DE102012104504B4

DE102012104504B4 - Polypeptidmarker

Info

Publication number: DE102012104504B4
Application number: DE102012104504.6A
Authority: DE
Inventors: Larissa Müller; Norbert Jakubowski; Peter Roos
Original assignee: Bundesrepublik Deutschland Vertreten Durch Das Bundesministerium fur Wirtsch und Technologie Dieses; Bundesanstalt fuer Materialforschung und Pruefung BAM
Current assignee: Bundesrepublik Deutschland Vertreten Durch Das Bundesministerium fur Wirtsch und Technologie Dieses; Bundesanstalt fuer Materialforschung und Pruefung BAM
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2021-10-07
Anticipated expiration: 2032-05-25
Also published as: DE102012104504A1

Abstract

Markersubstanz mit einer reaktiven Gruppe, wobei die Markersubstanz für den spezifischen Nachweis von Biomaterial angepasst ist und ein Trägermaterial (1) umfasst, das zumindest zwei Stück einer Untereinheit enthält, die miteinander über eine Peptidbindung (100) verknüpft sind, wobei die Untereinheit zumindest eine Aminosäure mit einer Heteroelement-haltigen Reportergruppe (10, 20) aufweist, und das Heteroelement ein beliebiges chemisches Element außer Wasserstoff (H), Kohlenstoff (C), Stickstoff (N) und Sauerstoff (O) ist, wobei die Untereinheit ein Peptid ist und die Reportergruppe (10, 20) über eine Seitengruppe einer Aminosäure mit dem Trägermaterial (1) verbunden ist.

