CN111413298A - 一种光纤表面等离子体共振传感器、制备方法及检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光纤SPR传感器，包括单模光纤，熔接于所述单模光纤两端的多模光纤，单模光纤的表面设置纳米传感层，纳米传感层表面设置纳米抗体层。采用纳米抗体作为光纤SPR传感器的特异性生物检测层，使传感器表面识别位点多且密，缩短传感器的光学感应距离，有效提高检测灵敏度和检测效率，纳米抗体与传感器表面的结合位点在尾部，特异性识别位点在头部，使得纳米抗体定向连接至传感器表面，纳米抗体上特异性的识别位点一致朝外，提高捕获待测生物分子的几率。本发明还提供一种利用上述光纤SPR传感器的检测系统，该检测系统响应快、检测过程耗时短。本发明还提供一种光纤SPR传感器的制备方法，具有操作简便，便于批量化生产的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种光纤表面等离子体共振传感器、制备方法及检测系统。
背景技术
表面等离子共振技术(Surface plasmon resonance，SPR)是从20世纪90年代发展起来的一种新技术，表面等离子共振是一种光学现象，可被用来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用。这种方法对生物分子无任何损伤，且不需任何标记物。
光纤表面等离子体共振传感器主要是基于光纤表面等离子体共振传感原理，通过探测光纤表面倏逝场区内折射率的变化来分析被测生物分子的特性。当倏逝场区域内生物分子发生识别反应时，金属薄膜表面的折射率会随之变化从而改变表面等离子体波的共振频率。共振频率变化的量取决于倏逝场区的平均有效折射率，通过检测这一变量就能够确定分析物在该区域的结合数量。由于该传感器具有生物样品无需标记且可实时监测反应动态过程的特点，特别适于生物分子的检测以及分子之间相互作用的研究。
但是，现有的光纤SPR传感器存在各种各样的问题：检测重复性差、灵敏度低等问题，从而影响检测效率。因为采用传统的抗体修饰方法，大体积的抗体容易相互间阻挡抗原识别位点，而且抗体结合到传感器表面的方向也不好控制，使得抗原识别位点无法准确一致地暴露，每个传感器的个体差异大，影响对检测结果的判断。
另外，在病毒的检测过程中，其检测方法主要是从样本中提取核酸后加入扩增检测试剂，将病毒基因表达后，通过荧光PCR检测，来判断样品的阳性或阴性，进一步判断患者是否被感染。荧光PCR检测设备通常造价高，体积大，检测步骤繁琐，检测时间长，一般适用于实验室检测。因需要专门的实验室条件要求，通常是配备于大型医疗机构，社区与偏远地区往往不具备检测条件，具有一定的局限性。同时现有核酸检测技术的存在一定的漏检率(通常需要采集两到三次样才能确诊)，为社区有效排查带来一定的难度。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种光纤表面等离子体共振传感器，具有灵敏度高，一致性好的特点，可显著提高检测效率。
本发明的目的之二在于提供一种包括上述光纤表面等离子体共振传感器的检测系统。
本发明的目的之三在于提供一种上述光纤表面等离子体共振传感器的制备方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种光纤表面等离子体共振传感器，包括单模光纤，熔接于所述单模光纤两端的多模光纤，所述单模光纤的表面设置纳米传感层，所述纳米传感层表面设置纳米抗体层。
进一步地，所述纳米抗体层由纳米抗体组成，所述纳米抗体的头端设置特异性识别位点，尾端通过巯基或者生物交联剂固定于纳米传感层的表面。
进一步地，所述纳米抗体头端的特异性识别位点为病毒S蛋白的识别位点；所述纳米抗体的尾端连接半胱氨酸，通过半胱氨酸的巯基定向自组装于纳米传感层的表面。
进一步地，所述纳米传感层的厚度为30-90nm，优选为45nm；所述纳米传感层的材料为金、银、铜、铝、复合金属、含自由电子的半导体中的一种。
