KR102369014B1 - 혼합물로부터 개별 항체들을 정량하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 특히, 2개 이상의 항체 분자를 포함하는 혼합물로부터 항체 분자의 양을 정량하는 방법으로서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피 (HIC-HPLC)에 의해 혼합물로부터 2개 이상의 항체 분자 각각을 분리하는 단계 및 각 항체 분자의 양을 정량하는 단계를 포함하며, 이 경우 각 항체 분자의 분자량은 해당 혼합물 중의 임의의 다른 항체들의 분자량에 대하여 15 kDa 이내이고, 각 항체 분자는 카이트 & 두리틀 소수도 스케일 상으로 해당 혼합물 중의 또 다른 항체 분자와 약 0.25 단위 이상 다르거나, 또는 각 항체 분자는, HIC-HPLC 상에서 단독으로 구동되는 경우, 해당 혼합물 중의 다른 항체 분자와 거의 중첩되지 않는 별도의 구동 시간으로 용리하거나, 또는 상기 양자 모두의 경우가 가능한 것인, 방법에 대한 것이다.

Description

혼합물로부터 개별 항체들을 정량하는 방법
관련 출원의 인용
본 출원은 2016년 8월 16일에 출원된 미국 가출원 62/375,887호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 치료적 항체의 복합제제(co-formulation)에 대한 분석 분야에 관한 것이다.
환자에게 일회성이 아닌 다회성의 단일클론 항체 (mAb)의 투여는 그들의 진단적 또는 치료적 적응증 및 효능을 개선시킬 수 있다. 이러한 mAb들은 단일 의약품 (DP)으로 복합제제화되어 이러한 DP를 환자에게 투여할 수 있다.
규제 당국은 DP에 포함될 복합 제제화된 의약 물질 (cFDS) 중의 개별 mAb, 또는 DP 그 자체를 정량하는 방법을 요구하고 있다. 2개 이상의 항체 분자들을 분리하는 방법과 각각의 mAb의 농도를 측정하는 방법을 개발하는 것은 쉽지 않는데, 그 이유는 항체 분자들이 유사한 분자량, 단백질 구조 및 전하 특성을 가질 수 있기 때문이다.
본 발명은 다수의 항체들을 포함하는 혼합물로부터 항체의 양을 정량하는 방법을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은, 무엇보다도, 소수성 상호작용 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피 (HIC-HPLC)를 이용하여 혼합물 중의 다수의 항체들 각각을 분리하는 단계, 및 혼합물 중에서 각 항체의 양을 정량하는 단계를 포함하며, 이 경우 혼합물 중의 각 항체의 분자량은 해당 혼합물 중의 임의의 다른 항체들의 분자량에 대하여 15 kDa 이내이고, 혼합물 중의 각 항체의 표면 소수성은 해당 혼합물 중의 또 다른 항체의 표면 소수성과 카이트 & 두리틀 소수도 스케일(Kyte & Doolittle hydropathy scale) 상으로 약 0.25 단위 이상 다르거나, 또는 혼합물 중의 각 항체는, HIC-HPLC 상에서 개별적으로 구동되는 경우, 해당 혼합물 중의 또 다른 항체와 별도의 구동 시간으로 용리하거나, 또는 상기 양자 모두가능하다.
일부 실시양태에서, 혼합물 중의 각 항체의 표면 소수성은 카이트 & 두리틀 소수도 스케일 상으로 해당 혼합물 중의 각각의 다른 항체의 표면 소수성과 약 0.5 내지 약 1.0 단위로 다르다. 추가의 실시양태에서, 혼합물 중의 각 항체의 표면 소수성은 단백질 구조 또는 구조 모델에 기초한 표면 소수성 계산, 황산암모늄 또는 PEG8000 중의 가용성에 대한 쾌속 스크리닝, 또는 친화도 포획 자가 상호작용 나노입자 분광법 (AC-SINS: affinity capture-self-interaction nanoparticle spectroscopy)에 의한 분자 상호작용에 대한 쾌속 스크리닝에 의해 측정한다.
추가의 실시양태에서, 혼합물 중의 제1 항체는 HIC-HPLC 구동 동안에 제1 구동 시간으로 용리하고, 혼합물 중의 제2 항체는 HIC-HPLC 구동 동안에 제2 구동 시간으로 용리하며, 상기 제1 및 제2 구동 시간은 중첩되지 않는다. 추가의 실시양태에서, 혼합물 중의 제1 항체 및 혼합물 중의 제2 항체는 적어도 90% 상동성인 단백질 서열을 가지거나, 상기 제1 항체 및 제2 항체는 이들의 단백질 서열에 의해 측정시 적어도 90% 상동성인 단백질 서열을 가지거나, 또는 제1 항체 및 제2 항체는 이들의 단백질 서열에 의해 측정시 서로에 대해 약 0.6 이내의 등전점 (pI)을 가진다.
일부 실시양태에서, 상기 다수의 항체는 3개의 항체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 혼합물 중의 하나 이상의 항체는 단일클론 항체이다. 추가의 실시양태에서, 혼합물 중의 하나 이상의 항체는 인간 단일클론 항체이다. 다른 실시양태에서, 혼합물 중의 2개 이상의 항체는 동일한 동형(isotype)이다. 일부 실시양태에서, 혼합물 중의 2개 이상의 항체는 서로에 대한 변이체이다. 추가의 실시양태에서, 혼합물 중의 2개 이상의 항체는 동일한 항원에 결합한다.
일부 실시양태에서, 상기 혼합물은 복합 제제화된 조성물이다. 추가의 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 인간 환자에서 MERS를 치료하도록 구성된다. 추가의 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 인간 환자에서 에볼라 출혈열(Ebola hemorrhagic fever)을 치료하도록 구성된다. 추가의 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 인간 환자에서 황반 변성(macular degeneration)을 치료하도록 구성된다. 추가의 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물 중의 2개 이상의 항체는 인간 환자에서 감염성 질병을 치료하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 의약품 중에 포함된다.
일부 실시양태에서, 상기 HIC-HPLC는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0의 버퍼 중에서 수행된다. 추가의 실시양태에서, 상기 방법은 HIC-HPLC로부터 크로마토그래프를 생성하는 단계로서, 혼합물 중의 각 항체의 용리에 있어서, 상기 크로마토그래프가 해당 크로마토그래프 중의 다른 피크들과 중첩되지 않는 피크를 나타내는 것인, 단계를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 다수의 항체들을 포함하는 혼합물로부터 항체의 양을 정량하는 방법으로서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피 (HIC-HPLC)를 이용하여 상기 혼합물 중의 다수의 항체들 각각을 분리하는 단계로서, 상기 혼합물 중의 각 항체의 분자량이 해당 혼합물 중의 각각의 다른 항체들의 분자량에 대하여 15 kDa 이내인 것인, 단계; 혼합물 중의 각 항체의 양을 정량하는 단계; 및 상기 HIC-HPLC로부터 크로마토그래프를 생성하는 단계로서, 상기 혼합물 중의 각 항체의 용리에 있어서, 상기 크로마토그래프가 해당 크로마토그래프 중의 다른 피크들과 중첩되지 않는 피크를 나타내는 것인, 단계를 포함하는 방법도 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 다수의 항체들 중 하나 이상은 인간 단일클론 항체이다. 추가의 실시양태에서, 혼합물 중의 각 항체의 표면 소수성은 카이트 & 두리틀 소수도 스케일 상으로 해당 혼합물 중의 또 다른 항체의 표면 소수성과 약 0.25 단위 이상 다르거나, 또는 혼합물 중의 각 항체는, HIC-HPLC 상에서 개별적으로 구동되는 경우, 해당 혼합물 중의 또 다른 항체와 별도의 구동 시간으로 용리하거나, 또는 상기 양자 모두 가능하다.
본 발명의 상기 양태들 및 다른 양태들에 따른 다양한 다른 양태들과 실시양태들이 제공된다. 본 발명의 다른 특징들과 양태들은 하기의 상세한 설명과 첨부되는 청구범위로부터 더욱 명백해질 것이다.
