CN103328514B - 用于抗原结合的蛋白复合物及其使用方法 - Google Patents
用于抗原结合的蛋白复合物及其使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103328514B CN103328514B CN201180064522.2A CN201180064522A CN103328514B CN 103328514 B CN103328514 B CN 103328514B CN 201180064522 A CN201180064522 A CN 201180064522A CN 103328514 B CN103328514 B CN 103328514B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antigen
- binding domains
- polypeptide
- cell
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
- C07K16/248—IL-6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/522—CH1 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明在某些实施方式中提供了一种能够与抗原结合的多肽复合物。本发明还提供了所述多肽复合物的药物组合物和使用方法。
Description
本申请要求2010年11月9日提交的关国临时专利申请号61/411,903的优先权,其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本公开涉及用于抗原结合的多肽复合物,及其药物组合物和使用方法。
背景
近些年来,全长单克隆抗体已成功用于治疗癌症、自身免疫性和炎性疾病以及其他人类疾病。尽管在自然界中存在五种不同类型的免疫球蛋白(IgA、IgD、IgG、IgM和IgE),但是最适宜用于人类治疗的为IgG,因为其具有良好的性质,体现在结合亲和性和特异性高、生物利用度高、循环血清半衰期长、潜在效应器功能的能力以及工业规模的可制造性等方面。
常规的IgG为四聚体分子,其具有两条相同的重链和两条相同的轻链。IgG重链的N-末端具有可变结构域,然后为第一恒定结构域(CHl)、铰链和另外两个恒定结构域(CH2CH3)。IgG轻链由两个结构域组成:N-末端可变结构域和C-末端恒定结构域。重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)相互作用,并且重链的第一恒定区(CHl)与轻链恒定区(CL)相互作用以形成Fab结构。两个CH2CH3结构域形成同型二聚体Fc结构。因此IgG具有两个抗原结合Fab臂,其相互之间和与FC结构域之间在方向上是相对灵活的。这种结构特征赋予了IgG活化细胞表面某些类型受体的能力,因为(当两个Fab臂结合至抗原时)通过二价结合可诱导靶点的二聚化。而且,因为IgGFc能够结合至细胞表面的Fcγ受体(FcγR),所以结合至IgG的细胞表面抗原能够交联形成受体簇并且因此被活化。从概念上讲,在单克隆抗体/抗原结合事件中FcγR还能够介导受体交联。己在大量细胞表面靶点(Seo,Nat.Med.(2004)10:1088-94,TRAIL受体(Belyanskay,Mol.Cancer(2007)6:66-78,Manero,CellStressChaperones(2004)9:150-66,Westwood,JournaloftranslationalMed.(2010)8:42-g,Marini,J.Radiat.Oncol.Biol.Physc(2009)75:198-2002))中成功证实了细胞表面受体通过IgG(激动性抗体)的活化。
尽管受体激动是1gG的一个有用的性质,但是其对于某些应用是不需要的。例如,抗cMet抗体意在阻断癌细胞中的HGF/cMet信号,但是实际上它却导致了该信号通路的活化(Manens,Clin.CancerRes.(2006)12:6144-52)。抗TNFR-l抗体意在通过该受体选择性阻断TNF配体的信号且同时保留TNFR2信号,据信这有利于抑制炎症,但是实际上却会诱导靶受体信号传导(Kontermann,J.Immunother.(2008)31:225-34;Faustman,Nat.Rev.drugdiscovery(2010)9:482-493)。
避免不需要的靶向交联的常规方法是使用工程化的抗体结构,其中针对给定的特异性仅存在一个结合单位。这些抗体结构通常被称为单价抗体。单价抗体显著扩充了用于治疗人类疾病的工具。
单价抗体直接和有效的工程化策略是使用单可变结构域、单链Fv(scFv)或Fab片段。将抗TNFR-1结构域抗体和Fab片段进行工程化,使其通过TNFR-l(而非通过TNFR-2的信号)选择性阻断TNF信号(Kontermann,J.Immunother.(2008)31(3):225-34;US20080008713;WO2008149144;U520100150916)。这些抗体片段用于全身性治疗应用的主要缺点是因为其尺寸较小(小于肾脏滤过的阈值~60kD)导致其半衰期较短。为使这些抗体片段实际地用于治疗慢性疾病,需要引入半衰期延长策略(Kontermann,BioDrugs(2009)23:93-109)。所述策略包括聚乙二醇化(US24121415)、与白蛋白融合(Muller,J.Biol.Chem.(2007)282:12650-60)或与白蛋白结合子融合(Stork,Pfot.Eng.Des.Sel.(2007)20:569-76)
与单体Fc(将CH3接头工程化以破坏CH3-CH3连接,US2009/022642)或单链FC(scFc)(通过N-末端-铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3-C-末端的序列构型,以便为产生单价抗体提供潜在的解决方法)融合是产生具有改善的半衰期的单价抗体的另一种潜在的解决方法(WO2005077981,WO/2008/012543,U520090304696,U520090252729)
其他已开展的方法主要对CH3-CH3接头残基进行工程化以制备单价抗体。CH3接头工程化在一个CH3中形成“突起(knob)”并在另一个CH3上形成“孔”,以形成异二聚体Fc分子(孔中的突起(knob-in-hole),US5,821,333,Merchant等,NatBiotech.(1998)16:677-681)。含有抗体V结构域的片段与突变CH2CH3链的不对称融合能够产生多种单价抗体分子。基于这种技术,产生了特异性针对cMet的单臂抗体OA5D5(U55821333,U52008/0063461)。积极的临床前试验确切地表明,与其相应的二价抗体不同,这种单价抗体是纯cMet拮抗剂(不具有激动剂活性)。目前已在多项抗癌临床试验中对这种单价抗体进行了检测。一种基于在CH3-CH3接头处氨基酸取代的类似的异二聚体Fc工程化策略己被用于形成抗TNFR-1单价抗体(WO2008089004,Gunasekaran等,J.B.C.(2010)285:19637-19646)。基于链交换工程化结构域(SEED)的设计,进行了有效的Fc异二聚体结构的设计(Davis等,PEDS2010,23:195-202,US20070287170)
值得注意的是,上文中提及的单价抗体的成功反应了实际需求、显著的投资力度和由此带来的科学进步。然而,这些分子的产生涉及在保守位置的化学修饰或氨基酸取代,而这常常会使蛋白的稳定性降低。将不稳定的蛋白用于治疗可能会引起对产品的可制造性和临床安全性(如免疫原性)的关注。因此,仍需要一种全新抗体模式,其在结合时将不活化靶受体,同时还能够在产品的稳定性、安全性和可制造性方面提供改善的性质。
发明概述
一方面,本公开提供了一种多肽复合物,所述复合物包括第一多肽,所述第一多肽包括第一蛋白单体和第一抗原结合结构域,和第二多肽,所述第二多肽包括第二蛋白单体和第二抗原结合结构域,其中所述第一蛋白单体与所述第二蛋白单体形成二聚体;其中所述第一蛋白单体的C-末端与所述第一抗原结合结构域的N-末端可操作地连接;以及其中所述第二蛋白单体的C-末端与所述第二抗原结合结构域的N-末端可操作地连接。
在某些实施方式中,其中所述二聚体的形成基本减少了所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域与抗原的同时结合。在某些实施方式中,所述二聚体的形成产生立体位阻,这样当所述第一抗原结合结构域与靶点结合时,所述第二抗原结合结构域基本上被阻止与相同靶点结合,结果基本上降低了由所述第一和第二抗原结合结构域同时结合导致的作用(例如,信号)
在某些实施方式中,所述第一多肽进一步包括含有巯基残基的第一肽接头,所述第二多肽进一步包括含有巯基残基的第二肽接头;所述第一肽接头的N-末端与所述第一蛋白单体的C-末端共价连接;所述第一肽接头的C-末端与所述第一抗原结合结构域的N-末端共价连接;所述第二肽接头的N-末端与所述第二蛋白单体的C-末端共价连接;所述第二肽接头的C-末端与所述第二抗原结合结构域的N-末端共价连接;以及所述第一肽接头与所述第二肽接头形成二硫键。在某些实施方式中,所述巯基残基是半胱氨酸。
在某些实施方式中,所述二硫键基本减少了所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域与抗原的同时结合。
在某些实施方式中,所述第一巯基残基或所述第二巯基残基与所述肽接头的C-末端相距1-10个氨基酸残基。
在某些实施方式中,所述第一蛋白单体与所述第二蛋白单体相同或不同。在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域相同或不同。在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合至相同或不同的靶点。
在某些实施方式中,所述第一蛋白单体和/或所述第二蛋白单体包括来自免疫球蛋白的CH3结构域,并且所述CH3结构域的C-末端与所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域的N-末端可操作地连接。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域进一步包括来自免疫球蛋白的CH2结构域,并且所述CH2结构域的C-末端与所述CH3结构域的N-末端共价连接。
在某些实施方式中,所述免疫球蛋白选自:IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域或所述第二结合结构域选自:CDR、Fv、VL、LH、轻链、和重链、ScFv、Fab、骆驼VHH、dAb、纤连蛋白3结构域(Fn3)、锚蛋白重复、和阿德奈汀(Adnectin)
在某些实施方式中,一个或多个其他抗原结合结构域可操作地连接至所述第一蛋白单体的N-末端、所述第二蛋白单体的N-末端、所述第一抗原结合结构域的C-末端、或所述第二抗原结合结构域的C-末端。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域是第一轻链片段,所述片段通过二硫键与第一重链片段连接。在某些实施方式中,一个或多个其他抗原结合结构域可操作地连接至所述第一轻链片段的C-末端、所述第一重链片段的C-末端、或所述第一重链片段的N-末端。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域是第二重链片段,所述片段通过二硫键与第二轻链片段连接。在某些实施方式中,一个或多个其他抗原结合结构域可操作地连接至所述第二轻链片段的C-末端、所述第二重链片段的C-末端、或所述第二轻链片段的N-末端。
另一方面,本公开提供了一种多肽,所述多肽包括蛋白单体和抗原结合结构域,其中所述蛋白单体的C-末端与所述抗原结合结构域的N-末端可操作地连接,其中所述蛋白单体能够形成同源二聚体。在某些实施方式中,所述多肽进一步包括含有巯基残基的肽接头,其中所述肽接头的N-末端与所述蛋白单体的C-末端共价连接;所述肽接头的C-末端与所述抗原结合结构域的N-末端共价连接。
在某些实施方式中,本公开提供了一种编码所述多肽的多核苷酸。在某些实施方式中,本公开提供了一种包含本文提供的所述多核苷酸的载体。在某些实施方式中,本公开提供了一种载体,所述载体包括编码本文公开的所述第一多肽的第一多核苷酸,和编码本文公开的所述第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方式中,本公开提供了一种含有本文提供的所述载体的宿主细胞。在某些实施方式中,本公开提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞包括包含所述第一多核苷酸的第一载体和包含所述第二多核苷酸的第二载体。在某些实施方式中,本公开提供了一种所述细胞,所述宿主细胞包括所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸。在某些实施方式中,本公开提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞包括本文公开的多肽复合物。在某些实施方式中,所述多肽复合物或所述多肽由宿主分泌至周围的基质或环境中。
在某些实施方式中,本公开提供了一种表达所述多肽或多肽复合物的方法,所述方法包括在适于表达本文提供的所述载体的条件下培养本文提供的所述宿主细胞。所述方法进一步包括纯化或分离所述多肽或多肽复合物的步骤。
在某些实施方式中,本公开提供了一种药物组合物,所述药物组合物包括本文提供的所述多肽复合物和药学载体。
在某些实施方式中,本公开提供了一种治疗或预防状况的方法,所述方法包括向所需对象给予有效量的本文提供的药物组合物,其中所述状况与所述多肽复合物能够结合的抗原相关。
在某些实施方式中,本公开提供了一种检测样品中抗原存在的方法,所述方法包括将所述样品与所述多肽复合物接触,并检测所述抗原的存在。
附图简述
图1:描述由抗体结合和FcγR结合至抗体/抗原复合物介导的受体二聚化或交联的示意图。A:二价IgG结合抗原,使靶分子二聚化;B:由二价抗体/抗原结合介导的受体交联(成簇)。细胞表面的TNF受体或超家族成员受体很可能结合成不传导信号的二聚体。二价抗体/抗原结合能够导致受体交联,以形成信号传导簇。C:通过抗体/抗原复合物与FcγR的结合,单价给合的抗原可以二聚化;D:通过抗体抗原复合物与FcγR的结合,单价给合的抗原形成受体簇。
图2:比较常规抗体的构型(左图)和DISCO体的基本构型(右图)。在DISCO体(右图)中,CH2CH3和含有半胱氨酸残基的C-末端柔性接头(或铰链)序列与Fab结构的N-末端融合。CH2CH3的二聚化促进了铰链半胱氨酸残基形成链间二硫键。二硫键的形成束缚了在空间上接近的两个Fab的抗原结合区域,同时限制了抗原结合区域在方向上的自由度。由此,表观抗原结合成为单价,或即使两个抗原结合区域能够与抗原靶点同时结合,所得到的靶分子的方向也可以被锁定于非活化构型。
图3:FabDISCO体。靶结合片段是Fab。CH2CH3-铰链融合至:A,Fab的VH;B,Fab的VL;CH3-铰链融合至:C,Fab的VH;D,Fab的VL。
图4:scFvDISCO体。靶结合片段是scFv。CH2CH3-铰链融合至:A,scFv的VH;B,scFv的VL;CH3-铰链融合至:C,scFv的VH;D,scFv的VL。
图5:单特异性DISCO体构型。CH3或CH2CH3序列通过含有半胱氨酸残基的柔性接头与Fab或scFv连接。铰链可以与Fab和scFv的VH或VL连接。CH3或CH2CH3融合蛋白形成同型二聚体并且随后促进链间铰链二硫键的形成。铰链二硫键锁定了空间上接近的抗原结合结构域,并对同时占据抗体上两个抗原结合位点形成空间位阻。由于抗体结合位点周围的空间的拥挤度,二硫键应该还限制了结合抗原的方向。
图6:多特异性FabDISCO体构型。多特异性FabDISCO体是通过将其他结合结构域与Fab单特异性DISCO体融合产生的(图5)。融合可以在CH3或CH2CH3的N-末端、Fd或LC的C-末端以及LC(A)或Fd(VHCHl)(B)的N-末端进行。所述其他的结合结构域可以是Fab、scFv、单结构域抗体(dAb)、单结构域骆驼抗体(骆驼VHH)、或基于非抗体结构域支架的结合子如纤连蛋白3结构域(Fn3)、锚蛋白重复、和其他支架形式。
图7:多特异性scFvDISCO体构型。多特异性scFvDISCO体是通过将其他结合结构域与Fab单特异性DISCO体融合产生(图5)。融合可以在CH3或CH2CH3的N-末端,和VL(A)或VH(B)的C-末端。所述附加的结合结构域可以是Fab、scFv、单结构域抗体(dAb)、单结构域骆驼抗体(骆驼VHH)、或基于非抗体结构域支架的结合子如纤连蛋白3结构域(Fn3)、锚蛋白重复、和其他支架形式。
图8:多肽复合物的实施方式和所实施的多肽复合物的主要序列示意图。图8A显示了多肽复合物的实施方式,其中第一蛋白单体与第二蛋白单体形成二聚体。图8B-8G显示了多肽复合物的不同实施方式的主要氨基酸序列示意图。在图8B和8C中,蛋白单体分别是CH2CH3结构域和CH3结构域,抗原结合结构域是Fab结构域,其中CH2CH3结构域或CH3结构域的C-末端与铰链序列的N-末端共价连接,铰链序列的C-末端与Fab结构域重链的C-末端共价连接,并且两个铰链序列形成两个链间二硫键。在图8D和8E中,蛋白单体分别是CH2CH3结构域和CH3结构域,抗原结合结构域是Fab结构域,其中CH2CH3结构域或CH3结构域的C-末端与铰链序列的N-末端共价连接,铰链序列的C-末端与Fab结构域轻链的C-末端共价连接,并且两个铰链序列形成两个链间二硫键。在图8F中,蛋白单体是CH2CH3结构域,抗原结合结构域是scFv结构域,其中CH2CH3结构域的C-末端与铰链序列的N-末端共价连接,铰链序列的C-末端与scFv结构域重链的C-末端共价连接,并且两个铰链序列形成两个链间二硫键。在图8G中,蛋白单体是CH3结构域,抗原结合结构域是scFv结构域,其中CH3结构域的C-末端与铰链序列的N-末端共价连接,铰链序列的C-末端与scFv结构域轻链的C末端共价连接,并且两个铰链序列形成两个链间二硫键。
图9显示了抗-CD3DISCO体和抗-EpCAM/CD3DISCO体的还原和非还原SDS-PAGE电泳图。
图10显示了根据FASC分析确定的抗-CD3DISCO体与Jurkat细胞的结合以及抗-CD3/EpCAMDISCO体与MCF-7细胞的结合:(a)同种型对照抗体与Jurkat细胞的结合;(b)抗-CD3DISCO体与Jurkat细胞的结合;(c)同种型对照抗体与MCF-7细胞的结合;和(d)抗-CD3/EpCAMDISCO体与MCF-7细胞的结合。
图11显示了在存在或不存在SW480细胞的条件下,与抗-CD3DISCO体或抗-EpCAM/CD3DISCO体孵育后在PBMC上CD69的表达。
图12显示了在为期65天的研究期间检测的经抗-EpCAM/CD3DISCO体(药物1)处理后小鼠的肿瘤体积(a)和体重(b)。
图13显示了在研究结束后检测的经抗-EpCAM/CD3DISCO体(药物1)处理后小鼠的肿瘤重量。
发明详述
下文中的描述仅仅旨在解释本公开的不同实施方式。因此,所讨论的具体的变型并非旨在进行限定。本领域技术人员将理解,在不脱离本文主题的主旨或范围的前提下可以其存在多种等同物、改变、和变型,并且理解此类等同的实施方式将包括在本文中。
本文所引用的所有参考文献,包括出版物、专利和专利申请通过整体引用并入本文。
常规的抗体由免疫球蛋白组成。免疫球蛋白具有四链基本结构,其由两条相同的重链和两条相同的轻链组成。免疫球蛋白分为五类,即免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG、和IgM,其均分别具有不同类型的重链α、δ、ε、γ、和μ。其中,根据其重链的性质,IgG可以进一步分为四个亚类,即IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4,IgA可以进一步分为两个亚类,即IgAl和IgA2。哺乳动物的轻链分为λ或κ轻链。
免疫球蛋白的各重链均由可变区(VH结构域)和若干恒定区(CH结构域)组成。在IgA、IgD、和IgC中,各重链均包含三个恒定区,即CHl结构域、CH2结构域和CH3结构域,以及在CHl和CH2结构域之间的铰链区。在IgM和IgE中,各重链均包含四个恒定区,即第一恒定区、第二恒定区、第三恒定区和第四恒定区,其中第二恒定区主要在IgA、IgD、和1gG的铰链区发挥作用。为了更好的说明,本文中使用的“CH2结构域”旨在指IgA、IgD、和IgG的第二恒定区,以及IgM和IgE的第三恒定区;本文中使用的“CH3结构域”旨在指IgA、IgD、和IgG的第三恒定区,以及IgM和IgE的第四恒定区;本文中使用的“铰链”区旨在指IgA、IgD、和IgG的铰链区,以及IgM和IgE的第二恒定区。免疫球蛋白的各轻链均由可变区(VL结构域)和恒定区(CL结构域)组成。
