JP3949712B2 - 抗体セグメントレパートリー由来でファージに表示される抗自己抗体の産生 - Google Patents

Description

本発明は自己抗原に対する抗体分子例えばヒト自己抗原に対するヒト抗体の単離に関する。抗体分子を選択するのに用いるファージ表示法は国際特許願公開第W092/01047号、国際特許願第PCT/GB92/00883号、国際特許願第PCT/GB92/01755号および英国特許願第9206372.6号に記載されている。出願人らは、自己抗原に対する抗体がファージ表示法を用いて単離することができることを見出したのである。
ヒト抗自己抗体（antiself antibody）は、生体内治療および診断を行うのに特に価値がある。というのは、異種の抗体例えばウスの抗体の抗原性から起こる問題が回避されるからである。治療用に最も有用なヒト抗体は、細胞表面分子例えば受容体、付着因子(adhesin)およびインテグリンに対する抗体、ならびに循環生物エフェクター分子例えばホルモン、成長因子およびサイトカインに対する抗体である。このような自己抗原に対するヒト抗体を得ることは極めて困難であった。本発明はこのような抗体を得る強力な方法を提供するものである。
自己抗原に対して特異性を有する抗体フラグメントを単離することは厳しい仕事である。動物は通常自己抗原に対して抗体を産生せずこの現象は寛容と呼ばれている（G. J. Nossal, Science, 245巻,147〜153頁、1989年）。自己免疫疾患は寛容性の破壊が原因である。一般に自己抗原で予防接種をしても循環抗体を産生しない。それ故に、自己抗原に対する抗体を、特にヒト中に生成させることは困難である。特にヒト抗原がマウスのような動物内の同等物に対して著しく密接な関係がない場合、その動物内にヒト抗原を認識する抗体を生成させることは可能である。ヒト抗体が必要な場合は、例えばCDRグラフティング法（英国特許第2188638B号）によってその抗体を人間化（humanise）する必要がある。
国際特許願公開第W092/01047号に記載されているファージ抗体法はこのようなヒト抗体を直接単離する技術を提供している。この出願において、我々は第一に、自己抗原に対する抗体は、例えば非免疫化起源から誘導されるファージライブラリーならびにＶ遺伝子の配列の合成的組換え、好ましくはDHとJHによるVHの組換えおよびJL配列によるVLの組換えによって得られるライブラリーから単離できるこを示している。これらの抗体はそれらの抗原に対して特異的である。この出願は、上記の方法による単一のライブラリーが異種抗原および自己抗原の両方の起源として利用することができ、あらゆる抗原に対する抗体を単離する大きな普遍的なライブラリーの可能性を開くものであることを示している。
抗体フラグメントはバクテリオファージの表面に表示することが可能で抗原を捕捉するということは国際特許願公開第W092/01047号に開示された。抗体フラグメントはこの特性を利用して直接選択することができる。このように、抗体フラグメント（Fab，Ｆ_V，scＦ_VおよびVH）は、繊維状バクテリオファージの表面へのそれらの表示を利用して単離できるということは、従来単離することが困難かまたは不可能であった抗体の特異性（すなわち特定の抗原に対する抗体）を単離する可能性を開いたのである。特に国際特許願公開第W092/01047号には、抗体特異性は、ヒトが通常暴露されることがない２−フェニル−５−オキサゾロンのような抗原に対する特異性でさえも、特別に免疫化されていない（“非免疫化）ヒトから単離できることが示されている。
本発明の実施態様において、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、馬などのような哺乳類の種由来の天然もしくは合成の抗体レパートリーが、複製可能な遺伝表示パッケージ（replicable genetic display package：rgdp）の表面に表示され、自己（self）に対する結合特異性は自己抗原に対する結合で選択される。このプロセスで、Ｖ遺伝子のレパートリーは、生体外または生体内で再配列されたＶ遺伝子から誘導されるか、または再配列されたＶ遺伝子の突然変異によって誘導される。そのＶ遺伝子レパートリーの重要な特徴は、配列が極めて多様であり通常10⁶を上まわる異なるメンバーがあることである。充分に大きなライブラリーは、あらゆる自己抗原に対する特異性の起源を提供することは実際に可能である。そのＶ遺伝子レパートリーは、抗体レパートリーがrgdpの表面に表示されるようにrgdp（例えば繊維状ファージのベクター）中にクローン化される。抗自己（antiself）に結合するまれな抗体特異性をコードするrgdpは自己抗原に対する結合性によって選択することができる。抗体レパートリーは、国際特許願公開第W092/01047号および国際特許願第PCT/GB92/00883号に記載されているように、単一レプリコンまたは二重レプリコンのフォーマット中にクローン化することができる。
Ｖ遺伝子は、rgdpの遺伝物質にクローン化され、単一領域として、例えば単一重鎖可変領域いわゆる単一領域リガンドまたは“dAb”（国際特許願公開第W090/01544号参照）として、または関連抗体(associated antibody)の重鎖と軽鎖の可変領域として発現させることができる。
これらの二つの領域は、別個のポリペプチド連鎖として（Fabフラグメント中に、領域の非共有結合および／またはジスルフィド結合によって結合されている）または上記連鎖の一部分として（二つの領域が同じポリペプチド連鎖内に含まれている単一連鎖のＦvフラグメント）表示することができる。
国際特許願公開第W092/61047号およびこの出願の実施例１〜８において、我々は、抗体フラグメントの表示と選択と行うため、抗体フラグメントと、繊維状バクテリオファージの遺伝子３タンパク質との融合を利用した。別の方法しては、抗体フラグメントを、繊維状バクテリオファージの遺伝子８タンパク質などの表面分子に融合させる方法がある。
ヒト抗原に対するヒト抗体の単離は厳しい仕事である。循環しているヒト抗体が自然に見つけられるヒト抗原の数はごく限られている。抗体はヒト起源の非自己抗原に対して存在している。ヒト血液型Ｂに対する抗体は、血液型Ｏの被検者から作製したファージ表示ライブラリーから単離されている（J. D. Marksら、Ｊ. Mol. Biol., 222巻, 581〜597頁, 1991年）そして血液型Ｏは血液型Ｂの抗原を異種のものとして認識する。
本発明は、関連する抗原に対して特異的な、自己抗原に対する抗体の一般的単離方法に関する。多くの患者は、かなりの濃度の循環自己抗体を示す。正常で健康な個体中のＢリンパ球の10〜30％が自己抗体を作ることに関与していると推定されている（I. R. CohenおよびA. Cooke, Immunol. Today, ７巻, 363〜364頁, 1986年）。しかし産生される‘天然の自己抗体’は、IgMの場合が多く低アフィニティーで多反応的（polyreactive）であるから治療用途にはむいていない（P. CasaliおよびA. L. Notkins, Ann. Rev. Immunol., ７巻, 515〜531頁, 1989年；S. Avrameas, Immunol. Today, 12巻, 154〜159頁）。自己に対する免疫応答は、自己免疫疾患中または感染後に生じることがあり、自己抗原に対する少数のモノクローナル抗体が、自己免疫疾患がみられる患者から単離されている（K. JamesおよびG. T. Bell, J. Immunol. Methods, 100巻, ５〜40頁, 1987年）。これらの自己抗体は特異的な場合が多いが、抗原の限られた範囲のエピトープにした結合しない（M. Bouananiら、Arthritis Rheum., 34巻, 1585〜1593頁, 1991年）。
IgG(またはIgM)抗体を分泌する形質細胞のmRNA由来のＶ遺伝子ライブラリーを作製すると、自己抗体由来の抗体フラグメントを単離できるようになるかもしれない。例えば抗自己抗体は自己免疫疾患がみられる患者から単離されるかもしれない。例えば抗アセチルコリン受容体抗体は、重症筋無力症の患者のIgGmRNAから作った抗体レパートリーから単離されると予想される。例えば“ヒト甲状腺ペルオキシダーゼに対して特異的な抗体フラグメントが、甲状腺自己免疫疾患がみられる患者由来のバクテリオファージλライブラリーから単離されている（S. Portolanoら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 179巻, 372〜377頁, 1991年）。しかしこの単離には、１個のクローンを得るのに200,000個のプラークの広範囲なスクリーニングを行う必要があった。その上に、このライブラリーは甲状腺の組織から誘導されたが、大部分の場合には容易に適用できない方法である。
これに対して、ファージ系を用いて利用できる選択力（国際特許願公開第W092/01047号に説明されている）によって、疾病がみられないドナーの末梢血液リンパ球のIgMmRNAから自己抗体を容易に単離できる。我々は、ヒトチログロブリン（自己免疫症の徴候があるかまたはないヒトの血清中に見つけることができる）に結合する抗体は、免疫化されていないヒトから作製したファージレパートリーから単離できることを実施例２に示す。多くのヒトのなかにチログロブリンの自己抗体が存在しているにもかかわらず、ヒトをヒトチログロブリンで免疫化することによって、ヒトチログロブリンに対する抗体を得ることができるとは必らずしも予想できることではない。正常な血清中のチログロブリンに対する自己抗体が高度の多反応性（polyreactivity）をもっていることが多いと報告されている（S. Avrameasの1991年の前記文献）。これに対して、ファージ抗体法を行う本発明の方法を用いて単離される抗体は（例えば実施例２参照）、チログロブリンに対して特異的である。
また本願では、我々は、ヒト腫瘍壊死因子−αに対する抗体でさえも、チログロブリンに対する抗体と同じライブラリーから、実施例１に述べるように単離できることを示す。多くの自己抗原は、検出可能な関連循環自己抗体をもっていない。さらに、実施例３には、自己抗原のムチン、癌胎児性抗原（CEA）およびCD4に対する抗体の単離を示すが、これらの抗体は正常な血清には報告されていない。さらにこれらの抗体は特異的であるが、時には見られる天然の自己抗体中で高度に多反応性であることが多い。大部分の自己抗原は検出可能な関連循環自己抗体をもっていない。したがって本発明に記載されている抗自己抗体の単離によって、循環ホルモンに結合してその作用を遮断、改変または強化する抗体、または細胞表面抗原に結合して、例えば癌細胞を映像化するかもしくは殺す抗体のような、多くの目的のためにヒト抗原に結合するヒト抗体を直接単離する可能性が開かれる。
ファージ表示ライブラリーから単離される抗自己抗体に関与するＶ遺伝子の起源は明らかでない。免疫系による自己抗原に対する寛容性（自己抗体に対する抗体の生成を防止する）は、自己反応性Ｂリンパ球のクローン欠失または官能性失活（アネルギー）によって仲介される（D. A. NemazeeおよびK. Burki, Nature, 337巻, 562〜566頁, 1989年；C. C. Goodnowら、Nature, 334巻, 676〜682頁, 1988年；S. B. Hartleyら、Nature, 353巻, 765〜769頁, 1991年；D. M. Russellら、Nature, 354巻, 308〜311頁, 1991年）。いずれの場合も、大部分の抗原に対する循環抗自己抗体はほとんど検出できない。しかし、アネルギーの場合、Ｂ細胞系由来の官能性が失活した自己反応性細胞は、末梢リンパ系器官に残り、循環してＢ細胞になる。抗自己特異性を有するこれらのまれなリンパ球は、抗自己特異性を有するファージ抗体に対する重鎖もしくは軽鎖のパートナー（または両者のパートナーさえも）を提供する。あるいはこのような抗自己特異性は、VH領域とVL領域のライブラリーの組合わせから生じ、天然に生じる場合には通常欠失している特異性を与える。このため、国際特許願公開第W092/01047号に記載されているような組合わせライブラリーと“連鎖がシャッフルされた（chain-shuffled）”ライブラリーが、抗自己抗体の特に豊富な起源である。ファージ抗体が提供するような強力な選択法が、かようなまれな抗自己抗体を得るのに必要である。
本願においてファージ法で単離された抗自己抗体フラグメントに見られる体細胞突然変異の程度は、いくつかの抗体は生殖系列配列をもっているので処女Ｂ細胞から生じたことを示している。本願でファージ抗体法によって単離された他の抗体は、体細胞の高度の突然変異（hypermutation）を示し、これはＶ遺伝子が、抗原の異種交差反応性抗原または他の異種の抗原によって刺激されたことを示している。両方の場合、ファージ法を用いて単離された抗体フラグメントは通常、Ｂリンパ球には本来存在していなかったVHとVLの領域の組合わせであり、本願に記載されているファージ法の力によってこの単離が可能になる。
本発明は、哺乳類の種の自己抗原である抗原に対して結合特異性を有する抗原結合部位をもっている、特異的結合対のメンバー（sbpメンバー）を得る方法であって；
（ａ）複製可能な遺伝表示パッケージ（rgdp）のライブラリーを準備し、各rgdpはその表面にsbpメンバーを表示し、そして各rgdpは、哺乳類の前記種由来の配列を有する核酸を含有し、かつそのrgdpの表面に表示されたsbpメンバーの要素部分であるポリペプチド連鎖をコードし；次いで
（ｂ）前記自己抗原との結合によって、前記自己抗原に対し結合特異性を有する一つ以上のsbpメンバーを選択する；ことからなる方法を提供するものである。
各rgdp内の核酸がコードするポリペプチド要素部分は、抗体のVH領域もしくはVL領域であるか、または単独で、もしくは一つ以上の他の要素部分との組合わせで、抗体を捕捉することができる抗体フラグメントを形成する抗体の部分である。それ故に、上記のようにsbpメンバーの要素部分として使用可能なポリペプチド連鎖の例としては、VHおよび孔の領域に加えて、Ｖ_LＣ_L，Ｖ_HＣ_H１，scＦ_Vのフラグメント、Fabフラグメントなどが挙げられる。
rgdpの表面に表示される前記の各sbpメンバーは、Ｖ_H領域とＶ_L領域を含有する抗体フラグメントである。
各抗体フラグメントは、scＦ_Vフラグメント、Fabフラグメント、抗体の単一アームのＶ_LとＶ_Hの領域からなるＦ_Vフラグメント、特に重鎖可変領域（Fd）で構成されているかもしくはFdを含有しているリガンドを捕捉する単一領域、またはエピトープもしくは抗原を捕捉することができる他のフラグメントである。
rgdpのライブラリーを提供するステップは、
（ｉ）rgdpの要素に融合されたsbpメンバーの第一ポリペプチド連鎖要素部分であって、組換え宿主細胞生物内で発現する際に前記第一ポリペプチド連鎖要素部分もしくはその集団を 表示し、またはrgdpの前記要素に融合された前記第一ポリペプチド連鎖要素部分の集団を表示する上記第一ポリペプチド連鎖要素部分と、（ii）sbpメンバーの第二ポリペプチド連鎖要素部分もしくはこのような第二ポリペプチド連鎖要素部分の集団とを結合させ、rgdpの表面に表示されるsbpメンバーのライブラリーを形成させ；
前記第一もしくは第二のポリペプチド連鎖要素部分またはその集団の少なくとも一つが、rgdpの前記要素を使用してパッケージすることができる核酸によってコードされている；ことからなるステップである。
rgdpのライブラリーを提供するステップは、rgdpの要素に融合されたsbp部材の第一ポリペプチド連鎖要素部分またはかような第一ポリペプチド連鎖要素部分の集団であって、rgdpの表面で前記ポリペプチド連鎖要素部分を表示する上記第一ポリペプチド連鎖要素部分を組換え宿主生物内で発現し；
前記第一ポリペプチド連鎖要素部分もしくは集団と、sbpメンバーの第二ポリペプチド連鎖要素部分もしくはかような第二ポリペプチド連鎖要素部分の集団とを結合させて、その表面にsbpメンバーを表示する各rgdpのライブラリーを形成し、前記ポリペプチド連鎖要素部分の少なくとも一つが、rgdpの前記要素を用いてパッケージできる核酸から発現される；ことからなるステップである。
sbpメンバーがFabフラグメントの場合、第一と第二のポリペプチド連鎖要素部分はＶ_LおよびＣ_Lの領域からなるポリペプチドであり、そして第二ポリペプチド連鎖要素部分はＶ_HおよびＣ_H１の領域からなるポリペプチドである。
第一と第二のポリペプチド連鎖要素部分もしくはその集団の結合は、第一要素部分をコードする配列および第二要素部分をコードする配列を各々内部に導入された発現ベクターにより核酸レベルで行われる。一方、この結合は、第一要素部分が第二要素部分と同じベクターから発現されない場合ポリペプチドレベルで行ってもよい。実際には、第一および第二の要素部分の一方もしくは他方が可溶性ライブラリーとして利用される。利用される各種のホーマットの詳細は、国際特許願公開第W092/01047号および国際特許願第PCT/GB92/00883号に記載されている。
ライブラリーを提供するステップは、
（ｉ）rgdpの要素に融合されたsbpメンバーの第一ポリペプチド連鎖要素、またはrgdpの要素に融合されたかような第一ポリペプチド連鎖要素部分の集団をコードする核酸を、（ii）sbpメンバーの第二ポリペプチド連鎖要素部分またはその集団をコードする核酸と結合させて、核酸のライブラリーを形成させ、前記ライブラリーの核酸はrgdpの前記要素を用いてパッケージすることができ；
組換え宿主生物内で、rgdpの要素に融合された前記第一ポリペプチド連鎖要素部分もしくはその集団、およびsbpメンバーの前記第二ポリペプチド連鎖要素部分もしくはその集団を発現させて、その表面にsbpメンバーを表示し、かつその表面に表示されるsbpメンバーの第一と第二のポリペプチドの連鎖要素部分をコードする核酸を有する各rgdpのライブラリー形成させる；ことからなるステップである（特に、ここで述べた方法のさらに詳細を知りたい場合は国際特許願W092/01047号を参照のこと）。
本発明の一実施態様では、第一と第二のポリペプチド連鎖要素部分の両方またはその集団はrgdpの前記要素を使用してパッケージすることができる核酸から発現される。これは、これらの要素部分がともにFabフラグメントを形成する場合か、または通常、rgdpの表面に表示されている前記の各sbpメンバーがscＦ_V、抗体フラグメントの場合である。
一つの実施態様では、前記第二ポリペプチド連鎖要素部分またはその集団は各々、前記第一ポリペプチド連鎖要素部分またはその集団が発現される核酸とは別の核酸から発現される。第一ポリペプチド連鎖要素部分をコードする上記核酸は、第二ポリペプチド連鎖要素部分をコードする核酸と同じ発現ベクター上にあってもよいが、例えばFabフラグメントを産生させるには別個にする。あるいは第一ポリペプチド連鎖要素部分をコードする核酸は第二ポリペプチド連鎖要素部分をコードする核酸とは異なる発現ベクター上にあってもよい。第一と第二のポリペプチド連鎖要素部分が、両者ともに同じ発現ベクター上にコードされている場合、これらの要素部分はscＦ_Vフラグメントとして発現される。この場合VH領域がポリペプチドリンカーによってVL領域に連結されその結果各scＦ_Vは単一ポリペプチド連鎖である。
rgdpの表面に表示される各sbpメンバーはFab抗体フラグメントである。
核酸は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、犬またはヒトの非免疫化哺乳類の例えば再配列されたＶ遺伝子から誘導することができる。哺乳類の種は好ましくはヒトである。というのはヒトの自己抗原を認識する（すなわちヒトの自己抗原と特異的に結合する）抗体を得ることが最も困難だからである。
核酸は、Ｖ遺伝子のセグメント（生殖細胞系のＶ遺伝子の配列でもよい）の人工もしくは合成の組換えによって製造されたライブラリーから誘導できる。
（ｂ）のステップで選択されrgdpの表面に表示されたsbpメンバーは、選択もしくはスクリーニングされて、個々のsbpメンバー、またはそれぞれのrgdpにて前記sbpメンバーもしくはそのポリペプチド連鎖をコードする核酸と結合された前記sbpメンバーの混合集団を提供する。（ｂ）のステップで選択されたsbpメンバーを表示するRgdpファージは、増殖させてその数を増やしてからさらに選択もしくはスクリーニングを行ってもよい。選択されたかまたはスクリーニングされたsbpメンバーをコードし、かつその表面に選択されたかもしくはスクリーニングされたsbpメンバーを表示するrgdpから誘導される核酸は、sbpメンバーまたはその誘導体のフラグメントを組換え宿主生物内で発現させるのに使用できる。
