BR112020001360A2 - anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno deste que se liga a cd8, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, conjugado de anticorpo, métodos para gerar imagens de um tecido que expressa cd8, para tratar um sujeito tendo um tumor sólido, para prever uma resposta positiva a uma terapia antitumoral, para monitorar uma resposta de um tumor em um sujeito a uma terapia antitumoral, para prever ou monitorar a eficácia da terapia antitumoral e para monitorar a presença de células t em um tumor ao longo do tempo, e, composto. - Google Patents

anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno deste que se liga a cd8, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, conjugado de anticorpo, métodos para gerar imagens de um tecido que expressa cd8, para tratar um sujeito tendo um tumor sólido, para prever uma resposta positiva a uma terapia antitumoral, para monitorar uma resposta de um tumor em um sujeito a uma terapia antitumoral, para prever ou monitorar a eficácia da terapia antitumoral e para monitorar a presença de células t em um tumor ao longo do tempo, e, composto. Download PDF

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Abstract

são fornecidos neste documento anticorpos anti-cd8, anticorpos anti-cd8 radiomarcados, anticorpos anti-cd8 marcados com fluorescência e uso destes na geração de imagens. são incluídos métodos de detecção da presença de proteínas cd8 em um sujeito ou amostra.

Description

1 / 120
ANTICORPO MONOCLONAL ISOLADO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DESTE QUE SE LIGA A CD8, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, CONJUGADO DE ANTICORPO,
MÉTODOS PARA GERAR IMAGENS DE UM TECIDO QUE EXPRESSA CD8, PARA TRATAR UM SUJEITO TENDO UM TUMOR SÓLIDO,
PARA PREVER UMA RESPOSTA POSITIVA A UMA TERAPIA ANTITUMORAL, PARA MONITORAR UMA RESPOSTA DE UM TUMOR EM UM SUJEITO A UMA TERAPIA ANTITUMORAL, PARA PREVER OU MONITORAR A EFICÁCIA DA TERAPIA ANTITUMORAL E PARA MONITORAR A PRESENÇA DE CÉLULAS T EM UM TUMOR AO LONGO DO TEMPO, E, COMPOSTO CAMPO
[001] Esta divulgação refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos que se ligam especificamente à glicoproteína CD8, métodos terapêuticos e diagnósticos de uso desses anticorpos, anticorpos anti- CD8 radiomarcados, anticorpos anti-CD8 marcados com fluorescência e seu uso na imagiologia (geração de imagens).
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] Uma cópia oficial da listagem de sequências é enviada simultaneamente com o relatório descritivo, eletronicamente, via EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um nome de arquivo de 10357WO01_SEQ_LIST_ST25.txt, uma data de criação de 23 de julho de 2018 e um tamanho de cerca de 12 kilobytes. A listagem de sequências contida neste documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e está incorporada neste documento por referência integralmente.
FUNDAMENTOS
[003] Moléculas co-estimuladoras e co-inibidoras de células T (coletivamente denominadas moléculas cossinalizadoras) desempenham um
2 / 120 papel crucial na regulação da ativação de células T, diferenciação de subconjuntos, função efetora e sobrevivência (Chen et al, 2013, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242). Após o reconhecimento de complexos peptídeo- MHC cognatos em células que apresentam antígenos pelo receptor de células T (TCR), receptores de cossinalização colocalizam com receptores de células T na sinapse imunológica, onde ocorre sinergia com sinalização TCR para promover ou inibir a ativação de célula T e função (Flies et al., 2011, Yale J. Biol. Med. 84: 409-421). A resposta imune final é regulada por um equilíbrio entre os sinais co-estimulatórios e co-inibitórios (“checkpoints imunológicos”) (Pardoll, 2012, Nature Reviews Cancer 12: 252-264). CD8, uma glicoproteína de superfície celular, estabiliza a interação do receptor- MHC-I de célula T e inicia a sinalização intracelular através da fosforilação de proteína tirosina quinase (Lck) específica de linfócito de motivos de ativação baseada em tirosina (ITAms) associados a CD3 para ativação.
[004] Em humanos, CD8 é predominantemente expressa em linfócitos T citotóxicos, mas também expressa em subconjuntos de células dendríticas, células natural killer, células T natural killer e células ɣδT. A glicoproteína consiste em duas isoformas, α e β, que são codificadas por genes diferentes e expressas como homodímeros αα ou heterodímeros αβ. Heterodímeros αβ são mais prevalentes.
[005] A tomografia por emissão de imuno-pósitron (PET) é uma ferramenta de diagnóstico por imagem que utiliza anticorpos monoclonais marcados com emissores de pósitron, combinando as propriedades de direcionamento de um anticorpo com a sensibilidade das câmeras de tomografia por emissão de pósitron. Ver, por exemplo, The Oncologist, 12: 1379 (2007); Journal of Nuclear Medicine, 52(8): 1171 (2011). Imuno-PET permite a visualização e a quantificação de antígeno e acúmulo de anticorpo in vivo e, como tal, pode servir como uma ferramenta importante para diagnósticos e terapia complementar. Por exemplo, imunoPET pode auxiliar
3 / 120 na seleção de candidatos potenciais para uma terapia em particular, bem como no monitoramento do tratamento.
[006] Há uma necessidade de ferramentas de diagnóstico para prever e monitorar a adequação ou a capacidade de resposta de um sujeito a uma terapia antitumoral específica.
BREVE SUMÁRIO
[007] São fornecidos neste documento anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação a antígeno deles que ligam CD8. Os anticorpos podem ser úteis, inter alia, para direcionar células imunes que expressam CD8, e para modular atividade de células T CD8 positivas. Em certas modalidades, os anticorpos são úteis para inibir ou neutralizar a atividade de células T CD8 positivas, por exemplo, inibindo a produção de IFNγ em células T CD8 positivas e/ou inibindo proteína ativadora do fator de transcrição (AP-1) em células T ativadas. Em algumas modalidades, os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno são úteis para a ligação CD8 in vivo. Os anticorpos são úteis no tratamento de uma doença ou condição associada à ativação de células T CD8 positivas.
[008] Os anticorpos fornecidos neste documento podem ser de comprimento total (por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4) ou podem compreender apenas uma porção de ligação a antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab')2 ou scFv) e podem ser modificados para afetar a funcionalidade, por exemplo, para eliminar funções efetoras residuais (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).
[009] Em um primeiro aspecto, são fornecidos neste documento anticorpos monoclonais recombinantes isolados ou fragmentos de ligação a antígeno deles que se ligam especificamente ao CD8. Em certas modalidades, os anticorpos são totalmente humanos.
[0010] Os anticorpos anti-CD8 exemplares estão listados na Tabela 1, que fornece os identificadores de sequência de aminoácidos e identificadores
4 / 120 de sequência de ácido nucleico das sequências de região determinantes de complementaridade de cadeia pesada e leve e sequências de região variável de cadeia pesada e leve.
[0011] Também se fornecem anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno deles, compreendendo uma HCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com ela.
[0012] Também se fornecem anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno deles, compreendendo uma LCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência à mesma.
[0013] Também se fornecem anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno deles, compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0014] Também se fornecem anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno deles, compreendendo uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0015] Também se fornecem anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno deles, compreendendo uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8 ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0016] Também se fornecem anticorpos, ou fragmentos de ligação a
5 / 120 antígeno deles, compreendendo uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0017] Também se fornecem anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno deles, compreendendo uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14 ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0018] Também se fornecem anticorpos, ou fragmentos de ligação a antígeno deles, compreendendo uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16 ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0019] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno dele compreende um par de sequência de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 compreendendo SEQ ID NOs: 8/16. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno dele compreende um par de sequência de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 2/10. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno dele compreende as sequências de aminoácidos de CDR dentro do par de sequência de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 2/10. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno dele compreende a combinação de sequências de aminoácidos de seis CDR (HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3) das SEQ ID NOs: 4/6/8/12/14/16.
[0020] Métodos e técnicas para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para identificar CDRs dentro das sequências de
6 / 120 aminoácidos de HCVR e/ou LCVR especificadas divulgadas neste documento. As convenções exemplares que podem ser usadas para identificar os limites das CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a definição de Chothia e a definição de AbM. Em termos gerais, a definição de Kabat baseia-se na variabilidade da sequência, a definição de Chothia baseia-se na localização das regiões de loop estrutural e a definição AbM é um ajuste entre as abordagens de Kabat e Chothia. Ver, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:9268-9272 (1989). Bancos de dados públicos também estão disponíveis para identificar sequências CDR dentro de um anticorpo.
[0021] São fornecidos neste documento anticorpos anti-CD8 com um padrão de glicosilação modificado. Em algumas modalidades, a modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo sem uma fração de fucose presente na cadeia de oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (ver Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, a modificação de galactosilação pode ser feita para modificar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
[0022] São fornecidos neste documento anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno deles que se ligam especificamente a CD8 de espécies humanas ou outras espécies. Em certas modalidades, os anticorpos podem se ligar a CD8 humana e/ou a CD8 de macaco. Em certas modalidades, os anticorpos se ligam a CD8α humana.
[0023] Em um segundo aspecto, são fornecidas moléculas de ácido nucleico neste documento que codificam anticorpos anti-CD8 ou porções deles. Por exemplo, são fornecidas neste documento moléculas de ácido nucleico que codificam a sequência de aminoácidos de HCVR da SEQ ID
7 / 120 NO: 2; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 1, ou uma sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência. São fornecidas neste documento moléculas de ácido nucleico que codificam a sequência de aminoácidos de LCVR da SEQ ID NO: 10; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica da SEQ ID NO: 9, ou uma sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência. São fornecidas neste documento moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de CDR listadas na Tabela 1; em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência polinucleotídica selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos CDR listadas na Tabela 1, ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0024] Em um aspecto relacionado, também são fornecidos neste documento vetores de expressão recombinantes capazes de expressar um polipeptídeo que compreende uma região variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti-CD8. Por exemplo, também são fornecidos neste documento vetores de expressão recombinantes compreendendo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico mencionadas acima, ou seja, moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das sequências de HCVR, LCVR e/ou CDR conforme estabelecido na Tabela 1. Também são fornecidos vetores de expressão recombinantes capazes de expressar um polipeptídeo que compreende uma região variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti-CD8. Por exemplo, vetores de expressão recombinantes compreendendo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico mencionadas acima, ou seja, moléculas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma
8 / 120 das sequências de cadeia leve ou pesada, conforme estabelecido na Tabela 1, são contemplados neste documento. Também incluídas dentro da presente divulgação estão células hospedeiras em que tais vetores foram introduzidos, bem como métodos de produção de anticorpos ou porções deles por meio da cultura das células hospedeiras em condições que permitem a produção de anticorpos ou fragmentos de anticorpos, e recuperação dos anticorpos e fragmentos de anticorpos assim produzidos.
[0025] Em um terceiro aspecto, é fornecida neste documento uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo humano recombinante ou fragmento seu que se liga especificamente a CD8 e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, a composição é uma combinação de um anticorpo anti-CD8 e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que seja vantajosamente combinado com um anticorpo anti- CD8. Agentes exemplares que podem ser combinados vantajosamente com um anticorpo anti-CD8 incluem, sem limitação, outros agentes que ligam e/ou modulam a sinalização de células T ativadas (incluindo outros anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno deles, etc.) e/ou agentes que não se ligam diretamente a CD8, mas que não se ligam a ativação de células imunes. Terapias de combinação adicionais e coformulações envolvendo os anticorpos anti-CD8 da presente invenção são divulgadas em outro lugar neste documento.
[0026] Em um quarto aspecto, são fornecidos métodos para modular a resposta imune em um sujeito, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD8 ou fragmento de ligação a antígeno dele ao sujeito em necessidade. Em certas modalidades, os métodos diminuem a resposta imune em um indivíduo, por exemplo, diminuem a produção de IFNγ em células T CD8 positivas ativadas e/ou inibem a proteína ativadora do fator de transcrição (AP-1) em células T
9 / 120 ativadas. Os métodos compreendem administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento seu que se liga a CD8. Em uma modalidade, é fornecido neste documento um método para mitigar a ativação de células T em um sujeito compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD8 ou fragmento de ligação a antígeno dele ao sujeito em necessidade. Em certas modalidades, o sujeito em necessidade disto pode sofrer de uma doença ou distúrbio, tal como infecção ou uma doença autoimune.
[0027] Em um quinto aspecto, são fornecidos neste documento métodos terapêuticos para tratar uma doença ou distúrbio, tal como uma infecção ou uma doença autoimune em um sujeito usando um anticorpo anti- CD8 ou porção de ligação a antígeno de um anticorpo fornecido neste documento, em que os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de um anticorpo fornecido neste documento ao sujeito em necessidade. O distúrbio tratado é qualquer doença ou condição que seja melhorada, minorada, inibida ou impedida pela inibição da atividade ou sinalização de células T CD8 positivas. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno dele é administrado em combinação com um segundo agente terapêutico ao sujeito em necessidade disso. O segundo agente terapêutico pode ser selecionado do grupo consistindo em um anticorpo para outro co-inibidor de célula T, um anticorpo para um antígeno de célula tumoral, um anticorpo para um receptor de células T, um anticorpo para um epítopo em uma célula infectada por vírus, um agente citotóxico, uma droga anticâncer, uma droga antiviral, uma droga anti-inflamatória (por exemplo, corticosteroides), agente quimioterápico, radioterapia, um imunossupressor e qualquer outra droga ou terapia conhecida na técnica. Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico pode ser um agente que ajuda a neutralizar ou reduzir qualquer
10 / 120 efeito adverso possível associado a um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno aqui apresentado, se tal(is) efeito(s) colateral(is) ocorrer(em).
[0028] O anticorpo ou fragmento seu pode ser administrado por via subcutânea, intravenosa, intradérmica, intraperitonealmente, oralmente, por via intramuscular ou intracraniana. O anticorpo ou fragmento seu pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg do peso corporal do sujeito.
[0029] É também fornecido neste documento o uso de um anticorpo anti-CD8 ou fragmento de ligação a antígeno dele na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio que se beneficiaria do bloqueio da ligação e/ou sinalização de CD8, ou a partir da mitigação de ativação de células T CD8 positivas.
[0030] Em outro aspecto, são fornecidos neste documento conjugados de anticorpo anti-CD8 radiomarcados para uso em geração de imagens de imuno-PET. O conjugado compreende um anticorpo anti-CD8 ou seu fragmento de ligação a antígeno, uma fração quelante e um emissor de pósitron.
[0031] São fornecidos neste documento processos para sintetizar os referidos conjugados e intermediários sintéticos úteis para tal.
[0032] São fornecidos neste documento métodos de geração de imagens de um tecido que expressa CD8, os métodos compreendendo administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado descrito neste documento ao tecido; e visualização da expressão de CD8 por geração de imagem de tomografia por emissão de pósitron (PET).
[0033] São fornecidos neste documento métodos de geração de imagens de um tecido compreendendo células que expressam CD8, por exemplo, linfócitos intratumorais que expressam CD8, ou células T CD8 positivas, os métodos compreendendo administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado descrito neste documento ao tecido e visualizando a
11 / 120 expressão de CD8 por geração de imagens por PET.
[0034] São fornecidos neste documento métodos para detectar CD8 em um tecido, os métodos compreendendo administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado descrito neste documento ao tecido; e visualizar a expressão de CD8 por geração de imagem por PET. Em uma modalidade, o tecido está presente em um sujeito humano. Em certas modalidades, o sujeito é um mamífero não humano. Em certas modalidades, o sujeito tem uma doença ou distúrbio, tal como câncer, uma doença inflamatória ou uma infecção.
[0035] São fornecidos neste documento métodos para detectar CD8 em um tecido, os métodos compreendendo colocar o tecido em contato com um anticorpo anti-CD8 conjugado a uma molécula fluorescente descrita neste documento; e visualização da expressão de CD8 por geração de imagem de fluorescência.
[0036] São fornecidos neste documento métodos para identificar um sujeito que seja adequado para terapia antitumoral, os métodos compreendendo selecionar um sujeito com um tumor sólido, administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado descrito neste documento e visualizar o conjugado de anticorpo radiomarcado administrado no tumor por geração de imagens por PET em que a presença do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor identifica o sujeito como adequado para terapia antitumoral.
[0037] São fornecidos neste documento métodos de tratamento de um tumor, os métodos compreendendo selecionar um sujeito com um tumor sólido; determinar que o tumor sólido é CD8 positivo; e administrar uma terapia antitumoral ao sujeito em necessidade disso. Em certas modalidades, a terapia antitumoral compreende um inibidor do eixo de sinalização PD-1/PD- L1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1), um exemplo de uma terapia de inibidor de checkpoint. Em determinadas
12 / 120 modalidades, ao sujeito é administrado um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado descrito neste documento, e a localização do conjugado de anticorpo radiomarcado é fotografada através de geração de imagens de tomografia por emissão de pósitron (PET) para determinar se o tumor é positivo para CD8. Em determinadas modalidades, ao sujeito é administrado ainda um conjugado de anticorpo anti-PD-1 radiomarcado e a localização do conjugado de anticorpo radiomarcado é fotografada através de geração de imagens de tomografia por emissão de pósitron (PET) para determinar se o tumor é positivo para PD-1.
[0038] São fornecidos neste documento métodos para monitorar a eficácia de uma terapia antitumoral em um sujeito, em que os métodos compreendem selecionar um sujeito com um tumor sólido, o indivíduo está sendo tratado com uma terapia antitumoral; administrar um conjugado anti- CD8 radiomarcado descrito neste documento ao sujeito; gerar imagens da localização do conjugado radiomarcado administrado no tumor por geração de imagens por PET; e determinar o crescimento do tumor, em que uma diminuição da base de referência na absorção do conjugado ou sinal radiomarcado indica eficácia da terapia antitumoral. Em certas modalidades, a terapia antitumoral é selecionada a partir de um inibidor de PD-1 (por exemplo, REGN2810, BGB-A317, nivolumabe, pidilizumabe, e pembrolizumabe), um inibidor de PD-L1 (por exemplo, atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, MDX-1105, e REGN3504, abem como aqueles divulgados na Publicação de Patente Nº US 2015-0203580), inibidor de CTLA-4 (por exemplo, ipilimumabe), um inibidor de TIM3, um inibidor de BTLA, um inibidor de TIGIT, um inibidor de CD47, um inibidor de GITR, um antagonista de outro co-inibidor ou ligante de células T (por exemplo, um anticorpo para LAG3, CD-28, 2B4, LY108, LAIR1, ICOS, CD160 ou VISTA), um inibidor de indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), um antagonista do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) [por exemplo, um
13 / 120 "VEGF-Trap", tal como aflibercept ou outra proteína de fusão que inibe VEGF, conforme estabelecido em US 7,087,411, ou um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de ligação a antígeno dele (por exemplo, bevacizumabe ou ranibizumabe) ou um inibidor de quinase molecular pequena de receptor de VEGF (por exemplo, sunitinibe, sorafenibe, ou pazopanibe)], um inibidor de Ang2 (por exemplo, nesvacumabe), um inibidor do fator de crescimento de transformação beta (TGFβ), um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, erlotinibe, cetuximabe), um inibidor de CD20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20, tal como rituximabe), um anticorpo para um antígeno tumor-específico [por exemplo, CA9, CA125, antígeno associado ao melanoma 3 (MAGE3), antígeno carcinoembrionário (CEA), vimentina, tumor-M2-PK, antígeno específico da próstata (PSA), mucina-1, MART-1 e CA19-9], uma vacina (por exemplo, Bacillus Calmette- Guerin, uma vacina contra o câncer), um adjuvante para aumentar a apresentação do antígeno (por exemplo, fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos), um anticorpo biespecífico (por exemplo, anticorpo biespecífico CD3xCD20, ou anticorpo biespecífico PSMAxCD3), uma citotoxina, um agente quimioterapêutico (por exemplo, dacarbazina, temozolomida, ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, cisplatina, carboplatina, gencitabina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatina, paclitaxel e vincristina), ciclofosfamida, radioterapia, um inibidor de IL-6R (por exemplo, sarilumabe), um inibidor de IL-4R (por exemplo, dupilumabe), um inibidor de IL-10, uma citocina como IL-2, IL-7, IL-21 e IL-15 e um conjugado de anticorpo-droga (ADC) (por exemplo, anti-CD19-DM4 ADC, e anti-DS6-DM4 ADC).
[0039] São fornecidos neste documento métodos para prever a resposta de um sujeito a uma terapia antitumoral, os métodos compreendendo selecionar um sujeito com um tumor sólido; e determinar se o tumor é CD8 positivo, em que se o tumor for CD8 positivo, ele prevê uma resposta positiva
14 / 120 do sujeito a uma terapia antitumoral.
Em certas modalidades, o tumor é determinado positivo pela administração de um conjugado de anticorpo anti- CD8 radiomarcado da presente divulgação e localização do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor por geração de imagens por PET em que a presença do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor indica que o tumor é positivo para CD8. Em certas modalidades, a terapia antitumoral é selecionada a partir de um inibidor de PD-1 (por exemplo, REGN2810,BGB- A317,nivolumabe,pidilizumabe,e pembrolizumabe)um inibidor de PD-L1 (por exemplo, atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, MDX-1105,e REGN3504), inibidor de CTLA-4 (por exemplo, ipilimumabe), um inibidor de TIM3, um inibidor de BTLA, um inibidor de TIGIT, um inibidor de CD47, um inibidor de GITR, um inibidor de LAG3, um antagonista de outro co- inibidor ou ligante de células T (por exemplo, um anticorpo a CD-28, 2B4, LY108, LAIR1, ICOS, CD160 ou VISTA), um inibidor de indoleamina-2,3- dioxigenase (IDO), um antagonista do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) [por exemplo, um “VEGF-Trap” tal como aflibercept ou outra proteína de fusão que inibe VEGF, conforme estabelecido em US 7,087,411, ou um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de ligação a antígeno dele (por exemplo, bevacizumabe, ou ranibizumabe) ou um inibidor de quinase de molécula pequena de um receptor de VEGF receptor (por exemplo, sunitinibe, sorafenibe, ou pazopanibe)], um inibidor de Ang2 (por exemplo, nesvacumabe), um inibidor de fator beta de crescimento transformador (TGFβ), um inibidor de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, erlotinibe, cetuximabe), um inibidor de CD20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20, tal como rituximabe), um anticorpo para um antígeno tumor-específico [por exemplo, CA9, CA125, antígeno associado ao melanoma 3 (MAGE3), antígeno carcinoembrionário (CEA), vimentina, tumor-M2-PK, antígeno específico da próstata (PSA), mucina-1, MART-1 e CA19-9], uma vacina (por exemplo, Bacillus Calmette-Guerin, uma vacina
15 / 120 contra o câncer), um adjuvante para aumentar a apresentação do antígeno (por exemplo, fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos), um anticorpo biespecífico (por exemplo, anticorpo biespecífico CD3xCD20, ou anticorpo biespecífico PSMaxCD3), uma citotoxina, um agente quimioterapêutico (por exemplo, dacarbazina, temozolomida, ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, cisplatina, carboplatina, gencitabina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatina, paclitaxel e vincristina), ciclofosfamida, radioterapia, um inibidor de IL-6R (por exemplo, sarilumabe), um inibidor de IL-4R (por exemplo, dupilumabe), um inibidor de IL-10, uma citocina como IL-2, IL-7, IL-21 e IL-15 e um conjugado de anticorpo-droga (ADC) (por exemplo, anti-CD19-DM4 ADC, e anti-DS6-DM4 ADC).
[0040] São fornecidos neste documento métodos para prever uma resposta positiva a uma terapia antitumoral em um sujeito com um tumor sólido. Os métodos compreendem a administração de um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado ao sujeito para determinar a presença de células CD8 positivas no tumor sólido; em que a presença de células CD8 positivas prevê uma resposta positiva a uma terapia antitumoral.
[0041] São fornecidos neste documento métodos para monitorar uma resposta positiva a uma terapia antitumoral em um sujeito com um tumor sólido. Os métodos compreendem (a) administrar uma ou mais doses de uma terapia antitumoral ao sujeito; e (b) administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado ao sujeito 1 a 20 semanas após a administração da terapia antitumoral para determinar a presença de células CD8 positivas no tumor sólido. A presença de células CD8 positivas indica uma resposta positiva à terapia antitumoral.
[0042] São fornecidos neste documento métodos para prever ou monitorar o sucesso ou eficácia da terapia antitumoral em um sujeito com um tumor sólido, o método compreendendo: (a) determinar o nível de células CD8 positivas no tumor; e (b) correlacionar o nível de células CD8 positivas
16 / 120 com terapia antitumoral bem sucedida. Um nível elevado de CD8 acima de um certo limiar é preditivo ou indicativo de terapia antitumoral bem sucedida.
[0043] São fornecidos neste documento métodos para o monitoramento da presença de células T ou infiltração de células T em um tumor ao longo do tempo, o método compreendendo: (a) administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado em um primeiro ponto de tempo a um sujeito tendo o tumor e determinar a presença de células T CD8 positivas no tumor; (b) administrar uma ou mais doses de uma terapia antitumoral ao sujeito; e (c) administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado no segundo ponto de tempo para o sujeito de 1 a 20 semanas após a administração da terapia antitumoral e determinar a presença de células T CD8 positivas no tumor. A presença de células T no tumor é indicativa de uma resposta positiva à terapia antitumoral.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0044] A Figura 1 representa a ligação mAb1 a células T CD8+ humanas e de macaco cynomolgus.
[0045] A Figura 2 mostra a modulação da atividade de células T CD8 humanas através da inibição da produção de IFNγ por mAb1.
[0046] A Figura 3 mostra dados de um ensaio de células T CD8/luciferase APC demonstrando inibição de mAb1 da atividade de transcrição de CD8.
[0047] A Figura 4 mostra o espectro UV/VIS do conjugado DFO- mAb1.
[0048] A Figura 5 mostra HPLC-SEC de uma injeção de 25 ug de conjugado de DFO-mAb1 na coluna Superdex 200 Increase com detecção de absorbância UV de 280 nm. Espécies monoméricas (97,5%) e de alto peso molecular (HMW) (2,5%) são indicadas.
[0049] A Figura 6 mostra eletroferogramas de conjugado de DFO- mAb1. Figura 6A) representa conjugado não reduzido e Figura B) representa
17 / 120 conjugado reduzido.
[0050] A Figura 7 mostra o cromatograma SEC-HPLC do radioimunoconjugado mAb1-L2-111016 na coluna Superdex 200 Increase com detecção de emissão gama. 89Zr não marcado compõe menos de 0,1% da atividade integrada total.
[0051] A Figura 8 mostra o cromatograma SEC-HPLC do radioimunoconjugado mAb1-L2-111516 na coluna Superdex 200 Increase com detecção de emissão gama. 89Zr não marcado compõe menos de 0,1% da atividade integrada total.
[0052] A Figura 9 mostra o cromatograma SEC-HPLC do radioimunoconjugado mAb1-L2-111016 na coluna Superdex 200 Increase com detecção de absorbância UV de 280 nm. Espécies monoméricas (98,5%) e de alto peso molecular (HMW) (1,5%) são indicadas.
