TWI613215B - 抗－大－內皮素－１（ｂｉｇ－ｅｔ－１）抗體及其用途 - Google Patents

抗－大－內皮素－１（ｂｉｇ－ｅｔ－１）抗體及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供結合大-內皮素-1(”大-ET-1”)的抗體，以及使用該等抗體的方法。依據本發明的某些具體例，該等抗體特異性地結合人類大-ET-1但不結合人類小-ET-1(亦即，大-ET-1因為內皮素轉化酶-1[ECE-1]而蛋白水解裂解所產生的內皮素-1活化形式)。依據本發明的某些具體例，該等抗-大-ET-1抗體能夠阻斷因為ECE-1所致的大-ET-1裂解。本發明抗體可用於治療高血壓病症與癌症。

Description

抗-大-內皮素-1(BIG-ET-1)抗體及其用途
本發明是有關於對人類大-內皮素-1具有特異性的抗體及其抗原-結合片段。
內皮素-1(亦稱為”ET-1”、”小-ET-1”與”EDN1”)是一種具有21個胺基酸的血管收縮劑，其最初是由豬主動脈內皮細胞分離並鑑別。(Yanagisawa et al.(1988),Nature 332：411-415)。ET-1是衍生自一個約200個胺基酸的前原-ET-1分子，其受內肽酶裂解而產生一個38個胺基酸形式，稱為”大-ET-1”(亦稱為”原-ET-1”)。大-ET-1被內皮素轉化酶(ECE-1)進一步裂解而產生21個胺基酸的血管活性ET-1肽。ET-1可活化內皮素受體A型(”ETaR”)與B型(”ETbR”)。ETaR或ETbR在平滑肌細胞中的活化會導致血管收縮，而將ET-1靜脈內投與至實驗動物模型造成動脈壓持續升高。在肺部中，內皮素基因表現因為缺氧而向上調節，對血管平滑肌肥大、血管收縮、發炎以及心臟肥大，與肺高壓中的纖維化造成前饋效應(feed-forward effect)。
與前述特性相符，內皮素-1涉入不同疾病與病症，包括，例如肺高壓、心臟衰竭、全身性高血壓與癌症。因此，已測試或提議數種 內皮素受體(ETA與ETB)的小分子拮抗劑供治療諸如肺高壓、心血管病症、發炎性疾病、腎臟疾病、癌症與阿茲海默症之用。
在EP0406628B1中提及抗-ET-1抗體；但是，EP0406628B1的抗體是對抗接合至牛甲狀腺球蛋白的合成ET-1(亦即小-ET-1)而產生。既然是小-ET-1用作為免疫原，EP0406628B1的抗體不預期會結合大-ET-1，也預期它們不能降低或抑制大-ET-1因內皮素轉化酶而裂解。阻斷大-ET-1裂解成小-ET-1的治療劑在內皮素訊號傳遞過程中的早期時點發揮作用，且因而可能提供比對ET-1本身具有特異性之抗體更為有效的抑制活性。因此，在本技藝中對於內皮素訊號傳遞的新穎抑制劑存在有需求，其包括特異性地結合人類大-ET-1且阻斷小-ET-1形成的抗體。
本發明提供結合人類大-ET-1的抗體。本發明抗體尤其可用於抑制ET-1-媒介的信號傳遞以及用於治療由ET-1活性及/或信號傳遞所引起或與ET-1活性及/或信號傳遞有關的疾病與病症。
依據某些具體例，本發明抗體特異性地結合人類大-ET-1但不結合人類小-ET-1。本發明亦提供阻斷大-ET-1之內皮素-轉化酶-1(ECE-1)媒介之裂解的抗體。如本文所述，阻斷大-ET-1之ECE-1媒介之裂解的抗-大-ET-1抗體在活體外與活體內皆是內皮素-1活性的強效抑制劑。
本發明抗體可以是全長(例如，IgG1或IgG4抗體)或可含有僅僅抗原-結合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，且可經修飾而影響功能性，例如減少殘基效應子功能(Reddy et al.,2000,J.Immunol.164：1925-1933)。
本發明提供一種包含一重鏈可變區(HCVR)的抗體或抗體之抗原-結合片段，該重鏈可變區具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370、386、402，及418，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列。
本發明亦提供一種包含一輕鏈可變區(LCVR)的抗體或抗體之抗原-結合片段，該輕鏈可變區具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378、394、410，及426，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列。
本發明亦提供一種包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群的HCVR與LCVR(HCVR/LCVR)序列對的抗體或其抗原-結合片段：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410，及418/426。
本發明亦提供一種抗體或抗體之抗原-結合片段，其包含一重鏈CDR3(HCDR3)域，具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376、392、408，及424，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列；以及一輕鏈CDR3(LCDR3)域，具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384、400、416，及432，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列。
在某些具體例中，該抗體或抗體之抗原-結合部分包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320、328/336、344/352、360/368、376/384、392/400、408/416，及424/432。
本發明亦提供一種抗體或其片段，其進一步包含一重鏈CDR1(HCDR1)域，具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372、388、404，及420，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列；一重鏈CDR2(HCDR2)域，具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374、390、406，及422，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列；一輕鏈CDR1(LCDR1)域，具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380、396、412，及428，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列；以及一輕鏈 CDR2(LCDR2)域，具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382、398、414，及430，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質相似序列。
本發明的某些非限制性、例示性抗體及抗原-結合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，各別具有選自由下列SEQ ID NO所組成之群的胺基酸序列：4-6-8-12-14-16(例如H2M6486N)；20-22-24-28-30-32(例如H2M6490N)；36-38-40-44-46-48(例如H1M6492N)；52-54-56-60-62-64(例如H1M6494N)；68-70-72-76-78-80(例如H2M6495N)；84-86-88-92-94-96(例如H2M6741N)；100-102-104-108-110-112(例如H4H6311P)；116-118-120-124-126-128(例如H4H6316P)；132-134-136-140-142-144(例如H4H6317P)；148-150-152-156-158-160(例如H4H6323P)；164-166-168-172-174-176(例如H4H6327P2)；180-182-184-188-190-192(例如H4H6328P)；196-198-200-204-206-208(例如H4H6329P)；212-214-216-220-222-224(例如H4H6330P)；228-230-232-236-238-240(例如H4H6332P)；244-246-248-252-254-256(例如H4H6334P)；260-262-264-268-270-272(例如H4H6334P2)；276-278-280-284-286-288(例如H4H6335P)；292-294-296-300-302-304(例如H4H6337P)；308-310-312-316-318-320(例如H4H6338P)；324-326-328-332-334-336(例如H4H6340P)；340-342-344-348-350-352(例如H4H6343P)；356-358-360-364-366-368(例如H4H6345P)；372-374-376-380-382-384(例如H4H6347P)；388-390-392-396-398-400(例如H4H6353P)；404-406-408-4.12-414-416(例 如H4H6490N2)；及420-422-424-428-430-432(例如H4H6492N2)。
在一個相關具體例中，本發明包括特異性地結合人類大-ET-1的抗體或抗體之抗原-結合片段，其中該抗體或片段包含選自下列SEQ ID NO所組成之群之重鏈與輕鏈序列中所含重鏈與輕鏈CDR域：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378、386/394、402/410，及418/426。用於鑑定HCVR與LCVR胺基酸序列中的CDR的方法及技術為技藝中已知的，且可用於鑑定本文揭示之特定HCVR及/或LCVR胺基酸序列中的CDR。可用於鑑定CDR邊界的例示性習知技術包括，例如Kabat界定法、Chothia界定法以及AbM界定法。在一般性術語中，Kabat界定法是以序列變異性為基礎，Chothia界定法是以結構環區的位置為基礎，而AbM界定法是一種介於Kabat與Chothia法之間的折衷法。參見，例如Kabat，”Sequences of Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；以及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。公開資料庫亦可用來鑑定抗體內的CDR序列。
在另一個方面，本發明提供編碼抗-人類大-ET-1抗體或其片段之核酸分子。帶有本發明核酸之重組型表現載體與引入該等載體的宿主細胞，與藉由在容許生產抗體的條件下培養宿主細胞而生產抗體和回收所生產之抗體的方法亦被本發明所含括。
在一個具體例中，本發明提供一種抗體或其片段，其包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核酸序列所編碼的HCVR：1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、 257、273、289、305、321、337、353、369、385、401，及417，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
本發明亦提供一種抗體或其片段，其包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核酸序列所編碼的LCVR：9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377、393、409，及425，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
本發明亦提供抗體或抗體之抗原-結合片段，其包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的HCDR3域：7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359、375、391、407，及423，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列；以及選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的LCDR3域：15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367、383、399、415，及431，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
本發明亦提供抗體或其片段，其進一步包含選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的HCDR1域：3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371、387、403，及419，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列；選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的HCDR2域：5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、 261、277、293、309、325、341、357、373、389、405，及421，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列；選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的LCDR1域：11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379、395、411，及427，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列；以及選自由下列SEQ ID NO所組成之群之核苷酸序列所編碼的LCDR2域：13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365、381、397、413，及429，或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之實質相同序列。
依據某些具體例，該抗體或其片段包含由下列SEQ ID NO的核酸序列所編碼的重鏈與輕鏈CDR序列：1與9(例如H2M6486N)、17與25(例如H2M6490N)、33與41(例如H1M6492N)、49與57(例如H1M6494N)、65與73(例如H2M6495N)、81與89(例如H2M6741N)、97與105(例如H4H6311P)、113與121(例如H4H6316P)、129與137(例如H4H6317P)、145與153(例如H4H6323P)、161與169(例如H4H6327P2)、177與185(例如H4H6328P)、193與201(例如H4H6329P)、209與217(例如H4H6330P)、225與233(例如H4H6332P)、241與249(例如H4H6334P)、257與265(例如H4H6334P2)、273與281(例如H4H6335P)、289與297(例如H4H6337P)、305與313(例如H4H6338P)、321與329(例如H4H6340P)、337與345(例如H4H6343P)、353與361(例如H4H6345P)、369與377(例如H4H6347P)、385與393(例如H4H6353P)、401與409(例如H4H6490N2)，及417與425(例如H4H6492N2)。
本發明包括抗-大-ET-1抗體，其具有經修飾的糖化型態。在一些應用中，移除非所欲糖化位點的修飾可能是有用的，或缺乏存在於寡醣鏈上的岩藻糖部分的抗體，例如增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)功能(參見Shield et al.(2002)JBC 277：26733)。在其他應用中，可以進行半乳糖化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。
在另一個方面，本發明提供一種醫藥組成物，其包含特異性地結合大-ET-1之重組型人類抗體或其片段，以及藥學上可接受載劑。在一個相關的方面，本發明特徵為一種組成物，其為內皮素-1抑制劑與第二治療劑的組合。在一個具體例中，該內皮素-1抑制劑為抗體或其片段。在一個具體例中，第二治療劑為任一種有利與內皮素-1抑制劑組合的藥劑。可有利與內皮素-1抑制劑組合的例示性藥劑包括，但不限於其他抑制內皮素-1與內皮素-1受體交互作用的藥劑(包括其他抗體或其抗原-結合片段、肽抑制劑、小分子拮抗劑等)，及/或干擾內皮素上游或下游信號傳遞的藥劑。
在又另一個方面，本發明提供使用本發明抗-大-ET-1抗體或抗體之抗原-結合部分來抑制內皮素-1活性的方法，其中該治療方法包含投與治療有效量之含有本發明抗體或抗體之抗原-結合片段的醫藥組成物。所治療的病症是任一種藉由移除、抑制或降低內皮素-1活性而被增進、改善、抑制或預防的疾病或病況。本發明抗-大-ET-1抗體或抗體片段可具有阻斷內皮素-1與內皮素-1受體(例如ETaR及/或ETbR)間交互作用或以其他方式抑制內皮素-1信號傳遞活性的功能。在本發明的一些具體例中，透過本發明方法而被治療、預防或改善的疾病或病況包括肺高壓(包括肺動脈高血壓、與左心瓣膜病相關的肺高壓、與肺臟疾病相關的肺高壓，或因為長期栓塞疾病的肺高壓或因為血栓疾病的肺高壓)、腎臟疾病、 同種移植排斥、糖尿病、癌症(包括前列腺癌、乳癌、卵巢癌與黑色素瘤)、心臟衰竭、動脈粥樣硬化與疼痛(包括痛覺疼痛)。
本發明亦包括本發明抗-大-ET-1抗體或抗體之抗原結合部分供製造用以在患者體內治療與內皮素-1活性有關或由內皮素-1活性所致的疾病或病症之藥物的用途。
其他具體例將因為檢閱下面詳細說明而變得清楚。
第1圖：肺動脈截面積(PA CSA)。H4H6327P2以及波生坦(Bosentan)治療明顯減輕長期缺氧所引起之PA CSA的降低。相對於基線(亦即常氧)的PA CSA維持反映肌肉壁增厚(亦即血管重塑)及/或血管緊張性(亦即血管收縮)較少。#表示相對常氧P<0.001。**、***分別表示P<0.01，及0.001。
第2圖：右心室心搏出量(RV CO)。H4H6327P2以比波生坦更高的效力維持RV CO。在長期缺氧期間RV CO降低與肺動脈中的血管阻力升高有關。RV CO維持在經H4H6327P2治療的動物中比在經波生坦治療的動物中更高，暗示H4H6327P2在降低RV後負荷(亦即肺動脈阻力)上具有較大的效力。#表示相對常氧P<0.001。*、**、***分別表示P<0.05、0.01，及0.001。
第3圖：右心室至左心室+中膈(RV/(LV+S))。H4H6327P2治療在長期缺氧期間明顯減輕在RV/(LV+S)重量比上的增加。比例相對於基線(亦即常氧)越大，RV肥大的程度越大，其係因為維持血流通過肺動脈所需的補償機制所產生，儘管血管阻力更高。波生坦治療的重量比類似於載劑與同型對照組，表示暴露於長期缺氧下發生RV肥大。#表示相對常氧P<0.001。*表示P<0.05。
第4圖：右心室游離壁厚度，收縮期(RVFW，s)。H4H6327P2 治療在長期缺氧時明顯降低RVFW增厚。RV的壁增厚(亦即，肥大)發展為維持血流通過肺動脈所需的補償機制，儘管血管阻力更高。在載劑與同型對照組中RV壁厚度越高(相對於常氧)表示發生RV肥大；相比於載劑治療，波生坦治療傾向降低(不明顯)RVFW增厚。#表示相對常氧P<0.001。***表示P<0.001。
第5圖：遠端肺小動脈壁增厚。使用H4H6327P2與波生坦治療明顯逆轉由長期缺氧所引起的遠端肺小動脈壁增厚，如小壁厚度-對-血管直徑比(反映較少平滑肌層增生及/或平滑肌細胞招募(亦即較少血管重塑))所示。血管壁增厚在動物回復至常氧數日後逆轉。†††表示相對常氧P<0.001。*、***分別表示P<0.05，0.001。[源自圖式說明的原文]
第6圖：肺動脈截面積(PA CSA)。H4H6327P2與波生坦明顯逆轉由長期缺氧引起之肺動脈截面積(PA CSA)上的降低。相對於基線(亦即常氧)的PA CSA維持反映較少肌肉壁增厚(亦即血管重塑)及/或較少血管緊張性(亦即血管收縮)。血管截面積上的降低在動物回復至常氧數日後逆轉。†††表示相對常氧P<0.001。**、***表示P<0.01、0.001。
第7圖：右心室游離壁(RVFW)增厚。H4H6327P2與波生坦治療在長期缺氧時明顯逆轉右心室游離壁(RVFW)增厚。RV的壁增厚(亦即肥大)發展為維持血流通過肺動脈所需的補償機制，儘管血管阻力更高。在同型對照組中RV壁厚度越高(相對於常氧)表示發生RV肥大。心室壁增厚在動物回復至常氧數日後逆轉。†††表示相對常氧P<0.001。***表示P<0.001。
第8圖：右心室對左心室+中膈[RV/(LV+S)]重量比。H4H6327P2治療在長期缺氧期間對於右心室對左心室+中膈[RV/(LV+S)]重量比具有不多的效用。比例相對於基線(亦即常氧)越大，RV肥大的程 度越大，其係因為維持血流通過肺動脈所需的補償機制所產生，儘管血管阻力更高。H4H6327P2與波生坦治療的重量比類似於同型對照組，表示在暴露於長期缺氧下發生RV肥大。†††表示相對常氧P<0.001。*、***表示P<0.05、0.001。
第9圖：右心室心搏出量(RV CO)。H4H6327P2傾向維持右心室心搏出量(RV CO)。在長期缺氧期間RV CO降低與肺動脈中的血管阻力升高有關。在經波生坦治療相對經抗體治療的動物中，RV CO維持越高暗示波生坦在降低RV後負荷(亦即肺動脈阻力)具有較高效力。RV CO在動物回復至常氧數日後恢復。†††表示相對常氧P<0.001。*、**、***表示P<0.05、0.01、0.001。
第10圖：右心室收縮壓。H4H6327P2治療不會降低右心室收縮壓(RVSP)。RVSP在長期缺氧期間升高與肺動脈中的血管阻力增加有關；此為開啟肺動脈瓣所需的壓力。波生坦傾向降低RVSP，而抗-大ET-1抗體治療則無。RVSP升高在動物回復至常氧數日時接近於基線。†††表示相對常氧P<0.001。**、***表示P<0.01、0.001。
第11圖：痛覺行為。在投與抗-大ET-1抗體H4H6327P2的小鼠中痛覺行為被降低。12週大C57BL/6雄性小鼠分成三個實驗組：一個對照組(n=6)，接受30mg/kg的非大-ET-1結合同型對照抗體(同型)(實心柱)；一個低劑量組(n=7)，接受3mg/kg的抗大-ET-1抗體H4H6327P2(灰色柱)；以及一個高劑量組(n=7)，接受30mg/kg的H4H6327P2(斜紋交叉柱)。*表示相對對照P<0.05。
詳細說明
在說明本發明之前，應理解本發明不限於所述特定方法以及實驗條件，因為這些方法以及條件可能會改變。亦應理解本文中所用術 語僅供說明特定具體例之用，而不是限制性的，因為本發明的範疇將僅會受到隨附申請專利範圍所限制。
除非另有定義，否則所有本文使用的技術以及科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技藝者普遍理解的相同意思。如本文所用，術語”約”，當使用在有關特定引用的數值時，表示該數值可自所引用的數值起改變達不超過1%。舉例而言，如本文所用，詞句”約100”包括99與101以及其間的所有數值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