本発明には、自己抗原との結合によってライブラリーから選択される一つ以上のrgdpから核酸を採取し、個々のsbpメンバーもしくはsbpメンバーの混合集団またはそのインコーディング核酸(encoding nucleic acid)を得るための他の方法（本発明の実施態様にしたがってまたはしたがわずに行う方法）にイン−コーディング核酸を提供するのに使用する方法が含まれる。
発現の最終産物すなわち選択されたsbpメンバーは、改変させて、その誘導体を産生させることができる。
発現の最終産物またはその誘導体は、治療用もしくは予防用の医薬または診断用製品を製造するのに使用できる。
本発明には、本発明にしたがって本願に記載された方法を用いて得られる、全抗体および酵素との融合体を含めて抗体フラグメント、その誘導体が含まれる。
本発明の態様によって、rgdp内にパッケージすることができ、rgdpの表面に表示して抗体のポリペプチド連鎖要素部分をコードする核酸からなる各ベクターのライブラリーを有するキットの、本願に記載の本発明の実施態様によるすべての方法での使用が提供される。
また本発明は、抗体の少なくとも一つのポリペプチド連鎖要素部分をコードする核酸を含有する各rgdpのライブラリーを有するキットの、本願に記載の本発明の実施態様によるすべての方法での使用を提供するものである。
本発明は、一般に複製可能な遺伝表示パッケージ（rgdp）またはかようなrgdpの集団を産生する方法であって；下記ステップすなわち
（ａ）特異的結合対および抗自己抗体のメンバーである結合分子をコードするヌクレオチド配列を、ウイルスのゲノム内に挿入し；
（ｂ）前記ヌクレオチド配列を含有するウイルスを培養して前記結合分子をウイルスによってその表面で発現させ表示させる；ステップからなる方法を提供するものである。
また本発明は、特定の自己抗原エピトープに対して特異的なrgdpを選択する方法であって、このようなrgdpの集団を製造し、およびこの集団を前記エピトープに接触させて所望の特異性を有する個々のrgdpを前記エピトープに結合させることによって、抗自己抗体である前記結合分子を選択する追加のステップを行うことからなる方法を提供するものである。この方法には、（ｉ）捕捉されたrgdpをエピトープから分離させ；（ii）分離させたrgdpを回収し；次いで（iii）分離されたrgdpからの挿入ヌクレオチド配列を組換え系に用いてウイルスから分離した結合分子を製造する；という一つ以上の追加のステップが含まれている。この選択ステップによって所望の特異性を有する結合分子をコードするヌクレオチド配列を単離できるが、これは前記結合分子が、前記のインコーディング核酸を含有しているウイルスの表面に関連して発現されるからである。
また本発明は、抗自己抗原である特異的結合対（sbp）の多量体メンバーの製造方法を提供するものである。この方法は、前記sbpメンバーの第一ポリペプチド連鎖、または分泌される複製可能な遺伝表示パッケージ（rgdp）の要素に融合されその結果前記ポリペプチドをパッケージの表面に表示する、前記sbpメンバーの遺伝的に多様な集団を組換え宿主生物内で発現させ；次いで前記多量体の第二ポリペプチド連鎖を組換え宿主生物内で発現させ次いでこれらポリペプチド連鎖に共に前記多量体を前記rgdpの部分として形成させるか形成できるようにすることからなり；前記ポリペプチド連鎖の少なくとも一つが前記要素を用いてパッケージできる核酸から発現され、その結果前記の各rgdpの遺伝物質が前記ポリペプチド連鎖をコードする方法である。
前記連鎖はともに同じ宿主生物内で発現することができる。
前記多量体の第一と第二の連鎖は、それらのそれぞれの核酸を含有する単一ベクターから別個の連鎖として発現させることができる。
前記ポリペプチド連鎖（またはポリペプチド連鎖要素部分）の少なくとも一つはファージベクターから発現させることができる。
前記ポリペプチド連鎖の少なくとも一つはファージミドベクター（phagemid vector）から発現させることができ、その方法はヘルパーファージまたは相補的ファージ遺伝子を発現するプラスミドを用いて前記ファージミドゲノムをパッケージするのを促進させる方法であり、そしてrgdpの前記要素はそのためのキャプシドタンパク質である。このキャプシドタンパク質は、ヘルパーファージ中には存在しないか、欠陥があるか、または条件的に欠陥がある。
上記の方法は、前記の第一ポリペプチド連鎖を発現することができるベクターを、前記第二ポリペプチド連鎖を遊離形態（free form）で発現する宿主生物中に導入するか、または前記の第二ポリペプチドを遊離形態で発現することができるベクターを、前記第一ポリペプチド連鎖を発現する宿主生物中に導入することからなる方法である。
ポリペプチド連鎖は各々、前記要素の融合生成物を用いてrgdpとしてパッケージできる核酸から発現可能で、その結果、前記の両ポリペプチド連鎖のインコーディング核酸はそれぞれのrgdp中にパッケージされる。
上記の融合体は、rgdp表示要素、おそらく野生型で発現されるキャプシドがないときに発現される。
このキャプシドタンパク質はヘルパーファージには存在しないか、欠陥があるかまたは条件的に欠陥がある。
宿主細胞は、遺伝の多様性をsbpメンバーの核酸に導入する突然変異誘発菌株（mutator strain）である。
rgdpはバクテリオファージであり、宿主は細菌であり、およびrgdpの前記要素はバクテリオファージのキャプシドタンパク質である。ファージは繊維状ファージでもよい。ファージは、クラスＩのファージfd，M13，f1，If1，Ike，ZJ/Z，FfおよびクラスIIのファージXf，Pf1およびPf3から選択される。ファージはfdまたはfdの誘導体でもよい。この誘導体はテトラサイクリン耐性である。前記sbpメンバーまたはそのポリペプチド連鎖は、ファージfdの遺伝子IIIキャプシドタンパク質または他の繊維状ファージ中のその対応物との融合体として発現される。sbpメンバーまたはそのポリペプチド連鎖は、成熟、キャプシドタンパク質のＮ末端領域中の分泌リーダーペプチドの下流に挿入される。その配列は成熟タンパク質のアミノ酸＋１の後に挿入される。挿入部位には、挿入される核酸の各末端にある配列に対応する短かい配列が隣接している。
宿主はイー・コリ（E. coli）でもよい。
sbpメンバーのポリペプチドをコードする核酸は、抑制的翻訳終止コドン（Suppresible translational stop codon）を通じて、ウイルスキャプシドタンパク質の下流に連結され、終止が抑制される条件下では、sbpメンバーのポリペプチドとウイルスキャプシドタンパク質を含有する融合タンパク質が産生され、一方非抑制条件下では、遊離形態のsbpメンバーのポリペプチドが産生される。
選択系と検定方式については本明細書の別のところで考察する。これらの系と方式では、所望の特異性を有する結合分子（例えば抗体）をコードする遺伝子配列は、その結合分子が特定の標的（例えば抗原もしくはエピトープ）に結合するということによって、ある範囲の特異性を有するrgdpの一般集団から分離される。したがって、前記発現によって形成されたrgdpは選択もしくはスクリーニングされ、個々のsbpメンバー、または前記sbpメンバーまたはそのポリペプチド連鎖をコードする核酸を有するそれぞれのrgdp内にて会合された前記sbpメンバーの選択された混合集団を提供する。このrgdpは前記sbpメンバーに相補的なメンバーに対するアフィニティーによって選択される。
前記第二メンバーに捕捉されたrgdpは溶離剤で洗浄することによって回収できる。その洗浄条件は、前記エピトープに対して異なる結合アフィニティーを有するrgdpを得るために変えることができる。あるいは、例えば高いアフィニティーのrgdpを得るには、相補的メンバー（例えばエピトープ）が、結合メンバーにすでに結合されているrgdp（例えばpAb）の集団に提供される。そしてこの場合エピトープに対して高いアフィニティーを有するpAbがすでに捕捉されている結合メンバーを置換する。したがって前記溶離剤は、前記相補的sbpメンバーへの結合について前記rgdpと競合する分子を含有している。rgdpは、前記相補的sbpメンバーに対する結合について、前記パッケージと競合する分子の存在下で前記相補的sbpメンバーに加えられる。選択もしくはスクリーニングされたrgdp由来の核酸は、前記sbpメンバーまたはそのフラグメントまたは誘導体を組換え宿主生物内に発現させるのに用いられる。一つ以上のrgdpから核酸を採取し、個々のsbpメンバーもしくはsbpメンバーの混合集団またはそのためのインコーディング核酸を得る前記方法にインコーディング核酸を提供するのに用いられる。発現の最終生成物を修飾してその誘導体を製造することができる。
非免疫化ヒトから多様なライブラリーを生成させるのには好ましい起源はIgMmRNAである。七面鳥の卵のリゾチウムおよび２−フェニル−５−オキサゾロンに対する抗体フラグメントは、IgGmRNAから製造されたライブラリーよりはるかに容易に、非免疫化ヒトドナー由来のIgMmRNAから誘導されたファージライブラリーから単離されることは、国際特許願公開第W092/01047号の実施例43に記載されている。さらに、２−フェニル−５−オキサゾロン結合抗体フラグメントは、非免疫化マウスのIgGmRNAから製造した200万個のファージ抗体クローンのライブラリーからは全く単離できなかった（T. Clacksonら、Nature, 352巻, 624〜628頁, 1991年）。本願の実施例１〜３ではIgMライブラリー由来の自己抗原に対して特異的な抗体の単離を示す。これらの試料では抗自己特異性は、単一レプリコン方式で単一連鎖Ｆ_Vフラグメントとして選択されたが、抗体特異性は、単一レプリコン方式、または二重組合せの二重レプリコン方式（Hoogenboomらの1991年の前記文献）例えばloxp系による組換え（国際特許願第PCT/GB92/00883）を用いて、Fabフラグメントとして選択できた。
自己に対する抗体が豊富なファージライブラリーを製造することができる。Ｂリンパ球は、抗原によって刺激される前に表面IgMと表面IgDを発現するが、可溶性のIgMまたはIgDをほとんど発現しない。これらの未刺激細胞は、抗自己特異性を有する抗体遺伝子を含有しているようである。これに対して、可溶性抗体を分泌する最終分化形質細胞は表面免疫グロブリンをほとんど発現しない。表面IgMまたは表面IgDに対して特異的なプライマーを用いてファージライブラリー標品用のcDNAを製造すると、Ｖ領域をコードする未変性の未選択遺伝子を豊富に有する抗体遺伝子のレパートリーが産生される。自己に対し暴露することによって機能を抑圧されたＢリンパ球では、表面IgMのレベルは大きく減少したが表面IgDのレベルは変化しなかった（C. C. Goodnowらの前記文献）。したがって表面IgDに対して特異的なプライマーは抗自己抗体を単離するのに特に適している。
しかし、本願に述べるように、未選択の末梢血液リンパ球由来のIgMmRNAは抗自己特異性のＶ遺伝子の好ましい起源の一つである。このような抗自己抗体の他の起源は胎児mRNAまたは臍帯血mRNAである（P. M. Lydyardら、Scand J. Immunol., 31巻, 33〜43頁, 1990年）。
PCRを用いかつVHとVLの領域を発現する細胞内にこれらの領域をコードする遺伝子を連結することによって、VHとVLの領域のもとの組合わせを使用して、ファージ表示のためのレパートリーを作れる可能性がある。元のVH／VLの対合が保持される場合の、‘In eell PCR’の原理は、国際特許願第PCT/GB92/01483号およびEmbletonら、Nucleic Acids Res., 20巻, 3831〜3837頁、1992年に記載されている。このことは、抗自己抗体を発現するクローンが欠失する前に白血球をステージで選択できる場合特に有用である。
本発明の一実施態様では、Ｖ遺伝子の配列またはＶ，ＤおよびＪの配列の合成組換えによって製造されたライブラリーさえも使用できる。これらは抗自己抗体の豊富な起源の役目を果たす。５〜７の実施例で我々は、TNFに対する抗自己特異性、ヒト抗アカゲザルＤ抗体（OAK3）およびヒトチログロブリンが、Ｖ，ＤおよびＪのセグメントを合成で結合することによって製造したファージ抗体ライブラリーから単離できることを示す。実施例５〜７に示すように、この目的のために生殖系のＶ遺伝子を使用することは、可溶性自己抗原に対するＢリンパ球が機能を抑圧され、かつ多価メンブランに捕捉された自己抗原に対するリンパ球が排除されているいくつかの証拠があるので（S. B. Hartleyらの前記文献；D. M. Russellらの前記文献）、抗自己抗体を単離するのに価値があるはずである。したがって、生体外でのVH，DH，JHもVK，JKもしくはVL，JLの組換えまたはこれと均等の方法で作製した合成ライブラリーを使用することは、多価メンブランに捕捉された自己抗原に対する抗体を単離するのに特に有利である。
実施例５〜７において、我々は、ランダム塩基の配列をＶ−Ｄ−Ｉ連結領域に組込んだ合成VH CD R3セグメントを使用し、これを生殖系VH遺伝子配列に連結した。ランダム配列の各CDRループを作るかまたは公知の標準的な構造のCDRループを作り（C. Chothiaら、Nature, 342巻, 877〜893頁, 1989年）次いでランダム配列要素を組込むような他の戦略を使ってもよい。ＶとＪのセグメントの生殖系の性質は、その配列に特異的なまたはランダムを変更を配列に組込むかまたは体細胞で突然変異を誘発されたＶ遺伝子領域を用いることによって変えることができる。実施例５〜７で用いた戦略は、Ｖ遺伝子のセグメントのループ構造が明確な折り畳みおよび折り畳みの組合わせを限定された数しか生成せず（C. Chothiaら、J. Mol. Biol., 227巻,779〜817頁, 1992年）、このループ構造の生成で恐らく安定性が得られ、かつ抗原の構造に適合させるのに好適の結合部位の分布と範囲が生成するという利点を有する。さらに、合成ヒト抗体の重鎖と軽鎖の両者のフレームワーク領域と最初の二つの高変異性ループは多くの異なる個体で同一のようにである。このような合成ヒト抗体は完全に人工の構造体より免疫原性が低いであろう。
上記の天然および合成のファージ表示ライブラリーに代わるものとして余り好ましくないが、ファージに表示され、一つもしくはいくつかのヒト抗体分子から誘導されたランダム突然変異誘発ライブラリーを製造し、そのライブラリーから抗自己抗原特異性を選択する方法がある。
選 択
ある抗原に対して所望の特異性を発現する個々のrgbp例えばpAbは通常のスクリーニング法を用いてライブラリーから単離することができる（例えば、Harlow, E.およびLane, D.の1988年の前記文献；Gherardi, E.ら、J. Immunol. meth., 126巻, 61〜68頁, 1990年に記載されている）。
まだ本願の出願入らは、rgdpが独得の特性を有しているので実用的な選択法を発明した。いくつかのスクリーニング法の概略を、rgdpの例としてpAbを用いて図５に示す。
スクリーニングされるpAbの集団／ライブラリーは、免疫化されたかまたは他の動物から生成させることができ、または既存のファージ抗体の突然変異誘発を行うことによって生体外で生成させることができるが〔オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発法（Sambrook, J.ら、1989 Molecular Cloning a Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press）のような当該技術分野で公知の方法を用いて行える〕、外のところで述べているように、免疫化されていないヒトまたはヒトＶセグメントの人工的組換えから誘導することが好ましい。この集団は、図５を参照して以下に述べる一つ以上の方式でスクリーニングして、この抗原結合特性が試料Ｃと異なる個々のpAbを誘導することができる。
結合の溶離
図５（ｉ）は個体表面（ｓ）に結合された抗原（ag）を示し、その固体表面（ｓ）はペトリ皿、クロマトグラフィーのビーズ、磁気ビーズなどによって提供される。次にpAbの集団／ライブラリーをag上に通過させる。結合している個体ｐは、洗浄後も保持され、検出装置ｄで任意に検出される。抗fd抗血清に基づいた検出装置が用いられる（例えば国際特許願公開第W092/01047号の実施例４参照）。捕捉された集団ｐの試料を緊縮条件（stringent condition）を増大しながら取出した場合、各試料が示す結合アフィニティーは増大する。緊縮性（stringency）を増大した条件は、例えば、浸漬時間を増やすかまたは浸漬溶液のpHを変えるなどして得ることができる。
競 合
図５（ii）では、抗原agが固体支持体ｓに結合されかつ元の結合分子ｃが結合して飽和している。変異体pAbの集団（または一組の非類縁のpAb）が上記の複合体に与えられると、抗原agに対してｃより高いアフィニティーを有するものだけが結合する。大部分の例では、少数の集団だけが集団ｐ由来の個体によって置換される。ｃが伝統的な抗体分子の場合、すべての捕捉された物質は回収することができ、捕捉されたｐは、適切な細菌を感染させるかおよび／またはPCRのような標準の方法を用いて、回収される。
有利な用途は、agが受容体として使用され、ｃが対応するリガンドとして使用される場合である。その場合捕捉されて回収された集団ｐは、構造上受容体の結合部位および／またはリガンドに関連がある。この種の特異性は医薬産業で非常に有用であることが知れている。
他の有利な用途は、agが抗体であり、ｃがその抗原の場合である。その場合捕捉されて回収された集団ｐは抗イディオタイプ抗体であり、これは研究および診断および医薬産業に多くの用途がある。
現在、抗イディオタイプ抗体を直接選択することは困難であるpAbは、pAbライブラリー〔例えばナイーブ（naive）なライブラリー〕をＢ細胞（その表面に抗体を発現する）に結合させ次いで充分に結合したファージを単離することによって、直接上記の選択を行う性能を示す。
いくつかの例では、集団ｐを前もって選択しておくと有利であることが分かっている。例えば上記の抗イディオタイプの例の場合、ｐは、抗原を捕捉しない類縁抗体に対して吸収されることがある。
しかし、ｃがpAbの場合、ｃとｐのどちらかまたは両方に何らかの方法で標識をつけて、両者を識別し捕捉されたｃよりも捕捉されたｐを選択することが有利である。この標識付けは、物理的に例えばｐにビオチンで予め標識を付けることによって行うことができるが遺伝子による標識の方が一層有利である。例えばｃはEco B制限部位で標識を付けることができ、一方ｐはEco K制限部位で標識を付けることができる（Carter, P.ら、Nucl. Acids Res., 13巻, 4431〜4443頁, 1985年参照）。捕捉されたｐ＋ｃが抗原から溶離されて適切な細菌に感染させるために使用されると集団ｃ（すなわちこの例におけるEco B制限細菌）の制限がある（したがって増殖しない）。増殖するいずれのファージも高い結合アフィニティーを有する、ｐ由来の個体が著しく豊富になる。あるいは遺伝子による標識付けはｐを新しい配列で標識を付けることによって行われ、この標識はPCR法を用いてｐ混合物から特別に増幅するのに利用することができる。
捕捉されたpAbは、例えばPCR法または細菌感染法を用いて増幅することができるから、充分な個体が捕捉されていない場合でさえも所望の特異性を保持しすることが可能であり、通常の方法によって検出することができる。
所望の特異性またはアフィニティーを有するタンパク質分子を表示するファージを選択する好ましい方法としては、リガンドによってアフィニティーマトリックスから溶離する方法が多い。したがって自己抗原またはそのフラグメントは、マトリックスに捕捉された自己抗原から特異的なファージ抗体を溶離するのに使用される。あるいは異なる種由来の相同抗原をマトリックスに結合させ、ファージ抗体ライブラリーを結合させ、次いで自己抗原に対して特異的なファージ抗体を自己抗原を使って溶離させる。例えば、ウシ抗原をマトリックスに結合させ、ヒトファージ抗体ライブラリーを結合させ、次いでヒト抗原が溶離に使用される。このようにして単離された抗自己抗体は、ウシとヒトの抗原に共有されているエピトープに対して特異的である。その外のあまり好ましくない代わりの方法としては、ファージをカラムに非特異的に結合させて自己抗原で溶離する方法である。例えば、Fabファージライブラリーを抗Fabアフィニティーカラムに結合させた場合、カラムを、非特異的ファージを溶離しないpHで洗浄し、次に、自己抗原を含有することを除いて同じ溶液で洗浄し、自己抗原に対する抗体を発現するファージの、移動相に対する高いアフィニティーによって溶離する。
