KR20210044810A

KR20210044810A - 시뮬레이션된 생체내 조건에서 치료요법적 단백질 선별

Info

Publication number: KR20210044810A
Application number: KR1020217007004A
Authority: KR
Inventors: 도로시 킴; 마이클 말로우
Original assignee: 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2018-08-13
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2021-04-23
Also published as: AU2019321282A1; US20240094219A1; JP2021534393A; WO2020036845A1; CN112639471B; MX2021001777A; US20230066527A1; BR112021002432A2; US20200064353A1; US11879896B2; EP3837546A1; CN112639471A; SG11202100467VA; IL280564A; CA3106997A1

Abstract

시뮬레이션된 생체내 조건에서 비-특이적 상효작용 효과를 결정하기 위한 방법이 개시된다. 상기 방법에는 다음이 내포된다: (a) 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제(crowding agent) 및 표적 분자를 포함하는 용액에 바이오센서를 접촉시키고, 이때 해당 바이오센서의 표면은 이 표적 분자에 특이적으로 결합하는 포획 분자를 포함하고; (b) 해당 포획 분자에 해당 표적 분자의 결합이 허용되고; 그리고 (c) 생물층 간섭계(biolayer interferometry)를 이용하여 포획 분자에 결합된 표적 분자의 양을 결정한다.

Description

시뮬레이션된 생체내 조건에서 치료요법적 단백질 선별

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 2019년 8월 12일에 생성된, 1466 바이트를 함유하는 10470W001-Sequence.txt 파일은 컴퓨터 판독가능한 형태로 제출된 서열 목록을 참조자료에 편입된다.

발명의 분야

본 발명은 바이오약품에 관한 것으로써, 거의 생리학적 조건에서 치료요법적 생분자, 이를 테면 항체의 거동을 결정하는 것에 관한 것이다.

배경

시험관 내 결합 평형의 적절한 분석은 반드시 해리 상수에 가까운 농도, 일반적으로 마이크로몰 및 그 이하의 농도로 제한된다. 이러한 조건 하에서, 단백질은 본질적으로 이상적인 분자처럼 거동하며, 임의의 비-특이적 상호작용은 용이하게 무시될 수 있다. 이런 단백질 농도를 임의로 높은 값으로 증가시키면 거대분자 과밀(crowding)로 이어지고, 여기에서 복합체 형성은 단백질 농도에 대해 더 이상 선형적이지 않으며, 질량 작용 법칙에서 유도된 결합 식은 농도보다는 열역학적 활성 측면에서 더 잘 표현된다 (Neal, B. L, D. Asthagiri and A. M. Lenhoff (1998). "Molecular origins of osmotic second virial coefficients of proteins." Biophys J 75(5): 2469-2477). 활성 계수의 크기는 전체 용액의 구성에 따라 달라지며; 비-이상성은 단백질 자체의 상승된 수준 뿐만 아니라, 상호-작용하지 않는 거대 분자 및 보조-용질(co-solute)의 존재로 인해 달라진다.

시험관내 특성화에 일반적으로 사용되는 것과 상당히 벗어난 비-이상적 조건 하에서 단백질 간의 비-특이적 상호작용의 이해는 생물학적 맥락에서 단백질 기능을 보다 더 완벽하게 이해하는데 중요하다. 따라서, 시뮬레이션된(simulated) 생체내 조건 하에서 생물학적 분자들의 비-특이적 상호작용을 결정하는 방법이 현재 필요하다.

발명의 요약

한 측면에서, 본 발명은 시뮬레이션된 생체내 조건에서 비-특이적 상호작용 효과를 결정하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 방법에는 다음이 내포된다: (a) 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제(crowding agent) 및 표적 분자를 포함하는 용액에 바이오센서를 접촉시키고, 이때 해당 바이오센서의 표면은 이 표적 분자에 특이적으로 결합하는 포획 분자를 포함하고; (b) 해당 표적 분자가 해당 포획 분자로의 결합이 허용되고; 그리고 (c) 생물층 간섭계(biolayer interferometry)를 이용하여 포획 분자에 결합된 표적 분자의 양을 결정한다.

일부 구체예들에서, 상기 방법에는 해당 포획 분자에 결합된 표적 바이오분자의 양을 대조군 임계치에 비교함으로써, 해당 용액 안에 다른 분자와 유인성(attractive) 비-특이적 상호작용을 갖는 표적 바이오분자와 해당 용액내 다른 분자와 반발성(repulsive) 비-특이적 상호작용을 갖는 표적 바이오분자를 구별하는 것이 더 내포된다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 대조군 임계치는 이상적인, 희석, 또는 반-희석 용액에서의 결합 양에 대해 정규화된 결합 양이다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제는 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함한다.

일부 구체예들에서, 상기 인간 혈청 알부민은 생리학적으로 관련 농도로 존재한다.

일부 구체예들에서, 상기 인간 혈청 알부민은 약 1g/L 내지 약 100g/L의 농도로 존재한다.

일부 구체예들에서, 상기 방법에는 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제의 두 가지 또는 그 이상의 농도에서의 결합 양을 결정하는 것이 추가로 내포된다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제는 혈청 및/또는 혈장을 포함한다.

일부 구체예들에서, 상기 방법에는 예를 들면, pH 의존적 결합를 결정하기 위해, 두 가지 또는 그 이상의 pH에서 결합 양을 결정하는 것이 추가 내포된다.

일부 구체예들에서, 상기 방법에는 예를 들면, 염 의존적 결합을 결정하기 위해, 두 가지 또는 그 이상의 염 농도에서 결합 양을 결정하는 것이 추가 내포된다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 표적 분자는 단일클론 항체를 포함하고, 상기 포획 분자는 이 단일클론 항체에 특이적으로 결합하는 항원을 포함한다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 표적 분자는 항원을 포함하고, 상기 포획 분자는 이 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함한다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 표적 분자는 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편을 포함하고, 상기 포획 분자는 이 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 표적 분자는 리간드를 포함하고, 상기 포획 분자는 이 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편드을 포함한다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 포획 분자는 상기 센서의 표면에 링커에 의해 결합된다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 링커는 바이오틴 및 스트렙타아비딘 또는 아비딘을 포함한다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 표적 분자는 항체를 포함하고, 상기 포획 분자는 항-IgG Fc를 포함한다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 항-IgG Fc는 항-인간 IgG Fc이다.

또다른 측면에서, 본 발명은 시뮬레이션된 생체내 조건 하에서 바이오분자를 선별하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 방법에는 다음이 내포된다: (a) 생체내 조건을 시뮬레이팅하는 용액에 바이오센서를 접촉시키고, 이때 해당 바이오센서의 표면은 관심 대상의 두 가지 또는 그 이상의 표적 바이오분자 세트에서 표적 바이오분자에 특이적으로 결합하는 포획 분자를 포함하고, 이때 이 용액은 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제와 관심 대상의 두 가지 또는 그 이상의 표적 바이오분자 세트로부터 선별된 제 1 표적 바이오분자를 더 포함하고; (b) 해당 제 1 표적 바이오분자가 해당 포획 분자로의 결합이 허용되고; 그리고 (c) 생물층 간섭계를 이용하여 해당 포획 분자에 결합된 제 1 표적 바이오분자를 결정한다.

일부 구체예들에서, 상기 방법에는 다음이 추가 내포된다: (a) 생체내 조건을 시뮬레이팅하는 제 2 용액에 해당 바이오센서를 접촉시키고, 이때 해당 제 2 용액은 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제, 그리고 관심대상의 두 가지 또는 그 이상의 바이오분자 세트에서 선택된 제 2 표적 바이오분자를 더 포함하고; (b) 이 제 2 표적 바이오분자가 상기 포획 분자로의 결합이 허용되고; (c) 생물층 간섭계를 이용하여 해당 포획 분자에 결합된 제 2 표적 분자의 양을 결정하고; 그리고 (d) 해당 포획 분자에 결합된 제 1 바이오분자의 양과 해당 포획 분자에 결합된 제 2 바이오분자의 양을 비교하여, 제 1 바이오분자와 제 2 바이오분자중 어느 것이 더 많은 결합 양을 갖는 지를 결정한다.

일부 구체예들에서, 상기 방법에는 해당 포획 분자에 결합된 표적 바이오분자의 양을 대조군 임계치에 비교함으로써, 해당 용액 안에 다른 분자와 유인성 비-특이적 상호작용을 갖는 제 1 및/제 2 표적 바이오분자와 해당 용액내 다른 분자와 반발성 비-특이적 상호작용을 갖는 표적 바이오분자를 구별하는 것이 더 내포된다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 임계치는 이상적인, 희석, 또는 반-희석 용액 안의 결합 양에 대해 정규화된 결합 양이다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 인간 혈청 알부민은 생리학적으로 관련 농도로 존재한다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 인간 혈청 알부민은 약 1g/L 내지 약 100g/L의 농도로 존재한다.

일부 구체예들에서, 상기 방법에는 두 가지 또는 그 이상의 농도의 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제에 결합 양을 결정하는 것이 추가 내포된다.

일부 구체예들에서, 상기 방법에는 pH 의존성 결합을 결정하기 위해 두 가지 또는 그 이상의 pH에서 결합 양을 결정하는 것이 추가 내포된다.

일부 구체예들에서, 상기 방법에는 염 의존성 결합을 결정하기 위해 두 가지 또는 그 이상의 염에서 결합 양을 결정하는 것이 추가 내포된다.

상기 방법의 다양한 구체예들에서, 상기 표적 분자는 리간드를 포함하고, 상기 포획 분자는 이 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편을 포함한다.

도 1은 CG-MALS을 이용하여 측정된 mAb1/HSA 및 mAb2/HSA 교차-상호작용의 이온 강도 의존성을 보여주는 그래프다. CG-MALS에 의해 인산염 완충액 안에서 NaCl 농도를 증가시킬 때 10g/L의 HSA와 10g/L mAb1 (ㆍ) 또는 mAb2 (□) 간의 상호작용에 대한 교차-비리얼 계수 (A₂₃)가 결정되었다. CVC의 음의 값은 분자 사이의 유인력을 나타내고, CVC의 양의 값은 분자 간의 반발력을 나타낸다. 상자는 mAb1 및 mAb2에 대한 CVC 값이 각각 음수 및 양수인 생리적 이온 강도를 나타낸다.
도 2는 mAbs 및 HSA에 대한 약한 양이온 교환 크로마토그래피 용출 프로파일을 보여주는 그래프다. 각 mAb 및 HSA는 200 mM MES, 20 mM NaCl, pH 6.5로 평형화된 약한 양이온 교환 컬럼 상에서 분석 크로마토그래피에 의해 평가되었다. 20-500 mM NaCl로부터 구배(gradient)가 적용되었으며, 1 M NaCl 용액에 대한 백분율은 점선으로 표시된다. HSA, mAb1, 및 mAb2에 대한 대표적인 용출 프로파일을 나타낸다.
도 3A 및 3B는 BLI에 의해 측정된, HSA 부재 하에서 137 mM NaCl에서 바이오티닐화된 항원에 대한 mAb의 결합을 보여주는 그래프들이다. 바이오티닐화된 항원에 대한 mAb1 (도 3A) 및 mAb2 (도 3B)의 결합은 생물층 간섭계를 이용하여 인산염 완충액에서 생리학적 염 농도에서 관찰되었다. 나노미터 (응답, nm) 단위의 파장 변화는 결합 사건으로 인한 생물층 두께의 변화를 나타내는 시간 함수로 표시된다. 1.25 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 및 40 nM mAb에 대한 연합 단계와 해리 단계를 보여준다. 점선 자국은 비가공(raw) 데이터를 나타내고, 실선 자국은 피팅된(fitted) 곡선을 나타낸다. mAb 연합 단계에서 데이터 추적들이 정렬되며, 모든 샘플 추적으로부터 참조 데이터를 차감시켰다.
도 4A 및 4B는 BLI에 의해 측정된 항원에 대한 mAb 결합에 있어서 HSA는 이온-강도 의존적임을 보여주는 그래프들이다. 인산염 완충액에서 10 (도 4A) 및 137 mM NaCl (도 4B)에서 HSA 존재 및 부재 하에서 바이오티닐화된 항원에 대한 40 nM mAb1 및 mAb2의 결합이 생물층 간섭계에 의해 관찰되었다. 시간의 함수로서 파장 (응답, nm)의 변화는 결합 사건을 나타내며, mAb 연합 단계 및 해리 단계만 표시된다. 상기에서 기재된 바와 같이 바이오티닐화된 항원은 SA 팁(tips) 상에 로딩되었다. 10g/L의 HSA의 존재 및 부재 하에서 mAb1의 결합이 평가되었으며, 10g/L의 HSA의 존재 및 부재 하에서 mAb2 결합이 평가되었다. 해당 바이오센서 팁에 대한 비-특이적 결합을 방지하기 위해 최저 0.1g/L의 HSA가 이용되었다. 등가 농도의 HSA에서 기선을 측정한 후, mAb 연합 단계에서 데이터 추적이 정렬된다. 10g/L의 HSA를 함유하는 샘플에 대한 추적은 용액의 굴절율 변화로 인해 연합에서 해리로 전환될 때 신호 변화에 대해 수정되었다.
도 5A 및 5B는 BLI에 의해 측정된 항원에 대한 mAb 결합에 있어서 HSA의 효과는 이온-강도 의존적이며, mAb-특이적임을 보여주는 그래프들이다. 생물층 간섭계에 의해 10 (도 5A) 및 137 (도 5B) mM NaCl에서 HSA 농도 농도를 증가시키면서 바이오티닐화된 항원에 대한 mAb1 (ㆍ) 및 mAb2 (□)의 결합이 관찰되었다. 정규화된 응답 (0.1g/L의 HSA에서 결합에 대해)은 HSA 농도에 대한 함수로 나타낸다. 점선은 이 점선에 대해 데이터 점들의 상관관계를 설명하기 위해 1.0에서 정상임을 나타낸다. 해당 바이오센서 팁에 대한 비-특이적 결합을 방지하기 위해 최저 0.1g/L의 HSA가 이용되었다. 실험은 세 번 수행되었으며, 평균 값과 표준 편차가 표시된다. 일-원, ANOVA는 각 HSA 농도에서 수행되었으며, p-값 <0.05는 별표로 표시된다. 표 2-4에 모든 데이터들이 요약되어 있다.
도 6A-6D는 BLI에 의해 측정된 항원에 대한 mAb 결합에 있어서 Ficoll 70의 효과를 보여주는 일련의 그래프들이다. 생물층 간섭계에 의해 10mM (도 6A) 및 137 mM NaCl(도 6B)에서 Ficoll 70 농도를 증가시키면서 바이오티닐화된 항원에 대한 mAb1 (ㆍ) 및 mAb2 (□)의 결합이 관찰되었다. 정규화된 응답 (0.1g/L의 Ficoll 70에서 결합에 대해)은 Ficoll 70 농도에 대한 함수로 플롯된다. 도 6A 및 6B의 점선은 이 점선에 대해 데이터 점들의 상관관계를 설명하기 위해 1.0에서 정상임을 나타낸다. 실험은 세 번 수행되었으며, 평균 값과 표준 편차가 표시된다. 일-원, ANOVA는 각 HSA 농도에서 수행되었으며, p-값 <0.05는 별표로 표시된다. 표 5-7에 모든 데이터들이 요약되어 있다. 느린 결합 역학은 고-농도의 Ficoll 70 (200g/L 및 그 이상, 도 6C 및 6D)에서 항원에 대한 mAb의 연합에 있어서 시간 연장이 요구된다. 300g/L의 Ficoll 존재 하에서 바이오티닐화된 항원에 대한 mAbs의 결합은 10 mM (도 6C) 및 137 mM (도 6D) NaCl에서 생물층 간섭계에 의해 관찰되었다. Ficoll 70 부재 시, mAb1 및 mAb2에 대한 정렬된 응답(nm 단위)은 연장된 연합 시간 (~ 3 시간) 동안 시간 함수로 표시된다. 300g/L의 Ficoll 70을 mAb1 및 mAb2에 추가하면 비교적 느린 결합 역학을 나타낸다.
도 7은 HSA 용액에 바이오센서를 담구면 생물층 간섭계 실험에서 신호가 증가됨을 보여주는 그래프다. 137 mM NaCl에서 바이오티닐화된 항원이 로딩된 SA 팁에 대한 mAb1 결합의 대표적인 센서그램(sensorgram). 기전 측정 후(0-120초), 바이오티닐화된 항원은 0.1g/L의 HSA 존재 하에 로딩되며, 평형화되도록 하고 (단계 A), 이 센서는 10g/L의 HSA (단계 B)에 담그고, 이 센서는 10g/L의 HSA + 40 nM mAb1 (단계 C)에 담구고, 이 센서는 기선 완충액 (단계 D)에 담근다. 단계 B에서 관찰된 신호 증가의 크기는 바이오틴-로드된 SA (항원 없음)를 사용한 동일한 실험 설정에서 관찰된 신호의 증가와 유사하며, 이것은 이 신호가 바이오센서 팁에 대한 특정 결합 사건이라기 보다는 HSA의 높은 단백질 농도의 굴절률 때문임을 나타낸다 (데이터는 제시되지 않음).
도 8A-8H는 항-인간 IgG Fc 포획 팁을 이용한 친화력 측정을 보여주는 일련의 그래프들이다. 대표적인 생물층 간섭계 센서그램은 10 mM (도 8A) 및 137 mM NaCl (도 8B)에서 라벨안된 항원과의 mAb1; 10 mM (도 8C) 및 137 mM NaCl (도 8D)에서 바이오티닐화된 항원과의 mAb1; 10 mM (도 8E) 및 137 mM NaCl (도 8F)에서 라벨안된 항원과의 mAb2; 10 mM (도 8G) 및 137 mM NaCl (도 8H)에서 바이오티닐화된 항원과의 mAb2로 나타낸다. 바이오센서 팁에는 ~ 0.6 nm 응답을 얻기 위해 항체가 로딩되었다. 항원 연합 단계는 100-300초이었으며, 해리는 600-750초이었다.
도 9는 mAb3이 항원에 결합하지 않고, BLI 신호에서 변화가 관찰되지 않음을 보여주는 그래프다. HSA 농도를 증가시키면서 이의 존재 하에 바이오티닐화된 항원에 대한 mAb3d의 결합은 생물층 간섭계에 의해 10 (ㆍ) 및 137 (□) mM NaCl에서 관찰되었다. 정규화된 응답이 아니라 관찰된 신호 (nm)가 HSA 농도의 함수로 표시된다. 실험은 두 번 수행되었으며, 평균 값과 표준 편차가 표시된다.
도 10은 이상적인, 희석, 및 반-희석 용액에서 차이를 보여주는 개략도이다.
도 11은 반-희석 용액이 농축 용액과 동일하지 않음을 보여주는 개략도이다.
도 12는 개시된 구체예들에 따라, 크라우딩 제제 및 항원 존재 하에서 항체 상호작용을 측정하기 위해 일반화된 생물층 간섭계 시스템을 보여주는 개략도이다.
도 13은 개시된 구체예들에 따라, 크라우딩 제제 및 FcRn 존재 하에서 항체 상호작용을 측정하기 위해 일반화된 생물층 간섭계 시스템을 보여주는 개략도이다.
도 14는 항체/FcRn 결합에 있어서 HSA 효과를 보여주는 그래프다.
도 15A 및 15B는 상이한 염 농도에서 HSA의 투여량(dose)-응답 곡선의 효과를 보여주는 그래프다.
도 16은 상이한 두 항체+/- FA에 대한 HSA의 투여량-응답 곡선의 효과를 보여주는 그래프다.
도 17은 야생형 및 YTE 돌연변이의 서열 정렬이다.
도 18은 FcRn에 대한 항-C5 mAbs 결합에 있어서 HSA의 투여량-응답 곡선의 효과를 보여주는 그래프다.
도 19는 FcRn에 대한 항-Zika mAbs 결합에 있어서 HSA의 투여량-응답 곡선의 효과를 보여주는 그래프다.
도 20은 반감기 연장 돌연변이체에서 HSA의 투여량-응답 곡선의 효과를 보여주는 일련의 그래프다.

