CN116121399A - 一种刺激响应型dna框架核酸纳米探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针及其制备方法与应用,该核酸纳米探针包括DNA八面体结构和CHA反应组件。CHA组件包括目标分子识别发夹和谷胱甘肽响应发夹。将探针与不同的目标核酸分子孵育后,探针识别域可以与特定的目标核酸分子结合;通过GSH刺激响应,可生物切割CHA反应组件上的双硫键,从DNA八面体结构上游离出来,发生CHA反应,释放目标核酸分子进入下一循环,实现“一对多”信号放大。本发明可实现多种目标核酸分子的同时检测成像,具有检测灵敏度高、检测特异性好等优点,在分子识别、临床诊断、细胞成像等研究中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针及其制备方法与应用。
背景技术
多种生物小分子、核酸、蛋白质的同时定性或定量检测对于疾病诊断及生物医学研究等具有重要的科学意义。例如:多种核酸、蛋白质的异常表达与肿瘤的发生和发展密切相关。分析活细胞中多种肿瘤相关核酸分子的表达水平对其生理病理研究具有重要意义。相对于单一标志物的检测,多种标志物的检测和成像可以提高检测结果的准确性,减少假阳性或假阴性的检测结果,多通路检测和成像对于临床医学来说及其重要。
荧光是一种物质在激发态回到基态时伴随的光发射现象,以荧光为输出信号的探针已成为用于分子传感和成像的最强大工具之一,特别是荧光原位杂交(Fluorescence insitu hybridization,FISH)一直是可视化细胞内DNA或RNA的主要方法,使直接可视化和实时监控内源性目标分析物在细胞内局部微环境的浓度成为可能。但是基于FISH荧光成像的方法需要固定细胞从而破坏细胞,且用于活细胞内分子检测的空间分辨率受限,极大的限制了其在活细胞内分子成像中的应用。
近年来,DNA纳米技术已经得到了很好的发展,成为一种由前途的强大的技术。由于DNA纳米技术的生物安全性、良好的生物相容性、可编程性以及易于合成和修饰的优势,DNA框架核酸已被用于一系列生物医学应用,从生物传感、生物成像、诊断到治疗。与传统的DNA探针(如线性单链捕获探针、茎环结构探针以及链取代双链探针)相比,框架核酸分子探针具有以下优势:(1)基于框架核酸的分子探针可通过适体、小分子、肽链、抗体以及荧光染料的修饰,实现其功能化;(2)基于框架核酸的分子探针无须特殊的转染试剂,可直接通过胞吞的方式通过细胞膜进入细胞,实现细胞内靶标识别和分析;(3)框架核酸分子在探针内吞过程中表现出较强的稳定性,可有效抵抗细胞内核酶水解;(4)作为天然的生物分子,DNA框架核酸分子探针表现出较低的细胞毒性;(5)结合荧光成像技术,可以针对不同的生物分子(如circRNA,miRNA等)进行灵活设计,有望实现核酸水平的高灵敏检测和超分辨成像。因此,DNA框架核酸分子探针在细胞内实现多靶标检测和成像中具有巨大的潜力。
传统探针通常基于“一对一”杂交反应对核酸分子进行检测,灵敏度有限,因此,本发明将刺激响应型DNA框架核酸纳米探针和催化发夹组装(Catalytic hairpin assembly,CHA)信号放大技术结合起来,制备了一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针,可用于活细胞中两种核酸分子的同时检测和成像。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针及其制备方法与应用,该核酸纳米探针具有良好的生物相容性和抗核酸酶的稳定性,可用于目标核酸的高灵敏检测,实现细胞内多靶标的同时成像研究。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针,由10条长单链DNA互补配对而成,其中包含四个DNA发夹结构;所述四个DNA发夹结构中的两个DNA发夹结构含有目标分子识别域,其余两个DNA发夹结构含有切割位点双硫键;含有目标分子识别域的一个DNA发夹结构和含有切割位点双硫键的一个DNA发夹结构构成一组CHA反应组件,即四个DNA发夹结构构成两组CHA反应组件。
进一步地,所述10条长单链DNA序列选自SEQ NO.1-10;其中,含有目标分子识别域的两个DNA发夹结构分别选自SEQ NO.7-8,含有切割位点双硫键的两个DNA发夹结构分别选自SEQ NO.9-10,其余6条长单链DNA序列选自SEQ NO.1-6。
