ES2612755T3 - Antagonistas de receptor y ligando de ALK1 y usos de los mismos - Google Patents
Antagonistas de receptor y ligando de ALK1 y usos de los mismos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2612755T3 ES2612755T3 ES07861684.4T ES07861684T ES2612755T3 ES 2612755 T3 ES2612755 T3 ES 2612755T3 ES 07861684 T ES07861684 T ES 07861684T ES 2612755 T3 ES2612755 T3 ES 2612755T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- alk1
- polypeptide
- angiogenesis
- amino acid
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101100490437 Mus musculus Acvrl1 gene Proteins 0.000 title description 158
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title description 36
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 119
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 117
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 116
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims abstract description 61
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 42
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 31
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 claims abstract description 6
- 101001023968 Homo sapiens Growth/differentiation factor 7 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102100035363 Growth/differentiation factor 7 Human genes 0.000 claims abstract 4
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 claims abstract 3
- 101001023988 Homo sapiens Growth/differentiation factor 5 Proteins 0.000 claims description 17
- 102100035379 Growth/differentiation factor 5 Human genes 0.000 claims description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 claims description 5
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 101000893585 Homo sapiens Growth/differentiation factor 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100040892 Growth/differentiation factor 2 Human genes 0.000 claims 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 47
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 41
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 41
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 41
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 36
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 31
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 27
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 23
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 21
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 19
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 18
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 18
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 17
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 16
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 16
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 15
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 15
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 15
- 101000695367 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 10 Proteins 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 13
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- 102100028726 Bone morphogenetic protein 10 Human genes 0.000 description 12
- -1 polyoxyethylene moiety Polymers 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 11
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 11
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 101001023964 Homo sapiens Growth/differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 10
- 101000799194 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase receptor R3 Proteins 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 102100035368 Growth/differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 8
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 8
- 102000047644 human ACVRL1 Human genes 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 8
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 8
- WLCZTRVUXYALDD-IBGZPJMESA-N 7-[[(2s)-2,6-bis(2-methoxyethoxycarbonylamino)hexanoyl]amino]heptoxy-methylphosphinic acid Chemical compound COCCOC(=O)NCCCC[C@H](NC(=O)OCCOC)C(=O)NCCCCCCCOP(C)(O)=O WLCZTRVUXYALDD-IBGZPJMESA-N 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 7
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 7
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 7
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 6
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 5
- 102100025744 Mothers against decapentaplegic homolog 1 Human genes 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 101700032040 SMAD1 Proteins 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 5
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- OVHQWOXKMOVDJP-UHFFFAOYSA-N melitin Chemical compound OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(O)C(OC=2C=C3C(C(C(OC4C(C(O)C(O)C(COC5C(C(O)C(O)C(CO)O5)O)O4)O)=C(C=4C=CC(O)=CC=4)O3)=O)=C(O)C=2)OC(C)C1O OVHQWOXKMOVDJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 5
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 5
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 5
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101000602237 Homo sapiens Neuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1 Proteins 0.000 description 4
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 4
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 4
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 4
- 102100034136 Serine/threonine-protein kinase receptor R3 Human genes 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 4
- 229960003407 pegaptanib Drugs 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 208000022211 Arteriovenous Malformations Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 102100023715 Poly(A)-specific ribonuclease PARN Human genes 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 3
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 description 3
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 3
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 3
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 230000005744 arteriovenous malformation Effects 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 3
- 206010023332 keratitis Diseases 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 229940092110 macugen Drugs 0.000 description 3
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 3
- 208000009056 telangiectasis Diseases 0.000 description 3
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 3
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 3
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 3
- LUHMPVSHFZVNQX-UHFFFAOYSA-N 2-(8-hydroxy-6-methoxy-1-oxoisochromen-3-yl)propanoic acid;isochromen-1-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)OC=CC2=C1.C1=C(C(C)C(O)=O)OC(=O)C=2C1=CC(OC)=CC=2O LUHMPVSHFZVNQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007173 Abies balsamea Nutrition 0.000 description 2
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 2
- 239000004857 Balsam Substances 0.000 description 2
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 2
- 206010061728 Bone lesion Diseases 0.000 description 2
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 102100031162 Collagen alpha-1(XVIII) chain Human genes 0.000 description 2
- 206010011017 Corneal graft rejection Diseases 0.000 description 2
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 244000018716 Impatiens biflora Species 0.000 description 2
- 102100026818 Inhibin beta E chain Human genes 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 description 2
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 102100030610 Mothers against decapentaplegic homolog 5 Human genes 0.000 description 2
- 101710143113 Mothers against decapentaplegic homolog 5 Proteins 0.000 description 2
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710082813 Serine/threonine-protein kinase receptor R3 Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010043189 Telangiectasia Diseases 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- JMNXSNUXDHHTKQ-QVMSTPCGSA-N [(3r,6r)-6-[(3s,5r,7r,8r,9s,10s,13r,14s,17r)-3-[3-(4-aminobutylamino)propylamino]-7-hydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylheptan-3-yl] hydrogen sulfate;(2s)-2-hydroxypropanoic ac Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O.C([C@@H]1C[C@H]2O)[C@@H](NCCCNCCCCN)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@H](C)CC[C@H](C(C)C)OS(O)(=O)=O)[C@@]2(C)CC1 JMNXSNUXDHHTKQ-QVMSTPCGSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 2
- 229940120638 avastin Drugs 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 2
- 230000004777 loss-of-function mutation Effects 0.000 description 2
- 229940076783 lucentis Drugs 0.000 description 2
- 210000004924 lung microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 2
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N triamcinolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@@]3(F)[C@@H](O)C[C@](C)([C@@]([C@H](O)C4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N 0.000 description 2
- 229960005294 triamcinolone Drugs 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 206010000050 Abdominal adhesions Diseases 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000018918 Activin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010052946 Activin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010001257 Adenoviral conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000031104 Arterial Occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000008720 Bone Marrow Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 1
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000009043 Chemical Burns Diseases 0.000 description 1
- 208000002691 Choroiditis Diseases 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000019878 Eales disease Diseases 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 101150050927 Fcgrt gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N Glu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 108010090290 Growth Differentiation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000037280 Growth Differentiation Factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100040898 Growth/differentiation factor 11 Human genes 0.000 description 1
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 101150105462 HIS6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 201000002563 Histoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000893545 Homo sapiens Growth/differentiation factor 11 Proteins 0.000 description 1
- 101000886562 Homo sapiens Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000712669 Homo sapiens TGF-beta receptor type-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010051151 Hyperviscosity syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000002260 Keloid Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 206010025412 Macular dystrophy congenital Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000024599 Mooren ulcer Diseases 0.000 description 1
- 101100175321 Mus musculus Gdf6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100175325 Mus musculus Gdf7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 206010062207 Mycobacterial infection Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100395023 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000010191 Osteitis Deformans Diseases 0.000 description 1
- 208000003076 Osteolysis Diseases 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000027868 Paget disease Diseases 0.000 description 1
- 208000004788 Pars Planitis Diseases 0.000 description 1
- 208000034038 Pathologic Neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 208000003971 Posterior uveitis Diseases 0.000 description 1
- 208000002158 Proliferative Vitreoretinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010037075 Protozoal infections Diseases 0.000 description 1
- 201000002154 Pterygium Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010038910 Retinitis Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010038934 Retinopathy proliferative Diseases 0.000 description 1
- 241000724205 Rice stripe tenuivirus Species 0.000 description 1
- 206010039705 Scleritis Diseases 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100033455 TGF-beta receptor type-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010064996 Ulcerative keratitis Diseases 0.000 description 1
- 206010058990 Venous occlusion Diseases 0.000 description 1
- 208000010011 Vitamin A Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010047663 Vitritis Diseases 0.000 description 1
- 208000013058 Weber syndrome Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940031955 anhydrous lanolin Drugs 0.000 description 1
- 210000002159 anterior chamber Anatomy 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000021328 arterial occlusion Diseases 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 201000006491 bone marrow cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 1
- 201000007293 brain stem infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002742 combinatorial mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000001609 comparable effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003511 ectopic pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 230000000437 effect on angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 208000021373 epidemic keratoconjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001497 fibrovascular Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 208000030304 gastrointestinal bleeding Diseases 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002873 global sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 102000045556 human ALK1-Fc fusion Human genes 0.000 description 1
- 108700014293 human ALK1-Fc fusion Proteins 0.000 description 1
- 102000052974 human BMP10 Human genes 0.000 description 1
- 102000046041 human GDF2 Human genes 0.000 description 1
- 102000046039 human GDF5 Human genes 0.000 description 1
- 102000053737 human GDF6 Human genes 0.000 description 1
- 102000048885 human GDF7 Human genes 0.000 description 1
- 102000050435 human NBL1 Human genes 0.000 description 1
- 208000013653 hyalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000554 iris Anatomy 0.000 description 1
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 1
- 210000005067 joint tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001117 keloid Anatomy 0.000 description 1
- 201000010666 keratoconjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 230000035984 keratolysis Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000002197 limbic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000000938 luteal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000029791 lytic metastatic bone lesion Diseases 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 208000027202 mammary Paget disease Diseases 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000006510 metastatic growth Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000010603 microCT Methods 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 208000001491 myopia Diseases 0.000 description 1
- 230000004379 myopia Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 208000021971 neovascular inflammatory vitreoretinopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000003883 ointment base Substances 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001599 osteoclastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000028742 placenta development Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000006785 proliferative vitreoretinopathy Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 201000004700 rosacea Diseases 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 201000006476 shipyard eye Diseases 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 229960003433 thalidomide Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000006685 tubal pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 201000007790 vitelliform macular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
Abstract
Una proteína de fusión ALK1-Fc que comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que es al menos 97% idéntica a la secuencia de aminoácidos 22-118 de la SEC ID Nº 1, en la que la proteína de fusión ALK1-Fc inhibe la angiogénesis estimulada por VEGF, FGF y GDF7, para uso en: (a) inhibición de angiogénesis en un mamífero o (b) tratamiento de artritis reumatoide en un mamífero.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Antagonistas de receptor y ligando de ALK1 y usos de los mismos Antecedentes
La angiogenesis, el procedimiento de formacion de nuevos vasos sangufneos, es crftica en muchos estados fisiologicos normales y anormales. En condiciones fisiologicas normales, los seres humanos y los animales experimentan angiogenesis en situaciones especfficas y restringidas. Por ejemplo, la angiogenesis se observa normalmente en la curacion de heridas, desarrollo fetal y embrionario y formacion del cuerpo luteo, endometrio y placenta.
La angiogenesis no deseable o regulada de manera inapropiada tiene lugar en muchos trastornos, en los que el crecimiento endotelial anormal puede ocasionar o puede participar en, el proceso patologico. Por ejemplo, la angiogenesis participa en el crecimiento de muchos tumores. La angiogenesis desregulada ha estado implicada en procesos patologicos tales como artritis reumatoide, retinopatfas, hemangiomas y soriasis. Las diversas condiciones patologicas en las que esta presente la angiogenesis no regulada han sido clasificadas como enfermedades asociadas a la angiogenesis.
Se cree que la angiogenesis, tanto controlada como no controlada, transcurre de una manera similar. Los vasos sangufneos capilares estan constituidos principalmente por celulas endoteliales y pericitos, rodeados por una membrana basal. La angiogenesis empieza con la erosion de la membrana basal por enzimas liberadas por celulas endoteliales y leucocitos. Las celulas endoteliales, que revisten el lumen de los vasos sangufneos, sobresalen entonces por la membrana basal. Los factores angiogenicos inducen a las celulas endoteliales a migrar por la membrana basal erosionada. Las celulas que migran forman un "brote" que sobresale del vaso sangufneo precursor, donde las celulas endoteliales experimentan mitosis y proliferan. Los brotes endoteliales se fusionan entre sf para formar bucles capilares, creando el nuevo vaso sangufneo.
Los agentes que inhiben la angiogenesis han demostrado ser eficaces en el tratamiento de una variedad de trastornos. Avastin™ (bevacizumab), un anticuerpo monoclonal que se une a Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF, por sus siglas en ingles), ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de una variedad de tumores malignos. Macugen™, un aptamero que se une a VEGF ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de la degeneracion macular relacionada con la edad neovascular (humeda). Los antagonistas de la ruta de senalizacion SDF/CXCR4 inhiben la neovascularizacion de los tumores y son eficaces contra el cancer en modelos de ratones (Guleng et al. Cancer Res. 1 de julio de 2.005; 65 (13): 5.864-71). El acido isocumarin-2-(8-hidroxi-6-metoxi-1-oxo- 1H-2-benzopiran-3-il)propionico (NM-3) ha completado la evaluacion clfnica de fase I como un inhibidor de la angiogenesis biodisponible por via oral. El NM-3 destruye directamente las celulas tanto endoteliales como tumorales in vitro y es eficaz en el tratamiento de diversos xenoinjertos de tumores humanos en ratones (Agata et al. Cancer Chemother Pharmacol. Diciembre de 2.005; 56 (6): 610-4.). La talidomida y compuestos relacionados han demostrado efectos beneficiosos en el tratamiento del cancer y aunque el mecanismo molecular de accion no esta claro, la inhibicion de la angiogenesis parece ser un componente importante del efecto antitumoral (vease, por ej., Dredge et al. Microvasc Res., enero de 2.005; 69 (1-2): 56-63). El exito de los antagonistas de TNF-alfa en el tratamiento de la artritis reumatoide se atribuye parcialmente a los efectos antiangiogenicos en el tejido articular inflamado (Feldmann et al. Annu Rev Immunol. 2.001; 19: 163-96). Se espera generalmente que los tratamientos antiangiogenicos presenten efectos beneficiosos en otras enfermedades inflamatorias, en particular la soriasis. Aunque muchos agentes antiangiogenicos presentan un efecto sobre la angiogenesis sin tener en cuenta el tejido que esta afectado, otros agentes angiogenicos pueden tender a presentar un efecto selectivo del tejido.
Es deseable tener composiciones y metodos adicionales para inhibir la angiogenesis. Estos incluyen metodos y composiciones que pueden inhibir el crecimiento no deseado de vasos sangufneos, en general o en ciertos tejidos y/o condiciones patologicas.
Resumen
La presente invencion se refiere a una protefna de fusion ALK1-Fc que comprende un polipeptido con una secuencia de aminoacidos que es al menos 97% identica a la secuencia de aminoacidos 22-118 de la SEC ID N° 1, en la que la protefna de fusion ALK1-Fc inhibe la angiogenesis estimulada por VEGF, FGF (factor de crecimiento de fibroblastos, por sus siglas en ingles) y GDF7 (factor de diferenciacion de crecimiento, por sus siglas en ingles), para uso en: (a) inhibicion de la angiogenesis en un mamffero o (b) tratamiento de la artritis reumatoide en un mamffero.
En una realizacion mas, la invencion se refiere a la protefna de fusion ALK1-Fc para uso segun la invencion como se definio anteriormente, en la que la protefna de fusion ALK1-Fc inhibe la angiogenesis estimulada por VEGF, FGF y GDF7 en un ensayo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM, por sus siglas en ingles).
En una realizacion mas, la invencion se refiere a la protefna de fusion ALK1-Fc para uso segun la invencion como se definio anteriormente, en la que la protefna de fusion ALK1-Fc se une a GDF5, GDF7 y BMP9 (Protefnas Morfogeneticas Oseas, por sus siglas en ingles) con una KD menor que 1 x 10-7 M y se une a TGFp-1 con una KD mayor que 1 x 10-6 M.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
En una realizacion mas, la invencion se refiere a la protefna de fusion ALK1-Fc para uso segun la invencion como se definio anteriormente, en la que la porcion Fc es una porcion Fc de una inmunoglobulina IgG1 humana.
En una realizacion mas, la invencion se refiere a la protefna de fusion ALK1-Fc para uso segun la invencion como se definio anteriormente que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N° 3.
En una realizacion mas, la invencion se refiere a una preparacion farmaceutica, que esta opcionalmente sustancialmente exenta de pirogeno, que comprende la protefna de fusion ALK1-Fc para uso segun la invencion como se definio anteriormente. En dichas realizaciones, la preparacion puede ser una formulacion farmaceutica oftalmica.
