DE102008006610A1

DE102008006610A1 - Verfahren zum sensitiven Nachweis von Polyaminosäuren und anderen Makromolekülen

Info

Publication number: DE102008006610A1
Application number: DE102008006610A
Authority: DE
Inventors: Horst Hennig; Ralf Hoffmann; Jörg MARX; Frank Schumer; Johannes Zeiser; Thole ZÜCHNER
Original assignee: Xyntec Chemie Wolfen GmbH; Xyntec-Chemie Wolfen GmbH; Universitaet Leipzig
Current assignee: Sensient Imaging Technologies GmbH
Priority date: 2008-01-29
Filing date: 2008-01-29
Publication date: 2009-07-30
Also published as: WO2009095189A1; US20110111388A1; EP2279415A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines polyaminosäurehaltigen Analyten. Es ist die Aufgabe gestellt, Polyaminosäuren hochempfindlich nachzuweisen. Die Aufgabe wird gelöst, indem ein LM nach chemischer Aktivierung an ein Protein gekoppelt und mit einem Lanthanoidion komplexiert wird. Zur Detektion der Polyaminosäuren wird nach elektrophoretischer Trennung die zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung eingesetzt. Die Nachweisgrenze liegt bei 0,5 pg pro Spot (Rinderserumalbumin), wobei sich der lineare Bereich über 6 Größenordnungen erstreckt. Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf nukleinsäurehaltige Analyten.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten, der vorzugsweise Polyaminosäuren oder andere Makromoleküle enthält, durch Lumineszenzmarkierung in Gelen und auf festen Trägern unter Verwendung von Lanthanoidionen, wie z. B. Europium(III)-, Terbium(III)-, Samarium(III)-, Neodymium(III)- oder Dysprosium(III)-Komplexen.
Der Nachweis und die Analyse von Polyaminosäuren sind bei verschiedenen kommerziellen und wissenschaftlichen Anwendungen wichtig. Nachfolgend wird als Polyaminosäure jedes Homopolymer oder Heteropolymer von Aminosäuren, einschließlich Peptiden, Proteinen und Nukleinsäuren angesehen.
Polyaminosäuren werden typischerweise durch Gelelektrophorese, Lösungsquantifizierungsassays oder durch Nachweis auf festen Trägern wie beispielsweise Filtermembranen nachgewiesen und charakterisiert. Ein Beispiel für Filtermembranen sind Nitrocellulosemembranen oder Membranen aus Polyvinylidendifluorid (PVDF). Kleine Mengen von Polyaminosäuren sind allgemein für das bloße Auge nicht sichtbar und müssen markiert werden, bevor sie lokalisiert und identifiziert werden können.
Zwei der gängigsten Verfahren des Markierens von Polyaminosäuren in Gelen sind die Coomassie-Brilliantblau-Färbung (hiernach als CBB-Färbung bezeichnet) und Silberfärbung. Bei bestimmten Polyaminosäuren ist die Silberfärbung etwa 100 bis 1000 Mal empfindlicher als die CBB-Färbung, beiden sind jedoch einige Nachteile gemeinsam. Die CBB-Färbung und die Silberfärbung sind beide relativ unempfindliche Färbungen und besitzen nur einen engen Bereich einer linearen Quantifizierbarkeit für die densitometrische Auswertung. Außerdem lassen sich die markierten Gele nicht für weitergehende Analysen blotten.
Darüber hinaus bedürfen sowohl die CBB-Färbung als auch die Silberfärbung kolorimetrische Nachweisverfahren, d. h. Proteine werden durch Vorhandensein markierter bzw. opaker Banden in dem Elektrophoresegel nachgewiesen. Die Verwendung lumineszierender Reagenzien zum Nachweis von Proteinen bietet die Möglichkeit einer stark erhöhten Empfindlichkeit und eines größeren linearen Quantifizierungsbereichs, während sich gleichzeitig die Einfachheit der Anwendung des Markierungsreagens erhöht. Mit „lumineszierend" ist jedes Reagens gemeint, das luminesziert, d. h. phosphoresziert, fluoresziert, chemiluminesziert oder elektroluminesziert.
Fluoreszierende Reagenzien sind bereits zum Markieren von Polyaminosäuren verwendet worden, wie beispielsweise der Farbstoff Nilrot (9-Diethylamino -5H-benzo(alpha)phenoxazin-5-on) (dazu Daban et al., ANAL. BIOCHEM. 199, 169 (1991)). Weitere Beispiele häufig verwendeter fluoreszierender Reagenzien gehören zu der Familie der Cyaninfarbstoffe (auch Cy-Farbstoffe genannt) (dazu Ernst LA, Gupta RK, Mujumdar RB, Waggoner AS. Cyanine dye labeling reagents for sulfhydryl groups. Cytometry. 1989; 10(1): 3–10). Cyaninfarbstoffe sind unter Anderem auch als fluoreszierende Farbstoffe für Polyaminosäuren in Gelen, auf Membranen oder anderen Trägern verwendet worden. Während das Markieren mit niedermolekularen organischen Farbstoffen sehr schnell verläuft und relativ unempfindlich gegenüber der Zusammensetzung der Polyaminosäure ist und kein Entfärben erfordert, leiden organische Fluoreszenzfarbstoffe typischerweise an dem Nachteil hoher Hintergrundfärbung auf festen Trägern und Gelen und einem schnellen Ausbleichen bei Illumination.
Alle bekannten Markierungsverfahren für Polyaminosäuren in Gelen und auf festen Trägern haben allerdings eine relativ schlechte Nachweisgrenze im unteren Nanogramm- bis oberen Pikogrammbereich (ng bis pg). Dies gilt auch für die empfindlichsten der heute bekannten Markierungsverfahren für Polyaminosäuren, wie beispielsweise die Silbermarkierung, die Verwendung von Cyaninfarbstoffen und Andere (dazu Übersicht: Hirsch J, Hansen KC, Burlingame AL, Matthag MA. (2004) Proteomics: current techniques and potential applications to lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. Jul; 287(1): L1–23 AND Gade D, Thiermann J, Markowsky D, Rabus R (2003). Evaluation of two-dimensional difference gel electrophoresis for Protein profiling. J Mol Microbiol Biotechnol; 5(4): 240–51.)