儘管任何類似或等同於本文所述的方法以及材料可應用於實施或測試本發明，現將說明較佳的方法以及材料。本說明書中提及的所有專利案、申請案與非專利公開文獻以其整體併入本文做為參考文獻。
定義
詞句”前-原-內皮素-1”、”前-原-ET-1”、”前-原-EDN-1”及類似者，如本文所用，表示具有如SEQ ID NO：433所示胺基酸序列的多肽。
詞句"大-內皮素-1”、”大-EDN-1”、”大-ET-1”及類似者，如本文所用，表示具有如SEQ ID NO：434之胺基酸序列的多肽，該胺基酸序列與SEQ ID NO：433的胺基酸53至90相同。
詞句”內皮素-1”、”ET-1”、”EDN-1”、小-內皮素-1”、”小-ET-1”、”小-EDN-1”及類似者，如本文所用，表示具有SEQ ID NO：435之胺基酸序列的多肽，該胺基酸序列與SEQ ID NO：433的胺基酸53至73相同。(小-ET-1的胺基酸序列就小鼠與人類的肽變體來說是相同的。)
所有前述詞句(例如”前-原-ET-1"、”大-ET-1”、”小-ET-1”、”內皮素-1”等)，如本文所用，意指對應分子的人類版本，除非另有指明來自非人類物種(例如”小鼠前-原-ET-1”、"小鼠大-ET-1”、”小鼠-小-ET-1”、”小鼠-內皮素-1”等)。
詞句”內皮素-轉化酶-1”、”ECE-1”及類似者，如本文所用，表示能夠在SEQ ID NO：434的Trp-21與Val-22接合(亦即”Tpr21/Val22接合”)處特異裂解大-ET-1的酶，從而產生小-ET-1與非活性C端產物，其具有SEQ ID NO：434的胺基酸22至38。例示性ECE-1為具有SEQ ID NO：436之胺基酸序列的人類酶。
術語”抗體”，如本文所用，意指特異性地結合至抗定抗原(例如大-ET-1)或與特定抗原交互作用的任一種抗原-結合分子或分子複合物，其包含至少一個互補決定區(CDR)。術語”抗體”包括免疫球蛋白分子，其含有4個多肽鏈，藉由雙硫鍵交互連結的2個重(H)鏈以及2個輕(L)鏈，以及其集合體(例如IgM)。各個重鏈含有1個重鏈可變區(此處縮寫為HCVR或VH)以及1個重鏈恆定區。重鏈恆定區含有3個結構域，CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有1個輕鏈可變區(此處縮寫為LCVR或VL)以及1個輕鏈恆定區。輕鏈恆定區含有1個結構域(CL1)。VH與VL區可進一步分成具有超變異性的區域(命名為互補決定區(CDR))，散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區(FR))。各個VH與VL由3個CDR以及4個FR所構成，按下列順序從胺基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明的不同具體例中，抗-大-ET-1抗體(或其抗原-結合部分)的FR可能與人類生殖系序列相同，或可以經天然或人工修飾。胺基酸一致序列可以依據並行分析兩個或多個CDR來定義。
術語”抗體”，如本文所用，亦包括完整抗體分子的抗原-結合片段。如本文所用，術語抗體的”抗原-結合部分”、抗體的”抗原-結合片段”及類似者包括任何天然存在的、以酵素所得到的、合成的或經遺傳工程的多肽或糖蛋白，其特異性地結合抗原而形成複合物。抗體的抗原-結合片段可以使用任何適當的標準技術(諸如蛋白水解消化或涉及操作並 表現編碼抗體可變與視情況恆定域之DNA的重組遺傳工程技術)而衍生自例如完整抗體分子。這樣的DNA是已知的及/或易於從例如商業來源、DNA圖書館(包括，例如噬菌體-抗體圖書館)獲得或可合成。DNA可以被定序且以化學的方式或使用分子生物技術來操作，例如將一或多個可變及/或恆定域排成適當構形，或引入會產生半胱胺酸殘基的密碼子、修飾、添加或刪除胺基酸等。
抗原-結合片段的非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；與(vii)由模擬抗體的超變異區之胺基酸殘基所構成的最小辨識單元(例如單離的互補決定區(CDR)，諸如CDR3肽)，或限制FR3-CDR3-FR4肽。其他經工程化的分子(諸如域特異性抗體、單域抗體、域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、雙價奈米抗體等)、小調節分子免疫藥物(SMIP)及鯊魚可變IgNAR域)亦含括在如本文所用詞句”抗原-結合片段”中。
抗體的抗原-結合片段典型含有至少1個可變域。可變域可以是任何大小與胺基酸組成，且通常含有至少1個鄰近1或多個骨架序列或在1或多個骨架序列中的CDR。在帶有與VL域締合之VH域的抗原-結合片段中，VH以及VL域可相對另一者位在適當排列處。舉例而言，可變區是二聚體且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。或者，抗體的抗原-結合片段可含有單體VH或VL域。
在某些具體例中，抗體的抗原-結合片段可含有至少1個共價連結至少1個恆定域的可變域。可以在本發明之抗體的抗原-結合片段中發現到的可變與恆定域的非限制例示性構形包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi) VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可變與恆定域的任一種構形中(包括上面列示的任一種例示性構形)，可變與恆定域可以是彼此直接連結或藉由完整或部分樞紐或連接子區域而連結。樞紐區是由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所構成，它在單一多肽分子中的相鄰可變及/或恆定域間產生彈性或半彈性鍵聯。此外，本發明抗體的抗原-結合片段可包含上列可變與恆定域構形的任一者彼此及/或與一或多個單體VH或VL域以非共價締合(例如藉由雙硫鍵(等))所形成的同型二聚體或異型二聚體(或其他集合體)。
就完整抗體分子而言，抗原-結合片段可以是單特異性或多特異性(例如雙特異性)。抗體的多特異性抗原-結合片段典型包含有至少兩個不同可變域，其中各個可變域能夠特異性地結合至個別抗原或相同抗原上的不同抗原決定位。任一種多特異性抗體形式，包括此處所揭示的例示性雙特異性抗體形式，可使用該技藝中可取得之慣用技術改造成使用於本發明之抗體的抗原-結合片段中。
本發明抗體可透過補體依賴性細胞毒性(CDC)或抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)來作用。”補體依賴性細胞毒性”(CDC)意指藉由本發明抗體在補體存在下溶解表現抗原的細胞。”抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)”意指細胞媒介的反應，其中表現Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺手(NK)細胞、嗜中性球與巨噬細胞)辨識目標細胞上的結合抗體且從而造成目標細胞溶解。CDC與ADCC可使用技藝中熟知且可取得的分析來測量。(參見，例如U.S.5,500,362與5,821,337及Clynes et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656)。抗體的恆定區就抗體固定補體與媒介細胞依賴性細胞毒性的 能力來說是重要的。因此，基於抗體媒介細胞毒性是否是所要的來選定抗體同型。
術語”人類抗體”，如本文所用，欲包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括不被人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或定位突變或藉由活體內體突變所引入的突變)，例如在CDR以及尤其在CDR3中。但是，術語”人類抗體”，如本文所用，不意欲要包括已被移植至人類骨架序列上之衍生自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列的抗體。
術語”重組型人類抗體”，如本文所用，欲包括所有藉由重組方法所製備、表現、產生或分離的人類抗體，諸如使用被轉染至宿主細胞中之重組型表現載體而被表現的抗體(進一步說明如下)、分離自重組型組合人類抗體圖書館的抗體(進一步說明如下)、分離自經人類免疫球蛋白基因轉基因的動物(例如小鼠)的抗體(參見，例如Taylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或藉由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之方法所製備、表現、產生或分離的抗體。此等重組型人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區及恆定區。但是，在某些具體例中，此等重組型人類抗體經活體外致突變(或，當使用經人類Ig序列基因轉基因的動物時為活體內體細胞致突變)，而因此該等重組型抗體之VH區與VL區的胺基酸序列為可能在活體內人類抗體生殖系本中非天然存在的序列，儘管它們是衍生自人類生殖系VH與VL序列或與其相關。
人類抗體以兩種與樞紐異質性相關的形式存在。在一種形式中，免疫球蛋白分子包含約150-160kDa的穩定四鏈建構物，其中二聚 體藉由鏈間重鏈雙硫鍵而被約束在一起。在第二種形式中，二聚體不是經由鏈間雙硫鍵連結，並形成一個由共價偶合輕鏈及重鏈組成的約75-80kDa分子(半抗體)。此等形式即使是在親和力純化之後也相當難以分離。
第二種形式在各種完整IgG同型中的出現頻率是因為(但不限於)與抗體之樞紐區同型有關的結構差異。在人類IgG4樞紐的樞紐區中，單個胺基酸置換可能將第二種形式的出現明顯降低至一般使用人類IgG1樞紐所觀察到的程度(Angal et al.(1993)Molecular Immunology 30：105)。本發明含括具有一或多個在樞紐CH2或CH3區中的突變的抗體，其可能是所要的，例如在製造時，俾以增進所欲抗體形式的產率。
”分離的抗體”，如本文所用，表示一種已被鑑定且分離及/或由其天然環境的至少一組分中被回收而來的抗體。例如，已被分離或由生物的至少一組分中，或由其中天然存在或天然生產之抗體的組織或細胞來的抗體就本發明之目的來說是一種”分離的抗體”。分離的抗體亦包括在重組型細胞內的原位抗體。分離抗體是已進行至少一個純化或分離步驟的抗體。依據某些具體例，分離的抗體基本上不含其他細胞物質及/或化學品。
術語”特異性地結合”或類似者表示與抗原在生理條件下形成相對穩定複合物的抗體或其抗原-結合片段。用於測定抗體是否特異性地結合至抗原的方法為本技藝中已知，且包括例如平衡透析、表面電漿共振及類似方法。例如，”特異性地結合”人類大-ET-1的抗體，如本發明上下文中所用，包括以低於約1000nM、低於約500nM、低於約300nM、低於約200nM、低於約100nM、低於約90nM、低於約80nM、低於約70nM、低於約60nM、低於約50nM、低於約40nM、低於約30nM、低於約20nM、低於約10nM、低於約5nM、低於約4nM、低於約3nM、 低於約2nM、低於約1nM或低於約0.5nM的KD結合人類大-ET-1或其部分的抗體，如同在表面電漿共振分析中所測得(參見，例如本文的實施例3)。但是，特異性地結合人類人類大-ET-1的分離抗體可能對其他抗原(諸如其他物種(非人類)的內皮素分子)具有交叉反應性。
”中和”或”阻斷”抗體，如本文所用，欲意指一種結合至大-ET-1的抗體，其結合(i)抑制或干擾內皮素轉化酶(例如ECE-1)所致的大-ET-1裂解，及/或(ii)造成抑制內皮素-1的至少一種生物功能。因為大-ET-1中和或阻斷抗體所造成的抑制不必然是完全的，只要其可使用適當分析被測得即可。偵測大-ET-1裂解抑制的例示性分析於本文他處中說明。
相較於抗體所衍生而來之對應生殖系序列，本文揭示的抗-大-ET-1抗體可在重鏈及輕鏈可變域之骨架及/或CDR區中含有一或多個胺基酸置換、插入及/或刪除。此等突變可透過將本文所揭示之胺基酸序列與可得自例如公用抗體序列資料庫的生殖系序列相比對而容易確認。本發明包括抗體及其抗原-結合片段，其等是衍生自本文所揭示的任一胺基酸序列，其中一或多個骨架及/或CDR區中的一或多個胺基酸突變成對應該抗體所源自的生殖系序列之對應殘基，或另一人類生殖系序列的對應殘基，或對應生殖系殘基的守恆性胺基酸置換(此等序列改變在本文中全意指為”生殖系突變”)。本技藝中具有通常技術者從本文揭示的重鏈與輕鏈可變區序列開始，可輕易製造出許多含有一或多個個別生殖系突變或其組合的抗體及抗原-結合片段。在某些具體例中，VH及/或VL域中的所有骨架及/或CDR殘基突變回復成在抗體衍生而來之原有生殖系序列中所發現的殘基。在其他具體例中，僅有某些殘基突變回復成原有生殖系序列，例如僅有在FR1的前8個胺基酸中或FR4的後8個胺基酸中所發現的突變殘基，或僅有CDR1、CDR2或CDR3中所發現的突變殘基。在其他具體 例中，骨架及/或CDR殘基的一或多者突變成不同生殖系序列的對應殘基(亦即，不同於抗體原有衍生而來之生殖系序列的生殖系序列)。此外，本發明抗體可含有兩個或更多個骨架及/或CDR區中之生殖系突變的組合，例如其中某些個別殘基突變成特定生殖系序列的對應殘基，而不同於原有生殖系序列的某些其他殘基維持原狀或突變成不同生殖系序列的對應殘基。在得到後，含有一或多個生殖系突變的抗體及抗原-結合片段可針對一或多種所要特性(諸如結合特異性增進、結合親和力增加、拮抗或促效生物特性增進或提高(視情況而定)、免疫原性降低等)來進行簡易測試。以此一般方式所得到的抗體及抗原-結合片段含括在本發明中。
本發明亦包括抗-大-ET-1抗體，該抗體含有本文揭示之具有一或多個守恆性置換的HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列任一者的變體。例如，本發明包括具有HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列的抗-大-ET-1抗體，該抗體相對於本文揭示之任一HCVR、LCVR、及/或CDR胺基酸序列具有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等的保守性胺基酸置換。
術語”表面電漿共振”，如本文所用，意指容許藉由偵測生物感測器基質中的蛋白質濃度變化來分析即時交互作用的光學現象，例如使用BIAcoreTM系統(Biacore Life Science division of GE Healthcare,Piscataway,N.J.)。
術語”KD”，如本文所用，欲意指特定抗體-抗原交互作用的平衡解離常數。
術語”抗原決定位(epitope)”意指一個與已知為抗原決定簇(paratope)之抗體分子的可變區中的特定抗原結合位點交互作用的抗原決定基。單獨一個抗原可能有超過一個抗原決定位。因此，不同抗體可結合 至一個抗原的不同區域且可能具有不同的生物效用。抗原決定位可以是具有構像或線性的。構像抗原決定位可透過在空間上並列的胺基酸由不同線性多肽鏈的區段所產生。線性抗原決定位是由多肽鏈中的相鄰胺基酸殘基所產生。在某些情況下，抗原決定位可包括抗原上的醣類、磷氧基或磺醯基的部分。
當意指核酸或其片段時，”實質同一性”或”實質相同”表示若藉由任何序列同一性的已知演算法(諸如FASTA、BLAST或Gap，如上所述)來測定時，當在有適當核苷酸插入或刪除的情況下與另一核酸(或其互補股)最佳排列時，在至少約95%，及更佳至少約96%、97%、98%或99%核苷酸鹼基中有核苷酸序列同一性。在某些情況下，與參考核酸分子具有實質同一性的核酸分子可編碼具有與參考核酸分子所編碼之多肽相同或實質類似胺基酸序列的多肽。
當應用於多肽時，術語”實質相似性”或”實質相似”表示當兩個肽序列最佳地排列時(諸如按照程式GAP或BESTFIT使用內定空位權重)，共有至少95%序列同一性，甚至更佳至少98%或99%序列同一性。較佳地，不相同的殘基位置因為守恆性胺基酸置換而有所差異。”守恆性胺基酸置換”是一種胺基酸殘基置換成另一種帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的胺基酸殘基。一般來說，守恆性胺基酸置換大體上不會改變蛋白質的官能性質。在2或多個胺基酸序列彼此因為守恆性置換而彼此有所不同的情況下，序列同一性百分比或相似性程度百分比可以向上調整而校正置換的守恆性質。用來做這個調整的方法對於習於該技藝者來說是熟知的。參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，併入本文做為參考文獻。帶有具類似化學性質的側鏈之胺基酸的群組實例包括(1)脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸與異 白胺酸；(2)脂肪族-羥基側鏈：絲胺酸與蘇胺酸；(3)含醯胺的側鏈：天門冬醯胺酸與麩醯胺酸；(4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸與色胺酸；(5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸與組胺酸；(6)酸性側鏈：天門冬胺酸與麩胺酸；以及(7)含硫側鏈為半胱胺酸與甲硫胺酸。較佳的守恆性胺基酸置換基團為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、天門冬胺酸-麩胺酸，以及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。或者，守恆性置換可以是任何在Gonnet et al.(1992)Science 256：1443-1445中揭示的PAM250對數-相似矩陣中具有正值的變化。”中度守恆”置換是任何在PAM250對數-相似矩陣中具有非負值的改變。
關於多肽的序列相似性，其亦可意指為序列同一性，典型是使用序列分析軟體來測量。蛋白質分析軟體使用分派給各種置換、刪除以及其他修飾(包括守恆性胺基酸置換)的相似性的測量法來配對相似序列。例如，GCG軟體含有諸如Gap與Bestfit的程式，它們可以與內定參數一起用來決定關係相近之多肽(諸如來自於不同物種之生物的同源性多肽)或野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的序列同源性或序列同一性。參見，例如GCG第6.1版。多肽序列也可以使用採內定或建議參數的FASTA(一種在GCG第6.1版中的程式)來比對。FASTA(例如FASTA2與FASTA3)提供查詢以及研究序列之間最佳重複區域的排列以及百分比序列同一性(Pearson(2000)上文)。當要將本發明的序列與含有大量來自不同生物之序列的資料庫比對時，另一個較佳的演算法是電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN，使用內定參數。參見，例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410以及Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402，各自併入本文做為參考文獻。
抗體的生物特性
本發明抗體特異性地結合人類大-ET-1(SEQ ID NO：434)但不結合人類小-ET-1(SEQ ID NO：435)。在定量上或定性上測量抗體與抗原間交互作用的任何分析形式可用來決定依抗體是否特異性地結合或不結合人類大-ET-1及/或人類小-ET-1。舉例而言，表面電漿共振分析，如實施例3中所說明，可用來決定一個特定測試抗體是否特異性地結合或不結合人類大-ET-1及/或人類小-ET-1。供本揭示內容用，若測試一抗體在表面電漿共振分析中結合至小-ET-1時表現大於約1.0E-06M(亦即>1000nM)的KD值，或不顯示任何偵測到結合至小-ET-1，則其被認為是”不結合人類小-ET-1”的抗體。不結合人類小-ET-1的本發明某些例示性抗體，如本文所定義的詞句，當在表面電漿共振分析中測試結合至人類大-ET-1時，仍證明以約少於1.0E-07M的KD值(例如1.0E-08M、1.0E-09M、1.0E-10M、1.0E-11M、1.0E-12M或更少)特異性地結合至人類大-ET-1，如在本文實施例3或類似分析中說明。
本發明某些例示性抗體的另一特性為阻斷大-ET-1(SEQ ID NO：434)因為內皮素-轉化酶-1(ECE-1)而裂解的能力。大-ET-1因為ECE-1而裂解會產生兩個片段：小-ET-1(對應於SEQ ID NO：434的N端21個胺基酸)，以及非活性C端產物(對應於SEQ ID NO：434的C端17個胺基酸)。因此，當將大-ET-1與ECE-1混合時，出現生物活性小-ET-1，及/或出現非活性C端肽係作為大-ET-1被ECE-1裂解程度的指標。
任何偵測大-ET-1因為ECE-1而裂解的分析形式可用來決定一個抗體是否”阻斷裂解”，如本文所用的詞句。可用來決定一個抗體是否阻斷大-ET-1因為ECE-1而裂解的非限制性、例示性分析形式顯示於本文實施例4中。在此實施例中，使用生產僅對存在內皮素-1(亦即小-ET-1， 大-ET-1的裂解產物)反應之報導訊號的經工程化細胞株來間接偵測大-ET-1的裂解。具體而言，此分析形式使用表現人類內皮素受體A型(ETaR)與螢光素酶報導要素的細胞株。首先準備裂解分應，其中抗體被添加至大-ET-1，接著添加ECE-1，且繼而容許反應在有助於大-ET-1酶促裂解的條件(亦即在37℃下過夜)下培育適當時間量。接著將裂解反應添加至表現ETaR的報導細胞株，並測量報導活性量(若有的話)。阻斷抗體會抑制大-ET-1裂解並因而抑制小-ET-1形成。包括阻斷抗體的反應因而會在添加至報導細胞株時產生降低或無報導活性。隨著此分析形式中所用的抗體量改變，可計算抑制50%大-ET-1裂解所需要的抗體量並表示為IC50值(參見，例如實施例4，表4-5)。依據本發明，當抗-大-ET-1抗體，在上述分析形式或實質類似分析中測試時表現少於約1.0E-08M的IC50(例如約9.0E-09M、約8.5E-09M、約8.0E-09M、約7.5E-09M、約7.0E-09M、約6.5E-09M、約6.0E-09M、約5.5E-09M、約5.0E-09M、約4.5E-09M、約4.0E-09M、約3.5E-09M、約3.0E-09M、約2.5E-09M、約2.0E-09M、約1.5E-09M、約1.0E-09M、約9.0E-10M、約8.5E-10M、約8.0E-10M、約7.5E-10M、約7.0E-10M、約6.5E-10M、約6.0E-10M、約5.5E-10M、約5.0E-10M、約4.5E-10M、約4.0E-10M、約3.5E-10M、3.0E-10M、約2.5E-10M、約2.0E-10M、約1.5E-10M、約1.0E-10M或更少的IC50)時，則其”阻斷大-ET-1因為ECE-1的裂解”。
可用於決定一個抗體是否阻斷大-ET-1因為ECE-1而裂解的其他或另外例示性分析形式顯示於本文實施例5中。在此分析形式中，準備裂解反應，其中抗體被添加至大-ET-1，接著添加ECE-1。容許反應在有助於大-ET-1酶促裂解的條件(亦即在37℃下)下培育並在不同時間點(例如0、15、30與60分)取得等分試樣。將等分試樣進行基質輔助雷射脫 附離子化-飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀分析來決定裂解產物存在或不存在。大-ET-1因為ECE-1的裂解會產生具有特定分子量的肽產物。舉例而言，人類大-ET-1因為ECE-1的裂解會產生具有分子量為2475Da的小-ET-1，以及具有分子量為1809Da的非活性C端肽。依據MALDI-TOF出現的此等片段之一者或兩者表示大-ET-1在這個分析中因為ECE-1而裂解。但是，若將大-ET-1與抗-大-ET-1抗體合併後，添加ECE-1不會產生裂解產物之一或兩者(或相較於陰性對照抗體產生實質較少的裂解產物)，則推論該抗體”阻斷大-ET-1因為ECE-1而裂解”，如本文詞句所用。
