JP6120416B2 - 細胞標的コンジュゲートを調製するための方法、及び得られる錯体 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

［発明の分野］
本発明は、治療用化合物、診断用化合物、又はキレート剤などの少なくとも１つの機能的モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）を標的モイエティにカップリングすることによる、細胞標的コンジュゲートを調製するための方法に関し、また、前記方法で得ることができる細胞標的コンジュゲート、及び前記細胞標的コンジュゲートを含んでいる医薬組成物に関する。

［発明の背景］
薬物の部位特異的送達又は標的化送達は、治療有効性を改善し、薬物の毒性を低減するための価値ある手段と考えられている。例えば、抗体−薬物コンジュゲートは当技術分野において知られており、合成のリンカーによって小型治療用化合物（典型的に３００Ｄａ〜１０００Ｄａ）に共有結合している組換え抗体からなる（Ｓ．Ｃ．Ａｌｌｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２０１０年、１４巻、５２９〜５３７号）。

非標的化の薬物化合物又は治療用化合物は、これらが目当てとする標的細胞に、全身分布及び受動拡散、又は細胞膜を超えた受容体媒介性の取込みによって到達するのが典型的であるが、標的化薬物又は標的化診断用化合物は、主に標的化組織を目指し、標的化組織で濃縮する。その結果、標的化薬物（本明細書において、標的モイエティによって標的化される薬物を意味する）又は標的化診断用化合物はより少ない投与量を必要とする一方で、それでも薬物が、治療的又は診断的に有効なレベルの中で、又は標的の病変若しくは細胞のレベルで到達できるようにし、ゆえに治療ウインドウ又は診断ウインドウが改善される。

この点に関して、標的細胞に到達する標的化治療用化合物の量をその有効性にしたがって調整することができれば一般的に好ましいことに、換言すると治療用化合物があまり強力ではない（例えば、毒性がない）場合は標的細胞の治療用化合物の蓄積がより高い必要があることに注目するのが重要である。診断用化合物では、クエンチングの場合などにおいて、診断用化合物がシグナルを低下させなければ、標的細胞に高度に蓄積するのが有利であると一般的に考えられている。

標的化診断用化合物の使用は、全身の画像診断に非常に価値があり、標的化治療法（個別化医療）において患者を選択し、応答を予測するのに、及び標的化した治療用化合物に対して治療応答を確証するのに用いることができる。

さらに、非標的化薬物の好ましい親油性又は両親媒性の特徴は、非標的化薬物が細胞膜を超えて容易に通過するのを促進するが、この特徴は薬物の他の要件と必ずしも一致するわけではなく、標的化薬物にあまり関連がない。治療用化合物又は診断用化合物の特定の細胞に対する標的化は、したがって、原理的には全身性の薬物としてあまり適さず又は不適切である化合物の、特異性を増強し、全身性の毒性を低減し、治療的使用又はｉｎ ｖｉｖｏの診断的使用を可能にする、概念的に魅力的な方法である。一般的に、薬物送達のテクノロジーは、薬物のｉｎ ｖｉｖｏ環境との相互作用を変えることを目的としており、薬物の他の分子とのコンジュゲーションにより、マトリクス若しくは粒子内への薬物の封入により、又は単に他の薬剤と同時投与することにより、この目的は達成される。最終結果は、薬物のバイオアベイラビリティが改善し、対象における臨床的な副作用の発生率が低減するような、薬物の標的化又は生物学的バリアを超えた薬物輸送の増強のいずれかである。薬物の標的化は、薬物の体内分布を変えることが、通常投与部位から離れている所望の部位での薬物の蓄積に好都合である場合に実現される。治療用薬剤（薬物）の細胞選択的な送達は、原理上、薬物分子を標的モイエティにカップリングすることにより得ることができるが、この標的モイエティは、特定の結合対のメンバー、すなわち、分子の対の一方が、ある領域をその表面上に有し、又は特異的に結合するキャビティを有する、分子の対からのメンバーであり、したがって対が相互に特異的に結合する性質を有するように、他の分子の特定の空間的及び極性的構造と相補的であると規定される。特異的な結合対のタイプの例として、例えば、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡがある。このような結合対からの特に適切な標的モイエティは、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、若しくはこれらの工学的変異体等の巨大分子担体、又は例えば、ペプチド等の低分子量担体である。

しかし、治療用化合物と標的モイエティとの間の連結はしばしば重大な問題を提起する。例えば、親油性の非標的化治療用化合物の親水性標的モイエティに対する連結は、このような連結を実現するための先行技術における方法が利用可能であるが、困難であることがある。さらに、従来のコンジュゲーション化学では化学反応基は非存在であることがあり、又は化学反応基は（豊富に）存在し得るが、（共有結合性の）連結はカップリングされる治療用化合物の生物活性を（不可逆的に）阻害し得る。

以下により詳しく説明する通り、このような化合物の半減期の増大によって観察され得る通り、本発明の方法で、このような化合物の生物活性を実質的に維持し、又は改善さえするコンジュゲートを調製することが可能である。

国際公開第２００７／０１１２１７号において、治療用化合物を標的モイエティに、（遷移）金属イオン錯体を用いて連結するための方法が記載されている。これらの金属イオン錯体は、治療用化合物又は診断用化合物（例えば、トレーサー）又はキレート剤などの機能的モイエティと配位結合を形成するための第１の反応基、及び標的モイエティの部位と配位結合を形成するための第２の反応基を有する。国際公開第２００７／０１１２１７号において、金属イオン錯体の第２の反応基と標的モイエティとの間に配位結合を形成するための典型的な反応条件は２４時間の間３７℃であると述べられている。これらの条件は、臨床使用のための化合物のバッチサイズの生成に適合しない。第１に、反応条件は比較的厳しく、これは標的モイエティの結合親和性（免疫反応性の場合に関して）に対して負の効果を有し、臨床使用のための認可を妨害する。さらに、用いられる条件は、細菌汚染及び菌体内毒素の形成を防ぐために、生成の間、極度な無菌の予防措置を必要とする。さらに、用いられる条件は、カップリングさせようとする薬物又はトレーサーのタイプに応じて、薬物／標的モイエティの最適な比の選択を提供しないエンドポイント反応を構成する。

これらのリスク及び問題点は、本発明による方法によって、少なくとも部分的に取り計らわれ得る。

［発明の概要］
本発明は、少なくとも１つの機能的モイエティを標的モイエティにカップリングすることにより、細胞標的コンジュゲートを調製するための方法であって、
ｉ．第１の反応基及び第２の反応基を有する金属イオン錯体を含み、金属イオン錯体の第１の反応基は機能的モイエティと配位結合を形成している、機能的金属イオン構築物を用意するステップと、
ｉｉ．機能的金属イオン構築物の金属イオン錯体の第２の反応基が、コンジュゲートを形成するように標的モイエティと配位結合を形成し、コンジュゲートの標的モイエティの免疫反応性は非結合の標的モイエティの免疫反応性と実質的に同じままである、機能的金属イオン構築物を標的モイエティと混合するステップと、
ｉｉｉ．得られたコンジュゲートを混合物から分離するステップと
を含む、方法に関する。
本発明は、このような方法によって得ることができる細胞標的コンジュゲート、及びこのような細胞標的コンジュゲートを含む医薬組成物にさらに関する。
本発明のさらなる一態様は、医薬品又は標識として用いるための、特に、がん、炎症、線維症、代謝障害、中枢神経系疾患、肝硬変、末期腎不全、感染症、又は心血管障害の処置又は診断において用いるための、これらの細胞標的コンジュゲート及び医薬組成物に関する。

［定義］
本明細書において用いられる「機能的金属イオン構築物」の語は、第１の反応基及び第２の反応基を有する金属イオン錯体を含む構築物を意味し、金属イオン錯体の第１の反応基は、治療用化合物又は診断用化合物などの機能的モイエティと配位結合を形成している。それゆえ、金属イオン錯体の第１の反応基は、機能的モイエティに対する結合部位を構成する。

金属イオン錯体の「反応基」の語は、標的モイエティ及び／又は機能的モイエティの関連する反応基に対する結合部位を形成することができる、化学基、空軌道（ｆｒｅｅ ｏｒｂｉｔａｌ）の反応部位、又は金属イオン錯体の配位子を意味する。

本明細書で用いられる「機能的」の語は、通常の科学上の意味を有し、機能的と記述されるアイテムが、ある生物学的な、化学的な、治療用の、及び／又は診断用の機能を有する場合を意味する。

本明細書で用いられる「機能的モイエティ」の語は、ヒトの身体などの身体において、又は身体の外で、ある生物学的、化学的、治療的、及び／又は診断的な機能を有する、化学的な基又は分子を意味する。典型的な機能的モイエティは、治療用化合物（すなわち、薬物）又は診断用化合物（すなわち、トレーサー若しくは色素）である。

本明細書で用いられる「標的モイエティ」の語は、特定の結合対のメンバー、すなわち、分子の対の一方が、ある領域をその表面上に有し、又は特異的に結合するキャビティを有する、分子の対のメンバーを意味し、したがって対が相互に特異的に結合する性質を有するように、他の分子の特定の空間的及び極性的構造と相補的であると規定される。特異的な結合対のタイプの例には、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡがある。

本明細書で用いられる「分離」の語は、通常の科学上の意味を有し、化学物質など１つの種の、溶媒など別の種からの分離を意味する。本出願の文脈内で、分離は、一度に行われてもよく、又は異なるステップにおいて行われてもよく、これらのステップは異なる場所で行われてもよい。

本明細書で用いられる「特異的な結合対」の語は、通常の科学上の意味を有し、分子の対の一方が、ある領域を表面上に有し、又は特異的に結合するキャビティを有する、分子の対からのメンバーを意味し、したがって対が相互に特異的に結合する性質を有するように、他の分子の特定の空間的及び極性的構造と相補的であると規定される。特異的な結合対のタイプの例には、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡがある。

本明細書で用いられる「標的化薬物」の語は、抗体など、標的モイエティにカップリングする薬物を意味する。

本明細書で用いられる「免疫反応性」の語は、通常の科学上の意味を有し、特異的な結合対のメンバーの結合親和性を意味する。

［発明の詳しい説明］
本発明は、上記に言及した機能的モイエティの連結の問題を回避し、標的モイエティがその標的化の性質を維持する方法を提供する。換言すると、本発明の方法を適用することにより、標的モイエティはその免疫反応能力（すなわち、結合親和性）を失うことなく、１つ又は複数の機能的金属イオン構築物に結合している。

本発明の第１の態様は、少なくとも１つの機能的モイエティを標的モイエティにカップリングすることにより、細胞標的コンジュゲートを調製するための方法であって、
ｉ．第1の反応基及び第２の反応基を有する金属イオン錯体を含み、金属イオン錯体の第１の反応基は機能的モイエティと配位結合を形成している、機能的金属イオン構築物を用意するステップと、
ｉｉ．機能的金属イオン構築物の金属イオン錯体の第２の反応基が、コンジュゲートを形成するように標的モイエティと配位結合を形成し、コンジュゲートの標的モイエティの免疫反応性は非結合の標的モイエティの免疫反応性と実質的に同じままである、機能的金属イオン構築物を標的モイエティと混合するステップと、
ｉｉｉ．得られたコンジュゲートを混合物から分離するステップと
を含む、方法に関する。

述べた通り、本発明の方法を用いることにより、本発明によるコンジュゲートの標的モイエティの免疫反応性、すなわち結合親和性は、非結合の標的モイエティ、すなわちこれらを反応混合物に加える前の標的モイエティと実質的に同じままである。これは、標的モイエティの免疫反応性が十分に高いままである場合にのみ、治療用化合物又は診断用化合物などの機能的モイエティを含むコンジュゲートを身体の正しい場所に送達することが可能であることから、重要である。さらに、本発明によるコンジュゲートにおいて機能的モイエティは標的モイエティに結合しているが、治療用化合物又は診断用化合物の半減期の増大及び／又は標的部位の保持時間によって観察され得る通り、治療用化合物若しくは診断用化合物の治療上若しくは診断上の利用可能性は維持され、又は改善さえなされている。