En parte, la presente descripcion presenta una caracterizacion de un sistema regulador mediado por cinasa I tipo activina (ALK1) y la funcion de este sistema en la angiogenesis in vivo. En ciertos aspectos, la descripcion proporciona antagonistas de ligandos de ALK-1 y el uso de tales antagonistas como agentes antiangiogenicos. Adicionalmente, la descripcion proporciona antagonistas de ALK-1 y el uso de tales antagonistas como agentes antiangiogenicos. Como se describe en la presente memoria, ALK1 es un receptor para el grupo GDF5 de ligandos, que incluye GDF6 y GDF7 y tambien para el grupo BMP9 de ligandos, que incluye BMP10. Esta descripcion demuestra que la senalizacion mediada por ALK1 y los ligandos descritos anteriormente esta implicada en la angiogenesis in vivo y que la inhibicion de este sistema regulador presenta un potente efecto antiangiogenico. Asf, en ciertos aspectos, la descripcion proporciona antagonistas del sistema regulador de ALK1, incluyendo los antagonistas del receptor o uno o mas de los ligandos, para uso en la inhibicion de la angiogenesis. En ciertos aspectos, la descripcion proporciona antagonistas de ligandos de ALK1 para el tratamiento de artritis reumatoide y trastornos asociados a la angiogenesis patologica en el ojo.
En ciertos aspectos, la descripcion proporciona polipeptidos que comprenden una porcion de union del ligando del dominio extracelular (ECD, por sus siglas en ingles) de ALK1 ("polipeptidos ECD ALK1") para uso en la inhibicion de la angiogenesis. Aunque no se desea estar ligados a ningun mecanismo de accion particular, se espera que dichos polipeptidos actuen uniendose a ligandos de ALK1 e inhibiendo la capacidad de estos ligandos para interactuar con ALK1 asf como otros receptores. En algunas realizaciones, un polipeptido ECD ALK1 comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100% identica a la secuencia de aminoacidos 22118 de la secuencia de ALK1 humana de la SEC. ID N° 1. Se puede usar un polipeptido ECD ALK1 como una protefna monomera pequena o en una forma dimerizada (por ejemplo, expresada como una protefna de fusion), en particular para administracion local en tejidos tales como el ojo. Tambien se puede fusionar un ECD de ALK1 a una segunda porcion polipeptfdica para proporcionar propiedades mejoradas, tales como semivida aumentada o mayor facilidad de produccion o purificacion. Las fusiones a una porcion Fc de una inmunoglobulina o union a un resto polioxietileno (por ejemplo, polietilenglicol) pueden ser utiles en particular para aumentar la semivida del suero del polipeptido ECD ALK1 en la administracion sistemica (por ejemplo, administracion intravenosa, intraarterial e intraperitoneal). Como se demuestra en la presente memoria, un polipeptido ALK1-Fc administrado por via sistemica presenta un potente efecto antiangiogenico en el ojo y tambien proporciona efectos positivos en modelos de murina de artritis reumatoide. En algunas realizaciones, una protefna de fusion ALK1-Fc comprende un polipeptido con una secuencia de aminoacidos que es al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100% identica a la secuencia de aminoacidos 22-118 de la sEc. ID N° 1, polipeptido que se fusiona, con o sin un ligador interviniente, a una porcion Fc de una inmunoalobulina y en la que la protefna de fusion ALK1-Fc se une a GDF5, GDF7 y BMP9 con una Kd menor que 1 x 10'rM y se une a TGFp-1 con una Kd mayor que 1 x 10-6. Se puede seleccionar una porcion Fc para que sea apropiada para el organismo. Opcionalmente, la porcion Fc es una porcion Fc de una IgG1 humana. En una realizacion preferida, la protefna de fusion ALK1-Fc comprende los aminoacidos 22-118 de la SEC. ID N° 1. Opcionalmente, la protefna de fusion ALK1-Fc comprende la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N° 3. Opcionalmente, la protefna de fusion ALK1-Fc es la protefna producida por expresion del acido nucleico de la SEC. ID N° 4 en una estirpe celular de mamffero, en particular una estirpe celular de ovario de hamster chino (CHO, por sus siglas en ingles). Los polipeptidos ECD ALK1 pueden formularse como una preparacion farmaceutica que esta sustancialmente exenta de pirogeno. La preparacion farmaceutica puede prepararse por suministro sistemico (por ej., suministro intravenoso, intraarterial o subcutaneo) o suministro local (por ejemplo, al ojo).
En ciertos aspectos, la descripcion proporciona metodos para la inhibicion de la angiogenesis en un mamffero por administracion de cualquiera de los polipeptidos ECD ALK1 descritos en general o de manera especffica en la presente memoria. En una realizacion, un metodo comprende administrar al mamffero una cantidad eficaz de una protefna de fusion ALK1-Fc, en la que la protefna de fusion ALK1 Fc comprende un polipeptido con una secuencia de aminoacidos que es al menos 90% identica a la secuencia de aminoacidos 22-118 de la SEC. ID N° 1, polipeptido que se fusiona a una porcion Fc de una inmunoglobulina y en la que la protefna de fusion ALK1-Fc se une a TGFp-1 con una Kd mayor que 1 x 10-6. Opcionalmente, la protefna de fusion ALK1-Fc se une a uno o mas ligandos de aLK1 seleccionados del grupo que consiste en: GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. Opcionalmente, la protefna de fusion ALK1-Fc presenta una secuencia de la SEC. ID N° 3. El polipeptido ECD ALK1 puede suministrarse de manera local (por ej., al ojo) o por via sistemica (por ej., por via intravenosa, por via intraarterial o por via subcutanea). En una realizacion particular, la descripcion proporciona un metodo para inhibir la angiogenesis en el ojo de un mamffero por administracion de una protefna ALK1-Fc al mamffero en una posicion distal al ojo, por ej.,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
por administracion sistemica.
Los miembros de la familia BMP/GDF, incluyendo BMP9, BMP10, GDF5, GDF6 y GDF7 se unen a un receptor tipo I y uno tipo II para formar un complejo de senalizacion funcional. Los sitios de union para estos receptores son diferentes. Tambien se describen en la presente memoria metodos para tratar artritis reumatoide en un mamffero.
En cada caso, se puede administrar un agente descrito en la presente memoria junto con un segundo agente que inhibe la angiogenesis.
La descripcion tambien proporciona una formulacion farmaceutica oftalmica como se define en las reivindicaciones. La invencion encuentra aplicacion en metodos de tratamiento de una enfermedad relacionada con la angiogenesis del ojo que comprende administrar a dicho ojo una formulacion farmaceutica oftalmica como se define en las reivindicaciones. La formulacion puede comprender ademas uno o mas de los siguientes medicamentos: pegaptanib, ranibizumab o un glucocorticoide. En una realizacion, la formulacion esta sustancialmente exenta de pirogeno.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoacidos para la cinasa 1 tipo activina, ALK1, humana, (SEC. ID N° 1). El subrayado unico muestra el domino extracelular predicho. El doble subrayado muestra el domino intracelular. El peptido senal y el domino transmembrana no estan subrayados.
La Figura 2 muestra la secuencia de acidos nucleicos de un ADNc de ALK1 humano (SEC. ID N° 2). La secuencia codificadora esta subrayada. La porcion que codifica el dominio extracelular lleva doble subrayado.
La Figura 3 muestra un ejemplo de una fusion del dominio extracelular de ALK1 humano a un dominio Fc (SEC. ID N° 3). La protefna hALK1-Fc incluye los aminoacidos 22-120 de la protefna ALK1 humana, fusionados en el C terminal a un ligador (subrayado) y una region Fc de IgG1.
La Figura 4 muestra la secuencia de acidos nucleicos para expresion del polipeptido hALK1-Fc de la SEC. ID N° 3. Tambien se muestra la secuencia de aminoacidos codificada. La secuencia lfder se escinde de manera que Asp 22 es el aminoacido N-terminal de la protefna segregada.
La Figura 5 muestra el efecto antiangiogenico de ALK1-Fc de murina ("RAP") y ALK1-Fc humana ("ACE") en un ensayo de formacion de tubo de celulas endoteliales. Todas las concentraciones de RAP y ACE redujeron el nivel de formacion de tubos como respuesta a un suplemento de crecimiento de celulas endoteliales (ECGF, por sus siglas en ingles) a un grado mayor que el control positivo, Endostatina.
La Figura 6 muestra el efecto angiogenico de GDF7 en un ensayo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM). El efecto de GDF7 es comparable al de VEGF.
La Figura 7 muestra el efecto antiangiogenico de la fusion de ALK1-Fc humana en el ensayo CAM. hALK1- Fc inhibe la angiogenesis estimulada por VEGF, FGF y GDF7.
La Figura 8 muestra efectos antiangiogenicos comparativos de ALK1-Fc (mALK1-Fc) de murina, hALK1-Fc, un anticuerpo monoclonal anti-ALK1 comercialmente disponible (mAb Anti-ALK1) y un anticuerpo monoclonal anti-VEGF de neutralizacion, comercialmente disponible. El efecto antiangiogenico de las construcciones ALK1-Fc es comparable a los efectos del anticuerpo anti-VEGF.
La Figura 9 muestra los efectos antiangiogenicos de hALK1-Fc y el anticuerpo anti-VEGF in vivo. hALK1-Fc y anti-VEGF presentaron efectos comparables sobre la angiogenesis en el ojo cuando se midio por el ensayo de microbolsa corneal de raton.
La Figura 10 muestra los efectos de mALK1-Fc en el modelo de artritis inducida por colageno (CIA, por sus siglas en ingles) de murina de la artritis reumatoide. La grafica muestra valoraciones artrfticas de grupo medias determinadas durante el periodo de observacion de 42 dfas en los ratones con artrosis DBA/1 machos, inducida por colageno. RAP-041 es mALK1-Fc. Avastin™ es el anticuerpo anti-VEGF bevacizumab.
Descripcion detallada
1. Resumen
ALK1 es un receptor de superficie celular tipo I para la superfamilia TGF- p de ligandos y tambien se conoce como ACVRL1 y ACVRLK1. Se ha implicado AlK1 como receptor para TGF-p1, TGF- p3 y bMp-9 (Marchuk et al., Hum Mol Genet. 2.003; Brown et al., J Biol Chem. 1 de julio de 2.005; 280 (26): 25.111-8).
En ratones, las mutaciones de perdida de funcion en ALK1 conducen a una variedad de anormalidades en la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
vasculatura que se desarrolla (Oh et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 2.000, 97, 2.626-2.631; Urness et al., Nat. Genet. 2.000, 26, 328-331).
En seres humanos, las mutaciones en perdida de funcion en ALK1 se asocian a telangiectasia hemorragica hereditaria (HHT, por sus siglas en ingles o sfndrome de Osler-Rendu-Weber), en que los pacientes desarrollan malformaciones arteriovenosas que crean un flujo directo (comunicacion) de una arteria a una vena (derivacion arteriovenosa), sin un lecho capilar interviniendo. Los sfntomas tfpicos de los pacientes con HHT incluyen epistaxis recurrente, hemorragia gastrointestinal, telangiectasas cutanea y mucocutanea y malformaciones arteriovenosas (AVM, por sus siglas en ingles) en la vasculatura pulmonar, cerebral o hepatica.
Las publicaciones recientes de David et al. (Blood. 1 de marzo de 2.007; 109 (5):1.953-61.) y Scharpfenecker et al. (J Cell Sci. 15 de marzo de 2.007; 120 (Pt 6): 964-72) concluyen que BMp9 y BMP10 activan ALK1 en celulas endoteliales y que la consecuencia de esta activacion es inhibir la proliferacion y la migracion de celulas endoteliales. Estos efectos se oponen directamente a los de factores pro-angiogenicos tales como VEGF. Asf, estas publicaciones concluyen que BMP9 y BMP10 son factores antiangiogenicos ellos mismos y ademas, que la activacion de ALK1 presenta un efecto antiangiogenico. Por el contrario, la presente descripcion demuestra que los antagonistas, en vez de los agonistas, de BMP9 y BMP10 presentan efectos antiangiogenicos.
La descripcion se refiere al descubrimiento de que los polipeptidos que comprenden una porcion del dominio extracelular de ALK1 ("polipeptidos ECD ALK1") pueden usarse para inhibir la angiogenesis in vivo, incluyendo angiogenesis independiente de VEGF y angiogenesis que esta mediada por multiples factores angiogenicos, incluyendo VEGF, FGF y PDGF. En parte, la descripcion proporciona la identidad de ligandos de alta afinidad, fisiologicos, para ALK1 y demuestra que los polipeptidos ECD ALK1 inhiben la angiogenesis. Los datos demuestran que un polipeptido ECD ALK1 puede ejercer un efecto antiangiogenico incluso en el caso en el que el polipeptido ECD ALK1 no presente union significativa a TGF-p1. Por otra parte, los polipeptidos ECD ALK1 inhiben la angiogenesis que es estimulada por muchos factores pro-angiogenicos diferentes, incluyendo VEGF, FGF y GDF7. Asf, la descripcion proporciona una descripcion de un sistema regulador de ALK1, en el que ALK1 es un receptor para el grupo GDF5 de ligandos, que incluye GDF6 y GDF7 y tambien para el grupo BMP9 de ligandos, que incluye BMP10, con diferentes afinidades para los dos grupos de ligandos. Ademas, la descripcion demuestra que la senalizacion mediada por ALK1 y los ligandos descritos anteriormente es pro-angiogenica in vivo y que la inhibicion de este sistema regulador presenta un potente efecto antiangiogenico in vivo. Asf, en ciertos aspectos, la descripcion proporciona antagonistas del sistema regulador de ALK1, incluyendo los antagonistas del receptor o uno o mas de los ligandos, para uso en inhibicion de angiogenesis, incluyendo tanto angiogenesis dependiente de VEGF como angiogenesis independiente de VEGF. Sin embargo, se deberfa observar que se espera que los anticuerpos dirigidos a ALK1 presenten diferentes efectos de un polipeptido ECD ALK1. Se esperarfa que un anticuerpo pan- neutralizante contra ALK1 (uno que inhibe la union de todos los ligandos fuertes y debiles) inhibiera la senalizacion de dichos ligandos a traves de ALK1 pero no se esperarfa que inhibiera la capacidad de dichos ligandos para senalizar a traves de otros receptores (por ej., BMPR1a, BMPR1b, BMPRII en el caso de GDF5-7 y BMP9-10 y TbRI y TBRII en el caso de TGFp). Por otra parte, se esperarfa que un polipeptido ECD ALK1 inhibiera a todos los ligandos a los que se une estrechamente, incluyendo, para una construccion tal como la mostrada en los Ejemplos, GDF5-7 y BMP9-10, pero no afectarfa a los ligandos a los que se une de manera debil, tales como TGF-p. Asf, mientras un anticuerpo pan-neutralizante contra ALK1 bloquearfa la senalizacion de BMP9 y TGF-p por aLK1 no bloquearfa la senalizacion de BMP9 y TGF-p por otro receptor y mientras un polipeptido ECD ALK1 puede inhibir la senalizacion de BMP9 por todos los receptores (incluso receptores distintos de ALK1) no se esperarfa que inhibiera la senalizacion de TGF-p por cualquier receptor, incluso ALK1.
Las protefnas descritas en la presente memoria son las formas humanas, a menos que se especifique de otro modo. Las referencias del Genbank para las protefnas son como sigue: GDF5 humana, CAA56874; GDF6 humana, AAH43222; GDF7 humana, NP_878248; BMP9 humana, Q9UK05; BMP10 humana, O95393; DAN humana, BAA92265. Las secuencias de ALK1 se explican en las Figuras 1-5.
Secuencia de aminoacidos de Dan humana (SEC. ID N° 10) (Genbank BAA92265):
MLRVLVGAVL PAMLLAAPPP IMKLALFPDK SAWCEAKNIT QIVGHSGCEA KSIQHRACLG QCFSYSVPHT FPQSTESLVH CDSCMPAQSM WEIVTLECPG HEEVPRVDKL VEKILHCSCQ ACGKEPSHEG LSVYVQGEDG PGSQPGTHPH PHPHPHPGGQ TPEPEDPPGA PHTEEEGAED
Se espera que la protefna Dan madura corresponda a los aminoacidos 17-180. El dominio de nudo de cistefna conservado de Dan corresponde a los aminoacidos 21-125 (subrayados).
