KR20170140180A - 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 면역원, 항체 및 그 용도 - Google Patents

중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 면역원, 항체 및 그 용도 Download PDF

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케이본 모자라드
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마사루 카네키오
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Abstract

중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)에 대한 개체의 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. 몇몇의 예시들에서, 이 면역 반응은 개체에서 MERS-CoV 감염을 억제하거나 또는 예방하는 예방적인 면역반응이다. 재조합 MERS-CoV 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 핵산 분자도 또한 제공한다. 추가로, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 중화항체들 및 이들의 항원결합단편들도 공개한다. 이 항체들과 항원결합단편들은, 예를 들어, 샘플 또는 개체에서 MERS-CoV S 단백질을 탐색하는 방법으로 유용함은 물론이고, 개체에서 MERS-CoV 감염을 예방하고 치료하는 방법으로도 유용하다.

Description

중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 면역원, 항체 및 그 용도{MIDDLE EAST RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS IMMUNOGENS, ANTIBODIES, AND THEIR USE}
관련된 출원들과의 상호 비교
본 명세서는 전체가 참고로 인용된 2015년 2월 24일에 출원된 U.S. Provisional Application No. 62/120,353의 우선권을 주장한다.
본 발명의 기술 분야
본 공개는 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (MERS-CoV) 의 감염 및 질병을 치료하고 예방하기 위해 재조합 MERS-CoV 폴리펩타이드, 이들의 면역원 단편 및 이들에 특이적인 단일클론 항체에 관한 것이다.
MERS-CoV는 심한 급성 호흡기 감염의 아주 치명적 원인으로 나타나고 있다. 수천명의 감염 및 수백명의 사망은 신규 베타-코로나바이러스가 원인인 것으로 나타났다. 이 바이러스의 사람에서 사람으로의 전염은 유지되지 않기 때문에, 대량의 인수 감염증 개체(large zoonotic reservoir)가 전염의 주 소스로 역할 할 가능성이 있다. 치사율이 높고, 병역학이 모호하고, 또 이 신규 바이러스에 대한 예방 또는 치료 방법이 없다는 사실은 효과가 있는 백신 및 관련된 치료제들을 급히 필요하게끔 하였다.
상기 공개는 개체에서 MERS-CoV 에 반응하여 중성 항체를 유도하게 하는데 매우 효과적인 MERS-CoV 스파이크(S) 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 새로운 방법들에 관한 것이다. 이 방법들은, 예를 들어, 개체에의 MERS-CoV 감염을 예방하거나 치료하는데 유용하다.
몇몇 예시에서, 이 방법에는 개체에 프라임-부스트 백신화(prime-boost vaccination) 투여를 포함하며, 이는 개체에 MER S-CoV S 단백질에 대한 면역반응을 일으키도록 하기 위해 MERS-CoV S 단백질을 코딩하는 핵산, 및 MER S-CoV S 단백질의 S1 서브유닛으로 (MERS-CoV S1 단백질) 구성되거나 포함하는 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함한다. 제한적이지 않은 한 예로서, 프라임-부스트 백신화에는 최초로 개체에 MER S-CoV S 단백질을 코딩하는 핵산분자를 투여하고, 제 1 부스트로 개체에 MER S-CoV S 단백질을 코딩하는 핵산분자의 치료적으로 효과 있는 양만큼의 투여, 및 제 2-부스트로 개체에 치료적으로 효과 있는 양만큼의 MER S-CoV S 단백질 투여로 조성될수 있다. 다른 예시들에서는, MER S-CoV S 단백질은 서열번호 14에서 제공되는 아미노산들로 구성되거나 포함될 수 있으며, 또한 MER S-CoV S1 단백질은 서열번호 16에서 제공되는 아미노산들로 구성되거나 포함될 수 있다.
추가로, 새로운 면역원들로는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편(수용체 결합도메인, RBD)들이 제공된다. 다른 예시들에서는, 단백질 나노입자에 연결된 MERS-CoV S 단백질의 수용체 결합도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 제공되며, 이는 MER S-CoV S 단백질 수용체 결합 도메인(MERS-CoV S 단백질 RBD)을 표현하는 단백질 나노입자들을 만드는데 사용될 수 있다. 폴리펩타이드들은 코딩하는 핵산 분자들도 또한 제공된다.
이 발명의 공시는 분리된 단클론 항체 및 MERS-CoV S 단백질의 에피톱에 특이적으로 결합하는 항원결합 단편들을 제공한다. 또한 항체들과 항원결합 단편들, 항체들과 항원결합 단편들을 코딩하는 핵산들, 이 핵산들을 포함하는 발현 벡터들 및 이 핵산들을 발현하는 개체 세포들을 포함하는 조성을 공시한다. 항체들과 항원결합 단편들은 MERS-CoV 감염을 중화시킬 수 있으며, 그러므로 개체에서 MERS-CoV 감염을 치료하거나 예방하는 방법들로 사용될 수 있다. 그 방법들에는 치료적으로 효과 있는 양만큼의 하나 또는 그 이상의 항체들, 항원결합 단편들, 핵산 분자들, 벡터들, 또는 상기 공시된 조성물들을 개체, 예를 들어 MER S-CoV 감염 위험이 있거나 감염된 개체에, 투여하는 것을 포함한다.
선행된 다른 특징들 및 본 공시의 장점들은 수반되는 도면들에 참고되어 진행된 몇몇의 예시들에서 상세히 서술되어 좀 더 명백해질 것이다.
도 1A-1C는, MERS-CoV 스파이크 당단백질 백신 디자인과 생쥐에서의 면역력을 보여준다. 후보 백신 면역원은 베타-코로나바이러스의 오직 하나인 표면 당단백질 주위에 대해 디자인 되었다. (A) MERS-CoV S 단백질 cDNA 및 재조합 단백질들의 개략적 표시이다. 다섯 가지 백신구조물이 만들어졌다: DNA 세 가지 및 단백질서브유닛 두 가지. DNA 구조물에는 전장-S로 구성되거나 또는 세포의 멤브레인을 통과하는 도메인이나 전체 S2 서브유닛이 삭제된 잘려진 단편으로 구성되었다. 단백질구조물들은 멤브레인을 통과하는 도메인이 삭제된 짤려진 S 분자(S-ΔTM)이거나 또는 S1 서브유닛를 포함한다. RBD:수용체 결합 도메인; SP:신호펩티드; TM:멤브레인을 통과하는 도메인; FTH: 폴돈(Foldon)(삼중체도메인, trimerization domain), 트롬빈(Thrombin) (절개부위), 이어서 히스티티딘 태그; 3CHis: 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 절개부위, 이어서 히스티딘 6개 태그. (B) 여덟가지 백신 프로그램의 면역력. 한 그룹당 5마리의 쥐에 플라즈미드 DNA로만 0, 3, 및 6주에 면역성을 주었다(그룹 1-3); 플라즈미드 DNA로 0 및 3주에 면역성을 주고 단백질과 Ribi 아주벤트(adjuvant)로 6주째에 면역성을 주었다(그룹 4-6); 또는 단백질과 Ribi 아주벤트로 0 및 4주에 면역성을 주었다(그룹 7, 8). 각각 면역성 부여한 지 2주 후에, 슈도타입의 MERS-CoV England1바이러스에 대한 중화항체의 타이터(titer)를 측정하였다. 오픈, 회색 및 흑색 바는 각각 초기 면역 후, 첫 번째 부스터 후 및 두 번째 부스터 면역 후 혈청의 IC90 중화 타이터(95% CI의 GMT)를 표시한다. 통계적 분석으로 비-파라메트릭 두-테일 t-테스트 (non-parametric two-tailed t-test)(Mann-Whitney)가 사용되었으며, 해당하는 P 값을 표시하였다. (C) MERS-CoV 백신은 8개의 MERS-CoV 균주에 대해 교차-중화성을 유도하였다. MERS-CoV S DNA 로 세번 면역성을 부여한 쥐, S DNA로 초기 면역성을 부여하고 S1 단백질과 Ribi 아주밴트로 부스트한 쥐, 또는 S1 단백질과 Ribi 아주밴트로 초기 면역성 부여와 부스터 한 쥐들의 혈청에 대해 표시한 대로 8개의 MERS-CoV 및 SARS-CoV 슈도타입 바이러스에 대한 중화성을 측정하였다. IC90 타이터를 보여준다.데이터는 표준오차를 포함한 세번 반복 샘플의 평균값을 의미한다.
도 2A 및 2B는 중화되는 항혈청 타겟을 보여준다. 다른 백신프로그램으로 면역성을 부여했을 때 수용체-결합 도메인 (RBD) 내외의 스파이크(S) 당단백질을 타겟으로 하는 중화 항체를 만들어낸다. (A) 세포흡착에세이. MERS-CoV S DNA로만 면역역성을 부여한 쥐, S DNA로 초기 면역성을 부여하고 S1 단백질과 Ribi 아주밴트로 부스트 한 쥐, 또는 S1 단백질과 Ribi 아주밴트로 초기 면역성 부여하고 부스터 한 쥐들의 혈청에 대해 MERS-CoV 스파이크 단백질들: S, RBD, S1, S2 를 표면에 발현하는 293T 세포로 흡착시킨 슈도타입의 MERS-CoV (Eng1)에 대한 중화 활성을 평가하였다. 혈청 중화 반응은 일회 희석으로 검사하였다. 감염시키지 않은 293T 세포로 흡착시킨 혈청을 대조군으로 사용하였으며 95%의 중화활성을 유지하였다. 각 바는 표준오차를 포함한 세 번 반복 에세이의 평균값을 나타낸다. (B)단백질 경쟁 중화에세이. 면역성이 부여된 쥐의 혈청을 일회 희석시켜 용해성 MERS-CoV RBD, S1 및 S2 단백질 0.016 내지 50 μg/ml의 농도 존재하에서 MERS-CoV England1 슈도타입 바이러스에 대한 중화력 에세이를 하였다.
도 3A 및 3B는 단일클론 항체(mAb) 결합 및 중화 활성을 보여준다. 네 개 mAbs의 결합 특이성 및 중화 활성을 분석하였다. (A) 결합특이성. ELISA 방법으로 각각의 항체 mAbs가 수용성 수용체 결합 도메인 (RBD), S1 및 안정화를 위해 Fc 에 혼합된 S2(S2-hFc)에 결합하는가를 테스트하였다. (B) 결합 친화력 및 중화. 결합 친화력 및 중화 활성이 바이오레이어 인터훼로메트리(biolayer interferometry)(가공하지 않은 데이터가 도 19에 보여준다) 및 슈도타입 MERS-CoV (영국1) 바이러스 중화 에세이로 각각 측정되었다. 분석된 네 개의 mAbs 중 MERS-CoV RBD―D12 및 F11- 에 특이적인 mAbs가 가장 높은 중화력을 보였다. RBD 밖에서 S1에 결합된 G2는 D12 및 F11보다 S1에 대해 약한 친화력을 가졌으나 거의 비슷한 중화 잠재력을 가졌다. S2-가 결합된 mAb 인, G4는 다른 mAb보다 10배 낮은 중화 잠재력을 가졌다.
도 4A-4E는 MERS-CoV 중화 mAbs의 분자적 특징을 보여준다. 백신-유도된 mAb D12는 MERS-CoV 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD)의 DPP4 상호작용하는 부위에 직접적으로 결합하여 수용체 결합을 직접적으로 막아 줌으로서 중화 효과를 낸다. (A) (왼쪽) D12 항체에 결합하는 RBD 및 DPP4에 의해 결합하는 RBD의 비교. 수용체 결합 모티브를 지닌 RED(RBM, 잔기 484-567, magenta) 및 D12는 만화 그림으로 표시되었다. 상호작용하는 주요부위들은 CDR H2, CDR H3, 및 CDR L2 내에 포함된다. (오른쪽) DPP4가 아스파라긴 229 및 막대모양으로 나태 낸 부착된 N- 글라이칸과 함께 만화 형식으로 보여준다. RED 분자는 (왼쪽)과 같은 방향으로 향하고 있다. (B) 항체: RBD 및 DPP4:RBD 결정 구조 복합체의 접촉면. (왼쪽) D12 헤비체인 및 라이트체인 파라토프(paratope)와 함께 각각 표면에서의 RBD 를 보여준다. CDR 루프들은 리본 형태로 보여진다. (중앙) DPP4의 N- 글라이칸과 연관된 아스파라긴 229 와 주로 상호작용 하는 RBD W535 및 E536 잔기와 상호작용하는 D12 CDR H2를 가진 전체 D12 파라토프를 보여주기 위해 RBD가 회전된다. (오른쪽)RBD 가 DPP4 상호작용하는 부위와 함께 표면에 표시하여 보여진다. DPP4의 주로 상호작용하는 부위들이 SARS mAbs(도 16)에서 보여진 것과 같은 방식으로 아스파라진 229 및 N-글라이칸이 막대로 표시된 만화형식으로 표시되었다. (C) MERS-CoV England1 RBD 의 결정 구조 및 결합시 결정적인 RBD 돌연변이 효과. (D)D12 및 RBD 접촉면. 모든 CDRs 만화형식으로 보여주며 상호작용하는 잔기들은 막대로 표시되고 수소결합은 점선으로 그려졌다. (D, E) 분리된 바이러스에서 발견된 여러 돌연변이가 나타난 RBD 잔기 506 및 509 들은 초록색으로 표시하였다. 구조적 결정으로 확인된 결정적인 RBD 잔기들 및 D12 결합을 감소시키거나 제거시키도록 진화된 바이러스 저항 532, 535, 및 536 가 형광표시 되었다. ELISA 결과 이 돌연변이들은 F11 또는 D12 결합을 효과적으로 제거할수 있는 것으로 나타났다.
도 5A-5D는 MERS-CoV 스파이크 당단백질 백신 디자인, 면역원성 및 사람이 아닌 영장류에서의 유효성을 보여준다. 생쥐실험에 근거하여 선택된 백신 면역원 후보들을 사람이 아닌 영장류(NHP)에서 평가하였다. (a) 전장 MERS-CoV 스파이크 단백질 cDNA 및 재조합 S1 단백질의 개요적 표시. 두 개의 백신 구조물을 테스트 하였다:하나의 DNA 와 하나의 단백질 서브유닛. DNA 구조물은 멤브레인 통과 도메인을 지닌 전장 S로 구성된다. 단백질 구조물은 S1 서브유닛를 지닌 잘려 진 S 분자를 포함한다. RBD: 수용체결합 도메인; SP: 신호펩티드, TM: 멤브레인통과 도메인: 3CHis: 인간 리노바이러스(human rhinovirus) 3C 프로테아제 절개 부위에 이어서 히스티딘 6개 태그. (b) 세 가지 백신 프로그램의 면역원성. 그룹당 6 마리의 사람이 아닌 영장류(NHP)에 플라즈미드 DNA 단독으로 근육주사로 면역성을 부여하고, 이어서 0, 4, 및 8주에 전기천공법으로; 0, 및 4주에 플라즈미드 DNA 와 전기천공; 및 8주에 단백질과 알루미늄 포스페이트, 또는 0, 및 8주에 단백질과 알루미늄 포스페이트로 면역성을 부여하였다. 각각의 면역성 부여 2주 후 및 12주 및 18주에, 슈도타입의 MERS-CoV England1바이러스에 대한 중화 항체 타이터를 측정하였다. 각각의 다른 심볼은 제시된 시간점에서 수집된 그룹당 6마리 NHP의 혈청을 표시한다. 이 혈청으로부터 IC90 중화 타이터 (95% CI를 가진 GMT)를 측정하였다. 각각의 데이터 포인트는 3번 측정의 평균값을 표시한다. 에세이는 한 번 반복하였다. 통계적 분석을 위해 비-파라메트릭 두개-테일 t-테스트(non-parametric two-tailed t-test)(Mann-Whitney)가 사용되었으며, 해당되는 P 값이 제시되었다. (c) MERS-CoV 스파이크 당단백질 면역원들은 사람이 아닌 영장류(NHPs)의 폐질환을 보호한다. 면역화시키지 않은 6 NHPs 및 선택된 두 개의 백신 면역원(immunogens) 후보 중 하나 (1. 전장 S DNA 초기면역/S1 서브유닛 단백질 부스트; 2. S1 서브유닛 단백질 프라임/S1 서브유닛 단백질 부스트)로 면역화시킨 12 NHPs를 마지막 백신 부스트후 19주에 MERS-CoV 로 공격(challenge) 하였다. 각 NHP에 5x106 PFU의 MERS-CoV 조르단 N3 (Jordan N3) 균주(GenBank ID: KC776174.1)를 기관지 내로 투여하였다. 모든 NHPs 에서 비정상적인 폐 부피 퍼센트는 공격 후(post-challenge) 3일에 피크였다; 그러나, 폐 침윤액은 백신화시킨 NHPs에 비해 백신화시키지 않은 NHPs 에서 의미 있게 좀 더 광범위하고 오래 지속 되었다. 통계적 분석을 위해 비-파라메트릭 두 개-테일 t-테스트(non-parametric two-tailed t-test)(Mann-Whitney)가 사용되었다. 스타 하나(*) 는 P 값이 0.05보다 적음을 표시하고, 스타 두개는(**) P 값이 0.01보다 적음을 표시한다. (d) 공격 (challenge)후 6일째 되는 날에 선택한 동물들의 비정상적인 폐 분절 이미지를 보여준다. 이 이미지들은 그림 5C에서 흑색으로 동그라미 친 데이터 포인트들에 해당한다. 18마리 모든 동물들의 CT 이미지들과 비정상적인 폐분절 이미지들이 도 18A-18C에 보여진다.
도 6A-6D는 MERS-CoV 슈도바이러스가 타겟 세포에 이전(transduce)되기 위해 인간 DPP4를 사용함을 보여준다. (A) 세포표면에서의 DPP4 발현. Huh7.5 세포(왼쪽 페널), DPP4로 이전 안된 293 세포(중앙 페널), 및 DPP4로 이전된 293 세포(오른쪽 페널)를 염소 항-DPP4 항체 및 컨트롤 항체로 염색하였고, 플루오사이토메트리 (flow cytometry)로 분석하였다. (B) 슈도타입의 MERS-CoV England1 바이러스에 의한 DPP4-발현 세포의 이전(Transduction). DPP4-이전이 안되거나 이전이 된 Huh7.5 및 293 cells(회색 및 흑색 바)을 MERS-CoV 슈도타입 바이러스로 이전시켰다. 루시퍼레이즈(luciferase) 활성의 상대적 발현을 측정하였다(CPS). 감염시키지 않고 이전시키지않은 세포들이 배경 컨트롤로 사용되었다 (열린 바). (C) MERS-CoV 슈도바이러스에 의한 Huh7.5 세포의 이전은 가용성 인간 DPP4 (sDPP4) 에 의해 차단시켰다. Huh7.5 세포를 이전시키기 전에 가용성 인간 DPP4 와 배양하였다. 상대적 루시퍼레이즈(luciferase) 활성(CPS)을 보여준다. (D)MERS-CoV 슈도바이러스에 의한 Huh7.5 세포의 이전은 항-ACE2 항체가 아닌 항-DPP4로 차단시켰다. Huh7.5 세포를 항-DPP4 또는 항-ACE2 다중클론 항체들과 배양시켰고 이어서 MERS-CoV England1 슈도바이러스로 이전시켰다. 상대적 루시퍼레이즈(luciferase) 활성(CPS)을 보여준다.
도 7은 슈도타입 바이러스 중화 페널에 사용된 균주들에 대한 MERS-CoV 스파이크 (S) 당단백질 시퀀스 비교를 보여준다. N-말단 도메인(NTD), 수용체 결합 도메인(RBD), 헵타드 반복서열 1 및 2 (HR1 and HR2), 및 멤브레인 통과 도메인(TM)을 포함한 MERS-CoV S 단백질의 개략적 표시를 보여준다. 진뱅크(GenBank)에 발표된 8개의 MERS-CoV S 서열을 England1 균주와 대조하였다. England1 균주를 대상으로 몇몇 아미노산들 차이가 보여진다. 균주들 사이의 계통발생 분류상의 거리는 서열의 왼쪽에 계통발생 트리의 가지 길이로 표시하였다.
도 8은 슈도타입 및 생(live) 바이러스 중화 에세이로 측정된 MERS-CoV 백신에 의해 야기된 바이러스 중화 반응을 보여준다. 도 1 에 표시된 대로 생쥐 여덟 그룹을 면역화시켰다. 마지막 백신 부스터 후 5주째 혈청의 MERS-CoV Jordan N3에 대한 중화 항체들을 슈도바이러스 중화 에세이(흑색 바) 및 생 바이러스 마이크로-중화 에세이(열린 바)로 각각 측정하였다.
도 9A-9C는 MERS-CoV S DNA 면역화에 의해 유도되는 항체의 S1 및 S2에의 결합을 보여 준다. (A 및 B) 세포 흡착 에세이에 사용된 MERS-CoV 스파이크 DNA 및 단백질 구조물의 개략적 표시이다. (C) MERS-CoV S DNA, S DNA로 프라임하고 S1 단백질과 Ribi 아주벤트로 부스터, 또는 S1 단백질과 Ribi 아주벤트로 프라임 및 부스터 한 생쥐의 혈청들에 대해 풀루오사이토메트리로 세포 표면에 발현된 MERS-CoV 스파이크 단백질과의 결합을 검정하였다. MERS-CoV S, RBD-HATM, S1-TM 및 S2-TM 로 감염시킨 293T 세포는 세 개의 면역화 그룹들로부터 얻은 혈청(1:200 희석)과 배양시키고 이어서 항-마우스 PE 혼합체 (anti-mouse PE conjugate)로 염색시켰다. S: 스파이크 당단벡질, RBD: 수용체 결합 도메인, HA: 헤마글루티닌, TM: 멤브레인통과.
도 10A 및 10B 는 생쥐에서 MERS-CoV S DNA/S1 단백질로 프라임-부스트 백신화는 S1 단백질로 프라임-부스트 프로그램 백신화에 의해 유도된 Th2-치우친 반응에 비해 Th1-치우친 IgG 반응을 유도함을 보여 준다. (A) MERS-CoV S DNA, S DNA로 프라임 하고 S1 단백질과 Ribi 아주벤트로 부스트, 또는 S1 단백질과 Ribi 아주벤트로 프라임 및 부스트로 면역화시킨 생쥐로부터 얻은 혈청들에 대해, 엘라이자 에세이로(ELISA), MERS-CoV S1-특이적인 IgG1 및 IgG2a 항체 반응을 우세하게 함을 검정하였다. 열린 동그라미 및 흑색 동그라미는 IgG2a 및 IgG1 항체 타이터 (95% CI를 지닌 기하학적 평균 타이터(Geometric mean titer) (GMT))를 각각 나타낸다. (B) 왼쪽 펜넬로부터 세 그룹에서의 IgG1에 대한 IgG2a 의 GMT 비율을 계산하였다.
도 11은 MERS-CoV 스파이크 당단백질에 대한 단일클론 항체의 동정을 보여준다. DNA 및 단백질 백신 그룹들에서 면역화된 생쥐들로 모두로부터 추가적인 S1 단백질 투여 3일 후에 지라(spleen)를 모았다. 그 후 지라세포(splenocytes)는 Sp2/0 골수 세포(myeloma cell)와 융합시켜 하이브리도마를 만들었고 S1, RBD, 및 S2 도메인에 결합하는 하이브리도마 스크리닝을 3차례 하였다. 마지막 차례 스크리닝에서는 45 서브클론(subclones)들을 얻었다. 서브클론들 배양에서 얻은 상등액에 대해 중화 및 결합 테스트를 하였다. 서브클론들로 부터 Eng1 슈도바이러스 균주에 대한 중화력 퍼센트를 측정하여 보여준다. 서브클론들로부터 얻은 상등액들은 RBDs, S1 및 S-ΔTM 단백질들에 대한 결합력을 평가하였다. 서브클론들이 변성된 S 직선 에피톱(S linear eptitopes)을 인식하는지를 평가하기 위해 웨스턴블럿 분석을 하였다. ELISA 결합 데이터에 근거하여, mAbs 는 세 그룹으로 분류되었다: 표시된대로 RBD 특이적, S1 특이적 (non-RBD) 및 S2 특이적. 이들 mAbs 중 항원 특이성 및 높은 중화 잠재력에 근거하여 추가로 성질을 규명하기 위해 4개 (D12, F11, G2 및 G4)의 mAbs를 선택되었다.
도 12는 백신-유도된 마우스 단클론 IgGs에 결합하는 MERS-CoV S1, MERS-CoV RBD, 및 MERS-CoV S2 분자들의 옥텟 바이오센서그램(Octet Biosensorgrams) 을 보여준다. 마우스 단클론 항체들을 AMC 프로브(probes)에 넣고 MERS-CoV 항원과 연합되도록 300초간 놓아두고, 이어서 300초간 분리하게 하고 그 반응을 Octet Red 384 기계를 사용하여 nm로 측정하였다. G4에 대한 S2의 결합은 인간- Fc-S2를 AHC 프로브에 넣고 여러 농도의 G4 Fab와의 연합력을 측정함으로서 측정하였다. 고형 흑색선들은 1:1 결합 모델에 가장 잘 맞는 키네틱 데이터를 표시한다. 모든 실험들은 비특이적인 결합을 최소화하기 위해 1% BSA가 보충된 PBS 버퍼(pH 7.4) 에서 30℃ 에서 수행되었다. 점선은 분리 시작을 표시하며 설명은 사용된 MERS-CoV 항원 및 G4 Fab 농도를 표시한다.
도 13은 MERS-CoV 감염된 세포에 특이적인 단일 클론 항체들(mAb)의 면역형광을 보여준다. MERS-CoV (EMC 균주)-감염된 베로세포(Vero cells)에 결합하는 분리된 mAbs D12, F11, G2 및 G4에 대한 Red Alexa Fluors 546 신호는 연속적인 희석으로 0.00125 μg/μl 까지 희석될 정도로 강하다. 보라색 영역은 베로 세포의 핵을 표시하며 컨트롤로 0 μg/ml 의 mAb 농도를 사용하였다.
도 14A-14C는 MERS-CoV 스파이크 당단백질 mAbs 의 특이성을 보여준다. (A) 단백질 경쟁 중화 에세이. 일회 희석한 mAbs 를 0.016-50 μg/ml의 농도의 가용성 MERS-CoV RBD, S1 및 S2 단백질 존재하에서 MERS-CoV England1 슈도바이러스에 대한 중화력 에세이를 하였다. (B, C) MERS-CoV 나 돌연변이 슈도타입에 대한 mAbs 의 중화력을 표준오차와 함께 3 샘플의 평균으로 표시한 대로 검정하였다. 두 번 반복 실험의 대표적 하나를 보여준다.
도 15A-15C는 D12 및 F11의 MERS-CoV RBD 와의 상호작용 평가를 보여준다. (A) D12 및 F11는 RBD 의 DPP4에의 결합을 직접 막는다. 마우스 단클론 항체들 D12 및 F11를 AMC 프로브에 300초간 넣고 MERS-CoV RBD 와의 연합을 300초간 하게 하고, 이어서 가용성 DPP4 와 300초 동안 배양시키고 그 반응을 Octet Red 384 기계를 사용하여 nm로 측정하였다. (B)MERS CoV RBD에는 다중 중화 에피톱들이 용이하다. MERS CoV RBD를 항-펜타-HIs 프로브에 300초 동안 넣고 이어서 D12 및 F11 mAbs 와 연속적인 결합을 하도록 하였다. (C) 가용성 DPP4는 RBD의 D12 및 F11에 대한 결합을 방해한다. MERS CoV RBD를 항-펜타-HIs 프로브에 300초 동안 넣고 이어서 DPP4 와 D12 또는 F11 mAbs 와 연속적인 결합을 하도록 하였다. 모든 실험들은 비특이적인 결합을 최소화하기 위해 1% BSA가 보충된 PBS 버퍼(pH 7.4) 에서 30℃에서 수행되었다. 점선은 각 실험에서 두 번째 및 세 번째 리간드와의 배양 시작을 표시한다.
도 16A-16D는 바이러스의 수용체와의 상호작용하는 영역을 효과적으로 막는 SARS-CoV 중화 항체의 발표된 구조를 보여준다. (A)　수용체 결합 모티브(RBM)를 가진 SARS 수용체 결합 도메인 및 ACE2 수용체를 만화형식으로 표시한다. ACE2 상호작용하는 영역은 SARS RBD (표면 표시, 회전된)에 위치되었다. ACE2 글라이칸과 상호작용하는 RBD 영역을 보여준다. (B-D) SARS RBD 및 M396 Fab (Prabakaran et al., J Biol Chem 281, 15829, 2006; Zhu et al., PNAS 104, 12123, 2007), F26G19 Fab (Pak et al., J mol biol 388, 815, 2009) 및 80R Fv (Hwang et al., J biol chem 281, 34610, 2006)가 만화형식으로 표시된다. 항체 상호작용하는 영역이 RBD에 위치되었다.
도 17은 백신화된 사람이-아닌 영장류(NHPs)로부터 얻은 혈청이 쥐 단클론 항체의 MERS-CoV 스파이크 단백질에의 결합을 막는 것을 보여준다. 백신화 된 세 그룹으로부터 얻은 혼합된 NHP 혈청을 연속적으로 희석하여 바이오티닐화(biotinylated)된 단클론 항체 F11, D12, G2, G4와 경쟁적으로 MERS-CoV S1 또는 S-dTM (for mAb G4)에 대한 결합력을 테스트하였다. 퍼센트 억제력을 보여준다.
도 18A-18C는 MERS-CoV 로 공격(challenged) 시킨 사람-아닌 영장류(NHPs)의 폐의 3차원 컴프티드 토모그래피 (computed tomography) (CT) 영상이다. 면역화시키지 않은 NHPs (A) 및 S DNA/S1 단백질로 (B) 또는 S1 단백질/S1 단백질로 면역화시킨 (C) NHPs 의 바이러스로 공격하기 이전 및 공격 후 3, 6, 9, 및 14일에 가슴 CT 이미지를 찍게 하였다. 2차원 관상 CT 이미지 및 3차원 재구성이미지에서 면역화시킨 NHPs에 비해 면역화시키지 않은 NHPs 의 폐에서 비정상적인 폐의 (침윤, 경화, 불투명유리 불투명성) 페센트가 더 컸음을 보여준다.
도 19A-19D는 사람-아닌 영장류(NHP) 항-MERS-CoV 항체 반응이 공격 후 어떻게 증가하는지를 보여주지만 이는 폐질환과는 연관이 있지 않다는 것을 보여준다. (A) ELISA IgG 항체 타이터 및 (B) 중화 타이터 모두 MERS-CoV 의 공격 후 높아졌다. 컴프티드 토모그래프(computed tomography)상에서 퍼센트 비정상 폐 부피로 측정했을 때 공격한 날(C) 또는 피크인날 (마지막 부스터 후 2주)(D)의 NHP 혈청의 중화 타이터와 폐질환과의 의미 있는 상관관계는 없었다. 피어슨 상관 계수(Pearson correlation coefficients) 및 해당하는 P 값을 정하기 위해 그래프드 프리즘 6 (Graphpad Prism 6)을 사용하였다.
도 20은 MERS-CoV RBD (England1 균주)와 함께 있는 D12 Fab의 결정구조를 위한 데이터 수집 및 결정구조 보정 통계를 보여준 표이다.
도 21A-21C는 RBD와 함께 있는 D12 Fab의 결정구조로부터 측정한 D12 항체와 MERS-CoV S 단백질 RBD (England1 균주)와의 상호작용을 보여주는 표들 셋트이다.
도 22는 MERS-CoV S 단백질의 구조 및 특이성 (RBD, S1 (non-RBD), 또는 S2)을 제시하는 그래프와 개략적 도표이며 동정된 S 단백질 특이 항체들의 소스이다.
도 23은 동정된 NHP 항체들 (JC57-11, JC57-14, JC57-13, FIB_B2, 및 FIB_H1), 인간 항체들 (C2, C5, A2, 및 A10), 및 쥐 항체들 (D12, F11, G2 및 G4)의 중화 활성을 보여주는 그래프 셋트이다. 중화 활성은 예들에서 서술된 대로 MERS-CoV EMC 균주에 대한 슈도바이러스 중화 에세이를 사용하여 검정하였다.
