ES2323468T3 - Trampas de vegf y usos terapeuticos de las mismas. - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de fusión que consiste en componentes (R1R2)x y un copartícipe de fusión (FP), donde X es 1, R1 es el dominio 2 de Ig de un componente receptor del factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGF) de Flt-1 y R2 es el dominio 3 de Ig de Flk-1; donde el copartícipe de fusión (FP) es un componente multimerizante (MC) capaz de interaccionar con otro MC para formar una estructura multimérica y es una secuencia aminoacídica de 1-15 aminoácidos de longitud con 1-2 restos de cisteína.

Description

Trampas de VEGF y usos terapéuticos de las mismas.
Campo de la invención
La invención se refiere a polipéptidos de fusión capaces de unirse al factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGF), a los miembros de la familia VEGF, y cortar y empalmar variantes con características específicamente deseables.
Breve descripción de la invención
La invención proporciona una molécula aislada de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido de fusión que consiste de componentes (R1R2)_{x}, y un copartícipe de fusión (FP), donde X es 1, R1 es el dominio 2 de Ig de un componente receptor del factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGF) de Flt-1 y R2 es el dominio 3 de Ig de Flk-2; donde el copartícipe de fusión (FP) es un componente multimerizante (MC) capaz de interaccionar con otro MC para formar una estructura multimérica y es una secuencia aminoacídica entre 1 y 15 aminoácidos de longitud que tiene al menos 1-2 restos de cisteína.
La invención también proporciona un polipéptido de fusión codificado por la molécula de ácido nucleico de la invención. Preferiblemente, el polipéptido de fusión tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 26, 27 o 28.
La invención también proporciona un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención, unida de forma operativa a una secuencia de control de la expresión.
La invención también proporciona un método para producir un polipéptido de fusión VEGF, que comprende las etapas de introducir en un sistema de expresión adecuado el vector de expresión de la invención y llevar a cabo la expresión del polipéptido de fusión VEGF.
La invención también proporciona una trampa del factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGF) capaz de unirse a VEGF e inhibir la actividad de VEGF, y que comprende un multímero de dos o más polipéptidos de fusión de la invención. Preferiblemente, dicho multímero es un dímero.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona una trampa de VEGF de la invención para uso en el tratamiento de una enfermedad o condición que es mejorada, aliviada, o inhibida por separación o inhibición del factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGF). Preferiblemente, la enfermedad o condición es una enfermedad o condición ocular, por ejemplo la degeneración macular relacionada con la edad.
La invención también proporciona el uso de la trampa de VEGF de la invención en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o condición que es mejorada, aliviada, o inhibida por separación o inhibición del factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGF). Preferiblemente, dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad o condición ocular, por ejemplo la degeneración macular relacionada con la edad.
La trampa de VEGF de la invención es conocida como una "mini-trampa".
Un ejemplo de la invención se muestra en la SEQ ID NO: 26 que tiene una secuencia señal (1-26) seguida de los componentes R1 (27-129) y R2 (130-231), seguida de una secuencia de nueve aminoácidos terminada en CPPC.
En todas las realizaciones de la trampa de VEGF de la invención, una secuencia señal (S) puede estar incluida al comienzo (o extremo N-terminal) del polipéptido de fusión de la invención. La secuencia señal puede ser natural de la célula, recombinante, o sintética. Cuando una secuencia señal está unida al extremo N-terminal de un primer componente receptor, entonces un péptido de fusión puede llamarse como, por ejemplo, S-(R1R2)_{x}.
La invención abarca vectores que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos de la invención, incluyendo vectores de expresión que comprenden la molécula de ácido nucleico unida de forma operativa a una secuencia de control de la expresión. La invención además abarca sistemas hospedador-vector para la producción de un polipéptido de fusión que comprende el vector de expresión, en una célula hospedadora adecuada; sistemas hospedador-vector donde la célula hospedadora adecuada es una bacteria, levadura, célula de insecto, célula de mamífero; una célula de E. coli, o una célula COS o CHO. Adicionalmente, están abarcadas las trampas de VEGF de la invención modificadas por acetilación o pegilación. Los métodos para acetilar o pegilar una proteína son bien conocidos en el estado de la técnica.
La invención también se refiere a un método para producir una trampa de VEGF de la invención, que comprende cultivar una célula hospedadora transfectada con un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína a partir de la célula hospedadora, y recuperar los polipéptidos de fusión así obtenidos.
Las trampas de VEGF de la invención son terapéuticamente útiles para tratar cualquier enfermedad o condición ocular que está mejorada, aliviada, o inhibida por separación, inhibición, o reducción de VEGF. Una lista no exhaustiva de condiciones específicas mejoradas por inhibición o reducción de VEGF incluye, por ejemplo, pérdida de plasma no deseado o permeabilidad vascular, crecimiento no deseado del vaso sanguíneo, por ejemplo, tal como un tumor, edema asociado a enfermedades inflamatorias tales como psoriasis o artritis, incluyendo artritis reumatoide; asma; edema generalizado asociado a quemaduras; ascitis y efusión pleural asociadas a tumores; inflamación o trauma; inflamación crónica de las vías aéreas; asma; síndrome de pérdida capilar; sepsis; enfermedad renal asociada a aumento de pérdida proteica; adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y enfermedades del ojo tales como la degeneración macular relacionada con la edad y la retinopatía diabética. La mini-trampa de VEGF de la invención es particularmente útil en el tratamiento de enfermedades del ojo, y como un adyuvante para la cirugía ocular, incluyendo cirugía de glaucoma; y el tratamiento de tumores intraoculares, tales como por ejemplo, melanoma coroideo (o uveal), retinoblastoma, liberación vía intra-vítreo.
Por consiguiente, La invención puede ser usada en un método terapéutico para el tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con VEGF, que comprende administrar una trampa de VEGF de la invención a un individuo que padece una enfermedad o condición relacionada con VEGF.
El individuo es preferiblemente un paciente humano.
Además, la invención además se puede usar en métodos de diagnóstico y pronóstico, así como en kits para detectar, cuantificar, y/o monitorizar VEGF con las mini-trampas de la invención.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden una trampa de VEGF de la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable pueden comprender una trampa dimérica del polipéptido de fusión, o ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de fusión. Las mini-trampas de la invención encuentran usos específicos en condiciones en las que es deseable una trampa de VEGF de semi-vida en suero reducida (por ejemplo, evacuación más rápida) y/o una penetración en tejido aumentada debido a un tamaño más pequeño. Las aplicaciones específicas para la mini-trampa de VEGF incluyen, por ejemplo, enfermedades donde es deseable la administración local a un tejido o célula específico. Ejemplos de tal condición o enfermedad son las enfermedades oculares del ojo.
Otros objetos y ventajas serán evidentes a partir de una revisión de la subsiguiente memoria descriptiva detallada.
