KR20190101975A - 면역-pet 영상화를 위한 방사성 표지된 항-pd-l1 항체 - Google Patents

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Abstract

방사성 표지된 항-PD-L1 항체 및 그것들의 면역-PET 영상화에서의 사용이 본원에 제공된다. 환자 또는 샘플에서 PD-L1 단백질의 존재를 검출하는 방법이 포함된다.

Description

면역-PET 영상화를 위한 방사성 표지된 항-PD-L1 항체
본 개시는 방사성 표지된 항-PD-L1 항체 및 면역-PET 영상화에서의 그것들의 사용에 관한 것이다.
서열 목록
서열 목록의 공식 사본은 명세서와 동시에, "10305WO01_SEQ_LIST_ST25.txt"의 파일 명칭, 2017년 12월 1일의 생성일, 및 약 117KB의 크기를 가진 ASCII 포맷의 서열 목록으로서 EPS-Web을 통해 전자 제출된다. 이 ASCII 포맷 서류에 포함된 서열 목록은 명세서의 일부이며 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1) (또한 B7-H1 또는 CD274로도 불림)은 CD4 및 CD8 T-세포, 대식세포 계통 세포, 말초 조직과 같은 림프계 및 비-림프계 조직 둘 다에서뿐만 아니라 종양 세포에서, 및 바이러스로 감염된 세포에서 광범위하게 발현되는 290개 아미노산 단백질 수용체 리간드이다 (Dong et al 1999, Nature Med.). PD-L1은 T-세포 동시-억제성 수용체 (Chen et al 2013, Nature Rev. Immunol. 13: 227-242)의 CD28/CTLA-4 (세포독성 T 림프구 항원)/ ICOS (유도성 동시 자극제) 패밀리에 속하는 수용체 PD-1 및 B7-1에 결합하여 T-세포 활성화를 억제함으로써 면역 반응을 약화시킨다. PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1 결합은 암, 및 바이러스 감염과 같은 질환에서 체액성 및 세포 면역 반응을 포함한, 감소된 T-세포 증식 및 사이토카인 분비를 초래한다. 종양 세포 및 바이러스-감염된 세포 상에서 PD-L1의 발현은 면역 반응을 피하기 위해 종양 및 만성 바이러스 감염에 의해 이용된다. PD-L1은 광범위한 종양에서 발현되며 동물 모델에서의 연구들은 종양 상의 PD-L1이 T-세포 활성화 및 종양 세포의 용해를 억제하고 종양-특이적 T-세포의 증가된 사멸로 이어질 수 있음을 밝혀냈다. 만성 바이러스 감염에서, 바이러스-감염된 세포 상에 발현된 PD-L1은 바이러스-특이적 T-세포 상에서 PD-1에 결합하고 이런 T-세포들은 이펙터 기능 및 증식성 용량의 손실과 함께 "소진"되어간다 (Freeman 2008, PNAS 105: 10275-10276). PD-1: PD-L1 시스템은 또한 유도된 T-조절성 (Treg) 세포 발달에서 및 Treg 기능을 지속시키는 데에 중요한 역할을 한다 (Francisco et al 2010, Immunol. Rev. 236: 219-242). 단클론성 항체를 포함한, 길항물질로 PD-L1을 차단하는 것이 암 및 만성 바이러스 감염의 치료에서 연구되어 왔다 (Ribas 2012, NEJM 366: 2517-2519; Freeman 2008, PNAS 105: 10275-10276; Sheridan 2012, Nature Biotechnology 30: 729-730).
면역-양전자 방출 단층촬영 (PET)은 양전자 방출 단층촬영 카메라의 민감성과 항체의 표적화 특성을 조합하는, 양전자 방출체로 표지된 단클론성 항체를 활용하는 진단용 영상화 도구이다. 예컨대, The Oncologist, 12: 1379 (2007); Journal of Nuclear Medicine, 52(8): 1171 (2011) 참조. 면역-PET는 생체내에서 항원 및 항체 축적의 시각화 및 정량화를 가능하게 하고, 그로써 진단 및 보완 치료법에 대한 중요한 도구로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 면역-PET는 특정 치료법에 대한 잠재적 환자 후보들의 선택과, 뿐만 아니라 치료의 모니터링에 도움을 줄 수 있다.
PD1 및 PD-L1이 둘 다 면역요법에 대한 표적으로서 나타나기 때문에, 무엇보다 먼저, 항-PD1 및/또는 항-PD-L1 치료법에 대한 적합한 환자 후보의 검출을 가능하게 하는 진단용 도구를 포함한, 항-PD1 및/또는 항-PD-L1 치료법에 대한 진단용 도구에 대한 필요성이 있다.
본 개시에는 면역-PET 영상화에 사용하기 위한 방사성 표지된 항-PD-L1 항체 콘쥬게이트가 포함된다.
한 측면으로, 콘쥬게이트는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 항원-결합 단편, 킬레이트화 모이어티, 및 양전자 방출체를 포함한다.
본원에는 또한 상기 콘쥬게이트의 합성 과정 및 그것에 유용한 합성 중간체들이 제공된다.
본원에는 또한 PD-L1을 발현하는 조직의 영상화 방법이 제공되며, 그 방법은 본원에 기술된 방사성 표지된 항-PD-L1 항체 콘쥬게이트를 조직에 투여하는 단계; 및 양전자 방출 단층촬영 (PET) 영상화에 의해 PD-L1 발현을 시각화하는 단계를 포함한다.
본원에는 또한 조직에서 PD-L1을 검출하는 방법이 제공되며, 그 방법은 본원에 기술된 방사성 표지된 항-PD-L1 항체 콘쥬게이트를 조직에 투여하는 단계; 및 PET 영상화에 의해 PD-L1 발현을 시각화하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 조직은 인간 대상체에 존재한다. 특정 구체예에서, 대상체는 비인간 동물이다. 특정 구체예에서, 대상체는 암, 염증성 질환, 또는 감염과 같은 질환 또는 질병을 가진다.
일부 측면으로, 대상체는 방사성 표지된 항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 5 mg, 또는 10 mg, 또는 20 mg의 용량으로 투여된다.
본원에는 또한 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제를 포함하는 항-종양 요법에 적합한지 환자를 확인하는 방법이 제공되며, 그 방법은 고체 종양을 가진 환자를 선택하는 단계, 본원에 기술된 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 투여하는 단계, 및 종양에서 투여된 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 PET 영상화에 의해 시각화하는 단계를 포함하며, 여기서 종양에서 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 존재는 환자를 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제를 포함하는 항-종양 요법에 적합한 것으로 확인해준다.
본원에는 또한 종양의 치료 방법이 제공되는데, 그 방법은 고체 종양을 가진 환자를 선택하는 단계; 고체 종양이 PD-L1-양성인지 측정하는 단계; 및 치료를 필요로 하는 대상체에게 항-종양 요법을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 항-종양 요법은 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제 (예컨대, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체)를 포함한다. 특정 구체예에서, 대상체는 본원에 기술된 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트가 투여되고, 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 국지화는 종양이 PD-L1-양성인지 측정하기 위하여 양전자 방출 단층촬영 (PET) 영상화를 통해 영상화된다.
본원에는 또한 대상체에서 항-종양 요법의 효능을 모니터링하는 방법이 제공되는데, 그 방법은 대상체가 항-종양 요법으로 치료되는, 고체 종양을 가진 대상체를 선택하는 단계; 본원에 기술된 방사성 표지된 콘쥬게이트를 대상체에게 투여하는 단계; 종양에서 투여된 방사성 표지된 콘쥬게이트의 국지화를 PET 영상화에 의해 영상화하는 단계; 및 종양 성장을 측정하는 단계를 포함하며, 이때 콘쥬게이트 또는 방사성 표지된 신호의 흡수에서 기준선으로부터의 감소는 종양 퇴행 및 항-종양 요법의 효능을 가리킨다. 특정 구체예에서, 항-종양 요법은 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제 (예컨대, 항-PD-1 항체)를 포함한다.
본원에는 또한 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제를 포함하는 항-종양 요법에 대한 환자의 반응을 예측하는 방법이 제공되며, 그 방법은 고체 종양을 가진 환자를 선택하는 단계; 및 종양이 PD-L1-양성인지를 측정하는 단계를 포함하며, 만약 종양이 PD-L1-양성이면 그것은 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제를 포함하는 항-종양 요법에 대한 환자의 양성 반응을 가리킨다. 특정 구체예에서, 종양은 본 개시의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 투여하고 종양에서 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 PET 영상화에 의해 국지화함으로써 측정되며, 종양의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 존재는 종양이 PD-L1-양성인 것을 가리킨다.
도 1은 미변형 항-PD-L1 항체 및 항-PD-L1 DFO 변형 항체의 SDS-PAGE 및 SEC를 도시한다.
도 2A 및 2B는 연구 1에 대해 89Zr 방사성 표지화 후 방사성-SEC-HPLC를 도시한다.
도 3은 연구 2에 대해 89Zr 방사성 표지화 후 DFO-콘쥬게이트 (항-PD-L1)의 방사성-SEC-HPLC를 도시한다.
도 4는 연구 3에 대해 89Zr 방사성 표지화 후 방사성-SEC-HPLC를 도시한다.
도 5는 연구 1에 대해 89Zr 방사성 표지화 후 UV280-SEC-HPLC 크로마토그램 및 방사성-iTLC 트레이스를 도시한다.
도 6A, 6B, 6C, 및 6D는 본원의 실시예 5에서 기술된 것과 같이, 시험관내에서 종양 세포주 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg (도 6A), LOX-IMVI (도 6B), MDA-MB-231 (도 6C), 및 SK-Br-3 (도 6D)에 의한 hPD-L1 발현을 도시한다.
도 7은 본원의 실시예 5에서 기술된 것과 같이, 제 2 실험으로 시험관내에서 인터페론-감마 처리가 있거나 없이 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 및LOX-IMVI 종양 세포에 의한 hPD-L1 발현을 도시한다.
도 8은 A, B, D, 및 E에서 나타낸 연구들에 대해 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 방사성면역콘쥬게이트로부터의, 및 C 및 F에서 나타낸 연구들에 대해 동위원소 대조군 방사성면역콘쥬게이트 89Zr-DFO-IgG4P의 샘플을 사용한 SEC-HPLC 분석에 의해 생성된 크로마토그램들을 도시한다. 280 nm에서의 흡광도에 대한 크로마토그램은 A 내지 C에서 나타내고 γ-방출의 세기에 대한 방사성-크로마토그램은 D 내지 F에서 나타낸다. A 내지 C에서, 완충액 구성요소들의 용출이 또한 검출되었다. 샘플 완충액 중의 염들의 이런 피크들 (보유 시간 >25분, 별표 "*")은 피크 면적의 적분으로부터 배제하였다. 피크들을 HMW (고분자량) 면역콘쥬게이트 ("1"), 모노머 면역콘쥬게이트 ("2"), 미통합 89Zr ("3"), 및 샘플 완충액 중의 염 ("*")을 나타내도록 표지화한다. 약어: mAU = 밀리 흡광 단위; cps = 초당 카운트.
도 9는 PD-1hu/hu-PD-L1hu/hu 마우스에서 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트에 대한 생체외 생체분포 데이터를 제공한다. 16마리의 마우스 (각각 8마리씩의 2개 그룹)에 단일 정맥내 용량의 50 μCi (1 mg/kg) 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트를 제 0일에 투여하고 투약 후 제 6일에 (검은색 칼럼) 또는 제 10일에 (회색 칼럼) 희생시켰다. 혈액을 심장 천공을 통해 수집하였고, 표시된 수득된 조직을 무게를 측정하고 방사능을 측정하였다. 제 6일 또는 제 10일에 수집한 개별적인 샘플에 대한 그램당 주사된 용량 퍼센트 (%ID/g) 값을 주사된 물질 (89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트) 및 개별적인 샘플의 무게로부터 용량-표준의 방사능에 비교하여 계산하였다. 데이터를 평균 ±SD로서 도표화한다.
I. 정의
본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 개시된 주제가 속하는 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 공통적으로 인지되는 것과 동일한 의미를 가진다.
용어 "PD-L1"은 CD274 및 B7H1로서도 알려져 있는 프로그램된 사멸-리간드 1을 나타낸다. 전장 PD-L1의 아미노산 서열은 GenBank에 등록 번호 NP_054862.1로서 제공된다. 용어 "PD-L1"은 또한 PD-L1의 변종을 포함한다. 용어 "PD-L1"은 재조합 PD-L1 또는 그것의 단편을 포함한다. 용어는 또한, 예를 들어, 히스티딘 태그, 마우스 또는 인간 Fc, 또는 신호 서열, 예컨대 ROR1에 결합된 PD-L1 또는 그것의 단편을 포함한다. 예를 들어, 용어는 전장 PD-L1 (NP_054862.1)의 아미노산 잔기 19 내지 239에 결합되어 있는, C-말단에서의 마우스 Fc (mIgG2a) 또는 인간 Fc (hIgG1)를 포함하는 서열들을 포함한다. 단백질 변종은 NP_054862.1의 아미노산 잔기 19 내지 239에 결합되어 있는, C-말단에서의 히스티딘 태그를 포함한다. 비인간 종으로부터 유래되는 것이라고 명시디지 않는 한, 용어 "PD-L1"은 인간 PD-L1을 의미한다. PD-L1은 세포외 IgV-유사 및 IgC-유사 도메인 (전장 PD-L1의 아미노산 19 내지 239), 경막 도메인 및 대략 30개 아미노산의 세포내 도메인을 가지는 290개 아미노산 단백질이다. PD-L1은 항원 제공 세포 (예컨대, 수지상 세포, 대식세포, 및 B-세포)와 같은 많은 세포 상에서 및 조혈 및 비조혈 세포 (예컨대 혈관 내피 세포, 췌장샘, 및 면역 특권 부위) 상에서 본질적으로 발현된다. PD-L1은 또한 광범위한 다양한 종양, 및 바이러스-감염된 세포 상에서 발현되고, 면역억제 환경의 구성요소이다 (Ribas 2012, NEJM 366: 2517-2519). PD-L1은 2개의 T-세포 보조 억제제 PD-1 및 B7-1 중 하나에 결합한다.
용어 "PD-1"은 프로그램된 사망-1 단백질, CD279로도 알려져 있는 T-세포 보조 억제제를 나타낸다. 전장 PD-1의 아미노산 서열은 GenBank에 등록 번호 NP_005009.2로서 제공된다. 용어는 또한 예를 들어, 히스티딘 태그, 마우스 또는 인간 Fc, 또는 신호 서열, 예컨대 ROR1에 결합된 PD-1 또는 그것의 단편을 포함한다. 예를 들어, 용어는 C93S 변화를 가진 NP_005009.2의 아미노산 잔기 25 내지 170에 결합된, C-말단에서의 마우스 Fc (mIgG2a) 또는 인간 Fc (hIgG1)를 포함한다. PD-1은 T-세포 보조 억제제의 CD28/ CTLA-4/ICOS 패밀리의 구성원이다. PD-1은 IgV-유사한 세포외N-말단 도메인, 경막 도메인 및 면역수용체 티로신-기반 억제성 (ITIM) 모티프 및 면역수용체 티로신-기반 스위치 (ITSM) 모티프를 함유한 세포내 도메인을 가진 288개 아미노산 단백질이다 (Chattopadhyay et al 2009, Immunol. Rev.). PD-1 수용체는 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 가진다.
용어 "B7-1"은 동시자극성 인자 CD80으로도 알려져 있는 T-림프구 활성화 항원을 나타낸다. B7-1은 IgV-유사 (aa 37 - 138) 및 IgC-유사 (aa 154 - 232) 영역을 포함하는 세포외 N-말단 도메인, 경막 도메인 (aa 243 - 263) 및 C-말단 세포내 영역 (aa 263 - 288)을 가지는 288개 아미노산 막 수용체이다. 전장 B7-1의 아미노산 서열은 GenBank에 등록 번호 NP_005182.1로서 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "T-세포 보조 억제제"는 T-세포 활성화 또는 억압을 통해 면역 반응을 조절하는 리간드 및/또는 수용체를 나타낸다. T-세포 보조-신호전달 분자로도 알려져 있는 용어 "T-세포 보조 억제제"는, 한정하는 것은 아니지만 PD-1, 림프구 활성화 유전자 3 단백질 (LAG-3, CD223으로도 알려짐), 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4), B 및 T 림프구 아테뉴에이터 (BTLA), CD-28, 2B4, LY108, T-세포 면역글로불린 및 뮤신-3 (TIM3), 면역글로불린 및 ITIM (TIGIT; VSIG9로도 알려짐)을 가진 T-세포 면역수용체, 백혈구 관련 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1; CD305로도 알려짐), 유도성 T-세포 동시자극제 (ICOS; CD278로도 알려짐), B7-1 (CD80), 및 CD160을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 사슬, 이황화 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)로 구성된 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 그것의 멀티머 (예컨대 IgM) 또는 그것들의 항원-결합 단편들을 나타내는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 ("HCVR" 또는 "VH") 및 중쇄 불변 영역 (도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 ("LCVR 또는 "VL") 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 더 보존된, 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 영역이 사이에 끼어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 다음 순서로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 특정 구체예에서, 항체 (또는 그것의 항원 결합 단편)의 FR은 인간 생식선 서열과 동일하거나, 또는 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 둘 이상의 CDR의 사이드 바이 사이드 분석을 기반으로 정의될 수 있다.
하나 이상의 CDR 잔기들의 치환 또는 하나 이상의 CDR의 생략이 또한 가능하다. 하나 또는 2개의 CDR이 결합을 위해 생략될 수 있는 항체들이 과학 문헌에서 기술되어 있다. Padlan 등 (1995 FASEB J. 9:133-139)은 항체와 그것들의 항원 사이의 접촉 영역을 공개된 결정 구조를 기반으로 분석하였고, 단지 약 1/5 내지 1/3의 CDR 잔기들이 실제로 항원과 접촉하는 것으로 결론내렸다. Padlan은 또한 하나 또는 2개의 CDR이 항원과 접촉하는 아미노산을 갖지 않는 많은 항체를 발견하였다 (또한 Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428 참조).
항원과 접촉하지 않은 CDR 잔기들은 이전의 연구를 기반으로 (예를 들어 CDRH2의 잔기 H60-H65는 종종 필요하지 않음) Chothia CDR 외부에 있는 Kabat CDR 영역으로부터 분자 모델링에DMLGO 및/또는 실험적으로 확인될 수 있다. 만약 CDR 또는 그것의 잔기(들)이 생략되면, 보통 또 다른 인간 항체 서열 또는 그러한 서열의 공통에서 상응하는 위치를 차지하는 아미노산으로 치환된다. 치환하기 위한 CDR 및 아미노산 내에서의 치환에 대한 위치는 또한 실험적으로 선택될 수 있다. 실험적 치환은 보존성이거나 비보존성 치환일 수 있다.
본원에서 개시된 전체 인간 항-PD=L1 단클론성 항체는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 상응하는 생식선 서열에 비교하여 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에 포함할 수 있다. 그러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열들을, 예를 들어 공개된 항체 서열 데이터베이스로부터 입수 가능한 생식선 서열과 비교함으로써 쉽게 확인될 수 있다. 본 개시는 본원에 개시된 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 유래된 항체, 및 그것의 항원-결합 단편을 포함하고, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래된 생식선 서열의 상응하는 잔기9들)로, 또는 또 다른 인간 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 상응하는 생식선 잔기(들)의 보존성 아미노산 치환으로 돌연변이된다 (그러한 서열 변화는 본원에서 종합적으로 "생식선 돌연변이"로서 언급됨). 당업자는, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 출발하여, 하나 이상의 개별적인 생식선 돌연변이 또는 그것들의 조합을 포함하는 많은 항체 및 항원-결합 단편을 쉽게 제조할 수 있다. 특정 구체예에서, V H 및/또는 V L 도메인 내에 있는 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기는 그 항체가 유래된 원래의 생식선 서열에서 발견되는 잔기들로 복귀 돌연변이된다. 다른 구체예에서, 특정 잔기만이, 예컨대, FR1의 처음 8개 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개 아미노산 내에서 발견된 돌연변이된 잔기들만, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발현된 돌연변이된 잔기들만이 원래의 생식선 서열로 복귀 돌연변이된다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들)은 상이한 생식선 서열 (즉, 그 항체가 원래 유래된 생식선 서열과 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 나아가, 본 개시의 항체들은 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 둘 이상의 생식선 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있는데, 예컨대 특정 개별 잔기는 특정 생식선 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 한편 원래의 생식선 서열과 상이한 특정한 다른 잔기는 유지되거나 상이한 생식선 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 얻어진 후에는, 하나 이상의 생식선 돌연변이를 함유한 항체 및 항원-결합 단편드른 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선된 또는 향상된 길항물질 또는 작용물질의 생물학적 특성 (경우에 따라), 감소된 면역원성, 등과 같은 하나 이상의 우너하는 특성에 대해 쉽게 테스트될 수 있다. 이런 일반적인 방식으로 얻어진 항체 및 항원-결합 단편들은 본 개시 내에 포함된다.
본 개시는 또한 하나 이상의 보존성 치환을 가진 본원에서 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열들 중 임의의 것의 변종을 포함하는 전체 인간 항-PD-L1 단클론성 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 개시는 예컨대 본원에 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 임의의 것에 비해 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하, 등의 보존선 아미노산 치환을 가진 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 가지는 항-PD-L1 항체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가지는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 개시의 인간 mAb는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기 (예컨대 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이생성에 의해 시험관내에서 또는 생체내에서 체세포성 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이들)를, 예를 들어 CDR에 및 특히 CDR3에 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 다른 포유류 종 (예컨대 마우스)의 생식선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 FR 서열 상으로 이식되어 있는 mAb를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "다중-특이적 항원-결합 분자"는 이중특이적, 삼중-특이적 또는 다중-특이적 항원-결합 분자, 및 그것들의 항원-결합 단편을 나타낸다. 다중-특이적 항원-결합 분자는 한 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프들에 특이적이거나 하나 이상의 표적 폴리펩타이드의 에피토프들에 특이적인 항원-결합 도메인들을 함유할 수 있다. 다중-특이적 항원-결합 분자는 단일한 다중기능성 폴리펩타이드이거나, 또는 서로 공유적으로 또는 비공유적으로 회합된 둘 이상의 폴리펩타이드의 멀티머 복합체일 수 있다. 용어 "다중-특이적 항원-결합 분자"는 다른 기능성 분자, 예컨대 다른 펩타이드 또는 단백질에 결합된 또는 그것들과 공동 발현될 수 있는 본 개시의 항체들을 포함한다. 예를 들어, 항체 또는 그것의 단편은 하나 이상의 다른 분자 실체, 예컨대 단백질 또는 그것의 단편에 기능적으로 (예컨대 화학적 결합, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 기타에 의해) 연결되어 제 2 결합 특이성을 가지는 이중-특이적 또는 다중-특이적 항원-결합 분자가 생성될 수 있다. 본 개시에 따르면, 용어 "다중-특이적 항원-결합 분자"는 또한 이중-특이적, 삼중-특이적 또는 다중-특이적 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 개시의 항체는 또 다른 항체 또는 그것의 항원-결합 단편에 기능적으로 연결되어 제 2 결합 특이성을 가지는 이중특이적 항체가 생성된다. 본 개시의 이중특이적 및 다중-특이적 항체는 본원의 다른 곳에서 기술된다.