これらの各方式の場合、増大した濃度のリガンドによる溶離を行うとアフィニティーが増大した結合分子を表示するファージを溶離するはずである。しかし例えばpAbがその抗原に対して高いアフィニティーまたは結合力（avidity）でその抗原に結合しているとき（または他のタンパク質がその結合パートナーに結合しているとき）、その抗原に類縁の分子で、pAbをアフィニティーマトリックスから溶離することは不可能である。換言すれば充分に高い濃度で製造できる適切な特異的溶離分子はない。このような場合、例えば抗原−抗体複合体に特異的でない溶離法を使用する必要がある。一般に使用されるいくつかの非特異的溶離法は、例えばファージの生存度を低下させ、ファージの生存度はpH12において時間の経過とともに低下する（Rossomando, E. F. およびZinder H. D., J. Mol. Biol., 36巻, 387〜399頁, 1968年）。例えば抗体とアフィニティーマトリックス間に、ファージの感染能を完全に除去しなければ破壊できない相互用がある場合がある。このような場合には、例えば抗体抗原の相互作用の破壊に依存しないファージを溶離する必要がある。それ故、ファージの構造を破壊しない緩和な条件下（ジチオトレイトールによるジチオール基の還元）で捕捉されたpAbを溶離できる方法が発明された（国際特許願第W092/01047号の実施例47）。
上記の緩和な溶離法では、ファージ抗体集団の、ビオチニル化抗原への結合とストレプタビジン磁気ビーズへの結合が利用される。洗浄して非結合のファージを除去してから、ファージ抗体を溶離し、それを用いて細胞に感染させて選択されたファージ抗体集団が得られる。ビオチンと抗原分子間のジスルフィド結合はジチオトレイトールによって緩和な溶離を行うことができる。この選択を行うのに特に有利な方法は、ビオチニル化抗原を過剰に用いるが、抗原−抗体の結合に対する所望の解離定数に相当する濃度もしくはそれより低い濃度で用いる方法である。この方法は高アフィニティーの抗体を選択するのに有利である（R. E. Hawkins, S. J. RussellおよびG. Winter, J. Mol. Biol., 226巻, 889〜896頁, 1992年）。また抗体は、（R. E. Hawkinsらの1992年の前記文献）に記載されているように抗原を選択するオフレート（off rate）を遅くするのに選択される。ビオチニル化された抗原の濃度は徐々に低下させてより高いアフィニティーを有するファージ抗体を選択した。別の方法として、ファージ抗体は、J. K. ScottおよびG. P. Smith, Science 249巻, 386〜390頁, 1990年に記載されている、ペプチドファージのビオチニル化抗体に対する競合と類似の方式でファージ抗体が結合について競合するため、ビオチニル化抗原を越える過剰な量で用いられる。
この溶離方法は緩和な条件下の溶離法の一つの実施例に過ぎない。特に有利な方法は、挿入された異種の遺伝子（この場合は抗体フラグメントの遺伝子）と、遺伝子IIIの残りの配列との間を高度に特異的なプロテアーゼで切断するための認識部位を構成するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を導入する方法である。このような高度に特異的プロテアーゼの例はＸ因子とトロンビンである。ファージをアフィニティーマトリックスに結合させ次に溶離して非特異的な結合しているファージと弱く結合しているファージを除いた後、上記開裂部位を消化するのに適した条件下でカラムをプロテアーゼで洗浄することによって、強く結合したファージを除去する。このようにしてファージ粒子から抗体フラグメントを切断して、ファージを溶出させる。これらのファージは、そのプロテアーゼ部位だけが特異的に導入された部位なので伝染性であると予想される。強く結合しているファージは次いで例えばイー・コリTG1細胞に感染させることによって回収することができる。
上記の方法の代わりの方法は、強く結合したpAbを保持したアフィニティーマトリックスを取り出して、例えばSDS溶液中で煮沸することによってDNAを抽出する方法である。抽出されたDNAは次にイー・コリ宿主細胞を直接形質転換するのに使用することができ、あるいは抗体をコードする配列を、例えば本願に開示したような適切なプライマーを用いPCR法を利用して増幅し、次いでその後の試験に用いる可溶性抗体またはその後のラウンドの選択のためのpAbとして発現させるのに用いるベクターに挿入することができる。
アフィニティーによる他の好ましい選択方法は、少量のリガンドを含有するアフィニティーマトリックスに結合させることによる方法である。
そのリガンドに対して高いアフィニティーを有するタンパク質分子を表示するファージの集団から選択したい場合に、好ましい戦略は、ファージの集団を少量のリガンドを含有するアフィニティーマトリックスに結合させることである。マトリックス上のリガンドに対する結合について、高アフィニティータンパク質を表示するファージと低アフィニティータンパク質を表示するファージの競合がある。高アフィニティータンパク質を表示するファージは優先的に捕捉され、低アフィニティータンパク質は洗い流されてしまう。その高アフィニティータンパク質は次にリガンドによる溶離、またはファージをアフィニティーマトリックスから溶離する別の方法によって回収される（国際特許願公開第W092/01047号の実施例35はこの方法を示す）。
パッケージされたDNAのアフィニティーのステップによる回収について要約すると、パッケージは、簡単に溶離することができ、相補的sbpメンバーに対する結合について前記パッケージと競合する相同sbpメンバーの存在下で溶離することができ、煮沸することによって除くことができ、タンパク質の分解反応によって除去することができ、そしてその他の方法としては、例えば基質と相補的sbpメンバー間の結合を破壊して前記のパッケージされたDNAとsbpメンバーを放出する方法があるが当該技術分野の当業者にとって明らかであろう。いずれにしろ、目的は、DNAをパッケージから得て、直接または間接的に使用してコードされているsbpメンバーを発現させることである。
pAbに対するこの選択法が有効であることと非常に大きなライブラリーを作ることができるということは、問題の抗体を産生する選択された細胞の比率を増大するために開発された免疫化法が絶対必要条件ではないことを意味する。上記の方法によれば結合特異性例えば抗原結合特異性を迅速に単離することができる。そしてこれらの特異性には従来の方法例えば触媒性もしくは抗イディオタイプの抗体によっては単離が困難もしくは単離できないものがある。免疫レパートリーの完全なライブラリーが一旦構築されたならば動物を完全に排除することも今や可能である。
自己抗原に対する抗体の用途
細胞表面要素に対するヒト抗体のような抗体の特異性を単離することは、例えば抗体の天然のエフェクター機能を用いて例えば癌細胞の細胞キリングを仲介する薬剤を製造するのに特に有用である。また抗自己抗体は、例えば放射性同位元素を用いる、診断用生体内影像形成剤（imaging reagent）を製造するのに価値がある。
特異的なＴ細胞のサブセットの細胞表面要素に対する抗体は、例えば慢性関節リウマチを起こすＴ細胞の作用を防止する治療に用いることができる（D. Wraithら、Cell, 57巻, 709〜715巻, 1989年；L. SteinmanおよびR. Mantegazza, FASEB J., 4巻, 2726〜2731頁, 1990年）。
自己分子の機能を改変するヒト抗体
ホルモン、成長因子および受容体のような自己分子の、分子上の特異的エピトープに結合することによる作用を改変する抗体を単離することができる。多官能性タンパク質は、特に治療に用いられる場合、望ましい特性と望ましくない特性の両方をもっている。例えばリンホカインTNF（腫瘍壊死因子）は、少なくとも二つの異なるクラスの細胞受容体、すなわち血管内皮細胞に通常見られる受容体と腫瘍細胞に通常みられる受容体に結合するるTNFが内皮細胞受容体に結合するのを防止し、一方TNFを腫瘍細胞に結合させ、その結果、内皮細胞によって仲介される毒性副作用なしで腫瘍を攻撃できる、マウスのTNFに対する抗体が製造されている（国際特許願第PCT/AU90/00337号）。ホルモンもしくは成長因子の分子の抗体改変因子を治療に用いる場合、このような抗体改変因子は、ファージライブラリーからの選択によって直接単離されたヒト抗体特異性をもっていることが好ましい。
ヒト抗イディオタイプ
抗イディオタイプ抗体（ヒト抗体の可変領域によって形成された抗原結合部位に対する抗体）は、通常、抗原に対する抗体を単離し次にこの単離された抗体を免疫原として用いてそれに対する抗体を生成させることによって製造される。元の抗体がホルモンまたは成長因子に対する抗体である場合、抗原と抗体結合部位の関係は、その抗イディオタイプがいくつかの点でホルモンもしくは成長因子とよく似ており、これらの分子の受容体と結合することを意味する。しかし受容体に対するホルモンの結合性を似せることができる抗イディオタイプの抗体の画分は小さいと予想される。さらに抗自己リンパ球が欠失していることは、抗イディオタイプへの通常の経路を用いて、ヒト受容体を捕捉する分子によく似ているヒト抗イディオタイプ抗体を単離することは困難であることを意味する。本願において我々は、ヒト抗体の可変領域によって形成された抗原結合部位に対する抗体は、実施例１と４に示すようにファージ抗体表示ライブラリーから直接単離することができ、そして受容体に対する結合性についてスクリーニングすることによて、ホルモンの結合がよく似ている抗イディオタイプ抗体を直接同定できるはずであることを示す。
また抗イディオタイプは自己免疫疾患を治療するのに有用である。これは循環している自己抗体に結合させるのに用いることができる。しかし、例えば細胞表面マーカーならびに抗イディオタイプ特異性に対する二重特異性抗体を使用して、抗体産生細胞を直接攻撃することが好ましい。あるいは、血漿分離交換法を用いて、循環抗体および治療される細胞を直接除くことができる。
受容体に対するヒト抗体
受容体に結合してリガンドの機能を阻止もしくは該機能に拮抗するヒト抗体は、免疫化されていないドナー由来の抗体を表示するファージライブラリーから直接選択することができる。
移植拒絶反応を防止するヒト抗体
主要組織適合性複合タンパク質に対する抗体は、拒絶反応を阻止するため、移植を行った後の患者または移植を行う前の器官を治療するのに用いることができる。いくつかのリンパ球細胞の表面マーカーに対する抗体が、移植物例えばCD45，CD3，CD4，CD8およびインターロイキン−２受容体の拒絶反応を阻止するのに使用された。実施例３は、CD4に対する抗体がファージ表示ライブラリーから直接単離できることを示す。
サイトカイン類に対するヒト抗体
サイトカイン類に対するヒト抗体は、ヒトの疾病、例えば抗−TNF抗体および抗−インターロイキン１抗体による敗血症性ショックの治療に有益である。実施例１と６は、TNFに対するヒト抗体は、免疫化されていないヒト由来のまたはＶ，ＤおよびＪフラグメントの合成組換え由来のファージ抗体ライブラリーから直接単離することができることを示す。多くの場合、これらのサイトカイン分子、例えばトランスフォーミング成長因子（TGF-β）は種にまたがって強く保存され、マウス内でさえ、ヒト分子に対する抗体を単離することは困難であることが分かっている。本発明に記載されているヒト抗自己抗体の単離法は、上記特異性を有するヒト抗体を得る方法を提供する。
心臓障害の診断と治療に用いるヒト抗体
血餅成分、例えばフィブリンに対するヒト抗体は、放射能で標識をつけたときに血餅の映像を形成させるのに有用であり、または例えばウロキナーゼのような血餅を溶解する酵素に連結した場合は血餅を溶解するのに有用である。
受容体の機能をトリガーする抗体
細胞受容体に結合して細胞の生物学的応答をトリガーする抗体を選択することができる。このことは以下に一層詳細に記載され、実施例８にはかような抗体の単離が記載されている。
増殖と選択のサイクルによって、細胞受容体に結合するこれらrgdpは単離される。これらのrgdpのいくつかは、受容体をトリガーする可能性を有する結合特異性を（単独もしくは他の結合特異性と組合わせて）コードしている。細胞受容体をトリガーするこれらの結合特異性は単独もしくは組合せで試験される。
リガンド例えばホルモン、成長因子またはペプチドが結合すると生物学的事象例えばチロシンキナーゼの活性の活性化またはイオンチャネルの開放をトリガーする各種の細胞受容体がある。rdgpは、例えば細胞受容体を表示する細胞を使用し、または固体相に固定化された可溶性受容体を用い、または受容体の領域またはペプチドエピトープを用いて、細胞受容体（または他の種由来のような表面の保存部分を有する類縁受容体）に結合させるために選択することができる。受容体は（トリガーするのに必要であるから）架橋形で提供するのが理想的である。
細胞表面の受容体をトリガーするとタンパク質またはサブユニットの相対的移動を起こすことが多いようである。例えば神経伝達物質依存性受容体では、メンブランの位置に対称的に配列されている五つのサブユニットはイオン経路を中心に向かって形成している。神経伝達物質が結合すると、アロステリック転移でサブユニット間の小さい再配列を起こすことによって中央イオンチャネルの大きさが変化すると考えられる。チロシンキナーゼ受容体の場合、そのリガンドは受容体のオリゴメリゼーション（oligomerisation）を駆動するようである。したがって受容体に対する結合特異性を有する抗体はアロステリック変化を促進するかまたはオリゴメリゼーションを促進する可能性がある。また受容体のオリゴメリゼーションは二極または二重特異性の抗体を用いて促進することができる。
可溶性の抗体または抗体フラグメントは一価のフラグメントで例えば一本鎖のＦ_VフラグメントもしくはFabフラグメントであるか、または二価のフラグメント例えばFab₂もしくは完全抗体フラグメントである。またこの二原子価は他の方法で促進することができる。例えば（１）モノマーのフラグメントのＮ末端またはＣ末端に自己会合する（self associate）ペプチドもしくはタンパク質（例えば二量体タンパク質のサブユニット）のようなタグ（tag）をコードさせることによって；（２）一価のフラグメントに結合する二価の抗体を、例えば共通のＣ末端タグにに用いることによって；または抗体の定常領域に（３）化学的架橋を用いることによって促進することができる。
二重特異性抗体または二重特異性フラグメントも二価フラグメント用に作ることができる（二重特異性の抗体もしくはフラグメントを小さな細胞中で発現させるためには、両方の特異性をコードする遺伝子をともに導入する必要がある）。異なる抗体の“アーム”は、同じ受容体例えば異なるエピトープまたは二つの異なる受容体に（ハイブリッド受容体をトリガーするため）対して指向させることができる。
本発明に述べられているようにしてファージライブラリーから抗自己抗体を直接単離することは、多数の抗体を、それらがトリガーする受容体について調べるのに重要である。本願に記載され、および本発明の態様として提供される、受容体をトリガーする抗体を作ることは、“抗イディオタイプのルート”と区別することが適切である。この抗イディオタイプルートでは、ヒトを含む動物に特異的抗原を接種することによって生成させた特異的抗体自体が他の動物に接種するのに使用され、抗イディオタイプ抗体（Anti-Id）と呼ばれる新しい抗体が産生され、その抗体は第一セットの抗体を認識してこの抗体に結合することができる。これらのAnti-Idのいくつの種は元の抗原の特異的生物学的特性に似せることができる。例えば抗原がペプチドホルモンもしくは細胞受容体の場合、このホルモンもしくは細胞受容体の抗原に対するAnti-Idは細胞の応答を引出すことができる（Gaulton, G. N.およびGreane, M. I., 1986年, Idiotypic mimicry of biological receptors, Ann. Rev. Immunol.,４巻, 253〜280頁；Sege, K.およびPeterson, P. A, 1978年, Use of anti-idiotypic antibodies as cell surface receptor probes, Pnoc. Ntl. Acad. Sci. USA, 75巻, 2443〜2447頁参照）。
抗原の模擬体（mimic）としてAnti-Idを現在教示している本質は、Anti-Idが元の抗原の抗体に対する抗体を構築する結果産生されるということである。しかしこのような抗イディオタイプが元の抗原に正確に似ているか否かについては議論の余地がある（S. J. Davisら、Nature, 358巻, 76〜79頁, 1992年）。
それ故に、成長因子もしくはホルモンのような抗原によく似ている、抗イディオタイプルートで製造された抗体と、受容体に対して直接製造され受容体をトリガーする抗体には明確な差異がある。抗イディオタイプルートによって誘導される抗体は抗原（ホルモン、成長因子）を必要とし、ホルモンと同じ、受容体上のエピトープに結合するが、受容体に結合することによって誘導される抗体は、受容体をトリガーするのに同じエピトープに結合する必要がない。実際には、かような抗体は、これら抗体の特異性または受容体に対する結合性〔エピトープ、オン−レート（on-rate）またはオフレートに特徴がある〕または血液クリアランスが異なっているようなので、公知のホルモンまたは成長因子に似ている必要がない。またこれら抗体の製造方法も全く異なっている。抗イディオタイプ抗体は、動物を免疫化することによって古典的に作られているが、上記の抗体は、上記のようにファージ表示ライブラリーから直接単離することができる。自己受容体に対する抗体はＶ遺伝子のライブラリーから（上記のようにして）選択することによって製造される。
受容体結合によって直接誘導される抗体は、抗イディオタイプルートをしのぐ利点のみならず、天然のホルモンまたは成長因子をしのぐ利点さえもっている。したがって、天然のホルモンもしくは成長因子の結合に欠陥がある受容体（例えば遺伝病の受容体）は異なるエピトープで結合する抗体でトリガーすることができる。
分子の特異性に対して応答可能な可変領域を保有する抗体もしくは抗体フラグメントの各種のイソタイプは、治療剤として、それらが似ている生物活性部分を越える利点を有する多数の特性をもっている。例えば、天然のホルモンと異なり、循環中の半減期は容易に改変できる。選択される抗体のイソタイプもしくはフラグメントによって、その患者内での循環中の半減期は数分間〜数週間の範囲である。長期の使用または短期間のクリアランスが必要な場合、半減期は、適切な抗体イソタイプを選択することによって、移植物もしくは連続静脈輸液装置などのような徐放装置を使用する必要なしで容易に適合させることができる。
さらに、多くのホルモンもしくは組織成長因子もしくは抗原は、一般に各種の特異的機能を有する各分子の異なるエピトープによって、機能が複雑である。抗体模擬体のクローンはこの点については一官能性なので第二の作用（患者に対して不都合の場合がある）なしでホルモンの一つの特異的な生物学的作用を生成させるのに使用できる。したがって、リンホカインTNF（腫瘍壊死因子）は、二つの異なるクラスの細胞受容体すなわち血管内皮細胞に普通存在するものおよび腫瘍細胞に普通存在するものに結合する。TNFが改変され、その結果内皮細胞受容体に結合できないが腫瘍細胞受容体には依然として結合できる場合、腫瘍は血管受容体を通じて仲介される毒性が非常に強い副作用を同時に誘発することなく攻撃される（このことはオーストラリアでの国際特許願第PCT/AU90/00337に記載されている）。腫瘍細胞受容体を認識できる抗体の模擬体は、非常に特異的であり、血管内皮によって仲介される毒性副作用を誘発することなく腫瘍細胞を殺すと予想される。というのは、このような模擬体は腫瘍細胞の受容体に結合するTNFエピトープに全く似ていないからである。
用 語
この項で考察する用語の多くは適切な場合に本明細書に記載される。
自 己（self）
自己抗原は、抗体の可変領域によって形成される抗原結合部位に結合することができ、かつ動物の種のメンバー間に保存され、身体に固有の抗原もしくはエピトープである。
