JP2014530848A - 抗体を精製する方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗体、抗体フラグメントおよび/もしくは抗体成分の混合物を迅速かつ効率的に分離して、上記混合物から所望の抗体生成物を単離するために、種々の抗体特異的精製媒体を使用して抗体を精製するための方法を提供する。本発明は、免疫グロブリン分子の各結合部位に対して異なる特異性を有する二重特異的モノクローナル抗体(例えば、単一の重鎖および2つの異なる軽鎖(一方は、κ定常ドメインを含み、他方は、λ定常ドメインを含む)から構成される抗体(共通の重鎖を共有する異なる特異性の抗体を含む))の精製に関する。本発明はまた、遊離軽鎖を含むインタクトでない抗体からインタクトな抗体を分離することによって、インタクトな抗体を効率的に精製するための方法を提供する。

Description

この出願は、2011年10月19日に出願された米国仮特許出願第61/548,958号(これは、その全体が参考として本明細書に援用される)の利益およびそれに対する優先権を主張する。
(発明の分野)
本発明は、抗体、抗体フラグメントおよび/もしくは抗体成分の混合物を迅速にかつ効率的に分離して所望の抗体生成物を上記混合物から単離するための、種々の抗体特異的アフィニティー媒体を使用して抗体を精製するための方法を提供する。本発明は、免疫グロブリン分子の各結合部位に対して異なる特異性を有する二重特異的(bispecific)モノクローナル抗体(例えば、単一の重鎖および2つの異なる軽鎖(一方は、κ定常ドメインを含み、他方は、λ定常ドメインを含む)から構成される抗体(共通の重鎖を共有する異なる特異性の抗体を含む)の精製に関する。本発明はまた、インタクトな抗体を、抗体細胞培養発現プロセスの間に生成された遊離軽鎖から分離することによって、インタクトな抗体を効率的に精製するための方法を提供する。
(発明の背景)
抗体は、4つのポリペプチド:2個の重鎖および2個の軽鎖、から構成される。抗体の抗原結合部分は、軽鎖可変ドメイン(VL)および重鎖可変ドメイン(VH)によって形成される。これらドメインの1つの末端において、6つのループが抗原結合部位を形成し、相補性決定領域(CDR)ともいわれる。3個のCDRが上記VHドメインに位置し(H1、H2およびH3)、他の3個が、上記VLドメインにある(L1、L2およびL3)。
免疫グロブリンの大部分は、2個の同一の重鎖ポリペプチドおよび2個の同一な軽鎖ポリペプチドから構成されるので、両方のアーム上で同じ特異性を有する二価でありかつ単一特異的(monospecific)分子である。
モノクローナル抗体は、ヒト疾患のいくつかの領域において、治療的介入のための成功したかつ魅力的な分子のクラスとして出現した。しかし、単一のタンパク質を標的化もしくは中和することは、モノクローナル抗体の治療的使用を制限する特定の疾患において効力を達成するには、常に十分であるわけではない。多くの適応症において、生物学的系の1つの成分を中和することが効力を達成するには十分でないということは、ますます明らかである。この問題の1つの解決法は、いくつかのモノクローナル抗体を同時に投与することである。しかし、このアプローチは、組み合わされる予定の抗体が、以前から個々に承認されていない場合には、規制的側面から複雑である。さらに、組み合わせアプローチはまた、製造の観点からコストがかかる。よって、複数の抗原を単一の分子で標的化することを可能にする抗体および治療剤、ならびにこれら多重特異的抗体を効率的に精製および単離することが必要である。また、抗体、抗体フラグメントおよび/もしくは抗体成分を含む混合物からインタクトな抗体を効率的に精製および単離することが必要である。
(発明の要旨)
本発明は、抗体特異的精製媒体および関連試薬を使用して、所望の抗体生成物もしくは所望の抗体生成物の組み合わせを、抗体、抗体フラグメント、抗体成分(例えば、遊離軽鎖)、およびこれらの組み合わせの混合物から、分離および単離する種々の技術を提供する。本明細書で提供される方法は、所望の抗体生成物もしくは所望の抗体生成物の組み合わせを、抗体および/もしくはそのフラグメントの混合物から迅速にかつ効率的に分離する。例えば、いくつかの実施形態において、上記方法は、インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、抗体成分(例えば、抗体製造プロセスの副生成物である遊離軽鎖)から単離するように設計される。本明細書で使用される場合、用語「インタクト」な抗体分子とは、全長抗体のフラグメントおよび/もしくは他の部分(これらは、「インタクトでない」抗体として、本明細書でまとめて言及される)とは対照的に、全長抗体を意味する。上記インタクトな抗体は、任意のインタクトな抗体であり得、非限定的例によれば、インタクトな一価抗体、インタクトな二重特異的抗体、インタクトな多重特異的抗体、インタクトなモノクローナル抗体(例えば、インタクトな完全ヒト抗体、インタクトなヒト化抗体および/もしくは他のインタクトなキメラ抗体)が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記方法は、二重特異的抗体(例えば、単一の重鎖および少なくとも1個のカッパ(κ)軽鎖領域(もしくはκ軽鎖に由来する軽鎖領域)および少なくとも1個のラムダ(λ)軽鎖領域(もしくはλ軽鎖由来の軽鎖領域)を有する二重特異的抗体を単離するように設計されている。
上記精製媒体は、いくつかの実施形態において、κ軽鎖(もしくはその一部)を含む抗体およびそのフラグメントを単離するアフィニティー媒体(例えば、κ軽鎖およびその一部に対して特異的な樹脂もしくは他の分離手段(例えば、KappaSelect樹脂および/もしくはProtein L含有樹脂)である。上記精製媒体は、いくつかの実施形態において、λ軽鎖(もしくはその一部)を含む抗体およびそのフラグメントを単離するアフィニティー媒体(例えば、λ軽鎖およびその一部に対して特異的な樹脂もしくは他の分離手段(例えば、LambdaFabSelect樹脂))である。上記精製媒体は、抗体フラグメントおよび他の抗体成分(遊離軽鎖を含む)からインタクトなIgG抗体を単離する、例えば、混合モードクロマトグラフィー作用物質(例えば、Mep HyperCelTMクロマトグラフィー吸着剤)である。上記精製媒体は、いくつかの実施形態において、これら媒体のうちの1種以上の組み合わせである。
一局面において、本発明は、標準的抗体から連続して区別できない二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメントの精製を可能にする。上記精製される抗体およびその抗原結合フラグメントの改変されていない性質は、上記抗体およびその抗原結合フラグメントに、標準的モノクローナル抗体に類似の都合のよい製造特性を提供する。
本明細書で提供される方法は、種々の二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメント、特に、2つの独立した標的に対する特異性を駆動する、共通のIgG重鎖および2種の異なる軽鎖(一方は、カッパ(κ)定常領域を有し、他方は、ラムダ(λ)定常領域を有する)を有する「κλ−ボディ(κλ−body)」と本明細書でいわれる二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメントを精製するために有用である。
精製される予定である上記二重特異的抗体およびそれらの抗原結合フラグメントは、種々の方法のうちのいずれかを使用して生成され得る。例えば、上記二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメントは、(i)異なる特異性を有し、そして同じ重鎖可変ドメインを共有するが、異なる可変軽鎖を有する(例えば、固定した重鎖を有する抗体ライブラリーもしくは単一のVH遺伝子を含むトランスジェニック動物を使用することによって)2種の抗体を単離する工程;(ii)上記重鎖可変ドメインを重鎖の定常領域に融合し、一方の軽鎖可変ドメインをκ定常ドメインに融合し、そして他方の軽鎖可変ドメインをλ定常ドメインに融合する工程;ならびに(iii)宿主細胞もしくは細胞株(例えば、哺乳動物細胞および/もしくは哺乳動物細胞株)において上記3種の鎖を同時発現し、3種の抗体(2種の単一特異的抗体および2個の異なる軽鎖を有する1種の二重特異的抗体)の混合物の上清中でアセンブリおよび分泌をもたらす工程によって生成され得る。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、第1の軽鎖の少なくとも第1の部分は、κタイプであり、上記第2の軽鎖の少なくとも一部は、λタイプである。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第1の軽鎖は、少なくともκ定常領域を含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第1の軽鎖は、κ可変領域をさらに含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第1の軽鎖は、λ可変領域をさらに含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第2の軽鎖は、少なくともλ定常領域を含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第2の軽鎖は、λ可変領域をさらに含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第2の軽鎖は、κ可変領域をさらに含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記第1の軽鎖は、κ定常領域およびκ可変領域を含み、上記第2の軽鎖は、λ定常領域およびλ可変領域を含む。この方法を使用して生成されるいくつかの抗体およびそれらの抗原結合フラグメントにおいて、上記定常および可変フレームワーク領域配列は、ヒトのものである。
この方法もしくは当該分野で公知の任意の他の適切な方法を使用して生成された上記二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメントは、抗体精製に使用される標準的クロマトグラフィー技術を使用して精製される。この方法もしくは当該分野で公知の任意の他の適切な方法を使用して生成される上記二重特異的抗体およびその抗原結合フラグメントはまた、他の分離技術を使用して(例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、膜濾過技術およびタンパク質沈殿技術によって)精製され得る。好ましい実施形態において、上記二重特異的抗体およびそれらの抗原結合フラグメントは、アフィニティークロマトグラフィー、例えば、KappaSelectアフィニティークロマトグラフィー、LambdaFabSelectクロマトグラフィーもしくはProtein Lアフィニティークロマトグラフィーを使用して、精製される。
