NO339766B1 - VEGF-feller og terapeutiske anvendelser derav - Google Patents

Description

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Oppfinnelsesområdet

Oppfinnelsen omfatter et isolert nukleinsyremolekyl som koder for et fusjonspolypeptid som angitt i krav 1, og hvilket peptid er i stand til å binde vaskulær, endotelcelle-vekstfaktor (VEGF), VEGF-familiemedlemmer, samt vaskulær endotelialcelle vekstfaktor-fusjonspolypeptid som kodes av slike nukleinsyremolekyler som angitt i krav 2. Oppfinnelsen angår også en VEGF-felle som angitt i krav 6 og som er nyttig ved behandling av okulær sykdom som angitt i krav 9 og 10.

KORTFATTET OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I en utførelsesform angår oppfinnelsen et isolert nukleinsyremolekyl som koder for et fusjonspolypeptid som består av reseptorkomponentene (R1R2)Xhvori RI er vaskulær, endotelcelle-vekstfaktor (VEGF) reseptorkomponent Ig-område 2 på Flt-1 (FltlD2), R2 er VEGF reseptorkomponent Ig-område 3 på Flk-1 (FlklD3), og hvori x = 1.

I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen en monomerisk VEGF-felle eller fusjonspolypeptid som består av VEGF- reseptorkomponentene (R1R2)Xhvori x = 1, og RI, R2 er som definert ovenfor. VEGF-reseptorkomponentene RI, R2 kan være direkte forbundet med hverandre eller forbundet via en eller flere avstandssekven-ser. Oppfinnelsen omfatter en monomerisk VEGF-felle som hovedsakelig består av VEGF-reseptorkomponentene (R1R2)Xog funksjonelt ekvivalente aminosyrevarian-ter av disse.

For det tredje viser oppfinnelsen et isolert nukleinsyremolekyl som koder for et fusjonspolypeptid som består av VEGF-reseptorkomponentene (R1R2)Xog en fusjonspartner (FP) komponent utvalgt fra gruppen som består av en multimeriserende komponent (MC). I en foretrukket utførelse er FP en multimeriserende komponent (MC) som er i stand til å interagere med en multimeriserende komponent på et annet fusjonspolypeptid for å danne en multimerisk struktur, f.eks. en dimer eller trimer. Aller helst blir MC utvalgt fra gruppen som består av (i) en multimeriserende komponent som består av en spaltbar region (C-region), (ii) en avkortet multimeriserende komponent, (iii) en aminosyresekvens mellom 1 til ca. 200 aminosyrer i lengde som har minst et cysteinresiduum, (iv) en leucin-zipper, (v) et helix loop motiv, (vi) et coil-coil motiv, og (vii) et immunoglobulin-område. Fusjonspolypeptider som i hovedsak består av (R1R2)X, og FP er også omfattet av dette.

For det fjerde, viser oppfinnelsen et fusjonspolypeptid som består av VEGF-reseptorkomponentene (R1R2)Xog FP som beskrevet ovenfor. Reseptorkomponentene kan bli stilt opp på forskjellige måter, f.eks. (R1R2)X-FP; (R1R2)X-FP-(R1R2)X; FP-(R2R1)X, osv. Fusjons-polypeptidets komponenter kan bli direkte bundet til hverandre eller bundet via en avstandssekvens.

For det femte, viser oppfinnelsen en VEGF-felle som består av en multimer av to eller flere fusjonspolypeptider som består av VEGF-komponentene (R1R2)Xog FP hvori FP-komponenten er en multimeriserende komponent (MC) som består av en C-region. C-regionen kan være naturlig forekommende eller kunstig og kan opptre på ethvert punkt innen den multimeriserende komponenten og funksjonerer for å tillate spalting av en opphavs-MC til en avkortet MC. En VEGF-felle bestående av to eller flere polypeptider som har minst en avkortet MC, blir betegnet "en avkortet mini-felle". C-regionen kan dannes i MC ved innsetting, delesjon eller mutasjon slik at et en-zymatisk eller kjemisk spaltbart sete, blir dannet. C-regionen kan dannes i ethvert MC og på enhver posisjon innen MC, fortrinnsvis blir C-regionen dannet i et full lengde Fc-område eller et fragment av dette eller et CH3-område. C-regionen kan være et sete som kan spaltes ved hjelp av et enzym så som trombin, ficin, pepsin, matrilysin eller prolydase eller kjemisk spaltet ved f.eks. maursyre eller CuCI2.

For det sjette viser oppfinnelsen en avkortet VEGF-mini-felle som er et multimerisk protein som består av to eller flere fusjonspolypeptider som består av (R1R2)Xog en multimeriserende komponent som er avkortet ved spalting fra en forelder-MC som består av en C-region (tMC).

For det syvende viser oppfinnelsen et fusjonspolypeptid som består av VEGF-(R1R2)Xog et MC hvori MC er en aminosyresekvens mellom 1 til ca. 200 aminosyrer i lengde, som består av minst et cysteinresiduum, hvori minst et cysteinresiduum er i stand til å danne en disulfidbinding med et cysteinresiduum som er til stede i Mcet på et annet fusjonspolypeptid (cMC). I en foretrukken utførelse er cMC en aminosyresekvens mellom 1 til 50 aminosyrer i lengde som består av minst et cysteinresiduum. I en mer foretrukken utførelse, er cMC en aminosyresekvens mellom 1-15 aminosyrer i lengde som består av minst en aminosyre. I en enda mer foretrukken utførelse er cMC en aminosyresekvens mellom 1-10 aminosyrer i lengde som består av 1-2 cysteinresiduer. Et eksempel på denne utførelsen av oppfinnelsen er vist i SEQ ID NO:27 som har en signalsekvens (1-26) fulgt av RI (27-129) og R2 (130-231) komponenter, fulgt av ni aminosyresekvenser som ender i et cysteinresiduum. I en annen utførelse, vist i SEQ ID NO:28 er en signalsekvens (1-26) fulgt av Rl-(27-129) og R2-(130-231) komponenter fulgt av en seks-aminosyresekvens som ender i et cysteinresiduum.

For det åttende, viser oppfinnelsen en VEGF-mini-felle som består av en multimer av to eller flere fusjonspolypeptider som består av (R1R2)Xog et cMC. I en mer spesifikk utførelse er mini-fellen en dimer. Et eksempel på denne utførelsen av oppfinnelsens mini-felle er en dimer av fusjonspolypeptidet vist i SEQ ID NO:2, hvori hvert fusjonspolypeptid (R1R2-CMC) har en molekylvekt på 23,0 kD og en pl på 9,22.

I en annen utførelse er cMC 4 aminosyrer i lengde som består av to cysteinresiduer, f.eks. XCXC (SEQ ID NO:3). I et eksempel på denne utførelsen av oppfinnelsen består mini-fellen av oppfinnelsens VEGF- reseptorkomponenter og et cMC som består av ACGC (SEQ ID NO:4). Et eksempel på denne utførelsen av oppfinnelsens mini-felle er en dimer av fusjonspolypeptidet vist i SEQ ID NO:5, hvori hver monomer har en molekylvekt på 23,2 kD og et pl på 9,22. Et annet eksempel på denne utfø-relsen av oppfinnelsen er vist i SEQ ID NO:26 som har en signalsekvens (1-26) fulgt av RI (27-129) og R2 (130-231) komponenter, fulgt av en ni-aminosyresekvens som ender i CPPC.

I alle utførelser av oppfinnelsens VEGF-felle (inkludert avkortet VEGF mini-felle, VEGF mini-feller, og monomeriske VEGF mini-feller), en signalsekvens (S) kan inkluderes i starten (eller N-terminalen) på oppfinnelsens fusjonspolypeptid. SignaI-sekvensen kan være iboende i cellen, rekombinant eller syntetisk. Således kan et fusjonspolypetid bli betegnet som, f.eks., S-(R1R2)Xnår en signalsekvens er bundet til en førstereseptor-komponents N-terminal.

Fusjonspolypeptid-komponentene kan være bundet direkte til hverandre eller være bundet via spacere. I spesifikke utførelser, er en eller flere reseptorer og/eller f u-sjons-polypeptidets fusjonspartner-komponenter direkte bundet til hverandre uten spacere. I andre utførelser er en eller flere reseptorer og/eller fusjonspartnerkom-ponenter forbundet med spacere. Oppfinnelsen omfatter vektorer som består av oppfinnelsens nukleinsyremolekyler som inkluderer ekspresjonsvektorer som består av nukleinsyremolekyler som er operativt bundet til en ekspresjonskontrollsekvens. Nukleinsyremolekylet ifølge oppfinnelsen kan benyttes i vertsvektorsystemer til produksjon av et fusjonspolypeptid som består av ekspresjonsvektoren, i en passende vertscelle, vertsvektorsystemer hvori den passende vertscellen er en bakterie-, gjær, insekt- eller pattedyrcelle; en E. Co//'-celle eller en COS- eller CHO-celle. Oppfinnelsens VEGF-feller modifisert ved acetylering eller pegylering er i tillegg omfattet. Metoder for å acetylere eller pegylere et protein er velkjent i faget.

For det niende, viser oppfinnelsen en metode for å produsere en av oppfinnelsens VEGF-fusjonspolypeptider, som består av å dyrke en vertscelle transfektert med en vektor som består av en av oppfinnelsens nukleinsyresekvenser, under betingelser som er passende for å uttrykke proteinet fra vertscellen, og for å fange opp det resulterende fusjonspolypeptidet.