免疫系は、自己抗原に対する抗体を作ることは避けようとする。（ｉ）生殖系のＶ遺伝子セグメントの配列は、異種の例えば病原体、抗原およびエピトープに対する圧力下で発生し、自己抗原を捕捉する抗体を提供できなくなり、および（ii）このことに加えて、発生する、抗自己抗体をコードする遺伝子セグメントの結合が、免疫寛容によって、欠失するかまたはアネルギー状態になる（anergise）ことが示唆されている。その結果、例えば疾病状態例えば自己免疫疾患の場合を除いてこれらの抗原に対する循環抗体は通常存在しない。自己抗原は、一つの種の個体間では変らない抗原である。また自己抗原は集団を通じて通常の対立遺伝子の変動（allelic variation）がある抗原である。自己抗原を有する種の一つの個体を免疫化した場合、寛容が恐らくゆっくり破壊される場合を除いて、抗原に対する抗体が生成しまたは検出されるようになるとは通常考えられない。自己抗原に対する抗体は、自己免疫疾患にかかっている個体にのみ存在している。一方、一つの種の正常な個体のサブ集団に、その循環抗体が見られるいくつかの自己抗原がある。
自己抗原は、Ｂ細胞の表面抗体によって認識される抗原であるが、循環しているのが見られる抗体には認識されない。おそらく個体が自己免疫の疾患または症状にかかっているときを除いて、自己抗原に対する循環抗体を検出または得ることは不可能である。
抗自己抗体もしくは抗自己抗体フラグメントは、自己抗原に対して結合特異性を有する抗体もしくは抗体フラグメントである。この抗体は、自己抗原にのみ見られるエピトープを認識し、または種の個体が異種として認識する抗原に対して交差反応性である。本発明は自己抗原のみを捕捉する抗体フラグメントを製造し単離するのに特によく適している。
特異的結合対
この用語は天然に得られるかまたは合成で製造される一対の分子（各々特異的な結合対のメンバーである）を意味する。分子の対の一方は、他方の分子の特定の空間の極性組織と特異的に結合しそのため相補的に形成されている表面上の領域または空どうを有し、そのためこの対は互いに特異的に結合する特性をもっている。特異的結合対のタイプの例は、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質、IgG-プロテインＡである。
多量体のメンバー
この用語は、遊離形態で発現されるおよび／または基質の表面に発現されるときに少なくとも第二ポリペプチドと会合する第一ポリペプチドを意味する。基質はバクテリオファージによって提供される。二つの会合したポリペプチドがある場合、その会合したポリペプチドの複合体は二量体であり、三つの会合ポリペプチドの場合三量体であるなどである。二量体、三量体、多量体などまたは多量体のメンバーは特異的結合対のメンバーで構成されている。
多量体メンバーの例は、免疫グロブリン分子に基づいた重領域、免疫グロブリン分子に基づいた軽領域、Ｔ細胞受容体のサブユニットである。
複製可能な遺伝表示パッケージ（Rgdp）
この用語は、複製する性能を有する粒子を提供する、遺伝情報を有する生物学的粒子を意味する。この粒子はその表面にポリペプチドの少なくとも一部を表示することができる。そのポリペプチドは、その粒子に固有のおよび／または粒子もしくはその祖先に人口的に入れられた遺伝情報によってコードされる。その表示されたポリペプチドは、特異的結合対のメンバーであり、例えば免疫グロブリン分子に基づいた重鎖もしくは軽鎖の領域、酵素または受容体などである。
粒子はウイルスでもよく、例えばfdもしくはM13のようなバクテリオファージである。
パッケージ
この用語は、粒子がその表面に特異的結合対のメンバーを表示している再生可能な遺伝表示パッケージを意味する。このパッケージはその表面に抗原結合領域を表示すバクテリオファージである。この種のパッケージはファージ抗体（pAb）と呼ばれている。
抗 体
この用語は、天然のまたは一部分または全体が合成によって産生されるか否かにかかわらず免疫グロブリンを意味する。またこの用語は、免疫グロブリン結合領域であるかまたはこの領域に相同の結合領域を有するタンパク質を含む。これらのタンパク質は天然の起源から誘導できるかまたは一部分または全体が合成で製造することができる。
抗体の例は、免疫グロブリンのイソタイプ、そのFab，F(ab')₂，scＦ_V，Ｆ_V，dAb，Fdのフラグメントである。
免疫グロブリンスーパーファミリー
この用語はポリペプチドのファミリーを意味し、そのファミリーのメンバーは、免疫グロブリン分子の可変領域まは定常領域の構造に類縁の構造を有する少なくとも一つの領域をもっている。その領域は二つのβシートと通常保存ジスルフィド結合を含有している（A. F. WilliamsおよびA. N. Barclay, Ann. Rev. Immunol. ６巻, 381〜405頁, 1988年参照）。
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの例はCD4、血小板由来の成長因子受容体（PDGFR）、細胞間接着分子（ICAM）である。特にことわらない限り、本願で引用される免疫グロブリンおよび免疫グロブリン同族体には、免疫グロブリンのスーパーファミリーのメンバーとその同族体が含まれる。
同族体
この用語は、その一次、二次または三次の構想において対応する位置に同じ残基または保存残基を有するポリペプチドを意味する。またこの用語には相同のポリペプチドをコードする二つ以上のヌクレオチド配列も含む広い範囲が含まれている。
相同ペプチドの例は免疫グロブリンのイソタイプおよびTIMバレル酵素である。
機能的（functional）
rgdpの表面に表示されるsbpメンバーについて、この用語はsbpメンバーが折畳まれた形態で提供され、折畳まれた形態では、その補的sbpメンバーに対して特異的なその結合領域はその未変性の形態と同じかまたはよく類似し、その結果それは相補的sbpメンバーに対して同じ特異性を示す。
遺伝的に多様な集団
sbpメンバーまたはそのポリペプチド要素については、この用語は、細胞もしくは生物の天然集団中に存在する多様性を意味するだけでなく、生体内もしくは生体外の人工突然変異によって作り出すことができる多様性も意味する。
生体外の突然変異としては例えば変化させることが所望の配列のランダム突然変異を有するオリゴヌクレオチドを用いるランダム突然変異誘発がある。生体内の突然変異誘発には、例えばDNAを入れるのに宿主微生物の突然変異誘発菌株を使用する（国際特許願公開第W092/01047号の実施例38参照）。用語“ユニーク集団（unique population）”は、複数の例えば遺伝的に多様でないすなわちすべて同じであるポリペプチド連鎖を示すのに使用する。制限集団は、多様であるが、動物の全レパートリーまたは合成もしくは他の方法によるライブラリーより多様性が低い集団である。その多様性は、例えば抗原結合特異性を使用して、前に選択することによって減少している。
領 域
領域は、それ自体内で折畳まれているタンパク質の一部分であり、同じタンパク質の他の部分から独立しかつ相補的結合メンバーから独立している。折畳まれた単位はα−らせんおよび／またはβ−シート構造の特異的な組合わせである。領域と折畳み単位は、一次構造で隣接していないアミノ酸を接合する構造をもっている。
遊離型
この用語は複製可能な遺伝表示パッケージによって表示されないポリペプチドの状態を意味する。
条件によっては欠陥がある（conditionally defective）
この用語は、一組の条件下で欠陥ポリペプチドを発現するが、別の組の条件下では異なっているが類縁の欠陥がないポリペプチドを発現する遺伝子を意味する。一例は、非抑制宿主または抑制宿主それぞれにおいて発現されるアンバー突然変異を含む遺伝子である。
あるいは、遺伝子は、一組の条件下では欠陥があるが他の組の条件下では欠陥がないタンパク質を発現する。一例は温度感受性突然変異を有する遺伝子である。
抑制的翻訳終止コドン
この用語は、一組の条件下ではコドンの下流のヌクレオチドを翻訳させるが、他の組の条件下ではそのコドンにおいて翻訳が終るコドンを示す。抑制的翻訳停止コドンの例は、アンバー、オーカーおよびオパールのコドンである。
突然変異誘発菌株（mutator strain）
これは、その中で複製されたDNAに、その親DNAについて突然変異を起こさせる遺伝欠陥を有する宿主細胞である。突然変異誘発菌株の例はNR9040 mut D5およびNR9046 mut T1である（国際特許願公開第W092/01047号の実施38参照）。
ヘルパーファージ
これは、欠陥ファージゲノムを有する細胞に感染させるのに用いられ、その欠陥を補足する働きをするファージである。その欠陥ファージゲノムは、なんらかの機能をコードする遺伝子配列が除去されたファージミドまたはファージである。ヘルパーファージの例は、M13K07，M13K07遺伝子III３号；およびキャプシドタンパク質に融合された結合分子を表示またはコードするファージである。
ベクター
これは、宿主生物内で複製することができるDNA分子であり、これに遺伝子が挿入されて組換えDNA分子が構築される。
ファージベクター
これはファージゲノムを改変すことによって誘導されるベクターであり、バクテリオファージの複製開始点を含有しているがプラスミドの複製開始点はもっていない。
ファージミドベクター
これは、プラスミドゲノムを改変することによって誘導されるベクターであり、バクテリオファージの複製開始点およびプラスミドの複製開始点を含有している。
分泌される（secreted）
これはrgdp上に表示されるsbpのメンバーと会合するrgdpもしくは分子を意味し、その中には、sbpメンバーおよび／または該分子が折畳まれ、そしてパッケージが細胞のサイドゾルの外側に組立てられる。
再配列された免疫グロブリン遺伝子のレパートリー
天然産のヌクレオチド例えば動物内で発現される免疫グロブリン遺伝子をコードするDNA配列のコレクションである。この配列は、例えばＨ鎖のＶ，ＤおよびＪのセグメントならびに例えばＬ鎖のＶおよびＪのセグメントを生体内で再配列することによって生成される。あるいは、これらの配列は、生体外で免疫化された細胞系から生成させることができ、そして免疫化に応答して再配列が細胞間で起こる。
ライブラリー
クローン中のヌクレオチド例えばDNA配列のコレクション；またはポリペプチドの遺伝的に多様なコレクション；または特異的な結合対のメンバー；または選択もしくはスクリーニングが可能なrgdp上に表示され、個々のポリペプチドもしくはsbpメンバーまたはポリペプチドもしくはsbpメンバーの混合集団を提供するポリペプチドまたはsbpメンバーである。
人工的に再配列された免疫グロブリン遺伝子のレパートリー
動物由来の再配列された免疫グロブリンの配列以外の起源から全体または一部を誘導されたヌクレオチド例えばDNA配列のコレクションである。これには例えば未再配列のＶセグメントをＤおよびＪのセグメントと結合することによるVH領域をコードするDNA配列およびＶとＪのセグメントを結合することによるVL領域をコードするDNA配列が含まれている。
これらDNA配列の一部またはすべてはオリゴヌクレオチド合成法によって誘導される。
分泌リーダーペプチド
これはポリペプチドのＮ末端に連結されたアミノ酸の配列であり、そのポリペプチドをサイトゾルから移動させる。
溶離剤
これは二つの分子間の結合を切断するのに用いられる溶液である。その結合は非共有結合でも共有結合でもよい。その二つの分子はsbpのメンバーであってもよい。
誘導体
これは、選択されたrdgp内のDNAでコードされる他のポリペプチドから誘導されるポリペプチドである。この誘導体ポリペプチドは、インコードされたポリペプチドに対してアミノ酸の付加、欠失、置換もしくは挿入を行うかまたは他の分子を連結することによって得られるインコードされたポリペプチドとは異なっている。これらの変更はヌクレオチドもしくはタンパク質のレベルで行われる。例えば、インコードされたポリペプチドは他の起源由来のＦ_Cテールに連結されるFabフラグメントである。あるいは酵素、フルオレセインなどのようなマーカーを例えばFab，scＦ_Vのフラグメントに連結してもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、ウシチログロブリン（上方パネール）、ヒトTNFα（中央パネル）またはヒトmAB Fog-１（γ−１，ｋ）上での選択によって未免疫化ライブラリーから単離された可溶性一本鎖Ｆ_VS、（scＦ_VS）の特異性のELISA法による分析結果を示す。結合性は、下記、下記タンパク質のパネルに対する結合性をELISA法で測定した。１−プラスチック；２−雌ニワトリの卵のトリプシンインヒビター；３−キモトリプシノーゲンＡ；４−雌ニワトリの卵のオボアルブミン；５−キーホールリンペットヘモシアニン；６−ウシチログロブリン；７−ヒトTNFα；８−七面鳥の卵の卵白リゾチウム；９−ウマ心臓のシトクロムｃ；10−ウシ血清アルブミン；11−mAb Fog-１。
図２は、ヒト癌胎児性抗原（CEA）（上方パネル）、MUC1ペプチド（Priceらの1990年の前記文献）（中央パネル）またはヒトCD4（下方パネル）上での選択によって、未免疫化ライブラリーから単離した可溶性scＦ_VSの特異性のELISA法による分析結果を示す。結合性は下記タンパク質のパネルに対する結合性をELISA法で測定した。１−雌ニワトリの卵のトリプシンインヒビター；２−キモトリプシノーゲンＡ；３−雌ニワトリ卵オボアルブミン；４−キーホールリンペットヘモシアニン；５−CEA；６−ヒト多形性上皮ムチン（PEM）を含有する尿抽出物；７−ウシチログロブリン；８−雌ニワトリ卵白リゾチーム；９−ウシ血清アルブミン；10−４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル酢酸にカップリングしたニワトリγグロブリン；11−ヒト組換え可溶性CD4。
図３は、ヒトモノクローナル抗体Fog-１（IgG1，ｋ）上での選択によって単離した３種のscＦ_VSの、下記各種のイソタイプのヒト抗体のパネルへの結合性をELISA法で検定した結果を示す。１-Fog-１；２−HulysllのＦ_Vフラグメント；３−Hulysll抗体（IgG1，ｋ）；４−RegA（IgG1，ｋ）；４−RegA（IgG1，ｋ）；５−FogC（IgG3，ｋ）；６−Pag1（IgG1，λ）；７−骨髄腫プラズマから精製したIgG2，λ抗体（Sigma社）；８−Oak3（IgG3，λ）；９−骨髄腫プラズマから精製したIgG4，λ（Sigma社）；10−Fom1（IgM，λ）；11−FomA（IgM，λ）。
図４は、合成ライブラリー創製中のＶ_H遺伝子の組立てを示す。
図５はpAbの選択法を図式的に示す。５（ｉ）は結合／溶離のシステムを示す；５（ii）は競合のシステムを示す（ｐ＝pAb；ag＝pAbによる結合が必要な抗原；Ｃ＝競合体の集団例えば抗体、pAb、リガンド；Ｓ＝基材（例えばプラスチックビーズなど）；ｄ＝検出システム）。
本発明を下記の実施例で説明する。本願で述べるオリゴヌクレオチドとプローブは表IVに列挙した。表Ｉ〜IVは実施例８の後に記載してある。
実施例１は、未免疫化ヒト由来の一本鎖Ｆ_Vフラグメントのファージライブラリーからの、ヒト腫瘍壊死因子−αに対する抗体およびヒトモノクローナル抗体の単離を示す。
実施例２は、未免疫化ヒト由来の一本鎖Ｆ_Vフラグメントのファージライブラリーから得たヒトチログロブリンに結合する抗体の単離を示す。
実施例３は、未免疫化ヒト由来の一本鎖Ｆ_Vフラグメントのファージ表示ライブラリーからの、自己抗原MUC1ムチン、癌胎児性抗原（CEA）および組換え可溶性CD4（rsCD4）に対する抗体フラグメントの単離を示す。
実施例４は、DNAの配列決定およびアフィニティーの測定による、選択された抗自己抗体のフラグメントのその後の特性決定を示す。
実施例５は、生殖系VHセグメントを用いた合成ヒトライブラリーの創製を示す。
実施例６は、ヒト生殖系合成ライブラリーからの、ヒト腫瘍壊死因子−αに結合する抗体フラグメントの単離を示す。
実施例７は、異なる長さのVH CDR3配列を含有するヒト生殖系VHセグメントを用いて行う合成ヒトライブラリーの創製、ならびにヒトチログロブリンに結合する一本鎖Ｆ_Vフラグメントとヒトモノクローナル抗体の単離を示す。
実施例８は、受容体の機能をトリガーするヒトインターロイキン−１受容体分子に対するヒト抗体の単離を示す。
実施例１
未免疫化血液ドナーから製造したscＦ _VS のライブラリーからの、自己抗原に対する抗体フラグメントの単離
ヒトPBLから単離された天然産のＶ遺伝子は、ドナーが暴露されたことがない抗原に対して反応性を有する抗体フラグメントの大きなライブラリーに構築することができる（国際特許願公開第W092/01047号実施例42）。我々は、これらのライブラリーが、除去されていなかった自己反応性Ｂ細胞から生じるか、またはVHとVLの連鎖の組換えからもたらされる。非天然産フラグメントとして生じる自己抗原に対する反応性も有していることを発見した。このことを試験するため、我々は、ヒトTNF-αおよびヒトIgG/k免疫グロブリンに対するファージミドの表面に表示される大きなヒトscＦ_Vライブラリーのパニングを行った。
方 法
ライブラリーのレスキュー（rescue）
scＦ_VSのライブラリーはヒトPBLのRNAから構築されすでに報告されている（国際特許願公開第W092/01047号の実施例42）。抗体フラグメントを表示するファージをレスキューするため、ファージミドを有する約10⁹個のイー・コリを用いて、１％グルコースと100mg／mlのアンピシリンを含有する2XTY（2XTY-AMP-GLU）50mlに接種し、振盪しながらO．D．が0.8に達するまで増殖させた。この培養物５mlを用いて2XTY-AMP-GLU 50mlに接種し、デルタ遺伝子３ヘルパー（M13D遺伝子III、国際特許願公開第W092/01047号参照）２×10⁸TUを添加し、次いでその培養物を、振盪せずに37℃にて45分間インキュベートし続いて振盪しながら37℃にて45分間インキュベートした。得られた培養物を4000r.p.m.で10分間インキュベートし、生成したペレットを、100mg／mlのアンピシリンと50mg／mlのカナマイシンを含有する2XTY ２ｌ中に再懸濁させ一夜培養した。ファージはすでに報告したのと同様にして調製した（国際特許願公開第W092/01047号実施例42）。M13D遺伝子IIIは以下のようにして調製した。
M13D遺伝子IIIヘルパーファージは遺伝子IIIタンパク質をコードしていない。したがって抗体フラグメントを表示するファージ（ミド）は抗原に結合する一層大きな結合力をもっている。伝染性のM13D遺伝子III粒子は、ファージの形態形成中に野生型ｇIIIタンパク質を供給するpUC19誘導体を含有する細胞中でヘルパーファージを増殖させることによって調製する。その培養物を振盪せずに37℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら37℃でさらに一時間インキュベートした。細胞を遠心分離（IEC-Centra8, 4000r.p.m.,10分間）、100mg／mlのアンピシリンおよび25mg／mlのカナマイシンを含有する2XTYブロス（2XTY-AMP-KAN）300ml中に再懸濁し、次いで37℃で振盪しながら一夜培養した。ファージ粒子を、PEG-沈澱法（Sambrookらの1990年の文献）に２回付して、培地から精製し濃縮し、PBS 2ml中に再懸濁し、0.45mmフィルター（Minisart NML；Sartorius社）を通過させて、約10¹³の形質導入単位／mlの最終濃度（アンピシリン耐性クローン）を得た。
ライブラリーのパニング
100mg／mlもしくは10mg／mlのPBS中組換えヒトTNF-α４ml、または10mg／mlのFog-１、ヒト赤血球‘Rh（D）抗原を認識するヒトIgG/k免疫グロブリン４mlを用いて、RBS中で免疫試験管（Numc）を一夜コートした。これら試験管を２％Marvel PBSで37℃にて２時間ブロックし次にPBS中で３回洗浄した。ファージ約1013 TUを試験管に加え、次いで室温で30分間、上下に動くターンテーブルでタンブリングしながらインキュベートし、次にさらに1.5時間静置した。試験管をPBS 0.10％Tween-20で10回洗浄し次にPBSで10回洗浄した。100mMトリエチルアミン１mlを添加することによってファージを溶離し、上下動タンブラーで15分間回転させ、得られた溶液を1.0ＭトリスHC1（pH7.4）0.5mlで直ちに中和した。溶離されたファージをmid-logイー・コリTG1 10mlとともに37℃にて30分間培養することによってファージを上記細菌に感染させた。そのイー・コリを、１％グルコースおよび100mg/mlアンピシリンを含有するTYEプレート上にプレートした。得られた細菌ライブラリーを先に述べたようにしてδ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューして、次の選択ラウンドに用いるファージを調製した。上記プロセスを繰返し、合計４ラウンドのアフィニティー精製を行ったが、試験管の洗浄は３ラウンドと４ラウンドにおいて、PBS.0.1％Tween-20による洗浄を20回に増やしかつPBSによる洗浄を20回に増やして行った。
