DE60217328T2

DE60217328T2 - Verfahren zur analyse von proteinproben

Info

Publication number: DE60217328T2
Application number: DE60217328T
Authority: DE
Inventors: C. Kenneth Hopkinton PARKER; K. Timothy Framingham NADLER; J. George Medway VELLA; Yulin Westwood HUANG; H. Rudolf Mercer Island AEBERESOLD; B. Marcus CEP-13084-010 Sao Paulo SMOLKA
Original assignee: PerSeptive Biosystems Inc; Institute for Systems Biology
Current assignee: Institute for Systems Biology; Applied Biosystems LLC
Priority date: 2001-05-08
Filing date: 2002-05-07
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2022-05-08
Also published as: US7045296B2; WO2002090929A3; US20020192720A1; DE60217328D1; AU2002340828A1; JP4188701B2; EP1392848A4; EP1392848A2; ATE350666T1; JP2004533610A; WO2002090929A2; EP1392848B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Detektieren von Unterschieden in der Proteinzusammensetzung zwischen komplexen Proteinproben, wie Zelllysaten, Zellextrakten oder Gewebeextrakten. Spezieller betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Analysieren von Proteinzusammensetzungen mittels Gelelektrophorese unter Verwendung wenigstens zweier markierter Reagenzien, die solche Unterschiede detektieren können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die zweidimensionale (2D) Elektrophorese ist seit langem ein Hauptstandbein bei der quantitativen Analyse komplexer Proteingemische, beispielsweise aus Zelllysaten oder Organellen. Der traditionelle Ansatz zum Quantifizieren von Proteinen besteht darin, eine Bildanalyse der Gele durchzuführen. Die Proteine können durch Färben der Proteine, mittels Audioradiographie oder sogar unter Verwendung von Antikörpern, die für bestimmte Proteine spezifisch sind (Western-Blotten), detektiert werden. Obwohl leistungsfähige Software entwickelt wurde, um die Menge an Protein zu quantifizieren, die zu einem Fleck in einem Gel wandert, ist die Menge an Informationen, die durch solche Analysen erhalten werden kann, beschränkt, selbst wenn die Gele vollkommen reproduzierbar sind und selbst wenn die Software für die Analyse der Flecken Mehrdeutigkeiten aus einander überlappenden Flecken und unebenen Hintergründen auflösen kann. In jüngerer Zeit wurden Massenspektrometrietechniken in der veröffentlichten internationalen PCT-Anmeldung WO 00/11208 beschrieben, wobei stabile Isotope in Peptide, die von jedem Protein abgeleitet sind, aufgenommen werden, was die Notwendigkeit von Gelen und von Bildanalyse jeglicher Art umgeht, da die Quantifizierung mit einem Massenspektrometer durchgeführt wird. Wenn jedoch Proteine vorzeitig verdaut werden, gehen fast alle Informationen bezüglich der chemischen Modifikation der Proteine verloren, und die quantitativen Informationen für verschiedene Proteine, die das detektierte Peptid gemeinsam haben, werden kombiniert.
Proteine sind wesentlich für die Kontrolle und die Ausführung nahezu jedes biologischen Prozesses. Die Synthesegeschwindigkeit und die Halbwertszeit von Proteinen und somit ihr Expressionsniveau werden auch posttranskriptional kontrolliert. Weiterhin wird die Aktivität von Proteinen häufig durch posttranslationale Modifikationen, insbesondere Proteinphosphorylierung, und in Abhängigkeit von der Verknüpfung des Proteins mit anderen Molekülen, einschließlich DNA und Proteinen, moduliert. Daher ist weder das Expressionsniveau noch der Aktivitätszustand von Proteinen direkt aus der Gensequenz oder sogar aus dem Expressionsniveau des korrespondierenden mRNA-Transkripts ersichtlich. Es ist daher überaus wünschenswert, daß eine vollständige Beschreibung eines biologischen Systems Messungen umfaßt, die die Identität, die Menge und den Aktivitätszustand der das System bildenden Proteine anzeigen. Die Analyse von Proteinen, die in einer Zelle oder in Gewebe exprimiert werden, in großem Umfang (letztendlich global) wurde als Proteomanaly se bezeichnet. Die Proteomanalyse erlaubt die Detektion und die Überwachung von Unterschieden in der Struktur, der Funktion und der Entwicklung von Zellen. Die Fähigkeit zur Bestimmung von Unterschieden im Proteingehalt zwischen normalen Zellen und abnormalen Zellen, wie Krebszellen, stellt ein wertvolles diagnostisches Werkzeug dar.
Derzeit erreicht keine Proteinanalysetechnik den Durchsatz und das Niveau der Automatisierung der derzeit zur Verfügung stehenden genomischen Technik. Die üblichste Implementierung der Proteomanalyse basiert auf der Trennung komplexer Proteinproben zumeist mittels 2D-Gelelektrophorese (2DE) und der nachfolgenden sequentiellen Identifizierung der abgetrennten Proteinspezies, typischerweise mittels Massenspektrometrie. Dieser Ansatz wurde durch die Entwicklung leistungsfähiger massenspektrometrischer Techniken und die Entwicklung von Computeralgorithmen, die Massenspektraldaten von Proteinen und Peptiden mit Sequenzdatenbanken korrelieren und somit Proteine schnell und schlüssig identifizieren, revolutioniert. Diese Technik hat ein Niveau von Empfindlichkeit erreicht, welches nun die Identifizierung im wesentlichen jedes Proteins erlaubt, welches durch konventionelle Proteinfärbeverfahren, einschließlich Silberfärbung, detektiert werden kann. In dem 2DE/MSⁿ-Verfahren werden Proteine mittels Densitometrie gefärbter Flecken in den 2DE-Gelen, gefolgt von Massenspektrometrie (MS), Tandem-Massenspektrometrie (MSMS oder MS²) oder mehreren Durchläufen von Massenspektrometrie (MS)ⁿ quantifiziert. Alternativ kann der Schritt des Färbens ausgelassen werden, und die Proteine können mittels Massenspektrometrie detektiert werden, beispielsweise durch Analysieren von Extrakten aus jeder Scheibe aus einem 1 D-Gel oder aus jedem Stück aus einem 2D-Gel oder durch Scannen von Membranen, auf denen Verdau aus solchen Gelen mittels Transblotting abgeschieden wurden (Bienvenut et al., Anal. Chem. 71:4800–4807, 1999).
In der Gelelektrophorese können Proteine entsprechend zu den Unterschieden in der Masse in einzelne Komponenten aufgetrennt werden, indem ein Proteingemisch in einem Polyacrylamidgel unter denaturierenden Bedingungen Elektrophorese unterworfen wird. Die eindimensionale und die zweidimensionale Gelelektrophorese sind bei der Untersuchung von Proteinen zu Standardwerkzeugen geworden. Die eindimensionale SDS-(Natriumdodecylsulfat-) Elektrophorese durch ein zylindrisches oder flaches Gel deckt nur die Hauptproteine auf, die in einer getesteten Probe vorliegen. Die zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE), die Proteine in der einen Dimension durch isoelektrische Fokussierung, d.h. nach Ladung, und in der zweiten Dimension nach Größe trennt, liefert eine höhere Auflösungsleistung, was wichtig ist, wenn viele Proteine in der Probe vorliegen. Die Proteine wandern in ein- oder zweidimensionalen Gelen als Banden bzw. Flecken. Die getrennten Proteine werden mit einer Vielzahl von Verfahren, wie z.B. durch Färben mit einem proteinspezifischen Farbstoff, durch proteinvermittelte Silberpräzipitation, autoradiographische Detektion von radioaktiv markiertem Protein und durch kovalente oder nicht-kovalente Anheftung fluoreszenter Verbindungen, sichtbar gemacht. Unmittelbar nach der Elektrophorese können die resultierenden Gelmuster durch das Auge, photographisch oder durch elektronische Bildaufnahme, beispielsweise unter Verwendung einer gekühlten ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD), sichtbar gemacht werden. Um Proben von Proteinen aus verschiedenen Zellen oder verschiedenen Stadien der Zellentwicklung anhand konventioneller Verfahren zu vergleichen, läßt man derzeit jede verschiedene Probe über separate Spuren eines eindimensionalen Gels oder getrennter zweidimensionaler Gele laufen. Der Vergleich erfolgt anhand visueller Untersuchung oder elektronischer Abbildung, beispielsweise anhand von computergestützter Bildanalyse von digitalisierten ein- oder zweidimensionalen Gelen. Das Ziel einer solchen Forschung besteht oft darin zu bestimmen, bei welchen Proteinen aus den Hunderten von Proteinen, die detektiert werden können, sich das Expressionsniveau zwischen einer Kontrollprobe und einer oder mehreren experimentellen Proben verändert hat.
Die zweidimensionale Gelelektrophorese ist ein leistungsstarkes Werkzeug zum Auflösen komplexer Gemische von Proteinen. Die Unterschiede bei der Migration zwischen den Proteinen können jedoch subtil sein. Unvollkommenheiten in dem Gel können exakte Beobachtungen beeinflussen. Um die Unvollkommenheiten zu minimieren, werden die in kommerziell erhältlichen Elektrophoresesystemen bereitgestellten Gele mit hoher Präzision hergestellt. Selbst mit akribischen Kontrollen sind nie zwei Gele identisch. Die Gele können sich hinsichtlich pH-Gradienten oder Einheitlichkeit voneinander unterscheiden. Zusätzlich können die Elektrophoresebedingungen von einem Durchlauf zum nächsten unterschiedlich sein. Es wurde Computersoftware für das automatisierte Alignment verschiedener Gele entwickelt. Die gesamten Softwarepakete basieren jedoch auf der linearen Streckung oder Verkürzung einer der oder beider Dimensionen bei zweidimensionalen Gelen. Die Software hat Schwierigkeiten bei der Anpassung an lokale Verzerrungen in den Gelen. Solche Beschränkungen werden in idealer Weise dadurch überwunden, daß die beiden Proben vor der Gelelektrophorese miteinander vereinigt werden, unter der Annahme, daß die beiden Proben im Analysestadium voneinander unterschieden werden können.
In den US-Patenten 6,043,025 und 6,127,134 wurde die Bereitstellung eines Verfahrens zum Analysieren von Proteinzusammensetzungen aus wenigstens zwei Proben vorgeschlagen, wobei eine Probe mit einem ersten Farbstoff gefärbt wird und eine zweite Probe mit einem zweiten Farbstoff gefärbt wird. Die Proben werden dann entweder durch ein 1D- oder 2D-Gelelektrophoreseverfahren getrennt, wodurch eine Auftrennung der Proteine in eine Mehrzahl von Flecken bewirkt wird. Ein interessierender Fleck wird dann analysiert, um den Unterschied in der Lumineszenzintensität der Farbstoffe zu bestimmen und so die Proteinkonzentration aus jeder Probe zu bestimmen. Die Kamera kann die beiden Farbstoffe anhand der Wellenlängen des emittierten Lichts unterscheiden, obwohl der dynamische Bereich aufgrund eines geringen Maßes an spektraler Überlappung zwischen den Farbstoffen beeinflußt werden kann. Damit diese Quantifizierung präzise ist, müssen die beiden Spezies von Proteinen zu exakt demselben Fleck wandern, im Idealfall zu der gleichen Position wie das nicht modifizierte Protein. In einigen Fällen ist anfangs nur ein kleiner Teil des Proteins mit den Farbstoffen gefärbt. Wenn es zu einer Trennung von gefärbten und ungefärbten Proteinen kommt, können einige fluoreszente Proteine zusammen mit damit nicht in Beziehung stehenden ungefärbten Proteinen migrieren, was in Fällen, in denen das Protein nach der Elektrophorese identifiziert wird, zu irreführenden Identifikationen führt.
