CN1842538A - 包含连接肽的修饰的结合分子 - Google Patents

Abstract

本发明描述了从包含两种类型的多肽二聚体的混合物分离或优选合成经由至少一个链间二硫键连接的二聚体与不经由至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。这些形式可利用疏水反应层析相互分离。此外，本发明涉及导致经由至少一个链间二硫键连接或不经由至少一个链间二硫键连接的二聚体的优先生物合成的连接肽。本发明还涉及组合物，其中大部分二聚体经由至少一个链间二硫键连接或不经由至少一个链间二硫键连接。本发明还涉及新的结合分子，例如，其包含本发明的连接肽。

Description

包含连接肽的修饰的结合分子

相关申请

本申请要求2003-6-27提交的题为“多肽的纯化和优选合成，”的USSN60/483877以及2003-10-3提交的题为“抗原结合多肽的纯化和优选合成，”的USSN 60/508,810的优先权。该申请还要求2003-10-28提交的题为“包含连接肽的修饰的抗体分子，”的USSN 60/515,351以及2003-10-30提交的题为“包含连接肽的修饰的抗体分子，”的USSN 60/516,030的优先权。该申请还与200406028提交的题为“连接多肽的纯化和优选合成”的USSN XX/XXXXXX有关。这些申请的全文内容包含在本文作为参考。

背景技术

抗体是二聚体分子；组成该二聚体的每个单体包含一条轻链和一条重链。抗体分子的溶液以两种与铰链异质性相关的形式存在。利用对纯化的Mab MAb的SDS-PAGE分析，通常这两种形式作为两条蛋白带即一条主要带(MW大约150-160kDa)和一条次要带(MW大约75-80kDa)而被观察到。该后一种形式通常在对纯化的IgG4制备物的SDS-PAGE分析之后观察到，但可在所有IgG同种型包括纯化的重组中MAb以低得多的频率得以鉴定(Angal etal.1993.Mol.Immunol.30：105；Norderhaug et al.1990.Eur.J.Immunol.21：2370)。较大分子量的同种型，称为A型，含有位于对应Kabat编号系统位置239和242(位置226和229，EU编号系统)的共价链间二硫键(Kabat，E，Wu，TT，Perry，HM，Gottesman，KS，Foeller，C：Sequences of Proteins ofImmunological Interest.Bethesda，US Department of Health和人Services，NIH，1991)。第二种同种型B型，被认为不包含两条重链之间的共价连接以及两个相邻半胱氨酸残基之间的链间二硫键，如非还原性SDS-PAGE电泳中所见的75-80kDa证实的。推定B型的两条重链由与该分子的CH3结构域区域相关的强的非共价(即离子)相互作用来连接。A型和B型的混合物不存在于Mab片段的溶液中，所述片段含有完整铰链区，但缺乏CH3区，诸如F(ab)₂片段。通常，遗传改造的或酶消化的F(ab)₂Mab制备物缺乏B型，这是由于该分子缺乏保持非共价相互作用(例如氢键结合)所需的结构域。然而，它们存在于含有CH3区的Mab制备物诸如IgG4，CH2区缺失的Mab片段(例如，如02/060955 A2中所述)以及微型抗体(见例如，Hu et al.1996.CancerResearch 56：3055)中。

将蛋白改造技术应用于治疗性抗体设计也产生出多种抗体模式，其具有改变的，在一些情况中具有改良的药效学、生物分布以及活性图谱。一些改变的抗体分子中，铰链区中的许多半胱氨酸残基被减少到一个，以促进抗体分子的聚集，因为半胱氨酸残基仅仅对于形成单个二硫键是必需的。这还提供了将铰链区附着于另一铰链区或者效应分子或报道分子的特异性靶(美国专利5,677,425)。抗体铰链中的半胱氨酸残基数目也增加(美国专利5,677,425)。其它突变的抗体被构建，其中IgG1铰链区和CH2结构域用人IgG3铰链区替换(WO 97/11370)。这些分子含有11个巯基用于经由硫醇基替换多个半抗原。

CH2结构域缺失的抗体的分子量约为120kDa，并且显示与全长IgG相比，其穿透肿瘤的能力明显更好。微型抗体，其也缺失CH2结构域，具有相似的性质。这些结构域缺失的分子在肿瘤位点的聚集比其它Mab片段诸如F(ab)′₂更为有效，但不具有利用完整IgG抗体时所见的不利药效学图谱。CH2结构域缺失的抗体由以下部分组成：VLCL轻链和VH1重链结构域以及与CH3结构域基因融合(直接和经由修饰的肽间隔物)的部分铰链区(例如，上和中铰链)。例如，重组CH2结构域缺失的ddCC49的合成，识别各种人癌症上表达的肿瘤相关的TAG72抗原的结构域缺失的抗体，在细胞培养物中产生大约50∶50分布的A和B同种型。改造为表达其它形式的CH2结构域缺失的抗体，所述抗体例如四价CH2结构域缺失的抗体，微型抗体，或四价微型抗体的细胞也表达A和B同种型和/或单体半-体(mer)分子组成的混合物。

即使在Mab纯化以后，A型和B型也极难分离，这是由于它们由相同的氨基酸组成，由此具有相同的分子量和类似的物理和化学性质。它们不能通过通常用于纯化抗体分子包括重组MAb蛋白的标准凝胶过滤，亲和层析，和离子交换层析来分离。目前的生产工艺丢弃所产生总抗体的至少50％，这对总产率具有负面影响。此外，两种同种型的存在增加下游加工所需的努力。因此，分离A型和B型的方法或增加一种或另一种形式的抗体的生物合成的方法非常有益。

发明内容

本发明至少部分基于以下发现：在包含含有不同同种型的二聚体多肽分子(包含两个重链部分的分子，其中部分分子包含经由至少一个链间二硫键(A型)连接的两个重链部分，部分分子包含不经由至少一个链间二硫键连接的两个重链部分(B型))混合物的组合物中，一种形式或另一种可优选获得，例如通过利用疏水作用层析分离或通过包含导致A型或B型的优选生物合成的合成连接肽。

一个实施方案中，本发明的结合分子是四价的。本发明的连接肽可包含在倾向于形成A型和B型的任何二聚体分子中，例如抗体分子，结构域缺失的抗体分子(例如缺乏所有或部分CH2结构域)，微型抗体，二价抗体，融合蛋白等。在优选的实施方案中，A型的形成被增强。

一个实施方案中，本发明涉及组合物，其包含含有至少四个结合位点和至少两条多肽链的多肽二聚体，其中所述至少两条多肽链包含至少一个重链部分和合成连接肽，其中超过约50％的所述多肽二聚体经由至少一个链间二硫键连接。

另一实施方案中，超过约90％的所述二聚体经由至少一个链间二硫键连接。

另一实施方案中，至少一条所述多肽链包含经由连接肽连接于VL，VH或CH1结构域的CH3结构域。

另一实施方案中，所述多肽链缺乏所有或部分CH2结构域。

另一实施方案中，所述二聚体经由两个或多个链间二硫键连接。

另一实施方案中，所述重链部分源自选自下组的抗体同种型：IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4。

另一实施方案中，所述重链部分包含源自选自下组的铰链区的氨基酸序列：γ1铰链，γ2铰链，γ3铰链，或γ4铰链。

另一实施方案中，所述分子是双特异性的。

另一实施方案中，所述分子包含至少一个对可溶配体特异的结合位点。

另一实施方案中，所述分子包含至少一个对细胞表面分子特异的结合位点。

另一实施方案中，所述所述分子包含对肿瘤细胞抗原特异的两个结合位点以及对前体药物特异的两个结合位点。

另一实施方案中，所述对前体药物特异的两个结合位点是催化性的。

另一实施方案中，所述合成连接肽包含位于Kabat编号系统的位置243的脯氨酸残基。

另一实施方案中，所述合成连接肽还包含位于Kabat编号系统的位置244的丙氨酸残基以及位置245的脯氨酸残基。

另一实施方案中，所述重链部分包含嵌合铰链。

另一实施方案中，所述合成连接肽包含至少部分IgG1铰链结构域，至少部分IgG3铰链结构域。

另一实施方案中，所述连接肽选自包含SEQ ID NO：8-15和48组成的组的氨基酸序列。

第二方面中，本发明提供了治疗受试者的方法，所述受试者将从利用抗体结合分子的治疗获益，所述方法包括将包含含有不同同种型的二聚体多肽分子混合物的组合物给予受试者，其中一种同种型和另一种优选获得，使得治疗发生。

一种实施方案中，所述受试者患有癌症。

另一实施方案中，所述受试者患有淋巴瘤。

另一实施方案中，所述受试者患有自身免疫疾病或病症。

另一实施方案中，所述受试者患有炎性疾病或病症。

第三个方面中，本发明提供核酸分子，其包含编码多肽分子的核苷酸序列，所述多肽分子包含不同同种型(包含两条重链部分的分子，其中一部分分子包含两个经由至少一个链间二硫键连接的两个重链部分(A型)，且一部分分子包含不经由至少一个连接二硫键连接的两个重链部分(B型))，使得一种形式或另一种可被优选获得。

一个实施方案中，所述多肽二聚体包含四条多肽链，且其中所述多肽链中的两条包含至少一个重链部分和合成连接肽。

另一实施方案中，所述核酸分子包含图8B所示的核苷酸序列(SEQ IDNO：17)。

另一实施方案中，所述核酸分子包含图8C所示的核苷酸序列(SEQ IDNO：18)。

另一实施方案中，所述核酸分子包含图10B所示的核苷酸序列(SEQ IDNO：23)。

另一实施方案中，所述核酸分子包含图12A所示的核苷酸序列(SEQ IDNO：26)。

另一实施方案中，所述核酸分子包含图12B所示的核苷酸序列(SEQ IDNO：27)。

另一实施方案中，所述核酸分子包含图14所示的核苷酸序列(SEQ IDNO：30)。

另一实施方案中，所述核酸分子包含图15所示的核苷酸序列(SEQ IDNO：31)。

另一实施方案中，所述核酸分子是载体。另一实施方案中，所述载体是宿主细胞。

第四方面中，本发明提供结合分子，其包含编码多肽分子的氨基酸序列，所述多肽分子包含不同同种型(包含两条重链部分的分子，其中一部分分子包含两个经由至少一个链间二硫键连接的两个重链部分(A型)，且一部分分子包含不经由至少一个连接二硫键连接的两个重链部分(B型))，使得一种形式或另一种可被优选获得。

一个实施方案中，所述结合分子包含图9B的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。

另一实施方案中，所述结合分子包含图9C的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。

另一实施方案中，所述结合分子包含图11B的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)。

另一实施方案中，所述结合分子包含图13A的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。

另一实施方案中，所述结合分子包含图13B的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。

另一实施方案中，所述结合分子包含图16的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)。

另一实施方案中，所述结合分子包含图17的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。

第五个方面中，本发明提供了组合物，其包含二聚体多肽分子的混合物，所述多肽分子包含不同同种型(包含两条重链部分的分子，其中一部分分子包含两个经由至少一个链间二硫键连接的两个重链部分(A型)，且一部分分子包含不经由至少一个连接二硫键连接的两个重链部分(B型))，使得一种形式或另一种可被优选获得，其中所述结合位点独立选自抗原结合位点，受体的配体结合位点，配体的受体结合位点组成的组。

一个实施方案中，所述多肽链具有至少一个结合位点，其源自选自下组的抗体：2B8，Lym1，Lym2，LL2，Her2，B1，MB1，BH3，B4，B72.3，CC49，5E8，B3F6，或5E10。

另一实施方案中，所述多肽二聚体是四价微型抗体分子。

另一实施方案中，所述多肽二聚体是四价结构域缺失的抗体分子。

另一实施方案中，所述多肽二聚体是二价抗体。

第六个方面中，本发明提供包含微型抗体分子的组合物，所述微型抗体分子包含两条多肽链，其中所述多肽链包含重链部分和合成连接肽，其中所述多肽链缺乏所有或部分CH2结构域，其中超过约50％的分子以所述多肽链之一经由至少一个链间二硫键连接的形式存在。

一个实施方案中，超过约90％的二聚体经由至少一个链间二硫键连接。

另一实施方案中，至少一条多肽链包含经由连接肽基因融合于VL，VH或CH1结构域的CH3结构域。

另一实施方案中，所述多肽链缺乏整个CH2结构域。

另一实施方案中，所述二聚体经由两个或多个链间二硫键连接。

另一实施方案中，所述重链部分源自选自下组的抗体同种型：IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4。

另一实施方案中，所述重链部分包含源自选自下组的铰链区的氨基酸序列：γ1铰链，γ2铰链，γ3铰链，或γ4铰链。

另一实施方案中，所述结合位点独立选自以下组：抗原结合位点，受体的配体结合部分，或配体的受体结合部分。

另一实施方案中，所述分子是双特异性的。

另一实施方案中，所述连接肽包含位于Kabat编号系统的位置243的脯氨酸残基。

另一实施方案中，所述合成连接肽包含嵌合铰链。

另一实施方案中，所述合成连接肽包含至少部分IgG1铰链区，至少部分IgG3铰链区。

第七方面，本发明提供了治疗可从利用抗原结合分子的疗法获益的受试者的方法，包括给予所述受试者包含微型抗体分子的组合物，所述微型抗体包含两条多肽链，其中所述多肽链包含重链部分和合成连接肽，其中所述多肽链缺乏所有或部分CH2结构域，且其中超过约50％的分子以其中一条多肽链经由至少一个链间二硫键连接的形式存在，使得治疗出现。

另一方面，本发明提供了包含编码多肽链的核苷酸序列的核酸分子，所述多肽链包含重链部分和合成连接肽，其中所述多肽链缺乏所有或部分CH2结构域，且其中超过约50％的分子以其中一条多肽链经由至少一个链间二硫键连接的形式存在。

另一方面，本发明提供了包含包含多肽二聚体的组合物，其中所述多肽二聚体具有至少四个结合位点和至少两条多肽链，其中所述至少两条多肽链包含至少一个重链部分并缺乏所有或部分CH2结构域，且其中超过约50％的分子经由至少一个链间二硫键连接。

附图简述

图1显示结构域缺失的抗体中，作为120kDa二聚体的A型和作为60kDa单体的B型。

图2图示了示例性的双链二聚体微型抗体和示例性的双链二聚体四价微型抗体，它们分别包含铰链连接肽(HCP)。其它结构也可能，例如，所述包含连接肽(HCP)的双链二聚体四价微型抗体也可构建成双特异性的。另一实施方案中，scFv中VH和VL结构域的方向可改变。

图3图示了包含铰链连接肽(HCP)的四链二聚体二价抗体。包含铰链连接肽(HCP)的四链二聚体二价抗体也可构建成双特异性的。VH和VL结构域的方向可改变。

图4图示了四链二聚体四价scFv抗体(C-scFv四价抗体)和四链四价scFvCH2结构域缺失的抗体(C-scFv四价CH2结构域缺失的抗体)，它们分别包含附着于CH3羧基末端的scFv以及铰链连接肽。scFv中VH和VL结构域的方向可改变。

图5图示了包含铰链连接肽(HCP)的四链二聚体CH2结构域缺失的四价(NL-scFv CH2结构域缺失的四价)抗体。包含连接肽(HCP)的四链二聚体CH2结构域缺失的四价抗体也可构建成双特异性的。附着于轻链的scFv中VH和VL结构域的方向可改变。

图6图示了包含铰链连接肽(HCP)的四链二聚体CH2结构域缺失的四价(NH-scFv CH2结构域缺失的四价)抗体。包含连接肽(HCP)的四链二聚体CH2结构域缺失的四价抗体也可构建成双特异性的。附着于重链的scFv中VH和VL结构域的方向可改变。

图7图示了包含铰链连接肽(HCP)的双链二聚体四价微型抗体(C-scFv四价微型抗体)。包含连接肽(HCP)的双链二聚体四价微型抗体也可构建成双特异性的。scFv中VH和VL结构域的方向可改变。

图8A(SEQ ID NO：16)显示重链CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)huCC49基因的单链DNA序列。图8B(SEQ IDNO：17)显示含有合成G1/G3：/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的重链四价CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)huCC49基因的单链DNA序列。图8C(SEQ ID NO：18)显示轻链CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)huCC49的单链DNA序列。

图9A(SEQ ID NO：19)显示重链CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)huCC49的氨基酸序列。图9B(SEQ ID NO：20)显示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的重链CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)huCC49的氨基酸序列。图9C(SEQ ID NO：21)显示轻链CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)huCC49的氨基酸序列。

图10A(SEQ ID NO：22)显示CH2结构域-缺失的huCC49四价(N-scFv四价)微型抗体基因的单链DNA序列。图10B(SEQ ID NO：23)显示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的四价CH2结构域-缺失的(N-scFv四价)huCC49四价微型抗体基因的单链DNA序列。

图11A(SEQ ID NO：24)显示四价CH2结构域-缺失的(N-scFv四价)huCC49微型抗体的氨基酸序列。图11B(SEQ ID NO：25)显示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的四价CH2结构域-缺失的(N-scFv四价)huCC49微型抗体的氨基酸序列。

图12A(SEQ ID NO：26)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的重链四价CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2(C-scFv四价CH2结构域缺失的)抗体基因的单链DNA序列。

图12B(SEQ ID NO：27)显示轻链四价CH2结构域-缺失的(C-scFv四价CH2结构域缺失的)PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2基因的单链DNA序列。

图13A(SEQ ID NO：28)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的重链四价CH2结构域-缺失的(C-scFv四价CH2结构域缺失的)PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2抗体的氨基酸序列。

图13B(SEQ ID NO：29)显示轻链四价CH2结构域-缺失的(C-scFv四价CH2结构域缺失的)PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2抗体的氨基酸序列。

图14(SEQ ID NO：30)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VL/VH微型抗体基因的单链DNA序列。

图15(SEQ ID NO：31)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VH/VL微型抗体基因的单链DNA序列。

图16(SEQ ID NO：32)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VL/VH微型抗体的氨基酸序列。

图17(SEQ ID NO：33)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VH/VL微型抗体的氨基酸序列。

图18显示来自产生huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)抗体的五个独立克隆的上清的Western印迹。每种上清都在还原和非还原条件下进行电泳。

图19显示纯化的A型和B型huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)抗体的考马斯蓝染色的凝胶。每种抗体都在还原和非还原条件下进行电泳。

图20纯化的A型huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)抗体主要作为单个峰通过HPLC大小排阻层析洗脱。

图21显示A型huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)抗体与TAG-72抗原来源牛颌下粘蛋白的竞争结合试验的结果，所述试验利用Delphia荧光计(Wallac Inc，Gaithersburg，MD)通过时间分辨的荧光免疫测定法(time-resolved fluorometic immunoassay)进行。

图22显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)抗体的代表性克隆的上清的Western印迹。

图23显示纯化的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的A型huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价G1/G3/PAP(C-scFv四价CH2结构域缺失的)抗体的考马斯蓝染色的凝胶。

图24显示纯化的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的A型huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价G1/G3/PAP(C-scFv四价CH2结构域缺失的)抗体主要作为单个峰通过HPLC大小排阻层析洗脱。

图25显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的A型huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价G1/G3/PAP(C-scFv四价CH2结构域缺失的)抗体与TAG-72抗原来源牛颌下粘蛋白的竞争结合试验的结果，所述试验利用Delphia荧光计(Wallac Inc，Gaithersburg，MD)通过时间分辨的荧光免疫测定法进行。

图26显示来自产生huCC49微型抗体，huCC49 2sc(Fv)2四价抗体(N-scFv四价huCC49微型抗体)，和huCC49 CH2结构域缺失的抗体的代表性克隆的上清的Western印迹。Western印迹对在还原和非还原条件下电泳的上清进行。

图27显示来自产生huCC49 2sc(Fv)2四价抗体(N-scFv四价huCC49微型抗体)和含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的huCC49 2 sc(Fv)2四价抗体(N-scFv四价huCC49微型抗体)的代表性克隆的上清的Western印迹。

图28显示纯化的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的A型huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体(N-scFv四价微型抗体)的考马斯蓝染色的凝胶。

图29显示纯化的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的A型huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体(N-scFv四价微型抗体)主要作为单个峰通过HPLC大小排阻层析洗脱。

图30显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体(N-scFv四价微型抗体)，huCC49微型抗体，含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的huCC49CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体(C-scFv四价抗体)，和对照亲本CH2结构域-缺失的huCC49(称为HuCC49或IDEC159)与TAG-72抗原来源牛颌下粘蛋白的竞争结合试验的结果，所述试验利用Delphia荧光计(Wallac Inc，Gaithersburg，MD)通过时间分辨的荧光免疫测定法进行。

图31显示产生含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的四价CH2结构域-缺失的(C-scFv四价CH2结构域缺失的)PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2抗体的细胞系的上清的Western印迹。

图32显示产生CH2结构域-缺失的huCC49 VL/VH微型抗体的五个独立细胞系的上清的Western印迹。微型抗体样品在非还原性变性条件下分析，显示A型和B型同种型的存在。

图33显示含有结合于CD23抗原的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的PRIMATIZEDp5E8 VH/VL和VL/VH微型抗体的ELISA结合测定的结果。p5E8G1是完整全长PRIMATIZEDIgG1。

图34显示产生含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的PRIMATIZEDp5E8 VH/VL和VL/VH微型抗体的细胞系的上清的Western印迹。

图35A显示对照亲本huCC49和huCC49CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的肿瘤保留，表示为％ID/gm。图35B显示相对于峰抗体聚集标准化的相同的肿瘤保留数据。

发明详述

人(Ig)，包括单克隆抗体(MAb)，可以以两种与铰链异源性相关的形式存在。在天然溶液中，这些形式都作为二聚体蛋白(每个单体包含一条重链和一条轻链)存在。一个免疫球蛋白分子包含大约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键(A型)连接在一起，一个包含其中二聚体不通过链间二硫键连接的形式(B型)。B型还在天然条件下形成稳定二聚体，但可在变性的非还原条件下鉴定，其中重链解离产生75-80kDa分子。这些形式非常难于分离，甚至在Mab亲和力纯化之后还是如此。

各种完整IgG同种型中B型出现的频率是由于但不限于与MAb分子的铰链区同种型相关的结构差异。实际上，人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可明显减少B型的出现(Angal et al.1993.Molecular Immunology30：105)至利用人IgG1铰链通常观察到的水平。然而，对其中保留了CH3结构域的MAb片段进行相同的氨基酸取代不能消除B型的产生。通常，细胞培养中产生的所有重组CH2结构域缺失的抗体通常导致铰链异源性，其不能经由铰链中相似的分子突变来校正。

本发明通过提供例如分离第一种二聚体多肽与第二种二聚体多肽的方法对现有技术作出贡献，其中第一种和第二种多肽包含至少两条多肽链，所述多肽链中至少有两条包含至少一个重链部分。一个实施方案中，本发明的多肽缺乏所有或部分CH2结构域。所述单体经由至少一个链间二硫键连接(本文称为“A型”)，并且第二种多肽的单体不经由至少一个链间二硫键(本文称为“B型”)连接。这些形式可利用疏水作用层析互相分离。此外，本发明涉及包含连接肽的多肽。包含具体的连接肽导致包含经由至少一条链间二硫键连接的多肽链或不经由至少一条链间二硫键连接的多肽链多肽二聚体的优选合成。

进一步描述本发明以前，为方便，在下文描述一些术语：

I.定义

本发明的多肽是结合分子，即，多肽分子或编码它们的核酸分子，其包含至少一个结合结构域，所述结构域包含与靶分子(诸如抗原或结合配偶体)特异性结合的结合位点。例如，一个实施方案中，本发明的结合分子包含免疫球蛋白抗原结合位点或负责配体结合的受体分子部分或负责受体结合的配体分子部分。本发明的结合分子是多肽或编码它们的核酸分子。

一个实施方案中，所述结合分子包含至少两个结合位点。一个实施方案中，所述结合分子包含两个结合位点。一个实施方案中，所述结合分子包含三个结合位点。另一实施方案中，所述结合分子包含四个结合位点。

本发明的多肽是多聚体。例如，一个实施方案中，本发明的多肽是二聚体。一个实施方案中，本发明的多肽是同源二聚体，包含两个相同的单体亚基。另一实施方案中，本发明的二聚体是异源二聚体，包含两个不相同的单体亚基。所述二聚体的亚基包含一或多条多肽链。例如，一个实施方案中，所述二聚体包含至少两条多肽链。一个实施方案中，所述二聚体包含两条多肽链。另一实施方案中，所述二聚体包含四条多肽链(例如，在抗体分子的情况中)。

本发明的多肽包含来自免疫球蛋白结构域的至少一种氨基酸序列。“源自”指定的蛋白质的多肽或氨基酸序列指多肽的来源。优选，来自具体起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与起始序列基本上相同的氨基酸序列，或其一部分，其中所述部分由至少10-20氨基酸，优选至少20-30氨基酸，更优选至少30-50氨基酸组成，或所述多肽或氨基酸序列可被本领域技术人员鉴定为其来源于所述起始序列。

优选的结合多肽包含来自人氨基酸序列的氨基酸序列。然而，结合多肽可包含来自另一哺乳动物物种的一或多个氨基酸。例如，灵长类重链部分，铰链部分，或结合位点可包含在受试结合多肽和/或连接多肽中。可选，一或多个鼠氨基酸可存在于结合多肽中，例如，在结合分子的抗原结合位点中。本发明优选的结合分子不是免疫原性的。

本领域技术人员应理解本发明的结合分子(例如，受试多肽的重链或轻链部分或结合部分)可被修饰使得它们的氨基酸序列与其所来源的天然存在的免疫球蛋白分子不同。例如，可进行导致保守取代的核苷酸或氨基酸取代或在“非必需”氨基酸残基的改变。

编码源自免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的核酸分子可通过将一或多个核苷酸取代，添加或缺失导入免疫球蛋白的核苷酸序列使得一或多种氨基酸取代，添加或缺失被导入编码的蛋白质来产生。突变可通过标准技术导入，诸如定点诱变和PCR介导的诱变。优选，保守氨基酸取代在一或多个非必需氨基酸残基进行。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族可在本发明中确定，包括碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电的急性侧链氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)以及芳香侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸优选被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基取代。另一实施方案中，一串氨基酸可被侧链家族成员中顺序和/或组成不同但结构类似的氨基酸串取代。

可选，另一实施方案中，突变可沿所有或部分免疫球蛋白编码序列随机引入，诸如通过饱和诱变，产生的突变体可掺入本发明的多肽，并筛选它们结合所需抗原的能力。

本文术语“重链部分”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重联部分的多肽包含以下结构域中的至少一个：CH1结构域，铰链(例如，上，中，和/或下铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。一个实施方案中，本发明的多肽包含多肽链，所述多肽链包含CH1结构域，至少部分铰链结构域，以及CH2结构域。另一实施方案中，本发明的多肽包含多肽链，所述多肽链包含CH1结构域以及CH3结构域。另一实施方案中，本发明的多肽包含多肽链，所述多肽链包含CH1结构域，至少部分铰链结构域，以及CH3结构域。另一实施方案中，本发明的多肽包含含有CH3结构域的多肽链。一个实施方案中，本发明的多肽缺乏至少部分CH2结构域(例如，所有或部分CH2结构域)。另一实施方案中，本发明的多肽包含完整Ig重链。如上所述，本领域技术人员理解这些结构域(例如，所述重链部分)可被修饰使得它们的氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子不同。

一个实施方案中，本发明结合分子的至少两条多肽链包含至少一个源自抗体或免疫球蛋白分子的重链部分。一个实施方案中，本发明的多肽的至少两个重链部分存在于不同多肽链上并例如经由至少一个二硫键相互作用(A型)或经由非共价相互作用(B型)形成二聚体蛋白，二聚体的每个单体包含至少一个重链部分。

一个实施方案中，二聚体一个多肽链的重链部分与二聚体另一多肽链上的那些相同。一个实施方案中，本发明的二聚体的单体(或半体)相同。另一实施方案中，它们不相同。例如，每个单体可包含不同靶结合位点。

一个实施方案中，本发明的二聚体通过共价相互作用例如，二硫键连接在一起。一个实施方案中，本发明的二聚体通过一或多个二硫键连接在一起。另一实施方案中，本发明的二聚体通过一或多个，优选两个二硫键连接在一起。另一实施方案中，本发明的二聚体通过一或多个，优选三个二硫键连接在一起。另一实施方案中，本发明的二聚体通过一或多个，优选四个二硫键连接在一起。另一实施方案中，本发明的二聚体通过一或多个，优选五个二硫键连接在一起。另一实施方案中，本发明的二聚体通过一或多个，优选六个二硫键连接在一起。另一实施方案中，本发明的二聚体通过一或多个，优选七个二硫键连接在一起。另一实施方案中，本发明的二聚体通过一或多个，优选八个二硫键连接在一起。另一实施方案中，本发明的二聚体通过一或多个，优选九个二硫键连接在一起。另一实施方案中，本发明的二聚体通过一或多个，优选十个二硫键连接在一起。另一实施方案中，本发明的二聚体不通过二硫键，而是例如，通过非共价反应连接在一起。

多肽的重链部分可来自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。另一实例中，重链部分可包含铰链区，其部分源自IgG1分子部分源自IgG3分子。另一实例中，重链部分可包含嵌合铰链，其部分源自IgG1分子，部分源自IgG4分子。

本文术语“轻链部分”包括源自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选，所述轻链部分包含VL或CL结构域的至少一种。

一个实施方案中，本发明的多肽包含氨基酸序列或一或多个不源自Ig分子的部分。示例性修饰在下文详细描述。例如，一个实施方案中，本发明的多肽可包含柔性接头序列。另一实施方案中，多肽可被修饰以添加功能部分(例如，PEG，药物，或标记)。

一个实施方案中，本发明的结合多肽是融合蛋白。融合蛋白是嵌合分子，其包含结合结构域，所述结合结构域包含至少一个靶结合位点和至少一个重链部分。一个实施方案中，融合蛋白还包含合成连接肽。

″嵌合″蛋白包含第一氨基酸序列，其与天然不连接的第二氨基酸序列相连。所述氨基酸序列通常存在于一起形成融合蛋白质的分离的蛋白质中，或者它们通常存在于同一蛋白质中但是在融合多肽中重新排列。嵌合蛋白或子可通过例如化学合成或产生和翻译新的多核苷酸来产生，其中所述肽区以所需的关系编码。示例性嵌合多肽包括本发明的融合蛋白以及嵌合铰链连接肽。

术语“异源(heterologous)”用于多核苷酸和多肽，指所述多核苷酸或多肽源自基因型与其相比较的实体的其余部分的不同的实体。例如，异源多核苷酸或抗原可源自不同物种来源，不同细胞类型或不同个体的相同细胞类型。

本文术语“配体结合结构域”或“受体的配体结合部分”指任何天然受体(例如，细胞表面受体)或其保持至少定性配体结合能力的任何区或衍生物，优选相应天然受体的生物活性。

本文术语″受体结合结构域″或“配体的受体结合部分”指任何天然配体或其保持至少定性受体结合能力优选相应天然配体的生物活性的任何区或衍生物。

一个实施方案中，本发明的结合分子是融合蛋白。本发明的融合蛋白是嵌合分子，其包含结合结构域(其包含至少一个结合位点)和二聚体化结构域(其包含至少一个重链部分)。所述重链部分可源自任何免疫球蛋白，诸如IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4亚型，IgA，IgE，IgD或IgM。

本发明另一实施方案中，结合分子是“抗体-融合蛋白嵌合体”。所述分子包含结合抗体的至少一个结合结构域与至少一个融合蛋白结合的分子。优选，两种多肽之间的界面是免疫球蛋白分子的CH3结构域。

一个实施方案中，本发明的结合分子是“抗体”或“免疫球蛋白”分子，例如，天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或遗传改造的抗体分子，其以类似抗体分子的方式结合抗原。本文术语″免疫球蛋白″包括多肽，其具有两条重链和两条轻链的组合，无论其是否具有相关特异免疫反应性。″抗体″指具有对目的抗原(例如肿瘤相关抗原)的明显已知特异性免疫反应活性的集合体。抗体和免疫球蛋白包含轻和重链，其间具有和不具有链间共价连接。脊椎动物体系中基本的免疫球蛋白结构是相对已知的。

如将在下文详述的，遗传术语“免疫球蛋白”包含五种不同类型的抗体，其可通过生化方法区分。所有物种抗体都明显包含在本发明范围内，以下讨论总体涉及免疫球蛋白分子的IgG种类。对于IgG，免疫球蛋白包含两条相同的轻多肽链，其分子量大约23,000道尔顿，以及分子量53,000-70,000的两条相同的重链。所述的四条链通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链在“Y”的开口处包住重链，并延续到整个可变区。

将轻链和重链分成结构和功能同源性的区。术语“恒定”和“可变”用于指功能。在这方面，将理解轻链(VL)和重链(VH)部分的可变区决定抗原识别和特异性。反之，轻链(CL)和重链(CH1，CH2和CH3)的恒定区显示重要的生物学性质，诸如分泌，跨胎盘活动力，Fc受体结合，补体结合，等。通常随恒定区远离抗体的抗原结合位点或氨基端，恒定区的数目增加。N末端是可变区，C末端是恒定区；CH3和CL结构域实际分别包含重链和轻链的羧基末端。

