JP2021514609A - ウイルス混入物質を同定するためのシステムおよび方法 - Google Patents

ウイルス混入物質を同定するためのシステムおよび方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＤＮＡ／ＲＮＡウイルスゲノムを優先するよう全ゲノム物質を傾けるための、効率化された試料調製プロセスであるＶＥＲＡ（ＶｉｒａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｂｙＲｅｄｕｃｉｎｇＡｒｔｉｆａｃｔｓ：アーチファクト低減によるウイルス富化）に関する。こうした宿主ゲノムアーチファクト低減は、試料取得から８時間未満で完了させることが可能である。（約１５分の）迅速なライブラリー調製プロトコールおよびリアルタイムナノポアシーケンシングを使用して、例えばＲＮＡウイルス混入などのウイルス混入の可能性を、試料取得から１営業日未満で同定することが可能である。【選択図】図２

Description

本発明は、全般的に、核酸、特に細胞培養物中に存在するウイルス核酸配列中の核酸を、シーケンシングする方法に関する。
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）およびその他の高性能配列解読装置（Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＨＴＳ）プラットフォームは、バイオ医薬品業界におけるウイルス安全性試験を再定義することに関して将来性がある。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアプローチは、感受性が高く、安価で、かつ迅速である。それに対し、ＮＧＳベースのアプローチは、特定の臨床試料または製造試料中に存在する全てのウイルスゲノムを、広範囲に試験できる。本テクノロジーを、製造プロセス中に混入が生ずる可能性を系統的に監視するためのツールとして活用することは妨げられてきた。その妨げの原因は、外来性病原体のメタゲノム検出に必要とされたワークフローに起因する。特に、常法的ウイルススクリーニング対策にＮＧＳテクノロジーを採用するにあたって必要とされるのが、試料調製ストラテジーの最適化、効率化および自動化によるライブラリー調製、ならびに時間依存的な分析ワークフローである。
ウイルスゲノムは複雑かつ多様であり、とりわけＲＮＡウイルスは、デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）ＨＴＳワークフローの際の適切なライブラリー調製を複雑にしてしまう。微生物およびマイコプラズマの混入は、検出が比較的容易であるが、対照的に、ウイルス混入の脅威は深刻とされている。原因は、ウイルスによっては検出困難なものもあり、感染した細胞培養物を処置する効果的な方法が欠如しているからである。
ゆえに、細胞培養物中のウイルス混入の検出および同定を目的とする新規な方法に対し、ニーズが存在している。
一実施形態では、ウイルスゲノムを優先するよう全ゲノム物質を傾ける（ｔｉｌｔ）ための、効率化された試料調製プロセスであるＶＥＲＡ（Ｖｉｒａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｂｙ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｒｔｉｆａｃｔｓ：アーチファクト低減によるウイルス富化）が提供されている。この宿主ゲノム物質の低減は、試料取得から８時間未満で完了させることが可能である。（約１５分の）迅速なライブラリー調製プロトコールおよびリアルタイムナノポアシーケンシングを使用して、ウイルス混入の可能性を、試料取得から１営業日未満で同定することが可能となる。
図１は、細胞培養試料中のウイルス核酸を検出し同定するための、例示的な方法の略図である。細胞培養物の試料中のウイルス核酸を同定するための方法は、細胞培養物の試料中の真核細胞を溶解させる工程を含む。細胞溶解は、超音波処理または均質化のような、機械的溶解技術を使用して実行できる。細胞を溶解するための方法としては、従来の凍結融解技術が、好適とされる。いったん細胞培養物中の細胞が溶解したら、試料から細胞デブリを取り除く。細胞デブリを除去する目的に用いられる従来技術としては、限定されるものではないが、遠心分離、サイズ濾過、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。いったん細胞デブリの大部分が試料から除去されたら、試料を濃縮して、保持液を生成する。次いで、保持液をヌクレアーゼで処理する。これにより、真核生物の核酸が消化される。ウイルス核酸はウイルス粒子で保護されていることから、ヌクレアーゼ処理ではウイルス核酸の消化は為されない。一実施形態では、保持液を、ベンゾナーゼ（登録商標）、Ｏｍｎｉ Ｃｌｅａｖｅ（商標）、およびＲｉｂｏＳｈｒｅｄｄｅｒ（商標）の組み合わせで処理することにより、培養中の宿主細胞ＤＮＡおよびＲＮＡが消化されるようにする。ヌクレアーゼで処理した後、保持液からウイルス核酸を抽出する。ウイルス核酸は、例えばリアルタイムナノポアシーケンシングによってシーケンシングすることにより、増幅なしで同定される。或る特定の実施形態では、シーケンシングにより得られたウイルスリードが、シーケンシングにより得られた細胞核酸リードを上回る。
本開示の方法の別の実施形態では、ウイルスリードは、シーケンシングにより得られた全リードの少なくとも５１％であるか、またはシーケンシングにより得られた全リードの５０〜９９％、またはシーケンシングにより得られた全リードの少なくとも８０％、８５％もしくは９０％である。
細胞培養物中の細胞は、一般的に、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、タンパク質薬物産物を分泌する。タンパク質薬物産物は、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、または組換えタンパク質であり得る。
或る特定の実施形態において、ウイルスは、ＲＮＡウイルス、ＤＮＡウイルス、またはそれらの組み合わせであり、そのウイルスは一本鎖または二本鎖であり得る。検出可能な例示的ウイルスとしては、限定されるものではないが、マウス微小ウイルス（Ｍｉｎｕｔｅ ｖｉｒｕｓ ｏｆ ｍｉｃｅ）（ＭＶＭ）、ＭＳＶ１、Ｐ１２／ＥＭＣ、マウス脳脊髄炎ウイルス（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、マウスアデノウイルス（Ｍｏｕｓｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、乳酸脱水素酵素ウイルス（ＬＤＶ）、ポリオーマウイルス、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、センダイウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、レオウイルス３型、キルハムラットウイルス、およびトゥーランＨ−１ウイルス（Ｔｏｏｌａｎ’ｓ Ｈ−１ ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。