도 24는 JC57-11, JC57-14, C2, 및 C5 항체들의 중화 활성을 보여주는 그래프 셋트를 보여준다. 중화 활성은 제시된 MRES-CoV 균주에 대한 슈도바이러스 중화 에세이를 사용하여 검정하였다.
도 25는 A2, JC57-13, A10, 및 G2 항체들의 중화 활성을 보여주는 그래프 셋트를 보여준다. 중화 활성은 제시된 MRES-CoV 균주에 대한 슈도바이러스 중화 에세이를 사용하여 검정하였다.
MERS-CoV 는 매우 급성인 호흡기 감염의 원인이 되는 것으로 나타났다. 높은 치사율, 모호하게 정의된 역학, 및 이 새로운 바이러스에 대한 예방적 또는 치료적 벙법이 없다는 것은, 감염이 일어나면 전 지역적에 고루 퍼지므로, 효과적인 백신을 긴급히 필요하게 하였다.
코로나바이러스 백신 개발을 위한 과거의 노력들을 사용하여 전체-불활성화된 바아러스, 살아있는-약화된 바이러스, 재조합 단백질 서브유닛, 또는 유전적 방법(Graham et al., Nature reviews. Microbiology 11, 836, 2013)들 을 사용했다. 본 공시는 MERS-CoV 스파이크 당단백질(S)에 근거한 면역화 전략을 제공한다. 제한적이지 않은 예에서, 전장-S DNA 프라임 및 S1 서브유닛 부스트를 포함하는 프라임-부스트 면역화 전략은 몇몇의 서로 다른 MERS-CoV 균주에 대한 높은 중화 항체 타이터를 끌어내는 것으로 나타났다. 전장 S를 발현하는 DNA와 이어서 S1 서브유닛 단백질로 면역화하는 방법은 생쥐와 NHPs에서 모두 강력한 중화 mAbs 를 생산하게 하였다 단백질만으로만 하는 것에 비해, S DNA 프라임/S1 단백질로의 면역화는 것이 기능적으로 다양한 중화 항체의 레파도아(repertoire)를 생산하며 또한 Th1-근거한 면역 반응을 생기게 한다.
백신-유도된 쥐 단클론 항체들도 동정되었으며 수용체 결합 도메인(RBD), S1, 또는 S2의 다중 비-RBD 부분들을 타겟팅 함으로서 바이러스를 중화하는 것으로 나타났다.
I. 용어의 요약
별도로 적지 않는 한 기술적인 용어들은 일반적인 사용법에 따라 사용되었다. 분자 생물학에서 쓰이는 보통 용어들의 정의들은 2009년에 Jones & Bartlett 출판사에서 발행된 Benjamin Lewin, Genes X : 및 2008년 Wiley-VCH에 의해 16 권으로 발행된 Meyers et al. (eds.), The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine 및 그외 비슷한 다른 참고 문헌에서 발견할 수 있다.
여기서 사용된 대로, 단수형들 "a," "an," 및 "the"는 달리 분명하게 제시하지 않는 한 단수뿐만 아니라 복수형도 의미한다. 예를 들어, "an antigen"이라는 용어는 단수 또는 복수의 항원들을 포함하며 "적어도 하나의 항원(at least one antigen)"이라는 구절과 동등하다고 간주 될 수 있다. 여기서 사용된대로, "구성된다(comprises)"는 "포함한다(includes)"를 의미한다. 또한 더나가 핵산들이나 폴리펩타이드에 주어진 어떤 또는 모든 염기의 크기들 또는 아미노산 크기들, 및 분자무게 또는 분자량 값들은 대략적인 것이며, 특별히 제시하지 않는 한, 서술적 목적으로 제공된다. 여기에 서술된 것과 같은 많은 방법들 및 재료들이 사용될 수 있다 할지라도, 특별한 적절한 방법들 및 재료들이 여기에 서술된다. 분쟁이 있을 경우, 용어의 설명을 포함하여, 본 발명 명세서가 조정할 것이다. 그 외에, 재료들, 방법들, 및 예들은 예시적인 것일 뿐이고 제한적인 의도는 없다. 여러 가지 예시들의 평가를 촉진하기 위해, 용어들에 대해 다음과 같은 설명을 제공한다:
보조제(Adjuvant): 항원성(antigenicity)을 높이기 위해 사용되는 운반 수단. 보조제에는 항원이 흡착되는 미네랄(명반, 수산화 알루미늄 또는 인산염)의 현탁액; 또는 때로 항원성을 더욱 강화하기 위해(항원의 분해를 억제 및/또는 마크로파지의 유입을 유발하기 위해) 사멸한 마이코박테리아(Freund incomplete adjuvant)를 첨가하여 항원 용액을 미네랄 오일(Freund incomplete adjuvant)에 유화시킨 경우, 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion)을 포함한다. 면역 자극(Immunostimulatory) 올리고 뉴클레오티드(예: CpG 모티프를 포함)는 또한 보조제로서 사용될 수 있다. 보조제에는 보조 자극 분자와 같은 생물학적 분자("생물학적 보조제(biological adjuvant)")가 포함된다. 예시적인 보조제는 IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L, 4-1BBL 및 톨 수용체(TLR) 작용제, 예컨대 TLR-9 작용제를 포함한다. 당업자는 보조제에 익숙하다(예컨대, Singh (ed.) Vaccine Adjuvants and Delivery Systems, Wiley-Interscience, 2007 참조). 보조제는 개시된 MERS-CoV 면역원과 조합하여 사용될 수 있다.
투여(Administration): 개체에 조성물을 선택한 루트로 주입하는 것. 투여는 국소적 또는 전저신적 일수 있다. 예를 들면, 선택된 루트가 정맥주사라면, 조성물은 (공개되는 면역원 또는 항체를 포함하는 조성물과 같은) 개체의 정맥으로 조성물을 주입하여 투여된다. 전형적인 투여 루트에는, 이것만 국한한 것은 아니고, 경구, 주사(피하, 근육, 내피, 복강내, 및 정맥 등과 같은), 설하, 직장, 경피(예를 들어, 국부), 비강내, 질내, 및 흡입 루트를 포함한다.
제제(Agent): 목적 및 결과를 달성하는데 유용한 어떤 자료 또는 자료들의 어떤 조합; 예를 들어, 개체에 MERS-CoV 감염을 억제하는데 유용한 물질 또는 물질들의 조합. 제제에는 단백질, 핵산 분자, 화합물, 소분자, 유기화합물, 무기화합물, 또는 관심 있는 다른 분자들을 포함한다. 제제에는 치료제제(항-레트로바이러스 제제와 같은), 진단제제, 또는 약물 제제를 포함할 수 있다. 어떤 예시에서는, 제제는 단백질 제제 (재조합 MERS-CoV 폴리펩타이드 또는 이의 면역성 단편, 또는 MERS-CoV-특이 항체와 같은), 또는 항-바이러스 제제이다. 이 분야 전문가는 특정 제제들이 하나 이상의 결과들을 성취하기 위해 유용할 것이라는 것을 이해할 것이다.
아미노산 대체(Amino acid substitution): 폴리펩타이드에서 한 개의 아미노산을 다른 아미노산으로 바꾸거나 또는 없애는 것(즉, 삭제). 어떤 예에서는, 한 폴리펩타이드의 한 개의 아미노산이 비슷한 폴리펩타이드(homologous polypeptide)의 아미노산으로 대체된다. 예를 들면, 재조합 MERS-CoV 폴리펩타이드에 있는 한 아미노산이 다른 MERS-CoV 균주의 그에 해당하는 아미노산 으로 대체 될수 있다.
항체(Antibody): MERS-CoV S 단백질 또는 이의 항원성 단편과 같은 항원 (analyte)에 특이적으로 결합하고 인식하는 폴리펩타이드. "항체"라는 용어는 여기서 가장 넓은 의미로 사용되며, 요구되는 항원-결합 활성만 보여 주기만 하면, 이에만 국한하지 않고, 단클론 항체, 다클론항체, 다중특이성 항체(예: 이중특이성 항체), 및 이들의 항원 결합 단편을 포함한 여러 항체 구조들을 포함한다. 제한 없이 항체의 예들에는, 예를 들어, 면역글로불린 (immunoglobulins)전체 및 변이체 및 항원 결합 친화력을 유지하고 있는다고 이 분야에서 알려진 이들의 단편이 포함된다.
"단클론 항체(monoclonal antibody)"는 상당히 동질성이 있는 항체들 집단으로부터 얻어진 항체이다, 즉 집단을 이루는 각 개개의 항체들은 아주 적은 양으로 존재할 수도 있는 자연적으로 일어나는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체들은 단일 항원 에피톱에 대하여 정해진 것이므로 매우 특이적이다. "단클론"이란 수식어는 항체의 특징이 상당히 균일한 집단의 항체로부터 얻어졌음의 의미하며, 어떤 특정한 방법으로 항체를 생산하는 것이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안 된다. 어떤 예들에서는, 단클론 항체는 B-임파구의 단일 클론에 의해 생산되는 항체이거나, 또는 단일 항체의 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역 (또는 이들의 항원결합 단편)을 코딩하는 핵산이 감염된 세포 또는 이의 후속 세포들에 의해 생산되는 항체이다. 어떤 예들에서는 단클론 항체는 개체로부터 분리된다. 단클론 항체는 항원 결합이나 다른 면역글로빈 기능들에 상당한 영향력을 주지 않는 아미노산으로 보수적으로 대체할 수 있다. 단클론 항체들을 생산하는 전형적인 방법이 알려졌다(예를 들어, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Publications, New York (2013)를 참조한다).
전형적으로, 면역글로빈은 중쇄(H) 및 경쇄(L)가 이황화 결합으로 서로 연결되어 있다. 면역글로빈 유전자에는 카파(kappa), 람다(lambda), 알파(alpha), 감마(gamma), 델타(delta), 입실론(epsilon) 및 뮤(mu)를 포함하며, 또한 무수한 면역글로빈 가변 도메인 유전자들도 포함한다. 경쇄에는 두 가지 타입, 람다(lambda, λ)및 카파 (kappa,κ)가 있다. 항체분자의 기능성을 결정하는 주 중쇄 부류(또는 아이소타이프)에는 다섯 가지가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE.
각 중쇄 및 경쇄는 고정 영역(또는 고정 도메인) 및 가변 영역(또는 가변 도메인, 예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6.sup.th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)를 참조)을 포함한다. 몇몇의 예시에서, 중쇄 및 경쇄 가변영역들은 항원에 특이적으로 붙기 위해 결합한다. 다른 예시들에서는, 중쇄 가변영역만 필요로 한다. 한 예로, 자연적으로 존재하는 중쇄로만 구성된 카멜리드(camelid) 항체는 경쇄 없이도 기능을 하며 안정적이다(예를 들면, Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448, 1993; Sheriff et al., Nat. Struct . Biol., 3:733-736, 1996 를 참조). "VH" 또는 "VH" 참조라는 말은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab와 같은 항원 결합 단편의 가변영역을 포함하는 항체 중쇄의 가변 영역을 의미한다. "VL" 또는 "VL" 참조라는 말은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab의 가변영역을 포함하는 경쇄 항체의 가변영역을 의미한다.
경쇄 및 중쇄의 가변영역들은 "상보성-결정 영역(complementarity-determiningregions)", 또는 "CDRs"이라고도 불리우는 세 개의 매우 가변적인 영역으로 차단된 "프레임워크 (framework)"영역을 포함한다(예를 들어, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991을 참조). 다른 경쇄 및 중쇄 의 프레임워크 영역들의 서열들은 종(species)내에서는 상대적으로 보존되어 있다. 한 항체의 프레임워크 영역은, 즉 구성요소인 경쇄 및 중쇄의 혼합된 프레임워크 영역은, CDRs이 3차원 공간에서 위치를 잡고 정렬하게 하도록 한다.
CDRs 은 주로 항원의 에피톱에 결합하는 책임이 있다. 주어진 CDRs의 아미노산 서열의 경계는 Kabat 등에("Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; "Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (JMB 273,927-948, 1997; "Chothia" numbering scheme), 및 Lefranc et al. ("IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003; "IMGT" numbering scheme) 의해 서술된 방법을 포함한 잘 알려진 여러 스킴들 중 어느 것을 사용해서 쉽게 결정할 수 있다. 각 체인의 CDRs 은 전형적으로 CDR1, CDR2, 및 CDR3 (N-말단으로부터 C-말단으로)으로 불리우며, 특정한 CDR이 위치해 있는 체인에의 전형적으로 동정된다. 그러므로, VH CDR3 는 이것이 발견된 항체 중쇄 가변 도메인으로부터 온 CDR3 이며, 반면에 VL CDR1은 이것이 발견된 항체 경쇄 가변 도메인으로부터 온 CDR1 이다. 경쇄 CDRs은 때로는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 라고도 불리운다. 중쇄 CDRs은 때로는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 라고도 불리운다.
"항원 결합 단편"은 해당 항원을 특이적으로 인식하는 능력을 유지하고 있는 전장 항체의 한 부분이며, 또한 이러한 부분들의 여러조합들이다. 항원 결합 단편들의 제한적이지 않은 예들에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디( diabodies); 선상 항체(linear antibodies): 단쇄 항체분자 (single-chain antibody molecules)(예를 들어 scFv); 및 항체 단편들로부터 생성된 다중 특이성 항체(multispecific antibodies)가 포함된다. 항체 단편들에는 전체 항체를 수정하여 생산하거나 또는 재조합 DNA 방법으로 새로 합성한 (예를 들어, Kontermann and Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2nd Ed., Springer Press, 2010를참조)항원 결합 단편들이 포함된다.
단쇄 항체(scFv)는 유전학적으로 융합된 단쇄 분자로서 적절한 폴리펩타이드 링커로 연결된 하나 또는 그 이상의 항체들의 VH 및 VL 도메인을 함유하는 유전공학적으로 만들어진 분자이다(한 예로, Bird et al., Science, 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 85:5879-5883, 1988; Ahmad et al., Clin. Dev . Immunol ., 2012, doi:10.1155/2012/980250; Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010 를 보시오). scFv 에서 VH-도메인 및 VL-도메인의 분자 내의 배열은 scFvs 에서는 전형적으로 결정적이지는 않다. 그러므로, 두 가지 가능한 배열 (VH-도메인-링커도메인-VL-도메인; VL-도메인-링커도메인-VH-도메인) 모두 사용될 수 있다.
dsFv 에서는 중쇄 및 경쇄 가변 체인들은 체인들의 연합을 안정화시키기 위해 이황화 결합을 도입시켜 변이시켰다. 디아바디(Diabodies)들도 포함되는데, 이들은 2가이며, VH 및 VL 도메인들이 단일 폴리펩타이드 체인에 발현되고 있지만 동일 체인에 있는 두 도메인 사이에 짝을 이루기에는 너무 짧은 링커를 사용하였기 때문에, 다른 체인에 있는 상보적인 도메인과 짝을 이루도록 하는 2중 특이적인 항체이다(예를 들어, Holliger et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 90:6444-6448, 1993; Poljak et al., Structure, 2:1121-1123, 1994를 참조).
항체에는 키메릭 항체 (chimeric antibodies) (인간화 쥐 항체와 같은) 및 헤테로컨주게이트 항체 (heteroconjugate antibodies) (이중특이적 항체와 같은)와 같은 유전공학적으로 만들어진 형태도 포함된다. Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997 도 보시오.
자연에는 존재하지 않는 항체도 고체상 펩타이드 합성(solid phase peptide synthesis)을 사용하여 만들 수 있으며, 재조합적으로 생산할 수 있으며, 예를 들면 여기 참고 문헌에 포함된 Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989) 에서 서술된 대로 가변 중쇄 및 가변 경쇄로 구성된 조합 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수도 있다. 예를 들면 키메릭, 인간화, CDR-이식된, 단일체인 및 이중기능 항체들을 만드는 이러한 및 다른 방법들은 이 분야의 전문가들에는 잘 알려져있다 (Winter and Harris, Immunol. Today 14:243-246 (1993); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); Harlow and Lane, supra, 1988; Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995); 이들 각각은 여기서 참고문헌으로 포함 되었다).
참고 항체로서 "같은 에피톱에 결합하는 항체"라는 것은 경쟁 에세이에서 참고 항체가 그의 항원에 결합하는 것을 50% 또는 그 이상을 차단하는 항체를 의미하며, 반대로, 경쟁 에세이에서 참고 항체가 그의 항원에 결합하는 항체의 결합을 50% 또는 그 이상을 차단하는 것을 의미한다. 항체 경쟁 에세이는 알려져 있으며, 전형적인 경쟁 에세이는 여기에서 제공된다.
"인간화" 항체 또는 항원결합 단편에는 인간 프레임워크 영역 및 비-인간( 생쥐, 쥐, 또는 합성)항체로부터 온 하나 또는 그 이상의 CDRs 또는 항원결합 단편을 포함한다. 비-인간항체 또는 CDRs을 제공하는 항원 결합 단편은 "공여자 (donor)" 로 불리며 인간 항체 또는 프레임워크를 제공하는 항원 결합 단편은 "수용자 (acceptor)" 로 불린다. 한 예시에서, 인간화 면역글로빈에서 모든 CDRs은 공여자 면역글로빈에서 온다. 불변 영역(constant regions)은 존재하지 않아도 되며, 그러나 만약 존재한다면, 인간 면역글로빈 불변영역과 적어도 약 85-90% 와 같이, 약 95% 와 같이 상당히 동일하거나 또는 좀 더 동일할 수 있다. 그러므로, 인간화 항체의 모든 부분들 또는 가능한 한 CDRs을 제외한 항원 결합 단편들은 자연적인 인간항체 서열의 해당 부분과 상당히 동일하다.
"키메릭 항체(chimeric antibody)"는 두 개의 다른 항체, 전형적으로 다른 종, 로부터 유래 된 서열을 포함하는 항체이다. 어떤 예들에서는, 키메릭 항체는 한 인간 항체로부터 온 하나 또는 그 이상의 CDRs 및/또는 프레임워크 영역과 다른 인간 항체로부터 온 CDRs 및/또는 프레임워크 영역을 포함한다.
"온전 인간항체(fully human antibody)" 또는 "인간 항체"는 인간유전체 (human genome)로 부터 온 (또는 유래한) 서열을 포함하고, 다른 종으로부터 온 서열은 포함하지 않은 항체이다. 어떤 예시에서는, 인간항체는 인간유전체 (human genome)로 부터 온 (또는 유래한) CDRs, 프레임워크 영역, 및(만약 존재한다면) Fc 영역을 포함한다. 인간 항체들은 예를 들어 파지디스플레이(phage display) 또는 형질전환 동물들을 사용하여 인간유전체로부터 유래한 서열에 근거하여 만드는 항체 기술을 사용하여 동정하고 분리할 수 있다 (예를 들어, Barbas et al. Phage display: A Laboratory Manuel. 1st Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004. Print.; Lonberg, Nat. Biotech., 23: 1117-1125, 2005; Lonenberg, Curr. Opin. Immunol., 20:450-459, 2008를 보시오).
항체는 하나 또는 그 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 만약 한 개 이상의 결합 부위가 있다면, 그 결합 부위들은 서로 동일하거나 또는 다를 수 있다. 예를 들어, 자연에 존재하는 면역글로빈은 두 개의 동일한 결합 부위, 단쇄 항체 또는 Fab 단편은 하나의 결합 부위 가지며, 반면에 이중특이성 또는 이중기능성 항체는 두 개의 다른 결합 부위 갖는다.
항원(Antigen): 동물에서 항체생산을 자극할 수 있거나 T-세포 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 또는 소재로서, 동물에게 주사하거나 또는 흡수될 수 있는 조성물들을 포함한다. 항원은 특정한 체액 또는 세포 면역의 산물과 반응하며, 이 산물에는 공시하는 MERS-CoV 항원과 같은 이질적인 항원들에 의해 유도되는 산물을 포함한다. 항원의 예에는, 이것에만 국한하지 않으나, 폴리펩타이드, 펩타이드, 지질, 다당류, 이들의 조합(당펩타이드와 같은) 및 면역세포에 의해 인식되는 것과 같은 항원 결정부위를 포함하는 핵산을 포함한다. 어떤 예들에서는, 항원은 MERS-CoV와 같은 관심 있는 병원균으로부터 유래된 펩타이드를 포함한다. 항원은 하나 또는 그 이상의 에피톱을 포함한다.
코돈-최적화된( Codon -optimized): "코돈-최적화된" 핵산은 특정한 시스템 (특정한 종 또는 종의 그룹 그룹과 같은) 에서 발현이 최적화 되도록 코돈이 변경된 핵산서열을 의미한다. 한 예로, 핵산 서열은 포유류 (사람과 같은)에서 발현을 위해 최적화 될수 있다. 코돈-최적화는 코딩하는 단백질의 아미노산 서열은 변경시키지 않는다.
면역 복합체를 형성하는데 충분한 조건들(Conditions sufficient to form an immune complex): 항원 또는 이의 항체결합 단편이 모든 상당히 다른 에피톱들과 결합하는 것보다, 및/또는 상당히 제외하는 것보다, 탐지할 수 있도록 큰 정도로, 이의 해당 에피톱에 결합하도록 하는 조건. 면역 복합체를 형성하는데 충분한 조건들은 결합 반응의 형태에 의존하며 전형적으로 면역에세이 프로토콜에 사용되는 조건들 또는 생체에서 마주치는 조건들이다. 면역에세이 형태 및 조건들의 서술을 위해 Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Publications, New York (2013)을 보시오. 방법에서 사용되는 조건들은 전형적으로 살아 있는 포유류 또는 포유류 세포 내에 있는 참조된 조건(예, 온도, 삼투압, pH)들을 포함한 "생리적 조건들"이다. 어떤 기관들은 극한 조건에 있을 수도 있는것을 인식하지만, 기관내 및 세포내 환경은 정상적으로는 pH 7 주변 (예, pH 6.0 에서 pH 8.0, 더 전형적으로는 pH 6.5 에서 7.5)에 놓여 있으며, 물을 우세적인 용매로 함유하고 있으며, 0℃ 이상 및 50℃ 아래 온도에서 존재한다. 삼투압은 세포 생존 및 증식을 지원하는 범위 내에 있다.
접합(Conjugate): 두 분자가 서로 연결된, 예를 들면, 공유결합으로 서로 연결된, 복합체. 어떤 예시에서는, 한 항체가 작동체 (effector)분자 또는 검출 마커에 연결된다; 예를 들면, MERS-CoV에 특이적으로 결합하는 항체가 작동체 (effector)분자 또는 검출 마커에 공유적으로 연결된다. 연결은 화학적 또는 재조합 방법으로 될 수 있다. 한 예시에서, 연결이 화학적일 때, 항체 부분과 작동체 분자 사이의 반응으로 두 분자 사이에 공유결합을 만들게 하여 한 분자를 형성하게 하였다. 항체와 작동체 분자 사이에 선택적으로 펩타이드 링커(짧은 펩타이드 서열)를 포함하게 할 수도 있다. 접합은 항체와 작동체 분자와 같은 서로 다른 기능을 가진 두 분자들로부터 만들어질 수 있으므로, 이들은 때로는 "키메릭 분자(chimeric molecules)"라고도 불리운다.
보전적인 변이체 (Conservative variants): "보전적인" 아미노산 대체는 개체에 투여했을 때 면역 반응을 유도하는 단백질 활성과 같은 단백질의 기능에 영향을 주거나 감소시키지 않는 아미노산으로의 대체 이다. 예를 들면, 어떤 예시에서는 재조합 MERS-CoV S 단백질 또는 S1 단편에 해당하는 천연 MERS-CoV 단백질서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개까지 대체된 서열이 포함될 수 있으며 개체에서 MERS-CoV S 단백질에 대한 면역반응을 유도할 수 있다. 보존적 변이라는 용어는 또한 대체되지 않은 모체 아미노산 대신 대체 아미노산의 사용을 포함한다.
더 나가, 숙련된 일반 사람은 암호화된 서열(encoded sequence)에 한 개 아미노산 또는 적은 퍼센트의 아미노산 (예를 들어 5% 미만, 어떤 예시들에서는 1% 미만)이 변경되거나, 추가, 또는 삭제된 개별적 대체, 삭제 또는 추가 삽입은 보존적 변이들이라고 인식할 것이며 여기서 이 변경들은 화학적으로 비슷한 아미노산으로 대체된 결과이다.
기능적으로 비슷한 아미노산들을 보여 주는 보존적 아미노산 대체 표는 이 분야에 숙련된 일반 사람에 게는 잘 알려져있다. 다음의 여섯 그룹들은 서로 보존적인 대체로 간주 되는 아미노산들의 예들이다:
1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T)
2) 아스파르틱 에시트 (D), 글루타믹 에시드(E)
3) 아스파라긴 (N), 글루타민(Q)
4) 알기닌(R), 라이신(K)
5) 이소루이신(I), 루이신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및
6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W)
비-보존적인 대체는 개체에 투여했을 때 면역 반응을 유도하는 활성과 같은 단백질, 예, MERS-CoV S 단백질, 의 활성과 기능을 감소시키는 아미노산으로의 대체이다. 한 예로, 만약 한 아미노산 잔기가 그 단백질의 기능에 필수적이면, 그 외 다른 보전적 대체라도 그 활성을 방해할 수 있다. 그러므로, 보존적인 대체는 관심있는 단백질의 기본 기능은 변경시키지 않는다.
접촉(contacting): 직접적인 물리적 연관성을 갖게 놓아 두는 것; 고체 및 액체 형태 둘다 포함하며, 생체내 또는 실험관 내에서 일어나게 할 수 있다. 접촉은 한 분자와 다른 분자, 예를 들면, 다른 폴리펩타이드와 접촉하는 한 펩타이드와 같은 한 폴리펩타이드의 표면에 있는 아미노산 분자 사이에 접촉을 포함한다, 접촉은 예를 들어 폴리펩타이드를 세포와 직접적으로 물리적인 접촉을 하도록 하는 세포와의 접촉도 포함될 수 있다.
컨트롤(control): 표준 참조물. 어떤 예시에서는, 컨트롤은 건강한 환자로부터 얻은 음성적 컨트롤 샘플이다. 다른 예시에서는, MERS-CoV 감염으로 진단된 환자로 부터 얻은 양성적 컨트롤 샘플이다. 또 다른 예시들에서는, 컨트롤은 역사적인 컨트롤 또는 표준 참조 값 또는 값의 범위들이다(예를 들어, 알려진 예후 또는 결과를 가진 MERS-CoV 환자 그룹, 또는 기본 값 또는 정상값을 가진 샘플 그룹과 같은, 일전에 테스트된 컨트롤 샘플과 같은).
테스트 샘플과 컨트롤 샘플의 차이는 증가 또는 반대로 감소이다. 이 차이는 질적인 차이 또는 예를 들어, 통계적으로 의미 있는, 차이양적인 차이가 될 수 있다. 어떤 예들에서는, 차이는 컨트롤에 비해 적어도 약 5% 정도, 적어도 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%,또는 500% 이상 과 같은 증가 또는 감소이다.
변성된 변이(degenerate variant): 본 공시의 내용에서, "변성된 변이(degenerate variant)"는 폴리펩타이드 (MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역성 조각과 같은)를 암호화하는, 유전 암호 결과로 변성된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 20가지 자연 아미노산이 있으며, 이의 대부분은 한 개 이상의 코돈(암호)으로 특정화된다. 그러므로, 핵산 서열에 의해 암호화되는 한 펩타이드의 아미노산 서열이 바뀌지 않는 한, 펩타이드를 암호화하는 모든 변성 핵산 서열은 다 포함된다.
검출될만한 마커 (Detectable marker): 2차 분자의 검출을 촉진 시키기 위해 항체와 같은 2차 분자에 직접 또는 간접적으로 접합시킨 검출될 분자(또는 라벨으로도 알려졌다). 예를 들면, 검출될만한 마커는 ELISA, 스펙트로포토메트리(spectrophotometry), 풀루오사이토메트리(flow cytometry), 마이크로스코피 (microscopy) 또는 진단용 이미징 기술 (microscopy or diagnostic imaging techniques)((CT 스캔, MRIs, 초음파, 섬유광학적 검사(fiberoptic examination), 및 복강경 검사 (laparoscopic examination)와 같은) 로 검출될 수 있다. 특이적이고, 제한적이지 않는 검출될 만한 마커들에는 풀루오로포아 ( fluorophores), 화학 발광제(chemiluminescent agents), 효소링크제 (enzymatic linkages),방사성동이원소, 및 중금속 또는 화합물 (예를들어, MRI에 의한 검출을 위해 수퍼 파라마그네틱 철 옥사이드(super paramagnetic iron oxide) 나노크리스탈과 같은)들이 포함 된다. 한 예에서는, "레블된 항체"는 항체에 다른 분자가 병합된 것을 의미한다. 한 예로, 방사성 레블된 아미노산의 병합 또는 마크된 아비딘 (avidin)((예로, 광학적 또는 색 측정 방법으로 검출될 수 있는 형광 마커를 함유하는 스트랍타비틴 (streptavidin) 또는 효소활성))으로 검출될 수 있는 바이오티닐 잔기의 폴리펩타이드에의부착 된 것과 같은, 이 레블은 검출될만한 마커이다. 폴리펩타이드 및 당단백질 들을 레블링 하는 여러가지 방법들이 이분야에서 알려져 있으며 사용될 수 있다. 폴리펩타이드 레블 예에는, 이것에만 국한하지 않으나, 다음이 포함된다; 방사성 동이원소 또는 방사성 핵종 (35S 또는 131I 와 같은), 형광 레블((플루오레신 이소치아네이트 (fluorescein isothiocyanate )(FITC), 로다민(rhodamine), 렌타나이드 포스포아(lanthanide phosphors)와 같은)), 효소적 레블 (호스레디쉬 퍼옥시데이즈 (horseradish peoxidase), 베타-갈락토시데이즈 (beta-galacosidase), 루시페라제 (luciferase), 알카라인 포스파타제 (alkaline phosphatase)와 같은), 화학발광적 마커들, 바이오티닐 그룹들, 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 정해진 폴리펩타이드 에피톱들((루이신지퍼 쌍 서열(leucine zipper pair sequences), 2차 항체결합부위, 금속 결합 도메인들, 에피톱 태그)들과 같은), 또는 가도리늄 킬레이트 (gadolinium chelates)와 같은 자석 제제들. 어떤 예시들에서는, 잠재적인 입체 장애를 감소시키기 위해 여러 가지 길이의 스페이서 팔을 레블에 부착시킨다. 검출될만한 마커를 사용하는 방법들 및 여러 가지 목적에 적합한 검출될만한 마커를 선택하는 기준은 예를 들어 Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012) 및 Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, through supplement 104, 2013) 에서 논의되고 있다.
검출(detecting): 어떤 것들의 존재, 출현, 또는 있다는 것을 동정하는 것. 검출하는 일반적인 방법들은 전문가들에게는 알려져 있으며, 여기서 공시되는 프로토콜 및 시약들로 보충될 수 있다. 한 예로, 샘플 또는 개체에 있는 단백질의 레벨을 검출하는 방법들이 여기에 포함되었다.
작동체 분자( effector molecule): 키메릭 분자가 타겟으로 하는 세포에 바람직한 효과를 갖도록 하는 키메릭 분자의 한 부분. 작동체 분자는 작동체 잔기((EM), 치료제, 또는 진단제, 또는 비슷한 용어들로도 알려진다.
디펩티딜 펩티데이즈 4( Dipeptidyl peptidase 4)(DPP4 ): MERS-CoV의 세포 수용체로 작용하는 240 kDa 호모다이머, 타입II 멤브레인 당단백질. DPP4 는 대부분의 포유류 조직에 분포되어 있고, 신장, 간, 및 내피에 높이 발현되어 있다. DPP4 는 짧은 사이토플라즈믹 도메인, 멤브레인 통과 도메인 및 약 740 아미노산의 상대적으로 큰 세포 밖 (extracellular)(ectodomain) 서열을 포함한다. MERS-CoV S 단백질의 RBD는 타겟 세포 멤브레인과 융합되기 전에 DPP4의 세포밖 (extracellular)도메인에 결합한다. 전형적인 인간 DPP4 아미노산 서열이 저장번호 NP_001926.2로 GenBank에 제공되며, 그 전부가 여기에 참고문헌으로 포함된다.