轻链分类为kappa或lambda(κ，λ)。每个重链种类可与kappa或lambda轻链结合。通常，当免疫球蛋白通过杂交瘤，B细胞和遗传改造的宿主细胞产生时，轻链和重链互相共价连接，两条重链的″尾″部分通过共价二硫键和非共价连接相互结合。在重链中，氨基酸序列从位于Y构型的分叉末端的N末端开始到每条链底部的C末端。本领域技术人员将理解重链分类为gamma，mu，alpha，delta，或epsilon(γ，μ，α，δ，ε)，其中还有一些亚类(例如，γ1.-γ4)。该链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG，IgM，IgA IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如，IgG₁，IgG₂，IgG₃，IgG₄，IgA₁等性质已知并且已知其使得功能专门化。这些种类以及同种型的每一种的修饰的版本对于本领域技术人员而言，结合本发明的教导，是可以轻易理解的，因此，包含在本发明的范围之内。

如上所述，可变区允许抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。即，抗体的V_L结构域和V_H结构域结合形成限定三维抗原结合位点的可变区。该四元抗体结构形成存在Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地，所述抗原结合位点通过V_H和V_L链每一条上的三个互补决定区(CDRs)限定。

本文术语“结合位点”或“结合结构域”包含负责与目的靶分子(例如抗原，配体，受体，底物或抑制物)选择性结合的多肽的区域。示例性结合结构域包括抗体可变区，配体的受体结合结构域，受体的配体结合结构域或酶结构域。

一个实施方案中，所述结合分子具有至少一个结合位点，其对被靶向减少或消除的分子特异，例如，细胞表面抗原或可溶抗原。

优选的实施方案中，所述结合结构域是抗原结合位点。抗原结合位点通过可变区形成，所述可变区在一个多肽中与另一多肽中不同。本发明的多肽包含至少两个抗原结合位点。本文术语“抗原结合位点”包括特异性结合(与之发生免疫反应)抗原(例如，细胞表面或可溶抗原)的位点。抗原结合位点包括免疫球蛋白重链和轻链可变区，这些可变区形成的结合位点决定抗体特异性。一个实施方案中，本发明的抗原结合分子包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR(例如，其序列是本领域已知的或本文描述的)。另一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含一或多个抗体分子的至少两个CDR。另一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含一或多个抗体分子的至少三个CDR。另一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含一或多个抗体分子的至少四个CDR。另一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含一或多个抗体分子的至少五个CDR。另一实施方案中，本发明的抗原结合分子包含一或多个抗体分子的至少六个CDR。示例性抗体分子包括至少一个CDR，其可包含在受试抗原结合分子中，是本领域已知的，本文所述了示例性分子。

所述多肽包含本文公开的两个重链部分，其可被连接形成两个结合的Y，使得四个结合位点形成“四价”分子(见例如，WO02/096948A2))。另一实施方案中，可制备四价微型抗体或结构域缺失的抗体。

术语“特异性”包括可能的结合位点数目，其特异性结合(例如与之发生免疫反应)给定的靶。多肽可为单特异性并包含一或多个结合位点，所述位点特异性结合靶，或多肽可为多特异性并含有两个或多个特异性结合相同或不同靶的结合位点。

一个实施方案中，本发明的结合分子是双特异性分子(例如，抗体，微型抗体，结构域缺失的抗体，或融合蛋白，其对一种以上的分子具有结合特异性，例如一种以上的抗原或同一抗原上一种以上的表位。一个实施方案中，所述双特异性分子具有至少一个靶结合位点，其对被靶向以被降低或消除的分子以及细胞上的靶向型分子特异。另一实施方案中，所述双特异性分子具有至少一个特异于被靶向降低或消除的分子的靶结合位点以及至少一个特异于药物的靶结合位点。另一实施方案中，所述双特异性分子具有至少一个特异于被靶向降低或消除的分子的靶结合位点以及至少一个特异于前药物的靶结合位点。优选的实施方案中，所述双特异性分子是四价抗体，其具有两个特异于一个靶和两个靶结合位点特异于第二个靶的靶结合位点。四价双特异性分子对于每种特异性可为二价的。双特异性分子的进一步描述如下。

本文术语“价”指多肽中潜在靶结合位点的数目。每个靶结合位点特异性结合一个靶分子或靶分子上的特异性位点。当多肽包含一个以上的靶结合位点时，每个靶结合位点可特异性结合相同或不同的分子(例如，可结合不同配体或不同抗原，或相同抗原上的不同表位)。

天然存在的抗体中，每个单体抗体上存在的六个CDR是短的、非连续氨基酸序列，其具有特定的位置以形成抗原结合位点，由于抗体在含水环境中呈其三维构型。重链和轻链可变结构域的其余部分显示氨基酸序列的分子间变异较小，并称为框架区。框架区大部分采用β-折叠构型，CDR形成环，其连接，一些情况下形成部分β-折叠结构。因此，这些这些框架区作用以形成框架，其通过链间非共价作用使得六个CDR定位的方向正确。定位的CDR形成的抗原结合位点限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位非共价结合。该互补表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。CDR的位置可由本领域技术人员轻易鉴定。

如前所述，各种免疫球蛋白种类的恒定区的亚基结构以及三维构型是已知的。本文术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(大部分氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域邻接VH结构域并位于免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基末端。

本文术语“CH2结构域”包括部分重链分子，利用常规编号方案，其从例如抗体的残基244扩展到残基360(残基244-360，Kabat编号系统；和残基231-340，EU编号系统，；和Kabat EA et al.Sequences of Proteins ofImmunological Interest.Bethesda，US Department of Health and HumanServices，NIH.1991)。CH2结构域的独特之处在于其与另一结构域不是紧密配对的。而两条N连接的分支碳水化合物链置于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。还已知CH3结构域从CH2结构域延伸到完整天然IgG分子的C末端并包括大约108个残基。

本文术语“铰链区”包括部分重链分子，其将CH1结构域连于CH2结构域。该铰链区包含大约25个残基并具有柔性，由此允许两个N末端抗原结合区独立移动。铰链区可细分为三个不同的结构域：上、中、下铰链结构域(Roux et al.J.Immunol.1998 161：4083)。

一个实施方案中，本发明的结合分子包含连接肽。本发明的连接肽是合成的。涉及多肽的本文术语“合成的”包括含有非天然存在的氨基酸序列的多肽。例如，为天然多肽的修饰形式的非天然多肽(例如包含突变诸如添加，取代或缺失)或包含通过线性氨基酸序列与其天然不连接的第二氨基酸序列(其可为或可不为天然存在的)相连的第一氨基酸序列(其可为或可不为天然存在的)。

本发明的连接多肽连接本发明的结合分子的两个结构域(例如，结合结构域和二聚体化结构域)。例如，连接肽将重链部分连接于包含结合位点的结合结构域。一个实施方案中，连接肽连接多肽链的线性氨基酸序列中的两个重链恒定区结构域，诸如CH1和CH2结构域；CH1和CH3结构域；铰链和CH1结构域；铰链和CH3结构域；VH和铰链结构域，或CH3结构域和非-免疫球蛋白多肽)。优选，所述连接肽为多肽分子提供柔性并促进经由二硫键的二聚体化。本发明的连接肽用于取代一或多个重链结构域(例如，结构域缺失的构建体中的至少部分恒定区结构域(例如，至少部分CH2结构域)和/或至少部分铰链区(例如，至少部分低铰链区结构域))。例如，一个实施方案中，VH结构域经由连接肽融合于CH3结构域(连接肽C-末端附着于CH3结构域N-末端，连接肽N-末端附着于VH结构域C-末端)。另一实施方案中，VL结构域经由连接肽融合于CH3结构域(连接肽C-末端附着于CH3结构域N-末端，连接肽N-末端附着于VL结构域C-末端)。另一实施方案中，CH1结构域经由连接肽融合于CH3结构域(连接肽C-末端附着于CH3结构域N-末端，连接肽N-末端附着于CH1结构域C-末端)。

一个实施方案中，合成连接肽包含部分恒定区结构域。例如，一个实施方案中，取代CH2结构域的连接肽可包含部分CH2结构域。

一个实施方案中，连接肽包含或由gly-ser接头组成。本文术语“gly-ser接头”指一种肽，其由甘氨酸和丝氨酸残基组成。示例性gly/ser接头包含氨基酸序列GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：1)。一个实施方案中，本发明的连接肽包含至少部分上铰链区(例如，源自IgG1，IgG3或IgG4分子)，至少部分中铰链区(例如，源自IgG1，IgG3，或IgG4分子)和一系列gly/ser氨基酸残基(例如，gly/ser接头诸如GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：1))。一个实施方案中，与天然存在的IgG1或IgG3铰链区相比，所述连接肽包含一或多个氨基酸取代。另一实施方案中，该连接肽包含诸如WO 02/060955中所述的氨基酸序列。连接肽在下文详细描述。

本文术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。半胱氨酸包含硫醇基团，其可形成二硫键或与第二个硫醇基团桥接。大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键相连，两条重链通过两个二硫键相连，利用Kabat编号系统，所述二硫键的位置对应239和242(位置226或229，EU编号系统)。

本领域已知，恒定区介导多种效应功能。例如，C1组分与抗体的结合活化补体系统。补体的活化对细胞病原体的调理和溶解是重要的。补体活化也刺激炎性反应并也参与自身超敏性。此外，抗体经由Fc区结合细胞，其中抗体Fc区上的Fc受体位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。有多种对不同种类的抗体特异的Fc受体，包括IgG(gamma受体)，IgE(epsilon受体)，IgA(alpha受体)和IgM(mu受体)。抗体与细胞表面Fc受体的结合激发多种重要的且多样的生物反应，包括吞噬和破坏抗体包被的颗粒，清除免疫复合物，通过杀伤细胞溶解抗体包被的靶(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒或ADCC)，释放免疫介导物，免疫球蛋白的胎盘转移以及生成控制。

一个实施方案中，所述Fc部分可利用本领域已知技术突变以降低效应功能。例如恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方法)可降低循环的经修饰抗体的Fc受体结合从而增加肿瘤定位。其它情况中，恒定区修饰可与本发明的适度补体结合一致，由此降低血清半寿期以及偶联的细胞毒素的非特异性结合。恒定区的其它修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分，其允许由于抗原特异性或抗体柔性增加导致的定位增加。更通常，本领域技术人员将认识到本文的修饰的抗体可显示多种可或不可轻易认识到的微妙效应。然而产生的生理学图谱，生物利用度以及修饰的其它生物化学效应，诸如肿瘤定位，生物分布以及血清半寿期，可利用已知的免疫学技术定量而无需不适当的试验轻易测定并定量。

一个实施方案中，修饰形式的抗体可利用本领域已知技术制备从完整前体或亲本抗体。示例性技术在下文更详细讨论。具体优选的实施方案中，本发明多肽的可变区和恒定区都是人的。一个实施方案中，完全人抗体可利用本领域已知技术制备。例如抗特异性抗原的完全人抗体可通过将抗原给药转基因动物来制备，所述动物经修饰应答于抗原攻击而产生所述抗体，但是其内源性基因座是失活的。用于制备抗体的示例性技术在美国专利：6,150,584；6,458,592；6,420,140中描述。其它技术是本领域已知的。

包含重链部分的多肽可包含或不包含不源自免疫球蛋白分子的其它氨基酸序列或部分。所述修饰在下文详细描述。例如，一个实施方案中，本发明的多肽可包含柔性接头序列。另一实施方案中，多肽可被修饰以添加功能部分诸如PEG。

本发明的多肽包含至少两个结合位点，其使得多肽与所选靶分子结合。

一个实施方案中，本发明的结合分子包含抗体分子，例如，完整抗体分子，或抗体分子的片段。另一实施方案中，本发明的结合分子是修饰的或合成的抗体分子。一个实施方案中，本发明的结合分子包含单克隆抗体，人源化的抗体，嵌合抗体，或重组制备的抗体的所有或部分(例如，至少一个抗原结合位点，至少一个CDR，或至少一个重链部分)。

在所述结合分子是抗体或修饰的抗体的实施方案中，所述抗原结合位点以及所述重链部分无需源自相同的免疫球蛋白分子。在这方面，可变区可源自任何类型的动物，其可被诱导激发体液反应并产生针对所述抗原的免疫球蛋白。由此，多肽的可变区可例如来自哺乳动物，例如可为人，鼠，非人灵长类(诸如食蟹猴，猕猴等)，狼，骆驼类(例如，来自骆驼，骆马(llamas)以及相关物种)来源的。另一实施方案中，所述可变区可来自软骨类动物(condricthoid)(例如，来自鲨鱼)。

本发明的多肽可利用本领域已知技术制备。一个实施方案中，本发明的多肽是“重组制备的”抗体分子，即利用重组DNA技术制备的。制备抗体分子的示例性技术在下文更为详细地描述。

一个实施方案中，本发明的多肽是修饰的抗体。本文术语“修饰的抗体”包括合成的形式的抗体，其被改变使得它们不是天然存在的。例如包含至少两个重链部分而不是两个完整重链的抗体(诸如，结构域缺失的抗体或微型抗体)；多特异性抗体(例如，双特异性，三特异性等)，其被改变以结合两个或多个不同抗原或结合单个抗原上的不同表位；连接于scFv分子的重链分子等。ScFv分子是本领域已知的并在例如，美国专利5,892,019中描述。此外，术语“修饰的抗体”包括多价形式的抗体(例如，三价，四价等抗体，其结合三个或更多个拷贝的相同抗原)。另一实施方案中，本发明的结合分子是融合蛋白，其包含至少一个缺乏CH2结构域的重链部分并包含含有配体及其受体的一个成员的结合部分的多肽结合结构域。

一个实施方案中，本发明术语“修饰的抗体”包括免疫球蛋白，抗体，或免疫反应性片段或其重组体，其中一或多个恒定区结构域的至少一部分被缺失或改变以提供所需的生物化学特性，诸如发生非共价二聚化的能力，定位于肿瘤位点的增加的能力，或与免疫原性大致相同的完整未改变的抗体相比降低的血清半寿期。优选实施方案中，本发明的多肽是结构域缺失的抗体，其包含类似于免疫球蛋白重链的多肽链，但其缺乏一或多个重链结构域的至少一部分。更优选，修饰的抗体恒定区的一个完整结构域将被缺失并更优选所有或部分CH2结构域将被缺失。

优选的实施方案中，本发明的多肽将激发人体中的有害免疫反应。与本发明相容的恒定区修饰包含一或多个结构域中的一或多个氨基酸的添加，缺失或取代。即，本发明的多肽可包含对三个重链恒定结构域(CH1，CH2或CH3)中的一或多个和/或对轻链恒定区结构域(CL)的改变或修饰。

一个实施方案中，本发明涉及修饰的抗体分子，其包含至少一个CC49结合位点(特异于Tag72)。例如，图8A(SEQ ID NO：16)显示sc(Fv)2重链四价CH2结构域-缺失的huCC49基因的单链DNA序列。图8B(SEQ ID NO：17)显示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的sc(Fv)2重链四价CH2结构域-缺失的huCC49基因的单链DNA序列。图8C(SEQID NO：18)显示sc(Fv)2轻链CH2结构域-缺失的huCC49的单链DNA序列。图9A(SEQ ID NO：19)显示重链sc(Fv)2四价CH2结构域-缺失的huCC49的氨基酸序列。图9B(SEQ ID NO：20)显示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的重链四价CH2结构域-缺失的sc(Fv)2huCC49的氨基酸序列。图9C(SEQ ID NO：21)显示轻链CH2结构域-缺失的sc(Fv)2huCC49的氨基酸序列。图10A(SEQ ID NO：22)显示四价CH2结构域-缺失的2sc(Fv)2huCC49微型抗体基因的单链DNA序列。图10B(SEQ ID NO：23)显示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的四价CH2结构域-缺失的sc(Fv)2huCC49微型抗体基因的单链DNA序列。图11A(SEQID NO：24)显示四价CH2结构域-缺失的sc(Fv)2 huCC49微型抗体的氨基酸序列。图11B(SEQ ID NO：25)显示含有合成G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的四价CH2结构域-缺失的sc(Fv)2 huCC49微型抗体的氨基酸序列。

另一实施方案中，本发明涉及修饰的抗体分子，其包含至少一个p5E8结合位点(特异于CD23)。图12A(SEQ ID NO：26)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的重链四价CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2抗体基因的单链DNA序列。图12B(SEQ ID NO：27)显示轻链四价CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8sc(Fv)2基因的单链DNA序列。图13A(SEQ ID NO：28)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的四价CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2抗体的氨基酸序列重链。图13B(SEQ IDNO：29)显示轻链四价CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2抗体的氨基酸序列。图14(SEQ ID NO：30)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VL/VH微型抗体基因的单链DNA序列。图15(SEQ ID NO：31)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VH/VL微型抗体基因的单链DNA序列。图16(SEQ IDNO：32)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VL/VH微型抗体的氨基酸序列。图17(SEQ ID NO：33)显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VH/VL微型抗体的氨基酸序列。

一个实施方案中，本发明的多肽可利用本领域已知技术修饰以降低它们的免疫原性。例如，本发明的抗体或多肽可为人源化的，去免疫的，或可制备嵌合抗体。这些类型的抗体源自非-人抗体，通常为鼠抗体，其保持或基本保持亲本抗体的抗原-结合性质，但其在人中的免疫原性较低。这可通过各种方法实现，包括(a)将整个非-人可变结构域移植到人恒定区上以生成嵌合抗体；(b)将一或多个非人互补决定区(CDR)的至少一部分移植到人框架和恒定区中，保留或不保留关键框架残基；或(c)移植整个非-人可变结构域，但通过取代表面残基用人样分泌“覆盖(cloak)”它们。所述方法公开于Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81：6851-5(1984)；Morrison et al.，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.31：169-217(1994)，和美国专利5,585,089，5,693,761和5,693,762，其全文内容包含在此作为参考。

去免疫可用于降低抗体免疫原性。本文术语“去免疫”包括改变抗体以修饰T细胞表位(见例如，WO9852976A1，WO0034317A2)。例如，起始抗体的VH和VL序列被分析，每个V区的人T细胞表位“图谱”显示与互补决定区(CDR)相关表位的定位，以及所述序列中的其它重要残基。分析T细胞表位图谱的各个T细胞表位以鉴定改变最终抗体活性可能性较小的可选氨基酸取代。多种可选VH和VL序列设计为包含氨基酸取代组合，并且这些序列随后被掺入多种待测定其功能的本发明的多肽。通常，产生12-24种变体抗体并检测。包含修饰的V和人C区的完全重和轻链基因随后被克隆入表达载体，以及随后被导入细胞系用于制备完整抗体的质粒。所述抗体随后在适宜生化和生物测定法种比较，鉴定最佳变体。

一个实施方案中，所述结合分子包含嵌合抗体。在本发明的背景中，术语“嵌合抗体”的指任何其中免疫反应性区域或位点得自或源自第一物种而恒定区(其可为完整，部分的或根据本发明修饰的)获自第二种物种的抗体。优选的实施方案中，所述靶结合区或位点来自非人来源(例如小鼠)，恒定区是人恒定区。优选，重链和轻链恒定区通过部分取代一或多个CDR、并且如果需要通过部分框架区取代和序列改变而改变。尽管CDRs可源自与框架区来源的抗体同种或甚至同亚种的抗体，预期CDR将源自不同种类的抗体并优选来自源自不同物种的抗体。无需用来自供体可变区的完整CDR取代所有CDR即可将一个可变区的抗原结合能力转移到另一个。然而，可能仅仅需要转移维持靶结合位点活性所需的残基。根据美国专利5,585,089,5,693,761和5,693,762的解释，本领域技术人员能通过实施常规试验或通过试验或错误检测来获得免疫原性降低的功能性抗体。

本文术语“正确折叠的多肽”包括这样的多肽(例如，抗原结合分子诸如抗体)，其中包含所述多肽的所有功能结构域的活性不同。本文术语“不正确折叠的多肽”包括其中多肽的至少一个功能结构域无活性的多肽。一个实施方案中，正确折叠的多肽包括通过至少一个二硫键连接的多肽链，反之，不正确折叠的多肽包含不是通过至少一个二硫键连接的多肽链。

本文术语“恶性疾病(malignancy)”指非良性肿瘤或癌症。本文术语“癌症”包括特征在于失调的或失控的细胞生长的恶性疾病。示例性癌症包括：癌，肉瘤，白血病和淋巴瘤。术语“癌症”包括原发恶性肿瘤(例如其细胞不迁移到受试者体内除外原始肿瘤位点的位点)以及继发恶性肿瘤(例如源自转移，肿瘤细胞迁移入与原始肿瘤位点不同的继发位点)。

一个实施方案中，本发明的结合分子结合肿瘤细胞。包含结合肿瘤细胞表达的抗原的抗原结合位点的示例性抗体是本领域已知的，所述抗体的一或多个CDR可包含在本发明的结合分子中。示例性抗体包括：2B8，Lym1，Lym2，LL2，Her2，B1，MB1，BH3，B4，B72.3，5E8，B3F6和5E10。优选的实施方案中，本发明的多肽是结合CD20的C2B8抗体。另一优选的实施方案中，本发明的多肽是识别TAG72的CC49抗体。

一个实施方案中，本发明的结合分子结合可用于治疗自身免疫或炎性疾病或病症的分子。

本文术语“自身免疫疾病或病症”指受试者中的疾病，其中免疫系统攻击机体自身细胞，导致组织破坏。自身免疫并包括全身性自身免疫病，即其中自身免疫反应同时出现在多种组织，或器官特异性自身免疫病，即其中自身免疫反应靶向单个器官。可通过本发明的方法和组合物诊断、预防或治疗的自身免疫病的实例包括，但不限于克隆氏病；炎性肠病(IBD)；系统性红斑狼疮；溃疡性结肠炎；类风湿性关节炎；goodpasture′s综合征；Grave′s病；桥本氏(Hashimoto′s)甲状腺炎；寻常天疱疮；重症肌无力；硬皮病；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性血小板减少性紫癜；多发性肌炎和皮肌炎；恶性贫血；干燥综合征；强硬性脊柱炎；血管炎；I型糖尿病；神经疾病，多发性硬化，以及自身免疫病导致的继发性疾病。

本文术语“炎性疾病或病症”包括至少部分由炎症导致或加重的疾病，例如增加的血流，水肿，免疫细胞的活化(例如增殖，细胞因子生成，或增加的吞噬)。示例性疾病包括其中炎症或炎性因子或(例如，基质金属蛋白酶(MMPs)，一氧化氮(NO)，TNF，白介素，胞浆蛋白质，细胞防御系统，细胞因子，脂质代谢物，蛋白酶，毒性自由基，线粒体，凋亡，粘附分子等)以异常量参与或存在于某一区域中，例如所述量可有利地改变，例如以便对受试者有利。炎性过程是活体组织对损伤的反应。炎症的原因可为物理损伤，化学物质，微生物，组织坏死，癌症或其它药剂。急性炎症持续时间短，仅仅持续数天。如果其持续较长时间，那么可称其为慢性炎症。

炎性疾病包括急性炎性疾病，慢性炎性疾病和复发性炎性疾病。急性炎性疾病通常时程较短，持续约数分钟到约1-2天，但其也可持续数周。急性炎性疾病的主要特征包括血流增加，液体和血浆白蛋白渗出(水肿)，以及白细胞诸如嗜中性粒细胞迁出。慢性炎性疾病通常病程较长，例如数周到数月到数年或更长时间，并在组织学上与淋巴细胞和巨噬细胞的存在以及血管和结绨组织的增殖相关。复发性炎性疾病包括在一段时间之后复发的疾病以及具有周期性病程的疾病。复发性炎性疾病的实例包括哮喘和多发性硬化。一些疾病可落入一或多个种类中。

炎性疾病的特征通常在于热、红、肿、痛和功能丧失。炎性疾病病因的实例包括但不限于微生物感染(例如细菌，病毒和真菌感染)，物理因素(例如烧伤，放射和外伤)，化学因素(例如毒素和致病性物质)，组织坏死和各种类型的免疫反应。炎性疾病的实例包括但不限于，骨性关节炎，类风湿性关节炎，急性和慢性感染(细菌，病毒和真菌)；急性和慢性支气管炎，鼻窦炎，以及其它呼吸感染，包括普通感冒；急性和慢性胃肠炎以及结肠炎；急性和慢性膀胱炎和尿道炎；急性呼吸窘迫综合征，囊性纤维化；急性和慢性皮炎；急性和慢性结膜炎；急性和慢性浆膜炎(心包炎，腹膜炎，滑膜炎，胸膜炎和肌腱炎)；尿毒症性心包炎；急性和慢性胆囊炎；急性和慢性阴道炎；急性和慢性葡萄膜炎；药物反应；和烧伤(热，化学和电)。

本文术语“基于疏水反应分离多肽的介质”包括含有共价连接于基质的疏水配体(例如烷基和芳基)的介质。所述介质可用于基于多肽表面的助溶性且可接近的非极性基团与所述介质的疏水配体之间的相互作用分离多肽。示例性介质是苯基5PW-HR，其可得自Tosoh Bioscience。

本文术语“电导性”包括以microSiemens/cm(以前为micromhos/cm)测定的溶液电导率。溶液的离子含量越高，溶液电导率越高。电导率可利用本领域已知技术轻易测定(例如通过测定通过两个电极之间的电流)。

本发明的分离方法可利用pH范围为酸性到中性的溶液，例如大约pH3.5到大约中性。本文术语“大约中性pH”包括大约7的pH。例如，一个实施方案中，本发明的分离方法可利用具有以下pH的溶液(例如缓冲液)进行：约3，约4，约5，约6，约7，或约8。优选，所述溶液pH为约6或约7。一个实施方案中，所述溶液pH为约4.0，约4.1，约4.2，约4.3，约4.4，约4.5，约4.6，约4.7，约4.8，约4.9，约5.0，约5.1，约5.2，约5.3，约5.4，约5.5，约5.6，约5.7，约5.8，约5.9，约6.0，约6.1，约6.2，约6.3，约6.4，约6.5，约6.6，约6.7，约6.8，约6.9，约7.0，约7.1，约7.2，约7.3，约7.4，约7.5，约7.6，约7.7，约7.8，约7.9，或约8.0。

本文术语“亲和基质”包括这样的基质，诸如附着有亲和配体的琼脂糖，控制的有孔玻璃和多聚(苯乙烯二乙烯基(styrenedivinyl))苯。所述亲和配体结合所需多肽，且污染性多肽不结合亲和配体。所需多肽可利用已知方案从亲和基质洗脱。

本文术语“改造的”包括通过合成方法(例如通过重组技术，体外肽合成，通过肽的酶促和化学偶联和这些技术的一些组合)操作核酸或多肽分子。优选，本发明的结合分子被改造，例如以表达本发明的连接肽。

本文术语″连接的，″″融合的″或″融合物″可互换使用。所述术语指通过包括化学偶联或重组方法的任何方法将两个以上元件和组分相连。“框内融合“指将两个或更多开放读框(ORF)连接以形成连续较长的ORF，其方式使得保持原始ORF的正确读框。因此，产生的重组融合蛋白是含有两个或多个片段的单个蛋白，所述片段对应原始ORF编码的多肽(该片段通常不是天然连接的)。尽管读框在整个融合的片段中连续，所述片段可通过例如框内接头序列物理或空间分离。

在多肽的背景中，″线性序列″或″序列″是多肽中从氨基到羧基方向的一系列氨基酸，其中序列中相邻的残基在多肽的一级结构中是相邻的。

本文术语“可从结合分子的给药获益的受试者“包括这样的受试者，诸如哺乳动物受试者，其可从所用结合分子的给药获益，例如用于检测结合分子所识别的抗原的(例如用于诊断方法)，和/或从用于减少或清除所述结合分子识别的靶的利用结合分子的治疗获益。例如，一个实施方案中，所述受试者可从可溶性或具体分子(例如毒素或病原体)从循环或血清的减少或消除获益，或从表达所述靶的细胞群体(例如肿瘤细胞)的减少或清除获益。如前具体所述，所述结合分子可以以非偶联的形式使用或偶联的形式例如与药物，前药，或同种型偶联的形式使用。

II.合成连接肽

本发明的二聚体的至少一条多肽链可包含本发明的合成连接肽。一个实施方案中，本发明的二聚体的至少两条链包含连接肽。优选的实施方案中，本发明的二聚体的两条链包含连接肽。

一个实施方案中，连接肽可用于在单个多肽链的框内连接两个重链部分。例如，一个实施方案中，本发明的连接肽可用于将CH3结构域(或合成的CH3结构域)融合于铰链区(或合成铰链区)。另一实施方案中，本发明的连接肽可用于将CH3结构域(或合成的CH3结构域)融合于CH1结构域(或合成的CH1结构域)。另一实施方案中，连接肽可作为铰链区(或合成铰链区)和CH2结构域(或合成的CH2结构域)之间的间隔物。

另一实施方案中，CH3结构域可融合于细胞外蛋白结构域(例如，VL结构域(或合成结构域)，VH结构域(或合成结构域)，CH1结构域(或合成结构域)，铰链结构域(或合成铰链)，或融合于受体的配体结合部分或配体的受体结合部分)。例如，一个实施方案中，VH或VL结构域经由连接肽融合于CH3结构域(该连接肽的C-末端附着于CH3结构域的N-末端，该连接肽的N-末端附着于VH或VL结构域的C-末端)。另一实施方案中，CH1结构域经由连接肽融合于CH3结构域(该连接肽的C-末端附着于CH3结构域的N-末端，该连接肽的N-末端附着于CH1结构域的C-末端)。另一实施方案中，本发明的连接肽可用于将CH3结构域(或合成的CH3结构域)融合于铰链区(或合成铰链区)或其一部分。另一实施方案中，连接肽可作为铰链区(或合成铰链区)和CH2结构域(或合成的CH2结构域)之间的间隔物。

一个实施方案中，连接肽可包含或由gly/ser间隔物组成。例如，具有取代CH2结构域的短氨基酸间隔物GGSSGGGGSG(SEQ.ID No.1)和低级铰链区(CC49.ΔCH2[gly/ser])的结构域缺失的CC49构建体可被使用。另一实施方案中，连接肽包含氨基酸序列IGKTISKKAK(SEQ ID NO：36)。

另一实施方案中，连接肽可包含至少部分免疫球蛋白铰链区。例如，可构建其中铰链元件源自不同抗体同种型的嵌合铰链结构域。一个实施方案中，连接肽包含至少部分IgG1铰链区。另一实施方案中，连接肽可包含至少部分IgG3铰链区。另一实施方案中，连接肽可包含至少部分IgG1铰链区和至少部分IgG3铰链区。一个实施方案中，连接肽可包含IgG1上和中铰链以及单个IgG3中铰链重复基序。

由于所述包含来自免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列的连接肽中的单个氨基酸的编号可根据所述连接肽的长度变化，这些分子中氨基酸位置的编号利用Kabat编号给出，参见表2。表1显示IgG1，IgG3，和IgG4分子的天然存在的铰链序列。表2显示这些铰链分子的一部分的Kabat编号并且也显示该表中的连接肽氨基酸残基的Kabat编号。

一个实施方案中，本发明的连接肽包含非-天然存在的免疫球蛋白铰链区结构域，例如，不天然存在于包含铰链区结构域的多肽中的铰链区结构域和/或已经被改变从而与天然存在的免疫球蛋白铰链区结构域的氨基酸序列不同的铰链区结构域。一个实施方案中，可使铰链区结构域突变以产生本发明的连接肽。一个实施方案中，本发明的连接肽包括不含天然存在数目个半胱氨酸的铰链结构域，即所述连接肽包含的半胱氨酸数目少于或多余天然存在的铰链分子中的半胱氨酸的数目。优选的实施方案中，将连接肽(例如包含非天然存在个数的半胱氨酸)掺入多肽产生这样的组合物，其中超过50％，60％，70％，80％或90％的二聚体分子以其中两个重链部分经由连接至少一个链间二硫键的形式存在。

本发明的一个实施方案中，连接肽包含铰链区结构域，所述铰链区结构域包含脯氨酸残基，其氨基酸位置相应于Kabat编号系统中的氨基酸位置243(位置230，EU编号系统)。一个实施方案中，连接肽包含丙氨酸残基，其氨基酸位置相应于位置244，Kabat编号系统(位置246，EU编号系统)。另一实施方案中，本发明的连接肽包含脯氨酸残基，其氨基酸位置相应于位置245(Kabat编号系统；位置247，EU编号系统))。一个实施方案中，连接肽包含半胱氨酸残基，其氨基位置相应于位置239，Kabat编号系统(位置226，EU编号系统)。一个实施方案中，连接肽包含丝氨酸残基，其氨基位置相应于位置239，Kabat编号系统(位置226，EU编号系统)。一个实施方案中，连接肽包含半胱氨酸残基，其氨基位置相应于位置242，Kabat编号系统(位置229，EU编号系统)。一个实施方案中，连接肽包含丝氨酸残基，其氨基位置相应于位置242，Kabat编号系统(位置229，EU编号系统)。