図１Ａ〜図１Ｈは、細胞培養物中のウイルス核酸を検出するための方法の、一実施形態の略図である。 図２は、単一試料、ランダムプライマーＰＣＲを用いたＶＥＲＡ、および標的指向させたプライマーＰＣＲを用いたＶＥＲＡの、平均ウイルスリード数の棒グラフである。 図３Ａは、採取元を保持液とした場合に、リードの９５％が（宿主に対応している）真核生物であり、かつ２％がウイルスであることを、図示した略図である。 図３Ｂは、試料をヌクレアーゼで処理した場合にリードの９７％が真核生物であり、かつ２％がウイルスであることを、図示した略図である。 図４は、真核生物のＤＮＡの大部分はＶＥＲＡを使用することによって除去されることを、臭化エチジウムゲルを用いて示している。 図５Ａは、ベンゾナーゼ（登録商標）、Ｏｍｎｉ Ｃｌｅａｖｅ（商標）、およびＲｉｂｏＳｈｒｅｄｄｅｒ（商標）を併用して、試料を処理した場合に、全リードの８７％がウイルスであり、かつ１２％が真核生物であることを、図示した略図である。 図５Ｂは、ベンゾナーゼ（登録商標）、ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ（商標）、およびＲｉｂｏＳｈｒｅｄｄｅｒ（商標）を併用して、試料を処理した場合に、全リードの９２％がウイルスであり、かつ５％が真核生物であることを、図示した略図である。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中に別段の指示がない限り、または文脈に矛盾することが明らかでない限り、請求されている本発明について記載する文脈において、とりわけ、特許請求の範囲との関連において、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および同様な指示対象の使用は、単数形および複数形の両方を対象とするものと解釈すべきである。
本明細書において別段の指示がない限り、本明細書中の値の範囲の列挙は、該範囲内に含まれる各個別の値を個々に参照する簡略法として機能することのみを意図したものにすぎず、各個別の値は、あたかも本明細書中に個々に列挙されているかのように本明細書に援用されている。
「約」という用語が使用されている場合、値は、陳述された値を約＋／−１０％の範囲で上回るかまたは下回るかのいずれかの値を記述することを意図したものである。他の実施形態において値は、陳述された値を約＋／−５％の範囲で上回るかまたは下回るかのいずれかの値の範囲であり得る。他の実施形態において値は、陳述された値を約＋／−２％の範囲で上回るかまたは下回るかのいずれかの値の範囲であり得る。他の実施形態において値は、陳述された値を約＋／−１％の範囲で上回るかまたは下回るかのいずれかの値の範囲であり得る。先行する範囲は、状況によって明確になることを意図しており、これ以上の制限は示唆されていない。本明細書中に別段の指示がない限り、または文脈に矛盾することが明らかでない限り、本明細書において記載される全ての方法は、任意の適切な順序で実行できる。本明細書中に提供されているありとあらゆる例、または例示的な言い回し（例えば、「のような（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、あくまで発明を分かりやすく例証することを意図したものであり、別途請求されていない限り、本発明の範囲を限定するものではない。非請求要素が本発明の実施に必須であることを示唆する言い回しは、本明細書中に一切含まれていないものと解釈すべきである。
シーケンシングに関する「リード」という用語は、シーケンシングプロセスの終了後に取得されたヌクレオチドのダスターの核酸配列であり、最終的には完全な核酸配列のセクションの配列となった配列を指す。「リード」とは、生の信号から導出されたヌクレオチドのストリングのベースコール値である。
「タンパク質」とは、ペプチド結合を介して互いに結合された２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。タンパク質としては、ポリペプチドおよびペプチドが挙げられ、例えばグルタミン酸残基のグリコシル化、脂質結合、硫酸化およびγカルボキシル化のほか、アルキル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰリボシル化といったような修飾もまた含まれる。タンパク質は、タンパク質を主成分とする薬物をはじめとする科学的または商業的関心の対象となり得る。それらのタンパク質の代表としては、酵素、リガンド、受容体、抗体、およびキメラもしくは融合タンパク質が挙げられる。タンパク質は、周知の細胞培養方法を使用して、様々なタイプの組換え細胞によって生産され、一般的には遺伝子工学技術（例えば、キメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、鉄を含まない配列など）によって細胞内に導入され、エピソームとして存在する場合もあれば、または細胞のゲノムに組み込まれる場合もある。
「抗体」とは、ジスルフィド結合を介して互いに結合された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、および２つの軽（Ｌ）鎖からなる、免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）と、重鎖定常領域とを、有する。重鎖定常領域には、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という、３つのドメインが含まれている。各軽鎖は、軽鎖可変領域と、軽鎖定常領域とを、有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に更に細分化されており、これらＣＤＲには、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、保全度の高い領域が散在している。ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、これらは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端にかけて配置されている。「抗体」という用語には、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方に対する言及が包含される。「抗体」という用語には、抗体発現用にトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体のように、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体分子も包含される。また、抗体という用語には、二重特異性抗体も含まれ、この二重特異性抗体には、複数のそれぞれ異なるエピトープに結合できるヘテロ四量体免疫グロブリンが含まれる。二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号に概説されており、本特許は、参照により本出願に援用されている
「細胞培養」とは、フラスコもしくはバイオリアクターのような容器内での細胞の増殖または増殖を指し、限定されるものではないが、流加回分培養、連続培養、灌流培養、およびこれらに類するものが含まれる。
ベンゾナーゼ（登録商標）は、プロプラエタリーのｐＮＵＣ１産生プラスミド（米国特許第５，１７３，４１８号）を含む、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０において産生されたセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由来の遺伝子工学的エンドヌクレアーゼを指す。
ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ（商標）は、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株由来の高度に精製された酵素であるＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ（商標）エンドヌクレアーゼを指し、一本鎖および二本鎖のＤＮＡならびにＲＮＡを、ジヌクレオチド、トリヌクレオチドおよびテトラヌクレオチドに分解する。ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅエンドヌクレアーゼは、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由来の酵素であるベンゾナーゼ（登録商標）と同じ基質特異性を備えており、同酵素と同じ産物を生成する。
ＲｉｂｏＳｈｒｅｄｄｅｒ（商標）は、ＤＮＡおよびタンパク質精製手技において不要とされたＲＮＡを完全に分解する非哺乳類ＲＮアーゼの、プロプラエタリーブレンドを指す。ＲｉｂｏＳｈｒｅｄｄｅｒ（商標）は、エピセンター社（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）から市販されている。