在免疫球蛋白中,重链的N-末端始于VH结构域的N-末端,VH结构域的C-末端与CH1结构域的N-末端共价连接。然后,CH1结构域的C-末端与铰链区的N-末端共价连接,接着CH2结构域的N-末端与铰链区的C-末端连接,CH3结构域的N-末端与CH2结构域的C-末端连接(参见图2,左图)。两个重链形成“Y”形。Y的各臂由VH结构域和CHl结构域组成,茎由两个铰链区、两个CH2结构域和两个CH3结构域组成,其中两个CH3结构域通过非共价相互作用形成二聚体。铰链区含有半胱氨酸且在两个重链之间能够形成二硫键。
同理,轻链的N-末端始于VL结构域的N-末端,其C-末端与CL结构域的N-末端共价连接。各轻链在Y臂与各重链配对,其VL结构域与VH结构域相联,CL结构域与CHl结构域相联,此类相联均通过CL结构域和CH1结构域之间的链间二硫键稳定。
位于Y两臂N-末端的VL结构域和VH结构域负责抗原的识别和结合。位于Y茎部C-末端的CH2和CH3结构域负责与效应器分子如Fc受体和补体C1q的相互作用,该相互作用触发了针对抗原的免疫应答,所述抗原与VL和VH结构域结合。
本公开的一方面提供了一种多肽复合物,所述多肽复合物包括第一多肽,所述第一多肽包括第一蛋白单体和第一抗原结合结构域,和第二多肽,所述第二多肽包括第二蛋白单体和第二抗原结合结构域,其中所述第一蛋白单体与所述第二蛋白单体形成二聚体;其中所述第一蛋白单体的C-末端可操作地与第一抗原结合结构域的N-末端连接;其中所述第二蛋白单体的C-末端可操作地与第二抗原结合结构域的N-末端连接。
如本文所使用的,术语“蛋白单体”指能够与另一蛋白片段形成二聚体的蛋白片段。
如本文所使用的,术语“抗原结合结构域”指能够与抗原靶点特异性结合的蛋白结构域。
如本文所使用的,术语“抗原靶点”或“抗原”或“靶点”指生物分子或其部分。抗原靶点的例子包括,但不限于,蛋白、肽、多核苷酸、脂质分子、糖分子、激素、神经递质、化合物、或者包含其组合的复合物。
如本文所使用的,术语“特异性结合”指两个分子之间的非随机结合。在某些实施方式中,抗原结合结构域与抗原靶点特异性结合的结合亲和力(Kd)为≤10-6M。例如,抗原结合结构域与抗原靶点结合的Kd可以是≤5×l0-7M、≤10-7M、≤5×l0-8M、≤10-8M、≤5×l0-9M、≤10-9M、≤5×l0-10M、或≤10-10M。如本文所使用的,Kd指解离速率与结合速率的比值(k解离/k结合),其可以采用本领域公知的任意适宜方法确定,例如Biacore(MalmqvistM.,Biochem.Soc.Trans.,27(2):335-340(1999))或Kinexa技术(Darling,R.J.等,AssayDrugDev.Technol.,2(6):647-657(2004))
在多肽复合物中,所述第一蛋白单体的C-末端可操作地与所述第一抗原结合结构域的N-末端连接,所述第二蛋白单体的C-末端可操作地与所述第二抗原结合结构域的N-末端连接。
如本文所使用的,多肽的“C-末端”指多肽的最后一个氨基酸残基,其贡献出胺基与相邻氨基酸残基的羧基形成肽键。如本文所使用的,术语多肽的“N-末端”指多肽的第一个氨基酸,其贡献出羧基与相邻氨基酸残基的胺基形成肽键。
如本文所使用的,术语“可操作地连接”指通过一个或多个化学键直接连接或通过一个或多个接头间接连接。
任意适宜的化学键均可以用于进行直接连接,包括但不限于,共价键如肽键和二硫键,非共价键如氢键、疏水键、离子键、和范德华键。
“共价键”在本文中指共用一个或多个电子的两个原子间的稳定结合。共价键的例子包括,但不限于肽键和二硫键。如本文所使用的“肽键”指在氨基酸的羧基和相邻氨基酸的胺基之间形成的共价键。如本文所使用的“二硫键”指在两个硫原子之间形成的共价键。二硫键可以通过两个巯基之间的氧化反应形成。在某些实施方式中,可操作地连接是通过共价键的直接连接。在某些实施方式中,可操作地连接是通过肽键或二硫键的直接连接。
“非共价键”在本文中指两个原子或两个化学基团之间不涉及共用电子的相互吸引的相互作用。非共价键的例子包括,但不限于,氢键、疏水键、离子键、和范德华键。“氢键”在本文中指第一个原子/基团的氢原子与第二个原子/基团的电负性原子之间的吸引力。“疏水键”在本文中指在水性环境中导致疏水性或非极性分子/基团聚集或结合在一起的力。“离于键”在本文中指阳离子与阴离子之间的吸引力。“范德华键”在本文中指在电子分布上具有瞬时随机波动的两个相邻的分子/基团之间的非特异性吸引力。在某些实施方式中,可操作地连接通过非共价键直接连接。在某些实施方式中,可操作地连接直接通过氢键、疏水键、离子键、或范德华键连接。
可以使用任意适宜的接头进行间接连接,例如但不限于,肽接头、聚合物接头、和化学接头。在某些实施方式中,可操作地连接是通过肽接头的间接连接。
在某些实施方式中,所述第一蛋白单体的C-末端通过一个或多个化学键,与所述第一抗原结合结构域的N-末端直接连接。在某些实施方式中,所述第二蛋白单体的C-末端通过一个或多个化学键,与所述第二抗原结合结构域的N-末端直接连接。
在某些实施方式中,所述第一多肽进一步包括第一接头,以及所述第一接头的一端与所述第一蛋白单体的C-末端共价连接,所述第一接头的另一端与所述第一抗原结合结构域的N-末端共价连接。在某些实施方式中,所述第二多肽进一步包括第二接头,以及所述第二接头的一端与所述第二蛋白单体的C-末端共价连接,所述第二接头的另一端与所述第二抗原结合结构域的N-末端共价连接。
在多肽复合物中,所述第一蛋白单体与所述第二蛋白单体形成二聚体。可以通过一个或多个化学键或者一个或多个接头形成二聚体。所述蛋白复合物的示例性结构见图8A。
在某些实施方式中,所述第一蛋白单体通过一个或多个化学键与所述第二蛋白单体形成二聚体。所述化学键可以包括共价键或非共价键。所述共价键可以包括二硫键。所述非共价键可以包括氢键、疏水键、离子键、和/或范德华键。
在某些实施方式中,所述第一蛋白单体通过一个或多个接头与所述第二蛋白单体形成二聚体。可以使用适于将两个分子连接的任意接头,包括但不限于肽接头、聚合物接头、和化学接头。在某些实施方式中,所述一个或多个接头包括肽接头。
抗原结合结构域
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包括来自抗体的组分或者可以是非抗体组分。来自抗体的组分可以包括抗体片段或者一个或多个抗体片段的基因工程产物,其中所述片段与抗原结合相关。来自抗体的组分的例子包括,但不限于,互补决定区(CDR)、可变结构域(Fv)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、重链、轻链、单链可变区(scFv)、Fab、单结构域骆驼抗体(骆驼VHH)、和单结构域抗体(dAb)。
抗体中的“互补决定区”或“CDR”指抗体重链或轻链可变区中的高变环。CDR能够与抗原构型互补并决定与抗原的结合。重链可变区和轻链可变区均含有3个CDR。可以通过常规方法定义或鉴定CDR,如根据Kabat等(Wu,TT和Kabat,E.A.,JEXpMed.132(2):211-50,(1970);Borden,P.和KabatE.A.,PNAS,84:2440-2443(1987);Kabat,E.A.等,Sequencesofprotelinsofimmunologicalinterest,PublishedbyDIANEPublishing,1992)进行测序,或根据Chothia等(Choithia,C.和Lesk,A.M.,JMol.Bio1.,196(4):901-917(1987),Choithia,C.等,Nature,342:877-883(1989))测定结构。
抗体的“重链可变区”或“VH”指重链片段,其含有三个CDR,CDR间接插入到两侧的伸展区(flankingstretch)即框架区,其与CDR相比更为高度保守并形成支架以支持CDR。
抗体的“轻链可变区”或“VL”指轻链片段,其含有插入框架区之间的三个CDR。
抗体的“Fv”指具有完整抗原给合位点的最小的抗体片段。Fv片段由与单一重链可变区结合的单一轻链可变区组成。
抗体的“单链Fv抗体”或“scFv”指工程化抗体,其由直接或通过肽接头序列相互连接的轻链可变区和重链可变区组成。
抗体的“Fab”指抗体部分,所述抗体部分由通过二硫键结合至单一重链的可变区和第一恒定区的单一轻链(可变区和恒定区)组成。
如本文所使用的“单结构域骆驼抗体”或“骆驼VHH”指已知最小的重链抗体的抗原结合单位(Koch-Nolte等,FASEBJ.,21:3490-3498(2007))。“重链抗体”或“骆驼”抗体指含有两个VH结构域且不含轻链的抗体(RiechmannL.等,J.Immunol.Methods231:25-38(1999);WO94/04678;WO94/25591;U.5.专利号6,005,079)
“单结构域抗体”或“dAb”指由抗体重链可变结构域(VH结构域)或抗体轻链可变结构域(VL结构域)组成的抗体片段(Holt,L.等,TrendsinBiotechnology,21(11):484-490)。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域选自:CDR、Fv、VH、VL、重链、轻链、scFv、Fab、骆驼VHH、和dAb。在某些实施方式中,所述第一抗原给合结构域和所述第二抗原结合结构域均为scFv或均为Fab。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域是来自抗-CD3抗体、抗-EpCAM抗体、抗-IL-6抗体、抗-CDl9抗体、抗-TNFR抗体、或抗-PSCK抗体的抗体组分。来自抗体的组分可以是这些抗体的Fab片段或scFv片段。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域包括第一轻链片段,其通过二硫键与第一重链片段连接。例如,所述第一蛋白单体的C-末端可操作地与所述第一轻链片段的N-末端连接,其通过二硫键与所述第一重链片段连接(参见,例如图3B和D)。在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域包括第二重链片段,其通过二硫键与第二轻链片段连接。例如,所述第一蛋白单体的C-末端可操作地与所述第二重链片段的N-末端连接,所述第二重链片段通过二硫键与第二轻链片段连接(参见,例如图3A和C)。
如本文所使用的术语“通过二硫键与……连接”指重链片段通过一个或多个链间二硫键与轻链片段结合。在两个片段之间通过巯基的连接可以在两个片段之间形成一个或多个二硫键。在某些实施方式中,在重链片段和轻链片段的一个或多个半胱氨酸残基之间可以分别形成一个或多个二硫键。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域包括scFv片段,其轻链或重链可操作地与各蛋白单体连接。所述蛋白复合物的示例性结构见图4a-d。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包括非抗体组分。与抗原结合的非抗体组分可以是能够识别并结合至抗原的任意适宜的蛋白结构域或者组分,例如参与蛋白-蛋白相互作用、蛋白-脂质相互作用、蛋白-多核苷酸相互作用、蛋白-糖相互作用、或配体结合的蛋白结构域。适宜的非抗体组分的例子包括,但不限于,纤连蛋白3结构域(Fn3)、锚蛋白重复、和阿德奈汀(Adnectin)。
]如本文所使用的“纤连蛋白3结构域”或“Fn3”指参与同生物分子结合的纤连蛋白中的自发折叠单元(Calaycay,J.等,J.Biol.Chem.,260(22):12136-41(1985);Koide,A.等,J.Mol.Bio1.,284(4):1141-1151(1998);Bloom,L.等,DrugDiscoveryToday,14(19-20):949-955(2009))。Fn3结构域可以见于多种蛋白中,,并且已发现Fn3结构域的不同重复中含有针对生物分子如DNA和蛋白的结合位点。
如本文所使用的“锚蛋白重复”指在红细胞锚蛋白中发现的含有33个氨基酸残基重复的蛋白组分(Davis,L.H.等,J.Biol.Chem.,266(17):11163-11169(1991))。已知锚蛋白重复是最常见的蛋白-蛋白相互作用结构之一,其出现在多种具有不同功能的蛋白中。
如本文所使用的“阿德奈汀(Adnectin)”是基于Fn3结构域的基因工程化的蛋白(Koide,A.等,MethodsMol.Bio1.,352:95-109(2007))。阿德奈汀中的Fn3结构域含有3个环,其模拟抗体可变区的三个CDR,并且能够对其进行基因裁剪以使其能够与不同的靶分子特异性结合。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域相同。所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域相同是指其至少具有一个相似性,例如但不限于,其均是来源于抗体、其均是非抗体组分、其均包含scFv、其均包含Fab、其均与相同的抗原靶点结合、或者其具有相同的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域不同。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域和所述第二结合结构域与相同的靶点结合。所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域与相同的靶点结合,指所述靶点具有至少一个相似性,例如但不限于,所述靶点都包括蛋白、多核苷酸、或脂质,所述靶点是相同的蛋白但可以是不同的同种型,所述靶点具有相同的化学结构但可以是不同立体异构体,或者所述靶点具有相同的氨基酸序列。在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域和所述第二结合结构域与不同的靶点结合。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域可能对一种以上的抗原靶点具有交叉反应性。如本文所使用的“交叉反应性”指能够特异性与一种以上抗原靶点结合的抗原结合结构域。在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域可能具有与完全不同的抗原靶点交叉反应性,不同的抗原靶点例如丙型肝炎核心蛋白和来源于宿主的GOR蛋白。在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域可能具有与不同种属的抗原靶点的交叉反应性,例如人CD3和猴CD3。
蛋白单体
在某些实施方式中,所述第一蛋白单体和/或所述第二蛋白单体包括来自抗体的单体或非抗体单体。
来自抗体的单体可以是抗体片段或一种或多种抗体片段的基因工程化产品,所述片段可以与另一个片段二聚化。所述来自抗体的单体的例子包括但不限于来自免疫球蛋白的CH3结构域。在某些实施方式中,来自免疫球蛋白的CH3结构域选自:IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。
在某些实施方式中,所述第一蛋白单体和/或所述第二蛋白单体包括来自免疫球蛋白的CH3结构域。在某些实施方式中,所述第一蛋白单体和/或所述第二蛋白单体进一步包括来自免疫球蛋白的CH2结构域。在某些实施方式中,所述CH2结构域的C末端与CH3结构域的N-末端共价连接。在某些实施方式中,来自免疫球蛋白的CH2结构域选自:IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。
非抗体单体可以是能够与另一个蛋白片段二聚化的非抗体蛋白片段。此类二聚化作用可以由共价键如二硫键或非共价相互作用如氢键、疏水键、离子键、和范德华键所介导。
在某些实施方式中,所述第一蛋白单体与所述第二蛋白单体相同。在某些实施方式中,所述第一蛋白单体与所述第二蛋白单体不同。
在某些实施方式中,所述第一蛋白单体和所述第二蛋白单体形成二聚体,在多肽复合物中二聚体的形成基本减少了所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域与抗原的同时结合。
术语“基本减少”指相比于所述第一多肽和所述第二多肽不关联时的同时结合,与所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的同时结合至少减少10%。
在某些实施方式中,相比于当所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域存在于常规抗体结构中时的同时结合,所述同时结合减少至少10%。例如,与具有两个相同Fab片段的常规抗-CD3抗体相比,本文中提供的包括此类Fab片段的蛋白复合物的两个Fab与CD3抗原的同时结合能够减少至少10%。再例如,可以对常规的IgG进行修饰使其包括两个scFv片段以取代大然的Fab片段,当与此类经修饰的IgG进行比较时,本文中提供的包括这样两个作为第一和第二抗原结合结构域的scFv片段的蛋白复合物中,scFv与各抗原的同时结合能够减少至少10%。所述减少的百分率可以是,例如但不限于,约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、或约90%。
术语“同时结合”指所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域同时被其各自的抗原占据。可以使用本领域公知的任意适宜方法确定同时结合。例如,将所述第一抗原固化在基质上,然后允许所述蛋白复合物与所述第一抗原结合,除去未结合的蛋白复合物后,加入所述第二抗原(其与第一抗原可以相同也可以不同)使其与所述蛋白复合物同时结合,然后除去未结合的第二抗原,测定结合的第二抗原的存在情况/量作为同时结合的指示。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域的同时结合可以使得抗原靶点足够接近或者处于适宜的空间方向,由此诱导结合的抗原靶点之间的功能性相互作用。如本文所使用的术语“功能性相互作用”指改变所述抗原靶点的生物学状态的相互作用,例如但不限于,失活的靶点可以通过相互作用活化,活化的靶点可以通过相互作用失活,或者未参与信号转导的靶点可以通过相互作用诱导发出信号。
在某些实施方式中,二聚体的形成产生了立体位阻,这样当所述第一抗原结合结构域与抗原靶点结合时,所述第二抗原结合结构域基本上被阻止与第二抗原靶点结合,由此,由第一和第二抗原结合结构域的同时结合导致的功能性相互作用(例如,信号转导)基本上减少。如本文所使用的“基本上阻止”指所述抗原结合结构域与所述抗原靶点结合的能力降低,或者即使所述抗原结合结构域与所述抗原靶点结合,但是这种结合并不会诱导涉及结合的抗原靶点的功能性相互作用。
在某些实施方式中,在结合的抗原靶点之间的功能性相互作用包括信号转导。如本文所使用的“信号转导”指同时结合抗原靶点间的功能性相互作用,其能够导致至少一个抗原靶点的活化。活化后,活化的抗原靶点可以吸引并与效应器分子反应,并由此开启生物应答的信号通路。效应器分子可以被转化为活性形式,或者可以被转化从而可与其他信号分子形成活性复合物,或者可以转位至细胞的某个功能性区域,或者如果效应器分子对通路具有抑制作用则可以被灭活以允许信号通路的继续进行。信号转导可能导致一个或多个生物应答。如本文所使用的术语“生物应答”指细胞活动的改变,包括但不限于,细胞增殖、细胞死亡、细胞运动、分子释放、蛋白表达、和分子迁移。可以在任意适宜的信号转导水平确定所述抗原靶点的信号转导。例如,可以确定效应器分子与活化的抗原靶点的结合,可以确定转化的效应器分子或效应器分子复合物或相关/下游效应器分子的量,可以确定效应器分子或效应器分子复合物或相关/下游效应器分子的位置,或者可以确定生物应答。在本领域中有多种可以用于信号转导测定的方法和实验。适宜方法的例子可以包括,但不限于,涉及使用放射性标记或荧光标记效应器分子以测定与活化的抗原靶点结合的效应器的那些方法,涉及使用针对效应器分子或效应器分子复合物或相关/下游效应器分子的放射性标记或荧光标记抗体的那些方法,针对生物应答如细胞增殖、细胞死亡、细胞运动、分子释放、蛋白表达、和分子迁移的实验。本领域技术人员能够根据活化的抗原靶点和相关信号转导通路选择适宜的检测。
接头
在某些实施方式中,所述第一多肽进一步包括第一接头,并且所述第二多肽进一步包括第二接头。在某些实施方式中,所述第一接头或所述第二接头包括肽接头。在某些实施方式中,所述第一多肽进一步包括第一肽接头,并且所述第一肽接头的N-末端与所述第一蛋白单体的C-末端共价连接,以及所述第一肽接头的C-末端与所述第一抗原结合结构域的N-末端共价连接。在某些实施方式中,所述第二多肽进一步包括第二肽接头,并且所述第二肽接头的N-末端与所述第二肽单体的C-末端共价连接,以及所述第二肽接头的C-末端与所述第二抗原结合结构域的N-末端共价连接。