Die Entwicklung von Verfahren und Instrumenten für die automatisierte datenabhängige Elektrospray-Ionisations-(ESI-) Tandem-Massenspektrometrie (MSⁿ) in Kombination mit Mikrokapillaren-Flüssigchromatographie (μLC) und Datenbanksuchen hat die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit der Identifikation von Gel-getrennten Proteinen wesentlich gesteigert. Als Alternative zu dem 2DE/MSⁿ-Ansatz der Proteomanalyse wurde die direkte Analyse von Peptidgemischen, die durch den Verdau von komplexen Proteingemischen erzeugt werden, mittels Tandem-Massenspektrometrie vorgeschlagen (Ducret et al., Prot. Sci. 7:706–719, 1998). Die Tandem-μLC/MSMS wurde auch erfolgreich zur Identifizierung einzelner Proteine in großem Maßstab direkt aus Gemischen ohne Abtrennung mittels Gelelektrophorese verwendet (Yates et al., Methods Mol. Biol, 146:17–26, 2000; Link et al., Nat. Biotechnol. 17:676–82, 1999; Opitek et al., Anal. Chem. 64:1518–1524, 1997). Während diese Ansätze die Identifikation von Proteinen drastisch beschleunigen, können die absoluten oder relativen Mengen der analysierten Proteine nicht leicht bestimmt werden, und es hat sich nicht gezeigt, daß diese Verfahren das Problem bezüglich des dynamischen Bereichs, wie es auch bei dem 2DE/MSMS-Ansatz auftritt, wesentlich mindern (Gygi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 17:9390–5, 2000). Daher sind Proteine, die in komplexen Proben in geringen Mengen vorliegen, mit dem μLC-MSMS-Verfahren ohne ihre vorherige Anreicherung ebenso schwierig zu analysieren.
Eine Alternative zur Quantifizierung von Proteinen in komplexen Gemischen nach SDS-PAGE oder 2D-PAGE auf Basis der Färbungsintensität unter Verwendung konventioneller Proteinfärbungen oder Fluoreszenzfärbungen besteht darin, Proteinfärbungen zu verwenden, um die interessierenden Regionen zu lokalisieren. Nach dem proteolytischen Verdau können die Peptide dann mit stabilen Isotopen, beispielsweise mit deuteriertem Nicotinoyloxysuccinimid, markiert werden (Munchbach, Quadroni, Miotto und James, Anal. Chem. A, 2000), was eine Verwendung von Massenspektrometrie für die Quantifizierung ermöglicht. Dieser Ansatz leidet unter dem Nachteil, daß das erhaltene Proteinverhältnis davon abhängig ist, wie sorgfältig die Flecken aus dem Gel ausgeschnitten werden. Auch muß man die Kontrolle und die experimentelle Probe auf separaten Gelen ablaufen lassen.
Alternativ können isotopisch markierte Aminosäurevorläufer vor dem proteolytischen Verdau spezifisch in eine der beiden Proben eingebracht werden (Sechi und Chait, Anal. Chem, 24:5150–8, 1998, Chen, Smith und Bradbury, Anal. Chem. 72:1134–1143, 2000). Dieser Ansatz leidet unter dem Nachteil, daß die Proteine aus Kulturbedingungen isoliert werden müssen, die eine nahezu vollständige Ersetzung der unmarkierten Aminosäurevorläufer durch die markierten Vorläufer ermöglichen, oder die Intensität jedes Peptids breitet sich über einen größeren Isotopencluster aus als es üblich ist, was sowohl die Empfindlichkeit als auch die Quantifizierung beeinflußt.
Vor kurzem wurde ein Ansatz entwickelt, der Isotopen-codierte Affinitätsmarkierungen (ICAT^TM) umfaßt und die Aufnahme stabiler Isotope in die Cystein enthaltenden Peptide von Proteinen mit der Fähigkeit, diese modifizierten Proteine einer Affinitätsreinigung zu unterziehen und anschließend die Proteine mittels Massenspektrometrie zu detektieren, kombiniert (Gygi et al., Nat. Biotechnol. 17:994–9, 1999). Reagenzien, die bei der Durchführung dieses Verfahrens von Nutzen sind, sind von Applied Biosystems (Foster City, CA) unter der Marke ICAT^TM kommerziell erhältlich. Da Proteine typischerweise eine geringe Anzahl an Cysteinresten enthalten, wird es möglich, große Zahlen von Proteinen zu identifizieren, indem man sich auf einen kleinen Teilsatz der Peptide, die bei proteolytischem Verdau erzeugt werden, konzentriert, was es ermöglicht, tiefer in das Proteom vorzudringen, ohne von großen Zahlen von Peptiden aus den am reichlichsten vorhandenen Proteinen überwältigt zu werden. Da die Quantifizierung mittels Massenspektrometrie durchgeführt wird, können zwei oder mehr Proben vor der Analyse miteinander kombiniert werden, so daß artefaktartige Verarbeitungsunterschiede bei den Proben die Ergebnisse nicht beeinflussen, solange sie nach der Modifikation von Cystein auftreten.
Es gibt jedoch mehrere Beschränkungen hinsichtlich der zuvor beschriebenen, auf ICAT-Reagens basierenden Technik, die in bestimmten Fällen die Informationen, die aus dem Experiment erhalten werden können, beschränken. Die Cystein enthaltenden Peptide sollten ausreichend lang sein, um Proteine (oder Klassen von homologen Proteinen) eindeutig zu identifizieren. Da jedes Peptid separat gereinigt wird, werden oft MSⁿ-Techniken verwendet, um das Protein, von dem das Peptid abgeleitet wurde, zu identifizieren, statt die einfachere Peptidmassen-Fingerabdruck-(PMF-) Technik zu verwenden. Es werden keine Informationen über das intakte Molekulargewicht des Proteins (der Proteine) zurückbehalten, von dem bzw. von denen das Cystein enthaltende Peptid abgeleitet wurde, oder darüber, ob das Protein mittels Phosphorylierung chemisch modifiziert wurde. Letztendlich werden keine Informationen von Proteinen erhalten, die kein Cystein enthalten.
Die vorliegende Erfindung kombiniert die massenspektrometrische Quantifizierung mit der Auflösungsleistung von 2D-Elektrophorese, so daß Unterschiede in Proteinzusammensetzungen aus zwei oder mehr Proben, die komplexe Gemische enthalten, aus einem einzigen 2D-Gel bestimmt werden können. Diese Ausweitung auf den derzeitigen Stand der ICAT-Reagens-Technik überwindet alle vorgenannten Beschränkungen. Proteine werden unter Verwendung der gleichen ICAT-Reagens-Technik wie zuvor modifiziert. Alle Vorteile der Proteintrennung mit 2D-Gelen bleiben jedoch erhalten. Obwohl die Analyse der mit ICAT-Reagens markierten Peptide selbst für gewöhnlich keine Informationen über die chemische Modifikation des Proteins, von dem sie abgeleitet wurden, liefert, zeigt die Position des Proteins auf dem Gel an, ob das Protein modifiziert wurde. Auch liegen die chemisch modifizierten Peptide selbst auf dem gleichen Fleck vor, so daß die mit ICAT-Reagens markierten Peptide noch immer für eine Quantifizierung der relativen Mengen jeder der modifizierten Spezies verwendet werden können. Zusätzlich sind nun ICAT-Reagens enthaltende Peptide jeder Länge informativ, da jeder Fleck sehr wenige Proteine enthält. Dies ermöglicht auch die Verwendung von PMF, um die Proteine zu identifizieren, einschließlich jeglicher kein Cystein enthaltender Proteine, die auf dem gleichen Fleck auf dem Gel vorliegen können. Diese Techniken erlauben noch immer die gleichzeitige Bearbeitung zweier oder mehrerer Proben, wie z.B. denjenigen, die aus einer experimentellen Probe und einer Kontrollprobe erhalten wurden. Die gleiche Kombination von Techniken ist auch auf niedriger auflösende Gelsysteme, wie 1D-SDS-PAGE-Gelanalyse, 1D-Gele für die isoelektrische Fokussierung und dergleichen, anwendbar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung liefert Verfahren auf Basis von 1D- und 2D-Gelelektrophorese und Massenspektrometrie für die schnelle quantitative Analyse von Proteinen oder der Proteinfunktion in Gemischen von Proteinen, die in einem Einheitsschritt von zwei oder mehr Proben abgeleitet wurden. So muß nur ein Gel durchgeführt werden, um daraus ableiten zu können, bei welchen Proteinen sich das Expressionsniveau zwischen der experimentellen Probe und der Kontrollprobe verändert hat, da die Quantifizierung mittels Massenspektrometrie durchgeführt wird. Das analytische Verfahren kann für die qualitative und insbesondere für die quantitative Analyse globaler Proteinexpressionsprofile in Zellen und Geweben, d.h. für die quantitative Analyse von Proteomen, verwendet werden. Das Verfahren kann auch verwendet werden, um Screenings nach Proteinen durchzuführen und Proteine zu identifizieren, deren Expressionsniveau in Zellen, Gewebe oder biologischen Flüssigkeiten durch einen Stimulus (z.B. die Verabreichung eines Arzneimittels oder den Kontakt mit einem potentiell toxischen Material), durch eine Veränderung der Umgebung (z.B. Nährstoffmenge, Temperatur, verstrichene Zeit) oder durch eine Veränderung des Zustands oder des Zellstadiums (z.B. Erkrankungszustand, Bösartigkeit, ortsgerichtete Mutation, Gen-Knockouts) der Zelle, des Gewebes oder des Organismus, aus der bzw. aus dem die Probe stammte, beeinflußt wird. Die in einem solchen Screening identifizierten Proteine können als Marker für den veränderten Zustand dienen. Beispielsweise können Vergleiche der Proteinexpressionsprofile von normalen und malignen Zellen zur Identifizierung von Proteinen führen, deren Vorhandensein oder Nichtvorhandensein charakteristisch für die und ein diagnostisches Merkmal der Bösartigkeit ist.
Die hier beschriebenen Verfahren können auch verwendet werden, um eine Vielzahl klinischer und diagnostischer Analysen zu implementieren, um das Vorhandensein, das Nichtvorhandensein, den Mangel oder den Überschuß eines gegebenen Proteins oder einer Proteinfunktion in einer biologischen Flüssigkeit (z.B. Blut) oder in Zellen oder Gewebe zu detektieren. Das Verfahren ist insbesondere bei der Analyse komplexer Proteingemische, d.h. derjenigen, die 5 oder mehr verschiedene Proteine oder Proteinfunktionen enthalten, von Nutzen. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um nach absoluten quantitativen Veränderungen zu suchen, falls spezielle kalibrierte Standards markiert sind.
Wie bei den Techniken, die in der vorgenannten veröffentlichten PCT-Patentanmeldung (WO 00/11208) beschrieben sind, verwendet die vorliegende Erfindung ein isotopisch markiertes Protein, welches entweder ein affinitätsmarkiertes mit Protein reagierendes Reagens oder ein nicht-affinitätsmarkiertes mit Protein reagierendes Reagens sein kann, welches die selektive Isolierung von Peptidfragmenten aus komplexen Gemischen ermöglicht. Zuerst werden die Kontrolle und die experimentelle(n) Probe(n) separat mit verschiedenen isotopischen Varianten des ICAT-Reagens markiert und dann kombiniert. Die Trennung der Proteinkomponenten der zwei oder mehr Proben wird entweder durch 1D- oder 2D-Gelelektrophorese, gefolgt von Proteinverdau, durchgeführt. Die isolierten Peptidfragmente oder Reaktionsprodukte sind charakteristisch für das Vorhandensein eines Proteins in diesen Gemischen. Isolierte Peptide werden mittels Massenspektrometrie-(MS-) Techniken charakterisiert. Die am häufigsten vorkommenden Proteine können durch das Peptid massen-Fingerabdruck-Verfahren identifiziert werden. Alternativ kann die Sequenz isolierter Peptide unter Verwendung von Tandem-MS-(MSⁿ-) Techniken bestimmt werden, und durch Anwendung der derzeit verfügbaren Sequenzdatenbank-Suchtechniken kann das Protein, aus dem das sequenzierte Peptid stammte, identifiziert werden. Die in dem Verfahren dieser Erfindung verwendeten Reagenzien liefern eine unterschiedliche isotopische Markierung der isolierten Peptide, die die quantitative Bestimmung der relativen Mengen an Proteinen in verschiedenen Proben mittels Massenspektrometrie vereinfacht. Auch vereinfacht die Verwendung unterschiedlich isotopisch markierter Reagenzien als interne Standards mit bekannter Konzentration die quantitative Bestimmung der absoluten Mengen eines oder mehrerer Proteine oder Reaktionsprodukte, die in der Probe vorliegen.
