ES2205030T3

ES2205030T3 - Procedimientos para la produccion de segmentos de conexion a base de platino entre marcadores y moleculas bio-organicas, para el marcado de moleculas bio-organicas, la deteccion de sustancias biologicas a estudiar.

Info

Publication number: ES2205030T3
Application number: ES96915218T
Authority: ES
Inventors: Hendrik Jan Houthoff; Jan Reedijk; Tinka Jelsma; Remco Maria Van Es; Franciscus Michiel Van Den Berg; Edwin Leo Mario Lempers; Marieke Johanna Bloemink
Original assignee: Kreatech Biotechnology BV
Current assignee: Kreatech Biotechnology BV
Priority date: 1995-05-09
Filing date: 1996-05-08
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2016-05-08
Also published as: DE69629403D1; AU724320B2; PT1019420E; WO1996035696A1; DK1019420T3; NZ307633A; CA2218815A1; AU5704096A; EP1019420B1; ATE246696T1; DE69629403T2; CA2218815C; MX9708590A; JPH11505533A; EP1019420A1

Abstract

Un método para preparar una sustancia marcadora de la fórmula en donde X representa cualquier puente estabilizador, A representa una porción reactiva, e Y es un marcador, comprendiendo las etapas de: - preparar un conector constando de un compuesto de platino de la fórmula en donde A y B representan las mismas o diferentes porciones reactivas, a partir de una materia de partida constando de un compuesto de la estructura en donde C representa una porción electronegativa, y - hacer reaccionar el conector con un grupo marcador, por lo que B es sustituido por Y.

Description

Procedimientos para la producción de segmentos de conexión a base de platino entre marcadores y moléculas bio-orgánicas, para el marcado de moléculas bio-orgánicas, la detección de sustancias biológicas a estudiar.

La invención se refiere a métodos para la producción de conectores (porciones conectoras entre marcadores y moléculas bioorgánicas), los cuales conectores están basados en compuestos de platino. Los compuestos de platino (coordinación) han sido considerados moléculas interesantes durante mucho tiempo. Durante una revisión de estos compuestos y sus usos, nos remitimos a Reedijk y col. (Structure and Bonding 67, pág. 53-89, 1987). Especialmente el Cisplatino ha recibido mucha atención como un posible fármaco antitumoral. Esta reactividad antitumoral de los compuestos de platino surge porque tienen al menos dos grupos reactivos (preferentemente con orientación cis entre sí), lo cual hace posible que reticulen moléculas de ADN, inhibiendo de ese modo la replicación de estas moléculas de ADN.

Se ha revelado un uso distinto de los compuestos de platino (coordinación) en la solicitud PCT (WO92/01699), en donde un compuesto de platino, que tiene dos porciones reactivas (denominadas aquí como grupos activos), reacciona con una fluoresceína para obtener un compuesto de platino marcado que tiene una única porción reactiva, la cual puede unirse (no covalentemente) a un ácido nucleico, preferentemente en la posición N-7 de un residuo guanina. La presente invención proporciona métodos perfeccionados para preparar tales compuestos de platino, los cuales son apropiados para su uso como conectores en tales sustancias marcadoras, métodos perfeccionados para preparar sustancias marcadoras y el empleo de tales sustancias para preparar juegos de ensayo diagnósticos.

En WO92/01699, los compuestos de partida revelados son el dicloruro de platino(II)(etilendiamina) o el [platino(II)(etilendiamina)(Me_{2}SO)Cl]^{+}Cl^{-}.

Ambos compuestos tienen ciertas desventajas para su uso como conectores. El primero puede ser obtenido comercialmente, el segundo (el preferido) debe ser sintetizado como sal cloruro. En el compuesto dicloruro, los iones Cl^{-} son menos fácilmente sustituidos por un grupo marcador o un grupo guanina, respectivamente. Además, puesto que los dos iones Cl^{-} tienen aproximadamente la misma reactividad, ocurre que ambos iones son sustituidos por un marcador, no dejando porción reactiva para acoplar la sustancia marcada a una biomolécula de interés. Es por esa razón que los compuestos que tienen porciones reactivas diferentes sean mucho más preferidos para su uso en el marcaje. Esto es verdad para el segundo compuesto, sin embargo, el marcaje total del ADN para estos compuestos será apreciablemente más largo, hasta varias horas en lugar de varios minutos, haciendo que el producto sea menos apropiado para su uso rutinario.

Ahora hemos descubierto un método muy simple y fiable para producir conectores simétricos, que incluyen el primero recién mencionado y varios nuevos, mediante la selección de compuestos de partida apropiados de la fórmula PtE_{4}, en donde E es un grupo electronegativo, preferentemente un halógeno o NO_{3}^{-} o SO_{3}^{-}. La reacción, la cual está descrita en los ejemplos, de estos compuestos de partida con etilendiamina es muy sencilla y eficaz. Además, esta reacción conduce a compuestos intermedios simétricos muy apropiados para producir sustancias marcadas. Nunca se han revelado las ventajas de trabajar con estos compuestos de partida para producir sustancias marcadas, y estos compuestos de partida no han sido utilizados con este fin. Una ventaja principal de utilizar estos compuestos es que, cuando se tiene que unir un puente estabilizador para el compuesto de platino resultante, no se tienen que emplear reactivos bloqueantes. Otra ventaja es que los compuestos intermedios resultantes pueden ser nuevamente marcados sin el empleo de agentes bloqueantes. Por lo tanto, se pueden eliminar completamente las etapas que eliminan los agentes bloqueantes. Además, los rendimientos de estas reacciones son muy altos. Otra ventaja del empleo de estos compuestos de partida simétricos es que no se pueden formar mezclas de diferentes compuestos resultantes, las cuales pueden interferir con la siguiente reacción y reducir el rendimiento o necesitar etapas de separación extras. Según la invención, un compuesto intermedio muy apropiado es platino(II)(etilendiamina)(NO_{3})_{2}. Sorprendentemente, difícilmente ocurre algún marcaje doble con estos compuestos, lo que esta en contraste con el compuesto dicloruro de WO92/01699. Esta sustancia puede ser fácilmente suministrada con un grupo marcador apropiado, produciendo una sustancia marcadora que aún se puede unir, mediante sustitución del grupo NO_{3} que queda, a una molécula bioorgánica para ser marcada o detectada, la cual reacción procede mucho más rápido que con los compuestos de platino conocidos. Además, los métodos para producir este compuesto y el compuesto resultante no implican sustancias sumamente tóxicas tales como DMSO.

