CN117597359A - 与tcr结合的多功能分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文提供了包含T细胞受体可变β结合部分和细胞因子的多功能多肽分子，以及使用所述多功能多肽分子治疗对象的病况或疾病的方法。在一些方面，本文记载了多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽以及至少一个细胞因子多肽或者其功能片段或功能变体。
Description
相关申请
本申请要求2021年4月8日提交的美国临时专利申请第63/172,468号的权益，其全部内容据此通过引用并入本文。
背景技术
目前可用的设计用于重定向T细胞以促进肿瘤细胞裂解而用于癌症免疫疗法的分子通常靶向T细胞受体(TCR)的CD3ε(CD3e)亚基。然而，这种方法有局限性。先前的研究已表明，例如，低剂量的抗CD3e单克隆抗体(mAb)可以引起T细胞功能障碍，并发挥免疫抑制效果。此外，抗CD3e mAb与所有T细胞结合，从而激活大量T细胞。这些抗CD3e mAb对T细胞的这种非生理性大规模激活可能导致产生促炎性细胞因子，诸如IFN-γ、IL-1-β、IL-6、IL-10和TNF-α、导致“细胞因子风暴”，称为细胞因子释放综合征(CRS)，这也与神经毒性(NT)相关。因此，需要改进的T细胞受体结合分子，其重定向T细胞以用于癌症免疫疗法。
发明内容
在一些方面，本文描述了一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽和至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中所述第一多肽和所述第二多肽是不连续的，其中(i)所述第一多肽包含二聚化模块的第一部分，所述二聚化模块的所述第一部分连接至(A)第一TCRβV结合部分，所述第一TCRβV结合部分包含第一重链可变结构域(VH)和第一轻链可变结构域(VL)，或单结构域抗体，或(B)包含第一TCRβV结合部分的VH的所述第一TCRβV结合部分的第一部分，其中当所述第一多肽包含所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分时，所述多功能多肽分子进一步包含第三多肽，所述第三多肽包含有包含所述第一TCRβV结合部分的VL的所述第一TCRβV结合部分的第二部分，其中所述第三多肽与所述第一多肽和所述第二多肽不连续；并且(ii)所述第二多肽包含所述二聚化模块的第二部分；其中(a)所述多功能多肽分子包含单个TCRβV结合部分，并且所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至所述第二多肽，或(b)所述多功能多肽分子进一步包含第二TCRβV结合部分，并且所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至所述第一多肽、所述第二多肽、当所述多功能多肽分子进一步包含所述第三多肽时的所述第三多肽，或其组合。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含所述第二TCRβV结合部分，并且所述二聚化模块的所述第二部分连接至：(A)第二TCRβV结合部分，所述第二TCRβV结合部分包含第二VH和第二VL，或单结构域抗体，或(B)包含第二TCRβV结合部分的VH的所述第二TCRβV结合部分的第一部分，其中当所述第二多肽包含所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分时，所述多功能多肽分子进一步包含第四多肽，所述第四多肽包含有包含所述第二TCRβV结合部分的VL的所述第二TCRβV结合部分的第二部分，其中所述第四多肽与所述第一多肽、所述第二多肽和所述第三多肽不连续；其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽、当所述多功能多肽分子进一步包含所述第四多肽时的所述第四多肽，或其组合。
在另一方面，本文描述了一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽和至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中所述第一多肽和所述第二多肽是不连续的，其中(i)所述第一多肽包含二聚化模块的第一部分，所述二聚化模块的所述第一部分连接至包含第一TCRβV结合部分的VH的所述第一TCRβV结合部分的第一部分，其中所述多功能多肽分子进一步包含第三多肽，所述第三多肽包含有包含所述第一TCRβV结合部分的VL的所述第一TCRβV结合部分的第二部分，其中所述第三多肽与所述第一多肽和所述第二多肽不连续；并且(ii)所述第二多肽包含所述二聚化模块的第二部分，其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至所述第二多肽。
在一些实施方案中，所述二聚化模块的所述第一部分和所述二聚化模块的所述第二部分是二聚化的。
在一些实施方案中，所述第一多肽包含：(A)包含所述第一VH和所述第一VL的所述第一TCRβV结合部分，其中所述第一TCRβV结合部分进一步包含连接至所述第一VH的第一重链恒定结构域1(CH1)；或者(B)包含所述第一TCRβV结合部分的所述VH的所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分，其中所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分进一步包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述VH的第一CH1。
在一些实施方案中，所述第一CH1连接至所述第一VH的C末端或所述第一TCRβV结合部分的所述VH的C末端。
在一些实施方案中，所述第二多肽包含：(A)包含所述第二VH和所述第二VL的所述第二TCRβV结合部分，其中所述第二TCRβV结合部分进一步包含连接至所述第二VH的第二CH1；或者(B)包含所述第二TCRβV结合部分的所述VH的所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分，其中所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分进一步包含连接至所述第二TCRβV结合部分的所述VH的第二CH1。
在一些实施方案中，所述第二CH1连接至所述第二VH的C末端或所述第二TCRβV结合部分的所述VH的C末端。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(1)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第一多肽，所述第一TCRβV结合部分包含所述第一VH和所述第一VL，其中所述第一TCRβV结合部分进一步包含连接至所述第一VL的第一轻链恒定结构域(CL)；或者(2)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的所述第一多肽和包含所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第三多肽，其中所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分进一步包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述VL的第一CL。
在一些实施方案中，所述第一CL连接至所述第一VL的C末端或所述第一TCRβV结合部分的所述VL的C末端。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(1)包含所述第二TCRβV结合部分的所述第二多肽，所述第二TCRβV结合部分包含所述第二VH和所述第二VL，其中所述第二TCRβV结合部分进一步包含连接至所述第二VL的第二CL；或者(2)包含所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分的所述第二多肽和包含所述第二TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第四多肽，其中所述第二TCRβV结合部分的所述第二部分进一步包含连接至所述第二TCRβV结合部分的所述VL的第二CL。
在一些实施方案中，所述第二CL连接至所述第二VL的C末端或所述第二TCRβV结合部分的所述VL的C末端。
在一些实施方案中，所述二聚化模块的所述第一部分连接至(A)包含所述第一VH和所述第一VL或所述单结构域抗体的所述第一TCRβV结合部分的C末端，或(B)包含所述第一TCRβV结合部分的所述VH的所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含所述第二TCRβV结合部分，并且所述二聚化模块的所述第二部分连接至(A)包含所述第二VH和所述第二VL或所述单结构域抗体的所述第二TCRβV结合部分的C末端，或(B)包含所述第二TCRβV结合部分的所述VH的所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含单个TCRβV结合部分，并且所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至所述第二多肽的N末端、所述第二多肽的C末端或其组合。
在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体在所述第二多肽的单个连续多肽链内。
在一些实施方案中，(a)所述第一多肽的N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b)所述第二多肽的N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(c)所述第三多肽的N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(d)所述第四多肽的N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或者(e)其组合。
在一些实施方案中，(a-1)所述第一多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(a-2)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b-1)所述第一多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(b-2)所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(c-1)所述第一多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(c-2)所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(d-1)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(d-2)所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(e-1)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(e-2)所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或者(f-1)所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(f-2)所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体。
在一些实施方案中，(a-1)所述第一多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(a-2)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(a-3)所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b-1)所述第一多肽的所述N末端连接细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b-2)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(b-3)所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或者(c-1)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(c-2)所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(c-3)所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合。
在一些实施方案中，所述第一多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合。
在一些实施方案中，所述细胞因子多肽或其功能片段或功能变体在所述细胞因子多肽或其功能片段或功能变体所连接的所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三细胞因子多肽或所述第四细胞因子多肽的单个连续多肽链内。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子进一步包含：(i)在所述二聚化模块的所述第一部分与包含所述第一VH和所述第一VL或所述单结构域抗体的所述第一TCRβV结合部分或包含所述第一TCRβV结合部分的所述VH的所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分之间的接头；(ii)在所述二聚化模块的所述第二部分与包含所述第二VH和所述第二VL或所述单结构域抗体的所述第二TCRβV结合部分或包含所述第二TCRβV结合部分的所述VH的所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分之间的接头；(iii)在所述第一VH与所述第一VL之间的接头；(iv)在所述第二VH与所述第二VL之间的接头；(v)在所述第一CH1与所述第一VH或所述第一TCRβV结合部分的所述VH之间的接头；(vi)在所述第二CH1与所述第二VH或所述第二TCRβV结合部分的所述VH之间的接头；(vii)在所述第一CL与所述第一VL或所述第一TCRβV结合部分的所述VL之间的接头；(vii)在所述第二CL与所述第二VL或所述第二TCRβV结合部分的所述VL之间的接头；(viii)在所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与所述第一多肽之间的接头，在所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与所述第二多肽之间的接头，在所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与所述第三多肽之间的接头，在所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与所述第四多肽之间的接头，或其组合；或者(ix)其组合。
在一些实施方案中，所述接头选自可裂解性接头、不可裂解性接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋形接头和非螺旋形接头。
在一些实施方案中，所述接头是肽接头，并且所述接头包含SEQ ID NO:3308或SEQID NO:3643的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子是分离的多功能多肽分子。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第一部分的所述第一多肽；(ii)包含所述二聚化模块的所述第二部分的所述第二多肽；(iii)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第三多肽；以及(iv)共价连接至所述第二多肽的N末端的细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中所述多功能多肽分子包含单个TCRβV结合部分。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第一部分的所述第一多肽；(ii)包含连接至所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第二部分的所述第二多肽；(iii)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第三多肽；(iv)包含所述第二TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第四多肽；(v)共价连接至所述第三多肽的C末端的细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，以及(vi)共价连接至所述第四多肽的C末端的细胞因子多肽或其功能片段或功能变体。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第一部分的所述第一多肽；(ii)包含连接至所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第二部分的所述第二多肽；(iii)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第三多肽；(iv)包含所述第二TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第四多肽；以及(v)共价连接至所述第三多肽的C末端或所述第四多肽的C末端，但不共价连接至两者的细胞因子多肽或其功能片段或功能变体。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第一部分的所述第一多肽；(ii)包含连接至所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第二部分的所述第二多肽；(iii)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第三多肽；(iv)包含所述第二TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第四多肽；以及(v)共价连接至所述第一多肽的C末端或所述第二多肽的C末端，但不共价连接至两者的细胞因子多肽或其功能片段或功能变体。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含选自Fab、F(ab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单结构域抗体、双抗体(dAb)、骆驼抗体及其组合中的任一者。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含所述Fab或所述scFv。
在一些实施方案中，所述TCRβV结合部分是所述多功能多肽分子的唯一抗原结合部分。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含所述至少一种细胞因子多肽中的两种或更多种。
在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子多肽包含白介素2(IL-2)或其片段。
在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子多肽包含与SEQ ID NO:2191的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述变体是包含置换突变的IL-2变体。
在一些实施方案中，所述变体是包含C125A突变的IL-2变体。
在一些实施方案中，所述变体包含与SEQ ID NO:2270的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述二聚化模块的所述第一部分包含第一免疫球蛋白恒定区(Fc区)，并且所述二聚化模块的所述第二部分包含第二Fc区。
在一些实施方案中，所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合选自IgG1 Fc区或其片段、IgG2 Fc区或其片段、IgG3 Fc区或其片段、IgGA1 Fc区或其片段、IgGA2 Fc区或其片段、IgG4 Fc区或其片段、IgJ Fc区或其片段、IgM Fc区或其片段、IgD Fc区或其片段以及IgEFc区或其片段。
在一些实施方案中，所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合选自人IgG1 Fc区或其片段、人IgG2 Fc区或其片段和人IgG4 Fc区或其片段。
在一些实施方案中，所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合包含具有成对的腔-突起、静电相互作用或链交换中的一种或多种的Fc界面，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区的二聚化被增强，如由相对于具有非工程化界面的Fc区的二聚化而言更大的异多聚体:同多聚体形式比率所指示的。
在一些实施方案中，所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合包含表14中列出的氨基酸置换。
在一些实施方案中，所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合包含Asn297Ala(N297A)突变或Leu234Ala/Leu235Ala(LALA)突变。
在一些实施方案中，所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合包含与SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:3645、SEQ ID NO:3646、SEQ ID NO:3647、SEQ ID NO:3648或SEQID NO:3649的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合与选自以下的TCRβV亚家族中的一者或多者结合：(i)TCRβV2亚家族，其包含TCRβV2*01；(ii)TCRβV3亚家族，其包含TCRβV3-1*01；(iii)TCRβV4亚家族，其包含选自TCRβV4-1、TCRβV4-2和TCRβV4-3中的一者或多者；(iv)TCRβV5亚家族，其包含选自TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01、TCRβV5-1*01和TCRβV5-8*01中的一者或多者；(v)TCRβV6亚家族，其包含选自TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01和TCRβV6-1*01中的一者或多者；(vi)TCRβV9亚家族；(vii)TCRβV10亚家族，其包含选自TCRβV10-1*01、TCRβV10-1*02、TCRβV10-3*01和TCRβV10-2*01中的一者或多者；(viii)TCRβV11亚家族，其包含TCRβV11-2；(ix)TCRβV12亚家族，其包含选自TCRβV12-4*01、TCRβV12-3*01和TCRβV12-5*01中的一者或多者；(x)TCRβV13亚家族，其包含TCRβV13*01；(xi)TCRβV16亚家族，其包含TCRβV16*01；(xii)TCRβV19亚家族，其包含选自TCRβV19*01和TCRβV19*02中的一者或多者；(xiii)TCRβV21亚家族；(xiv)TCRβV23亚家族；(xv)TCRβV27亚家族；以及(xvi)TCRβV28亚家族。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含所述第一TCRβV结合部分和所述第二TCRβV结合部分，并且所述第一TCRβV结合部分和所述第二TCRβV结合部分相同。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含所述第一TCRβV结合部分和所述第二TCRβV结合部分，并且所述第一TCRβV结合部分和所述第二TCRβV结合部分不同。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分和所述第二TCRβV结合部分分别结合：(i)TCRβV6亚家族成员中的一者或多者和TCRβV10亚家族成员中的一者或多者；(ii)TCRβV6亚家族成员中的一者或多者和TCRβV5亚家族成员中的一者或多者；(iii)TCRβV6亚家族成员中的一者或多者和TCRβV12亚家族成员中的一者或多者；(iv)TCRβV10亚家族成员中的一者或多者和TCRβV5亚家族成员中的一者或多者；(v)TCRβV10亚家族成员中的一者或多者和TCRβV12亚家族成员中的一者或多者；或者(vi)TCRβV5亚家族成员中的一者或多者和TCRβV12亚家族成员中的一者或多者。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)与表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任何一者具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；(ii)与表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3；或者(iii)其组合。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含框架区(FR)，所述框架区包含与非鼠种系框架1(FR1)、非鼠种系框架区2(FR2)、非鼠种系框架区3(FR3)和非鼠种系框架区4(FR4)具有至少75％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含与非鼠种系FR1、非鼠种系FR2、非鼠种系FR3和非鼠种系FR4具有至少75％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；或者(iii)其组合。
在一些实施方案中，所述VH包含所述FR3，所述FR3包含(i)根据Kabat编号在位置73处的苏氨酸；(ii)根据Kabat编号在位置94处的甘氨酸；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，所述VL包含所述FR1，所述FR1包含根据Kabat编号在位置10处的苯丙氨酸。
在一些实施方案中，所述VL包含所述FR2，所述FR2包含(i)根据Kabat编号在位置36处的组氨酸；(ii)根据Kabat编号在位置46处的丙氨酸；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，所述VL包含所述FR3，所述FR3包含根据Kabat编号在位置87处的苯丙氨酸。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)与表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；(ii)与表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3；或者(iii)其组合。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含FR，所述FR包含与表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少75％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含与表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少75％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；或者(iii)其组合。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含与表2中列出的人源化抗体B-H的VH序列具有至少75％序列同一性的序列；(ii)VL，所述VL包含与表2中列出的人源化抗体B-H的VL序列具有至少75％序列同一性的序列；或者(iii)其组合。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含重链恒定区，所述重链恒定区具有与表3中列出的序列中的任一者具有至少75％序列同一性的序列，或其组合。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含IgM的重链恒定区或其片段。
在一些实施方案中，所述IgM的所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:73的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含IgJ的重链恒定区或其片段。
在一些实施方案中，所述IgJ的所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:76的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽、其组合包含IgGA1的重链恒定区或其片段。
在一些实施方案中，所述IgGA1的所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:74的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含IgGA2的重链恒定区或其片段。
在一些实施方案中，所述IgGA2的所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:75的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含IgG1的重链恒定区或其片段。
在一些实施方案中，所述IgG1的所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:41或SEQ IDNO:3645的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽、所述第四多肽或其组合包含轻链恒定区，所述轻链恒定区具有与表3中列出的序列中的任一者具有至少75％序列同一性的序列，或其组合。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽、所述第四多肽或其组合包含κ链的轻链恒定区或其片段。
在一些实施方案中，κ链的所述轻链恒定区包含表3中列出的轻链恒定区序列。
在一些实施方案中，所述κ链的所述轻链恒定区包含与SEQ ID NO:39或SEQ IDNO:3644的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其包含与表1、2、10、11、12或13中公开的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；(ii)LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3，其包含与表1、2、10、11、12或13中公开的VL的CDR1、CDR2和CDR3序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)其组合。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含轻链，所述轻链包含FR1，所述FR1包含：(i)根据Kabat编号在位置1处的天冬氨酸；(ii)根据Kabat编号在位置2处的天冬酰胺；(iii)根据Kabat编号在位置4处的亮氨酸；或者(iv)其组合。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含轻链，所述轻链包含FR3，所述FR3包含：(i)根据Kabat编号在位置66处的甘氨酸；(ii)根据Kabat编号在位置69处的天冬酰胺；(iii)根据Kabat编号在位置71处的酪氨酸；或者(iv)其组合。
在一些实施方案中，所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合结合至TCRβV蛋白上的面向外的区域。
在一些实施方案中，所述TCRβV蛋白上的所述面向外的区域包含TCRβV的结构保守区域，所述结构保守区域在一个或多个TCRβV亚家族中具有相似的结构。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含：(i)第一序列，所述第一序列选自SEQ ID NO:80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、1309、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335、1336、1337、1338、1339、1340、1341、1342、3281和3642；以及(ii)第二序列，所述第二序列选自SEQ ID NO:40、41、42、73、74、75、76、3645、3646、3647、3648和3649；其中所述第一序列连接至所述第二序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽或其组合进一步包含选自SEQID NO:2191和SEQ ID NO:2270的第三序列，其中所述第三序列连接至所述第一序列、所述第二序列或其组合。
在一些实施方案中，所述第三序列连接至所述第一序列的N末端。
在一些实施方案中，所述第三序列连接至所述第二序列的C末端。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含：(i)第一序列，所述第一序列选自SEQ ID NO:1、9、15、23、25、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148、151、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、200、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、1100、1310、1311、1312、1344、1346、1348、1350、1356、1360、1362、1370和3438；以及(ii)第二序列，所述第二序列选自SEQ ID NO:40、41、42、73、74、75、76、3645、3646、3647、3648和3649；其中所述第一序列连接至所述第二序列。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽或其组合进一步包含选自SEQID NO:2191和SEQ ID NO:2270的第三序列，其中所述第三序列连接至所述第一序列、所述第二序列或其组合。
在一些实施方案中，所述第三序列连接至所述第一序列的N末端。
在一些实施方案中，所述第三序列连接至所述第二序列的C末端。
在一些实施方案中，所述第三多肽、所述第四多肽或其组合包含：(i)第四序列，所述第四序列选自SEQ ID NO:2、10、11、16、26、27、28、29、30、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、1101、1313、1314、1347、1349、1351、1353、1357、1361、1365、1367、1369和3279；以及(ii)第五序列，所述第五序列选自SEQ ID NO:39和3644，其中所述第四序列连接至所述第五序列。
在一些实施方案中，所述第三多肽、所述第四多肽或其组合进一步包含所述第三序列，其中所述第三序列连接至所述第四序列、所述第五序列或其组合。
在一些实施方案中，所述第三序列连接至所述第四序列的N末端。
在一些实施方案中，所述第三序列连接至所述第五序列的C末端。
在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含：连接至SEQ IDNO:40的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:42的第二序列的SEQ IDNO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:74的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQID NO:3645的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:3646的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:3648的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:3649的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:40的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:42的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:74的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:3645的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:3646的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:3648的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ IDNO:3649的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:40的第二序列的SEQ IDNO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:42的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:74的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:3645的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:3646的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:3648的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:3649的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:40的第二序列的SEQ IDNO:82的第一序列；连接至SEQ ID NO:42的第二序列的SEQ ID NO:82的第一序列；连接至SEQ ID NO:74的第二序列的SEQ ID NO:82的第一序列；连接至SEQ ID NO:3645的第二序列的SEQ ID 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在一些实施方案中，所述第一多肽、所述第二多肽或其组合进一步包含选自SEQID NO:2191和SEQ ID NO:2270的第三序列，其中所述第三序列连接至所述第一序列、所述第二序列或其组合。
在一些实施方案中，所述第三序列连接至所述第一序列的N末端。
在一些实施方案中，所述第三序列连接至所述第二序列的C末端。
在一些实施方案中，所述第三多肽、所述第四多肽或其组合包含：连接至SEQ IDNO:3644的第五序列的SEQ ID NO:2的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ IDNO:2的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:10的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:10的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:16的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:16的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:28的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:28的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:87的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:87的第四序列；连接至SEQID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:90的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:90的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:96的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:96的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:105的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:105的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:117的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:117的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:120的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:120的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:129的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:129的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ IDNO:132的第四序列；连接至SEQ IDNO:39的第五序列的SEQ ID NO:132的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:141的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:141的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:150的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:150的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:154的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ IDNO:154的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:163的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:163的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:169的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:169的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:175的第四序列；连接至SEQ IDNO:39的第五序列的SEQ ID NO:175的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQID NO:181的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:181的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:187的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:187的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:193的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:193的第四序列；连接至SEQ IDNO:3644的第五序列的SEQ ID NO:202的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQID NO:202的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1101的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:1101的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1349的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:1349的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1313的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:1313的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1361的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:1361的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1367的第四序列；连接至SEQID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:1367的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1367的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:1367的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:3279的第四序列；或连接至SEQ IDNO:39的第五序列的SEQ ID NO:3279的第四序列。
在一些实施方案中，所述第三多肽、所述第四多肽或其组合进一步包含所述第三序列，其中所述第三序列连接至所述第四序列、所述第五序列或其组合。
在一些实施方案中，所述第三序列连接至所述第四序列的N末端。
在一些实施方案中，所述第三序列连接至所述第五序列的C末端。
在一些实施方案中，所述第一多肽包含：连接至SEQ ID NO:40的第二序列的SEQID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:42的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:74的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:3645的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:3646的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:3648的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:3649的第二序列的SEQ ID NO:1的第一序列；连接至SEQ ID NO:40的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:42的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:74的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:3645的第二序列的SEQ IDNO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:3646的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:3648的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:3649的第二序列的SEQ ID NO:9的第一序列；连接至SEQ ID NO:40的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:42的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:74的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:3645的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:3646的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQID NO:3648的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:3649的第二序列的SEQ ID NO:25的第一序列；连接至SEQ ID NO:40的第二序列的SEQ ID NO:82的第一序列；连接至SEQ ID NO:42的第二序列的SEQ ID NO:82的第一序列；连接至SEQ ID NO:74的第二序列的SEQ ID NO:82的第一序列；连接至SEQ ID NO:3645的第二序列的SEQ ID 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在一些实施方案中，所述第二多肽包含：连接至SEQ ID NO:40的序列的SEQ IDNO:2191的序列；连接至SEQ ID NO:42的序列的SEQ ID NO:2191的序列；连接至SEQ ID NO:74的序列的SEQ ID NO:2191的序列；连接至SEQ ID NO:3645的序列的SEQ ID NO:2191的序列；连接至SEQ ID NO:3646的序列的SEQ ID NO:2191的序列；连接至SEQ ID NO:3648的序列的SEQ ID NO:2191的序列；连接至SEQ ID NO:3649的序列的SEQ ID NO:2191的序列；连接至SEQ ID NO:40的序列的SEQ ID NO:2270的序列；连接至SEQ ID NO:42的序列的SEQ IDNO:2270的序列；连接至SEQ ID NO:74的序列的SEQ ID NO:2270的序列；连接至SEQ ID NO:3645的序列的SEQ ID NO:2270的序列；连接至SEQ ID NO:3646的序列的SEQ ID NO:2270的序列；连接至SEQ ID NO:3648的序列的SEQ ID NO:2270的序列；或连接至SEQ ID NO:3649的序列的SEQ ID NO:2270的序列。
在一些实施方案中，所述第三多肽包含：连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQID NO:2的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:2的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:10的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:10的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:16的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:16的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:28的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:28的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:87的第四序列；连接至SEQID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:87的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:90的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:90的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:96的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:96的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:105的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:105的第四序列；连接至SEQ IDNO:3644的第五序列的SEQ ID NO:117的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQID NO:117的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:120的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:120的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:129的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:129的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:132的第四序列；连接至SEQID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:132的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:141的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:141的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:150的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:150的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ IDNO:154的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:154的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:163的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:163的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:169的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:169的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:175的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ IDNO:175的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:181的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:181的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:187的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:187的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:193的第四序列；连接至SEQ IDNO:39的第五序列的SEQ ID NO:193的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQID NO:202的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:202的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1101的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:1101的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1349的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:1349的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1313的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:1313的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1361的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:1361的第四序列；连接至SEQ IDNO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1367的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQID NO:1367的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:1367的第四序列；连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:1367的第四序列；连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:3279的第四序列；或连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQID NO:3279的第四序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-15受体αsushi结构域或其功能片段或功能变体、IL-15分子或其功能片段或功能变体以及免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-15受体αsushi结构域或其功能片段或功能变体、可操作地连接的IL-15分子或其功能片段或功能变体、和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述IL-15受体αsushi结构域经由接头可操作地连接至所述IL-15分子或其功能片段或功能变体，所述IL-15分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区，或其组合。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQID NO:3523的序列、SEQ ID NO:2170的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3523的序列、可操作地连接的SEQID NO:2170的序列、和可操作地连接的SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO:3523的序列经由SEQ ID NO:3524的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:2170的序列，所述SEQ ID NO:2170的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3519的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3519的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-15分子或其功能片段或功能变体和免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-15分子或其功能片段或功能变体和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述IL-15分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQID NO:2170的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:2170的序列和可操作地连接的SEQID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO:2170的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3520的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3520的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-2分子或其功能片段或功能变体或IL-2C125A突变分子或其功能片段或功能变体，以及免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-2分子或其功能片段或功能变体或IL-2C125A突变分子或其功能片段或功能变体，和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述IL-2分子或其功能片段或功能变体或所述IL-2C125A突变分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQID NO:2270的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:2270的序列和可操作地连接的SEQID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO:2270的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3521的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3521的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含所述第二多肽、所述第三多肽或其组合，所述第二多肽包含有包含L234A、L235A和P329G突变的免疫球蛋白重链恒定区，所述第三多肽包含有包含L234A、L235A和P329G突变的免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3530的序列和SEQ ID NO:3531的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQID NO:2191的序列和SEQ ID NO:3533的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQID NO:3527的序列和SEQ ID NO:3528的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3530的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3531的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:2191的序列和可操作地连接的SEQID NO:3533的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3527的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3528的序列。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO:2191的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3533的序列，或其组合。
在一些实施方案中，所述第一多肽进一步包含可操作地连接至SEQ ID NO:3531的序列的SEQ ID NO:3547的序列，所述第二多肽进一步包含可操作地连接至SEQ ID NO:3533的序列的SEQ ID NO:3534的序列，或其组合。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3529的序列或SEQ ID NO:3548的序列具有至少75％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3532的序列或SEQ ID NO:3549的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3526的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3529的序列或SEQ ID NO:3548的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQID NO:3532的序列或SEQ ID NO:3549的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQID NO:3526的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-7分子或其功能片段或功能变体和免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-7分子或其功能片段或功能变体和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述IL-7分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQID NO:3540的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3540的序列和可操作地连接的SEQID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO:3540的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3539的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3539的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-12分子或其功能片段或功能变体和免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-12分子或其功能片段或功能变体和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述IL-12分子或其功能片段或功能变体包含IL-12β亚基或其功能片段或功能变体以及IL-12α亚基或其功能片段或功能变体。
在一些实施方案中，所述IL-12分子或其功能片段或功能变体从N末端到C末端包含IL-12β亚基或其功能片段或功能变体和可操作地连接的IL-12α亚基或其功能片段或功能变体。
在一些实施方案中，所述IL-12β亚基或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述IL-12α亚基或其功能片段或功能变体，所述IL-12α亚基或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区，或其组合。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQID NO:3542的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3542的序列和可操作地连接的SEQID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述IL-12分子或其功能片段或功能变体包含SEQ ID NO:3543的序列和SEQ ID NO:3545的序列。
在一些实施方案中，所述IL-12分子或其功能片段或功能变体从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3543的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3545的序列。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO:3543的序列经由SEQ ID NO:3544的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3545的序列，所述SEQ ID NO:3545的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3541的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3541的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-21分子或其功能片段或功能变体和免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-21分子或其功能片段或功能变体和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述IL-21分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区，或其组合。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQID NO:3540的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3540的序列和可操作地连接的SEQID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO:3540的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3648的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3546的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3546的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区、免疫球蛋白轻链恒定区和IL-2分子或其功能片段或功能变体。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区、可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区、和可操作地连接的IL-2分子或其功能片段或功能变体。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白轻链恒定区经由接头可操作地连接至所述IL-21分子或其功能片段或功能变体。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含两个第一多肽和两个第二多肽。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含所述第一多肽，所述第一多肽包含有包含L234A、L235A和P329G突变的免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3530的序列和SEQ ID NO:3537的序列；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3527的序列、SEQ ID NO:3528的序列和SEQ ID NO:2191的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3530的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3537的序列；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3527的序列、可操作地连接的SEQ ID NO:3528的序列、和可操作地连接的SEQ ID NO:2191的序列。
在一些实施方案中，所述SEQ ID NO:3528的序列经由SEQ ID NO:3309的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:2191的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含两个第一多肽和两个第二多肽。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3536的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3535的序列具有至少75％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，所述多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3536的序列；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3535的序列。
在另一方面，本文描述了一种抗体，其包含抗T细胞受体β可变链(TCRβV)结合结构域，所述抗T细胞受体β可变链(TCRβV)结合结构域包含：(i)重链可变区(VH)，所述VH包含重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含与SEQ ID NO:3650、SEQ ID NO:3651和SEQ ID NO:5具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包含轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含与SEQ ID NO:3655、SEQ ID NO:3653和SEQ ID NO:8具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)其组合。
在一些实施方案中，所述TCRβV结合结构域包含：(i)VH，所述VH包含HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3，所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:3650、SEQ ID NO:3651和SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(ii)VL，所述VL包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:3655、SEQ ID NO:3653和SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或者(iii)其组合。
在一些实施方案中，所述TCRβV结合结构域包含：(i)VH，所述VH包含与SEQ ID NO:1346具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；(ii)VL，所述VL包含与SEQ ID NO:1349具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)其组合。
在一些实施方案中，所述TCRβV结合结构域包含：(i)VH，所述VH包含SEQ ID NO:1346的氨基酸序列；(ii)VL，所述VL包含SEQ ID NO:1349的氨基酸序列；或者(iii)其组合。
在一方面，本文描述一种核酸分子，其包含编码如本文所述的多功能多肽分子或如本文所述的抗体的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸分子是分离的核酸分子。
在一方面，本文描述了一种载体，其包含如本文所述的核酸分子中的一种或多种。
在一方面，本文描述了一种细胞，其包含如本文所述的核酸分子或如本文所述的载体。
在一方面，本文描述了一种药物组合物，其包含如本文所述的多功能多肽分子、如本文所述的抗体、如本文所述的核酸分子、如本文所述的载体或如本文所述的细胞，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
在一方面，本文描述了一种在有需要的对象中治疗病况或疾病的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的如本文所述的多功能多肽分子、如本文所述的抗体、如本文所述的核酸分子、如本文所述的载体、如本文所述的细胞、如本文所述的药物组合物或其组合，其中所述施用对治疗所述对象的所述病况或疾病是有效的。
在一些实施方案中，所述病况或疾病为癌症。
在一些实施方案中，所述癌症为实体瘤、血液学癌症、转移性癌症、软组织肿瘤或其组合。
在一些实施方案中，所述癌症为实体瘤，并且所述实体瘤选自黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、肝癌及其组合。
在一些实施方案中，所述癌症为血液学癌症，并且所述血液学癌症选自霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病及其组合。
在一些实施方案中，所述非霍奇金淋巴瘤选自B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病及其组合。
在一些实施方案中，所述T细胞淋巴瘤为外周T细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，所述癌症的特征在于存在于所述癌症上的癌抗原。
在一些实施方案中，所述癌抗原为肿瘤抗原、基质抗原或血液学抗原。
在一些实施方案中，所述癌抗原选自BCMA、CD19、CD20、CD22、FcRH5、PDL1、CD47、神经节苷脂2(GD2)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、Ron激酶、c-Met、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、BING-4、钙激活的氯化物通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、SAP-1、存活蛋白、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、Gp100/pmel17、酪氨酸酶、TRP-1/-2、MC1R、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、p53、Ras、TGF-B受体、AFP、ETA、MAGE、MUC-1、CA-125、BAGE、GAGE、NY-ESO-1、β-连环蛋白、CDK4、CDC27、α辅肌动蛋白-4、TRP1/gp75、TRP2、gp100、Melan-A/MART1、神经节苷脂、WT1、EphA3、表皮生长因子受体(EGFR)、MART-2、MART-1、MUC1、MUC2、MUM1、MUM2、MUM3、NA88-1、NPM、OA1、OGT、RCC、RUI1、RUI2、SAGE、TRG、TRP1、TSTA、叶酸受体α、L1-CAM、CAIX、gpA33、GD3、GM2、VEGFR、整合素、碳水化合物、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、TGF-β、透明质酸、胶原蛋白、生腱蛋白C和生腱蛋白W。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述对象施用第二治疗剂或疗法。
在一些实施方案中，所述第二治疗剂或疗法包括化疗剂、生物剂、激素疗法、放射或手术。
在一些实施方案中，所述第二治疗剂或疗法与如本文所述的多功能多肽分子、如本文所述的抗体、如本文所述的核酸分子、如本文所述的载体、如本文所述的细胞或如本文所述的药物组合物顺序地、同时地或并发地组合施用。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体并且单独地指出通过引用并入一样。
附图说明
本公开的新颖特征在所附权利要求中详细阐述。通过参考以下阐述其中利用了本公开的原理的说明性实施方案的详细描述以及附图，将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1A-1T描绘了如本文所述的多功能分子的示例性实施方案。图1A、1B和1C描绘了多功能分子的示例性实施方案，所述多功能分子包含多个，例如两个，示例性细胞因子白介素2(IL-2)的分子，其连接至与T细胞受体β可变区(TCRβV)(抗TCRβV抗体分子)结合的抗体分子。图1D、1E和1F描绘了多功能分子的示例性实施方案，所述多功能分子包含连接至抗TCRβV抗体分子的示例性细胞因子IL-2的单个分子。图1G、1H、1I和1J描绘了多功能分子的示例性实施方案，所述多功能分子包含连接至第一二聚化模块的示例性细胞因子IL-2。图1K、1L和1M描绘了多功能分子的示例性实施方案，所述多功能分子包含示例性的二聚化模块，例如包含N297A突变的Fc区，和多个，例如两个，连接至抗TCRβV抗体分子的示例性细胞因子IL-2的分子。图1N、1O和1P描绘了多功能分子的示例性实施方案，所述多功能分子包含示例性的二聚化模块，例如包含N297A突变(杵臼结构(Knob-in-hole))的Fc区，和连接至抗TCRβV抗体分子的示例性细胞因子IL-2的单个分子。图1Q、1R、1S和1T描绘了多功能分子的示例性实施方案，所述多功能分子包含示例性的二聚化模块，例如包含N297A突变(杵臼结构)的Fc区，和连接至示例性的二聚化模块的示例性细胞因子IL-2。
图2A-2B示出了抗体A小鼠源VH和VL框架区1、CDR1、框架区2、CDR2、框架区3、CDR3和框架区4与它们各自的人源化序列的比对。Kabat CDR以粗体示出，Chothia CDR以斜体示出，并且组合的CDR以方框示出。回复突变的框架位置用双下划线标出。图2A示出了鼠抗体A的VH序列(SEQ ID NO:1)和人源化抗体A-H的VH序列(SEQ ID NO:9)。图2B示出了鼠抗体A的VL序列(SEQ IDNO:2)和人源化抗体A-H的VL序列(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)。
图3A-3B示出了抗体B小鼠源VH和VL框架区1、CDR1、框架区2、CDR2、框架区3、CDR3和框架区4与它们各自的人源化序列的比对。Kabat CDR以粗体示出，Chothia CDR以斜体示出，组合的CDR以方框示出。回复突变的框架位置用双下划线标出。图3A示出了鼠抗体B的VH序列(SEQ ID NO:15)和人源化VH序列B-H.1A至B-H.1C(SEQ ID NO:23-25)。图3B示出了鼠抗体B的VL序列(SEQ ID NO:16)和人源化VL序列B-H.1D至B-H.1H(SEQ ID NO:26-30)。
图4描绘了TCRBV基因家族和亚家族的系统树，并映射了相应的抗体。亚家族身份如下：亚家族A：TCRβV6；亚家族B：TCRβV10；亚家族C：TCRβV12；亚家族D：TCRβV5；亚家族E：TCRβV7；亚家族F：TCRβV11；亚家族G：TCRβV14；亚家族H：TCRβV16；亚家族I：TCRβV18；亚家族J：TCRβV9；亚家族K：TCRβV13；亚家族L：TCRβV4；亚家族M：TCRβV3；亚家族N：TCRβV2；亚家族O：TCRβV15；亚家族P：TCRβV30；亚家族Q：TCRβV19；亚家族R：TCRβV27；亚家族S：TCRβV28；亚家族T：TCRβV24；亚家族U：TCRβV20；亚家族V：TCRβV25；以及亚家族W：TCRβV29亚家族。亚家族成员在本文标题为“TCR beta V(TCRβV)”的部分详细描述。
图5A-5C示出了被抗TCRVβ13.1抗体(A-H.1)激活6天的人CD3+ T细胞。将人CD3+ T细胞使用磁珠分离(阴性选择)进行分离，并用固定化的(板包被的)抗TCRVβ13.1(A-H.1)或抗CD3∈(OKT3)抗体以100nM激活6天。图5A示出了先使用抗TCRVβ13.1(A-H.1)，然后使用第二荧光色素缀合的抗体用于流式细胞术分析而评估了TCRVβ13.1表面表达的扩增T细胞的两个散点图(左：用OKT3激活；右：用A-H.1激活)。图5B示出了被抗TCRVβ13.1(A-H.1)或抗CD3e(OKT3)激活的TCRVβ13.1阳性T细胞相对于总T细胞(CD3+)的百分比(％)。图5C示出了通过以60μl/min的恒定速率对20秒内每个T细胞亚群门(CD3或TCRVβ13.1)中的事件数进行计数而获得的相对细胞计数。数据示为3个供体的平均值。
图6A-6B示出了被抗TCRVβ13.1抗体(A-H.1)激活的人CD3+T细胞对转化细胞系RPMI 8226的细胞溶解活性。图6A描绘了用A-H.1或OKT3激活的人CD3+ T细胞的靶细胞裂解。将人CD3+ T细胞使用磁珠分离(阴性选择)进行分离，并在指定浓度下用固定化的(板包被的)A-H.1或OKT3激活4天，然后与RPMI 8226细胞一起在5:1的(E:T)比例下共培养2天。接下来，使用流式细胞术分析，通过CFSE/CD138标记的且膜不透性的DNA染料(DRAQ7)进行FACS染色，来分析样品中RPMI 8226细胞的细胞裂解。图6B示出了将被A-H.1或OKT3激活的人CD3+ T细胞与RPMI-8226一起在5:1的(E:T)比例下温育6天，随后如上所述对RPMI 8226细胞进行细胞裂解分析而得到的靶细胞裂解。靶细胞裂解百分比(％)通过使用以下公式[(x-基础)/(100％-基础)，其中x为样品的细胞裂解]，相对于基础靶细胞裂解(即，无抗体处理)归一化来确定。示出的数据代表n＝1个供体。
图7A-7B示出了用指定抗体激活的人PBMC产生IFNγ。将人PBMC从指定数量的供体的全血中分离，然后用100Nm的指定抗体进行固相(板包被)刺激。在第1、2、3、5或6天收集上清液。图7A是比较在激活后第1、2、3、5或6天在用指定抗体激活(用抗TCR Vβ13.1抗体(A-H.1或A-H.2)或抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)激活)的人PBMC中IFNγ的产生的图。图7B示出了在激活后第1、2、3、5或6天，在用指定抗体激活(用抗TCRVβ13.1抗体或抗CD3e抗体(OKT3)激活)的人PBMC中IFNγ的产生。
图8A-8B示出了用指定抗体激活的人PBMC的IL-2产生。使用与图7A-7B所述的类似的实验设定。
图9A-9B示出了用指定抗体激活的人PBMC的IL-6产生。使用与图7A-7B所述的类似的实验设定。
图10A-10B示出了用指定抗体激活的人PBMC的TNF-α产生。使用与图7A-7B所述的类似的实验设定。
图11A-11B示出了用指定抗体激活的人PBMC的IL-1β产生。使用与图7A-7B所述的类似的实验设定。
图12A-12B是示出与被抗CD3e抗体OKT3激活的PBMC相比，在被抗TCRVβ13.1抗体A-H.1激活的人PMBC中延迟的IFNγ分泌动力学的图。图12A示出了来自4个供体的IFNγ分泌数据。图12B示出了来自另外4个供体的IFNγ分泌数据。示出的数据代表n＝8个供体。
图13描绘了与被抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)激活的PBMC相比，在被抗TCRVβ13.1抗体(A-H.1或A-H.2)激活的人PBMC中增加的CD8+ TSCM和Temra T细胞亚群。
图14A-14F示出了抗TCRVb抗体的表征。图14A是描绘被抗CD3(OKT3)抗体或抗TCRVb抗体激活的T细胞增殖的图。图14B示出了采用抗TCRVb抗体对CD45RA+效应记忆CD8+和CD4+ T细胞(TEMRA细胞)的选择性扩增。Tn＝初始T细胞；Tscm＝干细胞记忆T细胞；Tcm＝中央记忆T细胞；Tem＝效应记忆T细胞；Temra＝效应记忆CD45RA+T细胞。图14C是示出用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的PBMC的IFN-g分泌的图。图14D示出了用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的T细胞的靶细胞裂解。将细胞刺激4天，然后与多发性骨髓瘤靶细胞一起温育2天，以评估细胞杀伤。图14E是示出用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的T细胞的穿孔素分泌的图。用100ng/ml板结合的抗体刺激5天后，通过FACS染色来分析在PBMC中TCRVB阳性和TCRVB阴性T细胞中的穿孔素。图14F是示出用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的T细胞的颗粒酶B的图。用100ng/ml板结合的抗体刺激5天后，通过FACS染色来分析在PBMC中TCRVB阳性和TCRVB阴性T细胞中的颗粒酶B。
图15A-15B示出了通过用抗TCRVb抗体以100nM的剂量刺激PBMC 6天，IL-2和IL-15的产生以及人NK细胞的扩增。图15A示出了用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的T细胞中IL-2或IL-15的分泌。图15B描绘了流式细胞术点图，其示出了在用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体或对照样品刺激的细胞中NKp46染色对比CD56抗体染色。
图16A-16C示出了用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的PBMC中细胞因子的分泌。
图17A-17B示出了通过双重靶向BCMA-TCRvb抗体分子对MM细胞的杀伤。图17A示出了以下双重靶向抗体分子之一的体外杀伤：BCMA-TCRVb(分子I)、BCMA-CD3或对照-TCRVb；或同种型对照。图17B示出了通过双重靶向BCM-TCRVb抗体(分子I)对MM细胞的体内杀伤。
图18示出了用双重靶向抗体(分子E)裂解MM靶细胞，该抗体在一臂上识别FcRH5，并在另一臂上识别TCRVb。
图19A-19B显示了与被抗CD3∈抗体(OKT3或SP34-2)激活的人PBMC相比，被抗TCRVβ8a抗体(B-H.1)激活的人PBMC的细胞因子产生。图19A示出，被抗TCRVβ8a抗体(B-H.1)激活的人PBMC产生相似或降低水平的IFNγ。图19B示出，与被抗CD3ε抗体(OKT3或SP34-2)激活的人PBMC相比，被抗TCRVβ8a抗体(B-H.1)激活的人PBMC产生更高水平的IL-2。示出的数据代表n＝6个供体。
图20A-20C显示了被抗TCRVβ8a抗体(B-H.1)激活的人PBMC的细胞因子产生。与被抗CD3∈抗体(OKT3或SP34-2)激活的PBMC相比，被抗TCRVβ8a抗体(B-H.1)激活的人PBMC不显著产生IL-6(图20A)、IL1β(图20B)和更少的TNFα(图20C)。示出的数据代表n＝6个供体。
图21A-21E显示了与对照抗CD3e抗体(OKT3)相比，被抗TCRβV抗体D抗体激活的人PBMC的细胞因子产生。图21A示出，被抗TCRβV抗体D抗体激活的人PBMC产生相似或降低水平的IFNγ。图21B示出，与被抗CD3ε抗体(OKT3)激活的人PBMC相比，被抗TCRβV抗体D抗体激活的人PBMC产生更高水平的IL-2。被抗TCRβV抗体D抗体激活的人PBMC不显著产生IL-1β(图21C)、IL-6(图21D)或TNFα(图21E)。示出的数据代表n＝4个供体。
图22A-22B显示了被抗TCRVβ5抗体(抗体E)激活的人PBMC的细胞因子产生。图22A示出，与被抗CD3ε抗体(OKT3或SP34-2)激活的PBMC相比，被抗TCRVβ5抗体激活的人PBMC产生相似或降低水平的IFNγ。图22B示出，与被抗CD3ε抗体(OKT3或SP34-2)激活的人PBMC相比，被抗TCRVβ5 1抗体激活的人PBMC产生更高水平的IL-2。示出的数据代表n＝4个供体。
图23A-23D显示了被抗TCRVβ5抗体(抗体E)激活的人PBMC的细胞因子产生。与被抗CD3ε抗体(OKT3或SP34-2)激活的PBMC相比，被TCRVβ5抗体激活的人PBMC不显著产生IL-1β(图23A)、IL-6(图23B)、TNFα(图23C)或IL-10(图23D)。示出的数据代表n＝4个供体。
图24A-24F显示了由包括抗TCRβV结合部分和BCMA结合部分的双重靶向(双特异性)分子激活的人PBMC的细胞因子产生。图24A示出，与被抗CD3∈抗体(OKT3)激活的PBMC相比，被双特异性分子激活的人PBMC产生相似或降低水平的IFNγ。图24B示出，与被抗CD3ε抗体(OKT3)激活的PBMC相比，被双特异性分子激活的人PBMC产生更高水平的IL-2。被双特异性分子激活的人PBMC不显著产生IL-1β(图24C)、IL-6(图24D)、TNFα(图24E)或IL-10(图24F)。示出的数据代表n＝3个供体。
图25A-25B显示了来自七个不同亚家族的八种TCRβV蛋白的结构和序列：TCRβV6亚家族(显示TCRβV6-5和TCRβV6-4)、TCRβV28亚家族、TCRβV19亚家族、TCRβV9亚家族、TCRβV5亚家族、TCRβV20亚家族和TCRβV12亚家族。图25A显示了不同TCRβV蛋白的结构比对。圆圈区域代表包含如本文描述的抗TCRβV抗体的建议结合位点的面向外的区域。图25B显示了图25A中所示蛋白质的氨基酸序列比对(按出现顺序，分别为SEQ ID NO 3449-3456)。各种TCRβV蛋白(来自7个不同的TCRβV亚家族)具有不同的序列，但共享保守(相似)的结构和功能。
图26A-26J示出了被抗TCRVb抗体(A-H.1，B-H.1)，包括抗TCRVb抗体的双特异性分子(分子H)、对照同种型(122)或抗CD3e抗体(OKT3)激活的PBMC的细胞因子或趋化因子分泌。示出的数据代表n＝2个供体，并代表2个独立实验。
图27A-27H示出了被抗TCRVb抗体(A-H.1，B-H.1)，包括抗TCRVb抗体的双特异性分子(分子H)、对照同种型(122)或抗CD3e抗体(OKT3)激活的PBMC的细胞因子或趋化因子分泌。示出的数据代表n＝2个供体，并代表2个独立实验。
图28A-28L示出了被抗TCRVb抗体(A-H.1，B-H.1)，包括抗TCRVb抗体的双特异性分子(分子H)、对照同种型(122)或抗CD3e抗体(OKT3)激活的PBMC的细胞因子或趋化因子分泌。示出的数据代表n＝2个供体，并代表2个独立实验。
图29是描绘在第10至28天，被植入Raji-luc细胞的NOD/SCID/IL-2Rγnull(NSG)小鼠中的平均肿瘤体积的图。星号表示PBMC植入。空心三角形表示用指定抗体进行的抗体治疗。
图30A-30F是示出在第2天和第5天，被抗TRBC1(抗体F)或抗CD3(OKT3)刺激的细胞因子分泌的图。检查的细胞因子包括：IFNγ(图30A)、IL-2(图30B)、IL-1β(图30C)、IL-6(图30D)、IL-10(图30E)和TNFα(图30F)。
图31是FACS图，其显示使用抗TCRvb 6-5v1在8天期间扩增TCRvb 6-5+T细胞。
图32是柱形图，其显示使用抗CD3ε抗体OKT3(100nM)在8天期间扩增TCRvb 6-5+CD4+ T细胞和TCRvb 6-5+CD8+ T细胞。
图33是柱形图，其显示使用抗TCRvb 6-5v1抗体(100nM)在8天期间扩增TCRvb 6-5+CD4+ T细胞和TCRvb 6-5+CD8+ T细胞。
图34是FACS图，其显示使用抗TCRvb 6-5v1或抗CD3ε抗体OKT3在8天期间扩增TCRvb 6-5+T细胞。
图35A是柱形图，其显示用指定抗体培养8天后PBMC培养物中TCRβV6-5+T细胞的百分比。显示了5次重复的数据。图35B是柱形图，其显示用指定抗体培养8天后纯化的T细胞培养物中TCRβV6-5+T细胞的百分比。显示了5次重复的数据。
图36A是柱形图，其显示用指定抗体培养8天后PBMC培养物中TCRβV6-5+T细胞的相对计数。图36B是柱形图，其显示用指定抗体培养8天后PBMC培养物中TCRβV6-5+T细胞的相对计数。
图37A是柱形图，其显示用指定抗体培养8天后纯化的T细胞培养物中TCRβV6-5+T细胞的相对计数。图37B是柱形图，其显示用指定抗体培养8天后纯化的T细胞培养物中TCRβV6-5+T细胞的相对计数。
图38是线图，其显示用抗CD3ε抗体OKT3或抗TCRvb 6-5v1抗体培养T细胞8天后的总CD3+ T细胞计数(增加倍数)。
图39是一系列线图，其显示TCRβV6-5v1激活的T细胞或抗CD3ε(OKT3)激活的T细胞对靶细胞的动力学。使用了来自三个不同供体的T细胞(供体6769、供体9880、供体5411)。
图40A是散点图，其显示T细胞在没有T细胞预激活的情况下TCRβV6-5v1激活的T细胞或抗CD3ε(OKT3)激活的T细胞对靶细胞裂解的百分比。数据在靶细胞和效应T细胞之间共培养的第6天呈现。图40B是散点图，其显示T细胞在T细胞预激活4天情况下TCRβV6-5v1激活的T细胞或抗CD3ε(OKT3)激活的T细胞对靶细胞裂解的百分比。数据在靶细胞和效应T细胞之间共培养的第2天呈现(T细胞预激活4天后)。
图41是散点图，其显示T细胞在T细胞预激活4天情况下TCRβV6-5v1激活的T细胞或抗CD3ε(OKT3)激活的T细胞对靶细胞裂解的百分比。数据在靶细胞和效应T细胞之间共培养的第2天呈现(T细胞预激活4天后)。
图42是柱形图，其显示T细胞TCRβV6-5v1激活的T细胞或抗CD3ε(OKT3)激活的T细胞(每种抗体100nM)对靶细胞裂解。数据包括每个实验条件的七次重复。
图43是一系列FACS图，其显示在用SP34-2(抗CD3ε抗体)或抗TCRβV6-5v1(抗TCRβV6-5抗体)激活的CD4+ TCRβV6-5-或CD4+TCRβV6-5+T细胞上在抗体激活后第0、1、2、4、6或8天CD3ε的细胞表面表达。
图44是一系列FACS图，其显示在用SP34-2(抗CD3ε抗体)或抗TCRβV6-5v1(抗TCRβV6-5抗体)激活的CD8+ TCRβV6-5-或CD8+TCRβV6-5+T细胞上在抗体激活后第0、1、2、4、6或8天CD3ε的细胞表面表达。
图45是一系列FACS图，其显示在用SP34-2(抗CD3ε抗体)或抗TCRβV6-5v1(抗TCRβV6-5抗体)激活的CD4+ TCRβV6-5-或CD4+TCRβV6-5+T细胞上在抗体激活后第0、1、2、4、6或8天TCRβV的细胞表面表达。
图46是一系列FACS图，其显示在用SP34-2(抗CD3ε抗体)或抗TCRβV6-5v1(抗TCRβV6-5抗体)激活的CD8+ TCRβV6-5-或CD8+TCRβV6-5+T细胞上在抗体激活后第0、1、2、4、6或8天TCRβV的细胞表面表达。
图47A显示在食蟹猴PBMC激活后7天未经刺激的(左)或用抗TCRβV6-5v1(右)刺激的TCRβV6-5+食蟹猴T细胞扩增的FACS图。使用来自供体DW8N的PBMC(新鲜PBMC样品，雄性，8岁，体重7.9kg)。图47B显示在食蟹猴PBMC激活后7天未经刺激的(左)或用抗TCRβV6-5v1(右)刺激的TCRβV6-5+食蟹猴T细胞扩增的FACS图。使用来自供体G709的PBMC(冷冻保存的样品，雄性，6岁，体重4.7kg)。
图48显示了冷冻保存的供体DW8N食蟹猴PBMC激活后，未经刺激的(左)、用SP34-2(抗CD3ε抗体)刺激的(中)；或用抗TCRβV6-5v1刺激的(右)TCRβV6-5+食蟹猴T细胞扩增的FACS图和相应的显微镜图像。显微镜图像显示细胞簇的形成(用圆圈表示)。
图49显示了FACS图的示意图，其显示了在γδT细胞纯化之前PBMC的FACS门控/染色。
图50显示了FACS图的示意图，其显示了纯化的γδT细胞群的FACS门控/染色。
图51显示用抗CD3ε抗体(SP34-2)(左)或抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)(右)对纯化的γδT细胞群的激活。
图52A显示IFNγ从用抗CD3ε抗体(SP34-2)、抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)激活的或未经刺激的纯化γδT细胞群中释放。图52B显示TNFα从用抗CD3ε抗体(SP34-2)、抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)激活的或未经刺激的纯化γδT细胞群中释放。图52C显示IL-2从用抗CD3ε抗体(SP34-2)、抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)激活的或未经刺激的纯化γδT细胞群中释放。图52D显示IL-17A从用抗CD3ε抗体(SP34-2)、抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)激活的或未经刺激的纯化γδT细胞群中释放。图52E显示IL-1α从用抗CD3ε抗体(SP34-2)、抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)激活的或未经刺激的纯化γδT细胞群中释放。图52F显示IL-1β从用抗CD3ε抗体(SP34-2)、抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)激活的或未经刺激的纯化γδT细胞群中释放。图52G显示IL-6从用抗CD3ε抗体(SP34-2)、抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)激活的或未经刺激的纯化γδT细胞群中释放。图52H显示IL-10从用抗CD3ε抗体(SP34-2)、抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)激活的或未经刺激的纯化γδT细胞群中释放。
图53显示所有TCRαV区段(TRAV基因群)及其变体(顶部)、所有TCRβV区段6-5变体(TRBV6-5基因)(左下)，以及除6-5之外的所有TCRβV区段和变体(右下)的相对表示。
图54A是FACS图，其显示用抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)扩增的CD4+ T细胞的表型标志物。已定义的表型包括TEMRA(左上)、初始/TSCM(右上)、TEM(左下)和TCM(右下)。图54B是FACS图，其显示用抗CD3ε抗体(OKT3)扩增的CD4+ T细胞的表型标志物。已定义的表型包括TEMRA(左上)、初始/TSCM(右上)、TEM(左下)和TCM(右下)。
图55A是FACS图，其显示用抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)扩增的CD8+ T细胞的表型标志物。已定义的表型包括TEMRA(左上)、初始/TSCM(右上)、TEM(左下)和TCM(右下)。图55B是FACS图，其显示用抗CD3ε抗体(OKT3)扩增的CD8+ T细胞的表型标志物。已定义的表型包括TEMRA(左上)、初始/TSCM(右上)、TEM(左下)和TCM(右下)。
图56A是柱形图，其显示来自用抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)、抗CD3ε抗体(OKT3)激活的或未经刺激的T细胞培养物的表达PD1的CD4+ T细胞的百分比。图56B是柱形图，其显示来自用抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)、抗CD3ε抗体(OKT3)激活的或未经刺激的T细胞培养物的表达PD1的CD8+ T细胞的百分比。
图57A是柱形图，其显示来自用抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)、抗CD3ε抗体(OKT3)激活的或未经刺激的T细胞培养物的CD4+ T细胞表达Ki-67。图57B是柱形图，其显示来自用抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)、抗CD3ε抗体(OKT3)激活的或未经刺激的T细胞培养物的CD8+T细胞表达Ki-67。
图58A是FACS图，其显示使用抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)激活的表达CD57的TEMRA样CD8+ T细胞的百分比(18.7％)。图58B是FACS图，其显示使用抗CD3ε抗体(OKT3)激活的表达CD57的TEM样CD8+ T细胞的百分比(46.8％)和使用抗CD3ε抗体(OKT3)激活的表达CD57的TCM样CD8+ T细胞的百分比(18.9％)。
图59显示一系列FACS图，其显示来自用抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)、抗CD3ε抗体(OKT3)激活的、或未经刺激的T细胞培养物的CD4+(顶部)或CD8+(底部)T细胞表达CD27。
图60显示一系列FACS图，其显示来自用抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1)、抗CD3ε抗体(OKT3)激活的、或未经刺激的T细胞培养物的CD4+(顶部)或CD8+(底部)T细胞表达OX40、41BB和ICOS。
图61显示了一系列FACS图，其显示用BCMA和抗TCRVβ抗体抗TCRVβ6-5v1激活后1、2、3、4、5、6和8天CD3+(CD4门控)TCRβV6-5+T细胞的百分比。