본 명세서에 포함되어 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 다양한 실시예를 예시하며, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다. 본원에 기술된 실시양태 또는 실시예의 임의의 특징 (예컨대, 장치, 방법 등)은 임의의 다른 실시양태 또는 실시예들과 조합될 수 있으며, 이들도 본 발명에 포함된다.
도 1은 항-에볼라 mAb를 포함하는 복합제제에 대한 HIC-HPLC 구동의 예시적인 크로마토그래프를 나타낸 것이다.
도 2-8은 항-MERS mAb를 포함하는 복합제제에 대한 HIC-HPLC 구동의 예시적인 크로마토그래프를 나타낸 것이다.
도 9은 항-에볼라 mAb를 포함하는 복합제제에 대한 HIC-HPLC 구동의 예시적인 크로마토그래프를 나타낸 것이다.
도 10은 개개의 항-에볼라 mAb 구동의 양에 대한 피크 면적을 플롯팅한 HIC-HPLC의 직선성(linearity)에 대한 그래프이다.
도 11은 개개의 항-에볼라 mAb 구동의 양에 대한 mAb의 회수율(% recovery)을 플롯팅한, 범위에 대한 그래프이다.
도 12는 개개의 항-에볼라 mAb 구동의 양에 대한 mAb의 회수율을 플롯팅한, 서로 다른 혼합물 샘플 로트들에 대한 HIC-HPLC의 정확성의 그래프이다.
도 13은 개개의 항-에볼라 mAb 구동의 양에 대한 mAb의 회수율을 플롯팅한, 서로 다른 비율의 개개의 항-에볼라 mAb에 대한 HIC-HPLC의 정확성의 그래프이다.
도 14는 저장 시간(월)에 대한 개개의 항-에볼라 mAb의 양을 플롯팅한, cFDS 중의 mAb의 저장 안정성에 대한 그래프이다.
도 15는 항-에볼라 mAb를 포함하는 복합제제의 양이온 교환 초고압 액체 크로마토그래피 (CEX-UPLC) 구동에 대한 예시적인 크로마토그래프를 나타낸 것이다.
도 16은 개개의 항-에볼라 mAb의 양에 대한 피크 면적을 플롯팅한 CEX-UPLC의 직선성에 대한 그래프이다.
도 17은 항-에볼라 mAb를 포함하는 복합제제의 크기 배제 초고압 액체 크로마토그래피 (SE-UPLC) 구동에 대한 예시적인 크로마토그래프를 나타낸 것이다.
도 18은 항-에볼라 mAb를 포함하는 복합제제에 대한 이미지화된 예시적인 등전점 집중 모세관 전기영동 (imaged capillary isoelectric focusing, iCIEF) 프로파일을 나타낸 것이다.
도 19는 항-에볼라 mAb를 포함하는 복합제제의 역상 초고압 액체 크로마토그래피 (RP-UPLC) 구동에 대한 예시적인 크로마토그래프를 나타낸 것이다.
"항체"라는 용어는 흔히 "면역글로불린"이라는 용어와 서로 바꿔서 사용된다. 간략히 설명하면, 상기 용어는 2개의 경쇄 폴리펩타이드 및 2개의 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 전장 항체를 지칭할 수 있다. 전장 항체는 IgM, IgG, IgA, IgD 및 IgE 항체를 비롯한 서로 다른 항체 동형을 포함한다. "항체"라는 용어는, 예를 들어, 다클론 항체, 단일클론 항체 (mAb), 키메라화 또는 키메라 항체, 인간화 항체, 영장류화 항체, 탈면역화 항체 및 완전 인간 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 임의의 다양한 종, 예컨대, 인간, 인간이 아닌 영장류 (예컨대, 오랑우탄, 개코원숭이, 또는 침팬지), 말, 소, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니아 피그, 게르빌루스쥐, 햄스터, 랫트 및 마우스와 같은 포유동물 중에서 제조되거나 또는 이로부터 유래될 수 있다. 상기 항체는 정제된 항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 상기 항체는 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 함유하는 조작된 단백질 또는 항체유사 단백질(예컨대, 융합 단백질)일 수도 있다. 상기 조작된 단백질 또는 항체유사 단백질은 이중 특이적 항체 또는 삼중 특이적 항체이거나, 또는 이합체, 삼합체 또는 다합체 항체이거나, 또는 이원항체, DVD-Ig, CODV-Ig, Affibody®, 또는 Nanobody®일 수 있다.
"항체의 변이체," "항체 변이체" 등과 같은 용어는, 변이체 항체가 다른 항체의 결실 변이체, 삽입 변이체 및/또는 치환 변이체라는 점에서 또 다른 항체와는 다른 항체를 일컫는다.
본원에 사용된 "인간 항체"라는 용어는 인간 생식세포 계열의 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하려고 한다. 인간 mAb는, 예를 들어, CDR에서 및 특히 CDR3에서, 인간 생식세포 계열의 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 "인간 항체"라는 용어는, 또 다른 포유동물 종 (예를 들어, 마우스)의 생식세포 계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 FR 서열로 이식된 mAb를 포함하려는 것은 아니다. 상기 용어는 인간이 아닌 포유동물, 또는 인간이 아닌 포유동물의 세포에서 재조합에 의해 제조된 항체를 포함한다. 상기 용어는 인간 대상체로부터 분리되거나 인간 대상체에서 제조된 항체를 포함하려는 것은 아니다.
본원에서 사용된 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 질병 또는 질환의 치료가 필요한 대상체에게 2종 이상의 항체의 복합제제의 투여로 인한 해당질병 또는 질환의 적어도 하나의 증상 또는 징후의 중증도의 감소 또는 개선을 지칭한다. 상기 용어들은 질병 진행의 억제를 포함한다. 또한, 상기 용어들은 질병에 대한 긍정적인 예후도 포함한다.
"예방하다", "예방하는" 또는 "예방"이라는 용어는, 2종 이상의 항체의 복합제제의 투여시 질병 또는 질환의 징후 또는 이러한 질병 또는 질환의 임의의 증상 또는 징후의 억제를 지칭한다.
"예를 들어"와 "예컨대" 및 이와 문법적으로 동일한 용어에 있어서는, 명백히 달리 언급하지 않는 한, "이에 제한되지는 않는다"라는 어구가 뒤따르는 것으로 이해해야 한다. 본원에서, "약" 및 "~"라는 기호는 실험적 오차로 인한 편차를 처리하려는 것이다. 본원에 기록한 모든 측정값들은, 명백히 달리 언급하지 않는 한, "약"이라는 용어 (해당 용어가 명백하게 사용되었는지의 여부에 상관없이)에 의해 수식을 받는 것으로 이해해야 한다. 본원에서, 단수형 명사 ("a," "an" 및 "the")는, 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수형의 해당 대상물도 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 본원에 기술된 방법과 물질들; 그 밖에 당업계에 공지된 다른 적절한 방법과 물질들도 사용될 수 있다. 상기 물질, 방법 및 실시예들은 단지 예시일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목 및 기타 참고문헌들은 그 전문이 참고로 포함된다. 상기 문헌들과 내용상 상충하는 경우가 발생하는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
항체 분자, 예컨대 단일클론 항체 분자는 (인간 환자를 포함하는) 환자에 있어서 하나 이상의 질병 또는 질환을 치료하도록 복합 제제화될 수 있다. "환자"와 "피험체"라는 용어는 본원에서 상호교환하여 사용된다.
복합 제제화된 의약품 (DP)은 2개 이상의 (예컨대, 3개) 인간 단일클론 항체 (mAb) 분자를 함유하는 복합 제제화된 의약 물질 (cFDS) (본원에서 복합제제로도 지칭됨)을 포함할 수 있다. 상기 cFDS는 정제된 mAb들을 사전에 결정된 비율로 혼합하여 제조된다. 규제 당국은 cFDS 중의 각 개별 mAb를 정량하는 방법을 요구하고 있다.