进一步地,所述选自SEQ NO.1-8的8条长单链DNA构成DNA八面体结构,其中选自SEQ NO.7-8的含有目标分子识别域的两个DNA发夹结构分别位于DNA八面体结构的顶点上;所述选自SEQ NO.9-10的含有切割位点双硫键的两个DNA发夹结构分别位于DNA八面体结构的顶点上。
进一步地,所述含有目标分子识别域的两个DNA发夹结构标记有荧光分子和猝灭基团。
进一步地,所述荧光分子和猝灭基团通过共价、嵌入、配位中的任意一种或者多种方法标记。
一种上述的核酸纳米探针的制备方法,选自SEQ NO.1-8的8条长单链DNA通过程序性降温自组装形成DNA八面体结构,其中选自SEQ NO.7-8的两个DNA发夹结构含有目标分子识别域;所述程序性降温是指95℃保持10min,然后每3min降1℃缓慢降至4℃;选自SEQNO.9-10的含有切割位点双硫键的两个DNA发夹结构首先在90~100℃保持5~15min后,降温至20~30℃至少2h,使其形成稳定的发夹结构;将所述形成稳定的发夹结构的含有切割位点双硫键的两个DNA发夹结构通过链杂交的方式连接到DNA八面体结构上,得到刺激响应型DNA框架核酸纳米探针;所述链杂交的反应条件为25~37℃,0.5~2h。
进一步地,所述选自SEQ NO.1-10的10条长单链DNA的摩尔比为1。
进一步地,所述链杂交的反应条件为25℃,1h。
进一步地,所述刺激响应型DNA框架核酸纳米探针的缓冲体系包括Tris和Mg2+,其中pH为8.0~8.5。
上述的核酸纳米探针在细胞内检测多种目标核酸分子和活细胞成像的应用;所述目标核酸分子包括DNA和RNA。
本发明的有益效果是:(1)采用DNA材料,利用DNA八面体结构多个顶点设计DNA序列,连接不同的荧光分子,可同时实现多靶标检测成像,减少或避免假阳性结果;(2)DNA纳米材料具有良好的生物相容性,基于框架核酸的分子探针无须特殊的转染试剂,可直接通过胞吞的方式通过细胞膜进入细胞,实现细胞内靶标识别和分析;(3)结合荧光成像技术,可以针对不同的核酸分子(如circRNA,miRNA等)进行灵活设计,有望实现核酸水平的高灵敏检测和超分辨成像;(4)利用肿瘤细胞内高浓度的还原性物质GSH,设计含二硫键的CHA发夹组件通过链杂交反应连接到DNA八面体结构上,在目标核酸分子存在下,可通过GSH断裂二硫键释放CHA反应组件,引发CHA反应,实现信号放大,用于活细胞内相关生物标志物的检测和成像。
综上所述,根据本发明提供的一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针的制备方法与应用,解决了现有荧光成像技术检测灵敏度低,操作繁琐,容易出现假阳性信号等问题,根据本发明制备的刺激响应型DNA八面体框架核酸纳米探针具有良好的稳定性和生物相容性,在细胞中未见明显的毒性,在细胞成像上具有显著优势,为疾病的早期精准诊断和靶向治疗提供了新思路。
附图说明
图1是本发明提供的一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针用于同时分析活细胞中circRNA和miRNA的示意图。
图2是刺激响应型DNA八面体框架核酸纳米探针组装过程示意图。
图3是DNA八面体结构的针琼脂糖凝胶电泳表征结果。
图4是刺激响应性DNA框架核酸纳米探针琼脂糖凝胶电泳表征结果。
图5是基于CHA刺激响应型DNA框架核酸纳米探针同时检测circRNA和miRNA的可行性荧光光谱分析。(a)circHIPK3触发DNA框架核酸纳米探针CHA反应的荧光发射光谱表征;(b)miR-107触发DNA框架核酸纳米探针CHA反应的荧光发射光谱表征。
图6是DNA框架核酸纳米探针稳定性研究结果。
图7是DNA框架核酸纳米探针细胞毒性分析结果。
图8是DNA框架核酸纳米探针用于不同分化程度细胞成像分析结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
这里将详细地对示例性实施例进行说明,其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时,除非另有表示,不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反,它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。
本发明的一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针,由10条长单链DNA互补配对而成,其中包含四个DNA发夹结构;四个DNA发夹结构中的两个DNA发夹结构含有目标分子识别域,且构成一组CHA反应组件;四个DNA发夹结构中的其余两个DNA发夹结构含有切割位点双硫键,构成另一组CHA反应组件。