용어 "특이적으로 결합하다", 또는 "특이적으로 결합하는", 등은 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이 생리적 조건 하에서 상대적으로 안정적인 항원과 복합체를 형성하는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1x10-8 M 이하의 평형 해리 상수에 의해 특징지어질 수 있다 (예컨대 더 작은 KD는 더 단단한 결합을 나타냄). 두 분자가 특이적으로 결합하는지의 여부를 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라즈몬 공명, 등을 포함한다. 본원에서 기술되는 것과 같이, 항체는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 BIACORETM에 의해 확인될 수 있다. 더욱이, PD-L1 및 하나 이상의 추가적인 항원의 한 도메인에 결합하는 다중-특이적 항체 또는 PD-L1의 두 상이한 영역에 결합하는 이중특이적 항체는 그럼에도 불구하고 본원에서 사용되는 "특이적으로 결합"하는 항체로 여겨진다.
본원에서 사용되는 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편", 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적으로 발생하는, 효소적으로 얻을 수 있는, 합성의, 또는 유전자 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 항체의 "항원-결합 단편", 또는 "항체 단편"은 PD-L1에 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "분리된 항체"는 상이한 항원성 특이성을 가진 다른 항체 (Ab)가 실질적으로 없는 항체를 나타낸다 (예컨대, PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체, 또는 그것의 단편은 PD-L1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 Ab가 실질적으로 없다).
본원에서 사용되는 용어 "표면 플라즈몬 공명"은 예를 들어 BIACORETM 시스템 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)을 사용하여, 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도의 변경의 검출에 의해 실시간 생체분자 상호작용의 분석을 허용하는 광학 현상을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "KD "는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 나타내는 것으로 의도된다.
용어 "에피토프"는 파라토프(paratope)로서 알려져 있는 항체 분자의 가변 영역에서의 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 나타낸다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 그러므로, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 구역들에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효과들을 가질 수 있다. 용어 "에피토프"는 또한 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 나타낸다. 그것은 또한 항체에 의해 결합되는 항원의 영역을 나타낸다. 에피토프는 구조적 또는 기능적인 것으로서 규정될 수 있다. 기능적 에피토프는 일반적으로 구조적 에피토프들의 하위세트이고 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 잔기들을 가진다. 에피토프들은 또한 형태적일 수 있는데, 즉, 비선형 아미노산들로 구성될 수 있다. 특정 구체예에서, 에피토프들은 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기, 또는 설포닐기와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 그룹인 결정기를 포함할 수 있고, 특정 구체예에서, 특이적인 삼차원 구조적 특징, 및/또는 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다.
용어 "실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 핵산 또는 그것의 단편을 언급할 때, 또 다른 핵산 (또는 그것의 상보성 가닥)과 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실로 최적으로 정렬될 때, 서열 동일성의 임의의 잘 알려져 있는 알고리즘, 예컨대 FASTA, BLAST 또는 GAP에 의해 측정되는 바, 뉴클레오타이드 염기의 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%에서 뉴클레오타이드 서열 동일성이 있는 것을 가리킨다.
폴리펩타이드에 적용될 때, 용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은 최적으로 정렬될 때, 예컨대 디폴트 갭 무게를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 두 펩타이드가 적어도 90%의 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존성 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예컨대 전하 또는 소수성)을 가지는 측쇄 (R 기)를 가진 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 단백질의 기능성 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 둘 이상의 아미노산 서열이 보존성 치환에 의해 서로와 상이한 경우에, 유사성의 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존성 성질을 교정하기 위해 상향ㅇ 조정될 수 잇다. 이런 조정을 만들기 위한 수단은 당업계에서 당업자들에게 잘 알려져 있다. 예컨대, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331 (본원에 참조로 포함됨) 참조. 유사한 화학적 특성을 가진 측쇄를 가지는 아미노산 그룹의 실례로는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; 2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파테이트 및 글루타메이트, 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 들 수 있다. 바람직한 보존성 아미노산 치환기는 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존성 대체는 Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 양의 값을 가지는 임의의 변화이다. "적당히 보존적인" 대체는 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 음이 아닌 값을 가지는 임의의 변화이다. 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 기타 변형, 이를테면 보존성 아미노산 치환에 배정된 유사성의 척도를 사용하여 유사한 서열을 매치시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 밀접하게 관련된 폴리펩타이들, 예컨대 유기체의 상이한 종으로부터의 상동하는 폴리펩타이드들 사이의 또는 야생형 단백질과 그것의 뮤테인 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위해 디폴트 매개변수들로 사용될 수 있는 GAP 및 BESTFIT과 같은 프로그램을 포함한다. 예컨대, GCG Version 6.1 참조. 폴리펩타이드 서열은 또한 디폴트 또는 권장된 매개변수들을 가지는 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다; GCG Version 6.1. FASTA의 프로그램 (예컨대, FASTA2 및 FASTA3)은 문제의 서열 및 조사 서열 사이의 최상의 중복 영역의 배열 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다 ((Pearson (2000) 상기 동일). 개시의 서열을 상이한 유기체로부터의 대다수의 서열을 함유하는 데이터베이스에 비교할 때 또 다른 바람직한 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 디폴트 매개변수들을 사용하는 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예컨대, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 및 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 참조 (이것들은 각각 본원에 참조로 포함됨).
구절 "치료적 유효량"은 그것이 투여되는 경우 바람직한 효과를 생성하는 양을 의미한다. 정확한 양은 치료 목적에 따라 좌우될 것이고, 공지된 기법들을 사용하여 당업자에 의해 확인될 것이다 (예를 들어, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding 참조).
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 만성 바이러스 감염, 암 또는 자가면역 질환과 같은 질환 또는 질병의 개선, 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 동물, 바람직하게는 포유류를 나타낸다.
II. 면역-PET 영상화를 위한 PD-L1 항체의 방사성 표지된 면역콘쥬게이트
본원에는 프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 방사성 표지된 항원-결합 단백질이 제공된다. 방사성 표지된 항원-결합 단백질은 양전자 방출체를 킬레이트화할 수 있는 화학적 모이어티인, 하나 이상의 킬레이트화 모이어티에 공유적으로 결합된 항원-결합 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에는 PD-L1에 결합하는 항원-결합 단백질, 예컨대, 항체가 제공되며, 상기 PD-L1에 결합하는 항원-결합 단백질은 다음 구조를 가지는 하나 이상의 모이어티에 공유 결합된다:
-L-MZ
식에서 L은 킬레이트화 모이어티이고; M은 양전자 방출체이며; z는 독립적으로 각각의 발생시에 0 또는 1이고; 적어도 하나의 z는 1이다.
일부 구체예에서, 방사성 표지된 항원-결합 단백질은 식 (I)의 화합물이다:
M-L-A-[L-MZ]k (I)
A는 PD-L1에 결합하는 단백질이고; L은 킬레이트화 모이어티이며; M은 양전자 방출체이고; z는 0 또는 1이며; k는 0 내지 30의 정수이다. 일부 구체예에서, k는 1이다.
특정 구체예에서, 방사성 표지된 항원-결합 단백질은 식 (II)의 화합물이다:
A-[L-M]k (II)
식에서 A는 PD-L1에 결합하는 단백질이고; L은 킬레이트화 모이어티이며; M은 양전자 방출체이고; k는 0 내지 30의 정수이다.
일부 구체예에서, 본원에는 다음 구조를 가지는 콘쥬게이트를 포함하는 조성물이 제공된다:
A-Lk
식에서 A는 PD-L1에 결합하는 단백질이고; L은 킬레이트화 모이어티이며; k는 0 내지 30의 정수이고; 콘쥬게이트는 임상 PET 영상화에 적합한 비방사능을 제공하기에 충분한 양의 양전자 방출체로 킬레이트화된다.
적합한 결합 단백질, 킬레이트화 모이어티, 및 양전자 방출체가 하기에 제공된다.
A. PD-L1 결합 단백질
적합한 PD-L1 결합 단백질은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것들을 포함한, PD-L1에 특이적으로 결합하는 단백질이다. 본 개시의 예시적인 항-PD-L1 항체는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 표 1에서 열거되고, 또한 하기에 제시된다.
아미노산 서열 식별자
SEQ ID NO:
항체 명칭 HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3
H2M8306N 2 4 6 8 10 12 14 16
H2M8307N 18 20 22 24 26 28 30 32
H2M8309N 34 36 38 40 42 44 46 48
H2M8310N 50 52 54 56 58 60 62 64
H2M8312N 66 68 70 72 74 76 78 80
H2M8314N 82 84 86 88 90 92 94 96
H2M8316N 98 100 102 104 106 108 110 112
H2M8317N 114 116 118 120 122 124 126 128
H2M8321N 130 132 134 136 138 140 142 144
H2M8323N 146 148 150 152 154 156 158 160
H2M8718N 162 164 166 168 170 172 174 176
H2M8718N2 178 180 182 184 170 172 174 176
H2M8719N 186 188 190 192 194 196 198 200
H1H9323P 202 204 206 208 210 212 214 216
H1H9327P 218 220 222 224 226 228 230 232
H1H9329P 234 236 238 240 242 244 246 248
H1H9336P 250 252 254 256 258 260 262 264
H1H9344P2 266 268 270 272 274 276 278 280
H1H9345P2 282 284 286 288 274 276 278 280
H1H9351P2 290 292 294 296 274 276 278 280
H1H9354P2 298 300 302 304 274 276 278 280
H1H9364P2 306 308 310 312 274 276 278 280
H1H9373P2 314 316 318 320 274 276 278 280
H1H9382P2 322 324 326 328 274 276 278 280
H1H9387P2 330 332 334 336 274 276 278 280
H1H9396P2 338 340 342 344 274 276 278 280
표 1은 예시적인 항-PD-L1 항체의 중쇄 가변 영역 (HCVRs), 경쇄 가변 영역 (LCVRs), 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자들을 나타낸다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그것에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열들 중 임의의 것과 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열들 중 임의의 것을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열쌍 (HCVR/LCVR)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 특정 구체예에 따르면, 본 개시는 표 1에 열거된 예시적인 항-PD-L1 항체들 중 임의의 항체 내에 함유된 HCVR/LCVR 아미노산 서열쌍을 포함하는 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열쌍은 SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/170, 186/194, 202/210, 218/226, 234/242, 250/258, 266/274, 282/274, 290/274, 298/274, 306/274, 314/274, 322/274, 330/274, 및 338/274로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열쌍은 SEQ ID NO: 82/90 (예컨대, H2M8314N), 162/170 (예컨대, H2M8718N), 306/274 (예컨대, H1H9364P2), 및 314/274 (예컨대, H1H9373P2) 중 하나로부터 선택된다. 특정한 다른 구체예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열쌍은 SEQ ID NO: 98/106 (예컨대, H2M8316N), 146/154 (예컨대, H2M8323N), 290/274 (예컨대, H1H9351P2), 및 330/274 (예컨대, H1H9387P2) 중 하나로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (HCDR1)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (LCDR1)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 (LCDR2)를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열들 중 임의의 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열들 중 임의의 것과 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열들 중 임의의 것을 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열쌍 (HCDR3/LCDR3)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 특정 구체예에 따르면, 본 개시는 표 1에 열거된 예시적인 항-PD-L1 항체들 중 임의의 것 내에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열쌍을 포함하는 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열쌍은 SEQ ID NO: 88/96 (예컨대, H2M8314N), 168/176 (예컨대, H2M8718N), 312/280 (예컨대, H1H9364P2), 및 320/280 (예컨대, H1H9373P2)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정한 다른 구체예에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열쌍은 SEQ ID NO: 104/112 (예컨대, H2M8316N), 152/160 (예컨대, H2M8323N), 296/280 (예컨대, H1H9351P2), 및 336/280 (예컨대, H1H9387P2)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 예시적인 항-PD-L1 항체들 중 임의의 것 내에 함유된 6개의 CDR 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 특정 구체예에서, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 SEQ ID NO: 84-86-88-92-94-96 (예컨대, H2M8314N); 164-166-168-172-174-176 (예컨대, H2M8718N); 308-310-312-276-278-280 (예컨대, H1H9364P2); 및 316-318-320-276-278-280 (예컨대, H1H9373P2)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정한 다른 구체예에서, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트는 SEQ ID NO: 100-102-104-108-110-112 (예컨대, H2M8316N); 148-150-152-156-158-160 (예컨대, H2M8323N); 292-294-296-276-278-280 (예컨대, H1H9351P2); 및 332-334-336-276-278-280 (예컨대, H1H9387P2)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 표 1에 열거된 예시적인 항-PD-L1 항체들 중 임의의 것에 의해 정의된 HCVR/LCVR 아미노산 서열쌍 내에 함유된 6개의 CDR 세트 (즉, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 결합 단백질은 SEQ ID NO: 82/90 (예컨대, H2M8314N), 98/106 (예컨대, H2M8316N), 146/154 (예컨대, H2M8323N), 162/170 (예컨대, H2M8718N), 290/274 (예컨대, H1H9351P2), 306/274 (예컨대, H1H9364P2), 314/274 (예컨대, H1H9373P2) 및 330/274 (예컨대, H1H9387P2)로 이루어지는 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열쌍 내에 함유된 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내에서 CDR을 확인하기 위한 방법 및 기법들은 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 개시된 명시된 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내에서 CDR을 확인하기 위해 사용될 수 있다. CDR의 경계를 확인하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 관례로는, 예컨대 Kabat 정의, Chothia 정의, 및 AbM 정의를 들 수 있다. 일반적인 관점에서, Kabat 정의는 서열 가변성을 기반으로 하고, Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 하며, AbM 정의는 Kabat 및 Chothia 접근법 사이의 절충이다. 예컨대, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); 및 Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989) 참조. 공개된 데이터베이스 또한 항체 내에서 CDR 서열을 확인하기 위해 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 PD-L1에 대한 특이적 결합에 대해 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 경합하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편이며, 이때 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열들로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1 결합을 차단하는 분리된 항체 및 그것의 항원-결합 단편이다. 일부 구체예에서, PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1 결합을 차단하는 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 PD-1/B7-1과 동일한 PD-L1 상의 에피토프에 결합하거나 PD-1/B7-1과 상이한 PD-L1 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1 결합을 차단하는 개시의 항체는 표 1에 열거된 HCVR 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 HCVR의 CDR; 및 표 1에 열거된 LCVR 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 LCVR의 CDR을 포함한다.
대체 구체에에서, 본 개시는 PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1 결합을 차단하지 않는 항체 및 그것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 개시는 PD-L1에 결합하는 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제공하는데, 여기서 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1 결합을 향상시킨다. 일부 구체예에서, PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1 결합을 향상시키는 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 HCVR의 CDR, 이때 HCVR은 SEQ ID NO: 18, 66, 114, 130, 202, 218, 266, 282, 298, 322 및 338로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며; 및 LCVR의 CDR을 포함하며, 이때 LCVR은 SEQ ID NO: 26, 74, 122, 138, 210, 226, 및 274로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 분리된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 18/26 (예컨대, H2M8307N), 66/74 (예컨대, H2M8312N), 114/122 (예컨대, H2M8317N), 130/138 (예컨대, H2M8321N), 202/210 (예컨대, H1H9323P), 218/226 (예컨대, H1H9327P), 266/274 (예컨대, H1H9344P2), 282/274 (예컨대, H1H9345P2), 298/274 (예컨대, H1H9354P2), 322/274 (예컨대, H1H9382P2), 및 338/274 (예컨대, H1H9396P2)로 이루어지는 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열쌍을 포함한다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 인간 또는 다른 종으로부터의 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편이다. 특정 구체예에서, 항체는 인간 PD-L1에 및/또는 시노몰구스 PD-L1에 결합할 수 있다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 HCVR의 CDR 및 LCVR의 CDR을 포함하는 참조 항체 또는 그것의 항원-결합 단편과 PD-L1에 대한 결합에 대해 교차-경합하는 항체 및 그것의 항원-결합 단편이며, 여기서 HCVR 및 LCVR은 각각 표 1에 열거된 HCVR 및 LCVR 서열들로부터 선택된다.
한 구체예에서, 결합 단백질은 다음 특징들 중 하나 이상을 가진 분리된 항체 또는 항원-결합 단편이다: (a) PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1 결합을 차단하고; (b) 인간 PD-L1 및/또는 시노몰구스 PD-L1에 특이적으로 결합하며; (c) 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정에서 T-세포 증식을 억제하고; 및 (d) MLR 검정에서 IL-2 및/또는 인터페론-감마 분비를 증가시킨다.
일부 구체예에서, 결합 단백질은 작용성 방식으로 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있고, 즉, 그것은 PD-L1 결합 및/또는 활성을 향상 또는 자극하며; 다른 구체예에서, 항체는 길항성 방식으로 PD-L1에 특이적으로 결합할 수 있는, 즉, 그것의 수용체에 대한 결합으로부터 PD-L1을 차단하는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이다.
특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 PD-L1에 대한 제 1 결합 특이성 및 제 2 표적 에피토프에 대한 제 2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적이다. 제 2 표적 에피토프는 PD-L1 상의 또는 상이한 단백질, 예컨대 T-세포 보조 억제제 상의 또다른 에피토프일 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 에피토프는 예컨대 상이한 T-세포, B-세포, 종양 세포, 자가면역 조직 세포 또는 바이러스로 감염된 세포를 포함한 상이한 세포 상에 있을 수 있다.
일부 구체예에서, 항체 및 항체의 항원-결합 단편은, 예컨대, 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 318 pM 미만의 KD로 모노머 PD-L1에 결합한다 (예컨대, 25℃ 또는 37℃에서). 특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대, 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 300 pM 미만, 약 250 pM 미만, 약 150 pM 미만, 약 100 pM 미만, 또는 약 50 pM 미만의 KD로 모노머 PD-L1에 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 및 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대, 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 15 pM 미만의 KD로 다이머 PD-L1에 결합한다 (예컨대, 25℃ 또는 37℃에서). 특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대, 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 12 pM 미만, 약 10 pM 미만, 약 8 pM 미만, 또는 약 5 pM 미만의 KD로 모노머 PD-L1에 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 및 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대, 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 28 nM 미만의 KD로 시노몰구스 (Macaca fascicularis) PD-L1에 결합한다 (예컨대, 25℃ 또는 37℃에서). 특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대, 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정되는 바 약 25 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 또는 약 5 nM 미만의 KD로 시노몰구스 PD-L1에 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 및 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 25℃ 또는 37℃에서 측정되는 바 약 1분 이상의 해리성 반감기 (t½)로 PD-L1에 결합한다. 특정 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은, 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷 (예컨대, mAb-포획 또는 항원-포획 포맷), 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 25℃ 또는 37℃에서 측정되는 바 약 5분 이상, 약 10분 이상, 약 30분 이상, 약 50분 이상, 약 60분 이상, 약 70분 이상, 약 80분 이상, 약 90분 이상, 약 100분 이상, 약 200분 이상, 약 300분 이상, 약 400분 이상, 약 500분 이상, 약 600분 이상, 약 700분 이상, 또는 약 800분 이상의 t½로 PD-L1에 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 4에서 나타낸 ELISA-기반 면역검정, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 측정되는 바 약 770 pM 미만의 IC50으로 PD-1에 대한 PD-L1 결합을 차단한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 예컨대 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 4에서 나타낸 ELISA-기반 면역검정, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 측정되는 바 약 10 nM 미만의 IC50으로 B7-1에 대한 PD-L1 결합을 차단한다. 일부 구체예에서, 항체 및 그것의 항원-결합 단편은 PD-L1에 결합하고 PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1의 결합을 향상시킨다.
일부 구체예에서, 항체는 PD-L1의 세포외 도메인에 또는 도메인의 단편에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 하나 이상의 도메인에 결합한다 (교차 반응성 항체). 특정 구체예에서, 항체는 NP_054862.1의 아미노산 잔기 19 - 239를 포함하는 세포외 도메인에 위치한 에피토프에 결합한다.
특정 구체예에서, 항체는 전장 단백질의 임의의 다른 영역 또는 단편에 대한 결합에 의해 PD-L1과 관련된 PD-1-결합 또는 B7-1-결합 활성을 차단 또는 억제함으로써 기능한다. 특정 구체예에서, 항체는 PD-L1과 PD-1/B7-1 사이의 상호작용을 약화시키거나 조절한다.
특정 구체예에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 한 도메인의 한 에피토프에 결합할 수 있고 또한 PD-L1의 상이한 도메인의 제 2 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 이중특이적 항체는 동일한 도메인의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 한 구체예에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 제 1 항원-결합 특이성, 이때 제 1 항원-결합 특이성은 PD-1의 세포외 도메인 또는 그것의 단편을 포함하며; 및 PD-L1의 또 다른 에피토프에 대한 제 2 항원-결합 특이성을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 제 1 항원-결합 특이성, 이때 제 1 항원-결합 특이성은 B7-1의 세포외 도메인 또는 그것의 단편을 포함하며; 및 PD-L1의 또 다른 에피토프에 대한 제 2 항원-결합 특이성을 포함한다.
한 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 PD-L1에 결합하는 전체 인간 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이며, 이때 항체 또는 그것의 단편은 다음 특징들 중 하나 이상을 나타낸다: (i) SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 186, 202, 218, 234, 250, 258, 266, 274, 282, 290, 298, 306, 314, 322, 330 및 338로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 HCVR을 포함하거나; (ii) SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 194, 210, 226, 242, 258, 및 274로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 LCVR을 포함하거나; (iii) SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 280, 288, 296, 304, 312, 320, 328, 336 및 344로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 HCDR3 도메인; 및 SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 200, 216, 232, 248, 264, 및 280으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 LCDR3 도메인을 포함하거나; (iv) SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 292, 300, 308, 316, 324, 332, 및 340으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 HCDR1 도메인; SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 294, 302, 310, 318, 326, 334, 및 342로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 HCDR2 도메인; SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 196, 212, 228, 244, 260, 및 276으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 LCDR1 도메인; 및 SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 198, 214, 230, 246, 262, 및 278로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 LCDR2 도메인을 포함하거나; (v) PD-L1에 대한 제 1 결합 특이성 및 PD-L1, 종양 특이적 항원, 바이러스로 감염된 세포 항원, 및 T-세포 보조 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택된 항원에 대한 제 2 결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자이거나; (vi) 인간 PD-L1에 약 4 pM 내지 약 645 nM의 KD로 결합하거나; (vii) 시노몰구스 PD-L1에 약 70 pM 내지 약 400 nM의 KD로 결합하거나; (viii) PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 IC50 = 770 pM로 차단 또는 향상시키거나; (ix) B7-1에 대한 PD-L1의 결합을 IC50 ≤= 10 nM로 차단 또는 향상시키거나; (x) T-세포/APC 루시페라제 리포터 검정에서 PD-1-유도된 T-세포 하향 조절을 차단하거나 및/또는 T-세포 신호전달을 구제하거나; (xi) 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정에서 T-세포 증식 및 활성을 자극하거나; (xii) MLR 검정에서 IL-2 및/또는 IFNγ 생성을 유도하거나; 및 (xiii) 암에 걸린 대상체에서 종양 성장을 억합하고 생존율을 증가시킨다.