本發明亦包括抑制或降低內皮素-1媒介增加動脈血壓的抗體。可用來評估內皮素-1媒介增加動脈血壓的例示性動物模型說明於本文實施例6中。在此實施例中，小鼠被投與抗-大-ET-1抗體，接著投與人類大-ET-1肽。在大-ET-1刺激後即時測量動脈血壓的變化。大-ET-1在活體內裂解成生物活性小-ET-1反應於平均動脈血壓的增加上。若在此分析形式中投與阻斷抗-大-ET-1抗體，平均動脈血壓相較於投與同型對照抗體不增加或增加至較少的程度。
抗原決定位拼圖以及相關技術
本發明包括與大-ET-1的ECE-1裂解位點處或鄰近處的一或多個胺基酸交互作用的抗體。ECE-1在大-ET-1(SEQ ID NO：434)的Trp-21與Val-22接合處裂解大-ET-1。因此，本發明包括抗-大-ET-1抗體，其與大-ET-1(SEQ ID NO：434)的Trp-21/Val-22接合處的10個胺基酸內的一或多個胺基酸交互作用。抗體結合的抗原決定位可由大-ET-1的ECE-1裂解位點處或鄰近處的3個或更多個(例如3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸的單一連續序列所組成。或者，抗原決定位可由大-ET-1的ECE-1 裂解位點處或鄰近處(約10個胺基酸內)的數個非連續胺基酸(或胺基酸序列)所構成。
可使用技藝中具有通常技術者所熟知的各種技術來決定一個抗體是否會與多肽或蛋白質中的”一或多個胺基酸交互作用”。例示性技術包括，例如Harlow and Lane的”Antibodies”所述的慣用交叉-阻斷分析(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)、丙胺酸掃描突變分析、肽墨點分析(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)及肽切割分析。此外，可以採用諸如抗原決定位切除、抗原決定位抽出以及化學修飾抗原的方法(Tomer,2000,Protein Science 9：487-496)。另一種可用於鑑別與抗體交互作用之多肽中的胺基酸的方法為透過質譜偵測氫/氘交換。在通常術語中，氫/氘交換法涉及將感興趣的蛋白質標記氘，然後透過將抗體結合至經氘標記的蛋白質。接下來，蛋白質/抗體複合物被轉移至水中以容許氫-氘交換在除了受抗體保護之殘基(其維持經氘標記)以外的所有殘基發生。在抗體解離後，目標蛋白質被進行蛋白酶切割與質譜分析，從而揭開經氘標記的殘基，其對應於抗體交互作用的特定胺基酸。參見，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2)：252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。
本發明進一步包括結合至與本文所述特定例示性抗體任一者(例如，H2M6486N、H2M6490N、H1M6492N、H1M6494N、H2M6495N、H2M6741N、H4H6311P、H4H6316P、H4H6317P、H4H6323P、H4H6327P2、H4H6328P、H4H6329P、H4H6330P、H4H6332P、H4H6334P、H4H6334P2、H4H6335P、H4H6337P、H4H6338P、H4H6340P、H4H6343P、H4H6345P、H4H6347P、H4H6353P、H4H6490N2、H4H6492N2等)之相同抗原決定位的抗-大-ET-1抗體。同樣地，本發明亦包括與本文所述特定 例示性抗體任一者(例如，H2M6486N、H2M6490N、H1M6492N、H1M6494N、H2M6495N、H2M6741N、H4H6311P、H4H6316P、H4H6317P、H4H6323P、H4H6327P2、H4H6328P、H4H6329P、H4H6330P、H4H6332P、H4H6334P、H4H6334P2、H4H6335P、H4H6337P、H4H6338P、H4H6340P、H4H6343P、H4H6345P、H4H6347P、H4H6353P、H4H6490N2、H4H6492N2等)競爭結合至大-ET-1的抗-大-ET-1抗體。
吾人可容易地藉由使用技藝中已知的慣常方法決定一個抗體是否會與參考抗-大-ET-1抗體結合至相同的抗原決定位，或與參考抗-大-ET-1抗體競爭結合至相同抗原決定位。例如，為決定一測試抗體是否會結合至與本發明參考抗-大-ET-1抗體相同的抗原決定位，容許該參考抗體在飽合條件下結合至大-ET-1蛋白或肽。接著，評估測試抗體結合至大-ET-1分子的能力。若測試抗體能夠在參考抗-大-ET-1抗體飽合結合之後結合至大-ET-1，則可推論該測試抗體結合至與參考抗-大-ET-1抗體不同的抗原決定位。另一方面，若測試抗體無法在參考抗-大-ET-1抗體飽合結合後結合至大-ET-1分子，則該測試抗體可能結合至與本發明參考抗-大-ET-1抗體所結合之抗原決定位相同的抗原決定位。接而可進行其他慣常實驗(例如肽突變與結合分析)以確認觀察測試抗體沒有結合是因為結合至與參考抗體相同的抗原決定位，或若沒有觀察到結合是因為其空間障礙(或另一現象)。這類實驗係使用ELISA、RIA、Biacore、流式細胞儀或技藝中可供使用的其他任何定量或定性抗體-結合分析來進行。依據本發明的某些具體例，若例如在一個競爭性結合分析中測量一個過量1-、5-、10-、20-或100-倍的抗體抑制另一個抗體達至少50%，但較佳75%、90%或甚至99%，則兩個抗體結合至相同(或重疊)抗原決定位(參見，例如Junghans et al.,Cancer Res.1990：50：1495-1502)。或者，若基本上所有在抗原中會減 少或消除一個抗體結合的胺基酸突變也會減少或消除另一個抗體結合，則兩個抗體被視為是結合至相同抗原決定位。若減少或消除一抗體結合之僅有一部份胺基酸突變也會減少或消除另一個抗體結合，則兩個抗體被視為具有”重疊的抗原決定位”。
為測定一個抗體是否與參考抗-大-ET-1抗體競爭結合，以兩個方面來進行上述結合方法學：在第一個方面，容許參考抗體在飽和條件下結合至大-ET-1分子，繼而評估測試抗體對大-ET-1分子的結合。在第二個方面，容許測試抗體在飽和條件下結合至大-ET-1分子，繼而評估參考抗體對大-ET-1分子的結合。若在兩個方面中，僅有第一(飽和)抗體能夠結合至大-ET-1分子，則推斷測試抗體與參考抗體競爭結合至大-ET-1。如技藝中具有通常技術者所了解，與參考抗體競爭結合之抗體不必然會結合至與參考抗體相同的抗原決定位，但可能會在空間上藉由結合重疊或相鄰抗原決定位來阻斷參考抗體的結合。
製備人類抗體
用於製造單株抗體(包括完整人類單株抗體)的方法為技藝中已知的。任何此等已知方法可用於本發明的上下文中以製造特異性地結合至人類大-ET-1的人類抗體。
使用VELOCIMMUNETM技術或任何其他用於生成單株抗體的已知方法，首先分離出帶有人類可變區以及小鼠恆定區之對大-ET-1具高親和力的嵌合抗體。如同在下面實驗節中，鑑定抗體的特徵並且篩選所欲的特性，包括親和力、選擇性、抗原決定位等。小鼠恆定區取代成所欲的人類恆定區以生成本發明的完整人類抗體，例如野生型或經修飾的IgG1或IgG4。儘管選定的恆定區可能會依據特定用途、可變區中的高親 和力抗原-結合以及標的特異性特性而改變。
生物等效性
本發明的抗-大-ET-1抗體以及抗體片段含括帶有由那些所述抗體變化而來，但仍保有結合人類大-ET-1能力之胺基酸序列的蛋白質。當與親代序列相較之下，此等變異抗體以及抗體片段包含有一或多個胺基酸加入、刪除或置換，但仍展現出基本上與所述抗體等效的生物活性。同樣地，當與所揭示的序列相較之下，本發明之抗-大-ET-1抗體編碼DNA序列含括具有一或多個核苷酸加入、刪除或置換，但仍編碼基本上與本發明之抗-大-ET-1抗體或抗體片段生物等效的抗-大-ET-1抗體或抗體片段的序列。上面詳述此等變異胺基酸以及DNA序列的實例。
舉例而言，若2個抗原-結合蛋白或抗體是藥學等效物或藥學代用品，當它們以相同莫耳劑量在類似實驗條件下投與時的吸收速率與程度未顯示出明顯差異(不論是單劑量或多劑量)，它們被視為生物等效的。若一些抗體在它們的吸收程度上相等但在它們的吸收速率上沒有，它們將會被視為等效物或藥學代用品但不被視為生物等效，因為此等在吸收速率上的差異是有目的並且在歸類時被反映，對於在例如長期使用上維持有效生體藥物濃度來說不是必要的，並且就所研究的特定藥物產品來說被視為在醫學上沒有差異。
在一個具體例中，若2個抗原-結合蛋白在臨床上就其安全性、純度以及效力而言並無有意義的差異，它們是生物等效的。
在一個具體例中，若患者在參考產品與生物產品之間可以改變一或多次而沒有預期增高不良反應的風險(包括與持續治療而沒有這樣改變的情況下相比，在免疫原性上的臨床顯著變化，或減低有效性)時， 它們是生物等效的。
在一個具體例中，若2個抗原-結合蛋白就條件或使用條件來說均是藉由共同的機制或作用機制而作用達致此等機制已知的程度，它們是生物等效的。
生物等效性可以藉由活體內和活體外方法證實。生物等效性測量法包括，例如(a)在人類或其他哺乳動物體內的活體內測試，其中隨著時間函數測量抗體或其代謝物在血液、血漿、血清或其他生物液中的濃度；(b)已使用人類活體內生物可利用性數據校正並且可合理預測的活體外測試；(c)在人類或其他哺乳動物體內的活體內測試，其中隨著時間函數測量抗體(或其標的)之適當急性藥理學效用；以及(d)在已證實抗體的安全性、效力或生物可利用性或生物等效性的充分控制臨床試驗中。
本發明之抗-大-ET-1抗體的生物等效變體可以藉由例如，製造各種殘基或序列置換，或刪除不是生物活性所必需的末端或內部殘基或序列而建構。舉例而言，對於生物活性來說不是必要的半胱胺酸殘基可以被刪除或取代為其他會在再復性之後防止形成不必要或不正確分子內雙硫橋的胺基酸。在其他上下文中，生物等效性抗體可包括抗-大-ET-1抗體變體，其含有會修飾抗體之糖化特性的胺基酸改變，例如消除或移除糖化的突變。
物種選擇性以及物種交叉反應性
依據本發明的某些具體例，抗-大-ET-1抗體結合至人類大-ET-1而不會結合至其他物種的大-ET-1。本發明亦包括結合至人類大-ET-1以及一或多個非人類物種的大-ET-1的抗-大-ET-1抗體。舉例而言，本發明的抗-大-ET-1抗體可以結合至人類大-ET-1並且視情況可能結合或 不結合至小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、馬來猴、狨猿、恆河猴或黑猩猩大-ET-1的一或多者。
免疫接合物
本發明含括接合至一治療部分(”免疫接合物”)(諸如細胞毒素、化學治療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素)的抗-大-ET-1單株抗體。細胞毒性劑包括任何對細胞有害的藥劑。用於形成免疫接合物的適當細胞毒性劑以及化學治療劑的實施例在該技藝中是已知的(參見例如WO 05/103081)。
多特異性抗體
本發明的抗體可以是單特異性、雙特異性或多特異性。多特異性抗體可以是對一個標的多肽的不同抗原決定位具有特異性或者可能含有對超過一個標的多肽具有特異性的抗原-結合域。參見例如Tutt et al.,1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer et al.,2004,Trends Biotechnol.22：238-244。本發明的抗-大-ET-1抗體可以連結至另一個功能性分子(例如另一個肽或蛋白質)或與該另一個功能性分子一起表現。舉例而言，抗體或其片段在功能上可以連結(例如，藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如另一個抗體或抗體片段，以產生帶有第二種結合特異性的雙特異性或多特異性抗體。舉例而言，本發明包括雙特異性抗體，其中免疫球蛋白的一臂對於人類大-ET-1或其片段具有特異性，而免疫球蛋白的另一臂對第二治療標的具有特異性或接合至一個治療部分。
可以使用於本發明上下文的例示性雙特異性抗體形式涉 及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域以及第二Ig CH3域，其中第一與第二Ig CH3域因為至少1個胺基酸而彼此不同，以及其中與缺少該胺基酸差異的雙特異性抗體相較之下，至少1個胺基酸差異會減低該雙特異性抗體結合至蛋白質A。在一個具體例中，該第一Ig CH3域結合蛋白質A而該第二Ig CH3域含有1個會減低或消除蛋白質A結合的突變，諸如H95R修飾(按照IMGT外顯子編號；按照EU編號為H435R)。該第二CH3可進一步包含有Y96F修飾(按照IMGT；按照EU為Y436F)。可以在第二CH3中發現到的更多修飾包括：在IgG1抗體的情況下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(按照IMGT；按照EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I)；在IgG2抗體的情況下，N44S、K52N以及V82I(IMGT；按照EU為N384S、K392N以及V422I)；以及在IgG4抗體的情況下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(按照IMGT；按照EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。上述雙特異性抗體形式的變異在本發明範圍中是可預想的。
治療配方以及投藥
本發明提供包含有本發明之抗-大-ET-1抗體或其抗原-結合片段的醫藥組成物。本發明的醫藥組成物可與適當載體、賦形劑以及其他提供改善輸送、遞送、耐受性以及類似者的藥劑一起調配。可以在對於藥學化學家來說為熟悉的處方書中找到大量適當的配方：Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。這些配方包括，例如粉末、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質(陽離子或陰離子)(諸如LIPOFECTINTM)、DNA接合物、無水吸收糊劑、水包油與油包水乳劑、乳化卡波蠟(具有各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝 膠以及含有卡波蠟的半固體混合物。亦參見Powell et al.”Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
投與給患者的抗體劑量可以視患者的年齡與身材、標的疾病、病況、投藥途徑以及類似者來改變。較佳劑量通常是依據體重或體表面積來計算。當本發明的抗體用於在成人患者體內治療與內皮素-1活性有關的病況或疾病時，通常以約0.01至約20mg/kg體重、更佳約0.02至約7、約0.03至約5、或約0.05至3mg/kg體重的單劑量靜脈內投與本發明抗體是有益的。可以視病況的嚴重性調整治療頻率以及持續時間。用於投與抗-大-ET-1抗體的有效劑量與時間表可按經驗來決定；例如，可透過定期評估來監測患者進展，並據此調整劑量。此外，劑量的物種間標度可使用技藝中已知的方法來進行(例如Mordenti et al.,1991,Pharmaceut.Res.5：1351)。
已知有各種不同的遞送系統並且可用於投與本發明的醫藥組成物，例如封裝在脂質體內、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒的重組型細胞、受體媒介的胞吞作用(參見，例如Wu et al.,1987,J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入的方法包括，但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上以及口服途徑。組成物可以藉由任何習知途徑來投與，例如藉由輸注或團注、藉由透過上皮或黏膜內襯(例如口腔黏膜、直腸以及小腸黏膜等)吸收，並且可以與其他具有生物活性的藥劑一起投與。投藥可以是全身性或局部的。
本發明的醫藥組成物可以使用標準注射針與注射器來皮下或靜脈內遞送。此外，關於皮下遞送，筆型遞送裝置很容易應用於遞送本發明的醫藥組成物。這樣的一種筆型遞送裝置可以是重複使用或拋棄 式。可重複使用的筆型遞送裝置通常使用含有醫藥組成物的可換式卡匣。一旦卡匣內的所有醫藥組成物被投藥且卡匣空了，空的卡匣可易於丟棄並且置換成含有醫藥組成物的新卡匣。那麼就可以重複使用筆型遞送裝置。就拋棄式筆型遞送裝置來說，沒有可換式卡匣。更確切地來說，拋棄式筆型遞送裝置在裝置的貯器內預先填充醫藥組成物供選購。一旦貯器沒有醫藥組成物，整個裝置就被丟棄。
許多可重複使用的筆型以及自動注射遞送裝置在皮下遞送本發明之醫藥組成物方面有實用性。實例包括，但不限定於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM pen(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM pen、HUMALOGTM pen、HUMALIN 70/30TM pen(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM pen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅舉幾個為例。在皮下投遞本發明之醫藥組成物方面有實用性的拋棄式筆型遞送裝置的實例包括，但不限於SOLOSTARTM pen(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)以及HUMIRATM Pen(Abbott Labs,Abbott Park IL)，僅舉幾個為例。
在某些情況下，醫藥組成物以控制釋放系統的方式被投遞。在一個具體例中，可使用泵(參見Langer，上文；Sefton 1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一個具體例中，可使用聚合材料；參見 Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又另一個具體例中，控制釋放系統被置放在組成物標的鄰近處，因此僅需要全身性劑量的一部分(參見，例如Goodson,1984,Medical Applications of Controlled Release，上文，vol.2,pp.115-138中)。其他控制釋放系統在Langer,1990,Science 249：1527-1533的回顧中被討論。
可注射製品可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等的劑型。此等可注射製品可依照公知方法製備。例如，可注射製品可例如，藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於習知用於注射的無菌水性介質或油性介質中來製備。有關用於注射的水性介質，例如有生理食鹽水、含有葡萄糖與其他助劑的等張溶液等，其可與適當助溶劑(諸如醇(乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化菎麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等組合使用。有關油性介質，採用例如芝麻油、大豆油等，其可與助溶劑(諸如安息酸苯甲酯、苯甲醇等)組合使用。由此製備的注射劑較佳地被填充於適當安瓿中。
有利地，上述供經口或非經口使用的醫藥組成物被製備為呈適於活性成分投藥之單位劑量的劑型。此等呈單位劑量之劑型包括，例如錠劑、丸劑、囊劑、注射劑(安瓿)、栓劑等。在1個單位劑量中，所含前述抗體量通常每劑型約5至約500mg；尤其是呈注射型式，前述抗體就其他劑型而言較佳含有約5至約100mg以及約10至約250mg。
抗體的治療用途
本發明的抗體尤其可應用於治療、預防及/或改善任何與內 皮素-1活性相關或由內皮素-1活性媒介，或可藉由阻斷大-ET-1裂解成小-ET-1而治療的疾病或病症。本發明抗體及抗原-結合片段可用於治療，例如纖維化(例如肺纖維化)、發炎性病況、肥大(例如心肌及/或血管分布的肥大)、特徵為血管收縮的疾病與病症，以及疼痛。可使用本發明抗-大-ET-1抗體治療的特定例示性疾病與病症包括，例如肺高壓、動脈高血壓、腎臟疾病、同種移植排斥、糖尿病、胰島素抗性、癌症(例如前列腺癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、膀胱癌、卡波西氏肉瘤與神經膠質瘤)、心臟衰竭、動脈粥樣硬化、中風、心律不整、氣喘、鐮狀細胞貧血症、腦血管痙攣、糖尿病性腎病變、硬皮病、COPD與痛覺疼痛。可使用本發明抗-大-ET-1抗體治療的肺高壓子類包括，例如肺動脈高壓、與左心瓣膜病相關的肺高壓、與肺臟疾病相關的肺高壓，因為長期栓塞疾病相關的肺高壓或因為血栓疾病相關的肺高壓。
組合療法
本發明包括治療投藥方案，其包含將本發明抗-大-ET-1抗體與至少一種其他治療有效成分組合投與。該等其他治療有效成分的非限制性實例包括其他內皮素-1拮抗劑(例如抗-內皮素-1抗體，不同的抗-大-ET-1抗體或內皮素-1的小分子抑制劑)、內皮素-A受體拮抗劑、內皮素-B受體拮抗劑、內皮素-轉化酶-1(ECE-1)抑制劑、腦啡肽酶(neprilysin)抑制劑、血管收縮素-II受體促效劑與NF-κB抑制劑。可與本發明抗-大-ET-1抗體組合投與的例示性藥劑包括，例如波生坦(Bosentan)(Roche)、安立生坦(Ambrisentan)(Abbott)、西他生坦(Sitaxentan)(Encysive)、克拉生坦(Clazosentan)(Chugai)、達洛生坦(Darusentan)(Abbott)、ZD4054(AstraZeneca)、瑪西替坦(Macitentan)(Actelion)、阿伏生坦 (Avosentan)(Roche)、達格魯曲(Daglutril)(Solvay)、PS433540(Bristol-Myers Squibb)、S0139(Shionogi)、SLV334(Solvay)、TBC3711(Encysive)、泛多生坦(Fandosentan)(Pfizer)、PABSA(Shionogi)、YM598(Astellas)及YM62899(Astellas)。
其他可與本發明抗-大-ET-1抗體組合而被有利投與的藥劑包括細胞激素抑制劑，包括小分子細胞激素抑制劑與抗體，其結合至諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18的細胞激素或其個別受體。本發明亦包括治療組合，其包含本文所述的任一抗-大-ET-1抗體以及Ang2、Tie2、VEGF、DLL4、EGFR之一或多者，或任何前述細胞激素的抑制劑，其中該抑制劑為適體、反義分子、核糖酶、siRNA、肽體、奈米抗體或抗體片段(例如Fab片段；F(ab')2片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他經工程化的分子，諸如雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體與最小辨識單元)。本發明抗-大-ET-1抗體亦可與抗病毒劑、抗生素、止痛劑、皮質類固醇及/或NSAID組合投與。
其他治療活性成分可在本發明抗-大-ET-1抗體投與之前、同時或之後被投與；(為本揭示內容之用，此等投與方案被視為”組合”其他治療有效成分投與抗-大-ET-1抗體)。
抗體的診斷用途
本發明的抗-大-ET-1抗體也可以用來偵測及/或測量樣本中的大-ET-1，例如供診斷之用。舉例而言，抗-大-ET-1抗體或其片段可以用來診斷特徵在於大-ET-1或內皮素-1異常表現(例如過度表現、不足表現、缺乏表現等)的病況或疾病。有關大-ET-1的例示性診斷分析可包含， 例如使得自於一患者的樣本與本發明之抗-大-ET-1抗體接觸，其中抗-大-ET-1抗體標定有可偵測到的標記或報導分子。或者，未標定的抗-大-ET-1抗體可以組合本身可被偵測到標定之二級抗體一起使用於診斷應用。可偵測到的標記或報導分子可以是放射性同位素，諸如3H、14C、32P、35S或125I；螢光或化學發光部分，諸如螢光素異氰酸鹽或玫瑰紅；或諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶，或螢光素酶的酵素。可用來偵測或測量樣本中的大-ET-1的特定例示性分析包括酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)以及螢光-活化細胞選別(FACS)。