Oppfinnelsens VEGF-feller er terapeutisk nyttige for å behandle enhver sykdom eller tilstand som blir helbredet, lindret eller hemmet ved fjerning, hemming eller reduksjon av VEGF. En ikke uttømmende liste over spesifikke tilstander som blir bedret ved hemming eller reduksjon av VEGF inkluderer f.eks., uønsket plasmalekkasje, eller vaskulær permeabilitet, uønsket blodkarvekst, f.eks. i en tumor, ødem assosi-ert med inflammatoriske forstyrrelser som f.eks. psoriasis eller artritt inkludert reumatoid artritt, astma; generalisert ødem i forbindelse med brannskade; ascites og pleural effusjon i forbindelse med tumorer, inflammasjon eller skade; kronisk luftveisinflammasjon; astma; kapillært lekkasjesyndrom; sepsis; nyresykdom i forbindelse med økt protein lekkasje; pankreatisk duktalt adenokarcinom (PDAC) og øyesykdommer som f.eks. aldersrelatert makulær degenerasjon og diabetes retinopati. VEGF-mini-fellen er spesielt nyttig i behandling av øyesykdommer og som en adjuvans til øyekirurgi, som inkluderer operasjon av glaukom; og behandling av intraokulære tumorer, som f.eks. uvealt melanom, retinoblastom, via intravitreal tilførsel.

Følgelig, for det tiende kan VEGF-feller ifølge oppfinnelsen benyttes i en behand-lingsmetode for å behandle en VEGF-relatert sykdom eller tilstand, som består av å administrere en av oppfinnelsens VEGF-feller til et individ som lider av en VEGF-relatert sykdom eller tilstand. Selv om ethvert pattedyr kan behandles med dette, er individer som lider av, eller er i risikosonen for, en sykdom eller tilstand som kan forbedres, lindres, hemmes eller behandles med en VEGF-felle, den foretrukne pa-sient.

For det ellevte, kan fusjonspolypeptidene ifølge oppfinnelsen videre benyttes i diagnostiske og prognostiske metoder, så vel som utstyrssett for å påvise, kvantifisere og/eller monitorere VEGF med oppfinnelsens mini-feller.

For det tolvte, viser oppfinnelsen anvendelse av farmasøytiske sammensetninger som inneholder en av oppfinnelsens VEGF-feller med en farmasøytisk akseptabel bærer. Slike farmasøytiske sammensetninger kan bestå av en dimerisk fusjonspolypeptid-felle eller nukleinsyrer som koder for fusjonspolypeptidet. Oppfinnelsens mini-feller blir spesifikt brukt i tilstander hvor en VEGF-felle med redusert serumhalveringstid (f.eks. hurtigere clearance) og/eller økt vevspenetrasjon p.g.a. mindre størrelse, er ønskelig. Spesifikke applikasjoner for VEGF- mini-fellen inkluderer, f.eks., i sykdommer hvor lokal administrasjon til et spesifikt vev eller en spesifikk celle er ønskelig. Eksempler på en slik tilstand eller sykdom er øyets okulære sykdommer.

Andre mål eller fordeler vil bli tydelige i en gjennomgåelse av den nedenstående, detaljerte beskrivelse.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Før foreliggende metoder blir beskrevet, må det forstås at denne oppfinnelsen ikke er begrenset til spesielle metoder og eksperimentelle forsøksbetingelser beskrevet, fordi slike metoder og betingelser kan variere. Det må også være forstått at termi-nologien som brukes her har til hensikt bare å beskrive spesielle utførelser.

Som brukt i denne spesifikasjonen og de vedlagte krav, inkluderer både ubestemt og bestemt entallsform flertal Is referanse r med mindre konteksten klart tilsier noe annet. Således inkluderer f.eks., en referanse til "en metode", en eller flere metoder, og/eller trinn av typen som blir beskrevet i dette, og/eller som vil bli tydelig for faglærte personer når de leser denne redegjørelsen, og så videre.

Hvis ikke annerledes definert, har alle tekniske og vitenskapelige termer som blir brukt i dette, samme betydning som det som vanligvis forstås av en som har vanlige ferdigheter i faget som denne oppfinnelsen tilhører. Selv om hvilken som helst metode og hvilket som helst materiell som er likt eller ekvivalent til det som beskri-ves i dette, kan bli brukt i praktisering eller testing av denne oppfinnelsen, blir de foretrukne metodene og det foretrukne materiellet nå beskrevet.

Generell beskrivelse

Oppfinnelsen omfatter en VEGF-felle ifølge krav 6 og som er i stand til å binde og hemme VEGF-aktivitet hvor fellen er en monomer eller multimer av én eller flere fusjonspolypeptider. Oppfinnelsens molekyler binder og hemmer VEGFs biologiske aktivitet og/eller den fysiologiske reaksjon eller respons. For en beskrivelse av VEGF-reseptor-baserte antagonist VEGF-feller FltlD2.FlklD3.FcACl(a) (SEQ ID NOS:7-8) og VEGFRlR2-FcACl(a) (SEQ ID NOS:9-10), se PCT WO/0075319.

Oppfinnelsens mini-felle er mindre enn fellen i full størrelse, f.eks. ca. 50-60kD mot opphavsfellens 120 kD og inkluderer monomeriske feller som består vesentlig av VEGF reseptorområder (R1R2)X, feller generert ved spalting av en part av en opp-havsmultimerisert felle som har en fusjonspartnerkomponent som er en multimeriserende komponent (MC) som inneholder et restriksjonsområde (C-region); eller ved å tilknytte et cysteinresiduum eller aminosyresekvens som inneholder en eller flere cysteinresiduer til eller mellom reseptorkomponent-områder. I spesifikke utfø-relser er oppfinnelsens mini-felle mindre enn ca. 60 kD målt ved SDS-PAGE-analyse; mer fortrukket, ca. 50 kD og enda mer foretrukket ca. 20-30 kD; eller den er ca. 25 kD og i stand til å binde VEGF med en affinitet som kan sammenlignes med en opphavsfelle i full størrelse beskrevet i PCT/US00/14142.

Nukleinsyrekonstruksjoner og -uttrykk

Den foreliggende oppfinnelse angår konstruksjonen av nukleinsyremolekyler som koder for fusjonspolypeptider som er i stand til å binde VEGF alene eller multime-riserte VEGF-feller. Oppfinnelsens nukleinsyremolekyler kan kode forvill type RI, R2 og/eller R3 reseptorkomponenter, eller funksjonelt ekvivalente varianter av disse. Aminosyresekvens-varianter av RI, R2 og/eller R3 reseptorkomponenter av oppfinnelsens feller, kan også bli dannet ved å lage mutasjoner i kodende nukleinsyremolekylene. Slike varianter inkluderer f.eks. utelatelse av eller innsetting eller substitusjon av, aminosyreresiduer innen RI, R2 or/eller R3s aminosyresekvenser. Enhver kombinasjon av fjerning, innsetting og substitusjon kan gjøres for å oppnå en sluttkonstruksjon, under forutsetning av at den endelige konstruksjonen har evnen til å binde og hemme VEGF.

Disse nukleinsyremolekylene er satt inn i en vektor som er i stand til å uttrykke fusjonspolypeptider når den blir introdusert i en passende vertscelle. Passende vertsceller inkluderer, men er ikke begrenset til, bakterie-, gjær, insekt- og patte- dyrceller. Hvilken som helst av metodene, som er kjent for en faglært i innsetting av DNA fragmenter i en vektor, kan brukes for å konstruere ekspresjonsvektorer som koder for oppfinnelsens fusjonspolypeptider under kontroll av transkripsjons-/translasjonskontrollsignaler.

Oppfinnelsens nukleinsyremolekylers ekspresjon kan reguleres ved en annen nuk-leinsyresekvens, slik at molekylet blir uttrykt i en vert som er transformert med det rekombinante DNA-molekylet. For eksempel kan ekspresjon bli kontrollert med hvilket som helst promoterende/forsterkende element kjent i faget. Promotere som kan brukes for å kontrollere ekspresjon av kimeriske polypeptidmolekyler inkluderer, men er ikke begrenset til, en lang terminalgjentagelse (Squinto et al. (1991) Cell 65:1-20); SV40 tidlig promoter-region, CMV, M-MuLV, tymidinkinase-promoter, metallotionin-genets regulerende sekvenser; prokaryotiske ekspresjonsvektorer, slik som p-laktamase-promoter eller tac-promoter (se også Scientific American

(1980) 242:74-94), promoter-elementer fra gjær eller andre sopper slik som Gal 4-promoter, ADH, PGK, alkalisk fosfatase og vevsspesifikke transkripsjons-kontrollområder derivert fra gener, slike som elastase 1.

Ekspresjonsvektorer som er i stand til å bli replikert i en bakteriell eller eukariotisk vert som består av oppfinnelsens nukleinsyremolekyler, blir brukt for å transfektere verten og derigjennom dirigere slike nukleinsyrers ekspresjon for å produsere oppfinnelsens fusjonspolypeptider som danner feller som er i stand til å binde seg til VEGF. Transfekterte celler kan forbigående eller, fortrinnsvis, konstitutivt og per-manent uttrykke oppfinnelsens VEGF-felle.

Oppfinnelsens feller kan bli renset ved hvilken som helst teknikk som tillater etter-følgende dannelse av en stabil biologisk aktiv felle. For eksempel kan faktorer bli gjenopprettet fra celler enten som løselige proteiner eller som inklusjonslegemer, fra hvilke de kan kvantitativt ekstraheres ved 8M guanidiniumhydroklorid og dialyse (se f.eks. US patentnr. 5,663,304). For videre å rense faktorene, kan konvensjonell ionebyttekromatografi, hydrofob interaksjons- kromatografi, revers fasekromato-grafi eller gelfiltrering bli brukt.