Secuencia de ADNc de Dan humana (SEC. ID N° 11) (Genbank BC012037):
5
10
15
20
25
30
gccgagcctc
ggcgcgcgcg
tccctgccat
agagtgcctg
ccaagtccat
ccttcccaca
tgtgggagat
tggtggagaa
ggctgagcgt
acccccatcc
ccccccacac
tcatccccct
ccccctttgg
atggagatct
gggggaggaa
ctggcttcta
ggggaggcca
gctgaggtcc
ctagaaagac
caccccactt
agcggagggg
gggagccagg
aggaggggaa
aagaccatcc
cactgtgccc
ctcccaggga
gccccaaggt
ctggggcgcc
ggctctggag
gctactggct
gtgcgaagcc
ccagaacagg
gtccacagag
tgtgacgctg
gatcctgoac
ctatgtgcag
ccacccccat
agaggaagag
gtggaatgtt
cactggatgg
gaaggggcgg
gcagaggtct
gagatgtgcc
tccaagatgg
cgggcttagt
cactggcaga
cccatctcca
tttgggagtc
ctctccgggc
gaaggaaagg
ctgaagacga
caagttctag
tgctctttgt
tccagaggcc
cgggcccgcg
gccacgggca
gccccaccac
aagaacatca
gcgtgcctag
tccctggttc
gagtgcccgg
tgtagctgcc
ggcgaggacg
cctggcgggc
ggggctgagg
gggtctcact
acttggcttc
ggttagagcc
tcagggctct
tgtgggaggg
catgaatcgg
gtgagcatct
aacaggaggc
gggaagcgtc
aggcctgggc
ctttctctgg
gaagagtctt
gcatccccct
gccccccaga
aaatatcgga
ctaggcggga
acccccgcac
tgatgcttcg
ccatcaacaa
cccagatcgt
gacagtgctt
actgtgactc
gccacgagga
aggcctgcgg
ggccgggatc
agacccctga
actgaggccc
ctctggggaa
agactcggac
aagctgcaca
ttttttgggg
ggaggaagtt
gctaaggtcc
tgccagcctc
tccggcccca
gccccagtgg
aggaccctgc
cttccttggc
ccaaggccag
cctctccctg
aagctgtcag
tgggtgtggg
tgggctcgct
ccagctccgc
ggtcctggtg
gctggcactg
gggccacagc
cagctacagc
ctgcatgcca
ggtgcccagg
caaggagcct
ccagcccggc
gcccgaggac
ccccaactct
gtcaggggag
ttgaatgctg
atttaatata
ggggggtggt
ggctgagcca
ctgggggtgc
aggcttgagg
caggtttccc
cactgaagtg
tgactcgtgg
ttgcctggtg
aaggaggggg
ttagaaatgt
agccggccgc
agtgaggggt
gaacctcgag
aggaccggcg
ggggctgtcc
ttcccagata
ggctgtgagg
gtccccaaca
gcccagtcca
gtggacaagc
agtcacgagg
acccaccctc
ccccctgggg
tcctcccctc
aagctgaagc
cccggttgcc
ttcaagagtg
ctcttcctgt
ttgagtgctg
agatggtact
gagggctggg
caaggcctct
gccctccctc
cgcgggagct
ggggaagggg
acaacccccc
tagtgccccg
cttctcccct
tacctccctc
gaactccagg
acgaggagga
ccaattctgc
ggggagggac
gtctgctctt
gccctcctgg
atggaccctc
aaaaaaaaaa
catgggaott
ctgcctcctc
agggcaggcg
ctgtgcccag
ctgttgcgac
agtcttctca
aaaaaaaaaa
gogtggacag
cctcccagct
ggcccatgaa
ggtggctgcc
gcgggcttct
tgaataaatt
aaa
tcagggttca
gcactttaac
gaaagcccct
agcccactgc
ggagcttgtc
ccttcaacgc
cttgggctct
cctagaaggt
cgttgcccag
ctcctgcctg
accattggac
caaaaaaaaa
ctctagctcc
ggggacctgg
cactgtctgc
gggtggcctg
agtctccctg
aaaaaaaaaa
La secuencia codificadora para precursor de DAN corresponde a los acidos nucleicos 93-635. La secuencia codificadora para la protema DAN madura corresponde a los acidos nucleicos 141-632. La secuencia codificadora para la porcion de nudo de cistema conservada de DAN corresponde a los acidos nucleicos 153-467.
Los terminos usados en esta memoria descriptiva presentan en general sus significados ordinarios en la tecnica, en el contexto de esta descripcion y en el contexto espedfico donde se use cada termino. Ciertos terminos se discuten en la memoria descriptiva, para proporcionar grna adicional al medico en la descripcion de las composiciones y los metodos descritos en la presente memoria y como prepararlas y usarlas. El alcance o significado de cualquier uso de un termino sera evidente a partir del contexto espedfico en el que se use el termino.
2. Polipeptidos ALK1 solubles.
Las protemas ALK1 que se encuentran en la naturaleza son protemas transmembrana, con una porcion de la protema colocada fuera de la celula (la porcion extracelular) y una porcion de la protema colocada en el interior de la celula (la porcion intracelular). Aspectos de la presente descripcion incluyen polipeptidos que comprenden una porcion del dominio extracelular de ALK1.
El termino "polipeptido ECD ALK1" se destina a referirse a un polipeptido que consiste en, o que comprende, una secuencia de aminoacidos de un dominio extracelular de un polipeptido ALK1 que se encuentra en la naturaleza, incluyendo o excluyendo cualquier secuencia senal y N-terminal de la secuencia para la secuencia senal, o una secuencia de aminoacidos que es al menos 33 por ciento identica a un dominio extracelular de un polipeptido ALK1 que se encuentre en la naturaleza y opcionalmente al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 99% o 100% identica a la secuencia de un dominio extracelular de un polipeptido ALK1 que se encuentre en la naturaleza, como se ejemplifica por la region de nudo de cistema de los aminoacidos 34-95 de la SEC. ID N° 1 o el nudo de cistema mas aminoacidos adicionales en el N- y C-terminal del dominio extracelular, tales como los aminoacidos 22-118 de la SEC. ID N° 1. Asimismo, un polipeptido ECD ALK1 puede comprender un polipeptido que este codificado por los nucleotidos 100-285 de la SEC. ID N° 2 o variantes silenciosas del mismo o acidos nucleicos que se hibriden al complementario del mismo en condiciones de hibridacion rigurosas (en general, tales condiciones se conocen en la tecnica pero, por ejemplo, pueden implicar hibridacion en formamida al 50% v/v, SSC x 5, agente bloqueante al 2% p/v, N-lauroilsarcosina al 0,1%, SDS al 0,3% a 65°C durante la noche y lavando en, por ejemplo, sSc x 5 a aproximadamente 65 °C). Adicionalmente, un polipeptido ECD ALK1 puede comprender un polipeptido que este codificado por los nucleotidos 64-384 de la SEC.
6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ID N° 2 o variantes silenciosas de los mismos o acidos nucleicos que se hibriden al complementario de los mismos en condiciones de hibridacion rigurosas (en general, tales condiciones se conocen en la tecnica pero, por ejemplo, pueden implicar hibridacion en formamida al 50% v/v, SSC x 5, agente bloqueante al 2% p/v, N-lauroilsarcosina al 0,1%, SDS al 0,3% a 65°C durante la noche y lavando en, por ejemplo, SSC x 5 a aproximadamente 65°C). El termino "polipeptido ECD ALK1" de acuerdo con esto incluye porciones extracelulares aisladas de polipeptidos ALK1, variantes de los mismos (incluyendo variantes que comprenden, por ejemplo, no mas de 2, 3, 4, 5 o 10 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacidos en la secuencia que corresponde a los aminoacidos 22-118 de la SEC. ID N° 1 y que incluyen variantes que comprenden no mas de 2, 3, 4, 5 o 10 sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacidos en la secuencia que corresponde a los aminoacidos 34-95 de la SEC. ID N° 1), fragmentos de los mismos y protefnas de fusion que comprenden cualquiera de lo precedente, pero en cada caso preferiblemente cualquiera de los polipeptidos ECD ALK1 anteriores retendra una afinidad sustancial para uno o mas de GDF5, GDF6, gDf7, BMP9 o BMP10. El termino "polipeptido ECD ALK1" se destina de manera explfcita a excluir cualquier polipeptido ALK1 que se encuentre en la naturaleza, de longitud total. En general, se disenara que un polipeptido ECD ALK1 sea soluble en disoluciones acuosas a temperaturas, niveles de pH y osmolaridad, biologicamente relevantes.
Se describieron anteriormente polipeptidos ECD ALK1 que comparten un grado especificado de identidad o similitud de secuencias para un polipeptido ALK1 que se encuentre en la naturaleza. Para determinar la identidad en porcentaje de dos secuencias de aminoacidos, se alinean las secuencias para fines de comparacion optimos (por ejemplo, se pueden introducir huecos en uno o ambos de un primer y un segundo aminoacido o secuencia de acidos nucleicos para alineamiento optimo y se pueden rechazar secuencias no homologas para fines de comparacion). Los restos aminoacido en las posiciones correspondientes de los aminoacidos se comparan entonces. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo resto aminoacido que la correspondiente posicion en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion (como se usa en la presente memoria “identidad” de aminoacidos es equivalente a “homologfa” de aminoacidos). La identidad en porcentaje entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que se requiere introducir para alineamiento optimo de las dos secuencias.
La comparacion de secuencias y la determinacion de la identidad y la similitud en porcentaje entre dos secuencias puede llevarse a cabo usando un algoritmo matematico. (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed. Oxford University Press, Nueva York, 1.988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1.993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M. y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1.994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1.987 y Sequence Analysis Primer, eds., Gribskov, M. and Devereux, J., M Stockton Press, Nueva York, 1.991).
En una realizacion, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoacidos se determina usando el algoritmo Needleman and Wunsch (J Mol. Biol. (48): 444-453 (1.970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete informatico GCG (disponible en
http://www.gcg.com). En una realizacion especffica, se usan los siguientes parametros en el programa GAP: una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250 y un peso del hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realizacion mas, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de nucleotidos se determina usando el programa GAP en el paquete informatico GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12 (1): 387 (1.984)) (disponible en
http://www.gcg.com). Los parametros ejemplares incluyen usar una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de huecos de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de las longitudes de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. A menos que se especifique de otro modo, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoacidos se tiene que determinar usando el programa GAP usando una matriz Blosum 62, un peso de GAP de 10 y un peso de longitudes de 3 y si dicho algoritmo no puede computar el porcentaje de identidad deseado, se deberfa seleccionar una alternativa adecuada descrita en la presente memoria.
http://www.gcg.com). En una realizacion especffica, se usan los siguientes parametros en el programa GAP: una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250 y un peso del hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de la longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En otra realizacion mas, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de nucleotidos se determina usando el programa GAP en el paquete informatico GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12 (1): 387 (1.984)) (disponible en
http://www.gcg.com). Los parametros ejemplares incluyen usar una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de huecos de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de las longitudes de 1, 2, 3, 4, 5 o 6. A menos que se especifique de otro modo, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoacidos se tiene que determinar usando el programa GAP usando una matriz Blosum 62, un peso de GAP de 10 y un peso de longitudes de 3 y si dicho algoritmo no puede computar el porcentaje de identidad deseado, se deberfa seleccionar una alternativa adecuada descrita en la presente memoria.
En otra realizacion, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoacidos se determina usando el algoritmo de E. Myers y W. Miller (CaBiOS, 4: 11-17 (1.989)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), usando una tabla de restos de peso PAM120, una penalizacion por la longitud de los huecos de 12 y penalizacion por huecos de 4.
Otra realizacion para determinar el mejor alineamiento total entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse usando el programa de ordenador FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci., 6: 237-245 (1.990)). En un alineamiento de secuencias, las secuencias pregunta y encontrada son ambas secuencias de aminoacidos. El resultado de dicho alineamiento de secuencias global se presenta en terminos de porcentaje de identidad. En una realizacion, la identidad de la secuencia de aminoacidos se realiza usando el programa informatico FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci., 6: 237-245 (1.990)). En una realizacion especffica, los parametros empleados para calcular el porcentaje de identidad y similitud de un alineamiento de aminoacidos comprenden: Matriz =PAM 150, k-tupla=2, Penalizacion por desemparejamiento=1, Penalizacion por union =20, Longitud del grupo de aleatorizacion=0, Puntuacion lfmite=1, Penalizacion por huecos=5 y Penalizacion por tamano de huecos=0,05.
En algunas realizaciones, los polipeptidos ECD ALK1 comprenden una porcion extracelular de una protefna ALK1 que se encuentra en la naturaleza tal como una secuencia de la SEC. ID N° 1 y preferiblemente una porcion de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
union del ligando del dominio extracelular de ALK1. En algunas realizaciones, un polipeptido ALK1 soluble comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% identica a una secuencia de aminoacidos de los aminoacidos 22-118 de la SEC. ID N° 1. En algunas realizaciones, un polipeptido ALK1 extracelular truncado comprende al menos 30, 40 o 50 aminoacidos consecutivos de una secuencia de aminoacidos de una porcion extracelular de la SEC. ID N° 1.
En realizaciones preferidas, un polipeptido ECD ALK1 se une a uno o mas de GDF5, GDF6, GDF7, BMP9 y BMP10. Opcionalmente, el polipeptido ALK1 no muestra union sustancial a TGF-p1 o TGF-p3. La union puede ser evaluada usando protefnas purificadas en disolucion o en un sistema de resonancia plasmonica superficial, tal como un sistema Biacore™. Los polipeptidos ALK1 solubles preferidos presentaran una actividad antiangiogenica. Los bioensayos para actividad inhibitoria de la angiogenesis incluyen el ensayo de la membrana corioalantoidea de pollo (CAM), el ensayo de microbolsa corneal de raton, un ensayo para medir el efecto de administrar protefnas aisladas o sintetizadas en tumores implantados. El ensayo CAM es descrito por O'Reilly, et al. en "Angiogenic Regulation of Metastatic Growth" Cell, vol. 79 (2), 1 de octubre de 1.994, pags. 315-328. En resumen, se separaron embriones de pollo de 3 dfas con yemas intactas del huevo y se pusieron en una placa de petri. Despues de 3 dfas de incubacion, se aplico un disco de metilcelulosa que contenfa la protefna para ensayar al CAM de embriones individuales. Despues de 48 horas de incubacion, se observaron los embriones y los CAM para determinar si habfa sido inhibido el crecimiento endotelial. El ensayo de microbolsa corneal de raton implica implantar un granulo que contiene factor de crecimiento, junto con otro granulo que contiene el inhibidor de crecimiento endotelial sospechado, en la cornea de un raton y observar el patron de capilares que se elaboran en la cornea. Se describen otros ensayos en los Ejemplos.
Los polipeptidos ECD ALK1 pueden producirse eliminando la cola citoplasmica y la region transmembrana de un polipeptido ALK1. Alternativamente, se puede inactivar el dominio transmembrana por supresion o por sustitucion de los restos aminoacido normalmente hidrofobos que comprenden un dominio transmembrana con unos hidrofilos. En cualquier caso, se crea un perfil de hidropatfa sustancialmente hidrofilo que reducira la afinidad lipfdica y mejorara la solubilidad acuosa. La supresion del dominio transmembrana se prefiere sobre la sustitucion con restos aminoacido hidrofilos debido a que evita introducir epftopos potencialmente inmunogenicos.
Los polipeptidos ECD ALK1 pueden incluir adicionalmente cualquier numero de secuencias lfder conocidas en el N terminal. Dicha secuencia permitirfa que los peptidos se expresen y se fijan como objetivo para la ruta de secrecion en un sistema eucariota. Vease, por ej., Ernst et al., Patente de EE.UU. N° 5.082.783 (1.992). Alternativamente, puede usarse una secuencia senal de ALK1 natural para efectuar extrusion de la celula. Las posibles secuencias lfder incluyen lfderes naturales, tPa y melitina de abeja (SEC ID Nos. 7-9, respectivamente). El tratamiento de los peptidos senal puede variar dependiendo de la secuencia lfder escogida, el tipo de celula usado y las condiciones de cultivo, entre otras variables, y por lo tanto los sitios de partida N-terminal reales para polipeptidos ECD ALK1 maduros, incluyendo el de la SEC. ID N° 5, pueden desplazarse por 1-5 aminoacidos en la direccion N-terminal o C- terminal.