本明細書において、「増幅」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡセグメントの複数コピーを生成することを指す。増幅は通例、ポリメラーゼ連鎖反応によって誘発される。
本明細書において、「ＰＣＲ」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡセグメントの単一コピーを増幅することにより、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列のコピーを数千部ないし数百万部生成する目的に使用される分子生物学技術である、ポリメラーゼ連鎖反応を指す。ＰＣＲは、クローニング用ＤＮＡまたはＲＮＡセグメントのコピー部数を増幅する目的に繁用されることもあれば、あるいは他の分析手技で使用されることもある。
「リアルタイムナノポアシーケンシング」という用語は、ナノ細孔を貫通する核酸分子による電流崩壊に起因するシーケンシングが進行している最中の、配列分析を指す。
ＩＩ．細胞培養物中のウイルスを検出するための方法
細胞培養物中に存在するウイルスを同定してシーケンシングするための代表的方法には、培養中の細胞を溶解して細胞デブリを取り除く工程と、試料を濃縮してウイルス核酸を富化する工程と、富化された試料中に存在する細胞から放出された核酸を酵素的に消化する工程と、消化された試料からウイルス核酸を抽出する工程と、ウイルス核酸をシーケンシングしてウイルスを同定する工程と、が含まれる。
Ａ．細胞の溶解
細胞培養試料を、培養の対象とされる細胞が破壊または溶解するように、処理する。細胞は、典型的に、チャイニーズハムスター卵巣細胞のような真核細胞である。細胞培養に使用できる他の細胞および細胞株の例を、以下に示す。
細胞を溶解する技術は、当該技術分野において周知である。好ましい実施形態では、凍結融解技術を使用して、細胞を溶解する。例えば、細胞フラスコは通常、一晩凍結し、次いで、使用前に解凍する。
一実施形態において、細胞の溶解に使用される機械的デバイスとしては、限定されるものではないが、ワーリング・ブレンダー（Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒ）およびポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）が挙げられる。細胞および組織は、回転ブレードを介して粉砕され、かつ分散される。
別の実施形態では、例えば、ダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）型ホモジナイザー、ポッター・エルビーエム（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ）型ホモジナイザーまたは加圧型細胞破壊装置（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ）を使用して、細胞を液体均質化に供する。細胞または組織の懸濁液は、狭い空間に強制的に透通させることにより、剪断される。
別の実施形態では、超音波処理器を使用した超音波処理によって、細胞を溶解させる。細胞は、高周波音波を介して剪断される。
Ｂ．細胞デブリの除去
細胞を溶解することにより、細胞デブリが生ずる。細胞デブリは、従来技術、例えば、遠心分離、サイズ濾過、またはそれらの組み合わせを使用して取り除くことができる。
１．遠心分離
一実施形態では、低速の遠心分離を使用して、細胞デブリを取り除く。通例は、試料を１，６００ｘｇで５分間遠心させることにより清澄化し、次いで、上清を取り出す。
２．濾過
一実施形態では、試料を濾過することによって、細胞デブリを取り除く。例えば、細孔直径が０．２〜０．４５μｍのフィルターを使用して、試料を濾過する場合もある。好適なフィルターは市販されている。或る特定の実施形態では、まず試料を遠心分離してから、上清を濾過して、核のような細胞小器官を非限定的に含む追加的な細胞デブリを取り除く。別の実施形態では、０．８μｍフィルターを使用して、試料を濾過する。
次いで、結果として得られた濾液を濃縮する。
Ｃ．試料の濃縮
例えば、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）１００ｋＤａコンセントレーターを使用し、製造元の指示に従い、濾液を濃縮する。濾液を濃縮しウイルス核酸の総回収量を増加させる方法としては、ほかにも、凍結乾燥が挙げられる。ただし、これに限定されるものではない。一実施形態では、試料を透析濾過により濃縮する。
Ｄ．ヌクレアーゼ処理
次いで、濃縮された試料をヌクレアーゼで処理することにより、細胞培養物中の細胞由来の核酸が消化される。この段階では、ウイルスキャプシドの保護特性により、感染ウイルスがヌクレアーゼ処理の影響を受けずに済む。
一実施形態では、濃縮された試料を、ベンゾナーゼ（登録商標）、ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ（商標）、ＲｉｂｏＳｈｒｅｄｄｅｒ（商標）、およびそれらの組み合わせで処理する。また、２つの高純度リボヌクレアーゼＲＮアーゼＡ（５００Ｕ／ｍＬ）およびＲＮアーゼＴ１（２０，０００Ｕ／ｍＬ）の混合物である、ＲＮＡｓｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｍｉｘ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）ＲＮＡｓｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（商標））を、使用してもよい。
一実施形態では、２つの用量のウイルス濾液が、１００ｋＤａのパスフィルター装備のＡｍｉｃｏｎ １５マイクロコンセントレーターに個別に分配される。必要に応じて、リン酸緩衝生理食塩水を使用してチューブを平衡化させ、チューブをＡｌｌｅｇｒａ ６遠心分離機で最大速度で１５分間回転させてもよい。保持液量を検査し、必要に応じて、チューブを最大速度にて更に１５分間回転させる。各マイクロコンセントレーター中の保持液の量は、約２００μＬとする必要がある。保持液を、各マイクロコンセントレーターから注意深く取り出して、新しいチューブの中にプールする。保持液合計５０μＬを各試料から取り出し、試料ＤＰ（Ｓａｍｐｌｅ ＤＰ）および試料ＤＲ（Ｓａｍｐｌｅ ＤＲ）としてラベル付けする。
１ＸのＤＮアーゼバッファーを２つのプール済み保持液に加える。工程４．４で実行したように、Ａｍｉｃｏｎ ４で濃縮物を最大４ｍＬまで濃縮し、一方体積を５０μＬ〜２００μＬまで減少させる。
各バッファー交換保持液の用量に、２Ｘ用量のＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ、２Ｘ用量のベンゾナーゼ、２Ｘ用量のＲＮＡｓｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを加え、最終的に１ＸのＤＮアーゼバッファーが得られるよう十分な１０ＸのＤＮアーゼバッファーを加える。チューブをサーモミキサーで３７℃、１０００ＲＰＭで２時間インキュベートする。