Im allgemeinen haben die affinitätsmarkierten mit Protein reagierenden Reagenzien, die in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, drei Teile: eine Affinitätsmarkierung (A), die durch eine Linkergruppe (L) kovalent mit einer mit Protein reagierenden Gruppe (PRG) verknüpft ist: A-L-PRG
Der Linker kann unterschiedlich isotopisch markiert sein, z.B. durch Substitution eines oder mehrerer Atome in dem Linker mit einem stabilen Isotop davon. Beispielsweise können Wasserstoffatome mit Deuteriumatomen oder ¹²C mit ¹³C substituiert sein.
Die nicht-affinitätsmarkierten mit Protein reagierenden Reagenzien, die in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, haben zwei Teile: eine mit Protein reagierende Gruppe (PRG) und eine Linkergruppe (L): L-PRG die wie oben definiert sind.
Die Affinitätsmarkierung A dient als molekularer Griff, der selektiv kovalent oder nicht-kovalent an ein Einfangreagens (CR) bindet. Die Bindung an das CR vereinfacht die Isolation von mit A markierten Peptiden. In speziellen Ausführungsformen ist A ein Streptavidin oder Avidin. Nach der Affinitätsisolierung von affinitätsmarkierten Materialien, von denen einige isotopisch markiert sein können, wird die Wechselwirkung zwischen A und dem Einfangreagens gestört oder unterbrochen, um eine MS-Analyse der isolierten Materialien zu ermöglichen. Die Affinitätsmarkierung kann, wenn sie verwendet wird, von dem Einfangreagens verdrängt werden, indem man einen Verdrängungsliganden, der frei von A oder ein Derivat von A sein kann, zugibt, oder die Lösungsmittel-(z.B. den Lösungsmitteltyp oder den pH-Wert) oder Temperaturbedingungen verändert, oder der Linker kann chemisch, enzymatisch, thermisch oder photochemisch abgespalten werden, um die isolierten Materialien für die MS-Analyse freizusetzen.
Der Typ der PRG-Gruppe, wie sie hier speziell bereitgestellt wird, umfaßt diejenigen Gruppen, die selektiv mit einer funktionellen Proteingruppe reagieren, wodurch eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung gebildet wird, die das Protein an bestimmten Stellen markiert. In speziellen Ausführungsformen ist PRG eine Gruppe mit spezifischer Reaktivität für bestimmte Proteingruppen, wie Spezifität für Sulfhydrylgruppen, und ist im allgemeinen von Nutzen, um Proteine in komplexen Gemischen selektiv zu markieren. Ein für Sulfhydryl spezifisches Reagens markiert Cystein enthaltende Proteine.
Beispielhafte Reagenzien, die in dem Verfahren dieser Erfindung von Nutzen sind, haben die allgemeine Formel A-B¹-X¹-(CH₂)_n-[X²-(CH₂)_m]_x-X³-(CH₂)_p-X⁴-B²-PRG wobei:
A optional vorhanden ist und die Affinitätsmarkierung ist,
PRG die mit Protein reagierende Gruppe ist,
X¹, X², X³ und X⁴ jeweils unabhängig voneinander und X² unabhängig von anderen X² in der Linkergruppe unter O-, S-, NH-, NR-, NRR⁺-, CO-, COO-, COS-, S-S-, SO-, SO₂-, CO-NR'-, CS-NR'-, Si-O-, Aryl- oder Diarylgruppen ausgewählt sein können oder X¹–X⁴ abwesend sein können, jedoch vorzugsweise wenigstens einer von X¹–X⁴ vorhanden ist,
B¹ und B² unabhängig voneinander optional Reste sind, die die Bindung der A- oder PRG-Gruppe an den Linker erleichtern oder eine unerwünschte Abspaltung dieser Gruppen von dem Linker verhindern können und beispielsweise unter COO, CO, CO-NR', CS-NR' ausgewählt sein können und ein oder mehrere CH₂-Gruppen allein oder in Kombination mit anderen Gruppen, wie z.B. (CH₂)_q-CONR', (CH₂)_q-CS-NR' oder (CH₂)_q, enthalten können,
n, m, p und q ganze Zahlen sind, die Werte von 0 bis etwa 100 haben können; vorzugsweise ist einer von n, m, p oder q nicht 0, und x ist auch eine ganze Zahl, die im Bereich von 0 bis etwa 100 liegen kann, wobei die Summe von n + xm + p + q bevorzugt kleiner als etwa 100 und bevorzugter kleiner als etwa 20 ist,
R eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy- oder Arylgruppe ist und
R' eine Wasserstoff-, eine Alkyl-, Alkenyl, Alkinyl-, Alkoxy- oder Arylgruppe ist.
Eine oder mehrere der CH₂-Gruppen des Linkers können optional mit kleinen (C₁-C₆)-Alkyl-, -Alkenyl- oder -Alkoxygruppen oder mit einer Arylgruppe substituiert sein, oder sie können mit funktionellen Gruppen substituiert sein, die die Ionisation fördern, wie sauren oder basischen Gruppen oder Gruppen, die eine permanente positive oder negative Ladung tragen. Eine oder mehrere Einzelbindungen, die CH₂-Gruppen in dem Linker miteinander verbinden, können durch eine Doppel- oder Dreifachbindung ersetzt werden. Bevorzugte R- und R'-Alkyl-, -Alkenyl-, -Alkinyl- oder -Alkoxygruppen sind klein und enthalten 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome.
Eines oder mehrere der Atome in dem Linker können mit einem stabilen Isotop substituiert sein, um ein oder mehrere im wesentlichen chemisch identische, jedoch isotopisch unterscheidbare Reagenzien zu erzeugen. Beispielsweise kann ein Wasserstoff oder können mehrere Wasserstoffe in dem Linker mit Deuterium substituiert sein, um isotopisch schwere Reagenzien zu erzeugen.
In einer beispielhaften Ausführungsform enthält der Linker Gruppen, die abgespalten werden können, um die Affinitätsmarkierung zu entfernen. Wenn eine abspaltbare Linkergruppe verwendet wird, wird sie typischerweise abgespalten, nachdem affinitätsmarkierte Peptide unter Verwendung der Affinitätsmarkierung zusammen mit dem CR isoliert wurden. In diesem Fall bleibt jegliche isotopische Markierung in dem Linker vorzugsweise an das Protein oder Peptid gebunden.
Linkergruppen umfassen unter anderem die folgenden: Ether, Polyether, Etherdiamine, Polyetherdiamine, Diamine, Amide, Polyamide, Polythioether, Disulfide, Silylether, Alkyl- oder Alkenyl ketten (gerade- oder verzweigtkettige, von denen Teile auch zyklisch sein können), Aryl-, Diaryl- oder Alkyl-Aryl-Gruppen. Arylgruppen in Linkern können ein oder mehrere Heteroatome (z.B. N-, O-, oder S-Atome) enthalten.
In einem Aspekt liefert die Erfindung ein massenspektrometrisches Gelelektrophoreseverfahren zur Identifizierung und Quantifizierung eines oder mehrerer Proteine in einem komplexen Gemisch, welches affinitätsmarkierte Reagenzien verwendet, wobei die PRG eine Gruppe ist, die selektiv mit bestimmten Aminosäuren oder Derivaten von Aminosäuren, die typischerweise in Proteinen zu finden sind, reagiert (z.B. Sulfhydryl-, Amino-, Carboxy-, Homoserinlactongruppen). Markierte Reagenzien, die optional eine Affinitätsmarkierung enthalten können und verschiedene PRG-Gruppen aufweisen, werden in ein Proteine enthaltendes Gemisch eingebracht, und die Reagenzien reagieren mit bestimmten Proteinen, wodurch diese markiert werden. In jedem Fall ist es notwendig, entweder eine stöchiometrische Proteinmodifikation mit dem isotopisch markierten Reagens zu erhalten oder das isotopisch markierte Reagens so zu modifizieren, daß das Protein auf dem zu verwendenden Gelsystem homogen wandert. Es ist möglicherweise notwendig, das Proteingemisch vorzubehandeln, um Disulfidbindungen zu reduzieren oder die Markierung in anderer Weise zu vereinfachen. Nach der Umsetzung mit den markierten Reagenzien wird die Mehrzahl von Proben vereinigt, bevorzugt in gleichen Mengen, und die Proteine in dem komplexen Gemisch werden entweder mittels 1D- oder mittels 2D-Gelelektrophorese getrennt. Das Gel wird dann gefärbt, um die Position der Proteine aufzudecken. Der Bereich des Gels, der das interessierende Proteingemisch oder die interessierenden Proteingemische enthält, wird dann ausgeschnitten und beispielsweise enzymatisch in eine Anzahl von Peptiden aufgespalten oder das Gel wird einheitlich geschnitten, so daß alle Stücke analysiert werden können. Alternativ können die Proteine mittels Elektroblotten auf eine Membran aufgebracht werden und auf der Membran kann ein Verdau durchgeführt werden. Als eine dritte Alternative können die Proteine kontinuierlich aus dem Boden des Gels eluiert und als Fraktionen gesammelt werden, gefolgt von Verdau. Dieser Verdauschritt ist möglicherweise nicht erforderlich, wenn die Proteine relativ klein sein. Nachdem die Peptide gereinigt wurden, kann das Protein (können die Proteine) anhand des Peptidmassen-Fingerabdrucks (PMF) identifiziert werden. Bei Verwendung eines mit einer Affinitätsmarkierung markierten Reagens werden Peptide, die mit der Affinitätsmarkierung markiert bleiben, dann durch einen Affinitätsisolationsschritt, beispielsweise Affinitätschromatographie, über ihre selektive Bindung an den CR isoliert. Isolierte Peptide werden aus das CR durch Verdrängung von A oder Abspaltung des Linkers freigesetzt, und die freigesetzten Materialien werden mittels Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) analysiert. Wenn ein nicht-affinitätsmarkiertes Reagens verwendet wird, wird dieser Affinitätsisolationsschritt nicht durchgeführt. Die Sequenz eines oder mehrerer markierter Peptide wird dann mittels MSMS-Techniken bestimmt, falls dies erforderlich ist. In einigen Fällen ist wenigstens eine von einem Protein abgeleitete Peptidsequenz für dieses Protein charakteristisch und zeigt sein Vorliegen in dem Gemisch an. In anderen Fällen ist das isotopisch markierte Peptid möglicherweise zu kurz, um ein Protein in eindeutiger Weise zu identifizieren, und die Verwendung von PMF-Daten kann erforderlich sein, um das Ursprungsprotein zu identifizieren. In anderen Fällen sind die isotopisch markierten Peptide innerhalb einer Familie von eng verwandten Proteinen möglicherweise identisch, die dann durch PMF- oder MSMS-Analyse anderer in dem Gemisch vorliegender Peptide, die für spezifische Proteine einzigartig sind, unterschieden werden können. Schließlich ermöglicht es die hohe Auflösungsleistung von 2D-Gelelektrophorese, zwischen verschiedenen chemisch modifizierten Formen der gleichen Protein-codierenden Sequenz zu unterscheiden, selbst wenn diese Proteine mit anderen, damit nicht in Beziehung stehenden Proteinen räumlich überlappen. So liefern die Sequenzen der Peptide und die Informationen des Peptidmassen-Fingerabdrucks zusammen typischerweise ausreichend Informationen, um ein oder mehrere in einem Gemisch vorhandene Proteine zu identifizieren, selbst wenn die Sequenz des isotopisch markierten Peptids an sich nicht ausreichend informativ ist.
