KR20220110555A - Vegf 미니-트랩 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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KR20220110555A
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조엘 마틴
사무엘 다비스
숀 로렌스
에이미 존슨
메간 카세이
제이미 마스트로기아코모
슌하이 왕
??하이 왕
닝 리
앤드류 튜스티안
안킷 바탁
매튜 프랭클린
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 VEGF 미니-트랩 분자 및 혈관신생 장애, 예컨대, 혈관신생 눈 장애 및 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

Description

VEGF 미니-트랩 및 그의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 12월 6일 출원된 미국 특허 가출원 제62/944,635호의 이익을 주장하며, 상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원의 서열 목록은 파일명이 "250298_000141_seqlist.TXT"이고, 작성일이 2020년 12월 2일이며, 크기가 115,306 바이트인 ASCII 포맷의 서열 목록으로 전자적으로 제출된 것이다. 제출된 본 서열 목록은 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은 예컨대, 혈관신생 눈 장애 및 암을 치료하기 위한, VEGF 미니-트랩 분자, 그의 약학적 조성물 뿐만 아니라, 그의 사용 방법을 제공한다.
본 발명의 배경
여러 눈 장애는 병적 혈관신생과 연관이 있다. 예를 들어, 연령 관련 황반 변성(AMD: age-related macular degeneration)의 발병은 맥락막 신생혈관(CNV:choroidal neovascularization)이라는 프로세스와 연관이 있다. CNV의 누출은 황반 부종과 황반 아래의 체액 퇴적을 유발하여 시력 상실을 초래한다. 당뇨병성 황반 부종(DME: diabetic macular edema)은 혈관신생 성분이 있는 또 다른 눈 장애이다. DME는 당뇨병 환자에서 중등도 시력 상실의 가장 흔한 원인이며, 망막 혈관에 영향을 미치는 장애인 당뇨병성 망막증의 흔한 합병증이다. 임상적으로 중요한 DME는 선명한 시력의 직접시를 담당하는 망막의 빛에 민감한 부분인 황반의 중심으로 체액이 누출될 때 발생한다. 황반의 체액은 중증의 시력 상실 또는 실명을 유발할 수 있다. 비정상적인 혈관신생과 연관된 추가의 또 다른 눈 장애는 중심성 망막 정맥 폐색(CRVO: central retinal vein occlusion)이다. CRVO는 망막 중심 정맥의 폐쇄로 인해 발생하며, 이는 망막에서 혈액과 체액의 역류를 유도한다. 망막은 또한 허혈이 되어 추가의 시력 상실과 더욱 심각한 합병증을 유발할 수 있는 새로운 부적절한 혈관의 성장을 초래할 수 있다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF: vascular endothelial growth factor)의 방출은 눈의 혈관 투과성을 증가시키고, 부적절한 새로운 혈관 성장에 원인이 된다. 따라서, VEGF의 혈관신생 촉진 특성을 억제시키는 것이 혈관신생 눈 장애를 치료하는 데 효과적인 전략법이다.
각종 VEGF 억제제, 예컨대, VEGF 트랩 에일리아(Eylea)(애플리버셉트(aflibercept))는 상기 눈 장애를 치료하는 것으로 승인받았다. VEGF 트랩을 전달하기 위한 치료 프로토콜은 유리체내 주사를 포함한다. 상기 프로토콜은 환자에게 고통스럽고, 불편하며, 심리적, 신체적 외상을 입히고, 각 치료 이벤트에 대한 감염과 같은 부작용의 가능성을 포함한다. 애플리버셉트가 다양한 혈관신생 눈 장애 치료에서 매우 효과적인 것으로 입증되었지만, 투약은 한 달에 한 번 정도로 빈번하게 진행된다. 유사한 효능을 나타내고, 덜 빈번하게 투약될 수 있는 치료적 VEGF 트랩 치료가 큰 관심의 대상이 되고 있다. 애플리버셉트에 비해 더 많은 몰량의 VEGF 미니-트랩을 사용하여 투약하면, 애플리버셉트의 높은 치료 효능의 이점은 계속 그대로 얻으면서, 더 적은 투약 이벤트를 필요로 할 것이다.
본 발명의 요약
본 발명은 하기 도메인 구조를 포함하는 단리된 VEGF 미니-트랩으로서, 여기서, 상기 VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 히스티딘은 2-옥소-히스티딘으로 산화되고/거나, 하나 이상의 트립토판은 (예컨대, N-포르밀키누레닌으로) 이산화되거나, 또는 하이드록시트립토판 또는 디-하이드록시트립토판 또는 트리-하이드록실 트립토판으로 산화되고/거나, 하나 이상의 그의 아스파라긴은 글리코실화된 것인, (예를 들어, 단량체, 동종이량체 또는 동종다량체일 수 있는) 단리된 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F); 또는 그의 조성물, 예컨대, 수성 조성물을 제공한다: (R1D2)-(R2D3)-(MC), 또는 ((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))a-(MC)b, ((R1D2)-(R2D3))c-링커-((R1D2)-(R2D3))d; 또는 ((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))e-링커-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))f, 여기서, R1D2는 VEGFR1 Ig 도메인 2이고; R2D3은 VEGFR2 Ig 도메인 3이고; R2D4는 VEGFR2 Ig 도메인 4이고; MC는 아미노산 서열: DKTHTCPPC(서열 번호 22), DKTHTCPPCPPC(서열 번호 23), DKTHTCPPCPPCPPC(서열 번호 24), DKTHTC(PPC)h(서열 번호 25), 여기서, h는 1, 2, 3, 4, 또는 5임, DKTHTCPPCPAPELLG(서열 번호 6), DKTHTCPLCPAPELLG(서열 번호 7), DKTHTC(서열 번호 8) 또는 DKTHTCPLCPAP(서열 번호 9)로 구성된 다량체화 성분이고, 링커는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 아미노산을 포함하는 펩티드이고; 독립적으로, a= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고; b= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고; c= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고; d= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고; e= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고; f= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 미니-트랩(예컨대, REGN7483F)의 농도는 약 90 mg/ml이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩은 구성원에 서열 번호 10, 11, 12, 13, 26, 27, 28, 29, 30, 32 또는 33에 기재된 것으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 미니-트랩은 도메인 구조: (i)((R1D2)-(R2D3))a-링커-((R1D2)-(R2D3))b; 또는 (ii)((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))c-링커-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))d를 포함하고; 2차 구조를 갖고, 여기서: (i) 상기 R1D2 도메인은 코디네이팅하고/거나; (ii) 상기 R2D3 도메인은 코디네이팅하고/거나; (iii) 상기 R2D4 도메인은 코디네이팅하여 VEGF(예컨대, VEGF-a) 결합 도메인을 형성한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 링커는 (Gly4Ser)n이고, 예컨대, 여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다. 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물은 2-옥소-히스티딘으로 산화된 하나 이상의 히스티딘, 및/또는 이산화된 하나 이상의 트립토판, 및/또는 글리코실화된 하나 이상의 아스파라긴을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물(예컨대, 수성 조성물)은 VEGF 미니-트랩 중 0.1% 내지 2%의 히스티딘이 2-옥소-히스티딘인 것인 VEGF 미니-트랩을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은, Lys-C 및 트립신 프로테아제를 이용하여, 하나 이상의 카복시메틸화된 시스테인 및 2-옥소-히스티딘을 포함하는 VEGF 미니-트랩의(예컨대, S. 피오게네스(S. pyogenes) IdeS 또는 그의 서열 변이체를 이용한) 분해의 올리고펩티드 생성물은 약 0.006-0.013% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열 번호 12의 아미노산 73-89), 약 0.019-0.028% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열 번호 12의 아미노산 97-119), 약 0.049-0.085% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 ELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열 번호 12의 아미노산 128-148), 약 0.057-0.092% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열 번호 12의 아미노산 206-221), 약 0.010-0.022% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TNYLTH*R(서열 번호 12의 아미노산 90-96), 및/또는 약 0.198-0.298% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 IIWDSR(서열 번호 12의 아미노산 56-61), 여기서, H*는 2-옥소-히스티딘으로 산화될 수 있는 히스티딘이고, 여기서, C*는 카복시메틸화될 수 있는 시스테인이고, 임의적으로, 상기 올리고펩티드의 하나 이상의 트립토판은 이산화된 것이며,
또는
약 0.0095 또는 0.01% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열 번호 12의 아미노산 73-89), 약 0.0235 또는 0.24% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열 번호 12의 아미노산 97-119), 약 0.067 또는 0.07% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열 번호 12의 아미노산 128-148), 약 0.0745 또는 0.075% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열 번호 12의 아미노산 206-221), 약 0.016 또는 0.02% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TNYLTH*R(서열 번호 12의 아미노산 90-96), 및/또는 약 0.248 또는 0.25% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 IIWDSR(서열 번호 12의 아미노산 56-61), 여기서, H*는 2-옥소-히스티딘으로 산화될 수 있는 히스티딘이고, 여기서, C*는 카복시메틸화될 수 있는 시스테인이고, 임의적으로, 상기 올리고펩티드의 하나 이상의 트립토판은 이산화된 것인, 상기 VEGF 미니-트랩을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 2-옥소-히스티딘은 화학식:
Figure pct00001
를 특징으로 한다.
본 발명은 조성물이
(i) 유럽 색상 표준 BY2보다 더 진한 갈황색이 아니거나;
(ii) 유럽 색상 표준 BY3보다 더 진한 갈황색이 아니거나;
(iii) 유럽 색상 표준 BY4보다 더 진한 갈황색이 아니거나;
(iv) 유럽 색상 표준 BY5보다 더 진한 갈황색이 아니거나;
(v) 유럽 색상 표준 BY6보다 더 진한 갈황색이 아니거나;
(vi) 유럽 색상 표준 BY7보다 더 진한 갈황색이 아니거나;
(vi) 유럽 색상 표준 BY2와 BY3 사이이거나;
(vii) 유럽 색상 표준 BY2와 BY4 사이이거나;
(vii) CIEL*a*b* 색 공간에서, L은 약 70-99이고, a는 약 -2-0이고, b는 약 20 이하이거나;
(viii) CIEL*a*b* 색 공간에서, L은 약 70-99이고, a는 약 -2-0이고, b는 약 10-31, 약 10, 약 14, 약 12, 약 14, 약 15, 약 18, 약 21, 약 27 또는 약 31이거나;
(ix) CIEL*a*b* 색 공간에서, L*, a* 및 b*는 본원 표 9-3의 임의의 행에 기재된 대략적인 값이거나, BY 값은 표 9-3에 기재된 대략적인 값이고, 임의적으로, 농도는 또한 대략적으로 표에 기재된 것과 같거나;
(x) CIEL*a*b* 색 공간에서, L*, a* 및 b*는 본원 표 17-1의 임의의 행에 기재된 대략적인 값이고, 임의적으로, 농도는 또한 대략적으로 표에 기재된 것과 같은 것인 색상을 특징으로 하고; 임의적으로, VEGF 미니-트랩의 농도는 약 70-200 mg/ml(예컨대, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 mg/ml)이거나; 또는 임의적으로, VEGF 미니-트랩의 농도는 약 70-200 mg/ml(예컨대, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 mg/ml)이지만, 이는 약 10 또는 11 또는 10-11 mg/ml로 희석될 때, 상기 색상을 특징으로 하는 것인, VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483F 또는 REGN7483R)을 포함하는 조성물(예컨대, 수성 조성물)을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 조성물의 색상이 하기 공식을 특징으로 하는 것인, 본 발명의 미니-트랩을 포함한다:
0.046 + (0.066 X 미니-트랩의 농도(mg/ml))=b* 또는 0.05 + (0.07 X 미니-트랩의 농도(mg/ml))=b* 또는 b*=(0.11 X 미니-트랩의 농도(mg/ml) - 0.56), 여기서, L*= 약 97-99이고, a= 약 -0.085-0.06(예컨대, 약 0)이다.
본 발명은 또한 미니-트랩에 대해 (예컨대, pH 약 8.3-8.6 및/또는 전도도 약 2 mS/cm하에 로딩 완충제 중에서) 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하고, 여기서, 미니-트랩은 플로우 쓰루(flow-through) 크로마토그래피 분획에서 수집되는 것을 포함하는 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483F 또는 REGN7483R)을 포함하는 조성물(예컨대, 수성 조성물)을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 본 방법은 (i) 화학적으로 정의된 액체 배지 중 숙주 세포(예컨대, 차이니즈 햄스터 난소 세포)에서 애플리버셉트 또는 상기 VEGF 미니-트랩을 발현하는 단계로서, 여기서, 상기 애플리버셉트 또는 VEGF 미니-트랩은 숙주 세포로부터 배지로 분비되는 것인 단계; 및 (ii) 애플리버셉트가 발현되는 경우, 애플리버셉트를 단백질 분해 절단하여 Fc 도메인을 포함하는 펩티드, 또는 그의 단편, 및 상기 VEGF 미니-트랩을 생성하고, Fc 도메인 또는 그의 단편을 VEGF 미니-트랩으로부터 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 단계; (iii) VEGF 미니-트랩을 (예컨대, 4급 아민; -O-CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3; -N+(CH3)3, 또는 4급화 폴리에틸렌이민 작용기를 갖는) 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 적용하는 단계; 및 (iv) 상기 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드를 그의 크로마토그래피 플로우 쓰루 중에 보유하는 단계를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 애플리버셉트가 발현되는 경우, 본 프로세스는 상기 단백질 분해 절단 이전에 애플리버셉트의 단백질-A 정제 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단백질 분해 절단은 애플리버셉트를 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) IdeS 프로테아제, 또는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 그의 변이체와 인큐베이션시킴으로써 수행된다. 한 실시양태에서, pH 약 8.4 또는 7.7 및 전도도 약 2.0 mS/cm, 예컨대, 50 mM 트리스(Tris) pH 8.4 ± 0.1 및 전도도 2.0 mS/cm; 또는 50 mM 트리스, 60 mM NaCl, pH 7.7 ± 0.1 하의 완충제를 포함하는 수성 완충제 중에서 평형화된 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 VEGF 미니-트랩을 적용시킨다. 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩이 pH 약 8.4 또는 7.7 및 전도도 약 2.0 mS/cm, 예컨대, 50 mM 트리스 pH 8.4 ± 0.1 및 전도도 2.0 mS/cm; 또는 50 mM 트리스, 60 mM NaCl, pH 7.7 ± 0.1 하의 수성 완충제 중에 존재할 때, VEGF 미니-트랩을 음이온 교환 수지에 적용시킨다. 조성물을 수지에 적용시킨 후, 수지를 상기 수성 완충제로 세척할 수 있고, 상기 세액은 보유될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단백질 분해 절단 후, Fc 도메인 또는 단편 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물을 단백질-A 크로마토그래피 수지에 적용하고, VEGF 미니-트랩을 플로우 쓰루 분획 중에 보유함으로써 애플리버셉트 Fc 도메인 또는 그의 단편을 크로마토그래피에 의해 VEGF 미니-트랩 조성물로부터 제거한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 프로세스는 더 산성인 pH (예컨대, 약 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2), 여과, 심층 여과, 한외여과, 정용여과, 바이러스 불활성화, 양이온 교환 크로마토그래피, 단백질-A 크로마토그래피 정제 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 정제(예컨대, 페닐, 옥틸 또는 부틸 작용기로 및/또는 결합-및-용리 모드 또는 플로우 쓰루 모드로 실행), 예컨대, 페닐 세파로스 FF(Phenyl sepharose FF), 캅토 페닐(Capto Phenyl)(GE Healthcare: 스웨덴 웁살라 소재), 페닐 650-M(Phenyl 650-M)(Tosoh Bioscience: 일본 도쿄 소재) 또는 사토바인드 페닐(사르토바인드 Phenyl)(Sartorius corporation: 미국 뉴욕 소재)을 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 초기(0일째) 화학적으로 정의된 액체 배지 중 시스테인(예컨대, 시스테인 HCl·H2O) 농도는 약 1.5 mM이고, 추가 시스테인 피드를 매 2일마다(예컨대, 2, 4, 6, 및 8일째) 1.3 mM, 1.7 mM 또는 2.1 mM(부피 또는 배양 배지당)로 배양 배지에 첨가하고; 화학적으로 정의된 액체 배지는 EDTA 및/또는 시트르산, 철, 구리, 아연 및 니켈을 포함하고/거나; 화학적으로 정의된 액체 배지는 하이포타우린, 타우린, 글리신, 티옥트산 및/또는 비타민 C를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483F 또는 REGN7483R; 예를 들어, CDM에서(예컨대, CHO 세포)에서 발현되고, 본원에 기술된 바와 같이 AEX 플로우 쓰루 크로마토그래피에 의해 정제된 것)은 하기: VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 아스파라긴은 N-글리코실화되고/거나; VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 세린 또는 트레오닌은 O-글리코실화되고/거나; VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 아스파라긴은 탈아미드화되고/거나; VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 아스파르테이트-글리신 모티프는 이소-아스파르테이트-글리신 및/또는 Asn-Gly로 전환되고/거나; VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 메티오닌은 산화되고/거나; VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 트립토판은 N-포르밀키누레닌으로 전환되고/거나; VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 아르기닌은 Arg 3-데옥시글루코손으로 전환되고/거나; VEGF 미니-트랩의 C-말단 글리신(또는 다른 C-말단 잔기)는 존재하지 않고/거나; VEGF 미니-트랩에 하나 이상의 비글리코실화된 잠재적 글리코사이트가 존재하고/거나; VEGF 미니-트랩은 총 약 40% 내지 약 50%의 푸코실화된 글리칸을 포함하고/거나; VEGF 미니-트랩은 총 약 30% 내지 약 55%의 시알릴화된 글리칸을 포함하고/거나; VEGF 미니-트랩은 약 6% 내지 약 15%의 만노스-5를 포함하고/거나; VEGF 미니-트랩은 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 포함하고/거나; VEGF 미니-트랩은 크실로실화되고/거나; VEGF 미니-트랩은 리신에서 당화되고/거나; VEGF 미니-트랩은 유리 티올 기를 갖는 시스틴을 포함하고/거나; VEGF 미니-트랩은 트리술피드 브릿지를 포함하고/거나; VEGF 미니-트랩은 쇄내 디술피드 브릿지를 포함하고/거나; VEGF 미니-트랩은 평행 배향으로 디술피드 브릿지를 포함하고/거나; VEGF 미니-트랩은 카복시메틸화된 리신 또는 아르기닌을 포함하는 것을 특징으로 하고/거나; 하기: VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 아스파라긴은 G0-GlcNAc 글리코실화; G1-GlcNAc 글리코실화; G1S-GlcNAc 글리코실화; G0 글리코실화; G1 글리코실화; G1S 글리코실화; G2 글리코실화; G2S 글리코실화; G2S2 글리코실화; G0F 글리코실화; G2F2S 글리코실화; G2F2S2 글리코실화; G1F 글리코실화; G1FS 글리코실화; G2F 글리코실화; G2FS 글리코실화; G2FS2 글리코실화; G3FS 글리코실화; G3FS3 글리코실화; G0-2GlcNAc 글리코실화; Man4 글리코실화; Man4_A1G1 글리코실화; Man4_A1G1S1 글리코실화; Man5 글리코실화; Man5_A1G1 글리코실화; Man5_A1G1S1 글리코실화; Man6 글리코실화; Man6_G0+포스페이트 글리코실화; Man6+포스페이트 글리코실화; 및/또는 Man7 글리코실화를 포함하고, 예컨대, 이는 아스파라긴 123 잔기의 약 30-36%(예컨대, 약 30, 31, 32, 32-35, 33, 34, 35 또는 36%)에서, 및/또는 아스파라긴 196 잔기의 약 25-30%(예컨대, 약 25, 26, 27, 27-30, 28, 29 또는 30%)에서 Man5 글리코실화; Man6-포스페이트로 글리코실화된 약 6-8%(예컨대, 약 6, 7, 8%)의 아스파라긴 36; 및/또는 Man7로 글리코실화된 약 3-4%(예컨대, 약 3 또는 4 또는 4.5%)의 아스파라긴 123을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 미니-트랩(예컨대, REGN7483F, 예를 들어, CDM에서(예컨대, CHO 세포)에서 발현되고, 본원에 기술된 바와 같이 AEX 플로우 쓰루 크로마토그래피에 의해 정제된 것)은 고 만노스 글리코실화를 포함하는 약 38%의 아스파라긴 123 잔기 및/또는 고 만노스 글리코실화를 포함하는 약 29%의 아스파라긴 196 잔기를 갖는다.
본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483F 또는 REGN7483R) 또는 조성물(예컨대, 수성 조성물), 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. VEGF 미니-트랩 폴리펩티드, 조성물 또는 약학적 제제를 포함하는 주사 장치(예컨대, 선충전된 시린지(PFS: pre-filled syringe), 예컨대, 멸균 PFS) 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483F 또는 REGN7483R), 조성물(예컨대, 수성 조성물) 또는 약학적 제제는 추가 치료제와 연관되어 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483F 또는 REGN7483R)의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, DNA를 제공한다. 본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 뿐만 아니라, VEGF 미니-트랩, 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포(예컨대, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포)를 제공한다.
본 발명은 또한 미니-트랩의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포(예컨대, CHO 세포) 내로 도입하는 단계, 폴리펩티드가 발현되는 조건하에 배지 중에서 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의적으로, 폴리펩티드를 숙주 세포 및/또는 배지로부터 단리시키는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483F 또는 REGN7483R)을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 방법의 생성물인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물(예컨대, 수성 조성물) 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명은 또한 하기 서열: DKTHTCPPCPAPELLG(서열 번호 20) 뒤의 면역글로불린 Fc 폴리펩티드를 절단하는 효소, 예컨대, S. 피오게네스 IdeS 또는 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi) 아종 쥬에피데미쿠스(zooepidemicus) IdeZ로 VEGF 트랩(예컨대, 애플리버셉트 또는 컨버셉트)을 단백질 분해하는 단계를 포함하거나, 또는 본질적으로 그로 구성된, 본원에 기술된 바와 같은 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483F 또는 REGN7483R)을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 방법의 생성물인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명은 또한 예컨대, 안내 주사에 의해, 예컨대, 유리체내 주사(예컨대, 약 100 ㎕ 이하, 예컨대, 약 70 ㎕)에 의해 VEGF 미니-트랩, 조성물 또는 제제, 및 임의적으로, 추가 치료제를 대상체의 체내로 도입하는 단계를 포함하는, 대상체(예컨대, 인간)에게 본원에 기술된 바와 같은 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483F 또는 REGN7483R) 또는 그의 조성물(예컨대, 수성 조성물) 또는 그의 약학적 제제를 투여하는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체의 눈에 치료 유효량(예컨대, 0.5 mg, 2 mg, 4 mg, 6 mg, 8 mg 또는 10 mg)의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483F 또는 REGN7483R) 또는 그의 조성물(예컨대, 수성 조성물) 또는 약학적 제제(예컨대, 약 100 ㎕ 이하, 예컨대, 약 70 ㎕), 및 임의적으로, 추가 치료제를 안내로(예컨대, 유리체내로) 주사하는 단계를 포함하는, 혈관신생 눈 장애(예컨대, 연령 관련 황반 변성(습성), 연령 관련 황반 변성(건성), 황반 부종, 망막 정맥 폐색 후 황반 부종, 망막 정맥 폐색(RVO: retinal vein occlusion), 중심성 망막 정맥 폐색(CRVO: central retinal vein occlusion), 망막 분지 정맥 폐색(BRVO: branch retinal vein occlusion), 당뇨병성 황반 부종(DME: diabetic macular edema), 맥락막 신생혈관(CNV: choroidal neovascularization), 홍채 신생혈관, 신생혈관 녹내장, 녹내장에 있어 수술 후 섬유증, 증식성 유리체망막병증(PVR: proliferative vitreoretinopathy), 시신경 유두 신생혈관, 각막 신생혈관, 망막 신생혈관, 유리체 신생혈관, 판누스, 익상편, 혈관 망막증, 당뇨병성 망막증을 치료하는 방법으로서, 여기서, 대상체는 또한 그를 필요로 하는 대상체(예컨대, 인간)에서 당뇨병성 황반 부종; 및/또는 당뇨병성 망막증)을 앓고 있는 것인 방법을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1. 스트렙토코쿠스 피오게네스 IdeS(FabRICATOR)에 의한 애플리버셉트의 단백질 분해의 생성물인 VEGF 미니-트랩 분자(REGN7483F)를 도시한 것. 동종이량체 분자는 각 폴리펩티드에 함께 결합하는 Ig 힌지 도메인 단편과 함께 도시되어 있다. VEGFR1 도메인, VEGFR2 도메인 및 힌지 도메인 단편(MC)이 도시되어 있다. 애플리버셉트에서 IdeS 절단이 일어나는 지점은 "//"로 표시되어 있다. 애플리버셉트에서 절단된 Fc 단편도 도시되어 있다.
도 2. 도메인의 코디네이팅을 도시한 단일 쇄 VEGF 미니-트랩을 도시한 것. VEGFR1, VEGFR2 및 링커 도메인이 도시되어 있다. 제시된 링커는 (G4S)6(REGN7080)이다. 본 발명은 (G4S)3; (G4S)9 또는 (G4S)12 링커를 포함하는 단일 쇄 VEGF 미니-트랩을 포함한다.
도 3(도 3a-도 3c). HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ 클론 V3H9 세포를 VEGF110, VEGF121, 또는 VEGF165로 농도를 증가시켜가면서 처리하였고(각각 패널 a-c, 검은색 개방형 사각형 표시), 그 결과로 상대 발광 단위(RLU: relative luminescence unit)가 증가하였으며, 이는 키메라 VEGF 수용체의 활성화를 반영한다. 20 pM VEGF110, VEGF121, 또는 VEGF165의 존재하에서, REGN3(검은색 폐쇄형 동그라미 표시), REGN6824(검은색 폐쇄형 사각형 표시), 및 REGN7080(폐쇄형 삼각형 표시)의 연속 희석액 사용으로 중화가 일어난 것이 관찰되었다.
도 4a-도 4b. HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ 클론 V3H9 세포를 VEGF121 또는 VEGF110으로 농도를 증가시켜가면서 처리하였고(각각 패널 a-b, 개방형 사각형 표시), 그 결과로 상대 발광 단위(RLU)가 증가하였으며, 이는 키메라 VEGF 수용체의 활성화를 반영한다. 20 pM VEGF121 또는 VEGF110의 존재하에서, REGN3(VEGF-트랩; 폐쇄형 동그라미 표시), REGN7991(검은색 폐쇄형 사각형 표시), 및 REGN7992(개방형 삼각형 표시)의 연속 희석액 사용으로 중화가 일어난 것이 관찰되었다.
도 5a-도 5f. HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ 클론 V3H9 세포를 VEGF110(a-b), VEGF121 (c-d), 또는 VEGF165(e-f)로 농도를 증가시켜가면서 처리하였고, 그 결과로 상대 발광 단위(RLU)가 증가하였으며, 이는 키메라 VEGF 수용체의 활성화를 반영한다. 20 pM VEGF110, 40 pM VEGF121, 또는 40 pM VEGF165의 존재하에서, REGN3(VEGF-트랩; 작은 폐쇄형 검은색 사각형 표시); REGN7483F(큰 폐쇄형 검은색 사각형 표시 또는 개방형 회색 사각형 표시(별도의 로트)); REGN7483R(작은 검은색 폐쇄형 삼각형 표시); REGN112(개방형 삼각형 표시); REGN7850(폐쇄형 회색 동그라미 표시); REGN7851(개방형 동그라미 표시) 또는 VEGF 대조군(개방형 검은색 사각형 표시)의 연속 희석액 사용으로 중화가 일어난 것이 관찰되었다.
도 6. 다각도 광 산란에 커플링된 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS: size exclusion chromatography coupled to multi angle light scattering)에 의해 REGN6824:REGN110 복합체를 분석하였다. 머무름 시간(X축)의 함수로서 280 nm(우측 Y축)에서의 상대 UV 흡광도가 각 샘플에 대해 제시되어 있고, 분리된 피크의 측정된 몰 질량이 명시되어 있다(좌측 Y축). 피크 1은 복합체를 나타내고, 피크 2는 REGN6824 단독인 것을 나타내고, 피크 3은 REGN110 단독인 것을 나타낸다.
도 7. 다각도 광 산란에 커플링된 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS)에 의해 REGN7080:REGN110 복합체를 분석하였다. 머무름 시간(X축)의 함수로서 280 nm(우측 Y축)에서의 상대 UV 흡광도가 각 샘플에 대해 제시되어 있고, 분리된 피크의 측정된 몰 질량이 명시되어 있다(좌측 Y축). 피크 1은 복합체를 나타내고, 피크 2는 REGN7080 단독인 것을 나타내고, 피크 3은 REGN110 단독인 것을 나타낸다.
도 8. 다각도 광 산란에 커플링된 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS)에 의해 REGN7483F:REGN110 복합체를 분석하였다. 머무름 시간(X축)의 함수로서 280 nm(우측 Y축)에서의 상대 UV 흡광도가 각 샘플에 대해 제시되어 있고, 분리된 피크의 측정된 몰 질량이 명시되어 있다(좌측 Y축). 피크 1은 복합체를 나타내고, 피크 1a는 REGN7483F 단독 및 REGN110:REGN7483F 복합체의 혼합물과 일치하고, 피크 2는 REGN7483F 단독인 것을 나타내고, 피크 3은 REGN110 단독인 것을 나타낸다.
도 9. 대조군 hFc, VEGF 트랩(애플리버셉트), 단일 쇄 미니-트랩, REGN7080, 또는 이량체 미니-트랩, REGN7483F의 유리체내 투여 후 OIR(산소 유도성 망막증: oxygen induced retinopathy) 모델 마우스에서 관찰된 비정상적 신생혈관의 표면적이 제시되어 있다.
도 10a-도 10b. 이량체 미니-트랩, REGN7483F(3 mg/kg, 30 mg/kg 또는 100 mg/kg; 또는 3 mg/kg 대조군 hFc)의 전신 (ip) 투여 후 OIR(산소 유도성 망막증) 모델 마우스에서 관찰된 비정상적 신생혈관의 표면적이 제시되어 있다(a). 과거 연구에서의, 2.5 mg/kg, 6.25 mg/kg, 25 mg/kg 또는 50 mg/kg 애플리버셉트(VEGF 트랩)를 전신(ip) 투여받은 OIR 마우스에서의 (hFc 대조군 단백질에 대해 정규화된) 표면적 또한 제시되어 있다.
도 11. REGN112(R112), REGN7850(R7850), 및 REGN7851(R7851) 분자의 환원 및 비환원 SDS-PAGE 겔(M=분자량 마커). 이량체 및 단량체가 명시되어 있다.
도 12a-도 12c. VEGF 트랩 및 미니-트랩 구성물의 그래픽 요약
도 13. CIEL*a*b* 색 공간의 그래픽 표현.
도 14a-도 14d. CDM 발현 및 비CDM 발현 애플리버셉트(에일리아)에서 관찰된 번역 후 변형. (a)의 표는 REGN7483F 및 애플리버셉트(에일리아)에서 관찰된 부위 특이적 아스파라긴-연결된 글리코실화를 보여주는 것이다. 각 박스의 음영 정도는 명시된 잔기에서의 명시된 글리코실화 정도와 상관관계를 갖는다. Man4, Man5, Man6 및 Man7을 합산하여 고 만노스(%)를 계산하였다. (b)의 표는 REGN7483F 및 애플리버셉트(에일리아)에서 관찰된 N-연결된 글리코사이트에서의 비글리코실화를 포함하는 다른 번역 후 변형을 보여주는 것이다. (c)에서의 표는 REGN7483F(미니-트랩 생산 10), REGN7483R, REGN7711 및 애플리버셉트(에일리아)에서 관찰된 부위 특이적 아스파라긴-연결된 글리코실화를 보여주는 것이다. 상기 표는 오직 임의의 샘플 중에서 수준이 > 1%인 글리코폼만을 나타낸다. (d)는 추가 글리칸의 구조를 보여주는 것이다.
도 15. 군(애플리버셉트(500 ㎍ 및 2 mg 용량); REGN7483R(미니트랩 R, 250.5 ㎍ 용량); REGN7483F(미니트랩 F, 254.4 ㎍ 및 1.4 mg 용량) 및 위약)) 간의 기준선 혈관 투과도(누출/시신경 유도 면적).
도 16. 등몰 용량의 애플리버셉트(500 ㎍), REGN7483R(미니트랩 재조합, 250.5 ㎍), REGN7483F(미니트랩 Fabricat또는, 254.4 ㎍) 및 위약에서 시간 경과에 따른 혈관 투과도 억제(기준선 대비 비율(%)로 표시).
도 17. 고용량의 애플리버셉트(2 mg) 또는 REGN7483F(미니트랩 Fabricat또는, 1.4 mg); 또는 위약에서 시간 경과에 따른 혈관 투과도 억제(기준선 대비 비율(%)로 표시)
도 18. 각 처리군(애플리버셉트(500 ㎍ 및 2 mg 용량); REGN7483R(미니트랩 재조합, 250.5 ㎍ 용량); REGN7483F(미니트랩 Fabricat또는, 254.4 ㎍ 및 1.4 mg 용량) 및 위약))에서 토끼에서의 시간 경과에 따른 안압.
도 19. 각 군(애플리버셉트(500 ㎍ 및 2 mg 용량); REGN7483F(미니트랩 F, 254.4 ㎍ 및 1.4 mg 용량) 및 위약))에서 병적 혈관 퇴행률(%).
도 20. 애플리버셉트(500 ㎍), REGN7483F(미니트랩, 213 ㎍) 또는 위약 군에서의 기준선 혈관 투과도.
도 21. 애플리버셉트(500 ㎍), REGN7483F(미니트랩(F), 213 ㎍) 또는 위약 군에서의 시간 경과에 따른 혈관 투과도 억제율(%).
도 22. CIEL*a*b* 색 공간에서 BY 색상 표준의 색상 분석.
도 23. 상업적 애플리버셉트 중, 및 AEX 크로마토그래피에 의해 정제된 프로테아제 분해된 미니-트랩 생산 10으로부터의 올리고펩티드 및 AEX 크로마토그래피로부터 스트리핑된 프로테아제 분해된 미니-트랩 생산 10으로부터의 올리고펩티드 중 2-옥소-히스티딘(및 트립토판 이산화)의 비율(%) 평가.
도 24a-도 24b. 신선한 CDM 중 애플리버셉트와 다양한 성분의 인큐베이션이 색상(CIEL*a*b* b*-값 예측치) 생성에 미치는 효과(a); 및 b*-값 예측치 플롯에 의한 실측치. b-비타민 군은 티아민, 니아신아미드, 판토텐산, 비오틴 및 피리독신이다.
도 25. 금속 함량 및 시스테인 환원이 색상(CIEL*a*b* b*-값 예측치)에 미치는 효과.
도 26a-도 26b. 애플리버셉트 약물 물질을 함유하는 폐 CDM에 스파이킹된 다양한 항산화제가 b*-값 예측치에 미치는 효과; 그래프(a) 및 표 요약(b).
도 27. REGN7483 농도(미니-트랩 생산 23)가 b*-값에 미치는 효과.
도 28. 상이한 미니-트랩 생산 중 및 강한 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 수행시 수득된 분획 중에 존재하는 산성 종 비교를 수행한 실험의 결과.
도 29. 예시적인 실시양태에 따라 미니-트랩 생산 23(임의의 정제 절차 이전, ≤BY3)에 대해 수행된 강한 양이온 교환 크로마토그램에 대해 CEX를 수행하고, 이중 염-pH 구배를 사용하여 탈시알릴화된 미니-트랩(dsMT1)의 변이체에 대해 농축시켰다.
도 30. 예시적인 실시양태에 따라 VEGF 미니-트랩 생산 23(임의의 정제 절차 이전, ≤BY3)에 대해 수행된 이미지화된 모세관 등전점 포커싱(iciEF: imaged capillary isoelectric focusing) 전기영동도에 대해 CEX를 수행하고, 탈시알릴화된 미니-트랩(dsMT1)의 변이체에 대해 농축시켰다.
도 31a-도 31c. (a) 상업적 프로세스(비CDM)를 사용하여 제조된 애플리버셉트의 IdeS(FabRICATOR) 절단에 의해 수득된 VEGF 미니-트랩(MT4) 및 미니-트랩 생산 10(M1)에 대한 350 nm에서의 흡광도 대 시간(분) 차트 전체 보기; (b) MT4 및 MT1에 대한 350 nm에서의 흡광도 대 시간(16-30분) 차트 전체 보기; (c) MT4 및 MT1에 대한 350 nm에서의 흡광도 대 시간(30-75분) 차트 전체 보기.
도 32a-도 32b. 뉴질랜드 흰 토끼(토끼 428, 429, 430, 434, 435 및 436)의 유리체에서의 (a) VEGF 트랩 REGN3 및 (b) VEGF 미니-트랩 REGN7483F에 대한 붕괴 곡선의 자연 로그 플롯. OD= 오른쪽 눈; OS= 왼쪽 눈.
도 33a-도 33c. 뉴질랜드 흰 토끼(토끼 472, 473, 475, 476, 477, 431, 432 및 433)의 유리체에서의 (a) VEGF 트랩 REGN3, (b) VEGF 미니-트랩 REGN7850 및 (c) VEGF 미니-트랩 REGN7851에 대한 붕괴 곡선의 자연 로그 플롯. OD= 오른쪽 눈; OS=왼쪽 눈.
도 34. 2원 ANOVA 결과, VEGF 트랩 REGN3 군과 VEGF 미니-트랩 REGN7483F 군 사이 IVT 주사 이전 및 IVT 주사 후 20분 경과 후에 IOP에서 유의적인 변화는 없는 것으로 나타났다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 몇 가지 유익한 특성을 갖고, 상당한 기술적 장애를 극복하기 위한 노력의 결과인 VEGF 미니-트랩 분자(예컨대, REGN7483F) 및 그의 조성물을 제공한다. 화학적으로 정의된 배지(CDM: chemically defined media)에서의 미니-트랩의 발현 결과로 상당한 갈황색이 나타났다. CDM에서의 발현이 단백질 발현에 바람직한 현대적인 방법이지만(예컨대, CDM은 가수분해물 기반 배지보다 더 높은 재현성/일관성을 제공한다), 시각 기관인 눈에 유색 물질을 추가하면 시력에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 최적화된 정제 프로세스 및 숙주 세포 성장 조건의 분석 및 개발을 통해, 색상의 가능한 원인(2-옥소-히스티딘 변형)을 확인하고, 최종의 정제된 생성물 중 그의 존재를 크게 감소시켰다. 추가로, 증거에 따르면 본 발명의 미니-트랩은 유리체내 투여와 연관된 특정 부작용을 피할 수 있는 애플리버셉트(Eylea)보다 전신 반감기가 더 짧다. 이 효과의 원인은 명확하지 않지만, 애플리버셉트보다 미니-트랩 상의 만노스 함량이 더 높기 때문일 수 있다.
따라서, 본 발명은 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF: vascular endothelial cell growth factor)에 결합할 수 있는 융합 폴리펩티드 뿐만 아니라, 그의 치료적 사용 방법을 포함한다.
폴리펩티드(예컨대, VEGFR Ig 도메인)의 "변이체"는 참조된 아미노산 서열(예컨대, 서열 번호 1-5 또는 10-13 중 임의의 것)과 적어도 약 70-99.9%(예컨대, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) 동일하거나, 또는 유사한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하며; 비교가 BLAST 알고리즘에 의해 수행될 때, 여기서, 알고리즘의 파라미터는 각 참조 서열의 전장에 걸쳐 각 서열 사이에 가장 큰 매치가 이루어지도록 선택된다(예컨대, 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위에서 최대 매치: 0; BLOSUM 62 행렬; 갭 비용: 존재 11, 확장 1; 조건부 구성 점수 행렬 조정).
폴리펩티드(예컨대, VEGFR Ig 도메인)의 변이체는 또한 서열 번호 1-5, 10-13, 26-30, 32, 33 또는 36 중 임의의 것 대비 하나 이상의(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10) 돌연변이, 예컨대, 예를 들어, 미스센스 돌연변이(예컨대, 보존적 치환), 넌센스 돌연변이, 결실, 또는 삽입을 제외한 참조된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다
본 발명은 그의 아미노산 서열이 본원에 구체적으로 기술된 것의 변이체인 폴리펩티드를 포함하는 VEGF 미니-트랩을 포함한다.
하기 참고문헌은 서열 분석에 자주 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다: 문헌 [BLAST ALGORITHMS: Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109]; [Altschul, S. F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; [Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272]; [Madden, T. L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141]; [Altschul, S. F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; [Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656]; [Wootton, J. C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163]; [Hancock, J. M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70]; [ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M. O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M. O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.]; [Schwartz, R. M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M. O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.]; [Altschul, S. F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565]; [States, D. J., et al., (1991) Methods 3:66-70]; [Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919]; [Altschul, S. F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300]; [ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]; [Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]; [Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039]; 및 [Altschul, S. F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, N.Y.].
VEGF, VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3의 서열 및 도메인 구조는 공지되어 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 아미노산 서열은 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 AH001553하에 기재되어 있고/거나; VEGFR1 아미노산 서열은 유니프롯(Uniprot) 수탁 번호 P17948하에 기재되어 있고/거나; VEGFR2 아미노산 서열은 유니프롯 수탁 번호 P35968하에 기재되어 있고/거나; VEGFR3 아미노산 서열은 유니프롯 수탁 번호 P35916.하에 기재되어 있다. 문헌 [Holash et al., VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects, Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Aug 20;99(17):11393-8].
VEGF 미니-트랩
본 발명은 VEGF(예컨대, VEGF110, VEGF121 또는 VEGF165)의 억제에 의해 치료가능하거나, 또는 예방가능한 병태 및 질환, 예컨대, 혈관신생 눈 장애 및 암을 치료 또는 예방하는 데 치료적으로 유용한 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 결합할 수 있는 VEGF 미니-트랩을 제공하며--"VEGF 미니-트랩"과 관련하여 "VEGF"라는 용어 등은 미니-트랩이 VEGF에 결합하고, 상기 용도를 갖고 있다는 것을 나타낸다. 본 발명의 VEGF 미니-트랩의 요약은 도 11에 제시되어 있다.
VEGF 미니-트랩은 VEGF 수용체 Ig 유사 도메인(또는 그의 변이체)(예컨대, VEGFR1 Ig 도메인 2 및/또는 VEGFR2 Ig 도메인 3 및/또는 4)의 하나 이상의 세트 및 말단절단된 다량체화 성분(MC)을 갖거나, 또는 MC가 부재인 VEGF에 결합하는 분자 또는 분자의 복합체이며, 여기서, MC는 말단절단된 면역글로불린 Fc이다. 상기 말단절단은 VEGF 트랩(예컨대, 애플리버셉트 또는 컨버셉트)의 단백질 분해적 분해 또는 단축된 MC 서열을 갖는 생성된 폴리펩티드 쇄의 직접적인 발현의 결과일 수 있다. 도 1에 도시된 분자 구조를 참조한다. 도 1은 스트렙토코쿠스 피오게네스 IdeS에 의한 애플리버셉트의 단백질 분해의 생성물인 VEGF 미니-트랩 분자를 도시한 것이다. 동종이량체 분자는 2개의 평행한 디술피드 결합에 의해 연결된 Ig 힌지 도메인 단편과 함께 도시되어 있다. VEGFR1 도메인, VEGFR2 도메인 및 힌지 도메인 단편(MC)이 도시되어 있다. 애플리버셉트에서 IdeS 절단이 일어나는 지점은 "//"로 표시되어 있다. 애플리버셉트에서 절단된 Fc 단편도 도시되어 있다. 이량체화되지 않은 단일의 상기 키메라 폴리펩티드는 VEGF 결합 활성을 갖고 있다면, 이 또한 VEGF 미니-트랩일 수도 있다. 용어 "VEGF 미니-트랩"은 하나 이상의 VEGF 수용체 Ig 도메인(또는 그의 변이체)의 제1 세트를 포함하고, MC는 결여되어 있지만, 링커(예컨대, 펩티드 링커)에 의해 하나 이상의 VEGF 수용체 Ig 도메인(또는 그의 변이체)의 하나 이상의 추가 세트에 융합된 단일 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 VEGF 미니-트랩 중의 VEGF 결합 도메인은 서로 동일하거나, 또는 상이한 것일 수 있다. WO2005/00895를 참조한다.