本発明は、各結合部位において異なる特異性を有し、2コピーの単一の重鎖ポリペプチドならびにκ定常領域を含む第1の軽鎖およびλ定常領域を含む第2の軽鎖からなる二重特異的モノクローナル抗体を精製するための方法を提供する。これら方法は、以下の工程を包含する:(i)各結合部位において異なる特異性を有し、2コピーの単一の重鎖ポリペプチドならびにκ定常領域を含む第1の軽鎖およびλ定常領域を含む第2の軽鎖からなる1種以上の二重特異的モノクローナル抗体(二重特異的MAb);2個のλ軽鎖もしくはその一部を有する1種以上の単一特異的モノクローナル抗体(λ−MAb);ならびに2個のκ軽鎖もしくはその一部を有する1種以上の単一特異的モノクローナル抗体(κ−MAb)を含む混合抗体組成物を提供する工程;(ii)κ軽鎖定常領域もしくはλ軽鎖定常領域に対して特異的な親和性を有する分離手段を提供する工程;(iii)上記分離手段と上記混合抗体組成物とを、上記κ−MAbのκ軽鎖定常領域によるかもしくは上記λ−MAbのλ軽鎖定常領域による上記分離手段への結合と比較して、上記二重特異的MAbによる上記分離手段への差次的結合を可能にする条件下で接触させる工程;ならびに(iv)上記κ−MAbのκ軽鎖定常領域の脱離もしくは上記λ−MAbのλ軽鎖定常領域の脱離と比較して、上記二重特異的MAbの優先的脱離を可能にする条件下で、上記分離手段から抗体を溶離する工程。
いくつかの実施形態において、上記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリス(monolith)であり、いくつかの実施形態において、上記分離手段は、κ軽鎖定常領域もしくはλ軽鎖定常領域に対して高い特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされる。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、KappaSelect樹脂、LambdaFabSelect樹脂、もしくはProtein L樹脂である。いくつかの実施形態において、上記リガンドは、抗λモノクローナル抗体もしくは抗κモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態において、上記結合および/もしくは溶離条件は、pHレベルにおける段階的変化を含む。いくつかの実施形態において、上記結合および/もしくは溶離条件は、無機塩濃度(例えば、塩化ナトリウム(NaCl)濃度もしくは他の無機塩(例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、ホフマイスターシリーズのイオンからの無機塩組み合わせ)の濃度)における段階的変化を含む。いくつかの実施形態において、上記結合および/もしくは溶離条件は、組成物中のアミノ酸の濃度(例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよび/もしくはグリシンの濃度)における段階的変化を含む。いくつかの実施形態において、上記結合および/もしくは溶離条件は、1種以上の温和な変性剤(例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、ポリソルベート20、ポリソルベート80、ポリエチレングリコール2000、ポリエチレングリコール8000、Triton X−100、CHAPS、NP−40、ならびに他のイオン性、非イオン性および/もしくは双性イオン性界面活性剤)を含む。
いくつかの実施形態において、上記方法は、溶離した画分中の二重特異的抗体、κ−MAbおよび/もしくはλ−MAbの純度および割合を決定するためのさらなる工程を包含する。この工程は、種々の当該分野で認識された技術のうちのいずれか(例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー(HIC−HPLC)、イオン交換高速液体クロマトグラフィー(IEX−HPLC)もしくは逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC))を使用して達成され得る。
本明細書で提供される実施例は、より高いpH段階的溶離を使用すると、より低いpHで溶離する単一特異的κ−MAbより二重特異的κλ−ボディ生成物をKappaSelectアフィニティー樹脂から優先的に溶離するという実行可能性を実証する。なぜなら、上記単一特異的MAbは、上記単一特異的形式中の2個のκ鎖の存在のおかげで、上記κλ−ボディ中の単一のκ鎖とは対照的に、上記樹脂に対してより高い親和性を有するからである。本明細書で記載される方法は、上記軽鎖に対する親和性が上記単一特異的および/もしくは二重特異的生成物を差次的に結合するために使用される他のクロマトグラフィー支持体(例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、LambdaFabSelect、イオン交換、疎水性相互作用、および混合モード樹脂(例えば、ヒドロキシアパタイト)ならびに他のクロマトグラフィー技術)において有用である。当業者は、このカテゴリー内に入る他の当該分野で認識された技術を容易に理解する。上記異なる生成物を分離する溶離ストラテジーは、pH変化に限定されるべきではなく、非限定的かつ非網羅的な例によれば、塩濃度(例えば、NaCl濃度もしくは他の無機塩(例えば、ホフマイスターシリーズのイオンからの無機塩の組み合わせ)の濃度)、アルギニンおよび他のアミノ酸の濃度(例えば、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびグリシンの濃度)の段階的変化を使用するカチオン交換分離技術、温和な変性剤(例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート80、ポリエチレングリコール2000、ポリエチレングリコール8000、Triton X−100、CHAPS、NP−40、ならびに他のイオン性、非イオン性および/もしくは双性イオン性界面活性剤など)の使用をも包含し得る。
別の局面において、本発明は、インタクトな抗体(単一特異的抗体、二重特異的抗体およびインタクトな抗体の混合物を含む)からの遊離軽鎖の効率的除去に関する。特に、クロマトグラフィー条件は、インタクトな二重特異的もしくは単一特異的モノクローナル抗体、またはインタクトな二重特異的もしくは単一特異的モノクローナル抗体の組み合わせを、遊離軽鎖から単離するために適用可能であることが同定された。
本明細書で提供される実施例は、遊離軽鎖を含む混合物からの、インタクトなIgG分子の上記混合モードアフィニティー単離のために二重特異的抗体を使用する。これは、例に過ぎず、本明細書で提供される方法が、モノマーもしくはポリマーとして、および天然のもしくは変化したコンホメーションにおいて存在し得る不完全な抗体成分(すなわち、インタクトでない抗体)を生成する任意の抗体製造プロセスと組み合わせて有用であることは、理解されるべきである。さらに、本明細書で提供される実施例が、インタクトなIgG抗体を同定する精製媒体を使用するが、これら方法が他のインタクトな抗体分子を同定する任意の精製媒体とともに使用され得ることは、理解されるべきである。
当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して生成された上記インタクトな抗体分子は、本明細書で提供される混合モードクロマトグラフィー分離技術単独で、もしくは任意の他の適切な分離技術(例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、膜濾過技術およびタンパク質沈澱技術)と組み合わせて使用して、精製され得る。
本発明は、インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、インタクトでない抗体(抗体成分、抗体成分のダイマー、抗体フラグメントおよび/もしくはこれらの組み合わせを含む)を含む混合物から精製するための方法を提供する。上記インタクトな抗体の組み合わせは、インタクトな抗体の1種以上の異なるタイプ(同じ標的もしくは異なる標的を結合する抗体を含む)を含み得る。上記インタクトな抗体は、任意のインタクトな抗体(非限定的例によれば、インタクトな一価抗体、インタクトな二重特異的抗体、インタクトな多重特異的抗体、インタクトなモノクローナル抗体(例えば、インタクトな完全ヒト抗体、インタクトなヒト化抗体、および/もしくは他のインタクトなキメラ抗体)が挙げられる)であり得る。上記インタクトな抗体の組み合わせは、同じ標的もしくは異なる標的に対する任意のインタクトな抗体の組み合わせ(非限定的例によれば、以下:インタクトな一価抗体、インタクトな二重特異的抗体、インタクトな多重特異的抗体、インタクトなモノクローナル抗体、インタクトな完全ヒト抗体、インタクトなヒト化抗体および/もしくは他のインタクトなキメラ抗体のうちの1種以上を含む組み合わせが挙げられる)を含み得る。