[0053] A Figura 10 mostra o cromatograma SEC-HPLC do radioimunoconjugado mAb1-L2-111516 na coluna Superdex 200 Increase com detecção de absorbância UV de 280 nm. Espécies monoméricas (98,6%) e de alto peso molecular (HMW) (1,4%) são indicadas.
[0054] A Figura 11 fornece imagens por PET representativas de 89Zr- DFO-mAb1 injetado em doses de proteína de 0,5 ou 1,5 mg/kg em camundongos que expressam hCD8. Absorção específica de 89Zr-DFO-mAb1 é detectada no baço e nos linfonodos de camundongos que expressam hCD8 em ambas as doses administradas. Uma redução de absorção é detectada no baço e nos linfonodos com a dose de proteína mais alta de 1,5 mg/kg, indicando a especificidade direcionada aos órgãos linfoides. Abreviações: Cerv LNs – linfonodos cervicais; Axil LNs – linfonodos axilares; Brach LNs – linfonodos braquiais; Mes LNs – linfonodos mesentéricos; Ing LNs – linfonodos inguinais. 89
[0055] Figura 12 mostra imagens por PET representativas de Zr- DFO1-mAb1 injetado em uma dose de proteína de 0,1 mg/kg em
18 / 120 camundongos portadores do tumor Raji e Raji/hPBMC. A assimilação específica de 89Zr-DFO-mAb1 é detectada no baço e no tumor de camundongos portadores do tumor Raji/hPBMC.
[0056] A Figura 13 compara o tratamento de anticorpos de camundongos infectados com LCMV e demonstra que camundongos tratados com mAb1 retiveram a capacidade de limpar LCMV em relação a camundongos tratados com um anticorpo de bloqueio CD8 forte.
DESCRIÇÃO DETALHADA I. Definições
[0057] Salvo definido em contrário neste documento, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual este assunto divulgado pertence.
[0058] O termo "CD8" (Cluster de Diferenciação 8) refere-se a uma glicoproteína de superfície celular predominantemente expressa em linfócitos T citotóxicos, mas também expressa em subconjuntos de células dendríticas, células natural killer, células T natural killer e células ɣδT. A glicoproteína consiste em duas isoformas, α e β, que são codificadas por genes diferentes e expressadas como homodímeros αα ou heterodímeros αβ, sendo os últimos dominantes. Os correceptores CD8 estabilizam a interação do MHC-1 com o receptor de células T e iniciam a sinalização intracelular através da fosforilação de proteína tirosina quinase (Lck) específica de linfócitos de motivos de ativação baseados em tirosina de imunorreceptor (ITAMs) associados a CD3 para ativação.
[0059] A sequência de aminoácidos de CD8α de comprimento total é fornecida em UniProt como número de acesso P01732 e também é referida neste documento como SEQ ID NO: 18. A sequência de aminoácidos de CD8β de comprimento total é fornecida em UniProt como número de acesso 10966 e também é referida neste documento como SEQ ID NO: 20. O termo
19 / 120 "CD8" inclui CD8α ou CD8β completos, CD8 recombinante, fragmentos destes e fusões destes. O termo também engloba CD8α ou CD8β, ou um fragmento seu, acoplado a, por exemplo, marcador de histidina, Fc humano ou humano, ou uma sequência de sinal tal como a sequência de sinal de ROR1. Por exemplo, o termo inclui sequências exemplificadas por SEQ ID NO: 18 ou 20, compreendendo um Fc de camundongo (mIgG2a) no C- terminal, acoplado a um fragmento de CD8α ou CD8β. Outras variantes de proteínas compreendem um tag de histidina no C-terminal acoplado a CD8 ou um fragmento seu. Salvo se especificado como sendo de uma espécie não humana, o termo "CD8" significa CD8 humana.
[0060] CD8 é um membro da superfamília de imunoglobulina (Ig) com um domínio extracelular variável de imunoglobulina (IgV) conectado à membrana por um caule grosso e uma cauda intracelular.
[0061] Como usado neste documento, o termo "co-inibidor de células T" refere-se a um ligante e/ou receptor que modula a resposta imune através de ativação ou supressão de células T. O termo "co-inibidor de célula T", também conhecido como molécula de cossinalização de célula T, inclui, mas não está limitado a, proteína do gene 3 de ativação linfocitária (LAG-3, também conhecido como CD223), morte programada-1 (PD-1), antígeno-4 de linfócitos T citotóxico (CTLA-4), atenuador de linfócitos B e T (BTLA), CD- 28, 2B4, LY108, imunoglobulina de células T e mucina-3 (TIM3), imunorreceptor de células T com domínios de imunoglobulina e ITIM (TIGIT; também conhecido como VSIG9), receptor 1 semelhante a imunoglobulina associado a leucócitos (LAIR1; também conhecido como CD305), co-estimulador induzível de células T (ICOS ; também conhecido como CD278), B7-1 (CD80) e CD160.
[0062] O termo "anticorpo", como aqui utilizado, destina-se a se referir a moléculas de imunoglobulina compostas por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L)
20 / 120 interconectadas por ligações dissulfeto (isto é, "moléculas de anticorpo completo"), bem como seus multímeros (por exemplo, IgM) ou seus fragmentos de ligação ao antígeno. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada ("HCVR" ou "VH") e uma região constante de cadeia pesada (composta por domínios CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (“LCVR ou “VL”) e uma região constante de cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementariedade (CDR), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em certas modalidades, as FRs do anticorpo (ou seu fragmento de ligação a antígeno) podem ser idênticas às sequências de linhagem germinativa humana, ou podem ser natural ou artificialmente modificadas. Uma sequência consenso de aminoácidos pode ser definida com base em uma análise lado-a-lado de duas ou mais CDRs.
[0063] A substituição de um ou mais resíduos de CDR ou omissão de uma ou mais CDRs também é possível. Anticorpos foram descritos na literatura científica em que uma ou duas CDRs podem ser dispensados com para ligação. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) analisaram as regiões de contato entre anticorpos e seus antígenos, com base em estruturas cristalinas publicadas e concluíram que apenas cerca de um quinto a um terço dos resíduos de CDR realmente entram em contato com o antígeno. Padlan também encontrou muitos anticorpos nos quais uma ou dois CDRs não tinham aminoácidos em contato com um antígeno (ver também, Vajdos e col. 2002 J Mol Biol 320:415-428).
[0064] Resíduos de CDR que não entram em contato com o antígeno podem ser identificados com base em estudos anteriores (por exemplo,
21 / 120 resíduos H60-H65 em CDRH2 são muitas vezes não necessários), de regiões de CDRs de Kabat situadas fora de CDRs de Chothia, por modelagem molecular e/ou empiricamente. Se uma CDR ou resíduo(s) dela for(em) omitido(s), geralmente é substituída por um aminoácido ocupado pela posição correspondente em outra sequência de anticorpo humano ou um consenso de tais sequências. As posições para substituição dentro de CDRs e aminoácidos para substituir também podem ser selecionadas empiricamente. Substituições empíricas podem ser substituições conservadoras ou não conservadoras.
[0065] Os anticorpos monoclonais anti-CD8 totalmente humanos divulgados neste documento podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos na estrutura e/ou regiões CDR dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve em comparação com as sequências de linhagem germinativa correspondentes. Tais mutações podem ser facilmente atribuídas comparando as sequências de aminoácidos divulgadas neste documento a sequências de linhagem germinativa disponíveis a partir de, por exemplo, bancos de dados de sequência de anticorpos públicos. A presente divulgação inclui anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno deles, que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos divulgadas neste documento, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais estruturas e/ou regiões CDR são mutadas para o(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência de linha germinativa da qual o anticorpo foi derivado, ou para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência de linha germinativa humana ou para uma substituição conservadora de aminoácidos do(s) resíduo(s) de linhagem germinativa correspondente ( tais mudanças na sequência são aqui referidas coletivamente como "mutações na linhagem germinativa"). Uma pessoa versada na técnica, começando com as sequências de região variável de cadeia pesada e leve divulgadas neste documento, pode facilmente produzir inúmeros anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que compreendem uma ou mais mutações de linhagem
22 / 120 germinativa individuais ou combinações delas. Em certas modalidades, todo o framework e/ou resíduos de CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são mutados de volta aos resíduos encontrados na sequência de linhagem germinativa original a partir da qual o anticorpo foi derivado. Em outras modalidades, apenas determinados resíduos são mutados de volta à sequência original da linhagem germinativa, por exemplo, apenas os resíduos mutantes encontrados dentro dos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou apenas os resíduos mutantes encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais dentre o framework e/ou resíduo(s) de CDR são mutantes aos resíduos correspondentes de uma sequência de linhagem germinativa diferente (isto é, uma sequência de linhagem germinativa que é diferente da sequência de linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Além disso, os anticorpos da presente divulgação podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações de linhagem germinativa dentro da estrutura e/ou regiões CDR, por exemplo, em que certos resíduos individuais são mutados ao resíduo correspondente de uma sequência germinativa específica enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência de linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados no resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que contêm uma ou mais mutações de linhagem germinativa podem ser facilmente testados para uma ou mais propriedades desejadas, tais como especificidade de ligação melhorada, maior afinidade de ligação, propriedades biológicas antagonistas ou agonistas melhoradas ou aprimoradas (conforme o caso), imunogenicidade reduzida etc. Anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno obtidos desta forma geral são englobados dentro da presente divulgação.
[0066] A presente divulgação também inclui anticorpos monoclonais anti-CD8 totalmente humanos que compreendem variantes de qualquer uma
23 / 120 das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento tendo uma ou mais substituições conservadoras. Por exemplo, a presente divulgação inclui anticorpos anti-CD8 com HCVR, LCVR e/ou sequências de aminoácidos de CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições de aminoácidos conservadoras em relação a qualquer das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR e/ou CDR divulgadas neste documento.
[0067] O termo "anticorpo humano", como usado neste documento, destina-se a incluir anticorpos humanos de ocorrência não natural. O termo inclui anticorpos que são produzidos de forma recombinante em um mamífero não humano, ou em células de um mamífero não humano. O termo não se destina a incluir anticorpos isolados de ou gerados em um sujeito humano.
[0068] O termo "se liga especificamente", ou "se liga especificamente a", ou similares, significa que um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno dele forma um complexo com um antígeno que é relativamente estável sob condições fisiológicas. A ligação específica pode ser caracterizada por uma constante de dissociação de equilíbrio de pelo menos cerca de 5x10-8 M ou menos (por exemplo, um KD menor denota uma ligação mais firme). Métodos para determinar se duas moléculas se ligam especificamente entre si são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância plasmônica de superfície, e similares. Conforme descrito neste documento, os anticorpos foram identificados por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, BIACORE™, que se liga especificamente a CD8.
[0069] Os termos "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo, e similares, conforme usado neste documento, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintética ou geneticamente manipulada que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Os termos "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo, ou
24 / 120 "fragmento de anticorpo", como usado neste documento, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar a CD8.
[0070] Um "anticorpo isolado", como usado neste documento, destina-se a se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos (Abs) com diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a CD8, ou um fragmento seu, é substancialmente livre de Abs que se ligam especificamente a antígenos que não CD8.
[0071] O termo "ressonância plasmônica de superfície", conforme usado neste documento, refere-se a um fenômeno óptico que permite a análise de interações biomoleculares em tempo real pela detecção de alterações em concentrações de proteína dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo, usando o sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia, e Piscataway, NJ).
[0072] O termo "KD", conforme usado neste documento, significa a constante de dissociação de equilíbrio de uma interação específica de antígeno-anticorpo.
[0073] O termo "epítopo" refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação a antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como um parátopo. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo. Assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas em um antígeno e podem ter efeitos biológicos diferentes. O termo "epítopo" também se refere a um sítio em um antígeno ao qual as células B e/ou T respondem. Refere-se também a uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Os epítopos podem ser definidos como estrutural ou funcional. Epítopos funcionais geralmente são um subconjunto dos epítopos estruturais e têm aqueles resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da interação entre o polipeptídeo de ligação ao antígeno e o antígeno. Epítopos podem também ser conformacionais, isto é, composto de
25 / 120 aminoácidos não lineares. Em determinadas modalidades, os epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de superfície quimicamente ativos das moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforil ou grupos sulfonil e, em determinadas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características específicas da carga.
[0074] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", ao se referir a um ácido nucleico ou fragmento seu, indica que, quando alinhado de forma ideal com inserções nucleotídicas ou deleções apropriadas com outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), há identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos cerca de 90% e mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeos, como medido por algoritmos famosos de identidade de sequência, como FASTA, BLAST ou GAP.
[0075] Como aplicado a polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou "substancialmente similar" significa que duas sequências de peptídeo, quando idealmente alinhadas, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna padrão, compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferencialmente, posições de resíduo, que não são idênticas, diferem por substituições conservadoras de aminoácidos. Uma "substituição conservadora de aminoácidos" é aquela em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservadora não vai mudar substancialmente as propriedades funcionais de interesse de uma proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservadoras, o percentual ou grau de similaridade pode ser ajustado para
26 / 120 cima para corrigir a natureza conservadora da substituição.
Os meios para fazer esse ajuste são bem conhecidos pelos versados na técnica.
Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol.
Biol. 24: 307-331, que é incorporado neste documento por referência.
Exemplos de grupos de aminoácidos com cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem: 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais alifáticas de hidroxila: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais acídicas: ácido aspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina.
Grupos de substituição de aminoácidos conservadores preferenciais são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.
Alternativamente, uma substituição conservadora é qualquer mudança tendo um valor positivo na matriz de probabilidade de log PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45, incorporado neste documento por referência.
Uma substituição "moderadamente conservadora" é qualquer alteração que tenha um valor não negativo na matriz de probabilidade de log PAM250. A similaridade de sequência para polipeptídeos é tipicamente medida usando software de análise de sequência.
O software de análise de proteína combina sequências semelhantes usando medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições conservadoras de aminoácidos.
Por exemplo, o software GCG contém programas como GAP e BESTFIT que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de espécies diferentes de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína respectiva.
Ver, por exemplo, GCG Versão 6.1. Sequências de
27 / 120 polipeptídeos também podem ser comparadas usando FASTA com parâmetros padrão ou recomendados; um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade de sequência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de pesquisa e busca (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferencial ao se comparar uma sequência da divulgação a um banco de dados contendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros padrão. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência.
[0076] A frase "quantidade terapeuticamente eficaz" inclui um montante que produz o efeito desejado para o qual é administrado. A quantidade exata dependerá da finalidade do tratamento e será determinável por um versado na técnica usando técnicas conhecidas (ver, por exemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
[0077] Como usado neste documento, o termo "sujeito" refere-se a um animal, preferencialmente um mamífero, que precisa de melhora, prevenção e/ou tratamento de uma doença ou distúrbio, tal como infecção crônica, câncer ou doença autoimune. II. Descrição Geral
[0078] CD8 é expressa em células T citotóxicas, que são geradas no timo e expressam o receptor de células T. CD8 é expressa como um co- receptor dimérico, tipicamente compreendendo uma proteína CD8α e uma proteína CD8β. Células T CD8+ reconhecem peptídeos apresentados por MHC I, e o heterodímero CD8 se liga a MHC I α3 durante a apresentação do antígeno. Células T CD8+ ativadas estão envolvidas na eliminação de células infectadas ou malignas e também estão implicadas em doença autoimune.
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[0079] Anticorpos anti-CD8 totalmente humanos descritos neste documento demonstram ligação específica a CD8α e/ou CD8β. Tais anticorpos podem ser usados para tratar infecção crônica, câncer ou doença autoimune.
[0080] Em certas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento são obtidos de camundongos imunizados com um imunógeno primário, tal como proteína CD8α humana e/ou proteína CD8β humana, que pode ser comercialmente comprado, ou pode ser produzido de forma recombinante. As sequências de aminoácidos de comprimento total de CD8α humano e CD8β humano são mostradas como SEQ ID NOs: 18 e 20, respectivamente. Em certas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento são obtidos de camundongos imunizados com um imunógeno primário, tal como DNA de CD8α humano e/ou DNA de CD8β humano. A sequência de ácido nucleico de comprimento total para CD8α humano pode ser encontrada na SEQ ID NO: 17. A sequência de ácido nucleico de CD8β humano de comprimento total pode ser encontrada na SEQ ID NO: 19.
[0081] O imunógeno pode ser um fragmento biologicamente ativo e/ou imunogênico de CD8 produzido de forma recombinante, uma proteína de fusão, DNA que codifica o fragmento ativo respectivo, ou DNA que codifica toda a proteína CD8α ou proteína CD8β. O fragmento pode ser derivado do N-terminal ou C-terminal de CD8α humano e CD8α humano, ou de qualquer sítio dentro das sequências de aminoácidos de CD8α e de CD8β humanas. Preparação de Anticorpos Humanos
[0082] Métodos para gerar anticorpos humanos em camundongos transgênicos são conhecidos na técnica. Qualquer método conhecido pode ser usado no contexto da presente divulgação para produzir anticorpos humanos que se ligam especificamente a CD8.
[0083] Usando a tecnologia VELOCIMMUNE™ (ver, por exemplo, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) ou qualquer
29 / 120 outro método conhecido para gerar anticorpos monoclonais, os anticorpos quimérico de alta afinidade para CD8 são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. A tecnologia VELOCIMMUNE® envolve a geração de um camundongo transgênico com um genoma compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve humanas operacionalmente ligadas a loci de região constante de camundongo endógenos de modo que o camundongo produz um anticorpo que compreende uma região variável humana e uma região constante de camundongo em resposta à estimulação antigênica. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo é isolado e operacionalmente ligado ao DNA que codifica as regiões constantes de cadeia pesada e leve humanas. O DNA é então expresso em uma célula capaz de expressar o anticorpo totalmente humano.
[0084] Geralmente, um camundongo VELOCIMMUNE® é desafiado com o antígeno de interesse e células linfáticas (tais como células B) são recuperadas dos camundongos que expressam anticorpos. As células linfáticas podem ser fundidas com uma linhagem celular de mieloma para preparar linhagens celulares de hibridoma imortal e essas linhagens celulares de hibridoma são triadas e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos ao antígeno de interesse. O DNA que codifica as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve pode ser isolado e ligado a regiões constantes isotípicas desejáveis de cadeia pesada e cadeia leve. Tal proteína do anticorpo pode ser produzida em uma célula, tal como célula CHO. Alternativamente, o DNA que codifica os anticorpos quiméricos específicos ao antígeno ou os domínios variáveis de cadeias leve e pesada pode ser isolado diretamente dos linfócitos específicos ao antígeno.
[0085] Inicialmente, anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como na seção experimental abaixo, os anticorpos são
30 / 120 caracterizados e selecionados por características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas por uma região constante humana desejada para gerar o anticorpo totalmente humano fornecido neste documento, por exemplo, IgG1 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificada. Enquanto a região constante selecionada pode variar de acordo com o uso específico, as características de afinidade alta de ligação ao antígeno e especificidade alvo residem na região variável.
[0086] Em geral, os anticorpos fornecidos aqui possuem afinidades muito altas, tipicamente possuindo KD de cerca de 10-12 até cerca de 10-8 M, quando medido pela ligação ao antígeno seja imobilizado na fase sólida ou na fase de solução. As regiões constantes de camundongo são substituídas por regiões constantes humanas desejadas para gerar anticorpos totalmente humanos. Enquanto a região constante selecionada pode variar de acordo com o uso específico, as características de afinidade alta de ligação ao antígeno e especificidade alvo residem na região variável. Bioequivalentes
[0087] Os anticorpos anti-CD8 e fragmentos de anticorpos fornecidos neste documento abrangem proteínas com sequências de aminoácidos que variam de aqueles dos anticorpos descritos, mas que retêm a capacidade de ligar CD8. Tais anticorpos variantes e fragmentos de anticorpos compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparados com a sequência principal, mas exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente à dos anticorpos descritos. Da mesma forma, as sequências de DNA codificadoras de anticorpo fornecidas neste documento englobam sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de nucleotídeos quando comparado com a sequência divulgada, mas que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo ou fragmento de anticorpo divulgado neste documento.
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[0088] Duas proteínas de ligação a antígeno, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, são equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e extensão de absorção não mostram uma diferença significativa quando administradas na mesma dose molar sob condições experimentais similares, ou doses únicas ou doses múltiplas. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se forem equivalentes na extensão de sua absorção, mas não em sua taxa de absorção e, ainda assim, podem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidas na marcação, não são essenciais para o alcance de concentrações eficazes da droga corporal em, por exemplo, uso crônico e são considerados clinicamente insignificantes para o produto medicamentoso em particular estudado.
[0089] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se não houver diferenças clinicamente significativas na sua segurança, pureza e potência.
[0090] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se um sujeito puder ser trocado uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado no risco de efeitos adversos, incluindo uma mudança clinicamente significativa na imunogenicidade, ou eficácia diminuída, em comparação com a terapia contínua sem tal troca.
[0091] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se ambas atuarem por um mecanismo comum ou mecanismos de ação para a condição ou condições de uso, na medida em que tais mecanismos são conhecidos.
[0092] Bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e/ou in vitro. As medidas de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos, em que a concentração do anticorpo ou seus metabólitos é medida no sangue, plasma, soro ou outro
32 / 120 fluido biológico em função do tempo; (b) um teste in vitro que foi correlacionado e é razoavelmente preditivo de dados de biodisponibilidade in vivo de humanos; (c) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos em que o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) é medido em função do tempo; e (d) em um ensaio clínico bem controlado que estabelece segurança, eficácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.
[0093] As variantes bioequivalentes dos anticorpos fornecidos neste documento podem ser construídas através de, por exemplo, fazerem-se várias substituições de resíduos ou sequências ou excluírem-se resíduos ou sequências terminais ou internas não necessárias para a atividade biológica. Por exemplo, resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser deletados ou substituídos por outros aminoácidos para evitar a formação de pontes de dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas após a renaturação. Em outros contextos, anticorpos bioequivalentes podem incluir variantes de anticorpo que compreendem mudanças de aminoácidos, que modificam as características de glicosilação dos anticorpos, por exemplo, mutações que eliminam ou removem a glicosilação. Administração Terapêutica e Formulações
[0094] São fornecidas neste documento composições terapêuticas que compreendem os anticorpos anti-CD8 ou fragmentos de ligação a antígeno deles da presente divulgação. A administração de composições terapêuticas de acordo com a presente divulgação será administrada através de uma rota adequada, incluindo, mas não se limitando a, via intravenosa, por via subcutânea, por via intramuscular, intranasal, com carreadores, excipientes e outros agentes adequados que sejam incorporados nas formulações para fornecer transferência, distribuição, tolerância melhorada e similares. Uma infinidade de formulações apropriadas pode ser encontrada na formulação
33 / 120 conhecida por todos os químicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Essas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídios, vesículas contendo lipídeos (catiônicos ou aniônicos) (tais como LIPOFECTIN™), conjugados de DNA, pastas de absorção anidra, emulsões óleo-em-água e água-em-óleo, carbowax de emulsões (polietilenoglicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo carbowax. Ver também Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulation” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
[0095] A dose de anticorpo pode variar dependendo da idade e do tamanho de um indivíduo a ser administrado, doença alvo, condições, via de administração e similares.
[0096] Vários sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para administrar as composições farmacêuticas fornecidas neste documento, por exemplo, encapsulamento em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a rotas intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. A composição pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através dos revestimentos epitelial ou mucocutâneo (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.), e podem ser administradas juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.
[0097] A composição farmacêutica também pode ser distribuída em uma vesícula, em particular um lipossoma (ver, por exemplo, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533).
[0098] Em determinadas situações, a composição farmacêutica pode
34 / 120 ser entregue em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada. Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados. Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado na proximidade do alvo da composição, exigindo, assim, apenas uma fração da dose sistêmica.
[0099] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutânea e intramuscular, infusões por gotejamento, etc. Essas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, por meio de dissolução, suspensão ou emulsificação do anticorpo ou sal dele descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente usado para injeções. Como meio aquoso para injeções, há, por exemplo, soro fisiológico, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante adequado, tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propilenoglicol, polietilenoglicol), um surfactante não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (polioxietileno (50 mol) aduto de óleo de castor hidrogenado)] etc. Como o meio oleoso, há empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., que pode ser usado em combinação com um agente solubilizante, tal como benzoato de benzila, álcool benzílico etc. A injeção assim preparada é preferencialmente preenchida em uma ampola apropriada.
[00100] Uma composição farmacêutica da presente divulgação pode ser distribuída de forma subcutânea ou intravenosa com uma agulha e seringa padrão. Além disso, em relação à distribuição subcutânea, um dispositivo de distribuição de caneta tem, prontamente, aplicações na distribuição de uma composição farmacêutica da presente divulgação. Tal dispositivo de distribuição de caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de
35 / 120 distribuição de caneta reutilizável geralmente utiliza um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Uma vez que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho tenha sido administrada e o cartucho estiver vazio, o cartucho vazio poderá ser facilmente descartado e substituído por um novo cartucho que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de distribuição de caneta pode então ser reutilizado. Em um dispositivo de distribuição de caneta descartável, não há cartucho substituível. Em vez disso, o dispositivo de distribuição de caneta descartável vem pré-preenchido com a composição farmacêutica mantida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez que o reservatório é esvaziado da composição farmacêutica, o dispositivo inteiro é descartado.
[00101] Inúmeros dispositivos de distribuição de caneta e autoinjetor reutilizáveis têm aplicações na entrega subcutânea de uma composição farmacêutica da presente divulgação. Exemplos incluem, mas não estão limitados a AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), caneta DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 75/25™, caneta HUMALOG™, caneta HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), caneta BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, e OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemanha), para citar apenas alguns. Exemplos de dispositivos de distribuição de caneta descartáveis com aplicações na entrega subcutânea de uma composição farmacêutica da presente divulgação incluem, mas certamente não estão limitados a caneta SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) e KWIKPEN™ (Eli Lilly), o autoinjetor SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), a PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemanha), a EPIPEN (Dey, L.P.) e a Caneta HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, IL), para citar
36 / 120 apenas alguns.
[00102] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária adequada para se ajustar a uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagem em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios etc. III. Imunoconjugados Radiomarcados de Anticorpos CD8 para Geração de Imagem Imuno-PET
[00103] São fornecidas neste documento proteínas de ligação a antígeno radiomarcadas que ligam CD8. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação a antígeno radiomarcadas compreendem uma proteína de ligação a antígeno covalentemente ligada a um emissor de pósitron. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação a antígeno radiomarcadas compreendem uma proteína de ligação a antígeno covalentemente ligada a uma ou mais frações quelantes, que são frações químicas capazes de quelar um emissor de pósitron.
[00104] Proteínas de ligação a antígeno radiomarcadas adequadas, por exemplo, anticorpos radiomarcados, incluem aquelas que não comprometem, ou não comprometem substancialmente a função de células T após exposição à proteína de ligação a antígeno radiomarcada. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação a antígeno radiomarcada que se liga a CD8 é um bloqueador fraco da função de células T CD8, isto é, a função de células T é descomprometida, ou substancialmente não prejudicada, após exposição ao anticorpo radiomarcado. O uso de uma proteína de ligação anti-CD8 radiomarcada com impacto mínimo na função de células T mediada por CD8 de acordo com métodos fornecidos neste documento garante que um sujeito tratado com a molécula não esteja em desvantagem pela incapacidade de suas células T em limpar a infecção.