本発明の別の一利点は、標的モイエティが機能的金属イオン構築物の金属イオン錯体の第２の反応基に結合するのに非常に長くかからず、このカップリングを作製するための反応条件は機能的金属イオン構築物の金属イオン錯体の第１の反応基に結合している機能的モイエティに極めて非依存的であるということである。この方法で、使用者は、所望の機能的金属イオン構築物を適切な標的モイエティに速やかに結合させることが可能である。

本発明による方法において、機能的金属イオン構築物を標的モイエティと、比較的温和な条件下で混合する。この点に関して、温和な条件の語は、標的モイエティの免疫反応性（すなわち、結合親和性）が非結合の標的モイエティの免疫反応性と実質的に同じままであるように、反応条件を選択することを意味する。

本発明の文脈内で、「非結合の標的モイエティと実質的に同じ免疫反応性」の語は、反応条件又は標的モイエティに結合している機能的金属イオン構築物の量が、標的モイエティの免疫反応性、すなわち結合親和性を損なわないことを意味する。言及する免疫反応性は、Ｌｉｎｄｍｏ Ｔ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７２巻、７７〜８９頁、１９８４年に本質的に記載されている結合アッセイによって測定することができる。さらに、免疫反応性は、ＢＩＡＣＯＲＥ分析によっても決定することができる。

標的モイエティの免疫反応性が、機能的金属イオン構築物に結合していない同じ標的モイエティに比べて、１０％を超えず、好ましくは５％を超えずに低減するのが好ましい。

この点に関して、機能的金属イオン構築物と標的モイエティとの結合の間の反応条件、及び標的モイエティに結合している機能的金属イオン構築物の量の両方とも、標的モイエティの免疫反応性（すなわち、結合親和性）に影響を及ぼすことが注目される。

反応条件に関して、標的モイエティの免疫反応性が実質的に低下しないように反応条件を選択することが重要である。標的モイエティに最も好ましい反応条件は、約３７℃の温度でｐＨが生理学的ｐＨ付近すなわち約８〜９である場合、及び反応時間が１０〜２４０分など、できるだけ短い場合である。これは、例えば、より高い反応温度を用いる場合は、より短い反応時間を用いなければならないことを意味する。同じことがｐＨに適用される。より高い又はより低いｐＨを用いる場合、標的モイエティの免疫反応性が失われるのを避けるために、反応時間を短くしなければならない。さらに、標的モイエティは、これらの等電点が低いｐＨ又は高いｐＨである場合は低いｐＨ又は高いｐＨで沈殿し、したがってこのようなコンジュゲーション条件は適切ではない。

機能的金属イオン構築物を、標的モイエティと、１０〜２４０分間、好ましくは３０〜１２０分間、より好ましくは３０〜９０分間、より好ましくは４５〜９０分間、最も好ましくは約６０分間、混合するのが好ましい。これは、例えば、国際公開第２００７／０１１２１７号など、先行技術において用いられているよりもかなり短い反応時間である。例えば１０分より短いなど、３０分より短い反応時間は、このように速やかな反応は不均質である危険性があるため、あまり望ましくない。

本発明の方法は反応時間が比較的短いため、標的モイエティの生物学的性質は劣化せず、標的モイエティはもともとの免疫反応性、及びもともとの薬物動態学的特徴を維持する。さらに、反応時間が短いため、反応混合物中の不必要な細菌の増殖は実質的に回避される。

機能的金属イオン構築物及び標的モイエティの混合は、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃、より好ましくは３５〜４０℃、最も好ましくは約３７℃の温度で行うのが好ましい。この温度範囲内で、機能的金属イオン構築物の標的モイエティに対する結合は、標的モイエティの免疫反応性を犠牲にすることなく最適である。特に上記で言及した反応時間の組合せで、優れた結果が得られる。

本発明の好ましい一実施形態において、機能的金属イオン構築物と標的モイエティとの混合物のｐＨは、ｐＨ４〜１２、好ましくは６〜１０、最も好ましくは約７〜９に調整される。

反応条件の適切な一組合せは、温度３５℃〜４０℃、ｐＨ８〜９、及び反応時間３０〜１００分である。別の適切な一組合せは、３０℃〜３５℃、ｐＨ８〜９、及び反応時間１００〜２５０分である。さらに適切な一組合せは、４０℃〜４２℃、ｐＨ８〜９、及び反応時間３０〜６０分である。

上記に言及した通り、本発明による方法では温和な反応条件を用いるため、標的モイエティの免疫反応性は実質的に影響を受けない。これは、より機能的な金属イオン構築物が、標的モイエティの免疫反応性を失わずに、標的モイエティに配位結合によって結合し得ることを意味する。

しかし、非常に多くの機能的金属イオン構築物が標的モイエティと結合しているので、機能的金属イオン構築物が特異的な結合能力又は薬物動態学的性質を失っている点に到達し得る。それゆえ、免疫反応性及び／又は薬物動態学的性質が失われないように、標的モイエティに結合している機能的金属イオン構築物の量を選ばなければならない。

このように、本発明のコンジュゲートは、１つの標的モイエティに結合している１つの機能的金属イオン構築物を含むことができる。しかし、標的モイエティの免疫反応性、すなわち結合親和性は、カップリング反応による影響を実質的に受けないので、より多くの機能的金属イオン構築物が１つの標的モイエティに結合することができる。この方法で、機能的モイエティの応用のウインドウ、例えば、治療用化合物に対する治療ウインドウ、又は診断用化合物に対する診断ウインドウが拡大される。

少なくとも２個の、さらにより好ましくは少なくとも５個の機能的金属イオン構築物が、配位結合によって1つの標的モイエティと結合しているのが好ましい。

１〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１５個、最も好ましくは５〜１０個の機能的金属イオン構築物が、配位結合によって1つの標的モイエティと結合しているのが特に好ましい。これらの範囲により、薬物の有効性、薬物動態、及び結合親和性間の最適なバランスがもたらされる。

１個又は複数の機能的金属イオン構築物が１つの標的モイエティに結合している場合、金属イオン錯体が白金錯体であるのが好ましい。

標的モイエティに結合している機能的金属イオン構築物の量の決定は、Ｃｏｈｅｎら、ＥｊＮＭＭＩ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１１年、１巻、３１頁によって記載されている方法によって行うことができるが、他の方法も用いることができる。機能的金属イオン構築物の機能的モイエティが治療用化合物であるのが好ましい。

機能的金属イオン構築物の標的モイエティに対する上記に言及した比は、反応混合物中の構築物の比を変化させることにより実現することができる。例えば、機能的金属イオン構築物１０の標的モイエティ１に対する比を混合物において用いる場合、機能的金属イオン構築物約５が、標的モイエティ１と配位結合を形成する。これは配位効率とも呼ばれる。機能的金属イオン構築物の標的モイエティに対する結合の配位効率が、１０〜１００％、より好ましくは２０〜１００％、最も好ましくは少なくとも４０％であるのが好ましい。

上記に言及した時間の間、上記に言及した温度で混合した後、細胞標的コンジュゲートが形成される。これらのコンジュゲートを、クロマトグラフィーによって、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーによって混合物から分離する。細胞標的コンジュゲートを反応混合物から分離するのに、いわゆるＰＤ１０カラムを用いるのが特に好ましい。

用いる標的モイエティを、処置しようとする患者のためにカスタマイズしてもよい。この点に関して、患者に特異的な情報を、その患者に最も適する標的モイエティを同定するために使用できることが想定される。

標的モイエティ及び機能的モイエティ上の反応部位は、（遷移）金属イオン錯体と配位結合を形成することができる。本発明の文脈内で、配位結合の語はその通常の意味を有し、すなわち、両方の電子が同じ原子に由来する共有結合を意味する。配位結合に用いられる他の語は、双極性結合、又は付与共有結合である。

好ましい一実施形態において、金属イオン錯体は白金錯体である。白金錯体は、トランス白金錯体であってもよく、又はシス白金錯体であってもよい。シス白金錯体が好ましく、シス白金錯体が、安定化架橋として不活性の二座モイエティを含んでいるのが好ましい。別の一実施形態において、（白金）金属イオン錯体は、安定化架橋として三座モイエティを含んでいる。さらに別の一実施形態において、金属イオン錯体は、同じであっても、又は同じでなくても、少なくとも２個の（遷移）金属イオンを含んでいる。

機能的金属イオン構築物の金属イオン錯体の第２の反応基、すなわち標的モイエティと配位結合を形成する基は、標的モイエティに結合する前に窒素基又はクロリド基（ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）を含んでいてもよい。結合反応の間、窒素基又はクロリド基が離れ、機能的金属イオン構築物の第２の反応基が標的モイエティにより容易に結合し、それによりいわゆる細胞標的コンジュゲートを形成する。このような窒素基の使用は、配位結合によって１つの標的モイエティと結合することができる金属イオン錯体の数をさらに増大するという理由から、クロリド基よりもさらにより好ましい。

ｉｎ ｖｉｖｏの応用に十分な安定性のある結合を得るために、標的モイエティ及び／又は機能的モイエティが、１つ若しくは複数の含硫反応部位及び／又は１つ若しくは複数の含窒素部位を含んでいるのが好ましい。治療用化合物などの機能的モイエティが、１つ若しくは複数のイオウ基及び／又は１つ若しくは複数の窒素基、好ましくは芳香族窒素基を含んでいるのが特に好ましい。

機能的金属イオン構築物の機能的モイエティは、本発明の好ましい一実施形態において、（超）毒性薬物若しくはキナーゼインヒビターなどの治療用化合物、又は蛍光色素などの診断用化合物、又はキレート剤に連結している放射性トレーサーである。

機能的金属イオン構築物の機能的モイエティが、細胞システムにおけるシグナル伝達カスケードを阻害し、細胞骨格を妨害し、又はＤＮＡ二重らせん中にインターカレートする治療用化合物である場合が、特に好ましい。機能的モイエティが、抗炎症活性、抗高血圧活性、抗線維活性、抗血管新生活性、抗腫瘍活性、免疫刺激活性、若しくはアポトーシス誘導活性を有するのがさらに好ましく、治療用化合物が抗腫瘍活性を有するのが好ましい。

好ましい一実施形態において、機能的金属イオン構築物の機能的モイエティは、キナーゼインヒビター、又はこれらのプロドラッグの群から選択される治療用化合物である。本発明の特に好ましい一実施形態において、キナーゼインヒビターは、エルロチニブ、ゲフィニチブ（gefinitib）、イマチニブ、ペントキシフィリン、ＰＤＴＣ、ＰＴＫＩ、ＳＢ２０２１９０、バタナリブ（ｖａｔａｎａｌｉｂ）、ＬＹ３６４９４７、Ｙ２７６３２、ＡＧ１２９５、ＳＰ６００１２５である。

或いは、機能的金属イオン構築物の機能的モイエティは、ロサルタンなどのアンジオテンシン受容体ブロッカーである。

或いは、機能的金属イオン構築物の機能的モイエティは、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）などの組換えタンパク質である。或いは、機能的金属イオン構築物の機能的モイエティは、治療用放射性核種、例えば、ベータ放射体９０Ｙ若しくは１７７Ｌｕ、又はアルファ放射体２１１Ａｔである。

或いは、機能的金属イオン構築物の機能的モイエティは、タキサン、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、カリケアマイシン、メイタンシノイド、オーリスタチン、及びＣＣ１００６５アナログなどの（超）毒性薬物である。

治療用化合物を機能的モイエティとして用いるほかに、診断用化合物も用いることができる。代替の一実施形態において、機能的金属イオン構築物の機能的モイエティは、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＤＹ−８００、ＤＹ−８３１、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ７５０、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ７９０、及びインドシアニングリーンなどの蛍光色素である。

機能的金属イオン構築物の機能的モイエティとして本発明において用いることができる他の診断用化合物は、放射性核種、ＰＥＴ画像化剤、ＳＰＥＣＴ画像化剤、又はＭＲＩ画像化剤である。

キレート剤を機能的モイエティとして、金属イオン錯体の第１の反応基にカップリングし、その後の誘導体化ステップにおいてこれらのキレーターを、治療用若しくは診断用放射性核種、又は非放射性金属とローディングすることも可能である。考えられるキレート剤は、ＥＤＴＡ、ＤＰＴＡ、及びデスフェリオキサミンである。しかし、遷移金属ＰＥＴ放射性核種、非放射性金属、又は^９９ｍＴｃ若しくは^１９５ｍＰｔなどの遷移金属ＳＰＥＣＴ放射性同位元素がカップリングしている、ＤＯＴＡ又はｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡなどの大環状キレート剤も用いることができる。