VEGF reseptorkomponenter

VEGF reseptorkomponentene i VEGF-mini-fellen består av Ig-området 2 på Flt-1 (FltlD2) (RI), Ig-område 3 på Flk-1 (FlklD3) (R2) (sammen, R1R2). Betegnelsen "Ig-område" på Flt-1, Flt-4 eller Flk-1 har til hensikt å omfatte ikke bare det full- stendige vill-type-området, men også varianter hvor noe er satt inn, fjernet og/eller substituert, noe som stort sett gjør at man kan beholde det intakte områdets funksjonelle egenskaper. Det vil snart bli åpenbart for en faglært at utallige varianter av Ig-området ovenfor kan oppnås, noe som gjør at de samme funksjonelle egenskapene som i vill-type-området, kan beholdes.

Når det brukes med henvisning til RI eller R2, har betegnelsen "funksjonelle ekvi-valenser" til hensikt å omfatte et RI- eller R2-område med minst en endring, f.eks. fjerning, tillegg og/eller substitusjon, noe som hovedsakelig bevarer de samme funksjonelle egenskapene som vill-type RI- eller R2-områdene, dvs., en hovedsakelig ekvivalent binding til VEGF. Det vil bli oppfattet at forskjellige aminosyresub-stitusjoner kan gjøres i RI og R2 uten at man fjerner seg fra oppfinnelsens mål med hensyn til evnen disse reseptorkomponentene har til å binde og inaktivere VEGF. De funksjonelle egenskapene til oppfinnelsens feller kan bestemmes ved enhver passende screeningtest kjent i faget, som måler ønskede egenskaper. Eksempler på slike tester er beskrevet i forsøkskapitlet under, noe som gir anledning til å bestemme fellenes bindingsegenskaper for VEGF (Kd), og deres dissosiasjonshalve-ringstide til felleligandkomplekset (Ti/2). Andre tester, f.eks. en endring i evnen til å binde seg spesifikt til VEGF, kan måles ved en konkurransetype VEGF-bindingstest. Modifisering av proteinegenskaper som f.eks. termisk stabilitet, hydrofobisitet, mot-tagelighet for proteolytisk nedbryting eller tendens til aggregering, kan måles med metoder kjent for faglærte personer.

Fusjonspolypeptidets komponenter kan bindes direkte til hverandre eller bli bundet via spacere. Vanligvis betyr betegnelsen "spacer" (eller bindinger) en eller flere molekyler, f.eks. nukleinsyrer eller aminosyrer eller ikke-peptid-enheter, slik som polyetylenglykol, som kan settes inn mellom en eller flere komponentområder. For eksempel, kan spacersekvenser brukes for å fremskaffe et ønsket sete mellom komponenter, for å lette manipulering. En spacer kan også fremskaffes for å forsterke fusjonspolypeptidets ekspresjon fra en vertscelle, for å senke sterisk hind-ring slik at komponentene kan oppta sin optimale tertiære struktur og/eller interagere passende med sitt målmolekyl. For spacere og metoder for å identifisere ønskede spacere, se f.eks. George et al. (2003) Protein Engineering 15:871-879. En spacersekvens kan inkludere en eller flere aminosyrer som er naturlig bundet til en reseptorkomponent eller være en tillagt sekvens for å forsterke funsjonspolypep-tidenes ekspresjon, fremskaffe spesifikt ønskede interesseseter, tillate komponentområder å danne optimale, tertiære strukturer og/eller forsterke en komponents interaksjon med dens målmolekyl. I en utførelse omfatter spaceren en eller flere peptidsekvenser mellom en eller flere komponenter som er mellom 1-100 aminosyrer, fortrinnsvis 1-25.

I de mest spesifikke utførelsene er RI aminosyrer 27-126 i SEQ ID NO:8, eller 1-126 i SEQ ID NO:8 (inkludert signalsekvensen 1-26); eller aminosyre 27-129 i SEQ ID NO: 10, eller 1-129 i SEQ ID NO: 10 (inkludert signalsekvensen 1-26). I de mest spesifikke utførelsene er R2 aminosyrer 127-228 i SEQ ID NO:8, eller aminosyrer 130-231 i SEQ ID NO: 10. Nar, f.eks., R2 blir plassert på N-terminalen på fusjonspolypeptidet, kan en signalsekvens med fordel komme foran reseptorkomponenten. Reseptorkomponenten(e) bundet til den multimeriserende komponenten kan videre omfatte en spacerkomponent, f.eks., GPG-sekvensen til aminosyrene 229-231 i

SEQ ID NO:7.

Fusjonspartner og multimeriserende komponenter

Fusjonspartneren er en hvilken som helst komponent som forsterker fusjonspolypeptidets funksjonalitet. Således kan en fusjonspartner f.eks. forsterke fusjons-polypeptidets biologiske aktivitet, hjelpe dens dannelse og/eller reetablering eller forsterke fusjonspolypeptidets farmakologiske egenskap eller farmakokinetiske pro-fil ved f.eks. å øke serumhalveringstid, vevspenetrasjon, mangel på immunogenisi-tet eller stabilitet. I foretrukne utførelser blir fusjonspartneren utvalgt fra gruppen som består av en multimeriserende komponent, et serumprotein eller et molekyl som er i stand til å binde et serumprotein.

Når fusjonspartneren er et serumprotein eller fragment av dette, blir det utvalgt fra gruppen som består av oc-l-mikroglobulin, AGP-1, orosomuciod, oc-l-surt glykopro-tein, vitamin D-bindende protein (DBP), hemopexin, humant serumalbumin (hSA), transferrin, ferritin, afamin, haptoglobin, a-fetoprotein tyroglobulin, a-2-HS-glykoprotein, p-2-glykoprotein, hyaluronanbindende protein, syntaxin, C1R, Clq-lenke, galektin3-Mac2-bindende protein, fibrinogen, polymerisk Ig-reseptor (PIGR), a-2-makroglobulin, ureatransportprotein, haptoglobin, IGFBPs, makrofag scavenger reseptor, fibronektin, giantin, Fc, a-l-antikyromotrypsin, a-l-antitrypsin, antitrom-bin III, apolipoprotein A-I, apolipoprotein B, p-2-mikroglobulin, ceruloplasmin, komplement komponent C3 eller C4, Cl esterasehemmer, C-reaktivt protein, cysta-tin C og protein C. I en mer spesifikk utførelse blir fusjonspartneren utvalgt fra gruppen som består av a-l-mikroglobulin, AGP-1, orosomuciod, a-l-syreglyko-protein, vitamin D-bindende protein (DBP), hemopexin, humant serumalbumin (hSA), afamin og haptoglobin. Innsetting av en fusjonspartnerkomponent kan øke serumhalveringstiden til oppfinnelsens fusjonspolypeptid når det er ønsket. Se, f.eks., US patentnr. 6,423,512, 5,876,969, 6,593,295 og 6,548,653. hSA er vidt fordelt i hele kroppen, spesielt i tarm- og blodkomponentene, og har en viktig rolle i vedlikehold av osmolalitet og plasmavolum. Det blir langsomt metabolisert i leve-ren, og har en typisk in vivo halveringstid på 14-20 dager i mennesker (Waldmann et al. (1977) Albumin, Structure Function and Uses; Pergamon Press; s. 255-275).

Når en fusjonspartner er et molekyl som er i stand til å binde et serumprotein, kan molekylet være et syntetisk, lite molekyl, et lipid eller en liposom, en nukleinsyre

som inkluderer en syntetisk nukleinsyre så som en aptomer, et peptid eller et oligo-sakkarid. Molekylet kan videre være et protein slik som f.eks., FcyRl, FcyR2, FcyR3, polymerisk Ig-reseptor (PIGR), ScFv, og andre antistoff-fragmenter spesifikke til et serumprotein.

Når fusjonspartneren er en multimeriserende komponent (MC) er det en hvilken som helst naturlig eller syntetisk sekvens som er i stand til å interagere med en annen MC for å danne en høyere ordensstruktur, f.eks. en dimer, en trimer etc. Passende MC-ere kan inkludere en leucin- zipper, inkluderende leucin zipper-områder avledet fra c-jun eller c-fos; sekvenser avledet fra konstante regioner av kappa eller lambda lettkjeder; syntetiske sekvenser så som helix-loop-helix motiver (Muller et al. (1998) FEBS Lett. 432:45-49), coil-coil motiver, etc. eller andre generelt aksepterte multimeriserende områder kjent i faget. I noen utførelser består fusjonskomponenten av et immunoglobulin-derivert område fra, f.eks., humant IgG, IgM eller IgA. I spesifikke utførelser kan det immunoglobulin-avledete området bli utvalgt fra gruppen som består av Fc-området på IgG, IgGs tunge kjede og IgGs lette kjede. IgGs Fc-område kan velges ut fra isotypene IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4, såvel som hvilken som helst allotype innen hver isotypegruppe. I et eksempel i oppfinnelsens VEGF-felle er den multimeriserende komponenten et IgG4 Fc-område (SEQ ID NO:29).

Dannelse av forkortede VEGF-mini-feller

I en utførelse av oppfinnelsens felle, blir en forkortet VEGF-mini-felle som består av to eller flere av oppfinnelsens fusjonspolypeptider dannet ved å utsette en opphavsfelle som har en C-region inneholdende MCer, under betingelser hvor en eller flere C-regioninneholdende MCer blir spaltet.

Den C-regioninneholdende MCen kan være en hvilken som helst MC som er i stand til å interagere med en annen MC for å danne en høyere ordensstruktur, f.eks. en dimer eller en trimer. C-regionen kan dannes på et hvilket som helst ønsket sted innen en MC. I lys av veiledningen som blir gitt i eksempelet nedenfor, vil en som er faglært være i stand til å velge ut et ønsket sete for dannelse av en C-region basert på de resulterende, avkortede felles ønskede egenskaper, f.eks. molekylvekt, monomerisk eller dimerisk etc.