Descripción detallada de la invención
Antes de describir los presentes métodos, se ha de entender que esta invención no está limitada a métodos en particular, y las condiciones experimentales descritas, tales como métodos y condiciones, pueden variar. También se ha de entender que la terminología usada en la presente memoria sólo tiene el propósito de describir realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención sólo estará limitada por las reivindicaciones añadidas.
Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones añadidas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen referencia en plural a no ser que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia a "un método" incluye uno o más métodos, y/o etapas del tipo descrito en la presente memoria y/o que serán evidentes para aquellas personas expertas en la materia al leer esta descripción y etc.
A no ser que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia al que pertenece esta invención. Aunque se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora.
Descripción general
La invención abarca una trampa de VEGF capaz de unir e inhibir la actividad de VEGF, que es un monómero o multímero de uno o más polipéptidos de fusión. Las moléculas de la invención se unen e inhiben la acción biológica de VEGF y/o la reacción o respuesta fisiológica. Para una descripción de antagonistas de trampas de VEGF basadas en el receptor de VEGF Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1 (a) (SEQ ID NOs: 7-8) y VEGFR1R2-Fc\DeltaC1(a) (SEQ ID NOs: 9-10), véase PCT WO/0075319.
La mini-trampa de la invención es más pequeña que la trampa a tamaño completo, por ejemplo, alrededor de 50-60 kD frente a los 120 kD de la trampa pariente. La mini-trampa de la invención es menos de alrededor de 60 kD tal como se mide en un análisis de SDS-PAGE; más preferiblemente, alrededor de 50 kD; incluso más preferiblemente alrededor de 20-30 kD; o es aproximadamente 25 kD y es capaz de unir VEGF con una afinidad comparable a una trampa pariente de tamaño completo descrita en PCT/US00/14142 (WO 2000/075319).
Construcciones de Ácido Nucleico y Expresión
La presente invención proporciona la construcción de moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de fusión de la invención. Las variantes de secuencias de aminoácidos de los componentes de receptor R1 y R2 de las trampas de la invención también se pueden preparar por creación de mutaciones en las moléculas de ácidos nucleicos codificadas. Dichos variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, o inserciones o sustituciones de, restos de aminoácidos dentro de la secuencia aminoacídica de R1 o R2. Se puede hacer cualquier combinación de deleción, inserción, y sustitución para llegar a una construcción final, siempre que la construcción final posea la capacidad de unir e inhibir VEGF.
Estas moléculas de ácidos nucleicos están insertadas en un vector que es capaz de expresar polipéptidos de fusión cuando se introducen en una célula hospedadora apropiada. Células hospedadoras apropiadas incluyen, pero no se limitan a, bacterias, levaduras, células de insecto, y células de mamífero. Se puede usar cualquiera de los métodos conocidos por un experto en la materia para la inserción de fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresión que codifiquen los polipéptidos de fusión de la invención bajo el control de señales de control de la transcripción/traducción.
La expresión de moléculas de ácidos nucleicos de la invención puede ser regulada por una segunda secuencia de ácidos nucleicos de tal forma que la molécula se expresa en un hospedador transformado con la molécula de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión puede estar controlada por cualquier elemento promotor/potenciador conocido en el estado de la técnica. Los promotores que pueden utilizarse para controlar la expresión de moléculas polipeptídicas quiméricas incluyen, pero no se limitan a, una repetición terminal larga (Squinto et al. (1991) Cell 65:1-20); la región promotora temprana de SV40, CMV, M-MuLV, el promotor de timidina quinasa, las secuencias reguladoras del gen de la metalotionina; vectores de expresión procariótica tales como el promotor de b-lactamasa, o el promotor tac (véase también Scientific American (1980) 242:74-94); elementos promotores de levadura u otro hongo tal como el promotor Gal 4, ADH, PGK, fosfatasa alcalina, y las regiones de control de la transcripción específicas de tejido derivadas de genes tales como elastasa I.
Los vectores de expresión capaces de ser replicados en un hospedador bacteriano o eucariótico que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos de la invención son usados para transfectar al hospedador y así dirigir la expresión de dichos ácidos nucleicos para producir los polipéptidos de fusión de la invención, que forman trampas capaces de unirse a VEGF. Las células transfectadas pueden expresar, de forma transitoria o, preferiblemente, de forma constitutiva, las trampas de VEGF de la invención.
Las trampas de la invención pueden ser purificadas por cualquier técnica que permita la posterior formación de una trampa estable biológicamente activa. Por ejemplo, y no como limitación, los factores pueden recuperarse de células tanto como proteínas solubles o como cuerpos de inclusión, de los que se puede extraer cuantitativamente por hidrocloruro de guanidinio 8M o por diálisis (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 5.663.304). Además, con el fin de purificar los factores, se puede usar una cromatografía convencional de intercambio iónico, una cromatografía de interacción hidrofóbica, una cromatografía en fase inversa o filtración en gel.
Componentes del Receptor de VEGF
Los componentes del receptor de VEGF de la mini-trampa de VEGF de la invención consisten en el dominio 2 de Ig de Flt-1 (Flt1D2) (R1) y del dominio 3 de Ig de Flk-1 (Flk1D3) (R2) (juntos, R1R2). El término "dominio Ig" de Flt-1, Flt-4, o Flk-1 pretende abarcar no sólo el dominio salvaje completo, sino también variantes de inserción, de deleción, y/o de sustitución de los mismos que sustancialmente conservan las características funcionales del dominio intacto. Será fácilmente evidente para un experto en la materia que se pueden obtener numerosas variantes de los dominios Ig de más arriba, que sustancialmente conservarán las mismas características funcionales que el dominio salvaje.
El término "equivalentes funcionales", cuando se usa en referencia a R1 o R2, pretende abarcar un dominio R1 o R2 con al menos una alteración, por ejemplo, una deleción, adición, y/o sustitución, que conserva sustancialmente las mismas características funcionales que el dominio salvaje R1, R2, o R3, esto es, una unión a VEGF sustancialmente equivalente. Se apreciará que varias sustituciones aminoacídicas se pueden hacer en R1 o R2 sin salirse del espíritu de la invención con respecto a la capacidad de estos componentes del receptor para unirse e inactivar VEGF. Las características funcionales de las trampas de la invención pueden determinarse por cualquier ensayo de escrutinio apropiado conocido en el estado de la técnica para medir la característica deseada. Ejemplos de dichos ensayos están descritos en la sección experimental de más abajo que permiten la determinación de las características de unión de las trampas para VEGF (Kd), así como su semi-vida de disociación del complejo trampa-ligando (T½). Otros ensayos, por ejemplo, un cambio en la capacidad para unirse de forma específica a VEGF puede medirse por un ensayo de unión a VEGF de tipo competición. Las modificaciones de las propiedades de la proteína, tales como estabilidad térmica, hidrofobicidad, susceptibilidad a degradación proteolítica, o tendencia a agregarse, pueden ser medidas por métodos conocidos por aquellos expertos en la materia.