或いは、１種類を超える機能的モイエティが用いられる。この方法で、異なる機能的モイエティ、例えば、治療用化合物の異なる有用な組合せ、又は有用な診断用化合物の異なる組合せを、１つの標的モイエティに結合することが可能である。この方法で、好ましい組合せの治療用化合物を、対象の組織に送達することができる。

標的モイエティは、好ましくは特定の結合対のメンバーを含んでおり、したがってある細胞又は組織の特有な部分に結合することができる。この方法で、標的モイエティは、対象の場所に対して、機能的モイエティをもたらすことができ、機能的モイエティは、金属イオン錯体によって付着している。

標的モイエティは、モノクローナル抗体などの抗体、これらの誘導体若しくはフラグメントを含んでいてもよく、又はペプチドを含んでいてもよい。

抗体の誘導体は、本明細書において、得られた化合物の少なくとも１つの性質、好ましくは抗原結合性の性質が、必ずしも量においてではなく、種類において本質的に同じであるように変えられている抗体と規定される。誘導体は多くの方法において、例えば、保存的なアミノ酸の置換によって提供され、保存的なアミノ酸の置換により、アミノ酸残基は、一般的に同様の性質（サイズ、疎水性など）を有する別の残基によって置換され、その結果、全体の機能は重大な影響を受けない可能性がある。

抗体のフラグメントは、必ずしも量においてではなく、種類において前記抗体と同じ性質を少なくとも１つ有する一部分と規定される。前記機能的部分は、同じ程度である必要はなくとも、前記抗体と同じ抗原に結合することができる。抗体のフラグメントが、単一ドメイン抗体（ナノボディとも呼ばれる）、単鎖抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、又はＦ（ａｂ’）２フラグメントを含んでいるのが好ましい。標的モイエティがモノクローナル抗体であり、最も好ましくは選択的な腫瘍標的化のための能力を示す抗体の群、例えば、アダリムマブ、ベバシズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、及びトラスツズマブ、又はこれらの組合せから選択されるモノクローナル抗体であるのが適切である。

或いは、標的モイエティは、抗体フラグメント、又はこれらの工学的変異体、例えば、治療用ＦＡＢ、好ましくはラニビズマブ、ダイアボディ、ミニボディ、ドメイン抗体、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、好ましくは、ＡＬＸ−０６５１、又はアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）である。

述べた通り、機能的金属イオン構築物の標的モイエティに対する結合反応の反応条件が温和であり、期間が短いため、標的モイエティは優れた状態にあり、そのもともとの（非結合の）免疫反応性の殆どを保持している。１つを超える機能的金属イオン構築物でローディングする場合でも、標的モイエティは、実質的に、そのもともとの非結合の免疫反応性、例えば、標的モイエティそれ自体の反応性を保持している。

本発明の第２の態様は、上記に言及した方法によって得ることができる細胞標的コンジュゲートに関する。細胞標的コンジュゲートは、第1の反応基及び第２の反応基を有する金属イオン錯体を含み、第1の反応基は機能的モイエティと配位結合を形成しており、第２の反応基は標的モイエティと配位結合を形成している。このような細胞標的コンジュゲートの標的モイエティは、上記に説明及び規定した非結合の標的モイエティと実質的に同じ免疫反応性（すなわち、結合親和性）を有する。

標的モイエティの免疫反応性は、機能的金属イオン構築物の標的モイエティに対する結合反応による影響を実質的に受けないので、標的モイエティを、１つを超える機能的金属イオン構築物でローディングすることが可能である。

少なくとも２個、さらにより好ましくは少なくとも５個の機能的金属イオン構築物が、配位結合により１つの標的モイエティと結合しているのが好ましい。

１〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１５個、最も好ましくは５〜１０個の機能的金属イオン構築物が、配位結合により１つの標的モイエティと結合しているのが特に好ましい。

１個を超える機能的金属イオン構築物が１つの標的モイエティに結合している場合、金属イオン錯体が白金錯体であるのが好ましい。

本発明の第３の態様は、上記に記載し、又は上記に記載した方法により得ることができる細胞標的コンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

本発明にしたがって「医薬組成物」の語は、本明細書上記に記載した細胞標的コンジュゲートを含む組成物に関する。このような医薬組成物は、治療有効量のこれらの細胞標的コンジュゲート、及び薬学的に許容される担体を含む。

これらの医薬組成物は、本明細書に記載する通り、生理学的に許容される担体と一緒に患者に投与することができる。「担体」の語は、それと一緒に治療薬が投与される、希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを意味する。このような製薬上の担体は、無菌の液体、例えば、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む水及び油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであってもよい。医薬組成物を静脈内投与する場合は、水が好ましい担体である。食塩溶液、並びにデキストロース及びグリセロールの水溶液も、特に注射用溶液に対して、液体担体として用いることができる。適切な製薬上の賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、バクガ、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望により、微量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含むことができる。

これらの医薬組成物は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態をとることができる。組成物は、従来の結合剤及び担体、例えばトリグリセリドと一緒に、坐剤として調合することができる。経口製剤は、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。適切な製薬上の担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、患者に適切に投与するための形態を提供するために、治療有効量の細胞標的コンジュゲートを、好ましくは純粋な形態において、適切な量の担体と一緒に含む。製剤は、投与の様式にふさわしくなければならない。

別の好ましい一実施形態において、医薬組成物は、ヒトに静脈内投与するのに適応された医薬組成物として通例の手順にしたがって調合される。静脈投与用の組成物は、無菌の等張のバッファー水溶液中の溶液であるのが典型的である。必要な場合には、組成物は、可溶化剤、及び注射部位の疼痛を緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含むことができる。一般的に、成分は、例えば、有効薬剤の量を示すアンプル若しくはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの気密密閉容器中の凍結乾燥粉末若しくは無水濃縮物として、単位剤形において、一緒に混合して又は別々に提供される。組成物を点滴によって投与しようとする場合、無菌の製薬グレードの水又は食塩水を含む点滴ボトルで調合することができる。組成物を注射によって投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供することができる。

経口及び局所の使用に適する、製薬グレードの有機又は無機の担体及び／又は希釈剤を用いて、治療上有効な化合物を含む組成物を作り上げることができる。当技術分野に知られている希釈剤には、水性媒体、植物油脂及び動物油脂が含まれる。安定化剤、湿潤剤、及び乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、又は適当なｐＨ値を確実にするためのバッファー、並びに皮膚浸透増強剤を、補助剤として用いることができる。組成物は以下：担体タンパク質、例えば、血清アルブミン；バッファー；充填剤、例えば、微結晶性セルロース、ラクトース、コーンスターチ、及び他のデンプン；結合剤；甘味剤及び他の香味剤；着色剤；並びにポリエチレングリコールの１つ又は複数も含むことができる。添加剤は当技術分野において周知であり、様々な製剤において用いられている。

本発明の第４の態様は、がん、炎症、線維症、代謝障害、中枢神経系疾患、肝硬変、末期腎不全、感染症、又は心血管障害の処置において用いるための、上記に言及した細胞標的コンジュゲート、又は上記に言及した医薬組成物に関する。

本発明の第５の態様は、本発明による機能的モイエティ及び標的モイエティを含むキットに関する。

本発明者らは、（遷移）金属イオン錯体を治療用化合物などの機能的モイエティと標的化薬物における標的モイエティとの間のリンカーとして用いる特定の利点は、（遷移）金属イオン錯体は、送達可能な化合物をｉｎ ｖｉｖｏで様々な組織に輸送できる一方で、残りを標的モイエティにカップリングさせるよう十分に強力である結合を提供することであることを見出した。特に、白金錯体の、薬物分子における様々な反応部位に対する反応性は、所望の生成物の定量的収率をもたらす温和な条件下で直接的なコンジュゲーション反応を可能にすることから、薬物連結システムとしての適用における一利点である。（遷移）金属イオン錯体を使用するさらなる有利な点は、用いる機能的モイエティに応じて、このような錯体は広範囲の生物学的に活性な化合物の標的モイエティに対するカップリングを支持することがあり、それによって標的モイエティ及び機能的モイエティ（例えば、治療用化合物）の化学的性質が大幅に変化し得ることである。

本発明の方法において用いるための、白金（ＩＩ）錯体などの機能的金属イオン構築物の調製は、当技術分野において知られているあらゆる方法によって調製することができる。参考文献は、例えば、Ｒｅｅｄｉｊｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｏｎｄｉｎｇ、６７巻、５３〜８９頁、１９８７年に見出すことができる。いくつかのトランス白金錯体の調製は、欧州特許第０ ８７０ ７７０号に開示されている。さらなる調製方法は、国際公開第９６／３５６９６号及び国際公開第９８／１５５６４号に見出すことができる。あらゆるこれらの出版物に記載されている方法は、参照によって本明細書に援用される。

「標的モイエティ」の語は、上記に規定した通り、特定の結合対のメンバー、すなわち、分子の対の一方が、ある領域を表面上に有し、又は特異的に結合するキャビティを有する、分子の対のメンバーを意味し、したがって対が相互に特異的に結合する性質を有するように、他の分子の特定の空間的及び極性的構造と相補的であると規定される。特異的な結合対のタイプの例には、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、ＩｇＧ−プロテインＡがある。

好ましい一実施形態において、標的モイエティは、上記に言及した通り、細胞の表面上の結合部位と機能的に相互作用する化合物、又は分子の一部を含んでおり、「ホーミング部分（ｈｏｍｉｎｇ ｐａｒｔ）」の語でも示される。このように、標的モイエティは、ホーミング部分の存在により、１つ又は複数の細胞型に対する特異性又は結合親和性を提供する。

或いは、標的モイエティはホーミング部分からなっていてもよい。このような一実施形態において、例えば、上記に記載した、抗体、ＦＡＢ、又はナノボディは、機能的金属イオン構築物に直接結合している。標的モイエティによって標的化される細胞上の分子は、例えば、細胞表面受容体など、あらゆる適切な標的であることができる。標的モイエティは、それだけには限定されないが、抗体、抗体フラグメント、細胞表面受容体に対する内在性又は非内在性のリガンド、抗原結合性タンパク質、ウイルス表面成分、タンパク質、例えば、ウイルス表面成分に結合するもの、成長因子、レクチン、炭水化物、脂肪酸、又は他の疎水性置換基、ペプチド、及びペプチドミメチック分子などのホーミング部分を含むことができる。標的モイエティは、錯体、ここでホーミング部分が巨大分子と錯体形成して多価構造を生じる）を含有してもよく、又は抗体フラグメント若しくは小型タンパク質若しくはペプチドの形態の小分子、例えばリゾチームなどを含み、若しくはそれらからなっていてもよい。

本明細書で用いられる「機能的モイエティ」の語は、上記に規定した通り、標的モイエティによって細胞の表面及び／又は内側に運ばれ、或いは輸送される化合物を意味する。本発明の態様において、送達することができる化合物は、治療用化合物又は診断用化合物である。

「機能的モイエティ」及び「治療用化合物」及び「薬物」の語は、上記に規定した通り、本明細書において交換可能に用いられ、治療上又は診断上の使用に適用することができるあらゆる薬剤を表す。また、治療用化合物は、その活性型に到達させるのに（生）化学的修飾を必要とするプロドラッグであってもよい。

述べた通り、金属イオン錯体の「反応基」の語は、標的モイエティ又は機能的モイエティの反応基と結合を形成することができる、化学基、空軌道の反応部位、又は金属イオン錯体の配位子を意味する。本出願で用いられる「（遷移）金属イオン錯体」の語は、標的モイエティを機能的モイエティにカップリングするのに用いられる、上記に記載したリンカーシステムを意味する。このような錯体の特徴は、その中に配位結合が存在することである。本発明で用いられる（遷移）金属イオン錯体において用いるのに適する金属イオンは、配位子と配位結合を形成することができる金属イオンである。したがって、Ｐｔ、Ｅｕ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｏｓ、及びＣｄなどの遷移金属が本発明における使用の対象となる。本発明の（遷移）金属イオン錯体は、数々の他の分子、すなわち標的モイエティ及び機能的モイエティに結合している中央の金属イオンからなる。これらのモイエティと金属との間に形成される化学結合の性質は、機能的モイエティ若しくは標的モイエティ上に存在する1対の電子の供与を伴うとして、又は分子軌道の語において、機能的モイエティ若しくは標的モイエティの充填されている軌道を金属の空軌道と組み合わせることにより形成される分子軌道として考えることができる。金属イオンに対する化学結合の形成に直接関与するモイエティにおけるこれらの原子は、したがって供与原子と呼ばれ、周期表のＶ族及びＶＩ族の元素を一般的に含み、窒素及びイオウが最も好ましい。酸素、リン、及びヒ素も用いることができる。