I en spesifikk utførelse er C-regionen et trombinrestriksjonssete (LVPRGS) (SEQ ID NO:6) som er satt inn i et FcACl-område etterfulgt av den N-terminale CPPC-sekvensen (SEQ ID NO:l). I denne utførelsen blir en fullstørrelse opphavs-VEGF-fellekonstruksjon uttrykt i en celle som et Fc-merket protein, derved tillater den opptak og rensing på, f.eks., en Protein A søyle. Etter dannelse av en dimer og kovalent binding mellom en eller flere av CPPC-sekvensens cysteinresiduer (SEQ ID NO: 1), blir dimeren utsatt for trombin under betingelser som spalter en eller begge FcACl-områdene slik at avkortede, dimeriske mini-feller som har en molekylvekt på ca 50 kD-90kD og som har en affinitet til VEGF sammenlignbar med forelderfellen, blir dannet. Spaltingsbetingelsene kan kontrolleres av en faglært for å favorisere dannelse av et partielt spalteprodukt eller et fullt spalteprodukt, valg av spaltebe-tingelser blir gjort med det for øyet at et spesielt produkt skal ha spesielle egenskaper, så som molekylvekt.

I en spesifikk utførelse er C-regionen et trombinrestriksjonssekte (LVPRGS) (SEQ ID NO:6) satt inn i et FcACl-område N-terminal til CPPC-sekvensen (SEQ ID NO:l). Etter dannelse av en dimer og kovalent binding mellom en eller begge CPPC-sekvensens cysteinresiduer (SEQ ID NO: 1), blir dimeren utsatt for trombin under betingelser hvor en eller begge FcACl-områdene opptrer, og avkortede monomeriske mini-feller blir dannet. Den monomeriske, avkortede mini-fellen som således dannes, består av en reseptorkomponent og et lite fragment av Fc-et og har en størrelse på ca. 25 kD og uttrykker en redusert affinitet for VEGF sammenlignet med den avkortede, dimeriske fellen og opphavsfellen i full lengde. En lignende monomerisk felle dannet som et rekombinant protein, har vist seg å ha en KDpå ca. 1 nM.

Dannelse av VEGF-mini-feller

I en utførelse viser oppfinnelsen VEGF mini-feller som har en eller flere reseptor-komponentområder (R1R2)Xhvor X = 1, Y = 1 og RI og R2 er som definert ovenfor og om ønskes, en fusjonspartner som fortrinnsvis er et MC-område som er en aminosyre-sekvens mellom 1 til ca. 200 aminosyrer i lengde og som inneholder minst et cysteinresiduum, hvor minst et cysteinresiduum er i stand til å danne en disulfidbinding med et cysteinresiduum som finnes i MC-et til et annet fusjonspolypeptid (cMC). cMC-et kan opptre i et fusjonspolypeptids N-terminal eller C-terminal eller mellom to reseptorkomponent-områder. I en spesifikk utførelse blir cystein lagt til VEGF-reseptorkomponentens C-terminal, f.eks., R1R2C, som tillater at fusjonspolypeptidet danner kovalente dimere ved dannelse av en kovalent disulfidbinding mellom cysteinresiduet på et fusjonspolypeptids C-terminal og cysteinresiduet på et annet fusjonspolypeptids C-terminal. I dette eksempelet, er mini-fellen en dimer av fusjonspolypeptidet vist i SEQ ID NO:2, hvor hvert fusjonspolypeptid (R1R2-CMC eller R1R2C) har en molekylvekt på ca. 23,0 kD.

I en annen utførelse er cMC-et en sekvens på 4 aminosyrer (XXXX) (SEQ ID NO: 11) hvor X er en hvilken som helst aminosyre og sekvensen inneholder minst et cysteinresiduum. I en spesifikk utførelse er cMC-en lagt til et reseptorkomponent-områdes C-terminal. I en mer spesifikk utførelse er 4-aminosyresekvensen ACGC (SEQ ID NO:4) og cMC-et danner to disulfidbindinger med cysteinresiduer som er til stede i et annet fusjonspolypeptid. Som vist under (tabell 2), uttrykker begge mini-felle-eksemplene en affinitet til VEGF som er sammenlignbar med opphavsfellen.

Terapeutisk bruk

Oppfinnelsens VEGF-mini-feller er terapeutisk nyttige til behandling av hvilken som helst sykdom eller tilstand som blir bedret, lindret, hemmet eller forebygget ved fjerning, hemming eller reduksjon av VEGF. En ikke uttømmende liste over spesifikke tilstander som blir bedret av hemming eller reduksjon av VEGF inkluderer, kliniske tilstander som er kjennetegnet av utstrakt vaskulær endotelcelle-proliferasjon, vaskulær permeabilitet, ødem eller inflammasjon så som hjerneødem i forbindelse med skade, slag eller tumor; ødem i forbindelse med betennelsestil-stander så som psoriasis eller artritt, inkludert reumatoid artritt; astma; genelt ødem i forbindelse med brannskader; ascites og lungeeffusjon i forbindelse med tumorer, inflammasjon eller skade; kronisk luftveisinflammasjon; kapillært lekkasjesyndrom; sepsis; nyresykdom i forbindelse med økt proteinlekkasje; og øyefor-styrrelser så som aldersbetinget makulær degenerasjon og diabetes retinopati.

Oppfinnelsens sammensetting er terapeutisk nyttig for å behandle mangfoldige sykdommer i forbindelse med økte VEGF-nivåer. For eksempel, forverret Th2- inflammasjon og luftveisgjenoppbygging karakteristisk i astmaens patogenese (se, f.eks., Elias et al. (1999) J. Clin. Invest. 104:1001-6). Forhøyede VEGF-nivåer har blitt funnet i vev og biologiske prøver fra pasienter med astma, noe som korrelerer direkte med sykdomsaktivitet (Lee et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 107:1106-1108) og inverst med luftveisdiameter og luftveisfølsomhet. Videre har VEGF blitt postulert til å bidra til astmatisk vevsødem.

En annen sykdom som er forbundet med økt VEGF, er duktalt adenokarcinom i pankreas (PDAC). Denne ondartede sykdommen uttrykker ofte økede foki av endotelcelle-proliferasjon og overuttrykker ofte VEGF (Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543). PDAC er ansvarlig for over 20% av dødsfallene som skyldes gastro-intestinale, ondartede sykdommer, noe som gjør den til den fjerde mest vanlige årsaken til cancer-relatert mortalitet i USA og andre industrialiserte land. Forsøks-resultater støtter opp under VEGFs viktige rolle i pankreas-cancer, således er en VEGF-hemmer lovende som en behandling for å svekke intrapankreatisk tumor-vekst og regionale og distale metastaser.

En mindre, ikke-glykosylert mini-felle uttrykt i E. coli (eksempel 4), en glykosylert mini-felle uttrykt i CHO-celler (eksempel 5) eller en reseptorbasert monomerisk felle (eksempel 6) har optimaliserte egenskaper for lokal/intra-vitreal tilførsel, f.eks. en kortere serumhalveringstid for raskere fjerning og minimaliserer uønsket systemisk eksponering. På grunn av sin mindre størrelse har mini-fellen i tillegg evnen til å trenge gjennom de indre begrensende membraner (ILM) i øyet og diffu-serer gjennom glasslegemet til retina/det retinale pigmentepitellaget (RPE) som vil hjelpe på behandling av sykdommer i retina. I tillegg kan mini-fellen brukes til lokal administrasjon for behandling av okulær sykdom så som koroidal neovaskularise-ring, diabetes makulær ødem, prolifererende diabetes retinopati, korneal neovasku-larisering/transplantatavstøtning. Videre kan mini-fellen bli brukt i enhver situasjon hvor forbigående (korttids) blokkering av VEGF er nødvendig, f.eks. for å unngå kronisk eksponering for VEGF-blokkering, slik som f.eks. i behandling av psoriasis.

Et alvorlig problem som fører til mislykkete glaukomoperasjoner er tidlig inflammasjon og angiogenese, så vel som altfor aggressiv sårheling. Følgelig kan oppfinnelsens VEGF-feller være nyttige som en adjuvans til glaukomoperasjoner for å fore-bygge tidlig hemo- og lymfeangiogenese og makrofag tilstrømning til den filtreren-de boblen etter glaukomoperasjoner, og forbedrer operasjonsresultatet.

Kombinasjonsbehandlinger

I mange utførelser kan en VEGF-felle bli administrert i kombinasjon med en eller flere forbindelser eller behandlinger, inkludert et annet VEGF-fellemolekyl, et kjemoterapeutisk middel, kirurgi, kateterutstyr og stråling. Kombinasjonsbehandling inkluderer administrasjon av en enkelt farmasøytisk doseformulering som inneholder en VEGF-felle og en eller flere midler i tillegg; så vel som administrasjon av en VEGF-felle og en eller flere tilleggsmiddel(ler) i separate farmasøytiske doseformuleringer. For eksempel kan en VEGF-felle og et cytokoksisk middel, et kjemoterapeutisk middel eller et veksthemmende middel administreres til pasienten sammen i en enkelt doseblanding så som en kombinert formulering eller, hvert middel kan administreres i separate doseformuleringer. Når separate doseformuleringer brukes, kan oppfinnelsens VEGF-spesifikke fusjonspolypeptid og et eller flere tilleggs-midler bli administrert samtidig eller på separate forskjøvne tider, f.eks. sekvensi-elt.