Die linearen Bereiche der oben beschriebenen Farbstoffe erstrecken sich über drei bis vier Größenordnungen, wie in den angegebenen Veröffentlichungen beschrieben. Gleichzeitig können sich die Polyaminosäurekonzentrationen in einer biologischen Probe über bis zu 10 Größenordnungen erstrecken (Sellers TA and Yates JR. Review of proteomics with applications to genetic epidemiology. Genet Epidemiol 24: 83–98, 2003.). Es ist daher verständlich, dass ein Markierungsverfahren wünschenswert ist, das einen linearen Bereich von mehr als vier Größenordnungen aufweist.
Zu den Ausführungsformen gängiger Polyaminosäure-Nachweisverfahren gehören beispielsweise 2D-Gele, native und nicht-native 1D-Gele, isoelektrische Fokussierung, Dot-Blots, Slot-Blots, differentielle Gelelektrophorese, chromatographische Trenntechniken, Kapillarelektrophorese und andere. Die Schwierigkeiten bei diesen Techniken liegen im Nachweis kleiner Proteinmengen, bedingt durch Limitationen im dynamischen Bereich der Nachweisverfahren, und in der Identifizierung einer individuellen Polyaminosäure in einem komplexen Gemisch. Biomedizinische Proben, die typischerweise analysiert werden, umfassen beispielsweise Körperflüssigkeiten wie Plasma, Serum, Kortikospinalflüssigkeit, Blut und Andere sowie Gewebeproben verschiedener Art. Diese Arten von Proben sind komplexe Gemische von Polyaminosäuren mit Polyaminosäurekonzentrationen in einem dynamischen Bereich von bis zu 10 Größenordnungen (Sellers TA and Yates JR. Review of proteomics with applications to genetic epidemiology. Genet Epidemiol 24: 83–98, 2003). Die Expressions- und Modifikationsänderungen bei weniger häufigen Polyaminosäuren („Proteine mit geringer Kopienzahl", 10-1.000 Kopien je Zelle) sind möglicherweise die interessantesten. Ihre Visualisierung wird häufig von stark exprimierten Polyaminosäuren („dominante Proteine", 10.000 und mehr Kopien je Zelle) überdeckt (Blackstock WP and Weir MP. Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular Proteins. Trends Biotechnol 17: 121–127, 1999).
Die Erfindung hat das Ziel, die Nachteile der oben erwähnten Analyseverfahren zu überwinden. Die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens soll signifikant gesteigert werden
Die Erfindung hat die Aufgabe ein Verfahren anzugeben, individuelle Polyaminosäuren oder Gruppen von Polyaminosäuren sowie Nukleinsäuren spezifisch nachzuweisen. Es soll geprüft werden, inwieweit sich ein Lumineszenzmarker, der komplex gebundene Lanthanoidionen enthält, an andere Polyaminosäuren koppeln lässt, welche die nachzuweisenden Polyaminosäuren spezifisch erkennen (beispielsweise Antikörper), und inwieweit sich ein Lumineszenzmarker direkt an die nachzuweisenden Polyaminosäuren koppeln lässt.
Es soll weiterhin ein Markierungsverfahren angegeben werden, das einen linearen Bereich von mehr als vier Größenordnungen sowie eine hohe Lichtstabilität aufweist. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dem Hauptanspruch entsprechend gelöst.
Entscheidend ist die Verwendung einzelner ausgewählter Lanthanoid-Komplexe als Lumineszenzmarker (nachfolgend als LM bezeichnet).
Die hohe Emissionsintensität sowie die lange Lebensdauer der elektronischen Anregungszustände dieser Verbindungen eröffnen die Möglichkeit, diese Verbindungen in der zeitaufgelösten Fluorimetrie einzusetzen.
Die LM bestehen aus einer Licht einfangenden Einheit (Antenne), einem Chelat bildenden Gerüst, einer Funktionalität zum Koppeln an Polyaminosäuren sowie einem Lanthanoidzentralion (im folgenden als Ln(III) bezeichnet). Wie in WO 2005/108405 beschrieben ist es möglich, die unterschiedlichsten Kombinationen dieser Untereinheiten für die Synthese von LM zusammenzustellen. Sie bieten aufgrund ihrer chemischen Konstitution die Basis für eine Optimierung absorptionsspektroskopischer Eigenschaften durch Variieren der Antenne und der Emission durch Variation des Lanthanoidions.
Die allgemeine Formel lässt sich wie folgt wiedergeben:
mit
X Funktionalität zur Kopplung an ein Biomolekül
Y Funktionalität zur Kopplung an ein Biomolekül
Aus einer ungewöhnlich großen Anzahl möglicher Verbindungen sind die nachfolgend beschriebenen ausgewählt und für die Anwendung im vorliegend beanspruchten Analyseverfahren als geeignet erkannt worden.
Es sind nach langer Suche und vielen Experimenten verschiedene Heterocyclen aus der Gruppe der 2-(4'-Aminophenylethinyl)-1,10-phenanthroline, unterschiedlich substituiert, als geeignete Antennen für LM zum Nachweis von Polyaminosäuren gefunden worden. Aus dieser Gruppe ist mehr als eine geeignete Antenne erkannt worden, jedoch hat sich als besonders geeignet (6,9-Dicarboxymethyl-3-{(4[1,10]-phenanthrol-2-ylethinylphenylcarbamoyl)-methyl}-3,6,9-triaza)-undeca-1,11-dicarboxylsäure erwiesen, insbesondere für den Fall, dass als Lanthanoidion Eu(III) gewählt wird.