Los compuestos intermedios pueden ser marcados con cualquier marcador apropiado (también conocido como etiqueta). Estos marcadores pueden ser marcadores radiactivos, enzimas (las cuales necesitan reacción con un sustrato para ser detectadas), componentes de pares de unión específica tales como avidina, streptavidina o biotina, biocitina, iminobiotina, sustancias colorantes coloidales, fluorocromos (rodamina, etc.), sustancias reductoras (eosina, eritrosina, etc.), soluciones de látex (coloreadas), digoxigenina, soluciones de metales u otras soluciones de macropartículas (selenio, carbono y otros por el estilo), dansil lisina, anticuerpos, proteína A, proteína G, etc. Estos marcadores pueden ser unidos a los conectores directamente o mediante brazos espaciadores (preferentemente polilisina). Debido a que el marcaje de ácidos nucleicos y proteínas es tan fácil, es posible vender por separado los compuestos conector-marcador en un juego a fin de que cualquier usuario pueda producir fácilmente las sustancias marcadas, o pueda unir, mediante el mismo procedimiento, muchos diferentes marcadores de elección para las sustancias. Esto permite múltiples detecciones en un ensayo. Además, con los presentes métodos y compuestos también se obtienen, por supuesto, las conocidas ventajas de los compuestos de platino marcadores (de WO92/01699, por ejemplo). Otra ventaja de los compuestos de platino es que pueden ser detectados más o menos directamente utilizando el platino como núcleo para depositar plata u otros cristales metálicos.

Casi todas las moléculas bioorgánicas que contengan un S (azufre) o un N (nitrógeno) accesible pueden ser marcadas con los compuestos de platino. Una molécula bioorgánica muy conveniente para ser marcada con la sustancia marcadora según la invención es ácido nucleico (nucleótidos, oligonucleótidos, ADN, ARN, homodúplex, heterodúplex o multidúplex). El platino se une muy fácilmente (no covalentemente) a la posición N-7 de residuos guanina. De este modo, las moléculas de ADN o ARN, sean de banda simple o de otra manera, pueden ser fácilmente detectadas, pero esto también permite la producción de sondas para técnicas de hibridación en donde moléculas de ADN/ARN no marcadas se hibridan a la sonda marcada. Los compuestos de platino difícilmente interfieren con la hibridación, si la hubiera. También, esta técnica obvia el empleo de nucleótidos modificados para preparar sondas. Sin embargo, también se pueden marcar proteínas, péptidos y otras moléculas bioorgánicas con las sustancias marcadoras según la invención.

Los compuestos de platino según la invención son también muy apropiados para unir moléculas bioorgánicas a superficies sólidas tales como nitrocelulosa, filtros de nylon o placas de microtitulación.

Los nucleótidos modificados conforme a las prácticas de esta invención, y los oligo y polinucleótidos en los que hayan sido incorporados los nucleótidos modificados, o los oligo y polinucleótidos que hayan sido directamente modificados utilizando estos nuevos compuestos de platino, pueden ser utilizados como sondas en investigación biomédica, diagnóstica clínica y tecnología de ADN recombinante.

La amplia variedad de utilidades están basadas en la capacidad de los compuestos de platino para formar complejos estables con polipéptidos, los cuales, a su vez, pueden ser detectados mediante porciones detectables que están unidas a, o que interaccionan, con el polipéptido. Algunos usos incluyen el detectar e identificar agentes etiológicos que contengan ácidos nucleicos, por ejemplo, bacterias y virus; escrutar bacterias por su resistencia a los antibióticos, escrutar animales por sus trastornos genéticos con relación a los efectos farmacéuticos; diagnosticar trastornos genéticos, por ejemplo, trisomía 21, anemia de células falciformes; cariotipaje cromosomial, e identificar células tumorales.

Serán evidentes otras ventajas y formas de realización de la invención a partir de la siguiente parte experimental.

Experimental Síntesis de compuestos de platino intermedios

Estos compuestos se pueden preparar mediante un proceso que implica:

(a) hacer reaccionar un compuesto en el que el anión tiene la estructura:

1

con IK en un disolvente adecuado, bajo condiciones apropiadas, a fin de formar un compuesto de platino yodado en donde el anión tiene la estructura:

2

(b) hacer reaccionar dicho compuesto de platino yodado (2) con etilendiamina, en un disolvente apropiado, para formar un compuesto de platino yodado dietilenamino, representado por la fórmula Pt(en)I_{2}, y que tiene la estructura:

3

(c) hacer reaccionar dicho compuesto (3) con NO_{3}Ag, siendo realizada la reacción en un disolvente apropiado, bajo condiciones adecuadas, para formar un compuesto que tiene la estructura:

4

(d) hacer reaccionar dicho compuesto (4) con ClK en un disolvente apropiado, bajo condiciones adecuadas, para formar un compuesto que tiene la estructura:

5

(e) hacer reaccionar dicho compuesto (5) con NO_{3}Ag en un disolvente apropiado, bajo condiciones adecuadas, para formar un compuesto que tiene la estructura:

6

(f) recuperar dicho compuesto (6) como compuesto de partida de platino modificado, para la síntesis de compuestos de Pt(en) unidos a haptenos, para su uso como marcador de ADN y/o ARN.

Los compuestos (4) y (6) son, por supuesto, iguales; ambas reacciones que los preparan han sido dadas como alternativas.