Betegnelsen "cytotoksisk middel" blir her brukt med referanse til en substans som hemmer eller forebygger cellefunksjon og/eller forårsaker celledød. Betegnelsen er ment å inkludere radioaktive isotoper(f.eks. I<13>1,I12<5>, Y<90>og Re<1>86), kjemoterapeutiske midler og toksiner slik som enzymatiskt aktive toksiner av bakterie-, sopp, plante- eller dyreopprinnelse eller fragmenter av disse.

Et "kjemoterapeutisk middel" er en kjemisk forbindelse som er nyttig i behandling av cancer. Ekempler på kjemoterapeutiske midler inkluderer alkylerende midler så som tiotepa og Syklofosfamid (Cytoxan®); alkylsulfonater så som busulfan, impro-sulfan og piposulfan; aziridinerså som benzodopa, karboquone, meturedopa og uredopa; etyleniminer og metylamelaminer inkludert altretamin, trietylenmelamin, trietylenfosforamid, trietylenetiofosfaoramid og trimetylolomelamin; nitrogen-senneperså som klorambucil, klornafazin, kolofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, mekloretaminoksydhydroklorid, melfalan, novembichin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil- sennep; nitrosureas så som karmustin, klorozo-tocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotika så som aklacinomysi-ner, aktinomycin, autramycin, azaserin, bleomyciner, kaktinomycin, kalikeamicin, karabicin, karminomycin, karzinofilin, kromomyciner, daktinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-ozo-L-norleucin, doxorubicin, epirubicin, esorubicin, ida-rubicin, marcellomycin, mitomyciner, mykofenolsyre, nogalamycin, olivomuciner, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; anti-metabolitter så som metotrexat og 5-fluorouracil (f-FU); folinsyreanaloger så som denopterin, metotrexat, pteropterin, trimetrexat; purinanaloger så som fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pyrimidinanaloger så som ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, cytarain, dideoxyuridin, doxifluridin, enocitabin, floxuridin; androgener så som kalusteron, dromostanolonpropionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenaler så som aminoglutetimid, mitotan, trilostan; folinsyrefornyer så som frolinsyre; aceglaton; aldofosfamidglykosid; aminolevulinsyre; amsakrin; bestra-bucil; bisantren; edatraxat; defofamin; demekolcin; diaziqon; elfornitin; elliptiniu-macetat; etoglucid; galliumnitrat; hydroxyurea; lentinan; lonidamin; mitoguazon; mitoxantron; mopidamol; nitrakrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofyllin-syre; 2-etylhydrazid; prokarbazin; PSK®; razoxan; sizofiran; spirogermanium; tenuazonsyre; traziqon; 2, 2',2"-triklorotrietylamin; uretan; vindesin; dakarbazin, mannomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacytosin; arabinosid ("Ara-C"); cyklofosfamid; tiotepa; taxaner, f.eks. paklitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) og docetaxel (Taxotere®; Aventis Antony, France); klorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotrexat; plati-numanaloger så som cisplatin og karboplatin; vinblastin; platinum; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitomycin C; mitoxantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; no-vantron; teniposid; daunomycin; aminopterin; xeloda; ibandronat; CPT-11; to-poisomerasehemmer RFS 2000; difluorometylornitin (DMFO); retinolsyre; espe-ramiciner; kapecitabin; og farmasøytiskt akseptable salter, syrer eller derivater av enhver av de ovenstående. Også inkludert i denne definisjonen er antihormonelle midler som virker regulerende eller hemmende på hormonaktivitet i tumorer så som anti-østrogener inkludert f.eks. tamoxifen, raloxifen, aromatasehemmende 4(5)-imidazoler, 4-hyroxytamoxifen, trioxifen, keoxifen, LY 117018, onapriston og toremifen (Fareston); og anti-androgener så som flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid og goserelin; og farmasøytisk akseptable salter, syrer eller derivater av enhver av de ovennevnte.

Et "veksthemmende middel" som brukt her, refererer seg til en forbindelse eller blanding som hemmer cellevekst spesielt en cancercelle enten in vitro eller in vivo. Eksempler på cellehemmende midler inkluderer midler som blokkerer cellesyklus-progresjon (på et sted forskjellig fra S-fasen), så som midler som induserer Gl-stans og M-fasestans. Klassiske M-fase-blokkere inkluderer vinkasene (vinkristin og vinblastin) Taxol® og topo II-hemmere så som doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposid og bleomycin. De midlene som stanser Gl går også over til S-fasestans, f.eks., DNA-alkylerende midler så som tamoxifen, prednison, dakarbazin, mekloretamin, cisplatin, metotrexat, 5-fluorouracil og ara-C.

Administrasjonsmåter

Det er beskrevet behandlingsmåter som omfatter administrasjon av en effektiv mengde av oppfinnelsens VEGF-felle til et individ. I et foretrukket aspekt er fellen stort sett renset (f.eks. stort sett uten substanser som begrenser dens effekt eller som fremkaller uønskede bivirkninger). Individet er fortrinnsvis et pattedyr og aller helst et menneske.

Forskjellige tilførselssystemer er kjent og kan brukes for å administrere en av oppfinnelsens midler, f.eks. innkapsling i liposomer, mikropartikler, mikrokapsler, rekombinante celler som er i stand til å uttrykke forbindelsen, reseptormediert en-docytose (se f.eks. Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4420-4432), konstruksjon av en nukleinsyre som en del av en retroviral eller en annen vektor etc. Innfø-ringsmåtene kan være enterale eller parenterale og inkluderer intradermale, intra-muskulære, intraperitoniale, intravenøse, subkutane, intranasale, intraokkulære og orale veier. Forbindelsene kan administreres på hvilken som helst passende måte f.eks. ved infusjon eller bolusinjeksjon, ved absorpsjon gjennom epitel eller mukokutane lag (f.eks. slimhinne i munn, endetarm eller tarm osv.) og kan administreres sammen med andre biologisk aktive midler. Administrasjonen kan være systemisk eller lokal. Administrasjonen kan være akutt eller kronisk (f.eks. daglig, ukentlig, månedlig osv.) eller i kombinasjon med andre midler. Pulmonær administrasjon kan også benyttes, f.eks. ved bruk av en inhalator eller en nebulisator, og formulering med et aerosolmiddel.

I en annen utførelse kan den aktive middel bli tilført i en vesikkel, spesielt et liposom, i et kontrollert utløsningssystem eller i en pumpe. I en annen utførelse hvor oppfinnelsens aktive middel er en nukleinsyre som koder for et protein, kan nukleinsyren administreres in vivo for å fremme uttrykk av dets kodede protein, ved å danne det som en del av en passende nukleinsyre-ekspresjonsvektor og administrere det slik at det blir intracellulært f.eks. ved bruk av en retroviralvektor (se f.eks. U.S. patentnr. 4,980,286), ved direkte injeksjon eller ved bruk av bombar-dement med mikropartikler, eller belagt med lipider eller celleoverflate-reseptorer eller transfekterende midler eller ved å administrere det bundet til et homøboks-lignende peptid som er kjent for å entre cellekjerner (se f.eks. Joliot et al., 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:1864-1868) etc. Alternativt kan en nukleinsyre bli innføret intracellulært og bli inkorporert inne i vertscelle-DNA for uttrykk ved homo-log rekombinasjon.

I en spesifikk utførelse kan det være ønskelig å administrere oppfinnelsens farma-søytiske blandinger lokalt til området som trenger behandling; dette kan oppnås ved f.eks. lokal infusjon under operasjon, lokal påføring f.eks. ved injeksjon ved hjelp av et kateter eller ved hjelp av et implantat. Implantatet skal være av et po-røst, ikke-porøst eller gelatinmateriale, inkludert membraner så som sialastiske membraner, fibre eller kommersielt tilgjengelige hudsubstitutter.

En blanding som er nyttig når det gjelder å benytte VEGF-fellene ifølge oppfinnelsen kan være en væske som består av en av oppfinnelsens midler i løsning, i suspensjon eller begge. Betegnelsen "løsning/suspensjon" henviser til en væskeblanding hvor første del av det aktive midlet er til stede i løsning og en annen del av det aktive midlet er til stede i partikkelform i suspensjon i en væskematriks. En væskeblanding inkluderer også en gel. Væskeblandingen kan være vandig eller i form av en salve. Videre kan blandingen ha form av et fast produkt som kan settes inn i øyet, som f.eks. mellom øyet og øyelokket eller i bindehinnesekken, hvor VEGF-fellen blir utløst. Utløsning fra et slikt produkt skjer vanligvis til hornhinnen enten via tårevæsken eller direkte til selve hornhinnen med hvilken det faste produktet er i direkte kontakt. Faste produkter som er egnet for implantasjon i øyet, består vanligvis av hovedsakelig bionedbrytbare eller ikke-bionedbrytbare polymerer. En vandig løsning og/eller suspensjon kan være i form av øyedråper. En ønsket dose av den aktive forbindelsen kan bli målt ved hjelp av administrasjon av et kjent antall dråper i øyet. For eksempel vil administrasjon av 1 - 6 dråper tilsvare 25 - 150^1 av blandingen ved et dråpevolum på 25 ul.

En vandig suspensjon eller løsning/suspensjon som er nyttig ved bruk av de aktuelle behandlingsmåter, kan inneholde en eller flere polymerer som suspenderende midler. Nyttige polymerer inkluderer vannløselige polymerer så som cellulosepoly-merer og vannuløselige polymerer så som kryssbundne karboksyl-inneholdende polymerer. En vandig suspensjon eller løsning/suspensjon av den foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis viskøs eller muko-klebende eller enda bedre både viskøs og muko-klebende.