Diese Verbindung wird bevorzugt verwendet und als LM-Precursor 1 bezeichnet.
Diese Verbindung wird bevorzugt verwendet und als LM 1 bezeichnet.
Die Art der Ziel-Polyaminosäure wird von der Kopplungsfunktionalität gesteuert. Jedoch wird bei der Gelelektrophorese hauptsächlich Maleimid als kovalentes Sulfhydryl-Kopplungsreagens verwendet, weil sich in diesem Fall die Ladung der markierten Polyaminosäure nicht ändert.
Erfindungswesentlich ist das Vermessen der markierten Polyaminosäuren unter Anwendung zeitaufgelöster lumineszenzspektroskopischer Methoden.
Zeitaufgelöste Lumineszenzmessungen ermöglichen die Differenzierung zwischen Fluoreszenz und Phosphoreszenzeffekten. Bei der Phosphoreszenz handelt es sich um eine spezifische Art von Lumineszenz, die sich von der Fluoreszenz dadurch unterscheidet, dass sie von längerer Lebensdauer ist. Ein phosphoreszierendes Material emittiert nach Lichtabsorption zeitverzögert längerwellige Strahlung. Fluoreszierende Materialien emittieren nach Lichtanregung im Nanosekundenbereich, wohingegen phosphoreszierende Materialien die absorbierte Strahlung in Mikro- bis Millisekunden emittieren. Es ist daher möglich, die Phosphoreszenz separat zu messen, selbst, wenn das gemessene Material bzw. die gemessene Probe eine starke Fluoreszenz aufweisen. Dies erfolgt durch zeitverzögerte Messung nach Lichtanregung des zu messenden Materials bzw. der zu messenden Probe.
Die Erfindung betrifft die Phosphoreszenzemission von Polyaminosäuren in Gelen und auf festen Trägern mithilfe von LM, die Europium(III), Terbium(III), Samarium(III), Neodymium(III) oder Dysprosium(III) als Zentralionen enthalten.
Ein wesentlicher Aspekt der Erfindung ist eine neuartige Polyaminosäure-Nachweistechnik, die sich in der Handhabung von der herkömmlichen Markierungstechnik insofern unterscheidet, dass LM kovalent an den Analyten gebunden werden. Dabei wird der LM in einer bevorzugten Ausführungform der Erfindung kovalent mit Polyaminosäuren verknüpft. Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Europium(III)-, Terbium(III)-, Samarium(III)-, Neodymium(III)- oder Dysprosium(III)-Zentralionen zum Markieren von Polyaminosäuren durch zeitverzögerte Detektion mit signifikant höherer Empfindlichkeit als übliche, heute bekannte Färbeverfahren für Polyaminosäuren mit gleichzeitig einem grösseren linearen Signal zu Konzentrationsverhältnis und höherer Lichtstabilität.
Der Nachweis von Polyaminosäuren verlangt eine Möglichkeit, individuelle Polyaminosäuren oder Gruppen von Polyaminosäuren spezifisch nachzuweisen. Dieses Ziel lässt sich erreichen, indem der LM an andere Polyaminosäuren gekoppelt wird, welche die nachzuweisenden Polyaminosäuren spezifisch erkennen (beispielsweise Antikörper), oder indem der LM direkt an die nachzuweisenden Polyaminosäuren gekoppelt wird. Das Koppeln des LM an Polyaminosäuren erfolgt deshalb kovalent, um eine hohe Stabilität der LM-Analyt-Bindung unter Bedingungen zu gewährleisten, in denen folgende Parameter Veränderungen unterworfen sein können: Spannung, Temperatur, pH-Wert, Hydrophobizität, Enzymaktivitäten, elektromagnetische Strahlung, interferierende organische und anorganische Substanzen, Radioaktivität und andere.
Nachfolgend wird unter einer kovalenten Verknüpfung eine einzelne kovalente Bindung oder eine Kombination stabiler chemischer Bindungen, gegebenenfalls umfassend Einzel-, Doppel-, Dreifach- oder aromatische Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen sowie Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen, Stickstoff-Stickstoff-Bindungen, Schwefel-Stickstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen, Kohlenstoff-Schwefel-Bindungen, Phosphor-Sauerstoff-Bindungen und Phosphor-Stickstoff-Bindungen verstanden.
Geeignet für die kovalente Verknüpfung sind freie Amino-, Carboxylat- und Sulfhydrylgruppen von Polyaminosäuren. In einem ersten Schritt wird der LM-Precursor mit Hilfe einer der Kopplungsfunktionen X oder Y an die Polyaminosäure gebunden:
Der Markierungsprozess wird durch Zugabe der Lanthanoidsalzlösung zu dem Gemisch abgeschlossen. Die Bildung des entsprechenden Komplexes lässt sich durch Lumineszenz oder UV-Vis-Spektroskopie überwachen.
Die vorliegende Erfindung nutzt die oben beschriebenen LM zum Markieren eines Analyten, gefolgt vom Nachweis der Bindung des LM an den Analyten und gegebenenfalls seiner Quantifizierung bzw. einer anderen Analyse. Bei dem Analyten handelt es sich typischerweise um ein Biomolekül. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem Analyten um eine Polyaminosäure.
Der Analyt wird markiert, indem ein Probengemisch, von dem angenommen wird, dass es den Analyten enthält, mit zunächst Ln(III)-freiem LM (im folgenden als LM-Precursor bezeichnet) versetzt wird, so dass nach aliquoter Zugabe von Ln(III)-Ionen ein optischer Lumineszenzeffekt nach Lichtanregung beobachtet wird.
LM-Precursor
In einem Aspekt der Erfindung umfasst ein Schnellverfahren zum Nachweis eines Analyten folgende Schritte:

a) Markieren eines Probengemisches, von dem angenommen wird, dass es den Analyten enthält, zunächst mit LM-Precursor, und Zugeben eines aliquoten Anteils von Europium(III)-, Terbium(III)-, Samarium(III)-, Neodymium(III)- oder Dysprosium(III)-Ionen aufweist, um ein LM-markiertes Gemisch zu bilden, wobei jede Europium(III)-, Terbium(III)-, Samarium(III)-, Neodymium(III)- oder Dysprosium(III)-koordinierte LM unabhängig umfasst: i) ein Europium(III)-, Terbium(III)-, Samarium(III)-, Neodymium(III)- oder Dysprosium(III)-Ion, ii) mindestens einen Chelatliganden iii) mindestens einer Antenne und iv) eine Kopplungsfunktion zum kovalenten Koppeln des LM mit einer Polyaminosäure unter Anwendung der oben beschriebenen Bedingungen.
b) Inkubieren des Analyt-LM mit Europium(III)-, Terbium(III)-, Samarium(III)-, Neodymium(III)- oder Dysprosium(III)-Ionen, um vollständige Komplexbildung mit ausgewählten Ln(III)Ionen zu gewährleisten, so dass nach Lichtanregung markierte Analyten eine nachweisbare Lumineszenz auftritt, oder die direkte Verwendung des kovalent an Polyaminosäuren gekoppelten Lumineszenzmarkers in einem Polyaminosäure-Analyseverfahren, das bei Lichtanregung eine nachweisbare Lumineszenz zeigt;
c) Lichtanregung des Komplexes aus LM/Polyaminosäure und
d) Nachweis der Lumineszenz mittels zeitaufgelöster spektroskopischer Verfahren.