Ejemplo 1 Preparación de materia de partida Pt(en)-diamina Preparación de platinometilendiamino(NO_{3})_{2}: materia de partida Pt(en)(NO_{3})_{2}

Todas las reacciones son realizadas en la oscuridad

Disolver 1 gramo de tetracloroplatinato(II) potásico, Cl_{4}PtK_{2} (2'4 mmol, Sigma) en 50 ml de agua Millipore (agua filtrada) y agitar a temperatura ambiente. Añadir 10 equivalentes de yoduro potásico, IK (24 mmol, 3'999 g, Sigma). El color de la solución virará inmediatamente del naranja al rojo oscuro (I_{4}PtK_{2}), agitar durante 5 minutos.

Añadir un equivalente de etilendiamina (2'4 mmol, 160'8743 \mul, Merck, 1l = 0'9 kg), después de diluir 161 \mul de etilendiamina en 5 ml de agua Millipore, muy lentamente a la solución de platino, mezclar esta solución durante 1 hora a temperatura ambiente.

Se formará un precipitado amarillo/marrón, I_{2}Pt(en), y dejando estar el líquido anterior, debería ser transparente.

Filtrar la solución a través de un filtro de membrana de 1'0 \mum (Schleicher & Schuell), lavar el precipitado con agua Millipore, etanol y dietiléter (en este orden). Secar el I_{2}Pt(en) en un horno de secado a vacío a 37ºC, durante al menos 4 horas.

Pesar el I_{2}Pt(en) desecado (\sim 1'07 g) y suspenderlo en 45 ml de agua Millipore/5 ml de acetona, la solución será turbia. Añadir 1'95 equivalentes de NO_{3}Ag (M = 169'9, Sigma). Agitar la reacción durante la noche a temperatura ambiente.

Filtrar la solución a través de un filtro de membrana de 1'0 \mum, el precipitado es yoduro de plata, IAg, el filtrado debería ser transparente.

Añadir a 0'5 ml del filtrado, conteniendo Pt(en)(NO_{3})_{2}, un exceso de ClK o ClNa y asegurarse de que no se forma un precipitado blanco inmediatamente después de añadir el exceso de ClK o ClNa. Si no se forma precipitado blanco (únicamente uno amarillo), añadir entonces un exceso de ClK o ClNa al filtrado entero. Después de que se forme el precipitado amarillo, filtrar la solución y lavar el precipitado (Cl_{2}Pt(en)) con agua Millipore, etanol y diéter.

Secar el precipitado, durante al menos 4 horas, en un horno de secado a vacío a 37ºC.

Pesar el Cl_{2}Pt(en) seco (M = 326'1), y suspenderlo en 45 ml de agua Millipore/5 ml de acetona, y agitar la suspensión turbia. Añadir 1'95 equivalentes de NO_{3}Ag y agitar la solución durante la noche, a temperatura ambiente. El color de la solución se volverá blanco, debido a la formación de ClAg.

Filtrar la solución en la oscuridad y evaporar el filtrado para eliminar la acetona, mediante evaporación rotativa, hasta que quede 25 ml del filtrado. Luego se liofiliza el filtrado. Se comprueba el producto mediante RMN o Espectroscopia de Absorción Infrarroja. Abajo se da un análisis elemental.

TABLA I

7

No hubo materia suficiente para la prueba de Cl.

Se añadió O_{5}V_{2} para las combustiones de C, H, N y S.

TABLA II

8

Ejemplo 2 Preparación de compuestos de Pt(en)-hapteno detectables inmunológicamente Preparación de etilendiamino-\varepsilon-(6-(biotinoíl)amino)hexanoíl-L-lisina-nitrato de platino [Pt(en)(biocitina-X) (NO_{3})]NO_{3} Todas las reacciones son realizadas en la oscuridad

Disolver 31'6 mg de biocitina-X (0'065 mmol, Molecular Probes, Inc. EE.UU.) en 15 ml de agua Millipore en la oscuridad, y calentar la solución un poco (hasta un máximo de 40º) hasta disolver, y ajustar el pH a 7-8 con NaOH 0'4M. Disolver 23'4 mg de Pt(en)(NO_{3})_{2} (M = 379'1, 0'062 mmol) (ver ejemplo 1) en 10 ml de agua Millipore en la oscuridad, y calentar la solución un poco (hasta un máximo de 50ºC) hasta que se disuelva completamente el Pt(en)(NO_{3})_{2}.

Cuando ambos reactivos estén completamente disueltos, añadir la solución de biocitina a la solución de platino, y dejarlas reaccionar durante 210 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. El pH de la solución tiene que ser 7'0 a fin de que se verifique el pH durante la reacción, y se añade H_{2}O o NO_{3}H si fuese necesario.

Aislar el producto [Pt(en)(biocitina-X)(NO_{3})]NO_{3} mediante liofilización.

La estabilidad del producto está asegurada por la unión de Pt no únicamente al grupo amino de la biocitina-X, sino también al grupo carboxilato de la biocitina-X. Debido a la última cinética de la unión del compuesto de platino, se crea un anillo quelato que justificará la estabilidad del producto una vez que se disuelva en agua, porque no pueden ocurrir reacciones de polimerización. Abajo se da un análisis elemental del [Pt(en)(biocitina-X)(NO_{3})]NO_{3}.

TABLA III

9

No hubo materia suficiente para la prueba de Cl.

Ejemplo 3 Preparación de etilendiamino-Digoxigenin®-L-lisin-nitrato de platino [Pt(en)(Digoxigenina)(NO_{3})](NO_{3})

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'062 mmol, 23'65 mg) en 20 ml de metanol, y calentar a 50ºC hasta que se disuelva completamente el Pt(en)(NO_{3})_{2}.

Disolver la dixogenin-L-lisina (45'3 mg) en 20 ml de metanol, calentar hasta que toda la materia sólida esté disuelta.