한 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1 결합을 차단하는 전체 인간 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이며, 이때 항체 또는 그것의 단편은 다음 특징들 중 하나 이상을 나타낸다: (i) SEQ ID NO: 82, 98, 146, 162, 290, 306, 314, 및 330으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 HCVR을 포함하거나; (ii) SEQ ID NO: 90, 106, 154, 170, 및 274로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 LCVR을 포함하거나; (iii) SEQ ID NO: 88, 104, 152, 168, 296, 312, 320, 및 336으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 HCDR3 도메인; 및 SEQ ID NO: 96, 112, 160, 176, 및 280으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 LCDR3 도메인을 포함하거나; (iv) SEQ ID NO: 84, 100, 148, 164, 292, 308, 316, 및 332로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 HCDR1 도메인; SEQ ID NO: 86, 102, 150, 166, 294, 310, 318, 및 334로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 HCDR2 도메인; SEQ ID NO: 92, 108, 156, 172, 및 276으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 LCDR1 도메인; 및 SEQ ID NO: 94, 110, 158, 174, 및 278로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지는 그것의 실질적으로 유사한 서열을 가지는 LCDR2 도메인을 포함하거나; (v) PD-L1에 대한 제 1 결합 특이성 및 PD-L1의 상이한 에피토프, 종양 특이적 항원, 바이러스-감염 세포 항원, 및 T-세포 보조 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택된 항원에 대한 제 2 결합 특이성을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 분자이거나; (vi) 인간 PD-L1에 KD = 10-10 M로 결합하거나; (vii) 시노몰구스 PD-L1에 KD = 10-7 M로 결합하거나; (viii) PD-1 또는 B7-1에 대한 결합을 차단하거나; (ix) T-세포/APC 루시페라제 리포터 검정에서 PD-1-유도된 T-세포 하향 조절을 차단하거나 및/또는 T-세포 신호전달을 구제하거나; (xi) 혼합 림프구 반응 (MLR) 검정에서 T-세포 증식 및 활성을 자극하거나; (xii) MLR 검정에서 IL-2 및/또는 IFNγ 생성을 유도하거나; 및 (xiii) 암에 걸린 대상체에서 종양 성장을 억합하고 생존율을 증가시킨다.
특정 구체예에서, 항-PD-L1 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은, 천연 형태의 또는 재조합으로 제조된, PD-L1에 예시화된 영역들의 임의의 하나 이상의 영역 내의 에피토프, 또는 그것의 단편에 결합한다. 일부 구체예에서, 개시의 항체는 PD-L1의 아미노산 잔기 19 내지 239로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 세포외 영역에 결합한다. 일부 구체예에서, 개시의 항체는 시노몰구스 PD-L1의 아미노산 잔기 1 내지 221로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 영역에 결합한다.
특정 구체예에서, 개시의 항체는, 표 1에서 나타낸 것과 같이, PD-L1의 약 위치 19 내지 약 위치 130의 범위의 아미노산 잔기; 또는 PD-L1의 약 위치 130 내지 약 위치 153의 범위의 아미노산 잔기; 또는 PD-L1의 약 위치 153 내지 약 위치 210의 범위의 아미노산 잔기; 또는 PD-L1의 약 위치 210 내지 약 위치 239의 범위의 아미노산 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나으 아미노산 서열과 상호작용한다.
일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 표 1에서 본원에서 기술된 특정 예시 항체들 중 임의의 것, 또는 표 1에 기술된 예시적인 항체들 중 임의의 항체의 CDR 서열을 가지는 항체로서, 동일한 에피토프, 또는 에피토프의 부분에 결합한다. 마찬가지로, 적합한 항체는 또한 PD-L1 또는 PD-L1 단편에 대한 결합에 대해 표 1에서 본원에 기술된 특정 예시 항체들 중 임의의 항체, 또는 표 1에 기술된 예시적인 항체들 중 임의의 항체의 CDR 서열을 가지는 항체와 경합하는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 예를 들어, 적합한 항체는 본원의 실시예 6에서 정의된 하나 이상의 항체 (예컨대, H2aM8309N, H1H9329P, H1H9336P, H2aM8314N, H2aM8316N, H2AM8718N, H1H9387P2, H1H9351P2, H1H9364P2, H1H9373P2, 및 H2aM8306N)와 PD-L1에 대한 결합에 대해 교차 경합하는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 본 개시는 또한 PD-L1에 대한 결합에 대해 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 6에서 규정된 하나 이상의 항체 (예컨대, H1H9396P2, H2aM8317N, H2aM8321N, H1H9323P, H1H9382P2, H1H9344P2, H1H9345P2 및 H1H9354P2)와 교차 경합하는 항-PD-L1 항체를 포함한다.
본원에 기술된 항체 및 항원-결합 단편은 PD-L1에 특이적으로 결합하고 PD-L1의 PD-1 또는 B7-1과의 상호작용을 조절한다. 항-PD-L1 항체는 고친화도 또는 저친화도로 PD-L1에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는, 항체가 PD-L1에 결합하여 PD-L1의 PD-1과 또는 B7-1과의 상호작용을 차단하는 차단 항체이다. 일부 구체예에서, 개시의 차단 항체는 PD-L1의 PD-1 또는 B7-1에 대한 결합을 차단하고 및/또는 T-세포 활성화를 자극하거나 향상시킨다. 일부 구체예에서, 차단 항체는 면역 반응을 자극하거나 향상시키는 데에 및/또는 암, 또는 만성 바이러스 감염에 걸린 대상체를 치료하는데에 유용하다. 항체는 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 대상체에서 HIV, LCMV 또는 HBV와 같은 바이러스에 의한 만성 감염을 감소시킬 수 있다. 그것들은 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 그것들은 단독으로 또는 암, 또는 바이러스 감염을 치료하기 위해 업계에 알려져 있는 다른 치료 모이어티 또는 모달리티와의 부가 치료법으로서 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 저친화도로 PD-L1에 결합하는 항-PD-L1 항체는 제 1 결합 특이성이 저친화도로 PD-L1에 결합하고 제 2 결합 특이성이 PD-L1의 상이한 에피토프, T-세포 보조 억제제, 예컨대 PD-1, 종양 특이적 항원 및 감염된 세포-특이적 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택된 항원에 결합하는 다중-특이적 항원-결합 분자로서 사용된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 항체는 작용물질 항체이며, 이때 항체는 PD-L1에 결합하여 PD-L1과 PD-1/B7-1의 상호작용을 향상시킨다. 일부 구체예에서, 활성화 항체는 PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1의 결합을 향상시키고 및/또는 T-세포 활성화를 억제 또는 억압한다. 본 개시의 활성화 항체는 대상체에서 면역 반응을 억제하는데 및/또는 자가면역 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다.
특정 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 다중-특이적 항원-결합 분자이고, 이때 그것들은 PD-L1에 대한 제 1 결합 특이성 및 PD-L1의 상이한 에피토프, T-세포 보조 억제제, 예컨대 PD-1, 종양 특이적 항원 및 감염된 세포-특이적 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택된 항원에 대한 제 2 결합 특이성을 포함한다. 특정 구체예에서, 제 1 결합 특이성은 PD-L1에 저친화도로, 예컨대 10-8 M, 10-7 M 또는 그 이상의 KD로 결합한다.
본 개시의 특정 항-PD-L1 항체는 시험관내 또는 생체내 검정에 의해 측정되는 바, PD-L1에 결합하여 그것의 활성을 중화할 수 있다. 개시의 항체가 PD-L1에 결합하여 그것의 활성을 중화하는 능력은 본원에 기술된 것과 같이, 결합 검정, 또는 활성 검정을 포함하여, 당업자들에게 알려져 있는 임의의 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
결합 활성을 측정하기 위한 비제한적인, 예시적인 시험관내 검정은 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 3에서 예시된다. 실시예 3에서, 인간 PD-L1 및 시노몰구스 PD-L1에 대한 인간 항-PD-L1 항체의 결합 친화도 및 동역학 상수가 플라즈몬 공명에 의해 측정되었고 측정은 T200 Biacore 기기 상에서 수행되었다. 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 4 및 5에서, 차단 검정이 시험관내에서 항-PD-L1 항체가 PD-1 또는 B7-1에 대한 PD-L1-결합 능력을 차단하는 능력을 측정하기 위해 사용되었다. 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 6에서, 차단 검정이 상이한 항-PD-L1 항체들 사이의 교차-경합을 측정하기 위해 사용되었다. 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1의 실시예 7은 PD-L1을 과다발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 기술한다. US 2015-0203580 A1의 실시예 8에서, 루시페라제 검정이 항-PD-L1 항체가 T-세포에서 PD-1/PD-L1 신호전달을 길항하는 능력을 측정하기 위해 사용되었다.
구체적으로 다르게 표시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄 (즉, "전체 항체 분자")와 뿐만 아니라 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 인지되어야 한다. 본원에서 사용되는 용어, 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편", 등은 복합체를 형성하기 위해 항원에 특이적으로 결합하는, 임의의 자연적으로 발생하는, 효소적으로 얻어질 수 있는, 합성의, 또는 유전자적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어, 항체의 "항원-결합 단편", "항체 단편"은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 항체 단편은 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, dAb 단편, CDR을 함유한 단편, 또는 분리된 CDR을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 용어 "항원-결합 단편"은 다중-특이적 항원-결합 분자의 폴리펩타이드 또는 그것의 단편을 나타낸다. 그러한 구체예에서, 용어 "항원-결합 단편"은, 예컨대 PD-L1에 특이적으로 결합하는 PD-L1의 세포외 도메인을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예컨대 전체 항체 분자로부터, 단백질 가수분해성 소화 또는 항체 가변 및 (선택적으로) 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함한 재조합 유전자 조작 기법과 같은 임의의 적합한 표준 기법을 사용하여 유래될 수 있다. 그러한 DNA는, 예컨대 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예컨대 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 쉽게 입수할 수 있거나, 또는 합성될 수 있다. DNA는 서열분석될 수 있고 화학적으로 또는, 예를 들어, 적합한 구성으로 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 배열하거나, 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성시키거나, 아미노산을 변형, 부가 또는 결실시키는 등을 수행하기 위한 분자 생물학 기법을 사용함으로써 조작될 수 있다.
항원-결합 단편의 비제한적인 실례로는, (i) (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일-사슬 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체 (예컨대, CDR3 펩타이드와 같은 분리된 상보성 결정 영역 (CDR))의 초가변 영역, 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 모방하는 아미노산 잔기들로 이루어지는 최소 인식 단위를 포함한다. 다른 조작된 분자, 예컨대 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메릭 항체, CDR-그래프팅된 항체, 디아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디 (예컨대, 일가 나노바디, 이가 나노바디, 등), 작은 모듈 면역제약 (SMIP), 및 샤크 가변 IgNAR 도메인은 또한 본원에서 사용되는 표현 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성의 것일 수 있고 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 프레임으로 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 관련된 VH 도메인을 가진 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 서로에 대해 배치될 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 다이머일 수 있고 VH - VH, VH - VL 또는 VL - VL 다이머를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 모노머 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
특정 구체예에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 개시의 항체의 항원-결합 단편 내에서 찾아볼 수 있는 가변 및 불변 도메인의 예시적인 구성으로는 다음을 들 수 있다: (i) VH -CH1; (ii) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH -CH1-CH2; (v) VH -CH1-CH2-CH3; (vi) VH -CH2-CH3; (vii) VH -CL; (viii) VL -CH1; (ix) VL -CH2; (x) VL -CH3; (xi) VL -CH1-CH2; (xii) VL -CH1-CH2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3; 및 (xiv) VL -CL. 상기 열거된 예시적인 구성들 중 임의의 것을 포함한 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 가변 및 불변 도메인은 서로에 대해 직접적으로 결합되거나 또는 전체 또는 부분적인 힌지 또는 링커 영역에 의해 결합될 수 있다. 힌지 영역은 적어도 2개 (예컨대, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 또는 그 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있고, 그것은 단일한 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 가요성 또는 반가요성 결합을 초래할 수 있다. 더욱이, 본 개시의 항체의 항원-결합 단편은 서로와 및/또는 하나 이상의 모노머 VH 또는 VL 도메인과 비공유 회합으로 (예컨대, 이황화 결합(들)에 의해) 상기 열거된 가변 및 불변 도메인 구성들 중 임의의 단일-다이머 또는 헤테로-다이머 (또는 다른 멀티머)를 포함할 수 있다.
전체 항체 분자와 같이, 항원-결합 단편은 단일-특이적 또는 다중-특이적 (예컨대, 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중-특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이고, 이때 각 가변 도메인은 별도의 항원 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시적인 이중특이적 항체 포맷을 포함한 임의의 다중-특이적 항체 포맷이 업계에서 활용 가능한 기본적인 기법들을 사용하여 본 개시의 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서 사용되기 위해 조정될 수 있다.
본 개시의 항-PD-L1 항체 및 항체 단편은 기술된 항체들의 아미노산 서열과는 다른 아미노산들을 갖지만, PD-L1에 결합하는 능력을 보유한 단백질들을 포함한다. 그러한 변종 항체 및 항체 단편은 부모 서열과 비교할 때 하나 이상의 첨가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 기술된 항체의 것과 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본 개시의 항체-암호화 DNA 서열은 개시된 서열과 비교할 때 뉴클레오타이드의 하나 이상의 첨가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 개시의 항체 또는 항체 단편에 본질적으로 생물학적으로 동등한 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열들을 포함한다.
2개의 항원-결합 단백질, 또는 항체는, 예를 들어, 그것들이 유사한 실험 조건 하에서, 단일 용량 또는 다중 용량으로 동일한 몰 용량에서 투여되었을 때 그것들의 흡수 속도 및 정도가 유의한 차이를 보이지 않는 제약학적 동등물 또는 제약학적 대체물이라면 생물학적으로 동등한 것으로 간주될 수 있다. 일부 항체는 그것들이 흡수 정도에서는 동등하지만 흡수 속도에서는 그렇지 않다면 동등물 또는 제약학적 대체물인 것으로 여겨질 수 있고, 흡수 속도에서의 그러한 차이가 의도적이고 표지화를 반영하며, 예컨대 만성 사용시 효과적인 체내 약물 농도의 획득에 본질적이지 않고, 연구된 특정 약물 제품에 대해 의학적으로 무의미한 것으로 여겨지기 때문에 또한 생물학적으로 동등한 것이라고 여겨질 수 있다.
한 구체예에서, 2개의 항원-결합 단백질은, 만약 그것들의 안전성, 순도, 또는 효능에서 임상적으로 의미있는 차이가 없다면 생물학적으로 동등하다.
한 구체예에서, 2개의 항원-결합 단백질은, 만약 환자가 참조 생성물과 생물학적 생성물 사이에서, 스위칭 없이 계속된 치료법과 비교하여, 면역원성의 임상적으로 유의한 변화, 또는 감소된 유효성을 포함한 예상된 증가 없이 한 번 이상 스위치될 수 있다면 생물학적으로 동등하다.
한 구체예에서, 2개의 항원-결합 단백질은, 만약 그것들이 사용 조건 또는 조건들에 대한 통상적인 메커니즘 또는 작용 메커니즘들에 의해 그러한 메커니즘이 알려지는 정도로 둘 다 작용한다면, 생물학적으로 동등하다.
생물학적 동등성은 시험관내 및/또는 생체내 방법에 의해 증명될 수 있다. 생물학적 동등성 척도는, 예컨대 (a) 항체 또는 그것의 대사산물의 농도가 혈액, 혈장, 혈청, 또는 다른 생물학적 유체에서 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유류에서의 생체내 테스트; (b) 인간 생체내 생체이용률 데이터와 상관이 있고 타당하게 그것을 예측하는 시험관내 테스트; (c) 항체 (또는 그것의 표적)의 적절한 약물학적 효과가 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유류에서의 생체내 테스트; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용륭 또는 생물학적 동등성을 확립하는 잘-제어된 임상 실험을 포함한다.
개시의 항체의 생물학적으로 동등한 변종들은, 예를 들어, 생물학적 활성에 필요하지 않은 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 만들거나 또는 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 구성될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 대해 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 결실되거나 다른 아미노산들로 교체되어 재생시에 불필요한 또는 부정확한 분자내 이황화 가교의 형성이 방지될 수 있다. 다른 맥락으로, 생물학적으로 동등한 항체는 항체의 글리코실화 특징을 변형시키는 아미노산 변화를 포함하는 항체 변종, 예컨대 글리코실화를 없애거나 제거하는 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 개시의 특정 구체예에 따르면, 항-PD-L1 항체는, 예컨대 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서, FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 향상시키거나 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 예를 들어, 본 개시는 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에 돌연변이를 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하는데, 이때 돌연변이(들)은 산성 환경에서 (예컨대 pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 그러한 돌연변이들은 동물에게 투여되었을 때 혈청 반감기의 증가를 초래할 수 있다. 그러한 Fc 변형의 비제한적인 실례로는, 예컨대, 위치 250 (예컨대, E 또는 Q)에서의 변형; 250 및 428 (예컨대, L 또는 F)에서의 변형; 252 (예컨대, L/Y/F/W 또는 T), 254 (예컨대, S 또는 T)에서의 변형, 및 256 (예컨대, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433 (예컨대, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (예컨대, A, W, H, F 또는 Y [N434A, N434W, N434H, N434F 또는 N434Y])에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308 (예컨대, 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 변형은 428L (예컨대, M428L) 및 434S (예컨대, N434S) 변형; 428L, 259I (예컨대, V259I), 및 308F (예컨대, V308F) 변형; 433K (예컨대, H433K) 및 434 (예컨대, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (예컨대, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (예컨대, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형 (예컨대, 308F 또는 308P)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 변형은 265A (예컨대, D265A) 및/또는 297A (예컨대, N297A) 변형을 포함한다.
예를 들어, 본 개시는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된 돌연변이들의 하나 이상의 쌍 또는 그룹을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함한다: 250Q 및 248L (예컨대, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E (예컨대, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S (예컨대, M428L 및 N434S); 257I 및 311I (예컨대, P257I 및 Q311I); 257I 및 434H (예컨대, P257I 및 N434H); 376V 및 434H (예컨대, D376V 및 N434H); 307A, 380A 및 434A (예컨대, T307A, E380A 및 N434A); 및 433K 및 434F (예컨대, H433K 및 N434F). 한 구체예에서, 본 개시는 다이머 안정화를 촉진하기 위하여 IgG4의 힌지 영역에 S108P 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인 을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 전술한 Fc 도메인 돌연변이들, 및 본원에 개시된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이들의 모든 가능한 조합이 본 개시의 범주 내에 포함된다.
본 개시는 또한 키메릭 중쇄 불변 (CH) 영역을 포함하는 항-PD-L1 항체를 포함하며, 이때 키메릭 CH 영역은 하나 이상의 면역글로불린 아이소타입의 CH 영역들로부터 유래된 분절들을 포함한다. 예를 들어, 개시의 항체는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래된 CH3 도메인의 부분 또는 전부와 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래된 CH2 도메인의 부분 또는 전부를 포함하는 키메릭 CH 영역을 포함할 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 개시의 항체는 키메릭 힌지 영역을 가지는 키메릭 CH 영역을 포함한다. 예를 들어, 키메릭 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "하부 힌지" 서열 (EU 넘버링에 따르면 위치 228 내지 236의 아미노산 잔기)과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래된 "상부 힌지" 아미노산 서열 (EU 넘버링에 따르면 위치 216내지 227의 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 키메릭 힌지 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 상부 힌지로부터 유래된 아미노산 잔기 및 인간 IgG2 하부 힌지로부터 유래된 아미노산 산지를 포함한다. 본원에 기술된 키메릭 CH 영역을 포함하는 항체는, 특정 구체예에서, 항체의 치료적 또는 약물동역학적 특성에 불리하게 영향을 미치지 않으면서 변형된 Fc 이펙터 기능들을 나타낼 수 있다 (예컨대, 2014년 1월 31일에 출원된 USSN. 14/170,166 참조 (출원의 내용은 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)).
B. 양전자 방출체 및 킬레이트화 모이어티
적합한 양전자 방출체는, 한정하는 것은 아니지만, 킬레이트화 모이어티와 안정적인 복합체를 형성하고 면역-PET 영상화 목적에 적합한 물리전 반감기를 가지는 것들을 포함한다. 예시적인 양전자 방출체로는, 한정하는 것은 아니지만, 89Zr, 68Ga, 64Cu, 44Sc, 및 86Y를 들 수 있다. 적합한 양전자 방출체로는, 한정하는 것은 아니지만, 76Br 및 124I를 포함한, PD-L1 결합 단백질과 직접 결합하는 것들, 및 보결 분자단을 통해 도입되는 것들, 예컨대, 18F를 들 수 있다.
본원에 기술된 킬레이트화 모이어티는 PD-L1 결합 단백질, 예컨대, 항-PD-L1 항체에 공유적으로 결합되고 양전자 방출체를 킬레이트화할 수 있는, 즉 배위 킬레이트 복합체를 형성하기 위해 양전자 방출체와 반응할 수 있는 부분을 포함하는 화학적 모이어티이다. 적합한 모이어티는 특별한 금속의 효율적인 로딩을 허용하고 진단 용도, 예컨대, 면역-PET 영상화에 대해 생체내에서 충분히 안정적인 것들을 포함한다. 예시적인 킬레이트화 모이어티는 양전자 방출체의 해리, 및 진단 용도에 적합한 정도로 침착하는 미네랄 뼈, 혈장 단백질 및/또는 골수에서의 축적을 최소화하는 것들을 포함한다.