Weitere Schritte werden gegebenenfalls und unabhängig in beliebiger Kombination vor, nach oder gleichzeitig mit der Markierung verwendet, um für eine Trennung oder Reinigung des Analyten zu sorgen, um den Nachweis des Analyten zu verstärken, zur Quantifizierung des Analyten, zur Identifizierung eines spezifischen Analyten oder einer Gruppe von Analyten, beispielsweise durch Verwendung eines immunologischen Reagens wie beispielsweise eines Antikörpers, eines Aptamers oder eines Lektins.
In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Analyten um ein Biomolekül. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Analyten um eine Polyaminosäure. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Analyten um eine Polyaminosäure, die posttranslationale Modifikationen aufweist. Posttranslationale Modifikationen sind als chemische Modifikationen einer Polyaminosäure nach ihrem natürlicherweise stattfindenden Translationsprozess definiert. Beispiele für posttranslationale Modifikationen umfassen Phosphorylierung, Ubiquitierung, Methylierung, Glykosylierung, Glykierung, SUMOylierung, Acylierung, Alkylierung, Methylierung, Amidie rung, Biotinylierung, Formylierung, Carboxylierung, Glutamylierung, Glykylierung, Hydroxylierung, Isoprenylierung, Lipoylierung, Myristoylierung, Farnesylierung, Geranylgeranylierung, ADP-Ribosylierung, Oxidation, Pegylierung, Phosphopantetheinylierung, Pyroglutamatbildung, Sulfation, Selenoylierung, ISGylierung und andere.
In einer anderen Ausführungsform ist der Analyt eine Polyaminosäure, die chemisch modifiziert wurde, was zu einer Polyaminosäuremodifikation führt, die natürlicherweise nicht vorkommt. Beispiele für chemische Modifikationen, die zu einer Polyaminosäuremodifikation führen, die nicht natürlicherweise vorkommt, sind in der ABRF(Association of biomolecular resource facilities)-Datenbank unter www.abrf.org,) aufgeführt, diese sind aber nicht auf die gegebenen Beispiele beschränkt.
In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Analyten um ein Biomolekül, das mindestens eine Nukleinsäure aufweist.
Vorzugsweise ist der Analyt ein Polymer, das eine Polyaminosäure ist.
Typischerweise wird die vorliegende Erfindung verwendet, um den gewünschten Analyten nachzuweisen, indem ein Probengemisch, von dem angenommen wird, dass es den Analyten enthält, mit einem Markierungsstoffgemisch kombiniert wird, der mit mindestens einem der erfindungsgemäßen LM kombiniert wird.
Im Regelfall ist es erforderlich, eines der genannten Ln(III)-Ionen mit dem LM-Precursor zu kombinieren, um eine nachweisbare Lumineszenz zu erhalten. Die Komplexbildung des LM-Precursors mit den Ln(III)-Ionen kann stattfinden, vor der Kopplung an Polyaminosäuren, DNA, RNA oder PNA, aber auch nach der Kopplung des LM-Precursors an die Polyaminosäuren, DNA, RNA oder PNA mit anschließender Ln(III)-Ionen-Inkubation stattfinden.
Darüber hinaus kann die Inkubation des LM mit Europium(III), Terbium(III), Samarium(III) Neodymium(III) oder Dysprosium(III), gekoppelt oder nicht gekoppelt, zu folgenden Zeitpunkten der Analyse stattfinden:

– bevor oder nachdem eine Trenntechnik zur Analyse einer relevanten Probe angewandt wird;
– zu einem beliebigen Zeitpunkt bei der Analyse einer Probe auf einer festen oder halbfesten Matrix. Die Inkubation mit den oben erwähnten Lanthanoidionen kann auch zu mehr als einem Zeitpunkt stattfinden, um das Signal, das durch die optische Reaktion bei Beleuchtung erhalten wird, zu verstärken.

Nach der LM-Markierung des Analyten wird das Probengemisch in den oben erwähnten Anwendungen mit einer geeigneten Anregungswellenlänge bestrahlt, um ein nachweisbares Lumineszenzsignal zu erhalten. In einem Szenario liegt diese Wellenlänge im Bereich von 280 nm bis 400 nm. In einem anderen Szenario liegt diese Wellenlänge im Bereich von 350 nm bis 370 nm. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dieser Wellenlänge um 360 nm.
Nach Lichtanregung des Probengemisches wird das Lumineszenzsignal bei mindestens einer geeigneten Emissionswellenlänge beobachtet. In einem Szenario liegt diese Wellenlänge im Bereich von 280 nm bis 800 nm. In einem anderen Szenario liegt diese Wellenlänge im Bereich von 500 nm bis 700 nm. In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung handelt es sich bei diesen Wellenlängen um 595 nm und 616 nm.
Die Angaben werden durch die Abbildungen illustriert.
Die erfindungsgemäße Lösung wird mit einem Testkit realisiert, der wie nachfolgend beschrieben zusammengesetzt ist.
Allgemeine Beschreibung eines Testkits Bestandteile des Testkits sind:

– eine Lösung die Europium(III)-, Terbium(III)-, Samarium(III)-, Neodymium(III)- oder Dysprosium(III)-Ionen bestimmter Konzentration
– eine Lösung oder ein Pulver einer oder mehrerer Polyaminosäuren die mit dem LM-Precursor chemisch gekoppelt ist, wie unter Punkt 3.1 beschrieben,
– optional ein oder mehrere Lösungen die für das Lösen einer Polyaminosäure in Pulverform nötig ist,
– eine PVDF- oder Nitrocellulosemembran,
– erpackungsmaterialien und geeignete Gefässe zur Lieferung und Anwendung des Kits.

Beispielhafte Beschreibung eines Testkits
In einem konkreten Fall enthält der Testkit folgende Komponenten:

– 100 μl einer 10 μM Europium(III)chlorid Lösung,
– 1 mg eines lyophilisierten, mit LM-Precursor markierten Ziege-anti-Maus IgG Antikörpers,
– 100 μl PBS Lösung,
– eine PVDF Membran der Grösse 30 × 50cm.

Zur Anwendung des Testkits sind folgende Schritte notwendig:

a) Lösen des lyophilisierten Antikörpers in 100 μl PBS, vortexen
b) Western Blot eines 1D- oder 2D-Gels auf die mitgelieferte PVDF Membran wie in der Literatur beschrieben (siehe z. B. http://www.westernblotting.org/protocols%20western%20blot.htm)
c) Blockieren der Membran mit z. B. Milchpulver, Waschschritte, Inkubation der Membran mit primärem Antikörper nach Wunsch, Waschschritte wie in der Literatur beschrieben, z. B. http://www.westernblotting.org/protocols%20western%20blot.htm)
d) Mix des lyophilisierten Antikörpers aus Schritt a) mit mitgelieferter Europium(III)chloridlösung: 1 μl Antikörper plus 1 μl Europium(III)chloridlösung pro 2 ml TBS-T (Tris buffered saline-Tween 20) Inkubation mit Western Blot für 1 Stunde, drei mal Waschen mit TBS-T.
e) Messung der PVDF Membran bei 616 nm Emissionswellenlänge und 360 nm Excitationswellenlänge.