복합 제제 중의 mAb 분자는 서로 유사할 수 있다: 이들은 대략 동일한 분자량 (예컨대, ~145 kDa); 유사한 단백질 구조와 전하 특성을 갖는 면역글로불린 (예컨대, IgG1)일 수 있다.
복합 제제 중의 유사한 mAb 분자들을 정량하기 위해 본원에 개시된 방법들은 정밀하고, 정확하며, 재현가능하고, 품질 제어 환경에 사용하기에 적절하며, 고가의 장비를 사용하지 않고, 번거롭고 복잡한 샘플 제조가 필요없다.
방법
본 발명은 2개 이상의 항체 분자를 포함하는 혼합물로부터 항체 분자의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피 (HIC-HPLC)에 의해 혼합물로부터 2개 이상의 항체 분자 각각을 분리하는 단계 및 각 항체 분자의 양을 정량하는 단계를 포함할 수 있으며, 이 경우 각 항체 분자의 분자량은 해당 혼합물 중의 임의의 다른 항체들의 분자량에 대하여 15 kDa 이내이고, 각 항체 분자는 해당 혼합물 중의 또 다른 항체 분자와 카이트 & 두리틀 소수도 스케일(예컨대, 문헌 [Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)] 참조) 상으로 약 0.25 단위 이상 다르거나, 또는 각 항체 분자는, HIC-HPLC 상에서 단독으로 구동되는 경우, 해당 혼합물 중의 다른 항체 분자와 거의 중첩되지 않는 별도의 구동 시간으로 용리하거나, 또는 상기 양자 모두 가능하다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 각 항체 분자의 상대적 소수성은 카이트 & 두리틀 소수도 스케일 상으로 혼합물 중의 각각의 다른 항체 분자들과 약 0.5 내지 약 1.0 단위로 서로 다르다. 다른 특정 실시양태에서, 각각의 상기 항체 분자는, HIC-HPLC 상에서 단독으로 구동되는 경우, 해당 혼합물 중의 다른 항체 분자와 거의 중첩되지 않는 별도의 구동 시간으로 용리한다. 특정 실시양태에서, 상기 혼합물은 다수의 항체 분자 (예컨대, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 항체 분자)를 포함한다.
혼합물의 두 항체 분자가, HIC-HPLC 상에서 구동되는 경우, 해당 항체 분자의 흡광도 대 용리 시간에 의한 용리 프로파일을 모니터링하는 크로마토그래프에서 상당히 중첩된다면, 이는 상기 두 항체 분자들이 근접한 시간대에 용리하는 것을 의미하므로, 결국 컬럼 내에서 미약한 분리를 초래하여 상기 항체 분자들이 정제되지 않는다 (예컨대, 50% 미만 순도). 이러한 경우, 개별 항체들은 상기 상당한 중첩으로 인해 충분히 정량화될 수 없다. 일부 실시양태에서, 혼합물의 두 항체 분자가, HIC-HPLC 상에서 구동되는 경우, 해당 항체 분자의 흡광도 대 용리 시간에 의한 용리 프로파일을 모니터링하는 크로마토그래프에서 중첩이 거의 없거나 발생하지 않는다면, 이는 상기 항체 분자들이 근접하지 않은 시간대에 용리하는 것을 의미하므로, 결국 해당 항체 분자들은 각각 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 순도로 실질적으로 정제되도록 분리된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은, 2개 이상의 서로 다른 항체의 군들(이들 간에는 적어도 하나의 아미노산 차이가 있음)을 포함하는 항체들의 혼합물로부터 "항체 분자"로도 지칭되는 개별 항체의 군을 정량하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 항체의 군은 해당 항체들의 혼합물 중의 또 다른 군과 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있지만, 이들은 번역후 변형에 있어서는 상이할 수 있다. 특정 실시양태에서, 혼합물은 복합 제제화된 조성물, 예컨대 복합 제제화된 의약 물질 (cFDS)이거나 이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 혼합물을 부형제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 혼합물은 수크로스를 포함하며, mAb 분자를 포함하는 수크로스 의약 물질일 수 있다. 항체들의 혼합물 중의 각 항체는 서로에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 10 또는 15 킬로달톤 (kDa) 이내에서 유사한 분자량을 가질 것이다. 또 다른 양태에서, 모든 항체들의 평균 분자량은 약 150 kDa일 것이다. 상기 방법은 유사한 분자량을 갖는 2개 이상의 트랩(trap) 분자에도 사용될 수 있다. 추가의 특정 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 VEGF-Trap을 포함한다 (예컨대, 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 9,265,827호 및 미국 특허 출원 14/943,490호를 참조한다). 또한, 상기 방법은 저장 안정성을 모니터링하는데 있어서 혼합물 (예컨대, 복합제제) 중에서 각각의 mAb에 대한 농도를 모니터링하는데에도 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 다른 크로마토그래피 방법, 예컨대 역상 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 초고압 액체 크로마토그래피 (UPLC)에 의해 분리될 수 없는 항체 분자들을 분리하는데 사용된다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는 항체들의 표면 소수성에서의 차이를 바탕으로 감소하는 염구배로 항체들을 분리한다. HIC를 이용하는 분리는 항체 및 크로마토그래피 매트릭스에 결합된 소수성 리간드 간의 가역적 상호작용을 기반으로 한다. 단백질 및 펩타이드의 소수성 아미노산들은 보통 분자 표면에서 멀리 떨어져 위치하지만, 생체분자들은 매질 상의 소수성 리간드와 상호작용하도록 노출된 일부 소수성 기들을 보유한다. 상기 소수성 상호작용은 높은 이온 강도를 갖는 버퍼에 의해 향상된다.
임의의 적절한 HIC-HPLC 컬럼, 예컨대, 이에 제한되지는 않지만, 다이오넥스(Dionex) ProPac HIC-10, mAbPac HIC-10, mAbPac HIC-20, mAbPac HIC-부틸 [미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) 다이오넥스사 제조]이 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 버퍼는 임의의 적절한 버퍼일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 HIC-HPLC는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0, 또는 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0 또는 약 6.5 내지 약 7.5의 버퍼 pH 중에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 컬럼은 다이오넥스 MabPac HIC-10 (100×4.6 mm, 5 ㎛, 공극 크기 1000Å)과 ProPac HIC-10 (100×4.6 mm, 5 ㎛, 공극 크기 300Å)이다.
2개 이상의 항체를 포함하는 혼합물을 HIC-HPLC 상에 구동시킨다. 상기 항체들은 다른 시간 (구동 시간)대에서 용리한다. 상기 항체들은 예컨대, UV 스펙트럼 상의 280 nm에서 이들의 흡광도를 측정하여 모니터링한다. 크로마토그래프는 해당 구동에 대해 모니터링하고 이를 기록하는데 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, HIC-HPLC에서 사용된 버퍼들은 100 mM 인산염 버퍼 중의 1M 황산암모늄의 구배가 서로 다르다 (100% 내지 0%).
특정 실시양태에서, 항체 분자들은 280 nm에서의 이들의 흡광도를 표준 곡선과 비교하여 정량화한다. 표준 곡선은 예를 들어, 280 nm의 흡광도에서, HIC-HPLC 구동으로부터 공지된 농도의 공지된 항체의 흡광도를 측정하여 구축할 수 있다. 흡광도 (또는 "광학 밀도")가 클수록, 단백질 농도가 높다. 공지된 농도의 항체에 대한 이들 데이터를 사용하여, X축 상에는 농도를, Y축 상에는 HIC-HPLC 구동으로부터 해당 항체의 용리 프로파일에 대한 크로마토그래프로에서 수득한 흡광도를 나타낸 표준 곡선을 제작한다. 표준 곡선의 항체를 비롯하여 미지의 농도의 2개 이상의 항체를 포함하는 샘플을 구동시킨다. 데이터를 분석하기 위해, 상기 항체들을 HIC-HPLC로 분리시킨다. 항체들의 용리 프로파일을 크로마토그래프 상에 표시하고, 항체 농도는 분광광도계에 의해 시간의 경과에 따라 모니터링한 흡광도로 나타낸다. 항체의 용리 시간 (구동 시간)에 의해 확인된 각 항체의 흡광도를 사용하여 표준 곡선 상에 상응하는 흡광도 값을 배치시킨다. 표준 곡선 상의 해당 지점에 상응하는 X축 값이 샘플 중의 해당 항체의 농도이다.