一个实施方案中，所述连接肽可被选择为导致多肽具体同种型的优先合成，例如，其中两个重链部分经由连接二硫键或不经由二硫键连接。例如，如本发明实施例中所述，G1/G3/Pro243+[gly/ser]接头(SEQ ID NO：8)，G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[gly/ser]接头(SEQ ID NO：9)，Pro243+[gly/ser]接头(SEQ ID NO：15)，和Pro243Ala244Pro245+[gly/ser]接头(SEQID NO：14)，连接肽导致仅仅产生A型CH2结构域-缺失的抗体而无可检测的B型。相反，CH2结构域-缺失的Cys242Ser：Pro243(SEQ ID NO：12)，和CH2结构域-缺失的Cys242Ser：Pro243Ala244Pro245(SEQ ID NO：13)，均导致对B同种型的偏好。这些合成铰链区连接肽将由此可用于有利于A或B同种型的合成。这对于任何抗体同种型(例如，IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)都如此，其基于所有四种人同种型的CH3结构域之间的高度同源性。(包括相同和保守的氨基酸残基，IgG1 CH3结构域与IgG2 CH398.13％同源，与IgG3 CH397.20％同源，与IgG4 CH396.26％同源)。用于本发明的连接肽和各种结合分子的圆括号代表等同术语，除非另有说明。

一个实施方案中，本发明的连接肽包含铰链区结构域然后是柔性gly/ser接头。示例性连接肽显示于表2和SEQ ID NO：8-15，48和49。将理解这些示例性连接肽的各种形式可通过导入一或多个核苷酸取代，添加或缺失到编码连接肽的核苷酸序列中使得一或多个氨基酸取代，添加或缺失被导入连接肽而产生。例如，突变可通过标准技术导入，诸如定点诱变和PCR-介导的诱变。优选，保守氨基酸取代在一或多个非-必需氨基酸残基进行使得连接肽优选提高A型或B型的能力不变。″保守氨基酸取代″是其中的氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸取代的氨基酸。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本文定义，其包括碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，beta-分支的侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一氨基酸取代。另一实施方案中，一串氨基酸可被结构类似但顺序不同的氨基酸串和/或侧链家族成员的组合取代。

本发明的连接肽可为多种长度。一个实施方案中，本发明的连接肽的长度约15-约50个氨基酸。另一实施方案中，本发明的连接肽的长度为约20-约45个氨基酸。另一实施方案中，本发明的连接肽长度为约25-约40个氨基酸。另一实施方案中，本发明的连接肽的长度为约30-约35个氨基酸。另一实施方案中，本发明的连接肽长度为约24-约27个氨基酸。另一实施方案中，本发明的连接肽长度为约40-约42个氨基酸。

连接肽可利用本领域已知技术导入多肽序列。例如，一个实施方案中，可利用通过Overlap Extension(SOE)法(Horton，R.M.1993 Methods inMolecular Biology，Vol 15：PCR Protocols：Current Methods和applications.Ed.B.A.White)的拼接(Splicing)。修饰可通过DNA序列分析证实。质粒DNA可用于转化宿主细胞以稳定产生生成的多肽。

一个实施方案中，将目的连接肽之一掺入多肽产生包含多肽分子的组合物，其中所述多肽分子具有至少两个结合位点和至少两条多肽链，其中至少两条所述多肽链包含合成连接肽，其中超过50％的分子以其中两个重链部分经由连接至少一个链间二硫键的形式存在。另一实施方案中，超过60％的分子以其中两个重链部分经由连接至少一个链间二硫键的形式存在。另一实施方案中，超过70％的分子以其中两个重链部分经由连接至少一个链间二硫键的形式存在。另一实施方案中，超过80％的分子以其中两个重链部分经由连接至少一个链间二硫键的形式存在。另一实施方案中，超过90％的分子以其中两个重链部分经由连接至少一个链间二硫键的形式存在。

一个实施方案中，将受试连接肽之一掺入IgG4分子产生这样的组合物，其中超过95％的分子以其中两个重链部分经由至少一个链间二硫键连接的形式存在。

III.结合分子

本发明的多肽包含至少两个结合位点，其结合目的靶分子。示例性结合位点包括，例如结合抗体的位点(抗体结合位点)，结合受体的位点(受体结合位点)，和结合配体的位点(配体结合位点)。一个实施方案中，所述结合分子包含至少两个结合位点。一个实施方案中，所述结合分子包含两个结合位点。一个实施方案中，所述结合分子包含三个结合位点。一个实施方案中，所述结合分子包含四个结合位点。

一个实施方案中，所述结合分子具有至少一个特异于介导生物效应的分子(例如调节细胞活化(例如通过结合细胞表面受体并导致活化和抑制信号的转移和抑制)，导致细胞死亡(例如，通过补体固定或暴露于存在结合分子上的有效负荷)或调节受试者中的疾病或病症(例如，通过促进纤维蛋白凝块溶解或促进凝块形成)，或通过调节生物可利用物质的量(例如，通过增加或减少受试者中诸如TNFα的配体的量))的靶结合位点。

一个实施方案中，所述结合分子具有至少一个特异于被靶向减少或消除的分子例如细胞表面抗原或可溶抗原的靶结合位点。一个实施方案中，结合分子与靶的结合导致靶的减少或消除，例如从组织或循环减少或消除。另一实施方案中，所述结合分子具有至少一个特异于用于检测靶分子存在(例如检测污染物或诊断疾病或病症)的结合位点。另一实施方案中，本发明的结合分子包含至少一个将结合分子靶向受试者中的特定位点(例如肿瘤细胞或血液凝块)的结合位点。

可包含在本发明结合分子的结合结构域中的示例性结合位点包括：配体的受体结合部分，受体的配体结合部分，酶的底物结合部分，底物的酶结合部分，或抗体的一或多个抗原结合部分。

一个实施方案中，结合分子(例如抗体分子，双特异性抗体或修饰的抗体)的至少一个靶结合位点是催化性的(Shokat and Schultz.1990.Annu.Rev.Immunol.8：335)。

一个实施方案中，结合分子的重链可变区和轻链可变区存在于相同的多肽中，例如在单链抗体或微型抗体中(参见例如，美国专利5,837,821或WO94/09817A1)。另一实施方案中，多肽的的重链部分和轻链部分存在于不同多肽链中，例如在抗体分子中。

本发明的靶结合多肽是多聚体分子。一个实施方案中，所述靶结合肽是二聚体。一个实施方案中，本发明的二聚体是同源二聚体，包含两个相同的单体亚基。另一实施方案中，本发明的二聚体是异源二聚体，包含两个不同的单体亚基。所述二聚体包含至少两条多肽链。一个实施方案中，所述结合分子包含两条多肽链。另一个实施方案中，所述结合分子包含三条多肽链。另一个实施方案中，所述结合分子包含四条多肽链。

优选实施方案中，本发明的结合分子包含至少一个抗体CDR，所述抗体例如本领域已知结合目的靶的抗体。另一个实施方案中，本发明的结合分子包含至少两个CDR。另一个实施方案中，本发明的结合分子包含至少两个CDR。另一个实施方案中，本发明的结合分子包含至少两个CDR。另一个实施方案中，本发明的结合分子包含至少三个CDR。另一个实施方案中，本发明的结合分子包含至少四个CDR。另一个实施方案中，本发明的结合分子包含至少五个CDR。另一个实施方案中，本发明的结合分子包含至少六个CDR。优选实施方案中，本发明的结合分子包含至少一个抗体VH结构域，所述抗体例如本领域已知结合目的靶的抗体。优选实施方案中，本发明的结合分子包含至少一个VL结构域。另一优选实施方案中，本发明的结合分子包含抗体的至少一个VH结构域和一个VL结构域。

一个实施方案中，抗原结合位点由VH结构域组成，例如其源自camelid，在缺乏VL链是稳定(Hamers-Casterman et al.1993.Nature 363：446；Desmyter et al.1996.Nat.Struct.Biol.3：803；Desmyter，A.，1996.Nat.Struct.Biol.3：803；Decanniere，K.，et al.1999.Structure 7：361；Davies et al.1996.Protein Eng.9：531；Kortt et al.1995.J.Protein Chem.14：167)。

A.融合蛋白

本发明还涉及结合分子，其包含一或多个免疫球蛋白结构域。本发明的融合蛋白包含结合结构域(其包含至少一个结合位点)和二聚体化结构域(其包含至少一个重链部分)。目的融合蛋白可为双特异性(具有一个针对第一个靶的结合位和针对第二个靶的第二结合位点)或可为多价的(具有针对同一靶的两个结合位点)。

文献中报道的示例性融合蛋白包括T细胞受体融合物(Gascoigne et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936-2940(1987))；CD4(Capon et al.，Nature337：525-531(1989)；Traunecker et al.，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl et al.，DNA Cell Biol.USA 9：347-353(1990)；和Byrn et al.，Nature344：667-670(1990))；L-selectin(回巢受体)(Watson et al.，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和Watson et al.，Nature 349：164-167(1991))；CD44(Aruffo et al.，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley et al.，J.Exp.Med.173：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley et al.，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic et al.，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Lesslauer et al.，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel et al.，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))；和IgE受体a(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.Vol.115，Abstract No.1448(1991))。

一个实施方案中，融合蛋白将配体或受体的结合结构域(例如受体细胞外结构域(ECD))与至少一个重链结构域和合成连接肽相结合。一个实施方案中，当制备本发明的融合蛋白时，编码配体或受体的结合结构域的核酸的C末端可融合于编码免疫球蛋白恒定区序列N-末端的核酸。一个实施方案中，融合蛋白包括CH2和CH3结构域。也可在恒定结构域Fc部分的C-末端，或紧邻重链的CH1的N末端处或轻链相应区域进行融合。

一个实施方案中，配体或受体的结构域的序列融合于免疫球蛋白分子Fc结构域的N-末端。也可能将完整重链恒定区融合于配体或受体结构域。一个实施方案中，起始于铰链区内恰好位于木瓜蛋白酶裂解位点或其它免疫球蛋白的类似位点上游的序列用于融合中，所述木瓜蛋白酶裂解位点在化学上限定IgG Fc(即残基216，重链的第一个残基定义为114)。发生融合的精确位点并不重要；具体位点是已知的并可被选择以便优化分子的生物活性，分泌或结合特性。制备融合蛋白的方法是本领域已知的。

对于双特异性融合蛋白，融合蛋白聚集为多聚体，并具体为异二聚体或异四聚体。通常，这些聚集的免疫球蛋白将具有已知的亚基结构。基本的四链结构亚基是其中存在IgG，IgD，和IgE的形式。四链亚基在高分子量免疫球蛋白中重复；IgM通常作为由二硫键结合在一起的四个基本亚基形成的四聚体。IgA球蛋白，有时还有IgG球蛋白，也可以多聚体形式存在于血清中。在多聚体的情况下，四个亚基的每一个可以是相同或不同的。

可包含在融合蛋白中的其它示例性配体及其受体包括：

细胞因子和细胞因子受体

细胞因子对淋巴细胞的增殖，分化和功能活化具有多向性效应。各种细胞因子，或其受体结合部分可用于本发明的融合蛋白中。示例性细胞因子包括白介素(例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，和IL-18)，集落刺激因子(CSF)(例如粒细胞CSF(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)，和单核细胞巨噬细胞CSF(M-CSF))，肿瘤坏死因子(TNF)alpha和beta，以及干扰素诸如干扰素-α，β，或γ(美国专利Nos.4,925,793和4,929,554)。

细胞因子受体通常由配体-特异性alpha链和共同的beta链组成。示例性细胞因子受体包括GM-CSF受体，IL-3受体(美国专利No.5,639,605)，IL-4受体(美国专利No.5,599,905)，IL-5受体(美国专利No.5,453,491)，IFNγ受体(EP0240975)，和TNF受体家族(例如，TNFα(例如TNFR-1(EP 417,563)，TNFR-2(EP 417,014)淋巴毒素beta受体)。

粘附蛋白

粘附分子是膜结合的蛋白，其允许细胞相互作用。各种粘附蛋白，包括白细胞回巢受体和细胞粘附分子，或其受体结合部分，可包含在本发明的融合蛋白中。白细胞回巢受体在炎症过程中表达于细胞表面，并包括β-1整联蛋白(例如VLA-1，2，3，4，5，和6)(其介导与细胞外基质组分的结合)，以及β2-整联蛋白(例如LFA-1，LPAM-1，CR3，和CR4)(其结合血管内皮上的细胞粘附分子(CAM))。示例性CAM包括ICAM-1，ICAM-2，VCAM-1，和MAdCAM-1。其它CAM包括selectin家族的成员，包括E-selectin，L-selectin，P-selectin。

趋化因子

趋化因子，刺激白细胞向感染位点迁移的趋化蛋白，也可包含在本发明的融合蛋白中。示例性趋化因子包括巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α和MIP-1-β)，中性粒细胞趋化因子，和RANTES(调节活化，通常为T-细胞表达的和分泌的)。

生长因子和生长受体

生长因子或其受体(或受体结合或其配体结合部分)可包含在本发明的融合蛋白中。示例性生长因子包括血管内皮生长(VEGF)及其同种型(美国专利5,194,596)；纤维母细胞生长因子(FGF)，包括FGF和bFGF；心房钠利尿因子(ANF)；肝生长因子(HGFs；美国专利Nos.5,227,158和6,099,841)，神经营养因子诸如骨来源的神经营养因子(BDNF)，neurotrophin-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6)，或神经生长因子诸如NGF-β血小板来源的生长因子(PDGF)(美国专利4,889,919，4,845,075，5,910,574，和5,877,016)；转化生长因子(TGF)诸如TGF-alpha和TGF-beta(WO 90/14359)，骨诱导因子包括骨形态发生蛋白(BMP)；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II；美国专利Nos.6,403,764和6,506,874)；促红细胞生成素(EPO)；干细胞因子(SCF)，血小板生成素(thrombopoietin)(c-Mpl配体)，和Wnt多肽(美国专利No.6,159,462)。

示例性生长因子受体，其可用来靶向本发明的受体结构域，包括EGF受体；VEGF受体(例如Flt1或Flk1/KDR)，PDGF受体(WO 90/14425)；HGF受体(美国专利Nos.5,648,273，和5,686,292)，和神经营养受体(包括的亲和力受体(LNGFR)，也称为p75^NTR或p75，其结合NGF，BDNF，和NT-3)，和高亲和力受体，其为受体酪氨酸激酶trk家族的成员(例如trkA，trkB(EP 455,460)，trkC(EP 522,530))。

激素

用作本发明融合蛋白中的靶试剂的示例性生长激素包括肾素，人生长激素(HGH；美国专利No.5,834,598)，N-甲硫氨酰人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素(PTH)；甲状腺刺激激素(TSH)；甲状腺素；原胰岛素和胰岛素(美国专利Nos.5,157,021和6,576,608)；滤泡刺激激素(FSH)，降钙素，促黄体(luteinizing)激素(LH)，leptin，胰高血糖素；蛙皮素；生长激素；米勒管(mullerian)-抑制物；松弛素(relaxin)和原松弛素(prorelaxin)；促性腺激素相关肽；催乳素(prolactin)，胎盘催乳激素(lactogen)；OB蛋白；或米勒管抑制物。

凝血因子

用作本发明融合蛋白中的靶向剂的示例性凝血因子包括凝血因子(例如，因子V，VII，VIII，X，IX，XI，XII和XIII，von Willebrand因子)；组织因子(美国专利5,346,991，5,349,991，5,726,147，和6,596,84)；凝血酶和凝血酶原；血纤维蛋白和血纤维蛋白原；纤溶酶和纤溶酶原；纤溶酶原激活剂，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)。

其它示例性融合蛋白在例如，WO0069913A1和WO0040615A2中教导。其它可包含在本发明融合蛋白的示例性分子是IGSF9。

融合蛋白可利用本领域已知方法制备(见例如美国专利5,116,964和5,225,538)。通常，配体或受体结构域的C末端融合于重链恒定区(或重链部分)的N末端，并取代可变区。任何配体结合受体的跨膜区或脂质或磷脂锚定识别序列优选在融合前是失活的或缺失的。编码配体或受体结构域的DNA通过限制酶在或临近编码所需ORF片段的DNA的5’和3’末端裂解。产生的DNA片段随后容易地插入编码重链恒定区的DNA中。进行融合的精确位点可根据经验选择，以优化可溶融合蛋白的分泌或结合性质。编码融合蛋白的DNA随后转染入宿主细胞用于表达。

B.抗体或其一部分

一个实施方案中，本发明的结合分子例如抗原结合分子是抗体分子。利用本领域已知的方案，例如，抗体优选通过在哺乳动物中多次经皮下或腹腔内注射相关抗原(例如，纯化的肿瘤相关抗原或包含所述抗原的细胞或细胞提取物)和佐剂来激发。这样的免疫通常激发免疫反应，包括从活化的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应性抗体。虽然所生成的抗体可自动物血清收获以提供多克隆制备物，通常需要从脾、淋巴结或外周血收获个体淋巴细胞以提供单克隆抗体(MAb)的均质制备物。优选，所述淋巴细胞获自脾。

在该已知的方法中(Kohler et al.，Nature，256：495(1975))来自注射了抗原的哺乳动物的相对短寿的，或必死的淋巴细胞与永生化肿瘤细胞系(例如骨髓瘤细胞系)融合，由此产生杂合细胞或“杂交瘤”，其不仅是永生化的而且能够产生B细胞的遗传编码的抗体。产生的杂合体通过选择、稀释和再生长分离成单个同属菌株，每个个体菌株包含单个个体信息的特异性基因。它们产生针对所需抗原的均质抗体，根据它们的纯的同属来源，称为“单克隆的”。

如此制备的杂交瘤细胞接种并生长于适宜培养基中，其优选含有一或多种抑制未融合、亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。本领域技术人员应理解用于杂交瘤的形成、选择、生长的试剂、细胞系和介质可购自多种来源，并且标准化方案是已经确定的。通常，测定其中生长有杂交瘤细胞的培养基中针对所需抗原的单克隆抗体的产生。优选，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或体外测定法诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定。将杂交瘤细胞鉴定为产生具有所需特异性、亲和性和/或活性的抗体之后，所述克隆可通过限制稀释法亚克隆并通过标准方法生长(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles和Practice，pp59-103(Academic Press，1986))。应进一步理解所述亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规纯化法诸如例如蛋白质-A，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析或亲和层析分离自培养基。

另一实施方案中，编码所需单克隆抗体的DNA可利用常规方法轻易分离并测序(例如通过利用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。分离的且亚克隆的杂交瘤细胞作为所述DNA的优选来源。一旦分离，DNA可置于表达载体中，随后将表达载体转染入否则不产生免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞诸如大肠杆菌细胞，猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更具体地，分离的DNA(如本文所述其可为修饰的)可用于克隆恒定和可变区序列用于如Newman et al.，1995-1-25提交的美国专利5,658,570所述制备抗体，所述文献包含在本文作为参考。实质上，这需要从所选细胞提取RNA，转化成cDNA，以及利用Ig特异性引物通过PCR扩增。用于该目的的适宜引物也在美国专利5,658,570中描述。如下文具体所述，表达所需抗体的经转化的细胞可以以相对较大的量生长以提供临床及商业所需的免疫球蛋白。

本领域技术人员将理解编码抗体或抗体片段的DNA也可源自抗体噬菌体库，例如利用pd噬菌体或Fd噬粒技术。示例性方法见例如，EP 368 684 B1；美国专利5,969,108，Hoogenboom，H.R.和Chames.2000.Immunol.Today21：371；Nagy et al.2002.Nat.Med.8：801；Huie et al.2001.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：2682；Lui et al.2002.J.Mol.Biol.315：1063，每一篇都包含在本文作为参考。一些公开文献(例如，Marks et al.Bio/Technology10：779-783(1992))描述了通过链改组以及组合感染和体内重组作为构建大的噬菌体文库的策略来制备高亲和力人抗体。另一实施方案中，核糖体展示可用于取代噬菌体作为展示平台(见例如，Hanes et al.2000.Nat.Biotechnol.18：1287；Wilson et al.2001.Proc.Natl.Acad Sci.USA 98：3750；或Irving et al.2001 J.Immunol.Methods 248：31.另一实施方案中，可筛选细胞表面文库中的抗体(Boder et al.2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：10701；Daugherty et al.2000 J.Immunol.Methods 243：211。所述方法提供了单克隆抗体分离和随后的克隆的常规杂交瘤技术的其它选择。

本发明另一实施方案包含在转基因动物(例如小鼠)中产生人抗体或基本上的人抗体，所述动物不能产生内源性免疫球蛋白(见例如，美国专利6,075,181，5,939,598，5,591,669和5,589,369，每篇文献都包含在本文作为参考)。例如，描述了抗体重链联合区在嵌合和种系突变小鼠中的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变小鼠将导致在抗原攻击下产生人抗体。利用SCID小鼠产生人抗体的另一优选方法公开于美国专利5,811,524其包含在本文作为参考。将理解所述与这些人抗体相关的遗传物质将如本发明所述分离和操作。

用于产生重组抗体的另一种高度有效的方法公开于Newman，Biotechnology，10：1455-1460(1992)。具体地，该技术导致灵长类源化抗体的产生，所述抗体含有猴可变结构域和人恒定序列。该文献全文包含在本文作为参考。此外，该技术也在美国专利5,658,570，5,693,780和5,756,096中描述，每篇文献都包含在本文作为参考。

另一实施方案中，淋巴细胞可通过显微操作以及分离的可变基因来选择。例如，外周血单核细胞可分离自经免疫的哺乳动物并在体外培养约7天。可筛选培养物中满足筛选标准的特异性IgG。来自阳性孔的细胞可被分离。个体Ig产生型B细胞可通过FACS或通过在补体介导的溶血噬斑试验中鉴定来分离。可将Ig产生型B细胞显微操作到试管中，并利用例如，RT-PCR扩增Vh和Vl基因。VH和VL基因可被克隆入抗体表达载体并转染入细胞(例如真核或原核细胞)用于表达。

此外，用于产生本发明多肽的遗传序列可获自多种不同来源。例如，如上文所述，多种人抗体基因可得自公众可获得的保藏。许多抗体序列以及编码抗体的基因已经公开，并且可利用已知技术从这些序列化学合成适宜的抗体基因。与本发明该方面相容的寡核苷酸合成技术是本领域技术人员已知的并可利用多种可购得的自动合成仪进行。此外，本文所述编码多种类型的重链和轻链的DNA序列可通过商品化DNA合成销售商的服务获得。利用任何前述方法获得的遗传物质可为改变的或修饰的以获得本发明的多肽。

可选，抗体生成细胞系可利用本领域技术人员已知的技术选择和培养。所述技术在多种实验室手册和主要出版物中描述。在该方面中，下述适宜用于本发明的技术描述于Current Protocols in Immunology，Coligan et al.，Eds.，Green Publishing Associates和Wiley-Interscience，John Wiley和Sons，NewYork(1991)，其全文及附录都包含在本发明中作为参考。

将理解本发明的范围进一步包括所有抗原结合DNA序列的等位基因，变体和突变体。

已知RNA可通过标准技术分离自原始杂交瘤细胞或其它转化的细胞，诸如异硫氰酸胍(guanidinium isothiocyanate)提取和沉淀然后是离心或层析。需要时，mRNA可通过标准技术诸如在寡dT纤维素上层析而从总RNA分离。适宜技术是本领域技术人员熟悉的。

可变和恒定区结构域可得自任何来源并掺入本发明的修饰的抗体。为克隆抗体，mRNA可分离自杂交瘤，脾，或淋巴细胞，反转录入DNA，以及PCR扩增的抗体基因。PCR可通过共有恒定区因组或更特异的引物基于公开的重链和轻链DNA以及氨基酸序列来启动。如上所述，PCR也可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况中，可通过共有序列引物或较大的同源探针诸如小鼠恒定区探针来筛选文库。各种适于扩增抗体基因的引物组是本领域已知的(例如，基于纯化的抗体N末端序列的5’引物(Benhar and Pastan.1994.Protein Engineering  7：1509)；cDNA末端的快速扩增(Ruberti，F.et al.1994.J.Immunol.Methods 173：33)；抗体前导序列(Larrick et al.1989 Biochem.Biophys.Res.Commun.160：1250)；或基于Kabat的已知可变区框架氨基酸序列(Kabat et al.1991.Sequences ofProteins of Immunological Interest.Bethesda，MD：JS Dep.Health Hum.Serv.5th ed.)或V-碱基数据库(例如，Orlandi et al.1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3833；Sblattero et al.1998.Immunotechnology 3：271；or Krebber et al.1997.J.Immunol.Methods 201：35)。可选择具有特定效应功能(或缺乏特定效应功能)或具有降低免疫原性的特定修饰的恒定区结构域。可变和横笛功能结构域可被克隆，例如利用聚合酶链反应和被选用于扩增目的结构域的引物。PCR扩增法在U.S.Pat.Nos.4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188；和，例如，“PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications”Innis et al.eds.，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Ho et al.1989.Gene77：51：Horton et al.1993.Methods Enzymol.2l7：270)中详述。

可选，V结构域可获自所选动物的V基因序列文库。可利用所需抗原筛选表达结构域随机组合例如，VH和VL结构域的文库，以鉴定具有所需结合形式的元件。所述筛选方法是本领域已知的。例如，抗体基因库可被克隆入细菌噬菌体表达载体(Huse，WD et al.1989.Science 2476：1275)。此外，可筛选在其表面表达抗体细胞(Boder and Wittrup.1997.Nat.Biotechnol.15：553；Daugtherty，P.et al.2000.J.Immunol.Methods.243：211；Francisco etal.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10444；Georgiou et al.1997.NatureBiotechnology 15：29)或病毒(例如，Hoogenboom，HR.1998Immunotechnology 4：1 Winter et al.1994.Annu.Rev.Immunol.12：433；Griffiths，AD.1998.Curr.Opin.Biotechnol.9：102)。核糖体展示也可用于筛选抗体文库(Hanes J.，et al.1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：14130；Hanes，J.and Pluckthun.1999.Curr.Top.Microbiol.Immunol.243：107；He，M.and Taussig.1997.Nucleic Acids Research 25：5132)。

优选用于筛选的文库是人V基因文库。非人来源的VL和VH结构域也可使用。一个实施方案中，所述非人V结构域可利用本领域已知技术改变以降低它们的免疫原性。

文库可以是初始的(

)，来自未经免疫的受试者，或半合成的(Hoogenboom，H.R.and Winter.1992.J.Mol.Biol.227：381；Griffiths，AD，et al.EMBO J.13：3245；de Kruif，J.et al.1995.J.Mol.Biol.248：97；Barbas，C.F.，et al.1992.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4457)。

此外，许多抗体V和C结构域的序列已知并且所述结构域可利用本领域已知方法合成。

一个实施方案中，可对免疫球蛋白结构域进行突变以产生具有较高异质性的核酸分子文库(Thompson，J.，et al.1996.J.Mol.Biol.256：77；Lamminmaki，U.et al.1999.J.Mol.Biol.291：589；Caldwell，R.C.and JoyceGF.1992.PCR Methods Appl.2：28；CaldWell RC and Joyce GF.1994.PCR Methods Appl.3：S136。标准筛选法可用于选择高亲和力变体。另一实施方案中，可改变VH和VL序列以增加抗体亲合力，例如利用采用本领域已知技术从晶体结构获得的信息。

C.修饰的抗体

示例性构建体包括，例如，微型抗体，二价抗体，融合于CH3分子的二价抗体，四价抗体，intradiabodies(例如，Jendreyko et al.2003.J.Biol.Chem.278：47813)，双特异性抗体，融合蛋白质(例如，抗体细胞因子融合蛋白，融合于至少部分Fc受体的蛋白)，双特异性抗体。其它免疫球蛋白(Ig)及其特定变体在例如以下文献中描述：美国专利4,745,055；EP 256,654；Faulkner et al.，Nature 298：286(1982)；EP 120,694；EP 125,023；Morrison，J.Immun.123：793(1979)；Kohler et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980)；Raso et al.，Cancer Res.41：2073(1981)；Morrison et al.，Ann.Rev.Immunol.2：239(1984)；Morrison，Science 229：1202(1985)；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984)；EP 255,694；EP 266,663；和WO88/03559。再分类的免疫球蛋白链也是已知的。见例如，美国专利4,444,878；WO 88/03565；和EP 68,763以及本文所引用的文献。

一个实施方案中，本发明的多肽包含免疫球蛋白重链，其具有至少一个氨基酸的缺失或取代。A例如，在CH2结构域的所选区域中一或多个单个氨基的突变对于基本上降低Fc结合由此增加肿瘤定位而言是足够的。类似地，需要简单消除一或多个恒定区结构域的控制待调节的效应功能(例如补体结合)的部分。所述恒定区的部分缺失可改善抗体的所选特性(血清半寿期)，同时保持与受试恒定区结构域相关的其它所需功能的完整。因此，一个实施方案中，本发明的结合分子缺乏所有或部分CH2结构域。此外，如上所述，本发明抗体的恒定区可通过突变或取代一或多个增强所得构建体图谱的氨基酸来修饰。在这方面，可破坏保守结合位点(例如Fc结合)提供的活性，同时基本保持修饰的抗体的构型和免疫原性图谱。另一优选实施方案可包括将一或多个氨基酸加入恒定区以增强所需特征诸如效应功能或提供更多的细胞毒素或碳水化合物的附着。所述实施方案中，需要插入或复制来自所选恒定区结构域的特定序列。

另一实施方案中，可对天然存在铰链区进行突变。对本发明恒定区的所述突变可轻易利用本领域已知的生物化学或分子改造技术进行。

一个实施方案中，本发明的多肽包含修饰的恒定区，其中一或多个结构域被部分或完全缺失(“结构域缺失的抗体”)。在特别优选的实施方案中，适合的修饰的抗体将包含结构域缺失的构建体或变体，其中整个CH2结构域被去除。多种修饰的抗体构建体在下文详细描述。

i.微型抗体

一个实施方案中，本发明的修饰的抗体是微型抗体。微型抗体是嵌合分子，其由两条多肽链组成，每一条多肽链包含ScFv分子(包含一或多个抗原结合位点的单个多肽，例如，经由柔性结构连接于经由连接肽融合于CH3结构域的VH结构域的VL结构域。示例性微型抗体构建体显示于图2。图2中CH3结构域的N末端融合于连接肽，所述连接肽的N末端融合于经由其N末端融合于柔性接头的VH结构域，所述柔性结构的N末端融合于VL结构域。

ScFv分子可构建为VH-接头-VL方向或VL-接头-VH方向。

连接组成抗原结合位点的VL和VH结构域的柔性铰链优选包括约10-约50个氨基酸。用于该目的的示例性连接肽是(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：35)(Huston et al..1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879)。其它连接肽是本领域已知的。

制备单链抗体的方法是本领域已知的，例如，Ho et al.1989.Gene77：51；Bird et al.1988 Science 242：423；Pantoliano et al.1991.Biochemistry30：10117；Milenic et al.1991.Cancer Research 51：6363；Takkinen et al.1991.Protein Engineering 4：837。

微型抗体可通过构建ScFv组分和连接肽-CH3组分利用本领域所述方法来构建(见，例如，US专利5,837,821或WO 94/09817A1)。这些组分可作为限制片段分离自分离的质粒，随后连接并再克隆入适当的载体。适宜的组装可通过限制消化和DNA序列分析证实。

一个实施方案中，本发明的微型抗体包含连接肽。一个实施方案中，所述连接肽包含gly/ser接头，例如，GGGSSGGGSGG(SEQ ID NO：1)。

另一实施方案中，四价微型抗体可被构建。四价微型抗体可以与微型抗体相同的方式构建，但是两个ScFv分子经由柔性结构连接，例如具有氨基酸序列(G4S)4G3AS(SEQ ID NO：36)。示例性四价微型抗体显示于图2。

ii.缺失的抗体

另一实施方案中，本发明的修饰的抗体是CH2结构域缺失的抗体。结构域缺失的构建体可源自载体(例如，来自DEC Pharmaceuticals，San Diego)，所述载体编码IgG1人恒定结构域(见，例如，WO 02/060955A2和WO02/096948A2)。基本上，所述载体被改造，以消除CH2结构域，并提供表达结构域缺失的IgG1恒定区的修饰的载体。编码C2B8抗体，5E8抗体，B3F6抗体的鼠可变区或人源化的CC49抗体的可变区的基因随后被插入修饰的载体并被克隆。当在转化的细胞中表达的时候，这些载体提供，C2B8.ΔCH2，5E8.ΔCH2，B3F6.ΔCH2或huCC49.ΔCH2，或分别提供。这些构建体显示多种特性，所述的特性使得它们尤其适于作为单体亚基的有吸引力的候选物。

除了缺失完整恒定区结构域以外，可以理解本发明的抗体可被改造成部分缺失或取代一些氨基酸或甚至单个氨基酸的形式。例如，在CH2结构域所选区域内，单个氨基酸的突变对于基本上降低Fc结合以及由此增加肿瘤定位而言是足够的。类似地，需要简单缺失一或多个恒定区结构域的控制效应功能(例如补体C1Q结合)的部分。所述恒定区的部分缺失可改善抗体的所选性质(血清半寿期)，同时保持与受试恒定区结构域相关的其它所需功能完整。