在某些实施方式中,所述肽接头包括含有巯基残基的肽接头。如本文所使用的“巯基残基”指含有巯基的氨基酸。在某些实施方式中,所述巯基残基包括半胱氨酸残基。蛋白复合物的示例性结构包括如图5所示的含有巯基残基的胱接头。
在某些实施方式中,所述第一肽接头含有第一巯基残基并且所述第二肽接头含有第二巯基残基,以及所述第一肽接头和所述第二肽接头形成二硫键。在某些实施方式中,所述二硫键基本减少了所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域与抗原的同时结合。在某些实施方式中,所述二硫键基本减少了各抗原靶点对所述抗原结合结构域的共占位。在某些实施方式中,所述二硫键基本减少了同时结合的抗原靶点的信号转导,至少部分地通过限制所述结合抗原靶点的相互靠近或其空间定位。
不受理论的束缚,据信所述二硫键和所述肽接头C-末端之间的适宜距离,能够阻碍位于接近所述肽接头C-末端位置的所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域与抗原的同时结合。如果二硫键与所述肽接头的C-末端足够接近,则所述二硫键可以产生空间位阻以使得当所述第一抗原结合结构域与抗原靶点结合时,所述第二抗原结合结构域基本上被阻止与第二抗原靶点结合,结果基本减少由所述第一和第二抗原结合结构域的同时结合引起的功能性相互作用(例如,信号转导)。
在某些实施方式中,所述第一巯基残基与所述第一肽接头的C-末端相距1-10个氨基酸残基。在某些实施方式中,所述第二巯基残基与所述第二肽接头的C-末端相距1-10个氨基酸残基。
在某些实施方式中,所述含有巯基残基的肽接头可以包含至少一个免疫球蛋白铰链序列片段。在某些实施方式中,所述含有巯基残基的肽接头包含至少一个IgG铰链序列片段。在某些实施方式中,所述含有巯基残基的肽接头包含CysProProCys(SEQIDNO:68)、或ThrHisThrCysProProCysProAlaPfo(SEQIDNO:69)、或AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaPro(SEQIDNO:70)的氨基酸序列。
其他抗原结合结构域
在某些实施方式中,所述多肽复合物可以进一步包括一个或多个其他抗原结合结构域,其可操作地与所述多肽复合物的具有任意氨基(-NH2)的任意N-末端或具有任意羧基(-COOH)的任意C-末端连接。
在某些实施方式中,所述第一蛋白单体的N-末端可操作地与第三抗原结合结构域连接。在某些实施方式中,所述第二蛋白单体的N-末端可操作地与第四抗原结合结构域连接(参见,例如图6和7,“U”位置)。在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域的C-末端可操作地与第五抗原结合结构域连接。在某些实施方式中,所述第二抗原结合结构域的C-末端可操作地与第六抗原结合结构域连接(参见,例如图6和7,“W”和/或“V”位置)
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域是第一轻链片段,其通过二硫键与第一重链片段连接(参见,例如,图6B)。在某些实施方式中,所述第一轻链片段的C-末端可操作地与第七抗原结合结构域连接(参见,例如,图6B,“W”位置)。在某些实施方式中,所述第一重链片段的C-末端可操作地与第八抗原结合结构域连接(参见,例如,图6B,“V”位置)。在某些实施方式中,所述第一重链片段的N-末端可操作地与第九抗原结合结构域连接(参见,例如,图6B,“X”位置)。
在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域是第二重链片段,其通过二硫键与第二轻链片段连接(参见,例如,图6A)。在某些实施方式中,所述第二重链片段的C-末端可操作地与第十抗原结合结构域连接(参见,例如,图6A,“V”位置)。任某些实施方式中,所述第二轻链片段的C-末端可操作地与第十一抗原结合结构域连接(参见,例如,图6A,“W”位置)。在某些实施方式中,所述第二轻链片段的N-末端可操作地与第十二抗原结合结构域连接(参见,例如,图6A,“X”位置)。
在某些实施方式中,所述其他抗原结合结构域可以是来自于抗体的组分或非抗体组分。在某些实施方式中,所述其他抗原结合结构域选自:CDR、Fv、VL、VH、轻链、和重链、ScFv、Fab、骆驼VHH、dAb、纤连蛋白3结构域(Fn3)、锚蛋白重复、和阿德奈汀(Adnecth)。
在某些实施方式中,多肽复合物中的抗原结合结构域与抗原靶点特异性结合,所述抗原靶点与状况相关。所述状况可以包括生理状况、病理状况和关容状况。适宜状况的例子包括,但不限于,肿瘤、癌症、炎症、同种异体移植、I型糖尿病、和多发性硬化症。
在某些实施方式中,所述抗原靶点与所述状况负相关。在某些实施方式中,通过所述多肽复合物与所述抗原靶点的结合,能够灭活或拮抗所述抗原靶点的生物学功能,并由此改善所述状况。
多肽复合物中的抗原结合结构域能够与任意适宜的抗原靶点特异性结合。适宜抗原靶点的例子包括,但不限于,TNF受体(参见,例如,ShenH.M.等,FASEBJ.20(10):1589-98(2006)),cMet(参见,例如,Bottafo,D.P.等,Science,251(4995):802-804(1991)),CD3(参见,例如,ChettyR.等,JPathol.,173(4):303-7(1994)),CD40(参见,例如,ChatzigeorgiouA..,Biofactors.,35(6):474-83(2009)),DR3(参见,例如,MeylanF.等,Immunity.,29(1):79-89(2008)),FcγR(参见,例如,TorkildsenO.等,ActaNeurolScandSuppl.183:61-3(2006)),NKG2D(参见,例如,ObeidyP.等,IntJBiochemCellBio1.,41(12):2364-7(2009)),IL-6(参见,例如,Fefguson-Smith等,Genomics2(3):203-208(1988)),PCSK9(LambertG.等,Curr.Opin.Lipidol.18(3):304-9(2007))及其任意衍生物。
其他抗原结合结构域可以与所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域相同或不同。所述其他抗原结合结构域可以结合至与所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域相同或不同的靶点。
在某些实施方式中,当所述第一和所述第二抗原结合结构域与第一抗原靶点结合时,所述其他抗原结合结构域可以同时与第二抗原靶点结合。在某些实施方式中,当仅与一个靶点结合时,所述多肽复合物不会导致涉及结合靶点的显著功能性相互作用,但是当与所述第一靶点和所述第二靶点同时结合时,所述抗体复合物能够促进所述两个靶点之间的功能性相互作用。例如,多肽复合物能够结合至第一抗原靶点CD3,和第二抗原靶点肿瘤表面抗原,当所述多肽复合物与CD3或肿瘤表面抗原结合时,T细胞不会活化,但是当CD3和肿瘤表面抗原同时与所述多肽复合物结合时,T细胞在携带有肿瘤表面抗原的癌细胞的附近活化,因此T细胞的肿瘤杀伤作用显著增加,并且降低或阻止副作用,如由CD3活化引起的细胞因子风暴。
在某些实施方式中,所述第一抗原靶点和所述第二抗原靶点的组合可以是CD3和肿瘤表面抗原的组合,所述组合能够增强T细胞的肿瘤杀伤作用。在某些实施方式中,所述第一抗原靶点和所述第二抗原靶点的组合可以是FcγR和肿瘤表面抗原的组合,所述组合能够诱导表达FcγR的免疫细胞杀伤肿瘤细胞。在某些实施方式中,所述第一抗原靶点和所述第二抗原靶点的组合可以是CD3和NKG2D的组合,所述组合能够诱导自然杀伤(NK)细胞杀死肿瘤细胞。
在某些实施方式中,当所述第一和第二抗原结合结构域与第一抗原靶点结合时,所述其他抗原结合结构域能够同时与第二抗原靶点和第三抗原靶点结合。在某些实施方式中,所述第一抗原靶点、第二抗原靶点和第三抗原靶点之一可以选自:CD3、FcγR和NKG2D,以及另两个可以是优选在癌细胞上表达的两个不同抗原。这种组合可以增强对肿瘤细胞的靶向特异性,并防止杀死表达单一抗原或低水平表达这些抗原的正常细胞。
在某些实施方式中,当所述第一和第二抗原结合结构域与第一抗原靶点结合时,所述其他抗原结合结构域能够同时与第二抗原靶点、第三抗原靶点和第四抗原靶点结合。在某些实施方式中,当所述第一和第二抗原结合结构域与第一抗原靶点结合时,所述其他抗原给合结构域能够同时与第二抗原靶点、第三抗原靶点、第四抗原靶点和第五抗原靶点结合。
功能和优点
所述多肽复合物的功能在于与抗原靶点结合并且在某些情况下能够提供优于其他抗原结合蛋白的优点。
在某些实施方式中,所述多肽复合物的所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域与抗原靶点的同时结合基本减少。此类多肽复合物能够功能性地抑制所述抗原靶点,特别是那些当足够接近时容易被活化的抗原靶点,例如,通过与所述第一和第二抗原结合结构域同时结合而足够接近。由同时结合导致的抗原靶点的不必要活化可能是不需要的,且在某些情况下甚至是有害的,需要对所述靶点进行消除和/或抑制。例如,当使用常规抗体通过抑制受体酪氨酸激酶治疗肿瘤时,所述常规抗体的抗原结合结构域能够同时容纳足够接近的两个受体酪氨酸激酶,使得其能够彼此磷酸化成活化形式,并且引起导致肿瘤状况恶化的信号转导。抗原靶点的活化还能够导致其他副作用,例如,目前的抗-CD3抗体能够活化CD3并且导致如细胞因子风暴、淋巴细胞减少、T细胞的再分布和边缘化、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的再活化等的副作用。本文提供的所述多肽复合物的某些实施方式能够基本减少所述抗原靶点的同时结合,并因此阻止或减少靶点的活化,从而增强靶点抑制的效率以及阻止或减少与靶点活化相关的副作用。
在某些实施方式中,除所述第一和第二抗原结合结构域之外,所述多肽复合物进一步包括一个或多个其他抗原结合结构域。所述其他抗原结合结构域能够与一个或多个抗原靶点结合,所述抗原靶点不同于已有的与所述第一和第二抗原结合结构域结合的抗原靶点。在某些实施方式中,所述一个或多个抗原靶点可以是位于己有的抗原靶点附近的分子,以使得所述多肽复合物能够在已有的抗原靶点附近特异性的富集,以改善所述作用的特异性。在某些实施方式中,所述一个或多个抗原靶点可以参与已有的抗原靶点的相同或相近的状况,并且所述多肽复合物能够功能性同时抑制多个靶点,并因此对所述状况提供组合效应或甚至协同效应,或者对广谱的相关状况,如广谱的肿瘤有效。在某些实施方式中,所述一个或多个其他抗原靶点可以是免疫细胞表面标记物,所述己有的抗原靶点可以是疾病靶点,通过与所述免疫细胞表面标记物和所述疾病靶点的同时结合,所述多肽复合物能将免疫细胞引至疾病靶点,并促进针对疾病靶点的免疫应答。在某些实施方式中,所述一个或多个抗原靶点可以是存在于疾病细胞上的两个不同的标记物,所述己有的抗原靶点可以是免疫细胞表面标记物,通过与两个疾病标记物的同时结合,所述多肽复合物能够特异性将免疫细胞指向含有两个疾病靶点的靶点,并促进针对所述疾病细胞的免疫应答,结果可以阻止或减少针对仅含有疾病标记物之一的正常细胞的不需要的免疫应答。
在某些实施方式中,所述多肽复合物的蛋白单体是CH3结构域,其C-末端可操作地与所述抗原结合结构域的N-末端连接。与常规抗体相比,所述多肽复合物缺乏CH2结构域和,可选地,部分铰链序列,据信这两者均参与了Fc受体的结合。Fc受体结合可以通过形成Fc受体簇诱导抗原靶点的活化,并由此使得结合的抗体和结合的抗原靶点更接近。所述多肽复合物的某些实施方式不包括CH2结构域和,可选地,部分铰链序列,因而可能具有非常低的Fc受体结合,从而阻止或减少Fc受体诱导的抗原靶点的活化或其他副作用。
除了减少Fc受体结合以外,缺乏CH2结构域的多肽复合物还可以具有更短的血清半衰期,在不需要较长血清半衰期的情况下其可能是可取的。例如,缺乏CH2结构域的多肽复合物可以具有缩小的分子尺寸,但仍在肾滤过尺寸60kD以上,因此其不会从血液中被过滤并且能够具有约1-2天的中等的血清半衰期。
在需要较长血清半衰期的情况下,如果不涉及Fc受体的结合,可以将所述多肽与CH2结构域融合,或与偶联物如聚合物偶联物、白蛋白、白蛋白接头连接,以增加分子尺寸并由此使其具有更长的血清半衰期。
多肽
另一方面,本公开提供了一种多肽,所述多肽包括蛋白单体和抗原结合结构域,其中所述蛋白单体的C-末端可操作地与所述抗原结合结构域的N-末端连接。
在某些实施方式中,所述蛋白单体的C-末端通过一个或多个化学键直接与所述抗原结合结构域的N-末端连接。在某些实施方式中,所述一个或多个化学键包括共价键。在某些实施方式中,所述一个或多个化学键包括肽键。
在某些实施方式中,所述蛋白单体的C-末端通过接头间接与所述抗原结合结构域的N-末端连接。在某些实施方式中,所述接头可以是肽接头、聚合物接头或化学接头。在某些实施方式中,所述多肽进一步包括接头,并且所述接头的一端与所述蛋白单体的C-末端共价连接,并且所述接头的另一端与所述抗原结合结构域的N-末端共价连接。
在某些实施方式中,所述接头是肽接头。在某些实施方式中,所述多肽进一步包括肽接头,以及所述肽接头的N-末端与所述蛋白单体的C-末端共价连接,并且所述肽接头的C-末端与所述抗原结合结构域的N-末端共价连接。
在某些实施方式中,所述肽接头是含有巯基残基的肽接头。在某些实施方式中,所述巯基残基包括半胱氨酸残基。
在某些实施方式中,所述蛋白单体包括来自于抗体的单体或非抗体单体。在某些实施方式中,所述蛋白单体包括来自于抗体的组分。在某些实施方式中,所述蛋白单体包括来自免疫球蛋白的CH3结构域,并且所述CH3结构域的C-末端可操作地与所述抗原结合结构域的N-末端共价连接。在某些实施方式中,所述蛋白单体进一步包括来自免疫球蛋白的CH2结构域并且所述CH2结构域的C-末端与所述CH3结构域共价连接。在某些实施方式中,所述免疫球蛋白选自:IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。
在某些实施方式中,所述抗原结合结构域包括来自于抗体的组分或非抗体组分。在某些实施方式中,所述抗原结合结构域选自:CDR、Fv、VL、VH、轻链、和重链、ScFv、Fab、骆驼VHH、dAb、Fn3、锚蛋白重复、和阿德奈汀(Adnecth)。
在某些实施方式中,所述抗原结合结构域特异性地与抗原靶点结合。在某些实施方式中,所述抗原靶点与状况相关。在某些实施方式中,所述状况是生理状况、病理状况或美容状况。在某些实施方式中,所述抗原靶点包括TNF受体、cMet、CD3、CD4O、DR3、FcγR、NKG2D、IL-6、PCSK9、及其衍生物。
在某些实施方式中,所述第一多肽和第二多肽可以来自本文提供的多肽复合物。在某些实施方式中,所述第一多肽包括第一蛋白单体,并且所述第二多肽包括第二蛋白单体,以及所述第一蛋白单体与所述第二蛋白单体形成二聚体,以提供本文所述的多肽复合物。通过一个或多个化学键或者通过一个或多个接头,所述第一单体和所述第二单体可以形成二聚体。所述一个或多个化学键可以包括共价键如肽键或二硫键,和/或非共价键如氢键、疏水键、离子键、或范德华键。所述一个或多个接头可以包括肽接头、聚合物接头或化学接头。
在某些实施方式中,所述第一多肽和所述第二多肽是相同的或不同的。在某些实施方式中,所述第一蛋白单体和所述第二蛋白单体是相同的或不同的。在某些实施方式中,所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域是相同的或不同的。
多核苷酸、载体和宿主细胞
另一方面,本公开提供了一种编码本文所述多肽的分离的多核苷酸。所述多核苷酸可以是DNA或RNA。可以采用本领域公知的任意适宜方法分离和扩增所述的多核苷酸,例如聚合酶链式反应(PCR)。
在某些实施方式中,所述分离的多核苷酸被插入载体。如本文所使用的,术语“载体”指一种载体,在其中可以可操作地插入编码蛋白的多核苷酸,以表达所述蛋白和/或克隆所述多核苷酸。可以使用本领域公知的任意适宜方法将所述分离的多核苷酸插入载体,例如,但不限于,涉及使用限制性内切酶的方法,即可以使用适宜的限制性内切酶消化所述载体,然后可以将其与具有相匹配的内切酶酶切末端的分离的多核苷酸连接。
适宜的载体的例子包括,但不限于,质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或来源于Pl的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体、和动物病毒。用于作为载体的动物病毒类别的例子包括,但不限于,逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如,单纯疱诊病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、和乳头多瘤空泡病毒(例如,SV40)。
对所述多肽的表达而言,可以将所述载体引入宿主细胞,以使得所述多肽在宿主细胞内表达。所述表达载体可以包含用于控制表达的多种元件,包括但不限于,启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择性标记物、和信号序列。本领域的普通技术人员可以对这些元件进行适宜选择。例如,可以对启动子序列进行选择以便在载体中启动所述多核苷酸的转录。适宜的启动子序列包括,但不限于,T7启动子、T3启动子、SP6启动子、β-肌动蛋白启动子、EFla启动子、CMV启动子、和SV40启动子。可以对增强子序列进行选择以增强所述多核苷酸的转录。可以对选择性标记物进行选择,以便将插入所述载体的宿主细胞从未插入的那些中选择出来,例如所述选择性标记物可以是具有抗生素抗性的基因。可以对信号序列进行选择以使得已表达多肽被转运出宿主细胞。
载体还可以包括辅助其进入细胞的材料,包括但不限于病毒粒子、脂质体、或蛋白外壳。
对于所述多核苷酸克隆而言,可以将所述载体引入宿主细胞,以允许所述载体自身的复制,从而扩增其中含有的多核苷酸拷贝。所述克隆载体可以含有的序列组分一般包括但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列、和选择性标记物。本领域的普通技术人员可以对这些元件进行适宜选择。例如,可以对复制原点进行选择以启动所述载体在宿主细胞中的自主复制。
在某些实施方式中,本公开提供了一种载体,所述载体包括编码本文公开的第一多肽的第一多核苷酸,和编码本文公开的第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方式中,本公开提供了一种第一载体,所述第一载体包括编码本文公开的第一多肽的第一多核苷酸。在某些实施方式中,本公开提供了一种第二载体,所述第二载体包括编码本文公开的第二多肽的第二多核苷酸。
在某些实施方式中,本公开提供了一种包含本文所提供的载体的宿主细胞。含有所述载体的宿主细胞可以用于表达或克隆所述载体中含有的多核苷酸。
适宜的宿主细胞可以包括但不限于原核细胞、真菌细胞、或高等真核细胞。
用于这一目的的适宜原核细胞包括,但不限于,真细菌如革兰氏阴性或革兰氏阳性微生物,例如肠杆菌科如埃希氏菌属例如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属例如鼠伤寒沙门氏菌、沙雷氏菌属例如粘质沙雷氏菌、和志贺氏菌属,以及芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌、假单胞菌属如铜绿假单胞菌、和链霉菌属。
用于这一目的的适宜真菌细胞包括,但不限于,丝状真菌和酵母。真菌细胞的示例性例子包括酿酒酵母、常见的面包酵母、粟酒裂殖酵母、克鲁维酵母宿主例如克鲁氏乳酸菌属(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCCl2,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCCl6,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、沃尔蒂克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC56,500)、K.drosophilarum(ATCC36,906)、耐温克鲁维酵母(K.thewotolerans)、和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus);亚罗酵母属(EP402,226);毕赤酵母属(EP183,070);假丝酵母属;里氏木霉(Trichodermareesia)(EP244,234);粗糙脉孢菌属;许旺酵母属如许旺酵母;和丝状真菌如脉胞菌属、青霉菌属、弯颈霉属、和曲霉属宿主如构巢曲霉和黑曲霉。