本発明を次に、以下の非限定的な実施例によって説明するが、実施例において、白金錯体として白金（ＩＩ）エチレンジアミンを、Ｐｔ（ｅｎ）Ｃｌ_２又はＰｔ（ｅｎ）（ＮＯ_３）_２のいずれかとして用い、両者はＬＣＬと、及びＬｘとも呼ばれる。実施例番号１及び実施例番号２は、本明細書において言及した反応変数の影響を説明するモデル実験を含んでおり、実施例番号３から実施例番号７は臨床上潜在的に関連のある標的錯体の応用を記載するものである。

図１．１は、^１３１Ｉ−トラスツズマブ、^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（コンジュゲーション比４：１）、及び^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（コンジュゲーション比５：１）の、ＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合プロットを示す。図１．２は、^１３１Ｉ−トラスツズマブ、^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（コンジュゲーション比４：１）、及び^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（コンジュゲーション比５：１）の、ＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合に対するラインウィーバーバークプロットを示す。 図２．１は、８９Ｚｒ−トラスツズマブ及び８９Ｚｒ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−ローダミンの、ＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合に対する結合プロットを示す。図２．２は、８９Ｚｒ−トラスツズマブ及び８９Ｚｒ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−ローダミンの、ＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合に対するラインウィーバーバークプロットを示す。 図３．１は、セツキシマブ及びセツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブのＡ４３１細胞との結合プロットを示す。 図３．２は、トラスツズマブ及びトラスツズマブ−ＬＣＬ−エルロチニブのＳＫＯＶ−３細胞との結合プロットを示す。 図３．３は、Ａ４３１異種移植片を有するヌードマウスにおける^１２４Ｉ−セツキシマブ及び^１３１Ｉ−セツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブの血中動態を示す。 図４．１は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬ−セツキシマブのＧＰＣクロマトグラムを示す。図４．２は、時間の関数としての、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬのｍＡｂに対するコンジュゲーション（塗りつぶしたマーク）及びｍＡｂの回収（中抜きマーク）を示す（（黒四角）セツキシマブ（黒丸）トラスツズマブ）。 図５．１は、時間の関数としての、ＤＯＸ−ＬＣＬのセツキシマブに対するコンジュゲーションを示す。 図５．２は、ＤＯＸ−ＬＣＬ−セツキシマブのＧＰＣクロマトグラムを示す。 図５．３はＤＯＸ−ＬＣＬ−セツキシマブ（Ａ）及びＤＯＸ−ＬＣＬ−トラスツズマブ（Ｂ）コンジュゲートのＡ４３１細胞の生存性に対する効果を示す。

実施例１．４−ｐｙ−ＮＢＤ−ＬＣＬ標的錯体でのモデル実験
４−ｐｙ−ＮＢＤ−ＬＣＬ−クロリドの合成

ＣＯ_２Ｈ−ＮＢＤ

ＮＢＤ−Ｃｌ（５００ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、５ｍｌ）中に溶解し、０℃のＮａＯＨ（１Ｍ、７．５ｍｌ）中ピペリジン−４−カルボン酸（９７１ｍｇ、７．５２ｍｍｏｌ）水溶液に滴下添加した。５分後、暗赤色の反応混合物を室温に温めた。ＮａＯＨ（１Ｍ、５．０ｍｌ）中ピペリジン−４−カルボン酸（６４７ｍｇ、５．０１ｍｍｏｌ）の別のポーションを２時間後に加え、撹拌を２．５時間継続した。反応混合物を、ＨＣｌ（１Ｍ、１００ｍｌ）水溶液中に注ぎ、赤色沈殿物を濾去した。粗製生成物を、熱ＥｔＯＨ／ＭｅＯＨから再結晶して、赤色結晶の生成物（１９９ｍｇ、２７％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚＤＭＳＯ−ｄ６）∂１２．４１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、８．４５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．６６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．６６（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，２Ｈ）、３．６７（ｄｄｄ，Ｊ＝１４．０，１１．２，３．０Ｈｚ，２Ｈ）、２．７６（ｔｔ，Ｊ＝１０．３，４．３Ｈｚ，１Ｈ）、２．１１〜２．０３（ｍ，２Ｈ）１．７６（ｄｔｄ，Ｊ＝１４．４，１０．９，３．９Ｈｚ，２Ｈ）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）Ｃ_１２Ｈ_１２Ｎ_４Ｏ_３Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ］計算値３１５．０７００、実測値３１５．０６８７。

４−ｐｙ−ＮＢＤ

室温のＣＯ_２Ｈ−ＮＢＤ（１９４ｍｇ、０．６６４ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２３５ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（ＡＣＮ、３ｍｌ）中懸濁液に、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）（２９４ｍｇ、０、６６４ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、懸濁液はおおむね澄明になり、この時点でジクロロメタン（ＤＣＭ、６ｍｌ）中４−（メチルアミノ）ピリジン（７１．８ｍｇ、０．６６４ｍｍｏｌ）を加えた。１５分間撹拌後、橙色の沈澱物が形成し、この沈殿物を室温で５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、ＮａＨＣＯ_３飽和水溶液で洗浄した。水層をＤＣＭで抽出して（３×）、部分的に沈殿した生成物を全て溶解し、合わせた有機層を塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、シリカゲル上に蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１〜５％ＭｅＯＨ）により精製して、橙〜赤色固体の生成物（１２３ｍｇ、９９％）を得た。^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）∂８．５５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．５０〜８．４５（ｍ，３Ｈ）、７．２４〜７．２０（ｍ，２Ｈ）、６．６８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．７９（ｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．３０（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．６６〜３．５６（ｍ，２Ｈ）、２．７５（ｔｔ，Ｊ＝１１．０，４．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．０７〜１．９８（ｍ，２Ｈ）、１．８７〜１．７５（ｍ，２Ｈ）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）∂１７３．７、１４９．５、１４８．６、１４５．２、１４４．９、１４４．８、１３６．４、１２２．０、１２０．６、１０３．４、４９．４、４１．０、４０．７、２８．５。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）Ｃ_１８Ｈ_１９Ｎ_６Ｏ_４［Ｍ＋Ｈ］計算値３８３．１４６２、実測値３８３．１４９０。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ^＋）Ｃ_１８Ｈ_１９Ｎ_６Ｏ_４［Ｍ＋Ｈ］計算値３８３．１４６２、実測値３８３．１４９０。

４−ｐｙ−ＮＢＤ−ＬＣＬ−クロリド

硝酸銀（２６．０ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）を、ジクロロ（エチレンジアミン）白金（ＩＩ）（Ｐｔ（ｅｎ）Ｃｌ_２、５０ｍｇ、０．１５３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ中懸濁液に加え、反応混合物を光から保護し、２４時間撹拌した。灰色の懸濁液をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）で濾過し、ＤＭＦ（１ｍｌ）で洗浄した。４−ｐｙ−ＮＢＤ（４６．９ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）を加え、懸濁液が得られ、これは１５分以内に澄明になった。２４時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をＤＣＭ中２．５％ＭｅＯＨ（３０ｍｌ）中に懸濁し、１時間撹拌した。懸濁液を濾過し、次いで橙色固体を、室温でＭｅＯＨ（２０ｍｌ）中に部分的に溶解し、濾過した。濾液を約５ｍｌに濃縮し、撹拌しながらエーテルを滴下添加して生成物を沈殿させた。最後に、懸濁液を濾過すると橙〜赤色固体の生成物（２３．０ｍｇ、２６％）が得られた。この物質のポーションを、セミ分取用（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣ（Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８カラム、５ｍ、２５０×１０ｍｍ、溶離液Ａ：１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）バッファー、ｐＨ＝５．０／ＡＣＮ（９：１、ｖ：ｖ）、溶離液 Ｂ：１００ｍＭ ＴＥＡＡバッファー、ｐＨ＝５．０／ＡＣＮ（３：７、ｖ：ｖ）、４：１ Ａ：Ｂで定組成溶離、流速４ｍｌ／分、保持時間生成物：１９．１分）によってさらに精製した。生成物を０℃で採取し、溶出後、生成物を含む画分を合わせ、凍結し、凍結乾燥した。微量のバッファーを、生成物をミリＱ（ｍｉｌｌｉＱ）水（３ｍｌ）中に再び溶解することにより除去し、引き続き凍結乾燥して、橙〜赤色固体の生成物（１０ｍｇ、５９％）を得た。^１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ−ｄ６）：δ−２５０６ｐｐｍ。ＨＰＬＣ（８５％）。

４−ｐｙ−ＮＢＤ−ＬＣＬ−クロリドの細胞標的モイエティに対するカップリング
トラスツマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ；コンジュゲーション比４：１
４−ｐｙ−ＮＢＤ−ＬＣＬ−クロリド（０．２４０ｍｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）中５ｍＭ、２０当量）を、抗ＨＥＲ２抗体トラスツマブ（０．４２６ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ）及びトリシン／ＮＯ３バッファー（２４μｌ、０．２５Ｍトリシン、１Ｍ ＮａＮＯ３、ｐＨ＝８．５）の溶液に加え、最終体積を６９０ｍｌにした。混合物を、３７℃のサーモミキサーに２時間配置し、その後、コンジュゲーション混合物を、予め洗浄したＰＤ−１０カラムに充填し、トリシン／ＮＯ_３バッファーで溶出した。コンジュゲーション比及び回収率を、トリシン／ＮａＮＯ_３バッファー中のトラスツマブ及び４−ｐｙ−ＮＢＤ−ＬＣＬ−クロリド両方の検量線を用いて、タンパク質画分の２８０ｎｍ及び４７２ｎｍのＵＶ吸収の比較によって決定した。ＬＣＬ−ＮＢＤ：抗体の平均比率は３．９で回収率は９５％であった。

トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ；コンジュゲーション比５：１
４−ｐｙ−ＮＢＤ−ＬＣＬ−クロリド（０．２４０ｍｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ（ａｑ）中５ｍＭ、２０当量）を、トラスツズマブ（０．４２６ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ）、トリシン／ＮＯ３バッファー（３６μｌ、２５０ｍＭ トリシン、１Ｍ ＮａＮＯ３、ｐＨ＝８．５）、及びミリＱ（０．３２４ｍｌ）、最終体積１．０３ｍｌ）の溶液に加えた。混合物を３７℃のサーモミキサーに４時間配置し、その後コンジュゲーション混合物を、予め洗浄したＰＤ−１０カラムに充填し、トリシン／ＮＯ_３バッファーで溶出した。コンジュゲーション比及び回収率を、トリシン／ＮａＮＯ_３バッファー中のトラスツマブ及び４−ｐｙ−ＮＢＤ−ＬＣＬ−クロリド両方の検量線を用いて、タンパク質画分の２８０ｎｍ及び４７２ｎｍのＵＶ吸収の比較により決定した。ＬＣＬ−ＮＢＤ：抗体の平均比率は５：１で、回収率は９５％であった。

トラスツズマブ及びトラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤの放射標識
^１３１Ｉ−トラスツズマブ
トラスツズマブを^１３１Ｉで放射標識するための一般的なＩＯＤＯ−ＧＥＮベースの手順にしたがい（Ｔｉｊｉｎｋら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ、３６巻、１２３５〜１２４４頁、２００９年；実施例３も参照されたい）、トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（５０４μｇ）を１１．３ＭＢｑの^１３１Ｉで標識し、反応時間１分で^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（３．２ＭＢｑ、合計収率２８％）を得た。放射化学的純度：ＴＬＣ（９２．７％）、ＨＰＬＣ（１００％）、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（＞９０％）。