依據本發明，可用於大-ET-1診斷分析中的樣本包括任何可得自於患者的組織或體液樣本，其在正常或病理狀態下含有可偵測數量的大-ET-1蛋白或其片段。一般來說，測量大-ET-1在自健康患者(例如未罹患與異常內皮素-1濃度或活性有關之疾病或病況的患者)所得到之特定樣本中的濃度以在開始時建立基線，或標準大-ET-1濃度。大-ET-1的這個基線濃度接而可以與得自於被懷疑帶有與大-ET-1相關疾病或病況之個體的樣本中所測得的大-ET-1濃度來比對。
第1圖：肺動脈截面積(PA CSA)。H4H6327P2以及波生坦(Bosentan)治療明顯減輕長期缺氧所引起之PA CSA的降低。相對於基線(亦即常氧)的PA CSA維持反映肌肉壁增厚(亦即血管重塑)及/或血管緊張性(亦即血管收縮)較少。#表示相對常氧P<0.001。**、***分別表示P<0.01，及0.001。
第2圖：右心室心搏出量(RV CO)。H4H6327P2以比波生坦更高的效力維持RV CO。在長期缺氧期間RV CO降低與肺動脈中的血管阻力升高有關。RV CO維持在經H4H6327P2治療的動物中比在經波生坦治療的動 物中更高，暗示H4H6327P2在降低RV後負荷(亦即肺動脈阻力)上具有較大的效力。#表示相對常氧P<0.001。*、**、***分別表示P<0.05、0.01，及0.001。
第3圖：右心室至左心室+中膈(RV/(LV+S))。H4H6327P2治療在長期缺氧期間明顯減輕在RV/(LV+S)重量比上的增加。比例相對於基線(亦即常氧)越大，RV肥大的程度越大，其係因為維持血流通過肺動脈所需的補償機制所產生，儘管血管阻力更高。波生坦治療的重量比類似於載劑與同型對照組，表示暴露於長期缺氧下發生RV肥大。#表示相對常氧P<0.001。*表示P<0.05。
第4圖：右心室游離壁厚度，收縮期(RVFW，s)。H4H6327P2治療在長期缺氧時明顯降低RVFW增厚。RV的壁增厚(亦即，肥大)發展為維持血流通過肺動脈所需的補償機制，儘管血管阻力更高。在載劑與同型對照組中RV壁厚度越高(相對於常氧)表示發生RV肥大；相比於載劑治療，波生坦治療傾向降低(不明顯)RVFW增厚。#表示相對常氧P<0.001。***表示P<0.001。
第5圖：遠端肺小動脈壁增厚。使用H4H6327P2與波生坦治療明顯逆轉由長期缺氧所引起的遠端肺小動脈壁增厚，如小壁厚度-對-血管直徑比(反映較少平滑肌層增生及/或平滑肌細胞招募(亦即較少血管重塑))所示。血管壁增厚在動物回復至常氧數日後逆轉。†††表示相對常氧P<0.001。*、***分別表示P<0.05，0.001。[源自圖式說明的原文]
第6圖：肺動脈截面積(PA CSA)。H4H6327P2與波生坦明顯逆轉由長期缺氧引起之肺動脈截面積(PA CSA)上的降低。相對於基線(亦即常氧)的PA CSA維持反映較少肌肉壁增厚(亦即血管重塑)及/或較少血管緊張性(亦即血管收縮)。血管截面積上的降低在動物回復至常氧數日後逆轉。††† 表示相對常氧P<0.001。**、***表示P<0.01、0.001。
第7圖：右心室游離壁(RVFW)增厚。H4H6327P2與波生坦治療在長期缺氧時明顯逆轉右心室游離壁(RVFW)增厚。RV的壁增厚(亦即肥大)發展為維持血流通過肺動脈所需的補償機制，儘管血管阻力更高。在同型對照組中RV壁厚度越高(相對於常氧)表示發生RV肥大。心室壁增厚在動物回復至常氧數日後逆轉。†††表示相對常氧P<0.001。***表示P<0.001。
第8圖：右心室對左心室+中膈[RV/(LV+S)]重量比。H4H6327P2治療在長期缺氧期間對於右心室對左心室+中膈[RV/(LV+S)]重量比具有不多的效用。比例相對於基線(亦即常氧)越大，RV肥大的程度越大，其係因為維持血流通過肺動脈所需的補償機制所產生，儘管血管阻力更高。H4H6327P2與波生坦治療的重量比類似於同型對照組，表示在暴露於長期缺氧下發生RV肥大。†††表示相對常氧P<0.001。*、***表示P<0.05、0.001。
第9圖：右心室心搏出量(RV CO)。H4H6327P2傾向維持右心室心搏出量(RV CO)。在長期缺氧期間RV CO降低與肺動脈中的血管阻力升高有關。在經波生坦治療相對經抗體治療的動物中，RV CO維持越高暗示波生坦在降低RV後負荷(亦即肺動脈阻力)具有較高效力。RV CO在動物回復至常氧數日後恢復。†††表示相對常氧P<0.001。*、**、***表示P<0.05、0.01、0.001。
第10圖：右心室收縮壓。H4H6327P2治療不會降低右心室收縮壓(RVSP)。RVSP在長期缺氧期間升高與肺動脈中的血管阻力增加有關；此為開啟肺動脈瓣所需的壓力。波生坦傾向降低RVSP，而抗-大ET-1抗體治療則無。RVSP升高在動物回復至常氧數日時接近於基線。†††表示相對常氧P<0.001。**、***表示P<0.01、0.001。
第11圖：痛覺行為。在投與抗-大ET-1抗體H4H6327P2的小鼠中痛覺行為被降低。12週大C57BL/6雄性小鼠分成三個實驗組：一個對照組(n=6)，接受30mg/kg的非大-ET-1結合同型對照抗體(同型)(實心柱)；一個低劑量組(n=7)，接受3mg/kg的抗大-ET-1抗體H4H6327P2(灰色柱)；以及一個高劑量組(n=7)，接受30mg/kg的H4H6327P2(斜紋交叉柱)。*表示相對對照P<0.05。
實施例
提出下列實施例俾以將如何製造與使用本發明方法和組成物之完整揭示內容以及說明提供給技藝中具有通常技術者，且不欲限制發明人就其發明所視為的範疇。已盡力確保所用數字(例如數量、溫度等)的正確性，但可能產生某些實驗誤差與偏差。除非另有指明，否則份為重量份，分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，而壓力為大氣壓或近乎大氣壓。
實施例1. 製造針對人類大-內皮素-1(大-ET-1)的人類抗體
直接對VELOCIMMUNE®小鼠(含有編碼人類免疫球蛋白重鏈與κ輕鏈可變區的DNA)投與包含人類大-ET-1多肽(SEQ ID NO：434)的免疫原與佐劑以刺激免疫反應。藉由大-ET-1-特異免疫分析監控抗體免疫反應。當達到所欲的免疫反應時，收取脾臟細胞並且與小鼠骨髓瘤細胞融合以保留其活力並形成融合瘤細胞株。篩選並挑選融合瘤細胞株而鑑定出會生產大-ET-1-特異性抗體的細胞株。使用此技術獲得數種抗-大-ET-1嵌合抗體(例如具有人類可變域及小鼠恆定域的抗體)；以此方式所製造的 例示性抗體命名如下：6486N、6490N、6492N、6494N、6495N、6741N、6490N2，及6492N2。
如US 2007/0280945A1中所述，亦在不融合至骨髓瘤細胞的情況下直接由抗原-陽性B細胞分離抗-大-ET-1抗體。使用此方法，獲得數種完整人類抗-大-ET-1抗體(亦即具有人類可變域與人類恆定域的抗體)；以此方式所製造的例示性抗體命名如下：6311P、6316P、6317P、6323P、6327P2、6328P、6329P、6330P、6332P、6334P、6335P、6337P、6338P、6340P、6343P、6345P、6347P，及6353P。
依據本實施例方法所製造的例示性抗-大-ET-1抗體的某些結構與功能特性詳細描述於下面的實施例中。
實施例2. 重鏈與輕鏈可變區胺基酸序列
表1顯示所選抗-大-ET-1抗體的重鏈與輕鏈可變區胺基酸序列及其對應抗體標識符號。
Figure TWI613215BD00001
Figure TWI613215BD00002
抗體在本文中通常以下列命名法來意指：Fc前綴(例如”H4H”、”H1M”、”H2M”)，接著是數字標識符號(例如表1中所示的”6311”)，然後為”P”或”N”字尾。因此，依據這個命名法，抗體在本文可參照為例如”H4H6311P”。本文中所用抗體命名的H4H、H1M及H2M前綴表示抗體的特定Fc區。例如，”H2M”抗體具有小鼠IgG2 Fc，而”H4H”抗體具有人類IgG4 Fc。如同技藝中具有通常技術者所理解，H1M或H2M抗體可轉換成H4H抗體，且反之亦然，但在任何情況下，可變域(包括CDR)-由表1中所示數字標識符號所指-維持相同。
實施例3. 表面電漿共振導出之人類單株抗-大-ET-1抗體的結合親和力與動力學常數
人類單株抗-大-ET-1抗體的結合親和力與動力學常數是藉由在37℃下使用mAb捕獲形式的表面電漿共振來測定(表2-3)。在T200 Biacore儀器(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare,Piscataway,NJ)上進行測量。Biacore感測器表面經衍生為兔抗-小鼠供融合瘤捕捉(前綴H1M或H2M)或小鼠抗-人類Fc表面供人類IgG形式抗體(前綴H4H)用。不同濃度的小-ET-1(SEQ ID NO：435)、人類大-ET-1(SEQ ID NO：434)或小鼠大-ET-1(SEQ ID NO：437)以100μl/分的流速被注射通過抗-大-ET-1捕捉表面。監測肽結合歷時3分鐘，同時在HBST運行緩衝液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005% v/v表面活性劑P20)中監測mAb-結合肽解離。動力學締合(ka)與解離(kd)速率常數是藉由使用Scrubber 2.0曲線擬合軟體處理並將數據擬合至1：1結合模型而被測定。結合解離平衡常數(KD)與解離半衰期(t1/2)是由如下的動力學速率常數計算：KD(M)=kd/ka；且t1/2(分)=(ln2/(60*kd)。結果顯示於表2與3中(NB=在測試條件下的非結合)。
Figure TWI613215BD00003
Figure TWI613215BD00004
Figure TWI613215BD00005
 NB：無結合；ND：未測定
如表2與3中所示，數個例示性抗體結合至人類大-ET-1(SEQ ID NO：434)以及小鼠大-ET-1(SEQ ID NO：437)兩者。但是，本實施例中所測試的多個例示性抗體表現優先結合至人類大-ET-1更甚於小鼠大-ET-1。舉例而言，在本實施例中所用的測試條件下，抗體H2M6490N、H1M6492N、H1M6494N、H2M6495N、H4H6311P、H4H6316P、H4H6317P、H4H6328P及H4H6335P個別證實結合至人類大-ET-1有高親和力，但未顯示任何結合至小鼠大-ET-1。抗體H2M6495N、H4H6328P及H4H6334P對人類大-ET-1個別表現非常高的結合親和力，KD值小於50pM。
值得注意的，本發明抗體中沒有一種結合人類小-ET-1(SEQ ID NO：435)。
實施例4. 本發明抗-大-ET-1抗體在活體外阻斷大-ET-1的ECE1-媒介裂解
為測定本發明的例示性抗-大-ET-1抗體能否阻斷小鼠及/或人類大-ET-1的內皮素-轉化酶-1(ECE-1)-媒介裂解，採用NFAT螢光素酶報導分析。簡言之，產生會穩定表現全長人類內皮素受體A型(ETaR) 與螢光素酶報導元件[NFAT(4X)-螢光素酶]的HEK293細胞株。分離單一純系並維持在10% FBS、DMEM、NEAA、Pen/Strep與500μg/ml G418與100μg/ml潮黴素B。
為決定抑制效力，將抗體(100nM至0.002nM)與10nM人類大-ET-1(SEQ ID NO：434)或20nM小鼠大-ET-1(SEQ ID NO：437)一起培育(1小時；25℃)，接著分別添加3nM人類ECE-1或5nM小鼠ECE-1。容許人類與小鼠大-ET-1阻斷實驗培育(37℃；5% CO2)過夜。次日早晨，將此等溶液添加至293/ETaR/NFAT-Luc細胞(20,000細胞/孔)，並在5.5小時(37℃；5% CO2)後使用Victor X盤讀取儀(Perkin Elmer)偵測螢光素酶活性。在此等條件下所觀察到的螢光素酶活性量是與由小鼠或人類大-ET-1裂解所產生的小-ET-1數量成比例呈現。(小-ET-1在小鼠與人類之間是相同的。)結果呈現於表4與5中(NB=在測試條件下非阻斷；NT=未測試)。
Figure TWI613215BD00006
Figure TWI613215BD00007
Figure TWI613215BD00008
如表4中所示，本發明的數個融合瘤抗體實質上抑制人類大-ET-1的ECE-1媒介裂解(IC50值<10nM)。另外，人類IgG4形式中的選定抗體展現出不僅阻斷人類大-ET-1裂解的能力(表5；欄2)，還有阻斷小鼠大-ET-1裂解的能力(表5；欄3)。
實施例5. 藉由MALDI-TOF評估大-ET-1裂解的抗體保護
使用基質輔助雷射脫附離子化-飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀來測定選定抗-大-ET-1抗體能否在小鼠內皮素轉化酶1(ECE-1)存在下阻斷人類大-ET-1(SEQ ID NO：434)或小鼠大-ET-1(SEQ ID NO：437)轉化成其個別肽。人類大-ET-1在Trp-21/Val-22處被mECE-1特異地裂解，形成生物活性的小-ET-1(SEQ ID NO：435；MH+2474)與非活性C端產物(SEQ ID NO：434的胺基酸22-38；MH+1809)。小鼠大-ET-1在Trp-21/Val-22處 被裂解成小-ET-1(SEQ ID NO：435；MH+2474)及其非活性C端產物(SEQ ID NO：437的胺基酸22-39；MH+1875)。在抗體存在下，出現或不出現此等片段可藉由MALDI-TOF來監測。在下面的實施例中，出現或不出現C端產物當作大-ET-1裂解的指標，因為此等肽比小-ET-1(SEQ ID NO：435；MH+2474)更有效地被離子化，從而產生更靈敏的讀值。
簡言之，將人類或小鼠大-ET-1(0.5μM)與抗體(2.5μM)在磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)中以1：5莫耳比(大-ET-1：mAb)混合。在1小時培育後(25℃)，以40nM添加小鼠ECE-1(R&D Systems)並將溶液放置在37℃下。在0、15、30與60分鐘時取出用於質譜儀分析的等分試樣。各等分試驗係經由C18 Ziptip(Millipore)去鹽並在飛行時間質譜-陽性模式下使用Bruker Ultraflextreme MALDI-TOF儀器(Bruker Daltonics)分析。
在抗體存在下由人類或小鼠大-ET-1裂解而來的C端產物偵測結果歸納於表6中。
Figure TWI613215BD00009
當抗體H2M6490N與人類大-ET-1以及人類ECE-1一起培育時，沒有偵測到C端產物(在表6中表示為”-“)。相反地，小鼠Fc對照抗體在小鼠ECE-1存在下未防止人類大-ET-1裂解，且因而在時間0以外的所有時間點鑑定出C端產物(在表6中表示為”+”)。抗體H4H6334P得 到類似的結果。但是就H4H6327P2而言，這個抗體在小鼠ECE-1存在下明顯可防止人類與小鼠大-ET-1兩者裂解，因為沒有偵測到C端產物。因此，這個實施例確認本發明抗-大-ET-1抗體(例如H2M6490N)在活體外能夠阻斷人類大-ET-1酶促轉化成小-ET-1的生物活性形式。
實施例6. 抗-大-ET-1抗體阻斷小-ET-1媒介的平均動脈血壓上升
本實施例之目的在於評估例示性抗-大-ET-1抗體(H2M6490N)阻斷小-ET-1-媒介的動脈壓上升的能力。先前已被輸注阻斷抗-大-ET-1抗體或同型對照的小鼠經大-ET-1肽刺激。測量因為大-ET-1內源性轉化為小-ET-1，或使其轉化受到循環抗-大-ET-1抗體所阻斷而產生的動脈壓變化。為有助於在此等實驗期間即時測量動脈壓，使用標準程序對小鼠進行導管處理。
簡言之，以異氟烷麻醉天然Taconic C57BL/6小鼠(8-10週大)並切開頸動脈與頸靜脈上的皮膚。分出右頸靜脈與左頸動脈，小心不要傷及迷走神經或其他血管。使用標準技術，取頸靜脈並以32號注射針(以90度角彎折)穿刺靜脈以插入充填食鹽水的頸靜脈導管。接著，分出左頸動脈並使用標準程序引入Millar Micro-Tip®導管。在所有程序進行期間，使用溫度探針來監控動物體溫，使用Gaymar熱水循環墊使動物體溫維持在約36.5℃。上述程序容許在所有大ET-1刺激實驗期間紀錄即時血壓測量值(收縮壓、舒張壓、平均動脈壓及體溫)。
在第一個研究中，使用頸靜脈埠靜脈內注射150μg(~2mg/kg；1 x 10-9莫耳)H2M6490N或同型對照mAb，接著團注食鹽水以沖洗導管。這造成血壓些微並暫時下降，其回復至基線並建立本實驗的T=0。抗體給與後的30分鐘，每15分鐘靜脈內注射人類大-ET-1肽(SEQ ID NO：434)直到平均動脈壓明顯地增加超過基線。結果歸納於表7中。
Figure TWI613215BD00010
表7證實將人類大-ET-1注射至已接受同型對照的小鼠體內反應平均動脈壓明顯增加，如同當大-ET-1被內源性裂解成生物活性小-ET-1肽(SEQ ID NO：435)所預期。相反地，接受例示性抗-大-ET-1阻斷抗體H2M6490N的小鼠維持基線平均動脈壓，直到人類大-ET-1肽之量達到相等莫耳的抗體。
在第二個實驗中，採用相同的實驗程序，除了在以人類大-ET-1肽刺激前24小時將H2M6490N(~2mg/kg；1 x 10-9莫耳)皮下(s.c.)注射至小鼠體內。第二個實驗的結果歸納於表8中。
Figure TWI613215BD00011
Figure TWI613215BD00012
如表8中所示，當在皮下抗體給與後24小時以大-ET-1刺激小鼠所得結果類似於當在靜脈內抗體給與後30分鐘以大-ET-1刺激小鼠所觀察到的結果(表7)相似。在兩種實驗條件下，以抗-大-ET-1抗體H2M6490N預輸注的小鼠比起以同型對照抗體處理的小鼠維持更久的正常動脈壓。
因此，此等研究顯示，投與H2M6490N在活體內有效抑制內皮素-1媒介動脈壓升高。在以人類大-ET-1刺激前30分鐘或24小時投與抗體相比於對照明顯降低動脈壓反應。
實施例7. 以抗大-ET-1抗體阻斷/預防缺氧誘發肺高壓
在本實施例中，評估抗-大-ET-1抗體H4H6327P2在小鼠體內阻斷缺氧誘發肺高壓的能力。相較於維持在常氧條件下的對照動物，在缺氧狀態之前與期間將處理(抗-大-ET-1抗體H4H6327P2或波生坦)或對照(抗體載劑(50：50 PEG 400(v/v))或同型對照抗體)劑投與給動物並使用超音波影像與測量心室壓力及心臟肥大來評估。
評估材料與方法
使用下列程序取得超音波測量值。將小鼠麻醉，以仰位放置在加熱平台(THM 100,Indus Instruments)上並使用Vevo 2100超音波系統(VisualSonics)進行肺漏斗(B模式與M模式)的2D成像。在主動脈瓣位置處從胸骨旁短軸切面取得影像。在掃描頭對準最大層流後，於肺瓣膜處小葉頂端處取得脈衝波都卜勒測量值。另外，在短軸B模式成像平面處取得右心室的M模式紀錄以獲得整個心搏週期的右心室游離壁動力學。
超音波數據分析係以盲化的方式來分析下列參數：舒張與 收縮右心室游離壁厚度(RVFW，短軸M模式)、收縮末期時的肺動脈直徑(短軸B模式)，以及肺動脈流(PA流，PW都卜勒)。由這些測量值，計算出肺流的時間-速度積分、肺動脈截面積(PA CSA)以及右心室心搏出量(RV CO)。針對各治療組於各時間點的測量值計算平均值以及平均值的標準誤差。所有測量值是以3個心搏週期來進行平均。使用下列程序紀錄21天缺氧時的右心室壓：將小鼠麻醉，以仰位放置在加熱平台(以Gaymar加熱泵加熱的水套墊)上並切開右頸總動脈，且將右頸靜脈分出右頸，小心不要傷及頸動脈及/或迷走神經。將一段5-0絲縫線放在分出的頸靜脈下以從頸骨取得血管，接著使用30號注射針引入一個孔洞而插入至頸靜脈的遠段。將高逼真度壓力導管(SPR-1000,Mikro-Tip®,Millar Instruments,Inc.)引入頸靜脈並進一步通過右心房而進入右心室(RV)。導管可記錄心率以及舒張壓和收縮壓。以數位的方式使用PowerLab 4/35控制端(ADInstruments)取得數據。
使用LabChart Pro軟體(ADInstruments)以約60秒間隔的壓力追蹤(接著為2分鐘期間的紀錄以容許壓力穩定)進行右心室收縮壓分析。所分析的參數為RV舒張壓及收縮壓、心率與動物體溫。所報導的RV收縮壓係最小收縮壓與最大收縮壓的差異(因為起始基線RV壓力值有異)。
完成RV收縮壓測量後，將麻醉動物安樂死且打開胸腔切下心臟。小心將RV從左心室及中膈(LV+S)切開。使用微量天平將心臟的兩個部分個別稱重，以估算RV肥大的程度[RV/(LV+S)；右心指數(Fulton Index)]。
實驗步驟
肺高壓是使用經修飾的腔室(Biospherix,Ltd.)所引起，其容許對動物進行操作及給藥，同時維持常壓缺氧氛圍(10% O2)。將C57BL/6雄性小鼠(10-11週大)稱重並在如表9中所列23天的排程內連續給藥。波生坦與載劑係經口(PO)投與；抗-大-ET-1抗體H4H6327P2與同型對照抗體是皮下(SC)投與。在這個研究期間兩組間的體重一致。波生坦，內皮素受體-A與-B的一種口服活性非-選擇性拮抗劑，被用作為陽性對照，而載劑[50：50PEG 400(v/v)]與不相干同型相符抗體充作陰性對照。所有程序是受到Regeneron機構動物照顧與使用委員會(IACUC)所核可。
Figure TWI613215BD00013
進行非侵入性超音波掃描以決定在缺氧第18天的肺動脈截面積(PA CSA)、右心室心搏出量(RV CO)與右心室游離壁厚度 (RVFW)。使用高逼真度壓力導管(Mikro-Tip®,Millar Instruments)取得右心室中的右心室舒張壓與收縮壓；另外，在缺氧21天時測量右心室肥大測定(亦即，右心室對左心室+中膈的重量比；右心指數)。
結果
在小鼠體內使用抗-大-ET-1抗體H4H6327P2治療會減弱缺氧誘發的肺高壓發展。相對於經同型對照治療的小鼠，經抗體治療的動物在所測量之PA CSA展現出明顯(P≦0.001)較小的降低(第1圖)，表示因為暴露於長期缺氧所引起的血管收縮較少及/或肺動脈重塑減少。波生坦，已知在齧齒動物中會降低與缺氧所引起之肺高壓有關的症狀，顯示維持基線PA CSA的能力同樣降低。相較於經載劑治療的組別，經波生坦治療的動物顯示RV CO的保護較高(第2圖)。相較於經波生坦治療以及經同型治療的組別，以抗-大-ET-1抗體治療的動物顯示在統計學上RV CO的保護較高(P≦0.05)。另外，以抗-大-ET-1抗體治療的動物顯示明顯較小的RV肥大，如同藉由超音波(RVFW)以及右心指數測量所確認(第3圖)。此外，相對於同型對照，藉由在經抗-大-ET-1抗體治療的小鼠中心臟明顯較薄的右心室壁證明RV肥大降低(第4圖)。
結論
因此，本研究證實，本發明的抗-大-ET-1抗體能有效減弱與缺氧引發之肺高壓相關之症狀並在某些評估指標上勝過基準分子波生坦。
實施例8.以抗-大-ET-1抗體治療缺氧誘發的肺高壓
在本實施例中，評估抗-大-ET-1抗體H4H6327P2在小鼠 體內治療缺氧誘發之肺高壓的能力。將實驗組動物進行缺氧歷時21天(第1-21天)並在第14天起給與H4H6327P2、波生坦或對照同型抗體。在第21天，使用超音波影像與測量心室壓力與心臟肥大來評估動物(參見實施例7中的評估材料與方法)並且與對照動物相比較(維持在常氧狀態下、缺氧歷時14天，或缺氧歷時14天接著常氧歷時7天)。
實驗程序
透過暴露於常壓缺氧氛圍(10% O2)經由修飾腔室(Biospherix,Ltd.)誘發肺高壓。將C57BL/6雄性小鼠(10-11週大)稱重並在如表10中所列21天的排程內治療或治療與給藥。波生坦係經口(PO)投與；抗-大-ET-1抗體H4H6327P2與同型對照抗體是皮下(SC)投與。在這個研究期間組間的體重一致。波生坦，內皮素受體-A與-B的一種口服活性非-選擇性拮抗劑，被用作為陽性對照，而不相干同型相符抗體充作陰性對照。所有程序是受到Regeneron機構動物照顧與使用委員會(IACUC)所核可。
Figure TWI613215BD00014