Die relativen Mengen von Proteinen in einer oder mehreren verschiedenen Proben, die Proteingemische enthalten (z.B. biologische Flüssigkeiten, Zell- oder Gewebelysate usw.), können unter Verwendung von chemisch identischen, jedoch unterschiedlich isotopisch markierten Reagenzien bestimmt werden. Diese Reagenzien können eine Affinitätsmarkierung enthalten, müssen dies jedoch nicht. In diesem Verfahren wird jede zu vergleichende Probe mit einem anderen isotopisch markierten Reagens behandelt, um bestimmte Proteine darin zu markieren. Markierte Peptide, die aus verschiedenen Proben stammen, unterscheiden sich voneinander durch ihre Masse, obwohl sie die gleiche chemische Zusammensetzung haben. Peptide, die für ihren Proteinursprung charakteristisch sind, werden unter Verwendung von MS- oder MSⁿ-Techniken identifiziert, was eine Identifizierung von Proteinen in den Proben ermöglicht. Die relative Menge eines gegebenen Proteins in jeder Probe wird bestimmt durch Vergleichen der relativen Häufigkeit des Vorkommens der Ionen, die aus allen unterschiedlich markierten Peptiden, die aus diesem Protein stammen, erzeugt wurden. Das Verfahren kann verwendet werden, um gleichzeitig die relativen Mengen bekannter Proteine, die aus verschiedenen Proben entstanden sind, festzulegen. Da das Verfahren keine vorherige Kenntnis des Typs von Proteinen erfordert, die in den Proben vorliegen können, kann es verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die in unterschiedlichen Mengen in den untersuchten Proben vorhanden sind. Spezieller kann das Verfahren verwendet werden, um nach Proteinen zu suchen und Proteine zu identifizieren, die eine unterschiedliche Expression in Zellen, Gewebe oder biologischen Flüssigkeiten zeigen. Es ist auch möglich, die absoluten Mengen spezifischer Proteine in einem komplexen Gemisch zu bestimmen. In diesem Fall wird eine bekannte Menge an internem Standard, einer für jedes spezifische Protein in dem zu quantifizierenden Gemisch, zu der zu analysierenden Probe zugegeben. Der interne Standard ist ein Peptid, dessen chemische Struktur zu dem markierten Peptid, welches quantifiziert werden soll, identisch ist, mit der Ausnahme, daß der interne Standard anders isotopisch markiert ist als das zu quantifizierende Peptid. Der interne Standard kann auf andere Weise in der zu analysierenden Probe bereitgestellt werden. Beispielsweise kann ein spezifisches Protein oder ein Satz von Proteinen mit einem isotopisch markierten Reagens chemisch markiert werden. Eine bekannte Menge dieses Materials kann zu der zu analysierenden Probe zugegeben werden. Es ist auch möglich, die Niveaus spezifischer Proteine in mehreren Proben in einer einzelnen Analyse zu quantifizieren (Multiplexierung). In diesem Fall können Affinitäts markierungsreagenzien, die verwendet werden, um Proteine zu derivatisieren, die in verschiedenen markierten Peptiden aus unterschiedlichen Proben vorliegen, mittels Massenspektrometrie selektiv quantifiziert werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung liefert eine quantitative Messung spezifischer Proteine in biologischen Flüssigkeiten, Zellen oder Geweben und kann verwendet werden, um globale Proteinexpressionsprofile in verschiedenen Zellen und Geweben zu bestimmen. Die gleiche allgemeine Strategie kann ausgeweitet werden, um die proteomweite, qualitative und quantitative Analyse des Zustands der Modifikation von Proteinen zu erhalten, indem markierte Reagenzien mit unterschiedlicher Spezifität für eine Reaktion mit modifizierten Aminosäureresten verwendet werden. Das Verfahren dieser Erfindung kann verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die nicht in großen Mengen in komplexen Gemischen vorhanden sind, und es kann verwendet werden, um spezifische Gruppen oder Klassen von Proteinen, wie Membran- oder Zelloberflächenproteine, oder in Organellen, subzellulären Fraktionen oder biochemischen Fraktionen, wie Immunpräzipitaten, enthaltene Proteine selektiv zu analysieren. Weiterhin können diese Verfahren verwendet werden, um Unterschiede in exprimierten Proteinen in verschiedenen Zellstadien zu analysieren. Beispielsweise können die hier beschriebenen Verfahren in diagnostischen Tests zur Detektion des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines oder mehrerer Proteine, die einen Erkrankungszustand, wie Krebs, anzeigen, verwendet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Abbildung eines 2D-Gels, auf das fünf verschiedene Standardproteine geladen wurden, mit eingefügten Massenspektren, die die Bereiche zeigen, die ICAT^TM-Reagenspaare gemäß der vorliegenden Erfindung enthielten. Des weiteren sind das Verhältnis, mit dem die Proteine vor der Elektrophorese gemischt wurden, und das Verhältnis, das bei Messung der Intensitäten der ICAT-Reagenspaare erhalten wurde, aufgeführt.
2 ist eine vergrößerte Ansicht des Flecks für Lactalbumin, unterteilt in Quadranten. Ebenfalls gezeigt sind die Bereiche eines Massenspektrums, die ein ICAT-Reagenspaar enthalten, und das Intensitätsverhältnis, das für jedes davon gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt wurde.
3 ist ein Satz von Massenspektren, die aus einer Fraktion eines Gemischs zweier Lysate von E. coli, die vor der Elektrophorese durch eine Durchfluß-Gelvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung separat mit ICAT-Reagens markiert worden waren, erhalten wurden. Das erste Feld zeigt den gesamten Fingerabdruck der Peptidmasse, der nach Verdau mit Trypsin für eine bestimmte Fraktion erhalten wurde, und das zweite Feld zeigt die Peptide, die für diese Fraktion zurückgehalten und aus Avidinperlen eluiert wurden. Zwei ICAT-Reagenspaare sind in den Einfügungen gezeigt.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein Aspekt dieser Erfindung verwendet affinitätsmarkierte mit Protein reagierende Reagenzien, wobei die Affinitätsmarkierung durch einen Linker oder ein Reagens ohne Affinitätsmarkierung kovalent an eine mit einem Protein reagierende Gruppe angehängt ist, und welches eine mit einem Protein reagierende Gruppe umfaßt, die kovalent an einen Linker angehängt ist. Der Linker ist isotopisch markiert, um Paare oder Sätze von Reagenzien zu erzeugen, die im wesentlichen chemisch identisch, jedoch anhand ihrer Masse unterscheidbar sind. Beispielsweise kann für den Vergleich zweier Proben, von denen eine eine Vergleichsprobe sein kann, die ein oder mehrere bekannte Proteine in bekannten Mengen enthält, ein Paar von Reagenzien verwendet werden, von denen eines isotopisch schwer ist und von denen das andere isotopisch leicht ist. Beispielsweise kann irgendeines oder können mehrere der Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome in dem Linker durch ihre isotopisch stabilen Isotope ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O oder ³⁴S ersetzt werden.
Wenn sie verwendet werden, binden geeignete Affinitätsmarkierungen selektiv entweder kovalent oder nicht-kovalent und mit hoher Affinität an ein Einfangreagens (CR). Die CR-A-Wechselwirkung oder -Bindung sollte nach intensivem und mehrmaligem Waschen mit einer Vielzahl von Lösungen, um nicht-spezifisch gebundene Komponenten zu entfernen, intakt bleiben. Die Affinitätsmarkierung bindet minimal oder bevorzugt überhaupt nicht an Komponenten in dem Testsystem, mit Ausnahme von CR, und sie bindet nicht signifikant an Oberflächen von Reaktionsgefäßen. Jegliche nicht-spezifische Wechselwirkung der Affinitätsmarkierung mit anderen Komponenten oder Oberflächen sollte durch mehrmaliges Waschen, welches CR-A intakt läßt, unterbrochen werden. Weiterhin muß es möglich sein, die Wechselwirkung von A und CR zu unterbrechen, um Peptide, Substrate oder Reaktionsprodukte freizusetzen, beispielsweise durch Zugabe eines Verdrängungsliganden oder durch Ändern der Temperatur- oder Lösungsmittelbedingungen. Vorzugsweise reagieren weder CR noch A chemisch mit anderen Komponenten in dem Testsystem, und beide Gruppen sollten während der Zeitdauer eines Tests oder Experiments chemisch stabil sein. Die Affinitätsmarkierung durchläuft während der (MS)ⁿ-Analyse vorzugsweise keine peptidartige Fragmentierung. Die Affinitätsmarkierung ist vorzugsweise in der zu analysierenden Probenflüssigkeit löslich, und das CR sollte in der Probenflüssigkeit löslich bleiben, obwohl es an ein unlösliches Harz, wie Agarose, angehängt ist. Im Falle des CR bedeutet der Begriff löslich, daß das CR ausreichend hydratisiert oder in anderer Weise gelöst ist, so daß es für eine Bindung an A in geeigneter Weise funktioniert. CR oder CR enthaltende Konjugate sollten in der zu analysierenden Probe nicht vorliegen, außer wenn sie zugegeben werden, um A einzufangen.
Beispiele von A- und CR-Paaren umfassen die folgenden:
Reagenzien auf Basis von Biotin oder strukturell modifiziertem Biotin, einschließlich Iminobiotin, die an Proteine des Avidins/Streptavidins binden, die beispielsweise in den Formen Streptavidin-Agarose, oligomeres Avidin-Agarose oder monomeres Avidin-Agarose verwendet werden können,
jedes 1,2-Diol, wie 1,2-Dihydroxyethan (HO-CH₂-CH₂-OH), und andere 1,2-Dihydroxyalkane, einschließlich derjenigen zyklischen Alkane, z.B. 1,2-Dihydroxycyclohexan, die an einen Alkyl- oder Aryl-Borsäure- oder -Boronsäureester, wie Phenyl-B(OH)₂ oder Hexyl-B(O-ethyl)₂, binden, die über die Alkyl- oder Arylgruppe an ein festes Trägermaterial, wie Agarose, angehängt sein können,
Maltose, die an Maltose bindendes Protein bindet (sowie alle anderen Zucker/Zucker-Bindungsproteinpaare oder allgemeiner alle Ligand/Ligand-Bindungsproteinpaare, die die oben diskutierten Eigenschaften haben),
ein Hapten, wie eine Dinitrophenylgruppe, für irgendeinen Antikörper, wobei das Hapten an einen Anti-Hapten-Antikörper bindet, welcher das Hapten erkennt, beispielsweise bindet die Dinitrophenylgruppe an ein Anti-Dinitrophenyl-IgG,
einen Liganden, der an ein Übergangsmetall bindet, beispielsweise bindet ein oligomeres Histidin an Ni(II); das Übergangsmetall-CR kann in Form eines harzgebundenen chelierten Übergangsmetalls, wie z.B. als mit Nitriltriessigsäure cheliertes Ni(II) oder mit Iminodiessigsäure cheliertes Ni(II), verwendet werden,
Glutathion, welches an Glutathion-S-transferase bindet.
Im allgemeinen kann jedes A-CR-Paar, welches für gewöhnlich zur Affinitätsanreicherung verwendet wird und welches die oben diskutierten Eignungskriterien erfüllt, verwendet werden. Biotin und Biotin-basierte Affinitätsmarkierungen sind bevorzugt. Von besonderem Interesse sind strukturell modifizierte Biotine, wie Iminobiotin, die unter Lösungsmittelbedingungen, die mit ESI-MS-Analyse kompatibel sind, wie verdünnte Säuren, die 10–20% organisches Lösungsmittel enthalten, aus Avidin- oder Streptavidinsäulen eluieren. Es wird erwartet, daß mit Iminobiotin markierte Verbindungen in Lösungsmitteln bei einem pH-Wert unter 4 eluieren. Mit Iminobiotin-markiertem Protein reagierende Reagenzien können mit Verfahren, wie sie hier für die korrespondierenden Biotin-markierten Reagenzien beschrieben sind, synthetisiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Affinitätsanreicherungsmedium aus monomerem Avidin, welches eine geringere Affinität für Biotin hat als tetrameres Avidin und daher rezykliert und für die Reinigung von Peptiden aus vielen Fraktionen verwendet werden kann.
Ein Verdrängungsligand, DL, wird optional verwendet, um A von CR zu verdrängen. Geeignete DLs liegen typischerweise nicht in Proben vor, wenn sie nicht zugegeben werden. DL sollte in der zu analysierenden Probe chemisch und enzymatisch stabil sein und nicht mit Komponenten (außer CR) in Proben reagieren oder daran binden oder nicht-spezifisch an die Wände von Reaktionsgefäßen binden. DL durchläuft während der MS-Analyse vorzugsweise keine peptidartige Fragmentierung, und sein Vorliegen in einer Probe sollte die Ionisation markierter Peptid-, Substrat- oder Reaktionsproduktkonjugate nicht signifikant unterdrücken. DL selbst wird während der massenspektrometrischen Analyse vorzugsweise minimal ionisiert, und vorzugsweise ist die Bildung von aus DL-Clustern bestehenden Ionen minimal. Die Auswahl von DL ist abhängig von den verwendeten A- und CR-Gruppen. Im allgemeinen wird DL so ausgewählt, daß A in einer angemessenen Zeitskala, höchstens binnen einer Woche nach seiner Zugabe, bevorzugter jedoch innerhalb weniger Minuten oder bis zu einer Stunde, von CR verdrängt wird. Die Affinität von DL für CR sollte mit der Affinität der A enthaltenden markierten Verbindungen für CR vergleichbar oder größer sein. Weiterhin sollte DL in dem Lösungsmittel, welches während der Elution von A enthaltenden markierten Verbindun gen aus CR verwendet wird, löslich sein. DL ist vorzugsweise freies A oder ein Derivat oder eine strukturelle Modifikation von A. Beispiele von DL umfassen Biotin oder Biotinderivate, insbesondere diejenigen, die Gruppen enthalten, die die Clusterbildung unterdrücken oder die Ionisation bei MS unterdrücken.