10条长单链DNA序列选自SEQ NO.1-10;其中,含有目标分子识别域的两个DNA发夹结构分别选自SEQ NO.7-8,含有切割位点双硫键的两个DNA发夹结构分别选自SEQ NO.9-10,其余6条长单链DNA序列选自SEQ NO.1-6。
选自SEQ NO.1-8的8条长单链DNA构成DNA八面体结构,其中选自SEQ NO.7-8的含有目标分子识别域的两个DNA发夹结构分别位于DNA八面体结构的顶点上;所述选自SEQNO.9-10的含有切割位点双硫键的两个DNA发夹结构分别位于DNA八面体结构的顶点上。
含有目标分子识别域的两个DNA发夹结构标记有荧光分子和猝灭基团;荧光分子不限于选自FAM,ROX,TAMRA,Cy3,或Cy5,猝灭基团不限于选自BHQ2,BHQ3或Dabcyl。
荧光分子和猝灭基团通过共价、嵌入、配位中的任意一种或者多种方法标记。
本发明的一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针制备方法,在本实施例中选择circHIPK3和miR-107作为检测靶标,设计DNA序列构建刺激响应型DNA框架核酸纳米探针(如图2),通过在DNA框架核酸纳米探针分子上分别标记FAM/Dabcyl和ROX/BHQ2荧光基团,获得多色荧光探针用于响应不同目标核酸分子;接着,将上述制备获得的刺激响应型DNA框架核酸纳米探针与不同胃癌细胞系孵育,包括NCI-N87,SGC-7901,MKN45细胞,并通过共聚焦荧光显微镜观察该探针在不同肿瘤细胞中的成像情况。以下实施例具体说明本发明的实施效果。
其中,DNA序列购自上海生工生物工程有限公司,所用试剂如无特殊说明,均购自上海生工生物工程有限公司。所用化学试剂至少为分析纯,实验用水均为超纯水。
DNA序列如下:
注:P7,P8下划线部分即为识别靶标的识别域
实施例1
P1~P8、H1和H2分别对应SEQ NO.1-10;本发明的一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针的制备方法,包括以下步骤:
将所有DNA单链溶于超纯水中,通过紫外分光光度计测定单链在260nm处的吸收值进行定量分析,将所有DNA单链浓度精确定量至100μM。将DNA长单链P1~P8等摩尔比混合在TM缓冲液(Tris:10mM,NaCl:250mM,KCl:100mM,Mg2+:10mM,pH:8.0)中,在PCR仪中设定程序95℃保持10min,然后每3min降1℃缓慢降至4℃,制得DNA八面体结构;采用2%的琼脂糖凝胶电泳对DNA八面体结构进行表征,在100V条件下运行35min。
将H1,H2链在95℃保持10min,然后缓慢降至25℃保持2.5h,以确保H1,H2形成稳定的发夹结构,然后将与P1~P8等摩尔比的H1,H2添加到上述制得的DNA八面体结构溶液中,通过链杂交的方式将H1,H2连接到DNA八面体结构上,以获得完整的刺激响应型DNA框架核酸纳米探针;上述P1~P8、H1和H2这10条长单链DNA摩尔比为1;然后采用2%的琼脂糖凝胶电泳对DNA框架核酸纳米探针进行表征,在100V条件下运行35min。
结果:如图3所示,琼脂糖凝胶电泳表明随着DNA单链数量的增加,终产物迁移速率变慢,DNA八面体结构制备成功;如图4所示,加入等摩尔比的H1,H2后,泳道4中DNA框架核酸纳米探针迁移条带上移,H1,H2成功连接到DNA八面体结构上,即刺激响应型DNA框架核酸纳米探针构建完成。
实施例2
刺激响应型DNA框架核酸纳米探针用于检测circHIPK3和miR-107的可行性,实验组:首先按照实施例1相同步骤合成DNA框架核酸纳米探针(终浓度为100nM),将组装好的DNA框架核酸纳米探针在TM缓冲液(Tris:10mM,NaCl:250mM,KCl:100mM,Mg2+:10mM,pH:8.0)中分别与circHIPK3和miR-107孵育,并分别加入谷胱甘肽(Glutathione,GSH)(5mM)进一步研究了靶触发的CHA反应,实现输出荧光信号放大的可行性。同时设置对照实验:对照组(1)样品溶液中只有DNA框架核酸纳米探针(终浓度为100nM);对照组(2)样品溶液中包括DNA框架核酸纳米探针(终浓度为100nM)和GSH(终浓度为5mM);对照组(3)样品溶液中包括DNA框架核酸纳米探针(终浓度为100nM)、circHIPK3(终浓度为50nM)和miR-107(终浓度为50nM)。其它条件与实验组保持一致,所有样品溶液反应条件为:37℃,300r,3h。采用荧光分光光度计对其进行荧光光谱采集。FAM的激发波长为488nm,光谱接收范围为505-600nm;ROX激发波长为580nm,光谱接收范围为595-700nm。