进一步地，所述单模光纤的长度为1-20mm，优选为12mm。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种检测系统，包括上述光纤表面等离子体共振传感器、光源、传输光纤、光谱检测器及光信号处理单元，光源经传输光纤进入光纤表面等离子体共振传感器，自光纤表面等离子体共振传感器出来的出射光经传输光纤至光谱检测器，经光谱检测器后至光信号处理单元。
进一步地，还包括被金属纳米粒子修饰的抗体，所述被金属纳米粒子修饰的抗体位于待测溶液中。
进一步地，所述被金属纳米粒子修饰的抗体为被金纳米粒子修饰的纳米抗体，所述纳米抗体具有识别病毒S蛋白的位点。
进一步地，还包括固定传输光纤的光纤支架。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
上述光纤表面等离子体共振传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)取一段单模光纤在其两端熔接多模光纤得到MSM型异芯光纤；
(2)在上述步骤(1)中MSM型异芯光纤的单模光纤区域沉积纳米传感层；
(3)将纳米抗体固定在纳米传感层的表面，即得产品。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明采用纳米抗体作为光纤SPR传感器的特异性生物检测层，和传统抗体相比使得传感器表面识别位点多且密，缩短传感器的光学感应距离，有效提高检测灵敏度和检测效率。
本发明的纳米抗体与传感器表面的结合位点在尾部，特异性识别位点在头部，使得纳米抗体定向连接至传感器表面，纳米抗体上特异性的识别位点一致朝外，提高捕获待测生物分子的几率。
2、本发明的光纤SPR传感器可以一次性使用，确保操作人员的安全，可以有效避免传统传感器因重复使用所带来的交叉污染。并且灵敏度高、一致性好，提高检测结果的可靠性，结构简单且体积微小，使用或携带方便。
3、本发明的检测系统在使用时仅需将光纤SPR传感器置入样品中即可实现样品的检测，免去了各种繁琐的生物操作步骤，样品即时活性检测，降低了错检率，提高了检测效率。本发明的检测系统响应快，整个检测用时仅为纳米抗体捕获待测生物分子的时间，耗时较短。
4、在待测样品中只有极少量待测生物分子的的情况下，本发明可以通过在待检测样品中加入金属纳米粒子修饰的抗体实现检测。因为光纤SPR传感器实际探测的是表面吸附生物分子的质量，金属纳米粒子修饰的抗体可以特异性和待检测生物分子连接，在进行检测时，光纤SPR传感器捕获待检测的生物分子，然后通过加入金属纳米粒修饰的抗体增加光纤SPR传感器表面吸附生物分子的质量，进而实现光学检测信号的放大，提升光纤SPR传感器的灵敏度和检测限，降低漏检率。
5、本发明还提供了一种光纤SPR传感器的制备方法，操作简便，便于批量化生产。
附图说明
图1为本发明光纤SPR传感器未修饰纳米抗体层的结构示意图；
图2为本发明光纤SPR传感器单模光纤表面纳米传感层和纳米抗体通过巯基连接的结构示意图；
图3为本发明的纳米抗体和传统抗体的结构示意图；
图4为本发明的光纤SPR传感器在进行样品检测时纳米抗体捕获病毒的结构示意图；
图5为本发明检测系统在进行样品检测时的结构示意图；
图6为本发明的光纤SPR传感器在加入金纳米粒子修饰的抗体时纳米抗体捕获病毒的结构示意图；
图7为本发明的光纤SPR传感器在被纳米抗体修饰前灵敏度的检测结果；
图8为本发明的检测系统对猪流行性腹泻病毒检测过程中加入金纳米粒子修饰的抗体前后的检测结果。
图中：1、光纤SPR传感器；11、单模光纤；111、纳米传感层；112、纳米抗体；113、病毒S蛋白识别位点；114、半胱氨酸；115、金纳米粒子；116、病毒表面的S蛋白；12、多模光纤；2、光源；3、传输光纤；4、光谱检测器；5、光信号处理单元；6、光纤支架；7、待测样品。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