예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 비말단절단된 면역글로불린 Fc 도메인은 아미노산 서열 또는 그의 아미노산 1-226을 포함한다:
Figure pct00002
VEGF의 억제는 예를 들어, 예컨대, VEGF(예컨대, VEGF110, VEGF121 및/또는 VEGF165) 결합에 대한 VEGF 수용체와의 경쟁에 의한 VEGF 수용체에의 VEGF 결합의 길항작용을 포함한다. 상기 억제는 VEGFR의 VEGF 매개 활성화의 억제, 예컨대, 세포 상의 IL18Rα 및/또는 IL18Rα 세포내 도메인에 융합된 VEGFR 세포외 도메인을 갖고, NFkB-루시페라제-IRES-eGFP 리포터 유전자 또한 갖는, 키메라 VEGF 수용체(예컨대, 그의 동종이량체)를 발현하는 세포주(예컨대, HEK293), 세포주 HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rα에서 루시페라제 발현의 억제를 초래할 수 있다.
본 발명의 VEGF 미니-트랩의 VEGF 수용체 Ig 도메인 성분은 하기를 포함할 수 있다:
(i) VEGFR1(Flt1)의 면역글로불린 유사(Ig) 도메인 2(R1D2) 중 하나 이상의 것,
(ii) VEGFR2(Flk1 또는 KDR)의 Ig 도메인 3(Flk1D3)(R2D3) 중 하나 이상의 것,
(iii) VEGFR2(Flk1 또는 KDR)의 Ig 도메인 4(Flk1D4)(R2D4) 중 하나 이상의 것, 및/또는
(iv) VEGFR3(Flt4)의 Ig 도메인 3(Flt1D3 또는 R3D3) 중 하나 이상의 것.
VEGF 수용체의 면역글로불린 유사 도메인은 본원에서 VEGFR "Ig" 도메인으로서 지칭될 수 있다. 본원에서 예컨대, R1D2(본원에서 VEGFR1(d2)로 지칭될 수 있다), R2D3(본원에서 VEGFR2(d3)으로 지칭될 수 있다), R2D4(본원에서 VEGFR2(d4)로 지칭될 수 있다) 및 R3D3(본원에서 VEGFR3(d3)으로 지칭될 수 있다)으로 지칭되는 VEGFR Ig 도메인은 완전한 야생형 Ig 도메인 뿐만 아니라, 야생형 도메인의 기능적 특징을 실질적으로 보유하는, 예컨대, VEGF 미니-트랩 내로 도입되었을 때, 작용하는 VEGF 결합 도메인을 형성할 수 있는 능력을 보유하는 그의 변이체도 포함하는 것으로 의도된다. 야생형 도메인과 실질적으로 동일한 기능적 특징을 보유할 상기 Ig 도메인의 수많은 변이체가 수득될 수 있다는 것은 당업자에게 용이하게 자명할 것이다.
본 발명은 하기 도메인 구조를 포함하는 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드를 제공한다:
· ((R1D2)-(R2D3))a-링커-((R1D2)-(R2D3))b;
· ((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))c-링커-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))d;
· ((R1D2)-(R2D3))e-(MC)g; 또는
· ((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))f-(MC)g;
여기서,
-R1D2는 VEGF 수용체 1(VEGFR1) Ig 도메인 2(D2)이고;
-R2D3은 VEGFR2 Ig 도메인 3이고;
-R2D4는 VEGFR2 Ig 도메인 4이고;
-MC는 다량체화 성분(예컨대, IgG1)이고;
-링커는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 아미노산을 포함하는 펩티드, 예를 들어, (GGGS)g이고;
독립적으로,
a= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고;
b= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고;
c= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고;
d= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고;
e= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고;
f= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고;
g= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다.
본 발명의 한 실시양태에서, R1D2는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00003
(서열 번호 1). 본 발명의 한 실시양태에서, R1D2에는 N-말단 SDT가 결여되어 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, R1D2는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00004
(서열 번호 2).
본 발명의 한 실시양태에서, R2D3은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00005
(서열 번호 3).
본 발명의 한 실시양태에서, R2D4는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00006
(서열 번호 4).
본 발명의 한 실시양태에서, R2D4는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00007
(서열 번호 5).
본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩에 사용하기 위한 다량체화 성분(MC)은 펩티드, 예를 들어, 또 다른 다량체화 성분에 결합할 수 있는 말단절단된 Fc 면역글로불린(예컨대, IgG1)이다. 본 발명의 한 실시양태에서, MC는 면역글로불린 힌지 영역 또는 그의 단편을 포함하는 말단절단된 Fc 면역글로불린이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, MC는 또 다른 MC, 예컨대, DKTHTCPPC(서열 번호 22), DKTHTCPPCPPC(서열 번호 23), DKTHTCPPCPPCPPC(서열 번호 24), DKTHTC(PPC)h(서열 번호 25), 여기서, h는 1, 2, 3, 4, 또는 5임, DKTHTCPPCPAPELLG(서열 번호 6), DKTHTCPLCPAPELLG(서열 번호 7), DKTHTC(서열 번호 8) 또는 DKTHTCPLCPAP(서열 번호 9) 중 시스테인과 하나 이상의 시스테인 브릿지를 형성할 수 있는 하나 이상의(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의) 시스테인을 포함하는 펩티드이다.
본 발명은 또한 하기 도메인 구조를 포함하는 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드를 제공한다:
(i)((R1D2)-(R2D3))a-(MC)b; 또는
(ii)((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))c-(MC)d;
이는 예컨대, 각 폴리펩티드의 MC 사이의 결합에 의해 제2의 상기 폴리펩티드와 동종이량체화될 수 있고,
여기서,
(i) 상기 R1D2 도메인은 코디네이팅하고/거나;
(ii) 상기 R2D3 도메인은 코디네이팅하고/거나;
(iii) 상기 R2D4 도메인은 코디네이팅하여 이량체 VEGF 결합 도메인을 형성한다.
본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다:
Figure pct00008
(서열 번호 12; MC는 밑줄로 표시; REGN7483 (REGN7483F/REGN7483R));
Figure pct00009
(서열 번호 13; MC는 밑줄로 표시);
Figure pct00010
(서열 번호 26; MC는 밑줄로 표시(REGN112));
Figure pct00011
(서열 번호 27; MC는 밑줄로 표시; REGN7850);
Figure pct00012
(서열 번호 28; MC는 밑줄로 표시; REGN7851);
또는
Figure pct00013
(서열 번호 29; MC는 밑줄로 표시; 여기서, x는 1, 2, 3, 4 또는 5이다). 논의된 바와 같이, 상기 폴리펩티드는 다량체화될 수 있으며(예컨대, 이량체화될 수 있으며(예컨대, 동종이량체화될 수 있으며)), 여기서, 폴리펩티드 사이의 결합은 다량체화 성분을 통해 매개된다. 상기 다량체 및 단일 폴리펩티드는 본 발명의 일부이다.
본 발명의 한 실시양태에서, REGN7483F 또는 R, REGN7850 또는 REGN7851에서, N36, N68, N123 및/또는 N196은 N-글리코실화된다. 본 발명의 한 실시양태에서, REGN7483F 또는 R, REGN7850 또는 REGN7851에는 (i) C30과 C79 및/또는 (ii) C124와 C185 사이에 쇄내 디술피드 브릿지가 존재한다.
본 발명의 한 실시양태에서, REGN7483F 또는 R, REGN7850 또는 REGN7851의 힌지 영역에서, 쇄간 디술피드 브릿지는 (각 C211 사이 및 각 C214 사이에) 평행하거나, 또는 (C211과 C214 사이에) 교차되어 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 대부분의 디술피드 브릿지는 평행하다.
본 발명의 한 실시양태에서, REGN7483F 또는 R, REGN7850 또는 REGN7851에서, C-말단 글리신은 결손되어 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 단량체 VEGF 미니-트랩의 VEGFR1 Ig 유사 도메인 2는 N36 및/또는 N68에 N-연결된 글리코실화를 갖고/거나; C30과 C79 사이에 쇄내 디술피드 브릿지를 갖고/거나; 본 발명의 단량체 VEGF 미니-트랩의 VEGFR2 Ig 유사 도메인 3은 N123 및/또는 N196에 N-연결된 글리코실화를 갖고/거나; C124와 C185사이에 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다.
본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩은 하기 구조를 포함한다:
· (R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)3-(R1D2)1-(R2D3)1;
· (R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)6-(R1D2)1-(R2D3)1;
· (R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)9-(R1D2)1-(R2D3)1; 또는
· (R1D2)1-(R2D3)1-(G4S)12-(R1D2)1-(R2D3)1.
G4S는 -Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-이다.
본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00014
Figure pct00015
본원에서 논의된 바와 같이, 이들 폴리펩티드는 VEGFR Ig 유사 도메인이 회합하여 쇄내 VEGF 결합 도메인을 형성하는 2차 구조를 포함할 수 있다(예컨대, 도 2 참조). 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 폴리펩티드 중 2개 이상이 다량체화되고(예컨대, 이량체되고(예컨대, 동종이량체되고)), 여기서, 각 쇄의 VEGFR Ig 도메인은 또 다른 쇄의 Ig 유사 도메인과 회합하여 쇄간 VEGF 결합 도메인을 형성한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 VEGF 미니-트랩에는 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 어떤 유의적인 변형(예컨대, 예를 들어 N- 및/또는 C-말단에서의 PEG화 또는 아이오도아세트아미드화와 같은 지시된 화학적 변형)도 없다.
본 발명의 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 단일 키메라 폴리펩티드(예컨대, ((R1D2)-(R2D3))a-링커-((R1D2)-(R2D3))b; 또는 ((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))c-링커-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))d 중의 또는 별개의 키메라 폴리펩티드(예컨대, 동종이량체) 중의 VEGFR Ig 유사 도메인은 코디네이팅하여 VEGF 결합 도메인을 형성하는 2차 구조를 포함한다. 예를 들어, 여기서,
(i) 상기 R1D2 도메인은 코디네이팅하고/거나;
(ii) 상기 R2D3 도메인은 코디네이팅하고/거나; 및/또는
(iii) 상기 R2D4 도메인은 코디네이팅하여 VEGF 결합 도메인을 형성한다. 도 2는 상기 도메인의 코디네이팅을 도시한 단일 쇄 VEGF 미니-트랩을 도시한 것이다. VEGFR1, VEGFR2 및 링커 도메인이 도시되어 있다. 제시된 링커는 (G4S)6이다. 본 발명은 (G4S)3; (G4S)9 또는 (G4S)12 링커를 포함하는 단일 쇄 VEGF 미니-트랩을 포함한다.
추가로, 본 발명은 또한 VEGF 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 그의 융합체와 복합체를 형성한 본원에서 논의된 VEGF 미니-트랩을 포함하는 복합체를 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF(예컨대, VEGF165)는 동종이량체화되고/거나, VEGF 미니-트랩은 2:2 복합체(2 VEGF:2 미니-트랩)로 동종이량체화된다. 복합체는 동종이량체화된 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드에 결합된 동종이량체화된 VEGF 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 복합체는 시험관내에 있거나(예컨대, 고체 기판에 고정화되어 있거나), 또는 대상체의 체내에 존재한다. 본 발명은 또한 본원 표 3-3에 기술된 바와 같은 몰비로 VEGF 미니-트랩, 예컨대, REGN6824, REGN7080 또는 REGN7483F와 복합체를 형성한 VEGF 이량체(예컨대, VEGF165)의 복합체의 조성물을 포함한다.
IdeS 및 그의 변이체
본 발명은 스트렙토코쿠스 피오게네스 IdeS(FabRICATOR)에 의한 애플리버셉트의 단백질 분해에 의해 생성된 VEGF 미니-트랩 및 그의 조성물을 포함한다. FabRICATOR은 제노비스, 인크.(Genovis, Inc.: 미국 매사츠세츠주 케임브리지; 스웨덴 룬드 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다.
한 실시양태에서, IdeS 폴리펩티드는 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51 및 서열 번호 52로 구성된 군에 기재된 바와 같은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 80%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 측면에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 측면에서, 단리된 아미노산 서열은 단리된 아미노산 서열의 전장에 걸쳐 적어도 약 100%의 서열 동일성을 갖는다. 한 측면에서, 폴리펩티드는 표적 단백질을 단편으로 절단할 수 있다. 특정 측면에서, 표적 단백질은 IgG이다. 또 다른 특정 측면에서, 표적 단백질은 융합 단백질이다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 단편은 Fab 단편 및/또는 Fc 단편을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, IdeS 아미노산 서열은 서열 번호 37에 의해 정의되되, 위치 87, 130, 182 및/또는 274의 아스파라긴 잔기가 아스파라긴 이외의 아미노산으로 돌연변이화된 모체 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 돌연변이는 모체 아미노산 서열과 비교하여 알킬리성 pH 값에서 증가된 화학적 안정성을 부여할 수 있다. 또 다른 측면에서, 돌연변이는 모체 아미노산 서열과 비교하여 알킬리성 pH 값에서 50%만큼 증가된 화학적 안정성을 부여할 수 있다. 한 측면에서, 아미노산은 아스파르트산, 류신, 및 아르기닌으로부터 선택될 수 있다. 특정 측면에서, 위치 87의 아스파라긴 잔기는 아스파르트산 잔기로 돌연변이화된다. 또 다른 특정 측면에서, 위치 130의 아스파라긴 잔기는 아르기닌 잔기로 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 182의 아스파라긴 잔기는 류신 잔기로 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 274의 아스파라긴 잔기는 아스파르트산 잔기로 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 87 및 130의 아스파라긴 잔기는 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 87 및 182의 아스파라긴 잔기는 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 87 및 274의 아스파라긴 잔기는 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 130 및 182의 아스파라긴 잔기는 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 130 및 274의 아스파라긴 잔기는 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 182 및 274의 아스파라긴 잔기는 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 87, 130 및 182의 아스파라긴 잔기는 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 87, 182 및 274의 아스파라긴 잔기는 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 130, 182 및 274의 아스파라긴 잔기는 돌연변이화된다. 추가의 또 다른 특정 측면에서, 위치 87, 130, 182 및 274의 아스파라긴 잔기는 돌연변이화된다.
애플리버셉트는 고체 지지체, 예컨대, 크로마토그래피 비드에 고정된 IdeS에 의해 절단될 수 있다. 예를 들어, 완충처리된 수용액 중 (절단 완충제 중) 애플리버셉트를 포함하는 샘플을 예컨대, 크로마토그래피 칼럼에서 고정화된 IdeS에 적용할 수 있다. 칼럼을 예컨대, 약 18℃에서 예컨대, 30분 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 이어서, 칼럼을 절단 완충제로 세척할 수 있다. 절단 후, 분해 및 세척 용액을 단백질 A 칼럼에 적용하여 절단된 Fc 부산물을 포획할 수 있으며, 여기서, 미니-트랩 생성물은 플로우 쓰루 분획에 보유된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 절단 완충제 및/또는 단백질-A 칼럼 평형 및 세척 용액은 pH 7, 예컨대, 40 mM 트리스, 54 mM 아세테이트 pH 7.0 ± 0.1이다.
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
단백질 정제
단독으로 또는 조합하여 친화성, 이온 교환, 혼합 모드, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지 않는 상이한 정제 기술의 조합을 포함하는 방법에 의해 제조된 관심 단백질(예컨대, VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483F 또는 REGN7483R)을 포함하는 조성물은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 구상된다. 한 실시양태에서, 본 방법은 효소적으로 절단되어 REGN7483F를 생성하는 애플리버셉트를 정제하는 단계를 포함한다. 이들 크로마토그래피 단계는 특정 분리 형태에 따라 그의 전하, 소수성의 정도 또는 크기 또는 그의 임의 조합에 기초하여 샘플 매트릭스의 단백질 혼합물을 분리한다. 본원에서 언급된 각 기술에 대해 여러 상이한 크로마토그래피 수지가 이용될 수 있는 바, 이로써, 관여하는 특정 단백질에 맞게 정제 방식을 정확하게 조정할 수 있다. 각 분리 방법은 단백질을 칼럼을 통해 상이한 속도로 횡단하게 하여 칼럼을 더 통과하거나, 또는 분리 매질에 선택적으로 부착됨에 따라 증가하는 물리적 분리를 달성한다. 이어서, 단백질은 (i) 적절한 용리 완충제를 사용하여 차등적으로 용리되고/거나, (ii) 임의적으로, 적절한 평형 완충제로 칼럼을 세척하여 사용된 칼럼으로부터 수득된 플로우 쓰루 분획으로부터 수집된다. 일부 경우에, 불순물이 칼럼에 우선적으로 부착되어 관심 단백질이 덜 부착되는 경우, 즉, 관심 단백질이 특정 칼럼의 고체상에 흡착되지 못하고, 이로써, 칼럼을 통과하는 경우, 관심 단백질이 불순물(단백질 변이체 등)로부터 분리된다. 일부 경우에, 불순물은 칼럼에 흡착되지 못하고, 이로써, 칼럼을 통과하는 경우, 관심 단백질로부터 분리된다.
정제 프로세스는 재조합 단백질이 본원에 기술된 상류 제조 방법을 사용하고/거나, 당업계에서 통상적인 대안적 제조 방법에 의해 제조된 후 분리 단계에서 시작될 수 있다. 일단 관심 단백질, 예컨대, VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483)을 포함하는 정화된 용액 또는 혼합물을 수득하고 나면, 프로세스 관련 불순물(예컨대, 세포(예컨대, HCP)에 의해 생산된 다른 단백질 뿐만 아니라, 산성 또는 염기성 변이체와 같은 생성물 관련 물질)로부터의 관심 단백질의 분리가 수행된다. 특정 비제한적인 실시양태에서, 상기 분리는 CEX, AEX, 및/또는 MM(혼합 모드: mixed mode) 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 특정 실시양태에서, 친화성, 이온 교환, 혼합 모드, 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 비롯한, 하나 이상의 상이한 정제 기술의 조합이 사용될 수 있다. 상기 추가 정제 단계는 예컨대, 그의 전하, 소수성의 정도 및/또는 크기에 기초하여 샘플 매트릭스 내의 성분의 혼합물을 분리한다. 본원에서 언급된 각 크로마토그래피 기술에 대해 다수의 크로마토그래피 수지가 상업적으로 이용될 수 있는 바, 이로써, 관여하는 특정 단백질에 맞게 정제 방식을 정확하게 조정할 수 있다. 각 분리 방법을 통해 단백질은 칼럼을 통해 상이한 속도로 횡단할 수 있고, 이로써 칼럼을 더 통과하거나, 또는 분리 수지(또는 매질)에 선택적으로 부착됨에 따라 증가하는 물리적 분리를 달성할 수 있다. 이어서, 단백질은 적절한 완충제를 사용하여 차등적으로 용리된다. 일부 경우에, 이들 다른 성분이 칼럼의 수지에 특이적으로 부착되고, 관심 단백질은 흡착되지 못하는 경우, 관심 단백질이 샘플 매트릭스의 성분으로부터 분리되는 반면, 다른 경우에, 관심 단백질은 칼럼의 수지에 흡착되는 반면, 다른 성분은 세포 주기 동안 칼럼으로부터 압출된다.
1차 회수 및 바이러스 불활성화
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 정제 방법의 초기 단계는 샘플 매트릭스로부터의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483)의 정화 및 1차 회수를 포함한다. 특정 실시양태에서, 1차 회수는 숙주 세포 및 수반되는 세포 파편으로부터 관심 단백질, 예컨대, VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483)을 분리하는 1회 이상의 원심분리 단계를 포함할 것이다. 샘플의 원심분리는, 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 7,000 x g 내지 대략 12,750 x g로 수행될 수 있다. 대규모 정제와 관련하여, 상기 원심분리는, 예를 들어, 생성된 상청액에서 150 NTU의 탁도 수준을 달성하도록 설정된 유속으로 온-라인에서 발생할 수 있다. 이어서, 상기 상청액은 추가 정제를 위해 수집되거나, 또는 샘플의 추가 정화를 위해 하나 이상의 심층 필터를 통해 인-라인으로 여과될 수 있다.
특정 예시적인 실시양태에서, 1차 회수는 샘플 매트릭스를 정화하고, 이에 따라 본 발명에서 관심 단백질(예컨대, REGN7850, REGN7851, REGN7483)의 정제를 돕기 위해 하나 이상의 심층 여과 단계의 사용을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 1차 회수는 샘플 매트릭스를 추가로 정화시키기 위해 원심분리 후 하나 이상의 심층 여과 단계의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 심층 필터의 비제한적인 예로는 밀리스택(Millistak)+ X0HC, F0HC, D0HC, A1HC, B1HC 심층 필터(EMD 밀리포어), 3M™ 모델 30/60ZA, 60/90 ZA, VR05, VR07, 데리피드(delipid) 심층 필터(3M Corp.)를 포함한다. 전형적으로 0.2 ㎛ 필터 예컨대, 싸토리우스(Sartorius)의 0.45/0.2 ㎛ 싸토포어(Sartopore)™ 이중층 또는 밀리포어(Millipore)의 익스프레스(Express) SHR 또는 SHC 필터 카트리지 뒤로 심층 필터가 이어진다. 당업자에게 널리 공지된 다른 필터 또한 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 1차 회수 프로세스는 또한 샘플 매트릭스에 존재할 수 있는 바이러스를 감소시키거나, 또는 그를 불활성화시키는 지점이 될 수 있다. 예를 들어, 열 불활성화(저온멸균), pH 불활성화, 완충제/계면활성제 처리, UV 및 γ선 조사 및 β-프로피오락톤 또는, 예컨대, 미국 특허 제4,534,972호에 기술되어 있는 구리 페난트롤린을 비롯한, 다양한 바이러스 감소/불활성화 방법 중 임의의 하나 이상의 것이 정제의 1차 회수 단계 동안 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 예시적인 실시양태에서, 샘플 매트릭스는 1차 회수 단계 동안 계면활성제 바이러스 불활성화에 노출된다. 다른 실시양태에서, 샘플 매트릭스는 1차 회수 단계 동안 낮은 pH 불활성화에 노출될 수 있다.
바이러스 감소/불활성화가 이용되는 실시양태에서, 샘플 혼합물은 추가 정제 단계를 위해 필요에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 낮은 pH 바이러스 불활성화 후, 샘플 혼합물의 pH는 전형적으로 정제 프로세스를 계속하기 전, 더 중성인 pH, 예컨대, 약 4.5 내지 약 8.5로 조정된다. 추가로, 혼합물은 원하는 전도도를 얻기 위해 주사용수(WFI: water for injection)로 희석될 수 있다.
예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의 1차 회수, 여과 및/또는 바이러스 불활성화를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다. 예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의, 추후 IdeS 프로테아제로 절단되어 VEGF 미니-트랩을 생성하는 예컨대, 애플리버셉트와 같은 VEGF 트랩의 1차 회수, 여과 및/또는 바이러스 불활성화를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다.
친화성 크로마토그래피
특정 예시적인 실시양태에서, 관심 단백질의 정제를 위해 샘플 매트릭스에 대해 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것이 이로울 수 있다. 특정 실시양태에서, 크로마토그래피 물질은 단백질의 특정 모이어티를 이용하여 관심 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 크로마토그래피 물질의 비제한적인 예로는 단백질 A & 단백질 G를 포함한다. 또한, 예를 들어, 관심 단백질에 결합할 수 있는 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 크로마토그래피 물질. 본 발명의 한 실시양태에서, IdeS로 효소적으로 절단될 수 있는 애플리버셉트는 단백질 A 또는 단백질 G 크로마토그래피에 의해 정제된다. 본 발명의 한 실시양태에서, IdeS 절단에 의해 애플리버셉트로부터 제거된 Fc 단편은 단백질 A 또는 단백질 G 크로마토그래피에 의해 미니-트랩을 포함하는 샘플로부터 제거된다.
특정 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피는 샘플 매트릭스를 적합한 단백질 A 수지를 포함하는 칼럼에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 단백질 A 수지는 해당 영역을 가져야만 하는 오염 분자의 Fc 부분과 특이적으로 상호작용함으로써(여기서, 단백질 A에의 친화성이 결여된 미니-트랩은 플로우 쓰루 분획에 존재한다) 다양한 VEGF 미니-트랩 이소타입의 친화성 정제 및 단리에 유용하다. 단백질 A는 주로 Fc 영역을 통해 포유동물 IgG에 결합하는 박테리아 세포벽 단백질이다. 그의 천연 상태에서, 단백질 A는 5개의 IgG 결합 도메인 뿐만 아니라, 기능이 공지되지 않은 다른 도메인을 갖는다. 구체적인 실시양태에서, 친화성 크로마토그래피 단계는 1차 회수 샘플을 관심 항-단백질 항체를 포함하는 칼럼에 적용하는 것을 포함한다.
단백질 A 수지에 대한 여러 상업적 공급원이 있다. 하나의 적합한 수지는 GE 헬스케어(GE Healthcare)로부터의 맙셀렉트(MabSelect)™이다. 적합한 수지로는 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)™, 맙셀렉트 슈어 LX, 맙셀렉트, 맙셀렉트 X트라(MabSelect Xtra), GE 헬스케어로부터의 r프로테인 A 세포로스(rProtein A Sepharose), EMD 밀리포어(EMD Millipore)로부터의 프로셉(ProSep) HC, 프로셉 울트라(ProSep Ultra), 및 프로셉 울트라 플러스(ProSep Ultra Plus), 라이프 테크놀러지즈(Life Technologies)로부터의 맙캡쳐(MapCapture)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 맙셀렉트™로 패킹된 적합한 칼럼의 비제한적인 예는 약 1.0 cm(직경) x 약 21.6 cm(길이)의 칼럼(17 mL 베드 부피)이다. 상기 크기의 칼럼은 소규모 정제에 사용할 수 있으며, 규모 확장에 사용되는 다른 칼럼과 비교될 수 있다. 예를 들어, 베드 부피가 약 6.6 L인 20 cm x 21 cm 칼럼은 더 큰 정제에 사용될 수 있다. 적합한 칼럼으로는 수지, 예컨대, 맙셀렉트™ 슈어 또는 유사 수지를 포함할 수 있다.
친화성 칼럼은 샘플 로딩 전에 적합한 완충제로 평형화될 수 있다. 칼럼을 로딩한 후, 적합한 완충제를 사용하여 칼럼을 1회 또는 다회 세척할 수 있다. 일단 로딩하고 나면, 적절한 용리 완충제를 사용하여 칼럼을 용리시킬 수 있다. 예를 들어, 글리신-HCL, 아세트산, 또는 시트르산이 용리 완충제로서 사용될 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 기술, 예컨대, UV 검출기를 사용하여 모니터링할 수 있다. 관심 용리액 분획을 수집한 후, 이어서, 추가 프로세싱을 위해 준비될 수 있다.
한 측면에서, 용리액에 대해 예컨대, 계면활성제 또는 낮은 pH에 의해 바이러스 불활성화를 수행할 수 있다. 원하는 바이러스 불활성화 결과를 수득하기 위해 적합한 계면활성제 농도 또는 pH(및 시간)를 선택할 수 있다. 바이러스 불활성화 후, 일반적으로 후속 정제 단계를 위해 용리액의 pH 및/또는 전도도를 조정한다.
추가 크로마토그래피 폴리싱 단계 전에 관심 단백질로부터 탁도 및/또는 다양한 불순물을 제거하기 위해 용리액에 대해 심층 필터를 통해 여과를 수행할 수 있다. 심층 필터의 예로는 밀리스택+ XOHC, FOHC, DOHC, AIHC, X0SP, 및 BIHC 포드(Pod) 필터(EMD 밀리포어), 또는 제타 플러스(Zeta Plus) 30ZA/60ZA, 60ZA/90ZA, 데리피드, VR07, 및 VR05 필터(3M)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 엠파즈 AEX 하이브리드 퓨리파이어(Emphaze AEX Hybrid Purifier) 다중 기전 필터 또한 용리액을 정화시키는 데 사용될 수 있다. 용리액 풀은 심층 여과 단계로부터 원하는 불순물 제거 및 생성물 회수를 위해 적절한 pH 및 전도도로 조정될 필요가 있을 수 있다.
VEGF 미니-트랩에 결합할 수 있는 포획 모이어티, 예컨대, VEGF, VEGF165, 항VEGFR 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항VEGFR1 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 항VEGFR2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 다른 친화성 정제 수지.
예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의 (예컨대, 플로우 쓰루 모드로 수행된 바와 같이) 친화성 정제를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다. 예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의, 추후 IdeS 프로테아제로 절단되어 VEGF 미니-트랩을 생성하는 예컨대, 애플리버셉트와 같은 VEGF 트랩의 (예컨대, 결합-및-용리 모드로 수행된 바와 같이) 친화성 정제를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 친화성 칼럼을 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline), 예컨대, 둘베코스 포스페이트 완충처리된 염수로 세척한다.
음이온 교환 크로마토그래피
특정 실시양태에서, 샘플 매트릭스에 대해 적어도 하나의 음이온 교환 분리 단계를 수행함으로써 미니 트랩을 제조한다. 한 측면에서, 음이온 교환 단계는 상기 기술된 친화성 크로마토그래피, 예컨대, 단백질-A 친화성 후에 이루어질 것이다. 특정 다른 실시양태에서, 음이온 교환 단계는 상기 기술된 친화성 크로마토그래피, 예컨대, 단백질-A 친화성 전에 이루어질 것이다. 특정 다른 실시양태에서, 음이온 교환 단계는 상기 기술된 친화성 크로마토그래피, 예컨대, 단백질-A 친화성 전후로 두 시점 모두에서 이루어질 것이다.
양이온 교환 물질, 예컨대, 본원에서 상세히 논의된 양이온 교환 물질 대비 음이온 교환 물질의 사용은 적합한 조건하에서의 관심 단백질의 국부 전하에 기초한다. 음이온 교환 크로마토그래피는 다른 크로마토그래피 절차와 함께 조합하여 사용될 수 있다.
분리를 수행할 때, 다양한 기술 중 임의의 것을 사용함으로써, 예컨대, 배치 정제 기술 또는 크로마토그래피 기술을 사용하여 초기 단백질 조성물(샘플 매트릭스)을 음이온 교환 물질과 접촉시킬 수 있다.
예를 들어, 배치 정제와 관련하여, 음이온 교환 물질은 원하는 출발 완충제 중에서 제조되거나, 또는 그로 평형화된다. 제조 또는 평형화시, 음이온 교환 물질의 슬러리가 수득된다. 관심 단백질, 예컨대, VEGF 미니-트랩, 용액을 슬러리와 접촉시켜 단백질을 음이온 교환 물질에 흡착시킨다. AEX 물질에 결합하지 않는 산성 종을 포함하는 용액은, 예컨대, 슬러리를 침전시키고, 상청액을 제거함으로써 슬러리로부터 분리된다. 슬러리에 대해 하나 이상의 세척 단계 및/또는 용리 단계를 수행할 수 있다.
크로마토그래피 분리와 관련하여, 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 크로마토그래피 지지 물질(수지 또는 고체상)을 하우징한다. 관심 단백질을 포함하는 샘플 매트릭스를 분리를 위해 특정 크로마토그래피 칼럼에 로딩한다. 이어서, 적합한 완충제를 사용하여 칼럼에 대해 하나 이상의 세척 단계를 수행할 수 있다. 수지에 흡착되지 않은 샘플 매트릭스의 성분은 가능하게는 칼럼을 통과할 것이다. 수지에 흡착된 성분은 적절한 완충제를 사용하여 차등적으로 용리될 수 있다.
특정 실시양태에서, 세척 단계는 AEX 크로마토그래피와 관련하여 로딩 조건과 유사한 조건을 사용하거나, 또는 대안적으로, 단계식으로 또는 선형 구배 방식으로 pH를 감소시키고/거나, 세척의 이온 강도/전도도를 증가시킴으로써 수행될 수 있다. 특정 예시적인 실시양태에서, 로딩 및 세척 완충제 둘 모두에 사용되는 염 수용액은 관심 단백질의 등전점(pI: isoelectric point) 또는 그 근처에 있는 pH를 갖는다. 특정 예시적인 실시양태에서, pH는 관심 단백질의 pI보다 약 0 내지 2 단위 더 높거나, 또는 낮다. 특정 예시적인 실시예에서, 0 내지 0.5 단위 더 높거나 더 낮은 범위에 있을 것이다. 특정 예시적인 실시양태에서, 관심 단백질의 pI에 있을 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)을 함유하는 샘플을 적용하고, VEGF 미니-트랩이 AEX 플로우 쓰루 분획 중에 보유된 후, AEX 크로마토그래피 칼럼을 (i) pH 8.40 및 2.00 mS/cm 세척 완충제, (ii) pH 8.00 및 2.50 mS/cm 세척 완충제 또는 (iii) pH 7.80 및 4.00 mS/cm 세척 완충제로 세척한다. 세척 완충제는 칼럼 통과 후 보유된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세척 완충제는 트리스(예컨대, 50 mM), 및 임의적으로, NaCl을 함유한다. 본 발명의 한 실시양태에서, AEX 칼럼은 NaCl(예컨대, 2 M NaCl)로 미리 평형화된다. 본 발명의 한 실시양태에서, AEX 칼럼은 세척 완충제로 평형화된다.
특정 비제한적인 실시양태에서, 음이온성 작용제는 아세테이트, 클로라이드, 포르메이트, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 비제한적인 실시양태에서, 양이온성 작용제는 트리스, 아르기닌, 나트륨, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 완충제 용액은 트리스/포르메이트 완충제이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 완충제는 피리딘, 피페라진, L-히스티딘, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 이미다졸, N-에틸모르폴린, TEA(트리에탄올아민), 트리스, 모르폴린, N-메틸디에탄올아민, AMPD(2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올), 디에탄올아민, 에탄올아민, AMP(2-아미노-2-메틸-1-프로판올), 피페라진, 1,3-디아미노프로판 및 피페리딘으로 구성된 군으로부터 선택된다.
패킹된 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼, 음이온 교환 막 장치, 음이온 교환 모놀리식 장치, 또는 심층 필터 매질은 생성물이 크로마토그래피 물질에 대한 결합을 나타내지만, 로딩 완충제와 동일하거나, 또는 실질적으로 유사한 완충제를 사용하여 칼럼으로부터 세척될 수 있는 결합-용리 모드, 플로우 쓰루 모드, 또는 하이브리드 모드로 작동될 수 있다. 결합-용리 모드에서, 칼럼 또는 막 장치는 먼저 특정 단백질이 수지 기반 매트릭스에 흡착되는 조건하에 적절한 이온 강도 및 pH를 갖는 완충제로 조절된다. 예를 들어, 피드 로드 동안, 관심 단백질은 정전기적 인력으로 인해 수지에 흡착될 것이다. 평형 완충제 또는 상이한 pH 및/또는 전도도를 갖는 또 다른 완충제로 칼럼 또는 막 장치를 세척한 후, 생성물 회수는 용리 완충제의 이온 강도(즉, 전도도)를 증가시켜 음이온 교환 매트릭스의 하전된 부위에 대해 용질과 경쟁함으로써 달성된다. pH를 변경하여 용질의 전하를 변경시키는 것은 용질의 용리를 달성하기 위한 또 다른 방식이다. 전도도 또는 pH의 변화는 점진적(구배 용리) 또는 단계적(단계 용리)일 수 있다. 플로우 쓰루 모드에서, 칼럼 또는 막 장치는 관심 단백질이 수지 또는 막에 결합하지 않지만, 산성 종은 칼럼에 보유되거나, 또는 관심 단백질과 비교하여 뚜렷한 용리 프로파일을 갖게 되도록 하는 선택된 pH 및 전도도에서 작동된다. 상기 하이브리드 전략법과 관련하여, 산성 종은 관심 단백질과 다른 방식으로 크로마토그래피 물질에 결합(또는 통과)하는 반면, 예컨대, 관심 단백질 및 관심 단백질의 특정 응집체 및/또는 단편은 크로마토그래피 물질에 결합할 수 있고, 관심 있는 단백질을 우선적으로 제거는 세척이 적용될 수 있다. 이어서, 칼럼은 다음 사용 전에 재생된다.
음이온 교환 수지의 비제한적인 예는 디에틸아미노에틸(DEAE), 4급 아미노에틸(QAE) 및 4급 아민(Q) 기를 포함한다. 추가의 비제한적인 예로는 가교된 폴리[스티렌-디비닐벤젠]으로 구성된 백본을 갖는 경질 중합체 비드인, 포로스(Poros) 50PI 및 포로스 50HQ; 고유량 아가로스 비드인 캅토 Q 임프레스(Capto Q Impres) 및 캅토 DEAE; 중합체 기반 비드인 토요펄(Toyopearl) QAE-550, 토요펄 DEAE-650, 및 토요펄 기가캡(Toyopearl GigaCap) Q-650; 촉수형 이온 교환체가 있는 합성 중합체 수지인 프락토겔® EMD TMAE 하이캡(Fractogel® EMD TMAE Hicap); 1급 아민 리간드를 갖는 염 내성 크로마토그래피 막인 사르토바인드(Sartobind) STIC® PA 나노; 강한 음이온 교환 크로마토그래피 막인 사르토바인드 Q 나노; 무기 필터 보조제, 정제된 셀룰로스 및 이온 교환 수지로 구성된 제타-플러스 심층 필터 매질인 CUNO 바이오캡(BioCap); 및 무기 필터 보조제, 셀룰로스, 및 혼합 셀룰로스 에스테르로부터 구성된 심층 필터 매질인 XOHC를 포함한다.
특정 실시양태에서, 관심 단백질을 포함하는 혼합물의 단백질 로드는 약 50 내지 500 g/L, 또는 약 75 내지 350 g/L, 또는 약 200 내지 300 g/L의 칼럼에 대한 총 단백질 로드로 조정된다. 특정 예시적인 실시양태에서, 로드 단백질 혼합물의 단백질 농도는 약 0.5 내지 50 g/L, 약 1 내지 20 g/L, 또는 3 내지 10 g/L의 칼럼으로 로딩된 물질의 단백질 농도로 조정된다. 특정 예시적인 실시양태에서, 로드 단백질 혼합물의 단백질 농도는 약 37 g/L의 칼럼에 대한 물질의 단백질 농도로 조정된다.
특정 예시적인 실시양태에서, 더 우수한 회수 또는 생성물 품질을 달성하기 위하여 분리의 성능을 증진시키기 위해 첨가제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 계면활성제, 아미노산, 당, 카오트로픽제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 방법은 이온 교환의 경우 용리 분획 또는 스트립에서 동일한 것을 농축하면서, 플로우 쓰루에서 단백질 변이체의 적어도 10%를 선택적으로 제거하거나, 유의적으로 감소시키거나, 또는 본질적으로 제거하여, 이에 의해 단백질 변이체가 감소되거나, 또는 단백질 변이체가 본질적으로 없는 단백질 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 단백질 변이체는 하기와 같은 하나 이상의 잔기의 변형을 포함할 수 있다: 하나 이상의 아스파라긴이 탈아마이드화되고/거나; 하나 이상의 아스파르트산이 아스파테이트-글리신 및/또는 Asn-Gly로 전환되고/거나; 하나 이상의 메티오닌이 산화되고/거나; 하나 이상의 트립토판이 N-포르밀키누레닌으로 전환되고/거나; 하나 이상의 트립토판이 모노-하이드록실 트립토판이고/거나; 하나 이상의 트립토판은 디-하이드록실 트립토판이고/거나; 하나 이상의 트립토판은 트리-하이드록실 트립토판이고/거나; 하나 이상의 아르기닌은 Arg 3-데옥시글루코손으로 전환되고/거나; C-말단 글리신은 존재하지 않고/거나; 하나 이상의 비글리코실화된다 글리코사이트가 존재한다.
특정 예시적인 실시양태에서, 애플리버셉트 또는 VEGF 미니-트랩의 단백질 변이체는 (i) 예컨대, His86, His110, His145, His209, His95, His19 및/또는 His203으로부터 선택되는 히스티딘 잔기로부터의 산화된 히스티딘; (ii) 예컨대, Trp58 및/또는 Trp138의 트립토판 잔기로부터 선택되는 산화된 트립토판 잔기; (iii) 예컨대, Tyr64의 산화된 티로신 잔기; (iv) 예컨대, Phe44 및/또는 Phe166으로부터 선택되는 산화된 페닐알라닌 잔기; 및/또는 (v) 예컨대, Met10, Met 20, Met163 및/또는 Met192로부터 선택되는 산화된 메티오닌 잔기 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 상기 산화된 히스티딘은 비바람직한 갈황색 색상과 상관관계가 있다.
예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의 (예컨대, 플로우 쓰루 모드로 수행된 바와 같이) AEX 크로마토그래피를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다. 예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의, 추후 IdeS 프로테아제로 절단되어 VEGF 미니-트랩을 생성하는 예컨대, 애플리버셉트와 같은 VEGF 트랩의 AEX 크로마토그래피를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다.
양이온 교환 크로마토그래피
본 발명의 조성물은 조성물, 예컨대, 1차 회수 샘플에 대해 적어도 하나의 양이온 교환(CEX) 분리 단계를 수행함으로써 제조될 수 있다. 특정 예시적인 실시양태에서, CEX 단계는 상기 기술된 AEX 이전 또는 이후에 이루어질 것이다. 추가로, CEX 단계는 정제 절차 기간 내내 이루어질 것이다.
음이온 교환 물질, 예컨대, 본원에서 논의된 양이온 교환 물질 대비 양이온 교환 물질의 사용은 주어진 용액 중에서의 관심 단백질의 국부 전하에 기초한다. 그러므로, 음이온 교환 단계를 사용하기 전에 양이온 교환 단계를 사용하거나, 또는 양이온 교환 단계를 사용하기 전에 음이온 교환 단계를 사용하는 것이 본 발명의 범주 내에 있다. 추가로, 양이온 교환 단계만, 음이온 교환 단계만, 또는 그 둘의 임의의 연속 조합(본원에 기술된 다른 크로마토그래피 분리 기술과 한 이온 교환 단계 또는 그 둘의 연속 조합 포함)을 사용하는 것이 본 발명의 범주 내에 있다.
분리를 수행할 때, 단백질 A 또는 AEX와 관련하여 상기 기술된 바와 같이, 다양한 기술 중 임의의 것을 사용함으로써, 예컨대, 배치 정제 기술 또는 크로마토그래피 기술을 사용하여 초기 단백질 혼합물을 양이온 교환 물질과 접촉시킬 수 있다.
특정 예시적인 실시양태에서, 로딩 및 세척 완충제 둘 모두로 사용되는 염 수용액은 관심 단백질의 등전점보다 낮은 pH를 갖는다. 특정 예시적인 실시양태에서, pH는 단백질의 pI보다 약 0 내지 5 단위 더 낮다. 특정 예시적인 실시예에서, 1 내지 2 단위 범위로 더 낮다. 특정 예시적인 실시양태에서, 1 내지 1.5 단위 범위로 더 낮다.