バインダーの特性決定
３ラウンドと４ラウンドの選択ステップから溶出されたファージを用いてイー・コリHB2151に感染させ、可溶性scＦ_Vを検定用に単コロニーから産生させた（Marksらの1991年の文献）。TNFの場合もファージは単コロニーからレスキューした。50mM重炭酸塩pH9.6中10μｇ/mlのヒトTNF-αまたはPBS中10μｇ／mlのFog-１でコートした微量滴定プレートを用い、すでに述べたようにしてELISA法を実施した。ELISA法で陽性のクローンをPCRフィンガープリント法（国際特許願公開第W092/01047号実施例20）次いで配列決定を行ってさらに特性を決定した。
試験結果
TNF：1536個のコロニーから得た可溶性scＦ_Vと1152個のコロニーから得たファージをELISA法でスクリーニングした。結果を図１に示す。その主要事項は前記図面の簡単な説明の項に記載されている。TNF-αとの結合について陽性のクローンをPCRフィンガープリンティング法と配列決定によってさらに特性を決定した。この方法によって15種のバインダーを同定した。これらのうち４種は配列を決定した。Fog-１：961個のクローンから得た可溶性scＦ_VをELISA法でスクリーニングし、陽性のクローンはPCRフィンガープリンティング法と配列決定によってさらに特性決定を行った。この方式で４種のバインダーを同定し配列を決定した。
実施例２
バクテリオファージfd上の表示を用いて行う、ヒトチログロブリンに対する抗体フラグメント特異性の、scＦ _V フラグメントのライブラリーからの単離
国際特許願公開第W092/01047号の実施例44には、scＦ_Vフラグメントのライブラリーからの、ウシチログロブリンに対する抗体scＦ_Vフラグメントの選択が記載されている。これらのものは未免疫化ヒトから誘導し、ファージfdの表面に発現させ、ウシチログロブリンに対してパニングすることによって単離された。試験結果は、個体がかって暴露されたことがない抗原を捕捉する未免疫化個体の抗体フラグメント由来のライブラリーから単離できることを示した。
このパニングによってウシチログロブリンに対して特異的であることが見出された16個のクローンを、ヒトチログロブリンに対する結合性についてELISA検定法で分析した（国際特許願公開第W092/01047号の実施例44に記載されているようにして行った）。またこれらのクローンのうちの９個は、基質を添加して12分後に1.0〜1.6の吸収シグナルを示し、ヒトチログロブリンに強く結合した。交差反応性（90分後に0.005未満のシグナル）は、非類縁の抗原：雌ニワトリ卵リゾチーム、BSA、オボアルブミン、キモトリプシノーゲン、シトクロームＣ、キーホールリンペットヘモシアニン、インシュリン、カルジオリピンおよびDNAに対して全くみられなかった。
このように、ヒト自己抗原チログロブリンのエピトープに対して特異性を有する抗体は、未免疫化のヒトから調製したライブラリーから単離することができる。
ヒトとウシのチログロブリンの両方に結合する二つのクローン：α−Thy23およびα−Thy29、ならびにウシのチログロブリンにのみ結合する二つのクローン：α−Thy32およびα−Thy33の配列を決定した。
実施例３
ヒト一本鎖Ｆ _V フラグメントのファージ表示ライブラリーからの、ヒト自己抗原MUC1ムチン、癌胎児性抗原（CEA）および組換え可溶性CD4（rsCD4）に対する抗体フラグメントの単離
実施例１に使用した未免疫化ヒトドナー由来の一本鎖Ｆ_Vフラグメントのファージ表示ライブラリーを、自己抗原MUC1ムチン、癌胎児性抗原（CEA）および組換え可溶性CD4（rsCD4）に対する抗体フラグメントを単離する選択に利用した。
ライブラリーのレスキュー
ライブラリーをレスキューするのに、δ遺伝子３ヘルパーファージ（M13D遺伝子III）ではなくて標準のヘルパーファージM13K07（５×10¹⁰pfd）を使用したことを除いて、実施例１と同様にしてライブラリーをレスキューした。
MUC1および癌胎児性抗原（CEA）に対して特異的なファージの選択
ファージは、（Marksらの1991年の文献）とほとんど同様にして抗原をコートした免疫試験管（Nunc；Maxisorp）を用い結合性についてパニングを行うか、または抗原のカラムで選択した（J. McCaffertyら、Nature, 348巻, 552〜554頁, 1990年）。下記の抗原を用いた。すなわちヒト組換え可溶性CD4（rsCD4）（American Biotechnologies Inc. がバクロウイルス中に発現させ、the MRC AIDS Reagent Project［ADP608］が供給している）；ヒト癌胎児性抗原（CEA）；および20アミノ酸ペプチド（M. R. Priceら、Molec. Immunol., 27巻, 795〜802頁, 1990年）〔ヒトMUC1ムチン（腫瘍関連多形性上皮ムチンもしくはPEM）中の繰返しモチーフに対応している〕である（S. Gendlerら、J. Biol. Chem., 263巻, 12820〜12823頁, 1988年；J. R. Gumら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 171巻, 407〜415頁, 1990年）。
CEA（20mg／ml）とrsCD4（10mg/ml）を、リン酸緩衝食塩水中、室温下一夜、免疫試験管にコートした。選択の最初の２ラウンドでは、試験管はPBS,0.1％（ｖ／ｖ）Tween20で10回およびPBSで10回洗浄した。その後に続く選択のラウンドでは、試験管はPBS.0.1％（ｖ／ｖ）Tween20で20回およびPBSで20回洗浄した。ファージは、（Marksらの1991年の文献）に記載されているのと同様に100mMトリエチルアミンで溶離した。溶離されたファージ（通常10⁶〜10⁷の形質導入単位）を用いてイー・コリTG1細胞に感染させた。約10⁹個の感染した細胞は次のレスキューでの接種物として使用した。ライブラリーを３〜５ラウンドのレスキューに付し、次いで各抗原を選択した。
MUC1ペプチドに結合するファージを選択する場合、ペプチドをセファロース4B（M. R. Priceより提供された）に化学的にカップリングさせた。１mlのカラムを作製し、次いでファージを、MeCaffertyらの1990年の前記文献に記載されているようにして選択した。要約すると次のとおりである。セファロース−MU1カラムを２％の脱脂乳粉末を含有するPBS（MPBS）で洗浄し次いでファージを同じ緩衝液１ml中に入れた。それぞれ容積が10mlの、MPBS，PBS pH7.2，50mMトリス−HCl/500mM NaCl pH8.0、および50mMトリス−HCl/50mM NaCl pH9.0で連続的にカラムを洗浄した後、ファージを、100mMのトリエチルアミン５mlで溶離し、次いで0.5Ｍリン酸ナトリウム緩衝液pH6.8で中和した。５ラウンドの選択を行った。
クローンのスクリーニングと配列決定
溶離されたファージを感染させたイー・コリTG1由来のアンピシリン耐性の単コロニーを、ファージ（Clacksonらの1991年の文献）または可溶性scＦ_Vフラグメント（Marksらの1991年の文献）の結合についてスクリーニングした。抗体フラグメントをコードする遺伝子は、アンバーコドンによって、ファージのコートタンパク質をコードする遺伝子に連結しているので、可溶性フラグメントを、ファージが感染した細菌の非サプレッサー菌株から分泌させることができる（Hoogenboomらの1991年の文献）。細菌上澄み液中での可溶性scＦ_VSの抗原への結合は、マウスmAb 9E10（１μｇ／ml）〔Ｃ末端ペプチドのタグを認識する（MunroおよびPelham, Cell, 46巻, 291〜300頁, 1986年）〕およびペルオキシダーゼ接合抗マウスＦ_C抗体（Sigma社）をWaydらの1989年の文献に記載されているように用いて検出した。プレートを、抗原：Fog1，TNFa、ウシチログロブリンおよびrsCD4で前記免疫試験管について記載したのと同様にコートし、次いで５mg／mlのCEAでコートした。ヒト多形性上皮ムチン（PEM）を含有する尿抽出物を、約10mg／mlのタンパク質濃度で用いた。
単離されたクローンの特異性は、各種のタンパク質でコートしたプレートを用いて可溶性scＦ_VフラグメントをELISA法で検査した。さきに述べたようにして、プレートを、抗原：Fog-１，TNFa、ウシチログロブリン、rsCD4，CEAおよびPEMでコートした。他のタンパク質は、PBS中１mg／mlの濃度〔シトクロムｃ（Sigma社）〕または50mM NaHCO₃，pH9.6中１mg／mlの濃度〔ウシ血清アルブミン、七面鳥卵白リゾチウム、雌ニワトリ卵白リゾチウム、雌ニワトリオボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（CalBio-chem社）、キモトリプシノーゲンＡ、ニワトリ卵白トリプシンインヒビター（Sigma社）、４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル酢酸にカップリングさせたニワトリγ−グロブリン〕で室温下で一夜コートした。陽性のELISAシグナルを示すことが見出されたクローンを、Marksらの1991年の前記文献に記載されているように、PCRと制限酵素BstNIによるフィンガープリントによってスクリーニングして異なるクローンを同定した。異なる制限パターンを有するクローンの例を選択し、次いでSequenase kit（USB社）またはTag DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing kit （Applied Biosystems社）およびApplied Biosystems 373a DNA sequeneerを用いて重鎖と軽鎖の配列を決定した。
配列を決定したクローンを、プログラムMacVector 3.5（IBI Kodak社，米国，コネティカット州，ニューヘブン）を使ってさらに分析した。そのVH遺伝子は、Tomlinsonら、J. Mol. Biol., 227巻, 776〜798頁, 1992年に記載されているVHディレクトリー中に存在する83個の生殖系遺伝子セグメントと同等であった。VL遺伝子はすでに発表されている34個のκ生殖系遺伝子セグメントとすでに発表されている13個のλ遺伝子セグメントと同等であった。PCRプライマーがコードするＶ遺伝子の領域は上記の析結果には含まれていなかった。
選択されたヒト抗体フラグメントは自己抗原に対して高い特異性を示す
２〜５ラウンドの選択を行った後、イー・コリ細胞に溶離されたファージを感染させ、次いで個々のクローンによって産生された抗体フラグメントを、ELISA法によって結合についてスクリーニングした。20アミノ酸のMUC1ペプチド（Priceらの1990年の前記文献）〔ヒトMUC1ムチン（腫瘍関連多形性上皮ムチンまたはPEM）の繰返しモチーフに相当する（Gendlerらの1988年の前記文献；Gumらの1990年の前記文献）〕で選択されたファージを、ヒトPEMに対する結合についてスクリーニングした。したがってこのファージは、ペプチドとタンパク質の両方に結合する。結合活性を有するクローンのＶ遺伝子の配列を決定し、次いで１つのクローンをCEA，PEMおよびrsCD4の各抗原に対して同定した（表Ｉ）。数ラウンドの選択を行った後でも、CEA，PEMおよびヒト組換え可溶性CDA（rscCD4）に結合するごく少数のクローンが出現するということは、ヘルパーファージとして（他の抗原に使用したM13Dg IIIヘルパーの代わりに）VCS-M13（Stratagene社）を使用したことを反映しているのかもしれない。M13Dg III（ｐIIIを産生できない）でレスキューすることによって産生されたファージ（ミド）粒子の集団は、VCS-M13によるレスキューによって産生されたファージより平均結合が高い（ヘルパーファージによってコードされている野生型ｐIIIがscＦ_V−ｐIII融合体と競合できる場合）。
次にscＦ_Vフラグメントを他のタンパク質抗原のパネルに対する結合についてスクリーニングしたところ高度に特異的であることが見出された。このことは、ヒトCEA，MUC1およびヒトrsCD4に対して結合活性を有する単クローンによって図２に示す（主要事項については図２の簡単な説明（前記）参照）。
このように、腫瘍マーカーであるヒト自己抗原CEAおよびMUC1、ならびにrsCD4に対する抗体フラグメントは同じライブラリーから誘導することが可能で、そしてこれら抗体フラグメントはすべて抗原に対して高い特異性をもっている。
実施例４
DNAの配列決定および抗原に対する結合性による抗自己抗体フラグメントの特性決定
実施例１，２および３で単離した抗自己抗体フラグメントをDNAの配列決定および抗原結合性によって特性を決定した。
抗体フラグメントは突然変異をしていないＶ遺伝子と体細胞的に突然変異をしたＶ遺伝子の範囲から誘導する。
自己特異性を有するいくつかのクローンの配列を実施例３と同様にして測定したが、κとλの軽鎖をともに含有している（表II）。隣接生殖系Ｖ遺伝子のセグメントの配列を比較すると、いくつかの異なるフファミリーが使われていることを示している（VH１，３，４および５；Vl１，２および３）。いくつかの場合では、そのＶ遺伝子は完全に生殖系であり、例えばaThy-29のVHとVlの両方の遺伝子である。しかし大部分のＶ遺伝子は、ヌクレオチドとアミノ酸のレベルの両方に、隣接生殖系Ｖ遺伝子セグメントとはいくつか相違点がある（表II）。そしてこのことは、それらのＶ遺伝子が体細胞的に突然変異をしたＢ細胞から誘導されていることを示唆している。いくつかの突然変異がPCR増幅と組立てプロセスを行っているときに起こったかもしれない。例えばaFOG1-G8とaMUC1-1のVH遺伝子とaThy-33のVK遺伝子は、PCR増幅中の二つのＶ遺伝子間の交差から恐らく生成したのであろう（表II）。さらに、大きな相異（例えば36個のヌクレオチドが異なるaFOG1-H6のVK）は未知のＶ遺伝子セグメントを使用したことが原因かもしれない。aTNF-A1とaTNF-E1の重鎖のCDR3には著しい相同性がある。すなわち生殖系Ｖ遺伝子は異なっているが、同じJHセグメントが使用され、CDR3の11／16の残基が同一である。このことは両者のscＦ_VフラグメントがTNFの同じエピトープに結合していることを示唆している。
抗体フラグメントは同じタンパク質の異なるエピトープに関連している
実施例２で得た、ウシチログロブリンに対するscＦ_Vフラグメントを、ヒトチログロブリンに対する結合についてスクリーニングした。そしてヒトチログロブリンはプロトマーの単一アミノ酸残基の６個だけが異なっている

12個のクローンのうち、４個（aThy-29を含む）がヒトチログロブリンに結合したが、残り（aThy-32とaThy-33を含む）はヒトチログロブリンと結合しなかった（データは記載せず）。同様に、ヒト抗体Fog-１に結合するフラグメントを、重鎖と軽鎖のインタイプが異なっている一群の他の抗体への結合についてスクリーニングした（図３）（その主要事項についてはさきに述べた図３の簡単な説明参照）。フラグメントaFOG1-A4は、重鎖ｇ１，２および３のイソタイプのすべてに結合したがg4またはｍには結合しなかった。対照的に、フラグメントaFOG1-H6とaFOG1-A3は、FOG-１と同じイソタイプの抗体を含む他の抗体のいずれにも結合しなかった。このことは、これらのフラグメントがFOG-１の可変領域に関連していることを示唆している。
選択されたscＦ _V フラグメントの特定決定
次のクローンaFOG-H6，aFOG1-A3，aTNF-E7およびaThy-29を大規模な精製とさらに特性決定を行うために選択した。適切なファージミドを含有する非サプレッサーイー・コリ菌株HB2151のコロニーを用いて、100μｇ／mlのアンピシリンおよび0.1％グルコースを含有する2xTY 2ｌに接種した。培養物を培養し、次いで誘導し（induce）（De Bellis, D. およびSchwartz, I., Nucleic Acid Res., 18巻, 1311頁, 1990年）、次いでタッグされたscＦ_Vフラグメントを、Clacksonらの1991年の上記文献および国際特許願公開第W092/01047号に記載されているようにして、mAb 9E10を用いて精製した。
ヒトRh抗原に結合する125I-FogIの、アフィニティーで精製されたscＦ_VフラグメントaFOG1-H6とaFOG1-A3による阻害を、下記の改変を行って、Gorick, B. D., Thompson, K. M., Melamed, M. 0. およびHughes, J. N., Vox. Sang. 55巻, 165〜170頁, 1988年に記載の初期の方法とほとんど同じ方法で行った。125I-FOG1 0.0148μｇを、種々の量の精製されたaFOG1-H6またはaFOG1-A3 scＦ_Vフラグメント（０〜16μｇ）とともに、37℃にて1.5時間、前インキュベートを行い、次にRlR2細胞（またはrr細胞を対照として）0.5μｌ添加した。得られた混合物を、常に混合しながら、37℃でさらに1.5時間インキュベートし、最後に細胞を上澄み液から分離した。対照として、七面鳥卵白リゾチウムに対して、精製scＦ_Vフラグメントによって滴定を行った（aTEL9）（Marksらの1991年の前記文献）。動的測定を表面プラスモン共鳴（BIAcore, Pharmacia Biosensor AB）を利用して行った

モノマーと多量体の種を分離するために、精製されたscＦ_Vフラグメントを限外濾過で濃縮し、次いでPBS,0.2mM EDTA中で校正したSuperdex 75 FPLCカラム（Pharmacia社）で分画した。ゲル濾過は、280nmにおける吸光度とセンサーチップに固定化された抗原を用いるBIAcoreへのオンラインによって監視した。
動的実験を二つの異なる形態で行った。第一に可溶性scＦ_Vの結合性を分析するために、異なる抗原をセンサーチップに共有結合的に固定化した（mAb Fog-１の場合は、ウサギ抗マウスIgG1でコートしたセンサーチップを用い、マウス抗ヒトκ軽鎖mAbを通じて、抗体を固定化した）。第二に、可溶性mAb FOG1の結合性を分析するため、aFOG1-H6 scＦ_Vをチップ表面に固定化した。
抗原は、Amine Coupling Kit（Pharmacia Biosensor AB）を用い、抗原のアミン基を通じてCM5センサーチップにカップリングさせた

その抗原を10mM酢酸緩衝液pH5.0で約25μｇ／mlまで希釈し、次いでTNF〔3805共鳴単位（RU）〕、ヒトチログロブリン（6249 RU）およびFOG1（5279 RU）を固定化した。Fog-１の生物特異性を表示するため、アフィニティー精製がなされたウサギ抗マウスIgG1（Pharmacia Biosensor AB）をチップ表面にカップリングさせ、続いてマウスmAb抗ヒトκ（2300 RU）とFog-１（2050 RU）を順にカップリングさせた。ウサギ抗マウスIgG1のマウスmAbへの結合は10mM HClによって元に戻せるので、複合体は各分析サイクルごとに再構築した。scＦ_V抗−Fog-１（1538 RU）をCM5表面にカップリングさせた。測定はすべて、PBS, 0.2mM EDTA, 0.05％BIAcore界面活性剤P20中、25℃にて、一定流量10μｇ/minで実施し、試料の注入容量は35μｌであった。scＦ_Vフラグメントは迅速に解離するので、抗原を、ウサギ抗マウスIgG1によって生物特異的に表示するため10mM HClを用いて３分間再生させる場合を除いて、抗原を再生させる必要はなかった。
scＦ_Vモノマーの分析は100〜500mMの濃度範囲で行い、二量体の分析は、Fog-１を生物特異的に表示するため二量体scＦ_Vの濃度が0.25〜1.26μＭの場合を除いて40〜200nMの範囲で行った。Fog-１はの分析は、aFOG1-H6 scＦ_Vの表面で10〜200nMの濃度範囲で行った。濃度はすべて280nmの紫外線吸光度から計算した〔0.7mg／ml scＦ_VはA280＝１を示し（Mach, H., Middaugh, C. R. およびLewis, R. V., Anal. Biochem., 200巻, 74〜80頁, 1992年）、かつscＦ_VモノマーのMrは30KDで二量体のMrは60KDであるとして計算した）。活性タンパク質の画分に対する補正は行わなかったのでオンレート（on-rate）は低く見積ってある。データの動的評価をKatlsson, R., Michaelsson, A. およびMattsson, L., J. Immunol. Methods, 145巻, 229〜240頁，1991年にしたがって行い、プログラムOriginal. I（Microcal Inc. 社，米国，マサチューセッツ州，ノーサンプトン）で評価した。