본 발명의 일부 양태에서, 본원에 개시된 혼합물 중에서 개별 항체들을 정량하는 방법은 혼합물 중의 각 항체의 상대적인 표면 소수성이 카이트 & 두리틀 소수도 스케일 상으로 해당 혼합물 중의 각각의 다른 항체와 약 0.25 단위 초과, 예컨대 약 0.5 내지 약 1.0 단위로 다른 경우에 유용할 수 있다. 항체들의 상대적인 표면 소수성은 여러가지 방법들에 의해 측정/평가될 수 있다.
예를 들어, HIC-HPLC가 서로 다른 항체 분자들의 상대적인 표면 소수성을 측정하는데 사용될 수 있다. 각각의 상기 항체 분자들을 HIC-HPLC 상에서 단독으로 구동시켜, 각 항체에 대한 구동 시간 (용리 시간)을 측정한다.
특정 실시양태에서, 혼합물 중의 항체들 간의 표면 소수성의 차이는 하기의 방법들 중 하나 이상을 사용하여 측정한다: 단백질 구조 또는 구조 모델을 기초로 한 표면 소수성의 계산, 황산암모늄 또는 PEG8000 중의 가용성에 대한 쾌속 스크리닝, 및 친화도 포획 자가 상호작용 나노입자 분광법 (AC-SINS: affinity capture-self-interaction nanoparticle spectroscopy)에 의한 분자 상호작용에 대한 쾌속 스크리닝에 의해 측정한다.
상기 상대적인 표면 소수성은 (예를 들어, 결정 구조 또는 NMR 구조를 바탕으로 한) 해당 항체의 공지된 구조 또는 구조 모델을 기초로 산출할 수 있다. 이러한 산출 방법은 당업계에 공지되어 있다.
상대적인 표면 소수성은 예를 들어, 황산암모늄 또는 PEG8000에서와 같이, 소수성을 향상시키는 조건에서 가용성에 대한 쾌속 스크리닝법에 의해 항체 분자의 가용성을 측정함으로써 계산/추정할 수 있다. 단백질의 가용성 클수록, 소수성이 덜하다 (예컨대, 문헌 [Kramer et al., Biophysical Journal Volume 102 April 1907-1915 (2012)]을 참조한다).
상대적인 표면 소수성은 친화도 포획 자가 상호작용 나노입자 분광법 (AC-SINS)에 의해 분자 상호작용에 대한 쾌속 스크리닝으로 계산/추정할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Estep et al., mAb, 7:3, 553-561 (2015)]을 참조한다). AC-SINS는 금 나노입자로 다클론 항-인간 항체를 코팅하는 접근법으로서, 이러한 접합체를 사용하여 인간 mAb를 고정시키고, 황산암모늄 농도의 함수로서 항체 접합체의 플라스몬 파장을 측정함으로써 mAb간 상호작용을 평가한다.
다른 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 사용하여 분리시킬 수 있는 혼합물 중의 항체들은 하기의 방법들 중 하나 이상으로 측정시 유사한 크기 또는 총전하를 가질 것이다: 서열 및 기타 공지된 단백질 구조에 기초한 단백질 구조 또는 구조 모델, 단백질 서열을 바탕으로 계산된 총 단백질 전하 특성, 단백질 서열을 바탕으로 계산된 소수성, 및 단백질 시퀀싱.
특정 실시양태에서, 혼합물 중의 항체들은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성인, 서열 및 기타 공지된 단백질 구조에 기초한 단백질 구조 또는 구조 모델을 가진다. 특정 실시양태에서, 혼합물 중의 항체들은 서로에 대해 3, 4 또는 5, 10 또는 15 기본 단위 이내로 계산된 단백질 전하 특성(단백질 서열을 기초로 계산됨)을 가진다. 특정 실시양태에서, 혼합물 중의 2개 이상의 항체들은 이들의 단백질 서열들 간에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성을 가진다.
한 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 HIC-HPLC를 이용하여 혼합물 중의 항체들을 정량하는 방법은, 단백질 구조, 서열 기반의 구조 모델, 단백질 서열 및 기타 공지된 단백질 구조에 의해 계산 또는 추정된 항체 분자들 간에 큰 차이가 존재하는 경우에는 그리 유용하지 않을 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 항체들의 소수성 프로파일에 차이가 존재하는 경우, HIC-HPLC를 사용하는 방법은 항체 종류의 분리는 용이하게 할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 HIC-HPLC를 이용하여 혼합물 중의 항체들을 정량하는 방법은, 각 항체 분자의 단백질 서열을 바탕으로 계산된 각 항체 분자의 총 단백질 전하 특성에 의해 계산 또는 추정된 항체 분자들 간에 큰 차이가 존재하는 경우에는 그리 유용하지 않을 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 항체들의 소수성 프로파일에 차이가 존재하는 경우, HIC-HPLC를 사용하는 방법은 항체 종류의 분리는 용이하게 할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 HIC-HPLC를 이용하여 혼합물 중의 항체들을 정량하는 방법은, 단백질 전하 또는 크기를 검사하여 계산/추정된 항체 분자들 간에 큰 차이가 존재하는 경우에는 그리 유용하지 않을 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 항체들의 소수성 프로파일에 차이가 존재하는 경우, HIC-HPLC를 사용하는 방법은 항체 종류의 분리는 용이하게 할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체들의 혼합물 중의 하나 이상의 항체들은 단일클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 단일클론 항체들 중 하나 이상은 인간 단일클론 항체이다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 항체 분자들은 동일한 동형이다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 항체 분자들은 서로에 대한 변이체이다. 다른 특정 실시양태에서, 2개 이상의 항체 분자들은 동일한 항원에 결합한다. mAb는 전장 항체 분자일 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 혼합물은 복합 제제화된 조성물이다. 추가의 특정 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 인간 환자에서 중동 호흡기 증후군 (MERS)을 치료하는데 효과적인 2개 이상의 mAb를 포함한다. MERS 코로나 바이러스 (MERS-CoV)에 대한 항체는, 예를 들어, 미국 특허 출원 14/717,760호 및 국제 출원 공보 WO2015/179535A1호에 개시되어 있다. 추가의 특정 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 인간 환자에서 에볼라 출혈열을 치료하는데 효과적인 mAb를 포함한다. 에볼라 바이러스에 대한 항체는 예를 들어, 2016년 1월 25일에 출원된 미국 특허 출원 15/005,334호에 개시되어 있다. 추가의 특정 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 인간 환자에서 황반 변성을 치료하는데 효과적인 mAb를 포함한다. 추가의 특정 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 미국 가출원 62/302,907호 개시된 mAb 알리로쿠맙 및 에비나쿠맙을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 PD1 항체 및 기타 면역 종양 항체 생성물, 예컨대 이중특이적 항체를 포함한다 (예컨대, 미국 가출원 62/270,749호, 미국 특허 출원 15/386,443호 및 미국 특허 출원 15/386,453호에서 PD-1과 CD3xCD20에 대한 개시내용; 및 미국 가출원 62/365,006호 및 미국 특허 출원 15/289,032호의 PD-1과 Lag3에 대한 개시내용 참조). 특정 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 항-지카 바이러스 항체를 포함한다 (예컨대, 미국 가출원 62/363,546호 참조). 추가의 특정 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물은 트레보그루맙 및 액티빈 A 항체를 포함한다 (예컨대, 미국 특허 8,871,209호 참조). 특정 실시양태에서, 상기 복합 제제화된 조성물 중의 2개 이상의 항체는 인간 환자에서 감염성 질병을 치료할 수 있다. 본 단락에서 상기 언급한 각 특허 문헌들의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
복합제제 중의 항-MERS mAb는 예를 들어, MERS-CoV의 스파이크 단백질 (예컨대, MERS-CoV 분리주 EMC/2012의 스파이크 단백질)에 결합할 수 있다. 스파이크 단백질의 에피토프는 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 내에 존재할 수 있다 (예컨대, GenBank 등록번호 AFS88936.1의 아미노산 367 내지 606으로부터 선택된 아미노산). 복합 제제화된 조성물 중의 항-MERS mAb는, MERS-CoV 스파이크 단백질에 결합하는 완전 인간 단일클론 항체; GenBank 등록번호 AFS88936.1의 아미노산 잔기 367 내지 606으로부터 선택된 MERS-CoV 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 중의 하나 이상의 아미노산 잔기와 상호작용하는 것; 표면 플라스몬 공명 분석법으로 측정시 18.5 nM 미만의 해리 상수 (Ko)로 MERS-CoV 스파이크 단백질에 결합하는 것; 또는 디펩티딜 펩티다아제 4 (DPP4)에 대한 MERS-CoV 스파이크 단백질의 결합을 90% 이상으로 차단하는 것일 수 있다.