킬레이트화 모이어티의 실례로는, 한정하는 것은 아니지만, 양전자 방출체 89Zr, 68Ga, 64Cu, 44Sc, 및/또는 86Y와 안정적인 복합체를 형성하는 것들을 포함한다. 예시적인 킬레이트화 모이어티로는, 한정하는 것은 아니지만, Nature Protocols, 5(4): 739, 2010; Bioconjugate Chem., 26(12): 2579 (2015); Chem Commun (Camb), 51(12): 2301 (2015); Mol. Pharmaceutics, 12: 2142 (2015); Mol. Imaging Biol., 18: 344 (2015); Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 37:250 (2010); Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2016). doi:10.1007/s00259-016-3499-x; Bioconjugate Chem., 26(12): 2579 (2015); WO 2015/140212A1; 및 US 5,639,879 (이것들의 전문이 참조로 포함됨)에 기술된 것들을 들 수 있다.
예시적인 킬레이트화 모이어티로는 또한, 한정하는 것은 아니지만, 데스페리옥사민(데스페리옥사민, DFO), 1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA), 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산 (DTPA), 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), (1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라(메틸렌 포스폰)산 (DOTP), 1R, 4R, 7R, 10R)-□'□''□'''-테트라메틸-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTMA), 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8, 11-테트라아세트산 (TETA), H4octapa, H6phospa, H2dedpa, H5decapa, H2azapa, HOPO, DO2A, 1,4,7,10-테트라키스(카바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸 (DOTAM), 1,4,7-트라이아자사이클로노난-N,N',N''-트라이아세트산 (NOTA), 1,4,7,10-테트라키스(카바모일메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸 (DOTAM), 1,4,8,11-테트라아자비사이클로[6.6.2]헥사데칸-4, 11-다이아세트산 (CB-TE2A), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸 (Cyclen), 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸 (Cyclam), 옥타덴테이트 킬레이터, 헥사덴테이트 킬레이터, 포스포네이트-기반 킬레이터, 거대로기 킬레이터, 거대고리 테레프탈아미드 리간드를 포함한 킬레이터, 이중기능성 킬레이터, 푸사리닌 C 및 푸사리닌 C 유동체 킬레이터, 트라이아세틸푸사리닌 C (TAFC), 페리옥사민 E (FOXE), 페리옥사민 B (FOXB), 페리크롬 A (FCHA), 등을 포함하는 것들을 들 수 있다.
일부 구체예에서, 킬레이트화 모이어티는 PD-L1 결합 단백질, 예컨대, 항체 또는 그것의 항원 결합 단편에, 킬레이트화 모이어티의 킬레이트화 부분을 결합 단백질에 공유 부착시키는 링커 부분을 통해 공유 결합된다. 일부 구체예에서, 이런 링커 모이어티들은 PD-L1 결합 단백질의 반응성 모이어티, 예컨대 항체의 시스테인 또는 리신과, 예를 들어, p-아이소티오시아나토베닐기 및 하기 콘쥬게이션 방법에서 제공되는 반응성 모이어티를 포함한, 킬레이터에 부착되는 반응성 모이어티 사이의 반응으로부터 형성된다. 더불어, 그러한 링커 모이어티는 킬레이트화 부분과 PD-L1 결합 단백질 사이의 극성, 용해도, 입체적 상호작용, 견고성, 및/또는 길이를 조정할 목적으로 사용된 화학적 기들을 선택적으로 포함한다.
C. 방사성 표지된 항-PD-L1 콘쥬게이트의 제조
방사성 표지된 항-PD-L1 단백질 콘쥬게이트는 (1) PD-L1 결합 단백질, 예컨대, 항체를 양전자 방출체 킬레이터 및 PD-L1 결합 단백질의 바람직한 콘쥬게이션 부위에 반응성인 모이어티를 포함하는 분자와 반응시키고 (2) 바람직한 양전자 방출체를 로딩함으로써 제조될 수 있다.
적합한 콘쥬게이션 부위로는, 한정하는 것은 아니지만, 리신 및 시스테인을 들 수 있고, 둘 다, 예를 들어, 천연이거나 조작될 수 있으며, 예를 들어, 항체의 중쇄 또는 경쇄 상에 존재할 수 있다. 시스테인 콘쥬게이션 부위는, 한정하는 것은 아니지만, 돌연변이, 삽입, 또는 항체 이황화 결합의 환원으로부터 얻어진 것들을 포함한다. 시스테인 조작된 항체의 제조 방법은, 한정하는 것은 아니지만, WO2011/056983에 개시된 것들을 포함한다. 부위-특이적 콘쥬게이션 방법이 또한 항체의 특이적 부위로의 콘쥬게이션 반응을 지정하고, 바람직한 화학양론을 달성하며, 및/또는 바람직한 약물-대-항체 (DAR) 비율을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 콘쥬게이션 방법은 당업자들에게 알려져 있고, 한정하는 것은 아니지만, 시스테인 조작 및 효소적 및 화학-효소적 방법, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 글루타민 콘쥬게이션, Q295 콘쥬게이션, 및 트랜스글루타미나제-매개 콘쥬게이션, 뿐만 아니라 J. Clin.Immunol., 36: 100 (2016) (전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것들을 포함한다. 바람직한 콘쥬게이션 부위에 반응성인 적합한 모이어티는 일반적으로 PD-L1 결합 단백질, 예컨대, 항체 및 양전자 방출체 킬레이터의 효율적이고 용이한 결합을 가능하게 한다. 리신 및 시스테인 부위들에 반응성인 모이어티는 당업자들에게 알려져 있는 친전자성 기들을 포함한다. 특정 측면으로, 원하는 콘쥬게이션 부위가 리신일 때, 반응성 모이어티는 아이소티오시아네이트, 예컨대 p-아이소티오시아나토베닐기 또는 반응성 에스테르이다. 특정 측면으로, 원하는 콘쥬게이션 부위가 시스테인일 때, 반응성 모이어티는 말레이미드이다.
킬레이터가 데스페리옥사민 (DFO)일 때, 적합한 반응성 모이어티로는, 한정하는 것은 아니지만, 아이소티오시아나토벤질기, n-하이드록시석신이미드 에스테르, 2,3,5,6 테트라플루오로페놀 에스테르, n-석신이미딜-S-아세틸티오아세테이트, 및 BioMed Research International, Vol 2014, Article ID 203601 (전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것들을 들 수 있다. 특정 구체예에서, PD-L1 결합 단백질은 항체이고 양전자 방출체 킬레이터 및 콘쥬게이션 부위에 반응성인 모이어티를 포함하는 분자는 p-아이소티오시아나토벤질-데스페리옥사민 (p-SCN-Bn-DFO)이다:
Figure pct00001
.
양전자 방출체 로딩은, 예컨대 본원에 제공된 실시예에서 기술되는 방법들 또는 실질적으로 유사한 방법을 수행함으로써, PD-L1 결합 단백질 킬레이터 콘쥬게이트를 양전자 방출체와, 상기 양전자 방출체의 킬레이터에의 배위결합을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션함으로써 이루어진다.
D. 콘쥬게이트의 예시적인 구체예
본 개시에는 인간 프로그램된 사멸 리간드 1 (PD-L1), 킬레이트화 모이어티, 및 양전자 방출체에 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 포함하는 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트가 포함된다.
일부 구체예에서, 킬레이트화 모이어티는 89Zr과 착체를 형성할 수 있는 킬레이터를 포함한다. 특정 구체예에서, 킬레이트화 모이어티는 데스페리옥사민을 포함한다. 특정 구체예에서, 킬레이트화 모이어티는 p-아이소티오시아나토벤질-데스페리옥사민이다.
일부 구체예에서, 양전자 방출체는 89Zr이다.
일부 구체예에서, 콘쥬게이트의 킬레이트화 모이어티-대-항체 비율은 1 내지 2이다.
특정 구체예에서, 킬레이트화 모이어티는 p-아이소티오시아나토벤질-데스페리옥사민이고 양전자 방출체는 89Zr이다. 또 다른 특정 구체예에서, 킬레이트화 모이어티는 p-아이소티오시아나토벤질-데스페리옥사민이고 양전자 방출체는 89Zr이며, 콘쥬게이트의 킬레이트화 모이어티-대-항체 비율은 1 내지 2이다.
일부 구체예에서, 본원에는 PD-L1에 결합하는 항원-결합 단백질이 제공되며, 상기 PD-L1에 결합하는 항원-결합 단백질은 다음 구조를 가지는 하나 이상의 모이어티에 공유 결합된다:
-L-MZ
상기에서 L은 킬레이트화 모이어티이고; M은 양전자 방출체이며; z는 각각의 발생시에 독립적으로 0 또는 1이고; 여기서 z 중 적어도 하나는 1이다. 특정 구체예에서, 방사성 표지된 항원-결합 단백질은 식 (I)의 화합물이다:
M-L-A-[L-MZ]k (I)
식에서, A는 PD-L1에 결합하는 단백질이고; L은 킬레이트화 모이어티이며; M은 양전자 방출체이고; z는 0 또는 1이며; k는 0 내지 30의 정수이다. 일부 구체예에서, k는 1이다.
일부 구체예에서, L은:
Figure pct00002
이다.
일부 구체예에서, M은 89Zr이다.
일부 구체예에서, k는 1 내지 2의 정수이다. 일부 구체예에서, k는 1이다.
일부 구체예에서, -L-M은:
Figure pct00003
이다.
본 개시에는 또한 식 (III)의 화합물을 89Zr과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 합성하는 방법이 포함된다:
Figure pct00004
(III)
식에서, A는 PD-L1에 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다. 특정 구체예에서, 식 (III)의 화합물은 PD-L1에 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 p-SCN-Bn-DFO와 접촉시킴으로써 합성된다.
본원에는 또한 식 (III)의 화합물과 89Zr 사이의 반응 생성물이 제공된다.
본원에는 식 (III)의 화합물이 제공된다:
Figure pct00005
식에서, A는 PD-L1에 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이고 k는 1 내지 30의 정수이다. 일부 구체예에서, k는 1 또는 2이다.
일부 구체예에서, 다음 구조를 가지는 콘쥬게이트를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다:
A-Lk
상기에서 A는 PD-L1에 결합하는 단백질이고; L은 킬레이트화 모이어티이며; k는 1 내지 30의 정수이고; 콘쥬게이트는 임상에서 PET 영상화에 적합한 비방사능을 제공하기에 충분한 양의 양전자 방출체로 킬레이트화된다. 일부 구체예에서, 킬레이트화된 양전자 방출체의 양은 PD-L1에 결합하는 단백질의 1 내지 50 mg당 1 내지 3 mCi의 비방사능을 제공하기에 충분한 양이다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 모노머 인간 프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1)에, 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정되는 바 약 310 pM 미만의 결합 해리 평형 상수 (KD)로 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 모노머 인간 PD-L1에, 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정되는 바 약 180 pM 미만의 KD로 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 다이머 인간 PD-L1에, 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정되는 바 약 15 pM 미만의 KD로 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 다이머 인간 PD-L1에, 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정되는 바 약 8 pM 미만의 KD로 결합한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 HCVR의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 LCVR의 CDR을 포함하는 기준 항체와 인간 PD-L1에 대한 경합에 대해 경합하며, 이때에 HCVR은 표 1에 열거된 HCVR 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, LCVR은 표 1에 열거된 LCVR 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 기준 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 표 1에 제시된 HCVR/LCVR 아미노산 서열쌍을 포함한다. 일부 구체예에서, 기준 항체는 SEQ ID NO: 82/90, 98/106, 146/154, 162/170, 290/274, 306/274, 314/274 및 330/274로 이루어지는 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열쌍을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 PD-1 또는 B7-1 중 하나에 대한 PD-L1 결합을 향상시킨다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 PD-1 및/또는 B7-1에 대한 PD-L1 결합을 차단한다. 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 그것의 리간드에 대한 PD-L1 결합을 증가시키거나 감소시키지 않는다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 HCVR의 상보성 결정 영역 (CDR); 및 LCVR의 CDR을 포함하며, 여기서 HCVR은 SEQ ID NO: 18, 66, 114, 130, 202, 218, 266, 282, 298, 322, 및 338로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, LCVR은 SEQ ID NO: 26, 74, 122, 138, 210, 226, 및 274로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다. 특정 구체예에서, 분리된 항체는 SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 114/122, 130/138, 202/210, 218/226, 266/274, 282/274, 298/274, 322/274, 및 338/274로 이루어지는 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열쌍을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 인간 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이고, 여기서 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 HCVR 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 인간 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이고, 여기서 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 LCVR 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변 영역 (LCVR)을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 인간 단클론성 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이고, 여기서 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 (a) 표 1에 열거된 HCVR 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 HCVR; 및 (b) 표 1에 열거된 LCVR 서열들로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 LCVR을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 중쇄 가변 영역 (HCVR) 서열들 중 임의의 한 서열 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3); 및 표 1에 열거된 경쇄 가변 영역 (LCVR) 서열들 중 임의의 한 서열 내에 함유된 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함한다.
일부 구체예에서, the 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은
(a) SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 292, 300, 308, 316, 324, 332, 및 340으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 HCDR1 도메인;
(b) SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 294, 302, 310, 318, 326, 334, 및 342로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 HCDR2 도메인;
(c) SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 296, 304, 312, 320, 328, 336, 및 344로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 HCDR3 도메인;
(d) SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 196, 212, 228, 244, 260, 및 276으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 LCDR1 도메인;
(e) SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 198, 214, 230, 246, 262, 및 278로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 LCDR2 도메인; 및
(f) SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 200, 216, 232, 248, 264, 및 280으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 LCDR3 도메인을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 82/90, 98/106, 146/154, 162/170, 290/274, 306/274, 314/274 및 330/274로 이루어지는 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열쌍을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 HCVR의 CDR; 및 LCVR의 CDR을 포함하며, 여기서 HCVR은 SEQ ID NO: 2, 34, 50, 82, 98, 146, 162, 178, 186, 234, 250, 290, 306, 314, 및 330으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, LCVR은 SEQ ID NO: 10, 42, 58, 90, 106, 154, 170, 194, 242, 258, 및 274로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진다.
E. 항-PD-L1 항체-킬레이터 콘쥬게이트의 제조를 위한 확대 제조
본 개시에는 킬레이터에 콘쥬게이팅된 항-PD-L1 항체를 제조하기 위한 확대 제조 과정이 포함된다. 항-PD-L1 항체-킬레이터 콘쥬게이트는 방사성표지화에 적합한 형태로 있다.
양호한 제조 과정들이 멸균된 환경을 유지하기, 무균성 과정을 실시하기, 모든 과정의 기록을 보존하기, 및 생성물의 품질, 순도, 강도, 및 정체성, 및 그것으로부터의 임의의 편차를 기록하기를 포함한, 모든 제조 측면에서 준수된다.
확대 제조 과정은, 일부 구체예에서, 연구 및 개발을 위한 제조 과정보다 훨씬 더 빠르다. 일부 구체예에서, 확대 제조 과정은 12시간 미만, 또는 10시간 미만, 또는 8시간 미만, 또는 6시간 미만, 또는 4시간 미만, 또는 약 2시간 미만이 걸릴 수 있다.
일부 구체예에서, 제 1 단계는 부형제, 콘쥬게이션 간섭종, 및 콘쥬게이션 과정을 억제하는 염을 제거하기 위해, 30 내지 50 kDa 막을 사용한, 항-PD-L1 항체의 한외여과 및 투석여과 (UFDF)를 포함한다. 예시적인 막 폴리머로는 폴리에테르설폰 (PES), 셀룰로오스 아세테이트 (CA), 및 재생 셀룰로오스 (RC)가 있다. 이 단계에서, 항체는 낮은 이온 강도 및 비간섭 완충제 용액에서 완충액 교환된다. 완충제 pH는 약 4.5 내지 약 6, 또는 약 5 내지 약 6, 또는 약 5.3 내지 약 5.7, 또는 약 5.5일 수 있다. 본원에서 유용한 것으로 고려되는 완충제 시스템은 일차 아민이 없는 임의의 완충제 시스템을 포함한다. 예시적인 완충제로는 아세테이트, 포스페이트, 또는 시트레이트 완충제를 들 수 있다. 완충제는 사전-콘쥬게이션 프로세싱 중에 단백질 안정성을 제공한다. 공정 부피는 항체를 농축시키기 위해 추가로 감소될 수 있고, 그런 후 멸균 여과될 수 있다.
사전-콘쥬게이션 UFDF 후에, 농축되고 여과된 항체는 아민 유리 카보네이트 완충제 시스템으로 전달될 수 있다. 카보네이트 완충제 시스템은 약 8.5 내지 약 9.6, 또는 약 9.0 내지 약 9.6, 또는 약 9.2 내지 약 9.4, 또는 약 9.4 내지 약 9.6의 범위의 pH, 또는 약 9.4의 pH를 가질 수 있다.
용매 중의 킬레이터, 예를 들어, DFO는 항체를 함유하는 완충제 시스템 안으로 표적 농도로 첨가되고, 추가적인 용매가 원하는 백분율로 용액에 첨가될 수 있다. 킬레이터는 항체의 몰 과잉량으로, 예를 들어, 3.5 내지 5;1의 킬레이터 대 항체로 첨가될 수 있다. 총 반응 부피는 최대 5 L일 수 있다.
반응 온도 및 반응 시간은 역비례한다. 예를 들어, 만약 반응 온도가 더 높으면, 반응 시간은 더 짧아진다. 만약 반응 온도가 더 낮으면, 반응 시간은 더 길어진다. 예를 들어, 약 18℃를 초과하는 온도에서, 반응은 2시간 미만이 걸릴 수 있고; 18℃보다 아래의 온도에서, 반응은 2시간 이상이 걸릴 수 있다.
콘쥬게이션 반응은 퀀칭에 의해, 예를 들어, 아세트산의 첨가에 의해 종결될 수 있다.
일부 구체예에서, 항체의 데페록사민과의 콘쥬게이션은 DFO-mAb 콘쥬게이트를 제조하기 위해 수행된다. 일부 구체예에서, 항체의 p-SCN-Bn-데페록사민과의 콘쥬게이션은 DFO-mAb 콘쥬게이트를 제조하기 위해 수행된다.
킬레이터에 대한 예시적인 용매로는 DMSO와 DMA를 들 수 있다. 후속되는 UFDF 단계는 막을 사용하며, 막은 콘쥬게이션 단계에서 사용된 용매 시스템을 기반으로 선택된다. 예를 들어, DMA는 PES 막을 용해시키므로, 두 가지는 동일한 시스템에서 사용될 수 없을 것이다.
카보네이트 완충제는 장기간 보관 중에 콘쥬게이트의 안정성에는 바람직하지 못하다. 그러므로, 일단 항체-킬레이터 콘쥬게이트가 형성된 후에는, 그것들은 장기간 보관 및 안정성을 위해 특수하게 선택된 완충제로 완충액 교환될 수 있다. 예시적인 완충제로는 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 아르기닌, 및 히스티딘 완충제를 들 수 있다. 추가의 UFDF 단계는 잔류하는 염을 제거하고 적합한 농도, 부형제 수준, 및 콘쥬게이팅된 단클론성 항체의 pH를 제공하기 위하여 수행될 수 있다. 결과적으로 얻어지는 항체-킬레이터 콘쥬게이트는 후속되는 제제화를 위해 멸균 여과되고 보관될 수 있다.
III. 방사성 표지된 면역콘쥬게이트의 사용 방법
특정 측면으로, 본 개시는 본 개시의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 진단 및 치료 방법을 제공한다.
한 측면에 따르면, 본 개시는 조직에서 PD-L1을 검출하는 방법을 제공하며, 그 방법은 본원에 제공된 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 조직에 투여하는 단계; 및 PD-L1 발현을 양전자 방출 단층촬영 (PET) 영상화에 의해 시각화하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 조직은 세포 또는 세포주를 포함한다. 특정 구체예에서, 조직은 대상체에 존재하며, 대상체는 포유류이다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간 대상체이다. 특정 구체예에서, 대상체는 암, 감염성 질환 및 염증성 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환 또는 질병을 가진다. 한 구체예에서, 대상체는 암을 가진다. 특정 구체예에서, 감염성 질환은, 예를 들어, B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 미코박테리움 튜베르쿨로시스에 의애 유발된 박테리아 또는 바이러스 감염이다.
한 측면에 따르면, 본 개시는 PD-L1을 발현하는 조직의 영상화 방법을 제공하는데, 그 방법은 본 개시의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 조직에 투여하는 단계; 및 PD-L1 발현을 양전자 방출 단층촬영 (PET) 영상화에 의해 시각화하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 조직은 종양에 포함된다. 한 구체예에서, 조직은 종양 세포 배양물 또는 종양 세포주에 포함된다. 한 구체예에서, 조직은 대상체의 종양 병변에 포함된다.
한 측면에 따르면, 본 개시는 치료법에 대한 반응을 측정하는 방법을 제공하며, 여기서 치료법에 대한 반응은 염증을 측정함으로서 측정된다. 이 측면에 따르면, 방법은 본원에 제공된 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계 및 PD-L1 발현을 양전자 방출 단층촬영 (PET) 영상화에 의해 시각화하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 염증은 대상체의 종양에 존재한다. 특정 구체예에서, PD-L1 발현의 증가는 종양에서 염증의 증가와 상관이 있다.
한 측면에 따르면, 본 개시는 환자가 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제를 포함하는 항-종양 요법에 적합한지의 여부를 측정하는 방법을 제공하며, 그 방법은 고체 종양을 가진 환자를 선택하는 단계, 본 개시의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 투여하는 단계, 및 종양에서 투여된 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 PET 영상화에 의해 국지화하는 단계로, 이때 종양에서 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 존재는 환자를 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제를 포함하는 항-종양 요법에 적합한 것으로서 확인해주는 단계를 포함한다.
한 측면에 따르면, 본 개시는 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제를 포함하는 항-종양 요법에 대한 후보를 확인하는 방법을 제공하며, 그 방법은 고체 종양을 가진 환자를 선택하는 단계, 본 개시의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 투여하는 단계, 및 종양에서 투여된 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 PET 영상화에 의해 국지화하는 단계로, 이때 종양에서 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 존재는 환자를 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제를 포함하는 항-종양 요법에 적합한 것으로서 확인해주는 단계를 포함한다.
한 측면에 따르면, 본 개시는 환자를 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제를 포함하는 항-종양 요법에 대해 예측하는 방법을 제공하며, 그 방법은 고체 종양을 가진 환자를 선택하는 단계, 종양이 PD-L1-양성인지를 측정하는 단계로서, 환자의 양성 반응은 종양이 PD-L1-양성인 것을 예측하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 종양은 본 개시의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 투여하고 종양에서 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 PET 영상화에 의해 국지화함으로써 측정되며, 여기서 종양에서 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 존재는 종양이 PD-L1-양성인 것을 가리킨다.
