CN114786695A

CN114786695A - Vegf微型捕捉体及其使用方法

Info

Publication number: CN114786695A
Application number: CN202080084207.5A
Authority: CN
Inventors: J·马丁; S·戴维斯; S·劳伦斯; A·约翰逊; M·凯西; J·马斯特罗贾科莫; S·王; N·李; A·图斯蒂安; A·瓦塔克; M·弗兰克林
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2022-07-22
Also published as: AU2020397053A1; CA3163876A1; MX2022006751A; CO2022008799A2; KR20220110555A; WO2021113591A1; US20230063116A1; CL2022001479A1; BR112022010686A2; IL293286A; EP4069264A1; JP2023505216A

Abstract

本发明提供治疗或预防血管生成病如生血管眼病和癌症的VEGF微型捕捉体分子和方法。

Description

VEGF微型捕捉体及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年12月6日提交的美国临时专利申请号62/944,635的权益，所述文献通过引用的方式完整并入本文作为参考。

序列表

本申请的序列表以电子方式作为文件名称为“250298_000141_seqlist.TXT”、创建日期2020年12月2日和大小115,306比特的ASCII格式化序列表提交。提交的这个序列表是本说明书的部分并且通过引用方式完整并入本文作为参考。

技术领域

本发明提供VEGF微型捕捉体分子(VEGF mini-trap molecules)、其药物组合物及其使用方法(例如，用于治疗生血管眼病和癌症的)。

发明背景

几种眼病与病理性血管生成相关。例如，年龄相关性黄斑变性(AMD)的发展与称为脉络膜血管新生(CNV)的过程相关。来自CNV的渗漏造成黄斑水肿及流体聚集在黄斑下，导致视力减退。糖尿病性黄斑水肿(DME)是另一种具有生血管组分的眼病。DME是糖尿病患者中度视力丧失的最主流病因并且是糖尿病性视网膜病变(一种影响视网膜血管的疾病)的常见并发症。当流体渗漏入黄斑中心凹(负责清晰、直接视力的视网膜光敏感部分)时，有临床显著性的DME出现。黄斑中的流体可以造成重度视力减退或失明。然而，另一种与异常血管生成相关的眼病是视网膜中央静脉闭塞(CRVO)。CRVO由导致视网膜中血液和流体堵塞的视网膜中央静脉阻塞引起。视网膜还可能变得缺血，导致不适宜的新血管生长，所述生长可能造成视力进一步减退和更严重的并发症。血管内皮生长因子(VEGF)释放促成眼中血管通透性增加和不适宜的新血管生长。因此，抑制VEGF的生血管促进特性是治疗生血管性眼病的有效策略。

已经批准多种VEGF抑制剂如VEGF捕捉体(VEGF trap)Eylea(阿柏西普(aflibercept))用于治疗这类眼病。递送VEGF捕捉体的治疗方案包括玻璃体内注射。这类方案是令人疼痛且对患者不便、有心理与身体创伤性并且涉及不良作用(如伴随每次治疗活动(treatment event)的感染)可能性。尽管已经证明阿柏西普高度有效治疗多种生血管眼病，但给药频繁如每月一次进行。显示出类似疗效且可以按更低频率给药的治疗性VEGF捕捉体治疗引起巨大兴趣。以相对于阿柏西普而言更大摩尔量的VEGF微型捕捉体给药将必定使给药活动(dosing events)更少，与此同时仍从阿柏西普的高治疗功效获益。

发明简述

本发明提供一种分离的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F)(其可以例如是单体、同型二聚体或同型多聚体)，其包含以下结构域结构：(R1D2)-(R2D3)-(MC)，其中所述VEGF微型捕捉体的一个或多个组氨酸氧化成2-氧代-组氨酸，和/或一个或多个色氨酸二氧化(例如，二氧化成N-甲酰基犬尿氨酸)或氧化成羟色氨酸或二羟色氨酸或三羟基色氨酸，和/或其一个或多个天冬酰胺糖基化，或((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_a-(MC)_b、((R1D2)-(R2D3))_c-接头-((R1D2)-(R2D3))_d；或((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_e-接头-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_f；其中R1D2是VEGFR1 Ig结构域2；R2D3是VEGFR2 Ig结构域3；R2D4是VEGFR2 Ig结构域4；MC是由以下氨基酸序列组成的多聚化组分：DKTHTCPPC(SEQ ID NO：22)、DKTHTCPPCPPC(SEQ IDNO：23)、DKTHTCPPCPPCPPC(SEQ ID NO：24)、DKTHTC(PPC)_h(SEQ ID NO：25)，其中h是1、2、3、4或5，DKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：6)、DKTHTCPLCPAPELLG(SEQ ID NO：7)、DKTHTC(SEQID NO：8)或DKTHTCPLCPAP(SEQ ID NO：9)，并且接头是包含约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸的肽；以及独立地，a＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；b＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；c＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；d＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；e＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；并且f＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；或其组合物，例如，含水组合物。在本发明的一个实施方案中，微型捕捉体(例如，REGN7483^F)的浓度是约90mg/ml。例如，在本发明的一个实施方案中，VEGF微型捕捉体包含以下成员中所示的氨基酸序列或由其组成，所述成员选自SEQ ID NO：10、11、12、13、26、27、28、29、30、32或33中所示的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，微型捕捉体包含结构域结构：(i)((R1D2)-(R2D3))_a-接头-((R1D2)-(R2D3))_b；或(ii)((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_c-接头-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_d；并且具有二级结构，其中：(i)所述诸R1D2结构域配位；(ii)所述诸R2D3结构域配位；和/或(iii)所述诸R2D4结构域配位，以形成VEGF(例如，VEGF-a)结合结构域。在本发明的一个实施方案中，接头例如是(Gly₄Ser)_n，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在本发明的一个实施方案中，VEGF微型捕捉体或其组合物包括一个或多个氧化成2-氧代-组氨酸的组氨酸，和/或一个或多个被二氧化的色氨酸，和/或一个或多个糖基化的天冬酰胺。在本发明的一个实施方案中，组合物(例如，含水组合物)包含这种VEGF微型捕捉体，其中VEGF微型捕捉体中0.1％与2％之间的组氨酸是2-氧代-组氨酸。在本发明的一个实施方案中，组合物如此包含所述的VEGF微型捕捉体，从而用Lys-C蛋白酶和胰蛋白酶(例如，用化脓性链球菌(S.pyogenes)IdeS或其序列变体)消化包含一个或多个羧甲基化半胱氨酸和2-氧代-组氨酸的VEGF微型捕捉体的寡肽产物是：EIGLLTC*EATVNGH*LYK(SEQ ID NO：12的氨基酸73-89)，其包含约0.006-0.013％的2-氧代-组氨酸，QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(SEQ ID NO：12的氨基酸97-119)，其包含约0.019-0.028％的2-氧代-组氨酸；ELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(SEQ ID NO：12的氨基酸128-148)，其包含约0.049-0.085％的2-氧代-组氨酸；DKTH*TC*PPC*PAPELLG(SEQ ID NO：12的氨基酸206-221)，其包含约0.057-0.092％的2-氧代-组氨酸，TNYLTH*R(SEQ ID NO：12的氨基酸90-96)，其包含约0.010-0.022％的2-氧代-组氨酸，和/或IIWDSR(SEQ ID NO：12的氨基酸56-61)，其包含约0.198-0.298％的2-氧代-组氨酸；其中H*是可以氧化成2-氧代-组氨酸的组氨酸并且其中C*是可以羧甲基化的半胱氨酸，任选地其中所述寡肽的一个或多个色氨酸被二氧化；

或

EIGLLTC*EATVNGH*LYK(SEQ ID NO：12的氨基酸73-89)，其包含约0.0095或0.01％的2-氧代-组氨酸，QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK (SEQ ID NO：12的氨基酸97-119)，其包含约0.0235或0.24％的2-氧代-组氨酸；TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(SEQ ID NO：12的氨基酸128-148)，其包含约0.067或0.07％的2-氧代-组氨酸；DKTH*TC*PPC*PAPELLG(SEQ ID NO：12的氨基酸206-221)，其包含约0.0745或0.075％的2-氧代-组氨酸，TNYLTH*R(SEQ ID NO：12的氨基酸90-96)，其包含约0.016或0.02％的2-氧代-组氨酸，和/或IIWDSR(SEQ ID NO：12的氨基酸56-61)，其包含约0.248或0.25％的2-氧代-组氨酸；其中H*是可以氧化成2-氧代-组氨酸的组氨酸并且其中C*是可以羧甲基化的半胱氨酸，任选地其中所述寡肽的一个或多个色氨酸被二氧化。在本发明的一个实施方案中，2-氧代-组氨酸以如下化学式为特征：

本发明包括一种组合物(例如，含水组合物)，所述组合物包含VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483^F或REGN7483^R)，其中组合物以如下颜色为特征：

(i)所述颜色不比欧洲颜色标准BY2显得更棕黄；

(ii)所述颜色不比欧洲颜色标准BY3显得更棕黄；

(iii)所述颜色不比欧洲颜色标准BY4显得更棕黄；

(iv)所述颜色不比欧洲颜色标准BY5显得更棕黄；

(v)所述颜色不比欧洲颜色标准BY6显得更棕黄；

(vi)所述颜色不比欧洲颜色标准BY7显得更棕黄；

(vi)所述颜色介于欧洲颜色标准BY2与BY3之间；

(vi)所述颜色介于欧洲颜色标准BY2与BY4之间；

(vii)其中，在CIEL*a*b*颜色空间中，L是约70-99，a是约-2-0并且b是约20或更小；

(viii)其中，在CIEL*a*b*颜色空间中，L是约70-99，a是约-2-0并且b是约10-31、约10、约14、约12、约14、约15、约18、约21、约27或约31；

(ix)其中，在CIEL*a*b*颜色空间中，L*、a*和b*是约在本文表9-3的任一行中所述的那些或BY值是约表9-3中所述的那个值，任选地其中浓度也大致如该表中所述；

(x)其中，在CIEL*a*b*颜色空间中，L*、a*和b*是约在本文表17-1的任一行中所述的那些，任选地其中浓度也大致如该表中所述，任选地其中VEGF微型捕捉体的浓度是约70-200mg/ml(例如，70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg/ml)；或任选地，其中VEGF微型捕捉体的浓度是约70-200mg/ml(例如，70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200mg/ml)，但当稀释至约10或11或10-11mg/ml时，以所述颜色为特征。在本发明的一个实施方案中，组合物包括本发明的微型捕捉体，其中组合物的颜色以如下公式为特征：

0.046+(0.066X微型捕捉体浓度(mg/ml))＝b*或0.05+(0.07X微型捕捉体浓度(mg/ml))＝b*或b*＝(0.11X微型捕捉体浓度(mg/ml)-0.56)，其中L*＝约97-99并且a＝约-0.085-0.06(例如，约0)。

本发明还包括一种组合物(例如，含水组合物)，所述组合物包含VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483^F或REGN7483^R)，所述微型捕捉体是一个工艺的产物，所述工艺包括使微型捕捉体经历阴离子交换色谱(例如，在pH约8.3-8.6和/或电导率约2mS/em的上样缓冲液中)，其中在流通(flow-through)色谱级分中收集微型捕捉体。例如，在本发明的一个实施方案中，该方法包括：(i)在化学成分确知的液体培养基中的宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞)内表达阿柏西普或所述VEGF微型捕捉体，其中所述阿柏西普或VEGF微型捕捉体从宿主细胞分泌入培养基；和(ii)如果阿柏西普表达，则还包括蛋白水解切割阿柏西普以产生包含Fc结构域或其片段的肽和所述VEGF微型捕捉体，并且从VEGF微型捕捉体移除Fc结构域或其片段；(iii)施加VEGF微型捕捉体至阴离子交换色谱树脂(例如，具有以下官能团：季胺；-O-CH₂CHOHCH₂OCH₂CHOHCH₂N⁺(CH₃)₃；-N⁺(CH₃)₃、或季铵化聚乙烯亚胺)上；和(iv)保留其色谱流通液中的所述VEGF微型捕捉体多肽。在本发明的一个实施方案中，如果所述阿柏西普表达，则该工艺还包括在所述蛋白水解切割之前对阿柏西普进行蛋白A纯化。在本发明的一个实施方案中，通过将阿柏西普与化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)IdeS蛋白酶或其包含一个或多个点突变的变体温育进行蛋白水解切割。在一个实施方案中，将VEGF微型捕捉体施加至已经在水性缓冲液中平衡的阴离子交换色谱树脂上，所述水性缓冲液包含：pH为约8.4或7.7和电导率为约2.0mS/cm，例如，50mM Tris pH8.4±0.1以及具有电导率2.0mS/cm；或50mM Tris，60mM NaCl，pH 7.7±0.1的缓冲液。在本发明的一个实施方案中，将VEGF微型捕捉体在其处于水性缓冲液之时施加至阴离子交换色谱树脂上，所述水性缓冲液pH为约8.4或7.7并且电导率为约2.0mS/cm，例如，50mM Tris pH8.4±0.1以及具有电导率2.0mS/cm；或50mM Tris，60mM NaCl，pH7.7±0.1。在施加组合物至树脂后，可以用所述水性缓冲液洗涤树脂并且可以保留这种洗涤液。在本发明的一个实施方案中，在蛋白酶剪后切，通过施加包含Fc结构域或片段和VEGF微型捕捉体的组合物至蛋白A色谱树脂并且保留流通级分中的VEGF微型捕捉体，从VEGF微型捕捉体组合物中色谱移除阿柏西普的Fc结构域或其片段。在本发明的一个实施方案中，该工艺还包括调整至更酸性的pH例如，约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2)、过滤、深层过滤、超滤、渗滤、病毒灭活、阳离子交换色谱、蛋白A色谱纯化和/或疏水相互作用色谱纯化(例如，采用苯基、辛基或丁基官能团和/或以结合和洗脱模式或流通模式运行)，例如，苯基琼脂糖凝胶FF、Capto苯基(GE Healthcare，乌普萨拉，瑞典)、苯基650-M(Tosoh Bioscience，东京，日本)或Sartobind Phenyl(Sartorius公司，纽约，USA)。在本发明的一个实施方案中，初始性(第0天)化学成分确知的液体培养基中的半胱氨酸(例如，半胱氨酸HCl H₂O)浓度是约1.5mM并且每两天(例如，第2、第4、第6和第8天)将额外的半胱氨酸补料按1.3mM、1.7mM或2.1mM(每体积或培养物基质)添加至培养物基质；化学成分确知的液体培养基包含EDTA和/或柠檬酸、铁、铜、锌和镍；和/或化学成分确知的液体培养基包含亚牛磺酸、牛磺酸、甘氨酸、硫辛酸和/或维生素C。

在本发明的一个实施方案中，本发明的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483^F或REGN7483^R；例如，其已经在CDM中(例如，在CHO细胞中)表达并且如本文中所述通过AEX流通色谱纯化)如下表征：VEGF微型捕捉体的一个或多个天冬酰胺被N-糖基化；VEGF微型捕捉体的一个或多个丝氨酸或苏氨酸被O-糖基化；VEGF微型捕捉体的一个或多个天冬酰胺脱酰胺化；VEGF微型捕捉体的一个或多个天冬氨酸-甘氨酸基序转化成异天冬氨酸-甘氨酸和/或Asn-Gly；VEGF微型捕捉体的一个或多个甲硫氨酸氧化；VEGF微型捕捉体的一个或多个色氨酸转化成N-甲酰基犬尿氨酸；VEGF微型捕捉体的一个或多个精氨酸转化成Arg 3-脱氧葡糖醛酮；VEGF微型捕捉体的C末端甘氨酸(或其他C末端残基)不存在；VEGF微型捕捉体中存在一个或多个非糖基化的潜在糖基化位点；VEGF微型捕捉体包含约40％至约50％的总岩藻糖基化聚糖；VEGF微型捕捉体包含约30％至约55％的总唾液酸化聚糖；VEGF微型捕捉体包含约6％至约15％的甘露糖-5；VEGF微型捕捉体包含约60％至约79％的半乳糖化聚糖；VEGF微型捕捉体被木糖基化；VEGF微型捕捉体在赖氨酸处糖化；VEGF微型捕捉体包含带游离硫醇基的胱氨酸；VEGF微型捕捉体包含三硫键桥；VEGF微型捕捉体包含链内二硫桥；VEGF微型捕捉体包含平行取向的二硫桥；和/或VEGF微型捕捉体包含羧甲基化的赖氨酸或精氨酸；和/或如下表征：其中VEGF微型捕捉体的一个或多个天冬酰胺包含：G0-GlcNAc糖基化；G1-GlcNAc糖基化；G1S-GlcNAc糖基化；G0糖基化；G1糖基化；G1S糖基化；G2糖基化；G2S糖基化；G2S2糖基化；G0F糖基化；G2F2S糖基化；G2F2S2糖基化；G1F糖基化；G1FS糖基化；G2F糖基化；G2FS糖基化；G2FS2糖基化；G3FS糖基化；G3FS3糖基化；G0-2GlcNAc糖基化；Man4糖基化；Man4_A1G1糖基化；Man4_A1G1S1糖基化；Man5糖基化；Man5_A1G1糖基化；Man5_A1G1S1糖基化；Man6糖基化；Man6_G0+磷酸糖基化；Man6+磷酸糖基化；和/或Man7糖基化，例如，其在约30-36％(例如，约30、31、32、32-35、33、34、35或36％)的第123天冬酰胺残基处和/或在约25-30％(例如，约25、26、27、27-30、28、29或30％)的第196天冬酰胺残基处包含Man5糖基化；约6-8％(例如，约6、7、8％)的第36天冬酰胺以Man6-磷酸糖基化；和/或约3-4％(例如，约3或4或4.5％)的第123天冬酰胺以Man7糖基化。在本发明的一个实施方案中，本发明的微型捕捉体(例如，REGN7483^F，例如，其已经在CDM中(例如，在CHO细胞中)表达并且如本文中所述通过AEX流通色谱纯化)具有约38％的存在高甘露糖糖基化的第123天冬酰胺残基和/或约29％的存在高甘露糖糖基化的第196天冬酰胺残基。

本发明提供一种药物制剂，其包含如本文中所述的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483^F或REGN7483^R)或组合物(例如，含水组合物)和可药用载体。包含VEGF微型捕捉体多肽、组合物或药物制剂的注射装置(例如，预充填的注射器(PFS)，例如，无菌PFS)也是本发明的部分。

在本发明的一个实施方案中，如本文中所述的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483^F或REGN7483^R)，组合物(例如，含水组合物)或药物制剂与其他治疗剂组合。

本发明还提供一种编码本文所述的多肽VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483^F或REGN7483^R)的多核苷酸，例如，DNA。本发明还提供一种包含该多核苷酸的载体以及包含该VEGF微型捕捉体、多核苷酸和/或载体的宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。

本发明还包括一种用于产生如本文中所述的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483^F或REGN7483^R)的方法，所述方法包括向宿主细胞(例如，CHO细胞)中引入编码微型捕捉体多肽的多核苷酸，在其中表达多肽的条件下在培养基中培养宿主细胞，任选地，从宿主细胞和/或培养基分离多肽。作为这种方法的产物的VEGF微型捕捉体或其组合物(例如，含水组合物)也是本发明的部分。

本发明还包括一种用于产生如本文中所述的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483^F或REGN7483^R)的方法，所述方法包括或基本上由以下组成：用酶(例如化脓性链球菌(S.pyogenes)IdeS或马链球菌(Streptococcus equi)兽疫亚种IdeZ)对VEGF捕捉体(例如，阿柏西普或康柏西普(conbercept))进行蛋白酶解，所述酶切割以下序列后的免疫球蛋白Fc多肽：DKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：20)。作为这种方法的产物的VEGF微型捕捉体或其组合物也是本发明的部分。

本发明还包括一种用于向受试者(例如，人)施用如本文中所述的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483^F或REGN7483^R)或其组合物(例如，含水组合物)或其药物制剂的方法，包括向受试者的身体引入VEGF微型捕捉体、组合物或制剂，和任选地其他治疗剂，例如，通过眼内注射，例如，通过玻璃体内注射(例如，约100微升或更少，例如，约70微升)引入。

本发明还包括一种用于治疗有需求的受试者(例如，人)中生血管眼病(例如，年龄相关性黄斑变性(湿性)、年龄相关性黄斑变性(干性)、黄斑水肿、视网膜静脉闭塞后黄斑水肿、视网膜静脉闭塞(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、分支视网膜静脉闭塞(BRVO)、糖尿病性黄斑水肿(DME)、脉络膜血管新生(CNV)、虹膜新血管化、新生血管性青光眼、青光眼术后纤维化、增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、视盘新血管化、角膜新血管形成、视网膜血管新生、玻璃体新血管化、血管翳、翼状胬肉、血管性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变，其中受试者还患有糖尿病性黄斑水肿；和/或糖尿病性视网膜病变)的方法，所述方法包括眼内(例如，玻璃体内)注射治疗有效量(例如，0.5mg、2mg、4mg、6mg、8mg或10mg)的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483^F或REGN7483^R)或组合物(例如，含水组合物)或其药物制剂(例如，约100微升或更小，例如，约70微升)和任选地其他治疗剂至受试者的眼部。

附图简述

图1.描述了VEGF微型捕捉体分子(REGN7483^F)，其是用化脓性链球菌IdeS(FabRICATOR)对阿柏西普进行蛋白酶解的产物。描述了Ig铰链结构域片段使每个多肽结合在一起的同型二聚体分子。指示了VEGFR1结构域、VEGFR2结构域和铰链结构域片段(MC)。以“//”指示阿柏西普中IdeS切割作用发生的点。还指示了从阿柏西普切下的Fc片段。

图2.描述了单链VEGF微型捕捉体，示出了其结构域配位，指示了VEGFR1结构域、VEGFR2结构域和接头结构域。显示的接头是(G₄S)₆(REGN7080)。本发明包括具有(G₄S)₃；(G₄S)₉或(G4S)₁₂接头的单链VEGF微型捕捉体。

图3(A-C).将HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ克隆V3H9细胞用渐增浓度的VEGF₁₁₀、VEGF₁₂₁或VEGF₁₆₅(分别为小图A-C，黑色空心正方形)处理，导致相对发光单位(RLU)升高，这反映激活嵌合VEGF受体。在20pM VEGF₁₁₀、VEGF₁₂₁或VEGF₁₆₅存在下，随REGN3(黑色实心圆圈)、REGN6824(黑色实心正方形)和REGN7080(实心三角形)的系列稀释物观察到中和作用。

图4(A-B).将HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ克隆V3H9细胞用渐增浓度的VEGF₁₂₁或VEGF₁₁₀(分别为小图A-B，空心正方形)处理，导致相对发光单位(RLU)升高，这反映激活嵌合VEGF受体。在20pM VEGF₁₂₁或VEGF₁₁₀存在下，随REGN3(VEGF捕捉体；实心圆圈)、REGN7991(黑色实心正方形)和REGN7992(空心三角形)的系列稀释物观察到中和作用。

图5(A-F).将HEK293/D9/Flt-IL 18Rα/Flt-IL 18Rβ克隆V3H9细胞用渐增浓度的VEGF₁₁₀(A-B)、VEGF₁₂₁(C-D)或VEGF₁₆₅(E-F)处理，导致相对发光单位(RLU)升高，这反映激活嵌合VEGF受体。在20pM VEGF₁₁₀、40pM VEGF₁₂₁或40pM VEGF₁₆₅存在下，用REGN3 (VEGF捕捉体；黑色实心小正方形)；REGN7483^F(黑色实心大正方形或灰色空心正方形(独立的批次))；REGN7483^R(黑色实心小三角形)；REGN112(空心三角形)；REGN7850(灰色实心圆圈)；REGN7851(空心圆圈)或VEGF对照(黑色空心正方形)的系列稀释物确定中和作用。

图6.通过偶联多角度光散射(SEC-MALS)的大小排阻色谱法分析REGN6824：REGN110复合体。对每份样品显示随保留时间(X-轴)变化而变化的280nm处相对UV吸光度(右Y-轴)并且指示可分辨峰的测定的摩尔质量(左Y-轴)。峰1指示复合体，峰2代表单独的REGN6824并且峰3表代表单独的REGN110。

图7.通过偶联多角度光散射(SEC-MALS)的大小排阻色谱法分析REGN7080：REGN110复合体。对每份样品显示随保留时间(X-轴)变化而变化的280nm处相对UV吸光度(右Y-轴)并且指示可分辨峰的测定的摩尔质量(左Y-轴)。峰1指示复合体，峰2代表单独的REGN7080并且峰3表代表单独的REGN110。

图8.通过偶联多角度光散射(SEC-MALS)的大小排阻色谱法分析REGN7483^F：REGN110复合体。对每份样品显示随保留时间(X-轴)变化而变化的280nm处相对UV吸光度(右Y-轴)并且指示可分辨峰的测定的摩尔质量(左Y-轴)。峰1指示复合体，峰1a与单独REGN7483^F和REGN110：REGN7483^F复合体的混合物相符，峰2代表单独的REGN7483^F并且峰3表代表单独的REGN110。

图9.显示了玻璃体内施用对照hFc、VEGF捕捉体(阿柏西普)、单链微型捕捉体(REGN7080)或二聚体微型捕捉体(REGN7483^F)后，在OIR(氧诱导的视网膜病变)模型小鼠中观察到的异常血管新生的表面积。

图10(A-B).显示了全身性(ip)施用二聚体微型捕捉体REGN7483^F(3mg/kg、30mg/kg或100mg/kg；或3mg/kg对照hFc)后，在OIR(氧诱导的视网膜病变)模型小鼠中观察到的异常血管新生的表面积(A)。还显示对全身性(ip)施用2.5mg/kg、6.25mg/kg、25mg/kg或50mg/kg阿柏西普(VEGF捕捉体)的OIR小鼠中表面积(对hFc对照蛋白归一化)的历史研究(B)。

图11.REGN112(R112)、REGN7850(R7850)和REGN7851(R7851)分子(M＝分子量标记)的还原性和非还原性SDS-PAGE凝胶。指示了二聚体和单体。

图12.VEGF捕捉体构建体和微型捕捉体构建体的图形总结。

图13.CIEL*a*b*颜色空间的图形再现。

图14(A-D).对CDM表达的和非CDM表达的阿柏西普(Eylea)观察到的翻译后修饰。(A)的表格显示对REGN7483^F和阿柏西普(Eylea)观察到的位点特异性天冬酰胺连接的糖基化。每个框的阴影程度与所示残基处所示糖基化的程度相关。通过加和Man4、Man5、Man6和Man7计算高甘露糖％。(B)的表格显示对REGN7483^F和阿柏西普(Eylea)观察到的其他翻译后修饰，包括N连接的糖基化位点处的非糖基化。(C)的表格显示对REGN7483^F(微型捕捉体产品10)、REGN7483^R、REGN7711和阿柏西普(Eylea)观察到的位点特异性天冬酰胺连接的糖基化。这些表格仅显示任何样品中水平＞1％的糖型。(D)显示额外聚糖的结构。

图15.跨组的基线血管通透性(渗漏/视盘面积)(阿柏西普(500μg和2mg剂量)；REGN7483^R(Minitrap R，250.5μg剂量)；REGN7483^F(Minitrap F，254.4μg和1.4mg剂量)和安慰剂))。

图16.在等摩尔剂量的阿柏西普(500μg)、REGN7483^R(MiniTrap重组，250.5μg)、REGN7483^F(MiniTrap Fabricator，254.4μg)和安慰剂时，随时间推移的血管通透性抑制(作为基线的百分数)。

图17.在大剂量阿柏西普(2mg)或REGN7483^F(MiniTrap Fabricator，1.4mg)；或安慰剂时，随时间推移的血管通透性抑制(作为基线的百分数)。

图18.兔的每个治疗组(阿柏西普(500μg和2mg剂量)；REGN7483^R(MiniTrap重组，250.5μg剂量)；REGN7483^F(MiniTrap Fabricator，254.4μg和1.4mg剂量)和安慰剂))中随时间推移的眼内压。

图19.每个组(阿柏西普(500μg和2mg剂量)；REGN7483^F(MiniTrap F，254.4μg和1.4mg剂量)和安慰剂))中病理性血管消退百分数。

图20.阿柏西普组(500μg)、REGN7483^F组(Minitrap，213μg)或安慰剂组中的基线血管通透性。

图21.阿柏西普组(500μg)、REGN7483^F组(MiniTrap(F)，213μg)或安慰剂组中随时间推移的血管通透性抑制百分数。

图22.CIEL*a*b*颜色空间中对BY颜色标准品的颜色分析。

图23.对商用阿柏西普中和来自蛋白酶消化的微型捕捉体产品10的已经用AEX色谱纯化的寡肽和来自蛋白酶消化的微型捕捉体产品10的已经从AEX色谱取出的寡肽中2-氧代-组氨酸(和色氨酸二氧化)百分数的评价。

图24(A-B).新鲜CDM中多种组分与阿柏西普孵育对颜色生成(CIEL*a*b*预测的b*值)的影响(A)；和依据预测b*值图的实际B值。B族维生素是硫胺素、烟酰胺、泛酸、生物素和吡多醇。

图25.金属含量和半胱氨酸还原对颜色(CIEL*a*b*预测的b*值)的影响。

图26(A-B).内标入含有阿柏西普原料药的已用过CDM中的各种抗氧化剂对预测b*值的影响，图形(A)和表格总结(B)。

图27.REGN7483浓度(微型捕捉体产品23)对b*值的影响。

图28.为比较不同微型捕捉体产品中和实施强阳离子交换(CEX)色谱时所获得级分中存在的酸性种类而进行的实验的结果。

图29.使用双重盐-pH梯度，根据微型捕捉体产品23(在任何纯化操作之前，≤BY3)和去唾液酸化微型捕捉体的已富集变体(dsMT1)的示例性实施方案进行的强阳离子交换色谱图，所述微型捕捉体产品23经历CEX。

图30.根据VEGF微型捕捉体产品23(在任何纯化操作之前，≤BY3)和去唾液酸化VEGF微型捕捉体的已富集变体(dsMT1)的示例性实施方案进行的成像毛细管等电聚焦(iciEF)电泳图，所述微型捕捉体产品23经历CEX。

图31(A-C).(A)VEGF微型捕捉体(MT4)和微型捕捉体产品10(M1)在350nm处的吸光度对时间图(分钟)的全景，其中通过IdeS(FabRICATOR)切割利用商业化工艺(非CDM)产生的阿柏西普获得所述VEGF微型捕捉体；(B)MT4和MT1在350nm处的吸光度对时间图(16-30分钟)的全景；(C)MT4和MT1在350nm处的吸光度对时间图(30-75分钟)的全景。

图32(A-B).新西兰白兔(兔428、429、430、434、435和436)的玻璃体中(A)VEGF捕捉体REGN3和(B)VEGF微型捕捉体REGN7483^F的衰变曲线的自然对数图。OD＝右眼；OS＝左眼。

图33(A-C).新西兰白兔(兔472、473、475、476、477、431、432和433)的玻璃体中(A)VEGF捕捉体REGN3、(B)VEGF微型捕捉体REGN7850和(C)VEGF微型捕捉体REGN7851的衰变曲线的自然对数图。OD＝右眼；OS＝左眼。

图34.二因素ANOVA显示在VEGF捕捉体REGN3组和VEGF微型捕捉体REGN7483^F组之间，IOP在IVT注射之前和之后20分钟无显著变化。

发明详述

本发明提供了具备几个有利特性并且作为努力克服明显技术障碍的结果的VEGF微型捕捉体分子(例如，REGN7483^F)及其组合物。微型捕捉体在化学成分确知培养基(chemically defined media，CDM)中的表达导致明显的棕黄色。尽管在CDM中表达是表达蛋白质的优选现代方法(例如，CDM提供超过基于水解物的培养基更大的重现性/一致性)，向眼部(视觉器官)添加有色材料可能不利地影响视力。通过分析并且开发优化的纯化工艺和宿主细胞生长条件，确定了可能的有颜色原因(2-氧代-组氨酸修饰)并且已经显著减少最终的纯化产品中其存在。另外，证据表明，本发明的微型捕捉体具有比阿柏西普(Eylea)短的全身性半寿期，这可能避免与玻璃体内施用相关的某些不良事件。不清楚这种影响的起因，但它可能归因于微型捕捉体上比阿柏西普上甘露糖含量更高。

因此，本发明涵盖能够结合血管内皮细胞生长因子(VEGF)的融合多肽以及其治疗用方法。

多肽(例如，VEGFR Ig结构域)的“变体”指一种多肽，当通过BLAST算法进行比较时，所述多肽包含与参考的氨基酸序列(例如，SEQ ID NOs：1-5或10-13中任一者)至少约70-99.9％(例如，70、72、74、75、76、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9％)同一或相似的氨基酸序列；其中选择该BLAST算法的参数以给出相应的参考序列的整个长度范围内相应序列之间的最大匹配(例如，期望阈值：10；字长：3；查询范围内的最大匹配：0；BLOSUM 62矩阵；缺口代价：存在11、延伸1；条件性组合性评分矩阵修正)。

多肽(例如，VEGFRIg结构域)的“变体”还可以指一种多肽，所述多肽包含参考的氨基酸序列，但是相对于SEQ ID NOs：1-5、10-13、26-30、32、33或36中任一者存在一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)突变，例如，错义突变(例如，保守性置换)、无义突变、缺失或插入。

本发明包括包含多肽的VEGF微型捕捉体，所述多肽是本文具体描述其氨基酸序列的那些变体。

以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS：Altschul等人，(2005)FEBS J.272(20)：5101-5109；Altschul，S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang，J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656；Wootton，J.C.等人，(1993)Comput.Chem.17：149-163；Hancock，J.M.，(1994)Comput.Appl.Biosci.10：67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS(比对结果评定体系)：Dayhoff，M.O.等人，″A model ofevolutionary change in proteins(蛋白质演进变变化模型).″引自Atlas of ProteinSequence and Structure，(1978)第5卷，增刊3.M.O.Dayhoff(编著)，第345-352页，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.；Schwartz，R.M.等人，″Matrices fordetecting distant relationships(用于检测远缘关系的矩阵).″引自Atlas ofProteinSequence and Structure，(1978)第5卷，增刊3.″M.O.Dayhoff(编著)，第353-358卷，Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.；Altschul，S.F.，(1991)J.Mol.Biol.219：555-565；States，D.J.等人，(1991)Methods 3：66-70；Henikoff，S.等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919；Altschul，S.F.等人，(1993)J.Mol.Evol.36：290-300；ALIGNMENT STATISTICS(比对统计学)：Karlin，S.等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268；Karlin，S.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877；Dembo，A.等人，(1994)Ann.Prob.22：2022-2039；和Altschul，S.F.″Evaluating the statistical significance of multiple distinctlocal alignments(评价多个不同局部比对结果的统计显著性).″引自Theoretical andComputational Methods in Genome Research(基因组研究理论方法与计算方法)(S.Suhai编著)，(1997)第1-14页，Plenum，N.Y.。

已知VEGF、VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的序列和结构域结构。在本发明的一个实施方案中，VEGF氨基酸序列示于Genbank登录号AH001553下；VEGFR1氨基酸序列示于UniProt登录号P17948下；VEGFR2氨基酸序列示于UniProt登录号P35968下；和/或VEGFR3氨基酸序列示于UniProt登录号P35916。Holash等人，VEGF-Trap：a VEGF blocker with potentantitumor efiects(VEGF捕捉体：具有强力抗肿瘤作用的VEGF阻断剂)，Proc Natl AcadSci USA.2002Aug20；99(17)：11393-8。