Die Linkergruppe (L) sollte in der zu analysierenden Probenflüssigkeit löslich sein, und sie sollte hinsichtlich chemischer Reaktionen mit Komponenten der Probe sowie A- und CR-Gruppen stabil, z.B. im wesentlichen chemisch inert, sein. Wenn er an A gebunden ist, sollte der Linker die spezifische Wechselwirkung von A mit CR nicht stören oder die Verdrängung von A von CR durch einen Verdrängungsliganden oder durch eine Änderung der Temperatur oder des Lösungsmittels nicht stören. Der Linker sollte minimal oder vorzugsweise überhaupt nicht an andere Komponenten in dem System, an Oberflächen von Reaktionsgefäßen oder CR binden. Jegliche nicht-spezifischen Wechselwirkungen des Linkers sollten nach mehrmaligem Waschen, wobei der A-CR-Komplex intakt bleibt, abgebrochen werden. Linker durchlaufen während der (MS)ⁿ-Analyse vorzugsweise keine peptidartige Fragmentierung. Wenigstens einige der Atome in den Linkergruppen sollten leicht durch stabile Isotope mit schweren Atomen ersetzt werden können. Der Linker enthält vorzugsweise Gruppen oder Reste, die eine Ionisation der affinitätsmarkierten Reagenzien, Peptide, Substrate oder Reaktionsprodukte vereinfachen.
Um die Ionisation zu fördern, kann der Linker saure oder basische Gruppen, z.B. COOH, SO₃H, primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen, Stickstoff-Heterozyklen, Ether oder Kombinationen dieser Gruppen, enthalten. Der Linker kann auch Gruppen enthalten, die eine permanente Ladung tragen, z.B. Phosphoniumgruppen, quaternäre Ammoniumgruppen, Sulfoniumgruppen, chelierte Metallionen, Tetralkyl- oder Tetrarylborat oder stabile Carbanionen.
Die kovalente Bindung des Linkers an A oder PRG sollte typischerweise nicht unabsichtlich durch chemische oder enzymatische Reaktionen während des Tests gespalten werden. In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, den Linker von der Affinitätsmarkierung A oder von PRG abzuspalten, beispielsweise um die Freisetzung aus einer Affinitätssäule zu erleichtern. So kann der Linker beispielsweise durch chemische, thermische, enzymatische oder photochemische Reaktion spaltbar sein. Photospaltbare Gruppen in dem Linker können die 1-(2-Nitrophenyl)-ethyl-Gruppe beinhalten. Thermisch labile Linker können beispielsweise ein doppelstrangiger Duplex, der aus zwei komplementären Nukleinsäuresträngen gebildet ist, ein Strang einer Nukleinsäure mit einem komplementären Strang einer Peptidnukleinsäure oder zwei komplementäre Peptidnukleinsäurestränge, die sich bei Erhitzen trennen, sein. Spaltbare Linker umfassen auch diejenigen mit Disulfidbindungen, labilen Säure- oder Basengruppen, einschließlich unter anderem Diarylmethyl- oder Trimethylarylmethylgruppen, Silylether, Carbamate, Oxyester, Thioester, Thionoester und alpha-fluorierte Amide und Ester. Enzymatisch spaltbare Linker können beispielsweise proteaseempfindliche Amide oder Ester, β-Lactamase-empfindliche β-Lactamanaloge und Linker, die durch Nuklease spaltbar sind oder durch Glycosidase spaltbar sind, enthalten.
Die mit Protein reagierende Gruppe (PRG) kann eine Gruppe sein, die selektiv mit bestimmten funktionellen Proteingruppen reagiert. Jede selektiv reagierende mit Protein reagierende Gruppe sollte mit einer interessierenden funktionellen Gruppe, die wenigstens in einem Teil der Proteine in einer Probe vorhanden ist, reagieren. Die Reaktion von PRG mit funktionellen Gruppen auf dem Protein sollte unter Bedingungen stattfinden, die nicht zu einem wesentlichen Abbau der Verbindungen in der zu analysierenden Probe führen. Beispiele selektiv reagierender PRGs, die zur Verwendung in den affinitätsmarkierten Reagenzien dieser Erfindung geeignet sind, umfassen diejenigen, die mit Sulfhydrylgruppen reagieren, wodurch Cystein enthaltende Proteine markiert werden, diejenigen, die mit Aminogruppen, Carboxylatgruppen, Estergruppen, mit Phosphat reagierenden Gruppen und mit Aldehyd und/oder Keton reagierenden Gruppen oder nach der Fragmentierung mit CNBr mit Homoserinlacton reagieren.
Mit Thiol reagierende Gruppen umfassen Epoxide, Alpha-Halogenacylgruppen, Nitrite, sulfonierte Alkyl- oder Arylthiole und Maleimide. Aminoreaktive Gruppen markieren Aminogruppen in Proteinen und umfassen Sulfonylhalogenide, Isocyanate, Isothiocyanate, aktive Ester, einschließlich Tetrafluorphenylester und N-Hydroxysuccinimidylester, Säurehalogenide und Säureanhydride. Zusätzlich umfassen die aminoreaktiven Gruppen Aldehyde oder Ketone in Gegenwart oder in Abwesenheit von NaBH₄ oder NaCNBH₃.
Mit Carbonsäure reagierende Gruppen umfassen Amine oder Alkohole in der Gegenwart eines Kopplungsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder 2,3,5,6-Tetrafluorphenyltrifluoracetat, und in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Kopplungskatalysators, wie 4-Dimethylaminopyridin, und Übergangsmetall-Diamin-Komplexe, einschließlich Cu(II)-phenanthrolin.
Mit Ester reagierende Gruppen umfassen Amine, die beispielsweise mit Homoserinlacton reagieren.
Mit Phosphat reagierende Gruppen umfassen cheliertes Metall, wobei das Metall beispielsweise Fe(III) oder Ga(III) ist, welches beispielsweise an Nitriltriessigsäure oder Iminodiessigsäure cheliert ist.
Mit Aldehyd oder Keton reagierende Gruppen umfassen Amin plus NaBH₄ oder NaCNBH₃ oder sie umfassen diese Reagenzien, nachdem zuerst ein Kohlenhydrat mit Periodat behandelt wurde, um ein Aldehyd oder Keton zu erzeugen.
Die oben diskutierten Erfordernisse für A, L, PRG erstrecken sich auf die korrespondierenden Segmente von A-L-PRG und die mit diesem Reagens erzeugten Reaktionsprodukte.
Interne Standards, die in geeigneter Weise isotopisch markiert sind, können in den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, um absolute Mengen von Proteinen in Proben zu messen. Diese können durch Umsetzen von affinitätsmarkierten mit Protein reagierenden Reagenzien mit einem Präparat, von dem bekannt ist, daß es das interessierende Protein enthält, hergestellt werden, um die aus dem Verdau des markierten Proteins erzeugten affinitätsmarkierten Peptide zu erzeugen. Alternativ können die gewünschten Peptide chemisch synthetisiert werden. Interne Standards von affinitätsmarkierten Peptiden sind im wesentlichen chemisch identisch zu den korrespondierenden affinitätsmarkierten Peptiden, die aus dem Verdau des affinitätsmarkierten Proteins erzeugt werden, mit der Ausnahme, daß sie unterschiedlich isotopisch markiert sind, um ihre unabhängige Detektion mittels MS-Techniken zu ermöglichen.
Das Verfahren dieser Erfindung kann auch verwendet werden, um die relativen Mengen eines oder mehrerer Proteine in zwei oder mehr Proteinproben zu bestimmen und gleichzeitig deren Identität zu bestimmen. Die Proteine in jeder Probe werden mit den markierten Reagenzien, die im wesentlichen chemisch identisch, jedoch unterschiedlich isotopisch markiert sind, umgesetzt. Die Proben werden vereinigt und in einem Ansatz verarbeitet und dann zusammen einer Gelelektrophorese unterzogen. Die Proteine, die in spezifischen Banden oder Flecken enthalten sind, werden dann verdaut. Alternativ können die Proteine nach dem Mischen der Proteinproben, jedoch vor der Elektrophorese Avidin-Affinitätschromatographie unterzogen werden, um biotinylierte Proteine anzureichern, die beispielweise wichtig sein könnten, wenn intakte Zellen markiert worden sind. Die relative Menge jedes markierten Proteins, welche die relative Menge des Proteins, aus dem das Peptid entstanden ist, widerspiegelt, wird durch Messung der jeweiligen Isotoppeaks mittels Massenspektrometrie bestimmt.
Die Verfahren dieser Erfindung können auf die Analyse oder den Vergleich mehrerer verschiedener Proben angewandt werden. Proben, die durch Verfahren dieser Erfindung analysiert werden können, umfassen Zellhomogenisate, Zellfraktionen, biologische Flüssigkeiten, einschließlich Urin, Blut und zerebrospinaler Flüssigkeit, Gewebehomogenisate, Tränen, Fäkalien, Speichel, Spülflüssigkeiten, wie Lungen- oder Peritonealspülungen, Gemische von biologischen Molekülen, einschließlich Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten und Nukleinsäuren, die durch teilweise oder vollständige Fraktionierung von Zell- oder Gewebehomogenisaten erzeugt werden.
Die Verfahren dieser Erfindung verwenden MS- und (MS)ⁿ-Verfahren. Während eine Vielzahl von MS- und (MS)ⁿ-Techniken verfügbar ist und in diesen Verfahren verwendet werden kann, sind matrixunterstützte Laserdesorptions-Ionisations-(MALDI/MS-) und Elektrospray-Ionisations-MS-(ESI/MS-) Verfahren bevorzugt.
Wie oben ausgeführt, sind die Proteine in jeder Probe entweder mit einem (A) affinitätsmarkierten oder nicht-affinitätsmarkierten Reagens markiert, die jeweils einen markierten Linkerrest (L) und eine mit Protein reagierende Gruppe (PRG) umfassen.
Die markierten Proben werden gemischt und dann vorzugsweise 2D-PAGE unterzogen. Eindimensionale SDS-Elektrophorese kann anstelle von 2D-PAGE verwendet werden, oder es können eindimensionale isoelektrische Fokussierungsgele oder jedes andere Elektrophoreseverfahren zum Trennen von Proteinen, einschließlich nativer Proteinelektrophorese, verwendet werden. Die Verfahren für den Ablauf eindimensionaler und zweidimensionaler Elektrophorese sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt.
Proteine, die die beiden Zellproben gemeinsam haben, bilden bei Proteinfärbung oder bei direkter MS-Analyse eines Stücks des Gels übereinstimmende Flecken. Das Verhältnis der detektierbaren Isotope zwischen identischen Proteinen aus jeder Probe ist für die große Mehrzahl der Proteine konstant. Proteine, die die beiden Proben nicht gemeinsam haben, wandern unabhängig voneinander. So hat ein Protein, welches einzigartig ist oder relativ zu einer Probe eine unterschiedliche Konzentration hat, ein anderes Verhältnis von detektierbaren Isotopen als die Mehrzahl von Proteinflecken. Die interessierenden Proteinflecken werden dann verdaut, um markierte Peptide zu bilden, die dann mittels (MS)ⁿ analysiert werden.
Bei der konventionellen Analyse wird eine Kontrolle mit bekannten Proteinen für den untersuchten Zelltyp durchgeführt. Die bekannten Flecken auf dem Probengel müssen identifiziert und markiert werden, dann müssen sie mit der Kontrolle und dem zweiten Gel verglichen werden, um Unterschiede zwischen den beiden Gelen zu bestimmen. In der vorliegenden Erfindung gibt es nur ein Gel, so daß keine Markierung notwendig ist. Zusätzlich korrigiert die Software, die für herkömmliche Verfahren zur Ausrichtung verschiedener Gele vor dem Vergleich und der Kontrastierung von Proteinunterschieden verwendet wird, keine lokalen Verzerrungen und Inkonsistenzen zwischen zwei oder mehr Gelen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung eliminiert die Notwendigkeit einer solchen Korrektur, da die Extrakte für alle zu testenden Proben gemischt werden und das gleiche Gel durchlaufen. Jegliche Gelverzerrungen treten in allen Proben in gleichem Maße auf.