^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ；コンジュゲーション比４：１
トラスツズマブを^１３１Ｉで放射標識するための一般的なＩＯＤＯ−ＧＥＮベースの手順にしたがい（Ｔｉｊｉｎｋら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ、３６巻、１２３５〜１２４４頁、２００９年）、トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（４９８μｇ）を８．６ＭＢｑの^１３１Ｉで標識し、反応時間１分で^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（１．５ＭＢｑ、合計収率１８％）を得た。放射化学的純度：ＴＬＣ（９７．４％）、ＨＰＬＣ（１００％）、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（＞９０％）。

^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ；コンジュゲーション比５：１
トラスツズマブを^１３１Ｉで放射標識するための一般的なＩＯＤＯ−ＧＥＮベースの手順にしたがい（Ｔｉｊｉｎｋら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ、３６巻、１２３５〜１２４４頁、２００９年）、トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（３９６μｇ）を１３．１ＭＢｑの^１３１Ｉで標識し、反応時間１分で^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（４．５ＭＢｑ、合計収率３５％）を得た。放射化学的純度：ＴＬＣ（９９．２％）、ＨＰＬＣ（９９．７％）、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（＞９０％）。

^１３１ Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤコンジュゲート及び ^１３１ Ｉ−トラスツズマブの免疫反応性
モノクローナル抗体の標的モイエティとしての免疫反応性は、結合アッセイで評価することができる。この結合アッセイは、Ｌｉｎｄｍｏら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８４年）によって最初に記載されたものであり、段階希釈の標的細胞からなる。放射標識した４−ｐｙ−ＮＢＤ−ＬＣＬ細胞標的錯体をこの希釈液に加え、４℃で一晩インキュベート後、細胞を遠心沈殿し、ペレットと上清両方における放射活性をガンマ計数器で測定し、結合及び遊離の放射活性（細胞標的錯体の部分結合を表す）のパーセント値を算出できる。抗ＨＥＲ２^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤコンジュゲートの免疫反応性を、２％パラホルムアルデヒド固定したＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞を用いて決定し、^１３１Ｉ−トラスツズマブと比較した。５つの段階希釈（５×１０^６細胞／チューブ〜３．１×１０^５細胞／チューブの範囲）をＰＢＳ中１％ＢＳＡで調製した。過剰の非標識のトラスツズマブを２番目のチューブに加え、最小濃度の細胞を非特異的結合と決定した。放射標識した抗体を各チューブに加え、試料を４℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心沈殿し、ペレット及び上清における放射活性をガンマ計数器で測定し、結合及び遊離の放射活性のパーセント値を算出した。データを、改変ラインウィーバーバークプロットにおいてグラフにより分析し、最大細胞濃度での免疫反応性を比較のために採用した。図１．１及び図１．２に示す通り、^１３１Ｉ−トラスツズマブ（免疫反応性画分９６．７％）に比べて、トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤコンジュゲーション比４：１（免疫反応性画分９５．７％）及びトラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤコンジュゲーション比５：１（免疫反応性画分９７．１％）に免疫反応性における低下は観察されなかった。

図１．１は、^１３１Ｉ−トラスツズマブ、^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（コンジュゲーション比４：１）、及び^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（コンジュゲーション比５：１）の、ＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合プロットを示す。

図１．２は、^１３１Ｉ−トラスツズマブ、^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（コンジュゲーション比４：１）、及び^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ（コンジュゲーション比５：１）の、ＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合に対するラインウィーバーバークプロットを示す。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブのＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合は、ｍＡｂ分子１個あたり最高５個のＬＣＬ−４−ｐｙ−ＮＢＤ基のカップリングによる影響を受けなかったことに注目されたい。

実施例２．ローダミンＬＣｌ標的錯体でのモデル実験
ローダミン−ＬＣｌ−クロリドの合成

ジクロロ（エチレンジアミン）白金（ＩＩ）（Ｐｔ（ｅｎ）Ｃｌ_２；３００ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；３０ｍｌ）に溶解したもの）を、１モル当量のＡｇＮＯ３（５２０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、ＤＭＦ ５２ｍｌ中に溶解したもの）を等しい４ポーションに分割して加えることにより、Ｐｔ（ｅｎ（ＮＯ３）Ｃｌ（ＬＣＬ−クロリド）に変換した。各添加を２時間で分け、混合物を、光の非存在下、周囲温度で撹拌した。沈澱した灰色の塩化銀を、最終の添加の１６時間後、０．２μｍメンブレンフィルターで濾過することにより除去した。得られた淡黄色溶液を４℃で貯蔵した。生成物の同一性及び純度を^１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ−ｄ６）：δＰｔ−２０７５ｐｐｍによって確認した。

Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１，６−ヘキサンジアミン（３１５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）（Ｂｏｃ−ＨＤ）をキシレン（２５ｍｌ）中に溶解し、４０℃で１６時間、ＬＣＬ−クロリド（６４１ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）と反応させた。引き続き、溶媒を真空中で除去し、残余の生成物を微量のミリＱ水中に再び溶解し、４℃で一晩貯蔵した。残留の［Ｐｔ（ｅｎ）Ｃｌ（ＮＯ３）］の不溶性の黄色粒子を、メンブランフィルター（１．０μｍ）を通した濾過によって除去した。澄明な濾液を凍結乾燥し、白色綿毛状粉末を得た（収率７４％）。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２０）∂＝３．１１（２Ｈ）、２．７１（４Ｈ）、２．６３（２Ｈ）、１．６９（２Ｈ）、１．５２（２Ｈ）、１．４６（９Ｈ）、１．３９（４Ｈ）ｐｐｍ；^１９５Ｐｔ−ＮＭＲ：∂＝２６２５ｐｐｍ。

Ｂｏｃ−ＨＤ−ＬＣＬ（２８ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）をＨＣｌ（２ｍｌ、２００ｍＭ）中に溶解し、５０℃で一晩撹拌した。１Ｍ ＮａＯＨを少量加えることにより、溶液のｐＨを８．０に上げた。この溶液を、次いで、ＤＭＦ２．１ｍｌ中に溶解した６−カルボキシテトラメチルローダミン−ＳＥ ＮＨＳエステル（２１ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）と混合した。混合物を室温で１６時間反応させた。溶媒を真空中で除去し、残余の生成物を微量のローディングバッファー中に再び溶解し、引き続きセミ分取用ＨＰＬＣによって精製した（ＳＯＵＲＣＥ（商標）１５ ＲＰＣカラム、溶離液Ａ：９５％ＮａＣｌ（２０ｍＭ）／５％イソプロパノール、溶離液Ｂ：１０％ ＮａＣｌ（２０ｍＭ）／９０％イソプロパノール。グラジェント溶出（０〜５．７８分から０％Ｂ；５．７８〜３４．７分から０〜４０％Ｂ；３４．７〜３７．６分から４０〜１００％Ｂ；３７．６〜４６．３分から１００％Ｂ；４６．３〜４９．２分から１００〜０％Ｂ；４６．３〜５７．９分から０％Ｂ）、流速４．０ｍｌ／分）。溶出バッファーを引き続き、真空中で同時蒸発することにより除去した（収率２２％）。最終生成物であるローダミン−ＬＣＬ−クロリドの同一性及び純度を、ＨＰＬＣ（＞９０％）及び^１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ−ｄ６）：−２５４３ｐｐｍにより確認した。

トラスツズマブ−ＬＣＬ−ローダミンに対するコンジュゲーション条件の最適化
ローダミン−ＬＣＬ−クロリドのトラスツズマブとのコンジュゲーションを、ＬＣＬ−クロリド錯体の細胞標的錯体に対するコンジュゲーションに対する反応条件を最適化するためのモデルシステムとして用いた。

バッファー及びｐＨ
バッファー及びｐＨのコンジュゲーション比に対する効果を、ｐＨ＝５．５〜８．５の様々なバッファー中のローダミン−ＬＣＬ−クロリドのトラスツズマブとの反応によって調査した。４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）及び４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）は金属に対して親和性が低く（Ｇｏｏｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９６６年、４６７〜４７７頁）、これらのｐＨ範囲により酸性から塩基性のｐＨの調査が可能になるため、これらのバッファーを、トリシンに対する潜在的に適する代替として選択した。

表２．１に示す通り、強力なｐＨ効果が観察され、ｐＨ＝８．０〜８．２で最高のコンジュゲーション比３．０〜３．２が得られた（エントリー４及び５）。バッファーのコンジュゲーション比に対する効果は観察することができなかった（エントリー２〜３）。同様に、ｐＨ＝８．５のバッファーとしてトリシンと反応を行うと（エントリー５）、同様のｐＨのＨＥＰＥＳで得られた結果に比べた場合にほんのわずかな改善がもたらされた（エントリー５）。

トリシン／ＮＯ３バッファー濃度
バッファー濃度のコンジュゲーション比に対する効果を調査するために、ローダミン−ＬＣＬ−クロリドを、０〜８７％トリシン（２５０ｍＭ）／ＮＯ３（１Ｍ）バッファーからの範囲の様々なバッファー濃度のトラスツズマブと反応させた。

（表２．２）

最高コンジュゲーション比１．６が、１０％トリシン（２５０ｍＭ）／ＮａＮＯ_３（１Ｍ）で得られた（エントリー３）。

ｍＡｂ：ＬＣＬ比
ローダミン−ＬＣＬ−クロリドのトラスツズマブとのコンジュゲーションに最適のｍＡｂ：ＬＣＬ比を決定するために、比をトラスツズマブ：ローダミン−ＬＣＬ−クロリド（ｍＡｂ：ＬＣＬ）１：５〜１：５０から変化させて、トラスツズマブを過剰のローダミン−ＬＣＬ−クロリドと反応させた（表２．３）。実験条件下では、ｍＡｂ：ＬＣｌ比１：２０で最高コンジュゲーション比３．８が得られた（エントリー３）。比を１：５０に上昇させると（エントリー４）、タンパク質の沈澱がもたらされ、このため平均コンジュゲーション比の信頼できる決定が妨げられた。

反応時間
コンジュゲーション反応のキネティクスを調査するために、ローダミン−ＬＣＬ−クロリド（１０当量）のトラスツズマブとの反応を、その他の条件は同一にして、１、２、６、及び２４時間行った（表２．４）。予想通り、コンジュゲーション比に一定の上昇が観察され、２４時間後に最大コンジュゲーション比２．３がもたらされた（エントリー４）。

ローダミン−ＬＣＬ−クロリドとの反応は、反応をより高濃度で、２０当量のローダミン−ＬＣＬ−クロリドと行った場合に大幅に加速することができた（表２．５）。

これらの条件下で、コンジュゲーション比２．５が６時間後に達成された（エントリー３）。

トラスツズマブ及びトラスツズマブ−ＬＣＬ−ローダミンの８９Ｚｒ−標識
８９Ｚｒ−トラスツズマブ
Ｎ−ｓｕｃＤｆ−トラスツズマブ（５００μｇ）を、公開されている手順を用いて（Ｖｅｒｅｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００３年、１２７１〜１２８１頁）、１３．９ＭＢｑの８９Ｚｒで放射標識して８９Ｚｒ−トラスツズマブを得た（１０．４ＭＢｑ、合計収率７７％）。放射化学的純度：ＴＬＣ（９６％）、ＨＰＬＣ（９５％）、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（＞９０％）。

８９Ｚｒ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−ローダミン
Ｎ−ｓｕｃＤｆ−トラスツズマブ（０．３００ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ）を、ローダミン−ＬＣＬ−Ｃｌ（０．０２０ｍｌ、５ｍＭ）、トリシン／ＮＯ３バッファー（６０μｌ、２５０ｍＭトリシン、１Ｍ ＮａＮＯ３、ｐＨ＝８．５）、及びミリＱ（０．２２０ｍｌ、最終体積０．６ｍｌ）と、３７℃のサーモシェーカー中で２４時間反応させた。コンジュゲーション混合物のポーション（０．５ｍｌ）を予め洗浄したＰＤ−１０カラムに充填し、トリシン／ＮＯ_３バッファーで溶出した。コンジュゲーション比及び回収率を、トリシン／ＮａＮＯ_３バッファー中のトラスツマブ及びローダミン−ＬＣＬ−クロリド両方の検量線を用いて、タンパク質画分の２８０ｎｍ及び５５０ｎｍのＵＶ吸収の比較により決定した。ＬＣＬ：ｍＡｂの平均比率は２．４：１であった。生成物のポーション（５１０μｇ）を、公開されている手順を用いて（Ｖｅｒｅｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００３年、１２７１〜１２８１頁）、１４．３ＭＢｑの８９Ｚｒで放射標識して、８９Ｚｒ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−ローダミンを得た（９．９ＭＢｑ、合計収率７２％）。放射化学的純度：ＴＬＣ（９５％）、ＨＰＬＣ（１００％）、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（＞９０％）。