Añadir las dos soluciones juntas y hacer reaccionar durante al menos 3 horas. Aislar el producto final mediante evaporación rotativa. La Digoxigenin® es una marca registrada de Boehringer Mannheim.

Ejemplo 4 Preparación de compuestos de platino(en) fluorescentes Preparación de etilendiamino-fluoresceinamina-nitrato de platino [Pt(en)(Fluoresceinamina)(NO_{3})](NO_{3}) Todas las reacciones son realizadas en la oscuridad

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'25 mmol, 94'8 mg) en 10 ml de metanol/2 ml de agua, calentando hasta disolver.

Disolver fluoresceinamina (0'27 mmol, 95'5 mg, Sigma) en 10 ml de metanol.

Añadir la solución de fluoresceinamina a la solución de platino, y se observa un cambio inmediato de color.

Aplicar la reacción durante al menos 3 horas.

Aislar el producto cristalino final mediante evaporación rotativa, seguido por liofilización.

Ejemplo 5 Preparación de etilendiamino-5'-acetamidofluorescein-nitrato de platino [Pt(en)(5'-acetamidofluorescein)(NO_{3})](NO_{3}) Todas las reacciones son realizadas en la oscuridad

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'047 mmol, 17'8 mg) en 5 ml de metanol, calentar hasta disolver. Disolver 5'-acetamidofluoresceína (0'049 mmol, 20 mg, Molecular Probes, Inc.) en 10 ml de metanol.

Añadir la solución de acetamidofluoresceína a la solución de platino, y hacer reaccionar durante al menos 3 horas.

Aislar el producto final mediante evaporación rotativa.

Ejemplo 6 Preparación de etilendiamino-\varepsilon-(6-(fluorescein-5-carboxamido)hexanoíl-L-lisin-nitrato de platino [Pt(en)(fluores-ceinlisina)(NO_{3})] NO_{3} Todas las reacciones son realizadas en la oscuridad

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'077 mmol, 29'17 mg) en 10 ml de metanol, calentar hasta disolver.

Disolver \varepsilon-(6-(fluorescein-5-carboxamido)hexanoíl)-L-lisina (0'081 mmol, 50 mg) en 10 ml de metanol.

Añadir la solución de fluoresceína a la solución de platino, y hacer reaccionar durante al menos 3 horas. Aislar el producto final mediante evaporación rotativa.

Ejemplo 7 Preparación de etilendiamino-5-(y 6)-((N-(5-aminopentil)amino)carbonil)tetrametilrodamina-nitrato de platino[Pt(en)tetrametilrodamina cadaverina) (NO_{3})]NO_{3} Todas las reacciones son realizadas en la oscuridad

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'074 mmol, 28 mg) en 10 ml de metanol, calentar hasta disolver.

Disolver tetrametilrodamina cadaverina (0'077 mmol, 40 mg, Molecular Probes, Inc.) en 10 ml de metanol.

Añadir las dos soluciones juntas y hacer reaccionar durante al menos 3 horas.

Aislar el producto final mediante evaporación rotativa.

Ejemplo 8 Preparación de etilendiamino-Cascade Blue® cadaverina-nitrato de platino [Pt(en)(Cascade Blue® cadaverina)(NO_{3})]NO_{3}

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'057 mmol, 21'6 mg) en 10 ml de agua desmineralizada, y calentar a 50ºC hasta que se disuelva completamente el Pt(en)(NO_{3})_{2}.

Disolver Cascade Blue® cadaverina (0'06 mmol, 40 mg, Molecular Probes, Inc.) en 10 ml de agua desmineralizada.

Añadir la dos soluciones juntas y hacer reaccionar durante al menos 3 horas.

Aislar el producto final mediante liofilización.

Cascade Blue® cadaverina es una marca registrada de Molecular Probes Inc.

Ejemplo 9 Preparación de etilendiamino-4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-boraO-3a,4a-diaza-s-indaceno-3-propioniletilendiamina-nitrato de platino [Pt(en)BODIPY® 530/550 C3EDA)(NO_{3})]NO_{3}

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'052 mmol, 19'66 mg) en 10 ml de metanol, y calentar hasta disolver.

Disolver BODIPY 530/550 C3EDA (0'0545 mmol, 256 mg, Molecular Probes, Inc.) en 10 ml de metanol. Añadir las dos soluciones juntas y hacer reaccionar durante al menos 3 horas.

Aislar el producto final mediante evaporación rotativa.

BODIPY® es una marca registrada de Molecular Probes Inc.

Ejemplo 10 Preparación de etilendiamino-N-\varepsilon-(5-dimetilaminonaftalen-1-sulfonil)-L-lisin-nitrato de platino [Pt(en)(Dansillisina)(NO_{3})]NO_{3}

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'125 mmol, 47'5 mg) en 20 ml de agua desmineralizada, y calentar a 50ºC hasta que el Pt(en)(NO_{3})_{2} esté completamente disuelto.

Disolver dansil lisina (0'13 mmol, 50 mg, Molecular Probes Inc.) en 20 ml de agua desmineralizada, ajustar el pH a 7-8 con NaOH 0'4M.

Añadir las dos soluciones juntas y hacer reaccionar durante al menos 3 horas. Aislar el producto final por liofilización.

Ejemplo 11 Reacción para acoplar compuestos de Pt(en) a ADN Reacción típica para marcar moléculas de ADN con un compuesto de Pt(en)

5 \mug de ADN de banda doble son sonicados o tratados con DNasa para producir fragmentos de 300-500 pb. Se añade 6 \mug de compuesto de Pt(en) y se ajusta el volumen a 50 \mul con agua desmineralizada. Se incuba la mezcla de reacción a 65ºC durante 1 hora. El compuesto de Pt(en) no unido es bloqueado añadiendo 100 \mul de una solución de NADDTC. El ADN marcado con compuesto de Pt(en) es purificado en una columna Sephadex G-50. El ADN fácilmente marcado y purificado es almacenado a –20ºC o utilizado directamente en un ensayo basado en sonda de ADN. Las sondas de ADN marcadas con compuesto de Pt(en) pueden ser almacenadas, como mínimo 2 años a –20ºC, sin pérdida de actividad y/o especificidad.