발명의 상세한 설명

본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 특정 방법 및 실험 조건에 국한되지 않으며, 그러한 방법 및 조건은 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적이고, 임의의 제한을 두려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 하는데, 그 이유는 본 발명의 범위는 오로지 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다. 임의의 구체예들 또는 구체예들의 특징들 서로 결합될 수 있으며, 이러한 조합은 본 발명의 범위 내에 명시 적으로 포괄된다.

명시적으로 다른 언급이 없는 한, 본 발명에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 명세서가 속하는 당업계 숙련자들에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에서 사용된 바와 같이, 특정 인용된 수치와 관련하여 사용될 때, 용어 "약(about)"이란 그 값이 인용된 값으로부터 1 % 이하 미만으로 변할 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 본원에서 사용된 바와 같이, "약 100"이란 표현은 99와 101, 그리고 그 사이의 모든 값 (가령, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 내포한다.

본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질들이 지금부터 설명된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원 및 비-특허 공보는 그 전체가 참조자료로 본 명세서에 편입된다.

본원에서 이용된 약어

AUC: 분석용 초원심분리

NMR: 핵 자기 공명

MALS: 다중-각도 정적 광 산란

CG-MALS: 조성물-구배 다중-각도 광 산란

HSA: 인간 혈청 알부민

mAbs: 단일클론 항체

BLI: 생물층 간섭계

SA: 스트렙타아비딘

CVC: 교차-비리얼 계수

MBP: 말토스 결합 단백질

FcRn: 신생아 Fc 수용체

FelD1: 주요 고양이 알레르겐

정의

본원에서 사용된 바의 용어 "항체"란 이황화 결합에 의해 상호-연결된 2 개의 중쇄 (H) 및 2 개의 경쇄 (L)로된 4 개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 면역글로블린 분자(즉, "완전한 항체 분자) 뿐만 아니라 이의 다량체 (가령, IgM) 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 ("HCVR" 또는 "V_H")과 중쇄 불변 영역 (도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3으로 구성됨)으로 구성된다. 다양한 구체예들에서, 상기 중쇄는 IgG 아이소타입(isotype)일 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 중쇄는 아이소타입 IgG1 또는 IgG4의 중쇄이며, 임의선택적으로 아이소타입 IgG1/IgG2 또는 IgG4/IgG2의 키메라 힌지 영역이 내포된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 ("LCVR 또는 "V_L")과 경쇄 불변 영역 (C_L)으로 구성된다. V_H 영역 및 V_L 영역은 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있는데, 이는 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하며, 이것은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보존이 더 잘된 영역 사이에 끼여 있다. 각 V_H 및 V_L 은 3개의 CDRs 및 4개의 FRs을 포함하는데, 이들은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 용어 "항체"에는 임의의 아이소타입 또는 하위부류의 당화된 면역글로블린과 비-당화된 면역글로블린 모두를 지칭하는 것이 내포된다. 용어 "항체"에는 재조합적 수단에 의해 준비되고, 발현되고, 생성되거나 또는 단리된 항체 분자, 이를 테면, 해당 항체를 발현시키도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체가 내포된다. 항체 구조에 대한 검토는 Lefranc et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, 27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003); 그리고 M. Potter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1) Surv. Immunol. Res. 27-42 (1983) 참고.

용어 항체는 또한 하나 이상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 이종사량체성 면역글로불린을 포함하는 "이중-특이적 항체"를 또한 포괄한다. 상기 이중-특이적 항체의 절반에는 단일 중쇄와 단일 경쇄, 그리고 6개의 CDRs이 내포되며, 이는 하나의 항원 또는 에피토프에 결합하고, 해당 항체의 나머지 절반은 상이한 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 경우들에서, 상기 이중-특이적 항체는 동일한 항원의, 그러나 상이한 에피토프 또는 비-중첩 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우들에서, 상기 이중-특이적 항체의 두 절반은 모두 동일한 경쇄를 갖지만, 듀얼 특이성을 유지한다. 이중-특이적 항체는 전반적으로 U.S. 특허 출원 공개 번호 2010/0331527(2010년 12월 30일자)에서 기술된다.

항체의 "항원-결합 부분" (또는 "항체 단편")이란 항원에 특이적으로 결합하는 능력이 유지된 항체의 하나 또는 그 이상의 단편들을 지칭한다. 상기 항체의 "항원-결합 부분" 안에 포괄되는 결합 단편의 예로는 다음이 내포된다: (i) Fab 단편, 단가 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성됨; (ii) F(ab')2 단편, 이가(bivalent) 단편은 힌지 영역에서 이황화다리에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함; (iii) Fd 단편, VH 및 CH1 도메인으로 구성됨; (iv) Fv 단편, 항체의 단일 아암의 VL 도메인과 VH 도메인으로 구성됨, (v) dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), 이는 VH 도메인으로 구성됨, (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) scFv, Fv 단편의 두 개 도메인, VL 및 VH으로 구성되며, 합성 링커에 의해 연계되어 단일 단백질 쇄를 형성하고, 이때 당해 VL 및 VH 영역이 쌍을 형성하여 단가 분자들을 만든다. 단일 쇄 항체들의 다른 형태, 이를 테면, 디아바디 또한 "항체" 용어에 포괄된다(가령, Holliger et al. (1993) 90 PNAS U.S.A. 6444-6448; 및 Poljak et at. (1994) 2 Structure 1121-1123) 참고).

더욱이, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 당업계에 일반적으로 알려진 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻을 수 있다 (Sambrook et al., 1989 참조).

"Fc 융합 단백질"은 두 가지 또는 그 이상의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하며, 이중 하나는 면역글로블린 분자의 Fc 부분이며, 이는 자연계에서 함께 발견되지 않는다. 항체-유래된 폴리펩티드의 각종 부분 (Fc 도메인을 비롯함)에 융합된 특정 이종성(heterologous) 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는 예를 들면, Ashkenazi et at., (1991) 88 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 10535; Byrn et at., (1990) 344 Nature 677; and Hollenbaugh et at., (1992)"Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11에 기술된다. "수용체 Fc 융합 단백질"은 Fc 모이어티에 결합된 수용체의 하나 또는 그 이상의 세포외 도메인(들)을 포함하며, 이것은 일부 구체예들에서 힌지 영역에 이어서 면역글로블린의 CH2 도메인과 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 Fc-융합 단백질은 하나 또는 그 이상의 리간드(들)에 결합하는 두 가지 또는 그 이상의 별개 수용체 쇄를 함유한다. 예를 들면, Fc-융합 단백질은 트랩(trap), 이를 테면, 예를 들면 IL-1 트랩 (예를 들면, 릴오나셉트(rilonacept), 이것은 hIgG1의 Fc에 융합된 IL-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 함유한다; U.S. 특허 번호 6,927,004), 또는 VEGF 트랩 (예를 들면, 아필리베르셉트(aflibercept), 이것은 hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 함유한다; U.S. 특허 번호 7,087,411 (2006년 8월 8일에 등록됨) 및 U.S. 특허 번호 7,279,159 (2007년 10월 9일에 등록됨))이다.

용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체가 내포되도록 의도된다. 본 발명의 인간 mAbs는 예를 들면, CDRs 및 특정 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코드되지 않는 아미노산 잔기 (가령, 시험관에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이생성에 의해 도입된 돌연변이, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해)를 내포할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 그러나, 용어 "인간 항체" 의미에 또다른 포유류 종(이를 테면, 마우스)의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 FR 서열에 그래프트된 mAbs를 내포한다는 의도는 아니다. 이 용어에는 비-인간 포유동물 또는 비-인간 포유동물의 세포에서 재조합적으로 생산된 항체가 내포된다. 이 용어에 인간 대상체로부터 단리되거나 또는 생성된 항체를 내포시키려는 의도는 없다.

"생물-층 간섭계(Bio-layer interferometry)" 또는"BLI"란 바이오분자 상호작용 측정용 (예를 들면, Current Biosensor Technologies in Drug Discovery. Cooper, M. A. Drug Discovery World, 2006, 68-82 and Higher-throughout, label-free, real-time molecular interaction analysis. Rich, R. L; Myszka, D. G. Analytical Biochemistry, 2007, 361, 1-6) 라벨-없는 기술이다. BLI는 두 표면, 예를 들면, 바이오센서 팁 상의 고정된 생물 분자 층과 내부 참조 층에서 반사된 빛의 간섭 패턴을 분석하는 광학 분석 기술이다. 해당 바이오센서의 팁에 결합된 표적 바이오분자 수의 분화는 실시간으로 측정될 간섭 패턴의 변화 원인이 된다.

해당 바이오센서 팁 표면 상에 고정된 포획 분자와 용액 안의 표적 바이오분자 사이의 결합으로 해당 바이오센서 팁에 두께가 증가되고, 이로써 파장 이동이 일어난다. BLI의 예시적인 기구는 예를 들면 ForteBio, Fremont California에서 구입할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "접촉하는"이란 직접적은 물리적 연합이 일어나는 배치를 말한다. 접촉은 예를 들면, 샘플, 이를 테면 표적 바이오분자, 이를 테면 항체를 함유하는 생물학적 샘플과 시험관 내에서 일어날 수 있다.

전반적 설명

생물학적 환경과 관련하여, 혈액은 수 백개의 상이한 분자로 구성된 복잡한, 과밀화된(crowded) 용액이다. 이러한 비-이상적인 조건 하에서 단백질 간의 비-특이적 상호작용에 대한 이해는 생물학적 맥락에서 단백질 기능의 좀더 정확한 이해를 하는데 중요하다. 따라서, 과밀화된 환경에서 단백질 활성을 측정하는 것이 가장 중요하며, 이를 테면 분석용 초원심분리(AUC) 및 핵 자기 공명 (NMR)과 같은 방법은 기존에 군집된 용액 안의 분자 거동 검사에 이용되어 왔었다(Heddi, B. & Phan, A. T. Structure of human telomeric DNA in crowded solution. J Am Chem Soc 133, 9824-9833, doi:10.1021/ja200786q (2011), Martorell, G., Adrover, M., Kelly, G., Temussi, P. A. & Pastore, A. A natural and readily available crowding agent: NMR studies of proteins in hen egg white. Proteins 79, 1408-1415, doi:10.1002/prot.22967 (2011), Rivas, G., Fernandez, J. A. & Minton, A. P. Direct observation of the self-association of dilute proteins in the presence of inert macromolecules at high concentration via tracer sedimentation equilibrium: theory, experiment, and biological significance. Biochemistry 38, 9379-9388, doi:10.1021/bi990355z (1999), Rivas, G. & Minton, A. P. Non-ideal tracer sedimentation equilibrium: a powerful tool for the characterization of macromolecular interactions in crowded solutions. Journal of molecular recognition : JMR 17, 362-367, doi:10.1002/jmr.708 (2004), Pielak, G. J. et al. Protein nuclear magnetic resonance under physiological conditions. Biochemistry 48, 226-234, doi: 10.1021/bi8018948 (2009), Wright, R. T., Hayes, D. B., Stafford, W. F., Sherwood, P. J. & Correia, J. J. Characterization of therapeutic antibodies in the presence of human serum proteins by AU-FDS analytical ultracentrifugation. Analytical biochemistry 550, 72-83, doi:10.1016/j.ab.2018.04.002 (2018)). 그러나, 이러한 방법에는 몇 가지 단점이 있다: AUC는 며칠이 걸릴 수 있는 시간이 많이 걸리는 실험 방법인 반면, NMR은 샘플의 이온 강도 및 재료 소비와 관련하여 제약이 있다.

단백질의 열역학적 및 운동학적 특성에 있어서 거대 분자 크라우딩의 효과는 놀랍도록 복잡하고 예측하기 어렵다 (Elcock, A. H. Prediction of functionally important residues based solely on the computed energetics of protein structure. J Mol Biol 312, 885-896, doi: 10.1006/jmbi.2001.5009 (2001), Candotti, M. & Orozco, M. The Differential Response of Proteins to Macromolecular Crowding. PLoS Comput Biol 12, e1005040, doi:10.1371/journal. pcbi.1005040 (2016), Minton, A. P. The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media. The Journal of biological chemistry 276, 10577-10580, doi:10.1074/jbc.R100005200 (2001), Zimmerman, S. B. & Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct 22, 27-65, doi:10.1146/annurev.bb.22.060193.000331 (1993)). 주요한 그리고 피할 수 없는 결과는 입체적 배제 (배제된 부피 효과라고도 함)이며, 이는 일반적으로 모든 분자에 사용할 수 있는 부피를 증가시키기 위해 거대분자 연합 가능성이 더 커진다. 크기, 모양, 표면 및 고유 전하 특성, 용매 상태를 비롯한 단백질의 다양한 물리화학적 속성은 순(net) 비-특이적 상호작용에 기여한다. 더욱이, 정전기적 상호작용, 반데르발스힘, 전하 비등방성 (국소 쌍극자 모멘트) 및 소수성 상호작용이 전체 효과를 아마도 반대 방식으로 조절한다. 끝으로, 비-특이적 상호작용은 용액 조건 (예를 들면, pH 및 이온 강도; 비활성 보조-용질)에 따라 상당히 달라지며, 특정 경우에서 순 반발성으로부터 유인성 상호작용으로 변화될 수 있다 (Zhang, Z., Witham, S. & Alexov, E. On the role of electrostatics in protein-protein interactions. Phys Biol 8, 035001, doi: 10.1088/1478-3975/8/3/035001 (2011), Elcock, A. H. & McCammon, J. A. Calculation of weak protein-protein interactions: the pH dependence of the second virial coefficient. Biophys J 80, 613-625, doi:10.1016/S0006-3495(01)76042-0 (2001), Blanco, M. A., Perevozchikova, T., Martorana, V., Manno, M. & Roberts, C. J. Protein-protein interactions in dilute to concentrated solutions: alpha-chymotrypsinogen in acidic conditions. J Phys Chem B 118, 5817-5831, doi: 10.1021/jp412301 h (2014)). 따라서, 상호작용하지 않는 단백질을 함유하는 용액에서 높은 단백질 농도로 인한 비-이상성은 상당한 수준의 이종-연합으로 이어지거나 또는 더 분산된 분포로 용질을 유지할 수 있다.