CH2结构域缺失的版本的产生可通过重叠PCR诱变的方式来实现。gamma1恒定区结构域从质粒编码的Nhe I位点开始，其与免疫球蛋白序列一起在翻译读框中。构建5’PCR引物，其编码Nhe I位点以及紧邻其下游的序列。构建了3’PCR引物配对物，使得其在3’末端与免疫球蛋白铰链区退火，并在框内编码gamma1 CH3结构域的前几个氨基酸。第二个PCR引物对由来自第一个对(上文)的3’PCR引物的反向互补物作为5’引物，以及在CH3结构域中跨BsrG I限制位点的基因座退火的3’引物组成。每次PCR扩增后，所得产物用作模板，并分别利用Nhe I和BsrG I作为5’和3’引物。扩增的产物随后克隆回N5KG1中以产生质粒N5KG1ΔCH2。该构建将完整CH3结构域置于紧接的下游，并与完整铰链区在框内。可利用类似的方法产生结构域缺失的构建体，其中CH3结构域紧邻连接肽下游。例如，C2B8抗体的结构域缺失的版本以该方式产生如U.S.Pat.Nos.5,648,267和5,736,137所述，每篇文献都包含在本文作为参考。

一个实施方案中，四价结构域-缺失的抗体可通过将编码结构域缺失的抗体的DNA序列与ScFv分子结合来制备。例如，一个实施方案中，这些序列被组合，使得ScFv分子的N末端经由柔性结构连接于结构域缺失的的抗体的CH3结构域(例如，gly/ser接头，诸如(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：35)。

另一实施方案中，四价抗体可通过将ScFv分子融合于连接肽制备，所述连接肽融合于CH1结构域，以构建ScFv-Fab四价分子。(Coloma andMorrison.1997.Nature Biotechnology.15：159；WO 95/09917)。

iii.二价抗体

二价抗体类似于scFv分子，但通常具有短(少于10，优选1-5)氨基酸残基接头，所述结构连接两个V结构域，使得同一多肽链上的VL和VH结构域不相互作用。然而，一条多肽链上的VL和VH结构域与另一条多肽链上的VH和VL结构域(分别)作用(WO 02/02781)。一个实施方案中，本发明的结合分子是融合于至少一个重链部分的二价抗体。在优选实施方案中，本发明的结合分子是融合于CH3结构域的二价抗体。

本发明的修饰的抗体的一个实施方案中，结合分子包含具有附着于轻链N末端的scFv的四价或双特异性四价CH2结构域-缺失的抗体。本发明另一实施方案中，结合分子包含具有附着于重链N末端的scFv的四价或双特异性四价CH2结构域-缺失的抗体。一个实施方案中，scFv与N末端的连接导致所述分子与其中scFv附着于羧基末端的分子相比，前者的聚集减少。一个实施方案中，低于约30％聚集体存在于通过表达N末端融合构建体的细胞产生的结合分子的组合物中。一个实施方案中，低于约20％聚集体存在于通过表达N末端融合构建体的细胞产生的结合分子的组合物中。一个实施方案中，低于约10％聚集体存在于通过表达N末端融合构建体的细胞产生的结合分子的组合物中。一个实施方案中，低于约5％聚集体存在于通过表达N末端融合构建体的细胞产生的结合分子的组合物中。

其它形式的修饰的抗体也在本发明的范围内(例如，WO 02/02781 A1；5,959,083；6,476,198 B1；US 2002/0103345 A1；WO 00/06605；Byrn et al.1990.Nature.344：667-70；Chamow and Ashkenazi.1996.TrendsBiotechnol.14：52)。

D.催化抗体

一个实施方案中，本发明的修饰的抗体的至少一种结合特异性是催化性的。催化结合特异性可通过利用本领域已知的技术产生(见，例如，美国专利6,590,080，美国专利5,658,753)。催化结合特异性可通过多种基本机制起作用，所述机制类似于所鉴定的酶稳定过渡态，由此降低活化的自由能的机制。例如，大多数酸性和碱性残基可任选放置，使得参与催化活性位点内的催化；共价酶-底物中间体可形成；催化抗体可位于适于反应的方向中，并将反应物的有效浓度增加至少7个数量级(Fersht，A.R.，et al.，Am.Chem.Soc.90(1968)：5833)，由此，大大降低化学反应的熵。最后，催化性抗体可转化底物结合时获得的能量，以使得反应趋向类似过渡态的结构。

一个实施方案中，酸性和碱性氨基酸可通过互补电荷分子诸如免疫原而置于结合位点中。该技术对于利用含有带正电荷的铵离子的半抗原来激发抗体是成功的(Shokat，et al.，Chem.Int.Ed.Engl.27(1988)：269-271)。

另一方法中，抗体可被激发成稳定化合物，起类似于所需反应的过渡态的大小，形状，以及电荷(即过渡态类似物)。见，美国专利4,792,446和美国专利4,963,355，它们描述了利用过渡态类似物来免疫动物，以及催化性抗体的制备。这两篇专利文献都包含在本文作为参考。一个实施方案中，所述分子作为免疫偶联物的一部分例如，具有免疫原性载体分子，诸如KLH给药。

示例性催化结合特异性可具有，例如脂酶活性(涉及带电的过渡态，其静电特性以及形状特性可通过膦酸酯结构模拟；Jacobs，et al.，J.Am.Chem.Soc.109(1987)：2174-2176；Durfor，et al.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)：8713-8714；Tramontano，et al.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)：2282；Pollack，et al.，J.Am.Chem.Soc.111(1989)：5961-5962)；肽酶和酰胺酶活性(Janda，et al.，Science 241(1988)：1188-1191；Iverson，et al.，Science 243(1989)：1184-1188；Paul，et al.，Science 244(1989)：1158-1162)；Claisenrearrangement(Jackson，et al.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)：4841-4842；Hilvert，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)：4953-4955；Hilvert，et al.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)：5593-5594)；氧化还原反应(redox reactions)(Shokat，etal.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.27(1989)：269-271)；胸腺嘧啶二聚体的光化学裂解(photochemical cleavage)(Cochran，et al.，J.Am.Chem.Soc.110(1988)：7888-7890)；立体特异性酯基转移作用重排(stereospecifictransesterification rearrangements)(Napper，et al.，Science 237(1987)：1041-1043)；或双分子酰胺合成(bimolecular amide synthesis)(Benkovic，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)：5355-5358；Janda，et al.，Science 241(1988)：1188-1191).

另一方法中，常规结合特异性可突变，以使得它们称为催化性的。

筛选催化性抗体活性的方法是本领域技术人员已知的(例如，Reymond，J.L.2002.Journal of Immunological Methods 269：125；Mouratou et al.2002.J.of Immunological Methods.269：147。另一实施方案中，催化性B细胞可被选择，例如，美国专利6,590,080所述，所述选择利用可被构建成促进催化性B细胞选择的分子来进行。

另一实施方案中，催化性结合特异性可作为两步法的一个部分来开发。催化性抗体仅仅当显示以下结合特异性时才能被选择：结合底物以及反应基团，使得这两个基团在互相反应的位置中。其次，选择的抗体可通过共价结合反应性基团到抗体的结合袋子中而得以化学改造。J ImmunolMethods.2002.269：81-98。

一个实施方案中，催化性结合特异性特异于前体要去。所述结合特异性可用于催化前体药物转化成在体内有效的药物。优选，催化的反应是不能通过天然酶在体内实现的反应。抗体对前体药物的活化的实例是本领域已知的(见，例如，Miyashita et al.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5337)。

一个实施方案中，本发明的修饰的抗体分子包含至少一种对靶细胞的结合特异性，以及至少一种对前体药物的结合特异性。例如，优选实施方案中，本发明的修饰的抗体分子包含至少一种对肿瘤细胞的结合特异性，以及至少一种对前体药物的结合特异性，所述前体药物不能被转化成细胞毒药物。一个实施例中，本发明的修饰的抗体分子包含对氨基甲酸酯(carbamate)前体药物4-[N，N，-双(2-氯乙基)]氨基苯基-N-[(1S-(1，3-二羧基)丙基]氨基甲酸酯的特异性，并且产生相应的细胞毒性氮芥(itrogen mustard)(Wentworth et al.1996.Proc Natl.Acad.Sci.USA.93：799)。

一个实施方案中，修饰的抗体在给药前体药物之前给药，以允许在靶细胞位点的聚集。示例性前体药物是本领域已知的。前体药物也某一部分掺入来合成，所述部分可通过将设计为通过催化作用，例如通过具有醛缩酶活性的抗体催化的连续后-醛醇(retro-aldol)/后(retro)-Michael反应来裂解。

E.多特异性结合分子

一个实施方案中，本发明的结合分子是多特异性的，即具有至少一个结合第一分子或分子表位的结合位点，以及至少一个结合第二分子或分子表位的第二结合位点。

一个实施方案中，本发明的结合分子是双特异性的。双特异性分子可结合两种不同的靶位点。例如，在相同靶分子或不同靶分子上。例如，对于抗体的情况，双特异性分子可结合两个不同表位，例如在相同抗原或不同抗原上。双特异性分子可用于例如诊断和治疗应用中。例如，它们可用于固定酶，用于免疫测定法。它们也可用于诊断和治疗癌症，例如通过结合肿瘤相关分子以及可检测标记(例如，鳌合剂，其紧密结合放射性核素)。双特异性分子也可用于人治疗，例如通过将细胞毒性针对特定靶(例如通过结合病原体和肿瘤细胞，以及结合细胞毒性激发分子，诸如T细胞受体或Fcγ受体。双特异性抗体也可，例如用作纤维蛋白溶解剂或疫苗佐剂。

双特异性结合分子的实例包括具有至少两条针对肿瘤细胞抗原的臂的那些；具有至少一条针对肿瘤细胞抗原的臂和至少一条针对细胞毒性激发分子(诸如抗-Fc.gamma.RI/抗-CD15，抗-p185.sup.HER2/Fc.gamma.RIII(CD16)，抗-CD3/抗-恶性B-细胞(1D10)，抗-CD3/抗-p185.sup.HER2，抗-CD3/抗-p97，抗-CD3/抗-肾细胞癌，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L-D1(抗-结肠癌)，抗-CD3/抗-黑素细胞刺激激素类似物，抗-EGF受体/抗-CD3，抗-CD3/抗-CAMA1，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗-神经细胞黏附分子(NCAM)/抗-CD3，抗-叶酸结合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛(pan)癌相关抗原(AMOC-31)/抗-CD3)的臂的双特异性结合分子；具有至少一条特异结合肿瘤抗原的臂以及至少一条结合毒素(诸如抗-saporin/抗-Id-1，抗-CD22/抗-saporin，抗-CD7/抗-saporin，抗-CD38/抗-saporin，抗-CEA/抗-蓖麻蛋白A链，抗-干扰素-.alpha.(IFN-.alpha.)/抗-杂交瘤独特型，抗-CEA/抗-长春花生物碱)的臂的双特异性结合分子；用于转化酶活化的前体药物(such as抗-CD30/抗-碱性磷酸酶(其催化丝裂霉素磷酸盐前体药物转化为丝裂霉素醇(mitomycin alcohol)))的双特异性结合分子；可用作纤维蛋白裂解剂(诸如抗-纤维蛋白/抗-组织纤维蛋白溶酶原激活物(tPA)，抗-纤维蛋白/抗-尿激酶-型纤维蛋白溶酶原激活物(uPA))的双特异性结合分子；将免疫复合物靶向细胞表面受体(诸如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受体(例如Fc.gamma.RI，Fc.gamma.RII或Fc.gamma.RIII))的双特异性结合分子；用于治疗感染疾病的双特异性结合分子(诸如抗-CD3/抗-单纯疱疹病毒(HSV)，抗-T-细胞受体：CD3复合物/抗-流感，抗-Fc.gamma.R/抗-HIV)；用于体外和体内肿瘤检测的的双特异性结合分子，诸如抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-p185HER2/抗--半抗原)；作为疫苗佐剂的双特异性结合分子(见Fanger et al.，supra)；以及作为诊断工具的双特异性结合分子(诸如抗-兔IgG/抗-铁蛋白，抗-辣根过氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生长激素抑制素/抗-P物质，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-.beta.-半乳糖苷酶(见Nolan et al.，上文))。三特异性抗体的实例包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37，抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。

一个优选实施方案中，本发明的双特异性分子结合CRIPTO-I。

对于每种特异性而言，双特异性分子可为单价的，或对于每种特异性而言为多价的。例如，抗体分子或融合蛋白可包含一个与第二个靶分子反应的结合位点，或者包含两个与第一个靶分子反应的结合位点以及两个与第二个靶分子反应的结合位点。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。例如，重组技术可用于制备双特异性分子，例如二价抗体，单链二价抗体，串联scFv等。用于制备双特异性分子的示例性技术是本领域已知的(例如，Kontermann et al.Methods in Molecular Biology Vol.248：AntibodyEngineering：Methods and Protocols.Pp 227-242 US 2003/0207346 A1以及本文所述文献)。一个实施方案中，多聚体双特异性抗体可利用诸如例如，US2003/0207346 A1或US patent 5,821,333，或US2004/0058400中所述的方法来制备。

本文术语″多特异性融合蛋白″指具有至少两种结合特异性(即结合配体或受体的两个或多个结合结构域)的融合蛋白(如上文所述)。多特异性融合蛋白可聚集为异源二聚体，异源三聚体或异源四聚体，基本上如WO89/02922(1989-4-6公开)，EP 314,317(1989-5-3公开)，和美国专利5,116,964(1992-5-2公开)所述。优选的多特异性融合蛋白是双特异性的。双特异性融合蛋白的实例包括CD4-IgG/TNF受体-IgG和CD4-IgG/L-selectin-IgG。最后述及的分子结合了淋巴回巢受体(LHR，L-selectin)的淋巴结结合功能以及CD4的HIV结合功能，并且可用于预防和治疗HIV感染，相关疾病和作为诊断物。

本发明的多特异性结合分子的靶结合位点可由本领域技术人员轻易选择。不作为任何限制，示例性结合位点包括一或多个肿瘤抗原的表位。其它示例性靶分子包括以下物质的一或多个表位：例如硫酸肝素，生长因子或其受体(例如表皮生长因子受体，胰岛素样生长因子受体，肝细胞生长因子(HGF/SF)受体。更多可参见，例如，Cao et al.Proc.Natl.Acad.Sci 2001.98：7443；Lu et al.2004.J.Biol.Chem.279：2856。

另一实施方案中，本发明涉及双特异性分子，例如抗体，其包含至少一个结合已知靶的结合位点，以及至少一个识别未知靶的结合位点(例如，一个实施方案中，所述双特异性抗体包含选自半合成抗体噬菌体展示文库的结合位点)。

本发明的一个实施方案中，本领域技术人员可从特异性已知的单链抗体开始，利用本领域已知技术建造Fab文库，和可选，本领域技术人员可从特异性已知的Fab片段开始，利用本领域已知技术建造单链文库。本领域已知，来自非免疫的来源并通过V基因序列合成重组(优选VH与DH和JH，VL与JL序列重组)制备的文库，可用于分离针对任何抗原的抗体。例如，母案申请WO92/01047教导了抗体片段可在细菌噬菌体表面展示，并且它们将结合抗原。抗体片段(例如，Fab，Fv，ScFv和VH)可利用该性质直接选择。

其它本领域已知的方法包括例如，美国专利5,698,426；6,291,159；5,658,727；5,667,988；和5,969,108中教导的那些。

另一实施方案中，识别已知靶的scFv可与分离自半合成人噬菌体抗体展示文库的scFv二聚化。(见，例如，Kruif and Logtenberg 1996.J.Biol.Chem.271：7630)。

一个实施方案中，所述双特异性分子可表达于任何用于表达抗体分子的表达系统，例如哺乳动物细胞，酵母诸如毕赤酵母(Picchia)，大肠杆菌，杆状病毒等。一个实施方案中，所述双特异性分子在NEOSPLA载体系统(见，例如，美国专利6,159,730)中表达。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子，小鼠beta球蛋白主要启动子，SV40复制起点，牛生长激素多腺苷酸序列，新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2，二氢叶酸还原酶基因以及前导序列。

一个实施方案中，所述双特异性分子包含合成连接肽。

这些双特异性分子具有已知靶的一或多个结合位点，并在一或多个结合位点表达文库。所述双特异性分子可用于，例如鉴定与已知靶非常接近或相关的分子。例如，本领域技术人员可在用于利用本领域已知方法选择诱导具体反应例如凋亡或细胞活化的实验中利用受试双特异性结合分子。被鉴定为产生被筛选的反应的双特异性分子可随后被鉴定并测定其特异性。利用所述方法，可鉴定与具体的目的靶非常相关的分子，例如T细胞标记或其它信号分子(诸如CRIPTO-I，死亡结构域分子，参与凋亡的分子)。已知靶和新鉴定为“最近邻居(nearest neighbor)”的分子的接近性可利用免疫沉淀和其它本领域已知的技术证实。利用这些方法，可鉴定分子作为用于调节具体细胞反应的靶。

一个实施方案中，本发明的多肽含有包含下图所示核苷酸序列的核酸序列编码的氨基酸序列：显示于图8A(SEQ ID NO：16)，图8B(SEQ IDNO：17)，图8C(SEQ ID NO：18)，图10A(SEQ ID NO：22)，图10B(SEQ IDNO：23)。另一实施方案中，本发明的核酸分子包含显示于图8A(SEQ IDNO：16)，图8B(SEQ ID NO：17)，图8C(SEQ ID NO：18)，图10A(SEQ IDNO：22)，图10B(SEQ ID NO：23)的核苷酸分子。

另一实施方案中，本发明的多肽分子包含显示于图9A(SEQ ID NO：19)，图9B(SEQ ID NO：20)，图9C(SEQ ID NO：21)，图11A(SEQ ID NO：24)，或图11B(SEQ ID NO：25)的氨基酸序列。

另一实施方案中，本发明的多肽是由包含下图所示核苷酸序列的核酸序列编码的：图12A(SEQ ID NO：26)，图12B(SEQ ID NO：27)，图14(SEQ IDNO：30)，或图15(SEQ ID NO：31)。另一实施方案中，本发明的核酸分子包含显示于图12A(SEQ ID NO：26)，图12B(SEQ ID NO：27)，图14(SEQ IDNO：30)，或图15(SEQ ID NO：31)的核苷酸分子。

一个实施方案中，本发明的多肽分子包含显示于图13A(SEQ ID NO：28)，图13B(SEQ ID NO：29)，图16(SEQ ID NO：32)，或图17(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列。

本发明序列表和附图中公开的其它核酸和氨基酸序列也包含在本发明的范围之内。

D.多肽的表达

操作分离的遗传物质以提供本发明上述的多肽以后，将基因以常规方式插入表达载体以导入宿主细胞，该宿主细胞可用于制备所需量的多肽，从而提供权利要求的多肽。

本文中，为说明书和权利要求书的目的，术语“载体”或“表达载体”，是指根据本发明作为载体将所需基因(desired gene)导入细胞并进行表达的载体。正如本领域技术人员所知，该载体可以很容易地从质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组中选择。总之，适用于本发明的载体将具有选择性标记、有利于所需基因的克隆的适当的限制酶切位点、进入真核细胞或原核细胞和/或在其中复制的能力。

为达到本发明的目的，可能应用许多表达载体系统。例如，一种类型的载体利用源于动物病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其它涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的应用。示例性载体包括美国专利6,159,730或6,413,777或US 2003 0157641 A1中教导的那些。此外，可通过导入一个或多个允许选择转染的宿主细胞的标记物，选择那些把DNA整合到自身染色体的细胞。所述标记可为营养缺陷宿主提供原养型，杀菌剂(例如抗生素)抗性或对重金属如铜的抗性。选择性标记基因可直接连接(linked)到DNA序列以便表达，也可通过共转化导入同一细胞。

一个实施方案中，可使用可诱导的表达系统。

其它元件也可是优化合成mRNA所需的。这些元件可包括信号序列拼接信号，以及转录启动子，增强子和终止信号。

一个实施方案中，分泌信号，例如数种性质已知的细菌前导肽(例如pelB，phoA，或ompA)中的任意一种，可与本发明的多肽的N末端在框内融合以获得所述多肽的最佳分泌。(Lei et al.1988 Nature 331：543；Better et al.Science 1988.240：1041；Mullinax et al.，1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8095)。

一个实施方案中，可利用包含编码肽接头的核酸序列的载体。另一实施方案中，可能需要首先将所需的编码序列(例如分泌信号，VL，接头肽，VH等)组装入信号序列，例如通过利用重叠引物的PCR扩增，然后连入质粒或其它载体。

在优选的具体实施方案中，将克隆的可变区基因，连同前文讨论过的修饰的重链和轻链的恒定区基因(优选人类的)一起，插入表达载体。优选的是，采用IDEC公司的专利表达载体是有效的，其名称为NEOSPLA(参见U.S.专利6,159,730)。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主要启动子(major promoter)、SV40复制起点、牛生长激素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。正如下文实例所见，已发现该载体在掺入可变区和恒定区基因、在CHO细胞中转染、经含有G418的培养基选择和甲氨喋呤扩增后，导致抗体的极高水平的表达。载体系统在美国专利第5,736,137和5,658,570中也作过讲解，上述二者均全文收录在本文中作为参考。该系统提供了高表达水平，如＞30pg/细胞/天。其它具代表性的载体系统也被公开，如美国专利第6,413,777中。

其它优选的实施方案中，本发明的多肽可利用多顺反子构建体，所述构建体如那些2001年11月16日提交的美国临时申请第60/331,481号公开的那些，该专利也全文收录在本文中作为参考。这些新开发的表达系统中，感兴趣的多基因产物诸如抗体的重链和轻链可由单一的多顺反子结构产生。这些系统有利地应用内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)，在真核宿主细胞中提供相对高水平的本发明的多肽。适宜的IRES序列已在美国专利第6,193,980号中公布，该专利收录在本文中。本领域技术人员可理解，该表达系统可用来有效地生产本申请中公开的所有多肽。

更为普遍的是，一旦编码多肽的单体亚基(如一修饰后的抗体)的载体或DNA序列得以制备，表达载体可被导入合适的宿主细胞。即，所述宿主细胞可被转化。将质粒导入宿主细胞可采用该领域技术人员熟知的多种技术完成，这些技术包括转染(包括电泳和电穿孔法)、原生质体融合法、磷酸钙沉淀法、与包被DNA的细胞融合、显微注射法和完整病毒感染法，但不限于上述方法。参阅Ridgway，A.A.G.所著″(Mammalian Expression Vectors)″第24章第.2节，470-472页“载体”，Rodriguez和Denhardt撰写(Eds)。(Butterworths，Boston，Mass.1988)。更为优选的是，通过电穿孔法将质粒导入宿主。转化细胞在适合轻链和重链生成的条件下生长，测定其重链和/或轻链蛋白合成(的量)。具代表性的分析技术包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光激活的细胞分选分析法(flourescence-activated cell sorter analysis，FACS)、免疫组织化学法等。

此处所用术语“转化”广义上涉及将DNA导入受体宿主细胞、改变其基因型并因此引发受体细胞改变的任意导入。

同理(Along those same lines)，“宿主细胞”涉及已被利用重组DNA技术构建的载体转化，并至少编码一个外源基因的细胞。在说明抗体从重组宿主分离的过程时，术语“细胞”和“细胞培养”可交替应用，均表示抗体来源，除非明确强调另有所指。换言之，从“细胞”回收多肽可以指从离心所得的(spun down)完整细胞回收，也可指从包含培养基或混悬的细胞的细胞培养中回收。

用于蛋白表达的宿主细胞首选哺乳动物来源的细胞，确信本领域技术人员有优选决定最适合将在其中表达所需基因产物的具体细胞系的能力。具代表性的宿主细胞株包括：DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(用SV40T抗原由CVI衍生的细胞系)、R1610(中国仓鼠纤维母细胞)、BALBC/3T3(小鼠纤维母细胞)、HAK(仓鼠肾细胞株)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)及293(人肾细胞)。优选CHO细胞。宿主细胞株通常获自商业服务，美国典型培养物保藏中心或已发表的文章。

另一实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如允许二巯基腱形成的细胞株(Derman，AIet al，1993.Science.262：1744；Bessette，PH.Et al.1999.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：13703)。

体外实验允许扩大规模以产生大量预期的多肽。组织培养条件下的哺乳动物细胞培养技术是本领域已知的，其中包括均质混悬液培养(homogeneous suspension culture)如在空运反应器或持续搅拌反应器中，或固定化(immobilized)或捕获的(entrapped)细胞培养如在中空纤维、微胶囊(microcapsules)中，在琼脂糖珠(microbeads)或陶瓷筒上。如果必要和/或需要，多肽溶液可通过常用的层析法纯化，如凝胶过滤法、离子交换层析法、DEAE层析法或(免疫-)亲和层析法，例如，在修饰的铰链区多肽的优选生物合成之后，或在本文描述的HIC层析步骤之前或之后。

编码本发明多肽的基因也可在非哺乳动物细胞如细菌、酵母菌或植物细胞中表达。从这点上可以理解不同的非哺乳动物单细胞微生物如细菌也可被转化，即那些可在培养物和发酵物中生长的微生物。易于转化的细菌包括肠杆菌科成员例如大肠杆菌或沙门氏菌的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。也可进一步理解，当在细菌中表达时，多肽通常成为包涵体的一部分。该多肽必须被分离、纯化然后组装成有功能的分子。如果想得到抗体的四价形式，亚单位会自我组装成四价抗体(WO02/096948A2)。

除原核生物外，也可利用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母(common baker’s yeast)是最常应用的真核微生物，尽管其它一些菌株也通常可用。对于在糖酵母(Saccharomyces)中表达，常用的载体如质粒YRp7(Stinchcomb et al.，Nature，282：39(1979)；Kingsman et al.，Gene，7：141(1979)；Tschemper et al.，Gene，10：157(1980))。该质粒已具有TRP1基因，该基因给缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母菌突变株提供选择性标记，所述菌株例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics，85：12(1977))。trpl损害的存在作为该酵母菌宿主细胞基因组的特性，通过在缺乏色氨酸的条件下生长，为检测转化提供有效的环境。

IV.从缺乏链间二硫键的多肽中分离至少含有一个链间二硫键的多肽

一方面，本发明涉及采用疏水作用层析hydrophobic interactionchromatography)从混合物中分离带两个重链部分的分子，该混合物中部分分子的两个重链以至少一个链间二硫键连接，也有部分分子没有通过至少一个二硫键连接。

疏水作用层析最早是在观察到含有碳氢化合物间隔臂(hydrocarbonspacer arms)但缺乏亲和配体的蛋白质可被固定在亲和力凝胶上之后发展起来的。从HIC支持物的洗脱可在改变溶剂、pH、离子强度或添加离液序列高的物质或有机物改性剂(organic modifier)如乙二醇或丙二醇后实现。关于疏水作用层析的一般原则的说明可在美国专利如3,917,527和4,000,098中找到。高效液相层析(HPLC)背景中的HIC用于在一单步骤方案中，用于从完整的抗体分子分离缺乏重链部分的抗体片段(如，F(ab′)2)。

本发明的分离方法可应用于未经纯化的多肽(如培养物上清或制备物或从原核生物包涵体分离制备的多肽制剂)。作为选择之一，本分离方法也可用于经过一个或多个初始纯化步骤获取的多肽混合物，例如在包含A型和B型的制备物已从亲和基质洗脱后。

一种实施方案中，应用HIC层析的结合分子包含本发明的连接肽。

在优选的实施方案中，HIC可用于已经过其它蛋白质纯化方法部分纯化的混合物。此处所用术语“部分纯化”包括这样的蛋白制备物，其中目的蛋白至少占5％重量，更优选至少占10％重量，最好优选至少占45％重量。初始或后续纯化步骤可用于去除下列物质，如免疫球蛋白聚集物、错折叠种类(misfolded species)、宿主细胞蛋白，以及来自之前的层析分离步骤的残留物质(诸如蛋白质A，条件是应用到该蛋白时)。一种实施方案中，HIC可对分离包含本发明连接肽的多肽进行。相应地，也可以理解于完整的纯化方案(protocol)的背景下应用HIC。可先于HIC或继HIC之后应用的举例性的纯化步骤包括：亲和层析法(例如，包含与受控的有孔玻璃共价偶联的蛋白A的PROSEP-A(BioProcessing Ltd.，U.K.)，或蛋白A EPHAROSEFastFlow(Pharmacia)或TOYOPEARL 650M蛋白A(TosoHaas))。对人γ1，γ2，或γ4重链优选蛋白A，对小鼠同种型优选蛋白G。如果所述分子含有CH3区域(结构域)则可应用Bakerbond ABXtm树脂。也可应用离子交换层析法作为补充或替代选择。这种考虑下，各种阴离子或阳离子取代基可被吸附于基质以形成层析所需的阴离子或阳离子支持物。阴离子交换取代基包括二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl，DEAE)、季铵基乙基(quaternaryaminoethyl，QAE)和季胺(quaternary amine，Q)等。阳离子置换取代基包括羧甲基(carboxymethyl，CM)、磺乙基(sulfoethyl，SE)、磺丙基(sulfopropyl，SP)、磷酸基(phosphate，P)和磺酸基(sulfonate，S)。纤维素离子交换树脂如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52可购自英国Maidstone，Kent，的华特门有限公司(Whatman Ltd.Maidstone，Kent，U.K.)，基于SEPHADEX和-locross-连接的离子交换物(-locross-linked ion exchangers)也是已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-、SP-SEPHADEX、DEAE-、Q-、CM-、S-SEPHAROSE和SEPHAROSEFast Flow的购自PharmaciaAB。此外，DEAE和CM衍生的乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物(ethyleneglycol-methacrylate copolymer)如TOYOPEARL DEAE-650S或M以及TOYOPEARL CM-650S或M都可得自Toso Haas Co.，Philadelphia，Pa。因为从离子交换支持物上洗脱通常需要添加盐，且由于HIC在增加的盐浓度的情况下得以增强，所以在离子交换层析步骤或其它以盐为介质的纯化步骤之后采用HIC步骤是优选的。附加的纯化方案可包括如下步骤，但不必局限于此：进一步的离子交换层析、大小排阻层析、病毒灭活、浓缩、冷冻干燥、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、透析、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅层析、肝素SEQHAROSETM层析、层析聚焦或硫酸铵沉淀。

在采用所述方法纯化之前，含有要分离的多肽混合物的组合物最好放置在酸性或近中性PH值的缓冲液中。例如，可通过如下步骤完成：加入浓缩的缓冲液，将样品重悬在缓冲液中，更换缓冲液(如采用透析或超滤)。也可简单地调整样品缓冲液的pH使之保持在所需范围。

在高离子浓度时疏水作用达到最强，因此，这种分离形式在盐沉淀或离子交换步骤之后方便地进行。高盐浓度使得蛋白更易吸附于HIC层析柱，但根据蛋白的特性及所选HIC配体的不同，实际的盐浓度会在一个很宽的范围内变化。各种离子可以以所谓的soluphobic系列排列，这它们根据是否增强疏水作用(盐析效应)或破坏水结构(离液序列高的效应)并导致疏水作用的衰减，准备不同的离子。根据盐析效应增强的顺序排列的阳离子为Ba++＜Ca++＜Mg++＜Li+＜Cs+＜Na+＜K+＜Rb+＜NH4+，根据离液序列高的效应增强的顺序排列的阴离子为P0---＜S04--＜CH3COOO-＜Cl-＜Br-＜NO3-＜ClO4-＜I-＜SCN-。

一般来说，Na，K或NH4的硫酸盐可有效地增强HIC中配体-蛋白的相互作用。盐类对相互作用强度的影响通过如下所列关系阐明：(NH4)2SO4＞Na2SO4＞NaCl＞NH4Cl＞NaBr＞NaSCN。一般说来，约0.75到约2M之间的硫酸铵浓度和约1到4M之间的NaCL浓度是有用的。

在制备HIC层析柱时要用到一些层析支持物，应用最广泛的是琼脂糖、二氧化硅、有机聚合物或共聚体树脂。疏水作用材料通常为基础基质(如疏水碳水化合物(如交联的琼脂糖)或合成的共聚体材料)，其偶联有疏水配体。优选的HIC材料包含由苯基团取代的琼脂糖树脂。具代表性的HIC材料包括：苯基SEPHAROSETM，具有低或高取代的FAST FLOW(Pharmacia LKBBiotechnology，AB，Sweden)；苯基SEPHAROSETM高效柱；苯基或丁基-SEPHAROSECL-4B，丁基-SEPHAROSEFF，辛基-SEPHAROSEFF和苯基-SEPHAROSEFF(Pharmacia LKB Biotechnology AB，Sweden)；FractogelTM EMD丙基或FRACTOGELTM EMC苯基柱(E.Merck，Germany)；MACROPREPTM Methyl or MACRO-PREPTM t-丁基支持物(Bio-Rad，California)；WP HI-Propyl(C3)TM柱(J.T.Baker，New Jersey)示例性HIC材料也可得自日本东京Tosoh公司、产品名称为TOYOPEARL醚650，苯基650，丁基650(Fractogel)，醚-5PW-HR，或苯基-5PW-HR；来自Miles-Yeda，Rehovot，Israel、产品名称为烷基-琼脂糖，其中烷基类包含2-10个碳原子，以及J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.、产品名称为Bakerbond WP-HI-丙基。采用常规的化学方法制备所需的HIC层析柱也是可能的。(Sa：例如，Er-el.Z.gl all，Biochem.Biophys.Res.Comm.49：383(1972)或Ulbrich，V.rdgL Coll.Czech.Chem.Commum.9：1466(1964))。