에피톱 ( epitope ): 항원 결정자. 이들은 특이적인 면역 반응을 일으키게 하는 것과 같은 항원성이 있는 분자에 있는 특이한 화학적 그룹들 또는 펩타이드 서열들이며, 한 예로, 에피톱은 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원영역이다. 항체는 MERS-CoV S 단백질에 있는 에피톱과 같은, 특별한 항원 에피톱에 결합할 수 있다.
발현(Expression): 핵산 서열의 전사 또는 번역. 예를 들면, DNA가 RNA 또는 RNA 절편으로 전사될 때 유전자가 발현되며, 이는 어떤 예들에서는 가공되어 mRNA로 된다. 유전자는 이의 mRNA가 단백질 또는 단백질 조각과 같은 아미노산 서열로 번역 될 때 또한 발현되기도 한다. 특별한 한 예에서, RNA로 전사될 때 이종구조의 유전자가 발현된다. 다른 예에서는, 이의 RNA가 아미노산 서열로 번역될 때 이종구조의 유전자가 발현된다. "발현"이라는 용어는 여기서 전사나 번역을 의미하는데 사용된다. 발현의 조절은 전사, 번역, RNA 수송 및 가공, mRNA와 같은 중간 분자들의 분해를 조절하거나, 또는 생성된 후에 활성화, 비활성화, 분획화 또는 특이적인 단백질 분자들의 분해를 통해 조절하는 것을 포함할 수 있다.
발현 컨트롤 서열 (expression Control Sequences); 이종 핵산 서열의 발현이 조절되도록 하는 운영상으로 연결되어 있는 핵산서열. 발현 컨트롤 서열들이 핵산 서열의 전사 및 적절한 번역을 컨트롤하고 조절할 때 발현 컨트롤 서열들은 운영적으로 핵산 서열에 연결되어 있다. 그러므로, 발현 컨트롤 서열은 적절한 프로모토, 인핸서(enhancers), 전사종결자, 단백질-암호화하는 유전자 앞에 시작코돈(ATG), 인트론의 절개신호, mRNA가 적절한 번역이 되도록 제대로 된 리딩 프래임 (reading frame)의 유지, 및 종결코돈을 포함할 수 있다. "컨트롤 서열"이라는 용어는, 적어도, 이 서열의 존재가 발현에 영향을 줄 수 있는 성분을 포함하려는 의도이며, 또한 이 서열의 존재가 유리한 추가적인 성분, 예를 들면, 리더 서열 및 융합파바트너 서열을 포함할 수도 있다. 발현 컨트롤 서열은 프로모터를 포함할 수 있다.
프로모터는 전사를 지시하기에 충분한 최소의 서열이다. 또한 프로모터 의존적인 유전자 발현이 세포-타입 특이적, 조직-특이적 조절이 될수 있도록, 또는 외부의 신호나 제제에 의해 유도되도록 하는데 충분한 프로모터 요소들도 포함된다; 이런 요소들은 유전자의 5' 또는 3' 영역에 위치할 수 있다. 항상성 및 유도성 프로모터 모두 포함된다 (예를 들어, Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987를 보시오). 예를 들어, 박테리아 시스템에서 클로닝 할 때, 박테리오 파지 람다 (bacteriophage lambda)의 pL, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac hybrid 프로모터) 및 이와 유사한 것과 같은 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 한 예시에서, 포유류 세포 시스템에서 클로닝 할 때는, 포유류 세포의 유전체로부터 (metallothionein 프로모터와 같은) 유도되거나, 또는 포유류 바이러스 ((레트로바이러스 롱 터미날 리피트(retrovirus long terminal repeat); 아데노 바이러스 후기 프로모토; 박시니아 바이러스 (vaccinia virus) 7.5K 프로모터와 같은))로부터 유도된 프로모터가 사용될 수 있다. 핵산 서열의 전사를 제공하기 위해 재조합 DNA 및 합성 기술로 생산된 프로모터가 사용될 수도 있다.
폴리뉴클레오타이드는 삽입된 호스트의 유전자 서열을 충분히 전사하도록 촉진시키는 프로모터 서열을 포함하는 발현 벡터에 삽입될 수도 있다. 발현 벡터는 전형적으로 복제 기원점, 프로모터는 물론, 형질 전환된 세포의 표현형을 선택할 수 있게 하는 특정한 핵산 서열을 포함한다.
발현 벡터(expression vector): 발현이 될 핵산서열에 발현컨트롤 서열이 작동적으로 연결되어 있게 구성된 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터. 발현 벡터는 발현을 위해 충분한 시스-액팅 요소(cis- acting elements)로 구성된다; 발현을 위한 다른 요소들은 숙주 세포에 의해서 제공될 수 있거나 또는 실험관 내 발현 시스템으로 제공될 수 있다. 발현 벡터들에는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 병합하는 코스미드(cosmids), 플라즈미드(plasmids)(예, 단독으로 또는 리포좀에 포함되어) 및 바이러스 (예, 렌티바이러스(lentiviruses),레트로바이러스(retroviruses), 아데노바이러스(adenoviruses), 및 아데노 바이러스-연관된 바이러스 (adeno-associated viruses)) 등과 같은 이 분야에서 알려진 모든 것이 포함된다.
이종적 ( heterologous ): 다른 유전적 소스로부터 유래하는 그 핵산 분자가 발현되는 세포를 제외하고는 유전적 소스가 유래 된 세포와 이종적인 핵산 분자. 한 특정적인, 제한적이지 않은 예에서, 재조합 MERS-CoV 폴리펩타이드 또는 특정 항체를 암호화는 이종적 핵산분자가 포유류 세포와 같은 세포에서 발현된다. 이종적 핵산분자를 세포 또는 생물에 주입하는 방법들은, 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 리포획션 (lipofection), 입자 총 가속법 (particle gun acceleration) 및 상동 재조합(homologous recombination)을 포함한, 핵산으로 형질전환 하는 방법은 이분야에서는 잘 알려져 있다.
훼리틴 ( Ferritin ): 철은 저장하고 컨트롤 된 형식으로 방출하는 단백질. 이 단백질은 거의 모든 살아있는 생물들에서 생산된다. 훼리틴 폴리펩타이드들은 24개 단백질 서브유닛의 구형 단백질 복합체로 조합되며, 각 24개 서브유닛은 단일 훼리틴 폴리펩타이드를 포함한다. 어떤 예들에서는, 훼리틴은 그 표면에, 예를 들어, MERS-CoV 항원과 같은 항원을 제시하는 나노입자를 형성 하기 위해 사용된다.
숙주 세포(host cells): 벡터가 증식될 수 있고 DNA가 발현될 수 있는 세포. 이 세포는 비진핵세포 또는 진핵세포 일수 있다. 이 용어는 또한 개체 숙주 세포의 어떤 자손(progeny)도 포함한다. 복제되는 동안에 돌연변이가 일어날 수 있으므로모든 자손 세포들은 부모 세포와 동일하지 않을 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 그러나 "숙주세포" 라는 용어가 사용될 때는 그런 자손 세포들이 포함된다.
IgA : 알려진 면역글로빈 알파 유전자에 의해 주로 암호화되는 항체 부류에 속하는 폴리펩타이드. 사람에서는, 이 부류 또는 아이소타입은 IgA1 및 IgA2 이다. IgA 항체들은 모노머 (monomers), 대부분 다이머(dimeric) 형태인 폴리머 (polymers) (pIgA 라고 언급된다)및 분비형 IgA로 존재할 수 있다. 야생형 IgA의 고정 체인은 꼬리 조각(tp)이라고 불리는 18개 아미노산들이 확장되어 C-말단에 포함된다. 폴리머인 IgA는 꼬리 조각에 보전적인 시스테인 잔기를 통해 두 개의 IgA 모노머를 연결하는 J-체인이라고 불리는 15-kDa 펩타이드로 플라즈마 세포에 의해 분비된다.
IgG : 알려진 면역글로빈 감마 유전자에 의해 주로 암호화되는 항체 부류 또는 아이소 타입에 속하는 폴리펩타이드. 사람에서는, 이 부류에는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 가 포함된다. 생쥐에서는,이 부류에는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 .가 포함된다.
면역 복합체(immune complex): 항체 또는 항원결합 조각이 (scFv 와 같은) 용해성 항원에 결합하여 면역 복합체를 형성한다. 면역 복합체의 형성은 이 분야 전문가에는 알려진 전통적인 방법들, 예를 들면 면역조직학적방법 (mmunohistochemistry), 면역침강법 (immunoprecipitation), 플루오사이토메트리(flow cytometry), 면역형광 현미경법 (immunofluorescence microscopy), ELISA, 면역블럿팅 (immunoblotting) (예를 들어, 웨스턴 블럿(Western blot)), 자기공명 이미징 (magnetic resonance imaging), CT 스캔, X-ray 및 친화 크로마토그래피 (affinity chromatography)를 통해 검출될 수 있다. 선택된 항체들의 면역적 결합 성질들은 이 분야에서 잘 알려진 방법들을 사용하여 그 양을 측정할 수 있다.
면역 반응(Immune response): B 세포, T 세포, 또는 모노사이트 (monocyte) 와 같은 면역계의 세포들이 자극에 반응하는 것. 한 예에서, 이 반응은 특정한 항원 ("항원-특이 반응")에 특이적이다. 한 예에서, 면역 반응은 CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응과 같은 T 세포반응이다. 다른 예에서는, 반응은 B 세포 반응이며, 특이 항체들을 생산하는 결과를 가져온다. "면역 반응 강화"라는 것은 아주벤트 및 면역원성 제제를 동시에 투여하는 것을 말하며, 여기서 아주벤트는 아주벤트 없이 면역원성 제제를 개체에 투여했을 때에 비해 면역원 제제에 바람직한 면역반응을 증가시킨다.
면역원( immunogen ): 병원균으로 감염된 포유류 또는 감염 우려가 있는 포유류와 같은 포유류에서 면역반응을 유도할 수 있는 단백질 또는 이의 한 부분. 면역원 또는 이 면역원을 암호화하는 핵산의 투여는 관련 병원균에 대한 방어적 면역성 및/또는 예방적 면역성을 끌어낼 수 있다. 어떤 예들에서는, 이 면역원은 여기서 공시된대로 재조합 MERS-CoV S 단백질이다.
면역원성 조성물( immunogenic composition): 면역원성 폴리펩타이드, 또는 핵산분자, 또는 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터로 구성된 조성물로 면역원성 폴리펩타이드에 대항하여 측정가능 한 CTL 반응을 유도하거나, 또는 면역원성 폴리펩타이드에 대항하여 측정가능 한 B 세포 반응(항체 생산과 같은)을 유도한다. 한 예에서는, "면역원성 조성물"은 공시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 조성물로, MERS-CoV S 단백질에 대해 측정가능 한 CTL반응을 유도하거나, 또는 MERS-CoV S 단백질에 대해 측정가능 한 B 세포 반응 (항체 생산과 같은)을 유도한다. 이는 더 나아가 항원을 발현하기 위해 사용될 수 있는 (및 그래서 이 펩타이드에 대한 면역반응을 끌어 내는데 사용 되는)핵산과 같은 항원을 암호화하는 분리된 핵산을 의미한다.
실험관 내에서 사용되기 위해, 면역원성 조성물은 분리된 단백질 또는 단백질을 암호화하는 핵산분자를 포함하거나 구성될 수 있다. 생체 내 사용을 위해, 면역원성 조성물은 전형적으로 약학적으로 수용가능 한 케리어(carrier)에 단백질 또는 핵산분자를 포함할 것이며 또한 아주벤트와 같은 다른 제제들도 포함될 수 있다. MERS-CoV S 단백질 또는 이 단백질을 암호화하는 핵산과 같은 특정한 단백질은 이분야에서 인식된 에세이들로 CTL 또는 B 세포 반응을 유도하는 능력에 대한 테스트를 쉽게 할 수 있다.
분리된(Isolated): "분리된" 생물학적 성분(예를 들어 공시되는 면역원과 같은 단백질 또는 그런 항원을 암호화하는 핵산과 같은)은 그 성분이 자연적으로 있는 다른 생물학적 구성성분으로부터, 다른 염색체 및 염색체 이외 DNA, RNA, 및 단백질과 같은 것으로부터 상당히 분리되거나 정제되었다. 분리된 단백질, 펩타이드 및 핵산에는 표준 분리 방법들에 의해 정제된 단백질들이 포함된다. 이 용어는 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 단백질들 또는 펩타이드들은 물론 화학적으로 합성된 단백질들, 펩타이드들 또는 핵산 분자들을 포함한다. "분리된"은 절대적인 순도를 요구하지는 않으며, 적어도 50% 분리된, 적어도 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9%까지 분리된 것과 같은 단백질들, 펩타이드들 또는 핵산 분자들을 포함할 수 있다.
K D : 폴리펩타이드 리간드 또는 항체 항원 상호작용과 같은 주어진 상호작용에 대한 분리상수. 예를 들어, 항체 또는 항원결합조각과 면역원(MERS-CoV S 단백질과 같은)의 두분자 상호작용에서 KD 는 복합체 농도로 나눈 두 분자 상호작용의 각 구성성분의 농도이다.
링커(linker): 예를 들어, 케리어 분자를 면역원성 폴리펩타이드에 연결하는 것과 같은 두 분자들을 연속적인 한 분자로 연결하는데 사용될 수 있는 이중 기능성 분자. 펩타이드 링커들의 제한적이지 않은 예로 (GGGGS)x 링커와 같은 글라이신-세린 링커들이 포함된다.
"접합(conjugating)", "합류(joining)", "결합(bonding), 또는 링킹(linking)"은 두 분자들을 한 연속적인 분자로 만드는 것을 의미할 수 있다; 예로, 두 폴리펩타이드들을 하나의 연속적인 폴리펩타이드로, 또는 케리어 분자 또는 다른 분자들을 여기서 공시되는 것처럼 MERS-CoV S 단백질과 같은 면역원 폴리펩타이드에 공유결합으로 붙이는 것이다. 연결은 화학적 또는 재조합 방법일 수 있다. "화학적 방법"은 예를 들어, 면역원성 폴리펩타이드 잔기와 케리어 분자 사이에서 반응으로 두 분자 사이에 공유결합이 생성되어 한 분자로 형성되는 것을 의미한다.
중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 ((Middle East respiratory syndrome coronavirus ( MERS - CoV )): 베타코로나바이러스 (Betacoronavirus) 속의 양성-센스, 단일 가닥의 RNA 바이러스로서 심한 급성호흡기 감염의 매우 치명적인 원인으로 드러났다. 바이러스 유전체는 캡핑되고(capped), 폴리아데닐화 되고, (polyadenylated), 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid) 단백질로 쌓여 있다. MERS-CoV 비리온 (virion)은 커다란 스파이크 당단백질을 가진 바이러스 표피를 포함한다. MERS-CoV 유전체는 대부분의 코로나바이러스와 같이, 레프리카제 유전자(replicase gene)가 유전체 5'-쪽의 삼분의 이 (2/3)에 포함되고, 구조 유전자들이 유전체 3'-쪽 삼분의 일에 포함되어 있는 공통의 유전체 구조를 가진다. MERS-CoV 유전체는 5'-스파이크(S)- 표피(E)- 멤브레인(M) 및 뉴클레오켑시드 ((nucleocapsid (N))-3' 의 정통적인 구조 단백질 유전자 셋트를 암호화한다. MERS-CoV 유전체는 현재 Clade A 또는 Clade B MERS-CoV 로 분류된다. Clade A 또는 Clade B 바이러스의 예들에는 JordanN3/2012 (GenBank ID: KC776174) 및 England_Qatar/2012 (GenBank ID: KC667074) 균주가 각각 포함된다.
MERS-CoV 감염인 된 개체를 동정하는 방법들은 이 분야에서 알려져 있으며 포함된다(예;Sampathkumar P, Mayo Clin Proc. 2014 Aug;89(8):1153-8)를 보시오).
MERS - CoV 스파이크 (S) 단백질( MERS - CoV Spike (S) protein): 분류 1 (class I)융합 당단백질인, MERS-CoV S 단백질은 크기가 약 1350 아미노산인 전구체 단백질로 초기에는 합성된다. 각각의 전구체 S 폴리펩타이드들은 호모트라이머 (homotrimer)를 형성하고 골지체(Golgi apparatus) 내에서 당화(glycosylation)를거치고 또한 신호펩타이드를 제거하는 과정을 거치며, 약 752/753 위치 사이에서 세포 내 프로테아제에 의해 쪼개져 분리된 S1 및 S2 폴리펩타이드 체인들로 생성되며, 이들은 호모트라이머 내에서 S1/S2 프로토머(protomers)로 연합된 채로 남아 있다. S1 서브유닛은 바이러스 맴브레인에서 멀리 있으며, 바이러스가 숙주 수용체인, 디펩티딜 펩티데이즈-4 (dipeptidyl peptidase-4 )(DPP4), 에 붙는 것을 매개하는 수용체-결합 도메인 (receptor-binding domain) (RBD)을 포함하며, S- 단백질의 잔기 약 367-606 를 포함한다. S2 서브유닛은 멤브레인 통과 도메인 및 융합 당단백질들에 전형적인 두개의 헵타드-반복 (heptad-repeat) 서열 포함한다.
공시하는 MERS-CoV S 단백질 및 이의 단편에 사용된 번호 매김은 MERS-CoV 의 England1 균주의 S 단백질에 상응하는 것이며, 이의 서열은 서열동정 번호 서열번호 14 로 제공되며, GenBank as No. AFY13307.1로 저장되어 있고, 그 전체가 여기 참고로 포함되었다.
중화 항체(neutralizing antibody): 감염성 제제의 특정한 항원에 결합하여 감염성 제제의 감염 타이터를 감소시키는 항체. 어떤 예들에서는 감염성 제제는 바이러스이다. 어떤 예들에서는, MERS-CoV S 단백질에 특정한 항체는 MERS-CoV의 감염 타이터를 중화한다. "널리 중화하는 항체"는 적어도 항원의 항원성 표면과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고있는 항원과 같은 관련되는 항원들에 결합하고 기능을 억제하는 항체이다. 바이러스와 같은 병원균으로부터의 항원과 관련해서, 항체는 한 부류 및/또는 부속 부류보다 많은 병원균으로부터의 항원에 결합하고 항원의 기능을 억제할 수 있다. 한 예로, MERS-CoV에 관련해서는, 항체는 하나 이상의 MERS-CoV 균주로부터의 MERS-CoV S 단백질과 같은 항원에 결합하고 항원의 기능을 억제할 수 있다. 한 예시에서는, MERS-CoV S 단백질에 대한 널리 중화하는 항체들은 이들이 순환 중에 있는 많은 타입의 MERS-CoV를 높은 페센트로 중화시킨다는 점에서 MERS-CoV S 단백질에 대한 다른 항체와는 구별이 된다.
핵산(nucleic acid): 포스포디에스터 결합 (phosphodiester bonds)을 통해 연결된 뉴클레오타이드 유닛트으로 구성된 폴리머(라이보뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드, 관련되는 자연적으로 일어나는 구조적 변이체, 및 합성된 비-자연적으로 일어나는 이들의 유사물), 관련되는 자연적으로일어나는 구조적 변이체, 및 합성된 비-자연적으로 일어나는 이들의 유사물. 그러므로, 이 용어는 뉴클레오타이드들과 이들 간의 연결에, 예를 들어 제한적이지 않은, 포스포로티오레이트 (phosphorothioates), 포스포로아미데이트 (phosphoramidates), 메틸포스포네이트(methyl phosphonates), 카이랄-메틸 포ㅡ포네이트 (chiral-methyl phosphonates), 2-0 메틸 라이보뉴클레오타이드(2-O-methyl ribonucleotides), 펩타이드- 핵산 (peptide-nucleic acids )(PNAs), 및 이와 같은 것과 같은 자연에 존재하지 않은 합성 유사물을 포함한 뉴클레오타이드 폴리머를 포함한다. 이런 폴리뉴클레오타이드들은, 예를 들어, 자동 DNA 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. "올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)" 라는 용어는 전형적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드를 의미하며, 일반적으로 50 뉴클레오타이드 보다 크지 않다. 뉴클레오타이드 서열이 DNA 서열로 (즉, A, T, G, C)대표 될 때는, 이는 또한,"U" 가 "T" 를 대체한 RNA 서열(즉, A, U, G, C)도 포함된다는 것이 이해 될것이다.
"뉴클레오타이드"는, 이것에만 제한적이지는 않지만, 당, 피리미딘, 퓨린, 또는 이들의 합성 유사체에 연결된 한 염기, 또는 펩타이드 핵산 (peptide nucleic acid)(PNA)에서처럼 아미노산에 연결된 염기를 포함한 모노머를 포함한다. 한 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드에 있는 한 모노머이다. 한 뉴클레오타이드 서열은 한 폴리뉴클레오타이드에 있는 염기들의 서열을 의미한다.
뉴클레오타이드 서열을 서술하기 위해 전통적인 표기법이 여기서 사용된다:단일-가닥의 뉴클레오타이드 서열의 왼쪽은 5'-끝이다; 이중-가닥의 뉴클레오타이드 서열의 왼쪽 방향은 5'-방향을 의미한다. 새로이 만들어지는 RNA 전사체에 5' 에서 3' 방향으로 뉴클레오타이드들을 첨가하는 것을 전사 방향이라고 의미한다. mRNA 와 같은 서열을 갖는 DNA 가닥은 "코딩 가닥(coding strand)"으로 불린다; 그 DNA로부터 전사되는 mRNA 와 같은 서열을 갖으며 RNA 전사체 5'-끝의 5' 쪽에 위치 해 있는 DNA 가닥의 서열들은 "상위 서열(upstream sequences)"이라고 불린다; RNA 와 같은 서열을 갖으며 코딩 RNA 전사체 3'-끝의 3'쪽에 있는 DNA 가닥의 서열들은 "하위 서열(downstream sequences)"이라고 불린다.
"cDNA"는 단일-가닥 또는 이중-가닥의 형태로 상보적인 DNA 또는 mRNA와 동일한 DNA를 의미한다.
"암호화(encoding)"은 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드의 특정한 서열의 내재적인 성질을 의미하며, 생물학적 과정에서 정해진 서열의 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)나 정해진 서열의 아미노산을 가지고 있고 거기로부터의 결과로 생물학적 성질을 가지고 있는 다른 폴리머들 및 거대분자(macromolecules)들을 합성하는 템프레이트(templates )로서 역할을 하는 것을 의미한다. 그러므로, 만약 전사 및 그 유전자에 의해서 생산된 mRNA의 번역이 세포내 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산한다면, 이 유전자는 한 단백질을 암호화하는 것이다. 유전자나 cDNA의 mRNA 서열과 동일하고 보통 서열 리스트에서 제공되는 뉴클레오타이드 서열인 코딩 가닥 (coding strand)과 전사의 템프레이트로 사용되는 논코딩 가닥 (non-coding strand) 둘 다 그 유전자나 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 암호화한다고 말할 수 있다. 달리 특별히 구체화하지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"에는 서로 변질적인(degenerate) 형태이며 같은 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 모두가 포함된다. 단백질들과 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인트론(introns)을 포함 할 수 있다.
만약 한 폴리뉴클레오타이드의 서열이 두 번째 서열을 가진 폴리뉴클레오타이드와 특별히 혼성화하는 첫 번째 서열이라면, 첫 번째 서열은 두 번째 서열에 대비하여 "안티센스(antisense)"이다.
작동할 수 있게 연결된(operably linked): 첫 번째 뉴클레오타이드 서열이 두번째 뉴클레오타이드 서열과 기능적인 관계에 놓여 있을때 첫 번째 뉴클레오타이드 서열은 두 번째 뉴클레오타이드 서열과 작동할 수 있게 연결된 것이다. 예를 들어, CMV 프로모터와 같은, 프로모터가 만약 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 준다면 이 프로모터는 코딩서열과 작동할 수 있게 연결된다. 일반적으로, 작동할 수 있게 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 필요한 곳에서는 두 개의 단백질-암호화((코딩)(protein-coding)영역이 같은 리딩 프레임(reading frame)으로 연결된다.
약학적으로 수용할만한 케리어 (pharmaceutically acceptable carriers): 사용되는 약학적으로 수용할만한 케리어는 전통적인 것이다. Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition,1995, 에서는 공시되는 면역원들을 약학적으로 전달하는데 적절한 조성물 및 제형들을 서술하고 있다.
일반적으로, 케리어의 성질은 적용되는 투여하는 특정한 방식에 의존될 것이다. 예를 들어, 비경구적인 제형들은 보통 물, 생리식염수, 균형된 소금 용액, 수용성 덱스트로즈, 글리세롤, 또는 그와 비슷한 매체와 같은 약학적으로 및 생리적으로 수용가능한 액체를 포함한 주사가 가능한 액체로 구성된다. 고체 조성물들 ((예, 가루(powder), 환약(pill), 테불렛 (tablet), 또는 캡슐 (capsule)형태)을 위해서는, 전통적인 비-독성 고체 케리어에는, 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨 (mannitol), 락토즈 (lactose), 녹말 (starch), 또는 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate) 가 포함될 수 있다. 생물학적으로 중성인 케리어들 이외에, 투여될 약학적 조성물들은 적시거나 또는 유화시키는 제제, 방부제, 및 pH 버퍼제 및 이와 같은 것, 예를 들어 소듐 아세테이드 (sodium acetate) 또는 소르비탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate) 와 같은 비-독성 보조 물질을 소량 포함할 수 있다. 특별한 예시들에서는, 개체에 투여하기 적절하게 케리어는 멸균될 수 있으며, 및/ 또는 현탁되거나 또는 아니면 바람직한 항-MERS-CoV 면역 반응을 유도하기에 적절한 하나 또는 그 이상의 측정된 용량의 조성물을 포함하는 단위 용량형태로 포함될 수 있다. 이는 또한 치료 목적으로 사용하기 위해 약물을 수반할 수도 있다. 단위 용량 형태는, 예를 들어, 멸균된 내용물을 포함하는 봉인된 바이알에 또는 개체에 주사를 위한 주사기에, 또는 차후에 용해시켜 투여하는 동결건조 형태 이거나 또는 고체 또는 조절하여 방출되는 용량 형태로 될수 있다.
폴리펩타이드 (polypeptide); 길이 또는 번역 후 수식 (post-translational modification)(예, 당화 (glycosylation) 또는 인산화 (phosphorylation))에 상관없이 아미노산들의 체인 모두. "폴리펩타이드"는 자연에 존재하는 아미노산 폴리머 및 비-자연적 아미노산 폴리머는 물론 하나 또는 그 이상의 아미노산이 비-자연적인 아미노산, 예를 들면 해당하는 자연에 존재하는 아미노산이 인공적인 화학적으로 비슷한 비-자연적인 아미노산인, 잔기를 포함하는 아미노산 폴리머에도 적용된다. "잔기(residue)"는 아마이드 또는 아마이드 모방 결합으로 폴리펩타이드에 병합된 아미노산 또는 아미노산 모방을 의미한다. 폴리펩타이드는 아미노 말단((N-terminal)및 카복시 말단(C-terminal) 끝은 가진다. "폴리펩타이드"는 펩타이드 또는 단백질과 서로 교환적으로 사용되며, 여기서는 아미노산 잔기들의 폴리머라고 의미한다. 단백질은 복수의 폴리펩타이드 체인을 포함할 수 있다; 예를 들어, 성숙한 MERS-CoV S 단백질은 S1 및 S2 폴리펩타이드 체인을 포함한다.
펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질에 있는 아미노산들은 일반적으로 아마이드 결합(CONH)을 통해 서로 화학적으로 결합 되어 있다. 덧붙여, 아미노산들은 다른 화학적 결합으로도 서로 결합 될 수 있다. 예를 들어, 아미노산들 또는 아미노산 유사물들의 결합에는 CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2 -, -CH=CH-- (cis 및 trans), -COCH2 --, -CH(OH)CH2-, 및 -CHH2SO- 이 포함 될 수 있다 (이들 및 다른 것들은 Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci pp. 463-468, 1980; Hudson, et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185, 1979; Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249, 1986; Harm J. Chem . Soc Perkin Trans. 1307-314, 1982; Almquist et al. J. Med . Chem . 23:1392-1398, 1980; Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533, 1982; Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404, 1983; 및 Hruby Life Sci 31:189-199, 1982 에서 찾을 수 있다.
폴리펩타이드 수식(polypeptide modifications): 여기서 공시되는 MERS-CoV S 단백질과 같은 폴리펩타이드 및 펩타이드들은 수식되지 않은 펩타이드들과 본질적으로 동일한 활성을 갖으며 선택적으로 다른 바람직한 성질을 갖도록 하는 유도체들을 생산하기 위하여 다양한 화학적 기술로 수식될 수 있다. 예를 들어, 카복시-말단이든 사이드 체인(측쇄)이든 간에, 단백질의 카복실 그룹은 약학적으로-수용 할만한 양이온 염의 형태로 제공되거나 또는 에스테르화 되어 C1-C16 에스터로 형성되거나, 또는 R1 및 R2이 각각 독립적으로 H 또는 C1-C16 알킬인 NR1R2 형식의 아마이드로 전환되거나, 또는 5- 또는 6-멤버 링과 같이 혼합되어 헤테로사이클릭 링(heterocyclic ring)의 형태로 되기도 한다. 펩타이드의 아미노 그룹들은, 아미노-말단이든 사이드 체인(측쇄)이든 간에, 약학적으로-수용 할만 한, HCl, HBr, 아세틱(acetic), 벤조익(benzoic), 톨루엔 설포닉(toluene sulfonic), 말레익 (maleic), 타르타릭 (tartaric) 및 다른 유기염과, 같은 산 첨가 염의 형태이거나, 또는 C1-C16 알킬 또는 디알킬 아미노로 수식되거나 또는 더 나아가 아마이드로 전환된다.
펩타이드 측쇄의 하이드록실(hydroxyl) 그룹들은 잘-알려진 기술들을 사용하여 C1-C16 알콕시 또는 C1-C16 에스터 로 전환 될 수 있다. 펩타이드 측쇄의 페닐 및 페놀릭 링들은 F, Cl, Br 또는 I, 와 같은 할로겐 원소로 하나 또는 그 이상이 대체 될 수 있거나, 또는 C1-C16 알킬, C1-C16 알콕시, 카복실릭 에시트 (carboxylic acids) 및 이들의 에스터(esters)들로 또는 이러한 카복실릭 에시트의 아마이드로 대체 될 수 있다. 펩타이드 측쇄의 메틸렌 그룹들은 동종의 C2-C4 알킬렌으로 연장 될수 있다. 티올(Thiols)은 아세트아마이드 (acetamide)그룹과 같은 잘-알려진 많은 보호그룹들 중 하나를 사용하여 보호될 수 있다. 이 분야에 전문가들은 또한 구조에 안정성을 강화시키는 결과를 가져오는 구조적 압박을 선택하고 제공하기 위해 본 공시의 펩타이드에 환형구조(cyclic structures)를 도입하는 방법들을 인지 할 것이다. 예를 들어, C- 또는 N- 말단 시스테인이 펩타이드에 첨가될 수 있어, 산화 되었을 때 이 펩타이드는 이황화 결합을 함유할 것이 되어, 환형 펩타이드가 만들어질 것이다. 다른 펩타이드 환형화 방법에는 티오에테르 (thioethers) 및 카복실- 및 아미노-말단 아마이드 및 에스테르 (esters)의 형성이 포함된다.