Todas las aplicaciones mencionadas son realizadas con sondas marcadas según este protocolo.

Ejemplo 12 Preparación de etilendiamino-rodamina 123-nitrato de platino [Pt(en)(rodamina 123)(NO_{3})]NO_{3} Todas las reacciones son realizadas en la oscuridad

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'058 mmol, 21'9 mg) en 10 ml de N,N-dimetilformamida, calentar hasta disolver.

Disolver rodamina 123 (0'060 mmol, 22'8 mg) en 8 ml de N,N-dimetilformamida. Añadir la solución de rodamina a la solución de platino, y hacer reaccionar durante al menos 3 horas. Aislar el producto mediante evaporación rotativa.

Ejemplo 13 Preparación de etilendiamino-(7-amino-4-metilcumarina)-nitrato de platino [Pt(en)(7-amino-4-metilcumarina)(NO_{3})]NO_{3} Todas las reacciones son realizadas en la oscuridad

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'098 mmol, 37'0 mg) en 25 ml de metanol/2 ml de agua desmineralizada, calentar hasta disolver. Disolver 7-amino-4-metilcumarina (0'10 mmol, 18 mg) en 10 ml de metanol.

Añadir la solución de 7-amino-4-metilcumarina a la solución de platino, y hacer reaccionar durante al menos 4 horas. Aislar el producto por evaporación rotativa, seguido por liofilización.

Ejemplo 14 Preparación de etilendiamino-5-aminoeosinanitrato de platino [Pt(en)(5-aminoeosina)(NO_{3})]NO_{3} Todas las reacciones son realizadas en la oscuridad

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'068 mmol, 25'6 mg) en 15 ml de N,N-dimetilformamida, calentar hasta disolver.

Disolver 5-aminoeosina (0'075 mmol, 50 mg) en 10 ml de N,N-dimetilformamida.

Añadir la solución de 5-aminoeosina a la solución de platino, y hacer reaccionar durante al menos 4 horas.

Aislar el producto por evaporación rotativa.

5-Aminoeosina: disponible comercialmente por Molecular Probes Inc (A-117).

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Ejemplo 15 Preparación de etilendiamino-IRD-nitrato de platino [Pt(en)(IRD)(NO_{3})]NO_{3} Todas las reacciones son realizadas en la oscuridad

Disolver Pt(en)(NO_{3})_{2} (0'008 mmol, 3'2 mg) en 5 ml de N,N-dimetilformamida.

Calentar hasta disolver.

Disolver IRD (presenta abajo) (0'009 mmol, 7'5 mg) en 5 ml de N,N-dimetilformamida.

Añadir la solución de IRD a la solución de platino, y hacer reaccionar durante al menos 3 horas. Aislar el producto por evaporación rotativa.

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Ejemplo 16 Marcaje con biotina de sondas de ADN con el sistema de unión universal Introducción

El método de marcaje ha sido utilizado para marcar sondas de ADN con biotina, para hibridación in situ (ISH). En este ejemplo, se presentan procedimientos de marcaje que incluyen los protocolos y datos para procedimientos de control de calidad. Para marcaje con biotina, se utilizó un ADN total plasmídico clonado del Virus del Papiloma Humano tipo 6 (VPH-6, 40% de pares de bases de GC).

Procedimientos experimentales Preparación de ADN plasmídico

ADN total del Virus del Papiloma Humano tipo 6 fue clonado en el vector pSp-64. El ADN plasmídico fue transfectado en E. coli (C-600) y plaqueado en placas LB conteniendo ampicilina. Se cultivaron colonias individuales durante la noche, en un cultivo extenso. Se aisló ADN plasmídico según el método de Birnboim y Doly^{1}, se purificó mediante cromatografía en columna Sepharose C1-2B (Pharmacia), y se examinó las inserciones mediante análisis de la enzima de restricción. Se determinó la concentración de ADN plasmídico mediante absorción A260/280. Después de precipitación con etanol, el ADN fue reconstituido en TRIS 10mM/ClH pH 7'2, EDTA 0'3mM, hasta una concentración final de 1 \mug/\mul (lote nº 150894). Posteriormente, este ADN fue sonicado (Soniprep 150, MSE) durante 3 veces de 10 minutos (5 micrones de amplitud) en hielo.

El tamaño de los fragmentos de ADN resultantes fue determinado por electroforesis en gel de agarosa al 2%, y se encontró que estaba entre 200-400 pares de bases (lote nº 051094).

Marcaje y purificación de ADN plasmídico

El ADN plasmídico del VPH-6 fue marcado con Biotina-ULS, mezclando los reactivos siguientes:

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La mezcla de reacción de 50 \mul fue incubada durante 15 minutos a 85ºC.

El exceso de reactivo marcador fue capturado añadiendo 50 \mul de dietilditiocarbamato sódico (solución al 2% en agua desmineralizada) e incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Se eliminó el Biotina-ULS no unido, utilizando una columna microespín S300 HR (Pharmacia), mediante cromatografía de exclusión granulométrica.

El volumen de eluyente fue adaptado a 500 \mul, dando una concentración en sonda de VPH-6 con biotina de 10 ng/\mul (lote nº 06109-4).

Control de calidad para los límites de detección

El límite de detección de la sonda con biotina fue determinado mediante "spot blot" directo e hibridación sobre filtro inverso según los protocolos siguientes:

"Spot blot" directo

La sonda de VPH-6 (lote nº 061094), marcada con biotina, fue diluida 10 veces consecutivamente en un tampón para "spot" constando de cloruro sódico 900mM, citrato sódico 90mM, y ADN de esperma de salmón de banda simple de 200 \mug/ml, dando una serie de diluciones variando desde 1.000-0'1 pg de sonda con biotina por \mul.