한 측면에 따르면, 본 개시는 대상체에서 PD-L1-양성 종양을 검출하는 방법을 제공한다. 이 측면에 따르는 방법은 고체 종양을 가진 대상체를 선택하는 단계; 본 개시의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 대상체에게 투여하는 단계; 및 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 국지화를 PET 영상화에 의해 측정하는 단계를 포함하며, 종양에서 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 존재는 종양이 PD-L1-양성인 것을 가리킨다.
본원에서 사용되는 표현 "그것을 필요로 하는 대상체"는 암의 하나 이상의 증상 또는 적응증을 나타내는 인간 또는 비인간 포유류, 및/또는 고체 종양을 포함한 암으로 진단받은 사람들 및 그것에 대한 치료를 필요로 하는 사람들을 의미한다. 많은 구체예에서, 용어 "대상체"는 용어 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 대상체는 일차 또는 전이성 종양 및/또는 한정하는 것은 아니지만, 설명되지 않는 체중 감소, 일반적인 약함, 만성 피로, 식욕 상실, 발열, 식은땀, 뼈의 통증, 숨이 참, 복부 팽만, 흉부 통증/압박감, 비장 확대, 및 암-관련 생체마커 (예컨대, CA125)의 수준의 상승을 포함한, 하나 이상의 증상 또는 적응증으로 진단될 수 있다. 이 표현은 일차 또는 확립된 종양을 가진 대상체를 포함한다. 특정 구체예에서, 이 표현은 고체 종양, 예컨대 결장암, 유방암, 폐암, 전립선암, 피부암, 간암, 골암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 두경부암, 및 에 대한 치료를 받았거나 및/또는 필요로 하는 인간 대상체를 포함한다. 용어는 일차 또는 전이성 종양 (악성으로 진전됨)을 가진 대상체를 포함한다. 특정 구체예에서, 표현 "그것을 필요로 하는 대상체"는 선행 치료법 (예컨대, 항암제로의 치료)에 대해 내성이거나 난치성이거나 또는 부적당하게 제어된 고체 종양을 가진 환자들을 포함한다. 예를 들어, 이 표현은 화학요법 (예컨대, 카르보플라틴 또는 도세탁셀)으로의 치료와 같은 선행 치료법의 하나 이상의 라인으로 치료되었던 대상체들을 포함한다. 특정 구체예에서, 표현 "그것을 필요로 하는 대상체"는 선행 치료법 중 하나 이상의 요법으로 치료되었지만 계속해서 재발되었거나 전이된 고체 종양을 가진 환자를 포함한다. 특정 구체예에서, 용어는, 한정하는 것은 아니지만, 암, 류머티스성 관절염, 아테롬성 동맥경화증, 치주염, 건초열, 심장 질환, 관상 동맥 질환, 감염성 질환, 기관지염, 피부염, 뇌수막염, 천식, 결핵, 궤양성 대장염, 크론병, 염증성 장 질환, 간염, 부비동염, 건선, 알레르기, 섬유증, 루푸스, 혈관염, 강직성 척추염, 그레이브즈병, 셀리악병, 섬유근육통, 및 이식 거부를 포함한 염증성 질환 또는 질병을 가지는 대상체들을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 개시의 방법은 고체 종양을 가진 환자에서 사용된다. 용어 "종양", "암" 및 "악성 종양"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 용어 "고체 종양"은 통상적으로 낭 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적인 덩어리를 나타낸다. 고체 종양은 양성 (암이 아님)이거나 악성 (암)일 수 있다. 본 개시의 목적에 대해, 용어 "고체 종양"은 악성 고체 종양을 의미한다. 용어는 종양을 형성하는 세포 유형들에 대해 명명된 상이한 고체 종양, 즉 육종, 암종 및 림프종을 포함한다. 특정 구체예에서, 용어 "고체 종양"은, 한정하는 것은 아니지만, 대장암, 난소암, 전립선암, 유방암, 뇌암, 자궁경부암, 방광암, 폐암, 항문암, 자궁암, 결장암, 간암, 췌장암, 폐암, 자궁내막암, 골암, 고환암, 피부암, 신장암, 위암, 식도암, 두경부암, 침샘암, 및 골수종을 포함한다.
한 측면에 따르면, 본 개시는 대상체에서 종양의 치료 방법을 제공한다. 이 측면에 따르는 방법은 고체 종양을 가진 대상체를 선택하는 단계; 그 종양이 PD-L1-양성인 것을 측정하는 단계; 및 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제의 하나 이상의 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 종양은 본 개시의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 대상체에게 투여하고; 종양에서 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 PET 영상화에 의해 시각화함으로써 PD-L1-양성인 것으로서 측정되며, 이때 종양에서 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 존재는 종양이 PD-L1-양성인 것을 가리킨다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는", 등은 증상을 완화시키거나, 일과성 또는 영구적인 기준으로 증상의 원인을 제거하거나, 종양 성장을 지연 또는 억제하거나, 종양 세포 부하 또는 종양 부담을 감소시키거나, 종양 퇴행을 촉진하거나, 종양 수축, 괴사 및/또는 소멸을 유발하거나, 종양 재발을 방지하거나, 전이를 방지 또는 억제하거나, 전이성 종양 성장을 억제하거나, 및/또는 대상체의 생존 기간을 증가시키는 것을 의미한다.
한 측면에 따르면, 본 개시는 대상체에서 항-종양 요법의 효능을 모니터링하는 방법을 제공하며, 그 방법은 고체 종양을 가진 대상체를 선택하는 단계, 여기서 대상체는 항-종양 요법으로 치료되고 있는 단계; 본 개시의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 그 대상체에게 투여하는 단계; 종양에서 투여된 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 국지화를 PET 영상화에 의해 영상화하는 단계; 및 종양 성장을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 방사성 표지된 신호에서 기준선으로부터의 감소는 종양 퇴행 및 항-종양 요법의 효능을 가리킨다. 특정 구체예에서, 항-종양 요법은 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제 (예컨대, 항-PD-1 항체)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 개시는 종양의 염증 상태의 변화를 평가하기 위한 방법을 제공하며, 그 방법은 고체 종양을 가진 대상체를 선택하는 단계, 여기서 대상체는 항-종양 요법으로 치료되고 있는 단계; 본원에 제공된 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 그 대상체에게 투여하는 단계; 및 종양에서 투여된 방사성 표지된 콘쥬게이트의 국지화를 PET 영상화에 의해 영상화하는 단계를 포함하고, 여기서 방사성 표지된 신호에서 기준선으로부터의 증가는 염증의 증가 및 항-종양 요법의 효능을 가리킨다. 특정 구체예에서, 항-종양 요법은 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제 (예컨대, 항-PD-1 항체)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "기준선"은 종양에서 PD-L1 발현과 관련하여, 항-종양 요법의 용량의 투여 전 또는 투여 시에 대상체에 대한 방사성 표지된 콘쥬게이트의 흡수 수치를 의미한다. 방사성 표지된 콘쥬게이트의 흡수는 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 측정된다 (예를 들어, Oosting et al 2015, J. Nucl. Med. 56: 63-69 참조). 특정 구체예에서, 항-종양 요법은 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제를 포함한다.
종양 퇴행이 있는지를 측정하기 위하여, 방사성 표지된 콘쥬게이트의 흡수가 기준선에서 및 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제 (예컨대, 항-PD-1 항체)의 투여 후 하나 이상의 시점에서 정량화된다. 예를 들어, 투여된 방사성 표지된 콘쥬게이트 (예컨대, 방사성 표지된 항-PD-L1 항체 콘쥬게이트)의 흡수는 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제 (예컨대, 항-PD-1 항체)로의 초기 처리 후 제 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 14일, 15일, 22일, 25일, 29일, 36일, 43일, 50일, 57일, 64일, 71일, 85일에; 또는 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 16주, 17주, 18주, 19주, 20주, 21주, 22주, 23주, 24주, 또는 그 이상의 기간이 끝났을 때 측정된다. 초기 치료 후 특정 시점에서의 흡수 값과 기준선에서의 흡수 값 사이의 차이는 종양 조직의 차이 (종양 퇴행 또는 진행)가 있었는지를 확립하기 위해 사용된다. 예를 들어, PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제의 적어도 한 용량으로의 치료시에 흡수의 기준선으로부터의 감소는 종양 퇴행을 의미하며 항-종양 요법의 효능을 나타낸다.
특정 구체예에서, 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트는 대상체에게 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 특정 구체예에서, 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트는 종양내로 투여된다. 투여시에, 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트는 종양에 국지화된다. 국지화된 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트는 PET 영상화에 의해 영상화되고 종양에 의한 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 흡수는 당업계에 알려져 있는 방법들에 의해 측정된다. 특정 구체예에서, 영상화는 방사성 표지된 콘쥬게이트의 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 후에 수행된다. 특정 구체예에서, 영상화는 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 투여와 동일한 날에 수행된다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 PD-L1에 특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 HCVR의 CDR을 포함하고, 이때 HCVR은 SEQ ID NO: 2, 34, 50, 82, 98, 146, 162, 178, 186, 234, 250, 290, 306, 314, 및 330으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며; 및 LCVR의 CDR을 포함하고, 이때 LCVR은 SEQ ID NO: 10, 42, 58, 90, 106, 154, 170, 194, 242, 258, 및 274로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제는 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 REGN2810으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정한 다른 구체예에서, PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 항-PD-L1 항체는 SEQ ID NO: 82의 HCVR 및 SEQ ID NO: 90의 LCVR을 포함한다.
IV. 실시예
본 개시의 특정 구체예들은 다음의 비제한적인 실시예들에 의해 예시된다.
실시예 1: PD-L1에 대한 인간 항체의 생성
표 1에 열거된 것들을 포함한, 인간 항 PD-L1 항체를 미국 특허출원 공개 번호 US 2015-0203580 A1 (전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술된 것과 같이 제조하고 특성화하였다. 간단히 설명하면, PD-L1에 대한 인간 항체를 PD-L1 (Genbank 등록 번호 NP_054862.1)의 약 아미노산 19 내지 239의 범위에 걸침 PD-L1의 단편을 사용하여 생성하였다. 면역원을 직접, 면역 반응을 자극하기 위한 보조제와 함께, 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스에게 투여하였다. 항체 면역 반응을 PD-L1-특이적 면역검정에 의해 모니터링하였다. 원하는 면역 반응이 이루어졌을 때 비장세포를 수득하고 그것들의 생존성을 보존하고 하이브리도마 세포주를 형성하도록 마우스 골수종 세포와 융합시켰다. 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 PD-L1-특이적 항체를 생성하는 세포주를 확인하기 위하여 선택하였다. 이 기법을 사용하고, 상기 기술된 면역원을 사용하여, 여러 항-PD-L1 키메릭 항체 (즉, 인간 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 가진 항체)를 얻었다; 이 방식으로 생성된 예시적인 항체들을 H2M8306N, H2M8307N, H2M8309N, H2M8310N, H2M8312N, H2M8314N, H2M8316N, H2M8317N, H2M8321N, H2M8323N, H2M8718N, H2M8718N2, 및 H2M8719N으로서 표시하였다.
항-PD-L1 항체를 또한, U.S. 2007/0280945A1 (전문이 본원에 구체적으로 참조로 포함됨)에서 기술된 것과 같이, 골수종 세포에 대한 융합 없이 직접 항원-양성 B 세포로부터 분리하였다. 이 방법을 사용하여, 여러 전체 인간 항-PD-L1 항체 (즉, 인간 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 가진 항체)를 얻었다; 이 방식으로 생성된 예시적인 항체들을 다음과 같이 표시하였다: H1H9323P, H1H9327P, H1H9329P, H1H9336P, H1H9344P2, H1H9345P2, H1H9351P2, H1H9354P2, H1H9364P2, H1H9373P2, H1H9382P2, H1H9387P2, 및 H1H9396P2.
실시예 2: 항-PD-L1 항체 H4H8314N의 p-SCN-Bn-DFO와의 콘쥬게이션
부모 항-PD-L1 항체, H4H8314N, 및 아이소타입 대조군 항체가 방사성 표지화가 포함된 면역 PET 연구에 적합한 것이 되도록 변형시키기 위하여, 킬레이터, p-SCN-bn-데페록사민 (DFO; Macrocylics, Cat #: B-705)을 항체에 부착시켰다.
변형을 위하여, H4H8314N을 먼저 히스티딘 완충액으로부터 4℃에서의 밤샘 투석 (Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette G2 10k MWCO; ThermoScientific)에 의해 PBS, pH 7.2로 완충액 교환한 후, PD-10 칼럼 (GE Healthcare, Cat. #: 17-0851-01)을 사용하여 50 mM 탄산염 완충액, 150 mM NaCl, pH 9.0 (콘쥬게이션 완충액)으로 구성된 완충액에 다시 완충액 교환하였다. 완충제 교환 후 농도를 측정하기 위하여, 샘플을 1.46 g/L의 MacVector 서열 기반 흡광 계수를 사용하여 Nanodrop 2000 UV/VIS 분광계 (Thermo Scientific) 상에서 측정하였다 (표 2 참조). 15 mL 폴리프로필렌 튜브에서, 773.9 uL의 H4H8314N (12.5 mg)을 1676.1 uL의 콘쥬게이션 완충액에 첨가하였다. 별도의 바이알에서, 29.3 uL의 DMSO를 20.7 uL의 DFO에 첨가하였다. 1/4 증분에서, 이 DFO 용액을 H1H8314N 용액에 첨가하고, 매번 피펫을 위아래로 피펫팅함으로써 부드럽게 혼합하였다. 최종 용액은 DFO가 몰-대-몰로 6배 과다하게 들어있는 콘쥬게이션 완충액, 2% DMSO 중의 5 mg/mL H4H8314N이었다. 이 용액을 37℃ 수조에서 추가적인 교반 없이 인큐베이션하였다.
37℃에서 30분 후에, 용액을 pH 5.4에서 250 mM NaAcO를 함유한 완충액 (제제화 완충액)으로 사전-평형화되어 있는 PD-10 탈염 칼럼 (GE Healthcare, Cat. #: 17-0851-01)을 지체없이 통과시켰다. 최종 용액을 주사기 필터 (Acrodisc 13 mm 주사기 필터, Pall Corporation, Cat #: 4602)를 통해 멸균 여과하였다. 농도 및 DFO-대-항체 비율 (DAR)을 계속히여 UV/VIS 분광법에 의해 측정하였다. 흡광도 측정을 위해, DFO-콘쥬게이트된 항체를 제제화 완충액에 대해 252 nm (A252), 280 nm (A280) 및 600 nm (A600)에서 측정하였다. 계산을 위해서, 바탕값을 각 흡광도 값에서 다음의 식을 사용하여 보정하였다;
Figure pct00006
항체 콘쥬게이트를 SEC 크로마토그래피를 사용하여 응집에 대해 테스트하였는데, 25 ug의 샘플을 Superdex 200 칼럼 (GE Healthcare, Cat. No. 17-5175-01) 위에 주입하고 280 nm에서 PBS 이동상 (0.75 mL/분)으로 모니터링하였다. 항체 세기를 2 ug의 샘플이 로딩되어 있는 SDS-PAGE 4-20% Tris/Gly 프리-캐스트 겔 (Novex)에 의해 평가하였다. 겔은 도 1에 도시된다. 항체 농도, 콘쥬게이트 농도, 및 DAR을 하기 식들을 사용하여 계산하였다:
항체 농도 계산
Figure pct00007
콘쥬게이트 농도 계산
Figure pct00008
DAR 계산
Figure pct00009
몰 흡광 계수 및 분자량
항체 MW (g mol -1 ) ε280 (L g -1 cm -1 ) ε252 (L g -1 cm -1 )
H4H8314N 144984 1.46 0.553
DFO-부착 후 UV DAR, 퍼센트 응집물 및 농도
항체 UV DAR 농도 (mg/mL) % 응집물
H4H8314N 1.2 3.34 < 1%
실시예 3: DFO 콘쥬게이트된 단클론성 항체의 89 Zr 킬레이트화
생체내 연구에서 면역PET에서 사용하기 위하여, DFO-콘쥬게이트된 항-PD-L1 항체, H4H8314N, 및 DFO-콘쥬게이트된 아이소타입 대조군 항체를 89Zr로 방사성 표지하였다.
DFO-콘쥬게이트된 항체 (250 또는 750 ug)를 먼저 1 M HEPES, pH 7.2에 1.25 mg/mL이 되도록 넣었다. 각 연구에 대한 DFO-Ab 콘쥬게이트 용액의 제조법은 표 4에 열거한다. 별도로, 89Zr 용액을 표 5에 나타낸 각각의 상응하는 연구에 대한 제조법을 사용하여 제조하였다. 스톡 89Zr-옥살산 용액을 PerkinElmer 또는 3D Imaging으로부터 얻었다. 만약 스톡 용액의 방사능 농도가 낮으면 (표 5 참조), 중화 단계를 1 M 보레이트, pH 9.0을 사용하여 수행하였다. 용액의 최종 방사능을 Capintec CRC-25R 검량기 (Capintec #520)를 사용하여 확인한 후, 즉시 DFO-Ab 콘쥬게이트 용액과 조합하고, 부드럽게 혼합하고 (위아래로 피펫팅함) 계속해서 45분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후에, 각 반응 혼합물의 소량 샘플을 iTLC (순간 박막 액체 크로마토그래피)에 대해 취하여 방사성 표지화 반응 수율을 측정하고, 나머지 반응 혼합물을 중력 공급 탈염을 위해 pH 5.4의 250 mM 아세트산 나트륨이 들어 있는, 사전-평형화되어 있는 PD-10 칼럼 (Vendor)으로 옮겼다. 각각의 PD-10 칼럼은 1.2 mL 이상의 반응 혼합물을 받지 못하였다 (그렇지 않으면 다중 칼럼을 사용함). 반응 내용물이 칼럼 베드로 유입된 후에, 1.6 mL의 250 mM 아세트산 나트륨, pH 5.4 (제제화 완충액)를 첨가하였다; 통과액은 버렸다. 추가적인 1.8 mL의 제제화 완충액을 칼럼에 첨가하고, 용출액을 각 칼럼으로부터 수집하였다. 다음에, 대략 500 uL의 각 용액을 Nanodrop 분광광도계 (ThermoScientific)를 사용하여 분석하였다. 최종 Ab 농도를 적절한 흡광 계수 및 280 nm에서의 흡광도를 다음 식을 사용하여 계산하였다:
농도, mg/mL = 280 nm에서의 흡광도 ÷ 280 nm에서의 흡광 계수 (표 6에 제시됨).
그램으로 측정된 최종 질량을 표 4에서 기록하였다. 그런 후 방사능을 검량기를 사용하여 측정하고 표 5에서 기록하였다. PD-10 칼럼 처리 전 물질과 함께 최종 물질을 그런 다음, iTLC에 의해 분석하였다. 이 검정을 위해, 1 uL의 각 용액을 실리카 겔 (Agilent Technologies, Cat # SG10001)로 적셔진 iTLC-SG-Glass 마이크로파이버 크로마토그래피 종이에 첨가하고, 20 mM 시트르산 완충제 용액이 들어 있는 TLC 챔버에서 전개시켰다. 최종 물질을 또한 UV 280이 포함된 SEC-HPLC 및 0.75 mL/분의 유량의 PBS 이동상이 포함된 Superdex 200 칼럼을 사용하여 시리즈로 연결된 방사성 동위원소 검출기 (Agilent 1260 with Lablogic 방사성-TLC/HPLC Detector, SCAN-RAM)를 사용하여 분석하였다. 방사성 추적자를 사용하여 단백질 피크의 통합 (약 10 내지 16분) 및 유리 피크의 통합 (약 25분)을 비교함으로써 방사화학적 순도를 측정하였다. 모노머 순도를 올리고머 피크 (10분 내지 약 15분)의 통합을 모노머의 통합 (약 16분)에 비교함으로써 측정하였다.
각각의 방사성 표지된 콘쥬게이트의 비방사능 및 단백질 회수율 (%)을 다음 식들을 사용하여 측정하였다:
a. 콘쥬게이트 질량, mg = 농도, mg/mL x 용액의 질량, g
b. 비방사능, mCi/mg = 바이알의 활성, mCi ÷ 콘쥬게이트의 질량, mg
c. 단백질 회수율 = 출발 콘쥬게이트 질량 (mg) ÷ 콘쥬게이트의 질량, mg
마지막으로 외관을 주지하고 표 7에서 기록하였다. UV280 및 iTLC 추적을 둘 다 정제된 생성물에 대해 수행하였다.
그 결과를 표 7에서 통합한다. 방사성-SEC-HPLC 크로마토그램을 도 2 내지 4에 나타낸다. UV280 HPLC SEC 크로마토그램 및 방사성-iTLC의 실례는 89Zr 방사성 표지화, 연구 1에 대해 도 5에 나타낸다. UV280-HPLC SEC 크로마토그램은 모노머 생성물이 매우 많음 (99%)을 확인해준다. 방사성-iTLC 추적을 7-점 이항식 스무딩 함수로 처리하였다. 오리진과 용매 전선은 각각 대략 16 및 100 mm였다. 검출 가능한 89Zr을 22 nm 이상에서는 관찰하지 못하였고, 이것은 도 2B에서 방사성-SEC-HPLC SEC 에 의해 측정된 방사화학적 순도를 확증해준다.