高等真核细胞,特别是来自多细胞有机体的那些可以用于表达本文所提供的糖基化的多肽。适宜的高等真核细胞包括,但不限于,无脊椎动物细胞和昆虫细胞,以及脊椎动物细胞。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定了多种昆虫病毒株及其变体和来自宿主的相应许可(permissive)昆虫宿主细胞如地草夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)、和家蚕。多种用于转染的病毒株是公众可以获得的,例如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株,此类病毒根据本发明所述可以作为本文所述的病毒,特别是用于转染的草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄、和烟草的植物细胞培养物也能够作为宿主。脊椎动物细胞的例子包括,哺乳动物宿主细胞系如经SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCCCRLl651);人胚肾细胞系(293或在悬浮培养基中生长的293细胞亚克隆,Graham等,J.GenViro1.36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCCCCLlO);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠滋养细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34);水牛大鼠肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺细胞(W138,ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2,HB8065);小鼠乳腺肿瘤细胞(MMTO60562,ATCCCCL5l);TRI细胞(Mather等,AnnualsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5细胞;FS4细胞;和人肝癌细胞系(HepG2)。
可以采用本领域公知的任意适宜方法将所述载体引入宿主细胞,包括但不限于,DEAE-葡聚糖介导的递送(Gulick,T.,Curr.Protoc.Mol.Biol.,Chapter9,Unit9.2,(2001)),磷酸钙沉淀法(Kingston,R.E.等,Curr.Protoc.Mol.Biol.,ChapterlO,UnitlO.13,(2001)),阳离子脂质介导的递送(Hirko,A.等,Curr.Med.Chem.,l0(14):1185-1193(2003)),脂质体介导的转染(Schenborn,E.T.等,MethodsinMolecularBiology,130:155-164(2000)),电穿孔(NatureMethods,3:67-68(2006)),微粒轰击、受体介导的基因递送(Varga,C.M.等,Biotechnol.Bioeng.,70(6):593-605(2000)),病毒载体介导的基因递送(Young,L.S.等,J.Pathol.,208(2):299-318(2006)),多聚赖氨酸(Zauner,W.等,AdvancedDrugDeliveryReviews,30(1-3):97-113(1998))、组蛋白(Wagstaff,K.M.等,Mol.Ther,l5(4):721-731(2007))、壳聚糖(Koping-Hoggard,M.等,GeneTherapy,l1:1441-1452(2004))、和肽(Martin,M.E.等,TheAPPSJournal,9(1):E18-E2g(2007))介导的递送。
在某些实施方式中,所述宿主细胞包括第一载体和第二载体,所述第一载体包括编码第一多肽的第一多核苷酸,所述第二载体包括编码第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方式中,所述第一载体和所述第二载体可以是相同的或不同的。在某些实施方式中,所述第一多肽和所述第二多肽可以是相同的或不同的。
在某些实施方式中,所述第一载体和所述第二载体可以同时或不同时引入。在某些实施方式中,所述第一载体和所述第二载体可以一起引入宿主细胞。在某些实施方式中,可以先将所述第一载体引入宿主细胞,然后可以再将所述第二载体引入。在某些实施方式中,可以将所述第一载体引入宿主细胞,然后建立表达所述第一多肽的稳定细胞系,然后可以再将所述第二载体引入所述稳定的细胞系。
在某些实施方式中,所述宿主细胞包括载体,所述载体包括编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸。在某些实施方式中,所述第一多肽和多数第二多肽可以是相同的或不同的。
在某些实施方式中,本公开提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞包括第一多核苷酸和第二多核苷酸。在某些实施方式中,本公开提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞包括本文所公开的多肽复合物。在某些实施方式中,所述多肽复合物或多肽从宿主分泌至周围基质或环境中。
在某些实施方式中,本公开提供了一种表达本文所提供的多肽的方法,包括在使载体中插入的多核苷酸表达的条件下培养含有所述载体的宿主细胞。
用于所述多核苷酸表达的适宜条件可以包括,但不限于适宜的培养基,培养基中适宜的宿主细胞密度,存在必要的营养物质、存在补充因子、适宜的温度和湿度、和无微生物污染物。本领域的普通技术人员能够针对表达目的适当地选择适宜的条件。
在某些实施方式中,在宿主细胞中表达的所述多肽能够形成二聚体,以产生本文所提供的多肽复合物。在某些实施方式中,在宿主细胞中表达的所述多肽能够形成同型二聚体多肽复合物。在某些实施方式中,其中所述宿主细胞表达第一多核苷酸和第二多核苷酸,所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸能够形成异质二聚体多肽复合物。
在某些实施方式中,所述多肽复合物可以在宿主细胞内形成。例如,所述多肽复合物可以在宿主细胞内利朋相关的酶和/或辅因子形成。在某些实施方式中,所述多肽复合物可以分泌出细胞。在某些实施方式中,所述第一多肽和所述第二多肽可以分泌出宿主细胞并在宿主细胞外形成二聚体。
在某些实施方式中,所述第一多肽和所述第二多肽可以在适宜条件下分别表达和二聚化。例如,所述第一多肽和所述第二多肽可以在适宜缓冲液中组合,以使得所述第一蛋白单体和所述第二蛋白单体通过适宜的相互作用如疏水性相互作用二聚化。在另一个例子中,所述第一多肽和所述第二多肽可以任含有酶和/或辅因子的适宜缓冲液中组合,其能够促进所述第一多肽和所述第二多肽二聚化。在另一个例子中,所述第一多肽和所述第二多肽可以在适宜载体中组合,在存在适宜试剂和/或催化剂的条件下使其彼此之间发生反应。
在某些实施方式中,所述方法进一步包括纯化或分离所述多肽或多肽复合物的步骤。可以使用任意适宜的方法对所表达的多肽和/或多肽复合物进行纯化或分离。所述多肽和/或多肽复合物可以在细胞内、细胞间质表达或分泌至细胞外进入基质。如果所述多肽和/或多肽复合物在细胞内表达,则可以将含有所述多肽和/或多肽复合物的宿主细胞裂解,通过对裂解物进行离心或超滤除去不需要的碎片,将多肽和/或多肽复合物从裂解物中分离。如果所述多肽和/或多肽复合物被分泌至大肠杆菌的细胞间质,则可以在存在试剂如醋酸钠(pH3.5)、EDTA、和苯甲基磺酰氟(PMSF)的条件下融解细胞团约30min,并且可以通过离心除去细胞碎片(Carter等,BioTechnologylO:163-167(1992))。如果所述多肽和/或多肽复合物被分泌至基质,则可以使用商品化的蛋白浓缩滤器如Amincon或MilliporePellicon超滤器收集和浓缩细胞上清液。可以在收集和浓缩步骤中加入蛋白酶抑制剂和/或抗生素以抑制蛋白降解和/或污染微生物的生长。
可以通过适宜的方法对表达的多肽和/或多肽复合物进一步纯化,例如但不限于,亲和层析、羟基磷石灰层析、体积排阻层析、凝胶电泳、透析、在离子交换柱上进行离子交换分离、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶上的层析、在肝素琼脂糖上的层析、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚大冬氨酸柱)上的层析、色谱聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀(参见,综述Bonnef,P.L.,Proteinpurification,Taylof&Francis出版,2007;Janson,J.C.等,Proteinpurification:principles,highresolutionmethodsandapplications,Wiley-VCH出版,1998)。
在某些实施方式中,可以通过亲和层析对所述多肽和/或多肽复合物进行纯化。在某些实施方式中,可以使用蛋白A层析或蛋白NG(蛋白A和蛋白G的融合蛋白)层析对含有来自抗体CH2结构域和/或CH3结构域组分的多肽和/或多肽复合物进行纯化(Lindmark等,J.Immnunol.Meth.62:1-13(1983);Zettlit,K.A.,AntibodyEngineering,PartV,531-535,2010)。在某些实施方式中,可以使用蛋白G层析对含有IgGγ3重链的多肽和/或多肽复合物进行纯化(Guss等,EMBOJ.5:15671575(1986))。在某些实施方式中,可以使用蛋白L层析对含有κ轻链的多肽和/或多肽复合物进行纯化(Sudhir,P.,Antigenengineeringprotocols,第26章,HumanaPress出版,1995;Nilson,B.H.K.等,J.Biol.Chem.,267,2234-2239(1992))。亲和配体附着的基质最常用琼脂糖,但是也可以使用其他基质。机械稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯与琼脂糖相比,可以达到更高的流速和更短的处理时间。当所述抗体含有CH3结构域时,可以使用BakerbondABX树脂(J.T.Baker.Phillipsburg,N.J.)进行纯化。
在经过任意初步纯化步骤后,可以对包含目标抗体和污染物的混合物进行低pH疏水性相互作用层析,使用pH约2·54·5的洗脱缓冲液,优选在低盐浓度下进行(例如,约0-0.25M的盐)。
药物组合物和使用方法
另一方面,本公开提供了一种药物组合物,所述药物组合物包括治疗有效量的本文提供的多肽复合物和药学上可接受的载体。
在某些实施方式中,所述药物组合物包括治疗有效量的本文提供的多肽复合物。如本文所使用的,术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指所述多肽复合物有效治疗状况的量或浓度,所述状况与所述多肽复合物所结合的抗原靶点相关。如本文所使用的,“治疗”(动词)或“治疗”(名词)包括预防或缓解状况,延缓状况的起始或发展速率,降低发展成状况的风险,预防或推迟与状况相关的症状的发展,减少或终止与状况相关的症状、产生完全或部分的状况缓解、治愈状况、或其中某些的组合。
本文所提供的多肽复合物的治疗有效量将依赖于本领域公知的多种因素,例如体重、年龄、既往病史、当前用药、对象的健康状况和治疗目的、发生交叉反应的可能性、变态反应、敏感性和副作用、以及给药途径和状况发展的程度。本领域的普通技术人员(例如,医生或兽医)可以根据这些和其他情况或要求的指示按比例降低或增加给药剂量。
如本文所使用的,术语“药学上可接受的载体”指药学上可接受的材料、组分或载体,包括固体或液体稀释剂、赋形剂、盐、或溶剂,其参与携带所述多肽复合物至其在受体中的预计作用部分和/或其有利于所述多肽复合物的生产和/或贮存。载体是“药学上可接受的”指其与处方中的其他成分具有相容性,与其受体具有生理相容性,具有合理的风险/收益比。
供本文公开的药物组合物使用的药学上可接受的载体可以包括,例如,药学上可接受的液体、凝胶、或固体载体、水性载体、非水载体、抗菌剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、掩蔽或蟹合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂、无毒性辅助物质、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂、本领域公知的其他组分、或其不同的组合。
适宜的水性载体包括但不限于氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或者葡萄糖和乳酸盐林格注射液。
适宜的非水性载体包括,但不限于植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油、或花生油。
适宜的抗菌剂包括,但不限于酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。在药物组合物中的抗菌剂可以是抑制细菌或抑制真菌的浓度。
适宜的抗氧化剂可以包括,例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、疏基乙酸、疏基山梨醇、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、和/或没食子酸丙酯。如本文所公开的,在药物组合物中加入一种或多种抗氧化剂,如甲硫氨酸,能够减少所述多肽复合物的氧化,以阻止或减少所述多肽复合物结合亲和性的降低和改善其稳定性。
适宜的掩蔽或螯合剂包括,但不限于,EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸、或乳酸。
适宜的赋形剂可以包括,例如水、盐、葡萄糖、甘油、或乙醇。
适宜的无毒性辅助物质可以包括,例如润湿或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解性增强剂、或者试剂如醋酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯,三乙醇胺油酸酯,或环糊精。
为了进一步示例说明,其他药学上可接受的载体可以包括,但不限于局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因,混悬和分散剂如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素钠、或者聚乙烯吡咯烷酮,和乳化剂如聚山梨醇酯80(吐温-80)。
一般来说,所述药物组合物的制备可以通过将所述多肽复合物与药学上可接受的载体均匀混合、分装以制备成适宜单位,和可选地,将产品成形。
另一方面,本公开提供了一种使用本文所提供的药物组合物的方法。在某些实施方式中,本公开提供了一种治疗状况的方法,包括给予所需对象有效量的药物组合物,其中所述状况与所述多肽复合物能够结合的抗原相关。如本文所使用的“有效量”指药物组合物中含有的多肽复合物的治疗有效量。
在某些实施方式中,本文所提供的药物组合物按约0.O1mg/kg至约1OOmg/kg的有效量给予。在这些实施方式中的某些,本文所提供的多肽复合物的给药剂量为约0.Olmg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约1Omg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约g0mg/kg、约g5mg/kg、或约1OOmg/kg。在某些实施方式中,所述多肽复合物的给药剂量为约50mg/kg或以下,以及在这些实施方式中的某些,给药剂量等于或小于lOmg/kg或、等于或小于5mg/kg、等于或小于1mg/kg、等于或小于0.5mg/kg、或者等于或小于0.1mg/kg。
可以在不同间隔给予给定的剂量,例如每日一次、每日两次或更多次、每周两次或更多次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、或者每两个月或更多个月一次。在某些实施方式中,可以在治疗过程中调整给药频率,以优化所需应答。在某些实施方式中,可以在治疗过程中改变给药剂量。例如,在某些实施方式中,初始给药剂量可以高于随后的给药剂量。在某些实施方式中,在治疗过程中可以依据对象的反应改变给药剂量。
可以采用本领域公知的任意适宜途径给予本文提供的药物组合物,包括,但不限于,静脉、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、贲门内、腹腔内、椎管内、皮内、皮下、口服、鼻内、眼内、舌下、直肠、粘膜、表皮、透皮或局部途径。
可以将药物组合物制成适于目标给药途径的制剂。在某些实施方式中,可以将药物组合物制成可注射的形式。可注射的形式可以是无菌和无热源的,并且可以是任意常规形式如溶液、混悬液、和乳剂,以及适于形成溶液、混悬液、或乳剂的固体形式,例如冻干粉、皮下注射片、和其他准备与可注射载体组合的干燥产品。注射剂型可以包括可注射载体或可以在使用前立即与可注射载体组合。可注射载体可以是无菌和/或无热源液体,可以是水性的或非水性的。可以将可注射药物组合物以单位剂量或多剂量包装于安瓿、药品或注射器中。
可以在适宜条件下储存所述药物组合物,以阻止或减少所述多肽复合物生物学活性的损失,例如适宜的温度(例如,在约4°C至室温),和在适宜的光暴露下(例如,避光)。
另一方面,本公开提供了一种组合物,所述组合物包括与一种或多种偶联物连接的本文所提供的多肽复合物。
多种偶联物可以与本文所提供的多肽复合物连接(参见,例如“结合疫苗(ConjugateVaccines)”,ContributionstoMicrobio1ogyandImmunology,J.M。CruseandR.E.Lewis,Jr.(eds.),CargerPress,NewYork,(1989))。在某些实施方式中,与本文公开的多肽复合物连接的偶联物可以包括一种或多种试剂,其改变所述多肽复合物的一种或多种药代动力学性质,例如聚乙二醇可以增加多肽复合物的半衰期或降低其免疫原性。在某些实施方式中,与本文公开的多肽复合物连接的偶联物可以包括一种或多种可检测标记,包括但不限于,放射性同位素如123I、124I、120I、1311、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi、和32p、其他镧系元素,发光标记或荧光标记例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白、或德克萨斯红,以及酶底物标记例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、和β-D-半乳糖苷酶。
偶联物可以通过共价结合、亲和结合、插入、配位结合、络合作用、缔合作用、混合、或其他方法与多肽复合物连接。在某些实施方式中,可以对本公开的多肽复合物进行工程化以使其在抗原结合部分以外含有特定位点,其可被用于与一个或多个偶联物结合。例如,这样的位点可以包括一个或多个活性氨基酸残基,例如半胱氨酸或组氨酸残基,以便于与偶联物共价结合。在某些实施方式中,所述抗体可以间接地,或通过另一个偶联物与偶联物连接。例如,所述多肽复合物可以与生物素偶联,然后间接地与第二个偶联物连接,第二个偶联物与亲和素偶联。
另一方面,本公开提供了一种多肽复合物的非治疗用途。在某些实施方式中,本文提供了一种检测样品中存在的抗原靶点的方法,包括将样品与本文所提供的多肽复合物接触,并确定所述抗原靶点的存在。在某些实施方式中,可以使用与可检测标记偶联的多肽复合物。在某些实施方式中,所述多肽复合物可以不包含可检测偶联物,但是能够使用可以与所述多肽复合物特异性结合的标记材料,如标记抗体对其进行检测。
在某些实施方式中,所述多肽复合物可以用于体内或体外的诊断应用。所述多肽复合物可以用于诊断与抗原靶点相关的状况,所述抗原靶点能够与多肽复合物特异性结合。在某些实施方式中,可以使用与可检测标记偶联或不与可检测标记偶联的多肽复合物。在某些实施方式中,可以将多肽复合物与来自对象的生物样品接触,以确定生物样品中抗原靶点的存在情况和/或表达量,从而确定对象状况的状态。在某些实施方式中,可以给予对象所述多肽复合物,并且可以使用本领域公知的方法检测其与抗原靶点的结合。
在某些实施方式中,可以将所述多肽复合物作为亲和纯化试剂,用以纯化抗原靶点。在这些实施方式中,可以使用本领域公知的方法,将所述抗体或抗原结合片段固化于固相如树脂或滤纸上。所述多肽复合物还可以用于沉淀溶液中的抗原靶点。