Technische und ökonomische Vorteile der Erfindung
Es werden ausgewählte LM eingesetzt, die nach chemischer Aktivierung an Proteine gekoppelt und mit Europiumionen komplexiert werden. Nach Anregung im UV-Bereich wird die eingestrahlte Energie auf das komplexierte Europiumion übertragen. Die Lumineszenz des komplexierten Europiumions wird gemessen. Da die Phosphoreszenz dieser Europiumverbindungen deutlich langsamer abklingt als die Hintergrundfluoreszenz der Membran, können die mit den neuen LM markierten Proteine sehr sensitiv mittels zeitaufgelöster spektroskopischer Verfahren auf der Membran detektiert werden. Der Komplex ist während der elektrophoretischen Trennung stabil und die Proteine können danach sowohl im Gel als auch auf der Blotmembran mit etwa gleicher Empfindlichkeit detektiert werden. Die Nachweisgrenzen liegen bei 0,3 ng pro Bande (Rinderserumalbumin). Bei dem direkten Spotten der markierten Proteine auf eine Membran liegt die Nachweisgrenze bei 0,5 pg pro Spot (Rinderserumalbumin). Der lineare Bereich erstreckt sich über 6 Größenordnungen. Die Vorteile der Detektionsmethode sind offensichtlich, besonders im Fall der Verwendung von Membranen. Damit ist auch die gleichzeitige Detektion aller Proteine auf einer Membran und einzelner Proteine mittels Antikörper mit vergleichbarer Empfindlichkeit möglich. Dies konnte mit den bisher bekannten Färbetechniken nicht erreicht werden. Nunmehr kann zum Beispiel das vom Antikörper erkannte Protein relativ zur jeweiligen Bande quantifiziert werden. Damit sind auch Aussagen über Fremdproteine in der Bande oder posttranslationale Modifikationen quantifizierbar. Weitere Vorteile liegen in dem weiten linearen Signal zu Konzentrationsbereich über sechs Grössenordnungen sowie in der hohen Lichtstabilität.
Legenden zu den Abbildungen
Legende zu 4.1
Signalintensitäten von BSA (bovines Serumalbumin) einfach markiert mit LM 1. Die Proben wurden auf eine PVDF Membran gespottet und vermessen. (Emission 616 nm, Excitation 360 nm). Gezeigt sind die Ergebnisse von 6 unabhängigen Messungen verglichen mit dem Hintergrund der Membran. Die Konzentrationen von BSA sind logarithmisch aufgetragen und decken einen Bereich von 100.000 bis 5 pg ab.
Legende zu 4.2
Gezeigt sind die Signalverhältnisse vor/nach Elektroblot von an BSA gekoppeltem LM 1. Hierzu wurde BSA mit LM-Precursor 1 markiert und auf eine PVDF Membran im Dot Blot Verfahren aufgetragen, die resultierenden Signale gemessen und anschliessend diese Membran im Elektroblotverfahren für 15 min bei 25 V (Semi-dry blot) belassen. Danach erfolge eine erneute Vermessung der Signale. Die Verhältnisse unterscheiden sich nicht signifikant von eins, somit ist keine Abschwächung durch Elektroblot zu beobachten. BSA = bovines Serumalbumin
Legende zu 4.3

a) Signalintensität von LM 1 Peptid nach isoelektrischer Fokussierung (IEF). Inkubation des LM-Precursor 1 mit Europium(III) vor der IEF. Stoffmengen des eingesetzten Peptids zwischen 1000 und 10 ng. IEF-Streifen: 7 cm, pH 3–10, linear.

IEF-Bedingungen:

1) in 15 min auf 250 V
2) in 10 h auf 4.000 V (schneller Anstieg)
3) ca. 4 h auf 500 V

Anschliessende Messung des Streifens bei 616 nm Emission, 360 nm Excitation. Es zeigt sich, dass das Europium(III) vom LM komplexiert bleibt und ein Signal abhängig von der eingesetzten Konzentration detektiert werden kann.
Legende zu 4.4
Durchschnittliche Signalintensitäten von BSA (bovines Serumalbumin) einfach markiert mit LM 1. Die Proben wurden auf PVDF Membran gespottet und vermessen. (Emission 616 nm, Excitation 360 nm). Gezeigt sind die gemittelten Ergebnisse von 6 unabhängigen Messungen. Die Konzentrationen von BSA sind logarithmisch aufgetragen und decken einen Bereich von 100.000 bis 5 pg ab. Eine Linearität des Signals über sechs Grössenordnungen ist damit gegeben.
Legende zu 4.5
LM 1-stabilität nach verschiedenen Denaturierungsmethoden nach ein bzw. zwei Stunden verglichen mit unbehandelter Probe (Std.). RT = Raumtemperatur, ME = Mercaptoethanol, Std.
Legende zu 4.6
ESI-TOF-Massenspektrum von unmarkiertem BSA (bovines Serumalbumin)
Legende zu 4.7
Ausschnitt aus 4.6
Legende zu 4.8
ESI-TOF-Massenspektrum von BSA (bovines Serumalbumin) mit LM-Precursor 1 markiert
Legende zu 4.9
Ausschnitt aus 4.8 Masse des Maleimid-aktivierten gekoppelten LM-Precursor 1: 793 Da

A: 66468 Da (Ladung: 55+);
B: 66627 Da (Ladung: 55+);
A+1: 67231 Da (Ladung 56+); entspricht (A) + der LM-masse-31 Da
B+1: 67393 Da (Ladung 56+); entspricht (A) + der LM-masse-30 Da
A+2: 68022 Da (Ladung 56+); entspricht (A+1) + der LM-masse-1
B+2: 68185 Da (Ladung 56+); entspricht (B+1) + der LM-masse+1

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- WO 2005/108405 [0015]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- dazu Daban et al., ANAL. BIOCHEM. 199, 169 (1991) [0006]
- dazu Ernst LA, Gupta RK, Mujumdar RB, Waggoner AS. Cyanine dye labeling reagents for sulfhydryl groups. Cytometry. 1989; 10(1): 3–10 [0006]
- Hirsch J, Hansen KC, Burlingame AL, Matthag MA. (2004) Proteomics: current techniques and potential applications to lung disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. Jul; 287(1): L1–23 [0007]
- Gade D, Thiermann J, Markowsky D, Rabus R (2003). Evaluation of two-dimensional difference gel electrophoresis for Protein profiling. J Mol Microbiol Biotechnol; 5(4): 240–51. [0007]
- Sellers TA and Yates JR. Review of proteomics with applications to genetic epidemiology. Genet Epidemiol 24: 83–98, 2003. [0008]
- Sellers TA and Yates JR. Review of proteomics with applications to genetic epidemiology. Genet Epidemiol 24: 83–98, 2003 [0009]
- Blackstock WP and Weir MP. Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular Proteins. Trends Biotechnol 17: 121–127, 1999 [0009]
- www.abrf.org, [0034]
- http://www.westernblotting.org/protocols%20western%20blot.htm [0046]
- http://www.westernblotting.org/protocols%20western%20blot.htm [0046]