Einer der Vorteile bei der Durchführung von Gelelektrophorese besteht darin, daß besonders interessierende Proteine zu einer reproduzierbaren Stelle auf dem Gel wandern, so daß, falls es gewünscht ist, nur diese Proteine analysiert werden müssen. Diese Proteine können Krankheitsmarker sowie Kontrollproteine umfassen. Viele der posttranslational modifizierten Formen dieser Proteine können mittels Gelelektrophorese voneinander getrennt werden, so daß die Verfahren der Erfindung verwendet werden könnten, um Veränderungen in der Expression jeder dieser modifizierten Formen zu bestimmen und zu quantifizieren. Falls es Schwierigkeiten bei der Lokalisierung solcher Proteine geben sollte, könnte ein kleiner Teil der getrennten Proben aus dem Gel durch Transblotting übertragen werden, und diese Proteine könnten mittels Immunoblot-Techniken lokalisiert werden. Alternativ könnte vor der Elektrophorese eine kleine Menge des interessierenden Proteins mit einem Fluoreszenzmarker, vom dem bekannt ist, daß er die Migrationsposition nicht beeinflußt, markiert werden, um die interessierenden Bereiche, die analysiert werden sollen, zu identifizieren. Dann könnten die Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, um die quantitativen Veränderungen in der Mehrzahl der Proteine in dem Gel auf Basis der PRG als eine Funktion ihrer Migration auf dem Gel zu messen.
Das Verfahren dieser Erfindung kann verwendet werden, um die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 00/11208 beschriebene Proteinzusammensetzung zu analysieren.
Quantitative Proteomanalyse mit affinitätsmarkiertem Reagens
Dieses Verfahren besteht in der Verwendung eines Biotin-markierten, mit Sulfhydryl reagierenden Reagens für quantitative Proteinprofilmessungen in einem Probenproteingemisch und einem Vergleichsproteingemisch. Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:
A. Reduktion
Disulfidbindungen von Proteinen in dem Proben- und dem Vergleichsgemisch werden zu freien SH-Gruppen reduziert. Das bevorzugte Reduktionsmittel ist Tri-n-butylphosphin, welches unter Standardbedingungen verwendet wird. Alternative Reduktionsmittel umfassen Tricarboxyethylphosphin, Mercaptoethylamin und Dithiothreitol. Falls es erforderlich ist, kann diese Reak tion in der Gegenwart von Lösungsmitteln durchgeführt werden, einschließlich hoher Konzentrationen von Harnstoff und Detergenzien, um die Proteinlöslichkeit aufrechtzuerhalten. Die zu vergleichenden Vergleichs- und Probenproteingemische werden separat verarbeitet und es werden identische Reaktionsbedingungen verwendet.
B. Derivatisierung von SH-Gruppen mit einer Affinitätsmarkierung
Freie SH-Gruppen werden mit dem Biotinylierungsreagens Biotinyl-iodacetylamidyl-4,7-dioxadecandiamin derivatisiert. Das Reagens wird durch Substitution von Linkeratomen mit stabilen Isotopen in unterschiedlich isotopisch markierten Formen hergestellt, und jede Probe wird mit einer anderen isotopisch markierten Form des Reagens derivatisiert. Die Derivatisierung von SH-Gruppen wird vorzugsweise unter leicht basischen Bedingungen (pH 8,5) für 90 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Für die quantitative vergleichende Analyse zweier Proben wird jeweils eine Probe (bezeichnet mit Vergleichsprobe und Probe) mit der isotopisch leichten bzw. der isotopisch schweren Form des Reagens derivatisiert. Für die vergleichende Analyse mehrerer Proben wird eine Probe als Vergleichsprobe bezeichnet, mit der die anderen Proben dann in Beziehung gesetzt werden. Typischerweise wird die Vergleichsprobe mit dem isotopisch schweren Reagens markiert und die experimentellen Proben werden mit der isotopisch leichten Form des Reagens markiert, obwohl diese Wahl der Reagenzien beliebig ist. Diese Reaktionen sind auch mit dem Vorliegen hoher Konzentrationen von Lösungsmitteln kompatibel.
C. Kombination markierter Proben
Nach Abschluß der Affinitätsmarkierungsreaktion werden definierte aliquote Teile der mit den isotopisch unterschiedlichen Reagenzien (z.B. schweren und leichten Reagenzien) markierten Proben kombiniert und alle nachfolgenden Schritte werden mit den vereinigten Proben durchgeführt. Die Kombination der unterschiedlich markierten Proben in diesem frühen Stadium des Verfahrens eliminiert Variationen aufgrund nachfolgender Reaktionen und Manipulationen. Vorzugsweise werden gleiche Mengen jeder Probe kombiniert und anschließend mittels einer der nachstehenden gut bekannten Techniken fraktioniert:

1. Durchfluß-Gelelektrophorese Die markierten Proteine werden durch eine präparative Durchfluß-SDS-Gel-(5%) Vorrichtung (Mini Prep Cell, Bio-Rad) getrennt und die eluierten Proteine werden in Fraktionen gesammelt. Die Proteine können beispielsweise durch Acetonpräzipitation konzentriert werden, ehe ein proteolytischer Verdau durch Inkubation über Nacht mit einem Enzym, wie Trypsin, durchgeführt wird.
2. Standard-Gelelektrophorese Das Gel kann hinsichtlich Proteinen gefärbt werden, um Flecken oder Banden zu lokalisieren, oder die Flecken oder Scheiben können ohne eine Detektion von Proteinen in diesem Stadium verarbeitet werden. Proteingemische, die in einem Fleck (2D) oder einer Bande (1D) der Gelelektrophorese vorliegen, werden aus dem Gel ausgeschnitten, optional getrocknet und mit einem Enzym verdaut. Die Proteine in dem Probengemisch werden verdaut, typischerweise mit Trypsin. Alternative Proteasen sind mit dem Verfahren ebenso kompatibel wie chemische Fragmentierungsverfahren. Dieser Schritt kann bei der Analyse kleiner Proteine ausgelassen werden.
3. Standard-Gelelektrophorese mit Verdau und Transblotten zur Peptidextraktion Das Gel kann mit Enzymen behandelt und durch Transblotting (mit oder ohne Unterstützung durch elektrischen Strom) auf eine Membran übertragen werden, oder es kann durch ein Transblotting durch eine aktive Proteasemembran behandelt und auf einer zweiten Membran eingefangen werden (Bienvenut et al., Anal. Chem. 71:4800–4807, 1999). Diese Membran kann dann direkt mittels MS oder MALDI-MSMS analysiert werden.

D. Peptidmassen-Fingerabdruck
Das verdaute Protein kann dann PMF unterworfen werden, um die Hauptproteinkomponenten zu identifizieren. In günstigen Fällen sind die Cys enthaltenden biotinylierten Peptide in diesem Stadium als Isotopenpaare, die um 8 amu auseinanderliegen, detektierbar, und die relative Menge der Proteine kann durch Vergleichen der Intensitäten dieser Peptide im Massenspektrum ohne zusätzliche Reinigung bestimmt werden.
E. Affinitätsisolation der affinitätsmarkierten Peptide durch Wechselwirkung mit einem Einfangreagens
Die biotinylierten Peptide können dann auf Avidin-Agarose isoliert werden. Nach dem Verdau wird der pH-Wert der Peptidproben auf 6,5 gesenkt und die biotinylierten Peptide werden auf Perlen, die mit monomerem Avidin (Promega) beschichtet sind, immobilisiert. Die Perlen werden intensiv gewaschen. Das letzte Waschlösungsmittel enthält 10% Acetonitril, um restliches SDS zu entfernen. Biotinylierte Peptide werden beispielsweise mit 0,4% Trifluoressigsäure in der Gegenwart von Acetonitril aus Avidin-Agarose eluiert.
Die Analyse der isolierten, derivatisierten Peptide kann auch durch μLC-MSⁿ oder CE-MSⁿ mit datenabhängiger Fragmentierung durchgeführt werden. Es werden Verfahren und Protokolle zur Steuerung der Geräte verwendet, die auf dem Gebiet gut bekannt sind und beispielsweise in Ducret et al., 1998, Prot. Sci. 7: 706–719, Figeys und Aebersold, 1998 Electrophoresis 19:885–892, Figeys et al., 1996, Nature Biotech. 14:1579–1583, oder Haynes et al., 1998 Electrophoresis 19:939–945, beschrieben werden. In diesem letzten Schritt können sowohl die Menge als auch die Sequenzidentität der Proteine, aus denen die markierten Peptide stammten, durch automatisierte mehrstufige MS bestimmt werden. Dies wird durch den Betrieb des Massenspektrometers im dualen Modus, in dem das Instrument in aufeinanderfolgenden Scans zwischen der Messung der relativen Menge von Peptiden, die aus der Kapillarsäule eluieren, und der Aufzeichnung der Sequenzinformation ausgewählter Peptide wechselt, erzielt. Peptide werden quantifiziert, indem im MS-Modus die relativen Signalintensitäten für Paare von Peptidionen mit identischer Sequenz, die mit den isotopisch leichten bzw. schweren Formen des Reagens markiert sind und deren Masse sich daher um die Massedifferenz unterscheidet, die in dem affinitätsmarkierten Reagens codiert ist, gemessen werden. Peptidsequenzinformation wird automatisch erzeugt, indem Peptidionen mit einem bestimmten Masse-Ladungs-(m/z-) Verhältnis für stoßinduzierte Dissoziation (CID) in dem im MSⁿ-Modus betriebenen Massenspektrometer ausgewählt werden. Siehe Link, A.J. et al., Electrophoresis 18:1314–1334, 1997, Gygi, S.P. et al., Mol. Cell. Biol. 19:1720–1730, 1999, und Gygi, S.P. et al., Electrophoresis 20:310–319, 1999. Die resultierenden CID-Spektren werden dann automatisch mit Sequenzdatenbanken korreliert, um das Protein zu identifizieren, aus dem das sequenzierte Peptid stammte. Die Kombination der Ergebnisse der MS- und MSMS-Analysen von affinitätsmarkierten und unterschiedlich markierten Peptidproben bestimmt die relativen Mengen sowie die Sequenzidentitäten der Komponenten von Proteingemischen in einem einzigen automatisierten Vorgang.
Dieses Verfahren kann auch unter Verwendung anderer Affinitätsmarkierungen und anderer mit Protein reagierender Gruppen, einschließlich aminoreaktiver Gruppen, mit Carboxyl reagierender Gruppen oder Gruppen, die mit Homoserinlactonen reagieren, durchgeführt werden.
Der hier verwendete Ansatz für die quantitative Proteomanalyse basiert auf zwei Prinzipien. Erstens enthält eine kurze Sequenz zusammenhängender Aminosäuren aus einem Protein (5–25 Reste) ausreichend Informationen, um dieses Protein eindeutig zu identifizieren. Die Identifikation von Proteinen durch MSⁿ wird durchgeführt, indem unter Verwendung von ausgefeilten Computersuchalgorithmen die in dem CID-Massenspektrum enthaltene Sequenzinformation mit Sequenzdatenbanken korreliert wird (Eng, J. et al., J. Amer. Soc. Mass Spectrom. 5:976–989, 1994, Mann, M. et al., Anal. Chem. 66:4390–4399, 1994, Qin, J. et al., Amer. Chem. 69:3995–4001, 1997, Clauser, K.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5072–5076, 1995). Zweitens sind Paare von identischen Peptiden, die mit den leichten bzw. schweren affinitätsmarkierten Reagenzien markiert sind (oder bei der Analyse von mehr als zwei Proben: Sätze von identischen markierten Peptiden, wobei jedes Mitglied der Sätze unterschiedlich isotopisch markiert ist), chemisch identisch und dienen daher als gegenseitige interne Standards für die Quantifizierung. Die MS-Messung unterscheidet aufgrund des Unterschieds zwischen isotopisch unterschiedlichen Reagenzien, die an die Peptide angehängt sind, leicht zwischen Peptiden, die aus verschiedenen Proben stammen und beispielsweise verschiedene Zellstadien repräsentieren. Die Verhältnisse zwischen den Intensitäten der verschiedenen Gewichtskomponenten dieser Paare oder Sätze von Peaks liefern eine akkurate Messung der relativen Häufigkeit der Peptide (und damit der Proteine) in den ursprünglichen Zellpools, da die MS-Intensitätsantwort auf ein gegebenes Peptid von der isotopischen Zusammensetzung der Reagenzien unabhängig ist (De Leenheer, A.P. et al., Mass. Spectrom. Rev. 11:249–702, 1992). Die Verwendung von isotopisch markierten internen Standards ist in der quantitativen Massenspektrometrie Standardpraxis und wurde mit großem Vorteil beispielsweise in der präzisen Quantifizierung von Arzneimitteln und Metaboliten in Körperflüssigkeiten eingesetzt.