특정 예시적인 실시양태에서, 염 수용액 중 음이온성 작용제의 농도는 약 3.5 내지 10.5, 또는 약 4 내지 10, 또는 약 4.5 내지 9.5, 또는 약 5 내지 9, 또는 약 5.5 내지 8.5, 또는 약 6 내지 8, 또는 약 6.5 내지 7.5의 pH를 달성하기 위해 증가 또는 감소된다. 특정 예시적인 실시양태에서, 음이온성 작용제의 농도는 pH 5, 또는 5.5, 또는 6, 또는 6.5, 또는 6.8, 또는 7.5를 달성하기 위해 증가 또는 감소된다. CEX 방법에 사용하기에 적합한 완충제 시스템으로는 트리스 포르메이트, 트리스 아세테이트, 황산암모늄, 염화나트륨, 및 황산나트륨을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 예시적인 실시양태에서, 염 수용액의 전도도 및 pH는 양이온성 작용제의 농도를 증가 또는 감소시킴으로써 조정된다. 특정 예시적인 실시양태에서, 양이온성 작용제는 20 mM 내지 500 mM, 약 50 mM 내지 350 mM, 약 100 내지 300 mM, 또는 약 100 mM 내지 200 mM 범위의 농도로 유지된다. 특정 비제한적인 실시양태에서, 양이온성 작용제는 나트륨, 트리스, 트로메타민, 암모늄, 아르기닌, 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 비제한적인 실시양태에서, 음이온성 작용제는 포르메이트, 아세테이트, 시트레이트, 클로라이드 음이온, 술페이트, 포스페이트 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
패킹된 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼 또는 양이온 교환 막 장치는 생성물이 크로마토그래피 물질에 대한 결합을 나타내지만, 로딩 완충제와 동일하거나, 또는 실질적으로 유사한 완충제를 사용하여 칼럼으로부터 세척될 수 있는 결합-용리 모드, 플로우 쓰루 모드, 또는 하이브리드 모드로 작동될 수 있다. 상기 모드에 대한 상세한 설명은 상기에 개략적으로 제시되어 있다.
양이온성 치환기는 카복시메틸(CM), 술포에틸(SE), 술포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 술포네이트(S)를 포함한다. 추가의 양이온성 물질은 고유량 아가로스 비드인 캅토 SP 임프레스; 250 내지 400 이온기 μeq/mL의 작용화된 하이드로겔로 코팅되고, 침투된 세라믹 비드인 CM 하이퍼(Hyper) D 등급 F; 50 내지 100 μeq/mL의 이온 용량을 갖는 친수성 폴리비닐 에테르 기반 매트릭스인 에쉬무노(Eshmuno) S; 거대다공성의 고도로 가교된 친수성 중합체 매트릭스 55 내지 75 με/mL로 구성된 소수성 양이온 교환 매질인 누비아 C 프라임(Nuvia C Prime); 90 내지 150 με/mL 이온기가 있는 UNO스피어(UNOsphere) 기반 매트릭스를 갖는 것인 누비아 S; 가교된 폴리[스티렌-디비닐벤젠]으로 구성된 백본을 갖는 경질 중합체 비드인 포로스 HS; 가교된 폴리[스티렌 디비닐-벤젠]으로 구성된 백본을 갖는 경질 중합체 비드인 포로스 XS; 0.225 meq/mL 이온 용량을 갖는 중합체 기반 비드인 토요 펄 기가 캡 CM 650M; 중합체 기반 비드인 토요 펄 기가 캡 S 650M; 중합체 기반 비드인 토요 펄 MX TRP를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. CEX 크로마토그래피는 본원에 기술된 MM 수지와 함께 사용될 수 있다는 점에 주목한다.
특정 예시적인 실시양태에서, 관심 단백질(예컨대, VEGF 미니-트랩)을 포함하는 혼합물의 단백질 로드는 약 5 내지 150 g/L, 또는 약 10 내지 100 g/L, 약 20 내지 80 g/L, 약 30 내지 50 g/L, 또는 약 40 내지 50 g/L의 칼럼에 대한 총 단백질 로드로 조정된다. 특정 예시적인 실시양태에서, 로드 단백질 혼합물의 단백질 농도는 약 0.5 내지 50 g/L, 또는 약 1 내지 20 g/L의 칼럼으로 로딩된 물질의 단백질 농도로 조정된다.
특정 예시적인 실시양태에서, 더 우수한 회수 또는 생성물 품질을 달성하기 위하여 분리의 성능을 증진시키기 위해 첨가제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 계면활성제, 아미노산, 당, 카오트로픽제가 첨가될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 관심 단백질이 본질적으로 CEX 단계의 플로우 쓰루에 존재하는 반면, 옥소-변이체는 칼럼 매질에 의해 실질적으로 포획되는 샘플 중 변이체를 선택적으로 제거하거나, 유의적으로 감소시키거나, 또는 본질적으로 그들 모두를 제거하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, CEX에 예컨대, 20 mM 아세테이트, pH 5.0과 같은 pH 5.0의 로딩 완충제 중 VEGF 미니-트랩을 함유하는 샘플을 로딩한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 칼럼을 또한 로딩 완충제로 세척한다. 세척은 예컨대, 10 mM 포스페이트, pH 7.0과 같은 pH 7.0 세척 완충제로 수행될 수 있다. CEX 칼럼으로부터의 VEGF 미니-트랩의 용리는 예컨대, 50 mM 트리스, 62.5 mM (NH4)2SO4, pH 8.5와 같은 (NH4)2SO4, 예컨대, pH 8.5로 수행될 수 있다.
예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의 CEX 크로마토그래피를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다. 예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의, 추후 IdeS 프로테아제로 절단되어 VEGF 미니-트랩을 생성하는 예컨대, 애플리버셉트와 같은 VEGF 트랩의 CEX 크로마토그래피를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다.
혼합 모드 크로마토그래피
혼합 모드("MM") 크로마토그래피 또한 본 발명의 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 "다중모드 크로마토그래피"로도 지칭되는 MM 크로마토그래피는 결합되는 물질과 적어도 2개의 상이한 상호작용을 제공할 수 있는 리간드를 포함하는 지지체를 이용하는 크로마토그래피 전략법이다. 특정 예시적인 실시양태에서, 이들 부위 중 하나는 리간드와 관심 물질 사이에 관심의 대상이 되는 타입의 전하-전하 상호작용을 제공하고, 다른 부위는 전자 수용자-공여자 상호작용 및/또는 소수성 및/또는 친수성 상호작용을 제공한다. 전자 공여자-수용자 상호작용은 예컨대, 수소-결합, π-π, 양이온-π, 전하 이동, 쌍극자-쌍극자, 유도 쌍극자 등과 같은 상호작용을 포함한다.
특정 실시양태에서, 혼합 모드 분리에 이용되는 칼럼 수지는 캅토 어드히어(Capto Adhere)이다. 캅토 어드히어는 다중모드 관능성을 갖는 강한 음이온 교환체이다. 그의 기본 매트릭스는 예컨대, 이온 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용과 같은 상호작용에 대하여 상이한 관능성을 나타내는 리간드(N-벤질-N-메틸 에탄올 아민)가 있는 고도로 가교된 아가로스이다. 특정 측면에서, 혼합 모드 분리에 사용되는 수지는 PPA-하이퍼셀(HyperCel) 및 HEA-하이퍼셀로부터 선택된다. PPA-하이퍼셀 및 HEA-하이퍼셀의 기본 매트릭스는 높은 다공성 가교된 셀룰로스이다. 그의 리간드는 각각 페닐프로필아민 및 헥실아민이다. 페닐프로필아민 및 헥실아민은 단백질 분리를 위한 상이한 선택성 및 소수성 옵션을 제공한다. 추가적인 혼합 모드 크로마토그래피 지지체는 누비아 C 프라임, 토요 펄 MX Trp 650M, 및 에쉬무노® HCX를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 측면에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 때때로 직접적으로 또는 스페이서를 통해 기본 매트릭스로 제시되는 유기 또는 무기 지지체에 커플링된 리간드로 구성된다. 지지체는 예컨대, 본질적으로 구형 입자, 모노리스, 필터, 막, 표면, 모세관 등과 같은 입자 형태일 수 있다. 특정 측면에서, 지지체는 천연 중합체, 예컨대, 가교된 탄수화물 물질, 예컨대, 아가로스, 아가, 셀룰로스, 덱스트란, 키토산, 곤약, 카라기난, 젤란, 알기네이트 등으로부터 제조된다. 높은 흡착 능력을 얻기 위해, 지지체는 다공성일 수 있으며, 이어서, 리간드는 외부 표면 뿐만 아니라, 기공 표면에 커플링된다. 상기 천연 중합체는 예컨대, 역 현탁 겔화(문헌 [S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964)])와 같은 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 대안적으로, 지지체는 합성 중합체, 예컨대, 가교된 합성 중합체, 예컨대, 스티렌 또는 스티렌 유도체, 디비닐벤젠, 아크릴아미드, 아크릴레이트 에스테르, 메타크릴레이트 에스테르, 비닐 에스테르, 비닐 아미드 등으로 제조될 수 있다. 상기 합성 중합체는 표준 방법에 따라 제조될 수 있으며, 예컨대, 문헌 ["Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988))]을 참조한다. 다공성 천연 또는 합성 중합체 지지체 또한 상업적 공급원, 예컨대, GE 헬스케어(스웨덴 웁살라 소재)로부터 이용가능하다.
특정 실시양태에서, 관심 단백질을 포함하는 혼합물의 단백질 로드는 약 25 내지 750 g/L, 또는 약 75 내지 500 g/L, 또는 약 100 내지 300 g/L의 칼럼에 대한 총 단백질 로드로 조정된다. 특정 예시적인 실시양태에서, 로드 단백질 혼합물의 단백질 농도는 약 1 내지 50 g/L, 또는 약 9 내지 25 g/L의 칼럼으로 로딩된 물질의 단백질 농도로 조정된다.
특정 실시양태에서, 더 우수한 회수 또는 생성물 품질을 달성하기 위하여 분리의 성능을 증진시키기 위해 첨가제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 계면활성제, 아미노산, 당, 카오트로픽제가 첨가될 수 있다.
본 발명의 방법은 스트리핑된 분획 중 예컨대, 2-옥소-히스티딘 포함 단백질과 같은 PTM에 대해서는 농축시키면서, 플로우 쓰루 분획 중 그를 선택적으로 제거하거나, 유의적으로 감소시키거나, 또는 본질적으로 그들 모두를 제거하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물을 제조하는 방법은 또한 연속 크로마토그래피 모드로 실행될 수 있다. 상기 모드에서, 적어도 2개의 칼럼이 이용된다("제1" 칼럼 및 "제2" 칼럼으로 지칭). 특정 예시적인 실시양태에서, 상기 연속 크로마토그래피 모드는 이어서, 예컨대, 2-옥소-히스티딘 포함 단백질과 같은 PTM을 더 높은 수준으로 함유하는 용리된 분획 및/또는 스트리핑된 분획을 후속적으로 또는 동시에 제2 칼럼(희석하에 또는 희석 없이)에 로딩할 수 있도록 수행될 수 있으며, 이로써, 두 칼럼의 작동은 동시에 수행되지 않음으로써 작동의 복잡성은 감소된다.
한 실시양태에서, 연속 모드에 대한 매질 선택은 펜던트 소수성 및 음이온 교환 작용기가 있는 많은 크로마토그래피 수지, 모놀리식 매질, 막 흡착 매질 또는 심층 여과 매질 중 하나일 수 있다.
예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의 MM 크로마토그래피를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다. 예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의, 추후 IdeS 프로테아제로 절단되어 VEGF 미니-트랩을 생성하는 예컨대, 애플리버셉트와 같은 VEGF 트랩의 MM 크로마토그래피를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다.
소수성 상호작용 크로마토그래피
본 발명의 조성물은 또한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC: hydrophobic interaction chromatography)를 사용하여 제조될 수 있다.
분리를 수행할 때, 예컨대, 배치 정제 기술을 사용하여 또는 칼럼 또는 막 크로마토그래피를 사용하여 샘플 혼합물을 HIC 물질과 접촉시킨다. HIC 정제 전, 수지 또는 막에의 원하는 단백질 결합을 달성하기 위해 염 완충제의 농도를 조정하는 것이 바람직할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피는 선택적 분리를 위해 관심 단백질의 국부 전하에 의존하는 반면, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 선택적 분리를 달성하기 위해 단백질의 소수성 특성을 이용한다. 단백질 상의 소수성 기는 수지 또는 막의 소수성 기와 상호작용한다. 단백질 소수성이 클수록, 적합한 조건하의 칼럼 또는 막과 더 강력하게 상호작용할 것이다. 따라서, 적합한 조건하에, HIC는 프로세스-관련 불순물(예컨대, HCP) 뿐만 아니라, 생성물 관련 물질(예컨대, 응집체 및 단편)을 제거하는 데 사용될 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피와 같이, HIC 칼럼 또는 HIC 막 장치는 생성물이 크로마토그래피 물질에 대한 결합을 나타내지만, 로딩 완충제와 동일하거나, 또는 실질적으로 유사한 완충제를 사용하여 칼럼으로부터 세척될 수 있는 용리 모드, 플로우 쓰루, 또는 하이브리드 모드로 생성물에서 작동될 수 있다(이들 모두에 대한 상세한 설명은 AEX 정제와 관련하여 본원에서 개략적으로 제시되어 있다). 소수성 상호작용은 높은 이온 강도에서 가장 강하기 때문에, 이러한 형태의 분리는 전형적으로 이온 교환 크로마토그래피와 관련하여 사용되는 것과 같은 염 용리 단계 후에 편리하게 수행된다. 대안적으로, 염은 이 단계 전에 낮은 염 수준의 피드 스트림에 첨가될 수 있다. HIC 칼럼에의 VEGF 미니-트랩의 흡착은 높은 염 농도에 의해 선호되지만, 실제 농도는 관심 단백질의 성질, 염 타입 및 선택된 특정 HIC 리간드에 따라 넓은 범위에 걸쳐 달라질 수 있다. 다양한 이온은 소수성 상호작용을 촉진시키는지(염석 효과) 또는 물의 구조를 파괴시켜(카오트로픽 효과) 소수성 상호작용의 약화를 유도하는지 여부에 따라 소위 소용질성 시리즈로 배열될 수 있다. 양이온은 염석 효과 증가 측면에서 Ba2 +; Ca2 +; Mg2 +; Li+; Cs+; Na+; K+; Rb+; NH4+로 순위화되는 반면, 음이온은 카오트로픽 효과 증가 측면에서 PO4 3-; SO4 2-; CH3CO3 -; Cl-; Br-; NO3 -; ClO4 -; I-; SCN-으로 순위화될 수 있다.
일반적으로, Na+, K+ 또는 NH4+ 술페이트는 HIC를 사용하여 리간드-단백질 상호작용을 효과적으로 촉진시킨다. 하기 관계로 제공되는 바와 같이 상호작용의 강도에 영향을 미치는 염을 제제화할 수 있다: (NH4)2SO4 > Na2SO4 > NaCl > NH4Cl > NaBr > NaSCN. 일반적으로, 약 0.75 M 내지 약 2 M 황산암모늄 또는 약 1 내지 4 M NaCl인 염 농도가 유용하다.
HIC 매질은 일반적으로 소수성 리간드(예컨대, 알킬 또는 아릴 기)가 커플링되는 기본 매트릭스(예컨대, 가교된 아가로스 또는 합성 공중합체 물질)를 포함한다. 적합한 HIC 매질은 페닐 기로 작용화된 아가로스 수지 또는 막(예컨대, GE Healthcare로부터의 Phenyl Sepharose™ 또는 Sartorius로부터의 Phenyl Membrane)을 포함한다. 많은 HIC 수지가 상업적으로 이용가능하다. 예로는 캅토 페닐, 낮거나 또는 높은 치환도를 갖는 페닐 세파로스™ 6 패스트 플로우(Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow), 페닐 세파로스™ 하이 퍼포먼스(Phenyl Sepharose™ High Performance), 옥틸 세파로스™ 하이 퍼포먼스(Octyl Sepharose™ High Performance)(GE 헬스케어); 프락토겔™ EMD 프로필 또는 프락토겔™ EMD 페닐(E. Merck: 독일 소재); 마크로-프렙™ M에틸(Macro-Prep™ Methyl) 또는 마크로-프렙™ t-부틸(Macro-Prep™ t-Butyl) 칼럼(Bio-Rad: 미국 캘리포니아 소재); WP HI-프로필(C3)™(J. T. Baker: 미국 뉴저지 소재); 및 토요펄™ 에테르, 페닐 또는 부틸(TosoHaas: 미국 펜실베이니아주 소재)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의 HIC 크로마토그래피를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다. 예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의, 추후 IdeS 프로테아제로 절단되어 VEGF 미니-트랩을 생성하는 예컨대, 애플리버셉트와 같은 VEGF 트랩의 HIC 크로마토그래피를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다.
바이러스 여과
바이러스 여과는 정제 프로세스에서 전용 바이러스 감소 단계이다. 상기 단계는 일반적으로 크로마토그래피 폴리싱 단계 후에 수행된다. 바이러스 감소는 아사히 카세이 파마(Asahi Kasei Pharma)로부터의 플라노바(Planova) 20N™, 50 N 또는 바이오Ex(BioEx), EMD 밀리포어로부터의 비레솔브(Viresolve)™ 필터, 싸토리우스로부터의 비로사르트(ViroSart) CPV, 또는 팔 코포레이션(Pall Corporation)으로부터의 울티포르(Ultipor) DV20 또는 DV50™ 필터를 포함하나, 이에 제한되지 않는 적합한 필터 사용을 통해 달성될 수 있다. 원하는 여과 성능을 얻기 위해 적합한 필터를 선택하는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의 바이러스 여과를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다. 예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의, 추후 IdeS 프로테아제로 절단되어 VEGF 미니-트랩을 생성하는 예컨대, 애플리버셉트와 같은 VEGF 트랩의 바이러스 여과를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다.
한외여과 / 정용여과
본 발명의 특정 실시양태는 관심 단백질, 예컨대, 미니-트랩을 추가로 농축 및 제제화하기 위해 한외여과 및 정용여과를 사용한다. 한외여과는 문헌 [Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996)]에; 및 [Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762- 456-9)]에 상세하게 기술되어 있다. 한 여과 프로세스는 표제 ["Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp. 177-202 (Bedford, Mass., 1995/96)]하에 밀리포어 카탈로그에 기술되어 있는 바와 같은 접선 유동 여과이다. 한외여과는 일반적으로 공극 크기가 0.1 ㎛보다 작은 필터를 사용하는 여과를 의미하는 것으로 간주된다. 이러한 작은 기공 크기를 갖는 필터를 사용함으로써, 예컨대, VEGF 미니-트랩과 같은 단백질은 막 표면 위에 보유되는 반면, 필터 막 공극을 통한 샘플 완충제의 투과를 통해 샘플의 부피를 감소시킬 수 있다.
당업자는 UF/DF 작업에 적절한 막 필터 장치를 선택할 수 있다. 본 발명에 적합한 막 카세트의 예로는 EMD 밀리포어로부터의, 10 kD, 30kD 또는 50 kD 막을 갖는 펠리컨 2(Pellicon) 또는 펠리컨 3 카세트, GE 헬스케어로부터의, 크빅(Kvick) 10 kD, 30 kD 또는 50 kD 막 카세트, 및 팔 코포레이션으로부터의 센트라메이트(Centramate) 또는 센트라세트(Centrasette) 10 kD, 30 kD 또는 50 kD 카세트를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의 UF 및/또는 DF를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다. 예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은 조건하에서의, 추후 IdeS 프로테아제로 절단되어 VEGF 미니-트랩을 생성하는 예컨대, 애플리버셉트와 같은 VEGF 트랩의 UF 및/또는 DF를 포함하는 정제 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물은 본 발명의 일부이다.
예시적인 정제 방식
특정 예시적인 실시양태에서, 1차 회수는 생산 생물반응기 수확물로부터 세포 및 세포 파편(HCP 포함)을 제거하기 위해 pH 감소, 원심분리 및 여과를 순차적으로 사용함으로써 진행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 1차 회수로부터의 샘플 혼합물에 대해 하나 이상의 AEX, CEX, 및/또는 MM 정제 단계를 수행하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 특정 측면은 추가 정제 단계를 포함할 것이다. 이온 교환 크로마토그래피 방법 이전, 그 동안 또는 그 이후에 수행할 수 있는 추가 정제 절차의 예로는 에탄올 침전, 등전점 포커싱, 크기 배제 크로마토그래피, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스(heparin Sepharose)™ 상에서의 크로마토그래피, 추가 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 추가 양이온 교환 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피(예컨대, 단백질 G 또는 A, 항체, 특정 기질, 리간드 또는 항원을 포획 시약으로서 사용)를 포함한다. 특정 측면에서, 칼럼 온도는 임의의 특정 정제 단계의 분리 효율 및/또는 수율을 개선하기 위해 독립적으로 변할 수 있다.
특정 실시양태에서, 비결합 플로우 쓰루 및 세척 분획은 추가로 분획화될 수 있고, 표적 생성물 순도를 제공하는 분획의 조합이 풀링될 수 있다.
특정 예시적인 실시양태에서, 로딩 & 세척 단계는 표적 생성물 품질 및/또는 수율을 달성하기 위해, 칼럼 폐수 또는 수집된 풀 또는 그 둘 모두에서 생성물 관련 불순물/물질 수준의 인-라인, 엣-라인 또는 오프-라인 측정에 의해 제어될 수 있다. 특정 실시양태에서, 로딩 농도는 분리 효율 및/또는 수율을 개선시키는 데 필요한 분할을 달성하기 위해 완충제 또는 다른 용액을 사용한 인-라인 또는 배치 또는 연속 희석에 의해 동적으로 제어될 수 있다.
상기 정제 절차의 예는 하기와 같다. 본 발명은 상기 정제 프로세스 중 임의의 것의 단계를 포함하는 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩을 포함한다.
(1) 애플리버셉트를 제조하는 방법은
(a) CDM에서 애플리버셉트를 발현하는 단계;
(b) 친화성 포획 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제1 크로마토그래피 지지체를 사용하여 애플리버셉트를 포획하는 단계; 및
단계 (c)(b)의 애플리버셉트의 적어도 일부를, 음이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제2 크로마토그래피 지지체에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
단계 (c)는 제2 크로마토그래피 지지체에 결합하지 않는 애플리버셉트를 함유하는 혼합물의 플로우 쓰루 분획(들)을 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의적으로, 단계 (c)는 제2 크로마토그래피 지지체를 스트리핑하고, 스트리핑된 분획을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 단계는 본원에서 언급된 방법론과 함께 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
다른 추가의 예시적인 실시양태는 (d) 단계 (c)의 상기 애플리버셉트의 적어도 일부를 제3 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 실시양태의 한 측면에서, 제조는 (e) 단계 (d)의 애플리버셉트의 적어도 일부를 제4 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제조는 임의적으로, 단계 (c)의 상기 애플리버셉트를 5.5 미만의 pH에 가하는 것을 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 방법은 임의적으로 상기 포획 단계 (a) 전에 융합 결합 분자를 갖는 용액을 정화시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 방법은 임의적으로 단계 (a)의 상기 융합 결합 분자를 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, 애플리버셉트의 제조 방법은 임의적으로 단계 (c)의 플로우 쓰루 분획(들)을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, 애플리버셉트의 제조 방법은 임의적으로 단계 (d)의 상기 애플리버셉트를 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, 애플리버셉트의 제조 방법은 임의적으로 단계 (e)의 상기 애플리버셉트를 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제1 크로마토그래피 지지체 및/또는 제2 크로마토그래피 지지체 및/또는 제3 크로마토그래피 지지체 및/또는 제4 크로마토그래피 지지체는 동일하거나, 상이할 수 있고, 친화성 크로마토그래피 매질, 이온 교환 크로마토그래피 매질, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질을 포함할 수 있다. 상기 실시양태의 특정 측면에서, 이온 교환 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 크로마토그래피 매질일 수 있다. 상기 실시양태의 또 다른 특정 측면에서, 이온 교환 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 크로마토그래피 매질일 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 애플리버셉트 제조 방법은 임의적으로, 바이러스 여과를 사용하여 단계 중 임의의 것의 상기 애플리버셉트를 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제조는 임의적으로, 한외여과 및/또는 정용여과 절차(UF/DF)를 사용하여 단계 중 임의의 것의 상기 애플리버셉트를 여과하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 IdeS 프로테아제로 상기 애플리버셉트를 절단하는 단계를 포함하는 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩을 포함한다.
(2) VEGF 미니-트랩을 제조하는 방법은
(a) CDM에서 애플리버셉트를 발현하는 단계;
(b) 친화성 포획 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제1 크로마토그래피 지지체를 사용하여 애플리버셉트를 포획하는 단계;
(c)(예컨대, IdeS 프로테아제로) 애플리버셉트를 절단함으로써 애플리버셉트로부터 VEGF 미니-트랩 및 Fc 단편을 함유하는 혼합물을 형성하는 단계;
(d) 상기 혼합물을 친화성 포획 크로마토그래피일 수 있는 제2 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계; 및
(e) 단계 (c)의 상기 VEGF 미니-트랩의 적어도 일부를 음이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제3 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
단계 (d)는 또한 임의적으로 단계의 제2 크로마토그래피 지지체에 결합하지 않는 VEGF 미니-트랩을 함유하는 혼합물의 플로우 쓰루 분획(들)을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (e)는 제3 크로마토그래피 지지체에 결합하지 않는 VEGF 미니-트랩을 함유하는 혼합물의 플로우 쓰루 분획(들)을 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의적으로, 단계 (d)는 제3 크로마토그래피 지지체를 스트리핑하고, 스트리핑된 분획을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 단계는 본원에 언급된 방법론과 함께 통상의 방법론에 의해 수행될 수 있다.
다른 추가의 예시적인 실시양태는 (f) 단계 (e)의 상기 VEGF 미니-트랩의 적어도 일부를 제4 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 실시양태의 한 측면에서, 제조는 (g) 단계 (f)의 상기 VEGF 미니-트랩의 적어도 일부를 제5 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제조는 임의적으로 단계 (d)의 상기 VEGF 미니-트랩을 5.5 미만의 pH에 가하는 것을 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 상기 포획 단계 (a) 전에 융합 결합 분자를 갖는 용액을 정화시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 단계 (a)의 상기 융합 결합 분자를 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 단계 (e)의 플로우 쓰루 분획(들)을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 단계 (f)의 상기 VEGF 미니-트랩을 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 단계 (g)의 상기 VEGF 미니-트랩을 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제1 크로마토그래피 지지체 및/또는 제2 크로마토그래피 지지체 및/또는 제3 크로마토그래피 지지체 및/또는 제4 크로마토그래피 지지체 및/또는 제5 크로마토그래피 지지체는 동일하거나, 상이할 수 있고, 친화성 크로마토그래피 매질, 이온 교환 크로마토그래피 매질, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질을 포함할 수 있다. 상기 실시양태의 특정 측면에서, 이온 교환 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 크로마토그래피 매질일 수 있다. 상기 실시양태의 또 다른 특정 측면에서, 이온 교환 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 크로마토그래피 매질일 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 바이러스 여과를 사용하여 단계 중 임의의 것의 상기 VEGF 미니-트랩을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제조는 임의적으로 한외여과 및/또는 정용여과 절차(UF/DF)를 사용하여 단계 중 임의의 것의 상기 VEGF 미니-트랩을 여과하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩을 포함한다.
(3) 애플리버셉트를 제조하는 방법은
(a) CDM에서 애플리버셉트를 발현하는 단계;
(b) 양이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제1 크로마토그래피 지지체를 사용하여 애플리버셉트를 포획하는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 애플리버셉트의 적어도 일부를 음이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제2 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
단계 (c)는 제2 크로마토그래피 지지체에 결합하지 않는 애플리버셉트를 함유하는 혼합물의 플로우 쓰루 분획(들)을 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의적으로, 단계 (c)는 제2 크로마토그래피 지지체를 스트리핑하고, 스트리핑된 분획을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 단계는 본원에 언급된 방법론과 함께 통상의 방법론에 의해 수행될 수 있다.
다른 추가의 예시적인 실시양태는 (d) 단계 (c)의 상기 애플리버셉트의 적어도 일부를 제3 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 실시양태의 한 측면에서, 제조는 (e) 단계 (d)의 상기 애플리버셉트의 적어도 일부를 제4 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제조는 임의적으로, 단계 (c)의 상기 애플리버셉트를 5.5 미만의 pH에 가하는 것을 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 방법은 임의적으로 상기 포획 단계 (a) 전에 융합 결합 분자를 갖는 용액을 정화시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 방법은 임의적으로 단계 (a)의 상기 융합 결합 분자를 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, 애플리버셉트의 제조 방법은 임의적으로 단계 (c)의 플로우 쓰루 분획(들)을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, 애플리버셉트의 제조 방법은 임의적으로 단계 (d)의 상기 애플리버셉트를 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, 애플리버셉트의 제조 방법은 임의적으로 단계 (e)의 상기 애플리버셉트를 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제1 크로마토그래피 지지체 및/또는 제2 크로마토그래피 지지체 및/또는 제3 크로마토그래피 지지체 및/또는 제4 크로마토그래피 지지체는 동일하거나, 상이할 수 있고, 친화성 크로마토그래피 매질, 이온 교환 크로마토그래피 매질, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질을 포함할 수 있다. 상기 실시양태의 특정 측면에서, 이온 교환 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 크로마토그래피 매질일 수 있다. 상기 실시양태의 또 다른 특정 측면에서, 이온 교환 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 크로마토그래피 매질일 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 애플리버셉트 제조 방법은 임의적으로, 바이러스 여과를 사용하여 단계 중 임의의 것의 상기 애플리버셉트를 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제조는 임의적으로, 한외여과 및/또는 정용여과 절차(UF/DF)를 사용하여 단계 중 임의의 것의 상기 애플리버셉트를 여과하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 IdeS 프로테아제로 상기 애플리버셉트를 절단하는 단계를 포함하는 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩을 포함한다.
(4) VEGF 미니-트랩을 제조하는 방법은
(a) CDM에서 애플리버셉트를 발현하는 단계;
(b) 양이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제1 크로마토그래피 지지체를 사용하여 애플리버셉트를 포획하는 단계;
(c)(예컨대, IdeS 프로테아제로) 애플리버셉트를 절단함으로써 애플리버셉트로부터 VEGF 미니-트랩 및 Fc 단편을 함유하는 혼합물을 형성하는 단계;
(d) 상기 혼합물을 친화성 포획 크로마토그래피일 수 있는 제2 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계; 및
(e) 단계 (c)의 상기 VEGF 미니-트랩의 적어도 일부를 음이온 교환 크로마토그래피를 포함할 수 있는 제3 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
단계 (d)는 또한 임의적으로 단계의 제2 크로마토그래피 지지체에 결합하지 않는 VEGF 미니-트랩을 함유하는 혼합물의 플로우 쓰루 분획(들)을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (e)는 제3 크로마토그래피 지지체에 결합하지 않는 VEGF 미니-트랩을 함유하는 혼합물의 플로우 쓰루 분획(들)을 수집하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의적으로, 단계 (d)는 제3 크로마토그래피 지지체를 스트리핑하고, 스트리핑된 분획을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 단계는 본원에 언급된 방법론과 함께 통상의 방법론에 의해 수행될 수 있다.
다른 추가의 예시적인 실시양태는 (f) 단계 (e)의 상기 VEGF 미니-트랩의 적어도 일부를 제4 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 실시양태의 한 측면에서, 제조는 (g) 단계 (f)의 상기 VEGF 미니-트랩의 적어도 일부를 제5 크로마토그래피 지지체에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제조는 임의적으로 단계 (d)의 상기 VEGF 미니-트랩을 5.5 미만의 pH에 가하는 것을 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 상기 포획 단계 (a) 전에 융합 결합 분자를 갖는 용액을 정화시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 단계 (a)의 상기 융합 결합 분자를 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 단계 (e)의 플로우 쓰루 분획(들)을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 단계 (f)의 상기 VEGF 미니-트랩을 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 추가의 또 다른 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 단계 (g)의 상기 VEGF 미니-트랩을 용리시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제1 크로마토그래피 지지체 및/또는 제2 크로마토그래피 지지체 및/또는 제3 크로마토그래피 지지체 및/또는 제4 크로마토그래피 지지체 및/또는 제5 크로마토그래피 지지체는 동일하거나, 상이할 수 있고, 친화성 크로마토그래피 매질, 이온 교환 크로마토그래피 매질, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질을 포함할 수 있다. 상기 실시양태의 특정 측면에서, 이온 교환 크로마토그래피 매질은 음이온 교환 크로마토그래피 매질일 수 있다. 상기 실시양태의 또 다른 특정 측면에서, 이온 교환 크로마토그래피 매질은 양이온 교환 크로마토그래피 매질일 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, VEGF 미니-트랩 제조 방법은 임의적으로 바이러스 여과를 사용하여 단계 중 임의의 것의 상기 VEGF 미니-트랩을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 본 실시양태의 한 측면에서, 제조는 임의적으로 한외여과 및/또는 정용여과 절차(UF/DF)를 사용하여 단계 중 임의의 것의 상기 VEGF 미니-트랩를 여과하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 프로세스의 생성물인 VEGF 미니-트랩을 포함한다.
미니-트랩 번역 후 변형
본 발명의 VEGF 미니트랩 및 그의 조성물은 다양한 번역 후 변형을 특징으로 할 수 있다.
산화된 종
2-옥소-히스티딘은 히스티딘 산화의 결과이며, 단백질 산화에 대한 마커로서 작용할 수 있다. 2-옥소-히스티딘은 화학적으로 정의된 배지(CDM) 중에서 세포로부터 발현된 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F, REGN7483R, REGN7850 또는 REGN7851) 제제 중 갈황색 색상의 존재와 상관관계가 있다. 화학적으로 정의된 세포 성장 배지는 예를 들어, 감염원으로부터 로트간 변동성 감소 및 더 큰 안전성을 포함하여 생물제약 제조에 수개의 중요한 이점을 제공한다. 그러나, 안과용 주사를 위한 미니-트랩과 관련하여 이들 장점들로부터의 이점을 실현하기 위해서는 CDM에서 발현된 미니-트랩 조성물의 갈황색 색상 감소가 필요하다. 미니-트랩의 2-옥소-히스티딘 함량 감소는 유리체내 주사에 허용되는 수준으로 색상을 감소시킬 수 있는 수단이다. 본 발명은 부분적으로 2-옥소-히스티딘 및 이에 따라 갈황색 색상을 감소시키는 방법 및 상기 방법의 결과인 조성물을 제공한다.
갈황색 색상은 눈에 주입될 수 있는 임의의 생물학적 생성물(예컨대, VEGF 미니-트랩)에서 특히 비바람직하다. 예컨대, 가수분해물(예컨대, 대두 가수분해물)을 함유하는 배지와 같이 화학적으로 정의되지 않은 배지에서 발현된 상업적으로 이용가능한 VEGF 트랩 분자(예컨대, 에일리아)에서 극소량의 2-옥소-히스티딘만이 관찰되었다. 눈은 시각 기관이기 때문에, 유리체에 유색 액체가 유입되면, 시력에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 시력은 내안의 임의의 폐쇄에도 특히 민감하다. 예를 들어, 시린지 벽에서 떨어져 나와 유리체에 주사된 투명한 실리콘 오일 미세액적은 부유물 형태로 시력을 방해하는 것으로 보고되었다(문헌 [Yu et al., Am J Ophthalmol Case Rep. 2018 Jun; 10: 142-144]).
화학적으로 정의된 배지(CDM) 또는 합성 배지는 당업계에서 일반적으로 사용되는 용어이며, 화학 조성이 공지된 배지를 지칭한다. CDM은 가수분해물, 예컨대, 예를 들어, 대두 가수분해물을 포함하지 않는다. 적합한 CDM은 둘베코스 변형 이글(DME: Dulbecco's Modified Eagle's) 배지, 햄 영양 혼합물(Ham's 영양 Mixture), EX-CELL 배지, IS CHO-CD 배지, 및 그의 용도가 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려되는 당업자에게 공지된 다른 CDM을 포함한다.
Figure pct00020
는 히스티딘 대비 13.98 Da의 분자량 증가를 보이는 것(13.98 Da 버전); 또는
Figure pct00021
는 히스티딘 대비 15.99 Da의 분자량 증가를 보이는 것(15.99 Da 버전)인, 2-옥소-히스티딘(2-옥소-his)의 두 화학적 버전이 생성될 수 있으며; 여기서, 2-옥소-히스티딘의 13.98 Da 버전은 CDM에서 발현된 미니-트랩에서 관찰된 우세한 모이어티이다. 펩티드에서 2-옥소-히스티딘의 13.98 Da 버전의 함량은 상기 모이어티가 350 nM 파장에서 빛의 증강된 흡광도를 보이는 반면, 15.99 Da 버전은 상기 증강된 흡광도를 보이지 않기 때문에, 분광광도계로 평가할 수 있다. 미니-트랩에서 2-옥소-히스티딘의 13.98 Da 버전의 형성은 빛에 의해 촉매화될 수 있는 반면, 15.99 Da 버전의 형성은 금속, 예컨대, 구리(Cu2 +)에 의해 촉매화될 수 있다. CDM-발현 미니-트랩의 갈황색 색상은 2-옥소-히스티딘의 15.99 Da 버전의 존재와 상관관계가 없다.
갈황색 색상을 유도할 수 있는 다른 산화된 아미노산 종은 산화된 트립토판, 메티오닌, 페닐알라닌 및/또는 티로신을 포함한다. 본원에 기술된 방법은 또한 본원에서 논의된 VEGF 미니-트랩에서 이러한 산화된 아미노산의 존재를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
트립토판의 산화는 생성물의 복잡한 혼합물을 생성할 수 있다. 주요 생성물은 모노-산화, 디-산화 및/또는 트리-산화 생성물과 함께 N-포르밀키누레닌 및 키누레닌일 수 있다. 산화된 Trp 변형을 포함하는 펩티드는 일반적으로 키누레닌(KYN), 하이드록시트립토판(Wox1), 및 N-포르밀키누레닌/디하이드록시트립토판(NFK/Wox2, "이중으로 산화된 Trp"로도 지칭), 트리하이드록시트립토판(Wox3, "삼중으로 산화된 Trp"로도 지칭), 및 그의 조합, 예컨대, 하이드록시키누레닌 (KYNox1, +20 Da)의 형성에 상응하는, 4, 16, 32 및 48 Da의 질량 증가를 나타낸다. 하이드록시트립토판(Wox1)으로의 산화(문헌 [Mass spectrometric identification of oxidative modifications of tryptophan residues in proteins: chemical artifact or post-translational modification? J Am Soc Mass Spectrom. 2010 Jul; 21(7): 1114-1117]). 메티오닌 및 히스티딘 산화가 아닌 트립토판 산화가 단백질 생성물을 변색시키는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Characterization of the Degradation Products of a Color-Changed Monoclonal Antibody: Tryptophan-Derived Chromophores. dx.doi.org/10.1021/ac404218t│Anal. Chem. 2014, 86, 6850-6857]). 트립토판과 유사하게, 티로신의 산화를 통해 주로 3,4-디하이드록시페닐알라닌(DOPA) 및 디티로신이 생성된다(문헌 [Li, S, C Schoneich, and RT. Borchardt. 1995. Chemical Instability of Protein Pharmaceuticals: Mechanisms of Oxidation and Strategies for Stabilization. Biotechnol. Bioeng. 48:490-500]).
본 발명은 (예컨대, 본원에서 논의된 바와 같이) 산화된 하나 이상의 트립토판 잔기를 포함하는 미니-트랩(예컨대, REGN7483F) 및 그의 조성물로서, 예컨대, 여기서, 조성물중 약 0.1-10% 이하(예컨대, 약 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10%)의 트립토판 잔기가 산화된 것인, 미니-트랩(예컨대, REGN7483F) 및 그의 조성물을 포함한다.
본 발명은 (예컨대, H19, H86, H95, H110, H145, H147, H203 및/또는 H203으로부터 선택되는) 하나 이상의(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의) 히스티딘이 2-옥소-his로 산환된, 본원에 기술된 미니-트랩 분자(예컨대, REGN7483F 또는 REGN7483R) 뿐만 아니라, 그의 조성물(예컨대, 수성 조성물)을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F, REGN7483R, REGN7850 또는 REGN7851)(예컨대, CDM에서, 예컨대, 숙주 세포, 예컨대, CHO 세포에서 발현된 것)을 포함하는 조성물(예컨대, 수성 조성물)로서, 여기서, 조성물 중 약 1% 또는 2% 이하, 약 0.1% 이하 또는 약 0.1-1%, 0.2-1%, 0.3-1%, 0.4-1%, 0.5-1%, 0.6-1%, 0.7-1%, 0.8-1% 또는 0.9-1%의 히스티딘이 2-옥소-히스티딘인 것인 조성물을 포함한다. 상기 조성물에서, 미니-트랩 폴리펩티드는 각각 다양한 개수의 2-옥소-히스티딘 잔기 및 비산화된 히스티딘 잔기를 갖는 펩티드의 이종성 집단이다. 따라서, 조성물 내 2-옥소-히스티딘의 비율은 모든 미니 트랩 분자 중의 2-옥소-히스티딘 ÷ 미니 트랩 분자 내의 전체 히스티딘(산화된 것 + 비산화된 것) X 100을 지칭한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 갈황색 색상 프로파일(예컨대, BY3, 4, 5, 6 또는 7보다 진하지 않음; 또는 투명)을 특징으로 한다.
조성물 중 2-옥소-히스티딘의 수준을 정량화하는 한 가지 방법은 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F, REGN7483R, REGN7850 또는 REGN7851)(예컨대, CDM에서 발현된 것)을 프로테아제(예컨대, Lys-C 및/또는 트립신)를 분해하고, 예를 들어, 질량 분석법(ms: mass spectrometry)에 의해 생성된 펩티드 중의 2-옥소-히스티딘의 정량을 분석하는 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 미니-트랩 폴리펩티드의 분해 전에, 시스테인 술프하이드릴 기는 아이오도아세트아미드(IDAM)와의 반응에 의해 차단되고; 그 결과로 하기 화학 구조로 제시되는 잔기가 생성된다:
Figure pct00022
. 상기 변형은 유리 티올을 디술피드 브릿지 재형성으로부터 보호하고, 디술피드 결합 스크램블을 막는다. 본 발명은 IDAM으로 변형되고, 프로테아제(예컨대, Lys-C 및 트립신)로 분해되고, 질량 분석법으로 분석되었을 때, 하기 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F)를 포함하는 조성물(예컨대, 수성 조성물)을 포함한다:
· 약 0.0095% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열 번호 12의 아미노산 73-89,
· 약 0.0235% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열 번호 12의 아미노산 97-119),
· 약 0.067% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열 번호 12의 아미노산 128-148),
· 약 0.0745% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열 번호 12의 아미노산 206-221), 및/또는
· 약 0.016% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TNYLTH*R(서열 번호 12의 아미노산 90-96), 및/또는
· 임의적으로, 약 0.248% 이산화된 트립토판을 포함하는 IIW*DSR(서열 번호 12의 아미노산 56-61),
여기서, H*는 2-옥소-히스티딘이고, W*는 이산화된 트립토판이고, 여기서, C*는 카복시메틸화된 시스테인이며;
또는
· 약 0.006-0.013% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열 번호 12의 아미노산 73-89),
· 약 0.019-0.028% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열 번호 12의 아미노산 97-119),
· 약 0.049-0.085% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열 번호 12의 아미노산 128-148),
· 약 0.057-0.092% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열 번호 12의 아미노산 206-221), 및/또는
· 약 0.010-0.022% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TNYLTH*R(서열 번호 12의 아미노산 90-96), 및/또는
· 임의적으로, 약 0.198-0.298% 이산화된 트립토판을 포함하는 IIW*DSR(서열 번호 12의 아미노산 56-61),
여기서, H*는 2-옥소-히스티딘이고, W*는 이산화된 트립토판이고, 여기서, C*는 카복시메틸화된 시스테인이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 펩티드는 예컨대, PNG아제 F로 탈글리코실화된다.