VEGF微型捕捉.体

本发明提供能够结合血管内皮生长因子(VEGF)的VEGF微型捕捉体，所述VEGF微型捕捉体治疗性地用于治疗或预防通过抑制VEGF(例如，VEGF₁₁₀、VEGF₁₂₁或VEGF₁₆₅)可治疗或可预防的病状和疾病如生血管眼病和癌症——术语“VEGF”在“VEGF微型捕捉体”等的语境下表示结合VEGF和具有所述用途的微型捕捉体。图11给出了本发明VEGF微型捕捉体的概述。

VEGF微型捕捉体是与VEGF结合的分子或分子复合体，其具有一组或多组VEGF受体Ig样结构域(或其变体)(例如，VEGFR1 Ig结构域2和/或VEGFR2 Ig结构域3和/或4)和截短或不存在的多聚化组分(MC)，例如，其中MC是截短的免疫球蛋白Fc。所述截短可以因蛋白酶解消化VEGF捕捉体(例如，阿柏西普或康柏西普)或直接表达MC序列缩短的所得多肽链所致。参见图1中描述的分子结构。图1描述了VEGF微型捕捉体分子，其是用化脓性链球菌IdeS对阿柏西普进行蛋白酶解的产物。描述了Ig铰链结构域片段由二个平行二硫键连接的同型二聚体分子。指示了VEGFR1结构域、VEGFR2结构域和铰链结构域片段(MC)。以“//”指示阿柏西普中IdeS切割作用发生的点。还指示了从阿柏西普切下的Fc片段。如果单个的这种嵌合多肽(未二聚化)具有VEGF结合活性，它也可以是VEGF微型捕捉体。术语“VEGF微型捕捉体”包括单个多肽，所述单个多肽包含第一组中的一个或多个VEGF受体Ig结构域(或其变体)，缺少MC，但是借助接头(例如，肽接头)融合于其他一组或多组中的一个或多个VEGF受体Ig结构域(或其变体)。本发明VEGF微型捕捉体中的VEGF结合结构域可以相同或彼此不同。参见WO2005/00895。

例如，在本发明的一个实施方案中，未截短的免疫球蛋白Fc结构域包含以下氨基酸序列或其氨基酸1-226：

(SEQ ID NO：21，其中X₁是L或P并且X₂是A或T)

抑制VEGF例如包括拮抗VEGF与VEGF受体结合，例如，通过与VEGF受体竞争VEGF(例如，VEGF₁₁₀、VEGF₁₂₁和/或VEGF₁₆₅)结合来拮抗。这种抑制可以导致抑制VEGF介导的VEGFR激活，例如，抑制细胞系(例如，HEK293)中的萤光素酶表达，其中所述细胞系在细胞表面上表达具有与IL18Rα和/或IL18Rβ胞包内结构域融合的VEGFR胞外结构域的嵌合VEGF受体(例如，其同型二聚体)并且还具有NFkB-萤光素酶-IRES-eGFP报道基因，例如，如本文中所述的细胞系HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ。

本发明的VEGF微型捕捉体的VEGF受体Ig结构域组分可以包含：

(i)VEGFR1(Flt1)(R1D2)的一个或多个免疫球蛋白样(Ig)结构域2，

(ii)VEGFR2(Flk1或KDR)(Flk1D3)(R2D3)的一个或多个lg结构域3，

(iii)VEGFR2(Flk1或KDR)(Flk1D4)(R2D4)的一个或多个lg结构域4和/或

(iv)VEGFR3(Flt4)(Flt1D3或R3D3)的一个或多个Ig结构域3。

VEGF受体的免疫球蛋白样结构域在本文中可以称为VEGFR Ig结构域。本文中提到的VEGFRIg结构域，例如，R1D2(其可以在本文中称为VEGFR1(d2))、R2D3(其可以在本文中称为VEGFR2(d3))、R2D4(其可以在本文中称为VEGFR2(d4))和R3D3(其可以在本文中称为VEGFR3(d3))，意在不仅涵盖完整野生型Ig结构域，还涵盖其变体，所述变体基本上保留野生型结构域的功能特征，例如，保留在并入VEGF微型捕捉体时形成有功能的VEGF结合结构域的能力。本领域技术人员将显而易见的是，可以获得以上Ig结构域的众多变体，它们将保留与野生型结构域基本上相同的功能特征。

本发明提供包含以下结构域结构的VEGF微型捕捉体多肽：

·((R1D2)-(R2D3))_a-接头-((R1D2)-(R2D3))_b；

·((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_c-接头-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_d；

·((R1D2)-(R2D3))_e-(MC)_g；或

·((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_f-(MC)_g；

其中，

-R1D2是VEGF受体1(VEGFR1)Ig结构域2(D2)；

-R2D3是VEGFR2 Ig结构域3；

-R2D4是VEGFR2 Ig结构域4；

-MC是多聚化组分(例如，IgG1)；

-接头是包含约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸的肽，例如，(GGGS)_g；

并且，

独立地.

a＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；

b＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；

c＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；

d＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；

e＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；

f＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；和

g＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。

在本发明的一个实施方案中，R1D2包含以下氨基酸序列：

(SEQ ID NO：1)。在本发明的一个实施方案中，R1D2缺少N末端SDT。

在本发明的一个实施方案中，R1D2包含以下氨基酸序列：

(SEQ ID NO：2)。

在本发明的一个实施方案中，R2D3包含以下氨基酸序列：

(SEQ ID NO：3)。

在本发明的一个实施方案中，R2D4包含以下氨基酸序列：

(SEQ ID NO：4)。

在本发明的一个实施方案中，R2D4包含以下氨基酸序列：

(SEQ ID NO：5)。

在本发明的一个实施方案中，VEGF微型捕捉体中所用的多聚化组分(MC)是能够与另一个多聚化组分结合的肽，例如，截短的Fc免疫球蛋白(例如，IgG1)。在本发明的一个实施方案中，MC是包含免疫球蛋白铰链区或其片段的截短的Fc免疫球蛋白。例如，在本发明的一个实施方案中，MC是包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)半胱氨酸的肽，所述半胱氨酸能够与另一个MC(例如，DKTHTCPPC(SEQ ID NO：22)、DKTHTCPPCPPC(SEQ ID NO：23)、DKTHTCPPCPPCPPC(SEQ ID NO：24)、DKTHTC(PPC)_h(SEQ ID NO：25)(其中h是1、2、3、4或5)、DKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：6)、DKTHTCPLCPAPELLG(SEQ ID NO：7)、DKTHTC(SEQ ID NO：8)或DKTHTCPLCPAP(SEQ ID NO：9))的半胱氨酸形成一个或多个半胱氨酸桥。

本发明还提供包含以下结构域结构的VEGF微型捕捉体多肽：

(i)((R1D2)-(R2D3))_a-(MC)_b；或

(ii)((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_c-(MC)_d；

所述多肽可以(例如，通过每个多肽的MC之间结合)与第二个所述多肽同型二聚化，

其中

(i)所述诸R1D2结构域配位(coordinate)；

(ii)所述诸R2D3结构域配位；和/或

(iii)所述诸R2D4结构域配位，

以形成二聚体VEGF结合结构域。

在本发明的一个实施方案中，VEGF微型捕捉体多肽包含以下氨基酸序列或由其组成：

(SEQ ID NO：12；MC加下划线；REGN7483(REGN7483^F/REGN7483^R))；

(SEQ ID NO：13；MC加下划线)；

(SEQ ID NO：26；MC加下划线(REGN112))；

(SEQ ID NO：27；MC加下划线；REGN7850)；

(SEQ ID NO：28；MC加下划线；REGN7851)；

或

(SEQ ID NO：29；MC加下划线；其中x是1、2、3、4或5)。如所讨论的那样，这类多肽可以多聚化(例如，二聚化(例如，同型二聚化))，其中多肽之间的结合由多聚化组分介导。这类多聚体和单个多肽是本发明的部分。

在本发明的一个实施方案中，在REGN7483^F或R、REGN7850或REGN7851中，N36、N68、N123和/或N196被N-糖基化。在本发明的一个实施方案中，在REGN7483^F或R、REGN7850或REGN7851中，在(i)C30和C79和/或(ii)C124和C185之间存在链内二硫桥。

在本发明的一个实施方案中，在REGN7483^F或R、REGN7850或REGN7851、THTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：12的氨基酸208-221)的铰链区中，链间二硫桥(在每个C211之间和每个C214之间)平行或(在C211和C214之间)交叉。在本发明的一个实施方案中，大部分二硫桥平行。

在本发明的一个实施方案中，在REGN7483^F或R、REGN7850或REGN7851中，C末端甘氨酸是缺失的。

在本发明的一个实施方案中，本发明单体性VEGF微型捕捉体的VEGFR1 Ig样结构域2在N36和/或N68具有N连接的糖基化；和/或在C30和C79之间具有链内二硫桥；和/或，本发明单体性VEGF微型捕捉体的VEGFR2 Ig样结构域3在N123和/或N196具有N连接的糖基化；和/或在C124和C185之间具有链内二硫桥。

在本发明的一个实施方案中，VEGF微型捕捉体包含以下结构：

·(R1D2)₁-(R2D3)₁-(G₄S)₃-(R1D2)₁-(R2D3)₁；

·(R1D2)₁-(R2D3)₁-(G₄S)₆-(R1D2)₁-(R2D3)₁；

·(R1D2)₁-(R2D3)₁-(G₄S)₉-(R1D2)₁-(R2D3)₁；或

·(R1D2)₁-(R2D3)₁-(G₄S)₁₂-(R1D2)₁-(R2D3)₁.

G₄S is-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-

在本发明的一个实施方案中，VEGF微型捕捉体包含以下氨基酸序列：(i)

(SEQ ID NO：10；接头加下划线(REGN7080))；

(iii)

(SEQ ID NO：11；接头加下划线(REGN6824))；

(iv)

(SEQ ID NO：32；接头加下划线(REGN7991))

(v)

(SEQID NO：33；接头加下划线(REGN7992))；

(vi)

(SEQ ID NO：30；其中x是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)；或；

(vii)

(SEQ ID NO：36；REGN7711).

如本文中讨论，这些多肽可以包含其中VEGFRIg样结构域缔合以形成链内VEGF结合结构域的二级结构(参见例如图2)。在本发明的一个实施方案中，两个或更多个的这类多肽多聚化(例如，二聚化(例如，同型二聚化))，其中每条链的VEGFR Ig结构域与另一条链的Ig样结构域缔合以形成链间VEGF结合结构域。

在本发明的某个实施方案中，本发明的VEGF微型捕捉体缺少对VEGF微型捕捉体多肽中氨基酸残基的任何显著修饰(例如，定向化学修饰如聚乙二醇化或碘乙酰胺化，例如在N末端和/或C末端)。

在本发明的一个实施方案中，多肽包含这样的二级结构，其中，在单个嵌合多肽(例如，((R1D2)-(R2D3))_a-接头-((R1D2)-(R2D3))_b；或((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_c-接头-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_d中或在分离嵌合多肽(例如，同型二聚体)中的VEGFR Ig样结构域配位以形成VEGF结合结构域。例如，其中

(i)所述诸R1D2结构域配位；

(ii)所述诸R2D3结构域配位；和/或

(iii)所述诸R2D4结构域配位，

以形成VEGF结合结构域。图2是描述这种结构域配位的单链VEGF微型捕捉体的说明。指示了VEGFR1结构域、VEGFR2结构域和接头结构域。显示的接头是(G₄S)₆。本发明包括具有(G₄S)₃；(G₄S)₉或(G4S)₁₂接头的单链VEGF微型捕捉体。

另外，本发明还提供一种复合体，其包含与VEGF多肽或其片段或其融合物复合的如本文中讨论的VEGF微型捕捉体。在本发明的一个实施方案中，VEGF(例如，VEGF₁₆₅)同型二聚化和/或VEGF微型捕捉体按2∶2复合体(2个VEGF：2个微型捕捉体)同型二聚化。复合体可以包括与同型二聚化的VEGF微型捕捉体多肽结合的同型二聚化VEGF分子。在本发明的一个实施方案中，复合体在体外(例如，固定至固态基材)或在受试者体内。本发明还包括VEGF二聚体(例如，VEGF₁₆₅)与VEGF微型捕捉体(例如，REGN6824、REGN7080或REGN7483^F)以如本文表中3-3所述的摩尔比复合的复合体的组合物。

IdeS及其变体

本发明包括已经通过用化脓性链球菌IdeS(FabRICATOR)及其变体对阿柏西普进行蛋白酶解消化来产生的VEGF微型捕捉体和其组合物。FabRICATOR从Genovis，Inc.；Cambridge，MA；瑞典Lund可商业获得。

在一个实施方案中，IdeS多肽包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列相对于如SEQID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52组成的群组中所述的全长分离的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。在一个方面，分离的氨基酸序列相对于全长分离的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性。在另一个方面，分离的氨基酸序列相对于全长分离的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性。在另一个方面，分离的氨基酸序列相对于全长分离的氨基酸序列具有约100％序列同一性。在一个方面，多肽可以能够将靶蛋白切割成片段。在一个具体方面，靶蛋白是IgG。在另一个具体方面，靶蛋白是融合蛋白。在又另一个特定的方面，片段可以包含Fab片段和/或Fc片段。

在一个实施方案中，IdeS氨基酸序列包含亲本氨基酸序列，所述亲本氨基酸序列由SEQ ID NO：37定义，但使得位置87、130、182和/或274处的天冬酰胺残基突变成除天冬酰胺之外的氨基酸。在一个方面，突变可以赋予与亲本氨基酸序列相比，在碱性pH值时升高的化学稳定性。在另一个方面，突变可以赋予与亲本氨基酸序列相比，在碱性pH值时化学稳定性升高50％。在一个方面，氨基酸可以选自天冬氨酸、亮氨酸和精氨酸。在一个具体方面，位置87处的天冬酰胺残基突变成天冬氨酸残基。在另一个具体方面，位置130处的天冬酰胺残基突变成突变成精氨酸残基。在另外又一个具体方面，位置182处的天冬酰胺残基突变成亮氨酸残基。在另一个具体方面，位置274处的天冬酰胺残基突变成天冬氨酸残基。在另外又一个具体方面，位置87和130处的天冬酰胺残基突变。在另外又一个具体方面，位置87和182处的天冬酰胺残基突变。在另外又一个具体方面，位置87和274处的天冬酰胺残基突变。在另外又一个具体方面，位置130和182处的天冬酰胺残基突变。在另外又一个具体方面，位置130和274处的天冬酰胺残基突变。在另外又一个具体方面，位置182和274处的天冬酰胺残基突变。在另外又一个具体方面，位置87、130和182突处的天冬酰胺残基变。在另外又一个具体方面，位置87、182和274处的天冬酰胺残基突变。在另外又一个具体方面，位置130、182和274处的天冬酰胺残基突变。在另一个具体方面，位置87、130、182和274处的天冬酰胺残基突变。

阿柏西普可以用已经固定化至固相支持物(例如，色谱珠)的IdeS切割。例如，可以将在缓冲水溶液(在切割缓冲液中)中包含阿柏西普的样品施加至固定化的IdeS，例如，施加在色谱柱中。可以将色谱柱温育，例如，30分钟，例如，在约18℃温育。随后可以用切割缓冲液洗涤色谱柱。在切割后，可以施加消化液和洗涤液至蛋白A柱以捕获切割的Fc副产物，其中微型捕捉体产物滞留在流通级分中。在本发明的一个实施方案中，切割缓冲液和/或蛋白A柱平衡液与洗涤液处于pH 7，例如，40mM Tris，54mM乙酸盐，pH 7.0±0.1。

SEQ ID NO：37

SEQ ID NO：38

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蛋白质纯化

构思包含通过一种方法产生的目的蛋白(例如，VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483^F或REGN7483^R)的组合物属于本发明的范围内，所述方法包括不同纯化技术的组合，包括但不限于单独或组合的亲和色谱、离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱。在一个实施方案中，该方法包括纯化经酶促切割以产生REGN7483^F的阿柏西普。这些色谱步骤根据具体分离形式，基于蛋白质的电荷、疏水度或大小或其任意组合，分离样品的蛋白质混合物。数种不同的色谱树脂可用于本文暗指的每种技术，从而允许针对所涉及的具体蛋白质准确订制纯化方案。每种分离方法导致蛋白质按不同速率穿过柱子，以实现随着蛋白质进一步穿过色谱柱或选择性附着至分离介质而增长的物理分离。随后将蛋白质(i)使用适当的洗脱缓冲液差异性洗脱和/或(ii)从所用柱获得的流通级分收集，任选地，从采用适当的平衡缓冲液洗涤柱收集。在一些情况下，当杂质偏好地附着于色谱柱并且目的蛋白更少附着，即，目的蛋白不吸附于特定柱的固相并且因此流过色谱柱时，目的蛋白与杂质(蛋白质变体)分离。在一些情况下，当杂质不能吸附于柱上并且因此穿柱流过时，它们与目的蛋白分离。

纯化工艺可以始于已经使用本文所述的上游生产工艺和/或通过本领域常规的备选生产工艺产生重组蛋白后的分离步骤。一旦已经获得包含目的蛋白(例如，VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483))的澄清的溶液或混合物，则分离目的蛋白与工艺相关杂质(如细胞产生的其他蛋白质(如HCP)，以及产品相关物质，如酸性变体或碱性变体)。在某些非限制性实施方案中，使用CEX、AEX和/或MM(混合模式)色谱进行这种分离。在某些实施方案中，可以使用一项或多项不同纯化技术的组合，所述纯化技术包括亲和色谱、离子交换色谱、混合模式色谱和/或疏水相互作用色谱。例如基于组分的电荷、疏水度和/或大小，这类额外的纯化步骤分离样品基质内部诸组分的混合物。众多色谱树脂可商用于本文中提到的每项色谱技术，从而允许针对所涉及的具体蛋白质准确订制纯化方案。每种分离方法允许蛋白质以不同速率穿过柱子，实现随着蛋白质进一步穿过色谱柱或或选择性地吸附至分离树脂(或基质)而增长的物理分离。随后使用适宜的缓冲液差异性洗脱蛋白质。在一些情况下，当其他这些组分特异性吸附至柱的树脂并且目的蛋白不吸附时，目的蛋白与样品基质的组分分离，而在其他情况下，目的蛋白将吸附至柱的树脂上，同时在洗涤循环期间从色谱柱逐出其他组分。

初步回收和病毒灭活

在某些实施方案中，本文公开的纯化操作的起始步骤包括澄清和从样品基质初步回收VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483)。在某些实施方案中，初步回收将包括一个或多个将目的蛋白(例如，VEGF微型捕捉体(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483))与宿主细胞和伴随性细胞残片分离的离心步骤。可以在例如但不限于7,000xg至大约12,750xg进行样品离心。在大规模纯化情况下，这种离心可以用为了例如在所得上清液中实现浊度水平150NTU所设定流速在线进行。随后可以收集这种上清液供进一步纯化，或通过一个或多个深层滤器进行串联(in-line)过滤以进一步使样品澄清。

在某些示例性实施方案中，初步回收可以包括利用一个或多个深层过滤步骤使样品基质澄清，并且因而，辅助纯化本发明中的目的蛋白(例如，REGN7850、REGN7851、REGN7483)。在其他实施方案中，初步回收可以包括离心后利用一个或多个深层过滤步骤以进一步使样品基质澄清。可以在本发明语境下使用的深层滤器的非限制性例包括Millistak+X0HC、F0HC、D0HC、A1HC、B1HC深层滤器(EMD Millipore)、3M^TM30/60ZA型、60/90ZA、VR05、VR07、脱脂深层滤器(3M公司)。0.2μιη滤器如Sartorius的0.45/0.2μιη、Sartopore^TM双层或Millipore′s Express SHR或SHC滤芯一般接续深层滤器。也可以使用本领域技术人员熟知的其他滤器。

在某些实施方案中，初步回收过程也可以是减少或灭活样品基质中可能存在的病毒的时刻。例如，可以在纯化的初步回收阶段期间使用多种减少/灭活病毒的方法中任一者或多者，所述方法包括热灭活(巴斯德消毒)、pH灭活、缓冲液/去垢剂处理、UV和γ射线照射和添加某些化学灭活剂如β-丙内酯或例如，如美国专利号4,534,972中所述的铜菲咯啉。在本发明的某些示例性实施方案中，使样品基质在初步回收阶段期间暴露于去垢剂以灭活病毒。在其他实施方案中，样品基质可以在初步回收阶段期间暴露于低pH以灭活。

在采用病毒减少/灭活的那些实施方案中，可以针对进一步的纯化步骤，根据需要调节样品混合物。例如，在低pH灭活病毒后，在继续纯化工艺之前一般调节样品混合物的pH至更中性的pH，例如，从约4.5调节至约8.5。另外，混合物可以用注射用水(WFI)稀释以获得想要的电导率。

作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中所讨论条件下的初步回收、过滤和/或病毒灭活。作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中讨论的条件下对稍后用IdeS蛋白酶切割以产生VEGF微型捕捉体的VEGF捕捉体(如阿柏西普)进行初步回收、过滤和/或病毒灭活。

亲和色谱

在某些示例性实施方案中，使样品基质经历亲和色谱以纯化目的蛋白可能有利。在某些实施方案中，色谱材料能够利用蛋白质的特定部分与目的蛋白选择性或特异性结合。这种色谱材料的非限制性实例包括：蛋白A与蛋白G。另外，色谱材料例如包括能够与目的蛋白结合的蛋白质或其部分。在本发明的一个实施方案中，通过蛋白A或蛋白G色谱纯化可以用IdeS做酶促切割的阿柏西普。在本发明的一个实施方案中，通过蛋白A或蛋白G色谱从包含微型捕捉体的样品移除借助IdeS切割从阿柏西普移除的Fc片段。

在具体的实施方案中，亲和色谱可以涉及使样品基质经历包括合适蛋白A树脂的柱子作用。在某些方面，若某杂质分子拥有Fc部分，则蛋白A树脂可用于通过与杂质分子的该区域特异性相互作用，亲和纯化并且分离多种VEGF微型捕捉体同种型(其中对蛋白A缺少亲和力的微型捕捉体处于流通级分中)。蛋白A是主要通过哺乳动物IgG的Fc区与哺乳动物IgG结合的细菌细胞壁蛋白质。在其天然状态下，蛋白A具有五个IgG结合结构域以及功能未知的其他结构域。在具体实施方案中，亲和色谱步骤涉及使初步回收样品经受包含抗目的蛋白抗体的柱作用。

存在蛋白A树脂的几个商业来源。一个合适的树脂是来自GE Healthcare的MabSelecff^M。合适的树脂包括但不限于MabSelect SuRe^TM、MabSelect SuRe LX、MabSelect、MabSelect Xtra、来自GE Healthcare的重组蛋白A琼脂糖凝胶、来自EMDMillipore的ProSep HC、ProSep Ultra和ProSep Ultra Plus、来自LifeTechnologies的MapCapture。装填有MabSelect^TM的合适柱子的非限制性实例是约1.0cm直径x约21.6cm长的柱子(17mL床体积)。这种尺寸的柱子可以用于小规模纯化并且可以堪比用于放大规模的其他柱子。例如，床体积约6.6L的20cmx21cm柱子可以用于更大规模的纯化。合适的柱子可以包含树脂如MabSelect^TM SuRe或类似树脂。

可以将亲和柱在加载样品之前用合适的缓冲液平衡。在加载色谱柱后，使用合适的缓冲液，可以将柱洗涤一次或多次。一旦加载，则可以使用适当的洗脱缓冲液洗脱色谱柱。例如，甘氨酸-HCL、乙酸或柠檬酸可以用作洗脱缓冲液。可以使用本领域技术人员熟知的技术如UV检测器监测洗脱物。可以收集目的洗脱物级分并且随后制备供进一步加工。

在一个方面，洗脱物可以经历病毒灭活，例如，借助洗涤剂或低pH灭活。可以选择合适的去垢剂浓度或pH(和时间)以获得想要的病毒灭活结果。在病毒灭活后，通常对洗脱物调节pH和/或电导率用于后续的纯化步骤。

洗脱物可以经受深层滤器过滤，旨在从目的蛋白移除浊度杂质和/或各种杂质，之后进行额外的色谱精制步骤。深层滤器的实例包括但不限于Millistak+XOHC、FOHC、DOHC、AIHC、X0SP和BIHC Pod滤器(EMD Millipore)或Zeta Plus30ZA/60ZA、60ZA/90ZA、脱脂VR07和VR05滤器(3M)。Emphaze AEX Hybrid Purifier多机制滤器也可以用来澄清洗脱物。可以需要调整洗脱汇集物至恰当的pH和电导率，旨在从深层过滤步骤获得想要的杂质移除率和产物回收率。本发明不限于使用色谱法捕获目的蛋白。

其他亲和纯化树脂包含能够与VEGF微型捕捉体结合的捕获部分，如VEGF、VEGF₁₆₅、抗VEGFR抗体或其抗原结合片段、抗VEGFR1抗体或其抗原结合片段或抗VEGFR2抗体或其抗原结合片段。

作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中所讨论条件下的亲和纯化(例如，以流通模式(flow-through mode)进行)。VEGF微型捕捉体和组合物包含VEGF微型捕捉体作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中讨论的条件下对稍后用IdeS蛋白酶切割以产生VEGF微型捕捉体的VEGF捕捉体(如阿柏西普)进行亲和纯化(例如，以结合和洗脱模式进行)。

在本发明的一个实施方案中，将亲和柱用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(例如，Dulbecco磷酸盐缓冲盐水)洗涤。

阴离子交换色谱

在某些实施方案中，通过使样品基质经历至少一个阴离子交换分离步骤，产生微型捕捉体。在一个方面，阴离子交换步骤将在上述的亲和色谱(例如，蛋白A亲和色谱)之后发生。在某些其他实施方案中，阴离子交换步骤将在上述的亲和色谱(例如，蛋白A亲和色谱)之前发生。在某些其他实施方案中，阴离子交换步骤将在上述的亲和色谱(例如，蛋白A亲和色谱)之前和之后都发生。

相对于阳离子交换材料，如本文详细讨论的那些阳离子交换材料，基于合适条件下目的蛋白的局部电荷使用阴离子交换材料。阴离子交换色谱可以与其他色谱方法组合使用。

在进行分离时，可以通过使用多项技术中的任一项，例如，使用分批纯化技术或色谱技术，使初始的蛋白质组合物(样品基质)与阴离子交换材料接触。

例如，在分批纯化(batch purification)的背景下，将阴离子交换材料在想要的起始缓冲液中准备或针对其平衡。一旦准备或平衡好，则获得阴离子交换材料浆液。使目的蛋白(例如，VEGF微型捕捉体)溶液与该浆液接触，以允许蛋白质吸附至阴离子交换材料。使包含不与AEX材料结合的酸性种类的溶液与浆液分离，例如，通过允许浆液沉降并移除上清液。可以使浆液经受一个或多个洗涤步骤和/或洗脱步骤。

在色谱分离的背景下，色谱柱用来容纳色谱载体材料(chromatographic supportmaterial)(树脂或固相)。将包含目的蛋白的样品基质加载于特定的分离用色谱柱上。随后可以使色谱柱经历一个或多个使用合适缓冲液的洗涤步骤。尚未吸附到树脂上的样品培养基组分可能穿柱流过。可以使用适宜的缓冲液，差异性洗脱已经吸附至树脂的组分。

在某些实施方案中，可以在使用与加载条件相似的条件的AEX色谱背景下或备选地通过按逐级或线性梯度方式降低pH和/或增加洗液的离子强度/电导率进行洗涤步骤。在某些示例性实施方案中，在加载缓冲液和洗涤缓冲液二者中使用的水性盐溶液具有在目的蛋白等电点(pI)处或其附近的pH。在某些示例性实施方案中，pH高于或低于目的蛋白的pI约0至2单位。在某些示例性实施方案中，它将处于高于或低于0至0.5单位的范围内。在某些示例性实施方案中，它将在目的蛋白的pI处。

在本发明的一个实施方案中，在施加含有VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)的样品并且VEGF微型捕捉体滞留在AEX流通级分中之后，用(i)pH8.40和2.00mS/cm洗涤缓冲液，(ii)pH 8.00和2.50mS/cm洗涤缓冲液或(iii)pH7.80和4.00mS/cm洗涤缓冲液洗涤AEX色谱柱。洗涤缓冲液在穿过色谱柱后保留。在本发明的一个实施方案中，洗涤缓冲液含有Tris(例如，50mM)和任选地NaCl。在本发明的一个实施方案中，将AEX柱用NaCl(例如，2M NaCl)预平衡。在本发明的一个实施方案中，将AEX柱用洗涤缓冲液平衡。

在某些非限制性实施方案中，阴离子剂选自乙酸盐、氯化物、甲酸盐及其组合。在某些非限制性实施方案中，阳离子剂选自Tris、精氨酸、钠及其组合。在一个实施方案中，缓冲溶液是Tris/甲酸酯缓冲液。在另一个示例性实施方案中，缓冲剂选自吡啶、哌嗪、L-组氨酸、双-tris、双-Tris丙烷、咪唑、N-乙基吗啉、TEA(三乙醇胺)、Tris、吗啉、N-甲基二乙醇胺、AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、二乙醇胺、乙醇胺、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、哌嗪、1，3-二氨基丙烷和哌啶缓冲液。

装填的阴离子交换色谱柱、阴离子交换膜装置、阴离子交换一体装置(monolithicdevice)或深层滤器介质可以按其中产物显示与色谱材料结合并且使用与上样缓冲液相同或基本上相似的缓冲液仍可以从柱洗涤下来的结合和洗脱模式、流通模式或混合模式运行。在结合和洗脱模式下，在其中某些蛋白质将在基于树脂的基质上固定的条件下用具有适当离子强度和pH的缓冲液调整柱或膜装置。例如，在补料加载期间，目的蛋白将因静电吸引而吸附至树脂。用平衡缓冲液或另一种具有不同pH和/或电导率的缓冲液洗涤柱或膜装置后，通过升高洗脱缓冲液的离子强度(即，电导率)来与溶质竞争阴离子交换基质的带电荷位点，实现产物回收。改变pH并因而改变溶质的电荷是实现洗脱溶质的另一个方式。电导率或pH变化可以是逐渐的(梯度洗脱)或逐步的(分步洗脱)。在流通模式下，在选定的pH和电导率如此操作柱或膜装置，从而目的蛋白不与树脂或膜结合，而酸性种类将滞留在柱上或如与目的蛋白相比，将具有不同的洗脱图。在这种混合策略情况下，酸性种类将以区别于目的蛋白的方式与色谱材料结合(或流通)，例如，与此同时目的蛋白和目的蛋白的某些聚集物和/或片段可能结合色谱材料，可以施加偏好地移除目的蛋白的洗液。柱随后在下次使用之前再生。

阴离子交换树脂的非限制性实例包括二乙基氨乙基(DEAE)、季氨乙基(QAE)和季胺(Q)基团。额外的非限制性实例包含：Poros 50PI和Poros 50HQ，它们是主链由交联型聚[苯乙烯-二乙烯基苯]组成的刚性聚合物珠；Capto Q Impres and Capto DEAE，它们是高流量琼脂糖珠；Toyopearl QAE-550、Toyopearl DEAE-650和Toyopearl GigaCap Q-650，它们是聚合物碱性珠；

EMD TMAE Hicap，它们是带触须离子交换剂的合成聚合物树脂；纳米Sartobind

PA，其为带伯胺配体的耐盐色谱膜；纳米Sartobind Q；其是强阴离子交换色谱膜；CUNO BioCap；其是由无机助滤剂、精制纤维素和离子交换树脂构成的ζ-plus深层滤器介质；和XOHC，其是是由无机助滤剂、纤维素和混合纤维素酯构成的深层滤器介质。

在某些实施方案中，调节包含目的蛋白的混合物的蛋白质载量至约50和500g/L之间或约75和350g/L之间，或约200和300g/L之间的总蛋白载量/柱。在某些示例性实施方案中，将加载蛋白质混合物的蛋白质浓度调节至加载至柱上的材料的以下蛋白质浓度：约0.5和50g/L之间、约1和20g/L之间或3和10g/L之间。在某些示例性实施方案中，将加载蛋白质混合物的蛋白质浓度调节至材料/柱的约37g/L蛋白质浓度。

在某些示例性实施方案中，可以添加多种添加物如聚乙二醇(PEG)、去垢剂、氨基酸、糖、离液剂，以增强分离性能，从而实现更好的回收或产物质量。

本发明的方法可以用来选择性移除、显著减少或基本上移除流通液中至少10％的蛋白质变体，而在离子交换的情况下富集洗脱级分或洗脱条中的蛋白质变体，因而产生蛋白质变体减少的或基本上不含蛋白质变体的蛋白质组合物。

在某些实施方案中，蛋白质变体可以包含如下的一个或多个残基修饰：一个或多个天冬酰胺脱酰胺；一个或多个天冬氨酸转化成天冬氨酸-甘氨酸和/或Asn-Gly；一个或多个甲硫氨酸氧化；一个或多个色氨酸转化成N-甲酰基犬尿氨酸；一个或多个色氨酸是单羟基色氨酸；一个或多个色氨酸是二羟基色氨酸；一个或多个色氨酸是三羟基色氨酸；一个或多个精氨酸转化成Arg 3-脱氧葡糖醛酮；C末端甘氨酸不存在；和/或存在一个或多个未糖基化的糖基化位点。

在某些示例性实施方案中，阿柏西普或VEGF微型捕捉体的蛋白质变体可以包含以下一者或多者：(i)氧化型组氨酸，例如，来自选自His86、His110、His145、His209、His95、His19和/或His203的组氨酸残基；(ii)氧化型色氨酸残基，例如，选自Trp58和/或Trp138处的色氨酸残基；(iii)氧化型酪氨酸残基，例如，Tyr64处；(iv)氧化型苯丙氨酸残基，例如，选自Phe44和/或Phe166；和/或(v)氧化型甲硫氨酸残基，例如，选自Met10、Met20、Met163和/或Met192。这类氧化型组氨酸已经与不利的棕黄色相关。

作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中所讨论条件下的AEX色谱(例如，以流通模式进行)。作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中讨论的条件下对稍后用IdeS蛋白酶切割以产生VEGF微型捕捉体的VEGF捕捉体(如阿柏西普)进行AEX色谱。

阳离子交换色谱

可以通过使组合物(例如，初步回收样品)经历至少一个阳离子交换(CEX)分离步骤，产生本发明的组合物。在某些示例性实施方案中，CEX步骤将在上述的AEX之前或之后发生。进一步，CEX步骤可以在整个纯化流程期间发生。

相对于阴离子交换材料，如本文详细讨论的那些阴离子交换材料，基于给定溶液中目的蛋白的局部电荷使用阳离子交换材料。因此，在使用阴离子交换步骤之前利用阳离子交换步骤或在使用阳离子交换步骤之前利用阴离子交换步骤属于本发明的范围。另外，仅利用阳离子交换步骤、仅利用阴离子交换步骤或利用这两者的任何系列组合(包括一个或两个离子交换步骤与本文所述的其他色谱分离技术的系列组合)均处于本发明的范围内。

在进行分离时，可以通过使用如上文有关蛋白A或AEX所述的多项技术中任一项，例如，使用分批纯化技术或色谱技术，使初始的蛋白质混合物与阳离子交换材料接触。

在某些示例性实施方案中，作为加载缓冲液和洗涤缓冲液二者使用的水性盐溶液低于目的蛋白等电点(pI)的pH。在某些示例性实施方案中，pH低于蛋白质pI约0至5单位。在某些示例性实施方案中，它处于低于1至2单位的范围内。在某些示例性实施方案中，它处于低于1至1.5单位的范围内。