En algunas realizaciones, la presente descripcion considera mutaciones especfficas de los polipeptidos ALK1 para modificar la glucosilacion del polipeptido. Dichas mutaciones pueden seleccionarse para introducir o eliminar uno o mas sitios de glucosilacion, tales como sitios de glucosilacion ligados a O o ligados a N. Los sitios de reconocimiento de glucosilacion ligados a asparagina comprenden en general una secuencia de tripeptidos, asparagina-X-treonina (o asparaginas-X-serina) (donde "X" es cualquier aminoacido) que se reconozca de manera especffica por enzimas de glucosilacion celular apropiadas. La modificacion tambien se puede realizar por la adicion de, o sustitucion por, uno o mas restos serina o treonina para la secuencia del polipeptido ALK1 de tipo natural (para sitios de glucosilacion ligados a O). Una variedad de sustituciones o supresiones de aminoacidos en una o las dos de las posiciones de los aminoacidos primero o tercero de un sitio de reconocimiento de glucosilacion (y/o supresion de aminoacidos en la segunda posicion) da como resultado no glucosilacion en la secuencia de tripeptidos modificada. Otro medio de aumentar el numero de restos carbohidrato en un polipeptido ALK1 es por acoplamiento qufmico o enzimatico de glucosidos al polipeptido ALK1. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el azucar o los azucares pueden unirse a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cistefna; (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) restos aromaticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptofano o (f) el grupo amido de glutamina. Estos metodos se describen en la patente internacional WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1.987 y en Aplin y Wriston (1.981) CRC Crit. Rev. Biochem., pags. 259-306, incorporado como referencia en la presente memoria. La eliminacion de uno o mas restos carbohidrato presentes en un polipeptido ALK1 puede llevarse a cabo de manera qufmica y/o de manera enzimatica. La desglucosilacion qufmica puede implicar, por ejemplo, la exposicion del polipeptido ALK1 al compuesto acido trifluorometanosulfonico o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escision de la mayorfa o de todos los azucares excepto el azucar ligador (N-acetilglucosamina o N- acetilgalactosamina), al tiempo que sale la secuencia de aminoacidos intacta. La desglucosilacion qufmica es descrita ademas por Hakimuddin et al. (1.987) Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 y por Edge et al. (1.981) Anal. Biochem. 118: 131. La escision enzimatica de restos carbohidrato en polipeptidos ALK1 puede conseguirse por el uso de una variedad de endo- y exo-glucosidasas como describe Thotakura et al. (1.987) Meth. Enzymol. 138: 350. La secuencia de un polipeptido ALK1 puede ajustarse, cuando sea apropiado, dependiendo del tipo de sistema de expresion usado, ya que las celulas de mamffero, levadura, insecto y planta, pueden todas introducir diferentes
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
patrones de glucosilacion que pueden verse afectados por la secuencia de aminoacidos del peptido. En general, las protefnas ALK1 para uso en seres humanos se expresaran en una estirpe celular de mamffero que proporcione glucosilacion apropiada, tal como estirpes celulares HEK293 o CHO, aunque se espera que sean utiles tambien otras estirpes celulares de expresion de mamfferos, estirpes celulares de levaduras con enzimas de glucosilacion logradas y celulas de insectos.
Esta descripcion considera ademas un metodo para generar mutantes, en particular series de mutantes combinatorios de un polipeptido ALK1, asf como mutantes de truncamiento; las mezclas de mutantes combinatorios son especialmente utiles para identificar secuencias variantes funcionales. El fin de la identificacion sistematica de tales bibliotecas combinatorias puede ser generar, por ejemplo, variantes de polipeptido ALK1 que puedan actuar como agonistas o antagonistas, o alternativamente, que posean nuevas actividades todas juntas. Se proporciona una variedad de ensayos de identificacion sistematica a continuacion y dichos ensayos pueden usarse para evaluar variantes. Por ejemplo, se puede identificar sistematicamente una variante de polipeptido ALK1 por la capacidad para unirse a un ligando de ALK1, para evitar la union de un ligando de ALK1 a un polipeptido ALK1 o para interferir con la senalizacion ocasionada por un ligando de ALK1. La actividad de un polipeptido ALK1 o sus variantes tambien pueden ensayarse en un ensayo basado en celulas o in vivo, en particular cualquiera de los ensayos descritos en los Ejemplos.
Se pueden generar variantes de procedencia combinatoria que presenten una potencia selectiva o generalmente aumentada con respecto a un polipeptido ECD ALK1 que comprende un dominio extracelular de un polipeptido ALK1 que se encuentre en la naturaleza. Asimismo, la mutagenesis puede dar lugar a variantes que presenten semividas en suero drasticamente diferentes de las que corresponden a un polipeptido ECD ALK1 de tipo natural. Por ejemplo, la protefna modificada puede hacerse mas estable o menos estable a la degradacion proteolftica u otros procedimientos que den como resultado la destruccion de, o la eliminacion de otro modo o inactivacion de un polipeptido ECD ALK1 natural. Dichas variantes, y los genes que las codifican, pueden utilizarse para modificar los niveles de polipeptido ECD ALK1 por modulacion de la semivida de los polipeptidos ALK1. Por ejemplo, una semivida corta puede dar lugar a efectos biologicos mas transitorios y puede permitir un control mas estrecho de los niveles de polipeptidos ECD ALK1 recombinantes en el paciente. En una protefna de fusion Fc, se pueden realizar mutaciones en el ligador (si hay) y/o la porcion Fc para modificar la semivida de la protefna.
Se puede producir una biblioteca combinatoria por medio de una biblioteca degenerada de genes que codifiquen una biblioteca de polipeptidos que incluyan cada uno al menos una porcion de secuencias de polipeptidos ALK1 potenciales. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleotidos sinteticos puede ligarse de manera enzimatica en secuencias genicas de manera que el conjunto degenerado de secuencias de nucleotidos de polipeptidos ALK1 potenciales se pueda expresar como polipeptidos individuales, o alternativamente, como una serie de protefnas de fusion mayores (por ejemplo, para visualizar fagos).
Hay muchas maneras por las cuales la biblioteca de variantes de ECD de ALK1 potenciales puede generarse a partir de una secuencia de oligonucleotidos degenerada. La sfntesis qufmica de una secuencia genica degenerada puede llevarse a cabo en un sintetizador de ADN automatico y ligarse los genes sinteticos despues a un vector apropiado para expresion. La sfntesis de oligonucleotidos degenerados es conocida en la tecnica (vease, por ejemplo, Narang, SA (1.983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al., (1.981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. ed., Macromolecules, AG Walton, Amsterdam: Elsevier pags. 273-289; Itakura et al., (1.984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1.984) Science 198:1.056; Ike et al., (1.983) Nucleic Acid Res. 11: 477). Dichas tecnicas se han empleado en la evolucion dirigida de otras protefnas (vease, por ejemplo, Scott et al., (1.990) Science 249: 386-390; Roberts et al., (1.992) PNAS USA 89: 2.429-2.433; Devlin et al., (1.990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1.990) PNAS USA 87: 6.378-6.382; asf como las patentes de EE.UU. N°: 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815).
Alternativamente, pueden utilizarse otras formas de mutagenesis para generar una biblioteca combinatoria. Por ejemplo, se pueden generar y aislar variantes de polipeptidos ALK1 de una biblioteca por identificacion sistematica usando, por ejemplo, mutagenesis de barrido de alanina y similares (Ruf et al., (1.994) Biochemistry 33: 1.565-1.572; Wang et al., (1.994) J. Biol. Chem. 269: 3.095-3.099; Balint et al., (1.993) Gene 137: 109-118; Grodberg et al., (1.993) Eur. J. Biochem. 218: 597-601; Nagashima et al., (1.993) J. Biol. Chem. 268: 2.888-2.892; Lowman et al., (1.991) Biochemistry 30:10.832-10.838 y Cunningham et al., (1.989) Science 244: 1.081-1.085), por mutagenesis de barrido de ligador (Gustin et al., (1.993) Virology 193: 653-660; Brown et al., (1.992) Mol. Cell Biol. 12:2.644-2.652; McKnight et al., (1.982) Science 232:316); por mutagenesis de saturacion (Meyers et al., (1.986) Science 232:613); por mutagenesis PCR (Leung et al., (1.989) Method Cell Mol Biol 1:11-19) o por mutagenesis aleatoria, incluyendo mutagenesis qufmica, etc. (Miller et al., (1.992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY y Greener et al., (1.994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). Mutagenesis de barrido de ligador, en particular en un ajuste combinatorio, es un metodo atractivo para identificar formas truncadas (bioactivas) de polipeptidos ALK1.
Se conoce una amplia variedad de tecnicas en la tecnica para identificar sistematicamente productos genicos de bibliotecas combinatorias realizadas por mutaciones y truncaciones puntuales y, para ese asunto, para identificar sistematicamente bibliotecas de ADNc para productos genicos con una cierta propiedad. Dichas tecnicas seran adaptables en general para una rapida identificacion sistematica de las bibliotecas genicas generadas por la mutagenesis combinatoria de los polipeptidos ALK1. Las tecnicas mas extensamente usadas para identificacion
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
sistematica de bibliotecas genicas grandes comprenden tfpicamente clonar la biblioteca genica en vectores de expresion replicables, transformar las celulas apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la deteccion de una actividad deseada facilite el aislamiento relativamente facil del vector que codifique el gen cuyo producto fue detectado. Los ensayos preferidos incluyen ensayos de union de ligando de ALK1 y ensayos de senalizacion de celulas mediada por ligando.
En algunas realizaciones, los polipeptidos ECD ALK1 de la descripcion pueden comprender ademas modificaciones postraduccion ademas de cualquiera que este presente de manera natural en los polipeptidos ALK1. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acetilacion, carboxilacion, glucosilacion, fosforilacion, lipidacion y acilacion. Como resultado, los polipeptidos ECD ALK1 modificados pueden contener elementos no aminoacidos, tales como polietilenglicoles, lfpidos, poli- o mono-sacarido y fosfatos. Los efectos de tales elementos no aminoacido sobre la funcionalidad de un polipeptido ECD ALK1 pueden ensayarse como se describe en la presente memoria para otras variantes de polipeptidos ECD ALK1. Cuando se produce un polipeptido ECD ALK1 en celulas por escision de una forma naciente del polipeptido ALK1, tambien puede ser importante el tratamiento postraduccion para corregir el plegamiento y/o la funcion de la protefna. Diferentes celulas (tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 o HEK293) presentan una maquinaria celular especffica y mecanismos caracterfsticos para dichas actividades postraduccion y pueden elegirse para asegurar la correcta modificacion y tratamiento de los polipeptidos ALK1.
En ciertos aspectos, las variantes funcionales o formas modificadas de los polipeptidos ECD ALK1 incluyen protefnas de fusion con al menos una porcion de los polipeptidos ECD ALK1 y uno o mas dominios de fusion. Ejemplos conocidos de dichos dominios de fusion incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, Glu-Glu, glutation S transferasa (GST), tiorredoxina, protefna A, protefna G, una region constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Fc), protefna de union a maltosa (MBP) o albumina de suero humano. Puede seleccionarse un dominio de fusion para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusion son particularmente utiles para el aislamiento de protefnas de fusion por cromatograffa de afinidad. Para el fin de purificacion por afinidad, se usan matrices relevantes para cromatograffa por afinidad, tales como resinas glutation-, amilasa- y nfquel- o cobalto - conjugadas. Muchas de dichas matrices estan disponibles en forma de “estuche”, tal como el sistema de purificacion Pharmacia GST y el sistema QIAexpres™ (Qiagen) util con parejas de fusion (HIS6). Como otro ejemplo, puede seleccionarse un dominio de fusion para facilitar la deteccion de los polipeptidos ECD ALK1. Los ejemplos de dichos dominios de deteccion incluyen las diversas protefnas fluorescentes (por ej., GFP) asf como "etiquetas de epftopo", que son normalmente secuencias peptfdicas cortas para las que hay disponible un anticuerpo especffico. Las etiquetas de epftopos conocidas para las que hay facilmente disponibles anticuerpos monoclonales especfficos incluyen etiquetas FLAG, hemaglutinina del virus de la influenza (HA) y c-myc. En algunos casos, los dominios de fusion presentan un sitio de escision de proteasa, tal como para Factor Xa o Trombina, que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las protefnas de fusion y de ese modo se liberen las protefnas recombinantes de ahf. Las protefnas liberadas pueden aislarse despues del dominio de fusion por separacion cromatografica posterior. En ciertas realizaciones preferidas, se fusiona un polipeptido ECD ALK1 con un dominio que estabiliza el polipeptido ALK1 in vivo (un dominio “estabilizador”). Por “estabilizacion” se quiere decir cualquier cosa que incremente la semivida en suero, sin tener en cuenta si esto es debido a destruccion disminuida, remocion disminuida por el rinon u otro efecto farmacocinetico. Se sabe que las fusiones con la porcion Fc de una inmunoglobulina confieren propiedades farmacocineticas deseables en un amplio intervalo de protefnas. Asimismo, las fusiones a albumina de suero humano pueden conferir propiedades deseables. Otros tipos de dominios de fusion que pueden seleccionarse incluyen multimerizacion (por ejemplo, dimerizacion, tetramerizacion) de dominios y dominios funcionales.
Como un ejemplo especffico, la presente descripcion proporciona una protefna de fusion que comprende un dominio extracelular soluble de ALK1 fusionado a un dominio Fc (por ej., la SEC. ID N° 6).
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFN
WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK (A) VSNKALPV
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP
ENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSL
SLSPGK*
Opcionalmente, el dominio Fc presenta una o mas mutaciones en restos tales como Asp-265, lisina 322 y Asn-434. En ciertos casos, el dominio Fc mutante que tiene una o mas de estas mutaciones (por ejemplo, mutacion Asp-265) presenta capacidad reducida para unirse al receptor de Fcy respecto a un dominio Fc de tipo natural. En otros casos, el dominio Fc mutante que tiene una o mas de estas mutaciones (por ejemplo, mutacion Asn-434) presenta capacidad aumentada de union al receptor Fc relacionado con MHC de clase I (FcRN) respecto a un dominio Fc de tipo natural.
Se entiende que pueden disponerse diferentes elementos de las protefnas de fusion de cualquier manera que sea
10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
consistente con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un polipeptido ECD ALK1 puede colocarse en el C-terminal para un dominio heterologo, o alternativamente, puede colocarse un dominio heterologo en el C-terminal para un polipeptido ECD ALK1. El dominio del polipeptido ECD ALK1 y el dominio heterologo requieren no ser adyacentes en una protefna de fusion y pueden incluirse dominios o secuencias de aminoacidos adicionales en el C- o N- terminal para cualquier dominio o entre los dominios.
Como se usa en la presente memoria, el termino, "region Fc de la inmunoglobulina" o simplemente "Fc" se entiende que significa la porcion carboxilo terminal de una region constante de cadena de inmunoglobulina, preferiblemente una region constante de cadena pesada de inmunoglobulina o una porcion de la misma. Por ejemplo, una region Fc de la inmunoglobulina puede comprender: 1) un dominio CH1, un dominio CH2 y un dominio CH3, 2) un dominio CH1 y un dominio CH2, 3) un dominio CH1 y un dominio CH3, 4) un dominio CH2 y un dominio CH3 o 5) una combinacion de dos o mas dominios y una region bisagra de inmunoglobulina. En una realizacion preferida, la region Fc de la inmunoglobulina comprende al menos una region bisagra de inmunoglobulina un dominio CH2 y un dominio CH3 y preferiblemente carece del dominio CH1.
En una realizacion, la clase de inmunoglobulina de la que procede la region constante de cadena pesada es IgG (IgY) (subclases y 1, 2, 3 o 4). Se pueden usar otras clases de inmunoglobulina, IgA (Iga), IgD (Ig6), IgE (Ige) e IgM (Igp). La eleccion de la region constante de cadena pesada de inmunoglobulina apropiada se discute con detalle en las patentes de EE.UU. N° 5.541.087 y 5.726.044. La eleccion de secuencias de region constante de cadena pesada de inmunoglobulina, particulares, de ciertas clases y subclases de inmunoglobulina para conseguir un resultado particular se considera que esta dentro del alcance del experto en la materia. La porcion de la construccion de ADN que codifica la region Fc de la inmunoglobulina comprende preferiblemente al menos una porcion de un dominio bisagra y preferiblemente al menos una porcion de un dominio CH3 de Fc y o el dominio homologo en cualquiera de IgA, IgD, IgE o IgM.
Ademas, se considera que la sustitucion o supresion de aminoacidos dentro de las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina puede ser util en la practica de los metodos y las composiciones descritas en la presente memoria. Un ejemplo serfa introducir sustituciones de aminoacidos en la region CH2 superior para crear una variante de Fc con afinidad reducida por receptores Fc (Cole et al. (1.997) J. Immunol. 159:3.613).
En algunas realizaciones, la presente descripcion prepara formas aisladas y/o purificadas disponibles de los polipeptidos ECD ALK1, que son aislados de, o estan sustancialmente exentos de otro modo de (por ej., al menos 80%, 90%, 95%, 97% o 99% exentos de), otras protefnas y/u otra especie polipeptfdica ECD ALK1. Se produciran en general polipeptidos ALK1 por expresion de acidos nucleicos recombinantes.
En algunas realizaciones, la descripcion incluye acidos nucleicos que codifican polipeptidos ALK1 solubles que comprenden la secuencia codificadora para una porcion extracelular de una protefna ALK1. En realizaciones adicionales, esta descripcion tambien pertenece a una celula huesped que comprende tales acidos nucleicos. La celula huesped puede ser cualquier celula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipeptido de la presente descripcion puede expresarse en celulas bacterianas tales como E. coli, celulas de insecto (por ej., usando un sistema de expresion de baculovirus), levadura o celulas de mamffero. Otras celulas huesped adecuadas son conocidas por los expertos en la materia. De acuerdo con esto, algunas realizaciones de la presente descripcion pertenecen ademas a metodos para producir los polipeptidos ECD ALK1. Se ha establecido que una protefna de fusion ALK1-Fc explicada en la SEC. ID N° 3 y expresada en celulas CHO presenta una potente actividad anti- angiogenica.