프라임 - 부스트 면역 접종(prime-boost vaccination): 개체에서 타겟 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해, 선택된 타겟 항원 또는 타겟 항원을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 첫 번째 면역원 조성물(프라이머 백신)을 개체에 투여하고, 이어서 타겟 항원 또는 타겟 항원을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 두 번째 면역원 조성물(부스터 백신)을 투여하는 것을 포함하는 면역 치료법. 부스터 백신은 프라이머 백신 후에 개체에 투여된다; 숙련된 전문가는 프라이머 백신 투여와 부스터 백신 투여 사이의 적절한 시간적 간격을 이해할 것이며, 그런 기간의 예들이 여기에 공시된다. 추가 투여는 프라임-부스터 프로토콜에, 예를 들면 제 2 부스터에 포함 될 수 있다. 어떤 예시들에서, 프라이머 백신, 부스터 백신, 또는 프라이머 백신 및 부스터 백신 둘 다 추가로 아주번트를 포함한다. 한 제한적이지 않은 예에서, 프라이머 백신은 DNA-근거한 백신(또는 유전자 전달에 근거한 다른 백신)이고, 부스터 백신은 단백질-근거한 백신이다 (단백질 서브유닛 또는 단백질 나노입자와 같은).
단백질 나노입자 (protein nanoparticle ): 복합-서브유닛, 단백질-근거한 다면체 (polyhedron) 모양 구조. 서브유닛은 각각 단백질 또는 폴리펩타이드( 예로, 당화된 폴리펩타이드), 및 선택적으로 다음의 단일 또는 복합 모양으로 구성된다; 핵산, 프로스테텍 (prosthetic)그룹, 유기 및 무기 화합물들. 제한적이지 않은 단백질 나노입자 예들에는 훼리틴 나노입자 ((ferritin nanoparticles)(여기 참고 문헌으로 포함된, 예, Zhang, Y. Int . J. Mol . Sci., 12:5406-5421, 2011 를 보시오)), 인캡슐린 나노입자 ((encapsulin nanoparticles)(여기 참고 문헌으로 포함된, 예. Sutter et al., Nature Struct. and Mol. Biol., 15:939-947, 2008)를 보시오)), 설퍼 옥시지네이즈 리덕테이즈 (Sulfur Oxygenase Reductase) (SOR) 나노입자 ((여기 참고 문헌으로 포함된, 예, Urich et al., Science, 311:996-1000, 2006, 를 보시오)), 루마진 신테이즈 나노입자(lumazine synthase nanoparticles) (예., Zhang et al., J. Mol . Biol ., 306: 1099-1114, 2001) 또는 피루베이트 디하이드로지네이즈 나노입자 (pyruvate dehydrogenase nanoparticles) (여기 참고 문헌으로 포함된, 예. Izard et al., PNAS 96: 1240-1245, 1999을 보시오))가 포함된다. 훼리틴, 인캡슐린, SOR, 루마진 신테이즈, 및 피루벳 디하이드로지네이즈는 스스로 구형 단백질 복합체로 어셈블 되어 어떤 경우에서는 각각 24, 60, 24, 60, 및 60 단백질 서브유닛으로 구성되는 모노메릭 단백질이다. 어떤 예들에서는, 훼리틴, 인캡슐린, SOR, 루마진 신테이즈, 또는 피루벳 디하이드로지네이즈 모노머들은 MERS-CoV S 단백질(또는 이들 단편))에 연결되어 있으며, 그 표면에 MERS-CoV S 단백질을 제시하는 단백질 나노입자로 스스로-어셈블 되며, 이는 항원에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 개체에게 투여될 수 있다.
재조합(recombinant): 재조합 핵산은 자연에 존재하지 않는 서열을 가진 것이나, 또는 그렇지않으면 분리해 있는 두 개의 서열 단편이 인공적인 조합에 의해 만들어진 서열을 가진다. 인공적인 조합은 화학적인 합성에 의해, 또는 좀 더 보편적으로는, 분리된 핵산 단편을, 예를 들면, 유전공학적인 기술로, 인공적 조작으로 수행될 수 있다. 재조합 단백질은 자연에 존재하지 않는 서열, 또는 그렇지않으면 분리해 있는 두 개의 서열 단편이 인공적 조합에의 만들어진 서열을 가진 단백질이다. 몇몇의 예시들에서, 재조합 단백질은 박테리아 또는 진핵세포와 같은 숙주 세포에 도입된 이종 (예를 들면, 재조합) 핵산에 의해 암호화된다. 핵산은, 예를 들어, 도입되는 핵산에 의해 단백질을 발현하는 능력이 있는 신호를 가진 발현 벡터에 도입 될수 있으며 또는 핵산은 숙주 세포 염색체에 병합될 수도 있다.
샘플(또는 생물학적 샘플)(sample (or biological sample)): 유전체 DNA, RNA (mRNA 포함), 단백질, 또는 이들의 조합들을 함유하는 생물학적 시료는 개체로부터 얻는다. 예들에는, 이것에만 국한하지 않으나, 말초 혈액, 조직, 세포, 뇨, 타액, 조직 바이옵시, 미세바늘흡입액, 수술시료, 및 부검 재료들이 포함된다.
서열 동정(sequence identity): 아미노산 서열 사이의 유사성은 서열 사이의 유사성의 의미로 표현되며, 아니면 서열 동정성으로 언급된다. 서열 동정성은 자주 퍼센트 동정성(또는 유사성 또는 상동관계)의 용어로 측정된다; 퍼센트가 높을 수록 두 서열은 더 비슷하다. 펩타이드의 동족체(homologs), 오토로그 (orthologs), 또는 변이체는 표준 방법들을 사용하여 정렬하였을 때 상대적으로 높은 정도의 동정성을 가질것이다.
비교를 위해 서열들을 정렬하는 방법들은 이 분야에서는 잘 알려져 있다. 여러가지 프로그램들 및 정렬 알고리즘들은 다음에 서술되어 있다.:Smith & Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; 및 Pearson et al., Meth . Mol . Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10, 1990 에서는 서열 정렬방법들 및 상동성 계산에서의 상세히 고려할점을 제시한다.
일단 정렬이 되면, 짝의 (matche)수는 양쪽서열에서 동일한 핵산 또는 아미노산 잔기가 나타나는 위치의 수를 계산하여 결정한다. 퍼센트 서열 동정성은 짝의 (matche)수를 동정된 서열에서 정해진 서열의 길이로 나누거나, 또는 분절된 길이(동정된 서열에서 정해진 서열로부터 100개의 연속적인 핵산 또는 아미노산 잔기들과 같은)로 나누고, 이어서 그 결과값을 100으로 곱한다. 예를 들어, 1554 아미노산을 가진 테스트 서열과 정렬했을 때 한 펩타이드가 1166짝의 수를 가진다면 이는 테스트 서열과 75.0% 동일하다 (1166÷1554*100=75.0). 퍼센트 서열 동정 값은 10분의 1 에 가장 가깝도록 정수로 나타낸다. 예를 들어 75.11, 75.12, 75.13, 및 75.14 는 75.1로 반 내림하여 정수로 하며, 75.15, 75.16, 75.17, 75.18, 및 75.19 는 반 올림하여 75.2 로 한다. 길이값은 항상 정수이다.
NCBI 국부 정렬 탐색 방법 (NCBI Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403, 1990) 은 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx의 서열분석 프로그램과 연관하여 사용하기 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) 및 인터넷을 포함한 여러 소스로부터 얻어질 수 있다. 이 프로그램을 이용하여 어떻게 서열 동정성을 결정하는가에 대한 서술은 인터넷상에서 NCBI 웹사이트에서 얻을 수 있다.
폴리펩타이드의 동종체(호모로그) 및 변이체는 대상 아미노산 서열과 전장 정렬하여 계산하여 적어도 75%, 예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 의 서열 동정성을 가진 것이 전형적인 특징이다. 참조 서열에 비해 더 큰 유사성을 가진 단백질은 이 방법으로 평가 하였을때 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동정성과 같이 증가하는 퍼센트 동정성을 나타낼 것이다. 전체서열보다 적은 서열이 서열 동정성에 비교될 때는, 10-20 아미노산의 짧은 범위에 대해서는 전형적으로 적어도 80%의 동정성을 가질 것이며, 참조 서열에 대비한 이들의 유사성에 따라 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 95%의 서열 동정성을 갖기도 한다. 그러한 짧은 범위의 서열에 대한 동정성을 결정하는 방법은 인터넷 상에서 NCBI 웹사이트에서 얻을 수 있다. 이 분야 전문가는 이러한 서열 동정성 범위는 길잡이로만 제공된다는 것을 인지할 것이다; 제공된 범위에서 벗어난 아주 강한 동정체가 얻어질 수 있을 것도 전적으로 가능하다.
핵산 서열의 서열비교를 위해, 전형적으로 한 서열은 참조서열로 작용하고, 여기에 대해 테스트 서열이 비교된다. 서열비교 알고리즘을 사용할 때는, 테스트 및 참조 서열은 컴퓨터에 들어가고, 뒤이은 좌표가 디자인되고, 만약 필요하면, 서열 알고리즘 프로그램 계수들이 디자인된다. 디폴트 (default, 초기설정) 프로그램 계수들이 사용된다. 비교를 위한 서열 정렬 방법이 이 분야에서 잘 알려져 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 예를 들어, Smith & Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482, 1981, 의 국소 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443, 1970, 의 국소 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc . Nat'l . Acad . Sci. USA 85:2444, 1988, 의 유사성 방법의 탐색, 이들 알고리즘들의(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 컴퓨터화 구현, 또는 손으로 정렬 및 눈으로 검사 ((예, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012) 및 Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, through supplement 104, 2013 를 보시오)) 로 수행 될 수 있다. 유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP 이다. PILEUP는 Feng & Doolittle, J. Mol . Evol . 35:351-360, 1987 의 진행적 정렬 방법의 단일화법을 사용한다. 사용된 이 방법은 Higgins & Sharp, CABIOS 5:151PILEUP-153, 1989 에 의해 서술된 방법과 비슷하다. PILEUP를 사용하여, 퍼센트 서열 동정성 관계를 결정하기 위해 다음의 계수들을 사용하여 참조 서열이 다른 테스트 서열과 비교된다: 디폴트 갭 무게 (default gap weight)(3.00), 디폴트 갭 길이무게 (default gap length weight )(0.10), 및 무게의 말단 갭 (weighted end gaps). PILEUP 는 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지(GCG sequence analysis software package, e.g., version 7.0 (Devereaux et al., Nuc . Acids Res. 12:387-395, 1984) 로부터 얻을 수 있다.
퍼센트 서열 동정성 및 서열 유사성을 결정하는데 적절한 알고리즘의 다른 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-410, 1990 및 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1977. 에 서술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (ncbi.nlm.nih.gov) 를 통해 공공적으로 얻을 수 있다. BLASTN 프로그램은 (핵산 서열을 위해) 디폴트로 단어길이 (word length)(W)11, 정렬 (B) 50, 기대 (expectation)(E)10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥을 다 사용한다. BLASTP 프로그램(아미노산 서열을 위해)은 디폴트로 단어길이 (word length)(W)3, 기대 (expectation)(E)10, 및 BLOSUM62 scoring matrix (Henikoff & Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915, 1989를 보시오)를 사용한다. 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 베이스 길이 약 100까지의 직선의 폴리뉴클레오타이드 서열이다.
여기서 사용된 대로, "적어도 80% 동정성"에 관하여 란 것은 특정한 참조 서열에 대하여 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도" 동정성이 있는 것을 의미한다.
신호 펩타이드 ( 시그날 펩타이드 , signal Peptide): 새로 합성된 분비 또는 멤브레인 단백질이 멤브레인 ((예를 들어, 소포체 (endoplasmic reticulum membrane))으로 가도록 또는 멤브레인을 통과하도록 지시하는 짧은 아미노산 서열(예, 약 10-35 아미노산 길이). 신호 펩타이드는 전형적으로 폴리펩타이드의 N-말단에 위치해 있으며 시그날 펩티데이즈 (signal peptidases)에 의해 제거된다. 신호 펩타이드 서열들은 전형적으로 세 가지 공통의 구조적 특징을 가진다: N-말단 극성 염기성 영역(n-region), 소수성 코아(core), 및 친수성 c-영역 (c-region)). 전형적인 신호 펩타이드 서열들은 서열번호 14의 1-18 잔기들 (MERS-CoV S 단백질 England1 균주)로서 정해진다.
특별히 결합하는(specifically bind): 항체:항원 단백질 복합체 또는 단백질:단백질 복합체의 형성을 언급할 때, 이종 집단의 단백질들 또는 생물제제가 존재하는 중에서 타겟 단백질, 펩타이드, 또는 폴리삭카라이드 (polysaccharide)(예를 들어, 당단백질)의 존재를 결정하는 결합 반응을 의미한다. 그러므로, 주어진 조건들 하에서, 특정한 항체나 단백질은 특정한 타겟 단백질, 펩타이드, 또는 폴리삭카라이드 (병균의 표면에 제시되는 항원, 예를 들면, MERS-CoV S 단백질, 과 같은) 에 선호적으로 결합하며, 샘플 또는 개체에 존재하는 다른 단백질이나 폴리삭카라이드에는 의미 있을 정도로 결합하지않는다. 특이적인 결합은 이 분야에서 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 첫 번째 단백질 또는 항체는 상호작용 KD가 약 10-7 Molar, 10-8 Molar, 10-9 이하, 또는 약 10-10 Molar 보다 더 적은 것과 같은, 약 10-6 Molar 이하 일 때 타겟 단백질에 "특이적으로 결합한다.
특별한 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체 또는 다른 리간트들을 선택하는데 다양한 면역에세이 형태들이 적절하다. 예를 들어, 고체-상 ELISA 면역에세이(solid-phase ELISA immunoassays)는 단백질과 특이적으로 면역반응하는 단클론 항체들을 선택하는데 일상적으로 사용된다. 특정한 면역반응을 결정하는데 사용될 수 있는 면역에세이 형태 및 조건들의 서술을 위해 Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Publications, New York (2013)를 보시오.
개체(subject): 인간 및 비-인간 포유류를 포함한 범주(카테고리)의 살아 있는 복합-세포 척추 생물. 한 예에서, 개체는 인간이다. 한 특별한 예 에서는, 개체는 인간 또는 낙타 (camel), 또는 박쥐(bat)이다. 추가 예에서는, 개체는 MERS-CoV 감염을 억제 시킬 필요가 있는 개체가 선택된다. 예를 들어, 개체는 감염되지 않고 MERS-CoV감염 위험이 있거나, 또는 감염되고 치료가 필요 있는 개체이다.
치료적으로 효과적인 양(Therapeutically effective amount): 공시되는 면역원 또는 항체와 같은 제제가 증상 및/또는 장애 또는 질병의 내재하는 원인을 예방하고, 치료하고(예방을 포함한), 감소시키거나 및/또는 완화시키는 충분한 양, 예를 들어 MERS-CoV 감염을 예방, 억제, 및/또는 치료하기 위한 충분한 양. 한 몇몇 예시에서는, 치료적으로 효과적인 양은 MERS-CoV 감염과 같은 질병의 증상을 감소 시키커나 제거하는데 충분하다. 한 예로, 이 양은 바이러스의 복제를 억제하거나 예방하는데 또는 바이러스 감염의 표면상의 증상을 측정할 만하게 바꾸는데 필요한 양이 될 수 있다. 일반적으로, 이 양은 바이러스 복제 또는 감염능력을 측정할 만하게 억제하는데 충분할 것이다.
한 예에서, 바람직한 반응은 MERS-CoV 감염을 억제 또는 감소 또는 예방하는 것이다. 조성물이 효과적이기 위해 MERS-CoV 감염된 세포는 완전히 제거 또는 감소 또는 예방될 필요는 없다. 예를 들어, 조성물이 없는 MERS-CoV 감염된 세포의 수에 비교하여, 치료적으로 효과적인 양의 제제의 투여는 바람직한 양 만큼, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 100% (검출 가능할 만한 MERS-CoV 감염된 세포를 제거 또는 예방)만큼 까지도, MERS-CoV 감염된 세포의 수를 감소 (또는 감염된 세포를 예방)시킬 수 있다.
병원균에 대항하여 방어적인 면역반응을 얻는 것은 공시되는 면역원을 복합적으로 투여하는 것을 요구할 수 있다는 것이 이해된다. 그러므로, 치료적으로 효과적인 양은 앞선 투여 및 이어지는 투여와 함께 바람직한 면역반응에 도달하는데 기여하는 분할 용량(fractional dose)을 포함한다. 예를 들어, 치료적으로 효과적인 양의 면역원은 치료 코스 동안 (프라임-부스트 면역접종과 같이) 단일 용량으로, 또는 몇몇 용랑으로, 예를 들어 매일, 투여될 수 있다.
공시되는 면역원 또는 항체의 치료적으로 효과적인 양은 치료되는 개체, 치료 개체의 심각성 및 컨디션 타입, 및 투여 방식에 의존할 수 있다. 면역원 또는 항체의 단위 용량 형태는, 예를 들어, 바이알 또는 멸균 화합물을 가진 주사로, 치료 할 만한 양, 또는 복합 치료 양으로, 포장될 수 있다.
멤브레인 통과 도메인(transmembrane domain): 세포 또는 바이러스 또는 바이러스-유사 입자의 지질 이중층과 같은, 지질 이중층에 삽입된 아미노산 서열, 멤브레인 통과 도메인은 항원을 멤브레인에 고정시키는데 사용될 수 있다. 몇몇의 예에서 멤브레인 통과 도메인은 MERS-CoV S 단백질 멤브레인 통과 도메인이다. 전형적인 MERS-CoV S 단백질 멤브레인 통과 도메인은 이 분야 전문적인 일반 사람에게는 익숙하며, 여기서는, 예로 서열번호 14 의 1296-1318 잔기로 제공된다.
질병의 치료 또는 예방(treating or preventing a disease): 예를 들면, MERS-CoV 감염과 같은 질병의 위험이 있는 사람에서 질병 또는 커디션의 전적인 전개를 억제하는 것. "치료(treatment)"는 질병이 전개된 후 질병 또는 병리적 컨디션의 신호 또는 증상을 완화시키는 치료적 중재를 의미한다. 질병 또는 병리적 커디션에 관하여 "완화 하는(ameliorating)"이란 용어는 치료로 관찰될 수 있는 어떤 유익한 효과를 의미한다. 유익한 효과는, 예를 들어, 취약한 개체에서 질병의 임상적 증상의 개시가 연기되고, 질병의 임상 증상의 일부 또는 모두가 감소, 질병의 진행이 둔화 되고, 바이러스 로드 감소, 개체의 전체적인 건강 또는 웰-빙이 개선되고, 또는 그 특정 질병에 특이한 이 분야에서 잘 알려진 다른 파라메터들에 의해 증명될 수 있다. "예방적(prophylactic)" 치료란 병리적 전개의 위험을 감소시킬 목적으로 질병의 싸인 (signs)을 보여주지 않거나 조기 싸인 (signs) 만을 보여 주는 개체에게 투여하는 치료이다.
"감소(reduces)"라는 용어는 상대적인 용어이며, 만약 제제를 투여한 후에 반응 또는 컨디션이 정량적으로 감소하거나, 또는 참고 제제와 비교하여, 제제를 투여한 후에 감소되면, 제제는 반응 또는 컨디션을 감소한다. 마찬가지로, "예방(prevents)"이란 용어는 적어도 반응 또는 컨디션의 특징 한가지가 제거되는 한, 제제가 반응 또는 컨디션을 완전히 없애는 것을 반드시 의미하는 것은 아니다. 그러므로 감염이나 반응을 감소 또는 예방하는 면역원성 조성물은, 반드시 완전하게는 아니라도, 그 제제가 없을 때보다 감염 또는 반응이 측정할 만할 정도로, 예를 들어, 적어도 약 50%로, 적어도 70%, 또는 적어도 80% 와 같이, 또는 약 90% 와 같은 정도까지도 (10% 또는 이보다 적게까지) 감소 되는 한, 또는 참조 제제에 비해, 그러한 감염 또는 반응을 제거할 수 있다.
∼를 위한 충분한 조건하에서 (under conditions sufficient for): 바람직한 활성이 가능하도록 하는 어떠한 환경을 서술하는데 사용되는 구절.
백신(vaccine): 개체에서 예방적 또는 치료적 면역반응을 유도하는 약학적 조성물. 어떤 경우에는, 면역반응은 방어적인 면역반응이다. 전형적으로, 백신은 병원균의 항원에 대하여, 예를 들어 바이러스 병원균 또는 병리적 컨디션과 관계되는 세포 구성성분에 대하여, 항원-특이적인 면역반응을 유도한다. 백신은 폴리뉴클레오타이드 (공시되는 항원을 암호화하는 핵산과 같은), 펩타이드 또는 폴리펩타이드 (공시되는 항원과 같은), 바이러스, 세포, 또는 하나 또는 그 이상의 세포 구성 성분을 포함 할수 있다. 이것에만 국한하지 않는, 한 특별한 예에서는 백신은 컨트롤에 비해 MERS-CoV 감염과 연관된 심각한 증상을 감소시키는 면역 반응을 유도하며 및/또는 바이러스 로드(viral load)를 감소시킨다. 이것에만 국한하지 않는 다른 예에서는, 컨트롤에 비해 백신은 MERS-CoV 감염을 감소시키고 및/또는 에방하는 면역 반응을 유도한다.
벡터(vector): 숙주세포 내로 도입되어 형질전환 된 숙주 세포를 생산하는 핵산 분자. 재조합 DNA 벡터들은 재조합 DNA 들을 가지는 벡터들이다. 벡터는 숙주 세포에서 이 벡터가 복제 가능하게 하는 복제 기원 점과 같은 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 또는 그 이상의 선택할 수 있는 마커 유전자 및 이 분야에서 알려진 다른 유전적 요소들을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터들은 하나 또는 그 이상의 바이러스에서 유래한 적어도 어떤 핵산 서열을 가진 재조합 핵산 벡터이다. 복제 불능의 바이러스 벡터는 적어도 하나의 복제-필수 유전자 기능이 결여되었기 때문에 복제에 필요한 바이러스 유전체의 하나 또는 그 이상 영역의 상보성이 요구되는 벡터이다. 예를 들어, 그래서 바이러스 벡터는 전형적인 숙주 세포에서, 특히 치료 방법 도중에 바이러스 벡터로 감염시킬 가능성이 있는 인간 환자에서,복제되지 않는다.
바이러스-유사 입자(virus-like particle ( VLP )): 몇 몇의 어떤 바이러스로부터 유래 된 복제하지 않는, 바이러스 껍질. VLPs 는 일반적으로, 이것에만 국한 하지 않으나, 캡시드(capsid), 코트(coat), 껍질, 표면 및/또는 외피 단백질, 또는 이들 단백질로부터 유래 된 입자-형성 폴리펩타이드 와 같은, 하나 또는 그 이상의 바이러스 단백질들로 구성된다. VLPs 는 적절한 발현 시스템에서 단백질의 재조합 발현시 자동적으로 형성될 수 있다. 특정한 VLPs 를 생산하는 방법들이 이 분야에서 알려져 있다. 단백질들의 재조합 발현 후 VLPs 의 존재는 이 분야에서 알려진 전통적인 기술들, 전자현미경, 생물리학적 성질규명, 및 이와 비슷한 기술과 같은 것으로 검출될 수 있다. 더 나아가, VLPs는 알려진 기술들, 예를 들어 비중 구배 원심분리 (density gradient centrifugation)로 분리될 수 있으며 특정한 비중 밴딩(density banding)으로 동정 될 수 있다. 예로, Baker et al. (1991) Biophys. J. 60:1445-1456; 및 Hagensee et al. (1994) J. Virol . 68:4503-4505; Vincente, J Invertebr Pathol ., 2011; Schneider-Ohrum and Ross, Curr . Top. Microbiol. Immunol ., 354: 53073, 2012)를 보시오.
II. 중화 단클론 항체들 및 이들의 용도
분리된 단클론 항체들 및 MERS-CoV S 단백질의 에피톱에 특정하게 결합하는 이들의 항원 결합 단편들이 제공된다. 항체들 및 항원 결합 단편들은 인간화될 수 있다. 몇몇 예시 들에서, 항체들 및 항원 결합 단편들은 MERS-CoV 감염을 억제하거나 치료하는데 사용될 수 있다. 또한 항체들과 항원 결합 단편들 및 약학적으로 수용가능 한 케리어를 포함하는 조성물들이 여기서 공시된다. 항체들 또는 항원 결합 단편들을 암호화하는 핵산들, 이들 핵산들을 포함하는 발현 벡터들, 및 이 핵산들을 발현하는 분리된 숙주 세포들도 또한 제공된다.
항체들, 항원 결합 단편들, 핵산 분자들, 숙주 세포들, 및 조성물들은 연구, 진단 및 치료 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 단클론 항체들 및 항원 결합 단편들은 MERS-CoV 감염된 개체를 진단하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 항체들은 개체에서 MERS-CoV 타이터를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 여기서 공시되는 항체들은 또한 MERS-CoV의 생물학적 연구를 위해 사용될 수 있다.
A. 항체들 및 항원 결합 단편들
분리된 단클론 항체들 및 MERS-CoV S 단백질의 에피톱에 특정하게 결합하는 항원 결합 단편들이 제공된다. 항체들 및 항원 결합 단편들은 MERS-CoV 감염을 중화 할수 있다.
어떤 예시들에서는, 항체들 및 항원 결합 단편들은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄 (VL)를 포함하고 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체들 및 항원 결합 단편들은 중쇄 상보성 결정 영역 ((heavy chain complementarity determining region (HCDR))1, HCDR2 및 HCDR3 를 포함하는 중쇄, 및 경쇄 상보성 결정 영역 ((light chain complementarity determining region (LCDR))1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하고 선택적으로 또한 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편들은 JC57-13, JC57-14, JC57-11, C2, C5, A2, A10, FIB_B2, FIB_H1, G2, G4, D12, 또는 F11 항체들 중의 하나의 HCDR1, HCDR2, 과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하고 선택적으로 또한 MERS-CoV 감염을 중화한다.
하기의 단클론 항체들에 대한 논의는 IMGT의 번호메김 계획(IMGT numbering scheme)(본문에서 달리 제시하지 않는 한)을 참조하여 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 를 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인 (또는 이들의 항원 결합 단편)을 포함하는 분리된 단클론 항체들을 의미한다. 이 분야에 일반적으로 숙련된 사람은 CDR 위치를 결정하기 위해 여러가지 CDR 번호 메김 계획 (numbering schemes)(Kabat, Chothia 또는 IMGT numbering schemes와 같은)이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. IMGT의 번호 메김 계획에 따른 JC57-13, JC57-14, JC57-11, C2, C5, A2, A10, FIB_B2, FIB_H1, G2, G4, D12, 및 F11 단클론 항체들의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열들 및 CDR 위치들을 표 1 (Table 1) (IMGT)에 보여준다.