I en annen utførelse, er blandingen som er nyttig når de aktuelle fremgangsmåter praktiseres, en in situ gelatiniserbar vandig blanding. En slik blanding består av en gelatinforbindelse i en effektiv konsentrasjon for å fremme gelatinering ved kontakt med øyet eller tårevæske. Passende gelatinforbindelser inkluderer varmeherdende polymerer. Uttrykket " in situ gelform" som brukt her, inkluderer ikke bare væsker med lav viskositet som danner geler ved kontakt med øyet eller tårevæske, men inkluderer også viskøsere væsker så som semi-flytende og tixotropiske geler som viser en vesentlig forhøyet viskositet eller gelstivhet ved administrasjon i øyet.

Diagnostisering- og screeningmetoder

Oppfinnelsens VEGF-feller kan brukes diagnostisk og/eller i screeningmetoder. For eksempel kan fellen brukes for å overvåke VEGF-nivåer i en klinisk studie for å eva-luere behandlingseffekt. I en annen utførelse, blir den foreliggende oppfinnelses blandinger brukt for å screene individer for inntak i en klinisk studie for å identifisere individer som har f.eks. for høyt eller for lavt VEGF-nivå. Fellene kan brukes i metoder kjent i faget som vedrører VEGFs lokalisering og aktivitet, f.eks. imaging, måling av nivåer av VEGF i passende fysiologiske prøver, i diagnostiske metoder etc.

Oppfinnelsens feller kan brukes i in vivo og in vitro screeningtester for å kvantifisere hvor mye som er tilstede av ikke bundet VEGF, f.eks. i screeningmetoder for å identifisere testforbindelser som er i stand til å redusere ekspresjon av VEGF. Mer generelt, kan oppfinnelsens feller brukes i enhver test eller prosess hvor kvantifise-ring og/eller isolasjon av VEGF er ønsket.

Farmasøytiske blandinger

Det er også beskrevet farmasøytiske blandinger som består av en av oppfinnelsens VEGF-mini-feller. Slike blandinger består av en terapeutisk effektiv mengde av en eller flere mini-feller og en akseptabel farmasøytisk bærer. Betegnelsen "farmasøy-tisk akseptabel" betyr godkjent av en føderal eller statlig registreringsmyndighet eller registrert i U.S. Pharmacopeia eller en annen generelt anerkjent farmakopé til bruk i dyr og, mer spesielt, i mennesker. Betegnelsen "bærer" henviser til en opp-løsningsvæske, hjelpemiddel og bindemiddel eller vehikkel med hvilken middelet blir administrert. Slike farmasøytiske bærere kan være sterile væsker som f.eks. vann og oljer inkludert petroleum, animalsk, vegetabilsk eller syntetisk opprinnelse, så som peanøttolje, soyaolje, mineralolje, sesamolje og lignende. Passende farma-søytiske bindemidler inkluderer stivelse, glukose, laktose, sukrose, gelatin, malt, ris, mel, kalk, silica gel, natriumstearat, glyserolmonostearat, talkum, natriumklo-rid, skummet melkepulver, glyserol, propylen, glykol, vann, etanol og lignende. Blandingen kan også inneholde mindre mengder av fuktende eller emulgerende midler eller pH-buffere, hvis det er ønskelig. Disse blandinger kan være i form av løsninger, suspensjoner, emulsjoner, tabletter, piller, kapsler, pudre, formuleringer med forlenget utløsning eller lignende. Eksempler på passende farmasøytiske bærere er beskrevet i "Remington's Pharmaceutical Sciences" av E.W. Martin.

Oppfinnelsens VEGF-mini-felle kan formuleres i nøytral eller i saltform. Farmasøy-tisk akseptable salter inkluderer de som blir dannet med frie aminogrupper slik som de som er avledet fra saltsyre, fosforsyre, eddiksyre, oksalsyre, vinsyre etc, og de som blir dannet med frie karboksylgrupper så som de som er avledet fra natrium, kalium, ammonium, kalsium, jernhydroksyd, isopropylamin, trietylamin, 2-etyl-aminoetanol, histidin, prokain osv.

Videre har vandige blandinger oftalmisk kompatibel pH og osmolalitet. En eller flere oftalmisk akseptable pH-justerende midler og/eller buffere kan inkluderes i en av oppfinnelsens blandinger, inkludert syrer så som eddiksyre, borsyre, sitronsyre, melkesyre, fosforsyre og saltsyre; baser så som natriumhydroksyd, natriumfosfat, natriumborat, natriumcitrat, natriumacetat, natriumlaktat; og buffere så som citrat/dekstrose, natriumbikarbonat og ammoniumklorid. Slike syrer, baser og buffere er inkludert i en mengde som er i stand til å opprettholde blandingens pH i et oftalmisk akseptabelt område. En eller flere oftalmisk akseptable salter kan inkluderes i blandingen i en mengde som er tilstrekkelig for å gjøre blandingens osmolalitet til et oftalmisk akseptabelt område. Slike salter inkluderer de som har natrium-, kalium- eller ammoniumkationer og klorid-, citrat-, askorbat-, borat-, fos-fat-, bikarbonat-, sulfat-, tiosulfat- eller bisulfittanioner.

Mengden av fellen som vil være effektiv for dets tiltenkte terapeutiske bruk, kan bestemmes ved standard, klinisk teknikk, basert på den foreliggende beskrivelse. I tillegg kan in wtro-tester benyttes for å identifisere optimale doseområder. Vanligvis er passende doseområder for intravenøs administrasjon ca. 50-5000 mikrogram av den aktive forbindelsen pr. kilo kroppsvekt. Passende doseområde for intra-nasaladministrasjon er vanligvis ca. 0,01 pg/kg til 1 mg/kg kroppsvekt. Effektive doser kan ekstrapoleres fra doseresponskurver derivert fra in vitro eller dyremodell-testsystemer.

For systemisk administrasjon kan en terapeutisk effektiv dose til å begynne med bli estimert fra in wtro-tester, f.eks. kan en dose bli formulert i en dyremodell for å oppnå et konsentrasjonsområde i sirkulasjonen som inkluderer IC50bestemt i celle-kultur. Slik informasjon kan brukes for mer nøyaktig å bestemme nyttige doser til mennesker. Startdoser kan også bli estimert fra in wVo-data f.eks. dyremodeller ved bruk av teknikker som er velkjente i faget. En vanlig, faglært person kan lett optimalisere administrasjon til mennesker basert på dyredata.

Dosestørrelse og intervall kan justeres individuelt for å oppnå plasmanivåer av forbindelsen som er nødvendig for å opprettholde terapeutisk effekt. I tilfelle av lokal administrasjon eller selektivt opptak, kan den lokale, effektive konsentrasjonen av forbindelsen ikke være relatert til plasmakonstellasjonen. En som er faglært vil være i stand til å optimalisere terapeutisk effektive lokale doser uten unødvendig eksperimentering.

Mengden av den administrerte forbindelsen vil selvsagt være avhengig av individet som blir behandlet, individets vekt, hvor alvorlig lidelsen er, administrasjonsmåten og den ordinerende leges bedømmelse. Behandlingen kan gjentas periodisk mens symptomer er påvisbare og også når de ikke er påvisbare. Behandlingen kan gis alene eller i kombinasjon med andre legemidler.

Cellulær transfeksjon og genterapi

Den foreliggende oppfinnelse omfatter bruk av nukleinsyrer som koder for oppfinnelsens fusjonspolypeptider som transfekterer celler in vitro og in vivo. Disse nukleinsyrene kan settes inn i hvilket som helst antall velkjente vektorer for transfeksjon av målceller og organismer. Nukleinsyrene blir transfektert til celler ex vivo og in vivo gjennom interaksjon mellom vektoren og målcellen. Blandinger blir administrert (f.eks. ved injeksjon i en muskel) til et individ i en mengde som er tilstrekkelig for å bringe frem terapeutisk respons. En mengde som er adekvat for å oppnå dette, blir definert som "en terapeutisk effektiv dose eller mengde."

På den annen side gir oppfinnelsen en måte å redusere VEGF-nivåer i mennesket eller andre dyr som består av transfektering av en celle med en nukleinsyre som koder for et av oppfinnelsens fusjonspolypeptider, i hvilket nukleinsyren omfatter en induserbar fremmer som er bundet operativt til nukleinsyren som koder for fusjonspolypeptidet eller mini-fellen. Når det gjelder genterapiprosedyre i behandling eller forebyggelse av menneskelig sykdom, se f.eks. Van Brunt (1998) Biotechnology 6:1149-1154.

Utstyrssett

Det er også beskrevet et tilvirkningsprodukt som omfatter pakningsmateriell og et farmasøytisk middel i pakningsmateriellet, hvori det farmasøytiske midlet omfatter minst en VEGF-felle som består av to eller flere av oppfinnelsens fusjonspolypeptider og i hvilket pakningsmateriellet består av en etikett eller et pakningsvedlegg som indikerer at VEGF-spesifikke fusjonspolypeptider kan brukes til å behandle en VEGF-mediert sykdom eller tilstand.