3. Acidos nucleicos que codifican polipeptidos ALK1.
Tambien se describen en la presente memoria acidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican cualquiera de los polipeptidos ALK1 (por ej., polipeptidos ECD ALK1), incluyendo fragmentos, variantes funcionales y protefnas de fusion descritas en la presente memoria. Por ejemplo, la SEC. ID N° 2 codifica el polipeptido precursor de ALK1 humano que se encuentra en la naturaleza, mientras que la SEC. ID N° 4 codifica el precursor de un dominio extracelular de ALK1 fusionado a un dominio Fc de IgG1. Los acidos nucleicos objeto pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Dichos acidos nucleicos pueden ser moleculas de ADN o ARN. Se pueden usar estos acidos nucleicos, por ejemplo, en metodos para preparar polipeptidos ALK1 o como agentes terapeuticos directos (por ej., en una hebra complementaria, ARNi o propuesta de terapia genica).
En ciertos aspectos, se entiende ademas que los acidos nucleicos objeto que codifican los polipeptidos ALK1 incluyen acidos nucleicos que son variantes de la SEC ID N° 2 o 4. Las secuencias de nucleotidos variantes incluyen secuencias que difieren por una o mas sustituciones, adiciones o supresiones de nucleotidos, tales como variantes alelicas.
En algunas realizaciones, la descripcion proporciona secuencias de acidos nucleicos aisladas o recombinantes que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% identicas a la SEC. ID N° 2 o 4. Un experto en la materia apreciara que las secuencias de acidos nucleicos complementarias a la SEC. ID N° 2 o 4 y las variantes de la SEC ID N° 2 o 4 tambien estan dentro del alcance de esta descripcion. En realizaciones adicionales, las secuencias de acidos nucleicos de la descripcion pueden ser aisladas, recombinantes y/o fusionadas con una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
secuencia de nucleotidos heterologa o en una biblioteca de ADN.
Los acidos nucleicos de la descripcion tambien incluyen secuencias de nucleotidos que se hibridan en condiciones muy rigurosas a la secuencia de nucleotidos designada en la SEC. ID N° 2 o 4, secuencia complementaria de la SEC ID N° 2 o 4 o fragmentos de la misma. Como se discutio anteriormente, un experto en la materia entendera facilmente que las condiciones de rigurosidad apropiadas que activan la hibridacion de ADN se pueden variar. Un experto en la materia entendera facilmente que las condiciones de rigurosidad apropiadas que activan la hibridacion de ADN pueden variarse. Por ejemplo, se podia realizar la hibridacion a cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) x 6,0 a aproximadamente 45°C, seguido por un lavado de SSC x 2,0 a 50°C. Por ejemplo, la concentracion de sal en la etapa de lavado puede seleccionarse desde una baja rigurosidad de aproximadamente SSC x 2,0 a 50°C a una alta rigurosidad de aproximadamente SSC x 0,2 a 50°C. Ademas, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, a condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65°C. Tanto la temperatura como la sal pueden variarse o la temperatura o concentracion de sal puede mantenerse constante mientras se cambia la otra variable. En una realizacion, la descripcion proporciona acidos nucleicos que se hibridan en condiciones de baja rigurosidad de SSC x 6 a temperatura ambiente seguido por un lavado en SSC x 2 a temperatura ambiente.
Los acidos nucleicos aislados que difieren de los acidos nucleicos como se explica en las SEC ID N° 2 o 4 debido a la degeneracion en el codigo genetico tambien estan dentro del alcance de la descripcion. Por ejemplo, se designa un numero de aminoacidos por mas de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoacido o lo sinonimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinonimos para histidina) pueden dar como resultado mutaciones “silenciosas” que no afectan a la secuencia de aminoacidos de la proteina. Sin embargo, se espera que los polimorfismos de las secuencias de ADN que conducen a cambios en las secuencias de los aminoacidos de las proteinas objeto existiran entre celulas de mamifero. Un experto en la materia apreciara que estas variaciones en uno o mas nucleotidos (hasta aproximadamente 3-5% de los nucleotidos) de los acidos nucleicos que codifican una proteina particular pueden existir entre individuos de una especie determinada debido a la variacion alelica natural. Cualquiera y todas esas variaciones de nucleotidos y los polimorfismos de aminoacidos resultantes estan dentro del alcance de esta descripcion.
Los acidos nucleicos recombinantes de la descripcion pueden ligarse de manera operable a una o mas secuencias de nucleotidos reguladoras en una construccion de expresion. Las secuencias de nucleotidos reguladoras seran apropiadas en general para la celula huesped usada para expresion. Numerosos tipos de vectores de expresion apropiados y secuencias reguladoras adecuadas son conocidos en la tecnica para una variedad de celulas huesped. Tfpicamente, dichas una o mas secuencias de nucleotidos reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias activadoras, secuencias lfder o senal, sitios de union de ribosomas, secuencias de comienzo y terminacion transcripcional, secuencias de comienzo y terminacion de traduccion y secuencias potenciadoras o activadoras. Los activadores constitutivos o inducibles como se conocen en la tecnica estan considerados por la descripcion. Los activadores pueden ser activadores que se encuentren en la naturaleza o activadores hfbridos que combinen elementos de mas de un activador. Una construccion de expresion puede estar presente en una celula en un episoma, tal como un plasmido, o la construccion de expresion puede insertarse en un cromosoma. En una realizacion preferida, el vector de expresion contiene un gen marcador seleccionable para permitir la seleccion de celulas huesped transformadas. Los genes marcadores seleccionables son conocidos en la tecnica y variaran con la celula huesped usada.
El acido nucleico objeto puede proporcionarse en un vector de expresion que comprenda una secuencia de nucleotidos que codifique un polipeptido ALK1 y ligarse de manera operable a al menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras son reconocidas en la tecnica y se seleccionan para dirigir la expresion del polipeptido ALK1. De acuerdo con eso, el termino secuencia reguladora incluye activadores, potenciadores y otros elementos de control de expresion. Secuencias reguladoras ejemplares se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1.990). Por ejemplo, cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresion que controla la expresion de una secuencia de ADN cuando se liga de manera operable a ella puede usarse en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifiquen un polipeptido ALK1. Dichas secuencias de control de expresion utiles incluyen, por ejemplo, los activadores tempranos y tardfos de SV40, activador tet, activador temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, activadores de RSV, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, activador T7 cuya expresion se dirige por polimerasa ARN T7, el operador principal y regiones activadoras de fago lambda, las regiones de control para proteina de recubrimiento fd, el activador para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolfticas, los activadores de fosfatasa acida, por ej., Pho5, los activadores de los factores de apareamiento a de levaduras, el activador polihedro del sistema baculovirus y otras secuencias conocidas para controlar la expresion de genes de celulas procariotas o eucariotas o sus virus y varias combinaciones de los mismos. Se deberfa entender que el diseno del vector de expresion puede depender de dichos factores como la eleccion de la celula huesped que se tiene que transformar y/o el tipo de proteina deseado que se tiene que expresar. Ademas, el numero de copia del vector, la capacidad para controlar ese numero de copia y la expresion de cualquier otra proteina codificada por el vector, tales como marcadores de antibioticos, tambien deberfan considerarse.
Un acido nucleico recombinante incluido en la descripcion puede producirse por ligadura del gen clonado, o una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
porcion del mismo, a un vector adecuado para expresion en celulas procariotas, celulas eucariotas (levadura, especie aviar, insecto o mairnfero) o ambos. Los vehmulos de expresion para la produccion de un polipeptido ALK1 recombinante incluyen plasmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plasmidos de los tipos: plasmidos derivados de pBR322, plasmidos derivados de pEMBL, plasmidos derivados de pEX, plasmidos derivados de pBTac y plasmidos derivados de pUC para expresion en celulas procariotas, tales como E. coli.
Algunos vectores de expresion de mai^eras contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagacion del vector en las bacterias como una o mas unidades de transcripcion eucariotas que se expresan en celulas eucariotas. Los vectores procedentes de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresion de mai^eras adecuados para transinfeccion de celulas eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plasmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicacion y la seleccion de resistencia a farmacos en celulas tanto procariotas como eucariotas. Alternativamente, se pueden usar derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1) o virus Epstein-Barr (pHEBo, procedente de pREP y p205) para expresion transitoria de protemas en celulas eucariotas. Se pueden encontrar ejemplos de otros sistemas de expresion vmcos (incluyendo retroviral) a continuacion en la descripcion de sistemas de suministro de tratamiento genico. Los diversos metodos empleados en la preparacion de los plasmidos y en la trasformacion de organismos huesped son conocidos en la tecnica. Para otros sistemas de expresion adecuados para celulas tanto procariotas como eucariotas, asf como procedimientos recombinantes generales, vease Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.001). En algunos casos, puede ser deseable expresar los polipeptidos recombinantes por el uso de un sistema de expresion de baculovirus. Ejemplos de tales sistemas de expresion de baculovirus incluyen vectores procedentes de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores procedentes de pAcUW (tales como pAcUW1) y vectores procedentes de pBlueBac (tales como el (3-gal que contiene pBlueBac III).
Se puede disenar un vector para produccion de los polipeptidos ALK1 objeto en celulas CHO, tales como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vectores pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y vectores pCI-neo (Promega, Madison, Wisc.). Como sera evidente, se pueden usar las construcciones genicas objeto para ocasionar la expresion de los polipeptidos ALK1 objeto en celulas propagadas en el cultivo, por ejemplo, para producir protemas, incluyendo protemas de fusion o protemas variantes, para purificacion.
Esta descripcion tambien pertenece a una celula huesped transinfectada con un gen recombinante incluyendo una secuencia codificadora (por ej., la SEC. ID N° 2 o 4) para uno o mas de los polipeptidos ALK1 objeto. La celula huesped puede ser cualquier celula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipeptido ALK1 descrito en la presente memoria puede expresarse en celulas bacterianas tales como E. coli, celulas de insecto (por ej., usando un sistema de expresion de baculovirus), levadura o celulas de mai^ero. Otras celulas huesped adecuadas son conocidas por los expertos en la materia.
De acuerdo con eso, la presente descripcion se refiere ademas a metodos para producir los polipeptidos ALK1 objeto, incluyendo polipeptidos ECD ALK1. Por ejemplo, una celula huesped transinfectada con un vector de expresion que codifica un polipeptido ALK1 puede cultivarse en condiciones apropiadas para permitir que tenga lugar la expresion del polipeptido ALK1. El polipeptido ALK1 puede ser segregado y aislado de una mezcla de celulas y medio que contenga el polipeptido AlK1. Alternativamente, el polipeptido ALK1 puede ser retenido citoplasmicamente o en una fraccion de membrana y las celulas ser recogidas, lisadas y las protemas aisladas. Un cultivo celular incluye celulas huesped, medio y otros subproductos. Los medios adecuados para el cultivo de celulas son conocidos en la tecnica. Los polipeptidos ALK1 objeto pueden aislarse del medio de cultivo celular, celulas huesped o ambos, usando tecnicas conocidas en la tecnica para purificar protemas, incluyendo cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de filtracion en gel, ultrafiltracion, electroforesis, purificacion por inmunoafinidad con anticuerpos espedficos para epftopos particulares de los polipeptidos ALK1 y purificacion por afinidad con un agente que se une a un dominio fusionado al polipeptido ALK1 (por ej., puede usarse una columna de protemas A para purificar una fusion de ALK1-Fc). En una realizacion preferida, el polipeptido ALK1 es una protema de fusion que contiene un dominio que facilita su purificacion. En una realizacion preferida, la purificacion se consigue por una serie de etapas de cromatograffa de columna, incluyendo, por ejemplo, tres o mas de lo siguiente, en cualquier orden: cromatograffa en protema A, cromatograffa en Q-sefarosa, cromatograffa en fenilsefarosa, cromatograffa de exclusion por tamanos y cromatograffa de intercambio cationico. La purificacion podfa completarse con filtracion vffica e intercambio de tampon.
Un gen de fusion que codifica una secuencia ffder de purificacion, tal como una secuencia de sitio de escision de poli-(His)/enterocinasa en el N-terminal de la porcion deseada del polipeptido ALK1 recombinante, puede permitir la purificacion de la protema de fusion expresada por cromatograffa de afinidad usando una resina de metal Ni2+. La secuencia lfder de purificacion puede retirarse con posterioridad despues por tratamiento con enterocinasa para proporcionar el polipeptido ALK1 purificado (por ej., vease, Hochuli et al., (1.987) J. Chromatography 411: 177 y Janknecht et al., PNAS USA 88: 8.972).
Las tecnicas para preparar genes de fusion son conocidas. Esencialmente, la union de diversos fragmentos de ADN que codifiquen diferentes secuencias de polipeptidos se realiza de acuerdo con tecnicas convencionales, empleando terminos acabados en extremos romos o extremos escalonados para ligadura, digestion de enzima de restriccion
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
para proporcionar terminos apropiados, relleno de extremos cohesivos cuando sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la union no deseable y ligadura enzimatica. En otra realizacion, el gen de fusion puede sintetizarse por tecnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la multiplicacion PCR de fragmentos genicos puede realizarse usando cebadores de anclaje que den lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos genicos consecutivos que pueden hibridarse con posterioridad para generar una secuencia genica quimerica (vease, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1.992).
Los ejemplos de categorfas de compuestos de acidos nucleicos que son antagonistas de ALK1, BMP9, BMP10, GDF5, gDF6 o GDF7 incluyen acidos nucleicos de hebra complementaria, construcciones de ARNi y construcciones de acidos nucleicos catalfticas. Un compuesto de acido nucleico puede ser mono o bicatenario. Un compuesto bicatenario puede incluir tambien regiones de saliente o no complementaridad, en el caso de que una o la otra de las hebras sea monocatenaria. Un compuesto monocatenario puede incluir regiones de autocomplementaridad, que significa que el compuesto forma una estructura denominada “horquiMa” o “tallo-bude”, con una region de estructura de doble helice. Un compuesto de acido nucleico puede comprender una secuencia de nucleotidos que sea complementaria a una region que consista en no mas de 1.000, no mas de 500, no mas de 250, no mas de 100 o no mas de 50, 35, 30, 25, 22, 20 o 18 nucleotidos de la secuencia de acidos nucleicos ALK1 de longitud completa o secuencia de acidos nucleicos de ligandos. La region de complementaridad tendra preferiblemente al menos 8 nucleotidos y opcionalmente al menos 10 o al menos 15 nucleotidos y opcionalmente entre 15 y 25 nucleotidos. Una region de complementaridad puede encontrarse dentro de un intron, una secuencia codificadora o una secuencia no codificadora de la transcripcion objetivo, tal como la porcion de secuencia codificadora. En general, un compuesto de acido nucleico tendra una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 500 nucleotidos o pares de bases en longitud y opcionalmente la longitud sera aproximadamente 14 a aproximadamente 50 nucleotidos. Un acido nucleico puede ser un ADN (en particular para uso como una hebra complementaria), ARN o hfbrido ARN:ADN. Cualquier hebra puede incluir una mezcla de ADN y ARN, asf como formas modificadas que no pueden clasificarse facilmente como ADN o ARN. Asimismo, un compuesto bicatenario puede ser ADN:ADN, ADN:ArN o ARN:ARN y cualquier hebra puede incluir tambien una mezcla de ADN y ARN, asf como formas modificadas que no pueden clasificarse facilmente como ADN o ARN. Un compuesto de acido nucleico puede incluir cualquiera de una variedad de modificaciones, incluyendo una o modificaciones en la cadena principal (la porcion azucar-fosfato en un acido nucleico natural, incluyendo uniones internucleotido) o la porcion de la base (la porcion de purina o pirimidina de un acido nucleico natural). Un compuesto de acido nucleico de hebra complementaria tendra preferiblemente una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos y contendra con frecuencia una o mas modificaciones para mejorar las caracterfsticas tales como estabilidad en el suero, en una celula o en un lugar donde el compuesto es probable que se suministre, tal como el estomago en el caso de compuestos suministrados por via oral y el pulmon para compuestos inhalados. En el caso de una construccion de ARNi, la hebra complementaria para la transcripcion objetivo sera en general ARN o modificaciones del mismo. La otra hebra puede ser ARN, ADN o cualquier otra variacion. La doble porcion de construccion de ARNi “horquiMa” bicatenaria o monocatenaria presentara preferiblemente una longitud de 18 a 40 nucleotidos de longitud y opcionalmente aproximadamente 21 a 23 nucleotidos de longitud, mientras sirva como un sustrato Dicer. Los acidos nucleicos catalfticos o enzimaticos pueden ser ribozimas o enzimas de ADN y tambien pueden contener formas modificadas. Los compuestos de acidos nucleicos pueden inhibir la expresion del objetivo por aproximadamente 50%, 75%, 90% o mas cuando se ponen en contacto con celulas en condiciones fisiologicas y en una concentracion en la que un control de no transcripcion o transcripcion presenta poco efecto o ninguno. Las concentraciones preferidas para ensayar el efecto de los compuestos de acidos nucleicos son 1, 5 y 10 micromolar. Los compuestos de acidos nucleicos pueden ensayarse tambien para efectos sobre, por ejemplo, la angiogenesis.