[00105] Em algumas modalidades, proteínas de ligação a antígeno que
37 / 120 ligam CD8, por exemplo, anticorpos, são fornecidos, em que as referidas proteínas de ligação a antígeno que ligam CD8 são covalentemente ligadas a uma ou mais frações tendo a seguinte estrutura: -L-MZ em que L é uma fração quelante; M é um emissor de pósitron; e z, independentemente em cada ocorrência, é 0 ou 1; e em que pelo menos um dentre z é 1.
[00106] Em algumas modalidades, a proteína de ligação a antígeno radiomarcada é um composto da Fórmula (I): M-L-A-[L-MZ]k (I)
[00107] A é uma proteína que se liga a CD8; L é uma fração quelante; M é um emissor de pósitron; z é 0 ou 1; e k é um número inteiro de 0-30. Em algumas modalidades, k é 1. Em algumas modalidades, k é 2.
[00108] Em determinadas modalidades, a proteína de ligação a antígeno radiomarcada é um composto da Fórmula (II): A-[L-M]k (II) em que A é uma proteína que se liga a CD8; L é uma fração quelante; M é um emissor de pósitron; e k é um número inteiro de 1-30.
[00109] Em algumas modalidades, são fornecidas neste documento composições compreendendo um conjugado com a seguinte estrutura: A-Lk em que A é uma proteína que se liga a CD8; L é uma fração quelante; e k é um número inteiro de 1-30; em que o conjugado é quelado com um emissor de pósitron em uma quantidade suficiente para fornecer uma atividade específica adequada para geração de imagens por PET clínicas.
[00110] Proteínas de ligação adequadas, frações quelantes e emissores de pósitron são fornecidos abaixo.
38 / 120 A. Proteínas de Ligação a CD8
[00111] Proteínas de ligação a CD8 adequadas se ligam especificamente a CD8 e incluem aquelas descritas em WO 2014/164553, incorporadas neste documento por referência em sua totalidade. Uma proteína de ligação anti-CD8 exemplar aqui apresentada é o anticorpo monoclonal referido neste documento como mAb1, que compreende as características de sequência de ácido nucleico e aminoácido conforme estabelecido na Tabela 1. Tabela 1: Identificadores de Sequência de Ácido Nucleico e Aminoácido SEQ ID NOs mAb1 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 Identificadores de Sequência de 1 3 5 7 9 11 13 15 Ácidos Nucleicos Identificadores de Sequência de 2 4 6 8 10 12 14 16 Aminoácidos
[00112] A Tabela 1 apresenta os identificadores de sequência de ácido nucleico e os identificadores de sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (HCVR), região variável da cadeia leve (LCVR), regiões determinantes da complementaridade da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e regiões determinantes de complementaridade da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) dos anticorpos anti-CD8 exemplares.
[00113] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma HCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98 % ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00114] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma LCVR compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, ou uma sequência substancialmente semelhante à mesma com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98 % ou pelo menos 99% de identidade de
39 / 120 sequência.
[00115] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendendo uma HCVR e um par de sequência de aminoácidos de LCVR (HCVR/LCVR) da SEQ ID NOs: 2/10, por exemplo, mAb1.
[00116] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 (HCDR1) da cadeia pesada da SEQ ID NO: 4, ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00117] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácidos de CDR2 (HCDR2) da cadeia pesada da SEQ ID NO: 6, ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00118] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácidos de CDR3 (HCDR3) da cadeia pesada da SEQ ID NO: 8, ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00119] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácidos de CDR1 (LCDR1) da cadeia leve da SEQ ID NO: 12, ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
40 / 120
[00120] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácidos de CDR2 (LCDR2) da cadeia leve da SEQ ID NO: 14, ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00121] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácidos de CDR3 (LCDR3) da cadeia leve da SEQ ID NO: 16, ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[00122] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendendo uma HCDR3 e um par de sequência de aminoácidos de LCDR3 (HCDR3/LCDR3) compreendendo as SEQ ID NOs: 8/16.
[00123] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação antígeno compreendendo um conjunto de seis CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contido em qualquer um dos exemplos de anticorpos anti-CD8 listados na Tabela 1. Em certas modalidades, a combinação de sequências de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 compreende SEQ ID NOs: 4-6-8-12-14-16.
[00124] Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que compreende um conjunto de seis CDRs (ou seja,, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contido dentro um par de sequências de aminoácidos de HCVR / LCVR de SEQ ID NOs: 2/10. Métodos e técnicas para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR são bem conhecidos na técnica
41 / 120 e podem ser usados para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácidos de HCVR e/ou LCVR especificadas divulgadas neste documento. As convenções exemplares que podem ser usadas para identificar os limites das CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a definição de Chothia e a definição de AbM. Em termos gerais, a definição de Kabat baseia-se na variabilidade da sequência, a definição de Chothia baseia-se na localização das regiões de loop estrutural e a definição AbM é um ajuste entre as abordagens de Kabat e Chothia. Ver, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:9268-9272 (1989). Bancos de dados públicos também estão disponíveis para identificar sequências CDR dentro de um anticorpo.
[00125] Em algumas modalidades, proteínas de ligação são anticorpos e seus fragmentos de ligação a antígeno que competem por ligação específica a CD8 com um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreendendo as CDRs de uma HCVR e as CDRs de uma LCVR, em que o par de sequência de aminoácidos de HCVR e LCVR compreende SEQ ID NOs: 2/10.
[00126] Também são fornecidos neste documento anticorpos isolados e seus fragmentos de ligação a antígeno que ligam CD8 e inibem a produção de IFNγ em células T CD8 positivas ativadas. Em certas modalidades, os anticorpos da divulgação que se ligam a CD8 e inibem a produção de IFNγ em células T CD8 positivas ativadas compreendem as CDRs de uma HCVR com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e as CDRs de uma LCVR com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[00127] Também são fornecidos neste documento anticorpos isolados e fragmentos de ligação a antígeno deles que ligam CD8 e inibem a proteína ativadora do fator de transcrição (AP-1) em células T ativadas. Em certas
42 / 120 modalidades, os anticorpos da divulgação que se ligam a CD8 e inibem AP-1 em células T ativadas compreendem as CDRs de uma HCVR com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e as CDRs de uma LCVR com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[00128] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação são anticorpos e seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a CD8 de espécies humanas ou outras espécies. Em certas modalidades, os anticorpos podem se ligar a CD8 humano e/ou ao CD8 de cynomolgus.
[00129] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação são anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno deles que cruzam de maneira competem por ligação a CD8 com um anticorpo de referência ou fragmento de ligação a antígeno dele compreendendo as CDRs de uma HCVR e as CDRs de uma LCVR, em que a HCVR e a LCVR têm, cada uma, um par de sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2/10.
[00130] Em uma modalidade, a proteína de ligação é um anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno que tem uma ou mais das seguintes características: (a) é um anticorpo monoclonal totalmente humano; (b) se liga a CD8 com um KD igual ou inferior a 3,5x10-8 M, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície; (c) se liga a CD8α humana; (d) inibe a produção de IFNγ em células T CD8 ativadas; (e) inibe a proteína ativadora do fator de transcrição (AP-1) em células T ativadas; (f) reage cruzadamente com CD8 humana e de macaco; (g) compreende as três CDRs da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas na sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 2; e (h) compreende as três CDRs da cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas na sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (LCVR) da SEQ ID NO: 10.
[00131] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação
43 / 120 a antígeno dele pode se ligar especificamente a CD8 de forma agonista, isto é, pode aumentar ou estimular a ligação e/ou atividade de CD8; em outras modalidades, o anticorpo pode se ligar especificamente a CD8 de forma antagonista, isto é, pode bloquear o CD8 de ligação a um parceiro de ligação a CD8 natural.
[00132] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno dele pode se ligar especificamente a CD8 de forma neutra, isto é, se liga, mas não bloqueia, nem aumenta ou estimula a ligação e/ou atividade de CD8.
[00133] Em algumas modalidades, os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno deles se ligam a CD8, por exemplo, CD8α ou CD8β, com uma meia-vida dissociativa (t½) superior a cerca de 2,0 minutos, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície a 25ºC ou 37ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 2, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno se ligam a CD8 com um t½ superior a cerca de 5 minutos, superior a cerca de 10 minutos, superior a cerca de 30 minutos, superior a cerca de 50 minutos, superior a cerca de 60 minutos, superior a cerca de 70 minutos, superior a cerca de 80 minutos, superior a cerca de 90 minutos, superior a cerca de 100 minutos, superior a cerca de 200 minutos, superior a cerca de 300 minutos, superior a cerca de 400 minutos, superior a cerca de 500 minutos, superior a cerca de 600 minutos, superior a cerca de 700 minutos, superior a cerca de 800 minutos, superior a cerca de 900 minutos, superior a cerca de 1000 minutos , ou superior a cerca de 1100 minutos, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície a 25ºC ou 37ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 2 (por exemplo, formato de captura de mAb ou de captura de antígeno) ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00134] Em algumas modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação
44 / 120 a antígeno deste se ligam a uma célula que expressa CD8 humano com um EC50 menos de cerca de 1 nM, conforme medido por um ensaio de citometria de fluxo, conforme definido no Exemplo 6, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno deles se ligam a uma célula que expressa hCD8 com um EC50 de menos de cerca de 0,9 nM, menos de cerca de 0,8 nM, menos de cerca de 0,7 nM, menos de cerca de 0,6 nM, menos de cerca de 0,5 nM, ou menos de cerca de 0,4 nm, conforme medido por um ensaio de citometria de fluxo, por exemplo, usando o formato de ensaio no Exemplo 6, ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00135] Em algumas modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno deles se ligam a uma célula que expressa CD8 de macaco cynomolgus com um EC50 de menos de cerca de 1 nM, conforme medido por um ensaio de citometria de fluxo, conforme definido no Exemplo 6, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno deles se ligam a uma célula que expressa CD8 de macaco com um EC50 de menos de cerca de 0,9 nM, menos de cerca de 0,8 nM, menos de cerca de 0,7 nM, menos de cerca de 0,6 nM, menos de cerca de 0,5 nM, ou menos de cerca de 0,4 nm, conforme medido por um ensaio de citometria de fluxo, por exemplo, usando o formato de ensaio no Exemplo 6, ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00136] Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno deles atenuam ou bloqueiam a ativação de células T CD8 positivas com um EC50 de menos de 1,2E-09 M conforme medido por um ensaio repórter de luciferase de célula T/APC, conforme definido no Exemplo 8, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno deles bloqueiam a ativação de células T CD8 positivas com um EC50 em pelo menos cerca de 85%, ou cerca de 89%, conforme medido por um ensaio repórter de luciferase de célula
45 / 120 T/APC, por exemplo, usando o formato de ensaio conforme definido no Exemplo 8, ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00137] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento é um anticorpo monoclonal totalmente humano ou seu fragmento de ligação a antígeno que se liga a CD8, em que o anticorpo ou fragmento seu exibe uma ou mais das seguintes características: (i) compreende uma sequência de aminoácidos de HCVR da SEQ ID NO: 2, ou uma sequência substancialmente semelhante respectiva possuindo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (ii) compreende uma sequência de aminoácidos LCVR selecionada de SEQ ID NO: 10, ou uma sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iii) compreende um par de sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 de SEQ ID NOs: 8/16, ou uma sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iv) compreende um par de sequências de aminoácidos de HCDR1/LCDR1 de SEQ ID NOs: 4/12, ou uma sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um par de sequências de aminoácidos de HCDR2/LCDR2 de SEQ ID NOs: 6/14, ou uma sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um par de sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 de SEQ ID NOs: 8/16, ou uma sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (v) liga CD8 humano com uma constante de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) inferior a cerca de 3,5x10-8 M, medida em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície (vi) inibe IFNɣ produção em células T CD8 positivas ativadas; e (vii) inibe a proteína
46 / 120 ativadora do fator de transcrição (AP-1) nas células T ativadas.
[00138] Em certas modalidades, os anticorpos podem funcionar bloqueando ou inibindo a atividade de ligação a MHC classe I associada a CD8α por ligação a qualquer região ou fragmento da proteína de comprimento total, a sequência de aminoácidos da qual é mostrada na SEQ ID NO: 18. Em certas modalidades, os anticorpos podem funcionar bloqueando ou inibindo a atividade de ligação a MHC classe I associada a CD8β por ligação a qualquer região ou fragmento da proteína de comprimento total, a sequência de aminoácidos da qual é mostrada na SEQ ID NO: 20.
[00139] Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD8 ou fragmentos de ligação a antígeno deles se ligam a um epítopo dentro de qualquer uma ou mais das regiões exemplificadas em CD8α, tanto na forma natural, como exemplificado na SEQ ID NO: 18, ou produzido de forma recombinante, ou a um fragmento seu. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a uma região extracelular compreendendo um ou mais aminoácidos selecionados do grupo constituído por resíduos de aminoácidos 22 a 182 de CD8α. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD8 ou fragmentos de ligação a antígeno deles se ligam a um epítopo dentro de qualquer uma ou mais das regiões exemplificadas em CD8β, seja na forma natural, conforme exemplificado na SEQ ID NO: 20, ou produzido de forma recombinante, ou a um fragmento seu. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a uma região extracelular compreendendo um ou mais aminoácidos selecionados do grupo constituído por resíduos de aminoácidos 22 a 170 de CD8β.
[00140] Em certas modalidades, anticorpos anti-CD8 e fragmentos de ligação a antígeno deles interagem com um ou mais epítopos encontrados dentro da região extracelular de CD8α (SEQ ID NO: 18) ou CD8β (SEQ ID NO: 20). O(s) epítopo(s) pode(m) consistir em uma ou mais sequências contíguas de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
47 / 120 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos localizados dentro da região extracelular de CD8α ou CD8β. Alternativamente, o epítopo pode consistir em uma pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácidos) localizados dentro da região extracelular de CD8α ou CD8β.
[00141] A presente divulgação inclui anticorpos anti-CD8 que se ligam ao mesmo epítopo, ou uma porção do epítopo, como o anticorpo exemplar específico descrito neste documento na Tabela 1, ou um anticorpo com as sequências de CDR do anticorpo exemplar descrito na Tabela 1. Da mesma forma, também são incluídos anticorpos anti-CD8 que competem pela ligação a CD8 ou um fragmento de CD8 com o anticorpo exemplar específico descrito neste documento na Tabela 1, ou um anticorpo com as sequências de CDR do anticorpo exemplar descrito na Tabela 1. Por exemplo, a presente divulgação inclui anticorpos anti-CD8 que competem de maneira cruzada pela ligação a CD8 com um ou mais anticorpos fornecidos neste documento (por exemplo, mAb1).
[00142] Os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno descritos neste documento se ligam especificamente a CD8 e modulam a interação de CD8 com MHC classe I. Os anticorpos anti-CD8 podem se ligar a CD8 com alta afinidade ou com baixa afinidade. Em certas modalidades, os anticorpos são anticorpos de bloqueio, em que os anticorpos se ligam a CD8 e bloqueiam a interação de CD8 com MHC classe I. Em algumas modalidades, os anticorpos de bloqueio da divulgação bloqueiam a ligação de CD8 para MHC classe I e/ou atenuam a ativação de células T. Em algumas modalidades, os anticorpos de bloqueio são úteis para inibir a resposta imune e/ou tratar uma infecção ou doença ou distúrbio autoimune.
[00143] Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a CD8 e inibem a produção de IFNγ em células T CD8 positivas ativadas. Em certas modalidades, os anticorpos se ligam a CD8 e inibem a atividade de célula T reguladora, por exemplo, inibem o fator de transcrição AP-1 em células T
48 / 120 CD8 positivas.
[00144] Certos anticorpos anti-CD8 são capazes de ligar-se e neutralizar a atividade de CD8, conforme determinado por ensaios in vitro ou in vivo. A capacidade dos anticorpos de ligar e neutralizar a atividade de CD8 pode ser medida usando qualquer método padrão conhecido pelos versados na técnica, incluindo ensaios de ligação, ou ensaios de atividade, conforme descrito neste documento.
[00145] Ensaios não limitantes, exemplares, in vitro para medir a atividade de ligação são ilustrados nos Exemplos aqui apresentados: no Exemplo 2, as afinidades de ligação e constantes cinéticas de um anticorpo anti-CD8 humano exemplar para CD8 humana foram determinadas por ressonância plasmônica de superfície e as medições foram realizadas em um instrumento Biacore 4000 ou T200; no Exemplo 6, foi utilizado um ensaio de fluorescência para determinar a capacidade de anticorpos anti-CD8 se ligarem a células T CD8 positivas e células T de macaco cynomolgus; no Exemplo 7, foram utilizados ensaios de ligação para determinar a capacidade dos anticorpos anti-CD8 para diminuir a produção de IFNɣ em células T CD8 positivas; e no Exemplo 8, foram utilizados ensaios de ligação para determinar a capacidade dos anticorpos anti-CD8 para alterar a atividade transcricional das células T.
[00146] Salvo indicação em contrário, o termo "anticorpo", como usado neste documento, deve ser entendido como englobando moléculas de anticorpo que compreendem duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina. (ou seja, "moléculas de anticorpo completas") bem como seus fragmentos de ligação a antígeno. Os termos "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo, e similares, conforme usado neste documento, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintética ou geneticamente manipulada que se liga
49 / 120 especificamente a um antígeno para formar um complexo. Os termos "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo, ou "fragmento de anticorpo", conforme usado neste documento, referem-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a CD8. Um fragmento de anticorpo pode incluir um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um fragmento dAb, um fragmento contendo uma CDR ou uma CDR isolada. Em certas modalidades, o termo "fragmento de ligação a antígeno" refere-se a um polipeptídeo ou fragmento seu de uma molécula de ligação a antígeno multiespecífica. Em tais modalidades, o termo "fragmento de ligação a antígeno" inclui, por exemplo, molécula de MHC de classe II que se liga especificamente a CD8. Fragmentos de ligação a antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo inteiras usando quaisquer técnicas padrão, tais como digestão proteolítica ou técnicas de manipulação genética recombinante que envolvem a manipulação e expressão de DNA que codifica domínios variáveis e (opcionalmente) constantes de anticorpo. Esse DNA é conhecido e/ou está facilmente disponível por, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou por usado de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para dispor um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.
[00147] Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação a antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia única (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimo consistindo nos resíduos de aminoácido que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementariedade (CDR) isolada, tal como um
50 / 120 peptídeo CDR3), ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restrito. Outras moléculas manipuladas, tais como anticorpos domínio-específicos, anticorpos de domínio único, anticorpos de domínio deletado, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs), e domínios variáveis de IgNAR de tubarão, também são abrangidas dentro da expressão "fragmento de ligação a antígeno", conforme usado neste documento.
[00148] Um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo normalmente compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e compreenderá geralmente pelo menos uma CDR que seja adjacente a ou "in frame" com uma ou mais sequências de framework. Nos fragmentos de ligação a antígeno com o domínio VH associado a um domínio VL, os domínios VH e VL podem ser situados em relação um ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter os dímeros VH - VH, VH - VL ou VL - VL. Alternativamente, o fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode conter um domínio monomérico VH ou VL.
[00149] Em certas modalidades, um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio varável ligado covalentemente a pelo menos um domínio constante. Configurações exemplares não limitantes de domínios variáveis e constantes que podem ser encontradas dentro de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente divulgação incluem: (i) VH -CH1; (ii) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH -CH1-CH2; (v) VH -CH1-CH2-CH3; (vi) VH -CH2-CH3; (vii) VH -CL; (viii) VL - CH1; (ix) VL -CH2; (x) VL -CH3; (xi) VL -CH1-CH2; (xii) VL -CH1-CH2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3; e (xiv) VL -CL. Em qualquer configuração de domínios
51 / 120 variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplares listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser ligados diretamente um ao outro ou podem ser ligados por uma região de dobradiça ou de ligante inteira ou parcial. Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula de polipeptídeo. Além disso, um fragmento de ligação a antígeno pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente entre si e/ou com um ou mais domínios monoméricos VH ou VL (por exemplo, por ligação(ões) dissulfeto).
[00150] Os anticorpos anti-CD8 e fragmentos de anticorpos da presente divulgação abrangem proteínas com sequências de aminoácidos que variam daquelas dos anticorpos descritos, mas que retêm a capacidade de ligar CD8. Tais anticorpos variantes e fragmentos de anticorpos compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparados com a sequência principal, mas exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente à dos anticorpos descritos. Da mesma forma, as sequências de DNA codificadoras de anticorpo da presente divulgação englobam sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de nucleotídeos quando comparadas com a sequência divulgada, mas que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo ou fragmento de anticorpo da divulgação.
[00151] Duas proteínas de ligação a antígeno, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, são equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e extensão de absorção não mostram uma diferença significativa quando administradas na mesma dose molar sob
52 / 120 condições experimentais similares, ou doses únicas ou múltiplas doses. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se forem equivalentes na extensão de sua absorção, mas não em sua taxa de absorção e, ainda assim, podem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidas na marcação, não são essenciais para o alcance de concentrações eficazes da droga corporal em, por exemplo, uso crônico e são considerados clinicamente insignificantes para o produto medicamentoso em particular estudado.
[00152] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se não houver diferenças clinicamente significativas na sua segurança, pureza ou potência.
[00153] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se um sujeito puder ser trocado uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado no risco de efeitos adversos, incluindo uma mudança clinicamente significativa na imunogenicidade, ou eficácia diminuída, em comparação com a terapia contínua sem tal troca.
[00154] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se ambas atuarem por um mecanismo comum ou mecanismos de ação para a condição ou condições de uso, na medida em que tais mecanismos são conhecidos.
[00155] Bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e/ou in vitro. As medidas de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos, em que a concentração do anticorpo ou seus metabólitos é medida no sangue, plasma, soro ou outro fluido biológico em função do tempo; (b) um teste in vitro que foi correlacionado e é razoavelmente preditivo de dados de biodisponibilidade in vivo de humanos; (c) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos em que o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) é
53 / 120 medido em função do tempo; e (d) em um ensaio clínico bem controlado que estabelece segurança, eficácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.
[00156] As variantes bioequivalentes dos anticorpos da divulgação podem ser construídas através de, por exemplo, fazerem-se várias substituições de resíduos ou sequências ou excluírem-se resíduos ou sequências terminais ou internos não necessários para a atividade biológica. Por exemplo, resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser deletados ou substituídos por outros aminoácidos para evitar a formação de pontes de dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas após a renaturação. Em outros contextos, anticorpos bioequivalentes podem incluir variantes de anticorpo que compreendem mudanças de aminoácidos, que modificam as características de glicosilação dos anticorpos, por exemplo, mutações que eliminam ou removem a glicosilação. Anticorpos Anti-CD8 Compreendendo Variantes Fc
[00157] De acordo com certas modalidades da presente divulgação, os anticorpos anti-CD8 compreendem um domínio Fc que compreende uma ou mais mutações que potencializam ou diminuem a ligação do anticorpo ao receptor FcRn, por exemplo, em pH ácido em comparação com pH neutro. Por exemplo, a presente divulgação inclui anticorpos anti-CD8 compreendendo uma mutação na região CH2 ou um CH3 do domínio Fc, em que a(s) mutação(ões) aumenta(m) a afinidade do domínio Fc para FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossoma onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Essas mutações podem resultar em um aumento na meia-vida sérica do anticorpo quando administradas a um animal. Exemplos não limitantes de tais modificações Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256
54 / 120 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, A, W, H, F ou Y [N434A, N434W, N434H, N434F ou N434Y]); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F) e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação em 428L (por exemplo, M428L) e modificação em 434S (por exemplo,N434S); uma modificação em 428L, 259I (por exemplo, V259I), e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação em 433K (por exemplo, H433K) e 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação em 252, 254, e 256 (por exemplo,252Y, 254T, e 256E); uma modificação em 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação em 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P). Em ainda outra modalidade, a modificação compreende um 265A (por exemplo, D265A) e/ou um 297A (por exemplo, N297A).
[00158] Por exemplo, a presente divulgação inclui anticorpos anti-CD8 compreendendo um domínio Fc compreendendo um ou mais pares ou grupos de mutações selecionadas do grupo que consiste em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L e N434S); 257I e 311I (por exemplo, P257I e Q311I); 257I e 434H (por exemplo, P257I e N434H); 376V e 434H (por exemplo, D376V e N434H); 307A, 380A e 434A (por exemplo, T307A, E380A e N434A); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F). Em uma modalidade, a presente divulgação inclui anticorpos anti- CD8 compreendendo um domínio Fc que compreende uma mutação S108P na região de dobradiça de IgG4 para promover a estabilização do dímero. Todas as combinações possíveis das mutações do domínio Fc precedentes e outras mutações dentro dos domínios variáveis de anticorpo divulgados neste documento são contempladas dentro do escopo da presente divulgação.
[00159] A presente divulgação também inclui anticorpos anti-CD8
55 / 120 compreendendo uma região (CH) constante de cadeia pesada quimérica, em que a região quimérica de C H compreende segmentos derivados das regiões CH de mais de um isotipo de imunoglobulina. Por exemplo, os anticorpos da divulgação podem compreender uma região CH quimérica compreendendo parte ou todo de um domínio CH2 derivado de uma molécula de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, combinada com parte ou todo de um domínio CH3 derivado de uma molécula IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. De acordo com certas modalidades, os anticorpos da divulgação compreendem uma região CH quimérica com uma região de dobradiça quimérica. Por exemplo, uma dobradiça quimérica pode compreender uma sequência de aminoácidos de "dobradiça superior" (resíduos de aminoácido da posição 216 à posição 227 de acordo com a numeração EU) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, combinada com uma sequência de "dobradiça inferior" (resíduos de aminoácido da posição 228 à posição 236 de acordo com a numeração da EU) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. De acordo com algumas modalidades, a região de dobradiça quimérica compreende resíduos de aminoácido derivados de uma dobradiça superior IgG1 humana ou de IgG4 humana e resíduos de aminoácido derivados de uma dobradiça inferior de IgG2 humana. Um anticorpo compreendendo uma região C H quimérica a conforme descrito neste documento pode, em certas modalidades, apresentar funções efetoras Fc modificadas sem afetar adversamente as propriedades terapêuticas ou farmacocinéticas do anticorpo. (Ver, por exemplo, Publicação de Patente US nº 20140243504, cuja divulgação é incorporada a este documento por referência na sua totalidade). B. Emissores de Pósitron e Frações Quelantes
[00160] Emissores de pósitron adequados incluem, mas não estão limitados àqueles que formam complexos estáveis com a fração quelante e
56 / 120 têm meia-vida física adequada para fins de geração de imagem imuno-PET. 89 Emissores de pósitron ilustrativos incluem, mas não estão limitados a, Zr, 68 64 44 86 Ga, Cu, Sc, e Y. Emissores de pósitron adequados também incluem aqueles que se ligam diretamente com a proteína de ligação CD8, incluindo, mas não se limitando a, 76Br e 124I, e aqueles que são introduzidos através do grupo protético, por exemplo, 18F.