８９Ｚｒ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−ローダミン及び８９Ｚｒ−トラスツズマブの免疫反応性
抗ＨＥＲ２ ８９Ｚｒ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−ローダミンの免疫反応性を、２％パラホルムアルデヒド固定したＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞を用いて決定し、８９Ｚｒ−トラスツズマブと比較した。

図２．１及び図２．２に示す通り、免疫反応性における喪失は観察されなかった。
図２．１は、８９Ｚｒ−トラスツズマブ及び８９Ｚｒ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−ローダミンの、ＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合に対する結合プロットを示す。
図２．２は、８９Ｚｒ−トラスツズマブ及び８９Ｚｒ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−ローダミンの、ＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合に対するラインウィーバーバークプロットを示す。抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブのＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合は、ｍＡｂ分子１個あたり平均２．４個のＬＣＬ−ローダミン基のカップリングによる影響を受けなかったことに注目されたい（最大の抗体の結合は、トラスツズマブに比べて過剰のＨＥＲ２抗原がなかったため実現されなかった）。

実施例３．エルロチニブ−ＬＣＬ標的錯体
エルロチニブ−ＬＣＬ細胞標的錯体を調製するためのカップリングの戦略をスキーム１に概要する。

方法１：エルロチニブ−ＬＣＬクロリドの合成
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍｌ中に溶解したジクロロ（エチレンジアミン）白金（ＩＩ）（Ｐｔ（ｅｎ）Ｃｌ_２）；３００ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌを、等しい４ポーションに分割した１モル当量のＡｇＮＯ_３（５２０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、ＤＭＦ５２ｍｌに溶解したもの）を加えることにより、Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ_３）Ｃｌ（ＬＣＬ−クロリド）に変換した。各添加を２時間で分け、混合物を光の非存在下、周囲温度で撹拌した。塩化銀の灰色の沈殿物を、最終の添加の１６時間後、０．２μｍメンブレンフィルターで濾過することによって除去した。得られた淡黄色溶液を４℃で貯蔵した。生成物の同一性及び純度を^１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ−ｄ６）：δ−２０７５ｐｐｍによって確認した。

エルロチニブＨＣｌ（１２５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（８８ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ３７．５ｍｌ中に溶解し、ＬＣＬ−クロリド（１７６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、ＤＭＦ２２．５ｍｌ中に溶解したもの）と６５℃で１７時間反応させた。この混合物に、希ＨＣｌ（６５ｍｌ、０．１ｍＭ）を加え、引き続き溶媒を減圧下で除去した。粗製生成物をミリＱ中に再び溶解し、分取用ＨＰＬＣによって精製した（フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）（Ｐ／ＮＯ：００Ｇ−４２５３−Ｐ０）、Ｌｕｎａ２、１０μ、Ｃ１８カラム、２５０×２１．２０ｍｍ。溶離液Ａ：９０％ＮａＣｌ（２０ｍＭ）／１０％イソプロパノール、溶離液Ｂ：３０％ＮａＣｌ（２０ｍＭ）／７０％イソプロパノール、グラジェント溶出（０〜１７．７分から０％Ｂ；１７．７〜３５．３から０〜３０％Ｂ；３５．３〜７９．４分から３０〜８０％Ｂ；７９．４〜８８．２分から８０〜１００％Ｂ；８８．２〜１１４．７分から１００％Ｂ；１１４．７〜１２３．６分から１００〜０％Ｂ；１２３．６〜１５８．８分から０％Ｂ、流速５．０ｍＬ／分）。溶出バッファーを引き続き、真空中の同時蒸発によって除去した（収率２２％）。エルロチニブ−ＬＣＬ−クロリドをさらに用いるまで４℃で貯蔵した。最終生成物エルロチニブ−ＬＣＬ−クロリドの同一性及び純度を、ＨＰＬＣ（＞９５％）、^１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ−ｄ６）：δ−２５４３ｐｐｍ、及び質量分析計（計算質量：６８４（ｍ／ｚ）；検出質量：６８４［Ｍ＋］）によって確認した。

方法２：エルロチニブ−ＬＣＬ−硝酸塩の合成
ＬＣＬ−クロリド（２７５ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ、ＤＭＦ４０ｍｌ中に溶解したもの）を、等しい４ポーションに分割した１モル当量のＡｇＮＯ３（１２３ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ、ＤＭＦ１２ｍｌに溶解したもの）を加えることにより、ＬＣＬ−硝酸塩Ｐｔ（ｅｎ）（ＮＯ_３）（ＮＯ_３）に変換した。各添加を２時間で分け、添加と添加の間、混合物を光の非存在下、周囲温度で撹拌した。塩化銀の灰色の沈殿物を、最終の添加の１６時間後、０．２μｍメンブレンフィルターで濾過することによって除去した。得られた淡黄色溶液を４℃で貯蔵した。生成物の同一性及び純度を^１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ−ｄ６）：δ−１８５０ｐｐｍによって確認した。

エルロチニブＨＣｌ（１２５ｍｇ、０．２９１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ１２．５ｍｌ中３倍モル過剰のトリエチルアミン（８８ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を加えることにより、その遊離塩基形態において変換した。混合物を室温で２時間撹拌し、その後溶媒を減圧下で除去した。生成物をミリＱ５ｍｌで３回洗浄し、ＤＭＦ１２．５ｍｌ中に再び溶解した。引き続きこの溶液３ｍｌを、ＬＣＬ−硝酸塩（４６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、ＤＭＦ９ｍｌ中に溶解したもの）と６５℃で１７時間反応させた。この混合物にミリＱ４０ｍｌを加え、引き続き溶媒を減圧下で除去した。粗製生成物をミリＱ中に再び溶解し、分取用ＨＰＬＣによって精製した（フェノメネックス（Ｐ／ＮＯ：００Ｇ−４２５３−Ｐ０）、Ｌｕｎａ２、１０μ、Ｃ１８カラム、２５０×２１．２０ｍｍ。溶離液Ａ：９０％ＮａＣｌ（２０ｍＭ）／１０％イソプロパノール、溶離液Ｂ：３０％ＮａＣｌ（２０ｍＭ）／７０％イソプロパノール、グラジェント溶出（０〜１７．７分から０％Ｂ；１７．７〜３５．３から０〜３０％Ｂ；３５．３〜７９．４分から３０〜８０％Ｂ；７９．４〜８８．２分から８０〜１００％Ｂ；８８．２〜１１４．７分から１００％Ｂ；１１４．７〜１２３．６分から１００〜０％Ｂ；１２３．６〜１５８．８分から０％Ｂ、流速５．０ｍＬ／分）。溶出バッファーを引き続き、真空中で同時蒸発によって除去した（収率２９％）。エルロチニブ−ＬＣＬ−硝酸塩をさらに使用するまで４℃で貯蔵した。最終生成物エルロチニブ−ＬＣＬ−硝酸塩の同一性及び純度をＨＰＬＣ（＞９５％）、^１９５Ｐｔ−ＮＭＲ（ＤＭＦ−ｄ６）：δ−２５２５ｐｐｍ、及び質量分析法（計算質量：６８３（ｍ／ｚ）；検出質量：６８３［Ｍ＋］）によって確認した。

エルロチニブ−ＬＣＬの細胞標的モイエティに対するカップリング
一般的プロトコールを、エルロチニブ−ＬＣＬ（エルロチニブ−ＬＣＬ−クロリド又はエルロチニブ−ＬＣＬ−硝酸塩のいずれか）の、細胞標的モイエティに対するカップリング用に開発した。様々なカップリング比での合成プロトコールの典型的な例を以下に示す。行われるアッセイに適用可能な場合は、放射標識した標的モイエティのアリコートを標的モイエティにスパイクして、放射性トレーサーモイエティによる細胞標的錯体の追跡を可能にした。

セツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブ
セツキシマブ（１．５ｍｇ、１６．７μＭ）を、ｐＨ８．５の２０ｍＭトリシン／ＮＯ_３バッファー中５〜５０倍過剰に相当する様々なモル量のエルロチニブ−ＬＣLと３７℃で１時間反応させた。生成物を、ＰＤ１０カラムのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。コンジュゲートしたＬＣＬ基の数を、ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）でＵＶ測定することにより決定した。

エルロチニブ−ＬＣＬを、１３１Ｉ−セツキシマブ（１０ＭＢｑ）２００μｌをスパイクしたセツキシマブ１．５ｍｇと反応させることにより放射標識したエルロチニブ−ＬＣＬ−セツキシマブを調製した。

トラスツズマブ−ＬＣＬ−エルロチニブ
トラスツズマブ−ＬＣＬ−エルロチニブを同じ手順にしたがって調製した。

セツキシマブ及びトラスツズマブの放射標識
セツキシマブ２５０μｇを、標準の手順にしたがって１５ＭＢｑの^１２４Ｉで標識した。簡潔に述べると、ヨードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）２５μｇでコーティングした反応バイアル中、リン酸バッファー中セツキシマブ２５０μｇ、及び^１２４Ｉ（ＮａＩ５０μｌとプレインキュベートしたもの（１０μｇ／ｍｌ））を加えた。４分後、アスコルビン酸で反応を停止し、反応混合物を、予め洗浄したＰＤ−１０カラムによって精製した。収率は８９．５％であり、放射化学的純度は９９．９％であった。

セツキシマブ２５０μｇを、標準の手順にしたがって、６０ＭＢｑの^１３１Ｉで標識した。簡潔に述べると、ヨードゲン２５μｇでコーティングした反応バイアル中、リン酸バッファー中セツキシマブ２５０μｇ及び^１３１Ｉを加えた。４分後、アスコルビン酸で反応を停止し、反応混合液を、予め洗浄したＰＤ−１０カラムによって精製した。収率は７５．６％であり、放射化学的純度は９９．９％であった。

トラスツズマブを同じ手順にしたがって放射標識した。

結合アッセイ
セツキシマブに対する結合アッセイを、ＥＧＦＲ１発現性Ａ４３１腫瘍細胞で行った。最初に、Ａ４３１細胞を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で洗浄し、細胞の段階希釈をし、最大濃度は１.７×１０^６細胞／ｍｌであった。対照として、チューブ１本に過剰の非標識のセツキシマブを加えた。全てのチューブ及び対照のチューブに、^１３１Ｉ−セツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブ１６ｎｇ／ｍｌを加えた。４℃で一晩インキュベートした後、細胞を遠心沈殿し、ペレット及び上清をガンマ計数器で計数し、結合及び遊離の放射活性のパーセント値を測定した。図３．１は、これらの結合アッセイの結果を示す。非コンジュゲートのセツキシマブの結合を赤色で示し、青色線は様々なセツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブコンジュゲートを表す。セツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブのＥＧＦＲ発現性Ａ４３１細胞に対する結合は、ｍＡｂ分子１個あたり最高１５個のＬＣＬ−エルロチニブと反応する時、実質的に影響を受けないことに注目されたい。

トラスツズマブとの結合を試験するために、ＨＥＲ−２発現性ＳＫＯＶ−３細胞（卵巣がん）を用いた。洗浄後、段階希釈のＳＫＯＶ−３細胞を、最大濃度０．５×１０^６細胞／ｍｌで作製した。対照として、チューブ１本に過剰の非標識のトラスツズマブを加えた。全てのチューブ及び対照のチューブに、^１３１Ｉ−トラスツズマブ−ＬＣＬ−エルロチニブ２００ｎｇ／ｍｌを加えた。４℃で一晩インキュベート後、細胞を遠心沈殿し、ペレット及び上清をガンマ計数器で計数し、結合及び遊離の放射活性のパーセント値を測定した。