Description

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Markierung von Biomolekülen und betrifft die Verwendung von Peptiden zur Markierung von Biomolekülen mit Heteroelementen.
Die Detektion von Heteroelementen - beliebigen chemischen Elementen außer H, C, N und O - mittels Atomspektroskopie stellt ein neues Werkzeug der Biochemie, Molekularbiologie und der Zellbiologie dar. Dabei gewonnene Erkenntnisse über die Verteilung von Metallen in Biomolekülen, Zellen und Geweben münden in das sich allmählich herausbildende Fachgebiet „metallomics“ ein.
Die Markierung von Biomolekülen kann prinzipiell auf zweierlei Art - mittels eines labels (labelling) oder mittels eines tags (tagging) erfolgen. Während das bekannteste der labelling-Verfahren, die Markierung mittels Radionuklid, über den Ersatz einzelner Atome durch ein spezifisch nachweisbares Isotop des gleichen Elements sogar unter Beibehaltung der Atomzahl eines Biomoleküls erfolgen kann, setzt das tagging - dem Anbringen eines „Anhängeretiketts“ an einem Gepäckstück vergleichbar - stets die Derivatisierung bzw. Modifikation des markierten Biomoleküls voraus. Dabei können spezifische Eigenschaften des Biomoleküls unter Umständen signifikant verändert werden. Die direkte Markierung von Biomolekülen mit chelatisierten Metallen verändert die biologische Aktivität und Spezifität der jeweiligen Biomoleküle erheblich. Bei bisher bekannten Verwendungen von chelatisierten Metallen als tags zur Markierung von Proteinen vor deren Detektion mittels Atomspektroskopie spielt das keine Rolle. Einen Überblick über die Anwendung des Element-gestützten taggings in der Bioanalytik bietet die Publikation von Bettmer, J.; Jakubowski, N. und Prange A. in Analytical and Bioanalytical Chemistry (2006) 386:7-11. Martin L.J. et al (2007) beschreiben im Journal of American Chemical Society, Band 129, Seiten 7106-7113 doppelt Lanthanid bindende Tags, deren Design, photophysikalische Eigenschaften und Anwendungen in der NMR, umfassend ein zwei identische Sequenzen YIDTNNDGWIEGDEL aufweisendes Peptid, wobei die Sequenzen als Lanthanid-bindende Motive eine Verstärkung spezifischer NMR-Signale und eine bis zu dreifach gesteigerte Lumineszenz bewirken. In DE 27 24 486 A1 wird ein heterogenes spezifisches Bindungsverfahren zur Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium und Mittel zu dessen Durchführung gelehrt, wobei ein Metallatom oder mehrere Metallatome als Markierungssubstanz dienen, deren Menge in gebundenem oder in freiem Zustand ermittelt und zur Bestimmung des Liganden verwendet wird. In US 2008 / 0 267 882 A1 sind bildgebende Substanzen, Verfahren zu deren Herstellung, bildgebende Verfahren, Zherapeutika, Verfahren zu deren Herstellung und Therapieverfahren beschrieben, die sich auf die Verwendung von RGD (Arginin-Glycin-Asparaginsäure) stützen.
Soll jedoch beispielsweise die Spezifität eines Antikörpers oder die Selektivität eines Enzyms trotz der Modifikation aufrechterhalten werden, scheiden Metallmarkierungen bisher aus. Die vorbekannten Lösungen sind somit nur teilweise zufriedenstellend. Insbesondere sind bekannte Polymertags nur eingeschränkt biokompatibel, weisen eine heterogene Verteilung der Kettenlänge auf und sind damit nur schwer aufzureinigen. Das begrenzt ihre Anwendbarkeit und erschwert insbesondere die Quantifizierung der mit derartigen Markern erzielten Signale. Auf Grund einer nur eingeschränkten Auswahl chelatbildender Gruppen mit hinlänglich hoher Stabilität bzw. Affinität zum Metall, weisen bekannte Marker eine nach wie vor geringe oder gar keine spezifische Empfindlichkeit auf.
Die sich daraus ergebenden Aufgaben werden gelöst durch eine Markersubstanz nach Anspruch 1, ein Verfahren zu deren Herstellung nach Anspruch 12, ein Nachweisreagenz nach Anspruch 17, ein Analyseverfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis eines Analyten nach Anspruch 18, einen Immunoassay nach Anspruch 20, die Verwendung einer Markersubstanz nach Anspruch 21 und ein Verfahren zur Rückverfolgung und/oder zur verdeckten individuellen Kennzeichnung eines Biomoleküls nach Anspruch 22, sowie eine Nachweismethode nach Anspruch 25. Weitere Ausführungsformen, Modifikationen und Verbesserungen ergeben sich anhand der folgenden Beschreibung und aus den beigefügten Ansprüchen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform wird eine Markersubstanz mit einer reaktiven Gruppe vorgeschlagen, wobei die Markersubstanz für den spezifischen Nachweis von Biomaterial angepasst ist und ein Trägermaterial umfasst, das zumindest zwei Stück einer Untereinheit enthält, die miteinander über eine Peptidbindung (100) verknüpft sind, wobei die Untereinheit zumindest eine Aminosäure mit einer Heteroelement-haltigen Reportergruppe (10, 20) aufweist, und das Heteroelement ein beliebiges chemisches Element außer Wasserstoff (H), Kohlenstoff (C), Stickstoff (N) und Sauerstoff (O) ist. Vorteile dieser Ausführungsform bestehen in der ausgesprochen guten Bio-Verträglichkeit der resultierenden Markersubstanz sowie in der Möglichkeit, über unterschiedliche, jeweils an die Untereinheit gebundene Heteroelemente mittels atomspektroskopischer Analysemethoden ein für das Lanthanoid-dekorierte Peptid charakteristisches Signalmuster zu erzeugen. Das einer (poly-) peptidischen Grundstruktur, d.h. der Trägersubstanz, zuzuordnende Signalmuster setzt sich beispielsweise aus den Atomspektren oder den Massenzahlen der anwesenden Elemente zusammen. Da das anteilige Masse-Verhältnis der Elemente in gleichmäßig mit Reportergruppen versehenen Peptiden konstant ist, kann über die Anzahl der über Peptidbindungen miteinander verknüpften Untereinheiten und somit über die Länge des Polypeptids die erzielte Signalstärke einer gewünschten Signalstärke bzw. der jeweiligen Messsituation angepasst werden.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform wird eine Markersubstanz vorgeschlagen, deren Untereinheit selbst ein Peptid, insbesondere ein Polypeptid ist. Gemäß einer Modifikation dieser Ausführungsform können verschiedene Untereinheiten, also verschiedene Peptide vorliegen, die über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Besondere Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass ein bestimmtes Masse-Verhältnis der vorliegenden Heteroelemente zur Unterscheidung unterschiedlicher Markersubstanzen und der mit ihnen markierten Targetmoleküle verwendet werden kann, indem Peptide als Untereinheit genutzt werden, die aus unterschiedlichen Aminosäuren, welche wiederum mit unterschiedlichen Metallen befrachtet sind, zu einem Polypeptidstrang miteinander verknüpft werden können. So kann die Markersubstanz eine kodierte Nachricht tragen oder zur spezifischen Kennzeichnung eines Targetmoleküls verwendet werden.
Ebenso kann die Spezifität und Selektivität der Target(bio)moleküle genutzt werden, um unterschiedlichste molekulare und/oder zelluläre und/oder sub-zelluläre Strukturen zu identifizieren und/oder zu quantifizieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform können ebenso verschiedene Peptide die mit verschiedenen Metallionen befrachtet sind in einem Polypeptidstrang miteinander verbunden vorliegen. Genauso ist es möglich, Chelatbildner unterschiedlicher Affinität für unterschiedliche Metallionen zur Markierung verschiedener Aminosäure-Seitenketten eines Peptidstrangs zu nutzen. Ziel und Vorteil der dem Fachmann an Hand der hier gegebenen Informationen geläufigen Maßnahmen ist es, ein (vor)bestimmtes Verhältnis verschiedener Heteroelemente zu erreichen, das sich - nach einer entsprechenden Kalibrierung - mittels atomspektroskopischer Methoden nachweisen und zur Identifikation einer Markierung in einer unbekannten Probenzusammensetzung verwenden lässt.
Gemäß einer dritten Ausführungsform weist die Reportergruppe zu diesem Zweck ein Heteroelement auf, das ausgewählt ist unter allen Metallen, die im untersuchten Biosystem nicht vorkommen. Insbesondere ist das Heteroelement ausgewählt unter: Lanthan (La), Cer (Ce), Praseodym (Pr), Neodym (Nd), Promethium (Pm), Samarium (Sm), Europium (Eu), Gadolinium (Gd), Terbium (Tb), Dysprosium (Dy), Holmium (Ho), Erbium (Er), Thulium (Tm), Ytterbium (Yb), Lutetium (Lu), Silber (Ag), Aluminium (Al), Arsen (As), Gold (Au), Beryllium (Be), Wismut (Bi), Cadmium (Cd), Germanium (Ge), Kobalt (Co), Chrom (Cr), Kupfer (Cu), Eisen (Fe), Gallium (Ga), Quecksilber (Hg), Indium (In), Lithium (Li), Mangan (Mn), Natrium (Na), Blei (Pb), Rubidium (Rb), Antimon (Sb), Skandium (Sc), Selen (Se), Zinn (Sn), Tellur (Tl), Vanadium (V), Wolfram (W), Yttrium (Y), Zink (Zn), Zirkonium (Zr), Schwefel (S), Phosphor (P), Silizium (Si), Iod (I), Brom (Br), Fluor (F).
Weiterhin können auch Metallnanopartikel, -Cluster oder -Quantenpunkte dieser Elemente in der Reportergruppe verwendet werden, ebenso Nichtmetalle, wie Schwefel (S), Phosphor (P), Silizium (Si) (z.B. in Form von MSTFA (N-methy-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamid), Iod (I), Brom (Br) und Fluor (F) oder eines oder mehrere dieser Elemente enthaltende Nanopartikel.
Ein Vorteil dieser Ausführungsform ergibt sich beispielsweise daraus, dass mit Lanthanoiden (Lanthaniden) sich chemisch nahezu identisch verhaltende Elemente zur Verfügung stehen, die sich deutlich von den in biologischen Matrices anzutreffenden chemischen Elementen unterscheiden. Daraus ergeben sich Vorteile für den ungestörten und eindeutigen Nachweis der Markersubstanz und der mit ihr modifizierten Target(bio)moleküle.
Gemäß einer vierten Ausführungsform wird eine Markersubstanz vorgeschlagen, wobei die Reportergruppe der Markersubstanz einen Chelatbildner, einen Komplexbildner und/oder einen Ionenaustauscher umfasst. Vorteile ergeben sich aus der Möglichkeit verschiedene, ggf. auch nicht der Gruppe der Lanthanoide zuzurechnende Elemente an die Reportergruppe und damit an die Markersubstanz binden zu können. In Abhängigkeit von der jeweils anzutreffenden Messsituation kann das zu Nachweis verwendete Heteroelement, also ein chemisches Element, das in der jeweiligen unmarkierten Probe nicht oder nur in vernachlässigbarer Konzentration vorkommt, mit größerer Freiheit gewählt werden. Weiterhin können Metalle genutzt werden, um über einen geeigneten Chelatliganden eine Fluorophorgruppe anzudocken.
Gemäß einer fünften Ausführungsform wird eine derartige Markersubstanz vorgeschlagen, deren Chelat- und/oder Komplexbildner ausgewählt ist unter: Cyclohexandiamintetraessigsäure (CDTA); Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA); Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N, N, N', N'tetraessigsäure (EGTA); Nitrilotriessigsäure (NTA), N-(2-Hydroxyethyl)-ethylendiamin-N,N,N'-triessigsäure (HEDTA); Triethylentetraminhexaessigsäure (TTHA) oder 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA) oder DOTA-Derivate.