いくつかの実施形態において、これら方法は、以下の工程を包含する:(i)上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせおよび1種以上のインタクトでない抗体分子(1種以上の抗体成分(例えば、遊離軽鎖)、抗体成分(例えば、遊離軽鎖)の1種以上のダイマー、および/もしくは1種以上の抗体フラグメントを含む)のうちの1種以上を含む混合抗体組成物を提供する工程;(ii)上記インタクトでない抗体分子と比較して、インタクトな抗体分子の間で差次的親和性を有する分離手段を提供する工程;(iii)上記分離手段と上記混合抗体組成物とを、インタクトでない抗体分子(例えば、1種以上の抗体成分(例えば、遊離軽鎖)、抗体成分(例えば、遊離軽鎖)の1種以上のダイマー、および/もしくは1種以上の抗体フラグメント)による上記分離手段への結合と比較して、上記インタクトな抗体分子もしくはインタクトな抗体の組み合わせによる上記分離手段への差次的結合を可能にする条件下で接触させる工程;ならびに(iv)上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、上記分離手段から分離し、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを保持し、それによって、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、上記混合抗体組成物から精製する工程。いくつかの実施形態において、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせは、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、上記分離手段から、上記インタクトでない抗体分子(例えば、1種以上の抗体成分(例えば、遊離軽鎖)、抗体成分(例えば、遊離軽鎖)の1種以上のダイマー、および/もしくは1種以上の抗体フラグメント)の脱離と比較して、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせの優先的脱離を可能にする条件下で溶離することによって、上記分離手段から分離される。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、上記分離手段への上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせによる結合を可能にするが、上記インタクトでない抗体分子と上記分離手段との間の結合を可能にしない条件下で、上記抗体混合組成物によって接触させられる。いくつかの実施形態において、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせは、任意の結合していない、インタクトでない抗体を上記混合抗体組成物から除去することによって、または上記結合していない、インタクトでない抗体を上記分離手段から流し去って上記結合していない画分を廃棄するかもしくはさもなければ除去することによって、上記インタクトでない抗体画分から分離される。いくつかの実施形態において、上記インタクトでない抗体分子は、遊離軽鎖である。
いくつかの実施形態において、上記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、インタクトでない抗体分子と比較して、インタクトな抗体分子に対して差次的な特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされる。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、混合モードクロマトグラフィー媒体(例えば、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー(HIC−HPLC)もしくはイオン交換高速液体クロマトグラフィー(IEX−HPLC))である。いくつかの実施形態において、上記混合モードクロマトグラフィー媒体は、Mep HyperCelTMである。他の混合モードクロマトグラフィー媒体としては、例えば、CapioTM MC、CaptoTM adhere、HEA HyperCelTM、PPA HyperCelTM、CHTTMセラミックヒドロキシアパタイト、およびNuviaTM cPrimeTMが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記リガンドは、抗・抗体モノクローナル抗体(例えば、抗IgG抗体)である。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記溶離された画分における上記インタクトな抗体の純度および割合を決定するさらなる工程を包含する。この工程は、種々の当該分野で認識された技術のうちのいずれか(例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SEC−HPLC)、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー(HIC−HPLC)、イオン交換高速液体クロマトグラフィー(IEX−HPLC)、もしくは逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC))を使用して達成され得る。
いくつかの実施形態において、これら方法は、以下の工程を包含する:(i)1種以上の上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせおよび1種以上のインタクトでない抗体分子(1種以上の抗体成分(例えば、遊離軽鎖)、抗体成分(例えば、遊離軽鎖)の1種以上のダイマー、および/もしくは1種以上の抗体フラグメントを含む)を含む混合抗体組成物を提供する工程;(ii)インタクトな抗体分子と比較して、インタクトでない抗体分子との間で差次的親和性を有する分離手段を提供する工程;(iii)上記分離手段と上記混合抗体組成物とを、上記インタクトでない抗体分子による上記分離手段への結合を可能にするが、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせによる上記分離手段への結合を可能にせず、その結果、上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせが結合されていない画分の中に残る条件下で接触させる工程;ならびに(iv)上記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを含む結合されていない画分を保持する工程。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記インタクトでない抗体分子を上記分離手段から分離するさらなる工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記インタクトでない抗体分子は、遊離軽鎖である。
いくつかの実施形態において、上記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、インタクトな抗体分子に対して差次的な特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされる。いくつかの実施形態において、上記分離手段は、混合モードクロマトグラフィー媒体(例えば、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー(HIC−HPLC)もしくはイオン交換高速液体クロマトグラフィー(IEX−HPLC))である。いくつかの実施形態において、上記混合モードクロマトグラフィー媒体は、Mep HyperCelTMである。他の混合モードクロマトグラフィー媒体としては、例えば、CaptoTM MMC、CaptoTM adhere、HEA HyperCelTM、PPA HyperCelTM、CHTTMセラミックヒドロキシアパタイト、およびNuviaTM cPrimeTMが挙げられる。いくつかの実施形態において、上記リガンドは、抗・抗体モノクローナル抗体抗体(例えば、抗IgG抗体)である。
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記溶離した画分における上記インタクトな抗体の純度および割合を決定するさらなる工程を包含する。この工程は、種々の当該分野で認識された技術のうちのいずれか(例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SEC−HPLC)、疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー(HIC−HPLC)、イオン交換高速液体クロマトグラフィー(IEX−HPLC)、もしくは逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC))を使用して達成され得る。
図1A〜1Cは、2コピーの特有の重鎖ポリペプチドならびに2個の異なる軽鎖ポリペプチドから構成される異なるκλ−ボディ二重特異的抗体の構造の模式図である。これら図に示される上記κ軽鎖および上記λ軽鎖(もしくはこれらの一部)の位置および/もしくは構成は、限定ではないことが意図される。当業者は、上記κ軽鎖および上記λ軽鎖(もしくはこれらの一部)がまた、図1A〜1Cに示される二重特異的抗体の鏡像を生じるように配置され得ることを認識する。当業者はまた、図1A〜1Cにおける完全IgG形式で表されている二重特異的抗体がまた、他の免疫グロブリンアイソタイプを使用して、もしくはF(ab’)2のような他の免疫グロブリン形式において生成され得ることを認識する。図1A.κ定常ドメインに融合されたκ可変ドメインおよびλ定常ドメインに融合されたλ可変ドメイン。図1B.κ定常ドメインおよびλ定常ドメインに融合されたκ可変ドメイン。図1C.κ定常ドメインおよびλ定常ドメインに融合されたλ可変ドメイン。 図2は、CHO細胞における3シストロン発現ベクター(tri−cistronic expression vector)の発現が、3種の抗体生成物を、IgG生成物(「IgG」と表示された中央パネル)および遊離軽鎖(FLC)の混合物、ならびにこれらFLCのダイマー(「FLC」と表示された下側のパネル)に関して、理論上25:50:25の比で生じることを示す図である。 図3Aは、段階的pH溶離を使用するKappaSelectアフィニティークロマトグラフィーの代表的UVトレースプロフィールを示すグラフである。 図3Bは、KappaSelect溶離画分の非還元型および還元型SDS−PAGEを示す図である。 図3Cは、KappaSelect溶離画分のIEX−HPLC分析を示すグラフである。 図4Aは、段階的pH溶離を使用するLambdaFabSelectアフィニティークロマトグラフィーの代表的UVトレースプロフィールを示すグラフである。 図4Bは、LambdaFabSelect溶離画分の非還元型および還元型SDS−PAGEを示す図である。 図4Cは、LambdaFabSelect溶離画分のHIC−HPLC分析を示すグラフである。 図5Aは、段階的pH溶離を使用するMep HyperCelTM混合モードクロマトグラフィーの代表的UVトレースプロフィールを示すグラフである。 図5Bは、Mep HyperCelTM溶離画分の非還元型および還元型SDS−PAGEを示す図である。 図5Cは、Mep HyperCelTM溶離画分のHIC−HPLC分析を示すグラフである。
(詳細な説明)
本発明は、抗体特異的アフィニティー媒体および関連試薬を使用して、所望の抗体生成物を、抗体、抗体フラグメント、抗体成分(例えば、遊離軽鎖)、およびこれらの組み合わせの混合物から分離および単離する種々の技術を提供する。本明細書で提供される方法は、所望の抗体生成物を、抗体および/もしくはこれらのフラグメントの混合物から迅速にかつ効率的に分離する。