Transgeniske dyr

VEGF-fellene ifølge oppfinnelsen kan uttrykkes i transgeniske ikke-humane dyr. Et transgenisk dyr kan dannes ved å introdusere nukleinsyren i den hannlige pro-nucleus til en befruktet eggcelle, f.eks. ved mikroinjeksjon, retroviral infeksjon og ved å tillate en eggcelle å utvikle seg i et pseudogravid hunndyrefoster. En av de regulerende eller andre nyttige sekvenser i ekspresjonsvektorer, kan danne del av den transgeniske sekvens. En vevspesifikk reguleringssekvens kan være operativt bundet til transgenet for å uttrykke transgenets ekspresjon direkte til spesielle celler. Et transgent ikke-humant dyr som uttrykker et av oppfinnelsens fusjonspolypeptid eller mini-felle er nyttig i forskjellige applikasjoner, inkludert som en måte å danne et slikt fusjonspolypeptid. Videre kan transgenet settes under kontroll av en induserbar promoter slik at fusjonspolypeptidets eller mini-fellens ekspresjon kan kontrolleres ved, f.eks., administrasjon av et lite molekyl.

Spesifikke utførelser

I forsøket beskrevet nedenfor, ble mindre VEGF-feller dannet og deres evne til å binde VEGF ble undersøkt. Slike mini-feller blir fortrinnsvis brukt i spesifikke applikasjoner, f.eks. kan visse tilstander eller sykdommer bli behandlet fortrinnsvis ved lokal administrasjon av en VEGF-felle til et spesifikt organ, vev eller celle mer enn ved systemisk administrasjon. I et eksempel på oppfinnelsens mini-felle ble en mindre VEGF-felle dannet ved direkte spalting av en dimerisert VEGF-felle som har et restriksjonsområde (C-region) dannet i et Fc-område (eksempel 2). Den forkortede fellen viser sammenlignbar affinitet for VEGF og halveringstid som opphavsfellen i full størrelse. Eksempel 3-5 beskriver dannelse av fusjonspolypeptider som har en VEGF-reseptorkomponent og en multimeriserende komponent som består av en eller to cysteinresiduer. Affinitetsmålinger viste at ikke-glykosylerte fusjonspolypeptider uttrykt i E. coli eller de glykosylerte polypeptidene uttrykt i CHO-celler, hadde sammenlignbar bindingsaffinitet til VEGF som opphavsfellen i full størrelse. Eksempel 6 belyser videre en monomerisk VEGF-felle som består av (R1R2)2, som er i stand til å binde og hemme VEGF. Eksempel 7 beskriver dannelse av en VEGF-mini-felle (SEQ ID NO:26) som viser høy affinitet for binding til VEGF sammenlignbar med fellen i full lengde (SEQ ID NO: 10).

Andre av oppfinnelsens kjennetegn vil bli tydelig i løpet av de følgende beskrivelser av eksempler på utførelser som blir gitt for å illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPLER

Det følgende eksempelet blir gitt for å gi vanlige, faglærte personer en fullstendig beskrivelse av hvordan man lager og bruker oppfinnelsens metoder og blandinger. Man har anstrengt seg for å sikre nøyaktigheten med hensyn til tallene som blir brukt(f.eks. mengder, temperatur etc). Med mindre noe annet er oppgitt gjelder at deler er vektdeler, molekylvekt er gjennomsnittlig molekylvekt og temperatur er i celsiusgrader og trykk er ved eller nær atmosfærisk trykk.

Eksempel 1. Dannelse av FltlD2.FlklD3.FcACl(a)

Dannelse av en opphavs-VEGF-felle, FltlD2.FlklD3.FcACl(a)(SEQ ID Nos:7-8), VEGFRlR2.FcACl(a) (SEQ ID Nos:9-10) og FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) (SEQ ID Nos: 12-13) blir beskrevet i detalj i PCT-publikasjonen WO/0075319. Også beskrevet i WO/0075319 er metoder for dannelse og ekspresjon av nukleinsyrekonstruksjoner som koder for VEGF-feller, metoder for å oppdage og måle VEGF-felle-binding til VEGF, metoder for å bestemme VEGF-bindingens støkiometri ved BIAcore-analyse og farmakokinetiske analyser.

Eksempel 2: Trombinspaltet, dimerisk VEGF-mini-felle

VEGFRlR2.FcACl(a)-dannelse (SEQ ID Nos:9-10) ble modifisert ved å sette inn en trombinrestriksjon som følger etter CPPC (SEQ ID NO:l) på Fc-området. En renset VEGF-felle (5 ug) ble inkubert med trombin (Novagen) i 20 mM Tris-HCI, pH 8,4, 50 mM NaCI, 2,5 mM CaCI2i 16 timer ved 37°C. Kontroller inkluderte restriksjonskon-troll-proteiner (CCP) og opphavs-VEGF-felleprotein inkubert uten trombin. SDS-PAGE-analyse (Tris-Glycin 4-20% gel; 5^g protein pr. felt) bekreftet riktig restrik-sjon (resultater er ikke vist).

Affinitetsbestemmelse. Hver VEGF-felles Kd-binding til hVEGF165 ble bestemt som beskrevet i WO/0075319, for opphavs-VEGF-fellen, uspaltet. VEGF-felle som inneholder et trombinrestriksjonssete ("uspaltet VEGF-felle"), spaltet VEGF-mini-felle og rekombinant monomerisk RlR2-myc mye his. Nærmere bestemt ble fellenes evne til å blokkere VEGF165-avhengig reseptorfosforylering bestemt primært ved bruk av humane endotelceller (HUVECs). VEGF165ble inkubert i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av testfellene og blandingen ble tilsatt HUVECs for å stimulere tyrosin-fosforylering av VEGFR2. Ved sub-støkiometriske konsentrasjoner av VEGF-fellen, induserte ubundet VEGF reseptorfosforylering. Men når forholdet mellom VEGF-fellen til liganden var 1:1 i molar, ble en fullstendig blokkering av reseptorsignale-ringen observert, noe som fastslår at et enkelt molekyl av en felle-dimer er i stand til å blokkere et enkelt molekyl av humant VEGF165. Således resulterer VEGF-fellens høye bindingsaffinitet til VEGF i dannelse av et kompleks som forhindrer VEGF fra å interagere med celloverflatereseptorer. Ekvivalente resultater ble oppnådd ved identiske fosforyleringshemmende forsøk med forelder-VEGF-fellen, uspaltet VEGF-felle og spaltet VEGF-mini-felle. Resultatene er vist i tabell 1.

Eksempel 3. Konstruksjon av plasmider som koder for VEGF-mini-feller

VEGF-mini-feller ble dannet fra en forløper til opphavs-VEGF-fellen, VEGFRlR2.FcACl(a)(SEQ ID Nos:9-10), hvor de tre aminosyrene glysin-alanin-prolin tjener som en binding mellom Fikl D3 og FcACl(a). Dette plasmidet, pTE115, ble brukt ved dannelse av VEGF-mini-feller fordi bindings-DNA-sekvensen omfattet en Srf I restriksjons-endonukleær gjenkjennelsessekvens som forenklet manipulering av VEGF-fellen. Pa alle andre måter er VEGF-fellen kodet av pTE115 identisk med VEGF-fellen VEGFRlR2.FcACl(a)(SEQ ID Nos:9-10) beskrevet i detalj i PCT publikasjonen WO/0075319.

To VEGF-mini-feller ble dannet med multimeriseringsområder som består av enten et enkelt cysteinresidue (R1R2C)(SEQ ID NO:2) eller aminosyrene ACGC (SEQ ID NO:4) (RlR2ACGc)(SEQ ID NO:5) lagt til reseptorkomponentene FltlD2.FlklD3s C-terminal. Begge disse konstruksjonene er i stand til å danne homo-dimeriske molekyler stabilisert av en (R1R2C) eller to (R1R2ACgc) intermolekylære disulfider.

Plasmidet pTE517 ble laget ved å fjerne 690 bp-fragmentet generert ved spalting av pTE115 DNA med Srf I og Not I og ved å sette inn det syntetiske DNA-fragmentet som ble dannet ved å sammenkoble oligoene R1R2NC (SEQ ID NO: 14) og R1R2CC (SEQ ID NO: 15). Det resulterende plasmidet koder for R1R2C, som består av FltlD2.FlklD3-områder fulgt av et cysteinresiduum (SEQ ID NO:23). På samme måte ble plasmidet pTE518 laget ved å fjerne 690 bp-fragmentet generert ved spalting av pTE115 DNA med Srf I og Not I, fulgt av binding med det syntetiske DNA-fragmentet som er dannet ved å sammensmelte oligoene R1R2NACGC (SEQ ID NO: 16) og R1R2CACGC (SEQ ID NO: 17). Det resulterende plasmidet koder for RlR2AcGcSom består av FltlD2.FlklD3-områder fulgt av aminosyrene ACGC (SEQ ID NO:25).

Plasmider ble også konstruert for å styre disse mini-fellenes ekspresjon i E. Coli. Primerne RlR2N-Ncol (SEQ ID NO: 18) og RlR2Cnotl (SEQ ID NO: 19) ble brukt for å forsterke DNA-fragmentet fra pTE115 som koder for aminosyrer G30 til K231, relativt til opphavs-VEGF-fellen (SEQ ID NO: 10). Forsterkning av denne sekvensen resulterte i en fusjon mellom et startmetionin-kodon ved 5'-enden og en fusjon av kodonet for cystein, fulgt av et stopp-kodon ved 3'-enden (SEQ ID NO:2). Dette DNA-fragmentet ble deretter klonet med E. coli ekspresjonsplasmid pRG663s Nco I og Not I-seter for å resultere i pRG1102 slik at ekspresjonen av R1R2Cvar avhengig av transkripsjon fra fagen T7 (|>l.l-fremmer. Induksjon av genekspresjon fra pRG1102 resulterer i akkumulering av RlR2cys i E. coli vertsstamme RFJ238s cyto-plasma. På samme måte ble primerne RlR2N-Ncol (SEQ ID NO: 18) og R1R2ACGC-Notl (SEQ ID NO:20) brukt for å forsterke et DNA-fragment fra pTE115 som koder for aminosyrer G30 til K231 (SEQ ID NO: 10) med fusjon av et start-metioninkodon ved 5'-enden og fusjon av kodoner for ACGC (SEQ ID NO:4) fulgt av et stopp-kodon ved 3'-enden (SEQ ID NO:5) som resultat. Dette fragmentet ble deretter klonet med E. coli ekspresjonsplasmidet pRG663s Nco I og Not I-seter for å resultere i pRG1103 slik at ekspresjonen av R1R2ACgcvar avhengig av transkripsjon fra fagen T7 <J>1.1- fremmer. Induksjon av genekspresjon fra både pRG1102 og pRG1103 resulterte i akkumulering av henholdsvis R1R2Celler R1R2ACgc, i cyto-plasma til E.co//'-vertsstammen RFJ238.