갈황색 색상
본원에 기술된 폴리펩티드 조성물의 갈황색 색상은 유럽 색상 표준과 관련하여 설명될 수 있다. 문헌 [European Pharmacopoeia. Chapter 2.2.2. Degree of coloration of liquids. 8th ed.]를 참조한다. EP 색상은 전형적으로 제약 산업에서 예를 들어 제품 품질을 나타내는 액체 샘플에 색상 등급을 지정하는 데 사용된다. 유럽 약전 색상은 제약 산업에서 사용되는 시각적 액체 색상 등급이다. 문헌 [EP 2.2.2. Degree of Coloration of Liquids 2]에는 녹황색(GY), 황색(Y), 갈황색(BY), 갈색(B) 및 적색(R)의 5가지 색상 계열에 속하는 37개의 개별 "참조 용액" 제제에 대해 개략적으로 설명되어 있다. 7개의 갈황색 표준(BY 표준: brown-yellow standard) 중 BY1은 가장 어두운 표준이고, BY7이 최소로 어두운 표준이다. 주어진 샘플을 BY 색상 표준의 샘플에 매칭하는 것은 당업계에서 통상적으로 수행된다. 유럽 갈황색 색상 표준의 조성은 하기 표 A에 기술되어 있다.
<표 A>
Figure pct00023
액체의 색상에 대한 시험은 시험 용액과 표준 색상 용액을 비교함으로써 수행된다. 표준 색상 용액의 조성은 시험 용액의 색상의 색조 및 색도에 따라 선택된다. 전형적으로, 비교는 내경 및 모든 다른 측면에서 가능한 한 가깝게 매칭되는 무색의 투명한 중성 유리의 평평한 바닥 튜브(예컨대, 직경이 약 12, 15, 16 또는 25 mm인 튜브)에서 수행된다. 예를 들어, 비교는 2 또는 10 mL의 시험 용액과 표준 색상 용액 사이에서 이루어질 수 있다. 액체의 깊이는, 예를 들어, 약 15, 25, 40 또는 50 mm일 수 있다. 시험 용액에 부여된 색상은 표준 색상보다 진하지 않아야 한다. 색상 비교는 전형적으로 흰색 배경에 대해 산광(예컨대, 일광)에서 수행된다. 색상은 튜브의 수직 축 또는 수평 축을 따라 비교될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F)을 포함하는 조성물의 색상은 상기 기술된 바와 같이 수행된다.
BY 표준 색상은 또한 CIEL*a*b* 색 공간("CIELAB" 또는 "CIELab" 색 공간)하에 표현될 수도 있다. 표 B를 참조한다. CIE L*a*b* 좌표계에서, L*은 0-100까지 등급의 색상의 밝기 정도를 나타내고(0은 가장 어두운 것이고, 100은 가장 밝은 것이다), a*는 적색 또는 녹색의 색상을 나타내며(a*의 양의 값은 적색을 나타내는 반면, a*의 음의 값은 녹색을 나타낸다), b*는 샘플의 황색 또는 청색을 나타낸다(b*의 양의 값은 황색을 나타내고, b*의 음의 값은 청색을 나타낸다). 표준 또는 평가 초기 샘플의 색상 차이는 개별 색상 성분 ΔL*, Δa*, 및 Δb*의 변화로 나타낼 수 있다. 색상의 종합적 변화 또는 차이는 하기 공식을 사용하여 공간에서 단순 유클리디안 거리(simple Euclidian distance)로 계산될 수 있다:
Figure pct00024
. CIEL*a*b* 색상 좌표는, 예를 들어, 헌터 랩스 울트라스캔프로(Hunter Labs UltrascanPro)(Hunter Associates Laboratory: 미국 버지니아주 레스턴 소재)를 사용하여 또는 BYK 가드너 LCS IV(BYK Gardner LCS IV)(BYK-Gardner: 미국 메릴랜드주 칼럼비아 소재)에서 생성될 수 있다. 헌터 랩스 울트라스캔프로의 경우, 디디뮴 필터 테스트(Didymium Filter Test)가 파장 보정을 위해 실행될 수 있다. 기기는 사용 전에 0.780-인치 포트 인서트 및 DIW를 사용하여 TTRAN으로 표준화될 수 있고; 따라서, 유아등 및 검은색 카드를 이용하여 측광 등급의 최상위(L* = 100) 및 최하위(L* = 0)를 확립한다. 문헌 [Pack et al., Modernization of Physical Appearance and Solution Color Tests Using Quantitative Tristimulus Colorimetry: Advantages, Harmonization, and Validation Strategies, J. Pharmaceutical Sci. 104: 3299-3313 (2015)]을 참조한다.
<표 B>
Figure pct00025
본 발명은 BY2, BY3, BY4, BY5, BY6, BY7의 것에 가깝거나; 또는 BY2보다 어둡지 않거나, BY3보다 어둡지 않거나, BY4보다 어둡지 않거나, BY5보다 어둡지 않거나, BY6보다 어둡지 않거나, BY7보다 어둡지 않거나; 또는 BY2와 BY3의 것 사이; BY2와 BY4의 것 사이; BY3과 BY4의 것 사이; BY3과 BY5의 것 사이; BY4와 BY5의 것 사이; BY4와 BY6의 것 사이; BY5와 BY6의 것 사이; BY5와 BY7의 것 사이; 또는 BY6과 BY7의 것 사이인 갈황색 색상을 갖는 것을 특징으로 하는, 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F, REGN7483R, REGN7850 또는 REGN7851)(예컨대, 예컨대, CDM에서, 예컨대, 숙주 세포, 예컨대, CHO 세포에서 발현된 것)을 포함하는 조성물(예컨대, 수성 조성물)을 제공한다.
본 발명은 또한 CIEL*a*b* 색 공간에서 하기와 같은 색상을 특징으로 하는, 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F, REGN7483R, REGN7850 또는 REGN7851)(예컨대, 예컨대, CDM에서, 예컨대, 숙주 세포, 예컨대, CHO 세포에서 발현된 것)을 포함하는 조성물(예컨대, 수성 조성물)을 제공한다:
L*= 약 88.61, a*= 약 0.53, b*= 약 31.17; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 169 mg/ml이고/거나;
L*= 약 89, a*= 약 0.5, b*= 약 31; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 170 mg/ml이고/거나;
L*= 약 95.01, a*= 약 -1.68, b*= 약 18.16; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 161 mg/ml이고/거나;
L*= 약 95, a*= 약 -1.5, b*= 약 18; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 160 mg/ml이고/거나;
L*= 약 96.1, a*= 약 -1.05, b*= 약 14.34; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 158 mg/ml이고/거나;
L*= 약 96, a*= 약 -1, b*= 약 14; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 160 mg/ml이고/거나;
L*= 약 97.18, a*= 약 -0.93, b*= 약 10.31; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 106 mg/ml이고/거나;
L*= 약 97, a*= 약 -1, b*= 약 10; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 110 mg/ml이고/거나;
L*= 약 96.06, a*= 약 -1.02, b*= 약 14.48; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 154 mg/ml이고/거나;
L*= 약 96, a*= 약 -1, b*= 약 14.5; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 150 mg/ml이고/거나;
L*= 약 96.96, a*= 약 -0.85, b*= 약 14.89; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 159 mg/ml이고/거나;
L*= 약 97, a*= 약 -1, b*= 약 15; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 160 mg/ml이고/거나;
L*= 약 97.76, a*= 약 -1.02, b*= 약 12.16; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 128 mg/ml이고/거나;
L*= 약 98, a*= 약 -1, b*= 약 12; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 130 mg/ml이고/거나;
L*= 약 95.06, a*= 약 -1.07, b*= 약 20.87; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 205 mg/ml이고/거나;
L*= 약 95, a*= 약 -1, b*= 약 21; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 205 mg/ml이고/거나;
L*= 약 96.93, a*= 약 -1.55, b*= 약 14.02; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 158 mg/ml이고/거나;
L*= 약 97, a*= 약 -1.5, b*= 약 14; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 160 mg/ml이고/거나;
L*= 약 97.36, a*= 약 -0.39, b*= 약 10.64; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 150 mg/ml이고/거나;
L*= 약 97, a*= 약 -0.5, b*= 약 11; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 150 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99.16, a*= 약 -0.35, b*= 약 3.41; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 144 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99, a*= 약 -0.5, b*= 약 3; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 145 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99.33, a*= 약 -0.19, b*= 약 2.39; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 79.3 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99, a*= 약 0, b*= 약 2.4; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 79 mg/ml이고/거나;
L*= 약 97.37, a*= 약 -1.12, b*= 약 9.58; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 80 mg/ml이고/거나;
L*= 약 97, a*= 약 -1, b*= 약 9.6; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 80 mg/ml이고/거나;
L*= 약 97.1, a*= 약 -0.85, b*= 약 9.97; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 154 mg/ml이고/거나;
L*= 약 97, a*= 약 -1, b*= 약 10; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 150 mg/ml이고/거나;
L*= 약 98.04, a*= 약 -0.67, b*= 약 6.75; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 100 mg/ml이고/거나;
L*= 약 98, a*= 약 -1, b*= 약 6.8; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 100 mg/ml이고/거나;
L*= 약 98.5, a*= 약 -0.51, b*= 약 5.03; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 75 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99, a*= 약 -0.5, b*= 약 5; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 75 mg/ml이고/거나;
L*= 약 98.94, a*= 약 -0.36, b*= 약 3.58; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 50 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99, a*= 약 -0.5, b*= 약 3.6; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 50 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99.47, a*= 약 -0.13, b*= 약 1.65; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 25 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99.5, a*= 약 0, b*= 약 1.7; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 25 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99.77, a*= 약 -0.02, b*= 약 0.66; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 100, a*= 약 0, b*= 약 0.7; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99.9, a*= 약 0.01, b*= 약 0.36; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 5 mg/ml이고/거나;
L*= 약 100, a*= 약 0, b*= 약 0.4; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 5 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99.95, a*= 약 0.06, b*= 약 0.08; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 3 mg/ml이고/거나;
L*= 약 100, a*= 약 0.1, b*= 약 0.1; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 3 mg/ml이고/거나;
L*= 약 98.89, a*= 약 0.01, b*= 약 1.05; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99, a*= 약 0, b*= 약 1.1; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 98.3, a*= 약 -0.03, b*= 약 0.96; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 98, a*= 약 0, b*= 약 1; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99.07, a*= 약 -0.07, b*= 약 1.33; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99, a*= 약 0, b*= 약 1.3; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99.42, a*= 약 -0.04, b*= 약 1.35; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99, a*= 약 0, b*= 약 1.4; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99.19, a*= 약 -0.09, b*= 약 1.55; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 99, a*= 약 0, b*= 약 1.6; 예를 들어, 여기서, 미니-트랩 농도는 약 10 mg/ml이고/거나;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 23 이하;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 22 이하;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 21 이하;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 20 이하;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 19 이하;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 18 이하;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 17 이하;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 16 이하;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 15 이하;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 14 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 13 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 12 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 11 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 10 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 9 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 8 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 7 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 6 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 5 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 4 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 3 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 2 이하;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 1 이하;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 23;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 22;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 21;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 20;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 19;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 18;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 17;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 16;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 15;
L*= 약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 14;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 13;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 12;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 11;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 10;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 9;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 8;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 7;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 6;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 5;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 4;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 3;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 2;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 1;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 3-5;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 4-6;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 5-7;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 6-8;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 7-9;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 8-10;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 9-11;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 10-12;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 11-13;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 14-16;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 15-17;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 16-18;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 17-19;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 18-20;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 19-21;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 20-22;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 21-23;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 17-23;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 10-23;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 5-23;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 3-23;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 1-23;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 10-17;
L*=약 94-100, a*=-3-1 또는 -3-0 및 b*= 약 5-17;
L*= 70-99, a* = -2-0 및 b* = 20 이하; 및/또는
L* = 70-99, a*= -2-0 및 b* = 10-31, 약 10, 약 14, 약 12, 약 14, 약 15, 약 18, 약 21, 약 27 또는 약 31. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 기술된 바와 같은 색상 프로파일을 갖는 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물의 미니-트랩의 농도는 약 70 mg/ml 이상, 75-200 mg/ml; 또는 70-205 mg/ml; 10 mg/ml; 11 mg/ml; 12 mg/ml; 13 mg/ml; 14 mg/ml; 15 mg/ml; 16 mg/ml; 17 mg/ml; 18 mg/ml; 19 mg/ml; 20 mg/ml; 21 mg/ml; 22 mg/ml; 23 mg/ml; 24 mg/ml; 25 mg/ml; 26 mg/ml; 27 mg/ml; 28 mg/ml; 29 mg/ml; 30 mg/ml; 31 mg/ml; 32 mg/ml; 33 mg/ml; 34 mg/ml; 35 mg/ml; 36 mg/ml; 37 mg/ml; 38 mg/ml; 39 mg/ml; 40 mg/ml; 41 mg/ml; 42 mg/ml; 43 mg/ml; 44 mg/ml; 45 mg/ml; 46 mg/ml; 47 mg/ml; 48 mg/ml; 49 mg/ml; 50 mg/ml; 51 mg/ml; 52 mg/ml; 53 mg/ml; 54 mg/ml; 55 mg/ml; 56 mg/ml; 57 mg/ml; 58 mg/ml; 59 mg/ml; 60 mg/ml; 61 mg/ml; 62 mg/ml; 63 mg/ml; 64 mg/ml; 65 mg/ml; 66 mg/ml; 67 mg/ml; 68 mg/ml; 69 mg/ml; 70 mg/ml; 71 mg/ml; 72 mg/ml; 73 mg/ml; 74 mg/ml; 75 mg/ml; 76 mg/ml; 77 mg/ml; 78 mg/ml; 79 mg/ml; 80 mg/ml; 81 mg/ml; 82 mg/ml; 83 mg/ml; 84 mg/ml; 85 mg/ml; 86 mg/ml; 87 mg/ml; 88 mg/ml; 89 mg/ml; 90 mg/ml; 91 mg/ml; 92 mg/ml; 93 mg/ml; 94 mg/ml; 95 mg/ml; 96 mg/ml; 97 mg/ml; 98 mg/ml; 99 mg/ml; 100 mg/ml; 101 mg/ml; 102 mg/ml; 103 mg/ml; 104 mg/ml; 105 mg/ml; 106 mg/ml; 107 mg/ml; 108 mg/ml; 109 mg/ml; 110 mg/ml; 111 mg/ml; 112 mg/ml; 113 mg/ml; 114 mg/ml; 115 mg/ml; 116 mg/ml; 117 mg/ml; 118 mg/ml; 119 mg/ml; 120 mg/ml; 121 mg/ml; 122 mg/ml; 123 mg/ml; 124 mg/ml; 125 mg/ml; 126 mg/ml; 127 mg/ml; 128 mg/ml; 129 mg/ml; 130 mg/ml; 131 mg/ml; 132 mg/ml; 133 mg/ml; 134 mg/ml; 135 mg/ml; 136 mg/ml; 137 mg/ml; 138 mg/ml; 139 mg/ml; 140 mg/ml; 141 mg/ml; 142 mg/ml; 143 mg/ml; 144 mg/ml; 145 mg/ml; 146 mg/ml; 147 mg/ml; 148 mg/ml; 149 mg/ml; 150 mg/ml; 151 mg/ml; 152 mg/ml; 153 mg/ml; 154 mg/ml; 155 mg/ml; 156 mg/ml; 157 mg/ml; 158 mg/ml; 159 mg/ml; 160 mg/ml; 161 mg/ml; 162 mg/ml; 163 mg/ml; 164 mg/ml; 165 mg/ml; 166 mg/ml; 167 mg/ml; 168 mg/ml; 169 mg/ml; 170 mg/ml; 171 mg/ml; 172 mg/ml; 173 mg/ml; 174 mg/ml; 175 mg/ml; 176 mg/ml; 177 mg/ml; 178 mg/ml; 179 mg/ml; 180 mg/ml; 181 mg/ml; 182 mg/ml; 183 mg/ml; 184 mg/ml; 185 mg/ml; 186 mg/ml; 187 mg/ml; 188 mg/ml; 189 mg/ml; 190 mg/ml; 191 mg/ml; 192 mg/ml; 193 mg/ml; 194 mg/ml; 195 mg/ml; 196 mg/ml; 197 mg/ml; 198 mg/ml; 199 mg/ml; 200 mg/ml; 201 mg/ml; 202 mg/ml; 203 mg/ml; 204 mg/ml; 또는 205 mg/ml이다.
대안적으로, 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물의 VEGF 미니-트랩 농도는 약 70 이상, 약 75, 약 90, 약 106, 약 128, 약 147, 약 154, 158, 약 159, 약 161, 약 169, 약 200, 약 205, 약 75-200 또는 약 70-205 g/l이지만, 상기 조성물은 예를 들어, 약 10 mg/ml; 11 mg/ml; 12 mg/ml; 13 mg/ml; 14 mg/ml; 15 mg/ml; 16 mg/ml; 17 mg/ml; 18 mg/ml; 19 mg/ml; 20 mg/ml; 21 mg/ml; 22 mg/ml; 23 mg/ml; 24 mg/ml; 25 mg/ml; 26 mg/ml; 27 mg/ml; 28 mg/ml; 29 mg/ml; 30 mg/ml; 31 mg/ml; 32 mg/ml; 33 mg/ml; 34 mg/ml; 35 mg/ml; 36 mg/ml; 37 mg/ml; 38 mg/ml; 39 mg/ml; 40 mg/ml; 41 mg/ml; 42 mg/ml; 43 mg/ml; 44 mg/ml; 45 mg/ml; 46 mg/ml; 47 mg/ml; 48 mg/ml; 49 mg/ml; 50 mg/ml; 51 mg/ml; 52 mg/ml; 53 mg/ml; 54 mg/ml; 55 mg/ml; 56 mg/ml; 57 mg/ml; 58 mg/ml; 59 mg/ml; 60 mg/ml; 61 mg/ml; 62 mg/ml; 63 mg/ml; 64 mg/ml; 65 mg/ml; 66 mg/ml; 67 mg/ml; 68 mg/ml; 69 mg/ml; 70 mg/ml; 71 mg/ml; 72 mg/ml; 73 mg/ml; 74 mg/ml; 75 mg/ml; 76 mg/ml; 77 mg/ml; 78 mg/ml; 79 mg/ml; 80 mg/ml; 81 mg/ml; 82 mg/ml; 83 mg/ml; 84 mg/ml; 85 mg/ml; 86 mg/ml; 87 mg/ml; 88 mg/ml; 89 mg/ml; 90 mg/ml; 91 mg/ml; 92 mg/ml; 93 mg/ml; 94 mg/ml; 95 mg/ml; 96 mg/ml; 97 mg/ml; 98 mg/ml; 99 mg/ml; 100 mg/ml; 101 mg/ml; 102 mg/ml; 103 mg/ml; 104 mg/ml; 105 mg/ml; 106 mg/ml; 107 mg/ml; 108 mg/ml; 109 mg/ml; 110 mg/ml; 111 mg/ml; 112 mg/ml; 113 mg/ml; 114 mg/ml; 115 mg/ml; 116 mg/ml; 117 mg/ml; 118 mg/ml; 119 mg/ml; 120 mg/ml; 121 mg/ml; 122 mg/ml; 123 mg/ml; 124 mg/ml; 125 mg/ml; 126 mg/ml; 127 mg/ml; 128 mg/ml; 129 mg/ml; 130 mg/ml; 131 mg/ml; 132 mg/ml; 133 mg/ml; 134 mg/ml; 135 mg/ml; 136 mg/ml; 137 mg/ml; 138 mg/ml; 139 mg/ml; 140 mg/ml; 141 mg/ml; 142 mg/ml; 143 mg/ml; 144 mg/ml; 145 mg/ml; 146 mg/ml; 147 mg/ml; 148 mg/ml; 149 mg/ml; 150 mg/ml; 151 mg/ml; 152 mg/ml; 153 mg/ml; 154 mg/ml; 155 mg/ml; 156 mg/ml; 157 mg/ml; 158 mg/ml; 159 mg/ml; 160 mg/ml; 161 mg/ml; 162 mg/ml; 163 mg/ml; 164 mg/ml; 165 mg/ml; 166 mg/ml; 167 mg/ml; 168 mg/ml; 169 mg/ml; 170 mg/ml; 171 mg/ml; 172 mg/ml; 173 mg/ml; 174 mg/ml; 175 mg/ml; 176 mg/ml; 177 mg/ml; 178 mg/ml; 179 mg/ml; 또는 180 mg/ml으로 희석되었을 때, 상기 기술된 바와 같은 색상 프로파일을 갖는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포(예컨대, CHO 세포)에서, 예를 들어, CDM에서 발현된 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F)을 포함하는 조성물은 약 50 백만분율(ppm: parts per million) 이하의 숙주 세포 단백질을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물의 색상은 조성물(예컨대, 수성 조성물) 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, CDM에서 발현된 것) 농도와 상관관계가 있을 수 있으며, 여기서, 상관관계는 하기 식으로 표현된다:
0.046 + (0.066 X 미니-트랩의 농도(mg/ml))=b*,
예컨대, 여기서, L*= 약 97-99 및 a= 약 -0.085-0.06. 본 발명의 한 실시양태에서, 식은
b*=(0.11 X 미니-트랩의 농도(mg/ml) - 0.56)이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 약학적 제제 중 VEGF 미니-트랩의 농도는 약 90, 100, 110 또는 120 mg/ml(또는 상기 기술된 농도 중 임의의 것)이고, CIEL*a*b* 색 공간에서 상기 식에 따른 색상을 특징으로 한다.
VEGF 미니-트랩(예컨대, CDM에서 발현된 것)을 포함하는 조성물의 색상은 또한 AEX 크로마토그래피 정제(플로우 쓰루 모드)가 수행되는 pH 및 전도도와 상관관계를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 약 8.0 이상 또는 8.4 이상인 pH 및 약 2.0 mS/cm 이하 또는 4 mS/cm 이하인 전도도하의 AEX 크로마토그래피 정제를 포함하는 프로세스의 생성물이다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, AEX 크로마토그래피 조건은 약 8.1 또는 8.4보다 높은 pH(예컨대, 약 8.1-8.4) 및/또는 약 6.5보다 낮은 전도도(예컨대, 약 2.0, 4.0 또는 2-4 mS/cm)이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 AEX 칼럼으로부터의 플로우 쓰루 분획이고, 상기 pH(예컨대, 8.4) 및 전도도(예컨대, 2.0 mS/cm)를 갖는다. 본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 AEX 크로마토그래피 정제를 포함하고, 조성물을 더 낮은 pH, 예컨대, 약 6.0(예컨대, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2)으로 조정하는 것을 추가로 포함하는 프로세스의 생성물이다.
따라서, 본 발명은 화학적으로 정의된 배지에서 발현된 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F, REGN7483R, REGN7850 또는 REGN7851)을 포함하는 조성물(예컨대, 수성 조성물)로서, 여기서, 조성물 중 모든 히스티딘 중 약 0.1%-1%는 2-옥소-히스티딘으로 변형되고, 여기서, 조성물의 색산은 본원에서 논의된 바와 같은, 예컨대, 예를 들어, 유럽 갈황색 색상 표준 BY2, BY3 또는 BY4보다 어둡지 않고/거나, CIEL*a*b* 색 공간에서 L*=94-100, a*=-3-0 및 b*= 약 3-6인 것을 특징으로 하는 색상을 갖고; 예컨대, 약 90, 100, 110 또는 120 mg/ml의 농도; 또는 상기 논의된 농도 중 임의의 것을 갖는 것인 조성물을 포함한다.
산성 및 염기성 종
단백질 변이체는 산성 종 및 염기성 종, 둘 모두를 포함할 수 있다. 산성 종은 CEX로부터의 주요 피크보다 먼저 또는 AEX로부터의 주요 피크보다 늦게 용리되는 변이체인 반면, 염기성 종은 CEX로부터의 주요 피크보다 늦게 또는 AEX로부터의 주요 피크보다 먼저 용리되는 변이체이다.
용어 "산성 종," "AS(acidic species)," "산성 영역" 및 "AR(acidic region)"은 전체 산성 전하를 특징으로 하는 단백질의 변이체를 지칭한다. 예를 들어, 재조합 단백질 제제에서, 상기 산성 종은 예컨대, 이온 교환, 예를 들어, WCX-10 HPLC(약한 양이온 교환 크로마토그래피) 또는 IEF(등전위 포커싱)과 같은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. VEGF 미니-트랩의 산성 종은 변이체, 구조 변이체 및/또는 단편화 변이체를 포함할 수 있다. 예시적인 변이체는 탈아마이드화 변이체, 어푸코실화 변이체, 산화 변이체, 메틸글리옥살(MGO) 변이체, 당화 변이체 및 시트르산 변이체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 구조 변이체로는 글리코실화 변이체 및 아세톤화 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 단편화 변이체는 Fc 및 Fab 단편, Fab가 결손된 단편, 중쇄 가변 도메인이 결손된 단편, C-말단 말단절단 변이체, 경쇄에서 N-말단 Asp가 절단된 변이체 및 경쇄의 N-말단 말단절단을 갖는 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 펩티드 쇄의 해리, 효소적 및/또는 화학적 변형으로 인한 표적 분자로부터의 임의의 변형된 단백질 종을 포함한다. 다른 산성 종 변이체는 쌍을 형성하지 않는 디술피드, 숙주 세포 단백질 및 숙주 핵산, 크로마토그래피 물질 및 배지 성분을 포함하는 변이체를 포함한다. 일반적으로, 산성 종은 CEX 동안 주요 피크보다 먼저 또는 AEX 분석 동안 주요 피크보다 늦게 용리된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 단백질 조성물은 1 초과 타입의 산성 종 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 총 산성 종은 출현하는 피크의 크로마토그래피 머무름 시간을 기준으로 분류될 수 있다. 총 산성 종이 분류될 수 있는 또 다른 예는 변이체 타입 - 변이체, 구조 변이체 또는 단편화 변이체를 기준으로 할 수 있다.
용어 "산성 종" 또는 "AS"는 프로세스-관련 불순물을 지칭하지 않는다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "프로세스-관련 불순물"은 단백질을 포함하는 조성물에 존재하지만, 단백질 자체에서 유래하지 않는 불순물을 지칭한다. 프로세스-관련 불순물은 숙주 세포 단백질(HCP: host cell protein), 숙주 세포 핵산, 크로마토그래피 물질 및 배지 성분을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 산성 종을 포함할 수 있고, 여기서, 조성물 중 산성 종의 양은 VEGF 미니-트랩 대비 최대 약 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 또는 0.0% 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위일 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시양태에서, 본 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 산성 종을 포함할 수 있고, 여기서, 조성물 중 산성 종의 양은 VEGF 미니-트랩 대비 약 0% 내지 약 15% 예컨대, 약 0% 내지 약 15%, 약 0.05% 내지 약 15%, 약 0.1% 내지 약 15%, 약 0.2% 내지 약 15%, 약 0.3% 내지 약 15%, 약 0.4% 내지 약 15%, 약 0.5% 내지 약 15%, 약 0.6% 내지 약 15%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 15%, 약 0.9% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1.5% 내지 약 15%, 약 2% 내지 약 15%, 약 3% 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 15%, 약 6% 내지 약 15%, 약 7% 내지 약 15%, 약 8% 내지 약 15%, 약 9% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 15%, 약 0% 내지 약 10%, 약 0.05% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.2% 내지 약 10%, 약 0.3% 내지 약 10%, 약 0.4% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.6% 내지 약 10%, 약 0.7% 내지 약 10%, 약 0.8% 내지 약 10%, 약 0.9% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1.5% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 10%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 6% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 10%, 약 8% 내지 약 10%, 약 9% 내지 약 10%, 약 0% 내지 약 7.5%, 약 0.05% 내지 약 7.5%, 약 0.1% 내지 약 7.5%, 약 0.2% 내지 약 7.5%, 약 0.3% 내지 약 7.5%, 약 0.4% 내지 약 7.5%, 약 0.5% 내지 약 7.5%, 약 0.6% 내지 약 7.5%, 약 0.7% 내지 약 7.5%, 약 0.8% 내지 약 7.5%, 약 0.9% 내지 약 7.5%, 약 1% 내지 약 7.5%, 약 1.5% 내지 약 7.5%, 약 2% 내지 약 7.5%, 약 3% 내지 약 7.5%, 약 4% 내지 약 7.5%, 약 5% 내지 약 7.5%, 약 6% 내지 약 7.5%, 약 7% 내지 약 7.5%, 약 0% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.2% 내지 약 5%, 약 0.3% 내지 약 5%, 약 0.4% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.6% 내지 약 5%, 약 0.7% 내지 약 5%, 약 0.8% 내지 약 5%, 약 0.9% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1.5% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 5% 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위일 수 있다.
관심 단백질 이전에 용리되는 모든 피크는 산성 영역으로 합산될 수 있고, 관심 단백질 이후에 용리되는 모든 피크는 염기성 영역으로 합산될 수 있다. 일부 예시적인 실시양태에서, 산성 종은 2개 이상의 산성 영역으로서 용리될 수 있고, 피크의 특정 머무름 시간 및 사용된 이온 교환 칼럼에 기초하여 AR1, AR2, AR3 등으로 넘버링될 수 있다.
본 발명의 한 예시적인 실시양태에서, 본 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 산성 종을 포함할 수 있고, 여기서, VEGF 미니-트랩 영역과 비교하여 AR1은 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 또는 0.0%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 본 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 산성 종을 포함할 수 있고, 여기서, 항VEGF 영역과 비교하여 AR1은 약 0.0% 내지 약 10%, 약 0.0% 내지 약 5%, 약 0.0% 내지 약 4%, 약 0.0% 내지 약 3%, 약 0.0% 내지 약 2%, 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 8%, 또는 약 8% 내지 약 10%, 또는 약 10% 내지 약 15%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위이다.
본 발명의 한 예시적인 실시양태에서, 본 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 산성 종을 포함할 수 있고, 여기서, 항VEGF 단백질 영역과 비교하여 AR2는 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 또는 0.0%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 본 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 산성 종을 포함할 수 있고, 여기서, VEGF 미니-트랩 영역과 비교하여 AR2는 약 0.0% 내지 약 10%, 약 0.0% 내지 약 5%, 약 0.0% 내지 약 4%, 약 0.0% 내지 약 3%, 약 0.0% 내지 약 2%, 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 8%, 또는 약 8% 내지 약 10%, 또는 약 10% 내지 약 15%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위이다.
산성 또는 염기성 종의 원인이 되는 화학적 분해 경로 중에서, 단백질 및 펩티드에서 발생하는 가장 일반적으로 관찰되는 두 공유 변형은 탈아미노화 및 산화이다. 메티오닌, 시스테인, 히스티딘, 트립토판, 및 티로신은 산화에 가장 민감한 아미노산의 것이고: Met 및 Cys는 그의 황 원자 때문이고, 및 His, Trp 및 Tyr은 그의 방향족 고리 때문에 그러하다.
용어 "염기성 종," "염기성 영역" 및 "BR(basic region)"은 전체 염기성 전하를 특징으로 하는 단백질의 변이체를 지칭한다. 예를 들어, 재조합 단백질 제제에서, 상기 염기성 종은 예컨대, 이온 교환, 예를 들어, WCX-10 HPLC(약한 양이온 교환 크로마토그래피) 또는 IEF(등전위 포커싱)와 같은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 예시적인 변이체는 리신 변이체, 아스파르트산의 이성질체화, 아스파라긴에서의 숙신이미드 형성, 메티오닌 산화, 아미드화, 불완전한 디술피드 결합 형성, 세린에서 아르기닌으로의 돌연변이, 비글리코실화, 단편화 및 응집을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 염기성 종은 CEX 동안 주요 피크보다 늦게 또는 AEX 분석 동안 주요 피크보다 먼저 용리된다(문헌 [Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. MAbs. 2012 Sep 1; 4(5): 578-585]).
본 발명의 특정 예시적인 실시양태에서, 단백질 조성물은 1 초과 타입의 염기성 종 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, 총 염기성 종은 출현하는 피크의 크로마토그래피 머무름 시간을 기준으로 분류될 수 있다. 총 염기성 종이 분류될 수 있는 또 다른 예는 변이체 타입 - 변이체, 구조 변이체 또는 단편화 변이체를 기준으로 할 수 있다.
산성 종에 대해 예시된 바와 같이, 용어 "염기성 종"은 프로세스-관련 불순물을 포함하지 않고, 염기성 종은 생성물 제조의 결과물(본원에서 "제조 유래 염기성 종"으로 지칭) 또는 보관 결과물(본원에서 "보관 유래 염기성 종"으로 지칭)일 수 있다.
본 발명의 일부 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 염기성 종을 포함할 수 있고, 여기서, 조성물 중 염기성 종의 양은 VEGF 미니-트랩 대비 최대 약 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 또는 0.0% 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위일 수 있다.
본 발명의 다른 예시적인 실시양태에서, 본 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 염기성 종을 포함할 수 있고, 여기서, 조성물 중 염기성 종의 양은 VEGF 미니-트랩 대비 약 0% 내지 약 15% 예컨대, 약 0% 내지 약 15%, 약 0.05% 내지 약 15%, 약 0.1% 내지 약 15%, 약 0.2% 내지 약 15%, 약 0.3% 내지 약 15%, 약 0.4% 내지 약 15%, 약 0.5% 내지 약 15%, 약 0.6% 내지 약 15%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 15%, 약 0.9% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1.5% 내지 약 15%, 약 2% 내지 약 15%, 약 3% 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 15%, 약 6% 내지 약 15%, 약 7% 내지 약 15%, 약 8% 내지 약 15%, 약 9% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 15%, 약 0% 내지 약 10%, 약 0.05% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.2% 내지 약 10%, 약 0.3% 내지 약 10%, 약 0.4% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.6% 내지 약 10%, 약 0.7% 내지 약 10%, 약 0.8% 내지 약 10%, 약 0.9% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1.5% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 10%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 6% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 10%, 약 8% 내지 약 10%, 약 9% 내지 약 10%, 약 0% 내지 약 7.5%, 약 0.05% 내지 약 7.5%, 약 0.1% 내지 약 7.5%, 약 0.2% 내지 약 7.5%, 약 0.3% 내지 약 7.5%, 약 0.4% 내지 약 7.5%, 약 0.5% 내지 약 7.5%, 약 0.6% 내지 약 7.5%, 약 0.7% 내지 약 7.5%, 약 0.8% 내지 약 7.5%, 약 0.9% 내지 약 7.5%, 약 1% 내지 약 7.5%, 약 1.5% 내지 약 7.5%, 약 2% 내지 약 7.5%, 약 3% 내지 약 7.5%, 약 4% 내지 약 7.5%, 약 5% 내지 약 7.5%, 약 6% 내지 약 7.5%, 약 7% 내지 약 7.5%, 약 0% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.2% 내지 약 5%, 약 0.3% 내지 약 5%, 약 0.4% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.6% 내지 약 5%, 약 0.7% 내지 약 5%, 약 0.8% 내지 약 5%, 약 0.9% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1.5% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 5%, 약 4% 내지 약 5% 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위일 수 있다.
본 발명의 일부 예시적인 실시양태에서, 염기성 종은 2개 이상의 염기성 영역으로서 용리될 수 있고, 피크의 특정 머무름 시간 및 사용된 이온 교환 칼럼에 기초하여 BR1, BR2, BR3 등으로 넘버링될 수 있다.
본 발명의 한 예시적인 실시양태에서, 본 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 염기성 종을 포함할 수 있고, 여기서, VEGF 미니-트랩 영역과 비교하여 BR1은 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 또는 0.0%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 본 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 산성 종을 포함할 수 있고, 여기서, 항VEGF 단백질 영역과 비교하여 BR1은 약 0.0% 내지 약 10%, 약 0.0% 내지 약 5%, 약 0.0% 내지 약 4%, 약 0.0% 내지 약 3%, 약 0.0% 내지 약 2%, 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 8%, 또는 약 8% 내지 약 10%, 또는 약 10% 내지 약 15%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위이다.
본 발명의 한 예시적인 실시양태에서, 본 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 산성 종을 포함할 수 있고, 여기서, VEGF 미니-트랩 영역과 비교하여 BR2는 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4.5%, 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.9%, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 또는 0.0%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위이다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 조성물은 VEGF 미니-트랩 및 VEGF 미니-트랩의 산성 종을 포함할 수 있고, 여기서, 항VEGF 단백질 영역과 비교하여 BR2는 약 0.0% 내지 약 10%, 약 0.0% 내지 약 5%, 약 0.0% 내지 약 4%, 약 0.0% 내지 약 3%, 약 0.0% 내지 약 2%, 약 3% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 8%, 또는 약 8% 내지 약 10%, 또는 약 10% 내지 약 15%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위이다.
본원에 설명된 기술을 사용하여 생성된 크로마토그래피 샘플에서 단백질 변이체 및/또는 산성 종의 수준은 실시예 섹션에 설명된 대로 분석될 수 있다. 특정 실시양태에서, cIEF 방법은 탄화플루오르 코팅된 모세관 카트리지(100 ㎛ x 5 cm)가 장착된 iCE3 분석기(ProteinSimple)를 사용함으로써 이용된다. 양쪽성 전해질 용액은 정제수 중 0.35% 메틸 셀룰로스(MC: methyl cellulose), 4% 파말라이트(Pharmalyte) 3-10 캐리어 양쪽성 전해질, 4% 파말라이트 5-8 캐리어 양쪽성 전해질, 10 mM L-아르기닌 HCl, 24% 포름아미드, 및 pI 마커 5.12 및 9.77의 혼합물로 구성되었다. 양극액은 80 mM 인산이었고, 음극액은 100 mM 수산화나트륨이었고, 둘 모두 0.10% 메틸셀룰로스 중의 것이었다. 샘플을 정제수 중에 10 mg/mL로 희석하였다. 샘플을 양쪽성 전해질 용액과 혼합한 후, 이어서, 1분 동안 1500 V의 전위를 도입한 후, 7분 동안 3000 V의 전위를 도입하여 포커싱시켰다. 280 nm 자외선을 모세관을 통해 전하 결합 소자 디지털 카메라의 렌즈로 통과시켜 포커싱된 변이체의 이미지를 수득하였다. 이어서, 상기 이미지를 분석하여 다양한 전하 변이체의 분포를 확인하였다.
음이온 교환( AEX ) 크로마토그래피
본 발명의 한 실시양태에서, 완충제, 예를 들어, pH 8.4(예컨대, 트리스 완충제, 예컨대, 50 mM 트리스 중), 예컨대, 50 mM 트리스 pH 8.4, 2.0 mS/cm(센티미터당 밀리지멘스: millisiemens per centimeter)로 평형화된 AEX 수지에 (예컨대, AEX 평형 완충제 중) VEGF 미니-트랩을 로딩하고, 플로우 쓰루 분획을 수집한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 평형 완충제는 트리스 하이드로클로라이드, pH 약 8.3 내지 약 8.6이다. 예를 들어, 플로우 쓰루를 칼럼으로부터의 세척 분획과 함께 수집할 수 있다. 칼럼 세척은 예를 들어, 1 이상의 칼럼 부피(CV: column volume)의 평형 완충제(예컨대, 2 CV)로 수행할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, AEX 크로마토그래피 전에, 애플리버셉트를 IdeS 프로테아제(예컨대, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 것, 예컨대, FabRICATOR)로 절단하고, 단백질-A 크로마토그래피를 사용하여 미니-트랩 생성물로부터 절단된 Fc 단편을 제거한다. 논의한 바와 같이, 이어서, 미니-트랩을 AEX 크로마토그래피(플로우 쓰루 모드)에 의해 정제한다.
따라서, 본 발명은
(i) CDM에서 성장된 숙주 세포(예컨대, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포)에서 애플리버셉트를 발현시키는 단계(예컨대, 여기서, 애플리버셉트는 숙주 세포로부터 CDM으로 분비된다);
(ii) 배지 및/또는 숙주 세포로부터 애플리버셉트를 제거하는 단계;
(iii) 임의적으로, 단백질-A 크로마토그래피에 의해 애플리버셉트를 정제하는 단계;
(iii) 애플리버셉트를 S. 피오게네스 IdeS 프로테아제(예컨대, FabRICATOR) 또는 그의 변이체로 단백질 분해적 분해하여 미니-트랩 및 Fc 단편을 생성하고; 임의적으로, Fc는 단백질-A 크로마토그래피에 의해 조성물로부터 제거되고, 여기서, Fc는 단백질-A 수지에 결합하는 것인 단계;
(iv) 미니-트랩을 예컨대, 약 50-500 g/L 수지인 속도로 AEX 크로마토그래피 수지(예컨대, 수지 함유 칼럼) 상에 적용하는 단계; 및
(v) 수지의 플로우 쓰루 분획 중 미니-트랩의 보유가 이루어지는 단계; 및
(vi) 임의적으로, 예컨대, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 미니-트랩을 추가로 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F)을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, AEX 수지는 Q-세파로스 패스트 플로우이거나, 또는 활성 기: -O-CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3 또는 -N+(CH3)3 또는 4급 아민을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 수지는 POROS 50 HQ이거나, 또는 4급 폴리에틸렌이민 활성 기를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 플로우 쓰루 모드로 VEGF 미니-트랩의 AEX 크로마토그래피 정제를 위한 조건은 하기와 같다:
(1) AEX 칼럼은 1.90 - 2.10 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 8.30 - 8.50의 완충제로 평형화된 POROS 50 HQ(또는 4급화 폴리에틸렌이민 작용기를 갖는 AEX 수지)이거나;
(2) AEX 칼럼은 2.40 - 2.60 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 7.90 - 8.10의 완충제로 평형화된 Q 세파로스 FF(또는 -O-CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3 또는 -N+(CH3)3 또는 4급 아민 작용기를 갖는 AEX 수지)이거나;
(3) AEX 칼럼은 2.40 - 2.60 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 7.90 - 8.10의 완충제로 평형화된 POROS 50 HQ(또는 4급화 폴리에틸렌이민 작용기를 갖는 AEX 수지)이거나;
(4) AEX 칼럼은 3.90 - 4.10 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 7.70 - 7.90의 완충제로 평형화된 Q 세파로스 FF(또는 -O-CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3 또는 -N+(CH3)3 또는 4급 아민 작용기를 갖는 AEX 수지)이거나;
(5) AEX 칼럼은 3.90 - 4.10 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 7.70 - 7.90의 완충제로 평형화된 POROS 50 HQ(또는 4급화 폴리에틸렌이민 작용기를 갖는 AEX 수지)이거나;
(6) AEX 칼럼은 9.0 ± 0.1 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 7.70±0.1의 완충제로 평형화된 Q 세파로스 FF(또는 -O-CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3 또는 -N+(CH3)3 또는 4급 아민 작용기를 갖는 AEX 수지)이거나;
(7) AEX 칼럼은 2.0 ± 0.1 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 8.4±0.1의 완충제로 평형화된 POROS 50 HQ(또는 4급화 폴리에틸렌이민 작용기를 갖는 AEX 수지)이다.