JC57-13 VH
VH 서열번호 2 residues A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-33 GGSISSNY 59
HCDR2 51-58 IYGGSGST 60
HCDR3 97-110 ARLLPLGGGYCFDY 61
JC57-13 VL
VL 서열번호 4 residues A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 27-38 QSLFDSDYGNTY 62
LCDR2 56-58 MLS 63
LCDR3 95-103 MQSVEYPFT 64
JC57-11 VH
VH 서열번호 6 residues A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 27-34 GSISDSYR 65
HCDR2 52-59 IFATGTTT 66
HCDR3 98-120 AREPFKYCSGGVCYAHKDNSLDV 67
JC57-11 VL
VL 서열번호 8 residues A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 27-32 QSVSSN 68
LCDR2 50-52 SAS 69
LCDR3 89-96 YQHSSGYT 70
JC57-14 VH
VH 서열번호 10 residues A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-33 GDSISSNY 71
HCDR2 51-58 FSGSGGST 72
HCDR3 97-106 AKTYSGTFDY 73
JC57-14 VL
VL 서열번호 12 residues A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 27-32 QDINNY 74
LCDR2 50-52 YAS 75
LCDR3 89-97 QQYNNSPYS 76
C2 VH
VH 서열번호 36 A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-33 GGTFSIYA 77
HCDR2 51-58 IIPIFGTA 78
HCDR3 97-116 AREGGHQGYCSGGSCYDFDY 79
C2 VL
VL 서열번호 38 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 27-37 QSLLHSNGYNY 80
LCDR2 55-57 LGS 81
LCDR3 94-101 MQALQTPA 82
C2 LCDR1 NG-NS VL
VL 서열번호 110 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 27-37 QSLLHSNSYNY 112
LCDR2 55-57 LGS 81
LCDR3 94-101 MQALQTPA 82
C2 LCDR1 NG-NA VL
VL 서열번호 111 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 27-37 QSLLHSNAYNY 113
LCDR2 55-57 LGS 81
LCDR3 94-101 MQALQTPA 82
C5 VH
VH 서열번호 40 A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-35 GGSISSSSYY 83
HCDR2 53-59 IYYSGST 84
HCDR3 98-115 ASLLRPLIYCSGGSCTDY 85
C5 VL
VL 서열번호 42 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 26-34 SSDVGGYNY 86
LCDR2 52-54 EVS 87
LCDR3 91-100 SSYTSNITLV 88
A2 VH
VH 서열번호 44 A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-33 GFTFSDYY 89
HCDR2 51-58 ISSSGSTI 90
HCDR3 97-111 ARVGLGSGWYDWFDP 91
A2 VL
VL 서열번호 46 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 26-34 SSNIGASYD 92
LCDR2 52-54 GNT 93
LCDR3 91-101 QSYDSSLSGVV 94
A10 VH
VH 서열번호 48 A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-33 GGTFSTYA 95
HCDR2 51-58 IIPIFGTA 78
HCDR3 97-111 ARGSRSSSSAEYFQH 96
A10 VL
VL 서열번호 50 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 26-34 SSDVGGYNY 86
LCDR2 52-54 DVS 97
LCDR3 92-102 SYAGSYTLEVV 98
FIB_B2 VH
VH 서열번호 52 A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-33 GGSISSNY 59
HCDR2 51-55 IYGGSGGT 99
HCDR3 97-107 ARSFYSWNGES 100
FIB_B2 VL
VL 서열번호 54 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 27-32 QGINDY 101
LCDR2 50-52 YGN 102
LCDR3 89-97 QQGDSFPLT 103
FIB_H1 VH
VH 서열번호 56 A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-33 GHIFTSYV 104
HCDR2 51-58 IHPGNGGR 105
HCDR3 97-110 AASSGSYGVSSLDV 106
FIB_H1 VL
VL 서열번호 58 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 26-34 SDLSVGSKN 107
LCDR2 52-58 YYSDSDK 108
LCDR3 97-106 QVYDSSANWV 109
G2 VH
VH 서열번호 115 A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-33 GFTFSSSY 130
HCDR2 51-58 IYAGTGGT 131
HCDR3 97-107 ARGGSSFAMDY 132
G2 VL
VL 서열번호 117 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 26-36 ESVDNYGISF 133
LCDR2 54-56 TAS 134
LCDR3 93-97 QQSEE 135
G4 VH
VH 서열번호 119 A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-33 GYTFTDYA 136
HCDR2 51-58 FSTYYGNT 137
HCDR3 97-111 ARKSYYVDYVDAMDY 138
G4 VL
VL 서열번호 121 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 26-36 ESVDNYGISF 139
LCDR2 54-56 ATS 140
LCDR3 93-101 QQSKEVPRT 141
D12 VH
VH 서열번호 123 A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-33 GFTFSSYA 142
HCDR2 51-58 ISSGGTYT 143
HCDR3 97-105 VRDGNSMDY 144
D12 VL
VL 서열번호 125 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 26-32 QDINNY 74
LCDR2 50-52 YTS 145
LCDR3 89-97 QQANTLPPT 146
F11 VH
VH 서열번호 127 A.A. Sequence CDR 서열번호
HCDR1 26-33 GFTFSRYA 147
HCDR2 51-58 INNGGSYS 148
HCDR3 97-111 ARHYDYDGYYYTMDF 149
F11 VL
VL 서열번호 129 A.A. Sequence CDR 서열번호
LCDR1 26-37 QSIVHSNGNTY 150
LCDR2 55-57 KVS 151
LCDR3 94-102 FQGSHVPYT 152
JC57-13
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 JC57-13 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편은 JC57-13 항체의 HCDR1, HCDR2, 과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 또는 kabat 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에 정해진 대로 JC57-13 VH의 HCDR1, HCDR2, 과 HCD3를 포함하는 VH를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 및 항원 결합 단편은 표 1에 정해진 대로 JC57-13 VL 의 LCDR1, LCDR2, 과LCDR3 을 포함하는 VL를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 및 항원 결합 단편은 표 1에 정해진 대로 JC57-13 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 적어도 표 1에 보여준 대로 JC57-13 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 서열과도 적어도 95% (적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열 동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 2( 서열번호 2)의 아미노산 서열들 26-33, 51-58, 및 97-110 와 각각 적어도 90% 동일한 아미노산 (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 로 구성된 VH 을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열들 27-38, 56-58, 및 95-103 와 각각 적어도 90% 동일한 아미노산 (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 을 포함하는 VL 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열들 26-33, 51-58, 및 97-110 와 각각 적어도 90% 동일한 아미노산 (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 로 구성된 VH 및, 서열번호 4의 아미노산 서열들 27-38, 56-58, 및 95-103 와 각각 적어도 90% 동일한 아미노산 (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 을 포함하는 VL 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 2 에서 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 4 에서 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 2 및 서열번호 4에서 각각 정해진 아미노산 서열들과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 각각 독립적으로 구성된 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가의 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 2 에서 정해진 아미노산 서열로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 4 에서 정해진 아미노산 서열로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 2 및 서열번호 4에서 각각 정해진 아미노산 서열들로 구성된 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
JC57-11
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 JC57-11 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 JC57-11 항체의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, JC57-11 VH 의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, JC57-11 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, JC57-11 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 JC57-11 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 95% (적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 6 에서 27-38, 52-59, 및 98-120 아미노산 서열과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 8의 아미노산 아미노산 서열 27-32, 50-52, 및 89-96 과 각각, 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가적인 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 6 에서 27-38, 52-59, 및 98-120 아미노산 서열과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 8의 아미노산 서열 27-32, 50-52, 및 89-96 과 각각, 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 6 로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 VH 를 포함하며 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 8로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 6 및 서열번호 8로 각각 정해진 아미노산 서열들과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 VH 및 VL 를 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서는 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 6의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 8로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 각각 서열번호들 6 및 8로서 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
JC57-14
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 JC57-14 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 JC57-14 항체의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, JC57-14 VH 의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 정해진 대로, JC57-14 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, JC57-14 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 JC57-14 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 95% (적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 10 에서 26-33, 51-58, 및 97-106 아미노산 서열과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 12 의 아미노산 아미노산 서열 27-32, 50-52, 및 89-97 과 각각, 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은) 동일한 아미노산으로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가적인 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 10 에서 26-33, 51-58, 및 97-106 아미노산 서열과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 12의 아미노산 서열 27-32, 50-52, 및 89-97 과 각각, 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 10으로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은) 동일한 아미노산으로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 12로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 10 및 서열번호 12로 각각 정해진 아미노산 서열들과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은) 동일한 아미노산으로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서는 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 10의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 12로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 10 및 12로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
C2
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 C2 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 C2 항체의 HCDR1, HCDR2, 과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, C2 VH 의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, C2 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, C2 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, C2 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래한 항체 또는 항원 결합 단편은 kabat 위치 29에 글라이신이 세린으로 대체되거나 또는 글라이신이 알라닌으로 대체된 것을 포함하는 VL 를 포함할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 예시들에서는 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, C2 VH 의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH를 포함할 수 있으며, 표 1 에서 정해진 대로, C2 LCDR1 NG-NS VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 정해진 대로, C2 VH 의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3 을 포함하는 VH 및 표 1에서 정해진 대로, C2 LCDR1 NG-NA VL 의 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 C2 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 95% (적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열 동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 36에서 26-33, 51-58, 및 97-116 아미노산 서열과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 38의 아미노산 아미노산 서열 27-37, 55-57, 및 94-101 과 각각, 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 110의 아미노산 서열 27-37, 55-57, 및 94-101 과 각각, 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 111의 아미노산 아미노산 서열 27-37, 55-57, 및 94-101 과 각각, 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가적인 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 36의 26-33, 51-58, 및 97-116 아미노산들과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 38의 아미노산 서열 27-37, 55-57, 및 94-101 과 각각, 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가적인 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 36의 26-33, 51-58, 및 97-116 아미노산들과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 113의 아미노산 서열 27-37, 55-57, 및 94-101 과 각각, 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가적인 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 36의 26-33, 51-58, 및 97-116 아미노산들과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 114의 아미노산 아미노산 서열 27-37, 55-57, 및 94-101 과 각각, 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 36으로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 110으로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 VL를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 111으로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산 서열로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 36 및 38로 각각 정해진 아미노산 서열들과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산서열로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 36 및 110으로 각각 정해진 아미노산 서열들과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 36 및 111로 각각 정해진 아미노산 서열들과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 36의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 38로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 113으로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 114로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 36 및 38로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 36 및 110으로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 36 및 111로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
C5
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 C5 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 C5 항체의 HCDR1, HCDR2, 과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, C5 VH 의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, C5 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, C5 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 C5 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 95% (적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열 동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 40의 26-35, 53-59, 및 98-115 아미노산 서열과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 42의 26-34, 52-54, 및 91-100 아미노산 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 40의 26-35, 53-59, 및 98-115 아미노산 서열과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 42의 26-34, 52-54, 및 91-100 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 40로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 42로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산 서열로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 40 및 42로 각각 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 40의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 42로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 40 및 42로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
A2
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 A2 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 A2 항체의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, A2 VH 의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, A2 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, A2 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 A2 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 95% (적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열 동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 44의 26-33, 51-58, 및 97-111 아미노산들과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 46의 26-34, 52-54, 및 91-101 아미노산 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 44의 26-33, 51-58, 및 97-111 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 46의 26-34, 52-54, 및 91-101 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 44로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 46로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산 서열로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 44 및 46으로 각각 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 44의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 46로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 44 및 46으로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
A10
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 A10 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 A10 항체의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, A10 VH 의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, A10 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, A10 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 A10 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 95% (적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열 동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 48의 26-33, 51-58, 및 97-111 아미노산들과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 50의 26-34, 52-54, 및 92-102 아미노산 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 48의 26-33, 51-58, 및 97-111 아미노산 과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 50의 26-34, 52-54, 및 92-102 아미노산 아미노산 과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 48로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산서열로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 50으로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산 서열로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 48 및 50으로 각각 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 48의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 50으로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 48 및 50으로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
FIB_B2
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 FIB_B2 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 FIB_B2 항체의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, FIB_B2 VH의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, FIB_B2 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, FIB_B2 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 FIB_B2 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 95% (적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열 동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 52의 26-33, 51-55, 및 97-107 아미노산들과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 54의 27-32, 50-52, 및 89-97 아미노산 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 52의 26-33, 51-55, 및 97-107 아미노산 과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 54의 27-32, 50-52, 및 89-97 아미노산 아미노산 과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 52로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산서열로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 54로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산 서열로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 52 및 54로 각각 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 52의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 54로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 52 및 54로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
FIB_H1
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 FIB_H1 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 FIB_H1 항체의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, FIB_H1 VH의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, FIB_H1 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, FIB_H1 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 FIB_H1 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 95% (적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열 동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 56의 26-33, 51-55, 및 97-107 아미노산들과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 58의 27-32, 50-52, 및 89-97 아미노산 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 56의 26-33, 51-55, 및 97-107 아미노산 과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 58의 27-32, 50-52, 및 89-97 아미노산 아미노산 과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 56으로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산 서열로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 58로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산 서열로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 56 및 58로 각각 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 56의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 58로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 55 및 58로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
G2
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 G2 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 G2 항체의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, G2 VH의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, G2 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, G2 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 G2 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열 동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 115의 26-33, 51-58, 및 97-107 아미노산들과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 117의 26-36, 54-56, 및 93-97 아미노산 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.추가의 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 115의 26-33, 51-55, 및 97-107 아미노산 과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 117의 26-36, 54-56, 및 97-107 아미노산 아미노산 과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 115로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산서열로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 117로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산 서열로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 115 및 117로 각각 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 115의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 117로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 115 및 117로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
G4
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 G4 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 G4 항체의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, G4 VH의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, G4 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, G4 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 G4 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열 동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 119의 26-33, 51-58, 및 97-111 아미노산들과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 121의 26-36, 54-56, 및 93-101 아미노산 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 119의 26-33, 51-58, 및 97-111 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은) 동일한 아미노산 서열로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 121의 26-36, 54-56, 및 97-101 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 119로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산서열로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 121로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산 서열로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 119 및 121로 각각 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 119의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 121로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 119 및 121로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
D12
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 D12 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 D12 항체의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, D12 VH의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, D12 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, D12 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 D12 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열 동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 123의 26-33, 51-58, 및 97-105 아미노산들과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 125의 26-32, 54-52, 및 89-97 아미노산 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 123의 26-33, 51-58, 및 97-105 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은) 동일한 아미노산 서열로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 125의 26-36, 50-52, 및 89-97 아미노산 아미노산 과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 123으로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 125로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산 서열로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 123 및 125로 각각 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 123의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 125로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 123 및 125로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
F11
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 F11 항체에 근거하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 한 예로, 항체 또는 항원 결합 단편은 F11 항체의 HCDR1, HCDR2,과 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 각각 포함하는 VH 및 VL 를 (예를 들어, IMGT 에 따른) 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, F11 VH의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, F11 VL 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1 에서 정해진 대로, F11 VH 및 VL 의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 과 LCDR3 를 포함하는 VH 및 VL 를 포함할 수 있으며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 표 1에서 보여준 대로 F11 VH 또는 VL 의 중쇄 또는 경쇄 CDRs 의 어느 한 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)의 서열 동정성을 가진 적어도 하나의 CDR (HCDR3과 같은)을 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화한다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 127의 26-33, 51-58, 및 97-111 아미노산들과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은)동일한 아미노산으로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 129의 26-37, 55-57, 및 94-102 아미노산 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지도와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 127의 26-33, 51-58, 및 97-111 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은) 동일한 아미노산 서열로 구성된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3 를 포함하는 VH 를 포함하며, 및 서열번호 129의 26-37, 55-57, 및 94-102 아미노산과 각각 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 100% 까지와도 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 를 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 127으로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은)동일한 아미노산 서열로 구성된 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 129로 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산 서열로 구성된 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 추가의 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 127 및 129로 각각 정해진 아미노산 서열과 적어도 90% (적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%와 같은 )동일한 아미노산으로 구성된 VH 및 VL 를 각각 독립적으로 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
추가 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 127의 하나로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VH 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 더 많은 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 129로 정해진 아미노산 서열을 포함하는 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호들 127 및 129로서 각각 정해진 아미노산 서열들을 포함하는 VH 및 VL 를 포함하며, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고 MERS-CoV 감염을 중화할 수 있다.
1. 항체 또는 항원 결합 단편들에 대한 추가작 서술
항체 또는 항원 결합 단편은 인간 항체 또는 이의 단편이 될수 있다. 키메릭항체가 제공 된다. 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 프레임워크 영역 (이것에만 국한하지 않고)과 같은 어떠한 적절한 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 인간 프레임 영역에 만들어 질 수 있는 돌연변이들은 이 분야에서, 알려져 있다 (예를들어, 여기서 참고 문헌으로 포함된 U.S. Patent No. 5,585,089, 를 보시오). JC57-13, JC57-14, 및 JC57-11 항체들의 프레임워크 영역들은 전적으로 인간항체로 만들기 위해 인간 프레임워크 영역과 서로 바꿀 수 있다. 다른 한편으로, 이것에 만 국한하지 않으나, 생쥐 프레임워크 영역과 같은 이종의 프레임워크 영역이 항체의 중쇄 또는 경쇄에 포함될수 있다 (예를 들어, Jones et al., Nature 321:522, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988; Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 89:4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech.12:437, 1992; and Singer et al., J. Immunol .150:2844, 1993.를 보시오).
항체는 어느 아이소타입 (isotype)이 될 수 있다. 항체는, 예를 들어, gG1 , IgG2, IgG3, 또는 IgG4 와 같은 IgM 또는 IgG 항체가 될수 있다. MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 종류 (class)는 다른 종류와 대체될 수 있다. 한 관점에서, VL 또는 VH 를 암호화하는 핵산 분자는, 경쇄 또는 중쇄의 고정 영역을 각각 암호화하는 핵산 서열이 포함되지 않도록, 이 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 분리될 수 있다.
그후 VL 또는 VH 를 암호화하는 핵산 분자는 다른 종류의 면역글로빈으로부터 온 CL 또는 CH 를 암호화하는 핵산 서열과 작동적으로 연결된다. 이는 이 분야에 알려진대로, CL 또는 CH 체인을 포함하는 벡터 또는 핵산분자를 사용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 원래 IgM 인 항체는, IgG 로 종류 교환(class switch)될 수 있다. 종류 교환은 한 IgG 아종류( subclass) 를, IgG1 로부터 IgG2, IgG3, 또는 IgG4 와 같이, 다른 아종류로 전환하는데 사용될 수 있다.
몇몇 예들에서, 공시되는 항체들은 다이머(dimers), 트라이머(trimers), 테트라머(tetramers), 펜타머(pentamers), 헥사머(hexamers), 셉타머 (septamers), 옥타머(octomers),등등과 같은 항체의 올리고머들이다.
(a) 결합 친화도
몇몇 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 친화도 (예, Kd 로 측정), 1.0 x 10-8 M 이하로 ( 5.0 x 10-8 M 이하, 1.0 x 10-9 M이하, 5.0 x 10-9 M 이하, 1.0 x 10-10 M 이하, 5.0 x 10-10 M 이하, 또는 1.0 x 10-11 M이하 와 같이) 로 결합한다. 예를 들어 Kd 는 관심 있는 항체의 Fab 부분과 이의 항원을 알려진 방법을 사용하여 방사성 표지 항원 결합 에세이 (radiolabeled antigen binding assay)(RIA) 로 측정될 수 있다. 한 에세이에서, Fabs의 항원에 대한 용액 결합친화도 (solution binding affinity)는 Fab를 표지하지 않은 항원의 적정 시리즈 농도 존재하에 최소의 (125I)-표지한 항원과 평형시키고, 이어서 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 캡처하여(capturing) 측정한다(예, Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999)를 보시오). 에세이 조건을 설정하기 위해, MICROTITER® multi-well plates (멀티-웰플레이트) (Thermo Scientific) 는 하루 밤동안 5 μg/ml 의 캡처링 항Fab 항체(Cappel Labs)로 50 mM 소듐 카보네이트 (sodium carbonate) (pH 9.6)에서 코팅되게 하며, 이어서 PBS에 있는 2% (w/v) bovine serum albumin 으로 2-5 시간 동안 실온 (약 23° C) 에서 블럭킹 한다. 비-흡착 플레이트 (non-adsorbent plate) (Nunc #269620)에, 100 μM 또는 26 pM [125I]-항원을 대상 Fab의 시리즈 희석액(serial dilutions)(예; Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997) 에서 항-VEGF 항체, Fab-12 의 평가과 일치)과 혼합시킨다. 대상 Fab는 그 후 하루 밤 동안 배양한다; 그러나, 배양은 평형에 확실하게도달하게 하기 위해 더 오랜 동안(예, 약 65 시간) 계속 되기도 한다. 그 후, 혼합물은 실온에서 배양하기 위해 캡춰 플레이트에 옮겨진다 (예, 약 1 시간). 그 후 용액은 제거되고 플레이트는 0.1% polysorbate 20 (TWEEN-20®)이 있는 PBS 용액으로 8번 세척한다. 플레이트가 건조 되었을 때 150 μl/well 의 신틸런트 (scintillant) (MICROSCINT-20™; Packard)를 첨가하고, 플레이트는 TOPCOUNT™ 감마 카운터(gamma counter)(Packard) 에서 10분간 측정한다. 20% 미만 또는 20%와 동등한 최대 결합을 내는 각 Fab의 농도들은 선택하여 경쟁적 결합 에세이에 사용한다.
다른 에세이에서는, BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) 를 사용하여 25° C 에서 표면 플라즈몬 공명 에세이(surface plasmon resonance assays) 방법으로 ~10 반응 유닛트(response units)의 고정시키 항원 CM5 칩으로 측정 될 수 있다. 간략하게, carboxymethylated dextran biosensor chips (CM5, BIACORE®, Inc.) 를 공급자의 지시에 따라 N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS)로 활성화시킨다. 커플된 단백질의 반응 유닛트 (response units (RU))가 약 10 이 되도록 하기 위해 흐름속도 (flow rate) 5 l/minute 로 주사하기 전에 항원을 5 μg/ml (~0.2 μM)로 되도록 10 mM 소듐 아세테이트 (Sodium acetate), pH 4.8, 로 희석시킨다. 항원을 주사 후에 반응 안한 그룹들을 블럭킹하기 위해 1 M 에타놀아민 (ethanolamine) 을 주사한다. 키네틱 측정 (kinetics measurements)을 위해, 2배 희석 시리즈의 Fab (0.78 nM 에서 500 nM)액을 0.05% polysorbate 20 (TWEEN-20™) 계면활성제 (surfactant) (PBST) 가 있는 PBS 로 흐름속도 약 25 l/min 되도록 25° C에서 주사한다. 결합속도 (kon)및 해리 속도는(koff)들은 결합 및 해리 센서그램을 동시에 맞추어 가면서 단순한 1:1 Langmuir 의 결합 모델 (Langmuir binding model) (BIACORE® Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수(Kd)는 koff/kon 의 비율로 계산된다. 예, Chen et al., J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999)를 보시오. 만약 위의 표면 플라즈몬 공명에세이 (surface plasmon resonance assay)로 on-rate 가 106 M-1 s-1 를 넘으면, on-rate 는 형광 냉각(fluorescent quenching ) 기술로 결정할 수 있다. 이 방법은 교반되는 큐벳에서 stop-flow equipped spectrophometer (Aviv Instruments) 또는 a 8000-series SLM-AMINCO™ spectrophotometer (ThermoSpectronic)와 같은 것으로 증가하는 농도의 항원 존재하에서 20 nM 항-항원항체 (anti-antigen antibody )(Fab form)PBS, pH 7.2 용액의 25° C에서 형광 방출 강도의 증가 또는 감소를 (excitation=295 nm; emission=340 nm, 16 nm band-pass) 측정하는 방법이다.
(b) 중화
몇몇 예시들에서, 항체 또는 항원결합 단편은 중화 범위 (neutralization breadth)로 구별될 수도 있다. 몇몇 예시들에서, 항체 또는 항원결합 단편은 표 4에 리스트 되어 있는 대로 예를 들면, IC5 값 50 μg/ml 이하로, 적어도 70% (적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%,) 의 MERS-CoV 분리체를 중화 할 수 있다. 이 분야 익숙한 일반 사람은 중화 범위 및 강도를 측정하는 방법에 대해 친숙하다. 추가로 면역 접종 regime 에 대한 면역 반응의 중화 위 와 강도를 검증하는 전형적인 방법은 여기서 예 부분에 (Examples section)제공된다.
(c) 복합특이성 항체들
몇몇 예시들에서, 항체 또는 항원결합 단편은 이중-특이성 (bi-specific)항체와 같이 복합-특이성 항체에 포함된다. 그러한 복합특이성 항체들은, 두 개 또는 그 이상의 항체들, 같은 타입 또는 다른 타입의 항원 결합 단편들 (scFvs과 같은) 의 교차연결 (crosslinking) 과 같은 알려진 방법들로 생산 될수 있다. 복합-특이성 항체를 만드는 전형적인 방법들에는, 여기에 참고 문헌으로 그 전문이 병합 된 PCT Pub. No. WO2013/163427 에 서술된 것들이 포함된다. 적절한 교차링커 (crosslinkers)들에는 적절한 스페이서 (spacer)( m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester 와 같은) 로 분리된 두 개의 차별이 나는 반응 그룹을 가진 이종이중기능성(heterobifunctional) 인것, 또는 동종 이중기능성 (homobifunctional) (disuccinimidyl suberate와 같은 것)인 것이 포함된다.
여러 타입의 복합-특이성 항체들이 알려졌다. 이중특이성 단쇄항체 (bispecific single chain antibodies)는 단일 핵산 분자에 의해 암호화 될 수 있다. 이중특이성 단쇄항체의 예들 및 이러한 항체들을 만드는 방법들이 이 분야에 알려져 있다 (예, 여기에 참고 문헌으로 병합된 U.S. Pat. Nos. 8,076,459, 8,017,748, 8,007,796, 7,919,089, 7,820,166, 7,635,472, 7,575,923, 7,435,549, 7,332,168, 7,323,440, 7,235,641, 7,229,760, 7,112,324, 6,723,538, 를 보시오). 이중특이성 단쇄항체의 추가적인 예들은 PCT application No. WO 99/54440; Mack, J. Immunol ., 158:3965-3970, 1997; Mack, PNAS, 92:7021-7025, 1995; Kufer, Cancer Immunol . Immunother ., 45:193-197, 1997; Loffler, Blood, 95:2098-2103, 2000; 및 Bruhl, J. Immunol ., 166:2420-2426, 2001 에서 찾을 수 있다. 이중특이성 Fab-scFv ("bibody")분자의 생산이, 예를 들어, Schoonjans et al. (J. Immunol. 165:7050-57, 2000) 및 Willems et al. (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003)에 서술 되어 있다. 비바디 (bibodies)를 위해, scFv 분자를 VL-CL (L) 또는 VH-CH1 체인중 하나에 융합되게 할수 있다, 예를 들어, 비바디를 생산하기 위해 하나의 scFv 가 Fab 체인의 C- 말단에 융합 된다.
(d) 단편들
중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고 MERS-CoV S 에 결합하는 Fab, F(ab')2, 및 Fv 들과 같은 것들이 본 공시에서 포함되는 항원결합 단편이다. 이 항체 단편들은 항원에 선택적으로 결합하는 능력을 유지하고 있으며 "항원 결합" 단편들이다.이 단편들에는 다음이 포함된다:
(1) Fab, 항체 분자의 일가(monovalent)항원-결합 단편을 포함하는 단편,
으로 전체 항체를 파파인(papain) 효소로 소화시켜 온전한 경쇄 및 하나의 중쇄의 한 부분을 생산하게 할 수 있다;
(2) Fab', 항체 분자의 단편은 전체 항체를 펩신(pepsin)으로 처리한 후 환원으로 온전한 경쇄 및 중쇄의 한 부분을 생산하게 하여 얻을 수 있다; 항체 한 분자당 두 분자의 Fab' 단편;
(3)(Fab')2, 전체 항체를 펩신(pepsin)으로 처리한 후 환원하지 않고 얻은 항체 분자의 단편; (ab')2 는 두 개의 Fab' 단편이 이황화 결합으로 함께 붙어 있는 Fab' 다이머;
(4) Fv, 두 개의 체인으로 발현된 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역을 포함하는 유전공학적으로 만들어진 단편 및,
(5) 단쇄 항체(scFv 와 같은), 경쇄의 가변영역, 중쇄의 가변영역을 포함 하고 적절한 폴리펩타이드 링커가 유전학적으로 단쇄분자에 융합되어 연결된, 유전공학적으로 만들어진 것으로 정의된 분자, scFv는 면역글로빈의 경쇄 가변영역 과 면역글로빈 의 중쇄 가변영역이 링커로 결합된 융합 단백질이다 (예, Ahmad et al., Clin. Dev. Immunol., 2012, doi:10.1155/2012/980250; Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010를 보시오). scFv 에 있는 VH-도메인 VL-도메인의 분자내방향성(intramolecular orientation )은 제공되는 항체들 (예, 제공되는 복합특이성 항체들)에서 결정적이지 않다. 그러므로, 모두 가능한 두 정렬 (VH-도메인-링커 도메인-VL-domain; VL-도메인-링커 도메인-VH-도메인) 을 가진 scFvs 가 사용될 수 있다.
(6) 단쇄 항체의 다이머 (scFV2), scFV의 다이머로 정의 된다. 이는 또한 "미니항체"로도 불린다.
이 단편을 만드는 방법들은 이 분야에서 알려져 있다 (예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013를 보시오)).
항원 결합 단편들은 항체의 단백질분해 가수분해, 또는 숙주 세포 (E. coli 와 같은)에서 이 단편을 암호화하는 DNA를 발현시켜 제조될 수 있다. 항원 결합단편들은 기존의 방법들로 전체 항체들을 펩신 또는 파파인으로 소화시켜 얻을 수 있다. 예를 들어, 항원 결합단편들은 항체를 펩신으로 효소적으로 쪼개 F(ab')2 로 표시 되는 5S 단편을 만들 수 있다. 이 단편은 더 나아가 티올 환원제 (thiol reducing agent)를 사용하고, 및 선택적으로 다이설파이드 연결이 쪼개져 얻어지는 설파하이드릴 그룹을 브럭킹 하여 3.5S Fab' 단일가 단편이 생산되도록 더 쪼개지도록 할수 있다. 다른 한편으로, 펩신을 사용한 효소적 분해로 두 개의 단일가인 Fab' 단편 및 Fc 단편을 직접 얻는다( U.S. Patent No. 4,036,945 및 U.S. Patent No. 4,331,647, 및 거기 포함된 참고문헌; Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys . 89:230, 1960; Porter, Biochem . J. 73:119, 1959; Elman et al., Methods in Enzymology, Vol. 1, page 422, Academic Press, 1967; 및 Coligan et al. at sections 2.8.1-2.8.10 and 2.10.1-2.10.4 를 보시오).
완전한 항체에 의해 인식이 되는 항원에 결합하는 단편이기만 하는 한, 항체를 쪼개는 다른 방법들, 단일가 경쇄 단편을 형성하도록 하는 중쇄 분리, 더나아간 절편 절개, 또는 다른 효소적, 화학적, 또는 유전적 기술들 역시 사용될 수 있다.
도메인 항체(dAb)라고 불리는, 항원 결합 단일 VH 도메인들도 역시 면역접종된 생쥐의 유전체 DNA 로부터 증폭시켜 얻은 쥐 VH 유전자 라이브러리로부터 동정되었다 (Ward et al. Nature 341:544-546, 1989). 항원에 높은 결합 친화력을 가진 능력이 있는 인간 단일 면역글로빈 가변 도메인 폴리펩타이드도 역시 서술 되었다.( PCT Publication Nos. WO 2005/035572 and WO 2003/002609를 보시오). 여기서 공시되는 CDRs도 dAb 에 포함된다.
몇몇 예시에서는, 공시 되는 항체 (JC57-13, JC57-11, JC57-14, FIB_B2, FIB_H1, G2, G4, D12, F11, C2, C5, A2, 또는 A10 와 같은) 로부터의 하나 또는 그 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 상보성 결정 영역이 스케폴드 단백질 (scaffold protein)과 같은 다른 단백질의 표면에 발현된다. 스케폴딩 단백질의 표면에의 항체 도메인의 발현은 이 분야에서 알려져 있다(Liu et al., J. Virology 85(17): 8467-8476, 2011를 보시오). 이러한 발현은 MERS-CoV S 단백질에 대한 결합을 유지하는 키메릭 단백질을 만들어 낸다. 몇몇 특정한 예시에서는, 하나 또는 그 이상의 중쇄 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 와같이, 하나 또는 그 이상의 중쇄 CDRs 가 스케폴드 단백질 표면에 이식 (graft)된다. 하나 또는 그 이상의 CDRs 는 디바디나 또는 다른 타입의 단쇄 항체 분자에 포함될수도 있다.
추가의 예시에서, 항원 단편은 카메리드 항체 (camelid antibody)이며, 공시되는 항체의 경쇄 가변영역이 아닌 중쇄 가변영역을 포함한다. llama (Lama paccos, Lama glama 및 Lama vicugna) 와 같은 새로운 세계 맴버들을 포함하는 낙타 및 단봉 낙타 부류의 (Camelus bactrianus 및 Calelus dromaderius) 멤버들로부터 얻은 항체 단백질들은 그 크기, 구조적 복잡성 및 인간 개체애 대한 면역원성 에 관하여 성질이 규명 되었다. 자연에서 발견된 이 부류의 포유동물로부터 얻은 어떤 IgG 항체들은 경쇄가 없으며, 그러므로 두 개의 중쇄 와 두 개의 경쇄를 가진 전형적인 4개 체인의 4차 구조를 가진 다른 동물로부터 얻은 항체들과는 구조적으로 차별이 있다. PCT/EP93/02214 (WO 94/04678 published 3 March 1994) 를 보시오.
VHH 라고 동정 된 작은 단쇄 가변영역 도메인인 카멜리드 항체의 영역은 유전공학적으로 얻을 수 있으며, 타겟 단백질에 대한 친화도가 높은 작은 단백질이고, "카멜리드 항체"로 알려진 저 분자량 항체-유래한 단백질이다, U.S. patent number 5,759,808 issued June 2, 1998를 보시오; 또한 Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; 및 Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520 를 보시오. 카멜리드 항체들 및 항체 단백질 단편들의 유전공학적 라이브러리들이 상업적으로, 예를 들어, Ablynx, Ghent, Belgium 로부터, 얻을 수 있다. 비-인간 유래 다른 항체들처럼, 카멜리드 항체의 아미노산 서열은 인간의 서열과 좀 더 가깝게 비슷한 서열을 갖도록 하기 위해 재조합적으로 바꿀 수 있다, 즉 나노바디는 인간화 될수 있다. 그러므로, 인간에 대해 자연적으로 낮은 항원성을 가진 카멜리드 항체는 더감소시킬 수 있다. 카멜리드 나노바다는 인간의 IgG 분자의 약 10 분의 1 의 분자량을 가지며, 이 단백질은 단지 몇 나노미터의 물리적 직경을 가진다. 이 작은 사이즈의 결과는 카멜리드 항체가 큰 항체 단백질에서는 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합할 수 있는 능력이 있게 하는 것이다, 즉 카멜리드 나노바디는 고전적인 면역적 기술 사용으로는 찾기 어려운 숨어있는 항원을 찾는 시약으로, 및 치료 제제로서 유용하다. 그러므로, 작은 사이즈의 다른 결과는 카멜리드 나노바디가 타겟 단백질의 홈 또는 좁은 부위의 특정한 부위에 결합한 결과로 억제 할 수 있다는 것과, 그래서 다른 고전적인 항체보다 고전적인 저 분자량의 약물의 기능과 좀더 닮은 능력 있게 작용할 수 있다는 것이다.
저 분자량이고 크기가 작고 꽉 찬 것은 더 나아가 카멜리드 나노바디가 열에 매우 안정적이고, 극한 pH 및 단백질성 분해에 안정하며 항원성이 낮다는 결과이다. 다른 결과는 카멜리드 나노바디가 순환계 시스템으로부터 조직으로 쉽게 이동하며, 혈관-뇌 장벽까지도 넘을 수 도 있으며, 및 신경 조직에 영향을 주는 장애들도 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디들은 더나아가, 혈관-뇌 장벽을 통해 약물이 이동하는 것을 촉진시킬 수 있다. U.S. patent application 20040161738 published August 19, 2004 를 보시오. 이들 특징은 인간에게 항원성이 낮다는 것과 함께 치료적 잠재력이 크다는 것을 제시 한다. 더 나아가, 이들 분자들은 E. coli 에서와 같은 비진핵 세포에서도 전적으로 발현이 될수 있으며, 박테리오 파지와 융합 단백질로 발현되며 기능적이다.
따라서, 본 발명의 특징은 MERS-CoV S 단백질에 높은 친화도를 가진 카멜리드 항체 또는 나노바디이다. 몇몇의 예시에서, 예를 들어 PCT/EP93/02214 에서 서술된대로, 카멜리드 항체 또는 나노바디는 공시되는 MERS-CoV S 단백질 특이 항체들의 중쇄 및 경쇄의 CDRs 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열에 이식하여 얻어질 수 도 있다.
(e) 변이체들
어떤 예시들에서는, 여기서 제공된 항체들의 아미노산 변이체들은 심사숙고하고 있다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질을 증가 시키는 것이 바람직 할수도 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체들은 항체를 암호화하는 핵산 서열을 적절히 수정하거나 펩타이드 합성으로 만들 수 있다. 그러한 수정에는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기 삭제, 및/또는 삽입 및/또는 대체 가 포함된다. 최종 구조물이 바람직한 성질을, 예, 항원-결합,을 포함 하기만 한다면, 삭제, 삽입, 및 대체의 어느 조합도 최종 구조물에 도달하기 위해할 수 있다.