图62A显示了一系列FACS图，其显示使用同种型对照(IgG1N297A)、抗TCRβV(抗TCRVβ6-5v1)或抗CD3ε(OKT3)抗体在激活后第0天扩增的CD4+ T细胞的百分比。图62B显示了一系列FACS图，其显示使用同种型对照(IgG1 N297A)、抗TCRβV(抗TCRVβ6-5v1)或抗CD3ε(OKT3)抗体在激活后第1天扩增的CD4+ T细胞的百分比。图62C显示了一系列FACS图，其显示使用同种型对照(IgG1 N297A)、抗TCRβV(抗TCRVβ6-5v1)或抗CD3ε(OKT3)抗体在激活后第2天扩增的CD4+ T细胞的百分比。图62D显示了一系列FACS图，其显示使用同种型对照(IgG1 N297A)、抗TCRβV(抗TCRVβ6-5v1)或抗CD3ε(OKT3)抗体在激活后第3天扩增的CD4+ T细胞的百分比。图62E显示了一系列FACS图，其显示使用同种型对照(IgG1 N297A)、抗TCRβV(抗TCRVβ6-5v1)或抗CD3ε(OKT3)抗体在激活后第4天扩增的CD4+T细胞的百分比。图62F显示了一系列FACS图，其显示使用同种型对照(IgG1 N297A)、抗TCRβV(抗TCRVβ6-5v1)或抗CD3ε(OKT3)抗体在激活后第5天扩增的CD4+ T细胞的百分比。图62G显示了一系列FACS图，其显示使用同种型对照(IgG1 N297A)、抗TCRβV(抗TCRVβ6-5v1)或抗CD3ε(OKT3)抗体在激活后第6天扩增的CD4+ T细胞的百分比。图62H显示了一系列FACS图，其显示使用同种型对照(IgG1N297A)、抗TCRβV(抗TCRVβ6-5v1)或抗CD3ε(OKT3)抗体在激活后第8天扩增的CD4+T细胞的百分比。
图63A是柱形图，其显示来自用指定抗体激活的T细胞培养物的糖酵解的ATP产生。图63B是柱形图，其显示来自用指定抗体激活的T细胞培养物的氧化磷酸化的ATP产生。
图64是线图，其显示用指定抗体激活的T细胞从约0到75分钟的耗氧率(OCR)。
图65A显示在基础呼吸期间用指定抗体激活的T细胞的耗氧率(OCR)。图65B显示在最大呼吸期间用指定抗体激活的T细胞的耗氧率(OCR)。图65C显示在备用呼吸能力期间用指定抗体激活的T细胞的耗氧率(OCR)。图65D是线图，其分别表示如图64A和图64B所示的基础呼吸和最大呼吸的面积。
图66A是柱形图，其显示来自用抗TCRβV6-5v1激活并用指定抗体再刺激的T细胞培养物的糖酵解的ATP产生。图66B是柱形图，其显示来自用抗TCRβV6-5v1激活并用指定抗体再刺激的T细胞培养物的氧化磷酸化的ATP产生。
图67A-67G是显示在BHM1710(抗TCRVB)、亲和力降低的抗CD3抗体(TB)和SP34抗CD3e抗体的情况下IFNγ(图67A)、TNFα(图67E)、IL-1α(图67B)、IL-1β(图67C)、IL-6(与CRS和神经毒性相关的细胞因子)(图67D)的表达的图。IL-10(图67F)、IL-17A(图67G)。
图68是FACS图，其显示从用指定抗体激活的T细胞培养物扩增的NK细胞的百分比。
图69是柱形图，其显示从用指定抗体激活的T细胞培养物扩增的NK细胞的数量。
图70显示了一系列FACS图，其显示由用指定抗体激活的T细胞培养物诱导的NK细胞增殖。
图71是显示实施例中描述的测定，用以确定NK细胞介导的靶K562细胞裂解的示意图。
图72是柱形图，其显示由用指定抗体激活的PBMC激活的NK细胞介导的靶细胞裂解百分比。
图73显示了一系列FACS图，其显示来自用指定抗体(同种型对照或OKT3)激活/扩增的PBMC培养物的NK细胞增殖。分析了来自三个供体(D1、D2和D3)的PBMC。
图74显示了一系列FACS图，其显示来自用指定抗体(抗TCRvβ12-3/4v1或抗TCRvβ12-3/4v2)激活/扩增的PBMC培养物的NK细胞增殖。分析了来自三个供体(D1、D2和D3)的PBMC。
图75显示了一系列FACS图，其显示来自用指定抗体(抗TCRvβ12-3/4v3或SP34-2)激活/扩增的PBMC培养物的NK细胞增殖。分析了来自三个供体(D1、D2和D3)的PBMC。
图76是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3或5)的T细胞分泌的IFNγ的水平。
图77是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3或5)的T细胞分泌的IL-2的水平。
图78是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3或5)的T细胞分泌的IL-15的水平。
图79是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3或5)的T细胞分泌的IL-1β的水平。
图80是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3或5)的T细胞分泌的IL-6的水平。
图81是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3或5)的T细胞分泌的IL-10的水平。
图82是柱形图，其显示由用指定抗体(抗TCRβV6-5v1或SP34)激活/扩增的T细胞分泌的指定细胞因子的水平。数据包括使用17名个体PBMC供体。
图83A是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1或OKT3)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IFNγ的水平。图83B是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1或OKT3)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IL-1β的水平。图83C是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1或OKT3)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IL-4的水平。图83D是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1或OKT3)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IL-6的水平。图83E是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1或OKT3)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IL-10的水平。图83F是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1或OKT3)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的TNFα的水平。图83G是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1或OKT3)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IL-2的水平。
图84A是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3、SP34-2或同种型对照)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IFNγ的水平。图84B是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3、SP34-2或同种型对照)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IL-1β的水平。图84C是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3、SP34-2或同种型对照)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IL-4的水平。图84D是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3、SP34-2或同种型对照)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IL-6的水平。图84E是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3、SP34-2或同种型对照)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IL-10的水平。图84F是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3、SP34-2或同种型对照)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的TNFα的水平。图84G是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3、SP34-2或同种型对照)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、5或6)的T细胞分泌的IL-2的水平。
图85A是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v2、OKT3或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IFNγ的水平。图85B是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-1β的水平。图85C是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-4的水平。图85D是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-6的水平。图85E是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-10的水平。图85F是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的TNFα的水平。图85G是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-2的水平。
图86A是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(2、5或7)的T细胞分泌的IL-17A的水平。图86B是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(2、5或8)的T细胞分泌的IL-17A的水平。图86C是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1、OKT3或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(2、5或7)的T细胞分泌的IL-17A的水平。图86D是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-17A的水平。
图87A是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IFNγ的水平。图87B是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-1β的水平。图87C是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-4的水平。图87D是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-6的水平。图87E是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-10的水平。图87F是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的TNFα的水平。图87G是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-2的水平。图87H是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-12p70的水平。图87I是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-13的水平。图87J是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-8的水平。图87K是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的外毒素的水平。图87L是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的外毒素-3的水平。图87M是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-8的水平。图87N是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IP-10的水平。图87O是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的MCP-1的水平。图87P是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的MCP-4的水平。图87Q是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的MDC的水平。图87R是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的MIP-1a的水平。图87S是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的MIP-1b的水平。图87T是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的TARC的水平。图87U是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的GMCSF的水平。图87V是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-12-23p40的水平。图87W是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-15的水平。图87X是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-16的水平。图87Y是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-17a的水平。图87Z是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-1a的水平。图87AA是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-5的水平。图87BB是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的IL-7的水平。图87CC是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的TNF-B的水平。图87DD是柱形图，其显示用指定抗体(同种型对照；抗TCRβV6-5v1与抗BCMA抗体；抗TCRβV6-5v1；抗TCRβV 123/4v1或SP34-2)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、2、3、4、5、6或8)的T细胞分泌的VEGF的水平。
图88显示了不同TCRVB克隆型亚家族之间序列关系的图示。
图89A是柱形图，其显示使用指定抗体(抗TCRβV 12-3/4v1或SP34-2)激活/扩增八天的PBMC释放的细胞因子的百分比。图89B是柱形图，其显示使用指定抗体(抗TCRβV 5或SP34-2)激活/扩增八天的PBMC释放的细胞因子的百分比。图89C是柱形图，其显示使用指定抗体(抗TCRβV 10或SP34-2)激活/扩增八天的PBMC释放的细胞因子的百分比。
图90A是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IFNγ的水平。图90B是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-10的水平。图90C是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-17A的水平。图90D是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-1α的水平。图90E是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-1β的水平。图90F是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-6的水平。图90G是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的TNFα的水平。图90H是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-2的水平。
图91是柱形图，其总结来自使用指定抗TCRVβ抗体激活/扩增6天的PBMC的FACS分析的数据。
图92A是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IFNγ的水平。图92B是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-10的水平。图92C是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-17A的水平。图92D是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-1α的水平。图92E是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-1β的水平。图92F是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-6的水平。图92G是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-4的水平。图92H是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-2的水平。
图93是柱形图，其总结来自使用指定抗TCRVβ抗体激活/扩增7天的PBMC的FACS分析的数据。
图94A是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IFNγ的水平。图94B是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-10的水平。图94C是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-17A的水平。图94D是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-1α的水平。图94E是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-1β的水平。图94F是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-6的水平。图94G是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-4的水平。图94H是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的TNFα的水平。图94I是柱形图，其显示用指定抗体激活/扩增指定天数(3或6)的T细胞分泌的IL-2的水平。
图95A是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IFN-γ的水平。图95B是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IFN-γ的水平。图95C是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-1b的水平。图95D是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-6的水平。图95E是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-10的水平。图95F是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-15的水平。图95G是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-17A的水平。图95H是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-1a的水平。图95I是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-1b的水平。图95J是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-2的水平。图95K是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的IL-4的水平。图95L是柱形图，其显示用指定抗体(抗TCRβV6-5v1(板包被)、抗CD3ε(板包被)、抗TCRβV6-5v1(溶液中)或抗CD3ε(溶液中)激活/扩增并与所述抗体一起培养指定天数(1、3、5或7)的T细胞分泌的TNF-a的水平。
图96是FACS图，其显示当PBMC与TM23或不与TM23(单独MH3-2)一起预温育时MH3-2与来自两个供体之一的PBMC结合的能力。
图97是FACS图，其显示当PBMC与TM23或不与TM23(单独MH3-2)一起预温育时MH3-2与来自两个供体之一的PBMC结合的能力。
图98A是柱形图，其显示PBMC CD4+ T细胞、用抗CD3抗体扩增的CD4+ T细胞(CD3扩增的T细胞)和用抗TCRVβ6-5抗体扩增的CD4+T细胞(药物扩增的T细胞)的多功能强度指数(PSI)。效应介质是颗粒酶B、IFNγ、MIP-1α、穿孔素、TNFα和TNFβ。刺激性介质是IL-5。化学吸引性介质是MIP-1b。图98B是柱形图，其显示PBMC CD8+ T细胞、用抗CD3抗体扩增的CD8+ T细胞(CD3扩增的T细胞)和用抗TCRVβ6-5抗体扩增的CD8+ T细胞(药物扩增的T细胞)的多功能强度指数(PSI)。效应介质是颗粒酶B、IFNγ、MIP-1α、穿孔素和TNFβ。化学吸引性介质是MIP-1b和RANTES。
图99是如本文所述的多功能多肽分子的药代动力学(PK)概况和给药策略的实验设计示意图。
图100显示了表9，表9描绘了TCRBV氨基酸序列的比对(按照出现的顺序，分别为SEQ ID NO 3457-3516)。表9中TCRBV氨基酸序列的比对强调了TCR序列的多样性。特别地，来自不同亚家族的TRBV序列彼此显著不同。
图101显示了亲和力成熟的人源化抗体A-H VL序列的比对(按照出现的顺序，分别为SEQ ID NO:3377-3389)。
图102显示了亲和力成熟的人源化抗体A-H VH序列的比对(按照出现的顺序，分别为SEQ ID NO:3390-3436)。
图103A显示了如本文所述的包含TCRβV结合部分和细胞因子多肽(例如，IL2或IL2-C125A)的多功能分子的示例性实施方案(例如，BKM0186)。图103B显示了如本文所述的包含TCRβV结合部分和细胞因子多肽的多功能分子的示例性实施方案。图103C、103D、103E和103F显示了如本文所述的包含第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分和两种细胞因子多肽的多功能分子的示例性实施方案。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含IL-2或其功能片段或功能变体、IL2-C125A或其功能片段或功能变体、IL-15或其功能片段或功能变体、IL-7或其功能片段或功能变体、IL-12或其功能片段或功能变体、或IL-21或其功能片段或功能变体。在实施方案中，细胞因子多肽进一步包含细胞因子受体。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含连接至IL-15Ra的IL-15。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含连接至IL-15Ra sushi结构域的IL-15。在一些实施方案中，细胞因子多肽包括细胞因子二聚体。在一些实施方案中，细胞因子多肽包含连接至IL-12α亚基的IL-12β亚基。
图104显示了显示BKM0186与人PBMC中的不同免疫细胞群结合的FACS图。
图105显示了BKM0186与表达Vβ6或CD25(IL-2Rα)或两者的纯人类T细胞的结合。
图106显示了在第5天BKM0186介导的来自人PBMC的Vβ6T细胞和激活的(CD25)Vβ6T细胞的体外扩增的体外浓度-效应关系，以总T细胞毒性(CD8)和T辅助(CD4)群体的％表示。左图：T细胞毒性淋巴细胞；右图：辅助T淋巴细胞。
图107显示了体外TCR测序。PBMC与100nM的BKM0186一起温育5天，并且对T细胞进行TCRβ链V(TRBV)基因测序。与未经刺激的T细胞(灰色)相比，BKM0186选择性地扩增了带有TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5和TRBV10-3的T细胞。
图108A和图108B显示了一系列图(图108A)和一系列FACS图(图108B),其显示了在溶液中用BKM0186、RSV-IL2和抗TCRVβ6对照刺激后如通过CD25表达评估的CD4+和CD8+ T细胞的激活。
图109显示了一系列FACS图，其表明与未经刺激的和对照RSV-IL2和抗TCRVβ6相比，由BKM0186介导的记忆T细胞的分化。左上象限代表中央记忆(CM)，左下象限代表效应记忆(EM)，右上象限代表初始(N)，并且右下象限代表效应记忆RA(TEMRA)。
图110显示了使用MSD V-plex人细胞因子组在第4天从人PBMC中BKM0186诱导的细胞因子释放的体外浓度-效应关系。
图111显示了BKM0186介导的对人肿瘤类器官的杀伤，所述肿瘤类器官从来自结肠直肠癌和NSCLC癌症患者的原发性患者来源组织产生。竖柱表示在将类器官与BKM0186和自体TIL温育后，相对于同种型对照，类器官面积减少的百分比。
图112显示了经mBKM0186处理的EMT6荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线。在肿瘤体积为80-150mm3的随机化小鼠中进行研究。对于除MC38之外的所有模型，小鼠以0.5-1.5mg/kg的周剂量给药3周，并且基于2000mm3肿瘤体积终点来确定存活率。
图113显示了经mBKM0186处理的小鼠的肿瘤生长曲线。在肿瘤体积为80-150mm3的随机化小鼠中进行研究。对于除MC38之外的所有模型，小鼠以1-1.5mg/kg的每周剂量给药4周，并且基于2000mm3肿瘤体积终点来确定存活率。对于MC38，小鼠被给予3mg/kg的第一剂量，随后对于后续三次每周(QW)剂量为1mg/kg。
图114显示了经治疗的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。在肿瘤体积为80-150mm3的随机化小鼠中进行研究。对于除MC38之外的所有模型，小鼠以1-1.5mg/kg的每周剂量给药4周，并且基于2000mm3肿瘤体积终点来确定存活率。对于MC38，小鼠被给予3mg/kg的第一剂量，随后对于后续三次每周(QW)剂量为1mg/kg。
图115显示了肿瘤再激发研究的实验设计。用EMT6肿瘤细胞在一侧腹侧和CT26肿瘤细胞在另一侧腹侧对治愈的EMT6荷瘤小鼠进行再激发，并且监测肿瘤生长28天。
图116显示了肿瘤再激发研究的结果。当EMT6肿瘤被排斥时，CT26肿瘤生长，表明可能通过mBKM0186治疗介导的针对EMT6肿瘤的记忆响应已经建立。
图117显示了在mBKM0186给药后第14天在血液和肿瘤组织中T细胞的免疫概况。
图118显示了在耗尽和没有耗尽Vβ特异性T细胞的情况下，用1mg/kg的mBKM0186每周(QW)治疗具有150mm3肿瘤的小鼠后EMT6肿瘤的肿瘤生长曲线。实心三角形表示耗尽抗体的给药间隔，并且空心三角形表示mBKM0186的给药间隔。
图119A和图119B显示了在食蟹猴中IV单剂量施用的BKM0186(图119A)和BKM0281(图119B)的药代动力学概况。
图120A显示了在IV单剂量的BKM0186后的T细胞扩增。图120B显示了在IV单剂量的BKM0281后T细胞的扩增。n＝3只猴，n＝1只猴媒介物对照。
图121显示了施用IV单剂量的BKM0186的猴中的血清可溶性CD25水平。平均值，n＝每组2-3只猴。
图122A显示了施用IV单剂量的BKM0186的猴中的血清IL-6水平。图122B显示了施用IV单剂量的BKM0281的猴中的血清IL-6水平。平均值，n＝每组2-3只猴。
图123A显示了施用IV单剂量的BKM0186的猴中的血清IFN-γ水平。图123B显示了施用IV单剂量的BKM0281的猴中的IFN-γ水平。平均值，n＝每组2-3只猴。平均值，n＝每组2-3只猴。
图124显示了双特异性介导的Vβ6T细胞的体外扩增的体外浓度-效应关系。
具体实施方式
定义
阐述了本说明书的某些具体细节，以便提供对各种实施方案的全面理解。然而，本领域技术人员将理解，本公开可以在没有这些细节的情况下实施。在其他情况下，没有详细地示出或描述熟知的结构，以避免不必要地模糊对实施方案的描述。
除非上下文另有要求，否则在整个说明书和所附的权利要求书中，词语“包含(comprise)”及其变体，诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为开放、包含性的含义，即“包括，但不限于”。此外，本文提供的标题仅是为了方便，并且不解释所要求保护的公开内容的范围或含义。
如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非内容另有明确规定。当与术语“包含”结合使用时，词语“一”或“一种”的使用在本文中可以意指“一个”，但是它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。
还应当注意，术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用，除非内容另有明确规定。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本公开的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的方法和材料的方法和材料，但是合适的方法和材料在下文中描述。
当指代可测量值，诸如量、持续时间等时，术语“约”旨在涵盖与指定值偏离±20％的变化，或在一些情况下±10％，或在一些情况下±5％，或在一些情况下±1％，或在一些情况下±0.1％，这样的变化适合执行本公开的方法。如本文所用，“约”和“大约”通常是指在给定测量的性质或精度的情况下，所测量的量的可接受的误差程度。示例性误差程度在给定值范围的20％之内，通常在10％之内，并且更通常在5％之内。
如本文所用，术语“获取(acquire)”或“获取(acquiring)”是指通过“直接获取”或“间接获取”物理实体(例如，样品、多肽、核酸或序列)或值(例如，数值)，而获得拥有物理实体或值。“直接获取”是指执行一过程(例如，执行合成或分析方法)以获得物理实体或值。“间接获取”是指从另一方或来源(例如，直接获取物理实体或值的第三方实验室)接收物理实体或值。直接获取物理实体包括执行包括物理物质例如起始材料的物理变化的过程。直接获取值包括执行一过程，该过程包括样品或另一种物质中的物理变化，例如，执行包括物质(例如，样品)的物理变化的分析过程。
如本文所用，“抗体分子”是指包括至少一个免疫球蛋白可变结构域结构和/或序列的蛋白质，例如，免疫球蛋白链或其片段。抗体分子包括抗体(例如，全长抗体)和抗体片段。在一些实施方案中，抗体分子包括全长抗体的抗原结合片段或功能片段，或全长免疫球蛋白链。例如，全长抗体是天然存在或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免疫球蛋白(Ig)分子(例如，IgG抗体)。在实施方案中，抗体分子是指免疫球蛋白分子的免疫活性的抗原结合部分，诸如抗体片段。抗体片段，例如，功能片段，是抗体的部分，例如，Fab、Fab′、F(ab′)2、F(ab)2、可变片段(Fv)、域抗体(dAb)或单链可变片段(scFv)。功能性抗体片段与由完整(例如，全长)抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的分离的片段(诸如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段)，或重组单链多肽分子，其中轻链和重链可变区通过肽接头而连接(“scFv蛋白”)。在一些实施方案中，抗体片段不包括无抗原结合活性的抗体部分，诸如Fc片段或单个氨基酸残基。示例性抗体分子包括全长抗体和抗体片段，例如，dAb(域抗体)、单链、Fab、Fab′和F(ab′)2片段，以及单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，抗体分子是抗体模拟物。在一些实施方案中，抗体分子是或包括类似抗体的框架或支架，诸如纤连蛋白、锚蛋白重复序列(例如，设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin))、avimer、亲合体(affibody)亲和配体、抗运载蛋白(anticalin)或affilin分子。
如本文所用，术语“人样抗体分子”是指人源化抗体分子、人抗体分子或与非鼠种系框架区，例如，FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少95％序列同一性的抗体分子。在一些实施方案中，人样抗体分子包括与人种系框架区，例如，人种系框架区的FR1、FR2、FR3和/或FR4具有至少95％序列同一性的框架区。在一些实施方案中，人样抗体分子是重组抗体。在一些实施方案中，人样抗体分子是人源化抗体分子。在一些实施方案中，人样抗体分子是人抗体分子。在一些实施方案中，人样抗体分子是噬菌体展示或酵母展示的抗体分子。在一些实施方案中，人样抗体分子是嵌合抗体分子。在一些实施方案中，人样抗体分子是CDR接枝的抗体分子。
如本文所用，“免疫球蛋白可变结构域序列”是指可以形成免疫球蛋白可变结构域的结构的氨基酸序列。例如，该序列可以包括天然存在的可变结构域的全部或部分氨基酸序列。例如，该序列可以包括或可以不包括一个、两个或更多个N或C末端氨基酸，或可以包括与蛋白质结构的形成相容的其他改变。
在实施方案中，抗体分子是单特异性的，例如，其包含对单个表位的结合特异性。在一些实施方案中，抗体分子是多特异性的，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，而第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施方案中，抗体分子是双特异性抗体分子。如本文所用，“双特异性抗体分子”是指对多于一个(例如，两个、三个、四个或更多个)表位和/或抗原具有特异性的抗体分子。
如本文所用，“抗原”(Ag)是指可以引起免疫应答(例如，涉及某些免疫细胞的激活和/或抗体生成)的分子。包括几乎所有蛋白质或肽在内的任何大分子均可以是抗原。抗原也可以源自基因组重组体或DNA。例如，包含编码能够引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA都编码“抗原”。在实施方案中，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码，抗原也不必由基因编码。在实施方案中，抗原可以被合成或者可以衍生自生物样品，例如组织样品，肿瘤样品、细胞或具有其他生物学组分的流体。如本文所用，“肿瘤抗原”或可互换地，“癌抗原”包括存在于癌(例如，可以引发免疫应答的癌细胞或肿瘤微环境)上或与之相关的任何分子。如本文所用，“免疫细胞抗原”包括存在于可引起免疫应答的免疫细胞上或与之相关的任何分子。
抗体分子的“抗原结合位点”或“结合部分”是指抗体分子例如免疫球蛋白(Ig)分子的参与抗原结合的部分。在实施方案中，抗原结合位点由重(H)链和轻(L)链的可变(V)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的可变区内的三个高度分歧的序列段称为高变区，位于更保守的侧翼序列段(称为“框架区”(FR))之间。FR是天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在实施方案中，在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合表面，其与结合抗原的三维表面互补。每一个重链和轻链中的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。框架区和CDR已经在例如Kabat,E.A.,等人,(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH Publication No.91-3242和Chothia,C.等人,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917中定义和描述。每条可变链(例如，可变重链和可变轻链)通常由三个CDR和四个FR构成，它们按以下氨基酸顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
如本文所用，“免疫细胞”是指在免疫系统中起作用以例如保护免受感染试剂和异物侵害的各种细胞中的任何一种。在实施方案中，该术语包括白细胞，例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。固有白细胞包括吞噬细胞(例如，巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突状细胞)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和自然杀伤细胞。固有白细胞通过经由接触来攻击更大的病原体或通过吞噬并杀死微生物来识别和消灭病原体，并且是激活适应性免疫应答的介质。适应性免疫系统的细胞是特殊类型的白细胞，称为淋巴细胞。B细胞和T细胞是重要的淋巴细胞类型，它们来源于骨髓中的造血干细胞。B细胞参与体液免疫应答，而T细胞参与细胞介导的免疫应答。术语“免疫细胞”包括免疫效应细胞。
如本文所用，术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答，例如，促进免疫效应子应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括但不限于T细胞(例如，α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NK T)细胞和肥大细胞。
术语“效应子功能”或“效应子应答”是指细胞的专有功能。T细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
本文可互换地使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(如果是单链的话)是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物，所述修饰是例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，诸如与标记组分的缀合。多肽可以从天然来源中分离，可以通过重组技术从真核或原核宿主中产生，或者可以是合成方法的产物。
术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以是单链或双链的，并且如果是单链的，则可以是编码链或非编码(反义)链。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合后进一步被修饰，诸如与标记组分缀合。核酸可以是重组多核苷酸，或者是基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，其不是天然存在的，或是以非天然的方式与另一多核苷酸连接。
如本文所用，术语“分离的”是指从其来源或天然环境(例如，自然环境，如果其天然存在的话)中取出的材料。例如，存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，而通过人为干预从天然系统中的某些或全部共存物质中分离的相同多核苷酸或多肽则是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的部分，并且/或者这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的部分，并且仍然是分离的，因为这样的载体或组合物不是其在自然界中发现的环境的部分。分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA))或多肽不含在其天然存在状态下侧翼的基因/核酸或序列/氨基酸。
本发明的组合物和方法涵盖具有指定的序列或与其基本相同或相似的序列(例如，与指定的序列至少80％、85％、90％、95％相同或更高的序列)的多肽和核酸。在氨基酸序列的上下文中，术语“基本相同的”在本文中用于指包含足够或最小数量的氨基酸残基的第一氨基酸，所述氨基酸残基i)与第二氨基酸序列中的比对的氨基酸残基相同，或ii)为第二氨基酸序列中的比对的氨基酸残基的保守置换，使得第一氨基酸序列和第二氨基酸序列可以具有共同的结构结构域和/或共同的功能活性。例如，包含与参考序列(例如，本文提供的序列)具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的共同的结构结构域的氨基酸序列。在核苷酸序列的上下文中，术语“基本相同的”在本文中用于指第一核酸序列，其包含足够或最小数量的与第二核酸序列中的比对的核苷酸相同的核苷酸，使得第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码具有共同的功能活性的多肽，或编码共同的结构多肽结构域或共同的功能多肽活性。例如，与参考序列(例如，本文提供的序列)具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的核苷酸序列。
术语“变体”是指具有与参考氨基酸序列基本相同的氨基酸序列或由基本相同的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施方案中，变体是功能变体。在一些实施方案中，TCRβV变体可以与TCRα结合并且形成TCRα:β复合物。
术语“功能变体”是指具有与参考氨基酸序列基本相同的氨基酸序列或由基本相同的核苷酸序列编码并且能够具有参考氨基酸序列的一种或多种活性的多肽。
如下进行序列之间的同源性或序列同一性(这些术语在本文中可互换使用)的计算。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的而对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位，以供最佳比对，并且出于比较的目的可以忽略非同源序列)。在一个优选的实施方案中，出于比较的目的而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％、60％，并且甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是相同的(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。
在考虑到需要将其引入以供两个序列进行最佳比对的空位的数目和每个空位的长度的情况下，两个序列之间的同一性百分比是由该序列共享的相同位置的数目的函数。可以使用数学算法来完成序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定。在一个优选的实施方案中，使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(已结合到GCG软件包中的GAP程序中(可从http://www.gcg.com获取))，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及空位权重为16、14、12、10、8、6或4以及长度权重为1、2、3、4、5或6，来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及空位权重为40、50、60、70或80以及长度权重为1、2、3、4、5或6，来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。一组特别优选的参数(除非另有说明，否则应使用的一组参数)是Blossum 62评分矩阵，其空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。
可以使用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS,4:11-17)的算法(已结合至ALIGN程序(2.0版)中)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12和空位罚分为4，来确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比。本文所述的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，从而例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行搜索。可以用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以利用Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述的空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
应当理解，本发明的分子可以具有另外的保守或非必需氨基酸置换，该置换对它们的功能没有实质性影响。
术语“氨基酸”旨在涵盖所有分子，无论是天然的还是合成的，其既包括氨基官能团又包括酸官能团并且能够被包括在天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同类物；具有变异侧链的氨基酸类似物；以及前述的任一种的所有立体异构体。如本文所用，术语“氨基酸”包括D-或L-旋光异构体和拟肽。
“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
如本文所用，在例如抗体分子、细胞因子分子、受体分子中使用的术语“分子”包括全长的、天然存在的分子，以及变体，例如，功能变体(例如，其截短、片段、突变(例如，基本上相似的序列)或衍生形式)，只要未修饰的(例如，天然存在的)分子的至少一种功能和/或活性得到保留。
如本文所用，术语“突变”是指生物体、病毒或染色体外DNA的基因组核苷酸序列的改变。在一些实施方案中，突变可以是大规模突变，诸如染色体片段的扩增(或基因复制)或重复、大染色体区域的缺失、染色体重排(例如，染色体易位、染色体倒位、非同源染色体交叉和间隙缺失)，以及杂合性的缺失。在一些实施方案中，突变可以是小规模突变，诸如插入、缺失和置换突变。如本文所用，术语“置换突变”是指将单个核苷酸替换为另一个核苷酸的转变。
如本文所提及的“白介素2”(也称为IL2、IL-2、IL 2、TCGF、淋巴因子和白介素2)包括重组或天然存在形式的IL-2或其变体或同源物中的任一者，其具有或保持IL-2活性(例如，至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性)。在一些方面，与天然存在的IL-2相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，IL-2与由UniProt参考号P60568所鉴定的蛋白质或与其具有基本上同一性的变体或同源物基本相同。
抗TCRβV抗体
人T细胞受体(TCR)复合物
TCR是二硫键连接的膜锚定的异二聚体蛋白，通常由高度可变的阿尔法(α)和贝塔(β)链组成，这些链表示为具有不变的CD3链分子的复合物的部分。αβT细胞上的TCR由一条α链和一条β链的异二聚体形成。每个α或β链均由恒定结构域和被分类为免疫球蛋白超家族(IgSF)折叠的高度可变结构域组成。TCRβV链可以进一步分为30个亚家族(TRBV1-30)。尽管它们的结构和功能同源性高，但TRBV基因中的氨基酸序列同源性却很低。在约95个氨基酸中，只有4个氨基酸是相同的，而在所有亚家族中有10个另外的氨基酸是保守的(参见表9中TCRBV氨基酸序列的比对)。然而，在高度不同的序列的α和β链之间形成的TCR显示出显著的结构同源性(图25A和25B)，并且引发类似的功能，例如，T细胞的激活。
T细胞受体(TCR)可以在T细胞的表面上发现。TCR识别呈现在(例如，结合在)细胞(例如，抗原呈递细胞)表面上的主要组织相容性复合体(MHC)分子上的抗原(例如，肽)。TCR是异二聚体分子，并且可以包含α链、β链、γ链或δ链。包含α链和β链的TCR也称为TCRαβ。TCRβ链由以下区域(也称为区段)组成：可变(V)、多样(D)、连接(J)和恒定(C)(参见Mayer G.和Nyland J.(2010)第10章：Major Histocompatibility Complex and T-cell Receptors-Role in Immune Responses.In:Microbiology and Immunology on-line,University ofSouth Carolina School ofMedicine)。TCRα链由V区、J区和C区组成。通过可变(V)、多样(D)、连接(J)和恒定(C)区的体细胞重组而进行的T细胞受体(TCR)重排是T细胞发育和成熟的决定性事件。TCR基因重排发生在胸腺中。
TCR可包含被称为TCR复合物的受体复合物，其包含由α链和β链构成的TCR异二聚体和二聚体信号传导分子，例如CD3共受体，例如CD3δ/ε和/或CD3γ/ε。
如本文所用，术语“T细胞受体β可变链”或“TCRβV”是指包括T细胞受体的抗原识别结构域的T细胞受体β链的细胞外区。术语TCRβV包括异形体、哺乳动物(例如，人)TCRβV、人的同源物，以及与TCRβV具有至少一个共同表位的类似物。人TCRβV包括基因家族，该基因家族包括亚家族，包括但不限于：TCRβV6亚家族、TCRβV10亚家族、TCRβV12亚家族、TCRβV5亚家族、TCRβV7亚家族、TCRβV11亚家族、TCRβV14亚家族、TCRβV16亚家族、TCRβV18亚家族、TCRβV9亚家族、TCRβV13亚家族、TCRβV4亚家族、TCRβV3亚家族、TCRβV2亚家族、TCRβV15亚家族、TCRβV30亚家族、TCRβV19亚家族、TCRβV27亚家族、TCRβV28亚家族、TCRβV24亚家族、TCRβV20亚家族、TCRβV25亚家族、TCRβV29亚家族、TCRβV1亚家族、TCRβV17亚家族、TCRβV21亚家族、TCRβV23亚家族或TCRβV26亚家族，以及所述亚家族的家族成员，及其变体(例如，其结构或功能变体)。在一些实施方案中，TCRβV6亚家族包括：TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01。在一些实施方案中，TCRβV包括TCRβV6-5*01或其变体，例如，与天然存在的序列具有85％、90％、95％、99％或更高同一性的变体。TCRβV6-5*01也称为TRBV65；TCRBV6S5；TCRBV13S1或TCRβV13.1。TCRβV6-5*01，例如，人TCRβV6-5*01的氨基酸序列是本领域已知的，例如，如IMGT ID L36092提供。在一些实施方案中，TCRβV6-5*01由SEQ ID NO:43的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列编码。在一些实施方案中，TCRβV6-5*01包括SEQ ID NO:44的氨基酸序列，或其具有85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列。
SEQ ID NO:43
ATGAGCATCGGCCTCCTGTGCTGTGCAGCCTTGTCTCTCCTGTGGGCAGGTCCAGTGAATGCTGGTGTCACTCAGACCCCAAAATTCCAGGTCCTGAAGACAGGACAGAGCATGACACTGCAGTGTGCCCAGGATATGAACCATGAATACATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGCATGGGGCTGAGGCTGATTCATTACTCAGTTGGTGCTGGTATCACTGACCAAGGAGAAGTCCCCAATGGCTACAATGTCTCCAGATCAACCACAGAGGATTTCCCGCTCAGGCTGCTGTCGGCTGCTCCCTCCCAGACATCTGTGTACTTCTGTGCCAGCAGTTACTC
SEQ ID NO:44
MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDM NHEYMSWYRQDPGMGLRLIHY-SVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSY TCRβV(TCRβV)
免疫系统的多样性使得能够防护免于大批病原体。由于种系基因组的大小受到限制，多样性不仅通过V(D)J重组的过程来实现，而且通过核苷酸的连接(V-D和D-J区段之间的连接)缺失和伪随机非模板核苷酸的添加来实现。TCRβ基因经过基因排列而产生多样性。
由于例如在功能性基因区段中经常出现7种失活多态性以及涵盖2个Vβ基因区段的大的与插入/缺失相关的多态性，TCRVβ库因个人和群体而异。
本文尤其提供了抗体分子及其片段，其结合(例如，特异性结合)至人TCRβV链(TCRβV)，例如TCRβV基因家族(也称为组)，例如TCRβV亚家族(也称为亚组)，例如，如本文所述。TCRβV家族和亚家族是本领域已知的，例如，如Yassai等人,(2009)Immunogenetics61(7)第493-502页；Wei S.和Concannon P.(1994)Human Immunology41(3)第201-206页所述。本文所述的抗体可以是重组抗体，例如重组非鼠抗体，例如重组人或人源化抗体。
术语TCRBV、TCRVB、TRBV、TCRβV、TCRVβ或TRβV在本文中可互换使用并且是指TCRβV链，例如，如本文所述。
在一些实施方案中，本文提供了与人TCRβV例如TCRβV家族例如基因家族或其变体结合的抗TCRβV抗体分子。在一些实施方案中，TCRBV基因家族包含例如如本文例如图4、表8A或表8B中所述的一个或多个亚家族。在一些实施方案中，TCRβV基因家族包括：TCRβV6亚家族、TCRβV10亚家族、TCRβV12亚家族、TCRβV5亚家族、TCRβV7亚家族、TCRβV11亚家族、TCRβV14亚家族、TCRβV16亚家族、TCRβV18亚家族、TCRβV9亚家族、TCRβV13亚家族、TCRβV4亚家族、TCRβV3亚家族、TCRβV2亚家族、TCRβV15亚家族、TCRβV30亚家族、TCRβV19亚家族、TCRβV27亚家族、TCRβV28亚家族、TCRβV24亚家族、TCRβV20亚家族、TCRβV25亚家族、TCRβV29亚家族、TCRβV1亚家族、TCRβV17亚家族、TCRβV21亚家族、TCRβV23亚家族或TCRβV26亚家族。
在一些实施方案中，TCRβV6亚家族也称为TCRβV13.1。在一些实施方案中，TCRβV6亚家族包括：TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-4*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-4*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-9*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-8*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-6*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-6*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-2*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-3*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-1*01或其变体。
在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6，例如TCRβV6-5*01，被SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2识别，例如结合。在一些实施方案中，TCRβV6，例如TCRβV6-5*01，被SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10识别，例如结合。在一些实施方案中，TCRβV6被SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:11识别，例如结合。
在一些实施方案中，TCRβV10亚家族也称为TCRβV12。在一些实施方案中，TCRβV10亚家族包括：TCRβV10-1*01、TCRβV10-1*02、TCRβV10-3*01或TCRβV10-2*01或其变体。
在一些实施方案中，TCRβV12亚家族也称为TCRβV8.1。在一些实施方案中，TCRβV12亚家族包括：TCRβV12-4*01、TCRβV12-3*01或TCRβV12-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV12被SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16识别，例如结合。在一些实施方案中，TCRβV12被SEQ ID NO:23-25中的任何一者和/或SEQ ID NO:26-30中的任何一者识别，例如结合。
在一些实施方案中，TCRβV5亚家族选自：TCRβV5-5*01、TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01、TCRβV5-8*01、TCRβV5-1*01或其变体。
在一些实施方案中，TCRβV7亚家族包括TCRβV7-7*01、TCRβV7-6*01、TCRβV7-8*02、TCRβV7-4*01、TCRβV7-2*02、TCRβV7-2*03、TCRβV7-2*01、TCRβV7-3*01、TCRβV7-9*03或TCRβV7-9*01或其变体。
在一些实施方案中，TCRβV11亚家族包括：TCRβV11-1*01、TCRβV11-2*01或TCRβV11-3*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV14亚家族包括TCRβV14*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV16亚家族包括TCRβV16*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV18亚家族包括TCRβV18*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV9亚家族包括TCRβV9*01或TCRβV9*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV13亚家族包括TCRβV13*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV4亚家族包括TCRβV4-2*01、TCRβV4-3*01或TCRβV4-1*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV3亚家族包括TCRβV3-1*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV2亚家族包括TCRβV2*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV15亚家族包括TCRβV15*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV30亚家族包括TCRβV30*01或TCRβV30*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV19亚家族包括TCRβV19*01或TCRβV19*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV27亚家族包括TCRβV27*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV28亚家族包括TCRβV28*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV24亚家族包括TCRβV24-1*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV20亚家族包括TCRβV20-1*01或TCRβV20-1*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV25亚家族包括TCRβV25-1*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV29亚家族包括TCRβV29-1*01或其变体。
TCRβV亚家族成员的示例性氨基酸序列可在ImMunoGeneTics信息系统网站：http://www.imgt.org/或类似资源中找到。
抗TCRβV抗体
设计用于重定向T细胞以促进肿瘤细胞裂解用于癌症免疫治疗的当前双特异性构建体通常利用抗体片段(Fab、scFv、VH、单结构域抗体等)，这些抗体片段衍生自针对T细胞受体(TCR)的CD3e亚基的单克隆抗体(mAb)。然而，这种方法存在的局限性可能会限制这种双特异性构建体的治疗性潜力的完全实现。先前的研究已表明，即使是低“激活”剂量的抗CD3e mAb也可以引起长期的T细胞功能障碍并发挥免疫抑制效果。此外，抗CD3e mAb与由大规模T细胞激活引起的副作用有关。大量激活的T细胞分泌大量的细胞因子，其中最重要的是干扰素γ(IFNγ)。该过量的IFNγ进而激活巨噬细胞，然后巨噬细胞过度产生促炎性细胞因子，诸如IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α，引起“细胞因子风暴”，称为细胞因子释放综合征(CRS)(Shimabukuro-Vornhagen等人,J Immunother Cancer.2018年6月15日；6(1):56，其通过引用以其整体并入本文中)。因此，需要开发能够仅结合并激活效应T细胞亚群的抗体，例如，以减少CRS和/或神经毒性(NT)。
本文描述了靶向TCR的TCRβV链的分子及其方法。不希望受理论的束缚，此类分子能够仅结合、激活和/或扩增T细胞的亚群，避免或减少CRS和/或NT，并且使抗CD3 mAb的潜在免疫抑制效果最小化。
本文描述了一类抗体，即如本文所述的抗TCRβV抗体分子，尽管其具有低序列相似性(例如，识别不同TCRβV亚家族的不同抗体分子之间的序列同一性低)，但识别TCRβV蛋白上的结构保守的但按序列方式可变的区域，例如结构域(如图25A中的圆圈区域所示)，并且具有类似功能(例如，如本文所述的T细胞激活和相似的细胞因子谱)。因此，如本文所述的抗TCRβV抗体分子共有结构-功能关系。
不希望受理论的束缚，在一些实施方案中，当如本文所述的抗TCRβV抗体分子与TCRα蛋白处于复合物中时，其结合至TCRβV蛋白的面向外的表位，例如，如图25A中的圆圈区域所示。在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRβV抗体分子识别(例如，结合至)TCRβV蛋白上的结构域(例如，表位)，该结构域：(1)在不同的TCRβV亚家族中结构保守；并且(2)在不同的TCRβV亚家族中具有最小的序列同一性。如表9所示，来自不同TCRBV亚家族的TCRβV蛋白共有最小的序列相似性。然而，如图25A-25B所示，具有最小序列相似性的TCRβV蛋白共有相似的3D构象和结构。
表9中TCRBV氨基酸序列的比对强调了TCR序列的多样性。具体地，来自不同亚家族的TRBV序列彼此有相当大的不同。
在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRβV抗体分子不识别，例如，不与TCRβV:TCRα复合物的界面结合。在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRβV抗体分子不识别，例如不与TCRβV蛋白的恒定区结合。与TCRBV区的恒定区结合的示例性抗体是JOVI.1，如Viney等人(Hybridoma.1992年12月；11(6):701-13)所述。在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRβV抗体分子不识别，例如不与TCRβV蛋白的一个或多个(例如，全部)互补决定区(例如，CDR1、CDR2和/或CDR3)结合。
本文尤其提供了针对TCR的β亚基(TCRβV)的可变链的抗体分子，其结合并且例如激活T细胞亚群。如本文所述的抗TCRβV抗体分子导致较少或不产生与CRS相关的细胞因子，例如IL-6、IL-1β、IL-10和TNFα；以及增强的和/或延迟的IL-2和IFNγ的产生。在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRβV抗体具有例如如本文所述的细胞因子谱，其不同于与除TCRβV区以外的受体或分子结合的T细胞衔接物(“非TCRβV结合T细胞衔接物”)的细胞因子谱。在一些实施方案中，非TCRβV结合T细胞衔接物包含与CD3分子(例如，CD3ε(CD3e)分子)，或TCRα(TCRα)分子结合的抗体。在一些实施方案中，非TCRβV结合T细胞衔接物是OKT3抗体或SP34-2抗体。
在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRβV抗体导致TCRβV+T细胞(例如，称为TEMRA的记忆效应T细胞的亚群)的扩增。不希望受理论的束缚，据信在一些实施方案中，TEMRA细胞可以促进肿瘤细胞裂解，但不促进CRS。因此，本文提供了制备所述抗TCRβV抗体分子的方法及其用途。本文还描述了多特异性分子，例如包含所述抗TCRβV抗体分子的双特异性分子。在一些实施方案中，包含本公开的抗TCRβV抗体分子的组合物可以用于，例如：(1)激活和重定向T细胞以促进肿瘤细胞裂解用于癌症免疫疗法；和/或(2)扩增TCRβV+T细胞。在一些实施方案中，包含如本文所述的抗TCRβV抗体分子的组合物限制了CRS和/或NT(例如，与抗CD3e靶向相关的CRS和/或NT)的有害副作用。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子与以下中的一者或多者结合：TRBV2、TRBV3-1、TRBV4-1、TRBV4-2、TRBV4-3、TRBV5-1、TRBV5-4、TRBV5-5、TRBV5-6、TRBV5-8、TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-4、TRBV6-5、TRBV6-6、TRBV6-8、TRBV6-9、TRBV7-2、TRBV7-3、TRBV7-4、TRBV7-6、TRBV7-7、TRBV7-8、TRBV7-9、TRBV9、TRBV10-1、TRBV10-2、TRBV10-3、TRBV11-1、TRBV11-2、TRBV11-3、TRBV12-3、TRBV12-4、TRBV12-5、TRBV13、TRBV14、TRBV15、TRBV16、TRBV18、TRBV19、TRBV20-1、TRBV24-1、TRBV25-1、TRBV27、TRBV28、TRBV29-1和TRBV30。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子与TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-4、TRBV6-5、TRBV6-6、TRBV6-8和TRBV6-9中的一者或多者结合。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子是抗TRBV2、抗TRBV3-1、抗TRBV4-1、抗TRBV4-2、抗TRBV4-3、抗TRBV5-1、抗TRBV5-4、抗TRBV5-5、抗TRBV5-6、抗TRBV5-8、抗TRBV6-1、抗TRBV6-2、抗TRBV6-3、抗TRBV6-4、抗TRBV6-5、抗TRBV6-6、抗TRBV6-8、抗TRBV6-9、抗TRBV7-2、抗TRBV7-3、抗TRBV7-4、抗TRBV7-6、抗TRBV7-7、抗TRBV7-8、抗TRBV7-9、抗TRBV9、抗TRBV10-1、抗TRBV10-2、抗TRBV10-3、抗TRBV11-1、抗TRBV11-2、抗TRBV11-3、抗TRBV12-3、抗TRBV12-4、抗TRBV12-5、抗TRBV13、抗TRBV14、抗TRBV15、抗TRBV16、抗TRBV18、抗TRBV19、抗TRBV20-1、抗TRBV24-1、抗TRBV25-1、抗TRBV27、抗TRBV28、抗TRBV29-1或抗TRBV30。表10A中公开了示例性抗TCRβV抗体分子和由所述抗TCRβV抗体分子识别的相应TCRβV亚家族。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子特异性地结合TRBV2、TRBV3-1、TRBV4-1、TRBV4-2、TRBV4-3、TRBV5-1、TRBV5-4、TRBV5-5、TRBV5-6、TRBV5-8、TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-4、TRBV6-5、TRBV6-6、TRBV6-8、TRBV6-9、TRBV7-2、TRBV7-3、TRBV7-4、TRBV7-6、TRBV7-7、TRBV7-8、TRBV7-9、TRBV9、TRBV10-1、TRBV10-2、TRBV10-3、TRBV11-1、TRBV11-2、TRBV11-3、TRBV12-3、TRBV12-4、TRBV12-5、TRBV13、TRBV14、TRBV15、TRBV16、TRBV18、TRBV19、TRBV20-1、TRBV24-1、TRBV25-1、TRBV27、TRBV28、TRBV29-1或TRBV30。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子特异性地结合TRBV6-1。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子特异性地结合TRBV6-2。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子特异性地结合TRBV6-3。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子特异性地结合TRBV6-4。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子特异性地结合TRBV6-5。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子特异性地结合TRBV6-6。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子特异性地结合TRBV6-8。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子特异性地结合TRBV6-9。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子不与TCRβV12结合，或以与如美国专利5,861,155所述的16G8鼠抗体或其人源化变化形式的亲和力和/或结合特异性相比更小(例如，小约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)的亲和力和/或结合特异性与TCRβV12结合。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子以与如美国专利5,861,155所述的16G8鼠抗体或其人源化变化形式的亲和力和/或结合特异性相比更大(例如，大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)的亲和力和/或结合特异性与TCRβV12结合。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子以与如美国专利5,861,155所述的16G8鼠抗体或其人源化变化形式的亲和力和/或结合特异性相比更大(例如，大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)的亲和力和/或结合特异性与除TCRβV12以外的TCRβV区(例如，如本文所述的TCRβV区，例如，TCRβV6亚家族(例如，TCRβV6-5*01))结合。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子不包含抗体B鼠抗体的CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子不与TCRβV5-5*01或TCRβV5-1*01结合，或以与如美国专利5,861,155所述的TM23鼠抗体或其人源化变化形式的亲和力和/或结合特异性相比更小(例如，小约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)的亲和力和/或结合特异性与TCRβV5-5*01或TCRβV5-1*01结合。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子以与如美国专利5,861,155所述的TM23鼠抗体或其人源化变化形式的亲和力和/或结合特异性相比更大(例如，大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)的亲和力和/或结合特异性与TCRβV5-5*01或TCRβV5-1*01结合。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子以与如美国专利5,861,155所述的TM23鼠抗体或其人源化变化形式的亲和力和/或结合特异性相比更大(例如，大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约2、5或10倍)的亲和力和/或结合特异性与除TCRβV5-5*01或TCRβV5-1*01以外的TCRβV区(例如，如本文所述的TCRβV区，例如，TCRβV6亚家族(例如，TCRβV6-5*01)结合。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子不包括TM23鼠抗体的CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子的轻链或重链可变框架(例如，包括至少FR1、FR2、FR3和任选FR4的区域)可以选自：(a)轻链或重链可变框架，包括至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％的来自人轻链或重链可变框架的氨基酸残基，例如来自人成熟抗体、人种系序列或人共有序列的轻链或重链可变框架残基；(b)轻链或重链可变框架，包括20％至80％、40％至60％、60％至90％或70％至95％的来自人轻链或重链可变框架的氨基酸残基，例如来自人成熟抗体、人种系序列或人共有序列的轻链或重链可变框架残基；(c)非人框架(例如，啮齿动物框架)；或(d)已被修饰的非人框架，例如去除抗原或细胞毒性决定簇，例如去免疫或部分人源化的非人框架。在一些实施方案中，轻链或重链可变框架区(特别是FR1、FR2和/或FR3)包括与人种系基因的VL或VH区段的框架相同或至少70％、75％、80％、85％、87％、88％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的轻链或重链可变框架序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含重链可变结构域，所述重链可变结构域与A-H.1至A-H.85中任一者的氨基酸序列(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，例如整个可变区中的FR区的氨基酸序列，例如，图2A或SEQ IDNO:9中所示)相比具有至少一、二、三、四、五、六、七、十、十五、二十或更多个变化，例如氨基酸置换或缺失。
可替代地，或与本文所述的重链置换组合，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域与A-H.1至A-H.85中任一者的氨基酸序列(例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，例如整个可变区中的FR区的氨基酸序列，例如，图2B或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所示)相比具有至少一、二、三、四、五、六、七、十、十五、二十或更多个氨基酸变化，例如氨基酸置换或缺失。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括如图2A所示的一个、两个、三个或四个重链框架区，或与其基本相同的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括如图2B所示的一个、两个、三个或四个轻链框架区，或与其基本相同的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括例如如图2B所示的A-H.1或A-H.2的轻链框架区1。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括例如如图2B所示的A-H.1或A-H.2的轻链框架区2。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括例如如图2B所示的A-H.1或A-H.2的轻链框架区3。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括例如如图2B所示的A-H.1或A-H.2的轻链框架区4。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含轻链可变结构域，其包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包括改变，例如根据Kabat编号在位置10处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR1在位置10处包含苯丙氨酸，例如丝氨酸至苯丙氨酸的置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含轻链可变结构域，其包含框架区，例如框架区2(FR2)，所述框架区包括改变，例如根据Kabat编号在如本文所述的位置处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR2在位置36处包含组氨酸，例如根据Kabat编号在位置36处的置换，例如酪氨酸至组氨酸的置换。在一些实施方案中，FR2在位置46处包含丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置46处的置换，例如精氨酸至丙氨酸的置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含轻链可变结构域，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包括改变，例如根据Kabat编号在如本文所述的位置处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR3在位置87处包含苯丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置87处的置换，例如酪氨酸至苯丙氨酸的置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包括：(a)框架区1(FR1)，其在位置10处包含苯丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置10处的置换，例如丝氨酸至苯丙氨酸的置换；(b)框架区2(FR2)，其在位置36处包含组氨酸，例如根据Kabat编号在位置36处的置换，例如酪氨酸至组氨酸的置换，并且在位置46处包含丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置46处的置换，例如精氨酸至丙氨酸的置换；和(c)框架区3(FR3)，其在位置87处包含苯丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置87处的置换，例如酪氨酸至苯丙氨酸的置换，例如，如SEQ ID NO:10的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包括：(a)框架区2(FR2)，其在位置36处包含组氨酸，例如根据Kabat编号在位置36处的置换，例如酪氨酸至组氨酸的置换，并且在位置46处包含丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置46处的置换，例如精氨酸至丙氨酸的置换；和(b)框架区3(FR3)，其在位置87处包含苯丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置87处的置换，例如酪氨酸至苯丙氨酸的置换，例如，如SEQ ID NO:11的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包括：(a)框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号在如本文所述的一个或多个(例如全部)位置处的改变，例如置换(例如保守置换)；(b)框架区2(FR2)，其包括根据Kabat编号在如本文所述的一个或多个(例如全部)位置处的改变，例如置换(例如保守置换)；以及(c)框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在如本文所述的一个或多个(例如全部)位置处的改变，例如置换(例如保守置换)。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括例如如图2A所示的A-H.1或A-H.2的重链框架区1。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括例如如图2A所示的A-H.1或A-H.2的重链框架区2。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括例如如图2A所示的A-H.1或A-H.2的重链框架区3。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括例如如图2A所示的A-H.1或A-H.2的重链框架区4。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含重链可变结构域，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包括改变，例如根据Kabat编号在如本文所述的位置处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR3在位置73处包含苏氨酸，例如根据Kabat编号在位置73处的置换，例如谷氨酸至苏氨酸的置换。在一些实施方案中，FR3在位置94处包含甘氨酸，例如根据Kabat编号在位置94处的置换，例如精氨酸至甘氨酸的置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系重链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含重链可变结构域，其包含框架区3(FR3)，所述框架区在位置73处包含苏氨酸，例如根据Kabat编号在位置73处的置换，例如谷氨酸至苏氨酸的置换，以及在位置94处包含甘氨酸，例如根据Kabat编号在位置94处的置换，例如精氨酸至甘氨酸的置换，例如，如SEQ IDNO:10的氨基酸序列所示。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括A-H.1或A-H.2的重链框架区1-4，例如SEQ ID NO:9或如图2A和2B所示。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括A-H.1的轻链框架区1-4，例如SEQ ID NO:10或如图2A和2B所示。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括A-H.2的轻链框架区1-4，例如SEQID NO:11或如图2A和2B所示。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括A-H.1的重链框架区1-4，例如SEQ ID NO:9；和A-H.1的轻链框架区1-4，例如SEQ ID NO:10，或如图2A和2B所示。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含A-H.2的重链框架区1-4，例如SEQ IDNO:9；和A-H.2的轻链框架区1-4，例如SEQ ID NO:11，或如图2A和2B所示。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子的重链或轻链可变结构域或两者包含氨基酸序列，其与如本文所述的氨基酸基本相同，例如与本文所述的抗体(例如，选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或如表1所述的抗体，或由表1的核苷酸序列编码的抗体)的可变区至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同；或与本文所述的抗体的可变区相差至少1或5个残基，但相差少于40、30、20或10个残基。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个抗原结合区(例如，可变区)，该抗原结合区具有如表1所列的氨基酸序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的序列，或与表1中所示序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的序列)。在另一实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括由具有表1所列的核苷酸序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的序列，或与表1中所示序列相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的序列)的核酸编码的VH和/或VL结构域。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括：VH结构域，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和/或VL结构域，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，与SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括：VH结构域，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，与SEQ ID NO:9的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和/或VL结构域，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是完整的抗体或其片段(例如，Fab、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体或单链Fv片段(scFv))。在实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是单克隆抗体或具有单一特异性的抗体。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，也可以是人源化的、嵌合的、骆驼的、鲨鱼的或体外产生的抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是人源化抗体分子。抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子的重链和轻链可以是全长的(例如，抗体可以包括至少一条，优选两条完整的重链，以及至少一条，优选两条完整的轻链)或可以包含抗原结合片段(例如，Fab、F(ab’)2、Fv、单链Fv片段、单结构域抗体、双抗体(dAb)、二价抗体，或双特异性抗体或其片段、其单结构域变体或骆驼抗体)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，呈多特异性分子形式，例如双特异性分子，例如如本文所述。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，具有选自以下中的重链恒定区(Fc)：例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区。在一些实施方案中，Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区。在一些实施方案中，Fc区选自IgG1或IgG2(例如人IgG1或IgG2)的重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区是人IgG1。在一些实施方案中，Fc区包括Fc区变体，例如，如本文所述。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如，抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子，具有选自以下中的轻链恒定区：例如κ或λ，优选κ(例如人κ)的轻链恒定区。在一些实施方案中，恒定区被改变，例如突变以修饰抗TCRβV抗体分子(例如抗TCRβV6(例如抗TCRβV6-5*01)抗体分子)的性质(例如，以增加或减少以下中的一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数量、效应细胞功能或补体功能)。例如，恒定区在位置296(M至Y)、298(S至T)、300(T至E)、477(H至K)和478(N至F)处突变以改变Fc受体结合(例如，突变位置对应于SEQ ID NO:212或214的位置132(M至Y)、134(S至T)、136(T至E)、313(H至K)和314(N至F)；或SEQ ID NO:215、216、217或218的位置135(M至Y)、137(S至T)、139(T至E)、316(H至K)和317(N至F)，例如相对于人IgG1。
抗体A-H.1包含：包含SEQ ID NO:3278的氨基酸序列的重链，以及包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链。抗体A-H.2包含：包含SEQ ID NO:3278的氨基酸序列的重链，以及包含SEQ ID NO:3279的氨基酸序列的轻链。抗体A-H.68包含SEQ ID NO:1337的氨基酸序列，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。抗体A-H.69包含SEQ ID NO:1500的氨基酸序列，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。
表1中提供了另外的示例性人源化抗TCRB V6抗体。在一些实施方案中，抗TCRβV6是抗体A，例如人源化抗体A(抗体A-H)，如表1中提供的。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包括表1中提供的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)；和/或表1中提供的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗体A包含表1中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含A-H.1、A-H.2、A-H.3、A-H.4、A-H.5、A-H.6、A-H.7、A-H.8、A-H.9、A-H.10、A-H.11、A-H.12、A-H.13、A-H.14、A-H.15、A-H.16、A-H.17、A-H.18、A-H.19、A-H.20、A-H.21、A-H.22、A-H.23、A-H.24、A-H.25、A-H.26、A-H.27、A-H.28、A-H.29、A-H.30、A-H.31、A-H.32、A-H.33、A-H.34、A-H.35、A-H.36、A-H.37、A-H.38、A-H.39、A-H.40、A-H.1、A-H.42、A-H.43、A-H.44、A-H.45、A-H.46、A-H.47、A-H.48、A-H.49、A-H.50、A-H.51、A-H.52、A-H.53、A-H.54、A-H.55、A-H.56、A-H.57、A-H.58、A-H.59、A-H.60、A-H.61、A-H.62、A-H.63、A-H.64、A-H.65、A-H.66、A-H.67、A-H.68、A-H.69、A-H.70、A-H.71、A-H.72、A-H.73、A-H.74、A-H.75、A-H.76、A-H.77、A-H.78、A-H.79、A-H.80、A-H.81、A-H.82、A-H.83、A-H.84或A-H.85的VH，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含A-H.1、A-H.2、A-H.3、A-H.4、A-H.5、A-H.6、A-H.7、A-H.8、A-H.9、A-H.10、A-H.11、A-H.12、A-H.13、A-H.14、A-H.15、A-H.16、A-H.17、A-H.18、A-H.19、A-H.20、A-H.21、A-H.22、A-H.23、A-H.24、A-H.25、A-H.26、A-H.27、A-H.28、A-H.29、A-H.30、A-H.31、A-H.32、A-H.33、A-H.34、A-H.35、A-H.36、A-H.37、A-H.38、A-H.39、A-H.40、A-H.1、A-H.42、A-H.43、A-H.44、A-H.45、A-H.46、A-H.47、A-H.48、A-H.49、A-H.50、A-H.51、A-H.52、A-H.53、A-H.54、A-H.55、A-H.56、A-H.57、A-H.58、A-H.59、A-H.60、A-H.61、A-H.62、A-H.63、A-H.64、A-H.65、A-H.66、A-H.67、A-H.68、A-H.69、A-H.70、A-H.71、A-H.72、A-H.73、A-H.74、A-H.75、A-H.76、A-H.77、A-H.78、A-H.79、A-H.80、A-H.81、A-H.82、A-H.83、A-H.84或A-H.85的VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含A-H.1、A-H.2、A-H.3、A-H.4、A-H.5、A-H.6、A-H.7、A-H.8、A-H.9、A-H.10、A-H.11、A-H.12、A-H.13、A-H.14、A-H.15、A-H.16、A-H.17、A-H.18、A-H.19、A-H.20、A-H.21、A-H.22、A-H.23、A-H.24、A-H.25、A-H.26、A-H.27、A-H.28、A-H.29、A-H.30、A-H.31、A-H.32、A-H.33、A-H.34、A-H.35、A-H.36、A-H.37、A-H.38、A-H.39、A-H.40、A-H.1、A-H.42、A-H.43、A-H.44、A-H.45、A-H.46、A-H.47、A-H.48、A-H.49、A-H.50、A-H.51、A-H.52、A-H.53、A-H.54、A-H.55、A-H.56、A-H.57、A-H.58、A-H.59、A-H.60、A-H.61、A-H.62、A-H.63、A-H.64、A-H.65、A-H.66、A-H.67、A-H.68、A-H.69、A-H.70、A-H.71、A-H.72、A-H.73、A-H.74、A-H.75、A-H.76、A-H.77、A-H.78、A-H.79、A-H.80、A-H.81、A-H.82、A-H.83、A-H.84或A-H.85的VH，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％97％、98％、99％或更高同一性的序列；和A-H.1、A-H.2、A-H.3、A-H.4、A-H.5、A-H.6、A-H.7、A-H.8、A-H.9、A-H.10、A-H.11、A-H.12、A-H.13、A-H.14、A-H.15、A-H.16、A-H.17、A-H.18、A-H.19、A-H.20、A-H.21、A-H.22、A-H.23、A-H.24、A-H.25、A-H.26、A-H.27、A-H.28、A-H.29、A-H.30、A-H.31、A-H.32、A-H.33、A-H.34、A-H.35、A-H.36、A-H.37、A-H.38、A-H.39、A-H.40、A-H.1、A-H.42、A-H.43、A-H.44、A-H.45、A-H.46、A-H.47、A-H.48、A-H.49、A-H.50、A-H.51、A-H.52、A-H.53、A-H.54、A-H.55、A-H.56、A-H.57、A-H.58、A-H.59、A-H.60、A-H.61、A-H.62、A-H.63、A-H.64、A-H.65、A-H.66、A-H.67、A-H.68、A-H.69、A-H.70、A-H.71、A-H.72、A-H.73、A-H.74、A-H.75、A-H.76、A-H.77、A-H.78、A-H.79、A-H.80、A-H.81、A-H.82、A-H.83、A-H.84或A-H.85的VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
表10A中公开了示例性抗TCRβV抗体分子和由所述抗TCRβV抗体分子识别的相应TCRβV亚家族。
各种TCRβV亚家族和/或亚家族成员可以在个体(例如，健康个体)中以不同水平表达，如Kitaura K.等人(2016),BMC Immunology第17卷:38所公开，其全部内容通过引用并入本文中。例如，TCRβV6-5在大约3-6％的健康供体中存在。
各种TCRBV亚家族和/或亚家族成员的表现在癌细胞中也可能不同。例如，TCRβV存在于约3-6％的肿瘤浸润性T细胞中，无论肿瘤类型如何(参见Li B.等人,NatureGenetics,2016,第48(7)卷:725-32，其全部内容通过引用并入本文中)。Li等人还公开了TCRβV6-5在肿瘤细胞中以高频率存在。
抗TCRβV6抗体
在一方面，本文提供了与人TCRβV6(例如，TCRβV6亚家族)结合的抗TCRβV抗体分子，所述TCRβV6亚家族包括：TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01。在一些实施方案中，TCRβV6亚家族包括TCRβV6-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-4*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-4*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-9*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-8*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-5*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-6*02或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-6*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-2*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-3*01或其变体。在一些实施方案中，TCRβV6包括TCRβV6-1*01或其变体。
在一些实施方案中，TCRβV6-5*01由SEQ ID NO:43的核酸序列或与其具有85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列编码。在一些实施方案中，TCRβV6-5*01包含SEQ IDNO:44的氨基酸序列，或与其具有85％、90％、95％、99％或更高同一性的氨基酸序列编码。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是非鼠抗体分子，例如人或人源化抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是人抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是人源化抗体分子。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是分离的或重组的。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或由表1中的核苷酸序列编码的抗体，或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个抗原结合区，例如可变区或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或由表1中的核苷酸序列编码的抗体，或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个、两个、三个或四个可变区。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体分子，或由表1中的核苷酸序列编码的抗体，或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个或两个重链可变区。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子包含具有SEQ ID NO:231或3290的共有序列的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:231-共有VHQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGH/T/G/YD/T/SFH/R/D/K/TL/D/K/T/NW/F/T/I/Y/GYIHWVRQAPGQGLEWMGR/WV/I/FF/S/YA/PGSGN/ST/V/Y/IK/RYNEKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAG/VSY/IYSY/AD/GVLDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:3290-共有VH
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGX1X2FX3X4X5YIHWVRQAPGQGLEWMGX6X7X8X9GSGX10X11X1 2YNEKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAX13SX14YSX15X16VLDYWGQGTTVTVSS，其中：X1是H或T或G或Y；X2是D或T或S；X3是H或R或D或K或T；X4是L或D或K或T或N；X5是W或F或T或I或Y或G；X6是R或W；X7是V或I或F；X8是F或S或Y；X9是A或P；X10是N或S；X11是T或V或Y或I；X12是K或R；X13是G或V；X14是Y或I；X15是Y或A；并且X16是D或G。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或由表1中的核苷酸序列编码的抗体或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个或两个轻链可变区。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子包含具有SEQ ID NO:230或3289的共有序列的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:230-共有VL
DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVG/E/A/DN/DR/KVAWY/HQQKPGKAPKALIYSSSHRYK/SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQFKSYPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:3289-共有VL
DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVX1X2X3VAWX4QQKPGKAPKALIYSSSHRYX5GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQFKSYPLTFGQGTKLEIK，其中X1是G、E、A或D；X2是N或D；X3是R或K；X4是Y或H；并且X5是K或S。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括IgG4(例如人IgG4)的重链恒定区。在又一个实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括IgG1(例如人IgG1)的重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区包含表3中所示的氨基序列，或与其基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括κ轻链恒定区，例如人κ轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区包含表3中列出的氨基序列或与其基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或由表1中的核苷酸序列编码的抗体，或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区(VH)的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括来自包含表1所示氨基酸序列或由表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或所有CDR)。在一些实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或由表1中的核苷酸序列编码的抗体，或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括来自包含表1所示氨基酸序列或由表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或所有CDR)。在一些实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括来自包含表1所示氨基酸序列或由表1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或所有CDR)。在一些实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或由表1中的核苷酸序列编码的抗体)的所有六个CDR，或者包含密切相关的CDR，例如相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如置换、缺失、或插入，例如保守置换)的CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子可以包括本文所述的任何CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表1中列出的Kabat定义的至少一个、两个或三个CDR)；或者所述CDR相对于表1所示的根据Kabat等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，如保守置换)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表1中列出的Kabat定义的至少一个、两个或三个CDR)；或者所述CDR相对于表1所示的根据Kabat等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，如保守置换)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或由表1中的核苷酸序列编码的抗体；或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链和轻链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(例如，根据表1中列出的Kabat定义的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；或者所述CDR相对于表1所示的根据Kabat等人的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，如保守置换)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如，抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或由表1中的核苷酸序列编码的抗体；或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链和轻链可变区的根据Kabat等人的所有六个CDR(例如，根据表1中列出的Kabat定义的所有六个CDR)；或者所述CDR相对于表1所示的根据Kabat等人的所有六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，如保守置换)。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如，抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子可以包括本文所述的任何CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括具有与本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68)的相应高变环相同的规范结构(例如，与本文所述的抗体的重链和/或轻链可变结构域的至少环1和/或环2相同的规范结构)的至少一个、两个或三个高变环。对于高变环规范结构的描述，参见例如Chothia等人,(1992)J.Mol.Biol.227:799-817；Tomlinson等人,(1992)J.Mol.Biol.227:776-798。这些结构可以通过检查这些参考文献中描述的表格来确定。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或如表1中描述，或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的根据Chothia等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表1中列出的Chothia定义的至少一个、两个或三个CDR)；或者所述CDR相对于表1所示的根据Chothia等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，如保守置换)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的根据Chothia等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表1中列出的Chothia定义的至少一个、两个或三个CDR)；或者所述CDR相对于表1所示的根据Chothia等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，如保守置换)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如，抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或由表1中的核苷酸序列编码的抗体；或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链和轻链可变区的根据Chothia等人的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(例如，根据表1中列出的Chothia定义的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；或者所述CDR相对于表1所示的根据Chothia等人的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，如保守置换)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如选自A-H.1至A-H.85中任一者的抗体，例如A-H.1、A-H.2或A-H.68，或表1中描述的抗体，或由表1中的核苷酸序列编码的抗体；或与任何上述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链和轻链可变区的根据Chothia等人的所有六个CDR(例如，根据表1中列出的Chothia定义的所有六个CDR)；或者所述CDR相对于表1所示的根据Chothia等人的所有六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，如保守置换)。在一个实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子可以包括本文所述的任何CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，分子包括根据Kabat等人、Chothia等人定义或如表1所述的CDR或高变环的组合。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子可包含根据Kabat和Chothia定义的CDR或高变环的任何组合。
在一些实施方案中，如表1列出的组合的CDR是包括Kabat CDR和Chothia CDR的CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子，分子包括CDR或高变环的组合，其在表1中被标识为组合的CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子可包含根据表1中所述的“组合的”CDR的CDR或高变环的任何组合。
在一些实施方案中，例如在包含可变区、CDR(例如组合的CDR、Chothia CDR或Kabat CDR)或本文在例如表1中提及的其他序列的实施方案中，抗体分子是单特异性抗体分子、双特异性抗体分子、二价抗体分子、双互补位抗体分子，或包含抗体的抗原结合片段(例如，半抗体或半抗体的抗原结合片段)的抗体分子。在某些实施方案中，抗体分子包括多特异性分子，例如双特异性分子，例如，如本文所述的。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包括：(i)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个、两个或全部，和/或(ii)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个、两个或全部。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含SEQ ID NO:2的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，以及SEQ ID NO:1的HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含SEQ ID NO:10的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，以及SEQ ID NO:9的HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含SEQ ID NO:11的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，以及SEQ ID NO:9的HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含：(i)SEQ ID NO:6的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7的LC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:8的LC CDR3氨基酸序列；和/或(ii)SEQ ID NO:3的HC CDR1氨基酸序列、SEQ IDNO:4的HC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:5的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含：(i)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:6的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7的LC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:8的LC CDR3氨基酸序列；和/或(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:3的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:4的HC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:5的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含：(i)SEQ ID NO:51的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:52的LC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:53的LC CDR3氨基酸序列；和/或(ii)SEQ ID NO:45的HC CDR1氨基酸序列、SEQID NO:46的HC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:47的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含：(i)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:51的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:52的LC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:53的LC CDR3氨基酸序列；和/或(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:45的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:46的HC CDR2氨基酸序列或SEQ IDNO:47的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含：(i)SEQ ID NO:54的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:55的LC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:56的LC CDR3氨基酸序列；和/或(ii)SEQ ID NO:48的HC CDR1氨基酸序列、SEQID NO:49的HC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:50的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含：(i)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:54的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:55的LC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:56的LC CDR3氨基酸序列；和/或(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:48的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:49的HC CDR2氨基酸序列或SEQ IDNO:50的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含表1中所述的抗体的VH和/或VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子包含表1中所述的抗体的VH和VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRVb抗体具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有含有SEQ ID NO:230的共有序列的VL，其中位置30是G、E、A或D；位置31是N或D；位置32是R或K；位置36是Y或H；并且/或者位置56是K或S。
在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRVb抗体具有抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有含有SEQ ID NO:231的共有序列的VH，其中：位置27是H或T或G或Y；位置28是D或T或S；位置30是H或R或D或K或T；位置31是L或D或K或T或N；位置32是W或F或T或I或Y或G；位置49是R或W；位置50是V或I或F；位置51是F或S或Y；位置52是A或P；位置56是N或S；位置57是T或V或Y或I；位置58是K或R；位置97为G或V；位置99是Y或I；位置102是Y或A；并且/或者位置103是D或G。
抗TCRβV12抗体
在一方面，本文提供了与人TCRβV12例如TCRβV12亚家族结合的抗TCRβV抗体分子，所述TCRβV12亚家族包括：TCRβV12-4*01、TCRβV12-3*01或TCRβV12-5*01。在一些实施方案中，TCRβV12亚家族包括TCRβV12-4*01。在一些实施方案中，TCRβV12亚家族包括TCRβV12-3*01。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子例如抗TCRβV12抗体分子是非鼠抗体分子，例如人或人源化抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子例如抗TCRβV12抗体分子是人抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子例如抗TCRβV12抗体分子是人源化抗体分子。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子例如抗TCRβV12抗体分子是分离的或重组的。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如，表2中所述抗体，或由表2中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个抗原结合区，例如可变区或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如，如表2中所述的抗体，或由表2中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个、两个、三个或四个可变区。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如，如表2中所述的抗体，或由表2中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个或两个重链可变区。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如，如表2中所述的抗体，或由表2中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的至少一个或两个轻链可变区。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含IgG4(例如人IgG4)的重链恒定区。在另一实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含IgG1(例如人IgG1)的重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区包含表3中所示的氨基酸序列，或与其基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括κ轻链恒定区，例如人κ轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区包含表3中所示的氨基酸序列，或与其基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如，表2中所述抗体，或由表2中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自包含表2中所示的氨基酸序列或由表2中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或所有CDR)。在一些实施方案中，相对于表2中所示的氨基酸序列，或由表2中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含来自本文所述的抗体(例如，表2中所述抗体，或由表2中的核苷酸序列编码的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自包含表2中所示的氨基酸序列或由表2中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR(或所有CDR)。在一些实施方案中，相对于表2中所示的氨基酸序列，或由表2中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自包含表2中所示的氨基酸序列或由表2中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或所有CDR)。在一些实施方案中，相对于表2中所示的氨基酸序列，或由表2中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或所有CDR)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸置换或缺失。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述的抗体，或由表2中的核苷酸序列编码的抗体)的所有六个CDR，或密切相关的CDR，例如相同CDR或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子可以包括本文所述的任何CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如如表2中所述选择的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表2所列的Kabat定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2中所示的根据Kabat等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表2所列的Kabat定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2中所示的根据Kabat等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述的抗体，或由表2中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链和轻链可变区的根据Kabat等人的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(例如，根据表2所列的Kabat定义的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；或相对于表2中所示的根据Kabat等人的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述的抗体，或由表2中的核苷酸序列编码的抗体；或由表2中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链和轻链可变区的根据Kabat等人的所有六个CDR(例如，根据表2所列的Kabat定义的所有六个CDR)；或相对于表2中所示的根据Kabat等人的所有六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的所有六个CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子可以包括本文所述的任何CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括具有与本文所述抗体(例如表2中所述的抗体)的相应高变环相同的规范结构的至少一个、两个或三个高变环，例如与本文所述抗体的重链和/或轻链可变结构域的至少环1和/或环2相同的规范结构。对于高变环规范结构的描述参见，例如Chothia等人,(1992)J.Mol.Biol.227:799-817；Tomlinson等人,(1992)J.Mol.Biol.227:776-798。这些结构可以通过查看这些参考文献中描述的表来确定。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述选择的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的根据Chothia等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表2所列的Chothia定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2中所示的根据Chothia等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的根据Chothia等人的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表2所列的Chothia定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2中所示的根据Chothia等人的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述的抗体，或由表2中的核苷酸编码的抗体；或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链和轻链可变区的根据Chothia等人的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(例如，根据表2所列的Chothia定义的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；或相对于表2中所示的根据Chothia等人的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述的抗体，或由表2中的核苷酸序列编码的抗体；或由表2中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链和轻链可变区的根据Chothia等人的所有六个CDR(例如，根据表2所列的Kabat定义的所有六个CDR)；或相对于表2中所示的根据Chothia等人的所有六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的所有六个CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子可以包括本文所述的任何CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述选择的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链可变区的根据组合的CDR的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表2所列的组合的CDR定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2中所示的根据组合的CDR的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述的抗体，或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的轻链可变区的根据组合的CDR的至少一个、两个或三个CDR(例如，根据表2所列的组合的CDR定义的至少一个、两个或三个CDR)；或相对于表2中所示的根据组合的CDR的一个、两个或三个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个或三个CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述的抗体，或由表2中的核苷酸编码的抗体；或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链和轻链可变区的根据组合的CDR的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(例如，根据表2所列的组合的CDR定义的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR)；或相对于表2中所示的根据组合的CDR的一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括来自本文所述抗体(例如表2中所述的抗体，或由表2中的核苷酸序列编码的抗体；或由表2中的核苷酸序列编码的抗体；或与前述序列中的任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同)的序列)的重链和轻链可变区的根据组合的CDR的所有六个CDR(例如，根据表2所列的组合的CDR定义的所有六个CDR)；或相对于表2中所示的根据组合的CDR的所有六个CDR具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的所有六个CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子可以包括本文所述的任何CDR。
在一些实施方案中，表1中所列出的组合的CDR为包括Kabat CDR和Chothia CDR的CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，分子包括CDR或高变环的组合，其在表1中被标识为组合的CDR。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，可以包含CDR或高变环的任何组合，如表1中所述的“组合的”CDR。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括根据Kabat等人和Chothia等人定义的或如表1所述的CDR或高变环的组合。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子，可以包含根据Kabat和Chothia定义的CDR或高变环的任何组合。
在一些实施方案中，例如在包含可变区、CDR(例如组合的CDR、Chothia CDR或Kabat CDR)或本文在例如表2中提及的其他序列的实施方案中，抗体分子是单特异性抗体分子、双特异性抗体分子、二价抗体分子、双互补位抗体分子，或包含抗体的抗原结合片段(例如，半抗体或半抗体的抗原结合片段)的抗体分子。在某些实施方案中，抗体分子包括多特异性分子，例如双特异性分子，例如，如本文所述的。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：(i)SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个、两个或全部，和/或(ii)SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个、两个或全部。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：(i)SEQ IDNO:20的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:21的LC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:22的LCCDR3氨基酸序列；和/或(ii)SEQ ID NO:17的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:18的HC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:19的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：(i)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:20的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:21的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:2的LC CDR3氨基酸序列；和/或(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:17的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:18的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:19的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：(i)SEQ IDNO:63的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:64的LC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:65的LCCDR3氨基酸序列；和/或(ii)SEQ ID NO:57的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:58的HC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:59的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：(i)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:63的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:64的LC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:65的LC CDR3氨基酸序列；和/或(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:57的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:58的HC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:59的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：(i)SEQ IDNO:66的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:67的LC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:68的LCCDR3氨基酸序列；和/或(ii)SEQ ID NO:60的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:61的HC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:62的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：(i)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:63的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:64的LC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:65的LC CDR3氨基酸序列；和/或(ii)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:57的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:58的HC CDR2氨基酸序列或SEQ ID NO:59的HC CDR3氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子的轻链或重链可变框架(例如，包括至少FR1、FR2、FR3和任选地FR4的区域)可以选自：(a)轻链或重链可变框架，包括至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或100％的来自人轻链或重链可变框架的氨基酸残基，例如来自人成熟抗体、人种系序列或人共有序列的轻链或重链可变框架残基；(b)轻链或重链可变框架，包括20％至80％、40％至60％、60％至90％或70％至95％的来自人轻链或重链可变框架的氨基酸残基，例如来自人成熟抗体、人种系序列或人共有序列的轻链或重链可变框架残基；(c)非人框架(例如，啮齿动物框架)；或(d)已被修饰的非人框架，例如去除抗原或细胞毒性决定簇，例如去免疫或部分人源化的非人框架。在一些实施方案中，轻链或重链可变框架区(特别是FR1、FR2和/或FR3)包括与人种系基因的VL或VH区段的框架相同或至少70、75、80、85、87、88、90、92、94、95、96、97、98、99％相同的轻链或重链可变框架序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含重链可变结构域，其相对于表2所述氨基酸序列，例如整个可变区(例如图3A和3B所示)中的FR区的氨基酸序列，或SEQ ID NO:23-25中的氨基酸序列，具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十五个、二十个或更多个改变(例如，氨基酸置换或缺失)。
可替代地，或与本文所述的重链置换组合，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含轻链可变结构域，其相对于本文所述抗体的氨基酸序列，例如整个可变区(例如图3A和3B所示)中的FR区的氨基酸序列，或SEQ ID NO:26-30中的氨基酸序列，具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、十个、十五个、二十个或更多个氨基酸改变(例如氨基酸置换或缺失)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括如图3A所示的一个、两个、三个或四个重链框架区，或与其基本相同的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括如图3B所示的一个、两个、三个或四个轻链框架区，或与其基本相同的序列。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括例如如图3B所示的轻链框架区1。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括例如如图3B所示的轻链框架区2。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含例如如图3B所示的轻链框架区3。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括例如如图3B所示的轻链框架区4。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，其包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包括改变，例如根据Kabat编号在如本文所述的一个或多个(例如，所有)位置处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR1在位置1处包含天冬氨酸，例如根据Kabat编号在位置1处的置换，例如丙氨酸至天冬氨酸置换。在一些实施方案中，FR1在位置2处包含天冬酰胺，例如根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换、丝氨酸至天冬酰胺置换或酪氨酸至天冬酰胺置换。在一些实施方案中，FR1在位置4处包含亮氨酸，例如根据Kabat编号在位置4处的置换，例如蛋氨酸至亮氨酸置换。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，其包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置1处的置换，例如丙氨酸至天冬氨酸置换；根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换、丝氨酸至天冬酰胺置换或酪氨酸至天冬酰胺置换；和根据Kabat编号在位置4处的置换，例如蛋氨酸至亮氨酸置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，其包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置1处的置换，例如丙氨酸至天冬氨酸置换；和根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换、丝氨酸至天冬酰胺置换或酪氨酸至天冬酰胺置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，其包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置1处的置换，例如丙氨酸至天冬氨酸置换；和根据Kabat编号在位置4处的置换，例如蛋氨酸至亮氨酸置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，其包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换、丝氨酸至天冬酰胺置换或酪氨酸至天冬酰胺置换；和根据Kabat编号在位置4处的置换，例如蛋氨酸至亮氨酸置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包括改变，例如根据Kabat编号在如本文所述的一个或多个(例如，所有)位置处的置换(例如，保守置换)。在一些实施方案中，FR3在位置66处包含甘氨酸，例如根据Kabat编号在位置66处的置换，例如赖氨酸至甘氨酸置换，或丝氨酸至甘氨酸置换。在一些实施方案中，FR3在位置69处包含天冬酰胺，例如根据Kabat编号在位置69处的置换，例如酪氨酸至天冬酰胺置换。在一些实施方案中，FR3在位置71处包含酪氨酸，例如根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，或丙氨酸至酪氨酸置换。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置66处的置换，例如赖氨酸至甘氨酸置换，或丝氨酸至甘氨酸置换；和根据Kabat编号在位置69处的置换，例如酪氨酸至天冬酰胺置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置66处的置换，例如赖氨酸至甘氨酸置换，或丝氨酸至甘氨酸置换；和根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，或丙氨酸至酪氨酸置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置69处的置换，例如酪氨酸至天冬酰胺置换；和根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，或丙氨酸至酪氨酸置换。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，其包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包括根据Kabat编号在位置66处的置换，例如赖氨酸至甘氨酸置换，或丝氨酸至甘氨酸置换；根据Kabat编号在位置69处的置换，例如酪氨酸至天冬酰胺置换；和根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，或丙氨酸至酪氨酸置换。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，所述轻链包含：框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换；以及框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在位置69处的置换，例如苏氨酸至天冬酰胺置换，和根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，例如如SEQ IDNO:26的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，所述轻链包含：(a)框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号在位置1处的置换，例如丙氨酸至天冬氨酸置换，以及根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸至天冬酰胺置换；和(b)框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在位置69处的置换，例如苏氨酸至天冬酰胺置换，以及根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，例如如SEQ ID NO:27的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，所述轻链包含：(a)框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号在位置2处的置换，例如丝氨酸至天冬酰胺置换，以及根据Kabat编号在位置4处的置换，例如蛋氨酸至亮氨酸置换；和(b)框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在位置69处的置换，例如苏氨酸至天冬酰胺置换，以及根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸至酪氨酸置换，例如如SEQ ID NO:28的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，所述轻链包含：(a)框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号在位置2处的置换，例如丝氨酸至天冬酰胺置换；以及(b)框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在位置66处的置换，例如赖氨酸至甘氨酸置换；根据Kabat编号在位置69处的置换，例如苏氨酸至天冬酰胺置换，以及根据Kabat编号在位置71处的置换，例如丙氨酸至酪氨酸置换，例如如SEQ ID NO:29的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链，所述轻链包含：(a)框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号在位置2处的置换，例如酪氨酸至天冬酰胺置换；以及(b)框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在位置66处的置换，例如丝氨酸至甘氨酸置换；根据Kabat编号在位置69处的置换，例如苏氨酸至天冬酰胺置换；和根据Kabat编号在位置71处的置换，例如丙氨酸至酪氨酸置换，例如如SEQ ID NO:29的氨基酸序列所示。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含：(a)框架区1(FR1)，其包括根据Kabat编号的在如本文所述的一个或多个(例如，所有)位置处的改变，例如置换(例如保守置换)；和(b)框架区3(FR3)，其包括根据Kabat编号在如本文所述的一个或多个(例如，所有)位置处的改变，例如置换(例如保守置换)。在一些实施方案中，置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括例如如图3A所示的重链框架区1。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括例如如图3A所示的重链框架区2。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括例如如图3A所示的重链框架区3。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括例如如图3A所示的重链框架区4。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括重链框架区1-4，例如SEQ ID NO:20-23或如图3A所示。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括轻链框架区1-4，例如SEQID NO:26-30或如图3B所示。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括重链框架区1-4，例如SEQ ID NO:23-25；和轻链框架区1-4，例如SEQ ID NO:26-30，或如图3A和3B所示的。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子的重链或轻链可变结构域或两者包含氨基酸序列，其与如本文所述的氨基酸基本相同，例如与本文所述抗体(例如，表2所述的抗体，或由表2的核苷酸序列编码的抗体)的可变区至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更加相同；或与本文所述抗体的可变区相差至少1或5个残基，但相差少于40、30、20或10个残基。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个抗原结合区(例如，可变区)，所述抗原结合区具有表2所列的氨基酸序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的序列，或与表2中所示序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的序列)。在另一实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括由具有表2所列的核苷酸序列或与其基本相同的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的序列，或与表2中所示序列相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的序列)的核酸编码的VH和/或VL结构域。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括：VH结构域，其包含选自以下中的氨基酸序列：SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和/或VL结构域，其包含选自以下中的氨基酸序列：SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQID NO:30的氨基酸序列，与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸序列至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括：VH结构域，其包含：SEQ ID NO:23的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:23至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:23的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含：SEQ ID NO:26的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:26至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括：VH结构域，其包含：SEQ ID NO:23的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:23至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:23的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含：SEQ ID NO:27的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:27至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:27的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括：VH结构域，其包含：SEQ ID NO:23的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:23至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:23的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含：SEQ ID NO:28的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:28至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:28的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括：VH结构域，其包含：SEQ ID NO:23的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:23至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:23的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含：SEQ ID NO:29的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:29至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:29的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包括：VH结构域，其包含：SEQ ID NO:23的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:23至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:23的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含：SEQ ID NO:30的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:30至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:30的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:24或25至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:26至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:24或25至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:27至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:24或25至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:28至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:24或25至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:29至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:24或25至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:24或25的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:30至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:30的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:25或23的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:25或23至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25或23的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:26至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:26的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:25或23的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:25或23至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25或23的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:27至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:27的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:25或23的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:25或23至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25或23的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:28至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:25或23的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:25或23至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25或23的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:29至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:29的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子包含：VH结构域，其包含SEQ ID NO:25或23的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:25或23至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:25或23的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，与氨基酸序列SEQ ID NO:30至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:30的氨基酸序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子是完整的抗体或其片段(例如，Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV6(例如，抗TCRβV6-5*01)抗体分子是单克隆抗体或具有单一特异性的抗体。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子也可以是人源化的、嵌合的、骆驼的、鲨鱼的或体外产生的抗体分子。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子是人源化抗体分子。抗TCRβV抗体分子例如抗TCRβV12抗体分子的重链和轻链可以是全长的(例如，抗体可以包括至少一条，优选两条完整的重链，以及至少一条，优选两条完整的轻链)或可以包含抗原结合片段(例如Fab、F(ab’)2、Fv、单链Fv片段、单结构域抗体、双抗体(dAb)、二价抗体，或双特异性抗体或其片段、其单结构域变体或骆驼抗体)。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子为多特异性分子的形式，例如双特异性分子，例如，如本文所述的。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子具有选自以下中的重链恒定区(Fc)：例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区。在一些实施方案中，Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区。在一些实施方案中，Fc区选自IgG1或IgG2(例如，人IgG1或IgG2)的重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区是人IgG1。
在一些实施方案中，抗TCRβV抗体分子，例如抗TCRβV12抗体分子具有选自以下中的轻链恒定区：例如κ或λ，优选κ(例如人κ)的轻链恒定区。在一些实施方案中，恒定区被改变，例如突变，以修饰抗TCRβV抗体分子例如抗TCRβV12抗体分子的性质(例如，增加或减少以下中的一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能)。例如，恒定区在位置296(M至Y)、298(S至T)、300(T至E)、477(H至K)和478(N至F)处发生突变，以改变Fc受体结合(例如，突变位置对应于SEQ ID NO：212或214的位置132(M至Y)、134(S至T)、136(T至E)、313(H至K)和314(N至F)；或SEQ ID NO：215、216、217或218的位置135(M至Y)、137(S至T)、139(T至E)、316(H至K)和317(N至F))。
抗体B-H.1包含有包含SEQ ID NO:3280的氨基酸序列的第一链和包含SEQ ID NO:3281的氨基酸序列的第二链。
表2中提供了另外的示例性抗TCRβV12抗体。在一些实施方案中，抗TCRβV12是抗体B，例如人源化抗体B(抗体B-H)，如表2中提供的。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包含表2中提供的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)；和/或表2中提供的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)，或与其具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗体B包含表2中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRVB 12抗体分子(例如，抗TCRVB 12-3或抗TCRVB 12-4抗体分子)包含B-H.1A、B-H.1B、B-H.1C、B-H.1D、B-H.1E、B-H.1F、B-H.1G、B-H.1H、B-H.1、B-H.2、B-H.3、B-H.4、B-H.5或B-H.6的VH，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRVB 12抗体分子(例如，抗TCRVB 12-3或抗TCRVB 12-4抗体分子)包含B-H.1A、B-H.1B、B-H.1C、B-H.1D、B-H.1E、B-H.1F、B-H.1G、B-H.1H、B-H.1、B-H.2、B-H.3、B-H.4、B-H.5或B-H.6的VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRVB 12抗体分子(例如，抗TCRVB 12-3或抗TCRVB 12-4抗体分子)包含B-H.1A、B-H.1B、B-H.1C、B-H.1D、B-H.1E、B-H.1F、B-H.1G、B-H.1H、B-H.1、B-H.2、B-H.3、B-H.4、B-H.5或B-H.6的VH，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列；以及B-H.1A、B-H.1B、B-H.1C、B-H.1D、B-H.1E、B-H.1F、B-H.1G、B-H.1H、B-H.1、B-H.2、B-H.3、B-H.4、B-H.5或B-H.6的VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
抗TCRβV5抗体
在一方面，本文提供了与人TCRβV5结合的抗TCRβV抗体分子。在一些实施方案中，TCRβV5亚家族包括TCRβV5-5*01、TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01、TCRβV5-8*01、TCRβV5-1*01或其变体。
表10B中提供了示例性抗TCRβV5抗体。在一些实施方案中，抗TCRβV5是抗体C，例如人源化抗体C(抗体C-H)，如表10B中提供的。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包含表10B中提供的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)；和/或表10B中提供的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)，或与其具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗体C包含表10B中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少95％序列同一性的序列。
表11中提供了示例性抗TCRβV5抗体。在一些实施方案中，抗TCRβV5是抗体E，例如人源化抗体E(抗体E-H)，如表11中提供的。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包含表11中提供的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)；和/或表11中提供的HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)，或与其具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗体E包含表11中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗体E包含有包含SEQ ID NO:3284的氨基酸序列的重链和/或包含SEQ ID NO:3285的氨基酸序列的轻链，或与其具有至少95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV5抗体分子包含表10B中所述抗体的VH和/或VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV5抗体分子包含表10B中所述抗体的VH和VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV5抗体分子包含表11中所述抗体的VH和/或VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV5抗体分子包含表11中所述抗体的VH和VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
抗TCRβV10抗体
在一方面，本文提供了与人TCRβV10亚家族成员结合的抗TCRβV抗体分子。在一些实施方案中，TCRβV10亚家族也称为TCRβV12。在一些实施方案中，TCRβV10亚家族包括：TCRβV10-1*01、TCRβV10-1*02、TCRβV10-3*01或TCRβV10-2*01或其变体。
表12中提供了示例性抗TCRβV10抗体。在一些实施方案中，抗TCRβV10是抗体D，例如人源化抗体D(抗体D-H)，如表12中提供的。在一些实施方案中，抗体D包含表12中提供的一个或多个(例如三个)轻链CDR和/或一个或多个(例如三个)重链CDR，或与其具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗体D包含表12中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少95％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV10抗体分子包含表12中所述抗体的VH或VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，抗TCRβV10抗体分子包含表12中所述抗体的VH和VL，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
另外的抗TCRVβ抗体
表13中提供了另外的示例性抗TCRβV抗体。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体是人源化抗体，例如，如表13中提供的。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包含表13中提供的LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)；和/或表13中提供的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个或多个(例如，所有三个)，或与其具有至少95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗TCRβV抗体包含表13中提供的可变重链(VH)和/或可变轻链(VL)，或与其具有至少95％序列同一性的序列。
抗体样框架或支架
多种抗体/免疫球蛋白框架或支架可用于如本文所述的抗TCRvb抗体分子或其多功能形式，只要所得多肽包括至少一个与靶抗原例如TCRvb、肿瘤抗原等特异性结合的结合区。这样的框架或支架包括人免疫球蛋白或其片段的5种主要独特型，并且包括其他动物物种优选具有人源化方面的免疫球蛋白。本领域技术人员会继续发现和开发新颖的框架、支架和片段。
在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRvb抗体分子或其多功能形式包括采用其上可接枝CDR的非免疫球蛋白支架的基于非免疫球蛋白的抗体。可以使用任何非免疫球蛋白框架和支架，只要它们包含对靶抗原(例如，TCRvb或肿瘤抗原)具有特异性的结合区即可。示例性的非免疫球蛋白框架或支架包括但不限于纤连蛋白(Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,MA)、锚蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、域抗体(Domantis,Ltd.,Cambridge,MA,和Ablynx nv,Zwijnaarde,Belgium)、脂质运载蛋白(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模块免疫药物(Trubion PharmaceuticalsInc.,Seattle,WA)、超大抗体(maxybody)(Avidia,Inc.,Mountain View,CA)、A蛋白(Affibody AG,Sweden)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmB-H,Halle,Germany)。
纤连蛋白支架通常基于纤连蛋白III型结构域(例如，纤连蛋白III型的第十模块(10Fn3结构域))。纤连蛋白III型结构域具有分布在两个β片层之间的7或8个β链，它们自身相互堆积形成蛋白质的核，并且进一步包含将β链彼此连接的环(类似于CDR)并暴露在溶剂中。β片层夹心结构的每个边缘上至少有三个这样的环，其中该边缘是垂直于β链方向的蛋白质的边界(参见US 6,818,418)。由于这种结构，非免疫球蛋白抗体模仿了在本质和亲和力上与抗体相似的抗原结合特性。这些支架可用于类似于体内抗体亲和力成熟的过程的体外环随机化和改组策略(shuffling strategy)。这些基于纤连蛋白的分子可以用作支架，其中可以使用标准克隆技术将分子的环区替换为本发明的CDR。
锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白衍生的重复模块的蛋白质作为带有可变区的支架，该可变区可用于结合不同的靶标。锚蛋白重复模块通常是由两个反平行的α-螺旋和β-转角组成的约33个氨基酸的多肽。可变区的结合可以通过使用核糖体展示来优化。
Avimer根据性质被用于蛋白质与蛋白质的相互作用，在人类中，超过250种蛋白质在结构上基于A结构域。Avimer由通过氨基酸接头连接的许多不同的“A结构域”单体(2-10个)组成。可以使用例如在美国专利申请公开号20040175756；20050053973；20050048512；和20060008844中描述的方法来产生可以与靶抗原结合的Avimer。
亲合体亲和配体是由基于A蛋白的IgG结合结构域之一的支架的三螺旋束组成的简单的小蛋白质。A蛋白是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个氨基酸被随机化以生成具有大量配体变体的亲和体文库(参见例如US 5,831,012)。亲合体分子模仿抗体，它们的分子量为6kDa，相比之下，抗体的分子量为150kDa。尽管体积小，但亲和体分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
抗运载蛋白在商业上是已知的，例如Pieris ProteoLab AG。它们衍生自脂质运载蛋白，脂质运载蛋白是一类广泛的小而稳健的蛋白质，通常参与化学敏感化合物或不溶性化合物的生理转运或存储。在人体组织或体液中存在几种天然脂质运载蛋白。蛋白质结构让人联想到免疫球蛋白，其在刚性框架的顶部具有高变环。但是，与抗体或其重组片段相反，脂质运载蛋白由具有160至180个氨基酸残基的单个多肽链组成，仅比单个免疫球蛋白结构域略大。四个环的组合构成结合袋，具有明显的结构可塑性，并能承受各种侧链。结合位点因此可以在专有方法中重塑，以便以高亲和力和特异性识别规定的不同形状的靶分子。脂质运载蛋白家族的一种蛋白，芸苔菜粉蝶(Pieris Brassicae)的后胆色素结合蛋白(BBP)，已通过诱变四个环的组合而被用于开发抗运载蛋白。在PCT公开号WO 199916873中描述抗运载蛋白的专利申请的一个实例。
Affilin分子是小的非免疫球蛋白蛋白质，旨在与蛋白质和小分子形成特定亲和力。新的affilin分子可以从两个文库中快速选择，每个文库均基于不同的人源支架蛋白。Affilin分子与免疫球蛋白蛋白质没有任何结构同源性。当前，使用两种affilin支架，其中一种是γ晶体，是人的结构性晶状体蛋白，而另一种是“泛素”超家族蛋白。两种人类支架都非常小，显示出高温稳定性，并且几乎能抵抗pH值变化和变性剂。这种高稳定性主要归因于蛋白质的扩展的β片层结构。γ晶体衍生的蛋白质的实例描述于WO200104144中，并且“泛素样”蛋白的实例描述于WO2004106368中。
蛋白质表位模拟物(PEM)是模拟蛋白质的β-发夹二级结构的中型环状肽样分子(MW 1-2kDa)，该二级结构是参与蛋白质与蛋白质的相互作用的主要二级结构。
域抗体(dAb)可用于如本文所述的抗TCRvb抗体分子或其多功能形式中，是抗体的小功能结合片段，对应于抗体重链或轻链的可变区。域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中表达良好。域抗体的进一步细节及其生产方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；欧洲专利0368684&0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609。纳米抗体衍生自抗体的重链。
纳米抗体通常包含单个可变结构域和两个恒定结构域(CH2和CH3)，并保留原始抗体的抗原结合能力。纳米抗体可以通过本领域已知的方法制备(参见例如美国专利号6,765,087、美国专利号6,838,254、WO 06/079372)。单抗体(Unibodies)由IgG4抗体的一条轻链和一条重链组成。可通过去除IgG4抗体的铰链区来制备单抗体。单抗体的进一步细节及其制备方法可在WO2007/059782中找到。
抗TCRVβ抗体效应子功能和Fc变体
在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRVβ抗体包含Fc区，例如，如本文所述。在一些实施方案中，Fc区是野生型Fc区，例如野生型人Fc区。在一些实施方案中，Fc区包含变体，例如在Fc区中包含至少一个氨基酸残基的添加、置换或缺失的Fc区，这使得例如对至少一种Fc受体的亲和力降低或消除。
抗体的Fc区与许多受体或配体相互作用，所述受体或配体包括Fc受体(例如，FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA)、补体蛋白CIq以及其他分子，诸如蛋白质A和G。这些相互作用对于多种效应子功能和下游信号传导事件是必需的，包括：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗TCRVβ抗体对Fc受体(例如本文所述的Fc受体)具有降低的(例如消除的)亲和力。在一些实施方案中，将降低的亲和力与具有野生型Fc区的在其他方面相似的抗体进行比较。
在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗TCRVβ抗体具有特性中的一种或多种：(1)效应子功能降低(例如，ADCC、ADCP和/或CDC降低)；(2)与一种或多种Fc受体的结合减少；和/或(3)与C1q补体的结合减少。在一些实施方案中，将特性(1)-(3)中的任何一者或全部的降低与具有野生型Fc区的在其他方面相似的抗体进行比较。
在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗TCRVβ抗体对人Fc受体例如FcγRI、FcγRII和/或FcγRIII具有降低的亲和力。在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗TCRVβ抗体包含人IgG1区或人IgG4区。
在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗TCRVβ抗体激活和/或扩增T细胞，例如如本文所述。在一些实施方案中，包含变体Fc区的抗TCRVβ抗体具有本文所述的细胞因子谱，例如，与结合至除TCRβV区以外的受体或分子的T细胞衔接物(“非TCRβV结合T细胞衔接物”)的细胞因子谱不同的细胞因子谱。在一些实施方案中，非TCRβV结合T细胞衔接物包含与CD3分子(例如，CD3ε(CD3e)分子)或TCRα(TCRα)分子结合的抗体。
示例性Fc区变体在表14中提供，并且也公开于Saunders O,(2019)Frontiers inImmunology；第10卷,第1296条，其全部内容通过引用并入本文中。
在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRVβ抗体包含表14中公开的Fc区变体的任何一种或全部或任何组合。
在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRVβ抗体包含表14中公开的Fc区变体(例如突变)的任何一种或全部或任何组合。在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRVβ抗体包含Asn297Ala(N297A)突变。在一些实施方案中，如本文所述的抗TCRVβ抗体包含Leu234Ala/Leu235Ala(LALA)突变。
多功能分子
如本文所用，“多功能”或“多特异性”分子是指具有两种或更多种功能性(例如，两种或更多种结合特异性)的分子，例如，多肽。在一些实施方案中，所述功能性可以包括一种或多种免疫细胞衔接物、一种或多种肿瘤结合分子、一种或多种细胞因子分子、一种或多种基质修饰剂以及本文所述的其他部分。在一些实施方案中，多特异性分子是多特异性抗体分子，例如双特异性抗体分子。在一些实施方案中，多特异性分子包括如本文所述的抗TCRVb抗体分子。
在某些实施方案中，本文描述了一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽和至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽是不连续的，其中：(i)所述第一多肽包含第一T细胞受体可变β(TCRβV)结合部分的第一部分和连接至第一TCRβV结合部分的第一部分的第一二聚化模块；(ii)所述第二多肽包含第一TCRβV结合部分的第二部分；(iii)所述第三多肽包含第二TCRβV结合部分的第一部分和连接至第二TCRβV结合部分的第一部分的第二二聚化模块；并且(iv)所述第四多肽包含第二TCRβV结合部分的第二部分；并且其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合。
在某些实施方案中，本文描述了一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中第一多肽、第二多肽和第三多肽是不连续的，其中：(i)所述第一多肽包含第一TCRβV结合部分的第一部分和连接至第一TCRβV结合部分的第一部分的第一二聚化模块；(ii)所述第二多肽包含第一TCRβV结合部分的第二部分；并且(iii)所述第三多肽包含第二二聚化模块；并且其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至第一多肽、第二多肽、第三多肽或其组合。
在某些实施方案中，本文描述了一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中第一多肽、第二多肽和第三多肽是不连续的，其中：(i)所述第一多肽包含第一TCRβV结合部分的第一部分和连接至第一TCRβV结合部分的第一部分的第一二聚化模块；(ii)所述第二多肽包含第一TCRβV结合部分的第二部分；并且(iii)所述第三多肽包含第二二聚化模块；其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至第一多肽、第二多肽、第三多肽或其组合；并且其中多功能多肽分子不包含除第一TCRβV结合部分之外的另外的TCRβV结合部分。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分的第一部分包含第一重链可变结构域(VH)和连接至第一VH的第一重链恒定结构域1(CH1)。在一些实施方案中，第一CH1连接至第一VH的C末端。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分的第二部分包含第一轻链可变结构域(VL)和连接至第一VL的第一轻链恒定结构域(CL)。在一些实施方案中，第一CL连接至第一VL的C末端。在一些实施方案中，其中第一二聚化模块连接至第一TCRβV结合部分的第一部分。在一些实施方案中，第一二聚化模块连接至第一TCRβV结合部分的第一部分的C末端。在一些实施方案中，其中第二TCRβV结合部分的第一部分包含第二VH和连接至第二VH的第二CH1。在一些实施方案中，第二CH1连接至第二VH的C末端。在一些实施方案中，第二TCRβV结合部分的第二部分包含第二VL和连接至第二VL的第二CL。在一些实施方案中，第二CL连接至第二VL的C末端。在一些实施方案中，第二二聚化模块连接至第二TCRβV结合部分的第一部分。在一些实施方案中，第二二聚化模块连接至第二TCRβV结合部分的第一部分的C末端。
在一些实施方案中，(a)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(c)第三多肽的N末端连接至第五细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第三多肽的C末端连接至第六细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(d)第四多肽的N末端连接至第七细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第四多肽的C末端连接至第八细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或者(e)其组合。
在一些实施方案中，(a-1)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(a-2)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b-1)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(b-2)第三多肽的N末端连接至第五细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第三多肽的C末端连接至第六细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(c-1)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(c-2)第四多肽的N末端连接至第七细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第四多肽的C末端连接至第八细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(d-1)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(d-2)第三多肽的N末端连接至第五细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第三多肽的C末端连接至第六细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(e-1)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(e-2)第四多肽的N末端连接至第七细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第四多肽的C末端连接至第八细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或(f-1)第三多肽的N末端连接至第五细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第三多肽的C末端连接至第六细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(f-2)第四多肽的N末端连接至第七细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第四多肽的C末端连接至第八细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合。
在一些实施方案中，(a-1)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(a-2)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(a-3)第三多肽的N末端连接至第五细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第三多肽的C末端连接至第六细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b-1)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b-2)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(b-3)第四多肽的N末端连接至第七细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第四多肽的C末端连接至第八细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或(c-1)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(c-2)第三多肽的N末端连接至第五细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第三多肽的C末端连接至第六细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(c-3)第四多肽的N末端连接至第七细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第四多肽的C末端连接至第八细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合。
在一些实施方案中，(1)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(2)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(3)第三多肽的N末端连接至第五细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第三多肽的C末端连接至第六细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(4)第四多肽的N末端连接至第七细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第四多肽的C末端连接至第八细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合。
在一些实施方案中，第一细胞因子多肽、第二细胞因子多肽或其组合在第一多肽的单个连续多肽链内，第三细胞因子多肽、第四细胞因子多肽或其组合在第二多肽的单个连续多肽链内，第五细胞因子多肽、第六细胞因子多肽或其组合在第三多肽的单个连续多肽链内，第七细胞因子多肽、第八细胞因子多肽或其组合在第四多肽的单个连续多肽链内，或者其组合。
在一些实施方案中，(a)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(c)第三多肽的N末端连接至第五细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第三多肽的C末端连接至第六细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或者(d)其组合。
在一些实施方案中，(a-1)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(a-2)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b-1)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(b-2)第三多肽的N末端连接至第五细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第三多肽的C末端连接至第六细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或(c-1)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(c-2)第三多肽的N末端连接至第五细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第三多肽的C末端连接至第六细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合。
在一些实施方案中，(1)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(2)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(3)第三多肽的N末端连接至第五细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第三多肽的C末端连接至第六细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合。
在一些实施方案中，第一细胞因子多肽、第二细胞因子多肽或其组合在第一多肽的单个连续多肽链内，第三细胞因子多肽、第四细胞因子多肽或其组合在第二多肽的单个连续多肽链内，第五细胞因子多肽、第六细胞因子多肽或其组合在第三多肽的单个连续多肽链内，或者其组合。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子进一步包含在第一TCRβV结合部分的第一部分与第一二聚化模块之间的接头、在第二TCRβV结合部分的第一部分与第二二聚化模块之间的接头、在第一VH与第一CH1之间的接头、在第一VL与第一CL之间的接头、在第二VH与第二CH1之间的接头、在第二VL与第二CL之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第一多肽之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第二多肽之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第三多肽之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第四多肽之间的接头，或者其组合。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子进一步包含在第一TCRβV结合部分的第一部分与第一二聚化模块之间的接头、在第一VH与第一CH1之间的接头、在第一VL与第一CL之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第一多肽之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第二多肽之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第三多肽之间的接头，或者其组合。在一些实施方案中，接头选自可裂解性接头、不可裂解性接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋形接头和非螺旋形接头。在一些实施方案中，接头是肽接头，并且其中接头是GS接头。在一些实施方案中，接头是肽接头，并且其中接头包含SEQ ID NO:3308或SEQ ID NO:3643的序列。
在某些实施方案中，本文描述了一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体以及第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽是不连续的，其中：(i)所述第一多肽包含第一TCRβV结合部分的第一部分和连接至第一TCRβV结合部分的第一部分的第一二聚化模块；(ii)所述第二多肽包含第一TCRβV结合部分的第二部分；(iii)所述第三多肽包含第二TCRβV结合部分的第一部分和连接至第二TCRβV结合部分的第一部分的第二二聚化模块；并且(iv)所述第四多肽包含第二TCRβV结合部分的第二部分；并且其中第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至第二多肽的C末端，并且第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至第四多肽的C末端。
在某些实施方案中，本文描述了一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽是不连续的，其中：(i)所述第一多肽包含第一TCRβV结合部分的第一部分和连接至第一TCRβV结合部分的第一部分的第一二聚化模块；(ii)所述第二多肽包含第一TCRβV结合部分的第二部分；(iii)所述第三多肽包含第二TCRβV结合部分的第一部分和连接至第二TCRβV结合部分的第一部分的第二二聚化模块；并且(iv)所述第四多肽包含第二TCRβV结合部分的第二部分；并且其中所述细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至第二多肽的C末端或第四多肽的C末端。
在某些实施方案中，本文描述了一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽、细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽是不连续的，其中：(i)所述第一多肽包含第一TCRβV结合部分的第一部分和连接至第一TCRβV结合部分的第一部分的第一二聚化模块；(ii)所述第二多肽包含第一TCRβV结合部分的第二部分；(iii)所述第三多肽包含第二TCRβV结合部分的第一部分和连接至第二TCRβV结合部分的第一部分的第二二聚化模块；并且(iv)所述第四多肽包含第二TCRβV结合部分的第二部分；并且其中所述细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至第一多肽的C末端或第三多肽的C末端。
在某些实施方案中，本文描述了一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽和细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中第一多肽、第二多肽和第三多肽是不连续的，其中：(i)所述第一多肽包含第一TCRβV结合部分的第一部分和连接至第一TCRβV结合部分的第一部分的第一二聚化模块；(ii)所述第二多肽包含第一TCRβV结合部分的第二部分；并且(iii)所述第三多肽包含第二二聚化模块；其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至第三多肽的N末端；并且其中多功能多肽分子不包含除第一TCRβV结合部分之外的另外的TCRβV结合部分。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分的第一部分包含第一VH和连接至第一VH的第一CH1。在一些实施方案中，第一CH1连接至第一VH的C末端。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分的第二部分包含第一VL和连接至第一VL的第一CL。在一些实施方案中，第一CL连接至第一VL的C末端。
在一些实施方案中，第一二聚化模块连接至第一TCRβV结合部分的第一部分。在一些实施方案中，第一二聚化模块连接至第一TCRβV结合部分的第一部分的C末端。在一些实施方案中，第二TCRβV结合部分的第一部分包含第二VH和连接至第二VH的第二CH1。在一些实施方案中，第二CH1连接至第二VH的C末端。在一些实施方案中，第二TCRβV结合部分的第二部分包含第二VL和连接至第二VL的第二CL。在一些实施方案中，第二CL连接至第二VL的C末端。在一些实施方案中，第二二聚化模块连接至第二TCRβV结合部分的第一部分。在一些实施方案中，第二二聚化模块连接至第二TCRβV结合部分的第一部分的C末端。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子进一步包含在第一TCRβV结合部分的第一部分与第一二聚化模块之间的接头、在第二TCRβV结合部分的第一部分与第二二聚化模块之间的接头、在第一VH与第一CH1之间的接头、在第一VL与第一CL之间的接头、在第二VH与第二CH1之间的接头、在第二VL与第二CL之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第一多肽之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第二多肽之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第三多肽之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第四多肽之间的接头，或其组合。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子进一步包含在第一TCRβV结合部分的第一部分与第一二聚化模块之间的接头、在第一VH与第一CH1之间的接头、在第一VL与第一CL之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第三多肽之间的接头，或者其组合。在一些实施方案中，接头选自可裂解性接头、不可裂解性接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋形接头和非螺旋形接头。在一些实施方案中，接头是肽接头，并且其中接头是GS接头。在一些实施方案中，接头是肽接头，并且其中接头包含SEQ ID NO:3308或SEQ ID NO:3643的序列。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含选自Fab、F(ab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单结构域抗体、双抗体(dAb)、骆驼抗体及其组合中的任一者。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含scFv或Fab。
在一些实施方案中，多功能多肽分子不包含除TCRβV结合部分之外的另外的抗原结合部分。在一些实施方案中，多功能多肽分子进一步包含不是TCRβV结合部分的另外的抗原结合部分。
在某些实施方案中，本文描述了一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽和至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中第一多肽和第二多肽是不连续的，其中：(i)所述第一多肽包含第一TCRβV结合部分和连接至第一TCRβV结合部分的C末端的第一二聚化模块，其中第一TCRβV结合部分包含第一VL和第一VH；并且(ii)所述第二多肽包含第二TCRβV结合部分和连接至第二TCRβV结合部分的C末端的第二二聚化模块；其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至第一多肽、第二多肽或其组合；其中第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含scFv；并且其中多功能多肽分子不包含除第一TCRβV结合部分和第二TCRβV结合部分之外的另外的抗原结合部分。
在某些实施方案中，本文描述了一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽和至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中第一多肽和第二多肽是不连续的，其中：(i)第一多肽包含第一TCRβV结合部分和连接至第一TCRβV结合部分的C末端的第一二聚化模块，其中第一TCRβV结合部分包含第一VL和第一VH；并且(ii)所述第二多肽包含第二二聚化模块；其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至第一多肽、第二多肽或其组合；其中第一TCRβV结合部分包含scFv；其中多功能多肽分子不包含除第一TCRβV结合部分之外的另外的抗原结合部分；并且其中多功能多肽分子不包含除第一TCRβV结合部分之外的另外的TCRβV结合部分。
在一些实施方案中，(a)第一多肽的N末端连接至第一细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第一多肽的C末端连接至第二细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b)第二多肽的N末端连接至第三细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；第二多肽的C末端连接至第四细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或者(e)其组合。
在一些实施方案中，第一细胞因子多肽、第二细胞因子多肽或其组合在第一多肽的单个连续多肽链内，第三细胞因子多肽、第四细胞因子多肽或其组合在第二多肽的单个连续多肽链内，或其组合。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子进一步包含在第一TCRβV结合部分与第一二聚化模块之间的接头、在第二TCRβV结合部分与第二二聚化模块之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第一多肽之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第二多肽之间的接头，或者其组合。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子进一步包含在第一TCRβV结合部分与第一二聚化模块之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第一多肽之间的接头、在至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与第二多肽之间的接头，或者其组合。在一些实施方案中，接头选自可裂解性接头、不可裂解性接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋形接头和非螺旋形接头。在一些实施方案中，接头是肽接头，并且其中接头是GS接头。在一些实施方案中，接头是肽接头，并且其中接头包含SEQ ID NO:3308或SEQ ID NO:3643的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含至少两种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含至少三种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含至少四种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含至少五种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含至少六种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含至少七种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含至少八种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含两种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含三种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含四种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含五种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含六种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含七种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含八种细胞因子多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含两种细胞因子多肽，其各自分别连接至第一多肽和第二多肽；第一多肽和第三多肽；第一多肽和第四多肽；第二多肽和第三多肽；第二多肽和第四多肽；或第三多肽和第四多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含三种细胞因子多肽，其各自分别连接至第一多肽、第二多肽和第三多肽连接；第一多肽、第二多肽和第四多肽；第一多肽、第三多肽和第四多肽；或第二多肽、第三多肽和第四多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子包含四种细胞因子多肽，其各自分别连接至第一多肽、第二多肽、第三多肽和第四多肽。在一些实施方案中，细胞因子多肽不连接至包含第一TCRβV结合部分的多肽。