在某些示例性实施方案中，升高或降低水性盐溶液中阴离子剂的浓度以实现在约3.5和10.5之间、或在约4和10之间、或在约4.5和9.5之间、或在约5和9之间、或在约5.5和8.5之间、或在约6和8之间、或在约6.5和7.5之间的pH。在某些示例性实施方案中，升高或降低水性盐溶液中阴离子剂的浓度以实现5、或5.5、或6、或6.5、或6.8、或7.5的pH。适合用于CEX方法中的缓冲体系包括但不限于Tris甲酸盐、Tris乙酸盐、硫酸铵、氯化钠和硫酸钠。

在某些示例性实施方案中，通过升高或降低阳离子剂的浓度调整水性盐溶液的电导率和pH。在某些示例性实施方案中，维持阳离子剂的浓度在约20mM至500mM、约50mM至350mM、约100至300mM或约100mM至200mM。在某些非限制性实施方案中，阳离子剂选自钠、Tris、三(羟甲基)氨基甲烷、铵、精氨酸及其组合。在某些非限制性实施方案中，阴离子剂选自甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、氯化物阴离子、硫酸盐、磷酸盐及其组合。

装填的阳离子交换色谱柱或阳离子交换膜装置可以按其中产物显示与色谱材料结合并且使用与上样缓冲液相同或基本上相似的缓冲液，仍可以从柱洗涤下来的结合和洗脱模式、流通模式或混合模式运行。上文概述这些模式的详情。

阳离子取代基包含羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸酯(P)和磺酸酯(S)。额外的阳离子材料包括但不限于：Capto SP ImpRes，其是高流量琼脂糖珠；CM HyperD级F；其是用官能化水凝胶包被和渗透的陶瓷珠，250-400个离子基团μeq/mL；Eshmuno S，其是离子容量为50-100μeq/mL的亲水性聚乙烯醚碱性基质；Nuvia C Prime，其是由高度交联的大孔亲水聚合物基质组成的疏水性阳离子交换基质，55-75με/

；Nuvia S，其具有UNO球碱性基质，90-150με/ιηI.离子基团；Poros HS；其是主链由交联型聚[苯乙烯-二乙烯基苯]组成的刚性聚合物珠；Poros XS；其是主链由交联型聚[苯乙烯二乙烯基-苯]组成的刚性聚合物珠；Toyo Pearl Giga Cap CM 650M，其是子容量为0.225meq/mL的聚合物碱性；Toyo Pearl Giga Cap S 650M，其是聚合物碱性珠；Toyo Pearl MXTRP，其是聚合物碱性珠。应当指出CEX色谱可以随本文所述的MM树脂一起使用。

在某些示例性实施方案中，调节包含目的蛋白(例如，VEGF微型捕捉体)的混合物的蛋白质载量至约5和150g/L之间、或约10和100g/L之间、约20和80g/L之间、约30和50g/L之间、或约40和50g/L之间的总蛋白载量/柱。在某些示例性实施方案中，将加载蛋白质混合物的蛋白质浓度调节至加载至柱上的材料的以下蛋白质浓度：约0.5和50g/L之间或约1和20g/L之间。

在某些示例性实施方案中，可以添加多种添加物如聚乙二醇、去垢剂、氨基酸、糖、离液剂，以增强分离性能，从而实现更好的回收或产物质量。

在某些实施方案中，本发明的方法可以用来选择性移除、显著减少或基本上移除样品基质中的全部变体，其中目的蛋白将基本上处于CEX步骤的流通液中，同时氧代-变体将基本上由色谱柱介质捕获。

在本发明的一个实施方案中，以pH 5.0(例如，20mM乙酸盐，pH 5.0)的上样缓冲液中含有VEGF微型捕捉体的样品加载CEX。在本发明的一个实施方案中，还用上样缓冲液洗涤柱子。可以用pH 7.0洗涤缓冲液，例如，10mM磷酸盐，pH 7.0进行洗涤。可以用(NH₄)₂SO₄(例如，在pH 8.5处)，例如，50mM Tris，62.5mM(NH₄)₂SO₄、pH 8.5，从CEX柱洗脱VEGF微型捕捉体。

作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中所讨论条件下的CEX色谱。作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中讨论的条件下对稍后用IdeS蛋白酶切割以产生VEGF微型捕捉体的VEGF捕捉体(如阿柏西普)进行CEX色谱。

混合模式色谱

混合模式(“MM”)色谱也可以用来制备本发明的组合物。MM色谱在本文也称为“多模式色谱”，是一种利用载体的色谱策略，所述载体包含能够提供与待结合物质的至少两种不同相互作用的配体。在某些示例性实施方案中，这些位点之一在配体和目的物质之间提供吸引型电荷-电荷相互作用并且另一个位点提供电子接纳体-供体相互作用和/或疏水性和/或亲水性相互作用。电子供体-接纳体相互作用包括多种相互作用，如氢键、π-π、阳离子-π、电荷转移、偶极-偶极、诱导偶极等。

在某些实施方案中，用于混合模式分离的树脂是Capto Adhere。Capto Adhere是具有多模式官能度的强阴离子交换。其碱性基质是显示不同官能团用于相互作用如离子相互作用、氢键和疏水相互作用的高度交联型琼脂糖配体(N-苄基-N-甲基乙醇胺)。在某些方面，用于混合模式分离的树脂选自PPA-HyperCel和HEA-HyperCel。碱性基质PPA-HyperCel和HEA-HyperCel是高孔隙度交联型纤维素。它们的配体分别是苯基丙基胺和己胺。苯基丙基胺和己胺为蛋白质分离提供不同的选择性和疏水性选项。额外的混合模式色谱载体(chromatographic support)包括但不限于Nuvia C Prime、Toyo Pearl MX Trp 650M和

HCX。在某些方面，混合模式色谱树脂由直接或借助间隔团偶联于有机或无机载体(有时叫做碱性基质)的配体组成。色谱载体可以处于粒子(如基本上球状的粒子)、整体成型块、滤器、膜、表面、毛细管等形式。在某些方面，色谱载体从天然聚合物如交联型糖材料、如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、konjac、角叉菜胶、吉兰糖胶、藻酸盐等制备。为了获得高吸附容量，载体可以多孔，并且配体随后偶联于外表面以及孔表面。可以根据标准方法制备这种天然聚合物型载体，如反相悬浮凝胶化(S Hjerten：Biochim BiophysActa79(2)，393-398(1964))。备选地，载体可以制备自合成性聚合物，如交联型合成性聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺类、丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类、乙烯酯类、乙烯基酰胺类等。可以根据标准方法产生这类合成性聚合物，参见例如″Styrenebased polymer supports developed by suspension polymerization(通过悬浮聚合形成的基于苯乙烯的聚合物载体)″(R Arshady：Chimica e L′Industria 70(9)，70-75(1988))。多孔天然或合成聚合物载体还从商业来源可获得，如瑞典乌普萨拉GEHealthcare。

在某些实施方案中，调节包含目的蛋白的混合物的蛋白质载量至约25和750g/L之间或约75和500g/L之间，或约100和300g/L之间的总蛋白载量/柱。在某些示例性实施方案中，将加载蛋白质混合物的蛋白质浓度调节至加载至柱上的材料的以下蛋白质浓度：约1和50g/L之间或约9和25g/L之间。

在某些实施方案中，可以添加多种添加物如聚乙二醇、去垢剂、氨基酸、糖、离液剂，以增强分离性能，从而实现更好的回收或产物质量。

本发明的方法可以用来选择性移除、显著减少或基本上移除流通级分中的全部PTM，如包含2-氧代-组氨酸的蛋白质，同时在已抽提级分(stripped fraction)中富集它。

也可以按连续色谱模式实施用于产生本发明组合物的方法。在这个模式下，使用至少两种柱(称为“第一”柱和“第二”柱)。在某些示例性实施方案中，可以如此执行这种连续色谱模式，从而随后可以将可能含有更高水平PTM(如包含2-氧代-组氨酸的蛋白质)的已洗脱级分和/或已抽提级分(稀释或未稀释情况下)依次或同时加载到第二柱上，从而两种柱的运行未串联，降低操作复杂度。

在一个实施方案中，连续模式用介质选项可以是许多色谱树脂之一具有侧挂疏水性和阴离子交换官能团、一体性介质、膜吸附性介质或深层过滤介质。

作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中所讨论条件下的MM色谱。作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中讨论的条件下对稍后用IdeS蛋白酶切割以产生VEGF微型捕捉体的VEGF捕捉体(如阿柏西普)进行MM色谱。

疏水相互作用色谱

也可以使用疏水相互作用色谱(HIC)制备本发明的组合物。

在进行分离时，使样品混合物与HIC材料接触，例如，使用分批纯化技术或使用柱或膜色谱。在HIC纯化之前，可能想要调节缓冲液的盐浓度，以实现所需蛋白质与树脂或膜结合。

在离子交换色谱依赖于目的蛋白的局部电荷来选择性分离的同时，疏水相互作用色谱利用蛋白质的疏水属性实现选择性分离。蛋白质上的疏水基团与树脂或膜的疏水基团相互作用。蛋白质越疏水，它将在合适的条件下与柱或膜相互作用越强。因此，HIC可以用来在合适条件下移除工艺相关杂质(例如，HCP)以及产物相关物质(例如，聚集物和片段)。

类似于离子交换色谱，HIC柱或HIC膜装置也可以按其中产物显示与色谱材料结合并且使用与上样缓冲液相同或基本上相似的缓冲液，仍可以从柱洗涤下来的洗脱模式、流通模式或混合模式运行(本文有关AEX纯化概述了这些模式的详情)。由于疏水相互作用在高离子强度时最强烈，故这种形式的分离便利地在盐洗脱步骤(如那些一般与离子交换色谱相连使用的步骤)后进行。备选地，可以将盐在这个步骤之前加入低盐水平进料流中。高盐浓度有利于VEGF微型捕捉体吸附至HIC柱，但是取决于目的蛋白的性质、盐类型和选择的具体HIC配体，实际浓度可能大范围变动。根据是否促进疏水相互作用(盐析效应)或破坏水的结构(离液效应)并且导致疏水相互作用削弱，各种离子可以按所谓的疏溶系列排列。阳离子就渐增的盐析效应而言如下排序：Ba²⁺；Ca²⁺；Mg²⁺；Li⁺；Cs⁺；Na⁺；K⁺；Rb⁺；NH₄ ⁺，而阴离子可以就渐增的离液效应而言如下排序：PO₄ ^3-；5O₄ ^2-；CH₃C0₃ ^-；CI^-；Br^-；N0₃ ^-；ClO₄ ^-；I^-；SCN^-。

总体上，使用HIC时，Na⁺、K⁺或NH₄ ⁺硫酸盐有效地促进配体-蛋白质相互作用。可以配入这样的盐，所述盐影响如依据以下关系给出的相互作用强度：(NH₄)₂5O₄＞Na₂SO₄＞NaCl＞NH₄C1＞NaBr＞NaSCN。从总体上看，可用介于约0.75M与约2M硫酸铵之间或约1与4M NaCl之间的盐浓度。

HIC基质正常情况下包含与疏水性配体(例如，烷基或芳基)偶联的碱性基质(例如，交联型琼脂糖或合成性共聚物材料)。合适的HIC介质包括经苯基官能化的琼脂糖树脂或膜(例如，来自GE Healthcare的苯基琼脂糖凝胶^TM或来自Sartorius的苯基膜)。许多HIC树脂可商业获得。实例包括但不限于Capto苯基、具有低度或高度取代的PhenylSepharose^TM6Fast Flow、高性能苯基琼脂糖凝胶^TM、高性能辛基琼脂糖凝胶T^M(GEHealthcare)；Fractogel^TM EMD丙基或Fractogel^TM EMD苯基(E.Merck，德国)；Macro-Prep^TM甲基或Macro-Prep^TM叔丁基柱(Bio-Rad，加利福尼亚州)；WP HI-丙基(C3)T^M(J.T.Baker，新泽西州)；和Toyopearl^TM醚、苯基或丁基(TosoHaas，PA)。

作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中所讨论条件下的HIC色谱。作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中讨论的条件下对稍后用IdeS蛋白酶切割以产生VEGF微型捕捉体的VEGF捕捉体(如阿柏西普)进行HIC色谱。

病毒过滤

病毒过滤是纯化工艺中专用的病毒减少步骤。这个步骤通常在色谱精制步骤后进行。可以通过使用合适的滤器实现病毒减少，所述滤器包括但不限于来自Asahi KaseiPharma的Planova20N^TM、50N或BioEx、来自EMD Millipore的Viresolve^TM滤器、来自Sartorius的ViroSart CPV或来自Pall公司的Ultipor DV20或DV50^TM滤器。本领域普通技术人员将显而易见使用合适的滤器以获得想要的过滤性能。

作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中所讨论条件下的病毒过滤。作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中讨论的条件下对稍后用IdeS蛋白酶切割以产生VEGF微型捕捉体的VEGF捕捉体(如阿柏西普)进行病毒过滤。

超滤/渗滤

本发明的某些实施方案利用超滤和渗滤进一步浓缩和配制目的蛋白，例如，微型捕捉体。以下文献中详述超滤：Microfiltration and Ultrafiltration：Principles andApplications(微过滤和超滤：原理与应用)，L.Zeman和A.Zydney(Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1996)；和Ultrafiltration Handbook(超滤手册)，Munir Cheryan(Technomic Publishing，1986；ISBN编号：87762-456-9)。一种过滤工艺是如名为″Pharmaceutical Process Filtration Catalogue(制药工艺过滤目录)″第177页-第202页的Millipore目录(Bedford，Mass.，1995/96)中所述的切线流过滤。通常认为超滤意指使用滤器孔径小于0.1μm的滤器过滤。通过使用具有这种小孔径的滤器，样品体积可以因样品缓冲液渗透穿过滤膜孔，而蛋白质(如VEGF微型捕捉体)滞留在膜表面上而减小。

本领域普通技术人员可以选择适宜的膜滤器装置用于UF/DF操作。适于本发明的膜盒实例包括但不限于具有EMD Millipore 10kD、30kD或50kD膜的Pellicon2盒或Pellicon3盒、来自GE Healthcare的Kvick 10kD、30kD或50kD膜盒和来自Pall公司的Centramate或Centrasette 10kD、30kD或50kD盒。

作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中所讨论条件下的UF和/或DF。作为纯化工艺之产物的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物是本发明的部分，所述纯化工艺包括例如在如本文中讨论的条件下对稍后用IdeS蛋白酶切割以产生VEGF微型捕捉体的VEGF捕捉体(如阿柏西普)进行UF和/或DF。

示例性纯化方案

在某些示例性实施方案中，可以通过依次使用pH降低、离心和过滤继续进行初步回收，以从生产生物反应器收获物移除细胞和细胞残片(包括HCP)。在某些实施方案中，本发明涉及使来自初步回收的样品混合物经历一个或多个AEX、CEX和/或MM纯化步骤。本发明的某些方面将包括其他纯化步骤。可以在离子交换色谱法之前、期间或之后进行的额外纯化操作的实例包括乙醇沉淀、等电聚焦、大小排阻色谱、反相HPLC、硅胶上色谱、肝素琼脂糖凝胶^TM上色谱、深度阴离子交换色谱和/或深度阳离子交换色谱、聚焦色谱、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱(例如，使用蛋白G或A、抗体、特异性底物、配体或抗原作为捕获试剂)。在某些方面，色谱柱温度可以独立地变动以改进任何具体纯化步骤的分离效率和/或产率。

在某些实施方案中，可以进一步分离未结合的流通级分和洗涤级分并且可以汇集提供产物目标纯度的级分组合。

在某些示例性实施方案中，可以通过内嵌(in-line)、在线(at-line)或离线(off-line)测量柱流出物中或已收集汇集物中或二者中的产品相关杂质/物质水平控制加载步骤和洗涤步骤，从而实现目标产品质量和/或产量。在某些实施方案中，可以通过用缓冲液或其他溶液内嵌或分批或连续稀释动态控制加载浓度，以实现改进分离效率和/或产率所需的分配。

这类纯化操作的实例如下。本发明包括作为工艺之产物的VEGF微型捕捉体，所述工艺包括这类纯化工艺中任一者的步骤。

(1)一种制造阿柏西普的方法可以包括

(a)在CDM中表达阿柏西普；

(b)使用可以包括亲和捕获色谱的第一色谱载体捕获阿柏西普；和

(c)使步骤(b)的阿柏西普的至少一部分与可以包括阴离子交换色谱的第二色谱载体接触。

步骤(c)还可以包括收集混合物的流通级分，所述流通级分含有不与第二色谱载体结合的阿柏西普。任选地，步骤(c)可以包括抽提(stripping)第二色谱载体并且收集抽提的级分。诸步骤可以通过例行方法体系结合本文提到的方法体系一起实施。

其他额外的示例性实施方案可以包括(d)：使步骤(c)的所述阿柏西普的至少一部分与第三色谱载体接触。在这个实施方案的一个方面，制造过程可以包括(e)：使步骤(d)的所述阿柏西普的至少一部分与第四色谱载体接触。在这个实施方案的一个方面，制造过程可以任选地包括使步骤(c)的所述阿柏西普经历小于5.5的pH。在这个实施方案的一个方面，该方法可以任选地包括在所述捕获步骤(a)之前澄清具有融合结合性分子的溶液。在这个实施方案的一个方面，该方法可以任选地包括洗脱步骤(a)的所述融合结合性分子。在这个实施方案的又一个方面，制造阿柏西普的方法可以任选地包括收集步骤(c)的流通级分。在这个实施方案的又一个方面，制造阿柏西普的方法可以任选地包括洗脱步骤(d)的所述阿柏西普。在这个实施方案的又一个方面，制造阿柏西普的方法可以任选地包括洗脱步骤(e)的所述阿柏西普。在这个实施方案的一个方面，第一色谱载体和/或第二色谱载体和/或第三色谱载体和/或第四色谱载体可以相同或不同并且可以包括亲和色谱介质、离子交换色谱介质或疏水相互作用色谱介质。在这个实施方案的一个具体方面，离子交换色谱介质可以是阴离子交换色谱介质。在这个实施方案的另一个具体方面，离子交换色谱介质可以是阳离子交换色谱介质。在这个实施方案的一个方面，制造阿柏西普的方法可以任选地包括使用病毒过滤法过滤任一步骤的所述阿柏西普。在这个实施方案的一个方面，制造过程可以任选地包括使用超滤和/或渗滤方法(UF/DF)过滤诸步骤中任一者的所述阿柏西普。

本发明包括作为工艺之产物的VEGF微型捕捉体，所述工艺包括用IdeS蛋白酶切割这种阿柏西普的步骤。

(2)一种制造VEGF微型捕捉体的方法可以包括

(a)在CDM中表达阿柏西普；

(b)使用可以包括亲和捕获色谱的第一色谱载体捕获阿柏西普；

(c)(例如，用IdeS蛋白酶)切割阿柏西普，因而形成含有来自阿柏西普的VEGF微型捕捉体和Fc片段的混合物；

(d)使所述混合物与可以是亲和捕获色谱的第二色谱载体接触；并且

(e)使步骤(c)的所述VEGF微型捕捉体的至少一部分与可以包括阴离子交换色谱的第三色谱载体接触。

步骤(d)可以任选地还包括收集混合物的流通级分，所述流通级分含有不与步骤的第二色谱载体结合的VEGF微型捕捉体。步骤(e)还可以包括收集混合物的流通级分，所述流通级分含有不与第三色谱载体结合的VEGF微型捕捉体。任选地，步骤(d)可以包括抽提第三色谱载体并且收集抽提的级分。诸步骤可以通过例行方法体系结合本文提到的方法体系一起实施。

其他额外的示例性实施方案可以包括(f)：使步骤(e)的所述VEGF微型捕捉体的至少一部分与第四色谱载体接触。在这个实施方案的一个方面，制造过程可以包括(g)：使步骤(f)的所述VEGF微型捕捉体的至少一部分与第五色谱载体接触。在这个实施方案的一个方面，制造过程可以任选地包括使步骤(d)的所述VEGF微型捕捉体经历小于5.5的pH。在这个实施方案的一个方面，制造VEGF微型捕捉体的方法可以任选地包括在所述捕获步骤(a)之前澄清具有融合结合性分子的溶液。在这个实施方案的一个方面，制造VEGF微型捕捉体的方法可以任选地包括洗脱步骤(a)的所述融合结合性分子。在这个实施方案的又一个方面，制造VEGF微型捕捉体的方法可以任选地包括收集步骤(e)的流通级分。在这个实施方案的又一个方面，制造VEGF微型捕捉体的方法可以任选地包括洗脱步骤(f)的所述VEGF微型捕捉体。在这个实施方案的又一个方面，制造VEGF微型捕捉体的方法可以任选地包括洗脱步骤(g)的所述VEGF微型捕捉体。在这个实施方案的一个方面，第一色谱载体和/或第二色谱载体和/或第三色谱载体和/或第四色谱载体和/或第五色谱载体可以相同或不同并且可以包括亲和色谱介质、离子交换色谱介质或疏水相互作用色谱介质。在这个实施方案的一个具体方面，离子交换色谱介质可以是阴离子交换色谱介质。在这个实施方案的另一个具体方面，离子交换色谱介质可以是阳离子交换色谱介质。在这个实施方案的一个方面，制造VEGF微型捕捉体的方法可以任选地包括使用病毒过滤法过滤诸步骤中任一者的所述VEGF微型捕捉体。在这个实施方案的一个方面，制造过程可以任选地包括使用超滤和/或渗滤方法(UF/DF)过滤诸步骤中任一者的所述VEGF微型捕捉体。

本发明包括作为这种工艺之产物的VEGF微型捕捉体。

(3)一种制造阿柏西普的方法可以包括：

(a)在CDM中表达阿柏西普；

(b)使用可以包括阳离子交换色谱的第一色谱载体捕获阿柏西普；和

步骤(c)还可以包括收集混合物的流通级分，所述流通级分含有不与第二色谱载体结合的阿柏西普。任选地，步骤(c)可以包括抽提第二色谱载体并且收集抽提的级分。诸步骤可以通过例行方法体系结合本文提到的方法体系一起实施。

(4)一种的制造VEGF微型捕捉体的方法可以包括：

(a)在CDM中表达阿柏西普；

(b)使用可以包括阳离子交换色谱的第一色谱载体捕获阿柏西普；

本发明包括作为这种工艺之产物的VEGF微型捕捉体。

微型捕捉体翻译后修饰

本发明的VEGF微型捕捉体及其组合物可以各种翻译后修饰为特征。

氧化种类

2-氧代-组氨酸是组氨酸氧化的结果并且可以充当蛋白质氧化的标志物。2-氧代-组氨酸已经与VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F、REGN7483^R、REGN7850或REGN7851)制备物中存在的棕黄色相关，其中所述制备物已在化学成分确知培养基(chemically-definedmedia，CDM)中从细胞表达。化学成分确知的细胞生长培养基向生物制药制造提供数个显著优点，包括批间变异性降低和安全性更大，例如，免于传染因子影响。然而，就眼科注射用微型捕捉体而言，为了实现从这些优点获益，有必要减少CDM中表达的微型捕捉体组合物的棕黄色。降低微型捕捉体的2-氧代-组氨酸含量是一种籍此可以降低该颜色至玻璃体内注射可接受水平的手段。本发明部分地提供减少2-氧代-组氨酸并且因此减少棕黄色的方法以及作为这类方法之结果的组合物。

棕黄色尤其在将要注入眼部的生物产品(例如，VEGF微型捕捉体)中不利。在非化学成分确知培养基(如含有水解物(例如，大豆水解物)的培养基)中表达的市售VEGF捕捉体分子(例如，Eylea)中观察到仅非常稀少的2-氧代-组氨酸。由于眼是视觉器官，向玻璃体中引入有色液体可能不利地影响视力。视力对任何内眼阻碍特别敏感。例如，已经报道从注射器壁脱落并且被注入玻璃体的透明硅油微液滴以悬浮物形式扰动视力。Yu等人AmJOphthalmol Case Rep.2018Jun；10：142-144.

化学成分确知培养基(CDM)或合成性培养基是本领域常用术语并且指其中化学组成已知的培养基。CDM不包含水解物，例如大豆水解物。合适的CDM包括Dulbecco改良Eagle′s(DME)培养基、Ham营养混合物、EX-CELL培养基、IS CHO-CD培养基，和本领域技术人员已知的在本发明的范围内构思其用途的其他CDM。

可以产生2-氧代-组氨酸(2-氧代-his)的两种化学形式，为相对于组氨酸具有13.98Da分子量增加的

(13.98Da形式)；或相对于组氨酸具有15.99Da分子量增加的

(15.99Da形式)；其中2-氧代-组氨酸的13.98Da形式为CDM中所表达微型捕捉体中观察到的优势部分。可以按分光光度方式评价2-氧代-组氨酸的13.98Da形式的含量，因为这个部分在350nM波长具有增强的吸光度光，而15.99Da形式没有这种增强的吸光度。2-氧代-组氨酸的13.98Da形式在微型捕捉体中的形成可能受光催化，而15.99Da形式的形成可以受金属如铜(Cu²⁺)催化。CDM表达的微型捕捉体中的棕黄色尚未与存在2-氧代-组氨酸的15.99Da形式相关。

可能导致棕黄色的氨基酸的其他氧化种类包括氧化型色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和/或酪氨酸。本文所述的方法也可以用来减少本文讨论的VEGF微型捕捉体中这类氧化型氨基酸的存在。包含这类VEGF微型捕捉体的组合物也形成本发明的部分。

色氨酸氧化可以产生复杂的产物混合物。主要产物可以是N-甲酰基犬尿氨酸和犬尿氨酸连同单氧化、二氧化和/或三氧化产物。携带氧化型Trp修饰的肽通常显示出质量增长4、16、32和48Da，对应于形成犬尿氨酸(KYN)、羟色氨酸(W_ox1)和N-甲酰基犬尿氨酸/二羟色氨酸(NFK/W_ox2，也称为“双重氧化型Trp”)、三羟色氨酸(W_ox3，也称为“三重氧化型Trp”)及其组合，如羟犬尿氨酸(KYN_ox1，+20Da)。氧化成羟色氨酸(W_ox1)(Mass spectrometricidentification of oxidative modifications of tryptophan residues in proteins：chemical artifact or post-translational modification？(质量分光光度鉴定蛋白质中色氨酸残基的氧化修饰：化学人为假象或翻译后修饰？)J Am Soc MassSpectrom.2010Jul；21(7)：1114-1117)。已经发现色氨酸氧化，而非甲硫氨酸和组氨酸氧化在蛋白质产品中产生颜色变化(Characterization ofthe Degradation Products of aColor-Changed Monoclonal Antibody：Tryptophan-Derived Chromophores(表征变色单克隆抗体的降解产物：色氨酸衍生的发色团).dx.doi.org/10.1021/ac404218t|Anal.Chem.2014，86，6850-6857)。类似于色氨酸，酪氨酸氧化主要产生3，4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)和双酪氨酸(Li，S，C Schoneich和RT.Borchardt.1995.Chemical Instabilityof Protein Pharmaceuticals：Mechanisms of Oxidation and Strategies forStabilization(蛋白质药物的化学不稳定性：氧化机理与稳定策略).Biotechnol.Bioeng.48：490-500).

本发明包括包含一个或多个已经氧化(例如，如本文中讨论)的色氨酸残基的微型捕捉体(例如，REGN7483^F)及其组合物，例如，其中，组合物中不多于约0.1-10％(例如，约0.1、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％)的色氨酸残基氧化。

本发明包括本文所述的微型捕捉体分子(例如，REGN7483^F或REGN7483^R)，其中一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)组氨酸氧化成2-氧代-his(例如，选自H19、H86、H95、H110、H145、H147、H203和/或H203)，以及其组合物(例如，含水组合物)。

本发明还包括组合物(例如，含水组合物)，所述组合物包含本发明的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F、REGN7483^R、REGN7850或REGN7851)(例如，其在CDM中例如于宿主细胞如CHO细胞中表达)，其中组合物中不多于约1％或2％、不多于约0.1％或约0.1-1％、0.2-1％、0.3-1％、0.4-1％、0.5-1％、0.6-1％、0.7-1％、0.8-1％或0.9-1％的组氨酸是2-氧代-组氨酸。在这类组合物中，微型捕捉体多肽为不均一的肽群体，所述肽各自具有不同数目的2-氧代-组氨酸残基和非氧化型组氨酸残基。因此，组合物中2-氧代-组氨酸的百分数指全部微型捕捉体分子中的2-氧代-组氨酸÷微型捕捉体分子中的总组氨酸(氧化型+非氧化型)X 100。在本发明的一个实施方案中，该组合物以如本文所述的棕黄色为特征(例如，不深于BY3、4、5、6或7；或澄清)。

一种对组合物中2-氧代-组氨酸水平定量的方法是用蛋白酶(例如，Lys-C和/或胰蛋白酶)消化VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F、REGN7483^R、REGN7850或REGN7851)(例如，其表达于CDM中)并且分析所得肽中2-氧代-组氨酸的量，例如，通过质谱法(ms)分析。在本发明的一个实施方案中，在消化微型捕捉体多肽之前，半胱氨酸硫氢基团通过与碘乙酰胺(IDAM)反应被封闭；产生由以下化学结构代表的残基：

这种修饰使得游离硫氢基免于再形成二硫桥并防止二硫键混乱。本发明包括组合物(例如，含水组合物)，所述组合物包含VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F)，所述微型捕捉体包含用IDAM修饰并以蛋白酶(例如，Lys-C和胰蛋白酶)消化且通过质谱法分析时包含以下肽的多肽：

·EIGLLTC*EATVNGH*LYK(SEQ ID NO：12的氨基酸73-89)，其包含约0.0095％的2-氧代-组氨酸，

·QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(SEQ ID NO：12的氨基酸97-119)，其包含约0.0235％的2-氧代-组氨酸，

·TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(SEQ ID NO：12的氨基酸128-148)，其包含约0.067％的2-氧代-组氨酸，

·DKTH*TC*PPC*PAPELLG(SEQ ID NO：12的氨基酸206-221)，其包含约0.0745％的2-氧代-组氨酸，和/或

·TNYLTH*R(SEQ ID NO∶12的氨基酸90-96)，其包含约0.016％的2-氧代-组氨酸，和/或

·任选地，IIW*DSR(SEQ ID NO：12的氨基酸56-61)，其包含约0.248％的二氧化色氨酸，

其中H*是2-氧代-组氨酸，W*是二氧化色氨酸，并且其中C*是羧甲基化半胱氨酸；或

·EIGLLTC*EATVNGH*LYK(SEQ ID NO：12的氨基酸73-89)，其包含约0.006-0.013％的2-氧代-组氨酸，

·QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(SEQ ID NO：12的氨基酸97-119)，其包含约0.019-0.028％的2-氧代-组氨酸，

·TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(SEQ ID NO：12的氨基酸128-148)，其包含约0.049-0.085％的2-氧代-组氨酸，

·DKTH*TC*PPC*PAPELLG(SEQ ID NO：12的氨基酸206-221)，其包含约0.057-0.092％的2-氧代-组氨酸，和/或

·TNYLTH*R(SEQ ID NO：12的氨基酸90-96)，其包含约0.010-0.022％的2-氧代-组氨酸，和/或

·任选地，IIW*DSR(SEQ ID NO：12的氨基酸56-61)，其包含约0.198-0.298％的二氧化色氨酸，

其中H*是2-氧代-组氨酸，W*是二氧化色氨酸并且其中C*是羧甲基化半胱氨酸。在本发明的一个实施方案中，肽例如用PNGase F去糖基化。

棕黄色

可以相对于欧洲颜色标准描述本文所述多肽组合物的棕黄色。欧洲药典第8版第2.2.2章液体色度。EP颜色一般在制药业中用来给液态样品赋予颜色等级，例如指示产品质量。欧洲药典颜色是制药业中使用的目视液体色阶。EP 2.2.2.液体色度2概述了37种属于以下五个色系的分别的“参考溶液(Reference Solutions)”的配制：黄绿色(GY)、黄色(Y)、棕黄色(BY)、棕色(B)和红色(R)。7份棕黄色标准品当中(BY标准品(BY standards))，BY1为最深暗标准品并且BY7最不深暗。本领域常规进行给定样品与BY颜色标准品的匹配。下表A中描述欧洲棕黄色标准品的组成。

表A.欧洲棕黄色标准品的组成

棕黄色标准溶液(BY)：10.8g/L FeCl₃.6H₂O，6.0g/L CoCl₂.6H₂O和2.5g/LCuSO₄.5H₂O

通过比较供测试溶液与标准颜色溶液实施液体颜色试验。根据供测试溶液的颜色色调和强度，选择标准颜色溶液的组成。一般地，在无色、透明、中性玻璃平底管中实施比较，所述管在内径和全部其他方面尽可能接近匹配(例如，直径约12、15、16或25mm的管)。例如，可以在2或10mL供测试溶液和标准颜色溶液之间比较。液体深度例如可以是约15、25、40或50mm。分派给供测试溶液的颜色不应当比标准颜色更深。一般在散射光(例如，目光)下比照白色背景实施颜色比较。可以沿管的竖轴向下或水平轴比较颜色。在本发明的一个实施方案中，包含VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F)的组合物的颜色比较如上文所述进行。

BY标准品的颜色也可以依据CIEL*a*b*颜色空间(“CIELAB”或“CIELab”颜色空间)表示。参见表B。在CIE L*a*b*坐标系中，L*表示依照量表0-100的颜色亮度，其中0为最暗并且100为最亮，a*表示颜色的红度或绿度(正值*代表红色，而负值*代表绿色)，并且b*表示样品的黄度或蓝度，正值b*代表黄色并且负值b*代表蓝色。评价中与标准品或与初始样品的颜色差异可以用各颜色组分ΔL*、Δa*和Δb*表示。可以将颜色的复合变化或差异使用以下公式计算为空间中欧几里得简单距离(simple Euclidian distance)：

可以生成CIEL*a*b*颜色坐标，例如，使用Hunter Labs UltrascanPro(Hunter Associates Laboratory，Reston，弗吉尼亚州)或依照BYK Gardner LCS IV(BYK-Gardner，Columbia，马里兰州)生成。对于Hunter LabsUltraScan Pro，可以执行Didymium Filter Test(钕镨滤光片试验)校准波长。该仪器可以在使用前于TTRAN中用0.780英寸端口插片和DIW标准化；因此，使用光阱和黑卡建立光度测定量表的上限(L*＝100)和底部(L*＝0)。参见Pack等人，Modernization of PhysicalAppearance and Solution Color Tests Using Quantitative TristimulusColorimetry：Advantages，Harmonization，and Validation Strategies(使用定量性三色激励测色法使物理外观和溶液颜色试验现代化：优点、统一和验证策略)，J.Pharmaceutical Sci.104：3299-3313(2015)。

表B.CIEL*a*b*颜色空间中欧洲棕黄色标准品的表征

^Pack等人报道

^～图22中示出了CIEL*a*b*颜色空间中本文实验测量每个BY颜色标准品的L*和b*值。

本发明提供组合物(例如，含水组合物)，所述组合物包含以具有如下棕黄色为特征的本发明VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F、REGN7483^R、REGN7850或REGN7851)(例如，其表达于CDM中例如宿主细胞如CHO细胞中)，所述棕黄色近似BY2、BY3、BY4、BY5、BY6、BY7的棕黄色；或不深于BY2、不深于BY3、不深于BY4、不深于BY5、不深于BY6、不深于BY7；或介于BY2与BY3的棕黄色之间、介于BY2与BY4的棕黄色之间、介于BY3与BY4的棕黄色之间；介于BY3与BY5的棕黄色之间；介于BY4与BY5的棕黄色之间；介于BY4与BY6的棕黄色之间；介于BY5与BY6的棕黄色之间；介于BY5与BY7的棕黄色之间；或介于BY6与BY7的棕黄色之间。