二つの抗体フラグメントがヒトmAb Fog-１のイディオタイプに対しても関連している
RH D抗原を有するヒト赤血球に対する125I-Fog-1抗体の結合は、aFOG1-H6およびaFOG1-A3のscＦ_Vフラグメントの両方によって阻害することができる。したがって、aFOG1-H6とaFOG1-A3の両者は部位関連抗イディオタイプ抗体であり、Fog-１の抗原結合部泣と結合して複合体を生成する。125I-Fog-1のRh D抗原（ヒトRIR2赤血球上の）に対する結合の阻害度は、アフィニティー精製がなされたaFOG1-H6およびaFOG1-A3のscＦ_Vフラグメントによる滴定で測定した〔対照として、七面鳥卵白リゾチームに対してscＦ_Vフラグメント（aTEL9）（Marksらの1991年の前記文献）を使用したところ、125I-Fog-1の結合の阻害は全く認められなかった〕。最大値16μｇのscＦ_V（125I-Fog-1に対して1000倍の過剰モル量）によって、該結合は、aFOG1-H6の場合14.2％およびaFOG1-A3の場合20.9％阻害された。このことは、これらフラグメントのFog-１に対するアフィニティーは、一価で結合する（Gorickらの1988年の前記文献）、Fog-１のRh D抗原に対するアフィニティー（Ka＝2.2×10⁹Ｍ^-1）よりはるかに低いことを示唆している。これらフラグメントの100％が活性の場合、この２つのフラグメントのFog-１に結合するアフィニティーは、aFOG1-H6についてはKa＝３×10⁵Ｍ^-1およびaFOG1-A3についてはKa＝６×10⁵Ｍ^-1と推定され、このことは他の動的測定でも同じである（下記説明と表III参照）。
上記scＦ _V フラグメントは、モノマーおよび二量体の両者を溶液中で形成することができる
可溶性抗体フラグメントは、アフィニティークロマトグラフィーを用い、Ｃ末端ペプチドタッグをmAb 9E10に結合することによって、細菌上澄み液から精製した。限外濾過を行った後、フラグメントはSuperdex 75（Pharmacia社）によってFPLCゲル濾過（Pharmacia社）を行うことによってさらに精製し、次いで紫外線吸光度（280nm）およびBIAcoreのセンサーチップ（Pharmacia Biosensor AB）上に固定化した抗原に対する結合性の両方によってオンラインで検出した。この試験は、scＦ_Vフラグメントが、モノマーと二量体に大きさが対応する。二つのピークで出現することを示した。その二量体は、そのより大きな結合力によって、モノマーより強力に固定化抗原に結合する。scＦ_V二量体は、非還元性SDSゲル上ではモノマーと同様に走行するのでジスルフィド結合によって結合されることはない。二つのピークがゲル濾過で見られるので、この場合、モノマーと二量体は迅速には相互変換を行わないようである。恐らく、この二量体は、重鎖と軽鎖を連結するフレキシブルリンカー（flexiblelinker）によって、または、他方のscＦ_V分子の軽鎖に会合した一方のscＦ_V分子の重鎖によって、インターロックされたscＦ_Vフラグメントであろう。我々には細菌内に形成された抗体Fabフラグメントも多量体化することができることが分かっている（未発表データ）。
scＦ _V フラグメントはミクロモルのアフィニティーをもっている。
scＦ_Vのモノマーと二量体が共存すると、固相法を用いた場合、結合アフィニティーを過大評価することがある。それ故、scＦ_Vフラグメントの、抗原でコートされたチップに対する結合のアフィニティーと速動性（Kinetics）を表面プラスモン共鳴を用いて求めるために、我々はこのフラグメントをゲル濾過によって精製した（表III）。二量体については、オフレート定数が約10^-2ｓ^-1と測定され、そしてscＦ_V二量体のオンレート定数は約10⁵〜10⁶Ｍ^-1ｓ^-1と測定された（試料は完全に活性であると仮定）。aFOG1-H6の場合、抗原（mAb Fog-１）は、２つの方法すなわち直接にまたはウサギ抗マウスIgG1抗体を通じてセンサーチップに固定化した。得られた結果は、どちらの方法でもほとんど同一であって（表III参照）。しかしscＦ_Vフラグメントの活性画分はかなり変化し、オンレート（および結合のアフィニティー）の過大評価をもたらすことがある。例えばフェニルオキサゾロンに対して、いくつかのscＦ_Vフラグメントによる蛍光消光滴定法を用いたところ、我々はscＦ_V分子当り0.06〜0.38の官能性の結合部位しか検出しなかった（未発表データ）。実際に、aFOG1-H6フラグメントとFog-１抗体の会合について計算したオンレート定数は、抗体（Kon 2.2×10⁵Ｍ^-1ｓ^-1）またはscＦ_Vフラグメント（Kon 1.0×10⁶Ｍ^-1ｓ^-1）がセンサーチップ上に固定化されているか否かに依存しており（表III）、このことはaFOG1-H6フラグメントがFog-１抗体より活性が低いことを示している。
scＦ_Vのモノマーの場合、結合シグナルは低かったので、aThy-29モノマーの解離（Ｋ_off＝２×10^-2ｓ^-1）の場合を除いて、表面への結合の速動性を追跡することは困難であった。しかし、aThy-29フラグメントの二量体の安定性が４倍であるということは（下記の事項参照）、他のモノマーのオレフート定数が10^-2ｓ^-1未満、おそらくは10^-1ｓ^-1であることを示唆している。
scＦ_V二量体がセンサーチップ上でモノマーと比べて安定性が大きいということは、二量体が二価であることを示している。それ故、scＦ_Vの二量体は抗体IgGの二つの頭部（head）に似ており（しかし頭部間の間隔は異なっている）、それらの結合力はKon/Koffから約10⁷Ｍ^-1と推定した（表III）。モノマーのアフィニティーは、表面からの解離が速いことから低いはずである。aThy-29モノマーの場合、オンレート定数が二量体の場合と同じあると仮定すると（Mason, D. W.およびWilliams, A. F., Kinetics of Antibody Reactions and the Analysis of Cell Surface Antigens, Blackwell Scientific, オックスフォード，1986年）、我々はアフィニティーが約３×10⁶Ｍ^-1であると推定できる。これらのアフィニティーは、表面プラスモン共鳴法で測定された速度定数から計算されるが、蛍光消光法によって溶液で測定されたアフィニティーと類似しているようである。例えば七面鳥リゾチームに結合して（同じライブラリーから誘導された）モノマーscＦ_VフラグメントのTEL9（Marksらの1991年の文献）の結合アフィニティーは、表面プラスモン共鳴法を用いて3.9×10⁷Ｍ^-1と推定され（表III）、および蛍光消光法（Marksらの1991年の前記文献）によって1.2×10⁷Ｍ^-1と推定された。
単離された抗体のアフィニティーはマウスの一次免疫応答由来の抗体の一般的なアフィニティーである（Foote, J. およびMilstein, C., Nature, 352巻, 530〜532頁, 1991年）。抗体フラグメントのタンパク質自己抗原に対する解離の速動牲（10⁵〜10⁶Ｍ^-1ｓ^-1）も、さきに特性決定がなされたAb−タンパク質の相互作用の一般的な速動性である。しかし解離の速動性（10^-2ｓ^-1）はAb−タンパク質の相互作用の場合は比較的高い（しかし両者の速度は多くのAb−ハプテンの相互作用に比べ低い）。我々は、“モノマーの”のファージが、洗浄中、固体支持体上に保持されると予想していなかったので、このような高いオフレートでscＦ_Vフラグメントを単離できるということは、一見して驚くべきことである。しかしscＦ_Vフラグメントは、ファージ上に、特にM13Dg IIIヘルパーファージを用いて多原子価的に表示され、かつ溶液中で二量体を形成する傾向のあるいくつかのscＦ_VSもファージ上に二量体を形成できる。抗原との多原子価的相互作用はファージを保持する働きをし、インコードされたscＦ_Vファージが単離できるようになる。
免疫化された動物のmRNA由来のランダム組合わせＶ遺伝子レパートリーは抗原結合部位の一部をコードする重鎖もしくは軽鎖が豊富であるので、ファージ法を用いて抗原結合フラグメントを単離し易いが、各βリンパ球のＶ遺伝子の組合わせは大部分破壊されるようである、また抗原結合部位は、未免疫化ヒトドナーからの、異種抗原に対するscＦ_Vフラグメントの単離によって示されるように（Marksらの1991年の前記文献）、連鎖のランダム組合わせによって新たに生成させることができる。
“天然の自己抗体”すなわち健康なドナーから単離される自己反応性抗体は、アフィニティーが低くしかも多特異性（polyspecific）の傾向がみられかつＢ細胞の離散性サブセットによってかなり産生され、その内部活性セット（Holmberg, D.およびCoutinho, A. Immunol. Today, ６巻, 356〜357頁, 1985年）は一部分がCD5+Ｂ細胞の影響を受ける（Casali, P.およびNotkins, A. L., Annu. Rev. Immunol., 7巻, 513〜535頁, 1989）。これに対して我々が作製した抗自己scＦ_Vフラグメントは、ミクロモルのアフィニティーしかもっていないにもかかわらず抗原に対する結合については高度に特異的である。このことは驚くべき価値のある発見である。これらのアフィニティーはおそらく生体外で改善できるであろう。例えばファージライブラリーから誘導され（ならびに本願に記載された抗自己抗体と同様に比較的オフレートが高い）scＦ_Vフラグメントのハプテンフェニルオキサゾロンに対するアフィニティーは、連鎖のシャッフリングによって（国際特許願公開第W092/01047号；Marksら、Biotechnology, 10巻, 779〜783頁, 1992年ｂ）、Kaが3.1×10⁶Ｍ^-1から9.1×10⁸Ｍ^-1まで改善された。このようにして、ヒトの治療に用られる、高特異性でかつ高アフィニティーを有する、自己抗原に対するヒト抗体を創製することができる。
実施例５
合成ライブラリーの創製
繊維状ファージの表面に抗体レパートリーを表示させ次いでその分ファージを抗原¹で選択することによって、我々は、免疫選択^2,3に似せて、未免疫化ドナー⁴の再配列されたＶ遺伝子からヒト抗体を作ることができる。ヒト抗体は、現在、明確に分かっているＶ遺伝子の要素から合成によって製造されている。49個のヒト生殖系Ｖ_H遺伝子セグメントのレパートリーを、５個のランダムアミノ酸残基からなる合成の“Ｄセグメント”およびＪ．セグメントに連結することによって生体外で再配列して、８個の残基からなる合成の第三の相補性決定部位（CDR）を創製した。この再配列されたＶ_H遺伝子を、ファージ表示のための一本鎖Ｆ_VフラグメントとしてヒトVlambda3の軽鎖でクローン化した。10⁷のファージのライブラリーを、ウシ血清アルブミン（BSA）とハプテン２−フェニル−オキサゾール−５−オン（phOx）の接合体でパニングを行い、phOx-BSAに対して特異的な結合活性を有しかつphOx−γ−アミノ酪酸（phOx-GABA）に対してミクロモルの範囲のアフィニティーを有するフラグメントをコードするファージを単離した。ユニーク配列を有する21個のクローンを比較したところ、ハプテンに対する生体外での“免疫応答”は、CDR3の残基98における芳香族の非変異残基（Tyr，Phe，Trp）によってＶ_H26セグメント（Ｖ_H３ファミリー）⁶に大部分制限されることが分かった。生体外で再配列されたＶ遺伝子を用いると、既知の構造の抗原の結合に対してバイアスされた抗体ライブラリーを設計することが可能になり免疫原性が低下した治療用のヒト抗体を創製することができる。
抗体の可変領域は、超可変配列またはCDR⁵の三つのループを有するβ−シートのフレームワークで構成されている。これらのループは、平坦な表面⁷〜ポケット⁸の範囲の各種の形態の抗原結合部位を生成する。ヒト重鎖の場合、最初の二つのCDRの配列多様性は、約50個の生殖系Ｖ_Hセグメントのレパートリーによってコードされている（I. M. Tomlinsonらの前記文献）。三番目のCDRは、これらのセグメントの約30個のＤセグメントおよび６個のＪセグメント⁹による組換えから生成する。そして、その配列は高度に可変性であるが、ループのAsp101からフレームワーク¹⁰のArg⁹⁴への塩橋（salt bridge）を含有している場合が多い。最初の二つのCDRの構造と長さは制限されているが^10,11、CDR3の構造と長さは大きく異なり、長さは４〜25の残基⁵の範囲内にある。
単一のVlambda（参照文献12）の軽鎖を組合わせてAsp101を含む８個の残基からCDR3を用いて再配列されたＶ_H遺伝子を創製した。ヒトＶ_Hレパートリー（Tomlinsonらの前記文献）の大部分をコードする49個の生殖系Ｖ_Hセグメントを各々、ポリメラーゼ連鎖反応¹³および合成のＤセグメント（Ｖ_Hセグメントの３′末端におけるランダム配列の15個の塩基）とＪセグメント〔ともに８個の残基のCDR3ループをコードする（図４）〕を用いて増幅させた。再配列されたセグメントをプールし、ヒトVlambda3軽鎖によるファージ表示のためクローン化し、10⁷個のファージクローンからなる合成ライブラリーを創製した。免疫系と同様に、10⁷個のファージクローンからなる合成ライブラリーは、潜在牲多様性の小画分しかタップできない。したがって、その多様性は恐らく49×32⁵＝1.6×10⁹の異なるヌクレオチド配列すなわち49×20⁵＝1.6×10⁸の異なるアミノ酸配列である。
このライブラリーは、４ラウンドの増殖を行わせ、次いでphOx−ウシ血清アルブミン（BSA）でコートした試験管上でパニングし、次にクローンを、ELISA法⁴を用いphOx-BSAに対する結合活性について、可溶性¹⁴の一本鎖Ｆ_Vフラグメント^15,16としてスクリーニングした。第３と第４のラウンドを終ってから、14／96と61／96のクローンはそれぞれphOx-BSAに対する結合活性で固定し、これら（29個を試験した）のうちどれも他のタンパク質と結合しなかった（一覧表Ｂ参照）。さらにこれらのphOx-BSAでコートされたプレートへの結合は、可溶性ハプテンと競合する（表Ｂ）。
配列決定を行った結果、phOxバインダーの多く（21／29）はユニーク配列であり、８個の残基CDR3を有し、Ｖ_H４ファミリーからの一つのセグメントまたはＶ_H３ファミリーからの三つのセグメントのうちの一つを利用している（表Ｂ）ことが明らかになった。全体として、これらのセグメントは、ヒトＶ_Hセグメントの最初の二つの超可変性ループに利用可能な７個の“規定（canonical）”折畳みのうちの３個を利用する（C. Chothiaらの上記文献）。ユニーククローンの大部分（16／21）はVH26セグメント⁶から誘導され、かつ第三の超可変性ループ中に類縁配列をもっている。すなわち、このグループ内で、第一の残基は、分枝した脂肪族の側鎖（15／16）をもつ傾向があり、第二の残基はリシンまたはアルギニン（11／16）である傾向があるが、第四の残基は常に芳香族の残基である（最も頻度が高いのはチロシンである）。
phOx-GABAに対する一層強力なバインダーのうちの二つ（Ox13およびOx-31、表Ｂ）のアフィニティー（Kd）は、蛍光消光滴定法¹⁷で測定した結果それぞれ3.1±0.2μＭおよび6.7±0.7μＭであった。合成の抗体ライブラリーは、多様なVH-CDR3の長さと生体内で製造された抗体の異なる軽鎖を欠いているが、phOx-BABAに対するアフィニティーは、未免疫化ヒトドナー⁴から製造した（ファージ）抗体の0.5μＭまたはマウスの一次免疫応答¹⁸由来のいくつかのハイブリドーマの１μＭと同等である（しかし一覧表Ａの注意事項参照）。これらのアフィニティーを改善するために、選択された多くの異なるphOx抗体（表Ａ）を組織的に変更することができる（以下の説明参照）。
原則として、生体外で再配列されたＶ遺伝子のファージ表示ライブラリーを使用すると、生体内⁴で再配列されたのに代わる興味深いＶ遺伝子が得られる。第一に、該ライブラリーから創製された合成ヒト抗体の重鎖と軽鎖の両者のフレームワーク領域と最初の二つの超可変性ループはほぼ生殖系である。これは、生体内で再配列されたヒトＶ遺伝子からタップされた“一次”ファージ抗体と異なり、体細胞の突然変異の程度が広く⁴変化した。多形性を考えなければ、そのVH遺伝子のセグメントは異なる個体と同一であり、かつその合成抗体は免疫原性が恐らく低いであろう。重鎖と軽鎖のCDR3ループの長さと配列を変更するか、または他のCDRループの最少突然変異を局在化させるか、または合成の“生殖系”軽鎖^19,20でシャッフリングを行うことによって、その生殖系の特性を保持しながらそのアフィニティーを改善することが可能である。
第二に、両方の種類のライブラリーは高度にバイアスされている。“天然の”ライブラリーでは、このバイアスは、我々の制御の範囲外にあり、例えば対立遺伝子の変化、欠失多形性および自己反応性クローンの欠失によって与えられる。合成のライブラリーでは、このバイアスは組織的に導入することができる。例えば、VH遺伝子のセグメントはすべて選択され、その結果、第一と第二の超可変性ループの折畳み、すなわちVH-CDR3とその軽鎖の長さと多様性が固定される。多様な合成ライブラリーの製造方法がいくつか示唆されているが²、設計原理をコードされた構造に組込むことが可能でなければならない。抗原の形態が知られている場合、ほぼ相補的な結合部位のエンベロープを設計して明確にわかっているＶ遺伝子の要素で構築できる。このような“デザイナー”ライブラリーを使用することは高アフィニティーを有する抗体を単離するのに有利である。

表Ａ−合成ライブラリーの組成
49個のヒトＶ_Hセグメント（Tomlinsonらの前記文献）を使用した。すなわちＶ_H２，Ｖ_H５およびＶ_H６の各遺伝子ファミリーには１個のセグメントを使用し、残りの三つのファミリーには多数のセグメントを使用し、ファミリーごとにクローン化した。各ファミリーのＶ_Hセグメントからのクローンを、挿入断片の有無についてについて検査し（平均85％存在する）、表Ｂに示すように単一の大きなライブラリーにプールし、所定の遺伝子ファミリーに対して（制御された）バイアスを作った。したがってＶ_H２，Ｖ_H５，Ｖ_H６のファミリー由来のセグメントは、残りのファミリー由来のセグメントに比べて“過剰に存在している（overrepresented）”。未選択のライブラリー由来の35個のクローンの配列を決定して、各ファミリー由来のＶ_Hセグメントが存在し、かつヌクレオチドが予想された比率でＤセグメント中に存在しているがＣセグメントについては僅かにバイアスがみられることを確認した。（各コドンの第一と第二の位置には、Ａが21.3％；Ｇが17.9％；Ｃが33.7％およびＴが27.1％であり、第三の位置にはＧが42.6％およびＴが57.4％であった）。これら抗体フラグメントの発現レベルも検査し、そしてＶ_Hセグメントは、検出可能な発現レベルで、例えばＶ_H１（DP-7）,Ｖ_H２（DP-27），Ｖ_H３（DP-29，35，38，44，47，51，53），Ｖ_H４（DP-63,69），Ｖ_H５（DP-73）およびＶ_H６（DP-74）でクローン中に同定した。
方 法
クローンは、挿入断片の有無について、オリゴヌクレオチドLMB3とpHEN-SEQ（参照文献４）を用いPCRスクリーニング法²¹によって検査し、次いでオリゴヌクレオチドLINKSEQ（５′-CGA TCC GCC ACC GCC AGA G-３′）を用いジデオキシチェインターミネーション法²²によって二本鎖DNAから配列を決定した（表中の番号は挿入断片について修正されている）。可溶性scＦ_Vフラグメントの発現は、イー・コリHB2151（参照文献14）中に一夜誘導された培養物の上澄み液10μｌを、スロットーブロット装置（Minifold II, Schleicher and Schuell社）を用いてニトロセルロースフィルタ上にスポットし、次いで結合した、ペプチドをタグしたscＦ_Vフラグメントを、9E10抗体²³およびペルオキシダーゼで標識をつけた抗マウス抗体（Sigma社）で検出することによって検査した。

表Ｂ−合成ライブラリーから単離されたphOx−バインダー