Die Verfahren dieser Erfindung, insbesondere 1D-Gele, können zur Analyse von Klassen von Proteinen mit besonderen physikalisch-chemischen Eigenschaften, einschließlich schlechter Löslichkeit, großer oder geringer Größe und extrem hoher pI-Werte, verwendet werden. Weniger häufig vorkommende Proteine können analysiert werden, indem man vor der Elektrophorese eine Proteinaffinitätssubtraktion durchführt, um die am häufigsten vorkommenden Proteine zu entfernen. Alternativ könnte die Biotinylierungsreaktion in einer solchen Weise durchgeführt werden, daß ein kleiner Teilsatz von Proteinen, beispielsweise diejenigen Proteine, die auf der Außenseite einer Zelle freiliegen, oder Proteine, die nach Organellenreinigung freigelegt bleiben, markiert wird. Da dann eine große Menge an nicht biotinyliertem Protein vorhanden wäre, die ansonsten die Elektrophorese stören würde, könnte nach dem Mischen der Proteine aus der Kontrolle und der experimentellen Proteine das Proteinpräparat Avidin-Affinitätschromatographie unterzogen werden, um die biotinylierten Proteine anzureichern, die dann Elektrophorese unterzogen werden.
Die prototypische Verwendung der chemischen Prinzipien und des Verfahrens der vorliegenden Erfindung besteht in der Erstellung quantitativer Profile komplexer Proteinproben und schließlich von Gesamtlysaten von Zellen und Geweben gemäß dem oben beschriebenen bevorzugten Verfahren. Zusätzlich haben die Reagenzien und Verfahren dieser Erfindung Anwendungsformen, die über die Bestimmung von Proteinexpressionsprofilen hinausgehen. Solche Anwendungen umfassen die folgenden:
Die Verwendung von aminoreaktiven oder auf Sulfhydryl reagierenden, unterschiedlich isotopisch markierten affinitätsmarkierten Reagenzien kann für die quantitative Analyse von Proteinen in immunpräzipitierten Komplexen verwendet werden. In der bevorzugten Version dieser Technik werden Proteinkomplexe von Zellen, die verschiedene Stadien repräsentieren (z.B. verschiedene Stadien der Aktivierung, verschiedene Krankheitsstadien, verschiedene Stadien der Differenzierung), mit einem spezifischen Reagens, vorzugsweise einem Antikörper, präzipitiert. Die Proteine in dem präzipitierten Komplex werden dann wie oben derivatisiert und analysiert.
Die Verwendung von aminoreaktiven, unterschiedlich isotopisch markierten affinitätsmarkierten Reagenzien kann verwendet werden, um die Stellen zu bestimmen, an denen Proteinphosphorylierung induziert wurde. In einer bevorzugten Version dieses Verfahrens werden gereinigte Proteine (die z.B. unter verschiedenen stimulatorischen Bedingungen aus Zellen immunpräzipitiert sind) fragmentiert und derivatisiert, wie es oben beschrieben ist. Phosphopeptide werden in dem resultierenden Peptidgemisch durch Fragmentierung in der Ionenquelle des ESI-MS-Instruments identifiziert, und ihre jeweilige Häufigkeit wird durch Vergleichen der Ionensignalintensitäten der experimentellen Probe mit der Intensität eines eingeschlossenen, isotopisch markierten Standards bestimmt.
Aminoreaktive, unterschiedlich isotopisch markierte affinitätsmarkierte Reagenzien werden verwendet, um die N-terminale Ionenserie in MSMS-Spektren zu identifizieren. In einer bevorzugten Version dieser Verwendung werden die zu analysierenden Peptide mit einem 50:50-Gemisch eines isotopisch leichten und schweren Reagens, welches für Aminogruppen spezifisch ist, derivatisiert. Die Fragmentierung der Peptide mittels CID liefert daher zwei N-terminale Ionenserien, die sich bezüglich ihrer Masse exakt um die Massedifferenz der verwendeten Reagensspezies unterscheiden. Diese Verwendung erhöht die Schwierigkeit der Bestimmung der Aminosäuresequenz des derivatisierten Peptids drastisch.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen vier verschiedene Experimente, bei denen Trennungen mittels Gelelektrophorese durchgeführt wurden und quantitative Daten unter Verwendung von ICAT^TM-Reagenzien, die eine Biotinyl-Affinitätsmarkierung, einen Linker mit acht Deuteriumatomen und eine mit Protein reagierende Iodacetamidgruppe enthielten, erhalten wurden. Diese Beispiele sind nicht erschöpfend und sollen den Schutzumfang dieser Experimente nicht beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Fünf verschiedene Standardproteine wurden separat mit dem d0-ICAT-Reagens und dem d8-ICAT-Reagens alkyliert und in verschiedenen Verhältnissen miteinander gemischt, ehe 2D-Gelelektrophorese durchgeführt wurde. Nach dem Färben wurden die diesen Proteinen entsprechenden Flecken ausgeschnitten, mit Trypsin verdaut und PMF unterzogen. 1 zeigt eine Abbildung des Gels und Einfügungen jedes Massenspektrums, die eines der ICAT-Reagenspaare jedes Proteins enthalten. Zusätzlich ist das Verhältnis, in dem die Proteine vor der Gelelektrophorese miteinander gemischt wurden, aufgeführt, ebenso wie das Verhältnis von d0 zu d8, das mittels Massenspektrometrie erhalten wurde. In allen fünf Fällen lag die Diskrepanz zwischen den experimentellen und den beobachteten Verhältnissen weit unter 20%.
Einer der problematischen Aspekte beim Trennen von mit ICAT-Reagens markierten Peptiden mittels HPLC besteht darin, daß das mit d8 markierte Peptid typischerweise mehrere Sekunden vor dem korrespondierenden, mit d0 markierten Peptid eluiert. Um zu zeigen, daß es bei der Gelelektrophorese keinen ähnlichen Isotopentrennungseffekt gibt, wurde der 2D-Fleck für Lactalbumin, der in 2 gezeigt ist, in Quadranten unterteilt, die dann separat verdaut, extrahiert und MALDI MS-Analyse unterworfen wurden. Die rechte Seite von 2 zeigt, daß das gleiche Verhältnis von d0 zu d8 für jeden dieser Quadranten innerhalb von 10% erhalten wurde.
Beispiel 2
E. coli-Bakterienlysate, die entweder mit einem ICAT-Reagens markiert waren, welches deuteriertes Biotinyliodacetamidreagens für Wachstumsbedingungen mit Minimalmedium (Glucose) umfaßte oder für Wachstumsbedingungen mit reichhaltigem Medium (LB-Brühe) mit nicht-deuteriertem Reagens markiert waren, wurden in gleichen Mengen gemischt. Das Gemisch wurde durch eine präparative Durchfluß-SDS-Gel-(5%) Vorrichtung (Mini Prep Cell, Bio-Rad) getrennt, und Proteine wurden in Lösung fraktioniert. Die fraktionierten Proteine wurden dann mit Aceton präzipitiert, ehe sie durch Inkubation mit Trypsin über Nacht proteolytisch verdaut wurden. Bei der Avidinchromatographie wurden sowohl Peptide aus dem Durchflußteil als auch Peptide aus dem Elutionsteil in 96 Fraktionen gesammelt. Der Durchfluß wurde auf Umkehrphasenmedium (POROS^® 50R1, Applied Biosystems) eingefangen und mit destilliertem Wasser gewaschen und mit 60% ACN eluiert. Die Proben wurden unter Vakuum getrocknet und mit 50% ACN/0,1% TFA resuspendiert. Spektren wurden unter Verwendung eines Voyager-MALDI-TOF-Massenspektrometers von Applied Biosystems mit α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure als Matrix erhalten. Die Strategie bestand darin, Proteine unter Verwendung von PMF zu identifizieren, während das d0/d8-Verhältnis für die Quantifizierung verwendet wurde.
3 zeigt das für den Avidin-Durchfluß und die aus dem Avidin eluierten Peptide erhaltene Spektrum für eine Fraktion, die Proteine mit einem Molekulargewicht von ungefähr 40.000 enthielt. Zehn (10) verschiedene mit ICAT-Reagens markierte Paare sind markiert. Die Hauptproteinkomponenten wurden mittels PMF unter Verwendung des ChemApplex-PMF-Softwareprogramms (Applied Biosystems) vorläufig identifiziert, und sechs Komponenten sind in Tabelle 1 unten aufgelistet. OmpA war die Hauptkomponente, die 25% der Gesamtintensität ausmachte. Die Konfidenz der Identifikation ist ungefähr proportional zu dem in Spalte 5 aufgelisteten Ergebnis. Es sei angemerkt, daß alle sechs Proteine ein Molekulargewicht von zwischen 30.000 und 52.000 Dalton haben, wie es unter Verwendung einer groben SDS-Trennung zu erwarten wäre. Es wurde eine spezielle Peptiddatenbank erzeugt, die nur Cysteinpeptide enthielt, und die Massen aus den eluierten Peptiden wurden mit dieser Datenbank abgeglichen. Die oberen sechs Kandidatenproteine sind aufgeführt. Zwei dieser Proteine sind identisch zu denjenigen, die aus dem Avidin-Durchfluß identifiziert wurden. Vor allem haben zwei der Proteine in der Durchflußfraktion, nämlich Ribose-Bindungsprotein und das äußere Membranprotein C, keine Cysteine und tragen daher keine Peptide zu der Avidin-Eluatfraktion bei. Tabelle 1 Durchfluß
Avidinelution
Die in Tabelle 1 aufgelisteten Proteine wurden unter Verwendung des ChemApplex-PMF-Programms aus den Spektren in 3 identifiziert. Das obere Feld wurde aus dem Durchfluß der Avidinperlen erhalten, und das untere Feld wurde aus der Avidinelution erhalten. Die erste Spalte listet die SwissProt-Hinterlegungsnummer des identifizierten Proteins auf. In der zweiten Spalte ist eine Kurzform des Proteinnamens aufgeführt: EF-TU für Verlängerungsfaktor-TU, ompC für äußeres Membranprotein C, SHT für Serinhydroxymethyltransferase, Ribose-BP für das periplasmatische Ribosebindungsprotein, Glutaminsyn. für Glutaminsynthetase, ICDH für Isocitratdehydrogenase, ompA für äußeres Membranprotein A, hypo. für hypothetisches Protein, Succ.-CoA-Syn. für Succinyl-Coenzym A-Synthetase-Betakette. In der Spalte MW ist das Molekulargewicht des Proteins aufgeführt, unter # Peptid ist die Anzahl von Peptiden aufgeführt, die übereinstimmten (einschließlich lediglich der d0-Massen für die aus Avidin eluierten Peptide), das Ergebnis wurde mit dem ChemApplex-Programm berechnet, wobei nur die d0-Massen berücksichtigt wurden, % Intensität ist der Prozentsatz der Intensität aller Massen in dem Spektrum, die durch die Massen, die übereinstimmten (wieder nur die d0-Massen) nachgewiesen werden konnten, und ppm ist der nach der durchschnittlichen Intensität gewichtete ppm-Fehler für diese Massen zwischen den experimentellen Messungen aus dem Massenspektrum und der theoretischen Masse der Peptide. Das Verhältnis wurde durch Dividieren der Intensität des d0-Peptids durch die Intensität des korrespondierenden d8-Peptids und Mittelung, wo dies möglich war, manuell berechnet. Die geringe Intensität der d0-Massen für SHT erklärt, warum das ChemApplex-Programm Schwierigkeiten hatte, SHT von Rauschen zu unterscheiden; das Programm suchte nicht nach den d8-Massen, die alle drei über dem Hintergrund detektierbar waren. Es sei angemerkt, daß ompC und RBP keine Cysteine enthalten und daher in der Avidineluatfraktion nicht sichtbar sind. Die Konfidenz der Identifikationen ist für die Proteine mit dem höchsten Ergebnis und auch für die Proteine, die in der Durchflußfraktion und der Affinitätselutionsprobe unabhängig voneinander identifiziert wurden, am höchsten. Alle Proteine in beiden Tabellen mit Ausnahme der beiden hypothetischen Proteine in der zweiten Tabelle wurden wiederholt aus diesen E. coli-Lysaten identifiziert.