在某些实施方式中,所述多肽复合物可以用于减少抗原靶点与所述第一和第二抗原结合结构域的同时结合。在某些实施方式中,可以将能够与两个抗原结合的常规抗体或抗原结合片段工程化,从而成为本文所提供的多肽复合物,然后可以测定两个抗原的同时结合。例如,可以对编码常规抗体的多核苷酸进行重排以制备第一多核苷酸和第二多核苷酸,所述第一多核苷酸从5'端至3'端依次编码CH3结构域、CH2结构域、铰链序列、CHl结构域和VH结构域,所述第二多核苷酸从5'端至3'端依次编码CL结构域和VL结构域。可以对所述多核苷酸进行进一步修饰以适应特定需要,例如可以删除编码CH2结构域的序列,或可以对铰链区进行修饰,以便在适宜位点引入半胱氨酸密码子。可以在适宜条件下表达工程化的第一和第二多核苷酸以形成所述多肽复合物。在某些实施方式中,所述多肽复合物可以将抗原靶点的同时给合减少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
在某些实施方式中,所述多肽复合物可以用于减少因与常规抗体结合而导致的抗原靶点的信号转导或活化。在某些实施方式中,可以将常规抗体或抗原结合片段工程化为本文所提供的多肽复合物,并且可以测定抗原靶点的信号转导或活化。可以使用上文所述的方法将所述多肽复合物工程化。可以使用上文所述的方法测定抗原靶点的信号转导或活化。可以根据信号转导或活化的结果对所述多肽复合物进行进一步的工程化,以更好的满足降低诱导抗原靶点信号转导或活化的目的。例如,可以在蛋白单体和抗原结合结构域之间的接头序列中引入修饰或突变,以调节对所述第一和第二抗原结合结构域的空间位阻,从而调节抗原靶点的信号转导或活化。
在某些实施方式中,本公开提供了一种鉴定本文提供的新多肽复合物的方法。在某些实施方式中,所述方法可以包括:制备多肽复合物并针对与抗原靶点的所需结合特性筛选多肽复合物。所需的结合特性可以包括,但不限于,减少两个抗原靶点的同时结合,和减少抗原靶点的信号转导或活化。在某些实施方式中,可以将与相同抗原靶点结合的常规抗体作为用作对照,将其用于测定抗原靶点的同时结合或信号转导或活化降低的情况。
在某些实施方式中,所述方法可以包括:鉴定新的抗原结合结构域,制备含有所述抗原结合结构域的新的多肽复合物,并确定所述多肽复合物与抗原靶点的结合特性。可以采用本领域公知的适宜方法鉴定新的抗原结合结构域,例如噬菌体展示(O'Brien,P.M.等,Antibodyphagedisplay:methodsandprotocols,HumanaPress出版,2002),酵母展示(Boder,E.T.等,NatureBiotechnology,l5:553-557),杂交瘤技术(Kohler.G.等,Nature,256:495-497(1975)),酵母双杂交系统(MacDonald,P.,Two-hybridsystems:methodsandprotocols,HumanaPress出版,2001)。简言之,对于使用噬菌体展示鉴定新的抗原结合结构域而言,利用PCR从B细胞中扩增编码抗原结合片段的cDNA,并将其组装至引入大肠杆菌的噬菌粒载体,经过辅助噬菌体补救后,在噬菌体上展示抗原结合片段的组合文库并且可以用于鉴定新的抗原结合结构域的筛选。简言之,针对使用酵母双杂交系统鉴定新的抗原结合结构域而言,克隆针对抗原靶点的编码基因作为框架与第一质粒中的DNA结合结构域(DBD)融合,克隆针对蛋白文库(即,待筛选的蛋白)的编码基因作为框架与转录活化结构域(AD)融合,将两个质粒引入适宜的酵母株以使得两个融合蛋白共表达,并且如果待筛选的蛋白与抗原靶点结合,则报告基因将被活化从而产生表型信号。
在鉴定出适当的抗原结合结构域后,可以选择适宜的蛋白单体并将其与抗原结合结构域的N-末端融合以形成多肽复合物。如有需要,可以在所述抗原结合结构域和所述蛋白单体之间引入肽接头,并且可选地,可以在肽接头之间引入二硫键。如本文开的其他部分所示,可以使用本文中提供的方法表达和纯化所述多肽复合物,可以使用本文其他部分所公开的适宜的结合检测或功能性检测测定所述多肽复合物的结合特性。
提供的下述实施例是为了更好的举例说明所要求保护的发明,不应将其解释为限制本发明的范围。下文中描述的所有特定组合物、材料、和方法均并非旨在限制本发明,而是仅用于举例说明落入本发明范围内的具体的实施方式。在不需要付出创造性劳动和不脱离本发明主旨的前提下,本领域技术人员可以开发等同的组合物、材料、和方法。但应理解,可以对本文中描述的方法进行多种改变,但其仍在本发明的范围内。发明人的意图是此类改变均包括在本发明的范围内。
实施例l:DISCO体的介绍
制备一种新的多肽复合物的结构,其含有两个相同的结合结构域,其特异性相同,并且不会导致靶点活化。其不同于常规的二价IgG或者其他的二价抗体形式,其对某种类型受体的活化通常发生在结合之后(见图1)。这种功能性的单价是通过一种新策略实现的,即使用二硫键束缚空间,使得在给定抗体上的两个抗原结合位点难以同时占位,或者同时将靶分子束缚于活化所必须的位置之外。我们将这种抗体类型称为DISCO体(被二硫键束缚的抗体(DISulfideCOnstrainedantiBODY))(参见图2)。在单特异性DISCO体中的靶结合结构域可以是单链Fv(scFv)、Fab和来自于替代架构的任意结合子(参见图3和图4)。可以将DISCO体作为制备融合蛋白的模板,以产生双特异性、三特异性、或四特异性、或者其他的多特异性分子。DISCO体的融合伴侣可以是scFv、VH或VL单可变结构域结合子、肽、或来自于替代架构的其他结合子旭Fn3、骆驼VHH。
DISCO体的结构的益处体现在:多功能性、作为治疗剂的适用性、产品的稳定性和可制造性等方面。一方面,DISCO体提供了特异性的结合区域,由于二硫键的束缚使其在空间上接近和在空间方向上受限。另一方面,由于存在空间位阻使得所述的两个抗原结合位点可能不会同时被一些抗原(特别是较大尺寸的抗原)占据。另一方面,即使发生同时结合,由于结合靶点的空间方向受限使其被锁定成非活性排布,从而不会导致受体活化。在又一个方面,DISCO体形态缺乏或至少FcγR结合显著降低,从而不会与细胞表面受体交联。当激动活性对总体药物疗效是有害的时,相对于其他抗体形式而言,这些性质是提高疗效所必须的。
由于在这些新形态中位于Fc结构域N-末端的包括二硫键的铰链序列被删除,因而DISCO体的FcγR结合大大降低。因此,基于这种形态的DISCO体不与细胞表面受体交联并将其活化。
一方面,在DISCO体的一种类型中,Fc结构域为使用蛋白A或蛋白G层析的蛋白纯化提供了便利。
另一方面,在DISCO体形态的一种类型中,Fc结构域便所述蛋白具有较长的血清半衰期,因为作为普通IgG的抗体与新生受体(FcRn)之间的相互作用是完好的。
根据治疗应用不同,药物较长的血清半衰期可能并不总是可取的。而与之相反的是,中等范围的半衰期(1-2天)可能是优选的。在这种形态中删除CH2会消除FcRn的结合性质,其能够缩短血清半衰期。由于所述分子的尺寸明显大于60kD左右的肾滤过尺寸,因而所述半衰期可能为约1-2天。
这种新形态的模块结构提供了更高的灵活性,即通过基于结合片段与其他抗体或非抗体融合,可制备多种具有单特异性(参见图5)、双特异性、或多特异性(参见图6、图7和图8)的DISCO体。一方面,针对TNF受体及超家族成员(CD4O、DR3等)以及cMet的单特异性DISCO体能够作为针对疾病治疗的有效拮抗剂。抗CD3DISCO体还具有广泛的临床应用,如同种异体移植物移植、I型糖尿病、多发性硬化症、和其他自身免疫性疾病。在副作用方面,抗CD3DISCO体要优于目前进行临床试验的抗CD3抗体,因为DISCO体提供类似于单价的结合模式,不太可能引起CD3部分活化,并且能更大程度的降低FcγR的结合。例如,接受第二代抗CD3抗体OKT31Ala-All和ChAglyCD3治疗的患者仍出现严重的与细胞因子风暴相关的副作用。在治疗过程中还观察到了淋巴细胞减少,这是T细胞再分布和边缘化最主要的后果(由于T细胞部分活化引起)。在I型糖尿病试验中,目前的抗CD3抗体还会在大多数患者中诱导爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的再活化。尽管EBV再活化的根本原因尚不明确,仍需进行进一步研究,但是有直接证据表明早期免疫活化可能发挥了重要作用。
为了更好的预测抗CD3抗体在人体内治疗的潜在副作用,对非人灵长类动物具有交叉反应性的抗体是极有价值的,因为可以在猴中进行全面的毒理学研究。然而,目前在临床上使用的和在临床试验中检测的抗CD3抗体缺乏这种交叉反应性。为了解决这一问题,最近描述了用于药物研发目的的猴CD3交叉反应性抗体的制备。事实上,马萨诸塞州综合医院(MassachusettsGeneralHospital)Terhorst教授的课题组已在二十多年前制备了首个具有猴交叉反应性的抗人CD3抗体(Pessano,EMBOJ.(1985)4:337-344;Alarcon,EMBOJ.(1991)10:903-12)。所描述的抗体SP34识别细胞表面已变性的CD3和天然的CD3。当交联后,SP34是T细胞促有丝分裂的。因此,SP34抗体应该适于单特异性和多特异性DISCO体形式的药物研发。然而,由于SP34克隆的序列是未知的,因而尚无法制备SP34抗体或SP34抗体衍生物的重组产品。获得所述序列信息的可能方法是,采用通过埃德曼降解的自动N-末端测序和质谱技术(Bandeira,Nat.Biotech.(2008)26:1336-1338)对SP34抗体进行重新测序。
在另一方面,这种形态在制备双特异性或多特异性DISCO体方面是有价值的,其中第一靶点的结合不会导致活化。例如,这种形态特别适于制备针对CD3(第1个特异性)和肿瘤表面抗原(第2个结合特异性)的双特异性DISCO抗体。在这种情况下,双特异性DISCO体仅与CD3结合不会导致T细胞活化。仅当双特异性DISCO体同时与CD3和肿瘤细胞表面靶点结合,并导致肿瘤细胞和CD3交联时,才能使T细胞活化。在癌细胞附近(仅在)T细胞的活化显著增强了T细胞的肿瘤杀伤作用并且避免了因细胞因子风暴导致的副作用。
另一方面,在CD3/癌细胞抗原双特异性DISCO体中,通过FcYR特异性结合子取代CD3结合臂,以诱导FcγR表达免疫细胞介导的杀伤肿瘤细胞作用。
另一方面,在CD3/癌细胞抗原双特异性DISCO体中,通过NKG2D特异性结合子取代CD3结合臂,以诱导NK细胞介导的杀伤肿瘤细胞作用。
另一方面,基于这种形式制备三特异性或者甚至是四特异性DISCO体,所述DISCO体具有针对CD3或FcγR或NKG2D的一个结合特异性,和针对癌细胞靶点的另外两个结合特异性。癌细胞靶点可以同时存在于相同的癌细胞中。在这种情况下,当设计亲和性较低或中等的结合时,DISCO体选择性地与癌细胞结合,而与表达单一靶点的正常细胞的结合应较少。这种策略的优势在于将T细胞选择性靶向至癌细胞而非正常细胞。多特异性DISCO体识别的癌细胞靶点可以在不同类型的癌细胞中表达。在这种情况下,可以使用多特异性抗体药物治疗多种癌症,只要在细胞表面表达至少一种癌症靶点即可。
实施例2:质粒的构建
在这个实施例中,构建质粒用于表达靶向CD3的单特异性DISCO体,和靶向CD3和EpCAM的双特异性DISCO体。抗-CD3抗体的编码序列基于抗体OKT3的序列,其通过已公开的文献获得(参见,Yoshida等,Blood,l01:2300(2003))。抗-EpCAM抗体的编码序列基于M79scFv的序列,其通过已公开的文献获得(参见,例如Gottlinger等,IntJCancer,38:47(1986))。
pCR-TA-M79scFv载体的构建
分两步组装M79基因。第一步,合成表1中列出的10个寡核苷酸(SEQIDNO:1-10)。将所述10个寡核苷酸的等摩尔混合物加入PCR反应混合物中,使用Taq聚合酶进行30个循环的PCR反应组装编码M79N-末端的序列。第二步,合成表1中列出的另外10个寡核苷酸(SEQIDNO:11-20)。将所述10个寡核苷酸的等摩尔混合物加入PCR反应混合物中,用Taq聚合酶进行30个循环的PCR反应组装编码M7gC-末端的序列。
使用凝胶纯化来自第一步和第二步的PCR产物,将各2OOngPCR产物加入含Taq聚合酶的PCR反应混合物中,进行7个循环的PCR反应。随后在PCR反应混合物中加入SEQIDNO:21和22(见表1),随后再进行30个循环的PCR反应,以获得M79基因。
将M79基因的最终PCR产物克隆至pCR-TA载体(Invitrogen)中,以获得pCR-TA-M79scFv载体。通过DNA测序对M79scFv基因进行验证。
表1
pCR-TA-OKT3VH载体的构建
为获得抗体OKT3的VH基因(OKT3VH),合成表2中列出的10个寡核苷酸(SEQIDNO:23-32)。将所述10个寡核苷酸的等摩尔混合物加入PCR反应混合物中,使用Taq聚合酶进行7个循环的PCR反应组装OKT3VH。
使用末端引物:SEQIDNO33和SEQIDNO34(见表2)再进行30个循环的PCR反应扩增所组装的OKT3VH。将最终的OKT3VHPCR产物克隆至pCR-TA克隆载体(Invitrogen)中,以获得pCR-TA-OKT3VH载体。通过DNA测序对OKT3VH基因进行验证。
表2
pCR-TA-OKT3VL载体的构建
为获得抗体OKT3的VL基因(OKT3VL),合成表3中列出的8个寡核苷酸(SEQIDNO:35-42)。将所述8个寡核苷酸的等摩尔混合物加入PCR反应混合物中,使用Taq聚合酶进行7个循环的PCR反应组装OKT3VL。
使用末端引物:SEQIDNO43和SEQIDNO44(见表3)再进行30个循环的PCR反应扩增所组装的OKT3VL。将最终的OKT3VHPCR产物克隆至pCR-TA克隆载体中,以获得pCR-TA-OKT3VL载体。通过DNA测序对OKT3VL基因进行验证。
表3
pCR-TA-CH1CH2CH3载体和pCR-TA-Ck载体的构建
采用聚蔗糖(Ficoll)梯度实验方法分离人PBMC(外周血单核细胞)。使用RNA分离试剂盒(Qiagen)制备所分离的人PBMC的总RNA。使用SuperSchptTMIII第一链合成SupefMix试剂盒(Invitrogen)利用寡dT引物制备第一链cDNA。
使用SEQIDNO:45-46(见表4)作为末端引物,通过PCR利用Taq聚合酶和30个循环的PCR反应从第一链cDNA扩增人IgGl的CHlCH2CH3基因。将最终的CHlCH2CH3PCR产物克隆至pCR-TA克隆载体(hvitrogen),以获得pCR-TA-CHlCH2CH3载体。通过DNA测序对CHlCH2CH3基因进行验证。
使用SEQIDNO:47-48(见表4),通过PCR利用Taq聚合酶和30个循环的PCR反应从第一链cDNA扩增人Ck基因。将最终的CkPCR产物克隆至pCR-TA克隆载体(Invitrogen),以获得pCR-TA-Ck载体。通过DNA测序对Ck基因进行验证。
表4
pCR-TA-铰链-OKT3VH-CH1载体的构建
使用SEQIDNO:49-50(见表5)作为引物,通过PCR从pCR-TA-OKT3VH载体扩增OKT3VH基因以获得铰链-OKT3VH基因。利用引物通过PCR反应引入铰链序列的部分编码序列。所述部分铰链序列的氨基酸序列是ThrHisThrCysProProCysProAlaPro(SEQIDNO:69)
使用Taq聚合酶进行30个循环的PCR反应。使用SEQIDN0:45和51(见表5)通过PCR利用Taq聚合酶进行30个循环的PCR反应从pCR-TA-CH1CH2CH3载体扩增CH1基因。
对上述两个PCR产物进行凝胶纯化,并且用于通过PCR进行的铰链-OKT3VH-CH1基因的组装。简言之,将各2OOngPCR产物加入含有Taq聚合酶的PCR反应混合物中,进行7个循环的PCR反应。随后将SEQIDNO:49和51加入所述PCR反应混合物中,随后再进行30个循环的PCR反应。
将最终的铰链-OKT3VH-CH1PCR产物克隆至pCR-TA载体中,以获得pCR-TA-铰链-OKT3VH-CHl载体。通过DNA测序对铰链-OKT3VH-CH1基因进行验证。
表5
pTT5-VH3前导-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CHl载体的构建
通过两步PCR反应获得VH3前导-CH2CH3-铰链基因。简言之,在第一步PCR反应中,使用SEQIDNO:52和54(见表6)作为引物和pCR-TA-CHlCH2CH3载体作为PCR模板,将VH3前导序列与CH2CH3基因的5'末端连接。在第二步PCR反应中,使用SEQIDNO:53-54(见表6)作为引物和第一步PCR反应的PCR产物作为模板,将部分铰链序列与VH3前导-H2CH3序列的3'末端连接。VH3前导-CH2CH3-铰链基因来自第二步PCR反应的PCR产物。
使用SEQIDNO:49和51(见表5)作为引物,利用Taq聚合酶进行30个循环的PCR从pCR-TA-铰链-OKT3VH-CHl载体扩增铰链-OKT3VH-CHl基因。
将VH3前导-CH2CH3-铰链和铰链-OKT3VH-CHlPCR片段剪接在一起以产生VH3前导-CH2CH3-铰链-OKT3-CHl基因,其在两个末端(EcoRI和BamHI)具有限制性悬垂序列。简言之,对VH3前导-CH2CH3-铰链基因的PCR产物和铰链-OKT3VH-CHl基因的PCR产物进行凝胶纯化,加入含有Taq聚合酶的PCR反应混合物中,随后再进行PCR反应以扩增VH3前导-CH2CH3-铰链-OKT3-CH1基因。
使用EcoRI和BamHI限制性酶消化VH3前导-CH2CH3-铰链-OKT3-CH1基因的PCR产物,然后与pTT5载体(来自加拿大国家研究委员会)连接,所述载体已线性化具有相匹配的限制性末端,以生产pTT5-VH3前导-CH2CH3-连接-OKT3VH-CHl载体。
表6
pTT5-VH3前导-M79scFv-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1的构建
VH3前导-M7gscFv-CH2由两步PCR反应获得,其中将VH3前导序列和编码短CH2N-末端序列分别与M79scFv基因的N-末端和C-末端编码序列连接。简言之,通过PCR反应使用SEQIDNO:55和56作为引物,以及pCR-TA-M7gscFv载体作为模板扩增M7gscFv基因。随后使用SEQIDNO:53和56(参见表7)作为引物扩增所得到的PCR产物。
使用SEQIDNO:57和51作为引物,通过PCR从pTT5-VH3前导-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1载体扩增CH2CH3-铰链-OKT3LH-CH1基因。
对VH3前导-M79scFv-CH2和CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1基因的PCR产物进行凝胶纯化,将各2OOngPCR产物加入含有Taq聚合酶的PCR反应混合物中,进行7个循环的PCR反应。随后将SEQIDNO:53和51(参见表7)加入PCR反应混合物中,再进行30个循环的PCR反应,以获得VH3前导-M79scFv-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1基因。
使用EcoRI和BanHI对所获得的VH3前导-M7gscFv-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1基因的PCR产物进行消化,并克隆至pTT5中,pTT5已使用相同限制性酶线性化,以产生pTT5-VH3前导-M79scFv-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1载体。
表7
pTT5-VH3前导-OKT3VL-Ck的构建
通过两步PCR反应获得VH3前导-OKT3VL-Ck。第一步,使用SEQIDNO:58和59作为引物,以及pCR-TA-OKTVL载体作为模板,通过PCR反应扩增OKT3VL基因。随后使用SEQIDNO:53和59(参见表8)作为引物扩增所获得的PCR产物,以使得VH3前导序列与OKT3VLN-末端的编码序列连接。
第二步,使用SEQIDNO:60-61作为引物通过PCR从pCR-TA-huCk载体中扩增人Ck基因。
对第一步和第二步中获得的PCR产物进行凝胶纯化,将各2OOngPCR产物加入含有Taq聚合酶的PCR反应混合物中,进行7个循环的PCR反应。随后将SEQIDNO:53和61(参见表8)加入PCR反应混合物中,再进行30个循环的PCR反应,以获得VH3前导-OKT3VL-Ck基因。
使用EcoRI和BamHI对所获得的VH3前导-OKT3VL-Ck基因的PCR产物进行消化,并克隆至已使用EcoRI和BamHI线性化的pTT5中,w从而产生pTT5-VH3前导-OKTVL-huCk载体。
表8
实施例3:靶向CD3的单特异性DISCO体以及靶向CD3和EpCAM的双特异性DISCO体的表达