図３．２は、これらの結合アッセイの結果を示す。非コンジュゲートのトラスツズマブのＳＫＯＶ−３に対する結合を赤色で示し、青色線は様々なセツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブコンジュゲートを表す。トラスツズマブ−ＬＣＬ−エルロチニブのＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合は、ｍＡｂ分子１個あたり最高２５個のＬＣＬ−エルロチニブ基と反応する時、実質的に影響を受けないことに注目されたい。これらのデータは全て、セツキシマブ及びトラスツズマブの完全性は、エルロチニブ−ＬＣＬ基２５個とのコンジュゲーションを行った後でも依然として保存されることを示唆している。

動物試験
動物試験は、外陰腫瘍系Ａ４３１のヒト異種移植片を２側面に皮下に埋め込んだヌードマウス（ＨＳＤ：無胸腺Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ、Ｈａｒｌａｎ）で行い、セツキシマブ及びセツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブの血中動態及び体内分布を比較した。

この目的のために、マウス６匹に、マウス１匹あたり合計５００μｇのセツキシマブと一緒に、０．３７ＭＢｑの^１３１Ｉ−セツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブ（１３個のエルロチニブ−ＬＣＬ基で改変したもの）及び０．３７ＭＢｑの^１２４Ｉ−セツキシマブを眼窩内に（ｉ．ｏ．）同時注射した。別のマウス６匹に、マウス１匹あたり合計５００μｇのセツキシマブと一緒に、０．３７ＭＢｑの^１３１Ｉ−セツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブ（２２個のＬＣＬ基で改変したもの）及び０．３７ＭＢｑの^１２４Ｉ−セツキシマブを眼窩に同時注射した。血液試料を、注射後（ｐ．ｉ．）２４、４８、７２、９６、及び１６８時間に採取し、体内分布を、注射後７２時間及び１６８時間後に行った。血液及び体内分布の試料をガンマ計数器で計数し、％ＩＤ／ｇを算出した。

セツキシマブ及びセツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブの血中動態は、注射後最高１６８時間に匹敵するものであった。両群のマウスに対して、^１３１Ｉ−セツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブの観察された血漿濃度プロファイルは、^１２４Ｉ−セツキシマブの対応する基準プロファイルに匹敵した。明らかに、ｉｎ ｖｉｖｏでも、反応条件が温和であったため、標的モイエティであるセツキシマブは薬物動態挙動の殆どを維持していたことが示された（図３．３を参照されたい）。

図３．１は、セツキシマブ及びセツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブのＡ４３１細胞との結合プロットを示す。セツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブのＥＧＦＲ１発現性Ａ４３１細胞に対する結合は、ｍＡｂ分子１個あたり最高１５個のＬＣＬ−エルロチニブ基と反応する時、実質的に影響を受けなかった。
図３．２は、トラスツズマブ及びトラスツズマブ−ＬＣＬ−エルロチニブのＳＫＯＶ−３細胞との結合プロットを示す。トラスツズマブ−ＬＣＬ−エルロチニブのＨＥＲ２発現性ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合は、ｍＡｂ分子１個あたり最高２５個のＬＣＬ−エルロチニブ基と反応する時、実質的に影響を受けなかった。
図３．３は、Ａ４３１異種移植片を有するヌードマウスにおける^１２４Ｉ−セツキシマブ及び^１３１Ｉ−セツキシマブ−ＬＣＬ−エルロチニブの血中動態を示す。

実施例４．ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬ−標的錯体

ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬ−クロリドの合成
ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ ＮＨＳエステルのＮＨＳエステル基を、４−（メチルアミン）ピリジン（４−ｐｙ）との反応によりＬＣＬ適合性モイエティに変換した。典型的な一例において、４−ｐｙのミリＱ中溶液（１０ｇ／ｍｌ）のｐＨを、３７％ＨＣｌを少量加えることにより８．５に調整した。引き続き、この混合物１３０μｌに、リン酸ナトリウムバッファー溶液（ｐＨ８．５）６５μｌを加え、引き続きミリＱ１３０μｌを加えた。次いで、この溶液をＩＲＤｙｅ８００ＣＷ ＮＨＳエステル（１２．７ｍｇ、１０．９μｍｏｌ、ＤＭＦ１．３ｍｌに溶解したもの）と反応させた。反応混合物を、光から保護し、２時間周囲温度で撹拌した。引き続き、この溶液０．１３ｍｌを、周囲温度で１６時間、４倍過剰のＬＣＬ−クロリド（１．２ｍｇ、３．５μｍｏｌ、ＤＭＦ１７１μｌ中に溶解したもの）と反応させた。粗製生成物を、固相抽出（スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）スペル（Ｓｕｐｅｌ）（商標）−セレクト（Ｓｅｌｅｃｔ）ＨＬＢ ＳＰＥカラム）により精製した。ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬ−クロリド（収率：６５％）をさらに用いるまで４℃で貯蔵した。最終生成物ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬ−クロリドの同一性及び純度を、ＨＰＬＣ（＞９０％）により確認した。

ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬ−クロリドの細胞標的モイエティに対するカップリング
細胞標的錯体を調製するための典型的な一例として、ＩＲＤｙｅ８００−ＬＣＬ−クロリドをトラスツズマブ又はセツキシマブにカップリングした。ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬ−クロリド溶液（水中２．３ｍｇ／ｍｌ、０．１３μｍｏｌ ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬ−クロリド）８５μｌをセツキシマブ溶液（バッファー中５ｍｇ／ｍｌ、１．４ｎｍｏｌセツキシマブ）２００μｌ、２５０ｍＭトリシン／ＮａＮＯ_３バッファー溶液（ｐＨ８．５）４０μｌ、及びミリＱ７５μｌの混合物に加え、混合物を３７℃で２、４、６、１５、及び２４時間反応させることにより、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬ−クロリドをセツキシマブにコンジュゲートした。生成物をＰＤ１０ゲル濾過によって精製した。ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ含量を、７８０ｎｍのスペクトロスター（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｔａｒ）ＵＶ／ＶＩＳ分光計で検出した。検量線を、既知濃度のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ溶液を用いて構築した。タンパク質含量を、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ １０／３００ ＧＬカラム及びウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）２６９５ ＰＤＡ検出器を装着したウォーターズ２６９５液体クロマトグラムで、移動相としてＰＢＳを用いて検出した。検量線を、既知濃度のタンパク質溶液を用いて構築した。溶出ピークは、ｍＡｂの保持時間に、吸収波長２８０ｎｍ（タンパク質）及び７８０ｎｍを用いて検出し（図４．１）、ＬＣＬリンカーによるｍＡｂに対するＩＲＤｙｅ８００ＣＷの配位が確認された。

図４．１は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬ−セツキシマブのＧＰＣクロマトグラムを示す。

６時間後、２４時間後にカップリングすることができる量に比べて、７０％のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬ−クロリドがカップリングしていた（図４．２）。さらに、６時間後、タンパク質は沈殿を開始し、わずか４０〜５０％のｍＡｂが回収された。

図４．２は、時間の関数としての、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−ＬＣＬのｍＡｂに対するコンジュゲーション（塗りつぶしたマーク）及びｍＡｂの回収（中抜きマーク）を示す（（黒四角）セツキシマブ（黒丸）トラスツズマブ）。２４時間後のコンジュゲーションを１００％とした。

実施例５．ドキソルビシン−ＬＣＬ標的錯体

ドキソルビシン−ＬＣＬクロリドの合成
ドキソルビシン（ＤＯＸ、５．０ｍｇ、８．６μｍｏｌ、水１ｍｌ中に溶解したもの）を、ｃｉｓ−Ｐｔ（エチレンジアミン）硝酸塩−クロリド（ＬＣＬ、３０ｍｇ、８６μｍｏｌ、ＤＭＦ４．５ｍｌ中に溶解したもの）と、６０℃で４日間反応させた。ＤＯＸ−ＬＣＬの精製を、スペルコ スペル（商標）−セレクトＨＬＢ ＳＰＥ Ｔｕｂｅｓを用いて固相抽出（ＳＰＥ）により行った。反応混合物を、水で４０倍希釈し、ＳＰＥカラムに運び入れた。未反応のＬＣＬを過剰の水で洗浄することにより除去した。ＤＯＸ−ＬＣＬを、アセトニトリルとメタノールとの混合物（１／１ ｖ／ｖ）で引き続き溶出した。溶媒をロータリーエバポレーションにより除去し、ＤＯＸ−ＬＣＬを水中に再び溶解して１．４ｍｇ／ｍｌの濃度にした。ＤＯＸ−ＬＣＬの同一性及び純度を、ＨＰＬＣ（＞９５％）、ＮＭＲ、及び質量分析法によって確認した。ＤＯＸ−ＬＣＬ溶液をさらに使用するまで４℃で貯蔵した。

収率：１．４ｍｇ（１．７μｍｏｌ、２０％）。
ＤＯＸ−ＬＣＬ ^１９５ Ｐｔ−ＮＭＲ（Ｄ _２ Ｏ）：δＰｔ−２５９５ｐｐｍ（ＤＯＸのＮＨ_２基におけるＮ_３−Ｃｌ配位）。
ＤＯＸ−ＬＣＬイオンスプレーＭＳ：計算質量８３３。検出質量８３４ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ^＋］。

ドキソルビシン−ＬＣＬ−セツキシマブの合成
ＤＯＸ−ＬＣＬ溶液（水中１．４ｍｇ／ｍｌ、０．１３μｍｏｌ ＤＯＸ−ＬＣＬ）８０μｌをセツキシマブ溶液（バッファー中５ｍｇ／ｍｌ、セツキシマブ６．９ｎｍｏｌ）２００μｌに加えることにより、ＤＯＸ−ＬＣＬをセツキシマブにコンジュゲートした。２５０ｍＭトリシン／ＮａＮＯ_３バッファー溶液（ｐＨ８．５）５０μｌ及びミリＱ水１７０μｌを加え、混合物を３７℃で１、５、又は２４時間反応させた。未反応のＤＯＸ−ＬＣＬを、ＰＤ１０サイズ排除クロマトグラフィーによって除去した。ＤＯＸ−ＬＣＬ−セツキシマブ溶液を、さらに使用するまで−２０℃で貯蔵した。

ＤＯＸ−ＬＣＬ−セツキシマブコンジュゲートを、ＵＶ／ＶＩＳ分光法によって、及びＧＰＣによって、タンパク質及び薬物の含量に対して特徴付けた。ＤＯＸ含量を、４９０ｎｍのスペクトロスターＵＶ／ＶＩＳ分光計で検出した。既知濃度のＤＯＸ溶液を用いて検量線を構築した。ＧＰＣ分析を、スーパーデックス２００ １０／３００ＧＬカラム、ウォーターズ２４７５蛍光検出器、及びウォーターズ２４８７ ＵＶ検出器を装着したウォーターズ２６９５液体クロマトグラフで行った。移動相としてＰＢＳを用いた。溶出ピークを、励起波長及び発光波長それぞれ２８０ｎｍ及び３３０ｎｍ（タンパク質）、又は吸収波長４９０ｎｍ（ＤＯＸ）を用いて検出した。既知濃度のタンパク質溶液を用いて検量線を構築した。

図５．１に示す通り、ＤＯＸ−ＬＣＬはセツキシマブと速やかに錯体形成し、３７℃で１時間後、すでに最大コンジュゲーションの６７％であり、３７℃で５時間反応後、９０％がカップリングしていた。反応２４時間後、いくらかのタンパク質沈澱が観察された。この沈澱は反応１時間後では未だ検出されず、６０分の短い反応時間が最も好ましいことが強調された。

図５．１は、時間の関数としての、ＤＯＸ−ＬＣＬのセツキシマブに対するコンジュゲーションを示す。２４時間後のコンジュゲーションを１００％とした。

ＧＰＣサイズ排除クロマトグラフィーにより、図５．２に示す通り、ＤＯＸ−ＬＣＬのセツキシマブに対する安定なコンジュゲーションが確認された。４９０ｎｍのドキソルビシン特異的シグナルはセツキシマブの保持時間に溶出され、ＬＣＬリンカーによるＤＯＸのセツキシマブに対する安定な配位が確認された。