Beispiel 3
Zwei E. coli-Präparate ähnlich den oben beschriebenen wurden mit ICAT-d0-Reagens und ICAT-d8-Reagens markiert, miteinander gemischt und 1D-SDS-Gelanalyse unterzogen. Scheiben wurden aus dem Gel ausgeschnitten, gewaschen, mit Trypsin verdaut, und die Peptide wurden eluiert. Es wurde keine Avidin-Affinitätschromatographie durchgeführt, so daß nur die am stärksten mit ICAT-Reagens markierten Peptide detektierbar waren. Bei PMF-Analyse mit ChemApplex war E. coli-Tryptophanase als markanteste Proteinkomponente neben Trypsin selbst detektierbar. Unter diesen Bedingungen wurden die Peptide, die ICAT-Reagenspaaren entsprachen, aufgrund einer Oxidation am ursprünglichen Schwefelatom von Cystein analog zur Oxidation von Methioninresten, wie sie für gewöhnlich nach SDS-Gelanalyse beobachtet wird, auch in oxidierter Form detektiert. So liefert jedes Peptid zwei unabhängige Messungen des Verhältnisses von d0 zu d8, eine für die reduzierte Form des Peptids und eine für die oxidierte Form des Peptids. Ein markantes Quartett von Peaks, die um etwa 8 amu auseinanderliegen, beginnend bei 1581,85, was dem Tryptophanasepeptid QLPCPAELLR (SEQ ID NO:1) entspricht, und die d8-, d0+O- und d8+O-Peaks wurden detektiert. Das ICAT-Reagenspaar mit einem nicht modifizierten Methionin hatte ein Verhältnis von d8/d0 von 2,1, wohingegen das oxidierte Paar ein Verhältnis von d8/d0 von 1,9 hat. In diesen Experimenten lagen die Verhältnisse, die für ICAT-Reagenspaare von Peptiden, die von dem gleichen Protein ab geleitet waren, üblicherweise innerhalb eines Bereichs von 20% voneinander, mit Ausnahme der schwächsten Signale und derjenigen Signale, die offensichtlich andere Peptide überlappten (was besonders deutlich ist, wenn sie erwarteten Trypsinverdauprodukten aus den gleichen bereits identifizierten Proteinen entsprechen). Weitere ICAT-Reagenspaare aus Tryptophanase konnten detektiert werden, sie waren jedoch gegenüber dem Hintergrund nicht gut aufgelöst.
Beispiel 4
Proteine wurden aus Herzzellen der Ratte aus normalen Myozyten oder aus Myozyten, die ischämischen Bedingungen ausgesetzt worden waren, isoliert. Normale Rattenproteine wurden mit dem d0-ICAT-Reagens markiert, und die ischämischen Zellproteine wurden mit dem d8-ICAT-Reagens markiert. Die beiden Proben wurden miteinander gemischt, man ließ sie ein 2D-Gel durchlaufen und sie wurden mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Flecken wurden ausgeschnitten, mit Trypsin verdaut und PMF unterzogen. Die Daten wurden dann unter Verwendung des ChemApplex-Software-Programms untersucht, unter Verwendung einer Datenbank, die alle menschlichen, Ratten- und Mausproteine in der SwissProt-Datenbank enthielt. Der Spitzenkandidat für einen Fleck war menschliche Citratsynthetase. Die Homologen von Citratsynthetase von Ratte und Maus fehlten in der Datenbank. Das Spektrum des Peptidmassen-Fingerabdrucks enthielt ein markantes ICAT-Reagenspaar bei 1098, welches keinem der Citratsynthetasepeptide entsprach. Da das Rattencitratsynthetaseprotein in der SwissProt-Datenbank nicht vorlag, wurde eine Ratten-EST-Datenbank in dem Protein Prospector (University of California – San Francisco) Software-Programm durchsucht unter Verwendung von Massen, die exakt den theoretischen Massen von Citratsynthetase entsprachen, die identifiziert worden waren. Eine der EST-Sequenzen, die auf diese Weise identifiziert wurde, enthielt die Sequenz YSQCR (SEQ ID NO:2), welche dem ICAT-Reagenspaar bei 1098 entsprach. Die homologe menschliche Sequenz war YTQCR (SEQ ID NO:3), was erklärt, weshalb die gemessene Masse nicht zu der Sequenz in der Datenbank paßte. Diese Peptidsequenz ist zu kurz, um eine eindeutige Kennung eines Proteins zu sein, und wäre nicht geeignet, wenn es nicht möglich gewesen wäre, das Peptid der Citratsynthetase auf Basis der PMF-Daten zuzuweisen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Vergleichen von interessierenden Proteinzusammensetzungen zumindest zweier verschiedener Proben, wobei das Verfahren aufweist: (a) Herstellung eines Proteinextraktes aus jeder der zumindest zwei verschiedenen Proben, (b) Bereitstellen eines Satzes von im wesentlichen chemisch identischen und hinsichtlich der Isotopenzusammensetzung unterschiedlich markierten Proteinreagenzien, wobei das Reagens eine Formel hat, welche ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus: A-L-PRG und L-PRG, wobei A ein Affinitätsmarker ist, der gezielt an ein Einfangreagens bindet, L eine Linkergruppe ist, in welcher eines oder mehrere Atome unterschiedlich mit einem oder mehreren stabilen Isotopen markiert sind und PRG eine mit Protein reagierende Gruppe ist, die gezielt mit einer gegebenen funktionellen Gruppe eines Proteins reagiert oder ein Substrat für ein Enzym ist, (c) Reagieren lassen des Extraktes aus Proteinen aus unterschiedlichen Proben nach Schritt (a) mit einem isotopenmäßig unterschiedlich markierten Reagens aus dem Satz nach Schritt (b), um zwei oder mehrere Sätze von mit Isotopen markierten Proteinen bereitzustellen, (d) Mischen der zwei oder mehreren Sätze von isotopenmäßig unterschiedlich markierten Proteinen, um eine einzige Mischung aus mit Isotopen unterschiedlich markierten Proteinen zu bilden, (e) Trennen der zwei oder mehr unterschiedlich markierten Proteine in der Mischung nach Schritt (d) durch Elektrophorese mit der Mischung, (f) Verdau zumindest eines Teiles der Proteine, die der Elektrophorese nach Schritt (e) ausgesetzt wurden, um eine Probe aus markierten Peptiden zu erzeugen, und (g) Erfassen der Unterschiede in den Expressionsniveaus von einem oder mehreren differentiell markierten Proteinen in den beiden Proben durch Massenspektrometrie auf der Basis eines oder mehrerer differentiell markierter Peptide in der Probe von markierten Peptiden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagens die Formel: A-L-PRG aufweist, und angehängte Affinitätsproteine in den Proben enzymatisch oder chemisch verarbeitet werden, um sie in markierte Peptide umzuwandeln.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagens die Formel: L-PRG aufweist, und markierte Proteine in den Proben enzymatisch oder chemisch verarbeitet werden, um sie in markierte Peptide umzuwandeln.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das Protein oder der Peptidanteil eines oder mehrerer der markierten Proteine durch Tandem-Massenspektrometrie sequenziert werden, um das markierte Protein zu identifizieren, aus welchem das Peptid entstanden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei die Proteine durch den Fingerabdruck der Peptidmasse identifiziert werden, und wobei die durch Isotope markierten Peptide für die quantitative Bestimmung verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, bei welchem die Menge von einem oder mehreren Proteinen oder Peptiden in den Proben ebenfalls durch Massenspektrometrie bestimmt wird und welches weiterhin den Schritt aufweist, daß in eine Probe eine bekannte Menge einer oder mehrerer interner Standardsubstanzen für jedes der zu quantifizierenden Proteine eingebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei die freigesetzten durch Isotope markierten Proteine oder Peptide vor der Erfassung durch die Massenspektrometrie chromatographisch voneinander getrennt werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, wobei die Proben aus Proteinmischungen bestehen, die aus Geweben, Zellen, biologischen Flüssigkeiten, einschließlich Serum, zerebrospinaler Flüssigkeit, Urin, Asciten oder subzellulären Fraktionen, einschließlich Überständen, und verschiedenen Membranen enthaltenden Organellen oder Kernpräparaten oder Proteinpräparaten abgeleitet wurden, die durch chromatographische Verfahren, Kapillarelektrochromatographie- oder Kapillarelektrophoreseverfahren getrennt wurden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 oder 3, wobei die Proteine durch irgendeine Proteinfärbetechnik identifiziert werden oder wobei Protein enthaltende Bereiche durch Massenspektrometrie im Anschluß an systematischen Verdau und Extraktion oder irgendeine Kombination von „Transblotting" und Verdau lokalisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, bei welchem eine Mehrzahl von Proteinen oder Peptiden in einer Probe erfaßt und identifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, welches weiterhin einen Schritt aufweist, in welchem eines oder mehrere der Proteine oder Peptide in einer Probe chemisch oder enzymatisch verarbeitet werden, um eine funktionelle Gruppe freizulegen, die mit einem Marker reagieren kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei PRG eine mit einem Protein reagierende Gruppe ist, die gezielt mit bestimmten funktionellen Proteingruppen reagiert, und wobei eine Mehrzahl von Proteinen oder Peptiden in einer einzelnen Probe erfaßt und identifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei zwei oder mehr im wesentlichen chemisch identische, jedoch hinsichtlich der Isotope unterschiedlich markierte, mit Protein reagierende Reagenzien, die spezifisch unterschiedlich mit Proteinen oder Peptiden reagieren, bereitgestellt werden und mit jeder zu analysierenden Probe umgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei alle Proteine oder Peptide in einer Probe erfaßt und identifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei die relativen Mengen eines oder mehrerer Proteine oder Peptide in zwei oder mehr verschiedenen Proben bestimmt werden, und welches weiterhin die Schritte aufweist, daß die unterschiedlich markierten Proben kombiniert werden, durch Isotope markierte Komponenten von den kombinierten Proben eingefangen werden und die relativen Isotopenhäufigkeiten der differentiell markierten Proteine oder Peptide gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, welches die relativen Mengen von Membranproteinen in einer oder mehreren unterschiedlichen Proben bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 15, in welchem unterschiedliche Proben Proteine enthalten, die von unterschiedlichen Organellen oder unterschiedlichen subzellulären Fraktionen stammen.
Verfahren nach Anspruch 15, bei welchem unterschiedliche Proben Proteine oder Peptide repräsentieren, die in Reaktion auf unterschiedliche Umgebungs- oder Nährstoffbedingungen, unterschiedliche chemische oder physikalische Stimulanzien oder zu unterschiedlichen Zeiten exprimiert wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die absolute Proteinkonzentration durch Vergleich mit einer bekannten Menge eines mit Deuterium oder nicht mit Deuterium markierten Peptidstandards abgeleitet wird, wobei dieser Standard durch chemische Synthese abgeleitet wurde oder aus biologischen Proben isoliert wurde.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei mehrere Proben mit PRG markiert werden, welches unterschiedliche Anzahlen schwerer Atome enthält, so daß mehrere Proben gleichzeitig auf einem einzigen Gel getrennt und analysiert werden können.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei speziell interessierende Proteine, die bereits als besonders informativ bekannt sind, auf Basis ihrer Position auf einem 1D- oder 2D-Gel analysiert werden, wobei diese Proteine Krankheitsmarker ebenso wie Kontrollproteine enthalten können.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der posttranslationale Modifizierungsstatus spezieller Proteine durch Gelanalyse überwacht wird.