방사성 표지화를 위한 DFO-항체 콘쥬게이트 제조
방사성-표지화 # 연구 # 방사성 표지화
로트 		농도 (mg/mL) DAR* 콘쥬게이트 질량 (mg) 총부피 (uL) 최종 농도 (mg/mL)
1 1 아이소타입-DFO-89Zr 3.7 1.6 250 200 1.25
2 1 H4H8314N-DFO-89Zr 3.34 1.2 250 200 1.25
3 2 H4H8314N-DFO-89Zr 3.34 1.2 750 600 1.25
4 3 아이소타입-DFO-89Zr 3.7 1.6 250 200 1.25
5 3 H4H8314N-DFO-89Zr 3.34 1.2 250 200 1.25
* DAR은 DFO 대 항체 비율로서 정의됨
방사성 표지화를 위한 89 Zr 반응 용액 제조
방사성-표지화 연구 # 방사성-표지화 로트 89 Zr-옥살레이트 (uL) 첨가된 추가적인 1 M 옥살산 (uL) 첨가된 1 M 보레이트, pH 9.0 (uL) 1 M HEPES, pH 7.2 (uL) 최종 부피 (uL) 최종 활성 (uCi) 비방사능 (uCi/uL)
1 1 아이소타입-DFO-89Zr 50 50 400 500 1000 1009 1.01
2 1 H4H8314N-DFO-89Zr 50 50 400 500 1000 1000 1
3 2 H4H8314N-DFO-89Zr 150 150 1200 1500 3000 3070 1.02
4 3 아이소타입-DFO-89Zr ~1 0 0 1000 1000 1680 1.68
5 3 H4H8314N-DFO-89Zr ~1 0 0 1000 1000 1640 1.64
콘쥬게이트 로트에 대한 흡광 계수
방사성 표지화 로트 ε 280 (AU ml mg -1 cm -1 )
아이소타입-DFO-89Zr 1.71
H4H8314N-DFO-89Zr 1.61
생체내 영상화 및 생체분포 연구를 위한 89 Zr 표지된 DFO-Ab 콘쥬게이트의 요약
방사성-표지화 연구 # 콘쥬게이트 로트 외관 방사화학적 순도* (%) 모노머 순도* (%) 단백질 회수율 (%) 농도
(mg/mL) 		비방사능 (mCi/mg)
1 1 아이소타입-DFO-89Zr 투명함 >99% >95% 60% 0.106 3.35
2 1 H4H8341N-DFO-89Zr 투명함 >99% >95% 63% 0.121 2.75
3 2 H4H8341N-DFO-89Zr 투명함 >99% >95% 62% 0.134 3.58
4 3 아이소타입-DFO-89Zr 투명함 >99% >95% 66% 0.074 5.38
5 3 H4H8341N-DFO-89Zr 투명함 >99% >95% 74% 0.084 5.13
* 방사성-SEC-HPLC에 의한 것임
실시예 4: 면역반응성
방사성 표지된 항-PD-L1 항체 및 아이소타입 대조군 항체의 면역반응성 (IR)을 다음과 같이 측정하였다. 초기 연구를 위해, MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 세포를 사용하였고, 계속해서 LOX-IMVI 세포 (실시예 5에서 세포주의 상세한 설명 참조)를 또한 후기 연구에서 사용하였다. 이들 검정에서, 20 ng의 각각의 89Zr 표지된 항체를 15 x 106 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 또는 30 x 106 LOX-IMVI 세포에, 1 mL의 최종 부피로 첨가하였다. 샘플을 45분 동안 계속 혼합하면서 인큐베이션한 후에 배지로 3회 세척을 수행하여 임의의 미결합 항체를 제거하였다. 그런 후 자동 감마 카운터 (Wizard 2470, Perkin Elmer)에서 동일한 20 ng의 89Zr 표지된 항체를 함유하는 2개의 기준 표준에 대해 테스트 세포 펠릿의 방사능을 카운팅하였다. 백분율 면역반응성을 총 활성의 척도로서 표준의 평균을 사용하여 샘플에 대해 측정하였다.
표 8에서 알 수 있는 것과 같이, 89Zr 표지된 항-PD-L1 항체는 콘쥬게이션 및 방사성 표지화 후에 면역반응성을 보유하였고, %IR은 연구 전체에서 88 내지 98% 범위였다. 결합의 특이성은 1% 미만의 바탕 %IR을 가진 대조군 항체에서 나타난다.
89 Zr 킬레이트화된 DFP-콘쥬게이트의 면역반응성
연구 연구 1 연구 2 연구 3
세포주 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg LOX-IMVI
항체 89Zr-항-PD-L1 89Zr-대조군 89Zr-항-PD-L1 89Zr-대조군 89Zr-항-PD-L1 89Zr-대조군 89Zr-항-PD-L1 89Zr-대조군
세포 펠릿 활성 4048.4 29.6 8311.9 na 6262.4 68 5587.54 65.4
평균 표준 활성 4536.5 6432.4 8567.2 na 6386.6 9544.8 6386.6 9544.8
% IR 89.2 0.5 97.0 na 98.1 0.7 87.5 0.7
실시예 5: 종양 세포주 상에서 인간 PD-L1 발현의 시험관내 및 생체외 특성화
수컷 NCr 누드 (Taconic, Hudson NY) 마우스 또는 VelociGene® 기술 (Valenzuela et al 2003, Nat. Biotechnol. 21: 652-659; US 특허 출원 공개 US2016/0157469)을 사용하여 75% C57/Bl6 / 25% 129 스트레인을 바탕으로 마우스 PD-L1 (PD-L1 HumIn 마우스)의 세포외 도메인 대신 인간 PD-L1의 세포외 도메인의 발현에 대해 동형접합성이 되도록 조작된 마우스에서 생체내에서 종양에 의해 내인성으로 발현된 인간 PD-L1 발현을 검출할 목적으로, 인간 PD-L1의 발현 수준을 평가하기 위하여 여러 종양 세포주를 연구하였다.
이런 연구들에서 사용된 세포주는 다음을 포함한다: 1) 쥐과의 PD-L1을 녹아웃시키지만, 전장 인간 PD-L1 및 eGFP와 융합된 전장 닭 오브알부민을 과다 발현하도록 사내에서 조작된, 따라서 본원에서 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg로서 언급되는, 쥐과의 결장 암종 세포주 MC38 (미국 메릴랜드 프레데릭 소재의 NCI, 종양 면역학 및 생물학 실험실로부터 얻음); 2) 여러 인간 종양 세포주: 인간 흑색종 세포주 LOX-IMVI (내인성 PD-L1 양성 세포주, 미국 메릴랜드 프레데릭 소재의 NCI, 암 치료 및 진단, 종양 저장소 부서로부터 얻음), 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 (내인성 PD-L1 양성 세포주) 및 SK-Br-3 (PD-L1 음성 세포주) (둘 다 ATCC로부터 얻음). 일부 경우에는, 인간 PD-L1을 시험관내에서의 임의의 유도 없이 직접 평가하였고; 일부 경우에는, 인간 PD-L1 발현을 밤새 쥐과 또는 인간 IFNg (100ng/ml) 처리 (Peprotech로부터 얻음)로 평가하였으며; 일부 경우에는, 인간 PD-L1을 생체외에서 종양을 가지고 있는 누드 마우스 또는 인간화된 마우스로부터 추출된, 효소적으로 분해된 종양 세포 상에서 평가하였다. 인간 PD-L1의 모든 표면 염색을 표준 프로토콜을 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 종양 세포를 PBS로 1회 세척하고, 저온 염색 완충액으로 1회 세척한 후, 상업적으로 입수 가능한 형광 색소로 직접 콘쥬게이트된 항-인간 PD-L1 항체 (eBioscience, 클론 MIH1)를 염색 완충액에서 30분 동안 저온의 암실에서 염색한 후, 2 mL의 PBS로 다시 한 번 세척하였다. 고정 가능한 염료 eFluor506을 또한 제조자 (eBioscience, Cat #17-5983)의 프로토콜을 따라 포함시켰다. 샘플을 DIVA v8이 장착된 BD FACSCanto IITM IVD10 상에서 획득하였다. 데이터를 추가로 FlowJo v10.0.6 이상으로 분석하였다.
누드 마우스에서 이식 전 및 이식 후 7일 후의 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 세포에 의한 PD-L1 발현을 표 9에 나타낸다.
누드 마우스에서 이식 전 및 이식 후 7일 후의 인간 PD-L1 양성 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1 -/- hPD-L1 Tg 세포의 백분율
아이소타입 염색 hPD-L1 염색
이식 전 0.6% 94.7%
이식 후 1.09% 74.0%
이식 전, 대부분의 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 세포는 아이소타입 대조군 염색에 비교하여, 인간 PD-L1 양성이었다. 누드 마우스에서 이식 후 7일 후 및 종양 분해를 위한 효소적 및 기계적 처리 시에 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 세포의 약 70%가 여전히 인간 PD-L1 양성이었다.
PD-L1 인간화 마우스에서 이식 전 및 이식 후 14일 후의 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 세포에 의한 PD-L1 발현을 표 10에 나타낸다.
누드 마우스에서 이식 전 및 이식 후 14일 후의 인간 PD-L1 양성 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1 -/- hPD-L1 Tg 세포의 백분율
아이소타입 염색 hPD-L1 염색
이식 전 0.2% 92.5%
이식 후 3.6 46.2%
이식 전, 대부분의 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 세포는 아이소타입 대조군 염색에 비교하여, 인간 PD-L1 양성이었다. PD-1/PD-L1 이중 인간화 마우스에서 이식 후 14일 후 및 종양 분해를 위한 효소적 및 기계적 처리 시에 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 세포의 약 50%가 여전히 인간 PD-L1 양성이었다.
시험관 내에서 다중 종양 세포주에 의한 PD-L1 발현을 도 6에 나타낸다. 조작된 세포주 (MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg) 및 다른 인간 종양 세포주 (LOX-IMVI 흑색종 세포, MDA-MB-231 유방암 세포, 및 SK-Br-3 유방암 세포)에 의한 PD-L1의 발현 수준이 얼마나 비슷한지를 평가하기 위하여, 항-PD-L1 항체 염색의 용량 적정을 수행하였다. 도 6은 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg가 최고 수준의 인간 PD-L1 발현을 나타냈고 (도 6A) SK-Br-3이 최저 발현을 나타냈으며, 이때 PD-L1은 검출할 수 없었고 (도 6D), 반면 LOX-IMVI 및 MDA-MB-231에 의한 PD-L1 발현은 중간이었다 (MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg보다 약 5배 더 낮음)(도 6B 및 6C).
제 2 실험에서, 각각 100 ng/mL의 hIFNγ / mIFNγ로 밤새 처리하는 시험관내 처리가 있거나 없이, LOX-IMVI와 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 사이의 추가의 비교를 수행하였다. 도 7은 PD-L1의 중간 형광 세기가 염색을 위해 사용된 항-PD-L1 항체의 약 150 nM에서 고원에 도달하였음을 보여준다. 기준선에서, LOX-IMVI에 의한 PD-L1 발현은 중간이었다 (MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg보다 약 6 내지 7배 더 낮음). mIFNγ로 처리했을 때에는, MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 상에서 PD-L1 염색에 대한 변화가 없었던 반면, 인간 PD-L1 염색의 3배 증가를 hIFNγ로의 처리 후에 LOX-IMVI에서 볼 수 있었다.
누드 마우스에서 이식 후 약 3주 후의 LOX-IMVI 및 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 세포에 의한 생체외 PD-L1 발현을 표 11 및 12에 나타냈다.
누드 마우스에서 이식 후 약 3주 후의 PD-L1 양성 LOX-IMVI 및 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1 -/- hPD-L1 Tg 세포의 백분율
아이소타입 염색 hPD-L1 염색
LOX-IMVI 0.2% 56.6%
MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 0.2% 96.2%
누드 마우스에서 이식 후 약 3주 후의 LOX-IMVI 및 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1 -/- hPD-L1 Tg 세포에 의한 PD-L1의 평균 형광 세기
종양 1 종양 2
LOX-IMVI 8479.1 12121.5
MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 49589.1 51445.0
종양 분해를 허용하기 위한 효소적 및 기계적 처리 시에, 세포를 항-PD-L1 항체 (20μg/mL)로 염색하였다. LOX-IMVI 상에서의 PD-L1 발현 수준은 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 종양 세포 상에서의 그것보다 약 5배 더 낮았다.
실시예 6: 누드 마우스에서 hPD-L1 양성 종양에 대한 방사성 표지된 항-PD-L1 항체의 선택적 국지화
항-PD-L1 항체의 생체내 국지화를 측정하기 위하여, 지르코늄-89 표지된 DFO-항체 콘쥬게이트를 PD-L1 양성 종양을 갖고 있는 누드 마우스에 정맥내로 투여하였다.
연구를 위해 사용된 종양 라인은 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg로 언급되는 쥐과의 결장 암종 세포주였고, 그것은 야생형 MC38에서 쥐과의 PD-L1을 녹아웃시키고 전장 인간 PD-L1 및 eGFP와 융합된 전장 닭 오브알부민을 과다 발현하도록 조작되었다. 인간 PD-L1의 내인성 발현을 포함한 종양의 제 2 연구에서, 인간 흑색종 세포주 LOX-IMVI를 사용하여 후속적인 항-PD-L1 항체 국지화 연구를 위해 종양을 생체내에서 확립하는 데 사용하였다.
이 연구를 위해 사용한 예시적인 방사성 표지된 항-PD-L1 항체는, SEQ ID NO: 82/90의 HCVR/LCVR을 포함하는 H1H8314N이었다.
제 1 연구를 위하여, 1 x 106 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 세포를 생후 8 내지 10주령의 수컷 NCr 누드 마우스 (Taconic, Hudson NY)의 우측 옆구리에 피하로 이식하였다. LOX-IMVI 종양에 대해, 1 x 106 세포를 생후 8 내지 10주령의 수컷 NCr 누드 마우스의 우측 옆구리에 피하로 이식하였다. 종양이 50 내지 150 mm3의 평균 부피에 도달하고 나면 (약 7 내지 10일), 마우스들을 무작위로 여러 그룹으로 나누고, 89Zr 표지된 항-PD-L1 DFO-항체 콘쥬게이트 (H1H8314N) 또는 89Zr 표지된 비-결합 아이소타입 대조군 DFO-항체 콘쥬게이트로 투약하였다. MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 종양을 갖고 있는 누드 마우스는 50 ± 1 uCi의 89Zr 표지된 항체를 받았고, 이때의 단백질 용량은 약 0.6 mg/kg이었다. LOX-IMVI 종양을 갖고 있는 마우스를 사용하는 연구에서는, 마우스들은 35 ± 1 uCi의 89Zr 표지된 항체를 받았으며, 이때 최종 항체 용량은 0.3 또는 1 mg/kg이었다.
항체 국지화의 PET 영상화를 항체의 투여 후 6일 후에 평가하였다. Sofie Biosciences G8 PET/CT (Sofie Biosciences and Perkin Elmer)를 사용하여 영상을 얻었다. 기기는 영상 획득 전 89Zr의 검출을 위해 사전 보정하였다. 에너지 윈도우 범위는 150 내지 650 kev였고 시야의 중심에서 1.4 mm의 재구성된 해상도를 가진다. 마우스를 아이소플루란을 사용하여 마취를 유도하였고, 영상화 중에 아이소플루란의 연속적 흐름 하에 유지시켰다. 정적(static) 10-분 영상들을 G8 획득 소프트웨어를 사용하여 얻고 계속해서 사전-구성된 설정을 사용하여 재구성하였다. 영상 데이터를 붕괴(decay) 및 다른 매개변수들에 대해 보정하였다. CT 영상들을 PET 획득 후에 획득하고 나중에 PET 영상들과 공동으로 등록하였다. 영상을 VivoQuant 후처리 소프트웨어 (inviCRO Imaging Services)를 사용하여 제조하였다.
생체 분포에 대하여, 마우스를 최종 시점 (투여 후 5 내지 6일)에 안락사시키고 혈액을 심장 천공을 통해 수집하였다. 그런 후 종양 및 정상 조직을 절개하고 카운팅 튜브에 놓았다. 각 샘플에 대한 중량을 측정하고 기록하였다. 그런 다음 CPM으로 표시하는 89Zr에 대한 카운트 데이터를 자동 감마 카운터 (Wizard 2470, Perkin Elmer) 상에서 샘플을 측정함으로써 수집하였다. 그램당 퍼센트-주입 용량 (%ID/g)을 주입된 물질로부터 제조한 표준을 사용하여 각 샘플에 대해 계산하였다.
각 항체에 대한 평균 %ID/g을 표 13에 제시한다.
분석된 조직에서의 평균 %ID/g
샘플 89Zr-H1H8314N 89Zr-아이소타입 대조군 항체
평균 %ID/g STDEV %ID/g 평균 %ID/g STDEV %ID/g
간 3.1 0.4 0.9 0.9
비장 4.4 1.1 1.5 1.3
신장 4.0 0.7 1.4 1.6
뼈 5.1 2.6 1.7 1.6
폐 5.1 1.1 2.5 3.0
심장 2.4 0.2 1.3 1.4
혈액 7.6 1.6 3.8 4.6
흉선 5.3 3.0 2.8 2.2
MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 55.3 12.2 3.0 3.3
소장 1.5 0.3 0.6 0.6
이것으로부터, MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 종양에서 분명한 고흡수가 다른 정상 조직에 대해서도 나타났고, 이때 55.3 %ID/g의 종양 흡수가 흉선에서 관찰된 다음으로 높은 5.3 %ID/g의 흡수보다 상당히 더 높았다. 종양 흡수는 혈액 및 간에서의 활성보다 각각 7.3배 및 17.8배 더 높았다. 종양으로의 항-PD-L1 흡수의 특이성 (55.3% ID/g)은 비-결합 아이소타입 대조군 항체에 대해 관찰된 3%의 상당히 감소된 종양 흡수와 비교하여 나타났다. 여기서 수행된 파일럿 PET 영상화는 89Zr 표지된 항-PD-L1 DFO-항체 콘쥬게이트의 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 종양으로의 분명한 국지화를 증명하였다. 이 제 6일 투약 후 시점에서 아주 적은 바탕 신호를 동물에서 관찰하였다. 항-PD-L1 항체를 사용하여 나타난 분명한 종양 국지화와는 대조적으로, 이 모델에서 대조군 항체의 영상화에서는 단지 희미한 바탕 활성만이 나타났다. 영상화는 분명하게, 인간 PD-L1 양성 종양에서 항-PD-L1 항체의 높은, 특이적 흡수를 나타냈고, 이것은 NCr 누드 마우스에서 89Zr 방사성 표지된 항-PD-L1 항체의 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 종양으로의 국지화를 보여준다.
제 2 연구에서, 항-PD-L1 항체가 인간 PD-L1 항원의 내인성 수준을 발현하는 종양을 선태적으로 표적화하는 능력을 평가하였다. 여기서, 인간 LOX-IMVI 흑색종 종양을 갖고 있는 마우스에게 0.3 및 1 mg/kg의 용량의 89Zr 표지된 항체를 투여하였다. 다시, 혈액, 종양 및 조직을 주사 후 제 6일에 취하여 샘플에 대한 %ID/g을 계산하였다. 각 항체에 대한 평균 %ID/g을 표 14에 제시한다.
제 2 연구 (LOX-IMVI 종양)로부터 분석된 조직에서의 평균 %ID/G
　 89 Zr-DFO-H1H8314N
0.3 mg/kg 		89 Zr-DFO-H1H8314N
1 mg/kg 		89 Zr-아이소타입 대조군 항체
1 mg/kg
샘플 평균 %ID/g STDEV %ID/g 평균 %ID/g STDEV %ID/g 평균 %ID/g STDEV %ID/g
간 2.9 0.3 3.3 0.2 3.9 0.3
비장 4.2 0.2 4.3 0.9 4.2 0.7
신장 4.3 0.4 4.3 0.8 3.4 0.4
뼈 3.2 0.6 2.7 0.5 3.6 0.4
폐 5.7 1.0 6.6 1.6 5.9 1.2
심장 3.2 0.8 3.2 0.4 2.9 0.6
혈액 8.1 1.4 9.5 1.0 11.1 6.2
흉선 5.3 2.3 5.6 0.7 4.9 1.4
LOX-IMVI 종양 20.6 2.7 10.6 2.6 12.0 1.8
소장 1.5 0.2 1.8 0.4 2.0 0.3
더 적은 0.3 mg/kg 용량에서, 정상 조직 상에서 종양으로의 분명한 표적화가 관찰되었고, 이때 LOX-IMVI 종양에서는 20.6 %ID/g이 관찰되었다. 마우스가 더 높은 1 mg/kg 용량을 받았을 때, 10.6 %ID/g의 감소된 종양 흡수가 0.3 mg/kg 수준에 비해 관찰되었다. 이것은 더 높은 단백질 용량 및 아마도 후속된 미표지 항체의 더 높은 분획이 89Zr 표지된 항-PD-L1 항체에 의한 종양 흡수의 차단으로 이어졌음을 시사한다. 이것에 따르면, 생체분포 연구 직전에 수행된 PET 영상화는 또한 1 mg/kg 용량에서의 흡수가 대조군 항체의 그것과 대략 동등하였음을 보여주었다. 0.3 mg/kg의 더 낮은 용량에서, 항-PD-L1 항체의 종양 국지화의 분명한 증가가 대조군 항체에 대하여 나타났다. 종합적으로, PET 영상화 및 생체분포 데이터는 항-PD-L1 항체의 0.3 mg/kg 용량에서 LOX-IMVI 종양의 특이적 표적화를 증명해준다.
실시예 7: 마우스에서 방사성 표지된 항-PD-L1 항체의 hPD-L1 양성 종양으로의 선택적 국지화
이 실시예는 PD-L1에 대해 인간화된 마우스에서 지르코늄-89 표지된 DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트 의 생체내 국지화를 설명한다. 이 실시예에서 사용한 예시적인 항체는 SEQ ID NO: 82/90의 HCVR/LCVR 을 포함하는 H1H8314N이었다.
PD-L1에 대해 인간화된 마우스를 VelociGene® 기술 (Valenzuela et al 2003, Nat. Biotechnol. 21: 652-659; 미국 측허 출원 공개 US2016/0157469)을 사용하여 조작하였다.
사용한 종양 라인은 eGFP와 융합된 전장 닭 오브알부민을 발현하고 야생형 MC38에서 쥐과의 PD-L1을 녹아웃시키지만 전장 인간 PD-L1을 과다 발현하도록 사내에서 조작된, MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg로 언급되는, 쥐과의 결장 암종 세포주였다.
1 x 106 세포의 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg를 수컷 인간화된 PD-L1 마우스의 좌측 옆구리에 피하로 이식하였다. 종양이 50 내지 150 mm3의 평균 부피에 도달하게 되면 (약 제 7일), 마우스를 무작위로 여러 그룹으로 나누고, 89Zr 표지된 항-PD-L1 DFO-항체 콘쥬게이트 또는 89Zr 표지된 비-결합 아이소타입 대조군 DFO-항체 콘쥬게이트 중 하나를 투여하였다. 마우스는 50 ± 1 uCi의 89Zr 표지된 항체를 받았고 이때 최종 단백질 용량은 1 또는 3 mg/kg이었다.
항체 국지화의 PET 영상화를 항체 투여 후 6일 후에 평가하였다. Sofie Biosciences G8 PET/CT (Sofie Biosciences and Perkin Elmer)를 사용하여 영상들을 획득하였다. 기기를 영상 획득 전에, 89Zr의 검출을 위해 사전 보정하였다. 에너지 윈도우 범위는 150 내지 650 kev였고 시야의 중심에서 1.4 mm의 재구성된 해상도를 가진다. 마우스를 아이소플루란을 사용하여 마취를 유도하였고, 영상화 중에 아이소플루란의 연속적 흐름 하에 유지하였다. 정적 10-분 영상들을 G8 획득 소프트웨어를 사용하여 얻고 계속해서 사전-구성된 설정을 사용하여 재구성하였다. 영상 데이터를 붕괴 및 다른 매개변수들에 대해 보정하였다. CT 영상들을 PET 획득 후에 획득하고 나중에 PET 영상들과 공동으로 등록하였다. 영상을 VivoQuant 후처리 소프트웨어 (inviCRO Imaging Services)를 사용하여 제조하였다.