Figure TWI613215BD00015
進行非侵入性超音波掃描以決定在缺氧第21天的肺動脈截面積(PA CSA)、右心室心搏出量(RV CO)與右心室游離壁厚度(RVFW)。使用高逼真度壓力導管(Mikro-Tip®,Millar Instruments)取得右心室中的右心室舒張壓與收縮壓；另外，在缺氧21天時測量右心室肥大測定(亦即，右心室對左心室+中膈的重量比；右心指數)。
結果
使用H4H6327P2或波生坦治療減弱遠端肺動脈收縮與重塑，包括血管收縮和通常與缺氧誘發之PH有關的血管平滑肌細胞增生較少。相對於未經治療或同型對照組，使用抗-大-ET-1抗體H4H6327P2治療明顯降低長期缺氧誘發的小動脈壁增厚(第5圖)。使用H4H6327P2與波生坦治療也減少管腔直徑流失，如藉由保護肺動脈截面積(PA CSA)所證實(第6圖)，並且減弱右心室游離壁(RVFW)增厚(第7圖)。抗-大-ET-1抗體治療也維持右心室心搏出量(RVCO)，其通常因為肺動脈血管阻力升高而在肺高壓中降低，儘管比波生坦達到一個較少的程度(第9圖)。然而，抗-大-ET-1抗體治療不會明顯降低右心室肥大，這是一種為了要維持到肺動脈之血流而產生的補償機制(第8圖)或右心室收縮壓(RSVP)(第10圖)，兩者皆與血管阻力因為肺高壓而增加有關。
結論
因此，本研究證實，本發明的抗-大-ET-1抗體顯示在減輕肺高壓誘發的血管分布重塑方面有最大效力，與波生坦成比例，而波生坦 治療顯示在回復心臟功能的測量值上有較大的效用。
實施例9：以投與抗-大ET-1抗體降低痛覺反應行為
在本實施例中，評估抗-大-ET-1抗體H4H6327P2在小鼠體內阻斷大-ET-1誘發之對疼痛的防禦性反應的能力。H4H6327P2阻斷內皮素轉化酶(ECE)媒介大ET-1裂解成21個胺基酸的生物活性ET-1。在動物體內外源性投與ET-1已被紀錄會引起與明顯疼痛有關的行為(痛覺)，諸如腹部扭曲、退縮、刺痛或火燒。
實驗程序
在本研究中，將12週大的C57BL/6雄性小鼠分成三個實驗組：一個對照組(n=6)，接受30mg/kg的非大-ET-1結合同型對照抗體(同型)；一個低劑量組(n=7)，接受3mg/kg的抗大-ET-1抗體H4H6327P2；以及一個高劑量組(n=7)，接受30mg/kg的H4H6327P2。所有抗體係皮下投與。抗體給與後約48小時，所有小鼠接受2μg(0.2mg/ml)的大hET-1肽(其溶於磷酸鹽緩衝食鹽水中)注射至右後掌的蹠側。將小鼠立刻放入乾淨的圓筒中並在注射後錄影紀錄牠們的痛覺行為歷時60分鐘。對於組別身分為盲化的研究人員在整個60分鐘測試期間紀錄右後掌舔舐/啃咬行為總數。數據報導為組別平均值±SEM(第11圖)。
結果及結論
以H4H6327P2預處理在整個60分鐘測試期明顯降低大-hET-1肽誘發的痛覺行為(p=0.0173，依照重複測量ANOVA)。僅在30mg/kg的劑量組中觀察到劑量依賴性效用(p<0.05，圖凱(Tukey))。這個實 施例說明投與抗-大-ET-1抗體可藉由防止形成ET-1副產物與之後的受體活化來減輕與疼痛有關的行為。
本發明就範圍來說並不受到此處所述的特定具體例囿限。更確切地說，除了此處所述者以外，本發明的各種修飾對於那些習於技藝者來說由前面說明與隨附圖式來說是清楚的。此等修飾意欲落在隨附申請專利範圍的範疇內。
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
Figure TWI613215BD00048
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
Figure TWI613215BD00049
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
Figure TWI613215BD00050
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
Figure TWI613215BD00051
<210> 33
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
Figure TWI613215BD00052
<210> 34
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
Figure TWI613215BD00053
Figure TWI613215BD00054
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
Figure TWI613215BD00055
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
Figure TWI613215BD00056
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
Figure TWI613215BD00057
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
Figure TWI613215BD00058
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
Figure TWI613215BD00059
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Figure TWI613215BD00060
<210> 41
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
Figure TWI613215BD00061
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
Figure TWI613215BD00062
Figure TWI613215BD00063
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
Figure TWI613215BD00064
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
Figure TWI613215BD00065
<210> 45
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
Figure TWI613215BD00066
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
Figure TWI613215BD00067
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
Figure TWI613215BD00068
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
Figure TWI613215BD00069
<210> 49
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
Figure TWI613215BD00070
<210> 50
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
Figure TWI613215BD00071
Figure TWI613215BD00072
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
Figure TWI613215BD00073
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
Figure TWI613215BD00074
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
Figure TWI613215BD00075
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
Figure TWI613215BD00076
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
Figure TWI613215BD00077
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
Figure TWI613215BD00078
<210> 57
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
Figure TWI613215BD00079
<210> 58
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
Figure TWI613215BD00080
Figure TWI613215BD00081
<210> 59
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
Figure TWI613215BD00082
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
Figure TWI613215BD00083
<210> 61
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
Figure TWI613215BD00084
<210> 62
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
Figure TWI613215BD00085
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
Figure TWI613215BD00086
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
Figure TWI613215BD00087
<210> 65
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
Figure TWI613215BD00088
<210> 66
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
Figure TWI613215BD00089
Figure TWI613215BD00090
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
Figure TWI613215BD00091
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
Figure TWI613215BD00092
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
Figure TWI613215BD00093
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
Figure TWI613215BD00094
<210> 71
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
Figure TWI613215BD00095
<210> 72
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
Figure TWI613215BD00096
<210> 73
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
Figure TWI613215BD00097
<210> 74
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
Figure TWI613215BD00098
Figure TWI613215BD00099
<210> 75
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
Figure TWI613215BD00100
<210> 76
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
Figure TWI613215BD00101
<210> 77
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
Figure TWI613215BD00102
<210> 78
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
Figure TWI613215BD00103
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
Figure TWI613215BD00104
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
Figure TWI613215BD00105
<210> 81
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
Figure TWI613215BD00106
<210> 82
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
Figure TWI613215BD00107
Figure TWI613215BD00108
<210> 83
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
Figure TWI613215BD00109
<210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
Figure TWI613215BD00110
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
Figure TWI613215BD00111
<210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
Figure TWI613215BD00112
Figure TWI613215BD00113
<210> 87
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
Figure TWI613215BD00114
<210> 88
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
Figure TWI613215BD00115
<210> 89
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
Figure TWI613215BD00116
<210> 90
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
Figure TWI613215BD00117
Figure TWI613215BD00118
<210> 91
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 91
Figure TWI613215BD00119
<210> 92
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 92
Figure TWI613215BD00120
<210> 93
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 93
Figure TWI613215BD00121
<210> 94
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 94
Figure TWI613215BD00122
<210> 95
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 95
Figure TWI613215BD00123
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 96
Figure TWI613215BD00124
<210> 97
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 97
Figure TWI613215BD00125
<210> 98
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
Figure TWI613215BD00126
Figure TWI613215BD00127
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 99
Figure TWI613215BD00128
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 100
Figure TWI613215BD00129
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 101
Figure TWI613215BD00130
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 102
Figure TWI613215BD00131
Figure TWI613215BD00132
<210> 103
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 103
Figure TWI613215BD00133
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
Figure TWI613215BD00134
<210> 105
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 105
Figure TWI613215BD00135
<210> 106
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
Figure TWI613215BD00136
Figure TWI613215BD00137
<210> 107
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 107
Figure TWI613215BD00138
<210> 108
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 108
Figure TWI613215BD00139
<210> 109
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 109
Figure TWI613215BD00140
<210> 110
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 110
Figure TWI613215BD00141
<210> 111
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 111
Figure TWI613215BD00142
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 112
Figure TWI613215BD00143
<210> 113
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 113
Figure TWI613215BD00144
<210> 114
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 114
Figure TWI613215BD00145
Figure TWI613215BD00146
<210> 115
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 115
Figure TWI613215BD00147
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 116
Figure TWI613215BD00148
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 117
Figure TWI613215BD00149
<210> 118
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 118
Figure TWI613215BD00150
Figure TWI613215BD00151
<210> 119
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 119
Figure TWI613215BD00152
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 120
Figure TWI613215BD00153
<210> 121
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 121
Figure TWI613215BD00154
<210> 122
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 122
Figure TWI613215BD00155
Figure TWI613215BD00156
<210> 123
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 123
Figure TWI613215BD00157
<210> 124
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 124
Figure TWI613215BD00158
<210> 125
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 125
Figure TWI613215BD00159
<210> 126
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 126
Figure TWI613215BD00160
<210> 127
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 127
Figure TWI613215BD00161
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 128
Figure TWI613215BD00162
<210> 129
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 129
Figure TWI613215BD00163
<210> 130
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 130
Figure TWI613215BD00164
Figure TWI613215BD00165
<210> 131