本发明还提供组合物(例如，含水组合物)，所述组合物包含本发明的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F、REGN7483^R、REGN7850或REGN7851)(例如，其在CDM中例如于宿主细胞如CHO细胞中表达)，所述组合物用CIEL*a*b*颜色空间中的颜色如下表征：

L*＝约88.61，a*＝约0.53，b*＝约31.17；例如，其中微型捕捉体浓度是约169mg/ml；

L*＝约89，a*＝约0.5，b*＝约31；例如，其中微型捕捉体浓度是约170mg/ml；

L*＝约95.01，a*＝约-1.68，b*＝约18.16；例如，其中微型捕捉体浓度是约161mg/ml；

L*＝约95，a*＝约-1.5，b*＝约18；例如，其中微型捕捉体浓度是约160mg/ml；

L*＝约96.1，a*＝约-1.05，b*＝约14.34；例如，其中微型捕捉体浓度是约158mg/ml；

L*＝约96，a*＝约-1，b*＝约14；例如，其中微型捕捉体浓度是约160mg/ml；

L*＝约97.18，a*＝约-0.93，b*＝约10.31；例如，其中微型捕捉体浓度是约106mg/ml；

L*＝约97，a*＝约-1，b*＝约10；例如，其中微型捕捉体浓度是约110mg/ml；

L*＝约96.06，a*＝约-1.02，b*＝约14.48；例如，其中微型捕捉体浓度是约154mg/ml；

L*＝约96，a*＝约-1，b*＝约14.5；例如，其中微型捕捉体浓度是约150mg/ml；

L*＝约96.96，a*＝约-0.85，b*＝约14.89；例如，其中微型捕捉体浓度是约159mg/ml；

L*＝约97，a*＝约-1，b*＝约15；例如，其中微型捕捉体浓度是约160mg/ml；

L*＝约97.76，a*＝约-1.02，b*＝约12.16；例如，其中微型捕捉体浓度是约128mg/ml；

L*＝约98，a*＝约-1，b*＝约12；例如，其中微型捕捉体浓度是约130mg/ml；

L*＝约95.06，a*＝约-1.07，b*＝约20.87；例如，其中微型捕捉体浓度是约205mg/ml；

L*＝约95，a*＝约-1，b*＝约21；例如，其中微型捕捉体浓度是约205mg/ml；

L*＝约96.93，a*＝约-1.55，b*＝约14.02；例如，其中微型捕捉体浓度是约158mg/ml；

L*＝约97，a*＝约-1.5，b*＝约14；例如，其中微型捕捉体浓度是约160mg/ml；

L*＝约97.36，a*＝约-0.39，b*＝约10.64；例如，其中微型捕捉体浓度是约150mg/ml；

L*＝约97，a*＝约-0.5，b*＝约11；例如，其中微型捕捉体浓度是约150mg/ml；

L*＝约99.16，a*＝约-0.35，b*＝约3.41；例如，其中微型捕捉体浓度是约144mg/ml；

L*＝约99，a*＝约-0.5，b*＝约3；例如，其中微型捕捉体浓度是约145mg/ml；

L*＝约99.33，a*＝约-0.19，b*＝约2.39；例如，其中微型捕捉体浓度是约79.3mg/ml；

L*＝约99，a*＝约0，b*＝约2.4；例如，其中微型捕捉体浓度是约79mg/ml；

L*＝约97.37，a*＝约-1.12，b*＝约9.58；例如，其中微型捕捉体浓度是约80mg/ml；

L*＝约97，a*＝约-1，b*＝约9.6；例如，其中微型捕捉体浓度是约80mg/ml；

L*＝约97.1，a*＝约-0.85，b*＝约9.97；例如，其中微型捕捉体浓度是约154mg/ml；

L*＝约97，a*＝约-1，b*＝约10；例如，其中微型捕捉体浓度是约150mg/ml；

L*＝约98.04，a*＝约-0.67，b*＝约6.75；例如，其中微型捕捉体浓度是约100mg/ml；

L*＝约98，a*＝约-1，b*＝约6.8；例如，其中微型捕捉体浓度是约100mg/ml；

L*＝约98.5，a*＝约-0.51，b*＝约5.03；例如，其中微型捕捉体浓度是约75mg/ml；

L*＝约99，a*＝约-0.5，b*＝约5；例如，其中微型捕捉体浓度是约75mg/ml；

L*＝约98.94，a*＝约-0.36，b*＝约3.58；例如，其中微型捕捉体浓度是约50mg/ml；

L*＝约99，a*＝约-0.5，b*＝约3.6；例如，其中微型捕捉体浓度是约50mg/ml；

L*＝约99.47，a*＝约-0.13，b*＝约1.65；例如，其中微型捕捉体浓度是约25mg/ml；

L*＝约99.5，a*＝约0，b*＝约1.7；例如，其中微型捕捉体浓度是约25mg/ml；

L*＝约99.77，a*＝约-0.02，b*＝约0.66；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约100，a*＝约0，b*＝约0.7；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约99.9，a*＝约0.01，b*＝约0.36；例如，其中微型捕捉体浓度是约5mg/ml；

L*＝约100，a*＝约0，b*＝约0.4；例如，其中微型捕捉体浓度是约5mg/ml；

L*＝约99.95，a*＝约0.06，b*＝约0.08；例如，其中微型捕捉体浓度是约3mg/ml；

L*＝约100，a*＝约0.1，b*＝约0.1；例如，其中微型捕捉体浓度是约3mg/ml；

L*＝约98.89，a*＝约0.01，b*＝约1.05；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约99，a*＝约0，b*＝约1.1；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约98.3，a*＝约-0.03，b*＝约0.96；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约98，a*＝约0，b*＝约1；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约99.07，a*＝约-0.07，b*＝约1.33；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约99，a*＝约0，b*＝约1.3；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约99.42，a*＝约-0.04，b*＝约1.35；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约99，a*＝约0，b*＝约1.4；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约99.19，a*＝约-0.09，b*＝约1.55；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约99，a*＝约0，b*＝约1.6；例如，其中微型捕捉体浓度是约10mg/ml；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约23；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约22；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约21；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约20；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约19；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约18；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约17；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约16；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约15；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约14；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约13；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约12；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约11；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约10；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约9；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约8；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约7；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约6；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约5；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约4；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约3；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约2；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0和b*＝不大于约1；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约23；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约22；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约21；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约20；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约19；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约18；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约17；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约16；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约15；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约14；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约13；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约12；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约11；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约10；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约9；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约8；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约7；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约6；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约5；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约4；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约3；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约2；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约1；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约3-5；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约4-6；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约5-7；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约6-8；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约7-9；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约8-10；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约9-11；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约10-12；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约11-13；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约14-16；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约15-17；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约16-18；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约17-19；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约18-20；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约19-21；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约20-22；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约21-23；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约17-23；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约10-23；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约5-23；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约3-23；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约1-23；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约10-17；

L*＝约94-100，a*＝-3-1或-3-0并且b*＝约5-17；

L*＝70-99、a*＝-2-0和b*＝20或更小；和/或

L*＝70-99，a*＝-2-0和b*＝10-31、约10、约14、约12、约14、约15、约18、约21、约27或约31。在本发明的一个实施方案中，一种包含具有这种如上文所述颜色特征的VEGF微型捕捉体的组合物具有以下浓度的微型捕捉体：约70mg/ml或更高，75-200mg/ml；或70-205mg/ml；10mg/ml；11mg/ml；12mg/ml；13mg/ml；14mg/ml；15mg/ml；16mg/ml；17mg/ml；18mg/ml；19mg/ml；20mg/ml；21mg/ml；22mg/ml；23mg/ml；24mg/ml；25mg/ml；26mg/ml；27mg/ml；28mg/ml；29mg/ml；30mg/ml；31mg/ml；32mg/ml；33mg/ml；34mg/ml；35mg/ml；36mg/ml；37mg/ml；38mg/ml；39mg/ml；40mg/ml；41 mg/ml；42mg/ml；43mg/ml；44mg/ml；45mg/ml；46mg/ml；47mg/ml；48mg/ml；49mg/ml；50mg/ml；51mg/ml；52mg/ml；53mg/ml；54mg/ml；55mg/ml；56mg/ml；57mg/ml；58mg/ml；59mg/ml；60mg/ml；61 mg/ml；62mg/ml；63mg/ml；64mg/ml；65mg/ml；66mg/ml；67mg/ml；68mg/ml；69mg/ml；70mg/ml；71mg/ml；72mg/ml；73mg/ml；74mg/ml；75mg/ml；76mg/ml；77mg/ml；78mg/ml；79mg/ml；80mg/ml；81mg/ml；82mg/ml；83mg/ml；84mg/ml；85mg/ml；86mg/ml；87mg/ml；88mg/ml；89mg/ml；90mg/ml；91mg/ml；92mg/ml；93mg/ml；94mg/ml；95mg/ml；96mg/ml；97mg/ml；98mg/ml；99mg/ml；100mg/ml；101mg/ml；102mg/ml；103mg/ml；104mg/ml；105mg/ml；106mg/ml；107mg/ml；108mg/ml；109mg/ml；110mg/ml；111mg/ml；112mg/ml；113mg/ml；114mg/ml；115mg/ml；116mg/ml；117mg/ml；118mg/ml；119mg/ml；120mg/ml；121mg/ml；122mg/ml；123mg/ml；124mg/ml；125mg/ml；126mg/ml；127mg/ml；128mg/ml；129mg/ml；130mg/ml；131mg/ml；132mg/ml；133mg/ml；134mg/ml；135mg/ml；136mg/ml；137mg/ml；138mg/ml；139mg/ml；140mg/ml；141mg/ml；142mg/ml；143mg/ml；144mg/ml；145mg/ml；146mg/ml；147mg/ml；148mg/ml；149mg/ml；150mg/ml；151mg/ml；152mg/ml；153mg/ml；154mg/ml；155mg/ml；156mg/ml；157mg/ml；158mg/ml；159mg/ml；160mg/ml；161mg/ml；162mg/ml；163mg/ml；164mg/ml；165mg/ml；166mg/ml；167mg/ml；168mg/ml；169mg/ml；170mg/ml；171 mg/ml；172mg/ml；173mg/ml；174mg/ml；175mg/ml；176mg/ml；177mg/ml；178mg/ml；179mg/ml；180mg/ml；181mg/ml；182mg/ml；183mg/ml；184mg/ml；185mg/ml；186mg/ml；187mg/ml；188mg/ml；189mg/ml；190mg/ml；191mg/ml；192mg/ml；193mg/ml；194mg/ml；195mg/ml；196mg/ml；197mg/ml；198mg/ml；199mg/ml；200mg/ml；201mg/ml；202mg/ml；203mg/ml；204mg/ml；或205mg/ml。

备选地，在本发明的一个实施方案中，组合物具有约70g/1或更高、约75、约90、约106、约128、约147、约154、158、约159、约161、约169、约200、约205g/1、约75—200或约70-205g/1的VEGF微型捕捉体浓度，但在稀释至例如约10mg/ml；11mg/ml；12mg/ml；13mg/ml；14mg/ml；15mg/ml；16mg/ml；17mg/ml；18mg/ml；19mg/ml；20mg/ml；21mg/ml；22mg/ml；23mg/ml；24mg/ml；25mg/ml；26mg/ml；27mg/ml；28mg/ml；29mg/ml；30mg/ml；31mg/ml；32mg/ml；33mg/ml；34mg/ml；35mg/ml；36mg/ml；37mg/ml；38mg/ml；39mg/ml；40mg/ml；41mg/ml；42mg/ml；43mg/ml；44mg/ml；45mg/ml；46mg/ml；47mg/ml；48mg/ml；49mg/ml；50mg/ml；51mg/ml；52mg/ml；53mg/ml；54mg/ml；55mg/ml；56mg/ml；57mg/ml；58mg/ml；59mg/ml；60mg/ml；61mg/ml；62mg/ml；63mg/ml；64mg/ml；65mg/ml；66mg/ml；67mg/ml；68mg/ml；69mg/ml；70mg/ml；71mg/ml；72mg/ml；73mg/ml；74mg/ml；75mg/ml；76mg/ml；77mg/ml；78mg/ml；79mg/ml；80mg/ml；81mg/ml；82mg/ml；83mg/ml；84mg/ml；85mg/ml；86mg/ml；87mg/ml；88mg/ml；89mg/ml；90mg/ml；91mg/ml；92mg/ml；93mg/ml；94mg/ml；95mg/ml；96mg/ml；97mg/ml；98mg/ml；99mg/ml；100mg/ml；101mg/ml；102mg/ml；103mg/ml；104mg/ml；105mg/ml；106mg/ml；107mg/ml；108mg/ml；109mg/ml；110mg/ml；111mg/ml；112mg/ml；113mg/ml；114mg/ml；115mg/ml；116mg/ml；117mg/ml；118mg/ml；119mg/ml；120mg/ml；121mg/ml；122mg/ml；123mg/ml；124mg/ml；125mg/ml；126mg/ml；127mg/ml；128mg/ml；129mg/ml；130mg/ml；131mg/ml；132mg/ml；133mg/ml；134mg/ml；135mg/ml；136mg/ml；137mg/ml；138mg/ml；139mg/ml；140mg/ml；141mg/ml；142mg/ml；143mg/ml；144mg/ml；145mg/ml；146mg/ml；147mg/ml；148mg/ml；149mg/ml；150mg/ml；151mg/ml；152mg/ml；153mg/ml；154mg/ml；155mg/ml；156mg/ml；157mg/ml；158mg/ml；159mg/ml；160mg/ml；161mg/ml；162mg/ml；163mg/ml；164mg/ml；165mg/ml；166mg/ml；167mg/ml；168mg/ml；169mg/ml；170mg/ml；171mg/ml；172mg/ml；173mg/ml；174mg/ml；175mg/ml；176mg/ml；177mg/ml；178mg/ml；179mg/ml；或180mg/ml时，具有这种如上文所述的颜色特征。

在本发明的一个实施方案中，一种包含已经在CDM中例如于宿主细胞(例如，CHO细胞)中表达VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F)的组合物包含不多于每百万约50份(ppm)的宿主细胞蛋白。

在本发明的一个实施方案中，组合物的颜色可能与组合物(例如，含水组合物)中的VEGF微型捕捉体(例如，其表达于CDM中)浓度相关，其中相关性由以下等式表示：

0.046+(0.066X微型捕捉体浓度(mg/m1))＝b*，

例如，其中L*＝约97-99并且a＝约-0.085-0.06。在本发明的一个实施方案中，该等式是：

b*＝(0.11X微型捕捉体浓度(mg/ml)-0.56)。

在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物或药物制剂中VEGF微型捕捉体的浓度是约90、100、110或120mg/ml(或上文描述的任一浓度)并且根据如此等式以CIEL*a*b*颜色空间中的颜色为特征。

包含VEGF微型捕捉体(例如，其表达于CDM中)的组合物的颜色还与进行AEX色谱纯化(流通模式)的pH和电导率相关。在本发明的一个实施方案中，组合物是工艺的产物，所述工艺包括在约8.0或更高或8.4或更高的pH和约2.0mS/cm或更小或4mS/cm或更小的电导率进行AEX色谱纯化。因此，在本发明的一个实施方案中，AEX色谱条件是pH高于约8.1或8.4(例如，约8.1-8.4)和/或电导率低于约6.5(例如，约2.0、4.0或2-4mS/cm)。在本发明的一个实施方案中，组合物是来自AEX柱的流通级分并且具有所述的pH(例如，8.4)和电导率(例如，2.0mS/cm)。在本发明的一个实施方案中，组合物是工艺的产物，所述工艺包括AEX色谱纯化并且还包括调整组合物至更低pH，例如，调整至约6.0(例如，5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2)。

因此，本发明包括组合物(例如，含水组合物)，所述组合物包含已经在化学成分确知培养基中表达的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F、REGN7483^R、REGN7850或REGN7851)，其中组合物中约0.1％-1％的全部组氨酸均修饰成2-氧代-组氨酸并且其中如本文所讨论的那样，组合物的颜色例如不深于例如欧洲棕黄色标准品BY2、BY3或BY4和/或具有在CIEL*a*b*颜色空间中特征为L*＝94-100、a*＝-3-0并且b*＝约3-6的颜色；例如，具有约90、100、110或120mg/ml的浓度；或上文讨论的任一浓度。

酸性种类和碱性种类

蛋白质变体可以包括酸性种类和碱性种类。酸性种类是比主峰更早从CEX洗脱或比主峰更晚从AEX洗脱的变体，而碱性种类是比主峰更晚从CEX洗脱或比主峰更早从AEX洗脱的变体。

术语“酸性种类”、“AS”、“酸性区域”和“AR”指以酸性总电荷为特征的蛋白质变体。例如，在重组蛋白制备物中，可以通过多种方法，如离子交换，例如，WCX-10HPLC(弱阳离子交换色谱)，或IEF(等电聚焦)检测到此类酸性种类。VEGF微型捕捉体的酸性种类可以包括变体、结构变体和/或片段化变体。示例性变体可以包括但不限于脱酰胺化变体、非岩藻糖化变体、氧化变体、甲基乙二醛(MGO)变体、糖化变体和柠檬酸变体。示例性结构变体包括但不限于糖基化变体和丙酮化变体。示例性片段化变体包括起因于肽链解离、酶促和/或化学修饰的来自靶分子的任何修饰的蛋白质种类，包括但不限于Fc和Fab片段、缺乏Fab的片段、缺乏重链可变结构域的片段、C末端截短变体、切除轻链中N末端Asp的变体和具有轻链N端截短的变体。其他酸性种类变体包括含有未配对二硫化物的变体、宿主细胞蛋白和宿主核酸、色谱材料和培养基组分。常见地，酸性种类在CEX期间比主峰洗脱更早或在AEX分析期间比主峰洗脱更晚。

在本发明的一个实施方案中，蛋白质组合物可以包含多于一个类型的酸性种类变体。例如，但不限于，总酸性种类可以基于出现的峰的色谱保留时间划分。另一个可以划分总酸性种类的实例可以基于变体类型—变体、结构变体或片段化变体。

术语“酸性种类”或“AS”不指工艺相关杂质。如本文所用的术语“工艺相关杂质”指在包含蛋白质的组合物中存在，但不是从蛋白质本身衍生的杂质。工艺相关杂质包括但不限于宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞核酸、色谱材料和培养基组分。

在本发明的一些示例性实施方案中，本发明的组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的酸性种类，其中与VEGF微型捕捉体相比，组合物中酸性种类的量可以是最多约15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或0.0％和在前述一者或多者中的范围。

在本发明的一个示例性实施方案中，组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的酸性种类，其中与VEGF微型捕捉体相比，组合物中酸性种类的量可以是约0％至约15％，例如，约0％至约15％、约0.05％至约15％、约0.1％至约15％、约0.2％至约15％、约0.3％至约15％、约0.4％至约15％、约0.5％至约15％、约0.6％至约15％、约0.7％至约15％、约0.8％至约15％、约0.9％至约15％、约1％至约15％、约1.5％至约15％、约2％至约15％、约3％至约15％、约4％至约15％、约5％至约15％、约6％至约15％、约7％至约15％、约8％至约15％、约9％至约15％、约10％至约15％、约0％至约10％、约0.05％至约10％、约0.1％至约10％、约0.2％至约10％、约0.3％至约10％、约0.4％至约10％、约0.5％至约10％、约0.6％至约10％、约0.7％至约10％、约0.8％至约10％、约0.9％至约10％、约1％至约10％、约1.5％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约5％至约10％、约6％至约10％、约7％至约10％、约8％至约10％、约9％至约10％、约0％至约7.5％、约0.05％至约7.5％、约0.1％至约7.5％、约0.2％至约7.5％、约0.3％至约7.5％、约0.4％至约7.5％、约0.5％至约7.5％、约0.6％至约7.5％、约0.7％至约7.5％、约0.8％至约7.5％、约0.9％至约7.5％、约1％至约7.5％、约1.5％至约7.5％、约2％至约7.5％、约3％至约7.5％、约4％至约7.5％、约5％至约7.5％、约6％至约7.5％、约7％至约7.5％、约0％至约5％、约0.05％至约5％、约0.1％至约5％、约0.2％至约5％、约0.3％至约5％、约0.4％至约5％、约0.5％至约5％、约0.6％至约5％、约0.7％至约5％、约0.8％至约5％、约0.9％至约5％、约1％至约5％、约1.5％至约5％、约2％至约5％、约3％至约5％、约4％至约5％和在前述一者或多者中的范围。

在目的蛋白之前洗脱的全部峰可以加和为酸性区域，并且在目的蛋白之后洗脱的全部峰可以加和为碱性区域。在一些示例性实施方案中，酸性种类可以作为两个或更多个酸性区域洗脱并且可以基于峰的某个保留时间和基于所用的离子交换柱，给予编号AR1、AR2、AR3等。

在本发明的一个示例性实施方案中，组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的酸性种类，其中与VEGF微型捕捉体的区域相比，AR1是15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或0.0％和在前述一者或多者中的范围。在另一个示例性实施方案中，组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的酸性种类，其中与抗VEGF蛋白质的区域相比，AR1是约0.0％至约10％、约0.0％至约5％、约0.0％至约4％、约0.0％至约3％、约0.0％至约2％、约3％至约5％、约5％至约8％、或约8％至约10％、或约10％至约15％、和在前述一者或多者中的范围。

在本发明的一个示例性实施方案中，组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的酸性种类，其中与抗VEGF蛋白的区域相比，AR2是15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或0.0％和在前述一者或多者中的范围。在另一个示例性实施方案中，组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的酸性种类，其中与VEGF微型捕捉体的区域相比，AR2是约0.0％至约10％、约0.0％至约5％、约0.0％至约4％、约0.0％至约3％、约0.0％至约2％、约3％至约5％、约5％至约8％、或约8％至约10％、或约10％至约15％、和在前述一者或多者中的范围。

在造成酸性种类或碱性种类的化学降解途径当中，蛋白质和肽中最常观察到的两种共价修饰是脱胺作用和氧化。甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸是最易氧化的氨基酸：Met和Cys因为其硫原子而最易氧化，且His、Trp和Tyr因为其芳环而最易氧化。

术语“碱性种类”、“碱性区域”和“BR”指以碱性总电荷为特征的蛋白质变体。例如，在重组蛋白制备物中，可以通过多种方法，如离子交换，例如，WCX-10HPLC(弱阳离子交换色谱)，或IEF(等电聚焦)检测到此类碱性种类。示例性变体可以包括但不限于赖氨酸变体、天冬氨酸异构化、天冬酰胺处形成琥珀酰亚胺、甲硫氨酸氧化、酰胺化、不完整二硫键形成、从丝氨酸突变成精氨酸、去糖基化、片段化和聚集。常见地，碱性种类在CEX期间比主峰洗脱更晚或在AEX分析期间比主峰洗脱更早。(Chromatographicanalysis ofthe acidic andbasic species ofrecombinant monoclonal antibodies(色谱分析重组单克隆抗体的酸性种类和碱性种类).MAbs.2012Sep 1；4(5)：578-585)。

在本发明的某些示例性实施方案中，蛋白质组合物可能包含多于一个类型的碱性种类变体。例如，但不限于，总碱性种类可以基于出现的峰的色谱保留时间划分。另一个其中可以划分总碱性种类的实例可以基于变体类型-变体、结构变体或片段化变体。

如对酸性种类所示，术语“碱性种类”不包括工艺相关杂质并且碱性种类可以是产品制备的结果(在本文中称为“制备衍生的碱性种类”)或储存的结果(在本文中称为“储存衍生的碱性种类”)。

在本发明的一些示例性实施方案中，该组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的碱性种类，其中与VEGF微型捕捉体相比，组合物中碱性种类的量可以是最多约15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或0.0％和在前述一者或多者中的范围。

在本发明的其他示例性实施方案中，组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的碱性种类，其中与VEGF微型捕捉体相比，组合物中碱性种类的量可以是约0％至约15％例如，约0％至约15％、约0.05％至约15％、约0.1％至约15％、约0.2％至约15％、约0.3％至约15％、约0.4％至约15％、约0.5％至约15％、约0.6％至约15％、约0.7％至约15％、约0.8％至约15％、约0.9％至约15％、约1％至约15％、约1.5％至约15％、约2％至约15％、约3％至约15％、约4％至约15％、约5％至约15％、约6％至约15％、约7％至约15％、约8％至约15％、约9％至约15％、约10％至约15％、约0％至约10％、约0.05％至约10％、约0.1％至约10％、约0.2％至约10％、约0.3％至约10％、约0.4％至约10％、约0.5％至约10％、约0.6％至约10％、约0.7％至约10％、约0.8％至约10％、约0.9％至约10％、约1％至约10％、约1.5％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约5％至约10％、约6％至约10％、约7％至约10％、约8％至约10％、约9％至约10％、约0％至约7.5％、约0.05％至约7.5％、约0.1％至约7.5％、约0.2％至约7.5％、约0.3％至约7.5％、约0.4％至约7.5％、约0.5％至约7.5％、约0.6％至约7.5％、约0.7％至约7.5％、约0.8％至约7.5％、约0.9％至约7.5％、约1％至约7.5％、约1.5％至约7.5％、约2％至约7.5％、约3％至约7.5％、约4％至约7.5％、约5％至约7.5％、约6％至约7.5％、约7％至约7.5％、约0％至约5％、约0.05％至约5％、约0.1％至约5％、约0.2％至约5％、约0.3％至约5％、约0.4％至约5％、约0.5％至约5％、约0.6％至约5％、约0.7％至约5％、约0.8％至约5％、约0.9％至约5％、约1％至约5％、约1.5％至约5％、约2％至约5％、约3％至约5％、约4％至约5％和在前述一者或多者中的范围。

在本发明的一些示例性实施方案中，碱性种类可以作为两个或更多个碱性区域洗脱并且可以基于峰的某个保留时间和所用的离子交换，给予编号BR1、BR2、BR3等。

在本发明的一个示例性实施方案中，组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的碱性种类，其中与VEGF微型捕捉体的区域相比，BR1是15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或0.0％和在前述一者或多者中的范围。在另一个示例性实施方案中，组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的酸性种类，其中与抗VEGF蛋白质的区域相比，BR1是约0.0％至约10％、约0.0％至约5％、约0.0％至约4％、约0.0％至约3％、约0.0％至约2％、约3％至约5％、约5％至约8％、或约8％至约10％、或约10％至约15％、和在前述一者或多者中的范围。

在本发明的一个示例性实施方案中，组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的碱性种类，其中与VEGF微型捕捉体的区域相比，BR2是15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、或0.0％和在前述一者或多者中的范围。在另一个示例性实施方案中，组合物可以包含VEGF微型捕捉体和VEGF微型捕捉体的酸性种类，其中与抗VEGF蛋白质的区域相比，BR2是约0.0％至约10％、约0.0％至约5％、约0.0％至约4％、约0.0％至约3％、约0.0％至约2％、约3％至约5％、约5％至约8％、或约8％至约10％、或约10％至约15％、和在前述一者或多者中的范围。

可以如实施例部分中所述那样分析使用本文所述技术产生的色谱样品中蛋白质变体和/或酸性种类的水平。在某些实施方案中，使用cIEF方法，所述方法使用具有氟烃涂覆的毛细管管状柱(100μmx 5cm)的iCE3分析仪(ProteinSimple)。两性电解质溶液由纯化水中0.35％甲基纤维素(MC)、4％Pharmalyte 3-10载体两性电解质，4％Pharmalyte 5-8载体两性电解质、10mM L-精氨酸HCl、24％甲酰胺和pI标志物5.12和9.77的混合物组成。阳极电解质是80mM磷酸，并且阴极电解质是100mM氢氧化钠，二者均在0.10％甲基纤维素中。将样品于纯化水中稀释至10mg/mL。将样品与两性电解质溶液混合并且随后通过引入电势1500V持续一分钟，随后引入电势3000V持续7分钟来聚焦。通过使280nm紫外光穿过毛细管并进入电荷耦合元件数码照相机的透镜，获得已聚焦变体的图像。随后分析这个图像以确定多种电荷变体的分布。

阴离子交换(AEX)色谱

在本发明的一个实施方案中，将VEGF微型捕捉体(例如，在AEX平衡缓冲液中)加载于已经用缓冲液(例如，pH 8.4缓冲液(例如，Tris缓冲液中如50mM Tris)，例如，50mM TrispH 8.4，2.0mS/cm(毫西门子/厘米))平衡过的AEX树脂上，并且收集流通级分。在本发明的一个实施方案中，平衡缓冲液是pH约8.3至约8.6的Tris盐酸。例如，可以连同来自柱的洗涤级分收集流通液。可以例如用一个或多个柱体积(CV)的平衡缓冲液(例如，2个CV)进行色谱柱洗涤。在本发明的一个实施方案中，在AEX色谱之前，用IdeS蛋白酶(例如，来自化脓性链球菌，例如，FabRICATOR)切割阿柏西普并且使用蛋白A色谱用于从微型捕捉体产物中移除切割的Fc片段。如所讨论的那样，随后通过AEX色谱(流通模式)纯化微型捕捉体。

因此，本发明提供一种包含本发明VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F)的组合物，所述微型捕捉体通过一种包括以下步骤的方法产生：

(i)在宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中表达阿柏西普，所述宿主细胞在CDM(例如，其中阿柏西普从宿主细胞分泌入CDM)中培育；

(ii)从培养基和/或宿主细胞取出阿柏西普；

(iii)任选地，通过蛋白A色谱纯化阿柏西普；

(iii)用化脓性链球菌IdeS蛋白酶(例如，FabRICATOR)或其变体对阿柏西普进行蛋白酶解消化，以产生微型捕捉体和Fc片段；任选地，通过蛋白A色谱从组合物移除Fc，其中Fc与蛋白A树脂结合；

(iv)将微型捕捉体例如以约50-500g/L树脂的速率施加至AEX色谱树脂(例如，含有树脂的柱)；并且

(v)保留树脂流通级分中的微型捕捉体；并且

(vi)任选地，进一步纯化微型捕捉体，例如，通过疏水相互作用色谱(HIC)进一步纯化。

在本发明的一个实施方案中，AEX树脂是Q-琼脂糖凝胶Fast Flow或包含活性基团：-O-CH₂CHOHCH₂OCH₂CHOHCH₂N⁺(CH₃)₃或-N⁺(CH₃)₃或季胺。在本发明的一个实施方案中，树脂是POROS 50 HQ或包含季聚乙烯亚胺活性基团。

在本发明的一个实施方案中，流通模式下AEX色谱纯化VEGF微型捕捉体的条件如下：

(1)AEX柱是经具有电导率1.90-2.10mS/cm的pH 8.30-8.50的缓冲液平衡的POROS50HQ(或带季铵化聚乙烯亚胺官能团的AEX树脂)；

(2)AEX柱是经具有电导率2.40-2.60mS/cm的pH 7.90-8.10的缓冲液平衡的Q琼脂糖凝胶FF(或带-O-CH₂CHOHCH₂OCH₂CHOHCH₂N⁺(CH₃)₃或-N⁺(CH₃)₃或季胺官能团的AEX树脂)；

(3)AEX柱是经具有电导率2.40-2.60mS/cm的pH 7.90-8.10的缓冲液平衡的POROS50HQ(或带季铵化聚乙烯亚胺官能团的AEX树脂)；

(4)AEX柱是经具有电导率3.90-4.10mS/cm的pH 7.70-7.90的缓冲液平衡的Q琼脂糖凝胶FF(或带-O-CH₂CHOHCH₂OCH₂CHOHCH₂N⁺(CH₃)₃或-N⁺(CH₃)₃或季胺官能团的AEX树脂)；

(5)AEX柱是经具有电导率3.90-4.10mS/cm的pH 7.70-7.90的缓冲液平衡的POROS50HQ(或带季铵化聚乙烯亚胺官能团的AEX树脂)；

(6)AEX柱是经具有电导率9.0±0.1mS/cm的pH 7.70±0.1的缓冲液平衡的Q琼脂糖凝胶FF(或带-O-CH₂CHOHCH₂OCH₂CHOHCH₂N⁺(CH₃)₃或-N⁺(CH₃)₃或季胺官能团的AEX树脂)；或

(7)AEX柱是经具有电导率2.0±0.1mS/cm的pH 8.4±0.1的缓冲液平衡的POROS50HQ(或带季铵化聚乙烯亚胺官能团的AEX树脂)；

在本发明的一个实施方案中，pH 8.30-8.50缓冲液包含：50mM Tris pH 8.4和2.0mS/cm；pH 7.90-8.10缓冲液包含：50mM Tris，10mM乙酸盐pH 8.0和2.5mS/cm；pH7.70-7.90缓冲液包含：50mM Tris，10mM乙酸盐，10mM NaCl pH 7.8和4.0mS/em；pH 7.70+0.1缓冲液包含50mM Tris，60mM NaCl，pH 7.7±0.1；和/或pH 8.4±0.1缓冲液包含50mM Tris，pH 8.4±0.1。

在本发明的一个实施方案中，从宿主细胞和/或宿主细胞化学成分确知生长培养基收获阿柏西普(待例如被化脓性链球菌IdeS或其变体按蛋白酶解方式切割，以产生VEGF微型捕捉体)并且随后在任何AEX色谱纯化之前切割。

在本发明的一个实施方案中，AEX色谱柱以40克蛋白质/升树脂的速率加载。

在本发明的一个实施方案中，在AEX色谱之前和/或之后，通过额外的色谱(例如，混合模式色谱，阳离子交换色谱、蛋白A色谱和/或疏水相互作用色谱(按流通模式或结合和洗脱模式))和/或过滤步骤(例如，深层过滤、病毒过滤、渗滤和/或超滤)纯化VEGF微型捕捉体。

离子交换色谱树脂具有与树脂珠结合的带电荷官能团，所述带电荷官能团吸引具有相反电荷的生物分子或具有相反电荷的表面暴露小区域。阳离子交换树脂带负电荷，而阴离子交换树脂带正电荷。离子交换树脂也划分为“弱”或“强”交换剂。这些术语指官能团离子化状态随pH变动的程度。“弱”交换剂仅在有限pH范围离子化，而“强”交换剂随pH变化不显示离子交换能力变动。弱交换树脂可以随缓冲液pH变化取得或丢失质子，并且加入的电荷变异为结合和洗脱提供额外的选择性维度。强交换剂在宽pH范围无变动并且保持充分带电荷，这可以使分离过程优化，比采用微弱交换剂时更简单。例如，强阴离子交换树脂例如包括具有季胺官能团(例如，-N⁺-(CH₃)₃)的Q琼脂糖凝胶FF或Capto Q；或具有季聚乙烯亚胺官能团的POROS 50HQ。在本发明的一个实施方案中，用例如具有-N⁺-(CH₃)₃或季聚乙烯亚胺官能团的强或微弱阴离子交换剂进行AEX纯化。

本发明还提供一种用于产生本发明VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F、REGN7483^R、REGN7850或REGN7851)的方法，所述方法包括步骤：

(i)在微型捕捉体或阿柏西普表达的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码微型捕捉体或阿柏西普的多核苷酸，并且任选地，从宿主细胞分泌入生长培养基(宿主细胞可以在CDM中培育)；并且

(ii)从宿主细胞和/或培养基取出微型捕捉体或阿柏西普；

(iii)任选地，如果表达的话，通过蛋白A色谱纯化阿柏西普；并且

(iii)如果阿柏西普表达，则用IdeS蛋白酶(例如，FabRICATOR)或其变体对阿柏西普进行蛋白酶解消化，以产生微型捕捉体和Fc片段；任选地，通过蛋白A色谱从组合物移除Fc，其中Fc与蛋白A树脂结合。作为这种方法之产物的微型捕捉体及其组合物(例如，含水组合物)也是本发明的部分。