他の使用可能なヌクレアーゼとしては、限定されるものではないが、ＤＮアーゼＩ、ＤＮアーゼＩＩ、ヌクレアーゼＳ１、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＢ、ＲＮアーゼＩ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＨ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＶ、エキソヌクレアーゼＶ、ラムダエキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩ、エンドヌクレアーゼＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、および部位特異的エンドヌクレアーゼが挙げられる。この部位特異的エンドヌクレアーゼとしては、限定されるものではないが、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ、ＡｃｃＩ ＡｃｌＩ、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｌＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＢｇｌＩＩ、Ｂｍｅ１５８０Ｉ、ＢｍｔＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢｔｇＩ、ＣｌａＩ、ＤｒａＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＫａｓＩ、ＫｐｎＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｃＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、ＰａｃＩ、ＰｃｉＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｂｆＩ、ＳｃａＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｌＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、およびＸｍａＩが挙げられる。
一実施形態では、３７℃のシェーカー（すなわち、サーモミキサー）で、試料を１つ以上のヌクレアーゼで２時間消化させる。２Ｘヌクレアーゼ：保持液量は、十分である（２ＸのＯｍｎｉ Ｃｌｅａｖｅ、２Ｘベンゾナーゼ、２ＸのＲＮＡｓｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）。更に、１０ＸのＤＮアーゼ緩衝液を添加して、最終濃度を１Ｘにする。ゆえに、酵素：保持液の比率を増減することにより、手間をかけずに試料用量をいろいろに変えて処理できる。
Ｅ．ウイルス核酸の抽出
ウイルス核酸を、ヌクレアーゼカクテルで消化した後、試料から抽出する。一実施形態では、０．５Ｍ ＥＤＴＡをチューブに加え、その後、抽出を行い、最終濃度３ｍＭのＥＤＴＡを得る。ウイルス核酸の抽出には、サーモフィッシャー社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）製のＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔが使用される場合もある。
洗浄緩衝液を調製するには、９６〜１００％エタノール６０ｍＬを、キットに付属している１５ｍＬの洗浄緩衝液（ＷＩＩ）に加える。洗浄緩衝液には、エタノールが添加済みでありかつ室温であることを示す、チェック付きのラベルが貼付されている。
キャリアＲＮＡは、試料当たり５．６μｇのキャリアＲＮＡを使用して調製される（試料が５００μＬ以下の場合）。試料当たりのキャリアＲＮＡ使用量を少量化しても差し支えない。一方、その場合は、試料タイプごとおよび下流アプリケーションごとの、キャリアＲＮＡ所要量を検証する必要がある。
キャリアＲＮＡ（５．６μｇ／試料）を調製する：
１．３１０μＬのＲＮアーゼ不含水（キットに付属）を、キットに付属のチューブ中に用意された３１０μｇの凍結乾燥キャリアＲＮＡに加え、１μｇ／μＬのキャリアＲＮＡストック溶液を得た。
２．溶液を完全に混合し、少量に分注する。アリコートを−２０℃で保管する。
凍結および解凍の繰り返しを回避すること。
３．所望される数の試料を同時的に処理するための、溶解バッファー／キャリアＲＮＡミックスの所要量を、次式を使用して計算する。
Ｎ×０．２１ｍＬ（Ｌｙｓｉｓバッファー／反応の用量）＝ＡｍＬ
ＡｍＬ×２８μＬ／ｍＬ＝ＢμＬ
式中：
Ｎ＝試料の数
Ａ＝溶解バッファー（Ｌ２２）の計算量
Ｂ＝溶解バッファー（Ｌ２２）に添加される、１μｇ／μＬキャリアＲＮＡストック溶液の計算量
４．必要量の１μｇ／μＬキャリアＲＮＡストック溶液を解凍する。
５．滅菌チューブで、キャリアＲＮＡストック溶液（Ｂ、上記のように計算）の用量を、溶解バッファー（Ａ、上記のように計算）の用量に加える。上下にピペッティングして穏やかに混合する。気泡が発生するので、ボルテックスは回避すること。
６．使用まで４℃にて保管すること。１時間以内にバッファーを使用すること。
溶解液を調製する
後述の溶解物調製プロトコールは、２００μＬの出発物質を対象としている。２００μＬ超（５００μＬ以下）の試料用量を処理する場合は、それに応じて試薬量を増加させる。
１．２５μＬのプロテイナーゼＫを、滅菌済みマイクロ遠心チューブに加える。
２．無細胞試料２００μｌを、マイクロ遠心チューブに加える。
注記：２００μＬ未満の試料を処理する場合は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）または０．９％ＮａＣｌを使用して、試料の最終用量を２００μＬになるように調整する。
３．溶解バッファー２００μＬ（キャリアＲＮＡ含有量：５．６μｇ）を加える。チューブの蓋を閉じ、１５秒間ボルテックスして混合する。
４．５６℃で１５分間インキュベートする。
５．９６〜１００％エタノール２５０μＬをチューブに加え、蓋を閉めてから、１５秒間ボルテックスして混合する。
６．溶解液を室温で５分間インキュベートする。
精製する
１．上記の溶解液を回収チューブのウイルススピンカラムに加える。
２．カラムを６８００ｘｇで１分間遠心させる。回収チューブをデカンテーションする。スピンカラムを新しい洗浄チューブに入れる。
３．５００μＬの洗浄バッファー（ＷＩＩ）およびエタノールでカラムを洗浄する。６８００ｘｇで１分間遠心させる。通過画分を廃棄する。
４．５００μＬの洗浄バッファー（ＷＩＩ）を用いて、洗浄工程３を１回繰り返す。
５．回収チューブを廃棄し、スピンカラムを別の清浄な洗浄チューブに入れる。
６．スピンカラムを最高速度で１分間遠心し、残留洗浄バッファー（ＷＩＩ）を除去する。
７．スピンカラムを清潔な１．７ｍＬ回収チューブに入れる。
８．キットに付属の１０〜５０μＬの滅菌ＲＮアーゼ不含水（Ｅ３）で溶出させる（カートリッジ中心部に水を加える）。
９．室温で１分間インキュベートする。スピンカラムを最高速度で１分間遠心分離させて、核酸を溶出させる。回収チューブには、精製されたウイルス核酸が含まれている。スピンカラムを廃棄する。
１０．精製されたウイルスＲＮＡ／ＤＮＡを−８０℃で保管するか、または所望される下流アプリケーション用にＲＮＡ／ＤＮＡを使用する。
Ｆ．シーケンシング
いったんウイルス核酸が抽出されたら、シーケンシング用ライブラリーの調製を開始できる。ここで重要なのは、シーケンシングの前にはウイルス核酸が増幅に供されないという点である。一実施形態では、ＳＱＫ−ＬＳＫ３０８（１Ｄ２）またはＳＱＫ−ＲＡＤ００４（Ｒａｐｉｄ）ＯＮＴライブラリー調製キットを使用して、製造元の指示に従い、ライブラリー調製を行った。ＳＱＫ−ＲＡＤ００４は、１５分間で迅速にライブラリーを調製するキットである。それに対し、ＳＱＫ−ＬＳＫ３０８は、ライブラリー調製時間が長く（約３時間）、かつ堅牢性に優れる。
好ましい実施形態では、オックスフォード・ナノポアテクノロジーズ社（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の第３世代シーケンサー（ＭｉｎＩＯＮ（商標））を使用して、ウイルス核酸のシーケンシングを行う。ＭｉｎＩＯＮ（商標）は、微小なポータブルシーケンサーで、シーケンシングデータをリアルタイムで生成し、試料が受領されてから混入物質が同定されるまでの時間を大幅に短縮する。また、外来性病原体の核酸のネイティブシーケンシングを用いることによって、多大な時間を必要とする（標的指向させたまたはデノボ）増幅工程は不要となる。データの分析には、ＯＮＴのＷＩＭＰソフトウェアを使用した。このソフトウェアは、ＲｅｆＳｅｑからのウイルス、細菌、および真菌データベースに対しリードをアラインするプラットフォームであり、定期的に更新される。対応する「真核生物」または「細菌」のアラインメントは、偽陽性を表す。その原因として最も可能性が高いのは、ＣＨＯ（宿主）リードが真菌（真核生物）データベースに対し部分的にアライメントされたこと、または試薬から混入物質が出されたことである。