如图1和2所示：一种光纤SPR传感器1，包括单模光纤11，熔接于单模光纤11两端的多模光纤12，形成MSM型异芯光纤结构，由于单模光纤11与多模光纤12的不同纤芯对接，使得单模光纤11包层中的光波模式(简称：包层模式)被激发，包层模式能够到达光纤表面，并形成表面倏逝场。具体的，单模光纤11的长度为1-20mm，优选为12mm，并且所取单模光纤11和多模光纤12的两端必须光滑、齐平且无倾斜角。单模光纤11的表面设置纳米传感层111，优选的，纳米传感层111的厚度为30-90nm，优选为45nm，纳米传感层111的材料为金、银、铜、铝、复合金属(如铬/银/金合金、铬/银/铜合金等)、含自由电子的半导体中的任意一种，纳米传感层111用来激发SPR信号，光与纳米传感层111中等离子体相互作用。当光的频率与等离子共振频率相同时，频率相同的那部分光被等离子体吸收，进而转换成等离子震荡的能量，而在光谱上则表现为满足条件的那部分光的缺失，即在光谱上的一个共振吸收峰，SPR信号以共振吸收峰的形式表达，SPR共振吸收峰能灵敏地感应传感器表面的分子载荷变化，当生物分子结合到传感器表面时，SPR共振吸收峰就会移动，而分子结合质量的多少则会灵敏地反应于SPR共振吸收峰的移动。
纳米传感层111表面设置纳米抗体层。纳米抗体层由纳米抗体112组成，纳米抗体112的头端设置特异性识别位点，尾端通过巯基自组装或者生物交联剂固定于纳米传感层111的表面。本发明的纳米抗体112是一类由传统“Y”型抗体重链上的可变区(灰色部位，传统抗体只有可变区具有识别抗原的位点)简化下来的小型化抗体，如图3所示。因为传统的抗体修饰方法，大体积的抗体容易相互间阻挡抗原识别位点，而且抗体结合到传感器表面的方向也不好控制，使得抗原识别位点无法准确一致地暴露，导致每个传感器的个体差异大，无法真正应用于实际的免疫检测当中。与传统抗体相比，纳米抗体112同样具有与抗原作用的高亲和力和特异性，同时由于省去了传统抗体的大部分结构，使其还具备容易设计、生产成本低、结构稳定、耐高温、耐腐蚀的优势。并且本发明的纳米抗体112能够更加密集地结合到传感器表面，增加抗原识别位点的数量，提高捕获待检测生物分子的概率。由于纳米抗体112体积较小，大大缩短了光纤SPR传感器1的光学感应距离，能有效提高检测灵敏度和检测效率。
优选的，纳米抗体112的头端设置病毒S蛋白识别位点113，尾端为半胱氨酸114，如图2和图4所示：纳米抗体112通过半胱氨酸114的巯基定向自组装于纳米传感层111的表面。本领域技术人员也可根据需要选择其他具有巯基的化学分子实现将纳米抗体连接在纳米传感层的表面。纳米抗体112的尾端也可通过生物交联剂如多巴胺、京尼平、碳化二亚胺等固定于纳米传感层111的表面。本发明中纳米抗体112与光纤SPR传感器1表面的结合位点在尾部，病毒识别位点在头部，可以使纳米抗体112定向自组装到光纤SPR传感器1表面的纳米传感层111上，使得病毒S蛋白识别位点113一致朝外，提高捕获病毒的概率和检测的一致性。本领域技术人员也可对光纤SPR传感器1进行其他特异性纳米抗体112的修饰，修饰后的光纤SPR传感器1可成为该类生物分子的特异性检测工具，诸如蛋白、核酸、细胞等的特异性检测。
本发明的光纤SPR传感器1结构简单且体积微小，生产成本低，可以批量生产，一次性使用，当用于病毒检测时，有效避免传统的传感器重复使用带来的交叉感染，确保操作人员的安全，以及病毒检测的有效可靠。
实施例2
一种检测系统，如图5所示：包括实施例1中的光纤SPR传感器1、光源2、传输光纤3、光谱检测器4及光信号处理单元5，传输光纤3采用光纤支架6固定，提高光路的稳定性。入射光源2经传输光纤3到达光纤SPR传感器1，光可以到达单模光纤11表面并且以倏逝场的形式进入纳米传感层111，与纳米传感层111中的等离子体相互作用，激发可被光谱检测器4检测的SPR信号，该信号经光信号处理单元5处理后以图谱的形式被呈现，便于对检测结果做出准确的判断，具体的，光信号处理单元5可以为电脑。
该检测系统还包括被金属纳米粒子修饰的抗体，所述被金属纳米粒子修饰的抗体位于待测溶液中，金属纳米粒子修饰的抗体可以特异性和待检测生物分子连接，在进行检测时，光纤SPR传感器1捕获待检测的生物分子，然后通过加入金属纳米粒修饰的抗体增加光纤SPR传感器1表面吸附生物分子的质量，进而实现光学检测信号的放大，优选的，上述被金属纳米粒子修饰的抗体为被金纳米粒子115修饰的纳米抗体112，纳米抗体112具有识别病毒S蛋白的位点，如图6所示。当待测样品中只有极少量病毒的情况下，光纤SPR传感器1表面的纳米抗体层先对病毒进行捕获，然后通过在待测溶液中加入被金纳米粒子115修饰的纳米抗体112，将检测信号放大，降低漏检率，提高检测的岭灵敏性。金纳米粒子115的大小可以调节来满足不同检测需求。本领域技术人员也可以选择其他连接到抗体上增加其质量而不影响其结合抗原的活性的物质来放大检测信号。