结果:如图5所示,加入靶标后,靶标与含有识别域的发夹反应,发夹打开,导致FAM/ROX荧光信号略有恢复(c线);当加入GSH后,由于GSH对二硫键的裂解,使H1和H2从DNA八面体结构的探针上释放出来,通过靶标触发CHA反应,导致FAM/ROX荧光信号增强(d线);而在没有靶标存在的情况下,不能引发CHA反应的发生(a线);加入GSH,荧光信号也比较低,与裸探针荧光信号强度几乎一致(b线);即如图5所示,a线和b线几乎重合。
本实施例证明在检测物中先加入本发明的核酸纳米探针,之后加入GSH;若加入GSH之后,荧光强度明显增大,则含有目标核酸分子;反之,则不含有目标核酸分子。且本发明的核酸纳米探针可以同时检测多种目标核酸分子。
实施例3
刺激响应型DNA框架核酸纳米探针的稳定性及细胞毒性研究:
在DNA框架核酸纳米探针稳定性研究中,向5μL的1μM核酸纳米探针中加入10μL的0.005U/μL或0.0005U/μL的DNase I和5μL的TM缓冲液(Tris:10mM,NaCl:250mM,KCl:100mM,Mg2+:10mM,pH:8.0),反应体系终浓度:刺激响应型DNA框架核酸纳米探针:250nM;DNase I分别为0.0025U/mL或2.5U/mL,37℃条件下分别孵育10min、20min、30min、40min、50min、60min,分别取待测样品10μL,采用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征,在100V条件下运行1h,根据电泳条带亮度确定DNA框架核酸纳米探针在不同浓度DNase I酶作用下的稳定性。同样的,5μL的1μM探针中加入2μL的FBS和13μL的1640细胞培养基,37℃条件下分别孵育2h、4h、6h、8h、10h,分别取待测样品10μL,采用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征,在100V条件下运行1h,根据电泳条带亮度确定DNA框架核酸纳米探针在生理环境中的稳定性。
结果如图6所示:DNA框架核酸纳米探针在低浓度或高浓度DNase I酶作用下都具有较好的结构稳定性,可以有效抑制DNase I酶的降解;DNA框架核酸纳米探针10h内在血清中具有良好的结构稳定性,适用于细胞成像分析。
在刺激响应型DNA框架核酸纳米探针细胞毒性研究中,将~104个/mL SGC-7901细胞置于96孔板中,在37℃条件下培养过夜。然后,在培养基中分别加入终浓度为100nM和500nM的DNA框架核酸纳米探针,孵育时间分别为3h、6h、12h、24h、36h和48h。孵育结束后,用1×D-PBS清洗3次,然后在每个孔中加入50μL 1×MTT溶液,37℃孵育4h,吸出MTT溶液,每个孔中加入150μL DMSO后于摇床上缓慢振荡15min,直至将形成的甲瓒晶体完全溶解,并通过酶标仪(EL×808,BioTek)在490nm吸光度下测量,每组细胞样品重复5组。
结果如图7所示:细胞与不同浓度探针孵育后,细胞存活率大于85%,说明刺激响应型DNA框架核酸纳米探针基本无细胞毒性,具有良好的生物相容性,适用于活细胞成像分析。
实施例4
在刺激响应型DNA框架核酸纳米探针用于活细胞成像研究中,选用3种胃癌细胞系:NCI-N87(高分化胃癌细胞),SGC-7901(中分化胃癌细胞),MKN45(低分化胃癌细胞),将100nM的刺激响应型DNA框架核酸纳米探针分别加入到上述3种细胞中共同培养,37℃条件下孵育4h后,用1×D-PBS清洗3次,在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞形态,采集细胞在488nm和514nm通道中的荧光信号。
结果如图8所示:所选细胞分化程度不同,circHIPK3和miR-107的表达也不同。circHIPK3是一种致癌基因,在癌细胞中表达增加,随着癌细胞分化程度的降低,circHIPK3的表达逐渐增加;miR-107是一种抑癌基因,在癌细胞中表达降低,随着癌细胞分化程度的降低,miR-107的表达逐渐减少。该探针在癌细胞中的FAM信号强度随着细胞分化程度的降低逐渐增强,ROX信号强度随着细胞分化程度的降低逐渐减弱,三种细胞在不同通道中的荧光信号强度呈现明显差异。因此,基于刺激响应型DNA框架核酸纳米探针可以精准的识别不同分化程度的肿瘤细胞,可同时用于肿瘤细胞中多种靶标的同时监测成像。