好ましい実施形態において、ウイルス核酸は、ＲＴ−ＰＣＲによりシーケンシングされる。本明細書において、「ＲＴ−ＰＣＲ」とは、従来型ＰＣＲの変形である逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を指す。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ由来の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）転写産物の作製を通して遺伝子発現を定量的に検出する目的に使用される、分子生物学的手法である。ＲＴ−ＰＣＲ中に、ＲＮＡ分子は逆転写酵素を介してそのｃＤＮＡ配列に変換される。ｃＤＮＡ合成に使用されるプライマーは、非配列特異的プライマー（ランダムヘキサマーもしくはオリゴｄＴプライマーの混合物など）、または配列特異的プライマーのいずれかである。ランダムヘキサマーは、ＲＮＡプール全体に対しランダムに付着することの可能な、６つのヌクレオチド配列が取り得る全ての組み合わせの混合物である。オリゴｄＴプライマーは、ｍＲＮＡ分子のポリＡテールに対して相補的であり、ｍＲＮＡ分子由来のｃＤＮＡを合成する目的に限り、使用できる。従来、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡが、標準のＰＣＲ手技を使用して増幅されていた。
本開示の方法を使用して検出およびシーケンシング可能なウイルスとしては、限定されるものではないが、ハンタウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラットロタウイルス、レオウイルス３型、センダイウイルス、エクトロメリアウイルス、Ｋウイルス、キルハムラットウイルス、Ｐ１２、ＥＭＣ、ＭＡＶ１、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス、マウス微小ウイルス、タイラーズウイルス、マウス肝炎ウイルス、マウスロタウイルス、ポリオーマウイルス、ラットコロナウイルスレトロウイルス、シアロアクリオアデノティスウイルス、胸腺ウイルス、ＨＩウイルス、ネズミ白血病ウイルス、およびウシウイルス性下痢ウイルスが挙げられる。
細胞培養物に感染するヒトウイルス病原体としては、限定されるものではないが、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エンターウイルス、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、呼吸系発疹ウイルス、および水痘帯状疱疹ウイルスが挙げられる。
ＩＩＩ．目的タンパク質
目的タンパク質の発現または分泌は、本明細書中に開示されている細胞培養物中の細胞によって為されるのが、通例である。原核細胞または真核細胞における発現に適した任意の目的タンパク質を、提供された工学的宿主細胞系において使用できる。例えば、目的タンパク質としては、限定されるものではないが、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ＳｃＦｖもしくはそのフラグメント、Ｆｃ融合タンパク質もしくはそのフラグメント、成長因子もしくはそのフラグメント、サイトカインもしくはそのフラグメント、または細胞表面受容体もしくはそのフラグメントの細胞外ドメインが挙げられる。目的タンパク質は、単一のサブユニットからなる単純なポリペプチドである場合もあれば、あるいは２つ以上のサブユニットを含む複雑なマルチサブユニットタンパク質である場合もある。タンパク質で、関心の対象とされるのは、生物医薬品、食品添加物または保存料、あるいは精製および品質基準の対象となる任意のタンパク質産物であり得る。
いくつかの実施形態では、タンパク質産物（目的タンパク質）は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディもしくはテトラボディ、ＦａｂフラグメントもしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。一実施形態において、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５７９（Ａ１）号に記載の抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド−１（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５８０（Ａ１）号に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン−２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載の抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば米国特許第９，０１８，３５６号に記載の抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載の抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載の抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体５抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３１３１９４（Ａ１）号に記載の抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗上皮成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載の抗ＥＧＦＲ抗体、または米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２３（Ａ１）号に記載の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン−９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号もしくは米国特許出願公開第２０１４／００４４７３０（Ａ１）号に記載の抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗増殖分化因子８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号もしくは同第９，２６０，５１５号に記載の抗ＧＤＦ８抗体（別称：抗ミオスタチン抗体））、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０４５（Ａ１）号もしくは同第２０１６／００７５７７８（Ａ１）号に記載の抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６８１（Ａ１）号、または米国特許第８，７３５，０９５号もしくは同第８，９４５，５５９号に記載の抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、同第８，０４３，６１７号もしくは同第９，１７３，８８０号に記載の抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５８（Ａ１）号もしくは同第２０１４／０２７１６４２（Ａ１）号に記載の抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸系発疹ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６５３（Ａ１）号に記載の抗ＲＳＶ抗体）、抗分化クラスター３（例えば、米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５（Ａ１）号および同第２０１５０２６６９６６（Ａ１）号、ならびに米国特許第６２／２２２，６０５号に記載の抗ＣＤ３抗体）、抗分化クラスター２０（例えば、米