Los componentes del polipéptido de fusión pueden conectarse directamente entre sí o conectarse vía separadores. Generalmente, el término "separador" (o enlazador) significa una o más moléculas, por ejemplo, ácidos nucleicos o aminoácidos, o restos no peptídicos, tales como polietilenglicol, que pueden ser insertados entre uno o más dominios de componente. Por ejemplo, se pueden usar secuencias separadoras para proporcionar un lugar de interés deseado entre componentes para facilitar la manipulación. Un separador también se puede proporcionar para mejorar la expresión del polipéptido de fusión a partir de la célula hospedadora, para disminuir el impedimento estérico de forma que el componente puede asumir su estructura terciaria óptima y/o interaccionar de forma apropiada con su molécula diana. Para separadores y métodos para identificar separadores deseables, véase, por ejemplo, George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879. Una secuencia separadora puede incluir uno o más aminoácidos conectados de forma natural a un componente receptor, o puede ser una secuencia añadida usada para potenciar la expresión de los péptidos de fusión, proporcionar lugares de interés específicamente deseados, permitir que dominios de componentes formen estructuras terciarias óptimas y/o potenciar la interacción de un componente con su molécula diana. En una realización, el separador comprende una o más secuencias peptídicas entre uno o más componentes que está (están) entre 1-100 aminoácidos, preferiblemente 1-25.
En las realizaciones más específicas, R1 es los aminoácidos 27-126 de la SEQ ID NO: 8, o 1-126 de la SEQ ID NO: 8 (incluyendo la secuencia señal 1-26); o los aminoácidos 27-129 de la SEQ ID NO: 10, o 1-129 de la SEQ ID NO: 10 (incluyendo la secuencia señal 1-26). En las realizaciones más preferidas, R2 es los aminoácidos 127-228 de la SEQ ID NO: 8, o los aminoácidos 130-231 de la SEQ ID NO: 10. Cuando, por ejemplo, R2 es colocado en el extremo N-terminal del polipéptido de fusión, una secuencia señal puede preceder al componente receptor. El/los componente/s de receptor unido/s al componente multimerizante puede/n además comprender un componente separador, por ejemplo, la secuencia GPG de los aminoácidos 229-231 de la SEQ ID NO: 7.
Copartícipe de fusión y Componentes Multimerizantes
El copartícipe de fusión es un componente multimerizante.
Cuando el copartícipe de fusión en un componente multimerizante (MC), es cualquier secuencia natural o sintética capaz de interaccionar con otra MC para formar una estructura de orden superior, por ejemplo, un dímero, un trímero, etc. MCs apropiados pueden incluir una cremallera de leucina, incluyendo dominios de cremallera de leucina derivados de c-jun o c-fos; secuencias derivadas de las regiones constantes de cadenas ligeras kappa o lambda; secuencias sintéticas tales como motivos hélice-bucle-hélice (Müller et al. (1998) FEBS Lett. 432:45-49), motivos espiral-espiral, etc., u otros dominios multimerizantes generalmente aceptados conocidos en el estado de la técnica. En algunas realizaciones, el componente de fusión comprende un dominio derivado de inmunoglobulina de, por ejemplo, la IgG, IgM o IgA de ser humano.
Generación de Mini-trampas de VEGF
La invención proporciona mini-trampas de VEGF que tienen uno o más dominios de componentes de receptor (R1R2)_{x}, donde X\geq1, Y\geq1, y R1 y R2 son como se definen más arriba, y un copartícipe de fusión que es un domino MC que es una secuencia aminoacídica entre 1 y alrededor de 200 aminoácidos de longitud que comprende al menos un resto de cisteína, donde el, al menos, un resto de cisteína es capaz de formar un enlace disulfuro con un resto de cisteína presente en el MC de otro polipéptido de fusión (cMC). El cMC puede ocurrir en el extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido de fusión, o entre dos dominios de componentes de receptor. En una realización específica, la cisteína es añadida al extremo C-terminal de un componente receptor de VEGF, por ejemplo, R1R2c, que permite al polipéptido de fusión formar dímeros covalentes a través de la formación de un enlace disulfuro covalente entre el resto de cisteína en el extremo C-terminal de un polipéptido de fusión y el resto de cisteína en el extremo C-terminal de otro polipéptido de fusión. En este ejemplo, la mini-trampa es un dímero del polipéptido de fusión mostrado en la SEQ
ID NO: 2, donde cada polipéptido de fusión (R1R2-cMC) o R1R2_{c}) tiene un peso molecular de alrededor de 23,0 kD.
En otra realización, cMC es una secuencia de 4 aminoácidos (XXXX) (SEQ ID NO: 11) donde X es cualquier aminoácido y la secuencia comprende al menos un resto de cisteína. En una realización específica, cMC es añadido al extremo C-terminal de un dominio de componente receptor. En una realización más específica, la secuencia de 4 aminoácidos es ACGC (SEQ ID NO: 4) y cMC forma dos enlaces disulfuro con los restos de cisteína presentes en un segundo polipéptido de fusión. Como se muestra más abajo (Tabla 2), ambas mini-trampas del ejemplo exhiben una afinidad por VEGF comparable con la trampa pariente.
Usos Terapéuticos
Las mini-trampas de VEGF de la invención son terapéuticamente útiles para tratar cualquier enfermedad o condición que está mejorada, aliviada, inhibida o prevenida por extirpación, inhibición, o reducción de VEGF. Una lista no exhaustiva de condiciones específicas mejoradas por inhibición o reducción de VEGF incluyen, condiciones clínicas caracterizadas por proliferación excesiva de células del endotelio vascular, permeabilidad vascular, edema o inflamación tal como edema cerebral asociado a daños, golpes o tumor; edema asociado a enfermedades inflamatorias tal como psoriasis o artritis, incluyendo artritis reumatoide; asma; edema generalizado asociado a quemaduras; ascitis y efusión pleural asociadas a tumores, inflamación o trauma; inflamación crónica de las vías aéreas; síndrome de pérdida capilar; sepsis; enfermedad renal asociada a aumento de pérdida proteica; y trastornos del ojo tales como la degeneración macular relacionada con la edad y la retinopatía diabética.
Las composiciones de la invención son terapéuticamente útiles para tratar una amplia variedad de enfermedades asociadas a aumento en los niveles de VEGF. Por ejemplo, la inflamación exagerada de Th2 y la remodelación de las vías aéreas son características en la patogénesis del asma (véase, por ejemplo, Elias et al. (1999) J. Clin. Invest. 104:1001-6). Se han detectado elevados niveles de VEGF en tejidos y muestras biológicas de pacientes con asma, que se correlaciona directamente con la actividad de la enfermedad (Lee et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 107:1106-1108).e inversamente con el calibre de la vía aérea y la respuesta de la vía aérea. Además, Se ha postulado que VEGF contribuye al edema asmático de tejido.
