JP2014530848A - 抗体を精製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗体、抗体フラグメントおよび/もしくは抗体成分の混合物を迅速にかつ効率的に分離して所望の抗体生成物を上記混合物から単離するための、種々の抗体特異的アフィニティー媒体を使用して抗体を精製するための方法を提供する。本発明は、免疫グロブリン分子の各結合部位に対して異なる特異性を有する二重特異的(bispecific)モノクローナル抗体(例えば、単一の重鎖および2つの異なる軽鎖(一方は、κ定常ドメインを含み、他方は、λ定常ドメインを含む)から構成される抗体(共通の重鎖を共有する異なる特異性の抗体を含む)の精製に関する。本発明はまた、インタクトな抗体を、抗体細胞培養発現プロセスの間に生成された遊離軽鎖から分離することによって、インタクトな抗体を効率的に精製するための方法を提供する。
抗体は、4つのポリペプチド:2個の重鎖および2個の軽鎖、から構成される。抗体の抗原結合部分は、軽鎖可変ドメイン(VL)および重鎖可変ドメイン(VH)によって形成される。これらドメインの1つの末端において、6つのループが抗原結合部位を形成し、相補性決定領域(CDR)ともいわれる。3個のCDRが上記VHドメインに位置し(H1、H2およびH3)、他の3個が、上記VLドメインにある(L1、L2およびL3)。
本発明は、抗体特異的精製媒体および関連試薬を使用して、所望の抗体生成物もしくは所望の抗体生成物の組み合わせを、抗体、抗体フラグメント、抗体成分(例えば、遊離軽鎖)、およびこれらの組み合わせの混合物から、分離および単離する種々の技術を提供する。本明細書で提供される方法は、所望の抗体生成物もしくは所望の抗体生成物の組み合わせを、抗体および/もしくはそのフラグメントの混合物から迅速にかつ効率的に分離する。例えば、いくつかの実施形態において、上記方法は、インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、抗体成分(例えば、抗体製造プロセスの副生成物である遊離軽鎖)から単離するように設計される。本明細書で使用される場合、用語「インタクト」な抗体分子とは、全長抗体のフラグメントおよび/もしくは他の部分(これらは、「インタクトでない」抗体として、本明細書でまとめて言及される)とは対照的に、全長抗体を意味する。上記インタクトな抗体は、任意のインタクトな抗体であり得、非限定的例によれば、インタクトな一価抗体、インタクトな二重特異的抗体、インタクトな多重特異的抗体、インタクトなモノクローナル抗体(例えば、インタクトな完全ヒト抗体、インタクトなヒト化抗体および/もしくは他のインタクトなキメラ抗体)が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記方法は、二重特異的抗体(例えば、単一の重鎖および少なくとも1個のカッパ(κ)軽鎖領域(もしくはκ軽鎖に由来する軽鎖領域)および少なくとも1個のラムダ(λ)軽鎖領域(もしくはλ軽鎖由来の軽鎖領域)を有する二重特異的抗体を単離するように設計されている。
本発明は、抗体特異的アフィニティー媒体および関連試薬を使用して、所望の抗体生成物を、抗体、抗体フラグメント、抗体成分(例えば、遊離軽鎖)、およびこれらの組み合わせの混合物から分離および単離する種々の技術を提供する。本明細書で提供される方法は、所望の抗体生成物を、抗体および/もしくはこれらのフラグメントの混合物から迅速にかつ効率的に分離する。
上記κλ−ボディは、2種の独立した標的に対する特異性を駆動する、共通のIgG1重鎖および2個の異なる軽鎖を含む新規な二重特異的IgG形式である。大規模産業プロセスに適用可能な効率的精製プロトコルを可能にするために、その形式は、一方の軽鎖がκ定常領域を含むと同時に、他方がλ定常領域を含むことが必要である(図1を参照のこと)。
本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、前述の説明は、本発明の範囲を例示し、限定しないと解釈される。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
Claims (24)
- 各結合部位において異なる特異性を有し、2コピーの単一の重鎖ポリペプチド、ならびにκ定常領域を含む第1の軽鎖およびλ定常領域を含む第2の軽鎖からなる二重特異的モノクローナル抗体を精製する方法であって、該方法は、
(a)各結合部位において異なる特異性を有し、2コピーの単一の重鎖ポリペプチド、ならびにκ定常領域を含む第1の軽鎖およびλ定常領域を含む第2の軽鎖からなる1種以上の該二重特異的モノクローナル抗体(二重特異的MAb);2個のλ軽鎖もしくはその一部を有する1種以上の単一特異的モノクローナル抗体(λ−MAb);ならびに2個のカッパ軽鎖もしくはその一部を有する1種以上の単一特異的モノクローナル抗体(κ−MAb)を含む混合抗体組成物を提供する工程;
(b)κ軽鎖定常領域もしくはλ軽鎖定常領域に対して特異的親和性を有する分離手段を提供する工程;
(c)該分離手段と該混合抗体組成物とを、該κ−MAbのκ軽鎖定常領域によるかもしくは該λ−MAbのλ軽鎖定常領域による該分離手段への結合と比較して、該二重特異的MAbによる該分離手段への差次的結合を可能にする条件下で接触させる工程;ならびに
(d)該κ−MAbのκ軽鎖定常領域の脱離もしくは該λ−MAbのλ軽鎖定常領域の脱離と比較して、該二重特異的MAbの優先的脱離を可能にする条件下で、該分離手段から抗体を溶離する工程、
を包含する、方法。 - 前記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである、請求項1に記載の方法。