Vorteile ergeben sich aus der kommerziellen Verfügbarkeit der benannten Chelatbildner, ihrer guten Wasserlöslichkeit und der, insbesondere für DOTA und für DTPA ausgeprägte Stabilität der erhaltenen Komplexe. Beide letztbenannten Komplexe sind achtzähnig und komplexieren das dreiwertige Kation besonders stabil.
Ebenso kann ein Chelatbildner einer Reportergruppe ausgewählt sein unter: 1, 4, 7-Triazacyclononan-1, 4, 7-triessigsäure (NOTA), NOTA-Derivat, 1, 4, 8, 11-Tetraazacyclotetradecan-1, 4, 8, 11-tetraessigsäure (TETA), Diethylentriamin-N, N', N"triessigsäure- N, N"-bis(2-methylpyridin) (DTPA-BP), Diethylentriamin-N, N', N"triessigsäure- N, N"-bis(methylamid) (DTPA-BMA), 1-Oxa-4, 7, 10-tetraazacyclododecane-4, 7, 10-triessigsäure (DO3A), DO3A-Derivat, Diethylentriamin- N, N, N', N", N"pentaessigsäure (DTPAA), p-Isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine (Df-Bn-NCS), 1,4,7,10,13,16,19,22-Oktaazacyclotetracosan-1,4,7,10,13,16,19,22-oktaessigsäure (OTEC), 1,4,7,10,14,17,20,23-Oktaazacyclohexacosan-1,4,7,10,14,17,20,23-oktaessigsäure (OHEC), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10- tetra(methylene phosphonate) (DOTP), benzyloxypropionictetraacetate (BOPTA); Calixarene; Cryptate, z.B. trispyridine europium cryptate (TBP cryptate); 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane (cyclam); 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (cyclen); 1,4,7-triazacyclononane (tacn), oder unter Carbonyl-Komplexen, Carben-Komplexen und Metallocen basierten Reagenzien.
Gemäß einer sechsten Ausführungsform wird eine Markersubstanz vorgeschlagen, wobei die Verknüpfung der Reportergruppe zum Trägermaterial 1 eine Thiocarbonyl-Gruppe oder eine Thioether-Bindung aufweist. Die Reportergruppe ist jeweils kovalent mit der Seitenkette einer Aminosäure verknüpft. Die kovalente chemische Bindung kann auf unterschiedliche Art und Weise bewerkstelligt werden, wobei bevorzugte Umsetzungen unter milden Reaktionsbedingungen ablaufen. Unter milden Reaktionsbedingungen wird beispielsweise verstanden: Temperatur nicht wesentlich oberhalb von 40 °C, pH-Werte nicht oder nur kurzzeitig außerhalb des physiologischen Bereichs von pH 6 bis pH 9, insbesondere bevorzugt um pH 7. Unter diesen Bedingungen kann eine Markierung des jeweiligen Targetmoleküls vorgenommen werden, ohne dass das Targetmolekül während der Markierung seine Spezifität vermindert oder verliert. Das ist insbesondere wichtig, wenn das Targetmolekül ein Antikörper, d.h. ein Immunoglobulin oder ein Antikörperfragment, beispielsweise Fab, ist.
Gemäß einer siebenten Ausführungsform wird eine Markersubstanz gemäß der vorstehenden Beispiele vorgeschlagen, wobei die Reportergruppe über eine Seitengruppe einer Aminosäure mit der Trägersubstanz 1 verbunden ist. Das bietet den Vorteil über unterschiedliche, den jeweiligen Seitengruppen angepasste, Reaktionsbedingungen verschiedene chemische Elemente an einem Peptid verankern zu können. Auf diese Art und Weise ergibt sich die Möglichkeit, ein bestimmtes Masseverhältnis unterschiedlicher Elemente einzustellen, das für das jeweilige Polypeptid bzw. die resultierende Markersubstanz charakteristisch ist. Daraus ergeben sich die eingangs erläuterten Möglichkeiten einer spezifischen Kodierung.
Gemäß einer achten Ausführungsform wird vorgeschlagen, dass die zur Bindung von Reportergruppen genutzten Seitenketten ausgewählt sind unter Seitengruppen der Aminosäuren Arginin, Cystein, Histidin, Hydroxylysin, Lysin und/oder Serin.
Gemäß weiterer Ausführungsformen werden für die hier beschriebenen Trägermoleküle die nachfolgenden, mit einem gebräuchlichen Kürzel und dem entsprechenden Trivialnamen aufgeführten Aminosäuren verwendet: Ala (Alanin); Arg (Arginin); Asn (Asparagin); Asp (Asparaginsäure); Cys (Cystein); Glu (Glutaminsäure); Gln (Glutamin); Gly (Glycin); His (Histamin); HyLys (Hydroxylysin); HyPro (Hydroxyprolin); Ileu (Isoleucin); Leu (Leucin); Lys (Lysin); Met (Methionin); Phe (Phenylalanin); Pro (Prolin); Ser (Serin); Thr (Threonin); Try (Tryptophan); Tyr (Tyrosin); Val (Valin). Dabei stellen Cystein, Methionin und Selenocystein eine besondere Gruppe dar, da diese bereits ein Reporterelement enthalten (S bzw. Se), welches zum Nachweis herangezogen werden kann.
Gemäß weiteren Ausführungsformen werden ausdrücklich nicht ausschließlich proteinogene Aminosäuren zum Aufbau der Trägersubstanz verwendet. Beispiele dieser zum Aufbau geeigneter Trägermoleküle gleichwertig einsetzbarer Aminosäuren sind Ornithin, Citrullin, DOPA, Homoserin oder Thyroxin. Dem Fachmann sind weitere Aminosäuren bekannt. Dabei ist die optische Aktivität der Aminosäure bzw. deren Reinheit hinsichtlich des Gehalts an D- und L-Formen der jeweiligen Aminosäure für die vorgeschlagene Anwendung nicht entscheidend.
Vorteile der Verwendung dieser Aminosäuren ergeben sich daraus, dass die funktionellen Gruppen der Seitenketten dieser Aminosäuren chemisch deutlich voneinander verschieden sind, so dass über die Wahl der jeweiligen Kopplungsreagenzien, des jeweiligen pH-Wertes, der jeweiligen Ionenstärke und/oder der Temperatur ausschließlich eine Aminosäure mit einem spezifischen Element markiert werden kann. Nachfolgend kann dann eine andere Aminosäure mit einem Metall-Ion dekoriert werden, danach die nächste, und so fort, bis das gewünschte Element-Verhältnis eingestellt ist.
Gemäß einer neunten Ausführungsform wird eine Markersubstanz vorgeschlagen, deren Trägermolekül ein Peptid, umfassend eine Sequenz von D- und/oder L-Aminosäuren umfasst, wobei die Zahl der das Peptid ausbildenden Aminosäuren ausgewählt ist unter 2 bis 150, beispielsweise unter 3 bis 100, insbesondere unter 3 bis 50 und typischerweise zwischen 4 bis 36. Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich daraus, dass auch Racemate, also Enantiomeren-Mischungen, wie sie für synthetisch hergestellte Aminosäuren typisch sein können, verwendbar sind und die erhaltene Kettenlänge eine hinlänglich gute Löslichkeit des darauf basierenden Markermoleküls besitzt. Zudem ist die Trennung von Racematen zumeist aufwendig und kann für verschiedene Anwendungen der vorgeschlagenen Markersubstanz unterbleiben. Die erhaltene Markersubstanz ist damit kostengünstiger herstellbar.
Gemäß einer zehnten Ausführungsform stellt die vorgeschlagene Markersubstanz eine einzige lineare Sequenz von Aminosäuren dar. Vorteile ergeben sich aus der überschaubaren Möglichkeit der chemischen Modifizierung derartiger Moleküle.
Gemäß einer elften Ausführungsform kann die Markersubstanz ein Trägermolekül aufweisen, das ein zyklisches Peptid ist. Vorteile ergeben sich aus den zusätzlichen, ggf. vorteilhaften Eigenschaften eines Cyclopeptids. Beispielsweise kann die Löslichkeit eines Cyclopeptids in einem gegebenen Lösungsmittel von jener eines linearen Peptids einer identischen Zusammensetzung abweichen, oder eine physiologische Wirkung eines Cyclopeptids kann von jener eines linearen Peptids abweichen. Weitere Vorteile ergeben sich aus den spezifischen Eigenschaften des jeweils gewählten cyklischen Peptids. Ebenso kann die Stabilität eines zyklischen Peptids über oder unter jener eines linearen Peptids gleicher Zusammensetzung liegen.
Gemäß einer zwölften Ausführungsform wird eine Markersubstanz vorgeschlagen, die zumindest eine halogenierte Aminosäure aufweist. Insbesondere ist eine Seitengruppe zumindest eines Typs der im Trägermolekül vorhandenen Aminosäuren halogeniert. Die Besonderheiten von Halogenen, insbesondere bezüglich ihres Nachweises an Hand spezifischer Eigenschaften vervielfachen die Möglichkeiten der bereits erläuterten Kodierung und können zur Steigerung der Nachweisempfindlichkeit von Analysemethoden genutzt werden, die die beschriebenen Markersubstanzen nutzen.
Gemäß einer dreizehnten Ausführungsform sind die zur Halogenierung genutzten Elemente Brom, Chlor, Jod und/oder Fluor. An diese Elemente angepasste Nachweisverfahren, sowie die mit Hilfe dieser Elemente zusätzlich möglichen Verhältnisse der beispielsweise bei der Massenspektrometrie auftretenden Massezahlen eröffnen weitere Möglichkeiten der spezifischen Markierung und/oder Kodierung sowie zur Steigerung der Nachweisempfindlichkeit und der Spezifität von Analysen.
Gemäß einer vierzehnten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung einer Markersubstanz vorgeschlagen, das die folgenden Schritte umfasst: a) Auswählen eines Moleküls mit wenigstens einer terminalen funktionellen Gruppe, umfassend miteinander zu einem Peptid verknüpfte Aminosäuren, wobei wenigstens eine Aminosäure eine Seitenkette aufweist und wobei die terminale funktionelle Gruppe ausgewählt ist unter einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe; b) Umsetzen wenigstens einer Seitenkette einer Aminosäure mit einem bifunktionalen Reportermolekül; c) Einführen einer reaktiven Gruppe durch Umsetzen der terminalen funktionellen Gruppe mit einem bifunktionalen Linkermolekül. Vorteile dieser Ausführungsform ergeben sich aus der Möglichkeit, eine Markersubstanz gemäß der vorstehend erläuterten Ausführungsformen erhalten zu können.
Gemäß einer fünfzehnten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung einer Markersubstanz vorgeschlagen, wobei das bifunktionale Reportermolekül, umfassend Chelatkomplex und reaktives Linkermolekül, ausgewählt ist unter: p-SCN-Benzyl-DOTA; p-Maleimid-Benzyl-DOTA; S-2-(4-Nitrobenzyl)-DOTA; S-2-(4-Aminobenzyl)-DOTA; DOTA-succinimidylacetat; DOTA-N-hydroxysuccinimid ester; S-2-(4-Aminobenzyl)-DTPA, p-SCN-Benzyl-DTPA; p-Maleimid-Benzyl-DTPA; Aminobenzyl-DO3A; p-SCN-Benzyl-oxo-DO3A; S-2-(4-Aminobenzyl)-NOTA; p-SCN-Benzyl-NOTA; p-SCN-Benzyl-Deferroxamin, Bromoacetamidobenzyl-DOTA (BAD); 2,2',2"-(10-(2,6-dioxotetrahydro-2H-pyran-3-yl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triyl)triacetic acid (DOTA-GA anhydrid). Vorteile ergeben sich aus den relativ milden Reaktionsbedingungen bei der Umsetzung dieser Linkermoleküle mit dem jeweiligen Trägermolekül. Der mit DOTA bezeichnete Chelatbildner weist eine besonders hohe Affinität für Lanthanoide auf.
Als Linkermoleküle eignen sich Maleimid, Arylthiol, sulfoniertes Alkyl, Nitril, die alpha-Haloacylgruppe, ein Epoxid, Jodoacetylamid, die N-Hydroysuccinimidestergruppe, Isothiocyanat, Isocyanat, Sulfonylhalid, Tetrafluorphenylester, ein Säurehalid, ein Säureanhydrid, oder ein beliebiges carboxylsäurereaktives Amin.
Gemäß einer sechzehnten Ausführungsform wird ein Verfahren vorgeschlagen, wobei das bifunktionale Linkermolekül ausgewählt ist unter:

m-Maleimidobenzoyl N-hydroxysuccinimidester (MBS); einem Carbodiimid; N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid; 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid hydrochlorid (EDC); 2-Iminothiolan; Imidoester wie z.B. Dimethyl adipimidate (DMA); N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA). Die Handhabung der benannten Linkermoleküle ist dem Praktiker vertraut, sie sind kommerziell verfügbar und bei geeigneten Lagerbedingungen auch hinlänglich stabil, so dass sie ohne weiteres auch als Komponenten eines Kits zur Markierung von Biomolekülen bereitgestellt werden können. Daraus ergeben sich Vorteile für die Flexibilität in der Anwendbarkeit der die beschriebene Markersubstanz nutzenden Analyseverfahren.

Gemäß weiteren Ausführungsformen können Reportermoleküle ausgewählt sein unter organischen Quecksilberverbindungen wie p-hydroxymercuribenzoic acid (pHMB), Methylquecksilber (CH₃HgCl) oder Ethylquecksilber (CH₃CH₂HGCl). Diese Reagenzien binden an Thiolgruppen.
Gemäß einer siebzehnten Ausführungsform werden beim vorgeschlagenen Verfahren zur Herstellung einer Markersubstanz auf der Basis von Heteroelementmarkierten Biomolekülen die Reaktionsbedingungen zur Einführung einer auf das (Poly)peptid bezogen endständigen reaktive Gruppe so gewählt, dass die endständig eingeführte reaktive Gruppe nicht mit der Seitenkette einer im Trägermolekül vorhandenen Aminosäure reagiert. Insbesondere werden der pH-Wert, die Art und/oder Polarität eines Lösungsmittels, die Ionenstärke und/oder die Temperatur des Reaktionsansatzes so ausgewählt, dass die endständig eingeführte reaktive Gruppe nicht mit der Seitenkette einer im Trägermolekül vorhandenen Aminosäure reagiert. Das bietet den Vorteil, dass die Markersubstanz über die endständige Gruppe an das Targetbiomolekül gebunden werden kann. Daraus ergeben sich Möglichkeiten der Vereinheitlichung der Reaktionsbedingungen zur Umsetzung verschiedener Markersubstanzen mit dem Target.
Eine alternative Ausführungsform der Kopplung der Markersubstanz an ein Biomolekül ergibt sich aus der Verwendung eines geeigneten Enzyms, beispielsweise einer Transglutaminase, wie beschrieben von S. Jeger et al. (2010) in Angewandte Chemie 122:1-5.
Gemäß achtzehnten Ausführungsformen wird ein Verfahren zur Herstellung einer Markersubstanz gemäß der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen vorgeschlagen, das weiterhin den Schritt umfasst: d) Maskieren einer Aminogruppe Gruppe durch Acetylierung. Die Acetylierung ist nur ein Beispiel, wie die Reaktionsfähigkeit einer funktionellen Gruppe zeitweise herabgesetzt, bzw. ausgeschaltet werden kann um mehrstufige Synthesen zu ermöglichen.
Gemäß einer neunzehnten Ausführungsform wird ein Nachweisreagenz vorgeschlagen, umfassend eine Markersubstanz gemäß vorstehender Ausführungsformen und ein Molekül oder Fragmente eines Moleküls, das ausgewählt ist unter: einem Antikörper, umfassend IgG, IgM, und/oder IgE; Avidin; Biotin; einem Enzym; einem Enzymsubstrat; einem Hormon; Protein A; Protein G; einem Rezeptor; Streptavidin.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Quantifizierung und/oder zum Nachweis eines Biomoleküls in einer aus einem physiologischen Medium gewonnenen Probe vorgeschlagen. Das Verfahren kann optional einen Schritt der Probenaufbereitung umfassen. Während dieses Schritts wird der gesuchte Analyt angereichert und/oder von Begleitstoffen getrennt. Ebenso aber kann auf den Schritt der Anreicherung des Analyten verzichtet werden, wenn das mit der Markersubstanz, die über ein Targetbiomolekül spezifisch an den Analyten gebunden wurde, erzeugte Signal hinlänglich groß, intensiv, hoch, deutlich bzw. das Signal/Rausch - Verhältnis einer spezifischen Messgröße ausreichend ist, um den Analyten in der jeweiligen Matrix qualitativ nachzuweisen und/oder zu quantifizieren.
Gemäß einer zwanzigsten Ausführungsform weist das vorgeschlagene Verfahren zur Quantifizierung und/oder zum Nachweis eines Analyten in einer Probe die Schritte auf:

1) Markieren eines Analyten mit einer Markersubstanz wie vorstehend beschrieben und
2) Analysieren mittels Massenspektrometrie und/oder Atomspektroskopie.