在一些实施方案中，至少一种细胞因子多肽选自白介素2(IL-2)或其片段或功能片段或功能变体、白介素7(IL-7)或其片段或功能片段或功能变体、白介素12(IL-12)或其片段或功能片段或功能变体、白介素15(IL-15)或其片段或功能片段或功能变体、白介素18(IL-18)或其片段或功能片段或功能变体、白介素21(IL-21)或其片段或功能片段或功能变体、或干扰素γ或其片段或功能片段或功能变体，或其组合。
在一些实施方案中，至少一种细胞因子多肽包含白介素2(IL-2)或其片段。在一些实施方案中，至少一种细胞因子多肽是白介素2(IL-2)或其片段。在一些实施方案中，至少一种细胞因子多肽包含与SEQ ID NO:2191的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，至少一种细胞因子多肽包含SEQ ID NO:2191的序列。在一些实施方案中，至少一种细胞因子多肽的序列是与SEQID NO:2191的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，至少一种细胞因子多肽的序列是SEQ ID NO:2191的序列。
在一些实施方案中，至少一种细胞因子多肽的变体包含有包含突变的IL-2变体。在一些实施方案中，突变包括插入突变、缺失突变或置换突变。在一些实施方案中，突变包括置换突变。在一些实施方案中，变体包含有包含C125A突变的IL-2变体。在一些实施方案中，至少一种细胞因子多肽的变体是包含突变的IL-2变体。在一些实施方案中，突变是插入突变、缺失突变或置换突变。在一些实施方案中，突变是置换突变。在一些实施方案中，变体是包含C125A突变的IL-2变体。在一些实施方案中，变体包含与SEQ ID NO:2270的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，变体包含SEQ ID NO:2270的序列。在一些实施方案中，变体的序列是与SEQ IDNO:2270的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，变体的序列是SEQ ID NO:2270的序列。
在一些实施方案中，第一二聚化模块包含第一免疫球蛋白恒定区(Fc区)，并且第二二聚化模块包含第二Fc区。在一些实施方案中，第一二聚化模块是第一免疫球蛋白恒定区(Fc区)，并且第二二聚化模块是第二Fc区。
在一些实施方案中，第一Fc区、第二Fc区或其组合选自IgG1 Fc区或其片段、IgG2Fc区或其片段、IgG3 Fc区或其片段、IgGA1 Fc区或其片段、IgGA2 Fc区或其片段、IgG4 Fc区或其片段、IgJ Fc区或其片段、IgM Fc区或其片段、IgD Fc区或其片段和IgE Fc区或其片段。
在一些实施方案中，第一Fc区、第二Fc区或其组合选自人IgG1Fc区或其片段、人IgG2 Fc区或其片段和人IgG4 Fc区或其片段。
在一些实施方案中，第一Fc区、第二Fc区或其组合包含具有成对的腔-突起、静电相互作用或链交换中的一种或多种的Fc界面，其中第一Fc区和第二Fc区的二聚化被增强，如由相对于具有非工程化界面的Fc区的二聚化而言更大的异多聚体:同多聚体形式比率所指示的。在一些实施方案中，第一Fc区和第二Fc区的二聚化相对于具有非工程化界面的Fc区的二聚化被增强至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、250倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍或10000倍。在一些实施方案中，第一Fc区和第二Fc区的二聚化相对于具有非工程化界面的Fc区的二聚化被增强至多1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、250倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍或10000倍。在一些实施方案中，第一Fc区和第二Fc区的二聚化相对于具有非工程化界面的Fc区的二聚化被增强1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、250倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍或10000倍。
在一些实施方案中，第一Fc区、第二Fc区或其组合包含表14中列出的氨基酸置换。
在一些实施方案中，第一Fc区、第二Fc区或其组合包含Asn297Ala(N297A)突变或Leu234Ala/Leu235Ala(LALA)突变。
在一些实施方案中，第一Fc区、第二Fc区或其组合包含与SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:3645、SEQ ID NO:3646、SEQ ID NO:3647、SEQ ID NO:3648或SEQ ID NO:3649的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一Fc区、第二Fc区或其组合包含SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:3645、SEQ ID NO:3646、SEQ ID NO:3647、SEQ ID NO:3648或SEQ ID NO:3649的序列。
在一些实施方案中，第一Fc区、第二Fc区或其组合的序列是与SEQ ID NO:40、SEQID NO:42、SEQ ID NO:3645、SEQ ID NO:3646、SEQ ID NO:3647、SEQ ID NO:3648或SEQ IDNO:3649的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，第一Fc区、第二Fc区或其组合的序列是SEQ ID NO:40、SEQID NO:42、SEQ ID NO:3645、SEQ ID NO:3646、SEQ ID NO:3647、SEQ ID NO:3648或SEQ IDNO:3649的序列。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合与选自以下的TCRβV亚家族中的一者或多者结合：(i)TCRβV2亚家族，其包含TCRβV2*01；(ii)TCRβV3亚家族，其包含TCRβV3-1*01；(iii)TCRβV4亚家族，其包含选自TCRβV4-1、TCRβV4-2和TCRβV4-3中的一者或多者；(iv)TCRβV5亚家族，其包含选自TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01、TCRβV5-1*01和TCRβV5-8*01中的一者或多者；(v)TCRβV6亚家族，其包含选自TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01和TCRβV6-1*01中的一者或多者；(vi)TCRβV9亚家族；(vii)TCRβV10亚家族，其包含选自TCRβV10-1*01、TCRβV10-1*02、TCRβV10-3*01和TCRβV10-2*01中的一者或多者；(viii)TCRβV11亚家族，其包含TCRβV11-2；(ix)TCRβV12亚家族，其包含选自TCRβV12-4*01、TCRβV12-3*01和TCRβV12-5*01中的一者或多者；(x)TCRβV13亚家族，其包含TCRβV13*01；(xi)TCRβV16亚家族，其包含TCRβV16*01；(xii)TCRβV19亚家族，其包含选自TCRβV19*01和TCRβV19*02中的一者或多者；(xiii)TCRβV21亚家族；(xiv)TCRβV23亚家族；(xv)TCRβV27亚家族；以及(xvi)TCRβV28亚家族。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分和第二TCRβV结合部分相同。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分和第二TCRβV结合部分不同。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分和第二TCRβV结合部分分别结合：(i)TCRβV6亚家族成员中的一者或多者和TCRβV10亚家族成员中的一者或多者；(ii)TCRβV6亚家族成员中的一者或多者和TCRβV5亚家族成员中的一者或多者；(iii)TCRβV6亚家族成员中的一者或多者和TCRβV12亚家族成员中的一者或多者；(iv)TCRβV10亚家族成员中的一者或多者和TCRβV5亚家族成员中的一者或多者；(v)TCRβV10亚家族成员中的一者或多者和TCRβV12亚家族成员中的一者或多者；或者(vi)TCRβV5亚家族成员中的一者或多者和TCRβV12亚家族成员中的一者或多者。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)与表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；(ii)与表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)具有表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中任一者的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；(ii)具有表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中任一者的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)分别与表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；(ii)分别与表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列的LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)分别具有表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中任一者的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；(ii)分别具有表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中任一者的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含框架区(FR)，所述框架区包含与非鼠种系FR1、非鼠种系FR2、非鼠种系FR3和非鼠种系FR4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的框架1(FR1)、框架区2(FR2)、框架区3(FR3)和框架区4(FR4)；(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含与非鼠种系FR1、非鼠种系FR2、非鼠种系FR3和非鼠种系FR4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；或者(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含FR，所述FR包含具有非鼠种系FR1、非鼠种系FR2、非鼠种系FR3和非鼠种系FR4的序列的FR1、FR2、FR3和FR4；(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含具有非鼠种系FR1、非鼠种系FR2、非鼠种系FR3和非鼠种系FR4的序列的FR1、FR2、FR3和FR4；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含与非鼠种系FR1、非鼠种系FR2、非鼠种系FR3和非鼠种系FR4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含分别与非鼠种系FR1、非鼠种系FR2、非鼠种系FR3和非鼠种系FR4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含FR，所述FR包含分别具有非鼠种系FR1、非鼠种系FR2、非鼠种系FR3和非鼠种系FR4的序列的FR1、FR2、FR3和FR4；(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含分别具有非鼠种系FR1、非鼠种系FR2、非鼠种系FR3和非鼠种系FR4的序列的FR1、FR2、FR3和FR4；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，VH包含FR3，所述FR3包含(i)根据Kabat编号在位置73处的苏氨酸；(ii)根据Kabat编号在位置94处的甘氨酸；或(iii)其组合。在一些实施方案中，VL包含FR1，所述FR1包含根据Kabat编号在位置10处的苯丙氨酸。在一些实施方案中，VL包含FR2，所述FR2包含(i)根据Kabat编号在位置36处的组氨酸；(ii)根据Kabat编号在位置46处的丙氨酸；或(iii)其组合。在一些实施方案中，VL包含FR3，所述FR3包含根据Kabat编号在位置87处的苯丙氨酸。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)与表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；(ii)与表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)具有表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中任一者的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；(ii)具有表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中任一者的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)分别与表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；(ii)分别与表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列的LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)分别具有表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中任一者的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；(ii)分别具有表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中任一者的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含FR，所述FR包含与表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含与表2的人源化B-HLC的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含FR，所述FR包含具有表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4的序列的FR1、FR2、FR3和FR4；(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含具有表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4的序列的FR1、FR2、FR3和FR4；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含FR，所述FR包含分别与表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含分别与表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含FR，所述FR包含分别具有表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4的序列的FR1、FR2、FR3和FR4；(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含分别具有表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4的序列的FR1、FR2、FR3和FR4；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含与表2中列出的人源化抗体B-H的VH序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列；(ii)VL，所述VL包含与表2中列出的人源化抗体B-H的VL序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)VH，所述VH包含表2中列出的人源化抗体B-H的VH序列；(ii)VL，所述VL包含表2中列出的人源化抗体B-H的VL序列；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)表2中列出的人源化抗体B-H的VH；(ii)表2中列出的人源化抗体B-H的VL序列；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含重链恒定区，所述重链恒定区具有与表3中列出的序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列，或其组合。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含具有表3中列出的序列中的任一者的重链恒定区，或其组合。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含重链恒定区，所述重链恒定区的序列是与表3中列出的序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列，或其组合。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含具有表3中列出的重链恒定区序列中的任一者的重链恒定区，或其组合。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含IgM的重链恒定区或其片段。在一些实施方案中，IgM的重链恒定区包含与SEQ ID NO:73的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IgM的重链恒定区包含SEQ ID NO:73的序列。在一些实施方案中，IgM重链恒定区的序列是SEQ ID NO:73的序列。
在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含IgJ的重链恒定区或其片段。在一些实施方案中，IgJ的重链恒定区包含与SEQ ID NO:76的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IgJ的重链恒定区包含SEQ ID NO:76的序列。在一些实施方案中，IgJ的重链恒定区的序列是SEQ ID NO:76的序列。
在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含IgGA1的重链恒定区或其片段。在一些实施方案中，IgGA1的重链恒定区包含与SEQ ID NO:74的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IgGA1的重链恒定区包含SEQ ID NO:74的序列。在一些实施方案中，IgGA1的重链恒定区的序列是SEQ ID NO:74的序列。
在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含IgGA2的重链恒定区或其片段。在一些实施方案中，IgGA2的重链恒定区包含与SEQ ID NO:75的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IgGA2的重链恒定区包含SEQ ID NO:75的序列。在一些实施方案中，IgGA2的重链恒定区的序列是SEQ ID NO:75的序列。
在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含IgG1的重链恒定区或其片段。在一些实施方案中，IgG1的重链恒定区包含与SEQ ID NO:41的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IgG1的重链恒定区包含SEQ ID NO:41的序列。在一些实施方案中，IgG1的重链恒定区的序列是SEQ ID NO:41的序列。在一些实施方案中，IgG1的重链恒定区包含与SEQ ID NO:3645的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，IgG1的重链恒定区包含SEQ ID NO:3645的序列。在一些实施方案中，IgG1的重链恒定区的序列是SEQ ID NO:3645的序列。
在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含轻链恒定区，所述轻链恒定区具有与表3中列出的序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列，或其组合。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含轻链恒定区，所述轻链恒定区具有表3中列出的序列中的任一者，或其组合。在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含轻链恒定区，所述轻链恒定区具有表3中列出的轻链恒定区序列中的任一者，或其组合。
在一些实施方案中，第一多肽、第二多肽、第三多肽、第四多肽或其组合包含κ链的轻链恒定区或其片段。在一些实施方案中，κ链的轻链恒定区包含表3中列出的轻链恒定区序列。
在一些实施方案中，κ链的轻链恒定区包含与SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:3644的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，κ链的轻链恒定区包含SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:3644的序列。在一些实施方案中，κ链的轻链恒定区的序列是与SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:3644的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，κ链的轻链恒定区的序列是SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其包含与表1、2、10、11、12或13中公开的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列；(ii)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其包含与表1、2、10、11、12或13中公开的VL的CDR1、CDR2和CDR3序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其包含表1、2、10、11、12或13中公开的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列；(ii)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其包含表1、2、10、11、12或13中公开的VL的CDR1、CDR2和CDR3序列；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其包含分别与表1、2、10、11、12或13中公开的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列；(ii)LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3，其包含分别与表1、2、10、11、12或13中公开的VL的CDR1、CDR2和CDR3序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其分别包含表1、2、10、11、12或13中公开的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列；(ii)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其分别包含表1、2、10、11、12或13中公开的VL的CDR1、CDR2和CDR3序列；或(iii)其组合。在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含：(i)表1、2、10、11、12或13中公开的VH的HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3；(ii)表1、2、10、11、12或13中公开的VL的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含轻链，所述轻链包含FR1，所述FR1包含：(i)根据Kabat编号在位置1处的天冬氨酸；(ii)根据Kabat编号在位置2处的天冬酰胺；(iii)根据Kabat编号在位置4处的亮氨酸；或者(iv)其组合。
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合包含轻链，所述轻链包含FR3，所述FR3包含：(i)根据Kabat编号在位置66处的甘氨酸；(ii)根据Kabat编号在位置69处的天冬酰胺；(iii)根据Kabat编号在位置71处的酪氨酸；或者(iv)其组合
在一些实施方案中，第一TCRβV结合部分、第二TCRβV结合部分或其组合结合至TCRβV蛋白上的面向外的区域。在一些实施方案中，TCRβV蛋白上的面向外的区域包含TCRβV的结构保守区域，所述结构保守区域在一个或多个TCRβV亚家族中具有相似的结构。
细胞因子分子
在一些实施方案中，多功能分子包括细胞因子分子。如本文所用，如在本文中可互换使用的“细胞因子分子”或“细胞因子多肽”是指细胞因子的全长、片段或变体；进一步包括受体结构域例如细胞因子受体二聚化结构域的细胞因子；或细胞因子受体的激动剂，例如，针对细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)，其激发天然存在的细胞因子的至少一种活性。在一些实施方案中，细胞因子分子选自白介素2(IL-2)、白介素7(IL-7)、白介素12(IL-12)、白介素10(IL-10)、白介素15(IL-15)、白介素18(IL-18)、白介素21(IL-21)或干扰素γ，或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。细胞因子分子可以是单体或二聚体。在实施方案中，细胞因子分子可以进一步包括细胞因子受体二聚化结构域。在其他实施方案中，细胞因子分子是细胞因子受体的激动剂，例如，针对选自IL-15Ra或IL-21R中的细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)。
细胞因子通常是例如通过信号转导途径影响细胞活性的多肽。因此，多特异性或多功能多肽的细胞因子是有用的，并且可以与受体介导的信号传导相关，该信号传导从细胞膜外传递信号以调节细胞内的应答。细胞因子是蛋白质信号传导化合物，其为免疫应答的介质。它们控制许多不同的细胞功能，包括增殖、分化和细胞存活/凋亡；细胞因子也参与多种病理生理过程，包括病毒感染和自身免疫性疾病。细胞因子在先天免疫系统(单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)和适应性免疫系统(T细胞和B细胞)的各种细胞的不同刺激下合成。细胞因子可分为两组：促炎的和抗炎的。包括IFNγ、IL-1、IL-6和TNF-α在内的促炎细胞因子主要来源于先天免疫细胞和Th1细胞。包括IL-10、IL-4、IL-13和IL-5在内的抗炎细胞因子由Th2免疫细胞合成。
本文尤其提供了多特异性(例如，双、三、四特异性)或多功能分子，其包括例如经工程化以包含一种或多种细胞因子分子，例如免疫调节性(例如促炎性)细胞因子及其变体，例如其功能变体。因此，在一些实施方案中，细胞因子分子是白介素或其变体，例如其功能变体。在一些实施方案中，白介素是促炎性白介素。在一些实施方案中，白介素选自白介素2(IL-2)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素18(IL-18)、白介素21(IL-21)、白介素7(IL-7)或干扰素γ。在一些实施方案中，细胞因子分子是促炎性细胞因子。
在某些实施方案中，细胞因子是单链细胞因子。在某些实施方案中，细胞因子是多链细胞因子(例如，细胞因子包含2个或更多个(例如2个)多肽链。示例性的多链细胞因子是IL-12。
有用的细胞因子的实例包括但不限于GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-21、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α和TNFβ。在一些实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是选自以下的细胞因子：GM-CSF、IL-2、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IFN-α、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β和TGF-β。在一些实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是选自IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α和IFN-γ的细胞因子。在某些实施方案中，使细胞因子突变以去除N-和/或O-糖基化位点。消除糖基化增加了重组生产中可获得的产物的均质性。
在一些实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是IL-2。在具体的实施方案中，IL-2细胞因子可引起选自以下中的一种或多种细胞应答：激活的T淋巴细胞的增殖、激活的T淋巴细胞的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、激活的B细胞的增殖、激活的B细胞的分化、自然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、由激活的T细胞或NK细胞的细胞因子分泌，以及NK/淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK)抗肿瘤细胞毒性。在另一个特定的实施方案中，IL-2细胞因子是对IL-2受体的α亚基具有降低的结合亲和力的突变体IL-2细胞因子。α亚基(也称为CD 25)与β亚基和γ亚基(分别称为CD 122和CD132)一起形成异三聚体的高亲和力IL-2受体，而仅由β亚基和γ亚基组成的二聚体受体称为中等亲和力IL-2受体。如在PCT专利申请号PCT/EP2012/051991中描述的(其通过引用整体并入本文)，与野生型IL-2多肽相比，与IL-2受体的α亚基的结合减少的突变体IL-2多肽具有降低的在调节性T细胞中诱导IL-2信号传导的能力，在T细胞中诱导更少的激活诱导的细胞死亡(AICD)，并且在体内具有降低的毒性特征。这种具有降低的毒性的细胞因子的使用在本发明的多特异性或多功能多肽中特别有利，该多肽由于存在Fc结构域而具有较长的血清半衰期。在一些实施方案中，根据本发明的多特异性或多功能多肽的突变体IL-2细胞因子包含至少一种氨基酸突变，其与未突变的IL-2细胞因子相比，降低或消除了突变体IL-2细胞因子对IL-2受体的α亚基(CD25)的亲和力，但保留突变体IL-2细胞因子对中等亲和力IL-2受体(由IL-2受体的β和γ亚基组成)的亲和力。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸突变是氨基酸置换。在一个具体的实施方案中，突变体IL-2细胞因子在选自对应于人IL-2的残基42、45和72的位置的一个、两个或三个位置上包含一个、两个或三个氨基酸置换。在更具体的实施方案中，突变体IL-2细胞因子在对应于人IL-2的残基42、45和72的位置上包含三个氨基酸置换。在甚至更具体的实施方案中，突变体IL-2细胞因子是人IL-2，其包含氨基酸置换F42A、Y45A和L72G。在一些实施方案中，突变体IL-2细胞因子在与人IL-2的位置3相对应的位置处另外包含氨基酸突变，这消除了IL-2的O-糖基化位点。具体地，所述另外的氨基酸突变是通过丙氨酸残基代替苏氨酸残基的氨基酸置换。可用于本发明的特定的突变体IL-2细胞因子在对应于人IL-2的残基3、42、45和72的位置处包含四个氨基酸置换。特定的氨基酸置换是T3A、F42A、Y45A和L72G。如PCT专利申请号PCT/EP2012/051991和所附实施例所示，所述四重突变体IL-2多肽(IL-2qm)与CD25没有可检测的结合，在T细胞中诱导凋亡的能力降低，在T.sub.reg细胞中诱导IL-2信号传导的能力降低，以及体内毒性特征降低。但是，它保留了激活效应细胞中IL-2信号传导，诱导效应细胞增殖以及由NK细胞产生IFN-γ作为次级细胞因子的能力。
根据上述实施方案中任一项的IL-2或突变体IL-2细胞因子可包含提供进一步的优势诸如增加的表达或稳定性的其他突变。例如，位置125处的半胱氨酸可以用中性氨基酸诸如丙氨酸代替，以避免形成二硫键桥接的IL-2二聚体。因此，在某些实施方案中，本发明的多特异性或多功能多肽的IL-2或突变体IL-2细胞因子在对应于人IL-2的残基125的位置处包含另外的氨基酸突变。在一些实施方案中，所述另外的氨基酸突变是氨基酸置换C125A。
在一个具体的实施方案中，多特异性或多功能多肽的IL-2细胞因子包含SEQ IDNO:2270
[APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT]的多肽序列。
在另一个具体的实施方案中，多特异性或多功能多肽的IL-2细胞因子包含SEQ IDNO:2280
[APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNGAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT]的多肽序列。
在另一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是IL-12。在具体的实施方案中，所述IL-12细胞因子是单链IL-12细胞因子。在甚至更具体的实施方案中，单链IL-12细胞因子包含SEQ ID NO:2290
[IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS]的多肽序列。在一些实施方案中，IL-12细胞因子可引起选自以下中的一种或多种细胞应答：NK细胞的增殖、NK细胞的分化、T细胞的增殖和T细胞的分化。
在另一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是IL-10。在具体的实施方案中，所述IL-10细胞因子是单链IL-10细胞因子。在甚至更具体的实施方案中，单链IL-10细胞因子包含SEQ ID NO:2300
[SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN]的多肽序列。
在另一个具体的实施方案中，IL-10细胞因子是单体IL-10细胞因子。在更具体的实施方案中，单体IL-10细胞因子包含SEQ ID NO:2310
[SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENGGGSGGKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN]的多肽序列。在一些实施方案中，IL-10细胞因子可引起选自以下的一种或多种细胞应答：抑制细胞因子分泌、抑制抗原呈递细胞的抗原呈递、减少氧自由基释放和抑制T细胞增殖。根据本发明的多特异性或多功能多肽，其中细胞因子是IL-10，特别适用于下调炎症，例如用于治疗炎性疾病。
在另一个实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子是IL-15。在具体的实施方案中，所述IL-15细胞因子是对IL-15受体的α亚基具有降低的结合亲和力的突变体IL-15细胞因子。不希望受理论的束缚，与野生型IL-15多肽相比，与IL-15受体的α亚基的结合减少的突变体IL-15多肽具有降低的与整个身体的成纤维细胞结合的能力，从而导致改善其药代动力学和毒性特征。使用毒性降低的细胞因子，诸如所述的突变体IL-2和突变体IL-15效应子部分，在根据本发明的多特异性或多功能多肽中特别有利，该多肽由于存在Fc结构域而具有较长的血清半衰期。在一些实施方案中，根据本发明的多特异性或多功能多肽的突变体IL-15细胞因子包含至少一种氨基酸突变，与未突变的IL-15细胞因子相比，其降低或消除了突变体IL-15细胞因子对IL-15受体的α亚基的亲和力，但保留突变体IL-15细胞因子对中等亲和力IL-15/IL-2受体(由IL-15/IL-2受体的β亚基和γ亚基组成)的亲和力。在一些实施方案中，氨基酸突变是氨基酸置换。在具体的实施方案中，突变体IL-15细胞因子在对应于人IL-15的残基53的位置处包含氨基酸置换。在更具体的实施方案中，突变体IL-15细胞因子是包含氨基酸置换E53A的人IL-15。在一些实施方案中，突变体IL-15细胞因子在对应于人IL-15的位置79的位置处另外包含氨基酸突变，其消除了IL-15的N-糖基化位点。具体地，所述另外的氨基酸突变是用丙氨酸残基代替天冬酰胺残基的氨基酸置换。在甚至更具体的实施方案中，IL-15细胞因子包含SEQ ID NO:2320[NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLASGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGAVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS]的多肽序列。在一些实施方案中，IL-15细胞因子可引起选自以下的一种或多种细胞应答：激活的T淋巴细胞的增殖、激活的T淋巴细胞的分化、细胞毒性T细胞(CTL)活性、激活的B细胞的增殖、激活的B细胞的分化、自然杀伤(NK)细胞的增殖、NK细胞的分化、由激活的T细胞或NK细胞的细胞因子分泌，以及NK/淋巴细胞激活的杀伤细胞(FAK)抗肿瘤细胞毒性。
可用作多特异性或多功能多肽中的效应子部分的突变体细胞因子分子可以使用本领域熟知的遗传或化学方法通过缺失、置换、插入或修饰来制备。遗传方法可包括编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。正确的核苷酸改变可以例如通过测序来验证。置换或插入可涉及天然以及非天然氨基酸残基。氨基酸修饰包括众所周知的化学修饰方法，诸如添加或去除糖基化位点或碳水化合物附着等。
在一些实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是GM-CSF。在具体的实施方案中，GM-CSF细胞因子可以在粒细胞、单核细胞或树突状细胞中引起增殖和/或分化。在一些实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是IFN-α。在具体的实施方案中，IFN-α细胞因子可引起选自以下的一种或多种细胞应答：抑制病毒感染的细胞中的病毒复制，以及上调主要组织相容性复合体I(MHC I)的表达。在另一个具体的实施方案中，IFN-α细胞因子可以抑制肿瘤细胞的增殖。在一些实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是IFNγ。在具体的实施方案中，IFN-γ细胞因子可引起选自以下的一种或多种细胞应答：增加的巨噬细胞活性、增加的MHC分子表达和增加的NK细胞活性。在一些实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是IL-7。在具体的实施方案中，IL-7细胞因子可引起T和/或B淋巴细胞的增殖。在一些实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是IL-8。在具体的实施方案中，IL-8细胞因子可以引起嗜中性粒细胞的趋化性。在一些实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是MIP-1α。在具体的实施方案中，MIP-1α细胞因子可引起单核细胞和T淋巴细胞的趋化性。在一些实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是MIR-1β。在具体的实施方案中，MIR-1β细胞因子可引起单核细胞和T淋巴细胞的趋化性。在一些实施方案中，多特异性或多功能多肽的细胞因子，特别是单链细胞因子是TGF-β。在具体的实施方案中，TGF-β细胞因子可引起选自以下的一种或多种细胞应答：单核细胞的趋化性、巨噬细胞的趋化性、激活的巨噬细胞中IL-1表达的上调，和激活的B细胞中IgA表达的上调。
在一些实施方案中，本发明的多特异性或多功能多肽以比对照细胞因子大至少约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍的解离常数(KD)结合细胞因子受体。在另一个实施方案中，多特异性或多功能多肽以比对应的包括两个或更多个效应子部分的多特异性或多功能多肽大至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的KD结合细胞因子受体。在另一个实施方案中，多特异性或多功能多肽以比对应的包含两种或更多种细胞因子的多特异性或多功能多肽大约10倍的解离常数KD与细胞因子受体结合。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性分子包括细胞因子分子。在实施方案中，细胞因子分子包括细胞因子的全长、片段或变体；细胞因子受体结构域，例如，细胞因子受体二聚化结构域；或细胞因子受体的激动剂，例如针对细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)。
在一些实施方案中，细胞因子分子选自IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-7、IL-21或干扰素γ，或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。细胞因子分子可以是单体或二聚体。在一些实施方案中，细胞因子分子可以进一步包含细胞因子受体二聚化结构域。
在其他实施方案中，细胞因子分子是细胞因子受体的激动剂，例如针对选自IL-15Ra或IL-21R的细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)。
在一些实施方案中，细胞因子分子是IL-15，例如人IL-15，例如，包含氨基酸序列：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:2170)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:2170的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在一些实施方案中，细胞因子分子包含受体二聚化结构域，例如IL15Rα二聚化结构域。在一些实施方案中，IL15Rα二聚化结构域包含氨基酸序列：MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWV KSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVL(SEQ ID NO:2180)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:2180的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。在一些实施方案中，多特异性分子的细胞因子分子(例如，IL-15)和受体二聚化结构域(例如，IL15Rα二聚化结构域)例如通过接头(例如Gly-Ser接头，例如，包含氨基酸序列SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ(SEQ ID NO:2190)的接头)共价连接。在其他实施方案中，多特异性分子的细胞因子分子(例如，IL-15)和受体二聚化结构域(例如，IL15Rα二聚化结构域)没有共价连接，例如是非共价缔合的。
在其他实施方案中，细胞因子分子是IL-2，例如人IL-2，例如，包含氨基酸序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:2191)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:2191的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，细胞因子分子是IL-18，例如人IL-18，例如，包含氨基酸序列：
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:2192)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:2192的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，细胞因子分子是IL-21，例如人IL-21，例如，包含氨基酸序列：
QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ ID NO:2193)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:2193的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，细胞因子分子是干扰素γ，例如人干扰素γ，例如，包含氨基酸序列：
QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRG(SEQ IDNO:2194)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:2194的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
免疫细胞衔接物
在一些实施方案中，多功能分子进一步包括免疫细胞衔接物。“免疫细胞衔接物”是指结合和/或激活免疫细胞(例如，参与免疫应答的细胞)的一种或多种结合特异性。在实施方案中，免疫细胞选自T细胞、NK细胞、B细胞、树突状细胞和/或巨噬细胞。免疫细胞衔接物可以是抗体分子、受体分子(例如，全长受体、受体片段或其融合体(例如，受体-Fc融合体))或配体分子(例如，全长配体、配体片段或其融合体(例如，配体-Fc融合体))，其与免疫细胞抗原(例如，T细胞、NK细胞抗原、B细胞抗原、树突状细胞抗原和/或巨噬细胞抗原)结合。在实施方案中，免疫细胞衔接物特异性地结合靶免疫细胞，例如，优先结合靶免疫细胞。例如，当免疫细胞衔接物是抗体分子时，它以小于约10nM的解离常数与免疫细胞抗原(例如，T细胞抗原、NK细胞抗原、B细胞抗原、树突状细胞抗原和/或巨噬细胞抗原)结合。
如本文所述的多特异性或多功能分子的免疫细胞衔接物，例如第一和/或第二免疫细胞衔接物，可以介导与免疫细胞例如免疫效应细胞的结合和/或激活。在一些实施方案中，免疫细胞选自T细胞、NK细胞、B细胞、树突状细胞或巨噬细胞衔接物，或其组合。在一些实施方案中，免疫细胞衔接物选自T细胞衔接物、NK细胞衔接物、B细胞衔接物、树突状细胞衔接物或巨噬细胞衔接物中的一个、两个、三个或全部，或其组合。免疫细胞衔接物可以是免疫系统的激动剂。在一些实施方案中，免疫细胞衔接物可以是抗体分子、配体分子(例如，进一步包含免疫球蛋白恒定区，例如Fc区的配体)、小分子、核苷酸分子。
自然杀伤细胞衔接物：
自然杀伤(NK)细胞以独立于抗体的方式识别和破坏肿瘤和病毒感染的细胞。NK细胞的调节是通过激活和抑制NK细胞表面的受体来介导的。激活受体的一个家族是天然细胞毒性受体(NCR)，其包括NKp30、NKp44和NKp46。NCR通过识别癌细胞上的硫酸乙酰肝素来启动肿瘤靶向。NKG2D是一种受体，其可在激活的杀伤(NK)细胞上提供刺激性和共刺激性先天免疫应答，从而导致细胞毒活性。DNAM1是参与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和NK细胞介导的细胞间粘附、淋巴细胞信号传导、细胞毒性和淋巴因子分泌的受体。DAP10(也称为HCST)是一种跨膜衔接蛋白，其可与KLRK1缔合形成淋巴样和髓样细胞中的激活受体KLRK1-HCST；该受体在触发针对表达细胞表面配体(诸如MHC I类链相关的MICA和MICB)和U(任选地L1)6结合蛋白(ULBP)的靶细胞的细胞毒性中起主要作用；KLRK1-HCST受体在针对肿瘤的免疫监视中起作用，并且是肿瘤细胞的细胞溶解所必需的；实际上，不表达KLRK1配体的黑色素瘤细胞逃脱了NK细胞介导的免疫监视。CD16是IgG Fc区的受体，它结合复合或聚集的IgG以及单体IgG，从而介导抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)和其他抗体依赖性应答，诸如吞噬作用。
在一些实施方案中，NK细胞衔接物是病毒血凝素(HA)，HA是在流感病毒表面上发现的糖蛋白。它负责使病毒与膜上带有唾液酸的细胞，诸如上呼吸道中的细胞或红细胞结合。HA具有至少18种不同的抗原。这些亚型被命名为H1至H18。NCR可以识别病毒蛋白。已经证明NKp46能够与流感的HA和副粘病毒(包括仙台病毒和新城疫病毒)的HA-NA相互作用。除了NKp46，NKp44也可以在功能上与不同流感亚型的HA相互作用。
本文尤其提供了多特异性(例如，双、三、四特异性)或多功能分子，其经工程化以包含一种或多种介导与NK细胞的结合和/或激活的NK细胞衔接物。因此，在一些实施方案中，NK细胞衔接物选自与以下各项结合(例如对其进行激活)的抗原结合结构域或配体：NKp30、NKp40、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM1、DAP10、CD16(例如CD16a、CD16b或两者)、CRTAM、CD27、PSGL1、CD96、CD100(SEMA4D)、NKp80、CD244(也称为SLAMF4或2B4)、SLAMF6、SLAMF7、KIR2DS2、KIR2DS4、KIR3DS1、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR2DS1、CD94、NKG2C、NKG2E或CD160。
在一些实施方案中，NK细胞衔接物是NKp30的配体，即B7-6，例如，包含以下氨基酸序列：
DLKVEMMAGGTQITPLNDNVTIFCNIFYSQPLNITSMGITWFWKSLTFDKEVKVFEFFGDHQEAFRPGAIVSPWRLKSGDASLRLPGIQLEEAGEYRCEVVVTPLKAQGTVQLEVVASPASRLLLDQVGMKENEDKYMCESSGFYPEAINITWEKQTQKFPHPIEISEDVITGPTIKNMDGTFNVTSCLKLNSSQEDPGTVYQCVVRHASLHTPLRSNFTLTAARHSLSETEKTDNFS(SEQ ID NO:3291)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3291的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是NKp44或NKp46的配体，即病毒HA。病毒血凝素(HA)是病毒表面的糖蛋白。HA蛋白允许病毒通过唾液酸糖部分与细胞膜结合，唾液酸糖部分有助于病毒膜与细胞膜融合(参见例如，Eur J Immunol.2001年9月；31(9):2680-9“Recognition of viral hemagglutinins by NKp44 but not by NKp30”；以及Nature.2001年2月22日；409(6823):1055-60“Recognition of haemagglutinins onvirus-infected cells by NKp46 activates lysis by human NK cells”，其各自的内容均通过引用并入本文)。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是选自MICA、MICB或ULBP1的NKG2D的配体，例如，其中：(i)MICA包含氨基酸序列：
EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHW(SEQ ID NO:3292)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3292的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列；(ii)MICB包含氨基酸序列：
AEPHSLRYNLMVLSQDESVQSGFLAEGHLDGQPFLRYDRQKRRAKPQGQWAEDVLGAKTWDTETEDLTENGQDLRRTLTHIKDQKGGLHSLQEIRVCEIHEDSSTRGSRHFYYDGELFLSQNLETQESTVPQSSRAQTLAMNVTNFWKEDAMKTKTHYRAMQADCLQKLQRYLKSGVAIRRTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVPSGKVLVLQSQRTD(SEQ IDNO:3293)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3293的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列；或(iii)ULBP1包含氨基酸序列：
GWVDTHCLCYDFIITPKSRPEPQWCEVQGLVDERPFLHYDCVNHKAKAFASLGKKVNVTKTWEEQTETLRDVVDFLKGQLLDIQVENLIPIEPLTLQARMSCEHEAHGHGRGSWQFLFNGQKFLLFDSNNRKWTALHPGAKKMTEKWEKNRDVTMFFQKISLGDCKMWLEEFLMYWEQMLDPTKPPSLAPG(SEQ ID NO:3294)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3294的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是选自NECTIN2或NECL5的DNAM1的配体，例如，其中：(i)NECTIN2包含氨基酸序列：
QDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGG(SEQ ID NO:3295)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3295的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列；或(ii)NECL5包含氨基酸序列：
WPPPGTGDVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGISRN(SEQ ID NO:3296)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3296的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是DAP10的配体，该配体是NKG2D的衔接子(参见例如，Proc Natl Acad Sci US A.2005年5月24日；102(21):7641-7646；和Blood，2011年9月15日，第118卷第11期，其各自的全部内容通过引用并入本文)。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是CD16的配体，该配体是CD16a/b配体，例如，进一步包含抗体Fc区的CD16a/b配体(参见例如，Front Immunol.2013；4:76讨论了抗体如何使用Fc通过CD16触发NK细胞，其全部内容并入本文)。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是CRTAM的配体，即NECL2，例如，其中NECL2包含氨基酸序列：
QNLFTKDVTVIEGEVATISCQVNKSDDSVIQLLNPNRQTIYFRDFRPLKDSRFQLLNFSSSELKVSLTNVSISDEGRYFCQLYTDPPQESYTTITVLVPPRNLMIDIQKDTAVEGEEIEVNCTAMASKPATTIRWFKGNTELKGKSEVEEWSDMYTVTSQLMLKVHKEDDGVPVICQVEHPAVTGNLQTQRYLEVQYKPQVHIQMTYPLQGLTREGDALELTCEAIGKPQPVMVTWVRVDDEMPQHAVLSGPNLFINNLNKTDNGTYRCEASNIVGKAHSDYMLYVYDPPTTIPPPTTTTTTTTTTTTTILTIITDSRAGEEGSIRAVDH(SEQ ID NO:3297)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3297的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是CD27的配体，即CD70，例如，其中CD70包含氨基酸序列：
QRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP(SEQ ID NO:3298)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3298的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是PSGL1的配体，即L-选择蛋白(CD62L)，例如，其中L-选择蛋白包含氨基酸序列：
WTYHYSEKPMNWQRARRFCRDNYTDLVAIQNKAEIEYLEKTLPFSRSYYWIGIRKIGGIWTWVGTNKSLTEEAENWGDGEPNNKKNKEDCVEIYIKRNKDAGKWNDDACHKLKAALCYTASCQPWSCSGHGECVEIINNYTCNCDVGYYGPQCQFVIQCEPLEAPELGTMDCTHPLGNFSFSSQCAFSCSEGTNLTGIEETTCGPFGNWSSPEPTCQVIQCEPLSAPDLGIMNCSHPLASFSFTSACTFICSEGTELIGKKKTICESSGIWSNPSPICQKLDKSFSMIKEGDYN(SEQ ID NO:3299)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ IDNO:3299的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是CD96的配体，即NECL5，例如，其中NECL5包含氨基酸序列：
WPPPGTGDVVVQAPTQVPGFLGDSVTLPCYLQVPNMEVTHVSQLTWARHGESGSMAVFHQTQGPSYSESKRLEFVAARLGAELRNASLRMFGLRVEDEGNYTCLFVTFPQGSRSVDIWLRVLAKPQNTAEVQKVQLTGEPVPMARCVSTGGRPPAQITWHSDLGGMPNTSQVPGFLSGTVTVTSLWILVPSSQVDGKNVTCKVEHESFEKPQLLTVNLTVYYPPEVSISGYDNNWYLGQNEATLTCDARSNPEPTGYNWSTTMGPLPPFAVAQGAQLLIRPVDKPINTTLICNVTNALGARQAELTVQVKEGPPSEHSGISRN(SEQ ID NO:3296)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3296的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是CD 100(SEMA4D)的配体，即CD72，其中CD72包含氨基酸序列：
RYLQVSQQLQQTNRVLEVTNSSLRQQLRLKITQLGQSAEDLQGSRRELAQSQEALQVEQRAHQAAEGQLQACQADRQKTKETLQSEEQQRRALEQKLSNMENRLKPFFTCGSADTCCPSGWIMHQKSCFYISLTSKNWQESQKQCETLSSKLATFSEIYPQSHSYYFLNSLLPNGGSGNSYWTGLSSNKDWKLTDDTQRTRTYAQSSKCNKVHKTWSWWTLESESCRSSLPYICEMTAFRFPD(SEQ ID NO:3300)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3300的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是NKp80的配体，即CLEC2B(AICL)，例如，其中CLEC2B(AICL)包含氨基酸序列：
KLTRDSQSLCPYDWIGFQNKCYYFSKEEGDWNSSKYNCSTQHADLTIIDNIEEMNFLRRYKCSSDHWIGLKMAKNRTGQWVDGATFTKSFGMRGSEGCAYLSDDGAATARCYTERKWICRKRIH(SEQ ID NO:3301)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3301的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，NK细胞衔接物是CD244的配体，即CD48，例如，其中CD48包含氨基酸序列：
QGHLVHMTVVSGSNVTLNISESLPENYKQLTWFYTFDQKIVEWDSRKSKYFESKFKGRVRLDPQSGALYISKVQKEDNSTYIMRVLKKTGNEQEWKIKLQVLDPVPKPVIKIEKIEDMDDNCYLKLSCVIPGESVNYTWYGDKRPFPKELQNSVLETTLMPHNYSRCYTCQVSNSVSSKNGTVCLSPPCTLARS(SEQ ID NO:3302)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3302的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
T细胞衔接物
本文尤其提供了多特异性(例如，双、三、四特异性)或多功能分子，其经工程化以进一步包含一种或多种介导与T细胞的结合和/或激活的T细胞衔接物。在一些实施方案中，T细胞衔接物是抗原结合结构域，其结合(例如激活)TCRβ，例如本文所述的TCRβV区。在一些实施方案中，T细胞衔接物选自与以下一种或多种结合(并且例如在一些实施方案中对其进行激活)的抗原结合结构域或配体：CD3、TCRα、TCRγ、TCRζ、ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2或CD226。在其他实施方案中，T细胞衔接物选自与以下一种或多种结合但不对其进行激活的抗原结合结构域或配体：CD3、TCRα、TCRγ、TCRζ、ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2或CD226。
B细胞、巨噬细胞和树突状细胞衔接物
宽泛地说，B细胞(也称为B淋巴细胞)是淋巴细胞亚型的一种白细胞。它们通过分泌抗体在适应性免疫系统的体液免疫成分中起作用。此外，B细胞呈递抗原(它们也被分类为专业抗原呈递细胞(APC))并分泌细胞因子。巨噬细胞是一种白细胞，其通过吞噬作用吞噬并消化细胞碎片、异物、微生物、癌细胞。除吞噬作用外，它们在非特异性防御(先天免疫)中起重要作用，并通过募集其他免疫细胞(诸如淋巴细胞)来帮助启动特异性防御机制(适应性免疫)。例如，它们作为T细胞的抗原呈递者很重要。除了增加炎症和刺激免疫系统外，巨噬细胞还起重要的抗炎作用，并且可以通过释放细胞因子来降低免疫应答。树突状细胞(DC)是抗原呈递细胞，其作用于处理抗原物质并将其在细胞表面呈递给免疫系统的T细胞。
本文尤其提供了多特异性(例如，双、三、四特异性)或多功能分子，其进一步包括例如经工程化以包含一种或多种介导与B细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞的结合和/或激活的B细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞衔接物。
因此，在一些实施方案中，免疫细胞衔接物包括选自以下的一种或多种的B细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞衔接物：CD40配体(CD40L)或CD70配体；与CD40或CD70结合的抗体分子；针对OX40的抗体分子；OX40配体(OX40L)；Toll样受体的激动剂(例如，如本文所述，例如TLR4，例如组成型活性TLR4(caTLR4)，或TLR9激动剂)；41BB；CD2；CD47；或STING激动剂，或其组合。
在一些实施方案中，B细胞衔接物是CD40L、OX40L或CD70配体，或与OX40、CD40或CD70结合的抗体分子。
在一些实施方案中，巨噬细胞衔接物是CD2激动剂。在一些实施方案中，巨噬细胞衔接物是与以下结合的抗原结合结构域：CD40L或与CD40结合的抗原结合结构域或配体、Toll样受体(TLR)激动剂(例如，如本文所述)，例如TLR9或TLR4(例如caTLR4(组成型活性TLR4))、CD47或STING激动剂。在一些实施方案中，STING激动剂是环二核苷酸，例如环二GMP(cdGMP)或环二AMP(cdAMP)。在一些实施方案中，STING激动剂是生物素化的。
在一些实施方案中，树突状细胞衔接物是CD2激动剂。在一些实施方案中，树突状细胞衔接物是与以下一种或多种结合的配体、受体激动剂或抗体分子：OX40L、41BB、TLR激动剂(例如，如本文所述)(例如TLR9激动剂、TLR4(例如caTLR4(组成型活性TLR4))、CD47或STING激动剂。在一些实施方案中，STING激动剂是环二核苷酸，例如环二GMP(cdGMP)或环二AMP(cdAMP)。在一些实施方案中，STING激动剂是生物素化的。
在其他实施方案中，免疫细胞衔接物介导与B细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞中的一个或多个的结合或激活。示例性的B细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞衔接物可以选自以下一种或多种：CD40配体(CD40L)或CD70配体；与CD40或CD70结合的抗体分子；针对OX40的抗体分子；OX40配体(OX40L)；Toll样受体激动剂(例如TLR4，例如组成型活性TLR4(caTLR4)或TLR9激动剂)；41BB激动剂；CD2；CD47；或STING激动剂，或其组合。
在一些实施方案中，B细胞衔接物选自CD40L、OX40L或CD70配体或与OX40、CD40或CD70结合的抗体分子中的一种或多种。
在其他实施方案中，巨噬细胞衔接物选自以下一种或多种：CD2激动剂；CD40L；OX40L；与OX40、CD40或CD70结合的抗体分子；Toll样受体激动剂或其片段(例如TLR4，例如组成型活性TLR4(caTLR4))；CD47激动剂；或STING激动剂。
在其他实施方案中，树突状细胞衔接物选自以下一种或多种：CD2激动剂、OX40抗体、OX40L、41BB激动剂、Toll样受体激动剂或其片段(例如TLR4，例如组成型活性TLR4(caTLR4))、CD47激动剂或STING激动剂。
在一些实施方案中，OX40L包含氨基酸序列：
QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL(SEQ ID NO:3303)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3303的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，CD40L包含氨基酸序列：
MQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(SEQ ID NO:3304)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQID NO:3304的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在其他实施方案中，STING激动剂包含环二核苷酸，例如环二GMP(cdGMP)、环二AMP(cdAMP)或其组合，任选地具有2',5'或3',5'磷酸酯键。
在一些实施方案中，免疫细胞衔接物包括41BB配体，例如，其包含氨基酸序列：
ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE(SEQ ID NO:3305)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3305的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
Toll样受体：Toll样受体(TLR)是进化保守的受体，是果蝇属Toll蛋白的同源物，可识别被称为病原体相关微生物模式(PAMP)(仅由微生物病原体表达)或与危险相关的分子模式(DAMP)(从坏死或垂死细胞释放的内源性分子)的高度保守的结构基序。PAMP包括各种细菌细胞壁组分，诸如脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和脂肽，以及鞭毛蛋白、细菌DNA和病毒双链RNA。DAMP包括细胞内蛋白(诸如热激蛋白)以及来自细胞外基质的蛋白质片段。相应的PAMP或DAMP对TLR的刺激会引发信号传导级联反应，从而导致转录因子，诸如AP-1、NF-κB和干扰素调节因子(IRF)的激活。TLR发出的信号导致多种细胞反应，包括干扰素(IFN)、促炎性细胞因子和效应细胞因子的产生，它们指导适应性免疫应答。TLR与多种炎症和免疫疾病有关，并在癌症中起作用(Rakoff-Nahoum S.&Medzhitov R.,2009.Toll-like receptorsand cancer.Nat Revs Cancer 9:57-63)。
TLR是I型跨膜蛋白，其特征在于含有富含亮氨酸的重复序列(LRR)的细胞外结构域和含有称为Toll/IL-1受体(TIR)结构域的保守区域的胞质尾区。已鉴定出十种人类TLR和十二种鼠TLR，人类中为TLR1至TLR10，小鼠中为TLR1至TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，TLR10的同源物是假基因。TLR2对于识别革兰氏阳性细菌中的多种PAMP，包括细菌脂蛋白、脂甘露聚糖和脂磷壁酸至关重要。TLR3与病毒衍生的双链RNA有关。TLR4主要被脂多糖激活。TLR5检测细菌鞭毛蛋白，而对未甲基化的CpG DNA的应答则需要TLR9。最后，TLR7和TLR8识别小的合成抗病毒分子，据报道单链RNA是其天然配体。据报道，TLR11识别来自尿道致病性大肠杆菌和鼠弓形虫的抑制蛋白样蛋白质。TLR彼此异源二聚化的能力显然可以扩展TLR的全部特异性。例如，对二酰化脂蛋白的应答需要TLR2和TLR6的二聚体，而TLR2和TLR1相互作用以识别三酰化脂蛋白。TLR的特异性还受到各种衔接子和辅助分子的影响，诸如MD-2和CD14，它们响应于LPS而与TLR4形成复合物。
TLR信号传导由至少两个不同的途径组成：导致炎症细胞因子产生的MyD88依赖性途径，以及与IFN-β刺激和树突状细胞成熟相关的MyD88非依赖性途径。MyD88依赖性途径是除TLR3以外的所有TLR共有的(Adachi O.等人,1998.Targeted disruption of theMyD88gene results in loss of IL-1-and IL-18-mediated function.Immunity.9(1):143-50)。通过PAMP或DAMP激活后，TLR异源或同源二聚化通过胞质TIR结构域诱导衔接蛋白的募集。各个TLR通过使用不同的衔接分子诱导不同的信号传导响应。TLR4和TLR2信号传导需要衔接子TIRAP/Mal，该衔接子参与MyD88依赖性途径。TLR3以MyD88非依赖性方式通过衔接子TRIF/TICAM-1触发对双链RNA的应答的IFN-β产生。TRAM/TICAM-2是参与MyD88非依赖性途径的另一个衔接分子，其功能被限制于TLR4途径。
TLR3、TLR7、TLR8和TLR9识别病毒核酸并诱导I型IFN。根据激活的TLR，导致I型IFN诱导的信号传导机制不同。它们涉及干扰素调节因子IRF——已知在抗病毒防御、细胞生长和免疫调节中起关键作用的转录因子家族。三个IRF(IRF3、IRF5和IRF7)充当病毒介导的TLR信号传导的直接转导物。TLR3和TLR4激活IRF3和IRF7，而TLR7和TLR8激活IRF5和IRF7(Doyle S.等人,2002.IRF3mediates a TLR3/TLR4-specific antiviral geneprogram.Immunity.17(3):251-63)。此外，已显示由TLR9配体CpG-A刺激的I型IFN产生是由PI(3)K和mTOR介导的(Costa-Mattioli M.&Sonenberg N.2008.RAPping production oftype I interferon in pDCs through mTOR.Nature Immunol.9:1097-1099)。
TLR-9：TLR9识别DNA分子中未甲基化的CpG序列。与细菌基因组或病毒DNA相比，CpG位点在脊椎动物基因组上相对较少(约1％)。TLR9由免疫系统的许多细胞表达，诸如B淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞和浆细胞样树突状细胞。TLR9在内体区室中细胞内表达，并通过与富含CpG基序的DNA结合来提醒免疫系统有病毒和细菌感染。TLR9信号导致激活引发促炎症反应的细胞，从而导致产生细胞因子，诸如I型干扰素和IL-12。
TLR激动剂：TLR激动剂可以激动一种或多种TLR，例如人TLR-1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中的一种或多种。在一些实施方案中，本文所述的辅助剂是TLR激动剂。在一些实施方案中，TLR激动剂特异性地激动人TLR-9。在一些实施方案中，TLR-9激动剂是CpG部分。如本文所用，CpG部分是线性的二核苷酸，具有序列：5’—C—磷酸盐—G—3’，即，仅被一个磷酸盐分开的胞嘧啶和鸟嘌呤。在一些实施方案中，CpG部分包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，CpG部分由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个CpG二核苷酸组成。在一些实施方案中，CpG部分具有1-5、1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、5-10、5-20、5-30、10-20、10-30、10-40或10-50个CpG二核苷酸。在一些实施方案中，TLR-9激动剂是合成的ODN(寡脱氧核苷酸)。CpG ODN是短的合成的单链DNA分子，其在特定的序列环境中包含未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序)。与基因组细菌DNA中发现的天然磷酸二酯(PO)骨架相反，CpG ODN具有部分或完全硫代磷酸酯(PS)骨架。CpG ODN主要分为三类：A、B和C类，它们的免疫刺激活性不同。CpG-A ODN的特征是PO中心含CpG回文基序和PS修饰的3’多聚鸟苷酸(poly-G)串(string)。它们诱导pDC产生大量IFN-α，但是是TLR9依赖性NF-κB信号传导和促炎性细胞因子(例如IL-6)产生的较弱刺激物。CpG-B ODN包含具有一个或多个CpG二核苷酸的完整PS骨架。它们强烈激活B细胞和TLR9依赖性NF-κB信号传导，但微弱刺激IFN-α分泌。CpG-C ODN结合了A类和B类的特征。它们包含完整的PS骨架和含CpG的回文基序。C类CpG ODN诱导pDC产生大量的IFN-α并刺激B细胞。
基质修饰部分
在一些实施方案中，多功能分子进一步包含基质修饰部分。如本文所用，“基质修饰部分”是指能够改变，例如，降解基质的组分的药剂，例如蛋白质(例如酶)。在实施方案中，基质的组分选自，例如ECM组分，例如糖胺聚糖，例如玻璃酸钠(hyaluronan)(也称为透明质酸或HA)、硫酸软骨素、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、肝素、巢蛋白、生腱蛋白、聚集蛋白聚糖和硫酸角蛋白；或细胞外蛋白，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白和玻连蛋白。
实体瘤具有模仿正常组织的独特结构，并包含两个不同但相互依存的区室：实质(赘生性细胞)和赘生性细胞诱导并分散于其中的基质。所有肿瘤都具有基质，并且需要基质来提供营养支持和清除废物。在肿瘤以细胞悬液(例如白血病、腹水肿瘤)生长的情况下，血浆充当基质(Connolly JL等人,Tumor Structure and Tumor Stroma Generation.载于：Kufe DW等人编辑的Holland-Frei Cancer Medicine，第六版，Hamilton:BC Decker；2003中)。基质包括多种细胞类型，包括成纤维细胞/肌纤维母细胞、神经胶质细胞、上皮细胞、脂肪、血管、平滑肌和免疫细胞，以及细胞外基质(ECM)和细胞外分子(Li Hanchen等人,Tumor Microenvironment:The Role of the Tumor Stroma in Cancer.J of CellularBiochemistry 101:805-815(2007))。
本文所述的基质修饰部分包括能够降解基质组分的部分(例如蛋白质，例如酶)，该基质组分是例如ECM组分，例如糖胺聚糖，例如玻璃酸钠(也称为透明质酸或HA)、硫酸软骨素、软骨素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、肝素、巢蛋白、生腱蛋白、聚集蛋白聚糖和硫酸角蛋白；或细胞外蛋白，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白和玻连蛋白。
基质修饰酶
在一些实施方案中，基质修饰部分是酶。例如，基质修饰部分可包括但不限于透明质酸酶、胶原酶、软骨素酶、基质金属蛋白酶(例如，巨噬细胞金属弹性蛋白酶)。
透明质酸酶
透明质酸酶是在整个动物界中发现的一组中性和酸性活性酶。透明质酸酶在底物特异性和作用机理方面有所不同。透明质酸酶一般分为三类：(1)哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)，它们是内切-β-N-乙酰基己糖苷酶，四糖和六糖为主要终产物。它们同时具有水解和转糖苷酶活性，并且可以降解玻璃酸钠和硫酸软骨素；(2)细菌透明质酸酶(EC4.2.99.1)降解玻璃酸钠，并在不同程度上降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素。它们是内切-β-N-乙酰基己糖胺酶，通过β消除反应起作用，主要产生二糖终产物；(3)来自水蛭、其他寄生虫和甲壳类的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)是内切β-葡糖醛酸糖苷酶，其可通过水解β1-3键产生四糖和六糖终产物。
哺乳动物的透明质酸酶可以进一步分为两组：(1)中性活性酶和(2)酸性活性酶。人类基因组中有六个透明质酸酶样基因：HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。HYALP1是假基因，尚未显示HYAL3具有针对任何已知底物的酶活性。HYAL4是一种软骨素酶，并对玻璃酸钠缺乏活性。HYAL1是原型酸性活性酶，PH20是原型中性活性酶。酸性活性透明质酸酶，诸如HYAL1和HYAL2在中性pH下缺乏催化活性。例如，HYAL1在pH超过4.5的条件下在体外没有催化活性(Frost和Stern,“A Microtiter-Based Assay forHyaluronidase Activity Not Requiring Specialized Reagents”,AnalyticalBiochemistry,第251卷,第263-269页(1997)。HYAL2是一种在体外具有非常低的特异性活性的酸性活性酶。
在一些实施方案中，透明质酸酶是哺乳动物透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是重组人透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是中性活性透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是中性活性的可溶性透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是重组PH20中性活性酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是重组PH20中性活性的可溶性酶。在一些实施方案中，透明质酸酶是糖基化的。在一些实施方案中，透明质酸酶具有至少一种N连接的聚糖。重组透明质酸酶可以使用本领域技术人员已知的常规方法例如US7767429来生产，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，透明质酸酶是rHuPH20(也称为目前由Halozyme制造；在2005年被FDA批准(参见例如Scodeller P(2014)Hyaluronidase and otherExtracellular Matrix Degrading Enzymes for Cancer Therapy:New Uses and Nano-Formulations.J Carcinog Mutage 5:178；US7767429；US8202517；US7431380；US8450470；US8772246；US8580252，其各自的全部内容通过引用并入本文)。rHuPH20由基因改造的CHO细胞产生，该细胞含有编码人透明质酸酶PH20的可溶性片段的DNA质粒。在一些实施方案中，透明质酸酶是糖基化的。在一些实施方案中，透明质酸酶具有至少一种N连接的聚糖。重组透明质酸酶可以使用本领域技术人员已知的常规方法例如US7767429来生产，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，rHuPH20具有与以下氨基酸序列至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％、100％)相同的序列：
LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLS(SEQ ID NO:3306)。
在本文提供的任何方法中，抗玻璃酸钠试剂可以是降解玻璃酸钠的试剂或可以是抑制玻璃酸钠合成的试剂。例如，抗玻璃酸钠试剂可以是玻璃酸钠降解酶。在另一个实例中，抗玻璃酸钠试剂或为抑制玻璃酸钠合成的试剂。例如，抗玻璃酸钠试剂是抑制玻璃酸钠合成的试剂，诸如针对HA合成酶的有义或反义核酸分子，或者是小分子药物。例如，抗玻璃酸钠试剂是4-甲基伞形酮(MU)或其衍生物，或来氟米特或其衍生物。这样的衍生物包括例如4-甲基伞形酮(MU)的衍生物，即6,7-二羟基-4-甲基香豆素或5,7-二羟基-4-甲基香豆素。
在本文提供的方法的其他实例中，玻璃酸钠降解酶是透明质酸酶。在一些实例中，玻璃酸钠降解酶是PH20透明质酸酶或其截短形式，该截短形式缺乏C末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点或GPI附着位点的一部分。在特定的实例中，透明质酸酶是选自人、猴、牛、绵羊、大鼠、小鼠或豚鼠的PH20的PH20。例如，玻璃酸钠降解酶是具有中性活性并被N-糖基化的人PH20透明质酸酶，并且选自(a)为全长PH20或为PH20的C末端截短形式的透明质酸酶多肽，其中截短形式至少包含SEQ ID NO:139的氨基酸残基36-464，诸如36-481、36-482、36-483，其中全长PH20具有SEQ ID NO:139所示的氨基酸序列；或(b)包含的氨基酸序列与SEQID NO:139所示的氨基酸序列的多肽或截短形式具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的透明质酸酶多肽；或(c)包含氨基酸置换的(a)或(b)的透明质酸酶多肽，其中该透明质酸酶多肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:139所示的多肽或其相应的截短形式具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。在示例性实例中，玻璃酸钠降解酶是PH20，其包含称为rHuPH20的组成。
在其他实例中，抗玻璃酸钠试剂是玻璃酸钠降解酶，其通过缀合至聚合物而被修饰。聚合物可以是PEG，抗玻璃酸钠试剂是PEG化的玻璃酸钠降解酶。因此，在本文提供的方法的一些实例中，玻璃酸钠降解酶通过缀合至聚合物而被修饰。例如，玻璃酸钠降解酶缀合至PEG，因此玻璃酸钠降解酶被PEG化。在示例性的实例中，玻璃酸钠降解酶是PEG化的PH20酶(PEGPH20)。在本文提供的方法中，皮质类固醇可以是糖皮质激素，选自可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙和泼尼松。
软骨素酶
软骨素酶是在整个动物界中发现的一种酶，其通过内切糖苷酶反应降解糖胺聚糖，特别是软骨素和硫酸软骨素。在一些实施方案中，软骨素酶是哺乳动物软骨素酶。在一些实施方案中，软骨素酶是重组人软骨素酶。在一些实施方案中，软骨素酶是HYAL4。其他示例性的软骨素酶包括软骨素酶ABC(衍生自普通变形杆菌(Proteus vulgaris)；日本专利申请公开号6-153947；T.Yamagata等人,J.Biol.Chem.,243,1523(1968)；S.Suzuki等人,J.Biol.Chem.,243,1543(1968))、软骨素酶AC(衍生自肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)；T.Yamagata等人,J.Biol.Chem.,243,1523(1968))、软骨素酶AC II(衍生自金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)；K.Hiyama和S.Okada,J.Biol.Chem.,250,1824(1975)；K.Hiyama和S.Okada,J.Biochem.(Tokyo),80,1201(1976))、透明质酸酶ACIII(衍生自黄杆菌属种(Flavobacteriumsp.)Hpl02；Hirofumi Miyazono等人,Seikagaku,61,1023(1989))、软骨素酶B(衍生自肝素黄杆菌；Y.M.Michelacci和C.P.Dietrich,Biochem.Biophys.Res.Commun.,56,973(1974)；Y.M.Michelacci和C.P.Dietrich,Biochem.J.,151,121(1975)；Kenichi Maeyama等人,Seikagaku,57,1189(1985))、软骨素酶C(衍生自黄杆菌属种Hp102；Hirofumi Miyazono等人,Seikagaku,61,1023(1939))等。
基质金属蛋白酶
基质金属蛋白酶(MMP)是锌依赖性内肽酶，是参与细胞外基质(ECM)降解的主要蛋白酶。MMP能够降解各种细胞外分子和许多生物活性分子。已在人体中鉴定出二十四个MMP基因，根据域排布和底物偏好可将其分为六类：胶原酶(MMP-1、-8和-13)、明胶酶(MMP-2和MMP-9)、基质溶素(MMP-3、-10和-11)、基质溶解因子(MMP-7和MMP-26)、膜类型(MT)-MMP(MMP-14、-15、-16、-17、-24和-25)和其他(MMP-12、-19、-20、-21、-23、-27和-28)。在一些实施方案中，基质修饰部分是人重组MMP(例如，MMP-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、20、-21、-22、-23或-24)。
胶原酶
三种哺乳动物胶原酶(MMP-1、-8和-13)是能够裂解胶原细胞外基质的主要分泌的内肽酶。除了纤维胶原，胶原酶还可以裂解其他几种基质和非基质蛋白，包括生长因子。胶原酶被合成为非活性的替代形式，一旦被激活，其活性就会被金属蛋白酶、TIMP的特异性组织抑制剂以及非特异性蛋白酶抑制剂所抑制(Ala-aho R等人Biochimie.Collagenases incancer.2005年3月-4月；87(3-4):273-86)。在一些实施方案中，基质修饰部分是胶原酶。在一些实施方案中，胶原酶是人重组胶原酶。在一些实施方案中，胶原酶是MMP-1。在一些实施方案中，胶原酶是MMP-8。在一些实施方案中，胶原酶是MMP-13。
巨噬细胞金属弹性蛋白酶
巨噬细胞金属弹性蛋白酶(MME)，也称为MMP-12，是MMP基质溶素亚组的成员，催化可溶性和不可溶弹性蛋白以及多种基质和非基质底物的水解，包括IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、巢蛋白、乙酰肝素和硫酸软骨素(Erja等人Journal ofInvestigative Dermatology(2000)114,1113–1119；doi:10.1046/j.1523-1747.2000.00993)。在一些实施方案中，基质修饰部分是MME。在一些实施方案中，MME是人重组MME。在一些实施方案中，MME是MMP-12。
其他基质修饰部分
在一些实施方案中，基质修饰部分引起以下一种或多种：降低基质或细胞外基质(ECM)组分的水平或产生；减少肿瘤纤维化；增加间质肿瘤的运输；改善肿瘤灌注；扩大肿瘤微血管；降低肿瘤中的间质液压(IFP)；或减少或增强诸如癌症治疗剂或细胞疗法的药剂向肿瘤或肿瘤脉管系统的渗透或扩散。
在一些实施方案中，降低的基质或ECM组分选自糖胺聚糖或细胞外蛋白，或其组合。在一些实施方案中，糖胺聚糖选自玻璃酸钠(也称为透明质酸或HA)、硫酸软骨素、软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素、巢蛋白、生腱蛋白、聚集蛋白聚糖和硫酸角蛋白。在一些实施方案中，细胞外蛋白选自胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白或玻连蛋白。在一些实施方案中，基质修饰部分包括降解肿瘤基质或细胞外基质(ECM)的酶分子。在一些实施方案中，酶分子选自透明质酸酶分子、胶原酶分子、软骨素酶分子、基质金属蛋白酶分子(例如，巨噬细胞金属弹性蛋白酶)或上述任何一种的变体(例如，片段)。术语“酶分子”包括酶的全长、片段或变体，例如保留天然存在的酶的至少一种功能性质的酶变体。
在一些实施方案中，基质修饰部分降低了透明质酸的水平或产生。在其他实施方案中，基质修饰部分包含玻璃酸钠降解酶、抑制玻璃酸钠合成的试剂或抗透明质酸的抗体分子。
在一些实施方案中，玻璃酸钠降解酶是透明质酸酶分子，例如其全长或变体(例如，其片段)。在一些实施方案中，玻璃酸钠降解酶在中性或酸性pH，例如约4-5的pH中具有活性。在一些实施方案中，透明质酸酶分子是哺乳动物透明质酸酶分子，例如重组人透明质酸酶分子，例如其全长或变体(例如其片段，例如截短形式)。在一些实施方案中，透明质酸酶分子选自HYAL1、HYAL2或PH-20/SPAM1，或其功能片段功能变体(例如，其截短形式)。在一些实施方案中，截短形式缺乏C末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着位点或GPI附着位点的一部分。在一些实施方案中，透明质酸酶分子被糖基化，例如包含至少一种N连接的聚糖。
在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含氨基酸序列：
LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLS(SEQ ID NO:3311)，或其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3311的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含：(i)SEQ ID NO:3311的36-464的氨基酸序列；(ii)PH20的36-481、36-482或36-483的氨基酸序列，其中PH20具有SEQ ID NO:3311所示的氨基酸序列；或者(iii)与SEQ ID NO:3311所示的氨基酸序列的多肽或截短形式具有至少95％至100％序列同一性的氨基酸序列；或者(iv)对SEQ ID NO:3311所示的氨基酸序列具有30、20、10、5或更少的氨基酸置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，透明质酸酶分子包含与SEQ ID NO:3311的氨基酸序列至少95％(例如，至少95％、96％、97％、98％、99％、100％)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，透明质酸酶分子由与SEQ ID NO:3311的核苷酸序列至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％、100％)相同的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，透明质酸酶分子是PH20，例如rHuPH20。在一些实施方案中，透明质酸酶分子是HYAL1并包含氨基酸序列：
FRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW(SEQ ID NO:3312)，或其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3312的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
在一些实施方案中，玻璃酸钠降解酶，例如透明质酸酶分子，进一步包含聚合物，例如缀合至聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，玻璃酸钠降解酶是PEG化的PH20酶(PEGPH20)。在一些实施方案中，玻璃酸钠降解酶，例如透明质酸酶分子，进一步包含免疫球蛋白链恒定区(例如Fc区)，该免疫球蛋白链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，更具体而言，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区(例如Fc区)与玻璃酸钠降解酶例如透明质酸酶分子连接，例如共价连接。在一些实施方案中，改变免疫球蛋白链恒定区(例如Fc区)，例如使其突变，以增加或减少以下一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能。在一些实施方案中，玻璃酸钠降解酶，例如透明质酸酶分子形成二聚体。
在一些实施方案中，基质修饰部分包含玻璃酸钠合成例如HA合成酶的抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂包含针对HA合成酶的有义或反义核酸分子或为小分子药物。在一些实施方案中，抑制剂是4-甲基伞形酮(MU)或其衍生物(例如，6,7-二羟基-4-甲基香豆素或5,7-二羟基-4-甲基香豆素)或来氟米特或其衍生物。
在一些实施方案中，基质修饰部分包含针对透明质酸的抗体分子。
在一些实施方案中，基质修饰部分包含胶原酶分子，例如哺乳动物胶原酶分子，或其变体(例如，片段)。在一些实施方案中，胶原酶分子是胶原酶分子IV，例如，包含以下氨基酸序列：
YNFFPRKPKWDKNQITYRIIGYTPDLDPETVDDAFARAFQVWSDVTPLRFSRIHDGEADIMINFGRWEHGDGYPFDGKDGLLAHAFAPGTGVGGDSHFDDDELWTLGEGQVVRVKYGNADGEYCKFPFLFNGKEYNSCTDTGRSDGFLWCSTTYNFEKDGKYGFCPHEALFTMGGNAEGQPCKFPFRFQGTSYDSCTTEGRTDGYRWCGTTEDYDRDKKYGFCPETAMSTVGGNSEGAPCVFPFTFLGNKYESCTSAGRSDGKMWCATTANYDDDRKWGFCPDQGYSLFLVAAHEFGHAMGLEHSQDPGALMAPIYTYTKNFRLSQDDIKGIQELYGASPDIDLGTGPTPTLGPVTPEICKQDIVFDGIAQIRGEIFFFKDRFIWRTVTPRDKPMGPLLVATFWPELPEKIDAVYEAPQEEKAVFFAGNEYWIYSASTLERGYPKPLTSLGLPPDVQRVDAAFNWSKNKKTYIFAGDKFWRYNEVKKKMDPGFPKLIADAWNAIPDNLDAVVDLQGGGHSYFFKGAYYLKLENQSLKSVKFGSIKSDWLGC(SEQ ID NO:3313)，其片段，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或对SEQ ID NO:3313的氨基酸序列具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列。
肿瘤抗原部分
在一些实施方案中，多功能分子进一步包含肿瘤抗原部分。在一些实施方案中，肿瘤靶向部分是抗原，例如癌抗原。在一些实施方案中，癌抗原是肿瘤抗原或基质抗原，或血液学抗原。
如本文所用，“癌症”可以涵盖所有类型的致癌过程和/或癌性生长。在实施方案中，癌症包括原发性肿瘤以及转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官。在实施方案中，癌症涵盖所有组织病理学和阶段，例如癌症的浸润性/严重性的阶段。在实施方案中，癌症包括复发性和/或耐药性癌症。术语“癌症”和“肿瘤”可以互换使用。例如，两个术语都包括实体瘤和液体瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。
在一些实施方案中，肿瘤靶向部分例如癌抗原选自：BCMA、FcRH5、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD47、CD99、CD123、FcRH5、CLEC12、CD179A、SLAMF7或NY-ESO1、PDL1、CD47、神经节苷脂2(GD2)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、Ron激酶、c-Met、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、BING-4、钙激活的氯化物通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、SAP-1、存活蛋白、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、Gp100/pmel17、酪氨酸酶、TRP-1/-2、MC1R、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、p53、Ras、TGF-B受体、AFP、ETA、MAGE、MUC-1、CA-125、BAGE、GAGE、NY-ESO-1、β-连环蛋白、CDK4、CDC27、α辅肌动蛋白-4、TRP1/gp75、TRP2、gp100、Melan-A/MART1、神经节苷脂、WT1、EphA3、表皮生长因子受体(EGFR)、MART-2、MART-1、MUC1、MUC2、MUM1、MUM2、MUM3、NA88-1、NPM、OA1、OGT、RCC、RUI1、RUI2、SAGE、TRG、TRP1、TSTA、叶酸受体α、L1-CAM、CAIX、gpA33、GD3、GM2、VEGFR、整合素(整合素αVβ3、整合素α5βl)、碳水化合物(Le)、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、(FAP)、TGF-β、透明质酸、胶原蛋白，例如胶原蛋白IV、生腱蛋白C或生腱蛋白W。在一些实施方案中，肿瘤靶向部分，例如癌抗原，是BCMA。在一些实施方案中，肿瘤靶向部分，例如癌抗原，是FcRH5。
在一些实施方案中，肿瘤靶向部分，例如，癌抗原，选自：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素样分子-1、CD33、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂GD3、TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)、白介素13受体亚基α-2、间皮素、白介素11受体α(IL-11Ra)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、蛋白酶丝氨酸21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis(Y)抗原、CD24、血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)、粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、延伸因子2突变(ELF2M)、肝配蛋白B2、成纤维细胞激活蛋白α(FAP)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白酶体(前体巨蛋白因子)亚基β型9(LMP2)、糖蛋白100(gp100)、由断点簇区域组成的癌基因融合蛋白(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)(bcr-abl)、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸路易斯粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)、o-乙酰-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、密封蛋白6(CLDN6)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、CD97、CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、聚唾液酸、胎盘特异性1(PLAC1)、globoH糖神经酰胺(GloboH)的六糖部分、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、uroplakin 2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、泛连接蛋白3(PANX3)、G蛋白偶联受体20(GPR20)、淋巴细胞抗原6复合物、基因座K9(LY6K)、嗅觉受体51E2(OR51E2)、TCRγ替代阅读框蛋白(TARP)、肾母细胞瘤蛋白(WT1)、癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)、黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)、位于染色体12p的ETS易位变异基因6(ETV6-AML)、精子蛋白17(SPA17)、X抗原家族成员1A(XAGE1)、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)、黑色素瘤睾丸抗原1(MAD-CT-1)、黑色素瘤睾丸抗原2(MAD-CT-2)、Fos相关抗原1、肿瘤蛋白p53(p53)、p53突变体、prostein、存活、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1、T细胞识别的黑色素瘤抗原1、大鼠肉瘤(Ras)突变体、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、肉瘤易位断点、细胞凋亡的黑色素瘤抑制剂(ML-IAP)、ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、v-myc禽骨髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)、Ras同源物家族成员C(RhoC)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、滑膜肉瘤、X断点2(SSX2)、高级糖基化终末产物受体(RAGE-1)、肾遍在蛋白1(RU1)、肾遍在蛋白2(RU2)、豆荚蛋白、人乳头瘤病毒E6(HPV E6)、人乳头瘤病毒E7(HPV E7)、肠羧基酯酶、热休克蛋白70-2突变(muthsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、Fc受体样5(FCRL5)、或免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
FcRH5靶向部分
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性分子包括与FcRH5结合的靶向部分(例如，FcRH5靶向部分)。FcRH5靶向部分可以选自抗体分子(例如，如本文所述的抗原结合结构域)、受体或受体片段、或配体或配体片段或其组合。在一些实施方案中，FcRH5靶向部分与癌症或造血细胞(例如，存在于癌症或造血细胞的表面上的分子，例如抗原)缔合，例如结合。在某些实施方案中，FcRH5靶向部分将如本文所述的多特异性分子靶向，例如引导至癌细胞或造血细胞。在一些实施方案中，癌症是血液学癌症，例如多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，多特异性分子，例如FcRH5靶向部分，结合至细胞例如癌细胞或造血细胞的表面上的FcRH5抗原。FcRH5抗原可以存在于原发性肿瘤细胞或其转移性病变上。在一些实施方案中，癌症是血液学癌症，例如多发性骨髓瘤。例如，FcRH5抗原可以存在于肿瘤上，例如以下列一项或多项为特征的一类肿瘤：有限的肿瘤灌注、压缩的血管或纤维变性肿瘤间质。
本文所述的多特异性分子包含FcRH5靶向部分，其包含在以下专利中描述的抗FcRH5抗体或其抗原结合片段：美国专利7,999,077、US20150098900、US8299220、US7105149、US8362213、US8466260、US8617559、US20160368985、US20150166661和US20080247944，任何上述出版物的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性分子包含FcRH5靶向部分，其包含在美国专利7,999,077(其全部内容通过引用并入本文)中描述的抗FcRH5抗体或其抗原结合片段。