具体凝胶的选择可由熟练的技术人员决定。一般来说，蛋白和HIC配体之间的作用强度随着该烷基配体的链长增加而增加，但含有约4到约8个碳原子的配体对大多数分离多肽而言是合适的。苯基团与戊基具有相似的疏水性，但其选择性可由于与蛋白质芳香基团之间可能存在pi-pi轨道相互作用而不同。选择性也可能受到支撑树脂的化学性质的影响。

配体密度是一重要参数，不仅影响相互作用强度，还影响层析柱的容量。商业化的苯基或辛基苯基凝胶的配体密度一般为40皮摩尔/毫升(pmoles/ml)凝胶床。凝胶容量是具体目的蛋白以及PH值、温度以及盐的种类和浓度的函数，但一般预期在3-20mg/ml凝胶的范围内。

一般说来，温度的降低会导致HIC材料间相互作用的下降。然而，升高温度获得的任何益处也必须与其可能对蛋白质稳定性存在的不利作用相权衡。

一种实施方案中，本发明的多肽可被同步(isocratically)洗脱。在同步洗脱中，所有化合物从起始端开始迁移通过柱。然而，每种化合物以不同的速度迁移，造成较快或较慢的洗脱速度，例如，正如本文实例中所作说明，A型蛋白可随着液流通过层析柱而被洗脱。

另一实施方案中，本发明的一种或多种多肽可结合于层析柱并洗脱，例如采用逐步洗脱(stepwise elution)或梯度洗脱(gradient elution)。不管是逐步洗脱还是梯度洗脱，均可通过不同途径完成。(a)通过改变盐浓度，(b)通过改变溶剂极性或(c)通过加入去污剂。通过降低盐浓度，吸附的蛋白质按照疏水性增加的顺序被洗脱。极性的改变可受到添加溶剂如乙二醇、丙二醇或(异)丙醇的影响，因而降低疏水作用的强度。去污剂的功能是作为蛋白质的置换剂，主要应用于膜蛋白的纯化。

进行分离的过程中，多肽混合物可与HIC材料接触，例如采用成批纯化技术或采用柱。HIC纯化前，可能希望去除任何离液序列高的试剂或疏水性强的物质，例如通过使混合物通过预层析柱(precolumn)来进行。

例如，对于成批纯化(batch purification)，HIC材料在所需的起始缓冲液中制备或平衡。获得HIC材料的浆(slurry)。多肽溶液与浆接触，使至少一种待分离的多肽吸附在HIC材料上。含未与HIC材料结合的多肽的溶液从所述浆中分离，例如，通过允许所述浆沉淀而移除上清液。对所述浆采用一或多道洗涤步骤。如果需要，填充材料可与电导率较低的溶液结合，以使与HIC材料结合的多肽解吸附。为洗脱结合的多肽，可降低盐浓度。

一种实施方案中，HIC材料可被填充在层析柱中。可将含有待分离多肽的混合物上样于层析柱，允许至少一种待分离多肽吸附到层析柱上。未吸附到层析柱上的多肽流经层析柱并被收集起来。为洗脱结合的多肽，可降低盐浓度，例如采用逐步方式或利用盐浓度梯度。

由于B型较A型疏水性强，它不可逆地吸附于固定相(stationary phase)，采用约0.7M(如0.73M)硫酸铵/20mM磷酸钠，PH值4到8作为流动相(mobilephase)。A型在这些条件下与固定相结合的程度低，因此被同步洗脱，即与流经层析柱的部分一起离开层析柱。同步洗脱A型后，从流动相去除硫酸铵使B型解吸附。

在示例性纯化方案中，HIC材料在所含盐浓度使得电导率在约160到约110Ms/cm之间，更优选约140到约110Ms/cm之间，更优选在约130或约120Ms/cm到约117Ms/cm的缓冲液中达到平衡。例如，具代表性的起始溶液含盐浓度为约1M到0.7M，如1M到0.7M硫酸铵。在优选的实施方案中，含有待分离的多肽混合物的溶液也具有相同或大致相同的电导率(如采用浓缩的盐母液)。在这些条件下，A型在电导率约为120mS/cm时从层析柱洗脱。为洗脱B型，将逐级或线性梯度下降的硫酸铵内含物加至层析柱。B型在电导率约为115到约100mS/cm时洗脱。

一种实施方案中，所述纯化方法产生含有多肽分子的组合物，该多肽分子含有至少两个靶结合位点和两个重链部分，但重链部分缺少CH2区域，其中超过约50％以上的分子的存在形式是两个重链部分以至少一个链间二硫键连接。另一种实施方案中，超过约60％以上的分子的存在形式是两个重链部分以至少一个链间二硫键连接。另一种实施方案中，超过约70％以上的分子的存在形式是两个重链部分以至少一个链间二硫键连接。另一种实施方案中，超过约80％以上的分子的存在形式是两个重链部分以至少一个链间二硫键连接。另一种实施方案中，超过约90％以上的分子的存在形式是两个重链部分以至少一个链间二硫键连接。

一种实施方案中，该物质纯化方法产生含有重组多肽分子的组合物，该重组多肽分子含有至少两个靶结合位点和两个重链部分，其中约99％以上的分子的存在形式是两个重链部分以至少一个链间二硫键连接。

一种实施方案中，该物质纯化方法产生含有多肽分子的组合物，该多肽分子含有至少两个靶结合位点和两个重链部分，其中约95％以上的分子的存在形式是两个重链部分以至少一个链间二硫键连接，而多肽的重链部分来自IgG4同种型(isotype)抗体。

一种实施方案中，该物质纯化方法产生含有多肽分子的组合物，该多肽分子含有两个轻链部分和两个重链部分，但重链部分缺少CH2区域，其中约80％以上的分子的存在形式是两个重链部分没有以至少一个链间二硫键连接。

另一方面，本发明也提供测定纯化和/或优选生物合成的结果的方法，包括测定组合物中A型和B型的相对量。A型和B型的可通过下列方法测定：例如本文描述的非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳或质谱分析法。

V.多肽的标记或偶联

本发明中的多肽分子可以非偶联的形式应用，也可与至少一种分子偶联，例如，易化抗原检测或用于患者的显像或治疗。本发明的多肽可在纯化之前或之后被标记或偶联。具体地说，本发明的多肽可偶联于细胞毒素(如放射性同位素、细胞毒药物或毒素)治疗剂、细胞增殖抑制剂、生物毒素、前体药物、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物学应答调节物、药学制剂、免疫活性配体(如淋巴因子或抗体，其中所得分子既可偶联于肿瘤细胞，也可偶联于效应细胞如T细胞)或PEG。另一种实施方案中，本发明的多肽可偶联于降低肿瘤血管形成的分子。其它实施方案中，公开的组合物可包含与药物或药物前体偶联的本发明的多肽。本发明的其它实施方案包括与具体生物毒素或其细胞毒片段如蓖麻毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素或白喉毒素偶联的本发明的多肽的用途。偶联或非偶联的多肽的选择取决于癌的类型和分期、辅助治疗的应用(如化疗或外部放疗)以及患者的状况。可以理解，考虑到本文所教导的内容，本领域技术人员可以轻易地做出这种选择。

也可以理解，先前的研究中，在动物模型和部分人类病例中，同位素标记的抗肿瘤抗体已成功地用于破坏实体瘤和淋巴瘤/白血病的瘤细胞。常见的同位素包括：⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。放射性核素通过产生电离辐射起作用，电离辐射可导致核DNA链多处断裂，从而导致细胞死亡。用于产生治疗偶联物的同位素通常可产生高能量α-或β-粒子，该粒子具有短路径长度(short path length)。这种放射性核素杀死近距离的细胞，例如偶联物已附着或进入其中的肿瘤细胞。它们对非局部细胞很少或没有作用。放射性核素基本上是非免疫原性的。

关于与本发明有关的放射标记的偶联物的应用，本发明的多肽可被直接标记(如通过碘化作用)，或通过应用螯合剂间接标记。此处所用术语“间接标记”和“间接标记途径”均指螯合剂与分子共价结合，而至少一种放射性核素与该螯合剂相连。这种螯合剂通常指双功能螯合物，它们既与多肽结合也与放射性同位素结合。具体优选的螯合剂包括1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(1-isothiocycmatobenzyl-3-methyldiothelenetriaminepentaacetic acid)(″MX-DTPA″)和环己基二亚乙基三胺五乙酸(cyclohexyl diethylenetriamine pentaacetic acid)(″CHX-DTPA″)衍生物。其它螯合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。具体优选用于间接标记的放射性核素包括¹¹¹In和⁹⁰Y。

本文术语“直接标记”和“直接标记途径”均指螯合物与多肽直接共价结合(典型的是通过氨基酸残基)。更具体地，这些结合方法学包括随机标记和位点定向标记(site-directed labeling)。对于后者，标记针对多肽的特异位点，如仅存在于偶联物Fc部分的N端连接的糖残基。此外，不同的直接标记技术和方案适用于本发明。例如，锝-99m标记的多肽可通过以下方法制备：配体交换方法，通过用含二价锡离子的溶液还原高锝酸钠(TcO₄)，将还原的锝螯合在Sephadex柱上，并将多肽加载于该柱；或批量标记技术(batchlabeling techniques)，例如，通过将高锝酸钠、还原剂诸如SnCL2、缓冲液如邻苯二甲酸钠-钾和分子一起保温。无论如何，优选用于直接标记多肽的放射性核素在本领域是众所周知的，具体优选用于直接标记的放射性核素是通过酪氨酸残基共价连接的¹³¹I。根据本发明的多肽可，例如，利用以下物质衍生：放射性碘化钠或碘化钾以及化学氧化剂如次氯酸钠、氯胺-T等，或酶氧化剂如乳酸过氧化物酶(lactoperoxidase)、葡萄糖氧化酶和葡萄糖。然而，为达到本发明的目的，间接标记方法是特别优选的。

与螯合剂和螯合剂偶联物有关的专利在本领域中是已知的。例如，Gansow的美国专利第4,831,175号是关于多取代的二亚乙基三胺五乙酸螯合物，含有二乙撑三胺五乙酸的蛋白质偶联物，以及这些物质的制备方法。Gansow的美国专利第5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287及5,124,471号也是关于多取代的DTPA螯合物。这些专利全文收录在本文中作为参考。适用的金属螯合剂的其它实例是依地酸钙钠酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、二乙撑三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid，DPTA)、1，4，8，11-四氮杂四癸烷(tetraazatetradecane)、1，4，8，11-四氮杂四癸烷-1，4，8，11-四乙酸、1-(oxa)-4，7，12，15-四氮杂十七烷(tetraazaheptadecane)-4，7，12，15-四乙酸等。环己基-DTPA或CHX-DTPA是具体优选的。还有其它适用的螯合剂，包括那些尚未发现的，熟练的技术人员可轻易地辨别出来，它们明显属于本发明的范围。

适用的螯合剂，包括在共同未决申请系列第08/475,813、08/475,815和08/478,967号中用于促进螯合作用的具体的双功能螯合剂，优选被选择以为三价金属提供高亲和力，显示增加的肿瘤-非肿瘤比率(tumor-to-non-tumor ratios)、降低的骨骼摄取、以及放射性核素在靶位点即B细胞淋巴瘤位点的更多的体内贮留。然而，其它具有或不具所有这些特性的双功能螯合剂在本领域是已知的，它们也可能对肿瘤治疗有益。也可以理解，根据本文的技术，多肽可与不同放射性标记物偶联以用于诊断和治疗目的。为此目的，全文均收录在本文的参考文献中的、前述的待定申请，公开了在给药治疗性分子之前，用于肿瘤诊断性“显像”的放射标记的治疗偶联物。“In2B8”偶联物含有特异性针对人CD20的鼠单克隆抗体2B8，该单克隆抗体通过双功能螯合剂即MX-DTPA(diethylenetriaminepentaaceticacid)与¹¹¹In结合，MX-DTPA是1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基-DTPA(1-isothiocyanatobenzyl-3-methyl-DTPA)和1-甲基-3-异硫氰酸根合苄基-DTPA(1-methyl-3-isothiocyanatobenzyl-DTPA)按1∶1的比例的混合物。具体优选111In作为诊断用放射性核素，因为其在大约1到10mCi范围之间可安全施用而无可检出的毒性，且影像资料对随后的⁹⁰Y-标记抗体的分布通常有预示意义。多数影像学研究利用5mCi ¹¹¹In-标记的抗体，因为该剂量既安全，且与较低的剂量相比有增加的显像效果，给予抗体三到六天后出现最佳的显像。请参阅，例如，Murray，J.Nuc.Med.26：3328(1985)及Carraguilloet al.，J.Nuc.Med.26：67(1985)。67(1985)。

正如上文所示，不同的放射性核素可应用于本发明，本领域技术人员很容易辨别在不同情况下哪种放射性核素最适合。例如，¹³¹I是广为人知的用于靶向的免疫治疗的放射性核素。然而，¹³¹I的临床应用可被如下几个因素所限：八天的物理半衰期、碘化的抗体在血液中和肿瘤位点的脱卤化作用、放射特性(例如大量的gamma成分)，其对于在肿瘤内的局部剂量堆积(deposition)可能是次最佳的。随着更好的螯合剂的出现，将金属螯合基团与蛋白质结合的机会，增加了应用其它放射性核素如¹¹¹In和⁹⁰Y的可能性。在放射免疫治疗应用中利用⁹⁰Y有几点好处：⁹⁰Y64小时的半衰期长到足以在肿瘤中蓄积，而且不像¹³¹I，⁹⁰Y是高能量的纯的β放射源，衰减过程中不伴有gamma辐射，在组织中的范围是100到1000细胞直径。此外，最小量的贯穿辐射允许对门诊患者施用⁹⁰Y-标记的分子。此外，不需标记的多肽的内化来杀死细胞，电离辐射的局部放射对缺乏靶抗原的临近肿瘤细胞应该是致命的。

本领域技术人员可以理解，这些无放射活性的偶联物，也可根据所选的要偶联的物质，采用不同的技术组合起来。例如，带生物素的偶联物可通过如下方法制备：例如，使多肽与生物素的活性酯如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯起反应。同样，带荧光标记的偶联物可在偶联剂存在的情况下制备，例如所述偶联剂如上文所列那些；或者与异硫氰酸酯优选异硫氰酸荧光素反应。本发明的多肽与细胞生长抑制/细胞毒性物质的偶联物及金属螯合物可采取类似的方式制备。

本发明中应用的制剂优选是细胞毒药物，具体指那些应用于癌症治疗的药物。此处，所用“细胞毒素或细胞毒性物质”是指对细胞生长和增殖有害，并可能减少、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的任何物质。具代表性的细胞毒素包括但不限于：放射性核素、生物毒素、酶活性毒素、细胞生长抑制或细胞毒治疗物质、前体药物、免疫活性配体和生物应答调节剂如细胞因子。任何可阻止或延缓免疫活性细胞或恶性肿瘤细胞生长的细胞毒素均在本发明的范畴内。

一般来说，示例性细胞毒素包括：细胞生长抑制剂、烷化剂、抗代谢物、抗增殖剂、微管蛋白结合物、激素类和激素拮抗剂等。适用于本发明的具代表性的细胞生长抑制剂包括：烷化剂如氮芥(mechlorethamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulfan)、美法仑(melphalan)或三亚胺醌(triaziquone)，以及亚硝基脲化合物(nitrosoureacompounds)如亚硝脲氮芥(carmustine)、环己亚硝脲(lomustine)或甲基环己亚硝脲(semustine)。细胞毒性物质的其它优选类别包括，例如美登素类(maytosinoid)家族的药物。细胞毒性物质的其它优选类别包括：例如蒽环类抗生素(anthracycline)家族的药物、长春花类(vinca)药物、丝裂霉素(mitomycins)、博来霉素(bleomycins)、细胞毒性核苷、蝶啶类药物、二炔基类(diynenes)和鬼臼毒素(podophyllotoxins)。这些类别中具体有用的成分包括：例如，阿霉素(adriamycin)、去甲柔红霉素(carminomycin)、柔红霉素(daunorubicin)(道诺霉素(daunomycin))、多柔比星(doxorubicin)、氨基蝶呤(aminopterin)、氨甲喋呤(methotrexate)、甲喋呤(methopterin)、光辉霉素(mithramycin)、链黑菌素(streptonigrin)、二氯甲氨喋呤(dichloromethotrexate)、丝裂霉素C(mitomycin C)、放线菌素D(actinomycin-D)、泊非霉素(porfiromycin)、5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)、氟尿嘧啶脱氧核苷(floxuridine)、呋喃氟尿嘧啶(ftorafur)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷胞嘧啶(cytosine arabinoside)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)或鬼臼毒素衍生物如依托泊甙(etoposide)或磷酸依托泊苷、美法仑、长春花碱(vinblastin)、长春新碱(vincristine)、异长春碱(leurosidine)、长春酰胺(vindesine)和长春罗新(leurosine)等。适用于本发明教导的还有其它细胞毒素，包括紫杉醇(taxol)、紫杉烷(taxane)、松胞菌素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、tenoposide、秋水仙碱(colchicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普奈洛尔(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)及其类似物或同系物。激素和激素拮抗剂也适用于本发明的教导，例如皮质激素如强的松(prednisone)，黄体酮(progestin)如羟孕酮(hydroxyprogesterone)或美托孕酮(medroprogesterone)，雌激素如己烯雌酚(diethylstilbestrol)，抗雌激素药如它莫西芬(tamoxifen)，雄激素如睾酮及芳香酶抑制剂如aminogluthetimide。正如上文所述，本领域技术人员可对所需化合物进行化学修饰，使该化合物的反应更利于制备本发明的偶联物。

优选的细胞毒素的具体实例包括抗肿瘤抗生素中enediyne家族的成员或衍生物，包括刺孢霉素(calicheamicin)、esperamicins或蒽环类抗生素(dynemicins)。这些毒素极其强效，通过使核DNA断裂导致细胞死亡。不象蛋白质毒素，在体内可被裂解生成许多无活性但有免疫原性的多肽片段，毒素如刺孢霉素、esperamicins和其它enediynes都是小分子，基本上无免疫原性。这些非肽类毒素通过先前曾被用于标记单克隆抗体和其它分子的技术化学连接于二聚体和四聚体。这些连接技术学包括通过仅存在于构建体Fc部分的N端连接的糖残基的位点特异性连接。这种定点连接方法的优势是降低了连接对该结构的结合特性可能产生的影响。

如前文所述，适用的细胞毒素可包括前体药物(prodrug)。此处所用术语“前体药物”是指药物活性物质的前体或衍生物，其相对于亲本药物对肿瘤细胞的细胞毒性较小，并能被酶激活或转化为活性更强的亲本形式(parentform)。适用于本发明的前体药物包括但不限于：含磷酸盐(酯)的前体药物、含硫代磷酸盐(酯)的前体药物、含硫酸盐(酯)的前体药物、含肽的前体药物、含β-内酰胺的前体药物、任意取代的含苯氧基乙酰胺(phenoxyacetamide)的前体药物、任意取代的含苯乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其它5-氟脲嘧啶前体药物，这些前体药物可被转化为活性更强的无细胞毒性的药物。可被衍生为应用于本发明的前体药物形式的细胞毒性药物的其它实例包括上述那些化疗药物。

其它细胞毒素中，可以理解，多肽也可与生物毒素如蓖麻毒素亚单位A、相思豆毒素(abrin)、白喉毒素、肉毒素(botulinum)、cyanginosins、海藻毒素(saxitoxin)、志贺氏菌毒素(shigatoxin)、破伤风毒素(tetanus)、河豚毒素(tetrodotoxin)、单端孢霉烯(trichothecene)、verrucologen或毒性酶连接。优选的是，采用允许结合分子-毒素构建体直接表达的基因改造技术来制备这种构建体。其它可与本发明的多肽连接的生物学应答调节物包括细胞因子如淋巴因子和干扰素。根据本发明的公开，本领域技术人员可采用常规技术轻易合成这种结构。

可与本发明公开的多肽连接的、适宜的细胞毒素的其它类别是放射增敏剂，该放射增敏剂可被有效地针对肿瘤或免疫反应性细胞。这种药物增强了对电离辐射的敏感性，因此增加了放疗的效果。被肿瘤细胞内化的偶联物在细胞核附近释放放射增敏剂，该部位的放射敏化作用会达到最大。本发明非结合的放射增敏剂连接的多肽，可很快从血液中清除，其余的放射增敏剂定位在靶肿瘤中，使得正常组织的摄取最少。从血液中快速清除后，辅助放疗会以下列三种途径之一进行：1)特异性针对肿瘤的外部射线束，2)直接植入肿瘤的放射活性，3)利用相同靶向型分子的全身放免治疗。这种途径的一种有潜在吸引力的变化将是把治疗用放射性同位素与放射增敏剂的免疫偶联物结合起来，因此提供只需给患者施用单一药物的便利。

一种实施方案中，增强多肽稳定性或效能的部分(moiety)可被偶联。例如，一种实施方案中，PEG可偶联于本发明的多肽上以延长其在体内的半衰期。Leong，S.R.，et al.2001.Cytokine 16：106；2002；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531；或Weir et al.2002.Biochem.Soc.Transactions 30：512.

VI.多肽的施用

制备本发明的多肽并给患者施用的方法，对本领域的技术人员而言是熟知且容易确定的。本发明的多肽的施用途径包括经口服、通过吸入或局部应用的胃肠外给药。此处所用术语“胃肠外”包括经静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠内或阴道内施用。通常优选的非肠道施用剂型是经静脉内、动脉内、皮下和肌内施用剂型。对于本发明范畴内的所有这些剂型，施用剂型将是注射用溶液，具体地说是经静脉或动脉内注射或滴注的剂型。通常，适用于注射的药物组合物包含缓冲液(如醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(如多山梨醇酯(polysorbate))、任选的稳定剂(如人白蛋白)等。然而，在适用于本文所讲的其它方法中，该多肽可被直接递送到有害细胞群所在部位，因此增加患病组织对治疗药物的暴露。

非肠道施用剂型的制备物包括无菌水或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油及可注射的有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、含乙醇/水的溶液、乳剂或混悬液，包括盐和缓冲介质。本发明中，药学上可接受的载体包括但不限于：0.01-0.1M并优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常见的胃肠外载体包括磷酸盐溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内载体包括液体、营养补充物、电解质补充物如那些基于林格氏葡萄糖的等等。也可能有防腐剂和其它添加剂，如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。更为具体地说，适用于注射用的药学组合物包括无菌水溶液(水溶的)或胶体溶液和用于即时制备无菌注射溶液或胶体溶液的无菌粉末。这些情况中，该组合物必须是无菌的，且为易注射的液体。其在加工和贮藏条件下应该是稳定的，优选在抗微生物如细菌和真菌污染的容器中保存。载体可为溶剂或分散介质，含有，例如水、乙醇、多羟基化合物(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及适宜的上述混合物。适当的流动性可通过如下方法保持，例如，通过利用卵磷脂包被、保持分散体系中所需的微粒大小及表面活性剂的应用。预防微生物污染可通过应用各种抗菌药和抗真菌药实现，所述抗菌药和抗真菌药例如对羟苯甲酸酯(parabens)、三氯叔丁醇(chlorobutanol)、苯酚(phenol)、抗坏血酸、邻乙汞硫基苯酸钠(thimerosal)等。许多情况中，所述组合物中优选包括等张剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可通过在组合物中含有延长吸收的药剂诸如单硬脂酸铝和白明胶，从而延长可注射组合物的吸收。

在任何情况中，无菌注射溶液可通过如下方法制备：将所需剂量的活性化合物(多肽本身或其与其它活性物质结合)，在适当的溶剂中与此处列举的一种成分或多种成分的组合混合，按照需要随后进行过滤灭菌。通常情况下，分散系统通过如下方法制备：将活性化合物与含有基础分散介质的无菌载体及上文列举的其它所需成分混合。对用于制备无菌注射液的无菌粉末，优选的制备方法是：真空干燥和冷冻干燥，使得从其先前无菌过滤的溶液，产生活性成分加附加所需成分的粉末。注射制备物经处理，根据本领域已知的方法在无菌条件下装入容器如安瓿、袋子、瓶、注射器或管形瓶中并封口。下一步，制备品可以以诸如共同未决申请U.S.S.N.09/259,337和U.S.S.N.09/259,338中说明的试剂盒的形式包装并出售，上述两篇文献收录在本文参考文献中。这种制品优选具有商标或包装插页(package inserts)，提示相关的组合物可用于治疗患有或易患自身免疫疾病或肿瘤的患者。本发明的组合物治疗上述情况的有效剂量，根据许多不同的因素会有差别，这些因素包括给药方法、靶位点、患者的生理状态、患者是人或动物、所用的其它药物，以及处理是预防性还是治疗性的。通常，患者是人类，但非人类哺乳动物包括转基因哺乳动物也可被治疗。治疗剂量可采用本领域技术人员已知的常规方法滴定，以使安全性和有效性达到最优化。对于用抗体被动免疫，剂量范围可在，例如，0.0001到100mg/kg宿主体重之间，更常见是在0.01到5mg/kg宿主体重之间(0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)。例如，剂量可为1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg体重的范围内，优选至少1mg/kg体重。介于上述范围之间的剂量也意图在本发明的范围以内。患者可每日，或隔日(alternative day)，或每周，或根据经验分析决定的其它时间表接受所述剂量。具代表性的治疗是在延长的时期，如至少六个月内给药多个剂量。另一具代表性的治疗方案(regimes)是每两周给药一次，或每月一次，或每3到6月一次。具代表性的给药计划表包括1-10mg/kg或15mg/kg每日连续给药，30mg/kg隔日给药或60mg/kg每周一次。某些方法中，可同时施用两种或多种具不同结合特异性的单克隆抗体，其中每种抗体的给药剂量均在指示范围以内。

本发明的多肽可在多种情况下施用。单剂给药的间期可为每周一次、每月一次或每年一次。根据患者血中多肽或抗原水平的测定提示，给药间隔可为不定期的。某些方法中，调整剂量以使血浆多肽浓度达到1-1000μg/ml，某些方法则可达到25-300μg/ml。可选，结合分子可作为持续释放制剂施用，其中所需的给药频率降低。给药剂量和频率根据分子在患者体内的半衰期不同而不同。一般来说，人抗体的半衰期最长，其次是嵌合体抗体和非人抗体。一种实施方案中，本发明的结合分子可以非偶联的形式施用，另一实施方案中，本发明的多肽可以偶联的形式多次施用。再一实施方案中，本发明的结合分子可先以非偶联的形式施用，然后以偶联的形式施用，或以相反的顺序施用。

给药剂量和频率可根据该治疗是预防性或治疗性而有所不同。预防性应用中，含有本发明多肽或其混合成分的组合物，给予尚未在疾病状态中的患者以增加其抵抗力。这种量定义为“预防有效剂量”。这种用法中，精确剂量也依赖于患者健康状态和全身免疫力，但一般每个剂量的范围为0.1到25mg，具体是0.5到2.5mg。在长时间内，以相对频繁的间隔施用相对较低的剂量。某些患者在其余生中持续接受治疗。

治疗性应用中，有时需要以相对较短的间期施用相对较高的剂量(例如，约1到400mg/kg抗体每剂，通常对于放射免疫偶联物物更常用5到25mg的剂量，对于细胞毒素药物偶联的分子而言剂量则更高)，直到疾病进展减慢或终止，优选持续到患者显示疾病症状部分或完全缓解。此后，可给药还患者预防方案。

一种实施方案中，可应用编码本发明多肽的核酸分子治疗受试者。编码多肽的核酸的剂量范围为每位患者约10ng到1g，、100ng到100mg、1μg到10mg或30-300μg DNA。感染性表达载体的剂量为每剂10到100病毒粒不等、或更多。

治疗剂可通过非胃肠道、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹腔内、鼻内或肌内途径给药，用于预防性或治疗性治疗。免疫原性药物最常见的施用途径是经皮下，但其它途径同样有效。次常用的途径是肌内注射。这种类型的注射多在手臂或腿的肌肉中进行。某些方法中，药物直接注入沉积物(deposit)聚集的具体组织，例如颅内注射。分子的施用优选肌内注射或静脉输注。某些方法中，特定的治疗分子直接注射入颅。某些方法中，分子作为持续释放的组合物或装置诸如Medipad^TM装置施用。

本发明的药剂可任选与其它对需要治疗(例如，预防性或治疗性)的疾病或病症有效的药剂联用。

本发明的⁹⁰Y-标记的多肽的单次有效剂量(即治疗有效剂量)范围在约5到约75mCi之间，优选在约10到约40mCi之间。¹³¹I-标记抗体的无骨髓破坏作用的(non-marrow ablative)单次有效治疗剂量范围在约5到约70mCi之间，优选在约5到约40mCi之间。¹³¹I-标记抗体的有骨髓破坏作用的(ablative)单次有效治疗剂量(即可能需要自体骨髓移值)范围在约30到约600mCi之间，优选在约50到小于约500mCi之间。对于嵌合抗体，由于鼠抗体循环半衰期较长，¹³¹I-标记的嵌合抗体的无骨髓破坏作用的单次有效治疗剂量范围在约5到约40mCi之间，优选小于约30mCi。例如¹³¹I-标记的成像标准通常低于约5mCi。

当¹³¹I和⁹⁰Y的应用取得了大量临床经验后，其它本领域已知的放射性标记被用于类似目的。还有其它放射性同位素被用于成像。例如，适用于本发明的其它放射性同位素包括但不限于：¹²³I、¹²⁵I、³²P、⁵⁷Co、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁷⁷Br、⁸¹Rb、⁸¹Kr、⁸⁷Sr、¹¹³In、¹²⁷Cs、¹²⁹Cs、¹³²I、¹⁹⁷Hg、²⁰³Pb、²⁰⁶Bi、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、²¹²Pb、²¹²Bi、⁴⁷Sc、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹⁵³Sm、¹⁸⁸Re、¹⁹⁹Au、²²⁵Ac、²¹¹At及²¹³Bi。在这点上，α、γ和β放射源均适用于本发明。此外，根据本发明的公开，本领域技术人员可轻易决定哪种放射性核素适用于治疗所选的病程，而不需不恰当的实验。为此目的，已应用于临床诊断的其它放射性核素包括：¹²⁵I、¹²³I、⁹⁹Tc、⁴³K、⁵²Fe、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga及¹¹¹In。抗体也已经用有应用于可能用于靶向的免疫治疗的不同放射性同位素标记(Peirersz et al.Immunol.Cell Biol.65：111-125(1987))。这些放射性核素在较小的范围内包括¹⁸⁸Re、¹⁸⁶Re、¹⁹⁹Au、⁶⁷Cu，美国专利5,460,785给出了这些放射性同位素的附加资料，该专利收录在本文中作为参考。

不管本发明的多肽是否以偶联或非偶联的形式应用，可以理解本发明的一个主要优势是这些多肽可用于骨髓抑制的患者，即那些正在接受或已经接受了辅助治疗如放疗或化疗的患者。即，该多肽的有益的递送图谱(beneficialdelivery profile)(即相对短的血清停留时间、高结合亲和力和增强的局部化)使得它们对于治疗红骨髓储备下降并对骨髓毒性敏感的患者更为有益。在这点上，该多肽独特的递送图谱，使得它们对于向骨髓抑制的癌症患者施用放射标记的偶联物非常有效。同样，本发明的多肽可以以偶联或非偶联的形式用于先前接受过辅助治疗如外部射线放射治疗或化疗的患者中。在优选的其它实施方案中，该多肽(以偶联或非偶联的形式)可用于与化疗药剂的联合治疗方案。本领域技术人员可以理解，这种治疗方案可包括续贯给药、同时(simultaneous)、并存(concurrent)或同延(coextensive)给药公开的分子以及一或多种化疗剂。本发明在这方面具体的优选实施方案将包括放射标记的多肽的施用。

虽然该多肽可按上文刚刚所述的方式施用，但必须强调在其它实施方案中，偶联或非偶联的多肽可作为一线治疗药物施用于否则为健康的患者。在这些实施方案中，该多肽可施用于具有正常或平均水平的红骨髓储备、和/或未接受过或不是正在接受辅助治疗如外部射线放射治疗或化疗的患者。

然而，正如上文所讨论，本发明选择的实施方案包括对骨髓抑制患者施用多肽，或在与一种或多种辅助治疗诸如放疗或化疗组合或联用(即联用的治疗方案)。本文中与辅助治疗结合或联用给予多肽是指：该疗法与公开的多肽的续贯、同时、同延、并存、伴随(concomitant)或同期(contemporaneous)给予或应用。本领域技术人员会理解，联用治疗方案的不同组成部分可被定时施用或应用以增强治疗的整体有效性。例如，可在标准的已知疗程中施用化疗药剂，然后在几周之内施用本发明的放射免疫偶联物。相反，细胞毒素联合的多肽可经静脉内给药，然后应用肿瘤定向外部射线放射。然而在其它实施方案中，该多肽可与所选择的一种或多种化疗药剂在一次就诊时同时施用。熟练的技术人员(例如有经验的肿瘤学家)，可根据所选择的辅助治疗和本说明书的指导，轻易辨别有效的联合治疗方案而不需过多的实验。