Der Schritt des Markierens kann beim vorgeschlagenen Verfahren zur Quantifizierung und/oder zum Nachweis eines Analyten so erfolgen, dass ein den Analyten spezifisch bindendes oder vom Analyten spezifisch gebundenes Biomolekül, hier auch als Targetmolekül bezeichnet, mit der Markersubstanz modifiziert vorliegt und dieses Agens als Nachweisreagenz des Analyten anhand eines spezifischen Elementverhältnisses der Markersubstanz verwendet wird. Zum Feststellen des spezifischen Elementverhältnisses werden atomspektroskopische Methoden, beispielsweise Atomabsorptionsspektroskopie, Massenspektrometrie, Röntgenfluoreszenzanalyse oder andere elementspezifische Nachweisverfahren genutzt. Besonders bevorzugt werden dabei Nachweistechniken, die eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Elementen der Lanthanoide / Lanthanide oder anderer der benannten Heteroelemente erlauben.
Das Verfahren umfasst den Schritt der Markierung des mit einer Markersubstanz nach Anspruch 1 markierten spezifischen Target-Moleküls. Ein derartiges Targetmolekül kann beispielsweise ein Antikörper, ein Antikörperfragment, eine antigenbindende Domäne eines Antikörpers, ein Enzym, ein Plasmid, ein Oligonukleotid oder eine Nukleinsäure sein.
Als Target-Moleküle kommen insbesondere Avidin, Streptavidin, Protein G und Protein A in Betracht. Die Targetmoleküle Protein A und Protein G binden spezifisch an bestimmte Antikörperklassen und können so genutzt werden, um Antikörper mit der Markersubstanz zu identifizieren. Ebenso können die Antikörper für ihren Einsatz im Immunoassay schonend mit der ProteinA/G-Markersubstanz modifiziert werden. In diesem Fall dient Protein A bzw. Protein G als bifunktionaler Linker.
Ähnliches gilt für die Anwendung von Avidin und Streptavidin, die eine spezifische Bindung mit Biotin eingehen. Wird die Markersubstanz an Avidin oder Streptavidin angebracht, können biotinylierte Targetmoleüle identifiziert werden bzw. im Falle von Antikörpern würden diese für den Einsatz im Immunoassay mit der Avidin-, bzw. Streptavidin- Markersubstanz modifiziert werden. Beispiele für Biotinylierungsreagenzien sind Biotin-N-hydroxsuccinimidester und 3-(N-Maleimidopropionyl)biocytin.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die vorgeschlagene Markersubstanz genutzt, indem eine erste Markersubstanz ein erstes und ein zweites chemisches Element in einem bekannten Massenverhältnis zueinander aufweist und zur Modifizierung eines ersten Biomoleküls verwendet wird. So kann das erste Biomolekül an Hand des analytisch messbaren Massen-Verhältnisses der vorliegenden Elemente wiedererkannt werden. Ebenso können unbekannte Proben, die vorgeblich das erste Biomolekül enthalten, auf ihre Authentizität hin überprüft werden. Das ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn ein spezifisches Bindungsvermögen des Biomoleküls zur Durchführung eines validierten Nachweisverfahrens genutzt werden soll, gleichzeitig aber die Verwendung anderer Biomoleküle, deren Spezifität nicht validiert wurde, von der ggf. unrechtmäßigen Verwendung in derartigen Nachweisverfahren ausgeschlossen werden sollen oder wenn deren Verwendung erkannt werden soll. Die Markersubstanz gemäß Anspruch 1 kann somit zur Authentifizierung von Biomolekülen und diese beinhaltenden Analyse-Kits oder von Bestandteilen solcher verwendet werden.
Gemäß zweiundzwanzigsten Ausführungsformen können die hier vorgeschlagenen Markersubstanzen zur Durchführung von Immunoassays verwendet werden. Vorteile ergeben sich gemäß spezieller Ausführungsformen, insbesondere wenn der Immunoassay ausgewählt ist unter: Enzym Immuno Assay (EIA), Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Immunoblot, Western blot oder Southern blot, Microarrays. Die hohe Sensitivität und/oder universale Einsetzbarkeit zur Analyse der benannten Immunoassay-Formate bietet Vorteile hinsichtlich Zuverlässigkeit und Aussagekraft der erhobenen Befunde. Weiterhin können die Markersubstanzen in der Immunhistochemie Anwendung finden.
Gemäß einer dreiundzwanzigsten Ausführungsformen kann zumindest eine der vorgeschlagenen Markersubstanzen oder Nachweisreagenzien verwendet werden, um die Präsenz, die Lokalisierung, und/oder die Konzentration einer Entität oder eines Bestandteils einer Entität zu bestimmen, die ausgewählt ist unter: einem Biopolymer, insbesondere einem Protein oder einer Nukleinsäure; einem Hormon; einem Rezeptor; einer Biomembran; einer Zelle; einem Mikroorganismus; einem Virus; einer bioaktiven Substanz; einem pharmazeutischen Wirkstoff. Vorteile ergeben sich beispielsweise für eine gesteigerte Nachweisempfindlichkeit und Zuverlässigkeit von Analyse- bzw. Untersuchungsergebnissen, beispielsweise in der Diagnostik, zur Therapieüberwachung oder in der Histochemie, sowie für die Rückverfolgbarkeit von Analyse- bzw. Untersuchungsergebnissen.
Gemäß dieser Ausführungsform wird die vorgeschlagene Markersubstanz kovalent beispielsweise an einen Antikörper gebunden. Dabei kann der Antikörper ausgewählt sein unter Immunoglobulinen der Klassen IgG, IgM, und/oder IgE. Die vorgeschlagene Bindung der Markersubstanz an einen Antikörper erlaubt es, die Nachweisempfindlichkeit eines Analyseverfahrens für das jeweilige vom Antikörper erkannte Antigen weiter zu steigern (Signalamplifikation). Zusätzlich zu anderen, ggf. am Antikörper vorhandenen Markern, etwa Fluoreszenzfarbstoffen und/oder Enzymen und/oder Quantenpunkten kann der jeweils erhobene Befund mit Hilfe einer unabhängigen Nachweistechnik abgesichert werden. Aus der Verwendung unterschiedlicher Klassen von Antikörpern ergeben sich die mit diesen Antikörperklassen verbunden Vorteile. Insbesondere Antikörper der Klasse IgM zeichnen sich typischerweise durch eine hohe Avidität aus. Die Gewinnung von Antikörpern der Klasse IgM ist häufig dadurch erleichtert, dass die Etablierung von Zelllinien, die diese Antikörper in hoher Konzentration sezernieren erleichtert ist gegenüber jenen für Antikörper der Klasse IgG.
Gemäß einer vierundzwanzigsten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Rückverfolgung und/oder zur verdeckten individuellen Kennzeichnung eines Biomoleküls vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst die Schritte: A) Auswählen einer ersten Markersubstanz nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die erste Markersubstanz durch ein erstes Verhältnis der Mengenanteile von wenigstens zwei Heteroelementen zueinander gekennzeichnet ist; B) Kovalentes Binden der ersten Markersubstanz an das Biomolekül; C) in-Verkehr-Bringen des Biomoleküls.
Gemäß einer fünfundzwanzigsten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Rückverfolgung und/oder zur verdeckten individuellen Kennzeichnung eines Biomoleküls vorgeschlagen, das weiterhin die folgenden Schritte umfasst: D) Durchführen einer atomspektroskopischen Analyse einer mutmaßlich das individuell gekennzeichnete Biomolekül beinhaltenden Probe; E) Ermitteln eines Verhältnisses der Massen- bzw. Mengenanteile von wenigstens zwei Heteroelementen zueinander in der mutmaßlich dass individuell gekennzeichnete Biomolekül beinhaltenden Probe; F) Feststellen der Identität oder der Nicht-Identität des festgestellten vom erwarteten Verhältnis der Massen bzw. Stoffmengen von wenigstens zwei Heteroelementen.
Gemäß einer sechsundzwanzigsten Ausführungsform umfasst das bezeichnete Verfahren weiterhin den Verfahrensschritt: G) Zuordnen des Biomoleküls der Probe zu einer Liste bzw. das Feststellen der Zugehörigkeit oder das Nichtfeststellen der Zugehörigkeit zu einer Liste, bzw. das Feststellen der Nicht-Zugehörigkeit zu einer Liste. Vorteile dieses Verfahrensschritts ergeben sich aus der Validierbarkeit und Standardisierbarkeit von Analysen und Nachweisverfahren im analytisch/chemischen und diagnostisch/medizinischen Bereich, können sich aber ebenso im Bereich des Umweltmonitoring oder der Authentifizierung einer Produktidentität und der Fälschungssicherheit von Produkten und Erzeugnissen ergeben.
Die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen können, auch nur teilweise, beliebig miteinander kombiniert werden.
Insgesamt wird somit ein Verfahren zur Elementmarkierung von Biomolekülen sowie für die Verwendung als Trägermaterial angepasste Aminosäuresequenzen, bzw. Peptide und Polypeptide, die zumindest teilweise mit einer Lanthanoid-haltigen Reportergruppe versehen sind, in diesem Verfahren vorgeschlagen.
Unter einem Peptid wird dabei die Verknüpfung von mindestens zwei Aminosäuren verstanden, wobei eine Aminogruppe einer ersten Aminosäure mit einer Carboxylgruppe einer zweiten Aminosäure kondensiert vorliegt. Damit ist das einfachste Peptid ein Dipeptid, das aus zwei miteinander kovalent verknüpften Aminosäureresten besteht. Ein Tetrapeptid weist dementsprechend drei Peptidbindungen auf und umfasst vier Aminosäuremoleküle. Ein Tetrapeptid kann als lineares Molekül mit mindestens zwei, jeweils endständigen funktionellen Gruppen vorliegen. Ein zyklisches Tetrapeptid weist hingegen keine endständige funktionelle Gruppe mehr auf, kann jedoch in Abhängigkeit von der Art der vier Aminosäure-Moleküle bzw. den in der Seitenkette vorhandenen funktionellen Gruppen, verschiedene funktionelle, d.h. reaktionsfähige Gruppen tragen.
Der vorgeschlagene molekulare Anhänger bzw. Marker („molecular tag“) besteht aus einer Trägersubstanz und an die Trägersubstanz gebundener signalerzeugender Reportergruppen. Als Trägersubstanz 1 werden Peptide vorgeschlagen. Ein für die Anwendung angepasstes Peptid umfasst eine Sequenz von derartigen Aminosäuren, die leicht mit den jeweiligen signalerzeugenden Reportergruppen (S1,S2,...,Sx) markiert werden können.
Gemäß typischer Ausführungsformen weist das als Trägermolekül einer Markersubstanz vorgeschlagene Molekül eine Vielzahl von miteinander über Peptidbindungen verketteten Peptid-Einheiten auf, deren Aminosäuresequenz identisch ist. Beispielsweise kann ein solches Trägermolekül die peptidische Grundstruktur „RKYCS“ aufweisen, wobei R, K, Y, C und S hier jeweils Aminosäuren, und zwar R - Arginin, K - Lysin, Y - Tyrosin, C - Cystein und S - Serin sind, die miteinander zu einem linearen Peptid der Sequenz RKYCS verbunden sind. Im entsprechenden „Polypeptid“ sind mehrere solcher Grundstrukturen miteinander peptidisch verbunden. Das resultierende Trägermolekül kann beispielsweise die Struktur RKYCS-RKYCS-RKYCS-RKYCS-RKYCS haben. Die Peptidbindung zwischen benachbarten Aminosäuren innerhalb des Pentapeptids RKYCS ist identisch mit einer vorstehend als Strich „-“ dargestellten Peptdidbindung zwischen Aminosäuren benachbarter Pentapeptide. Eine andere Schreibweise dieser Struktur ist (RKYCS)₅. Um die frei bleibenden endständigen funktionellen Gruppen, beispielsweise für den Fall der hier vorliegenden 2-Aminocarbonsäuren (α-Aminosäuren) zu verdeutlichen, wird vereinfachend eine weitere Schreibweise gewählt, die diese funktionellen Gruppen zeigt: H₂N-(RKYCS)₅-COOH. Diese Art der Schreibweise ist in den 3 bis 6 verwendet, auch wenn dabei die Aminosäuren nicht mit einem Ein-Buchstaben-Code, sondern mit einem Drei-Buchstaben-Code dargestellt sind.
Die Zahl der ein Trägermolekül (Peptid) ausbildenden Aminosäuren ist ausgewählt unter 2 bis 150, beispielsweise unter 3 bis 100, insbesondere unter 3 bis 50 und beträgt typischerweise zwischen 4 und 36.
Da Peptide automatisch synthetisiert werden können, zeichnet sich das routinemäßig erhaltbare Trägermaterial durch eine extrem gut-definierbare Heterogenität aus.
Als die mit der Markersubstanz markierten Zielmoleküle - hier als Targetbiomoleküle bezeichnet - kommen Proteine, insbesondere Antikörper, Metaboliten oder Nukleinsäuren in Betracht. Diese Targetbiomoleküle sind in der Lage, an unterschiedliche Strukturen (Entitäten) spezifisch zu binden (diese „zu erkennen“) oder von diesen „erkannt“ bzw. gebunden zu werden. Derartige Entitäten können beispielsweise in Lösungen, in physiologischen Flüssigkeiten, auf Zelloberflächen, an Membranen, auf Gewebeschnitten, auf oder in Mikroorganismen oder im Inneren von lebenden oder fixierten toten Zellen vorliegen. Ebenso aber können derartige Entitäten auf Feststoff- Oberflächen vorliegen.
Zum Nachweis der signalerzeugenden Reportergruppen können unterschiedliche Methoden eingesetzt werden. Insbesondere wird die Verwendung von:

■ optischen und photometrischen Methoden für den indirekten Nachweis einer oder mehrerer Reportergruppen, die eine Absorption, eine Fluoreszenz, Lumineszenz, Chemilumineszenz, eine Färbung bzw. einen Farbumschlag zur Signalgebung erzeugen kann; und von
■ atomspektrometrischen Methoden (Atomemissionsspektrometrie oder Massenspektrometrie) für den direkten Nachweis von signalerzeugenden Reportergruppen, die Heteroelemente enthalten, vorgeschlagen.