本発明は、ヒト免疫グロブリンと構造が同一な二重特異的抗体を精製するための方法を提供する。この分子タイプは、2コピーの特有の重鎖ポリペプチド、定常κドメインに融合された第1の軽鎖可変領域および定常λドメインに融合された第2の軽鎖可変領域から構成される。各結合部位は、上記重鎖および軽鎖の両方が寄与する異なる抗原特異性を示す。上記軽鎖可変領域は、λファミリーもしくはκファミリーのものであり得、好ましくは、それぞれ、λ定常ドメインおよびκ定常ドメインに融合される。これは、非天然のポリペプチド接合部の生成を回避するために好ましい。しかし、κ軽鎖可変ドメインを第1の特異性のために定常λドメインに融合し、λ軽鎖可変ドメインを第2の特異性のために定常κドメインに融合することによって、本発明の二重特異的抗体を得ることもまた可能である(図1)。本明細書で記載される二重特異的抗体は、IgGκλ抗体もしくは「κλ−ボディ」(完全ヒト二重特異的IgG形式)ともいわれる。このκλ−ボディ形式は、標準的モノクローナル抗体、例えば、標準的IgG分子から区別不能である二重特異的抗体のアフィニティー精製を可能にし、従って、以前の形式と比較して都合がよい。
上記κλ−ボディは、同じ重鎖可変ドメインを共有する、異なる抗原特異性を有する2種の抗体Fv領域(各々、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインによって構成される)を同定することによって生成される。
本発明はまた、インタクトでない抗体分子(例えば、抗体成分、抗体成分のダイマー、抗体フラグメントおよび/もしくはこれらの組み合わせを含む)を含む混合物からインタクトな抗体を精製するための方法を提供する。
本発明の方法を使用して精製される予定である上記κλ−ボディおよび/もしくはインタクトな抗体は、抗体を生成するための種々の方法のうちのいずれかを使用して生成される。モノクローナル抗体およびそのフラグメントの生成について多くの方法が記載されてきた(例えば、Antibodies: A Laborator Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(本明細書に参考として援用される)を参照のこと)。完全ヒト抗体は、軽鎖および重鎖(CDR1およびCDR2を含む)両方の配列が、ヒト遺伝子から生じる抗体分子である。CDR3領域は、ヒト起源のものであり得るか、または合成手段によって設計され得る。このような抗体は、「ヒト抗体」もしくは「完全ヒト抗体」と本明細書でいわれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ(trioma)技術;ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら、1983 Immunol Today 4: 72を参照のこと);およびEBVハイブリドーマ技術を使用して、ヒトモノクローナル抗体(Coleら、1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77−96を参照のこと)を生成することによって、調製され得る。ヒトモノクローナル抗体が利用され得、それは、ヒトハイブリドーマを使用することによって(Coteら、1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026−2030を参照のこと)もしくはヒトB細胞をインビトロで、エプスタイン・バー・ウイルスで形質転換することによって(Coleら、1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77−96を参照のこと)生成され得る。
モノクローナル抗体は、例えば、動物を標的抗原、またはその免疫原性フラグメント、誘導体もしくは改変体で免疫化することによって生成される。あるいは、上記動物は、上記標的抗原をコードする核酸分子を含むベクターでトランスフェクトされた細胞で免疫化され、その結果、上記標的抗原が発現され、上記トランスフェクトされた細胞の表面と会合する。異種の非ヒト動物を生じるための種々の技術が当該分野で周知である。例えば、米国特許第6,075,181号および同第6,150,584号(これはその全体が本明細書に参考として援用される)を参照のこと。
あるいは、上記抗体は、上記標的抗原に結合するための抗体もしくは抗原結合ドメイン配列を含むライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。このライブラリーは、例えば、組み立てられたファージ粒子の表面で発現されるバクテリオファージコートタンパク質へのタンパク質もしくはペプチド融合物および上記ファージ粒子内に含まれるコードDNA配列としてバクタリオファージにおいて、調製される(すなわち、「ファージディスプレイライブラリー」)。
次いで、骨髄腫/B細胞融合物から生じるハイブリドーマは、上記標的抗原への反応性についてスクリーニングされる。モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)によって記載されるもの)を使用して調製される。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、もしくは他の適切な宿主動物が、代表的には、免疫化因子で免疫化されて、上記免疫化因子に特異的に結合する抗体を生成するかもしくは生成し得るリンパ球が誘発される。あるいは、上記リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。
厳密には不可能ではないものの、同じ重鎖可変ドメインを有するが、異なる抗原に対して指向される異なる抗体の思いがけない同定は、非常に可能性が低い。実際に、大部分の場合には、重鎖は、抗原結合表面に主に寄与し、配列の中で最も可変性も高い。特に、重鎖のCDR3は、配列、長さおよび構造において最も多様なCDRである。従って、異なる抗原に対して特異的な2種の抗体は、異なる重鎖可変ドメインをほぼ常に有する。
いくつかの実施形態において、精製される予定の上記κλ−ボディおよび/もしくはインタクトな抗体は、例えば、上記重鎖可変ドメインが全てのライブラリーメンバーに関して同一であり、従って、多様性が上記軽鎖可変ドメインに制限されている抗体ライブラリーを使用して、生成される。このようなライブラリーは、例えば、同時係属中の出願PCT/US2010/035619(2010年5月20日出願およびPCT公開番号WO 2010/135558として2010年11月25日公開)および同時係属中の出願PCT/US2010/057780(2010年11月23日出願およびPCT公開番号WO 2011/084255として2011年7月14日公開)(これらの各々が、その全体において本明細書に参考として援用される)に記載される。しかし、上記軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインと組み合わせて発現されるので、両方のドメインが抗原結合に寄与し得る。上記プロセスをさらに促進するために、同じ重鎖可変ドメインおよび多様なλ可変軽鎖もしくはκ可変軽鎖のいずれかを含む抗体ライブラリーが、異なる抗原に対する抗体のインビトロ選択のために並行して使用され得る。このアプローチは、本発明の完全な免疫グロブリン形式にある二重特異的抗体の生成のための構成要素として使用され得る、共通の重鎖を有するが、一方はλ軽鎖可変ドメインを、他方はκ軽鎖可変ドメインを有する2つの抗体の識別を可能にする。本発明の方法を使用して精製される予定の上記二重特異的抗体は、異なるアイソタイプのものであり得、それらのFc部分は、異なるFcレセプターへの結合特性を変化させるために改変され得、このようにして、上記抗体のエフェクター機能ならびにその薬物動態特性を改変し得る。上記Fc部分の改変のための多くの方法が記載されてきており、本発明の抗体に適用可能である(例えば、Strohl,WR Curr Opin Biotechnol 2009 (6):685−91;米国特許第6,528,624号;米国特許出願公開番号2009/0191199(2009年1月9日出願)を参照のこと)。本発明の方法はまた、上記Fc部分を欠くF(ab’)2形式において二重特異的抗体および抗体混合物を精製するために使用され得る。
好ましくは、上記精製される予定のκλ−ボディは、本発明の二重特異的抗体の組み立てを可能にするために、単一細胞への上記共通の重鎖および2個の異なる軽鎖の同時発現のために最適化されてきた。上記ポリペプチドの全てが、同じレベルで発現されかつ免疫グロブリン分子を形成するために等しく十分に組み立てられるようにするのであれば、単一特異的(同じ軽鎖)および二重特異的(2個の異なる軽鎖)の比は、50%であるはずである。しかし、異なる軽鎖が異なるレベルで発現され、そして/または同じ効率で組み立てられないことは、あり得ることである。さらに、インタクトなIgG分子への組み立てから逃れた軽鎖は、「遊離軽鎖」(FLC)として細胞培養培地に分泌され得る。上記異なるポリペプチドの相対的発現を調節して、それらの本質的な発現特性もしくは共通な重鎖と会合する傾向が異なることを補償する手段としては、非限定的例示によれば、種々の強度を有するプロモーターの使用、異なる効率を特徴とする内部リボソーム進入部位(IRES)の使用、または転写レベルもしくは翻訳レベルにおいて作用し得る、ならびにmRNA安定性に対して作用する調節エレメントの他のタイプの使用が挙げられる。上記発現の調節はまた、一方のもしくは他方の軽鎖を発現する個々の遺伝子のコピー数を増大させ、従って、それらの相対的発現を改変するために、細胞の複数の逐次的なトランスフェクションによって達成され得る。
上記重鎖および2個の軽鎖の同時発現は、細胞培養上清へと分泌される3種の異なる抗体:2種の単一特異的二価抗体および1種の二重特異的二価抗体の混合物を生じる。後者は、上記目的のκλ−ボディを得るために、上記混合物から精製されなければならない。本明細書に記載される精製法は、上記κ軽鎖もしくはλ軽鎖の定常ドメインと特異的に相互作用するアフィニティークロマトグラフィー媒体(例えば、KappaSelectアフィニティー媒体、LambdaFabSelectアフィニティー媒体、ならびに/もしくはProtein L、CaptureSelect Fab KappaおよびCaptureSelect Fab Lambdaアフィニティーマトリクス)の使用による精製手順を大いに促進する。このアフィニティークロマトグラフィー精製アプローチは効率的であり、二重特異的抗体(κλ−ボディを含む)に一般的に適用可能である。これは、抗体混合物を発現するクアドローマもしくは他の細胞株から得られる各二重特異的抗体のために開発され最適化されなければならない特定の精製法とは際だって対照的である。実際に、上記混合物中の異なる抗体の生化学的特性が類似している場合には、標準的クロマトグラフィー技術(例えば、イオン交換クロマトグラフィー)を使用するそれらの分離は、困難であり得るかもしくは全く不可能であり得る。