从这点上可以理解，该多肽(带有或不带有细胞毒素)和化疗药剂的组合，可按任何顺序或在任意对患者提供治疗益处的时间窗内给药。换句话说，化疗药剂和多肽可按任意顺序给药或同时给药。在选择的实施方案中，本发明的多肽可施用于先前已接受化疗的患者。在另一实施方案中，该多肽和化疗治疗可基本同时或并存给药。例如，可在患者接受化疗的过程中给予结合分子。在优选的实施方案中，结合分子应在任何化疗药剂或治疗的1年内给药施用。在其它优选的实施方案中，该多肽应在任何化疗药物或治疗的10、8、6、4、或2月内施用。而在其它优选的实施方案中，该多肽应在任何化疗药剂或治疗的4、3、2或1周内施用。在其它实施方案中，该多肽应在所选择的化疗药物或治疗的5、4、3、2或1天内施用。可以进一步理解，这两种药剂或治疗可在数小时或数分钟内(即基本同时)施用于患者。

此外，根据本发明，骨髓抑制患者应指血细胞计数降低的任何患者。本领域技术人员可以理解，有几种血细胞计数参数常规用作骨髓抑制的临床指标，可据此轻易测定患者中骨髓抑制的程度。本领域接受的骨髓抑制测定的实例是绝对中性粒细胞计数(Absolute Neutrophil Count，ANC)或血小板计数。这种骨髓抑制或部分骨髓破坏(myeloablation)可以是各种生化病症或疾病的结果，所述病症和疾病是先前化疗或放疗的结果。在这方面，本领域技术人员会理解，接受过常规化疗的患者通常可出现红骨髓储备下降。如上文所讨论，由于可导致死亡率或发病率增加的、难以接受的副反应如贫血或免疫抑制，这种患者经常无法应用最佳水平的细胞毒素(即放射性核素)治疗。

更为具体地说，本发明的偶联或非偶联的多肽，可用于有效治疗ANC低于约2000/mm³或血小板计数低于约150,000/mm³的患者。更优选，本发明的多肽，可用于治疗ANC低于约1500/mm³、低于约1000/mm³的患者，更优选低于约500/mm³的患者。同样，本发明的多肽，可用于治疗血小板计数低于约75,000/mm³、低于约50,000/mm³、甚至低于约10,000/mm³的患者。更为普遍地说，本领域技术人员可应用政府制定的指南或方法轻易确定存在骨髓抑制的患者。

如上文所示，许多骨髓抑制患者已接受多种疗程，包括化疗、植入放疗或外部射线放射治疗。对于后者，外部放射源是为了对恶性肿瘤进行局部照射。对于植入放疗法，放射活性的反应物通过手术植入恶性肿瘤中，因此选择性照射疾病的部位。不管如何，本发明公布的多肽可用于治疗存在骨髓抑制的患者的疾患，而不管导致骨髓抑制的原因如何。

从这点上可进一步理解，本发明的多肽可与用于消除、降低、抑制或控制体内肿瘤细胞生长的任意化疗药剂的联合或组合治疗(即提供联用治疗方案)。如上文所讨论的，这种药物经常导致红骨髓储备的下降。这种下降可被本发明的化合物降低了的骨髓毒性完全或部分弥补，这对这种患者的肿瘤的进一步治疗有利。在其它优选的实施方案中，本文公开的放射标记的免疫偶联物，可与增加肿瘤细胞对放射性核素的敏感性的放射增敏剂一起应用。例如，可在放射标记结合分子已从血流中被大量清除、但在肿瘤或肿瘤部位仍保留治疗有效水平时，施用放射增敏化合物。

考虑到本发明的这些方面，适用于本发明的具代表性的化疗药物包括：烷化剂、长春花碱类(例如长春新碱(vincristine)和长春花碱(vinblastine))、甲基苄肼(procarbazine)、氨甲喋呤(methotrexate)和强的松(prednisone)。四药联合的MOPP方案(二氯甲基二乙胺(mechlethamine)(氮芥)、长春新碱(Oncovin)、甲基苄肼和强的松(prednisone))对于治疗各种类型的淋巴瘤非常有效，且含有本发明优选的一个实施方案。对MOPP-耐药的患者，可应用ABVD(即阿霉素(adriamycin)、博来霉素(bleomycin)、长春花碱和氮烯唑胺(dacarbazine))、ChlVPP(苯丁酸氮芥(chlorambucil)、长春花碱、甲基苄肼和强的松)、CABS(洛莫司汀(lomustine)、阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)和链唑霉素(streptozotocin))、MOPP加ABVD、MOPP加ABV(阿霉素、博来霉素和长春花碱)或BCVPP(卡莫司汀(carmustine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、长春花碱、甲基苄肼和强的松)的组合。Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，Malignant Lymphomas，inHarrison′s Principles of Internal Medicine 1774-1788(Kurt J.Isselbacher et al.，eds.，13th ed.1994)和V.T.DeVita et al.(1997)。其中引用的参考文献有标准剂量和治疗计划表。正如本文所述，这些治疗方案可不加任何更改或者按具体患者需要更改，而与本发明的一种或多种多肽联用。

本发明的背景(context)中有用的其它方案包括：单个烷化剂如环磷酰胺或苯丁酸氮芥的应用，组合诸如CVP(环磷酰胺，长春新碱和强的松)、CHOP(CVP和阿霉素(doxorubicin))、C-MOPP(环磷酰胺，长春新碱，强的松和甲基苄肼)，环磷酰胺、长春新碱、强的松和甲基苄肼)、CAP-BOP(CHOP加甲基苄肼和博来霉素)、m-BACOD(CHOP加氨甲喋呤，博来霉素和甲酰四氢叶酸(leucovorin))，ProMACE-MOPP(强的松、甲氨喋呤、阿霉素、环磷酰胺、依托泊甙和甲酰四氢叶酸加标准MOPP)、ProMACE-CytaBOM(强的松、阿霉素、环磷酰胺、依托泊甙、阿糖胞苷(cytarabine)、博来霉素、长春新碱、氨甲喋呤和甲酰四氢叶酸)及MACOP-B(氨甲喋呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、固定剂量的强的松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)的应用。本领域技术人员可轻易决定上述每种用药法的剂量和治疗计划。CHOP也可与博来霉素、氨甲喋呤、甲基苄肼、氮芥、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosine arabinoside)和依托泊甙组合应用。其它适用的化疗药物包括但不限于：2-氯脱氧腺苷(2-chlorodeoxyadenosine，2-CDA)、2′-脱氧考福霉素(2′-deoxycoformycin)和氟达拉滨(fludarabine)。

对患有中等或高级NHL而未实现缓解或复发的患者，可采用补救治疗。补救治疗所用药物如胞嘧啶阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、顺铂(cisplatin)、依托泊甙(etoposide)和异环磷酰胺(ifosfamide)。对于一定瘤性病变的复发或进展形式，常采用下述治疗计划：IMVP-16(异环磷酰胺、氨甲喋呤和依托泊甙)、MIME(丙米腙(methyl-gag)、异环磷酰胺、氨甲喋呤和依托泊甙)、DHAP(地塞米松(dexamethasone)、高剂量的阿糖胞苷和顺铂)、ESHAP(依托泊甙、地塞米松(methylpredisolone)、HD阿糖胞苷、顺铂)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊甙、甲基苄肼、强的松和博来霉素)及CAMP(洛莫司汀、氨甲喋呤、阿糖胞苷和强的松)，其中每种的剂量比例和方案都是已知的。

与本发明的多肽联合用药时化疗药剂的用量，可随不同患者而不同，或根据本领域已知的剂量给药。例如可参阅：Bruce A Chabner et al.，Antineoplastic Agents，in Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics 1233-1287((Joel G.Hardman et al.，eds.，9th ed.1996)。

如前文所讨论，本发明的多肽，其免疫反应性片段或重组体可按照药学有效剂量施用，以用于哺乳动物疾病的体内治疗。从这点上可以理解，本发明公开的结合分子可配制成可方便给药并增加活性剂的稳定性。优选的是，依照本发明的药学组合物，含有药学上可接受的、无毒的无菌载体例如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。为达到本申请的目的，偶联或不偶联于治疗药物的多肽的、其免疫活性片段或重组体的药学有效剂量，指足以获得与靶的有效结合并获益的剂量，例如改善疾病和病症的症状或检测物质或细胞。对于肿瘤细胞，该多肽优选能够与肿瘤或免疫反应性细胞上选定的免疫反应抗原相互作用，并使得那些细胞的死亡增加。当然，本发明的药学组合物可以以单个或多个剂量给药，以提供该多肽的药学有效剂量。

与本发明的范围一致，本发明的多肽，可依照前述治疗方法，以充足的剂量施用于人或动物，以提供治疗或预防效果。本发明的结合分子可按常规剂型(dosage form)用于这些人类和其它动物，该常规剂型可根据已知技术，通过将本发明的抗体与常规的、药学可接受的载体或稀释剂组合而制备。本领域技术人员会认可，药学上可接受载体和稀释剂的形式和特性由与其结合的活性成分的量、给药途径及其它已知的变量决定。本领域技术人员会进一步理解，含有一种或多种依照本发明的多肽的混合物将被证实特别有效。

VII.应用方法

本发明的多肽可用于诊断或治疗目的。本发明优选的实施方案提供用于诊断和治疗疾患的化合物、组合物、试剂盒和方法，例如需要该治疗的哺乳动物受试者的肿瘤性疾病。优选的受试者是人。

本发明的多肽会在一些不同应用中是有益的。例如，一种实施方案中，受试结合分子将对降低或清除具有被本发明的结合分子识别的靶的细胞有用。另一实施方案中，受试结合分子对降低循环中可溶性靶分子的浓度或清除该抗原有效。

一种实施方案中，肿瘤大小、抑制肿瘤生长和/或延长荷瘤动物的生存期。相应地，本发明也涉及在人或其它动物中，通过给该人或动物施用有效且无毒剂量的多肽治疗肿瘤的方法。本领域技术人员会能够凭借常规实验，决定该多肽用于治疗恶性肿瘤目的的、有效且无毒的剂量。例如，多肽的治疗有效剂量会根据诸如疾病分期(例如：I期对IV期)、年龄、性别、医学并发症(如免疫抑制的病症或疾病)、患者体重和该分子在患者中激发所需反应的能力之类的因素而有所不同。可调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，每日剂量可分几次给药，或根据治疗情况的紧急程度所提示，按比例降低剂量。然而，一般来说，预期有效剂量范围在约0.05到100毫克每公斤体重每天，更优选约0.5到10毫克每公斤体重每天。

为澄清起见，“哺乳动物”涉及任何分类为哺乳动物者，包括人、家养和农场动物、动物园饲养动物、运动用动物或宠物类动物，例如狗、马、猫、牛等。优选的哺乳动物是人。

“治疗”涉及治疗性治疗和预防性治疗两种。需要治疗者包括已患疾病或病症者，也包括预防疾病或病症者。因此，该哺乳动物可已被诊断患该病或病症，或者有患该疾病倾向或对该疾病易感。

如上文所讨论，本发明的多肽可与一种或多种肿瘤抗原或与免疫异常有关的抗原发生免疫反应。例如，对于肿瘤性疾病，本发明公开的多肽的抗原结合位点(即其可变区或免疫反应性片段或重组体)，在恶性肿瘤部位与所选择的肿瘤相关抗原结合。同样，在免疫(包括自身免疫)疾病中，本发明公开的多肽会与入侵细胞(offending cells)的所选标记结合。根据已报道的与肿瘤或免疫异常有关的分子的数目，本领域技术人员将会理解，本发明公开的多肽可源自多种完整抗体的任意一种。更为普遍地说，本发明中有用的多肽可得自或起源于与所选择的条件有关的靶或标记起反应的任意抗体(包括先前文献报道过的)。此外，用于产生本发明公开的多肽的亲本抗体或前体抗体、其片段，可为鼠、人、嵌合的、人源化的、非人类灵长类或灵长源化的。其它优选的实施方案中，本发明公开的多肽可含有如本文所述、具已被改变的恒定区的单链抗体构建体(诸如美国专利5,892,019所公开的，包含在本文作为参考)。因此，按照本文教导的这些类型的修饰的抗体中的任意一种，均适用于本发明。

此处所用的“肿瘤相关抗原”是指通常与肿瘤细胞相关的任意抗原，即与正常细胞相比出现在相同或更大范围。更常见地，肿瘤相关抗原包括使免疫反应性抗体定位在肿瘤细胞的任意抗原，而不考虑其在非恶性细胞上的表达。这种抗原是相对肿瘤特异性的，且其表达限于恶性细胞表面。作为一种选择，这种抗原在恶性和非恶性细胞上均可被发现。例如，CD20是在恶性和非恶性B细胞表面发现的泛(pan)B抗原，它已被证实是治疗非霍奇金淋巴瘤的免疫治疗抗体的极为有效的靶目标。从这方面看，泛T细胞抗原如CD2、CD3、CD5、CD6和CD7也含有本发明定义范围内的肿瘤相关抗原。其它具代表性的肿瘤相关抗原包括但不限于：MAGE-1、MAGE-3、MUC-1、HPV 16、HPV E6 & E7、TAG-72、CEA、L6-抗原、CD19、CD22、CD37、CD52、HLA-DR、EGF受体和HER2受体。许多情况中，这些抗原中任意一种的免疫反应性抗体已有文献报道过。本领域技术人员会理解，根据本发明，这些抗体的任意一种均可作为本发明的多肽的前体。

本发明多肽优选与上述肿瘤或免疫相关抗原相连或结合。因此，如下文一些部分具体详述的，本发明的多肽可源自，产生自，制备自多种与肿瘤相关抗原反应的抗体中的任何一种。优选实施方案中，所述多肽是修饰的或结构域缺失的抗体，其可利用遗传改造技术衍生，由此一或多种恒定区结构域的至少一部分被缺失或改变，以提供所需的生化性质诸如缩短的半寿期。更具体地，如下所示，本领域技术人员可轻易分离对应目的抗体的可变和/或恒定区的遗传序列并缺失或改变适宜核苷酸以提供本发明多肽，其根据本发明用作单体亚基。将理解本发明的相容多肽可在临床或商品范围内利用已经确立的方案表达或制备。

以前报道的与肿瘤相关分子反应的抗体可如本文所述而被改变，以提供本发明的多肽。可用于提供抗原结合区以产生或驱动公开的多肽的示例性抗体包括，但不限于2B8和C2B8(Zevalin^和Rituxan^，IDECPharmaceuticals Corp.，San Diego)，Lym1和Lym2(Techniclone)，LL2(Immunomedics Corp.，New Jersey)，HER2(Herceptin^，Genentech Inc.，South San Francisco)，B1(Bexxar^，Coulter Pharm.，San Francisco)，Campath^(Millennium Pharmaceuticals，Cambridge)MB1，BH3，B4，B72.3(Cytogen Corp.)，CC49(National Caner Institute)和5E10(University ofIowa)。可掺入受试结合分子的其它抗体结合位点包括：Orthoclone OKT3(CD3)，ReoPro(GpIIb/gIIa)，Zenapax(C25)，Remicade(TNF-a)，Simulect(CD25)，Synagis(RSV)，Mylotarg(CD33)，和Campath(CD52)。优选的实施方案中，本发明多肽将结合于上文列举的抗体相同的肿瘤结合抗原。具体优选的实施方案中，所述多肽将源自或结合相同的抗原如2B8，C2B8，CC49和C5E10，甚至更优选，将缺乏所有和部分CH2结构域。

一个实施方案中，本发明的结合分子结合CD23(美国专利6,011,138)。优选的实施方案中，本发明的结合分子结合的表位与5E8抗体结合的表位相同。另一实施方案中，本发明的结合分子包含来自抗-CD23抗体，例如，5E8抗体的至少一个CDR。

一个实施方案中，本发明的结合分子结合CRIPTO-I抗原(WO02/088170A2或WO03/083041A2)。优选的实施方案中，本发明的结合分子结合的表位与B3F6抗体结合的表位相同。另一实施方案中，本发明的结合分子包含来自抗-CRIPTO-I抗体，例如，the B3F6抗体的至少一个CDR。

第一个优选实施方案中，所述多肽将结合相同的肿瘤相关抗原如Rituxan^。Rituxan^(也已知为rituximab，IDEC-C2B8和C2B8)是第一种FDA认可用于治疗人B细胞淋巴瘤的单克隆抗体(见美国专利Nos.5,843,439；5,776,456和5,736,137，每篇文献都包含在本文作为参考)。Y2B8(⁹⁰Y标记的2B8；Zevalin；ibritumomab tiuxetan)是鼠C2B8亲本。Rituxan^是嵌合抗-CD20单克隆抗体，其抑制生长并据报道致敏特定的淋巴瘤细胞系，以在体外通过化学药剂的凋亡。所述抗体有效结合人补体，具有强FcR结合，并可经由补体依赖性(CDC)和抗体-依赖性(ADCC)机制在体外有效杀死人淋巴细胞(Reff et al.，血液83：435-445(1994))。本领域技术人员将理解根据本发明修饰的C2B8或2B8的二聚体变体(同源二聚体或异源二聚体)，可以以偶联的或非偶联的形式使用以有效治疗患有CD20+恶性疾病的患者。更常见地，必须重申本发明的多肽可以以“裸露的”或非偶联的状态或与细胞毒药剂偶联的状态使用以有效治疗多种疾病中的任何一种。

本发明其它优选实施方案中，本发明的多肽将源自或结合于与CC49相同的肿瘤相关抗原。如以前所述，CC49结合人肿瘤相关抗原TAG-72，其与人源特定肿瘤细胞表面相关，具体是LS174T肿瘤细胞系。LS174T[美国典型培养物保藏中心(本文ATCC)No.CL 188]是LS180(ATCC No.CL 187)结肠腺癌细胞系的变体。将进一步理解，多种鼠单克隆抗体已经开发，其特异性结合TAG-72。一种这样的单克隆抗体B72.3，是杂交瘤B72.3(ATCC No.HB-8108)产生的鼠IgG1。B72.3是利用人乳腺癌提取物作为免疫原开发的第一代单克隆抗体(见Colcher et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，78：3199-3203(1981)；和美国专利4,522,918和4,612,282，每篇文献都包含在本文作为参考)。其它针对TAG-72的单克隆抗体称为″CC″(对于结肠癌症)。如Schlom etal.(美国专利5,512,443其包含在本文作为参考)所述，CC单克隆抗体是利用由B72.3纯化的TAG-72制备的第二代鼠单克隆抗体。由于它们相对较好的TAG-72结合亲和力，以下CC抗体被保藏在ATCC，可要求有限制地获取：CC49(ATCC No.HB 9459)；CC 83(ATCC No.HB 9453)；CC46(ATCC No.HB 9458)；CC92(ATTCC No.HB 9454)；CC30(ATCC No.HB 9457)；CC11(ATCC No.9455)；和CC15(ATCC No.HB 9460)。U.S.P.N.5,512,443进一步教导了公开的抗体可通过利用技术本领域已知的重组DNA，用例如人恒定区(Fc)结构域取代小鼠恒定区来改变成所述抗体的嵌合形式。除了公开鼠和嵌合抗抗-TAG-72抗体，Schlom et al.也制备了如PCT/US99/25552中公开的人源化的CC49抗体的变体以及美国专利5,892,019公开的单链构建体，每一篇都包含在本文作为参考。本领域技术人员将理解每种前述的抗体，构建体或重组体，以及它们的变体可被修饰并用于提供本发明的多肽。

除了上述抗-TAG-72抗体，各个小组已经报道了结构域缺失的CC49和B72.3抗体的构建和部分定性(例如，Calvo et al.Cancer Biotherapy，8(1)：95-109(1993)，Slavin-Chiorini et al.Int.J.Cancer 53：97-103(1993)andSlavin-Chiorini et al.Cancer.Res.55：5957-5967(1995)。

本发明其它优选的实施方案包含修饰的抗体，其源自或结合与C5E10相同的肿瘤相关抗原。如共同未决申请09/104,717所述，C5E10是识别大约115kDa的糖蛋白决定簇的抗体，其显示对前列腺肿瘤细胞系(例如DU145，PC3，或ND1)特异。因此，结合本发明，特异性结合C5E10抗体所识别的肿瘤相关抗原的多肽(例如CH2结构域-缺失的抗体)可被制备并以偶联或非偶联的形式使用以治疗肿瘤疾病。具体优选的实施方案中，所述修饰的抗体将源自或包含自ATCC保藏号PTA-865的杂交瘤细胞系分泌的C5E10抗体的所有或部分抗原结合区。产生的修饰的抗体将如下所述偶联于放射性核素，并根据本发明的方法给予患有前列腺癌的患者。

总而言之，公开的发明可用于预防或治病性治疗任何包含允许所述结合分子靶向癌性细胞的抗原型标记的任何肿瘤。可治疗的示例性癌症包括，但不限于，前列腺癌，胃肿癌诸如结肠癌，皮肤癌，乳腺癌，卵巢癌，肺癌和胰腺癌。更具体地，本发明的结合分子可用于治疗卡波奇肉瘤(Kaposi′ssarcoma)，CNS肿瘤(毛细管成血管细胞瘤(capillary hemangioblastomas)，脑膜瘤和脑转移)，黑素瘤，胃肠和肾肉瘤，横纹肌肉瘤，胶质母细胞瘤(优选多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme))，平滑肌肉瘤，视网膜母细胞瘤，卵巢乳头状囊腺癌(papillary cystadenocarcinoma of the ovary)，Wilm′s瘤或小细胞肺癌。将理解适宜的多肽可源自于前述肿瘤的每一种相关的肿瘤相关分子，而且根据本发明的公开无需不恰当的试验。

可根据本发明的公开治疗的示例性血液恶性疾病包括何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤以及白血病，包括ALL-L3(Burkitt型白血病)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以及单核细胞白血病。将理解本发明的化合物和方法对于治疗多种B-细胞淋巴瘤尤其有效，包括低级/滤泡非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)，细胞淋巴瘤(FCC)，套细胞淋巴瘤(MCL)，弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)，小淋巴细胞(SL)NHL，中间级/滤泡NHL，中间级弥漫性NHL，高级免疫母细胞性(high grade immunoblastic)NHL，高级淋巴母细胞性(high gradelymphoblastic)NHL，高级小非凹陷细胞(high grade small non-cleavedcell)NHL，bulky病NHL和Waldenstrom’s巨球蛋白血症。本领域技术人员应清楚由于分类系统的改变这些淋巴瘤通常具有不同的名称，患有分类为不同名称的淋巴瘤的患者可从本发明的联合治疗方案获益。除了上述肿瘤疾病，应理解本发明可优选治疗携带适合的肿瘤相关抗原的其它恶性疾病。

除了肿瘤疾病，本发明的多肽对于治疗自身免疫疾病和异常免疫反应尤其有效。在此方面，将理解本发明的多肽可用于控制，抑制，调节或消除对外部和自体抗原的不需要的免疫反应。例如，一个实施方案中，所述抗原是自身抗原。另一实施方案中，所述抗原是过敏原。另一实施方案中，所述抗原是同种抗原或异种抗原。利用公开的多肽降低对同种或异种抗原的免疫反应在移植中特别有用，例如用于抑制移植受体对受体移植物例如组织或器官移植物或骨髓移植物的排斥。此外，骨髓移植物内的受体T细胞的抑制或消除可用于抑制移植物抗宿主疾病。

另一实施方案中，本发明多肽可用于治疗免疫疾病，包括但不限于，过敏性支气管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis)；过敏性鼻炎；自身免疫性溶血性贫血；黑棘皮病(Acanthosis nigricans)；过敏性接触性皮炎(Allergic contact dermatitis)；Addison氏病；异位性皮炎；斑秃(Alopeciaareata)；普秃(Alopecia universalis)；淀粉样变(Amyloidosis)；过敏性紫癜(Anaphylactoid purpura)；类过敏性反应(Anaphylactoid reaction)；再生障碍性贫血；遗传性血管性水肿(Angioedema，hereditary)；特发性血管性水肿(Angioedema，idiopathic)；强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis)；脑动脉炎(Arteritis，cranial)；巨细胞动脉炎(Arteritis，giant cell)；Takayasu动脉炎；颞动脉炎；哮喘；济失调毛细管扩张(Ataxia-telangiectasia)；自身免疫性卵巢炎(Autoimmune oophoritis)；自身免疫性睾丸炎(Autoimmune orchitis)；自身免疫性多内分泌衰竭(Autoimmune polyendocrine failure)；白塞病(Behcet′sdisease)；Berger病；Buerger病；支气管炎(bronchitis)；大疱性天疱疮(Bullouspemphigus)；慢性粘膜皮肤性念珠菌病(candidiasis，chronic mucocutaneous)；Caplan综合征；心肌梗死后综合征；心包切开术后综合征(Post-pericardiotomy syndrome)；心脏炎(Carditis)；口炎性腹泻(Celiac sprue)；Chagas病；Chediak-Higashi综合征；Churg-Strauss病；Cogan综合征；冷凝集素病(Cold agglutinin disease)；CREST综合征；Crohn氏病；冷球蛋白血症；隐原性纤维化肺泡炎(Cryptogenic fibrosing alveolitis)；Dermatitis herpetifomis；皮肌炎；糖尿病；Diamond-Blackfan综合征；DiGeorge综合征；盘状红斑狼疮(Discoid lupus erythematosus)；嗜酸细胞性筋膜炎(Eosinophilic fasciitis)；巩膜外层炎(Episcleritis)；Drythema elevatum diutinum；边缘性红斑(Erythemamarginatum)；多形性红斑(Erythema multiforme)；结节性红斑(Erythemanodosum)；家族性地中海热(Familial Mediterranean fever)；Felty′s综合征；肺纤维化；过敏样肾小球肾炎(Glomerulonephritis，anaphylactoid)；自身免疫性肾小球肾炎(Glomerulonephritis，autoimmune)；链球菌后肾小球肾炎(Glomerulonephritis，post-streptococcal)；移植后肾小球肾炎(Glomerulonephritis，post-transplantation)；膜性肾小球肾病(Glomerulopathy，membranous)；Goodpasture′s综合征；免疫介导的粒细胞缺乏症(Granulocytopenia，immune-mediated)；环状肉芽肿(Granuloma annulare)；过敏性肉芽肿(Granulomatosis，allergic)；肉芽肿性皮肌炎(Granulomatousmyositis)；Grave病；桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)；新生儿溶血性疾病(Hemolytic disease of the newborn)；特发性血色素病(Hemochromatosis，idiopathic)；Henoch-Schoenlein紫癜；慢性活性肝炎和慢性进展性肝炎；组织细胞增多病X；高嗜酸性(Hypereosinophilic)综合征；特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura)；Job′s综合征；青少年型皮肌炎(Juvenile dermatomyositis)；幼年型类风湿关节炎(Juvenile rheumatoidarthritis)(幼年型慢性关节炎)；Kawasaki病；角膜炎；干燥性角结膜炎；Landry-Guillain-Barre-Strohl综合征；结节性麻风病(Leprosy，lepromatous)；Loeffler′s综合征；狼疮；Lyell′s综合征；莱姆病(Lyme disease)；淋巴瘤样肉芽肿病；系统性肥大细胞增多症(Mastocytosis，systemic)；混合型结缔组织病；多发性单神经炎(Mononeuritis multiplex)；Muckle-Wells综合征；粘膜皮肤淋巴结(Mucocutaneous lymph node)综合征；粘膜皮肤淋巴结(Mucocutaneouslymph node)综合征；多中心网状组织细胞增多症(Multicentricreticulohistiocytosis)；多发性硬化；重症肌无力；蕈样肉芽肿病(Mycosisfungoides)；系统性坏死性血管炎(Necrotizing vasculitis，systemic)；肾病综合征；重叠(Overlap)综合征；脂膜炎(Panniculitis)；阵发性冷性血红蛋白尿症(Paroxysmal cold hemoglobinuria)；阵发性夜间血红蛋白尿(Paroxysmalnocturnal hemoglobinuria)；类天疱疮(Pemphigoid)；天疱疮(Pemphigus)；红斑性天疱疮(Pemphigus erythematosus)；落叶性天疱疮(Pemphigus foliaceus)；寻常型天疱疮(Pemphigus vulgaris)；鸽子喂食者病(Pigeon breeder′s disease)；超敏性肺炎(Pneumonitis，hypersensitivity)；结节性多动脉炎(Polyarteritisnodosa)；风湿性多肌炎(Polymyalgia rheumatic)；多发性肌炎(Polymyositis)；特发性多神经炎(Polyneuritis，idiopathic)；葡萄牙家族性多神经病(Portuguese familial polyneuropathies)；先兆子痫(Pre-eclampsia)/子痫(eclampsia)；原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis)；进展性系统性硬皮病(Progressive systemic sclerosis)(硬皮病)；银屑病；银屑病关节炎；肺泡蛋白沉积症(Pulmonary alveolarproteinosis)；肺纤维化(Pulmonary fibrosis)，雷诺现象(Raynaud′s phenomenon)/综合征；Reidel′s甲状腺炎；Reiter′s综合征，复发性多发性软骨炎(Relapsing polychrondritis)；风湿热(Rheumatic fever)；类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis)；结节病(Sarcoidosis)；巩膜炎(Scleritis)；硬化性胆管炎(Sclerosing cholangitis)；血清病(Serum sickness)；Sezary综合征；Sjogren′s综合征；Stevens-Johnson综合征；Still病；亚急性硬化性全脑炎(Subacute sclerosing panencephalitis)；交感性眼炎(Sympatheticophthalmia)；系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus)；移植物排斥(Transplant rejection)；溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis)；非分化的结缔组织病(Undifferentiated connective tissue disease)；慢性荨麻疹(Urticaria，chronic)；Urticaria，cold；葡萄膜炎(Uveitis)；白癜风(Vitiligo)；Weber-Christian病；Wegener肉芽肿病和Wiskott-Aldrich综合征。

本发明还通过以下实施例说明，所述实施例不应被解释为对本发明的限制。本文引用的所有参考文献，专利，公开的专利申请的内容包含在本文作为参考。

实施例

实施例1：鉴定A和B同种型

抗体分子溶液包含两种不同的同种型。其中的一种A型包含经由至少一个二硫键连接的重链分子。另一种B型，包含不经由至少一个二硫键连接的重链分子。在完整gamma 1MAb，诸如Rituxan中，B型不出现或频率非常低。然而与具有相似铰链的结构域缺失的(dd)构建体相比，B型的频率高得多。这些形式可利用变性型非还原SDS page区分。在结构域缺失的抗体制备物中，A型为120kDa二聚体而B型为60kDa单体(图1)。

实施例2：鉴定CH2结构域缺失的Mab片段中的铰链区异源性

铰链结构域可再分成三个不同的区：上，中，和下铰链区(Roux et al.J.Immunol.1998 161：4083)。对于IgG1和IgG3铰链，包含这些区的多肽序列显示于表1。IgG3铰链中区除了含有两个保守的半胱氨酸残基以外，还含有重复三次的15个氨基酸的基序。来自这些区的氨基酸序列被用于设计合成的IgG1/IgG3连接肽。这些由以下成分组成：相应于位置226-238的IgG1上铰链残基，相应于位置239-241的IgG1中铰链，和相应于位置241EE-242的单个IgG3中铰链重复基序，其结合位置243的另外的脯氨酸或分别位于位置243，244，和245(Kabat编号系统)的加入的脯氨酸，丙氨酸、脯氨酸，然后是柔性Gly/Ser间隔物(表2)。此外，新的连接肽被设计为由以下部分组成：取代位置239或242的半胱氨酸的丝氨酸残基结合位置243的添加的脯氨酸，和分别位于位置243，244，245的添加的脯氨酸，丙氨酸，脯氨酸(Kabat编号系统)。也制备了Pro243Ala244Pro245和Pro243连接肽。亲本CH2结构域缺失的人源化的CC49连接肽的氨基酸序列开始于IgG1铰链的第一个残基(位置226，Kabat编号系统)，并延续到铰链/GlySer连接肽的第二个残基，所述氨基酸序列显示于表2。通过与具有Kabat编号系统中所示半胱氨酸残基位置的CC49进行比对，还显示了各种连接肽设计。

表1：IgG1，IgG3和IgG4铰链区

IgG	上铰链	中铰链	下铰链
				IgG1IgG3IgG4	EPKSCDKTHT(SEQ ID NO：2)ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：5)ESKYGPP(SEQ ID NO：45)	CPPCP(SEQ ID NO：3)CPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3(SEQ ID NO：6)CPSCP(SEQ ID NO：46)	APELLGGP(SEQ ID NO：4)APELLGGP(SEQ ID NO：4)APEFLGGP(SEQ ID NO：47)

表2：铰链区连接肽序列

实施例3.连接多肽的构建以及同种型的优选合成

利用通过重叠延伸的拼接(SOE)方法(Horton，R.M.1993 Methods inMolecular Biology，Vol 15：PCR Protocols：Current Methods and applications.Ed.B.A.White)，将编码显示于表2的铰链区连接肽的核酸序列导入CH2结构域缺失的huCC49基因序列。对铰链区的正确修饰通过DNA序列分析证实。质粒DNA用于转化CHO DG44细胞，以稳定制备抗体蛋白。