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５（Ａ１）号および同第２０１５０２６６９６６（Ａ１）号、ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載の抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗分化クラスター４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載の抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載の抗体）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０２９（Ａ１）号に記載の抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２１５０４０号に記載の抗体）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１７０２９号、ならびに米国特許第８，３０９，０８８号および同第９，３５３，１７６号に記載の抗ＮＧＦ抗体）、および抗アクチビンＡ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５（Ａ１）号および米国特許出願公開第２０１５／０２６６９６６（Ａ１）号に記載）、抗ＣＤ３ｘ抗ムチン１６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）、および抗ＣＤ３ｘ抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３ｘ抗−ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アダリムマブ−アト、アド−トラスツズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブロダツマブ、カナキヌマブ、カプロマブペンデタイド、セルトリズマブペゴル、セミプリマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エミシズマブ−ｋｘｗｈ、エンタンシネリロクマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、ファシヌマブ、ゴリムマブ、グセルクマブ、イブリツモマブチウクセタン、イダルシズマブ、インフリキシマブインフリキシマブ−アブダ、インフリキシマブ−ダイブ、イピリムマブ、イキセキズマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ネスバクマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルツナブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リヌクマブ、リツキシマブ、サリルマブ、セキキヌマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トレボグルマブ、ウステキヌマブ、およびベドリズマブからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、目的タンパク質は、Ｆｃ部分と別のドメインとを含む、組換えタンパク質（Ｆｃ融合タンパク質など）である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ部分に結合した受容体の１つ以上の細胞外ドメイン（類）を含む、受容体Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はヒンジ領域を含み、その後にＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインが続く。いくつかの実施形態において、受容体Ｆｃ融合タンパク質には、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいずれかに結合する、２つ以上の別個の受容体鎖が含まれる。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えばＩＬ−１トラップ（例えば、リロナセプト）またはＶＥＧＦトラップ（例えば、アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）もしくはジブ−アフリベルセプト（ｚｉｖ−ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ））のような、ＴＲＡＰタンパク質である。該ＩＬ−１トラップは、ＩＬ−１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含み、このリガンド結合領域はＩｌ−１Ｒ１細胞外領域に融合されており、この細胞外領域はｈＩｇＧ１のＦｃに融合されている（その全体が本明細書において参照により援用されている米国特許第６，９２７，００４号を参照）。該ＶＥＧＦトラップは、ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含む。このＦｌｔ１はＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合されており、このＦｌｋ１はｈＩｇＧ１のＦｃに融合されている。（米国特許第７，０８７，４１１号、および同第７，２７９，１５９号を参照）。他の実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、１つもしくはそれ以上の抗原結合ドメイン（類）（Ｆｃ部分に結合した抗体の可変重鎖フラグメントおよび可変軽鎖フラグメントなど）を１つ以上含む、ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質である。
ＩＶ．細胞培養
本明細書に記載の細胞培養は、回分培養を指す「流加回分細胞培養」または「流加回分培養」であり得る。本回分培養では、まず細胞および培地を培養容器に供給する。中間の追加的な培養栄養素は、培養中に離散的増分にて培養物にゆっくり供給される。この栄養素供給は、培養終了前に、細胞および／または産物を定期的に採取することの有無に関係なく為される。流加回分培養には、培養物全体（細胞および培地を含み得る）を定期的に取り除いて新鮮な培地と交換する、「半連続流加回分培養」が包含される。流加回分培養は、単純な「回分培養」とは区別される。この回分培養において、細胞培養用の全てのコンポーネント（動物細胞および全ての培養栄養素を含む）が、回分培養の培養プロセスの開始時に培養容器に供給される。流加回分培養は、標準的な流加プロセス中に培養容器から上清が除去されない限り、「灌流培養」とは異なり得る。この灌流培養では、細胞は、例えば濾過によって培養物中に拘束され、培養培地が連続的または断続的に導入されて培養容器から除去される。対照的に、流加細胞培養中には、試験目的で試料を取り出すことが想到される。流加プロセスは、ワーキングボリューム（ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）および／またはタンパク質産生が最大限に到達したことが判別され、かつ以後にタンパク質が回収されるまで継続される。
細胞培養は、「連続細胞培養」とされる場合がある。この細胞培養は、通常は特定の成長段階にて、細胞を継続的に成長させる目的に用いられる技術である。例えば、細胞をコンスタントに供給することが必要とされる場合、または特定の目的タンパク質を生産することが必要とされる場合、細胞培養を、特定の成長段階にて、維持保守することが必要であると考えられる。したがって、その特定の段階にて細胞を維持保守するには、条件を継続的にモニターして、それに応じて調整される必要がある。