Eksempel 4. Rensing og karakterisering av VEGF mini-feller fra E. coli

Både R1R2Cog R1R2ACgcble uttrykt som cytoplasmaproteiner i E. coli og ble renset på samme måte. Induksjon av fagen T7 (|>l.l-fremmer på enten pRG1102 eller pRG1103 i E. coli K12-stammen RFJ238 resulterte i akkumulering av proteinet i cy-toplasma. Etter induksjon, ble cellene høstet ved sentrifugering, resuspendert i 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 20 mM EDTA og lysert ved passasje gjennom en Niro-Soavi celle-homogenisator. Inklusjonslegemer ble høstet fra lyserte celler ved sentrifugering, vasket en gang i destillert vann, deretter oppløst i 8 M guanidium-HCI, 50 mM Tris-HCI, pH 8,5, 100 mM natriumsulfitt, 10 mM natriumtetrationat og inkubert ved romtemperatur i 16 timer. Klaret supernatant ble fraksjonert i en S300-søyle ekvilibrert med 6 M guanidin-HCI, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5. Fraksjoner som inneholder R1R2Cble samlet og dialysert mot 6 M Urea, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5. Dialysert protein ble fortynnet til 2 M Urea, 50 mM Tris-HCI, pH 8,5, 2 mM cystein og deretter rørt sakte i 7 dager ved 4°C. Refoldet protein ble dialysert mot 50 mM Tris-HCI, pH 7,5 og deretter overført til en SP-sefarose-søyle, ekvilibrert med 50 mM Tris-HCI, pH 7,5 og fortynnet med en NaCI-gradient fra 0 til 1 M i 50 mM Tris-HCI, pH 7,5. Fraksjoner som inneholder R1R2Cble samlet, konsentrert, og overført til en Super-dex-søyle ekvilibrert med 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI. Fraksjoner som inneholder mini-felle-dimere ble høstet og samlet. Den rensede mini-fellens molekylvekt ble estimert til å være ca. 46 kD ved hjelp av SDS-PAGE.

BIAcore-forsøk ble utført (som beskrevet i WO/0075319) for å bestemme fellens affinitet til VEGF og resultatene viste at R1R2Cog R1R2ACgcmini-feller hadde VEGF-affinitet sammenlignbart med VEGF-fellen i full lengde (Tabell 2).

Eksempel 5. VEGF-mini-felles uttrykk i CHO Kl

Ekspresjon av VEGF-mini-fellene som koder for pTE517 og pTE518 er avhengig av transkripsjon fra den humane CMV-MIE-fremmeren og resulterer i utskillelse av mini-fellene til dyrkningsmediet når de blir uttrykt i CHO-celler. Når de blir uttrykt som sekresjonsproteiner i CHO Kl, ble begge mini-fellene funnet i det kondisjoner-te mediet og estimering av deres molekylvekt ved hjelp av SDS-PAGE antydet, som forventet, at proteinene var glykosylert. Analyse ved hjelp av SDS-PAGE indikerte også at mini-fellene var i stand til å danne homo-dimeriske molekyler, stabilisert ved intermolekylære disulfid(er) mellom cystein(ene)s C-terminal. Spesielt dannet RlR2c-mini-fellen effektivt kovalente dimere når den ble uttrykt som et sekresjons-protein i CHO-celler.

Eksempel 6. En enkeltkjedet VEGF-mini-felles konstruksjon og uttrykk

En VEGF-mini-felle som ikke hadde behov for et multimeriserende område (SEQ ID NO:24), ble også konstruert. Denne mini-fellen ble konstruert ved direkte fusjon mellom et FltlD2.FlklD3-område (R1R2) (aminosyrer 30-231 i SEQ ID NO:24) og et annet FltlD2.FlklD3-område (R1R2) (aminosyrer 234-435 i SEQ ID NO:24) med en Gly-Pro-binding mellom tandemreseptorområdene (aminosyrer 232-233 i SEQ ID NO:24).

For å konstruere et gen som koder for tandem FltlD2.FlklD3-områder, ble et DNA-fragment syntetisert (Blue Heron Biotechnology) som kodet for et FltlD2.FlklD3-område som minimaliserte DNA-ensartetheten med DNA-område-kodende FltlD2.FlklD3 funnet i pTE115. Dette syntetiske DNA-fragmentet ble klonet som et Srf I-Not I-fragment i Srf I-Not I-setene på pTE115 for å gi pTE570, som uttrykker R1R2-R1R2 VEGF-minifelle fra CMV-MIE-fremmeren. Når dette plasmidet blirtrans-fektert inn i CHO Kl-celler, akkumuleres R1R2-R1R2 VEGF-mini-fellen i dyrkningsmediet.

Eksempel 7. En VEGF-mini-felles konstruksjon og ekspresjon

En VEGF-mini-felle ble konstruert som beskrevet ovenfor ved direkte fusjon mellom et FltlD2.FlklD3-område (R1R2) (aminosyrer 30-231 i SEQ ID NO:26) og en C-terminal-niaminosyresekvens som ender i CPPC. Når dette plasmidet blir transfektert inn i CHO Kl-celler, blir VEGF-mini-fellen i SEQ ID NO:26 utskilt i dyrkningsmediet. Etterfølgende rensing med ikke-reduserende SDS-PAGE-elektroforese så vel som iboende lysspredende analyse identifiserte et felle-molekyl med en molekylvekt på ca. 64 kDa. Denne molekylvekten indikerer at en kovalent dimer ble dannet mellom to fusjonspolypeptider i SEQ ID NO:26. Lignende forsøk ble utført med plasmider som koder for fusjonspolypeptidene i SEQ ID Nos:27 og 28 og på samme måte viste det seg at disse molekylene dannet homo-dimeriske feller. Affi-nitetsbestemmeise for bindingen av humant VEGF-165 til VEGF-feller bestående av dimere i SEQ ID NO: 10 og SEQ ID NO:26 er vist i tabell 3.

Claims (14)

1. Isolert nukleinsyremolekyl som koder for et fusjonspolypeptid bestående av komponenter (R1R2)Xog en fusjonspartner (FP), hvor x er 1, RI er vaskulær endotelialcelle vekstfaktor (VEGF)-reseptorkomponent lg domene 2 av Flt-1 og R2 er lg domene 3 av Flk-1; hvor fusjonspartneren (FP) er en multimeriserende komponent (MC) som er i stand til å samvirke med en annen MC for å danne en multimer struktur og er en aminosyresekvens 1-15 aminosyrer lang med 1-2 cysteinresiduer.

2. Fusjonspolypeptid kodet av nukleinsyremolekylet ifølge krav 1.

3. Fusjonspolypeptid ifølge krav 2, hvis aminosyresekvens er den av SEQ ID NO: 26, 27 eller 28.

4. Ekspresjonsvektor omfattende nukleinsyremolekylet ifølge krav 1, operativt bundet til en ekspresjonskontrollsekvens.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et VEGF fusjonspolypeptid omfattende trinnene å introdusere i et passende ekspresjonssystem ekspresjonsvektoren ifølge krav 4, og utføre ekspresjon av VEGF fusjonspolypeptidet.

6. Vaskulær endotelialcelle vekstfaktor (VEGF)-felle som er i stand til å binde til VEGF og inhibere VEGF-aktivitet, og omfattende en multimer av to eller flere fusjonspolypeptider ifølge krav 2 eller 3.

7. VEGF-felle ifølge krav 6, som er en dimer.

8. Farmasøytisk sammensetning omfattende fusjonspolypeptidet ifølge krav 2 eller 3 samt et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.

9. VEGF-felle ifølge krav 6 eller 7 for anvendelse ved behandling av en okulær sykdom eller tilstand som blir forbedret, lettet eller hemmet ved fjerning eller inh i-bering av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF).

10. VEGF-felle ifølge krav 9 for anvendelse ved behandling av en okulær sykdom eller tilstand som er aldersrelatert makulær degenerering eller retinopati ved diabetes.

11. VEGF-felle ifølge krav 9 for anvendelse som en adjuvant ved øyekirurgi så som kirurgi ved grå stær eller ved behandling av intra-okulære svulster så som uvealt melanom eller retinoblastom, hvor nevnte behandling er via intravitreal avlevering.

12. Anvendelse av VEGF-felle ifølge krav 6 eller 7 for fremstilling av et medikament til behandling av en okulær sykdom eller tilstand som blir forbedret, lettet eller hemmet ved fjerning eller inhibering av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF).

13. Anvendelse ifølge krav 11, hvor nevnte medikament er for behandling av aldersrelatert makulær degenerering eller retinopati ved diabetes.

14. Anvendelse ifølge krav 11, hvor nevnte medikament anvendes som en adjuvant ved øyekirurgi så som kirurgi ved grå stær eller er for behandling av intra-okulære svulster så som uvealt melanom eller retinoblastom, hvor nevnte behandling er via intravitreal avlevering.