上述检测系统在使用时，采用差分检测法去除了背景噪声的干扰，并以检测空气中的检测光谱作为参考光谱，检测空气时，不会激发SPR信号。检测空气作为参考的光谱，在进行生物分子检测前预先测好，保存于系统。在进行生物分子检测时，从系统中调用出来作为参考和差分使用，提高检测的可靠性。在400-1000nm的光谱范围内得到共振吸收峰。当生物分子附着在传感器表面时，SPR条件发生变化，共振吸收峰的相对位移反映了生物分子结合的量。
在进行病毒检测时，将光纤SPR传感器1置入待测样品7中，表面的纳米抗体112通过头端的病毒S蛋白的识别位点捕获病毒，如图4所示。SPR共振吸收峰能灵敏地感应传感器表面的分子载荷变化，当病毒分子结合到传感器表面时，SPR共振吸收峰就会移动，而分子结合质量的多少则会灵敏地反应于SPR共振吸收峰的移动，根据SPR共振吸收峰的位移判断病毒的检测结果。
当待测样品中只有极少量病毒的情况下，光纤SPR传感器1不足以感应到表面的质量变化，可以通过在待测溶液中加入被金纳米粒子115修饰的纳米抗体112提高检测的灵敏性。先利用光纤SPR传感器1捕获病毒，然后加入被金纳米粒子115修饰的纳米抗体112，上述纳米抗体112通过特异性识别病毒S蛋白结合在病毒表面，而金纳米粒子115则给抗体增加了质量。由于病毒表面密布凸起的S蛋白，带有金纳米粒子115的抗体会迅速结合到病毒表面，使得光纤SPR传感器1表面吸附的质量大大增加，实现光学检测信号的放大，提升光纤SPR传感器1的灵敏度和检测限。
上述检测系统的光纤SPR传感器1为可更换的一次性使用传感器，在用于病毒检测时，一方面可以避免交叉感染，另一方面可以确保操作人员的安全，以及病毒检测的可靠性，在检测时仅需将光纤SPR传感器1置入样品中即可实现，免去了各种繁琐的生物操作步骤，样品即时活性检测，降低了错检率，大大的提高了探测效率。整个检测系统响应快，检测过程耗时短，整个检测耗时仅为纳米抗体112捕获病毒的时间，10分钟以内能够完成检测。
实施例3
光纤表面等离子体共振传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用光纤切割刀截取一段12mm的单模光纤，保证单模光纤的两端光滑、齐平且无倾斜角；同样采用光纤切割刀将一段多模光纤切成两段，保证两段多模光纤的切割端面光滑、齐平且无倾斜角，采用光纤熔接机将单模光纤两端分别熔接于两段多模光纤的切割端面，形成多模-单模-多模异芯光纤，即MSM型异芯光纤；
(2)采用热蒸发真空镀膜方式在单模光纤传感区的圆柱面上均匀地沉积上厚度为45nm的纳米传感层；
(3)将上述步骤(2)中沉积纳米传感层的单模光纤传感区放入尾端带有半胱氨酸的纳米抗体溶液中，该纳米抗体通过半胱氨酸的巯基定向自组装于单模光纤表面的纳米传感层。
实施例4
光纤表面等离子体共振传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用光纤切割刀截取一段1mm的单模光纤，保证单模光纤的两端光滑、齐平且无倾斜角；同样采用光纤切割刀将一段多模光纤切成两段，保证两段多模光纤的切割端面光滑、齐平且无倾斜角，采用光纤熔接机将单模光纤两端分别熔接于两段多模光纤的切割端面，形成多模-单模-多模异芯光纤，即MSM型异芯光纤；
(2)采用激光脉冲沉积真空镀膜方式在单模光纤传感区的圆柱面上均匀地沉积上厚度为30nm的纳米传感层；
(3)将上述步骤(2)中沉积纳米传感层的单模光纤传感区放入尾端带有半胱氨酸的纳米抗体溶液中，该纳米抗体通过半胱氨酸的巯基定向自组装于单模光纤表面的纳米传感层。
实施例5
光纤表面等离子体共振传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用光纤切割刀截取一段20mm的单模光纤，保证单模光纤的两端光滑、齐平且无倾斜角；同样采用光纤切割刀将一段多模光纤切成两段，保证两段多模光纤的切割端面光滑、齐平且无倾斜角，采用光纤熔接机将单模光纤两端分别熔接于两段多模光纤的切割端面，形成多模-单模-多模异芯光纤，即MSM型异芯光纤；