본 발명의 한 실시양태에서, pH 8.30 - 8.50 완충제는 50 mM 트리스 pH 8.4 및 2.0 mS/cm를 포함하고/거나; pH 7.90 - 8.10 완충제는 50 mM 트리스, 10 mM 아세테이트 pH 8.0 및 2.5 mS/cm를 포함하고/거나; pH 7.70 - 7.90 완충제는 50 mM 트리스, 10 mM 아세테이트, 10 mM NaCl pH 7.8 및 4.0 mS/cm를 포함하고/거나; pH 7.7 0+0.1 완충제는 50 mM 트리스, 60 mM NaCl, pH 7.7±0.1을 포함하고/거나; pH 8.4±0.1 완충제는 50 mM 트리스 pH 8.4±0.1을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 예컨대, S. 피오게네스 IdeS 또는 그의 변이체에 의해 단백질 분해적으로 절단되어 VEGF 미니-트랩을 생성하는 애플리버셉트를 숙주 세포 및/또는 숙주 세포 화학적으로 정의된 성장 배지로부터 수확한 후, 임의의 AEX 크로마토그래피 정제 이전에 절단한다.
본 발명의 한 실시양태에서, AEX 크로마토그래피 칼럼을 수지 1 리터당 40 그램의 비율로 로딩한다.
본 발명의 한 실시양태에서, AEX 크로마토그래피 이전 및/또는 이후에, VEGF 미니-트랩을 추가 크로마토그래피(예컨대, 혼합 모드 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 단백질-A 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(플로우 쓰루 모드 또는 결합-및-용리 모드로)) 및/또는 여과 단계(예컨대, 심층 여과, 바이러스 여과, 정용여과 및/또는 한외여과)에 의해 정제한다.
이온 교환 크로마토그래피 수지는 반대 전하의 생체 분자 또는 반대 전하의 표면 노출 패치를 끌어당기는 수지 비드에 결합된 하전된 작용기를 가지고 있다. 양이온 교환 수지는 음으로 하전되고, 음이온 교환 수지는 양으로 하전된다. 이온 교환 수지는 또한 "약한" 또는 "강한" 교환체로 분류된다. 상기 용어는 작용기의 이온화 상태가 pH에 따라 변하는 정도를 나타낸다. "약한" 교환체는 제한된 pH 범위에서만 이온화되는 반면, "강한" 교환체는 pH 변화에 따른 이온 교환 능력의 변화를 나타내지 않는다. 약한 교환 수지는 완충제 pH의 변화에 따라 양성자를 흡수하거나, 또는 손실할 수 있으며, 추가의 전하 변화는 결합 및 용리에 대한 추가 규모의 선택성을 제공한다. 강한 교환체는 변화하지 않고, 넓은 pH 범위에서 완전히 하전된 상태를 유지하는 바, 약한 교환체를 사용하는 것보다 분리 최적화를 더 간단하게 만들 수 있다. 예를 들어, 강한 음이온 교환 수지는 예를 들어, 예컨대, -N+-(CH3)3과 같은 4급 아민의 작용기를 갖는 Q 세파로스 FF 또는 캅토 Q; 또는 4급 폴리에틸렌이민 작용기를 갖는 POROS 50 HQ를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, AEX 정제는 예컨대, -N+-(CH3)3; 또는 4급 폴리에틸렌이민 작용기를 갖는, 강한, 또는 약한 음이온 교환체를 이용하여 수행된다.
본 발명은 또한
(i) 미니-트랩 또는 애플리버셉트가 발현되고, 임의적으로, 숙주 세포로부터 성장 배지로 분비되도록 하는 조건하에서 미니-트랩 또는 애플리버셉트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계(숙주 세포는 CDM에서 성장될 수 있다); 및
(ii) 숙주 세포 및/또는 배지로부터 미니-트랩 또는 애플리버셉트를 제거하는 단계;
(iii) 임의적으로, 발현된다면, 단백질-A 크로마토그래피에 의해 애플리버셉트를 정제하는 단계; 및
(iii) 애플리버셉트가 발현되는 경우, 애플리버셉트를 IdeS 프로테아제(예컨대, FabRICATOR) 또는 그의 변이체로 단백질 분해적 분해하여 미니-트랩 및 Fc 단편을 생성하고; 임의적으로, Fc는 단백질-A 크로마토그래피에 의해 조성물로부터 제거되고, 여기서, Fc는 단백질-A 수지에 결합하는 것인 단계를 포함하는, 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F, REGN7483R, REGN7850 또는 REGN7851)을 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 생성물인 미니-트랩, 및 그의 조성물(예컨대, 수성 조성물) 또한 본 발명의 일부이다.
광 노출
CDM에서 발현된 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F, REGN7483R, REGN7850 또는 REGN7851)을 특징으로 하는 갈황색 색상은 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 정제에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, 화학적으로 정의된 액체 성장 배지에서 숙주 세포(예컨대, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포)에 의해 발현된 미니-트랩은 AEX 수지(예컨대, 강한 AEX 수지)에의 적용 및 플로우 쓰루 분획 중 물질의 보유에 의해 (숙주 세포 제거 후) 성장 배지로부터 제거될 수 있다. 추가로, 미니-트랩을 광에 노출시키면 갈황색 색상 출현이 증가하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 빛 노출을 최소화하면 색상의 출현은 감소될 수 있다. 본 발명은 VEGF 미니-트랩을 보관용 착색 베쓸(예컨대, 갈색 바이알)에 배치하는 것을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, (예컨대, AEX(플로우 쓰루) 크로마토그래피를 포함하는) 정제 프로세스 및/또는 CDM에서의 발현 및/또는 보관은 임의의 약 0.24, 0.6, 0.96, 1.2 또는 2.4 x 106 lux*hr 초과의 백색광 노출; 및/또는 임의의 약 40, 100, 160, 200 또는 400 W*h/㎡ 초과의 자외선 A(UVA: ultra-violet A) 광 노출의 광 노출은 막으면서 수행된다.
세포 배양 조건
CDM에서 발현된 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물에서 갈황색 색상을 감소시키는 다른 수단은 배양 배지의 다양한 성분 농도의 조정을 포함한다. 특히, 철 및 아연이 존재할 때, 시스테인의 존재는 갈황색 색상과 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, CDM 및 배양물 피드 중 시스테인 농도를 감소시키는 것이 갈황색 색상을 감소시키는 것으로 나타났다. 색상을 감소시키거나, 또는 시스테인 농도를 감소시키는 한 방법은 시스테인을 시스틴 또는 시스테인 술페이트로 대체하고/거나, CDM 중 금속 철 및/또는 아연 및/또는 니켈 및/또는 구리 및/또는 킬레이트 함량을 감소시킴으로써 이루어진다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포가 초기에(0일째) 성장된 CDM 중 시스테인 농도는 약 1.3-1.6(예컨대, 1.3, 1.4, 1.5 또는 1.6) 밀리몰/리터이고, 추가 시스테인 피드는 배양물 성장 기간 내내 첨가되고, 예컨대, 배양물 1 리터당 1.1-1.4(예컨대, 1.1, 1.2, 1.3 또는 1.4) 밀리몰, 배양물 1 리터당 1.6-1.9(예컨대, 1.6, 1.7, 1.8 또는 1.9) 밀리몰 또는 배양물 1 리터당 2.0-2.3(2.0, 2.1, 2.2 또는 2.3) 밀리몰의 피드는 매 2일마다 예컨대, 2, 4, 6 및 8일째 첨가된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 철(Fe), 아연(Zn), 구리(Cu) 및 니켈(Ni)은 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및/또는 시트르산과 같은 킬레이트제와 함께 초기 배양 배지에 포함된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 킬레이터는 약 38-190(예컨대, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 또는 190) 마이크로몰 농도로 존재하는 EDTA 및 약 22-110(예컨대, 22, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 110) 마이크로몰 농도로 존재하는 시트레이트이고; Fe는 약 34-125(예컨대, 34, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100, 120 또는 125) 마이크로몰 농도로 존재하고; Zn은 약 3-10(예컨대, 3, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 8.5 9 또는 10) 마이크로몰 농도로 존재하고; Cu는 약 0.05-0.4(예컨대, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.1, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.2, 0.3 또는 0.4) 밀리몰 농도로 존재하고; Ni은 약 0.25-2.0(예컨대, 0.25, 0.5, 0.6, 0.64, 0.65, 0.70, 0.75, 1, 1.5 또는 2.0) 밀리몰 농도로 존재한다. 본 발명의 한 실시양태에서, Fe: Zn: Cu: EDTA: 시트레이트: Ni의 비는 약 441:38:1:500:294:4이다.
VEGF 미니-트랩이 발현되는 CDM에 항산화제를 포함하는 것 또한 갈황색 색상을 감소시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 항산화제는 하이포타우린, 타우린, 글리신, 하이포타우린, 타우린 및 글리신의 조합; 하이포타우린, 타우린, 글리신 및 글루타티온의 조합; 티옥트산 및/또는 비타민 C이다. 도입될 수 있는 다른 항산화제는 콜린, 하이드로코르티손 및 비타민 E를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 초기 배양 배지는 배양물 중 약 10 mM인 농도로 타우린; 배양물 중 약 10 mM인 농도로 하이포타우린; 배양물 중 약 10 mM인 농도로 글리신; 배양물 중 약 0.0024 mM인 농도로 티옥트산; 및/또는 배양물 중 약 0.028 mM인 농도로 비타민 C(아스코르브산)를 갖는다. 임의적으로, 초기 배양 배지는 배양물 중 약 2 mM인 농도로 글루타티온; 배양물 중 약 1.43 mM인 농도로 콜린 클로라이드; 배양물 중 약 0.0014 mM인 농도로 하이드로코르티손; 및/또는 배양물 중 약 0.009 mM인 농도로 비타민 E(a-토코페롤)를 갖는다.
배양 배지 성분의 농도와 관련하여, "누적"이라는 용어는 배양 시작 시점에 첨가된 성분(0일째 CDM) 및 이어서, 첨가된 성분("화학적으로 정의된 피드")을 포함하는, CDM을 형성하기 위해 세포 배양 과정에 걸쳐 첨가된 특정 성분 또는 성분들의 총량 또는 총 농도를 지칭한다. 배지 성분은 배양 동안 대사되는 바, 주어진 성분의 누적량이 동일한 배양물은 상기 성분이 상이한 시점에 첨가된다면, 상이한 절단 수준을 갖게 될 것이다(예컨대, 초기에 존재하는 것 모두 대 피드에 첨가되는 것 일부).
본 발명의 일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 본 발명의 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물(예컨대, 수성 조성물)을 제조하는 데 사용된다. 변형된 CDM에서 배양된 숙주 세포에 의해 생산된 미니-트랩 및 상기 미니-트랩을 포함하는 조성물(예컨대, 본원에서 논의된 색상 특징 중 임의의 것을 갖는 것)은 본 발명의 일부를 형성한다. 변형된 CDM은 CDM 중 아미노산의 누적 농도를 감소 또는 증가시킴으로써 수득될 수 있다. 상기 아미노산의 비제한적인 예로는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린(또는 그의 염)을 포함한다. 변형된 CDM 중 상기 아미노산의 누적량의 증가 또는 감소는 CDM과 비교하여 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위의 증가 또는 감소일 수 있다. 대안적으로, 변형된 CDM 중 하나 이상의 아미노산의 누적량의 증가 또는 감소는 비변형된 CDM과 비교하여 약 5 내지 약 20%, 약 10 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위의 증가 또는 감소일 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 CDM 중 시스테인의 누적 농도를 감소시킴으로써 수득될 수 있다. 변형된 CDM을 형성하기 위한 CDM 중 시스테인의 양 감소는 비변형된 CDM과 비교하여 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위일 수 있다. 대안적으로, 변형된 CDM 중 시스테인의 누적량의 감소는 CDM과 비교하여 약 5 내지 약 20%, 약 10-약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위일 수 있다. 한 측면에서, 변형된 CDM 중 시스테인의 누적량은 약 1 mM, 약 2 mM, 약 3 mM, 약 4 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM 또는 약 10 mM 미만이다.
일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 CDM 중 적어도 특정 비율(%)의 누적 시스테인을 시스틴으로 대체함으로써 수득될 수 있다. 대체는 CDM과 비교하여 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위일 수 있다. 대안적으로, 대체는 비변형된 CDM과 비교하여 약 5 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 CDM 중 적어도 특정 비율(%)의 누적 시스테인을 시스테인 술페이트로 대체함으로써 수득될 수 있다. 대체는 CDM과 비교하여 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위일 수 있다. 대안적으로, 대체는 비변형된 CDM과 비교하여 약 5 내지 약 20%, 약 10-약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위일 수 있다.
한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 여기서, 적합한 조건은 CDM 중 철의 누적 농도를 약 50 μM 이하로 낮춤으로써 수득된다. 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 여기서, 적합한 조건은 CDM 중 구리의 누적 농도를 약 0.1 μM 이하로 낮춤으로써 수득된다. 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩은 적합한 조건하에 CDM에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 여기서, 적합한 조건은 CDM 중 아연의 누적 농도를 약 5 μM 이하로 낮춤으로써 수득된다. 상기 미니-트랩(예컨대, 수성 조성물)을 포함하는 조성물, 예컨대, 여기서, 상기 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 색상 특징을 갖는 것인 조성물은 본 발명의 일부이다.
일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 CDM 중 금속의 누적 농도를 감소 또는 증가시킴으로써 수득될 수 있다. 금속의 비제한적인 예로는 철, 구리, 망가니즈, 몰리브덴, 아연, 니켈, 칼슘, 칼륨 및 나트륨을 포함한다. 변형된 CDM 중 하나 이상의 금속 양의 증가 또는 감소는 CDM과 비교하여 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위의 증가 또는 감소일 수 있다. 대안적으로, 변형된 CDM 중 하나 이상의 금속의 누적량의 증가 또는 감소는 비변형된 CDM과 비교하여 약 5 내지 약 20%, 약 10 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 100%, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 하나 이상의 항산화제를 포함한다. 항산화제의 비제한적인 예로는 타우린, 하이포타우린, 글리신, 티옥트산, 글루타티온, 콜린 클로라이드, 하이드로코르티손, 비타민 C, 비타민 E 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 약 0.01 mM 내지 약 20 mM의 타우린, 즉, 0.01 mM 내지 약 1 mM, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM, 약 0.01 mM 내지 약 10 mM, 0.1 mM 내지 약 1 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 약 0.01 mM 내지 약 20 mM의 하이포타우린, 즉, 0.01 mM 내지 약 1 mM, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM, 약 0.01 mM 내지 약 10 mM, 0.1 mM 내지 약 1 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 약 0.01 mM 내지 약 20 mM의 글리신, 즉, 0.01 mM 내지 약 1 mM, 약 0.01 mM 내지 약 5 mM, 약 0.01 mM 내지 약 10 mM, 0.1 mM 내지 약 1 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 약 0.01 nM 내지 약 5 nM의 티옥트산, 즉, 약 0.01 nM 내지 약 0.1 nM, 약 0.1 nM 내지 약 1 nM, 약 1 nM 내지 약 2.5 nM, 약 1 nM 내지 약 3 nM, 약 1 nM 내지 약 5 nM, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 약 0.01 mM 내지 약 5 mM의 글루타티온, 즉, 0.01 mM 내지 약 1 mM, 0.1 mM 내지 약 1 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 약 0.01 mM 내지 약 5 mM의 콜린 클로라이드, 즉, 0.01 mM 내지 약 1 mM, 0.1 mM 내지 약 1 mM, 약 0.1 mM 내지 약 5 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 약 0.01 nM 내지 약 5 nM의 하이드로코르티손, 즉, 약 0.01 nM 내지 약 0.1 nM, 약 0.1 nM 내지 약 1 nM, 약 1 nM 내지 약 2.5 nM, 약 1 nM 내지 약 3 nM, 약 1 nM 내지 약 5 nM, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 약 1 mM 내지 약 50 mM의 비타민 C, 즉, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 5 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 5 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 약 50 mM, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 CDM은 약 1 mM 내지 약 50 mM의 비타민 E, 즉, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 약 5 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 5 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 25 mM 내지 약 50 mM, 및 상기 중 하나 이상의 것 이내의 범위를 포함한다.
글리코실화
예를 들어, 본원에서 논의된 바와 같은 색상 특징을 갖는, 그의 글리코실화 조정 방법에 의해 제조된 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851) 뿐만 아니라, 그의 조성물(예컨대, 수성 조성물)은 본 발명의 일부를 형성한다. 글리코실화는 미니-트랩을 발현하는 숙주 세포의 성장이 이루어지는 CDM 중의 특정 성분의 누적 농도를 달리함으로써 달라질 수 있다. CDM에 첨가된 성분의 누적량에 기준으로, 총 푸코실화(%), 총 갈락토실화(%), 총 시알릴화(%) 및 만노스-5가 달라질 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩은 탈시알릴화된다.
일부 예시적인 실시양태에서, VEGF 미니-트랩의 글리코실화를 조정하는 방법은 CDM을 우리딘으로 보충하는 단계를 포함할 수 있다. VEGF 미니-트랩은 총 약 40% 내지 약 50%의 푸코실화된 글리칸, 총 약 30% 내지 약 55%의 시알릴화된 글리칸, 약 6% 내지 약 15%의 만노스-5, 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다.
일부 예시적인 실시양태에서, VEGF 미니-트랩의 글리코실화를 조정하는 방법은 CDM에 망가니즈로 보충하는 단계를 포함할 수 있다. 보충 전, 본원에서 논의된 CDM에는 망가니즈가 없다. VEGF 미니-트랩은 총 약 40% 내지 약 50%의 푸코실화된 글리칸, 총 약 30% 내지 약 55%의 시알릴화된 글리칸, 약 6% 내지 약 15%의 만노스-5, 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다.
일부 예시적인 실시양태에서, VEGF 미니-트랩의 글리코실화를 조정하는 방법은 CDM에 갈락토스로 보충하는 단계를 포함할 수 있다. 보충 전, 본원에서 논의된 CDM에는 갈락토스가 없다. VEGF 미니-트랩은 총 약 40% 내지 약 50%의 푸코실화된 글리칸, 총 약 30% 내지 약 55%의 시알릴화된 글리칸, 약 6% 내지 약 15%의 만노스-5, 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다.
일부 예시적인 실시양태에서, VEGF 미니-트랩의 글리코실화를 조정하는 방법은 CDM에 덱사메타손으로 보충하는 단계를 포함할 수 있다. 보충 전, 본원에서 논의된 CDM에는 덱사메타손이 없다. VEGF 미니-트랩은 총 약 40% 내지 약 50%의 푸코실화된 글리칸, 총 약 30% 내지 약 55%의 시알릴화된 글리칸, 약 6% 내지 약 15%의 만노스-5, 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다.
일부 예시적인 실시양태에서, VEGF 미니-트랩의 글리코실화를 조정하는 방법은 CDM에 우리딘, 망가니즈, 갈락토스 및 덱사메타손 중 하나 이상의 것으로 보충하는 단계를 포함할 수 있다. 보충 전, 본원에서 논의된 CDM에는 우리딘, 망가니즈, 갈락토스 및 덱사메타손 중 하나 이상의 것이 없다. 항VEGF 단백질은 총 약 40% 내지 약 50%의 푸코실화된 글리칸, 총 약 30% 내지 약 55%의 시알릴화된 글리칸, 약 6% 내지 약 15%의 만노스-5, 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서,
· 약 0.1% 미만이 트리-크실로실화되고/거나
· 약 1.5%가 디-크실로실화되고/거나;
· 약 15%가 모노-크실로실화되고/거나;
· 약 0.9% 또는 약 1% 미만이 실로스-갈락토스로 변형되고/거나;
· 약 0.7% 또는 약 1% 미만이 크실로스-갈락토스-시알산으로 변형된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서
· 약 8%의 아르기닌 5 잔기;
· 약 0.1% 미만의 아르기닌 153 잔기; 및/또는
· 약 0.1% 미만의 아르기닌 96 잔기가 3-데옥시글루코손으로 변형된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서
· 약 0.1%의 아르기닌 5 잔기;
· 약 1.0 또는 1.1%의 리신 62 잔기;
· 약 0.4% 이하의 리신 68 잔기;
· 약 0.6% 이하의 리신 149 잔기; 및/또는
· 약 0.1% 미만의 리신 185 잔기는 당화된다.
본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)을 포함하는 조성물에서,
· 예컨대, (R)VTSPNITVTLK(밑줄로 표시)(서열 번호 12의 아미노산 31-42)에 상응하는 약 98% 이상의 아스파라긴 36 잔기;
· 예컨대, (K)GFIISNATYK(밑줄로 표시)(서열 번호 12의 아미노산 62-72)에 상응하는 약 51, 52, 53, 54 또는 55%의 아스파라긴 68 잔기;
· 예컨대, (K)LVLNCTAR(밑줄로 표시)(서열 번호 12의 아미노산 119-127)에 상응하는 약 99% 이상의 아스파라긴 123 잔기; 및/또는
· 예컨대, (K)NSTFVR(서열 번호 12의 아미노산 195-201)에 상응하는 약 44, 50, 60, 70, 80, 90, 98 또는 99%의 아스파라긴 196 잔기가 N-글리코실화된다.
글리코실화는 생물치료제의 안전성 및 기능에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 바람직한 글리코실화 프로파일을 가진 미니 트랩을 수득하는 것은 혈관신생 눈 장애 치료를 위한 그의 성공적인 용도에 매우 유익할 것이다. 일반적으로, VEGF 길항제는 고혈압, 종종 단백뇨 및 혈전성 미세혈관병증으로 나타나는 신장 혈관 손상, 및 울혈성 심부전을 비롯한, 그의 항VEGF 효과에 직접 또는 간접적으로 기인하는 일반적인 혈관 부작용을 나타내는 것으로 나타났다. 따라서, 유리체내로 주사된 미니-트랩을 받는 대상체의 전신 노출을 감소시키기 위한 모든 수단이 유익할 것이다. 유리체내로 주사된 VEGF 길항제는 소량으로 전신 순환계로 누출되어 상기 부작용을 일으킬 수 있는 것으로 간주된다. 예컨대, 문헌 [Avery RL et al., Comparison of Systemic Pharmacokinetics Post Anti-VEGF Intravitreal Injections of Ranibizumab, Bevacizumab and Aflibercept (abstract). Presented at the 2013 Annual Meeting of the American Society of Retina Specialists (ASRS); Toronto, 25 August 2013]; [Avery et al., Intravitreal bevacizumab (Avastin) in the treatment of proliferative diabetic retinopathy. Ophthalmology 2006;113:1695-705]; [Matsuyama et al., Plasma levels of vascular endothelial growth factor and pigment epithelium-derived factor before and after intravitreal injection of bevacizumab. Br J Ophthalmol 2010;94:1215-18]; 및 [Carneiro et al., Vascular endothelial growth factor plasma levels before and after treatment of neovascular age-related macular degeneration with bevacizumab or ranibizumab. Acta Ophthalmol 2012;90:e25-30]을 참조한다. 본원에 제시된 생체내 연구는 미니-트랩이 전신 투여되었을 때, 애플리버셉트보다 더 짧은 반감기를 갖는다는 것을 시사한다(실시예 6 참조). 이 효과에 대한 한 가지 원인은 미니-트랩의 글리코실화 프로파일일 수 있다. 화학적으로 정의된 배지에서 생성된 REGN7483F는 N123 및 N196에서 특히 높은 수준의 고 만노스 글리칸(애플리버셉트에서 관찰된 것보다 더 높은 수준)을 갖는 것으로 알려져 있다. 하기 표 C 및 도 14(도 14a 및 도 14ca-도 14cd)에서 추가로 논의되는 바와 같이, 시험된 조성물 중 N123 및 N196의 약 30-40%가 고도로 만노실화되었다. 애플리버셉트는 이들 잔기의 약 6-13%를 갖고, 애플리버셉트에서 고도로 만노실화된 것으로 관찰되었다. 항체에서 고 만노스 글리칸은 빠른 전신 제거 및 더 짧은 반감기를 유도하는 것으로 나타났다. 문헌 [Goetze et al., High-mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increase serum clearance in humans, Glycobiology 21(7): 949-959 (2011)]을 참조한다. 이는 혈액으로부터 고 만노스 함유 병원체를 제거하는 만노스 수용체에 의한 결합 때문일 수 있다. 유사한 기전이 미니-트랩의 빠른 전신 제거를 일으킬 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, VEGF 미니-트랩의 조성물의 글리코실화 프로파일은 하기와 같다: 총 약 40% 내지 약 50%의 푸코실화된 글리칸, 총 약 30% 내지 약 55%의 시알릴화된 글리칸, 약 6% 내지 약 15%의 만노스-5, 및 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸. 본 발명의 한 측면에서, 미니-트랩은 약 32.4%의 아스파라긴 123 잔기 및/또는 약 27.1%의 아스파라긴 196 잔기에 Man5 글리코실화를 갖는다.
예를 들어, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, CHO 세포에서 및 CDM에서 발현되고, AEX 플로우 쓰루 크로마토그래피에 의해 정제되고,
· 약 30-35%의 아스파라긴 123 잔기에 Man5 글리코실화;
· 약 25-30%의 아스파라긴 196 잔기에 Man5 글리코실화;
· 약 6-8%의 아스파라긴 36 잔기에 Man6-포스페이트 글리코실화;
· 약 3-4%의 아스파라긴 123 잔기에 Man7 글리코실화;
· 약 38%의 아스파라긴 123 잔기에 고 만노스 글리코실화; 및/또는
· 약 29%의 아스파라긴 196 잔기에 고 만노스 글리코실화를 포함하는 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)을 포함한다.
본 발명은 또한 Asn123에 Man5 글리코실화; Asn196에 Man5 글리코실화; Asn36에 Man6-포스페이트 글리코실화; 및/또는 Asn123에 Man7 글리코실화를 포함하는 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F 또는 REGN7483R)을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 VEGF 미니-트랩은 하기 열거된 글리코실화 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 예컨대, 명시된 비율의 빈도로 상기 글리코실화를 갖는 미니-트랩 분자를 포함하는 본 발명의 미니-트랩을 포함하는 조성물(예컨대, 수성 조성물) 또한 본 발명의 일부이다.
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 1.00%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 1.40%)에서 G0-GlcNAc 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 4.80%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 2.70%)에서 G1-GlcNAc 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 4.10%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 2.20%)에서 G1S-GlcNAc 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 G0 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 6.10%)에서 G1 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 1.90%)에서 G1S 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 11.50%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 18.10%)에서 G2 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 14.50%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 18.40%)에서 G2S 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 1.50%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 3.70%)에서 G2S2 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 G0F 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 2.00%), Asn68(예컨대, 약 2.00%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 G2F2S 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 1.60%), Asn68(예컨대, 약 0.50%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 G2F2S2 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 5.60%), Asn68(예컨대, 약 6.10%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 G1F 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 3.80%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 G1FS 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 20.20%), Asn68(예컨대, 약 28.00%), Asn123(예컨대, 약 1.80%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 2.10%)에서 G2F 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 35.20%), Asn68(예컨대, 약 48.90%), Asn123(예컨대, 약 2.80%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 2.20%)에서 G2FS 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 22.40%), Asn68(예컨대, 약 9.10%), Asn123(예컨대, 약 0.30%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0.60%)에서 G2FS2 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 3.40%), Asn68(예컨대, 약 1.60%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 G3FS 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 1.70%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 G3FS3 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 3.40%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 2.60%)에서 G0-2GlcNAc 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 0.50%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 1.60%)에서 Man4 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 3.60%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 2.10%)에서 Man4_A1G1 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 4.60%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 3.00%)에서 Man4_A1G1S1 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 32.40%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 27.10%)에서 Man5 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 4.80%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 2.80%)에서 Man5_A1G1 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 3.30%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 1.50%)에서 Man5_A1G1S1 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 1.30%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 Man6 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 1.70%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 Man6_G0+포스페이트 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 6.20%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 0%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 Man6+포스페이트 글리코실화;
· Asn36(예컨대, 약 0%), Asn68(예컨대, 약 0%), Asn123(예컨대, 약 3.60%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0%)에서 Man7 글리코실화;
· 본원에 기술된 REGN7483F, REGN7483R, REGN7711 또는 VTSPNITVTLK; KGFIISNATYK; GFIISNATYK; LVLNCTAR; KNSTFVR; 또는 NSTFVR 모티프 및/또는 N36, N68, N123 또는 N196 잔기를 포함하는 또 다른 VEGF 미니-트랩, 어느 것이든, 도 14(도 14a 또는 도 14ca-도 14cd)에 명시된 아스파라긴에 (예컨대, 대략 명시된 수준으로) 글리코실화 중 임의의 것;
· 본원에 기술된 REGN7483F 또는 N36, N68, N123 또는 N196 잔기를 포함하는 또 다른 VEGF 미니-트랩, 어느 것이든, 본원 표 C(a 또는 b)에 명시된 아스파라긴에 (예컨대, 대략 명시된 수준으로) 글리코실화 중 임의의 것; 및/또는
· 본원에 기술된 REGN7483F 또는 또 다른 VEGF 미니-트랩, 어느 것이든, 본원 표 D의 (예컨대, 대략 명시된 수준으로) 글리코실화 중 임의의 것.
본 발명의 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물(예컨대, 수성 조성물)은 예컨대, 제시된 비율의 빈도로 표 C에 명시된 하나 이상의 글리코실화(예컨대, 명시된 비율로, 예컨대, 명시된 비율 수치의 ± 10%로 글리코실화 모두를)를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 VEGF 미니-트랩은 예컨대, 명시된 잔기 중 하나 이상의 것에서 하기 열거된 하나 이상의 글리코실화를 포함할 수 있다.
<표 C>
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
* 글리칸 잔기(G0-GlcNAc; G1-GlcNAc; G1S-GlcNAc; G0; G1; G1S; G2; G2S; G2S2; G0F; G2F2S; G2F2S2; G1F; G1FS; G2F; G2FS; G2FS2; G3FS; G3FS3; G0-2GlcNAc; Man4; Man4_A1G1; Man4_A1G1S1; Man5; Man5_A1G1; Man5_A1G1S1; Man6; Man6_G0+포스페이트; Man6+포스페이트 및 Man7)의 구조는 표준화된 것이다 - 문헌 [Varki et al., Symbol nomenclature for glycan Representation, Proteomics 9: 5398-5399 (2009)]; [Harvey et al., Proposal for a standard system for drawing structural diagrams of N- and O-linked carbohydrates and related compounds. Proteomics 2009, 9, 3796-3801]; [Kornfeld et al., The synthesis of complex-type oligosaccharides II characterization of the processing intermediates in the synthesis of the complex oligosaccharide units of the vesicular stomatitis virus G protein. J Biol Chem. 1978, 253, 7771-7778]; [Varki et al. (Eds.), Essentials of Glycobiology, 1st Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY 1999; Varki et al. (Eds.), Essentials of Glycobiology, 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY 2009]; 및 [Dwek, Glycobiology: Moving into the mainstream. Cell 2009, 137, 1175-1176]을 참조한다. REGN7483R 및 애플리버셉트는 CDM에서 발현되는 REGN7483F를 제조하기 위해 사용.
본 발명은 하기 표 D에 명시된 임의의 하나 이상의 글리코실화(%)를 포함하는 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483F)을 포함하는 조성물을 포함한다.
<표 D>
Figure pct00030
본 발명의 일부 예시적인 실시양태에서, VEGF 미니-트랩은 비CDM을 사용하여 생성된 VEGF 미니-트랩 중 푸코실화된 글리칸 수준과 비교하여 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 상기 값 중 하나 이상의 값 이내의 범위, 예컨대, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 1-30%, 1-35%, 1-40%, 1-41%, 1-42%, 1-43%, 1-44%, 1-45%, 1-46%, 1-47%, 1-48%, 1-49%, 1-50%, 2-10%, 2-15%, 2-20%, 2-25%, 2-30%, 2-35%, 2-40%, 2-41%, 2-42%, 2-43%, 2-44%, 2-45%, 2-46%, 2-47%, 2-48%, 2-49%, 2-50%, 3-10%, 3-15%, 3-20%, 3-25%, 3-30%, 3-35%, 3-40%, 3-41%, 3-42%, 3-43%, 3-44%, 3-45%, 3-46%, 3-47%, 3-48%, 3-49%, 3-50%, 4-10%, 4-15%, 4-20%, 4-25%, 4-30%, 4-35%, 4-40%, 4-41%, 4-42%, 4-43%, 4-44%, 4-45%, 4-46%, 4-47%, 4-48%, 4-49%, 4-50% 또는 1-99%만큼 감소된 수준의 푸코실화된 글리칸을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 예시적인 실시양태에서, VEGF 미니-트랩은 비CDM을 사용하여 생성된 VEGF 미니-트랩 중 시알릴화된 글리칸 수준과 비교하여 약 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 상기 값 중 하나 이상의 값 이내의 범위, 예컨대, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 1-30%, 1-35%, 1-40%, 1-41%, 1-42%, 1-43%, 1-44%, 1-45%, 1-46%, 1-47%, 1-48%, 1-49%, 1-50%, 2-10%, 2-15%, 2-20%, 2-25%, 2-30%, 2-35%, 2-40%, 2-41%, 2-42%, 2-43%, 2-44%, 2-45%, 2-46%, 2-47%, 2-48%, 2-49%, 2-50%, 3-10%, 3-15%, 3-20%, 3-25%, 3-30%, 3-35%, 3-40%, 3-41%, 3-42%, 3-43%, 3-44%, 3-45%, 3-46%, 3-47%, 3-48%, 3-49%, 3-50%, 4-10%, 4-15%, 4-20%, 4-25%, 4-30%, 4-35%, 4-40%, 4-41%, 4-42%, 4-43%, 4-44%, 4-45%, 4-46%, 4-47%, 4-48%, 4-49%, 4-50% 또는 1-99%만큼 감소된 수준의 시알릴화된 글리칸을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 예시적인 실시양태에서, VEGF 미니-트랩은 비CDM을 사용하여 생성된 VEGF 미니-트랩 중 갈락토실화된 글리칸 수준과 비교하여 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 상기 값 중 하나 이상의 값 이내의 범위, 예컨대, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 1-30%, 1-35%, 1-40%, 1-41%, 1-42%, 1-43%, 1-44%, 1-45%, 1-46%, 1-47%, 1-48%, 1-49%, 1-50%, 2-10%, 2-15%, 2-20%, 2-25%, 2-30%, 2-35%, 2-40%, 2-41%, 2-42%, 2-43%, 2-44%, 2-45%, 2-46%, 2-47%, 2-48%, 2-49%, 2-50%, 3-10%, 3-15%, 3-20%, 3-25%, 3-30%, 3-35%, 3-40%, 3-41%, 3-42%, 3-43%, 3-44%, 3-45%, 3-46%, 3-47%, 3-48%, 3-49%, 3-50%, 4-10%, 4-15%, 4-20%, 4-25%, 4-30%, 4-35%, 4-40%, 4-41%, 4-42%, 4-43%, 4-44%, 4-45%, 4-46%, 4-47%, 4-48%, 4-49%, 4-50% 또는 1-99%만큼 감소된 수준의 갈락토실화된 글리칸을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 예시적인 실시양태에서, VEGF 미니-트랩은 비CDM을 사용하여 생성된 VEGF 미니-트랩 중 만노실화된 글리칸 수준과 비교하여 약 1%, 1.2%, 1.5%, 2%, 2.2%, 2.5%, 3%, 3.2%, 3.5%, 4%, 4.2%, 4.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%, 상기 값 중 하나 이상의 값 이내의 범위, 예컨대, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 1-30%, 1-35%, 1-40%, 1-41%, 1-42%, 1-43%, 1-44%, 1-45%, 1-46%, 1-47%, 1-48%, 1-49%, 1-50%, 2-10%, 2-15%, 2-20%, 2-25%, 2-30%, 2-35%, 2-40%, 2-41%, 2-42%, 2-43%, 2-44%, 2-45%, 2-46%, 2-47%, 2-48%, 2-49%, 2-50%, 3-10%, 3-15%, 3-20%, 3-25%, 3-30%, 3-35%, 3-40%, 3-41%, 3-42%, 3-43%, 3-44%, 3-45%, 3-46%, 3-47%, 3-48%, 3-49%, 3-50%, 4-10%, 4-15%, 4-20%, 4-25%, 4-30%, 4-35%, 4-40%, 4-41%, 4-42%, 4-43%, 4-44%, 4-45%, 4-46%, 4-47%, 4-48%, 4-49%, 4-50% 또는 1-99%만큼 증가된 수준의 만노실화된 글리칸을 가질 수 있다.
다른 번역 후 변형( PTM : Post-Translational Modification)
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 다른 PTM, 예컨대, 유리 티올, 트리술피드 결합, 탈아미드화, 메티오닌 산화 및 C-말단 아미노산 손실을 갖는 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조성물 중 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)의 힌지 영역 중의 약 0%의 시스테인 및/또는 조성물 중 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)의 VEGFR1 및/또는 VEGFR2 도메인 중의 약 0.3% 이하의 시스테인은 유리 티올이고; 예를 들어; VEGFR1 중(ELVIPCR에 상응, 밑줄로 표시), VEGFR2 중(LVLNCTAR에 상응, 밑줄로 표시(서열 번호 12의 아미노산 120-127)), 및/또는 힌지 영역 중(THTCPPCPAPELLG(서열 번호 12의 아미노산 208-221) 또는 THTCPPCPPC(서열 번호 28의 아미노산 208-217)에 상응, 밑줄로 표시) 시스테인(들)과 관련하여 그러하다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)의 힌지 영역 중의 약 4% 이하의 시스테인 및/또는 본 발명의 조성물 중 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)의 VEGFR1 및/또는 VEGFR2 도메인 중의 약 0.1% 이하의 시스테인은 트리술피드 브릿지에 있고; 예를 들어; VEGFR1 중(ELVIPCR(서열 번호 12의 아미노산 25-31) & EIGLLTCEATVNGHLYK(서열 번호 12의 아미노산 73-89)에 상응, 밑줄로 표시), VEGFR2 중(LVLNCTAR(서열 번호 12의 아미노산 120-127) & SDQGLYTCAASSGLMTK(K)(서열 번호 12의 아미노산 178-195)에 상응, 밑줄로 표시), 및/또는 힌지 영역 중(THTCPPCPAPELLG & THTCPPCPAPELL(G)(서열 번호 12의 아미노산 208-221)에 상응, 밑줄로 표시) 시스테인(들)과 관련하여 그러하다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서 약 0.1% 미만의 시스테인 쇄내 디술피드 및/또는 트리술피드 결합에 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서 약 99% 초과(예컨대, 약 99.8%)의 디술피드 브릿지는 평행한 형태로 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서, 약 3%의 아스파라긴 84 잔기, 예컨대, EIGLLTCEATVNGHLYK(서열 번호 12의 아미노산 73-89)(밑줄로 표시)에 상응하는 아스파라긴은 탈아미드화되어 숙신이미드를 형성한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 약 18, 19, 20, 21 또는 22%의 상기 아스파라긴은 탈아미드화되어 아스파르테이트/이소아스파르테이트를 형성한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서, 약 5% 미만의 아스파라긴 99 잔기, 예컨대, QTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEK(서열 번호 12의 아미노산 97-119)(밑줄로 표시)에 상응하는 아스파라긴은 탈아미드화되어 숙신이미드를 형성한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 약 1% 미만의 상기 아스파라긴은 탈아미드화되어 아스파르테이트/이소아스파르테이트를 형성한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서, 약 2% 이하의 메티오닌 10 잔기, 예컨대, SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGR(서열 번호 12의 아미노산 1-24)(밑줄로 표시)에 상응하는 메티오닌은 산화된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서, 약 3% 이하의 메티오닌 20 잔기, 예컨대, SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGR(서열 번호 12의 아미노산 1-24)(밑줄로 표시)에 상응하는 메티오닌은 산화된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서, 약 2% 이하의 메티오닌 163 잔기, 예컨대, TQSGSEMK(서열 번호 12의 아미노산 157-164)(밑줄로 표시)에 상응하는 메티오닌은 산화된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서, 약 4.3% 이하의 메티오닌 192 잔기, 예컨대, SDQGLYTCAASSGLMTK(서열 번호 12의 아미노산 178-194)(밑줄로 표시)에 상응하는 메티오닌은 산화된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서, 약 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5% 또는 2%의 C-말단 글리신은 손실/결손된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483, REGN7850 또는 REGN7851)에서,
· 약 1.5% 이하의 아르기닌 5 잔기;
· 약 0.1% 미만의 리신 62 잔기; 및/또는
· 약 0.1% 미만의 리신 185 잔기
는 카복시메틸화된다.
하기 특징들 중 임의의 하나 이상의 것을 갖는 VEGF 미니-트랩, 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물 또한 본 발명의 일부를 형성한다:
· 예를 들어, Asn84(예컨대, 약 27%), Asn99(예컨대, 약 0.5-1.0%) 및/또는 Asn152(예컨대, 약 2.5-3.0%)에서 아스파라긴 탈아미드화.
· 예를 들어, Asp173(예컨대, 약 2%)에서 Asp 숙신이미드+이성질체화. 예를 들어, 여기서, 아스파르테이트-글리신은 L-숙신아미딜 중간체
Figure pct00031
로 전환되고, 이소-아스파르테이트-글리신 및/또는 Asn-글리신으로 이성질체화된다. 예컨대, 문헌 [Stephenson & Clarke, Succinimide Formation from Aspartyl and Asparaginyl Peptides as a Model for the Spontaneous Degradation of Proteins, J. Biol. Chem. 264(11): 6164-6170 (1989)]를 참조한다.
· 예를 들어, Met10(예컨대, 약 5-6%), Met20(예컨대, 약 2%), Met163(예컨대, 약 7%) 및/또는 Met192(예컨대, 약 6-7%)에서, 예를 들어, 메티오닌 술폭시드 및/또는 메티오닌 술폰에서 메티오닌 산화.
· 예를 들어, Trp58(예컨대, 약 0.3%)의 Trp 이산화를 통해 예를 들어, N-포르밀키누레닌을 형성한다.
· 예를 들어, Arg5(예컨대, 약 8.1%)에서 Arg 3-데옥시글루코손 형성.
· C-말단 글리신 손실(예컨대, 약 7.2%).
· 예를 들어, Asn36(예컨대, 약 1.7%), Asn68(예컨대, 약 47.3%), Asn123(예컨대, 약 0.2%) 및/또는 Asn196(예컨대, 약 0.8%)에서 비글리코실화된 N-연결된 글리코사이트.
폴리뉴클레오티드 및 제조 방법
본원에 기술된 임의의 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드, 벡터, VEGF 미니-트랩 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포(예컨대, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포)와 마찬가지로 본 발명의 일부를 형성한다. 상기 숙주 세포 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA를 포함한다. 본 발명은 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 본원에 기술된 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드(예컨대, 서열 번호 10-13, 26, 27, 28, 30, 32 또는 33 중 임의의 것)를 코딩하는 것을 포함한다. 임의적으로, 폴리뉴클레오티드는 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분비 신호 서열에 융합된다. 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드 또한 본 발명의 범주 포함된다.