为表达靶向CD3的单特异性DISCO体(抗-CD3DISCO体),使用Dufocher等(参见,Durocher等,NucleicAcidRes2002,30:eg)此前已描述的阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)将所述pTT5-VH3前导-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1载体和所述pTT5-VH3前导-OKTVL-huCk载体共转染至HEK293-6E细胞(来自加拿大国家研究委员会)。
为了表达靶向CD3和EpCAM的双特异性DISCO体(抗-EpCAM/CD3DISCO体),使用Durocher等(参见,Durocher等,NucleicAcidRes2002,30:e9)此前已描述的PEI将所述pTT5-VH3前导-M79scFv-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1载体和所述pTT5-VH3前导-OKTVL-huCk载体共转染至HEK293-6E细胞。
对转染细胞进行培养以表达蛋白。收集细胞培养物上清液并使用蛋白A层析进行纯化。使用SDS-PAGE和体积排阻色谱分析蛋白完整性和均一性。简言之,使用SDS上样缓冲液和SDS-还原上样缓冲液制备抗-CD3DISCO体和抗-EpCAM/CD3DISCO体,然后在4-20%的聚丙烯酰胺凝胶上对样品进行电泳。然后使用标准的考马斯亮蓝染料(Pierce)将凝胶染色,分析所得蛋白条带的大小。如图9所示,所述抗-CD3DISCO体和所述抗-EpCAA4/CD3DISCO体均在正确的分子量表达。
实施例4:DISCO体靶向结合活性的表征
与表达CD3的Jurkat细胞的结合
通过FACS分析抗-CD3DISCO体与人CD3蛋白的结合。在细胞表面表达人CD3的Jurkat细胞来自美国模式培养物保藏中心(ATCC),并根据ATCC提供的方案培养细胞。在进行FACS分析前,将Jurkat细胞先与抗-CD3DISCO体孵育再与抗人Fc-PE偶联物(SouthernBiotech)孵育。将经处理的Jurkat细胞进行FACS分析,以确定DISCO体的结合情况。如图1O(a)和(b)所示,与抗-CD3DISCO体孵育的Jurkat细胞的PE染色为阳性,而与同种型对照抗体1D6(人抗体,针对非相关抗原Dot1L)孵育的对照Jurkat细胞未显示出大量染色。该结果表明抗-CD3DISCO体能够与其靶点CD3特异性结合。
与表达EpCAM的MCF-7细胞的结合
亦通过FACS分析抗-EpCAAUCD3DISCO体与人EpCAA4的结合。在其表面表达EpCAM的肿瘤细胞系MCF-7细胞系来自美国模式培养物保藏中心(ATCC),并根据ATCC提供的方案培养细胞。在进行FACS分析前,将MCF-7细胞先与抗-EpCAM/CD3DISCO体孵育再与抗人Fc-PE偶联物(SouthernBiotech)孵育。如图1O(c)和(d)所示,与经同种型对照抗体1D6孵育的MCF-7细胞相比,MCF-7细胞与抗-EpC/AM/CD3DISCO体孵育后具有更强的染色。该结果确证了抗-EpCAM/CD3DISCO体与其靶点EpCAM的特异性结合。
DISCO体与人FcγR的结合减少
已检测了抗-CD3DISCO体和抗-EpCAM/CD3DISCO体同FcγR蛋白的结合活性。使用常规的人IgG1作为对照。还对两个抗-CD3抗体平行进行检测以作为对照,所述抗体经工程化使其与FcγR的结合降至最低:OKT3γ1Ala-Ala(teplizumab,铰链残基LeuLeu突变为AlaAla的人源化抗CD3IgG1抗体,Xu等,CellImmunol.(2000)200:16-26)和ChAglyCD3(otelixizumab,具有Asn297Ala突变的人源化抗CD3抗体,Bolt,Eur.J.Immunol.(1993)23:403-11)
FcγR蛋白购自R&Dsystems(Minnesota,WI),将其固化于ELISA板上。将抗-CD3DISCO体和抗-EpCAAWCD3DISCO体分别与经FcγR包被的板孵育。平行检测常规人IgGl、OKT3γ1Ala-Ala、和ChAglyCD3。随后加入HRP偶联的山羊-抗人Fc的Fab'2并进行孵育。使用HRP底物ABTS进行检测。
结果显示删除铰链序列或消除铰链区的二硫键能降低DISCO体的FcγR结合,因为CH2CH3之后的二硫键铰链是FcγR结合所必须的。与常规人IgG1相比,DISCO体与人FcγRs(FcγRI,II,III)的结合大大降低,与OKT3γ1Ala-Ala和ChAglyCD3相比结合显著降低。
人CD3与抗-CD3DISCO体的单价结合
在大肠杆菌表达系统中,将人CD3ε和γ链复合物蛋白表达为具有CD3ε-(GlyGlyGlyGlySeD)3-CD3γ-6组氨酸序列构型的单链蛋白。CD3ε和CD3γ链序列来自文献,相应基因定制合成(IDT寡核苷酸技术(oligonucleotideTechnologies),圣地亚哥,加利福尼亚州)。使用PCR方法制备来自CD3ε和CD3γ的单链基因。使用标准镍蟹合柱色谱对大肠杆菌表达的蛋白进行纯化。为了检测是否抗-CD3DISCO体仅能够给合一个抗原分子(不是两个分子),将CD3蛋白包被于ELISA板上,再与抗-CD3DISCO体孵育,然后再与生物素化的CD3蛋白孵育。使用ABTS底物和抗生物素蛋白链菌素-HRP偶联物检测生物素化CD3蛋白的结合情况。结果显示抗-CD3DISCO体与生物素化的CD3蛋白的抗生物素蛋白链菌素-HRP偶联物不具有显著的结合作用。
实施例5:抗-CD3DISCO体和抗-EpCAM/CD3DISCO体的体外生物学活性
抗-CD3DISCO体和抗-EpCAM/CD3DISCO体对T细胞的活化
DISCO体与其靶点的结合是通过功能性单价的方式,其对T细胞没有活化作用。还因为FcγR的结合大大降低,因而当FcγR表达细胞与T细胞同时存在时,FcγR介导的受体交联作用产生的影响极低。
使用基于FACS的T细胞活性检测,对DISCO体这种独特的结合性质进行验证。按照实施例3制备抗-CD3DISCO体和抗-EpCAAWCD3DISCO体,在所述抗体与PBMC上的靶点CD3结合后检测抗体活化T细胞的能力。对CD69的表达进行检测,将其作为早期T细胞活化的标记物。
简言之,将PBMC与浓度为0.1ug/m1和1ug/ml的抗-CD3DISCO体或抗-EpCAM/CD3DISCO体孵育24小时。对1D6进行平行检测作为阴性对照,使用hSP34IgG2(人源化的抗-CD3IgG抗体)作为阳性对照。然后将PBMC与FITC-偶联的抗-CD3抗体(1:200)和PE-偶联的抗-CD69抗体(1:200)在4°C下孵育1h。使用PBS洗涤PBMC一次并将其重悬于PBS中用于FACS分析。
FACS的结果见图11并汇总于表9。在各FACS结果图中,X轴表示通过FITC-偶联的抗-CD3抗体检测得到的阳性细胞,Y轴表示通过PE-偶联的抗-CD69抗体检测得到的阳性细胞。FACS结果中的百分率为UR/LR%,其中UR表示CD3和CD69的表达均为阳性的细胞,LR表示CD3的表达为阳性而CD69为阴性的细胞。
表9
NEG:阴性对照;
药物1:抗-EpCAM/CD3DISCO体;
药物2:抗-CD3DISCO体;
UR(事件):CD3和CD69的表达均为阳性的细胞;
LR(事件):CD3的表达为阳性但CD69的表达为阴性的细胞。
如图11中的上图所示(仅PBMC),与阴性对照相比,经阳性对照hSP34IgG2处理的PBMC显示出CD69的表达显著提高,这表明阳性对照抗体使T细胞活化。而与之相反的是,在这两个浓度下抗-CD3DISCO体均不会诱导任何CD69的表达,并且所述结果与阴性对照的结果相当。在0。1ug/ml时抗-EpCAM/CD3DISCO体也显示出与阴性对照相当的结果,尽管在1ug/ml时CD69的表达略有升高,但其仍远远低于阳性对照。总之,这些结果表明,DISCO体不具有T细胞活化作用,或者其活化作用与常规CD3抗体相比非常低。
在肿瘤细胞存在的条件下抗-CD3DISCO体和抗-EpCAM/CD3DISCO体对T细胞的 活化
根据实施例3制备抗-CD3DISCO体和抗-EpCAAM/CD3DISCO体,在肿瘤细胞存在时进一步检测其活化T细胞的能力。将PBMCs和SW480细胞(结肠癌细胞系,来自ATCC)与浓度为0.lug/ml和lug/ml的抗-CD3DISCO体或抗-EpCAAUCD3DISCO体孵育16-24小时。类似地,对1D6进行平行检测作为阴性对照,使用hSP3419G2作为阳性对照。然后将PBMC和SW480细胞的组合与FITC-偶联的抗-CD3抗体和PE-偶联的抗-CD69抗体共同孵育,随后针对CD3和CD69的表达进行FACS分析。
如图11中的下图(PBMC+SW480)和表9所示,对于阳性对照hSP341gG2而言,与仅为PBMC时相比,在存在SW480细胞时,PBMC的CD69表达适度增加。但是,在存在SW480细胞时,抗-CD3DISCO体和抗-EpC/AM/CD3DISCO体使PBMC的CD69表达至少增加3-7倍,这表明肿瘤特异性T细胞活化。在存在SW480细胞时,抗-EpCAM/CD3DISCO体对T细胞的活化甚至略高于阳性对照。
实施例6:抗-CD3DISCO体和抗-EpCAM/CD3DISCO体的体外细胞杀伤活性
根据实施例3制备抗-CD3DISCO体和抗-EpCAAWCD3DISCO体,在体外检测其通过介导T细胞的活化对癌细胞的杀伤作用。
在37°C5%C02的湿润培养箱中,在添加了10%胎牛血清的RPMI1640中培养SW480细胞,然后用胰酶消化并使用RPMI1640/10%热灭活FCS洗涤一次。根据生产厂商的说明,使用PKH26染料(Sigma)标记SW480细胞。使用RPMI1640/10%热灭活FCS洗涤己标记细胞两次。
根据生产厂商的说明(GEhealthcare)从两名健康人供体的全血样品中分离人PBMC。将已纯化的PBMC重悬于RPMI1640/10%热灭活FCS中,密度为约2XlO6/ml,在37°C5%CO2的条件下培养24小时。
收集SW480细胞和PBMC细胞。将SW480细胞调整至密度为4X1O5个细胞/ml,将PBMC细胞调整至密度为4X1O6个细胞/ml(检测用效应器细胞:靶细胞的比例(E:T比例)为1:1)。
使用RPMI1640/10%热灭活FCS将抗-CD3DISCO体和抗-EpCAM/CD3DISCO体从初始浓度15ug/ml按照10:1的比例连续稀释为8个浓度。使用抗-CD3常规抗体OKT3作为阳性对照,使用对照IgG1D6作为阴性对照。对阳性对照和阴性对照也进行倍比稀释制备相同的8个浓度。
在96-孔圆底板的各孔中分别加入5OulS480细胞和5OulPBMC,并在相应的孔中加入5Oul待测样品(抗-CD3DISCO体或抗-EpCAM/CD3DISCO体)或对照样品(阳性或阴性)。各浓度的样品均设置双复孔。通过用手摇动板轻轻将各孔中的内容物混合,然后将板在37°C5%C02的条件下孵育48小时。在显微镜下对死细胞(裂解的)计数。
结果见表10。“+”表示癌细胞杀伤活性为阳性,和“-”表示癌细胞杀伤活性为阴性。更多个“+”表示具有更强的癌细胞杀伤活化。“+/-”表示癌细胞杀伤活性不显著。
表10
如表10所示,抗-EpCAM/CD3DISCO体在浓度为0.00Olug/ml时显示出阳性的癌细胞杀伤活性,在0.001ug/ml或以上时其活性与常规抗-CD3抗体相当。
实施例7:在小鼠移植瘤模型中抗-EpCAM/CD3DISCO体对肿瘤生长的抑制作用
将14只4-5周龄的雌性NOD/SCID小鼠(来自中山大学,中国)随机分成三组,各测试组每组5只小鼠,溶剂对照组4只小鼠。在各只小鼠的右侧肋部接种0。1ml细胞悬液,其中含有与基质胶(matrigel)(BDBiosciences)按照1:1的比例混合的5XlO6个SW480细胞和5X106个PBMC细胞。接种5天后,按照表11所示的给药方案,给予小鼠相应的待测样品(溶于PBS中)。
表11
末次给药后对小鼠进行为期约两个月的观察。末次给药5天后,观察到小鼠出现肿瘤,计数荷瘤小鼠的数量。结果见表12。
表12
使用游标卡尺每周测定两次小鼠的肿瘤体积,还在相同的时间间隔测定体重。结果见图12(a)和(b)。抗-EpCAM/CD3DISCO体在两个检测浓度下均能有效抑制肿瘤生长,这种抑制与溶剂对照组相比具有统计学差异(p〈0。01)。如图12(b)所示,研究期间,小鼠的体重保持在相似水平。
还计算了RTVT/C和肿瘤抑制率,见表13。
表13
在研究结束时,处死所有的荷瘤小鼠,收集肿瘤并称重。结果见图13。研究显示,抗-EpCAM/CD3DISCO体有效抑制小鼠的肿瘤生长。
实施例8:抗-CDl9/CD3DISCO体的构建和体外生物学活性研究
使用与实施例2中所述类似的方法构建表达抗-CDl9/CD3DISCO体的质粒。
pTT5-VH3前导-抗-CD19-scFv-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1的构建
抗-CDl9scFv的编码序列基于从已公开文献中获得的序列(参见,美国专利申请20090220501)。根据已发表的序列设计重叠寡核苷酸,然后对其进行合成。将编码抗-CDl9scFv的N-末端的重叠寡核苷酸混合,并在PCR反应中利用Taq聚合酶组装。通过相同方法组装抗-CD1gscFv的C-末端编码序列。将所获得的编码抗-CD19scFV的N-末端和C-末端的PCR产物进一步混合,并通过PCR组装以获得抗-CD19scFv的全长编码序列,然后将其克隆至pCR-TA载体(Invitrogen)以获得pCR-TA-抗-CD19scFv载体。通过DNA测序对抗-CD19scFv基因进行验证。
使用pCR-TA-抗-CD19scFv载体作为模板,使用含VH3前导序列和CH2部分编码序列的引物,通过PCR组装VH3前导-抗-CD19scFv-CH2基因。利用PCR从pTT5-VH3前导-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1载体扩增CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1基因。利用PCR将两个PCR产物进一步组装,以获得VH3前导-抗-CD19scFv-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1基因,随后将其克隆至己线性化的pTT5载体以产生pTT5-VH3前导-抗-CDl9scFv-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CH1载体。
pTT5-VH3前导-OKT3VL-Ck的构建
使用实施例2中所述的方法构建pTT5-VH3前导-OKT3VL-Ck。
靶向CD3和CDl9的DISCO体的表达
将pTT5-VH3前导-抗-CD19scFv-CH2CH3-铰链-OKT3VH-CHl载体和pTT5-VH3前导-OKT3VL-Ck共转染至HECK293-6E细胞,然后培养所转染的细胞以使得蛋白表达。从细胞培养物上清中分离CD3/CDl9DISCO体,并使用SDS-PAGE电泳对其进行鉴定。
靶向结合活性的表征
使用与实施例4中所述类似的方法,通过FACS分析抗-CD3/CDl9DISCO体与PBMC细胞和Raji细胞(表达CD19,来自ATCC)的结合进行鉴定。
抗-CD3/CD19DISCO体的体外生物学活性
在存在或不存在Raji细胞的条件下,将抗-CD3/CDl9DISCO体与PBMC共同孵育。使用hSP34IgG2作为阳性对照,使用1D6作为阴性对照。然后将PBMC或PBMCs/Raji细胞与FITC-偶联的抗-CD3抗体和PE-偶联的抗-CD69抗体共同孵育,随后针对CD3和CD69的表达进行FACS分析。当在不存在Raji细胞的条件下孵育时,与阳性对照相比,抗-CD3/CD19DISCO体未显示出显著诱导CD19的表达。当在存在Raji细胞的条件下孵育时,抗-CD3/CD19DISCO体诱导CD19的表达增加,其与阳性对照相当。
抗-CD3/CD19DISCO体的体外癌细胞杀伤活性
培养Raji细胞,胰酶消化并使用PKH26染料标记。从全血中分离人PBMC并将其重悬于培养基中。将2X106个人PBMC与2X1O5个Raji细胞在培养基中混合并接种于96-孔板中。将-CD3/CD19DISCO体的系列稀释物加入相应孔中并在37C下孵育16-24小时。通过在显微镜下计数检测针对癌细胞的细胞毒性。抗-CD3/CD19DISCO体对Raji细胞的细胞毒性与阳性对照,即常规CD3抗体相当。
实施例9:抗-IL-6单特异性DISCO体的构建和生物学活性研究
抗-人IL-6mab240.glDISCO体重链(HC)和轻链(LC)基因的构建
使用与实施例2中所述类似的方法,通过PCR组装抗-人IL-6mab240.g1DISCO体的编码序列。根据实施例2所述制备抗-人IL-6DISCO体的CH2CH3-铰链部分。抗-人IL-6抗体克隆240。gl的重链可变序列来自己公开的专利(参见,例如WO2007/066082,SEQIDNO:62)。通过重叠寡核苷酸的PCR合成相应的VH基因。通过重叠PCR方法使用VH和人IgG1CH1制备Fd基因,人IgG1CH1PCR克隆自人B细胞cDNA文库。通过重叠PCR方法使用IgGlCH2CH3-铰链基因和抗-人IL-6240.g1Fd基因制备抗-人IL-6DISCO体重链基因(HC)。相应的VL序列亦来自己公开的专利(参见,例如WO2007/066082,SEQIDNO:63),使用重叠寡核苷酸的PCR合成相应的VL基因。可以通过重叠PCR方法使用VL和人IgG1Cκ基因制备抗-人IL-6240.g1LC基因,人IgGlCκ可以克隆自人B细胞cDNA文库。同样制备常规人IgGl形式的抗-人IL-6mab克隆240.g1重链基因作为对照抗体(参见,例如WO2007/066082)
抗-人IL-6mab240.g1DISCO体的表达
通过将抗-人IL-6mab240.glDISCO体HC和LC表达盒克隆至哺乳动物表达载体pcDNA3.1(Invitrogen,0地亚哥,加利福尼亚州),制备抗-人IL-6mab240.glDISCO体的HC和LC表达构建体。类似地,将常规IgGl形式的抗-人IL-6mab240.gl的HC表达盒也克隆至pcDNA3.1表达载体。根据生产厂商的说明,将pcDNA3.1-240.glDISCO体-HC和pcDNA3.1-240.glLC构建体共转染至HEK293细胞(Invitrogen,圣地亚哥,加利福尼亚州)。使用标淮蛋白A层析纯化条件培养基中的抗-IL-6mab240.g1DISCO体。类似地,将pcDNA3.1-240.glIgGl-HC和pcDNA3.1-240.glLC构建体也共转染至HEK293细胞,同样使用蛋白-A层析纯化来自条件培养基的常规IgGl形式的抗-人IL-6mab240.g1。
抗-人IL-6mab240.lDISCO体的体外表征
抗-人IL-6mab240.glDISCO体与人IL-6结合。使用包被了重组人IL-6(R&DSystem,美国)的板,通过基于标淮ELISA的结合检测,评估抗-人IL-6mab240.glDISCO体与人IL-6的结合亲和性。单体DISCO形式的mab240.gl与人IL-6的结合亲和性低于二价IgGl形式的mab240.gl。
在人DS-1细胞表面阻断人IL-6与人IL-6R的结合。通过阻断人IL-6与人DS-1细胞表面的结合确定抗-人IL-6mab240.glDISCO体的中和活性。人DS-1细胞(ATCC,美国)的生长依赖于IL-6。在含2mML-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中培养DS-1细胞,经调整所述培养基中含有1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/L葡萄糖、1OmMHEPES、和1.0mM丙酮酸钠并添加了l0U/mlIL-6和10%胎牛血清。采用标准的蛋白生物素化试剂盒(皮尔斯,美国)使用生物素标记重组的人IL-6。
使用标准的流式细胞术分析方法评估人IL-6与DS-1细胞表面的结合,以及人工-6与DS-1细胞结合的阻断作用。简言之,将DS-1细胞重悬于FACS缓冲液(含2%FBS的PBS)中,使其浓度为lXlO6个细胞/ml。将0.1ug生物素化的人IL-6加入1OOulDS-1细胞中,在4°C下孵育15min。对于这些反应中的某些而言,将浓度递增(0.1ug至20ug的抗-人IL-6DISCO体或常规IgGl抗体加入反应中。15min后,使用FACS缓冲液洗涤细胞3次,并将其重悬于1OOulFACS缓冲液中。然后在各反应中加入1ulFITC-抗生物素蛋白链菌素,4°C下孵育15min。洗涤细胞3次,随后使用FACSCaliber(BD,美国)进行分析。对于IL-6与DS-1细胞的结合,抗-人IL-6mab240.g1的阻断活性低于常规IgGl形式的mab240.gl,但是抗-人IL-6DISCO体仍是针对人IL-6与DS-1的结合非常强的阻断抗体。