(2)采用磁控溅射真空镀膜方式在单模光纤传感区的圆柱面上均匀地沉积上厚度为90nm的纳米传感层；
(3)将上述步骤(2)中沉积纳米传感层的单模光纤传感区放入纳米抗体溶液中，该纳米抗体通过生物交联剂固定于单模光纤表面的纳米传感层。
实验例1纳米抗体修饰前光纤SPR生物传感器的性能
生化分子的结合、解离、浓度变化等都会不可避免地引起其周围环境的折射率变化，而SPR现象对折射率(RI)的变化十分敏感，因此，我们首先通过测量折射率或浓度变化来评估本发明的光纤SPR生物传感器在未被纳米抗体修饰前的生化检测性能和一致性。如图7a所示，共振吸收峰随折射率的增加呈线性红移(往长波长方向的移动)。在1.3343-1.3765的折射率范围内，其线性灵敏度(移动波长随折射率的变化率)为1829.80nm/RIU。
然后以纯净水的检测为参照点，选择0.25M、0.5M和1M浓度的三种NaCl溶液对本发明提供的不同传感器进行一致性测试。结果如图7b所示，各浓度点的偏差几乎相同，附带偏差值的NaCl检测的灵敏度为13.82±0.54nm/M，由上述结果可知，本发明不同SPR传感器的高一致性保证了光纤SPR传感器一次性使用结果的可靠性。
实验例2
采用本发明的检测系统对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行检测，每个检测均进行了三次以上的重复性实验，结果如图8所示。从图8的检测结果可以明显看出本发明的检测系统对于浓度增长的PEDV表现出相应的共振吸收峰波长移动量的增加。而加入金纳米粒子(Au NPs)修饰的抗体后，检测性能得到明显的增强，即共振吸收峰波长移动量显著增强。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种光纤表面等离子体共振传感器，其特征在于，包括单模光纤，熔接于所述单模光纤两端的多模光纤，所述单模光纤的表面设置纳米传感层，所述纳米传感层表面设置纳米抗体层。
2.根据权利要求1所述光纤表面等离子体共振传感器，其特征在于，所述纳米抗体层由纳米抗体组成，所述纳米抗体的头端设置特异性识别位点，尾端通过巯基或者生物交联剂固定于纳米传感层的表面。
3.根据权利要求2所述光纤表面等离子体共振传感器，其特征在于，所述纳米抗体头端的特异性识别位点为病毒S蛋白的识别位点；所述纳米抗体的尾端连接半胱氨酸，通过半胱氨酸的巯基定向自组装于纳米传感层的表面。
4.根据权利要求3所述光纤表面等离子体共振传感器，其特征在于，所述纳米传感层的厚度为30-90nm；所述纳米传感层的材料为金、银、铜、铝、复合金属、含自由电子的半导体中的一种。
5.根据权利要求1所述光纤表面等离子体共振传感器，其特征在于，所述单模光纤的长度为1-20mm。
6.一种检测系统，其特征在于，包括权利要求1至5任一项所述光纤表面等离子体共振传感器、光源、传输光纤、光谱检测器及光信号处理单元，光源经传输光纤进入光纤表面等离子体共振传感器，自光纤表面等离子体共振传感器出来的出射光经传输光纤至光谱检测器，经光谱检测器后至光信号处理单元。
7.根据权利要求6所述检测系统，其特征在于，还包括被金属纳米粒子修饰的抗体，所述被金属纳米粒子修饰的抗体位于待测溶液中。
8.根据权利要求7所述检测系统，其特征在于，所述被金属纳米粒子修饰的抗体为被金纳米粒子修饰的纳米抗体，所述纳米抗体具有识别病毒S蛋白的位点。
9.根据权利要求6所述检测系统，其特征在于，还包括固定传输光纤的光纤支架。
10.如权利要求1至5所述光纤表面等离子体共振传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取一段单模光纤在其两端熔接多模光纤得到MSM型异芯光纤；
(2)在上述步骤(1)中MSM型异芯光纤的单模光纤区域沉积纳米传感层；
(3)将纳米抗体固定在纳米传感层的表面，即得产品。
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