생체 분포에 대하여, 마우스를 최종 시점 (투여 후 5 내지 6일)에 안락사시키고 혈액을 심장 천공을 통해 수집하였다. 그런 후 종양 및 정상 조직을 절개하고 카운팅 튜브에 놓았다. 각 샘플에 대한 중량을 측정하고 기록하였다. 그런 다음 CPM으로 표시하는 89Zr에 대한 카운트 데이터를 자동 감마 카운터 (Wizard 2470, Perkin Elmer) 상에서 샘플을 측정함으로써 수집하였다. 그램당 퍼센트-주입 용량 (%ID/g)을 주입된 물질로부터 제조한 표준을 사용하여 각 샘플에 대해 계산하였다.
결과
MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 종양을 갖고 있는 인간화된 PD-L1 마우스는 89Zr 표지된 항-PD-L1 DFO-항체 콘쥬게이트를 1 또는 3 mg/kg의 최종 항체 용량으로 받았다. 혈액, 종양 및 조직을 취하고 주사 후 제 6일에 체중을 재고 샘플에 대한 %ID/g을 각 샘플ㄹ부터의 카운트를 기반으로 계산하였다. 1 및 3 mg/kg에서 용량에 대한 평균 %ID/g을 각각 표 15 및 표 16에 제시한다.
1 mg/kg에서 항-PD-L1 항체의 분석된 조직에서의 평균 %ID/g
샘플 평균 %ID/g STDEV %ID/g
간 8.6 1.5
비장 14.1 1.1
신장 7.8 1.0
뼈 4.5 1.4
폐 7.9 3.0
심장 4.3 1.1
혈액 9.1 4.6
흉선 9.7 3.5
MC38-cOVA/eGFP-
mPD-L1-/-hPD-L1Tg 		34.1 18.0
소장 2.4 0.9
1 mg/kg 용량 수준에서, MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 종양의 분명한 종양 표적화가, 이들 인간화된 마우스의 정상 조직에서의 PD-L1 발현에도 불구하고, 34/1%의 %ID/g으로 나타난다. 이 용량에서, 89Zr 표지된 항-PD-L1 항체의 일부 국지화가 비장에서 나타났는데, 여기서 14.1 %ID/g의 항체 흡수가 관찰되었다. 그러한 흡수는 비장에서 인간 PD-L1의 마우스 PD-L1 발현 대신 인간 PD-L1의 정상적인 발현 때문에 예상된다. 3 mg/kg 항체 용량에서, 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 비장에 대한 국지화는, 이 항체 용량을 받은 마우스에서 이제 평균 9.7 %ID/g로 흡수된 것과 같이, 감소되었다 (표 16).
3 mg/kg에서 항-PD-L1 항체의 분석된 조직에서의 평균 %ID/g
샘플 평균 %ID/g STDEV %ID/g
간 6.7 1.4
비장 9.7 1.3
신장 7.0 1.1
뼈 3.6 0.6
폐 11.0 1.0
심장 4.7 0.7
혈액 12.4 2.1
흉선 7.6 0.5
MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 28.7 13.1
소장 0.4 0.2
분명한 종양 표적화가 3 mg/kg 용량에서도 여전히 관찰되었고, 이때 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 종양에 의한 흡수는 평균 28.7 %ID/g이었다. 그러므로 비록 감소된 정상 조직 국지화가 3 mg/kg 용량의 영상화에서 나타났지만, 항-PD-L1 표지된 항체의 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 종양으로의 분명한 국지화가 이 용량에서도 유지되었다. 종합적으로, 이런 결과들은 MC38-cOVA/eGFP-mPD-L1-/-hPD-L1Tg 종양의 분명한 표적화가 정상 조직 발현의 정규 부위에서 PD-L1을 발현하는 마우스에서 가능하였음을 나타낸다.
여기서 수행된 연구들로부터의 결과는 89Zr로 표지된 항-PD-L1 항체가 유의하게 및 특이적으로 종양으로 국지화되는 것을 명백하게 증명한다. 당업자는 항-PD-L1 항체가 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제로의 후속 처리를 위해 PD-L1 양성 종양을 가진 환자들의 선택에 사용되는 시나리오를 예상할 수 있다.
실시예 8: DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트를 제조하기 위한 확대 제조 공정
이 실시예는 p-SCN-bn-데페록사민 (DFO)을 본원에서 기술된 항-PD-L1 항체 (mAb, H4H8314N)에 부착시킴으로써 방사성 표지화에 적합한 항-PD-L1 항체를 제조하기 위한 확대 제조 공정을 상세하게 설명한다: (1) mAb 콘쥬게이션 전의 한외여과 및 투석여과 (UFDF) 공정은 콘쥬게이션 공정을 억제하는 부형제들을 제거한다; (2) 콘쥬게이션-전 UFDF 후에, mAb의 p-SCN-Bn-데페록사민으로의 콘쥬게이션은 DFO-mAb 콘쥬게이트를 제조하기 위해 수행된다; 및 (3) 잔류 염을 제거하기 위한 콘쥬게이션-후 UFDF는 콘쥬게이트된 단클론성 항체의 적합한 농도, 부형제 수준, 및 pH를 제공한다. 그런 다음 결과적으로 얻어지는 DFO-mAb 콘쥬게이트는 완충된 상태로 제공되고 후속 제제화를 위해 개선된 안정성을 가진다.
(1) 콘쥬게이션-전 한외여과 및 투석여과 (UFDF)
100 g의 항-PD-L1 항체를 5.50의 pH를 가지는 5 mM 아세테이트 완충 용액으로 Sius Prostream (TangenX Technology Corporation) 막 (막 용량 = 500 g/m2)을 사용하여 완충액 교환하여 콘쥬게이션 전에 잔류하는 염을 제거하였다. 공정 부피는 항체를 추가로 농축하기 위해 감소하였고, 그런 후 항체를 0.45/0.2 μm를 가지는 (이질성 PES 이중층) 또는 동등한 기공 크기를 가지는 Sartopore 2 (Sartorius) 막을 사용하여 멸균 여과하였다. 아세테이트 완충액 온도를 20±5℃의 표적 온도에서 유지하였다. 용액을 잘 혼합하였다.
(2) 콘쥬게이션
농축되고 여과된 항체 (20 g)를 아민 유리 카보네이트 완충액 시스템 (56 mM 카보네이트, 167 mM 염화나트륨, pH 9.40)을 함유한 콘쥬게이션 용기에 옮겨서 잔류 아세테이트를 무시할만한 수준으로 만들었다. DFO (25 mM p-SCN-Bn-데페록사민)를DMSO에 용해시켜서 추가적인 DMSO와 함께 콘쥬게이션 용기에 첨가하여서, DMSO가 5%의 최종 양으로 존재하도록 하였다. DFO를 4.5:1 DFO 대 mAb의 비율로 몰 과다량으로 첨가하였다. 총 반응 부피는 2.0 L였다. 완충액 시스템을 반응 성분들을 첨가하는 동안 및 반응 시간 내내 혼합하였다.
반응 온도를 반응 시간에 대한 온도와 관련된 식을 사용함으로써 특정 시간에 대해 제어하였다. 이 경우에, 반응 온도를 120분 동안 18℃에서 유지하였다. 반응을 2M 아세트산 (23 mL/L)을 첨가함으로써 퀀칭하여, pH 6을 가진 용액을 얻었다.
(3) 콘쥬게이션-후 UFDF
콘쥬게이션 단계 후에, 퀀칭한 DFO-mAb 콘쥬게이션 용액을 히스티딘 완충액 (10 mM 히스티딘, pH 5.50, 전단 보호제로서 첨가된 0.0005% (w/v)의 초정제 폴리소르베이트 80이 포함되어 있음)으로 완충액 교환하여 잔류하는 공정 염, DMSO, 및 미반응 DFO를 제거하였다. 투석여과된 후에, 용액을 농축하고 계속해서 제제화하였다. 히스티딘 완충액을 -80℃에서의 장기간 보관을 위해 선택하였다. 단계 (1)에서 언급한 것과 동일한 Sius Prostream 막을 최종 UFDF 단계에서 사용하였다. 결과적으로 농축된 DFO-mAb 콘쥬게이트 용액을 상기에서 언급한 Sartopore 2 필터를 사용하여 멸균 여과하였다.
UV-DAR (1.5의 표적) 및 단백질 농도 측정을 실시예 2에서 기술한 것과 같이 수행하였다.
몰 흡광 계수 및 분자량
항체 MW (g mol -1 ) ε280 (L g -1 cm -1 ) ε252 (L g -1 cm -1 )
H4H8314N 144984 211480 80172
실시예 9: IV 용량의 89 Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트가 제공될 인간 대상체에서 방사능의 예측된 전신 및 조직 노출
다음 실험의 목적은 정맥내 (IV) 용량의 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트로 인한 인간 대상체에서 방사능에 대한 예측된 전신 및 조직 노출을 평가하는 것이었다. 방사성 표지된 콘쥬게이트에 사용한 예시적인 항-PD-L1 항체는 H4H8314N이었다.
방사성면역콘쥬게이트의 특성화
항-PD-L1 면역콘쥬게이트 (DFO-Ab) 및 아이소타입 대조군 면역콘쥬게이트 (DFO-IgG4P 대조군)를 생체내 영상화 및 생체분포 연구에 사용하기 위하여 방사성 표지화하고 정제하였다. SEC-HPLC 분석 및 MC38/mPD-L1-/-/hPD-L1 (마우스 PD-L1을 녹아웃하고 인간 PD-L1을 안정적으로 발현하도록 조작된 쥐과 MC38 결장 선암종 세포) 세포-기반 시험관내 검정을 수행하여 결과적으로 얻어진 방사성 면역콘쥬게이트를 특성화하였다.
모노머 및 방사화학적 순도
UV- 및 γ-방출 검출기를 사용하는 SEC-HPLC를 수행하여 모노머 및 방사화학적 순도를 평가하였다. 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 방사성 면역콘쥬게이트 조제물 및 아이소타입 대조군 방사성면역콘쥬게이트 89Zr-DFO-IgG4 P의 조제물에 대한 결과들을 도 8에 나타낸다.
280 nm에서의 흡광에 대한 크로마토그램의 분석을 수행하여 방사성면역콘쥬게이트 조제물에서의 고분자량 (HMW) 및 모노머 단백질의 상대적인 양을 평가하였다. 표 18에서 요약한 것과 같이, 모노머 피크 (모노머 순도의 판독)는 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트 및 아이소타입 대조군 89Zr-DFO-IgG4P의 조제물들에 대한 총 단백질 피크 면적의, 각각 99.6, 99.2, 및 98.6%를 구성한다; 저수준의 HMW 종들 (각각 0.4, 0.8, 및 1.4%) 또한 검출되었다. 저분자량 (LMW) 종은 테스트된 샘플 중 어느 것에 대해서도 관찰되지 않았다.
γ-방출에 대한 방사성-크로마토그램의 분석을 수행하여 통합되지 않은 89Zr (예컨대 유리 89Zr 또는 유리 DFO-유도체로 킬레이트화된 89Zr)과 비교하여 방사성면역콘쥬게이트로 통합된 89Zr의 상대적인 양을 평가하였다. 표 18에서 요약한 것과 같이, 통합되지 않은 89Zr에 대한 피크는 총 γ-방출 피크 면적의 1.1% 이하를 구성한 한편, 방사성 표지된 모노머 및 HMW 종에 대한 조합된 피크 (방사화학적 순도의 판독)는 각각, 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트 및 아이소타입 대조군 89Zr-DFO-IgG4P의 조제물들에 대한 총 γ-방출 피크 면적의 98.9, 99.5, 및 99.5%를 구성한다.
SEC-HPLC 데이터의 요약
피크 번호 종 대략적인 보유
시간 (분) 		피크 면적 (%)
UV-
크로마토그램 		방사성-
크로마토그램
89Zr-DFO-H4H8314N 연구 1
1 HMW 13 0.4 1.1
2 모노머 16 99.6 97.8
3 통합되지 않은 89Zr 26 n/a 1.1
89Zr-DFO-H4H8314N 연구 2
1 HMW 14 0.8 1.3
2 모노머 16 99.2 98.2
3 통합되지 않은 89Zr 26 n/a 0.5
89Zr-DFO-IgG4P 대조군
1 HMW 13 1.4 1.5
2 모노머 16 98.6 98.0
3 통합되지 않은 89Zr 26 n/a 0.5
SEC-HPLC 분석에 대한 수치를 도 8에서 그래프로 나타낸다. UV-크로마토그램은 280 nm에서의 흡광에 대한 크로마토그램을 나타내고, 방사성-크로마토그램은 γ-방출의 세기에 대한 크로마토그램을 나타낸다. HMW: 고분자량; n/a: 적용할 수 없음.
면역반응성
그것의 항원에 결합할 수 있는 방사성 표지된, 콘쥬게이트된 항체의 퍼센트의 척도인 면역반응성을, 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트를 MC38/mPD-L1-/-/hPD-L1 세포와 인큐베이션함으로써 측정하였다. 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 2개의 테스트된 로트는 에 대한 84.5 및 88.8%의 면역반응성을 증명하였다 (표 19). 아이소타입 대조군 방사성면역콘쥬게이트에 대해서는 8.8%의 바탕, 비특이적 면역반응성을 관찰하였다.
89 Zr 표지된 항-PD-L1 DFO-항체 콘쥬게이트 및 아이소타입 대조군 89 Zr-DFO-IgG4 P 의 면역반응성
방사성면역콘쥬게이트 면역반응성
89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트 (로트 1) 84.5%
89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트 (로트2) 88.8%
아이소타입 대조군 89Zr-DFO-IgG4P 8.8%
결론적으로, 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 2개의 별도의 로트는 높은 면역반응성, 모노머의 백분율, 및 방사화학적 순도를 나타냈다.
마우스에서 89 Zr-DFO-항-PD-L1 생체분포
이 실험은 단일한 50 μCi (1 mg/kg) 정맥내 (IV) 용량의 PD-L1/PD-1-인간화된 마우스 (PD-1hu/huPD-L1hu/hu)로의 투여 후 시간 경과에 따른 항-인간 PD-L1 방사성면역콘쥬게이트, 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 생체분포를 평가하였다. H4H8314N이 마우스 PD-L1에 결합하지 않기 때문에, PD-L1 엑토도메인을 암호화하는 마우스 PD-L1 유전자의 부분을 PD-1hu/hu-PD-L1hu/hu 마우스에서의 상응하는 이간 서열에 의해 교체하였다. 이 스트레인에서, 마우스 PD-1의 엑토도메인을 유사하게 인간화하였다. 이런 마우스들은 면역/염증성 도전을 수행하지 않았고, 그러므로 면역 세포 상에서 자극되지 않은 수준의 PD-L1 발현을 가질 것으로 예상된다. 각 8마리씩의 2개 그룹을 투약 후 제 6일 (144시간) 또는 10일 (240시간) 후에 희생시키고, 혈액을 수집하고 다음의 조직을 수득하였다: 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 위, 소장, 맹장, 대장, 뼈 (대퇴골), 흉선, 근육, 방광, 및 뇌. 특정 조직 또는 혈액으로 국지화된 총 주입 용량 (%ID)의 방사능의 백분율을 측정하였고 조직의 그램당 평균 %ID (%ID/g)로서 기록하였다. 희생에 앞서, 면역-PET/컴퓨터 단층촬영 (CT) 영상을 동일한 동물들로부터 투약 후 1, 24, 48, 72, 144, 192시간 (8-일 그룹 단독), 및 240 (10-일 그룹 단독) 시간에 획득하였다.
혈액에서의 89Zr 수준에 대하여, 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 특이적 조직으로의 흡수는, 생체외 조직 분석 (표 20 및 도 9) 및 생체내 영상화에 의해 평가되는 바, 10-일 연구 기간 전체를 통해 무시할만하였다. 혈액 (9.4±2.2%ID/g)과 비교할 때, 수득한 모든 조직은, 비장을 제외하고는, 투약 후 제 6일째에 더 낮은 89Zr 수준 (=6.7%ID/g)을 증명하였다. 비장에서는, 적은 정도의 표적-매개된 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트 흡수 (10.2±1.9%ID/g)를 관찰하였고, 이것은 유동 세포분석에 의해 증명되는 것과 같이, 비장 세포 상에서의 PD-L1 발현과 일치한다. 투약 후 제 10일째에, 혈액에서 89Zr 수준은 투약 후 제 6일에 비해 7.8배 감소하였고, 이것은 마우스-항-인간 항체 (MAHA) 반응이 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트 수준에 영향을 준 것을 시사한다. 이런 관찰된 MAHA 반응은 표적인 PD-L1이 항원-제공 세포 (Francisco, 2010) 상에서 발현되어 인간 항체가 마우스 면역 체계에 제공되고 후속되는 MAHA 형성을 유도한다는 사실로 인한 가능성이 있다. 동시에, 간에서의 89Zr 수준은, 아마도 MAHA/89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트 면역 복합체 (IC) 형성 및 후속되는 간-매개된 IC 소멸 (Rojko, 2014)의 결과로서, 투약 후 6일 후와 비교하여 제 10일에 4.1배 증가하였다. 생체내 PET 영상화에서 전체 동물은 비장에 대한 낮은 신호 및 상기 기술된 간에서의 MAHA-매개된 축적을 뛰어 넘는, 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 뚜렷한 조직-특이적 흡수를 알아내지 못하였다.
요약하면, 혈액에서의 89Zr 수준을 넘는, 상기 특정 조직으로의 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 뚜렷한 표적-매개된 흡수는 비장을 제외하고, 1 mg/kg (50 μCi)의 단일 IV 용량의 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트가 투여된 PD-L1/PD-1-인간화된 마우스에서 6-일 기간에 걸쳐 관찰되지 않았고, 적은 정도의 표적-매개된 흡수가 비장세포 상에서의 PD-L1의 증명된 발현과 일치하여 관찰되었다. 제 6일을 지나 투약 후 제 10일에 연구가 끝날 때까지 수집한 데이터는 MAHA 반응에 의해 영향을 받았다.
평균 생체외 생체분포 데이터
조직 투약 후 제 6일에서의 89 Zr 수준
(%ID/g) 		투약 후 제 10일에서의 89 Zr 수준 (%ID/g)
평균 SD 평균 SD
혈액 9.4 2.2 1.2 1.4
심장 3.1 0.6 1.2 0.4
폐 5.9 0.7 2.6 0.7
간 4.9 1.9 20.2 7.8
비장 10.2 1.9 12.1 3.0
신장 5.3 1.1 3.9 1.3
위 0.9 0.3 0.4 0.1
소장 1.5 0.3 0.9 0.1
맹장 1.0 0.2 0.6 0.2
대장 1.4 0.3 0.7 0.2
뼈 (대퇴골) 6.3 2.1 6.9 1.4
흉선 6.7 1.6 5.3 1.1
근육 0.9 0.1 0.5 0.1
방광 4.3 2.1 1.7 0.9
뇌 0.4 0.1 0.2 0.1
약어: %ID/g = (조직의) 그램당 주사된 용량 퍼센트
인간에서 방사능에 대한 전신 및 조직 노출의 추정
이 실험은 50 μCi (1 mg/kg)의 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 단일 IV 투여 후 1, 24, 48, 72, 144, 192, 및 240시간째에 영상화된 4마리의 PD-1/PD-L1-인간화된 수컷마우스 및 4마리의 PD-1/PD-L1-인간화된 암컷 마우스에 대한 PET/CT 영상 데이터를 사용하였다. 이런 임상적으로 관련된 용량에 의해 생성된 데이터는 방사능에 대한 인간 노출의 추정치를 게산하는데 사용되었다. 조직 농도 데이터를 관심 부피 (VOI) 분석을 사용하여 측정하였다.
방사선 선량측정 추정을 위해, 평균 체류 시간을 다음의 영역들에 대해 측정하였다: 뇌, 위 내용물, 심장 내용물, 신장, 간, 폐, 근육, 적색 골수, 비장, 방광 내용물, 및 신체의 나머지. 이런 평균 체류 시간 값들을 인간에서 평균 흡수된 조직 용량 및 유효 용량을 추정하기 위한 OLINDA/EXM 1.1 소프트웨어 프로그램에 입력값으로서 사용하였다.
89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트에 유효한 인간 용량은 성인 남성에서 0.513 mSv/MBq (밀리시버트/메가베크렐) 및 성인 여성에서 0.622 mSv/MBq인 것으로 추정되었다. 인간에서 최고 흡수 용량을 가지는 것으로 예측된 기관은 비장 및 간이었다. 비장에서 추정된 흡수 용량은 성인 남성에서는 0.856 mSv/MBq이었고 성인 여성에서는 1.12 mSv/MBq이었다. 간에서의 추정된 흡수 용량은 성인 남성에서는 0.764 mSv/MBq이었고 성인 여성에서는 0.974 mSv/MBq이었다.
각 VOI에 대한 수컷 및 암컷 마우스 (n = 4마리 수컷, n = 4마리 암컷)에 대한 mK당 주사된 용량의 붕괴-보정된 퍼센트 (DC %ID/mL)를 표 21에서 요약한다.
Figure pct00010
추정된 인간 평균 체류 시간 (MRT) 값을 공급 기관의 각각에 대해 표 22에 제공한다. 신체의 나머지에서의 MRT를 모든 공급 기관 체류 시간의 합을 89Zr 붕괴 상수의 역수로부터 뺌으로써 얻었다 (Huang et al., Biodistribution, toxicity and radiation dosimetry studies of the serotonin transporter radioligand 4-[18F]-ADAM in rats and monkeys. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2010; 37: 545-555). 이것은 누적된 조직 방사능의 보수적 추정(conservative estimation)을 나타낸다.
인간 평균 체류 시간 (시간)
물리적 붕괴 1 쌍지수 맞춤 2
기관/조직 여성 남성 여성 남성
뇌 0.398 0.364 0.372 0.344
위 내용물 0.511 0.476 0.492 0.480
심장 내용물 2.433 2.279 2.290 2.154
신장 0.868 0.818 0.832 0.794
간 5.902 5.919 8.240 5.938
폐 2.508 2.772 2.411 2.642
근육 17.635 23.677 13.348 17.182
적색 골수 2.777 2.024 2.613 1.913
비장 0.996 0.871 1.053 0.910
방광 내용물 0.299 0.491 0.315 0.405
신체의 나머지 78.794 73.430 81.157 80.361
16일 후 시점에서 물리적 붕괴만을 추정하는 계산된 평균 체류 시간
2데이터의 쌍지수 맞춤으로부터 계산된 평균 체류 시간
OLINDA/EXM 1.1 성인 남성 및 성인 여성 팬텀에 대한 모든 표적 기관에 대한 추정된 흡수된 조직 용량을 표 23에 제공한다. 국제 방사선 방호 위원회 (ICRP) (International Commission on Radiological Protection. 1990 Recommendations of the International Commission on Radiological Protection. ICRP Publication 60, Pergamon Press, New York, 1991)에 의해 규정된 유효 용량은 확률적인 위험 가중 인자에 의해 주어진 기관에 대한 흡수 용량을 곱하고 측정된 용량을 함께 더함으로써 계산된 양이다. 추정된 유효 용량을 표 23의 마지막에 제공한다. 이 값들은 방사성 흡수 용량의 보수적 추정을 나타낸다.