BCMA靶向部分
在某些实施方案中，如本文所述的多特异性分子包括与BCMA结合的靶向部分(例如，BCMA靶向部分)。BCMA靶向部分可以选自抗体分子(例如，如本文所述的抗原结合结构域)、受体或受体片段，或配体或配体片段或其组合。在一些实施方案中，BCMA靶向部分与例如癌细胞或造血细胞(例如，存在于癌细胞或造血细胞的表面上的分子，例如抗原)缔合，例如结合。在某些实施方案中，BCMA靶向部分将如本文所述的多特异性分子靶向，例如引导至癌细胞或造血细胞。在一些实施方案中，癌症是血液学癌症，例如多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，多特异性分子，例如BCMA靶向部分，结合至细胞例如癌细胞或造血细胞的表面上的BCMA抗原。BCMA抗原可以存在于原发性肿瘤细胞或其转移性病变上。在一些实施方案中，癌症是血液学癌症，例如多发性骨髓瘤。例如，BCMA抗原可以存在于肿瘤上，例如以下列一项或多项为特征的一类肿瘤：有限的肿瘤灌注、压缩的血管或纤维变性肿瘤间质。
示例性的BCMA靶向部分：本文所述的多特异性分子可以包括BCMA靶向部分，其包含描述于以下专利中的抗BCMA抗体或其抗原结合片段：US8920776、US9243058、US9340621、US8846042、US7083785、US9545086、US7276241、US9034324、US7799902、US9387237、US8821883、US861745、US20130273055、US20160176973、US20150368351、US20150376287、US20170022284、US20160015749、US20140242077、US20170037128、US20170051068、US20160368988、US20160311915、US20160131654、US20120213768、US20110177093、US20160297885、EP3137500、EP2699259、EP2982694、EP3029068、EP3023437、WO2016090327、WO2017021450、WO2016110584、WO2016118641、WO2016168149，其全部内容通过引用方式并入本文。
在一些实施方案中，BCMA靶向部分包括与BCMA结合的抗体分子(例如，Fab或scFv)。在一些实施方案中，针对BCMA的抗体分子包含来自表1的任何重链可变结构域序列的一个、两个或三个CDR，或紧密相关的CDR，例如相对于表15的CDR序列中的任一者具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的CDR。在一些实施方案中，针对BCMA的抗体分子包含选自表15的氨基酸序列中的任一者，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列的重链可变结构域序列。
可替代地，或与如本文所述的BCMA的重链组合，针对BCMA的抗体分子包含来自表15的轻链可变结构域序列中的任一者的一个、两个或三个CDR，或紧密相关的CDR，例如，相对于表15的CDR序列中的任一者具有至少一个氨基酸改变，但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换)的CDR。在一些实施方案中，针对BCMA的抗体分子包含选自表15的氨基酸序列中的任一者，或与其基本相同(例如，与其95％至99.9％相同，或具有至少一个氨基酸改变，但不超过五个、十个或十五个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守置换))的氨基酸序列的轻链可变结构域序列。
肿瘤靶向部分
在一些实施方案中，如本文所述的多功能或多特异性(例如，双、三、四特异性)分子进一步包含，例如经工程化以进一步包含一个或多个将分子引导至肿瘤细胞的肿瘤特异性靶向部分。
在某些实施方案中，如本文所述的多特异性分子进一步包括肿瘤靶向部分。肿瘤靶向部分可以选自抗体分子(例如，如本文所述的抗原结合结构域)、受体或受体片段、或配体或配体片段或其组合。在一些实施方案中，肿瘤靶向部分与肿瘤细胞(例如，存在于肿瘤细胞的表面上的分子，例如抗原)缔合，例如结合。在某些实施方案中，肿瘤靶向部分将如本文所述的多特异性分子靶向，例如引导至癌症(例如，癌细胞或肿瘤细胞)。在一些实施方案中，癌症选自血液学癌症、实体癌、转移性癌症，或其组合。
在一些实施方案中，多特异性分子，例如肿瘤靶向部分，结合至实体瘤抗原或基质抗原。实体瘤抗原或基质抗原可以存在于实体瘤或其转移性病变上。在一些实施方案中，实体瘤选自胰腺癌(例如，胰腺腺癌)、乳腺癌、结直肠癌、肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、皮肤癌、卵巢癌或肝癌中的一种或多种。在一些实施方案中，实体瘤是纤维化或增生性实体瘤。例如，实体瘤抗原或基质抗原可以存在于肿瘤上，例如以下列一项或多项为特征的一类肿瘤：有限的肿瘤灌注、压缩的血管或纤维化的肿瘤间质。
在某些实施方案中，实体瘤抗原选自以下中的一种或多种：PDL1、CD47、神经节苷脂2(GD2)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、Ron激酶、c-Met、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、BING-4、钙激活的氯化物通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、SAP-1、存活蛋白、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、Gp100/pmel17、酪氨酸酶、TRP-1/-2、MC1R、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、p53、Ras、TGF-B受体、AFP、ETA、MAGE、MUC-1、CA-125、BAGE、GAGE、NY-ESO-1、β-连环蛋白、CDK4、CDC27、CD47、α辅肌动蛋白-4、TRP1/gp75、TRP2、gp100、Melan-A/MART1、神经节苷脂、WT1、EphA3、表皮生长因子受体(EGFR)、MART-2、MART-1、MUC1、MUC2、MUM1、MUM2、MUM3、NA88-1、NPM、OA1、OGT、RCC、RUI1、RUI2、SAGE、TRG、TRP1、TSTA、叶酸受体α、L1-CAM、CAIX、EGFRvIII、gpA33、GD3、GM2、VEGFR、整合素(整合素αVβ3、整合素α5β1)、碳水化合物(Le)、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2或RANKL。
在其他实施方案中，多特异性分子，例如肿瘤靶向部分，结合至血液学癌症例如白血病或淋巴瘤的表面上存在的分子例如抗原。在一些实施方案中，血液学癌症是B细胞或T细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，血液学癌症选自以下中的一种或多种：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、多发性骨髓瘤或急性淋巴细胞性白血病。在实施方案中，癌症不是急性髓细胞性白血病(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)。在实施方案中，血液学抗原选自CD47、CD99、CD30、CD38、SLAMF7或NY-ESO1。在一些实施方案中，血液学抗原选自以下中的一种或多种：BCMA、CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、FcRH5、CLEC12或CD179A。
抗体分子
在一些实施方案中，抗体分子结合至癌抗原，例如，肿瘤抗原或基质抗原。在一些实施方案中，癌抗原是例如哺乳动物，例如人的癌抗原。在其他实施方案中，抗体分子结合至免疫细胞抗原，例如哺乳动物，例如人的免疫细胞抗原。例如，抗体分子特异性地结合至癌抗原或免疫细胞抗原上的表位，例如线性或构象表位。
在一些实施方案中，抗体分子为单特异性抗体分子，并且结合单一表位。例如，具有多个免疫球蛋白可变结构域序列的单特异性抗体分子，每个序列与相同的表位结合。
在一些实施方案中，抗体分子是多特异性或多功能抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且所述多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原，例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一些实施方案中，第一表位和第二表位重叠。在一些实施方案中，第一表位和第二表位不重叠。在一些实施方案中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一些实施方案中，多特异性抗体分子包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
在一些实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一些实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原，例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一些实施方案中，第一表位和第二表位重叠。在一些实施方案中，第一表位和第二表位不重叠。在一些实施方案中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一些实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一些实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或Fab或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或Fab或其片段。
在一些实施方案中，抗体分子包含双抗体、单链分子以及抗体的抗原结合片段(例如，Fab、F(ab’)2和Fv)。例如，抗体分子可以包含重(H)链可变结构域序列(在本文中缩写为VH))和轻(L)链可变结构域序列(在本文中缩写为VL)。在一些实施方案中，抗体分子包含重链和轻链或由其组成(在本文中称为半抗体)。在另一个实例中，抗体分子包括两个重(H)链可变结构域序列和两个轻(L)链可变结构域序列，从而形成两个抗原结合位点，诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、单链抗体(例如scFv)、单可变结构域抗体、双抗体(Dab)(二价和双特异性)和嵌合(例如人源化)抗体，它们可以通过修饰完整抗体而产生或使用重组DNA技术从头合成。这些功能性抗体片段保留与它们各自的抗原或受体选择性结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何种类的抗体，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，以及来自抗体的任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗体分子的制剂可以是单克隆的或多克隆的。抗体分子也可以是人的、人源化的、CDR接枝的或体外产生的抗体。抗体可以具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。抗体还可具有选自例如κ或λ的轻链。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可以与术语“抗体”互换使用。
抗体分子的抗原结合片段的实例包括：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，一种包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的双抗体(dAb)片段；(vi)骆驼或骆驼化可变结构域；(vii)单链Fv(scFv)，参见例如Bird等人(1988)Science242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)；(viii)单结构域抗体。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
抗体分子包括完整分子以及其功能片段。可以改变抗体分子的恒定区，例如使其突变，以修饰抗体的性质(例如，增加或减少以下中的一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能，或补体功能)。
抗体分子也可以是单结构域抗体。单结构域抗体可以包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。实例包括但不限于重链抗体、天然不含轻链的抗体、衍生自常规4链抗体的单结构域抗体、工程化的抗体和并非衍生自抗体的单结构域支架。单结构域抗体可以是任何本领域的单结构域抗体，或任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人类、骆驼、美洲驼羊、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。根据本发明的另一个方面，单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体，称为缺乏轻链的重链抗体。例如在WO 9404678中公开了这种单结构域抗体。为了清楚起见，这种源自天然缺乏轻链的重链抗体的可变结构域在本文中被称为VHH或纳米抗体，以使其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这样的VHH分子可以源自在骆驼科物种(例如骆驼、美洲驼羊、单峰骆驼、羊驼和原驼)中产生的抗体。除骆驼科外，其他物种也可能产生天然缺乏轻链的重链抗体；这样的VHH在本发明的范围内。
VH区和VL区可以被细分为高变区，称为“互补决定区”(CDR)，其间散布有更为保守的区，称为“框架区”(FR或FW)。
框架区和CDR的范围已通过多种方法精确地定义(参见Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，U.S.Department ofHealth and Human Services,NIH Publication No.91-3242；Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；和Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。通常参见例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains。载于Antibody Engineering Lab Manual(编辑：Duebel，S.和Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg)。
如本文所用，术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内的赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。通常，每个重链可变区中有三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，并且每个轻链可变区中有三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
可以使用多种已知方案中的任何一种来确定给定CDR的精确氨基酸序列边界，包括Kabat等人(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版，美国国立卫生研究院公共卫生局(Public Health Service,National Institutes ofHealth)，Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的方案。如本文所用，根据“Chothia”编号方案定义的CDR有时也称为“高变环”。
例如，根据Kabat，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；而轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；而VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。
每个VH和VL通常包括三个CDR和四个FR，它们按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体分子可以是多克隆或单克隆抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体可以通过杂交瘤技术或不使用杂交瘤技术的方法(例如重组方法)制备。
抗体可以重组产生，例如通过噬菌体展示或通过组合方法或通过酵母展示产生。
用于产生抗体的噬菌体展示和组合方法在本领域中是已知的(如在例如Ladner等人,美国专利号5,223,409；Kang等人,国际公开号WO 92/18619；Dower等人,国际公开号WO91/17271；Winter等人,国际公开号WO 92/20791；Markland等人,国际公开号WO 92/15679；Breitling等人,国际公开号WO 93/01288；McCafferty等人,国际公开号WO 92/01047；Garrard等人,国际公开号WO 92/09690；Ladner等人,国际公开号WO 90/02809；Fuchs等人,(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等人,(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85；Huse等人,(1989)Science 246:1275-1281；Griffths等人,(1993)EMBO J 12:725-734；Hawkins等人,(1992)J Mol Biol 226:889-896；Clackson等人,(1991)Nature 352:624-628；Gram等人,(1992)PNAS 89:3576-3580；Garrad等人,(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等人,(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137；以及Barbas等人,(1991)PNAS88:7978-7982中所述，其全部内容通过引用并入本文)。
用于产生或鉴定抗体的酵母展示方法在本领域是已知的，例如，如Chao等人(2006)Nature Protocols 1(2):755-68所述，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抗体是完全人抗体(例如，在已被基因工程化以从人免疫球蛋白序列产生抗体的小鼠中制备的抗体)，或非人抗体，例如啮齿动物(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类动物(例如猴)、骆驼的抗体。优选地，非人抗体是啮齿动物抗体(小鼠或大鼠抗体)。产生啮齿动物抗体的方法是本领域已知的。
可以使用携带人免疫球蛋白基因而非小鼠系统的转基因小鼠来产生人单克隆抗体。这些用感兴趣的抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞被用于产生杂交瘤，该杂交瘤分泌对人蛋白质的表位具有特定亲和力的人mAb(参见例如Wood等人,国际申请WO 91/00906，Kucherlapati等人,PCT公开WO 91/10741；Lonberg等人,国际申请WO 92/03918；Kay等人,国际申请92/03917；Lonberg,N等人1994Nature 368:856-859；Green,L.L.等人1994NatureGenet.7:13-21；Morrison,S.L.等人1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855；Bruggeman等人1993Year Immunol 7:33-40；Tuaillon等人1993PNAS 90:3720-3724；Bruggeman等人1991Eur J Immunol 21:1323-1326)。
抗体分子可以是在非人类生物体例如大鼠或小鼠中产生可变区或其一部分例如CDR的抗体分子。嵌合的、CDR接枝的和人源化的抗体在本发明之内。在非人类生物体例如大鼠或小鼠中产生，然后例如在可变框架或恒定区中修饰以降低在人中的抗原性的抗体分子在本发明之内。
“有效人”蛋白是基本上不引起中和抗体应答，例如人抗鼠抗体(HAMA)应答的蛋白。在许多情况下，例如，如果反复施用抗体分子，例如用于治疗慢性或复发性疾病，HAMA可能会成问题。由于从血清中清除的抗体增加(参见例如Saleh等人,CancerImmunol.Immunother.,32:180-190(1990))，并且还由于潜在的变态反应(参见，例如LoBuglio等人,Hybridoma,5:5117-5123(1986))，HAMA应答可能会使重复的抗体给药潜在地无效。
嵌合抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术来产生(参见Robinson等人,国际专利公开PCT/US86/02269；Akira等人,欧洲专利申请184,187；Taniguchi,M.,欧洲专利申请171,496；Morrison等人,欧洲专利申请173,494；Neuberger等人,国际申请WO 86/01533；Cabilly等人,美国专利号4,816,567；Cabilly等人,欧洲专利申请125,023；Better等人(1988Science 240:1041-1043)；Liu等人(1987)PNAS 84:3439-3443；Liu等人,1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等人(1987)PNAS 84:214-218；Nishimura等人,1987,Canc.Res.47:999-1005；Wood等人(1985)Nature 314:446-449；和Shaw等人,1988,J.NatlCancer Inst.80:1553-1559)。
人源化或CDR接枝的抗体将有(免疫球蛋白重链和/或轻链的)至少一个或两个，但通常所有三个受体CDR被供体CDR置换。抗体可以被非人CDR的至少一部分置换，或者仅一些CDR可以被非人CDR置换。仅需要替换与抗原结合所需的CDR数量。优选地，供体将是啮齿动物抗体，例如大鼠或小鼠抗体，而受体将是人框架或人共有框架。通常，提供CDR的免疫球蛋白被称为“供体”，而提供框架的免疫球蛋白被称为“受体”。在一些实施方案中，供体免疫球蛋白是非人的(例如啮齿动物)。受体框架是天然存在的(例如人)框架或共有框架，或与其具有约85％或更高，优选地90％、95％、99％或更高同一性的序列。
如本文所用，术语“共有序列”是指在相关序列家族中由最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987)。在蛋白质家族中，共有序列中的每个位置都被该家族中在该位置最频繁出现的氨基酸占据。如果两个氨基酸频率均等地出现，则任何一个都可以包括在共有序列中。“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区域。
抗体分子可以通过本领域已知的方法人源化(参见例如Morrison,S.L.,1985,Science 229:1202-1207；Oi等人,1986,BioTechniques 4:214以及Queen等人US 5,585,089、US 5,693,761和US 5,693,762，其全部内容通过引用并入本文)。
人源化或CDR接枝的抗体分子可以通过CDR接枝或CDR置换来产生，其中免疫球蛋白链的一个、两个或全部CDR可以被置换。参见例如美国专利5,225,539；Jones等人1986Nature 321:552-525；Verhoeyan等人1988Science 239:1534；Beidler等人1988J.Immunol.141:4053-4060；Winter US 5,225,539，其全部内容通过引用明确并入本文。Winter描述了可用于制备本发明的人源化抗体的CDR接枝方法(1987年3月26日提交的英国专利申请GB 2188638A；Winter5,225,539)，其内容通过引用明确并入本文。
人源化抗体分子也在本发明的范围内，其中已置换、删除或添加特定氨基酸。从供体选择氨基酸的标准描述于US 5,585,089，例如，US 5,585,089的第12-16栏，例如，US 5,585,089的第12-16栏中，其内容通过引用并入本文。用于使抗体人源化的其他技术描述于1992年12月23日公开的Padlan等人EP 519596A1。
抗体分子可以是单链抗体。可以对单链抗体(scFV)进行工程化(例如，参见Colcher,D.等人(1999)Ann N Y Acad Sci 880:263-80；以及Reiter,Y.(1996)ClinCancer Res 2:245-52)。可以将单链抗体二聚化或多聚化以产生对相同靶蛋白的不同表位具有特异性的多价抗体。
在又其他实施方案中，抗体分子具有重链恒定区，该重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；特别地选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如人)重链恒定区。在另一个实施方案中，抗体分子具有选自例如κ或λ的(例如人的)轻链恒定区的轻链恒定区。可以改变恒定区，例如使其突变，以修饰抗体的性质(例如，增加或减少以下中的一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应细胞功能和/或补体功能)。在一些实施方案中，该抗体具有：效应子功能；并且可以修复补体。在其他实施方案中，抗体不会：募集效应细胞；或修复补体。在另一个实施方案中，抗体具有降低的结合Fc受体的能力或没有结合Fc受体的能力。例如，它是不支持与Fc受体的结合的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如，其具有诱变或缺失的Fc受体结合区。
改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。功能改变(例如对效应子配体(诸如细胞上的FcR或补体的C1成分)的亲和力改变)的抗体，可以通过用不同的残基替换抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基来产生(参见例如EP 388,151A1，美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260，其全部内容通过引用并入本文)。可以描述相似类型的改变，如果其应用于鼠或其他物种，免疫球蛋白将减少或消除这些功能。
抗体分子可以被衍生或连接至另一功能分子(例如，另一种肽或蛋白质)。如本文所用，“衍生的”抗体分子是已经被修饰的抗体分子。衍生的方法包括但不限于添加荧光部分、放射性核苷酸、毒素、酶或亲和配体诸如生物素。因此，本发明的抗体分子旨在包括本文所述的抗体的衍生形式和其他修饰形式，包括免疫粘附分子。例如，抗体分子可以被功能性地连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他分子实体，诸如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、可检测药剂、细胞毒性药剂、药物剂和/或可以介导抗体或抗体部分与另一种分子缔合的蛋白质或肽(诸如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)。
一种类型的衍生抗体分子是通过交联两种或更多种抗体(相同类型或不同类型，例如以产生双特异性抗体)而产生的。合适的交联剂包括异双官能的交联剂，具有两个被适当的间隔基隔开的不同的反应性基团(例如，间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)，或同双官能的交联剂(例如，辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。此类接头可从Pierce ChemicalCompany,Rockford,Ill获得。
CDR接枝的支架
在一些实施方案中，抗体分子是CDR接枝的支架结构域。在一些实施方案中，支架结构域基于纤连蛋白结构域，例如纤连蛋白III型结构域。纤连蛋白III型(Fn3)结构域的整体折叠与最小的功能性抗体片段(抗体重链的可变结构域)的折叠紧密相关。Fn3的末尾有三个环；BC、DE和FG环的位置大致对应于抗体的VH结构域的CDR1、2和3的位置。Fn3没有二硫键；因此，与抗体及其片段不同，Fn3在还原条件下是稳定的(参见例如WO 98/56915；WO 01/64942；WO 00/34784)。可以修饰(例如，使用本文所述的CDR或高变环)或改变Fn3结构域，例如，以选择与本文所述的抗原/标志物/细胞结合的结构域。
在一些实施方案中，支架结构域，例如折叠结构域，是基于抗体，例如通过从单克隆抗体的重链可变结构域中删除三条β链而产生的“微抗体”支架(参见例如Tramontano等人,1994，J Mol.Recognit.7:9；和Martin等人,1994,EMBO J.13:5303-5309)。“微抗体”可用于呈现两个高变环。在一些实施方案中，支架结构域是V样结构域(参见例如Coia等人WO99/45110)或是衍生自tendamistatin的结构域，tendamistatin是由两个二硫键保持在一起的74残基的六链β片层夹心结构(参见例如McConnell和Hoess,1995,J Mol.Biol.250:460)。例如，可以修饰(例如，使用CDR或高变环)tendamistatin的环或将其改变，例如以选择与本文所述的标志物/抗原/细胞结合的结构域。另一个示例性支架结构域是衍生自CTLA-4的细胞外结构域的β-夹心结构(参见例如WO 00/60070)。
其他示例性支架结构域包括但不限于T细胞受体；MHC蛋白；细胞外结构域(例如纤连蛋白III型重复序列，EGF重复序列)；蛋白酶抑制剂(例如Kunitz结构域、大肠杆菌素、BPTI等)；TPR重复序列；三叶(trifoil)结构；锌指结构域；DNA结合蛋白；特别是单体DNA结合蛋白；RNA结合蛋白；酶，例如蛋白酶(特别是灭活的蛋白酶)，RNA酶；蛋白伴侣分子，例如硫氧还蛋白和热休克蛋白；以及细胞内信号传导结构域(诸如SH2和SH3结构域)。参见例如US20040009530和US 7,501,121，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，例如通过以下标准中的一个或多个来评估和选择支架结构域：(1)氨基酸序列，(2)几个同源结构域的序列，(3)3维结构，和/或(4)在pH、温度、盐度、有机溶剂、氧化剂浓度范围内的稳定性数据。在一些实施方案中，支架结构域是小的、稳定的蛋白质结构域，例如少于100、70、50、40或30个氨基酸的蛋白质。该结构域可以包括一个或多个二硫键或可以螯合金属，例如锌。
基于抗体的融合体
可以产生包含附着于抗体的N或C末端的另外结合实体的多种形式。这些与单链或二硫键稳定化的Fv或Fab的融合体导致产生对每种抗原具有二价结合特异性的四价分子。scFv和scFab与IgG的组合可产生可识别三种或更多种不同抗原的分子。
抗体-Fab融合体
抗体-Fab融合体是双特异性抗体，其包含与抗体重链的C末端融合的针对第一靶标的传统抗体和针对第二靶标的Fab。通常，抗体和Fab将具有共同的轻链。抗体融合体可以通过以下方式产生：(1)将靶标融合体的DNA序列工程化，以及(2)将靶标DNA转染到合适的宿主细胞中以表达融合蛋白。如Coloma，J.等人(1997)Nature Biotech15:159所述，似乎抗体-scFv融合体可以通过CH3结构域的C末端与scFv的N末端之间的(Gly)-Ser接头连接。
抗体-scFv融合体
抗体-scFv融合体是双特异性抗体，其包含与抗体重链的C末端融合的传统抗体和具有独特特异性的scFv。scFv可以直接通过scFv重链或通过接头肽融合至C末端。抗体融合体可以通过以下方式产生：(1)将靶标融合体的DNA序列工程化，以及(2)将靶标DNA转染到合适的宿主细胞中以表达融合蛋白。如Coloma，J.等人(1997)Nature Biotech 15:159所述，似乎抗体-scFv融合体可以通过CH3结构域的C末端与scFv的N末端之间的(Gly)-Ser接头连接。
可变结构域免疫球蛋白DVD
一种相关形式是双重可变结构域免疫球蛋白(DVD)，其通过较短的接头序列由在V结构域的N末端的第二个特异性位置的VH和VL结构域构成。
其他示例性多特异性抗体形式包括，例如在以下专利中描述的那些：US20160114057A1、US20130243775A1、US20140051833、US20130022601、US20150017187A1、US20120201746A1、US20150133638A1、US20130266568A1、US20160145340A1、WO2015127158A1、US20150203591A1、US20140322221A1、US20130303396A1、US20110293613、US20130017200A1、US20160102135A1、WO2015197598A2、WO2015197582A1、US9359437、US20150018529、WO2016115274A1、WO2016087416A1、US20080069820A1、US9145588B、US7919257和US20150232560A1。采用完整抗体-Fab/scFab形式的示例性多特异性分子包括在以下专利中描述的那些：US9382323B2、US20140072581A1、US20140308285A1、US20130165638A1、US20130267686A1、US20140377269A1、US7741446B2和WO1995009917A1。采用结构域交换形式的示例性多特异性分子包括在以下专利中描述的那些：US20150315296A1、WO2016087650A1、US20160075785A1、WO2016016299A1、US20160130347A1、US20150166670、US8703132B2、US20100316645、US8227577B2、US20130078249。
含Fc的多特异性分子
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性分子包含免疫球蛋白恒定区(例如，Fc区)。示例性的Fc区可以选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区；更具体地，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。
在一些实施方案中，改变免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)，例如使其突变，以增加或减少以下中的一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应细胞功能或补体功能。
在其他实施方案中，第一免疫球蛋白链恒定区和第二免疫球蛋白链恒定区(例如，第一Fc区和第二Fc区)的界面被改变(例如使其突变)，以例如相对于非工程化界面(例如自然存在的界面)增加或减少二聚化。例如，免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)的二聚化可以通过为第一Fc区和第二Fc区的Fc界面提供以下一种或多种来增强：成对的突起-腔(“杵臼结构”)、静电相互作用或链交换，使得例如相对于非工程化界面，形成异多聚体与同多聚体的更大比率。
在一些实施方案中，多特异性分子包括在选自例如人IgG1的Fc区的347、349、350、351、366、368、370、392、394、395、397、398、399、405、407或409的一个或多个中的位置处的成对的氨基酸置换。例如，免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)可以包括选自以下的成对的氨基酸置换：T366S、L368A或Y407V(例如，对应于腔或臼)和T366W(例如，对应于突起或杵)。
在其他实施方案中，多功能分子包括半衰期延长剂，例如人血清白蛋白，或针对人血清白蛋白的抗体分子。
在一些实施方案中，Fc包含表14中列出的示例性Fc修饰。异二聚化的抗体分子及 制备方法
已经公开了产生多特异性抗体的各种方法来解决不正确的重链配对的问题。示例性方法描述如下。示例性的多特异性抗体形式和制备所述多特异性抗体的方法也公开于例如Speiss等人Molecular Immunology 67(2015)95–106；和Klein等人mAbs 4:6,653–663；2012年11月/12月中；其各自的全部内容通过引用并入本文。
异二聚化的双特异性抗体基于天然IgG结构，其中两个结合臂识别不同的抗原。通过强制重链异二聚化，并结合将轻链(例如共有轻链)错配最小化的技术，来产生能够实现确定的单价(和同时)抗原结合的IgG衍生形式。强制重链异二聚化可以使用例如杵-臼结构或链交换工程化结构域(SEED)获得。
杵臼结构
杵臼结构在US 5,731,116、US 7,476,724和Ridgway，J.等人(1996)Prot.Engineering 9(7):617-621中描述，一般说来涉及：(1)使一种或两种抗体的CH3结构域突变以促进异二聚化；和(2)在促进异二聚化的条件下将突变的抗体组合。“杵”或“突起”通常是通过将亲本抗体中的小氨基酸替换为较大的氨基酸(例如T366Y或T366W)来生成的；“臼”或“腔”是通过将亲本抗体中的较大残基替换为较小氨基酸(例如，Y407T、T366S、L368A和/或Y407V)来生成的。
对于包括Fc结构域的双特异性抗体，可以利用将特定突变引入重链的恒定区来促进Fc部分的正确异二聚化。在Klein等人(mAbs(2012)4:6,1-11)中综述了几种这样的技术，其内容通过引用整体并入本文。这些技术包括“杵臼结构”(KiH)方法，该方法涉及将庞大的残基引入到一条抗体重链的一个CH3结构域中。该庞大的残基配合到配对重链的另一个CH3结构域中的互补“臼”中，从而促进重链的正确配对(参见例如US7642228)。
示例性的KiH突变包括“杵”重链中的S354C、T366W和“臼”重链中的Y349C、T366S、L368A、Y407V。表4提供了其他示例性的KiH突变，以及另外的可选的稳定化Fc半胱氨酸突变。
Igawa和Tsunoda提供了其他Fc突变，他们确定了一条链的CH3结构域中的3个带负电荷的残基，其与另一条链的CH3结构域中的3个带正电荷的残基配对。这些特定的带电荷残基对为：E356-K439、E357-K370、D399-K409，反之亦然。通过单独地或与新发现的二硫桥结合地在链A中引入以下三个突变中的至少两个：E356K、E357K和D399K，以及在链B中引入以下三个突变中的至少两个：K370E、K409D、K439E，能够促进非常有效的异二聚化，同时抑制同二聚化(Martens T等人A novel one-armed antic-Met antibody inhibitsglioblastoma growth in vivo.Clin Cancer Res 2006；12:6144-52；PMID:17062691)。Xencor基于结构计算和序列信息的组合定义了41个变体对，随后筛选了最大异二聚化，定义了链A上的S364H、F405A(HA)和链B上的Y349T、T394F(TF)的组合(Moore GL等人Anovelbispecific antibody format enables simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of distinct target antigens.MAbs 2011；3:546-57；PMID:22123055)。
促进多特异性抗体异二聚化的其他示例性Fc突变包括在以下参考文献中描述的那些，其各自内容通过引用并入本文：WO2016071377A1、US20140079689A1、US20160194389A1、US20160257763、WO2016071376A2、WO2015107026A1、WO2015107025A1、WO2015107015A1、US20150353636A1、US20140199294A1、US7750128B2、US20160229915A1、US20150344570A1、US8003774A1、US20150337049A1、US20150175707A1、US20140242075A1、US20130195849A1、US20120149876A1、US20140200331A1、US9309311B2、US8586713、US20140037621A1、US20130178605A1、US20140363426A1、US20140051835A1和US20110054151A1。
稳定化半胱氨酸突变也已经与KiH和其他促进Fc异二聚化的变体组合使用，参见例如US7183076。其他示例性半胱氨酸修饰包括，例如在US20140348839A1、US7855275B2和US9000130B2中公开的那些。
链交换工程化结构域(SEED)
通过设计链交换工程化结构域(SEED)C(H)3异二聚体来支持双特异性和不对称融合蛋白设计的异二聚体Fc平台是已知的。人IgG和IgA C(H)3结构域的这些衍生物可形成互补的人SEED C(H)3异二聚体，其由人IgA和IgG C(H)3序列的交替区段组成。当在哺乳动物细胞中表达时，所得的一对SEED C(H)3结构域优先缔合形成异二聚体。SEEDbody(Sb)融合蛋白由[IgG1铰链]-C(H)2-[SEED C(H)3]组成，其可以与一个或多个融合伴侣遗传连接(参见例如Davis JH等人SEEDbodies:fusion proteins based on strand exchangeengineered domain(SEED)CH3 heterodimers in an Fc analogue platform forasymmetric binders or immunofusions and bispecific antibodies,Protein Eng DesSel2010；23:195-202；PMID:20299542和US8871912。其各自的内容通过引用并入本文)。
含Fc的实体(微抗体)
含Fc的实体(也称为微抗体)可以通过将scFv与恒定重链区结构域3的C末端(CH3-scFv)和/或与具有不同特异性的抗体的铰链区(scFv-铰链-Fc)融合而产生。也可以制备具有与IgG的CH3结构域的C末端融合的二硫键稳定化的可变结构域(无肽接头)的三价实体。
Duobody
产生具有正确重链配对的双特异性抗体的“Duobody”技术是已知的。DuoBody技术涉及三个基本步骤，用于在生产后的交换反应中生成稳定的双特异性人IgG1抗体。第一步，使用标准的哺乳动物重组细胞系分别生产两个IgG1，每个IgG1在第三恒定(CH3)结构域中包含单个匹配的突变。随后，根据用于回收和纯化的标准方法来纯化这些IgG1抗体。在生产和(生产后的)纯化后，两个抗体在定制的实验室条件下重组，从而以非常高的产率(通常>95％)产生双特异性抗体产品(参见例如Labrijn等人,PNAS2013；110(13):5145-5150和Labrijn等人Nature Protocols 2014；9(10):2450-63，其各自的内容通过引用并入本文)。
静电相互作用
公开了采用带电荷的氨基酸，使用CH3氨基酸变化而制备多特异性抗体的方法，使得同二聚体的形成在静电上是不利的。EP1870459和WO 2009089004描述了在宿主细胞中共表达不同抗体结构域时有利于异二聚体形成的其他策略。在这些方法中，用带电荷的氨基酸替换两个CH3结构域中组成重链恒定结构域3(CH3)、CH3-CH3界面的一个或多个残基，使得同二聚体形成在静电上是不利的并且异二聚化在静电上是有利的。在以下参考文献中描述了使用静电相互作用制备多特异性分子的其他方法，每个参考文献的内容通过引用并入本文，包括US20100015133、US8592562B2、US9200060B2、US20140154254A1和US9358286A1。
共有轻链
需要避免轻链错配以产生双特异性IgG的均质制剂。其实现方式之一是通过使用共有轻链原理，即将共享一个轻链但仍具有不同特异性的两种结合剂组合。增强由单体混合物形成期望的双特异性抗体的示例性方法是通过提供共有的可变轻链来与双特异性抗体的每个异聚可变重链区域相互作用。产生具有共同轻链的双特异性抗体的组合物和方法公开于例如US7183076B2、US20110177073A1、EP2847231A1、WO2016079081A1和EP3055329A1中，其各自的内容通过引用并入本文。
CrossMab
减少轻链错配的另一种选择是CrossMab技术，它通过交换一半双特异性抗体的Fab中的CH1和CL结构域来避免非特异性L链错配。这样的交错变体保留了结合特异性和亲和力，但是使两个臂如此不同，以至于防止了L链错配。CrossMab技术(如前述Klein等人中所概述)涉及重链和轻链之间的域互换，以促进正确配对的形成。简而言之，为了通过使用两个不同的轻链-重链对来构建可以结合两种抗原的双特异性IgG样CrossMab抗体，采用了两步式修饰过程。首先，使用异二聚化方法(例如，杵臼(KiH)技术)将二聚化界面工程化到每个重链的C末端，以确保仅有效地形成了来自一个抗体(例如，抗体A)和第二抗体(例如，抗体B)的两条不同重链的异源二聚体。接下来，交换一种抗体(抗体A)的恒定重链1(CH1)结构域和恒定轻链(CL)结构域，同时使可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域保持如一。CH1和CL结构域的交换确保修饰的抗体(抗体A)轻链仅能与修饰的抗体(抗体A)重链有效地二聚化，而未修饰的抗体(抗体B)轻链仅能与未修饰的抗体(抗体B)重链有效地二聚化；因此仅有效地形成期望的双特异性CrossMab(参见例如Cain，C.SciBX 4(28)；doi:10.1038/scibx.20l1.783，其内容通过引用并入本文)。
共有重链
增强由单体混合物形成期望的双特异性抗体的示例性方法是通过提供共有的可变重链来与双特异性抗体的每个异聚可变轻链区相互作用。产生具有共有重链的双特异性抗体的组合物和方法公开于例如US20120184716、US20130317200和US20160264685A1中，其各自的内容通过引用并入本文。
氨基酸修饰
产生具有正确的轻链配对的多特异性抗体的替代组合物和方法包括各种氨基酸修饰。例如，Zymeworks描述了在CH1和/或CL结构域中具有一个或多个氨基酸修饰，在VH和/或VL结构域中具有一个或多个氨基酸修饰，或其组合的杂二聚体，这些修饰是轻链和重链之间的界面的一部分，并在每条重链和所期望的轻链之间建立优先配对，使得当异源二聚体对的两条重链和两条轻链在细胞中共表达时，第一异源二聚体的重链优先与一条轻链而不是彼此配对(参见例如W02015181805)。其他示例性方法描述于WO2016026943(Argen-X)、US20150211001、US20140072581A1、US20160039947A1和US20150368352中。
λ/κ形式
包括λ轻链多肽和κ轻链多肽的多特异性分子(例如，多特异性抗体分子)可用于允许异二聚化。产生包含λ轻链多肽和κ轻链多肽的双特异性抗体分子的方法公开于2017年9月22日提交的PCT/US17/53053，指定公开号为WO2018/057955，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，多特异性分子包括多特异性抗体分子，例如，具有两种结合特异性的抗体分子，例如，双特异性抗体分子。多特异性抗体分子包括：
对第一表位具有特异性的λ轻链多肽1(LLCP1)；
对第一表位具有特异性的重链多肽1(HCP1)；
对第二表位具有特异性的κ轻链多肽2(KLCP2)；以及
对第二表位具有特异性的重链多肽2(HCP2)。
如本文所用，术语“λ轻链多肽1(LLCP1)”是指包含足够的轻链(LC)序列的多肽，使得当与同源重链可变区组合时，可以介导与其表位的特异性结合以及与HCP1的复合。在一些实施方案中，LLCP1包含CH1区的全部或片段。在一些实施方案中，LLCP1包含LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4和CH1，或来自其中的足以介导其表位的特异性结合以及与HCP1的复合的序列。LLCP1与其HCP1一起对第一表位提供特异性(而KLCP2与其HCP2一起对第二表位提供特异性)。如本文其他地方所述，LLCP1对HCP1的亲和力高于对HCP2的亲和力。
如本文所用，术语“κ轻链多肽2(KLCP2)”是指包含足够的轻链(LC)序列的多肽，使得当与同源重链可变区组合时，可以介导与其表位的特异性结合以及与HCP2的复合。在一些实施方案中，KLCP2包含CH1区的全部或片段。在一些实施方案中，KLCP2包含LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4和CH1，或来自其中的足以介导其表位的特异性结合以及与HCP2的复合的序列。KLCP2与其HCP2一起为第二表位提供特异性(而LLCP1及其HCP1为第一表位提供特异性)。
如本文所用，术语“重链多肽1(HCP1)”是指包含足够的重链(HC)序列(例如，HC可变区序列)的多肽，使得当与同源LLCP1组合时可以介导与其表位的特异性结合以及与HCP1的复合。在一些实施方案中，HCP1包含CH1区的全部或片段。在一些实施方案中，HCP1包含CH2和/或CH3区的全部或片段。在一些实施方案中，HCP1包含HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4、CH1、CH2和CH3，或来自其中的足以实现以下各项的序列：(i)介导其表位的特异性结合以及与LLCP1的复合，(ii)如本文所述优先与LLCP1而非KLCP2复合；以及(iii)如本文所述优先与HCP2而非HCP1的另一分子复合。HCP1与其LLCP1一起提供对第一表位的特异性(而KLCP2与其HCP2一起提供对第二表位的特异性)。
如本文所用，术语“重链多肽2(HCP2)”是指包含足够的重链(HC)序列(例如，HC可变区序列)的多肽，使得当与同源LLCP1组合时可以介导与其表位的特异性结合以及与HCP1的复合。在一些实施方案中，HCP2包含CH1区的全部或片段。在一些实施方案中，HCP2包含CH2和/或CH3区的全部或片段。在一些实施方案中，HCP1包含HC-CDR1、HC-CDR2、HC-CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4、CH1、CH2和CH3，或来自其中的足以实现以下各项的序列：(i)介导其表位的特异性结合以及与KLCP2的复合，(ii)如本文所述优先与KLCP2而非LLCP1复合；以及(iii)如本文所述优先与HCP1而非HCP2的另一分子复合。HCP2与其KLCP2一起提供了对第二表位的特异性(而LLCP1与其HCP1一起提供了对第一表位的特异性)。
在一些实施方案中，在如本文所述的多功能多肽分子中：LLCP1对HCP1的亲和力高于对HCP2的亲和力；并且/或者KLCP2对HCP2的亲和力高于对HCP1的亲和力。
在一些实施方案中，LLCP1对HCP1的亲和力充分大于其对HCP2的亲和力，使得在预选条件下，例如在水性缓冲液中(例如在pH7下)、在盐水中(例如在pH 7下)，或在生理条件下，至少75、80、90、95、98、99、99.5或99.9％的多特异性抗体分子具有与HCP1复合或接合的LLCP1。
在一些实施方案中，在如本文所述的多功能多肽分子中：HCP1对HCP2的亲和力大于对HCP1的第二分子的亲和力；并且/或者
HCP2对HCP1的亲和力大于对HCP2的第二分子的亲和力。
在一些实施方案中，HCP1对HCP2的亲和力充分大于其对HCP1的第二分子的亲和力，使得在预选条件下，例如在水性缓冲液中(例如在pH 7下)、在盐水中(例如在pH 7中)，或在生理条件下，至少75％、80、90、95、98、99、99.5或99.9％的多特异性抗体分子分子具有与HCP2复合或接合的HCP1。
在另一方面，本文描述了一种用于制备或产生多特异性抗体分子的方法。该方法包括在其中(i)-(iv)缔合的条件下：
(i)提供第一重链多肽(例如，包含第一重链可变区(第一VH)、第一CH1、第一重链恒定区(例如，第一CH2、第一CH3或两者)中的一个、两个、三个或全部的重链多肽)；
(ii)提供第二重链多肽(例如，包含第二重链可变区(第二VH)、第二CH1、第二重链恒定区(例如，第二CH2、第二CH3或两者)中的一个、两个、三个或全部的重链多肽)；
(iii)提供优先与第一重链多肽(例如，第一VH)缔合的λ链多肽(例如，λ轻可变区(VLλ)、λ轻恒定链(VLλ)或两者)；以及
(iv)提供优先与第二重链多肽(例如，第二VH)缔合的κ链多肽(例如，λ轻可变区(VLλ)、λ轻恒定链(VLλ)或两者)。
在一些实施方案中，第一重链和第二重链多肽形成增强异二聚化的Fc界面。
在一些实施方案中，将(i)-(iv)(例如，编码(i)-(iv)的核酸)引入到单个细胞，例如单个哺乳动物细胞，例如CHO细胞中。在一些实施方案中，(i)-(iv)在细胞中表达。在一些实施方案中，将(i)-(iv)(例如，编码(i)-(iv)的核酸)引入到不同的细胞，例如不同的哺乳动物细胞，例如两个或更多个CHO细胞中。在一些实施方案中，(i)-(iv)在细胞中表达。
在一些实施方案中，该方法进一步包括例如使用λ和/或κ特异性纯化(例如亲和色谱法)来纯化细胞表达的抗体分子。
在一些实施方案中，该方法进一步包括评估细胞表达的多特异性抗体分子。例如，纯化的细胞表达的多特异性抗体分子可以通过本领域已知的技术(包括质谱法)进行分析。在一些实施方案中，将纯化的细胞表达的抗体分子裂解，例如用木瓜蛋白酶消化以产生Fab部分，并且使用质谱法进行评估。
在一些实施方案中，该方法以高产率，例如至少75％、80、90、95、98、99、99.5或99.9％，产生正确配对的κ/λ多特异性(例如双特异性)抗体分子。
在其他实施方案中，多特异性(例如双特异性)抗体分子包括：(i)第一重链多肽(HCP1)(例如，包含第一重链可变区(第一VH)、第一CH1、第一重链恒定区(例如，第一CH2、第一CH3或两者)中的一个、两个、三个或全部的重链多肽)，例如其中HCP1结合至第一表位；(ii)第二重链多肽(HCP2)(例如，包含第二重链可变区(第二VH)、第二CH1、第二重链恒定区(例如，第二CH2、第二CH3或两者)中的一个、两个、三个或全部的重链多肽)，例如其中HCP2结合至第二表位；(iii)优先与第一重链多肽(例如，第一VH)缔合的λ轻链多肽(LLCP1)(例如，λ轻可变区(VLλ)、λ轻恒定链(VLλ)或两者)，例如其中LLCP1结合至第一表位；以及
(iv)优先与第二重链多肽(例如，第二VH)缔合的κ轻链多肽(KLCP2)(例如，κ轻可变区(VLκ)、κ轻恒定链(VLκ)或两者)，例如其中KLCP2结合至第二表位。
在一些实施方案中，第一重链多肽和第二重链多肽形成增强异二聚化的Fc界面。在一些实施方案中，多特异性抗体分子具有第一结合特异性和第二结合特异性，所述第一结合特异性包括杂合的VLλ-CLλ，其被异二聚化至与Fc恒定CH2-CH3结构域连接的第一重链可变区(具有杵修饰)，而所述第二结合特异性包括杂合的VLκ-CLκ，其被异二聚化至与Fc恒定CH2-CH3结构域连接的第二重链可变区(具有臼修饰)。
多特异性或多功能抗体分子
全文描述了本文定义的多特异性和多功能分子的示例性结构。在以下文献中进一步描述了示例性结构：Weidle U等人(2013)The Intriguing Options ofMultispecificAntibody Formats for Treatment of Cancer,Cancer Genomics&Proteomics 10:1-18(2013)；以及Spiess C等人(2015)Alternative molecular formats and therapeuticapplications for bispecific antibodies,Molecular Immunology 67:95-106；其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，多特异性抗体分子可以包含多于一个的抗原结合位点，其中不同的位点对不同的抗原具有特异性。在一些实施方案中，多特异性抗体分子可以结合同一抗原上的多于一个(例如，两个或更多个)的表位。在一些实施方案中，多特异性抗体分子包含对靶细胞(例如癌细胞)具有特异性的抗原结合位点和对免疫效应细胞具有特异性的不同抗原结合位点。在一些实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体分子可以分为五个不同的结构组：(i)双特异性免疫球蛋白G(BsIgG)；(ii)附加有额外的抗原结合部分的IgG；(iii)双特异性抗体片段；(iv)双特异性融合蛋白；以及(v)双特异性抗体缀合物。
BsIgG是对每种抗原为单价的形式。示例性的BsIgG形式包括但不限于crossMab、DAF(二合一)、DAF(四合一)、DutaMab、DT-IgG、杵臼结构的常见LC、杵臼结构组装体、电荷对、Fab臂交换、SEEDbody、triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ体、正交Fab。参见Spiess等人Mol.Immunol.67(2015):95-106。示例性的BsIgG包括卡妥索单抗(catumaxomab)(Fresenius Biotech，Trion Pharma，Neopharm)，其包含抗CD3臂和抗EpCAM臂；以及厄马索单抗(ertumaxomab)(Neovii Biotech，Fresenius Biotech)，其靶向CD3和HER2。在一些实施方案中，BsIgG包含经工程化用于异源二聚化的重链。例如，可以使用“杵臼结构”策略、SEED平台、常见的重链(例如，在kλ体中)和使用异源二聚体Fc区来将重链工程化以进行异二聚化。参见Spiess等人Mol.Immunol.67(2015):95-106。用来避免BsIgG中同源二聚体的重链配对的策略包括杵臼结构、双抗体、azymetric、电荷对、HA-TF、SEEDbody和差异蛋白质A亲和力。参见前一文献。BsIgG可以通过在不同宿主细胞中分别表达组分抗体并随后纯化/组装成BsIgG来产生。BsIgG也可以通过在单个宿主细胞中表达组分抗体来产生。可以使用亲和色谱法纯化BsIgG，例如使用蛋白质A和连续的pH洗脱。
附加有另外的抗原结合部分的IgG是双特异性抗体分子的另一种形式。例如，可以通过在单特异性IgG上(例如在重链或轻链的N末端或C末端)附加另外的抗原结合单元，将单特异性IgG工程化为具有双特异性。示例性的另外的抗原结合单元包括单域抗体(例如，可变重链或可变轻链)、工程化的蛋白支架和成对的抗体可变结构域(例如，单链可变片段或可变片段)。参见前一文献。附加的IgG形式的实例包括双可变结构域IgG(DVD-Ig)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、zybody和DVI-IgG(四合一)。参见Spiess等人Mol.Immunol.67(2015):95-106。IgG-scFv的实例是MM-141(Merrimack Pharmaceuticals)，其结合IGF-1R和HER3。DVD-Ig的实例包括结合IL-1α和IL-1β的ABT-981(AbbVie)；以及结合TNF和IL-17A的ABT-122(AbbVie)。
双特异性抗体片段(BsAb)是缺乏一些或全部抗体恒定结构域的双特异性抗体分子的形式。例如，一些BsAb缺乏Fc区。在一些实施方案中，双特异性抗体片段包括通过肽接头连接的重链和轻链区，该肽接头允许BsAb在单个宿主细胞中有效表达。示例性的双特异性抗体片段包括但不限于纳米抗体、纳米抗体-HAS、BiTE、双抗体、DART、TandAb、sc双抗体、sc双抗体-CH3、双抗体-CH3、三体(triple body)、微抗体、微体、TriBi微体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab’)2、F(ab’)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、sc双抗体-Fc、双抗体-Fc、串联scFv-Fc和细胞内抗体。参见前一文献。例如，BiTE形式包括串联scFv，其中组分scFv结合至T细胞上的CD3和癌细胞上的表面抗原。
双特异性融合蛋白包括与其他蛋白连接的抗体片段，例如，以增加额外的特异性和/或功能。双特异性融合蛋白的实例是immTAC，其包含与识别HLA呈递肽的亲和力成熟的T细胞受体连接的抗CD3scFv。在一些实施方案中，对接锁定(dock-and-lock，DNL)方法可以用于产生具有更高价态的双特异性抗体分子。而且，与白蛋白结合蛋白或人血清白蛋白的融合体可以延长抗体片段的血清半衰期。参见前一文献。
在一些实施方案中，化学缀合，例如抗体和/或抗体片段的化学缀合，可以用于产生BsAb分子。参见前一文献。示例性的双特异性抗体缀合物包括CovX体形式，其中低分子量药物在每个Fab臂或抗体或其片段中位点特异性地缀合至单个反应性赖氨酸。在一些实施方案中，缀合改善了低分子量药物的血清半衰期。示例性的CovX体是CVX-241(NCT01004822)，其包含缀合至两个抑制VEGF或Ang2的短肽的抗体。参见前一文献。
可以通过在宿主系统中例如至少一种或多种组分的重组表达来产生抗体分子。示例性的宿主系统包括真核细胞(例如哺乳动物细胞，例如CHO细胞，或昆虫细胞，例如SF9或S2细胞)和原核细胞(例如，大肠杆菌)。双特异性抗体分子可以通过组分在不同宿主细胞中的单独表达以及随后的纯化/组装来产生。或者，可以通过在单个宿主细胞中表达组分来产生抗体分子。双特异性抗体分子的纯化可以通过各种方法进行，诸如亲和色谱法，例如，使用蛋白质A和连续的pH洗脱。在其他实施方案中，亲和标签可以用于纯化，例如含组氨酸的标签、myc标签或链霉亲和素标签。
示例性双特异性分子
在一方面，如本文所述的多特异性分子包含如本文所述的序列，例如选自SEQ IDNO:1004-1007、3275-3277、3286或3287中的序列，或与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性分子包含前导序列，该前导序列包含SEQ ID NO:3288的氨基酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性分子不包含含有SEQ ID NO:3288的氨基酸序列的前导序列。
分子F：aCD19 x aVb6.5：分子F包含有包含SEQ ID NO:1004的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:1005的氨基酸序列的轻链。
分子F.1
SEQ ID NO:1004(重链)(Tcrvβ6_5scFv/抗CD19重链)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWFFPGSGNIKYNEKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGSYYSYDVLDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGINVVWHQQKPGKAPKALIYSSSHRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQFKSYPLTFGQGTKLEIKGGGGSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVFLTMTNMDPVDTATYYCARMELWSYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
分子F.2
SEQ ID NO:1005(轻链)(抗CD19轻链)
METPAQLLFLLLLWLPDTTGENVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDHTLTISSLEPEDFAVYYCFQGSVYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一方面，如本文所述的多特异性分子包含SEQ ID NO:1004和/或SEQ ID NO:1005或与其具有至少85％、90％、955、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
分子G：aBCMA x aVb6.5：分子G包含有包含SEQ ID NO:1006的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:1007的氨基酸序列的轻链。
分子G.1
SEQ ID NO:1006(重链)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWFFPGSGNIKYNEKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGSYYSYDVLDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGINVVWHQQKPGKAPKALIYSSSHRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQFKSYPLTFGQGTKLEIKGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGIDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVGEINPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
分子G.2
SEQ ID NO:1007(轻链)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDSNVAWYQQKPEKAPKALIFSASLRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNNYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一方面，如本文所述的多特异性分子包含SEQ ID NO:1006和/或SEQ ID NO:1007或与其具有至少85％、90％、955、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
分子H：aBCMAx aTCRvβ6_5：分子H包含有包含SEQ ID NO:3275的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ ID NO:3277的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:3276的氨基酸序列的第二重链。
分子H.1
SEQ ID NO:3275(抗BCMA重链)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGIDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVGEINPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
分子H.2
SEQ ID NO:3276(人源化的TCRvβ_6_5scFv)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTTYYIHWVRQAPGQGLEWMGWFFPGSGNIKYNEKFKGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAGSYYSYDVLDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVGINVVWHQQKPGKAPKALIYSSSHRYSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFCQQFKSYPLTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
分子H.3
SEQ ID NO:3277(抗BCMA轻链)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDSNVAWYQQKPEKAPKALIFSASLRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNNYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一方面，如本文所述的多特异性分子包含SEQ ID NO:3275、SEQ ID NO:3276和/或SEQ ID NO:3277或与其具有至少85％、90％、955、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
分子I：具有c末端scFv TCRvβ的半臂BCMA Fab：分子I包含有包含SEQ ID NO:3286的氨基酸序列的第一重链，包含SEQ IDNO:3277的氨基酸序列的轻链和包含SEQ ID NO:3287的氨基酸序列的第二重链。
分子I.1
SEQ ID NO:3286(重链1)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGIDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVGEINPDSSTINYAPSLKDRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCASLYYDYGDAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
分子I.2
SEQ ID NO:3277(轻链)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDSNVAWYQQKPEKAPKALIFSASLRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNNYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
分子I.3
SEQ ID NO:3287(重链2)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一方面，如本文所述的多特异性分子包含SEQ ID NO:3286、SEQ ID NO:3277和/或SEQ ID NO:3287或与其具有至少85％、90％、955、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子结合至免疫细胞。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子结合至免疫细胞的亚群。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子结合至T细胞。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子结合至γ/δT细胞。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子结合至NKT细胞。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子经由结合部分结合至T细胞。示例性的结合部分包括但不限于结合TRBC1、TRBC2、CD3、TRAC、TRAV亚型、CD4、CD8、CD2、CD28、41BB、PD1、CTLA4、OX40、TIM3或LAG3的结合部分。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子经由结合至TRBC1的结合部分与T细胞结合。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子经由结合至TRBC2的结合部分与T细胞结合。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子包含结合至TRBC1的结合部分。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子包含结合至TRBC2的结合部分。
接头
如本文所述的多特异性或多功能分子可以进一步包括接头，例如在以下一种或多种之间的接头：抗原结合结构域和细胞因子分子、抗原结合结构域和免疫细胞衔接物、抗原结合结构域和基质修饰部分、细胞因子分子和免疫细胞衔接物、细胞因子分子和基质修饰部分、免疫细胞衔接物和基质修饰部分、抗原结合结构域和免疫球蛋白链恒定区、细胞因子分子和免疫球蛋白链恒定区、免疫细胞衔接物和免疫球蛋白链恒定区或基质修饰部分和免疫球蛋白链恒定区。在一些实施方案中，接头选自：可裂解性接头、不可裂解性接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋形接头或非螺旋形接头，或其组合。
在一些实施方案中，多特异性分子可以包括一个、两个、三个或四个接头，例如肽接头。在一些实施方案中，肽接头包括Gly和Ser。在一些实施方案中，肽接头选自GGGGS(SEQID NO:3307)；GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:3308)；GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:3309)；DVPSGPGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:3310)；和GGGGSGGGGSGGGGGS(SEQ ID NO:3643)。在一些实施方案中，肽接头是接头的A(EAAAK)nA(SEQ ID NO:3437)家族(例如，如Protein Eng.(2001)14(8):529-532中所述)。这些是刚性螺旋形接头，n范围为2-5。在一些实施方案中，肽接头选自AEAAAKEAAAKAAA(SEQ ID NO:3314)；AEAAAKEAAAKEAAAKAAA(SEQ ID NO:3315)；AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA(SEQ ID NO:3316)；和AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA(SEQID NO:3317)。
核酸
在某些实施方案中，本文描述了一种分离的核酸分子，其包含与编码如本文所述的多功能多肽分子的核苷酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性的核苷酸序列。
还公开了编码前述抗体分子，例如抗TCRβV抗体分子，多特异性或多功能分子的核酸。
在某些实施方案中，本发明的特征在于核酸，其包含编码如本文所述的抗体分子的重链和轻链可变区和CDR或高变环的核苷酸序列。例如，本发明的特征在于分别编码选自如本文所述的一种或多种抗体分子的抗体分子的重链和轻链可变区的第一核酸和第二核酸。核酸可包含如本文表中所列的核苷酸序列，或与其基本相同(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同的序列)或与本文表中所示的序列相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸的序列。
在某些实施方案中，核酸可包含编码来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR或高变环的核苷酸序列，该重链可变区具有如本文表中所列的氨基酸序列或与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或具有一个或多个置换，例如保守置换的序列)。在其他实施方案中，核酸可包含编码来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR或高变环的核苷酸序列，该轻链可变区具有如本文表中所列的氨基酸序列，或与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或具有一个或多个置换，例如保守置换的序列)。在又另一个实施方案中，核酸可以包含编码来自重链可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR或高变环的核苷酸序列，该重链可变区和轻链可变区具有如本文表中所列的氨基酸序列，或与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或具有一个或多个置换，例如保守置换的序列)。
在某些实施方案中，核酸可以包含编码来自重链可变区的至少一个、两个或三个CDR或高变环的核苷酸序列，该重链可变区具有如本文表中所列的核苷酸序列，与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或能够在本文描述的严格条件下杂交的序列)。在另一个实施方案中，核酸可以包含编码来自轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR或高变环的核苷酸序列，该轻链可变区具有如本文表中所列的核苷酸序列，或与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或能够在本文描述的严格条件下杂交的序列)。在又另一个实施方案中，核酸可以包含编码来自重链可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR或高变环的核苷酸序列，该重链可变区和轻链可变区具有如本文表中所列的核苷酸序列，或与其基本同源的序列(例如，与其至少约85％、90％、95％、99％或更加相同，和/或能够在本文描述的严格条件下杂交的序列)。
在某些实施方案中，核酸可以包含编码如本文所述的细胞因子分子、免疫细胞衔接物或基质修饰部分的核苷酸序列。
在另一方面，本申请的特征在于含有本文所述的核酸的宿主细胞和载体。核酸可以存在于同一宿主细胞或不同的宿主细胞中的单个载体或不同载体中，如下文更详细地描述。
载体
在某些实施方案中，本文描述了一种载体，其包含一种或多种如本文所述的核酸分子。
本文进一步提供了载体，其包含编码抗体分子例如抗TCRβV抗体分子或本文所述的多特异性或多功能分子的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码抗体分子例如抗TCRβV抗体分子或本文所述的多特异性或多功能分子的核酸序列。在一些实施方案中，载体包含本文所述的核苷酸序列。载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工合成染色体(YAC)。
可以采用许多载体系统。例如，一类载体利用来自动物病毒(诸如例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(Rous肉瘤病毒、MMTV或MOMLV)或SV40病毒)的DNA元件。另一类载体利用来自RNA病毒(诸如西门利克森林病毒、东方马脑炎病毒和黄病毒)的RNA元件。
另外，可以通过引入一种或多种允许选择转染的宿主细胞的标志物来选择DNA被稳定整合到其染色体中的细胞。例如，标志物可以向营养缺陷宿主提供质子移变、杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属诸如铜的抗性等。可选择的标志物基因可以直接连接至要表达的DNA序列，或可以通过共转化引入相同的细胞。mRNA的最佳合成可能还需要其他元件。这些元件可能包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
一旦准备好用于表达的表达载体或包含DNA序列的构建体，就可以将表达载体转染或引入合适的宿主细胞中。可以采用多种技术来实现这一点，诸如，例如原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其他常规技术。在原生质体融合的情况下，使细胞在培养基中生长并筛选适当的活性。
用于培养所得转染细胞和用于回收产生的抗体分子的方法和条件是本领域技术人员已知的，并且基于本说明书，可以根据所使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞进行改变或优化。
细胞
在某些实施方案中，本文描述了一种包含如本文所述的核酸或如本文所述的载体的细胞。
在另一方面，本文描述了包含核酸的宿主细胞和载体。核酸可以存在于同一宿主细胞或不同宿主细胞中的单个载体或不同载体中。宿主细胞可以是真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或原核细胞，例如，大肠杆菌。例如，哺乳动物细胞可以是培养的细胞或细胞系。示例性的哺乳动物细胞包括淋巴细胞细胞系(例如，NSO)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS细胞、卵母细胞和来自转基因动物的细胞，例如，乳腺上皮细胞。
在一些实施方案中，本文描述了包含编码如本文所述的抗体分子的核酸的宿主细胞。
在一些实施方案中，本文描述了宿主细胞，其经遗传工程化以包含编码抗体分子的核酸。
在一些实施方案中，通过使用表达盒对宿主细胞进行遗传工程化。短语“表达盒”是指核苷酸序列，其能够影响基因在与此类序列相容的宿主中的表达。这样的盒可以包括启动子，具有或没有内含子的开放阅读框以及终止信号。也可以使用对影响表达所必需或有帮助的其他因素，诸如例如可诱导的启动子。
在一些实施方案中，本文描述了包含本文所述的载体的宿主细胞。该细胞可以是但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括但不限于Vero细胞、HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞和MDCKII细胞。合适的昆虫细胞包括但不限于Sf9细胞。
用抗TCRVB抗体扩增细胞的方法
本文所述的任何组合物和方法均可用于扩增免疫细胞群。本文提供的免疫细胞包括衍生自造血干细胞的免疫细胞或衍生自非造血干细胞的免疫细胞，例如通过分化或去分化。
免疫细胞包括造血干细胞，其后代和/或已经从所述HSC分化的细胞，例如淋巴样细胞或髓样细胞。免疫细胞可以是适应性免疫细胞或先天免疫细胞。免疫细胞的实例包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和粒细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、TCRα-βT细胞、TCRγ-δT细胞。在一些实施方案中，T细胞包括记忆T细胞(例如，中央记忆T细胞，或效应记忆T细胞(例如，TEMRA))或效应T细胞。在一些实施方案中，T细胞包含肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是TIL。TIL是可以在肿瘤(例如实体瘤)中或在肿瘤周围(例如，在肿瘤的基质或肿瘤微环境中)发现的免疫细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)，例如如本文所述。TIL可以获自患有癌症的对象的样品，例如活检或手术样品。在一些实施方案中，可以使用如本文所述的方法来扩增TIL。在一些实施方案中，可以向对象施用例如使用如本文所述的方法扩增的经扩增TIL群体，以治疗疾病，例如癌症。
在一些实施方案，可以使用本领域技术人员已知的许多技术，诸如FicollTM分离，在从对象收集的血液单位中获得免疫细胞，例如T细胞(例如，TIL)。在一方面，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采血液成分术产品通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一方面，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级分，并且任选地，将细胞置于适当的缓冲液或培养基中以用于随后的处理步骤。在一些实施方案中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在替代实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或者可能缺少许多(如果不是所有的话)二价阳离子。本文描述的方法可以包括一个以上的选择步骤，例如，一个以上的耗尽步骤。
在一些实施方案中，本申请的方法可以利用包含DMEM、DMEM F12、RPMI 1640和/或AIM V培养基的培养基条件。可以向培养基补充谷氨酰胺、HEPES缓冲液(例如10mM)，血清(例如热灭活的血清，例如10％)和/或β巯基乙醇(例如55uM)。在一些实施方案中，如本文所述的培养条件包括一种或多种补充剂、细胞因子、生长因子或激素。在一些实施方案中，培养条件包括IL-2、IL-15或IL-7中的一种或多种，或其组合。
免疫效应细胞，诸如T细胞，通常可以使用例如在美国专利6,352,694；6,534,055；或6,905,680中描述的方法激活和扩增。通常，可以通过与刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体接触来扩增免疫细胞群；和/或通过与细胞因子例如IL-2、IL-15或IL-7接触来扩增免疫细胞群。T细胞扩增方案还可以包括刺激，诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑制素)以及钙离子载体接触。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Bcsancon，法国)，也可以使用本领域中通常已知的其他方法(Berg等人,TransplantProc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
TIL群体也可以通过本领域已知的方法扩增。例如，可以如Hall等人,Journal forImmunoTherapy of Cancer(2016)4:61中所述扩增TIL群体，其全部内容通过引用并入本文。简而言之，可以通过机械和/或物理消化从样品中分离TIL。在不分裂的饲养细胞的存在下，可用抗CD3抗体刺激所得的TIL群体。在一些实施方案中，可以在IL-2(例如人IL-2)的存在下培养(例如扩增)TIL群体。在一些实施方案中，可以将TIL细胞培养，例如使其扩增至少1-21天的时间段，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天。
如本文所述，在一些实施方案中，可以通过使免疫细胞群与例如本文所述的抗TCRVB抗体接触来扩增免疫细胞群(例如，T细胞(例如，TEMRA细胞或TIL群体))。
在一些实施方案中，扩增发生在例如对象体内。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的包含TCRβV结合部分的多特异性或多功能分子，从而导致体内免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，扩增在离体例如体外发生。在一些实施方案中，使用如本文所述的多特异性或多功能分子在体外扩增来自对象的细胞，例如T细胞，例如TIL细胞。在一些实施方案中，将扩增的TIL施用给对象以治疗疾病或疾病的症状。
在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法导致扩增至少1.1-10倍、10-20倍或20-50倍的扩增。在一些实施方案中，扩增为至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍的扩增。
在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法包括培养(例如扩增)细胞至少约4小时、6小时、10小时、12小时、15小时、18小时、20小时或22小时。在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法包括培养(例如扩增)细胞至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天。在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法包括培养(例如扩增)细胞至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。
在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法在获自健康对象的免疫细胞上进行。
在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法在获自患有疾病的对象的免疫细胞(例如TIL)上进行，所述疾病为例如癌症，例如如本文所述的实体瘤。
在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法进一步包括使细胞群与促进例如增加免疫细胞扩增的试剂接触。在一些实施方案中，该试剂包括免疫检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂、LAG-3抑制剂、CTLA4抑制剂或TIM-3抑制剂。在一些实施方案中，该试剂包括4-1BB激动剂，例如抗4-1BB抗体。
不希望受理论的束缚，在一些实施方案，如本文所述的多特异性或多功能分子可以扩增，例如选择性或优先地扩增表达包含TCRα和/或TCRβ分子的T细胞受体(TCR)的T细胞，例如TCRα-βT细胞(αβT细胞)。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子不扩增表达包含TCRγ和/或TCRδ分子的TCR的T细胞，例如TCRγ-δT细胞(γδT细胞)，也不诱导其增殖。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子相对于γδT细胞选择性或优先地扩增αβT细胞。
不希望受理论的束缚，在一些实施方案中，据信γδT细胞与细胞因子释放综合征(CRS)和/或神经毒性(NT)有关。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子导致非γδT细胞的选择性扩增，例如，αβT细胞的扩增，因此降低了CRS和/或NT。
在一些实施方案中，如本文所述的任何组合物或方法导致免疫细胞群中的γδT细胞减少，例如耗尽。在一些实施方案中，使免疫细胞群与减少例如抑制或耗尽γδT细胞的药剂例如抗IL-17抗体或结合TCRγ和/或TCRδ分子的药剂接触。
CRS分级
在一些实施方案中，CRS(细胞因子释放综合征)可以以严重性分为如下1-5级。1-3级低于严重CRS。4-5级是严重CRS。对于1级CRS，仅需要对症治疗(例如，恶心、发热、疲劳、肌痛、全身乏力、头痛)，并且症状不会危及生命。对于2级CRS，症状需要进行中等程度的干预，并且通常会对中等程度的干预产生应答。患有2级CRS的对象出现对流体或一种低剂量的升压药产生应答的低血压；或他们出现对低流量氧气(<40％氧气)产生应答的2级器官毒性或轻度呼吸道症状。在3级CRS对象中，低血压通常无法通过流体疗法或一种低剂量升压药逆转。这些对象通常需要超过低流量的氧气，并具有3级器官毒性(例如，肾或心脏功能障碍或凝血病)和/或4级转氨酶升高。3级CRS对象需要更积极的干预，例如40％或更高的氧气、高剂量的升压药和/或多种升压药。4级CRS对象患有立即威胁生命的症状，包括4级器官毒性或需要机械通气。4级CRS对象通常不具有转氨酶升高。在5级CRS对象中，毒性导致死亡。本文如表5、表6和表7提供了用于对CRS进行分级的标准集。除非另有说明，否则如本文使用的CRS指的是根据表6的标准的CRS。
在一些实施方案中，CRS根据表5分级：
如本文所用，术语“细胞因子谱”，是指一种或多种例如如本文所述的细胞因子或趋化因子的水平和/或活性。在一些实施方案中，细胞因子谱包括天然存在的细胞因子、其片段或功能片段或功能变体的水平和/或活性。在一些实施方案中，细胞因子谱包括一种或多种细胞因子和/或一种或多种趋化因子(例如，如本文所述)的水平和/或活性。在一些实施方案中，细胞因子谱包括天然存在的细胞因子、其片段或功能片段或功能变体的水平和/或活性。在一些实施方案中，细胞因子谱包括天然存在的趋化因子、其片段或功能片段或功能变体的水平和/或活性。在实施方案中，细胞因子谱包括以下各项中的一种或多种的水平和/或活性：IL-2(例如，全长、其变体或片段)；IL-1β(例如，全长、其变体或片段)；IL-6(例如，全长、其变体或片段)；TNFα(例如，全长、其变体或片段)；IFNγ(例如，全长、其变体或片段)；IL-10(例如，全长、其变体或片段)；IL-4(例如，全长、其变体或片段)；TNFα(例如，全长、其变体或片段)；IL-12p70(例如，全长、其变体或片段)；IL-13(例如，全长、其变体或片段)；IL-8(例如，全长、其变体或片段)；嗜酸性粒细胞趋化因子(例如，全长、其变体或片段)；嗜酸性粒细胞趋化因子-3(例如，全长、其变体或片段)；IL-8(HA)(例如，全长、其变体或片段)；IP-10(例如，全长、其变体或片段)；MCP-1(例如，全长、其变体或片段)；MCP-4(例如，全长、其变体或片段)；MDC(例如，全长、其变体或片段)；MIP-1a(例如，全长、其变体或片段)；MIP-1b(例如，全长、其变体或片段)；TARC(例如，全长、其变体或片段)；GM-CSF(例如，全长、其变体或片段)；IL-12 23p40(例如，全长、其变体或片段)；IL-15(例如，全长、其变体或片段)；IL-16(例如，全长、其变体或片段)；IL-17a(例如，全长、其变体或片段)；IL-1a(例如，全长、其变体或片段)；IL-5(例如，全长、其变体或片段)；IL-7(例如，全长、其变体或片段)；TNF-β(例如，全长、其变体或片段)；或VEGF(例如，全长、其变体或片段)。在一些实施方案中，细胞因子谱包括一种或多种细胞因子或趋化因子的分泌。在一些实施方案中，细胞因子谱中的细胞因子可以通过本文所述的抗TCRBV抗体分子来调节，例如，增加或减少。在一些实施方案中，细胞因子谱包括与细胞因子风暴或细胞因子释放综合征(CRS)相关的细胞因子，例如，IL-6、IL-1β、TNFα和IL-10。
药物组合物
在某些实施方案中，本文描述了一种药物组合物，其包含如本文所述的多功能多肽分子、如本文所述的核酸分子、如本文所述的载体或如本文所述的细胞以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
包含所述组合物的药剂(例如多功能或多特异性分子)并且用于所述方法中任一种的药物组合物或制剂可以根据制药工业中熟知的常规技术制备，并且在公开的文献中描述。在一些实施方案中，用于治疗对象的药物组合物或制剂包含有效量的如本文所述的任何多功能或多特异性分子或组合物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或酯。包含如本文所述的多功能或多特异性分子的药物制剂可以进一步包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
药学上可接受的盐适用于与人类和低等动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的效益/风险比相称。(参见例如S.M.Berge等人,J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19(1977)，其为此目的通过引入并入本文。盐可以在化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者通过使游离碱形式与合适的有机酸反应单独制备。药学上可接受的无毒的酸加成盐的实例是与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸形成的氨基基团的盐，或与有机酸诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸形成的氨基基团的盐，或通过使用其他文献记载的方法诸如离子交换形成的氨基基团的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸酯、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。适当时，另外的药学上可接受的盐包括使用抗衡离子诸如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的无毒铵、季铵和胺阳离子。
在一些实施方案中，组合物被配制成许多可能的剂型中的任一种，诸如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软胶囊、栓剂和灌肠剂。在一些实施方案中，组合物被配制成在水性介质、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加悬浮液的粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液也可以含有稳定剂。在一些实施方案中，如本文所述的药物制剂或组合物包括但不限于溶液、乳液、微乳液、泡沫或含脂质体的制剂(例如阳离子脂质体或非阳离子脂质体)。
本文所述的药物组合物或制剂可以包含一种或多种渗透促进剂、载剂、赋形剂或其他活性或非活性成分，视情况而定，并且为本领域技术人员所熟知或在公开的文献中有所描述。在一些实施方案中，脂质体还包括空间上稳定的脂质体，例如包含一种或多种专门脂质的脂质体。这些专门的脂质导致脂质体具有增强的循环寿命。在一些实施方案中，空间上稳定的脂质体包含一种或多种糖脂，或者用一种或多种亲水性聚合物衍生，诸如聚乙二醇(PEG)部分。在一些实施方案中，在药物制剂或组合物中包含表面活性剂。在药物产品、制剂和乳剂中使用表面活性剂在本领域中是熟知的。在一些实施方案中，本公开使用渗透促进剂来实现如本文所述的多功能或多特异性分子或组合物的有效递送，例如，以帮助穿过细胞膜的扩散和/或增强亲脂性药物的渗透性。在一些实施方案中，渗透促进剂是表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂或非螯合非表面活性剂。
在一些实施方案中，药物制剂包含如本文所述的多种多功能或多特异性分子。在一些实施方案中，如本文所述的多功能或多特异性分子或组合物与另一种药物或治疗药剂联合施用。
对象的治疗
本文提供的任何组合物可以施用于个体。“个体”可以与“对象”或“患者”互换使用。个体可以是哺乳动物，例如人或动物，诸如非人灵长类动物、啮齿动物、兔、大鼠、小鼠、马、驴、山羊、猫、狗、牛、猪或绵羊。在一些实施方案中，个体是人类。在一些实施方案中，个体是胎儿、胚胎或儿童。在其他实施方案中，个体可以是另一种真核生物，诸如植物。在一些实施方案中，本文提供的组合物被离体施用于细胞。
在一些实施方案中，将本文提供的组合物作为治疗疾病或病症的方法施用于个体。在一些实施方案中，个体患有遗传病，诸如本文所述的任何疾病。在一些实施方案中，个体处于患有疾病(诸如本文所述的任何疾病)的风险中。在一些实施方案中，个体处于患有由蛋白质的量不足或蛋白质的活性不足引起的疾病或病症的增加的风险中。如果个体“处于患有由蛋白质的量不足或蛋白质的活性不足引起的疾病或病症的增加的风险中”，则该方法涉及防止性或预防性治疗。例如，由于疾病的家族史，个体可能处于患有此类疾病或病症的增加的风险中。通常，处于患有此类疾病或病症的增加的风险中的个体受益于预防性治疗(例如，通过防止或延迟疾病或病症的发作或进展)。在一些实施方案中，胎儿在子宫内接受治疗，例如，通过直接或间接(例如，经由母亲)向胎儿施用如本文所述的多功能或多特异性分子或组合物。
如本文所述的多功能或多特异性分子或组合物的合适的施用途径可以根据多功能或多特异性分子或组合物期望递送至的细胞类型而变化。如本文所述的多功能或多特异性分子或组合物可以肠胃外施用于患者，例如通过鞘内注射、脑室内注射、腹膜内注射、肌肉注射、皮下注射或静脉注射。
在一些实施方案中，通过本领域已知的任何方法，将如本文所述的多功能或多特异性分子或组合物与一种或多种能够促进如本文所述的多功能或多特异性分子或组合物穿过对象的血脑屏障的药剂一起施用。例如，在美国专利第6,632,427号，“Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons”(其通过引入并入本文)中描述了通过将腺病毒载体施用到肌肉组织中的运动神经元来递送药剂。例如，在美国专利第6,756,523号，“Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes intocells of the central nervous system particularly in brain”(其通过引入并入本文)中描述了将载体直接递送至大脑，例如纹状体、丘脑、海马或黑质。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能或多特异性分子或组合物与提供所需药物或药效性质的试剂连接或缀合。在一些实施方案中，如本文所述的多功能或多特异性分子或组合物与本领域已知的促进穿过或转运穿过血脑屏障的物质(例如针对转铁蛋白受体的抗体)偶联。在一些实施方案中，如本文所述的多功能或多特异性分子或组合物与病毒载体连接。
在一些实施方案中，使用本领域中已知和描述的任何方法，评估使用所述方法和组合物治疗的对象的病况的改善。
本文使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”等通常意指获得所需的药理和/或生理效果。就预防或部分预防疾病、其症状或病况而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病、病况、症状或由该疾病引起的副作用而言，该效果可以是治疗性的。如本文所用的术语“治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人类)的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的对象中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即减轻或改善疾病和/或其症状或病况。术语“预防”在本文中用于指用于预防或部分预防疾病或病况所采取的一种或多种措施。在一些实施方案中，如本文使用的术语“病况”、“疾病”或“病症”是可互换的。
“治疗或预防疾病或病症”意指在病症发生之前或之后改善与病症相关的任何病况或体征或症状。与同等的未治疗的对照相比，如通过任何标准技术所测量的，此类减少或预防程度为至少3％、5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％。正在治疗疾病或病症的患者是被医师诊断为患有此类病况的患者。可以通过任何合适的手段进行诊断。诊断和监测可以涉及，例如，检测生物样品中病理细胞的存在(例如，组织活检、血液测试或尿液测试)，检测生物样品中病症的替代标志物的水平，或检测与病症相关的症状。正在预防病症的发展的患者可能已经接受此类诊断或可能没有接受此类诊断。本领域技术人员将会理解，这些患者可能已经经受如上所述的相同的标准测试，或者可能由于一种或多种风险因素(例如，家族史或遗传素质)的存在而在没有检查的情况下就已经被鉴定为处于高风险的患者。
癌症治疗方法
在某些实施方案中，本文描述了一种治疗有需要的对象的病况或疾病的方法，包括向对象施用治疗有效量的如本文所述的多功能多肽分子、如本文所述的核酸分子、如本文所述的载体、如本文所述的细胞、如本文所述的药物组合物或其组合，其中施用对治疗对象的病况或疾病是有效的。
在一些实施方案中，所述病况或疾病为癌症。在一些实施方案中，癌症是实体瘤、血液学癌症、转移性癌症、软组织肿瘤或其组合。在一些实施方案中，癌症是实体瘤，并且其中实体瘤选自黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、肝癌及其组合。在一些实施方案中，所述癌症是血液学癌症，并且其中所述血液学癌症选自霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病及其组合。在一些实施方案中，非霍奇金淋巴瘤选自B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病及其组合。在一些实施方案中，T细胞淋巴瘤为外周T细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，癌症的特征在于存在于癌症上的癌抗原。
在一些实施方案中，癌抗原为肿瘤抗原、基质抗原或血液学抗原。在一些实施方案中，癌抗原选自BCMA、CD19、CD20、CD22、FcRH5、PDL1、CD47、神经节苷脂2(GD2)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、Ron激酶、c-Met、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、BING-4、钙激活的氯化物通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、SAP-1、存活蛋白、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、Gp100/pmel17、酪氨酸酶、TRP-1/-2、MC1R、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、p53、Ras、TGF-B受体、AFP、ETA、MAGE、MUC-1、CA-125、BAGE、GAGE、NY-ESO-1、β-连环蛋白、CDK4、CDC27、α辅肌动蛋白-4、TRP1/gp75、TRP2、gp100、Melan-A/MART1、神经节苷脂、WT1、EphA3、表皮生长因子受体(EGFR)、MART-2、MART-1、MUC1、MUC2、MUM1、MUM2、MUM3、NA88-1、NPM、OA1、OGT、RCC、RUI1、RUI2、SAGE、TRG、TRP1、TSTA、叶酸受体α、L1-CAM、CAIX、gpA33、GD3、GM2、VEGFR、整合素、碳水化合物、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、TGF-β、透明质酸、胶原蛋白、生腱蛋白C和生腱蛋白W。
本文所述的方法包括通过使用如本文所述的多特异性或多功能分子，例如使用本文所述的药物组合物，治疗对象的癌症。还提供了用于减轻或改善对象的癌症的症状的方法，以及用于抑制癌症的生长和/或杀死一种或多种癌细胞的方法。在一些实施方案中，本文所述的方法在施用本文所述的或本文所述的药物组合物的对象中减小肿瘤的大小和/或减少癌细胞的数量。
本文描述了治疗患有癌症的对象的方法，包括获得对象中一种或多种TCRBV分子的状态。在一些实施方案中，对象(例如，来自对象的样品)中一种或多种TCRβV分子的较高(例如，增加的)水平或活性指示对象中表达所述一种或多种TCRβV分子的T细胞的偏好(例如，优先扩增，例如，克隆扩增)。
不希望受理论的束缚，据信有偏倚的T细胞群，例如表达TCRβV分子的T细胞群，对疾病抗原(例如癌抗原)是抗原特异性的(Wang CY等人,Int J Oncol.(2016)48(6):2247-56)。在一些实施方案中，癌抗原包括癌相关抗原或新抗原。在一些实施方案中，患有例如如本文所述的癌症的对象具有更高(例如升高)水平或活性的与癌症相关的一种或多种TCRβV分子。在一些实施方案中，TCRβV分子与例如癌抗原(例如癌相关抗原或新抗原)缔合，例如对其进行识别。
因此，本文描述了扩增从对象获得的免疫效应细胞群的方法，该方法包括从来自对象的样品中获取一种或多种TCRβV分子的状态，包括使所述免疫效应细胞群与如本文所述的抗TCRβV抗体分子，例如结合至相同TCRβV分子的抗TCRβV抗体分子接触，所述TCRβV分子在来自对象的样品中的免疫效应细胞群中的含量更高，例如增加。在一些实施方案中，使免疫效应细胞群(例如，包含表达一种或多种TCRβV分子的T细胞)与抗TCRβV分子接触导致表达一种或多种TCRβV分子的免疫效应细胞群的扩增。在一些实施方案中，将扩增的群体或其一部分施用于对象(例如，从其获得该免疫效应细胞群的同一对象)，以治疗癌症。在一些实施方案中，将扩增的群体或其一部分施用于不同的对象(例如，不是从其获得免疫效应细胞群的同一对象)，以治疗癌症。