본 발명은 예컨대, 효소로 절단되어 유사한 분자 상의 또 다른 힌지 서열에 결합하여 동종이량체 VEGF 미니-트랩을 생성하는 힌지 서열을 남기면서 Fc 다량체화 성분을 제거할 수 있는 전구체 VEGF 트랩을 코딩하는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
Figure pct00032
Figure pct00033
일반적으로, "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 세포에서 (예컨대, 직접적으로 또는 다른 프로모터-결합 단백질 또는 물질을 통해) RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고, 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DN조절 영역이다. 프로모터는 인핸서 및 리프레서 서열을 포함하는 다른 발현 제어 서열에 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 수 있다. 유전자 발현을 제어하는 데 사용될 수 있는 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(미국 특허 제5,385,839호 및 제5,168,062호), SV40 조기 프로모터 영역(문헌 [Benoist et al., (1981) Nature 290:304-310]), 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 포함된 프로모터(문헌 [Yamamoto et al., (1980) Cell 22:787-797]), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(문헌 [Wagner, et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445]), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(문헌 [Brinster et al., (1982) Nature 296:39-42]); 원핵성 발현 벡터, 예컨대, 베타-락타마제 프로모터(문헌 [VIIIa-Komaroff et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731]), 또는 tac 프로모터(문헌 [DeBoer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25])(또한 문헌 ["Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American (1980) 242:74-94]도 참조); 및 효모 또는 다른 진균으로부터의 프로모터 요소, 예컨대, Gal4 프로모터, ADC(알콜 데하이드로게네제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제: phosphoglycerol kinase) 프로모터 또는 알칼리성 포스파타제 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 다른 발현 시스템에서 서열이 코딩 서열의 RNA, 바람직하게는 mRNA로의 RNA 폴리머라제 매개 전사를 지시할 때 프로모터 또는 다른 발현 조절 서열에 "작동가능하게 연결"되고, 이어서, 이는 RNA 스플라이싱(인트론을 포함하는 경우) 및 임의적으로, 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질로 번역될 수 있다.
본 발명은 비교가 BLAST 알고리즘에 의해 수행될 때(알고리즘의 파라미터가 각 참조 서열의 전장에 걸쳐 각 서열 간에 가장 크게 매칭되도록 선택된다(예컨대, 예상 임계값: 10, 단어 크기: 28; 질의 범위에서 최대 매치: 0; 매치/미스매치 점수: 1, -2, 갭 비용: 선형); 적어도 본원에 기술된 참조된 뉴클레오티드 서열(예컨대, 서열 번호 14-16 중 임의의 것)과 적어도 약 70-99.9%(예컨대, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본원에 구체적으로 기술된 뉴클레오티드 서열의 변이체는 서열 번호 14-16 중 임의의 것과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드의 하나 이상의(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의) 점 돌연변이, 삽입(예컨대, 프레임내 삽입) 또는 결실(예컨대, 프레임내 결실)을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 돌연변이는 미스센스 또는 넌센스 돌연변이일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 변이체 폴리뉴클레오티드는 VEGF에의 특이적 결합을 보유하는 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드 쇄를 코딩한다.
포유동물 세포를 포함하는 진핵성 및 원핵성 숙주 세포는 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주로서 사용될 수 있다. 상기 숙주 세포는 당업계에 널리 공지되어 있고, 다수가 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC: American Type Culture Collection)으로부터 입수가능하다. 이들 숙주 세포는 특히 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, CHO K1, EESYR, NICE, NS0, Sp2/0, 배아 신장 세포 및 BHK 세포를 포함한다. 본 발명은 하나 이상의 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드(또는 그의 변이체) 및/또는 (예컨대, 본원에서 논의된 바와 같은) 상기 폴리펩티드(들)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 숙주 세포(예컨대, CHO 세포 또는 상기 기술된 임의 타입의 숙주 세포)를 포함한다.
형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 포유동물 세포에 이종성 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜에의 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 바이오리스틱스 주입 및 DNA의 핵 내로의 직접적인 미세주입을 포함한다. 추가로, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포에 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4399216호; 제4912040호; 제4740461호 및 제4959455호를 참조한다. 따라서, 본 발명은
(i) 숙주 세포 내로 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 벡터에 있고/거나; 숙주 세포 염색체 내로 통합되고/되거나 프로모터에 작동가능하게 연결된, VEGF 미니-트랩 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(예컨대, 서열 번호 14-16 중 임의의 하나 이상의 것에 있는 뉴클레오티드 서열; 또는 그의 변이체 포함)를 도입하는 단계;
(ii) 폴리뉴클레오티드의 발현에 바람직한 조건하에서 숙주 세포(예컨대, CHO 또는 피치아(Pichia) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris))를 배양하는 단계, 및
(iii) 임의적으로, 숙주 세포 및/또는 숙주 세포가 성장한 배지로부터 VEGF 미니-트랩 또는 그의 쇄를 단리시키는 단계를 포함하는, VEGF 미니-트랩을 제조하는 재조합 방법을 포함한다.
2개 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 VEGF 미니-트랩을 제조할 때, 단일 숙주 세포에서의 쇄의 공동발현은 동종이량체 미니-트랩을 형성하기 위해, 예컨대, 세포에서 또는 세포 표면 상에서 또는 쇄가 분비된 경우에는 세포 외부에서의 상기 쇄의 회합을 유도한다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 제조 방법, 및 임의적으로, 본원에 기술된 정제 방법의 생성물인 VEGF 미니-트랩을 포함한다.
수개의 재조합 항체 제조 방법이 당업계에 공지되어 있다. 항체의 재조합 제조 방법의 한 예는 US4816567에 개시되어 있다. 재조합 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7850 또는 REGN7851)은 본 발명의 일부이다.
본 발명은 또한 Fc 힌지 도메인 아래의 (그의 C-말단 측면에의) 면역글로불린 Fc 다량체화 성분에서 VEGF 트랩을 절단하는 프로테아제로 VEGF 트랩을 단백질 분해하는 단계를 포함하거나, 그로 구성되거나, 또는 본질적으로 그로 구성된, VEGF 트랩(예컨대, 애플리버셉트 또는 컨버셉트)으로부터 본원에 기술된 VEGF 미니-트랩(예컨대, 동종이량체 VEGF 미니-트랩)을 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 단백질 분해는 S. 피오게네스 IdeS(예컨대, FabRICATOR 프로테아제; Genovis, Inc.; 미국 매사츠세츠주 케임브리지; 스웨덴 룬드 소재) 또는 스트렙토코쿠스 에퀴 아종 쥬에피데미쿠스 IdeZ(New England Biolabs; 미국 매사츠세츠주 입스위치)로 이루어질 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 방법에는 상기 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 상당한 변형(예컨대, PEG화 또는아이오도아세트아미드화와 같은 지시된 화학적 변형) 및/또는 디술피드 브릿지 환원을 포함하는 임의의 단계가 결여되어 있다. 상기 제조 방법의 VEGF 미니-트랩 생성물 또한 본 발명의 일부이다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 트랩의 Fc 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00034
여기서, 효소절단 부위는 "//"로 표시되어 있다.
VEGF 미니-트랩을 제조하는 상기 방법 후, 예컨대, 오염물질, 예컨대, Fc 단편(예컨대, 서열 번호 19), 단백질 분해적 효소 또는 다른 물질로부터 VEGF 미니-트랩을 정제하는 방법이 진행될 수 있다. 예컨대, 도 1을 참조한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 정제 방법은 동종이량체 VEGF 미니-트랩의 형성을 촉진하는 조건하에서 (예컨대, 비환원 조건하에서, 예컨대, 환원제, 예컨대, 디티오트레이톨(DTT) 또는 베타-메르캅토에탄올의 존재하에서) 수행된다. 상기 제조 방법 및 정제 방법의 VEGF 미니-트랩 생성물 또한 본 발명의 일부이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 정제는 크로마토그래피 정제를 포함하는 방법에 의해 수행된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 프로테아제로 절단된 VEGF 트랩은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00035
.
본 발명의 한 실시양태에서, VEGF 트랩은 애플리버셉트(에일리아로서 상업적으로 시판) 또는 컨버셉트이다. WO2000/75319 또는 US9669069를 참조한다.
조합물 및 약학적 제제
본 발명은 하나 이상의 성분과 함께 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)을 포함하는 조성물; 뿐만 아니라, 그의 사용 방법 및 상기 조성물 제조 방법을 제공한다. VEGF 미니-트랩 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 제제는 본 발명의 일부이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 약학적 제제의 pH는 대략 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 또는 6.2이다.
VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)의 약학적 제제를 제조하기 위해, 미니-트랩은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 혼합된다. 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984)]; [Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.]; [Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.]; [Avis, et al. (eds.)(1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al. (eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY]; [Lieberman, et al. (eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, N.Y.]; [Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.]를 참조한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 약학적 제제는 멸균성이다. 상기 조성물은 본 발명의 일부이다.
본 발명의 약학적 제제는 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851), 및 예를 들어, 물, 완충화제, 보존제 및/또는 계면활성제를 비롯한, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명은 본원에 기술된 VEGF 미니-트랩 중 임의의 것(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851) 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 제제로서; 예컨대, 여기서, 폴리펩티드의 농도는 약 40 mg/ml, 약 60 mg/ml, 약 80 mg/ml; 90 mg/ml; 약 100 mg/ml; 약 110 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 133 mg/ml, 약 140 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 200 mg/ml 또는 약 250 mg/ml인 것인 약학적 제제를 제공한다.
본 발명의 범주는 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851), 또는 약학적으로 허용되는 담체를 포함하나, 실질적으로 물은 결여되어 있는 그의 약학적 제제를 포함하는, 건조된, 예컨대, 동결 건조된 조성물을 포함한다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 본원에 개시된 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)과 함께 대상체에게 투여되는 추가 치료제는 문헌 [Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57th edition (Nov. 1, 2002))]에 따라 대상체에게 투여된다.
본 발명은 VEGF 미니-트랩 중 임의의 것(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851) 또는 그의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 제제를 포함하는 베쓸(예컨대, 마개가 있는 플라스틱 또는 유리 바이알 또는 크로마토그래피 칼럼, 중공 보어 니들 또는 시린지 실린더)를 제공한다. 본 발명은 본원에 기술된 VEGF 미니-트랩 또는 제제를 포함하는 주사 장치, 예컨대, 시린지, 선충전된 시린지 또는 자가주사기를 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 베쓸은 광을 차단하기 위해 착색(예컨대, 갈색)된다.
본 발명은 하나 이상의 추가 치료제와 함께 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)을 포함하는 조합물을 포함한다. VEGF 미니-트랩 및 추가 치료제는 단일 조성물 또는 별개의 조성물일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 추가 치료제는 Ang-2 억제제(예컨대, 네스바쿠맙), Tie-2 수용체 활성제, 항PDGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항PDGF 수용체 또는 PDGF 수용체 베타 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및/또는 추가 VEGF 길항제, 예컨대, 애플리버셉트, 컨버셉트, 베바시주맙, 라니비주맙, 항VEGF 압타머, 예컨대, 페갑타닙(예컨대, 페갑타닙 나트륨), 단일 쇄(예컨대, VL-VH) 항VEGF 항체, 예컨대, 브롤루시주맙, 항VEGF DARPin, 예컨대, 아비시파르 페골(Abicipar Pegol) DARPin, 이중특이적 항VEGF 항체, 예컨대, ANG2에도 또한 결합하는 것, 예컨대, RG7716, 또는 Fc-융합 단백질로서 발현되는 세포외 도메인 1-3을 포함하는 인간 혈관 내피 성장 인자 수용체-3(VEGFR-3)의 가용성 형태이다.
투여 및 치료
본 발명은 대상체에게 치료 유효량의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암(예컨대, 그의 성장 및/또는 전이가 적어도 부분적으로 VEGF, 예컨대, VEGF-매개 혈관신생에 의해 매개되는 것) 또는 혈관신생 눈 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 바, "혈관신생 눈 장애"라는 표현은 혈관의 성장 또는 증식에 유발되거나, 또는 그와 연관되거나, 또는 혈관 누출에 의해 유발되는 임의의 눈 질환을 의미한다.
용어 "치료하다" 또는 "치료"는 예를 들어, 대상체에서 예컨대, 혈관신생 눈 장애와 관련하여, 당뇨병성 망막증 중증도 점수(DRSS: diabetic retinopathy severity score)를 감소 또는 유지시킴으로써, (예컨대, 문자의 증가로 측정된 최상의 교정 시력에서) ETDRS 시력을 개선 또는 유지시킴으로써, 시야를 증가 또는 유지시키고/거나, 중심 망막 두께를 감소 또는 유지시킴으로써, 및 암과 관련하여, 암 세포의 성장, 생존 및/또는 전이를 정지 또는 역전시킴으로써 이루어지는 것과 같이, 임의의 임상적으로 측정가능한 정도만큼 상기 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 징후의 퇴행, 안정화 또는 제거를 유발함으로써 바람직하지 않은 질환 또는 장애(예컨대, 혈관신생 눈 장애 또는 암)를 역전, 안정화 또는 제거하는 치료 수단을 지칭한다.
본 발명은 또한 예컨대, 안내 주사에 의해, 예컨대, 유리체내 주사에 의해 VEGF 미니-트랩(예컨대, 예를 들어, 약 100 ㎕ 이하, 예컨대, 약 50, 70 ㎕ 또는 100 ㎕ 중 약 0.5 mg, 2 mg, 4 mg, 6 mg, 8 mg, 10 mg, 12 mg, 14 mg, 16 mg, 18 mg 또는 20 mg의 폴리펩티드), 및 임의적으로, 추가 치료제를 대상체의 체내로 도입하는 단계를 포함하는, 대상체(예컨대, 인간)에게 본원에 기술된 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)을 투여하는 방법을 제공한다.
본 발명은 암 또는 혈관신생 눈 장애 치료를 필요로 하는 대상체의 체내로, 예컨대, 대상체의 눈에 본원에 기술된 VEGF 미니-트랩(예컨대, 약 100 ㎕ 이하 중 예컨대, 2 mg, 4 mg, 6 mg, 8 mg 또는 10 mg), 및 임의적으로, 추가 치료제를 대상체의 체내로 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 혈관신생 눈 장애 치료를 필요로 하는 대상체에서 암(예컨대, 그의 성장 및/또는 전이가 적어도 부분적으로 VEGF, 예컨대, VEGF-매개 혈관신생에 의해 매개되는 것) 또는 혈관신생 눈 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 투여는 유리체내 주사에 의해 수행된다. 본원의 방법을 사용하여 치료가능하거나, 또는 예방가능한 혈관신생 눈 장애의 비제한적인 예로는
· 연령 관련 황반 변성(예컨대, 습성 또는 건성),
· 황반 부종,
· 망막 정맥 폐색 후 황반 부종,
· 망막 정맥 폐색(RVO),
· 중심성 망막 정맥 폐색(CRVO),
· 망막 분지 정맥 폐색(BRVO),
· 당뇨병성 황반 부종(DME),
· 맥락막 신생혈관(CNV),
· 홍채 신생혈관,
· 신생혈관 녹내장,
· 녹내장에 있어 수술 후 섬유증,
· 증식성 유리체망막병증(PVR),
· 시신경 유두 신생혈관,
· 각막 신생혈관,
· 망막 신생혈관,
· 유리체 신생혈관,
· 판누스,
· 익상편,
· 혈관 망막증,
· 당뇨병성 황반 부종을 앓는 대상체에서의 당뇨병성 망막증; 및
· 당뇨병성 망막증(예컨대, 비증식성 당뇨병성 망막증(예컨대, 당뇨병성 망막증 중증도 척도(DRSS: Diabetic Retinopathy Severity Scale) 수준이 약 47 또는 53인 것을 특징으로 하는 것), 또는 증식성 당뇨병성 망막증; 예컨대, DME을 앓지 않는 대상체에서의 것)
을 포함한다.
VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851) 또는 그의 조성물의 투여 모드는 달라질 수 있다. 투여 경로는 비경구적, 비경구적 이외의 모드, 경구적, 직장, 경점막, 장, 근육내, 피하, 진피내, 골수내, 척수강내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비내, 안내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 안내, 유리체내, 경피 또는 동맥내를 포함한다.
본 발명은 미니-트랩 또는 그의 약학적 제제를 대상체의 체내로 도입하는 단계를 포함하는, VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)을 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 본 방법은 예컨대, 시린지의 니들로 대상체의 신체를 피어싱하는 단계, 및 항원 결합 단백질 또는 그의 약학적 제제를 대상체의 체내로, 예컨대, 대상체의 눈, 정맥, 동맥, 근육 조직 또는 피하 조직 내로 주사하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, (본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)을 포함하는) 본 발명의 약학적 제제의 유리체내 주사는 제제를 함유하는 시린지 및 니들(예컨대, 30-게이지 주사 니들)로 눈을 피어싱하는 단계, 및 (예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 치료 유효량, 예컨대, 약 2, 4, 6, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8 또는 8.9, 10 또는 20 mg VEGF 미니-트랩을 전달하기에 충분한 부피로) 제제(예컨대, 약 100 ㎕ 이하; 약 40, 50, 55, 56, 57, 57.1, 58, 60 또는 70 ㎕)를 눈의 유리체 내로 주사하는 단계를 포함한다. 임의적으로, 본 방법은 국소 마취제(예컨대, 프로파라카인, 리도카인 또는 테트라카인), 항생제(예컨대, 플루오로퀴놀론), 소독제(예컨대, 포비돈-아이오딘) 및/또는 동공 확장제를 주사맞는 눈에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 주사 전, 주사맞는 눈 주위의 멸균 영역이 확립된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 유리체내 주사 후, 대상체는 안압, 염증 및/또는 혈압의 상승에 대해 모니터링된다.
"~와 함께"이라는 용어는 성분인 본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)이 또 다른 작용제, 예컨대, 항ANG2와 함께 예컨대, 동시 전달용으로 단일 조성물로 제제화될 수 있거나, 또는 2개 이상의 조성물(예컨대, 각 성분을 포함하는 키트)로 별개로 제제화될 수 있다는 것을 나타낸다. 서로 연관되어 투여되는 성분은 다른 성분이 투여되는 시점과 상이한 시간에 대상체에게 투여될 수 있으며; 예를 들어, 각 투여는 주어진 기간에 걸쳐 간격을 두고 비동시적으로(예컨대, 별개으로 또는 순차적으로) 제공될 수 있다. 서로 연관되어 투여되는 개별 성분은 또한 동일한 투여 기간 동안 본질적으로 동시에(예컨대, 정확히 동일한 시간에 또는 비임상적으로 유의적인 기간의 간격을 두고) 투여될 수 있다. 더욱이, 서로 연관되어 투여되는 별개의 성분은 동일하거나, 상이한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
(예컨대, 적어도 부분적으로 혈관신생에 의해 매개되는) 암 또는 혈관신생 눈 장애를 치료 또는 예방하기 위한 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)의 유효량 또는 치료 유효량은 임의의 임상적으로 측정가능한 정도만큼 암 또는 혈관신생 눈 장애의 하나 이상의 증상 또는 징후를 퇴행, 안정화 또는 제거함으로써, 예를 들어, 대상체에서 예컨대, 혈관신생 눈 장애와 관련하여, 당뇨병성 망막증 중증도 점수(DRSS)를 감소 또는 유지시킴으로써, (예컨대, 문자의 증가로 측정된 최상의 교정 시력에서) ETDRS 시력을 개선 또는 유지시킴으로써, 시야를 증가 또는 유지시키고/거나, 중심 망막 두께를 감소 또는 유지시킴으로써, 및 암과 관련하여, 암 세포의 성장, 생존 및/또는 전이를 정지 또는 역전시킴으로써 암 또는 혈관신생 눈 장애의 퇴행, 안정화 또는 제거를 유발하는 데 충분한 VEGF 미니-트랩의 양을 지칭한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 혈관신생 눈 장애를 치료 또는 예방하기 위한 VEGF 미니-트랩의 유효량 또는 치료 유효량은 예컨대, 약 100 ㎕ 이하 중 약 0.5 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 7.25 mg, 7.7 mg, 7.9 mg, 8.0 mg, 8.1 mg, 8.2 mg, 8.3 mg, 8.4 mg, 8.5 mg, 8.6 mg, 8.7 mg, 8.8 mg, 8.9 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg 또는 20 mg이다. 양은 투여받는 대상체의 연령 및 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 특정 실시양태에서, 초기 용량에 이어 제2 또는 복수의 후속 용량의 VEGF 미니-트랩이 초기 용량과 거의 동일하거나, 또는 그보다 적은 양으로 또는 더 많은 양으로 투여될 수 있으며, 여기서, 후속 용량은 적어도 1일 내지 3일; 적어도 1주, 적어도 2주; 적어도 3주; 적어도 4주; 적어도 5주; 적어도 6주; 적어도 7주; 적어도 8주; 적어도 9주; 적어도 10주; 적어도 12주; 또는 적어도 14주의 간격을 두고 이루어진다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "대상체"는 예를 들어, 암 또는 혈관신생 눈 장애 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 포유동물(예컨대, 래트, 마우스, 고양이, 개, 소, 양, 말, 염소, 토끼), 바람직하게, 인간을 지칭한다. 대상체는 암 또는 혈관신생 눈 장애를 앓는 대상체일 수 있거나, 암 또는 혈관신생 눈 장애가 쉽게 발병될 수 있는 대상체일 수 있다.
진단학적 용도
본 발명의 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)은 또한 예컨대, 진단 목적으로 샘플 중 VEGF 또는 VEGF 발현 세포를 검출 및/또는 측정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, VEGF 미니-트랩은 예컨대, VEGF를 발현하는 종양 세포 및/또는 조직을 확인하기 위해, VEGF의 비정상적인 발현(예컨대, 과다발현, 과소발현, 발현 결여 등)을 특징으로 하는 병태 또는 질환을 진단하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 VEGF 진단 검정법은 예컨대, 환자로부터 수득된 샘플을 본 발명의 VEGF 미니-트랩과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 여기서, VEGF 미니-트랩은 검출가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다. 샘플에 표지된 VEGF 미니-트랩의 존재는 VEGF가 세포 및/또는 조직에 존재한다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 표지되지 않은 VEGF 미니-트랩은 자체적으로 검출가능하게 표지된 2차 항체(VEGF 미니-트랩에 대한 결합 친화성을 갖는 것)와 조합하여 함께 진단 적용에 사용될 수 있다. 검출가능한 표지 또는 리포터 분자는 방사성 동위원소, 예컨대, 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I; 형광성 또는 화학발광성 모이어티, 예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 로다민; 또는 효소, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 또는 루시페라제일 수 있다. 샘플 상의 VEGF 미니-트랩에 결합된 표지된 2차 항체의 존재는 VEGF가 세포 및/또는 조직에 존재한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 방법은 VEGF 발현에 대해 측정하고자 하는 세포 및/또는 조직을 함유하는 샘플을 VEGF 미니-트랩과 접촉시키는 단계, 및 VEGF 미니-트랩과 세포 및/또는 조직 사이의 결합이 관찰되었다면, 세포 및/또는 조직이 VEGF를 발현하는 것으로 결정되는 것인 단계를 포함한다.
접합체
본 발명은 또 다른 모이어티, 예컨대,치료 모이어티에 접합된 VEGF 미니-트랩(예컨대, REGN7483R, REGN7483F, REGN7850 또는 REGN7851)을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "접합체"는 VEGF 트랩 또는 미니-트랩 또는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 약물, 방사성 작용제, 리포터 모이어티, 효소, 펩티드, 단백질 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결된 VEGF 미니-트랩을 지칭한다.
특정 실시양태에서, 치료 모이어티는 세포독소, 화학요법 약물, 면역억제제 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 세포독성제는 세포에 유해한 임의의 작용제를 포함한다. 면역접합체를 형성하는 데 적합한 세포독성제 및 화학요법제의 예는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, WO2005/103081 참조).
세포독소에 연결된 VEGF 미니-트랩의 접합체는 암을 치료하기 위해 치료학적으로 사용될 수 있다. 접합된 미니-트랩의 종양 조직에의 결합은 세포독소를 종양으로 국재화시키고, 이에 따라 종양의 세포는 사멸되거나, 성장 및/또는 전이를 중단하게 된다. 접합된 VEGF 미니-트랩의 이러한 사용 방법은 본 발명의 일부이다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시 목적으로만 제공되며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수치와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 실험상 오차 및 편차를 고려해야 한다. 이들 실시예에 기술된 임의의 제제는 본 발명의 일부이다.
실시예 1 : VEGF 미니-트랩의 재조합 발현
재조합 VEGF 미니-트랩의 코딩 영역을 신호 서열에 연결하고, 포유동물 발현 벡터에 클로닝하고, 차이니즈 햄스터 난소(CHO-K1) 세포에 형질감염시키고, 12일 동안 400 ㎍/ml 하이그로마이신으로 선별한 후, 안정하게 형질감염된 풀을 단리시켰다. 화학적으로 정의된 단백질 무함유 배지에서 성장한 안정한 CHO 세포 풀을 사용하여 시험을 위한 단백질을 제조하였다. 재조합 폴리펩티드를 세포로부터 성장 배지로 분비하고, 세포를 심층 여과한 후, 폴리펩티드를 성장 배지 및 다른 오염물질로부터 크로마토그래피로 정제하였다.
VEGF 미니-트랩의 구성 도메인 서열
· 인간 Flt1(수탁 번호 NP_001153392.1)
· 인간 Flk1(수탁 번호 NP_002244.1)
· 인간 Fc(IGHG1, 수탁 번호 P01857-1)
VEGF 미니-트랩 서열
REGN7483F(애플리버셉트로부터 절단된 동종이량체 미니-트랩 FABricator)
hFlt1 Ig 도메인 2(S129-D231). hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327).hFc (D104-G119)
Figure pct00036
(서열 번호 12)
REGN7483R(동종이량체 미니-트랩, 재조합)
hFlt1 Ig 도메인 2(S129-D231).hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327).hFc (D104-G119)
Figure pct00037
(서열 번호 12)
REGN7850( VEGF 미니-트랩-hFc DKTHCPPCPPC )
hFlt1 Ig 도메인 2(S129-D231). hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327).hFc (D104-G112).PPC
Figure pct00038
(서열 번호 27)
REGN7851( VEGF 미니-트랩-hFc DKTHCPPCPPCPPC )
hFlt1 Ig 도메인 2(S129-D231).hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327).hFc(D104-C112).PPCPPC
Figure pct00039
(서열 번호 28)
REGN6824( hVEGF 미니트랩- G4Sx3 - hVEGF 미니트랩- mmH )
hFlt1 Ig 도메인 2(S129-D231).hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327). G4Sx3 링커 .Flt1 Ig 도메인 2(S129-D231).hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327).mycmyc6His
Figure pct00040
(서열 번호 34)
REGN7080( VEGF 미니트랩- G4Sx6 - VEGF 미니트랩 mmH )
hFlt1 Ig 도메인 2(S129-D231). hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327). G4Sx6 링 커. Flt1 Ig 도메인 2(S129-D231).hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327).mycmyc6His
Figure pct00041
(서열 번호 35)
REGN7991( hVEGF 미니트랩- G4Sx9 - hVEGF 미니트랩)
hFlt1 Ig 도메인 2(S129-D231).hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327). G4Sx9 링 커 .Flt1 Ig 도메인 2(S129-D231).hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327)
Figure pct00042
(서열 번호 32)
REGN7992( hVEGF 미니트랩- G4Sx12 - hVEGF 미니트랩)
hFlt1 Ig 도메인 2(S129-D231). hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327). G4Sx12 링 커.Flt1 Ig 도메인 2(S129-D231).hFLK1 Ig 도메인 3(V226-K327)
Figure pct00043
(서열 번호 33)
실시예 2: 애플리버셉트의 단백질 분해적 절단.
VEGF 미니-트랩 분자 REGN7483F를 생성하기 위해, 고정화된 IdeS 효소(Genovis(미국 매사츠세츠주 케임브리지; 스웨덴 룬드 소재)로부터 수득된 FabRICATOR®)를 사용하였다.
REGN7483F를 생성하기 위해, FabRICATOR 효소를 함유하는 칼럼을 사용하였다. 이어서, 애플리버셉트(1.0 mL 절단 완충제 중 20 mg)를 칼럼에 첨가하고, 18℃에서 30 min 동안 칼럼 상에서 인큐베이션시켰다. 30 min 후, 칼럼을 절단 완충제(1.0 mL)로 세척하였다. 분해 혼합물 및 세척액을 혼합하였다.
혼합물을 분석용 proA 칼럼(Applied Biosystems™, POROS™ 20 uM Protein A Cartridge 2.1x30 mm, 0.1 mL(Cat# 2-1001-00)) 상에서 용리시켰다. POROS™ 20 uM 단백질 A 카트리지 2.1x30 mm, 0.1 mL(Cat# 2-1001-00)에 대한 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)™의 프로토콜에 따라 정제를 수행할 수 있다.
실시예 3 : 수용체 포획된 표면 상에서의 VEGF 미니-트랩 및 VEGF의 결합 동력학적 분석
VEGF165에 결합할 수 있는 VEGF 미니-트랩 분자의 능력을 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)에 의해 평가하였다.
<표 3-1>
Figure pct00044
실험 절차 . 다양한 정제된 VEGF 미니-트랩 구성물에 결합하는 인간 VEGF165에 대한 평형 해리 상수(KD 값)는 비아코어(Biacore) 3000 기기를 사용하는 실시간 표면 플라즈몬 공명 바이오센서를 사용하여 측정하였다. 모든 결합 연구는 25℃에서 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% v/v 계면활성제 트윈-20, pH 7.4(HBS-ET) 러닝 완충제 중에서 수행하였다. VEGF 미니-트랩 구성물를 포획하기 위해, 비아코어 센서 표면을 먼저 단일클론 마우스 항VEGFR1 항체와의 아민 커플링에 의해 유도체화하였다. 인간 VEGF 시약, 인간 VEGF165(인간 VEGF165; 서열 번호 31)에 대해 결합 연구를 수행하였다. HBS-ET 러닝 완충제 중에서 제조된 상이한 농도의 시약(2 nM - 62.5 pM; 인간 VEGF165에 대한 2배 연속 희석액)을 90 ㎕/분의 유속으로 1.8분 동안 항VEGFR1-포획 VEGF 미니-트랩 구성물 표면 상에 주입하고, 동시에 VEGF 미니-트랩 구성물 결합 VEGF165 시약의 해리를 HBS-ET 러닝 완충제 중에서 60분 동안 모니터링하였다. 스크러버(Scrubber) 2.0c 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 실시간 센서그램을 1:1 결합 모델에 피팅함으로써 동력학적 회합(k a) 및 해리(k d) 속도 상수를 결정하였다. 결합 해리 평형 상수(K D) 및 해리 반감기(t½)는 하기와 같이 동력학적 속도 상수로부터 계산하였다:
Figure pct00045
.
25℃에서의 상이한 VEGF 미니-트랩 구성물에 결합하는 인간 VEGF165에 대한 결합 동력학적 파라미터가 표 1-2 및 1-3에 제시되어 있다.
<표 3-2>
Figure pct00046
<표 3-3>
Figure pct00047
본 실시예에 제시된 바와 같이, 본 발명의 특정 VEGF 미니-트랩은 VEGF 분자에 대하여 전장의 애플리버셉트와 유사한 결합 친화도를 보였다.
실시예 4 : 루시페라제 생물검정법에서의 VEGF 110 , VEGF 121 및 VEGF 165 에 의한 VEGFR1의 활성화를 차단시킬 수 있는 VEGF 미니-트랩의 능력 평가
시험관내에서 VEGF110, VEGF121, 및 VEGF165 매개 VEGFR1 활성화를 억제시킬 수 있는 다양한 VEGF 미니-트랩의 능력을 평가하였다.
<표 4-1>
Figure pct00048
Figure pct00049
실험 절차 .
세포주
IL18Rα 또는 IL18Rβ의 세포질 도메인에 융합된 VEGFR1 세포외 도메인을 도입한 2개의 키메라 수용체로 세포주, HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ 클론 V3H9를 구성하였다. NFκB-루시페라제-IRES-eGFP 리포터 유전자를 이용하여 세포주에 키메라 수용체를 형질감염시켰다. 세포외 VEGFR1은 VEGF에 결합할 때 이량체화되고, 그 결과로 IL18Rα 및 IL18Rβ 세포내 도메인의 상호작용, NFκB 신호전달 및 후속하여 루시퍼라제 생성이 일어난다.
검정법 절차
HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ 클론 V3H9 세포를 0.5% FBS(Seradigm, Cat#1500-500)를 포함하는 OptiMEM(Invitrogen, Cat#31985) 중 10,000개의 세포/웰로 96-웰 백색 불투명 플레이트(Nunc, Cat#136101) 중에 플레이팅하고, 5% CO2하에 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 다음날, 5000 pM 내지 0.085 pM 농도 범위의 VEGF-트랩 또는 미니-트랩 단백질의 1:3 연속 희석액으로 세포를 차별적으로 처리한 후, 고정 농도의 20 pM VEGF110(R&D Systems Cat# 298-VS), VEGF121(R&D Systems Cat#4644-VS) 또는 VEGF165(R&D Systems Cat#293-VE) 리간드 단백질을 첨가하고, 5% CO2하에 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 원-글로(One-Glo) 루시페라제 기질(Promega, Cat#E6130)을 세포에 첨가하고, VICTOR™ X5 멀티라벨(Multilabel) 플레이트 판독기(PerkinElmer, 모델 2030-0050)를 사용하여 발광을 측정하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어로 11-포인트 반응 곡선에 대하여 4-파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여 데이터를 분석하여 EC50 및 IC50 값을 결정하였다.
결과 요약 및 결론 . VEGF110, VEGF121, 및 VEGF165는 실험에 걸쳐 각각 ~11-24 pM, ~21-44 pM, 및 ~28-43 pM의 EC50 값(도 3-도 5f, 표 4-2, 4-4 및 4-6)으로 HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ 클론 V3H9 세포를 활성화시켰다.
(G4S)3 링커를 갖는 단일 쇄 미니-트랩(REGN6824) 또는 (G4S)6 링커를 갖는 단일 쇄 미니-트랩(REGN7080)은 20 pM VEGF110 또는 20 pM VEGF121 존재하에 ~0.2 nM의 IC50 값으로 VEGFR1 신호전달을 억제시켰고, VEGF165 존재하에 부분적으로 차단하였다(도 3 및 표 4-2 및 4-3).
더 긴 G4S 링커((G4S)9 또는 (G4S)12)를 갖는 단일 쇄 미니-트랩(REGN7991 및 REGN7992)은 ~24 내지 ~79 pM 범위의 개선된 IC50 값으로 VEGFR1 신호전달을 억제시켰다(도 4a-도 4b 및 표 4-4 및 4-5).
VEGF 트랩(REGN3; 애플리버셉트)은 실험에 걸쳐 ~9-21 pM 범위의 IC50 값으로 VEGF 이소폼의 신호전달을 억제시켰다.
FabRICATOR 절단된 미니-트랩인 REGN7483F, 재조합 이량체 미니-트랩인 REGN7483R, 및 REGN7850 및 REGN7851의 억제 활성을 VEGF 트랩(애플리버셉트)의 것과 비교하였다. REGN7843F, REGN7483R, REGN7850 및 REGN7851은 전장의 VEGF 트랩에 대하여 관찰된 것과 비교하여 유사한 IC50 값으로 VEGF110, VEGF121, 및 VEGF165 매개 VEGFR1 활성화를 억제시켰다(도 5a-도 5f 및 표 4-6 및 4-7). VEGF110, VEGF121, 및 VEGF165 매개 VEGFR1 활성화 억제가 관찰되었으며, 여기서, IC50 값은 REGN7483F의 경우, ~9-12 pM이고, REGN7483R의 경우, ~8-19 pM이고; REGN7850의 경우, ~12-30 pM이고, REGN7851의 경우, ~15-27 pM이었다.
데이터를 3개의 독립 실험에서 수집하였고, 이는 하기에 기재되어 있다.
생물검정법 실험 1
<표 4-2>
Figure pct00050
<표 4-3>
Figure pct00051
생물검정법 실험 2
<표 4-4>
Figure pct00052
<표 4-5>
Figure pct00053
생물검정법 실험 3
<표 4-6>
Figure pct00054
<표 4-7>
Figure pct00055
본 실시예는 본 발명의 특정 VEGF 미니-트랩이 VEGF-매개 VEGFR1 활성 차단과 관련하여 동등하거나, 또는 더 우수한 효능을 보였다는 것을 입증한다.
실시예 5 : 다각도 광 산란에 커플링된 크기 배제 크로마토그래피(SEC- MALS )에 의한 VEGF 미니-트랩과 VEGF 사이에 형성된 시험관내 복합체의 크기 분석
VEGF와 다양한 VEGF 미니-트랩 분자의 화학량론을 결정하였다.
<표 5-1>
Figure pct00056
실험 절차.
다각도 광 산란을 동반한 크기 배제 크로마토그래피(SEC- MALS ) 적정
상이한 미니-트랩-VEGF 복합체의 화학량론을 이해하기 위해, 상이한 몰비로 미니-트랩 및 VEGF 단백질을 함유하는 일련의 용액을 표 5-3에 제시된 바와 같이 제조하고, 이를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 연구된 복합체는 하기와 같았다: REGN110-REGN7483F, REGN110-REGN6824 및 REGN110-REGN7080. REGN110, REGN7483F, REGN6824 및 REGN7080 만을 단독으로 함유하는 대조군 샘플도 동일한 방식으로 제조하였다. 인큐베이션된 샘플을 AKTA 마이크로 시스템(GE Healthcare Life Sciences)으로 작동되는 슈퍼로스 12 Inc 10/300 Gl 칼럼(Superose 12 Inc 10/300 Gl 칼럼)에 커플링된 미니DAWN 트레오스(miniDAWN Treos) MALS 장치 및 옵티랩(Optilab) T-rEX(굴절률 측정)(Wyatt Technology Corporation)로 구성된 SEC-MALS 시스템에 주입하였다. 모든 샘플에 대한 칼럼 실행 완충제는 10 mM 포스페이트 pH 7.0, 500 mM NaCl이었다. MALS 측정값을 보정하기 위해 분자량이 공지된 표준으로서 100 ug BSA(우혈청 알부민: Bovine Serum Albumin, Thermo Scientific)를 별도로 주입하였다. 크기 배제 크로마토그래피 데이터는 mAU(280 nm에서의 흡광도) 대 머무름 부피(ml)를 플롯팅하여 Unicorn(Version 5.20 GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 평가하였다. MALS 데이터는 몰 질량 대 부피(ml) 및 레일리(Rayleigh) 비 대 부피(ml)를 플롯팅하여 ASTRA(버전 7.0.0.69 Wyatt Technology)를 사용하여 평가하였다.
결과 요약 및 결론 . 결과 요약 및 결론. SEC-MALS를 사용하여 상이한 버전의 미니-트랩(REGN7483F, REGN6824, REGN7080)과 VEGF(REGN110) 사이에 형성된 복합체의 몰 질량 및 용리 프로파일을 평가하였다. 표 5-2는 VEGF 미니-트랩 단백질 및 REGN110에 대한 이론상의 몰 질량 예상치(글리코실화를 포함하지 않는 펩티드 서열로부터 계산), 몰 질량 관측치 뿐만 아니라, 시약의 올리고머 상태를 제공한다. 표 5-3은 분석된 복합체에 대한 크로마토그램의 각 피크에 대한 중량 평균 몰 질량 관측치를 보여준다.
REGN110은 ~42 kDa의 단일 피크로 용리되었으며, 이는 문헌에 VEGF의 주요 종인 것으로 제시된 디술피드-연결된 동종이량체와 일치한다(도 6-8, 피크 3). 미니-트랩 단백질은 그의 이론상의 펩티드 몰 질량 50-51 kDa 및 8 N-연결된 글리코실화가 기여한 추가의 ~12 kDa과 일치하는 ~63 kDa의 몰 질량을 갖는 단량체로 전개되었다(도 6-8, 피크 2). REGN7483F는 FabRICATOR 절단이 무손상 REGN3의 Fc 도메인에서 힌지 디술피드를 분해하지 않기 때문에 디술피드-연결된 동종이량체일 것으로 예상된다.
REGN6824 및 REGN7080은 시험된 모든 조건하에서 REGN110과 유사한 복합체를 형성하였다(표 5-3, 도 6 및 도 7). 단일 쇄 단량체(REGN6824)가 몰 당량의 VEGF 동종이량체(REGN110)와 조합될 때, ~215 KDa의 몰 질량을 갖는 피크(도 6, 피크 1)가 관찰되었으며, 이는 두 REGN6824 분자로 이루어진 복합체가 2개의 REGN110 동종이량체에 결합하였다는 것을 시사한다. REGN110 또는 REGN6824/REGN7080이 과량으로 존재하는 상이한 몰비에서, 관찰된 유일한 복합체 종은 과량 VEGF 또는 과량 미니-트랩을 나타내는 피크와 함께, ~215 kDa의 2:2 복합체이다.
한편, REGN7483F는 등몰 또는 과량의 REGN110과 조합될 때, ~99 KDa의 복합 피크를 나타내었다(도 8, 피크 1). 상기 피크는 하나의 REGN110 동종이량체에 결합된 하나의 REGN7483F 디술피드-연결된 동종이량체로 이루어진 복합체와 일치한다. 과량의 REGN7483F의 존재하에서(도 8, 피크 1a), MALS 피크의 몰 질량은 약 ~70kDa이다. 이 경우, 슈퍼로스 12 칼럼은 과량의 REGN7483F로부터 REGN7483F + REGN110 복합체를 완전히 분리할 수 없었고; 따라서, 몰 질량 관측치는 복합체(99 kDa)와 REGN7483F 단독(63 kDa) 사이의 평균을 나타낸다.
<표 5-2>
Figure pct00057
<표 5-3>
Figure pct00058
실시예 6 : 마우스 OIR 모델에서 VEGF 트랩 및 이량체 미니-트랩의 유리체내 및 전신 투여
마우스 새끼를 생후 6일째(P6; 생후 #6)에 과산소 환경(75% O2)에 두었고, P11에 실내 공기(21% O2)로 복귀시켰다. 이는 앞으로 며칠 동안 병적 신생혈관을 유발한다. P13에 새끼에 하기 등몰 용량의
· VEGF 트랩(애플리버셉트)(.25 ㎍/눈, n=3),
· 단일 쇄 미니-트랩(REGN7080)(.125 ㎍/눈, n=3),
· 이량체-미니-트랩(REGN7483F)(.125 ㎍/눈, n=3), 또는
· 대조군 단백질, hFc(.125 ㎍/눈, n=3)를 유리체내로 주사하거나;
또는
P12에
· 3 mg/kg 대조군 단백질, hFc,
· 3 mg/kg 이량체 미니-트랩(REGN7483F),
· 30 mg/kg 이량체 미니-트랩(REGN7483F); 또는
· 100 mg/kg 이량체 미니-트랩(REGN7483F)을 전신으로(복강내로) 주사하였다.
P16에, 눈을 수확하였다. 망막을 절개하고, FITC 표지된 그리포니아 심플리시폴리아(Griffornia simplicifolia) 렉틴 I(Vector Laboratories)로 염색하고, 프로롱 골드(Prolong Gold)(Invitrogen)를 플랫 마운팅하였다. 비정상 면적을 측정하기 위해, 4x 대물렌즈가 있는 니콘(Nikon) 80i로 평면 마운트를 이미지화하고, 이미지 분석 소프트웨어(Adobe Photoshop CC 2015 확장)로 망막 혈관신생 면적을 정량화하였다.