Se aplicaron manchas de 1 \mul sobre membrana de nitrocelulosa, y se incubaron durante 2 horas a 80ºC para unir el ADN. La sonda con biotina fue visualizada utilizando un conjugado de streptavidina-fosfatasa alcalina (Sigma) combinado con una solución de substrato precipitador NBT/BCIP (Sigma), según el protocolo siguiente:

-: Las membranas fueron remojadas durante 5 minutos en solución de TBS conteniendo 0'5% de Tween 20 (TBST).

-: Las membranas fueron incubadas con Strep-AP (3 U DEA/ml) en TBST durante 15 minutos a 37ºC.

-: Las membranas de NC fueron lavadas 3 veces de 5 minutos en solución de TBS, seguido por una etapa de lavado de 5 minutos en agua desmineralizada.

-: Las membranas fueron incubadas con solución de substrato NBT/BCIP durante 15 minutos a 37ºC, posteriormente lavadas en agua desmineralizada y secadas al aire.

Resultados

Utilizando este método, se encontró que el límite de detección de la sonda de ADN con biotina era menor de 1 pg.

Hibridación sobre filtro inverso

El ADN de VPH-6 (lote nº 051094) fue diluido diez veces en NaOH 0'1N, incubado a 100ºC durante 5 minutos, y puesto directamente en hielo durante 5 minutos para fabricar el ADN de banda simple.

Se hizo una dilución decimal en serie en NaOH 0'1N frío para dar una serie variando desde 10.000-1 pg de ADN por \mul. Se aplicaron manchas de 1 \mul sobre membrana de nylon (Boehringer Mannheim) y se secaron al aire.

La sonda de ADN de VPH-6, marcada con biotina, fue diluida en solución de 5xSSPE-SDS al 5% para producir una concentración de 200 ng/ml. Esta solución fue incubada durante 5 minutos a 100ºC y puesta directamente en hielo durante 5 minutos.

Las membranas de nylon conteniendo el ADN diana fueron remojadas en 2xSSC durante 5 minutos, e incubadas posteriormente con la solución de sonda de banda simple, durante 2 horas a 37ºC. El exceso de sonda con biotina fue eliminado mediante tres cambios en 2xSSPE-SDS al 0'1% durante 10 minutos a 37ºC, seguido por una incubación de 5 minutos en TBST.

La sonda con biotina fue visualizada ejecutando el mismo protocolo que se describió en el método "spot blot" directo.

Resultados

Utilizando este procedimiento, se encontró que el límite de detección de la sonda con biotina era menor de 10 pg.

Realización de Hibridación In Situ

El material de ensayo se componía de secciones de parafina de 6 \mum de un condiloma de cérvix positivo para el VPH-6, montadas en portaobjetos de vidrio recubiertos con organosilano.

Se aplicó el siguiente protocolo (las etapas indicadas son a temperatura ambiente, a menos que se diga lo contrario):

1 Las secciones de parafina fueron desparafinadas en 3 cambios de xileno, e hidratadas en etanol graduado.

2 Las secciones fueron aclaradas en TBST durante 5 minutos.

3 Las secciones fueron digeridas en pepsina al 0'25% en ClH 0'1N, durante 30 minutos a 37ºC, deshidratadas en etanol graduado y secadas al aire.

4 Se aplicó 10 \mul de solución de sonda a una sección, y se cubrió con una funda. La solución de sonda constaba de sonda de ADN de VHP-6 con biotina (lote nº 061094), en una concentración de 2 ng/\mul disueltos en mezcla de hibridación constando de ClNa 0'6M, citrato sódico 0'06M, formamida al 35%, sulfato de dextrano al 10%, 2'5xDenhardts y 10 \mug/ml de ADN de esperma de salmón de banda simple.

5 Los portaobjetos fueron colocados en un grupo de placas de calentamiento a 95ºC, durante 5 minutos, para desnaturalizar simultáneamente la sonda y el ADN diana.

6 Se realizó la hibridación poniendo los portaobjetos en una cámara humidificada a 37ºC durante 2 horas.

7 Se quitaron las fundas y los portaobjetos fueron lavados en 3 cambios de ClNa 15mM, citrato sódico 1'5mM, y formamida al 5%, durante 10 minutos a 37ºC.

8 Los portaobjetos fueron aclarados con TBST.

9 Se incubaron las secciones con conjugado de Streptavidina AP (3 U DEA/ml en TBST) durante 15 minutos a 37ºC.

10 Los portaobjetos fueron lavados en TBST (3x) y agua desmineralizada (1x) durante 5 minutos.

11 Se incubaron las secciones con solución de substrato NBT/BCIP durante 15 minutos a 37ºC.

12 Los portaobjetos fueron lavados en agua desmineralizada (3x) durante 1 minuto, y se montaron las secciones en glicerol/gelatina.

Resultados

Utilizando las secciones, se mostraron precipitados azul/púrpura en los sitios de células infectadas con VPH-6 y fondo menor en el tejido restante.

Conclusiones

Los resultados demuestran que el ADN marcado con el método ULS tiene buenos límites de detección. El método ULS se adapta muy bien a investigación, rutina, y para producción industrial de ácidos nucleicos marcados, ya que el método es rápido y fácil de realizar, muy sensible, y no incluye ninguna etapa enzimática, lo que le hace sumamente reproducible y hecho a medida para una producción de bajo coste total. El método ULS ofrece una alternativa útil que iguala a métodos de marcaje no isotópico convencionales.

Referencias generales

1 Maniatis T., Sambrook J., Fritsch E.F., Molecular Cloning, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-8769-309-6.