本文还描述了治疗患有癌症的对象的方法，该方法包括：从来自对象的样品中获取一种或多种TCRβV分子的状态，并且确定该一种或多种TCRβV分子在来自对象的样品中与参考值比较是否更高，例如增加，其中响应于所述确定，向对象施用有效量的抗TCRβV抗体分子，例如激动性抗TCRβV抗体分子，例如如本文所述的那些。
在一些实施方案中，对象患有B-CLL。在一些实施方案中，患有B-CLL的对象具有更高(例如升高)水平或活性的一种或多种TCRβV分子，例如该一种或多种TCRβV分子包括：(i)包含例如TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01的TCRβV6亚家族；(ii)包含TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01或TCRβV5-8*01的TCRβV5亚家族；(iii)包含TCRβV3-1*01的TCRβV3亚家族；(iv)包含TCRβV2*01的TCRβV2亚家族；或(v)包含TCRβV19*01或TCRβV19*02的TCRβV19亚家族。
在一些实施方案中，患有B-CLL的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV6亚家族，包括例如TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV6亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV6亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，患有B-CLL的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV5亚家族，包括TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01或TCRβV5-8*01。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV5亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV5亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，患有B-CLL的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV3亚家族，包括TCRβV3-1*01。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV3亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV3亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，患有B-CLL的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV2亚家族，包括TCRβV2*01。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV2亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV2亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，患有B-CLL的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV19亚家族，包括TCRβV19*01或TCRβV19*02。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV19亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRBV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV19亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，对象患有黑色素瘤。在一些实施方案中，患有黑色素瘤的对象具有更高(例如升高)水平或活性的一种或多种TCRβV分子，例如包含TCRβV6亚家族的一种或多种TCRβV分子，所述TCRβV6亚家族包括：例如TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV6亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV6亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，对象患有DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)。在一些实施方案中，患有DLBCL的对象具有更高(例如升高)水平或活性的一种或多种TCRβV分子，例如该一种或多种TCRβV分子包括：(i)包含TCRβV13*01的TCRβV13亚家族；(ii)包含TCRβV3-1*01的TCRβV3亚家族；或(iii)TCRβV23亚家族。
在一些实施方案中，患有DLBCL的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV13亚家族，所述TCRβV13亚家族包括TCRβV13*01。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV13亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV13亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，患有DLBCL的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV3亚家族，所述TCRβV3亚家族包括TCRβV3-1*01。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV3亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV3亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，患有DLBCL的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV23亚家族。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV23亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV23亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，对象患有CRC(结肠直肠癌)。在一些实施方案中，患有CRC的对象具有更高(例如升高)水平或活性的一种或多种TCRβV分子，例如该一种或多种TCRβV分子包括：(i)包含TCRβV19*01或TCRβV19*02的TCRβV19亚家族；(ii)包含TCRβV12-4*01、TCRβV12-3*01或TCRβVl2-5*01的TCRβV12亚家族；(iii)包含TCRβV16*01的TCRβV16亚家族；或(iv)TCRβV21亚家族。
在一些实施方案中，患有CRC的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV19亚家族，所述TCRβV19亚家族包括TCRβV19*01或TCRβV19*02。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV19亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV19亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，患有CRC的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV12亚家族，所述TCRβV12亚家族包括TCRβV12-4*01、TCRβV12-3*01或TCRβV12-5*01。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV12亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV12亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，患有CRC的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV16亚家族，所述TCRβV16亚家族包括TCRβV16*01。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV16亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV16亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，患有CRC的对象具有更高(例如升高)水平或活性的TCRβV21亚家族。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，所述多功能多肽分子包含与TCRβV21亚家族的一个或多个成员结合的抗TCRβV分子(例如，如本文所述的激动性抗TCRβV分子)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的施用导致表达TCRβV21亚家族的一个或多个成员的免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，获取一种或多种TCRβV分子的状态，例如存在、水平和/或活性的值包括获取样品的T细胞受体(TCR)库的量度。在一些实施方案中，该值包括样品中T细胞群的克隆型的量度。
在一些实施方案中，使用Wang CY等人,Int J Oncol.(2016)48(6):2247-56(其全部内容据此通过引用并入本文)中描述的测定来获得(例如测量)一种或多种TCRβV分子的状态值。
在一些实施方案中，例如使用流式细胞术来获得一种或多种TCRβV分子的状态值。
联合疗法
在一些实施方案中，如本文所述的方法进一步包括向对象施用第二治疗剂或疗法。
在一些实施方案中，第二治疗剂或疗法包括化疗剂、生物剂、激素疗法、放射或手术。
在一些实施方案中，第二治疗剂或疗法与如本文所述的多功能多肽分子、如本文所述的核酸分子、如本文所述的载体、如本文所述的细胞、如本文所述的药物组合物顺序地、同时地或并发地组合施用。
如本文所述的多特异性或多功能分子可以与第二治疗剂或程序联合使用。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子和第二治疗剂或程序在对象已经被诊断患有癌症之后，例如，在癌症已经从对象中消除之前施用/进行。在一些实施方案中，同时或并发地施用/执行如本文所述的多特异性或多功能分子和第二治疗剂或程序。例如，当第二种的递送开始时，一种治疗的递送仍在进行，例如，在治疗的施用中存在重叠。在其他实施方案中，顺序施用/执行如本文所述的多特异性或多功能分子和第二治疗剂或程序。例如，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前停止。
在一些实施方案中，联合疗法能够产生比使用单独的任一药剂的单一疗法更有效的治疗。在一些实施方案中，第一治疗和第二治疗的组合比单独的第一治疗或第二治疗更有效(例如，导致症状和/或癌细胞的更大减少)。在一些实施方案中，与作为单一疗法施用时达到类似效果通常所需的第一治疗或第二治疗的剂量相比，联合疗法允许使用较低剂量的第一治疗或第二治疗。在一些实施方案中，联合疗法具有部分相加效应、完全相加效应或大于相加效应。
在一个实施方案中，将抗TCRBV抗体、多特异性或多功能分子与疗法例如癌症疗法(例如，抗癌剂、免疫疗法、光动力疗法(PDT)、手术和/或放射中的一种或多种)联合施用。术语“化学疗法”、“化疗剂”和“抗癌剂”在本文中可互换使用。多特异性或多功能分子和疗法例如癌症疗法的施用可以顺序(有或没有重叠)或同时进行。抗TCRBV抗体、多特异性或多功能分子的施用在疗法(例如癌症疗法)过程期间可以是连续或间歇的。本文所述的某些疗法可以用于治疗癌症和非癌性疾病。例如，使用本文所述的方法和组合物，可以在癌性和非癌性病况(例如，结核病)中提高PDT的功效(例如，在Agostinis,P.等人(2011)CA CancerJ.Clin.61:250-281中综述)。
本文所述的方法包括通过使用如本文所述的多特异性或多功能分子，例如使用如本文所述的药物组合物，来治疗对象的癌症。还提供了用于减轻或改善对象的癌症的症状的方法，以及用于抑制癌症的生长和/或杀死一种或多种癌细胞的方法。在一些实施方案中，本文所述的方法在施用本文所述的或本文所述的药物组合物的对象中减小肿瘤的大小和/或减少癌细胞的数量。
在一些实施方案中，癌症为血液学癌症。在一些实施方案中，血液学癌症是白血病或淋巴瘤。如本文所用，“血液学癌症”是指造血或淋巴组织的肿瘤，例如，影响血液、骨髓或淋巴结的肿瘤。示例性的血液学恶性肿瘤包括但不限于白血病(例如，急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞白血病、急性单核细胞白血病(AMoL)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、幼年型粒单核细胞白血病(JMML)或大颗粒淋巴细胞白血病)、淋巴瘤(例如AIDS相关淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(例如经典霍奇金淋巴瘤或结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤)、蕈样真菌病、非霍奇金淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤)或T细胞非霍奇金淋巴瘤(蕈样真菌病、退行性大细胞淋巴瘤或前体T淋巴母细胞性淋巴瘤))、原发性中枢神经系统淋巴瘤、塞扎里综合征、巨球蛋白血症)、慢性骨髓增生性肿瘤、郎格汉斯细胞组织细胞增多症、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、骨髓增生异常综合征或骨髓增生异常/骨髓增生性赘生物。
在一些实施方案中，癌症为骨髓增生性赘生物，例如原发性或特发性骨髓纤维化(ML)、原发性血小板增多症(ET)、真性红细胞增多症(PV)或慢性髓细胞性白血病(CML)。在一些实施方案中，癌症为骨髓纤维化。在一些实施方案中，对象患有骨髓纤维化。在一些实施方案中，对象具有钙网蛋白突变，例如如本文所述的钙网蛋白突变。在一些实施方案中，对象不具有JAK2-V617L突变。在一些实施方案中，对象具有JAK2-V617L突变。在一些实施方案中，对象具有MPL突变。在一些实施方案中，对象不具有MPL突变。
在一些实施方案中，癌症为实体癌。示例性的实体癌包括但不限于卵巢癌、直肠癌、胃癌、睾丸癌、肛门区域癌、子宫癌、结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺非小细胞癌、小肠癌、食道癌、黑色素瘤、卡波济氏肉瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、表皮样癌、子宫颈鳞状细胞癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、软组织肉瘤、尿道癌、外阴癌、阴茎癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、脊柱轴肿瘤、中枢神经系统(CNS)赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、所述癌症的转移性病变，或其组合。
在一些实施方案中，癌症为急性淋巴母细胞性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、再生障碍性贫血、慢性髓细胞性白血病、促纤维增生性小圆细胞瘤、尤文肉瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常、非霍奇金淋巴瘤、阵发性夜间血红蛋白尿、辐射中毒、慢性淋巴细胞白血病、AL淀粉样变性、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、严重再生障碍性贫血、神经母细胞瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、肾细胞癌、自身免疫性障碍(诸如系统性硬化症、骨硬化症、遗传性代谢障碍、幼年型慢性关节炎、肾上腺脑白质营养不良、巨核细胞性血小板减少症、镰状细胞病、严重先天性免疫缺陷、Griscelli综合征II型、Hurler综合征、Kostmann综合征、Krabbe病、异染性脑白质营养不良、地中海贫血、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症和Wiskott-Aldrich综合征)、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、神经内分泌肿瘤、上皮癌和肉瘤。可以用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑瘤、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性、ER阳性、ER阴性、化疗抗性、赫赛汀抗性、HER2阳性、多柔比星抗性、他莫昔芬抗性、导管癌、小叶癌、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、黑色素瘤、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部或食道)、结直肠癌、白血病、急性髓细胞性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、或多发性骨髓瘤。另外的示例包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或髓母细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑瘤、癌症、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、皮肤癌前病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺髓质瘤、黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺乳头状癌、肝细胞癌、乳头佩吉特病、叶状瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。在一些实施方案中，癌症为实体瘤。在一些实施方案中，癌症是血液学的。
在一些实施方案中，以适合于待治疗或预防的疾病的方式施用如本文所述的多特异性或多功能分子(或如本文所述的药物组合物)。施用的数量和频率取决于患者的病情、患者疾病的类型和严重性等因素。适当的剂量可以通过临床试验确定。例如，当指示“有效量”或“治疗量”时，医师可以通过考虑肿瘤大小、感染或转移的程度、对象的年龄、体重和状况的个体差异来确定要施用的药物组合物(或多特异性或多功能分子)的精确量。在一些实施方案中，本文描述的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量施用，例如105至106个细胞/kg体重，包括在这些范围内的所有整数值。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以以这些剂量多次施用。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以使用在免疫疗法中所述的输注技术来施用(参见例如Rosenberg等人,New Eng.J.ofMed.319:1676,1988)。
在一些实施方案中，将如本文所述的多特异性或多功能分子或如本文所述的药物组合物在肠胃外施用给对象。在一些实施方案中，将细胞经静脉内、皮下、肿瘤内、结节内、肌内、皮内或腹膜内施用给对象。在一些实施方案中，将细胞直接施用(例如注射)到肿瘤或淋巴结中。在一些实施方案中，细胞以输注(例如，如Rosenberg等人,New Eng.J.ofMed.319:1676,1988)或静脉推注的形式施用。在一些实施方案中，细胞以可注射的储库型制剂形式施用。
在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是人、猴、猪、狗、猫、牛、绵羊、山羊、兔、大鼠或小鼠。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是儿科对象，例如小于18岁，例如小于17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1岁或更小的年龄。在一些实施方案中，对象是成年人，例如，至少18岁，例如，至少19、20、21、22、23、24、25、25-30、30-35、35-40、40-50、50-60、60-70、70-80或80-90岁。
抗癌疗法
在其他实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子与低分子量或小分子量化疗剂联合施用。示例性的低分子量或小分子量化疗剂包括但不限于：l3-顺式-维A酸(异维A酸，)、2-CdA(2-氯脱氧腺苷，克拉屈滨，LEUSTATINTM)、5-阿扎胞苷(阿扎胞苷，)、5-氟尿嘧啶(5-FU，氟尿嘧啶，)、6-巯嘌呤(6-MP，巯嘌呤，)、6-TG(6-硫鸟嘌呤，硫鸟嘌呤，THIOGUANINE)、abraxane(紫杉醇蛋白结合型)、放线菌素D(放线菌素，)、阿利维A酸全反式维A酸(ATRA，维A酸，)、六甲蜜胺(六甲基三聚氰胺，HMM，)、氨甲蝶呤(甲氨蝶呤，甲氨蝶呤钠，MTX，TREXALLTM，)、氨磷汀阿糖胞嘧啶(Ara-C，阿糖胞苷，)、三氧化二砷天冬酰胺酶(欧文氏菌L-天冬酰胺酶，L-天冬酰胺酶， )、BCNU(卡莫司汀，)、苯达莫司汀贝沙罗汀博来霉素白消安甲酰四氢叶酸钙(嗜橙菌因子，亚叶酸，甲酰四氢叶酸)、喜树碱-11(CPT-11，伊立替康，)、卡培他滨卡铂卡莫司汀晶片(带有卡莫司汀植入物的prolifeprospan 20，晶片)、CCI-779(坦罗莫司，)、CCNU(洛莫司汀，CeeNU)、CDDP(顺铂，)、苯丁酸氮芥(瘤可宁)、环磷酰胺达卡巴嗪(DIC，DTIC，咪唑羧酰胺，)、道诺霉素(柔红霉素，盐酸柔红霉素，盐酸红比霉素，)、地西他滨右雷佐生DHAD(米托蒽醌，)、多西紫杉醇多柔比星表柔比星(ELLENCETM)、雌莫司汀依托泊苷(VP-16，依托泊苷磷酸盐，)、氟尿苷氟达拉滨氟尿嘧啶(奶油)(CARACTM， )、吉西他滨羟基脲(DROXIATM，MYLOCELTM)、伊达比星异环磷酰胺伊沙匹隆(IXEMPRATM)、LCR(醛基长春碱，长春新碱，VCR，)、L-PAM(L-溶肉瘤素，美法仑，苯丙氨酸氮芥，)、二氯甲基二乙胺(盐酸二氯甲基二乙胺，氮芥，氮芥子气，)、美司钠(MESNEXTM)、丝裂霉素(丝裂霉素-C，MTC，)、奈拉滨奥沙利铂(ELOXATINTM)、紫杉醇(ONXALTM)、培门冬酶(PEG-L-天冬酰胺酶，)、PEMETREXED喷司他丁丙卡巴肼链脲菌素替莫唑胺替尼泊苷(VM-26，)、TESPA(硫代磷酰胺，塞替派，TSPA，)、托泊替康长春碱(硫酸长春碱，长春花碱，VLB，)、长春瑞滨(酒石酸长春瑞滨，)和伏立诺他
在另一个实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子与生物制剂联合施用。可用于治疗癌症的生物制剂是本领域已知的，并且如本文所述的结合分子可以例如与此类已知的生物制剂联合施用。例如，FDA已批准以下用于治疗乳腺癌的生物制剂：(曲妥珠单抗，Genentech Inc.,South San Francisco,Calif.；在HER2阳性乳腺癌中具有抗肿瘤活性的人源化单克隆抗体)；(氟维司群，AstraZenecaPharmaceuticals,LP,Wilmington,Del.；用于治疗乳腺癌的雌激素受体拮抗剂)；(阿那曲唑，AstraZeneca Pharmaceuticals,LP；阻断芳香酶(制备雌激素所需的酶)的非甾体芳香酶抑制剂)；(依西美坦，Pfizer Inc.,New York,N.Y.；用于治疗乳腺癌的不可逆的甾族芳香酶灭活剂)；(来曲唑，NovartisPharmaceuticals,East Hanover,N.J.；FDA批准用于治疗乳腺癌的非甾体芳香酶抑制剂)；和(他莫昔芬，AstraZeneca Pharmaceuticals,LP；FDA批准用于治疗乳腺癌的非甾体抗雌激素药)。可以与如本文所述的结合分子联合的其他生物制剂包括：(贝伐单抗，Genentech Inc.；第一种经FDA批准的旨在抑制血管生成的疗法)；和(替伊莫单抗，Biogen Idee,Biogen Idec,Cambridge,Mass.；目前批准用于治疗B细胞淋巴瘤的放射性标记的单克隆抗体)。
此外，FDA已批准以下用于治疗结直肠癌的生物制剂： (西妥昔单抗，ImClone Systems Inc.,New York,N.Y.，和Bristol-Myers Squibb,New York,N.Y.；是一种针对表皮生长因子受体(EGFR)的单克隆抗体)；(甲磺酸伊马替尼；一种蛋白激酶抑制剂)；和(盐酸左旋咪唑，Janssen PharmaceuticaProducts,LP,Titusville,N.J.；一种免疫调节剂，1990年被FDA批准在Dukes C期结肠癌患者手术切除后，与5-氟尿嘧啶联合用作辅助治疗)。
对于肺癌的治疗，示例性的生物制剂包括(盐酸厄洛替尼，OSIPharmaceuticals Inc.,Melville,N.Y.；一种设计为靶向人表皮生长因子受体1(HER1)途径的小分子)。
对于多发性骨髓瘤的治疗，示例性的生物制剂包括(硼替佐米，Millennium Pharmaceuticals,Cambridge Mass.；一种蛋白酶体抑制剂)。其他生物制剂包括(沙利度胺，Clegene Corporation,Warren,N.J.；一种免疫调节剂，似乎具有多种作用，包括抑制骨髓瘤细胞的生长和存活以及抗血管生成的能力)。
另外的示例性癌症治疗性抗体包括但不限于3F8、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、培化阿珠单抗(alacizumab pegol)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)马安莫单抗(anatumomab mafenatox)、安芦珠单抗(anrukinzumab)(IMA-638)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)贝利木单抗(belimumab)贝索单抗(besilesomab)贝伐珠单抗(bevacizumab)比伐单抗美登素(bivatuzumabmertansine)、博纳吐单抗(blinatumomab)、布仁妥昔单抗维度丁(brentuximab vedotin)、莫坎妥珠单抗美登素(cantuzumab mertansine)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)CC49、西妥昔单抗(cetuximab)(C225，)、泊西他珠单抗(citatuzumab bogatox)、西妥木单抗(cixutumumab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、可那木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、地舒单抗(denosumab)地莫单抗(detumomab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依屈洛单抗(edrecolomab)依洛珠单抗(elotuzumab)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)埃达珠单抗(etaracizumab)、法利珠单抗(farletuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、夫苏木单抗(fresolimumab)、加利昔单抗(galiximab)、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)吉瑞昔单抗(girentuximab)、glembatumumab vedotin、伊莫单抗(ibritumomab)(替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)，)、伊戈伏单抗(igovomab)英妥木单抗(intetumumab)、伊珠单抗奥加米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、他那可单抗(nacolomab tafenatox)、他那莫单抗(naptumomab estafenatox)、奈昔木单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)巯诺莫单抗(nofetumomab merpentan)奥法木单抗(ofatumumab)奥拉单抗(olaratumab)、莫奥珠单抗(oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)帕木单抗(panitumumab)、培妥莫单抗(pemtumomab)、培妥珠单抗(pertuzumab)平妥莫单抗(pintumomab)、普立木单抗(pritumumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、雷珠单抗(ranibizumab)利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)罗妥木单抗(robatumumab)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、松妥珠单抗(sontuzumab)、他珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)帕他莫单抗(taplitumomab paptox)、替妥莫单抗(tenatumomab)、TGN1412、替昔木单抗(ticilimumab)(曲美木单抗(tremelimumab))、替加珠单抗(tigatuzumab)、TNX-650、托西莫单抗(tositumomab)曲妥珠单抗(trastuzumab)曲美木单抗、西莫白介素单抗(tucotuzumabcelmoleukin)、维妥珠单抗(veltuzumab)、伏洛昔单抗(volociximab)、伏妥木单抗(votumumab)扎芦木单抗(zalutumumab)和扎木单抗(zanolimumab)
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子与病毒癌症治疗剂联合施用。示例性的病毒癌症治疗剂包括但不限于牛痘病毒(vvDD-CDSR)、表达癌胚抗原的麻疹病毒、重组牛痘病毒(TK-缺失加GM-CSF)、塞内卡谷病毒001、新城病毒、柯萨奇A21病毒、GL-ONC1、表达EBNA1 C末端/LMP2嵌合蛋白的重组经修饰痘苗安卡拉疫苗、表达癌胚抗原的麻疹病毒、G207溶瘤病毒、表达p53的经修饰痘苗病毒安卡拉疫苗、OncoVEX GM-CSF修饰的单纯疱疹1病毒、鸡痘病毒疫苗载体、重组牛痘前列腺特异性抗原疫苗、人乳头瘤病毒16/18L1病毒样颗粒/AS04疫苗、MVA-EBNA1/LMP2注射液疫苗、四价HPV疫苗、四价人乳头瘤病毒(6、11、16、18型)重组疫苗重组鸡痘-CEA(6D)/TRICOM疫苗、重组牛痘-CEA(6D)-TRICOM疫苗、重组经修饰牛痘安卡拉-5T4疫苗、重组鸡痘-TRICOM疫苗、溶瘤性疱疹病毒NV1020、HPV L VLP疫苗V504、人乳头瘤病毒二价(16和18型)疫苗单纯疱疹病毒HF10、Ad5CMV-p53基因、重组牛痘DF3/MUC1疫苗、重组牛痘-MUC-1疫苗、重组牛痘-TRICOM疫苗、ALVAC MART-1疫苗、表达人前脑啡肽原(NP2)的复制缺陷型单纯疱疹病毒I型(HSV-1)载体、野生型呼肠孤病毒、呼肠孤病毒3型Dearing溶瘤病毒HSV1716、基于重组经修饰牛痘安卡拉(MVA)的编码爱泼斯坦-巴尔病毒靶抗原的疫苗、重组鸡痘-前列腺特异性疫苗抗原疫苗、重组牛痘前列腺特异性抗原疫苗、重组牛痘B7.l疫苗、rAd-p53基因、Ad5-δ24RGD、HPV疫苗580299、JX-594(胸苷激酶缺失的牛痘病毒加GM-CSF)、HPV-16/18L1/AS04、鸡痘病毒疫苗载体、牛痘酪氨酸酶疫苗、MEDI-517HPV-16/18VLP AS04疫苗、含有单纯疱疹病毒的胸苷激酶的腺病毒载体TK99UN、HspE7、FP253/氟达拉滨、ALVAC(2)黑色素瘤多抗原治疗疫苗、ALVAC-hB7.1、金丝雀痘-hIL-12黑色素瘤疫苗、Ad-REIC/Dkk-3、rAd-IFN SCH 721015、TIL-Ad-INFg、Ad-ISF35和柯萨奇病毒A21(CVA21，)。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子与纳米药物联合施用。示例性的癌症纳米药物包括但不限于(紫杉醇结合的白蛋白纳米颗粒)、CRLX101(CPT与线性环糊精基聚合物缀合)、CRLX288(将多西紫杉醇与可生物降解的聚合物聚(乳酸-共-乙醇酸)缀合)、阿糖胞苷脂质体(脂质体Ara-C，DEPOCYTTM)、柔红霉素脂质体多柔比星脂质体胶囊化的柔红霉素柠檬酸脂质体和PEG抗VEGF适体
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子与紫杉醇或紫杉醇制剂，例如结合蛋白质的紫杉醇(例如)联合施用。示例性的紫杉醇制剂包括但不限于结合纳米颗粒白蛋白的紫杉醇(由Abraxis Bioscience销售)、二十二碳六烯酸结合的紫杉醇(DHA-紫杉醇，Taxoprexin，由Protarga销售)、聚谷氨酸结合的紫杉醇(PG-紫杉醇，聚谷紫杉醇，CT-2103，XYOTAX，由Cell Therapeutic销售)、肿瘤激活的前药(TAP)、ANG105(与紫杉醇的三个分子结合的Angiopep-2，由ImmunoGen销售)、紫杉醇-EC-1(与识别erbB2的肽EC-1结合的紫杉醇；参见Li等人,Biopolymers(2007)87:225-230)和葡萄糖缀合的紫杉醇(例如2’-紫杉醇甲基2-葡萄糖吡喃葡萄糖基琥珀酸酯，参见Liu等人,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters(2007)17:617-620)。
用于治疗癌症的示例性的RNAi和反义RNA试剂包括但不限于CALAA-01、siG12DLODER(本地药物EluteR)和ALN-VSP02。
其他癌症治疗剂包括但不限于细胞因子(例如，阿地白介素(IL-2，白介素2，)、α干扰素(IFN-α，干扰素α，A(干扰素α-2b)、(干扰素α-2a))、依泊汀α非格司亭(G-CSF，粒细胞-集落刺激因子，)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，沙格司亭，LEUKINETM)、IL-11(白介素11，奥普瑞白介素，)、干扰素α-2b(PEG缀合物)(PEG干扰素，PEG-INTRONTM)和培非司亭(NEULASTATM))、激素治疗剂(例如，氨鲁米特阿那曲唑比卡鲁胺依西美坦氟甲睾酮氟他胺氟维司群戈舍瑞林来曲唑亮丙瑞林(ELIGARDTM，LUPRONVIADURTM)、甲地孕酮(醋酸甲地孕酮，)、尼鲁米特奥曲肽(醋酸奥曲肽，SANDOSTATIN)、雷洛昔芬罗米司亭他莫昔芬和托瑞米芬)、磷脂酶A2抑制剂(例如阿那格雷)、生物应答调节剂(例如BCG和达贝汀α)、靶向治疗剂(例如硼替佐米达沙替尼(SPRYCELTM)、地尼白介素厄洛替尼依维莫司吉非替尼甲磺酸伊马替尼(STI-571，GLEEVECTM)、拉帕替尼索拉非尼和SU11248(舒尼替尼，))、免疫调制和抗血管生成剂(例如CC-5013(来那度胺，)和沙利度胺)、糖皮质激素(例如可的松(氢化可的松，氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠，HYDROCORT氢化可的松磷酸)、地卡特隆(地塞米松，醋酸地塞米松，磷酸地塞米松， )、甲泼尼龙(6-甲基泼尼松龙，醋酸甲泼尼龙，甲泼尼龙琥珀酸钠， )、泼尼松龙 和泼尼松(LIQUID))和双膦酸盐(例如帕米膦酸二钠和唑来膦酸)。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子与酪氨酸激酶抑制剂(例如受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂)联合使用。示例性的酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于表皮生长因子(EGF)途径抑制剂(例如表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)、血管内皮生长因子(VEGF)途径抑制剂(例如针对VEGF的抗体、VEGF阱、血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(例如VEGFR-1抑制剂、VEGFR-2抑制剂、VEGFR-3抑制剂))、血小板衍生的生长因子(PDGF)途径抑制剂(例如，血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)抑制剂(例如，PDGFR-β抑制剂))、RAF-1抑制剂、KIT抑制剂和RET抑制剂。在一些实施方案中，与AHCM试剂联合使用的抗癌剂选自：阿昔替尼(AG013736)、波舒替尼(SKI-606)、西地尼布(RECENTINTM，AZD2171)、达沙替尼(BMS-354825)、厄洛替尼吉非替尼伊马替尼(CGP57148B，STI-571)、拉帕替尼 来妥替尼(CEP-701)、奈拉替尼(HKI-272)、尼洛替尼司马尼布(司马沙尼(semaxinib)，SU5416)、舒尼替尼(SU11248)、托西尼布凡他尼布(ZD6474)、伐拉尼布(PTK787，PTK/ZK)、曲妥珠单抗贝伐珠单抗利妥昔单抗西妥昔单抗帕木单抗雷珠单抗尼洛替尼索拉非尼阿仑珠单抗吉姆单抗奥佐米星ENMD-2076、PCI-32765、AC220、度维替尼(TKI258，CHIR-258)、BIBW 2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、替沃扎尼(tivozanib)(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、XL228、AEE788、AG-490、AST-6、BMS-599626、CUDC-101、PD153035、培利替尼(EKB-569)、凡他尼布(凡德他尼(zactima))、WZ3146、WZ4002、WZ8040、ABT-869(利尼伐尼(linifanib))、AEE788、AP24534(泊那替尼)、AV-951(替沃扎尼(tivozanib))、阿昔替尼、BAY 73-4506(瑞戈非尼)、丙氨酸布立尼布(BMS-582664)、布立尼布(brivanib)(BMS-540215)、西地尼布(AZD2171)、CHIR-258(度维替尼)、CP 673451、CYC116、E7080、Ki8751、马赛替尼(AB1010)、MGCD-265、二磷酸莫替沙尼(motesanib diphosphate)(AMG-706)、MP-470、OSI-930、盐酸帕唑帕尼、PD173074、甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-9006)、SU 5402、TSU-68(SU6668)、伐拉尼布、XL880(GSK1363089，EXEL-2880)。选定的酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼、厄洛替尼、吉非替尼或索拉非尼。在一些实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是舒尼替尼。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子与抗血管生成剂，或血管靶向剂或血管破坏剂中的一种或多种联合施用。示例性的抗血管生成剂包括但不限于VEGF抑制剂(例如抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗)；VEGF受体抑制剂(例如伊曲康唑)；细胞增殖素和/或内皮细胞迁移的抑制剂(例如，羧酰胺基三唑，TNP-470)；血管生成刺激剂的抑制剂(例如，舒拉明)等。血管靶向剂(VTA)或血管破坏剂(VDA)被设计成损害癌症肿瘤的脉管系统(血管)，引起中心性坏死(在例如Thorpe,P.E.(2004)Clin.Cancer Res.第10卷:415-427中概述)。VTA可以是小分子。示例性的小分子VTA包括但不限于微管失稳药物(例如康普瑞汀A-4磷酸二钠(CA4P)、ZD6126、AVE8062、Oxi 4503)；和伐地美生(ASA404)。
免疫检查点抑制剂
在其他实施方案中，本文所述的方法包括将免疫检查点抑制剂与如本文所述的多特异性或多功能分子联合使用。该方法可以用于体内治疗方案。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂抑制检查点分子。示例性的检查点分子包括但不限于CTLA4、PD1、PD-L1、PD-L2、TIM3、LAG3、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、BTLA、KIR、MHC I类、MHC II类、GAL9、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1和A2aR。参见例如Pardoll.Nat.Rev.Cancer 12.4(2012):252-64，通过引用并入本文。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂，例如抗PD-1抗体，诸如纳武利尤单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)或匹地利珠单抗(Pidilizumab)。纳武利尤单抗(也称为MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558)是特异性抑制PD1的完全人IgG4单克隆抗体。参见例如US 8,008,449和WO2006/121168。派姆单抗(也称为帕博利珠单抗(Lambrolizumab)、MK-3475、MK03475、SCH-900475或Merck)是与PD-1结合的人源化IgG4单克隆抗体。参见，例如Hamid,O.等人(2013)New England Journal ofMedicine 369(2):134–44、US 8,354,509和WO2009/114335。匹地利珠单抗(也称为CT-011或Cure Tech)是与PD1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。参见例如WO2009/101611。在一些实施方案中，PD-1的抑制剂是具有与纳武利尤单抗、派姆单抗或匹地利珠单抗的序列基本相同或相似的序列(例如，与其至少85％、90％、95％或更加相同的序列)的抗体分子。另外的抗PD1抗体，例如AMP 514(Amplimmune)，在例如US 8,609,089、US2010028330和/或US20120114649中描述。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是免疫粘附素，例如包含与恒定区(例如，免疫球蛋白的Fc区)融合的PD-1配体(例如PD-L1或PD-L2)的细胞外/PD-1结合部分的免疫粘附素。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg，例如，在WO2011/066342和WO2010/027827中所述)，一种阻断B7-H1与PD-1之间的相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1抑制剂，例如抗体分子。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是MSB0010718C(也称为A09-246-2；Merck Serono)，其是与PD-L1结合的单克隆抗体。例如在WO2013/079174中描述了示例性的人源化抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体，例如YW243.55.S70。YW243.55.S70抗体描述于例如WO 2010/077634中。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是MDX-1105(也称为BMS-936559)，其描述于例如WO2007/005874中。在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是MDPL3280A(Genentech/Roche)，其是针对PD-L1的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。参见例如美国专利号7,943,743和美国公开号20120039906。在一些实施方案中，PD-L1的抑制剂是具有与YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105的序列基本相同或相似的序列(例如，与其至少85％、90％、95％或更加相同的序列)的抗体分子。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L2抑制剂，例如AMP-224(其是阻断PD1和B7-H1之间相互作用的PD-L2 Fc融合可溶性受体)。参见例如WO2010/027827和WO2011/066342。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是LAG-3抑制剂，例如抗LAG-3抗体分子。在一些实施方案中，抗LAG-3抗体是BMS-986016(也称为BMS986016；Bristol-Myers Squibb)。BMS-986016和其他人源化抗LAG-3抗体描述于例如US2011/0150892、WO2010/019570和WO2014/008218中。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是TIM-3抑制剂，例如抗TIM3抗体分子，例如描述于美国专利号8,552,156、WO 2011/155607、EP 2581113和美国公开号2014/044728中。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂，例如抗CTLA-4抗体分子。示例性的抗CTLA4抗体包括曲美木单抗(来自Pfizer的IgG2单克隆抗体，以前称为提昔单抗(ticilimumab)，CP-675,206)；和伊匹木单抗(也称为MDX-010，CAS号477202-00-9)。其他示例性的抗CTLA-4抗体描述于例如美国专利号5,811,097中。
扩增细胞的方法
本文所述的任何组合物和方法均可以用于扩增免疫细胞群。本文提供的免疫细胞包括衍生自造血干细胞的免疫细胞或衍生自非造血干细胞的免疫细胞，例如通过分化或去分化。
免疫细胞包括造血干细胞，其后代和/或已经从所述HSC分化的细胞，例如淋巴样细胞或髓样细胞。免疫细胞可以是适应性免疫细胞或先天免疫细胞。免疫细胞的实例包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和粒细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞包括CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、TCRα-βT细胞、TCRγ-δT细胞。在一些实施方案中，T细胞包括记忆T细胞(例如，中央记忆T细胞，或效应记忆T细胞(例如，TEMRA))或效应T细胞。在一些实施方案中，T细胞包含肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞是TIL。TIL是可以在肿瘤(例如实体瘤)中或在肿瘤周围(例如，在肿瘤的基质或肿瘤微环境中)发现的免疫细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)，例如如本文所述。TIL可以获自患有癌症的对象的样品，例如活检或手术样品。在一些实施方案中，可以使用如本文所述的方法来扩增TIL。在一些实施方案中，可以向对象施用例如使用如本文所述的方法扩增的经扩增TIL群体，以治疗疾病，例如癌症。
在一些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的许多技术(诸如FicollTM分离)，在从对象收集的血液单位中获得免疫细胞，例如T细胞(例如，TIL)。在一方面，通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产品通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一方面，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级分，并且任选地，以将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于随后的处理步骤。在一个实施方案中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在替代实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或者可能缺少许多(如果不是所有的话)二价阳离子。本文描述的方法可以包括多于一个的选择步骤，例如，多于一个的耗尽步骤。
在一个实施方案中，如本文所述的方法可以利用包含DMEM、DMEM F12、RPMI 1640和/或AIM V培养基的培养基条件。培养基可以补充有谷氨酰胺、HEPES缓冲液(例如，10mM)、血清(例如，热灭活的血清，例如10％)和/或β巯基乙醇(例如，55uM)。在一些实施方案中，如本文所述的培养条件包含一种或多种补充剂、细胞因子、生长因子或激素。在一些实施方案中，培养条件包含IL-2、IL-15或IL-7中的一种或多种，或其组合。
免疫效应细胞，诸如T细胞，通常可以使用如例如在美国专利6,352,694、6,534,055或6,905,680中描述的方法激活和扩增。通常，可以通过与刺激CD3/TCR复合物相关信号的药剂和刺激T细胞的表面上的共刺激分子的配体接触来扩增免疫细胞群；和/或通过与细胞因子例如IL-2、IL-15或IL-7接触来扩增免疫细胞群。T细胞扩增方案还可以包括刺激，诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑制素)以及钙离子载体接触。例如，可以在适于刺激T细胞的增殖的条件下使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Bcsancon，法国)，也可以使用本领域中通常已知的其他方法(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在一些实施方案中，TIL群体也可以通过本领域中已知的方法扩增。例如，可以如Hall等人,Journal for ImmunoTherapy of Cancer(2016)4:61(其全部内容据此通过引用并入)中所述扩增TIL群体。简而言之，可以通过机械和/或物理消化从样品中分离TIL。在不分裂的饲养细胞的存在下，可以用抗CD3抗体刺激所得的TIL群体。在一些实施方案中，可以在IL-2例如人IL-2的存在下培养(例如扩增)TIL群体。在一些实施方案中，可以培养TIL细胞，例如使其扩增持续至少1-21天的时间段，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天。
如本文所述，在一些实施方案中，可以通过使免疫细胞群与如本文所述的多功能多肽分子接触来扩增免疫细胞群(例如，T细胞(例如，TEMRA细胞或TIL群体))。
在一些实施方案中，扩增在体内发生，例如对象内。在一些实施方案中，向对象施用如本文所述的多功能多肽分子，从而导致体内免疫细胞的扩增。
在一些实施方案中，扩增离体，例如在体外发生。在一些实施方案中，使用如本文所述的多功能多肽分子在体外扩增来自对象的细胞，例如T细胞，例如TIL细胞。在一些实施方案中，将经扩增的TIL施用于对象以治疗疾病或疾病的症状。
在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法导致扩增至少1.1-10倍、10-20倍或20-50倍的扩增。在一些实施方案中，扩增为至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000倍的扩增。
在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法包括培养(例如扩增)细胞持续至少约4小时、6小时、10小时、12小时、15小时、18小时、20小时或22小时。在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法包括培养(例如扩增)细胞持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天。在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法包括培养(例如扩增)细胞持续至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。
在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法在获自健康对象的免疫细胞上进行。
在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法在获自患有疾病的对象的免疫细胞(例如TIL)上进行，所述疾病为例如癌症，例如如本文所述的实体瘤。
在一些实施方案中，如本文所述的扩增方法进一步包括使细胞群与促进(例如增加)免疫细胞扩增的药剂接触。在一些实施方案中，该药剂包括免疫检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂、LAG-3抑制剂、CTLA4抑制剂或TIM-3抑制剂。在一些实施方案中，该药剂包括4-1BB激动剂，例如抗4-1BB抗体。
不希望受理论的束缚，在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子可以扩增，例如选择性或优先地扩增表达包含TCRα和/或TCRβ分子的T细胞受体(TCR)的T细胞，例如TCRα-βT细胞(αβT细胞)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子不扩增表达包含TCRγ和/或TCRδ分子的TCR的T细胞，例如TCRγ-δT细胞(γδT细胞)，或不诱导其增殖。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子相对于γδT细胞选择性或优先扩增αβT细胞。
不希望受理论的束缚，在一些实施方案中，γδT细胞与细胞因子释放综合征(CRS)和/或神经毒性(NT)有关。在一些实施方案中，如本文所述的多特异性或多功能分子导致非γδT细胞的选择性扩增，例如，αβT细胞的扩增，因此降低了CRS和/或NT。
在一些实施方案中，如本文所述的任何组合物或方法导致免疫细胞群中的γδT细胞减少，例如耗尽。在一些实施方案中，使免疫细胞群与减少例如抑制或耗尽γδT细胞的药剂例如抗IL-17抗体或结合至TCRγ和/或TCRδ分子的药剂接触。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子导致免疫细胞的扩增，该免疫细胞为例如，T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、NK细胞或其他免疫细胞(例如，如本文所述)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子与TCRβV区的结合导致以下中的一项、两项、三项或全部：(i)降低的T细胞增殖动力学；(ii)细胞杀伤，例如靶细胞杀伤，例如癌细胞杀伤，例如如通过实施例4的测定测量的；(iii)增加的自然杀伤(NK)细胞增殖，例如扩增；或(iv)扩增，例如，具有记忆样表型的T细胞群的至少约1.1-10倍扩增(例如，至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍扩增)，例如，如本文所述，例如其中(i)-(iv)是相对于非TCRβV结合T细胞衔接物。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使细胞群与促进(例如，增加)免疫细胞扩增的药剂接触。在一些实施方案中，药剂包括免疫检查点抑制剂，例如，如本文所述。在一些实施方案中，药剂包括4-1BB(CD127)激动剂，例如抗4-1BB抗体。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使细胞群与非分裂细胞群，例如饲养细胞，例如经辐射的同种异体人PBMC接触。
在一些实施方案中，将免疫细胞群的扩增与具有抗体的相似细胞群的扩增进行比较，所述抗体结合至：CD3分子，例如CD3ε(CD3e)分子；或TCRα(TCRα)分子。
在一些实施方案中，将免疫细胞群的扩增与未接触抗TCRβV抗体分子或如本文所述的多特异性或多功能分子的相似细胞群的扩增进行比较。
在一些实施方案中，将记忆效应T细胞群(例如TEM细胞，例如TEMRA细胞)的扩增与具有与以下结合的抗体的相似细胞群的扩增进行比较：CD3分子，例如CD3ε(CD3e)分子；或TCRα(TCRα)分子。
在一些实施方案中，该方法导致表达包含TCRα和/或TCRβ分子的T细胞受体(TCR)的T细胞(例如，TCRα-βT细胞(αβT细胞))的扩增，例如，选择性扩增或优先扩增。
在一些实施方案中，该方法导致αβT细胞的扩增超过表达包含TCRγ和/或TCRδ分子的TCR的T细胞(例如，TCRγ-δT细胞(γδT细胞))的扩增。在一些实施方案中，αβT细胞超过γδT细胞的扩增导致与CRS相关的细胞因子的产生减少。在一些实施方案中，当施用到对象体内时αβT细胞超过γδT细胞的扩增导致免疫细胞具有降低的诱导CRS的能力，例如，较不易诱导CRS。
在一些实施方案中，在存在如本文所述的多功能多肽分子的情况下培养(例如，用其扩增)的免疫细胞群(例如，T细胞(例如，TEMRA细胞或TIL)或NK细胞)当施用于对象例如患有如本文所述的疾病或病况的对象时，不诱导CRS和/或NT。
在一些实施方案中，本文提供了如本文所述的多功能多肽分子，其包含非鼠的，例如人样抗体分子(例如，人或人源化抗体分子)，其结合，例如，特异性地结合至T细胞受体β可变(TCRβV)区。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的结合导致T细胞群(例如具有记忆样表型的T细胞群，例如CD45RA+CCR7-T细胞)扩增，例如至少约1.1-50倍扩增(例如，至少约1.5-40倍、2-35倍、3-30倍、5-25倍、8-20倍或10-15倍扩增)。在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群包含CD4+和/或CD8+ T细胞。在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群包括记忆T细胞群，例如T效应记忆(TEM)细胞，例如表达CD45RA的TEM细胞(TEMRA)细胞，例如CD4+或CD8+ TEMRA细胞。在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群不表达衰老标志物，例如CD57。在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群不表达抑制性受体，例如OX40、4-1BB和/或ICOS。
在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群是具有CD45RA+CCR7-CD57-的T细胞群。在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群不表达抑制性受体，例如OX40、4-1BB和/或ICOS。
在一些实施方案中，例如，与参考细胞群(例如，未与抗TCRβV抗体或如本文所述的多特异性或多功能分子接触的其他方面相似的细胞群)相比，具有记忆样表型的T细胞群(例如，如本文所述)具有增加的增殖能力。
在一些实施方案中，扩增为至少约1.1-10倍扩增(例如，至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍扩增)。
在一些实施方案中，将具有记忆样表型的T细胞群(例如记忆效应T细胞，例如TEM细胞，例如TEMRA细胞，例如CD4+或CD8+TEMRA细胞)的扩增与具有与以下结合的抗体的相似细胞群的扩增进行比较：CD3分子，例如CD3ε(CD3e)分子；或TCRα(TCRα)分子。
在一些实施方案中，具有记忆样表型的经扩增的T细胞群，例如，T效应记忆细胞，包含细胞T细胞，例如，CD3+、CD8+或CD4+T细胞。在一些实施方案中，具有记忆样表型的经扩增的T细胞群，T效应记忆细胞，包含CD3+和CD8+ T细胞。在一些实施方案中，具有记忆样表型的经扩增的T细胞群，例如T效应记忆细胞，包含CD3+和CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，具有记忆样表型的经扩增的T细胞群，T效应记忆(TEM)细胞，包含细胞T细胞，例如CD3+、CD8+或CD4+T细胞，其表达或再表达CD45RA，例如CD45RA+。在一些实施方案中，该群体包含表达CD45RA的TEM细胞，例如TEMRA细胞。在一些实施方案中，可以通过如本文所述的方法(例如，流式细胞术)来检测CD45RA在TEMRA细胞(例如，CD4+或CD8+ TEMRA细胞)上的表达。
在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群，例如TEMRA细胞具有低的CCR7表达或不表达CCR7，例如CCR7-或CCR7低。在一些实施方案中，CCR7在TEMRA细胞上的表达不能通过如本文所述的方法(例如，流式细胞术)来检测。
在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群，例如TEMRA细胞，表达CD95，例如CD95+。在一些实施方案中，CD95在TEMRA细胞上的表达可以通过如本文所述的方法(例如，流式细胞术)来检测。
在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群，例如TEMRA细胞表达CD45RA，例如CD45RA+，具有低的CCR7表达或没有CCR7的表达，例如CCR7-或CCR7低，并且表达CD95，例如CD95+。在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群，例如TEMRA细胞，可以被鉴定为CD45RA+、CCR7-和CD95+细胞。在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群，例如TEMRA细胞，包含CD3+、CD4+或CD8+ T细胞(例如，CD3+ T细胞、CD3+CD8+ T细胞或CD3+CD4+ T细胞)。
在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群不表达衰老标志物，例如CD57。
在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群不表达抑制性受体，例如OX40、4-1BB和/或ICOS。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的结合导致T细胞亚群的扩增，例如，至少约1.1-50倍扩增(例如，至少约1.5-40倍、2-35倍、3-30倍、5-25倍、8-20倍或10-15倍扩增)。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子-活化的(例如，扩增的)T细胞亚群在CD45RA的高表达和/或CCR7的低表达方面类似于TEMRA细胞。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子-活化的(例如，扩增的)T细胞亚群不显示衰老标志物CD57和/或KLRG1的上调。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子-活化的(例如，扩增的)T细胞亚群不显示共刺激分子CD27和/或CD28的上调。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子-活化的(例如，扩增的)T细胞亚群是高度增殖的。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子-活化的(例如，扩增的)T细胞亚群分泌IL-2。在一些实施方案中，T细胞上表面标志物的表达可以通过如本文所述的方法(例如，流式细胞术)检测。在一些实施方案中，T细胞的增殖能力可以通过如本文所述的方法，例如实施例4中所述的方法检测。在一些实施方案中，T细胞的细胞因子表达可以通过如本文所述的方法，例如实施例10和35中所述的方法检测。在一些实施方案中，扩增是至少约1.1-10倍扩增(例如，至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍扩增)。在一些实施方案中，将扩增与具有与以下结合的抗体的相似细胞群的扩增进行比较：CD3分子，例如CD3ε(CD3e)分子；或TCRα(TCRα)分子。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的结合导致自然杀伤(NK)细胞群的增殖，例如扩增，例如至少约1.1-50倍扩增(例如，至少约1.5-40倍、2-35倍、3-30倍、5-25倍、8-20倍或10-15倍扩增)。在一些实施方案中，NK细胞的扩增为至少约1.1-30倍扩增(例如，至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或至少约1.1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30倍扩增)。在一些实施方案中，NK细胞的扩增通过实施例4的测定来测量。在一些实施方案中，将NK细胞通过例如结合如本文所述的多功能多肽分子的扩增与未接触如本文所述的多功能多肽分子的其他方面相似的群体的扩增进行比较。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的结合导致细胞杀伤，例如靶细胞杀伤，例如癌细胞杀伤。在一些实施方案中，癌细胞是血液癌细胞或实体瘤细胞。在一些实施方案中，癌细胞是多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子的结合导致体外或体内细胞杀伤。在一些实施方案中，通过实施例4的测定来测量细胞杀伤。
在一些实施方案中，与如美国专利5,861,155中所述的16G8或TM23鼠抗体或其人源化版本的活性相比，如本文所述的多功能多肽分子与TCRβV区的结合导致本文所述的任何活性的至少2、5、10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或2000倍，或至少2-2000倍(例如，5-1000、10-900、20-800、50-700、100-600、200-500或300-400倍)的增加或减少。
在一些实施方案中，该方法包括扩增对象中的免疫细胞群，例如增加其数量。在一些实施方案中，本文提供了一种扩增免疫细胞群(例如增加其数量)的方法，其包括使免疫细胞群与有效量的如本文所述的多功能多肽分子接触。在一些实施方案中，扩增在体内或离体(例如，体外)发生。
在一些实施方案中，本文提供了一种扩增免疫细胞群(例如，增加其数量)的方法，其包括使免疫细胞群与如本文所述的多功能多肽分子接触，所述多功能多肽分子包含抗体分子，例如，人源化抗体分子，所述抗体分子结合(例如，特异性地结合)至T细胞受体β可变链(TCRβV)区(例如，抗TCRβV抗体分子)，从而扩增所述免疫细胞群。在一些实施方案中，扩增在体内或离体(例如，体外)发生。
在一些实施方案中，本文提供了一种扩增来自患有癌症的对象的免疫效应细胞群的方法，该方法包括：(i)从对象中分离包含免疫效应细胞群的生物样品；例如外周血液样品、活检样品或骨髓样品；(ii)获得对象的一种或多种TCRβV分子的状态值，例如，在来自对象的生物样品中，其中所述值包括与参考值(例如，来自健康对象的样品)相比，来自对象的样品中TCRβV分子的存在(例如，水平或活性)的量度，其中对象中相对于参考值(例如，健康对象)更高(例如升高)的值表明在对象中存在癌症，和(iii)使包含免疫效应细胞群的生物样品与如本文所述的多功能多肽分子接触。
在一些实施方案中，该方法进一步包括向对象施用与如本文所述的多功能多肽分子接触的免疫效应细胞群。
在一些实施方案中，对象中(例如，来自对象的样本中)一种或多种TCRβV分子的较高(例如升高)水平或活性指示对象中表达所述一种或多种TCRβV分子的T细胞的偏好(例如优先扩增，例如克隆扩增)。
因此，本文尤其提供了包含如本文所述的TCRβV结合部分的多特异性或多功能分子(例如，多特异性或多功能抗体分子)，其包含抗TCRβV抗体分子，编码其的核酸，生产上述分子的方法，包含上述分子的药物组合物，以及使用上述分子治疗疾病或病症例如癌症的方法。如本文所述的抗体分子和药物组合物可以用于(单独或与其他药剂或治疗方式组合)治疗、预防和/或诊断病症和病况，例如癌症，例如如本文所述。
示例性多功能多肽分子
本文所述的任何组合物和方法可以用于扩增免疫细胞群。本文提供的免疫细胞包括来源于造血干细胞的免疫细胞或来源于非造血干细胞的免疫细胞，例如通过分化或去分化。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3523的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，与SEQ ID NO:2170的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ IDNO:3523的序列、SEQ ID NO:2170的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:3523的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ IDNO:2170的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3523的序列、可操作地连接的SEQ IDNO:2170的序列、和可操作地连接的SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:3523的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列经由与SEQ ID NO:3524的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:2170的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，与SEQ ID NO:2170的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列经由与SEQ ID NO:3308的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，或其组合。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:3523的序列经由SEQ ID NO:3524的序列可操作地连接至SEQ ID NO:2170的序列，SEQ ID NO:2170的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:3517的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3519的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3519的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:2170的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ IDNO:2170的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ IDNO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:2170的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ IDNO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:2170的序列和可操作地连接的SEQ IDNO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2170的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列经由与SEQ ID NO:3308的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，或其组合。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:2170的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:3517的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3520的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3520的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，IL-2分子或其功能片段或功能变体或IL-2C125A突变分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:2270的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，IL-2分子或其功能片段或功能变体或IL-2C125A突变分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至免疫球蛋白重链恒定区。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ IDNO:2270的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ IDNO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:2270的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ IDNO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:2270的序列和可操作地连接的SEQ IDNO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2270的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列经由与SEQ ID NO:3308的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，或其组合。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:2270的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:3517的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3521的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3521的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:3530的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQID NO:3531的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:2191的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3533的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3527的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3528的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:3530的序列和SEQ ID NO:3531的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ IDNO:2191的序列和SEQ ID NO:3533的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ IDNO:3527的序列和SEQ ID NO:3528的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:3530的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3531的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:2191的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ IDNO:3533的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:3527的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3528的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3530的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3531的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:2191的序列和可操作地连接的SEQ IDNO:3533的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3527的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3528的序列。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2191的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列经由与SEQ ID NO:3308的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:3533的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，或其组合。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:2191的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至SEQ ID NO:3533的序列，或其组合。
在一些实施方案中，第一多肽进一步包含与SEQ ID NO:3547的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，所述SEQ ID NO:3547的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:3531的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，第二多肽进一步包含与SEQ ID NO:3534的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，所述SEQ ID NO:3534的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:3533的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，或其组合。
在一些实施方案中，第一多肽进一步包含可操作地连接至SEQ ID NO:3531的序列的SEQ ID NO:3547的序列，第二多肽进一步包含可操作地连接至SEQ ID NO:3533的序列的SEQ ID NO:3534的序列，或其组合。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:3529的序列或SEQ ID NO:3548的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3532的序列或SEQ ID NO:3549的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3526的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:3529的序列或SEQ ID NO:3548的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ IDNO:3532的序列或SEQ ID NO:3549的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ IDNO:3526的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3540的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ IDNO:3540的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ IDNO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:3540的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ IDNO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3540的序列和可操作地连接的SEQ IDNO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:3540的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列经由与SEQ ID NO:3308的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，或其组合。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:3540的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:3517的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3539的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3539的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3542的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ IDNO:3542的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ IDNO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:3542的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ IDNO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3542的序列和可操作地连接的SEQ IDNO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，IL-12分子或其功能片段或功能变体包含与SEQ ID NO:3543的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3545的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，IL-12分子或其功能片段或功能变体包含SEQ ID NO:3543的序列和SEQ ID NO:3545的序列。
在一些实施方案中，IL-12分子或其功能片段或功能变体从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:3543的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3545的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，IL-12分子或其功能片段或功能变体从N末端到C末端包含SEQID NO:3543的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3545的序列。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:3543的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列经由与SEQ ID NO:3544的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:3545的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，与SEQ ID NO:3545的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列经由与SEQ ID NO:3308的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，或其组合。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:3543的序列经由SEQ ID NO:3544的序列可操作地连接至SEQ ID NO:3545的序列，SEQ ID NO:3545的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:3517的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3541的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3541的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3540的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ IDNO:3540的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ IDNO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1346的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3649的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:3540的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ IDNO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:1349的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3644的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3540的序列和可操作地连接的SEQ IDNO:3648的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:3540的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列经由与SEQ ID NO:3308的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:3648的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:3540的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至SEQ ID NO:3648的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:3517的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3546的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:3517的序列；(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3546的序列的；以及(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:3530的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，以及与SEQID NO:3537的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3527的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列、与SEQ ID NO:3528的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列以及与SEQ ID NO:2191的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQID NO:3530的序列和SEQ ID NO:3537的序列；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQID NO:3527的序列、SEQ ID NO:3528的序列和SEQ ID NO:2191的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:3530的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3537的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含与SEQ ID NO:3527的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:3528的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列，和可操作地连接的与SEQ ID NO:2191的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3530的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3537的序列；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3527的序列、可操作地连接的SEQID NO:3528的序列、和可操作地连接的SEQ ID NO:2191的序列。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:3528的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列经由与SEQ ID NO:3309的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列可操作地连接至与SEQ ID NO:2191的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:3528的序列经由SEQ ID NO:3309的序列可操作地连接至SEQ ID NO:2191的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含两个第一多肽和两个第二多肽。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQID NO:3536的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3535的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)包含SEQ ID NO:3536的序列的第一多肽；和(ii)包含SEQ ID NO:3535的序列的第二多肽。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)包含如表21中所列的一种或多种组分的第一多肽；以及(ii)包含如表21中所列的一种或多种组分的第二多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子进一步包含：(i)包含如表21中所列的一种或多种组分的第三多肽；以及(ii)包含如表21中所列的一种或多种组分的第四多肽。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)包含一种或多种组分的第一多肽，所述一种或多种组分包含与如表21中所列的组分序列中的任一者具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(ii)包含一种或多种组分的第二多肽，所述一种或多种组分包含与如表21中所列的组分序列中的任一者具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。在一些实施方案中，多功能多肽分子进一步包含：(i)包含一种或多种组分的第三多肽，所述一种或多种组分包含与如表21中所列的组分序列中的任一者具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列；以及(ii)包含一种或多种组分的第四多肽，所述一种或多种组分包含与如表21中所列的组分序列中的任一者具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)包含如表21中所列的一种或多种组分序列的第一多肽；以及(ii)包含如表21中所列的一种或多种组分序列的第二多肽。在一些实施方案中，多功能多肽分子进一步包含：(i)包含如表21中所列的一种或多种组分序列的第三多肽；以及(ii)包含如表21中所列的一种或多种组分的第四多肽。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含与如表21中所列的多肽序列中的任一者具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与如表21中所列的多肽序列中的任一者具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多功能多肽分子进一步包含：(i)第三多肽，所述第三多肽包含与如表21中所列的多肽序列中的任一者具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列；以及(ii)第四多肽，所述第四多肽包含与如表21中所列的多肽序列中的任一者具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多功能多肽分子包含：(i)第一多肽，所述第一多肽包含如表21中所列的多肽序列中的任一者；以及(ii)第二多肽，所述第二多肽包含如表21中所列的多肽序列中的任一者。在一些实施方案中，多功能多肽分子进一步包含：(i)第三多肽，所述第三多肽包含如表21中所列的多肽序列中的任一者；以及(ii)第四多肽，所述第四多肽包含如表21中所列的多肽序列中的任一者。
在另一方面，本文描述了一种包含抗T细胞受体β可变链(TCRβV)结合结构域的抗体，所述TCRβV结合结构域包含：(i)重链可变区(VH)，其包含重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，其分别包含与SEQ ID NO:3650、SEQ ID NO:3651和SEQ ID NO:5具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列；(ii)轻链可变区(VL)，其包含轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，其分别包含与SEQ ID NO:3655、SEQ ID NO:3653和SEQ ID NO:8具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，TCRβV结合结构域包含：(i)包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3的VH，所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:3650、SEQ ID NO:3651和SEQID NO:5的氨基酸序列；(ii)包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3的VL，所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:3655、SEQ ID NO:3653和SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，TCRβV结合结构域包含：(i)VH，其包含与SEQ ID NO:1346具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列；(ii)VL，其包含与SEQ ID NO:1349具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，TCRβV结合结构域包含：(i)包含SEQ ID NO:1346的氨基酸序列的VH；(ii)包含SEQ ID NO:1349的氨基酸序列的VL；或(iii)其组合。
在一些实施方案中，包含抗T细胞受体β可变链(TCRβV)结合结构域的抗体进一步包含细胞因子多肽或其功能片段或功能变体。在一些实施方案中，细胞因子多肽可以是IL-2、IL2-C125A、IL-15、IL-7、IL-12或IL-21。在实施方案中，细胞因子多肽可以进一步包含细胞因子受体。在一些实施方案中，细胞因子多肽可以包含与IL-15Ra连接的IL-15。在一些实施方案中，细胞因子多肽可以包含与IL-15Ra sushi结构域连接的IL-15。在一些实施方案中，细胞因子多肽可以包含细胞因子二聚体。在一些实施方案中，细胞因子多肽可以包含与IL-12α亚基连接的IL-12β亚基。
表1.与TCRVB 6(例如，TCRVB 6-5)结合的鼠抗体分子、嵌合抗体分子和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。抗体分子包括鼠mAb抗体A和人源化mAb抗体A-H克隆A-H.1至A-H.85。显示了重链和轻链CDR的氨基酸，以及重链和轻链可变区、重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。
表2.与TCRVB 12(例如，TCRVB 12-3或TCRVB 12-4)结合的鼠抗体分子和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。抗体分子包括鼠mAb抗体B和人源化mAb抗体B-H.1至B-H.6。显示了重链和轻链CDR的氨基酸，以及重链和轻链可变区、重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。
表3.人IgG重链和人κ轻链的恒定区氨基酸序列
表4.示例性的Fc KiH突变和任选的半胱氨酸突变
表5.CRS分级
表6.CTCAE v 4.0CRS分级量表
表7.NCI CRS分级量表
表8A.TCRβV亚家族和亚家族成员的列表
表8B.另外的TCRβV亚家族
表10A.示例性的抗TCRβV抗体分子
表10B.抗TCRβV5抗体的氨基酸序列。与TCRVB 5(例如，TCRVB 5-5或TCRVB 5-6)结合的鼠抗体分子和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。显示了重链和轻链CDR的氨基酸，以及重链和轻链可变区、重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。
表11.抗TCRβV5抗体的氨基酸序列。与TCRVB 5(例如，TCRVB 5-5或TCRVB 5-6)结合的鼠抗体分子和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。显示了重链和轻链CDR的氨基酸，以及重链和轻链可变区、重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。
表12.抗TCRβV10抗体的氨基酸序列。与TCRBV 10(例如，TCRBV 10-1、TCRBV 10-2或TCRBV 10-3)结合的鼠抗体分子和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。显示了重链和轻链CDR的氨基酸，以及重链和轻链可变区、重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。
表13.另外的抗TCRβV抗体的氨基酸序列。公开了与各种TCRVB家族结合的鼠抗体分子和人源化抗体分子的氨基酸和核苷酸序列。显示了重链和轻链CDR的氨基酸，以及重链和轻链可变区、重链和轻链的氨基酸和核苷酸序列。表中公开的抗体包括MPB2D5、CAS1.1.3、IMMU222、REA1062和JOVI-3。MPB2D5结合人TCRβV 20-1(按照旧命名法为TCRβV2)。CAS1.1.3结合人TCRβV 27(按照旧命名法为TCRβV14)。IMMU 222结合人TCRβV6-5、TCRβV6-6或TCRβV6-9(按照旧命名法为TCRβV13.1)。REA1062结合人TCRβV 5-1)。JOVI-3结合人TCRβV 28(按照旧命名法为TCRβV3.1)。IMMU546结合人TCRβV 2。
表14.示例性的Fc修饰
表15.抗BCMA抗体的示例性可变区的氨基酸序列。
实施例
本公开将通过以下实施例进行更具体地说明。然而，应当理解，本公开不以任何方式受到这些实施例的限制。
实施例1：α-TRBV6-5抗体克隆抗体A的人源化
使用IMGT命名法分配小鼠α-TCRβ抗体克隆抗体A VH和VL的种系，其中通过Kabat和Chothia分类的组合来定义CDR区。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别是抗体A VH和VL序列，其中VH种系是小鼠IGHV1S12*01，而VL种系是小鼠IGKV6-15*01。SEQ ID NO:3-5分别是抗体A VH CDR区1-3，而SEQ ID NO:6-8对应于VL CDR区1-3(如表1中所述)。
使用相似的方法分别完成了抗体A VH和VL序列的人源化。在框架区中鉴定出对于CDR接枝的成功重要的氨基酸位置。鉴定了人种系序列，其保留了必要的残基并包含大量的整体同一性。当人种系框架序列不包含匹配的重要氨基酸时，将其回复突变以匹配小鼠序列。将CDR区原样接枝到人种系上。将抗体A VH人源化为人IGHV1-69*01，并且将抗体A VL人源化为IGKV1-17*01和IGKV1-27*01。证实所有3种人源化序列均不包含由于人源化过程而引入的潜在负面的翻译后修饰位点，诸如NG、DG、NS、NN、DS、NT、NXS或NXT。SEQ ID NO:9是人源化抗体A-H.1VH，并且SEQ ID NO:10和11分别是人源化VL IGKV1-17*01和IGKV1-27*01种系(如表1中所述)。图2A和2B显示了具有注释的鼠和人源化序列，描绘了CDR和框架区(FR)。
实施例2：α-TRBV12-3和TRBV12-4抗体克隆抗体B的人源化
使用IMGT命名法分配小鼠α-TCRβ抗体克隆抗体B VH和VL的种系，其中通过Kabat和Chothia分类的组合来定义CDR区。SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16分别是抗体B VH和VL序列，其中VH种系是小鼠IGHV5-17*02，而VL种系是小鼠IGKV4-50*01。SEQ ID NO:17-19分别是B-H VH CDR区1-3，而SEQ ID NO:20-22是B-HVL CDR区1-3(如表2中所述)。
使用实施例1中所述的用于人源化抗体A的方法来人源化抗体B。将抗体B VH人源化为人IGHV3-30*01、IGHV3-48*01和IGHV3-66*01，并且将抗体B VL人源化为人IGKV1-9*01、IGKV1-39*01、IGKV3-15*01、IGLV1-47*01和IGLV3-10*01。SEQ ID NO:23-25是BH.1A、BH.1B和BH.1C人源化重链，并且SEQ ID NO:26-30是B-H.1D、BH.1E、BH.1F、BH.1G和BH.1H人源化轻链(如表2中所述)。图3A和3B显示了带有注释的鼠和人源化序列，描绘了CDR和框架区(FR)。
实施例3：抗TCRβV抗体的特征
介绍
设计用于重定向T细胞以促进肿瘤细胞裂解以用于癌症免疫治疗的当前双特异性构建体通常利用源自针对T细胞受体(TCR)的CD3e亚基的单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFV)。但是，这种方法存在的局限性可能会阻止这种双特异性构建体的治疗性潜力的完全实现。先前的研究已表明，例如，低“激活”剂量的抗CD3e mAb可以引起长期的T细胞功能障碍并发挥免疫抑制效果。此外，抗CD3emAb与所有T细胞结合，从而均等地激活所有T细胞，这与大规模T细胞激活导致的抗CD3e mAb的第一剂量副作用有关。这些大量的激活T细胞分泌大量的细胞因子，其中最重要的是干扰素γ(IFNg或IFNγ)。该过量的IFNγ进而例如激活巨噬细胞，然后巨噬细胞可以过量产生促炎性细胞因子，诸如IL-1、IL-6和TNF-α，引起称为细胞因子释放综合征(CRS)的“细胞因子风暴”。因此，开发能够仅结合和激活必需的效应T细胞亚群以减少CRS的抗体可能是有利的。
结果