曝光

可以通过阴离子交换(AEX)色谱纯化减少表征在CDM中表达的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F、REGN7483^R、REGN7850或REGN7851)的棕黄色。微型捕捉体例如已经由宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)在化学成分确知液体生长培养基中表达，可以(在已经移除宿主细胞后)通过施加至AEX树脂(例如，强AEX树脂)上并且保留流通级分中的物质，从生长培养基取出微型捕捉体。另外，已经发现微型捕捉体暴露于光增加棕黄色的出现。因此，最少光暴露可以减少颜色出现。本发明包括在储存用着色容器(例如，棕色小瓶)中放置VEGF微型捕捉体。在本发明的一个实施方案中，实施纯化工艺(例如，包括AEX(流通)色谱)和/或在CDM中表达和/或储存，同时防止任何大于约0.24、0.6、0.96、1.2或2.4百万lux*hr白光暴露量；和/或任何大于约40、100、160、200或400W*h/m²紫外A(UVA)光暴露量的曝光。

细胞培养条件

减少在包含CDM中所表达VEGF微型捕捉体的组合物中棕黄色的其他手段包括调节培养物基质的多种组分的浓度。已经显示半胱氨酸的存在，尤其存在铁和锌时，与棕黄色相关。例如，已经显示降低CDM和培养物补料中的半胱氨酸浓度减少棕黄色。一种减少颜色或降低半胱氨酸浓度的方法是将半胱氨酸替换为胱氨酸或硫酸半胱氨酸和/或降低CDM中的金属铁和/或锌和/或镍和/或铜和/或螯合物含量。例如，在本发明的一个实施方案中，在最初(在第0天)培育宿主细胞的CDM中半胱氨酸浓度是约1.3-1.6(例如，1.3、1.4、1.5或1.6)毫摩尔/升并且在整个培养生长期间添加额外的半胱氨酸补料，例如，每两天(例如，在第2、4、6和8天)添加的1.1-1.4(例如，1.1、1.2、1.3或1.4)毫摩尔/升培养物、1.6-1.9(例如，1.6、1.7、1.8或1.9)毫摩尔/升培养物或2.0-2.3(2.0、2.1、2.2或2.3)毫摩尔/升培养物的补料。在本发明的一个实施方案中，初始培养物基质中包含铁(Fe)、锌(Zn)、铜(Cu)和镍(Ni)，连同螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)和/或柠檬酸。在本发明的一个实施方案中，螯合剂是以约38-190(例如，80、85、90、95、100、105、110、115、120、130、140、150、160、170、180或190)微摩尔的浓度存在的EDTA和以约22-110(例如，22、30、40、50、60、70、80、90、100或110)微摩尔的浓度存在的柠檬酸盐；Fe以约34-125(例如，34、40、50、60、70、75、80、90、100、120或125)微摩尔的浓度存在；Zn以约3-10(例如，3、4、5、6、6.5、7、8、8.5、9或10)微摩尔的浓度存在；Cu以约0.05-0.4(例如，0.05、0.06、0.07、0.08、0.1、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.3或0.4)微摩尔的浓度存在；并且Ni以约0.25-2.0(例如，0.25、0.5、0.6、0.64、0.65、0.70、0.75、1、1.5或2.0)微摩尔的浓度存在。在本发明的一个实施方案中，Fe：Zn：Cu：EDTA：柠檬酸盐：Ni的比率是约441∶38∶1∶500∶294∶4。

已经显示在表达VEGF微型捕捉体的CDM中包括抗氧化剂引起棕黄色减少。例如，在本发明的一个实施方案中，抗氧化剂是亚牛磺酸、牛磺酸、甘氨酸；亚牛磺酸、牛磺酸与甘氨酸的组合；亚牛磺酸、牛磺酸、甘氨酸和谷胱甘肽的组合；硫辛酸和/或维生素C。可以引入的其他抗氧化剂包括胆碱、氢化可的松和维生素E。在本发明的一个实施方案中，初始培养物基质具有浓度约10mM培养物的牛磺酸；浓度约10mM培养物的亚牛磺酸；浓度约10mM培养物的甘氨酸；浓度约0.0024mM培养物的硫辛酸浓度；和/或浓度约0.028mM培养物的维生素C(抗坏血酸)。任选地，初始培养物基质具有浓度约2mM培养物的谷胱甘肽；浓度约1.43mM培养物的氯化胆碱；浓度约0.0014mM培养物的氢化可的松；和/或浓度约0.009mM培养物的维生素E(α-生育酚)。

关于培养物基质组分的浓度，术语“累积的”指在细胞培养期间为CDM形成所添加的某种或多种特定组分的总量或总浓度，所述组分包括在培养伊始(第0天处CDM)添加的组分和后续添加的组分(“化学成分确知补料”)。培养基组分在培养期间经如此代谢，从而若在不同时间添加给定组分，则具有相同累积量的这些组分的培养物将具有不同的绝对水平(例如，开始就全部存在vs.通过补料添加一些)。

在本发明的一些实施方案中，改良的CDM用来产生本发明的VEGF微型捕捉体或其组合物(例如，含水组合物)。通过在改良CDM中培养的宿主细胞产生的微型捕捉体及包含这类微型捕捉体(例如，具有本文中讨论的任一颜色特征)的组合物形成本发明的部分。可以通过降低或升高CDM中氨基酸的累积浓度获得改良的CDM。这类氨基酸的非限制性实例包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸(或其盐)。如与CDM相比，改良的CDM中这些氨基酸的累积量增加或减少可以是约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％和在前述一者或多者中的范围。备选地，如与未改良的CDM相比，改良的CDM中一种或多种氨基酸的累积量增加或减少可以是约5至约20％、约10至约30％、约30％至约40％、约30％至约50％、约40％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、或约90％至约100％和在前述一者或多者中的范围。

在一些实施方案中，可以通过降低CDM中半胱氨酸的累积浓度获得改良的CDM。如与未改良的CDM相比，CDM中半胱氨酸的量减少可以是约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％和在前述一者或多者中的范围。备选地，如与CDM相比，改良的CDM中半胱氨酸的累积量减少可以是约5至约20％、约10-约30％、约30％至约40％、约30％至约50％、约40％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、或约90％至约100％和在前述一者或多者中的范围。在一个方面，改良的CDM中累积性半胱氨酸的量少于约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM或约10mM。

在一些实施方案中，可以通过将CDM中至少某个％的累积性半胱氨酸替换为胱氨酸，获得改良的CDM。如与CDM相比，替换可以是约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，及前述一者或多者内部的范围。备选地，如与未改良的CDM相比，替换可以是约5至约20％、约10至约30％、约30％至约40％、约30％至约50％、约40％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、或约90％至约100％和在前述一者或多者中的范围。

在一些实施方案中，可以通过将CDM中至少某个％的累积性半胱氨酸替换为硫酸半胱氨酸，获得改良的CDM。如与CDM相比，替换可以是约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，及前述一者或多者内部的范围。备选地，如与未改良的CDM相比，替换可以是约5至约20％、约10-约30％、约30％至约40％、约30％至约50％、约40％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、或约90％至约100％和在前述一者或多者中的范围。

在一个实施方案中，通过一种包括在CDM中合适条件下培养宿主细胞的方法产生VEGF微型捕捉体，其中通过降低CDM中铁的累积浓度至小于或等于约50μM获得合适的条件。在一个实施方案中，通过一种包括在CDM中合适条件下培养宿主细胞的方法产生VEGF微型捕捉体，其中通过降低CDM中铜的累积浓度至小于或等于约0.1μM获得合适的条件。在一个实施方案中，通过一种包括在CDM中合适条件下培养宿主细胞的方法产生VEGF微型捕捉体，其中通过降低CDM中锌的累积浓度至小于或等于约5μM获得合适的条件。包含这类微型捕捉体的组合物(例如，含水组合物)是本发明的部分，例如，其中这类组合物具有如本文中所述的颜色特征。

在一些实施方案中，可以通过降低或升高CDM中金属的累积浓度获得改良的CDM。金属的非限制性实例包括铁、铜、锰、钼、锌、镍、钙、钾和钠。如与CDM相比，改良的CDM中一种或多种金属的量增加或减少可以是约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％和在前述一者或多者中的范围。备选地，如与未改良的CDM相比，改良的CDM中一种或多种金属的累积量增加或减少可以是约5至约20％、约10至约30％、约30％至约40％、约30％至约50％、约40％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、或约90％至约100％和在前述一者或多者中的范围。

在一些实施方案中，改良的CDM包含一种或多种抗氧化剂。抗氧化剂的非限制性实例可以包括牛磺酸亚牛磺酸、甘氨酸、硫辛酸、谷胱甘肽、氯化胆碱、氢化可的松、维生素C、维生素E及其组合。在一些实施方案中，改良的CDM包含约0.01mM至约20mM的牛磺酸，即，0.01mM至约1mM、约0.01mM至约5mM、约0.01mM至约10mM，0.1mM至约1mM、约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约10mM、约1mM至约5mM、约1mM至约10mM和在前述一者或多者中的范围的牛磺酸。在一些实施方案中，改良的CDM包含约0.01mM至约20mM的亚牛磺酸，即，0.01mM至约1mM、约0.01mM至约5mM、约0.01mM至约10mM，0.1mM至约1mM、约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约10mM、约1mM至约5mM、约1mM至约10mM和在前述一者或多者中的范围的亚牛磺酸。在一些实施方案中，改良的CDM包含约0.01mM至约20mM的甘氨酸，即，0.01mM至约1mM、约0.01mM至约5mM、约0.01mM至约10mM，0.1mM至约1mM、约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约10mM、约1mM至约5mM、约1mM至约10mM和在前述一者或多者中的范围的甘氨酸。在一些实施方案中，改良的CDM包含约0.01nM至约5nM的硫辛酸，即，约0.01nM至约0.1nM、约0.1nM至约1nM、约1nM至约2.5nM、约1nM至约3nM、约1nM至约5nM，和在前述一者或多者中的范围的硫辛酸。在一些实施方案中，改良的CDM包含约0.01mM至约5mM的谷胱甘肽，即，0.01mM至约1mM，0.1mM至约1mM、约0.1mM至约5mM、约1mM至约5mM和在前述一者或多者中的范围的谷胱甘肽。在一些实施方案中，改良的CDM包含约0.01mM至约5mM的氯化胆碱，即，0.01mM至约1mM、0.1mM至约1mM、约0.1mM至约5mM、约1mM至约5mM和在前述一者或多者中的范围的氯化胆碱。在一些实施方案中，改良的CDM包含约0.01nM至约5nM的氢化可的松，即，约0.01nM至约0.1nM、约0.1nM至约1nM、约1nM至约2.5nM、约1nM至约3nM、约1nM至约5nM，和在前述一者或多者中的范围的氢化可的松。在一些实施方案中，改良的CDM包含约1mM至约50mM的维生素C，即，约1mM至约5mM、约5mM至约20mM、约10mM至约30mM、约5mM至约30mM、约20mM至约50mM、约25mM至约50mM，和在前述一者或多者中的范围的维生素C。在一些实施方案中，改良的CDM包含约1mM至约50mM的维生素E，即，约1mM至约5mM、约5mM至约20mM、约10mM至约30mM、约5mM至约30mM、约20mM至约50mM、约25mM至约50mM，和在前述一者或多者中的范围的维生素E。

糖基化

通过调节其糖基化的方法产生的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)以及其例如具有如本文中所讨论之颜色特征的组合物(例如，含水组合物)形成本发明的部分。可以通过使培育表达微型捕捉体的宿主细胞的CDM中某些组分的累积浓度变动，使糖基化变动。基于向CDM添加的组分的累积量，可以使总％岩藻糖基化、总％半乳糖基化、总％唾液酸化和甘露糖-5变动。

在本发明的一个实施方案中，VEGF微型捕捉体是去唾液酸化的。

在一些示例性实施方案中，调节VEGF微型捕捉体糖基化的方法可以包括用尿苷补充CDM。VEGF微型捕捉体可以具有约40％至约50％的总岩藻糖基化聚糖、约30％至约55％的总唾液酸化聚糖、约6％至约15％的甘露糖-5和约60％至约79％的半乳糖化聚糖。

在一些示例性实施方案中，调节VEGF微型捕捉体糖基化的方法可以包括用锰补充CDM。如此处讨论的CDM在补充之前缺少锰。VEGF微型捕捉体可以具有约40％至约50％的总岩藻糖基化聚糖、约30％至约55％的总唾液酸化聚糖、约6％至约15％的甘露糖-5和约60％至约79％的半乳糖化聚糖。

在一些示例性实施方案中，调节VEGF微型捕捉体糖基化的方法可以包括用半乳糖补充CDM。如此处讨论的CDM在补充之前缺少半乳糖。VEGF微型捕捉体可以具有约40％至约50％的总岩藻糖基化聚糖、约30％至约55％的总唾液酸化聚糖、约6％至约15％的甘露糖-5和约60％至约79％的半乳糖化聚糖。

在一些示例性实施方案中，调节VEGF微型捕捉体糖基化的方法可以包括用地塞米松补充CDM。如此处讨论的CDM在补充之前缺少地塞米松。VEGF微型捕捉体可以具有约40％至约50％的总岩藻糖基化聚糖、约30％至约55％的总唾液酸化聚糖、约6％至约15％的甘露糖-5和约60％至约79％的半乳糖化聚糖。

在一些示例性实施方案中，调节VEGF微型捕捉体糖基化的方法可以包括用以下一者或多者补充CDM：尿苷、锰、半乳糖和地塞米松。如此处讨论的CDM在补充之前缺少尿苷、锰、半乳糖和地塞米松中的一者或多者。抗VEGF蛋白可以具有约40％至约50％的总岩藻糖基化聚糖、约30％至约55％的总唾液酸化聚糖、约6％至约15％的甘露糖-5和约60％至约79％的半乳糖化聚糖。

在本发明的一个实施方案中，本发明组合物中的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)中，

·少于约0.1％是三木糖基化的

·约1.5％是二木糖基化的；

·约15％是单木糖基化的；

·约0.9％或少于约1％是经木糖-半乳糖修饰的；和/或

·约0.7％或少于约1％是经木糖-半乳糖-唾液酸修饰的。

在本发明的一个实施方案中，在本发明组合物的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)中

·约8％的第5精氨酸残基；

·少于约0.1％的第153精氨酸残基；和/或

·少于约0.1％的第96精氨酸残基；

是经3-脱氧葡糖醛酮修饰的。

·约0.1％的第5精氨酸残基；

·约1.0或1.1％的第62赖氨酸残基；

·约0.4％或更少的第68赖氨酸残基；

·约0.6％或更少的第149赖氨酸残基；和/或

·少于约0.1％的第185赖氨酸残基；

是经糖化的。

在本发明的一个实施方案中，在包含VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)的组合物中，

·约98％或更多的第36天冬酰胺残基，例如，其对应于(R)VTSPNITVTLK(加下划线)(SEQ ID NO：12的氨基酸31-42)；

·约51％、52％、53％、54％或55％的第68天冬酰胺残基，例如，其对应于(K)GFIISNATYK(加下划线)(SEQ ID NO：12的氨基酸62-72)；

·约99％或更多的第123天冬酰胺残基，例如，其对应于(K)LVLNCTAR(加下划线)(SEQ ID NO：12的氨基酸119-127)；和/或

·约44％、50％、60％、70％、80％、90％、98或99％的第196天冬酰胺残基，例如，其对应于(K)NSTFVR(SEQ ID NO：12的氨基酸195-201)；

是N-糖基化的。

已经显示糖基化对生物治疗药的安全性和功能具有巨大影响。获得具备有利糖基化特征的微型捕捉体将高度有益于它们成功用于治疗生血管眼病。从总体上看，已经显示VEGF拮抗剂具有直接或间接归咎于其抗VEGF作用的常见不良血管作用，包括高血压、肾血管损伤(经常表现为蛋白尿和血栓性微血管病)和充血性心力衰竭。因此，借以减少接受玻璃体内注射微型捕捉体的受试者的全身暴露量的任何手段将有益。认为玻璃体内注射的VEGF拮抗剂少量渗漏入全身循环，在那里它们可以具有这类不良作用。参见例如，Avery RL等人，Comparison of Systemic Pharmacokinetics Post Anti-VEGF IntravitrealInjections of Ranibizumab，Bevacizumab and Aflibercept(抗VEGF玻璃体内注射来尼珠单抗(Ranibizumab)、贝伐单抗(Bevacizumab)和阿柏西普后全身性药代动力学的比较)(摘要).2013年美国视网膜专家协会(ASRS)年会演讲；多伦多，2013年8月25日；Avery等人，Intravitreal bevacizumab(Avastin)in the treatment of proliferative diabeticretinopathy(玻璃体内贝伐单抗(阿瓦斯汀)治疗增生性糖尿病性视网膜病变).Ophthalmology 2006；113：1695-705；Matsuyama等人，Plasma levels of vascularendothelial growth factor and pigment epithelium-derived factor before andafter intravitreal injection ofbevacizumab(玻璃体内注射贝伐单抗前后血管内皮生长因子和色素上皮衍生因子的血浆水平).Br J Ophthalmol2010；94：1215-18；和Carneiro等人，Vascular endothelial growth factor plasma levels before and aftertreatment of neovascular age-related macular degeneration with bevacizumab orranibizumab(用贝伐单抗或来尼珠单抗(ranibizumab)治疗新生血管性年龄相关黄斑变性前后的血管内皮生长因子血浆水平).Acta Ophthalmol 2012；90：e25-30。本文展示的体内研究表明全身施用时，微型捕捉体具有比阿柏西普更短的半寿期(参见实施例6)。这种影响的一个原因可能是微型捕捉体的糖基化特征。已在化学成分确知培养基中产生的REGN7483^F已知在N123和N196-a上具有特别高的高甘露糖聚糖水平，高于对阿柏西普观察的水平。如下文在表C中和在图14(A和C)中进一步讨论，组合物中约30-40％的受测N123和N196高度甘露糖化。在阿柏西普中观察到阿柏西普具有约6-13％的这些残基高度甘露糖化。已经显示抗体中的高甘露糖聚糖导致全身快速清除和半寿期较短。参见Goetze等人，High-mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increaseserum clearance in humans(治疗性IgG体Fc区上的高甘露糖聚糖提高人体中的血清清除率)，Glycobiology21(7)：949-959(2011)。这可以归因于被甘露糖受体结合，所述甘露糖受体从血液消除含有高甘露糖的病原体。相似机理可能造成全身快速清除微型捕捉体。

在本发明的一个方面，VEGF微型捕捉体组合物的糖基化特征如下：约40％至约50％的总岩藻糖基化聚糖、约30％至约55％的总唾液酸化聚糖、约6％至约15％的甘露糖-5、和约60％至约79％的半乳糖化聚糖。在本发明的一个方面，微型捕捉体在约32.4％的第123天冬酰胺残基和/或约27.1％的第196天冬酰胺残基处具有Man5糖基化。

例如，本发明的组合物包含本发明的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)，所述微型捕捉体例如已经在CHO细胞中及CDM中表达并且通过如本文中所述的AEX流通色谱纯化，包含：

·在约30-35％的第123天冬酰胺残基处的Man5糖基化；

·在约25-30％的第196天冬酰胺残基处Man5糖基化；

·在约6-8％的第36天冬酰胺残基处Man6-磷酸糖基化；

·在约3-4％的第123天冬酰胺残基处Man7糖基化；

·在约38％的第123天冬酰胺残基处高甘露糖糖基化；和/或

·在约29％的第196天冬酰胺残基处高甘露糖糖基化。

本发明还包括一种VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F或REGN7483^R)，所述微型捕捉体包含Asn123处的Man5糖基化；Asn196处的Man5糖基化；Asn36处的Man6-磷酸糖基化；和/或Asn123处的Man7糖基化。

在本发明的一个实施方案中，本发明的VEGF微型捕捉体可以包含下文所列的多种糖基化之一。包含本发明微型捕捉体的组合物(例如，含水组合物)也是本发明的部分，其中所述微型捕捉体包括例如按所示百分数频率具有这类糖基化的微型捕捉体分子。

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约1.00％)和/或Asn196(例如，约1.40％)处的G0-GlcNAc糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约4.80％)和/或Asn196(例如，约2.70％)处的G1-GlcNAc糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约4.10％)和/或Asn196(例如，约2.20％)处的G1S-GlcNAc糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约0％)处的G0糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约6.10％)处的G1糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约1.90％)处的G1S糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约11.50％)和/或Asn196(例如，约18.10％)处的G2糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约14.50％)和/或Asn196(例如，约18.40％)处的G2S糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约1.50％)和/或Asn196(例如，约3.70％)处的G2S2糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约0％)处的G0F糖基化；

·Asn36(例如，按2.00％)、Asn68(例如，约2.00％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约0％)处的G2F2S糖基化；

·Asn36(例如，按1.60％)、Asn68(例如，约0.50％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约0％)处的G2F2S2糖基化；

·Asn36(例如，按5.60％)、Asn68(例如，约6.10％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约0％)处的G1F糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约3.80％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约0％)处的G1FS糖基化；

·Asn36(例如，按20.20％)、Asn68(例如，约28.00％)、Asn123(例如，约1.80％)和/或Asn196(例如，约2.10％)处的G2F糖基化；

·Asn36(例如，按35.20％)、Asn68(例如，约48.90％)、Asn123(例如，约2.80％)和/或Asn196(例如，约2.20％)处的G2FS糖基化；

·Asn36(例如，按22.40％)、Asn68(例如，约9.10％)、Asn123(例如，约0.30％)和/或Asn196(例如，约0.60％)处的G2FS2糖基化；

·Asn36(例如，按3.40％)、Asn68(例如，约1.60％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约0％)处的G3FS糖基化；

·Asn36(例如，按1.70％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约0％)处的G3FS3糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约3.40％)和/或Asn196(例如，约2.60％)处的G0-2GlcNAc糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约0.50％)和/或Asn196(例如，约1.60％)处的Man4糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约3.60％)和/或Asn196(例如，约2.10％)处的Man4_A1G1糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约4.60％)和/或Asn196(例如，约3.00％)处的Man4_A1G1S1糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约32.40％)和/或Asn196(例如，约27.10％)处的Man5糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约4.80％)和/或Asn196(例如，约2.80％)处的Man5_A1G1糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约3.30％)和/或Asn196(例如，约1.50％)处的Man5_A1G1S1糖基化；

·Asn36(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约1.30％)和/或Asn196(例如，约0％)处的Man6糖基化；

·Asn36(例如，按1.70％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约0％)处的Man6_G0+磷酸糖基化；

·Asn36(例如，按6.20％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约0％)和/或Asn196(例如，约0％)处的Man6+磷酸糖基化；

·Asn36处(例如，按约0％)、Asn68(例如，约0％)、Asn123(例如，约3.60％)和/或Asn196(例如，约0％)的Man7糖基化；

·图14(A或C)中所示天冬酰胺处的任一糖基化(例如，以大约所示水平)，无论对

REGN7483^F、REGN7483^R、REGN7711或本文所述的包含VTSPNITVTLK；

KGFIISNATYK；GFIISNATYK；LVLNCTAR；KNSTFVR或NSTFVR基序和/或

N36、N68、N123或N196残基的另一个VEGF微型捕捉体而言；和/或；

·本文表C(a或b)中所示天冬酰胺处的任一糖基化(例如，以大约所示水平)，无论对REGN7483^F或本文所述的包含N36、N68、N123或N196残基的另一个VEGF微型捕捉体而言；和/或

·本文表D的任一糖基化(例如，以大约所示水平)，无论对REGN7483^F或本文所述的另一个VEGF微型捕捉体而言

包含本发明VEGF微型捕捉体的组合物(例如，含水组合物)可以包括表C中所示的多种糖基化之一，例如，按显示的百分数频率包含(例如，所示百分数的全部糖基化，例如，所示百分数值的±10％)。在本发明的一个实施方案中，本发明的VEGF微型捕捉体可以包含下文所列的多种糖基化之一，例如，在一个或多个所示残基处包含。

表C^*.翻译后糖基修饰

(a)

X：未观察到所示的糖基化

(b)对REGN7483^R和REGN7483^F中N36、N68、N123和N196上观察到的聚糖(第二实验)

^*聚糖残基(G0-GlcNAc；G1-GlcNAc；G1S-GlcNAc；G0；G1；G1S；G2；G2S；G2S2；G0F；G2F2S；G2F2S2；G1F；G1FS；G2F；G2FS；G2FS2；G3FS；G3FS3；G0-2GlcNAc；Man4；Man4_A1G1；Man4_A1G1S1；Man5；Man5_A1G1；Man5_A1G1S1；Man6；Man6_G0+磷酸；Man6+磷酸和Man7)的结构是经标准化的-参见Varki等人，Symbol nomenclaturefor glycan representation(用于再现聚糖的符号命名法)，Proteomics 9：5398-5399(2009)；Harvey等人，Proposal fora standard system for drawing structural diagrams of N-and O-linkedcarbohydrates and related compounds(绘制N连接糖类和O连接糖类及相关化合物结构简图的标准体制提议).Proteomics 2009，9，3796-3801；Kornfeld等人，The synthesis ofcomplex-type oligosaccharides II characterization of the processingintermediates in the synthesis of the complex oligosaccharide units of thevesicular stomatitis virus G protein (合成复杂型低聚糖II对合成水泡性口炎病毒G蛋白复杂低聚糖单元中加工用中间体的表征).J Biol Chem.1978，253，7771-7778；Varki等人，(编著)，Essentials of Glycobiology(糖生物学基础)，第1版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，NY 1999；Varki等人，(编著)，Essentials ofGlycobiology(糖生物学基础)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY 2009；和Dwek，Glycobiology：Moving into the mainstream (糖生物学基础：走向主流).Cell 2009，137，1175-1176。REGN7483^R和阿柏西普用来产生在CDM中表达的REGN7483^F。

本发明包括了包含VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F)的组合物，所述微型捕捉体包含任一个或多个在下表D中所示的糖基化百分数。

表D.REGN7483^F样品中的糖基化百分数

	REGN7483<sup>F</sup>	REGN7483<sup>F</sup>	REGN7483<sup>F</sup>
				岩藻糖基化％	42.9％	57.8％	57.2％
半乳糖基化％	71.6％	92.9％	93.7％
				唾液酸化％	33.1％	47.6％	44.8％
高甘露糖％	17.6％	2.6％	2.3％
				对分(Bisecting)％	1.9％	0.4％	0.4％

在本发明的一些示例性实施方案中，VEGF微型捕捉体可以具有水平降低约1％、1.2％、1.5％、2％、2.2％、2.5％、3％、3.2％、3.5％、4％、4.2％、4.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的岩藻糖基化聚糖。与使用非CDM产生的VEGF微型捕捉体中岩藻糖基化聚糖的水平相比，为前述一个或多个值中的范围，例如，1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、1-30％、1-35％、1-40％、1-41％、1-42％、1-43％、1-44％、1-45％、1-46％、1-47％、1-48％、1-49％、1-50％、2-10％、2-15％、2-20％、2-25％、2-30％、2-35％、2-40％、2-41％、2-42％、2-43％、2-44％、2-45％、2-46％、2-47％、2-48％、2-49％、2-50％、3-10％、3-15％、3-20％、3-25％、3-30％、3-35％、3-40％、3-41％、3-42％、3-43％、3-44％、3-45％、3-46％、3-47％、3-48％、3-49％、3-50％、4-10％、4-15％、4-20％、4-25％、4-30％、4-35％、4-40％、4-41％、4-42％、4-43％、4-44％、4-45％、4-46％、4-47％、4-48％、4-49％、4-50％或1-99％。

在本发明的一些示例性实施方案中，VEGF微型捕捉体可以具有水平降低约1％、1.2％、1.5％、2％、2.2％、2.5％、3％、3.2％、3.5％、4％、4.2％、4.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的唾液酸化聚糖。与使用非CDM产生的VEGF微型捕捉体中唾液酸化聚糖的水平相比，为前述一个或多个值中的范围，例如，1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、1-30％、1-35％、1-40％、1-41％、1-42％、1-43％、1-44％、1-45％、1-46％、1-47％、1-48％、1-49％、1-50％、2-10％、2-15％、2-20％、2-25％、2-30％、2-35％、2-40％、2-41％、2-42％、2-43％、2-44％、2-45％、2-46％、2-47％、2-48％、2-49％、2-50％、3-10％、3-15％、3-20％、3-25％、3-30％、3-35％、3-40％、3-41％、3-42％、3-43％、3-44％、3-45％、3-46％、3-47％、3-48％、3-49％、3-50％、4-10％、4-15％、4-20％、4-25％、4-30％、4-35％、4-40％、4-41％、4-42％、4-43％、4-44％、4-45％、4-46％、4-47％、4-48％、4-49％、4-50％或1-99％。

在本发明的一些示例性实施方案中，VEGF微型捕捉体可以具有水平降低约1％、1.2％、1.5％、2％、2.2％、2.5％、3％、3.2％、3.5％、4％、4.2％、4.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的半乳糖化聚糖。与使用非CDM产生的VEGF微型捕捉体中半乳糖化聚糖的水平相比，为前述一个或多个值中的范围，例如，1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、1-30％、1-35％、1-40％、1-41％、1-42％、1-43％、1-44％、1-45％、1-46％、1-47％、1-48％、1-49％、1-50％、2-10％、2-15％、2-20％、2-25％、2-30％、2-35％、2-40％、2-41％、2-42％、2-43％、2-44％、2-45％、2-46％、2-47％、2-48％、2-49％、2-50％、3-10％、3-15％、3-20％、3-25％、3-30％、3-35％、3-40％、3-41％、3-42％、3-43％、3-44％、3-45％、3-46％、3-47％、3-48％、3-49％、3-50％、4-10％、4-15％、4-20％、4-25％、4-30％、4-35％、4-40％、4-41％、4-42％、4-43％、4-44％、4-45％、4-46％、4-47％、4-48％、4-49％、4-50％或1-99％。

在本发明的一些示例性实施方案中，VEGF微型捕捉体可以具有水平升高约1％、1.2％、1.5％、2％、2.2％、2.5％、3％、3.2％、3.5％、4％、4.2％、4.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的甘露糖化聚糖。与使用非CDM产生的VEGF微型捕捉体中甘露糖化聚糖的水平相比，为前述一个或多个值中的范围，例如，1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、1-30％、1-35％、1-40％、1-41％、1-42％、1-43％、1-44％、1-45％、1-46％、1-47％、1-48％、1-49％、1-50％、2-10％、2-15％、2-20％、2-25％、2-30％、2-35％、2-40％、2-41％、2-42％、2-43％、2-44％、2-45％、2-46％、2-47％、2-48％、2-49％、2-50％、3-10％、3-15％、3-20％、3-25％、3-30％、3-35％、3-40％、3-41％、3-42％、3-43％、3-44％、3-45％、3-46％、3-47％、3-48％、3-49％、3-50％、4-10％、4-15％、4-20％、4-25％、4-30％、4-35％、4-40％、4-41％、4-42％、4-43％、4-44％、4-45％、4-46％、4-47％、4-48％、4-49％、4-50％或1-99％。

其他翻译后修饰(PTM)

在本发明的一个实施方案中，包含本发明VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)的组合物具有其他的PTM如游离硫醇、三硫键、脱酰胺、甲硫氨酸氧化和C末端氨基酸丢失。

在本发明的一个实施方案中，组合物中本发明VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)的铰链区中约0％的半胱氨酸和/或在组合物中本发明VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)的VEGFR1和/或VEGFR2结构域中约0.3％或更少的半胱氨酸是游离硫醇；例如；相对于VEGFR1中的半胱氨酸(对应于ELVIPCR，加下划线者)、VEGFR2中的半胱氨酸(对应于LVLNCTAR，加下划线者(SEQ ID NO：12的氨基酸120-127))和/或铰链区中的半胱氨酸(对应于THTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：12的氨基酸208-221)或THTCPPCPPC(SEQ ID NO：28的氨基酸208-217)，加下划线者)而言如此。

在本发明的一个实施方案中，本发明组合物的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)的铰链区中约4％或更少的半胱氨酸和/或本发明组合物的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)的VEGFR1和/或VEGFR2结构域中约0.1％或更少的半胱氨酸处于三硫键中；例如；对于VEGFR1中的半胱氨酸(对应于ELVIPCR(SEQ IDNO：12的氨基酸25-31)和EIGLLTCEATVNGHLYK(SEQ ID NO：12的氨基酸73-89)，加下划线者)、VEGFR2中的半胱氨酸(对应于LVLNCTAR(SEQ ID NO：12的氨基酸120-127)和SDQGLYTCAASSGLMTK(K)(SEQ ID NO：12的氨基酸178-195)，加下划线者)和/或铰链区中的半胱氨酸(对应于THTCPPCPAPELLG和THTCPPCPAPELL(G)(SEQ ID NO：12的氨基酸208-221)或THTCPPCPPC和THTCPPCPPC(SEQ ID NO：28的氨基酸208-217)，加下划线者)而言如此。

在本发明的一个实施方案中，本发明组合物的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)中少于约0.1％的半胱氨酸处于链内二硫键和/或三硫键中。

在本发明的一个实施方案中，本发明组合物的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)中多于约99％(例如，约99.8％)的二硫桥处于平行形式。

在本发明的一个实施方案中，本发明组合物的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)中约3％的第84天冬酰胺残基(例如，对应于EIGLLTCEATVNGHLYK(SEQID NO：12的氨基酸73-89)的天冬酰胺(加下划线))脱酰胺以形成琥珀酰亚胺。在本发明的一个实施方案中，约18、19、20、21或22％的所述天冬酰胺脱酰胺化以形成天冬氨酸/异天冬氨酸。

在本发明的一个实施方案中，本发明组合物的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)中少于约5％的第99天冬酰胺残基(例如，对应于QTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEK(SEQ ID NO：12的氨基酸97-119)的天冬酰胺(加下划线))脱酰胺以形成琥珀酰亚胺。在本发明的一个实施方案中，少于约1％的所述天冬酰胺脱酰胺化以形成天冬氨酸/异天冬氨酸。

在本发明的一个实施方案中，本发明组合物的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)中约2％或更少的第10甲硫氨酸残基(例如，对应于SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGR(SEQ ID NO：12的氨基酸1-24)的甲硫氨酸(加下划线))氧化。

在本发明的一个实施方案中，本发明组合物的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)中约3％或更少的第20甲硫氨酸残基(例如，对应于SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGR(SEQ ID NO：12的氨基酸1-24)的甲硫氨酸(加下划线))氧化。

在本发明的一个实施方案中，本发明组合物的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)中约2％或更少的第163甲硫氨酸残基(例如，对应于TQSGSEMK(SEQID NO：12的氨基酸157-164)的甲硫氨酸(加下划线))氧化。

在本发明的一个实施方案中，本发明组合物的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)中约4.3％或更少的第192甲硫氨酸残基(例如，对应于SDQGLYTCAASSGLMTK(SEQ ID NO：12的氨基酸178-194)的甲硫氨酸(加下划线))氧化。

在本发明的一个实施方案中，本发明组合物中的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483、REGN7850或REGN7851)中约0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的C末端甘氨酸丧失/缺失。