열역학적 비-이상성의 결과는 다양하다. 분자의 최종 표시가 100g/L를 자주 초과하는 항체 제조 및 제형의 관점에서 비-이상성은 점도, 용해도, 상 분리 및 자가-연합을 비롯한 다양한 단백질 용액 현상을 변경하는 것으로 나타났다 (Salinas, B. A. et al Understanding and modulating opalescence and viscosity in a monoclonal antibody formulation. J Pharm Sci 99, 82-93, doi:10.1002/jps.21797 (2010), Connolly, B. D. et al Weak interactions govern the viscosity of concentrated antibody solutions: high-throughput analysis using the diffusion interaction parameter. Biophys J 103, 69-78, doi:10.1016/j.bpj.2012.04.047 (2012), Liu, J., Nguyen, M. D., Andya, J. D. & Shire, S. J. Reversible self-association increases the viscosity of a concentrated monoclonal antibody in aqueous solution. J Pharm Sci 94, 1928-1940, doi: 10.1002/jps.20347 (2005), Raut, A. S. & Kalonia, D. S. Pharmaceutical Perspective on Opalescence and Liquid-Liquid Phase Separation in Protein Solutions. Mol Pharm 13, 1431-1444, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.5b00937 (2016)). 세포-내 환경, 세포외 기질 및 순환 혈액을 비롯한 생물학적 시스템의 특정 환경과 관련하여, 거대분자 크라우딩은 결합 평형 뿐만 아니라 반응 속도, 단백질 폴딩 및 이성질화, 단백질-단백질 상호작용 그리고 전반적인 세포 항상성에 영향을 미친다 (Spitzer, J. From water and ions to crowded biomacromolecules: in vivo structuring of a prokaryotic cell. Microbiol Mol Biol Rev 75, 491-506, second page of table of contents, doi:10.1128/MMBR.00010-11 (2011), van den Berg, J., Boersma, A. J. & Poolman, B. Microorganisms maintain crowding homeostasis. Nat Rev Microbiol 15, 309-318, doi:10.1038/nrmicro.2017.17 (2017), Zhou, H. X., Rivas, G. & Minton, A. P. Macromolecular crowding and confinement: biochemical, biophysical, and potential physiological consequences. Annu Rev Biophys 37, 375-397, doi:10.1146/annurev.biophys.37.032807.125817 (2008). 예를 들면, 세포 안팎으로의 삼투적 수송에 영향을 미치는 세포 삼투 평형의 이론적 모델링은 과밀화된 세포 환경으로 인하여 비-이상적인 세포내 열역학을 고려해야 한다 (Ross-Rodriguez, L. U., Elliott, J. A. & McGann, L. E. Non-ideal solution thermodynamics of cytoplasm. Biopreserv Biobank 10, 462-471, doi: 10.1089/bio.2012.0027 (2012)). 추가적으로, 거대분자 크라우딩은 세포 병리에 영향을 미칠 수 있고; 가속화된 아밀로이드 형성은 과밀화된 환경에서 발생하는 것으로 입증되었다 (Hatters, D. M., Minton, A. P. & Howlett, G. J. Macromolecular crowding accelerates amyloid formation by human apolipoprotein C-ll. The Journal of biological chemistry 277, 7824-7830, doi:10.1074/jbc.M110429200 (2002), Lashuel, H. A., Hartley, D., Petre, B. M., Walz, T. & Lansbury, P. T., Jr. Neurodegenerative disease: amyloid pores from pathogenic mutations. Nature 418, 291, doi: 10.1038/418291a (2002), Munishkina, L. A., Cooper, E. M., Uversky, V. N. & Fink, A. L. The effect of macromolecular crowding on protein aggregation and amyloid fibril formation. Journal of molecular recognition: JMR 17, 456-464, doi:10.1002/jmr.699 (2004)). 생리학적 환경의 구성은 비리얼 계수를 특징화화는데 일반적으로 사용되는 분석 방법을 종종 방해한다. 따라서, 열역학적 비-이상성 현상과 그에 따른 결과는 실질적으로, 그리고 생물학적으로 모두 중요하다.

바이오치료제 단백질, 이를 테면 단일클론 항체는 흔히 혈액에 고 농도로 투여되는데, 혈액은 실질적 단백질 내용물과 함께 있어 본질적으로 복잡하고, 과밀화된 용액이다. 거대분자 크라우딩 효과와 이로 인한 단백질 비-이상성으로 이러한 생리학적 환경에서 비-특이적 이종성-연합이 상당 수준에 이를 수 있다 (도 11 및 도 12 참고). 따라서, 시험관내 특성화에 일반적으로 사용되는 것과는 상당히 벗어난 이러한 비-이상적이며, 과밀화된 조건 하에서 단백질 간의 비-특이적 상호작용을 이해하는 방법을 개발하는 것은 생물학적 맥락에서 단백질 기능을 더 잘 이해하는데 중요하다. 이를 위해, 본 명세서는 생물학적으로 활성 분자 (예를 들면, 항체, 이중-특이적 항체, 융합 단백질, Fc-수용체 융합 단백질)와 이들의 동족성(cognate) 결합 짝의 상호작용, 예를 들면, 항체-항원 또는 수용체-리간드 상호작용에 있어서 분자 크라우딩 효과를 연구하기 위한 모델 시스템 개발에 관계한다. 본원에 개시된 바와 같이, 생체내 환경을 모방하는 용액 안에서 이들 분자의 상호작용, 예를 들면 결합을 결정함으로써, 비용이 많이 드는 생체내 및/또는 임상 시험을 시작하기 전, 이들 분자의 거동에 대한 정보를 얻을 수 있다. 이러한 정보는 최종 치료제의 선두주자로 삼을 분자 또는 화합물에 대한 정보에 근거한 결정을 내리는 데 사용될 수 있다.

인간 혈청 알부민 (HSA)은 인간의 순환계에 가장 풍부한 단백질중 하나로써, 혈장에 있는 단백질의 대략 절반을 차지한다. HSA의 상대적 풍도 및 다중 생물학적 프로세스에서의 이의 역할은 바이오치료제와 이들의 잠재적 상호작용의 조사를 촉발시키고, 더 중요한 것은 이들 상호작용이 대상체에서 해당 바이오치료제의 생물학적 활성에 어떻게 영향을 미칠 수 있는 지에 대한 조사를 촉발시켰다. 추가적으로, 알부민은 생리학적 pH에서 음전하이기 때문에 이것은 HSA와 순 양전하를 갖는 바이오치료제, 또는 양의 표면에 노출된 거대한 용매 사이의 비-특이적 정전기적 상호작용 가능성이 있다.

인간 혈청 알부민 (HSA)과 두 개의 재조합적 단일클론 항체 (mAbs) 사이의 비-특이적 상호작용, 그리고 mAb:항원 결합에 있어서 이들 상호작용의 영향이 본원에서 입증된다. 생물층 간섭계 (BLI)를 이용하여, 생리학적 HSA 농도에서 mAbs에 의한 항원 결합에 있어서 HSA의 효과를 검정하여 이들 비-특이적 상호작용이 mAb:항원 상호작용에 대해 기능적 영향을 가진다는 것을 보여주었다. 중요한 것은, HSA 대신 Ficoll 70 (많은 분자 크라우딩 실험에 사용되는 제제)을 대체했을 때 유사한 결과가 나오지 않았는데, 이것은 HSA가 정전기적 상호작용으로 인해 분자 크라우딩 이상의 효과가 있음을 입증하는 것이다. 현재 공개된 시험관내 데이터는 혈청 내 고-농도의 HSA가 생체내 mAbs와의 비-특이적 상호작용을 유발할 가능성이 있으며, Fc 수용체들을 비롯한 기능적으로 관련된 다른 단백질들과 항원에 대한 이들의 친화력에 대해 잠재적인 영향을 미칠 가능성이 있음을 보여준다. 이와 함께, 이들 결과는 본원에서 개시된 BLI 기반 방법들을 이용하여 특이적 생물학적으로-관련 상호작용에 대해 비-특이적 단백질-단백질 상호작용의 영향을 결정할 수 있고, 이는 과밀화된 조건에서 결합 사건을 평가하는 직접적인 방법을 제공한다.

본 명세서의 측면들은 바이오분자 거동에 있어서 비-특이적 상호작용의 영향, 이를 테면 생체내 조건을 모방하는 조건 하에서 항원 및/또는 이의 에피토프에 대한 항체의 특이적 결합의 효과를 결정하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 본원에 개시된 방법들을 이용하여 잠재적 치료요법적 바이오분자, 이를 테면 단일클론 항체의, 이를 테면 유효 농도가 감소되고, 따라서 해당 잠재적 치료요법적 바이오분자의 효과가 감소됨으로써, 항체의 기능을 억제시킬 수도 있는 생체내 비-특이적 상호작용을 받을 것인지를 예측할 수 있다. 따라서, 시뮬레이션된 생체내 조건에서 비-특이적 상호작용의 효과를 평가하는 방법이 본원에 개시된다 (예시적인 시스템에 대해 도 12를 참고). 구체예들에서, 상기 방법에는 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제와 표적 바이오분자를 포함하는 용액을 바이오센서에 접촉시키는 것이 내포된다. 해당 바이오센서의 표면에는 이 표적 분자에 특이적으로 결합하는 포획 분자가 내포되어 있고, 따라서 이 바이오센서 (상기 포획 분자를 통하여 매개된)에 해당 표적 바이오분자의 결합이 평가되거나 및/또는 결정될 수 있다. 다양한 구체예들에서, 상기 바이오센서는 상기 표적 바이오분자가 상기 포획 분자에 결합할 수 있는 충분한 시간 동안, 예를 들면, 평형에 도달될 때 까지 이 용액에서 항온처리된다. 그 다음, 해당 포획 분자에 결합된 표적 바이오분자의 양은 예를 들면, 생물층 간섭계를 이용하여 결정된다 (예를 들면, 도 4A 및 4B 참고). 구체예들에서, 해당 포획 분자에 결합된 표적 바이오분자의 양은 대조군, 이를 테면 이 용액에 있는 다른 분자와 유인성 비-특이적 상호작용을 갖는 표적 바이오분자, 그리고 이 용액 안에 있는 다른 분자와 반발성 비-특이적 상호작용을 갖는 표적 바이오분자들 간을 구별하는 임계치와 비교된다. 비-특이적 유인력을 갖는 임계치 미만의 표적 바이오분자는 해당 임계치를 초과하는 것(이것들은 이러한 비-특이적 상호작용을 나타내지 않거나 또는 더 적게 나타냄)보다 덜 바람직할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 식별된 표적 바이오분자를 투여한 대상체 안에서 발견될 수 있는 생체내 조건에 더 적합한 표적 바이오분자의 식별에 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 임계치는 정규화된 응답, 예를 들면, 분자 크라우딩 제제가 없거나 또는 매우 적은 용액, 및/또는 이상적인, 희석, 또는 반-희석 용액에 대해 정규화된다. 일부 구체예들에서, 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제는 인간 혈청 알부민 (HSA)을 포함하고, 결합의 양은 저-농도의 HSA, 이를 테면 약 0.0001g/L의 HSA 내지 0.1g/L의 HSA, 예를 들면, 이상적인, 희석, 또는 반-희석 용액을 모방하거나 또는 이에 근접한 조건하에서 관찰되는 결합에 대해 정규화된다. 이 실시예에서, 상기 임계치는 순 유인력 또는 반발력이 없는 것에 상응하는 1로 설정될 것이다. 1 미만의 정규화된 응답을 갖는 분자는 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제, 이를 테면 HSA와의 비-특이적 상호작용을 갖는 것으로 간주될 수 있고, 치료 잠재력을 평가하기 위한 추가 연구가 재고될 수 있다. 역으로, 1 초과된 정규화된 응답을 갖는 분자는 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제, 이를 테면 HSA와의 유의적인 비-특이적 상호작용이 없는 것으로 간주될 수 있고, 더 큰 치료요법적 잠재력을 갖는 것으로 간주될 수 있는데, 이는 추가적인 평가를 요한다. 구체예들에서, HSA는 해당 용액 안에 생리학적으로 관련 농도로 존재한다. 다른 구체예들에서 (이를 테면, HSA와 관련하여 상기에서 또는 본원에서 논의된 것들), 분자 크라우딩 제제는 IgG, 트랜스페린, 피브리노겐, IgA, α2-마크로글로불린, IgM, α1-안티트립신, 합토글로빈, α1-산 당단백질, 아포리포단백질 A-1, 아포리포단백질 A-11, 혈장, 혈청 또는 혈액 또는 혈청 샘플에서 발견되는 임의의 다른 단백질 성분에서 선택된다.

특정 구체예들에서, HSA는 약 1g/L 내지 약 100g/L, 이를 테면 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100g/L의 HSA, 예를 들면 약 35-50, 25-40, 또는 10-80g/L의 HSA의 농도로 존재한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 증가되는 HSA 농도에 대한 해당 표적 분자의 응답을 결정하기 위해 다양한 농도의 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제, 예를 들면, 약 1g/L 내지 약 100g/L의 HSA에서 실행된다 (예를 들면, 도 5A 및 5B 참고). 구체예들에서, 상기 방법에는 예를 들면, 투여량 응답 곡선을 생성하기 위해, 두 가지 또는 그 이상의 농도의 분자 크라우딩 제제에서 결합 양을 결정하는 것이 내포된다.

구체예들에서, 상기 HSA는 예를 들어 FA의 효과를 결정하기 위해 지방산 (FA)이 로딩된 HSA이다. 일부 구체예들에서, 이 용액에는 생리학적 성분들 (또는 추가적인생리학적 성분들), 이를 테면 IgG, 트랜스페린, 피브리노겐, IgA, α2-마크로글로불린, IgM, α1 -안티트립신, 합토글로빈, α1-산 당단백질, 아포리포단백질 A-1, 아포리포단백질 A-11, 또는 혈액 또는 혈청 샘플에서 발견되는 임의의 다른 단백질 성분들이 내포된다. 구체예들에서, 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제는 혈청 및/또는 혈장을 포함한다.

구체예들에서, 이 용액은 생리학적 pH, 이를 테면, 중성 pH 부근의 단일 생리학적 pH를 갖는다. 그러나, 상기 방법들은 다양한 pH에서 수행될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 방법에는 pH 의존성 결합을 결정하기 위해 두 가지 또는 그 이상의 pH에서 결합 양을 결정하는 것이 추가 내포된다.

구체예들에서, 이 용액은 생리학적 염 농도이다. 특정 구체예들에서, 상기 방법에는 염 의존성 결합을 결정하기 위해 두 가지 또는 그 이상의 염에서 결합 양을 결정하는 것이 추가 내포된다.

개시된 방법은 생체내 환경의 비-특이적 상호작용을 시뮬레이션하는 조건 하에서 생물학적으로 관련된 분자 쌍의 결합을 결정하는데 사용될 수 있다. 구체예들에서, 상기 표적 분자는 단일클론 항체를 포함하고, 상기 포획 분자는 이 단일클론 항체에 특이적으로 예를 들면, 고-친화력으로 결합하는 항원을 포함한다. 구체예들에서, 상기 표적 분자는 항원, 이를 테면 단백질-기반 면역원을 포함하고, 상기 포획 분자는 이 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 생물학적 표적 분자는 반감기-연장된 돌연변이 단일클론 항체 세트이다. 특정 구체예들에서, 상기 표적 분자는 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편을 포함하고, 상기 포획 분자는 이 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 표적 분자는 리간드를 포함하고, 상기 포획 분자는 이 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편을 포함한다.