추정된 인간 조직 흡수 용량 및 유효량
기관/조직 물리적 붕괴 1 쌍지수 맞춤 2
성인 남성
(mSv/MBq) 		성인 여성
(mSv/MBq) 		성인 남성
(mSv/MBq) 		성인 여성
(mSv/MBq)
부신 0.561 0.702 0.567 0.726
뇌 0.179 0.237 0.182 0.234
가슴 0.366 0.459 0.379 0.466
담낭 벽 0.601 0.692 0.610 0.751
LLI 벽 0.519 0.652 0.530 0.651
소장 0.563 0.600 0.582 0.605
위 벽 0.575 0.714 0.584 0.718
ULI 벽 0.553 0.685 0.571 0.700
심장 벽 0.789 0.973 0.781 0.964
신장 0.650 0.773 0.641 0.774
간 0.764 0.974 0.764 1.220
폐 0.575 0.705 0.561 0.700
근육 0.396 0.481 0.381 0.464
난소 0.533 0.645 0.542 0.642
췌장 0.597 0.743 0.606 0.765
적색 골수 0.480 0.591 0.483 0.587
골형성 세포 0.604 0.777 0.625 0.779
피부 0.291 0.373 0.297 0.374
비장 0.856 1.120 0.876 1.160
고환 0.399 NA 0.407 NA
흉선 0.481 0.605 0.484 0.601
갑상선 0.417 0.484 0.423 0.480
방광 벽 0.580 0.496 0.559 0.494
자궁 0.545 0.638 0.554 0.636
총 신체 0.440 0.550 0.440 0.554
유효량 0.513 0.622 0.516 0.625
16일 후 시점에서 물리적 붕괴만을 추정하는 MRT로부터 계산된 흡수 용량
2데이터의 쌍지수 맞춤으로 MRT로부터 계산된 흡수 용량
약어: LLI = 하부 대장, ULI = 상부 대장, NA = 적용할 수 없음
물리적 붕괴 및 쌍지수 맞춤 방법으로부터 추정된 인간 조직 흡수 용량 및 유효한 인간 용량 (표 23)은 유사하였다. 이 쥐과 모델에서 외관상 MAHA 반응으로 인한 추정된 인간 조직 흡수 용량 및 유효 용량의 최종 세트를 제조하기 위해 물리적 붕괴 방법을 선택하였다. 그러므로, 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트 에 대한 유효한 인간 용량은 성인 남성에서는 0.513 mSv/MBq 및 성인 여성에서는 0.622 mSv/MBq인 것으로 추정하였다. 인간에서 최고 흡수 용량을 가지는 것으로 예측된 기관은 비장 및 간이었다. 비장에서 추정된 흡수 용량은 성인 남성에서는 0.856 mSv/MBq이었고 성인 여성에서는 1.12 mSv/MBq이었다. 간에서 추정된 흡수 용량은 성인 남성에서는 0.764 mSv/MBq이었고 성인 여성에서는 0.974 mSv/MBq이었다.
실시예 10: 진행형 흉부 악성종양을 가진 환자들에서 89 ZrDFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트를 사용하는 종양의 PD-L1의 면역PET 영상화
이 연구의 일차 목적은 89Zr-DFO-항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 안전성 및 관용성을 측정하는 것이고, 이때 방사성 표지된 콘쥬게이트에서 사용된 항-PD-L1 항체는 H4H8314N이다. 연구의 이차 목적은 다음과 같다:
· 연구 파트 A 단독: 트레이서 투입 후 영상화 및 채혈에 의해 평가되는 바, 89ZrDFO항-PD-L1 항체 콘쥬게이트의 적당한 대량 용량 및 투입 후 최적 영상화 시간을 확립하기.
· 연구 파트 B 단독: 파트 A에서 측정되는 최적 대량 용량 및 영상화 시점에서 두 개의 별도의 트레이서 투이에 대해 평가되는 바 PET 측정의 검사/재검사 신뢰도를 확립하기.
· 트레이서 혈장내 활성 농도를 기반으로 의 약물동역학 (PK) 프로파일을 특성화하기.
이것은 89ZrDFO항-PD-L1의 안전성 및 관용성을 평가하기 위해 설계된 오픈 라벨, 2-파트 연구이다. 연구 파트 A는 89ZrDFO항-PD-L1의 적당한 대량 용량 및 호라성 용량 및 최적의 투입 후 영상화 시간을 확립할 것이다. 89ZrDFO항-PD-L1의 검사/재검사 가변성은 파트 B에서 평가될 것이다.
모든 환자들은 선별 과정을 거칠 것이다. 적격 기준을 충족하는 환자들은 18F-플루오로데옥시글루코오스 (18F-FDG) PET/컴퓨터 단층촬영 (CT) 및 진단용 CT 스캔이 진행되어서 병변 생존성, 위치, 및 크기가 평가될 것이다. 이런 스캔들은 89ZrDFO항-PD-L1의 예상된 제 1 투여의 28일 이내에 얻어진 적당한 품질의 영상들이 활용될 수 있다면 필요하지 않을 것이다.
파트 A
3개의 순차적인 용량 집단을 5　mg, 10　mg, 또는 20　mg의 89ZrDFO항-PD-L1로 오픈-라벨로 처리되는 것으로 계획한다.
89ZrDFO항-PD-L1을 투입한 후, 환자들을 제 1일, 제 4　±　1일 및 제 7　±　1일에 89ZrDFO항-PD-L1 PET/CT 스캔을 진행할 것이다. 추가적인 영상화는 제 10일에 수행될 수 있다. 환자들은 안전성 평가를 진행할 것이고 혈액학, 화학, 면역 안전성 검정, 약물동역학, 항-약물 항체 분석, 및 생체마커 분석을 위해 샘플을 제공할 것이다.
환자들은 89ZrDFO항-PD-L1 트레이서의 투입 후 최대 21일까지, 신체 검사, 바이탈 신호, 및 부작용 (AE)의 기록을 포함한 안전성 평가를 계속 진행할 것이다.
적당한 용량을 확인하기 위한 용량의 단계적 확대 결정은 아래에서 기술되는, 안전성 및 관용성 데이터에 의해 및 면역-양전자 방출 단층촬영 (iPET) 양성 및 트레이서 혈장 활성 농도의 평가에 의해 고지될 것이다.
파트 A에서의 용량 집단
최대 3개의 상승적인 대량 용량 집단을 계획한다. 각 대량 용량 집단에 대해, 초기 2명의 환자에게, 각 환자의 투약 사이에 최소 48시간의 간격을 두로 투약할 것이다. 주어진 대량 용량에서 제 2 환자에 대해 제 7　±　1일이 끝났을 때 PET/CT 스캔을 하고, 모든 이용할 수 있는 영상화, 트레이서 혈장 활성 농도, 임상적 선량측정, 및 안전성 데이터를 검토할 것이다. 이 검토를 기반으로, 다음에 대한 결정이 내려질 것이다:
· 1보다 큰 종양-대-혈액 비율에 의해 규정되는바, 적어도 1명의 환자에서 종양 흡수 양성/종양 국지화가 있다면, 집단을 6명의 환자로 확대한다.
· 최적 영상화 시점에서 1 내지 5 범위의 혈액 표준화된 흡수 값 (SUV)에 의해 적당하게 규정되는 바, 부적당한 종양 흡수 및 혈장 트레이서 활성 농도가 있다면 다음의 대량 용량으로 올라간다.
· 부적당한 종양 흡수 및 적당한 혈장 트레이서 활성 농도를 기반으로, 더 낮은 대량 용량에서 다음 대량 용량으로 진행한다.
만약 모든 3가지 제안된 대량 용량 수준에서 종양 국지화가 적어도 2명의 환자에게서 부적당하고, 이것이 낮은 영상 신호-대-노이즈로 인한 것으로 측정된다면, 활성 용량은 이전에 검사된 대량 용량 집단의 추가의 확대를 위해 최대 185 MBq까지 증가될 것이다.
파트 B
연구 파트 B는 일단 파트 A에서 적당한 89ZrDFO항-PD-L1 용량 및 최적의 영상화 시간이 측정된다면 시작될 것이다. 파트 B의 제 1일에, 환자들은 트레이서 대량 용량을 받을 것이다. 트레이서를 받은 것에 계속해서, 환자들은 파트 A에서 확인된 최적의 시간에 스캔이 진행될 것이다. 파트 B에서 환자들은 14 내지 28일의 용량 간 간격 후에 제 2 트레이서 용량을 받을 것이고 스캔될 것이다. 간격 후 제 2 트레이서 용량의 실제 타이밍은 파트 A로부터의 결과를 기반으로 결정될 것이다.
환자들은 89ZrDFO항-PD-L1 트레이서가 투여되는 방문 중 및 방문 후에 신체 검사, 바이탈 신호, 및 부작용 (AE)의 기록을 포함한 안전성 평가가 진행될 것이다. 이런 방문들 중에, 환자들은 PK, 혈액학, 화학, 및 면역 안전성 검정을 위한 샘플을 제공할 것이다.
파트 A 및 파트 B 둘 다에 대해, 환자들은 89ZrDFO항-PD-L1 트레이서의 마지막 투여 후 최대 21일까지 신체 검사, 바이탈 신호, 및 AE의 기록을 포함한, 안전성 평가를 계속해서 진행할 것이다.
연구 기간
파트　A의 경우, 환자들은 최대 28일 (4주)의 스크리닝기간 및 트레이서 용량의 투입 후 최대 21일 (대략 3주)의 후속 기간을 가질 것이다. 연구 파트 A의 기간은 스크리닝 기간을 포함하여 대략 7주이다.
파트　B의 경우, 환자들은 최대 28일 (4주)의 스크리닝기간, 최대 28일 (4주)의 투입 간 간격, 및 제 2 스캔 기간을 포함하는 21일 (3주) 안전성 후속 기간을 가질 것이다. 각 환자에 대한 연구의 총 기간은 스크리닝 기간을 포함하여 최대 11주일 것이다.
이 연구에 대한 연구의 종료는 마지막 환자의 마지막 방문으로서 정의한다.
연구 파트 A의 경우, 총 18명의 환자에 대해 3개 집단을 계획하고, 집단마다 최대 6명의 환자 각각의 3가지 순차적인 용량 수준을 계획한다. 연구 파트 B의 경우, 10명의 환자를 등록할 것이다. 전체 연구를 위해 단일 연구 부위에서 최대 28명의 환자의 등록을 계획한다.
환자 표적 집단
표적 집단은 진행형 흉부 악성종양 및 PD-L1 IHC 점수가 진단 또는 후속 생검에서 1% 이상인 18세 이상의 환자들로 구성될 것이다 (22C3 PharmDx assay, Dako North America Inc.에 의한 양성 PDL1 IHC 점수).
· 파트 A의 경우, 흉부 악성종양은 NSCLC, 위-식도 접합부 선암종, 및 위암에 한정될 것이고, 이때 PD-L1 점수는 INC에 의해 1% 이상이다.
· 파트 B의 경우, IHC에 의해 1% 이상의 진행형 흉부 악성종양 및 PD-L1 점수를 가진 모든 환자들이 적격일 것이다. 환자들은 또한 2가지 가장 최근의 영상화 연구 사이에 RECIST 1.1에 따라 안정적인 질환을 가져야 한다.
치료법을 필요로 하는 모든 환자들은 돌봄 요법의 기준에 부합해야 한다.
치료
89ZrDFO항-PD-L1은 이중기능성 킬레이터 (p-SCN-Bn-DFO)를 H4H8314N (항-PD-L1 단클론성 항체)에 공유 콘쥬게이팅하고 그 화합물을 89Zr로 방사성 표지화함으로써 형성된 방사성면역콘쥬게이트이다. 89ZrDFO항-PD-L1은 수성 완충된 비히클로 공급된다.
파트 A의 경우, 89ZrDFO항-PD-L1은 제 1일에 IV 투여될 것이다 (기준선). 파트 B의 경우, 89ZrDFO항-PD-L1은 제 1일 및 제 7　±　3일에 IV 투여될 것이다. 파트 B에서 제 2 용량의 실제 타이밍은 파트 A의 결과로부터 결정될 것이다.
89ZrDFO항-PD-L1 트레이서는 PK 모델을 기반으로 인간에서 추정된 누적 노출 수준보다 꽤 아래의 용량 수준 및 현재 이용할 수 있는 항-PD-1 작용제가 항암 치료를 위해 사용되는 수준보다 낮은 수준으로 투여될 것이다. 이 연구는 표적에 대한 경합을 피하기 위하여 현재 항-PD-L1으로 치료받고 있는 환자들을 배제할 것이다.
종점
연구의 일차 종점은 89ZrDFO항-PD-L1이 투여된 흉부 악성종양 환자들에서 트레이서 투입의 마지막 용량의 21일 동안의 치료제-유발 부작용 (TEAE)의 발생 및 중증도이다.
파트 A 단독의 경우, 연구는 89ZrDFO항-PD-L1의 적당한 대량 용량 및 활성 용량 및 최적의 투입 후 영상화 시간을 확립할 것인데, 트레이서 투입 후 제 1, 4, 및 7일 후의 채혈 및 영상화를 통해 다음의 것들이 측정될 것이다:
· 혈액 풀에서 89ZrDFO항-PD-L1의 표준화된 흡수 값, 이때 영상화와 동시에 종양-대-혈액 비율이 계속해서 게산된다.
· PET 영상 획득 데이터 및 혈액 중의 트레이서 활성 농도로부터 계산된, 흡수된 용량 및 유효한 조직 방사선을 기반으로 한 임상적 선량 측정.
· 관심의 종양 영역 (ROI)을 가로지르는 표준화된 흡수 값 (SUV).
· 종양 ROI 내의 최대 SUV (SUVmax).
· SUV로서 표시되는 혈장 트레이서 활성 농도, 이때 7일 동안의 곡선 아래의 면적이 계산된다 (AUC0-7).
파트 B 단독의 경우, 연구는 89ZrDFO-항-PD-L1 PET의 검사/재검사 신뢰도를 확립할 것이고, 파트 A로부터 측정되는 것과 같이, 적당한 대량 용량 및 최적의 영상화 시점에서 2개의 별도의 트레이서 주입의 측정으로부터 다음의 것들이 측정될 것이다:
· 혈액 풀 SUV, 이때 종양-대-혈액 비율의 계산이 후속된다.
· 종양 ROI를 가로지르는 SUV
· 종양 ROI 내의 SUVmax
· 89ZrDFO항-PD-L1의 생체분포
결과적으로 얻어진 데이터는 인간에서 89Zr-DFO-항-PD-L1의 안전성 및 관용성의 지표가 될 것이다.
상기 기술된 구체예 및 실시예들은 단순히 예시적이고 비제한적인 것으로 의도된다. 당업자들은 기본적인 실험만을 사용하여, 특정 화합물, 물질 및 과정들의 수많은 동등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 모든 동등물은 범주 내에 있는 것으로 고려되며 첨부되는 청구범위에 의해 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Kelly, Marcus Ma, Dangshe Olson, William Thurston, Gavin <120> RADIOLABELED ANTI-PD-L1 ANTIBODIES FOR IMMUNO-PET IMAGING <130> 10305WO01 <140> TBD <141> 2017-12-01 <160> 344 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt aggttttgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaccaag atggaactga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccggggac acggctgtgt attactgtgc gaatacgtat 300 tacgattttt ggagtggtca ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 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Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 322 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Gly Thr Asn 20 25 30 Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Tyr Ser Gly Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 323 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 323 gggttcaccg tcggtactaa cttc 24 <210> 324 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 324 Gly Phe Thr Val Gly Thr Asn Phe 1 5 <210> 325 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 325 atttatagcg gtggtaccgc t 21 <210> 326 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 326 Ile Tyr Ser Gly Gly Thr Ala 1 5 <210> 327 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 327 gcgagagggg ggggtatgga cgtc 24 <210> 328 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 328 Ala Arg Gly Gly Gly Met Asp Val 1 5 <210> 329 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 329 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcaac acctatgttc tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagag atcatcccta tcttaggtgc agcaaactac 180 gcacagaact tccagggcag agtcactttt accacggacg aatccacgaa tacagcctac 240 atggacctga gcagcctaag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcgg 300 acctccgggg ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcactgtctc ctca 354 <210> 330 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 330 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Val Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Glu Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Thr Ser Gly Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 331 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 331 ggaggcacct tcaacaccta tgtt 24 <210> 332 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 332 Gly Gly Thr Phe Asn Thr Tyr Val 1 5 <210> 333 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 333 atcatcccta tcttaggtgc agca 24 <210> 334 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 334 Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ala Ala 1 5 <210> 335 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 335 gcgagagatc ggacctccgg ggggttcgac ccc 33 <210> 336 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 336 Ala Arg Asp Arg Thr Ser Gly Gly Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 337 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 337 caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtggagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta catctttacc cactatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag gacttgagtg ggtgggctgg atcagccctt acaatggtta cacagactat 180 gcacagaaac tccagggcag agtcaccttg accacagaca catccacgac cacagcctac 240 atggagctga ggaacctgag atctgacgac acggccatgt attactgttc gagagggagg 300 ggcccttact ggtccttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 338 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 338 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Glu Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Gly Arg Gly Pro Tyr Trp Ser Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 339 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 339 ggttacatct ttacccacta tggt 24 <210> 340 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 340 Gly Tyr Ile Phe Thr His Tyr Gly 1 5 <210> 341 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 341 atcagccctt acaatggtta caca 24 <210> 342 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 342 Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Tyr Thr 1 5 <210> 343 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 343 tcgagaggga ggggccctta ctggtccttc gatctc 36 <210> 344 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 344 Ser Arg Gly Arg Gly Pro Tyr Trp Ser Phe Asp Leu 1 5 10

Claims (26)

  1. 모노머 인간 프로그램된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편, 킬레이트화 모이어티, 및 양전자 방출체를 포함하는 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 콘쥬게이트는 PD-L1에 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하고, 상기 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 식 (A)의 하나 이상의 모이어티에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트:
    -L-MZ (A)
    식에서, L은 킬레이트화 모이어티이고; M은 양전자 방출체이며; z는, 각각의 발생시에 독립적으로 0 또는 1이고; 적어도 하나의 z는 1이다.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 킬레이트화 모이어티는 데스페리옥사민을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 양전자 방출체는 89Zr인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, -L-M은
    Figure pct00011

    인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 식 (A)의 1, 2, 또는 3개의 모이어티에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트:
    (a) 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정되는 바 약 310 pM 미만의 결합 해리 평형 상수 (KD)로 모노머 인간 PD-L1에 결합하고;
    (b) 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정으로 약 180 pM 미만의 KD로 모노머 인간 PD-L1에 결합하며;
    (c) 37℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정되는 바 약 15 pM 미만의 KD로 다이머 인간 PD-L1에 결합하고; 및
    (d) 25℃에서 표면 플라즈몬 공명 검정으로 약 8 pM 미만의 KD로 다이머 인간 PD-L1에 결합한다.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 중쇄 가변 영역 (HCVR)에 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR)을 포함하고, HCVR은 SEQ ID NO: 2, 34, 50, 82, 98, 146, 162, 178, 186, 234, 250, 266, 290, 306, 314, 및 330으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며; 항체는 경쇄 가변 영역 (LCVR)에 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하고, LCVR은 SEQ ID NO: 10, 42, 58, 90, 106, 154, 170, 194, 242, 258, 및 274로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 SEQ ID NO: 82의 HCVR에 3개의 CDR; 및 SEQ ID NO: 90의 LCVR에 3개의 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 조직에 투여하는 단계; 및 양전자 방출 단층촬영 (PET) 영상화에 의해 PD-L1 발현을 시각화하는 단계를 포함하는, PD-L1을 발현하는 조직의 영상화 방법.
  11. 종양의 치료 방법으로서,
    (a) 고체 종양을 가진 대상체를 선택하는 단계;
    (b) 고체 종양이 PD-L1-양성인 것을 측정하는 단계; 및
    (c) PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제의 하나 이상의 용량을, 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 단계 (b)는
    (i) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계; 및
    (ii) 양전자 방출 단층촬영 (PET) 영상화에 의해 종양의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 국지화를 영상화하는 단계로, 종양에서 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 존재는 종양이 PD-L1-양성인 것을 가리키는 것인 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 대상체는 0.1 내지 10 mg/kg의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트가 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트는 대상체에게 피하로 또는 정맥내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, PET 영상화는 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트가 투여된 후 2 내지 7일 후에 시행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제로 대상체를 치료하기 전에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 단계들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제의 적어도 한 용량으로 대상체를 치료한 후에 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트를 투여하는 단계; 및
    (b) PET 영상화에 의해 종양에서의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 국지화를 영상화하는 단계, 여기서 종양에서의 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트의 국지화의 면적의 기준선으로부터의 감소는 종양 퇴행을 나타내는 것인 단계.
  18. 제 17 항에 있어서, 대상체는 PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제의 투여 후 1 내지 20주 후에 방사성 표지된 항체 콘쥬게이트가 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 11 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 혈액암, 뇌암, 신장세포 암, 난소암, 방광암, 전립선암, 유방암, 간세포 암종, 골암, 결장암, 비-소세포 폐암, 두경부의 편평세포 암종, 대자암, 중피종, B 세포 림프종, 및 흑색종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 11 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제는 항-PD-1 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 REGN2810으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 11 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1/PD-L1 신호전달 축의 억제제는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 항-PD-L1 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO: 82의 중쇄 가변 영역 (HCVR)의 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR); 및 SEQ ID NO: 90의 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22 항에 있어서, 항-PD-L1 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 3개의 HCDR (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 3개의 LCDR (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하며, HCDR1은 SEQ ID NO: 84의 아미노산 서열을 포함하고; HCDR2는 SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함하며; HCDR3은 SEQ ID NO: 88의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR1은 SEQ ID NO: 92의 아미노산 서열을 포함하며; LCDR2는 SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 포함하고; LCDR3은 SEQ ID NO: 96의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 식 (III)의 화합물:
    Figure pct00012

    식에서 A는 PD-L1에 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이고 k는 1 내지 30의 정수이다.
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