Dabei werden Heteroelemente ausgewählt, die im zu untersuchenden biologischen System selbst nicht vorkommen, wie z.B. seltene Metalle. Besonders geeignet sind hierzu die Lanthanoide. Dabei wird davon ausgegangen, dass das bei Detektion jeweils erzeugte Signal proportional zur Anzahl der eingeführten Reportergruppen ist. Insbesondere entspricht eine Intensität, eine Höhe oder eine Größe eines Messsignals der Anzahl der in der markierten Probe vorhandenen Reportergruppen. Damit ist bei durchgehend gleichmäßiger Markierung des nachzuweisenden Biomoleküls das jeweils erhaltene Messsignal proportional zur vorliegenden Menge bzw. Konzentration des Biomoleküls.
Eine Signalverstärkung wird erreicht durch Verwendung mehrerer, mittels gleicher Reportergruppen markierter, Aminosäuren. Das Vorliegen einer bestimmten Mischung verschiedener Reportergruppen kann zur Erzeugung eines Codes, bzw. zur Kodierung einer mit dem „molecular tag“ markierten Entität genutzt werden. Eine solche Entität kann ein Protein, beispielsweise ein Antikörper; eine Nukleinsäure (DNA, RNA); eine Organelle, beispielsweise ein Zellkern; eine Zelle oder eine Zellgruppe; oder ein Mikroorganismus sein. Die beschriebene Kodierung bietet prinzipiell die gleichen Möglichkeiten, die in anderen Anwendungsfeldern ein Barcode bietet.
Das genutzte Trägermaterial kann entweder synthetisch erzeugt oder aus natürlichen Quellen (Polypeptide, Proteine) gewonnen werden und besteht aus miteinander über Peptidbindungen verknüpften Aminosäuren (X,Y, Z). Am Trägermaterial werden Heteroelemente gebunden. Einerseits können beispielsweise Halogene, wie z.B. Jod oder Brom direkt und kovalent an Aminosäuren gebunden werden (Jodierung, Bromierung etc.).
Gemäß anderen Ausführungsformen kann die Komplexbildung bestimmter Aminosäuren, bzw. Aminosäuresequenzen mit Heteroelementen, z.B. die Komplexbildung von poly-His mit Metall-Ionen zum Nachweis genutzt werden. Gemäß weiteren Ausführungsformen können über extra eingeführte Reportergruppen Heteroelemente am Trägermaterial gebunden werden. Das eröffnet vielfältige Möglichkeiten der Einführung von Heteroelementen in das Trägermolekül.
Eine hohe Anzahl mit identischen signalerzeugenden Atomen oder Ionen markierter Aminosäuren eines Trägermoleküls (z.B. eines Oligopeptid) bewirkt im jeweiligen Detektorsystem ein höheres Detektorsignal, als ein kürzerer „molecular tag“ und ermöglicht damit eine Steigerung der Empfindlichkeit der Nachweismethode bei der Untersuchung einer entsprechend markierten Probe. Die erreichbare Signalempfindlichkeit ist proportional zur Zahl der Markierungen in der genutzten Sequenz, wenn jeweils nur ein „molecular tag“ am nachzuweisenden Biomolekül gebunden vorliegt.
Ein synthetisch erzeugtes Trägermaterial weist eine durch die gewählten Synthesebedingungen definierte Kettenlänge auf. Das ist von Vorteil für die exakte Quantifizierung einer mit dem entsprechenden „molecular tag“ markierten Probe.
Der prinzipielle Aufbau und beispielhafte Ausführungsformen der entsprechenden „molecular tags“ sind in den 1 bis 8 schematisch dargestellt:

1 zeigt den allgemeinen Aufbau der vorgeschlagenen Peptidmarker.
2 zeigt einen an ein Biomolekül gebundenen Peptidmarker.
3 zeigt den prinzipiellen Bauplan eines Trägermoleküls am Beispiel von poly(Lysyl-Tyrosin) und deca(Lysyl-Tyrosin).
4 zeigt ein Cysteinyl-Tyrosin - Trägermolekül.
5 zeigt Trägermolekül das aus vier miteinander über Peptidbindungen verknüpften Lysyltyrosinylcysteinylserin-Peptiden aufgebaut ist (Polypeptid).
6 zeigt ein Trägermolekül am Beispiel eines poly-Lysins.
7 zeigt auf zweierlei schematische Art die Verknüpfung der Aminosäuren eines tetrapeptidischen Trägermoleküls.
8 zeigt schematisch einige prinzipielle Möglichkeiten der Bindung von Heteroelementen am Trägermolekül und damit den prinzipiellen Aufbau der vorgeschlagenen Peptidmarker.

Die Figuren veranschaulichen Ausführungsformen und dienen zusammen mit der Beschreibung der Erläuterung der Prinzipien der vorgeschlagenen molekularen Marker. Die Elemente der Zeichnungen sind relativ zueinander und nicht notwendigerweise maßstabsgetreu. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen entsprechend ähnliche Teile.
Die in den 1 bis 8 gezeigte Grundstruktur der vorgeschlagenen Polypeptid-basierten Marker-Moleküle zur Markierung von Biomolekülen, nachfolgend verkürzt als „Polypeptidmarker“ bezeichnet, umfasst ein als Trägermolekül fungierendes Peptid, eine reaktionsfähige Gruppe und wenigstens eine signalerzeugende Reportergruppe, die an wenigstens einem der beteiligten Aminosäure-Reste gebunden ist.
Typischerweise weist das Trägermolekül miteinander über Peptidbindungen verknüpfte Untereinheiten auf. Diese Untereinheiten können vorteilhafterweise über Peptidbindungen miteinander verknüpfte Alpha-Aminosäuren sein. Weiterhin weist das Trägermolekül wenigstens eine endständige reaktive Gruppe auf. Unter einer Peptidbindung wird dabei verstanden, dass je eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe beteiligter Aminosäuren am gleichen Kohlenstoffatom gebunden sind und dass die Peptid-Bindung zwischen einzelnen Aminosäuren auf dem Wege der Kondensation derartiger Aminogruppen und Carboxylgruppen miteinander zu Stande kommt. Daraus ergibt sich, beispielsweise, das ein aus Lysin-Bausteinen aufgebautes Peptid im Sinne eines hier beschriebenen Trägermoleküls, also ein poly-Lysin, anders aufgebaut ist als ein, beispielsweise in der Zellkultur zur Oberflächenmodifizierung verwendetes, Polylysin, dessen Verknüpfungen Säureamide mit der Epsilon-Aminogruppe des Lysin darstellen.
Das so aufgebaute Di-, Tri- ,Tetra-, ... Oligo-, bzw. Polypeptid weist, neben ggf. in Seitenketten der beteiligten Aminosäurereste vorhandenen funktionellen Gruppen, wenigstens zwei endständige reaktionsfähige Gruppen auf. Typischerweise sind das eine endständige Aminogruppe und eine endständige Carboxylgruppe. Beispiele für Aminosäuren, die als Bausteine für die hier beschriebenen Trägermoleküle in Frage kommen, sind, aufgeführt mit einem gebräuchlichen Kürzel und dem entsprechenden Trivialnamen: Ala (Alanin); Arg (Arginin); Asn (Asparagin); Asp (Asparaginsäure); Cys (Cystein); Glu (Glutaminsäure); Gln (Glutamin); Gly (Glycin); His (Histamin); HyLys (Hydroxylysin); HyPro (Hydroxyprolin); Ileu (Isoleucin); Leu (Leucin); Lys (Lysin); Met (Methionin); Phe (Phenylalanin); Pro (Prolin); Ser (Serin); Thr (Threonin); Try (Tryptophan); Tyr (Tyrosin); Val (Valin). Eine besondere Gruppe stellen Cystein, Methion, Selenocystein dar, da diese bereits ein Reporterelement enthalten (S, Se), welches zum Nachweis herangezogen werden kann.
Gemäß weiteren Ausführungsformen werden ausdrücklich nicht ausschließlich proteinogene Aminosäuren zum Aufbau der Trägersubstanz verwendet. Beispiele anderer, ebenso zum Aufbau geeigneter Trägermoleküle gleichwertig einsetzbarer Aminosäuren sind Ornithin, Citrullin, DOPA, Homoserin oder Thyroxin. Dem Fachmann sind weitere Aminosäuren bekannt. Dabei wird hier bewusst nicht unterschieden zwischen den D- und L-Formen der Aminosäuren, da für einige der hier vorgesehenen Anwendungen die Chiralität der Aminosäuren nicht zwingend der in der belebten Natur anzutreffenden entsprechen muss. Insbesondere, wenn der Einsatz des Markermoleküls zu analytischen Zwecken außerhalb des Körpers oder überhaupt unabhängig von jeglichen physiologischen Bedingungen erfolgt, können auch typischerweise nicht-proteinogene D-Aminosäuren verwendet werden.
Beispielsweise kann die beschriebene Markersubstanz zur Verstärkung und/oder Erzeugung eines Signals dienen, das auf die selektive Bindung mit Hilfe eines Antikörpers gewonnen wird, der zum spezifischen Nachweis von Antibiotika, Pestiziden, Pestizidrückständen oder anderen Substanzen mittels angepasster Nachweistechniken (z.B. Enzymimmunoassay (EIA), ELISA, entsprechende Mikrospot-Arrays, partikelgestützte Nachweisverfahren) oder entsprechenden Sensorsystemen Verwendung findet.
Auch ist die Auswahl der verwendbaren Aminosäuren nicht auf α-Aminosäuren beschränkt. Beispielsweise kann als endständige Aminosäure des Trägermoleküls eine β-Aminosäure, beispielsweise β-Alanin, oder eine γ-Aminosäure, beispielsweise γ-Aminobuttersäure (GABA) oder auch eine Aminosulfonsäure eingesetzt werden.
In der Konsequenz der Verwendung einer dieser „Nicht- α-Aminosäuren“ als terminale Aminosäure des vorgeschlagenen Markermoleküls, kann die Vielfalt der zur Verfügung stehenden „terminalen“ funktionellen Gruppen erhöht werden.
Im Fall der Verwendung eines zyklischen Peptids als Trägermaterial wird die Funktion der terminalen funktionellen Gruppe durch eine entsprechend ausgewählte funktionelle Gruppe einer Seitenkette der zu einer Ringstruktur miteinander verbundenen Aminosäuren erfüllt. Diese funktionelle Gruppe kann während der Peptidsynthese geschützt sein und erst nach Ringschluss entschützt werden.
Die signalerzeugende Reportergruppe umfasst typischerweise einen Chelat- oder Komplex-Bildner, der ein Heteroelement aufweist. Unter einem Heteroelement werden im vorliegenden Zusammenhang beliebige chemische Elemente verstanden, ausgenommen Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff und Sauerstoff. Vorteilhafterweise werden für die vorgeschlagene Anwendung derartige Heteroelemente gewählt, die in der jeweiligen Probenmatrix nicht oder in nicht störenden Mengen vorkommen. Als Probenmatrix werden in diesem Zusammenhang beispielsweise eine physiologische Flüssigkeit, ein Serum, eine Zelle, ein Zellverband, ein Zell-Extrakt, ein Zell-Aufschluss, ein Biopsat, ein Abstrich, ein Gewebe, ein Gewebsaufschluss, eine Zellkulturflüssigkeit, ein Gewebeschnitt, eine Chromatographie- oder eine Elektrophorese-Fraktion verstanden. Ebenso ist es von Vorteil, wenn das Heteroelement nicht in den zur Handhabung der jeweiligen Probe verwendeten Hilfsmaterialien und Utensilien vorkommt. Derartige Hilfsmaterialien und Utensilien sind beispielsweise chromatographische Trägermaterialien oder zum Abklatsch (Blot) verwendete Papiere oder Folien, beispielsweise Nitrozellulose oder Nylon, sowie Laborgeräte und Einwegmaterialien, wie etwa Mikrotiterplatten, Pipettenspitzen oder Schutzhandschuhe. Ebenso ist das Heteroelement vorteilhafterweise nicht in Wasch-, Puffer- und Inkubationslösungen enthalten.
Typische Anwendungen der vorgeschlagenen Markersubstanz umfassen die Erzeugung und/oder die spezifische Verstärkung eines Signals, das auf die selektive Bindung eines Antikörpers an einem Molekül, einem Rezeptor, einer Oberflächenstruktur, einem Membranbestandteil, einem Mikroorganismus, einer Pilzhyphe, einem Virus, einer Organelle, oder einem Gewebe zurückgeht. Dabei kann ein mit Hilfe der Heteroelement-Markierung erzeugtes spezifisches atomspektroskopisches Signal (z.B. eine Spektrallinie, eine Massenzahl, ein Energiespektrum) als alleiniges Signal zur Identifikation der Markersubstanz und der mit ihr markierten Entität dienen. Ebenso aber kann eine andersartige Reportergruppe, beispielsweise ein Fluoreszenzfarbstoff oder ein Enzym, die an identischen Antikörpern oder an Antikörpern einer identischen Spezifität gebunden vorliegen, zur Multispektralanalyse einer Probe herangezogen werden. Beispielsweise kann ein Typ der hier vorgeschlagenen Markermoleküle gemeinsam mit einem anderen spezifischen Nachweisreagenz zur Bildgebung genutzt werden. Derartige Nachweisreagenzien können für diagnostische Fragestellungen, für pharmakokinetische Untersuchungen und/oder für die biomedizinische Forschung von Interesse sein. Auf Anwendungen im Bereich der Produktidentifikation wurde bereits hingewiesen.
Eine typische Struktur des mit Reportergruppen versehenen Trägermaterials ist in 1 gezeigt. Dabei stellt „A“ eine funktionelle Gruppe, beispielsweise eine Aminogruppe dar. Dem Fachmann sind zahlreiche Methoden bekannt und entsprechende Reagenzien zugänglich, die unter milden und physiologischen Bedingungen die direkte oder indirekte kovalente Bindung einer Aminogruppe an ein Target-Molekül gestatten. Üblicherweise werden als „Linker“ bezeichnete niedermolekulare Verbindungen eingesetzt, um ein Targetmolekül mit der beschriebenen Markersubstanz zu modifizieren.
2 zeigt schematisch ein Biomolekül „BM“, das über eine Gruppe „A“ mit einer Sequenz von Aminosäuren X-X-X-Z-Y verbunden ist. Die Aminosäuren tragen jeweils spezifische signalerzeugende Reportergruppen S1, S2, S3, S4, Sx. Dabei ist die signalerzeugende Reportergruppe S so ausgewählt, dass der Nachweis des markierten Biomoleküls (Target) folgenden Anforderungen genügt:

1) qualitative Nachweisbarkeit;
2) quantitativ Nachweisbarkeit;
3) Unterscheidbarkeit, bzw. Möglichkeit der Codierung;
4) Signalverstärkung gegenüber herkömmlichen Markierungen.

Die Aminosäuresequenz kann einerseits eine Reihenfolge verschiedener Aminosäuren sein, kann aber auch eine Folge unterschiedlicher Gruppen von Aminosäuren (Peptide) umfassen. An einer derartigen Gruppe von Aminosäuren, beispielsweise an einem Tetrapeptid, können verschiedene Reportergruppen angekoppelt sein, so dass das markierte Trägermaterial, d.h. der Peptidmarker, verschiedene Reportergruppen S1 .... S4, bzw. im allgemeineren Fall S1 .... Sx in einem bestimmten quantitativen Verhältnis tragen kann.
Das feste quantitative Verhältnis der Reportergruppen bietet die Möglichkeit der Erzeugung jeweils charakteristischer Signal-Muster (Signatur) beim Nachweis der Heteroelemente. Das wiederum ermöglicht eine elementbasierte Kodierung der modifizierten Biomoleküle (Targets).
3 zeigt schematisch den Aufbau eines aus einander wiederholenden Lysyl-Tyrosin-Einheiten aufgebauten Trägermoleküls. Es handelt sich somit um ein Lysyltyrosin-Polypeptid. Wie ersichtlich, ist die jeweils gewählte Länge des Trägermoleküls frei wählbar und kann der gewünschten Anwendung angepasst werden. Die Seitenketten des Tyrosins können direkt mit Jod modifiziert werden. Ebenso kann Jod aber auch direkt an Histidin gebunden werden, wenn Histidin in einem entsprechenden Trägermaterial vorliegt
Die Seitenketten der Lysin-Moleküle können über die Bindung von p-SCN-Benzyl-DOTA mit verschiedenen Lanthanoiden befrachtet werden. Dazu kann die endständige Carboxylfunktion zur Kupplung des Chelatbildners an das Target-Molekül benutzt werden. Mit Bezug zu den Anwendungsgebieten der vorgeschlagenen Peptidmarker bietet z.B. die Jodierung über die Auswahl spezifischer Isotope die Vorteile der Anwendung der für diese Isotope bekannten bildgebenden Verfahren der biochemischen bzw. medizinischen Diagnostik. Beispielsweise kann neben ¹²⁷ I auch ¹²³I oder ¹²⁵I verwendet werden.
4 zeigt eine weitere Ausführungsform eines Trägermoleküls, umfassend eine Cysteinyl-Tyrosin-Sequenz. Auch hier ist die Länge des Trägermoleküls einstellbar und wird praktischerweise an die jeweilige Anwendung angepasst. Tyrosin kann leicht halogeniert, beispielsweise problemlos jodiert werden. Ein weiteres Heteroelement kann über die Bindung je eines p-Maleimid-Benzyl-DOTA pro Cystein-Seitenkette eingeführt werden. Die endständige Carboxyl- und Aminofunktion können zur Kupplung an das Target benutzt werden.
5 zeigt ein aus vier identischen Blöcken aufgebautes Trägermolekül. Dieses Trägermolekül hat ein Molekulargewicht von MW = 2404,69 g/Mol. Es hat je 4 Kupplungsstellen folgender Art: -NH₂; -C₆H₄OH; -SH und -OH. Die endständige Carboxylfunktion kann zur Kupplung benutzt werden.
6 zeigt ein aus 18 Lysinmolekülen aufgebautes lineares Peptid. Besondere Vorteile bieten die einer selektiven Modifizierung mit den vorstehend erwähnten bifunktionellen Reportermolekülen zugänglichen ε-Amino-Gruppen der Seitenketten des Lysins. Sie erlauben eine besonders hohe Beladung mit signalerzeugenden Heteroelementen, beispielsweise mit Lanthaniden. Das gezeigte Molekül unterscheidet sich deutlich von dem in der Zellkultur verwendeten Polylysin, dessen Verknüpfungen Säureamide mit der ε-Aminogruppe des Lysins darstellen. Das hier zu verwendende Molekül enthält tatsächliche über die α-Aminogruppe geknüpfte Peptidbindungen. Markierungen können z.B. mit Isothiocyanato-Verbindungen der chelatbildenden Gruppen erzielt werden, insbesondere mit 2-(4-Isothiocyanatobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure.
Die positiven Ladungen von aus sterischen Gründen nicht modifizierten ε-Aminogruppen können gegebenenfalls durch Umsetzung mit kleinen NH₂-reaktiven Molekülen neutralisiert werden. Die endständige Carboxylfunktion kann zur Kupplung benutzt werden.
Die 7 und 8 veranschaulichen zusammenfassend typische Merkmale und Besonderheiten des hier vorgeschlagenen Peptidmarkers. Dabei zeigt 7 ein Trägermolekül 1 in Gestalt eines Tetrapeptids Tyr-Cys-Lys-Cys, bzw. YCKC. Die Aminosäurebausteine sind über Peptidbindungen 100 miteinander verknüpft. Im Formelschema ist die chemische Struktur der Aminosäuren vereinfacht dargestellt, insbesondere ist die Seitenkette des Lysin nicht gezeigt, sondern nur die ε-Aminogruppe.
8 zeigt am Beispiel dieses Trägermoleküls 1 die endständige Aminogruppe 11 sowie die endständige Carboxylgruppe 12, die beide zur Kopplung des Peptidmarkers an das Target (hier nicht gezeigt) genutzt werden können. Die bereits erwähnte direkte Markierung einzelner Aminosäuren ist hier am Beispiel einer Jodierung 5 der Seitenkette des Tyrosins gezeigt. Als bifunktionale Reportergruppen wurden hier p-SCN-Benzyl-DOTA 210 und p-Maleimid-Benzyl-DOTA 220 eingesetzt. Das gebräuchliche Kürzel DOTA steht hier für 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetat. Diese Verbindung bildet stabile Komplexe, z.B. mit Lanthaniden und ist hinlänglich gut bioverträglich. Bisherige Einsatzgebiete liegen auf dem Gebiet der Formulierung von Kontrastmitteln für medizinischdiagnostische Anwendungen, beispielsweise bei der Kernspinresonanztomographie. Die chemische Struktur des Metallbindenden Chelatbildners DOTA 10, 20 ist im rechten Teil der Figur schematisch gezeigt. Vorteilhafterweise kann der nicht-metallierte Chelatbildner mit unterschiedlichen Kationen 50 beladen werden. Die verwendeten unterschiedlichen Schraffuren der metallierten Chelatbildner stehen für Chelate zweier unterschiedlicher Metalle. Die Möglichkeit zur Einführung von mehr als nur zwei unterschiedlichen Metallspezies ist dem Fachmann an Hand der hier gegebenen Hinweise verständlich.
Das chelatisierte Metallion 50 ist typischerweise das Kation eines Lanthanoids, wie Lanthan, Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium oder Lutetium, beispielsweise La³⁺, Ce³⁺, Ce⁴⁺, Pr³⁺, Pr⁴⁺, Nd³⁺, Nd⁴⁺, Pm³⁺, Sm²⁺, Sm³⁺, Eu²⁺, Eu³⁺, Gd³⁺, Tb³⁺, Tb⁴⁺, Dy³⁺, Dy⁴⁺, Ho³⁺, Er³⁺, Tm²⁺, Tm³⁺, Yb²⁺, Yb³⁺, Lu³⁺.
An das Trägermaterial kann endständig entweder an die Aminogruppe 11 oder an die Carboxylgruppe 12 der entsprechenden endständigen Aminosäure ein reaktiver Linker angebracht sein, der nicht mit den Aminosäuren der Sequenz, wohl aber mit dem TargetBiomolekül (einem Peptid, einem Polypeptid, einer Nukleinsäure, einem Protein - beispielsweise einem Enzym oder einem Antikörper) reagieren kann oder der sich problemlos mit Hilfe eines Kopplungsreagenz mit dem genannten Target verknüpfen lässt.
Nach Bindung der Sequenz an das Biomolekül kann dann das Biomolekül direkt qualitativ oder quantitativ bestimmt werden, lässt sich mit entsprechenden Methoden durch seine Elementsignatur in einem biologischen System verfolgen, oder kann als Standard zur Kalibrierung oder Eichung eines Messgeräts oder zur Validierung einer Nachweismethode dienen.
Als Methoden zum Nachweis des Markermoleküls können jegliche für die Detektion der jeweiligen Heteroelemente geeignete analytische Messtechniken verwendet werden. Insbesondere werden atomspektroskopische Verfahren eingesetzt, wie z.B. Atomabsorptionsspektroskopie (AAS), Atomemissionsspektroskopie (AES), Atomfluoreszenzspektroskopie (AFS), Massenspektrometrie (MS), insbesondere Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS).
Eine besondere Bedeutung kommt der Markierung von Antikörpern durch den vorgeschlagenen Peptidmarker zu. Während in bisherigen Untersuchungen zur Biokonjugation die Zahl der signalgebenden Reportergruppen, die an ein Antikörpermolekül konjugiert werden konnte, mit typischerweise < 10 sehr begrenzt war, ermöglicht das vorgeschlagene Konzept des Einsatzes von Trägermolekülen einer definierten Sequenz und damit definierter Bindungseigenschaften sehr heterogene Konjugationen von einigen Zehn bis zu Hunderten von Reportergruppen je Antikörpermolekül.
Die Länge der Sequenz wird typischerweise so gewählt, dass sie die spezifischen Immuneigenschaften des Antikörpers nicht beeinträchtigt. Damit kann, beispielsweise in Abhängigkeit von der Affinität und Avidität des jeweiligen Antikörpers, die Sequenzlänge angepasst und die mit dem jeweiligen Antikörper erreichbare Nachweisempfindlichkeit optimiert werden. Vorteilhafterweise werden monoklonale Antikörper mit den hier beschriebenen Peptidmarkern dekoriert und für analytische Zwecke eingesetzt.
Anwendungen derartig markierter Antikörper liegen auf den Gebieten der Detektion einzelner Zellen, dem Nachweis von Analyten mittels ELISA, dem Nachweis von Proteinen oder dem Nachweis von Viren. Beispielsweise kann ein entsprechend markiertes Molekül ein Wirkstoff sein dessen Kinetik (Pharmakokinetik) untersucht werden soll. Ebenso kann ein beschriebenes Markermolekül zum spezifischen Nachweis von Proteinen in 2D-Elektrophorese oder Elektroblotting, insbesondere „Western-Blot“-Assay und im Immunoimaging verwendet werden.
Für die Bindung der Heteroelemente bestimmte reaktive Gruppen des Trägermaterials können reaktive Gruppen sein, wie sie typischerweise mit dem Begriff „bivalente Reportergruppen“ beschrieben werden: In diesem Zusammenhang wird unter einer bivalenten Reportergruppe eine reaktive heteroelementbindende Gruppe verstanden, die sowohl das Heteroelement binden als auch mit einer definierten Aminosäure reagieren kann. So kann beispielsweise ein Maleimid-Reaktand selektiv an Thiolgruppen (Cystein) und ein SCN-Reaktand selektiv an Aminogruppen (z.B. Lysin, Arginin) binden. Auch die terminale Aminogruppe eines Peptids kann mit einem SCN-Reaktanden mit einer Reportergruppe dekoriert werden. Die heteroelementbindene reaktive Gruppe kann aus Chelat- und Komplexbildnern aufgebaut sein, die gezielt Metalle oder andere Markierungselemente binden. Als chelatbildende Gruppe kann beispielsweise DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetat) oder DTPA (Diethylentriaminpentaacetat), sowie die bereits benannten chelatbildenden Gruppen verwendet werden.
Die beschriebene Markersubstanz, bzw. ein entsprechender Peptidmarker ist erforderlichenfalls hochgradig biokompatibel, da sein Grundgerüst vollständig aus natürlich vorkommenden Aminosäuren aufgebaut werden kann. Über die jeweilige Zusammensetzung der Aminosäuresequenz können die chemischen und physikalischen Eigenschaften wie z.B. Wasserlöslichkeit, Hydrophobizität, Restladung, isoelektrischer Punkt etc. gesteuert und so der jeweiligen Anwendung angepasst werden. Auch wenn in den Figuren nicht gezeigt, kann der Peptidmarker bzw. das Trägermolekül Aminosäuren aufweisen, die keine Reportergruppe tragen und selbst auch nicht mit Heteroatomen markiert sind. Insbesondere derartige Aminosäuren bzw. Peptide aus derartigen Aminosäuren können zur elektrostatischen Stabilisierung oder zur Verbesserung der Löslichkeit der Markersubstanz eingesetzt werden.
Ein wesentlicher Vorteil der beschriebenen Markermoleküle gegenüber herkömmlichen Anwendungen ergibt sich aus der Homogenität automatisch synthetisierter Peptide und Polypeptide. Die beschriebene Markersubstanz umfasst ein Polymerbasismaterial, d.h. ein Peptid oder ein Polypeptid, einen oder mehrere verschiedene reaktive Linker und metallbindene Seitenketten (z.B. Chelatbildner). Da bisher bekannte Polymermaterialien äußerst heterogen bezüglich ihrer Kettenlänge sind, ist die Quantifizierung atomspektroskopischer Messdaten erschwert oder ganz unmöglich. Dieser Nachteil wird mit dem beschriebenen Trägermaterial überwunden. Zusätzlich werden wie beschrieben neue Anwendungsmöglichkeiten erschlossen.
Ein besonderer Vorteil der beschriebenen Ausführungsformen und ihrer Kombination miteinander besteht darin, dass eine hohe und frei einstellbare Nachweisempfindlichkeit erzielt werden kann, die molekulare Homogenität der zur Markierung verwendeten Moleküle, d.h. des Trägermaterials erheblich verbessert wird und eine Möglichkeit zur zusätzlichen Kodierung geschaffen wird, die multimodale Nachweistechniken unter Verwendung der molekularen Markierungen (engl.: molecular tags) ermöglicht.
Mit den vorstehend beschriebenen Markermolekülen und den beschriebenen darauf basierenden Verfahren und Verwendungen werden die Vorteile einer Metall-Chelatmarkierung zur Steigerung der Nachweisempfindlichkeit für unterschiedlichste Analyte erschlossen. Insbesondere kann über die beschriebene Metallchelat-Markierung von biospezifischen Liganden, biologisch aktiven Substanzen, Enzymen, Immunoglobulinen, insbesondere von monoklonalen Antikörpern, Antikörperfragmenten bzw. Fraktionen, die hohe Spezifität und Selektivität dieser Moleküle für unterschiedlichste molekulare und zelluläre Strukturen, wie z.B. Rezeptoren, Enzymsubstrate, Differenzierungsmarker (sogenannte cluster of differentiation; CD-Marker), Proteine, Glykolipide, Sphingolipide, Phospholipide, ja selbst für niedermolekulare (auch synthetische) Antigene wie Pestizide, Antibiotika oder pharmazeutische Wirkstoffe, mit der äußerst empfindlichen und wenig störanfälligen Atomspektroskopie kombiniert werden. Moderne atomspektroskopische Messtechniken und deren Kombination mit anderen Techniken, beispielsweise der Massenspektroskopie (MS, ICP-MS, ESI-/MALDI-MSMS, TOF-MS etc.) oder der Atomabsorptionsspektroskopie, der Röntgenfluoreszenzanalyse, EDX bieten die Möglichkeit verschiedene, nahe verwandte chemische Elemente selektiv aus ihrem Gemisch nachzuweisen.
Vorteilhafterweise können mit dem vorgeschlagenen Trägermaterial, insbesondere in Gestalt von Polypeptiden mit einer einzigen Markierung, d.h. mit Hilfe nur eines an das Target(bio)molekül angekoppelten Markermoleküls, mehrere Heteroelemente mit dem markierten Molekül verknüpft werden. Das steigert einerseits die Nachweisempfindlichkeit für entsprechend markierte Biomoleküle erheblich, wenn zahlreiche Ionen eines Heteroelements eingeführt werden. Andererseits schafft das die beschriebenen Möglichkeiten einer Kodierung oder einer multimodalen Detektion, wenn mehrere verschiedene Heteroelemente in einem fest eingestellten Mengenverhältnis zueinander eingeführt werden.
Wenngleich hierin spezifische Ausführungsformen dargestellt und beschrieben worden sind, liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die gezeigten Ausführungsformen geeignet zu modifizieren, ohne vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Die nachfolgenden Ansprüche stellen einen ersten, nicht bindenden Versuch dar, die Erfindung allgemein zu definieren.
Bezugszeichenliste

1: Trägermolekül
5: Halogen, z.B. Jod
10: Chelatbildner DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetat)
11: endständige Aminogruppe
12: endständige Carboxylgruppe
20: Chelatbildner DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraacetat)
100: Peptidbindung
50: komplexiertes Metall-Ion, z.B. Lanthanid-Ion
210: p-SCN-Benzyl-DOTA
220: p-Maleimid-Benzyl-DOTA