본 명세서의 측면은 시뮬레이션된 생체내 조건 하에서 바이오분자를 선택하는 방법에 추가로 관련된다. 개시된 방법들은 예를 들면 전임상 또는 임상 시험에서 추가 연구용으로 바이오분자 세트, 이를 테면, 잠재적 치료요법적 단일클론 항체 후보 세트의 스크리닝에 이용될 수 있다. 구체예들에서, 상기 방법에는 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제와 표적 바이오분자 (이를 테면 제 1 표적 바이오분자)를 포함하는 용액을 바이오센서에 접촉시키는 것이 내포된다. 해당 바이오센서의 표면에는 이 표적 분자에 특이적으로 결합하는 포획 분자가 내포되어 있고, 따라서 이 바이오센서 (상기 포획 분자를 통하여 매개된)에 해당 표적 바이오분자의 결합이 평가되거나 및/또는 결정될 수 있다. 구체예들에서, 제 1 표적 바이오분자는 관심 대상의 두 가지 또는 그 이상의 표적 바이오분자 세트로부터 선택된다. 상기 바이오센서는 상기 표적 바이오분자가 상기 포획 분자에 결합할 수 있는 충분한 시간 동안, 예를 들면, 평형에 도달될 때 까지 이 용액에서 항온처리된다. 그 다음, 해당 포획 분자에 결합된 표적 바이오분자의 양은 예를 들면, 생물층 간섭계를 이용하여 결정된다.

구체예들에서, 상기 방법에는 용액, 이를 테면 생체내 조건을 시뮬레이팅하는 제 2 용액을 해당 바이오센서에 접촉시키는 것이 추가 내포되는데, 이때 해당 제 2 용액에는 관심대상의 두 가지 또는 그 이상의 바이오분자 세트에서 선택된 제 2 표적 바이오분자가 내포된다. 상기 바이오센서는 상기 제 2 표적 바이오분자가 상기 포획 분자에 결합할 수 있는 충분한 시간 동안, 예를 들면, 평형에 도달될 때 까지 이 용액에서 항온처리된다. 그 다음, 해당 포획 분자에 결합된 제 2 표적 바이오분자의 양은 예를 들면, 생물층 간섭계를 이용하여 결정된다. 구체예들에서, 해당 포획 분자에 결합된 제 2 바이오분자의 양은 해당 포획 분자에 결합된 제 1 바이오분자의 양과 비교하여 제 1 바이오분자와 제 2 바이오분자중 어느 것이 더 큰 결합 양을 갖는 지를 결정하여, 예를 들면 생물학적으로 관련 크라우딩 제제에서 해당 포획 분자에 대한 이들의 각 결합에 대해 이들 바이오분자(예를 들면, 항체, 이중-특이적 항체, 또는 융합 단백질)들의 순위를 매긴다. 이 과정은 관심대상 단일클론 항체 세트와 같은 관심 바이오분자 세트에서 임의의 수의 바이오분자에 대해 반복될 수 있다. 이러한 순위매김으로 이들 세트 중에서 추가 분석용 단일클론 항체를 선택할 수 있다. 특정 구체예들에서, 바이오분자는 생체내 적합성에 기초하여 선택된다. 구체예들에서, 제 2 용액, 또는 제 3 용액, 제 4 용액 등은 개별 표적 바이오분자(들)이 존재한다는 점을 제외하고는 제 1 용액과 동일하다. 따라서, 본원에 개시된 방법들을 사용하여 두 가지 또는 그 이상의 표적 바이오분자, 이를 테면 상기 포획 분자에 특이적인 단일클론 항체 세트로부터 선택된 두 가지 또는 그 이상의 단일클론 항체의 결합을 비교한다. 구체예들에서, 포획 분자에 결합된 제 1 표적 바이오분자 및/또는 제 2 표적 바이오분자를 상기에서 기술된 대조군과 비교할 수 있다.

특정 구체예들에서, 상기 생물학적으로 관련 크라우딩 제제 (예를 들면, HSA)는 농도의 약 1g/L 내지 약 100g/L, 이를 테면 약, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100g/L, 예를 들면, 약 35-50, 25-40, 또는 10-80g/L로 존재한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 증가되는 크라우딩 제제 농도에 대한 해당 표적 분자의 응답을 결정하기 위해 다양한 농도의 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제, 예를 들면, 약 1g/L 내지 약 100g/L에서 실행된다. 구체예들에서, 상기 방법에는 예를 들면, 투여량 응답 곡선을 생성하기 위해, 두 가지 또는 그 이상의 농도의 분자 크라우딩 제제에서 결합 양을 결정하는 것이 내포된다.

구체예들에서, 상기 크라우딩 제제는 HSA, 또는 예를 들어 FA의 효과를 결정하기 위해 지방산 (FA)이 로딩된 HSA이다. 구체예들에서, 이 용액에는 생리학적 성분들 (또는 추가적인생리학적 성분들), 이를 테면 IgG, 트랜스페린, 피브리노겐, IgA, α2-마크로글로불린, IgM, α1-안티트립신, 합토글로빈, α1-산 당단백질, 아포리포단백질 A-1, 아포리포단백질 A-11, 또는 혈액 또는 혈청 샘플에서 발견되는 임의의 다른 단백질 성분들이 내포된다. 구체예들에서, 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제는 혈청 및/또는 혈장을 포함한다.

포획 분자는 공유 부착 및/또는 화학적 가교를 비롯한 임의의 다수 수단을 통해 바이오센서에 부착될 수 있다. 그 다음, 표적 바이오분자는 상기 포획 프로브에 특이적 결합을 통해 해당 바이오센스에 부착될 수 있다. 바이오센서, 시약 및 반응 용기의 조작은 로봇으로 수행할 수 있다. 바이오센서에 의한 표적 바이오분자의 포획은 예를 들어, 항원에 대한 특정 항체 친화력을 비롯한 표적 분자의 특정 인이적 의존한다. 선택된 포획 분자는 당업자에게 이용가능한 임의의 방법에 의해 적합한 기질에 고정된다. 예를 들면, 상기 포획 분자를 해당 기질 상에 있는 선택된 작용기에 직접 연결시킬 수 있다. 대안적으로, 상기 포획 분자를 링커 또는 스페이서를 통해 기질에 간접적으로 연결시킬 수 있다. 도 12에 도시된 바와 같이, 스트렙타아비딘은 해당 바이오센서의 표면에 결합되고, 상기 포획 분자는 스트렙타아비딘과 바이오틴의 결합 (도 12에 나타낸 예시에서 바이오티닐화된 항원)을 통하여 해당 바이오센서로 동원된다. 일부 경우들에서, 상기 선택된 포획 분자는 스트렙타아비딘 (또는 바이오틴)에 링키지(linkage)를 경유하여 고정될 수 있고, 그 다음 해당 기질에 공유적으로 연계된 바이오틴 (또는 스트렙타아비딘) 모이어티를 통하여 이 기질에 부착될 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 포획 분자는 링커를 통하여 상기 센서의 표면에 결합된다. 특정 구체예들에서, 상기 링커는 바이오틴과 스트렙타아비딘 또는 아비딘을 포함한다. 예시에서, 상기 표적 분자는 항체, 이를 테면 인간화된 항체, 상기 포획 분자는 항-IgG Fc, 이를 테면 항-인간 IgG Fc이다.

실시예

다음 실시예들은 본 발명의 방법을 어떻게 만들고, 사용하는 지에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된 것이며, 본 발명자들이 이러한 실시예들을 그들의 발명으로 고려하는 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 사용되는 값들 (예컨대, 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 확보하기 위하여 노력을 하였으나, 일부 실험적 오차 및 편차를 물론 고려하여야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부분은 중량 부(parts by weight)이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨이며, 실온은 약 25 ℃이고, 그리고 압력은 대기압 또는 그 부근이다.

실시예 1: 생물층 간섭계를 이용하여 단백질 기능에 있어서 거대분자 크라우딩의 영향 측정

분자 수준에서는 매우 복잡하지만, 적당히 높은 수준의 단백질 농도 (10g/L와 비슷하게)에서 관찰되는 이상성의 편차는 제 2 삼투 비리얼 계수로 통상적으로 표현될 수 있다 (Neal, B. L, Asthagiri, D. & Lenhoff, A. M. Molecular origins of osmotic second virial coefficients of proteins. Biophys J 75, 2469-2477, doi: 10.1016/S0006- 3495(98)77691 -X (1998)). 자가-비리얼 계수 (B₂₂) 및 교차-(B₂₃) 비리얼 계수는 차례로 단일 종과 다수 종 단백질이 함유된 용액에서 약한, 비-특이적 단백질-단백질 상호작용을 특성화시킨다. 다중-각도 정적 광 산란 (MALS)은 이상적인 한계에서 단백질을 비롯한 다양한 거대분자의 몰 질량을 결정할 수 있는 제 1 원리 분석 방법이다. 따라서, 정적 광 산란 방법은 일반적으로 순 상호작용 (단백질-단백질과 단백질-용질)을 반영하고, 몰 질량의 농도 의존성에서 용액의 모든 종에 대한 부피 효과를 배제하는 제 2 비리얼 계수 결정에 사용된다(Alford, J. R., Kendrick, B. S., Carpenter, J. F. & Randolph, T. W. Measurement of the second osmotic virial coefficient for protein solutions exhibiting monomer-dimer equilibrium. Analytical biochemistry 377, 128-133, doi:10.1016/j.ab.2008.03.032 (2008)). 조성-구배 다중-각도 광 산란(CG-MALS)에있어서, 이 광 산란 검출기는 필요에 따라, 각각 상이한 분자를 함유하는 최대 3 가지 상이한 용액을 동시에 주입할 수 있는 자동화된 주사기 펌프 시스템의 하류에 배치된다(Some, D., Kenrick, S. in Protein Interactions (ed Jianfeng Cai) (InTech, 2012)). 이러한 배취(batch) 모드에서 용액 내 모든 용질의 중량 평균-몰 질량이 결정되며, 제한된 사전 지식으로 결합 상호작용의 정량 분석을 제공할 수 있다. 단백질과 다른 거대분자 간의 특정 상호작용과 비-특이적 상호작용을 특성화하기 위해 CG-MALS의 몇 가지 구현이 개발되었다. 비-특이적 단백질-단백질 상호작용의 경우, 상기 CG-MALS 시스템은 단일 실험으로부터 자가-비리얼 계수 뿐만 아니라 교차-비리얼 항목(term) 모두를 추출해내는 장점을 갖는다. 이용된 잘-확립된 분석 알고리즘의 이용과 함께, 확고한 기술로 다양한 범위의 농도에 걸쳐 효율적이고, 비교적 간단하게 단백질 용액 내 상호작용을 특성화시킬 수 있다(Some, D., Pollastrini, J. & Cao, S. Characterizing Reversible Protein Association at Moderately High Concentration Via Composition-Gradient Static Light Scattering. J Pharm Sci 105, 2310-2318, doi:10.1016/j.xphs.2016.05.018 (2016)).

상기 CG-MALS 방법은 두 종 간의 비-특이적 상호작용의 정도 및 속성 결정에 매우 편리하지만; 그러나, 농도가 10g/L를 초과할 때 이러한 시스템에 대한 데이터 분석은 더 번거롭고, 정확도가 떨어지게된다. 이로 인해 농도 범위를 생리학적으로 관련된 농도로 확장시킬 수 있는 대체 방법을 찾게 되었으며, 특정 기능적 결합 사건에 대한 비-특이적 상호작용의 영향이 내포되도록 해당 연구를 확장할 수 있다. 생물층 간섭계 (BLI)는 동역학 및 결합 친화력 결정을 비롯한 특이적 거대분자 상호작용 측정을 위한 라벨-없는 광학 기술이다 (Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A. & Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical biochemistry 377, 209-217, doi:10.1016/j.ab.2008.03.035 (2008), Fang, Y., Li, G. & Ferrie, A. M. Non-invasive optical biosensor for assaying endogenous G protein-coupled receptors in adherent cells. Journal of pharmacological and toxicological methods 55, 314-322, doi:10.1016/j.vascn.2006.11.001 (2007), Rich, R. L. & Myszka, D. G. Survey of the year 2006 commercial optical biosensor literature. Journal of molecular recognition: JMR 20, 300-366, doi:10.1002/jmr.862 (2007)). BLI는 바이오센서 팁 (즉, 생물층)에 고정된 단백질 층 뿐만 아니라 내부 참조 층에서 반사된 백색광의 간섭 패턴을 분석한다. 결합 사건은 생체 층의 분자 수를 증가시켜 실-시간으로 모니터링할 수 있는 간섭 패턴의 변화를 생성시킨다. 이 방법은 그 중에서도 단백질-단백질 상호작용(Shah, N. B. & Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE, e51383, doi:10.3791/51383 (2014)), 단백질-리간드 상호작용 (Frenzel, D. & Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PloS one 9, e106882, doi: 10.1371/journal. pone.0106882 (2014)), protein-nucleic acid interactions (Park, S. et al. Structural Basis for Interaction of the Tandem Zinc Finger Domains of Human Muscleblind with Cognate RNA from Human Cardiac Troponin T. Biochemistry 56, 4154-4168, doi:10.1021/acs.biochem.7b00484 (2017), Sultana, A. & Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Current protocols in protein science 79, 19 25 11-26, doi: 10.1002/0471140864. ps1925s79 (2015)) 그리고 소-분자 및 펩티드 스크리닝 (Wartchow, C. A. et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of computer-aided molecular design 25, 669-676, doi: 10.1007/s10822-011-9439-8 (2011)) 평가에 이용되었다.

단순화된 시스템에서 이러한 원리를 입증하기 위해, 인간 혈청 알부민 (HSA)을 사용하여 과밀화된 용액에서 mAb:항원 상호작용에 있어서 비-특이적 상호작용의 영향을 측정하는 방법이 본원에 개시된다. 알부민은 35-50g/L의 생리적 농도 범위에서 혈청에서 부피 분율의 상당 부분을 구성하며, 생리학적 pH에서 음-전하를 띠는데 이것은 순 양-전하(또는 음-전하)를 갖는 바이오치료제 또는 용매 노출 표면과 정전기적 연합 (또는 반발)을 유발할 수 있다. 이를 위해, HSA와 동일한 항원에 결합하는 두 가지 재조합적 완전한 인간 IgG4 단일클론 항체(mAb1 및 mAb2) 간의 비-특이적 상호작용을 우선 CG-MALS를 이용하여 이원 시스템(HSA 및 mAb)에서 먼저 조사하였고, 그 다음 생물층 간섭계 (BLI)를 이용하여 삼원(ternary) 상호작용 (HSA, mAb, 항원)에서 조사하였다. 이들 mAb는 해당 항원의 상이한 에피토프를 표적으로 하는 상이한 상보성 결정 영역(CDR)을 제외하고 서열이 매우 유사하다. 상기 이원(binary) 시스템은 잘 확립된 광 산란 방법과 함께, 준-생리학적 단백질 농도에서 HSA와 mAbs 사이의 비-특이적 상호작용은 이온 강도-의존적일 뿐만 아니라 mAb-특이적이라는 것을 입증했다. mAbs의 기능적 특성에 대한 이러한 상호작용의 효과를 추가로 설명하기 위해, 비-표준 방식으로 BLI를 활용하여 낮은 농도에서부터 생리학적 HSA 농도에 이르기 까지 mAbs에 의한 항원 결합을 평가했다. 이러한 BLI 결과는 CG-MALS 데이터와 관련되며, 고-농도의 HSA 존재 하에 BLI의 신규한 용도는 매우 특이적, 기능적 상호작용 이를 테면, 항체:항원 결합에서 크라우딩으로 인하여 비-특이적 상호작용의 영향을 직접 평가할 수 있음이 입증된다. 본원에 제시된 결과는 혈청 내 고-농도의 HSA는 mAbs와의 비-특이적 상호작용을 유도하여, 항체 기능에 잠재적인 영향을 미친다는 것을 입증한다. 이 효과는 낮은 이온 강도에서 특히 명확하지만, 이러한 특정 mAb 세트의 생리적 이온 강도에서 경감되며; 그러나 이러한 경향이 반드시 다른 모든 mAb:항원 시스템으로 확장되는 것은 아니다. 바이오치료제 개발의 초기 단계에서 이 접근 방식을 활용하면, 비-특이적 상호작용의 효과를 쉽게 감지할 수 있고; 역으로, 이러한 유형의 조사는 생체 내에서 예상치 못한 결과에 대한 우려를 완화시킬 수도 있다. 본 발명자들은 단순하고 제어된 시스템에서 개작된(adapted) 분석과 함께 BLI 플랫폼을 사용하여 비-특이적 상호작용의 기능적 영향을 결정할 수 있음을 보여 주며, 더 복잡한 용액 안에서 거대분자 크라우딩 및 단백질 비-이상성이 나타날 수 있는 결과의 폭을 탐색하기 위한 단계 설정을 나타낼 수 있다.

재료 및 시약 준비: 본 연구에 사용된 모든 단일클론 항체는 연구 등급이며, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.의 전-임상 제조 및 공정 개발 부서(Tarrytown, NY)에서 생산되었다. 모든 항체는 완전한 인간 lgG4 분자이며, lgG1 힌지 서열을 재생성시켜 lgG4 이량체 형성을 안정화하기 위해 힌지 영역에 돌연변이 S108P를 함유하며, 중국 햄스터 난소 세포로부터 클로닝된 Regeneron의 독점 세포주에서 생산되었다. 동결건조된 인간 혈청 알부민 (HSA), Ficoll 70, 및 용액 성분들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 또는 VWR (Radnor, PA)에서 구입했으며, 이용가능한 최고 등급이었다.