인간 Fc 대조군, 애플리버셉트(VEGF 트랩), 두 VEGFR1(d2)-VEGFR2(d3) 융합 단백질 사이에 (G4S)6 링커를 갖는 단일 쇄 미니-트랩 또는 애플리버셉트의 FabRICATOR 프로테아제 절단의 생성물인 이량체 미니-트랩(이량체 미니-트랩)을 투여받은 마우스에서의 비정상 혈관화 면적(㎟)을 평가하였다. 마우스 망막에서 비정상 혈관화 면적 감소에 있어 이량체 미니-트랩이 단일 쇄 미니-트랩 및 애플리버셉트보다 유의적으로 더 우수한 성능을 보였다. 도 9를 참조한다.
전신으로(ip) 전달되었을 때, 심지어 100 mg/kg에서도 신생혈관을 완전히 억제시키지 못한 이량체 미니-트랩은 VEGF 트랩(애플리버셉트)보다 훨씬 더 낮은 효력을 보였다. 도 10a를 참조한다. 과거 데이터에 따르면, OIR 마우스 모델에서 6.25 mg/kg으로 전신으로(ip) 전달되었을 때, VEGF 트랩(애플리버셉트)은 거의 완전히 억제시키는 것으로 나타났다. 도 10b를 참조한다. 이는 전신 투여시 이량체 미니-트랩이 애플리버셉트보다 반감기가 더 짧다는 것을 시사하는 것이다. 유리체내 공간으로부터 혈액으로 누출되는 이량체 미니-트랩은 비교적 신속하게 제거되기 때문에 상기와 같이 더 짧은 반감기는 더 우수한 안전성 프로파일을 유도할 수 있다.
실시예 7 : EESYR CHO 세포에서 발현된 REGN112의 C-말단에의 PPC 부가
본 실시예에서, 이량체 또는 단량체를 형성할 수 있는 다양한 미니-트랩의 능력을 평가하였다.
REGN112, REGN7850 또는 REGN7851을 코딩하는 재조합 미니-트랩을 발현 플라스미드에 클로닝하고, CHO 세포에 형질감염시키고, 12일 동안 400 ㎍/ml 하이그로마이신으로 선별한 후, 안정하게 형질감염된 풀을 단리시켰다. 화학적으로 정의된 단백질 무함유 배지에서 성장한 안정한 CHO 세포 풀을 사용하여 시험을 위한 단백질을 제조하였다. 정제 전, 분취량(10 ㎕)의 미니-트랩 함유 배지를 환원 또는 비환원 조건하에 1X 트리스-글리신 SDS 러닝 완충제 중 4-20% 노벡스 트리스-글리신(Novex Trys-Glycine)(10 웰, 1.0 mm 미니겔) SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 시약으로 염색하여 단백질을 시각화하였다. 단량체 및 이량체 종을 화살표로 마킹하였다.
SDS-PAGE 겔 육안 검사 결과(도 11), REGN112를 발현하는 세포는 단백질의 약 절반을 미리 형성된 이량체로서 분비하고, 나머지 절반은 단량체로 분비하는 것으로 나타났다. REGN112의 카복시 말단에 1개(REGN7850) 또는 2개(REGN7851) PPC 모티프를 부가하면 미리 형성된 이량체의 생성이 거의 100%까지 개선되었다.
실시예 8: 미니-트랩 색상 감소를 위한 음이온 교환 크로마토그래피( AEX )
선행 다변수 특성화 연구(음성 모드, pH 8.0, 7.0 mS/cm) 동안 최적화된 AEX 설정값은 더 진한의 갈색 REGN7483 종을 적절히 제거하지 못했다. 새 설정값이 갈색 REGN7483 종을 추가로 감소시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해 새 AEX 설정값(pH 8.4, 2.0 mS/cm)을 3가지 크로마토그래피 수지에 대해 결합-및 용리 모드로 평가하였다. 상기 설정값은 캅토 Q 수지를 이용한 이전의 REGN3 AEX 전개 동안 덜 진한 갈색 REGN3 종으로부터 더 진한 갈색 REGN3 종을 분리하는 것으로 나타났다. 3개의 AEX 분리는 REGN7483에 대해 Q 세파로스 FF, POROS 50 HQ 및 캅토 Q에서 상기 설정값을 평가하였다. 제4 AEX 분리는 REGN3에 대해 캅토 Q에서 상기 설정값을 평가하였다. 제5 AEX 분리는 처음 4개의 AEX 분리가 추가로 색상을 감소시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위한 대조군으로서 REGN7483에 대해 원래의 설정값(pH 8.0, 7.0 mS/cm)을 평가하였다.
디자인 . 본 연구를 위해 표 8-1에 상세하게 설명된 바와 같이 5개의 AEX 분리를 수행하였다. AEX 분리 1 내지 4는 표 8-3에 상세하게 설명된 방법을 사용하여 수행된 반면, AEX 분리 5는 표 8-2에 상세하게 설명된 방법을 사용하여 수행되었다. 모든 AEX 로드는 유사한 생물반응기로부터 공급받았다. 본 실험을 위해 15.7 mL 캅토 Q 칼럼(20.0 cm 베드 높이, 1.0 cm I.D.), 14.1 mL POROS 50 HQ 칼럼(18.0 cm 베드 높이, 1.0 cm I.D.), 및 16.5 mL Q 세파로스 FF 칼럼(21.0 cm 베드 높이, 1.0 cm I.D.)을 AKTA 아반트(Avant) 벤치탑 액체 크로마토그래피 컨트롤러 내로 통합시켰다.
AEX 로드 pH를 2 M 트리스 염기 또는 2 M 아세트산을 사용하여 표적 ± 0.05 pH 단위로 조정하였다. AEX 로드 전도도는 5 M 염화나트륨 또는 RODI(역삼투 탈이온수)를 사용하여 표적 ± 0.1 mS/cm로 조정하였다. 모든 풀 샘플을 HMW, 색상, 및 수율에 대해 분석하였다.
<표 8-1>
Figure pct00059
<표 8-2>
Figure pct00060
<표 8-3>
Figure pct00061
결과 . AEX 풀에서 색상을 허용가능한 수준으로 감소시킬 수 있는 최적의 수지 및 설정값을 결정하기 위해 5개의 AEX 분리를 수행하였다. CIELAB 색 공간(L*, a* 및 b* 변수)을 사용하여 색상을 분석하기 전에 모든 풀을 11 g/L로 농축시켰다. 문헌 [CIEL*C*h* Color Scale, Application Notes, 8(11): 1-4 (Hunter Lab; Reston, VA) (2008) and Objective Colour Assessment and Quality Control in the Chemical, Pharmaceutical and Cosmetic Industries", Application Report No. 3.9 e from Hach Lange GmbH, pp. 1-28, Feb. 2013]을 참조한다. 처음 4개의 AEX 분리(1-4)는 결합-및-용리 모드로 평가하는 것으로 의도된 반면, 생성물 대부분은 로드 및 세척 블록, 즉, 음성, 또는 플로우 쓰루 모달리티로 작동된 칼럼에 존재하였다(62 - 94%).
처음 3개의 분리(1-3)는 로드 물질로서 REGN7483을 사용하여 캅토 Q, POROS 50 HQ, 및 Q 세파로스 FF 수지에 대해 pH 8.4 및 2.0 mS/cm 설정값을 평가하였다. 3개의 분리 모두 > 80%의 수율 및 < 3.4%의 풀 HMW(고분자량 종 함량)을 보였다. POROS 50 HQ AEX 풀은 AEX 풀에서 가장 낮은 황색 색상(b* = 2.09)을 나타내었고, 이어서, Q 세파로스 FF AEX 풀(b* = 2.22) 및 캅토 Q AEX 풀(b* = 2.55)이었다.
제4 AEX 분리(4)는 로드 물질로서 REGN3을 사용하여 캅토 Q에 대해 pH 8.4및 2.0 mS/cm 설정값을 평가하였다. 상기 설정값은 로드 및 세척 동안 61.9% 수집 및 용리 동안 34.0% 수집인 수율을 보였다. 상기 AEX 풀은 가장 옅은 황색(b* = 1.44)이었다. 상기 AEX 조건하에서는 가장 옅은 황색 AEX 풀을 얻었지만, FabRICATOR 효소에 의한 절단, 및 이어서, 절단된 Fc 부분 제거 후, 황색 색상은 증가하는 것으로 관찰되었다(절단 전 풀에서, b* = 3.52 및 절단 후 및 Fc 제거 풀에서, b* = 4.17). 이는 가정컨대 갈색 색상은 Fc 부분보다는 REGN3 분자의 REGN7483 부분에 더 많이 존재하기 때문이며, 따라서, Fc를 제거하고, 결과로서, 효소적 절단에 의해 유발된, REGN7483의 몰 농도를 g/L 단위로 일정한 농도가 배가하는 것은 색상을 진하게 만든다. 이러한 예상된 황색 색상 증가(Δb* = +0.65)를 REGN3 AEX 풀 색상(b* = 1.44 + 0.65 = 2.09)에 가하면, FabRICATOR 단위 작동 후, 가장 옅은 황색 REGN7483 AEX 풀(b* = 2.09)과 유사한 색산을 갖게 될 것으로 나타날 것이다. 추가로, 로드 및 세척 수율이 62%인 것은 개발 목표(> 80%)보다 낮기 때문에, AEX 분리에 덜 바람직한 설정값이 되었다.
제5 AEX 분리(5)는 로드 물질로서 REGN7483을 이용하여 POROS 50 HQ 수지에서 이전에 최적화된 설정값(pH 8.0 및 7.0 mS/cm)을 평가하였다. 상기 AEX 분리는 > 80%의 수율 및 < 3.4%의 풀 HMW였지만, 가장 진한 황색 풀(b* = 3.40)이었다.
<표 8-5>
Figure pct00062
결론 . 5개의 AEX 분리를 수행하여 수지(캅토 Q, Q 세파로스 FF, 및 POROS 50 HQ) 및 설정값(pH 8.0 및 7.0 mS/cm, pH 8.4 및 2.0 mS/cm)을 평가하였다. pH 8.4 및 2.0 mS/cm의 설정값하에 POROS 50 HQ에서 REGN7483을 이용하여 AEX 분리를 수행한 결과, 동일한 프로세스 및 로드 공급원을 이용한 Q 세파로스 FF AEX 풀 및 캅토 Q AEX 풀과 비교하여 덜 진한 황색 풀을 얻었다. 제4 AEX 분리(REGN3 로드 공급원, 캅토 Q 수지, pH 8.4 및 2.0 mS/cm 설정값)는 효소적 절단 단위 작동 후, REGN7483 POROS 50 HQ AEX 풀과 유사한 색상을 가질 것으로 예상된다.
최종적으로, 제5 AEX 분리(REGN7483 로드 공급원, POROS 50 HQ 수지, pH 8.0 및 7.0 mS/cm 설정값) 결과, 가장 진한 황색 풀을 얻었다. 과량의 황색 색상은 비교적 낮은 pH(7.9-8.1) 및 높은 전도도(6.5-7.5 mS/cm)에 기인하는 것으로 간주된다. 이러한 두 인자가 REGN7483F 발현 CDM에서 더 높은 수준의 황색 색상을 유발한 것으로 나타났다.
CDM에서 발현된 (갈황색 색상을 갖는) 애플리버셉트의 단백질-A 크로마토그래피에 의한 정제, 및 이어서, 활성탄 여과 결과, 유의적인 갈황색 색상 감소는 이루어지지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 9 : 더 높은 pH 및 더 낮은 전도도에서 정제된 미니-트랩 AEX에서 색상 및 2-옥소-히스티딘 분석
본 실시예에서 다양한 미니 트랩 생산 로트에서 2-옥소-히스티딘으로 산화된 미니-트랩(REGN7483F) 히스티딘의 갈황색 색상 및 정량을 평가하였다.
샘플 제조. 환원 및 알킬화된 미니-트랩(REGN7483F) 샘플 로트(10, 23 및 14)의 트립신 맵핑을 수행하여 2-옥소-히스티딘 번역 후 변형을 확인하고, 정량화하였다. 200 ㎍ 분취량의 각 약물 물질을 0.1 M 트리스-HCl, pH 7.5 중 8.0 M 우레아 중에서 변성시키고, DTT로 환원시킨 후, 이어서, 아이오도아세트아미드로 알킬화하였다. 이어서, 변성, 환원 및 알킬화된 약물 물질을 먼저 37℃에서 30분 동안 1:100(w/w)의 효소 대 기질 비로 재조합 Lys-C(rLys-C)로 분해하고, 최종 우레아 농도가 1.8 M이 되도록 0.1 M 트리스-HCl, pH 7.5로 희석한 후, 이어서, 37℃에서 2시간 동안 1:20(w/w)의 효소 대 물질 비로 트립신으로 분해한 후, 이어서, 37℃에서 1시간 동안 1:5(w/w)의 효소 기질 비로 PNG아제 F로 탈글리코실화시켰다. 포름산(FA: formic acid)을 사용하여 pH를 pH 2.0 미만으로 낮추어 분해를 중단시켰다.
미니-트랩 생산 . 500 리터의 생물반응기 작동 부피를 사용하여 애플리버셉트를 발현시켰다. 애플리버셉트를 함유하는 세포 배양물에 대해 3개의 여과 단계(심층, 연마 및 보호), 이어서, 단백질-A 친화성 포획 크로마토그래피 (결합-및-용리) 및, 추가 여과를 수행하였다. 이어서, 상기 물질을 스트렙토코쿠스 피오게네스 IdeS 프로테아제(FabRICATOR, 미국 매사츠세츠주 케임브리지; 스웨덴 룬드 소재)로 효소 절단하고, 수지에 고정시켜 미니-트랩 및 절단된 Fc 단편 부산물을 생성하였다. Fc 단편을 단백질-A 친화성 포획 크로마토그래피에 의해 반응으로부터 제거한 후(플로우 쓰루 분획 중 미니-트랩 생성물), 여과 단계(오직 미니-트랩 생산 162, 29 및 30에 대해서만 수행)를 수행하였다. 바이러스를 낮은 pH에서 유지시켜 불활성화시키고, 여과 단계를 거친 후, 미니-트랩을 표 9-1에 제시된 파라미터를 사용하여 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피(플로우 쓰루 모드)에 의해 정제하였다.
<표 9-1>
Figure pct00063
이어서, 정제된 물질을 소수성 상호작용 크로마토그래피(페닐 리간드를 갖는 수지), 농축 및 정용여과에 의해 추가로 정제하였다.
350 nm에서 흡광도 증가의 원인이 되는 펩티드 단편의 국재화 . 미니-트랩 생산 10 샘플의 진한 색상의 원인이 될 수 있는 미니-트랩 생산 10에 대한 PTM은 미니-트랩 생산 10 및 상업적 프로세스(비CDM)를 사용하여 생산된 애플리버셉트의 절단에 의해 수득된 VEGF 미니-트랩에 대한 트립신 펩티드 맵을 비교할 때 관찰되었다(20.0 내지 75분에서 용리된 펩티드의 흡광도를 나타내는 도 31a). 다양한 UV 피크를 포함하는 펩티드가 강조 표시되어 있다. 크로마토그램의 확대도는 16분 내지 30분에서 용리된 펩티드의 흡광도를 보여주는 도 31b에 제시되어 있다. 미니-트랩 생산 10 및 상업적 프로세스(비CDM)를 사용하여 생산된 애플리버셉트의 절단에 의해 수득된 VEGF 미니-트랩 사이의 UV 흡광도에서 뚜렷한 대조를 보이는 펩티드는 TNYLTH*R, IIW*DSR 및 IIIW*DSR이었다(*는 잔기의 산화를 나타낸다). 추가로, 크로마토그램의 확대도는 30분 내지 75분에서 용리된 펩티드의 흡광도를 보여주는 도 31c에 제시되어 있다. 미니-트랩 생산 10 및 상업적 프로세스(비CDM)를 사용하여 생산된 애플리버셉트의 절단에 의해 수득된 VEGF 미니-트랩 사이의 UV 흡광도에서 뚜렷한 대조를 보이는 펩티드는 DKTH*TCPPCPAPELLG, TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK, EIGLLTCEATVNGH*LYK 및 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK였다(*는 잔기의 산화를 나타낸다). 펩티드 맵핑을 통해 VEGF 미니-트랩 간에 존재비가 유의적으로 상이한 펩티드의 아이덴티티를 밝혀냈다. 펩티드 맵핑 분석으로부터 확인된 펩티드의 상대적인 존재비는 표 9-2에 제시되어 있다. 미니 트랩 생산 10 중 2-옥소-히스티딘의 양은 상업적 프로세스(비CDM)를 사용하여 생산된 애플리버셉트의 절단에 의해 수득된 VEGF 미니-트랩보다 높았고, 이는 2-옥소-히스티딘의 존재가 진한 갈황색 색상의 원인이 될 수 있다는 것을 시사한다.
<표 9-2>
Figure pct00064
LC-MS 분석 . 로트 10, 14 및 23으로부터 생성된 rLys-C/트립신 펩티드 20 ㎍의 분취량을 분리하고, 워터스(Waters) ACQUITY UPLC BEH130 C18 칼럼(130 Å, 1.7 ㎛, 2.1x150 mm)을 사용한 역상 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC: ultra-performance liquid chromatography)로 분석한 후, 온라인 PDA 검출(파장 280 nm, 320 nm 및 350 nm에서 수행) 및 질량 분석법에 의한 분석을 수행하였다. 이동상 A는 물 중 0.1% FA이고, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1% FA였다. 샘플 주입 후, 구배는 0.1% B에서 5분 유지로 시작하여, 최적의 펩티드 분리를 위해 75분에 걸쳐 35% B로 선형 증가하였다. MS 및 MS/MS 실험은 MS/MS 실험을 위한 펩티드 단편화에 사용되는 고에너지 충돌 해리(HCD: higher-energy collisional dissociation)를 사용하는 써모 사이언티픽 Q 이그젝티브 플러스 하이브리드 사중극자-오비트랩(Thermo Scientific Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap) 질량 분석기에서 수행하였다. 펩티드 이덴티티 할당은 전체 MS 스펙트럼에서 주어진 펩티드의 실험적으로 측정된 정확한 질량 뿐만 아니라, 상응하는 HCD MS/MS 스펙트럼에서의 b 및 y 단편 이온을 기반으로 하였다. REGN7483F 샘플 내 2-옥소-his의 부위 특이적 비율(%)을 계산하기 위해 적분된 피크 면적을 이용하여 2-옥소-히스티딘 함유 펩티드 및 상응하는 천연 펩티드에 대한 추출된 이온 크로마토그램을 작성하였다.
미니-트랩 생산 10, 23 및 14의 2-옥소-히스티딘 정량화 .
유럽 갈황색 색상 표준(BY) 대비 (AEX 칼럼 플로우 쓰루 분획 중) 또는 AEX 칼럼으로부터 스트리핑된 물질 중의 다양한 미니-트랩 제제의 색상이 하기 표 9-3에 제시되어 있다. 질량 분석법에 의해 측정된, 프로테아제 분해에 의해 생성된 펩티드 중의 2-옥소-히스티딘의 비율(%)도 제시되어 있다.
<표 9-3>
Figure pct00065
[+57]: 아이오도아세트아미드에 의한 시스테인의 알킬화는 시스테인 상에 카복시메틸 아민 모이어티를 부가하고, 그 결과로 순 질량은 비변형된 시스테인 대비 약 +57 증가한다:
Figure pct00066
[+14]: His로부터 2-옥소-His로 탄소 2 상에 하나의 산소 원자가 부가되지만, 2개의 수소 원자가 (하나는 탄소 2로부터, 다른 하나는 질소 3으로부터) 손실되고, 그 결과로 순 질량은 비변형된 히스티딘 대비 약 +14 증가한다.
Figure pct00067
[+32]: 트립토판 이산화를 통해 N-포르밀키누레닌이 형성되고, 이로써, 순 질량은 비변형된 트립토판 대비 약 +32 증가한다.
미니-트랩 생산 10, 14, 22, 23, 162, 29, 30 및 REGN 3의 색상 분석 . 미니-트랩 생산의 CIEL*a*b* 색상 분석은 하기 표 9-4에 제시되어 있다.
<표 9-4>
Figure pct00068
애플리버셉트(비화학적으로 정의된 배지에서 생산) 및 REGN7483F 중 2-옥소-히스티딘(및 트립토판 이산화)의 비율(%)을 평가하기 위해 실험 세트를 수행하였다. 애플리버셉트, 미니-트랩 생산 10으로부터 AEX 칼럼을 통과한 REGN7483F 물질 뿐만 아니라, AEX 칼럼으로부터 스트리핑된 물질을 트립신 및 LysC 뿐만 아니라, PNG아제 F로 분해하였다. 이어서, 펩티드를 워터스 BEH200, 4.6 cm x 150 mm 크기 배제(SEC) 칼럼에 적용시켰다. 흡수 피크에 상응하는 물질을 보유하고, 질량 분석법에 의해 분석하여 그의 함량을 측정하였다. AEX 칼럼으로부터 스트리핑된 물질은 2-옥소-his 및 트립토판 이산화 종의 존재에 대해 농축된 것으로 확인되었다. 더욱이, 2-옥소-히스티딘 및 이산화된 트립토판의 수치는 매우 낮았다. 도 23 및 표 9-5를 참조한다.
이들 데이터는 2-옥소-his 및 트립토판 이산화 종이 AEX 수지에 대해 친화성을 갖고, 플로우 쓰루 모드의 AEX 크로마토그래피가 이들 종을 REGN7483으로부터 제거하는 효과적인 수단이라는 것을 시사한다.
<표 9-5>
Figure pct00069
미니-트랩 생산 10(임의의 정제 절차 이전, BY1), 미니-트랩 생산 23(임의의 정제 절차 이전, ≤BY3), 미니-트랩 생산 14(임의의 정제 절차 이전, ≤BY3), 미니-트랩 생산 10으로부터의 산성 분획 1(AEX 절차 후 수득, 황색 색상), 미니-트랩 생산 10으로부터의 산성 분획 2(AEX 절차 후 수득, 황색 색상), 및 미니-트랩 생산 10으로부터의 주요 분획(AEX 절차 후 수득, 투명)에 대한 AEX 스트립에 존재하는 산성 종 비교(표 9-5)는 도 28에 제시되어 있다.
강한 양이온 교환 크로마토그램( CEX ). 본 방법은 세포 배양 수확 샘플에 존재하는 산성 종 및 다른 변이체의 확인을 위해 사용되었다.
[Dionex ProPac WCX-10, Analytical 칼럼(Dionex: 미국 캘리포니아주 소재)]에서 강한 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 샘플에 대해 사용된 이동상 [10 mM 인산나트륨 이염기성 pH 7.5(이동상 A) 및 10 mM 인산나트륨 이염기성, 500 mM 염화나트륨 pH 5.5(이동상 B). 이원 구배(94% A, 6% B: 0-20 min; 84% A, 16% B: 20-22 min; 0% A, 100%B: 22-28 min; 94% A, 6% B: 28-34 min)을 사용하였고, 280 nm에서 검출이 수행되었다]. 산성 피크에 상응하는 주요 피크보다 빠른 상대 체류 시간에 용리되는 피크.
미니 트랩 생산 23(정제 절차 전, ≤BY3)으로부터의 샘플에 대해 CEX를 수행하였다. 미니 트랩 생산의 변이체의 복잡성을 감소시키기 위해 샘플에 탈시알릴화를 적용하였다. 이어서, 강한 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피를 적용하여 이중 염-pH 구배를 사용하여 탈시알화된 미니트랩(dsMT1)의 변이체에 대해 농축시켰다. 절차 결과 총 7개의 분획이 생성되었다(F1-F7, MC는 방법 대조군). 갈황색 변이체는 가장 산성인 2개의 단백질 변이체 분획 1 및 2에서만 관찰되었다. 본 결과는 MT1의 갈황색 변이체의 대부분을 제거하는 데 사용되었으며, MT1의 산성 변이체를 포함하는, 생산된 AEX 스트립 샘플에 의해 뒷받침되었다(도 29).
이미지화된 모세관 등전점 포커싱 ( iciEF ) 전기영동도. 분획 F1-7 및 MC(CEX 이후 미니-트랩 생산 23으로부터의 것) 중의 변이체 분포는 [탄화플루오르 코팅된 모세관 카트리지(100 ㎛ x 5 cm)가 장착된 iCE280 분석기(ProteinSimple)를 사용하여 iCIEF에 의해 추가로 평가하였다. 양쪽성 전해질 용액은 정제수 중 0.35% 메틸 셀룰로스(MC), 0.75% 파말라이트 3-10 캐리어 양쪽성 전해질, 4.2% 파말라이트 8-10.5 캐리어 양쪽성 전해질, 및 0.2% pi 마커 7.40 및 0.15% pi 마커 9.77의 혼합물로 구성되었다. 양극액은 80 mM 인산이었고, 음극액은 100 mM 수산화나트륨이었고, 둘 모두 0.10% 메틸셀룰로스 중의 것이었다. 샘플을 정제수 중에 희석하고, CpB를 1:100의 효소 대 기질 비로 희석된 각 샘플에 첨가한 후, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. CpB 처리된 샘플을 양쪽성 전해질 용액과 혼합한 후, 이어서, 1분 동안 1500 V의 전위를 도입한 후, 10분 동안 3000 V의 전위를 도입하여 포커싱시켰다. 280 nm 자외선을 모세관을 통해 전하 결합 소자 디지털 카메라의 렌즈로 통과시켜 포커싱된 ot-PDL1 변이체의 이미지를 수득하였다. 이어서, 상기 이미지를 분석하여 다양한 전하 변이체의 분포를 확인하였다(도 30).
실시예 10 : REGN7483 F 의 광안정성 연구
본 실시예에서, 미니 트랩 생산 14(상기 논의)로부터의 REGN7483F의 광안정성은 다양한 양의 냉백색광 또는 자외선 A 광에의 노출 후 측정하였다. 광 노출된 샘플의 색상 및 2-옥소-히스티딘 함량을 측정하였다.
<표 10-1>
Figure pct00070
<표 10-2>
Figure pct00071
<표 10-3>
Figure pct00072
REGN7483F의 냉백색광 또는 UVA 광 노출은 산화된 히스티딘(2-옥소-히스)의 출현과 상관관계가 있었다. 2-옥소-히스티딘의 2종, 즉, 13.98 Da 종
Figure pct00073
및 15.99 Da 종
Figure pct00074
이 관찰되었으며, 여기서, 13.98 Da 종은 가벼운 스트레스를 받은 미니-트랩 샘플에서 우세하였다. 증거에 따르면 관찰된 갈황색 색상은 13.98 Da 종에 의존하지만, 15.99 Da 종에는 의존하지 않는다는 것을 시사한다. 15.99 Da 종은 구리 금속 촉매화 프로세스의 생성물인 것으로 공지되어 있다. (문헌 [Schoneich, J. Pharm. Biomed Anal. 21:1093-1097 (2000)]). 구리를 미니-트랩에 스파이킹하였을 때, 눈에 띄는 색상 변화는 없었다(데이터는 제시되지 않음). 그러나, 13.98 Da 종은 광 유도 프로세스의 생성물이다 (문헌 [Liu et al., Anal. Chem. 86(10: 4940-4948 (2014))]).
실시예 11 : 환원된 펩티드 맵핑에 의한 번역 후 변형( PTM ) 분석.
미니-트랩(REGN7483F 포함) 및 애플리버셉트의 글리코실화 프로파일 및 다른 번역 후 변형의 존재를 본 실시예에서 평가하였다.
샘플 제조 . 환원 및 알킬화된 미니-트랩(REGN7483F; 미니-트랩 생산 22) 및 에일리아 약물 물질 로트의 트립신 맵핑을 수행하여 번역 후 변형(예컨대, 부위 특이적 글리코실화, 탈아미드화 및 산화 등)을 확인하고, 정량화하였다. 1 mg 분취량의 각 약물 물질을 6.0 M 구아니딘 하이드로클로라이드에서 변성시키고, DTT로 환원시키고, pH 7.5에서 아이오도아세트아미드로 알킬화하였다. 이어서, 변성, 환원 및 알킬화된 약물 물질을 탈염하고, NAP-5 칼럼을 사용하여 완충제를 0.1 M 트리스 HCl로 교환한 후, 37℃에서 2시간 동안 1:20(w/w)의 효소 대 물질 비로 트립신으로 분해하였다. TFA를 사용하여 pH를 pH 2.0 미만으로 낮추어 분해를 중단시켰다.
LC-MS 분석 . 각 약물 물질 로트로부터 생성된 트립신 펩티드 및 당펩티드 7.6 ㎍의 분취량을 분리하고, 워터스 ACQUITY UPLC BEH130 C18 칼럼(1.7 ㎛, 2.1x150 mm)을 사용한 역상 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)로 분석한 후, 온라인 질량 분석법에 의한 분석을 수행하여 펩티드 및 당펩티드 질량을 측정하고, 펩티드 서열을 확인하였다. 이동상 A는 물 중 0.05% TFA이고, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.045% TFA였다. 샘플 주입 후, 구배는 0.1% B에서 5분 유지로 시작하여, 최적의 펩티드 분리를 위해 75분에 걸쳐 35% B로 선형 증가하였다. MS 및 MS/MS 실험은 MS/MS 실험을 위한 펩티드 단편화에 사용되는 고에너지 충돌 해리(HCD)를 사용하는 써모 사이언티픽 Q 이그젝티브 플러스 하이브리드 사중극자-오비트랩 질량 분석기에서 수행하였다. 펩티드 및 당펩티드 아이덴티티 할당은 전체 MS 스펙트럼에서 주어진 펩티드 또는 당펩티드의 실험적으로 측정된 정확한 질량 뿐만 아니라, 상응하는 HCD MS/MS 스펙트럼에서의 b 및 y 단편 이온을 기반으로 하였다. PTM 분석을 위해, REGN7483F 및 에일리아 샘플 내 PTM의 부위 특이적 비율(%)을 계산하기 위해 적분된 피크 면적을 이용하여 PTM 함유 펩티드 및 상응하는 천연 펩티드에 대한 추출된 이온 크로마토그램을 작성하였다.
도 14a는 REGN7483F 및 애플리버셉트(Eylea 상업적 로트) 상의 각 아스파라긴 글리코실화 부위에서 확인된 글리코폼을 제시한다. 도 14a에 글리칸 잔기 구조(G0-GlcNAc; G1-GlcNAc; G1S-GlcNAc; G0; G1; G1S; G2; G2S; G2S2; G0F; G2F2S; G2F2S2; G1F; G1FS; G2F; G2FS; G2FS2; G3FS; G3FS3; G0-2GlcNAc; Man4; Man4_A1G1; Man4_A1G1S1; Man5; Man5_A1G1; Man5_A1G1S1; Man6; Man6_G0+포스페이트; Man6+포스페이트 및 Man7)가 제시되어 있다. 다양한 글리칸 구조에 적용된 명명법은 표준화된 것이다 - 문헌 [Varki et al., Symbol nomenclature for glycan Representation, Proteomics 9: 5398-5399 (2009)]; [Harvey et al., Proposal for a standard system for drawing structural diagrams of N- and O-linked carbohydrates and related compounds. Proteomics 2009, 9, 3796-3801]; [Kornfeld et al., The synthesis of complex-type oligosaccharides II characterization of the processing intermediates in the synthesis of the complex oligosaccharide units of the vesicular stomatitis virus G protein. J Biol Chem. 1978, 253, 7771-7778]; [Varki et al. (Eds.), Essentials of Glycobiology, 1st Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY 1999]; [Varki et al. (Eds.), Essentials of Glycobiology, 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY 2009]; 및 [Dwek, Glycobiology: Moving into the mainstream. Cell 2009, 137, 1175-1176]을 참조한다.
도 14b는 REGN7483F 및 애플리버셉트에서 관찰되는 글리코실화 이외의 번역 후 변형을 제시한다.
도 14ca-도 14cd는 REGN7483F의 별개의 로트(미니-트랩 생산 10) 뿐만 아니라, REGN7483R, 애플리버셉트 및 REGN7711의 글리코실화 프로파일을 제시한다.
실시예 12 : 단기 미니-트랩 혈관 투과성
어린 뉴질랜드 흰 토끼 눈에 80 mM DL-α-아미노아디프산(DL-AAA) 용액 80 mcl를 주사하였다. 4개월 후, 플루오레세인 혈관조영술을 수행하여 혈관 투과성을 평가하였다. 눈을 기준선 혈관 투과 면적이 유사한 6개 군으로 나누었다(도 15). 이어서, 각 군에 대해 하기 중 하나의 단일 유리체내 주사로 눈을 처리하였다:
1군: 애플리버셉트, 50 mcl 중 500 mcg, n=6;
2군: 애플리버셉트, 50 mcl 중 2 mg, n=6;
3군: 재조합(R) 미니-트랩(REGN7483R), 50 mcl 중 250.5 mcg(1군과 등몰 용량), n=6;
4군: FabRICATOR(F) 절단된 미니-트랩(REGN7483F), 50 mcl 중 254.4 mcg(1군과 등몰 용량), n=6;
5군: FabRICATOR (F) 절단된 미니-트랩(REGN7483F), 50 mcl 중 1.4 mg, n=6;
6군: 50 mcl의 위약 완충제, n=6
기준선 및 1, 2, 3, 4, 5 및 6주째에 안과 검사를 수행하였다. 각 안과 검사는 안압(IOP) 측정 뿐만 아니라, 무적색(RF: red-free) 영상화(혈관 형태 측정), 플루오레세인 혈관조영술(FA: fluorescein angiography; 혈관 누출 측정) 및 광간섭 단층촬영(OCT: optical coherence tomography; 유리체 염증 확인)을 포함하였다. 혈청(ADA) 및 혈장(약물 수준)은 기준선 및 1, 2 및 4주째 수집하였다.
등몰 용량의 애플리버셉트(500 mcg) 및 미니-트랩(250.5 또는 254.4 mcg)은 유사한 시간 동안 혈관 투과성을 차단하였다(도 16). 더 높은 용량의 애플리버셉트 또는 FabRICATOR 절단된 미니-트랩(REGN7483F)은 더 장기간 동안 혈관 투과성을 차단하였다(도 17). 시험된 용량에서 FabRICATOR 절단된 미니-트랩도 재조합 미니-트랩(REGN7483R)도 안압에 대해 어떤 유의적인 변화도 일으키지 않았다(도 18). 모든 처리는 유사한 수준의 병적 혈관 퇴행을 일으켰다(도 19).
실시예 13 : 장기 미니-트랩 혈관 투과성
어린 뉴질랜드 흰 토끼 눈에 80 mM DL-α-아미노아디프산(DL-AAA) 용액 80 mcl를 주사하였다. 22개월 후, 플루오레세인 혈관조영술을 수행하여 혈관 투과성을 평가하였다. 눈을 기준선 혈관 투과 면적이 유사한 3개 군으로 나누었다(도 20). 눈을 나눈 후, 하기 중 하나의 단일 유리체내 주사로 눈을 처리하였다:
1군: 애플리버셉트, 50 mcl 중 500 mcg, n=4;
2군: FabRICATOR 절단된 미니-트랩(REGN7483F), 50 mcl 중 213 mcg/눈, n=4;
3군: 50 mcl의 위약 완충제, n=4.
기준선 및 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10 및 14주째에 안과 검사를 수행하였다. 각 안과 검사는 안압(IOP) 측정 뿐만 아니라, 무적색(RF) 영상화(혈관 형태 측정), 플루오레세인 혈관조영술(FA; 혈관 누출 측정) 및 광간섭 단층촬영(OCT; 유리체 염증 확인)을 포함하였다.
애플리버셉트 및 FabRICATOR 절단된 미니-트랩(REGN7483F), 둘 모두 혈관 투과성을 차단하였다. 애플리버셉트 처리와 미니-트랩 처리 사이의 차단 기간에 있어 통계적으로 유의적인 차이는 없었다(도 21).
실시예 14 : 신선한 화학적으로 정의된 배지 인큐베이션 연구
애플리버셉트(REGN3)를 함유하는 신선한 화학적으로 정의된 배지(CDM)에 스파이킹된 다양한 성분이 색상에 미치는 효과를 조사하였다.
인큐베이션 연구를 위한 작동 파라미터는 하기와 같았다:
· 10 mL 작업 부피를 포함하는 50 mL 벤트 캡이 있는 진탕기 튜브
· 7일 동안 인큐베이션, 0일째 및 7일째 샘플 채취
· 온도 = 35.5℃
· 5 N HCl 또는 5 N NaOH를 이용하여 pH를 7.35로 조정
· CO2 = 6.9%
· 습도 = 75%
· 교반 = 150 prm
· 성분 첨가(DOE로 실행)
· 6 g/L 농도로 진탕기 튜브에 스파이킹된 애플리버셉트 약물 물질
· 매트릭스 = 신선한 CDM.
하기 열거된 최종 농도에 도달하도록 성분 첨가:
· 시스테인: 16.6 mM
· 리보플라빈: 0.014 mM
· 엽산: 0.17 mM
· 비타민 B12: 0.014 mM
· 티아민 : 0.18 mM
· 니아신아미드: 0.84 mM
· D-판토텐산: 0.62 mM
· D-비오틴: 0.002 mM
· 피리독신: 0.49 mM
· 철: 0.22 mM
· 구리: 0.0071 mM
· 아연: 0.54 mM.
각 성분 첨가가 b* 값(CIEL*a*b* 색 공간)에 치미는 효과가 도 24a-도 24b에 제시되어 있다. 시스테인이 색상을 가장 크게 증가시켰다. 철 및 아연은 시스테인과 함께 인큐베이션되었을 때, 색상을 생성하였다. 리보플라빈 및 비타민 B12는 색상에 통계적으로 영향을 미치지 않았다.
실시예 15: 시스테인 및 금속 감소가 b*-값에 미치는 효과 평가.
REGN3이 발현될 때, 시스테인 및 금속 농도 저하가 색상에 미치는 효과를 평가하였다. 세포 배양 연구를 위한 작동 파라미터는 하기와 같았다:
· 2 L 생물반응기
· 온도: 약 35℃
· pH 약 7
· 배지 = 시스테인을 포함하는, 하기 기술되는 바와 같은, CDM + Fe, Zn, Cu, Ni, EDTA 및 시트레이트
· 영양 피드(대조군):
o 2일째 = 20X 베이스 CDF
o 4일째 = 20X 베이스 CDF
o 6일째 = 13X 베이스 CDF
o 8일째 = 13X 베이스 CDF
* CDF= 화학적으로 정의된 영양 피드
· 2, 4, 6 및 8일째 하기 성분을 (20X 또는 13X이든) 베이스 CDF의 일부로서 배양물에 첨가한다: 배양물 1 리터당 약 1-3 마이크로몰 Fe, 약 6-19 마이크로몰 Zn, 약 0.1-0.3 마이크로몰 Cu, 약 8-24 마이크로몰 EDTA, 및 약 1-3 마이크로몰 시트레이트.
생물반응기 실험 조건은 하기와 같았다:
· 용존 산소 설정값 = 20.0%, 40.4%(대조군), 또는 60.0%
· 피드당 시스테인 첨가* = 배양물 1 L당 약 1.2-1.3 밀리몰, 배양물 1 L당 1.6-1.7 밀리몰(대조군), 또는 배양물 1 L당 2.0-2.1 밀리몰
· 출발 CDM 중 금속* = 0.5x, 1x, 또는 1.5x CDM 수준-1X 수준은 하기에 열거되어 있다:
o Fe = 배양물 1 리터당 68-83 마이크로몰
o Zn = 배양물 1 리터당 6-7 마이크로몰
o Cu = 배양물 1 리터당 0.1-0.2 마이크로몰
o EDTA = 배양물 1 리터당 76-95 마이크로몰
o 시트레이트 = 배양물 1 리터당 45-55 마이크로몰
o Ni = 배양물 1 리터당 0.5-1 마이크로몰
* 시스테인을 격일로 배양물에 공급한다.
시스테인 수준을 1.2-1.3 밀리몰/L/피드로 감소시킴에 따라 색상은 감소하였고, 역가에는 어떤 유의적인 영향도 미치지 않았다. 배지 중 금속 농도를 0.5x로 감소시킴에 따라 색상은 감소하였고, 역가는 유의적으로 증가하였다. VCC(생존가능한 세포 농도: viable cell concentration), 생존능, 암모니아 또는 오스몰 농도에는 최소한의 영향을 미쳤다. 금속 함량 및 시스테인이 b*-값에 미치는 예측 효과는 도 25에 제시되어 있다.
실시예 16 : 항산화제가 b*-값에 미치는 효과 평가
애플리버셉트(REGN3)를 함유하는 폐 CDM에 스파이킹된, 항산화제, 타우린, 하이포타우린, 티옥트산, 글루타티온, 글리신 및 비타민 C가 색상에 미치는 효과를 평가하였다. 인큐베이션 연구를 위한 작동 파라미터는 하기와 같았다:
· 10 mL 작업 부피를 포함하는 50 mL 벤트 캡이 있는 진탕기 튜브
· 7일 동안 인큐베이션, 0일째 및 7일째 샘플 채취
· 온도 = 35.5℃
· 5 N HCl 또는 5 N NaOH를 이용하여 pH를 7.35로 조정
· CO2 = 6.9%
· 습도 = 75%
· 교반 = 150 prm.
폐 CDM에 성분을 첨가하기 위한 조건은 하기와 같았다:
· 6 g/L 농도로 진탕기 튜브에 스파이킹된 애플리버셉트 약물 물질(5 mM 인산나트륨, 5 mM 시트르산나트륨 및 100 mM 염화나트륨을 함유하는 완충처리된 수용액(pH 6.2) 중의 정제된 애플리버셉트 재조합) 매트릭스 = 미니-트랩 2 L 대조군 생물반응기로부터의 폐 배지
· 하기 최종 농도에 도달하도록 첨가된 항산화제:
o 타우린 = 배양물 중 10 mM
o 하이포타우린 = 배양물 중 10 mM
o 글리신 = 배양물 중 10 mM
o 티옥트산 = 배양물 중 0.0024 mM
o 글루타티온(환원) = 배양물 중 2 mM
o 콜린 = 배양물 중 1.43 mM
o 하이드로코르티손 = 배양물 중 0.0014 mM
o 비타민 C(아스코르브산) = 배양물 중 0.028 mM
o 비타민 E(α-토코페롤) = 배양물 중 0.009 mM.
다중 항산화제는 폐 배지 중 색상 형성을 감소시켰고; 하이포타우린, 타우린 및 글리신; 티옥트산; 및 비타민 C. 글루타티온의 조합은 b*-값을 증가시켰다.
<표 16-1>
Figure pct00075
다양한 항산화제가 b*-값(CIEL*a*b* 색 공간)에 미치는 예측 효과의 요약은 도 26a-도 26b에 제시되어 있다.
실시예 17: 색상 검정 선형성
미니-트랩 생산 23으로 채취된 미니-트랩을 154 mg/mL에서 3.5 mg/ mL로 희석하고, CIEL*a*b* 색 공간에서 각 희석액의 색상을 측정하였다. 표 17-1은 관찰된 색상에 대해 값을 매긴 것이다.
<표 17-1>
Figure pct00076
다양한 희석액 중의 색상을 그래프에 플롯팅하고, 점의 선형 회귀 분석도 수행하고, 농도와 b* 사이의 관계는 하기 방정식으로 표시되는 것으로 결정되었다:
b*=0.046 + (0.066 X 농도(mg/ml));
여기서, L*은 약 97-99이고, a*는 약 0.06―0.85이다. 도 27을 참조한다.