[00161] As frações quelantes descritas neste documento são frações químicas que estão covalentemente ligadas à proteína de ligação CD8, por exemplo., anticorpo anti-CD8 e compreende uma porção capaz de quelar um emissor de pósitron, ou seja., capaz de reagir com um emissor de pósitron para formar um complexo de quelato coordenado. Frações adequadas incluem aquelas que permitem o carregamento eficiente do metal específico e formam complexos de metal-quelador que são suficientemente estáveis in vivo para usos diagnósticos, por exemplo, geração de imagem de imuno-PET. Frações quelantes ilustrativas incluem aquelas que minimizam a dissociação do emissor de pósitron e acumulação em osso mineral, proteínas plasmáticas e/ou deposição de medula óssea em uma extensão adequada para usos diagnósticos.
[00162] Exemplos de frações quelantes incluem, mas não estão limitados àqueles que formam complexos estáveis com emissores de pósitron 89 68 64 44 86 Zr, Ga, Cu, Sc e/ou Y. Frações quelantes ilustrativas incluem, mas não estão limitadas àquelas descritas em Nature Protocols, 5(4): 739, 2010; Bioconjugate Chem., 26(12): 2579 (2015); Chem Commun (Camb), 51(12): 2301 (2015); Mol. Pharmaceutics, 12: 2142 (2015); Mol. Imaging Biol., 18: 344 (2015); Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 37:250 (2010); Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2016). doi:10.1007/s00259-016-3499-x; Bioconjugate Chem., 26(12): 2579 (2015); WO 2015/140212A1; e US 5,639,879, incorporados por referência integralmente.
[00163] Frações quelantes ilustrativas também incluem, mas não estão
57 / 120 limitadas àquelas que compreendem desferrioxamina (DFO), ácido 1,4,7,10- tetra-acético (DOTA), ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido (1,4,7,10-Tetra-azaciclododecano- 1,4,7,10-tetra(metileno fosfônico) (DOTP), ácido 1R, 4R, 7R, 10R)-α'α''α'''- tetrametil-1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTMA), ácido 1,4,8,11-tetra-azaciclotetradecano-1,4,8,11-tetra-acético (TETA), H4octapa, H6fospa, H2dedpa, H5decapa, H2azapa, HOPO, DO2A, 1,4,7,10- Tetrakis(carbamoilmetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecano (DOTAM), ácido 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N''-triacético (NOTA), 1,4,7,10- Tetrakis(carbamoilmetil)-1,4,7,10-tetra-azaciclododecano (DOATM), ácido 1,4,8,11-Tetra-azabiciclo[6.6.2]hexadecano-4,11 diacético (CB-TE2A), 1,4,7,10-Tetra-azaciclododecano (Cicleno), 1,4,8,11-Tetra- azaciclotetradecano (Cíclame)quelantes octadentados, quelantes hexadentados, quelantes a base de fosfonato, quelantes macrocíclicos, quelantes compreendendo ligantes de tereftalamida macrocíclicos, quelantes bifuncionais, fusarinina C e quelantes derivados de fusarinina C, triacetilfusarinina C (TAFC), ferrioxamina E (FOXE), ferrioxamina B (FOXB), ferricromo A (FCHA) e similares.
[00164] Em algumas modalidades, as frações quelantes são covalentemente ligadas à proteína de ligação CD8, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, através de uma fração ligante, que se fixa covalentemente a porção quelante da fração quelante à proteína de ligação. Em algumas modalidades, estas frações de ligante são formadas a partir de uma reação entre uma fração reativa da proteína de ligação CD8, por exemplo, cisteína ou lisina de um anticorpo, e fração reativa que é ligada a um quelante, incluindo, por exemplo, um grupo p-isotiocicanatobenil e as frações reativas fornecidas nos métodos de conjugação abaixo. Além disso, tais frações de ligante opcionalmente compreendem grupos químicos usados para propósitos de ajuste de polaridade, solubilidade, interações estéricas, rigidez
58 / 120 e/ou o comprimento entre a porção quelante e a proteína de ligação CD8. C. Preparação de Conjugados Anti-CD8 Radiomarcados
[00165] Os conjugados de proteína anti-CD8 radiomarcados podem ser preparados por (1) reação de uma proteína de ligação CD8, por exemplo, anticorpo, com uma molécula compreendendo um quelante emissor de pósitron e uma fração reativa ao sítio de conjugação desejável da proteína de ligação CD8 e (2) carregando o emissor de pósitron desejável.
[00166] Locais de conjugação adequados incluem, mas não estão limitados a, lisina e cisteína, ambas podem ser, por exemplo, nativas ou manipuladas e podem ser, por exemplo, presentes na cadeia pesada ou leve de um anticorpo. Os sítios de conjugação de cisteína incluem, mas não estão limitados àqueles obtidos a partir de mutação, inserção ou redução de ligações dissulfeto de anticorpo. Métodos para produzir anticorpos manipulados com cisteína incluem, mas não estão limitados àqueles divulgados em WO2011/056983. Métodos de conjugação sítio específicos também podem ser usados para direcionar a reação de conjugação a sítios específicos de um anticorpo, atingir estequiometria desejável e/ou alcançar proporções desejáveis de quelante para anticorpo. Tais métodos de conjugação são conhecidos pelos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados a, manipulação de cisteína e métodos enzimáticos e quimicamente enzimáticos, incluindo, mas não limitados a, conjugação de glutamina, conjugação Q295 e conjugação mediada por transglutaminase, bem como aquelas descritas em J.Clin.Imunol., 36: 100 (2016), incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Frações adequadas reativas ao sítio de conjugação desejável geralmente permitem um acoplamento eficiente e fácil da proteína de ligação CD8, por exemplo, anticorpo e quelante emissor de pósitron. As frações reativas aos sítios de lisina e cisteína incluem grupos eletrofílicos, que são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em certos aspectos, quando o sítio de conjugação desejado é lisina, a fração reativa é um isotiocianato, por
59 / 120 exemplo, grupo p-isotiocianatobenil ou éster reativo. Em certos aspectos, quando o sítio de conjugação desejado é cisteína, a fração reativa é um maleimida.
[00167] Quando o quelante é desferrioxamina (DFO), frações reativas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, um grupo isotiociantatobenzil, um éster n-hidroxisuccinimida, 2,3,5,6 éster tetrafluorofenol, n-succinimidil- S-acetiltioacetato e aqueles descritos em Biomed Research International, Vol 2014, Article ID 203601, incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, a proteína de ligação CD8 é um anticorpo e a molécula que compreende um quelante emissor de pósitron e uma fração reativa ao sítio de conjugação é p-isotiociantatobenzil-desferrioxamina (p- SCN-Bn-DFO):
O H N N O HO OH N
O HN O CH3
OH N S O N N NCS H H .
[00168] O carregamento de emissor de pósitron é realizado pela incubação do conjugado de quelante de proteína de ligação CD8 com o emissor de pósitron por um tempo suficiente para permitir a coordenação do referido emissor de pósitron ao quelante, por exemplo, através da realização dos métodos descritos nos exemplos fornecidos neste documento, ou um método substancialmente semelhante. D. Modalidades Ilustrativas de Conjugados
[00169] Incluídos na presente divulgação estão os conjugados de anticorpos radiomarcados compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga ao CD8 humano e um emissor de
60 / 120 pósitron. Também incluídos na presente divulgação estão os conjugados de anticorpos radiomarcados compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a CD8 humano, uma fração quelante e um emissor de pósitron.
[00170] Em algumas modalidades, a fração quelante compreende um quelante capaz de formar um complexo com 89Zr. Em certas modalidades, a fração quelante compreende desferrioxamina. Em certas modalidades, a fração quelante é p-isotiocianatobenzil-desferrioxamina. 89
[00171] Em algumas modalidades, o emissor de pósitron é Zr. Em algumas modalidades, menos de 1,0% do anticorpo anti-CD8 é conjugado com o emissor de pósitron, menos de 0,9% do anticorpo anti-CD8 é conjugado com o emissor de pósitron, menos de 0,8% do anticorpo anti-CD8 é conjugado com o emissor de pósitron, menos de 0,7% do anticorpo anti- CD8 é conjugado com o emissor de pósitron, menos de 0,6% do anticorpo anti-CD8 é conjugado com o emissor de pósitron, menos de 0,5% do anticorpo anti-CD8 é conjugado com o emissor de pósitron, menos de 0,4% do anticorpo anti-CD8 é conjugado com o emissor de pósitron, menos de 0,3% do anticorpo anti-CD8 é conjugado com o emissor de pósitron, menos de 0,2% do anticorpo anti-CD8 é conjugado com o emissor de pósitron, ou menos de 0,1% do anticorpo anti-CD8 é conjugado com o emissor de pósitron.
[00172] Em algumas modalidades, a razão de fração-a-anticorpo quelante do conjugado é de 1,0 a 2,0. Conforme usado neste documento, "razão de fração-para-anticorpo quelante" é a proporção média de fração quelante para anticorpo e é uma medida da carga de quelante por anticorpo. Esta razão é análoga a "DAR", isto é, razão droga-anticorpo, que é usada por aqueles versados na técnica para medir a carga de droga por anticorpo para conjugados de anticorpo-droga (ADCs); no contexto dos conjugados descritos neste documento para geração de imagens de iPET, a razão de fração-para-
61 / 120 anticorpo quelante pode ser verificada usando métodos descritos neste documento e outros conhecidos na técnica para a determinação de DAR, por exemplo, aqueles descritos em Wang et al., Antibody-Drug Conjugates, The 21st Century Magic Bullets for Cancer (2015). Em algumas modalidades, a razão de fração-para-anticorpo quelante é de cerca de 1,7. Em algumas modalidades, a razão de fração-para-anticorpo quelante é de 1,0 a 2,0. Em algumas modalidades, a razão de fração-para-anticorpo quelante é de cerca de 1,7.
[00173] Em uma modalidade particular, a fração quelante é p- isotiocianatobenzil-desferrioxamina e o emissor de pósitron é 89Zr. Em outra modalidade particular, a fração quelante é p-isotiocianatobenzil- 89 desferrioxamina e o emissor de pósitron é Zr, e a razão de fração-para- anticorpo quelante do conjugado é de 1 a 2.
[00174] Em algumas modalidades, são fornecidas neste documento proteínas de ligação a antígeno que se ligam a CD8, em que as referidas proteínas de ligação a antígeno que se ligam a CD8 são covalentemente ligadas a uma ou mais frações tendo a seguinte estrutura: -L-MZ em que L é uma fração quelante; M é um emissor de pósitron; e z, independentemente em cada ocorrência, é 0 ou 1; e em que pelo menos um dentre z é 1. Em certas modalidades, a proteína de ligação a antígeno radiomarcada é um composto da Fórmula (I): M-L-A-[L-MZ]k (I)
[00175] A é uma proteína que se liga a CD8; L é uma fração quelante; M é um emissor de pósitron; z é 0 ou 1; e k é um número inteiro de 0-30. Em algumas modalidades, k é 1. Em algumas modalidades, k é 2.
[00176] Em algumas modalidades, L é:
62 / 120 .
[00177] Em algumas modalidades, M é 89Zr.
[00178] Em algumas modalidades, k é um número inteiro de 1 a 2. Em algumas modalidades, k é 1. Em algumas modalidades, k é 2.
[00179] Em algumas modalidades, -L-M é .
[00180] Também estão incluídos na presente divulgação os métodos de síntese de um conjugado de anticorpo radiomarcado compreendendo o contato de um composto de Fórmula (III):
O H N N O HO OH N
O HN O CH3
OH N S S O N N N N A
H H H H 1-2
63 / 120 (III) com 89Zr, em que A é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a CD8. Em certas modalidades, o composto de Fórmula (III) é sintetizado pelo contato de um anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga a CD8, com p-SCN-Bn-DFO.
[00181] Também é fornecido neste documento o produto da reação entre um composto de Fórmula (III) e 89Zr.
[00182] São fornecidos neste documento compostos da Fórmula (III): caracterizado pelo fato de que A é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga a CD8 e k é um número inteiro dentre 1-30. Em algumas modalidades, k é 1 ou 2.
[00183] São fornecidos neste documento conjugados de anticorpos compreendendo (i) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a CD8 e (ii) uma ou mais frações quelantes.
[00184] Em algumas modalidades, a fração quelante compreende:
64 / 120 .
é uma ligação covalente ao anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
[00185] Em alguns aspectos, o conjugado de anticorpo tem uma razão de fração-para-anticorpo quelante de cerca de 1,0 a cerca de 2,0. Em alguns aspectos, o conjugado de anticorpo tem uma razão de fração-para-anticorpo quelante de cerca de 1,7.
[00186] Em algumas modalidades, são fornecidas neste documento composições compreendendo um conjugado com a seguinte estrutura: A-Lk em que A é uma proteína que se liga a CD8; L é uma fração quelante; e k é um número inteiro de 1-30; o conjugado é quelado com um emissor de pósitron em uma quantidade suficiente para fornecer uma atividade específica adequada para geração de imagens por PET clínicas. Em algumas modalidades, a quantidade de emissor de pósitron quelado é uma quantidade suficiente para fornecer uma atividade específica de cerca de 1 a cerca de 50 mCi por 1-50 mg da proteína que se liga a CD8.
[00187] Em algumas modalidades, a quantidade de emissor de pósitron quelado é uma quantidade suficiente para fornecer uma atividade específica de até 50 mCi, até 45 mCi, até 40 mCi, até 35 mCi, até 30 mCi, até 25 mCi, ou até 10 mCi por 1-50 mg da proteína que se liga a CD8, por exemplo, em um intervalo de cerca de 5 a cerca de 50 mCi, cerca de 10 a cerca de 40 mCi,
65 / 120 cerca de 15 a cerca de 30 mCi, cerca de 7 a cerca de 25 mCi, cerca de 20 a cerca de 50 mCi, ou cerca de 5 a cerca de 10 mCi.
[00188] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga a CD8 humano com uma constante de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) inferior a cerca de 3,5x10-8 M, conforme medido em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície.
[00189] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga a CD8α humano com uma KD inferior a cerca de 3,5x10-8 em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície.
[00190] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga ao CD8 humano com um KD inferior a cerca de 3,3x10-8M, conforme medido em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície.
[00191] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compete para ligação a CD8 humano com um anticorpo de referência compreendendo as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma HCVR, em que a HCVR tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e CDRs de uma LCVR, em que a LCVR tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o anticorpo de referência ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um par de sequência de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 2/10.
[00192] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo inibe a ligação de CD8 a MHC classe I. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo inibe a produção de IFNγ em células T CD8 ativadas. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo inibe a proteína ativadora do fator de transcrição (AP-1) em células T ativadas.
[00193] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação
66 / 120 a antígeno do mesmo compreende as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma HCVR, em que a HCVR tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e CDRs de uma LCVR, em que a LCVR tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. Em certas modalidades, o anticorpo isolado compreende um par de sequência de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 2/10.
[00194] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal humano ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD8 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2.
[00195] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal humano ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD8 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR) tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[00196] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal humano ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a CD8 humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende (a) uma HCVR com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e (b) uma LCVR com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.
[00197] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende três regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDRs) (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro da região variável de cadeia pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 2; e três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro da região variável de cadeia leve (LCVR) da SEQ ID NO: 10.
[00198] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação
67 / 120 a antígeno do mesmo compreende seis combinações de sequência de aminoácidos de CDR de SEQ ID NOs: 4/6/8/12/14/16.
[00199] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende um par de sequência de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID Nos: 2/10. IV. Métodos de Uso de Imunoconjugados Radiomarcados
[00200] Em certos aspectos, a presente divulgação fornece métodos diagnósticos e terapêuticos de uso dos conjugados de anticorpos radiomarcados da presente divulgação.
[00201] De acordo com um aspecto, a presente divulgação fornece métodos de detecção de CD8 em um tecido, os métodos compreendendo administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado do presente documento ao tecido; e visualizar a expressão de CD8 por geração de imagem de tomografia por emissão de pósitron (PET). Em certas modalidades, o tecido compreende células ou linhagens celulares. Em certas modalidades, o tecido está presente em um sujeito, em que o sujeito é um mamífero. Em determinadas modalidades, o sujeito é um sujeito humano. Em certas modalidades, o sujeito tem uma doença ou distúrbio selecionado do grupo que consiste em câncer, doença infecciosa, doença autoimune e doença inflamatória. Em uma modalidade, o sujeito tem câncer. Em certas modalidades, a doença infecciosa é uma infecção bacteriana causada, por exemplo, por bactérias rickettsias, bacilos, klebsiella, meningococcos e gonococcos, proteus, pneumonococos, pseudomonas, estreptococos, staphylococcos, serratia, Borriella, Bacillus anthricis, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium diphtheriae, Legionella, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis, Salmonella, Vibrio cholerae e Yersinia pestis. Em certas modalidades, a doença infecciosa é uma infecção viral causada, por exemplo, pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite B (HBV), vírus do herpes (por exemplo,
68 / 120 VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, CMV e vírus Epstein Barr), vírus do papiloma humano (HPV), vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV) e vírus da imunodeficiência simiana (SIV). Em certas modalidades, a doença infecciosa é uma infecção parasitária causada, por exemplo, por Entamoeba spp., Enterobius vermicularis, Leishmania spp., Toxocara spp., Plasmodium spp., Schistosoma spp., Taenia solium, Toxoplasma gondii e Trypanosoma cruzi. Em certas modalidades, a doença infecciosa é uma infecção fúngica causada, por exemplo, por Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Blastomyces dermatitidis, Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizopus, etc.), Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis e Sporothrix schenkii.
[00202] De acordo com um aspecto, a presente divulgação fornece métodos de geração de imagens de um tecido que expressa CD8 compreendendo administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado da presente divulgação ao tecido; e visualizar a expressão de CD8 por geração de imagem de tomografia por emissão de pósitron (PET). Em uma modalidade, o tecido é compreendido em um tumor. Em uma modalidade, o tecido é compreendido em uma cultura de células tumorais ou linhagem de células tumorais. Em uma modalidade, o tecido é compreendido em uma lesão tumoral em um sujeito. Em uma modalidade, o tecido é linfócitos intratumorais em um tecido. Em uma modalidade, o tecido compreende células que expressam CD8.
[00203] De acordo com um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para medir a resposta a uma terapia, em que a resposta a uma terapia está correlacionada com um aumento de células T CD8 positivas em relação aos níveis de referência. Os métodos, de acordo com este aspecto, compreendem a administração de um conjugado de anticorpo radiomarcado apresentado neste documento a um sujeito em necessidade e visualizando a
69 / 120 expressão de CD8 por geração de imagem de tomografia por emissão de pósitron (PET). Em certas modalidades, as células T CD8 positivas estão presentes em um tumor no sujeito. Em certas modalidades, um aumento na expressão de CD8 correlaciona-se para aumentar na inflamação em um tumor. Em certas modalidades, a inflamação está presente em um tecido infectado no sujeito. Em certas modalidades, uma diminuição na expressão de CD8 correlaciona-se a uma diminuição na inflamação em um tecido infectado.
[00204] De acordo com um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para medir a resposta a uma terapia, em que a resposta a uma terapia está correlacionada com células T CD8 positivas para o nível de referência. Os métodos, de acordo com este aspecto, compreendem (i) administrar um conjugado de anticorpos radiomarcados fornecidos neste documento a um sujeito em necessidade e visualizar a expressão de CD8 por geração de imagem de tomografia por emissão de pósitron (PET), e (ii) repetir a etapa (i) uma ou mais vezes após o início da terapia. Em certas modalidades, as células T CD8 positivas estão presentes em um tecido no sujeito. Em certas modalidades, um aumento na expressão de CD8 correlaciona-se para aumentar na inflamação no tecido. Em certas modalidades, uma diminuição na expressão de CD8 correlaciona-se a uma diminuição na inflamação no tecido. Em certas modalidades, a expressão de CD8 visualizada na etapa (i) é comparada à expressão de CD8 visualizada na etapa (ii).
[00205] De acordo com um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para prever uma resposta à terapia antitumoral. O método compreende administrar conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado a um sujeito em necessidade do mesmo e determinar que o tumor sólido do sujeito compreende células T CD8 positivas. Se os tumores do sujeito estiverem infiltrados com células T CD8 positivas ou imunologicamente "quente", o sujeito provavelmente responderá à terapia antitumoral. A presença de células T CD8 positivas pode ser um marcador preditivo de resposta ou um marcador
70 / 120 prognóstico para sobrevida. Por exemplo, a infiltração do tumor basal com células CD8 positivas é prognóstica de sobrevida em câncer de mama, cabeça/pescoço e ovário. Além disso, a infiltração do tumor de células CD8 positivas detectadas durante terapia anti-PD-1 ou terapia anti-PDL-1 é um marcador preditivo de resposta ao tratamento.
[00206] De acordo com um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para determinar se um sujeito com um tumor é adequado para terapia antitumoral, os métodos compreendem administrar um conjugado de anticorpo radiomarcado da presente divulgação e localizar o conjugado de anticorpo radiomarcado administrado no tumor por geração de imagens por PET em que a presença do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor identifica o sujeito como adequado para terapia antitumoral.
[00207] De acordo com um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para identificar um sujeito tendo um tumor para terapia antitumoral compreendendo um inibidor do eixo de sinalização PD-1/PD-L1, os métodos compreendendo administrar um conjugado de anticorpo radiomarcado da presente divulgação ao sujeito e localizar o conjugado de anticorpo radiomarcado administrado no tumor por geração de imagens por PET em que a presença do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor identifica o sujeito como adequado para terapia antitumoral. Em algumas modalidades, o sujeito é administrado ainda com um conjugado de anti-PD-1 radiomarcado e o conjugado de anti-PD-1 radiomarcado administrado é localizado no tumor por geração de imagens por PET, em que a presença do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor identifica o sujeito como adequado para terapia antitumoral compreendendo um inibidor do eixo de sinalização PD- 1/PD-L1.
[00208] Outro aspecto da presente divulgação fornece métodos para monitorar a presença de células T e/ou infiltração em um tumor ao longo do tempo. Em algumas modalidades, o método compreende (a) administrar um
71 / 120 conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado em um primeiro momento a um sujeito tendo o tumor e determinar a presença de células T CD8 positivas no tumor; (b) administrar uma ou mais doses de uma terapia antitumoral ao sujeito; e (c) administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado em um segundo momento para o sujeito 1 a 20 semanas após a administração da terapia antitumoral e determinar a presença de células T CD8 positivas no tumor. A presença de células T no tumor indica uma resposta positiva à terapia antitumoral. A etapa (c) pode ser repetida ao longo do tratamento com a terapia antitumoral. O primeiro momento pode ocorrer antes (b) ou pode ocorrer após (b).
[00209] A determinação da presença de células T em um tumor pode envolver a quantificação dos níveis de células T por métodos conhecidos por aquele versado na técnica. Em alguns aspectos, os níveis de referência de células T CD8 positivas são comparados aos níveis de células T CD8 positivas medidas após ou durante um período de terapia antitumoral. Manter níveis de células T CD8 positivas em relação à linha basal, ou um aumento nas células T CD8 positivas ao longo do tempo, indica uma resposta positiva à terapia antitumoral.
[00210] A determinação da presença de células T em um tumor pode envolver uma determinação simples - o tumor é positivo para células T ou o tumor é negativo para células T.
[00211] São fornecidos neste documento métodos para prever a resposta de um sujeito a uma terapia antitumoral, os métodos compreendendo a determinação se o tumor é CD8 positivo, em que se o tumor for CD8 positivo, ou seja, o tumor contiver células T, prevê uma resposta positiva do sujeito a uma terapia antitumoral. Em certas modalidades, o tumor é determinado positivo pela administração de um conjugado de anticorpo anti- CD8 radiomarcado da presente divulgação e localização do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor por geração de imagens por PET em que a
72 / 120 presença do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor indica que o tumor é positivo para CD8. Em algumas modalidades, a terapia antitumoral é uma terapia de inibidor de ponto de verificação.
Em algumas modalidades, a terapia antitumoral é selecionada a partir de um inibidor de PD-1 (por exemplo, REGN2810, BGB-A317, nivolumabe, pidilizumabe, e pembrolizumabe), um inibidor de PD-L1 (por exemplo, atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, MDX-1105, e REGN3504, bem como aqueles divulgados na Publicação de Patente Nº US 2015-0203580), inibidor de CTLA-4 (por exemplo, ipilimumab), um inibidor de TIM3, um inibidor de BTLA, um inibidor de TIGIT, um inibidor de CD47, um inibidor de GITR, um inibidor de LAG3, um antagonista de outro co-inibidor ou ligante de células T (por exemplo, um anticorpo para CD-28, 2B4, LY108, LAIR1, ICOS, CD160 ou VISTA), um inibidor de indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), um antagonista do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) [por exemplo, um "VEGF-Trap", tal como aflibercept ou outra proteína de fusão que inibe VEGF, conforme estabelecido em US 7,087,411, ou um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, bevacizumabe ou ranibizumabe) ou um inibidor de quinase molecular pequena de receptor de VEGF (por exemplo, sunitinib, sorafenibe, ou pazopanibe)], um inibidor de Ang2 (por exemplo, nesvacumabe), um inibidor do fator de crescimento de transformação beta (TGFβ), um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, erlotinibe, cetuximabe), um inibidor de CD20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20, tal como rituximabe), um anticorpo para um antígeno tumor- específico [por exemplo, CA9, CA125, antígeno associado ao melanoma 3 (MAGE3), antígeno carcinoembrionário (CEA), vimentina, tumor-M2-PK, antígeno específico da próstata (PSA), mucina-1, MART-1 e CA19-9], uma vacina (por exemplo, Bacillus Calmette-Guerin, uma vacina contra o câncer), um adjuvante para aumentar a apresentação do antígeno (por exemplo, fator
73 / 120 estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos), um anticorpo biespecífico (por exemplo, anticorpo biespecífico CD3xCD20, ou anticorpo biespecífico PSMAxCD3), uma citotoxina, um agente quimioterapêutico (por exemplo, dacarbazina, temozolomida, ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, cisplatina, carboplatina, gencitabina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatina, paclitaxel e vincristina), ciclofosfamida, radioterapia, um inibidor de IL-6R (por exemplo, sarilumabe), um inibidor de IL-4R (por exemplo, dupilumabe), um inibidor de IL-10, uma citocina como IL-2, IL-7, IL-21 e IL-15 e um conjugado de anticorpo-droga (ADC) (por exemplo, anti-CD19-DM4 ADC e anti-DS6-DM4 ADC).
[00212] De acordo com um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para prever a resposta de um sujeito com um tumor sólido a uma terapia antitumoral, os métodos compreendendo determinar se o tumor é positivo para CD8, em que uma resposta positiva do sujeito é prevista se o tumor for CD8 positivo. Em certas modalidades, o tumor é determinado positivo pela administração de um conjugado de anticorpo radiomarcado da presente divulgação e localização do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor por geração de imagens por PET em que a presença do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor indica que o tumor é positivo para CD8.