단량체 HSA는 동결건조된 HSA를 10 mM NaCl이 보충된 인산염 완충액 (1.8 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HP0₄, 2.7 mM KCl, pH 7.4)에 용해시킴으로써 준비하였고, 동일한 완충액으로 평형화시킨 HiLoad 26/100 Superdex 200 크기-압출 컬럼 (GE Healthcare Little Chalfont, UK) 상에서 정제시켰다. 정제 후, HSA는 10 kDa 컷-오프 (Amicon, Billerica, MA) 원심분리 필터를 이용하여 ~100~130g/L 로 농축시켰다. 상기 항체는 CG-MALS 실험과 유사한 방식으로 준비되었다. HSA 농도는 UV_λ=_280nm 에서 35,700M^-1cm^-1 의 흡광 계수를 이용하여 SoloVPE 분광광도계로 측정되었다. BLI 측정을 위해, 고-농도 mAb 제형 (> 50g/L)을 10mM NaCl이 보충된 인산염 완충액에 희석시킴으로써 mAb의 스톡 용액 (1g/L)을 준비하였고, 평형 실험에서 40nM의 최종 농도로 사용되었다. 단백질 농도는 UV_λ=280nm 에서 mAb1의 경우 103,555 M^-1cm^-1 의 흡광 계수를, 그리고 mAb2의 경우 100,700 M^-1cm^-1 의 흡광 계수를 이용하여 결정되었다. 동결건조된 Ficoll 70를 10mM NaCl이 보충된 인산염 완충액에 용해시켜 Ficoll 70의 스톡 용액(600mM)이 준비되었고, 가용화를 촉진하기 위해 하룻밤 동안 부드럽게 회전시켰다. 상기 항원은 제작자의 라벨링 프로토콜에 따라 바이오틴-하이드라지드 (Thermo Fisher, Waltham, MA)로 바이오티닐화된다.

당단백질 항원은 제작자의 라벨링 프로토콜에 따라 바이오틴-하이드라지드 (Thermo Fisher, Waltham, MA)와 함께 단일 글리칸에서 바이오티닐화된다. 간략하게 설명하자면, 8g/L 메타-과아이오딘산염 용액 (Sigma-Aldrich)은 0.1 M 아세테이트 나트륨 pH 4.7을 이용하여 만들고, 호일 안에서 실온 15 분 동안 회전시킴으로써, 항원과 혼합시키고, 1 % (v/v) 글리세롤을 이용하여 켄칭시킨다. 산화된 항원을 0.1 M 인산나트륨염 pH 6.0에서 Superdex 75 Increase 10/300 컬럼 (GE Healthcare Little Chalfont, UK) 을 통하여 용출시켰다. 항원이 함유된 분획을 모으고, 농축시킨 다음, 10-배 몰 과량의 바이오틴-하이드라지드와 함께 실온에서 2 시간 동안 항온처리하였다. 라벨된 항원은 10 mM NaCl이 보충된 인산염 완충액, pH 7.4로 평형화시킨 동일 컬럼을 통하여 용출시켰다.

약한 양이온 교환 크로마토그래피: 약한 양이온 교환 크로마토그래피는 200 mM MES, 20 mM NaCl, pH 6.5으로 평형화된 ProPac WCX-10 (4 mm x 250 mm) 액체 크로마토그래피 컬럼 (Thermo Fisher) 상에서 수행되었다. 단백질을 깔끔하게 주사하고, 각 샘플 10 μg을 ACQUITY UPLC 시스템 (Waters, Milford, MA) 상의 컬럼에 0.5 mL/분의 유속으로 적용시켰다. 단백질 용출을 위해 20 ~ 500 mM NaCl 구배가 이용되었다.

조성 구배 다중-각도 광 산란 (CG-MALS): 모든 단백질은 적절한 완충액에 대해 밤새 투석되었고; 모든 완충액을 0.02μm 필터 통과시키고, 모든 단백질 샘플을 0.1μm Anotop 25 Plus 주사기 필터 (Whatman, Maidstone, UK)를 통과시키고, 사용 전 10 분 동안 ~25 Torr에서 진공 탈기했다. 초기 단백질 스톡 용액은 여과 전, 대략 10g/L로 희석되었다. miniDAWN TREOS MALS 광도계 및 Optilab T-rEX 인-라인 차등 굴절계 (Calypso system, 그리고 Wyatt Technology, Santa Barbara, CA의 두 검출기 모두)와 병용된 Calypso 조성 구배 시스템을 이용하여 구배-교차 계획을 이용하여 HSA, mAb, 및 이의 혼합물의 정적 광 산란 측정을 수집하였다. 간략하게 설명하자면, Calypso 펌프 시스템은 자동 희석 및 HSA를 1에서 10g/L 농도까지 1g/L증량되어 자동 주입(10회 주입, 또는 단계)되도록 프로그램되어 있다. 희석되지 않은 (10g/L) HSA를 주입할 때, 일련의 10회 주입에서 mAb의 농도가 10% 증가될 때 HSA 농도는 10% 감소된다 (해당 시간에 걸쳐 교차) 희석되지 않은 mAb (10g/L)를 주입한 후, 이의 농도는 일련의 9회 주십을 통하여 1g/L 증량으로 감소되었다. 이 농도는 생리학적 조건을 반영하지 않지만, 이것은 교차-비리얼 계수 결정을 위해 권장된 최대 최적 농도이다. 각 단계에서, 적절하게 희석된/혼합된 샘플의 2mL 볼루스(bolus)를 검출기 플로우 셀이 완전히 포화되도록 주입시켰고; 데이터는 후속 농도/혼합 단계 생성 및 주입 중단(quiescent) 상태에서 90초 동안 수집되었다. 기선 측정은 구배 프로그램 직전과 직후에 얻었다. 유의적인 각도-의존적 광 산란이 부족함을 확인한 후, 오로지 90^'' 광 산란 검출기의 데이터만 분석에 사용되었다. 기기 제어, 데이터 수집 및 데이터 분석 (Some, D., Kenrick, S. in Protein Interactions (ed Jianfeng Cai) (InTech, 2012), Some, D. Light-scattering-based analysis of biomolecular interactions. Biophys Rev 5, 147-158, doi:10.1007/s12551-013-0107-1 (2013))은 모두 Calypso 소프트웨어 (Wyatt Technology)를 이용하여 수행되었다.

생물층 간섭계: 생물층 간섭계 테스트는 Octet Red96를 이용하여 바이오센서 팁 (ForteBio, Menlo Park, CA) 상에 피복된 스트렙타아비딘 (SA, 카달로그 번호 18-5019) 또는 항-인간 IgG Fc 포획 (AHC, 카달로그 번호 18-5064)와 함께 수행되었다. 96-웰 플레이트에 200 μL 용액 (완충액, 항원, HSA, 또는 mAb)을 채우고, 1,000 rpm에서 교반시키고, 모든 실험에서 온도는 25 ℃로 제어되었다. 용액의 증발로 인해 더 높은 온도를 피했다. 모든 테스트에서, SA 또는 항-인간 Fc 팁은 낮은 (10 mM NaCl) 또는 생리학적 (137 mM NaCl) 염 농도가 보충된 인산염 완충액, pH 7.4에서 실온에서 20분 동안 수화되었다. 기재된 모든 완충액 및 샘플 용액에는 달리 명시되지 않는 한 0.1g/L의 HSA가 함유되었다. 분석물이 없는 상태에서 완충액에 팁을 담구어 기선을 추출했다.

항체-로딩된 팁에 대한 항원 결합을 측정하는 표준 실험은 AHC 팁을 이용하여 수행했다. 0.1g/L의 HSA이 보충된 낮은 또는 생리학적 염 농도를 함유하는 인산염 완충액에서 2 분 동안 AHC 팁의 기선 측정 후, 해당 팁을 2.5 μg/mL의 항체에 항온처리하여 ~ 0.6 nm 응답을 얻었다. 그 다음, 항체-로딩된 팁을 완충액에 담구어 2 분 동안 과량의 mAb를 제거하였고, 이어서 다양한 농도, 전형적으로 2.5-50 nM의 라벨안된 항원과 100-300초의 연합 단계가 이어졌다. 해리 단계에서는 상기 팁을 완충액에 750초 동안 담구었다. 두 mAb 모두에 대해 10 mM 및 137 mM NaCl에서 바이오티닐화된 항원에 대해 동일한 절차를 밟았다.

SA 팁을 이용하여 항원-로딩된 팁에 대한 항체 결합을 측정하는 표준 결합 테스트를 수행했다. 0.1g/L의 HSA을 함유하는 낮은 또는 생리학적 염 인산염 완충액 용액에서 SA 팁에 대해 2분 동안 기선 측정 후, 상기 팁을 5 μg/mL의 바이오티닐화된 항원에 항온처리하여 ~ 0.6 nm 응답을 얻었다. 그 다음, 항체-로딩된 팁을 완충액에 담구어 2 분 동안 과량의 항원을 제거하였고, 이어서 다양한 농도, 전형적으로 2.5-50 nM의 라벨안된 항원과 900 초의 연합 단계가 이어졌다. 해리 단계에서는 상기 팁을 완충액에 1800-3600초 동안 담구었다. 두 mAb 모두에 대해 10 mM 및 137 mM NaCl에서 동일한 절차를 밟았다.

최대 50g/L의 HSA의 존재 하에서 항원에 결합하는 mAb의 정상 상태(steady state) 분석을 위해 HSA에서 추가 항온처리 단계가 요구되었다. 항원 로딩 후, 센서를 ~ 15 분 동안 평형을 위해 0.1-50g/L의 HSA를 함유하는 웰에 담근 다음, HSA 항온처리시 신호가 약간 증가하기 때문에, 새로운 기선을 설정하기 위해 동일한 조성을 갖는 신선한 용액에서 2 분 항온처리한다 (도 7, 단계 B 참고). 그 다음 센서를 두 번째 연합 단계로써 20 분 동안 40 nM mAb + 0.1-50g/L의 HSA를 함유하는 웰에 담구었다. 모든 평형 실험의 경우, 항원 연합 단계에 대한 mAb 결합 완료시 신호 응답 (nm)을 계량(metric)으로 사용했다. HSA > 0.1g/L 존재 하에서 mAb:항원 결합을 측정하는 임의의 실험에서 운동 분석은 수행되지 않았다. 데이터는 각 HSA 농도에서 얻은 미가공 응답(nm)을 0.1g/L의 HSA에서의 mAb:항원 결합의 미가공 응답으로 나눔으로써 1.0으로 정규화되었다. 모든 실험은 세 번 수행되었다. 각 조건에서 JMP 소프트웨어 (SAS Institute, Cary, NC)를 사용하여 일원-분산 분석 (ANOVA)을 수행함으로써, mAb1과 mAb2 간의 차이가 p-값 결정을 통해 통계적으로 유의적인지 여부를 평가했다.

Ficoll 70을 함유하는 실험은 HSA를 Ficoll 70으로 대체하여 유사한 방식으로 수행되었다. 200g/L의 Ficoll 70 또는 그 이상을 함유하는 실험의 경우, 평형을 얻기 위해 증가된 점도로 인해 항원에 대한 mAb 결합을 위해 더 긴 연합 시간 (~1.7-3 시간)이 필요했다.

mAb1/HSA 및 mAb2/HSA 비-특이적 상호작용의 이온 강도 의존성 : 상이한 이온 강도에서 HSA와 각 mAb 간의 비-특이적 상호작용은 교차-비리얼 계수 (CVC) 결정을 위한 잘-확립된 접근법인 조성-구배 다중-각도 광 산란 (CG-MALS)을 이용하여 검사하였다. 이 접근법은 데이터를 가장 잘 해석하기 위해, BLI로 분석하기 전에 HSA와 mAb 간의 비-특이적 상호작용의 정도와 속성의 결정에 적용되었다. 몇몇 연구자들은 엄격한 열역학적 원리에 기초하여, 정적 광 산란으로부터 결정된 바이리얼 계수가 순수한 자가- 또는 교차-상호작용 매개 변수가 아니라, 단백질:공-용매 (즉, 완충액 또는 전해질) 상호작용이 뒤엉켜 있다고 지적했다(Alford, J. R., Kendrick, B. S., Carpenter, J. F. & Randolph, T. W. Measurement of the second osmotic virial coefficient for protein solutions exhibiting monomer-dimer equilibrium. Analytical biochemistry 377, 128-133, doi:10.1016/j.ab.2008.03.032 (2008), Deszczynski, M., Harding, S. E. & Winzor, D. J. Negative second virial coefficients as predictors of protein crystal growth: evidence from sedimentation equilibrium studies that refutes the designation of those light scattering parameters as osmotic virial coefficients. Biophys Chem 120, 106-113, doi: 10.1016/j.bpc.2005.10.003 (2006), Winzor, D. J., Deszczynski, M., Harding, S. E. & Wills, P. R. Nonequivalence of second virial coefficients from sedimentation equilibrium and static light scattering studies of protein solutions. Biophys Chem 128, 46-55, doi:10.1016/j.bpc.2007.03.001 (2007)). 따라서, 몰(molal) 조건(B₂₂)과 구별하기 위해, 광 산란 분석에서 비리얼 계수를 A₂로 언급하는 것이 바람직한 관례이다. 단백질이 고도로 하전되지 않고, 공-용질이 단순한 완충액과 전해질인 경우, A₂ (여기에 사용됨)와 B₂₂ 사이의 수치적 차이는 최소화된다. 마찬가지로, 광 산란 측정의 CVC 또는 A₂₃은 두 종 간의 비-특이적 상호작용의 속성과 정도를 나타내는 지표이며, 10-750 mM NaCl을 함유하는 완충 용액에서 mAb1/HSA 및 mAb2/HSA 상호작용에 대해 측정되었다(도 1). A₂₃의 음수 값은 두 종 간의 유인력을 나타내고, 양수 값은 반발력을 나타낸다. 10mM NaCl의 농도에서 mAb1/HSA와 mAb2/HSA는 모두 유인력을 보였으며, mAb2/HSA에 비해 mAb1/HSA간에 더 강한 힘이 관찰되었다. 이 현상은 이온 강도가 증가함에 따라 완화되었다. 생리학적 이온 강도 (~137 mM NaCl)에서, mAb1과 HSA 간의 비-특이적 상호작용은 약간 유인성인 반면, mAb2와 HSA 간의 비-특이적 상호작용은 약간 반발성이었다. 이로써 HSA와의 비-특이적 상호작용은 이온-강도 의존성 및 mAb-의존성을 보여준다. 이들 상호작용에서 정전기의 역할을 결정하기 위해, 이들 분자는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 평가되었다.

크로마토그래피 방법에서 mAb1과 mAb2는 상이한 표면 성질을 갖는다는 것을 보여준다. mAb1 및 mAb2의 표면 성질을 조사하여, HSA와의 서로 다른 정도의 비-특이적 상호작용이 분자들 간의 장-거리(long range) 전하-전하 상호작용에 의해 유도될 수 있는지 여부를 결정했다. 후속적으로, 약한 양이온 교환 크로마토그래피를 실행하여, 두 mAb의 표면 성질을 더 구체적으로 평가했다. 이들 실험에서 mAb1의 정체 시간 (~13 분)은 mAb2의 정체 시간 (~6 분)보다 더 길었고, 이는 하전된 컬럼 수지와 더 강한 상호작용을 나타낸다 (도 2). 유사하게, HSA에 대한 크로마토그래피 프로파일이 평가되었으며, 이는 두 mAb와 비교하여 매우 낮은 정체 시간 (~ 2 분)에서 용출됨으로써, 산성이 더 강한 표면 전하를 나타낸다. 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용한 mAbs의 평가는 용출 부피에서 최소한의 차이를 보였으며 (데이터는 표시되지 않음), 이는 mAbs와 HSA 간의 비-특이적 상호작용의 차이가 소수성 상호작용 때문이 아니라 본질적으로 정전기적일 가능성이 있음을 나타낸다. 함께, 이러한 데이터는 각 mAb의 표면 성질이 HSA와의 비-특이적 상호작용의 정도와 속성에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여준다. 이러한 상호작용을 더 평가하기 위해, 뿐만 아니라 mAbs에서 기능적 성질에 있어서 이러한 영향을 더 평가하기 위해, HSA 존재 및 부재 하에서 항원에 대한 mAbs의 결합 친화력을 검사하기 위해 생물층 간섭계가 이용되었다.