ファージはVCS-M13でレスキューすることによってライブラリーから製造し、参照文献４のようにして、phOx-BSAでコートされた試験管内で数ラウンド、パニングを行った。phOxに結合する21個のファージの配列が、４個の生殖系VHセグメント、すなわちDP-42，45，47（VH３ファミリー）およびDP-67（VH４ファミリー）を示した。DP-47はVH26と同一であるが（参照文献６，参照文献24で修正）、DP-42，DP-45およびDP-67はそれぞれ、8-1B（参照文献25）、65-2（参照文献26）またはVH4.22（参照文献27）とは、１つまたは数個のフレームワーク残基だけが異なっている。DP47VHセグメントを用いかつCDR3の特徴的なパターンを欠いているライブラリーからのクローンはphOxに結合しなかった。試験された21個のphOxバインダーのうちどれも、BSA，NIP-BSA、プラスチック、キモトリプシノーゲンＡ、シトクロムＣ、ウシチログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニンまたは七面鳥卵白リゾチームに結合しなかった。BSAに結合した（しかしphOxには結合しなかった）４個のクローンは汚染物（参照文献４からのαBSA3のクローン）であることが分かった。
方 法
参照文献４のようにして、scＦ_Vフラグメントの相対アフィニティーを阻害ELISA法²⁸によって測定した。４−γ−アミノ酪酸−メチレン２−フェニル−オキサゾール−５−オン（phOx-GABA）の連続希釈を６〜400μＭの濃度範囲で、４％Marvel-PBSを用いて行い、次いでscＦ_V上澄み液を添加した。phOx-BSAに結合するシグナルが50％減少するに至るphOx-GABAの濃度（Ｉ₅₀）を記録した。クローンOx-13とOx-31のphOx-GABAに対するアフィニティーを、c-mycタグ（参照文献４）によって精製したscＦ_Vを用いて蛍光消光滴定法で測定した。理想的にphOx-BSA接合体に対するアフィニティーが直接測定され、またはphOx−カプロン酸に対するアフィニティーも測定されたが、phOx-GABAを用いて参照文献18のハイブリドーマのデータと比較した。phOx接合体またはphOx−カプロン酸に対する抗体のアフィニティーはphOx-GABAに対して測定されたアフィニティーより優れているようである。
図４は再配列されたVH遺伝子の組立てを示す（明細書参照）
方 法
合成のオリゴヌクレオチドSYNLIBI（表IV参照）は、５個の残基のランダムアミノ酸配列を有するＤセグメント、ＪセグメントおよびXhoI制限部位を、49個のヒトＶ_H生殖系セグメントの各々の３′末端に導入した（Tomlinsonらの前記文献）。ポリメラーゼ連鎖反応¹³にはプライマーを使用し、そのプライマーは、HuVH1BAckSfiからHuVH6BackSfiまでのＶ_Hファミリーベースのバックプライマー（VHBACK）でありNcoI部位⁴をもっている。各Ｖ_Hセグメントのクローン（M13ベクター中、一本鎖の鋳型として提供される）を、別々に、94℃で１分間、50℃で１分間および72℃で1.5分間のサイクル25サイクルをPHC-3サーモサイクラー（Techne）で行って増幅した。各増幅はアガロースゲルの電気泳動法で検査し、同じファミリーのＶ_Hセグメント由来のDNAの類似した量をプールし、NcoIとXhoIで消化し、BSA⁴に結合するscＦ_Vフラグメントから取出した、再配列Vlambda3軽鎖可変領域（IGLV3S1；参照文献12）を保有するベクターPHEN1（参照文献14）中にクローン化した。
ランダムオリゴヌクレオチドの代わりに、CDRをコードするオリゴヌクレオチド例えばげっ歯類由来のものが使用される場合は、その非ヒトCDRが産物の合成ヒトライブラリーにインプリント（imprint）される。
実施例５で引用した参照文献
１．McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G. & Chiswell D. J.（1990）. Nature, 348, 552-554.
２．Milstein, C. （1990）. Proc R Soc Lond Biol, 239, 1-16.
３．Winter, G. & Milstein, C（1991）. Nature, 349, 293-299.
４．Marks, J. D., et al（1991）. J Mol Biol, 222, 581-597.
５．Kabat, E. A., Wu, T. T., Reid-Miller, M., Perry, H. M. & Gottesman, K. S. Sequences of proteins of immunological interest（US Department of Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1987）.
６．Matthyssens, G. & Rabbits, T. H.（1980）. Proc Natl Acad Sci USA, 77, 6561-6565.
７．Amit, A. G., Mariuzza, R. A., Phillips, S. E. & Poljak, R. J.（1986）. Science, 233, 747-753.
８．Aizari, P. M., et al（1990）. Embo J, 9, 3807-3814.
９．Ichihara, Y., Matsuoka, H. & Kurosawa, Y（1988）. Embo J, 7, 4141-4150.
10．Chothia, C. & Lesk, A. M.（1987）. J Mol Biol, 196, 901-917.
11．Chothia, C., et al（1989）. Nature, 342, 877-883.
12．Frippiat, J. P., et al（1990）. Nucleic Acids Res, 18, 7134.
13．Saiki, R. K., et al（1985）. Science, 230, 1350-1354.
14．Hoogenboom, H. R., et al（1991）. Nucleic Acids Res, 19, 4133-4137.
15．Huston, J. S., et al（1988）. Proc Natl Acad Sci USA, 85, 5879-5883.
16．Bird, R. E., et at（1988）. Science, 242, 423-426.
17．Eisen, H. N.（1964）. Meth Med Research, 10, 115-121.
18．Foote, J. & Milstein, C.（1991）. Nature, 352, 530-532.
19．Clackson, T., Hoogenboom, H. R., Griffiths, A. D. & Winter, G（1991）. Nature, 352, 624-628.
20．Roberts, A. J., et al（1992）. Bio/Technology, in press.
21．Gussow, D. & Clackson, T.（1989）. Nucleic Acids Res, 17, 4000.
22．Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R.（1977）. Proc Natl Acad Sci USA, 74, 5463-5467.
23．Munro, S. & Pelham, H. R. B.（1986）. Cell, 46, 291-300.
24．Chen, P. P., Liu, M. F., Sinha, S. & Carson, D. A.（1988）. Arthritis Rheum, 31, 1429-1431.
25．Berman, J. E., et al（1988）. Embo J, 7, 727-738.
26．Matsuda, F., et al（1990）. Embo J, 9, 2501-2506.
27．Sanz, I., et al（1989）. Embo J, 8, 3741-3748.
28．Rath, S., Stanley, C. M. & Steward, M. W.（1988）. J Immunol Methods, 106, 245-249.
実施例６
腫瘍壊死因子−αに対して特異的な抗体フラグメントの、生殖系ヒト合成ライブラリーからの単離
腫瘍壊死因子−αに対して特異的な抗体フラグメントをコードするクローンを生殖系ヒト合成ライブラリーから単離した。このライブラリーは、オリゴヌクレオチドSYNLIB2をSYNLIB1の代わりに用いたことを除いて実施例５に記載されているようにして製造した。したがって５個のアミノ酸のＶ_HCDR3が生成した。このライブラリーは、未免疫化ヒト由来のライブラリーについて実施例１に記載したのと同様にして、腫瘍壊死因子−αに対してパニングを行った。４ラウンドのパニングを行った後、ファージ抗体（および対応する可溶性フラグメント）を、TNFに対する結合活性によって単離した。scＦ_Vフラグメント（αTNF-10）のＶ_H領域をVHセグメントDP-45から誘導した（Tomlinsonらの1992年の上記文献）。ハプテン結合クローンαNIP-６，αNIP-12，αOx-15およびαOx-18も上記のセグメントから誘導したが、それにもかかわらずこれらの各フラグメントはハプテンまたはTNFに対する結合について特異的であった。このことは、全く異なった特異性を有する抗原結合部位が、CDR3だけを置換することによって同じ抗体フレームワーク上に創製することができることを意味する。非特異的抗原に対する結合は、実施例１に記載されているのと同様にELISA法で評価した。
実施例７
長さが異なるVH CDR3配列を含有する生殖系ヒト合成ライブラリーからの、ヒトチログロブリンおよびヒトモノクローナル抗体に結合する一本鎖Ｆ _V フラグメントの単離
生殖系ヒト合成一本鎖Ｆ_Vフラグメントライブラリーを、実施例５のライブラリーと同様の方法で調製した。すなわち生殖系VHセグメントと合成のDHとJHの領域を含有させ、４〜12個のアミノ酸からなるVH CDR3領域を生成させた。生殖系の再配列された一本鎖の軽鎖が得られた。このファージライブラリーは、抗ヒト特異性を有する抗体フラグメントの起源として使用した。
50個の生殖系遺伝子VHセグメント（実施例５の場合と同様、Tomlinsonらの1991年の前記文献）をオリゴヌクレオチドを用いて増幅して、長さが４〜12残基の範囲で変化する完全にランダム化したCDR3を導入した。最初のPCR反応において、各遺伝子はそのファミリーの特異的VHBACK−プライマー（VH1BACKSfi〜VH6BACKSfiのうちの１つ；Marksらの1991年の前記文献；国際特許願公開第W092/01047号）を用い５′末端で増幅し、次いで３′末端においてシリーズSYNLIB4-SYNLIB12（表IV）の各オリゴヌクレオチドの一つをアニールした。このPCRでは、250μＭ dNTP，10mM KCl，10mM（NH₄）₂SO₄，20mMトリスHCl（pH8.8），２mM MgCl₂，100μｇ／ml BSAおよび１μｌ（１単位）のタグDNAポリメラーゼ（Cetus社）を含有する反応混合物50μｌ当りオリゴヌクレオチドの適切な対を各々2.5pmolづつ用いた。鋳型は、適切な生殖系Ｖ遺伝子をコードするMBファージクローンを感染させたイー・コリの菌株１μｌであった。増幅のサイクルは94℃で１分間、55℃で１分間および72℃で1.5分間のサイクルであった。25サイクルの後、同じVHBACKオリゴヌクレオチド30pmolおよびJHSAL（表IV）30pmolを添加し、次いでPCRを15サイクル続け、SalIクローン化部位をVH遺伝子の３′末端に導入した。適切な大きさのバンドがアガロースゲルの電気泳動で認められたことを確認した後、同じSYNLIBプライマーで行った全増幅のPCR産物を集め、NcoIとSalIで切断し、次いで実施例５の場合と同様に、NcoI-XhoIで切断したpHEN1-V3（クローン化IGLV3S1を含有するpHEN1）中にクローン化した。このようにして、９個のライブラリー（各々一つの特定のCDR3の長さを有する）を作製した。各々５×10⁶〜５×10⁷個のクローンを含有していた。
選 択
実施例３に記載したのと同様にしてVCS-M13でレスキューすることによって、９個の異なるライブラリーからファージを調製した。９個の個々のライブラリーから得たファージを混合して一つの大きなライブラリーとして、二つの抗原の各々の一つでパニング（panning）行った。すなわち免疫吸着試験管（immunosorp tube）を、炭酸緩衝液（0.1Ｍ NaHCO₃，100μｇ／mlでpH9.6）中OAK3（ヒト抗−Rhesus D抗体、IgG3，K）で一夜コートするか、またはヒトチログロブリン（PBS中100μｇ／mlでコートする）でコートした。選択は実施例３と同様に行った。
スクリーニング
ELISA法をHoogenboomらの1991年の前記文献に記載されているようにして実施した。ELISA法のプレートは、PBS中100μｇ／mlのOAK3で室温にて一夜コートするか、または100μｇ／mlのヒトチログロブリンで室温にてコートした。
試験結果
OAK3をコートした試験管での選択を４ラウンド行った後、溶離されたファージを用いてHB2151に感染させ、次いで可溶性scＦ_VフラグメントをELISA法によって結合性について分析した。59／96のクローンがOAK3 ELISA法で陽性と判定された。
また生殖系ヒト合成ライブラリーには、ヒトチログロブリンでコートされた試験管で５ラウンドの選択が行われ、80／96のクローンが、VCS-M13でレスキューされた個々のクローンのファージELISA試験によって陽性と判定された。
上記の各陽性クローンのうちの二つを、一連の抗原（OAK3、ヒトチログロブリン、phOx-BSA，NIP-BSA，BSA、オボアルブミン、キモトリプシノーゲンＡ、ストレプタビジン、シトクロムＣ，KLH，七面鳥の卵白リゾチウム）に対する結合性についてELISA法で分析した。上記の二つのOAK3結合クローン（可溶性scＦ_Vフラグメントとして）はともにELISA法でのOAK3のバックグランドの約３倍の高いシグナルを示した。上記の二つのチログロブリン結合クローン（ファージに表示されたscＦ_Vフラグメントとして）はともにELISA法におけるチログロブリンのバックグランドの約５倍の高いシグナルを示した。これらのクローンはすべて、それらが選択された抗原に対して著しく特異性であることが判明した。ファミリー特異的プライマーとハイブリッドを形成させることによって（J. D. Marksら、Eur. J. Immunol., 21巻, 985〜991頁, 1991年）、上記４種の全クローンのVHセグメントはVH3ファミリーのセグメントであると同定された。各クローンのCDR3の長さは、オリゴヌクレオチドのCDRFORとCDRBACK（表Ｖ）を用いてCDR3を増幅することによって分析し、次いで産物を８％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。我々は、二つのOAK3結合クローンは長さが４もしくは７個のアミノ酸残基の長さであるが、チログロブリン結合クローンはともに10個の残基のCDR3長を使用していることを見出した。
したがって、ヒトモノクローナル抗体とヒト自己抗原に結合する抗体scＦ_Vフラグメントがヒト生殖系合成ライブラリーから単離されたのである。
実施例８
インターロイキン−１受容体の活性をトリガーする抗体フラグメントの単離
実施例１に記載した、未免疫化ヒト由来の一本鎖Ｆ_Vフラグメントのライブラリーを使用して、インターロイキン−１受容体の活性をトリガーする抗体を選択する。まず、Ｔ細胞のインターロイキン−１受容体（IL-1R）の可溶性外部領域に結合する抗体フラグメントを単離する。このようにして同定される抗体クローンを、次にインターロイキン−１のタイプの生物活性についての検定法で分析する。マウスおよびヒトのＴ細胞のIL-1Rは、インターロイキン−１αおよびインターロイキン−１βの両者を捕捉する著しく相同性の80KDの細胞表面糖タンパク質である。マウス受容体外部領域のＮ末端の316個のアミノ酸をコードするcDNAクローンをHeLa細胞（S. K. Dowerら、J. Immunol., 142巻, 4314〜4320頁, 1989年）に発現させた。このようにして発現させた可溶性IL1-R分子を精製したが、全長のIL-1R分子と区別できない結合特性を示し、単一の可溶性IL1-R分子とIL-1との複合体が形成されている。この可溶性受容体分子はヒトインターロイキン−１に結合する。ヒトＴ細胞インターロイキン１受容体はJ. E. Simsらによってクローン化されて配列が決定されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86巻, 8946〜8950頁, 1989年）。ヒトIL1受容体の可溶性外部領域（１〜316のアミノ酸）を、HeLa細胞中で発現させ、マウス受容体について記載したのと同様にして精製する。
レスキューされた未免疫化ヒトライブラリーを、まずIL-1受容体の外部領域に相当する組換えヒト可溶性IL-1受容体に対して選択する。免疫試験管を、上記の可溶性IL-1受容体で（１μｇ／ml）実施例１に記載されているのと同様にしてコートし、次いで合計４ラウンドのアフィニティー選択に対して実施例１に記載されているのと同様にパニングを実施する。
可溶性IL-1受容体に結合するクローンは、実施例３にTNF-αについて記載したのと同様にして、組換え可溶性IL-1受容体（10μｇ／ml）をコートした微量滴定プレートを用いELISAによって特性を決定した。次に可溶性IL-1受容体によって著しいELISAシグナルを示すが非特異的抗原によってELISAシグナルを示さない抗体フラグメントを次の試験を行うために選択する。
このようにして単離した抗体クローンを可溶性scＦ_Vフラグメントとしてイー・コリ中で発現させ、次にmAb 9E10アフィニティークロマトグラフィーによって、実施例４に記載されているのと同様にして精製する。ヒト受容体に対する結合性は、¹²⁵Ｉで標識を付けた抗体フラグメントの、インターロイキン−１受容体を発現するヒト繊維芽細胞系TIG-1に対する結合性を、利用して評価する。なおこの方法は、これら細胞系の受容体に対する¹²⁵Ｉ−IL1αのアフィニティーを測定するT. Takiiらが報告している方法（Eur. J. Immunol., 22巻, 1221〜1227頁, 1992年）と基本的に同じである。受容体結合性を示す精製抗体フラグメントは、ヒト上皮細胞を用いる生物学的スクリーニング検定法に用い、E．Dejanaらが報告しているようにして（Blood, 69巻, 695〜699頁, 1987年）、プロスタサイクリン（PG12）および血小板活性化因子（PAF）の合成の刺激についてこれらのフラグメントを試験する。これらの試験によって、受容体活性をトリガーするIL-1受容体に対して抗自己特性を有する抗体フラグメントが同定される。この活性は、IL-1αに対する標準の生物検定法を用いて、ヒトインターロイキン−１αに対して定量することができる。なおこの生物検定法としては例えば³Ｈ−チミジン取り込を利用するD10SヘルパーＴ細胞系の増殖法（S. F. OrencoleおよびC. A. Dinarello, Cytokine, 1巻, 14〜22頁, 1989年）またはA. J. Gearingらが報告している変換増殖検定法（J. Immunol. Methods, 99巻, 7-11頁, 1987年）がある。

上記の比率は選択の各ラウンドの後にクローンを捕捉する頻度を示す。VCS-M13ヘルパーファージが用いられるCEA，MUC1およびrsCD4の選択の場合を除いて、ファージミドはM13Dg IIIヘルパーファージでレスキューした。

すべての重鎖生殖系遺伝子に対する参照記号はTomlinsonらの1992年の文献に記載されている。軽鎖の参照記号は、VL2.1（Brocklyらの1989年の文献）；IGLV1S2（Bernardらの1990年の文献）；IGLV3S1（Frippiatらの1990年の文献）；L8（Vd）およびL5（Vb）（Pechらの1984年の文献）；L12（HK102）（BentleyおよびRabbitsの1980年の文献）；B3（VKIV）（Klobeckらの1985年の文献）；02および04（Pargentらの1991年の文献；L11（Scottらの1991年の文献）；HumlvlL1（Daleyらの1992年の文献）である。
ａ）これらの遺伝子はPCR増幅中に二つのＶ遺伝子間の交差によって生成したようである。それ故、組合わせ（match）を二つの推定されている生殖系セグメント：FRすなわちフレームワーク；CDRすなわち相補性決定領域を用いて決定した。
Bentley, D. L. and Rabbits, T. H.（1980） Nature, 288, 730-3.