2 Keller G.H., Manak M.M., DNA probes, Stockton Press, ISBN 0-333-47659-X.

Aplicaciones 1. El empleo de conectores de Pt-ADN en la llamada técnica LIDIA: Inmunoensayo de ADN unido

La técnica LIDIA permite el análisis cuantitativo de pequeñas cantidades de ADN (o ARN), por ejemplo, después de una amplificación por PCR de la materia de partida. La técnica es sensible y específica debido al empleo de sondas de ADN (ARN) específicas, y fácil de realizar debido a las rápidas etapas de marcaje de ADN (ARN) con Pt de la invención.

Descripción de la técnica

La técnica utiliza compuestos de Pt de marcaje rápido, para marcar sondas de ADN (ARN).

Esta técnica es posible con 3 enfoques diferentes.

1. Unir moléculas de sondas de ADN a una superficie utilizando un compuesto de Pt, el cual reticula irreversiblemente moléculas de ADN a plástico, nylon o nitrocelulosa. La detección de dianas de ADN puede ser realizada luego utilizando sondas de ADN/ARN marcadas clásicamente (traducción por corte o modificación química, cebamiento aleatorio).

2. Unir un grupo detectable al ADN, para transformar una molécula de ADN en una denominada sonda de ADN. La unión de compuestos de ADN a una superficie puede ser realizada luego utilizando técnicas clásicas conocidas por la ciencia (unión covalente a placas de microtitulación tratadas especialmente, el horneado de moléculas de ADN sobre nitrocelulosa, o la unión de moléculas de ADN a membranas de nylon).

3. Una combinación de las técnicas 1 y 2.

Enfoque 1

Se puede utilizar una sonda de ADN inmovilizada para atrapar moléculas diana específicas en una muestra, utilizando una técnica de hibridación. La detección de los híbridos formados se puede hacer utilizando diferentes técnicas, por ejemplo, se puede utilizar una segunda sonda de ADN marcada para hibridarse con un sitio distinto en la molécula de ADN diana, para formar un híbrido sándwich. Luego se puede detectar el marcador utilizando técnicas inmunológicas modernas de detección y de coloración.

Enfoque 2

Un volumen conteniendo ADN (ARN) detectable (amplificado) es directamente marcado según el protocolo.

El exceso de marcador es apagado añadiendo DDTCNa o Tiourea. Este enfoque se distingue de otras técnicas por el hecho de que se marca la molécula diana a diferencia del otro ensayo donde se utilizan sondas de ADN (ARN) marcadas para detectar la diana. La rápida capacidad de unión del compuesto marcador de Pt (ULS) permite una etapa de unión de ADN como etapa rutinaria en un procedimiento de ensayo diagnóstico (los tiempos de unión normales son 60 minutos a 65ºC).

Se realiza una segunda etapa en una placa de microtitulación prerrevestida con una sonda específica diana. Se permite la incubación para la formación de híbridos estables de "Diana marcada" y sonda. El marcaje directo de moléculas diana permite la omisión de técnicas laboriosas de hibridación doble donde se utiliza una sonda para atrapar la diana, y se utiliza otra sonda marcada para detectar la diana inmovilizada.

En este método, las sondas son covalentemente unidas a la placa de microtitulación, en la superficie de los pocillos. La segunda etapa de incubación tiene el carácter de una hibridación líquida y, por lo tanto, se puede realizar muy rápidamente. Esta es una de las principales características innovadoras de este enfoque para cuantificar técnicas de hibridación de ADN.

Enfoque 3

Para la inmovilización de sondas de ADN o dianas de ADN, y para el marcaje de sondas y dianas de ADN, se puede utilizar el Sistema de Marcaje Universal con Pt recientemente desarrollado. Estas dos técnicas de unión de ADN pueden ser combinadas en un ensayo donde el "captor" y el "detector" están unidos a una segunda substancia (un grupo detectable como biotina, digoxigenina, o una superficie soporte como una barra de plástico, una placa de microtitulación o una membrana).

Ejemplos de la técnica: la detección de microorganismos relacionados con STD en diagnósticos humanos (Clamidia, Sífilis, SIDA, Herpes, Gonorrea, Hep. B).

2. El empleo de marcadores de Pt-ADN en combinación con procedimientos y formatos por tiras de ensayo La "Varilla medidora de ADN por inmersión"

La técnica de varilla medidora de ADN por inmersión permite el análisis cualitativo y semicuantitativo de pequeñas cantidades de ADN (o ARN), por ejemplo, después de una amplificación por PCR o presente libremente en muestras de fluidos corporales (sangre, orina, sudor, etc.).

La técnica es sensible y específica debido al empleo de sondas de ADN (ARN) específicas, y fácil de realizar debido a las rápidas etapas de marcaje de ADN (ARN) con Pt.

Las características universales de marcaje del marcador de Pt recientemente desarrollado se pueden utilizar de 3 formas, para lograr una molécula de unión de ADN (ARN).

1. Se puede utilizar para unir un grupo marcador detectable a una secuencia polinucleotídica.

2. Se puede utilizar para unir irreversiblemente secuencias polinucleotídicas a una fase sólida (plástico, membranas, cuentas de látex, hidrosoles o pocillos de una placa de microtitulación.

3. Una combinación de 1 y 2.

Artículo 1

En este ejemplo, hay un enfoque doble para la detección de biolitos, analitos biológicos, en muestras de ensayo. En primer lugar, se puede marcar una sonda de ADN con el compuesto marcador de Pt recientemente desarrollado. Esta sonda marcada puede ser utilizada luego para detectar híbridos preformados en una membrana formada entre la secuencia de ADN diana y una sonda primaria. En este método es esencial que la sonda primaria reconozca una secuencia diferente en la diana que la sonda secundaria marcada con Pt. En la práctica, esto se puede lograr, por ejemplo, con hibridación de ARN donde se utilice una sonda POLY A como sonda primaria para inmovilizar todo el ARN (reconocible por sus colas poliT) a una membrana.