·约1.5％或更少的第5精氨酸残基

·少于约0.1％的第62赖氨酸残基；和/或

·少于约0.1％的第185赖氨酸残基；

是羧甲基化的。

具有以下特征中任一者或多者的VEGF微型捕捉体和包含VEGF微型捕捉体的组合物也形成本发明的部分：

·天冬酰胺脱酰胺化，例如，在Asn84(例如，约27％)、Asn99(例如，约0.5-1.0％)和/或Asn152(例如，约2.5-3.0％)处。

·Asp琥珀酰亚胺+异构化，例如，在Asp173(例如，约2％)处。例如，其中天冬氨酸-甘氨酸转化成L-琥珀酰胺基中间体

并且异构化成异天冬氨酸-甘氨酸和/或Asn-甘氨酸。参见例如，Stephenson和Clarke，Succinimide Formation from Aspartyl and AsparaginylPeptides as a Model for the Spontaneous Degradation ofProteins (琥珀酰亚胺从天冬氨酰肽和天冬酰胺酰肽形成作为蛋白质自发降解模型)，J.Biol.Chem.264(11)：6164-6170(1989)。

·甲硫氨酸氧化，例如，在Met10(例如，约5-6％)、Met20(例如，约2％)、Met163(例如，约7％)和/或Met192(例如，约6-7％)处，例如，在甲硫氨酸亚砜和/或甲硫氨酸砜处氧化。

·Trp二氧化，例如，Trp58二氧化(例如，约0.3％)，例如，以形成N-甲酰基犬尿氨酸。

·Arg 3-脱氧葡糖醛酮形成，例如，在Arg5(例如，约8.1％)处形成。

·C末端甘氨酸丢失(例如，约7.2％)。

·非糖基化的N连接的糖基化位点，例如，在Asn36(例如，约1.7％)、Asn68(例如，约47.3％)、Asn123(例如，约0.2％)和/或Asn196(例如，约0.8％)处。

多核苷酸和制造方法

编码本文所述的任何VEGF微型捕捉体多肽的分离的多核苷酸形成本发明的部分，包含该多核苷酸的载体和/或包括本文所述的多核苷酸，载体，VEGF微型捕捉体和/或多肽的宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)也形成本发明的部分。这类宿主细胞也形成本发明的部分。

多核苷酸包括DNA和RNA。本发明包括本发明的任何多核苷酸，例如，编码本文所述的VEGF微型捕捉体多肽的多核苷酸(例如，SEQ ID NOs：10-13、26、27、28、30、32或33中任一者)。任选地，多核苷酸与启动子或其他表达控制序列有效连接。在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸与分泌信号序列融合。这类多核苷酸编码的多肽也处于本发明的范围内。

本发明包括一种包含以下核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码前体VEGF捕捉体，所述前体VEGF捕捉体可以例如用酶切割，以移除Fc多聚化组分，留下铰链序列，所述铰链序列可以与相似分子上另一个铰链序列结合，因此产生同型二聚体VEGF微型捕捉体：

REGN7843-VEGF微型捕捉体-hFc DKTHCPPCPAPELLG

(SEQ ID NO：14)

REGN7850-VEGF微型捕捉体-hFc DKTHCPPCPPC

(SEQ ID NO：15)

REGN7851-VEGF微型捕捉体-hFc DKTHCPPCPPCPPC

(SEQ ID NO：16)

通常，“启动子”或“启动子序列”是能够在细胞中(例如，直接或通过其他启动子结合蛋白或物质)结合RNA聚合酶并且启动编码性序列转录的DNA调节区。启动子可以有效连接于其他表达控制序列(包括增强子和阻遏蛋白序列)和/或本发明的多核苷酸。可以用来控制基因表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利号5,385,839和5，168,062)、SV40早期启动子区域(Benoist等人，(1981)Nature 290：304-310)、劳斯肉瘤病毒3′长末端重复序列中所容纳的启动子(Yamamoto等人，(1980)Cell 22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，(1982)Nature 296：39-42)；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(VIIIa-Komaroff等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3727-3731)、或tac启动子(DeBoer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25))；也参见ScientificAmerican(1980)242：74-94中的″Useful proteins from recombinant bacteria(来自重组细菌的有用蛋白质)″；和来自酵母或其他真菌的启动子元件如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子或碱性磷酸酶启动子。

当在细胞或其他表达系统中时，编码多肽的多核苷酸“有效连接”至启动子或其他表达控制序列，该序列指导RNA聚合酶介导编码性序列转录成RNA、优选地mRNA，所述RNA随后可以经历RNA剪接(如果它含有内含子)并且任选地翻译成编码性序列编码的蛋白质。

本发明包括编码VEGF微型捕捉体多肽链的多核苷酸，所述多核苷酸是本文具体描述其核苷酸序列的那些多核苷酸的变体。多核苷酸的“变体”指一种多核苷酸，当通过BLAST算法进行比较时，所述多核苷酸包含与本文所述的参考核苷酸序列(例如，SEQ ID NOs：14-16中任一者)至少约70-99.9％(例如，70、72、74、75、76、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9％)同一的氨基酸序列；其中选择该BLAST算法的参数以给出相应的参考序列的整个长度范围内相应序列之间的最大匹配(例如，期望阈值：10；字长：28；查询范围内的最大匹配：0；匹配/错配评分：l，-2；空位代价：线性)。在本发明的一个实施方案中，本文具体所述的核苷酸序列的变体相对于SEQ ID NOs：14-16中任一者包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)点突变、一个或多个核苷酸的插入(例如，符合可读框插入)或缺失(例如，符合可读框缺失)。在本发明的一个实施方案中，这类突变可以是错义或无义突变。在本发明的一个实施方案中，这种变体多核苷酸编码保持与VEGF特异性结合的VEGF微型捕捉体多肽链。

真核宿主细胞和原核宿主细胞(包括哺乳动物细胞)可以用作表达抗VEGF微型捕捉体多肽的宿主。这类宿主细胞是本领域熟知的并且许多是从美国典型培养物保藏中心(ATCC)可获得的。这些宿主细胞尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO K1、EESYR、NICE、NS0、Sp2/0、胚肾细胞和BHK细胞。本发明包括分离的宿主细胞(例如，CHO细胞或上文所述的任何类型宿主细胞)，所述宿主细胞包含一种或多种VEGF微型捕捉体多肽(或其变体)和/或编码这种(类)多肽的多核苷酸(例如，如本文所讨论者)。

可以通过任何向宿主细胞引入多核苷酸的已知方法来转化。将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法是本领域熟知的并且包括葡聚糖介导的转染法、磷酸钙沉淀法、聚凝胺(polybrene)介导的转染法、原生质体融合法、电穿孔法、脂质体中多核苷酸的包封法、生物射弹注射和向胞核直接微量注射DNA。此外，可以由病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞。本领域熟知转化细胞的方法。参见例如美国专利号4399216；4912040；4740461和4959455。因此，本发明包括用于制备VEGF微型捕捉体的重组方法，所述方法包括

(i)将一个或多个编码VEGF微型捕捉体多肽的多核苷酸(例如，包含SEQ ID NOs：14-16中一者或多者的核苷酸序列；或其变体)引入宿主细胞，例如，其中多核苷酸处于载体中；和/或整合至宿主细胞染色体中和/或与启动子有效连接；

(ii)在有利于多核苷酸表达的条件下培养宿主细胞(例如，CHO或毕赤酵母(Pichia)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))，并且

(iii)任选地，从宿主细胞和/或培育宿主细胞的培养基分离VEGF微型捕捉体或其链。当产生包含两条或更多条多肽链的VEGF微型捕捉体时，在单个宿主细胞中共表达诸链导致链缔合，例如，在细胞中或在细胞表面上或细胞外部缔合(如果此类链被分泌)，从而形成同型二聚体微型捕捉体。本发明还包括作为本文所述生产方法之产物的VEGF微型捕捉体，并且任选地，本文中描述纯化操作。

存在本领域已知的借以产生重组抗体的若干方法。US4816567中公开了用于重组产生抗体的方法的一个实例。重组VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7850或REGN7851)是本发明的部分。

本发明还提供一种从VEGF捕捉体(例如，阿柏西普或康柏西普)产生本文所述VEGF微型捕捉体(例如，同型二聚体VEGF微型捕捉体)的方法，所述方法包括、由以下组成或基本上由以下组成：用蛋白酶对VEGF捕捉体进行蛋白酶解，所述蛋白酶在Fc铰链结构域的免疫球蛋白Fc多聚化组分以下切割VEGF捕捉体(至其C端侧)。例如，可以用化脓性链球菌IdeS(例如，FabRICATOR蛋白酶；Genovis，Inc.；Cambridge，MA；Lund，瑞典)或马链球菌(Streptococcusequi)兽疫亚种IdeZ(New England Biolabs二Ipswich，MA)进行蛋白酶解。在本发明的一个实施方案中，这种方法缺少任何包括显著修饰此种VEGF微型捕捉体多肽中氨基酸残基的步骤(例如，定向化学修饰如聚乙二醇化或碘乙酰胺化)和/或二硫桥还原。这种产生方法的VEGF微型捕捉体产物是本发明的部分。例如，在本发明的一个实施方案中，VEGF捕捉体的Fc结构域包含氨基酸序列：DKTHTCPPCPAPELLG//GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK；其中酶切割位点用“//”指出。

这种用于产生VEGF微型捕捉体的方法之后可以是一种用于纯化(例如，从污染物如Fc片段(例如，SEQ ID NO：19)、蛋白水解酶或其他物质中纯化)VEGF微型捕捉体的方法。参见例如图1。在本发明的一个实施方案中，纯化操作在促进同型二聚体VEGF微型捕捉体形成的条件下(例如，在非还原条件下，例如，在无还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇的情况下)完成。这种产生方法和纯化方法的VEGF微型捕捉体产物也是本发明的部分。在本发明的一个实施方案中，通过一种包括色谱纯化的方法进行纯化。

在本发明的一个实施方案中，将VEGF捕捉体用蛋白酶切割，其包含以下氨基酸序列：

(SEQ ID NO：17；任选地其中K432缺失)

或

(SEQ ID NO：18)

在本发明的一个实施方案中，VEGF捕捉体是阿柏西普(作为Eylea商业出售)或康柏西普。参见WO2000/75319或US9669069。

组合和药物制剂

本发明提供组合物，所述组合物包含与一种或多种成分联合的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)；及其使用方法和产生这类组合物的方法。包含VEGF微型捕捉体和可药用载体或赋形剂的药物制剂是本发明的部分。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物制剂具有大约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1或6.2的pH。

为了制备VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)的药物制剂，将微型捕捉体与可药用载体或赋形剂混合。参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences和美国药典：国家处方集，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1984)；Hardman等人，(2001)Goodman and Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，McGraw-Hill，New York，N.Y.；Gennaro(2000)Remington：The Science andPractice of Pharmacy，Lippincott，Williams，and Wilkins，New York，N.Y.；Avis等人(编著)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman等人(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，MarcelDekker，NY；Lieberman等人(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：DisperseSystems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity andSafety，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.。在本发明的一个实施方案中，药物制剂是无菌的。这类组合物是本发明的部分。

本发明的药物制剂包含VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)和可药用载体，例如包括水、缓冲剂、防腐剂和/或去垢剂。

本发明提供药物制剂，其包含本文所述VEGF微型捕捉体中任一者(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)和可药用载体；例如，其中多肽的浓度是约40mg/ml、约60mg/ml、约80mg/ml；90mg/ml；约100mg/ml；约110mg/ml、约120mg/ml、约133mg/ml、约140mg/ml、约150mg/ml、约200mg/ml或约250mg/ml。

本发明的范围包括了包含VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)的脱水(例如冻干)组合物或其包含可药用载体、但基本上缺少水的药物制剂。

在本发明的又一个实施方案中，将联合本文公开的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)向受试者施用的其他治疗剂根据2003年医师案头参考(Physicians′Desk Reference2003)(Thomson Healthcare；第57版(2002年11月1日))施用至受试者。

本发明提供包含VEGF微型捕捉体中任一者(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)的容器(例如，塑料小瓶或玻璃小瓶，例如，带盖，或色谱柱、空心针或注射筒(syringe cylinder))或包含其可药用载体的药物制剂。本发明还提供包含本文所述VEGF微型捕捉体或制剂的注射装置，例如，注射器、预充填的注射器或自动注射器。在本发明的一个实施方案中，容器着色(例如，棕色)以阻断光。

本发明包括与一种或多种其他治疗剂联合的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)的组合。VEGF微型捕捉体和其他治疗剂可以处于单一组合物或处于独立组合物中。例如，在本发明的一个实施方案中，其他治疗剂是Ang-2抑制剂(例如，奈伐苏单抗(nesvacumab))、Tie-2受体激活蛋白、抗PDGF抗体或其抗原结合片段、抗PDGF受体或PDGF受体β抗体或其抗原结合片段和/或额外的VEGF拮抗剂如阿柏西普、康柏西普(conbercept)、贝伐单抗、来尼珠单抗(ranibizumab)、抗VEGF适配体如哌加他尼(例如，哌加他尼钠)、单链(例如，V_L-V_H)抗VEGF抗体如布洛赛珠单抗(brolucizumab)、抗VEGFDARPin如Abicipar Pegol DARPin、例如还与ANG2结合的双特异性抗VEGF抗体如RG7716、或表达为Fc-融合蛋白的包含胞外结构域1-3的可溶形式人血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)。

施用和治疗

本发明提供一种用于治疗或预防受试者中癌症(例如，其生长和/或转移由VEGF介导，至少部分地由其介导，例如，VEGF介导的血管生成)或生血管眼病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^F、REGN7483^R、REGN7850或REGN7851)至受试者。

如本文所用的表述“生血管性眼病”意指由血管生长或增生引起或与之相关或由血管渗漏引起的任何眼病。

术语“治疗”或“处理”指逆转、稳定或消除不利疾病或病症(例如，生血管眼病或癌症)的治疗性手段，例如，通过任何临床可测量程度造成这类疾病或病症的一个或多个症状或指标消退、稳定化或清除，例如，就生血管眼病而言，通过造成视网膜病变严重程度评分(DRSS)降低或维持该评分、通过改善或维持视力(例如，在最佳矫正视力方面，例如，如依据ETDRS字母增加所测量)、增加或维持视野和/或减少或维持视网膜中央增厚以及相对于癌症而言，阻止或逆转受试者中癌细胞的生长、存活和/或转移来测量。一般地，治疗措施是施用一剂或多剂治疗有效量的VEGF微型捕捉体至具有疾病或病症的受试者。

本发明还提供一种向受试者(例如，人)施用本文所述的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)的方法，所述方法包括例如，通过眼内注射如通过玻璃体内注射，向受试者的身体引入VEGF微型捕捉体(例如，约0.5mg、2mg、4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg、18mg或20mg多肽，例如在不多于约100μl中，例如，约50、70μl或100μl)和任选地其他治疗剂。

本发明提供一种用于治疗有需求的受试者中癌症(例如，其生长和/或转移由VEGF介导，至少部分地由其介导，例如，VEGF介导的血管生成)或生血管眼病的方法，所述方法包括施用治疗有效量(例如，2mg、4mg、6mg、8mg或10mg，例如，在不多于约100μl中)的本文所述VEGF微型捕捉体和任选地其他治疗剂至受试者的身体，例如，至受试者的眼部。在本发明的一个实施方案中，通过玻璃体内注射进行施用。用本文方法可治疗或可预防的生血管眼病的非限制性实例包括：

·年龄相关性黄斑变性(例如，湿性或干性)，

·黄斑水肿，

·视网膜静脉闭塞后黄斑水肿，

·视网膜静脉闭塞(RVO)，

·视网膜中央静脉阻塞(CRVO)，

·分支视网膜静脉闭塞(BRVO)，

·糖尿病性黄斑水肿(DME)，

·脉络膜血管新生(CNV)，

·虹膜血管新生，

·新生血管性青光眼，

·青光眼术后纤维化，

·增生性玻璃体视网膜病变(PVR)，

·视盘血管新生，

·角膜新血管形成，

·视网膜血管新生，

·玻璃体的血管新生，

·血管翳，

·翼状胬肉，

·血管性视网膜病变，

·具有糖尿病性黄斑水肿的受试者中的糖尿病性视网膜病变；和

·糖尿病性视网膜病变(例如，非增生性糖尿病性视网膜病变(例如，以约47或53的糖尿病性视网膜病变严重程度量表(Diabetic Retinopathy Severity Scale，DRSS)水平为特征)或增生性糖尿病性视网膜病变；例如，未患DME的受试者中)。

VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)或其组合物的施用模式可以变动。施用途径包括肠胃外、非肠胃外、口服、直肠、经粘膜、肠内、肌内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、眼内、玻璃体内、透皮或动脉内。

本发明提供向受试者施用VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)的方法，所述方法包括向受试者的身体中引入微型捕捉体或其药物制剂。例如，在本发明的一个实施方案中，该方法包括例如用注射器的针头穿刺受试者的身体并将抗原结合蛋白或其药物制剂注射入受试者的身体，例如，注射入受试者的眼部、静脉、动脉、肌肉组织或皮下组织。

在本发明的一个实施方案中，玻璃体内注射本发明的药物制剂(其包含本发明的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851))包括步骤：用含有制剂的注射器和针头(例如，30号注射针)穿刺眼并且向眼玻璃体中注射该制剂(例如，小于或等于约100微升；约40、50、55、56、57、57.1、58、60或70微升)(例如，足够体积，从而递送如本文中所述的治疗有效量，例如，约2、4、6、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8或8.9、10或20mg VEGF微型捕捉体)。任选地，该方法包括步骤：向待注射的眼施用局部麻醉药(例如，丙美卡因(proparacaine)、利多卡因或丁卡因)、抗生素(例如，氟喹诺酮)、防腐剂(例如，聚维酮-碘)和/或扩瞳剂。在本发明的一个实施方案中，注射之前建立待注射的眼周围的无菌区。在本发明的一个实施方案中，在玻璃体内注射后，监测受试者的眼内压升高、炎症和/或血压。

术语“与联合”表示可以将诸组分(本发明的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851))连同另一药剂(如抗ANG2)配制成单一组合物，例如，用于同时递送，或分别配制成两种或更多种组合物(例如，包含每种组分的药盒)。彼此联合施用的组分可以在不同于另一组分的时间施用至受试者；例如，可以按历经给定时间段的间隔期非同时(例如，分别或依次)给予每次施用。彼此联合施用的独立组分也可以在相同的施用期间基本上同时施用(例如，精确在相同时间或由无临床意义的时间段分隔)。另外，可以将彼此联合施用的独立组分通过相同途径或通过不同途径施用至受试者。

VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)的治疗或预防癌症(例如，其由血管生成介导，至少部分地由其介导)或生血管眼病的有效量或治疗有效量指VEGF微型捕捉体的量，所述量足以造成癌症或生血管眼病消退、稳定或清除，例如，通过使癌症或生血管眼病的一个或多个症状或指标消退、稳定或消除达任何临床可测量程度，例如，就生血管眼病而言，通过造成糖尿病性视网膜病变严重程度评分(DRSS)的降低或维持该评分、通过改善或维持视力(例如，在最佳矫正视力方面，例如，如依据ETDRS字母增加所测量)、增加或维持视野和/或减少或维持视网膜中央增厚以及对于癌症而言，阻止或逆转受试者中癌细胞的生长、存活和/或转移来测量。在本发明的一个实施方案中，VEGF微型捕捉体治疗或预防生血管眼病的有效量或治疗有效量是约0.5mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、7.25mg、7.7mg、7.9mg、8.0mg、8.1mg、8.2mg、8.3mg、8.4mg、8.5mg、8.6mg、8.7mg、8.8mg、8.9mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg或20mg，例如，在不多于约100μl中。该量可以根据待施用的受试者的年龄和体格、目标疾病、状况、施用途径等变动。在某些实施方案中，初始剂量后可以按可大致等同于或少于或多于初始剂量的量施用第二或多个后续剂量的VEGF微型捕捉体，其中后续剂量相隔至少1天至3天；至少一周，至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。

如本文所用，术语“受试者”指例如需要预防和/或治疗癌症或生血管眼病的哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、猫、犬、奶牛、绵羊，马、山羊、兔)、优选地人。受试者可以患有癌症或生血管眼病或有形成癌症或生血管眼病的素质。

诊断用途

本发明的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)也可以用来例如出于诊断目的检测和/或测量样品中的VEGF或VEGF表达细胞。例如，VEGF微型捕捉体可以用来诊断例如以VEGF异常表达(例如，过量表达、过少表达、缺少表达等)为特征的病状或疾病，例如以鉴定表达VEGF的肿瘤细胞和/或组织。示例性VEGF诊断测定法可以包括例如使本发明的VEGF微型捕捉体与获得自患者的样品接触，其中VEGF微型捕捉体用可检测标记物或报道分子标记。样品上存在标记的VEGF微型捕捉体则表示VEGF存在于细胞和/或组织上。备选地，未标记的VEGF微型捕捉体可以与本身被可检测标记的第二抗体(对VEGF微型捕捉体具有结合亲和力)组合用于诊断性应用中。可检测标记物或报道分子可以是放射性同位素，如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、或¹²⁵I；荧光部分或化学发光部分如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。样品上存在与VEGF微型捕捉体结合的标记第二抗体则表示VEGF存在于细胞和/或组织上。例如，在本发明的一个实施方案中，这种方法包括步骤：使待确定VEGF表达情况的含有细胞和/或组织的样品接触VEGF微型捕捉体，并且，如果在VEGF微型捕捉体和细胞和/或组织之间观察到结合，则确定t细胞和/或组织表达VEGF。

缀合物

本发明涵盖与另一部分(例如，治疗用部分)缀合的VEGF微型捕捉体(例如，REGN7483^R、REGN7483^F、REGN7850或REGN7851)。如本文所用，术语“缀合物”指一种VEGF微型捕捉体，其化学上或生物学上连接于VEGF捕捉体或微型捕捉体或抗体或其抗原结合片段、药物、放射剂、报道分子部分、酶、肽、蛋白质或治疗剂。

在某些实施方案中，治疗用部分可以是细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素。细胞毒药物包括有损细胞的任何物质。本领域已知用于形成免疫缀合的合适细胞毒药物和化疗药物的示例(参见例如，WO2005/103081)。

可以使用与细胞毒素连接的VEGF微型捕捉体的缀合物治疗性治疗癌症。缀合的微型捕捉体与肿瘤组织结合使细胞毒素定位至肿瘤，并且因而，造成肿瘤的细胞死亡或停止生长和/或停止转移。这类使用缀合的VEGF微型捕捉体的方法是本发明的部分。

实施例

仅出于阐述的目的提供以下实施例，并且它们不意在用来限制本发明的范围。已经作出努力以确保所用数字方面的准确度，但是应当考虑一些实验性误差和偏离。这些实施例中所述的任何制剂是本发明的部分。

实施例1：VEGF微型捕捉体的重组表达

将重组VEGF微型捕捉体的编码区与信号序列连接并且克隆入哺乳动物表达载体，转染入中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞中，并且用400μg/ml潮霉素选择12天后，分离稳定转染的汇集物。使用无蛋白质的化学成分确知培养基中培育的稳定CHO细胞汇集物产生测试用蛋白质。重组多肽从细胞分泌至生长培养基中，深层过滤细胞并且随后从生长培养基和其他污染物中色谱纯化多肽。

VEGF微型捕捉体组分结构域的序列

·人Fltl(登录号NP_001153392.1)

·人Flkl(登录号NP_002244.1)

·人Fc(IGHG1，登录号P01857-1)

VEGF微型捕捉体序列

REGN7483^F(FABricator从阿柏西普切下的同型二聚体微型捕捉体)

hFlt1 Ig结构域2(S129-D231).hFLK1Ig结构域3(V226-K327).hFc(D104-G119)

(SEQ ID NO：12)

REGN7483^R(同型二聚体微型捕捉体，重组)

hFlt1 Ig结构域2(S129-D231).hFLK1 Ig结构域3(V226-K327).hFc(D104-G119)

(SEQ ID NO：12)

REGN7850(VEGF微型捕捉体-hFc DKTHCPPCPPC)

hFlt1 Ig结构域2(S129-D231).hFLK1Ig结构域3(V226-K327).hFc(D104-G112) .PPC

(SEQ ID NO：27)

REGN7851(VEGF微型捕捉体-hFc DKTHCPPCPPCPPC)

hFlt1 Ig结构域2(S129-D231).hFLK1 Ig结构域3(V226-K327).hFc(D104-C112).PPCPPC

(SEQ ID NO：28)

REGN6824(hVEGF微型捕捉体-G4Sx3-hVEGF微型捕捉体-mmH)

hFlt1 Ig结构域2(S129-D231).hFLK1 Ig结构域3(V226-K327).G4Sx3接头.Flt1Ig结构域2(S129-D231).hFLK1 Ig结构域3(V226-K327).mycmyc6His

(SEQ ID NO：34)

REGN7080(VEGF微型捕捉体-G4Sx6-VEGF微型捕捉体-mmH)

hFlt1 Ig结构域2(S129-D231).hFLK1 Ig结构域3(V226-K327).G4Sx6接头.Flt1Ig结构域2(S129-D231).hFLK1 Ig结构域3(V226-K327).mycmyc6His

(SEQ ID NO：35)

REGN7991 (hVEGF微型捕捉体-G4Sx9-hVEGF微型捕捉体)

hFlt1Ig结构域2(S129-D231).hFLK1Ig结构域3(V226-K327).G4Sx9接头.Flt1 Ig结构域2(S129-D231).hFLK1 Ig结构域3(V226-K327)

(SEQ ID NO：32)

REGN7992(hVEGF微型捕捉体-G4Sx12-hVEGF微型捕捉体)

hFlt1 Ig结构域2(S129-D231).hFLK1 Ig结构域3(V226-K327).G4Sx12接头.FIt1Ig结构域2(S129-D231).hFLK1 Ig结构域3(V226-K327)

(SEQ ID NO：33)

实施例2：对阿柏西普的蛋白水解切割。

为了产生VEGF微型捕捉体分子REGN7483^F，使用固定化IdeS酶(从Genovis(剑桥，MA；Lund，瑞典)获得的

)。

为了产生REGN7483^F，使用含有FabRICATOR酶的柱。随后将阿柏西普(1.0mL切割缓冲液中20mg)添加至柱并且在柱上18℃孵育30分钟。在30分钟后，用切割缓冲液(1.0mL)洗涤柱。合并消化混合物和洗涤液。

在分析性ProA柱(Applied Biosystems^TM，POROS^TM 20uM蛋白A管柱2.1x30mm，0.1mL(目录号2-1001-00))上洗脱混合物。可以根据Applied Biosystems^TM的POROS^TM20uM蛋白A管柱2.1x30mm，0.1mL(目录号2-1001-00)方案实施纯化。

实施例3：受体捕获表面上VEGF微型捕捉体和VEGF的结合动力学分析

通过表面等离体共振法(SPR)评估多种VEGF微型捕捉体分子结合VEGF₁₆₅的能力。表3-1.受测试的VEGF捕捉体蛋白和配体

VEGF₁₆₅：

(SEQ ID NO：31)

mmh标签是myc-myc-His₆。

实验方法：使用BIAcore3000仪，使用实时表面等离体共振生物传感器测定人VEGF₁₆₅与多种纯化的VEGF微型捕捉体构建体结合的平衡解离常数(K_D值)。全部结合研究均在10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％v/v表面活性剂Tween-20，pH 7.4(HBS-ET)运行缓冲液中于25℃进行。Biacore传感器表面首先通过胺偶联法用小鼠单克隆抗VEGFR1抗体衍生化，以捕获VEGF微型捕捉体构建体。对人VEGF试剂-人VEGF₁₆₅(人VEGF₁₆₅；SEQ IDNO：31)进行结合研究。将HBS-ET运行缓冲液(2nM-62.5pM；人VEGF₁₆₅的2倍系列稀释物)中配制的不同浓度的VEGF₁₆₅试剂以90μL/分钟的流速注射于抗VEGFR1捕获的VEGF微型捕捉体构建体表面上持续1.8分钟，同时在HBS-ET运行缓冲液中监测VEGF微型捕捉体构建体结合的VEGF₁₆₅试剂的解离60分钟。使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件，通过针对1∶1结合模型拟合实时传感图，确定动力学结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(K_D)和解离半寿期(t1/2)为：

和

表1-2和表1-3中显示25℃时人VEGF₁₆₅与不同VEGF微型捕捉体构建体结合的结合动力学参数。

表3-2.25℃时人VEGF_16s与不同VEGF微型捕捉体构建体结合的结合动力学参数

表3-3.25℃时人VEGF₁₆₅与不同VEGF微型捕捉体构建体结合的结合动力学参数*

**重复测量，导致报告值的一种变化

如这个实施例中所显示，本发明的某些VEGF微型捕捉体对VEGF分子显示出与全长阿柏西普相当的结合亲和力。

实施例4：在萤光素酶生物测定法中评价VEGF微型捕捉体阻断VEGF₁₁₀、VEGF₁₂₁和VEGF₁₆₅激活VEGFR1的能力

评估多种VEGF微型捕捉体在体外抑制VEGF₁₁₀、VEGF₁₂₁和VEGF₁₆₅介导VEGFR1激活的能力。

表4-1.受测试的VEGF捕捉体蛋白和配体

实验方法

细胞系

用两种嵌合受体构建了细胞系HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ克隆V3H9，所述嵌合受体并入与IL18Rα或IL18Rβ的胞质结构域融合的VEGFR1胞外结构域。将嵌合受体转染至整合有NFκB-萤光素酶-IRES-eGFP报道基因的细胞系中。一旦结合VEGF，胞外VEGFR1二聚化，导致IL18Rα和IL18Rβ胞包内结构域相互作用、NFκB信号传导和后续产生萤光素酶。

测试方法

将HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ克隆V3H9细胞按10，000个细胞/孔铺种在96孔白色不透明平板(Nunc，目录号136101)中含0.5％FBS(Seradigm，目录号1500-500)的OptiMEM(Invitrogen，目录号31985)中并且在37℃，5％CO₂孵育过夜。次日，将细胞用浓度范围从5000pM至0.085pM的VEGF捕捉体或微型捕捉体蛋白1∶3系列稀释物差异性处理，随后添加固定浓度的20pM VEGF₁₁₀(R&D Systems目录号298-VS)、VEGF₁₂₁(R&D Systems目录号4644-VS)或VEGF₁₆₅(R&D Systems目录号293-VE)配体蛋白质并且在37℃，5％CO₂孵育6小时。随后向细胞添加One-Glo萤光素酶底物(Promega，目录号E6130)并且使用VICTOR^TMX5多标记平板读数仪(PerkinElmer，2030-0050型)测量发光。用GraphPad Prism软件，使用4参数逻辑方程对11个数据点反应曲线分析数据，以确定EC₅₀值和IC₅₀值。

结果总结与结论：VEGF_H0、VEGF₁₂₁和VEGF₁₆₅在各实验中分别以约11-24pM、约21-44pM和约28-43pM的EC₅₀值激活HEK293/D9/Flt-IL18Rα/Flt-IL18Rβ克隆V3H9细胞(图3-5、表4-2、4-4和4-6)。

带(G₄S)₃接头(REGN6824)或(G₄S)₆接头(REGN7080)的单链微型捕捉体在20pMVEGF₁₁₀或20pM VEGF₁₂₁存在下以约0.2nM的IC₅₀值抑制VEGFR1信号传导，并且在VEGF₁₆₅存在下被部分地阻断。参见图3和表4-2与表4-3。

带较长G₄S接头((G₄S)₉或(G₄S)₁₂)的单链微型捕捉体(REGN7991和REGN7992)以范围约24至约79pM的改良IC₅₀值抑制VEGFR1信号传导(图4(A-B)和表4-4和表4-5)。

VEGF捕捉体(REGN3；阿柏西普)在各实验中以范围约9-21pM的IC₅₀值抑制VEGF异构体的信号传导。

将FabRICATOR切割的微型捕捉体(REGN7483^F)、重组二聚体微型捕捉体REGN7483^R和REGN7850及REGN7851的抑制性活性与VEGF捕捉体(阿柏西普)比较。REGN7843^F、REGN7483^R、REGN7850和REGN7851抑制VEGF₁₁₀、VEGF₁₂₁和VEGF₁₆₅介导的VEGFR1激活，IC₅₀值类似于用全长VEGF捕捉体所观察到的(图5和表4-6和表4-7)。观察到REGN7483^F、REGN7483^R、REGN7850和REGN7851分别以约9-12pM、约8-19pM、约12-30pM和约15-27pM的IC₅₀值抑制VEGF₁₁₀、VEGF₁₂₁和VEGF₁₆₅介导的VEGFR1激活。

收集下文所述三个独立实验中的数据。

生物测定实验1

表4-2.用多种VEGF变体激活HEK293/D9/FIt-IL18Ra/Flt-IL18Rb

表4-3.阿柏西普或单链微型捕捉体在VEGF₁₁₀、VEGF₁₂₁或VEGF₁₆₅存在下抑制

VEGFR1信号传导

生物测定实验2

表4-4.用多种VEGF变体激活HEK293/D9/FIt-IL18Ra/FIt-IL18Rb

VEGF剂量反应	VEGF<sub>110</sub>	VEGF<sub>121</sub>	VEGF<sub>165</sub>
				EC<sub>50</sub>[M]	1.509E-11	2.559E-11	未测试

表4-5.阿柏西普或单链微型捕捉体在VEGF₁₁₀或VEGF₁₂₁存在下抑制VEGFR1信号传导

生物测定实验3

表4-6.用多种VEGF变体激活HEK293/D9/Flt-IL18Ra/Flt-IL18Rb

表4-7.阿柏西普或突变的二聚体微型捕捉体在VEGF₁₁₀、VEGF₁₂₁或VEGF₁₆₅存在下抑制VEGFR1信号传导(不同的C末端氨基酸加下划线)

这个实施例表明就阻断VEGF介导的VEGFR1活性而言，本发明的一些VEGF微型捕捉体显示等同或更好的效能。

实施例5：通过大小排阻色谱偶联多角度光散射(SEC-MALS)对VEGF微型捕捉体与VEGF之间形成的体外复合体进行大小分析

确定了多种VEGF微型捕捉体分子与VEGF的化学计量。

表5-1.受测试的VEGF捕捉体蛋白和配体

实验方法

大小排阻色谱连同多角度光散射(SEC-MALS)

为了理解不同微型捕捉体-VEGF复合体的化学计量，如表5-3中所示那样制备一系列按不同摩尔比含有微型捕捉体和VEGF蛋白的溶液并且在4℃孵育过夜。研究的复合体如下：REGN110-REGN7483^F、REGN110-REGN6824和REGN110-REGN7080。以相同方式制备仅含有REGN110、REGN7483^F、REGN6824和REGN7080的对照样品。将孵育的样品注入SEC-MALS系统，该系统由偶联于Superose 12Inc 10/300Gl柱的miniDAWN Treos MALS装置和Optilab T-rEX(折射率测量)(Wyatt Technology Corporation)组成，所述柱用

微量系统(GEHealthcare Life Sciences)运行。全部样品的柱运行缓冲液是10mM磷酸盐pH 7.0，500mMNaCl。单独注射100ug BSA(牛血清白蛋白，ThermoScientific)作为已知分子量的标准品以校准MALS测量。使用Unicorn(版本5.20GE Healthcare Life Sciences)，通过绘制mAU(280nm处吸光度)vs.保留体积(ml)图来评价大小排阻色谱数据。使用ASTRA(WyattTechnology版本7.0.0.69)，通过绘制摩尔质量vs.体积(ml)和瑞利比(Rayleigh ratio)vs体积(ml)图来评价MALS数据。

结果总结与结论：SEC-MALS用来评估不同形式微型捕捉体(REGN7483^F、REGN6824、REGN7080)和VEGF(REGN110)之间形成的复合体的摩尔质量和洗脱图谱。表5-2提供VEGF微型捕捉体蛋白和REGN110的理论预计摩尔质量(从肽序列算得，不包括糖基化)、观测摩尔质量以及试剂的低聚状态。表5-3显示所分析复合体的色谱图中每个峰的观测重均摩尔质量。