Bernard, F., Chuchana, P., Frippiat, J. P., Buluwela, L. and Lefranc, M. P.（1990）Nucleic Acids Res, 18, 7139.
Brockly, F., Alexandre, D., Chuchana, P., Huck, S., Lefranc, G. and Lefranc, M. P.（1989） Nucleic Acids Res, 17, 3976.
Frippiat, J. P., Chuchana, P., Bernard, F., Buluwela, L., Lefranc, G. and Lefranc, M. P.（1990）Nucleic Acids Res, 18, 7134.
Klobeck, H. G. Bornkamm, G. W., Combriato, G., Mocikat, R., Pohlenz, H. D. and Zachau, H. G.（1985）Nucleic Acids Res, 13, 6515-29.
Pargent, W., Meindl, A., Thiebe, R., Mitzel, S. and Zachau, H. G.（1991） Eur J Immunol, 21, 1821-7.
Pech, M., Jaenichen, H. R., Pohlenz, H. D., Neumaier, P. S., Klobeck, H. G. and Zachau,（1984）J Mol Biol, 176, 189-204.
Scott, M. G., Crimmins, D. L., McCourt, D. W., Chung, G., Schable, K. F., Thiebe, R., Quenzel, E. M., Zachau, H. G. and Nahm, M. H.（1991） J Immunol, 47, 4007-13.
Tomlinson, I. M. Walter, G., Marks, J. D., Llewelyn, M. B. and Winter, G.（1992）J. Mol. Biol., 227, in press.

Claims (40)

1. ヒトの自己抗原に対して結合特異性を有する抗原結合部位を有するヒト抗体または前記結合部位を有するヒト抗体フラグメントである特異的結合対のメンバー（sbpメンバー）としてのポルペプチド鎖を得る方法であって；
   ａ）繊維状バクテリオファージ（filamentous bacteriophage)のライブラリーを用意し、各繊維状バクテリオファージはその表面にsbpメンバーであるポリペプチド鎖を表示し、そして各繊維状バクテリオファージは、前記自己抗原により免疫感作されていないヒトに由来し、ヒト抗体に基づく配列を有する核酸を含有し、そしてこの核酸は前記繊維状バクテリオファージの表面に表示されるsbpメンバーであるポリペプチド鎖をコードし；次いで
   ｂ）表面にsbpメンバーであるポリペプチド鎖を表示する繊維状バクテリオファージと前記ヒトの自己抗原との結合によって、前記ヒトの自己抗原に対し結合特異性を有する１又は複数のsbpメンバーであるポリペプチド鎖を選択する；
   ことを含んでなる方法。
2. 繊維状バクテリオファージのライブラリーを用意する前記方法が、
   （ｉ）組換え宿主細胞生物内で発現される際に繊維状バクテリオファージの表面においてsbpメンバーの第一ポリペプチド鎖又はその集団を表示するように、繊維状バクテリオファージの成分に融合されたsbpメンバーの第一ポリペプチド鎖または繊維状バクテリオファージの成分に融合された第一ポリペプチド鎖の集団を、（ii）sbpメンバーの第二ポリペプチド鎖またはこのような第二ポリペプチド鎖の集団と一緒にして、繊維状バクテリオファージの表面に表示されるsbpメンバーであるポリペプチド鎖のライブラリーを形成させ；
   前記第一もしくは第二のポリペプチド鎖の少なくとも一方またはその集団が、繊維状バクテリオファージの前記成分を使用してパッケージすることができる核酸によってコードされている；
   ことを含んでなる請求の範囲第１項記載の方法。
3. 繊維状バクテリオファージのライブラリーを用意する前記方法が、
   （ｉ）繊維状バクテリオファージの成分に融合されたsbpメンバーの第一ポリペプチド鎖をコードするかまたは繊維状バクテリオファージの成分に融合された前記のごとき第一ポリペプチド鎖の集団をコードする核酸を、（ii）sbpメンバーの第二ポリペプチド鎖またはその集団をコードする核酸と一緒にして、核酸のライブラリーを形成させることを含んで成り、前記ライブラリーの核酸は繊維状バクテリオファージの前記成分を用いてパッケージすることができ；
   組換え宿主生物内で、繊維状バクテリオファージの成分に融合された前記第一ポリペプチド鎖又はその集団、およびsbpメンバーの前記第二ポリペプチド鎖又はその集団を発現させて、それぞれがその表面にsbpメンバーであるプリペプチド鎖を表示し、かつその表面に表示されるsbpメンバーの第一及び第二のポリペプチド鎖をコードする核酸を含有する繊維状バクテリオファージのライブラリーを形成させる；
   ことを含んでなる請求の範囲第１項記載の方法。
4. 繊維状バクテリオファージの表面に表示される前記sbpメンバーであるポリペプチド鎖の各々がＶ_H領域およびＶ_L領域を含んでなる抗体フラグメントである請求の範囲第１，２または３項に記載の方法。
5. 前記第一及び第二のポリペプチド鎖の両方またはその集団が、繊維状バクテリオファージの前記要素を使用してパッケージすることができる核酸から発現される請求の範囲第２項記載の方法。
6. 繊維状バクテリオファージの表面に表示される前記sbpメンバーであるポリペプチド鎖の各々がscＦ_V抗体フラグメントである請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記第二ポリペプチド鎖またはその集団が、前記第一ポリペプチド鎖またはその集団をコードする核酸とは別個の核酸によってコードされている請求の範囲第２または３項に記載の方法。
8. 繊維状バクテリオファージの表面に表示される前記sbpメンバーであるポリペプチド鎖の各々がFab抗体フラグメントである請求の範囲第１または７項に記載の方法。
9. 前記核酸が、再配列されたＶ遺伝子に由来する請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記核酸が、Ｖ遺伝子の配列の人工的又は合成的組換えによって製造されるライブラリーに由来する請求の範囲第１〜８項のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記ライブラリーが生殖系Ｖ遺伝子の配列に由来する請求の範囲第10項記載の方法。
12. VHドメインコード配列の遺伝的に多様な集団が、少なくとも50のヒト生殖系VH遺伝子セグメントとDH及びJH遺伝子セグメントとを一緒にする人工的再配列により前記ライブラリー中に提供される、請求の範囲第11項記載の方法。
13. VHドメインコード配列の遺伝的に多様な集団が、複数のヒト生殖系VH遺伝子セグメントとDH及びJH遺伝子セグメントとを一緒にする人工的再配列により前記ライブラリー中に提供され、ここで前記複数のヒト生殖系VH遺伝子セグメントは１又は複数のVH遺伝子ファミリーに偏している、請求の範囲第11項に記載の方法。
14. 前記VHドメインコード配列の遺伝的に多様な集団が、前記生殖系VH遺伝子セグメントをランダムヌクレオチド配列を含む合成VH CDR3セグメントに連結することにより提供される、請求の範囲第12項又は第13項に記載の方法。
15. 前記自己抗原が癌胎児性抗原である、請求の範囲第１項〜第14項のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記自己抗原が、腫瘍壊死因子α(TNFα)である、請求の範囲第１項〜第14項のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記自己抗原がトランスフォーミング成長因子β（TGFβ）である、請求の範囲第１項〜第14項のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記自己抗原が受容体であり、そしてこの受容体に結合しそして該受容体を開始させるsbpメンバーであるポリペプチド鎖が選択される、請求の範囲第１項〜第14項に記載の方法。
19. 前記ライブラリー中の繊維状バクテリオファージが、sbpメンバーであるポリペプチド鎖又はその部分と該繊維状バクテリオファージの遺伝子III蛋白質との融合により、sbpメンバーであるポリペプチド鎖を表示する、請求の範囲第１項〜第18項に記載の方法。
20. （ｂ）のステップで選択された繊維状バクテリオファージの表面に表示されるsbpメンバーであるポリペプチド鎖が、sbpメンバーであるポリペプチド鎖を表示する個々の繊維状バクテリオファージまたは該繊維状バクテリオファージの混合集団を提供するように選択もしくはスクリーニングされ、ここで各繊維状バクテリオファージが、その表面で表示されるsbpメンバーであるポリペプチド鎖をコードする核酸を含有している請求の範囲第１〜19項のいずれか１項に記載の方法。
21. 選択又はスクリーニングされたsbpメンバーであるポリペプチド鎖をコードし、かつ選択又はスクリーニングされたsbpメンバーであるポリペプチド鎖をその表面に表示する繊維状バクテリオファージに由来する核酸を使用して、組換え宿主生物内に、sbpメンバーであるポリペプチド鎖もしくはそのフラグメント又はその誘導体を発現させる請求の範囲第１〜20項のいずれか１項に記載の方法。
22. １又は複数の繊維状バクテリオファージから核酸を採取し、これを用いて、個々のsbpメンバーであるポリペプチド鎖もしくはその混合集団またはそれらをコードする核酸を得るために別の方法においてコード核酸を提供する請求の範囲第21項記載の方法。
23. 発現最終産物が１〜数個のアミノ酸の付加、欠失、置換もしくは挿入により又は他の分子の連結により改変されている誘導体を製造する請求の範囲第21項または22項に記載の方法。
24. 前記誘導体がFcテールを含んで成る、請求の範囲第23項に記載の方法。
25. 発現最終産物またはその誘導体を使用して治療用又は予防用医薬または診断用製品を製造する請求の範囲第21, 22又は23項に記載の方法。
26. ライブラリーを含んで成るキットを、請求の範囲第１〜25項のいずれか１項に記載の方法において使用する方法。
27. 抗体の少なくとも一つのポリペプチド鎖をコードする核酸を各々が含有する繊維状バクテリオファージのライブラリーを含んで成るキットを、請求の範囲第１〜25項のいずれか１項の記載の方法において使用する方法。
28. 特異的結合対（sbp）のメンバーであるポリペプチド鎖の製造方法において、
    （ｉ）請求の範囲第20項に記載の方法により得られる選択されたsbpメンバーであるポリペプチド鎖を表示する繊維状バクテリオファージから核酸を得；そして
    （ii）工程（ｉ）において得られた核酸からの発現により、コードされたsbpメンバーであるポリペプチド鎖を生産する；
    ことを含んで成る方法。
29. 特異的結合対（cbp）のメンバーであるポリペプチド鎖をコードする核酸の製造方法であって、
    （ｉ）請求の範囲第20項に記載の方法により得られる選択された特異的結合対のメンバーであるポリペプチド鎖を表示する繊維状バクテリオファージから核酸を得；そして
    （ii）工程（ｉ）において得られた核酸から、特異的結合対のメンバーであるポリペプチド鎖をコードする核酸を生産する；
    ことを含んで成る方法。
30. 特異的結合対（cbp）のメンバーであるポリペプチド鎖をコードする核酸の製造方法であって、
    （ｉ）請求の範囲第20項に記載の方法により得られる選択された特異的結合対のメンバーであるポリペプチド鎖を表示する繊維状バクテリオファージから核酸を得、この核酸はcbpメンバーであるポリペプチド鎖又はその部分をコードするものであり；そして
    （ii）工程（ｉ）において得られた核酸から、誘導体cbpメンバーであるポリペプチド鎖をコードする核酸を生産し、ここで前記誘導体cbpメンバーであるポリペプチド鎖は、工程（ｉ）において得られる核酸によりコードされたcbpメンバーであるポリペプチド鎖又はその部分に対して、１〜数個のアミノ酸の付加、除去、置換もしくは挿入により、又は他の分子の連結により提供される；
    ことを含んで成る方法。
31. 請求項30に記載の方法により得られるコード核酸からの発現により、誘導体特異的結合対のメンバーであるポリペプチド鎖を生産することを含んで成る、特異的結合対のメンバーであるポリペプチド鎖の製造方法。
32. 標的ヒト自己抗原に対する結合特異性を持つ抗原結合部位を有するヒト抗体又は前記抗原結合部位を有するヒト抗体フラグメントである特異的結合対のメンバー（sbpメンバー）であるポリペプチド鎖製造方法であって、
    （ａ）繊維状バクテリオファージ（filamentous bacteriophage）のライブラリーを用意し、各繊維状バクテリオファージはその表面にsbpメンバーであるポリペプチド鎖を表示し、そしてその表面にsbpメンバーを表示する各繊維状バクテリオファージは核酸を含み、この核酸は前記繊維状バクテリオファージの表面に表示されるsbpメンバーであるポリペプチド鎖をコードするか又は前記繊維状バクテリオファージの表面に表示されるsbpメンバーポリペプチド鎖をコードし、ライブラリーにおいて表示されるsbpメンバーであるポリペプチド鎖をコードする核酸は、ヒト抗体配列に基づいており、この場合、標的ヒト自己抗原によりヒトを免疫感作せず、標的ヒト自己抗原に対する自己免疫疾患を有するヒトから核酸を得ず、そして前記標的ヒト自己抗原に対する結合特異性を有するヒト抗体がヒトにおいて検出可能であることを決定せず；そして
    （ｂ）前記標的ヒト自己抗原との結合により、前記標的ヒト自己抗原に対する結合特異性を有する１又は複数のメンバーであるポリペプチド鎖を選択する；
    ことを含んで成る方法。
33. 前記繊維状バクテリオファージの表面に表示されるsbpメンバーであるポリペプチド鎖が、VHドメイン及びVLドメインを含んで成る、請求の範囲第32項に記載の方法。
34. 前記繊維状バクテリオファージの表面に表示されるsbpメンバーであるポリペプチド鎖が、単鎖Fv抗体断片である、請求の範囲第32項に記載の方法。
35. 前記特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖が、繊維状バクテリオファージの遺伝子IIIキャプシドタンパク質表面成分との融合体として表示される、請求の範囲第32項に記載の方法。
36. 特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖の製造方法において、
    （ｉ）請求の範囲第32項に記載の方法により得られる特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖をその表面に表現する繊維状バクテリオファージから核酸を得；そして
    （ii）工程（ｉ）において得られた核酸からの発現により、コードされた特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖を製造する；
    ことを含んで成る方法。
37. 特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖をコードする核酸の製造方法において、
    （ｉ）請求の範囲第32項に記載の方法により得られる特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖をその表面に表現する繊維状バクテリオファージから核酸を得；そして
    （ii）工程（ｉ）において得られた核酸から、コードされた特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖をコードする核酸を製造する；
    ことを含んで成る方法。
38. 特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖をコードする核酸の製造方法において、
    （ｉ）請求の範囲第32項に記載の方法により得られる特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖をその表面に表現する繊維状バクテリオファージから核酸を得、前記核酸は特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖をコードしており；そして
    （ii）工程（ｉ）において得られた核酸からの発現により、コードされた特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖を製造する、ここで前記誘導体結合対メンバーであるポリペプチド鎖は、工程（ｉ）において得られた特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖に対する１〜数個のアミノ酸の付加、欠失、置換もしくは挿入、又は他の分子の連結により製造される；
    ことを含んで成る方法。
39. 特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖の製造方法において、請求の範囲第38に記載の方法により得られるコード核酸からの発現により前記誘導体特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖を製造する、ことを含んで成る方法。
40. 前記誘導体特異的結合対メンバーであるポリペプチド鎖が、Fcテールを含んで成る、請求の範囲第39項に記載の方法。

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