Otra enfermedad asociada al aumento de VEGF es el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Este cáncer a menudo exhibe focos potenciados de proliferación de células endoteliales sobre expresa de forma frecuente VEGF (Ferrara (1991) J. Mol. Med. 77:527-543). PDAC es responsable de un 20% de las muertes debidas a cáncer gastrointestinal, haciéndola la cuarta causa más común de mortalidad relacionada con el cáncer en Estados Unidos y otros países industrializados. La evidencia experimental confirma un importante papel de VEGF en cáncer pancreático, así se ha prometido un inhibidor de VEGF como terapia para atenuar el crecimiento del tumor intrapancreático y la metástasis regional y distal.
Una mini-trampa no glicosilada y más pequeña, expresada en E. coli (Ejemplo 4), una mini-trampa glicosilada expresada en células CHO (Ejemplo 5) o una trampa monomérica basada en receptor (Ejemplo 6) tienen características optimizadas para la liberación local/intra-vítrea, es decir una semi-vida en suero más corta para una evacuación más rápida y reducida exposición sistémica no deseada. Además, debido a su pequeño tamaño, la mini-trampa tiene la capacidad de penetrar a través de la membrana limitante interna (ILM) en el ojo, y difundirse a través del vítreo a la capa epitelial de la retina/pigmento de la retina (RPE) que ayudará a tratar la enfermedad de retina. Adicionalmente, la mini-trampa puede ser usada para administración local para el tratamiento de enfermedad ocular tal como neovascularización coroidal, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa, neovascularización de la córnea/rechazo de transplante. Además, la mini-trampa puede ser usada en cualquier situación donde se requiera el bloqueo transitorio (a corto plazo) de VEGF, por ejemplo, para evitar la exposición crónica a bloqueo de VEGF, tal como, por ejemplo, en el tratamiento de la psoriasis.
Un serio problema que lleva a fallo tras la cirugía del glaucoma es la inflamación temprana y la angiogénesis, así como curación demasiado agresiva de heridas. Por consiguiente, las trampas de VEGF de la invención pueden ser empleadas de forma útil como un adyuvante en cirugía del glaucoma para prevenir hemangiogénsis y linfangiogénesis temprana y reclutamiento de macrófagos en la ampolla de filtrado tras la cirugía del glaucoma, y mejorar el resultado de la cirugía.
Terapias de Combinación
Una trampa de VEGF puede ser administrada en combinación con uno o más componentes o terapias adicionales, incluyendo una segunda molécula de trampa de VEGF, un agente quimioterapéutico, cirugía, dispositivos de catéter, y radiación. La terapia de combinación incluye la administración de una sola formulación farmacéutica posológica que contiene una trampa de VEGF y uno o más agentes adicionales; así como la administración de una trampa de VEGF y uno o más agente(s) adicional(es) en su propia formulación farmacéutica posológica separada. Por ejemplo, una trampa de VEGF y un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico o un agente inhibidor del crecimiento pueden ser administrados a un paciente juntos en una sola composición posológica tal como una formulación combinada, o cada agente puede ser administrado en una formulación posológica separada. Cuando se usan formulaciones posológicas separadas, el polipéptido de fusión específico de VEGF de la invención y uno o más agentes adicionales pueden ser administrados al mismo tiempo, o separados en el tiempo, es decir, secuencialmente.
El término "agente citotóxico" tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de células y/o que causa la destrucción de células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de bacterias, hongos, de origen vegetal o animal, o fragmentos de las mismas.
Un "agente quimoterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (Cytoxan®); sulfonatos de alquilo tales comobusulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfaoramida y trimetilolomelamina; mostrazas nitrogenadas tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustinas, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubucina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcellomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedores del ácido fólico tales como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de elliptinio; etoglucida; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazina; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazoico; triaziquona; 2,2',2''-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; decarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabidasida ("Ara-C"); ciclofosfamica; tiotepa; taxanos; por ejemplo paclitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y docetaxel (Taxotere®, Aventis Anthony, Francia); clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor RFS 2000 de la topoisomerasa; difluorometilomitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capacitabina; y sales. Ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los compuestos de más arriba. También incluidos en esta definición están los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre el tumor, tales como anti-estrógenos, incluyendo por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles que inhiben la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ketoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolina, y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los de más arriba.
Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa tanto in vitro como in vivo. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la detención de la fase G1 y la detención de la fase M. Bloqueantes clásicos de la fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), Taxol®, e inhibidores de la topo II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposida, y bleomicina. Aquellos agentes que detienen la fase G1 también se extienden a la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes del ADN tales como tamoxifeno, prednisona, decarbazina, mecroretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C.
Métodos de Administración
La invención puede ser usada en métodos de tratamiento que comprenden administrar a un individuo una cantidad eficaz de una trampa de VEGF de la invención. En un aspecto preferido, la trampa está sustancialmente purificada (por ejemplo, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o que producen efectos secundarios no deseados). El individuo es, preferiblemente, un mamífero, y más preferiblemente un ser humano.
Se conocen varios sistemas de liberación y pueden ser usados para administrar un agente de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un retrovirus u otro vector, etc. Los métodos de introducción pueden ser enterales o parenterales e incluyen, pero no se limitan a, rutas intradérmicas, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, intraocular, y oral. Los compuestos pueden se administrados por cualquier ruta conveniente, por ejemplo por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de las capas epiteliales o muco-cutáneas (por ejemplo, mucosa oral, rectal y mucosa intestinal, etc.) y pueden ser administrados junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. La administración puede ser aguda o crónica (por ejemplo diariamente, semanalmente, mensualmente, etc.) o en combinación con otros agentes. También se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, por uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente tipo aerosol.
El agente activo puede ser liberado en una vesícula, en particular un liposoma, en un sistema de liberación controlada, o en una bomba. Cuando el agente activo de la invención es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico puede ser administrado in vivo para promover la expresión de la proteína que codifica, construyéndolo como parte de un vector de expresión apropiado del ácido nucleico y administrándolo de forma que se vuelve intracelular, por ejemplo, usando un vector retroviral (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 4.980.286), por inyección directa, o usando bombardeo de micropartículas, o revistiéndolo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes transfectantes, o administrándolo unido a un péptido de tipo homeobox que se conoce entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, un ácido nucleico puede ser introducido de forma intracelular e incorporado dentro del ADN de la célula hospedadora para la expresión, por recombinación homóloga.
Puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área que necesita el tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no como forma de limitación, por infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo, por inyección, por medio de un catéter, o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialácticas, fibras, o sustitutos de piel comerciales.