[00213] De acordo com um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para detectar um tumor CD8 positivo em um sujeito. Os métodos, de acordo com este aspecto, compreendem a administração de um conjugado de anticorpo radiomarcado da presente divulgação ao sujeito; e a determinação da localização do conjugado de anticorpo radiomarcado por imagens por PET, em que a presença do conjugado de anticorpo radiomarcado em um tumor indica que o tumor é positivo para CD8.
[00214] São fornecidos neste documento métodos para prever uma resposta positiva a uma terapia antitumoral que compreende: administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado ao sujeito determina a
74 / 120 presença de células T CD8 positivas no tumor sólido. A presença de células T CD8-positivas prevê uma resposta positiva a uma terapia antitumoral.
[00215] São fornecidos neste documento métodos para monitorar uma resposta positiva a uma terapia antitumoral em um sujeito compreendendo: (a) administrar uma ou mais doses de uma terapia antitumoral ao sujeito; e (b) administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado ao sujeito 1 a 20 semanas após a administração da terapia antitumoral para determinar a presença de células CD8 positivas no tumor sólido. A presença de células T CD8-positivas indica uma resposta positiva à terapia antitumoral.
[00216] São fornecidos neste documento métodos para prever ou monitorar o sucesso ou eficácia da terapia antitumoral em um sujeito tendo um tumor sólido, o método compreendendo: (a) determinar o nível de células CD8 positivas no tumor; e (b) correlacionar o nível de células CD8 positivas com terapia antitumoral bem sucedida. Um nível elevado acima de um certo limiar é preditivo ou indicativo de uma terapia antitumoral bem sucedida.
[00217] Conforme usado neste documento, a expressão "um sujeito em necessidade do mesmo" significa um mamífero humano ou não humano que exibe um ou mais sintomas ou indicações de câncer e/ou que foi diagnosticado com câncer, incluindo um tumor sólido e que precisa de tratamento para o mesmo. Em muitas modalidades, o termo "sujeito" pode ser usado de forma intercambiável com o termo "paciente". Por exemplo, um sujeito humano pode ser diagnosticado com um tumor primário ou metastático e/ou com um ou mais sintomas ou indicações, incluindo, mas não limitado a, perda de peso inexplicável, fraqueza geral, fadiga persistente, perda de apetite, febre, sudorese noturna, dor óssea, falta de ar, abdômen inchado, dor/pressão no peito, ampliação do baço e elevação no nível de um biomarcador relacionado ao câncer (por exemplo, CA125). A expressão inclui sujeitos com tumores primários ou estabelecidos. Em modalidades específicas, a expressão inclui sujeitos humanos que têm e/ou precisam de
75 / 120 tratamento para um tumor sólido, por exemplo, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de pele, câncer de fígado, câncer de ossos, câncer de ovário, câncer cervical, câncer pancreático, câncer de cabeça e pescoço e câncer do cérebro. O termo inclui sujeitos com tumores primários ou metastáticos (malignidades avançadas). Em certas modalidades, a expressão "um sujeito em necessidade do mesmo" inclui sujeitos com um tumor sólido que é resistente ou refratário a ou é controlado de forma inadequada por terapia prévia (por exemplo, tratamento com um agente anticâncer). Por exemplo, a expressão inclui sujeitos que foram tratados com uma ou mais linhas de terapia prévia, tais como tratamento com quimioterapia (por exemplo, carboplatina ou docetaxel). Em certas modalidades, a expressão "um sujeito em necessidade do mesmo" inclui sujeitos com um tumor sólido que foi tratado com uma ou mais linhas de terapia anterior, mas que posteriormente sofreu recaída ou metástase. Em certas modalidades, o termo inclui sujeitos tendo uma doença ou distúrbio inflamatório incluindo, mas não limitado a, câncer, artrite reumatoide, aterosclerose, periodontite, rinite alérgica, doença cardíaca, doença arterial coronariana, doença infecciosa, bronquite, dermatite, meningite, asma, tuberculose, colite ulcerativa, doença de Crohn, doença intestinal inflamatória, hepatite, sinusite, psoríase, alergia, fibrose, lúpus, vasiculite, espondilite anquilosante, doença de Graves, doença celíaca, fibromialgia e rejeição do transplante.
[00218] Em certas modalidades, os métodos da presente divulgação são usados em um sujeito com um tumor sólido. Os termos "tumor", "câncer" e "malignidade" são usados de forma intercambiável neste documento. Conforme usado neste documento, o termo "tumor sólido" refere-se a uma massa anormal de tecido que geralmente não contém cistos ou áreas líquidas. Tumores sólidos podem ser benignos (não cancerosos) ou malignos (câncer). Para os fins da presente divulgação, o termo "tumor sólido" significa tumores sólidos malignos. O termo inclui diferentes tipos de tumores sólidos indicados
76 / 120 para os tipos de células que os formam, a saber sarcomas, carcinomas e linfomas. Em certas modalidades, o termo "tumor sólido" inclui cânceres incluindo, entre outros, câncer colorretal, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de mama, câncer cerebral, câncer cervical, câncer de bexiga, câncer anal, câncer uterino, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer de endométrio, câncer ósseo, câncer testicular, câncer de pele, câncer de rim, câncer de estômago, câncer de esôfago, câncer de cabeça e pescoço, câncer de glândula salivar e mieloma.
[00219] De acordo com um aspecto, a presente divulgação fornece métodos de tratamento de um tumor sólido em um sujeito. Os métodos, de acordo com este aspecto, compreendem determinar que o tumor é positivo para CD8, ou seja, o tumor compreende células T CD8 positivas; e administrar uma ou mais doses de uma terapia antitumoral. A terapia antitumoral pode ser uma terapia de inibidor de ponto de verificação. Em certas modalidades, o tumor é determinado como sendo positivo para CD8 através da administração de um conjugado de anticorpo radiomarcado da presente divulgação ao sujeito; e visualização do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor por geração de imagens por PET. A presença do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor indica que o tumor é positivo para CD8.
[00220] Um anticorpo anti-CD8 radiomarcado divulgado neste documento pode ser usado para avaliar se um sujeito é adequado para terapia de inibidor de ponto de verificação. Em alguns aspectos, um anticorpo anti- CD8 radiomarcado pode ser usado para monitorar a infiltração de células T em um tumor, incluindo, por exemplo, monitoramento sem a necessidade de fazer uma biópsia do tumor. Em certas modalidades, a infiltração de células T suficiente é indicativa de que o tumor responderá à terapia de inibidor de ponto de verificação. Um anticorpo anti-CD8 radiomarcado divulgado neste documento também pode ser usado para monitorar a infiltração de células T
77 / 120 ao longo do ou após o tratamento com inibidor de ponto de verificação, por exemplo, medindo a alteração na extensão da infiltração de células T em pontos de tempo antes e/ou durante o tratamento.
[00221] A presença de células T CD8 positivas em um tumor é indicativa de que o tumor responderá melhor ao tratamento, por exemplo, o tratamento com uma terapia de inibidor de ponto de verificação. Além disso, a presença de células T CD8 positivas em um tumor após o tratamento com uma terapia antitumoral é indicativa de que a terapia está funcionando e quanto maior o aumento nas células T, mais eficaz o tratamento é.
[00222] Em um aspecto adicional, os métodos de tratamento podem compreender ainda administrar uma ou mais doses de um inibidor de CTLA-4 (por exemplo, ipilimumab), um inibidor de TIM3, um inibidor de BTLA, um inibidor de TIGIT, um inibidor de CD47, um inibidor de GITR, um antagonista de outro co-inibidor ou ligante de células T (por exemplo, um anticorpo para CD-28, 2B4, LY108, LAIR1, ICOS, CD160 ou VISTA), um inibidor de indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), um antagonista do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) [por exemplo, um "VEGF-Trap", tal como aflibercept ou outra proteína de fusão que inibe VEGF, conforme estabelecido em US 7,087,411, ou um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, bevacizumabe ou ranibizumabe) ou um inibidor de quinase molecular pequena de receptor de VEGF (por exemplo, sunitinib, sorafenibe, ou pazopanibe)], um inibidor de Ang2 (por exemplo, nesvacumab), um inibidor do fator de crescimento de transformação beta (TGFβ), um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, erlotinibe, cetuximabe), um inibidor de CD20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20, tal como rituximabe), um anticorpo para um antígeno tumor-específico [por exemplo, CA9, CA125, antígeno associado ao melanoma 3 (MAGE3), antígeno carcinoembrionário (CEA), vimentina, tumor-M2-PK, antígeno específico da próstata (PSA), mucina-1,
78 / 120 MART-1 e CA19-9], uma vacina (por exemplo, Bacillus Calmette-Guerin, uma vacina contra o câncer), um adjuvante para aumentar a apresentação do antígeno (por exemplo, fator estimulante de colônia de granulócitos- macrófagos), um anticorpo biespecífico (por exemplo, anticorpo biespecífico CD3xCD20, ou anticorpo biespecífico PSMaxCD3), uma citotoxina, um agente quimioterapêutico (por exemplo, dacarbazina, temozolomida, ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, cisplatina, carboplatina, gencitabina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatina, paclitaxel e vincristina), ciclofosfamida, radioterapia, um inibidor de IL-6R (por exemplo, sarilumabe), um inibidor de IL-4R (por exemplo, dupilumabe), um inibidor de IL-10, uma citocina como IL-2, IL-7, IL-21 e IL-15, um conjugado de anticorpo-droga (ADC) (por exemplo, anti-CD19-DM4 ADC e anti-DS6-DM4 ADC), uma droga anti-inflamatória (por exemplo, corticosteroides e drogas anti-inflamatórias não esteroidais), um suplemento dietético, tal como antioxidantes ou qualquer outra terapia para tratar câncer. Em certas modalidades, a terapia antitumoral pode ser usada em combinação com vacinas contra câncer incluindo vacinas de células dendríticas, vírus oncolíticos, vacinas de células tumorais, etc. para aumentar a resposta antitumoral. Exemplos de vacinas contra câncer que podem ser usadas em combinação com uma terapia antitumoral incluem vacina MAGE3 para melanoma e câncer de bexiga, vacina MUC1 para câncer de mama, EGFRv3 (por exemplo Rindopepimut) para câncer cerebral (incluindo glioblastoma multiforme), ou ALVAC-CEA (para cânceres CEA+).
[00223] Em certas modalidades, a terapia antitumoral pode ser usada em combinação com radioterapia em métodos para gerar respostas antitumorais duradouras de longo prazo e/ou aumentar a sobrevida de sujeitos com câncer. Em algumas modalidades, um inibidor de PD-1 ou PDL-1, por exemplo, um anticorpo anti-PD-1, pode ser administrado antes, concomitantemente ou após administrar a radioterapia a um sujeito com
79 / 120 câncer. Por exemplo, a radioterapia pode ser administrada em uma ou mais doses às lesões tumorais, seguido pela administração de uma ou mais doses de anticorpos anti-PD-1. Em algumas modalidades, a radioterapia pode ser administrada localmente a uma lesão tumoral para aumentar a imunogenicidade local do tumor de um sujeito (radiação adjuvante) e/ou matar células tumorais (radiação ablativa) seguido pela administração sistêmica de um anticorpo anti-PD-1. Por exemplo, a radiação intracraniana pode ser administrada a um sujeito com câncer cerebral (por exemplo, glioblastoma multiforme) em combinação com a administração sistêmica de um anticorpo anti-PD-1. Em certas modalidades, os anticorpos anti-PD-1 podem ser administrados em combinação com radioterapia e um agente quimioterapêutico (por exemplo, temozolomida) ou um antagonista VEGF (por exemplo, aflibercepte).
[00224] Em certas modalidades, o sujeito em necessidade do mesmo pode ser administrado com drogas antivirais para tratar a infecção viral causada, por exemplo, por LCMV, HIV, HPV, HBV ou HCV. Exemplos de drogas antivirais incluem, mas não estão limitados a, zidovudina, lamivudina, abacavir, ribavirina, lopinavir, efavirenz, cobicistat, tenofovir, rilpivirina e corticosteroides.
[00225] Em certas modalidades, o sujeito em necessidade do mesmo pode ser administrado com uma ou mais drogas antibacterianas para tratar a infecção bacteriana causada, por exemplo, por bactérias rickettsiais, bacilos, klebsiella, meningococcos e gonococcos, proteus, pneumonococos, pseudomonas, estreptococos, staphylococcos, serratia, Borriella, Bacillus anthricis, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium diphtheriae, Legionella, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis, Salmonella, Vibrio cholerae e Yersinia pestis. Exemplos de drogas antibacterianas incluem, mas não estão limitados a, penicilinas, tetraciclinas, cefalosporinas, quinolonas, lincomicinas, macrolídeos, cetolidas, sulfonamidas, glicopeptídeos,
80 / 120 aminoglicosídeos e carbapenêmicos.
[00226] Em certas modalidades, o sujeito em necessidade do mesmo pode ser administrado com uma ou mais drogas antifúngicas para tratar a infecção fúngica causada, por exemplo, por Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Blastomyces dermatitidis, Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, gênero Mucorales (mucor, absidia, rhizopus, etc.), Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis e Sporothrix schenkii. Exemplos de drogas antifúngicas incluem, mas não estão limitados a, anfotericina B, fluconazol, vorixonazol, posaconazol, itraconazol, voriconazol, anidulafungina, caspofungina, micafungina e flucitosina.
[00227] Em determinadas modalidades, o sujeito em necessidade do mesmo pode ser administrado com uma ou mais drogas antiparasitárias para tratar uma infecção parasitária causada, por exemplo, por Entamoeba spp., Enterobius vermicularis, Leishmania spp., Toxocara spp., Plasmodium spp., Schistosoma spp., Taenia solium, Toxoplasma gondii, e Trypanosoma cruzi. Exemplos de drogas antiparasitárias incluem, mas não estão limitados a, praziquantel, oxamniquina, metronidazol, tinidazol, nitazoxanida, desidroemetina ou cloroquina, furoato de diloxanida, iodoquinolina, cloroquina, paromomicina, pamoato de pirantel, albendazol, nifurtimox e benznidazol.
[00228] O(s) agente(s)/componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicional(is) pode(m) ser administrado(s) antes, simultâneo(s), ou após a administração do inibidor de CD8. Para fins da presente divulgação, tais regimes de administração são considerados a administração de um inibidor de CD8 "em combinação com" um segundo componente terapeuticamente ativo.
[00229] Em alguns aspectos, os métodos de tratamento compreendem selecionar um sujeito com uma infecção bacteriana, uma infecção viral, uma infecção fúngica ou uma infecção parasitária; determinar que um tecido
81 / 120 afetado no sujeito é positivo para CD8; e administrar uma ou mais doses de um agente terapêutico apropriado à infecção. Em determinadas modalidades, o tecido afetado é determinado como sendo positivo para CD8 através da administração de um conjugado de anti-CD8 radiomarcado da presente divulgação ao sujeito; e visualização do conjugado de anticorpo radiomarcado no sujeito por geração de imagens por PET, em que a presença do conjugado de anticorpo radiomarcado em um tecido indica que o tecido é positivo para CD8. Em certas modalidades, as etapas de administração e visualização são realizadas uma ou mais vezes para monitorar a eficácia do agente terapêutico no tratamento da infecção.
[00230] Em alguns aspectos, os métodos de tratamento compreendem selecionar um sujeito com um tumor sólido; determinar que o tumor é positivo para CD8 e positivo para PD-1 ; e administrar uma ou mais doses de um inibidor do eixo de sinalização PD-1/PD-L1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1). Em certas modalidades, o tumor é determinado como sendo positivo para CD8 através da administração de um conjugado de anti-CD8 radiomarcado da presente divulgação ao sujeito; e visualização do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor por geração de imagens por PET, em que a presença do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor indica que o tumor é positivo para CD8. Em certas modalidades, o tumor é determinado como sendo positivo para PD-1- através da administração de um conjugado anti-PD-1 radiomarcado da presente divulgação ao sujeito; e visualização do conjugado de anti-PD-1 radiomarcado no tumor por geração de imagens por PET, em que a presença do conjugado anti-PD-1 radiomarcado no tumor indica que o tumor é positivo para PD-1.
[00231] Anticorpos anti-PD-1 exemplares incluem REGN2810, BGB- A317, nivolumabe, pidilizumabe, e pembrolizumabe.
[00232] Exemplos de anticorpos anti-PD-L1 incluem: atezolizumabe,
82 / 120 avelumabe, durvalumabe, MDX-1105, e REGN3504, bem como aqueles divulgados na Publicação de Patente Nº US 2015-0203580.
[00233] Conforme usado neste documento, os termos "tratar", "tratando" ou similares, significam aliviar os sintomas, eliminar a causa dos sintomas seja em uma base temporária ou permanente, para retardar ou inibir o crescimento do tumor, para reduzir a carga de células tumorais ou carga tumoral, para promover a regressão do tumor, causar o encolhimento, necrose e/ou desaparecimento do tumor, prevenir a recorrência do tumor, prevenir ou inibir metástase, inibir o crescimento do tumor metastático e/ou aumentar a duração da sobrevida do sujeito.
[00234] De acordo com um aspecto, a presente divulgação fornece métodos para monitorar a eficácia de uma terapia antitumoral em um sujeito, em que os métodos compreendem selecionar um sujeito com um tumor sólido em que o sujeito está sendo tratado com uma terapia antitumoral; administrar um conjugado anti-CD8 radiomarcado da presente divulgação ao sujeito; gerar imagens da localização do conjugado radiomarcado administrado no tumor por geração de imagens por PET; e determinar o crescimento do tumor, em que uma diminuição do valor basal no sinal radiomarcado indica eficácia da terapia antitumoral. Em certas modalidades, a terapia antitumoral compreende um inibidor do eixo de sinalização PD-1/PD-L1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1).
[00235] Em certas modalidades, a presente divulgação fornece métodos para avaliar as alterações no estado inflamatório de um tumor, os métodos compreendendo a seleção de um sujeito com um tumor sólido em que o sujeito está sendo tratado com uma terapia antitumoral; administrar um conjugado anti-CD8 radiomarcado fornecido neste documento ao sujeito; e gerar imagens da localização do conjugado radiomarcado administrado no tumor por geração de imagens por PET, em que um aumento da linha de base no sinal radiomarcado indica aumento na inflamação e eficácia da terapia
83 / 120 antitumoral.
Em certas modalidades, a terapia antitumoral compreende um inibidor do eixo de sinalização PD-1/PD-L1 (por exemplo, um anticorpo anti- PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1). Em certas modalidades, a terapia antitumoral compreende um inibidor de PD-1 (por exemplo, REGN2810, BGB-A317, nivolumabe, pidilizumabe, e pembrolizumabe),um inibidor de PD-L1 (por exemplo, atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, MDX-1105, e REGN3504), inibidor de CTLA-4 (por exemplo, ipilimumab), um inibidor de TIM3, um inibidor de BTLA, um inibidor de TIGIT, um inibidor de CD47, um inibidor de GITR, um antagonista de outro co-inibidor ou ligante de células T (por exemplo, um anticorpo para CD-28, 2B4, LY108, LAIR1, ICOS, CD160 ou VISTA), um inibidor de indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), um antagonista do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) [por exemplo, um "VEGF-Trap", tal como aflibercept ou outra proteína de fusão que inibe VEGF, conforme estabelecido em US 7,087,411, ou um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, bevacizumabe ou ranibizumabe) ou um inibidor de quinase molecular pequena de receptor de VEGF (por exemplo, sunitinib, sorafenibe, ou pazopanibe)], um inibidor de Ang2 (por exemplo, nesvacumab), um inibidor do fator de crescimento de transformação beta (TGFβ), um inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, erlotinibe, cetuximabe), um inibidor de CD20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20, tal como rituximabe), um anticorpo para um antígeno tumor- específico [por exemplo, CA9, CA125, antígeno associado ao melanoma 3 (MAGE3), antígeno carcinoembrionário (CEA), vimentina, tumor-M2-PK, antígeno específico da próstata (PSA), mucina-1, MART-1 e CA19-9], uma vacina (por exemplo, Bacillus Calmette-Guerin, uma vacina contra o câncer), um adjuvante para aumentar a apresentação do antígeno (por exemplo, fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos), um anticorpo biespecífico (por exemplo, anticorpo biespecífico CD3xCD20, ou anticorpo
84 / 120 biespecífico PSMaxCD3), uma citotoxina, um agente quimioterapêutico (por exemplo, dacarbazina, temozolomida, ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, cisplatina, carboplatina, gencitabina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatina, paclitaxel e vincristina), ciclofosfamida, radioterapia, um inibidor de IL-6R (por exemplo, sarilumab), um inibidor de IL-4R (por exemplo, dupilumab), um inibidor de IL-10, uma citocina como IL-2, IL-7, IL-21 e IL-15 e um conjugado de anticorpo-droga (ADC) (por exemplo, anti-CD19-DM4 ADC e anti-DS6-DM4 ADC).
[00236] Conforme usado neste documento, o termo "referência", em relação à expressão de CD8 no tumor, significa o valor numérico de absorção do conjugado radiomarcado para um sujeito antes ou no momento da administração de uma dose de terapia antitumoral. A absorção do conjugado radiomarcado é determinada usando métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Oosting et al 2015, J. Nucl. Med. 56: 63-69). Em certas modalidades, a terapia antitumoral compreende um inibidor do eixo de sinalização PD-1/PD-L1.
[00237] Para determinar se há eficácia na terapia antitumoral, a absorção do conjugado radiomarcado é quantificada na linha de base e em um ou mais momentos após a administração do inibidor de CD8. Por exemplo, a absorção do conjugado de anticorpo radiomarcado administrado (por exemplo, conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado) pode ser medida no dia 2, dia 3, dia 4, dia 5, dia 6, dia 7, dia 8, dia 9, dia 10, dia 11, dia 12, dia 14, dia 15, dia 22, dia 25, dia 29, dia 36, dia 43, dia 50, dia 57, dia 64, dia 71, dia 85, ou ao final da semana 1, semana 2, semana 3, semana 4, semana 5, semana 6, semana 7, semana 8, semana 9, semana 10, semana 11, semana 12, semana 13, semana 14, semana 15, semana 16, semana 17, semana 18, semana 19, semana 20, semana 21, semana 22, semana 23, semana 24, ou mais, após o tratamento inicial com o eixo de sinalização PD-1/PD-L1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-1). A diferença entre o valor da absorção em
85 / 120 um momento específico após o início do tratamento e o valor da absorção na linha de base é usada para estabelecer se a terapia antitumoral é eficaz (regressão ou progressão tumoral).
[00238] Em determinadas modalidades, o conjugado de anticorpo radiomarcado é administrado por via intravenosa ou subcutânea ao sujeito. Em determinadas modalidades, o conjugado de anticorpo radiomarcado é administrado via intratumor. Após a administração, o conjugado de anticorpo radiomarcado é localizado no tumor. O conjugado de anticorpo radiomarcado localizado é fotografado por geração de imagens por PET e a absorção do conjugado de anticorpo radiomarcado pelo tumor é medida por métodos conhecidos na técnica. Em certas modalidades, a imagem é realizada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias após a administração do conjugado radiomarcado. Em certas modalidades, a imagem é realizada no mesmo dia após a administração do conjugado de anticorpo radiomarcado.
[00239] Em certas modalidades, o conjugado de anti-CD8 radiomarcado pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,1 mg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal do sujeito, por exemplo, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, ou cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 25 mg/kg, ou cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 1,0 mg/kg de peso corporal.
[00240] Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo se liga especificamente a CD8. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD8 compreende os CDRs de uma HCVR, em que a HCVR tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e CDRs de uma LCVR, em que a LCVR tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10. V. Usos Diagnósticos dos Anticorpos
[00241] O anticorpo anti-CD8 da presente divulgação também pode ser usado para detectar e/ou medir células que expressam CD8 ou CD8 em uma amostra, por exemplo, para fins de diagnóstico. Por exemplo, um anticorpo anti-CD8, ou fragmento do mesmo, pode ser usado para diagnosticar uma
86 / 120 condição ou doença caracterizada pela expressão aberrante (por exemplo, superexpressão, sub-expressão, falta de expressão, etc.) de CD8. Os ensaios de diagnóstico exemplares para CD8 podem compreender, por exemplo, colocar em contato uma amostra, obtida de um sujeito, com um anticorpo anti-CD8, em que o anticorpo é marcado com uma molécula repórter ou marcadora detectável. Alternativamente, um anticorpo anti-CD8 não marcado pode ser usado em aplicações diagnósticas em combinação com um anticorpo secundário que é identificado por si detectavelmente. A molécula repórter ou marcadora detectável pode ser um radioisótopo, como 3H, 14 C, 32 P, 35 S, ou 125 I; uma fração fluorescente ou quimioluminescente, tal como fluoresceína, ou rodamina; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase, peroxidase de rábano, ou luciferase. Ensaios exemplares específicos que podem ser usados para detectar ou medir CD8 em uma amostra incluem ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaio (RIA), imuno-PET (por exemplo, 89Zr, 64Cu, etc.) e separação de células ativada por fluorescência (FACS).
[00242] As amostras que podem ser usadas em ensaios diagnósticos de CD8, de acordo com a presente divulgação, incluem qualquer tecido ou amostra de fluido obtenível de um sujeito. Geralmente, os níveis de CD8 em uma amostra particular obtida de um indivíduo saudável (por exemplo, um sujeito não afligido por uma doença ou condição associada com níveis ou atividade anormais de CD8) será medido para estabelecer inicialmente uma linha de base, ou padrão, nível de CD8. Este nível de referência de CD8 pode então ser comparado com os níveis de CD8 medidos em amostras obtidas de sujeitos suspeitos de ter uma doença ou condição relacionada ao CD8.
[00243] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD8 é marcado com um radioisótopo, uma fração fluorescente, uma fração quimioluminescente ou uma enzima. O radioisótopo pode ser selecionado do grupo consistindo em 3H, 14 C, 32 P, 35 S, ou 125 Eu. A fração fluorescente ou
87 / 120 quimioluminescente pode ser selecionada do grupo que consiste em fluoresceína ou rodamina. A enzima pode ser selecionada do grupo que consiste em fosfatase alcalina, beta-galactosidase, peroxidase de rábano ou luciferase.
[00244] Em algumas modalidades, um ensaio compreende um anticorpo anti-CD8 descrito neste documento detectavelmente marcado com uma fração fluorescente ou uma fração quimioluminescente.
[00245] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD8 é conjugado com um corante fluorescente. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD8 é conjugado a um corante fluorescente quase infravermelho (NIR). Os corantes adequados incluem aqueles que fornecem alta sensibilidade para alvos de baixa expressão sob a aplicação de tomografia molecular de fluorescência. Em algumas modalidades, o corante é BODIPY-X630/650®, VivoTag®645, Alexa Fluor®647, VivoTag680®, AlexaFluor680®, AlexaFluor750®, IRDye800CW®, DyLight800, CF®660C, CF®660R, CF®790, e CF®800. Em algumas modalidades, o corante é IRDye 800CW. Em algumas modalidades, o corante é Vivotag680XL. Em algumas modalidades, o corante é IRDye 800CW e o DAR é de 0,10-1,00. Em algumas modalidades, o corante é Vivotag680XL e o DAR é 1-2. Em algumas modalidades, o corante é IRDye 800CW ou Vivotag680XL, e a pureza monomérica é >90, 95, 96, ou 97%, conforme determinado por SE-HPLC, com base nos métodos descritos no Exemplo 13.