상기 복합 제제화된 조성물은 동일하거나 상이한 표적에 대한 2개 이상의 항체를 포함하는 임의의 조성물일 수 있으며, 인간 환자를 비롯한 환자에서 동일하거나 상이한 질병 또는 질환을 치료하는데 효과적이다.
약학 조성물 및 제제
2개 이상의 항체 분자를 포함하는 조성물은 피험체에 투여하기 위한 약학 조성물 (예컨대, DP)로 제제화될 수 있다. 상기 약학 조성물은, 예를 들어, 3개의 항체 분자를 포함할 수 있다. 임의의 적절한 약학 조성물 및 제제 뿐만 아니라 제제화를 위한 적절한 방법과 적절한 경로 및 적절한 투여 부위도 본 발명의 범위 내이다. 또한, 달리 언급하지 않는 한, 임의의 적절한 투여량 및 투여 빈도도 고려된다.
복합제제 중의 mAb는 동시 투여되기 전에 당업계에 공지된 방법으로 정제된다. 2개 이상의 항체의 복합제제는 임의의 적절한 복합제제일 수 있다.
상기 약학 조성물/복합제제는 약학적으로 허용가능한 담체 (즉, 부형제)를 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제, 희석제, 활택제 등을 지칭하며 이들을 포함한다. 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 염, 예컨대, 산 부가염 또는 염기 부가염을 포함할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Berge et al. J Pharm Sci 66:1-19 (1977)] 참조). 상기 조성물은 수크로스를 포함할 수 있거나, 또는 적절한 경우 코팅될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 단백질 조성물을 용액, 마이크로에멀전, 분산액, 리포좀, 동결건조 케이크, 고체 등으로 안정화시켜 제제화할 수 있다. 멸균 주사액은, 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께, 적절한 용매 중에 2개 이상의 mAb를 도입하여 제조한 후, 멸균 여과시켜 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산매 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 기타 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내에 2개 이상의 mAb 분자를 도입함으로써 제조된다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 흡수 지연은, 해당 조성물 중에 흡수를 지연시키는 시약, 예를 들어, 모노스테아레이트염, 및 젤라틴을 포함시켜 달성할 수 있다.
실시예
본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여, 하기의 실시예를 기재한다. 이러한 실시예는 예시의 목적일 뿐이지, 어떠한 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 안된다.
실시예 1 및 3-7에 사용된 복합제제 중의 항-에볼라 mAb는 전장의 완전 인간 IgG 1 단일클론 항체이다. 3개의 mAb (mAb A, mAb B 및 mAb C)는 유사한 분자량 (예컨대, 약 145 kDa), 단백질 구조 및 전하 특성 (예컨대, 단백질 서열에 의해 측정시, pI에서 약 0.6 이하의 차이)을 가진다. mAb A의 등전점 (pI)은 9.0으로 측정되었고, mAb B의 pI는 8.5로 측정되었으며, mAb C의 pI는 9.1로 측정되었다.
실시예 2에 사용된 복합제제 중의 항-MERS mAb는 전장의 완전 인간 항-에볼라 mAb이다. 상기 두 mAb들은 유사한 분자량 (예컨대, 서로에 대하여 약 15 kDa 이내) 및 전하 특성을 가진다. (미국 특허 공보 US2015/0337029호, WO2015/179535A1호 및 미국 특허 출원 14/717,760호를 참조하며, 상기 각 문헌들의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)
실시예 1
HIC-HPLC 방법을 사용하여 복합제제로부터 유사한 분자량, 단백질 구조 및 전하 특성을 갖는 3개의 항-에볼라 단일클론 항체 (mAb 1, mAb 2 및 mAb 3)를 정량하였는데, 먼저 복합제제로부터 상기 3개의 mAb를 분리한 후 이들 각각에 대하여 정량하였다.
다이오넥스 ProPac HIC-10 컬럼을 사용하였다: Cat# 063655 (미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 써모 피셔 사이언티픽, 다이오넥스사 제조), 4.6×100 mm.
이동상의 제조
이동상은 이동상 A 및 이동상 B를 포함한다. 이동상 A는 1M 인산암모늄 및 100 mM 인산염 (pH 7.0)을 포함한다. 이동상 A의 제조는 하기의 단계를 포함한다: 800 mL의 Milli Q 중에 13.8 g의 제1인산나트륨 제1수화물 (NaH2PO4·H2O) 및 132.1 g의 인산암모늄을 용해시키는 단계; 50% NaOH로 pH를 7.0으로 조절하는 단계; 부피를 1000 mL로 만드는 단계; 및 0.22 ㎛의 필터를 통해 상기 용액을 여과시키는 단계. 이동상 B는 100 mM 인산염 (pH 7.0)을 포함한다. 이동상 B의 제조는 하기의 단계를 포함한다: 900 mL의 Milli Q 중에 13.8 g의 제1인산나트륨 제1수화물 (NaH2PO4·H2O)을 용해시키는 단계; 50% NaOH로 pH를 7.0으로 조절하는 단계; 부피를 1000 mL로 만드는 단계; 및 0.22 ㎛의 필터를 통해 상기 용액을 여과시키는 단계.
HIC-HPLC 방법
상기 HIC-HPLC는 0.5 mL/분의 유속으로 상기 언급한 컬럼을 통해 구동시켰다. 상기 컬럼 온도를 30℃로 유지하였고, 상기 복합제제 샘플 온도는 5℃였다. 상기 컬럼에 대한 중단 시간은 40분이었다. 상기 유출물의 280 nm 자외선광에 대한 흡광도는 UV 검출기를 사용하여 모니터링하였다. 하기 표 1은 컬럼 구동 시간 경과에 따라 도입하는 이동상 A 및 이동상 B의 혼합물을 이동상 조성 구배의 비율로 나타낸 것이다.
Figure 112019016221297-pct00001
3개의 개별 mAb에 대한 검량
3개의 개별 mAb에 대한 결과를 검량하기 위해, FDS 중 기지량의 각 mAb를 구동시켰다. 기지의 농도의 각 mAb를 함유하는 FDS를 제조하고, 상기 농도를 역상 (RP) 크로마토그래피 또는 Solo VPE® 분광법 [예컨대, 씨 테크놀로지스 인코포레이티드(C Technologies, Inc.)]으로 측정하였다. 각 mAb에 대해 기지된 FDS는 하기와 같다:
Figure 112019016221297-pct00002
검량 작업을 위해 대조군 샘플도 제조하였다. 대조군 샘플은 Solo VPE® 분광법 (예컨대, 씨 테크놀로지스 인코포레이티드)으로 측정시 농도가 50.31 mg/mL였다. 대조군 샘플의 1회 주입량은 12.0 μL (603.72 ㎍)였다.
하기 표 2는 각각의 mAb FDS에 대해 사용된 검량 샘플을 열거하고 있다.