在DS-1细胞增殖实验里中和IL-6的生物学活性
人DS-1细胞在体外的增殖依赖于IL-6。通常,在添加了10%FBS和l0ng/ml人IL-6的RPMI中培养人DS-1细胞。为评估DISCO体形式或常规二价IgGl形式的抗-人IL-6mAb的中和活性,建立了DS-1细胞增殖检测。简言之,使用PBS洗涤人DS-1细胞三次,以除去培养基中残留的IL-6。然后将细胞重悬于含10%血清但不含人IL-6的RPMI1640培养基中,使其浓度为5XlO5/ml,并接种至96孔平底板中,使其密度为5X104/孔。在单独的96-孔板中,在存在lng/ml(0.038nM)人IL-6的条件下,孵育240.glDISCO体或240.glIgGl抗体的系列稀释物。将预先混合的抗体-IL-6复合物转移至含DS-1细胞的孔中,然后在37°C湿润的CO2环境下孵育。然后,将2OulCellTiter96Aqueous(普洛麦格,加利福尼亚州)加入各孔中,与细胞再孵育6小时,以确定增殖细胞数。240.glDISCO体或常规二价IgG1抗体对DS-1细胞IL-6依赖性增殖的抑制率表示为,仅经过IL-6处理孔的抑制百分率减去含有细胞但无IL-6的对照孔结果。该结果表明与常规二价形式的240.gl抗体相比,抗-人IL-6mab240.gl单特异性DISCO体针对人IL-6的中和活性降低。但是,该结果也表明240.gl单特异性DISCO体仍是DS-1增殖非常强的抑制剂。
抗-人IL-6mab240.glDISCO体的体内生物学活性。在体内注射后,IL-6诱导多种急性反应蛋白分泌至血清。这些蛋白之一是血清淀粉样A(SAA)。因而,在体内IL-6诱导血清淀粉样蓄积的阻断可以用于评估抗-IL-6抗体的中和活性。皮下(s.c.)注射给予C57BL6小鼠浓度渐增(0.005mg/kg至1mg/kg)的抗-L-6240.glDISCO体或240.gl常规1gG1抗体。24小时后,腹腔(i.p.)注射给予小鼠30ug/kg的重组人IL-6(R&DSystems,USA)。20小时后,收集这些小鼠的血清样品,使用ELISA试剂盒(Tridelta,爱尔兰)测定血清中SAA的浓度。结果表明与常规二价形式的240.gl抗体相比,抗-人IL-6mab240.gl单特异性DISOCO体在体内对人IL-6的中和活性降低。然而,该结果还表明240.gl单特异性DISCO体仍是在体内针对人IL-6诱导的SAA分泌非常强的抑制剂。
还分别在24、48、72、96和168小时时间点通过尾静脉取血收集这些小鼠的血液样品,测定在这些小鼠中存在的人IL-6。将血液样品在65°C下加热,以分离人IL-6/抗体复合物。使用人IL-6特异性ELISA试剂盒(R&DSystems,美国)测定血液样品中人IL-6的量。使用DS-1增殖检测确定血液样品中人IL-6的生物学活性。结果表明与给予240.glIgG1抗体的小鼠相比,给予240.glDISCO体动物的血液中存在的人IL-6的量降低。这些结果表明给予240.glDISCO体不会导致人IL-6在血液中的蓄积,其在体内具有较低的IL-6诱导的病理作用。
实施例10:抗-IL6单特异性DISCO体的构建和生物学活性研究
抗人TNFRlIZI-06.1DISCO体HC和LC基因的构建
采用与实施例2所述类似的方法,通过PCR组装抗-人TNFR1IZI-06.1DISCO体的编码序列。根据实施例2所述制备抗-人TNFRlIZI-06.1DISCO体的CH2CH3-铰链部分。抗-人TNFRl抗体IZI-06.1(人源化的克隆H398)的重链可变序列来自于文献(Kontermann等,J.Immunother,Vol.31(3),225-234;Zettlitz等,MAbs,20lOVol.2(6):639-47;SEQIDN0:64)。使用重叠寡核苷酸的PCR合成相应的VH基因。可以使用VH和人IgG1CH1通过重叠PCR方法制备Fd基因,人IgG1CH1可以通过PCR克隆自人B细胞cDNA文库。使用IgG1CH2CH3-铰链基因和抗-人TNFRlIZI-06.1Fd基因,通过重叠PCR方法制备抗-人TNFR1IZI-06.1DISCO体重链基因(HC)。相应的VL序列亦来自文献(Kontermann等,J.Immunother,Vol.31,3,225-234;Zettlitz等,MAbs,20lOVol.2(6):639-47;SEQIDNO:65),使用重叠寡核苷酸的PCR合成相应的VL基因。可以使用VL和人IgGlCκ基因,通过重叠PCR方法制备抗-人TNFRlIZI-06.1LC基因,人1gGlCκ可以PCR克隆自人B细胞cDNA文库。同样制备常规人IgG1形式的抗-人TNFRlIZI-06.1重链基因作为对照抗体。
抗-人TNFRlIZI-06.1DISCO体的表达
通过将抗-人TNFRlIZI-06.1DISCO体HC和LC表达盒克隆至哺乳动物表达载体,如pcDNA3.1(Invitrogen,圣地亚哥,加利福尼亚州),制备抗-人TNFRlIZI-06.1DISCO体的HC和LC表达构建体。类似地,将常规IgGl形式的抗-人TNFRlIZ1-06.1的HC表达盒也克隆至pcDNA3.1表达载体。根据生产厂商的说明,将pcDNA3.1-IZI-06.1DISCO体-HC和pcDNA3.1-IZI-06.1LC构建体共转染至HEK293细胞(Invitrogen,圣地亚哥,加利福尼亚州)。使用标准蛋白A层析纯化条件培养基中的抗-人TNFRlIZI-06.1DISCO体。类似地,将pcDNA3.1-IZI-06.1IgG1-HC和pcDNA3.1-IZI-06.1LC构建体也共转染至HEK293细胞,同样使用蛋白-A层析纯化条件培养基中的常规IgGl形式的抗-人TNFRlIZI-06.1。
抗-人TNFRlIZI-06.1体的体外表征。可以使用固化的人TNFRlFc融合蛋白测定抗-人TNFRl抗体的结合亲和性。将人TNFRlFc融合蛋白和阴性对照Fc融合蛋白在96-孔板(60ng/孔)中的PBS中固化过夜。然后使用2%BSA洗涤并封闭已包被的板。将不同浓度的IZI-06.1DISCO体和IZI-06.1IgG1抗体加入各孔中,使用HRP偶联的抗-人Fab抗体和标准ECL试剂检测结合的抗体。与二价IZI-06.1IgGl抗体相比,IZI-06.1DISCO体对TNFRlTc蛋白具有更低的结合亲和性。
使用人横纹肌肉瘤细胞系Kym-l(JCRB,日本)测定抗-人TNFRl抗体的中和活性。Kym-1细胞对TNF诱导的凋亡具有较高的敏感性(LD50<1OOpg/ml),其可以被抗-TNFRl拮抗剂所阻断。给药前1天将Kym-1细胞接种于96-孔板中(在含5%FCS的RPMI-1640中,15,000个细胞/孔)。在细胞中加入不同浓度的抗-TNFRlIZI-06.1DISCO体和常规IZI-06.11gG1(0.1至5Oug/ml),在37°C下孵育60分钟。然后在细胞中加入重组人TNF(R&DSystem,美国),使其终浓度为1.25ng/m1。20小时后,采用结晶紫染色测定细胞活力。TNF非常显著的诱导Kym-1细胞死亡,其能够被浓度为lOug/ml以上的抗-TNFRlIZ1-06.1DISCO体完全阻断。常规IgGl形式的IZI-06.1在较低浓度下也能够阻断TNF-l诱导的Kym-l细胞死亡;但是,即使最高剂量的抗体也仅能够阻断70%的TNF诱导的细胞死亡。这是由于这样的事实,1gG1形式的IZI-06.1抗体能够与TNFRl交联并且在较高浓度下诱导激动信号。这些结果表明,与常规二价IgGl抗体相比,单特异性DISCO体形式的抗-TNFRlIZ1-06.1抗体是更好的中和剂。这些结果表明抗-TNFRlDISCO体是用于治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和克罗恩氏病更好的治疗剂。
实施例11:抗-人PCSK9mab3OONDISCO体的构建和使用这种抗体治疗高胆固醇血症
抗-人PCSK9mabDISCO体HC和LC基因的构建
采用与实施例2所述类似的方法,通过PCR组装抗-人PCSK9mab30ONDISCO体的编码序列。根据实施例2所述制备抗-人PCSK9mab3OONDISCO体的CH2CH3-铰链部分。抗-人PCSK9抗体克隆300N的重链可变序列来自己公开的专利(WO2010077854;SEQIDNO66)。使用重叠寡核苷酸的PCR合成相应的LH基因。可以使用VH和人IgGlCHl通过重叠PCR方法制备Fd基因,人IgGlCHl可以通过PCR克隆自人B细胞cDNA文库。使用IGGlCH2CH3-铰链基因和抗-人PCSK9mab30ONFd基因通过重叠PCR方法制备抗-人PCSK9mab3OONDISCO体重链基因(HC)。相应的VL序列亦来自己公开的专利(WO2010077854;SEQIDNO:67),使用重叠寡核苷酸的PCR合成相应的VL基因。使用VL和人IgGlCκ基因通过重叠PCR方法制备抗-人PCSKgmab30ONLC基因,人IgGlCκPCR克隆自人B细胞cDNA文库。同样制备常规人IgGl形式的抗-人PCSK9mab3O0N重链基因作为对照抗体(WO2010077854)。
抗-人PCSK9mab3OONDISCO体的表达
通过将抗-人PCSKgmab30ONDISCO体HC和LC表达盒克隆至哺乳动物表达载体,如pcDNA3.1(Invitrogen,圣地亚哥,加利福尼亚州),制备抗-人PCSK9mab30ONDISCO体的HC和LC表达构建体。类似地,将常规IgGl形式的抗-人PCSK9mab300N的HC表达盒也克隆至pcDNA3.1表达载体。根据生产厂商的说明,将pcDNA3.1-300NDISCO体-HC和pcDNA3.1-300NLC构建体共转染至HEK293细胞(Invitrogen,圣地亚哥,加利福尼亚州)。使用标淮蛋白A层析纯化条件培养基中的抗-人PCSK9mab30ONDISCO体。类似地,将pcDNA3.1-300NIgGl-HC和pcDNA3.1-30ONLC构建体也共转染至HEK293细胞,同样使用蛋白-A层析纯化条件培养基中的常规1gG1形式的抗-人PCSK9mab3O0N。
抗-人PCSK9mab300NDISCO体的外表征
使用包被人PCSK9蛋白的板和标准的ELISA方法,测定抗-人PCSK9mab3O0NDISCO体的结合亲和性。抗-人PCSK9mab30ONDISCO体对人PCSK9的结合亲和性低于常规IgGl形式的mab300N。这是预料之中的,因为mab300NDISCO体以单价形式结合至PCSK9。采用LDL-摄取检测(Chan等,PNAS,2009,16:106(24):9820-5)在体内对抗-PCSK930ONDISCO体的生物学活性进行进一步评价。简言之,在肝HepG2细胞(ATCC,美国)中加入荧光BODIPY标记的LDL(Invitrogen,美国)并孵育3小时。使用Safife酶标仪(TecanSystems,美国)测定细胞摄取标记LDL的情况。在反应中加入重组人PCSK9(25ug/ml)后,HepG2细胞对LDL的摄取被阻断约80%。在将所述复合物加入HepG2细胞以前,将不同浓度的(1-1OOug/ml)抗-人PCSK9mab3OONDISCO体和mab300NIgGl抗体与人PCSK9预孵育。30ONDISCO体和300NIgGl抗体均能有效恢复HepG2细胞对LDL的摄取。由于是与抗原的单价结合,因而30ONDISCO体的阻断活性低于300NIgGl,但是其仍是PCSK9介导的LDLR下调的非常有效的阻断剂。
抗-人PCSK9mab3OONDISCO体的体内生物学活性和药代动力学性质
使用通过AAV5过表达人PCSK9的小鼠测定抗-人PCSK9mab300NDISCO体的体内生物学活性(Chan等,PNAS,2009,16:106(24):9820-5)。简言之,静脉(i.v.)注射给予C57BL/6小鼠5XlO12pfu的AAV5-人PCSK9。然后针对血清非-HDL-C(LDL-C和VLDL-C)的水平对动物进行筛选,将具有相似非-HDL-C水平的动物分为一组用于抗-PCSKg抗体治疗。在这些小鼠中观察到非-HDL-C一般增加3-4倍。单次静脉(i.v.)注射给予这些小鼠不同剂量(10-5Omg/kg)的抗-PCSK9mab300NDISCO体或300NIgGl抗体。在注射后的不同时间点(0、6、12、24、48、72、96、144、168小时),通过尾部取血从这些动物中收集血液样品,并测定血清中非-HDL-C的水平。此外,还通过抗-人FcELISA测定血清中存在的抗-人PCSK9抗体。
在较高剂量下(>30mg/kg),这两种抗-人PCSK9抗体(300NDISCO体和300NIgGl)均能够将小鼠血清中的非-HDL-C有效降至基线水平(未经AAV5处理的动物)。但是,在这些小鼠中30ONDISCO体具有更加持久的使非-HDL-C降低的作用。可以将其解释为,300NDISCO体具有更长的PK。300NIgGl以二价形式与人PCSK9结合,其通过PSCK9/LDLR再循环有效从循环中清除。30ONDISCO体的单特异性抗原结合性质使其对PCSK9介导的清除不太敏感,并在体内具有更长的PK和PD作用。因而,与常规IgG形式的抗体相比,DISCO体形式的抗-PCSK9mab300N在临床条件下针对高胆固醇血症和冠心病(CHD)治疗具有明显的优势。
Claims (26)
1.一种多肽复合物,所述复合物包括:
第一多肽,所述第一多肽包括第一蛋白单体和第一抗原结合结构域,和
第二多肽,所述第二多肽包括第二蛋白单体和第二抗原结合结构域,
其中所述第一蛋白单体与所述第二蛋白单体形成二聚体;
其中所述第一蛋白单体的C-末端与所述第一抗原结合结构域的N-末端可操作地连接;
其中所述第二蛋白单体的C-末端与所述第二抗原结合结构域的N-末端可操作地连接;
以及其中所述第一多肽进一步包括含有巯基残基的第一肽接头,
所述第二多肽进一步包括含有巯基残基的第二肽接头;
所述第一肽接头的N-末端与所述第一蛋白单体的C-末端共价连接;
所述第一肽接头的C-末端与所述第一抗原结合结构域的N-末端共价连接;
所述第二肽接头的N-末端与所述第二蛋白单体的C-末端共价连接;
所述第二肽接头的C-末端与所述第二抗原结合结构域的N-末端共价连接;以及
所述第一肽接头与所述第二肽接头形成二硫键,
其中所述二硫键基本减少了所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域与抗原的同时结合。
2.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第一蛋白单体与所述第二蛋白单体相同或不同。
3.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域相同或不同。
4.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域结合至相同或不同的靶点。
5.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第一蛋白单体和/或所述第二蛋白单体包括来自免疫球蛋白的CH3结构域,并且所述CH3结构域的C-末端与所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域的N-末端可操作地连接。
6.根据权利要求5所述的多肽复合物,其中所述第一蛋白单体和/或第二蛋白单体进一步包括来自免疫球蛋白的CH2结构域,并且所述CH2结构域的C-末端与所述CH3结构域的N-末端共价连接。
7.根据权利要求5所述的多肽复合物,其中所述免疫球蛋白选自:IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。
8.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域选自:CDR、Fv、VL、VH、轻链、和重链、ScFv、Fab、骆驼VHH、dAb、纤连蛋白3结构域(Fn3)、锚蛋白重复、和阿德奈汀(Adnectin)。
9.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第一蛋白单体的N-末端与第三抗原结合结构域可操作地连接。
10.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第二蛋白单体的N-末端与第四抗原结合结构域可操作地连接。
11.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第一抗原结合结构域的C-末端与第五抗原结合结构域可操作地连接。
12.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第二抗原结合结构域的C-末端与第六抗原结合结构域可操作地连接。
13.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域是第一轻链片段,所述片段通过二硫键与第一重链片段连接。
14.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域是第二重链片段,所述片段通过二硫键与第二轻链片段连接。
15.根据权利要求13所述的多肽复合物,其中所述第一轻链片段的C-末端与第七抗原结合结构域可操作地连接。
16.根据权利要求13所述的多肽复合物,其中所述第一重链片段的C-末端与第八抗原结合结构域可操作地连接。
17.根据权利要求13所述的多肽复合物,其中所述第一重链片段的N-末端与第九抗原结合结构域可操作地连接。
18.根据权利要求14所述的多肽复合物,其中所述第二重链片段的C-末端与第十抗原结合结构域可操作地连接。
19.根据权利要求14所述的多肽复合物,其中所述第二轻链片段的C-末端与第十一抗原结合结构域可操作地连接。
20.根据权利要求14所述的多肽复合物,其中所述第二轻链片段的N-末端与第十二抗原结合结构域可操作地连接。
21.根据权利要求1所述的多肽复合物,其中所述第一巯基残基或所述第二巯基残基与所述肽接头的C-末端相距1-10个氨基酸残基。
22.一种组合物,所述组合物包括如权利要求1-21任意一项所述的多肽复合物,其中所述多肽复合物与一个或多个偶联物连接。
23.一种药物组合物,所述药物组合物包括如权利要求1-21任意一项所述的多肽复合物和药学上可接受的载体。
24.如权利要求1-21任意一项所述的多肽复合物在制备治疗状况的药物组合物中的用途,其中向所需对象给予有效量的所述多肽复合物,其中所述状况与所述多肽复合物能够结合的抗原相关。
25.根据权利要求24所述的用途,其中所述状况选自:肿瘤、癌症、炎症、同种异体移植、I型糖尿病、和多发性硬化症。
26.一种检测样品中抗原存在的方法,所述方法包括将所述样品与权利要求1-21任意一项所述的多肽复合物接触,并检测所述抗原的存在。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US41190310P | 2010-11-09 | 2010-11-09 | |
US61/411,903 | 2010-11-09 | ||
PCT/US2011/059844 WO2012064792A2 (en) | 2010-11-09 | 2011-11-09 | Protein complexes for antigen binding and methods of use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103328514A CN103328514A (zh) | 2013-09-25 |
CN103328514B true CN103328514B (zh) | 2015-12-02 |
Family
ID=46051526
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201180064522.2A Active CN103328514B (zh) | 2010-11-09 | 2011-11-09 | 用于抗原结合的蛋白复合物及其使用方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9518132B2 (zh) |
EP (1) | EP2638073A4 (zh) |
CN (1) | CN103328514B (zh) |
CA (1) | CA2817015A1 (zh) |
WO (1) | WO2012064792A2 (zh) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JOP20080381B1 (ar) | 2007-08-23 | 2023-03-28 | Amgen Inc | بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9) |