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 131
Figure TWI613215BD00166
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 132
Figure TWI613215BD00167
<210> 133
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 133
Figure TWI613215BD00168
<210> 134
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 134
Figure TWI613215BD00169
Figure TWI613215BD00170
<210> 135
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 135
Figure TWI613215BD00171
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 136
Figure TWI613215BD00172
<210> 137
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 137
Figure TWI613215BD00173
<210> 138
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 138
Figure TWI613215BD00174
Figure TWI613215BD00175
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 139
Figure TWI613215BD00176
<210> 140
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 140
Figure TWI613215BD00177
<210> 141
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 141
Figure TWI613215BD00178
<210> 142
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 142
Figure TWI613215BD00179
<210> 143
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 143
Figure TWI613215BD00180
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 144
Figure TWI613215BD00181
<210> 145
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 145
Figure TWI613215BD00182
<210> 146
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 146
Figure TWI613215BD00183
Figure TWI613215BD00184
<210> 147
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 147
Figure TWI613215BD00185
<210> 148
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 148
Figure TWI613215BD00186
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 149
Figure TWI613215BD00187
<210> 150
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 150
Figure TWI613215BD00188
Figure TWI613215BD00189
<210> 151
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 151
Figure TWI613215BD00190
<210> 152
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 152
Figure TWI613215BD00191
<210> 153
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 153
Figure TWI613215BD00192
<210> 154
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 154
Figure TWI613215BD00193
Figure TWI613215BD00194
<210> 155
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 155
Figure TWI613215BD00195
<210> 156
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 156
Figure TWI613215BD00196
<210> 157
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 157
Figure TWI613215BD00197
<210> 158
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 158
Figure TWI613215BD00198
<210> 159
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 159
Figure TWI613215BD00199
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 160
Figure TWI613215BD00200
<210> 161
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 161
Figure TWI613215BD00201
<210> 162
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 162
Figure TWI613215BD00202
Figure TWI613215BD00203
<210> 163
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 163
Figure TWI613215BD00204
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 164
Figure TWI613215BD00205
<210> 165
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 165
Figure TWI613215BD00206
<210> 166
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 166
Figure TWI613215BD00207
Figure TWI613215BD00208
<210> 167
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 167
Figure TWI613215BD00209
<210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 168
Figure TWI613215BD00210
<210> 169
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 169
Figure TWI613215BD00211
<210> 170
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 170
Figure TWI613215BD00212
Figure TWI613215BD00213
<210> 171
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 171
Figure TWI613215BD00214
<210> 172
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 172
Figure TWI613215BD00215
<210> 173
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 173
Figure TWI613215BD00216
<210> 174
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 174
Figure TWI613215BD00217
<210> 175
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 175
Figure TWI613215BD00218
<210> 176
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 176
Figure TWI613215BD00219
<210> 177
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 177
Figure TWI613215BD00220
<210> 178
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 178
Figure TWI613215BD00221
Figure TWI613215BD00222
<210> 179
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 179
Figure TWI613215BD00223
<210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 180
Figure TWI613215BD00224
<210> 181
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 181
Figure TWI613215BD00225
<210> 182
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 182
Figure TWI613215BD00226
<210> 183
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 183
Figure TWI613215BD00227
<210> 184
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 184
Figure TWI613215BD00228
<210> 185
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 185
Figure TWI613215BD00229
<210> 186
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 186
Figure TWI613215BD00230
Figure TWI613215BD00231
<210> 187
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 187
Figure TWI613215BD00232
<210> 188
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 188
Figure TWI613215BD00233
<210> 189
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 189
Figure TWI613215BD00234
<210> 190
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 190
Figure TWI613215BD00235
Figure TWI613215BD00236
<210> 191
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 191
Figure TWI613215BD00237
<210> 192
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 192
Figure TWI613215BD00238
<210> 193
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 193
Figure TWI613215BD00239
<210> 194
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 194
Figure TWI613215BD00240
Figure TWI613215BD00241
<210> 195
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 195
Figure TWI613215BD00242
<210> 196
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 196
Figure TWI613215BD00243
<210> 197
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 197
Figure TWI613215BD00244
<210> 198
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 198
Figure TWI613215BD00245
<210> 199
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 199
Figure TWI613215BD00246
<210> 200
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 200
Figure TWI613215BD00247
<210> 201
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 201
Figure TWI613215BD00248
<210> 202
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 202
Figure TWI613215BD00249
Figure TWI613215BD00250
<210> 203
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 203
Figure TWI613215BD00251
<210> 204
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 204
Figure TWI613215BD00252
<210> 205
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 205
Figure TWI613215BD00253
<210> 206
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 206
Figure TWI613215BD00254
<210> 207
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 207
Figure TWI613215BD00255
<210> 208
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 208
Figure TWI613215BD00256
<210> 209
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 209
Figure TWI613215BD00257
<210> 210
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 210
Figure TWI613215BD00258
Figure TWI613215BD00259
<210> 211
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 211
Figure TWI613215BD00260
<210> 212
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 212
Figure TWI613215BD00261
<210> 213
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 213
Figure TWI613215BD00262
<210> 214
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 214
Figure TWI613215BD00263
<210> 215
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 215
Figure TWI613215BD00264
<210> 216
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 216
Figure TWI613215BD00265
<210> 217
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 217
Figure TWI613215BD00266
<210> 218
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 218
Figure TWI613215BD00267
Figure TWI613215BD00268
<210> 219
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 219
Figure TWI613215BD00269
<210> 220
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 220
Figure TWI613215BD00270
<210> 221
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 221
Figure TWI613215BD00271
<210> 222
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 222
Figure TWI613215BD00272
<210> 223
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 223
Figure TWI613215BD00273
<210> 224
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 224
Figure TWI613215BD00274
<210> 225
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 225
Figure TWI613215BD00275
<210> 226
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 226
Figure TWI613215BD00276
Figure TWI613215BD00277
<210> 227
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 227
Figure TWI613215BD00278
<210> 228
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 228
Figure TWI613215BD00279
<210> 229
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 229
Figure TWI613215BD00280
<210> 230
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 230
Figure TWI613215BD00281
<210> 231
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 231
Figure TWI613215BD00282
<210> 232
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 232
Figure TWI613215BD00283
<210> 233
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 233
Figure TWI613215BD00284
<210> 234
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 234
Figure TWI613215BD00285
Figure TWI613215BD00286
<210> 235
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 235
Figure TWI613215BD00287
<210> 236
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 236
Figure TWI613215BD00288
<210> 237
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 237
Figure TWI613215BD00289
<210> 238
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 238
Figure TWI613215BD00290
<210> 239
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 239
Figure TWI613215BD00291
<210> 240
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 240
Figure TWI613215BD00292
<210> 241
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 241