생물층 간섭계를 이용하여 두 mAb는 바이오티닐화된 항원에 유사한 결합 친화력으로 결합한다: 2 개의 mAb의 결합 성질에 대한 HSA의 생리학적 관련 수준의 효과를 평가하기 위해, 생물층 간섭계 (BLI)를 사용하여 이들의 공통 항원에 대한 당해 mAb의 연합을 모니터링했다. 상기 시스템 및 시약을 테스트하기 위해, 표준 친화력 측정 실험을 항-인간 IgG Fc 포획 (AHC) 바이오센서 팁을 이용하여 실행하였는데, 이 팁에 mAb1 또는 mAb2를 로딩하고, 낮은 염 조건과 생리학적 염 조건 모두에서 변형안된 항원 또는 바이오티닐화된 항원과의 항원 결합을 측정하였다(도 8A-8H). 이들 실험의 데이터는 표 1에 요약되어 있으며, k_on, k_0ff, 및 K_D에 있어서 기존의 생성된 Biacore 표면 플라즈몬 공명(SPR) 데이터(데이터는 표시되지 않음)와 상당한 유사성을 보여준다.

항원-로딩된 바이오센서 팁을 이용한 표준 항원항체결합력(avidity) 측정 실험을 실행하여 항체 결합을 탐지했다. 이를 위해, 상기 항원은 부위-특이적으로 바이오티닐화되었으며, 그리고 스트렙타아비딘-피복된 바이오센서 팁 상에 로딩되었다. mAb보다 작은 항원을 고정시킴으로써, 항체 결합으로 인한 응답 (nm 단위)에서의 변화는 더 뚜렷한 신호를 제공하고, 따라서 잡음에 대한 신호가 개선되었다. 도 3은 이상적인 용액 조건 하에서 각 mAb에 대한 결합 친화력을 결정하기 위해 수행된 표준 BLI 테스트의 결과를 보여준다. 느린 해리 동역학은 겉보기(apparent) K_D의 정확한 추정하지 못하지만, 단단한 결합은 나노몰-하위 기능적 결합 활성을 나타내고, 이는 Biacore SPR 데이터 (표시되지 않음)와 일치한다.

이상적인 용액 및 실험 조건 하에서 실행된 동역학 결합 테스트는 기존의 실행된 Biacore SPR 연구 (데이터 표시되지 않음)와 일치되는 결과를 만들었으며, 준비된 시약이 완전히 활성임이 확인되었으며, 바이오티닐화된 항원에 mAb 결합은 높은, 생리학적으로 관련 농도의 HSA 존재 하에서 검사되었다. 신호의 증가 및 감소의 모니터링이 가능하며, 대략적으로 생리학적 투여량인 ~550 nM보다는 상당히 더 낮은 40nM 농도의 mAb에서 항원에 대한 결합의 응답 수준으로 인하여, 이 농도는 모든 후속 실험에서 선택되었다.

항원에 대한 mAb 결합에 있어서 HSA의 전반적인 효과는 이온-강도 의존적이며, mAb-특이적이다: mAb-항원 결합에 있어서 HSA 효과를 조사하기 위해, 비-이상적인 용액 조건 하에서 BLI 테스트를 이용하여, 정상 상태(steady state), 종점-데이터를 분석했다. 각 mAb와의 긴 (20 분) 연합 단계 후 정상 상태(steady state) 응답 (nm) 수준을 모니터링함으로써, 평형 또는 거의 평형 상태에서 HSA의 존재 하에 수득된 항원에 대한 결합 수준을 결정했다. HSA 농도 증가로 부여된 항원항체결합력 포멧 및 추가된 복잡성으로 인해 동역학 (결합 및 해리-속도) 분석은 수행되지 않았다. HSA가 항원과 상호작용하지 않는다는 것을 입증하기 위해, 항체 부재 하에서 오로지 HSA만으로 대조군을 수행했다 (데이터는 표시되지 않음). 도 4는 10 mM 또는 137 mM NaCl에서 10g/L의 HSA 존재 하에서 그리고 부재 하에서 mAb1 및 mAb2에 대한 센서그램을 보여준다. 이러한 데이터는 HSA의 효과가 두 mAb에 대한 두 가지 이온 강도 조건에서 갖는 차이를 정성적으로 보여 주는데, HSA와 mAb 상호작용의 이온 강도 의존성과 차이를 모두 입증한다. 저-염에서, HSA의 효과는 mAb2 보다는 mAb1에서 더 크고, 이는 HSA 추가 시 응답의 차이를 반영한 것이다. 생리학적 염에서, 어느 mAb 이건 간에 항원과의 상호작용에 있어서 10g/L의 HSA 효과는 최소이다. 이들 결과는 위에서 설명한 CG-MALS 데이터와 관련이 있으며, mAbs의 기능적 성질에 대한 잠재적인 영향을 나타낸다.

HSA 농도 증가의 효과는 저-염 및 생리학적염 조건에서 추가 입증되는데 (도 5), 여기에서 다양한 HSA 농도의 평형 상태에서 응답 수준은 0.1g/L의 HSA 수준으로 정규화되었다. 10 mM NaCl에서, mAb2는 HSA 농도가 증가함에 따라 응답이 완만하게 (~20%) 감소되었으며(즉, 항원 결합의 감소), 한편 mAb1는 좀더 극적인 감소 (~40%; 도 5A, 표 2)를 나타냈다. 137 mM NaCl에서, 두 mAb는 20g/L 이하의 HSA 농도에서 항원 결합이 완만하게 증가됨을 보여주었고, 더 높은 HSA 농도에서 항원 결합에 대한 HSA의 효과는 mAb2와 비교하여 mAb1에서 더 크다 (도 5B, 표 3). HSA 부재 시 mAb 결합의 응답과 비교하였을 때(도 5B에서 점선으로 나타냄), mAb1에 대한 신호는 ~10% 감소된 반면, mAb2에 대한 신호는 생리학적 HSA 범위 (35-50g/L, 표 4)에서 ~6% 향상되었다. 관찰된 결합 사건은 항원 결합에 특이적이었고; 이 항원에 결합하지 않는 대조군 mAb (mAb3)는 0.1 내지 50g/L의 HSA 존재 하에서 신호 또는 결합의 증가를 나타내지 않았다 (도 9).

크라우딩 제제 Ficoll 70은 항원에 대한 mAb 결합에 있어서 동일한 효과를 만들지 않는다: mAb/항원 결합에 있어서 HSA의 관찰된 효과가 mAb와 HSA 사이의 비-특이적 상호작용에 기여할 수 있는지, 또는 보다 일반적인 거대분자 크라우딩 효과에 기여할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 항원에 대한 mAb 결합을 대등한 농도의 Ficoll 70 (크라우딩 에이전트로 자주 사용되는 가용성 다당류임) 존재 하에 평가했다(Zhou, H. X., Rivas, G. & Minton, A. P. Macromolecular crowding and confinement: biochemical, biophysical, and potential physiological consequences. Annu Rev Biophys 37, 375-397, doi:10.1146/annurev.biophys.37.032807.125817 (2008)). Ficoll 70은 단백질과 특이적으로 상호작용하지 않는 무색의, ~ 70kDa 중합체다. HSA 실험에 사용된 것과 대등한 Ficoll 70 농도 (0-50g/L, 도 6)에서 10 및 137 mM NaCl에서 항원에 결합하는 mAb1 및 mAb2의 정규화된 응답에서 변화는 전혀 없거나, 거의 관찰되지 않았다. 결합은 또한 크라우딩 연구에 사용된 것보다 더 대표적인 Ficoll 70 농도 (100-300g/L, 도 6)에서 평가되었다. 예상대로, 이러한 농도의 Ficoll 70, 특히 mAb1의 경우 항원에 결합하는 mAb의 느린 동역학은 거의 평형 반응 수준을 달성하기 위해 연합 단계의 연장을 필요로 했다 (전체 시간은 웰 용액의 증발을 방지하기 위해 ~ 3 시간까지로 제한되었다; 도 6C 및 6D). 낮은 농도와 생리학적 염 농도 모두에 있어서, 모든 Ficoll 농도에 대해 항원 결합에 있어서 최소한의, 그리고 매우 유사한 효과가 관찰되었다. 이러한 데이터는 HSA로 관찰된 항원 결합에 대한 효과가 배제된 부피 효과에 의한 보다 일반적인 현상이라기 보다는 HSA와 mAb 간의 정전기 상호작용 때문일 가능성이 있음을 시사한다.

거대분자 크라우딩은 생물계에서 어디에나 존재한다. 과밀화된 용액에서 단백질 간의 발생된 비-이상적인 상호작용은 단백질 거동 및 기능에 상당히 영향을 미치는 것으로 예상된다 (Minton, A. P. The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media. The Journal of biological chemistry 276, 10577-10580, doi: 10.1074/jbc.R100005200 (2001), Hu, Z., Jiang, J. & Rajagopalan, R. Effects of macromolecular crowding on biochemical reaction equilibria: a molecular thermodynamic perspective. Biophys J 93, 1464-1473, doi: 10.1529/biophysj.107.104646 (2007), Wei, J., Dobnikar, J., Curk, T. & Song, F. The Effect of Attractive Interactions and Macromolecular Crowding on Crystallins Association. PloS one 11, e0151159, doi:10.1371/journal. pone.0151159 (2016)). 여러 보고서(Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. & Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. Int J Mol Sci 15, 23090-23140, doi:10.3390/ijms151223090 (2014), Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol 10, 34-39 (2000))에서 다양한 결론에 의해 입증된 것처럼, 이러한 상당한 비-선형 효과의 특이적 성질은 대개 예측하기 어렵다. 서로 다른 거대분자 크라우딩 제제를 사용한 한정된 수의 연구들은 평형 상수와 반응 속도에 대해 상당한 결과(몇 로그 크기로)를 보여주었다 (Minton, A. P. The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media. The Journal of biological chemistry 276, 10577-10580, doi:10.1074/jbc.R100005200 (2001), Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K. & Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. Int J Mol Sci 15, 23090-23140, doi:10.3390/ijms151223090 (2014), Minton, A. P. Molecular crowding: analysis of effects of high concentrations of inert cosolutes on biochemical equilibria and rates in terms of volume exclusion. Methods Enzymol 295, 127-149 (1998), Kim, J. S. & Yethiraj, A. Effect of macromolecular crowding on reaction rates: a computational and theoretical study. Biophys J 96, 1333-1340, doi: 10.1016/j.bpj.2008.11.030 (2009), Jiao, M., Li, H. T., Chen, J., Minton, A. P. & Liang, Y. Attractive protein-polymer interactions markedly alter the effect of macromolecular crowding on protein association equilibria. Biophys J 99, 914-923, doi: 10.1016/j.bpj.2010.05.013 (2010)). 함께, 이것은 생리적 환경을 밀접하게 복제하는 조건에서 비-이상성의 영향에 대한 정보를 쉽게 제공할 수 있는 기술의 필요성을 강조한다. 여기에서, CG-MALS 및 BLI의 두 가지 상보적 기술을 사용하여 알부민의 생리적 농도가 단일 클론 항체 기능에 어떻게 영향을 미치는지 조사했다. 두 종 간의 교차-비리얼 계수를 측정할 수 있는 강력하고, 잘-확립된 도구인 CG-MALS를 사용하여 시스템에서 비-특이적 상호작용에 대한 기초적인 이해를 구하였다. 그런 다음, BLI 방법을 사용하여 비-이상적인 용액 조건에 적합한 정상 상태(steady-state) 분석을 사용하여, 먼저 CG-MALS 결과를 복제한 다음, HSA의 생리적 농도 하에서 항원 결합의 평형 측정을 수행함으로써, 이러한 관찰을 확장시켰다. 직교 방법(orthogonal methods) 이를 테면, 형광 탐지와 함께 AUC는 비-이상적인 조건 하에서 특이적 상호작용을 측정할 수 있다 (Wright, R. T., Hayes, D. B., Stafford, W. F., Sherwood, P. J. & Correia, J. J. Characterization of therapeutic antibodies in the presence of human serum proteins by AU-FDS analytical ultracentrifugation. Analytical biochemistry 550, 72-83, doi:10.1016/j.ab.2018.04.002 (2018), Wright, R. T., Hayes, D., Sherwood, P. J., Stafford, W. F. & Correia, J. J. AUC measurements of diffusion coefficients of monoclonal antibodies in the presence of human serum proteins. Eur Biophys J, doi:10.1007/s00249-018-1319-x (2018)), BLI는 고유한 유연성으로 결합 상호작용을 평가하여 고-농도의 크라우딩 제제에서 많은 상이한 조건을 테스트하는 편리하고, 고-처리량 방법으로 유용하고, 그리고 소규모 실험 세트에서 다양한 환경에서의 결합에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이 접근법은 발견 연구 초기에 스크리닝 프로세스 동안 고려 사항에서 mAbs 또는 기타 분자의 제거가 쉽고 효율적이다.

상이한 단백질에 의해 제시된 용매-접근가능한 표면 영역의 물리화학적 복잡성은 비-특이적 거대분자 상호작용의 다양성에서 근본적인 역할을 한다. 배제된 부피 효과가 덜 현저한 중간 수준의 단백질 농도 (≤10g/L)에서 정전기가 지배적인 분자간 힘일 수 있다 (Elcock, A. H. & McCammon, J. A. Calculation of weak protein-protein interactions: the pH dependence of the second virial coefficient. Biophys J 80, 613-625, doi:10.1016/S0006-3495(01)76042-0 (2001)). 이 개념과 일치하여, 실험적으로 관찰된 서로 다른 기본 등전점 (~0.65 pH 단위로 상이함)을 가진 mAb1과 mAb2는 모두 CG-MALS를 사용하여 산성 등전점을 가진 HSA와 상호작용하는 것으로 나타났다. 이는 특이적 상호작용이 아니라, HSA와 각 항체 간의 비-특이적 상호작용이다. 두 항체의 경우, HSA와의 상호작용의 크기는 이온 강도가 증가함에 따라 완화되는 것으로 나타났으며, 이는 또한 이온 강도가 증가함에 따라 정전기 상호작용이 효과적으로 스크리닝될 수 있기 때문에, 이들 분자 간의 주요 힘이 정전기임을 암시한다(Roberts, D. et al. Specific ion and buffer effects on protein-protein interactions of a monoclonal antibody. Mol Pharm 12, 179-193, doi:10.1021/mp500533c (2015); Roberts, D. et al. The role of electrostatics in protein-protein interactions of a monoclonal antibody. Mol Pharm 11, 2475-2489, doi:10.1021/mp5002334 (2014)). 흥미롭게도, 거의 생리적 이온 강도에 가까운 mAb1은 HSA와의 유인성 상호작용을 계속해서 나타내었고, mAb2는 HSA와 약간의 반발성 상호작용을 나타냈다. CG-MALS에 사용된 2-성분 시스템은 생리적 조건의 복잡성을 완전히 반영하지 않고, 기술적 이유 때문에 생리적 농도보다 낮은 농도를 사용하지만, 이 분석은 단백질 간의 비-특이적 상호작용의 정도와 속성이 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다. 항체는 CDR에서만 상이하기 때문에, HSA와의 약한 상호작용의 차이가 이 영역에서 발생할 가능성이 있다. 더욱이, 이러한 비-특이적 상호작용은 단백질 의존적이며, 이는 생리학적 환경에서 광범위한 기능적 거동 및 구조적 거동에 대한 잠재력을 나타내며, 시험관내 결과와 약동학적 그리고 임상 결과 간에 관찰되는 간헐적인 차이를 설명할 수 있다. 합성 및 단백질 클라우더의 분자 역학 시뮬레이션에서 생물학적 네트워크 내 단백질의 구조, 역학 및 상호작용에 있어서 크라우딩의 효과가 기능성에 영향을 줄 수 있는 일시적인 상호작용을 촉진시킬 수 있음을 보여주었다(Candotti, M. & Orozco, M. The Differential Response of Proteins to Macromolecular Crowding. PLoS Comput Biol 12, e1005040, doi: 10.1371/journal. pcbi.1005040 (2016)). 실제로, 진화적인 압박이 비-특이적 단백질-단백질 상호작용을 최소화시키고, 단백질 뒤범벅(promiscuity)에 대한 복잡성 및 가능성을 줄인다는 가설이 세워졌다 (Johnson, M. E. & Hummer, G. Nonspecific binding limits the number of proteins in a cell and shapes their interaction networks. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 603-608, doi: 10.1073/pnas.1010954108 (2011), Deeds, E. J., Ashenberg, O., Gerardin, J. & Shakhnovich, E. I. Robust protein protein interactions in crowded cellular environments. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 14952-14957, doi:10.1073/pnas.0702766104 (2007)). 또한, 몇몇 무관한 연구들에서 정전기가 비-특이적 상호작용의 주요 동인임이 암시된다 (Elcock, A. H. Prediction of functionally important residues based solely on the computed energetics of protein structure. J Mol Biol 312, 885-896, doi: 10.1006/jmbi.2001.5009 (2001), Zhang, Z., Witham, S. & Alexov, E. On the role of electrostatics in protein- protein interactions. Phys Biol 8, 035001, doi: 10.1088/1478-3975/8/3/035001 (2011), Gunasekaran, K. et al. Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects: applications to bispecific molecules and monovalent IgG. The Journal of biological chemistry 285, 19637-19646, doi: 10.1074/jbc.M 110.117382 (2010), Persson, B. A., Jonsson, B. & Lund, M. Enhanced protein steering: cooperative electrostatic and van der Waals forces in antigen-antibody complexes. J Phys Chem B 113, 10459-10464, doi:10.1021/jp904541g (2009), Wlodek, S. T., Shen, T. & McCammon, J. A. Electrostatic steering of substrate to acetylcholinesterase: analysis of field fluctuations. Biopolymers 53, 265-271, doi:10.1002/(SICI)1097-0282(200003)53:3<265::AID-BIP6>3.0.CO;2-N (2000)). 여기에 제시된 CG-MALS 및 크로마토그래피 데이터는 이러한 연구에서 더욱 확장되어, 단백질의 표면 전하 성질및 이러한 전하로 인해 발생하는 정전기 상호작용의 잠재적 효과를 이해하는 것의 중요성을 강조하고, 본원에서 비-특이적 상호작용, 이를 테면 항체:항원 결합 사건에 영향을 미칠 수 있음이 입증되었다.