図５．２は、ＤＯＸ−ＬＣＬ−セツキシマブのＧＰＣクロマトグラムを示す。

ドキソルビシン−ＬＣＬ−トラスツズマブの合成
ＤＯＸ−ＬＣＬ溶液（水中２．７ｍｇ／ｍｌ、ＤＯＸ−ＬＣＬ０．２８μｍｏｌ）９０μｌをトラスツズマブ溶液（バッファー中２１ｍｇ／ｍｌ、トラスツズマブ１４ｎｍｏｌ）１００μｌに加えることにより、ＤＯＸ−ＬＣＬをトラスツズマブにコンジュゲートした。２５０ｍＭトリシン／ＮａＮＯ_３バッファー溶液（ｐＨ８．５）２５μｌ及びミリＱ水３５μｌを加え、混合物を３７℃で２４時間反応させた。未反応のＤＯＸ−ＬＣＬを、ディスポーザブルＰＤ１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。ＤＯＸ−ＬＣＬ−トラスツズマブ溶液を、さらに使用するまで−２０℃で貯蔵した。

ＤＯＸ−ＬＣＬ−トラスツズマブの特徴付けは、先に記載したＤＯＸ−ＬＣＬ−セツキシマブの特徴付けと同様であった。

ＤＯＸ−ＬＣＬ−トラスツズマブは、そのタンパク質及び薬物の含量から算出して、タンパク質１分子あたり平均２．２個のカップリングしたＤＯＸ分子を含んでいた。

ドキソルビシン−ＬＣＬ−セツキシマブ及びドキソルビシン−ＬＣＬ−トラスツズマブの機能評価
Ａ４３１細胞を、３．７ｇ／ｌ炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／ｌ ｌ−グルコース、２ｍＭ ｌ−グルタミンを含み、７．５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００□ｇ／ｍｌ）、及びアムホテリシンＢ（０．２５□ｇ／ｍｌ）を補った、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＰＡＡ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、オーストリア）中、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気中３７℃で培養した。1ウエルあたり４０００細胞を９６ウエルプレート中に接種した。２４時間後、培地を、少なくとも３回繰返して、２５ｎＭ〜６．７μＭの最終濃度にＰＢＳ中希釈したＤＯＸ−ＬＣＬ−抗体をスパイクした新鮮な培地で置き換えた。合計細胞数を決定するために、増殖１日後、トリクロロ酢酸を４％に添加することにより、細胞のタンパク質を沈殿させた。細胞を水で洗浄し、室温で乾燥させ、１％酢酸中０．４％スルホローダミンＢで３０分間染色した。過剰の色素を１％酢酸で洗い流し、細胞を室温で乾燥させた。結合した色素を、非緩衝性の（ｕｎｂｕｆｆｅｒｅｄ）１０ｍＭ Ｔｒｉｓで１５分間抽出し、ＯＤ値をバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ノバパスマイクロプレートリーダー（Ｎｏｖａｐａｔｈ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）（バイオラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ、オランダ）で、５１０ｎｍで測定した。

図５．３は、ＤＯＸ−ＬＣＬ−抗体コンジュゲートは、非修飾の抗体よりも、細胞を死滅させるのにより効果的であることを明らかに示している。ＤＯＸ−ＬＣＬ−セツキシマブの効果は、標的モイエティのないＤＯＸの効果と同様である（図５．３Ａ）。Ａ４３１細胞は、主にＥＧＦＲ受容体（セツキシマブによって標的化される）を提示し、その細胞膜で比較的少量のＨＥＲ２受容体（トラスツズマブによって標的化される）を示すことに注目されたい。それにもかかわらず、最大濃度の７μＭで、非修飾のトラスツズマブに比べて、著しい効果のＤＯＸ−ＬＣＬ−トラスツズマブが観察される（図５．３Ｂ）。

図５．３はＤＯＸ−ＬＣＬ−セツキシマブ（Ａ）及びＤＯＸ−ＬＣＬ−トラスツズマブ（Ｂ）コンジュゲートのＡ４３１細胞の生存性に対する効果を示す。非処理細胞を１００％と設定する。データを、平均値±標準偏差として表す（実験は３回ずつ行った）。

実施例６：パクリタキセル−ＬＣＬ標的錯体

パクリタキセル−ＬＣＬの合成
パクリタキセル（ＰＡＸ、２８０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（ｄｒｙ ｐｙｒｉｄｉｎｅ）７ｍｌ中に溶解した。無水コハク酸（３９３ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、モレキュラーシーブの存在下、室温で５時間反応させた。ピリジンを減圧下で蒸発させ、残渣をＤＭＳＯ２ｍｌ中に再び溶解した。この溶液を、大過剰の水中で沈殿させた。引き続き、沈殿物を濾去し、五酸化リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ ｐｅｎｔｏｘｉｄｅ）の存在下、減圧下で乾燥させた。生成物の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ_６）において、シグナルが、メチレンコハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）のプロトンに相当する２．６２ｐｐｍに出現し、スクシニル−ＰＡＸの形成が確認された。

合成手順の第２のステップにおいて、スクシニル−ＰＡＸ（１０８ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（４１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）と一緒にジクロロメタン２ｍｌ中に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシミド（１８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、モレキュラーシーブの存在下、室温で１８時間反応させた。反応混合物を、０．４５μｍシリンジフィルターを用いて濾過し、ジエチルエーテルとメタノールの大過剰の冷混合物（２０／１ ｖ／ｖ）中で沈殿させた。ＮＨＳ−スクシニル−パクリタキセルを濾過によって得て、真空下で乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ_６）において、メチレンコハク酸のプロトンは低磁場にシフトし、スクシンイミドのプロトンに相当する新たなピークが２．７９ｐｐｍに出現し、カルボン酸基のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルへの変換が確認された。

第３のステップにおいて、ＮＨＳ−スクシニル−ＰＡＸ溶液（ＤＭＦ中５ｍｇ／ｍｌ、１．０μｍｏｌ ＮＨＳ−スクシニル−パクリタキセル）２００μｌを、４−ピコリルアミン溶液（ＤＭＦ中５ｍｇ／ｍｌ、１．０μｍｏｌ ４−ピコリルアミン）２０μｌと混合した。混合物を室温で４８時間反応させた。ピコリル−ＰＡＸの同一性及び純度を、ＨＰＬＣ（＞９５％）及びイオンスプレーＭＳ（計算質量１０４４；検出質量１０４４ｍ／ｚ）によって確認した。

手順の最終ステップにおいて、ピコリル−ＰＡＸ（５０μｇ、４８ｎｍｏｌ、ＤＭＦ１０μｌに溶解したもの）を、６０℃で４８時間、ＬＣＬ（８４μｇ、０．２４μｍｏｌ、ＤＭＦ１２μｌ中に溶解したもの）と反応させた。ピコリル−ＰＡＸ−ＬＣＬの同一性及び純度を、ＨＰＬＣ（＞８０％）及び質量分析法により点検した。ピコリル−ＰＡＸ−ＬＣＬ溶液を、さらに使用するまで４℃で貯蔵した。

ピコリル−ＰＡＸ−ＬＣＬイオンスプレーＭＳ：計算質量１３３４。検出質量１３３４ｍ／ｚ。

ピコリル−ＰＡＸ−ＬＣＬを標的モイエティにカップリングするための手順は、ドキソルビシン−ＬＣＬを標的モイエティにカップリングするための上記に記載した手順に類似する。

実施例７．ＤＭ１−ＬＣＬ標的錯体

ＤＭ１をＬＣＬにカップリングするための手順は、ドキソルビシンをＬＣＬにカップリングするための上記に記載した手順に類似する。また、ＤＭ１−ＬＣＬを標的モイエティにカップリングするための手順は、ドキソルビシン−ＬＣＬを標的モイエティにカップリングするための上記に記載した手順に類似する。

Claims (29)

1. 少なくとも１つの機能的モイエティを標的モイエティにカップリングすることにより、細胞標的コンジュゲートを調製するための方法であって、
   ｉ．第１の反応基及び第２の反応基を有する金属イオン錯体を含み、金属イオン錯体の第１の反応基は機能的モイエティと配位結合を形成している、機能的金属イオン構築物を用意するステップと、
   ｉｉ．機能的金属イオン構築物の金属イオン錯体の第２の反応基が、コンジュゲートを形成するように標的モイエティと配位結合を形成し、コンジュゲートの標的モイエティの免疫反応性の低減が非結合の標的モイエティの免疫反応性に比べて５％を超えないように、機能的金属イオン構築物を標的モイエティと、１０分〜２４０分間混合するステップと、
   ｉｉｉ．得られたコンジュゲートを混合物から分離するステップと
   を含む、方法。
2. 金属イオン錯体が白金錯体である、請求項１に記載の方法。
3. 白金錯体がシス白金錯体である、請求項２に記載の方法。
4. 機能的モイエティが、治療用化合物、診断用化合物、又はキレート剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 標的モイエティが、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、又はこれらの工学的変異体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 混合を、２０〜５０℃の温度で行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 混合前又は混合中、機能的金属イオン構築物と標的モイエティとの混合物のｐＨを、４〜１２に調整する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 少なくとも１個の機能的金属イオン構築物が、配位結合によって１つの標的モイエティと結合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. １〜３０個の機能的金属イオン構築物が、配位結合によって１つの標的モイエティと結合している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 用いられる機能的金属イオン構築物が、異なる機能的モイエティを含んでいる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 機能的金属イオン構築物の機能的モイエティが治療用化合物であり、治療用化合物が、細胞システムにおけるシグナル伝達カスケードを阻害し、細胞骨格を妨害し、ＤＮＡ二重らせん中にインターカレートし、又は抗炎症活性、抗高血圧活性、抗線維活性、抗血管新生活性、抗腫瘍活性、免疫刺激活性、若しくはアポトーシス誘導活性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 機能的金属イオン構築物の機能的モイエティが、イオウ基又は芳香族窒素基を含んでいる治療用化合物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 機能的金属イオン構築物の機能的モイエティが、キナーゼインヒビター、受容体ブロッカー、及び組換えタンパク質の群から選択される治療用化合物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. キナーゼインヒビターが、エルロチニブ、ゲフィニチブ、イマチニブ、ペントキシフィリン、ＰＤＴＣ、ＰＴＫＩ、ＳＢ２０２１９０、バタナリブ、ＬＹ３６４９４７、Ｙ２７６３２、ＡＧ１２９５、及びＳＰ６００１２５の群から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. 受容体ブロッカーが、ロサルタンである、請求項１３に記載の方法。
16. 組換えタンパク質が、ＴＲＡＩＬである、請求項１３に記載の方法。
17. 機能的金属イオン構築物の機能的モイエティが、（超）毒性薬物である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. （超）毒性薬物が、タキサン、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、カリケアマイシン、メイタンシノイド、オーリスタチン、チューブリシン、及びＣＣ１００６５アナログの群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 機能的金属イオン構築物の機能的モイエティが診断用化合物であり、診断用化合物が蛍光色素である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
20. 蛍光色素が、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＤＹ−８００、ＤＹ−８３１、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（商標） ７５０、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（商標） ７９０、及びインドシアニングリーンの群から選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 機能的金属イオン構築物の機能的モイエティが、放射性核種、ＰＥＴ画像化剤、ＳＰＥＣＴ画像化剤、及びＭＲＩ画像化剤の群から選択される診断用化合物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
22. 機能的金属イオン構築物の機能的モイエティが、ＥＤＴＡ、ＤＰＴＡ、デスフェリオキサミン、及び、遷移金属ＰＥＴ放射性核種、非放射性金属、又は遷移金属ＳＰＥＣＴ放射性同位元素がカップリングしている、大環状キレーターからなるキレート剤の群から選択されるキレート剤である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
23. 大環状キレーターが、ＤＯＴＡ及びｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡの群から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 遷移金属ＳＰＥＣＴ放射性同位元素が、^９９ｍＴｃ及び^１９５ｍＰｔの群から選択される、請求項２２又は２３に記載の方法。
25. 標的モイエティが、インタクト抗体である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. インタクト抗体が、アダリムマブ、ベバシズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、及びトラスツズマブの群から選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 標的モイエティが、抗体フラグメント又はこれらの工学的変異体である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
28. 抗体フラグメント又はこれらの工学的変異体が、治療用ＦＡＢ、ラニビズマブ、ダイアボディ、ミニボディ、ドメイン抗体、アフィボディ、ナノボディ、及びアンチカリンの群から選択される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記ｉｉ．のステップにおいて標的モイエティが沈殿しない、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。

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