上記3個の鎖の同時発現は、3種の異なる抗体:2種の単一特異的抗体および1種の二重特異的抗体、の組み立てをもたらした。それらの理論的相対比は、発現レベルおよび組み立て速度が両方の軽鎖に関して類似であるとするならば、1:1:2であるはずである。上記二重特異的抗体を、上記二重特異的抗体(例えば、上記κλ−ボディ)を、アフィニティー樹脂を使用して優先的に溶離するアフィニティークロマトグラフィー手順を使用して精製した。
上記3つの鎖の同時発現はまた、細胞培養上清中に過剰な遊離軽鎖の生成をもたらした。このような遊離軽鎖は、例えば、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを省略する精製プロセスにおいて除去するのは潜在的に問題があり得る。遊離軽鎖は、本明細書中で示されるとおり、混合モードクロマトグラフィーを使用して上記インタクトな抗体ミックスから効率的に分離され得る。
異なる抗体操作アプローチを使用して均質な二重特異的分子の生成を無理矢理行うことを目指して二重特異的抗体形式を生成および精製する以前のアプローチは、上記生成物の生産性、拡張性および安定性を犠牲にして行われた。本明細書に記載される方法は、上記二重特異的抗体を、一価のモノクローナル抗体および遊離軽鎖を含む混合物から精製する効率的かつ包括的な手段を提供する。
実施例1:λ軽鎖およびκ軽鎖を有する二重特異的抗体の精製
上記κλ−ボディは、2種の独立した標的に対する特異性を駆動する、共通のIgG1重鎖および2個の異なる軽鎖を含む新規な二重特異的IgG形式である。大規模産業プロセスに適用可能な効率的精製プロトコルを可能にするために、その形式は、一方の軽鎖がκ定常領域を含むと同時に、他方がλ定常領域を含むことが必要である(図1を参照のこと)。
κλ−ボディを生成するために、上記共通の重鎖および2個の軽鎖を、CHO細胞において、3シストロン発現ベクターを使用して発現させる。このベクター形式は、3種の生成物:単一特異的κモノクローナル抗体(MAb)、二重特異的κλ−ボディおよび単一特異的λ−MAb、の構築を可能にする。κ軽鎖とλ軽鎖との間で類似の発現レベルおよび上記重鎖との組み立てを仮定すると、理論的生成物比は、遊離軽鎖を加えて25:50:25である(図2を参照のこと)。
このκλ−ボディ形式の精製は、例えば、同時係属中の米国特許出願第13/210,723号(2011年8月16日出願)に記載されるように、KappaSelectアフィニティー樹脂およびLambdaFabSelectアフィニティー樹脂(GE Healthcare)への逐次的結合によって行われ得る。これら樹脂は、上記κ定常領域もしくはλ定常領域のいずれかに対して高い特異性および親和性を有するドメインリガンドとカップリングされる。しかし、上記κλ−ボディおよび他の二重特異的抗体の大規模精製を可能にする、改善されかつコスト効率的精製プロセスが必要である。遊離軽鎖が、KappaSelectアフィニティークロマトグラフィーおよびLambdaFabSelectアフィニティークロマトグラフィーより前に上記混合物から除去され得る限りにおいて、プロテインAアフィニティー上清捕捉工程の除去が想定され、可能である。
上記精製プロセスを合理化することを目的として、上記κλ−ボディが、その対応する、単一特異的κ−MAb(KappaSelectに対して)もしくは単一特異的λ−MAb(LambdaFabSelectに対して)の副生成物より弱い親和性で、上記モノクローナル形式(κもしくはλのいずれか)に関して、双方ではなく各軽鎖のうちの一方のみを含むという事実に起因して、KappaSelect樹脂もしくはLambdaFabSelect樹脂のいずれかに結合すると仮定した。さらに、遊離軽鎖が、上記上清から組換えタンパク質を直接捕捉するために、混合モードクロマトグラフィーを使用してインタクトな抗体から分離され得ると仮定した(図2を参照のこと)。
本明細書中で提供される研究から、KappaSelectアフィニティークロマトグラフィーもしくはLambdaFabSelectアフィニティークロマトグラフィーのいずれかの間に段階的pH溶離を使用して、κλ−ボディを単一特異的κAbから成功裏に分離することが示される。
出発材料:KappaSelectクロマトグラフィーに関しては、κλ二重特異的発現ベクター(1つのγ1重鎖cDNA、1つのκ軽鎖cDNA、および1つのλ軽鎖cDNAを含む)でトランスフェクトしたCHO細胞の清澄にした25Lウェーブバッグ発酵上清を、精製のための出発材料として使用した。LambdaFabSelectおよび混合モードクロマトグラフィーに関しては、κλ二重特異的発現ベクター(1つのγ1重鎖cDNA、1つのκ軽鎖cDNAおよび1つのλ軽鎖cDNAを含む)でトランスフェクトしたCHO細胞のBIOSTAT CultiBag STR 100L発酵の清澄にした上清を、精製のための出発材料として使用した。
KappaSelectクロマトグラフィー工程: 抗IFNγ/IL−6RC(すなわち、IL−6RCは、IL−6とIL−6Rとの間で形成された複合体である)κλ−ボディ二重特異的IgG抗体を、KappaSelectアフィニティークロマトグラフィー媒体(GE Healthcare)を使用して精製した。上記抗IFNγ/IL−6RC κλ−ボディ二重特異的IgG抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を、以下に示す:
10mg/mLでのカラムへのローディングならびに50mM リン酸ナトリウム、250mM 塩化ナトリウム、pH7.0(5カラム容積)での洗浄工程の後、pH段階的溶離(pH3.0、続いて、pH2.5およびpH2.0)を、この関連するpHに調節した50mM グリシン緩衝液を使用して行った。フロースルー(F/T)画分および溶離した画分を集め、生成物回収を決定するために280nmでの吸光度測定(NanoDrop UV−Vis分光光度計(Thermo Scientific)を使用)によって、上記サンプルの純度および組成を決定するために還元型および非還元型SDS−PAGE(製造業者のガイドラインに従ってInvitrogen Novex NuPAGE 12ウェル 4〜20% 勾配ゲルを使用)によって、そして上記精製プロセスが上記κλ−ボディ二重特異的IgGを上記2種の単一特異的抗体副生成物から分離する能力を決定するためにイオン交換高速液体クロマトグラフィー(IEX−HPLC;以下に記載される方法)によって分析した。
IEX−HPLC法:このイオン交換高速液体クロマトグラフィー(IEX−HPLC)法を、精製サンプル中の単一特異的抗体および二重特異的抗体の割合を決定するために使用した。上記IEX−HPLC法は、タンパク質改変体の分離をそれらの電荷分布に従って可能にする。サンプルを調製して、A BioMab NP5−SSカラム(Agilent)の上に50μgをローディングし、流量0.8mL/分での10mM リン酸ナトリウム、500mM NaCl、pH6.5(0%〜100% NaCl濃度)の直線勾配を、上記異なる抗体生成物を分離するために適用した。214nmでのUV検出を使用して、サンプル溶離をモニターした。3つの集団を(参照標準に従って)同定し、それらのパーセンテージ相対面積に従って分析した。各アイソフォームのパーセンテージを、総ピーク面積に対する各成分のピーク面積を計算することによって決定した。
図3A中のUVトレース(青色)によって示されるように、上記KappaSelectクロマトグラフィー樹脂に適用した3つのpH段階的溶出は、3つの結合画分の逐次的単離を可能にした。非還元型SDS−PAGE分析(図3Bに示される)から、認識されるように、組み立てられた全長抗体を含む高純度の溶離した画分が明らかになった。いくつかの遊離軽鎖生成物(モノマーおよびダイマー形態)もまた、検出された。還元型SDS−PAGE分析から、逐次的pH溶離工程は、軽鎖組成に基づいて、上記2種の単一特異的抗体に対して上記κλ−ボディの差次的保持をもたらすことが示唆された。pH3.0での溶離画分は、両方の軽鎖を等しいレベルで含んだのに対して、上記pH2.5画分およびpH2.0画分は、最小のもしくは検出不能なレベルのλ軽鎖を示した。上記3つの結合画分を、上記IEX−HPLCクロマトグラムのピーク面積を積分することによってさらに特徴付けた(図3C)。表1にまとめた結果は、上記SDS−PAGE分析と一致し、このことは、pH3.0における第1の溶離画分中の上記κλ−ボディの量が非常に豊富である(70.10%)ことを示す。pH2.5およびpH2.0でのその後の溶離工程は、上記単一特異的κ抗体の溶離を生じた。上記KappaSelect樹脂でのpH段階的溶離ストラテジーは、従って、二重特異的κλ−ボディを、単一特異的なκ−MAbおよびλ−MAbから効率的に分離することを示した。
このデータから、より低いpHで溶離する単一特異的κ−MAbより、二重特異的κλ−ボディ生成物をKappaSelectアフィニティー樹脂から優先的に溶離するために、より高いpH段階的溶離を使用することの実行可能性が実証される。このことは、おそらく、上記κλ−ボディ中の単一のκ鎖とは対照的に、上記単一特異的形式における2個のκ鎖の存在のため、上記樹脂へのより高い親和性に起因する。
従って、この分離はまた、上記軽鎖に対する親和性が上記単一特異的および/もしくは二重特異的生成物を差次的に結合するために使用される他のクロマトグラフィー支持体(例えば、非限定的かつ非網羅的な例によれば、LambdaFabSelectイオン交換、疎水性相互作用、および混合モード樹脂(例えば、ヒドロキシアパタイト))において有用である。当業者は、このカテゴリー内に入る他の当該分野で認識された技術を容易に認識する。上記異なる生成物を分離するための溶離ストラテジーは、pH変化に限定されるべきでないのみならず、非限定的かつ非網羅的な例によれば、塩濃度(例えば、NaCl濃度もしくは他の無機塩(例えば、ホフマイスターシリーズのイオンからの無機塩組み合わせ)の濃度)の段階的変化、アルギニンおよび他のアミノ酸(例えば、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびグリシンの濃度)を使用するカチオン交換分離技術、温和な変性剤(例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート80、ポリエチレングリコール2000、ポリエチレングリコール8000、Triton X−100、CHAPS、NP−40、ならびに他のイオン性、非イオン性および/もしくは双性イオン性界面活性剤)の使用などをも含み得る。
LambdaFabSekctクロマトグラフィー工程: 抗IL−6Rc/IL−6RC κλ−ボディ二重特異的IgG抗体を、LambdaFabSelectアフィニティークロマトグラフィー媒体(GE Healthcare)を使用して精製した。上記抗IL−6Rc/IL−6RC κλ−ボディ二重特異的IgG抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、以下に示す:
20mg/mLでのカラムへのローディング、ならびに50mM リン酸ナトリウム、250mM 塩化ナトリウム、pH7.0(5カラム容積)での洗浄工程の後に、pH段階的溶離を、pH3.0に調節した50mM グリシン緩衝液を使用して行った。フロースルー画分および溶離した画分を集め、生成物回収を決定するために280nmでの吸光度測定(NanoDrop UV−Vis分光光度計(Thermo Scientific)を使用)によって、上記サンプルの純度および組成を決定するために還元型および非還元型SDS−PAGE(製造業者のガイドラインに従ってInvitrogen Novex NuPAGE 12ウェル 4〜20% 勾配ゲルを使用)によって、そして上記精製プロセスが上記κλ−ボディ二重特異的IgGを上記2種の単一特異的抗体副生成物から分離する能力を決定するために疎水性高速液体クロマトグラフィー(HIC−HPLC;以下に記載される方法)によって、分析した。
HIC−HPLC法:サンプル混合物中の上記λ−MAb、κ−MAbおよび上記κλ−ボディの相対的割合を決定するために、Dionex ProPac HIC−10カラムを使用するHIC−HPLC(疎水性相互作用クロマトグラフィー)アッセイを使用した。硫酸アンモニウムの85〜25%の間の下降勾配を、高分離能で上記3種(上記κ−MAbの溶離が最初、続いて、上記κλ−ボディ、最後に、上記λ−MAb)を溶離するために、上記サンプルのローディングの後に、上記カラムに適用した。280nmでモニターしたUVトレースのピーク面積積分を、各種の量を決定するために行った。
図4A中のUVトレースによって示されるように、上記LambdaFabSelectクロマトグラフィー樹脂に適用されたpH段階的溶離は、上記κλ−ボディの精製を可能にした。非還元的SDS−PAGE分析(図4Bに示される)から、認識されるように、組み立てられた全長抗体を含む精製画分が高純度であることが明らかにされた。いくつかの遊離軽鎖生成物(モノマーおよびダイマー形態)もまた、非還元型SDS−PAGEによって検出した。上記精製画分を、上記HIC−HPLCクロマトグラムのピーク面積を積分することによってさらに特徴付けた(図4C)。表2にまとめた結果は、上記SDS−PAGE分析と一致し、このことは、pH3.0での溶離画分において上記κλ−ボディの量が非常に豊富である(89.4%)ことを示す。
Mep HyperCelTM混合モードクロマトグラフィーを使用する遊離軽鎖減少:製造コストを減らすために、生物工学/製薬産業は、最初のプロテインAアフィニティークロマトグラフィー工程を省略する精製プロセスを開発中である。代替の精製解決策は、従って、現在探索されている最中である。特に、混合モードクロマトグラフィーは、細胞培養夾雑物からの抗体の選択的単離を可能にするイオン性相互作用および疎水性相互作用両方の組み合わせの新規な選択的活用を提供する。これら夾雑物としては、宿主細胞タンパク質、細胞DNA、エンドトキシン、ウイルス、ならびに抗体フラグメントが挙げられ得る。上記のように、組換え抗体を発現する哺乳動物細胞はまた、組み立てられていない遊離軽鎖を上清へと分泌する。
本発明は、遊離軽鎖を、単一特異的抗体および二重特異的抗体から効率的に除去することに関する。特に、二重特異的抗体もしくは単一特異的モノクローナル抗体および遊離軽鎖に適用可能なクロマトグラフィー条件が、同定された。本発明は、遊離軽鎖夾雑物を、κλ−ボディを発現するCHO細胞株の上清から減らすための方法によって示される(図5A〜5Cを参照のこと)。上記方法は、以下の工程を包含する:a)上記細胞培養上清を、固体のクロマトグラフィー混合モード樹脂(例えば、MEP HyperCel)に適用する工程、b)上記モノクローナル抗体を酢酸緩衝溶離バッファー(pH5.0)(溶離液)で溶離する工程、およびc)pH2.1において上記樹脂に強く結合している遊離軽鎖を除去する工程(ストリップ)。
図5Aは、非還元型SDS PAGE(図5B)によって決定されるように、上記ストリップ中のFLCの存在を示す代表的MEP HyperCelクロマトグラムを示す。SEC HPLC分析から、上記細胞培養上清中の60%から下がって上記抗体溶離画分中の33%へと、効率的FLC除去が確認された(図5Cおよび以下の表3)。
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、前述の説明は、本発明の範囲を例示し、限定しないと解釈される。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

Claims (24)

  1. 各結合部位において異なる特異性を有し、2コピーの単一の重鎖ポリペプチド、ならびにκ定常領域を含む第1の軽鎖およびλ定常領域を含む第2の軽鎖からなる二重特異的モノクローナル抗体を精製する方法であって、該方法は、
    (a)各結合部位において異なる特異性を有し、2コピーの単一の重鎖ポリペプチド、ならびにκ定常領域を含む第1の軽鎖およびλ定常領域を含む第2の軽鎖からなる1種以上の該二重特異的モノクローナル抗体(二重特異的MAb);2個のλ軽鎖もしくはその一部を有する1種以上の単一特異的モノクローナル抗体(λ−MAb);ならびに2個のカッパ軽鎖もしくはその一部を有する1種以上の単一特異的モノクローナル抗体(κ−MAb)を含む混合抗体組成物を提供する工程;
    (b)κ軽鎖定常領域もしくはλ軽鎖定常領域に対して特異的親和性を有する分離手段を提供する工程;
    (c)該分離手段と該混合抗体組成物とを、該κ−MAbのκ軽鎖定常領域によるかもしくは該λ−MAbのλ軽鎖定常領域による該分離手段への結合と比較して、該二重特異的MAbによる該分離手段への差次的結合を可能にする条件下で接触させる工程;ならびに
    (d)該κ−MAbのκ軽鎖定常領域の脱離もしくは該λ−MAbのλ軽鎖定常領域の脱離と比較して、該二重特異的MAbの優先的脱離を可能にする条件下で、該分離手段から抗体を溶離する工程、
    を包含する、方法。
  2. 前記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである、請求項1に記載の方法。
  3. 前記分離手段は、κ軽鎖定常領域もしくはλ軽鎖定常領域に対して高い特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされる、請求項1に記載の方法。
  4. 前記分離手段は、KappaSelect樹脂、LambdaFabSelect樹脂もしくはProtein L含有樹脂である、請求項3に記載の方法。
  5. 前記リガンドは、抗λモノクローナル抗体もしくは抗κモノクローナル抗体である、請求項3に記載の方法。
  6. 前記結合および/もしくは溶離条件は、pHレベルにおける段階的変化を含む、請求項1に記載の方法。
  7. 前記結合および/もしくは溶離条件は、前記組成物中のアミノ酸の濃度の変化を含む、請求項1に記載の方法。
  8. 前記アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよび/もしくはグリシンである、請求項7に記載の方法。
  9. インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを混合物から精製する方法であって、該方法は、
    (a)1種以上のインタクトな抗体および少なくとも1種のインタクトでない抗体分子を含む混合抗体組成物を提供する工程であって、ここで該インタクトでない抗体分子は、1種以上の抗体成分、抗体成分の1種以上のダイマー、1種以上の抗体フラグメント、およびこれらの組み合わせを含む、工程;
    (b)インタクトな抗体とインタクトでない抗体分子との間で差次的親和性を有する分離手段を提供する工程;
    (c)該分離手段と該混合抗体組成物とを、該インタクトでない抗体分子による該分離手段への結合と比較して、該1種以上のインタクトな抗体による該分離手段への差次的結合を可能にする条件下で接触させる工程;ならびに
    (d)該1種以上のインタクトな抗体を、該分離手段から分離し、該1種以上のインタクトな抗体を保持する工程、
    を包含する、方法。
  10. 前記インタクトでない抗体分子は、遊離軽鎖である、請求項9に記載の方法。
  11. 前記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである、請求項9に記載の方法。
  12. 前記分離手段は、インタクトな抗体分子に対して高い特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされている、請求項9に記載の方法。
  13. 前記分離手段は、混合モードクロマトグラフィー樹脂である、請求項12に記載の方法。
  14. 前記分離手段は、Mep HyperCelTM樹脂である、請求項13に記載の方法。
  15. 工程(d)は、前記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、前記分離手段から、前記インタクトでない抗体分子の脱離と比較して、該分離手段からの該1種以上のインタクトな抗体の優先的脱離を可能にする条件下で溶離する工程を包含する、請求項9に記載の方法。
  16. 工程(c)は、前記分離手段を、該分離手段への前記1種以上の抗体の結合を可能にするが、該分離手段への前記インタクトでない抗体分子の結合を可能にしない条件下で接触させる工程を包含する、請求項9に記載の方法。
  17. 工程(d)は、前記インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、該1種以上のインタクトな抗体の脱離を可能にする条件下で、前記分離手段から溶離する工程を包含する、請求項16に記載の方法。
  18. 工程(c)は、任意の結合していない、インタクトでない抗体分子を、前記組成物から除去する工程をさらに包含する、請求項16に記載の方法。
  19. インタクトな抗体もしくはインタクトな抗体の組み合わせを、混合物から精製する方法であって、該方法は、
    (a)1種以上のインタクトな抗体および少なくとも1種のインタクトでない抗体分子を含む混合抗体組成物を提供する工程であって、ここで該インタクトでない抗体分子は、1種以上の抗体成分、抗体成分の1種以上のダイマー、1種以上の抗体フラグメント、およびこれらの組み合わせを含む、工程;
    (b)インタクトな抗体とインタクトでない抗体分子との間で差次的親和性を有する分離手段を提供する工程;