作为约42kDa单峰洗脱的REGN110，与文献已经显示为VEGF主要种类的二硫键连接的同型二聚体一致(图6-8，峰3)。作为摩尔质量约63kDa的单体运行的微型捕捉体蛋白，与其50-51 kDa的理论肽摩尔质量和8个N连接的糖基化贡献的额外约12kDa一致(图6-8，峰2)。预计REGN7483^F是二硫键连接的同型二聚体，因为FabRICATOR切割不断开完整REGN3的Fc结构域中的铰链二硫键。

REGN6824和REGN7080在全部受测试条件下均与REGN110形成相似的复合体(表5-3；图6和图7)。当单链单体(REGN6824)与VEGF同型二聚体(REGN110)的摩尔等同物组合时，观察到摩尔质量约215KDa的峰(图6，峰1)，这提示2个REGN6824分子结合2个REGN110同型二聚体的复合体。对REGN7080观察到类似结果。在不同的摩尔比，如REGN110或REGN6824/REGN7080过量存在，观察到的唯一复合体种类是约215kDa的2：2复合体，连同代表过量VEGF或过量微型捕捉体的峰。

在另一方面，与等摩尔或过量REGN110组合时，REGN7483^F显示一个约99KDa复合体峰(图8，峰1)。该峰与一个REGN7483^F二硫键连接的同型二聚体结合于一个REGN110同型二聚体的复合体一致。在过量REGN7483^F存在下(图8，峰1a)，MALS峰具有约70kDa摩尔质量。在这种情况下，Superose 12柱不能将REGN7483^F+REGN110复合体与过量的REGN7483^F充分分离；因此，观察到的摩尔质量代表复合体(99 kDa)和仅REGN7483^F(63kDa)之间的平均数。

表5-2.受测试的微型捕捉体蛋白和配体的近似摩尔质量的汇总表

kDa：千道尔顿；Mw：重均摩尔质量。

表5-3.具有REGN110的微型捕捉体复合体的近似摩尔质量的汇总表

kDa：千道尔顿；Mw：重均摩尔质量；NA：不适用。

*REGN6824和REGN7080是单一多肽链；REGN110和REGN7483^F是共价(二硫键连接的)同型二聚体。

实施例6：小鼠OIR模型中玻璃体内和全身性施用VEGF捕捉体和二聚体微型捕捉体

将小鼠幼仔在出生后第6天(P6；出生后第6天)置于高氧环境(75％O₂)中并在P11返回室内空气(21％O₂)。这导致接下来数天内病理性血管新生。在P13用等摩尔剂量的以下制剂对幼仔进行玻璃体内注射：

·VEGF捕捉体(阿柏西普)(.25μg/眼，n＝3)，

·单链微型捕捉体(REGN7080)(.125μg/眼，n＝3)，

·二聚体微型捕捉体(REGN7483^F)(.125μg/眼，n＝3)，或

·对照蛋白，hFc(.125μg/眼，n＝3)；

或

在P12用以下制剂进行全身性(腹膜内)注射：

·3mg/kg对照蛋白，hFc，

·3mg/kg二聚体微型捕捉体(REGN7483^F)，

·30mg/kg二聚体微型捕捉体(REGN7483^F)；或

·100mg/kg二聚体微型捕捉体(REGN7483^F)。

在P16，收获眼。剖取视网膜，用FITC标记的加纳籽(Griffornia simplicifolia)凝集素I(Vector Laboratorie)染色并且用Prolong Gold(Invitrogen)铺片(flat-mounted)。为测量异常面积，用带4x物镜的Nikon 80i对铺片成像并且用图像分析软件(Adobe Photoshop CC2015扩展版)定量视网膜血管新生面积。

评价小鼠中的异常血管化面积(mm²)，其中向小鼠施用了人Fc对照、阿柏西普(VEGF捕捉体)、在二个VEGFR1(d2)-VEGFR2(d3)融合蛋白之间具有(G₄S)₆接头的单链微型捕捉体或作为FabRICATOR蛋白酶切割阿柏西普之产物的二聚体微型捕捉体(二聚体微型捕捉体)。在减少小鼠视网膜的异常血管化面积方面，二聚体微型捕捉体表现显著好于单链微型捕捉体和阿柏西普。参见图9。

当全身性(ip)递送时，甚至在100mg/kg也未实现完全抑制新血管化的二聚体微型捕捉体效力比VEGF捕捉体(阿柏西普)低得多。参见图10A。VEGF捕捉体(阿柏西普)的历史数据显示在OIR小鼠模型中以6.25mg/kg全身性(ip)递送时，几乎完全抑制。参见图10B。这表明全身施用时，二聚体微型捕捉体具有比阿柏西普短的半寿期。这种短半寿期可以产生更好的安全性特征，因为从玻璃体内腔隙渗漏入血液的二聚体微型捕捉体将相对迅速地消除。

实施例7：添加PPC至EESYRCHO细胞中表达的REGN112的C末端

在这个实施例中，评估了多种微型捕捉体形成二聚体或单体的能力。

将编码REGN112、REGN7850或REGN7851的重组微型捕捉体克隆入表达质粒，转染入CHO细胞中，并且用400μg/ml潮霉素选择12天后，分离稳定转染的汇集物。使用无蛋白质的化学成分确知培养基中培育的稳定CHO细胞汇集物产生测试用蛋白质。在纯化之前，将等份试样(10μl)的含有微型捕捉体的培养基在还原条件或非还原条件下加载于1X Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液中的4-20％Novex Trys-甘氨酸(10孔，1.0mm微型凝胶)SDS-PAGE凝胶上。通过用考马斯蓝试剂染色使蛋白质可视化。用箭头标记单体种类和二聚体种类。

视觉检查SDS-PAGE凝胶(图11)表明，表达REGN112的细胞分泌约半数蛋白质为预先形成的二聚体，而另一半作为单体分泌。在REGN112的羧基端添加一个(REGN7850)或二个(REGN7851)PPC基序改善预先形成的二聚体的产生至近乎100％。

实施例8：减少微型捕捉体颜色的阴离子交换色谱(AEX)

在现有多变量表征研究期间优化的AEX设定值(负模式，pH 8.0，7.0mS/cm)并未充分清除棕色较深的REGN7483种类。对结合和洗脱模式下的三种色谱树脂评价新的AEX设定值(pH 8.4，2.0mS/cm)，以确定新设定值是否可以提供额外的棕色REGN7483种类减少。这个设定值已在使用Capto Q树脂的先前REGN3 AEX开发期间显示使棕色较深的REGN3种类与棕色较浅的REGN3种类分离。三种AEX分离在Q琼脂糖凝胶FF、POROS 50HQ和Capto Q上对REGN7483评价这个设定值。第四种AEX分离在Capto Q上对REGN3评价这个设定值。第五种AEX分离对REGN7483评价原始设定值(pH 8.0，7.0mS/cm)作为对照，以确定前4种AEX分离是否能够额外减少颜色。

设计：如表8-1中详述那样对这项研究进行五种AEX分离。使用表8-3中详述的方法进行AEX分离1至4，而使用表8-2中详述的方法进行AEX分离5。全部AEX加载液均源自相似的生物反应器。将15.7mL Capto Q柱(20.0cm床高度，1.0cm I.D.)、14.1mL POROS50HQ柱(18.0cm床高度，1.0cm I.D.)和16.5mL Q琼脂糖凝胶FF柱(21.0cm床高度，1.0cm I.D.)集成入AKTA Avant台式液相色谱法控制器用于这个实验。

使用2M tris碱或2M乙酸，调节AEX加载液pH至目标±0.05pH单位。使用5M氯化钠或RODI(反渗透去离子水)调节AEX加载液电导率至目标±0.1mS/em。分析全部汇集物样品的HMW、颜色和产率。

图8-1.AEX减色研究的研究设计总结

图8-2.用于减色研究的流通AEX方案(分离5)

AEX，阴离子交换色谱；CV，柱体积

图8-3.用于减色研究的结合和洗脱AEX方案(分离1-4)

AEX，阴离子交换色谱；CV，柱体积

结果：进行五种AEX分离，以确定能够减少AEX汇集物中颜色至可接受水平的最佳树脂和设定值。在使用CIELAB颜色空间(L*、a*和b*变量)分析颜色之前，将全部汇集物浓缩至11g/L。参见CIEL*C*h*色阶，Application Notes，8(11)：1-4(Hunter Lab；Reston，VA)(2008)和“Objective Colour Assessment and Quality Control in the Chemical，Pharmaceutical and Cosmetic Industries (化工业、制药业和化妆品工业中客观颜色评价和质量控制)”，Hach Lange GmbH第3.9e号应用报告(Application Report No.3.9e)，第1-28页，2013年2月。尽管前四种AEX分离(1-4)意于在结合和洗脱模式下评价，但大部分产物存在于加载区和洗涤区中(62-94％)，即，柱以负模式或流通模式运行。

前3种分离(1-3)评价Capto Q、POROS 50HQ和Q琼脂糖凝胶FF树脂的pH 8.4和2.0mS/cm设定值，以REGN7483作为加载材料。全部3种分离均显示＞80％的产率及<3.4％的汇集物HMW(高分子量种类含量)。POROS 50HQ AEX汇集物显示AEX汇集物中黄色颜色最浅(b*＝2.09)，随后是Q琼脂糖凝胶FF AEX汇集物(b*＝2.22)和Capto Q AEX汇集物(b*＝2.55)。

第四种AEX分离(4)评价Capto Q的pH 8.4和2.0mS/cm设定值，以REGN3作为加载材料。这个设定值显示在加载和洗涤期间收集的61.9％产率以及洗脱期间收集的34.0％产率。这种AEX汇集物的黄色最浅(b*＝1.44)。尽管这种AEX条件产生黄色最浅的AEX汇集物，但已经观察到，黄颜色在FabRICATOR酶切割且后续移除已切割Fc部分后增加(切割前汇集物中b*＝3.52并且切割后和Fc移除汇集物中b*＝4.17)。其假定原因如下：棕色更多地存在于REGN3分子的REGN7483部分中，而非Fc部分中，从而移除Fc且由酶促切割引起以g/L计恒定浓度的REGN7483的体积摩尔浓度加倍令颜色更深。这种预期的黄颜色增加(Δb*＝+0.65)加至REGN3 AEX汇集物的颜色(b*＝1.44+0.65＝2.09)将提示，在FabRICATOR单元操作后，它将具有与黄色最浅的REGN7483 AEX汇集物(b*＝2.09)相似的颜色。另外，62％的加载与洗涤产率低于开发目标(＞80％)，使得该产率成为不太想要的AEX分离设定值。

第五种AEX分离(5)在POROS 50 HQ树脂上评价了事先优化的设定值(pH 8.0和7.0mS/cm)，以REGN7483作为加载材料。尽管这种AEX分离显示产率＞80％并且汇集物HMW＜3.4％，但它是黄色最深的汇集物(b*＝3.40)。

图8-5.AEX减色研究的实验结果总结*

*测定蛋白质浓度11g/l的样品中的颜色

AEX，阴离子交换色谱；HMW，高分子量种类；N/A，不适用

结论：进行五种AEX分离以评价树脂(Capto Q、Q琼脂糖凝胶FF和POROS 50HQ)和设定值(pH 8.0和7.0mS/cm，pH 8.4和2.0mS/cm)。以设定值pH 8.4和2.0mS/cm在POROS 50HQ上用REGN7483进行AEX分离，这产生与工艺和加载液来源相同情况下的Q琼脂糖凝胶FF AEX汇集物和Capto Q AEX汇集物相比，黄色更浅的AEX汇集物。预测第四种AEX分离(REGN3加载液来源，Capto Q树脂，pH 8.4和2.0mS/cm设定值)具有与酶促切割单元操作后REGN7483POROS 50HQ AEX汇集物相当的颜色。

最后，第五种AEX分离(REGN7483加载液来源，POROS 50HQ树脂，pH 8.0和7.0mS/cm设定值)产生黄色最深的汇集物。认为过量的黄颜色归因于相对低的pH(7.9-8.1)和高电导率(6.5-7.5mS/cm)。已经显示这两个因素造成CDM表达的REGN7483^F中较高水平的黄颜色。

采用蛋白A色谱和随后活性炭过滤法纯化CDM中表达的(且具有棕黄色)的阿柏西普并不导致棕黄色明显降低(数据未显示)。

实施例9：分析在较高pH和较低电导率时AEX纯化的微型捕捉体中的颜色和2-氧代-组氨酸

这个实施例中评价各个微型捕捉体生产批次中已经氧化成2-氧代-组氨酸的微型捕捉体(REGN7483^F)组氨酸的棕黄色和量。

样品制备：进行还原型和烷基化微型捕捉体(REGN7483^F)样品批(10、23和14)的胰蛋白酶解定位，以鉴定并定量2-氧代-组氨酸翻译后修饰。使200μg等份量的每种原料药批次在0.1M Tris-HCl，pH 7.5中的8.0M尿素中变性，经DTT还原并且随后经碘乙酰胺烷基化。将变性、还原和烷基化的原料药首先用重组Lys-C(rLys-C)按酶/底物比率1∶100(w/w)在37℃消化30分钟，用0.1M Tris-HCl，pH 7.5稀释，从而尿素终浓度是1.8M，随后用胰蛋白酶按酶/底物比率1∶20(w/w)在37℃消化2小时，并且随后用PNGase F按酶/底物比率1∶5(w/w)在37℃去糖基化1小时。通过利用甲酸(FA)使pH低于2.0来终止消化。

微型捕捉体产品：工作容积500升的生物反应器用来表达阿柏西普。含有阿柏西普的细胞培养物经历三个过滤步骤(深层过滤、精密过滤和保护过滤)，随后蛋白A亲和捕获色谱(结合和洗脱)和进一步过滤。随后用已经固定在树脂上的化脓性链球菌IdeS蛋白酶(FabRICATOR，Genovis；剑桥，MA；Lund，瑞典)酶促切割这种材料以产生微型捕捉体和切割的Fc片段副产物。通过蛋白A亲和捕获色谱从反应移除Fc片段(微型捕捉体产品在流通级分中)，所述蛋白A亲和捕获色谱随后是过滤步骤(仅用于微型捕捉体产品162、29和30)。在低pH灭活病毒和过滤步骤后，使用表9-1中所述的参数通过阴离子交换(AEX)色谱(流通模式)纯化微型捕捉体。

表9-1.AEX色谱条件

RODI＝反渗透去离子水

随后将纯化的材料通过疏水相互作用色谱(带苯基配体的树脂)进一步纯化，接着浓缩和渗滤。

引起350nm处吸光度升高的肽片段的定位比较微型捕捉体产品10和通过切割用商业化工艺(非CDM)生产的阿柏西普所获得的VEGF微型捕捉体的胰蛋白酶解肽图时，观察到微型捕捉体产品10上可能引起微型捕捉体产品10样品颜色强烈的PTM(图31(A)，其显示从20.0至75分钟洗脱的肽的吸光度)。突出显示具有不同UV峰的肽。图31(B)中显示色谱图的放大视图，其显示从16至30分钟洗脱的肽的吸光度。微型捕捉体产品10和通过切割用商业化工艺(非CDM)生产的阿柏西普所获得的VEGF微型捕捉体之间UV吸光度对比鲜明的肽是TNYLTH*R、IIW*DSR和IIIW*DSR(*表示氧化残基)。进一步，图31(C)中显示色谱图的放大视图，其显示从30至75分钟洗脱的肽的吸光度。微型捕捉体产品10和通过切割用商业化工艺(非CDM)生产的阿柏西普所获得的VEGF微型捕捉体之间UV吸光度对比鲜明的肽是DKTH*TCPPCPAPELLG、TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK、EIGLLTCEATVNGH*LYK和QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(*表示氧化残基)。肽定位揭示了VEGF微型捕捉体之间丰度显著不同的肽的身份。表9-2中显示从肽定位分析鉴定的肽的相对丰度。微型捕捉体产品10中2-氧代-组氨酸的量高于通过切割用商业化工艺(非CDM)生产的阿柏西普所获得的VEGF微型捕捉体，显示2-氧代-组氨酸的存在可以是强烈黄棕色的原因。

表9-2.从肽定位分析鉴定的肽的相对丰度

LC-MS分析：通过使用Waters ACQUITY UPLC CSH C18柱(

1.7μm，2.1×150mm)的反相超高效液相色谱法(UPLC)，接着在线PDA检测(波长280nm、320nm和350nm处)和质谱分析，分离并分析20μg等份量来自批次10、14和23的所得rLys-C/胰蛋白酶解肽。流动相A是水中0.1％FA，流动相B是乙腈中的0.1％FA。在上样后，梯度以5分钟保持在0.1％B开始，随后历经75分钟线性升高至35％B以便最佳分离肽。在Thermo Scientific QExactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪上实施MS实验和MS/MS实验，高能碰撞解离(HCD)用于MS/MS实验的肽碎裂。以完整MS图谱中给定肽的实验测定的准确质量以及相应HCD MS/MS图谱中的b和y碎片离子为基础进行肽身份赋予。生成含有2-氧代-组氨酸的肽和相应天然肽的提取离子色谱图，其中峰面积经积分以计算REGN7483^F样品中2-氧代-his的位点特异性百分数。

微型捕捉体产品10、23和14的2-氧代-组氨酸定量相对于欧洲棕黄色标准品(BY)，下文表9-3中示出了(AEX柱流通级分中)或抽提自AEX柱的物料中的多种微型捕捉体制备物的颜色。还显示经蛋白酶消化产生的肽中2-氧代-组氨酸的百分数，如通过质谱法所测量。

表9-3.REGN7483^F中棕黄色与2-氧代-组氨酸百分数之间的相关性

[+57]：碘乙酰胺对半胱氨酸的烷基化在半胱氨酸上添加羧甲基胺部分，这导致净质量超过未修饰的半胱氨酸，增加约+57：

[+14]：从His至2-氧代-his，一个氧原子添加于碳2上，但是二个氢原子丢失(一个从碳2丢失，另一个从氮3丢失)，这导致净质量超过未修饰的组氨酸，增加约+14。

[+32]：色氨酸二氧化导致N-甲酰基犬尿氨酸形成，这使净质量超过未修饰的色氨酸，增加约+32。

微型捕捉体产品10、14、22、23、162、29、30和REGN3的颜色分析。下文表9-4中示出了微型捕捉体产品的CIEL*a*b*颜色分析。

表9-4.微型捕捉体产品的颜色分析

REGN7483^F后的括号数字指示本文具体说明其状况的微型捕捉体产品编号。REGN3后的括号数字指示阿柏西普(REGN3)产品编号。FCP＝浓缩的最终汇集物。DS＝原料药(drugsubstance)。L*、a*和b*是CIEL*a*b*颜色空间中的值。＜和＞表示颜色是否浅于或深于BY参比溶液；例如，“＜BY2”意指颜色介于BY3和BY2之间。

进行一组实验以评价阿柏西普(在化学成分非确知培养基中产生)和REGN7483^F中2-氧代-组氨酸(和色氨酸二氧化)的百分数。用胰蛋白酶和LysC以及用PNGase F对阿柏西普、微型捕捉体产品10中流过AEX柱的REGN7483^F物质以及从AEX柱抽提的物质进行蛋白酶消化。随后将肽施加至Waters BEH200，4.6cmx150mm大小排阻(SEC)柱上。保留与吸附剂峰相对应的物质并通过质谱法分析以确定它们的含量。确定从AEX柱抽提的材料相对于2-氧代-his和色氨酸二氧化种类的存在富集。另外，2-氧代-组氨酸及二氧化色氨酸的水平非常低。参见图23和表9-5。

这些数据显示2-氧代-his和色氨酸二氧化种类对AEX树脂具有亲和力并且流通模式下的AEX色谱是从REGN7483消除这些种类的有效手段。

表9-5.阿柏西普、REGN7483^F或AEX抽提液中2-氧代-his或色氨酸二氧化的定量

^a：使用不同肽对REGN3计算的值，因为C末端肽不同于微型捕捉体。

图28中显示比较在AEX抽提微型捕捉体产品10(在任何纯化操作之前，BY1)、微型捕捉体产品23(在任何纯化操作之前，≤BY3)、微型捕捉体产品14(在任何纯化操作之前，≤BY3)、来自微型捕捉体产品10的酸性级分1(在AEX方法后获得，着黄色)、来自微型捕捉体产品10的酸性级分2(在AEX方法后获得，着黄色)和来自微型捕捉体产品10的主要级分(在AEX方法后获得，澄清)时存在的酸性种类(表9-5)。

强阳离子交换色谱图(CEX)：这种方法用来鉴定细胞培养物收获样品中存在的酸性种类和其他变体。

在[Dionex ProPac WCX-10，分析柱(Dionex，CA)]上进行强阳离子交换色谱。对于样品，所用的流动相是[10mM磷酸氢二钠pH 7.5(流动相A)和10mM磷酸氢二钠，500mM氯化钠pH 5.5(流动相B)。使用双元梯度(94％A，6％B：0-20分钟；84％A，16％B：20-22分钟；0％A，100％B：22-28分钟；94％A，6％B：28-34分钟)，在280nm检测]。在比主峰更早的相对停留时间洗脱的峰对应于酸性峰。

来自微型捕捉体产品23(在任何纯化操作之前，≤BY3)的样品经历CEX。去唾液酸化应用于样品以减少微型捕捉体产品变体的复杂度。随后，使用双重盐-pH梯度，应用强阳离子交换(CEX)色谱富集去唾液酸化微型捕捉体(dsMTl)的变体。这个操作产生总计7个级分(F1-F7，MC是方法对照)。仅在两个最酸的蛋白变体级分1和2中观察到棕黄变体。这个结果得到产生的AEX抽提液样品支持，所述AEX抽提液样品用来移除MT1的大部分棕黄色变体并且含有MT1的酸性变体(图29)。

成像毛细管等电聚焦(iciEF)电泳图：使用具有氟烃涂覆的毛细管管状柱(100μmx5cm)的iCE280分析仪(ProteinSimple)，通过iCIEF进一步评估级分F1-7和MC中变体(来自CEX后的微型捕捉体产品23)的分布。两性电解质溶液由纯化水中0.35％甲基纤维素(MC)、0.75％Pharmalyte 3-10载体两性电解质，4.2％Pharmalyte 8-10.5载体两性电解质以及0.2％pi标志物7.40和0.15％pi标志物9.77的混合物组成。阳极电解液是80mM磷酸，并且阴极电解液是100mM氢氧化钠，二者均在0.10％甲基纤维素中。将样品稀释于纯化水中并且将CpB按酶/底物比率1∶100添加至每份稀释的样品，随后在37℃孵育20分钟。将CpB处理的样品与两性电解质溶液混合并且随后通过引入电势1500V持续一分钟，随后引入电势3000V持续10分钟来聚焦。通过使280nm紫外光穿过毛细管并进入电荷耦合元件数码照相机的透镜，获得已聚焦ot-PDL1变体的图像。随后分析这个图像以确定多种电荷变体的分布(图30)。

实施例10：REGN7483^F的光稳定性研究

在这个实施例中，在暴露于不同量的冷白光或紫外A光后，确定来自微型捕捉体产品14的REGN7483^F(上文讨论)的光稳定性。确定已曝光的样品的颜色和2-氧代-组氨酸含量。

表10-1.REGN7483^F光稳定性研究设计

ICH指ICH协调三方指南(ICH Harmonised Tripartite Guideline)：稳定性试验：光稳定性检验新原料药和产物Q1B，规定以小于1.2百万lux*小时光的净量实施光稳定性研究。表10-2.暴露于冷白光和紫外A光的样品的颜色^～◆

^～使用CIELAB颜色空间(L*、a*和b*变量)且相对于EP BY颜色标准品指示样品颜色。

◆样品以10mM组氨酸，7％蔗糖，0.03％PS20-SR，pH 5.8中的80mg/mL REGN7483^F(微型捕捉体产品19)测量。

*离群值

表10-3.来自经受紫外光和冷白光胁迫的微型捕捉体中的肽中的2-氧代-His水平

REGN7483^F冷白光或UVA光的暴露量与出现氧化型组氨酸(2-氧代-his)相关。观察到二个种类的2-氧代-组氨酸：13.98Da种类

和15.99Da种类

其中13.98Da种类在经历光胁迫的微型捕捉体样品中为优势。证据表明观察到的棕黄色依赖于13.98Da种类，而非15.99Da种类。已知15.99Da种类是铜金属催化过程的产物。Sch6neich，J.Pharm.Biomed Anal.21：1093-1097(2000)。用铜掺入微型捕捉体并不导致可观的颜色变化(数据未显示)。然而，13.98Da种类是光驱动过程的产物。Liu等人，Anal.Chem.86(10：4940-4948(2014))。

实施例11：通过还原型肽定位分析翻译后修饰(PTMs)

在这个实施例中评价微型捕捉体(包括REGN7483^F)和阿柏西普的糖基化特征和其他翻译后修饰的存在。

样品制备：进行还原型和烷基化微型捕捉体(REGN7483^F；微型捕捉体产品22)和Eylea原料药批次的胰蛋白酶解定位，以鉴定并定量翻译后修饰(例如，位点特异性糖基化、脱酰胺化和氧化等)。使1mg等份量的每种原料药在6.0M盐酸胍中变性，经DTT还原并且随后经碘乙酰胺在pH7.5烷基化。随后将变性、还原和烷基化的原料药脱盐并且使用NAP-5柱，经缓冲液交换成0.1M Tris HCl，并且随后用胰蛋白酶按酶/物质比1∶20(w/w)在37℃消化2小时。通过利用TFA使pH低于pH 2.0来终止消化。

LC-MS分析：通过使用Waters ACQUITY UPLC BEH130C18柱(1.7μm，2.1×150mm)的反相超高效液相色谱法(UPLC)，接着在线质谱分析，分离并分析等份量7.6μg来自每个原料药批次的所得胰蛋白酶解肽和糖肽，以确定肽和糖肽质量并且确认肽序列。流动相A是水中0.05％TFA，而流动相B是乙腈中的0.045％TFA。在上样后，梯度以5分钟保持在0.1％B开始，随后历经75分钟线性升高至35％B以便最佳分离肽。在ThermoScientific Q ExactivePlus Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪上实施MS实验和MS/MS实验，高能碰撞解离(HCD)用于MS/MS实验的肽碎裂。以完整MS图谱中给定肽或糖肽的实验测定的准确质量以及相应HCD MS/MS图谱中的b和y碎片离子为基础进行肽与糖肽身份赋予。对于PTM分析，生成含有PTM的肽和相应天然肽的提取离子色谱图，峰面积经积分以计算REGN7483^F样品和Eylea样品中PTM的位点特异性百分数。

图14(A)阐述了REGN7483^F和阿柏西普(Eylea商业化批次)中每个天冬酰胺糖基化位点处鉴定的糖型。图14(A)中显示聚糖残基的结构(G0-GlcNAc；G1-GlcNAc；G1S-GlcNAc；G0；G1；G1S；G2；G2S；G2S2；G0F；G2F2S；G2F2S2；G1F；G1FS；G2F；G2FS；G2FS2；G3FS；G3FS3；G0-2GlcNAc；Man4；Man4_A1G1；Man4_A1G1S1；Man5；Man5_A1G1；Man5_A1G1S1；Man6；Man6_G0+磷酸；Man6+磷酸和Man7)。应用于各种聚糖结构物的命名法是标准化的-参见Varki等人，Symbol nomenclature for glycan Representation(用于再现聚糖的符号命名法)，Proteomics 9：5398-5399(2009)；Harvey等人，Proposal for a standard system fordrawing structural diagrams of N-and O-linked carbohydrates and relatedcompounds(绘制N连接糖类和O连接糖类及相关化合物结构简图的标准体制提议).Proteomics 2009，9，3796-3801；Kornfeld等人，The synthesis of complex-typeoligosaccharides II characterization of the processing intermediates in thesynthesis of the complex oligosaccharide units of the vesicular stomatitisvirus G protein(合成复杂型低聚糖II对合成水泡性口炎病毒G蛋白复杂低聚糖单元中加工用中间体的表征).JBiol Chem.1978，253，7771-7778；Varki等人，(编著)，Essentialsof Glycobiology(糖生物学基础)，第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY 1999；Varki等人，(编著)，Essentials of Glycobiology(糖生物学基础)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY 2009；和Dwek，Glycobiology：Moving into the mainstream(糖生物学基础：走向主流).Cell 2009，137，1175-1176。

图14(B)阐述了REGN7483^F和阿柏西普中除糖基化之外观察到的翻译后修饰。

图14(C)阐述了REGN7483^F的独立批次(微型捕捉体产品10)以及REGN7483^R、阿柏西普和REGN7711的糖基化特征。

实施例12：微型捕捉体短期血管通透性

在幼年新西兰白兔的眼部注射80mcl的80mM DL-α-氨基己二酸(DL-AAA)溶液。四个月后，通过进行荧光素血管造影术评估血管通透性。将诸眼分配入基线血管通透性面积相似的6个组(图15)。随后，对每个组，用单次玻璃体内注射以下之一处理眼：

组1：阿柏西普，50mcl中500mcg，n＝6；

组2：阿柏西普，50mcl中2mg，n＝6；

组3：重组(R)微型捕捉体(REGN7483^R)，50mcl中250.5mcg(与组1是等摩尔剂量)，n＝6；

组4：FabRICATOR(F)-切割的微型捕捉体(REGN7483^F)，50mcl中254.4mcg(与组1是等摩尔剂量)，n＝6；

组5：FabRICATOR(F)-切割的微型捕捉体(REGN7483^F)50mcl中1.4mg，n＝6；

组6：50mcl安慰剂缓冲液，n＝6

在基线时并且在第1、2、3、4、5和6周进行眼科检查。每次眼科检查包括测量眼内压(IOP)，以及无红(RF)成像(以确定血管形态)、荧光素血管造影术(FA；以确定血管渗漏)和光学相干断层摄影术(OCT；以鉴定玻璃体炎症)。在基线时并且在第1、2和4周采集血清(ADA)和血浆(药物水平)。

等摩尔剂量的阿柏西普(500mcg)和微型捕捉体(250.5或254.4mcg)以相似时间量阻断血管通透性(图16)。更高剂量的阿柏西普或FabRICATOR切割的微型捕捉体(REGN7483^F)阻断血管通透性持续更长时间段(图17)。在受测试剂量，FabRICATOR切割的微型捕捉体和重组微型捕捉体(REGN7483^R)均不引起眼内压显著变化(图18)。全部处理均造成相似水平的病理血管消退(图19)。

实施例13：微型捕捉体血管长期通透性

在幼年新西兰白兔的眼部注射80mcl的80mM DL-α-氨基己二酸(DL-AAA)溶液。二十二个月后，通过进行荧光素血管造影术评估血管通透性。将诸眼分配入基线血管通透性面积相似的3个组(图20)。在眼分配后，用单次玻璃体内注射以下之一处理眼：

组1：阿柏西普，50mcl中500mcg，n＝4；

组2：FabRICATOR切割的微型捕捉体(REGN7483^F)50mcl中213mcg/眼，n＝4；

组3：50mcl安慰剂缓冲液，n＝4

在基线时并且在第1、2、4、5、6、8、10和14周进行眼科检查。每次眼科检查包括测量眼内压(IOP)，以及无红(RF)成像(以确定血管形态)、荧光素血管造影术(FA；以确定血管渗漏)和光学相干断层摄影术(OCT；以鉴定玻璃体炎症)。

阿柏西普和FabRICATOR切割的微型捕捉体(REGN7483^F)均阻断血管通透性。在阿柏西普处理和微型捕捉体处理之间不存在阻断时长的统计显著差异(图21)。

实施例14：新鲜化学成分确知培养基孵育研究

研究了内标入含有阿柏西普(REGN3)的新鲜化学成分确知培养基(CDM)中的各种组分对颜色的影响。

用于孵育研究的运行参数是：

·10mL工作容积的50mL通气孔带盖振摇管

·孵育7天，在第0和第7天取得样品

·温度＝35.5℃

·用5N HCl或5N NaOH调节pH至7.35

·CO₂＝6.9％

·湿度＝75％

·搅拌＝150prm

·组分添加(作为DOE运行)

·阿柏西普原料药按6g/L浓度内标入振摇管

·基质＝新鲜CDM

为达到下文所列终浓度所添加的组分：

·半胱氨酸：16.6mM

·核黄素：0.014mM

·叶酸：0.17mM

·维生素B12：0.014mM

·硫胺素：0.18mM

·烟酰胺：0.84mM

·D-泛酸：0.62mM

·D-生物素：0.002mM

·吡多醇：0.49mM

·铁：0.22mM

·铜：0.0071mM

·锌：0.54mM

图24(A-B)中示出了添加的每种组分对b*值(CIEL*a*b*颜色空间)的影响。半胱氨酸导致最大的颜色增加。铁和锌与半胱氨酸孵育时生成颜色。核黄素和维生素B12统计学上不影响颜色。

实施例15：评价减少半胱氨酸和金属对b*值的影响。

评价了表达REGN3时降低半胱氨酸和金属的浓度对颜色的影响。细胞培养物研究的运行参数是：

·2L生物反应器

·温度：约35℃

·pH约7

·培养基＝如下文所述的CDM+Fe、Zn、Cu，Ni、EDTA和柠檬酸盐，包含半胱氨酸

·营养物进料(对照)：

о第2天＝20X基础CDF

о第4天＝20X基础CDF

о第6日＝13X基础CDF

о第8天＝13X基础CDF

*CDF＝化学成分确知的营养物进料

·以下组分作为基础CDF的部分(20X或13X)在第2、4、6和8天添加至培养物：约1-3微摩尔Fe、约6-19微摩尔Zn、约0.1-0.3微摩尔Cu、约8-24微摩尔EDTA和约1-3微摩尔柠檬酸盐/升培养物。

生物反应器实验条件如下：

·溶解氧设定值＝20.0％、40.4％(对照)或60.0％

·半胱氨酸添加/进料*＝约1.2-1.3毫摩尔/L培养物、1.6-1.7毫摩尔/L培养物(对照)或2.0-2.1毫摩尔/L培养物

·初始CDM中的金属*＝0.5x、1x或1.5x CDM水平——下文列出1X水平：

оFe＝68-83微摩尔/升培养物

оZn＝6-7微摩尔/升培养物

оCu＝0.1-0.2微摩尔/升培养物

оEDTA＝76-95微摩尔/升培养物

о柠檬酸＝45-55微摩尔/升培养物

оNi＝0.5-1微摩尔/升培养物

*每两天向培养物进料半胱氨酸。

降低半胱氨酸水平至1.2-1.3毫摩尔/L/进料减少颜色，而不显著影响滴度。降低培养基中金属浓度至0.5x减少颜色，同时滴度明显升高。存在对VCC(活细胞浓度)、活力、氨或重量摩尔渗透压浓度的最小影响。图25中示出了金属含量和半胱氨酸对b*值的预期影响。

实施例16：评价抗氧化剂对b＊值的影响

评价了内标入含有阿柏西普(REGN3)的已用过CDM中的抗氧化剂、牛磺酸、亚牛磺酸、硫辛酸、谷胱甘肽、甘氨酸和维生素C对颜色的影响。用于孵育研究的运行参数是：

·10mL工作容积的50mL通气孔带盖振摇管

·孵育7天，在第0和第7天取得样品

·温度＝35.5℃

·用5N HCl或5N NaOH调节pH至7.35

·CO₂＝6.9％

·湿度＝75％

·搅拌＝150prm

向已用过CDM添加组分的条件如下：

·阿柏西普原料药(pH 6.2、含有5mM磷酸钠、5mM柠檬酸钠和100mM氯化钠的缓冲水溶液中的纯化阿柏西普重组蛋白)按6g/L浓度内标入振荡器管中，基质＝来自微型捕捉体2L对照生物反应器的已用过培养基