4. Modificaciones en protefnas de fusion fc.
La solicitud proporciona ademas protefnas de fusion ALK1-Fc con regiones Fc logradas o variantes. Dichas protefnas de fusion Fc pueden ser utiles, por ejemplo, en la modulacion de funciones efectoras, tales como, citotoxicidad dependiente de antfgeno (ADCC, por sus siglas en ingles) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Adicionalmente, las modificaciones pueden mejorar la estabilidad de las protefnas de fusion Fc. Las variantes de las secuencias de aminoacidos de las protefnas de fusion Fc se preparan introduciendo cambios de nucleotidos apropiados en el ADN o por sfntesis de peptidos. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos dentro de las secuencias de aminoacidos de las protefnas de fusion Fc descritas en la presente memoria. Cualquier combinacion de supresion, insercion y sustitucion se realiza para llegar a la construccion final, siempre que la construccion final posea las caracterfsticas deseadas. Los cambios de aminoacidos tambien pueden modificar procedimientos postraduccion de las protefnas de fusion Fc, tales como cambiar el numero o la posicion de los sitios de glucosilacion.
Las protefnas de fusion Fc con funcion efectora reducida pueden producirse introduciendo cambios en la secuencia de aminoacidos, incluyendo, pero no limitandose a, la mutacion Ala-Ala descrita por Bluestone et al. (vease, la Patente Internacional WO 94/28027 y la Patente Internacional WO 98/47531; tambien vease Xu et al. 2.000 Cell Immunol 200; 16-26). Asf en algunas realizaciones, las protefnas de fusion Fc de la descripcion con mutaciones dentro de la region constante incluyendo la mutacion Ala-Ala pueden usarse para reducir o eliminar la funcion efectora. De acuerdo con estas realizaciones, las protefnas de fusion Fc pueden comprender una mutacion a una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
alanina en la posicion 234 o una mutacion a una alanina en la posicion 235 o una combinacion de los mismos. En una realizacion, la protefna de fusion Fc comprende un entramado IgG4, en el que la mutacion Ala-Ala describirfa una mutacion o mutaciones de fenilalanina a alanina en la posicion 234 y/o una mutacion de leucina a alanina en la posicion 235. En otra realizacion, la protefna de fusion Fc comprende un entramado IgG1, en el que la mutacion Ala- Ala describirfa una mutacion o mutaciones de leucina a alanina en la posicion 234 y/o una mutacion de leucina a alanina en la posicion 235. La protefna de fusion Fc puede portar alternativamente o adicionalmente otras mutaciones, incluyendo la mutacion puntual K322A en el dominio CH2 (Hezareh et al. 2.001 J Virol. 75: 12.161-8).
En realizaciones particulares, la protefna de fusion Fc puede modificarse para activar o inhibir la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Se puede conseguir actividad CDC modulada por introduccion de una o mas sustituciones, inserciones o supresiones de aminoacidos en una region Fc (vease, por ej., la patente de EE.UU. N° 6.194.551). Alternativamente o adicionalmente, puede introducirse un resto o restos cistefna en la region Fc, permitiendo de ese modo la formacion de enlace disulfuro entre cadenas en esta region. El anticuerpo homodimerico asf generado puede presentar capacidad de internalizacion mejorada o reducida y/o destruccion celular mediada por complemento aumentada o disminuida. Vease, Caron et al., J. Exp Med. 176:1.191-1.195 (1.992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2.918-2.922 (1.992), patente internacional WO 99/51642, Duncan & Winter Nature 322: 738-40 (1.988); Patente de EE.UU. N° 5.648.260; Patente de EE.UU. N° 5.624.821 y patente internacional WO 94/29351.
5. Metodos y composiciones para modular la angiogenesis y ciertos trastornos.
Las enfermedades asociadas a la angiogenesis incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide; soriasis; rubeosis; sfndrome de Osler-Webber; angiogenesis en el miocardio; neovascularizacion de las placas; telangiectasia; articulaciones hemofflicas y angiofibroma.
En algunas realizaciones de dichos metodos, se puede administrar uno o mas agentes terapeuticos polipeptfdicos, juntos (simultaneamente) o en momentos diferentes (secuencialmente). Ademas, se pueden administrar agentes terapeuticos polipeptfdicos con otro tipo de compuestos para inhibir la angiogenesis.
Un amplio grupo de compuestos convencionales ha demostrado tener actividades antineoplasicas. Estos compuestos se han usado como agentes farmaceuticos en quimioterapia para reducir tumores solidos, prevenir las metastasis y crecimiento adicional o disminuir el numero de celulas malignas en tumores malignos leucemicos o de medula osea. Aunque la quimioterapia ha sido eficaz en el tratamiento de varios tipos de tumores malignos, muchos compuestos antineoplasicos inducen efectos secundarios indeseables. Se ha demostrado que cuando dos o mas tratamientos diferentes se combinan, los tratamientos pueden actuar de manera sinergica y permitir la reduccion de la dosis de cada uno de los tratamientos, reduciendo de ese modo los efectos secundarios perjudiciales ejercidos por cada compuesto a dosis mayores. En otros casos, los tumores malignos que son resistentes a un tratamiento pueden responder a un tratamiento asociado de dos o mas tratamientos diferentes.
Cuando un agente terapeutico polipeptfdico descrito en la presente memoria es administrado en asociacion con otro agente antineoplasico convencional, de manera concomitante o de manera secuencial, dicho agente terapeutico puede mejorar el efecto terapeutico del agente antineoplasico o superar la resistencia celular a dicho agente antineoplasico. Esto permite la disminucion de la dosis de un agente antineoplasico, reduciendo de ese modo los efectos secundarios no deseables o restaura la eficacia de un agente antineoplasico en celulas resistentes.
Segun la presente descripcion, los agentes antiangiogenicos descritos en la presente memoria pueden usarse en asociacion con otras composiciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, se puede tratar un tumor de manera convencional con cirugfa, radiacion o quimioterapia asociada al antagonista del ALK1 o ligando ALK1 y despues puede administrarse con posterioridad el antagonista al paciente para extender la inactividad de las metastasis y estabilizar cualquier tumor primario residual.
Como se demuestra en la presente memoria, ALK1-Fc es eficaz para disminuir el fenotipo de un modelo de murina de artritis reumatoide. De acuerdo con esto, los agentes terapeuticos descritos en la presente memoria pueden usarse para el tratamiento de la artritis reumatoide y otro tipo de inflamacion osea o articular.
Ciertos procedimientos fisiologicos normales tambien estan asociados a la angiogenesis, por ejemplo, ovulacion, menstruacion y placentacion. Las protefnas que inhiben la angiogenesis de la presente descripcion son utiles en el tratamiento de la enfermedad de estimulacion excesiva o anormal de celulas endoteliales. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, adhesiones intestinales, aterosclerosis, esclerodermia y cicatrices hipertroficas, es decir, queloides. Tambien son utiles en el tratamiento de enfermedades que presentan angiogenesis como una consecuencia patologica tal como enfermedad por aranazo de gato (Rochele minalia quintosa) y ulceras (Helicobacter pylori).
Pueden usarse protefnas que inhiban la angiogenesis general como un agente de control de la natalidad reduciendo o evitando la vascularizacion uterina requerida para la implantacion de embriones. Asf, la presente descripcion proporciona un metodo de control de la natalidad cuando se administra a una mujer una cantidad de la protefna inhibitoria suficiente para evitar la implantacion del embrion. En un aspecto del metodo de control de la natalidad, se administra una cantidad de la protefna inhibitoria suficiente para bloquear la implantacion embrionaria antes o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
despues de la relacion sexual y que tenga lugar la fertilizacion, proporcionandose asf un metodo eficaz de control de la natalidad, posiblemente, un metodo ‘^a siguiente”. Aunque no se desea estar ligados por esta afirmacion, se cree que la inhibicion de la vascularizacion del endometrio uterino interfiere con la implantacion del blastocito. La inhibicion similar de la vascularizacion de la mucosa del tubo uterino interfiere con la implantacion del blastocito, evitandose la ocurrencia de un embarazo tubarico. Los metodos de administracion pueden incluir, pero no se limitan
а, pfldoras, inyecciones (intravenosa, subcutanea, intramuscular), supositorios, esponjas vaginales, tampones vaginales y dispositivos intrauterinos. Tambien se cree que la administracion de agentes que inhiben la angiogenesis de la presente descripcion interferiran con la vascularizacion mejorada normal de la placenta y tambien con el desarrollo de vasos dentro de un blastocisto implantado con exito y embrion y feto que se desarrolle.
En el ojo, la angiogenesis esta asociada a, por ejemplo, retinopatfa diabetica, retinopatfa de la prematuridad, degeneracion macular, rechazo del injerto corneal, glaucoma neovascular y fibroplasias retrolentales. Los agentes terapeuticos descritos en la presente memoria pueden administrarse por via intraocular o por otra administracion local al ojo. Ademas, como se muestra en los Ejemplos, se puede administrar ALK1-Fc de manera sistemica y aun presentar el efecto deseado sobre la angiogenesis ocular.
Otras enfermedades asociadas a la angiogenesis en el ojo incluyen, pero no se limitan a, queratoconjuntivitis epidemica, deficiencia de Vitamina A, uso excesivo de lentes de contacto, queratitis atopica, queratitis lfmbica superior, queratoconjuntivitis seca del pterigion, sjogren, acne rosaceo, filectenulosis, sffilis, infecciones por micobacterias, degeneracion lipfdica, quemaduras qufmicas, ulceras bacterianas, ulceras fungicas, infecciones por herpes simple, infecciones por herpes zoster, infecciones protozoarias, sarcoma de Kaposi, ulcera de Mooren, degeneracion marginal de Terrien, queratolisis marginal, artritis reumatoide, lupus sistemico, poliarteritis, traumatismo, sacoidosis de Wegener, escleritis, enfermedad de Steven's Johnson, queratomfa radial perifigoide y rechazo de injerto corneal, anemia falciforme, sarcoide, pseudoxantoma elastico, enfermedad de Paget, oclusion venosa, oclusion arterial, enfermedad obstructiva de la carotida, uveitis cronica/vitritis, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso sistemico, retinopatfa de prematuridad, enfermedad de Eales, enfermedad de Bechets, infecciones que causan retinitis o coroiditis, histoplasmosis ocular presunta, enfermedad de Best, miopia, criptas opticas, enfermedad de Stargart, pars planitis, desprendimiento de retina cronico, sindromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, complicaciones de traumatismos y postlaser. Otras enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedades asociadas a rubeosis (neovascularizacion del angulo) y enfermedades ocasionadas por la proliferacion anormal de tejido fibrovascular o fibroso incluyendo todas las formas de vitreorretinopatfa proliferativa.
Las afecciones del ojo se pueden tratar o evitar por, por ejemplo, inyeccion sistemica, topica, intraocular de un agente terapeutico o por insercion de un dispositivo de liberacion prolongada que libera un agente terapeutico. Un agente terapeutico puede suministrarse en un vehfculo oftalmico farmaceuticamente aceptable, de manera que el compuesto se mantenga en contacto con la superficie ocular durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el compuesto penetre en las regiones corneal e interna del ojo, como por ejemplo la camara anterior, camara posterior, cuerpo vftreo, humor acuoso, humor vftreo, cornea, iris/ciliar, lente, coroide/retina y esclerotica. El vehfculo oftalmico farmaceuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, una pomada, aceite vegetal o un material de encapsulamiento. Alternativamente, los agentes terapeuticos de la descripcion pueden inyectarse directamente en el humor vftreo y acuoso. En una alternativa adicional, los compuestos se pueden administrar por via sistemica, tal como por infusion intravenosa o inyeccion, para tratamiento del ojo.
Se puede administrar uno o mas agentes terapeuticos. Los metodos de la descripcion tambien incluyen la administracion conjunta con otros medicamentos que se usan para tratar afecciones del ojo. Cuando se administra mas de un agente o una combinacion de agentes y medicamentos, la administracion puede tener lugar de manera simultanea o de manera secuencial en el tiempo. Los agentes terapeuticos y/o medicamentos pueden administrarse por diferentes vfas de administracion o por la misma via de administracion. En una realizacion, se administran juntos un agente terapeutico y un medicamento en una formulacion farmaceutica oftalmica.
En una realizacion, se usa un agente terapeutico para tratar una enfermedad asociada a la angiogenesis en el ojo por administracion concurrente con otros medicamentos que actuan bloqueando la angiogenesis por mecanismos farmacologicos. Los medicamentos que pueden administrarse de manera concurrente con un agente terapeutico de la descripcion incluyen, pero no se limitan a, pegaptanib (Macugen™), ranibizumab (Lucentis™), lactato de escualamina (Evizon™), heparinasa y glucocorticoides (por ej., Triamcinolona). En una realizacion, se proporciona un metodo para tratar una enfermedad asociada a la angiogenesis se trata por administracion de una formulacion farmaceutica oftalmica que contiene al menos un agente terapeutico descrito en la presente memoria y al menos uno de los siguientes medicamentos: pegaptanib (Macugen™), ranibizumab (Lucentis™), lactato de escualamina (Evizon™), heparinasa y glucocorticoides (por ej., Triamcinolona).
б. Formulaciones y dosis eficaces.
Los agentes terapeuticos descritos en la presente memoria pueden formularse en composiciones farmaceuticas. Las composiciones farmaceuticas para uso segun la presente descripcion pueden formularse de manera convencional usando uno o mas portadores o excipientes fisiologicamente aceptables. Dichas formulaciones estaran en general sustancialmente exentas de pirogeno, conforme a la mayorfa de los requerimientos reguladores.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En algunas realizaciones, el metodo terapeutico de la descripcion incluye administrar la composicion por via sistemica o por via local como un implante o dispositivo. Cuando se administra, la composicion terapeutica para uso en esta descripcion esta en una forma fisiologicamente aceptable, exenta de pirogeno. Los agentes terapeuticamente utiles distintos de los antagonistas de senalizacion de ALK1 que tambien pueden estar incluidos opcionalmente en la composicion como se describio anteriormente, pueden administrarse de manera simultanea o de manera secuencial con los compuestos objeto (por ej., polipeptidos ECD ALK1 descritos en la presente memoria) en los metodos descritos en la presente memoria.
Tfpicamente, los agentes terapeuticos protefnicos descritos en la presente memoria se administraran por via parenteral y en particular por via intravenosa o por via subcutanea. Las composiciones farmaceuticas adecuadas para administracion parenteral pueden comprender uno o mas polipeptidos ECD ALK1 en asociacion con una o mas disoluciones acuosas o no acuosas, dispersiones, suspensiones o emulsiones, isotonicas, esteriles, farmaceuticamente aceptables o polvos esteriles que puedan reconstituirse en disoluciones o dispersiones inyectables esteriles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos, solutos que hacen la formulacion isotonica con la sangre del receptor destinado o agentes de suspension o espesantes. Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos, adecuados, que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas de la descripcion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener una fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de las dispersiones, y por el uso de tensioactivos.
En una realizacion, las protefnas ECD ALK1 descritas en la presente memoria se administran en una formulacion farmaceutica oftalmica. En algunas realizaciones, la formulacion farmaceutica oftalmica es una disolucion acuosa esteril, preferible de concentracion adecuada para inyeccion o un balsamo o pomada. Dichos balsamos o pomadas comprenden tfpicamente una o mas protefnas ECD ALK1 descritas en la presente memoria disueltas o suspendidas en una base de balsamo o pomada farmaceuticamente aceptable, esteril, tal como una base de aceite de parafina- vaselina blanca. En composiciones de balsamo o pomada, tambien puede estar incluida lanolina anhidra en la formulacion. Tambien se anaden preferiblemente timerosal o clorobutanol a dichas composiciones de pomada como agentes antimicrobianos. En una realizacion, la disolucion acuosa esteril es como se describe en la Patente de EE.UU. N° 6.071.958.