[00246] Também são fornecidos os compostos que têm a seguinte fórmula: Ab-[D]n, em que Ab é um anticorpo anti-CD8 descrito neste documento ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e D é um corante fluorescente, e n é um número inteiro de 1-4. Em algumas modalidades, n é 1-
2. Em algumas modalidades, n é 1. Em algumas modalidades, D é:
88 / 120 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste. VI. Exemplos
[00247] Certas modalidades da divulgação são ilustradas pelos seguintes exemplos não limitantes. Exemplo 1: Geração de Anticorpos Humanos para CD8
[00248] Um imunogene que compreende DNA de CD8α e/ou DNA de CD8β pode ser usado para gerar anticorpos para CD8. Da mesma forma, um imunogene que compreende proteína CD8α e/ou proteína CD8β pode ser usado para gerar anticorpos para CD8. Em certas modalidades, os anticorpos são obtidos de camundongos imunizados com DNA de CD8α completo (por exemplo, SEQ ID NO: 17) e/ou DNA de CD8β (por exemplo, SEQ ID NO: 19), proteína CD8α completo (por exemplo, SEQ ID NO: 18) e/ou proteína CD8β (por exemplo, SEQ ID NO: 20), ou um fragmento de proteína CD8α e/ou proteína CD8β. Em algumas modalidades, os anticorpos são obtidos de camundongos imunizados com um peptídeo de fusão contendo CD8α e CD8β completo, ou um peptídeo de fusão contendo fragmentos de CD8α e CD8β.
[00249] Um anticorpo anti-CD8 exemplar foi obtido injetando um camundongo VELOCIMMUNE® (isto é, um camundongo manipulado compreendendo DNA que codifica regiões variáveis de cadeia leve pesada e kappa de imonoglobulina humana) com DNA de CD8α completo (SEQ ID NO: 17) e DNA de CD8β (SEQ ID NO: 19). As sequências de DNA causam expressão da proteína CD8 no camundongo e podem produzir alvos de
89 / 120 proteína mais estruturalmente precisos in vivo aos quais os anticorpos são gerados. A resposta imune do anticorpo foi monitorada por um imunoensaio CD8 específico. Quando uma resposta imune desejada foi obtida, os esplenócitos foram coletados e fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formar linhagens celulares de hibridoma. As linhagens celulares de hibridoma foram triadas e selecionadas para identificar linhagens celulares que produzem anticorpos CD8 específicos. Com o uso desta técnica, um anticorpo anti-CD8 quimérico (isto é, um anticorpo que possui domínios variáveis de humanos e domínios constantes de roedores) foi obtido. Uma versão totalmente humana do anticorpo pode ser feita substituindo a região constante de camundongo pela região constante humana. As sequências de aminoácido e ácido nucleico de região variável do anticorpo exemplar são fornecidos na Tabela 1 acima. O anticorpo anti-CD8 exemplar gerado de acordo com os métodos descritos acima é o anticorpo designado "mAb1".
[00250] As propriedades biológicas dos anticorpos exemplares gerados de acordo com os métodos deste Exemplo são descritas em detalhes nos Exemplos estabelecidos abaixo. Exemplo 2: Ligação de Anticorpo a CD8 conforme Determinado pela Ressonância Plasmônica de Superfície
[00251] Constantes de dissociação de equilíbrio (valores de KD) para ligação de hCD8α.mmh a mAbs anti-CD8 purificados foram determinados usando um biossensor de ressonância plasmônica de superfície em tempo real usando uma superfície de sensor de amina Sierra Sensors MASS-1 de alta capacidade derivada por acoplamento de amina com um anticorpo Fc anti- camundongo de cabra policlonal (GE, # BR-1008-38) para capturar mAbs anti-CD8 purificados. Os estudos de ligação de SPR foram realizados em um tampão composto de 0,01M de HEPES pH 7,4, 0,15M NaCl, 3mM EDTA, 0,05% v/v de Surfactante P20 (tampão de execução HBS-ET). Diferentes
90 / 120 concentrações de hCD8α com um tag C-terminal myc-myc-polihistidina (hCD8α.mmh, REGN3940) preparadas em tampão de execução HBS-ET (variando de 300 nM a 3,7 nM, diluições em 3 vezes) foram injetadas sobre a superfície capturada mAb anti-CD8 a uma taxa de fluxo de 50μL/minuto. A associação de hCD8α.mmh ao anticorpo monoclonal capturado foi monitorada por 4 minutos e a dissociação de hCD8α.mmh em tampão de execução de HBS-ET foi monitorada por 10 minutos. Todos os experimentos de cinética de ligação foram realizados a 25°C. As constantes de taxas de associação cinética (ka) e dissociação (kd) foram determinadas ajustando-se os sensorgramas em tempo real a um modelo de ligação de 1:1 usando o software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. A constante de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) e meia-vida dissociativa (t½) foram calculadas a partir das taxas constantes cinéticas como: KD = , e t½ =
[00252] Os parâmetros cinéticos de ligação para ligação de hCD8α.mmh ao anticorpo monoclonal anti-CD8 purificado a 25°C são mostrados na Tabela 2. Tabela 2. Características de Ligação de Anticorpo REGN #/Ab PID # ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) t1/2 (min) H2aM25428N 1,59E+05 5,19E-03 3,26E-08 2,2 Exemplo 3: Ligação celular por análise FACS
[00253] A citometria de fluxo foi realizada a fim de avaliar a ligação de anticorpos CD8 ou anticorpos de controle de isotipo a células T CD8 positivas humanas primárias e células T de macaco cynomolgus. Caracterização da ligação de anticorpo CD8 às células T humanas e de macaco:
[00254] PBMCs foram isoladas de pacotes de leucócitos humanos ou sangue integral de macaco cynomolgus. Subsequentemente, células T CD8 positivas foram isoladas de PBMCs humanos e de PBMCs de macaco cynomolgus, células T que eram CD4 e CD8 positivas foram isoladas.
91 / 120 a) Isolamento de células T CD8 positivas humanas de pacotes de leucócitos humanos:
[00255] Células T CD8 positivas humanas foram isoladas de um leucopack de sangue periférico de um doador saudável para testar a ligação de mAb1. Os pacotes de leucócitos humanos foram obtidos a partir do Centro Sanguíneo NY. O isolamento de PBMC foi realizado por centrifugação de gradiente de densidade usando tubos de 50 ml de SepMateTM e seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Resumidamente, 15ml de Ficoll- Paque PLUS foram colocados em camadas em tubos de 50ml de SepMateTM, seguido pela adição de 30 ml de leucócitos diluídos 1:2 com PBS. As etapas subsequentes foram seguidas de acordo como protocolo do fabricante SepMateTM. Após o isolamento de PBMC, células T CD8 positivas foram enriquecidas usando kits de microesferas CD8 humanas da Miltenyi Biotec seguindo o protocolo do fabricante. Células T CD8 positivas foram expandidas pela incubação de células com o Ativador T CD3/CD28 Dynabeads® humano em meio de cultura primário humano (meio X-Vivo 15 suplementado com 10% de soro bovino fetal e 0,01 mM de beta- mercaptoetanol). A IL-2 humana recombinante (50IU/ml) foi suplementada em meio de cultura 72 horas após incubação Dynabead CD3/CD28. Quando as células foram expandidas para o número de células necessário para análise de citometria de fluxo, as Dynabeads foram removidas por separação magnética e as células foram imediatamente usadas para determinar a ligação de anticorpos CD8 ou controles de isotipo. b) Isolamento de células T de Macaco Cynomolgus
[00256] Sangue integral de cynomolgus da BioreclamationIVT foi usado para isolar células T de macaco para análise de ligação de anticorpo. PBMCs foram isoladas usando tubos SepMate™ 15 e centrifugação de gradiente de densidade seguindo o protocolo do fabricante. Posteriormente, as células T foram enriquecidas usando o Kit de isolamento-T de Pan para
92 / 120 primatas não humanos (Miltenyi Biotech) seguindo o protocolo recomendado pelos fabricantes. Células T enriquecidas foram então ativadas e expandidas usando o kit de Ativação/Expansão de células T (Miltenyi Biotech) para primatas não humanos no meio de cultura primário de macaco (meio X-Vivo 15 suplementado com 10% de soro bovino fetal e 0,01 mM de beta- mercaptoetanol). Após 72 horas, a IL-2 humana recombinante (100 IU/ml) foi suplementada no meio de cultura primário e as células T foram expandidas por uma semana. Esferas magnéticas usadas para ativação e expansão de células T foram magneticamente removidas imediatamente antes da coloração das células com anticorpos de controle de isotipo ou CD8 . c) Análise de citometria de fluxo de ligação de anticorpo mAb1 a células T CD8 positivas humanas e de macaco cynomolgus.
[00257] mAb1 e anticorpos de controle de isotipo foram diluídos em série 4 vezes em tampão de coloração (PBS contendo 2% de FBS) em uma titulação de 8 pontos para células T CD8 positivas humanas ou titulação de 11 pontos para células T de macaco cynomolgus, começando a uma concentração de 200nM. Uma amostra sem anticorpo primário, apenas tampão de coloração, foi incluída como um controle. As titulações de anticorpos foram plaqueadas, 50ul/poço, em microplacas de fundo em V. Células T humanas e de macaco cynomolgus primárias foram coradas por 15 minutos com a Coloração de Célula Morta Violeta Fixável LIVE/DEAD™ (Invitrogen) diluída 1:1000 em PBS. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em PBS contendo 2% de FBS. Para delimitar células T CD4+ de macaco um anticorpo CD4 de BD Biosciences, que reage com células T CD4+ de cynomolgus, foi incubado com células T de macaco durante 30 min em gelo e as células foram posteriormente lavadas uma vez com tampão de coloração. Células T CD8 positivas humanas e de macaco em tampão de coloração foram plaqueadas de modo que 50ul de suspensão celular contendo aproximadamente 150,000 células T, foram adicionados nos poços da
93 / 120 microplaca de fundo em V de 96 poços contendo os anticorpos titulados. Os anticorpos foram, portanto, diluídos 2 vezes, as concentrações finais em conformidade variaram de 100nM a 24pM para anticorpos incubados com células T CD8 positivas humanas ou 100nM a 0,10pM para anticorpos incubados com células T de macaco. As células foram incubadas com anticorpo primário por 30 minutos em gelo, lavadas duas vezes com tampão de coloração (PBS complementado com FBS a 2%) e Anticorpo IgG anti- camundongo de cabra aloficocianina (APC) secundário foi adicionado a todos os poços em uma concentração de 2 µg/mL e incubado em gelo por 30 minutos. As amostras foram então lavadas uma vez com tampão de coloração e subsequentemente fixadas em BD Cytofix diluído com tampão de coloração 1:1. Após a remoção do tampão de fixação, as células foram ressuspensas em tampão de coloração e filtradas antes da análise no instrumento citometria de fluxo Citflex Beckman Coulter. As amostras foram analisadas com o software FlowJo10 de modo que apenas células simples viáveis CD8 positivas foram avaliadas para ligação com anticorpo. MFI geométrico de APC foi determinado e plotado contra concentrações de anticorpo e os valores de EC50 foram determinados com base em 8 pontos de dados para células T CD8 positivas humanas ou 12 pontos para células T de macaco, começando com 100 nM usando uma equação logística de quatro parâmetros em GraphPad Prism™. Resultados: Análise de citometria de fluxo de ligação de anticorpo mAb1 a células T CD8 positivas humanas e de macaco cynomolgus.
[00258] A capacidade do mAb1 para se ligar ao CD8 humano e de macaco foi avaliada por citometria de fluxo (Figura 1). Um anticorpo correspondente de isotipo irrelevante foi usado como um controle negativo nesses experimentos. Ligação dependente da dose de mAb1 foi observada em células T CD8 positivas humanas e de macaco. mAb1 exibiu um valor de
94 / 120 EC50 de 0,37 nM para células T CD8 positivas humanas com um aumento aproximado de 2,778 vezes em MFI em comparação ao anticorpo controle de isotipo a 25nM. mAb1 se ligou a células T de macaco cynomolgus com um valor de EC50 de 0,33nM e um aumento aproximado de 1,475 vezes em MFI em comparação ao controle de isotipo a 25nM. Ver Tabela 3. O isotipo controle não demonstrou ligação dependente da dose a células T humanas ou de macaco. Esses resultados indicam que mAb1 sofre reação cruzada com CD8 humano e de macaco e se liga ao CD8 de ambas as espécies com valores de EC50 semelhantes. Fold change = MFI geométrico a 25nM mAb1 MFI geométrico a 25nM de isotipo Tabela 3. Análise de citometria de fluxo de ligação mAb1 a células T CD8 positivas humanas e células T de macaco cynomolgus. mAb1 ligação celular Humano Macaco EC50 [nM] 0,37 0,33 Fold Change 2778 1475 Exemplo 4: Produção de IFNɣ alterado por células T ativadas na presença de mAb1
[00259] Células T são ativadas quando seu receptor de células T (TCR) reconhece especificamente o antígeno estranho apresentado por moléculas MHC em células alvo. Esta interação pode ser reforçada pela presença de co-receptores, tais como CD4 e CD8, em células T que se ligam a regiões não variáveis de MHCII ou MHCI, respectivamente, nas células alvo interagindo. Além disso, esses co-receptores têm um papel direto na modulação da atividade de células T através da associação de seu domínio citoplasmático com a proteína tirosina quinase Lck. Interferir com a interação entre co-receptores e moléculas de MHC pode impactar a atividade de células T. A fim de discernir se os anticorpos específicos de CD8 alteram a atividade de células T, foi empregado um ensaio de reação de linfócitos mistos (MLR). Um ensaio MLR é um meio in vitro, fisiologicamente relevante de células T
95 / 120 de ativação. Em um MLR unidirecional, os leucócitos de um sujeito são cocultivados com leucócitos com proliferação de outro indivíduo, geneticamente distinto. A incompatibilidade de determinantes alogênicas leva à ativação de células T, que pode ser avaliada pela produção e/ou proliferação de citocinas. As citocinas IFNγ e IL-2, bem como a proliferação, são comumente usadas como leituras para atividade de células T CD4+. No entanto, observou-se que a atividade de célula T efetora CD8 positiva é melhor refletida pela sua produção de IFNγ, enquanto IL-2 e proliferação podem ser o resultado de efeitos de observador e não estão diretamente relacionados à proporção de células T CD8 positivas ativadas (Anthony et al. 2012 - Dissecting the T Cell Response: Proliferation Assays vs. Cytokine Signatures by ELISPOT - Cells, 1, 127-140). Ensaio MLR de célula T CD8 positiva humana:
[00260] PBMCs foram isoladas de pacotes de leucócitos humanos e posteriormente processadas por isolamento negativo para obter células T CD8 positivas intocadas. Um ensaio MLR unidirecional foi realizado usando células T CD8 positivas para avaliar se mAb1 impacta a atividade de células T, indicado pela produção de IFNγ. Isolamento de PBMCs e células T CD8 positivas humanas de pacotes de leucócitos humanos:
[00261] PBMCs humanas foram isoladas de quatro leucócitos de sangue periférico de doadores saudáveis obtidos do Centro Sanguíneo de NY. O isolamento de PBMC foi realizado por centrifugação de gradiente de densidade usando tubos de 50 ml de SepMateTM e seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Resumidamente, 15ml de Ficoll-Paque PLUS foram colocados em camadas em tubos de 50ml de SepMateTM, seguido pela adição de 30 ml de leucócitos diluídos 1:2 com PBS. As etapas subsequentes foram seguidas de acordo como protocolo do fabricante SepMateTM. Uma fração das PBMC isoladas (>300 x 10^6) foi congelada em FBS contendo
96 / 120 10% de DMSO a uma concentração de 50 milhões de células por frasco. Com o restante de PBMCs, células T CD8 positivas foram enriquecidas usando kits de Isolamento de Célula T CD8 humana da Miltenyi Biotec seguindo o protocolo do fabricante. Células T CD8 positivas isoladas foram posteriormente congeladas em FBS contendo 10% de DMSO a uma concentração de 50 milhões de células por frasco. PBMCs e células T CD8 positivas foram descongeladas no dia da configuração de ensaio MLR no meio de cultura primário (meio X-Vivo 15 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 0,01 mM de beta-mercaptoetanol) contendo Benzonase Nuclease, em uma concentração de 50 milhões de células por 10 ml de meio de cultura primário contendo 500U de Benzonase Nuclease. Configuração do Ensaio MLR
[00262] O meio de cultura de célula primária (125ul/poço) foi plaqueado em cada poço de uma placa de microtitulação de fundo redondo. Uma diluição em série de 10 vezes em três pontos de mAb1 e anticorpo de controle de isotipo foi realizada em meios de cultura primários, iniciando em uma concentração de 400nM. A partir destes 25ul de anticorpo foi plaqueado em triplicado em poços de microplacas de fundo redondo. O anticorpo foi 1/8 do volume total em cada poço, produzindo concentrações finais de anticorpo 50nM, 5nM e 0,5nM. Poços sem anticorpo, somente meio de cultura primário, foram incluídos também como controles. Células T CD8 positivas isoladas negativamente de 3 doadores e PBMCs provenientes desses mesmos 3 doadores, bem como um doador adicional foram usados no ensaio MLR. PBMCs foram tratadas com mitomicina C diluída a 50ug/mL em meio de estimulação primária a uma concentração de 12 x 10^6 células/ml. Após incubação a37oC/5% CO2 por 1 hora, as PBMCs foram coletadas em tubos cônicos de 50 ml e lavadas um total de 3 vezes com meios de cultura celular primários. Essas células foram ressuspensas em uma concentração final de 12 x 10^6 células/ml em meio de cultura primário e 25ul foi adicionado aos
97 / 120 poços da placa de microtitulação de fundo redondo, levando a uma concentração final de 300.000 PBMCs por poço. Além disso, poços sem PBMCs, apenas meios e células T foram incluídos como um controle para determinar se as células T sozinhas poderiam produzir IFNγ. Células T foram preparadas a uma concentração de 7 x 10^6 células/ml em meio de cultura primário e 25ul foi plaqueado em poços da placa de microtitulação de fundo redondo, assim, a concentração final de células T em cada poço foi de 175,000. Poços sem células T, apenas meio, foram incluídos também para servir como controles para verificar que as PBMCs sozinhas não estavam contribuindo para produção de IFNγ. As células T de doado único e PBMCs tratadas com mitomicina C de doador único foram incluídas por poço. Cada uma das três células T doadoras foi emparelhada com seu próprio ou diferente PBMCs de doador . Após 72 horas de incubação a 37oC/5% CO2, placas de microtitulação foram centrifugadas para peletizar as células e 20ul de sobrenadante de meio foram coletados. A partir do sobrenadante coletado 5ul foi testado em um ensaio de IFNγ alphaLISA humano de acordo com o protocolo do fabricante. As medições foram adquiridas no leitor de placa multimodo Envision (PerkinElmer). Os valores de RLU brutos foram plotados em gráficos de barras em GraphPad Prism™ e a quantidade de produção de IFNγ nos poços contendo anticorpo foi comparada aos poços contendo apenas PBMCs e células T e calculada como inibição percentual da produção de IFNγ. Resultados:
[00263] A capacidade do mAb1 para impactar a atividade de células T CD8 foi medida pela produção de IFNɣ em um MLR unidirecional (Figura 2). Um anticorpo correspondente de isotipo irrelevante foi usado como um controle nesses experimentos. Resultados e imagens representativas abaixo, para dois pares diferentes de células T/PBMC, indicam que mAb1 é capaz de diminuir produção de IFNɣ de forma dependente da dose. A extensão desta
98 / 120 inibição parece ser dependente do doador como um par de doador/PBMC (reação MLR 1) exibe < 10% de inibição de IFNɣ a 5nM de tratamento com mAb1 , enquanto outro par doador/PBMC (reação MLR 2) apresenta >50% de inibição de IFNɣ. Em ambas as reações, o isotipo controle teve impacto mínimo em 5nM na produção de IFNɣ. Ver Tabela 4. Cálculo para % de Inibição de IFNɣ: Inibição de IFNγ Sinal RLU de mistura de PBMC/células T incubadas com 5nM de anticorpo Sinal RLU de mistura de células PBMC/T sem anticorpo Tabela 4. Inibição Percentual da Produção de IFNɣ Reação MLR 1 Reação MLR 2 Concentração de mAb1 Isotipo mAb1 Isotipo Anticorpo 0,5nM -11,4 0,5 29,8 2,3 5nM 7,6 3,9 51,6 3,4 50nM 21,4 -6,6 74,1 25,4 Exemplo 5: Atividade alterada de células T na presença de mAb1
[00264] Células T são ativadas quando seu receptor de células T (TCR) reconhece especificamente o antígeno estranho apresentado por moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) também conhecido como Antígenos de Leucócitos Humanos (HLA) em células apresentadoras de antígeno (APC). Esta interação pode ser reforçada pela presença de co- receptores, tais como CD4 e CD8, em células T que se ligam a regiões não variáveis de MHCII ou MHCI, respectivamente, no APC de interação. Além disso, esses co-receptores têm um papel direto na modulação da atividade de células T através da associação de seu domínio citoplasmático com a proteína tirosina quinase Lck (Goldrath et al., Selecting and maintaining a diverse T cell repertoire, Nature 402: 255-262, 1999; Denkberg et al.Critical Role for CD8 in Binding of MHC Tetramers to TCR: CD8 Antibodies Block Specific Binding of Human Tumor-Specific MHC-Peptide Tetramers to TCR, The Journal of Immunology, 2001, 167: 270-276; Cantrell et al.T cell Antigen Receptor Signal Transduction, Immunology, 2002, 105.4: 369–374; e Wang et al. 2009).
[00265] A molécula de CD8 existe como um homodímero (CD8αα) ou
99 / 120 heterodímero (CD8αβ) na superfície de subconjuntos de células do sistema imunológico. Em células TCRαβ T, a forma heteromérica CD8αβ é expressa. Interferir com a interação entre co-receptores e moléculas de MHC pode impactar a atividade de células T.
[00266] A fim de discernir se os anticorpos específicos de CD8 alteram a atividade de células T, foi empregado um bioensaio baseado em células T/APC. Manipulação de células T repórter:
[00267] Os eventos de sinalização de TCR podem ser monitorados por genes repórter, induzidos por vários fatores de transcrição, tais como ativador- proteína 1 (AP-1), fator nuclear de células T ativadas (NFAT) ou potencializador de cadeia leve kappa nuclear de células B ativadas (NFkb B) (Shapiro et al., Cutting Edge: Nuclear Factor of Activated T Cells and AP-1 Are Insufficient for IL-2 Promoter Activation: Requirement for CD28 Up- Regulation of RE/AP, The Journal of Immunology, 1998, 161 (12): 6455- 6458).
[00268] O clone de célula T humana, JRT3.T3.5 foi manipulado para expressar o gene repórter, luciferase de vagalume, sob o controle do fator de transcrição AP-1. As células resistentes a antibióticos foram adicionalmente manipuladas por transdução com CD28 humano, (NP_006130.1), subunidade alfa e beta de TCR 1G4 (Chen et al. 2000) e subunidade alfa e beta de CD8 humano (acesso alfa # NP_001759.3 e acesso beta # NP_004922.1). Um único clone foi gerado (clone 18 de JRT3.T3/AP1- Luc/CD28/CD8ΑB/1G4AB) e usado em experimentos de bioensaio repórter de células T/APC. A linhagem de células T repórter estabelecida foi mantida em RPMI + 10% de FBS + penicilina/estreptomicina/glutamina (P/S/G) suplementada com 100 ug/mL de higromicina + 500 ug/mL de G418 + 1 ug/mL de puromicina. Manipulação de APC:
100 / 120
[00269] A linhagem celular de fibroblastos de camundongo 3T3 foi manipulada para superexpressar de forma estável o alelo HLA-A*02 (acesso # P01892-1) e β2-microglobulina humana (hβ2M; Nº de Acesso NP_004039.1) juntamente com NY-ESO-1 157-165, um peptídeo restrito de HLA-A2*02 derivado de um antígeno câncer-testicular NY-ESO-1 (acesso # NP_001318.1).
[00270] A linhagem de APC estabelecida foi mantida em DME + 10% de P/S/G suplementado com 100ug/mL de higromicina + 500ug/mL de G418 + 1ug/mL de puromicina. Estímulo de células T/APC:
[00271] No bioensaio de complexo HLA-A2/NYESO1(157-165) MHCI/peptídeo desenvolvido no APC manipulado se liga e estimula o 1G4 TCR (Robbins et al.Single and Dual Amino Acid Substitutions in TCR CDRs Can Enhance Antigen-Specific T Cell Functions, J. Immunol. 2008; 180(9): 6116–6131) e leva a atividade trancricional de AP-1 na linhagem de células T repórter manipulada. O AP-1 por sua vez ativa a transcrição do gene repórter de luciferase, que é usado como a leitura do ensaio. Neste bioensaio, os anticorpos monoclonais CD8 foram testados para avaliar sua atividade de bloqueio. Configuração do Ensaio de Luciferase:
[00272] O RPMI1640 suplementado com FBS a 10% e P/S/G foi usado como meio de ensaio para preparar suspensões celulares e diluições de anticorpo para realizar a triagem de anticorpos anti-CD8 no dia do experimento.
[00273] Um dia antes do experimento, as células T repórter manipuladas foram cultivadas em meio de seleção a 5x10^5 células/mL. Foi preparada uma diluição em série de 10 pontos de 1:3 de anticorpos monoclonais anti-CD8 e controles negativos combinados de isotipo. A diluição dos anticorpos monoclonais variou entre 15 pM a 100 nM. O último
101 / 120 ponto de diluição não continha um anticorpo. Células T repórter durante a noite e células APC foram ressuspensas em meio de ensaio a 2x10^6/mL e 4x10^5/mL, respectivamente. Os reagentes foram adicionados na seguinte ordem a placas de fundo plano de 96 poços: diluições em série de anticorpos monoclonais foram pipetadas para poços correspondentes, seguido por 1x10^4 células/poço de células APC. As placas foram incubadas durante 15- 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as células T repórter de 5x10^4 foram adicionadas no topo do APC e as amostras foram incubadas durante mais 4-6 horas a 37°C/5% de CO2, antes da adição de 100uL de reagente ONE-Glo™ (Promega) para detectar a atividade de AP1-Luc. A luz emitida foi capturada em unidades de luz relativa (RLU) no leitor de placas Multilabel Enviosion (PerkinElmer). Todas as diluições em série foram testadas em duplicatas.