    (c)該分離手段と該混合抗体組成物とを、該インタクトでない抗体分子による該分離手段への結合を可能にするが、該1種以上のインタクトな抗体による該分離手段への結合を可能にせず、その結果、該1種以上のインタクトな抗体が、結合していない画分中に残る条件下で接触させる工程;ならびに
    (d)1種以上のインタクトな抗体を含む該結合していない画分を保持する工程、
    を包含する、方法。
  20. 前記インタクトでない抗体分子は、遊離軽鎖である、請求項19に記載の方法。
  21. 前記分離手段は、樹脂、膜、磁性ビーズ、粒子もしくはモノリスである、請求項19に記載の方法。
  22. 前記分離手段は、インタクトでない抗体分子に対して高い特異性および親和性を有するリガンドにカップリングされている、請求項19に記載の方法。
  23. 前記分離手段は、混合モードクロマトグラフィー樹脂である、請求項22に記載の方法。
  24. 前記分離手段は、Mep HyperCelTM樹脂である、請求項23に記載の方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018510868A (ja) * 2015-03-13 2018-04-19 ノビミューン エスアー 二重特異性抗体を精製する方法
KR20190039144A (ko) * 2016-08-16 2019-04-10 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 혼합물로부터 개별 항체들을 정량하는 방법

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2767135T3 (es) 2011-10-19 2020-06-16 Novimmune Sa Métodos para purificar anticuerpos
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
PT2925782T (pt) 2012-12-03 2020-04-22 Novimmune Sa Anticorpos anti-cd47 e métodos de utilização destes
CN105473612A (zh) * 2013-08-19 2016-04-06 豪夫迈·罗氏有限公司 用羟基磷灰石层析分离双特异性抗体和双特异性抗体生产副产物
CA2935960C (en) 2014-01-08 2023-01-10 Bart Lipkens Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
GB201414823D0 (en) 2014-08-20 2014-10-01 Argen X Bv Multispecific antibodies
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
WO2017005649A1 (en) 2015-07-09 2017-01-12 Genmab A/S Bispecific and multispecific antibodies and method for isolation of such
CA3016563A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
KR101933656B1 (ko) 2016-08-20 2018-12-28 (주) 아이벤트러스 목적하는 이중특이성 항체의 선택적 생산 확인 방법
WO2018038469A1 (ko) * 2016-08-20 2018-03-01 (주)아이벤트러스 목적하는 이중특이성 항체의 선택적 생산 확인 방법
EP3515936A1 (en) * 2016-09-23 2019-07-31 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific antibody molecules comprising lambda and kappa light chains
WO2018083535A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Novimmune Sa Anti-cd19 antibodies and methods of use thereof
KR102293106B1 (ko) 2016-12-21 2021-08-24 에프. 호프만-라 로슈 아게 항체의 시험관 내 당조작 방법
JP6850351B2 (ja) * 2016-12-21 2021-03-31 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 抗体のインビトロ糖鎖工学
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
US20200190138A1 (en) * 2017-02-28 2020-06-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Protein purification with protein l
WO2018215835A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Novimmune Sa Anti-cd47 x anti-mesothelin antibodies and methods of use thereof
WO2018222901A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
EP3655429A1 (en) * 2017-07-21 2020-05-27 Novimmune S.A. Generating multispecific antibody mixtures and methods of uses thereof
BR112020009889A2 (pt) 2017-12-14 2020-11-03 Flodesign Sonics, Inc. acionador e controlador de transdutor acústico
WO2019175658A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Novimmune Sa Anti-cd3 epsilon antibodies and methods of use thereof
EP3765516A2 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
EP3765517A1 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2019234576A1 (en) 2018-06-03 2019-12-12 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
CN112513074A (zh) 2018-06-22 2021-03-16 健玛保 生产两种或更多种不同抗体的受控混合物的方法
DE202019005887U1 (de) 2018-07-03 2023-06-14 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon
WO2020115283A1 (en) * 2018-12-07 2020-06-11 Baxalta GmbH Bispecific antibodies binding factor ixa and factor x
SG11202106393SA (en) 2018-12-24 2021-07-29 Sanofi Sa Pseudofab-based multispecific binding proteins
SG11202109122SA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
SG11202109061YA (en) 2019-02-21 2021-09-29 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
JP2022521750A (ja) 2019-02-21 2022-04-12 マレンゴ・セラピューティクス,インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
JP2022522662A (ja) 2019-02-21 2022-04-20 マレンゴ・セラピューティクス,インコーポレーテッド T細胞に結合する多機能性分子および自己免疫障害を処置するためのその使用
GB2597851B (en) 2019-02-21 2024-05-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
KR20220113353A (ko) 2019-09-18 2022-08-12 람캅 바이오 알파 에이지 Ceacam5 및 cd3에 대한 이중특이적 항체
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
CN111018969A (zh) * 2019-12-27 2020-04-17 上海药明生物技术有限公司 采用轻链select联合层析色谱纯化双特异性抗体的方法
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES
CN115066258A (zh) * 2020-02-28 2022-09-16 上海药明生物技术有限公司 双特异性抗体的纯化
KR20220156912A (ko) 2020-03-25 2022-11-28 일라이 릴리 앤드 캄파니 다중특이적 결합 단백질 및 그의 개발 방법
CA3180321A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
JP2023542080A (ja) 2020-08-26 2023-10-05 マレンゴ・セラピューティクス,インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
WO2022047046A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
KR20230074144A (ko) 2020-08-26 2023-05-26 마렝고 테라퓨틱스, 인크. NKp30에 결합하는 항체 분자 및 이의 용도
US11753481B2 (en) 2020-12-18 2023-09-12 Lamkap Bio Beta Ltd Bispecific antibodies against CEACAM5 and CD47