실시예 18 : REGN3에 대한 음이온 교환 크로마토그래피( AEX )에 대한 색상 감소 평가
2개의 AEX 수지(POROS 50 HQ 및 Q Sepharose Fast Flow) 및 3개의 설정값(pH 8.40 및 2.00 mS/cm, pH 8.00 및 2.50 mS/cm, 및 pH 7.80 및 4.00 mS/cm)에서 REGN3에 대한 색상 감소를 평가하였다.
표 18-2에 설명된 AEX 프로토콜을 사용하여 표 8-1에 설명된 바와 같이 본 연구를 위해 5개의 AEX 분리를 수행하였다. 모든 AEX 로드는 파일럿 생물반응기 S504-190828(REGN3 X0SP 여과된 풀, CCF38105-L8)로부터 공급받았다. 본 실험을 위해, 15.7 mL Q 세파로스 패스트 플로우 칼럼(19.5 cm 베드 높이, 1.0 cm I.D.) 및 14.1 mL POROS 50 HQ 칼럼(18.0 cm 베드 높이, 1.0 cm I.D.)을 AKTA 아반트 벤치탑 액체 크로마토그래피 컨트롤러 내로 통합시켰다.
AEX 로드 pH를 2 M 트리스 염기 또는 2 M 아세트산을 사용하여 표적 ± 0.05 pH 단위로 조정하였다. AEX 로드 전도도는 5 M 염화나트륨 또는 RODI를 사용하여 표적 ± 0.1 mS/cm로 조정하였다. 모든 풀 샘플을 HMW, 색상, 및 수율에 대해 분석하였다.
<표 18-1>
Figure pct00077
<표 18-2>
Figure pct00078
5개의 AEX 분리를 수행하여 수지(Q Sepharose FF 또는 POROS 50 HQ), 및 pH ?? 전도도 설정값 (pH 8.40 및 2.00 mS/cm, pH 8.00 및 2.50 mS/cm, 또는 pH 7.80 및 4.00 mS/cm)가 REGN3에 대한 색상에 미치는 효과를 평가하였다. POROS 50 HQ의 경우, 설정값이 더 낮은 pH 및 더 높은 전도도로 변경됨에 따라, 수율(64.4, 81.9, 및 91.4%) 및 풀 HMW 수준(1.02, 1.29, 및 1.83%)은 증가하였다. 설정값이 더 낮은 pH 및 더 높은 전도도로 변경됨에 따라, 색상(b* 값) 또한 증가하였다(1.05, 1.33, 및 1.55). 이는 POROS 50 HQ에 대한 AEX 분리에서 더 높은 pH 수준 및 더 낮은 전도도가 색상을 더 크게 감소시켰다는 것을 시사하는 것이었다.
칼럼 평형 완충제 및 칼럼에 적용될 때, REG3이 제제화된 완충제는 하기와 같았다:
· 50 mM 트리스 pH 8.4 및 2.0 mS/cm,
· 50 mM 트리스, 10 mM 아세테이트 pH 8.0 및 2.5 mS/cm; 또는
· 50 mM 트리스, 10 mM 아세테이트, 10 mM NaCl pH 7.8 및 4.0 mS/cm.
Q 세파로스 패스트 플로우의 경우, 설정값이 더 낮은 pH 및 더 높은 전도도로 변경됨에 따라, 수율(49.5 및 77.7%) 및 풀 HMW 수준(0.59 및 1.25%) 또한 증가하였다. 설정값이 더 낮은 pH 및 더 높은 전도도로 변경됨에 따라, 색상(b* 값) 또한 증가하였다(0.96 및 1.35). 이는 Q 세파로스 패스트 플로우에 대한 AEX 분리에서 더 높은 pH 수준 및 더 낮은 전도도가 색상을 더 크게 감소시켰다는 것을 시사하는 것이었다.
추가로, 두 수지 모두에서 평가된 두 설정값에 대해 Q 세파로스 패스트 플로우가 POROS 50 HQ보다 더 크게 색상을 감소시켰다. pH 8.00 및 2.50 mS/cm 설정값에서, POROS 50 HQ 풀의 b* 값은 1.33인 반면, Q 세파로스 패스트 플로우 풀의 b* 값은 0.96이었다. 유사하게, pH 7.80 및 4.00 mS/cm 설정값에서, POROS 50 HQ 풀의 b* 값은 1.55인 반면, Q 세파로스 패스트 플로우 풀의 b* 값은 1.35였다.
<표 18-3>
Figure pct00079
2개의 AEX 수지(POROS 50 HQ 및 Q Sepharose Fast Flow) 및 3개의 설정값(pH 8.40 및 2.00 mS/cm, pH 8.00 및 2.50 mS/cm, 및 pH 7.80 및 4.00 mS/cm)에서 REGN3에 대한 색상 감소를 평가하였다. 두 수지 모두, 더 높은 pH 및 더 낮은 전도도 설정값에서 색상 감소는 가장 최적인 것으로 나타났다. 추가로, 두 수지 모두에서 평가된 두 설정값에서(pH 8.00 및 2.50 mS/cm 및 pH 7.80 및 4.00 mS/cm) Q 세파로스 패스트 플로우가 POROS 50 HQ보다 더 크게 색상을 감소시켰다.
실시예 19: CDM을 사용한 애플리버셉트 생산을 위한 글리코실화 및 생존능 연구
이 실시예에서, 애플리버셉트 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포주의 생산은 CDM 1, CDM 2(상업적으로 입수) 및 CDM 3(상업적으로 입수)을 사용하여 수행하였다. 추가 배지 성분 없이, CDM 1, 2 및 3을 사용하여 한 실험 세트를 수행하였다. 또 다른 실험 세트는 갈락토실화 프로파일을 변형시키기 위해 망가니즈 (염화망가니즈 3수화물, Sigma, 3.2 mg/L), 갈락토스(Sigma, 8 g/L), 및 우리딘(Sigma, 6 g/L)이 피드에 첨가된 CDM 1-3을 이용하여 수행하였다. 마지막으로, 한 실험 세트는 갈락토실화 프로파일을 변형시키기 위해 망가니즈(염화망가니즈 3수화물, Sigma, 3.2 mg/L), 갈락토스(Sigma, 8 g/L), 및 우리딘(Sigma, 6 g/L)이 피드에 첨가되고, 조성물의 시알릴화 프로파일을 변형시키기 위해 덱사메타손(Sigma, 12 mg/L)이 피드에 첨가된 CDM 1-3을 이용하여 수행하였다. 원심분리, 이어서, 0.45 ㎛ 여과에 의해 각 CDM을 이용한 수확물을 제조하였다.
N-글리칸 분석 이전에 ProA에 의해 샘플을 정제하였다.
역가 측정
낮은 pH, 및 단계 용리 구배로 작동하고, 280 nm에서 검출이 진행된, 애질런트(Agilent: 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재) 1200 시리즈 HPLC, 또는 등가물을 사용하여 애플리버셉트 역가를 매일 측정하였다. 참조 표준 보정 곡선와 관련하여 절대 농도를 할당하였다.
생존가능한 세포 밀도(VCD: viable cell density) 및 세포 생존능 값
노바 바이오프로파일 플렉스(Nova BioProfile Flex) 자동 세포 계수기(Nova Biomedical: 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 통한 트립판 블루 배제를 통해 생존가능한 세포 밀도(VCD) 및 세포 생존능 값을 측정하였다. 글루코스, 락테이트, 오프라인 pH, 용존 산소(DO: dissolved oxygen), pCO2 측정, 및 오스몰 농도를 노바 바이오프로파일 플렉스(Nova Biomedical: 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 통해 측정하였다.
N- 글리칸 올리고당 프로파일링
글리코워크스 래피드 데글리코실레이션(GlycoWorks Rapid Deglycosylation) 및 글리코워크스 래피플루오르-MS 라벨(GlycoWorks RapiFluor-MS Label) 키트(각각 Waters 부품 번호 186008939 및 186008091)를 사용하여 워터스 글리코워크스(Waters GlycoWorks) 프로토콜에 따라 N-글리칸 분석을 위해 CDM1-3 수확물로부터 대략 15 ㎍의 단백질 A 정제 샘플을 제조하였다. 샘플을 50.5℃에서 5분 동안 PNG아제-F로 처리한 후, 25℃에서 5분 동안 냉각시켜 단백질로부터 N-글리칸을 제거하였다. 실온에서 5분 동안 반응시켜 유리된 글리칸을 래피플루오르-MS 형광 염료로 표지하였다. 반응 혼합물에 아세토니트릴을 첨가하여 단백질을 침전시키고, 10분 동안 2,204 x g로 원심분리하여 웰의 바닥으로부터 펠릿화하였다. 표지된 글리칸을 함유하는 상청액을 수집하고, 칼럼 후 형광 검출과 함께 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(Waters BEH 아미드 칼럼)를 사용하여 UPLC에서 분석하였다. 칼럼에의 결합 후, 표지된 글리칸을 분리하고, 아세토니트릴 및 수성 50 mM 포름산 암모늄 (pH 4.4)으로 구성된 이원 이동상 구배를 사용하여 용리시켰다. 265 nm의 여기 파장 및 425 nm의 방출 파장을 갖는 형광 검출기를 사용하여 표지된 글리칸을 검출하였다. 생성된 크로마토그램에서 N-글리칸 피크의 상대 면적 비율(%)을 사용하여, N-글리칸 분포를 (1) 코어 푸코스 잔기 함유(총 푸코실화, 표 19-1), (2) 적어도 하나의 시알산 잔기 함유(총 시알릴화, 표 19-2), (3) 만노스-5로서 확인(만노스-5, 표 19-3), (4) 적어도 하나의 갈락토스 잔기 함유(총 갈락토실화, 표 19-4), 및 (5) 아이덴티티 공지된(전체 확인된 피크, 표 19-5) N-글리칸의 총 비율(%)로서 기록하였다.
결과
9개의 배양물 중에서, 우리딘, 망가니즈, 및 갈락토스를 포함하는 CDM1을 포함하는 배양물은 12일째 최고 역가를 보였다(5.5 g/L). 추가 성분 없이 포함하는 CDM1 배양물 또한 다른 7개의 배양물과 비교하여 12일째 높은 역가(약 4.25 g/L)를 보였다.
세포 생존능 결과는 최대 프로세스 6일째까지 다양한 조건 간에 유사하였다. 프로세스 7일째 후, 추가 배지 성분을 포함하거나, 또는 포함하지 않는 CDM2 및 CDM3 배양물은 약 90% 초과의 생존능을 보였다.
우리딘, 망가니즈 및 갈락토스를 포함하는 CDM1 배양물은 대략 6일째 최고 VCC를 보였다.
배양물 및 보충물의 영향은 전체 N-글리칸 분포에 유의적인 영향을 미쳤다(표 19-1 내지 19-5). 상업적 상류 프로세스를 사용하여, CDM을 사용하지 않는 애플리버셉트 제조의 단백질 A 정제 애플리버셉트와 글리칸 수준을 비교하였다(두 샘플 평가). 전체 확인된 피크는 표 19-5에 열거되어 있다.
<표 19-1&19-2>
Figure pct00080
<표 19-3&19-4&19-5>
Figure pct00081
CDM에 대한 배양 12일째 관찰된 총 푸코실화, 총 시알릴화, 총 갈락토실화 및 만노스-5는 각각 42.61% 내지 46.26%, 30.84% 내지 39.14%, 59.02 내지 66% 및 8.86% 내지 13.38%였다. 상기 글리코실화 값은 상류 프로세스를 사용하여 단백질 A 정제된 애플리버셉트에 대해 수득된 글리코실화 값과 유의적으로 상의하다.
실시예 20 : 토끼에서의 VEGF 미니-트랩 유리체내 광형광측정 약동학적 성질(PK)
뉴질랜드 흰 토끼의 눈에서 다양한 VEGF 트랩 및 미니-트랩의 약동학적 성질을 분석하였다.
<표 20-1>
Figure pct00082
REGN3 및 REGN7483 (실험 1)
VEGF 트랩(REGN3) 및 VEGF 미니-트랩(REGN7483F)은 아민 접합을 통해 알렉사 플루오르 488(AF488)로 태그부착된 분자였다. 단백질 농도, 내독소 수준 및 표지 정도(DOL: Degree of Labeling)가 표 20-2에 제공되어 있다. 트랩 및 미니-트랩에 대한 붕괴 곡선의 자연 로그 플롯은 도 32a-도 32b에 제시되어 있다. 양측 유리체내(IVT) 주사는 6마리의 수컷 뉴질랜드 흰(NZW: New Zealand White) 토끼(6마리의 눈/3마리의 토끼/분자)에 이루어졌다. 눈 모두를 주사 전에 오큐메트릭스 플루오로트론(OcuMetrics Fluorotron) 형광광도계(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)를 이용하여 유리체 기준선 형광에 대해 검사하고, 주사 후 2, 7, 10, 14 및 28일째 유리체 형광 강도에 대해 추적 검사하였다. 일반 눈 검사는 IVT 주사 전 및 IVT 주사 후 10분째, 및 각 추적검사 시점의 안압(IOP), 염증 징후, 각막 및 결막 부종, 출혈, 전방 부유물, 동공 크기 및 모양, 백내장, 및 망막 박리를 포함한다. 그래픽 디스플레이 및 분석을 위해 형광 강도 및 위치 정보를 추출하고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)으로 임포트하였다. 데이터를 1차 단일 구획 모델로 피팅하였다.
<표 20-2>
Figure pct00083
결과
NZW 토끼 유리체에서의 VEGF 트랩(REGN3) 및 VEGF 미니-트랩(REGN7483F)의 PK 연구에서 반감기는 각각 4.6(±0.3)일 및 3.9(±0.4)일인 것으로 나타났다. 어느 분자든 그의 IVT 주사 전후의 유의적인 IOP 변화는 없었다. 도 34를 참조한다. 일반 눈 검사에서 임상적으로 주목할 만한 징후는 관찰되지 않았다.
결론
이전 연구에서 통상적으로 측정된 VEGF 트랩의 토끼 유리체 반감기는 4.8일이었고, 이는 생체내 형광광도법에 의해 측정된 것과 유사하였다. 본 연구에서 NZW 토끼 유리체에서의 VEGF 미니-트랩(REGN7483F)의 반감기가 VEGF 트랩(REGN3)보다 짧고, VEGF 미니-트랩은 지속적으로 약 15% 더 짧은(3.9일 대 4.6일) 것으로 나타났다.
REGN3 , REGN7850 및 REGN7851 (실험 2)
VEGF 트랩(REGN3), 및 두 VEGF 미니-트랩(REGN7850 및 REGN7851)은 아민 접합을 통해 알렉사 플루오르 488(AF488)로 태그부착된 분자였다. 단백질 농도, 내독소 수준 및 표지 정도(DOL)가 표 20-3에 제공되어 있다. 트랩 및 미니-트랩에 대한 붕괴 곡선의 자연 로그 플롯은 도 33a-도 33c에 제시되어 있다. 양측 유리체내(IVT) 주사는 6마리의 수컷 뉴질랜드 흰(NZW) 토끼(6마리의 눈/3마리의 토끼/분자)에 이루어졌다. 눈 모두를 주사 전에 오큐메트릭스 플루오로트론 형광광도계(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)를 이용하여 유리체 기준선 형광에 대해 검사하고, 주사 후 4, 7, 9, 및 14일째 유리체 형광 강도에 대해 추적 검사하였다. 일반 눈 검사는 IVT 주사 전 및 IVT 주사 후 10분째, 및 각 추적검사 시점의 안압(IOP), 염증 징후, 각막 및 결막 부종, 출혈, 전방 부유물, 동공 크기 및 모양, 백내장, 및 망막 박리를 포함한다. 그래픽 디스플레이 및 분석을 위해 형광 강도 및 위치 정보를 추출하고, 그래프패드 프리즘으로 임포트하였다. 데이터를 1차 단일 구획 모델로 피팅하였다.
<표 20-3>
Figure pct00084
결과
NZW 토끼 유리체에서의 VEGF 트랩(REGN3) 및 VEGF 미니-트랩(REGN7850 및 REGN7851)의 PK 연구에서 반감기는 각각 4.3(±0.3)일, 3.4(±0.5)일, 및 3.4(±0.5)일인 것으로 나타났다. 어느 분자든 그의 IVT 주사 전후의 유의적인 IOP 변화는 없었다. 일반 눈 검사에서 임상적으로 주목할 만한 징후는 관찰되지 않았다.
결론
생체내 형광광도법에 의해 측정된 PK 연구에서 NZW 토끼 유리체에서의 VEGF 미니-트랩의 또 다른 두 변이체(REGN7850 및 REGN7851)의 반감기가 VEGF 트랩(REGN3)의 것보다 짧고, 상기 두 VEGF 미니-트랩 모두 지속적으로 약 21% 더 짧은(3.4일 대 4.3일) 것으로 나타났다.
<표 20-4>
Figure pct00085
본원에 인용된 모든 참고문헌은, 마치 각각의 개별 공개 문헌, 데이터베이스 엔트리 (예컨대, 진뱅크 서열 또는 GeneID 엔트리), 특허 출원 또는 특허가 참조로 인용되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같은 정도로 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> VEGF MINI-TRAPS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 10549 <141> <150> 62/944,635 <151> 2019-12-06 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp 100 <210> 2 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr 1 5 10 15 Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile 20 25 30 Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly 35 40 45 Lys 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gagcacctta actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa 540 ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc 600 agggtccatg aaaaggacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 660 ggg 663 <210> 15 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mini-trap <400> 15 agtgataccg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60 actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120 ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180 agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240 gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300 atcatagatg tggttctgag tccgtctcat ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt 360 gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac 420 ccttcttcga agcatcagca taagaaactt gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg 480 agtgagatga agaaattttt gagcacctta actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa 540 ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc 600 agggtccatg aaaaggacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaccgtg ctga 654 <210> 16 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mini-trap <400> 16 agtgataccg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60 actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120 ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180 agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240 gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300 atcatagatg tggttctgag tccgtctcat ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt 360 gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac 420 ccttcttcga agcatcagca taagaaactt gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg 480 agtgagatga agaaattttt gagcacctta actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa 540 ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc 600 agggtccatg aaaaggacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaccgtg cccaccgtgc 660 tga 663 <210> 17 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trap <400> 17 Ser 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Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 47 <211> 339 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 47 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 48 <211> 339 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 48 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asn Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 49 <211> 339 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 49 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Asn Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 50 <211> 339 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 50 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Asn Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 51 <211> 339 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 51 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asn Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn <210> 52 <211> 339 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 52 Met Arg Lys Arg Cys Tyr Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Val 1 5 10 15 Thr Leu Phe Val Leu Ser Val Asp Arg Gly Val Ile Ala Asp Ser Phe 20 25 30 Ser Ala Asn Gln Glu Ile Arg Tyr Ser Glu Val Thr Pro Tyr His Val 35 40 45 Thr Ser Val Trp Thr Lys Gly Val Thr Pro Pro Ala Asn Phe Thr Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Val Phe His Ala Pro Tyr Val Ala Asn Gln Gly Trp Tyr 65 70 75 80 Asp Ile Thr Lys Thr Phe Asp Gly Lys Asp Asp Leu Leu Cys Gly Ala 85 90 95 Ala Thr Ala Gly Asn Met Leu His Trp Trp Phe Asp Gln Asn Lys Asp 100 105 110 Gln Ile Lys Arg Tyr Leu Glu Glu His Pro Glu Lys Gln Lys Ile Asn 115 120 125 Phe Arg Gly Glu Gln Met Phe Asp Val Lys Glu Ala Ile Asp Thr Lys 130 135 140 Asn His Gln Leu Asp Ser Lys Leu Phe Glu Tyr Phe Lys Glu Lys Ala 145 150 155 160 Phe Pro Tyr Leu Ser Thr Lys His Leu Gly Val Phe Pro Asp His Val 165 170 175 Ile Asp Met Phe Ile Leu Gly Tyr Arg Leu Ser Leu Thr Asn His Gly 180 185 190 Pro Thr Pro Val Lys Glu Gly Ser Lys Asp Pro Arg Gly Gly Ile Phe 195 200 205 Asp Ala Val Phe Thr Arg Gly Asp Gln Ser Lys Leu Leu Thr Ser Arg 210 215 220 His Asp Phe Lys Glu Lys Asn Leu Lys Glu Ile Ser Asp Leu Ile Lys 225 230 235 240 Lys Glu Leu Thr Glu Gly Lys Ala Leu Gly Leu Ser His Thr Tyr Ala 245 250 255 Asn Val Arg Ile Asn His Val Ile Asn Leu Trp Gly Ala Asp Phe Asp 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Leu Lys Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ser Asp Ser Asn 275 280 285 Ala Ser Ile Gly Met Lys Lys Tyr Phe Val Gly Val Asn Ser Ala Gly 290 295 300 Lys Val Ala Ile Ser Ala Lys Glu Ile Lys Glu Asp Asn Ile Gly Ala 305 310 315 320 Gln Val Leu Gly Leu Phe Thr Leu Ser Thr Gly Gln Asp Ser Trp Asn 325 330 335 Gln Thr Asn

Claims (51)

  1. 하기 도메인 구조를 포함하는 단리된 VEGF 미니-트랩으로서,
    여기서, 상기 VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 히스티딘은 2-옥소-히스티딘으로 산화되고/거나,
    하나 이상의 트립토판은 이산화되고/거나,
    그의 하나 이상의 아스파라긴은 글리코실화된 것인, 단리된 VEGF 미니-트랩, 또는 그의 조성물:
    ((R1D2)-(R2D3))a-(MC)c;
    또는,
    ((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))a-(MC)b,
    ((R1D2)-(R2D3))c-링커-((R1D2)-(R2D3))d; 또는
    ((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))e-링커-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))f;
    여기서,
    R1D2는 VEGFR1 Ig 도메인 2이고;
    R2D3은 VEGFR2 Ig 도메인 3이고;
    R2D4는 VEGFR2 Ig 도메인 4이고;
    MC는 하기 아미노산 서열:
    DKTHTCPPC(서열 번호 22),
    DKTHTCPPCPPC(서열 번호 23),
    DKTHTCPPCPPCPPC(서열 번호 24),
    DKTHTC(PPC)h(서열 번호 25), 여기서, h는 1, 2, 3, 4, 또는 5임,
    DKTHTCPPCPAPELLG(서열 번호 6),
    DKTHTCPLCPAPELLG(서열 번호 7),
    DKTHTC(서열 번호 8) 또는
    DKTHTCPLCPAP(서열 번호 9)로 구성된 폴리펩티드 또는 면역글로불린 힌지 영역의 단편인 다량체화 성분이고,
    링커는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 아미노산을 포함하는 펩티드이고;
    독립적으로, a= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고; b= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고; c= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고; d= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고; e= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이고; f= 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다.
  2. 제1항에 있어서,
    (i)(R1D2)1-(R2D3)1-(MC)1;
    및
    (ii)(R1D2)1-(R2D3)1-(R2D4)1-(MC)1
    로부터 선택되는, VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  3. Figure pct00086

    Figure pct00087

    로 구성된 군으로부터 선택되는 구성원에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미니-트랩이 하기 도메인 구조:
    (i)(R1D2)a-(R2D3)b-링커-(R1D2)c-(R2D3)d; 또는
    (ii)(R1D2)a-(R2D3)b-(R2D4)c-링커-(R1D2)d-(R2D3)e-(R2D4)f를 포함하고;
    (i) 상기 R1D2 도메인은 코디네이팅하고/거나;
    (ii) 상기 R2D3 도메인은 코디네이팅하고/거나;
    (iii) 상기 R2D4 도메인은 코디네이팅하여
    VEGF 결합 도메인을 형성하는 것인 2차 구조를 갖는, VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  5. 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 (Gly4Ser)n이고, 여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이거나;
    MC는 또 다른 MC와 2, 3 또는 4개의 시스테인 브릿지를 형성하는 면역글로불린 힌지 영역의 단편인, VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 동종이량체화된 것인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 히스티딘이 2-옥소-히스티딘으로 산화되고/거나, 상기 VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 트립토판이 이산화되고/거나, 상기 VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 아스파라긴이 글리코실화된 것인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 미니-트랩 중 0.1% 내지 2%의 히스티딘이 2-옥소-히스티딘인, 상기 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Lys-C 및 트립신 프로테아제에 의한, 하나 이상의 카복시메틸화된 시스테인 및 2-옥소-히스티딘을 포함하는, 상기 VEGF 미니-트랩의 분해의 올리고펩티드 생성물이
    약 0.006-0.013% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열 번호 12의 아미노산 73-89),
    약 0.019-0.028% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열 번호 12의 아미노산 97-119),
    약 0.049-0.085% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열 번호 12의 아미노산 128-148),
    약 0.057-0.092% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열 번호 12의 아미노산 206-221), 및/또는
    약 0.010-0.022% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TNYLTH*R(서열 번호 12의 아미노산 90-96), 및
    임의적으로, 약 0.198-0.298% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 IIW*DSR(서열 번호 12의 아미노산 56-61)이고,
    여기서, H*는 2-옥소-히스티딘으로 산화될 수 있는 히스티딘이고, W*는 이산화될 수 있는 트립토판이고, C*는 카복시메틸화될 수 있는 시스테인인, 상기 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드를 포함하는 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Lys-C 및 트립신 프로테아제에 의한, 하나 이상의 카복시메틸화된 시스테인 및 2-옥소-히스티딘을 포함하는, 상기 VEGF 미니-트랩의 분해의 올리고펩티드 생성물이
    약 0.0095% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 EIGLLTC*EATVNGH*LYK(서열 번호 12의 아미노산 73-89),
    약 0.0235% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(서열 번호 12의 아미노산 97-119),
    약 0.067% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(서열 번호 12의 아미노산 128-148),
    약 0.0745% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 DKTH*TC*PPC*PAPELLG(서열 번호 12의 아미노산 206-221), 및/또는
    약 0.016% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 TNYLTH*R(서열 번호 12의 아미노산 90-96), 및
    임의적으로, 약 0.248% 2-옥소-히스티딘을 포함하는 IIW*DSR(서열 번호 12의 아미노산 56-61)이고,
    여기서, H*는 2-옥소-히스티딘으로 산화될 수 있는 히스티딘이고, W*는 이산화될 수 있는 트립토판이고, C*는 카복시메틸화될 수 있는 시스테인인, 상기 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 트립토판이 이산화된 것인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 2-옥소-히스티딘이 하기 화학식을 특징으로 하는 것인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물:
    Figure pct00088
    .
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 유럽 색상 표준 BY2보다 더 진한 갈황색이 아니고/거나;
    (ii) 유럽 색상 표준 BY3보다 더 진한 갈황색이 아니고/거나;
    (iii) 유럽 색상 표준 BY4보다 더 진한 갈황색이 아니고/거나;
    (iv) 유럽 색상 표준 BY5보다 더 진한 갈황색이 아니고/거나;
    (v) 유럽 색상 표준 BY6보다 더 진한 갈황색이 아니고/거나;
    (vi) 유럽 색상 표준 BY7보다 더 진한 갈황색이 아니고/거나;
    (vi) 유럽 색상 표준 BY2와 BY3 사이이고/거나;
    (vii) 유럽 색상 표준 BY2와 BY4 사이이고/거나;
    (vii) CIEL*a*b* 색 공간에서, L*은 약 70-99이고, a*는 약 -2-0이고, b*는 약 20 이하이고/거나;
    (viii) CIEL*a*b* 색 공간에서, L*은 약 98-99이고, a*는 약 -1-0이고, b*는 약 5-10이고, 미니-트랩 농도는 75 내지 100 mg/ml인 색상을 특징으로 하는 조성물이며;
    임의적으로, VEGF 미니-트랩의 농도가 약 70-200 mg/ml이거나,
    임의적으로, VEGF 미니-트랩의 농도가 약 70-200 mg/ml이지만, 약 10, 11, 10-11, 80 또는 90 mg/ml로 희석되었을 때 상기 색상을 특징으로 하는 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 색상이 하기 공식:
    0.046 + (0.066 X 미니-트랩의 농도(mg/ml))=b* 또는 b*=(0.11 X 미니-트랩의 농도(mg/ml) - 0.56)을 특징으로 하고, 여기서, L*= 약 97-99이고, a= 약 -0.085-0.06인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 화학적으로 정의된 액체 배지 중 숙주 세포에서 애플리버셉트 또는 상기 VEGF 미니-트랩을 발현하는 단계로서, 여기서, 상기 애플리버셉트 또는 VEGF 미니-트랩은 숙주 세포로부터 배지로 분비되는 것인 단계; 및
    (ii) 애플리버셉트가 발현되는 경우, 애플리버셉트를 단백질 분해 절단하여 Fc 도메인을 포함하는 펩티드, 또는 그의 단편, 및 상기 VEGF 미니-트랩을 생성하고, Fc 도메인 또는 그의 단편을 VEGF 미니-트랩으로부터 제거하는 것을 추가로 포함하는 것인 단계;
    (iii) VEGF 미니-트랩을 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 적용하는 단계; 및
    (iv) 상기 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드를 그의 크로마토그래피 플로우 쓰루 중에 보유하는 단계
    를 포함하는 프로세스의 생성물인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 애플리버셉트가 발현되는 경우, 상기 단백질 분해 절단 이전에, 프로세스가 애플리버셉트의 단백질-A 정제 단계를 추가로 포함하는 것인 조성물인, VEGF 미니-트랩 또는 그의 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 음이온 교환 수지가
    강한 음이온 교환 수지;
    4급 아민 작용기;
    -O-CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3 작용기; 또는
    4급화 폴리에틸렌이민 작용기
    를 포함하는 것인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 분해 절단이 애플리버셉트를 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) IdeS 프로테아제, 또는 하나 이상의 점 돌연변이를 포함하는 그의 변이체와 인큐베이션시킴으로써 수행되는 것인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF 미니-트랩이
    (1) 음이온 교환(AEX) 수지가 4급화 폴리에틸렌이민 작용기를 포함하고, 1.90 - 2.10 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 8.30 - 8.50의 완충제로 평형화된 것인 조건;
    (2) AEX 수지가 -O-CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3 또는 -N+(CH3)3 또는 4급 아민 작용기를 포함하고, 2.40 - 2.60 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 7.90 - 8.10의 완충제로 평형화된 것인 조건;
    (3) AEX 수지가 4급화 폴리에틸렌이민 작용기를 포함하고, 2.40 - 2.60 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 7.90 - 8.10의 완충제로 평형화된 것인 조건;
    (4) AEX 수지가 -O-CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3 또는 -N+(CH3)3 또는 4급 아민 작용기를 포함하고, 3.90 - 4.10 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 7.70 - 7.90의 완충제로 평형화된 것인 조건;
    (5) AEX 수지가 4급화 폴리에틸렌이민 작용기를 포함하고, 3.90 - 4.10 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 7.70 - 7.90의 완충제로 평형화된 것인 조건;
    (6) AEX 수지가 -O-CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3 또는 -N+(CH3)3 또는 4급 아민 작용기를 포함하고, 9.0 ± 0.1 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 7.70±0.1의 완충제로 평형화된 것인 조건; 및
    (7) AEX 수지가 4급화 폴리에틸렌이민 작용기를 포함하고, 2.0 ± 0.1 mS/cm의 전도도를 갖는, pH 8.4±0.1의 완충제로 평형화된 것인 조건
    으로 구성된 군으로부터 선택되는 조건하에서 AEX 크로마토그래피 수지에 적용되고,
    임의적으로, 여기서,
    조건 (1)하의 완충제가 50 mM 트리스, pH 8.4 및 2.0 mS/cm를 포함하고/거나;
    조건 (2)-(3)하의 완충제가 50 mM 트리스, 10 mM 아세테이트, pH 8.0 및 2.5 mS/cm를 포함하고/거나;
    조건 (4)-(5)하의 완충제가 50 mM 트리스, 10 mM 아세테이트, 10 mM NaCl, pH 7.8 및 4.0 mS/cm를 포함하고/거나;
    조건 (6)하의 완충제가 50 mM 트리스, 60 mM NaCl, pH 7.7±0.1을 포함하고/거나;
    조건 (7)하의 완충제가 50 mM 트리스, pH 8.4±0.1을 포함하고;
    VEGF 미니-트랩이 수지에의 적용 이전에 평형 완충제인 로딩 완충제 중에 있고/거나;
    VEGF 미니-트랩의 수지에의 적용 이후, 상기 수지를 상기 수성 완충제로 세척하는 것인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 도메인 또는 그의 단편이 단백질 분해 절단 후, Fc 도메인 또는 단편 및 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물을 단백질-A 크로마토그래피 수지에 적용하고, 플로우 쓰루 분획 중 VEGF 미니-트랩을 보유함으로써 VEGF 미니-트랩으로부터 크로마토그래피에 의해 제거되는 것인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 프로세스가 약 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 또는 6.2로의 pH 조정, 여과, 정용여과, 바이러스 불활성화, 단백질-A 크로마토그래피 정제 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 정제를 추가로 포함하는 것인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  22. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 프로세스가 페닐 작용기를 포함하는 수지 상에서의 소수성 상호작용 크로마토그래피 정제를 추가로 포함하는 것인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 정제가 결합-및-용리 모드 또는 플로우 쓰루 모드로 수행되는 것인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  24. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미니-트랩이 화학적으로 정의된 배지(CDM) 중에 있는 숙주 세포에서 발현되었거나, 상기 미니-트랩이 IdeS 효소에 의한 애플리버셉트의 단백질 분해 절단을 포함하는 프로세스의 생성물이고, 상기 애플리버셉트가 화학적으로 정의된 액체 배지 중에 있는 숙주 세포에서 발현되었고, 상기 숙주 세포가
    o (i) ■ 배양물 1 리터당 약 68 마이크로몰의 Fe,
    ■ 배양물 1 리터당 약 6 마이크로몰의 Zn,
    ■ 배양물 1 리터당 약 0.1 마이크로몰의 Cu,
    ■ 배양물 1 리터당 약 76 마이크로몰의 EDTA,
    ■ 배양물 1 리터당 약 45 마이크로몰의 시트레이트, 및
    ■ 배양물 1 리터당 약 0.5 마이크로몰의 Ni, 및 임의적으로,
    ■ 배양물 1 리터당 약 1.2 밀리몰의 시스테인
    을 포함하는 CDM에 숙주 세포를 도입하는 단계;
    o 매 2일마다 배양물에
    ■ 배양물 1 리터당 약 1.2 밀리몰의 시스테인,
    ■ 배양물 1 리터당 약 1 마이크로몰의 Fe,
    ■ 배양물 1 리터당 약 6 마이크로몰의 Zn,
    ■ 배양물 1 리터당 약 0.1 마이크로몰의 Cu,
    ■ 배양물 1 리터당 약 8 마이크로몰의 EDTA, 및
    ■ 배양물 1 리터당 약 1 마이크로몰의 시트레이트
    를 첨가하는 단계
    를 포함하는 프로세스에서 배양되었고;
    임의적으로, CDM이 티옥트산, 비타민 C 및/또는 하이포타우린, 타우린 및 글리신의 혼합물을 포함하고,
    임의적으로, CDM이 우리딘, 망가니즈, 갈락토스 및/또는 덱사메타손을 포함하는 것인 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    · VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 아스파라긴이 N-글리코실화되고/거나;
    · VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 세린 또는 트레오닌이 O-글리코실화되고/거나;
    · VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 아스파라긴이 탈아미드화되고/거나;
    · VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 아스파르테이트-글리신 모티프가 이소-아스파르테이트-글리신 및/또는 Asn-Gly으로 전환되고/거나;
    · VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 메티오닌이 산화되고/거나;
    · VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 트립토판이 N-포르밀키누레닌으로 전환되고/거나;
    · VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 아르기닌이 Arg 3-데옥시글루코손으로 전환되고/거나;
    · VEGF 미니-트랩의 C-말단 글리신이 존재하지 않고/거나;
    · VEGF 미니-트랩에 하나 이상의 비글리코실화된 글리코사이트가 존재하고/거나;
    · VEGF 미니-트랩이 총 약 40% 내지 약 50%의 푸코실화된 글리칸을 포함하고/거나;
    · VEGF 미니-트랩이 총 약 30% 내지 약 55%의 시알릴화된 글리칸을 포함하고/거나;
    · VEGF 미니-트랩이 약 6% 내지 약 15%의 만노스-5를 포함하고/거나;
    · VEGF 미니-트랩이 약 60% 내지 약 79%의 갈락토실화된 글리칸을 포함하고/거나;
    · VEGF 미니-트랩이 크실로실화되고/거나;
    · VEGF 미니-트랩이 리신에서 당화되고/거나;
    · VEGF 미니-트랩이 유리 티올 기를 갖는 시스틴을 포함하고/거나;
    · VEGF 미니-트랩이 트리술피드 브릿지를 포함하고/거나;
    · VEGF 미니-트랩이 쇄내 디술피드 브릿지를 포함하고/거나;
    · VEGF 미니-트랩이 평행 배향으로 디술피드 브릿지를 포함하고/거나;
    · VEGF 미니-트랩이 카복시메틸화된 리신 또는 아르기닌을 포함하는 것인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 미니-트랩의 하나 이상의 아스파라긴이
    · G0-GlcNAc 글리코실화;
    · G1-GlcNAc 글리코실화;
    · G1S-GlcNAc 글리코실화;
    · G0 글리코실화;
    · G1 글리코실화;
    · G1S 글리코실화;
    · G2 글리코실화;
    · G2S 글리코실화;
    · G2S2 글리코실화;
    · G0F 글리코실화;
    · G2F2S 글리코실화;
    · G2F2S2 글리코실화;
    · G1F 글리코실화;
    · G1FS 글리코실화;
    · G2F 글리코실화;
    · G2FS 글리코실화;
    · G2FS2 글리코실화;
    · G3FS 글리코실화;
    · G3FS3 글리코실화;
    · G0-2GlcNAc 글리코실화;
    · Man4 글리코실화;
    · Man4_A1G1 글리코실화;
    · Man4_A1G1S1 글리코실화;
    · Man5 글리코실화;
    · Man5_A1G1 글리코실화;
    · Man5_A1G1S1 글리코실화;
    · Man6 글리코실화;
    · Man6_G0+포스페이트 글리코실화;
    · Man6+포스페이트 글리코실화; 및/또는
    · Man7 글리코실화
    를 포함하는 것인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 미니-트랩이
    · 약 30-35%의 아스파라긴 123 잔기에 Man5 글리코실화;
    · 약 25-30%의 아스파라긴 196 잔기에 Man5 글리코실화;
    · 약 6-8%의 아스파라긴 36 잔기에 Man6-포스페이트 글리코실화;
    · 약 3-4%의 아스파라긴 123 잔기에 Man7 글리코실화;
    · 약 38%의 아스파라긴 123 잔기에 고 만노스 글리코실화; 및/또는
    · 약 29%의 아스파라긴 196 잔기에 고 만노스 글리코실화
    를 포함하는 것인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 약 80, 85, 90, 80-90, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130 또는 90-120 mg/ml의 농도로 VEGF 미니-트랩을 포함하는 조성물인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    · 조성물이 수성이고/거나;
    · 미니-트랩이 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 발현되었고/거나;
    · 조성물의 pH가 약 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1 또는 6.2이고/거나;
    · 미니-트랩이 임의의 약 0.24, 0.6, 0.96, 1.2 또는 2.4 x 106 lux*hr 초과의 백색광; 및/또는 임의의 약 40, 100, 160, 200 또는 400 W*h/㎡ 초과의 자외선 A(UVA) 광에 노출되지 않은 것인
    VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 미니-트랩이 단량체, 동종이량체 또는 다량체인 VEGF 미니-트랩 또는 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 VEGF 미니-트랩 또는 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 제제.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드, 조성물 또는 제제를 포함하는 주사 장치.
  33. 제32항에 있어서, 멸균 선충전된 시린지인 주사 장치.
  34. 추가 치료제와 연관되어 있는 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 VEGF 미니-트랩 폴리펩티드, 조성물 또는 제제.
  35. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 VEGF 미니-트랩을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  36. 제35항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  37. 제1항 내지 제7항, 제35항 및 제36항 중 어느 한 항의 VEGF 미니-트랩, 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  38. 제37항에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소 세포인 숙주 세포.
  39. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 VEGF 미니-트랩을 제조하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 단계, 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 숙주 세포를 배지 중에서 배양하는 단계, 및 임의적으로, 숙주 세포 및/또는 배지로부터 폴리펩티드를 단리시키는 단계를 포함하는, 상기 VEGF 미니-트랩을 제조하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인 방법.
  41. 제39항 또는 제40항의 생성물인 VEGF 미니-트랩.
  42. 본질적으로 하기 서열: DKTHTCPPCPAPELLG(서열 번호 20) 뒤의 면역글로불린 Fc 폴리펩티드를 절단하는 효소로 VEGF 트랩을 단백질분해하는 단계로 구성된, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 VEGF 미니-트랩을 제조하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, VEGF 트랩이 애플리버셉트 또는 컨버셉트인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 효소가 S. 피오게네스 IdeS 또는 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi) 아종 쥬에피데미쿠스(zooepidemicus) IdeZ인 방법.
  45. 대상체의 체내로 VEGF 미니-트랩, 조성물 또는 제제, 및 임의적으로, 추가 치료제를 도입하는 단계를 포함하는, 대상체에게 제1항 내지 제31항, 및 제34항 중 어느 한 항의 상기 VEGF 미니-트랩 또는 조성물 또는 약학적 제제를 투여하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 VEGF 미니-트랩을 안내 주사에 의해 대상체의 체내로 투여하는 것인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 VEGF 미니-트랩을 유리체내 주사에 의해 대상체의 체내로 안내로 투여하는 것인 방법.
  48. 혈관신생 눈 장애 치료를 필요로 하는 대상체의 눈에 치료 유효량의, 제1항 내지 제31항, 제34항 및 제41항 중 어느 한 항의 VEGF 미니-트랩 또는 조성물 또는 그의 약학적 제제, 및 임의적으로, 추가 치료제를 안내로 주사하는 단계를 포함하는, 혈관신생 눈 장애 치료를 필요로 하는 대상체에서 혈관신생 눈 장애를 치료하는 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 약 0.5 mg, 2 mg, 4 mg, 6 mg, 8 mg 또는 10 mg의 VEGF 미니-트랩을 대상체의 눈에 유리체내로 주사하는 것인 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 혈관신생 눈 장애가
    · 연령 관련 황반 변성(습성),
    · 연령 관련 황반 변성(건성),
    · 황반 부종,
    · 망막 정맥 폐색 후 황반 부종,
    · 망막 정맥 폐색(RVO),
    · 중심성 망막 정맥 폐색(CRVO),
    · 망막 분지 정맥 폐색(BRVO),
    · 당뇨병성 황반 부종(DME),
    · 맥락막 신생혈관(CNV),
    · 홍채 신생혈관,
    · 신생혈관 녹내장,
    · 녹내장에 있어 수술 후 섬유증,
    · 증식성 유리체망막병증(PVR),
    · 시신경 유두 신생혈관,
    · 각막 신생혈관,
    · 망막 신생혈관,
    · 유리체 신생혈관,
    · 판누스,
    · 익상편,
    · 혈관 망막증,
    · 대상체가 당뇨병성 황반 부종을 또한 앓는 것인 당뇨병성 망막증; 및
    · 당뇨병성 망막증
    인 방법.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, VEGF 미니-트랩이 약 100 ㎕ 이하로 투여되는 것인 방법.
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