La descripcion proporciona formulaciones que pueden variarse para que se incluyan acidos y bases para ajustar el pH y agentes tamponantes para mantener el pH dentro de un intervalo estrecho. Se pueden anadir medicamentos adicionales a la formulacion. Estos incluyen, pero no se limitan a, pegaptanib, heparinasa, ranibizumab o glucocorticoides. La formulacion farmaceutica oftalmica segun la descripcion se prepara por manipulacion aseptica o esterilizacion en una fase de preparacion adecuada.
Las composiciones y formulaciones pueden presentarse, si se desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una o mas formas farmaceuticas unitarias conteniendo el principio activo. El envase puede comprender, por ejemplo, hoja fina de metal o de plastico, tal como un envase de ampollas. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompanado de instrucciones para administracion.
Ejemplos:
Ejemplo 1: Expresion de protefnas de fusion ALK1-Fc.
Los solicitantes construyeron una protefna de fusion ALK1 soluble que presenta el dominio extracelular de ALK1 humana fusionada a una Fc humana o ALK1 de raton fusionada a un dominio Fc de murina con un ligador mfnimo en medio. Las construcciones se refieren como hALK1-Fc y mALK1-Fc, respectivamente.
Se muestra hALK1-Fc como purificado de estirpes celulares de CHO en la Figura 3 (SEC. ID N° 3). Especialmente, mientras el C-terminal convencional del dominio extracelular de protefna ALK1 humana es el aminoacido 118 de la SEC. ID N° 1, se determina que es deseable evitar tener un dominio que termine en un resto glutamina. De acuerdo con esto, la porcion de la SEC. ID N° 3 que procede de ALK1 humana incorpora dos restos c-terminales a Q118, una leucina y una alanina. La descripcion, por lo tanto, proporciona polipeptidos ECD ALK1 (incluyendo protefnas de fusion Fc) que tienen un C-terminal de la secuencia procedente del ALK1 que es cualquier parte de 1 a 5 los aminoacidos aguas arriba (113-117 relativo a la SEC. ID N° 1) o aguas abajo (119-123) de Q118.
Las protefnas hALK1-Fc y mALK1-Fc se expresaron en estirpes celulares de CHO. Se consideraron tres diferentes secuencias lfder:
(i) Melitina de abeja (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEC. ID N° 7)
(ii) Activador de plasminogeno de tejidos (TPA, por sus siglas ingles): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEC. ID N° 8)
(iii) Natural: MTLGSPRKGLLMLLMALVTQG (SEC. ID N° 9).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La forma seleccionada emplea el lfder TPA y presenta la secuencia de aminoacidos no procesada mostrada en la Figura 4 (SEC. ID N° 5).
Este polipeptido es codificado por la secuencia de acidos nucleicos mostrada en la Figura 4 (SEC. ID N° 4).
Se puede conseguir purificacion por una serie de etapas de cromatograffa de columna, incluyendo, por ejemplo, tres o mas de lo siguiente, en cualquier orden: cromatograffa en protefna A, cromatograffa en Q-sefarosa, cromatograffa en fenilsefarosa, cromatograffa de exclusion por tamanos y cromatograffa de intercambio cationico. La purificacion podia completarse con filtracion vfrica e intercambio de tampon. La protefna hALK1-Fc se purifico a una pureza de >98% cuando se determina por cromatograffa de exclusion de tamanos y >95% cuando se determina por SDS PAGE.
Ejemplo 2: Identificacion de ligandos ALK1-Fc.
ALK1 es un receptor tipo I para miembros de la familia TGFp. Se ensayo en una variedad de miembros de la familia TGFp la union a una protefna de fusion ALK1-Fc humana, usando un sistema Biacore™. El propio TGFp, GDF8, GDF11, BMP2 y BMP4 fracasaron todos en mostrar la union sustancial a la protefna hALK1-Fc. BMP2 y BMP4 mostraron union limitada. GDF5, GDF7 y BMP9 mostraron union con valores de Kd de aproximadamente 5 x 10-8 M, 5x 10-8 M y 1 x 10'10 M, respectivamente. Basandose en la similitud de GDF5 y GDF7 a GDF6, se espera que GDF6 se una con similar afinidad. BMP10 esta estrechamente relacionado con BMP9 y tambien se espera que se una con afinidad similar.
Ejemplo 3: Caracterizacion de ALK1-Fc y efectos de anticuerpo anti-ALK1 sobre celulas endoteliales.
Usando una construccion informadora de luciferasa bajo el control de cuatro sitios SBE de consenso secuencial (SBE4-luc), que son sensibles a senalizacion mediada por Smad1/5/8, se midio la actividad mediada por BMP-9 en presencia y en ausencia de farmaco de hALK1-Fc o neutralizacion de anticuerpo monoclonal especffico de ALK1 en celulas HMVEC. Se estimularon celulas HMVEC con rhBMP-9 (50 ng/ml), que indujo activacion de la transcripcion mediada por Smad1/5/8 puesta de manifiesto en la presente por el aumento en la regulacion hacia arriba de la transcripcion modulada por SBE4-luc. Cuando se anade, el compuesto de hALK1-Fc (10 pg/ml) o anticuerpo (10 pg/ml) disminuyo su respuesta transcripcional, cada uno por casi 60%, indicando que la presencia de ALK1-Fc reduce significativamente la senalizacion de BMP9 y, por otra parte, que la senalizacion de BMP9 esta relacionada con la actividad de ALK1.
La activacion de fosforilacion de SMAD se usa comunmente para ensayar la activacion de los receptores de activina aguas arriba. Se sabe que ALK1 modula la fosforilacion de protefnas SMAD 1,5 y 8 en la activacion por este ligando. Aquf, se anaden rhBMP-9 (50 ng/ml) para iniciar la fosforilacion de SMAD en celulas HUVEC, una estirpe de celulas endoteliales humanas que expresa intrfnsecamente el receptor de ALK1 durante un transcurso del tiempo de 30 minutos. La fosforilacion de SMAD 1/5/8 se observo 5 minutos despues de tratamiento de las celulas con ligando y se mantuvo la fosforilacion durante la totalidad del periodo de 30 minutos. En presencia de concentraciones relativamente bajas de hALK1-Fc (250 ng/ml), se redujo la fosforilacion de SMAD 1/5/8, que confirma que este agente inhibe la activacion de Smad1/5/8 en celulas endoteliales.
Para evaluar el efecto angiogenico de ALK1-Fc en un sistema in vitro, se ensayo la eficacia del compuesto en la reduccion de la formacion de tubo de celulas endoteliales en un sustrato Matrigel. Esta tecnica se usa comunmente para valorar la neovascularizacion, proporcionando resultados tanto rapidos como altamente reproducibles. Se usa suplemento de crecimiento de celulas endoteliales (ECGS, por sus siglas en ingles) para inducir la formacion de microvasos a partir de celulas endoteliales en Matrigel y la eficacia de compuestos antiangiogenicos se estima despues como una reduccion de la formacion de cordon en presencia de tanto el farmaco como ECGS durante un transcurso de tiempo de 18 horas. Como se espera, la adicion de ECGS (200 ng/ml) indujo la formacion significativa de cordon, cuando se compara con el control negativo (no tratamiento anadido), que indica niveles basales de formacion de cordon de celulas endoteliales producidas en sustrato Matrigel (Fig. 5). En la adicion de hALK1-Fc (100 ng/ml) o mALK1-Fc (100 ng/ml), la formacion de cordon se redujo visiblemente. La cuantificacion final de la longitud del vaso en todas las muestras revelo que cada concentracion de hALK1-fc o mALK1-Fc redujo la neovascularizacion a niveles basales. Adicionalmente, hALK1-Fc y mALK1-Fc en presencia del factor fuertemente pro-angiogenico ECGS mantuvo fuerte inhibicion de neovascularizacion que demuestra actividad antiangiogenica incluso mas potente que el control negativo endostatina (100 ng/ml).
Ejemplo 4: Ensayos CAM.
Se sabe que VEGF y FGF estimulan la angiogenesis. Se uso un sistema de ensayo CAM (membrana corioalantoidea de pollo) para valorar los efectos angiogenicos de GDF7. Como se muestra en la Figura 6, GDF7 estimula la angiogenesis con una potencia que es similar a la de VEGF. Se observaron resultados similares con GDF5 y GDF6.
Se ensayaron fusiones ALK1-Fc para actividad antiangiogenica en el ensayo CAM. Estas protefnas de fusion mostraron un potente efecto antiangiogenico sobre la angiogenesis estimulada por VEGF, FGF y GDF7. Vease la Figura 7. BMP9 y PDGF mostraron una capacidad relativamente deficiente para inducir la angiogenesis en este
18
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ensayo, pero dicho efecto angiogenico de estos factores fue inhibido, sin embargo, por ALK1.
Las protemas ALK1-Fc y un anticuerpo monoclonal anti-VEGF antiangiogenico, comercialmente disponible, se compararon en el ensayo CAM. Las protemas ALK1-Fc presentaron una potencia similar cuando se compara con anti-VEGF. El anticuerpo anti-VEGF bevacizumab se usan normalmente en el tratamiento de cancer y degeneracion macular en seres humanos. Vease la Figura 8.
Curiosamente, un anticuerpo anti-ALK1 (R&D Systems) fracaso en inhibir significativamente la angiogenesis en este sistema de ensayo. Se espera que esto pueda reflejar la diferencia en la secuencia de ALK1 en diferentes especies.
Ejemplo 5: Ensayo de microbolsa corneal de raton.
El ensayo de microbolsa corneal de raton se uso para valorar los efectos de ALK1-Fc sobre la angiogenesis en el ojo de raton. hALK1-Fc, administrado por via intraperitoneal, inhibio significativamente la angiogenesis ocular. Como se muestra en la Figura 9, hALK1-Fc inhibio la angiogenesis ocular al mismo grado que anti-VEGF. Se usaron hALK1- Fc y anti-VEGF a identicas dosis peso/peso. Se obtuvieron datos similares cuando fue implantado un tapon Matrigel impregnado con VEGF en una posicion no ocular.
Estos datos demuestran que los ligandos de alta afinidad para ALK1 activan la angiogenesis y que una protema de fusion ALK1-Fc presenta una actividad antiangiogenica potente. Los ligandos para ALK1 se encuentran en dos categonas, teniendo el agrupamiento GDF5,6,7 una afinidad intermedia para ALK1 y teniendo el agrupamiento BMP9,10 una alta afinidad para ALK1.
Se localizan principalmente GDF5, 6 y 7 para hueso y articulaciones, mientras que BMP9 se hace circular en la sangre. Asf, parece haber un sistema proangiogenico de los huesos y articulaciones que incluye ALK1, GDF5, 6 y 7 y un sistema angiogenico sistemico que incluye ALK1 y BMP9 (y posiblemente BMP10).
Ejemplo 6: Modelo de murina de artritis reumatoide.
El modelo de artritis inducida por colageno de murina es un modelo aceptado de artritis reumatoide. En este estudio, se trataron grupos de 10 ratones con vehmulo, anti-VEGF (bevacizumab - como un control negativo, debido a que bevacizumab no inhibe VEGF de murina) o dosis de mALK1-Fc ("RAP-041") a 1 mg/kg, 10 mg/kg o 25 mg/kg. Despues del refuerzo de colageno el dfa 21 las valoraciones artrfticas (vease la Figura 10) y la hinchazon de la pata aumento constantemente en todos los grupos, dando un maximo alrededor del dfa 38. Los ratones tratados con mALK1-Fc ("RAP-041") mostraron valoraciones reducidas para ambas caractensticas, en particular a la dosis mas alta (25 mg/kg), aunque la reduccion no consiguio una significacion estadfstica. Sin embargo, es evidente la tendencia relacionada con la dosis.
Para la terminacion del estudio el dfa 42 la incidencia de artritis habfa alcanzado 10/10 en los ratones tratados con control de vehmulo, 9/10 en los ratones tratados con bevacizumab, 8/10 en el grupo tratado con mALK1-Fc a 1 mg/kg y 9/10 en el grupo tratado con 10 mg/kg de mALK1-Fc. En el grupo tratado con 25 mg/kg de mALK1-Fc la incidencia de enfermedad fue menor que 6/10.
Ejemplo ilustrativo 7: Modelo de murina de mieloma multiple.
El mieloma multiple es un cancer principalmente del hueso que se asocia a perdida sustancial de hueso. El modelo 5T2MM de mieloma en ratones se basa en el uso de celulas tumorales (celulas 5T2MM) de un tipo de tumor espontaneo que se desarrolla en ratones ancianos y causa efectos en los ratones que son similares a los observados en pacientes de mieloma multiple humanos. Vease, por ej., Vanderkerken et al., Methods Mol Med. 2.005; 113:191-205. Se ensayaron en mALK1-Fc efectos en este modelo.
Las celulas 5T2MM inyectadas en ratones C57BL/KaLwRij potencian un aumento en superficie osteoclastica, la formacion de lesiones osteolfticas y produjeron una disminucion en area osea. La enfermedad osea se asocia a una disminucion en el numero de osteoblastos, superficie de osteoblastos y una reduccion en la mineralizacion.
Se trataron ratones que soportaban celulas 5T2MM con mALK1-Fc (RAP-041) (10 mg/kg, i. p. dos veces a la semana) o un vehmulo, desde el momento de la inyeccion de 5T2MM, durante un total de 12 semanas. El analisis MicroCT de la tibia proximal y las vertebras lumbares demostro una reduccion estadfsticamente significativa en el volumen de hueso esponjoso y numero trabecular en ratones que soportaban 5T2MM comparado con ratones vftgenes (volumen oseo reducido por 40% respecto a los controles; numero trabecular reducido por 40%). RAP-041 evito completamente disminuciones inducidas por 5T2MM en volumen oseo y numero trabecular cuando se compara con ratones tratados con vehmulo (los ratones tratados teman un volumen oseo de 120% respecto a los controles no tumorados y numero trabecular de 115% respecto a controles no tumorados). Adicionalmente, los ratones tratados con tumor desarrollaron lesiones oseas lfticas que fueron detectadas por microCT. El tratamiento de mALK1-Fc redujo el numero de lesiones oseas lfticas por 50% respecto a ratones tratados con vehmulo.
Basandose en los efectos antiangiogenicos de ALK1-Fc, se deduce que el efecto protector para el hueso proporcionado por este agente es una consecuencia de crecimiento disminuido del tumor.
Por lo tanto, ALK1-Fc puede usarse para tratar mieloma multiple y para disminuir los efectos de enfermedad osea que resulte de este tipo de tumor.
Tomados juntos, los hallazgos descritos en estos Ejemplos proporcionan numerosos reactivos, descritos en la presente memoria, para inhibir la angiogenenesis in vivo, y en particular angiogenesis ocular. Estos hallazgos 5 tambien indican que los agentes fijados como objetivo para GDF5, 6 y 7 pueden usarse para inhibir de manera selectiva la angiogenesis osea y articular. Estos hallazgos indican ademas que dichos agentes pueden usarse para tratar la artritis reumatoide.
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Una protefna de fusion ALK1-Fc que comprende un polipeptido con una secuencia de aminoacidos que es al menos 97% identica a la secuencia de aminoacidos 22-118 de la SEC ID N° 1, en la que la protefna de fusion ALK1- Fc inhibe la angiogenesis estimulada por VEGF, FGF y GDF7, para uso en: (a) inhibicion de angiogenesis en un5 mamffero o (b) tratamiento de artritis reumatoide en un mamffero.
- 2. La protefna de fusion ALK1-Fc para uso segun la reivindicacion 1, en la que la protefna de fusion ALK1-Fc inhibe la angiogenesis estimulada por VEGF, FGF y GDF7 en un ensayo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM).
- 3. La protefna de fusion ALK1-Fc para uso segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en la que la protefna de fusion ALK1-Fc se une a GDF5, GDF7 y BMP9 con una Kd menor que 1 x 10-7 M y se une a TGFp-1 con una Kd10 mayor que 1 x 10-6 M.
- 4. La protefna de fusion ALK1-Fc para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la porcion Fc es una porcion Fc de una IgG1 humana.