[00274] Os valores de EC50 dos anticorpos monoclonais CD8 foram determinados a partir de uma equação logística de quatro parâmetros ao longo de uma curva de dose-resposta de 10 pontos usando o software GraphPad Prism. A redução percentual da resposta de células T no bioensaio foi calculada conforme mostrado abaixo: % de Redução = 100% - [mAb de RLU médio a 100 nM x 100/RLU médio a 0 nM] Resultados:
[00275] A Tabela 5 e a Figura 3 mostram que mAb1 e o Clone RPA- T8 comercialmente disponível reduzem a atividade da luciferase em células T manipuladas com um IC50 de 1,2 nM e 161 pM, respectivamente. O isotipo 1 e o isotipo 2 não mostram uma inibição dependente da dose conforme esperado. A 100 nM, o mAb1 reduz a atividade de células T por volta de 89,7%, enquanto o Clone RPA-T8 bloqueia 97,9%. Em comparação com o Clone RPA-T8, o mAb1 bloqueia interação mais fraca de CD8/MHCI. Ambos os anticorpos mostraram ligar-se à subunidade CD8α humana em
102 / 120 experimentos de Biacore e ELISA. Tabela 5. IC50 e % de Inibição de resposta de células T por anticorpos monoclonais CD8 em ensaio de luciferase de células CD8 T/APC Anticorpo IC50 [M] Redução da resposta de células T a 100 nM [%] Isotipo 1 - 7,4 Isotipo 2 - 6,2 Clone RPA-T8 1,61E-10 97,9 mAb1 1,2E-09 89,7 Exemplo 6: Quantificação de LC-MS de CD8 em Xenoenxertos de Raji/PBMC e Amostras Clínicas
[00276] As amostras de tecido congelado (tumores Raji/PBMC, baços de camundongo e tecido de melanoma) foram lisadas em 1× Tampão de lise RIPA com inibidores da protease (Thermo Fisher Scientific). Os tecidos foram cortados em pedaços pequenos e foram homogeneizados com tampão de lise de 1 mL em um homogeneizador Dounce ajustado. O lisado foi incubado em gelo durante 30 minutos com sonicação durante 30 segundos a cada 10 minutos para atingir a extração completa de proteína. O lisado foi centrifugado a 14.000 g durante 10 minutos. A concentração de proteína foi medida pelo ensaio de BCA. Cada amostra foi diluída em 1 mg/mL, centrifugada a 14.000 g durante 10 minutos e armazenada em alíquotas a - 80°C.
[00277] Cem µL de proteína de ligação anti-CD8α Biotinilada (2 µg/mL) foi adicionada a cada poço de uma placa de 96 poços revestida com estreptavidina (Thermo Fisher Scientific). A placa foi então incubada à temperatura ambiente durante 2 horas, seguida por lavagem por 3 vezes com PBST (pH 7,4, 0,05% Tween-20). O lisado de baço de camundongo foi usado como matrizes substitutas para gerar a curva padrão para quantificação de CD8. CD8α.mmh recombinante foi contaminado em cada 100 μg de lisado de baço de camundongo em uma concentração final que varia dentre 0,39 a 100 ng/mg de proteína (diluição em série de 1:2). Cem µL da amostra testada foi aplicada em cada poço e foi incubada à R.T. durante 2 horas. Cada poço foi
103 / 120 então lavado com 200 µL de PBST por 3 vezes e com 200 µL de ddH2O uma vez. O CD8 capturado foi eluído com 100 µL de tampão de eluição (3% de ácido fórmico em 50% de ACN) e completamente seco após transferência para uma nova placa de 96 poços.
[00278] Cada amostra foi desnaturada em 10 μL de 8M de tampão de ureia/TCEP a 37°C durante 1 hora. Um peptídeo de assinatura (AAEGLDTQR) de CD8α foi seletivamente monitorado e o peptídeo marcado com isótopo pesado correspondente (mesma sequência AA com Arg-13C615N4/ Lys-13C615N2) foi adicionado em cada amostra como um padrão interno. As amostras padrão e de teste foram alquiladas com 5μM de IAA em R.T. durante 30 minutos e digerida por lys-C (1:100 p/p) durante 4 horas e, então, por tripsina (1:20 p/p) durante a noite a 37°C. A digestão foi interrompida pela adição de 10% de ácido fórmico a cada amostra.
[00279] Cada amostra processada (15μL) foi injetada em uma coluna nano-trap C18 pré-equilibrada e os peptídeos foram separados por uma coluna de separação fácil nano C18 seguida por análise de monitoramento de reação paralela (PRM) usando um espectrômetro de massa Q Exactive plus. A curva de calibração de cada proteína foi estabelecida pelo gráfico da razão de área de pico de L/H contra a concentração do peptídeo de contaminação. A abundância do CD8α endógeno em cada amostra de tecido foi calculada com base nas curvas de calibração. A concentração mais baixa do padrão de referência de CD8α.mmh (equivalente a 0,96 ng/mg de CD8α endógeno) estava dentro do intervalo dinâmico do ensaio e foi definida como o LLOQ do ensaio (limite inferior de quantificação). Resultados:
[00280] A expressão de CD8α foi analisada em 5 dos tumores e baços de camundongos implantados com PBMC/Raji, 2 tumores e baços de camundongos implantados somente com Raji, 10 amostras clínicas de melanoma e 5 tecidos adjacentes normais de melanoma (NAT). Os pesos de
104 / 120 tecido, quantidades de proteína, rendimento de extração e expressão de CD8 foram listados na Tabela 6. Bmax foi calculado com base na seguinte equação com uma estimativa da densidade do tumor a 1 g/mL. CD8 (ng/mg proteína) × Quantidade Total de Proteína (mg) × 10E6 Bmáx (nM) = 2,57 *10E4 × Peso Tumoral (mg) Tabela 6. Pesos de Tecido, Quantidades de Proteína, Rendimento de Extração e Expressão de CD8 Rendiment Peso CD8α Proteína o da CD8_Bmáx Tipo de Tecido Amostra Tumoral (ng/mg de (mg) Proteína (nM) (mg) proteína) (%) Melanoma 131778T2(5) 250 24,1 9,6 29,4 55,2 Melanoma 13841T2(1) 220 20,1 9,1 37,2 66,1 Melanoma 13765T2(2) 250 19,4 7,8 4,5 6,8 Melanoma 13524T2(7) 200 13,0 6,5 36,9 46,6 Melanoma 13547T2(1) 220 16,1 7,3 32,9 46,8 Melanoma 131086T6(1) 180 9,3 5,2 11,1 11,2 Melanoma 131719T2(3) 230 17,6 7,7 9,3 13,9 Melanoma 131291T2(1) 240 17,4 7,3 30,5 43,1 Melanoma 131815T2(3) 290 9,1 3,1 29,0 17,7 Melanoma 131778T2(5) 180 9,2 5,1 2,5 2,5 NAT 131291T1(1) 270 8,9 3,3 1,6 1,1 NAT 131086T1(1) 280 5,9 2,1 1,5 0,6 NAT 131719T1(2) 250 4,1 1,6 2,3 0,7 NAT 13841T1(1) 250 6,6 2,6 1,9 1,0 NAT 13788T1(2) 170 10,9 6,4 1,9 2,4 Tumor somente M6T 140 7,2 5,2 0,1 0,1 de Raji Tumor somente M7T 290 13,1 4,5 0,1 0,1 de Raji Tumor de M13T 320 12,7 4,0 15,0 11,6 Raji/PBMC Tumor de M14T 310 14,4 4,7 10,6 9,6 Raji/PBMC Tumor de M19T 370 17,0 4,6 6,1 5,5 Raji/PBMC Baço somente M6S 31 2,1 6,7 0,0 0,0 com Raji Baço somente M7S 28 2,0 7,2 0,0 0,0 com Raji Baço com M13S 20 1,3 6,7 6,2 8,0 Raji/PBMC Baço com M14S 16 1,3 7,9 0,6 0,9 Raji/PBMC Baço com M19S 27 1,9 7,0 1,8 2,5 Raji/PBMC Baço com M21S 29 1,8 6,3 2,0 2,5 Raji/PBMC Exemplo 7: Conjugação do mAb1 de anticorpo anti-CD8 com p-SCN-Bn-
DFO
[00281] Para modificar o anticorpo anti-CD8 parental, mAb1 (tendo
105 / 120 um par de sequência HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 2/10) e um anticorpo de controle de isotipo para ser adequado para estudos ImmunoPET com radiomarcação, um quelante, p-SCN-bn-Deferoxamina (DFO; Macrocylics, Cat #: B-705), foi ligado aos anticorpos.
[00282] Para a modificação, o mAb1 foi concentrado a aproximadamente 29 mg/mL em PBS + 5% de glicerol com um concentrador rotativo MWCO de 10K (Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, EMD Millipore, Cat #: UFC901024). A concentração foi determinada por um espectrômetro UV/VIS Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) usando o coeficiente de extinção com base em sequência MacVector de 212,400 M- 1 cm-1 e peso molecular 145,654 g/mol. Cinco miligramas do anticorpo concentrado foram diluídos a 10 mg/mL com 100 mM de NaCO3, pH 9,0 (o pH final foi confirmado como sendo 9,0).
[00283] Em um frasco separado, DFO foi preparado em sulfóxido de dimetil puro (DMSO) em uma concentração de DFO de 50 mM. Esta solução DFO foi adicionada à solução de anticorpo em incrementos de ¼, de modo que a composição de solução final foi de 10 mg/mL de mAb1 em tampão de conjugação, 2% de DMSO com excesso de 3 vezes em mol para mol de DFO. Esta solução foi deixada incubar em um banho de água de 37°C sem agitação adicional. Após 30 minutos a 37˚C, a solução foi imediatamente passada através de uma coluna de dessalinização de NAP-5 (GE Healthcare, Cat. Nº 17-0853-02), pré-equilibrada com um tampão contendo 10 mM de histidina em pH 5,5 (tampão de formulação). A solução final foi esterilizada estéril através de um filtro de seringa (filtro Acrodisc de seringa de 13 mm, Pall Corporation, Cat #: 4602).
[00284] A concentração de anticorpo e Razão de DFO para Anticorpo (razão de fração quelante para anticorpo) foi, em seguida, medida por espectroscopia UV/VIS. Ver a Figura 4. Para a medição da absorbância, o anticorpo conjugado com DFO foi medido contra o tampão de formulação a
106 / 120 252 nm (A252), 280 nm (A280) e 600 nm (A600). Para o cálculo, o fundo foi corrigido em cada valor de absorbância usando a equação:
[00285] A concentração de anticorpo, a concentração de conjugado e a razão de fração quelante para anticorpo foram calculadas usando as equações abaixo: Cálculo da Concentração de Anticorpo Conc. de mAB (mg/mL) = *MW Cálculo da Concentração de Conjugado Conc. de Conjugado (mg/mL) = *MW Cálculo da Razão de Fração Quelante para Anticorpo
[00286] O conjugado de anticorpo foi testado para agregação usando cromatografia líquida de alta performance (SE-HPLC) por exclusão de tamanho, com 25 ug da amostra injetada em uma coluna GL 10/300 de Superdex 200 Increase (GE Healthcare, Cat. Nº 28990944)monitorada em 280 nm com uma fase móvel de PBS (0,75 mL/min). Ver a Figura 5. A integridade do anticorpo foi avaliada por eletroferogramas de microfluidos GXII (Caliper, Chip ID: P099P-0563N-03) e foi configurada de acordo com as instruções do fabricante. Ver a Figura 6. Resultados:
[00287] mAb1 foi conjugado com sucesso através de lisina com DFO, conforme mostrado pela espectroscopia UV/VIS. A razão de fração quelante para anticorpo calculada de 1,7 era dentro do intervalo esperado de 1,0 a 2,0. Os traços da SEC mostram 97,5% de produto monomérico sem espécies de peso molecular mais baixo detectáveis. Este resultado é corroborado por eletroferogramas de ambos os estados reduzido e não reduzido. Tabela 7. Coeficientes de Extinção e Peso Molecular do Anticorpo Nu.
107 / 120 Lote de mAb Parental MW (gmol-1) Ɛ280 (M-1cm-1) Ɛ252 (M-1cm-1) mAb1-L1 145654 212400 80493 Tabela 8. Razão de Fração Quelante para Anticorpo, Concentração e Pureza Monomérica de Conjugado. Lote de Conjugado Razão de Fração Concentração % Monomérica Quelante UV para (mg/mL) Anticorpo mAb1-L2 1,68 5,57 97,5% 89 Exemplo 8: Quelação de Zr de anticorpos monoclonais conjugados de
DFO
[00288] Para uso em estudos in vivo ImmunoPET, o anticorpo anti- CD8 conjugado com DFO, mAb1-L2, foi radiomarcado com 89Zr.
[00289] As soluções imunoconjugadas de DFO-Ab foram formuladas antes da quelação de forma idêntica para os números de Estudo 1 e 2. A composição da formulação está listada na Tabela 9. Em resumo, o imunoconjugado de DFO-Ab (212 ug) foi primeiramente trazido a 1,06 mg/mL em 1 M de HEPES, pH 7,2. Separadamente, uma solução de 89Zr foi preparada usando as composições para cada estudo correspondente mostrado na Tabela 10. A solução de ácido 89Zr-oxálico estoque foi obtida a partir de imagem 3D. A radioatividade final da solução foi confirmada primeiramente usando um calibrador de dose Capintec CRC-25R (Capintec #502), em seguida, combinada imediatamente com a solução de imunoconjugado de DFO-Ab, misturada lentamente (pipetando para cima e para baixo) e, em seguida, incubada durante 45 minutos à temperatura ambiente. O volume total da reação foi de 1200 uL.
[00290] Após a incubação, as misturas foram transferidas para as colunas de dessanilização, PD-10 (GE Healthcare, Cat. #: 17-0851-01) pré- equilibrado com 250 mM de acetato de sódio em pH 5,4 para dessalinização alimentada por gravidade. Após o conteúdo da reação entrar no leito da coluna, o fluxo foi descartado. O produto foi eluído com 250 mM de acetato de sódio em pH 5,4 (tampão de formulação) e o eluato foi coletado conforme as instruções do fabricante. A concentração do produto, agora referida como
108 / 120 radioimunoconjugado de DFO-Ab, foi, em seguida, medida por espectroscopia UV/VIS e calculada usando o coeficiente de extinção adequado e a absorção a 280 nm usando a equação: Concentração em mg/mL = Absorção a 280 nm ÷ coeficiente de extinção a 280 nm
[00291] Ver Tabela 11.
[00292] A massa final medida em gramas foi registrada na Tabela 12. A radioatividade foi então medida usando o calibrador de dose (Capintec, CRC-25R) e relatada na Tabela 12. O material final (5 ug) foi analisado usando uma SEC-HPLC com UV 280 e detector de radioisótopo (emissão gama) conectado em série (Agilent 1260 com Detector Lablogic-TLC/HPLC, SCAN-RAM) usando uma coluna GL 10/300 Superdex 200 Increase Coluna (GE Healthcare, Cat. Nº 28990944) com fase móvel PBS a uma taxa de fluxo de 0,75 mL/min. O elemento radiotraçado foi usado para determinar a pureza 89 radioquímica (100% - porcentagem de Zr não marcado) comparando a 89 integração do pico de proteína total (~10 a ~18 min) e pico de Zr não marcado (~ 25 min). A porcentagem de pureza monomérica foi determinada pelo traço UV 280 comparando a integração do pico de espécies de alto peso molecular (HMW) (~10 min a ~ 15 min) ao monômero (~15 a ~18 min).
[00293] A atividade específica e recuperação de proteína (%) de cada radioimunoconjugado de DFO-Ab foi determinada usando as seguintes equações: a. Massa de Conjugado em mg = Concentração em mg/mL x Massa de Solução em Gramas b. Atividade Específica em mCi/mg = Atividade do Frasco em mCi ÷ Massa de Conjugado em mg c. Recuperação de Proteína = Massa de Conjugado (mg) ÷ Massa de Conjugado em mg
[00294] Finalmente, a aparência foi observada e registrada na Tabela
109 / 120
12. Os resultados são consolidados na Tabela 12. Os cromatogramas de rádio- SEC-HPLC, mostrados nas Figuras 7 e 8, confirmam pelo menos 99,9% de pureza radioquímica. Os cromatogramas de SEC de UV280-HPLC mostrados nas Figuras 9 e 10 confirmam o produto altamente monomérico (>90%).
[00295] Os dados demonstram que o radioimunoconjugado de DFO foi radiomarcado com sucesso e consistentemente com 89Zr em ambos os estudos. Tabela 9. Preparação do Conjugado de Anticorpo-DFO para Radiomarcação Razão de Lote de Fração Massa do Concentra Radiomarcaç Estudo Imunoconjuga Concentraçã Volume Quelante Conjugad ção Final ão # # do de DFO- o (mg/mL) total (uL) para o (mg) (mg/mL) Ab # Anticorpo 1&2 1&2 mAb1-L2 5,57 1,68 212 200 1,06 89 Tabela 10. Preparação da Solução de Reação de Zr para Radiomarcação 89 1 M de Atividade Radiomarca Zr-oxalato Vol. final Atividade Estudo # HEPES, pH Específica ção (uL) (uL) Final (uCi) 7,2 (uL) (uCi/uL) 1 1 8,0 992,0 1000 5220 5,220 2 2 6,8 993,2 1000 1607 1,607 Tabela 11: Coeficientes de Extinção para Lotes Conjugados Conjugado de DFO-Ab Ɛ280 (AU ml mg-1 cm-1) mAb1-L2 1,68 Tabela 12: Resumo de Imunoconjugados de DFO-Ab Marcados com 89Zr para Estudos de Imagem e Biodistribuição In Vivo
[00296] Recuperaçã Lotes de Pureza ureza Conc. Atividade Radiomar Estudo o de Radioimunoconj Aparência radioquími monoméri (mg/mL específica cação # Proteína ugados ca* (%) ca** ) (mCi/mg) (%) (%) 1 1 mAb1-L2-111016 Puro >99,9 98,5 71 0,085 24,8 2 2 mAb1-L2-111516 Puro >99,9 98,6 72 0,087 7,19 * por radio-SEC-HPLC, ** por UV-SEC-HPLC Exemplo 9: Imunorreatividade
[00297] A imunorreatividade (IR) do anticorpo anti-CD8 radiomarcado preparado de acordo com os Exemplos 7 e 8 foi determinada da seguinte forma. Todos os tampões/lavagens de soluções foram feitos com PBS e 10%
110 / 120 de soro de feto bovino (Seradigm, Cat # 1500-500). A Tabela 13 fornece o número de células usadas para cada ensaio de IR. Para cada ensaio, ~107 Células JRT3.T3/AP1-luc/hCD28/hCD8ΑB 1G4 foram trazidas a um volume final de 0,5 mL. Vinte ng do respectivo radioimunoconjugado de DFO-Ab foi adicionado a esta solução e incubado durante 45 minutos a 37°C, 5% de CO2 em uma incubadora (ThermoScientific, Forma Esteri-Cycle CO2) com mistura contínua em um rotador de tubos. As células foram então giradas a 1500 rpm durante 5 minutos, criando "pélete celular A". O sobrenadante (~0,5 mL) foi removido e introduzido em outro pélete de células não expostas, chamado de "pellet celular B", e deixado incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 45 minutos novamente. Enquanto o pélete celular B estava em incubação, o pélete celular A foi enxaguado três vezes com 1 mL de meio fresco, girando a 1500 rpm durante 5 minutos. Cada enxágue foi coletado e guardado para análise posterior. Após o tempo de incubação do pélete celular B de 45 minutos, o mesmo foi, em seguida, enxaguado três vezes com 1 mL de meio fresco, girando a 1500 rpm durante 5 minutos. Novamente, cada enxágue foi coletado para análise.
[00298] A radioatividade dos péletes celulares, todos os enxágues e o sobrenadante foram contados em um contador gama automático (2470 Wizard2, Perkin Elmer) para cada imunorradioimunoconjugado. A porcentagem de IR foi determinada pela equação 1 e registrada na Tabela 14:
[00299] Como pode ser visto na Tabela 14, os radioimunoconjugados de anticorpo retiveram pelo menos 55% de imunorreatividade após a conjugação e a radiomarcação. Tabela 13. Números de Células Usados por Pélete para Cada Lote de Radioimunoconjugado Lote de Radioimunoconjugado # Número de Células no Pélete Número de Células no Pélete
A B mAb1-L2-111016 2,25 *107 células 2,25*107 células mAb1-L2-111516 1,5*107 células 1,5*107 células
111 / 120 Tabela 14. Imunorreatividade de Conjugados de DFO Quelados com 89Zr Amostras mAb1-L2-111016 mAb1-L2-111516 Imunorreatividade 57% 55% Exemplo 10: Localização Seletiva do Anticorpo Anti-CD8 Radiomarcado In Vivo em Camundongos que expressam hCD8 Dosagem e geração de imagens por PET/CT de 89Zr-DFO-mAb1:
[00300] Os camundongos de 16 semanas de idade que expressam hCD8 foram injetados com 89Zr-DFO-mAb1 em uma dose de proteína de 0,5 ou 1,5 mg/kg. Os camundongos injetados com uma dose de 0,5 mg/kg receberam 7 µg de mAb1-L2-20161115 radiomarcado (~48 µCi) e 8 µg adicionais de mAb1 não conjugado com DFO (L1) como suplemento para produzir a dose final de proteína injetada total. Os camundongos injetados com uma dose de 1,5 mg/kg receberam 7 µg de mAb1-L2-20161115 radiomarcado (~48 µCi) e 38 µg adicionais de mAb1 não conjugado com DFO (L1) como suplemento para produzir a dose final de proteína injetada total.
[00301] A geração de imagens por PET da localização do anticorpo foi 89 avaliada 6 dias após a administração de Zr-DFO - mAb1. Um Sofie Biosciences G8 PET/CT foi usado para adquirir imagens por PET/CT (Sofie Biosciences e Perkin Elmer). O instrumento foi pré-calibrado para detecção 89 de Zr antes da aquisição da imagem. A janela de energia variou de 150 a 650 kEv com uma resolução reconstruída de 1,4 mm no centro do campo de visão. Os camundongos foram submetidos à anestesia por indução usando isoflurano e foram mantidos sob fluxo contínuo de isoflurano durante a geração de imagens. Imagens estáticas de 10 minutos foram adquiridas usando o software de aquisição G8 e, em seguida, reconstruídas usando as configurações pré-configuradas. Os dados da imagem foram corrigidos para o decaimento e outros parâmetros. As imagens de CT foram adquiridas após a aquisição de PET e, em seguida, co-registradas com as imagens por PET. As imagens foram preparadas usando software de pós-processamento VivOquant
112 / 120 (inviCRO Imaging Services). Biodistribuição de 89Zr-DFO-mAb1:
[00302] Para estudos de biodistribuição, os camundongos foram 89 sacrificados no ponto de tempo final (6 dias após a administração de Zr- DFO-mAb1) e o sangue foi coletado através de punção cardíaca. Os tecidos foram extirpados, colocados em tubos de contagem e pesados. Os dados de contagem para 89Zr em contagens por minuto (CPM) foram adquiridos usando um contador gama automático (Wizard 2470, Perkin Elmer). A porcentagem de dose injetada por grama (%ID/g) foi calculada para cada amostra usando padrões preparados a partir do material injetado. Resultados: 89
[00303] Este experimento demonstrou a capacidade de Zr-DFO - mAb1 de direcionar CD8 humano expresso em células T endógenas no baço e linfonodos de camundongos que expressam hCD8. A dose de proteína mais baixa de 0,5 mg/kg administrada demonstrou depuração mediada por antígeno mais rápida do sangue no dia 6 após a injeção do radiotraçador (3,57 ± 1,50% ID/g) em comparação com a dose de proteína mais alta de 1,5 mg/kg administrada (10,32 ± 1,54% ID/g). Esta liberação mais rápida do sangue em camundongos injetados com a dose de proteína mais baixa administrada pode ser atribuída à maior absorção em órgãos linfoides secundários do que os camundongos injetados com a dose de proteína mais alta administrada, demonstrando direcionamento específico ao antígeno para CD8 expresso no baço e linfonodos. Os valores de %ID/g da biodistribuição no dia 6 após a 89 injeção de Zr-DFO-mAb1 em camundongos que expressam hCD8 são mostrados na Tabela 15. As Imagens iPET representativas de 0,5 e 1,5 mg/kg de 89Zr-DFO -mAb1 no dia 6 após a injeção em camundongos que expressam hCD8 são mostrados na Figura 11. Tabela 15. Biodistribuição Ex Vivo no Dia 6 Após a Administração de 89Zr- DFO-mAb1 Injetado em uma Dose de Proteína de 0,5 ou 1,5 mg/kg a
113 / 120 Camundongos que Expressam hCD8. 0,5 mg/kg (n = 3) 1,5 mg/kg (n = 3) AMOSTRA [00304] [00305] [00306] [00307] édia ESVIO PADRÃO édia ESVIO PADRÃO %ID/g %ID/g %ID/g %ID/g Sangue 3,57 1,50 10,32 1,54 Ing LNs 85,30 24,35 71,00 17,83 Axil LNs 103,56 7,00 65,71 12,13 Baço 105,51 18,60 37,07 4,80 Timo 9,63 0,93 13,83 0,53 Coração 1,28 0,23 2,81 0,46 Pulmões 4,11 2,68 6,63 0,94 Estômago 0,64 0,17 0,70 0,20 Intestino S 6,28 2,42 4,78 1,06 Fígado 5,05 1,92 3,97 0,44 Rins 10,00 0,96 6,44 0,69 Músculo 0,47 0,21 0,84 0,20 Osso 3,73 0,55 4,16 0,51 Razão de Axil LNs 32,67 14,15 6,35 0,39 para Sangue Razão de Baço para 31,93 8,72 3,6 0,14 Sangue
[00308] Os valores são mostrados como médias e desvios padrão de percentual de dose injetada por grama de tecido (%ID/g) e razões de tecido para sangue. (n = 3 para ambas as doses de proteína de 0,5 e 1,5 mg/kg). Abreviações: Ing LNs – linfonodos Inguinais; Axil LNs – linfonodos axilares; Intestino S – intestino delgado. Exemplo 11: Localização Seletiva de Anticorpo Anti-CD8 Radiomarcado para Tumores Raji/PBMC em Camundongos
[00309] Este exemplo descreve a geração de imagens in vivo e a biodistribuição ex vivo de um conjugado de DFO-anticorpo anti-CD8 marcado com Zircônio-89 em camundongos NSG fêmeas co-implantados com células Raji e PBMC humano. Implantação de Tumores e Alocação de Grupos de Dosagem:
[00310] Para demonstrar especificidade do anticorpo radiomarcado para direcionamento de CD8, 2 x 106 Células Raji foram implantadas sozinhas ou co-implantadas com 5 x 105 PBMCs humanas (Lote 0160614, ReachBio Research Labs) no flanco direito de camundongos fêmeas NSG (8 – 10 semanas de idade; NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ; Jackson Labs). O
114 / 120 crescimento do tumor foi monitorado e 13-14 dias após o implante do tumor de camundongos foram randomizados em grupos de 4 para dosagem de 89Zr- DFO -mAb1. Tumores Raji e Raji/hPBMC foram ~335 ± 68 mm3 e ~371 ± 40 mm3, respectivamente, quando administrado com 89Zr-DFO -mAb1. Dosagem e Geração de Imagens por PET/CT de 89Zr-DFO-mAb1:
[00311] Os camundongos portadores de tumores Raji ou Raji/hPBMC subcutâneos foram injetados com uma dose de 0,1 mg/kg de 89Zr-DFO-mAb1 (~66 µCi e 2,8 µg de proteína).