어떤 예시들에서는, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 대체된 항체 변이체들이 제공된다. 관심 있는 돌연변이 대체 생성 부위는 CDRs 및 플레임워크 영역이다. 대상 항체에 아미노산 대체가 도입되고, 그 생산물에 대해 바람직한 활성을, 예, 유지/증가된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 증강된 ADCC 또는 CDC, 에 대한 스크리닝을 한다.
변이체들은 올바른 접힘(correct folding), 및 VH 및 VL 사이의 안정화에 필요한 잔기들을 전형적으로 유지하며, 분자들의 낮은 pI 및 낮은 독성을 보존하기 위하여 잔기들의 전기적 성질을 유지할 것이다. 수율을 증가시키기 위해 VH 및 VL 영역에 아미노산 대체를 할 수 있다. 기능적으로 비슷한 아미노산을 제공하는 보존적 아미노산 대체표는 이 분야에 일반적인 전문가들에는 잘 알려져 있다.
몇몇 예시들에서, 항체들 JC57-13, JC57-11, JC57-14, FIB_B2, FIB_H1, G2, G4, D12, F11, C2, C5, A2, 또는 A10 중 하나의 해당하는 VH 및 VL의 아미노산에 비해, 항체의 VH 는 10개 까지의 (1 개까지, 2 개까지, 3 개까지, 4 개까지, 5 개 까지, 6 개까지, 7 개까지, 8 개 까지, 또는 9 개까지) 아미노산 대체 (보존적 아미노산 대체와 같은), 및/또는 항체의 VL 는 10개 까지의 (1 개까지, 2 개까지, 3 개까지, 4 개까지, 5 개 까지, 6 개까지, 7 개까지, 8 개 까지, 또는 9 개까지) 아미노산 대체 (보존적 아미노산 대체와 같은)를 포함한다.
어떤 예시들에서는, 대체, 삽입, 또는 삭제는 이러한 변형이 항체의 항원 결합 능력을 상당히 감소시키지 않는 한 하나 또는 그 이상의 CDRs 내에서 일어나 수도 있다. 예를 들어, 결합 친화력을 상당히 감소시키지 않는 보존적 변경들은(예, 여기 제공된대로 보존적 대체) CDRs 내에 만들 수 있다. 상기 제공된 변이 VH 및 VL 서열들의 어떤 예시들에서는, 각 CDR 은 변경되지 않거나, 또는 하나, 둘, 또는 셋 이하인 아미노산 대체를 포함한다.
항체의 결합친화력을 증가시키기 위해, 자연 면역 반응 동안에 항체의 친화력 성숙에 관여하는 생체 내 체세포 돌연변이화 과정과 비슷한 과정으로 VH 및 VL 조각들은 HCDR3 영역 또는 LCDR3 영역 내와 같은 곳에 무작위적으로 돌연변이 시킬 수 있다. 그러므로, 생체 내 친화력 성숙은 HCDR3 또는 LCDR3에 각각 상보적인 PCR 프라이머들을 사용하여 VH 및 VL 영역을 증폭시켜 달성 할 수 있다. 이 과정에서, 무작위 돌연변이가 VH 및 VL CDR3 영역의 특정위치에 도입된 VH 및 VL 조각들을 암호화하는 PCR 산물들이 결과적으로 얻어지도록 프라이머들은 4개의 뉴크레오타이드 염기들의 무작위 혼합으로 특정 위치에 "꽂히도록" (스파이크)(spiked)" 한다, 무작위로 돌연변이 된 이들 VH 및 VL 조각들은 MERS-CoV S 단백질에 대한 결합 친화력을 측정하기 위하여 테스트 될 수 있다. 실험관 내 친화도 성숙 방법들은 알려져 있다 (예, Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008)), 및 Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001)를 보시오)
돌연변이화의 타겟이 되는 항체의 잔기들 및 영역들을 동정하는 유용한 방법들은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085 에서 서술된대로 "알라닌 스캐닝 돌연변이제조(alanine scanning mutagenesis)" 라고 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 타겟 잔기들의 그룹((예, arg, asp, his, lys, 및 glu 와 같은 전기적 성질(charged)을 가진 잔기들))이 동정되며, 이 잔기들은 항체의 항원과의 상호 작용에 영향이 있는지를 측정하기 위해 중성 또는 음성적 전기성질 (negatively charged)을 가진 아미노산(예, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다. 초기 대체에서 기능적으로 민감성을 보이는 아미노산 위치들에 대체가 더 도입되기도 한다. 다른 한편으로, 또는 추가로, 항원과 항체 사이의 접촉점을 동정하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조가 사용된다. 그런 접촉 잔기들 및 그 주변 잔기들은 타겟이 되기도 하며 또는 대체 후보 잔기로서는 제거 되기도 한다. 변이체들이 바람직한 성질들을 가졌는지 결정하기 위해 변이체들이 스크린 되기도 한다.
어떤 예시들에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 또는 항원 결합단편의 당화(glycosylated) 되는 정도가 증가 또는 감소 되도록 변경된다. 당화 되는 부위의 삽입 또는 삭제는 하나 또는 그 이상의 당화 되는 부위가 새로이 만들어지거나 제거 되도록 아미노산 서열을 변경하여 편리하게 성취될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 곳에는, 거기에 붙는 탄수화물은 변경될 수도 있다. 포유류 세포에서 생산되는 자연 항체들은 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297 에 N-링케이지(연결로)로 전형적으로 가지형, 이중 촉각(biantennary)의 올리고삭카라이드(oligosaccharid)를 포함한다. 예, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)를 보시오. 올리고삭카라이드에는 여러가지 탄수화물들, 예, 만노즈(mannose), N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine)(GlcNAc), 갈락토즈 (galactose), 및 시알릭에시드(sialic acid)는 물론, 이중촉각 올리고삭카라이드 구조의 " 줄기 (stem) 에 있는 GlcNAc 에 붙은 후코즈를 포함할 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 특정한 증강된 성질을 갖는 항체 변이체들 만들기 위해 항체 내에 올리고삭카라이드의 수정을 할 수 있다.
한 예시에서는, Fc 영역에 후코즈가 붙지 않는 (직접적으로 또는 간접적으로) 탄구화물 구조를 가진 항체 변이체들이 제공된다. 예를 들어, 그런 항체에서 후코즈의 양은 1% 에서 80%, 1% 에서 65%, 5% 에서 65%, 또는 20% 에서 40% 일수 있다. 후코즈의 양은, 예를 들어, WO 2008/077546 에 서술된 대로, MALDI-TOF 질량 스펙트로메트리 (MALDI-TOFmass spectrometry) 로 측정한 대로, Asn 297에 붙은 모든 당구조들의 합에 ((예, 복합체, 혼성 및 고 만노즈 (high mannose)구조)) 대비하여, Asn297에 있는 당쇄 (sugar chain) 내에 있는 후코즈의 양으로 계산하여 결정한다. Asn297 은 Fc 영역의 약 297 위치에 놓여 있는 아스파라긴 잔기를 말한다;그러나 Asn297 은 297 위치에서 ±3 아미노산 위 또는 아래에 놓일수 있다, 즉, 항체들의 약간의 서열 변이로 위치 294 에서 300 사이. 그런 후코실화 변이체들은 증가된 ADCC 기능을 가지기도 한다. US Patent Publication Nos. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 보시오. "탈후코실된 (defucosylated)" 또는 "후코즈-결여(fucose-deficient)" 된 항체 변이체들과 관계되는 문헌의 예들에는; US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004); 이 포함된다. 탈후코실된 항체들을 생산할 수 있는 세포주들의 예들에는 단백질 후코실화가 결여된 Lec 13 CHO 세포주 (Ripka et al. Arch. Biochem . Biophys . 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; and WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 예11), 및, 알파-1,6-후코실트란스페라제 유전자 (alpha-1,6-fucosyltransferase gene), FUT8, 가 넉-아웃된 CHO 세포와 같은 넉-아웃 세포주들 ((예, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol . Bioeng ., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107)를 보시오))이 포함된다.
항체 변이체는 더나아가 양분된 올리고삭카라이드로 제공된다, 예, 항체의 Fc 영역에 붙은 양촉각 올리고삭카라이드(biantennary oligosaccharide)에는 GlcNAc 에 의해 양분된다. 그런 항체 변이체들은 감소된 후코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 갖는다. 그런 항체 변이체들의 예들이, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); U.S. Pat. No. 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 서술되어 있다. Fc 영역에 붙은 올리고삭카라이드에 적어도 하나의 갈락토즈 잔기를 가진 항체 변이체들이 제공된다. 그러한 항체 변이체들은 개선된 CDC 기능을 가질수 있다. 그러한 항체 변이체들은, 예, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); and WO 1999/22764 (Raju, S.)에 서술되어 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체의 고정 영역은 생체 내에서의 항체의 반감기를 최적화 하기 위해 하나 또는 그 이상의 대체된 아미노산을 포함한다. IgG Abs의 혈청 반감기는 신생 Fc 수용체 (neonatal Fc receptor) (FcRn)에 의해 조절된다. 그러므로, 몇몇의 예시들에서, 항체는 FcRn 에의 결합을 증가시키는 한 아미노산 대체를 포함한다. IgG 고정 영역들 T250Q 및 M428L (예, Hinton et al., J Immunol ., 176:346-356, 2006 를 보시오); M428L 및 N434S (예, Zalevsky, et al., Nature Biotechnology, 28:157-159, 2010를 보시오);N434A (예, Petkova et al., Int . Immunol., 18:1759-1769, 2006); T307A, E380A, 및 N434A (예, Petkova et al., Int. Immunol., 18:1759-1769, 2006); 및 M252Y, S254T, 및 T256E (예, Dall'Acqua et al., J. Biol . Chem., 281:23514-23524, 2006) 와 같은 몇몇의 그러한 대체는 이 분야의 일반 전문가들에게는 알려져 있다.
몇몇 예시들에서는, 항체의 고정 영역은 항체-의존적 세포-연계 세포독성 (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)(ADCC)을 최적화하기 위해 하나 또는 그 이상의 대체된 아미노산을 포함한다. ADCC는 가깝게 연관된 Fcγ 수용체들의 셋트를 통해 주로 매개 된다. 몇몇 예시들에서는, 항체는 FcγRIIIa 에의 결합을 증가 시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 대체 (substitution)를 포함한다. IgG 고정 영역들에 S239D 및 I332E (예, Lazar et al., Proc . Natl ., Acad . Sci . U.S.A., 103:4005-4010, 2006); 및 S239D, A330L, 및 I332E (예, Lazar et al., Proc . Natl ., Acad . Sci . U.S.A., 103:4005-4010, 2006) 와 같은 몇몇의 그러한 대체는 이 분야의 일반 전문가들에게는 알려져 있다.
FcRn 및 FcRγIIIa 에의 증가된 결합을 가진 IgG 고정 영역을 만들기 위해, 상기 대체들의 조합들도 포함된다. 이 조합들은 항체의 반감기 및 ADCC를 증가시킨다. 예를 들어, 그러한 조합들에는 Fc영역에 다음의 아미노산 대체를 가진 항체들이 포함된다.
(1) S239D/I332E 및 T250Q/M428L;
(2) S239D/I332E 및 M428L/N434S;
(3) S239D/I332E 및 N434A;
(4) S239D/I332E 및 T307A/E380A/N434A;
(5) S239D/I332E 및 M252Y/S254T/T256E;
(6) S239D/A330L/I332E 및 T250Q/M428L;
(7) S239D/A330L/I332E 및 M428L/N434S;
(8) S239D/A330L/I332E 및 N434A;
(9) S239D/A330L/I332E 및 T307A/E380A/N434A; or
(10) S239D/A330L/I332E 및 M252Y/S254T/T256E.
몇몇 예들에서는, 항체들, 또는 이들의 항원 결합단편이 수정되어 이것이 감염된 세포에 직접적으로 세포독성이 있게 하거나, 또는 보완(complement), 항체의존세포독성(ADCC), 또는 마크로파지 (대식세포)에 의한 파고사이토시스(phagocytosis)와 같은 자연 방어를 사용 하도록 한다.
어떤 예시들에서는, 여기서 제공된 항체들은 이 분야에서 알려졌고 바로 사용 가능 한 비-단백질성 잔기들을 추가로 포함하도록 더 수정된다. 항체 유도체를 만드는데 적절한 잔기들은 이것에만 국한하지는 않으나 수용성 폴리머들을 포함한다. 수용성 폴리머들의 제한적이지 않은 예들에는, 이것에만 국한하지는 않으나, 폴리에틸렌 글라이콜 (polyethylene glycol) (PEG), 에틸렌 글라이콜/플로필렌 글라이콜(ethylene glycol/propylene glycol)의 코폴리머, 카복시메틸셀루로즈 (carboxymethylcellulose), 덱스트란(dextran), 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol), 폴리 비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone),폴리-1,3-디옥소랜 ( poly-1,3-dioxolane), 폴리-1,3,6-트리옥산 (poly-1,3,6-trioxane), 에틸렌/ 말릭 안하이드라이 코 폴리머 (ethylene/maleic anhydride copolymer), 폴리아미노산(polyaminoacids)(호모폴리머 또는 무작위 코풀리머), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌글라이콜 (dextran or poly(n-vinyl pyrrolidone)polyethylene glycol), 플로프로필렌 글라이콜 호모폴리머((propropylene glycol homopolymers), 프로릴프로필렌 옥사이드/에텔렌 옥사이드 코 폴리머 (prolypropylene oxide/ethylene oxide co-polymers), 폴리옥시에틸레이티드 폴리올즈 (polyoxyethylated polyols) (예, 글리세롤), 폴리비닐 알콜 (polyvinyl alcohol) 및 이들의 혼합물들이 포함된다. 폴리에틸렌 글라이콜 프로피온알데하이드 (polyethylene glycol propionaldehyde )는 이의 물에서의 안정성 때문에 제조하는데 유리하다. 폴리머는 어느 분자량도 될수 있으며, 가지가 있거나 (branched) 없거나 (unbranched) 할 수 있다. 항체에 붙는 폴리머들의 수는 다양할 수 있으며, 만약 하나 이상이 붙는다면, 이들은 같거나 또는 다른 분자가 될 수 있다. 일반적으로, 유도체 만드는데 사용되는 폴리머들의 수 및/또는 타입은, 이것에만 국한하지 않으나, 특정한 성질 또는 개선될 항체의 기능들, 항체 유도체가 제한적인 조건하에서 치료에 사용될것인가 아닌가, 등등을 포함 하는 고려에 근거하여 결정할 수 있다.
항체 또는 항원결합 단편은 유도체를 만들거나 또는 다른 분자에 (다른 펩타이드 또는 단백질)연결될 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 항원결합 단편은 MERS-CoV S 단백질에의 결합이 유도체화 (derivatization)나 레블링(labeling.)에 의해 나쁘게 영향을 받지 않도록 유도체를 만든다. 예를 들어, 항체 또는 항원결합 단편은 하나 또는 그 이상의 다른 분자 실체, 다른 항체(예를 들어, 이중-특이성 항체 또는 디바디), 검출마커, 작동체 분자, 또는 항체 또는 항체 일부분과 다른 분자들과 (스트랩타비딘 코아 영역 또는 폴리히스티딘 태그)를 연합하게 하는 단백질 또는 펩타이드 와 기능적으로 연결 (화학적 커풀링, 유전적 융합, 비공유적 연합 또는 다른 방법으로) 될수 있다.
B. 접합 (Conjugates)
MERS-CoV S 단백질의 에피톱에 특이적으로 결합하는 단클론 항체 및 항원 결합단편들은 이분야에 숙련된 사람에게는 알려진 어떤 수의 수단을 통해, 작동체 분자 또는 검출마커와 같은, 제제와 접합(conjugate) 될 수 있다. 공유결합 및 비공유결합 모두 사용될수 있다. 이 분야에 숙련된 사람은 (이것에만 국한하지 않으나)톡신 및 125I, 32P, 14C, 3H 및 35S 및 다른 레불 등과 같은 방사성 제제, 타겟 잔기들 및 리간드들 등을 포함한 다양한 작동체 분자 또는 검출마커가 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 특별한 작동체 분자 또는 검출마커의 선택은 특별한 타겟 분자 또는 세포, 및 요구되는 생물학적 효과에 따른다.
특별한 작동체 분자 또는 검출마커의 선택은 특별한 타겟 분자 또는 세포, 및 요구되는 생물학적 효과에 따른다. 그러므로, 예를 들어, 작동체 분자는 특별한 타겟 세포의(MERS-CoV 감염된 세포)사멸을 가져오게 하는데 사용되는 세포톡신(cytotoxin)이 될 수 있다. 다른 예시들에서는, 작동체 분자는 IL-15와 같은 사이토카인 (cytokine)이 될수 있다;사이토카인 (cytokine)을 포함한 접합체가, 예,국부적으로 면역세포를 자극하기 위해, 사용될수 있다.
작동체 분자 또는 검출마커를 항체 또는 항원 결합단편에 붙이는 과정은 작동체의 화학적 구조에 따라 다르다. 폴리펩타이드들은 전형적으로 다양한 기능 그룹들; 카복실릭 에시드 (carboxylic acid) (COOH), 유리 아민 (free amine)(-NH2) 또는 설파히드릴 (sulfhydryl) (-SH)과 같은 그룹들을 포함하며, 이들은 폴리펩타이드의 적절한 기능 그룹과 반응을 가능하도록 하여 작동체 분자 또는 검출마커가 결합하게 한다. 다른 한편으로는, 항체 또는 항원결합 단편의 유도체를 만들어 추가의 활성이 있는 기능 그룹들에 노출되거나 붙을 수 있도록 한다, 유도체화(derivatization)는 Pierce Chemical Company, Rockford, IL. 로 부터 얻을 수 있는 것과 같은 어떤 수의 링커 (linker) 분자든지 붙이는 것이 관여 될 수 있다. 링커는 항체 또는 항원 결합단편을 작동체 분자 또는 검출마커에 연결시키는데 사용되는 어떤 분자든지 될수 있다. 링커는 항체 또는 항원 결합단편 및 작동체 분자 또는 검출마커에 둘다 공유결합을 형성할수 있는 능력이 있다. 적절한 링커들은 이 분야 전문가들에게는 잘 알려져 있으며, 이것에만 국한하지 않으나 직쇄 또는 가지친-체인의 탄소 링커들, 헤테로사이클릭(heterocyclic) 탄소 링커들, 또는 펩타이드 링커들이 포함된다. 항체 또는 항원 결합단편 및 작동체 분자 또는 검출마커가 폴리펩타이드들 인곳에서, 링커들은 구성하는 아미노산들에 그들의 측쇄 그룹(side groups)을 통해((이황화 링케이지 (disulfide linkage)를 통해 시스테인에와 같은)), 또는 말단 아미노산의 알파 탄소 아미노 및 카복실 그룹에 연결될 수 있다.
몇몇 예시들에서, 링커들은, 스페이서 요소(spacers element)를 포함할 수 있으며, 이것이 존재할 때는, 링커의 크기를 증가시켜 작동체 분자 또는 검출마커와 항체 또는 항원 결합단편 사이의 거리를 증가시키도록 한다. 전형적인 스페이서는 전문가들에게는 잘 알려져 있으며, 각각이 그 전체로 참고 문헌으로 병합되어 있는 U.S. Pat. Nos. 7,964,5667, 498,298, 6,884,869, 6,323,315, 6,239,104, 6,034,065, 5,780,588, 5,665,860, 5,663,149, 5,635,483, 5,599,902, 5,554,725, 5,530,097, 5,521,284, 5,504,191, 5,410,024, 5,138,036, 5,076,973, 4,986,988, 4,978,744, 4,879,278, 4,816,444, 및 4,486,414, 는 물론 U.S. Pat. Pub. Nos. 20110212088 및 20110070248 에 리스트 되어 있는 것이 포함 된다,
몇몇 예시들에서, 세포내 환경에서 링커가 쪼개져 항체 또는 항원 결합단편으로부터 작동체 분자 또는 검출마커가 방출되도록 링커는 세포내 조건에서 쪼개질 수 있다. 그러나 다른 예시들에서, 링커는 쪼개질 수 없으며, 예를 들어, 항체가 분해됨으로서 작동체 분자 또는 검출마커가 방출된다. 몇몇 예시들에서, 링커는 세포내 환경((예, 라이소좀 (lysosome) 또는 엔도좀(endosome) 또는 카베올리에(caveolea)내)에 존재하는 절개 제제 (cleaving agent)에 의해 쪼개질 수 있다. 링커는, 예를 들어, 이것에만 국한하지 않으나, 라이소조말 (lysosomal)또는 엔도조말 (endosomal) 프로테아제(protease)를 포함하는 세포 내 펩티데이즈(peptidase) 또는 프로테아제 효소에 의해 쪼개질 수 있는 펩타이드 링커가 될 수 있다. 몇몇 예시들에서, 펩타이드 링커는 적어도 두 개 아미노산 길이 또는 세 개 아미노산 길이이다. 그러나 링커는 1-2, 1-3, 2-5, 3-10, 3-15, 1-5, 1-10, 1-15, 아미노산 길이처럼, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 아미노산 길이가 될 수 있다.
다양한 방사성진단 화합물들, 방사성치료 화합물들, 레블들(효소 또는 형광분자들과 같은), 톡신들, 및 다른 제제들을 항체에 붙이는 많은 수의 방법들이 보고 되었다는 관점에서, 이 분야 전문가들은 주어진 제제를 항체 또는 항원 결합단편 또는 다른 폴레펩타이드에 붙이는 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 항체 또는 항원 결합단편은 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate) (ADC)를 만들기 위해, 모노메틸 아우리스타틴 E (Monomethyl Auristatin E) (MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F (Monomethyl Auristatin F)(MMAF), 메이타신(maytansine), DM1으로 알려진 메이타신 유도체(mertansine으로도 알려진)를 포함한 메이타신 (maytansine) 유도체와 같은 소 분자량 약물 같은 작동체 분자들과, 또는 다른 제제들과 접합시킬 수 있다. 몇몇 예시들에서는, 항체 또는 항원 결합단편과 칼리케마신 (calicheamicin), 메이타시노이드 (maytansinoids), 돌라스타틴(dolastatins), 아우리스타틴(auristatins), 트리코테센(trichothecene), 및 CC1065, 및 톡신 활성을 가진 이들 톡신들의 유도체와 같은, 소 분자량 톡신들의 하나 또는 그 이상과 의 접합체들이 제공된다.
항체 또는 항원 결합단편은 검출가능한 마커; 예를 들어, ELISA, 스펙트러메트리 (spectrophotometry), 풀루오 사이토메트리(flow cytometry), 현미경(microscopy) 또는 진단적 이미징 기술 ((컴프티드 토모그래피 (computed tomography)(CT), 컴프티드 액시알 토모그래피(computed axial tomography) (CAT) 스캔, 자기공명 이미징(magnetic resonance imaging) (MRI), 핵자기공명 이미징(nuclear magnetic resonance imaging) NMRI), 자성 공명 토모그래피 (magnetic resonance tomography) (MTR), 초음파, 섬유광학적 검사 (fiberoptic examination), 및 복강경 검사 (laparoscopic examination)와 같은 것으로))로 검출이 가능한 검출가능한 마커, 와 접합 될 수 있다. 특정적인, 제한적이지 않은 검출가능 한 마커들의 예들에는 형광물질 ((풀루오로포아) (fluorophores)), 화학발광제(chemiluminescent agents), 효소적 링케지 (enzymatic linkages), 방사성 동위원소 (radioactive isotopes) 및 중금속들 또는 화합물들 ((예를 들어 MRI에 의한 검출을 위해 수퍼 파라마그네틱 아이언 옥사이드 나노크리스탈 (super paramagnetic iron oxide nanocrystals )) 이 포함된다. 예를 들어, 유용한 검출가능 한 마커들에는 풀루오레신 (fluorescein), 풀루오레신 아이소 티아네이트 (fluorescein isothiocyanate), 로다민 (rhodamine), 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드 (5-dimethylamine-1-napthalenesulfonyl chloride), 파이코에리트린 (phycoerythrin), 란테나이드 포스포아(lanthanide phosphors) 및 이와 같은 것들을 포함하는 형광 화합물들이 포함된다. 루시페라아제 (luciferase), 녹색 형광 단백질 (Green fluorescent protein )(GFP), 황색 형광 단백질 Yellow fluorescent protein) (YFP)과 같은 생체발광(bioluminescent) 마커들도 사용된다. 항체 또는 항원 결합단편은 또한 검출에 유용한, 호스레데쉬 퍼옥시데이즈 (horseradish peroxidase), β- 갈락토시데이즈 (β- galactosidase), 루시페라아제 (luciferase), 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 글루코즈 옥시데dl즈 (glucose oxidase) 및 이와 비슷한 것과 같은 효소들과도 접합 될수 있다. 항체 또는 항원 결합단편이 검출가능 한 효소들과 접합할 될 때는, 이는 효소가 차별이 나는 반응 산물을 생산하는데 사용되는 추가의 시약을 첨가하여 검출 될수 있다. 예를 들어, 호스레데쉬 퍼옥시데이즈 제제가 있을 때, 하이드록시 퍼옥사이드 (hydrogen peroxide) 및 디아미노벤즈딘(diaminobenzidine)의 첨가는 눈으로 검출이 가능한 유색의 반응산물이 나오도록 한다. 항체 또는 항원 결합단편은 또한 바이오틴과 접합 될 수 있으며, 아비딘(avidin)또는 스트랩타빈(streptavidin) 과의 결합을 측정하여 간접적으로 검출한다. 아비딘 그 자체가 효소나 또는 풀루오레센 레블과 접합할 수 있음을 주지해야 한다.
항체 또는 항원 결합단편은, 가도리늄(gadolinium) 과 같은 파라마그네틱 제제와 접합될 수 있다. 수퍼 파라마그네틱 아이언 옥사이드 (superparamagnetic iron oxide)제제들과 같은 것도 또한 레블로 유용하다. 항체들은 또한 란타나이드 (lanthanides) ((유로피움(europium) 및 디스프로지움(dysprosium 과 같은)), 및 망가네이즈 (manganese)와 접합될 수 있다. 항체 또는 항원 결합단편은 또한 2차 리포터((루이신 지퍼 쌍 서열 (leucine zipper pair sequences), 2차 항체 결합 부위 (binding sites for secondary antibodies), 메탈결합 도메인들, 에피톱 태그(epitope tags) 와 같은))로 인식될 수 있는 미리 결정된 폴리펩타이드 에피톱과 레불될 수 있다.
항체 또는 항원 결합단편 방사성레불된 아미노산과 접합 될 수 있다. 방사성레불은 진단 및 치료 목적으로 모두 사용될 수 있다. 예를 들어, 방사성레불은 x-ray, 방출 스펙트라 (emission spectra), 또는 다른 진단 기술로 MERS-CoV S 단백질 및 MERS-CoV S 단백질 발현 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 폴리펩타이드 레불의 예들에는, 이것에 국한 하지 않으나, 다음의 방사성아이소톱들 또는 방사성핵종들: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I 이 포함된다.
그러한 검출가능한 마커들을 검출하는 수단들은 이 분야 전문가들에게는 잘 알려져 있다. 그러므로, 예를 들어, 방사성레불들은 사진 필름 또는 신틸레이션 카운터 (scintillation counters)를 사용하여 검출될 수 있으며, 형광 마커들은 방출되는 빛을 검출하는 포토디텍터(photodetector)를 사용하여 검출될 수 있다, 효소레불들은 전형적으로 효소에 기질을 제공하여 효소의 작용에 의해 생산되는 반응 산물을 검출하여 검출될 수 있으며, 및 비색계 레불들은 단순히 채색된 레불을 눈으로 측정하여 검출될 수 있다.
접합체에서 항체 또는 항원 결합단편 한 분자당 작동체 분자나 검출가능 한 마커 잔기들의 평균 수는, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합단편 하나당 1 에서 20 잔기 범위가 될 수 있다. 어떤 특정한 예시들에서는, 접합체에서 항체 또는 항원 결합단편 한 분자당 작동체 분자나 검출가능한 마커 잔기들의 평균 수는 약 1 에서 약 2, 약 1 에서 약 3, 약 1 에서 약 8, 약 2 에서 약 6, 약 3 에서 약 5, 또는 약 3 에서 약 4의 범위이다. 접합체의 로딩(예를 들어, 작동체 분자/항체 비율)은 다른 방식으로 조절 될수 있다, 예를 들어, :(i) 항원 대비 작동체 분자-링커 중간체 또는 링커시약의 몰수 초과를 제한, (ii) 접합체 반응 시간 또는 온도 제한, (iii) 시스테인 티올 반응의 부분 또는 제한적인 환원 조건들, (iv) 링커-작동체 분자가 붙는 수와 위치를 조절하기 위하여 시스테인 잔기들의 수와 위치가 변형되도록 항체 아미노산 서열을 재조합기술로 제조.
C. 방법들
공시되는 MERS-CoV S 단백질 특이 항체 또는 항원 결합단편, 또는 암호화하는 핵산 분자의 치료적으로 효과 있는 양을 개체에 투여함으로서 개체에서 MERS-CoV 감염의 예방 또는 치료를 위한 방법들이 여기 공시된다. 몇몇 예들에서, 항체, 항원 결합단편, 또는 핵산 분자가 사전-노출 ( pre-exposure)(예를 들어, MERS-CoV 감염의 예방 또는 치료하기 위하여)에 사용 될수 있다. 몇몇 예들에서, 항체, 항원 결합단편, 또는 핵산 분자가 사후-노출 (post-exposure) 예방에 사용 될수 있다. 몇몇 예들에서, 항체, 항원 결합단편, 또는 핵산 분자는 항-바이러스 치료법으로 치료받고 있는 개체와 같은, MERS-CoV 감염이 있는 개체에 투여될 수 있다. 몇몇 예들에서 항체, 항원 결합단편, 또는 핵산 분자는 변형되어 (예, 톡신에 접합되어) 감염된 세포에 직접적으로 세포독성이 있도록 되거나, 또는 보완(complement), 항체 의존 세포성 세포독성 ((ADCC), 또는 마크로파지에 의한 파고사이토시스와 같은 자연 방어를 사용한다.
방법이 효과적이기 위해 MERS-CoV 감염이 완전히 제거되거나 예방될 필요는 없다. 한 방법은 예를 들어, 치료하지 않는 MERS-CoV 감염에 비해, 개체에서 원하는 만큼, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 100% (검출가능성 있는 MERS-CoV 감염된 세포 제거) 까지도, MERS-CoV 감염을 감소시킬 수 있다. 추가적인 예시들에서, 비슷한 방법으로 MERS-CoV 복제가 감소되거나 또는 억제될 수 있다. 방법이 효과적이기 위해 MERS-CoV 복제가 완전히 제거될 필요는 없다. 예를 들어, 한 방법은, 치료 하지 않을 때의 MERS-CoV 복제에 비해, 개체에서 원하는 만큼, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 100% (검출가능성 있는 MERS-CoV 제거)까지도, MERS-CoV 복제를 감소시킬 수 있다.
한 예시에서, 공시되는 항체, 항원 결합단편, 또는 접합체, 또는 핵산 분자 의 투여는 개체에서 MERS-CoV 감염의 확립을 감소시키는 결과를 가져오며 및/또는 이어지는 MERS-CoV 질병 진행을 감소시킨다. MERS-CoV 감염의 확립의 감소 및/또는 이어지는 MERS-CoV 질병 진행을 감소는 통계적으로 의미 있는 MERS-CoV 활성의 어떤 감소도 포함한다.
어떤 적용을 위해, 항체, 항원 결합단편, 또는 접합체, 또는 핵산 분자는 항-바이러스 치료제와 혼합될 수 있다.