构建含有表2所示的8种设计的合成连接肽的CH2结构域缺失的huCC49抗体，并在CHO DG44细胞中产生抗体。上清液收集自分离的细胞系，培养上清中的抗体浓度通过免疫测定法确定。含有0-30ng总抗体蛋白的抗体的每种细胞系的上清利用非还原SDS-PAGE电泳分析，然后利用抗-人kappa HRP偶联的抗体进行Western印迹以检测CH2结构域缺失的huCC49A型和B型同种型。在这些条件下，A型作为单个120kDa同源二聚体迁移，B型作为60kDa双体(doublet)迁移。还可见kappa链单体和二聚体。SEQ ID NO：8，9，14，和15的连接肽都增加A型的比例。

表3.亲和层析(蛋白质G)之后且HIC纯化之后A型抗体的百分比

CH2结构域 缺失的抗体	％A型抗体
			蛋白G之后	HIC纯化之后
	HuCC49(连接肽SEQ ID NO：7)	60			98
HuCC49 PAP(连接肽SEQ ID NO：14)			83	98
	HuCC49 V2 PAP(连接肽SEQ ID NO：14)	90			99
HuCC49 G1/G3/PAP(连接肽SEQ ID NO：9)			98	未进行
	HuCC49V2 G1/G3/PAP(连接肽SEQ ID NO：9)	96			未进行

表4

改造的HuCC49ΔCH2抗体铰链区肽的肽绘图

样品	片段#                  A.A#        理论    理论连MW      接的MW	观察分子量还原的	观察分子量非还原的
				HuCC49ΔCH2PAPG1/G3：PAPHuCC49ΔCH2PAPG1/G3：PAP	内切Lys-C    片段  29  (H221-257)  3711.7  7419.4THTCPPCGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTK内切Lys-C    片段  29  (H221-260)  3976.9  7949.8THTCPPCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTK内切Lys-C    片段  29  (H221-231)  1208.5  2413.0THTCPPCPEPK内切Lys-C    片段  30  (H232-275)  4394.0  8782.0SCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTK胰蛋白酶片段 39        (H221-241)  1971.8  NATHTCPPCGGGSSGGGSGGQPR胰蛋白酶片段 39        (H221-244)  2237.9  NATHTCPPCPAPGGGSSGGGSGGQPR胰蛋白酶片段 39        (H221-231)  1324.5  NATHTCPPCPEPK胰蛋白酶片段 40        (H232-241)  1187.5  NASCDTPPPCPR胰蛋白酶片段 41        (H242-259)  1542.6  NACPAPGGGSSGGGSGGQPR	3711.53976.81208.94394.41972.62237.81325.11187.51542.9	7419.17949.72414.38782.6NANANANANA

这些数据显示，新的改造的合成铰链区连接肽可用于优选促进形成A或B同种型。这些研究还揭示了位置242(Kabat编号系统)的半胱氨酸残基在合成CH2结构域-缺失的抗体A型同种型中的重要性。用丝氨酸取代位置239或242的半胱氨酸(例如，利用显示于SEQ ID NO：0，11，12，或13的连接肽)使得CH2结构域-缺失的抗体的生物合成移动到B型同种型。因此，一个实施方案中，本发明的连接肽包含位置239和242的半胱氨酸。增加A型比例的连接肽的使用导致加工，产量和/或稳定性的有利的改善。这些合成铰链区连接肽的使用有利于合成任何抗体同种型例如，IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4的CH2结构域缺失的抗体A型同种型，其基于所有四种人同种型CH3结构域的极高同源性。包括相同和保守的氨基酸残基，IgG1 CH3结构域与IgG2 CH3有98.13％同源，与IgG3 CH3有97.20％同源，与IgG4 CH3有96.26％同源。

实施例4：从含有两种同种型的单克隆抗体混合物纯化A型和B型

10mL ddCC49上清用1M Tris pH9.0滴定至终pH7.5。该物质经一系列Sol-Vac 0.8μ和0.4μ的膜过滤。100mL XK50蛋白G柱用1xPBS以流速80ml/min预平衡。滴定的过滤的上清以80ml/min上样到柱上。结合的蛋白利用两倍柱体积的平衡缓冲液洗涤，然后用100mM甘氨酸、pH3.0洗脱。收集含有ddCC49峰的级分并立刻用1M Tris pH9.0滴度至终pH7.0。

Toso Biosep苯基5PW-HR柱用20mM磷酸盐pH7.2；1M硫酸盐预平衡。蛋白G洗脱物利用3.5M硫酸铵pH7.2母液滴定到1M硫酸铵并以浓度2mg/ml凝胶床上样。结合的蛋白利用20mM磷酸盐pH4或7.2硫酸铵洗脱以调节电导性至116.4mS/cm。自此条件洗脱的物质在非还原SDS-PAGE上的表观分子量约120kD(A型)。余下的结合的抗体用磷酸盐缓冲液中的还原硫酸铵物质线性梯度洗脱。该方法将A型和B型分离成两个分离的峰。后一种洗脱的抗体明显缺乏重链之间的二硫键并且其分子量为约60kDa(B型)。

以上纯化的物质均可通过将硫酸铵浓度调节为1M并将其重新上样到清洁的苯基5PW-HR柱来再捕获。结合的蛋白利用20mM磷酸盐pH7.2洗脱并透析入1xPBS。

实施例5.比较A型和B型的稳定性

A和B型的生物活性(如在预试验中测定的例如，利用直接结合或竞争研究)揭示A型和B型具有相似的生物活性。

比较A型和B型的稳定性。纯化的ddCC49分子通过配有YM30膜(Millipore)的Amicon浓缩仪浓缩到约5mg/ml。对于每个同种型，浓缩的物质等分成四个部分，每个级分被置于10K透析盒(Pierce，cat#66410)中16h，在以下缓冲液中透析：1)10mM磷酸钠，pH3；2)10mM乙酸钠，pH5；3)10mM磷酸钠，pH7；和4)10mM硼酸钠，pH9。透析后，每种溶液的蛋白浓度调节到3mg/ml。除了纯的A和B同种型溶液之外，混合每种pH的部分A和B溶液以产生含有50％每种同种型的混合物。总共产生12种配制剂(四种pH水平乘以3种抗体溶液)。过滤所述溶液并灌装入具有灰色丁基塞子的3ml 1型玻璃血清小瓶(West Pharmaceuticals)中。

选择三种温度，2-8℃，20-25℃和38-42℃来保存蛋白以检测稳定性。保存之前，从每种配制剂中取出500μl样品用于物理和化学分子，这些0时间点数据用作对照。一旦保存，在以下时间取样：2周，1个月，2个月，3个月，并立即送检。

为了评估两种同种型的物理和化学稳定性，采用以下方法：在OD320测定浊度，非-还原SDS-PAGE，和大小排阻层析。

于不同时间点对保存在2-8℃，20-25℃和38-42℃的样品进行非-还原SDS-PAGE。在2-8℃保存时，A型和B型都相对稳定。然而，但在pH7和9配制时，A型和B型显示降解，如小于原始主要带(A型的为120kDa，B型的为60kDa)的带的数目增加所示。注意到，具体对于保存在低温和中间温度的pH7和9的样品而言，低于55kDa的带的强度和数量在B型中高于A型。这表明在这些条件下A同种型比B同种型更稳定。然而，对于pH5并保存在20-25℃的A同种型而言并非如此。该样品具有的片段似乎多于B同种型的。这看上去是由于微生物污染(在下文详述)导致的人工现象。在高保存温度下，pH9时两种形式都明显降解，并且样品的凝胶模式几乎没有差异。在该条件下，在凝胶顶部出现痕量的污染带，其表明形成了聚集物。由于聚集物可通过SDS溶解，所述聚集物利用本发明以下部分描述的方法研究。

表4A-表4C列出了保存在三种不同温度的ddCC49的浊度数据。浊度测定了可溶和非-可溶聚集物，并且其基于这些颗粒散射的光的量。当存在时，聚集物将散射光并导致A320增加。如表4A-C所示，对于A和B同种型，保存在2-8℃的ddCC49分子的浊度随pH的增加而增加，前者的浊度低于后者的浊度。该趋势对于在更高温度(20-25℃和38-40℃)保存少于一个月时间的样品而言是正确的。保存时间达到3个月时，高pH和温度的样品的浊度明显增加，A同种型与B同种型之间的差异减小。这些结果与SDS-PAGE的结果平行，表明两种同种型在pH3和5都相对稳定(就不形成聚集物而言)，A同种型对于聚集的易感性低于B同种型。

表4A.在A320测定的保存在2-8℃的ddCC49样品浊度

	A-同种型				B-同种型				混合物
													时间(月)	pH＝3	5	7	9	3	5	7	9	3	5	7	9
0	0.030	0.038	0.044	0.056	0.034	0.042	0.046	0.066	0.036	0.042	0.051	0.061
														0.029	0.029	0.046	0.045	0.030	0.038	0.048	0.058	0.034	0.033	0.043	0.055
1	0.033	0.039	0.035	0.055	0.033	0.035	0.044	0.059	0.032	0.040	0.039	0.066
													2	0.042	0.022	0.042	0.044	0.039	0.037	0.055	0.067	0.042	0.024	0.040	0.058
3	0.035	0.047	0.051	0.050	0.038	0.041	0.066	0.081	0.027	0.048	0.051	0.065

表4B.在A320测定的保存在20-25℃的ddCC49样品浊度

	A-同种型				B-同种型				混合物
													时间(月)	pH＝3	5	7	9	3	5	7	9	3	5	7	9
	0.031	0.032	0.056	0.066	0.039	0.034	0.064	0.083	0.034	0.039	0.060	0.071
													1	0.025	0.043	0.055	0.090	0.034	0.042	0.070	0.084	0.028	0.039	0.055	0.094
2	0.034	0.053	0.077	0.113	0.046	0.032	0.090	0.087	0.037	0.038	0.066	0.108
													3	0.036	0.056	0.156	0.143	0.029	0.060	0.121	0.125	0.044	0.050	0.101	0.142

表4C.在A320测定的保存在38-42℃的ddCC49样品浊度

	A-同种型				B-同种型				混合物
													时间(月)	pH＝3	5	7	9	3	5	7	9	3	5	7	9
	0.041	0.042	0.068	0.063	0.041	0.044	0.080	0.067	0.041	0.039	0.070	0.064
													1	0.041	0.043	0.071	0.065	0.036	0.040	0.079	0.069	0.032	0.048	0.078	0.070

2	0.047	0.030	0.066	0.060	0.046	0.045	0.087	0.082	0.051	0.034	0.078	0.079
													3	0.058	0.051	0.098	0.105	0.046	0.057	0.101	0.157	0.056	0.057	0.101	0.126

大小排阻层析(SEC)是显示完整分子以及降解的产物(片段和可溶聚集物)的百分比的有效方法，并且高度可重复。在表4A-C中，保存在不同温度的A-同种型，B-同种型和混合物的完整单体被列出。对于保存在2-8℃的样品，很明显A型的单体百分比高于B型的，A型与B型混合物的所述百分比在前述两者之间。在该保存温度，两种形式在pH3，5和7相对稳定(pH5是最稳定的条件)，持续约三个月。然而，在pH9，B型单体的百分比明显降低，而A型的仅仅降低很少。

在升高的温度下，所有样品显示单体百分比随保存时间增加而明显增加；A同种型的增加超过B同种型。然而，也有例外，在相似保存条件下，保存在室温的A同种型的样品显示比B同种型或其混合物的降解更多。该特定A同种型小瓶的检验表明，来自SDS-PAGE的数据，样品的SEC提示微生物污染可能导致这一意料之外的结果。首先，SEC和SDS-PAGE结果表明该样品的降解对片段化增加负主要责任，推定是由于微生物消化，否则预期聚集在一定程度上增加。其次，含有A和B同种型各50％的混合样品显示比B同种型更好的稳定性图谱，表明更稳定的A同种型对单体的高百分比有贡献。最后，保存在2-8℃和38-42℃、pH5的A同种型均显示高于相似条件下的B同种型的单体百分比。因此，中间保存温度应当产生相似的结果。由于样品量有限，不能进行微生物污染试验。

还注意到对于保存在高pH(9)和40℃的IDEC-159同种型，单体减少到约30％。在这些苛刻的条件下，两种同种型之间的稳定性差异消失。SEC结果与利用SDS-PAGE的结果一致。两个结果都表明，尽管两同种型之间存在一些化学和物理性质差异，两种同种型的降解机制以及副产物类似，或相同。

总之，SEC结果表明A和B同种型具有约5的最佳pH，A同种型就在类似保存条件下保持高百分比完整单体而言，比B同种型更稳定。

表5A.保存在2-8℃的ddCC49的单体百分比

	A-同种型				B-同种型				混合物
													时间(月)	pH＝3	5	7	9	3	5	7	9	3	5	7	9
0	98.81	99.13	98.16	97.93	97.02	97.70	96.88	93.51	97.83	98.27	97.44	95.81
														98.98	99.16	98.25	98.00	97.15	97.87	96.96	91.95	98.15	98.49	97.68	95.59
1	98.80	99.20	97.99	97.11	97.02	97.81	96.62	88.99	98.04	98.45	97.41	94.45
													2	98.74	99.01	98.00	95.67	97.15	97.69	95.50	84.84	98.06	98.34	96.81	92.17
3	98.28	98.89	97.88	95.31	96.69	98.14	95.37	85.98	97.61	98.15	96.65	89.90

表5B.保存在20-25℃的ddCC49的单体百分比

	A-同种型				B-同种型				混合物
													时间(月)	pH＝3	5	7	9	3	5	7	9	3	5	7	9
	97.83	99.04	97.12	93.65	95.84	97.62	93.71	79.61	96.75	98.30	95.37	87.67
													1	96.60	96.63	95.65	88.09	94.38	97.23	90.69	72.26	95.36	97.99	93.05	80.92
2	93.62	92.79	93.17	80.06	91.71	96.96	85.51	66.53	92.78	97.51	89.33	73.91
													3	92.81	89.56	x	74.31	89.30	96.04	82.57	63.25	90.46	97.02	86.80	69.36

表5C.保存在38-42℃的ddCC49的单体百分比

	A-同种型				B-同种型				混合物
													时间(月)	pH＝3	5	7	9	3	5	7	9	3	5	7	9

	86.31	97.50	85.06	66.42	79.85	94.29	69.68	63.64	82.09	95.70	76.24	63.95
													1	78.71	95.19	73.77	51.55	66.73	89.37	54.70	50.10	68.53	92.02	62.93	49.28
2	66.64	91.63	60.45	38.43	60.29	81.08	42.98	37.09	61.33	85.81	51.08	36.68
													3	57.87	86.99	52.82	30.81	43.61	74.23	36.68	29.73	46.75	80.93	44.35	30.18

实施例7.A型和B型的制备纯化

IDEC-159(ddCC49)是针对表达于肿瘤表面的TAG-72抗原的CH2结构域缺失的单克隆抗体。IDEC-159含有两种抗体同种型，称为A型和B型。目前用于IDEC-159产物的细胞培养方法产生的A型与B型的比例为大约50∶50。A型同种型是重链FC部分中具有缺失的CH2区的抗体。除了具有缺失的CH2结构域，B型也缺乏跨Fc区的二硫键连接，并仅仅通过疏水反应和盐桥连接。

IDEC-159纯化法中的第三步和最后的层析步骤被开发用于分离IDEC-159的两个同种型。所述分离通过疏水反应层析(HIC)，利用苯基TSKgel 5PW-HR吸附剂进行。由于B型的疏水性高于A型，其不可逆吸附于固定相，其中利用大约0.73M硫酸铵/20mM磷酸钠，pH4.0-pH7.0作为流动相。A型在这些条件下与固定相的结合力较低，并由此可同步洗脱，即其与流过柱的级分一起离开柱子。A型的同步洗脱之后，从固定相去除硫酸铵可使得B型解吸附。以下方法用于分离IDEC-159的两个同种型：

·所述柱利用≥3CV 0.5N NaOH，以≤150cm/hr消毒。

·所述柱利用≥5CV 0.73M硫酸铵/20mM磷酸钠，pH4.0，以≤150cm/hr平衡。

·所述柱上样于室温TMAE Flowthrough，其被调节为包括0.43体积的2.5M硫酸铵/20mM磷酸钠，pH4.0液体母液，5mg每ml树脂。所述抗体在pH4.0，以≤100cm/hr上样于所述柱。抗体的收集开始于流出物280nm O.D.达到10mAU时。

·所述柱利用15CV 0.73M硫酸铵/20mM磷酸钠，pH4.0，以≤100cm/hr洗涤。在整个15CV洗涤持续抗体收集，流出物被废弃。

·所述柱利用≥5CVs 20mM磷酸钠，pH4.0，以≤100cm/hr剥离6.所述柱≥3CVs 0.5N NaOH，以≤150cm/hr清洗。

·所述柱用≥3CVs 0.73M硫酸铵/20mM磷酸钠，pH4.0，以≤150cm/hr洗涤。

·所述柱保存在≥3CV 20％乙醇，以≥150cm/hr。

两种形式在制备水平的分离(5L柱体积，总IDEC-159负载大约20g)显示于图13(A和B)。第一个峰包含A型的同步洗脱物，第二个峰显示洗脱的B型，第三个峰含有杂质，其在清洗过程中从固定相去除。

该方法在制备水平分离A型和B型的能力也通过SDS PAGE证实。

实施例8.制备CH2结构域-缺失的四价抗体

HuCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体设计基于将huCC49单链Fv(scFv)附着于HuCC49 CH2结构域-缺失的抗体CH3结构域的羧基末端。HuCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的示意图显示于图4。该设计的对等参照是C-scFv四价CH2结构域缺失的抗体。Fv区，单链Fv分子的单个多肽链结合分子的制备描述于美国专利4,946,778。CC49 scFv免疫球蛋白-样抗体描述于美国专利5,892,019。huCC49 scFv包含VL和VH区序列，其通过短合成接头(VL→(Gly4Ser)3接头→VH方向)连接，并通过PCR扩增合成。5′VL PCR引物包括Bam HI限制性核酸内切酶位点然后是编码(Gly4Ser)2接头肽的序列。3′VL PCR引物包括部分编码用于连接两个VL和VH区的(Gly4Ser)3接头肽的序列。5′VH PCR引物也包括部分编码用于连接VL和VH区的(Gly4Ser)3接头肽的序列。最后，3′VH PCR引物包括终止密码子然后是Bam HI位点。两个V区利用两组PCR引物扩增，所述引物来自含有huCC49 CH2结构域-缺失的抗体的质粒DNA底物，scFv的组装在第二次PCR反应中通过编码(Gly4Ser)3接头的共同重叠序列完成。huCC49 scFv基因片段通过凝胶分离，用Bam HI限制核酸内切酶消化，并克隆入单个Bam HI位点，所述位点已被导入huCC49 CH2结构域-缺失的抗体多顺反子表达载体。(见US 2003 0157641 A1.)。简而言之，所述载体通过去除存在于CH3结构域编码基因的3’末端的终止密码子并用编码氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly的核苷酸取代，然后紧接着Bam HI限制性核酸内切酶位点(编码Gly-Ser)来修饰。Bam HI消化的huCC49 scFv片段克隆入所述载体的Bam HI位点导致经由16氨基酸Ser(Gly4Ser)3接头连接的的huCC49 scFv与huCC49 CH2结构域-缺失的抗体CH3结构域的羧基末端的融合产物。正确的序列通过DNA序列分析证实。质粒DNA用于转化CHO DG44细胞以稳定产生抗体蛋白。改造的抗体称为huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体。图8A显示重链huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的DNA序列。图8C显示轻链huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的DNA序列。图9A显示重链huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的氨基酸序列。图9C轻链huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的氨基酸序列。

上清收集自分离的细胞系，培养上清中的抗体浓度通过免疫测定法确定。上清通过非还原SDS-PAGE电泳然后通过Western印迹分析，其中利用抗人kappa-HRP偶联的抗体检测huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体A型和B型同种型。在这些条件下，A型作为单个～170kDa同源二聚体迁移，B型作为～85kDa双体(doublet)迁移，A同种型与B同种型之比为约50∶50。如图18所示，发现五个独立分离的克隆都产生A和B CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体同种型。这些克隆之一被选用于抗体制备，以及如实施例4所述利用HIC层析进行纯化。纯化的huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体A型和B型通过非还原和还原SDS-PAGE分析，结果显示于图19。A型huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体以超过95％的纯度与B型有效分离。如所预料那样，两种纯化的形式在还原SDS-PAGE条件下的表现一样。HuCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体A型通过大小排阻层析检测并发现主要作为单个峰洗脱(96％)，表明抗体产物没有明显的聚集和分解(图20)。

实施例9.HuCC49 CH2结构域-缺失的四价抗体的生物分布图谱

在竞争结合试验中检测HuCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体A型与TAG-72抗原来源牛颌下粘蛋白结合的能力，所述检测通过时间-分辨荧光免疫测定法利用Delphia荧光计(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)进行。竞争结合曲线显示于图21。评估HuCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体A型和对照亲本CH2结构域-缺失的huCC49(称为HuCC49或IDEC 159)抗体。四价抗体的相对结合活性的亲和力高于对照亲本CC49抗体5-倍(GraphPad Prism 4.0 for Windows，GraphPad，Software，San Diego CaliforniaUSA.www.graphpad.com)，与预期的抗原结合位点数量增加一致。

在携带LS-174T人肿瘤异种移植物的无胸腺裸小鼠中，比较⁹⁰Y-放射标记的huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的生物分布与以前利用对照亲本huCC49抗体产生的结果。HuCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体偶联于螯合剂Chx-DTPA，评估结合活性。偶联的huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体显示的亲和力高于偶联的对照亲本huCC495-6倍，显示所述四价抗体可在不明显损失结合活性的条件下衍生化。HuCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体用⁹⁰Y标记，并经尾静脉iv注射给予携带预确立的大约250mm³的肿瘤的小鼠单剂量放射标记的抗体。收集样品，并进行beta计数。测定从3-72小时的⁹⁰Y放射标记的抗体每克肿瘤或正常组织的百分比注射的剂量(％ID)，并显示于表6。

表6.

5-7小鼠/组
						％ID/gm-组织
	血液	脾	肾	肝	肿瘤
						HuCC49(结构域缺失的)
3-5hrs	18.24	5.39	9.15	8.83	13.66
						12hrs	3.21	5.01	15.50	14.20	17.33
24hrs	1.03	6.21	14.09	10.84	20.53
						48hrs	0.17	6.92	11.15	11.85	13.17
72hrs	0.10	6.22	9.01	10.59	10.55

四价HuCC49
						3hrs	20.3	12.60	7.60	9.60	10.80
6hrs	15.4	12.20	6.70	12.40	12.10
						12hrs	7.20	15.10	5.10	13.90	13.10
24hrs	2.40	9.50	3.90	12.10	14.00
						48hrs	0.50	10.00	2.60	11.90	11.50
72hrs	0.10	**	1.90	12.70	6.40

数据表示平均值+/-标准差

**样品的技术问题

HuCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)抗体显示在肾中的聚集低于对照huCC49抗体，很可能是由于抗体的分子量增加。huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的肿瘤聚集类似利用对照亲本huCC49所产生的(表6)。然而，如所述，这两个生物分布研究不是同时进行的，并存在试验差异。图35显示对照亲本huCC49和huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的肿瘤保留，其被测定为％ID/gm。图35也显示相对于放射活性的峰值聚集进行标准化的同样的肿瘤保留数据。图35中的两条标准化保留曲线的AUC分析利用GraphPad Prism 4.0 for Windows，GraphPad，Software，San Diego California USA. www.graphpad.com计算。对照亲本huCC49的总峰面积为2037单位，huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的总峰面积为2562单位，代表四价蛋白的面积的25.8％的增加。该模式表示的数据提示肿瘤隔室中四价抗体的保留与亲本二价分析相比有所改善。

四价HuCC49构建体提供一些预靶向的优势，例如，放射免疫治疗(RIT)预靶向。该优势通过来自表6的三个观察定义。首先，四聚体HuCC49 CH2结构域-缺失的构建体的血液清除率与目前的CH2结构域-缺失的HuCC49构建体的相当。这种快速血液清除可避免需要“清洁剂”来加速在给予局部化到肿瘤结合的抗体的放射标记的配体之前抗体从血液的清除。清洁剂的消除明显降低该治疗形态在临床环境中的复杂性。其次，四价构建体的肿瘤清除与目前的二价构建体的可比。因此，递送的放射剂量对于两种构建体而言是可比的(表6)。第三，与CH2结构域-缺失的HuCC49相比，较低的肾和肝吸收能够使得在到达器官限制性毒性以前放射标记的配体的输入剂量更高。

实施例10.包含新的连接肽的HuCC49 CH2结构域-缺失的四价抗体的制备以及A同种型的优选合成

构建类似于图4下半部分的设计但含有表2所示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]合成连接肽的huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体。简而言之，编码部分G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的基因序列通过PCR扩增合成，利用编码Sal I限制性核酸内切酶位点的5′连接肽PCR引物和编码Xho I位点的3′连接肽PCR引物。含有编码G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的基因序列的质粒DNA用作底物。PCR产物编码所有G1/G3/Pro243Ala244Pro245和部分[Gly/Ser]连接肽。G1/G3/Pro243Ala244Pro245铰链片段经凝胶纯化，用SalI和Xho I限制核酸内切酶消化并克隆入Sal I和Xho I载体位点，产生全长G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽。正确的序列通过DNA序列分析证实。质粒DNA用于转化CHO DG44细胞以稳定生成抗体蛋白。图8B显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的重链huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的DNA序列。图8C显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的轻链huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的DNA序列。图9B显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的重链huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的氨基酸序列。图9C含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的轻链huCC49结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的氨基酸序列。

上清收集自分离的细胞系，培养上清中的抗体浓度通过免疫测定法确定。上清通过非还原SDS-PAGE电泳然后通过Western印迹分析，其中利用抗人kappa-HRP偶联的抗体检测huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域-缺失的)抗体A型和B型同种型。在这些条件下，A型作为单个～170kDa同源二聚体迁移，B型作为～85kDa双体(doublet)迁移，A同种型与B同种型之比为约50∶50。如图22所示，代表性含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体产生所有A型四价抗体同种型。

含有导入huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体序列的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：9)连接肽的细胞系用于抗体制备。产生抗体并如实施例4所述纯化。含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：9)连接肽的HuCC49CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体仅仅利用蛋白质G柱纯化，作为基本上单个峰以纯度96％洗脱而无需进一步HIC纯化。还原的和非还原的纯化的蛋白样品通过SDS-PAGE电泳分析。在非还原条件下，A型被预期作为单个170kDa同源二聚体、B型作为85kDa的双体迁移。SEQ ID NO：9的连接肽基本上增加产生的A型的比例。示例性结果显示于图23。该结果显示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链(SEQ ID NO：9)导致基本上产生所有A型huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价(C-scFv四价CH2结构域缺失的)抗体而B型很少或不可检测，证实了用于制备A型同种型的该铰链通常可用于复合抗体诸如多价抗体。很明显，本发明也可用于双特异性四价抗体模式。HuCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗体通过大小排阻层析检验并基本上作为含有84％单体的单个峰洗脱。含有残余聚集物的级分通过制备型大小排阻层析去除，产生含有基本上95％单体的制备物(图24)。

在竞争结合试验中检测HuCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗体与TAG-72抗原来源牛颌下粘蛋白结合的能力，所述检测通过时间-分辨荧光免疫测定法利用Delphia荧光计(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)进行。竞争结合曲线显示于图25。评估HuCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体A型和对照亲本CH2结构域-缺失的huCC49(称为HuCC49或IDEC159)抗体。四价抗体的相对结合活性的亲和力高于对照亲本HuCC49抗体8倍(GraphPad Prism 4.0 for Windows，GraphPad，Software，San Diego California USA.www.graphpad.com)，与预期的抗原结合位点数量增加一致。

这些结果显示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽(SEQ IDNO：9)导致产生基本上所有A型huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体而B型不可检出。纯化的抗体证实了对抗原的亲和力增加。

实施例11.制备CH2结构域-缺失的四价抗体

构建图2所示huCC49微型抗体和huCC49 2sc(Fv)2四价抗体(N-scFv四价微型抗体)。简而言之，huCC49 2sc(Fv)2四价抗体(N-scFv四价微型抗体)设计基于将huCC49单链Fv(scFv)插入huCC49微型抗体中第一个scFv结构域的羧基末端以及铰链连接肽的氨基末端之间。Fv区，单链Fv分子的单个多肽链结合分子的制备描述于美国专利4,946,778。CC49 scFv免疫球蛋白-样抗体描述于美国专利5,892,019。微型抗体的制备描述于美国专利5,837,821。huCC49 scFv包含VL和VH区序列，其通过短合成接头(VL→(Gly4Ser)3接头→VH方向)连接，并通过PCR扩增合成，用于构建huCC49微型抗体。其次，所述微型抗体载体通过利用PCR扩增将修饰的(Gly₄Ser)₅接头加入huCC49微型抗体氨基末端scFv结构域的羧基末端来修饰，以利用Nhe I限制性核酸内切酶位点取代编码所述接头的最后两个氨基酸残基的核苷酸。这导致(Gly4Ser)₄-Gly₃-Ala-Ser接头然后是Sal I限制性核酸内切酶位点，其通过数个核苷酸分离。第二个huCC49 scFv利用PCR从含有huCC49 scFv基因的质粒DNA底物，利用编码Nhe I限制性核酸内切酶位点的5′VL PCR引物和编码Sal I位点的3′VH PCR引物扩增。huCC49 scFv片段经凝胶纯化，用Nhe I和Sal I限制性核酸内切酶消化并克隆入第一scFv和铰链连接肽之间的Nhe I和Sal I位点。产生由前导肽与两个连续huCC49 scFv与铰链连接肽与CH3结构域融合的产物。正确的序列通过DNA序列分析证实。质粒DNA用于转化CHO DG44细胞以稳定产生抗体蛋白。图10A显示huCC49四价(N-scFv四价)微型抗体基因的DNA序列。图11A显示huCC49四价(N-scFv四价)微型抗体的氨基酸序列。

上清收集自分离的细胞系，培养上清中的抗体浓度通过免疫测定法确定。上清通过非还原SDS-PAGE电泳然后通过Western印迹分析，其中利用抗-IgG-HRP偶联的抗体检测A型和B型同种型中的重链恒定序列。在这些条件下，预期A型作为单个～82kDa同源二聚体迁移，半分子或B型作为～41kDa双体(doublet)迁移。预期HuCC49 2sc(Fv)2四价微型抗体A型作为单个～138kDa同源二聚体迁移，B型作为～69kDa双体(doublet)迁移，A同种型与B同种型之比为约50∶50。通过比较，huCC49 CH2结构域缺失的抗体(预期作为～120kDa同源二聚体迁移，B型作为～60kDa双体(doublet)迁移，A同种型与B同种型之比为约50∶50)用作对照。如图26所示，发现代表性分离的微型抗体和2sc(Fv)2四价微型抗体克隆分泌A和B同种型，与在非还原和还原SDS-PAGE条件下预期的分子量一致。

实施例12.制备包含新连接肽的HuCC49 CH2结构域-缺失的四价抗体以及A同种型的优选合成

构建类似于显示于图2底部的设计、但是含有表2所示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的huCC49 2sc(Fv)2四价抗体(N-scFv四价微型抗体)。简而言之，编码部分G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的基因序列利用编码Sal I限制性核酸内切酶位点的5′连接肽PCR引物和编码Xho I位点的3′连接肽PCR引物通过PCR扩增合成。含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽编码基因序列的质粒DNA用作底物。PCR产物编码所有G1/G3/Pro243Ala244Pro245和部分[Gly/Ser]连接肽。G1/G3/Pro243Ala244Pro245铰链片段通过凝胶分离，利用Sal I和Xho I限制性核酸内切酶消化，克隆入Sal I和Xho I载体位点，重构全长G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽。正确的序列通过DNA序列分析证实。质粒DNA用于转化CHO DG44细胞以稳定产生抗体蛋白。图10B显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的huCC49 2sc(Fv)2四价抗体(N-scFv四价微型抗体)基因的DNA序列。图11B显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的huCC49 2sc(Fv)2四价抗体(N-scFv四价微型抗体)基因的氨基酸序列。

上清收集自分离的细胞系，培养上清中的抗体浓度通过免疫测定法确定。上清通过非还原SDS-PAGE电泳然后通过Western印迹分析，其中利用抗-IgG-HRP偶联的抗体检测huCC49 2sc(Fv)2四价微型抗体(N-scFv四价微型抗体)A型和B型同种型。在这些条件下，预期huCC49 2sc(Fv)2四价微型抗体A型作为单个～138kDa kDa同源二聚体迁移，B型作为～69kDa双体(doublet)迁移，A同种型与B同种型之比为约50∶50。如图27所示，代表性含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的huCC49 2sc(Fv)2四价微型抗体产生基本上所有A型四价微型抗体同种型。