미세유체공학(microfluidics)보다는 딥 앤 리드 디자인(dip and read design)을 활용하는 생물층 간섭계는 항체:항원 결합과 같은 고도의 특이적인 기능적 상호작용에 있어서 높은 용질 농도에 의해 유도된 비-특이적 상호작용의 영향 연구에 더 좋다. 항원을 고정시키고, 농도를 증가시키는 HSA를 함유하는 mAb 용액을 사용함으로써, 본 발명자들은 CG-MALS에 사용된 조건을 확장시킬 수 있고, 증가된 HAS 농도를 검사하고, 이 방법을 사용하여 비록 항원항체결합-기반 포멧에서라도 3-원 상호작용 시스템을 확립할 수 있다. 중요한 것은, 항원 결합에 대한 생리학적 HSA 농도의 영향은 낮은 이온 강도에서 mAb2보다 mAb1에 대해 더 큰 것으로 나타났지만, 반면 생리적 염 수준에서는 HSA의 효과가 상당히 감소한 것으로 나타났다. 생리학적 이온 강도에서 mAb들 간의 차이의 크기는 10mM 염에서 관찰된 것보다 상당히 작지만, 복제내에서 정밀도를 고려할 때 20g/L 및 그 이상에서 통계적으로 의미가 있다. 용액 증발에 대한 현재의 기술적 문제로 개발 중에 있는 생리적 온도가 아닌 주변 온도에서 BLI 테스트를 필요로 하지만, 본원에서 설명된 BLI 접근법이 기술적 문제로 인해 주변 온도에서 수행되었던 광 산란 방법의 데이터를 복제하고 확장시킬 수 있음을 분명히 암시한다. 더욱이, 낮은 이온 강도에서 CG-MALS에 의해 관찰된 비-특이적 상호작용은 실제로 항체:항원 상호작용에 기능적 영향을 미치며, 이 효과는 적당한 HAS 농도에서 안정된 것으로 보이며; 예를 들어, 50g/L의 HSA는 35g/L의 경우보다 결합에 대해 눈에 띄게 큰 영향을 미치지 않는다. 이것이 대부분의 치료용 mAbs 또는 다른 바이오치료제에 대한 일반적인 추세인지 여부는 불분명하며, 지속적인 조사가 필요하다. 혈청에서 이들의 고유 비정제 항원과 연합되는 mAbs를 테스트하는 해당 바이오센서 플랫폼 KinExA를 이용하여 실행된 연구(Bee, C., Abdiche, Y. N., Pons, J. & Rajpal, A. Determining the binding affinity of therapeutic monoclonal antibodies towards their native unpurified antigens in human serum. PloS one 8, e80501, doi: 10.1371/journal. pone.0080501 (2013))에서 일부 mAbs가 완충액 또는 혈청에서 동일한 겉보기 친화력을 나타내는 반면, 다른 것들은 겉보기 친화력에서 차이를 나타냄을 보여주었다. 이러한 결과들은 단백질 공동-용질에 의해 매개되는 거대분자 크라우딩에 대한 우리의 이해를 더욱. 리소자임, RNase A, 알부민 및 재구성된 대장균(E. coli) 시토졸을 비롯한 여러 단백질이 거대분자 크라우딩 제제로 사용되었는데, 종종 대조적인 결과가 보여주었다. 예를 들면, 아포-미오글로빈의 자가-연합은 과밀화된 RNase A 용액에서는 강화되었지만, 과밀화된 HSA 용액에서는 그렇지 않았다 (Zorrilla, S., Rivas, G., Acuna, A. U. & Lillo, M. P. Protein self-association in crowded protein solutions: a time-resolved fluorescence polarization study. Protein Sci 13, 2960-2969, doi: 10.1110/ps.04809404 (2004)). 반대로, GB1의 A34F 돌연변이체의 이량체화는 100g/L의 BSA로 강화되었고, 50g/L의 리소자임에서 감소했다(Kyne, C. & Crowley, P. B. Short Arginine Motifs Drive Protein Stickiness in the Escherichia coli Cytoplasm. Biochemistry 56, 5026-5032, doi:10.1021/acs.biochem.7b00731 (2017)). 상기 저자들은 A34F와 비교하였을 때 전하 상태의 차이를 해리 상수에서 관찰된 차이의 주요 동인으로 지적한다. 더욱이, 농축된 BSA/SH3 도메인 용액에서 약한 이종성-상호작용은 용액 점도에 대해 예상되는 것보다 훨씬 웃도는 두 단백질의 병진적 확산(translational diffusion)을 보였다(Rothe, M. et al. Transient binding accounts for apparent violation of the generalized Stokes- Einstein relation in crowded protein solutions. Phys Chem Chem Phys 18, 18006-18014, doi: 10.1039/c6cp01056c (2016)). 이것은 병진적 확산에 필적하거나 또는 더 빠른 시간 척도에서 일시적인 결합 사건으로부터 기인될 수 있다. 여기에 제시된 결과와 함께, 일시적 상호작용이 항체:항원 결합 사건과 같은 고친화력 (nM-pM) 상호작용에도 영향을 미칠 수 있음이 분명하다.

합성 중합체 이를 테면, PEG, 덱스트란, 또는 Ficoll은 빈번하게 크라우딩 제제로 이용되지만; 그러나, 조사의 목적은 전형적으로 단백질 폴딩 또는 안정성이다 (Candotti, M. & Orozco, M. The Differential Response of Proteins to Macromolecular Crowding. PLoS Comput Biol 12, e1005040, doi:10.1371/journal.pcbi.1005040 (2016), McGuffee, S. R. & Elcock, A. H. Diffusion, crowding & protein stability in a dynamic molecular model of the bacterial cytoplasm. PLoS Comput Biol 6, e1000694, doi:10.1371/journal. pcbi.1000694 (2010), Mittal, S. & Singh, L. R. Denatured state structural property determines protein stabilization by macromolecular crowding: a thermodynamic and structural approach. PloS one 8, e78936, doi:10.1371/journal. pone.0078936 (2013), Zhou, H. X. Polymer crowders and protein crowders act similarly on protein folding stability. FEBS Lett 587, 394-397, doi:10.1016/j.febslet.2013.01.030 (2013), Batra, J., Xu, K., Qin, S. & Zhou, H. X. Effect of macromolecular crowding on protein binding stability: modest stabilization and significant biological consequences. Biophys J 97, 906-911, doi:10.1016/j.bpj.2009.05.032 (2009), Senske, M. et al. Protein stabilization by macromolecular crowding through enthalpy rather than entropy. J Am Chem Soc 136, 9036-9041, doi:10.1021/ja503205y (2014), Hong, J. & Gierasch, L. M. Macromolecular crowding remodels the energy landscape of a protein by favoring a more compact unfolded state. J Am Chem Soc 132, 10445-10452, doi:10.1021/ja103166y (2010)). 고분자가 이종성 단백질-단백질 상호작용에 미치는 영향에 대한 연구는 상대적으로 거의 발표되지 않았다(Candotti, M. & Orozco, M. The Differential Response of Proteins to Macromolecular Crowding. PLoS Comput Biol 12, e1005040, doi: 10.1371/journal. pcbi.1005040 (2016), Jiao, M., Li, H. T., Chen, J., Minton, A. P. & Liang, Y. Attractive protein-polymer interactions markedly alter the effect of macromolecular crowding on protein association equilibria. Biophys J 99, 914-923, doi: 10.1016/j.bpj.2010.05.013 (2010), Phillip, Y. & Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments--from in vitro to in vivo. FEBS Lett 587, 1046-1052, doi:10.1016/j.febslet.2013.01.007 (2013), Kozer, N., Kuttner, Y. Y., Haran, G. & Schreiber, G. Protein-protein association in polymer solutions: from dilute to semidilute to concentrated. Biophys J 92, 2139-2149, doi:10.1529/biophysj.106.097717 (2007)). 다시 돌아와서, 합성 중합체의 진정한 효과에 대한 명확한 합의가 없으며, 순 결과는 관심대상 시스템에 특이적인 것으로 나타난다. Schreiber와 그 동료들은 바르나제(barnase)와 바르스타(barstar) 사이 또는 β-락탐아제와 이의 단백질 억제제 사이의 상호작용에 있어서 PEG와 덱스트란의 최소 효과를 보여 주었고, Liang과 그 동료들은 카탈라아제-수퍼옥사이드 디스뮤타제 연합에 있어서 중합체 크라우딩의 상당한 영향을 보여주었다 (Jiao, M., Li, H. T., Chen, J., Minton, A. P. & Liang, Y. Attractive protein-polymer interactions markedly alter the effect of macromolecular crowding on protein association equilibria. Biophys J 99, 914-923, doi:10.1016/j.bpj.2010.05.013 (2010), Phillip, Y., Sherman, E., Haran, G. & Schreiber, G. Common crowding agents have only a small effect on protein-protein interactions. Biophys J 97, 875-885, doi:10.1016/j.bpj.2009.05.026 (2009)). 항체:항원 결합에 대한 고-농도 HSA의 영향은 부피 효과가 배제되었기 때문에 단순할 수 있지만, HSA가 아닌 다당류 Ficoll 70의 존재 하에서 수행된 등가의 실험에서는 상이한 결과를 얻었고, 이것으로 고-농도에서 조차도 결합에 있어서 전혀 영향을 미치지 않거나 거의 영향을 미치지 않음을 보여준다. 상기 차이는 특히 낮은 이온 강도에서 명백한데, HSA의 존재 하에 결합 활성에서 유의적인 mAb-특이적 감소를 보였다. Ficoll 과밀화된 용액에서, 상기 효과는 두 mAb에 대해 최소이며, 유사하다. 이것은 HSA의 효과가 배제된 부피에 대한 효과만으로는 설명될 수 없음을 시사하고; 생물학적 시스템의 복잡성 (즉, 단백질의 표면 성질)은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 관심대상의 추가 시스템에 대한 조사는 단백질 거대분자 크라우딩 모델을 개선하는 데 도움이 될 것이다.

당연히, 높은 Ficoll 농도 (100g/L 및 그 이상)는 정상 상태(steady state) 조건 달성에 필요한 시간에 의해 평가된 바와 같이, 두 항체에 모두 겉보기 결합을 보였지만; 그 효과는 mAb2보다 mAb1에서 더 두드러졌다. 이것은 높은 용액 점도 외에도 전형적인 크라우딩 연구에 사용되는 것과 유사한 Ficoll 농도에서 해당 시스템의 결합 성질에 있어서 단백질-특이적 추가 효과를 암시한다. 두 mAb에 있어서 고-농도의 Ficoll의 상이한 효과에 대한 구체적인 이유는 명확하지 않지만, 결합 또는 배제와 같은 선호적 상호작용의 차이에 기인할 수 있다 (Arakawa, T. & Timasheff, S. N. Preferential interactions of proteins with solvent components in aqueous amino acid solutions. Arch Biochem Biophys 224, 169-177 (1983), Timasheff, S. N. Protein-solvent preferential interactions, protein hydration, and the modulation of biochemical reactions by solvent components. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 9721-9726, doi:10.1073/pnas.122225399 (2002)). 특히, 각 mAb에 대한 Ficoll의 효과는 낮은 이온 강도와 높은 이온 강도 사이에서 상당히 일관되었다. 기존 연구들은 Ficoll은 분자의 열적 안정성과 형태학적 구조적 역학에 가변적으로 영향을 미칠 수 있음을 암시한다 (Qu, Y. & Bolen, D. W. Efficacy of macromolecular crowding in forcing proteins to fold. Biophys Chem 101-102, 155-165 (2002), Sasahara, K., McPhie, P. & Minton, A. P. Effect of dextran on protein stability and conformation attributed to macromolecular crowding. J Mol Biol 326, 1227-1237 (2003), Stagg, L, Zhang, S. Q., Cheung, M. S. & Wittung-Stafshede, P. Molecular crowding enhances native structure and stability of alpha/beta protein flavodoxin. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 18976-18981, doi:10.1073/pnas.0705127104 (2007), Tokuriki, N. et al. Protein folding by the effects of macromolecular crowding. Protein Sci 13, 125-133, doi: 10.1110/ps.03288104 (2004)), and differences in the CDRs between the two mAbs could contribute to varied Ficoll-induced effects on structure or dynamics, with a concomitant effect on binding. An investigation using maltose binding protein (MBP) showed that Ficoll can bind to the protein and compete with binding of the natural ligand, maltose (Miklos, A. C., Sumpter, M. & Zhou, H. X. Competitive interactions of ligands and macromolecular crowders with maltose binding protein. PloS one 8, e74969, doi: 10.1371/journal. pone.0074969 (2013)). 이것은 단백질-리간드 상호작용에 대한 크라우딩 제제의 직접적인 영향과 다른 거대분자들과의 경쟁의 잠재적 결과를 보여준다. 그러나, Ficoll에서 관찰된 효과는 평형 응답 자체가 아니라 평형에 도달하는데 필요한 시간을 기반으로 했으며, 이는 중합체 (Ficoll)와 단백질 (HSA) 크라우딩 제제가 반드시 동일한 결과를 생성하지 않음을 보여준다. 이러한 전위 차는 검사 중인 분자들과 연합된 내재된 물리화학적 특성에 의존적인 것 같다. 이 복잡한 현상을 더 잘 이해하려면 추가 조사가 필요하고; 더욱이, 단백질 수화 또는 선호적 배제/상호작용 연구는 이러한 불일치 뒤에 는 기전을 명확하게 할 수 있다. 중합체 클라우더(crowders)는 리간드 결합에 있어서 일관된 효과를 낳지 않는다. 이 시스템에서 중합체를 단백질 클라우더로 대체하면 열역학에 있어서 완전히 상이한 효과를 가질 수 있는데, 이는 정전기 상호작용 및 다른 비-이상적인 거동에 추가적인 복잡성을 도입시킬 수 있기 때문이다.

생물학적 용액의 복잡성과 부피 점유는 구성 분자들 상에서 이상적인 거동과는 상당한 편차를 초래한다. 이러한 조건 하에서 단백질의 비-이상적인 거동과 비-특이적 상호작용에 대한 이해는 단백질 기능에 대한 보다 완전하고 정확한 이해를 얻는데 중요하다. 여기에서, 본 발명자들은 최소한의 물질을 사용하여, 비교적 짧은 시간 안에 많은 수의 시험 제품을 스크리닝할 수 있는 생물층 간섭계를 사용하여, 비-특이적인 단백질-단백질 상호작용의 기능적 영향을 특성화시키는 고-처리량 접근법을 입증했다. 구체적으로, 본 발명자들은 알부민의 생리적 농도가 항체-항원 결합에 미치는 영향을 조사했다. 동일한 항원에 결합하는 두 가지 상이한 항체는 알부민의 존재에 의해 상이하게 영향을 받았으며, 이는 바이오치료제가 특정된 시스템에서 알부민과의 다양한 비-특이적 상호작용을 나타낼 수 있음을 시사한다. HSA의 존재 하에 다른 생물학적으로 관련된 분자, 예컨대 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 결합하는 mAb의 평가가 무엇보다 중요하다. 산성 엔도좀으로부터 혈류로 IgG와 HSA 모두의 재순환은 pH-의존적 방식으로 FcRn에 의해 촉진된다 (Vaughn, D. E. & Bjorkman, P. J. Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor. Structure 6, 63-73 (1998)), and while this process is well-understood, the potential interplay between IgG and HSA that was observed suggests a more complex process (Wang, W. et al. Monoclonal antibodies with identical Fc sequences can bind to FcRn differentially with pharmacokinetic consequences. Drug Metab Dispos 39, 1469-1477, doi:10.1124/dmd.111.039453 (2011)). 마지막으로, 바이오치료제 개발의 대개 미개척 영역으로서, 징조 및 투여 경로와 관련된 비-특이적 상호작용을 특성화는 주요 후보 분자들의 모듬 사이에서 중요한 식별자로 삼을 수 있다. 다양한 생물학적 그리고 약물 발견 문제에 생물층 간섭 측정계 기술의 적용이 확대되고 있다 (Verzijl, D., Riedl, T., Parren, P. & Gerritsen, A. F. A novel label-free cell-based assay technology using biolayer interferometry. Biosens Bioelectron 87, 388-395, doi: 10.1016/j. bios.2016.08.095 (2017), Kaminski, T., Gunnarsson, A. & Geschwindner, S. Harnessing the Versatility of Optical Biosensors for Target-Based Small-Molecule Drug Discovery. ACS Sens 2, 10-15, doi:10.1021/acssensors.6b00735 (2017), Yang, D., Singh, A., Wu, H. & Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. Journal of visualized experiments : JoVE, doi:10.3791/55659 (2017)). 초기 발견 연구 스크리닝 도구인 BLI는 파이프라인으로부터 후보자를 더 빨리 탈락시키는데 사용할 수 있으며, 발견 연구에 사용되는 분석 유형의 다양화에 도움이될 수 있다. 여기에 설명된 접근 방식은 NMR 및 AUC와 같은 다른 생물물리학적 방법과 병용하여 과밀화된 용액 현상을 더 잘 조사할 수 있는 중요한 도구다.