MERS-CoV S 단백질-특이 항체, 항원 결합단편, 또는 접합체, 또는 그러한 분자들을 암호화하는 핵산 분자의 치료적으로 효과적인 양은, 질병 및/또는 감염의 심각성 및 환자 건강의 일반적인 상태에 의존할 것이다. 치료적으로 효과적인 양은 증상(들)의 주관적인 완화나 혹은 임상가나 또는 다른 자격 있는 관찰자가 주목한대로 객관적으로 동정할만한 개선을 제공하는 양이다. MERS-CoV S 단백질-특이 항체, 항원 결합단편, 또는 접합체, 또는 그러한 분자를 암호화하는 핵산 분자는 다른 치료제와 함께, 동시에 혹은 연속적으로, 투여될 수 있다.
공시되는 MERS-CoV S 단백질-특이 항체, 항원 결합단편, 또는 접합체, 또는 그러한 분자들을 암호화하는 핵산 분자들을 포함하는 조성물의 일 회 또는 복합투여는 복용량 (dosage)및 환자에 의해 요구되고 견디는 빈도에 의존하여 투여될 수 있다. MERS-CoV S 단백질-특이 항체, 항원 결합단편, 또는 접합체, 또는 그러한 분자들을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조성물들은 환자를 효과적으로 치료하기 위해 MERS-CoV S 단백질-특이 항체, 항원 결합 단편, 또는 접합체, 또는 그러한 분자들을 암호화하는 핵산 분자 중 적어도 하나의 충분한 양이 제공되어야 한다. 복용량은 한번 투여될 수 있으나, 치료적 결과가 달성될 때까지 또는 부작용으로 치료 중단을 정당화 할 때까지 주기적으로 투여될 수도 있다. 한 예에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 용량은 이틀마다 30 분 안 주입된다. 이 예에서, 이틀마다 또는 여섯 용량이 투여 될수 있는 것과 같이 약 하나 (1)에서 약 열(10)의 용량이 투여 될수 있다. 더 나아간 예에서, 연속적인 주사는 약 5일에서 10일 동안 투여된다. 개체는, 한달 간격으로와 같이, 규칙적인 간격으로 바람직한 치료 결과가 얻어질 때까지 처치될 수 있다. 일반적으로, 용량은 환자가 수용하지 못할 만한 독성을 생산함이 없이 질병의 증상들이나 징후들을 치료 또는 완화 시키는데 충분하다.
세포 배양 에세이 및 동물 연구로부터 얻은 데이터들을 사람에서 사용되는 복용량의 범위를 나타내는데 사용될 수 있다. 복용량은 보통 독성이 거의 없거나 최소로서, ED50를 포함하는 순환되는 농도의 범위내 에 놓인다. 복용량은 적용되는 복용량 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 다양할 수 있다. 치료적으로 효과적인 용량은 세포 배양 에세이 및 동물 연구로부터 결정될 수 있다.
어떤 예시들에서, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원결합 단편, 또는 이들의 접합체, 또는 그러한 분자들을 암호화하는 핵산 분자 또는 벡터, 또는 이런 분자들을 포함하는 조성물은 약 5 또는 10nmol/kg 에서 약 00 nmol/kg, 까지 또는 20 nmol/kg 에서 약 about 200 nmol/kg 까지의 범위 내의 용량 에서 투여 되거나, 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 or 2000 nmol/kg의 용량에서, 또는 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 or 1000 μg/kg 용량에서, 또는 약 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는10 mg/kg 에서, 또는 치료하는 의사들이 적절하다고 생각하는 다른 용량 으로 투여 된다. 여기서 서술되는 용량은 제한없이 매일, 일주일에 2 또는 3 번, 매주, 매 2 주, 매 3주, 매달, 등등을 포함하여, 용량 빈도/ 여기서 서술되는 투여 빈도에 따라 투여될 수 있다.
몇몇 예시에서, 공시되는 치료제는 정맥주사로, 피하로, 또는 다른 방법으로 일정기간 동안 매일 또는 일주일에 여러 번 투여 될 수 있으며, 이어서 치료하지 않는 기간이 따르고, 그리고 이 사이클이 반복된다. 초기 치료 기간은 (예, 치료제를 매일 또는 일주일에 여러 번 투여) 예를 들어, 1일, 3일, 1주일, 2 주일, 3 주일, 4주일, 5주일, 6주일, 7주일, 8주일, 9주일, 10주일, 11주일 또는 12주일 동안이 될 수 있다. 관련되는 예시에서는, 치료하지 않는 기간은, 3 일, 1 주일, 2주일, 3 주일 또는 4 주일, 2달, 3 달, 4 달, 5 달, 6 달 과 같이, 몇 일, 몇 주일, 또는 몇 달 동안, 또는 더 많은 기간 일 수 있다. 어떤 예시에서는, 치료제의 투약 프로그램은 매일 3일 투여 이어서 3 일 투약 정지; 또는 일주일에 매일 또는 여러 번을 1주일 동안 투여하고 이어서 3일 또는 1주일 정지; 일주일에 매일 또는 여러 번을 2주일 동안 투여하고 이어서 1 일주 또는 2주일 정지; 일주일에 매일 또는 여러 번을 3주일 동안 투여하고 이어서 1, 2 또는 3주일 정지; 또는 일주일에 매일 또는 여러 번을 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 주일 투여하고 이어서 1, 2, 3 또는 4 주일 정지.
MERS-CoV S 단백질의 실험관 내 및 생체 내에서 발현을 측정하는 방법 또한 제공 된다. 한 예에서, MERS-CoV S 단백질의 존재는 공시되는 MERS-CoV S 단백질-특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다. 생물학적 샘플에서 MERS-CoV S 단백질 존재의 검출은 그 샘플은 MERS-CoV 감염이 있는 개체로부터 온 샘플임을 제시한다. 샘플은, 이것에만 국한하지 않으나, 바이옵시, 부검 또는 병리 표본들로 부터부터 온 조직을 포함한 어떤 샘플도 될 수 있다. 생물학적 샘플은 또한, 예를 들어, 조직학적인 목적으로 얻은 냉동 절편 같은 조직의 절편도 포함된다. 생물학적 샘플은 더 나아가 혈액, 혈청, 플라즈마, 객담, 척수액 또는 뇨와 같은 체액도 포함한다. 검출 방법은 세포 또는 샘플과 접촉, 또는 MERS-CoV S 단백질에 특별히 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 개체에 투여, 또는 복합체를 형성하기에 충분한 조건에서 이들의 접합체 (예, 검출 가능한 접합체 포함), 및 면역 복합체 검출(예, 항체 또는 항원 결합 단편에 접합된 검출 가능한 마커 검출하여).
몇 몇 예시들에서, 개체의 MERS-CoV 감염을 검출하는 방법이 제공된다. 본 공시는 생물학적 샘플에서 MERS-CoV를 검출하는 한 방법을 제공하며, 여기서는 이방법에는 공시되는 항체 또는 항원 결합 단편을 가진 개체의 샘플과 복합체를 형성하기에 충분한 조건에서 접촉, 및 생물학적 샘플에서 MERS-CoV S 단백질을 검출하기 위해 면역 복합체 검출이 포함된다. 한 예에서, 샘플에서 MERS-CoV S 단백질 검출은 그 개체가 MERS-CoV 감염되었음을 제시한다.
몇 예시들에서는, 이들의 공시되는 항체 또는 항원 결합 단백질이 백신을 테스트하기 위해 사용된다. 예를 들어 MERS-CoV S 단백질을 포함하는 조성물이 MERS-CoV 감염을 중화하는 항체에 의해 특이적으로 결합 될 수 있는 에피톱을 포함하는지를 테스트하기 위해. 그러므로 여기 제공되는 것은 백신을 테스트하기 위한 한 방법으로, 이 벙법에는, MERS-CoV S 단백질 면역원,과 같은 백신을 포함하는 샘플을 복합체를 형성하기에 충분한 조건하에서 공시되는 항체 또는 항원 결합 단백질과 접촉, 및 샘플에 있는 MERS-CoV 감염을 중화하는 항체에 의해 특이적으로 결합 될 수 있는 에피톱을 가진 백신을 검출하기 위해, 면역 복합체를 검출하는 것을 포함한다.
한 예시에서, 항체 또는 항원 결합 단백질은 검출 가능한 마커와 직접적으로 레불 된다. 다른 예시에서는, MERS-CoV S 단백질에 결합하는 항체(제1차 항체)는 레불되지 않고 제2차 항체 또는 제1차 항체에 결합하는 항체에 결합할 수 있는 다른 분자가 검출에 사용된다. 이 분야 전문가에게 잘 알려진 대로, 제2차 항체는 종 특이적이고 제1차 항체의 부류에 특이적으로 결합할 수 있는 것이 선택된다. 예를 들어, 만약 제1차 항체가 인간 IgG 이면, 그러면 제2차 항체는 항-인간-IgG (anti-human-IgG)가 될 수 있다. 항체에 결합할 수 있는 다른 분자들에는, 제한적이지 않고, 프로테인 A (Protein A) 및 프로테인G (Protein G)이며, 이들 둘 다 상업적으로 구할 수 있다.
항체, 항원 결합 단편, 또는 제2차 항체에 적절한 레불들은 상기에 서술되며, 여러가지 효소, 치환그룹들(prosthetic groups), 형광물질들, 발광 물질들, 자석제제들 및 방사성 물질들을 포함한다. 제한적이지 않은 적절한 효소들의 예들에는 호ㅡ레디쉬 퍼억시데이즈(horseradish peroxidase), 알카라인 포스파테제(alkaline phosphatase), 베타-갈락토시데이즈(beta-galactosidase), 또는 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)가 포함된다. 제한적이지 않은 적절한 치환그룹 복합체들의 예들에는 스트렙타비딘/바이오틴(streptavidin/biotin) 및 아비딘/바이오틴(avidin/biotin)이 포함된다. 제한적이지 않은 적절한 형광물질들의 예들에는 움벨리페론( umbelliferone), 풀루오레신(fluorescein), 풀루오레신 아이소 티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민 (rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 풀루오레신 (dichlorotriazinylamine fluorescein), 덴실 클로라이드 (dansyl chloride) 또는 파이코에리시린(phycoerythrin)이 포함된다. 제한적이지 않은 전형적인 발광물질은 루미놀(luminol); 제한적이지 않은 전형적이 자성물질은 가도리늄(gadolinium), 및 제한적이지 않은 전형적인 방사성 레불에는 125I, 131I, 35S or 3H 가 포함 된다.
Ⅲ. MERS - CoV 면역원 및 이의 용도
A. MERS - CoV S 단백질 및 이의 면역원성 단편
몇몇 예시들은 MERS-CoV S 단백질 또는 단편 또는 이의 변이 또는 그러한 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 제1 부류 융합 당단백질, MERS-CoV S 단백질은 초기에는 그 크기가 약 1350 아미노산인 단백질 전구체로j 합성된다. 각각의 전구체 S 폴리펩타이드들은 호모트라이머(homotrimer)를 형성하며, 골지장치 (Golgi apparatus)내에서 당화를 거치는 것은 물론 신호 펩타이드 제거 과정도 거치고, 및 약 751/752 위치 사이에서 세포 내 프로테아제에 의해 쪼개져 분리된 S1 및 S2 폴리펩타이드 체인들이 만들어지며, 이는 호모트라이머 내에서 S1/S2 프로토머 (protomers)로서 연합되어 있으며 헤테로다이머의 트라이머를 제공한다. 또 다른 절개 과정이 887/888 사이에서 일어나 S2의 N-말단이 노출되고 융합 펩타이드가 생긴다. S1 서브유닛은 바이러스 멤브레인에서 멀리 있으며, 숙주 수용체, dipeptidyl peptidase-4 (DPP4)에 바이러스가 붙도록 수용체 결합 도메인(receptor-binding domain) (RBD) 을 포함하며, 및 S 단백질의 잔기 약 367-606 를 포함한다. S2 서브유닛은 멤브레인 통과도메인 및 융합 단백질의 전형적인 헵타드-반복서열(heptad-repeat sequences) 두 개를 포함하며 숙주 타겟 세포와 멤브레인 융합을 통해 바이러스의 숙주내 도입을 매개한다.
공시되는 MERS-CoV S 단백질 및 이들의 단편들에 사용되는 번호매김은 MERS-CoV의 England1 균주의 S 단백질에 상응하는 것으로, 이 서열은 서열번호 14로 제공되며, 및 GenBank No. AFY13307.1,로 저장되었으며, 그 전체가 여기에 참고 문헌으로 병합되었다. 추가의 MERS-CoV 균주가 알려졌다. 전장 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는전형적이 핵산서열이 서열번호 13으로 하기에 제공된다.
gtgaacaacaacgcccaggccctgagcaagctggccagcgagctgagcaacaccttcggcgccatcagcgccagcatcggcgacatcatccagcggctggacgtgctggagcaggacgcccagatcgaccggctgatcaacggccggctgaccaccctgaacgccttcgtggcccagcagctggtgcggagcgagagcgccgccctgagcgcccagctggccaaggacaaggtgaacgagtgcgtgaaggcccagagcaagcggagcggcttctgcggccagggcacccacatcgtgagcttcgtggtgaacgcccccaacggcctgtacttcatgcacgtgggctactaccccagcaaccacatcgaggtggtgagcgcctacggcctgtgcgacgccgccaaccccaccaactgcatcgcccccgtgaacggctacttcatcaagaccaacaacacccggatcgtggacgagtggagctacaccggcagcagcttctacgcccccgagcccatcaccagcctgaacaccaagtacgtggccccccaggtgacctaccagaacatcagcaccaacctgcccccccccctgctgggcaacagcaccggcatcgacttccaggacgagctggacgagttcttcaagaacgtgagcaccagcatccccaacttcggcagcctgacccagatcaacaccaccctgctggacctgacctacgagatgctgagcctgcagcaggtggtgaaggccctgaacgagagctacatcgacctgaaggagctgggcaactacacctactacaacaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctggtggccctggccctgtgcgtgttcttcatcctgtgctgcaccggctgcggcaccaactgcatgggcaagctgaagtgcaaccggtgctgcgaccggtacgaggagtacgacctggagccccacaaggtgcacgtgcactga (서열번호 13)
예시적인 MERS-CoV S 단백질인 England1 균주는 하기 서열번호 14로 제공된다:
VNNNAQALSKLASELSNTFGAISASIGDIIQRLDVLEQDAQIDRLINGRLTTLNAFVAQQLVRSESAALSAQLAKDKVNECVKAQSKRSGFCGQGTHIVSFVVNAPNGLYFMHVGYYPSNHIEVVSAYGLCDAANPTNCIAPVNGYFIKTNNTRIVDEWSYTGSSFYAPEPITSLNTKYVAPQVTYQNISTNLPPPLLGNSTGIDFQDELDEFFKNVSTSIPNFGSLTQINTTLLDLTYEMLSLQQVVKALNESYIDLKELGNYTYYNKWPWYIWLGFIAGLVALALCVFFILCCTGCGTNCMGKLKCNRCCDRYEEYDLEPHKVHVH (서열번호 14)
개별 전구체 S 폴리 펩타이드는 homotrimer를 형성하고, homotrimer 내에서 S1/S2 protomer로 유지되는, S1 및 S2 폴리펩타이드 사슬을 생성하기 위해, 골지체(Golgi apparatus) 내에서 글리코실화 뿐만 아니라 신호 펩타이드를 제거하는 처리 및 대략 751/752 위치 사이에서 세포 프로테아제에 의한 절단을 수행한다. MERS-CoV S1 단백질을 코딩하는 예시적인 핵산 분자는 하기 서열번호 15로서 제공된다:
MERS-CoV S1 (1-752) 인코딩 서열, England1 strain:
ccacaatgtctcagtacagtagatcaactaggtcaatgctgaagaggcgcgatagcacctatggacctctgcagacaccagtggggtgtgtcctgggactggtgaactctagtctgtttgtcgaggactgcaagctgcccctgggccagagcctgtgcgccctgcccgacacccccagcaccctgaccccccggagcgtgcggagctga (서열번호 15)
예시적인 MERS-CoV S1 단백질 서열, England1 균주는 하기 서열번호 16으로 제공된다:
MIHSVFLLMFLLTPTESYVDVGPDSVKSACIEVDIQQTFFDKTWPRPIDVSKADGIIYPQGRTYSNITITYQGLFPYQGDHGDMYVYSAGHATGTTPQKLFVANYSQDVKQFANGFVVRIGAAANSTGTVIISPSTSATIRKIYPAFMLGSSVGNFSDGKMGRFFNHTLVLLPDGCGTLLRAFYCILEPRSGNHCPAGNSYTSFATYHTPATDCSDGNYNRNASLNSFKEYFNLRNCTFMYTYNITEDEILEWFGITQTAQGVHLFSSRYVDLYGGNMFQFATLPVYDTIKYYSIIPHSIRSIQSDRKAWAAFYVYKLQPLTFLLDFSVDGYIRRAIDCGFNDLSQLHCSYESFDVESGVYSVSSFEAKPSGSVVEQAEGVECDFSPLLSGTPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPLSMKSDLSVSSAGPISQFNYKQSFSNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRFLSDDRTEVPQLVNANQYSPCVSIVPSTVWEDGDYYRKQLSPLEGGGWLVASGSTVAMTEQLQMGFGITVQYGTDTNSVCPKLEFANDTKIASQLGNCVEYSLYGVSGRGVFQNCTAVGVRQQRFVYDAYQNLVGYYSDDGNYYCLRACVSVPVSVIYDKETKTHATLFGSVACEHISSTMSQYSRSTRSMLKRRDSTYGPLQTPVGCVLGLVNSSLFVEDCKLPLGQSLCALPDTPSTLTPRSVRS (서열번호 16)
S1 서브유닛은 바이러스 멤브레인의 말단에 있으며 숙주 수용체인 dipeptidyl peptidase-4 (DPP4)에 대한 바이러스 부착을 매개하는 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함한다. RBD는 S 단백질의 대략 367-606 잔기를 포함한다. MERS-CoVS 단백질 RBD, England1 strain을 코딩하는 예시적인 핵산 서열은 하기 서열번호 17로 제공된다.
gaggccaagccctctgggagtgtggtcgagcaggctgaaggagtggagtgcgatttcagtcctctgctgtcagggaccccccctcaggtgtacaacttcaagcggctggtctttactaactgtaactacaatctgaccaagctgctgtcactgttcagcgtgaatgactttacatgctcccagatcagccccgcagccattgctagtaactgttactcctctctgatcctggactacttctcatatccactgagtatgaagagcgacctgagcgtgagttcagccggccccatcagccagttcaactataaacagagcttcagcaatcctacatgcctgattctggctactgtgccacataatctgactaccatcactaagcccctgaaatactcctatattaacaagtgcagccggttcctgtccgacgatagaaccgaagtgccacagctggtcaacgccaatcagtactctccctgtgtgagtatcgtcccttcaaccgtgtgggaagacggggattactatagaaaacagctgagccccctggagggaggaggatggctggtggcatccggatctacagtcgccatgactgagcagctgcagatggggttcggaatcacagtgcagtacggcacagacactaactctgtctgtcccaagctggaattcgctaacgatactaagatcgcaagtcagctgggaaactgcgtggagtac (서열번호 17)
MERS-CoV S 단백질 RBD의 예시적인 폴리 펩타이드 서열은 하기 서열번호 18로 제공된다:
EAKPSGSVVEQAEGVECDFSPLLSGTPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPLSMKSDLSVSSAGPISQFNYKQSFSNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRFLSDDRTEVPQLVNANQYSPCVSIVPSTVWEDGDYYRKQLSPLEGGGWLVASGSTVAMTEQLQMGFGITVQYGTDTNSVCPKLEFANDTKIASQLGNCVEY (서열번호 18)
MERS-CoV S 단백질의 또 다른 단편은 ΔTM 단편으로 S 단백질의 세포 외 부분을 포함한다. MERS-CoVS ΔTM 단편을 코딩하는 예시적인 핵산 서열은 하기 서열번호 19로 제공된다.
S-ΔTM (VRC 4228) DNA 서열
gtgaacaacaacgcccaggccctgagcaagctggccagcgagctgagcaacaccttcggcgccatcagcgccagcatcggcgacatcatccagcggctggacgtgctggagcaggacgcccagatcgaccggctgatcaacggccggctgaccaccctgaacgccttcgtggcccagcagctggtgcggagcgagagcgccgccctgagcgcccagctggccaaggacaaggtgaacgagtgcgtgaaggcccagagcaagcggagcggcttctgcggccagggcacccacatcgtgagcttcgtggtgaacgcccccaacggcctgtacttcatgcacgtgggctactaccccagcaaccacatcgaggtggtgagcgcctacggcctgtgcgacgccgccaaccccaccaactgcatcgcccccgtgaacggctacttcatcaagaccaacaacacccggatcgtggacgagtggagctacaccggcagcagcttctacgcccccgagcccatcaccagcctgaacaccaagtacgtggccccccaggtgacctaccagaacatcagcaccaacctgcccccccccctgctgggcaacagcaccggcatcgacttccaggacgagctggacgagttcttcaagaacgtgagcaccagcatccccaacttcggcagcctgacccagatcaacaccaccctgctggacctgacctacgagatgctgagcctgcagcaggtggtgaaggccctgaacgagagctacatcgacctgaaggagctgggcaactacacc (서열번호 19)
MERS-CoVS ΔTM 단편의 예시적인 폴리펩티드 서열은 하기 서열번호 20으로 제공된다.
S-ΔTM (VRC 4228) 아미노산 서열
VNNNAQALSKLASELSNTFGAISASIGDIIQRLDVLEQDAQIDRLINGRLTTLNAFVAQQLVRSESAALSAQLAKDKVNECVKAQSKRSGFCGQGTHIVSFVVNAPNGLYFMHVGYYPSNHIEVVSAYGLCDAANPTNCIAPVNGYFIKTNNTRIVDEWSYTGSSFYAPEPITSLNTKYVAPQVTYQNISTNLPPPLLGNSTGIDFQDELDEFFKNVSTSIPNFGSLTQINTTLLDLTYEMLSLQQVVKALNESYIDLKELGNYT (서열번호 20)
MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들은 자연 소스로 부터 분리 될수 있으며, 또는 재조합 기술들, 또는 화학적으로나 효소적 합성을 사용하여 생산될 수 있다.
MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들의 유사체나 변이체들은 본 발명의 방법들 및 시스템에 사용될 수 있다. 재조합 DNA 기술사용을 통해 내재하는 DNA를 변경시킴으로서 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들의 변이체들을 제조할 수 있다. 변이체가 나오는 결과를 가져오는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들의 구조의 모든 그런 변이나 변경들은 본 발명의 범위 내에 포함된다.그러한 변형들에는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 대체, 또는 삭제, 당화 변형체, 당화되지 않은 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들, 유기 및 무기 염들, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들의 공유결합적으로 수정된 유도체들, 또는 이들의 전구체들이 포함된다. 그러한 변형들은 DPP4에 결합하는 것과 같은 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들의 하나 또는 그 이상의 기능, 생물학적 활성들을 유지할 수도 있다. MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들(예, MERS-CoV S1 단백질)은, 수여자에서 이 단백질의 반감기를 증가시키기 위해, 심장 주위 공간으로부터 제거를 늦추기 위해,및/또는 개체에 전달하는데 더 적절한 단백질로 만들기 위해 예를 들어, PEGylation에 의해,수정 될수 있다.
몇 예시들에서, 공시 내에서 유용한 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들은 하나 또는 그 이상의 20개 유전적으로 암호화되는 자연적으로 존재하는 아미노산 (또는 D-amino acids)의 측쇄들을 다른 측쇄, 예를 들어 알킬, 낮은 알킬(lower alkyl), 사이클릭 4-, 5-, 6-, 에서 7-멤버 알킬 (cyclic 4-, 5-, 6-, to 7-membered alkyl), 아마이드, 아마이드 낮은 알킬 (amide lower alkyl), 아마이드 디 (낮은 알킬)(amide di(lower alkyl), 낮은 알콕시(lower alkoxy), 하이드록시(hydroxy), 카복시(carboxy) 및 이들의 낮은 에스터 유도체, 및 4-, 5-, 6--, 에서 7-멤버 헤테로 사이클릭(4-, 5-, 6--, to 7-membered heterocyclics)와 같은 그룹으로 대체되어 펩타이드 모방품으로 변형된다. 예를 들어, 프로린 유사체들은 프로린 잔기의 링 크기가 5-멤버 링에서 4-, 6-, 또는 7-멤버 링으로 변경되게 만들어질 수 있다. 사이클릭 그룹들은 포화 또는 불포화 될 수 있으며, 만약 불포화되면, 방향족 (romatic)또는 비-방향족(on-aromatic) 될 수 있다, 헤테로사이클릭 그룹들은 하나 또는 그 이상의 질소, 산소, 및/또는 황의 헤테로원자들(heteroatoms))을 포함할 수 있다. 그러한 그룹들의 예들에는 furazanyl, furyl, imidazolidinyl, imidazolyl, imidazolinyl, isothiazolyl, isoxazolyl, morpholinyl (예., morpholino), oxazolyl, piperazinyl (예., 1-piperazinyl), piperidyl (예, 1-piperidyl, piperidino), pyranyl, pyrazinyl, pyrazolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolyl, pyridazinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrrolidinyl (예, 1-pyrrolidinyl), pyrrolinyl, pyrrolyl, thiadiazolyl, thiazolyl, thienyl, thiomorpholinyl (예., thiomorpholino), 및 triazolyl 그룹이 포함된다. 이들 헤테로사이클릭 그룹들은 대체될 수도 대체 안 될 수도 있다. 그룹이 대체되는 곳에서는, 대체물은 알킬, 알콕시(alkoxy), 할로겐 (halogen), 산소(oxygen), 또는 대체된 또는 대체안 된 페닐 phenyl 이 될 수 있다. 펩타이드들은 물론 펩타이드 유사체(analogs)및 모방체(mimetics)들도, U.S. Patent Nos. 4,640,835; 4,496,668; 4,301,144; 4,668,417; 4,791,192; 및 4,179,337 에 서술된 대로, 하나 또는 그 이상의 다양한 비 단백질성(nonproteinaceous) 폴리머들, 예를 들어, 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글라이콜 (polypropylene glycol), 또는 폴리옥시 알캔(polyoxyalkenes) 에 공유적으로 결합될 수 있다.
자연적으로 존재하는 유전적으로 암호화되는 아미노산에 이외에, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들에 있는 잔기들은 자연에 존재하는 암호화 되지 않는 아미노산 및 합성 아미노산으로 대체될 수 있다. 유용한 대체를 제공하는 흔히 마주치는 어떤 아미노산에는, 이것에만 제한하지는 않으나, 3-aminopropionic acid, 2,3-diaminopropionic acid, 4-aminobutyric acid 및 이와 같은 β-alanine 및 다른 오메가-아미노산;α-aminoisobutyric acid;ε-aminohexanoic acid; δ-aminovaleric acid; N-methylglycine 또는 sarcosine; ornithine; citrulline; t-butylalanine; t-butylglycine; N-methylisoleucine; phenylglycine; cyclohexylalanine; norleucine; naphthylalanine; 4-chlorophenylalanine; 2-fluorophenylalanine; 3-fluorophenylalanine; 4-fluorophenylalanine; penicillamine; 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid; β-2-thienylalanine; methionine sulfoxide; homoarginine; N-acetyl lysine; 2,4-diaminobutyric acid; 2,3-diaminobutyric acid; p-aminophenylalanine; N-methyl valine; homocysteine; homophenylalanine; homoserine; hydroxyproline; homoproline; N-methylated amino acids; 및 peptoids (N-substituted glycines) 이 포함된다.
반면에 어떤 예시들에서는, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들의 아미노산들은 L-아민노산으로 대체될 것이다: 그러나, 대체는 L-아미노산에만 제한되지는 않는다, 그러므로, 본 공시에서 포함되는 것은 SAHPs의 변형된 형태이며, 여기서 L-아미노산은 동일한 D-아미노산 (예, L-ArgD-Arg) 또는 보존적으로-대체되는 D-아미노산 (예, L-ArgD-Lys)으로 대체되고, 및 역으로 대체된다.
본 공시의 범위 내에 있는 다른 펩타이드 유사체(analogs) 및 모방체(mimetics)들에는 당화 변형체들이 포함되며, 다른 화학적 잔기들과의 공유접합체 및 응집 접합체를 포함된다. 공유 유도체들은 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 아미노산 체인 또는 N- 또는 C-말단에서 발견되는 기능성 그룹들과 연결시켜제조 될수 있다. 이 유도체들에는, 제한 없이, 카복시 말단 또는 카복실 측쇄를 포함하는 잔기들의 알리파틱 에스터(aliphatic esters)나 아마이드, 하이드록시 그룹-함유하는 잔기들의 O-acyl 유도체들, 및 아미노 말단의 아미노산에 또는 아미노-그룹 함유하는 잔기들에 ( 예,라니신 또느 아르기닌) N-acyl 유도체 를 포함할수 있다. Acyl 그룹들은 C3 에서 C18 노말 알킬(C3- C18 normal alkyl)을 포함하는, 알킬-잔기 그룹들로부터 선택 되며, 그러므로, 알케노일 아로일 (alkanoyl aroyl) 종류를 형성 한다. 또한 예를 들어, 포스포타이로신(phosphotyrosine), 포스포세린 (phosphoserine), 또는 포스포트레오닌 (phosphothreonine)과 같은 인산화된 아미노산 잔기들, 또는 라이보실 (ribosyl)그룹이나 크로스-링킹(cross-linking ) 제제를 포함하는 다른 잔기들을 포함하는, 다른 사소한 변형을 가진 자연적인 일차 아미노산 서열 형도 포함 된다.
다른 예시에서, 추가의 기능 도메인 또는 펩타이드가 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편 또는 여기서 공시되는 유사체들에 연결될 수 있어 펩타이드/펩타이드 유사체-추가 기능 도메인/펩타이드 접합체가 만들어질 수 있다. 추가 기능 도메인 또는 펩타이드는 RLX 폴리펩타이드 또는 펩타이드 유사체에 N- 및/또는 C-말단에 연결 될 수 있다.
선택적으로, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편 또는 유사체와 추가 기능 도메인 또는 펩타이드 사이에 링커가 포함 될 수 있다. 본 공시에서 고려하고 있는 링커들은 두 펩타이드들을 서로 공유적으로 연결 시켜주는 능력이 있는 어떤 이중 기능(bifunctional molecules) 분자일 수 있다 . 그러므로, 적절한 링커는 이중 기능 분자로서 기능 그룹들이 펩타이드의 N- 및/또는 C-말단에 공유적으로 연결될 수 있도록 한다. 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 연결 되는데 적절한 기능 그룹들은, 그런 공유결합 형성에 효과적인 적절한 화학으로서, 이 분야에서 잘 알려져있다. 링커는 유연하거나(flexible), 경직되거나(rigid), 반-경직( semi-rigid) 될 수 있다. 적절한 링커들에는 예를 들어, Pro 또는 Gly와 같은 아미노산 잔기들, 2 에서 약 5, 10, 15, 20, 또는 더 많은 아미노산을 포함하는 펩타이드 잔기들, n 이 1 에서 12의 정수인 H2N(CH2)nCOOH 와 같은 이중 기능성 유기화합물, 및 이와 같은 것들이 포함된다. 그러한 링커들의 예들은 물론, 그런 링커들과 그런 링커들을 병합하는 펩타이드를 만드는 방법들이 이분야 잘 알려져 있다 (예, unig et al., Chem . Ber. 100:3039-3044, 1974 및 Basak et al., Bioconjug . Chem . 5:301-305, 1994 를 보시오).