Una composición útil para practicar los métodos de la invención puede ser un líquido que comprende un agente de la invención en solución, en suspensión, o ambos. El término "solución/suspensión" se refiere a una composición líquida donde una primera porción del agente activo está presente en solución y una segunda porción del agente activo está presente en forma de partícula, en suspensión en una matriz líquida. Una composición líquida también incluye un gel. La composición líquida puede ser acuosa o en forma de un ungüento. Además, la composición puede tomar la forma de un artículo sólido que puede ser insertado en el ojo, tal como por ejemplo entre el ojo y el párpado o en el saco conjuntival, donde la trampa de VEGF es liberada. La liberación a partir de dicho artículo normalmente es a la córnea, tanto vía fluido lacrimal como directamente a la misma córnea, con la que el artículo sólido está generalmente en contacto directo. Los artículos sólidos apropiados para implantación en el ojo están generalmente compuestos principalmente de polímeros biodegradables o no biodegradables. Una solución y/o suspensión acuosa puede estar en forma de gotas oculares. Una posología deseable del agente activo puede medirse por administración de un número conocido de gotas dentro del ojo. Por ejemplo, para un volumen de gota de 25 \mul, la administración de 1-6 gotas administrará 25-150 \mul de la composición.
Una suspensión o solución/suspensión acuosa útil para practicar los métodos de la invención puede contener uno o más polímeros como agentes suspensores. Polímeros útiles incluyen polímeros solubles en agua tales como polímeros de celulosa y polímeros insolubles en agua tales como polímeros que contienen carboxilo reticulado. Una solución o solución/suspensión acuosa de la presente invención es preferiblemente viscosa o muco-adhesiva, o incluso más preferiblemente, tanto viscosa como muco-adhesiva.
Una composición útil para practicar los métodos de la invención es una composición acuosa gelatinosa in situ. Dicha composición comprende un agente gelificante en una concentración eficaz para promover la gelificación en contacto con el ojo o con el fluido lacrimal. Agentes gelificantes apropiados incluyen, pero no se limitan a, polímeros termoestables. El término "gelificante in situ", tal como se usa en la presente memoria, no solo incluye líquidos de baja viscosidad que forman geles en contacto con el ojo o con el fluido lacrimal, sino que también incluyen líquidos más viscosos tales como semi-fluidos y geles tixotrópicos que exhiben viscosidad sustancialmente aumentada o rigidez del gel en la administración al ojo.
Métodos de Diagnóstico y Escrutinio
Las trampas de VEGF de la invención pueden usarse de forma diagnóstica y/o en métodos de escrutinio. Por ejemplo, la trampa puede usarse para monitorizar niveles de VEGF durante un estudio clínico para evaluar la eficacia del tratamiento. En otra realización, los métodos y composiciones de la presente invención se usan para escrutar individuos que entran en un estudio clínico para identificar individuos que tienen, por ejemplo, un nivel de VEGF muy alto o muy bajo. Las trampas se pueden usar en métodos conocidos en el estado de la técnica que se relacionan con la localización y actividad de VEGF, por ejemplo, en métodos de formación de imágenes, en métodos para medir niveles del mismo en muestras fisiológicas apropiadas, en métodos de diagnóstico, etc.
Las trampas de la invención se pueden usar en ensayos de escrutinio in vivo e in vitro para cuantificar la cantidad de VEGF no unido presente, por ejemplo, en un método de escrutinio para identificar agentes de ensayo capaces de disminuir la expresión de VEGF. Más generalmente, las trampas de la invención se pueden usar en cualquier ensayo o proceso en el que se desea la cuantificación y/o el aislamiento de VEGF.
Composiciones Farmacéuticas
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprende mini-trampas de VEGF de la invención. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más mini-trampas, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora Federal o un gobierno estatal o listado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "vehículo" se refiere e un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Excipientes farmacéuticos aceptables incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulgentes, o agentes tamponantes de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martín.
La mini-trampa de VEGF de la invención se puede formular como formas neutras o sales. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como aquellos derivados de ácidos hidroclórico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y aquellos formados con grupos carboxilo libres tales como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
Además, las composiciones acuosas útiles para practicar los métodos de la invención tienen pH y osmolalidad oftálmicamente compatibles. Se pueden incluir, en la composición de la invención, uno o más agentes ajustadores de pH y/o agentes tamponantes aceptables oftálmicamente compatibles, que incluyen ácidos tales como ácido acético, bórico, cítrico, láctico, fosfórico e hidroclórico; bases tales como hidróxido sódico, fosfato sódico, borato sódico, citrato sódico, acetato sódico, y lactato sódico; y tampones tales como citrato/dextrosa, bicarbonato sódico y cloruro de amonio. Dichos ácidos, bases y tampones están incluidos en una cantidad necesaria para mantener el pH de la composición en un intervalo oftálmicamente aceptable. Se pueden incluir en la composición una o más sales oftálmicamente aceptables en una cantidad suficiente para llevar la osmolalidad de la composición a un intervalo oftálmicamente aceptable. Dichas sales incluyen aquellas que tienen cationes sodio, potasio o amonio y aniones cloruro, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonato, sulfato, tiosulfato y bisulfito.
La cantidad de la trampa que será eficaz para su previsto uso terapéutico se puede determinar por técnicas clínicas clásicas basadas en la presente descripción. Además, opcionalmente se pueden emplear ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de posología óptimos. Generalmente, los intervalos de posología apropiados para la administración intravenosa son generalmente alrededor de 50-5000 microgramos de compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los intervalos de posología apropiados para administración intranasal son generalmente aproximadamente 0,01 pg/Kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Las dosis eficaces pueden ser extrapoladas a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas in vitro o sistemas de ensayo en modelos animales.
Para la administración sistémica, se puede estimar una dosis terapéuticamente eficaz inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluye la IC_{50} tal como se determinó en cultivo celular. Dicha información se puede usar para determinar de forma más precisa las dosis útiles en seres humanos. Las posologías iniciales también se pueden estimar a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que son bien conocidas en el estado de la técnica. Un experto en la materia fácilmente puede optimizar la administración a seres humanos basándose en los datos en animales.
La cantidad y el intervalo de posología puede ajustarse individualmente para proporcionar niveles de plasma de los compuestos que son suficientes para mantener el efecto terapéutico. En casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz del os compuestos puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la materia será capaz de optimizar las posologías locales terapéuticamente eficaces sin excesiva experimentación.
La cantidad de compuesto administrado será, por supuesto, dependiente del individuo a tratar, del peso del individuo, la severidad del mal, de la manera de administración, y del juicio del médico que prescribe. La terapia se puede repetir intermitentemente mientras los síntomas sean detectables o incluso cuando no sean detectables. La terapia se puede proporcionar sola o en combinación con otros fármacos.
Transfección Celular y Terapia Génica
La presente invención se refiere al uso de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de fusión de la invención para transfectar células in vitro. Estos ácidos nucleicos pueden ser insertados dentro de cualquier número de vectores bien conocidos para la transfección de células diana. Los ácidos nucleicos se transfectan dentro de las células ex vivo, a través de la interacción del vector y de la célula diana. Las composiciones pueden ser administradas (por ejemplo, por inyección en un músculo) a un individuo en una cantidad suficiente para provocar una respuesta terapéutica. Una cantidad adecuada para lograr esto es definida como "una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz".
En otro aspecto, la invención puede ser usada en un método para reducir los niveles de VEGF en un ser humano u otro animal, que comprende transfectar una célula con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de la invención, donde el ácido nucleico comprende un promotor inducible unido de forma operativa al ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión o mini-trampa. Para procedimientos de terapia génica en el tratamiento o prevención de enfermedad del ser humano, véase por ejemplo, Van Brunt (1998) Biotechnology 6:1149-1154.