Figure 112019016221297-pct00003
상기 검량 작업을 수행하였다. 상기 검량 작업 동안, 대조군 샘플의 1회 주입은 각 샘플 세트 (예컨대, mAb 1 FDS 주입 세트, mAb 2 FDS 주입 세트 또는 mAb 3 FDS 주입 세트)의 처음, mAb FDS의 매 20-24회의 주입 후, 그리고 각 주입 작업의 마지막에 도입하였다.
한번의 검량 작업 동안, 기지량의 각 mAb에 대한 1회 주입을 수행하였다. 또 다른 검량 작업 동안, 기지량의 각 mAb에 대한 4회 주입을 수행하여 주입의 반복성(repeatability)을 측정하였다.
각 mAb에 대하여 표준 검량 곡선을 구축하였다. 각 mAb에 대한 검량 곡선은 R2 ≥ 0.999이었으며, 동일한 양의 각 mAb의 반복된 주입의 변동성은 ≤ 1%이었다.
대조군 사양
기지의 각 mAb FDS에 대한 대조군 HIC-HPLC 구동을 수행하였다. 기지의 각 mAb FDS에 대한 회수율은 HIC-HPLC에 의해 농도를 측정하여 계산한 후, 상기 HIC-HPLC에 의해 측정된 농도를 표 2의 기지의 mAb 농도로 나누었다. 회수율은 3개의 모든 기지의 mAb FDS에 있어서 기지의 농도의 90 - 110%인 것으로 계산되었다.
미지의 샘플
총 600 ㎍의 mAb를 함유하는 샘플 복합제제 (예컨대, 12 μL의 50 mg/mL mAb 샘플)를 HIC-HPLC를 통해 구동시켰다. 예를 들어, 총 600 ㎍의 mAb를 포함하는 12 μL의 복합제제는 200 ㎍/개별 mAb의 주입의 3회 상당량을 포함할 수 있다. 복합제제 중의 개별 mAb는 mAb 1, mAb 2 및 mAb 3이다.
상기 샘플에 대한 두번 구동을 수행하고, 복합제제 중의 각 개별 mAb의 평균 농도 (mg/mL) 및 mAb의 총량에 대한 각 mAb의 비율을 기록하였다.
도 1은 상기 복합제제의 HIC-HPLC 구동을 보여주는 크로마토그래프이다. 각 mAb는 별도의 선으로 나타냈으며, 전체로서의 cFDS도 선으로 나타냈다. 상기 3개의 항체들은 HIC-HPLC로 잘 분리되었으며, 피크에서의 중복도 거의 없었다.
실시예 2
HIC-HPLC 방법을 사용하여 복합제제로부터 유사한 분자량 및 전하 특성을 갖는 2개의 항-MERS 단일클론 항체를 정량하였는데, 먼저 복합제제로부터 상기 2개의 mAb를 분리한 후 이들 각각에 대하여 정량하였다.
mAb 의약 물질
두 mAb (mAb 1 및 mAb 2) 의약 물질을 혼합하였다. mAb 1 의약 물질은 52.3 mg/ml의 mAb 1 및 10 mM His (pH 5.5)를 포함하였다 (미국 뉴욕주 테리타운 소재의 리제너론 파아마슈티컬스사 제조). mAb 2 의약 물질은 40.4 mg/ml의 mAb 2와 10 mM His (pH 6.0) 및 5% (w/v) 수크로스를 포함하였다 (미국 뉴욕주 테리타운 소재의 리제너론 파아마슈티컬스사 제조).
HIC-HPLC 방법
7개의 HIC-HPLC 방법을 구동시켰다. 각 방법에서, 50 ㎍ (mAb 1 및 mAb 2)의 샘플을 로딩시켰다. 280 nm에서 UV 검출을 사용하여 유출물을 모니터링하였다. 이동상에서 다양한 비율의 두 용매를 사용하였다. 용매 A는 1M (NH4)SO4 20 mM 아세테이트 (pH 5.5)였고, 용매 B는 20 mM 아세테이트 (pH 5.5)였다.
1. 방법 1
Figure 112019016221297-pct00004
도 2는 상기 구동에 대한 크로마토그래프를 나타낸 것이다. 상기 두 항체는 어느 정도 분리되지만 상당한 중첩이 존재하였다.
2. 방법 2 - 분당 0.5%
Figure 112019016221297-pct00005
도 3은 상기 구동에 대한 크로마토그래프를 나타낸 것이다. 상기 두 항체는 어느 정도 분리되지만 상당한 중첩이 존재하였다.
3. 방법 3 - 분당 0.2%
Figure 112019016221297-pct00006
도 4는 상기 구동에 대한 크로마토그래프를 나타낸 것이다. 상기 두 항체는 어느 정도 분리되지만 상당한 중첩이 존재하였다.
4. 방법 4 - 분당 2%
Figure 112019016221297-pct00007
도 5는 상기 구동에 대한 크로마토그래프를 나타낸 것이다. 상기 두 항체는 어느 정도 분리되지만 여전히 일부 중첩이 존재하였다.
5. 방법 5 - 분당 1%
Figure 112019016221297-pct00008
도 6은 상기 구동에 대한 크로마토그래프를 나타낸 것이다. 상기 두 항체는 어느 정도 분리되지만 일부 중첩이 존재하였다.
6. 방법 6 - 분당 1%
Figure 112019016221297-pct00009
도 7은 상기 구동에 대한 크로마토그래프를 나타낸 것이다. 상기 두 항체는 어느 정도 분리되지만 일부 중첩이 존재하였다.
7. 방법 7 - 분당 0.5%
Figure 112019016221297-pct00010
도 8은 상기 구동에 대한 크로마토그래프를 나타낸 것이다. 상기 두 항체는 어느 정도 분리되지만 일부 중첩이 존재하였다.
실시예 3
유사한 분자량, 단백질 구조 및 전하 특성을 갖는 3개의 항-에볼라 mAb를 포함하는 복합제제에 대한 HIC 분리를 개발하여 애질런트 1100 HPLC 시스템 상에서 평가하였다.
상기 HIC-HPLC 방법은 0.5 mL/분의 유속으로 이원(two-part) 이동상 [이동상 A (100 mM 인산염, 1M 황산암모늄, pH 7.0) 및 이동상 B (100 mM 인산염, pH 7.0)를 포함]을 갖는 다이오넥스 ProPac HIC-10 컬럼을 사용한다. 각 mAb에 대한 5-포인트 검량 곡선을 사용하는 HIC 방법이 적합하다. 정확성 (%　회수율)은 각 mAb에 대해 측정된 농도를 이론적 농도와 비교하여 측정한다. 600 내지 0 mM의 황산암모늄의 구배를 사용하여 상기 컬럼을 구동시킨다.
도 9는 상기 HIC-HPLC 구동에 대한 크로마토그래프를 나타낸 것이다. 3개의 개별 피크들에서 볼 수 있는 것과 같이, 상기 3개의 항체들은 잘 분리되었으며 이들의 피크는 중첩이 거의 없거나 발생하지 않았다.
HIC-HPLC의 반복성 및 정밀성
cFDS의 샘플을 목표량(600 ㎍/cFDS의 주입)의 75%, 100%, 125%, 150%로 3회 분석하여 반복성을 평가하였다. 반복성의 상대 표준 편차 (RSD)는 ≤0.2%인 것으로 측정되었다.
Figure 112019016221297-pct00011
상기 반복성 연구를 서로 다른 컬럼 로트 및 서로 다른 이동상 뱃치를 사용하여 서로 다른 날에 반복하였다. 실험실내 정밀성(intermediate precision)의 RSD는 ≤1.7%인 것으로 측정되었다.
Figure 112019016221297-pct00012
HIC-HPLC의 직선성
cFDS 샘플을 9개의 수준으로 3회 분석하여 직선성을 측정하였다 (75 내지 1200 ㎍의 cFDS; 25 내지 400 ㎍의 개별 mAb). 개별 mAb의 피크 면적 대 주입량의 플롯 (도 10)은 직선형 곡선을 유도하였다: 75 내지 300 ㎍에서, R2　≥　0.999; 25 내지 400 ㎍에서, R2 ≥ 0.98.