IL305827A (en) 2021-03-22 2023-11-01 Novimmune Sa Bispecific antibodies targeting CD47 and PD-L1 and methods of using them
JP2024512574A (ja) 2021-03-22 2024-03-19 ノビミューン エスアー Cd47およびpd-l1を標的とする二重特異性抗体ならびにその使用方法
CN117597359A (zh) 2021-04-08 2024-02-23 马伦戈治疗公司 与tcr结合的多功能分子及其用途
WO2023175064A1 (en) * 2022-03-17 2023-09-21 Astrazeneca Ab Methods for purifying bispecific antibodies
WO2023178357A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Bispecific antibody fusion molecules and methods of use thereof
WO2023242351A1 (en) 2022-06-16 2023-12-21 Lamkap Bio Beta Ag Combination therapy of bispecific antibodies against ceacam5 and cd47 and bispecific antibodies against ceacam5 and cd3
WO2024084052A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Novimmune Sa Pd-l1xcd28 bispecific antibodies for immune checkpoint-dependent t cell activation

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007523882A (ja) * 2003-08-07 2007-08-23 アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ イムノグロブリン様(Ig−様)ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の精製方法
JP2008517906A (ja) * 2004-10-21 2008-05-29 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ 抗体精製法
JP2010517942A (ja) * 2007-01-09 2010-05-27 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド 水溶性の非イオン性有機高分子の存在下での混合モードクロマトグラフィーによる抗体の能力の増大および精製方法
JP2011517462A (ja) * 2008-04-08 2011-06-09 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド 抗体のクロマトグラフィー精製法
JP2013539461A (ja) * 2010-08-16 2013-10-24 ノビミューン エスアー 多重特異性多価抗体の生成方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4745183A (en) * 1984-02-21 1988-05-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Use of hydroxylapatite for the analysis and preparation of purified monoclonal antibodies
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP2238154B1 (en) * 2008-01-18 2015-09-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced purification of phosphorylated and non-phosphorylated biomolecules by apatite chromatography
BRPI1011195B1 (pt) 2009-05-20 2020-10-13 Novimmune S.A métodos para produzir uma coleção de ácidos nucleicos
WO2011084255A2 (en) 2009-12-17 2011-07-14 Novimmune S.A. Synthetic polypeptide libraries and methods for generating naturally diversified polypeptide variants
SG10201710439UA (en) * 2010-05-25 2018-01-30 Genentech Inc Methods of purifying polypeptides
RU2608644C2 (ru) * 2010-11-03 2017-01-23 арДЖЕН-ИКС Н.В. Антитела против белка рецептора с-мет
ES2767135T3 (es) 2011-10-19 2020-06-16 Novimmune Sa Métodos para purificar anticuerpos

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007523882A (ja) * 2003-08-07 2007-08-23 アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ イムノグロブリン様(Ig−様)ドメインを含む非イムノグロブリンタンパク質の精製方法
JP2008517906A (ja) * 2004-10-21 2008-05-29 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ 抗体精製法
JP2010517942A (ja) * 2007-01-09 2010-05-27 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド 水溶性の非イオン性有機高分子の存在下での混合モードクロマトグラフィーによる抗体の能力の増大および精製方法
JP2011517462A (ja) * 2008-04-08 2011-06-09 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド 抗体のクロマトグラフィー精製法
JP2013539461A (ja) * 2010-08-16 2013-10-24 ノビミューン エスアー 多重特異性多価抗体の生成方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. BIOCHEM. BIOPHYS. METHODS, 2002, VOL.51, NO.3, PP.203-216, JPN6016030146, ISSN: 0003600621 *
J. CHROMATOGR. B, 2001, VOL.754, NO.2, PP.427-435, JPN6016030148, ISSN: 0003600623 *
J. IMMUNOL. METHODS, 2001, VOL.249, NO.1-2, PP.33-41, JPN6016030147, ISSN: 0003600622 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018510868A (ja) * 2015-03-13 2018-04-19 ノビミューン エスアー 二重特異性抗体を精製する方法
JP2021130714A (ja) * 2015-03-13 2021-09-09 ノビミューン エスアー 二重特異性抗体を精製する方法
KR20190039144A (ko) * 2016-08-16 2019-04-10 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 혼합물로부터 개별 항체들을 정량하는 방법
JP2019529350A (ja) * 2016-08-16 2019-10-17 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. 混合物から個々の抗体を定量する方法
KR102369014B1 (ko) * 2016-08-16 2022-03-02 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 혼합물로부터 개별 항체들을 정량하는 방법
KR20220025943A (ko) * 2016-08-16 2022-03-03 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 혼합물로부터 개별 항체들을 정량하는 방법
US11369896B2 (en) 2016-08-16 2022-06-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for quantitating individual antibodies from a mixture
US11571636B2 (en) 2016-08-16 2023-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for quantitating individual antibodies from a mixture
KR102511050B1 (ko) * 2016-08-16 2023-03-17 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 혼합물로부터 개별 항체들을 정량하는 방법
US11850535B2 (en) 2016-08-16 2023-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for quantitating individual antibodies from a mixture

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