Kits
La invención también se relaciona con un artículo de fabricación que comprende material de empaquetado y un agente farmacéutico contenido dentro del material de empaquetado, donde el agente farmacéutico comprende al menos una trampa de VEGF compuesta por dos o más polipéptidos de fusión de la invención, y donde el material de empaquetado comprende una etiqueta o paquete insertado que indica que el polipéptido de fusión específico de VEGF puede ser usado para tratar una enfermedad o condición mediada por VEGF.
Animales Transgénicos
La invención se refiere a animales transgénicos no humanos que expresan una trampa de la invención. Un animal transgénico puede ser producido introduciendo un ácido nucleico dentro del pro núcleo macho de un oocito fertilizado, por ejemplo, por microinyección, infección retroviral, y permitiendo que el oocito se desarrolle en un animal adoptivo hembra pseudopreñada. Cualquiera de las secuencia reguladoras u otras secuencias útiles en vectores de expresión pueden formar parte de la secuencia transgénica. Una(s) secuencia(s) reguladora(s) específica(s) de tejido puede(n) estar unida(s) de forma operativa al transgén para dirigir la expresión del transgén a células en particular. Un animal transgénico no humano que expresa un polipéptido de fusión o mini-trampa de la invención es útil en una variedad de aplicaciones, incluyendo como un medio de producción de dicho polipéptido de fusión. Además, el transgén puede ser colocado bajo el control de un promotor inducible de forma que la expresión del polipéptido de fusión o mini-trampa puede ser controlada por, por ejemplo, la administración de un molécula pequeña.
Realizaciones Específicas
En los experimentos abajo descritos, se generaron trampas de VEGF más pequeñas y se investigó su capacidad para unir VEGF. Dichas mini-trampas de VEGF son preferiblemente usadas en aplicaciones específicas. Por ejemplo, ciertas condiciones o enfermedades pueden ser tratadas preferiblemente con administración local de una trampa de VEGF para un órgano, tejido, o célula específicos, en lugar de por administración sistémica. En un experimento, se generó, por escisión, una trampa de VEGF más pequeña por escisión dirigida de una trampa de VEGF dimerizada que tiene una región de escisión (región C) generada en dominios Fc (Ejemplo 2). La trampa truncada exhibía afinidad por VEGF y semi-vida comparables a la trampa parental de tamaño completo. Los Ejemplos 3-5 describen la construcción de polipéptidos de fusión que tienen un componente receptor de VEGF y un componente multimerizante que consiste en uno o más restos de cisteína. Las medidas de afinidad mostraron que los polipéptidos de fusión no glicosilados expresados en E. coli o los polipéptidos glicosilados expresados en células CHO tenían afinidad de unión por VEGF comparable a la trampa parental de tamaño completo. El Ejemplo 6 además ilustra una trampa de VEGF monomérica que consiste en (R1R2)_{2} que es capaz de unir e inhibir VEGF. El Ejemplo 7 describe la construcción de una mini-trampa de VEGF (SEQ ID NO: 26) que exhibe alta afinidad de unión por VEGF comparable a la trampa de longitud completa (SEQ ID NO: 10).
Otras características de la invención serán evidentes en el curso de las siguientes descripciones de las realizaciones ejemplares que se dan para la ilustración de la invención y que no pretenden limitar la misma.
Ejemplos
El siguiente ejemplo es propuesto con el fin de proporcionar a aquellos expertos en la materia una revelación y descripción completa de cómo hacer y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que la invención considera como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se podrían explicar algunos errores y desviaciones experimentales. A no ser que se indique lo contrario, partes son partes en peso, peso molecular es peso molecular medio, temperatura es en grados Celsius, y presión es la, o está cerca de la atmosférica.
Ejemplo 1 Construcción de Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)
La construcción de una trampa de VEGF parental, Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) (SEQ ID NOs: 7-8), VEGFR1R2. Fc\DeltaC1(a) (SEQ ID NOs: 9-10), y Ftl1D2.VEGFR3D3. Fc\DeltaC1(a) (SEQ ID NOs: 12-13) se describe en detalle en la publicación PCT WO/0075319, incorporada específicamente por referencia en su totalidad en la presente memoria. También se describen en WO/0075319 métodos para construir y expresar construcciones de ácidos nucleicos que codifican trampas de VEGF, métodos para detectar y medir la unión a VEGF de trampas de VEGF, métodos para determinar la estequiometría de unión a VEGF por análisis BIAcore, y análisis farmacocinéticos.
Ejemplo 2 Mini-trampa de VEGF dimérica escindida de Trombina
La construcción VEGFR1R2.Fc\DeltaC1(a) (SEQ ID NOs: 9-10), se modificó por inserción de una escisión de trombina tras el CPPC del dominio de Fc (SEQ ID NO: 1). La trampa de VEGF purificada (5 \mug) se incubó con trombina (Novagen) en Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, NaCl 50 mM, CaCl_{2} 2,5 mM durante 16 horas a 37ºC. Los controles incluían la proteína de escisión control (CCP) y la proteína parental de la trampa de VEGF incubadas sin trombina. El análisis de SDS-PAGE (gel de Tris-Glicina al 4-20%; 5 \mug de proteína por pocillo) verificó la correcta escisión (resultados no mostrados).
Determinación de la afinidad: La Kd de unión de cada trampa de VEGF para hVEGF165 se determinó tal como se describe en WO/0075319, para la trampa de VEGF parental, la trampa de VEGF no escindida que contiene un lugar de escisión de trombina ("trampa de VEGF no escindida"), la mini-trampa de VEGF escindida y R1R2-myc myc his recombinante monomérico. Más específicamente, la capacidad de las trampas para bloquear la fosforilación del receptor dependiente de VEGF_{165} se determinó usando células primarias de endotelio humano (HUVECs). VEGF_{165} se incubó en presencia de concentraciones variables de las trampas ensayo, y la mezcla se añadió a las HUVECs para estimular la fosforilación en tirosina de VEGF. A concentraciones sub-estequiométricas de la trampa de VEGF, el VEGF no unido indujo la fosforilación del receptor. Sin embargo, a una relación molar 1:1 o superior de una trampa de VEGF al ligando, se observó el bloqueo completo de la señalización del receptor, estableciendo que una sola molécula de un dímero de la trampa es capaz de bloquear una sola molécula de VEGF_{165} humana. Así, la alta afinidad de unión de la trampa de VEGF por VEGF da como resultado la formación de un complejo que impide la interacción de VEGF con los receptores de la superficie celular. Se obtuvieron resultados similares para experimentos idénticos de inhibición de la fosforilación para la trampa de VEGF parental, la trampa de VEGF no escindida, y la mini-trampa de VEGF escindida. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1
1
Ejemplo 3 Construcción de Plásmidos que Codifican Mini-Trampas de VEGF
Se construyeron mini-trampas de VEGF a partir del precursor de la trampa de VEGF parental, VEGFR1R2.Fc
\DeltaC1(a) (SEQ ID NOs: 9-10), en las que los tres aminoácidos glicina-alanina-prolina servían como un enlace entre Flk1 D3 y Fc\DeltaC1(a). Este plásmido, pTE115 se usó en la construcción de las mini-trampas de VEGF porque la secuencia enlazadora de ADN incluía una secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción Srf1 que facilitaba la construcción de la trampa de VEGF. En todos los demás aspectos, la trampa de VEGF codificada por pTE115 es idéntica a la trampa de VEGF, VEGFR1R2. Fc\DeltaC1(a) (SEQ ID NOs: 9-10) descrita en detalle en la publicación PCT WO/0075319.