HIC-HPLC의 범위
범위라는 것은 본 방법이 허용가능한 정밀성 (≤ 1.7%), 정확성 (93-106% 회수율) 및 직선성 (R2 ≥ 0.999)을 입증할 수 있는 하한 및 상한 농도 사이의 간격을 말한다. 상기 범위는 cFDS 샘플에 있어서 300 내지 900 ㎍ (각 개별 mAb에 대해 100 내지 300 ㎍)인 것으로 측정되었다. 도 11은 개별 mAb들의 양에 대한 % 회수율의 그래프이다.
cFDS의 서로 다른 로트들에 대한 HIC-HPLC의 정확성
일중 및 일간 정밀성 (cFDS 로트 #1) 및 범위 연구 (cFDS 로트 #2)로부터 수득된 데이터를 사용하여 상기 방법의 정확성을 평가하였다. 도 12는 개별 mAb의 양에 대한 mAb들의 % 회수율의 그래프이다. % 회수율은 목표량(총 600 ㎍의 단백질, 각 200 ㎍의 mAb)의 75%, 100%, 125%, 150%에서 93 - 106% 이내였다. 정확성 (% 회수율)은 93% - 106%인 것으로 측정되었다.
cFDS 중의 다양한 비율의 개별 mAb에 대한 HIC-HPLC의 정확성
cFDS는 개별 mAb의 1:1:1, 2:1:1, 1:2:1, 1:1:2 혼합에 의해 제제화하였다. 각 cFDS는 목표량(600 ㎍/주사, n=3)의 100%에서 분석하였다. 도 13은 서로 다른 cFDS 비율에서 각 개별 mAb에 대한 mAb의 % 회수율의 그래프이다. % 회수율은 ≤ 0.3%의 반복성으로 94 - 106% 이내였다.
Figure 112019016221297-pct00013
복합제제 개발에 있어서 HIC-HPLC의 적용
복합제제 또는 DP에서 각각의 mAb를 정량하기 위한 HIC-HPLC의 사용은 복합제제 개발에 있어서 다양한 응용을 할 수 있다. 예를 들어, 복합제제 또는 DP에서 각 mAb의 농도를 저장 안정성 연구에서 모니터링할 수 있다.
도 14는 시간 (월)의 함수로서 DP에서 3개의 mAb의 저장 안정성을 모니터링한 도표이다. HIC-HPLC를 사용하여 1년 동안의 시간 중 6개의 시점에서 각각의 3개의 mAb의 양을 정량하고 이에 따라 농도를 측정하였다. 본 연구에서 한 시점의 실시예 데이터 지점들의 세트는 16.6 mg/mL의 mAb A의 농도, 17.5 mg/mL의 mAb B의 농도 및 17.1 mg/mL의 mAb C의 농도 측정값을 포함한다. 이 경우, 저장 안정성은 모니터링한 기간 동안 각각의 mAb의 농도에서 눈에 띌 정도의 변화가 없었다 (≤4%).
상기 HIC-HPLC 방법은 100 내지 300 ㎍ (각 개별 mAb)의 범위에서 허용가능한 반복성 (≤ 0.2%), 실험실내 정밀성 (≤ 1.7%), 정확성 (93% - 106% 회수율) 및 직선성 (R2 ≥ 0.999)을 나타내어, cFDS 및 DP에 있어서 각각의 3개의 mAb의 농도를 측정하는데 사용할 수 있다.
상기 HIC-HPLC 방법은 복합 제제화된 DS 및 DP에 있어서 각각의 3개의 mAb를 정량하기 위한 분리(release) 방법으로 사용될 수 있다. 또한, 본 방법을 사용하여 제제 개발을 지원할 수도 있다.
실시예 4
유사한 분자량, 단백질 구조 및 전하 특성을 갖는 3개의 항-에볼라 mAb를 포함하는 복합제제에 대한 양이온 교환 초고압 액체 크로마토그래피 (CEX-UPLC) 분리를 개발하여 평가하였다.
상기 CEX-UPLC 방법은 200 mM MES 버퍼 및 10 내지 120 mM NaCl 구배 (pH 6.5)를 포함하는 이동상을 갖는 YMC-BioPro SP-F 컬럼을 사용한다. 각각의 3개의 mAb 분자 (mAb A, mAb B, mAb C)에 대하여 6-포인트 표준 검량 곡선을 제작하였다. 각 검량 곡선의 직선성은 R2 ≥ 0.99인 것으로 측정되었다. CEX-UPLC를 사용하여 복합제제 (즉, 혼합물)로부터 상기 3개의 mAb 분자들을 분리하고, UPLC의 크로마토그래프를 생성하였다. 상기 크로마토그래프는 각 mAb가 분리되었음을 나타내었는데, mAb A와 mAb C 간에는 일부 중첩이 존재하였다.
3개의 서로 다른 양 (150 ㎍, 225 ㎍ 및 300 ㎍)으로 구동된 복합제제의 샘플을 3회 분석하여 상기 방법의 반복성을 평가하였다. 정확성 (%　회수율)은 각 샘플에 대해 측정된 농도를 이론적 수치와 비교하여 측정하였다. 각 mAb의 정량에 대한 직선성 범위는 mAb A를 제외하고는 각 항체에 대하여 50 내지 100 ㎍으로 측정되었으며, R2 ≥ 0.973 및 정확성은 75%-91%이었다.
도 15는 복합제제로부터 3개의 mAb에 대한 CEX-UPLC 구동의 크로마토그래프를 나타낸 것이다. 3개의 항체들은 분리되었으며, mAb A와 mAb C 간에 적은 중첩이 존재하였다.
CEX-UPLC의 반복성 및 정확성
cFDS의 샘플을 목표량 (600 ㎍/cFDS 주입)의 5개의 서로 다른 비율(25%-100%)로 3회 분석하여 반복성을 평가하였다. 반복성의 RSD는 3.7% 내지 21.4%인 것으로 측정되었다.
Figure 112019016221297-pct00014
CEX-UPLC의 직선성
반복성 연구의 데이터를 사용하여 CEX-UPLC 방법의 범위와 직선성을 평가하였다. 주입량에 대한 개별 mAb의 피크 면적의 플롯 (도 16)은 대체로 각 mAb에 대한 직선형 곡선을 유도하였다. 그러나, mAb에 대한 RSD가 10%를 넘기 때문에, 100 ㎍에서 mAb A에 대한 데이터 지점은, 100 ㎍까지 연장된 직선형 곡선이 mAb A에 대해 존재한다는 결론을 낼 정도로 통계적으로 충분히 유의성이 없었다.
CEX-UPLC의 범위
항체 총량이 150 내지 300 ㎍인 cFDS 샘플에 대해 일부 반복성 (RSD ≤ 10%), 정확성 (> 80%) 및 직선성 (R2 ≥ 0.97)이 나타났다. 그러나, CEX-UPLC에 대한 범위는 HIC-HPLC에서와 같이 명확히 나타나지는 않았다.
Figure 112019016221297-pct00015
상기 CEX-UPLC 방법은 3개의 mAb를 이들의 전하 특성을 기초로 분리하였으며, 일부 중첩이 존재하였다. 상기 중첩은 본 방법의 수동적 통합이 필요함을 시사하는 것이다. CEX-UPLC의 정밀성, 정확성 및 범위는 HIC-HPLC만큼 최적이지는 않다.
실시예 5
유사한 분자량의 3개의 항-에볼라 mAb를 포함하는 복합제제에 대한 SE-UPLC를 평가하였다. SE-UPLC는 크기에 의해 mAb를 분리한다. 워터스(Waters)사의 Acquity H UPLC 시스템을 사용하였다. 워터스사의 두 BEH200 SEC 컬럼을 직렬로 연결하였다. 이동상은 10 mM 인산염 버퍼 (pH 6.0) 및 1 M 과염소산염을 포함하였다. 도 17은 SE-UPLC의 크로마토그램을 나타낸 것이다. 보이는 바와 같이, 3개의 mAb의 용리 시간들 간에 상당한 중첩이 존재한다. 따라서, SE-UPLC는 유사한 분자량의 3개의 항-MERS mAb를 분리하기 위한 차선의 방법이다.