导入huCC49 2sc(Fv)2四价微型抗体序列的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ ID NO：9)连接肽的细胞系用于抗体制备。由于huCC49 2sc(Fv)2四价微型抗体缺乏CH1结构域，蛋白质不能利用蛋白G层析纯化。抗体随后利用阴离子交换，疏水反应和大小排阻层析法的组合纯化。含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser](SEQ IDNO：9)连接肽的HuCC49 2sc(Fv)2四价微型抗体主要作为单个峰以纯度97.6％纯化。还原的和非还原的蛋白样品通过SDS-PAGE电泳分析。在非还原条件下，预期A型作为单个～138kDa kDa同源二聚体迁移，B型作为～69kDa双体(doublet)迁移。SEQ ID NO：9的连接肽基本上增加生成的A型的比例。示例性结果显示于图28。该结果显示，G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]铰链(SEQ ID NO：9)导致产生基本上所有A型huCC49 2sc(Fv)2四价微型抗体(N-scFv四价微型抗体)而B型几乎没有或不可检出，证实了该铰链产生A型同种型的用途通常可用于复合抗体诸如多价抗体。很明显，本发明也可用于双特异性四价抗体模式。纯化的huCC49 2sc(Fv)2四价G1/G3/Pro243Ala244Pro245微型抗体通过大小排阻层析检测，发现基本上作为含有97.6％的单体的单个峰洗脱(图29)。

在竞争结合试验中检测纯化的huCC49 2sc(Fv)2四价G1/G3/Pro243Ala244Pro245微型抗体与TAG-72抗原来源牛颌下粘蛋白结合的能力，所述检测通过时间-分辨荧光免疫测定法利用Delphia荧光计(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)进行。竞争结合曲线显示于图30。评估HuCC49 2sc(Fv)2四价G1/G3/Pro243Ala244Pro245微型抗体，huCC49微型抗体，huCC49 CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价G1/G3/Pro243Ala244Pro245抗体，和对照亲本CH2结构域-缺失的huCC49(称为HuCC49或IDEC159)抗体。四价抗体的相对结合活性的亲和力高于对照亲本huCC49抗体或微型抗体(GraphPad Prism 4.0 for Windows，GraphPad，Software，San Diego CaliforniaUSA.www.graphpad.com)，与预期的抗原结合位点数量增加一致。

实施例13.制备包含新的连接肽的PRIMATIZEDp5E8 CH2结构域-缺失的四价抗体和以及A同种型的优选合成

PRIMATIZEDp5E8G1是嵌合猕猴/人(PRIMATIZED)单克隆抗体含有分别融合于人gamma 1和kappa恒定区的猕猴重和轻可变区。PRIMATIZEDp5E8G1结合人CD23，IgE(FcεRII)的低亲和力受体(Mavromatis和Cheson.2003.J.Clin.Oncol.21：1874；美国专利申请20030059424)。含有表2所示的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]合成连接肽(SEQ ID NO：9)的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2四价抗体利用类似实施例10所述的策略构建。用于构建sc(Fv)2四价抗体的PRIMATIZEDp5E8 scFv由通过短合成接头以VL→(Gly4Ser)3接头→VH方向连接的p5E8 VL和a VH区序列组成，并在实施例12中详述。正确的序列通过DNA序列分析证实。质粒DNA用于转化CHO DG44细胞以稳定产生抗体蛋白。图12A显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的重链CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2四价抗体的DNA序列。图12B显示轻链CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2四价抗体的DNA序列。图13A显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的重链CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2四价抗体的氨基酸序列。图13B显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的轻链CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2四价抗体的氨基酸序列。

上清收集自分离的细胞系，培养上清中的抗体浓度通过免疫测定法确定。上清通过非还原SDS-PAGE电泳然后通过Western印迹分析，其中利用抗人-IgG-HRP偶联的抗体检测含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2四价抗体的A型和B型同种型。在这些条件下，预期A型作为单个～170kDa同源二聚体迁移，B型作为～85kDa双体迁移。SEQ ID NO：9的连接肽基本上增加A型的比例。示例性结果显示于图31。这些结果显示，G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽(SEQ ID NO：9)导致产生基本上所有A型CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 sc(Fv)2四价抗体而无可检测的B型，证书了该铰链用于制备A型同种型CH2结构域-缺失的sc(Fv)2四价抗体的用途通常可用于特异性各异的抗体。

实施例14.制备包含新的连接肽的PRIMATIZEDp5E8微型抗体以及A同种型的优选合成

微型抗体是由融合于免疫球蛋白铰链区和CH3结构域的scFv组成的单链多肽。微型抗体单个多肽链结合分子的制备描述于美国专利5,837,821。通常，完整IgG分子中，铰链区位置230的半胱氨酸残基与位置214的羧基末端轻链恒定区半胱氨酸形成共价二硫键，连接重和轻链多肽(Kabat编号系统)。微型抗体设计中，轻链恒定区缺失，消除了参与二硫键形成的两个半胱氨酸之一。然而，铰链区中位置230的单个残余半胱氨酸据称参与同型链间二硫键，其可能对铰链区结构有贡献并由此保持在原位。

缺乏CH2结构域的微型抗体自细胞分泌，并在培养上清中作为含有A型和B型同种型的混合物以及有可能作为未组装的半分子累积，如图32所示。这些形式的比例高度可变，并且对可重复制备的纯产物提出了挑战。缺乏免疫球蛋白CH1/CL结构域防止了利用蛋白G免疫亲和基质分离所有微型抗体。虽然未组装的半分子(MW～40-45kD)可利用多种层析策略分离自同源二聚体(MW～80-90kD)，余下的完整A和B同种型不能利用诸如HIC层析(本文所述)的技术有效互相分离，这也是由于缺乏CH1/CL结构域。这些同种型也不能通过大小排阻层析分离，因为两种同种型的分子量非常接近，从而阻止了基于该特征的分离。由此微型抗体制备物的组成可实际上是复合的，由A和B同种型的混合物组成。检测了经改造含有表2所示G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽(SEQ ID NO：9)的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8微型抗体的产生。

PRIMATIZEDp5E8 scFvs通过PCR扩增构建。ScFvs以两种方向(VL→(Gly4Ser)3接头→VH(VL/VH)和VH→(Gly4Ser)3接头→VL(VH/VL))构建。用于构建的寡核苷酸显示于下表：

表7.用于构建含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VL/VH微型抗体的PCR引物。在SEQ ID NO：37中，BspLU11 I限制性核酸内切酶位点加有下划线。在SEQ IDNO：40中Sal I限制性核酸内切酶位点加有下划线。

N-23VL-1F(SEQ ID NO：37)

5’-AGAGA GACATGTGGCGACATCCAGATGACCCAGTC-3’

23-VL-1R(SEQ ID NO：38)

5’-GGAGCCACCCCCACCGGACCCGCCACCGCCTTTGATTTCCACCTTGGTCC-3’

23-VH-2F(SEQ ID NO：39)

5’-GGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3’

N-23-VH-2R(SEQ ID NO：40)

5’-AGAGAG GTCGACTGAGGAGACGGTGACCAGGAC-3’

表8.用于构建含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VH/VL微型抗体的PCR引物。SEQ IDNO：41中的BspLU11 I限制性核酸内切酶位点加有下划线。SEQ ID NO：44中的Sal I限制性核酸内切酶位点加有下划线。

N-23VH-1F(SEQ ID NO：41)

5’-AGAGA GACATGTGGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3’

23-VH-1R(SEQ ID NO：42)

5’-GGAGCCACCCCCACCGGACCCGCCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGAC-3’

23-VL-2F(SEQ ID NO：43)

5’-GGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCGACATCCAGATGACCCAGTC-3’

N-23-VL-2R(SEQ ID NO：44)

5’-AGAGAG GTCGACTTTGATTTCCACCTTGGTCC-3

VL/VH scFv在两步中构建。5′VL PCR正向引物N-23VL-1F(SEQ IDNO：37)包括BspLU11 I限制性核酸内切酶位点以允许将scFv连接于表达载体中的免疫球蛋白信号肽。3′VL PCR反向引物23-VL-1R(SEQ ID NO：38)包括部分编码用于连接VL和VH区的(Gly4Ser)3接头肽的序列。5′正向VH PCR引物23-VH-2F(SEQ ID NO：30)也包括部分编码用于连接VL和VH区的(Gly4Ser)3接头肽的序列，3′VH PCR反向引物N-23-VH-2R(SEQ ID NO：40)包括Sal I限制性核酸内切酶位点以将scFv连于铰链区。两个V区利用两组PCR引物自含有PRIMATIZEDp5E8G1抗体的质粒DNA底物扩增，并在两步PCR反应中通过编码(Gly4Ser)3接头的共同重叠序列进行scFv的组装。PRIMATIZEDp5E8 scFv基因片段利用凝胶分离，用BspLU11 I和Sal I限制性核酸内切酶消化，并克隆入BspLU11 I和Sal I双消化的、含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的CH2结构域-缺失的抗体双顺反子表达载体。PRIMATIZEDp5E8 VH/VL scFv以类似方式利用PCR引物对N-23VH-1F(SEQ ID NO：41)和23-VH-1R(SEQ ID NO：36)和23-VL-2F(SEQ ID NO：43)和N-23-VL-2R(SEQ ID NO：44)构建，所述引物对显示于表7和8。两种完整构建体的正确序列通过DNA分析确证。质粒DNA用于转化CHO DG44细胞以瞬时(transient)产生抗体蛋白。图14显示含有VL→VH方向(VL/VH)的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VL/VH微型抗体的DNA序列。图15显示含有VH→VL方向(VH/VL)的G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VH/VL微型抗体的DNA序列。图16显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VL/VH微型抗体的氨基酸序列。图17显示含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8 VH/VL微型抗体的氨基酸序列。

上清收集自转染的细胞系，通过ELISA分析培养上清中的微型抗体分子与固定在塑料微量滴定板的可溶CD23抗原的结合。结果显示于图33，证实了PRIMATIZEDp5E8 VH/VL和含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的VL/VH微型抗体均以剂量反应方式同等结合CD23抗原。

上清通过非还原SDS-PAGE电泳然后通过Western印迹分析，利用抗人IgG-HRP偶联的抗体检测含有G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽的CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8微型抗体的A型和B型同种型。在这些条件下，预期A型作为单个～80-90kDa同源二聚体迁移，B型作为～40-45kDa双体迁移。SEQ ID NO：9的连接肽基本上增加A型的比例。示例性结果显示于图34。这些结果显示，G1/G3/Pro243Ala244Pro245+[Gly/Ser]连接肽(SEQ ID NO：9)导致产生基本上所有A型CH2结构域-缺失的PRIMATIZEDp5E8微型抗体而无可检测的B型。

等同物

本领域技术人员利用不超过常规试验将认识到，或能确定本发明具体实施方案的许多等同物。所述等同物意图包含在以下权利要求中。

                             序列表

                             序列表

SEQ ID NO：1

GGGSSGGGSG

SEQ ID NO：2

EPKSCDKTHT

SEQ ID NO：3

CPPCP

SEQ ID NO：4

APELLGGP

SEQ ID NO：5

ELKTPLGDTTHT

SEQ ID NO：6

CPRCPEPKSCDTPPPCPRCP

SEQ ID NO：7

EPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSG

SEQ ID NO：8

EPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPGGGSSGGGSG

SEQ ID NO：9

EPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSG

SEQ ID NO：10

EPKSCDKTHTSPPCPGGGSSGGGSG

SEQ ID NO：11

EPKSCDKTHTSPPCPAPGGGSSGGGSG

SEQ ID NO：12

EPKSCDKTHTCPPSPGGGSSGGGSG

SEQ ID NO：13

EPKSCDKTHTCPPSPAPGGGSSGGGSG

SEQ ID NO：14

EPKSCDKTHTCPPCPAPGGGSSGGGSG

SEQ ID NO：15

EPKSCDKTHTCPPCPGGGSSGGGSG

SEQ ID NO：16

CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGGTGAAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAA

GGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAATCCACTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGG

AGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGATGATTTTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCC

ACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGCCTACGTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATAC

TGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATATGGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCT

CCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGC

ACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG

CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA

GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC

AGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTG

CGGAGGTGGCTCGAGTGGAGGCGGTTCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC

CATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGC

GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCT

GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGA

ACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG

TCTCCGGGTAAATCCGGCGGGGGTGGATCCGGTGGAGGGGGCTCCGGCGGTGGCGGGTCCGACATCGT

GATGAGCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGTGACTCTGAATTGCAAGTCCA

GCCAGTCCCTGCTCTATAGCGGAAATCAGAAGAACTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAG

AGCCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCGCTAGGGAATCCGGCGTGCCTGATCGCTTCAGCGGCAG

CGGATCTGGGACAGACTTCACTCTGACAATCAGCAGCGTGCAGGCAGAAGACGTGGCAGTCTATTATT

GTCAGCAGTATTATAGCTATCCCCTCACATTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTTAAGGGCGGTGGC

GGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGT

GGTGAAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAA

TCCACTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGAT

GATTTTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGC

CTACGTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATA

TGGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGC

SEQ ID NO：17

CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGGTGAAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAA

GGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAATCCACTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGG

AGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGATGATTTTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCC

ACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGCCTACGTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATAC

TGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATATGGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCT

CCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGC

ACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG

CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCA

GCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC

AGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTG

CCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGGAGGTGGCTCGAGTGGAG

GCGGTTCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACC

AAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGA

GAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCT

TCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTG

ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATCCGGCGG

GGGTGGATCCGGTGGAGGGGGCTCCGGCGGTGGCGGGTCCGACATCGTGATGAGCCAGTCTCCAGACT

CCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGTGACTCTGAATTGCAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTCTATAGC

GGAAATCAGAAGAACTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGAGCCCTAAACTGCTGATTTA

CTGGGCATCCGCTAGGGAATCCGGCGTGCCTGATCGCTTCAGCGGCAGCGGATCTGGGACAGACTTCA

CTCTGACAATCAGCAGCGTGCAGGCAGAAGACGTGGCAGTCTATTATTGTCAGCAGTATTATAGCTAT

CCCCTCACATTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTTAAGGGCGGTGGCGGGTCCGGTGGGGGTGGCTC

CGGGGGCGGTGGCTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGGTGAAACCTGGGGCTTCCG

TGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAATCCACTGGGTGAAACAGAAT

CCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGATGATTTTAAGTACAATGAGAG

GTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGCCTACGTGGAGCTCTCCAGCC

TGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATATGGCCTACTGGGGACAGGGA

ACCCTGGTCACCGTCTCCAGC

SEQ ID NO：18

GACATCGTGATGAGCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGTGACTCTGAATTG

CAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTCTATAGCGGAAATCAGAAGAACTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAAC

CAGGGCAGAGCCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCGCTAGGGAATCCGGCGTGCCTGATCGCTTC

AGCGGCAGCGGATCTGGGACAGACTTCACTCTGACAATCAGCAGCGTGCAGGCAGAAGACGTGGCAGT

CTATTATTGTCAGCAGTATTATAGCTATCCCCTCACATTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTGAAAC

GTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCC

TCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGC

CCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCA

GCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCAT

CAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA

SEQ ID NO：19

QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKA

TLTADTSASTAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG

TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP

SNTKVDKKVEPKSCDKTETCPPCGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL

SPGKSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMSQSPDSLAVSLGERVTLNCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQ

SPKLLIYWASARESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGG

GSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGND

DFKYNERFKGKATLTADTSASTAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO：20

QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDEAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKA

TLTADTSASTAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG

TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP

SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDE

LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMSQSPDSLAVSLGERVTLNCKSSQSLL

YSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASARESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYY

SYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVK

QNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADTSASTAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWG

QGTLVTVSS

SEQ ID NO：21

DIVMSQSPDSLAVSLGERVTLNCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASARESGVPDRF

SGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA

SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH

QGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO：22

GACATCGTGATGAGCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGTGACTCTGAATTG

CAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTCTATAGCGGAAATCAGAAGAACTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAAC

CAGGGCAGAGCCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCGCTAGGGAATCCGGCGTGCCTGATCGCTTC

AGCGGCAGCGGATCTGGGACAGACTTCACTCTGACAATCAGCAGCGTGCAGGCAGAAGACGTGGCAGT

CTATTATTGTCAGCAGTATTATAGCTATCCCCTCACATTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTTAAGG

GCGGTGGCGGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGC

GCTGAGGTGGTGAAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGA

TCACGCAATCCACTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCG

GAAACGATGATTTTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCC

AGCACTGCCTACGTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATC

CCTGAATATGGCCTACTGGGGACAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGGCGGTGGAGGGTCCGGTG

GAGGGGGCTCTGGAGGGGGCGGTTCAGGGGGCGGTGGATCGGGCGGAGGTGCTAGCGACATCGTGATG

AGCCAGTCTCCAGACTCCCTTGGCCGTGTCCCTGGCGAGAGGGTGACTCTGAATTGCAAGTCCAGCCA

GTCCCTGCTCTATAGCGGAAATCAGAAGAACTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGAGCC

CTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCGCTAGGGAATCCGGCGTGCCTGATCGCTTCAGCGGCAGCGGA

TCTGGGACAGACTTCACTCTGACAATCAGCAGCGTGCAGGCAGAAGACGTGGCAGTCTATTATTGTCA

GCAGTATTATAGCTATCCCCTCACATTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTTAAGGGCGGTGGCGGGT

CCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGGTG

AAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAATCCA

CTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGATGATT

TTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGCCTAC

GTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATATGGC

CTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGTCGACCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA

CATGCCCACCGTGCGGAGGTGGCTCGAGTGGAGGCGGATCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTG

TACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGG

CTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA

CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG

TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAA

GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO：23

GACATCGTGATGAGCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGTGACTCTGAATTG

CAAGTCCAGCCAGTCCCTGCTCTATAGCGGAAATCAGAAGAACTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAAC

CAGGGCAGAGCCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCGCTAGGGAATCCGGCGTGCCTGATCGCTTC

AGCGGCAGCGGATCTGGGACAGACTTCACTCTGACAATCAGCAGCGTGCAGGCAGAAGACGTGGCAGT

CTATTATTGTCAGCAGTATTATAGCTATCCCCTCACATTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTTAAGG

GCGGTGGCGGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGC

GCTGAGGTGGTGAAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGA

TCACGCAATCCACTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCG

GAAACGATGATTTTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCC

AGCACTGCCTACGTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATC

CCTGAATATGGCCTACTGGGGACAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGGCGGTGGAGGGTCCGGTG

GAGGGGGCTCTGGAGGGGGCGGTTCAGGGGGCGGTGGATCGGGCGGAGGTGCTAGCGACATCGTGATG

AGCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGTGACTCTGAATTGCAAGTCCAGCCA

GTCCCTGCTCTATAGCGGAAATCAGAAGAACTATCTCGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGAGCC

CTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCGCTAGGGAATCCGGCGTGCCTGATCGCTTCAGCGGCAGCGGA

TCTGGGACAGACTTCACTCTGACAATCAGCAGCGTGCAGGCAGAAGACGTGGCAGTCTATTATTGTCA

GCAGTATTATAGCTATCCCCTCACATTCGGCGCTGGCACCAAGCTGGAACTTAAGGGCGGTGGCGGGT

CCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGGTG

AAACCTGGGGCTTCCGTGAAGATTTCCTGCAAGGCAAGCGGCTACACCTTCACTGATCACGCAATCCA

CTGGGTGAAACAGAATCCTGGACAGCGCCTGGAGTGGATTGGATATTTCTCTCCCGGAAACGATGATT

TTAAGTACAATGAGAGGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCTGCCAGCACTGCCTAC

GTGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCCGAGGATACTGCAGTGTACTTCTGCACAAGATCCCTGAATATGGC

CTACTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCAGCGTCGACCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA

CATGCCCACCGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGGAGGT

GGCTCGAGTGGAGGCGGATCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCG

GGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCG

CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC

GACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT

CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG

GTAAATGA

SEQ ID NO：24

DIVMSQSPDSLAVSLGERVTLNCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASARESGVPDRF

SGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSG

AEVVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADTSA

STAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGASDIVM

SQSPDSLAVSLGERVTLNCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASARESGVPDRFSGSG

SGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVV

KPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADTSASTAY

VELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSVDPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGGQPREPQV

YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：25

DIVMSQSPDSLAVSLGERVTLNCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASARESGVPDRF

SGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSG

AEVVKPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADTSA

STAYVELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGASDIVM

SQSPDSLAVSLGERVTLNCKSSQSLLYSGNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASARESGVPDRFSGSG

SGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVV

KPGASVKISCKASGYTFTDHAIHWVKQNPGQRLEWIGYFSPGNDDFKYNERFKGKATLTADTSASTAY

VELSSLRSEDTAVYFCTRSLNMAYWGQGTLVTVSSVDPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAP

GGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：26

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGCAAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGC

AGCCTCCGGGTTCAGGTTCACCTTCAATAACTACTACATGGACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGCAGG

GGCTGGAGTGGGTCTCACGTATTAGTAGTAGTGGTGATCCCACATGGTACGCAGACTCCGTGAAGGGC

AGATTCACCATCTCCAGAGAGAACGCCAAGAACACACTGTTTCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGA

GGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGCTTGACTACAGGGTCTGACTCCTGGGGCCAGGGAGTCCTGG

TCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACC

TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG

GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACT

CCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT

CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATG

CCCACCGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGCACCTGGAG

GTGGCTCGAGTGGAGGCGGTTCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC

CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT

CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACT

CCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC

TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC

GGGTAAATCCGGCGGGGGTGGATCCGGTGGAGGGGGCTCCGGCGGTGGCGGGTCCGACATCCAGATGA

CCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCAGGGCAAGTCAG

GACATTAGGTATTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGT

TGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTC

TCACCGTCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCGACTTATTACTGTCTACAGGTTTATAGTACCCCT

CGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCGGTGGCGGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGG

GGGCGGTGGCTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGCAAAGCCTGGGGGGTCCCTGA

GACTCTCCTGCGCAGCCTCCGGGTTCAGGTTCACCTTCAATAACTACTACATGGACTGGGTCCGCCAG

GCTCCAGGGCAGGGGCTGGAGTGGGTCTCACGTATTAGTAGTAGTGGTGATCCCACATGGTACGCAGA

CTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGAGAACGCCAAGAACACACTGTTTCTTCAAATGAACA

GCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGCTTGACTACAGGGTCTGACTCCTGGGGC

CAGGGAGTCCTGGTCACCGTCTCCTCATGA

SEQ ID NO：27

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTG

CAGGGCAAGTCAGGACATTAGGTATTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGC

TCCTGATCTATGTTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGG

ACAGAGTTCACTCTCACCGTCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCGACTTATTACTGTCTACAGGT

TTATAGTACCCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCAT

CTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTG

AATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC

CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGA

GCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCC

GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA

SEQ ID NO：28

EVQLVESGGGLAKPGGSLRLSCAASGFRFTFNNYYMDWVRQAPGQGLEWVSRISSSGDPTWYADSVKG

RFTISRENAKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCASLTTGSDSWGQGVLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST

SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN

HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPAPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPS

RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV

FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ

DIRYYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTVSSLQPEDFATYYCLQVYSTP

RTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLAKPGGSLRLSCAASGFRFTFNNYYMDWVRQ

APGQGLEWVSRISSSGDPTWYADSVKGRFTISRENAKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCASLTTGSDSWG

QGVLVTVSS

SEQ ID NO：29

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRYYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSG

TEFTLTVSSLQPEDFATYYCLQVYSTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL

NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP

VTKSFNRGEC

SEQ ID NO：30

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTG

CAGGGCAAGTCAGGACATTAGGTATTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGC

TCCTGATCTATGTTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGG

ACAGAGTTCACTCTCACCGTCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCGACTTATTACTGTCTACAGGT

TTATAGTACCCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGGCGGTGGCGGGTCCGGTG

GGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGCAAAGCCT

GGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCCGGGTTCAGGTTCACCTTCAATAACTACTACATGGA

CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGCAGGGGCTGGAGTGGGTCTCACGTATTAGTAGTAGTGGTGATCCCA

CATGGTACGCAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGAGAACGCCAAGAACACACTGTTT

CTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGCTTGACTACAGGGTC

TGACTCCTGGGGCCAGGGAGTCCTGGTCACCGTCTCCTCAGTCGACCCCAAATCTTGTGACAAAACTC

ACACATGCCCACCGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGCA

CCTGGAGGTGGCTCGAGTGGAGGCGGATCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC

CCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA

GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG

CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG

GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC

TGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO：31

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGCGGCTTGGCAAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGC

AGCCTCCGGGTTCAGGTTCACCTTCAATAACTACTACATGGACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGCAGG

GGCTGGAGTGGGTCTCACGTATTAGTAGTAGTGGTGATCCCACATGGTACGCAGACTCCGTGAAGGGC

AGATTCACCATCTCCAGAGAGAACGCCAAGAACACACTGTTTCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGA

GGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGCTTGACTACAGGGTCTGACTCCTGGGGCCAGGGAGTCCTGG

TCACCGTCTCCTCAGGCGGTGGCGGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCGACATCCAG

ATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCAGGGCAAG

TCAGGACATTAGGTATTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCT

ATGTTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTC

ACTCTCACCGTCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCGACTTATTACTGTCTACAGGTTTATAGTAC

CCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAAGTCGACCCCAAATCTTGTGACAAAACTC

ACACATGCCCACCGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGCA

CCTGGAGGTGGCTCGAGTGGAGGCGGATCCGGAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC

CCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA

GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG

CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG

GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC

TGTCTCCGGGTAAATGA

SEQ ID NO：32

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRYYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSG

TEFTLTVSSLQPEDFATYYCLQVYSTPRTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLAKP

GGSLRLSCAASGFRFTFNNYYMDWVRQAPGQGLEWVSRISSSGDPTWYADSVKGRPTISRENAKNTLF

LQMNSLRAEDTAVYYCASLTTGSDSWGQGVLVTVSSVDPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPA

PGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV

LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：33

EVQLVESGGGLAKPGGSLRLSCAASGFRFTFNNYYMDWVRQAPGQGLEWVSRISSSGDPTWYADSVKG

RFTISRENAKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCASLTTGSDSWGQGVLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQ

MTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRYYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASSLQSGVPSRFSGSGSGTEF

TLTVSSLQPEDFATYYCLQVYSTPRTFGQGTKVEIKVDPKSCDKTHTCPPCPEPKSCDTPPPCPRCPA

PGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV

LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：34

IGKTISKKAK

SEQ ID NO：35

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

SEQ ID NO：36

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser

SEQ ID NO：37

AGAGAGACATGTGGCGACATCCAGATGACCCAGTC

SEQ ID NO：38

GGAGCCACCCCCACCGGACCCGCCACCGCCTTTGATTTCCACCTTGGTCC

SEQ ID NO：39

GGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC

SEQ ID NO：40

AGASAGGTCGACTGAGGAGACGGTTGACCAGGAC

SEQ ID NO：41

AGAGAGACATGTGGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGAGCCACCCCCACCGGACCCGCCACCGCCTGA

GGAGACGGTGACCAGGAC

SEQ ID NO：43

GGGTCCGGTGGGGGTGGCTCCGGGGGCGGTGGCTCCGACATCCAGATGACCCAGTC

SEQ ID NO：44

AGAGAGGTCGACTTTGATTTCCACCTTGGTCC

SEQ ID NO：45

ESKYGPP

SEQ ID NO：46

CPSCP

SEQ ID NO：47

APEFLGGP

SEQ ID NO：48

ESKYGPPCPSCPEPKSCDTPPPCPRCPAP

SEQ ID NO：49

CPEPKSCDTPPPCPR

Claims (60)

1.组合物，其包含含有至少四个结合位点和至少两条多肽链的多肽二聚体，其中所述至少两条多肽链包含至少一个重链部分和合成连接肽，其中超过约50％的二聚体包含经由至少一个链间二硫键连接的多肽链。

2.权利要求1的组合物，其中超过约90％的二聚体经由至少一个链间二硫键连接。

3.权利要求1的组合物，其中所述多肽链的至少一条包含经由所述连接肽与VL，VH或CH1结构域连接的CH3结构域。

4.权利要求1的组合物，其中所述多肽链缺乏所有或部分CH2结构域。

5.权利要求1的组合物，其中所述二聚体经由两个或更多个链间二硫键连接。

6.权利要求1的组合物，其中所述重链部分源自选自IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4组成的组的抗体同种型。

7.权利要求6的组合物，其中所述重链部分包含源自选自γ1铰链，γ2铰链，γ3铰链和γ4铰链组成的组的铰链区的氨基酸序列。

8.权利要求1的组合物，其中所述分子是双特异性的。

9.权利要求1的组合物，其中所述分子包含至少一个特异于可溶配体的结合位点。

10.权利要求1的组合物，其中所述分子包含至少一个特异于细胞表面分子的结合位点。

11.权利要求1的组合物，其中所述分子包含两个特异于肿瘤细胞抗原的结合位点以及两个特异于前体药物的结合位点。

12.权利要求11的组合物，其中所述特异于前体药物的结合位点是催化性的。

13.权利要求1的组合物，其中所述合成连接肽包含位于Kabat编号系统的位置243的脯氨酸残基。

14.权利要求13的组合物，其中所述合成连接肽还包括位于Kabat编号系统的位置244的丙氨酸残基以及位于位置245的脯氨酸残基。

15.权利要求1的组合物，其中所述重链部分包含嵌合铰链。

16.权利要求1的组合物，其中所述合成连接肽包含至少部分IgG1铰链结构域，至少部分IgG3铰链结构域。

17.权利要求1的组合物，其中所述连接肽包含选自SEQ ID NO：8-15，和48组成的组的氨基酸序列。

18.治疗可从利用抗原结合分子的疗法获益的受试者的方法，包括将权利要求1的组合物给予所述受试者，使得治疗发生。

19.权利要求18的方法，其中所述受试者患有癌症。

20.权利要求18的方法，其中所述受试者患有淋巴瘤。

21.权利要求18的方法，其中所述受试者患有自身免疫疾病或病症。

22.权利要求18的方法，其中所述受试者患有炎性疾病或病症。

23.核酸分子，其包含编码权利要求1的多肽链的核苷酸序列。

24.权利要求1的组合物，其中所述多肽二聚体包含四条多肽链，且其中的两条多肽链包含至少一个重链部分以及合成连接肽。

25.核酸分子，包含图8B所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)。

26.核酸分子，包含图8C所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)。

27.核酸分子，包含图10B所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：23)。

28.核酸分子，包含图12A所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)。

29.核酸分子，包含图12B所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)。

30.核酸分子，包含图14所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)。

31.核酸分子，包含图15所示的核苷酸序列(SEQ ID NO：31)。

32.权利要求24-30之一的核酸分子，其是载体。

33.宿主细胞，其包含权利要求32的载体。

34.结合分子，其包含图9B的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。

35.结合分子，其包含图9C的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。

36.结合分子，其包含图11B的氨基酸序列(SEQ ID NO：25)。

37.结合分子，其包含图13A的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。

38.结合分子，其包含图13B的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。

39.结合分子，其包含图16的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)。

40.结合分子，其包含图17的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。

41.权利要求1的组合物，其中所述结合位点独立选自抗原结合位点，受体的配体结合部分，或配体的受体结合部分组成的组。

42.权利要求41的方法，其中所述多肽链具有至少一个结合位点，其源自选自以下抗体组成的组的抗体：2B8，Lym 1，Lym 2，LL2，Her2，B1，MB1，BH3，B4，B72.3，CC49，5E8，B3F6，和5E10。

43.权利要求1的组合物，其中所述多肽二聚体是四价微型抗体分子。

44.权利要求1的组合物，其中所述多肽二聚体是四价结构域缺失的抗体分子。

45.权利要求1的组合物，其中所述多肽二聚体是二价抗体。

46.包含微型抗体分子的组合物，所述微型抗体分子包含两条多肽链，其中所述多肽链包含重链部分和合成连接肽，其中所述多肽链缺乏所有或部分CH2结构域，且其中超过约50％的微型抗体分子以其中的多肽链之一经由至少一个链间二硫键连接的形式存在。

47.权利要求46的组合物，其中超过约90％的二聚体经由至少一个链间二硫键连接。

48.权利要求46的组合物，其中至少一条多肽链包含经由连接肽基因融合于VL，VH或CH1结构域的CH3结构域。

49.权利要求46的组合物，其中所述多肽链缺乏整个CH2结构域。

50.权利要求46的组合物，其中所述二聚体经由两个或多个链间二硫键连接。

51.权利要求46的组合物，其中所述重链部分源自选自IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4组成的组的抗体同种型。

52.权利要求46的组合物，其中所述重链部分包含源自选自γ1铰链，γ2铰链，γ3铰链，和γ4铰链组成的组的铰链区的氨基酸序列。

53.权利要求46的组合物，其中所述结合位点独立选自抗原结合位点，受体的配体结合部分，和配体的受体结合部分组成的组。

54.权利要求46的组合物，其中所述分子是双特异性的。

55.权利要求46的组合物，其中所述连接肽包含位于Kabat编号系统的位置243的脯氨酸残基。

56.权利要求46的组合物，其中所述合成连接肽包含嵌合铰链。

57.权利要求46的组合物，其中所述合成连接肽包含至少部分IgG1铰链结构域，至少部分IgG3铰链结构域。

58.治疗可从利用抗原结合分子的疗法获益的受试者的方法，包括给予所述受试者权利要求45的组合物，使得治疗出现。

59.核酸分子，其包含编码权利要求46所述多肽链的核苷酸序列。

60.包含多肽二聚体的组合物，其中所述多肽二聚体具有至少四个结合位点和至少两条多肽链，其中所述至少两条多肽链包含至少一个重链部分并缺乏所有或部分CH2结构域，且其中超过约50％的多肽二聚体包含经由至少一个链间二硫键连接的多肽链。

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