Se construyeron dos mini-trampas de VEGF con dominios de multimerización que consisten tanto de un solo resto de cisteína (R1R2) (SEQ ID NO: 2) como delos aminoácidos ACGC (SEQ ID NO: 4) (R1R2_{ACGC}) (SEQ ID NO: 5) añadidos al extremo C-terminal de los componentes de receptor Flt1D2.Flk1D3. Ambas construcciones son capaces de formar moléculas homodiméricas estabilizadas por un disulfuro intermolecular (R1R2_{c}) o dos disulfuros intermoleculares (R1R2_{ACGC}).
El plásmido pTE517 se hizo separando el fragmento de 690 pares de bases generado por digestión del ADN de pTE115 con Srf1 y Not I e insertando el fragmento de ADN sintético formado al aparear los oligos R1R2NC (SEQ ID NO: 14) y R1R2CC (SEQ ID NO: 15). El plásmido resultante codifica R1R2_{c}, que consiste en dominios Flt1D2.Flk1D3 seguidos de un resto de cisteína (SEQ ID NO: 23). De forma similar, el plásmido pTE518 se hizo separando el fragmento de 690 pares de bases generado por digestión del ADN de pTE115 con Srf1 y Not I, seguido de ligación con el fragmento de ADN sintético formado al aparear los oligos R1R2NACGC (SEQ ID NO: 16) y R1R2CACGC (SEQ ID NO: 17). El plásmido resultante codifica R1R2_{ACGC}, que consiste en dominios Flt1D2.Flk1D3 seguidos de los aminoácidos ACGC (SEQ ID NO: 25).
Los Plásmidos también se construyeron para dirigir la expresión de estas mini-trampas en E. coli. Los cebadores R1R2N-Ncol1 (SEQ ID NO: 18) y R1R2CNot1 (SEQ ID NO: 19) se usaron para amplificar un fragmento de ADN de pTE115 que codifica los aminoácidos G30 a K231, relacionados con la trampa de VEGF parental (SEQ ID NO: 10). La amplificación de esta secuencia dio como resultado la fusión de un codón de iniciación de metionina en el extremo 5' y la fusión del codón para cisteína, seguido de un codón de parada, en el extremo 3' (SEQ ID NO: 2). Luego, este fragmento de ADN se clonó dentro de los lugares Nco I y Not I del plásmido de expresión pRG663 de E. coli para producir pRG1102 de forma que la expresión de R1R2_{c} era dependiente de la transcripción del promotor del fago T7 \Phi1.1. La inducción de la expresión génica a partir de pRG1102 dio como resultado la acumulación de R1R2cys en el citoplasma de la cepa hospedadora RFJ238 de E. coli. De forma similar, los cebadores R1R2N-Nco1 (SEQ ID NO: 18) y R1R2ACGC-Not1 (SEQ ID NO: 20) se usaron para amplificar el fragmento de ADN de pTE115 que codifica los aminoácidos G30 a K231 (SEQ ID NO: 10) dando como resultado la fusión de un codón de iniciación de metionina en el extremo 5' y la fusión de codones para ACGC (SEQ ID NO: 4), seguidos de un codón de parada, en el extremo 3' (SEQ ID NO: 5). Luego, este fragmento se clonó dentro de los lugares Nco I y Not I del plásmido de expresión pRG663 de E. coli para producir pRG1103 de forma que la expresión de R1R2_{ACGC} era dependiente de la transcripción del promotor del fago T7 \Phi1.1. La inducción de la expresión génica tanto de pRG1102 como de pRG1103 dio como resultado la acumulación de R1R2_{C} o R1R2_{ACGC}, respectivamente, en el citoplasma de la cepa hospedadora RFJ238 de E. coli.
Ejemplo 4 Purificación y caracterización de mini-trampas de VEGF de E. coli
Tanto R1R2_{C} como R1R2_{ACGC} se expresaron como proteínas citoplásmicas en E. coli y se purificaron por el mismo método. La inducción del promotor del fago T7 \Phi1.1 o pRG1102 o pRG1103 en la cepa RFJ238 de E. coli K12 dio como resultado la acumulación de la proteína en el citoplasma. Tras la inducción, las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 20 mM, y se lisaron al pasarlas por un homogenizador celular Niro-Soavi. Los cuerpos de inclusión se recogieron por centrifugación a partir de las células lisadas, se lavaron una vez en H_{2}O destilada, luego se solubilizaron en guanidinio-HCL 8 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, sulfito de sodio 100 mM, tetrationato de sodio 10 mM y se incubaron a temperatura ambiente durante 16 horas. El sobrenadante aclarado se fraccionó en una columna S300 equilibrada con guanidinio-HCL 6M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5. Las fracciones que contienen R1R2_{c} se agruparon y dializaron frente a Urea 6 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5. La proteína dializada se diluyó con urea 2M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, cisteína 2 mM luego se agitó lentamente durante 7 días a 4ºC. La proteína replegada se dializó frente a Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, luego se cargó en una columna SP-Sepharose equilibrada con Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 y se eluyó con un gradiente de NaCl de 0 a 1M en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5. Las fracciones que contienen R1R2_{c} se agruparon, concentraron, y cargaron en una columna Superdex 200 equilibrada con Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. Las fracciones que contienen el dímero de la mini-trampa se recogieron y agruparon. El peso molecular de la mini-trampa purificada se estimó que fue alrededor de 46 kD en SDS-PAGE.
Se llevaron a cabo ensayos BIAcore (como se describe en WO/0075319) para determinar la afinidad de la trampa por VEGF, y los resultados mostraron que las mini-trampas de R1R2_{C} y R1R2_{ACGC} tenían una afinidad por VEGF comparable con la trampa de VEGF de longitud completa (Tabla 2).