为此，鉴定了针对TCR的β亚基的可变链(TCR Vb)的抗体。这些抗TCR Vb抗体结合并激活T细胞的亚群，但是例如没有CRS或具有显著降低的CRS。使用板结合的抗TCR Vb13.1mAb(A-H.1和A-H.2)，显示可以扩增T细胞群，如A-H.1阳性染色定义(从细胞培养的第0天的约5％的T细胞到第6天的几乎60％总T细胞)(图5A-5C)。对于该实验，将人CD3+ T细胞使用磁珠分离(阴性选择)进行分离，并用固定化的(板包被的)A-H.1或OKT3(抗CD3e)抗体以100nM激活6天。当与纯化的CD3+ T细胞共培养时，经扩增的Vb13.1+T细胞显示出对转化的细胞系RPMI-8226的细胞溶解活性(图6A-6B)。
接下来，评估了被抗TCR VB抗体激活的PBMC产生细胞因子的能力。将用抗TCR VB抗体激活的PBMC的细胞因子产生与用以下抗体激活的PBMC的细胞因子产生进行比较：(i)抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)；(ii)抗TCR Vα(TCR VA)抗体，包括抗TCR VA12.1抗体6D6.6、抗TCR VA24JA18抗体6B11；(iii)抗TCRαβ抗体T10B9；和/或(iv)同种型对照(BGM0109)。测试的抗TCR VB抗体包括：人源化抗TCRVB 13.1抗体(A-H.1或A-H.2)、鼠抗TCR VB5抗体E、鼠抗TCR VB8.1抗体B和鼠抗TCR VB 12抗体D。BGM0109包含以下氨基酸序列METDTLLLWVLLLWVPGSTGGLNDIFEAQKIEWHEGGGGSEPRTDTDTCPNPPDPCPTCPTPDLLGGPSVFIFPPKPKDVLMISLTPKITCVVVDVSEEEPDVQFNWYVNNVEDKTAQTETRQRQYNSTYRVVSVLPIKHQDWMSGKVFKCKVNNNALPSPIEKTISKPRGQVRVPQIYTFPPPIEQTVKKDVSVTCLVTGFLPQDIHVEWESNGQPQPEQNYKNTQPVLDSDGSYFLYSKLNVPKSRWDQGDSFTCSVIHEALHNHHMTKTISRSLGNGGGGS(SEQ ID NO:3282)。
如图7A所示，当使用板结合的A-H.1或A-H.2或抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)来激活人PBMC时，诱导了T细胞细胞因子IFNg(图7A)。测试的所有抗TCR VB抗体对IFNg的产生具有相似的效果(图7B)。抗TCR VA抗体没有诱导类似的IFNg产生。
关于IL-2产生，与用抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)激活的PBMC相比，用A-H.1和A-H.2激活的PBMC导致IL-2的产生增加(图8A)，且具有延迟的动力学(图8B)。图8B显示，抗TCRVB抗体激活的PBMC在激活(与板包被的抗体一起温育)后第5天或第6天显示IL-2的产生达到峰值。相比之下，用OKT3激活的PBMC中IL-2的产生在激活后第2天达到峰值。与IFNG一样，在测试的所有抗TCR VB抗体中，IL-2效果(例如，IL-2的产生增加和动力学延迟)都相似(图8B)。
在相似的条件下还评估了与“细胞因子风暴”(以及相应的CRS)相关的细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的产生。图9A、10A和11A显示，虽然用抗CD3e抗体激活的PBMC显示出IL-6(图9A)、TNF-α(图10A)和IL-1β(图11A)的产生，但是没有或几乎没有观察到用A-H.1或A-H.2激活的PBMC诱导这些细胞因子。如图10B和11B所示，TNF-α和IL-1β的产生未被用任何抗TCR VB抗体激活PBMC诱导。
进一步注意到，相对于由抗CD3e mAb(OKT3和SP34-2)激活的CD3+ T细胞产生的动力学，由A-H.1-1激活的CD3+ T细胞产生IFNg的动力学延迟(图12A和12B)。
最后，观察到被称为TEMRA的记忆效应T细胞亚群优先在被A-H.1或A-H.2激活的CD8+ T细胞中扩增(图13)。将分离的人PBMC用固定化的(板包被的)抗CD3e或抗TCRVβ13.1以100nM激活6天。温育6天后，通过FACS染色以下细胞的表面标志物来鉴定T细胞亚群：初始T细胞(CD8+、CD95-、CD45RA+、CCR7+)、干细胞记忆T细胞(TSCM；CD8+、CD95+、CD45RA+、CCR7+)、中央记忆T细胞(Tcm；CD8+、CD95+、CD45RA-、CCR7+)、效应记忆T细胞(Tem；CD8+、CD95+、CD45RA-、CCR7-)和再表达CD45RA的效应记忆T细胞(Temra；CD8+、CD95+、CD45RA+、CCR7-)。与被抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)激活的PBMC相比，被抗TCRVβ13.1抗体(A-H.1或A-H.2)激活的人PBMC增加了CD8+ TSCM和Temra T细胞亚群。用CD4+ T细胞观察到类似的扩增。
结论
本实施例中提供的数据表明，针对TCR Vb的抗体可以例如优先激活T细胞的亚群，从而导致TEMRA扩增，这可以例如促进肿瘤细胞裂解而非CRS。因此，利用针对TCR Vb的Fab或scFV或肽的双特异性构建体可以例如用于激活和重定向T细胞以促进肿瘤细胞裂解以用于癌症免疫疗法，而没有例如与抗CD3e靶向相关的CRS的有害副作用。
实施例4：采用针对BCMA和T细胞衔接物的双重靶向抗体分子对多发性骨髓瘤(MM)细胞的中靶T细胞介导的细胞毒性
本实施例显示了采用双重靶向抗体分子对多发性骨髓瘤(MM)细胞的中靶T细胞介导的细胞毒性，该双重靶向抗体分子识别T细胞上的T细胞衔接物，例如TCRVb，和MM细胞上的BCMA。
如图14A所示，被板结合的抗TCRVb抗体激活5天的经纯化人T细胞以高于被板结合的抗CD3(OKT3)抗体激活的经纯化人T细胞的速率增殖。对T细胞的抗TCRVb抗体刺激导致CD45RA+效应记忆CD8+和CD4+ T细胞(TEMRA)细胞的选择性扩增(图14B)。与未经刺激的细胞或由抗CD3(SP34)抗体刺激的细胞相比，当用抗TCRVb抗体刺激时，CD8+和CD4+ Temra细胞群都扩增更多。与用抗CD3抗体刺激的PBMC相比，抗TCRVb抗体导致用抗TCRVb抗体刺激的PBMC延迟分泌IFN-g(图14C)。另外，如图14D所示，用抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激的T细胞导致多发性骨髓瘤靶细胞的裂解相当。如图14E-14F所示，用100ng/ml板结合的抗TCRVb抗体或抗CD3抗体刺激5天的T细胞分泌穿孔素和颗粒酶B。
与用抗OKT3抗体激活的PBMC相比，用抗TCRVb抗体激活PBMC导致更高的IL-2和/或IL-15的产量和/或分泌(图15A)。抗TCRVb抗体激活的PBMC还导致自然杀伤(NK)细胞的扩增和/或存活，例如增殖(图15B)。相比之下，用抗OKT3抗体激活的PBMCS不会导致NK细胞扩增。此外，如实施例3中所述，用抗TCRVb抗体激活的PBMC不导致产生与CRS相关的细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α(图16)。这些体外表征研究表明，在一些实施方案中，抗TCRVb抗体例如激活和/或刺激T细胞以促进T细胞的杀伤，如由靶细胞裂解、穿孔素分泌和颗粒酶B分泌证明的，以及IFN-g的分泌例如具有延迟的动力学。
接下来，测试了在一个臂上靶向BCMA并且在另一臂上靶向TCRVb的双重靶向抗体分子(分子I)靶向并杀死多发性骨髓瘤(MM)细胞的能力。将健康的供体PBMC与RMPI8226 MM细胞系和以下双重靶向抗体分子之一共同温育：BCMA-TCRVb(分子I)、BCMA-CD3或对照-TCRVb；或者同种型对照。然后使用流式细胞术评估靶细胞裂解。如图17A所示，双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子(分子I)导致在体外杀死MM细胞。
在MM小鼠模型中进一步测试了双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子(分子I)体内抑制MM肿瘤生长的能力。在第0天将NCI-H929细胞系注射到NOD-scid IL2rγnull(NSG)受体小鼠中，然后在第9天递送PBMC。在第12、15、18和21天，通过腹膜内注射施用0.5mg/kg剂量的双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子(分子I)。图17B显示了使用双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子(分子I)阻止(例如抑制)体内MM肿瘤的生长。这些结果证明，在一些实施方案中，双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子例如可以在体外和体内杀死肿瘤细胞，例如MM肿瘤细胞。因此，在一些实施方案中，可以将双重靶向BCMA-TCRVb抗体分子用作癌症(例如，血液学癌症，例如MM)的疗法。
实施例5：针对FcRH5和T细胞衔接物的双重靶向抗体分子的体外细胞毒性
本实施例显示了双重靶向抗体分子对多发性骨髓瘤(MM)细胞的体外细胞毒性，该双重靶向抗体分子识别T细胞上的T细胞衔接物(例如TCRVb)和MM细胞上的FcRH5。将健康的供体PBMC或纯化的T细胞与MOL8M MM细胞系和在一个臂上靶向FcRH5并且在另一臂上靶向TCRVb的双重靶向抗体分子(分子E)或同种型对照抗体共同温育。然后使用流式细胞术评估靶细胞裂解。如图18所示，双重靶向FcRH5-TCRVb分子(分子E)导致由纯化的T细胞或PBMC杀死MM细胞。这表明双重靶向FcRH5-TCRVb分子可以靶向MM细胞并促进免疫细胞(例如在包含T细胞的PBMC中的免疫细胞)杀死MM细胞。
实施例6：抗TCRVβ8a抗体的特征
本实施例显示了抗TCRVβ8a抗体(B-H.1)的体外表征。TCRVβ8也称为TCRVβ12(如表8中所述)。用固定化的(板包被的)抗CD3∈或抗TCRVβ8a以100nM激活分离的人PBMC，并在刺激后第1、2、3、5、6和8天收集细胞培养上清液。如制造商的方案所述，使用MSD技术平台(MesoScale Discovery)测量细胞因子(IFNγ、IL-2、TNFα、IL-1β或IL-6)。
如图19A-19B所示，与被抗CD3∈抗体(OKT3或SP34-2)激活的人PBMC相比，被抗TCRVβ8a抗体(B-H.1)激活的人PBMC产生相似或降低水平的IFNγ(图19A)和更高水平的IL-2(图19B)。
图20A-20B显示被抗TCRVβ8a抗体(B-H.1)激活的人PBMC不产生显著水平的IL-6或IL1b。与被抗CD3∈抗体(OKT3或SP34-2)激活的PBMC相比，用抗TCRVβ8a抗体(B-H.1)激活人PBMC还产生较少的TNFα(参见图20C)。
总之，如实施例3所示，本实施例显示，抗TCRVβ8a抗体可以例如优先诱导T细胞细胞因子例如IL-2和IFNg的表达，但不诱导产生与“细胞因子风暴”(以及相应的CRS)有关的细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α。
实施例7：抗TCRβV抗体D抗体的特征
本实施例描述了可以结合并激活T细胞的亚群但是例如没有CRS或CRS显著减少的抗TCRβV抗体的表征。
将人PBMC从全血中分离，然后用抗TCRVβ12抗体(抗体D)或抗CD3e抗体(OKT3)以100nM进行固相(板包被)刺激。在第1、2、3、5或6天收集上清液，然后对IFNg、IL-2、IL-6、IL-1β或TNFα进行多重细胞因子分析。按照制造商的方案，使用MSD(Meso Scale Discovery)平台对数据进行量化。
如图21A所示，当使用板结合的抗TCRVβ12抗体(抗体D)或抗CD3e抗体(OKT3)来激活人PBMC时，诱导了T细胞细胞因子IFNg。对于IL-2产生，与用抗CD3e抗体(OKT3)激活的PBMC相比，用抗TCRVβ12抗体(抗体D)激活的PBMC导致增加的IL-2产生，并且具有延迟的动力学(图21B)。
在相似的条件下还评估了与“细胞因子风暴”(以及相应的CRS)相关的细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的产生。图21C-21E显示，虽然用抗CD3e抗体激活的PBMC显示出IL-6(图21D)、TNF-α(图21C)和IL-1β(图21E)的产生，但是没有或几乎没有观察到用抗TCRVβ12抗体(抗体D)激活的PBMC诱导这些细胞因子。
本实施例中提供的数据表明，针对TCRVβ的抗体可以例如优先激活T细胞的亚群，并且不会导致与细胞因子风暴或CRS相关的细胞因子的诱导。
实施例8：抗TCRβV抗体E的特征
本实施例描述了可以结合并激活T细胞的亚群但是例如没有CRS或CRS显著减少的抗TCRβV抗体的表征。
将人PBMC从全血中分离，然后用抗TCRVβ5抗体(抗体E)或抗CD3e抗体(OKT3和SP34-2)各自以100nM进行固相(板包被)刺激。在第1、3、5或7天收集上清液，然后对IFNg、IL-2、IL-6、IL-1β、IL-10或TNFα进行多重细胞因子分析。按照制造商的方案，使用MSD(MesoScale Discovery)平台对数据进行量化。
如图22A所示，当使用板结合的抗TCRVβ5抗体(抗体E)或抗CD3e抗体(OKT3和SP34-2)来激活人PBMC时，诱导了T细胞细胞因子IFNg。对于IL-2产生，与用抗CD3e抗体(OKT3或SP34-2)激活的PBMC相比，用抗TCRVβ5抗体(抗体E)激活的PBMC导致IL-2产生增加，并具有延迟的动力学(图22B)。
在相似的条件下还评估了与“细胞因子风暴”(以及相应的CRS)相关的细胞因子IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α的产生。图23A-23D显示，虽然用抗CD3e抗体激活的PBMC显示出IL-1β(图23A)、IL-6(图23B)、TNF-α(图23C)和IL-10(图23D)的产生，但是没有或几乎没有观察到用抗TCRVβ5抗体(抗体E)激活的PBMC诱导这些细胞因子。
本实施例中提供的数据表明，针对TCRVβ的抗体可以例如优先激活T细胞的亚群，并且不会导致与细胞因子风暴或CRS相关的细胞因子的诱导。
实施例9：针对BCMA和TCRβV的双重靶向抗体分子的特征
本实施例描述了可以结合并激活T细胞的亚群但是例如没有CRS或CRS显著减少的双重靶向抗体(分子H)(例如双特异性分子)的表征，该双重靶向抗体包含抗TCRβV结合部分和BCMA结合部分。
将人PBMC从全血中分离，然后用抗TCRβV x BCMA双特异性分子(分子H)或抗CD3e抗体(OKT3)分别以100nM进行固相(板包被)刺激。在第1、2、3或5天收集上清液，然后对IFNg、IL-2、IL-6、IL-1β、IL-10或TNFα进行多重细胞因子分析。按照制造商的方案，使用MSD(Meso Scale Discovery)平台对数据进行量化。
如图24A所示，当使用板结合的抗TCRβV x BCMA双特异性分子(分子H)或抗CD3e抗体(OKT3)来激活人PBMC时，诱导了T细胞细胞因子IFNg。对于IL-2产生，与用抗CD3e抗体(OKT3)激活的PBMC相比，用抗TCRβV x BCMA双特异性分子(分子H)激活的PBMC导致IL-2的产生增加(图24B)。
在相似的条件下还评估了与“细胞因子风暴”(以及相应的CRS)相关的细胞因子IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α的产生。图24C-24E显示，虽然用抗CD3e抗体激活的PBMC显示出IL-1β(图24C)、IL-6(图24D)、TNF-α(图24D)和IL-10(图24E)的产生，但是没有或几乎没有观察到用抗TCRβV x BCMA双特异性分子(分子H)激活的PBMC诱导这些细胞因子。
本实施例中提供的数据表明，针对TCRVβ的抗体可以例如优先激活T细胞的亚群，并且不会导致与细胞因子风暴或CRS相关的细胞因子的诱导。
实施例10：抗TCRVb抗体的细胞因子和趋化因子谱
本实施例描述了被抗TCRVβ抗体激活后PBMC分泌的细胞因子和趋化因子。
将人PBMC从全血中分离，然后用抗TCRVβ抗体(A-H.1，B-H.1)，或包含抗TCRVb抗体的双特异性分子(分子H)、同种型对照(BGM0122)或抗CD3e抗体(SP34)分别以100nM进行固相(板包被)刺激。在第1、2、3、4、5、6、7和8天收集上清液，然后对指定的细胞因子或趋化因子进行多重分析。按照制造商的方案，使用MSD(Meso Scale Discovery)平台对数据进行量化。BGM0122包含以下氨基酸序列：METDTLLLWVLLLWVPGSTGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGLNDIFEAQKIEWHE(SEQID NO:3283)。
图26A-26J、图27A-27H以及图28A-28L显示了来自由指定抗体激活的PBMC的细胞因子和趋化因子的水平。
如图26A所示，当使用板结合的抗TCRVβ抗体或抗CD3e抗体(OKT3)来激活人PBMC时，诱导了T细胞细胞因子IFNg。对于IL-2产生，与用抗CD3e抗体(OKT3)激活的PBMC相比，用抗TCRVβ抗体激活的PBMC导致IL-2的产生增加，并且具有延迟的动力学(图26B)。
虽然IL-1β(图26C)、IL-6(图26D)、IL-10(图26E)、IL-4(图26F)、TNFα(图26G)、IP-10(图27C)、IL-12-23p40(图28D)、IL-17A(图28G)和IL-1a(图28H)被抗CD3e抗体(OKT3)诱导，但是没有或几乎没有观察到用抗TCRVb抗体激活的PBMC诱导这些细胞因子或趋化因子。
用抗TCRVβ抗体激活的PBMC表现出IL-13(图26I)、IL-8(图26J)、嗜酸性粒细胞趋化因子(图27A)、嗜酸性粒细胞趋化因子3(图27B)、IL-18(HA)(图27C)、MCP-1(图27E)、MCP-4(图27F)、MDC(图27G)、MIP1a(图27H)、MIP1B(图28A)、TARC(图28B)、GM-CSF(图28C)、IL-15(图28E)、IL-16(图28F)和IL-15(图28I)、IL-7(图28J)的诱导。
实施例11：TCR Vb激活的T细胞的基于纳米串的基因表达谱分析本实施例描述了TCRVβ激活的T细胞的基因表达谱分析，用以例如揭示TCRVβ激活T细胞的潜在机制或途径。
在第一项研究中，将抗TCRVβ13.1抗体A-H.1与抗CD3抗体OKT3进行了比较。简而言之，从全血中分离出人PBMC。使用磁珠分离(阴性选择)(Miltenyi biotec)从分离的PBMC中分离人CD3+ T细胞，并通过固定化(板包被)抗TCRVβ13.1抗体(A-H.1)或抗CD3抗体(OKT3)以100nM激活6天。然后按照制造商的方案，准备激活的T细胞(来自板包被)用于基因表达谱分析(PanCancer IO 360TM Panel，nanoString)。使用nSolver分析软件(Nanostring)，按照抗TCRβ13.1(A-H.1)与抗CD3(OKT3)激活的T细胞分组进行差异基因表达分析。表16A中所示的数据是来自3个供体的平均值。表16A中所示的差异调节基因的p值为0.05或更小。在表16A的第四栏中，显示了基因表达的倍数变化，正值表示TCRVβ激活的T细胞与OKT3激活的T细胞相比，转录水平被上调的基因，而负值表示TCRVβ激活的T细胞与OKT3激活的T细胞相比，转录水平被下调的基因。
在第二项研究中，将多特异性抗TCRVβ13.1/抗BCMA抗体分子H与抗CD3抗体OKT3进行了比较。在6天内用固相抗TCRVβ抗体刺激纯化的T细胞，其中抗TCRVβ抗体分子H或抗CD3e抗体(OKT3)为100nM。通过离心来收集经扩增的T细胞，然后提取RNA。使用nCounter技术(Nanostring)对七百七十八(778)个免疫相关基因进行了计数，然后使用nSolver分析工具进行基因表达分析。本实施例中描述的数据代表3个供体。
基于该分析，鉴定出与OKT3激活的T细胞相比，在TCRVβ激活的T细胞中受到差异调节的一组基因(表16B)。表16B中所示的差异调节基因的p值为0.05或更小。例如，与OKT3激活的T细胞相比，TCRVβ激活的T细胞中的LIF、CD40LG、PDCD1、CXCR5、LTA和CD80在转录水平上均被上调。与OKT3激活的T细胞相比，TCRVβ激活的T细胞中的GZMK、ENTPD1(CD39)、TCF7、CD96、HLA-DRB4、SIGIRR和SELL在转录水平上被下调。TCRVβ激活的T细胞还表达高水平的细胞溶解效应因子(例如IFNg、颗粒酶B和穿孔素)。
表16A.与OKT3激活的T细胞相比，其表达在TCRVβ激活的T细胞中优先受到调节的基因的汇总。
表16B.与OKT3激活的T细胞相比，其表达在TCRVβ激活的T细胞中优先受到调节的基因的汇总。
实施例12：亲和力成熟的人源化抗体A-H抗体的结合亲和力
本实施例描述了亲和力成熟的人源化抗体A-H抗体与重组蛋白TCRVB 6-5的结合亲和力的评价。
使抗体A-H人源化抗体亲和力成熟。如下所述测试所得亲和力成熟的抗体与TCRVB6-5的结合亲和力。
将5ug/mL的TCRVB 6-5固定在Biotin CAP Series S传感器芯片上至60RU。将BJM0277稀释至200nM，然后连续稀释两倍。缔合为120秒，解离为300秒。该测定在1x HBS-EP+缓冲液pH 7.4和25℃下进行。使用1:1结合模型来拟合数据。
将5ug/mL的TCRVB 6-5固定在Biotin CAP Series S传感器芯片上至60RU。将A-H.45稀释至50nM，然后连续稀释两倍。缔合为120秒，解离为300秒。该测定在1x HBS-EP+缓冲液pH 7.4和25℃下进行。使用1:1结合模型来拟合数据。A-H.45是一种改良的酵母克隆(TCRvB/CD19双特异性)，且恰好在HCDR3之前在框架3的最后一个残基处包含一个突变(从G到V)。亲和力是BJM0277的35倍(表17)。
将5ug/mL的TCRVB 6-5固定在Biotin CAP Series S传感器芯片上至60RU。将A-H.52稀释至50nM，然后连续稀释两倍。缔合为120秒，解离为300秒。该测定在1x HBS-EP+缓冲液pH 7.4和25℃下进行。使用1:1结合模型来拟合数据。A-H.52是噬菌体克隆，并且是单价scFv。A-H.52在CDRH1上有两个突变。A-H.52的亲和力是BJM0277的20倍(表17)。
将5ug/mL的TCRVB 6-5固定在Biotin CAP Series S传感器芯片上至60RU。将A-H.53稀释至50nM，然后连续稀释两倍。缔合为120秒，解离为300秒。该测定在1x HBS-EP+缓冲液pH 7.4和25℃下进行。使用1:1结合模型来拟合数据。A-H.53(噬菌体克隆)亲和力在pM范围内(表17)。A-H.53的亲和力是BJM0277的200倍(表17)。
将5ug/mL的TCRVB 6-5固定在Biotin CAP Series S传感器芯片上至60RU。将A-H.54稀释至50nM，然后连续稀释两倍。缔合为120秒，解离为300秒。该测定在1x HBS-EP+缓冲液pH 7.4和25℃下进行。使用1:1结合模型来拟合数据。A-H.54(噬菌体克隆)亲和力是BJM0277的17倍(表17)。
表17.抗TCRVb抗体的亲和力成熟的汇总
实施例13：抗体构建体的表达和纯化
质粒的构建
对编码蛋白质序列的DNA进行优化以使其在灰仓鼠(Cricetulus griseus)中表达，将其合成并使用Gateway克隆技术克隆到pcDNA3.4-TOPO(Life Technologies A14697)中。所有构建体均包含Igκ前导序列METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO:3288)。
表达与纯化
将质粒共转染到Expi293细胞(Life Technologies A14527)或ExpiCHO细胞(LifeTechnologies A29127)中。如果适用，使用1mg总DNA进行多特异性构建体的转染，该构建体的重链比为1:1，轻链与重链比为3:2。使用线性25,000Da聚乙烯亚胺(PEI，PolysciencesInc23966)以3:1的比例与总DNA完成Expi293细胞转染。将DNA和PEI分别添加到50mL的OptiMem(Life Technologies 31985088)培养基中，并无菌过滤。将DNA和PEI合并10分钟，并添加至1.8-2.8×106个细胞/mL的细胞密度和至少95％活力的Expi293细胞。根据制造商的说明进行ExpiCHO转染。转染后，Expi293细胞在37℃、8％CO2的潮湿培养箱中生长5-7天，并且ExpiCHO细胞在32℃、5％CO2下生长14天。通过在4500×g下离心来沉淀细胞，并通过0.2μm膜过滤上清液。将A蛋白树脂(GE 17-1279-03)加入到过滤的上清液中，并在室温下温育1-3小时。将该树脂填充到柱中，用3×10柱体积的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，LifeTechnologies 14190-144)洗涤。用20mM柠檬酸盐、100mM NaCl(pH 2.9)从柱上洗脱结合的蛋白质。必要时，在Superdex 200色谱柱上使用DPBS运行缓冲液，通过配体亲和力和/或尺寸排阻色谱法进一步纯化蛋白质。
实施例14：抗TRBV5-5抗体克隆抗体C的人源化
使用IMGT命名法分配小鼠抗TCRvβ抗体克隆抗体C VH和VL的种系，其中通过Kabat和Chothia分类的组合来定义CDR区。SEQ ID NO:232和SEQ ID NO:233分别是抗体C VH和VL序列，其中VH种系是小鼠IGHV2-6-7*01，而VL种系是小鼠IGKV10-94*02。使用实施例1中所述的用于人源化抗体A的方法来人源化抗体C。将抗体C VH人源化为人IGHV2-26*01、IGHV2-70*04、IGHV4-4*02、IGHV2-5*09、IGHV2-5*08、IGHV4-34*09、IGHV4-59*01、IGHV4-59*07、IGHV4-61*02、IGHV4-38-2*01、IGHV4-31*01、IGHV3-49*04、IGHV3-49*02、IGHV4-4*07、IGHV3-49*05、IGHV4-34*10、IGHV4-28*04、IGHV3-72*01、IGHV3-15*07、IGHV6-1*01、IGHV3-7*01、IGHV4-34*01、IGHV3-33*02、IGHV3-48*02、IGHV3-23*03、IGHV3-21*01、IGHV3-73*01、IGHV3-30*02、IGHV3-7*01、IGHV3-43*01和IGHV3-53*03，并且将抗体C VL人源化为人IGKV1D-43*01、IGKV1-27*01、IGKV1-17*02、IGKV1-17*01、IGKV1-5*01、IGKV4-1*01、IGKV3-7*02、IGKV3-7*01、IGKV2-29*02、IGKV6D-41*01、IGKV2-28*01、IGKV2-40*01、IGKV3-15*01、IGKV2-24*01、IGKV6-21*01、IGKV2D-26*01和IGKV2D-26*03。
SEQ ID NO:3040-3089是抗体C人源化的重链，而SEQ ID NO:3000-3039是抗体C人源化的轻链(如表10中所述)。
实施例15：TRBV10-1、TRBV10-2和TRBV10-3抗体克隆抗体D的人源化
使用IMGT命名法分配小鼠抗TCRvβ抗体克隆抗体D VH和VL的种系，其中通过Kabat和Chothia分类的组合来定义CDR区。SEQ ID NO:3183和SEQ ID NO:3184分别是抗体D VH和VL序列，其中VH种系是小鼠IGHV5-6*01，而VL种系是小鼠IGKV4-59*01。
使用实施例1中所述的用于人源化抗体A的方法来人源化抗体D。将抗体D VH人源化为人IGHV3-30*03、IGHV3-30*02、IGHV3-7*01、IGHV3-21*01、IGHV3-23*04、IGHV3-30*15、IGHV3-48*02、IGHV3-53*04、IGHV3-23*03、IGHV3-53*03、IGHV3-53*01、IGHV3-9*01、IGHV3-30*13、IGHV3-20*01、IGHV3-43D*03、IGHV3-43*02、IGHV3-43*01、IGHV3-53*02、IGHV3-13*01、IGHV3-38-3*01、IGHV3-9*03、IGHV3-64D*06、IGHV3-33*02、IGHV3-11*03、IGHV3-64*02、IGHV3-64*01、IGHV3-64*03、IGHV3-7*01、IGHV3-35*01、IGHV3-13*02、IGHV3-38*02和IGHV3-38*01，并且将抗体D VL人源化为人IGKV3-11*01、IGKV1-13*02、IGKV1-9*01、IGKV6-21*01、IGKV1D-43*01、IGKV3-11*01、IGKV3D-11*02、IGKV1-17*03、IGKV3D-20*01、IGKV3-20*01、IGKV1D-16*01、IGKV4-1*01、IGKV2-28*01、IGKV2-40*01、IGKV2-29*02、IGKV2-29*01、IGKV1D-42*01、IGKV2-24*01和IGKV5-2*01。SEQ ID NO:3225-3274是抗体D人源化的重链，而SEQ ID NO:3185-3224是抗体D人源化的轻链(如表12中所述)。
实施例16：TRBV5-5和TRBV5-6抗体克隆抗体E的人源化
使用IMGT命名法分配小鼠抗TCRβ抗体克隆抗体E VH和VL的种系，其中通过Kabat和Chothia分类的组合来定义CDR区。SEQ ID NO:3091和SEQ ID NO:3092分别是抗体E VH和VL序列，其中VH种系是小鼠IGHV1-82*01，而VL种系是小鼠IGKV3-5*01。
使用实施例1中所述的用于人源化抗体A的方法来人源化抗体E。将抗体E VH人源化为人IGHV1-69*08、IGHV1-3*02、IGHV1-18*03、IGHV1-3*01、IGHV1-18*01、IGHV1-2*06、IGHV1-2*01、IGHV1-2*06、IGHV1-8*01、IGHV7-4-1*02、IGHV1-58*02、IGHV5-51*01、IGHV7-4-1*04、IGHV7-81*01、IGHV5-51*04、IGHV5-51*01、IGHV1-45*03、IGHV3-49*04、IGHV3-49*02、IGHV3-49*05、IGHV4-4*02、IGHV3-49*05、IGHV3-73*01、IGHV4-4*02、IGHV3-15*07、IGHV3-15*02、IGHV3-72*01、IGHV4-59*07、IGHV4-31*01、IGHV4-31*02、IGHV3-30*15、IGHV3-21*01、IGHV3-7*01、IGHV4-28*01、IGHV4-28*02、IGHV3-30*08、IGHV3-30*05和IGHV3-30*01，并且将抗体E VL人源化为人IGKV4-1*01、IGKV3-11*01、IGKV3-20*02、IGKV3-11*01、IGKV1-13*02、IGKV3D-11*01、IGKV3D-20*02、IGKV1-13*02、IGKV3D-20*01、IGKV1-9*01、IGKV3D-15*03、IGKV3-15*01、IGKV1-5*01、IGKV2D-29*01、IGKV3-7*02、IGKV1-9*01、IGKV2-28*01、IGKV2-40*01、IGKV2D-29*02、IGKV3-7*01、IGKV2-30*01、IGKV2-24*01、IGKV6D-41*01、IGKV1D-42*01、IGKV2D-26*01、IGKV2D-26*03和IGKV5-2*01。SEQ ID NO:3133-3182是抗体E人源化的重链，而SEQ ID NO:3093-3132是抗体E人源化的轻链(如表11中所述)。
实施例17：TCRβV6-5刺激后T细胞扩增的动力学
为了评估抗TCRβv 6-5扩增的T细胞的动力学和绝对计数—在100nM的T细胞激活抗体情况下用板固定的抗TCRvb 6-5抗体刺激PBMC或纯化的T细胞8天。测试的T细胞激活抗体包括：i)抗TCRvb 6-5v1抗体；ii)抗TCRvb 6-5v2；iii)OKT3(抗CD3ε抗体)；iv)SP34-2(抗CD3ε抗体)；和v)IgG1 N297A(同种型对照)。每天收集细胞沉淀并针对CD3、CD4、CD8和TCRvb6-5进行染色以进行流动分析。
图31显示了使用抗TCRvb 6-5v1在8天期间TCRvb 6-5+T细胞的扩增，如通过流式细胞术所评估的。数据是针对单一代表性供体的；来自其他两个独立供体的PBMC也观察到了类似的结果。图33进一步显示了TCRvb 6-5v1对TCRvb 6-5+CD4+ T细胞和TCRvb 6-5+CD8+ T细胞的特异性扩增。相反，OKT3没有特异性的TCRvb 6-5+T细胞扩增(图32；图34)。
图35A和35B显示了TCRβV6-5+T细胞在人PBMC(图35A)和纯化的T细胞(图35B)中的选择性扩增。
图36A-38显示抗TCRβV和抗CD3ε抗体在PBMC培养物中扩增T细胞(图36A和36B)或扩增纯化的T细胞培养物(图37A和37B)在8天后达到相当的水平，如通过TCRVB 6-5+T细胞的相对计数(图36A-37B)和总CD3+ T细胞的相对计数(图36A-38)所测量的。
实施例18：激活的TCRvb 6-5+T细胞发挥细胞溶解功能
为了评估用抗TCRVβ激活/扩增的T细胞介导肿瘤细胞裂解的能力—用100nM的固定化T细胞激活抗体刺激纯化的T细胞6天。测试的T细胞激活抗体包括：i)TCRvb 6-5v1抗体；ii)OKT3(抗CD3ε抗体)；或iii)IgG1 N297A(同种型对照)。每天添加靶细胞(RPMI-8226细胞)，并以5:1的初始效应T细胞:靶细胞(E:T)比例与激活的T细胞一起温育48小时。使用CFSE/CD138和DRAQ7 FACS染色测量靶细胞裂解的定量。使用了三种不同的T细胞供体(供体6769、供体9880、供体54111)。数据显示TCRVb 6-5v1激活的T细胞的靶细胞裂解动力学与TCRvb 6-5+T细胞的扩增相关(图39)。
为了进一步评估靶细胞裂解，将OKT3或TCRvb 6-5v1抗体用从100nM的最高剂量浓度的1/2log连续稀释液固定(板包被)用于纯化的T细胞(泛CD3分离)激活。在添加靶细胞之前，用激活板刺激纯化的T细胞0(即没有抗体预激活)到4天(即有抗体预激活)。将靶细胞(RPMI8226)添加到激活板(以5:1的初始E:T细胞比例)长达6天(即对于板0，E:T共培养6天，而对于板4，E:T共培养2天)，然后经由CFSE/CD138和DRAQ7FACS染色对靶细胞裂解进行量化。数据显示，在没有T细胞预激活的情况下，大约3％的Vb细胞能够在第6天(在更高浓度下)杀伤靶细胞(图40A)；并且在T细胞预激活的情况下，大约25％的Vb细胞能够在第6天杀伤靶细胞(杀伤曲线向左移动)(图40B)。当T细胞预激活4天时，TCRvb 6-5v1激活的T细胞与抗CD3ε相比表现出相当的最大靶细胞裂解(图41)。在100nM时，TCRvb 6-5v1激活显示与抗CD3ε激活相当的靶细胞杀伤(图42)(预激活在4-6天之间，取决于供体和在靶细胞的存在下培养48小时的培养物)。
实施例19：通过抗TCRvb 6-5抗体评估TCRvb下调/内化
为了评估抗TCRvb 6-5介导的T细胞激活对TCRvb的细胞表面表达的影响—将纯化的T细胞用100nM的指定T细胞激活抗体刺激8天(板结合)。T细胞激活抗体包括：i)抗TCRvb6-5v1抗体；或ii)SP34-2(抗CD3ε抗体)。每天收集细胞沉淀并针对CD3、CD4、CD8和TCRβV6-5进行染色以进行流式细胞术分析。总共测试了三个供体，每个都显示出相似的结果。
结果显示抗CD3ε和抗TCRvb抗体激活的CD4+ T细胞(图43)和激活的CD8+ T细胞(图44)都显示降低的CD3ε细胞表面表达；而在T细胞激活后，CD4+ T细胞(图45)和CD8+ T细胞(图46)上的TCRvb 6-5细胞表面表达仍然是可检测的。结果表明，CD3ε亚基在由抗CD3ε或抗TCRvb抗体激活的T细胞中被下调/内化；而TCRvb 6-5在T细胞激活后仍可检测到。此外，CD4和CD8染色未显示任何一种抗体下调这些受体的任何迹象。
实施例20：抗TCRβV抗体的食蟹猴交叉反应性
为了评估抗TCRβV抗体对食蟹猴TCRβV克隆型的交叉反应性—新鲜和冷冻保存的食蟹猴PBMC在组织培养物处理过的平底96孔板(预包被有100nM浓度的抗TCRβV6-5v1或抗CD3ζ抗体)中在完全培养基(RPMI和10％ FBS)中培养。阴性对照或未经刺激的孔仅接受PBS。在培养6天后使用CytoFlex流式细胞仪(Beckmann Coulter)评估TCRβV6-5表达并成像。使用了两个供体样品：供体DW8N-新鲜PBMC样品，雄性，8岁，体重7.9kg(数据显示在图47A中)；供体G709-冷冻保存的样品，雄性，6岁，体重4.7kg(数据显示在图47B中)。数据显示食蟹猴T细胞被抗TCRβV6-5v1激活和扩增(图47A和图47B)。冷冻保存来自已显示TCRvb 6-5扩增的供体DW8N的新鲜食蟹猴PBMC，冷冻保存一周后，将细胞解冻并使用抗CD3ξ和抗TCRvb6-5v1刺激七天。如图48所示，簇形成和扩增都是可再现的。
实施例21：抗TCRβV抗体不激活γδT细胞
为了确定抗TCRvb抗体是否能够激活γδT细胞—通过磁珠分离从人PBMC中纯化γδT细胞。γδT细胞被固定在板包被的抗CD3ε(SP34-2)或抗TCRvb 6-5(抗TCRvb 6-5v1)抗体上24小时，并通过流式细胞术分析CD69和CD25的表达。在激活后2、5和7天收集上清液，并使用Meso Scale Discovery(MSD)测定来分析细胞因子。在γδT细胞纯化之前对PBMC进行FACS门控/染色，显示γδT细胞是vβ6-5阴性(供体12657-基于FMO对γδT和TCRvβ6-5进行门控)(图49)。对纯化的γδT细胞进行FACS门控/染色，显示纯化的γδT细胞是vβ6-5阴性(供体12657-基于FMO对γδT和TCRvβ6-5进行门控)(图50)。如图51所示，抗TCRVβ6-5抗体(抗TCRvb 6-5v1)没有激活γδT细胞；而抗CD3ε抗体(SP34-2)确实激活γδT细胞。细胞因子分析表明，抗TCRβV6-5v1不诱导γδT细胞的细胞因子释放，分析的细胞因子包括IFNγ、TNFα、IL-2、IL-17A、IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-10(图52A-56H)。
实施例22：抗TCRVβ抗体的多克隆T细胞扩增
为了评估抗TCRVβ抗体诱导多克隆T细胞扩增的能力—使用磁珠分离(阴性选择)来分离人CD3+ T细胞，并用100nM的固定化(板包被)抗TCRβV6-5v1激活6天。将经扩增的T细胞群洗涤并且使用Takara单细胞裂解缓冲液裂解，用于SMART(er)TCR cDNA合成和测序。进行了TCR测序，并确定了不同TCRαV和J区段以及TCRβV、D和J区段的绝对计数和相对表示，以及在V(D)J重组过程中由Artemis/TdT活性产生的以及对应于T细胞的独特克隆的它们各自的不同变体。图53显示所有TCRαV区段(TRAV基因群)及其变体(顶部)、所有TCRβV区段6-5变体(TRBV6-5基因)(左下)，以及除6-5之外的所有TCRβV区段和变体(右下)的相对表示。数据显示，抗TCRVβ抗体刺激不会诱导TRBV6-5阳性群体中特定T细胞克隆的增殖，因为该群体中克隆表现方面的相对差异与TRBV6-5阴性群体以及总TRAV使用相当。
实施例23：抗TCRβV扩增的T细胞代表新近激活的效应T细胞的新颖亚群
为了评估抗TCRβV扩增的T细胞的表型—在100nM的指定T细胞激活抗体情况下用固相抗TCRβV抗体刺激纯化的T细胞8天：i)抗TCRvb 6-5v1抗体；ii)抗TCRvb 6-5v2；iii)OKT3(抗CD3ε抗体)；或iv)IgG1 N297A(同种型对照)。通过FACS染色鉴定T细胞亚群的特定表面标志物：初始T细胞(CD4/CD8+、CD45RA+、CCR7+)；干细胞记忆T细胞(TSCM；CD4/CD8+、CD95+、CD45RA+、CCR7+)；中央记忆T细胞(TCM；CD4/CD8+、CD95+、CD45RA-、CCR7+)；效应记忆T细胞(TEM；CD4/CD8+、CD95+、CD45RA-、CCR7-)；再表达CD45RA的效应记忆T细胞(TEMRA；CD4/CD8+、CD95+、CD45RA+、CCR7-)；和CD27、CD28、4-1BB、OX40和ICOS。数据代表超过5个独立实验。
数据显示通过抗TCRVβ抗体(图54A)而非OKT3(图54B)扩增的CD4+ T细胞与TEMRA亚群共享表型标志物。同样，数据显示通过抗TCR Vβ抗体(图55A)而非OKT3(图55B)扩增的CD4+ T细胞与TEMRA亚群共享表型标志物。PD1表达的进一步分析显示抗TCRVβ激活的CD4+ T细胞(图56A)和CD8+ T细胞(图56B)显示相对于抗CD3ε激活的CD4+ T细胞(图56A)和CD8+ T细胞(图56B)增加的PD1表达。这些抗TCRVβ激活的CD4+ T细胞(图57A)(PD-1+TEMRA表型)和抗TCRVβ激活的CD8+ T细胞(图57B)(PD-1+TEMRA表型)显示了相对于抗CD3ε激活的CD4+ T细胞(图57A)和CD8+ T细胞(图57B)富集Ki-67的表型。
对CD57表达的进一步分析显示抗TCRVβ激活的CD8+ T细胞(图58A)相对于抗CD3ε激活的CD8+ T细胞(图58B)没有表现出增加的CD57表达。同样，CD27和CD28表达分析显示抗TCRVβ激活的CD4+T细胞(图59顶部)和抗TCRVβ激活的CD8+ T细胞(图59底部)相对于抗CD3ε激活的CD8+ T细胞没有表现出增加的CD27和CD28表达(图59)。
OX40、41BB和ICOS表达的进一步分析显示抗TCRVβ激活的CD4+ T细胞(图60顶部)和抗TCRVβ激活的CD8+ T细胞(图60底部)相对于抗CD3ε激活的CD8+ T细胞表现出增加的OX40、41BB和ICOS表达(图60)。
使用延时流式细胞术进一步分析抗TCRVβ抗体扩增的T细胞的TEMRA样表型，以评估CD45RA和CCR7在激活后不同时间点的表达。将分离的人T细胞用100nM的固定化(板包被)抗CD3ε或抗TCRVβ激活1-8天。在每(1、2、3、4、5、6、8)天激活后，通过FACS染色鉴定T细胞亚群的针对以下的表面标志物：初始/TSCM T细胞(CD4+/CD8+、CD45RA+、CCR7+)、中央记忆T细胞(TCM；CD4+/CD8+、CD95+、CD45RA-、CCR7+)、效应记忆T细胞(TEM；CD4+/CD8+、CD95+、CD45RA-、CCR7-)和再表达CD45RA(TEMRA；CD4+/CD8+、CD95+、CD45RA+、CCR7-)的效应记忆T细胞。TCRβV+T细胞通过TCRVβ+染色进行鉴定。通过流式细胞术分析对FACS染色的样品进行分析。数据显示了来自3个供体中的1个的CD4+ T细胞的代表。
图61显示了一系列FACS图，其显示用BCMA和抗TCRVβ抗体抗TCRVβ6-5v1激活后1、2、3、4、5、6和8天CD3+(CD4门控)TCRβV6-5+T细胞的百分比。在激活后第0天(图62A)、激活后第1天(图62B)、激活后第2天(图62C)、激活后第3天(图62D)、激活后第4天(图62E)、激活后第5天(图62F)、激活后第6天(图62G)和激活后第8天(图62H)使用同种型对照(IgG1N297A)、抗TCRβV(抗TCRVβ6-5v1)或抗CD3ε(OKT3)抗体扩增的CD4+ T细胞的百分比分析。表达CD45RA和CCR7的TEMRA样T细胞的百分比显示，与用OKT3抗体扩增的那些相比，用抗TCRVβ6-5v1抗体扩增的CD4+ TCRVβ6-5+T细胞培养物中TEMRA样细胞的群体增加。用CD8+ T细胞观察到类似的结果。结果进一步表明，与由抗CD3ε(OKT3)激活的纯化T细胞相比，由抗TCRβV6-5激活的经纯化人T细胞直接分化为TEMRA亚群并增殖。
总之，数据显示抗TCRβV抗体激活和扩增的T细胞代表了最近激活的效应T细胞的新颖亚群，它们与TEMRA共享表型标志物。这与分化为TCM和TEM的抗CD3e扩增的T细胞形成对比。TCRβV扩增的T细胞具有高度增殖性，不会上调衰老标志物CD57OX40、4-1BB，并且ICOS在抗TCRβV激活的T细胞上上调。
实施例24：αTCRβV激活的T细胞的代谢状态
为了评估用αTCRβV抗体激活的T细胞的代谢表型—用板结合的抗CD3抗体(OKT3)或抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1抗体)刺激和扩增来自PBMC的初始T细胞5天。然后将激活的T细胞在含有IL-2的培养基中静置2天，然后将它们冷冻保存。在测定设置之前，将细胞解冻并分别用板结合的抗CD3 Ab(克隆OKT3)或抗TCRβV抗体(抗TCRβV6-5v1抗体)再刺激3天。将相同数量的活细胞铺板在Seahorse盒上，并根据制造商的说明进行实时ATP速率测定。数据显示来自3个供体的被抗TCRβV6-5v1抗体激活的T细胞中的糖酵解(图63A)氧化磷酸化(图63B)产生的ATP(来自图63A-67B中呈现的单个供体的代表性结果)与用OKT3抗体激活的T细胞相比增加(平均观察到ATP产生增加3倍)；并且一名供体在抗TCRβV6-5v1和OKT3 Ab刺激的细胞中表现出相同水平的ATP产生(数据未显示)。
图64进一步显示了与用OKT3抗体激活的T细胞相比，用抗TCRβV6-5v1抗体激活的T细胞中增加的线粒体呼吸，这显示了用指定抗体激活的T细胞从约0到75分钟的耗氧率(OCR)。图63中的数据来自单一供体；测试的第二供体在抗TCRβV6-5v1和OKT3 Ab刺激的细胞中表现出相同水平的ATP产生(数据未显示)。图65A-65C显示在基础呼吸(图65A)、最大呼吸(图65B)和备用呼吸能力(图65C)期间用指定抗体激活的T细胞的耗氧率(OCR)。将细胞铺板于含有葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中以测量基础OCR。将FCCP(ETC加速剂)添加到细胞培养基中以确定最大呼吸容量/最大OCR。将抗霉素A和鱼藤酮(ETC抑制剂)添加到细胞培养基中，以确定备用呼吸能力和非线粒体耗氧量。图65A-65C中提供的数据，与α-CD3(OKT3)激活的T细胞相比，α-TCRβV6-5v1激活的T细胞具有显著增加的基础呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力(来自单个供体的数据)。测试了第二供体，其显示在抗TCRβV6-5v1和OKT3 Ab刺激的细胞中产生相同水平的ATP(数据未显示)。图65D分别表示如图64A和图64B所示的基础呼吸和最大呼吸的面积。
为了确定观察到的代谢增加是由于T细胞刺激的差异还是用抗TCRβV抗体激活的T细胞的分化阶段所固有的，将TCRβV6-5+T细胞用板结合的抗TCRβV6-5v1 Ab扩增5天。然后将细胞在含有IL-2的培养基中静置2天并冷冻保存。解冻后，用抗TCRβV6-5v1再刺激细胞3天。然后对细胞进行计数，重新接种等数量的活细胞，并分别用板结合的抗CD3 Ab(克隆OKT3)或抗TCRβV6-5v1刺激24小时。将等数量的活细胞铺板在Seahorse盒上，并进行实时ATP速率测定。
结果显示，由抗TCRβV6-5v1激活的T细胞通过糖酵解(图66A)和氧化磷酸化(图66B)产生的ATP在用α-CD3抗体OKT3相比于α-TCRβV6-5v1抗体再刺激后显著增加。观察到的用抗TCRβV6-5v1激活的T细胞的代谢增加似乎是由于分化成这些细胞后的固有差异。与CD3激活的T细胞相比，用抗TCRβV6-5v1激活的T细胞具有增加的代谢，经由OKT3的强T细胞刺激可以进一步增强代谢。
总之，结果表明用抗TCRβV抗体激活的T细胞具有代谢记忆表型。细胞不会在代谢上耗竭，因为耗竭的T细胞的新陈代谢会降低。α-TCRβV6-5v1刺激诱导T细胞分化阶段，该阶段具有高度代谢活性，表明存在效应记忆表型。当这些细胞用其他T细胞衔接物(OKT3)再刺激时，该代谢表型得以维持。
实施例25：与抗TCRβV抗体相比，使用抗CD3e抗体评估CRS
为了确定低亲和力(Teneobio)抗CD3e抗体的CRS效应，使用了PBMC的细胞因子释放测定(CRA)。简而言之，来自两个供体的PBMC用板包被的抗体进行刺激：抗TCRvb 6-5v2、抗CD3em(SP34)或Teneobio的抗CD3e抗体。T细胞激活抗体在100nM下进行了测试，这是之前在该测定中显示不会诱导CRS细胞因子的最高浓度。在第1、3、5和7天收集上清液。使用MSD分析检测细胞因子分泌测量(IFN-g、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6和TNF-a)。数据显示来自两个供体的结果。
图67A-67F显示亲和力降低的抗CD3e抗体(TeneoBio)类似于SP34-2抗CD3e抗体诱导IFNγ、TNFα、IL-1a、IL-1b、IL-6(CRS和神经毒性相关细胞因子)表达。相反，如本文所述的抗TCRvb 6-5v2不诱导CRS或神经毒性相关的细胞因子。
总之，数据显示Tenebio的抗CD3e抗体在这种高度敏感的PBMC CRA中诱导与CRS和神经毒性相关的细胞因子。因此，Tenebio的抗CD3e抗体具有诱导CRS和NT的潜力，如用基于SP34的T细胞重定向双特异性分子时所见。如本文所述的抗TCRvb 6-5在该测定中不诱导CRS和NT相关的细胞因子，表明在一些实施方案中，基于TCRvb 6-5的抗体可能适合以更高剂量施用并避免当前基于CD3e的双特异性分子所需的MABEL(最小预期生物效应水平)给药方案。
实施例26：抗TCRβV刺激的PBMC介导的NK细胞扩增刺激
为了评估抗TCRβV刺激的PBMC是否在体外介导NK细胞的扩增—用100nM板包被的抗TCRβV6-5v1抗CD3ε(OKT3和SP34-2)刺激人PBMC长达7天。通过对CD3-/CD56+/CD16+/NKp46+群体的FACS染色鉴定NK细胞。NK细胞计数由恒定μl样品确定(表示为每个供体的相对计数)。在刺激后6天确定NK细胞介导的靶细胞裂解，其中收获PBMC并与K562靶细胞共培养4小时以通过DRAQ7活力FACS染色确定细胞杀伤。
结果显示，与OKT3刺激相比，抗TCRβV刺激增加了NK细胞数量(图68；图69)。FACSCFSE染色进一步显示NK细胞增殖(图70)。图71和图72显示NK细胞介导的靶K562细胞裂解。总之，抗TCRβV6-5抗体诱导PBMC中NK细胞的扩增；并且这种作用不太可能通过NK细胞上的FcR介导，因为抗CD3ε抗体不会扩增NK细胞。通过抗TCRβV6-5v1扩增的NK细胞在体外介导有效的靶细胞(K562)裂解。
除使用抗TCRβV6-5v1抗体进行的上述实验之外，使用识别不同克隆型的抗TCRβV抗体进行了类似的实验。在一项实验中，抗TCRβV12抗体：抗TCRvβ12-3/4v1、抗TCRvβ12-3/4v2和抗TCRvβ12-3/4v3用于如上所述使用指定的T细胞激活抗体以100nM进行固相刺激(板包被)6天来激活/扩增PBMC。使用NKp46和CD56(CD3阴性)对NK细胞进行流动分析。数据来自3个供体并代表1个独立实验。
用同种型对照或抗CD3ε抗体OKT3或SP34-2激活/扩增PBMC不诱导NK细胞扩增(图73；图75)。然而，用抗TCRvβ12-3/4v1(图74)、抗TCRvβ12-3/4v2(图74)和抗TCRvβ12-3/4v3(图75)激活/扩增PBMC均诱导NK细胞扩增。总之，数据显示抗TCRvb12抗体能够在体外诱导来自PBMC培养物的NK细胞的间接扩增。
实施例27：体外对抗TCRβV刺激的浓度应答
用指定的不同浓度的指定T细胞激活抗体对人PBMC进行固相刺激(板包被)：i)抗TCRvb 6-5v1抗体；ii)OKT3(抗CD3ε抗体)；或iii)SP34-2(抗CD3ε抗体)。在第1天、第3天和第5天收集上清液，并通过使用Meso Scale Discovery(MSD)测定来定量细胞因子。分析了细胞因子IFNγ(图76)、IL-2(图77)、IL-15(图78)、IL-1β(图79)、IL-6(图80)和IL-10(图81)的产生。结果表明，用抗TCRvb激活的T细胞缺乏与CRS相关的细胞因子诱导不是由于高抗体浓度引起的抑制或毒性的结果。实施例28：与抗CD3ε抗体激活的T细胞相比，抗TCRβV抗体激活的T细胞具有不同的细胞因子释放谱
为了评估使用抗TCRβV抗体与抗CD3ε抗体相比激活/扩增的T细胞的细胞因子释放谱—在包被有固定化抗TCRβV抗体抗TCRβV6-5v1或抗CD3ε抗体OKT3或SP37-2的细胞培养板中培养PBMC。将细胞培养1-8天，收集上清液，并使用Meso Scale Discovery(MSD)测定来分析细胞因子。测试了来自众多不同人供体的T细胞样品。
图82显示了来自17个供体的数据总结。从时间点(第3天及以后)开始的最高总细胞因子分泌用于进一步分析。每个数据点针对每个供体的最高分泌进行标准化，并显示为最高的相对％(置信区间为0.95％)。数据显示，与抗CD3ε抗体相比，用抗TCRβV抗体激活/扩增的T细胞释放的IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-4、IL-6、IL10和IL-17较少；而释放增加量的IL-2(图82)。
使用来自不同供体的PBMC进行了一系列使用前述方法但不同培养期的实验。在一项实验中，来自四个不同供体的PBMC在包被有固定化抗TCRβV抗体抗TCRβV6-5v1或抗CD3ε抗体OKT3或SP37-2的板中培养1-6天。数据证实，与抗CD3ε抗体相比，用抗TCRβV抗体激活/扩增的T细胞释放更低水平的IFNγ(图83A)、IL-1β(图83B)、IL-4(图83C)、IL-6(图83D)、IL10(图83E)和TNFα(图83F)；和更高水平的IL-2(图83G)。
在第二实验中，来自六个不同供体的PBMC在包被有固定化抗TCRβV抗体抗TCRβV6-5v1或抗TCRβV6-5v2；或抗CDε抗体OKT3或SP37-2，或同种型对照的板中培养1-6天。数据证实，与抗CD3ε抗体相比，用抗TCRβV抗体激活/扩增的T细胞释放更低水平的IFNγ(图84A)、IL-1β(图84B)、IL-4(图84C)、IL-6(图84D)、IL10(图84E)和TNFα(图84F)；和更高水平的IL-2(图84G)。
在第三实验中，来自三个不同供体的PBMC在包被有固定化抗TCRβV抗体抗TCRβV6-5v1或抗TCRβV6-5v1；或抗CDε抗体OKT3或SP37-2，或同种型对照的板中培养1-8天。数据证实，与抗CD3ε抗体相比，用抗TCRβV抗体激活/扩增的T细胞释放更低水平的IFNγ(图85A)、IL-1β(图85B)、IL-4(图85C)、IL-6(图85D)、IL10(图85E)和TNFα(图85F)；和更高水平的IL-2(图85G)。
在第四实验中，来自两个不同供体的PBMC在包被有固定化抗TCRβV抗体抗TCRβV6-5v1或抗TCRβV6-5v1；或抗CDε抗体OKT3或SP37-2，或同种型对照的板中培养2-7天。数据证实，与抗CD3ε抗体相比，用抗TCRβV抗体激活/扩增的T细胞释放更低水平的IL-17A(图86A)。在第五实验中，来自四个不同供体的PBMC在包被有固定化抗TCRβV抗体抗TCRβV6-5v1或抗TCRβV6-5v1；或抗CDε抗体OKT3或SP37-2，或同种型对照的板中培养2-8天。数据证实，与抗CD3ε抗体相比，用抗TCRβV抗体激活/扩增的T细胞释放更低水平的IL-17A(图86B)。在第六实验中，来自两个不同供体的PBMC在包被有固定化抗TCRβV抗体抗TCRβV6-5v1或抗TCRβV6-5v1；或抗CDε抗体OKT3或SP37-2，或同种型对照的板中培养2-7天。数据证实，与抗CD3ε抗体相比，用抗TCRβV抗体激活/扩增的T细胞释放更低水平的IL-17A(图86C)。在第七实验中，来自两个不同供体的PBMC在包被有固定化抗TCRβV抗体抗TCRβV6-5v1或抗TCRβV6-5v1；或抗CDε抗体OKT3或SP37-2，或同种型对照的板中培养2-7天。数据证实，与抗CD3ε抗体相比，用抗TCRβV抗体激活/扩增的T细胞释放更低水平的IL-17A(图86D)。
使用TCRβV抗体抗TCRβV6-5v1或抗TCRvb12-3/4v1进行了一系列类似的实验，以进一步评估与抗CD3ε抗体相比，使用抗TCRβV抗体激活/扩增的T细胞的细胞因子释放谱。如上所述，将PBMC在包被有固定化抗TCRβV抗体抗TCRβV6-5v1或抗TCRvb12-3/4v1；或抗CD3ε抗体OKT3或SP37-2；同种型对照；或抗TCRβV6-5v1组合的细胞培养板中培养。将细胞培养1-8天，收集上清液，并使用Meso Scale Discovery(MSD)测定来分析细胞因子。数据来自2个供体并代表2个独立实验。
数据证实，与任一抗CD3ε抗体(OKT3或SP37-2)相比，由抗TCRβV抗体、抗TCRβV6-5v1或抗TCRvb12-3/4v1激活/扩增的T细胞分泌更低水平的IFNγ(图87A)、IL-1β(图87B)、IL-4(图87C)、IL-6(图87D)、IL10(图87E)、TNFα(图87F)；和更高水平的IL-2(图87G)。还测试了IL-12p70(图87H)、IL-13(图87I)、IL-8(图87J)、外毒素(Exotaxin)(图87K)、外毒素-3(图87L)、IL-8(图87M)、IP-10(图87N)、MCP-1(图87O)、MCP-4(图87P)、MDC(图87Q)、MIP-1a(图87R)、MIP-1b(图87S)、TARC(图87T)、GMCSF(图87U)、IL-12-23p40(图87V)、IL-15(图87W)、IL-16(图87X)、IL-17a(图87Y)、IL-1a(图87Z)、IL-5(图87AA)、IL-7(图87BB)、TNF-B(图87CC)和VEGF(图87DD)的分泌。
除了确定用αTCRβV抗体αTCRβV6-5v1和αTCRβV6-5v2(如上所述)激活的T细胞的细胞因子谱；使用识别不同克隆型的另外αTCRβV抗体进行测定。
在一系列实验中，测试的抗体包括抗TCRvb12-3/4v1、抗TCRvb10和抗TCRvb 5。根据上述方案，将人PBMC用指定的T细胞激活抗体(抗TCRvb12-3/4v1、抗TCRvb10、抗TCRvb 5或抗CD3ε抗体SP34)以100nM进行固相刺激(板包被)。第1天至第8天收集上清液；并且使用Meso Scale Discovery(MSD)测定来定量细胞因子。图88提供了不同克隆型之间序列的图形表示，突出了在这一系列实验中测试的四个亚家族。用抗TCRvb12-3/4v1抗体(图89A)、抗TCRvb10抗体(图89B)或抗TCRvb抗体(图89C)激活/扩增的PBMC与用抗CD3ε抗体SP34-2激活/扩增的PBMC相比表现出更低水平的与细胞因子释放综合征相关的细胞因子(包括IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-10)的分泌。
在第二系列实验中，测试的抗体包括抗TCRVβ抗体：BJ1460、BJ1461、BJ1465、BJ1187、BJM1709；抗CD3ε抗体OKT3和仅有细胞的对照。在第0天，来自供体10749的PBMC与来自两个新鲜供体(13836和14828)的PBMC一起解冻并计数。将180uL的X-vivo培养基/孔(1x10e6个细胞/mL)中的200,000个PBMC添加到圆底96孔板中—一个供体用1/3板。将100nM或15μg/mL的20uL的10X TCRVβ抗体添加到板的孔中，并且一式三份的孔中仅添加细胞。将板保持在具有5％ CO2的37℃培养箱中。用选定的抗体刺激细胞3天，并从板上收获50μL上清液并在-20℃下储存。将50μL培养基添加回每个孔中，并将板保持在具有5％ CO2的37℃培养箱中。在第6天，从板的每个孔中收获50uL上清液并在-20℃下储存。将来自一式三份中的两个孔的细胞合并并添加补充有huIL-2的培养基，将每个供体的细胞悬浮液转移到12孔板中。将细胞温育过夜以允许在IL-2中静置和扩增。随后对细胞进行特异性Vβ-克隆染色，以通过FACS分析检测特异性Vβ-克隆扩增。培养基中的细胞因子浓度(包括IFNγ、IL-10、IL-17A、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6和TNFα)在第3天和第6天上清液样品中使用Meso ScaleDiscovery(MSD)测定进行分析。数据证实，使用抗TCRβV抗体—BJ1460、BJ1461、BJ1465、BJ1187、BJM1709—中的任一者激活/扩增的PBMC细胞分泌更低水平的IFNγ(图90A)、IL-10(图90B)、IL-17A(图90C)、IL-1α(图90D)、IL-1β(图90E)、IL-6(图90F)、TNFα(图90G)；和更高水平的IL-2(图90H)。FACS分析进一步显示了表达所示TCRVβ克隆的T细胞的扩增(图91)。
在第三系列实验中，测试的抗体包括抗TCRVβ抗体：BHM1675、BJM0816、BJ1188、BJ1189、BJ1190；和抗CD3ε抗体SP34-2。将指定抗体以在PBS中100nM或15μg/mL的浓度以200μl/孔包被到96孔圆底板中在4℃下过夜或在37℃下至少2小时。第二天用200μL的PBS和来自供体CTL_123、CTL_323和CTL_392的0.2x10^6PBMC/孔清洗板。在第1、3、5和7天收集上清液样品。对上清液进行10-plex Meso Scale Discovery(MSD)测定以确定细胞因子(包括IFNγ、IL-10、IL-17A、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-2)的浓度。第7天后，将细胞沉淀并添加到补充有IL-2的培养基中，再保持一天以进行扩增。通过FACS染色分析表达TCRVβ克隆的T细胞的扩增，其中使用相同的激活抗体，然后是二级抗人/小鼠FITC抗体。还使用BHM1675、BJM0816、BJ1189和BJ1190抗体对活/死、CD4+和CD8+ T细胞进行染色。数据证实，使用抗TCRβV抗体—BHM1675、BJM0816、BJ1188、BJ1189、BJ1190—中的任一者激活/扩增PBMC细胞分泌更低水平的IFNγ(图92A)、IL-10(图92B)、IL-17A(图92C)、IL-1α(图92D)、IL-1β(图92E)、IL-6(图92F)、IL-4(图92G)；和更高水平的IL-2(图92H)。FACS分析进一步显示TCRVβ亚克隆T细胞被它们各自的激活抗体扩增(图93)。
在第四系列实验中，测试的抗体包括抗TCRVβ抗体：BJ1538、BJ1539、BJ1558、BJ1559、BHM1709；和抗CD3ε抗体OKT3。将指定抗体以在PBS中100nM或15μg/mL的浓度以200μl/孔包被到96孔圆底板中在4℃下过夜或在37℃下至少2小时。第二天用200μL的PBS和来自供体10749、5078和15562(冷冻和解冻样品)的0.2x10^6PBMC/孔清洗板。在第3天和第6天收集上清液样品。对上清液进行10-plex Meso Scale Discovery(MSD)测定以确定细胞因子(包括IFNγ、IL-10、IL-17A、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-4、TNFα和IL-2)的浓度。数据证实，使用抗TCRβV抗体—BJ1538、BJ1539、BJ1558、BJ1559、BHM1709—中的任一者激活/扩增的PBMC细胞分泌更低水平的IFNγ(图94A)、IL-10(图94B)、IL-17A(图94C)、IL-1α(图94D)、IL-1β(图94E)、IL-6(图94F)、IL-4(图94G)、TNFα(图94H)；和更高水平的IL-2(图94I)。
总之，数据显示识别不同TCRvb亚家族(或亚型)的抗TCRvb抗体具有相似的细胞因子谱，并且不会诱导与CRS相关的细胞因子。
实施例29：抗TCRvb在没有交联的情况下不会激活T细胞
为了评估二价抗TCRvb抗体是否在不发生交联的情况下激活T细胞—用抗TCRvb(TCRvb 6-5v1)或抗CD3e(SP34)(无论是板包被还是在溶液中)刺激来自2个供体的纯化的T细胞。在激活后第1、3、5和7天收集上清液。使用MSD 10plex试剂盒(IFN-g、IL-10、IL-15、IL-17A、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6和TNF-a)检测细胞因子分泌。
结果表明，与固定化的抗TCRvb 6-5v1抗体激活/扩增的PBMC(允许交联)相比，溶液中的抗TCRvb 6-5v1抗体激活/扩增的PBMC不诱导非常少的IFNγ分泌(图95A和图95B)。结果显示溶液中的抗TCRvb6-5v1抗体激活/扩增的PBMC不诱导非常少或不诱导IL-1b(图95C)、IL-10(图95E)、IL-15(图95F)、IL-17A(图95G)、IL-1a(图95H)、IL-1b(图95I)、IL-2(图95J)、IL-4(图95K)、IL-6(图95D)和TNF-a(图95L)分泌。总之，数据显示抗CD3ε在溶液中激活T细胞(没有交联)；而抗TCRvb抗体在溶液中不激活T细胞。
实施例30：具有不同序列的两种抗TCRVβ5-5、5-6抗体竞争与TCRVB的结合
本实施例描述了两种抗TCRVβ5-5、5-6抗体与它们共有的TCRVB抗原结合的表位竞争。TM23和MH3-2抗体都与TCRVβ5-5、5-6结合。然而，TM23和MH3-2抗体不共有实质性序列同源性。
如图25A-25B所示，本文所述的抗TCRβV抗体分子识别TCRBV蛋白上的结构保守结构域(如图25A中的圆圈区域所示)，但它们之间具有低序列相似性。为了测试不共有实质序列同源性的两种抗TCRVβ5-5、5-6抗体是否可以竞争与TCRBV抗原的结合，进行了竞争测定。
纯化的MH3-2抗体与AF647缀合。来自两个供体的T细胞与500nM的TM23抗体预温育或不处理。然后用缀合至AF647的MH3-2抗体对T细胞进行染色。
结果显示T细胞与TM23抗体的预温育阻断了MH3-2的结合(图96和图97)。数据显示TM23抗体与MH3-2抗体竞争结合相同的表位，尽管两种抗体具有不同的序列。该数据证实了以下观察结果：彼此之间具有低序列相似性的抗TCRβV抗体分子结合并识别TCRBV蛋白上的结构保守表位。
实施例31：抗TCRVβ6-5抗体扩增的T细胞的多功能强度指数
将PBMC的多功能强度指数(PSI)与抗CD3ε抗体扩增的CD4+ T细胞(图98A)和CD8+T细胞(图98B)和抗TCRVβ6-5抗体扩增(药物扩增的T细胞)的CD4+ T细胞(图98A)和CD8+ T细胞(图98B)进行比较。PSI被定义为样品中多功能细胞的百分比乘以分泌的细胞因子的强度。数据显示，在用抗TCRVβ6-5抗体扩增的组中，CD4+ T细胞(图98A)和CD8+ T细胞(图98B)中的PSI上调更大。
实施例32：如本文所述多功能多肽分子与可溶性TCR和表达TCR的Jurkat细胞的结合
在本实施例中，测试了如本文所述的多功能多肽分子对TCR的结合亲和力。
表达TCR的Jurkat细胞在4摄氏度下用浓度渐增的如本文所述的多功能多肽分子或对照TCRvb抗体染色30min。随后，用PBS缓冲液洗涤细胞，并且通过PE标记的抗人Fc抗体检测结合到细胞的表面的抗体。将阳性染色细胞的百分比相对于浓度进行印迹。将如本文所述的多功能多肽分子与可溶性TCR的结合绘制成图。计算如本文所述的多功能多肽分子与可溶性TCR结合的Kd。
如本文所述的多功能多肽分子经由抗人Fc抗体固定在CM5系列S传感器芯片上至50RU。将可溶性TRBV抗原稀释至例如500nM，然后连续稀释两倍。测量缔合和解离的持续时间。该测定在1x HBS-EP+缓冲液pH 7.4中并且在25℃下进行。使用1:1结合模型评估数据是否合适。将如本文所述的多功能多肽分子或对照抗TCRvb抗体与在Jurkat细胞上表达的TCR的结合绘制成图。计算如本文所述的多功能多肽分子的EC50，并且与抗TCRvb抗体的EC50进行比较。
实施例33：如本文所述的多功能多肽分子的体外和体内表征
本实施例描述了鼠抗TCRvb抗体和如本文所述的多功能多肽分子的特征。与人克隆型(亚家族)相似，小鼠中的TCRb可变链基因座由31个不同的家族组成，共有35个亚家族，其中23个被功能性表达。已经鉴定出用于小鼠品系C57BL/6的替代TCRvb克隆型抗体，其与人TCRvb抗体共享相似的特征。该抗小鼠TCRvb抗体特异性地结合至C57BL/6小鼠中的TCRvb，它们在所有T细胞的约15％上表达。与人TCRvb特异性抗体类似，该鼠TCRvb特异性抗体在体外诱导鼠T细胞增殖和类似的细胞因子谱。抗TCRvb抗体的发现将能够在完全免疫活性小鼠模型中评估TCRvb介导的T细胞激活和重定向的细胞杀伤，以及评估体内的记忆抗肿瘤应答。
首先，测试了如本文所述的多功能多肽分子的体外功能活性。从C57BL6小鼠中新鲜分离脾单核细胞，用如本文所述的多功能多肽分子处理。评估分离的细胞的TCRvβ+T细胞结合、扩增和激活。用例如0.0008-200nM剂量(4倍稀释)的在含有10％ FBS的RPMI-1640或单独的培养基中的如本文所述的多功能多肽分子处理细胞持续例如6天。在例如第3天和第6天，使用如下所示的示例性抗体通过流式细胞术分析细胞：
表18.
| 初级Ab | 次级Ab |
| eFLuor780 | 存活力 |
| CD20 | A647 |
| CD3 | BV421 |
| TCRvβ13-2/3 | PE |
| CD25 | FITC |
将与来自C57BL6小鼠的脾T细胞特异性结合的如本文所述的多功能多肽分子绘制成图。分别在例如第3天和第6天分析mTCRvβ+T细胞的活化和扩增。如本文所述的多功能多肽分子的体外表征预期显示如本文所述的多功能多肽分子用作同系肿瘤模型研究的替代工具。
接下来，用如本文所述的多功能多肽分子进行体内实验。在第0天，基于体重，将8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分成三组(例如，n＝5只/组)。向小鼠静脉注射一次PBS，例如0.1mg/kg和1mg/kg的如本文所述的多功能多肽分子。在第3天，处死小鼠并收获全血和脾脏。对组织进行流式细胞术并检查B细胞、NK细胞、TCRvb+细胞和CD3+细胞。
预期如本文所述的多功能多肽分子在体内、血液和脾脏中扩增小鼠NK细胞。该研究还预期证明如本文所述的多功能多肽分子在指定剂量和研究的持续时间下是否可耐受。
实施例34：如本文所述的多功能多肽分子的靶细胞裂解和细胞因子谱本实施例描述了用如本文所述的多功能多肽分子有效裂解靶细胞并减少CRS相关的细胞因子分泌。
为了测试靶细胞杀伤，将αTCRvβ预扩增的T细胞与靶细胞(例如Raji靶细胞)在如本文所述的多功能多肽分子或αTCRvβ抗体的存在下温育24小时。如下通过KILR细胞毒性和细胞因子定量评估靶细胞裂解。从全血中分离人PBMC。从分离的PBMC中，使用磁珠分离(阴性选择)(Miltenyi biotec)分离人CD3+ T细胞，并且通过例如100nM的固定化(板包被)抗TCRVβ13.1(例如A-H.1或BHM1709)激活6天。然后将激活的T细胞(来自板包被的)转移并在组织培养瓶中在例如50U/ml的浓度下扩增另外2天。将经扩增的TCRVβ13.1洗涤并且在靶细胞(例如Raji细胞)(E:T比例为5:1)和连续稀释浓度的如本文所述的多功能多肽分子和抗TCRVβ(用作对照)的存在下共培养例如24小时。在例如24小时后，收集细胞共培养上清液并针对特定靶细胞死亡进行定量。靶细胞(Raji细胞)是KILR-逆转录颗粒报告细胞测定(DiscoverX)。
KILR-Raji靶细胞经工程化以使用KILR逆转录颗粒稳定表达经增强型ProLabel(ePL)(β-gal报告片段)标记的蛋白质，当其膜因细胞死亡而受损时，它会将经标记的蛋白质释放到培养基。通过添加含有β-gal报告子的酶受体(EA)片段的检测试剂，在培养基/上清液中检测KILR报告蛋白。这导致活性β-gal酶的形成，该酶水解底物以产生化学发光输出(RLU)。使用以下公式计算靶细胞死亡的百分比(％)：(RLU处理-RLU不处理)/(RLU最大裂解-RLU不处理)x100。预期由如本文所述的多功能多肽分子预扩增的T细胞(TrEK)在低效应子下可有效杀死Raji靶细胞。如本文所述的多功能多肽分子可能需要时间来分化和扩增TCRvβ+T细胞。
为了确定固定化抗TCRvβ抗体引起的CRS相关细胞因子诱导的缺乏是否可以由如本文所述的多功能多肽分子重现，在存在例如3nM的如本文所述的T细胞激活多特异性分子多肽分子的情况下温育人PBMC。在第1天至第6天收集上清液，并且通过使用MSD来定量细胞因子。在CRS相关细胞因子的水平延迟和降低的背景下，如本文所述的多功能多肽分子可以显示细胞因子产量增加。
实施例35：如本文所述的多功能多肽分子的细胞因子谱
本实施例描述了在由如本文所述的多功能多肽分子激活后由PBMC分泌的细胞因子。为了比较，也分析了抗TCRβ恒定1(TRBC1)抗体的激活。
简而言之，从全血中分离人PBMC，然后用分子H或抗体F以100nM进行固相(板包被)刺激。在例如第1、2、3和5天(对于分子H)或第2和5天(对于抗体F)收集上清液，随后对例如IFNγ、IL-2、IL-1β、IL-6、IL-10和TNFα进行多重细胞因子分析，使用MSD(Meso ScaleDiscovery)平台，按照制造商的方案进行定量。预期如本文所述的多功能多肽分子的细胞因子谱不同于抗CD3抗体OKT3或抗TRBC1抗体F的细胞因子谱。
实施例36：如本文所述的多功能多肽分子在小鼠中的药代动力学(PK)谱本实施例描述了如本文所述的多功能多肽分子在小鼠中的药代动力学(PK)谱，以指导功效研究的给药和/或计划治疗决策。示例性的研究设计在图99中示出。简而言之，在第0天，6-8周龄的雌性NSG小鼠被皮下植入例如1×106个Raji白血病细胞。在第2天，通过经由腹膜腔注射10×106个人PBMC使小鼠人源化。在第9天，用单剂量的如本文所述的多功能多肽分子静脉内治疗小鼠。在0、0.5、1、6、24、48、72、96、148小时(每个时间点n＝3)通过颌下放血从动物收集血清。通过夹心ELISA来测量血清药物浓度。
计算如本文所述的多功能多肽分子在携带肿瘤的人源化NSG动物中的血清半衰期。该数据有望实现疗效研究的剂量和方案。在该剂量下的暴露允许高于细胞EC90的覆盖率。
实施例37：如本文所述的多功能多肽分子的优化
如本文所述的多功能多肽分子被优化以提高对人和食蟹猴抗原的亲和力，提高热稳定性，并且去除可能造成化学稳定性问题的序列基序。例如使用随机诱变(Caldwell等人(1992)Randomization of genes by PCR mutagenesis.PCR Meth.Appl.2:28)或Kunkel诱变的修改版本(Kunkel TA.(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesiswithout phenotypic selection.PNAS 82(2):488-92)构建TCRβV结合部分的ScFv文库。为了提高亲和力，使用标准噬菌体展示(Lee,CM等人(2007)Selection of human antibodyfragments by phage display.Nature protocols2,3001)和酵母展示技术(Chao G等人(2006)Isolating and engineering human antibodies using yeast surfacedisplay.Nature Protocols.1(2):755-69)进行文库选择vs人和食蟹猴抗原。噬菌体或酵母群体的热激发用于选择具有改善的热稳定性的克隆。选择之后是标准筛选方法，诸如ELISA和流式细胞术，以鉴定具有改进特性的单个克隆。在命中测序和突变活性相关性分析之后，使用上述相同方法构建第二代文库。如上重复文库选择和个体克隆筛选，其中修改是应用更严格的条件来选择具有最大活性的克隆。在命中测序后，TCRβV结合部分的scFv基因被重新格式化为生物学相关的抗体格式，用于表达、纯化和分类。实施例38：如本文所述的多功能多肽分子在皮下人类肿瘤异种移植模型中的治疗功效
本实施例证明了如本文所述的多功能多肽分子在皮下人类肿瘤动物模型中的体内功效。
在研究的第1天，例如，在雌性NOD/SCID/IL-2Rγnull(NSG)小鼠的右背侧皮下注射稳定表达萤火虫荧光素酶的人癌细胞系Raji(Raji-luc)的1×106个细胞。在第3天，例如，通过注射到腹膜腔中将10×106个人PBMC移植到小鼠中。
用如本文所述的多功能多肽分子的治疗在第10天开始，此时肿瘤已经达到例如80mm3的平均肿瘤体积(TV)。在治疗开始时，每组的平均TV与任何其他组没有统计学差异。每三天用例如0.2mg/kg、1mg/kg和5mg/kg的如本文所述的多功能多肽分子通过静脉内团注注射来治疗小鼠，总共例如7次剂量。每3天通过卡尺测量肿瘤体积(TV)，并且通过TV的组间比较评估进展。肿瘤生长抑制T/C[％]被计算为T/C[％]＝100x(分析组的平均TV)/(媒介物组的平均TV)。与媒介物对照治疗相比，用如本文所述的多功能多肽分子治疗预期抑制肿瘤生长。预期结果将证明如本文所述的多功能多肽分子抑制肿瘤生长并且具有抗肿瘤活性。
实施例39：如本文所述的多功能多肽分子在人类肿瘤异种移植模型中的治疗功效
本实施例证明了如本文所述的多功能多肽分子在异种移植动物模型中的体内功效。
在研究的第1天，例如，通过注射到腹膜腔中，将10×106个人PBMC移植到NOD/SCID/IL-2Rγnull(NSG)小鼠中。在第7天，例如，将稳定表达萤火虫荧光素酶的人癌细胞系Raji(Raji-luc)的1×106个细胞静脉注射到NOD/SCID/IL-2Rγnull(NSG)小鼠中。对照动物被注射例如稳定表达萤火虫荧光素酶的人对照癌细胞系K562(K562-Luc)的10×106个细胞。这些动物用于评估如本文所述的多功能多肽分子的特异性杀伤能力。用如本文所述的多功能多肽分子的治疗开始于第16天，此时肿瘤移植物已经达到例如4×107个光子/s的平均生物发光通量水平。在治疗开始时，每组的平均通量水平与任何其他组没有统计学差异。每三天用例如1mg/kg和5mg/kg的如本文所述的多功能多肽分子通过静脉内团注注射治疗小鼠，总共例如6次剂量。每周通过生物发光成像测量肿瘤负荷，并且通过总生物发光通量(总通量)的组间比较评估进展。肿瘤生长抑制T/C[％]被计算为T/C[％]＝100x(分析组的平均总通量)/(媒介物组的平均总通量)。
预期结果将证明如本文所述的多功能多肽分子抑制肿瘤生长并且具有抗肿瘤活性。
实施例40：如本文所述的多功能多肽分子在人类肿瘤异种移植模型中的治疗功效
本实施例证明了如本文所述的多功能多肽分子在异种移植动物模型中的体内功效。
在第1天，例如，将稳定表达萤火虫荧光素酶的人癌细胞系RPMI-8226(RPMI-8226-luc)的20×106个细胞静脉注射到NOD/SCID/IL-2Rγnull(NSG)小鼠中。在第11天，例如，通过注射到腹膜腔中将10×106个人PBMC移植入到小鼠中。用如本文所述的多功能多肽分子的治疗在例如第17天开始，此时肿瘤移植物已经达到例如4×107个光子/s的平均生物发光通量水平。通过静脉内团注注射，用例如0.5mg/kg的如本文所述的多功能多肽分子每周一次治疗小鼠，总共例如2次剂量。
每周通过生物发光成像测量肿瘤负荷，并且通过总生物发光通量(总通量)的组间比较评估进展。肿瘤生长抑制T/C[％]被计算为T/C[％]＝100x(分析组的平均总通量)/(媒介物组的平均总通量)。
与媒介物对照治疗相比，用如本文所述的多功能多肽分子的治疗预期抑制肿瘤生长。预期结果将证明如本文所述的多功能多肽分子抑制肿瘤生长并且具有抗肿瘤活性。
实施例41：双特异性的产生
所有编码双特异性分子的DNA序列都由GeneArt合成并且克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.4中。ExpiCHO表达系统用于表达BKM0186。根据制造商的方案，ExpiCHO-S细胞在ExpiCHO表达培养基中生长至最佳转染密度和存活力。根据制造商的方案，使用ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒瞬时转染细胞。每条链以1:1:1wt/wt/wt的比率加入。使用最大滴度方案，其中在转染后的第二天，将ExpiFectamineTMCHO增强剂和ExpiCHOTM饲料加入到烧瓶中，然后将烧瓶转移到32℃培养箱中，该培养箱含有在空气中的5％ CO2的湿润气氛。在转染后第5天，加入第二体积的饲料，并且将烧瓶放回32℃/5％CO2培养箱，并在转染后第14天收获。通过离心收获细胞，并且随后使用0.22μm过滤器过滤。
在收获和过滤后，使用AKTAPure FPLC，以226cm/hr的流速，将澄清的细胞培养物上清液加载到填充有用Dulbecco的PBS pH 7.4平衡的MabSelect SuRe树脂的40mL柱上。用20倍柱体积(CV)的DPBS洗涤该柱，或者直到UV280达到基线。然后用5倍柱体积的20mM柠檬酸盐、150mM的NaCl pH 3.0洗脱BKM0186。洗脱液用10％ Tris-HCl pH 8.0中和。使用Nanodrop One-C利用消光系数对中和的洗脱液的浓度进行定量。在分析后，将蛋白A洗脱液在阳离子交换(CEX)缓冲液A:50mM MES、20mM NaCl pH 5.6中稀释10倍，并且应用于使用AKTA Pure FPLC以458cm/h用缓冲液A平衡的Mono STM10/100GL柱。在用缓冲液A进行10CV洗涤步骤后，用20CV 0-50％梯度的缓冲液B:50mM MES，1M NaCl，pH 5.6洗脱双特异性。汇合含有目标蛋白质(POI)的主峰。使用用制剂缓冲液(20mM组氨酸，7％蔗糖，0.02％吐温80，pH6.0)平衡的HiPrep 26/10脱盐柱，在AKTA Pure FPLC上以113cm/hr的流速对CEX池进行缓冲液交换。经由分析性SEC(aSEC)和SDS-PAGE对配制的材料进行定量和分析，以确定纯度。
在Agilent 1100HPLC上，使用用50mM磷酸钠、300mM NaCl pH7.0以0.35mL/min平衡的AdvanceBio SEC 300A 2.7um 4.6x300 mm SEC柱进行分析性SEC。SDS-PAGE凝胶用考马斯蓝染料染色。
实施例42：等离子体共振(SPR)结合
在Biacore T200仪器上通过表面等离子体共振(SPR)分析双特异性受体和相关受体之间的所有相互作用。
经由人Fc抗体将2ug/mL的BKM0186固定在Series S CM5芯片上至80RU。将人IL2Ra和食蟹猴IL2Ra稀释至500nM，将人IL2Rβ-γ和食蟹猴IL2Rβ-γ稀释至125nM，并且将人IL2R三聚体复合物稀释至50nM，然后在1x HBS-EP+缓冲液中连续稀释两倍，总共10个浓度。运行多循环动力学，其中在每个循环之间用3M氯化镁再生芯片，随后注射新的BKM0186。在30uL/min下，缔合时间为120秒并且对于人和cyno IL2Ra，解离时间为150秒，对于人和cyno IL2Rβ-γ，解离时间为300秒，并且对于人IL2R三聚体复合物，解离时间为900秒。该测定在1xHBS-EP+缓冲液pH 7.4和25℃下运行。使用未用BKM0186处理的参比流动池和单独的缓冲液空白循环，通过双参比扣除法来校正传感图。使用BIAevaluation软件进行数据分析，并且使用1:1Langmuir结合模型拟合数据以用于计算KD值(Koff/Kon)。由于针对人和cyno IL2Ra结合观察到的更快的解离速率，因此使用稳态模型拟合数据，其中分析了平衡结合响应。
经由人Fc抗体将2ug/mL的BKM0186固定在Series S CM5芯片上至80RU。将人Vβ6TCR和食蟹猴Vβ6TCR稀释至250nM，然后在1x HBS-EP+缓冲液中连续稀释两倍，总共10个浓度。以30uL/min进行多循环动力学研究，其中缔合时间为120秒并且对于人Vβ6TCR，解离时间为600秒，对于食蟹猴Vβ6TCR，解离时间为300秒。该测定在25℃下在1x HBS-EP+缓冲液pH7.4中运行。使用未用BKM0186处理的参比流动池，通过参比扣除法来校正传感图。使用BIAevaluation软件进行数据分析，并且使用1:1Langmuir结合模型拟合数据以用于计算KD值(Koff/Kon)。
如通过表面等离子体共振(SPR)评估的，BKM0186对人和食蟹猴vβ6TCR两者都具有高亲和力结合(表19)。此外，BKM0186表现出与人和食蟹猴IL-2Rα和IL-2Rβγ异二聚体相当的结合，并且结合亲和力与先前报道的值大致一致。
如使用PBMC的FACS分析评估的BKM0186与T细胞的结合进一步证明了BKM0186对Vβ6T细胞的高度选择性，其中没有观察到与任何其他免疫细胞的可测量结合(图104)。
表19.使用表面等离子体共振(SPR)测量的BKM0186与同源结合受体的结合亲和力
| 抗原 | BKM0186(KD) |
| 人TCRVβ | 1.7nM |
| Cyno TCRVβ | 4.9nM |
| 人IL-2Rα | 45nM |
| Cyno IL-2Rα | 48nM |
| 人IL-2Rβγ | 3.8nM |
| Cyno IL-2Rβγ | 3.3nM |
| 人IL-2Rαβγ | 0.1nM |
实施例43：BKM0186与PBMC混合物中T细胞的选择性结合
将正常健康供体人PBMC以2百万个细胞/mL重悬于PBS中，并且向圆底组织培养处理的无菌板的每个孔中加入100μL。在用固定活性染料染色后，将适量的市售荧光染料标记的表面抗体(图1)加入到合适的样品孔中。将板涡旋并在2-8℃(冷藏)下在黑暗中温育30分钟。在组1染色后，将板离心(设定为400×g；5分钟；RT)，吸出上清液并用200μL的1％ BSAPBS洗涤两次。然后将组1的细胞沉淀物重悬于0.2mL的1％ PFA中，然后转移至96孔u形底板用于分析。
表20.使用的示例性抗体
| # | 抗体 | 缀合物 | 克隆 | 供应商 |
| 1 | CD4 | BV7185 | L200 | BD |
| 2 | CD8 | BV650 | RPA-T8 | BD |
| 3 | CD2 | Per Cp Cy5.5 | RPA-2.10 | BioLegend |
| 4 | CD3 | BV605 | 10D12 | Miltenyi |
| 5 | NKG2A | PE | Z199 | Beckman Coulter |
| 6 | TCRvβ | AF647(读作APC) | ----- | Marengo |
| 7 | CD20 | PE Cy7 | J3.119 | Beckman Coulter |
| 8 | CD14 | FITC | M5E2 | BioLegend |
| 9 | 活/死 | NUV450 | N/A | ThermoFisher |
如使用PBMC的FACS分析评估的BKM0186与T细胞的结合进一步证明了BKM0186对Vβ6T细胞的高度选择性，其中没有观察到与任何其他免疫细胞的可测量结合(图104)。
实施例44：BKM0186与表达Vβ6TCR和/或CD25的纯T细胞的结合经由autoMACS上的阴性选择从PBMC中分离出泛T细胞。对T细胞进行TCRVβ6-5染色，并且在Sony SH800细胞分选仪上分选到细胞培养基中。分选的TCRVβ6-5T细胞和未分选的泛T细胞使用抗CD3/CD28珠激活并扩增，然后用IL-2培养。允许部分激活的T细胞在无血清培养基中静置3天。抗CD25FACS染色以确认CD25上调(来自激活)和下调(来自静止)。检查代表TCRVβ6-5(pos)CD25(hi)、TCRVβ6-5(pos)CD25(低)、TCRVβ6-5(neg)CD25(hi)、TCRVβ6-5(neg)CD25(低)的T细胞是否与BKM0186构建体结合。
如图105所示，与非Vβ6CD25Hi T细胞(正方形)和Vβ6CD25低T细胞(三角形)相比，作为协同结合的结果，BKM0186显示以更高的亲合力结合Vβ6CD25Hi T细胞(圆形)，其中结合EC50为0.5nM。这种亲合力效应证实BKM0186经由顺式结合模式与Vβ6和IL-2R接合。
实施例45：原代人外周血单核细胞(PBMC)的体外T细胞刺激和扩增
使用密度梯度分离从血液白细胞单采样品中分离外周血单核细胞。在加入在X-Vivo 15培养基中培养5天，在37℃下温育的BKM0186(浓度在文本中规定)的情况下，从外周血单核细胞刺激并扩增人T细胞。
当在37℃下在健康人PBMC中评估超过5天的时间段时，BKM0186与Vβ6T细胞的结合导致仅Vβ6T细胞的选择性扩增。图106显示了人CD4+和CD8+ T细胞两者中BKM0186介导的激活(CD25表达)和扩增(对于Vβ6TCR阳性)的浓度-效应曲线。这些图显示了Vβ6T细胞的增殖程度占总CD8+和CD4+ T细胞群的比例，其中EC50分别为6和12nM。在经扩增的CD4+和CD8+Vβ6T细胞中CD25的显著上调表明了这些细胞的激活状态。在人PBMC中的另外的体外激活测定证明了特别是在CD8+ T细胞上其他激活标志物(例如，颗粒酶B、CD69、ICOS等)的上调，进一步表征了它们的细胞毒性潜力。
进一步评估了经扩增的CD4+和CD8+Vβ6T细胞的记忆亚池的各种标志物，这些标志物证明了经BKM0186处理的人PBMC向任一中央记忆(TCM)表型的一致转变。
使用相同的方案，如图124所示，证明了由另外的双特异性构建体BMM0317、BLM0318和BLM0321介导的TCRVβ+T细胞的扩增。
实施例46：体外TCR测序
使用Maxwell SimplyRNA试剂盒从T细胞中提取总RNA。使用Qubit高灵敏度RNA测定对RNA进行定量，并且使用Agilent Tape station分析质量。根据制造商的方案，使用用于人类细胞的SMARTer人TCR a/b分析试剂盒或SMARTer小鼠TCR a/b分析试剂盒来生成测序文库。然后合并最终文库，并且在Illumina MiSeq上测序(配对末端，300bp)。在修整后，对产生的数据进行解复用，并且执行FastQC。使用MiXCR pipeline工具将序列读数与数据集中TRA、TRB、TRD和TRG基因的TCR种系片段特异性比对，用于克隆型鉴定、CDR3序列和克隆型丰度。对TRBV基因进行计数，并且根据其特定的克隆型进行分组，并绘制成代表频率/丰度的柱形图。每个TRBV基因相对于相对丰度(其中1等于总TRBV基因的100％)作图，相当于总T细胞丰度。BKM0186选择性扩增携带TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5和RBV10-3的T细胞。(图107)
实施例47：BKM0186对TCRVβ6+T细胞的扩增和激活
将冷冻保存的PBMC解冻，并且在37℃下静置30min，然后以每孔3×105个细胞接种在96孔圆底板中。在X-Vivo 15培养基中稀释无菌生物素化的构建体，并且进行系列稀释。不含构建体(仅培养基)的孔用于确定背景信号。将细胞与构建体在37℃下一起温育5天。在第5天的早上，将Brefeldin加入到所有孔中，并且将细胞温育另外4小时。然后将细胞转移到V形底板用于染色。离心并洗涤细胞，然后用活性染料染色，随后用表面标志物、生物素化的TCRvB单克隆抗体和二级链霉亲和素抗体染色，以检测TCRvB结合的细胞和构建体两者。在彻底洗涤后，使用eBioscience FoxP3染色试剂盒来固定和透化细胞。将FoxP3、颗粒酶B和IFNg在透化缓冲液中染色。在用透化缓冲液洗涤后，将细胞重悬于流动缓冲液(PBS+BSA)中，并且在Cytek Aurora上运行。在FlowJo中进行分析。图108A显示了由BKM0186介导的CD4+ TCRVβ6+和CD8+TCRVβ6+T细胞的强烈扩增，而在对照RSV-IL2双特异性和抗TCRVβ6臂mAb的情况下观察到很少扩增或没有扩增，表明扩增由TCR和IL2R两者的交联介导。如图108B所示，BKM0186对TCRVβ6+T细胞的激活导致颗粒酶B和干扰素γ细胞因子的上调。
实施例48：记忆T细胞分化的评估
使用密度梯度分离从血液白细胞单采样品中分离外周血单核细胞PBMC。通过在溶液中添加10ng/ml的BKM0186或对照RSV-IL2，从外周血单核细胞中刺激和扩增人类T细胞，并且在X-Vivo 15培养基中培养7天，在37℃下温育。单价抗TCRVβ6抗体被固定到用于刺激的板上，以用作仅含TCRVβ的对照。在刺激后，使用(FITC)抗人CD45RA(克隆5H9)、(PE)抗人CCR7(克隆OX-108)、(BV-421)抗人CD4(克隆OKT4)、(PerCP-Cy5.5)抗人CD8克隆SK1)、生物素化的TCRVβ6单克隆抗体、AlexaFluor 647链霉亲和素抗体对PBMC进行CD3、CD4、CD8、CD45RA、CCR7和TCRVβ6染色，以用于流式细胞术分析。对TCRVβ6阳性染色的CD4或CD8 T细胞进行门控，以表征由BKM0186和对照处理介导的记忆表型表达。如图109所示，BKM0186在中央记忆(左上)和效应记忆(左下)象限中均显示出稳健的扩增。
实施例49：通过用BKM0186刺激PBMC介导的细胞因子诱导
使用中尺度检测(Meso Scale Detection)(MSD)免疫测定，进一步测定来自体外人PBMC刺激测定的上清液的炎性细胞因子水平。如图110所示，用BKM0186刺激人PBMC导致一些促炎细胞因子的适度释放。与发表的发现一致，这些细胞因子水平通常低于来自用抗CD3双特异性抗体刺激的人PBMC的测定水平。值得注意的是，在用BKM0186激活食蟹猴PBMC后的细胞因子释放谱与使用该测定刺激的人PBMC中的图谱相似。
实施例50：使用高含量分析(HCA)在自体TIL-PDX-O共培养物中评估BKM0186的结合离体细胞毒性
通过共聚焦高含量分析(HCA)，在自体TIL-PDX-O共培养物中，在0.3-10μg/mL的四个浓度范围内，对作为单一药剂的BKM0186进行离体评估，所述自体TIL-PDX-O共培养物来自4个患者衍生的Champions模型：CTG-3493、代表人类非小细胞肺癌的CTG-3571、代表人类直肠癌的CTG-3629和代表人类结肠直肠癌的CTG-3631。还通过相对类器官荧光强度和相对类器官面积来测定肿瘤细胞毒性。
使用共聚焦显微镜的高含量分析测定使用三种颜色开发。在共培养之前，用不同的染料标记TIL和PDX-O肿瘤细胞，并且在研究终点向共培养物中加入死细胞检测染料。在第3天，对冷冻保存的PDX片段进行解冻，计数，并且用CellTracker Deep Red(CTDR)染色。将染色的PDX片段洗涤并重悬于PDX类器官培养基中，并以50μl类器官培养基/孔大约5000个细胞的密度铺板在96孔板超低附着圆形底板中。允许在3天的时间段内形成类器官。在三天后，在第0天，PDX-O匹配的TIL用Cell Trace Violet(CTV)染色。洗涤染色的TIL，重悬在TIL培养基中，并且在合适的孔中以大约25,000个细胞/孔的密度(在50μLd TIL培养基中)与匹配的PDX-O共培养。在同一天(第0天)，一式四份施用不同浓度的对照和BKM0186(在另外的50μL PDX-O培养基中)。在研究终点，第5天(在施用TIL和测试药剂/对照后大约120小时)，将Dead 488探针直接加入到孔中以对死细胞进行染色。使用CellInsightCX7 LZR HCA仪器，在死细胞染色后约3小时，以4X放大倍数拍摄图像z堆叠。使用适合每个标志物的过滤器组来收集图像，并且使用HCS Cellomics Studio软件(每孔)进行分析。对于所有检查的模型，PDX-O细胞毒性通过检测类器官荧光强度进行定量，并且被报道为相对类器官荧光强度和相对类器官面积(针对同型分子归一化)。
在4个供体中的3个中，BKM0186有效地原位扩增并激活人TIL，其然后引发对周围肿瘤组织的有效杀伤，如由类器官大小的减小所代表的(图111)。与用临床可用的抗PD-1抗体(帕博利珠单抗(Pembrolizumab)；Keytruda)处理的相同样品相比，用BKM0186处理的样品的TIL扩增和人类肿瘤杀伤都显著更强。
实施例51：体内小鼠模型实验(同基因小鼠肿瘤研究)
由于人和小鼠或其他啮齿类物种在TRB基因座方面的有限同源性，不存在Vβ6基因的直接同源物(TRBV6)，因此BKM0186和BKM0281超越非人灵长类的物种交叉反应性的可能性非常低。因此，在同基因鼠肿瘤模型中进行的功效实验是用具有与人分子相似的分子构型的小鼠直向同源分子(mBKM0186和mBKM0281)进行的，该分子靶向并扩增表达Vβ13TCR的鼠T细胞，并且重现小鼠中BKM0186和BKM0281的免疫学。Vβ13T细胞是小鼠中最丰富的种系VβTCR变体之一，并且在所有携带肿瘤的小鼠的TIL中表达。
所有小鼠均从Jackson Laboratory获得。所有的程序都是按照既定的伦理法规进行的，并且得到了机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)(IACUC)的批准。
小鼠肿瘤细胞系RENCA(CRL-2947)、B16F10(CRL-6475)、CT26(CRL-2638)、RM1(CRL-3310)和EMT6(CRL-2755)获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)。MC38获自NIH(ENH204-FP)。测试细胞系的支原体和其他病原体，并且根据其指南进行培养。
BALB/c雌性小鼠被植入1×105个重悬于PBS中的RENCA细胞；5×104个重悬于PBS中的CT26或EMT6细胞。C57BL/6雌性小鼠被植入5×104个MC38；和2×104个重悬于PBS中的B16F10细胞。C57BL/6雄性小鼠通过在右侧中皮下注射被植入2×104个重悬于PBS中的RM1细胞。在肿瘤植入后，当肿瘤大小达到80-150mm3时，将小鼠随机分成治疗组(每组8-10只小鼠)。每天监测小鼠的发病率和死亡率。
通过腹膜内注射(第0天)鼠替代双特异性(1.0-1.5mg/kg)或PBS来施用抗体，每周一次，进行3-4次治疗。使用X和Y直径的卡尺测量来监测肿瘤随时间的生长，并记录体重。计算肿瘤体积[X*Y*(X/2)]。如IACUC方案CR-0147所示，当肿瘤体积达到2000mm3，或在1周时间内体重减轻超过20％时，对小鼠实施安乐死。将继续监测存活的治愈的小鼠，直到它们到达第100天。此外，在左侧用肿瘤细胞系再次激发无肿瘤治愈的小鼠，以评价记忆响应。
如图114中的Kaplan-Meier存活图和图113中的肿瘤生长曲线所示，mBKM0186导致所有模型(包括抗PD-1抗性RENCA、B16F10和RM1模型)中的肿瘤显著消退，从而导致存活的显著改善，除了在非常侵袭性的RM1模型中。在EMT6中，这种效应在QW IP 0.5、1和1.5mg/kg剂量的mBKM0186和mBKM0281的剂量范围中是剂量相关的，其中1mg/kg和1.5mpk的mBKM0186和1.5mpk的mBKM0281的每周剂量似乎是最佳的(图112)。此外，100％治愈的EMT6小鼠在用相应的肿瘤细胞再次激发后没有显示出肿瘤生长，证明了记忆的诱导。这种来自对小鼠中的肿瘤再次激发的长期保护似乎也是由于记忆CD8+Vβ13T细胞的积累(图115和图116)。总的来说，这些数据支持BKM0186作为单一药剂将在人体内促进有效和持久抗肿瘤响应的可能性。
实施例52：同基因模型中的药效学和机制研究
为了进一步探索所观察到的mBKM0186的抗肿瘤活性的潜在机制，通过流式细胞术和免疫组织化学(IHC)在组织切片上评估在用媒介物或mBKM0186处理后从鼠EMT6肿瘤分离的TIL的免疫谱。在用mBKM0186进行14天的QW给药(即，2次给药)后，与媒介物治疗的小鼠相比，观察到VβCD8+ T细胞在TIL中显著的积累。鉴于VβCD8+ T细胞的扩增程度，这反映在肿瘤中CD8+ T细胞数量的总体显著增加，其中显著比例显示溶细胞分子诸如颗粒酶B的上调(图117)。
重要的是，在用mBKM0186处理后，CD8+ T细胞和FoxP3+调节性T细胞(Treg)之间的比率也显著增加。为了证实mBKM0186扩增的VβCD8+ T细胞负责在同基因小鼠中观察到的抗肿瘤作用，在存在和不存在特异性VβT细胞耗尽抗体的情况下，用mBKM0186处理EMT6小鼠。如图118所示，mBKM0186的抗肿瘤作用在也接受了VβT细胞耗尽抗体的给药的小鼠中被消除，从而证实了经扩增和激活的VβT细胞群对于mBKM0186在小鼠中的功效的核心重要性。
实施例53：食蟹猴的体内实验
进行了多剂量的BKM0186和BKM0281的静脉(IV)输注的探索性研究，以评估初步的安全性和耐受性、药代动力学和药效学。所有研究都是在初始的雌性食蟹猴(原产于柬埔寨的食蟹猴，年龄为2.3-4.9岁，体重在2-4kg的范围内)中进行的。
对于药代动力学评估，使用MSD电化学发光(ECL)测定平台来测量BKM0186的浓度。该测定包括用于捕获BKM0186或BKM0281的板结合的TCRVβ6抗原试剂，然后是两步生物素化的抗人IL-2抗体和链霉亲和素-Sulfotag-TAG，用于检测药物复合物，其中有效的定量下限(LLoQ)为0.05nM。简而言之，用25uL/孔的TCRVβ6抗原包被板，在4℃下温育过夜，然后用250uL/孔的含有3％ BSA的PBS封闭2小时。将血清样品在PBS-T中以1:50稀释，以落入标准曲线的线性范围内(对于高于线性部分的样品，以1:200重新运行产生不属于标准曲线的线性范围的信号的样品；并且对于低于线性部分的样品以1:20重新运行产生不属于标准曲线的线性范围的信号的样品。将样品以25uL/孔加入到板中，一式两份，并且在4℃下温育过夜。加入25uL/孔的生物素化的抗IL2抗体，其在PBST+1％ BSA中的终浓度为5ug/mL，并且在室温(RT)下温育2小时。洗涤板，然后在RT下以25uL/孔向板中加入在PBST中的链霉亲和素-Sulfo-TAG的1:1000稀释液持续30分钟，然后洗涤。将在去离子水中的MSD阅读缓冲液A的1:4稀释液以150uL/孔加入到板中，然后在MSD板读取器上读取。用于计算分析物浓度的标准曲线通过将来自标准物的信号拟合到具有1/Y^2加权的4参数逻辑(或s形剂量响应)模型来建立。LLOQ从满足以下标准的标准曲线的最低浓度得出：CV％<20，并且回收率％85-115。
对于药效学评估，在一系列时间点对血液进行评估。使用流式细胞术对Vβ6T细胞的扩增和激活进行定量，对取自给药的猴的血液样品中的Vβ6CD8+ T细胞进行评估。通过IL2Rα(CD25)和炎性细胞因子IFNγ、TNFα和IL6的表达来测量T细胞激活。对于流式细胞术测定，每个染色的孔(96深孔板)使用50μL的全血(用于细胞表面染色)或95μL的全血(用于细胞内染色)。在细胞表面染色后，向每个孔中加入1.5mL的FACS裂解溶液1X，并且在RT下在黑暗中温育10分钟。温育后，立即将板离心(设定为400×g；5分钟；RT)，吸出上清液并用1700mL的染色缓冲液(PBS加上0.04％ BSA)洗涤。然后将细胞沉淀物重悬于在FACSFlow中稀释的0.4mL的0.05％福尔马林溶液中，并且转移至96孔u形底板中用于分析。对于细胞内染色，向每个孔中加入预热的1.8mL的1X LYSE/FIX缓冲液。将板置于培养箱中，并且设定以保持在37℃持续15min，并且离心(设定为600×g；8min；RT)，洗涤，并且在湿冰上重悬于1mL的冷Perm缓冲液III中持续30分钟。将抗体加入到适当的样品孔中用于染色。将板在设定为在黑暗中保持4℃的冰箱中温育60-70分钟。在温育后，将板洗涤两次(离心机设定为600×g；8分钟；4℃)，吸出上清液，然后将细胞沉淀物重悬于0.3mL的染色缓冲液中，并且转移至96孔u形底板用于分析。使用LSRFortessaTMII流式细胞仪和8.0.1软件来分析样品。使用非人灵长类细胞因子试剂盒(Millipore，#PRCYTOMAG-40k)按照制造商的说明来测量炎性细胞因子，并且使用Luminex BioPlex系统检测。
图119A和图119B(A&B)说明了所有IV剂量(30min输注)的浓度-时间曲线。在快速分布阶段后，BKM0186和BKM0281两者均以剂量依赖性方式快速从血液中清除，其中BKM0281与BKM0186相比显示出更快的清除。尽管清除很快，但BKM0186和BKM0281两者在整个剂量范围内在施用单次IV剂量的BKM0186和BKM0281的猴体内都显示了Vβ6CD8+ T细胞(占总CD8+T细胞区室的比例)(图120A和图120B)的持续扩增长达100小时，以及可溶性CD25(sCD25)(图121)(一种T细胞激活的血清标志物)的血清水平。相反，观察到Treg的最小扩增。细胞因子数据支持对MCP-1、MIP1β、IL-10、IL-1RA、IFN-γ(图123A和图123B)、IL-5和IL-6(图122A和图122B)的剂量依赖性测试制品作用。细胞因子数据支持对IL-4和IL-12/23(p40)的不确定作用。对于隔离的动物，存在两种细胞因子的可检测浓度；然而，因为它们的偶发性的存在和明确的剂量响应的缺乏，这些变化与IL2xTCRVβ施用的关系尚不确定。对IL-8、TNF-α、IL-2、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、GM-CSF或IL-1β不存在测试制品相关的影响。
虽然已经在本文中示出和描述了本发明的优选的实施方案，但对本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅通过实例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替换。应该理解，在实施本发明时，可以采用本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。本领域技术人员将会认识到或者能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在被所附权利要求涵盖。
表21.示例性的构建体序列
示例性实施方案
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子与TCRβV区的结合导致细胞因子谱不同于T细胞衔接物的细胞因子谱，所述T细胞衔接物结合至除TCRβV区以外的受体或分子(非TCRβV结合T细胞衔接物)。在一些实施方案中，非TCRβV结合T细胞衔接物包含结合至CD3分子(例如，CD3ε(CD3e)分子)或TCRα(TCRα)分子的抗体。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子进一步包含以下中的一种或多种：肿瘤靶向部分、细胞因子分子、基质修饰部分或除第一部分之外的抗TCRβV抗体分子。
在一些实施方案中，通过如本文所述的多功能多肽分子与TCRβV区结合而产生的细胞因子谱包含以下中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部：(i)IL-2的增加的水平，例如，表达水平和/或活性；(ii)IL-1β的降低的水平，例如表达水平和/或活性；(iii)IL-6的降低的水平，例如表达水平和/或活性；(iv)TNFα的降低的水平，例如表达水平和/或活性；(v)IL-10的降低的水平，例如表达水平和/或活性；(vi)IL-2的增加的水平，例如表达水平和/或活性的延迟，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多小时的延迟；(vii)IFNg的增加的水平，例如表达水平和/或活性的延迟，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时的延迟；或者(viii)IL-15的增加的水平，例如表达水平和/或活性，例如，其中(i)-(viii)是相对于非TCRβV结合T细胞衔接物的细胞因子谱。