실시예 2: FcRn-매개된 재순환 경로에서 항체 선택

FcRn은 내피 세포에서 리소좀 분해를 줄임으로써 IgG 및 혈청 알부민의 반감기를 연장시킨다. IgG, 혈청 알부민 및 기타 혈청 단백질은 피노사이토시스(pinocytosis)를 통해 지속적으로 내재화된다. 일반적으로, 혈청 단백질은 엔도좀으로부터 리소좀으로 운반되고, 여기에서 분해된다. IgG와 혈청 알부민은 약-산성 pH (<6.5)에서 FcRn에 결합되고, 혈액의 중성-pH (> 7.0)에서 방출되는 세포 표면으로 재순환된다. 이러한 방식으로 IgG 및 혈청 알부민은 리소좀 분해를 회피한다. 이 기전은 IgG 및 혈청 알부민의 혈청 순환 반감기가 더 큰 것에 대한 설명이 된다. 따라서, 시뮬레이션된 생체내 조건 하에서 FcRn의 결합이 증가된 항체는 더 긴 반감기를 가질 것으로 예상되며, 따라서 우수한 치료제가 될 수 있다. 항체 FcRn 결합에 대한 HSA의 효과를 결정하기 위한 테스트 시스템이 도 13에 도시되어 있다. 도 14는 HSA 및 mAb/HSA 연합 단계가 pH 6.0에서 특정 FcRn 결합 응답을 생성했음을 보여주며, 이는 pH 7.4에서 완전히 가역적이다. 도 15A 및 15B는 mAb1 및 mAb2에 의한 FcRn에 대한 결합이 HSA에 의해 유사하게 영향을 받는 것을 보여준다. 상기 효과는 낮은 이온 강도와 생리적 이온 강도에서 동일하다. HSA는 HSA의 낮은 농도와 생리적 농도에서 FcRn에 대한 mAb 결합을 감소시킨다. 하기에 기술된 시험은 일반적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행된다.

FcRn 항체 결합에 대한 FA 로드된 HSA의 효과: C18:1은 hFcRn 결합을 폐기시켰고, C16:0은 강력하게 감소시켰고, 반면 C12:0은 효과가 적었다는 것은 이미 보고된 바 있으며, 이는 FA-결합된 HSA의 재순환 효율이 리간드-없는 HSA의 재순환 효율보다 낮을 가능성이 있음을 나타낸다. 여기에서, 실험에서 FA:HSA 존재 하에서 FcRn:HSA에 대한 두 가지 상이한 mAbs (mAb1 및 mAb2)의 결합은 순수 HSA와의 결합과 비교하여 더 높다는 것을 보여준다(도 16 참고). 이 결과는 순수한 HSA가 "더티(dirty) HSA" 보다 높은 친화력으로 FcRn에 결합하여, FcRn과의 mAb 상호작용을 간섭함을 시사한다. FA가 로드된 HSA는 순환을 지속해야 할 수 있지만, 리간드-없는 HSA는 세포질로 재순환을 요한다. FA-결합된 HSA의 전하 상태 변화는 FcRn 친 화성을 감소시킬 수 있다.

FcRn에 결합하는 항-C5 mAb에 대한 HSA의 차등 효과 : mAb3은 항-C5 mAb이다. 이 mAb의 반감기 연장된 형태 (mAb4)는 YTE 돌연변이 (M252Y, S254T, T256E)를 함유한다 (도 17 참고). mAb5 및 mAb6은 차례로 HLE 돌연변이 KFF (H433K, N434F, Y436F)와 LS (M428L, N434S)를 함유한다. mAb1 및 mAb2에 대한 관찰과 대조적으로, HSA는 FcRn에 대한 다양한 항-C5 분자의 결합에 상이하게 영향을 주었다(도 18 참고). 모든 분자들이 HSA의 존재 하에서 FcRn에 대한 결합이 감소했지만, HLE 돌연변이체 (mAb4, mAb5 및 mAb6)는 영향을 적게 받았다. mAb5는 다른 HLE 돌연변이와 비교하였을 때 FcRn 결합에 있어서 HSA의 영향이 가장 적었다.

FcRn에 대한 항-Zika mAbs에 있어서 상이한 HSA 효과: mAb7은 Fcγ 수용체 결합 활성이 없는 항-Zika mAb이다. mAb8 = mAb7 + YTE 돌연변이. mAb9는 Fcγ 수용체 결합 활성이 감소된 항-Zika 바이러스다. 오직 YTE 돌연변이만이 FcRn과의 상호작용에 영향을 준다. 도 19에 나타낸 바와 같이, FcRn에 mAb9의 결합은 생리학적 수준의 HSA에서 감소되며; 그러나, mAb9는 HSA 존재 하에서 mAb7과 mAb8과 비교하였을 때, FcRn과 더 높은 수준의 상호작용을 유지했다. 20 mg/ml 또는 이 이상의 농도의 HSA에서, FcRn에 대한 mAb7 및 mAb9 결합은 HSA 신호에 대해 약간 모호했다 (음의 값).

반감기 연장 돌연변이체는 HSA의 존재 하에서 모계(parental) mAbs보다 FcRn에 대해 더 높은 결합 반응을 보여준다: HLE 돌연변이체는 FcRn에 대한 더 높은 결합 친화력을 갖도록 설계되었으며, HSA의 존재 하에 이 등급 순서를 유지한다(도 20에서 입증됨). KFF 돌연변이체는 생리학적 농도에 가까운 농도의 HSA 하에서 최대 결합 응답을 보인다.

FcRn 결합 실험은 생리학적 설정에서 mAb 기능을 평가하기 위한 도구로써 이 플랫폼을 사용할 수 있는 가능성을 입증한다: 정규 BLI 결합 실험은 mAb1 및 mAb2가 두 염 농도 모두에서 FcRn에 대해 유사한 결합 친화력을 갖는 것으로 나타났다. HSA는 10 및 137 mM NaCl에서 FcRn에 mAb1 및 mAb2의 결합에 유사한 영향을 미친다. HSA의 존재로 FcRn에 대한 mAb의 결합이 감소되었다. 항-C5 및 항-Zika 항체로부터의 YTE 돌연변이체는 FcRn에 대한 결합 친화력 증가 뿐만 아니라 '야생형'에 비해 HSA의 영향이 감소되었음을 입증했다. 이 방법론은 거의 생리적 환경에서 mAb 기능을 이해하는 플랫폼을 제공하여, 생물물리적 개발 가능성 평가와 PK 연구 사이의 공간을 채울 수 있다.

본 발명은 여기에 설명된 특정 구체예들에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 설명된 것 외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되도록 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> THERAPEUTIC PROTEIN SELECTION IN SIMULATED IN VIVO CONDITIONS <130> 10470WO01 <150> 62/718,307 <151> 2018-08-13 <150> 62/865,446 <151> 2019-06-24 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial Peptide Sequence of Wild-Type IgG1 or IgG4 <400> 1 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 1 5 10 15 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 20 25 30 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 35 40 45 Thr Lys 50 <210> 2 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial Peptide Sequence of IgG1 or IgG4 with YTE Mutation <400> 2 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu 1 5 10 15 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 20 25 30 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 35 40 45 Thr Lys 50

Claims

시뮬레이션된 생체내 조건에서 비-특이적 상효작용 효과를 결정하기 위한, 다음을 포함하는 방법:
생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제와 표적 분자를 포함하는 용액을 바이오센서에 접촉시키고, 이때 해당 바이오센서의 표면은 이 표적 분자에 특이적으로 결합하는 포획 분자를 포함하고;
해당 표적 분자가 해당 포획 분자에 결합하도록 허용하고; 그리고
생물층 간섭계를 이용하여 해당 포획 분자에 결합된 표적 분자의 양을 결정한다.
청구항 1에 있어서, 다음을 더 포함하는 방법:
해당 포획 분자에 결합된 표적 바이오분자의 양과 대조군 임계치의 양을 비교하여, 해당 분자 크라우딩 제제와 유인성 비-특이적 상호작용을 갖는 표적 바이오분자와 해당 분자 크라우딩 제제와 반발성 비-특이적 상호작용을 갖는 표적 분자 크라우딩 제제를 구별하는, 방법.
청구항 2에 있어서, 이때 상기 임계치는 이상적인, 희석, 또는 반-희석 용액에 대해 정규화된 응답인, 방법.
청구항 1-3중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제는 인간 혈청 알부민 (HSA), IgG, 트랜스페린, 피브리노겐, IgA, α2-마크로글로불린, IgM, α1-안티트립신, 합토글로빈, α1-산 당단백질, 아포리포단백질 A-1, 아포리포단백질 A-11, 또는 혈액 또는 혈청 샘플에서 발견되는 기타 단백질 성분을 포함하는, 방법.
청구항 4에 있어서, 이때 상기 분자 크라우딩 제제는 생리학적으로 관련 농도로 존재하는 방법.
청구항 4에 있어서, 이때 상기 분자 크라우딩 제제는 약 1g/L 내지 약 100g/L의 농도로 존재하는 방법.
청구항 1-6중 임의의 한 항에 있어서, 두 가지 또는 그 이상의 농도의 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제에서 결합 양을 결정하는 것을 더 포함하는, 방법.
청구항 1-7중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제는 혈청 및/또는 혈장을 포함하는, 방법.
청구항 1-8중 임의의 한 항에 있어서, pH 의존적 결합을 결정하기 위해 두 가지 또는 그 이상의 pH에서 결합 양을 결정하는 것을 더 포함하는, 방법.
청구항 1-9중 임의의 한 항에 있어서, 염 의존성 결합을 결정하기 위해 두 가지 또는 그 이상의 염에서 결합 양을 결정하는 것을 더 포함하는, 방법.
청구항 1-10중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 분자는 항체를 포함하고, 상기 포획 분자는 이 항체에 특이적으로 결합하는 항원을 포함하는, 방법.
청구항 1-10중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 분자는 항원을 포함하고, 상기 포획 분자는 이 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 방법.
청구항 1-10중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 분자는 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편을 포함하고, 상기 포획 분자는 이 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는, 방법.
청구항 1-10중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 분자는 리간드를 포함하고, 상기 포획 분자는 이 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편을 포함하는, 방법.
청구항 1-14중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 포획 분자는 링커를 사용하여 상기 센서의 표면에 결합된, 방법.
청구항 15에 있어서, 이때 상기 링커는 바이오틴 및 스트렙타아비딘 또는 아비딘을 포함하는, 방법.
청구항 1-10중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 분자는 항체를 포함하고, 상기 포획 분자는 항-IgG Fc를 포함하는, 방법.
청구항 17에 있어서, 이때 상기 항-IgG Fc는 항-인간 IgG Fc인, 방법.
시뮬레이션된 생체내 조건 하에서 바이오분자를 선택하기 위한, 다음을 포함하는 방법:
생체내 조건을 시뮬레이팅하는 용액에 바이오센서를 접촉시키고, 이때 해당 바이오센서의 표면은 관심 대상의 두 가지 또는 그 이상의 표적 바이오분자 세트에서 표적 바이오분자에 특이적으로 결합하는 포획 분자를 포함하고, 이때 이 용액은 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제와 관심 대상의 두 가지 또는 그 이상의 표적 바이오분자 세트로부터 선별된 제 1 표적 바이오분자를 더 포함하고; 해당 포획 분자에 해당 제 1 표적 바이오분자의 결합이 허용되고; 그리고 생물층 간섭계를 이용하여 해당 포획 분자에 결합된 제 1 표적 바이오분자를 결정한다.
청구항 19에 있어서, 다음을 더 포함하는 방법: 생체내 조건을 시뮬레이팅하는 제 2 용액에 해당 바이오센서를 접촉시키고, 이때 해당 제 2 용액은 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제, 그리고 관심대상의 두 가지 또는 그 이상의 바이오분자 세트에서 선택된 제 2 표적 바이오분자를 더 포함하고; 해당 포획 분자에 해당 제 2 표적 바이오분자의 결합이 허용되고; 생물층 간섭계를 이용하여 해당 포획 분자에 결합된 제 2 표적 분자의 양을 결정하고; 그리고 해당 포획 분자에 결합된 제 1 바이오분자의 양과 해당 포획 분자에 결합된 제 2 바이오분자의 양을 비교하여, 제 1 바이오분자와 제 2 바이오분자중 어느 것이 더 많은 결합 양을 갖는 지를 결정한다.
청구항 19 또는 20에 있어서, 해당 포획 분자에 결합된 제 1 및/또는 제 2 표적 바이오분자의 양과 대조군 임계치의 양을 비교하여, 해당 분자 크라우딩 제제와 유인성 비-특이적 상호작용을 갖는 표적 바이오분자와 해당 분자 크라우딩 제제와 반발성 비-특이적 상호작용을 갖는 표적 분자 크라우딩 제제를 구별하는, 방법.
청구항 21에 있어서, 이때 상기 임계치는 이상적인, 희석, 또는 반-희석 용액에 대해 정규화된 응답인, 방법.
청구항 19-22중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제는 인간 혈청 알부민 (HSA), IgG, 트랜스페린, 피브리노겐, IgA, α2-마크로글로불린, IgM, α1-안티트립신, 합토글로빈, α1-산 당단백질, 아포리포단백질 A-1, 아포리포단백질 A-11, 또는 혈액 또는 혈청 샘플에서 발견되는 기타 단백질 성분을 포함하는, 방법.
청구항 23에 있어서, 이때 상기 분자 크라우딩 제제는 생리학적으로 관련 농도로 존재하는 방법.
청구항 23에 있어서, 이때 상기 분자 크라우딩 제제는 약 1g/L 내지 약 100g/L의 농도로 존재하는 방법.
청구항 19-25중 임의의 한 항에 있어서, 두 가지 또는 그 이상의 농도의 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제에서 결합 양을 결정하는 것을 더 포함하는, 방법.
청구항 19-26중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 생물학적으로 관련 분자 크라우딩 제제는 혈청 및/또는 혈장을 포함하는, 방법.
청구항 19-27중 임의의 한 항에 있어서, pH 의존적 결합을 결정하기 위해 두 가지 또는 그 이상의 pH에서 결합 양을 결정하는 것을 더 포함하는, 방법.
청구항 19-28중 임의의 한 항에 있어서, 염 의존성 결합을 결정하기 위해 두 가지 또는 그 이상의 염에서 결합 양을 결정하는 것을 더 포함하는, 방법.
청구항 19-29중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 분자는 항체를 포함하고, 상기 포획 분자는 이 항체에 특이적으로 결합하는 항원을 포함하는, 방법.
청구항 19-29중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 분자는 항원을 포함하고, 상기 포획 분자는 이 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 방법.
청구항 19-29중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 분자는 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편을 포함하고, 상기 포획 분자는 이 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는, 방법.
청구항 19-29중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 분자는 리간드를 포함하고, 상기 포획 분자는 이 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체 또는 이의 리간드 결합 단편을 포함하는, 방법.
청구항 19-33중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 포획 분자는 링커를 사용하여 상기 센서의 표면에 결합된, 방법.
청구항 34에 있어서, 이때 상기 링커는 바이오틴 및 스트렙타아비딘 또는 아비딘을 포함하는, 방법.
청구항 19-29중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 표적 분자는 항체를 포함하고, 상기 포획 분자는 항-IgG Fc를 포함하는, 방법.
청구항 36에 있어서, 이때 상기 항-IgG Fc는 항-인간 IgG Fc인, 방법.