[00312] A geração de imagens por PET da localização do anticorpo foi 89 avaliada 6 dias após a administração de Zr-DFO-mAb1. Um Sofie Biosciences G8 PET/CT foi usado para adquirir imagens por PET/CT (Sofie Biosciences e Perkin Elmer). O instrumento foi pré-calibrado para detecção 89 de Zr antes da aquisição da imagem. A janela de energia variou de 150 a 650 kEv com uma resolução reconstruída de 1,4 mm no centro do campo de visão. Os camundongos foram submetidos à anestesia por indução usando isoflurano e foram mantidos sob fluxo contínuo de isoflurano durante a geração de imagens. Imagens estáticas de 10 minutos foram adquiridas usando o software de aquisição G8 e, em seguida, reconstruídas usando as configurações pré-configuradas. Os dados da imagem foram corrigidos para o decaimento e outros parâmetros. As imagens de CT foram adquiridas após a aquisição de PET e, em seguida, co-registradas com as imagens por PET. As imagens foram preparadas usando software de pós-processamento VivOquant (inviCRO Imaging Services). Biodistribuição de 89Zr-DFO-mAb1:
[00313] Para estudos de biodistribuição, sangue foi coletado através de punção cardíaca após a varredura final de PET em 6 dias após a administração de 89Zr-DFO-mAb1). Os camundongos foram sacrificados e tumores Raji ou Raji/hPBMC, juntamente com outros tecidos normais, foram então extirpados, colocados em tubos de contagem e pesados. Os dados de
115 / 120 contagem para 89Zr em contagens por minuto (CPM) foram adquiridos usando um contador gama automático (Wizard 2470, Perkin Elmer). A porcentagem de dose injetada por grama (%ID/g) foi calculada para cada amostra usando padrões preparados a partir do material injetado. Resultados:
[00314] Este estudo demonstra direcionamento específico ao antígeno de 89Zr-DFO-mAb1 a CD8 expresso em linfócitos humanos intratumorais em s.c. Tumores Raji/hPBMC (31,11 ± 8,82% ID/g) em comparação com apenas tumores Raji (6,39 ± 0,93% ID/g) cultivados em camundongos NSG. As razões de tumor para sangue de Raji/hPBMC e tumores somente Raji foram de 3,32 ± 0,11 e 0,43 ± 0,07, respectivamente. Além disso, há uma maior absorção nos baços de camundongos que foram co-implantados com tumores Raji/hPBMC. Imagens de iPET representativas (Figura 12) de camundongos 89 portadores do tumor de Raji e Raji/hPBMC no dia 6 após injeção de Zr- DFO-mAb1 demonstra maior direcionamento de 89Zr-DFO-mAb1 ao tumor e baço dos camundongos portadores do tumor de Raji/hPBMC em comparação com camundongos portadores do tumor de Raji. Os valores de %ID/g da 89 biodistribuição no dia 6 após a injeção de Zr-DFO-mAb1 (Tabela 16) confirma os dados de geração de imagens de iPET. Tabela 16. Biodistribuição Ex Vivo no Dia 6 Após a Administração de 89Zr- DFO-mAb1 Injetado em uma Dose de Proteína de 0,1 mg/kg a Camundongos NSG Portadores do tumor de Raji ou Raji/hPBMC. Camundongos Portadores do Tumor Camundongos Portadores do Tumor de Raji de Raji/hPBMC AMOSTRA Média DESVIO PADRÃO Média DESVIO PADRÃO %ID/g %ID/g %ID/g %ID/g Sangue 14,81 0,96 10,14 2,79 Tumor 6,39 0,93 31,11 8,82 Baço 4,75 0,35 56,35 36,45 Timo 6,56 1,70 3,96 0,76 Coração 3,42 0,65 2,41 0,57 Pulmões 11,22 1,76 9,02 0,40 Estômago 0,57 0,08 0,56 0,19 Intestino S 1,18 0,26 1,01 0,23 Fígado 2,62 0,13 8,64 3,04 Rins 4,00 0,59 4,31 0,78 Músculo 1,08 0,17 0,84 0,20
116 / 120 Osso 2,81 0,55 5,36 1,29 Razão de Tumor para Sangue 0,43 0,07 3,32 0,11
[00315] Os valores são mostrados como desvios médios e padrão de percentual de dose injetada por grama de tecido (%ID/g) e razões de tumor para sangue. Exemplo 12: O tratamento de camundongos com Mab1 bloqueador funcional de CD8 fraco não impacta negativamente a remoção da infecção de LCMV aguda em camundongos humanizados.
[00316] Os dados experimentais deste exemplo se baseiam em um modelo anteriormente publicado: infecção de camundongos C57Bl/6 com a cepa Armstrong de vírus da coriomeningite linfocítica (Cepa Armstrong de LCMV ou Braço de LCMV) provoca uma infecção aguda cuja resolução é dependente da geração de uma resposta CTL funcional CD8+ (PNAS. Vol. 91, pp. 10854-10858; J Virol. 1987 Jun;61(6):1867-74). Neste exemplo, os camundongos foram geneticamente modificados para expressar co-receptores de TCRs, HLA, CD4 e CD8 humanos, referidos como camundongos humanizados. Os camundongos humanizados foram expostos a um braço de LCMV (2 x 105 ffu (unidade formadora de foco), injeção intraperitoneal (i.p.)) e demonstrou uma resolução de infecção aguda semelhante aos camundongos C57Bl/6, embora com cinética ligeiramente retardada (dias 12-21 pós- infecção vs. dias 8-10 em controles) (dados não mostrados).
[00317] Neste exemplo, o modelo de infecção aguda de LCMV em camundongos humanizados foi usado para avaliar o efeito de anticorpos anti- CD8 anti-humanos com atividade de bloqueio diferencial na remoção do vírus. Os grupos consistiam em camundongos tratados com A) um anticorpo depletor de células T CD8 (OKT8), que é considerado o controle positivo, B) um anticorpo bloqueador forte da atividade de CD8, C) uma atividade de CD8 de anticorpo bloqueador fraco (Mab1) e D) um controle de proteína de ligação a não CD8. As atividades de bloqueio de B e C foram avaliadas usando o
117 / 120 bioensaio manipulado descrito no Exemplo 5.
[00318] O anticorpo depletor OKT8 foi administrado 2 dias antes, 1 dia antes e 1 dia após a infecção a 100 ug/dose i.p., enquanto que as outras condições de tratamento foram entregues como uma dose única de 0,5 mg/kg i.p. um dia antes da injeção. Os camundongos foram infectados com o braço de LCMV (2x105 ffu i.p.) e baços foram coletados de grupos de camundongos nos dias 5, 14 e 21 após a infecção. As titulações de vírus foram avaliadas a partir de tecido do baço homogeneizado usando métodos de ensaio de placa padrão.
[00319] No dia 5 após a infecção, como mostrado na Figura 13, todos os grupos de tratamento tinham titulações altas de LCMV (>1x105 ffu/ml) demonstrando o estabelecimento adequado de infecção por vírus nos camundongos geneticamente modificados. Como em camundongos C57Bl/6, a depuração de LCMV em camundongos humanizados é dependente de CD8, uma vez que a depleção de células T CD8 usando o anticorpo CD8 anti- humano OKT8 resulta em um atraso na remoção da infecção por LCMV ao longo do primeiro mês após a infecção. Os camundongos tratados com o anticorpo de depleção de CD8 de OKT8 falharam em remover o vírus e mantiveram as titulações altas do vírus (>1x105 ffu/ml) no dia 14 e no dia 21 após a infecção, enquanto o grupo de controle desativou progressivamente o vírus para o limite de detecção (LOD 100 ffu/ml). Os camundongos tratados com uma dose única de mAb1, um bloqueador fraco de CD8 da função de células T CD8, demonstraram depuração de vírus semelhante ao controle sem ligação sem diferença estatística (n.s.). O tratamento de camundongos com uma dose única de anticorpo que bloqueia fortemente a função de CD8 exibiu um fenótipo de depuração de vírus intermediário que foi estatisticamente diferente dos grupos de controle de proteína de bloqueador fraco e de proteína de não ligação no dia 21 (p < 0,05). Todos os grupos de tratamento no dia 21 foram estatisticamente diferentes do grupo de depleção de OKT8 (p < 0,01).
118 / 120 Ver a Figura 13.
[00320] Coletivamente, os dados demonstram que o anticorpo de bloqueio mais fraco para CD8 (mAb1), em uma dose terapeuticamente relevante, não compromete a capacidade de camundongos humanizados em remover a infecção por LCMV e, portanto, a função de células T é intacta quando comparada tanto com o controle positivo (anticorpo depletor de CD8) quanto com o controle negativo (controle de proteína não ligante). Exemplo 13: Conjugação de mAb1 com Compostos Fluorescentes NIR
[00321] Aproximadamente 10 mg do anticorpo, mAb1, foi trocada do tampão de formulação (baseado em histidina) para 50 Mm de carbonato, pH 8,4, através de uma coluna de Nap-5 pré-condicionada (GE Healthcare, Cat. #: 17085302) de acordo com as instruções do fabricante. Este processo foi realizado em quadruplicata; cada eluição (400 µl) foi coletada e combinada para um total de 1600 µl. A concentração de eluição combinada foi determinada como sendo de 18,1 mg/mL por espectrometria UV/VIS (espectrômetro UV/VIS Nanodrop 2000, Thermo Scientific, Cat. # ND- 2000c-CAN-CAN).
[00322] Para conjugações de IRDye 800CW (Li-Cor, Cat. #: 929- 70020) , 2, 4 ou 6 vezes do excesso de 10 mM de Éster de IRDye 800CW NHS foram introduzidos a 7,2 mg (400 µL) do mAb1 de troca de tampão. Após mistura lenta por pipeta, a reação foi deixada continuar durante 2 horas em temperatura ambiente, quiescente no escuro.
[00323] Para a conjugação com Vivotag680XL à base de cianina (Perkin-Elmer, Cat. #: NEV11120), um excesso de 2 vezes de mol para mol de 10 mM de VivoTag680XL em DMSO foi introduzido a 7,2 mg (400 µl) do mAb1 com tampão trocado. Após mistura lenta por pipeta, a reação foi deixada continuar durante 2 horas em temperatura ambiente, quiescente no escuro.
[00324] Cada reação de conjugação foi trocada por um tampão de
119 / 120 coluna de Nap-5 pré-condicionado com PBS mais 5% de glicerol, pH 7,4 para remover corante reagido. Em resumo, para cada reação de conjugação, a eluição total de 1000 µl foi fracionada, e cada fração foi analisada para a presença de proteína pelo espectrômetro UV/VIS. Frações com alto teor de proteína foram combinadas. A concentração de proteína final e a razão de corante para anticorpo (DAR) para cada reação foi determinada por espectrometria UV/VIS seguindo as instruções do fabricante. Os resultados estão resumidos na Tabela 17.
[00325] Sob todas as condições de conjugação, determinou-se que a pureza monomérica foi maior ou igual a 95,0% como testado por cromatografia líquida de alta performance por exclusão de tamanho, SE- HPLC, monitorando uma absorbância de 280 nm (coluna: Superdex 200 10/300 GL SEC Column, GE Lifesciences, Cat. #: 28990944). Os resultados estão resumidos na Tabela 17. A integridade do anticorpo foi analisada por eletroforese de gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE, Novex 4 – 20% Gel Tris-Glicina, ThermoFisher Scientific, Cat. #: EC6026BOX) sob condições reduzida e não reduzida. Em comparação com o anticorpo não conjugado, não foi observada fragmentação dos conjugados. Tabela 17.DAR, Concentração e Pureza Monomérica dos Conjugados de Corante IV. Condição de Monomérico Conjugação Concentração Final Pureza Corante DAR (corante para (mg/mL) Por anticorpo) SE-HPLC (%) IRDye 800CW 2 para 1 0,16 12,7 97,4 IRDye 800CW 4 para 1 0.34 12,5 97,5 IRDye 800CW 6 para 1 0,57 11,1 95,0 VivoTag680 XL 2 para 1 1,51 14,6 96,3
[00326] As modalidades e os exemplos descritos acima destinam-se a ser meramente ilustrativos e não limitativos. Aqueles versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de verificar o uso não mais do que a experiência rotineira, numerosos equivalentes de compostos, materiais e procedimentos específicos. Todos esses equivalentes são considerados como
120 / 120 estando dentro do escopo e estão abrangidos pelas reivindicações anexas.

Claims (58)

1 / 12 REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno deste que se liga a CD8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento deste exibe uma ou mais das seguintes características: (a) é um anticorpo monoclonal totalmente humano; (b) se liga a CD8 com um KD igual ou inferior a 3,5x10-8 M, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície; (c) se liga ao CD8α humano; (d) inibe a produção de IFNγ em células T CD8 ativadas; (e) inibe a proteína ativadora do fator de transcrição (AP-1) em células T ativadas; e (f) reage cruzadamente com o CD8 humano e de macaco.
2. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno deste que se liga a CD8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento deste compreende as três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas na sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (HCVR) da SEQ ID NO: 2; e as três CDRsu de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas na sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (LCVR) da SEQ ID NO: 10.
3. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de HCVR da SEQ ID NO: 2.
4. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de LCVR da SEQ ID NO: 10.
5. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR das SEQ ID NOs: 2/10.
6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que
2 / 12 compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpos monoclonais humanos isolados, ou fragmentos de ligação a antígeno destes como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, juntamente com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
7. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica um anticorpo monoclonal humano ou fragmento deste que se liga a CD8 como definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5.
8. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo monoclonal humano ou fragmento deste que se liga a CD8 como definidos na reivindicação 7.
9. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que contém o vetor de expressão como definido na reivindicação 8.
10. Conjugado de anticorpo radiomarcado, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste que se liga a CD8 e um emissor de pósitron.
11. Conjugado de anticorpo radiomarcado, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste que se liga a CD8, uma fração quelante e um emissor de pósitron.
12. Conjugado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste é ligado covalentemente à fração quelante, L, da fórmula (A): -L-MZ (A) em que M é o emissor de pósitron; e z, independentemente em cada ocorrência, é 0 ou 1; e em que pelo menos um dentre z é 1.
13. Conjugado de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a fração quelante compreende desferrioxamina.
14. Conjugado de acordo com qualquer uma das
3 / 12 reivindicações de 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o emissor de pósitron é 89Zr.
15. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 14, caracterizado pelo fato de que -L-M é .
16. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste é ligado covalentemente a uma, duas ou três frações da Fórmula (A).
17. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende as três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas na sequência de aminoácidos de HCVR da SEQ ID NO: 2; e as três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas na sequência de aminoácidos de LCVR da SEQ ID NO: 10.
18. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma ou mais propriedades selecionadas dentre o grupo que consiste em: (a) ligar-se ao CD8 humano com uma constante de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) inferior a cerca de 3,5x10-8 M, conforme medido pela ressonância plasmônica de superfície; (b) ligar-se ao CD8α humano; (c) inibir a produção de IFNγ em células T CD8 ativadas; (d) inibir a proteína ativadora do fator de transcrição (AP-1)
4 / 12 em células T ativadas; e (e) reagir com o CD8 humano e de macaco.
19. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende o par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR das SEQ ID NOs: 2/10.
20. Método para gerar imagens de um tecido que expressa CD8, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um conjugado de anticorpo radiomarcado como definido em qualquer uma das reivindicações de 10 a 19, ao tecido; e visualização da expressão de CD8 por geração de imagem de tomografia por emissão de pósitron (PET).
21. Método para tratar um sujeito tendo um tumor sólido com uma terapia de inibidor de checkpoint, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar se o tumor sólido compreende células T CD8 positivas; e (b) se o tumor compreender células T CD8 positivas, administrar uma ou mais doses da terapia de inibidor de checkpoint ao sujeito, em que a presença de células T CD8 positivas no tumor indica a resposta do tumor ao tratamento com a terapia de inibidor de checkpoint.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende: (i) administrar um conjugado de anticorpo radiomarcado de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 19, ao sujeito; e (ii) gerar imagens da localização do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor por geração de imagem de tomografia por emissão de pósitron (PET), em que a presença do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor indica que o tumor compreende células CD8 positivas.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado
5 / 12 pelo fato de que o sujeito é administrado com 0,1 – 10 mg/kg do conjugado de anticorpo radiomarcado.
24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a função de células T é intacta pela administração do conjugado de anticorpo radiomarcado.
25. Método de acordo com a reivindicação 22 ou 24, caracterizado pelo fato de que o conjugado de anticorpo radiomarcado é administrado por via subcutânea ou intravenosa ao sujeito.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 22 a 25, caracterizado pelo fato de que a geração de imagem por PET é realizada 2 – 7 dias após a administração do conjugado de anticorpo radiomarcado.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 25, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada antes da etapa (b).
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 27, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: (c) repetir a etapa (a) após tratar o sujeito com pelo menos uma dose de uma terapia antitumoral; e em que um aumento a partir da referência na área da localização do conjugado de anticorpo radiomarcado no tumor indica eficácia da terapia antitumoral.
29. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o sujeito é administrado o conjugado de anticorpo radiomarcado de 1 a 20 semanas após a administração da terapia antitumoral.
30. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de determinar que o tumor sólido é PD-1 positivo através da administração de um conjugado anti- PD-1 radiomarcado ao sujeito em necessidade deste e geração de imagens da localização do conjugado anti-PD-1 radiomarcado no tumor por geração de
6 / 12 imagens por PET, em que a presença do conjugado anti-PD-1 radiomarcado no tumor indica que o tumor é positivo para PD-1.
31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 30, caracterizado pelo fato de que a terapia antitumoral é selecionada dentre o grupo que consiste em um inibidor do eixo de sinalização de PD- 1/PD-L1, um inibidor de CTLA-4, um inibidor de TIM3, um inibidor de BTLA, um inibidor de TIGIT, um inibidor de CD47, um inibidor de GITR, um antagonista de outro co-inibidor de células T ou ligante, um inibidor de indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), um antagonista de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), um inibidor de Ang2, um inibidor de fator de crescimento beta (TGFβ) de transformação, um inibidor de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), um inibidor de CD20, um anticorpo para um antígeno específico ao tumor, uma vacina para câncer, um anticorpo biespecífico, uma citotoxina, um agente quimioterapêutico, cilofosfamida, radioterapia, um inibidor de IL-6R, um inibidor de IL-4R, um inibidor de IL- 10, IL-2, IL-7, IL-21, IL-15 e um conjugado de anticorpo-droga (ADC).
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 30, caracterizado pelo fato de que a terapia antitumoral é selecionada dentre o grupo que consiste em REGN2810,BGB- A317,nivolumabe,pidilizumabe,pembrolizumabe, atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe, MDX-1105, REGN3504, ipilimumabe, um anticorpo anti-CD- 28, um anticorpo anti-2B4, um anticorpo anti-LY108, um anticorpo anti- LAIR1, um anticorpo anti-ICOS, um anticorpo anti-CD160, um anticorpo anti-VISTA, aflibercepte, bevacizumabe, ranibizumabe, sunitinibe, sorafenibe, pazopanibe, nesvacumabe, erlotinibe, cetuximabe, rituximab, um anticorpo anti-CA9, um anticorpo anti-CA125, um anticorpo de antígeno 3 associado a anti-melanoma (MAGE3), um anticorpo de antígeno anti- carcinoembrionário (CEA), um anticorpo anti-vimentina, um anticorpo anti- tumor-M2-PK, um anticorpo de antígeno específico anti-próstata (PSA), um
7 / 12 anticorpo anti-mucina-1, um anticorpo anti-MART-1, um anticorpo anti- CA19-9, Bacillus Calmette-Guérin, um anticorpo biespecífico CD3xCD20, um anticorpo biespecífico PSMAxCD3, dacarbazina, temozolomida, ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, daunorrubicina, cisplatina, carboplatina, gemcitabina, metotrexato, mitoxantrona, oxaliplatina, paclitaxel, vincristina, ciclofosfamida, radioterapia, sarilumabe, dupilumabe, ADC anti- CD19-DM4 e ADC anti-DS6-DM4.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 32, caracterizado pelo fato de que a terapia antitumoral é selecionada dentre o grupo que consiste em um anticorpo anti-PD-1 e um anticorpo anti- PD-L1.
34. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o inibidor do eixo de sinalização de PD-1/PD-L1 é um anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno deste.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno deste é REGN2810, nivolumabe, ou pembrolizumabe.
36. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-1 ou fragmento de ligação ao antígeno deste é REGN2810.
37. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o inibidor do eixo de sinalização de PD-1/PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno deste.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno deste é atezolizumabe, avelumabe, ou durvalumabe.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 38, caracterizado pelo fato de que o tumor é selecionado dentre o grupo que consiste em câncer do sangue, câncer cerebral, câncer de células renais,
8 / 12 câncer de ovário, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de mama, carcinoma não de células hepáticas, câncer ósseo, câncer de cólon, câncer de pulmão de células não pequenas, carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer colorretal, mesotelioma, linfoma de células B e melanoma.
40. Método para prever uma resposta positiva a uma terapia antitumoral em um sujeito tendo um tumor sólido, o método caracterizado pelo fato de que compreende: administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado ao sujeito determina a presença de células CD8 positivas no tumor sólido; em que a presença de células CD8 positivas prevê uma resposta positiva a uma terapia antitumoral.
41. Método para monitorar uma resposta de um tumor em um sujeito a uma terapia antitumoral, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) administrar uma ou mais doses de uma terapia antitumoral ao sujeito; e (b) administrar pelo menos uma dose de um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado ao sujeito 1 a 20 semanas após a administração da terapia antitumoral para determinar a presença de células CD8 positivas no tumor sólido; em que a presença de células CD8 positivas indica uma resposta positiva à terapia antitumoral.
42. Método para prever ou monitorar a eficácia da terapia antitumoral em um sujeito com um tumor, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar o nível de células T CD8 positivas no tumor; e (b) correlacionar o nível de células T CD8 positivas com terapia antitumoral bem sucedida; em que um nível elevado acima de um certo limiar é preditivo
9 / 12 ou indicativo de uma terapia antitumoral bem sucedida.
43. Método para monitorar a presença de células T em um tumor ao longo do tempo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado em um primeiro ponto de tempo a um sujeito tendo o tumor e determinar a presença de células T CD8 positivas no tumor; (b) administrar uma ou mais doses de uma terapia antitumoral ao sujeito; e (c) administrar um conjugado de anticorpo anti-CD8 radiomarcado em um segundo momento ao sujeito de 1 a 20 semanas após a administração da terapia antitumoral e determinar a presença de células T CD8 positivas no tumor; em que a presença de células T no tumor indica uma resposta positiva à terapia antitumoral.
44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) é repetida ao longo do curso do tratamento com a terapia antitumoral.
45. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o primeiro ponto de tempo ocorre antes de (b).
46. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que as células T CD8 positivas de acordo com (a) são comparadas em relação às células T CD8 positivas de acordo com (c) e um aumento em células T CD8 positivas ao longo do tempo indica uma resposta positiva para terapia antitumoral.
47. Composto de Fórmula (III):
10 / 12 caracterizado pelo fato de que A é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga a CD8 e k é um número inteiro dentre 1-30.
48. Composto de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que k é 1 ou 2.
49. Conjugado de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende (i) um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno deste que se liga a CD8 e (ii) uma ou mais frações quelantes.
50. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a fração quelante é em que é uma ligação covalente ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste.
11 / 12
51. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o referido conjugado tem uma razão de droga para anticorpo (DAR) de 1,0 a 2,0.
52. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a razão de fração quelante para anticorpo é de cerca de 1,7.
53. Conjugado de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende (i) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga a CD8 e (ii) corante fluorescente.
54. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o corante fluorescente é um corante infravermelho próximo.
55. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o corante é IRDye800CW ou VivoTag680XL.
56. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o conjugado de anticorpo tem a seguinte estrutura: Ab-[D]n, em que Ab é um anticorpo anti-CD8 ou fragmento de ligação ao antígeno deste, D é um corante fluorescente e n é um número inteiro de 1-
4.
57. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que D é:
12 / 12 ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
58. Método para gerar imagens de um tecido que expressa CD8, o método caracterizado pelo fato de que compreende (a) contatar um conjugado de anticorpo compreendendo: (i) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno deste que se liga a CD8 e (ii) corantes fluorescentes ao tecido; e (b) visualiza a expressão de CD8 por geração de imagens do tecido usando geração de imagens de fluorescência.
Petição 870200010225, de 22/01/2020, pág. 146/160 Células T CD8+ humanas Células T de Macaco Cynomolgus
Isotipo Isotipo 1/13
Concentração do Anticorpo Concentração do Anticorpo (M) (M)
Figura 1
Petição 870200010225, de 22/01/2020, pág. 147/160 Reação MLR2 Isotipo Reação MLR 1 Células T+PBMC's sozinhas)
Liberação de IFN gama Liberação de IFN gama 2/13
(aumento acima de células T Concentração do Anticorpo (nM) Concentração do Anticorpo (nM)
(aumento acima de células T sozinhas) Concetntração do Inibição percentual de IFNγ Concetntração do Inibição percentual de IFNγ Anticorpo [nM] Anticorpo [nM] Isotipo Isotipo
Figura 2
Ensaio de Repórter APC/Células T
Isotipo 1 Clone RPA-T8 Isotipo 2
Células T sozinhas
Clone RPA-T8
Figura 3
Absorbância (AU)
Comprimento de Onda (nm)
Figura 4
Monômero em Espécies de
HMW Tempo de retenção (min) Figura 5
Figura 6A Fluorescência
Tamanho [KDa]
Figura 6B Fluorescência
Tamanho [KDa]
Figura 6 γ-intensidade (cpsx103)
<0,1% de 89Zr não marcado
Tempo de retenção (min)
Figura 7 γ-intensidade (cpsx103)
<0,1% de 89Zr não marcado
Tempo de retenção (min) Figura 8
98,5% de Absorbância a 280 nm (mAU)
1,5% de Espécies de HMW
Tempo de retenção (min)
Figura 9
98,6% de monômero Absorbância a 280 nm (mAU) 1,4% de Espécies de
HMW Tempo de retenção (min) Figura 10
Cerv LNs
Axil LNs Brach LNs
Baço
Figura 11
Camundongo Camundongo portador Raji portador de de Tumor de Tumor de Raji Raji/hPBMC
Baço
Tumor de Raji/hPBMC
Tumor de Raji
Figura 12
Petição 870200010225, de 22/01/2020, pág. 158/160 Depleção de Okt8 Bloqueador funcional forte
Proteína de controle não ligante
(ffu/mL) 13/13
Titulação de LCMV Tempo (dias) Depuração de LCMV em D21 Camundongos Porcentagem de Camundongos <= Tratamento totais # Camund.
LOD (depleção de CD8) 0,5 mg/kg de Bloqueador de CD8 Forte controle com proteína não ligante
Figura 13 Total de
BR112020001360-9A 2017-07-24 2018-07-23 anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno deste que se liga a cd8, composição farmacêutica, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, conjugado de anticorpo, métodos para gerar imagens de um tecido que expressa cd8, para tratar um sujeito tendo um tumor sólido, para prever uma resposta positiva a uma terapia antitumoral, para monitorar uma resposta de um tumor em um sujeito a uma terapia antitumoral, para prever ou monitorar a eficácia da terapia antitumoral e para monitorar a presença de células t em um tumor ao longo do tempo, e, composto. BR112020001360A2 (pt)

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