Claims

Verfahren zum sensitiven Nachweis von Polyaminosäuren und anderen Makromolekülen, bei dem es sich um ein Polymer oder Makromolekül handelt, das mindestens eine Thiolgruppe oder mindestens eine primäre oder sekundäre Aminogruppe enthält, oder um ein Polymer oder Makromolekül, das chemisch modifiziert werden kann, um mindestens eine Thiolgruppe oder mindestens eine primäre oder sekundäre Aminogruppe zu enthalten, das folgende Schritte umfasst: a) Versetzen eines Probengemisches, von dem angenommen wird, dass es den Analyten enthält, mit einem Antennenchelatliganden, nachfolgend als LM-Precursor bezeichnet, der in der Lage ist, Lanthanoid(III)-Ionen zu komplexieren, insbesondere Europium(III), Terbium(III), Samarium(III), Neodymium(III) oder Dysprosium(III), der chemisch aktiviert ist, um die Thiolgruppe, die primäre Amino- oder die sekundären Aminogruppen des Polymers oder des Makromoleküls kovalent zu binden, wobei der Antennenchelatligand eine derivatisierte Polyaminopolycarbonsäure ist, und mit einem Aktivator A, der eine chemische Gruppe ist, die mit Thiolgruppen reagiert oder alternativ mit einem Aktivator B, der eine chemische Gruppe darstellt, die mit primären oder sekundären Aminogruppen reagiert, b) Inkubieren des kombinierten Gemisches für eine Zeit, die ausreichend ist für den mit Aktivator A aktivierten Präfluorophor, um mit den Thiolgruppen zu reagieren, oder alternativ mit dem mit Aktivator B aktivierten Präfluorophor, um mit den primären Amino- oder sekundären Aminosäuren zu reagieren, in dem Färbegemisch, um das Makromolekül oder das Polymer zu derivatisieren; c) Inkubieren des mit dem LM-Precursor markierten, kombinierten Gemisches für eine ausreichende Zeit mit Lanthanoid(III)-Ionen, insbesondere Europium(III)-, Terbium(III)-, Samarium(III)-, Neodymium(III)- oder Dysprosium(III)-Ionen, um einen stabilen Komplex mit dem Analyten zu bilden, der mindestens einen LM-Precursor trägt, komplexiert mit Lanthanoid(III)-Ionen, der bei Lichtanregung eine nachweisbare Lumineszenzemission ergibt; d) Trennung oder teilweise Trennung des Analytgemisches, damit eine Analyse der Einzelverbindungen durch Ausfällung, Extraktion, Festphasenextraktion, Immunfärbetechniken einschließlich Immunoassays wie ELISA, Dialyse, Zentrifugation, Chromatographie, Elektrophorese, Massenspektrometrie, Ionenmobilität, Interaktion zwischen dem Analyten und anderen Molekülen, insbesondere Makromolekülen wie beispielsweise Proteine, DNA, RNA, Antikörper, Aptamere und Phagen möglich wird, während nach dem Trennen die Analyten direkt analysiert werden können oder zunächst in ein anderes Lösungsmittel übertragen werden, wozu sich Elektroelution anbietet oder an eine Fläche adsorbiert werden, was gemeinhin als Blotting bezeichnet wird e) Lichtanregung des kovalenten Analyt-LM-Komplexes; und f) Nachweis der Lumineszenzreaktion mittels zeitaufgelöster spektroskopischer Methoden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Analyten um eine Polyaminosäure, ein Peptid, Peptidomimetika, eine Peptidnukleinsäure PNA oder ein Protein handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Analyten um eine Polynukleinsäure, eine einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA, RNA oder ein Oligonukleotid mit mindestens einer Thiolgruppe und/oder primären und/oder sekundären Aminogruppe handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, welches des Weiteren das Quantifizieren des Analyten durch zeitaufgelöste Messung der nachweisbaren Lumineszenz reaktion und Vergleichen des Messwertes mit einem Standard umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei sich der Analyt auf oder in einer festen oder halbfesten Matrix befindet.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei der Matrix um ein Elektrophoresegel oder eine proteinbindende Membran handelt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, welches des Weiteren die elektrophoretische Trennung des Probengemisches, bevor, während oder danach es mit dem Färbegemisch kombiniert wird, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die elektrophoretische Trennung, der Bestrahlungsschritt oder der Beobachtungsschritt mittels automatischer Verfahren erfolgen.
Verfahren nach Anspruch 2, welches des Weiteren das Analysieren der Polyaminosäure, des Peptids, der Peptidomimetika, der Peptidnukleinsäure PNA oder des Proteins durch Massenspektrometrie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, welches des Weiteren das Analysieren der Polyaminosäure, des Peptids oder des Protein durch Edman-Sequenzierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, welches des Weiteren das Analysieren der Polynukleinsäure, einer einzelsträngigen DNA, einer doppelsträngigen DNA, RNA, PNA oder eines Oligonukleotids durch Massenspektrometrie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, welches des Weiteren das Analysieren der Polynukleinsäure, einer einzelsträngigen DNA, einer doppelsträngigen DNA, RNA, PNA oder eines Oligonukleotids durch Sequenzanalyse umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, welches des Weiteren das Zugeben eines weiteren Reagens zu dem Probengemisch, dem LM-Precursor und den entsprechenden Ln(III)-Ionen oder dem kombinierten Gemisch umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, welches des Weiteren den Nachweis einer bestimmten Polyaminosäure, eines bestimmten Peptids oder Proteins oder eine Klasse einer Polyaminosäure, eines Peptids, von Peptidomimetika, PNA oder einem Protein mit einem monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörper oder einem Antikörperfragment, einem Aptamer oder Phagen umfasst, welche vorzugsweise zuvor nach Anspruch 1 markiert wurden.
Verfahren nach Anspruch 14 zur Quantifizierung des/der Analyten bestehend aus Polyaminosäure, Peptid, Peptidomimetika, PNA oder Protein, relativ zu dem monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Aptamer oder einem Phagen, welche den Analyten erkennen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei mindestens zwei Polyaminosäure-, Peptid- oder Proteingemische mit verschiedenen LM markiert worden sind, was einen parallelen und unabhängigen Nachweis aller Analyten in derselben Lösung, demselben Volumen oder auf derselben Fläche erlaubt, um die in jedem Gemisch vorhandenen Analyten relativ zu den in einem anderen Gemisch vorhandenen Analyten zu quantifizieren.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Proteine elektrophoretisch getrennt wurden, um in jedem der Gemische, die einen anderen LM enthalten, ein bestimmtes Protein zu quantifizieren.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Polyaminosäuren, Proteine, Peptidomimetika, PNA oder Peptide auf eine Membran übertragen worden sind.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei bestimmte Proteine zusätzlich mit einem monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Aptamer oder einem Phagen markiert werden, welche zuvor nach Anspruch 1 markiert worden sind.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei bestimmte Proteine zusätzlich mit einem monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Aptamer oder einem Phagen markiert werden, welche zuvor nach Anspruch 1 markiert worden sind.
Verfahren nach Anspruch 3, welches des Weiteren den Nachweis einer Polynukleinsäure, einer einzelsträngigen DNA, einer doppelsträngigen DNA, RNA, PNA oder eines Oligonukleotids mit einem monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Aptamer oder einem Phagen oder einem beliebigen anderen Protein oder Oligonukleotid, einer Polynukleinsäure, einer einzelsträngigen DNA, einer doppelsträngigen DNA, RNA oder PNA umfasst, die hybridisieren können und welche vorzugsweise zuvor nach Anspruch 1 markiert worden sind.
Verfahren nach Anspruch 14 zur Quantifizierung des/der Analyten bestehend aus RNA oder, relativ zu der eingesetzen DNA-Sonde den Analyten erkennen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei mindestens zwei DNA- oder RNA gemische mit verschiedenen LM markiert worden sind, was einen parallelen und unabhängigen Nachweis aller Analyten in derselben Lösung, demselben Volumen oder auf derselben Fläche erlaubt, um die in jedem Gemisch vorhandenen Analyten relativ zu den in einem anderen Gemisch vorhandenen Analyten zu quantifizieren.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die DNA oder RNA elektrophoretisch getrennt wurden, um in jedem der Gemische, die einen anderen LM enthalten, ein bestimmtes DNA oder RNA zu quantifizieren.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei bestimmte DNA- oder RNA zusätzlich mit DNA- oder RNA-Sonde markiert werden, welche zuvor nach Anspruch 1 markiert worden sind.
Verwendung von Derivaten des 2-(4'-Aminophenylethinyl)-1,10-phenanthrolins als Lumineszenzmarker zur Bestimmung von Biomolekülen durch zeitaufgelöste Lumineszenzspektroskopie.
Verwendung von Derivaten des 2-(4'-Aminophenylethinyl)-1,10-phenanthrolins nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass (6,9-Dicarboxymethyl-3-{(4[1,10]-phenanthrol-2-ylethinylphenylcarbamoyl)-methyl}-3,6,9-triaza)-undeca-1,11-dicarboxylsäure, als LM-Precursor 1 bezeichnet, eingesetzt wird.
Testkit zum Durchführen des Verfahrens nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er die folgenden Bestandteile enthält a) eine wässrige Lösung eines dreiwertigen Lanthanoidions b) eine oder mehrere Polyaminosäuren, die mit einem LM aus der Gruppe der der 2-(4'-Aminophenylethinyl)-1,10-phenanthroline, unterschiedlich substituiert als Lumineszenzmarker chemisch gekoppelt ist c) eine oder mehrere Lösungen, die für das Lösen einer Polyaminosäure nötig sind d) eine PVDF- oder Nitrocellulosemembran e) an sich bekannte Hilfs- und Packungsmittel.
Testkit nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass er die folgenden Bestandteile konfektioniert und in beliebiger Anzahl enthält – 100 μl einer 10 μM Eu(III)chloridlösung – 1 mg eines lyophylisierten lumineszenzmarkierten Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörpers, wobei als LM Precursor 1 6,9-Dicarboxymethyl-3-{(4[1,10]-phenanthrol-2-ylethinylphenylcarbamoyl)-methyl}-3,6,9-triaza)-undeca-1,11-dicarboxylsäure eingesetzt ist – 100 μl PBS-Lösung – eine PVDF-Membran der Grösse 30 × 50 cm.