Figure TWI613215BD00293
<210> 242
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 242
Figure TWI613215BD00294
Figure TWI613215BD00295
<210> 243
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 243
Figure TWI613215BD00296
<210> 244
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 244
Figure TWI613215BD00297
<210> 245
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 245
Figure TWI613215BD00298
<210> 246
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 246
Figure TWI613215BD00299
<210> 247
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 247
Figure TWI613215BD00300
<210> 248
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 248
Figure TWI613215BD00301
<210> 249
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 249
Figure TWI613215BD00302
<210> 250
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 250
Figure TWI613215BD00303
Figure TWI613215BD00304
<210> 251
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 251
Figure TWI613215BD00305
<210> 252
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 252
Figure TWI613215BD00306
<210> 253
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 253
Figure TWI613215BD00307
<210> 254
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 254
Figure TWI613215BD00308
<210> 255
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 255
Figure TWI613215BD00309
<210> 256
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 256
Figure TWI613215BD00310
<210> 257
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 257
Figure TWI613215BD00311
<210> 258
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 258
Figure TWI613215BD00312
Figure TWI613215BD00313
<210> 259
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 259
Figure TWI613215BD00314
<210> 260
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 260
Figure TWI613215BD00315
<210> 261
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 261
Figure TWI613215BD00316
<210> 262
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 262
Figure TWI613215BD00317
<210> 263
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 263
Figure TWI613215BD00318
<210> 264
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 264
Figure TWI613215BD00319
<210> 265
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 265
Figure TWI613215BD00320
<210> 266
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 266
Figure TWI613215BD00321
Figure TWI613215BD00322
<210> 267
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 267
Figure TWI613215BD00323
<210> 268
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 268
Figure TWI613215BD00324
<210> 269
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 269
Figure TWI613215BD00325
<210> 270
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 270
Figure TWI613215BD00326
<210> 271
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 271
Figure TWI613215BD00327
<210> 272
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 272
Figure TWI613215BD00328
<210> 273
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 273
Figure TWI613215BD00329
<210> 274
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 274
Figure TWI613215BD00330
Figure TWI613215BD00331
<210> 275
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 275
Figure TWI613215BD00332
<210> 276
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 276
Figure TWI613215BD00333
<210> 277
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 277
Figure TWI613215BD00334
<210> 278
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 278
Figure TWI613215BD00335
<210> 279
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 279
Figure TWI613215BD00336
<210> 280
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 280
Figure TWI613215BD00337
<210> 281
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 281
Figure TWI613215BD00338
<210> 282
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 282
Figure TWI613215BD00339
Figure TWI613215BD00340
<210> 283
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 283
Figure TWI613215BD00341
<210> 284
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 284
Figure TWI613215BD00342
<210> 285
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 285
Figure TWI613215BD00343
<210> 286
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 286
Figure TWI613215BD00344
<210> 287
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 287
Figure TWI613215BD00345
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 288
Figure TWI613215BD00346
<210> 289
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 289
Figure TWI613215BD00347
<210> 290
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 290
Figure TWI613215BD00348
Figure TWI613215BD00349
<210> 291
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 291
Figure TWI613215BD00350
<210> 292
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 292
Figure TWI613215BD00351
<210> 293
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 293
Figure TWI613215BD00352
<210> 294
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 294
Figure TWI613215BD00353
<210> 295
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 295
Figure TWI613215BD00354
<210> 296
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 296
Figure TWI613215BD00355
<210> 297
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 297
Figure TWI613215BD00356
<210> 298
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 298
Figure TWI613215BD00357
Figure TWI613215BD00358
<210> 299
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 299
Figure TWI613215BD00359
<210> 300
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 300
Figure TWI613215BD00360
<210> 301
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 301
Figure TWI613215BD00361
<210> 302
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 302
Figure TWI613215BD00362
<210> 303
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 303
Figure TWI613215BD00363
<210> 304
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 304
Figure TWI613215BD00364
<210> 305
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 305
Figure TWI613215BD00365
<210> 306
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 306
Figure TWI613215BD00366
Figure TWI613215BD00367
<210> 307
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 307
Figure TWI613215BD00368
<210> 308
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 308
Figure TWI613215BD00369
<210> 309
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 309
Figure TWI613215BD00370
<210> 310
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 310
Figure TWI613215BD00371
<210> 311
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 311
Figure TWI613215BD00372
<210> 312
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 312
Figure TWI613215BD00373
<210> 313
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 313
Figure TWI613215BD00374
<210> 314
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 314
Figure TWI613215BD00375
Figure TWI613215BD00376
<210> 315
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 315
Figure TWI613215BD00377
<210> 316
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 316
Figure TWI613215BD00378
<210> 317
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 317
Figure TWI613215BD00379
<210> 318
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 318
Figure TWI613215BD00380
<210> 319
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 319
Figure TWI613215BD00381
<210> 320
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 320
Figure TWI613215BD00382
<210> 321
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 321
Figure TWI613215BD00383
<210> 322
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 322
Figure TWI613215BD00384
Figure TWI613215BD00385
<210> 323
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 323
Figure TWI613215BD00386
<210> 324
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 324
Figure TWI613215BD00387
<210> 325
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 325
Figure TWI613215BD00388
<210> 326
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 326
Figure TWI613215BD00389
<210> 327
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 327
Figure TWI613215BD00390
<210> 328
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 328
Figure TWI613215BD00391
<210> 329
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 329
Figure TWI613215BD00392
<210> 330
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 330
Figure TWI613215BD00393
Figure TWI613215BD00394
<210> 331
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 331
Figure TWI613215BD00395
<210> 332
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 332
Figure TWI613215BD00396
<210> 333
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 333
Figure TWI613215BD00397
<210> 334
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 334
Figure TWI613215BD00398
<210> 335
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 335
Figure TWI613215BD00399
<210> 336
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 336
Figure TWI613215BD00400
<210> 337
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 337
Figure TWI613215BD00401
<210> 338
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 338
Figure TWI613215BD00402
Figure TWI613215BD00403
<210> 339
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 339
Figure TWI613215BD00404
<210> 340
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 340
Figure TWI613215BD00405
<210> 341
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 341
Figure TWI613215BD00406
<210> 342
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 342
Figure TWI613215BD00407
<210> 343
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 343
Figure TWI613215BD00408
<210> 344
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 344
Figure TWI613215BD00409
<210> 345
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 345
Figure TWI613215BD00410
<210> 346
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 346
Figure TWI613215BD00411
Figure TWI613215BD00412
<210> 347
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 347
Figure TWI613215BD00413
<210> 348
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 348
Figure TWI613215BD00414
<210> 349
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 349
Figure TWI613215BD00415
<210> 350
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 350
Figure TWI613215BD00416
<210> 351
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 351
Figure TWI613215BD00417
<210> 352