細胞は、細胞培養培地で培養される。「細胞培養培地」および「培養培地」という用語は、哺乳動物細胞の増殖に使用される栄養溶液を指す。この栄養溶液は、通常、細胞の成長を促進するために必要な栄養素を提供する。例えば、炭水化物エネルギー源とされる、必須アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、バリン、スレオニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、リジン、ヒスチジン）、非必須アミノ酸（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、チロシン）、微量元素、エネルギー源、脂質、ビタミンなどである。細胞培養培地は、細胞増殖を支持する原料を供給する抽出物、例えば、血清またはペプトン（加水分解物）を含有し得る。培地中に、動物由来の抽出物を含有させる代わりに、酵母由来または大豆抽出物を含有させてもよい。化学的に定義された培地は、全ての化学成分が公知である（すなわち、公知の化学構造を有する）細胞培養培地を指す。化学的に定義済みの培地は、血清または動物由来のペプトンのような、動物由来の成分は全く含まれていない。一実施形態において、培地は、化学的に定義済みの培地とされる。
また、溶液中には、成長率および／または生存率を最低率を超える程度に増強させる成分（ホルモンおよび成長因子など）も含有されている。本溶液は、培養の対象となる特定の細胞を生存させかつ増殖させるのに最適なｐＨおよび塩濃度となるように調合してもよい。
「細胞株」とは、細胞の連続継代または継代培養を介して特定の系統から誘導される、細胞（１つまたは複数）を指す。「細胞」という用語は、「細胞母集団」と同義に使用される。
「細胞」という用語には、組換え核酸配列を発現するのに好適な、任意の細胞が包含される。細胞類としては、例えば細菌細胞のような原核生物および真核生物の細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト動物細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または例えばハイブリドーマもしくはクアドローマのような細胞融合物が挙げられる。或る特定の実施形態において、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。他の実施形態において、細胞は、下記の細胞：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、ベロ（Ｖｅｒｏ）、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３ 、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０、リンパ球などジャーカット（Ｔリンパ球）またはＤａｕｄｉ（Ｂリンパ球）、Ａ４３１（表皮）、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）が、細胞内に含まれる。いくつかの実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。他の実施形態において、細胞はＣＨＯ Ｋ１である。
実施例１：増幅を行わないウイルス同定
材料および方法：
マウスアデノウイルス１型（ＭＡＶ１）（約３０，０００ｂｐのｄｓＤＮＡウイルス）を、ＣＨＯ−Ｋ１指標細胞上で、７日間増殖させた。細胞フラスコを、ＶＥＲＡ最適化研究に使用するため、事前に一晩凍結してから、解凍した。ＳＱＫ−ＬＳＫ３０８（１Ｄ２）またはＳＱＫ−ＲＡＤ００４（Ｒａｐｉｄ）ＯＮＴライブラリー調製キットのいずれかを使用して、製造元の指示に従い、ライブラリーを調製した。ＳＱＫ−ＲＡＤ００４は、１５分間で迅速にライブラリーを調製するキットである。それに対し、ＳＱＫ−ＬＳＫ３０８は、ライブラリー調製時間が長く（約３時間）、かつ堅牢性に優れる。ＯＮＴのＷＩＭＰソフトウェアを使用して、データを分析する。このソフトウェアは、ＲｅｆＳｅｑからのウイルス、細菌、および真菌データベースに対しリードをアラインするプラットフォームであり、定期的に更新される。対応する「真核生物」または「細菌」のアラインメントは、偽陽性を表す。その原因として最も考えられるのは、ＣＨＯ（宿主）リードが真菌（真核生物）データベースに対し部分的にアライメントされたことである。
結果
初期作業では、ランダムＰＣＲ技術の組み込みに焦点を当て、ストックウイルス力価から残りの少量のウイルス核酸を増幅した。この結果、大量の全リードがシーケンシングに利用可能となったが、一方、残留した宿主核酸も増幅されてしまい、シーケンシング後のデータ分析が複雑にもなった。増幅なしでは、大量のネイティブウイルスリードをシーケンシングするのが困難となった。ＶＥＲＡとランダムプライミングとの併用により、ウイルスリードのアライメントが増強するが、その効率性は、標的指向させたＰＣＲプライマーを使用した場合に比べて劣っていた（図２）。
別の実験では、２つのＤＮＡウイルス（ＭＶＭおよびＭＡＶ１）を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞上で７日間増殖させた。上記の方法を、細胞に対して実施した。シーケンシングリードをＱ＞７（約８０％の精度）にてフィルタリングし、全ての通行可能リードをリアルタイムで分析した。リードの大半（全リードの９８％超）は、スパイクされたウイルスに対応している。表２から分かるように、ＶＥＲＡプロトコールは、宿主細胞のバックグラウンドを効果的に除去し、ネイティブウイルスリードのシーケシングを行うことにより、混入物質を５分未満で同定することを可能としている。
実施例２：試料の濾過
０．２２μｍフィルターを使用して、宿主の細胞デブリ（すなわち、核）を、より適切に捕捉した。この初期ＶＥＲＡ手技により、２つの試料（試験＃１Ａおよび試験＃１Ｂ）を調製した。試験＃１Ａでは、ヌクレアーゼ処理を施さなかったＶＥＲＡ（図１の工程Ｄ）からの残りの保持液をシーケンシングしようと試みた。試験＃１Ｂでは、ヌクレアーゼカクテル処理後に、試料をシーケンシングした。ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅとＲｉｂｏＳｈｒｅｄｄｅｒとの併用により、ヌクレアーゼ処理で宿主の核酸が消化された後に、ウイルスのシーケンシング済みリードの増分が漸増したかどうかを試験する（図１の工程Ｅ）。いずれの調製物によっても、ウイルスの同定が生起されなかった。同定されなかった微小な残留リードを奪回（ｒｅｓｃｕｅ）するため、図２のランダムＰＣＲ手法を用いた。これにより、ＭＡＶ１リードが正確に同定された。一方、ＭＡＶ１のシーケンシングメトリクスは、２つの調製物間で変化がなく、合計ウイルスリードは、合計アライン済みリードの２％にすぎなかった（図３Ａおよび図３Ｂ）。
別の実験では、０．２２μｍフィルターを、それより径の大きい０．４５μｍフィルターに置き換えた。ＶＥＲＡ手技からの別々のヌクレアーゼ処理のアリコートをシーケンシングし、ＲＮアーゼＩのみ（試験＃２Ａ）または市販のＯｍｎｉＣｌｅａｖｅヌクレアーゼカクテル（試験＃２Ｂ）をシーケンシングした。これら個々の処理ではそれぞれ、ＭＡＶ１を同定することができたが、そのリード数は限定された。リードの大部分は真核生物にマッピングされた。このことから示唆されるように、どちらのヌクレアーゼ処理も、宿主核酸を完全に除去するのに十分ではなかった。この問題は、ライブラリー調製の問題と相関する可能性があり、その原因として、１％未満のマップされたリードはＭＡＶ１由来のものであったことが考えられる。試験＃１の場合と同様、ランダムＰＣＲストラテジーは試行されなかった。
実施例３：ヌクレアーゼ処理
別の実験では、０．４５μｍフィルターを保持し、試料を（ｉ）ベンゾナーゼ（登録商標）、（ｉｉ）ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ（商標）、および（ｉｉｉ）ＲｉｂｏＳｈｒｅｄｄｅｒ（商標）のヌクレアーゼカクテルで処理した。上記工程４．５のバッファー交換保持液５０μＬに、ＯｍｎｉＣｌｅａｖｅ １００μＬ、ベンゾナーゼ１００μＬ、ＲｉｂｏＳｈｒｅｄｄｅｒ １００μＬ、および１０ＸのＤＮアーゼバッファー３５μＬを加えた。試料をサーモミキサーで３７℃、５００ＲＰＭで２時間インキュベートした。ヌクレアーゼ：保持液は、２：１とすることが、好適とされる。この配合のカクテルは、ＣＨＯ ｇＤＮＡ、ｍＲＮＡ、および大部分のｒＲＮＡを除去するうえで、十分であった（図４）。この配合でヌクレアーゼ処理を使用してＶＥＲＡプロトコールの二連の調製物をシーケンシングした結果、合計ウイルスリードの収量が大幅に増加した。ＭＡＶ１にマッピングされた全リードの増分は、８７％および９２％であった。このことから、宿主核酸の減少が達成されたことが、示唆される（図５Ａおよび図５Ｂ）。