Claims

Markersubstanz mit einer reaktiven Gruppe, wobei die Markersubstanz für den spezifischen Nachweis von Biomaterial angepasst ist und ein Trägermaterial (1) umfasst, das zumindest zwei Stück einer Untereinheit enthält, die miteinander über eine Peptidbindung (100) verknüpft sind, wobei die Untereinheit zumindest eine Aminosäure mit einer Heteroelement-haltigen Reportergruppe (10, 20) aufweist, und das Heteroelement ein beliebiges chemisches Element außer Wasserstoff (H), Kohlenstoff (C), Stickstoff (N) und Sauerstoff (O) ist, wobei die Untereinheit ein Peptid ist und die Reportergruppe (10, 20) über eine Seitengruppe einer Aminosäure mit dem Trägermaterial (1) verbunden ist.
Markersubstanz nach Anspruch 1, wobei das Heteroelement ausgewählt ist unter: Lanthan (La), Cer (Ce), Praseodym (Pr), Neodym (Nd), Promethium (Pm), Samarium (Sm), Europium (Eu), Gadolinium (Gd), Terbium (Tb), Dysprosium (Dy), Holmium (Ho), Erbium (Er), Thulium (Tm), Ytterbium (Yb), Lutetium (Lu), Silber (Ag), Aluminium (Al), Arsen (As), Gold (Au), Beryllium (Be), Wismut (Bi), Cadmium (Cd), Germanium (Ge), Kobalt (Co), Chrom (Cr), Kupfer (Cu), Eisen (Fe), Gallium (Ga), Quecksilber (Hg), Indium (In), Lithium (Li), Mangan (Mn), Natrium (Na), Blei (Pb), Rubidium (Rb), Antimon (Sb), Skandium (Sc), Selen (Se), Zinn (Sn), Tellur (Tl), Vanadium (V), Wolfram (W), Yttrium (Y), Zink (Zn), Zirkonium (Zr), Schwefel (S), Phosphor (P), Silizium (Si), Iod (I), Brom (Br), Fluor (F).
Markersubstanz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Reportergruppe (10, 20) einen Chelatbildner, einen Komplexbildner und/oder einen Ionenaustauscher umfasst.
Markersubstanz nach Anspruch 3, wobei der Chelatbildner und/oder Komplexbildner ausgewählt ist unter: Cyclohexandiamintetraessigsäure (CDTA); Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA); Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraessigsäure (EGTA); Nitrilotriessigsäure (NTA); N-(2-Hydroxyethyl)-ethylendiamin-N,N,N'-triessigsäure (HEDTA); Triethylentetraminhexaessigsäure (TTHA); 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA); 1, 4, 7-Triazacyclononan-1, 4, 7-triessigsäure (NOTA); einem NOTA-Derivat; 1, 4, 8, 11-Tetraazacyclotetradecan-1, 4, 8, 11-tetraessigsäure (TETA); Diethylentriamin-N, N', N"-triessigsäure- N, N"-bis(2-methylpyridin) (DTPA-BP); Diethylentriamin-N, N', N"-triessigsäure- N, N"-bis(methylamid) (DTPA-BMA), 1-Oxa-4, 7, 10-tetraazacyclododecan-4, 7, 10-triessigsäure (DO3A); einem DO3A-Derivat; Diethylentriamin- N, N, N', N", N"-pentaessigsäure (DTPAA), p-Isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin (Df-Bn-NCS), 1,4,7,10,13,16, 19,22-Oktaazacyclotetracosan-1,4,7,10,13,16,19,22-oktaessigsäure (OTEC); 1,4,7,10,14,17,20,23-Oktaazacyclohexacosan-1,4,7,10,14,17,20,23-oktaessigsäure (OHEC); 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10- tetra(methylen phosphonat) (DOTP); benzyloxypropionictetraacetat (BOPTA); Calixaren; Cryptat; trispyridin europium cryptat (TBP cryptat); 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan (cyclam); 1,4,7,10-tetraazacyclododecan (cyclen); 1,4,7-triazacyclononan (tacn), oder unter Carbonyl-Komplexen, Carben-Komplexen und Metallocen basierten Reagenzien.
Markersubstanz nach Anspruch 3, wobei die Verknüpfung der Reportergruppe (10, 20) zum Trägermaterial (1) eine Thiocarbonyl-Gruppe oder eine Thioether-Bindung aufweist.
Markersubstanz nach Anspruch 5, wobei die Seitengruppe ausgewählt ist unter Seitengruppen der Aminosäuren: Arginin, Cystein, Histidin, Hydroxylysin, Lysin und/oder Serin.
Markersubstanz nach Anspruch 1, wobei das Peptid eine Sequenz von D- und/oder L-Aminosäuren aufweist und die Zahl der das Peptid ausbildenden Aminosäuren ausgewählt ist unter 2 bis 150, beispielsweise unter 3 bis 100, insbesondere unter 3 bis 50 und typischerweise zwischen 4 und 36 beträgt.
Markersubstanz nach Anspruch 7, wobei das Peptid eine einzige lineare Sequenz von Aminosäuren darstellt.
Markersubstanz nach Anspruch 7, wobei das Peptid ein zyklisches Peptid ist.
Markersubstanz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Trägermaterial halogeniert ist.
Markersubstanz nach Anspruch 10, wobei die das halogenierte Trägermaterial eine jodierte, eine bromierte und/oder eine fluorierte Aminosäure umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer in den Ansprüchen 1 bis 11 beschriebenen Markersubstanz umfassend - Auswählen eines Moleküls mit wenigstens einer terminalen funktionellen Gruppe als Untereinheit, umfassend zu einem Peptid verknüpfte Aminosäuren, wobei wenigstens eine Aminosäure eine Seitenkette aufweist und wobei die terminale funktionelle Gruppe ausgewählt ist unter einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe; - Umsetzen wenigstens einer Seitenkette einer Aminosäure mit einem bifunktionalen Reportermolekül; - Einführen einer reaktiven Gruppe durch Umsetzen der terminalen funktionellen Gruppe mit einem bifunktionalen Linkermolekül, - Verknüpfen von wenigstens zwei der als Untereinheit ausgewählten Moleküle, sodass zumindest eine terminale Aminogruppe einer ersten Untereinheit mit zumindest einer terminalen Carboxylgruppe einer weiteren Untereinheit die Untereinheiten unter Ausbildungen einer Peptidbindung verknüpft.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das bifunktionale Reportermolekül ausgewählt ist unter: p-SCN-Benzyl-DOTA; p-Maleimid-Benzyl-DOTA; S-2-(4-Nitrobenzyl)-DOTA; S-2-(4-Aminobenzyl)-DOTA; DOTA-succinimidylacetat; DOTA-N-hydroxysuccinimid ester; S-2-(4-Aminobenzyl)-DTPA, p-SCN-Benzyl-DTPA; p-Maleimid-Benzyl-DTPA; Aminobenzyl-DO3A; p-SCN-Benzyl-oxo-DO3A; S-2-(4-Aminobenzyl)-NOTA; p-SCN-Benzyl-NOTA; p-SCN-Benzyl-Deferroxamin, Bromoacetamidobenzyl-DOTA (BAD); 2,2',2"-(10-(2,6-dioxotetrahydro-2H-pyran-3-yl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triyl)triacetic acid (DOTA-GA anhydrid).
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das bifunktionale Linkermolekül ausgewählt ist unter: m-Maleimidobenzoyl N-hydroxysuccinimidester (MBS); einem Carbodiimid; N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid; 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid hydrochlorid (EDC); 2-Iminothiolan; Imidoester wie z.B. Dimethyl adipimidate (DMA); N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat (SATA).
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die eingeführte endständige reaktive Gruppe und/oder der zu ihrer Einführung eingestellte pH-Wert und/oder ein Lösungsmittel so ausgewählt ist, dass die endständig eingeführte reaktive Gruppe nicht mit der Seitenkette der wenigstens einen Aminosäure reagiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, weiterhin umfassend: - Maskieren einer Aminogruppe durch Acetylierung.
Nachweisreagenz umfassend eine Markersubstanz nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und ein Molekül oder Fragmente eines Moleküls, das ausgewählt ist unter: einem Antikörper, umfassend IgG, IgM, und/oder IgE; Avidin; Biotin; einem Enzym; einem Enzymsubstrat; einem Hormon; Protein A; Protein G; einem Rezeptor; Streptavidin.
Analyseverfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis eines Analyten in einer Probe, umfassend: (a) Markieren eines Analyten mit einem Nachweisreagenz nach Anspruch 17; und (b) Analyse mittels Massenspektrometrie und/oder Atomspektroskopie; wobei sich das quantitative Verhältnis der zur Analyse genutzten signalerzeugenden Heteroelemente zueinander bis zum Zeitpunkt der Analyse nicht ändert.
Analyseverfahren nach Anspruch 18, wobei die Bestimmung eines Verhältnisses der Heteroelemente eines ersten Nachweisreagenz zu dessen Identifikation und/oder zu dessen Unterscheidung von einem zweiten Nachweisreagenz genutzt wird.
Immunoassay, umfassend die Verwendung einer Markersubstanz nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder eines Nachweisreagenz nach Anspruch 17, wobei der Immunoassay ausgewählt ist unter: Enzym Immuno Assay (EIA), Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA), Immunoblot, Western blot, Southern blot, Microarray.
Verwendung einer Markersubstanz nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder eines Nachweisreagenz nach Anspruch 17 zum Nachweis der Präsenz, der Lokalisierung, und/oder der Konzentration einer Entität oder eines Bestandteils einer Entität, die ausgewählt ist unter: einem Biopolymer, insbesondere einem Protein oder einer Nukleinsäure; einem Hormon; einem Rezeptor; einer Biomembran; einer Zelle; einem Mikroorganismus; einem Virus; einer bioaktiven Substanz; einem pharmazeutischen Wirkstoff.
Verfahren zur Rückverfolgung und/oder zur verdeckten individuellen Kennzeichnung eines Biomoleküls, umfassend: - Auswählen einer ersten Markersubstanz nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die erste Markersubstanz durch ein erstes Verhältnis der Massen von wenigstens zwei Heteroelementen zueinander gekennzeichnet ist; - Kovalentes Binden der ersten Markersubstanz an das Biomolekül; - in-Verkehr-Bringen des Biomoleküls.
Verfahren zur Rückverfolgung und/oder zur verdeckten individuellen Kennzeichnung eines Biomoleküls, weiterhin umfassend: - Durchführen einer atomspektroskopischen Analyse einer mutmaßlich das individuell gekennzeichnete Biomolekül beinhaltenden Probe; - Ermitteln eines Verhältnisses der Massen von wenigstens zwei Heteroelementen zueinander in der mutmaßlich dass individuell gekennzeichnete Biomolekül beinhaltenden Probe; - Feststellen der Identität oder der Nicht-Identität des festgestellten vom erwarteten Verhältnis der Massen von wenigstens zwei Heteroelementen.
Verfahren nach Anspruch 23, weiterhin umfassend: - Feststellen der Zugehörigkeit des Biomoleküls aus der Probe zu einer Liste oder Feststellen seiner Nicht-Zugehörigkeit zu einer Liste.
Nachweismethode für ein Biomolekül basierend auf einem an das Biomolekül gebundenen Peptidmarker, der eine Vielzahl von miteinander über Peptidbindungen verketteten Peptid-Einheiten mit einer identischen Sequenz von Aminosäuren aufweist, wobei die Aminosäuren ausgewählt sind unter Arginin, Cystein, Histidin, Hydroxylysin, Lysin, Serin und Tyrosin; wobei Seitenketten zumindest eines Tyrosin-Moleküls der Peptid-Einheiten jodiert und/oder Seitenketten zumindest einer der verbleibenden Aminosäuren der Peptid-Einheiten kovalent mit einer chelatbildenden Gruppe verknüpft sind, die ein Metallion trägt; umfassend: - Bestimmen des Metallions und/oder des Jodids; - optionales Ermitteln eines quantitativen Verhältnisses von Metallion und/oder Jodid; - Qualitatives und/oder quantitatives Nachweisen des Biomoleküls an Hand des bestimmten Metallions und/oder des bestimmten Jodids und/oder des ermittelten quantitativen Verhältnisses.
Nachweismethode nach Anspruch 25, wobei das Metallion ausgewählt ist unter: La³⁺, Ce³⁺, Ce⁴⁺, Pr³⁺, Pr⁴⁺, Nd³⁺, Nd⁴⁺, Pm³⁺, Sm²⁺, Sm³⁺, Eu²⁺, Eu³⁺, Gd³⁺, Tb³⁺, Tb⁴⁺, Dy³⁺, Dy⁴⁺, Ho³⁺, Er³⁺, Tm²⁺, Tm³⁺, Yb²⁺, Yb³⁺, Lu³⁺; und die chelatbildende Gruppe ausgewählt ist unter: DOTA und DTPA.