El segundo enfoque difiere un poco porque, en este caso, la diana puede ser marcada en el fluido de la muestra de ensayo debido a las rápidas y muy específicas características de marcaje del Pt. Un procedimiento como este constaría de una captura de la diana marcada con una sonda de ADN no marcada específica, inmovilizada en una membrana adecuada. Por lo tanto, una versión de varilla medidora por inmersión para aplicaciones de ADN/ARN.

Artículo 2

Para inmovilizar sondas de ADN o ADN diana, se puede utilizar un compuesto de Pt no marcado (esto es, un compuesto de Pt con 2 sitios de unión libres) para que actúe como puente entre el ADN y la superficie de los soportes (plástico, membrana, placas de microtitulación, etc.).

Esto intensifica mucho la utilizabilidad de secuencias de ADN como moléculas captoras en ensayos diagnósticos, puesto que hay pequeñas substancias conocidas por la ciencia que se unen fácilmente a ADN de una manera espontánea. Introduciendo esta molécula puente de Pt, ha llegado a la investigación un amplio campo de nuevas aplicaciones para la tecnología del ADN.

Artículo 3: una combinación de los ejemplos 1 y 2

General: especialmente, el empleo de la molécula conectora de Pt en ensayos con látex o hidrosoles es particularmente interesante. El conector permite el acoplamiento de moléculas de ADN a partículas pequeñas. Las moléculas de ADN pueden ser hibridadas a material diana. Se visualiza una reacción positiva por aglutinación de las partículas, debido a la reticulación de los compuestos de partículas de híbridos de ADN.

Un ensayo como éste puede ser hecho cuantitativo, la velocidad de aglutinación puede ser sintonizada y medida a una longitud de onda específica. Especialmente, las partículas de oro tienen la característica intrínseca de que, después de la aglutinación, sucede un desplazamiento a una longitud de onda óptima.

3. Marcaje de proteínas utilizando compuestos marcadores de Pt en procedimientos de ensayos diagnósticos

La capacidad de los compuestos marcadores de Pt para interaccionar con estructuras proteicas, bajo condiciones especificadas que difieran de las condiciones de unión de ADN, puede ser utilizada para marcar, por ejemplo:

a. anticuerpos mono o policlonales para detectar dianas primarias en muestras de ensayo.

b. derivados proteicos utilizados como antígenos en procedimientos de ensayo basados en el denominado principio de inhibición.

c. estructuras proteicas específicas que son conocidas por interaccionar específicamente con otros compuestos, pero que generan una interacción no inmunogénica entre sí, por ejemplo, streptavidina y biotina, y proteína A y G con inmunoglobulinas.

Se pueden utilizar moléculas trazadoras marcadas para determinar, cualitativa o cuantitativamente, una cantidad de un cierto biolito en un formato de ensayo apropiado (varillas medidoras por inmersión, ELISA u otros).

4. Proteínas de acción a largo plazo

De especial interés es el uso potencial del conector de Pt para estabilizar proteína (biomoléculas en general) in vivo. Un uso terapéutico del compuesto de Pt es que las biosustancias utilizadas como productos terapéuticos (insulina, factor VIII y otros) muestran una acción a corto plazo una vez dentro del cuerpo. El acoplamiento de estas sustancias al compuesto de Pt puede intensificar la vida media de estas moléculas, permitiendo, de este modo, que sean producidas y utilizadas in vivo sustancias de acción a más largo plazo. Esto supone menos problema para los pacientes y el uso más eficaz de fármacos y medicinas caros.

5. Detección de sondas de ADN platinadas, con la técnica de intensificación por plata

En métodos de hibridación se puede emplear sonda de ADN/ARN platinada para detectar secuencias de ADN/ARN en un material de muestra. La introducción de un compuesto de platino en el sitio de la diana permite la deposición de moléculas de Ag en una reacción química especialmente diseñada para reducir plata iónica en plata metálica. En el sitio de un núcleo de Pt ocurre una descomposición de plata metálica (negra) debido al efecto catalítico del núcleo de Pt.

La plata iónica es reducida mediante un agente reductor (por ejemplo, borohidruro sódico, hidroquinona) en solución. En una proporción constante, la cantidad de plata depositada en el Pt es proporcional a la duración de la incubación de intensificación.

La visualización de un núcleo de Pt no visible se puede llevar a cabo mediante la observación empírica de la aparición de una mancha negra en la muestra de ensayo.

Las manchas negras indican el sitio de unión específica de las sondas y, de este modo, el sitio de ubicación específica de la diana. La técnica permite un procedimiento diagnóstico rápido y fácil para la detección de diversos microorganismos y transposiciones/anormalidades genéticas.

Claims

1. Un método para preparar una sustancia marcadora de la fórmula:

13

en donde X representa cualquier puente estabilizador, A representa una porción reactiva, e Y es un marcador,

comprendiendo las etapas de:

- preparar un conector constando de un compuesto de platino de la fórmula:

14

en donde A y B representan las mismas o diferentes porciones reactivas, a partir de una materia de partida constando de un compuesto de la estructura:

15

en donde C representa una porción electronegativa, y

- hacer reaccionar el conector con un grupo marcador, por lo que B es sustituido por Y.

2. Un método según la Reivindicación 1, en donde A y B son lo mismo.

3. Un método según la Reivindicación 1 ó 2, en donde X representa una diamina alifática.

4. Un método según la Reivindicación 3, en donde X representa una diamina que tiene 2-6 átomos de carbono.

5. Un método según la Reivindicación 2, en donde X es un grupo etilendiamino.

6. Un método según la Reivindicación 5, en donde A y B son seleccionados del grupo que se compone de NO_{3}-, SO_{3}-, Cl-, I-, u otros halógenos.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde C es un halógeno, NO_{3}-, o SO_{3}-.

8. Un método según alguna de las reivindicaciones precedentes, en donde X es un grupo etilendiamino, A y B representan NO_{3}-, y C representa un grupo halógeno, y en donde la materia de partida reacciona con etilendiamina, y el compuesto resultante reacciona con NO_{3}Ag.