US20130064834A1 (en) | 2008-12-15 | 2013-03-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9 |
JO3672B1 (ar) | 2008-12-15 | 2020-08-27 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9). |
RU2604139C2 (ru) | 2011-01-28 | 2016-12-10 | Санофи Байотекнолоджи | Фармацевтические композиции, содержащие антитела к pcsk9 человека |
AR087305A1 (es) | 2011-07-28 | 2014-03-12 | Regeneron Pharma | Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit |
EA028278B1 (ru) | 2011-09-16 | 2017-10-31 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | СПОСОБЫ СНИЖЕНИЯ УРОВНЕЙ ЛИПОПРОТЕИНА(а) ПОСРЕДСТВОМ ВВЕДЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОПРОТЕИНКОНВЕРТАЗЫ СУБТИЛИЗИН/КЕКСИН-9 (PCSK9) |
US10111953B2 (en) | 2013-05-30 | 2018-10-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9) |
EP3004171B1 (en) | 2013-06-07 | 2021-10-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of pcsk9 |
CN113307873A (zh) | 2013-11-11 | 2021-08-27 | 中外制药株式会社 | 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子 |
CN118105482A (zh) | 2013-11-12 | 2024-05-31 | 赛诺菲生物技术公司 | 用于与pcsk9抑制剂一起使用的给药方案 |
EP3677277A1 (en) | 2014-07-16 | 2020-07-08 | Sanofi Biotechnology | Methods for treating patients with heterozygous familial hypercholesterolemia (hefh) |
US11154615B2 (en) | 2014-11-11 | 2021-10-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region |
CA2995645A1 (en) | 2015-08-18 | 2017-02-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-pcsk9 inhibitory antibodies for treating patients with hyperlipidemia undergoing lipoprotein apheresis |
AU2018219887B2 (en) | 2017-02-08 | 2024-08-15 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer |
CA3235295A1 (en) | 2017-02-20 | 2018-08-23 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Proteins binding her2, nkg2d and cd16 |
JP2020517259A (ja) | 2017-04-19 | 2020-06-18 | ボード・オブ・リージエンツ,ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | 操作された抗原受容体を発現する免疫細胞 |
US11952422B2 (en) | 2017-12-05 | 2024-04-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137 |
US11884733B2 (en) | 2018-02-08 | 2024-01-30 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Antibody variable domains targeting the NKG2D receptor |
AU2019235523A1 (en) | 2018-03-14 | 2020-10-29 | Novimmune Sa | Anti-CD3 epsilon antibodies and methods of use thereof |
AR114544A1 (es) * | 2018-08-08 | 2020-09-16 | Dragonfly Therapeutics Inc | Proteínas de unión multiespecíficas que unen a bcma, nkg2d y cd16, y métodos de uso |
US20220112296A1 (en) * | 2018-09-28 | 2022-04-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region |
CA3173519A1 (en) * | 2020-03-31 | 2021-10-07 | Vishnu Priyanka Reddy CHICHILI | Method for producing multispecific antigen-binding molecules |
EP4126969A4 (en) | 2020-03-31 | 2024-05-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | MULTISPECIFIC ANTIGEN-BINDING MOLECULES TARGETING DLL3 AND THEIR USES |
EP4267607A1 (en) * | 2020-12-22 | 2023-11-01 | Sanofi | Effectorless fc molecules |
WO2023217289A1 (en) * | 2022-05-13 | 2023-11-16 | Vibrant Pharma Limited | Multispecific antibodies and uses thereof |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004076489A1 (en) * | 2003-02-25 | 2004-09-10 | Medinnova As | Modified antibody |
CN1842538A (zh) * | 2003-06-27 | 2006-10-04 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 包含连接肽的修饰的结合分子 |
WO2007110205A2 (en) * | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Merck Patent Gmbh | Engineered heterodimeric protein domains |
Family Cites Families (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US20040121415A1 (en) | 1996-12-10 | 2004-06-24 | King David John | Monovalent antibody fragments |
DE69922159T2 (de) | 1998-01-23 | 2005-12-01 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie | Mehrzweck-antikörperderivate |
ATE460946T1 (de) * | 1998-06-22 | 2010-04-15 | Immunomedics Inc | Gebrauch von bispezifischen antikörpern in diagnose und therapie |
WO2000006605A2 (en) * | 1998-07-28 | 2000-02-10 | Micromet Ag | Heterominibodies |
US7087411B2 (en) * | 1999-06-08 | 2006-08-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion protein capable of binding VEGF |
AU2001265417A1 (en) | 2000-06-05 | 2002-04-08 | University Of Tennessee Corporation | Compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors |
US7754208B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
US20080008713A1 (en) | 2002-06-28 | 2008-01-10 | Domantis Limited | Single domain antibodies against tnfr1 and methods of use therefor |
US20070298041A1 (en) | 2002-06-28 | 2007-12-27 | Tomlinson Ian M | Ligands That Enhance Endogenous Compounds |
JP2004082013A (ja) | 2002-08-28 | 2004-03-18 | Hitachi Ltd | パーフルオロコンパウンド分解方法,分解触媒及び処理装置 |
NZ544924A (en) | 2003-06-27 | 2009-03-31 | Biogen Idec Inc | Modified binding molecules comprising connecting peptides |
US20050249723A1 (en) | 2003-12-22 | 2005-11-10 | Xencor, Inc. | Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites |
SG188175A1 (en) * | 2004-06-03 | 2013-03-28 | Novimmune Sa | Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof |
CN101137673B (zh) * | 2005-01-05 | 2013-12-04 | 比奥根艾迪克Ma公司 | Cripto结合分子 |
GB0614780D0 (en) | 2006-07-25 | 2006-09-06 | Ucb Sa | Biological products |
US8338376B2 (en) * | 2006-10-20 | 2012-12-25 | Biogen Idec Ma Inc. | Compositions comprising variant LT-B-R-IG fusion proteins |
WO2008112325A2 (en) * | 2007-03-15 | 2008-09-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Treatment of autoimmune disorders |
AR064623A1 (es) * | 2006-12-21 | 2009-04-15 | Centocor Inc | Uso de agonistas del receptor de glp -1 de accion prolongada para mejorar la sensibilidad a la insulina y los perfiles lipidicos |
PL1972637T3 (pl) | 2007-03-19 | 2012-01-31 | Univ Stuttgart | Antagoniści selektywni wobec huTNFR1 |
US20090252729A1 (en) | 2007-05-14 | 2009-10-08 | Farrington Graham K | Single-chain Fc (scFc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto |
GB0724331D0 (en) | 2007-12-13 | 2008-01-23 | Domantis Ltd | Compositions for pulmonary delivery |
US20090148447A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-06-11 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding Peptides Having a C-terminally Disposed Specific Binding Domain |
-
2011
- 2011-11-09 CA CA2817015A patent/CA2817015A1/en not_active Abandoned
- 2011-11-09 EP EP11840535.6A patent/EP2638073A4/en not_active Withdrawn
- 2011-11-09 CN CN201180064522.2A patent/CN103328514B/zh active Active
- 2011-11-09 WO PCT/US2011/059844 patent/WO2012064792A2/en active Application Filing
- 2011-11-09 US US13/883,282 patent/US9518132B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004076489A1 (en) * | 2003-02-25 | 2004-09-10 | Medinnova As | Modified antibody |
CN1842538A (zh) * | 2003-06-27 | 2006-10-04 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 包含连接肽的修饰的结合分子 |
CN1842539A (zh) * | 2003-06-27 | 2006-10-04 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 疏水-相互作用-层析或铰链区修饰对于均质抗体溶液的制备的用途 |
WO2007110205A2 (en) * | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Merck Patent Gmbh | Engineered heterodimeric protein domains |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2638073A2 (en) | 2013-09-18 |
WO2012064792A3 (en) | 2012-07-19 |
WO2012064792A2 (en) | 2012-05-18 |
CN103328514A (zh) | 2013-09-25 |
EP2638073A4 (en) | 2014-05-07 |
CA2817015A1 (en) | 2012-05-18 |
US9518132B2 (en) | 2016-12-13 |
US20130230525A1 (en) | 2013-09-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103328514B (zh) | 用于抗原结合的蛋白复合物及其使用方法 | |
AU2018393424B2 (en) | Triabody, preparation method and use thereof | |
US11746148B2 (en) | Antibody molecules comprising a single-domain antigen-binding site and Fab fragments | |
JP2020515239A (ja) | 抗icosアゴニスト抗体およびそれらの使用 | |
CN110944651A (zh) | 用于自然杀伤细胞激活的多特异性结合蛋白及其治疗癌症的治疗性用途 | |
CA2993276A1 (en) | Novel anti-pd-1 antibodies | |
CN111065649A (zh) | 结合nkg2d、cd16和egfr、hla-e、ccr4或pd-l1的蛋白质 | |
JP6317674B2 (ja) | 医学的使用のための二重特異性抗体 | |
WO2021000530A1 (zh) | 一种双特异性抗体及其制备方法与应用 | |
CN110944661A (zh) | 结合her2、nkg2d和cd16的蛋白质 | |
KR20200051789A (ko) | Nkg2d, cd16, 및 c-유형 렉틴-유사 분자-1 (cll-1)에 결합하는 단백질 | |
CN108218990A (zh) | 分离的抗体或其抗原结合片段及其在肿瘤治疗中的应用 | |
IL299542A (en) | Polypeptides containing modified 2-IL polypeptides and uses thereof | |
AU2020269268A1 (en) | CD123-binding polypeptides and uses thereof | |
CA3146341A1 (en) | Bispecific anti lrrc15 and cd3epsilun antibudies | |
CN110913902A (zh) | 结合psma、nkg2d和cd16的蛋白质 | |
JP2019524087A (ja) | 低免疫原性を有する抗体及びその使用 | |
CN113272017A (zh) | 抗tim-3抗体 | |
KR102261582B1 (ko) | 항-pd-l1-항-tim-3 이중특이적 항체 | |
WO2020249041A1 (zh) | 靶向lag-3的抗体和双特异性抗体及其用途 | |
CA3104252A1 (en) | Anti-l1cam antibodies and uses thereof | |
CN110914305A (zh) | 结合cd123、nkg2d和cd16的蛋白质 | |
CN114981301A (zh) | Pd1和vegfr2双结合剂 | |
CN110305216B (zh) | 新型抗tim-3抗体 | |
EP4373854A1 (en) | Cd8-binding polypeptides and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20171027 Address after: No. 1, No. 1, No. 9, No. 5, South Garden Road, Chengdu, Sichuan Patentee after: Chengdu grace Biotechnology Co., Ltd. Address before: American California Patentee before: Altimab Therapeutics Inc |