- 前記分離手段は、κ軽鎖定常領域もしくはλ軽鎖定常領域に対して高い特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされる、請求項1に記載の方法。
- 前記分離手段は、KappaSelect樹脂、LambdaFabSelect樹脂もしくはProtein L含有樹脂である、請求項3に記載の方法。
- 前記リガンドは、抗λモノクローナル抗体もしくは抗κモノクローナル抗体である、請求項3に記載の方法。
- 前記結合および/もしくは溶離条件は、pHレベルにおける段階的変化を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記結合および/もしくは溶離条件は、前記組成物中のアミノ酸の濃度の変化を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよび/もしくはグリシンである、請求項7に記載の方法。
- インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを混合物から精製する方法であって、該方法は、
(a)1種以上のインタクトな抗体および少なくとも1種のインタクトでない抗体分子を含む混合抗体組成物を提供する工程であって、ここで該インタクトでない抗体分子は、1種以上の抗体成分、抗体成分の1種以上のダイマー、1種以上の抗体フラグメント、およびこれらの組み合わせを含む、工程;
(b)インタクトな抗体とインタクトでない抗体分子との間で差次的親和性を有する分離手段を提供する工程;
(c)該分離手段と該混合抗体組成物とを、該インタクトでない抗体分子による該分離手段への結合と比較して、該1種以上のインタクトな抗体による該分離手段への差次的結合を可能にする条件下で接触させる工程;ならびに
(d)該1種以上のインタクトな抗体を、該分離手段から分離し、該1種以上のインタクトな抗体を保持する工程、
を包含する、方法。 - 前記インタクトでない抗体分子は、遊離軽鎖である、請求項9に記載の方法。
- 前記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである、請求項9に記載の方法。
- 前記分離手段は、インタクトな抗体分子に対して高い特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされている、請求項9に記載の方法。
- 前記分離手段は、混合モードクロマトグラフィー樹脂である、請求項12に記載の方法。
- 前記分離手段は、Mep HyperCelTM樹脂である、請求項13に記載の方法。
- 工程(d)は、前記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、前記分離手段から、前記インタクトでない抗体分子の脱離と比較して、該分離手段からの該1種以上のインタクトな抗体の優先的脱離を可能にする条件下で溶離する工程を包含する、請求項9に記載の方法。
- 工程(c)は、前記分離手段を、該分離手段への前記1種以上の抗体の結合を可能にするが、該分離手段への前記インタクトでない抗体分子の結合を可能にしない条件下で接触させる工程を包含する、請求項9に記載の方法。
- 工程(d)は、前記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、該1種以上のインタクトな抗体の脱離を可能にする条件下で、前記分離手段から溶離する工程を包含する、請求項16に記載の方法。
- 工程(c)は、任意の結合していない、インタクトでない抗体分子を、前記組成物から除去する工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
- インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、混合物から精製する方法であって、該方法は、
(a)1種以上のインタクトな抗体および少なくとも1種のインタクトでない抗体分子を含む混合抗体組成物を提供する工程であって、ここで該インタクトでない抗体分子は、1種以上の抗体成分、抗体成分の1種以上のダイマー、1種以上の抗体フラグメント、およびこれらの組み合わせを含む、工程;
(b)インタクトな抗体とインタクトでない抗体分子との間で差次的親和性を有する分離手段を提供する工程;
(c)該分離手段と該混合抗体組成物とを、該インタクトでない抗体分子による該分離手段への結合を可能にするが、該1種以上のインタクトな抗体による該分離手段への結合を可能にせず、その結果、該1種以上のインタクトな抗体が、結合していない画分中に残る条件下で接触させる工程;ならびに
(d)1種以上のインタクトな抗体を含む該結合していない画分を保持する工程、
を包含する、方法。 - 前記インタクトでない抗体分子は、遊離軽鎖である、請求項19に記載の方法。
- 前記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである、請求項19に記載の方法。
- 前記分離手段は、インタクトでない抗体分子に対して高い特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされている、請求項19に記載の方法。
- 前記分離手段は、混合モードクロマトグラフィー樹脂である、請求項22に記載の方法。
- 前記分離手段は、Mep HyperCelTM樹脂である、請求項23に記載の方法。
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