실시예 6
유사한 분자량, 단백질 구조 및 전하 특성을 갖는 3개의 항-에볼라 mAb를 포함하는 복합제제의 iCIEF를 평가하였다. iCIEF는 단백질을 이들의 등전점 (pI)에 의해 분리한다. ProteinSimple iCE3 전하 변이체 분석기를 사용하였다. 4%의 pH 3-10 Pharmalyte®를 양쪽성 전해질로 사용하였고, 2M 우레아를 버퍼로 사용하였다. 도 18은 상기 사양들을 사용하여 생성된 iCIEF 프로파일을 나타내는 것이다. 보이는 바와 같이, mAb A와 mAb C의 용리 시간들 간에 상당한 중첩이 존재한다. 따라서, iCIEF는 3개의 항-MERS mAb를 분리하기 위한 차선의 방법이다.
실시예 7
유사한 분자량, 단백질 구조 및 전하 특성을 갖는 3개의 항-에볼라 mAb를 포함하는 복합제제의 RP-UPLC를 평가하였다. RP-UPLC는 소수성에 의해 mAb를 분리한다. 워터스사의 Acquity UPLC 시스템을 사용하였다. ZORBAX 300SB-C8 컬럼을 사용하였고, 상기 컬럼은 80℃에서 구동시켰다. 이동상은 0.1% TFA 중의 60-90% 아세토니트릴을 포함하였다. 도 19는 RP-UPLC의 크로마토그램을 나타낸 것이다. 보이는 바와 같이, mAb A와 mAb B의 용리 시간들 간에 상당한 중첩이 존재한다. 따라서, RP-UPLC는 유사한 분자량의 3개의 항-MERS mAb를 분리하기 위한 차선의 방법이다.
실시양태
상술한 설명들은 본 발명의 예시적인 실시양태만을 개시하는 것이다.
본 발명을 이의 상세한 설명과 함께 기술하였지만, 상술한 설명은 예시하려는 목적에서 기술된 것이지, 첨부되는 청구범위의 범위에 의해 한정되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아님을 이해해야 한다. 기타 양태, 이점 및 변형들도 첨부되는 청구범위의 범위 내에 속한다. 이에 따라, 본 발명의 구체적인 특징들만을 예시하여 기술하였지만, 당업계의 숙련자라면 누구나 여기에 다양한 변형 및 변화를 가할 수 있을 것이다. 따라서, 첨부되는 청구범위는 본 발명의 진정한 의미에 속하는 상기의 모든 변형과 변화들을 망라하려는 것임을 이해해야 한다.

Claims (22)

  1. 다수의 항체들을 포함하는 혼합물로부터 항체의 양을 정량하는 방법으로서,
    소수성 상호작용 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피 (HIC-HPLC)를 이용하여 혼합물 중의 상기 다수의 항체들 각각을 분리하는 단계; 및
    혼합물 중의 각 항체의 양을 정량하는 단계를 포함하며,
    상기 혼합물 중의 각 항체의 분자량은 해당 혼합물 중의 임의의 다른 항체들의 분자량에 대하여 15 kDa 이내이고,
    혼합물 중의 각 항체의 표면 소수성은 카이트 & 두리틀 소수도 스케일(Kyte & Doolittle hydropathy scale) 상으로 해당 혼합물 중의 또 다른 항체의 표면 소수성과 0.25 단위 이상 다르고; 혼합물 중의 각 항체가, HIC-HPLC 상에서 개별적으로 구동되는 경우, 해당 혼합물 중의 또 다른 항체와 별도의 구동 시간으로 용리하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혼합물 중의 각 항체의 표면 소수성이 카이트 & 두리틀 소수도 스케일 상으로 해당 혼합물 중의 각각의 다른 항체의 표면 소수성과 0.5 내지 1.0 단위로 다른 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 혼합물 중의 제1 항체가 HIC-HPLC 구동 동안에 제1 구동 시간으로 용리하고, 혼합물 중의 제2 항체가 HIC-HPLC 구동 동안에 제2 구동 시간으로 용리하며, 상기 제1 및 제2 구동 시간이 중첩되지 않는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 HIC-HPLC를 pH 5.0 내지 pH 7.0의 버퍼 중에서 수행하는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 다수의 항체가 3개의 항체를 포함하는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 혼합물 중의 각 항체의 표면 소수성은 단백질 구조 또는 구조 모델을 기초로 한 표면 소수성의 계산, 황산암모늄 또는 PEG8000 중의 가용성에 대한 쾌속 스크리닝, 및 친화도 포획 자가 상호작용 나노입자 분광법 (AC-SINS: affinity capture-self-interaction nanoparticle spectroscopy)에 의한 분자 상호작용에 대한 쾌속 스크리닝으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 측정하는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    혼합물 중의 제1 항체 및 혼합물 중의 제2 항체가 적어도 90% 상동성인 단백질 서열을 가지거나;
    상기 제1 항체 및 제2 항체가 이들의 단백질 서열로 측정시, 적어도 90% 상동성인 단백질 구조를 가지거나; 또는
    상기 제1 항체 및 제2 항체가 이들의 단백질 서열로 측정시, 서로에 대해 0.6 이내의 등전점 (pI)을 가지는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 혼합물 중의 하나 이상의 항체가 단일클론 항체인 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 혼합물 중의 하나 이상의 항체가 인간 단일클론 항체인 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 혼합물 중의 2개 이상의 항체는 동일한 동형(isotype)인 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 혼합물 중의 2개 이상의 항체가 서로에 대한 변이체인 것인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 혼합물 중의 2개 이상의 항체가 동일한 항원에 결합하는 것인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 혼합물이 복합 제제화된(co-formulated) 조성물인 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 복합 제제화된 조성물이 인간 환자에서 MERS를 치료하도록 구성되는 것인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 복합 제제화된 조성물이 인간 환자에서 에볼라 출혈열을 치료하도록 구성되는 것인, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 복합 제제화된 조성물이 인간 환자에서 황반 변성을 치료하도록 구성되는 것인, 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 복합 제제화된 조성물 중의 2개 이상의 항체가 인간 환자에서 감염성 질병을 치료하도록 구성되는 것인, 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 복합 제제화된 조성물이 의약품 중에 포함되는 것인, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 HIC-HPLC로부터 크로마토그래프를 생성하는 단계로서, 혼합물 중의 각 항체의 용리에 있어서, 상기 크로마토그래프가 해당 크로마토그래프 중의 다른 피크들과 중첩되지 않는 피크를 나타내는 것인, 상기 단계를 더 포함하는 방법.
  20. 다수의 항체들을 포함하는 혼합물로부터 항체의 양을 정량하는 방법으로서,
    소수성 상호작용 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토그래피 (HIC-HPLC)를 사용하여 혼합물 중의 상기 다수의 항체를 각각 분리하는 단계로서, 혼합물 중의 각 항체의 분자량이 해당 혼합물 중의 각각의 다른 항체들의 분자량에 대하여 15 kDa 이내인 것인, 상기 단계;
    혼합물 중의 각 항체의 양을 정량하는 단계; 및
    상기 HIC-HPLC로부터 크로마토그래프를 생성하는 단계로서, 혼합물 중의 각 항체의 용리에 있어서, 상기 크로마토그래프가 해당 크로마토그래프 중의 다른 피크들과 중첩되지 않는 피크를 나타내는 것인, 상기 단계를 포함하는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 다수의 항체들 중 하나 이상이 인간 단일클론 항체인 것인, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 혼합물 중의 각 항체의 표면 소수성이 카이트 & 두리틀 소수도 스케일 상으로 해당 혼합물 중의 또 다른 항체의 표면 소수성과 0.25 단위 이상 다르고; 혼합물 중의 각 항체가, HIC-HPLC 상에서 개별적으로 구동되는 경우, 해당 혼합물 중의 또 다른 항체와 별도의 구동 시간으로 용리하는 것인, 방법.
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