- 5. La protefna de fusion ALK1-Fc para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEC ID N° 3.15 6. Una preparacion farmaceutica, que esta opcionalmente sustancialmente exenta de pirogeno, que comprende unaprotefna de fusion ALK1-Fc para uso como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
- 7. La preparacion para uso segun la reivindicacion 6, que es una formulacion farmaceutica oftalmica.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US85659206P | 2006-11-02 | 2006-11-02 | |
US856592P | 2006-11-02 | ||
PCT/US2007/023217 WO2008057461A2 (en) | 2006-11-02 | 2007-11-02 | Alk1 receptor and ligand antagonists and uses thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2612755T3 true ES2612755T3 (es) | 2017-05-18 |
Family
ID=39365087
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES07861684.4T Active ES2612755T3 (es) | 2006-11-02 | 2007-11-02 | Antagonistas de receptor y ligando de ALK1 y usos de los mismos |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US8455428B2 (es) |
EP (2) | EP2087001B1 (es) |
JP (5) | JP2010508816A (es) |
KR (3) | KR20150008889A (es) |
CN (2) | CN101652387A (es) |
AU (1) | AU2007317926A1 (es) |
BR (1) | BRPI0717964A2 (es) |
CA (1) | CA2668411C (es) |
DK (1) | DK2087001T3 (es) |
ES (1) | ES2612755T3 (es) |
IL (2) | IL198522A (es) |
MX (1) | MX2009004718A (es) |
RU (2) | RU2559532C2 (es) |
WO (1) | WO2008057461A2 (es) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8764725B2 (en) | 2004-02-09 | 2014-07-01 | Covidien Lp | Directional anchoring mechanism, method and applications thereof |
US7897581B2 (en) * | 2005-02-24 | 2011-03-01 | Massachusetts Eye & Ear Infirmary | Methods and compounds for promoting vessel regression |
US10059756B2 (en) * | 2006-11-02 | 2018-08-28 | Acceleron Pharma Inc. | Compositions comprising ALK1-ECD protein |
MX2009004718A (es) | 2006-11-02 | 2009-06-19 | Acceleron Pharma Inc | Antagonistas de receptor de alk1 y ligando y sus usos. |
US8642031B2 (en) | 2006-11-02 | 2014-02-04 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of BMP9, BMP10, ALK1 and other ALK1 ligands, and uses thereof |
TW200924796A (en) * | 2007-11-09 | 2009-06-16 | Genentech Inc | Activin receptor-like kinase-1 compositions and methods of use |
US7855564B2 (en) * | 2008-02-14 | 2010-12-21 | Delaware Capital Formation, Inc. | Acoustic wave device physical parameter sensor |
KR20180029111A (ko) * | 2008-05-02 | 2018-03-19 | 악셀레론 파마 인코포레이티드 | 혈관신생 및 혈관주위세포 적용범위의 조정을 위한 alk1 길항제 기재의 방법 및 조성물 |
CA2724525A1 (en) * | 2008-05-15 | 2009-11-19 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of bmp9, bmp10, alk1 and other alk1 ligands, and uses thereof |
WO2010126169A1 (ja) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | 協和発酵キリン株式会社 | Alk1阻害剤を有効成分とする血管障害を抑制するための医薬組成物 |
WO2011056494A1 (en) * | 2009-10-26 | 2011-05-12 | Genentech, Inc. | Activin receptor-like kinase-1 antagonist and vegfr3 antagonist combinations |
JP6250533B2 (ja) * | 2011-04-20 | 2017-12-20 | アクセレロン ファーマ インコーポレイテッドAcceleron Pharma,Inc. | エンドグリンポリペプチドおよびその使用 |
KR101421171B1 (ko) * | 2011-08-31 | 2014-07-22 | 재단법인 제이씨비 공동생물과학연구소 | 인간 골형성 단백질 수용체 1a의 세포외 도메인을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 |
EP2809335A4 (en) * | 2012-02-02 | 2015-10-28 | Acceleron Pharma Inc | ALK1 ANTAGONISTS AND USES THEREOF IN THE TREATMENT OF NEPHROCARCINOMA |
KR20220013459A (ko) | 2013-10-25 | 2022-02-04 | 악셀레론 파마 인코포레이티드 | 섬유화 질환을 치료하기 위한 엔도글린 펩티드 |
WO2015147908A1 (en) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | Acceleron Pharma, Inc. | Use of activin receptor-like kinase 1 (alk-1) antagonists in the treatment of cancer |
GB201412290D0 (en) | 2014-07-10 | 2014-08-27 | Cambridge Entpr Ltd | Novel use |
JP2016036322A (ja) * | 2014-08-11 | 2016-03-22 | 日本化薬株式会社 | 血管新生因子と結合するキメラタンパク質 |
MA53883A (fr) | 2015-04-06 | 2021-08-18 | Acceleron Pharma Inc | Protéines de fusion de récepteur type i et type ii à bras unique et leurs utilisations |
BR112017021510A2 (pt) * | 2015-04-06 | 2018-07-03 | Acceleron Pharma Inc | heteromultímeros do receptor tipo i e tipo ii da superfamília tgf-beta e sua utilização |
BR112017021484A2 (pt) | 2015-06-05 | 2018-07-03 | Novartis Ag | anticorpos de direcionamento à proteína morfogenética óssea 9 (bmp9) e métodos para os mesmos |
CN105254764A (zh) * | 2015-08-27 | 2016-01-20 | 上海康岱生物医药技术有限公司 | ACVR1-Fc融合蛋白及其制法和用途 |
US20210403549A1 (en) * | 2017-05-17 | 2021-12-30 | Yale University | Compounds and compositions that inhibit or prevent lipoprotein entry into the endothelium |
Family Cites Families (60)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8529014D0 (en) | 1985-11-25 | 1986-01-02 | Biogen Nv | Enhanced secretion of heterologous proteins |
JPS63502716A (ja) | 1986-03-07 | 1988-10-13 | マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー | 糖タンパク安定性の強化方法 |
EP0307434B2 (en) | 1987-03-18 | 1998-07-29 | Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. | Altered antibodies |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5096815A (en) | 1989-01-06 | 1992-03-17 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides |
US5198346A (en) | 1989-01-06 | 1993-03-30 | Protein Engineering Corp. | Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides |
US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6673986B1 (en) | 1990-01-12 | 2004-01-06 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
AU633698B2 (en) | 1990-01-12 | 1993-02-04 | Amgen Fremont Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US6150584A (en) | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
CA2104964A1 (en) | 1991-02-28 | 1992-08-29 | Ruth Sager | Cancer diagnosis and therapy with tumor suppressor genes |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
US5776427A (en) | 1992-03-05 | 1998-07-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for targeting the vasculature of solid tumors |
US5965132A (en) | 1992-03-05 | 1999-10-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors |
AU5541094A (en) | 1992-10-30 | 1994-05-24 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Compositions and methods for modifying the regulatory activity of tgf-beta |
US5830847A (en) | 1992-10-30 | 1998-11-03 | Hsc Research & Development Limited Partnership | Soluble TGF-β-binding endoglin polypeptides and homodimers |
ATE234920T1 (de) | 1992-11-17 | 2003-04-15 | Ludwig Inst Cancer Res | Aktivin-rezeptor-ähnliche kinasen, proteine mit serin/threonin kinase domänen und deren anwendungen |
US6692925B1 (en) | 1992-11-17 | 2004-02-17 | Ludwig Institute For Cancer Research | Proteins having serine/threonine kinase domains, corresponding nucleic acid molecules, and their use |
US7592428B1 (en) | 1992-11-17 | 2009-09-22 | Ludwig Institute For Cancer Research | Antibodies which bind specifically to activin receptor like kinases |
CA2153654A1 (en) | 1993-01-12 | 1994-07-21 | Se-Jin Lee | Growth differentiation factor-5 |
US5885573A (en) | 1993-06-01 | 1999-03-23 | Arch Development Corporation | Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies |
JPH08511420A (ja) | 1993-06-16 | 1996-12-03 | セルテック・セラピューテイクス・リミテッド | 抗 体 |
US5541087A (en) | 1994-09-14 | 1996-07-30 | Fuji Immunopharmaceuticals Corporation | Expression and export technology of proteins as immunofusins |
JP2000514777A (ja) | 1995-08-14 | 2000-11-07 | クリエイティブ バイオモレキュールズ,インコーポレイテッド | 骨形成タンパク質(op−1)およびそのアナログの細胞表面レセプターalk−1およびそのアナログへの結合 |
US6190660B1 (en) | 1996-05-31 | 2001-02-20 | Health Research, Inc. | Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in antiangiogenic therapy |
CA2256413C (en) | 1996-05-31 | 2007-07-03 | Health Research Inc. | Anti-endoglin monoclonal antibodies and their use in antiangiogenic therapy |
MX9701946A (es) | 1997-03-14 | 1998-04-30 | Arturo Jimenez Bayardo | Solucion oftalmica transportadora. |
WO1998047531A2 (en) | 1997-04-21 | 1998-10-29 | Arch Development Corporation | Fc receptor non-binding anti-cd3 monoclonal antibodies deliver a partial tcr signal and induce clonal anergy |
EP1071765A4 (en) | 1998-03-13 | 2003-01-15 | Ludwig Inst Cancer Res | ALK-1 REACTS TO TGF-BETA AND CONTINUOUSLY SIGNALS BY SMAD-1 AND SMAD-5 |
EP1068241B1 (en) | 1998-04-02 | 2007-10-10 | Genentech, Inc. | Antibody variants and fragments thereof |
US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
US6413513B1 (en) | 1998-05-22 | 2002-07-02 | Entremed, Inc. | Compositions and methods for inhibiting endothelial cell proliferation and regulating angiogenesis using cancer markers |
US20030012792A1 (en) | 1998-05-22 | 2003-01-16 | Holaday John W. | Compositions and methods for inhibiting endothelial cell proliferation and regulating angiogenesis using cancer markers |
KR20020092779A (ko) * | 1999-06-03 | 2002-12-12 | 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 | 혈관형성 단백질 및 이의 용도 |
US7740841B1 (en) | 2000-01-28 | 2010-06-22 | Sunnybrook Health Science Center | Therapeutic method for reducing angiogenesis |
US7077836B2 (en) | 2000-07-21 | 2006-07-18 | Vein Rx, Inc. | Methods and apparatus for sclerosing the wall of a varicose vein |
WO2002011785A2 (en) | 2000-08-03 | 2002-02-14 | The University Of Utah Research Foundation | Manipulation of arterial-venous identity |
DE10043481A1 (de) | 2000-09-04 | 2002-04-11 | Vectron Therapeutics Ag Imt | Humaner Antikörper gegen Endoglin (CD105) und seine Verwendung |
ES2278079T3 (es) | 2001-10-31 | 2007-08-01 | Alcon, Inc. | Proteinas morfogenicas oseas (bmp), receptores de bmp y proteinas de union a bmp y su utilizacion en el diagnostico y en el tratamiento del glaucoma. |
WO2003064628A2 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-07 | Curagen Corporation | Novel proteins and nucleic acids encoding same |
US7045534B2 (en) * | 2002-02-12 | 2006-05-16 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods of reducing angiogenesis |
WO2003093293A2 (en) | 2002-04-29 | 2003-11-13 | Saint Louis University | Peptide antagonists of tgf-beta family members and therapeutic uses thereof |
US20060160729A1 (en) | 2002-06-27 | 2006-07-20 | Li Dean Y | Methods and compositions for manipulating the guided navigation of endothelial tubes during angiogenesis |
AU2003287444A1 (en) | 2002-10-31 | 2004-05-25 | The General Hospital Corporation | Repairing or replacing tissues or organs |
WO2005010049A2 (en) | 2003-07-09 | 2005-02-03 | Eli Lilly And Company | Tgf-beta1 ligands |
WO2005044849A2 (en) | 2003-08-05 | 2005-05-19 | Eli Lilly And Company | Lp mammalian proteins; related reagents |
EP1697520A2 (en) | 2003-12-22 | 2006-09-06 | Xencor, Inc. | Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites |
WO2005116850A2 (en) | 2004-01-27 | 2005-12-08 | Compugen Ltd. | Differential expression of markers in ovarian cancer |
WO2005113590A2 (en) * | 2004-05-12 | 2005-12-01 | Acceleron Pharma Inc. | Bmp10 propeptides and related methods |
CA2574777C (en) * | 2004-07-23 | 2015-09-01 | Acceleron Pharma Inc. | Actrii receptor polypeptides, methods and compositions |
US7897581B2 (en) * | 2005-02-24 | 2011-03-01 | Massachusetts Eye & Ear Infirmary | Methods and compounds for promoting vessel regression |
AU2006223301B2 (en) * | 2005-03-10 | 2010-11-04 | Eisai, Inc. | Anti-mesothelin antibodies |
PT2447283E (pt) | 2005-09-07 | 2015-10-08 | Pfizer | Anticorpos monoclonais humanos para cinase-1 tipo recetor de activina (alk-1) |
WO2007143023A1 (en) | 2006-05-31 | 2007-12-13 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Soluble endoglin compounds and uses thereof for the treatment and prevention of cancer |
MX2009004718A (es) * | 2006-11-02 | 2009-06-19 | Acceleron Pharma Inc | Antagonistas de receptor de alk1 y ligando y sus usos. |
US8642031B2 (en) | 2006-11-02 | 2014-02-04 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of BMP9, BMP10, ALK1 and other ALK1 ligands, and uses thereof |
TW200924796A (en) | 2007-11-09 | 2009-06-16 | Genentech Inc | Activin receptor-like kinase-1 compositions and methods of use |
KR20180029111A (ko) | 2008-05-02 | 2018-03-19 | 악셀레론 파마 인코포레이티드 | 혈관신생 및 혈관주위세포 적용범위의 조정을 위한 alk1 길항제 기재의 방법 및 조성물 |
CA2724525A1 (en) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of bmp9, bmp10, alk1 and other alk1 ligands, and uses thereof |
-
2007
- 2007-11-02 MX MX2009004718A patent/MX2009004718A/es active IP Right Grant
- 2007-11-02 EP EP07861684.4A patent/EP2087001B1/en active Active
- 2007-11-02 KR KR1020147033523A patent/KR20150008889A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-11-02 WO PCT/US2007/023217 patent/WO2008057461A2/en active Application Filing
- 2007-11-02 RU RU2009120695/10A patent/RU2559532C2/ru active
- 2007-11-02 AU AU2007317926A patent/AU2007317926A1/en not_active Abandoned
- 2007-11-02 CA CA2668411A patent/CA2668411C/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-11-02 KR KR1020177001896A patent/KR20170012582A/ko not_active Application Discontinuation
- 2007-11-02 ES ES07861684.4T patent/ES2612755T3/es active Active
- 2007-11-02 BR BRPI0717964-2A patent/BRPI0717964A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2007-11-02 EP EP16189344.1A patent/EP3181580A1/en not_active Withdrawn
- 2007-11-02 CN CN200780044656A patent/CN101652387A/zh active Pending
- 2007-11-02 US US11/982,738 patent/US8455428B2/en active Active
- 2007-11-02 CN CN202010267166.5A patent/CN111518218A/zh active Pending
- 2007-11-02 DK DK07861684.4T patent/DK2087001T3/en active
- 2007-11-02 KR KR1020097011291A patent/KR101581961B1/ko active IP Right Grant
- 2007-11-02 JP JP2009535341A patent/JP2010508816A/ja not_active Withdrawn
-
2009
- 2009-05-03 IL IL198522A patent/IL198522A/en active IP Right Grant
-
2013
- 2013-05-31 US US13/907,798 patent/US20130344067A1/en not_active Abandoned
- 2013-07-08 JP JP2013142324A patent/JP2013199496A/ja not_active Withdrawn
- 2013-07-22 RU RU2013134324/10A patent/RU2013134324A/ru not_active Application Discontinuation
-
2015
- 2015-04-24 JP JP2015089239A patent/JP6348448B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-06-20 IL IL253035A patent/IL253035A0/en unknown
- 2017-08-25 US US15/686,588 patent/US20170354731A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-04-03 JP JP2018071503A patent/JP2018127471A/ja not_active Withdrawn
-
2020
- 2020-06-24 JP JP2020108938A patent/JP2020150955A/ja active Pending
-
2021
- 2021-12-09 US US17/546,983 patent/US20220296708A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2612755T3 (es) | Antagonistas de receptor y ligando de ALK1 y usos de los mismos | |
US20210388104A1 (en) | Methods and compositions for modulating angiogenesis and pericyte composition | |
US9452197B2 (en) | Antagonists of BMP9, BMP10, ALK1 and other ALK1 ligands, and uses thereof | |
JP2014031380A (ja) | アクチビン−ActRIIa拮抗薬およびFSH分泌を低減または阻害するための使用 | |
US20130202594A1 (en) | ALK1 Antagonists and Their Uses in Treating Renal Cell Carcinoma | |
WO2009139891A2 (en) | Antagonists of bmp9, bmp10, alk1 and other alk1 ligands, and uses thereof | |
US20220017600A1 (en) | Methods and compositions for modulating angiogenesis and pericyte composition | |
WO2023022968A2 (en) | Compositions and methods for treating renal diseases or conditions | |
AU2018279010A1 (en) | ALK1 receptor and ligand antagonists and uses thereof | |
AU2014200003A1 (en) | ALK1 receptor and ligand antagonists and uses thereof |