本具体实施例方式仅仅是对本发明的解释,并不是对本发明的限制,只要是在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明保护的范围之内。
以上实施例仅用于说明本发明的设计思想和特点,其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施,本发明的保护范围不限于上述实施例。所以,凡依据本发明所揭示的原理、设计思路所作的等同变化或修饰,均在本发明的保护范围之内。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的内容后,将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化,这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的。
应当理解的是,本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构,并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。
Claims (10)
1.一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针,其特征在于,由10条长单链DNA互补配对而成,其中包含四个DNA发夹结构;所述四个DNA发夹结构中的两个DNA发夹结构含有目标分子识别域,其余两个DNA发夹结构含有切割位点双硫键;含有目标分子识别域的一个DNA发夹结构和含有切割位点双硫键的一个DNA发夹结构构成一组CHA反应组件,即四个DNA发夹结构构成两组CHA反应组件。
2.根据权利要求1所述的一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针,其特征在于,所述10条长单链DNA序列选自SEQ NO.1-10;其中,含有目标分子识别域的两个DNA发夹结构分别选自SEQ NO.7-8,含有切割位点双硫键的两个DNA发夹结构分别选自SEQ NO.9-10,其余6条长单链DNA序列选自SEQ NO.1-6。
3.根据权利要求2所述的一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针,其特征在于,所述选自SEQ NO.1-8的8条长单链DNA构成DNA八面体结构,其中选自SEQ NO.7-8的含有目标分子识别域的两个DNA发夹结构分别位于DNA八面体结构的顶点上;所述选自SEQNO.9-10的含有切割位点双硫键的两个DNA发夹结构分别位于DNA八面体结构的顶点上。
4.根据权利要求1所述的一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针,其特征在于,所述含有目标分子识别域的两个DNA发夹结构标记有荧光分子和猝灭基团。
5.根据权利要求4所述的一种刺激响应型DNA框架核酸纳米探针,其特征在于,所述荧光分子和猝灭基团通过共价、嵌入、配位中的任意一种或者多种方法标记。
6.一种基于权利要求1所述的核酸纳米探针的制备方法,其特征在于,选自SEQ NO.1-8的8条长单链DNA通过程序性降温自组装形成DNA八面体结构,其中选自SEQ NO.7-8的两个DNA发夹结构含有目标分子识别域;所述程序性降温是指95℃保持10min,然后每3min降1℃缓慢降至4℃;选自SEQ NO.9-10的含有切割位点双硫键的两个DNA发夹结构首先在90~100℃保持5~15min后,降温至20~30℃至少2h,使其形成稳定的发夹结构;将所述形成稳定的发夹结构的含有切割位点双硫键的两个DNA发夹结构通过链杂交的方式连接到DNA八面体结构上,得到刺激响应型DNA框架核酸纳米探针;所述链杂交的反应条件为25~37℃,0.5~2h。
7.根据权利要求6所述的核酸纳米探针的制备方法,其特征在于,所述选自SEQ NO.1-10的10条长单链DNA的摩尔比为1。
8.根据权利要求6所述的核酸纳米探针的制备方法,其特征在于,所述链杂交的反应条件为25℃,1h。
9.根据权利要求6所述的核酸纳米探针的制备方法,其特征在于,所述刺激响应型DNA框架核酸纳米探针的缓冲体系包括Tris和Mg2+,其中pH为8.0~8.5。
10.权利要求1-5任一项所述的核酸纳米探针在细胞内检测多种目标核酸分子和活细胞成像的应用;所述目标核酸分子包括DNA和RNA。
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