在一些实施方案中，如通过实施例3的测定所测量的，例如，相对于由非TCRβV结合T细胞衔接物诱导的细胞因子风暴，如本文所述的多功能多肽分子与TCRβV区的结合导致细胞因子风暴减少，例如，细胞因子释放综合征(CRS)减少。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子与TCRβV区的结合导致以下中的一项、两项、三项或全部：(i)降低的T细胞增殖动力学；(ii)细胞杀伤，例如靶细胞杀伤，例如癌细胞杀伤，例如如通过实施例4的测定所测量的；(iii)增加的自然杀伤(NK)细胞增殖，例如扩增；或(vi)具有记忆样表型的T细胞群的扩增，例如，至少约1.1-10倍扩增(例如，至少约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍扩增)，例如，其中(ix)-(xii)相对于非TCRβV结合T细胞衔接物。在一些实施方案中，具有记忆样表型的T细胞群包含CD45RA+CCR7-T细胞，例如CD4+和/或CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子与选自以下的TCRβV亚家族中的一者或多者结合：(i)TCRβV6亚家族，其包含例如TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01中的一者或多者；(ii)TCRβV10亚家族，其包含例如TCRβV10-1*01、TCRβV10-1*02、TCRβV10-3*01或TCRβV10-2*01中的一者或多者；(iii)TCRβV5亚家族，其包含例如TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01、TCRβV5-1*01或TCRβV5-8*01中的一者或多者；(iv)TCRβV12亚家族，其包含例如TCRβV12-4*01、TCRβV12-3*01或TCRβV12-5*01中的一者或多者；(v)TCRβV27亚家族；(vi)TCRβV28亚家族；(vii)TCRβV4亚家族，其包含例如TCRβV4-1、TCRβV4-2或TCRβV4-3中的一者或多者；(viii)TCRβV19亚家族；(ix)TCRβV9亚家族；或(x)TCRβV11亚家族，其包含例如TCRβV11-2。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子：其(i)特异性结合至TCRβV上的表位，例如，与由如本文所述的抗TCRβV抗体分子(例如第二抗TCRβV抗体分子)识别的表位相同或相似的表位；(ii)显示与如本文所述的抗TCRβV抗体分子(例如第二抗TCRβV抗体分子)相同或相似的结合亲和力或特异性，或两者；(iii)抑制(例如竞争性地抑制)如本文所述的抗TCRβV抗体分子(例如第二抗TCRβV抗体分子)的结合；或(iv)与如本文所述的抗TCRβV抗体分子(例如第二抗TCRβV抗体分子)结合相同或重叠的表位。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含选自双特异性抗体分子、二价抗体分子或双互补位抗体分子的抗体分子。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含与两种不同TCRβV亚家族成员结合的双特异性抗体分子。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含重链，所述重链包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包含以下之一或两者：(i)在位置73处的苏氨酸，例如根据Kabat编号在位置73处的置换，例如谷氨酸到苏氨酸的置换；或(ii)在位置94处的甘氨酸，例如根据Kabat编号在位置94处的置换，例如精氨酸到甘氨酸的置换；其中所述置换是相对于人种系重链框架区序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含轻链，所述轻链包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包含在位置10处苯丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置10处的置换，例如丝氨酸到苯丙氨酸的置换，其中所述置换是相对于人类种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含轻链，所述轻链包含框架区，例如框架区2(FR2)，所述框架区包含以下之一或两者：(i)在位置36处的组氨酸，例如根据Kabat编号在位置36处的置换，例如酪氨酸到组氨酸的置换；或(ii)在位置46处的丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置46处的置换，例如精氨酸到丙氨酸的置换；其中所述置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含轻链，所述轻链包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包含在位置87处的苯丙氨酸，例如根据Kabat编号在位置87处的置换，例如酪氨酸到苯丙氨酸的置换，其中所述置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：(a)轻链可变区(VL)，所述VL包含：(i)表2的人源化B-H轻链(LC)的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个、两个或全部(例如三个)；和(ii)框架区(FR)，所述FR与表2的人源化B-H LC的框架区1(FR1)、框架区2(FR2)、框架区3(FR3)和框架区4(FR4)中的一个、两个、三个或全部(例如四个)具有至少95％序列同一性；和/或(b)重链可变区(VH)，所述VH包含：(i)表2的人源化B-H重链(HC)的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个、两个或全部(例如三个)；和(ii)框架区(FR)，所述FR与表2的人源化B-H HC的框架区1(FR1)、框架区2(FR2)、框架区3(FR3)和框架区4(FR4)中的一个、两个、三个或全部(例如四个)具有至少95％序列同一性。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含：(i)表2中列出的抗体B-H的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；或(ii)表2中列出的抗体B-H的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)，所述VH包含表2中列出的人源化抗体B-H的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部(例如三个)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含轻链可变区(VL)，所述VL包含表2中列出的人源化抗体B-H的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部(例如三个)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV包含：表2中列出的人源化抗体B-H的VH序列，或与表2中列出的人源化抗体B-H的VH具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的序列；和/或表2中列出的人源化抗体B-H的VL序列，或与表2中列出的人源化抗体B-H的VL具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含与表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4之一具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的框架区(FR)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含与表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4中的任何两种具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的框架区(FR)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含与表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4中的任何三种具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的框架区(FR)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含与表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4的全部具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的框架区(FR)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含与表2的人源化B-H HC的FR1、FR2、FR3和FR4之一具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的框架区(FR)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含与表2的人源化B-H HC的FR1、FR2、FR3和FR4中的任何两种具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的框架区(FR)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含与表2的人源化B-H HC的FR1、FR2、FR3和FR4中的任何三种具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的框架区(FR)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含与表2的人源化B-H HC的FR1、FR2、FR3和FR4中的全部具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的框架区(FR)。
在一些实施方案中，如本文所述多功能多肽分子与TCRβV区的结合导致IL-1β的表达水平和或活性的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000倍或至少2-10000倍的减少，如通过实施例3的测定所测量的。
在一些实施方案中，如本文所述多功能多肽分子与TCRβV区的结合导致IL-16的表达水平和或活性的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000倍或至少2-10000倍的减少，如通过实施例3的测定所测量的。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子与TCRβV区的结合导致TNFα的表达水平和或活性的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000倍或至少2-10000倍的减少，如通过实施例3的测定所测量的。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子与TCRβV区的结合导致IL-2的表达水平和或活性的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000倍或至少2-10000倍的减少，如通过实施例3的测定所测量的。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子结合至T细胞上的构象或线性表位。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子是完整抗体(例如，包括至少一条，并且优选地两条完整重链和至少一条，并且优选地两条完整轻链的抗体)，或抗原结合片段(例如，Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段、单结构域抗体、双抗体(dAb)、二价抗体、或双特异性抗体或其片段、其单结构域变体、或骆驼抗体)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgGA1、IgGA2、IgG4、IgJ、IgM、IgD或IgE中的一个或多个重链恒定区或其片段，例如如表3中所述。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含IgM的重链恒定区或其片段，任选地其中所述IgM重链恒定区包含SEQID NO:73的序列，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含IgJ的重链恒定区或其片段，任选地其中所述IgJ重链恒定区包含SEQID NO:76的序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含IgGA1的重链恒定区或其片段，任选地其中所述IgGA1重链恒定区包含SEQ ID NO:74的序列，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含IgGA2的重链恒定区或其片段，任选地其中所述IgGA2重链恒定区包含表3中列出的序列，例如SEQ ID NO:75，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含选自κ或λ的轻链恒定区中的轻链恒定区或其片段，例如如表3中所述。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含κ链的轻链恒定区或其片段，任选地其中所述κ链恒定区包含SEQ IDNO:39的序列，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子包含抗TCRβV抗体分子，所述抗TCRβV抗体分子包含：(i)一个或多个重链恒定区，其包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgGA1、IgGA2、IgG4、IgJ、IgM、IgD或IgE的重链恒定区或其片段，例如如表3中所述；和(ii)轻链恒定区，其包含选自κ或λ的轻链恒定区中的轻链恒定区或其片段，例如如表3中所述。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子与免疫细胞(例如效应细胞)结合并对其进行激活。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子与免疫细胞(例如效应细胞)结合但不对其进行激活。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子进一步包含NK细胞衔接物、除抗TCRβV抗体分子以外的T细胞衔接物、B细胞衔接物、树突状细胞衔接物或巨噬细胞衔接物，或其组合。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子进一步包含肿瘤靶向部分，所述肿瘤靶向部分与存在于癌症上的癌抗原结合，所述癌症例如为血液学癌症、实体瘤、转移性癌症、软组织肿瘤、转移性病变或其组合。
在一些实施方案中，所述癌抗原为肿瘤抗原或基质抗原，或血液学抗原。
在一些实施方案中，所述癌抗原选自：BCMA、CD19、CD20、CD22、FcRH5、PDL1、CD47、神经节苷脂2(GD2)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、Ron激酶、c-Met、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、BING-4、钙激活的氯化物通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、SAP-1、存活蛋白、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、Gp100/pmel17、酪氨酸酶、TRP-1/-2、MC1R、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、p53、Ras、TGF-B受体、AFP、ETA、MAGE、MUC-1、CA-125、BAGE、GAGE、NY-ESO-1、β-连环蛋白、CDK4、CDC27、α辅肌动蛋白-4、TRP1/gp75、TRP2、gp100、Melan-A/MART1、神经节苷脂、WT1、EphA3、表皮生长因子受体(EGFR)、MART-2、MART-1、MUC1、MUC2、MUM1、MUM2、MUM3、NA88-1、NPM、OA1、OGT、RCC、RUI1、RUI2、SAGE、TRG、TRP1、TSTA、叶酸受体α、L1-CAM、CAIX、gpA33、GD3、GM2、VEGFR、整合素(整合素αVβ3、整合素α5β1)、碳水化合物(Le)、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、(FAP)、TGF-β、透明质酸、胶原蛋白，例如胶原蛋白IV、生腱蛋白C和生腱蛋白W。
在一些实施方案中，肿瘤靶向部分是BCMA靶向部分或FcRH5靶向部分。
在一些实施方案中，所述癌症为实体瘤，包括但不限于：胰腺癌(例如，胰腺腺癌)、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌(例如，小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、皮肤癌、卵巢癌或肝癌。
在一些实施方案中，所述癌症为血液学癌症，包括但不限于：B细胞或T细胞恶性肿瘤，例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和急性淋巴细胞白血病。
在一些实施方案中，细胞因子分子选自白介素2(IL-2)、白介素7(IL-7)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素18(IL-18)、白介素21(IL-21)或干扰素γ，或其片段、变体或组合。
在一些实施方案中，细胞因子分子是单体或二聚体。
在一些实施方案中，细胞因子分子进一步包含受体二聚化结构域，例如，IL15Rα二聚化结构域。
在一些实施方案中，细胞因子分子(例如，IL-15)和受体二聚化结构域(例如，IL15Rα二聚化结构域)不是共价连接的，例如，是非共价缔合的。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子进一步包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgGA1、IgGA2、IgG4、IgJ、IgM、IgD或IgE的重链恒定区的免疫球蛋白恒定区(例如，Fc区)或其片段，任选地其中所述重链恒定区包含人IgG1、IgG2或IgG4的重链恒定区。
在一些实施方案中，免疫球蛋白恒定区(例如，Fc区)连接至(例如，共价连接至)肿瘤靶向部分、细胞因子分子或基质修饰部分中的一者或多者。
在一些实施方案中，第一免疫球蛋白链恒定区和第二免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)的界面被改变，例如突变，以例如相对于非工程化界面增加或减少二聚化。
在一些实施方案中，免疫球蛋白链恒定区(例如，Fc区)的二聚化通过向第一Fc区和第二Fc区的Fc界面提供以下中的一种或多种来增强：成对的腔-突起(“杵-臼结构”)、静电相互作用或链交换，使得例如相对于非工程化界面更大的异多聚体:同多聚体形式比率。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子进一步包含接头，例如本文所述的接头，任选地其中所述接头选自：可裂解性接头、不可裂解性接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋形接头或非螺旋形接头。
在一些实施方案中，本文提供了一种分离的核酸分子，其包含编码如本文所述的多功能多肽分子的核苷酸序列，或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％、99.7％、99.9％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文提供了一种载体，例如表达载体，其包含一种或多种如本文所述的核酸分子。
在一些实施方案中，本文提供了一种细胞，例如宿主细胞，其包含如本文所述的核酸分子或如本文所述的载体。
在一些实施方案中，本文提供了一种制造(例如，生产或制造)如本文所述的多功能多肽分子的方法，其包括在合适的条件(例如，适合表达如本文所述的多功能多肽分子的条件)下培养如本文所述的宿主细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含如本文所述的多功能多肽分子，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
在一些实施方案中，本文提供了一种调节(例如，增强)对象的免疫应答的方法，所述方法包括向对象施用有效量的如本文所述的多功能多肽分子。在一些实施方案中，所述方法包括扩增，例如增加对象中免疫细胞群的数量。
在一些实施方案中，本文提供了一种扩增(例如，增加)免疫细胞群的方法，所述方法包括使所述免疫细胞群与有效量的如本文所述的多功能多肽分子接触。在一些实施方案中，扩增在体内或离体(例如，体外)发生。
在一些实施方案中，免疫细胞群包含TCRβV表达细胞，例如，TCRβV+细胞。
在一些实施方案中，表达TCRβV的细胞为T细胞，例如，CD8+T细胞、CD3+ T细胞或CD4+ T细胞。
在一些实施方案中，所述免疫细胞群包含T细胞(例如，CD4 T细胞、CD8 T细胞(例如，效应T细胞、具有记忆样表型的T细胞或记忆T细胞(例如，记忆效应T细胞(例如，TEM细胞，例如TEMRA细胞)或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，免疫细胞群包括T细胞、自然杀伤细胞、B细胞或髓样细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞群获自健康对象。
在一些实施方案中，免疫细胞群获自患有疾病(例如癌症，例如如本文所述的癌症)的对象(例如，来自所述对象的单采样品)，任选地其中所述免疫细胞群包含肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，所述方法导致至少1.1-10倍的扩增(例如，至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的扩增)。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述细胞群与促进(例如，增加)免疫细胞扩增的药剂接触。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述细胞群与免疫检查点抑制剂(例如，PD-1抑制剂)接触。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述细胞群与4-1BB(CD127)激动剂(例如，抗4-1BB抗体)接触。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述细胞群与非分裂细胞群例如饲养细胞群，例如经辐射的同种异体人PBMC群体接触。
在一些实施方案中，细胞群在包含一种或多种细胞因子例如，IL-2、IL-7、IL-15或其组合的适当培养基(例如，本文所述的培养基)中扩增。
在一些实施方案中，细胞群被扩增持续至少约4小时、6小时、10小时、12小时、15小时、18小时、20小时或22小时的时间段，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，或至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。
在一些实施方案中，将免疫细胞群的扩增与具有与以下各项结合的抗体的相似细胞群的扩增进行比较：CD3分子，例如CD3ε(CD3e)分子；或TCRα(TCRα)分子。在一些实施方案中，将免疫细胞群的扩增与未接触抗TCRβV抗体分子或包含抗TCRβV抗体分子的多特异性分子的相似细胞群的扩增进行比较。
在一些实施方案中，将具有记忆样表型的T细胞群例如CD45RA+CCR7-细胞(例如，记忆效应T细胞，例如TEM细胞，例如TEMRA细胞)群的扩增与具有与以下各项结合的抗体的相似细胞群的扩增进行比较：CD3分子，例如CD3ε(CD3e)分子；或TCRα(TCRα)分子。
在一些实施方案中，经扩增的具有记忆样表型的T细胞群例如效应记忆细胞群包含这样的细胞，所述细胞：(i)具有可检测水平的CD45RA，例如，表达或再表达CD45RA；(ii)具有CCR7的低表达或无表达；和/或(iii)具有可检测水平的CD95，例如表达CD95，例如CD45RA+、CCR7-、CD95+T细胞群，任选地其中所述T细胞包含CD3+、CD4+或CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，所述方法导致表达包含TCRα和/或TCRβ分子的T细胞受体(TCR)的T细胞例如TCRα-βT细胞(αβT细胞)的扩增，例如，选择性或优先扩增。
在一些实施方案中，所述方法导致αβT细胞的扩增超过表达包含TCRγ和/或TCRδ分子的TCR的T细胞例如TCRγ-δT细胞(γδT细胞)的扩增。
在一些实施方案中，本文提供了一种在对象中治疗疾病(例如，癌症)的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的如本文所述的多功能多肽分子。
在一些实施方案中，本文提供了一种包含如本文所述的多功能多肽分子的组合物，其用于在对象中治疗疾病，例如癌症。
在一些实施方案中，本文提供一种包含如本文所述的多功能多肽分子的组合物，其用于制造用于治疗对象的疾病(例如，癌症)的药物。
在一些实施方案中，本文提供了一种在对象中治疗疾病(例如，癌症)的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的包含如本文所述的多功能多肽分子，从而治疗癌症。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗(例如，预防或减少)对象的细胞因子释放综合征(CRS)和/或神经毒性(NT)，例如与治疗例如先前施用的治疗相关的CRS和/或NT的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的如本文所述的多功能多肽分子，从而预防所述对象的CRS和/或NT。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗(例如，预防或减少)对象的细胞因子释放综合征(CRS)和/或神经毒性(NT)，例如与治疗例如先前施用的治疗相关的CRS和/或NT的方法，所述方法包括向所述对象施用有效的如本文所述的多功能多肽分子，从而预防所述对象的CRS和/或NT。
在一些实施方案中，本文提供了一种在患有疾病例如癌症的对象中将疗法例如治疗靶向T细胞的方法，所述方法包括施用有效量的：(i)如本文所述的多功能多肽分子；和(ii)所述疗法，例如肿瘤靶向疗法(例如，结合至癌抗原的抗体)，例如如本文所述的，从而将所述疗法靶向所述对象中的所述T细胞
在一些实施方案中，所述方法导致：与单独施用(ii)相比，细胞因子释放综合征(CRS)减少(例如，CRS持续时间较短或无CRS)，或CRS严重性降低(例如，不存在严重CRS，例如，CRS 4级或5级)。
在一些实施方案中，如本文所述的多功能多肽分子与施用与CRS相关的治疗并发地或在施用与CRS相关的治疗之后施用。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括：获取所述对象的TCRβV亚家族的状态的值，其中所述值包括对来自所述对象的样品中TCRβV分子的存在例如水平或活性的测量；以及向所述对象施用有效量的如本文所述的多功能多肽分子，从而治疗所述对象。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的如本文所述的多功能多肽分子，其中与例如在健康对象例如没有患癌症的对象中的一个或多个TCRβV亚家族的参考水平或活性相比，所述对象具有例如如本文所述的一个或多个TCRβV亚家族的更高的(例如升高的)水平或活性。
在一些实施方案中，本文提供了一种扩增来自患有癌症的对象的免疫效应细胞群的方法，所述方法包括：(i)从所述对象中分离包含免疫效应细胞群的生物样品，例如，外周血样品、活检样品或骨髓样品；(ii)获取所述对象例如来自所述对象的所述生物样品中的一个或多个TCRβV亚家族的状态的值，其中所述值包括与参考值(例如来自健康对象的样品)相比，对来自所述对象的样品中TCRβV亚家族的存在例如水平或活性的测量，其中在所述对象中相对于所述参考值(例如健康对象)较高的例如增加的值指示在所述对象中存在癌症，以及(iii)使包含免疫效应细胞群的生物样品与例如如本文所述的多功能多肽分子接触。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向对象施用与如本文所述的多功能多肽分子接触的免疫效应细胞群。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括例如与参考群体(例如，未接触如本文所述的多功能多肽分子的在其他方面相似的群体或获自健康对象(例如，未患有癌症的对象)的免疫效应细胞群)相比，测量免疫效应细胞群中的T细胞功能(例如，细胞毒性活性、细胞因子分泌或脱粒)。
在一些实施方案中，使包含免疫效应细胞群的生物样品与如本文所述的多功能多肽分子接触，所述多功能多肽分子在生物样品中被鉴定为较高的，例如增加的。
在一些实施方案中，使包含免疫效应细胞群的生物样品与如本文所述的多功能多肽分子接触，所述多功能多肽分子在生物样品中被鉴定为较高的，例如增加的。
在一些实施方案中，所述癌症为实体瘤，包括但不限于：黑色素瘤、胰腺癌(例如，胰腺腺癌)、乳腺癌、结肠直肠癌(CRC)、肺癌(例如，小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、皮肤癌、卵巢癌或肝癌。
在一些实施方案中，所述癌症为血液学癌症，包括但不限于：B细胞或T细胞恶性肿瘤，例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(例如，B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤和急性淋巴细胞白血病。
在一些实施方案中，所述癌症为B-CLL，并且所述TCRβV分子包含：(i)TCRβV6亚家族，其包含例如TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01；(ii)TCRβV5亚家族，其包含TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01或TCRβV5-8*01；(iii)TCRβV3亚家族，其包含TCRβV3-1*01；(iv)TCRβV2亚家族，其包含TCRβV2*01；或(v)TCRβV19亚家族，其包含TCRβV19*01或TCRβV19*02。
在一些实施方案中，所述癌症为黑色素瘤，并且所述TCRβV分子包含TCRβV6亚家族，其包含例如TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01或TCRβV6-1*01。
在一些实施方案中，所述癌症为DLBCL，并且所述TCRβV分子包含：(i)TCRβV13亚家族，其包含TCRβV13*01；(ii)TCRβV3亚家族，其包含TCRβV3-1*01；或(iii)TCRβV23亚家族。
在一些实施方案中，所述癌症为CRC，并且所述TCRβV分子包含：(i)TCRβV19亚家族，其包含TCRβV19*01或TCRβV19*02；(ii)TCRβV12亚家族，其包含TCRβV12-4*01、TCRβV12-3*01或TCRβV12-5*01；(iii)TCRβV16亚家族，其包含TCRβV16*01；或(iv)TCRβV21亚家族。
在一些实施方案中，所述肿瘤包含抗原，例如肿瘤抗原，例如肿瘤相关抗原或新抗原；和/或一个或多个TCRβV亚家族识别肿瘤抗原，例如结合至肿瘤抗原。
在一些实施方案中，所述样品包括血液样品，例如外周血液样品，活检，例如肿瘤活检，或骨髓样品。
在一些实施方案中，所述样品包含生物样品，所述生物样品包含免疫细胞，例如，TCRBV表达细胞(例如，TCRBV+细胞)、T细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，T细胞包括CD4 T细胞、CD8 T细胞(例如，效应T细胞或记忆T细胞(例如，记忆效应T细胞(例如，TEM细胞，例如TEMRA细胞))，或肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，所述方法导致包含表达TCRVB的免疫效应细胞例如T细胞的免疫效应细胞群的至少1.1-1000倍的扩增例如体内或离体扩增，例如1.1-10、10-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900或900-1000倍扩增。
在一些实施方案中，细胞群在包含一种或多种细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15或其组合)的适当培养基(例如，本文所述的培养基)中扩增。
在一些实施方案中，细胞群被扩增持续至少约4小时、6小时、10小时、12小时、15小时、18小时、20小时或22小时的时间段，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，或至少约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。
在一些实施方案中，将所述免疫细胞群的扩增与具有与以下各项结合的抗体的相似细胞群的扩增进行比较：CD3分子，例如CD3ε(CD3e)分子；或TCRα(TCRα)分子。
在一些实施方案中，将免疫细胞群的扩增与未接触抗TCRβV抗体分子的相似细胞群的扩增进行比较。
在一些实施方案中，将具有记忆样表型的T细胞群(例如记忆效应T细胞例如TEM细胞例如TEMRA细胞群)的扩增与具有与以下各项结合的抗体的相似细胞群的扩增进行比较：CD3分子，例如CD3ε(CD3e)分子；或TCRα(TCRα)分子。
在一些实施方案中，经扩增的具有记忆样表型的T细胞群例如效应记忆细胞群包含这样的细胞，所述细胞：(i)具有可检测水平的CD45RA，例如，表达或再表达CD45RA；(ii)具有CCR7的低表达或无表达；和/或(iii)具有可检测水平的CD95，例如表达CD95，例如，CD45RA+、CCR7-、CD95+T细胞群，任选地其中所述T细胞包含CD3+、CD4+或CD8+ T细胞。
在一些实施方案中，所述方法导致表达包含TCRα和/或TCRβ分子的T细胞受体(TCR)的T细胞例如TCRα-βT细胞(αβT细胞)的扩增，例如选择性或优先扩增。
在一些实施方案中，所述方法导致αβT细胞的扩增超过表达包含TCRγ和/或TCRδ分子的TCR的T细胞例如TCRγ-δT细胞(γδT细胞)的扩增。
在一些实施方案中，所述TCRβV结合部分或分子包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含轻链可变区(VL)，所述VL包含表1、2、10、11、12或13中公开的VL的LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3中的一种、两种或全部。
在一些实施方案中，所述TCRβV结合部分或分子包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)，所述VH包含表1、2、10、11、12或13中公开的VH的HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3中的一种、两种或全部。
在一些实施方案中，所述TCRβV结合部分或分子包含轻链，所述轻链包含框架区，例如框架区1(FR1)，所述框架区包含以下中的一种、两种或全部(例如三种)：(i)在位置1处的天冬氨酸，例如根据Kabat编号在位置1处的置换，例如丙氨酸到天冬氨酸的置换；或者(ii)在位置2处的天冬酰胺，例如根据Kabat编号在位置2处的置换，例如异亮氨酸到天冬酰胺、丝氨酸到天冬酰胺或酪氨酸到天冬酰胺的置换；或者(iii)在位置4处的亮氨酸，例如根据Kabat编号在位置4处的置换，例如蛋氨酸到亮氨酸的置换，其中所述置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，所述TCRβV结合部分或分子包含轻链，所述轻链包含框架区，例如框架区3(FR3)，所述框架区包含以下中的一种、两种或全部(例如三种)：(i)在位置66处的甘氨酸，例如根据Kabat编号在位置66处的置换，例如赖氨酸到甘氨酸或丝氨酸到甘氨酸的置换；或者(ii)在位置69处的天冬酰胺，例如根据Kabat编号在位置69处的置换，例如苏氨酸到天冬酰胺的置换；或者(iii)在位置71处的酪氨酸，例如根据Kabat编号在位置71处的置换，例如苯丙氨酸到酪氨酸或丙氨酸到酪氨酸的置换，其中所述置换是相对于人种系轻链框架区序列。
在一些实施方案中，所述TCRβV结合部分或分子结合至TCRβV蛋白上的例如如由图24A中的圆圈区域描绘的面向外的区域(例如，表位)。在一些实施方案中，TCRβV蛋白上的面向外的区域包含TCRβV的结构保守区域，例如在一个或多个TCRβV亚家族中TCRβV的具有相似结构的区域。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括(例如，顺序地、同时地或并发地)施用第二药剂，例如治疗剂，例如如本文所述的。
在一些实施方案中，所述第二药剂(例如，治疗剂)包括化疗剂、生物剂、激素疗法、放射或手术。
在一些实施方案中，所述疾病为癌症，例如，实体瘤或血液学癌症，或转移性病变。
在一些实施方案中，所述癌抗原为BCMA或FcRH5。
Claims (193)
1.一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽和至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中所述第一多肽和所述第二多肽是不连续的，其中
(i)所述第一多肽包含二聚化模块的第一部分，所述二聚化模块的所述第一部分连接至
(A)第一TCRβV结合部分，所述第一TCRβV结合部分包含第一重链可变结构域(VH)和第一轻链可变结构域(VL)，或单结构域抗体，或
(B)包含第一TCRβV结合部分的VH的所述第一TCRβV结合部分的第一部分，其中当所述第一多肽包含所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分时，所述多功能多肽分子进一步包含第三多肽，所述第三多肽包含有包含所述第一TCRβV结合部分的VL的所述第一TCRβV结合部分的第二部分，其中所述第三多肽与所述第一多肽和所述第二多肽不连续；并且
(ii)所述第二多肽包含所述二聚化模块的第二部分；
其中
(a)所述多功能多肽分子包含单个TCRβV结合部分，并且所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至所述第二多肽，或
(b)所述多功能多肽分子进一步包含第二TCRβV结合部分，并且所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至所述第一多肽、所述第二多肽、当所述多功能多肽分子进一步包含所述第三多肽时的所述第三多肽，或其组合。
2.根据权利要求1所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含所述第二TCRβV结合部分，并且其中所述二聚化模块的所述第二部分连接至：
(A)第二TCRβV结合部分，所述第二TCRβV结合部分包含第二VH和第二VL，或单结构域抗体，或
(B)包含第二TCRβV结合部分的VH的所述第二TCRβV结合部分的第一部分，其中当所述第二多肽包含所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分时，所述多功能多肽分子进一步包含第四多肽，所述第四多肽包含有包含所述第二TCRβV结合部分的VL的所述第二TCRβV结合部分的第二部分，其中所述第四多肽与所述第一多肽、所述第二多肽和所述第三多肽不连续；
其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽、当所述多功能多肽分子进一步包含所述第四多肽时的所述第四多肽，或其组合。
3.一种多功能多肽分子，其包含第一多肽、第二多肽和至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，其中所述第一多肽和所述第二多肽是不连续的，其中
(i)所述第一多肽包含二聚化模块的第一部分，所述二聚化模块的所述第一部分连接至包含第一TCRβV结合部分的VH的所述第一TCRβV结合部分的第一部分，其中所述多功能多肽分子进一步包含第三多肽，所述第三多肽包含有包含所述第一TCRβV结合部分的VL的所述第一TCRβV结合部分的第二部分，其中所述第三多肽与所述第一多肽和所述第二多肽不连续；并且
(ii)所述第二多肽包含所述二聚化模块的第二部分，其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至所述第二多肽。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述二聚化模块的所述第一部分和所述二聚化模块的所述第二部分是二聚化的。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽包含：
(A)包含所述第一VH和所述第一VL的所述第一TCRβV结合部分，其中所述第一TCRβV结合部分进一步包含连接至所述第一VH的第一重链恒定结构域1(CH1)；或者
(B)包含所述第一TCRβV结合部分的所述VH的所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分，其中所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分进一步包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述VH的第一CH1。
6.根据权利要求5所述的多功能多肽分子，其中所述第一CH1连接至所述第一VH的C末端或所述第一TCRβV结合部分的所述VH的C末端。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第二多肽包含：
(A)包含所述第二VH和所述第二VL的所述第二TCRβV结合部分，其中所述第二TCRβV结合部分进一步包含连接至所述第二VH的第二CH1；或者
(B)包含所述第二TCRβV结合部分的所述VH的所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分，其中所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分进一步包含连接至所述第二TCRβV结合部分的所述VH的第二CH1。
8.根据权利要求7所述的多功能多肽分子，其中所述第二CH1连接至所述第二VH的C末端或所述第二TCRβV结合部分的所述VH的C末端。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(1)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第一多肽，所述第一TCRβV结合部分包含所述第一VH和所述第一VL，其中所述第一TCRβV结合部分进一步包含连接至所述第一VL的第一轻链恒定结构域(CL)；或者
(2)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的所述第一多肽和包含所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第三多肽，其中所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分进一步包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述VL的第一CL。
10.根据权利要求9所述的多功能多肽分子，其中所述第一CL连接至所述第一VL的C末端或所述第一TCRβV结合部分的所述VL的C末端。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(1)包含所述第二TCRβV结合部分的所述第二多肽，所述第二TCRβV结合部分包含所述第二VH和所述第二VL，其中所述第二TCRβV结合部分进一步包含连接至所述第二VL的第二CL；或者
(2)包含所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分的所述第二多肽和包含所述第二TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第四多肽，其中所述第二TCRβV结合部分的所述第二部分进一步包含连接至所述第二TCRβV结合部分的所述VL的第二CL。
12.根据权利要求11所述的多功能多肽分子，其中所述第二CL连接至所述第二VL的C末端或所述第二TCRβV结合部分的所述VL的C末端。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述二聚化模块的所述第一部分连接至(A)包含所述第一VH和所述第一VL或所述单结构域抗体的所述第一TCRβV结合部分的C末端，或(B)包含所述第一TCRβV结合部分的所述VH的所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含所述第二TCRβV结合部分，并且其中所述二聚化模块的所述第二部分连接至(A)包含所述第二VH和所述第二VL或所述单结构域抗体的所述第二TCRβV结合部分的C末端，或(B)包含所述第二TCRβV结合部分的所述VH的所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含单个TCRβV结合部分，并且其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体共价连接至所述第二多肽的N末端、所述第二多肽的C末端或其组合。
16.根据权利要求15所述的多功能多肽分子，其中所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体在所述第二多肽的单个连续多肽链内。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的多功能多肽分子，其中
(a)所述第一多肽的N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；
(b)所述第二多肽的N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；
(c)所述第三多肽的N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；
(d)所述第四多肽的N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或者
(e)其组合。
18.根据权利要求17所述的多功能多肽分子，其中
(a-1)所述第一多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(a-2)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；
(b-1)所述第一多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(b-2)所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；
(c-1)所述第一多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(c-2)所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；
(d-1)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(d-2)所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；
(e-1)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(e-2)所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或者
(f-1)所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(f-2)所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体。
19.根据权利要求17所述的多功能多肽分子，其中
(a-1)所述第一多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(a-2)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(a-3)所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；
(b-1)所述第一多肽的所述N末端连接细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(b-2)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(b-3)所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；或者
(c-1)所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；(c-2)所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且(c-3)所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合。
20.根据权利要求17所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第一多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；所述第二多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第二多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；所述第三多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第三多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合；并且所述第四多肽的所述N末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；所述第四多肽的所述C末端连接至细胞因子多肽或其功能片段或功能变体；或其组合。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述细胞因子多肽或其功能片段或功能变体在所述细胞因子多肽或其功能片段或功能变体所连接的所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三细胞因子多肽或所述第四细胞因子多肽的单个连续多肽链内。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的多功能多肽分子，其进一步包含：
(i)在所述二聚化模块的所述第一部分与包含所述第一VH和所述第一VL或所述单结构域抗体的所述第一TCRβV结合部分或包含所述第一TCRβV结合部分的所述VH的所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分之间的接头；
(ii)在所述二聚化模块的所述第二部分与包含所述第二VH和所述第二VL或所述单结构域抗体的所述第二TCRβV结合部分或包含所述第二TCRβV结合部分的所述VH的所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分之间的接头；
(iii)在所述第一VH与所述第一VL之间的接头；
(iv)在所述第二VH与所述第二VL之间的接头；
(v)在所述第一CH1与所述第一VH或所述第一TCRβV结合部分的所述VH之间的接头；
(vi)在所述第二CH1与所述第二VH或所述第二TCRβV结合部分的所述VH之间的接头；
(vii)在所述第一CL与所述第一VL或所述第一TCRβV结合部分的所述VL之间的接头；
(vii)在所述第二CL与所述第二VL或所述第二TCRβV结合部分的所述VL之间的接头；
(viii)在所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与所述第一多肽之间的接头，在所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与所述第二多肽之间的接头，在所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与所述第三多肽之间的接头，在所述至少一种细胞因子多肽或其功能片段或功能变体与所述第四多肽之间的接头，或其组合；或者
(ix)其组合。
23.根据权利要求22所述的多功能多肽分子，其中所述接头选自可裂解性接头、不可裂解性接头、肽接头、柔性接头、刚性接头、螺旋形接头和非螺旋形接头。
24.根据权利要求23所述的多功能多肽分子，其中所述接头是肽接头，并且其中所述接头包含SEQ ID NO:3308或SEQ ID NO:3643的序列。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子是分离的多功能多肽分子。
26.根据权利要求1所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第一部分的所述第一多肽；
(ii)包含所述二聚化模块的所述第二部分的所述第二多肽；
(iii)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第三多肽；以及
(iv)共价连接至所述第二多肽的N末端的细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，
其中所述多功能多肽分子包含单个TCRβV结合部分。
27.根据权利要求2所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第一部分的所述第一多肽；
(ii)包含连接至所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第二部分的所述第二多肽；
(iii)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第三多肽；
(iv)包含所述第二TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第四多肽；
(v)共价连接至所述第三多肽的C末端的细胞因子多肽或其功能片段或功能变体，以及
(vi)共价连接至所述第四多肽的C末端的细胞因子多肽或其功能片段或功能变体。
28.根据权利要求2所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第一部分的所述第一多肽；
(ii)包含连接至所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第二部分的所述第二多肽；
(iii)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第三多肽；
(iv)包含所述第二TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第四多肽；以及
(v)共价连接至所述第三多肽的C末端或所述第四多肽的C末端，但不共价连接至两者的细胞因子多肽或其功能片段或功能变体。
29.根据权利要求2所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)包含连接至所述第一TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第一部分的所述第一多肽；
(ii)包含连接至所述第二TCRβV结合部分的所述第一部分的C末端的所述二聚化模块的所述第二部分的所述第二多肽；
(iii)包含所述第一TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第三多肽；
(iv)包含所述第二TCRβV结合部分的所述第二部分的所述第四多肽；以及
(v)共价连接至所述第一多肽的C末端或所述第二多肽的C末端，但不共价连接至两者的细胞因子多肽或其功能片段或功能变体。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含选自Fab、F(ab’)2、Fv、单链Fv(scFv)、单结构域抗体、双抗体(dAb)、骆驼抗体及其组合中的任一者。
31.根据权利要求30所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含所述Fab或所述scFv。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述TCRβV结合部分是所述多功能多肽分子的唯一抗原结合部分。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含所述至少一种细胞因子多肽中的两种或更多种。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述至少一种细胞因子多肽包含白介素2(IL-2)或其片段。
35.根据权利要求34所述的多功能多肽分子，其中所述至少一种细胞因子多肽包含与SEQ ID NO:2191的序列具有至少75％序列同一性的序列。
36.根据权利要求34所述的多功能多肽分子，其中所述变体是包含置换突变的IL-2变体。
37.根据权利要求36所述的多功能多肽分子，其中所述变体是包含C125A突变的IL-2变体。
38.根据权利要求34所述的多功能多肽分子，其中所述变体包含与SEQ ID NO:2270的序列具有至少75％序列同一性的序列。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述二聚化模块的所述第一部分包含第一免疫球蛋白恒定区(Fc区)，并且所述二聚化模块的所述第二部分包含第二Fc区。
40.根据权利要求39所述的多功能多肽分子，其中所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合选自IgG1 Fc区或其片段、IgG2 Fc区或其片段、IgG3 Fc区或其片段、IgGA1 Fc区或其片段、IgGA2 Fc区或其片段、IgG4Fc区或其片段、IgJ Fc区或其片段、IgM Fc区或其片段、IgDFc区或其片段以及IgE Fc区或其片段。
41.根据权利要求40所述的多功能多肽分子，其中所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合选自人IgG1 Fc区或其片段、人IgG2 Fc区或其片段和人IgG4 Fc区或其片段。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合包含具有成对的腔-突起、静电相互作用或链交换中的一种或多种的Fc界面，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区的二聚化被增强，如由相对于具有非工程化界面的Fc区的二聚化而言更大的异多聚体:同多聚体形式比率所指示的。
43.根据权利要求42所述的多功能多肽分子，其中所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合包含表14中列出的氨基酸置换。
44.根据权利要求43所述的多功能多肽分子，其中所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合包含Asn297Ala(N297A)突变或Leu234Ala/Leu235Ala(LALA)突变。
45.根据权利要求42所述的多功能多肽分子，其中所述第一Fc区、所述第二Fc区或其组合包含与SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:3645、SEQ ID NO:3646、SEQ ID NO:3647、SEQ ID NO:3648或SEQ ID NO:3649的序列具有至少75％序列同一性的序列。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合与选自以下的TCRβV亚家族中的一者或多者结合：
(i)TCRβV2亚家族，其包含TCRβV2*01；
(ii)TCRβV3亚家族，其包含TCRβV3-1*01；
(iii)TCRβV4亚家族，其包含选自TCRβV4-1、TCRβV4-2和TCRβV4-3中的一者或多者；
(iv)TCRβV5亚家族，其包含选自TCRβV5-6*01、TCRβV5-4*01、TCRβV5-1*01和TCRβV5-8*01中的一者或多者；
(v)TCRβV6亚家族，其包含选自TCRβV6-4*01、TCRβV6-4*02、TCRβV6-9*01、TCRβV6-8*01、TCRβV6-5*01、TCRβV6-6*02、TCRβV6-6*01、TCRβV6-2*01、TCRβV6-3*01和TCRβV6-1*01中的一者或多者；
(vi)TCRβV9亚家族；
(vii)TCRβV10亚家族，其包含选自TCRβV10-1*01、TCRβV10-1*02、TCRβV10-3*01和TCRβV10-2*01中的一者或多者；
(viii)TCRβV11亚家族，其包含TCRβV11-2；
(ix)TCRβV12亚家族，其包含选自TCRβV12-4*01、TCRβV12-3*01和TCRβV12-5*01中的一者或多者；
(x)TCRβV13亚家族，其包含TCRβV13*01；
(xi)TCRβV16亚家族，其包含TCRβV16*01；
(xii)TCRβV19亚家族，其包含选自TCRβV19*01和TCRβV19*02中的一者或多者；
(xiii)TCRβV21亚家族；
(xiv)TCRβV23亚家族；
(xv)TCRβV27亚家族；以及
(xvi)TCRβV28亚家族。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含所述第一TCRβV结合部分和所述第二TCRβV结合部分，并且其中所述第一TCRβV结合部分和所述第二TCRβV结合部分相同。
48.根据权利要求1-46中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含所述第一TCRβV结合部分和所述第二TCRβV结合部分，并且其中所述第一TCRβV结合部分和所述第二TCRβV结合部分不同。
49.根据权利要求48所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分和所述第二TCRβV结合部分分别结合：
(i)TCRβV6亚家族成员中的一者或多者和TCRβV10亚家族成员中的一者或多者；
(ii)TCRβV6亚家族成员中的一者或多者和TCRβV5亚家族成员中的一者或多者；
(iii)TCRβV6亚家族成员中的一者或多者和TCRβV12亚家族成员中的一者或多者；
(iv)TCRβV10亚家族成员中的一者或多者和TCRβV5亚家族成员中的一者或多者；
(v)TCRβV10亚家族成员中的一者或多者和TCRβV12亚家族成员中的一者或多者；或者
(vi)TCRβV5亚家族成员中的一者或多者和TCRβV12亚家族成员中的一者或多者。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：
(i)与表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；
(ii)与表1中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3；或者
(iii)其组合。
51.根据权利要求50所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：
(i)VH，所述VH包含框架区(FR)，所述框架区包含与非鼠种系框架1(FR1)、非鼠种系框架区2(FR2)、非鼠种系框架区3(FR3)和非鼠种系框架区4(FR4)具有至少75％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；
(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含与非鼠种系FR1、非鼠种系FR2、非鼠种系FR3和非鼠种系FR4具有至少75％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；或者
(iii)其组合。
52.根据权利要求51所述的多功能多肽分子，其中所述VH包含所述FR3，所述FR3包含(i)根据Kabat编号在位置73处的苏氨酸；(ii)根据Kabat编号在位置94处的甘氨酸；或(iii)其组合。
53.根据权利要求51-52中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述VL包含所述FR1，所述FR1包含根据Kabat编号在位置10处的苯丙氨酸。
54.根据权利要求51-53中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述VL包含所述FR2，所述FR2包含(i)根据Kabat编号在位置36处的组氨酸；(ii)根据Kabat编号在位置46处的丙氨酸；或(iii)其组合。
55.根据权利要求51-54中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述VL包含所述FR3，所述FR3包含根据Kabat编号在位置87处的苯丙氨酸。
56.根据权利要求1-49中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：
(i)与表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；
(ii)与表2中列出的CDR1、CDR2和CDR3序列中的任一者具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3；或者
(iii)其组合。
57.根据权利要求56所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：
(i)VH，所述VH包含FR，所述FR包含与表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少75％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；
(ii)VL，所述VL包含FR，所述FR包含与表2的人源化B-H LC的FR1、FR2、FR3和FR4具有至少75％序列同一性的FR1、FR2、FR3和FR4；或者
(iii)其组合。
58.根据权利要求56-57中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：
(i)VH，所述VH包含与表2中列出的人源化抗体B-H的VH序列具有至少75％序列同一性的序列；
(ii)VL，所述VL包含与表2中列出的人源化抗体B-H的VL序列具有至少75％序列同一性的序列；或者
(iii)其组合。
59.根据权利要求1-58中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含重链恒定区，所述重链恒定区具有与表3中列出的序列中的任一者具有至少75％序列同一性的序列，或其组合。
60.根据权利要求59所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含IgM的重链恒定区或其片段。
61.根据权利要求60所述的多功能多肽分子，其中所述IgM的所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:73的序列具有至少75％序列同一性的序列。
62.根据权利要求59所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含IgJ的重链恒定区或其片段。
63.根据权利要求62所述的多功能多肽分子，其中所述IgJ的所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:76的序列具有至少75％序列同一性的序列。
64.根据权利要求59所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽、其组合包含IgGA1的重链恒定区或其片段。
65.根据权利要求64所述的多功能多肽分子，其中所述IgGA1的所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:74的序列具有至少75％序列同一性的序列。
66.根据权利要求59所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含IgGA2的重链恒定区或其片段。
67.根据权利要求66所述的多功能多肽分子，其中所述IgGA2的所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:75的序列具有至少75％序列同一性的序列。
68.根据权利要求59所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含IgG1的重链恒定区或其片段。
69.根据权利要求68所述的多功能多肽分子，其中所述IgG1的所述重链恒定区包含与SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:3645的序列具有至少75％序列同一性的序列。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽、所述第四多肽或其组合包含轻链恒定区，所述轻链恒定区具有与表3中列出的序列中的任一者具有至少75％序列同一性的序列，或其组合。
71.根据权利要求70所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽、所述第三多肽、所述第四多肽或其组合包含κ链的轻链恒定区或其片段。
72.根据权利要求71所述的多功能多肽分子，其中κ链的所述轻链恒定区包含表3中列出的轻链恒定区序列。
73.根据权利要求72所述的多功能多肽分子，其中所述κ链的所述轻链恒定区包含与SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:3644的序列具有至少75％序列同一性的序列。
74.根据权利要求1-73中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含：
(i)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其包含与表1、2、10、11、12或13中公开的VH的CDR1、CDR2和CDR3序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其包含与表1、2、10、11、12或13中公开的VL的CDR1、CDR2和CDR3序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；或者
(iii)其组合。
75.根据权利要求1-74中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含轻链，所述轻链包含FR1，所述FR1包含：
(i)根据Kabat编号在位置1处的天冬氨酸；
(ii)根据Kabat编号在位置2处的天冬酰胺；
(iii)根据Kabat编号在位置4处的亮氨酸；或者
(iv)其组合。
76.根据权利要求1-75中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合包含轻链，所述轻链包含FR3，所述FR3包含：
(i)根据Kabat编号在位置66处的甘氨酸；
(ii)根据Kabat编号在位置69处的天冬酰胺；
(iii)根据Kabat编号在位置71处的酪氨酸；或者
(iv)其组合。
77.根据权利要求1-76中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一TCRβV结合部分、所述第二TCRβV结合部分或其组合结合至TCRβV蛋白上的面向外的区域。
78.根据权利要求77所述的多功能多肽分子，其中所述TCRβV蛋白上的所述面向外的区域包含TCRβV的结构保守区域，所述结构保守区域在一个或多个TCRβV亚家族中具有相似的结构。
79.根据权利要求1-78中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含：
(i)第一序列，所述第一序列选自SEQ ID NO:80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、1309、1326、1327、1328、1329、1330、1331、1332、1333、1334、1335、1336、1337、1338、1339、1340、1341、1342、3281和3642；以及
(ii)第二序列，所述第二序列选自SEQ ID NO:40、41、42、73、74、75、76、3645、3646、3647、3648和3649；
其中所述第一序列连接至所述第二序列。
80.根据权利要求79所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽或其组合进一步包含选自SEQ ID NO:2191和SEQ ID NO:2270的第三序列，其中所述第三序列连接至所述第一序列、所述第二序列或其组合。
81.根据权利要求80所述的多功能多肽分子，其中所述第三序列连接至所述第一序列的N末端。
82.根据权利要求80所述的多功能多肽分子，其中所述第三序列连接至所述第二序列的C末端。
83.根据权利要求1-78中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含：
(i)第一序列，所述第一序列选自SEQ ID NO:1、9、15、23、25、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148、151、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、200、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、1100、1310、1311、1312、1344、1346、1348、1350、1356、1360、1362、1370和3438；以及
(ii)第二序列，所述第二序列选自SEQ ID NO:40、41、42、73、74、75、76、3645、3646、3647、3648和3649；
其中所述第一序列连接至所述第二序列。
84.根据权利要求83所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽或其组合进一步包含选自SEQ ID NO:2191和SEQ ID NO:2270的第三序列，其中所述第三序列连接至所述第一序列、所述第二序列或其组合。
85.根据权利要求84所述的多功能多肽分子，其中所述第三序列连接至所述第一序列的N末端。
86.根据权利要求84所述的多功能多肽分子，其中所述第三序列连接至所述第二序列的C末端。
87.根据权利要求83-86中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第三多肽、所述第四多肽或其组合包含：
(i)第四序列，所述第四序列选自SEQ ID NO:2、10、11、16、26、27、28、29、30、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、1101、1313、1314、1347、1349、1351、1353、1357、1361、1365、1367、1369和3279；以及
(ii)第五序列，所述第五序列选自SEQ ID NO:39和3644，
其中所述第四序列连接至所述第五序列。
88.根据权利要求87所述的多功能多肽分子，其中所述第三多肽、所述第四多肽或其组合进一步包含所述第三序列，其中所述第三序列连接至所述第四序列、所述第五序列或其组合。
89.根据权利要求84所述的多功能多肽分子，其中所述第三序列连接至所述第四序列的N末端。
90.根据权利要求84所述的多功能多肽分子，其中所述第三序列连接至所述第五序列的C末端。
91.根据权利要求83所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽或其组合包含：
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92.根据权利要求91所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽、所述第二多肽或其组合进一步包含选自SEQ ID NO:2191和SEQ ID NO:2270的第三序列，其中所述第三序列连接至所述第一序列、所述第二序列或其组合。
93.根据权利要求92所述的多功能多肽分子，其中所述第三序列连接至所述第一序列的N末端。
94.根据权利要求92所述的多功能多肽分子，其中所述第三序列连接至所述第二序列的C末端。
95.根据权利要求91-94中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第三多肽、所述第四多肽或其组合包含：
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连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:3279的第四序列。
96.根据权利要求95所述的多功能多肽分子，其中所述第三多肽、所述第四多肽或其组合进一步包含所述第三序列，其中所述第三序列连接至所述第四序列、所述第五序列或其组合。
97.根据权利要求96所述的多功能多肽分子，其中所述第三序列连接至所述第四序列的N末端。
98.根据权利要求96所述的多功能多肽分子，其中所述第三序列连接至所述第五序列的C末端。
99.根据权利要求91所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽包含：
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100.根据权利要求99所述的多功能多肽分子，其中所述第二多肽包含：
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101.根据权利要求99-100中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述第三多肽包含：
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连接至SEQ ID NO:3644的第五序列的SEQ ID NO:3279的第四序列；或
连接至SEQ ID NO:39的第五序列的SEQ ID NO:3279的第四序列。
102.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-15受体αsushi结构域或其功能片段或功能变体、IL-15分子或其功能片段或功能变体以及免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
103.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-15受体αsushi结构域或其功能片段或功能变体、可操作地连接的IL-15分子或其功能片段或功能变体、和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
104.根据权利要求103所述的多功能多肽分子，其中所述IL-15受体αsushi结构域经由接头可操作地连接至所述IL-15分子或其功能片段或功能变体，所述IL-15分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区，或其组合。
105.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3523的序列、SEQ ID NO:2170的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
106.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3523的序列、可操作地连接的SEQ ID NO:2170的序列、和可操作地连接的SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
107.根据权利要求106所述的多功能多肽分子，其中所述SEQ ID NO:3523的序列经由SEQ ID NO:3524的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:2170的序列，所述SEQ ID NO:2170的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
108.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3519的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
109.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3519的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
110.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-15分子或其功能片段或功能变体和免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
111.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-15分子或其功能片段或功能变体和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
112.根据权利要求111所述的多功能多肽分子，其中所述IL-15分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区。
113.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:2170的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
114.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:2170的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
115.根据权利要求114所述的多功能多肽分子，其中所述SEQ ID NO:2170的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
116.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3520的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
117.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3520的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
118.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-2分子或其功能片段或功能变体或IL-2C125A突变分子或其功能片段或功能变体，以及免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
119.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-2分子或其功能片段或功能变体或IL-2C125A突变分子或其功能片段或功能变体，和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
120.根据权利要求119所述的多功能多肽分子，其中所述IL-2分子或其功能片段或功能变体或所述IL-2C125A突变分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区。
121.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:2270的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
122.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:2270的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
123.根据权利要求122所述的多功能多肽分子，其中所述SEQ ID NO:2270的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
124.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3521的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
125.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3521的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
126.根据权利要求118-120中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含所述第二多肽、所述第三多肽或其组合，所述第二多肽包含有包含L234A、L235A和P329G突变的免疫球蛋白重链恒定区，所述第三多肽包含有包含L234A、L235A和P329G突变的免疫球蛋白轻链恒定区。
127.根据权利要求118-120和126中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3530的序列和SEQ ID NO:3531的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:2191的序列和SEQ ID NO:3533的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3527的序列和SEQ ID NO:3528的序列。
128.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3530的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3531的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:2191的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3533的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3527的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3528的序列。
129.根据权利要求128所述的多功能多肽分子，其中所述SEQ ID NO:2191的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3533的序列，或其组合。
130.根据权利要求128或129所述的多功能多肽分子，其中所述第一多肽进一步包含可操作地连接至SEQ ID NO:3531的序列的SEQ ID NO:3547的序列，所述第二多肽进一步包含可操作地连接至SEQ ID NO:3533的序列的SEQ ID NO:3534的序列，或其组合。
131.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3529的序列或SEQ ID NO:3548的序列具有至少75％序列同一性的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3532的序列或SEQ ID NO:3549的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3526的序列具有至少75％序列同一性的序列。
132.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3529的序列或SEQ ID NO:3548的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3532的序列或SEQ ID NO:3549的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3526的序列。
133.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-7分子或其功能片段或功能变体和免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
134.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-7分子或其功能片段或功能变体和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
135.根据权利要求134所述的多功能多肽分子，其中所述IL-7分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区。
136.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3540的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
137.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3540的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
138.根据权利要求137所述的多功能多肽分子，其中所述SEQ ID NO:3540的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
139.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3539的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
140.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3539的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
141.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-12分子或其功能片段或功能变体和免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
142.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-12分子或其功能片段或功能变体和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
143.根据权利要求141或142所述的多功能多肽分子，其中所述IL-12分子或其功能片段或功能变体包含IL-12β亚基或其功能片段或功能变体以及IL-12α亚基或其功能片段或功能变体。
144.根据权利要求141或142所述的多功能多肽分子，其中所述IL-12分子或其功能片段或功能变体从N末端到C末端包含IL-12β亚基或其功能片段或功能变体和可操作地连接的IL-12α亚基或其功能片段或功能变体。
145.根据权利要求144所述的多功能多肽分子，其中所述IL-12β亚基或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述IL-12α亚基或其功能片段或功能变体，所述IL-12α亚基或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区，或其组合。
146.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3542的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
147.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3542的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
148.根据权利要求146或147所述的多功能多肽分子，其中所述IL-12分子或其功能片段或功能变体包含SEQ ID NO:3543的序列和SEQ ID NO:3545的序列。
149.根据权利要求146或147所述的多功能多肽分子，其中所述IL-12分子或其功能片段或功能变体从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3543的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3545的序列。
150.根据权利要求149所述的多功能多肽分子，其中所述SEQ ID NO:3543的序列经由SEQ ID NO:3544的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3545的序列，所述SEQ ID NO:3545的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至SEQ ID NO:3648的序列，或其组合。
151.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3541的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
152.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3541的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
153.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含IL-21分子或其功能片段或功能变体和免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和免疫球蛋白轻链恒定区。
154.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含IL-21分子或其功能片段或功能变体和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区。
155.根据权利要求154所述的多功能多肽分子，其中所述IL-21分子或其功能片段或功能变体经由接头可操作地连接至所述免疫球蛋白重链恒定区，或其组合。
156.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:1346的序列和SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3540的序列和SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:1349的序列和SEQ ID NO:3644的序列。
157.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1346的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3649的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3540的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3648的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:1349的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3644的序列。
158.根据权利要求157所述的多功能多肽分子，其中所述SEQ ID NO:3540的序列经由SEQ ID NO:3308的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:3648的序列。
159.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3517的序列具有至少75％序列同一性的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3546的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含与SEQ ID NO:3518的序列具有至少75％序列同一性的序列。
160.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3517的序列；
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3546的序列；以及
(iii)第三多肽，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3518的序列。
161.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含抗TCRvβ抗体重链可变区和免疫球蛋白重链恒定区；以及
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含抗TCRvβ抗体轻链可变区、免疫球蛋白轻链恒定区和IL-2分子或其功能片段或功能变体。
162.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体重链可变区和可操作地连接的免疫球蛋白重链恒定区；以及
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含抗TCRvβ抗体轻链可变区、可操作地连接的免疫球蛋白轻链恒定区、和可操作地连接的IL-2分子或其功能片段或功能变体。
163.根据权利要求162所述的多功能多肽分子，其中所述免疫球蛋白轻链恒定区经由接头可操作地连接至所述IL-21分子或其功能片段或功能变体。
164.根据权利要求161-163中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含两个第一多肽和两个第二多肽。
165.根据权利要求161-164中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含所述第一多肽，所述第一多肽包含有包含L234A、L235A和P329G突变的免疫球蛋白重链恒定区。
166.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3530的序列和SEQ ID NO:3537的序列；以及
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3527的序列、SEQ ID NO:3528的序列和SEQ ID NO:2191的序列。
167.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3530的序列和可操作地连接的SEQ ID NO:3537的序列；以及
(ii)第二多肽，所述第二多肽从N末端到C末端包含SEQ ID NO:3527的序列、可操作地连接的SEQ ID NO:3528的序列、和可操作地连接的SEQ ID NO:2191的序列。
168.根据权利要求167所述的多功能多肽分子，其中所述SEQ ID NO:3528的序列经由SEQ ID NO:3309的序列可操作地连接至所述SEQ ID NO:2191的序列。
169.根据权利要求166-168中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含两个第一多肽和两个第二多肽。
170.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含与SEQ ID NO:3536的序列具有至少75％序列同一性的序列；以及
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含与SEQ ID NO:3535的序列具有至少75％序列同一性的序列。
171.根据权利要求1-101中任一项所述的多功能多肽分子，其中所述多功能多肽分子包含：
(i)第一多肽，所述第一多肽包含SEQ ID NO:3536的序列；以及
(ii)第二多肽，所述第二多肽包含SEQ ID NO:3535的序列。
172.一种抗体，其包含抗T细胞受体β可变链(TCRβV)结合结构域，所述抗T细胞受体β可变链(TCRβV)结合结构域包含：
(i)重链可变区(VH)，所述VH包含重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HCCDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含与SEQ IDNO:3650、SEQ ID NO:3651和SEQ ID NO:5具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)轻链可变区(VL)，所述VL包含轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LCCDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含与SEQ IDNO:3655、SEQ ID NO:3653和SEQ ID NO:8具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；或者
(iii)其组合。
173.根据权利要求172所述的抗体，其中所述TCRβV结合结构域包含：
(i)VH，所述VH包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:3650、SEQ ID NO:3651和SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(ii)VL，所述VL包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:3655、SEQ ID NO:3653和SEQ ID NO:8的氨基酸序列；或者
(iii)其组合。
174.根据权利要求172或173所述的抗体，其中所述TCRβV结合结构域包含：
(i)VH，所述VH包含与SEQ ID NO:1346具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)VL，所述VL包含与SEQ ID NO:1349具有至少75％序列同一性的氨基酸序列；或者
(iii)其组合。
175.根据权利要求172-174中任一项所述的抗体，其中所述TCRβV结合结构域包含：
(i)VH，所述VH包含SEQ ID NO:1346的氨基酸序列；
(ii)VL，所述VL包含SEQ ID NO:1349的氨基酸序列；或者
(iii)其组合。
176.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求1-171中任一项所述的多功能多肽分子或根据权利要求172-175中任一项所述的抗体的核苷酸序列。
177.根据权利要求176所述的核酸分子，其中所述核酸分子是分离的核酸分子。
178.一种载体，其包含根据权利要求176-177中任一项所述的核酸分子中的一种或多种。
179.一种细胞，其包含根据权利要求176-177中任一项所述的核酸分子或根据权利要求178所述的载体。
180.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-171中任一项所述的多功能多肽分子、根据权利要求172-175中任一项所述的抗体、根据权利要求176-177中任一项所述的核酸分子、根据权利要求178所述的载体或根据权利要求179所述的细胞，以及药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。
181.一种在有需要的对象中治疗病况或疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的根据权利要求1-171中任一项所述的多功能多肽分子、根据权利要求172-175中任一项所述的抗体、根据权利要求176-177中任一项所述的核酸分子、根据权利要求178所述的载体、根据权利要求179所述的细胞、根据权利要求180所述的药物组合物或其组合，
其中所述施用对治疗所述对象的所述病况或疾病是有效的。
182.根据权利要求181所述的方法，其中所述病况或疾病为癌症。
183.根据权利要求182所述的方法，其中所述癌症为实体瘤、血液学癌症、转移性癌症、软组织肿瘤或其组合。
184.根据权利要求183所述的方法，其中所述癌症为实体瘤，并且其中所述实体瘤选自黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、肝癌及其组合。
185.根据权利要求183所述的方法，其中所述癌症为血液学癌症，并且其中所述血液学癌症选自霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、T细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病及其组合。
186.根据权利要求185所述的方法，其中所述非霍奇金淋巴瘤选自B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病及其组合。
187.根据权利要求185所述的方法，其中所述T细胞淋巴瘤为外周T细胞淋巴瘤。
188.根据权利要求182-187中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征在于存在于所述癌症上的癌抗原。
189.根据权利要求188所述的方法，其中所述癌抗原为肿瘤抗原、基质抗原或血液学抗原。
190.根据权利要求188-189中任一项所述的方法，其中所述癌抗原选自BCMA、CD19、CD20、CD22、FcRH5、PDL1、CD47、神经节苷脂2(GD2)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、Ron激酶、c-Met、未成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、BING-4、钙激活的氯化物通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、SAP-1、存活蛋白、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、Gp100/pmel17、酪氨酸酶、TRP-1/-2、MC1R、β-连环蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤连蛋白、p53、Ras、TGF-B受体、AFP、ETA、MAGE、MUC-1、CA-125、BAGE、GAGE、NY-ESO-1、β-连环蛋白、CDK4、CDC27、α辅肌动蛋白-4、TRP1/gp75、TRP2、gp100、Melan-A/MART1、神经节苷脂、WT1、EphA3、表皮生长因子受体(EGFR)、MART-2、MART-1、MUC1、MUC2、MUM1、MUM2、MUM3、NA88-1、NPM、OA1、OGT、RCC、RUI1、RUI2、SAGE、TRG、TRP1、TSTA、叶酸受体α、L1-CAM、CAIX、gpA33、GD3、GM2、VEGFR、整合素、碳水化合物、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、TGF-β、透明质酸、胶原蛋白、生腱蛋白C和生腱蛋白W。
191.根据权利要求181-190中任一项所述的方法，其进一步包括向所述对象施用第二治疗剂或疗法。
192.根据权利要求191所述的方法，其中所述第二治疗剂或疗法包括化疗剂、生物剂、激素疗法、放射或手术。
193.根据权利要求191-192中任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂或疗法与根据权利要求1-171中任一项所述的多功能多肽分子、根据权利要求172-175中任一项所述的抗体、根据权利要求176-177中任一项所述的核酸分子、根据权利要求178所述的载体、根据权利要求179所述的细胞或根据权利要求180所述的药物组合物顺序地、同时地或并发地组合施用。
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