TABLA 2
3
Ejemplo 5 Expresión de mini-trampas de VEGF en CHO K1
La expresión de las mini-trampas de VEGF codificadas por pTE517 y pTE518 es dependiente de la trascripción del promotor humano CMV-MIE y da como resultado la secreción de las mini-trampas en el medio de cultivo cuando se expresan en células CHO. Cuando se expresan como proteínas secretadas en CHO K1, ambas mini-trampas se encontraron en el medio condicionado y la estimación de su peso molecular por SDS-PAGE sugirió, como se esperaba, que las proteínas estaban glicosiladas. El análisis por SDS-PAGE también indicó que las mini-trampas eran capaces de formar moléculas homodiméricas estabilizadas por disulfuro(s) intermolecular(es) entre la(s) cisteína(s) del extremo C-terminal. De forma específica, la mini-trampa R1R2_{c} formaba, de forma eficaz, dímeros covalentes cuando se expresaba como una proteína secretada en las células CHO.
Ejemplo Comparativo 6
Construcción y expresión de una mini-trampa de VEGF de cadena sencilla
También se construyó una mini-trampa de VEGF que no necesita un dominio de multimerización (SEQ ID NO: 24). Esta mini-trampa se construyó por fusión directa de un dominio Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (aminoácidos 30-231 de la SEQ ID NO: 24) a un segundo domino Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (aminoácidos 234-435 de la SEQ ID NO: 24) con un enlazador Gly-Pro entre los dominios de receptor tándem (aminoácidos 232-233 de la SEQ ID NO: 24).
Para construir un gen que codifique los dominios tándem Flt1D2.Flk1D3, se sintetizó un fragmento de ADN (Blue Heron Biotechnology) que codificaba un dominio Flt1D2.Flk1D3 que minimizaba la homología del ADN con el ADN que codifica el dominio Flt1D2.Flk1D3 encontrado en pTE115. Este fragmento de ADN sintético se clonó como un fragmento Srf I-Not I dentro de los lugares Srf I-Not I de pTE115 para producir pTE570, que expresa la mini-trampa de VEGF R1R2-R1R2 del promotor de CMV-MIE. Cuando este plásmido se transfecta en las células CHO K1 la mini-trampa R1R2-R1R2 se acumula en el medio de cultivo.
Ejemplo 7 Construcción y expresión de una mini-trampa de VEGF
Se construyó una mini-trampa de VEGF, tal como se describe más abajo, por fusión directa de un dominio Flt1D2.Flk1D3 (R1R2) (aminoácidos 30-231 de la SEQ ID NO: 26) con una secuencia de nueve aminoácidos que termina en CPPC en el extremo C-terminal. Cuando este plásmido se transfecta dentro de células CHO K1, la mini-trampa de VEGF de la SEQ ID NO: 26 es secretada al medio de cultivo. La purificación posterior por electroforesis no reductora en SDS-PAGE, así como el análisis de dispersión ligera natural identificaron una molécula trampa con peso molecular de aproximadamente 64 kDa. Este peso molecular indica que se formó un dímero covalente entre dos polipéptidos de fusión de SEQ ID NO: 26. Se llevaron a cabo experimentos similares con plásmidos que codifican los polipéptidos de fusión de SEQ ID NOs: 27 y 28, y, de forma similar, mostraron que estas moléculas formaban trampas homodiméricas. Las determinaciones de afinidad para la unión de VEGF-165 humano a trampas de EGF compuesta de dímeros de SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 26 se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3
4
<110> Daly, Thomas J.
\hskip1cm
Fandl, James P. 
\hskip1cm
Papadopoulos, Nicholas J. 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> TRAMPAS DE VEGF Y USOS TERAPÉUTICOS DE LAS MISMAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 710D2-WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> A ASIGNAR
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2004-06-29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 10/609,775
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2003-06-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows, Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
5 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1, 3
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier Aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1453
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 458
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
12 
\hskip1cm
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1377
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 458
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
15 
\hskip1cm
16 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1, 2, 3, 4
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier Aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
17 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
18 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 455
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
19 
\hskip1cm
20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggctgttga gagagagaga gagc 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggccgctctc tctctctctc aacagccc 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcgcatgc ggttgttgag agc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggccgctctc aacaaccgca tgcgccc 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagagagacc atgggtagac ctttcgtaga gatgta 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagaggcgg ccgctttatc aacacttttc atggaccctg acaaatgt 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagaggcgg ccgctttatc aacaaccgca tgccttttca tggaccctga caaatgt 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agttccggaa gtgccatggg tagacctttc gtagagatg 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agagaggcgg ccgctgttat cacttctcgt gcacgcgcac gaag 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
23 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
25 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1,2cm
26 
\hskip1cm
27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 434
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
28 
\hskip1cm
29

Claims (14)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de fusión que consiste en componentes (R1R2)_{x} y un copartícipe de fusión (FP), donde X es 1, R1 es el dominio 2 de Ig de un componente receptor del factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGF) de Flt-1 y R2 es el dominio 3 de Ig de Flk-1; donde el copartícipe de fusión (FP) es un componente multimerizante (MC) capaz de interaccionar con otro MC para formar una estructura multimérica y es una secuencia aminoacídica de 1-15 aminoácidos de longitud con 1-2 restos de cisteína.
2. Un polipéptido de fusión codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
3. El polipéptido de fusión de la reivindicación 2 cuya secuencia de aminoácidos es la de SEQ ID NO: 26, 27 o 28.
4. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, unida de forma operativa a una secuencia de control de la expresión.
5. Un método para producir un polipéptido de fusión de VEGF, que comprende las etapas de introducir en un sistema de expresión apropiado el vector de expresión de la reivindicación 4 y efectuar la expresión del polipéptido de fusión de VEGF.
6. Una trampa del factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGF) capaz de unirse a VEGF e inhibir la actividad de VEGF, y que comprende un multímero de dos o más polipéptidos de fusión de la reivindicación 2 ó 3.
7. La trampa de VEGF de la reivindicación 6 que es un dímero.
8. Una composición farmacéutica que comprende el péptido de fusión de la reivindicación 2 o 3, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. Una trampa de VEGF de la reivindicación 6 o 7 para uso en el tratamiento de una enfermedad o condición ocular que es mejorada, aliviada, o inhibida por separación o inhibición del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
10. Una trampa de VEGF de la reivindicación 9 para uso en el tratamiento de una enfermedad o condición ocular que es una degeneración macular relacionada con la edad o una retinopatía diabética.
11. Una trampa de VEGF de la reivindicación 9 para uso como un adyuvante en las cirugías del ojo, tales como cirugía de glaucoma o en el tratamiento de tumores intra oculares, tales como melanoma coroideo (o uveal) o retinoblastoma, donde dicho tratamiento es vía administración intravítrea.
12. Uso de una trampa de VEGF de la reivindicación 6 o 7 en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o condición ocular que está mejorada, aliviada, o inhibida por separación o inhibición del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF).
13. Uso según la reivindicación 11, donde dicho medicamento es para tratar la degeneración macular relacionada con la edad o la retinopatía diabética.
14. Uso según la reivindicación 11, donde dicho medicamento es usado como un adyuvante en las cirugías del ojo, tales como cirugía de glaucoma, o es para tratar tumores intra oculares, tales como melanoma coroideo (o uveal) o retinoblastoma, donde dicho tratamiento es vía administración intravítrea.
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