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 352
Figure TWI613215BD00418
<210> 353
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 353
Figure TWI613215BD00419
<210> 354
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 354
Figure TWI613215BD00420
Figure TWI613215BD00421
<210> 355
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 355
Figure TWI613215BD00422
<210> 356
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 356
Figure TWI613215BD00423
<210> 357
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 357
Figure TWI613215BD00424
<210> 358
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 358
Figure TWI613215BD00425
<210> 359
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 359
Figure TWI613215BD00426
<210> 360
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 360
Figure TWI613215BD00427
<210> 361
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 361
Figure TWI613215BD00428
<210> 362
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 362
Figure TWI613215BD00429
Figure TWI613215BD00430
<210> 363
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 363
Figure TWI613215BD00431
<210> 364
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 364
Figure TWI613215BD00432
<210> 365
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 365
Figure TWI613215BD00433
<210> 366
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 366
Figure TWI613215BD00434
<210> 367
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 367
Figure TWI613215BD00435
<210> 368
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 368
Figure TWI613215BD00436
<210> 369
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 369
Figure TWI613215BD00437
<210> 370
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 370
Figure TWI613215BD00438
Figure TWI613215BD00439
<210> 371
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 371
Figure TWI613215BD00440
<210> 372
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 372
Figure TWI613215BD00441
<210> 373
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 373
Figure TWI613215BD00442
<210> 374
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 374
Figure TWI613215BD00443
<210> 375
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 375
Figure TWI613215BD00444
<210> 376
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 376
Figure TWI613215BD00445
<210> 377
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 377
Figure TWI613215BD00446
<210> 378
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 378
Figure TWI613215BD00447
Figure TWI613215BD00448
<210> 379
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 379
Figure TWI613215BD00449
<210> 380
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 380
Figure TWI613215BD00450
<210> 381
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 381
Figure TWI613215BD00451
<210> 382
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 382
Figure TWI613215BD00452
<210> 383
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 383
Figure TWI613215BD00453
<210> 384
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 384
Figure TWI613215BD00454
<210> 385
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 385
Figure TWI613215BD00455
<210> 386
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 386
Figure TWI613215BD00456
Figure TWI613215BD00457
<210> 387
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 387
Figure TWI613215BD00458
<210> 388
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 388
Figure TWI613215BD00459
<210> 389
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 389
Figure TWI613215BD00460
<210> 390
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 390
Figure TWI613215BD00461
<210> 391
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 391
Figure TWI613215BD00462
<210> 392
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 392
Figure TWI613215BD00463
<210> 393
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 393
Figure TWI613215BD00464
<210> 394
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 394
Figure TWI613215BD00465
Figure TWI613215BD00466
<210> 395
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 395
Figure TWI613215BD00467
<210> 396
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 396
Figure TWI613215BD00468
<210> 397
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 397
Figure TWI613215BD00469
<210> 398
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 398
Figure TWI613215BD00470
<210> 399
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 399
Figure TWI613215BD00471
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 400
Figure TWI613215BD00472
<210> 401
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 401
Figure TWI613215BD00473
<210> 402
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 402
Figure TWI613215BD00474
Figure TWI613215BD00475
<210> 403
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 403
Figure TWI613215BD00476
<210> 404
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 404
Figure TWI613215BD00477
<210> 405
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 405
Figure TWI613215BD00478
<210> 406
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 406
Figure TWI613215BD00479
<210> 407
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 407
Figure TWI613215BD00480
<210> 408
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 408
Figure TWI613215BD00481
<210> 409
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 409
Figure TWI613215BD00482
<210> 410
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 410
Figure TWI613215BD00483
Figure TWI613215BD00484
<210> 411
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 411
Figure TWI613215BD00485
<210> 412
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 412
Figure TWI613215BD00486
<210> 413
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 413
Figure TWI613215BD00487
<210> 414
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 414
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<210> 415
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 415
Figure TWI613215BD00489
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 416
Figure TWI613215BD00490
<210> 417
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 417
Figure TWI613215BD00491
<210> 418
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 418
Figure TWI613215BD00492
Figure TWI613215BD00493
<210> 419
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 419
Figure TWI613215BD00494
<210> 420
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 420
Figure TWI613215BD00495
<210> 421
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 421
Figure TWI613215BD00496
<210> 422
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 422
Figure TWI613215BD00497
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 423
Figure TWI613215BD00498
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 424
Figure TWI613215BD00499
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Figure TWI613215BD00500
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 426
Figure TWI613215BD00501
Figure TWI613215BD00502
<210> 427
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<212> DNA
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<220>
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<400> 427
Figure TWI613215BD00503
<210> 428
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 428
Figure TWI613215BD00504
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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Figure TWI613215BD00505
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Figure TWI613215BD00506
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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Figure TWI613215BD00507
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Figure TWI613215BD00508
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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Figure TWI613215BD00512
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<212> PRT
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<210> 437
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<212> PRT
<213> 人類
<400> 437
Figure TWI613215BD00516

Claims (15)

  1. 一種分離抗體或其抗原-結合片段，其特異性地結合人類大-ET-1(SEQ ID NO：434)，且不結合小-ET-1(SEQ ID NO：435)，其中該抗體或其抗原-結合片段阻斷大-ET-1因為內皮素-轉化酶-1(ECE-1)之裂解且包含選自下列SEQ ID NO所組成之群之重鏈可變區(HCVR)/輕鏈可變區(LCVR)胺基酸序列對的互補決定區(CDR)：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、146/154、162/170、194/202、210/218、226/234、242/250、274/282、290/298、322/330、338/346、370/378及386/394。
  2. 如申請專利範圍第1項之分離抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或其抗原-結合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，各別選自由下列SEQ ID NO所組成之群：4-6-8-12-14-16、20-22-24-28-30-32、36-38-40-44-46-48、52-54-56-60-62-64、68-70-72-76-78-80、148-150-152-156-158-160、164-166-168-172-174-176、196-198-200-204-206-208、212-214-216-220-222-224、228-230-232-236-238-240、244-246-248-252-254-256、276-278-280-284-286-288、292-294-296-300-302-304、324-326-328-332-334-336、340-342-344-348-350-352、372-374-376-380-382-384及388-390-392-396-398-400。
  3. 如申請專利範圍第2項之分離抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或其抗原-結合片段包含選自下列SEQ ID NO所組成之群之 HCVR/LCVR胺基酸序列對：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、146/154、162/170、194/202、210/218、226/234、242/250、274/282、290/298、322/330、338/346、370/378及386/394。
  4. 請專利範圍第3項之分離抗體或抗原-結合片段，其中該抗體或其抗原-結合片段包含SEQ ID NO：242/250之HCVR/LCVR胺基酸序列對。
  5. 一種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第1、2、3或4項之抗體或抗原-結合片段以及醫藥上可接受載劑或稀釋劑。
  6. 一種如申請專利範圍第5項之醫藥組成物用於製造治療、預防或減輕選自由下列組成之群的疾病或病症的藥物之用途：肺高壓、腎臟疾病、同種移植排斥、糖尿病、癌症、心臟衰竭與動脈粥樣硬化。
  7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該疾病或病症為肺高壓。
  8. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該肺高壓為肺動脈高血壓、與左心瓣膜病相關的肺高壓、與肺臟疾病相關的肺高壓，或因為長期栓塞疾病的肺高壓或因為血栓疾病相關的肺高壓。
  9. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該疾病或病症為癌症。
  10. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該癌症為前列腺癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、腎癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、膀胱癌、卡波西氏肉瘤或神經膠質瘤。
  11. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該藥物係與第二醫藥組成物使用，該第二醫藥組成物包含一或多種選自下列組成之群的活性成分：內皮素-A受體拮抗劑、內皮素-B受體拮抗劑、內皮素-轉化酶-1(ECE-1)抑制劑、腦啡肽酶(neprilysin)抑制劑、血管收縮素-II 受體促效劑與NF-κB抑制劑。
  12. 一種如申請專利範圍第5項之醫藥組成物用於製造減低疼痛的藥物之用途。
  13. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該疼痛為痛覺疼痛。
  14. 一種如申請專利範圍第5項之醫藥組成物用於製造治療纖維化的藥物之用途。
  15. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該纖維化為肺纖維化。
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