実施例４：自動抽出
ＤＮＡウイルス（ＭＶＭ、ＰＩ２、ＲＥＯ２、および／またはＭＡＶ−１）を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にスパイクした。細胞を超遠心分離に供した後、ウイルスでスパイクされたＣＨＯ−Ｋ１細胞に対してフェノール／クロロホルム抽出を行った。細胞をＶＥＲＡプロトコールに供した後、ウイルスが添加されたＣＨＯ−Ｋ１細胞に対してＤＮＡの自動抽出を行った。自動抽出は、試薬の使用量およびインキュベーション時間を指示する精製プロトコールを用いて予備プログラムされたｉＰｒｅｐ（商標）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ用のｉＰｒｅｐ（商標）ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ウイルスキットを使用して行った。表３から分かるように、自動抽出によって、ウイルス富化が低減した。一方、超遠心分離後も、宿主リードは高比率のままに維持された。
（表１）生データ
Figure 2021514609
（表２）生データ
Figure 2021514609
（表３）自動抽出生データ
Figure 2021514609
前述の明細書では、本発明をその或る特定の実施形態との関連において説明し、例証目的に多くの詳細を記載してきたが、本発明が追加的な実施形態を受け入れる余地のあること、および本明細書に記載される特定の詳細が、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更できることは、当業者に明らかであろう。
本明細書中に引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により援用されている。本発明は、その趣旨または本質的属性から逸脱することなしに他の特定の形態で実施できる。したがって、本発明の範囲を指示するものとしては、前述の明細書ではなく寧ろ、添付の特許請求の範囲の方を、参照すべきである。

Claims (18)

  1. 試料中のウイルスを同定するための方法であって、
    細胞培養物の試料中の真核細胞を溶解する工程と、
    前記試料から細胞デブリを除去する工程と、
    前記試料を濃縮して保持液を生成する工程と、
    前記保持液をヌクレアーゼで処理して、真核生物の核酸を分解する工程と、
    前記ヌクレアーゼ処理された保持液からウイルス核酸を抽出する工程と、
    前記試料中の前記核酸を増幅することなしに、前記ウイルス核酸をシーケンシングして前記ウイルスを同定する工程と
    を含む、方法。
  2. 前記真核細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記真核細胞がタンパク質薬物産物を分泌する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記タンパク質薬物産物が、抗体またはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、および組換えタンパク質からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記細胞培養物を処理して前記同定されたウイルスを除去する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記細胞が、凍結融解技術を使用して溶解される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記細胞デブリを除去する工程が、前記溶解された試料を遠心分離して上清を作製することと、前記上清を濾過して前記試料から細胞デブリを除去することとを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ウイルスが、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、Ｋウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、およびマウスアデノウイルス、ＭＡＶ１、Ｐ１２、ＥＭＣ、乳酸脱水素酵素ウイルス（ＬＤＶ）、ポリオーマウイルス、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、センダイウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、レオウイルス３型、キルハムラットウイルス、およびトゥーランＨ−１ウイルス（Ｔｏｏｌａｎ’ｓ Ｈ−１ ｖｉｒｕｓ）からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 細胞培養試料中のウイルス核酸を検出するための方法であって、
    前記細胞培養試料中の細胞を溶解して細胞デブリを生成する工程と、
    前記細胞デブリを分離して上清を作製する工程と、
    前記上清を濃縮して保持液を作製する工程と、
    前記保持液中の真核生物核酸を酵素的に消化する工程と、
    前記保持液からウイルス核酸を抽出する工程と、
    前記抽出されたウイルス核酸を増幅せずに前記抽出されたウイルス核酸をシーケンシングする工程であって、前記シーケンシングにより得られたウイルスリードが、前記シーケンシングにより得られた細胞核酸リードを上回る、工程と
    を含む、方法。
  11. 前記ウイルスリードが、前記シーケンシングにより得られた全リードの少なくとも５１％である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ウイルスリードが、前記シーケンシングにより得られた全リードの５０〜９９％である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記ウイルスリードが、前記シーケンシングにより得られた全リードの少なくとも８０％である、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記ウイルスリードが、前記シーケンシングにより得られた全リードの少なくとも８５％である、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記ウイルスリードが、前記シーケンシングにより得られた全リードの少なくとも９０％である、請求項９に記載の方法。
  16. 前記ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記シーケンシングが、試料調製から８時間以内に完了する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記シーケンシングが、リアルタイムナノポアシーケンシングである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
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A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

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A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

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