·添加抗氧化剂以达到以下终浓度：

о牛磺酸＝10mM培养物

о亚牛磺酸＝10mM培养物

о甘氨酸＝10mM培养物

о硫辛酸＝0.0024mM培养物

о还原型谷胱甘肽＝2mM培养物

о胆碱＝1.43mM培养物

о氢化可的松＝0.0014mM培养物

о维生素C(抗坏血酸)＝0.028mM培养物

о维生素E(α-生育酚)＝0.009mM培养物

多种抗氧化剂减少已用过培养基中的颜色形成：亚牛磺酸、牛磺酸和甘氨酸的组合；硫辛酸；和维生素C。谷胱甘肽升高b*值。

表16-1.抗氧化剂影响已用过CDM中微型捕捉体的颜色形成的总结

条件	b*值
		已用过培养基第0天	0.37
已用过培养基第7天对照	1.47
		已用过培养基第7天+抗氧化剂	1.02

^＊显著降低b*值的抗氧化剂：亚牛磺酸/牛磺酸/甘氨酸、硫辛酸、维生素C。

图26(A-B)示出了多种抗氧化剂对b*值(CIEL*a*b*颜色空间)的预期影响总结。

实施例17：颜色分析线性度

取自微型捕捉体产品23的微型捕捉体从154mg/ml稀释至3.5mg/ml，并且在CIEL*a*b*颜色空间中确定每种稀释物的颜色。表17-1给出了观察到的颜色。

表17-1.蛋白质浓度对b*值

将各种稀释物中的颜色在图表上标出并且还进行各点的线性回归分析，确定浓度与b*之间的关系由以下等式表示：

b*＝0.046+(0.066X浓度(mg/ml))；

其中L*是约97-99并且a*是约0.06-0.85。参见图27。

实施例18：对REGN3的阴离子交换色谱(AEX)的减色评价

在二种AEX树脂(POROS 50HQ和Q琼脂糖凝胶Fast Flow)和三个设定值(pH 8.40和2.00mS/cm、pH 8.00和2.50mS/cm、以及pH 7.80和4.00mS/cm)上评价REGN3的颜色减少。

采用如表18-2中详述的AEX方案，如图8-1中详述那样对这项研究进行五种AEX分离。全部AEX加载液均源自中试生物反应器S504-190828(REGN3 X0SP过滤的汇集物，CCF38105-L8)。将15.7mL Q琼脂糖凝胶Fast FloW柱(19.5cm床高度，1.0cm I.D.)和14.1mLPOROS50HQ柱(18.0cm床高度，1.0cm I.D.)集成入AKTA Avant台式液相色谱法控制器用于这个实验。

使用2M tris碱或2M乙酸，调节AEX加载液pH至目标±0.05pH单位。使用5M氯化钠或RODI调节AEX加载液电导率至目标±0.1mS/cm。分析全部汇集物样品的HMW、颜色和产率。

表18-1.REGN3 AEX减色评价的研究设计总结

图18-2.用于REGN3减色评价的流通AEX方案。

AEX，阴离子交换色谱；CV，柱体积

进行五种AEX分离以评价树脂(Q琼脂糖凝胶FF或POROS 50HQ)以及pH和电导率设定值(pH 8.40和2.00mS/cm，pH 8.00和2.50mS/cm，或pH 7.80和4.00mS/cm)对REGN3减色的影响。对于POROS 50HQ，产率(64.4、81.9和91.4％)和汇集物HMW水平(1.02、1.29和1.83％)随设定值变更至更低pH和电导率更高而升高。颜色(b*值)也随设定值变更至更低pH和电导率更高而增加(1.05、1.33和1.55)。这表明更高pH水平和更低电导率为POROS 50HQ历经AEX分离时提供最大减色。

柱平衡缓冲液和施加至柱时其中配制有REG3的缓冲液如下：

·50mM Tris pH 8.4和2.0mS/cm，

·50mM Tris，10mM乙酸盐pH 8.0和2.5mS/cm；或

·50mM Tris，10mM乙酸盐，10mM NaCl pH 7.8和4.0mS/cm

对于Q琼脂糖凝胶Fast Flow，产率(49.5和77.7％)和汇集物HMW水平(0.59和1.25％)也随设定值变更至更低pH和电导率更高而升高。颜色(b*值)也随设定值变更至更低pH和电导率更高而增加(0.96和1.35)。这表明更高pH水平和更低电导率为Q琼脂糖凝胶Fast Flow历经AEX分离时提供最大减色。

另外，对于两种树脂上评价的两个设定值，Q琼脂糖凝胶Fast Flow较之POROS50HQ减少更多颜色。在pH 8.00和2.50mS/cm设定值，POROS 50HQ汇集物具有ab*值1.33，而Q琼脂糖凝胶Fast Flow汇集物具有b*值0.96。类似地，在pH 7.80和4.00mS/em设定值，POROS50HQ汇集物具有b*值1.55，而Q琼脂糖凝胶Fast Flow汇集物具有b*值1.35。

表18-3.AEX减色研究的实验结果总结*

AEX，阴离子交换色谱；HMW，高分子量种类；N/A，不适用

*全部颜色读取均在浓度10g/升时进行

在二种AEX树脂(POROS 50HQ和Q琼脂糖凝胶Fast Flow)和三个设定值(pH 8.40和2.00mS/cm、pH 8.00和2.50mS/cm、以及pH 7.80和4.00mS/cm)上评价REGN3的颜色减少。对于两种树脂，减色在更高pH和更低电导率设定值时最佳。另外，在两种树脂上评价的两个设定值(pH8.00和2.50mS/cm以及pH7.80和4.00mS/cm)，Q琼脂糖凝胶Fast Flow较POROS 50HQ提供更多减色。

实施例19：使用CDM产生阿柏西普的糖基化和活力研究

在这个实施例中，使用CDM 1、CDM 2(商业获得)和CDM 3(商业获得)产生宿主细胞系表达阿柏西普融合蛋白。用无额外培养基组分的CDM 1、2和3实施一组实验。使用以下CDM1-3进行另一组实验，其中将锰(氯化锰三水合物，Sigma，3.2mg/L)、半乳糖(Sigma，8g/L)和尿苷(Sigma，6g/L)添加至进料，以调节半乳糖基化特征。最后，使用以下CDM 1-3进行另一组实验，其中将锰(氯化锰三水合物，Sigma，3.2mg/L)、半乳糖(Sigma，8g/L)和尿苷(Sigma，6g/L)添加至进料以调节半乳糖基化特征并且将地塞米松(Sigma，12mg/L)添加至进料以调节该组合物的唾液酸化特征。通过离心随后0.45μm过滤制备使用每种CDM的收获物。

在N-聚糖分析之前，通过ProA纯化样品。

滴度测量

使用Agilent(Santa Clara，Calif.)1200系列HPLC或等同物，每天测量阿柏西普滴度，以低pH和分步洗脱梯度于280nm处检测运行。相对于参照物标准校准曲线赋予绝对浓度。

活细胞密度(VCD)和细胞活力值

借助Nova BioProfile Flex自动化细胞计数器(Nova Biomedical，Waltham，MA)，通过台盼蓝拒染法测量活细胞密度(VCD)和细胞活力值。用Nova BioProfile Flex(NovaBiomedical，Waltham，MA)测量葡萄糖、乳酸盐、离线pH、溶解氧(DO)、pCO₂量值和重量摩尔渗透压浓度。

N-聚糖低聚糖剖析

使用GlycoWorks快速去糖基化试剂盒和GlycoWorks RapiFluor-MS标记物试剂盒(Waters货号分别是186008939和186008091)，制备大约15μg经蛋白A纯化的来自CDM1-3的收获物中的样品以根据Waters GlycoWorks方案进行N-聚糖分析。通过以下方式从蛋白质移除N-聚糖：用PNGase-F在50.5℃处理样品5分钟，随后在25℃降温5分钟。通过在室温反应5分钟，用RapiFluor-MS荧光染料标记释放的聚糖。通过添加乙腈至反应混合物并且通过2，204x g离心10分钟粒化至孔底，使蛋白质沉淀。将含有标记聚糖的上清液收集并且在UPLC上使用亲水相互作用液相色谱法(Waters BEH酰胺柱)附带柱后荧光检测进行分析。与柱结合后，将标记的聚糖分离并且使用由乙腈和含水50mM甲酸铵(pH 4.4)组成的双元流动相梯度洗脱。使用激发波长265nm和发射波长425nm的荧光检测器检测标记的聚糖。使用所得色谱图中的N-聚糖峰的相对面积百分数，将N-聚糖分布报告为以下N-聚糖的总百分数：(1)含有核心岩藻糖残基的N-聚糖(总岩藻糖基化，表19-1)、(2)含有至少一个唾液酸残基的N-聚糖(总唾液酸化，表19-2)，(3)鉴定为甘露糖-5的N-聚糖(甘露糖-5，表19-3)，(4)含有至少一个半乳糖残基的N-聚糖(总半乳糖基化，表19-4)，和(5)身份已知的N-聚糖(总的鉴定峰，表19-5)。

结果

在九种培养物当中，包含尿苷、锰和半乳糖的CDM1培养物在12天显示最高滴度(5.5g/L)。相比其他七种培养物，不包含额外组分的CDM1培养物在12天也显示高滴度(约4.25g/L)；。

直至第6工艺日，细胞活力结果在各种条件下类似。在第7工艺日后，具有或没有额外培养基组分的CDM2培养物和CDM3培养物显示超过约90％活力。

具有尿苷、锰和半乳糖的CDM1培养物约第6天显示最高VCC。

培养物和补充物的影响对N-聚糖总体分布产生显著影响(表19-1至表19-5)。比较了对蛋白A纯化的阿柏西普(评价两份样品)使用未利用CDM的商用化阿柏西普制造上游工艺产生的聚糖水平。表19-5中列出总的鉴定峰。

表19-1.总岩藻糖基化(％)

U是尿苷，M是锰，G是半乳糖，Dex是地塞米松

表19-2.总唾液酸化(％)

U是尿苷，M是锰，G是半乳糖，Dex是地塞米松

表19-3.甘露糖-5(％)

U是尿苷，M是锰，G是半乳糖，Dex是地塞米松

表19-4.总半乳糖基化(％)

U是尿苷，M是锰，G是半乳糖，Dex是地塞米松

表19-5.总的鉴定峰(％)

U是尿苷，M是锰，G是半乳糖，Dex是地塞米松

对CDM的第12天培养物观察到的总岩藻糖基化、总唾液酸化、总半乳糖基化和甘露糖-5分别是42.61％至46.26％、30.84％至39.14％、59.02至66％和8.86％至13.38％。这些糖基化值显著不同于对蛋白A纯化的阿柏西普使用上游工艺所获得糖基化值。

实施例20：兔中VEGF微型捕捉体玻璃体内荧光测定药代动力学(PK)

在新西兰白兔的眼中分析多种VEGF捕捉体和微型捕捉体的药代动力学。

表20-1.所用的VEGF捕捉体和微型捕捉体蛋白

REGN3和REGN7483(实验1)

VEGF捕捉体(REGN3)和VEGF微型捕捉体(REGN7483^F)是用Alexa Fluor 488(AF488)通过胺缀合法标记的分子。表20-2中提供蛋白质浓度、内毒素水平和标记程度(DOL)。图32中示出捕捉体和微型捕捉体的衰变曲线自然对数图。对6只雄性新西兰白色(NZW)兔(6只眼/3只兔/分子)进行双侧玻璃体内(IVT)注射。注射前，用OcuMetricsFluorotron荧光光度计(Mountain View，CA)检查全部眼的玻璃体基线荧光，随后在注射后第2、7、10、14和28天检查玻璃体荧光强度。一般眼科检查包括IVT注射之前与之后10分钟及每个随访时间点时的眼内压(IOP)、炎症体征、角膜水肿与结膜水肿、出血、前房飞蚊症、瞳孔尺寸与形状、白内障和视网膜脱离情况。提取荧光强度和位置信息并输入GraphPadPrism中用于图形显示和分析。数据对一级、单区室模型拟合。

表20-2.兔玻璃体内荧光测定PK中VEGF捕捉体和VEGF微型捕捉体的半寿期(t₁/₂)

结果

NZW兔玻璃体中VEGF捕捉体(REGN3)和VEGF微型捕捉体(REGN7483^F)的PK研究显示，半寿期分别是4.6(±0.3)天和3.9(±0.4)天。在IVT注射任一种分子之前和之后不存在显著的IOP变化。参见图34。一般眼科检查中未观察到临床明显的体征。

结论

先前研究中常规测量的VEGF捕捉体的兔玻璃体半寿期是4.8天，与通过体内荧光测定测量值相当。本研究显示，VEGF微型捕捉体(REGN7483^F)的半寿期在NZW兔玻璃体中短于VEGF捕捉体(REGN3)，VEGF微型捕捉体持续存在约15％更短时间(3.9天vs.4.6天)。

REGN3、REGN7850和REGN7851(实验2)

VEGF捕捉体(REGN3)和两种VEGF微型捕捉体(REGN7850和REGN7851)是用AlexaFluor488(AF488)通过胺缀合法标记的分子。表20-3中提供蛋白质浓度、内毒素水平和标记程度(DOL)。图33中阐述捕捉体和微型捕捉体的衰变曲线自然对数图。对6只雄性新西兰白色(NZW)兔(6只眼/3只兔/分子)进行双侧玻璃体内(IVT)注射。注射前，用OcuMetricsFluorotron荧光光度计(Mountain View，CA)检查全部眼的玻璃体基线荧光，随后在注射后第4、7、9和14天检查玻璃体荧光强度。一般眼科检查包括IVT注射之前与之后10分钟及每个随访时间点时的眼内压(IOP)、炎症体征、角膜水肿与结膜水肿、出血、前房飞蚊症、瞳孔尺寸与形状、白内障和视网膜脱离情况。提取荧光强度和位置信息并输入GraphPad Prism中用于图形显示和分析。数据对一级、单区室模型拟合。

表20-3.兔玻璃体内荧光测定PK中VEGF捕捉体和微型捕捉体不同变体的半寿期

结果

NZW兔玻璃体中VEGF捕捉体(REGN3)和VEGF微型捕捉体(REGN7850和REGN7851)的PK研究显示，半寿期分别是4.3(±0.3)天、3.4(±0.5)天和3.4(±0.5)天。在IVT注射任一种分子之前和之后不存在显著的IOP变化。一般眼科检查中未观察到临床明显的体征。

结论

通过体内荧光测定法测量的PK研究显示，另外两种变体VEGF微型捕捉体(REGN7850和REGN7851)的半寿期在NZW兔玻璃体中短于VEGF捕捉体(REGN3)，两种VEGF微型捕捉体持续存在约21％更短时间(3.4天对比4.3天)。

表20-4.独立眼的半寿期总结

*****************

本文援引的全部参考文献均通过引用方式以相同程度并入本文，如同通过引用方式专门且独自地并入每份单独的出版物、数据库项(例如，Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利。

Claims

1.一种分离的VEGF微型捕捉体，包含以下结构域结构：

((R1D2)-(R2D3))_a-(MC)_c；

其中所述VEGF微型捕捉体的一个或多个组氨酸氧化成2-氧代-组氨酸，

和/或一个或多个色氨酸是二氧化的，

和/或其一个或多个天冬酰胺是糖基化的，

或

((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_a-(MC)_b，

((R1D2)-(R2D3))_c-接头-((R1D2)-(R2D3))_d；或

((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_e-接头-((R1D2)-(R2D3)-(R2D4))_f；

其中，

R1D2是VEGFR1 Ig结构域2；

R2D3是VEGFR2 Ig结构域3；

R2D4是VEGFR2 Ig结构域4；

MC是多聚化组分，所述多聚化组分是免疫球蛋白铰链区片段或由以下氨基酸序列组成的多肽：

DKTHTCPPC(SEQ ID NO：22)，

DKTHTCPPCPPC(SEQ ID NO：23)，

DKTHTCPPCPPCPPC(SEQ ID NO：24)，

DKTHTC(PPC)_h(SEQ ID NO：25)，其中h是1、2、3、4或5，

DKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：6)，

DKTHTCPLCPAPELLG(SEQ ID NO：7)，

DKTHTC(SEQ ID NO：8)或

DKTHTCPLCPAP(SEQ ID NO：9)

和

接头是包含约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸的肽；

以及独立地，a＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；b＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；c＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；d＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；e＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；并且f＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；

或其组合物。

2.根据权利要求1所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，选自

(i)(R1D2)₁-(R2D3)₁-(MC)₁；

和

(ii)(R1D2)₁-(R2D3)₁-(R2D4)₁-(MC)₁。

3.VEGF微型捕捉体或其组合物，其包含选自以下成员中所示的氨基酸序列：

(SEQ ID NO：12)；

(SEQ ID NO：13)；

(SEQ ID NO：26)；

(SEQ ID NO：27)；

(SEQ ID NO：28)；

(SEQ ID NO：29；其中x是1、2、3、4或5)；

(SEQ ID NO：32)；

(SEQ ID NO：33)；

和

(SEQ ID NO：30；其中y是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其中所述微型捕捉体包含以下结构域结构：

(i)(R1D2)_a-(R2D3)_b-接头-(R1D2)_c-(R2D3)_d；或

(ii)(R1D2)_a-(R2D3)_b-(R2D4)_c-接头-(R1D2)_d-(R2D3)_e-(R2D4)_f；并且

具有二级结构，其中：

(i)所述诸R1D2结构域配位；

(ii)所述诸R2D3结构域配位；和/或

(iii)所述诸R2D4结构域配位，

以形成VEGF结合结构域。

5.根据权利要求1、3或4中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其中接头是(Gly₄Ser)_n，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；或

其中MC是与另一个MC形成2个、3个或4个半胱氨酸桥的免疫球蛋白铰链区的片段。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其中所述多肽是同型二聚化的。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其中所述VEGF微型捕捉体的一个或多个组氨酸氧化成2-氧代-组氨酸，和/或所述VEGF微型捕捉体的一个或多个色氨酸被二氧化，和/或所述VEGF微型捕捉体的一个或多个天冬酰胺是糖基化的。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其是包含所述VEGF微型捕捉体的组合物，其中VEGF微型捕捉体中0.1％和2％之间的组氨酸是2-氧代-组氨酸。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其是包含所述VEGF微型捕捉体多肽的组合物，其中用Lys-C蛋白酶和胰蛋白酶消化所述VEGF微型捕捉体获得的寡肽产物如下，其包含一个或多个羧甲基化半胱氨酸和2-氧代-组氨酸：

EIGLLTC*EATVNGH*LYK(SEQ ID NO：12的氨基酸73-89)，其包含约0.006-0.013％的2-氧代-组氨酸，

QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(SEQ ID NO：12的氨基酸97-119)，其包含约0.019-0.028％的2-氧代-组氨酸，

TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(SEQ ID NO：12的氨基酸128-148)，其包含约0.049-0.085％的2-氧代-组氨酸，

DKTH*TC*PPC*PAPELLG(SEQ ID NO：12的氨基酸206-221)，其包含约0.057-0.092％的2-氧代-组氨酸，和/或

TNYLTH*R(SEQ ID NO：12的氨基酸90-96)，其包含约0.010-0.022％的2-氧代-组氨酸，和

任选地，IIW*DSR(SEQ ID NO：12的氨基酸56-61)，其包含约0.198-0.298％的2-氧代-组氨酸，

其中H*是可以氧化成2-氧代-组氨酸的组氨酸，W*是可以被二氧化的色氨酸并且其中C*是可以羧甲基化的半胱氨酸。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其是包含所述VEGF微型捕捉体的组合物，其中用Lys-C蛋白酶和胰蛋白酶消化所述VEGF微型捕捉体获得的寡肽产物如下，其包含一个或多个羧甲基化半胱氨酸和2-氧代-组氨酸：

EIGLLTC*EATVNGH*LYK(SEQ ID NO：12的氨基酸73-89)，其包含约0.0095％的2-氧代-组氨酸，

QTNTIIDVVLSPSH*GIELSVGEK(SEQ ID NO：12的氨基酸97-119)，其包含约0.0235％的2-氧代-组氨酸，

TELNVGIDFNWEYPSSKH*QHK(SEQ ID NO：12的氨基酸128-148)，其包含约0.067％的2-氧代-组氨酸，

DKTH*TC*PPC*PAPELLG(SEQ ID NO：12的氨基酸206-221)，其包含约0.0745％的2-氧代-组氨酸，和/或

TNYLTH*R(SEQ ID NO：12的氨基酸90-96)，其包含约0.016％的2-氧代-组氨酸，和

任选地，IIW*DSR(SEQ ID NO：12的氨基酸56-61)，其包含约0.248％的2-氧代-组氨酸，

11.根据权利要求1-10中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其是其中一个或多个色氨酸被二氧化的组合物。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其是其中2-氧代-组氨酸以如下化学式为特征的组合物：

13.根据权利要求1-12中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其是以如下颜色为特征的组合物：

(i)所述颜色不比欧洲颜色标准BY2更棕黄；

(ii)所述颜色不比欧洲颜色标准BY3更棕黄；

(iii)所述颜色不比欧洲颜色标准BY4更棕黄；

(iv)所述颜色不比欧洲颜色标准BY5更棕黄；

(v)所述颜色不比欧洲颜色标准BY6更棕黄；

(vi)所述颜色不比欧洲颜色标准BY7更棕黄；

(vi)所述颜色介于欧洲颜色标准BY2和BY3之间；

(vi)所述颜色介于欧洲颜色标准BY2和BY4之间；

(vii)其中，在CIEL*a*b*颜色空间中，L*是约70-99，a*是约-2-0并且b*是约20或更小；和/或

(viii)其中，在CIEL*a*b*颜色空间中，L*是约98-99，a*是约-1-0并且b*是约5-10，并且微型捕捉体浓度介于75和100mg/ml之间；

任选地，其中VEGF微型捕捉体的浓度是约70-200mg/ml或

任选地，其中VEGF微型捕捉体的浓度是约70-200mg/ml，但当稀释至约10、11、10-11、80或90mg/ml时，以所述颜色为特征。

14.根据权利要求1-12中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其是其中组合物的颜色以如下公式为特征的组合物：

0.046+(0.066X微型捕捉体浓度(mg/ml))＝b*或b*＝(0.11X微型捕捉体浓度(mg/ml)-0.56)，其中L*＝约97-99并且a＝约-0.085-0.06。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其是作为以下方法之产物的组合物：

(i)在化学成分确知的液体培养基中于宿主细胞中表达阿柏西普或所述VEGF微型捕捉体，其中所述阿柏西普或VEGF微型捕捉体从宿主细胞分泌入培养基；并且

(ii)如果表达阿柏西普，则还包括蛋白水解切割阿柏西普以产生包含Fc结构域或其片段的肽和所述VEGF微型捕捉体，和从VEGF微型捕捉体移除Fc结构域或其片段；

(iii)施加VEGF微型捕捉体至阴离子交换色谱树脂；并且

(iv)保留其色谱流通液中的所述VEGF微型捕捉体多肽。

16.根据权利要求15所述的VEGF微型捕捉体或其组合物，其为组合物，其中如果表达所述阿柏西普，则该方法还包括在所述蛋白水解切割之前对阿柏西普进行蛋白A纯化。

17.根据权利要求15-16中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其为组合物，其中阴离子交换树脂包含：

强阴离子交换树脂；

季胺官能团；

-O-CH₂CHOHCH₂OCH₂CHOHCH₂N⁺(CH₃)₃官能团；或

季铵化聚乙烯亚胺官能团。

18.根据权利要求15-17中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其为组合物，其中通过将阿柏西普与化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)IdeS蛋白酶或其包含一个或多个点突变的变体温育进行蛋白水解切割。

19.根据权利要求15-18中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其为组合物，其中将所述VEGF微型捕捉体在选自以下的条件下施加至阴离子交换(AEX)色谱树脂：

(1)AEX树脂包含季铵化聚乙烯亚胺官能团并且经具有电导率1.90-2.10mS/cm的pH8.30-8.50的缓冲液平衡；

(2)AEX树脂包含-O-CH₂CHOHCH₂OCH₂CHOHCH₂N⁺(CH₃)₃或-N⁺(CH₃)₃或季铵官能团并且经具有电导率2.40-2.60mS/cm的pH 7.90-8.10的缓冲液平衡；

(3)AEX树脂包含季铵化聚乙烯亚胺官能团并且经具有电导率2.40-2.60mS/cm的pH7.90-8.10的缓冲液平衡；

(4)AEX树脂包含-O-CH₂CHOHCH₂OCH₂CHOHCH₂N⁺(CH₃)₃或-N⁺(CH₃)₃或季铵官能团并且经具有电导率3.90-4.10mS/cm的pH 7.70-7.90的缓冲液平衡；

(5)AEX树脂包含季铵化聚乙烯亚胺官能团并且经具有电导率3.90-4.10mS/cm的pH7.70-7.90的缓冲液平衡；

(6)AEX树脂包含-O-CH₂CHOHCH₂OCH₂CHOHCH₂N⁺(CH₃)₃或-N⁺(CH₃)₃或季铵官能团并且经具有电导率9.0±0.1mS/cm的pH 7.70±0.1的缓冲液平衡；并且

(7)AEX树脂包含季铵化聚乙烯亚胺官能团并且经具有电导率2.0±0.1mS/cm的pH 8.4±0.1的缓冲液平衡；

任选地其中：

条件(1)下的缓冲液包含：50mM Tris，pH 8.4和2.0mS/cm；

条件(2)-(3)下的缓冲液包含：50mM Tris，10mM乙酸盐，pH 8.0和2.5mS/cm；

条件(4)-(5)下的缓冲液包含：50mM Tris，10mM乙酸盐，10mM NaCl，pH 7.8和4.0mS/cm；

条件(6)下的缓冲液包含：50mM Tris，60mM NaCl，pH 7.7±0.1；和/或

条件(7)下的缓冲液包含：50mM Tris，pH 8.4±0.1；

在施加至树脂之前，VEGF微型捕捉体处于作为平衡缓冲液的上样缓冲液中；

如/或

在施加VEGF微型捕捉体至树脂之后，将所述树脂用所述水性缓冲液洗涤。

20.根据权利要求15-19中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其为组合物，其中在蛋白水解切割后，通过施加包含Fc结构域或片段和VEGF微型捕捉体的组合物至蛋白A色谱树脂并且保留流通级分中的VEGF微型捕捉体，从VEGF微型捕捉体中色谱移除Fc结构域或其片段。

21.根据权利要求15-20中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其为组合物，其中该方法还包括调节pH至约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1或6.2、过滤、渗滤、病毒灭活、蛋白A色谱纯化和/或疏水相互作用色谱纯化。

22.根据权利要求15-20中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其为组合物，其中该方法还包括在包含苯基官能团的树脂上疏水相互作用色谱纯化。

23.根据权利要求15-22中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其为组合物，其中疏水相互作用色谱纯化以结合和洗脱模式或流通模式完成。

24.根据权利要求15-20中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其为组合物，其中：

所述微型捕捉体在处于化学成分确知培养基(CDM)中的宿主细胞中表达或其中所述微型捕捉体是包括用IdeS酶对阿柏西普进行蛋白水解切割方法的产物，其中所述阿柏西普在化学成分确知的液体培养基中的宿主细胞中表达，其中在包括以下步骤的方法中培养所述宿主细胞：

○(i)引导宿主细胞至CDM，所述CDM包含：

■约68微摩尔Fe/升培养物，

■约6微摩尔Zn/升培养物，

■约0.1微摩尔Cu/升培养物，

■约76微摩尔EDTA/升培养物，

■约45微摩尔柠檬酸盐/升培养物，和

■约0.5微摩尔Ni/升培养物，和任选地

■约1.2毫摩尔半胱氨酸/升培养物；

○每两天向培养物添加：

■约1.2毫摩尔半胱氨酸/升培养物，

■约1微摩尔Fe/升培养物，

■约6微摩尔Zn/升培养物，

■约0.1微摩尔Cu/升培养物，

■约8微摩尔EDTA/升培养物，和

■约1微摩尔柠檬酸盐/升培养物；

任选地，其中CDM包含硫辛酸、维生素C和/或亚牛磺酸、牛磺酸和甘氨酸的混合物；

任选地其中CDM包含尿苷、锰、半乳糖和/或地塞米松。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其中：

●VEGF微型捕捉体的一个或多个天冬酰胺被N-糖基化；

●VEGF微型捕捉体的一个或多个丝氨酸或苏氨酸被O-糖基化；

●VEGF微型捕捉体的一个或多个天冬酰胺是脱酰胺的；

●VEGF微型捕捉体的一个或多个天冬氨酸-甘氨酸基序转化成异天冬氨酸-甘氨酸和/或Asn-Gly；

●VEGF微型捕捉体的一个或多个甲硫氨酸是氧化的；

●VEGF微型捕捉体的一个或多个色氨酸转化成N-甲酰基犬尿氨酸；

●VEGF微型捕捉体的一个或多个精氨酸转化成Arg 3-脱氧葡糖醛酮；

●VEGF微型捕捉体的C末端甘氨酸不存在；

●在VEGF微型捕捉体中存在一个或多个未糖基化的糖基化位点；

●VEGF微型捕捉体包含约40％至约50％的总岩藻糖基化聚糖；

●VEGF微型捕捉体包含约30％至约55％的总唾液酸化聚糖；

●VEGF微型捕捉体包含约6％至约15％的甘露糖-5；

●VEGF微型捕捉体包含约60％至约79％的半乳糖化聚糖；

●VEGF微型捕捉体被木糖基化；

●VEGF微型捕捉体在赖氨酸处糖化；

●VEGF微型捕捉体包含带游离硫醇基的胱氨酸；

●VEGF微型捕捉体包含三硫桥；

●VEGF微型捕捉体包含链内二硫桥；

●VEGF微型捕捉体包含平行取向的二硫桥；和/或

●VEGF微型捕捉体包含羧甲基化的赖氨酸或精氨酸。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其中VEGF微型捕捉体的一个或多个天冬酰胺包含：

●G0-GlcNAc糖基化；

●G1-GlcNAc糖基化；

●G1S-GlcNAc糖基化；

●G0糖基化；

●G1糖基化；

●G1S糖基化；

●G2糖基化；

●G2S糖基化；

●G2S2糖基化；

●G0F糖基化；

●G2F2S糖基化；

●G2F2S2糖基化；

●G1F糖基化；

●G1FS糖基化；

●G2F糖基化；

●G2FS糖基化；

●G2FS2糖基化；

●G3FS糖基化；

●G3FS3糖基化；

●G0-2GlcNAc糖基化；

●Man4糖基化；

●Man4_A1G1糖基化；

●Man4_A1G1S1糖基化；

●Man5糖基化；

●Man5_A1G1糖基化；

●Man5_A1G1S1糖基化；

●Man6糖基化；

●Man6_G0+磷酸糖基化；

●Man6+磷酸糖基化；和/或

●Man7糖基化。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其中VEGF微型捕捉体包含：

●在约30-35％的第123天冬酰胺残基处的Man5糖基化；

●在约25-30％的第196天冬酰胺残基处Man5糖基化；

●在约6-8％的第36天冬酰胺残基处Man6-磷酸糖基化；

●在约3-4％的第123天冬酰胺残基处Man7糖基化；

●在约38％的第123天冬酰胺残基处高甘露糖糖基化；和/或

●在约29％的第196天冬酰胺残基处高甘露糖糖基化。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其是包含浓度约80、85、90、80-90、100、105、110、115、120、125、130或90-120mg/ml的VEGF微型捕捉体的组合物。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其中

●组合物是水性的；

●微型捕捉体在中国仓鼠卵巢细胞中表达；

●组合物的pH是约5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1或6.2；

如/或

●微型捕捉体尚未暴露于任何大于约0.24、0.6、0.96、1.2或2.4百万lux*hr的白光；和/或任何大于约40、100、160、200或400W*h/m²的紫外线A(UVA)光。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物，其中VEGF微型捕捉体是单体、同型二聚体或多聚体。

31.药物制剂，其包含根据权利要求1-30中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物和可药用载体。

32.注射装置，其包含根据权利要求1-31中任一项所述的VEGF微型捕捉体多肽、组合物或制剂。

33.根据权利要求32所述的注射装置，其是无菌预充填的注射器。

34.根据权利要求1-31中任一项所述的VEGF微型捕捉体多肽、组合物或制剂，与其他治疗剂联合。

35.分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1-7中任一项所述的VEGF微型捕捉体。

36.载体，其包含根据权利要求35所述的多核苷酸。

37.宿主细胞，其包含根据权利要求1-7、35或36中任一项所述的VEGF微型捕捉体、多核苷酸和/或载体。

38.根据权利要求37所述的宿主细胞，其是中国仓鼠卵巢细胞。

39.用于制备根据权利要求1-7中任一项所述的VEGF微型捕捉体的方法，包括向宿主细胞中引入编码所述多肽的多核苷酸，在表达所述多肽的条件下在培养基中培养宿主细胞，和任选地，从宿主细胞和/或培养基分离所述多肽。

40.根据权利要求39所述的方法，其中宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

41.VEGF微型捕捉体，其是根据权利要求39-40中任一项所述的产物。

42.用于制备根据权利要求1-7中任一项所述的VEGF微型捕捉体的方法，所述方法基本上由以下组成：用酶对VEGF捕捉体进行蛋白酶解，所述酶切割以下序列后的免疫球蛋白Fc多肽：DKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：20)。

43.根据权利要求42所述的方法，其中VEGF捕捉体是阿柏西普或康柏西普。

44.根据权利要求42-43中任一项所述的方法，其中酶是化脓性链球菌(S.pyogenes)IdeS或马链球菌(Streptococcus equi)兽疫亚种IdeZ。

45.用于向受试者施用根据权利要求1-31和34中任一项的所述VEGF微型捕捉体或组合物或药物制剂的方法，包括向受试者的身体引入VEGF微型捕捉体、组合物或制剂，和任选地其他治疗剂。

46.根据权利要求45所述的方法，其中通过眼内注射施用所述VEGF微型捕捉体至受试者的身体。

47.根据权利要求45-46中任一项所述的方法，其中通过玻璃体内注射以眼内方式施用所述VEGF微型捕捉体至受试者的身体。

48.在有需求的受试者中治疗生血管眼病的方法，所述方法包括向受试者的眼内注射治疗有效量的根据权利要求1-31或34或41中任一项所述的VEGF微型捕捉体或组合物或其药物制剂和任选地其他治疗剂。

49.根据权利要求45-48所述的方法，其中将约0.5mg、2mg、4mg、6mg、8mg或10mg的VEGF微型捕捉体以玻璃体内方式注射入受试者的眼。

50.根据权利要求48-49中任一项所述的方法，其中生血管眼病是

●年龄相关性黄斑变性(湿性)，

●年龄相关性黄斑变性(干性)，

●黄斑水肿，

●视网膜静脉闭塞后黄斑水肿，

●视网膜静脉闭塞(RVO)，

●视网膜中央静脉阻塞(CRVO)，

●分支视网膜静脉闭塞(BRVO)，

●糖尿病性黄斑水肿(DME)，

●脉络膜血管新生(CNV)，

●虹膜血管新生，

●新生血管性青光眼，

●青光眼术后纤维化，

●增生性玻璃体视网膜病变(PVR)，

●视盘血管新生，

●角膜新血管形成，

●视网膜血管新生，

●玻璃体血管新生，

●血管翳，

●翼状胬肉，

●血管性视网膜病变，

●糖尿病性视网膜病变，其中受试者还患有糖尿病性黄斑水肿；和

●糖尿病性视网膜病变。

51.根据权利要求45-50中任一项所述的方法，其中VEGF微型捕捉体以约100微升或更小体积施用。