본 공시에 적용될만한 접합 방법들에는, 제한적이지 않은 예로서, 환원적 아미네이션(reductive amination), 디아조 키플링(diazo coupling), 티오에테르(thioether)결합, 이황화 결합(disulfide bond), 아미데이션 (amidation) 및 티오카바모일(thiocarbamoyl)케미스트리가 포함 된다. 한 예시에서, 양친매성 알파-헬리칼 (amphipathic alpha-helical)도메인들은 접합이전에 "활성화" 된다. 활성화는 접합 반응이 일어나도록 필요한 화학그룹을 제공한다. 한 특정한, 제한적이지 않은 예시에서는, 활성화 단계는 아디픽 에시드 디하이드라이즈(adipic acid dihydrazide)와 유도체화 되는 것을 포함한다. 다른 특정한, 제한적이지 않은, 예시에서는, 활성화 단계는 3-(2-pyridyl dithio)-propionic acid 의 N-hydroxysuccinimide 에스터 로 유도체화 하는 것을 포함한다. 또 다른 특정한, 제한적이지 않은, 예시에서는, 활성화 단계는 succinimidyl 3-(bromoacetamido) propionate 와의 유도체화를 포함한다. 더 나아가, 제한적이지 않은 유도체화 제제의 예들에는 succinimidylformylbenzoate 및 succinimidyllevulinate이 포함된다.
본 공시는 또한 같은 또는 다른 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 다이머, 트라이머, 테트라머 및 더 높은 차원의 폴리머 (즉, "멀티머")를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 멀티머들에서, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편은 하나 또는 그 이상의 링커들에의해 서로 직접적으로 붙거나 또는 분리될 수 있다. MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편은 머리-꼬리(head-to-tail ) 방식 (즉, N-말단에서 C-말단), 머리-머리 (head-to-head) 방식 (즉, N-말단에서 N-말단), 꼬리-꼬리 (tail-to-tail) 방식 ((즉, C-말단에서 C-말단), 및/또는 이들의 조합 방식으로 연결 될 수 있다. 한 예시에서, 멀티머들은 둘, 셋, 넷, 및 약 10개까지의 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편의 나란한 반복(tandem repeats)이다, 그러나 어느 수의 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편들이 사용될수 있다.
B. 단백질 나노입자들
몇 예시들에서 공시하는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편 (예, MERS-CoV S 단백질, 또는 S1 단백질, 또는 RBD) 하나 또는 그 이상을 포함하는 단백질 나노입자를 제공한다. 제한되지 않는 나노입자의 예에는 페리틴 (ferritin nanoparticles),인캡슐린 나노입자(encapsulin nanoparticles), 설퍼 옥시지네이즈 리덕테이즈(Sulfur Oxygenase Reductase) (SOR) 나노입자, 및 루바진 신테에제 (lumazine synthase) 나노입자가 포함되며, 이들은 페리틴 단백질, 인캡슐린 단백질, SOR 단백질, 및 루마진 신테에제 각각을 포함하는 모노머 서브유닛의 조립으로 이루어진다. 재조합 나노입자 서브유닛에 연결된 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편의 전형적인 서열이 아래에 제공된다. MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역성 단편을 포함하는 단백질 나노입자를 만들기 위해, MERS-CoV S 단백질 또는 단편을 단백질 나노입자의 각 서브유닛(페리틴 단백질, 인캡슐린 단백질, SOR 단백질, 또는 루마진 신테에제 단백질과 같은) 에 연결 시킬수 있다. 융합 단백질은 적당한 조건하에서 나노입자로 스스로-집합 된다.
몇몇 예시들에서, 단백질 나노입자는 두 개 또는 그 이상의 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역성 단편으로 구성되며, 여기서 두 개 또는 그 이상의 MERS-CoV S 단백질 또는 단편은 적어도 두 개의 다른 MERS-CoV 균주로 부터 온다.
몇몇 예시들에서, 페리틴 나노입자를 만들기 위해 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역성 단편이 페리틴 서브유닛에 연결 될 수 있다. 페리틴 나노입자들 및 이들의 면역 접종으로서의 용도(예, 인풀루엔자 항원)가 이 분야에 공시되었다 (예, 그 전문이 참고 문헌으로 병합 된, Kanekiyo et al., Nature, 499:102-106, 2013, 여기서 를 보시오). 페리틴은 모든 동물들, 박테리아, 및 식물들에서 발견되는 구형 단백질로서, 수화된 철이온 및 프로톤(hydrated iron ions 및 protons) 을 광물화된 코아(core)로 또는 코아(core)로부터, 이동시킴으로서, 주로 폴리뉴클레아 Fe(III)2O3 ( polynuclear Fe(III)2O3)의 형성 비율 및 위치를 조절하도록 작용한다. 페리틴 나노입자의 구형 형태는 약 17-20 kDa 의 분자량을 가진 폴리펩타이드인 모노머 서브유닛로 이루어진다. 그러한 모노머 페리틴 서브유닛의 한 아미노산 서열의 예가 다음에 표시된다;
ESQVRQQFSKDIEKLLNEQVNKEMQSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIIFLNENNVPVQLTSISAPEHKFEGLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKSKDHATFNFLQWYVAEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKS (서열번호 21)
각 모노머의 서브유닛는 다섯 번째 짧은헤릭스(c-말단 헤릭스)가 4개의 긴 헤릭스 축에 수직적으로 대략적으로 누워 있는 형태를 가진 4개의 역평행 헤릭스 모티프를 포함하는 헤릭스 뭉치 (helix bundle)의 토폴로지를 가진다. 관례에 따라, 헤릭스들은 N- 말단으로부터 각각 'A, B, C, D & E'로 레불된다. N-말단 서열은 캡시드의 3배-접힙축(three-fold axis) 바로 옆에 놓여있고 표면으로 뻗어 있다, 반면에 E 헤릭스는 4배-접힘축에 C-말단과 같이 뭉쳐(pack) 있으며 캡시드 코아로 뻗어 있다. 이러한 포장 (packing)의 결과로 캡시드 표면에 두개의 포아(pore)가 생긴다. 이들 포아 하나 또는 두개 모두는 수화된 철 (하이드레이티드 아이언, hydrated iron)이 캡시드로 또는 캡시드로부터 확산되는 포인트를 나타낸다고 예상 된다. 생산 된 후에는, 이들 모노머의 서브유닛 단백질들은 구형의(globular) 페리틴 단백질로 스스로-집합된다. 그러므로 구형의 형태의 페리틴은 24 모노머, 서브유닛 단백질들, 및 432 대칭을 가진 캡시드-비슷한 구조로 구성된다. 페리틴 나노입자를 구성하는 방법들은 이 분야에 전문적인 일반 사람에게는 알려져 있으며, 여기서 더 서술된다 (예, 그 전문이 여기서 참고 문헌으로 병합된 Zhang, Int. J. Mol. Sci., 12:5406-5421, 2011 를 보시오).
특정한 예들에서, 페리틴 폴리펩타이드는 E. coli 페리틴, Helicobacter pylori 페리틴, 인간 경쇄 페리틴, 황소개구리 페리틴, 또는 E. coli-인간 하이브리드 페리틴, E. coli- 황소개구리 하이브리드 페리틴, 또는 인간-황소개구리 하이브리드 페리틴과 같은 이들의 하이부리드이다. MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 페리틴 나노입자를 만들기 위해 사용하도록 전형적인 페리틴 폴리펩타이드 아미노산 서열 및 페리틴 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열들을 GENBANK ®, 예를 들어, 가입 번호(accession numbers)ZP_03085328, ZP_06990637, EJB64322.1, AAA35832, NP_000137 AAA49532, AAA49525, AAA49524 및 AAA49523에서 찾을 수 있으며, 이들은 특별히 여기서 June 20, 2014 에 가능한 대로 그 전체를 참고문헌으로 병합 하였다. 몇 예시들에서는, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편은 서열번호 21로 정해진 아미노산 서열과 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97% 와 같은)동일한 아미노산 서열을 포함하는 페리틴 서브유닛에 연결될 수 있다.
몇 예시들에서는, MERS-CoV S 단백질의 RBD 도메인은 페리틴 나노입자 서브유닛에 연결될 수 있다. 예를 들어, RBD 도메인은 서열번호 14 로 정해진 MERS-CoV S 단백질의 아미노산 367-601, 367-606, 또는 381-588 로 포함 또는 구성 될수 있으며, 및 페리틴 나노입자 서브유닛에 연결될 수 있다. 페리틴 나노입자 서브유닛에 연결된 MERS-CoV S 단백질의 RBD 도메인의 폴리페타이드의 특정한 예들이 하기 서열번호 22 및 23으로 정해진 아미노산 서열들로 제공된다. 몇 예시들에서는 단백질 나노입자 서브유닛에 연결된 RBD 도메인은 서열번호 22 또는 23로 정해진 아미노산 서열과 적어도 80% (적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 와 같은)동일한 아미노산 서열을 포함한다.
MERS-CoV S-RBD(367-601)_506F_ferritin
EAKPSGSVVEQAEGVECDFSPLLSGTPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPLSMKSDLSVSSAGPISQFNYKQSFSNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRFLSDDRTEVPQLVNANQYSPCVSIVPSTVWEDGDYYRKQLSPLEGGGWLVASGSTVAMTEQLQMGFGITVQYGTDTNSVCPKLEFANDTKIASQLGSGESQVRQQFSKDIEKLLNEQVNKEMQSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIIFLNENNVPVQLTSISAPEHKFEGLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKSKDHATFNFLQWYVAEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKSGS (서열번호 22)
MERS-CoV S-RBD(381-588)_506F_ferritin
VECDFSPLLSGTPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPLSMKSDLSVSSAGPISQFNYKQSFSNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRFLSDDRTEVPQLVNANQYSPCVSIVPSTVWEDGDYYRKQLSPLEGGGWLVASGSTVAMTEQLQMGFGITVQYGTDTNSVCPKLSGESQVRQQFSKDIEKLLNEQVNKEMQSSNLYMSMSSWCYTHSLDGAGLFLFDHAAEEYEHAKKLIIFLNENNVPVQLTSISAPEHKFEGLTQIFQKAYEHEQHISESINNIVDHAIKSKDHATFNFLQWYVAEQHEEEVLFKDILDKIELIGNENHGLYLADQYVKGIAKSRKSGS (서열번호 23)
생산 목적으로, 나노입자 서브유닛에 연결된 RBD 도메인은 세포 처리 중에 절단되는 신호 펩타이드(signal peptide)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 나노입자와 연결된 RBD 도메인은 N- 말단에 다음과 같은 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩타이드를 포함할 수 있다:
bPRL(LA) 신호 펩타이드
MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLPQGVLA (서열번호 24)
hCD5 신호 펩타이드
MPMGSLQPLATLYLLGMLVASVLA (서열번호 25)
페리틴 나노입자 서열에 연결된 개시된 RBD 도메인을 코딩하는 예시적인 핵산 분자 서열은 하기 서열번호 26 및 27로 제공된다.
CMV8xR-bPRL(LA)-MERS-CoV S-RBD(367-601)_506F_ferritin (서열번호 26)
CMV8xR-bPRL(LA)-MERS-CoV S-RBD(381-588)_506F_ferritin (서열번호 27)
추가의 구체예에서, 개시된 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 단편 중 임의의 것을 루마진 신타아제 서브유닛과 연결시켜 루마진 신타제 나노 입자를 구성할 수있다. 루마진 신타제 나노 입자의 구형 (globular form)은 단량체 서브유닛으로 구성되어있다. 그러한 루마진 신타제 서브유닛 중 하나의 서열의 예는 다음과 같은 아미노산 서열로서 제공된다:
MQIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDAIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKEDIDAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLADLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTKHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR (서열번호 28).
추가적인 구체예에서, 본 명세서에 개시된 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 단편 중 임의의 것을 루마진 신타아제(lumazine synthase) 서브유닛과 연결시켜 루마진 신타제 나노입자를 구성할 수 있다. 루마진 신타제 나노입자의 구형(globular form)은 단량체 서브유닛으로 구성되어 있다. 그러한 루마진 신타아제 서브유닛 중 하나의 서열의 예는 다음과 같은 아미노산 서열로서 제공된다:
MQIYEGKLTAEGLRFGIVASRFNHALVDRLVEGAIDAIVRHGGREEDITLVRVPGSWEIPVAAGELARKEDIDAVIAIGVLIRGATPHFDYIASEVSKGLADLSLELRKPITFGVITADTLEQAIERAGTKHGNKGWEAALSAIEMANLFKSLR (서열번호 28).
몇 예시들에서는, 공시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편은 서열번호 28로 정해진 아미노산 서열과 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%, 와 같은)동일한 아미노산 서열을 가진 루마진 신테이즈 서브유닛에 연결될 수 있다.
추가의 예시에서, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편은 인캡술린 나노입자를 만들기 위해 인캡술린 나노입자 서브유닛에 연결될 수 있다. 구형 형태의 인캡술린 나노입자는 모노머 서브유닛으로 구성되었다; 그러한 하나의 인캡술린 서브유닛의 서열의 예가 다음과 같이 정해진 아미노산열로서 제공된다;
MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSLPLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEECLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF (서열번호 29).
몇 예시에서, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편은 서열번호 29로 정해진 아미노산 서열과 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90% 적어도 95%, 또는 적어도 97% 와 같은)동일한 아미노산 서열을 포함하는 인캡술린 서브유닛에 연결될 수 있다.
인캡슐린 단백질은 보전성 박테리아 단백질류로서 효소를 포장하는 최소 구획으로 기능을 하는 커다란 단백질 집합체를 형성하는 리노신(linocin-like)-유사 단백질이라고도 알려져 있다. 인캡슐린 집합은 약 30 kDa 분자량을 가진 폴리펩타이드 모노머 서브유닛로 구성된다. 만들어진 후에는, 모노머 서브유닛들은 60, 또는 어떤 경우에는, 180 모노머 서브유닛들을 포함하는 구형의 인캡슐린 집합체로 스스로-집합 (self-assemble)한다. 인캡슐린 나노입자를 구성하는 방법들은 이 분야에 숙련된 일반인에게 알려져있으며, 여기에 더 서술한다 (예를 들어 그 전문이 여기서 참고 문헌으로 병합된 Sutter et al., Nature Struct. and Mol. Biol., 15:939-947, 2008, 보시오).
몇 예시들에서는, MERS-CoV S 단백질의 RBD 도메인이 인캡슐린 나노입자 서브유닛에 연결될수 있다. 예를 들어, RBD 도메인은 서열번호 14로 정해진 MERS-CoV S 단백질 서열의 아미노산 67-601, 367-606, 또는 381-588 를 포함하거나또는 으로 구성되며 인캡슐린 나노입자 서브유닛에 연결될 수 있다. 인캡슐린 나노입자 서브유닛에 연결된 MERS-CoV S 단백질의 RBD 도메인의 폴리펩타이드 서열의 특정한 예들이 아미노산 서열번호 30 및 31로 정해져 아래에 제공된다. 몇 예시에서, 인캡슐린 나노입자 서브유닛에 연결된 RBD 도메인은 서열번호 30 또는 31로 정해진 서열과 적어도 80% (적어도 90% 적어도 95%, 또는 100% 와 같은)동일한 아미노산 서열을 포함한다. 생산 목적으로, 인캡슐린 나노입자 서브유닛에 연결된 RBD 도메인은 세포 진행과정 동안에 쪼개지는 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 나노입자에 연결된 RBD 도메인은 서열번호 24 또는 서열번호 25로 정해진 아미노산 서열을 포함한 N- 말단에 신호 펩타이드를 포함 할 수있다.
MERS-CoV S-RBD(367-601)_506F_encapsulin
MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSLPLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEECLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKSGEAKPSGSVVEQAEGVECDFSPLLSGTPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPLSMKSDLSVSSAGPISQFNYKQSFSNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRFLSDDRTEVPQLVNANQYSPCVSIVPSTVWEDGDYYRKQLSPLEGGGWLVASGSTVAMTEQLQMGFGITVQYGTDTNSVCPKLEFANDTKIASQLG (서열번호 30)
MERS-CoV S-RBD(381-588)_506F_encapsulin
MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSLPLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEECLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKSGVECDFSPLLSGTPPQVYNFKRLVFTNCNYNLTKLLSLFSVNDFTCSQISPAAIASNCYSSLILDYFSYPLSMKSDLSVSSAGPISQFNYKQSFSNPTCLILATVPHNLTTITKPLKYSYINKCSRFLSDDRTEVPQLVNANQYSPCVSIVPSTVWEDGDYYRKQLSPLEGGGWLVASGSTVAMTEQLQMGFGITVQYGTDTNSVCPKL (서열번호 31)
캡슐린 나노입자 서브유닛(encapsulin nanoparticle subunit)에 연결된, 본 명세서에 개시된 RBD 도메인을 코딩하는 예시적인 핵산 분자 서열은 서열번호 32 및 33으로 제공된다.
CMV8xR-hCD5-MERS-CoV S-RBD(367-601)_506F_encapsulin (서열번호 32)
CMV8xR-hCD5-MERS-CoV S-RBD(381-588)_506F_encapsulin (서열번호 33)
추가적인 구체예에서, MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편은 재조합 SOR 나노입자를 제조하기 위해 유황 옥시게나제 환원효소(Sulfur Oxygenase Reductase; SUR) 서브유닛에 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, SOR 서브유닛은 다음으로 기재되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
MEFLKRSFAPLTEKQWQEIDNRAREIFKTQLYGRKFVDVEGPYGWEYAAHPLGEVEVLSDENEVVKWGLRKSLPLIELRATFTLDLWELDNLERGKPNVDLSSLEETVRKVAEFEDEVIFRGCEKSGVKGLLSFEERKIECGSTPKDLLEAIVRALSIFSKDGIEGPYTLVINTDRWINFLKEEAGHYPLEKRVEECLRGGKIITTPRIEDALVVSERGGDFKLILGQDLSIGYEDREKDAVRLFITETFTFQVVNPEALILLKF (서열번호 34).
몇 예시들에서, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편은 서열번호 34로 정해진 아미노산 서열과 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90% 적어도 95%, 또는 적어도 97% 와 같은)동일한 아미노산 서열을 포함하는 SOR 서브유닛에 연결될 수 있다.
SOR 단백질들은 미생물 단백질들이다 (예를 들어 24 서브유닛 단백질 집합을 형성하는 thermoacidophilic archaeon Acidianus ambivalens 로부터). SOR 나노입자를 구성하는 방법들은 이 분야에 숙련된 일반인에게 알려져있다 (예를 들어 그 전문이 여기서 참고 문헌으로 병합된 Urich et al., Science, 311:996-1000, 2006 를 보시오). SOR 나노입자를 만드는데 사용되는 SOR 단백질의 아미노산 서열의 예가 Urich et al., Science, 311:996-1000, 2006 에 정해져 있고, 그 전문이 여기서 참고 문헌으로 병합되었다.
몇 예들에서, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편은 페리틴, 인갭슐린, SOR, 또는 루마진 신테이즈 서브유닛의 N- 또는 C-말단에 연결될 수 있거나, 또는 예를 들어 Ser-Gly 링커와 같은 링커와 함께, 내부 루프에 놓여질 수 있다. 이 구조가 HEK 293 Freestyle 세포에서 만들어졌을 때, 융합 단백질이 세포로부터 분비 되었으며 나노입자로 스스로-집합되었다. 나노입자들은 알려진 기술, 예를 들어, 몇 가지 다른 크로토그래피 과정, 예, Mono Q (anion exchange) 이어서 크기 제외 크로마토그래피(size exclusion(SUPEROSE® 6) chromatography), 를 사용하여 정제될 수 있다.
몇 예시들은 페리틴, 인캡슐린, SOR, 또는 루마진 신테이즈 서브유닛 단백질의 모노머 서브유닛 또는 이들의 모노머 서브유닛이 구형 형태의 단백질로 스스로-집합하게 지시하는 능력이 있는 어느 부분을 포함한다. 임의의 공지된 페리틴, 인캡슐린, SOR 또는 루마진 신타제 단백질의 단량체 서브유닛으로부터의 아미노산 서열은 단량체 서브유닛이 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편의 표면 상에 나타내는 나노입자로 자기 조립 가능한 한 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편과의 융합 단백질을 생성하는데 사용될 수 있다.
융합 단백질들은 페리틴, 인캡슐린, SOR, 또는 루마진 신테이즈 단백질 모노머 서브유닛 폴리펩타이드의 전장 서열을 포함할 필요는 없다. 모노머 서브유닛 폴리펩타이드의 한 부분들, 또는 영역들은 이 부분들이 모노머 서브유닛들을 구형 형태의 단백질로 스스로-집합하게 지시하는 아미노산 서열을 포함하기만 하면 사용될 수 있다.
몇 예시들에서는, 모노머 페리틴, 인캡슐린, SOR, 또는 루마진 신테이즈의 서브유닛들의 아미노산 서열에 돌연변이를 조작하는 것도 유용할 것이다. 예를 들어, 융합 단백질에 유리한 성질을 (예, 반감기) 부여하기 위해 효소인식부위 또는 당화 부위와 같은 부위를 변경하는 것은 유용할 수 있다.
이 분야 전문가들은 MERS-CoV S 단백질 (예. 트라이머 형태) 또는 이의 면역원성 단편 (RBD 도메인과 같은) 어떤 것이든지 페리틴, 인캡슐린, SOR, 또는 루마진 신테이즈 단백질과의 융합에서 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편이 모노머 페리틴, 인캡슐린, SOR, 또는 루마진 신테이즈 서브유닛이 구형(globula)의 단백질로 스스로-집합되는 것을 방해하지 않도록, 및 페리틴, 인캡슐린, SOR, 또는 루마진 신테이즈 서브유닛은 디스크(disc) MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편이 MERS-CoV 에 대해 면역반응을 끌어내는 능력을 방해하지 않도록 수행되어야 한다는 것을 이해할 것이다. 몇 예시에서, 페리틴, 인캡슐린, SOR, 또는 루마진 신테이즈 단백질 및 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편이 각 부분에 활성에 영향을 주지 않고 서로 같이 직접적으로 연결될 수 있다. 다른 예시들에서, 페리틴, 인캡슐린, SOR, 또는 루마진 신테이즈 단백질 및 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편이 링커 (스페이서 라고도 언급)서열을 사용하여 연결될 수 있다. 링커 서열은 융합 단백질의 페리틴, 인캡슐린, SOR, 또는 루마진 신테이즈 부분과 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편이 서로에 대해 융합 단백질의 부분에 연결될 수 있도록 위치하게 디자인되며, 그래서 융합 단백질이 나노입자로 집합되는 능력이 유지되고, 또한 MERS-CoV에 대한 면역 반응을 끌어내도록 한다. 몇몇 예시들에서, 링커 서열들은 아미노산들을 포함한다. 사용하기 선호하는 아미노산들은 작은 측쇄를 가진 것 들 및/또는 전기적 성질이 없는 것들이다. 그러한 아미노산들은 적절한 접힘 및 융합 단백질의 활성을 덜 방해 할 것이다. 따라서, 링커에 사용되는 선호하는 아미노산들은, 단독으로 또는 조합으로, 세린, 글라이신, 및 알라닌 이다. 그런 링커 서열의 한 예는 SGG 이다. 아미노산들은 필요에 따라 첨가되거나 뺄 수 있다. 이 분야 익숙한 사람은 단백질 나노입자를 만드는데 적절한 링커 서열을 결정할 능력이 있다.
C. 바이러스-유사입자(Virus-Like Particles)
몇 예시들에서, 공시되는 면역원 (예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편)을 포함하는 바이러스-유사 입자 (VLP)가 제공된다, VLPs 은 바이러스 복제에 요구되는 바이러스 구성 성분이 없고 그래서 바이러스의 매우 약화 된 형태를 나타낸다. VLP는 개체에 투여되었을 때 MERS-CoV에 대한 면역 반응을 끌어내는 능력이 있는 폴리펩타이드 (예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원성 단편)를 표현할 수있다. 바이러스-유사 입자들 및 이들 생산 방법들은 잘 알려졌고 이 분야에 숙련된 일반인에게는 익숙하며, human papillomavirus, HIV (Kang et al., Biol. Chem. 380: 353-64 (1999)), Semliki-Forest virus (Notka et al., Biol. Chem. 380: 341-52 (1999)), Chikungunya virus (Akahata et al., Nat. Med. 16:334-338 (2010)), human polyomavirus (Goldmann et al., J. Virol. 73: 4465-9 (1999)), rotavirus (Jiang et al., Vaccine 17: 1005-13 (1999)), parvovirus (Casal, Biotechnology and Applied Biochemistry, Vol 29, Part 2, pp 141-150 (1999)), canine parvovirus (Hurtado et al., J. Virol. 70: 5422-9 (1996)), hepatitis E virus (Li et al., J. Virol. 71: 7207-13 (1997)), 및 Newcastle disease virus 를 포함하는 몇몇의 바이러스로부터의 바이러스 단백질들이 VLPs를 형성하는 것이 알려졌다. 그러한 VLPs 형성은 어떤 적절한 방법으로 검출될 수 있다. 배지 안에 있는 VLPs의 검출을 위한 이 분야에서 알려진 적절한 방법의 예들에는, 예를 들어, 전자현미경 기술(electron microscopy techniques), 다이나믹 라이트 스캐터링 (dynamic light scattering) (DLS), 선택적인 크로마토그래피적 분리 (예, 이온교환(ion exchange), 소수성 상호작용, 및/또는 the VLPs의 크기배제 크로마토그래피적 분리) 및 비중 구배 원심분리(density gradient centrifugation)가 포함된다.
D. 바이러스성 벡터
예를 들면 숙주 세포에서 항원의 발현을 위해, 또는 여기 공시된 대로 개체에 면역 접종을 위하여, 공시되는 면역원들(예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편)을 암호화하는 핵산 분자들이 바이러스성 벡터에 포함될 수 있다, 몇 예시들에서 바이러스성 벡터들은 개체에 프라임-부스트 면역 접종의 한 부분으로서 투여된다. 몇몇의 예시들에서, 바이러스성 벡터들은 프라이머 백신 또는 부스터백신과 같이 프라임-부스트 면역 접종에서 사용하기 위해 백신에 포함된다.
몇 몇의 예들에서, 바이러스성 벡터는 복제-능력 있게 할 수 있다. 예를 들어, 바이러스성 벡터는 숙주 세포에서 바이러스 복제를 억제하지 않는 돌연변이를 바이러스 유전체에 가지게 할 수 있다. 바이러스성 벡터는 또한 조건적으로 복제-능력(replication-competent) 있게 할 수 있다. 다른 예들에서, 바이러스성 벡터는 숙주에서 복제-결여 (replication-deficient)하다.
공시되는 항원들을 발현하는데 사용될 수 있는, 여러 개의 바이러스성 벡터가 만들어졌으며, 폴리오마 (polyoma), 즉, SV40 (Madzak et al., 1992, J. Gen. Virol., 73:15331536), 아데노바이러스 (adenovirus) (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-6; Berliner et al., 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia et al., 1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin et al., 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:2581-2584; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson et al., 1992, Nucl . Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet et al., 1990, Hum. Gene Ther ., 1:241-256), 박시니아 바이러스 (vaccinia virus) (Mackett et al., 1992, Biotechnology, 24:495-499), 아데노- 어소시에티드 바이러스 (adeno-associated virus) (Muzyczka, 1992, Curr . Top. Microbiol . Immunol., 158:91-123; On et al., 1990, Gene, 89:279-282), HSV 및 EBV 를 포함하는 허피스 바이러스 (herpes viruses) (Margolskee, 1992, Curr . Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90; Johnson et al., 1992, J. Virol., 66:29522965; Fink et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfield et al., 1987, Mol . Neurobiol., 1:337-371; Fresse et al., 1990, Biochem . Pharmacol ., 40:2189-2199), 신드비스 바이러스 (Sindbis viruses (H. Herweijer et al., 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; U.S. Pat. Nos. 5,091,309 and 5,2217,879), 알파바이러스 (alphaviruses) (S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11:18-22; I. Frolov et al., 1996, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:11371-11377) 및 에이비안 레트로바이러스 (retroviruses of avian) (Brandyopadhyay et al., 1984, Mol . Cell Biol., 4:749-754; Petropouplos et al., 1992, J. Virol., 66:3391-3397), 쥐(murine) (Miller, 1992, Curr . Top. Microbiol . Immunol., 158:1-24; Miller et al., 1985, Mol . Cell Biol., 5:431-437; Sorge et al., 1984, Mol . Cell Biol., 4:1730-1737; Mann et al., 1985, J. Virol., 54:401-407), 및 인간 기원 Page et al., 1990, J. Virol., 64:5370-5276; Buchs 벡큘러바이러스 (Baculovirus) (Autographa californica multinuclear polyhedrosis virus; AcMNPV) 벡터도 이 분야에서 역시 알려져 있으며, 상업적 소스로부터 얻을 수 있다 (PharMingen, San Diego, Calif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla, Calif. 와 같이).
몇몇의 예시들에서, 바이러스성 벡터는 공시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 비-인간 아데노바이러스(예, 원숭이 (simian), 침판지 (chimpanzee), 고릴리(gorilla), 조류(avian), 개 (cane), 양 (ovine), 또는 소(bovine) 아데노바이러스들)가 아데노바이러스 벡터를 만들기에 사용될 수 있다. 예를 들어, 시미안 아데노바이러스가 아데노바이러스 벡터의 바이러스 유전체의 소스로서 사용될 수 있다. 시미안 아데노바이러스 (simian adenovirus)는 혈청타입 1, 3, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38, 39, 48, 49, 50, 또는 어느 다른 어떤 타입의 시미안 아데노바이러스 혈청타입이 될 수있다. 시미안 아데노바이러스는 이 분야에서 알려진 어떤 적절한 약어를, 예를 들어 V, SAdV, SAV 또는 sAV 와 같이, 사용하여 언급될 수 있다. ChAd3 또는 인간 Ad5 와 비슷하고 아데노바이러스 서브타입 C인 고릴라-유래 아데노바이러스 벡터도 역시 사용될 수 있다 ((예, Johnson et al., Mol Ther. 2014 Jan;22(1):196-205)을 보시오)).어떤 예들에서는, 시미안 아데노바이러스 벡터는 혈청 타입 3, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38, 또는 39의 시미안 아데노바이러스 이다. 한 예에서, 침판지 혈청타입C Ad3 백터가 사용된다 (예, Peruzzi et al., Vaccine, 27:1293-1300, 2009 를 보시오). 인간 아데노바이러스가 아데노바이러스 벡터의 바이러스 유전체의 소스로서 사용될 수 있다. 인간 아데노바이러스는 여러가지 서브그룹 또는 혈청타입이 될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 서브그룹 (subgroup) A (예, 혈청타입 12, 18, 및 31), 서브그룹 B (예, 혈청타입 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 및 50), 서브그룹 C (예, 혈청타입 1, 2, 5, 및 6), 서브그룹 D (예, 혈청타입 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36-39, 및 42-48), 서브그룹 E((예, 혈청 타입 4), 서브그룹 F (예, 혈청타입 40 및 41), 분류되지 않은 혈청 (예 혈청 타입 49 alc 51), 또는 어떤 다른 아데노바이러스 혈청 타입. 이 분야 숙련된 일반 사람은 복제 가능 및 결여 아데노바이러스 벡터들 (일회적 및 다회적 복제 결여 아데노바이러스 벡터를 포함하여)에 친숙할 것이다. 복제-결여 아데노바이러스 벡터들의, 다회 복제 결여 아데노바이러스 벡터 포함, 예들이, U.S. Patent Nos. 5,837,51 1; 5,851 ,806; 5,994,106; 6,127,175; 6,482,616; and 7,195,896, 및 국제특허 청구(International Patent Application) Nos. WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/16772, WO 95/34671, WO 96/22378, WO 97/12986, WO 97/21826, 및 WO 03/02231 1. 에 공시 된다.
E. 면역 반응 유도 방법
공시되는 면역원들(예,MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들) 및 조성물들은 MERS-CoV S 단백질에 대한 면역반응을 유도하는 방법들에 사용될 수 있다. 몇몇의 예시들에서, 하나 또는 그 이상의 공시되는 면역원들을 포함하는 면역원성 조성물들의 치료적으로 효과 있을 만한 양을 MERS-CoV에 대한 면역 반응을 발생하게 하기 위하여 개체에 투여될 수 있다.
몇 예시들에서, 예를 들어, MERS-CoV 에 노출 또는 노출가능성 때문에, MERS-CoV 감염이 있거나 감염의 전개 위험에 있는 개체가 치료를 위해 선택된다. 치료적으로 효과 있을 만한 양의 공시되는 면역원들의 투여 후에 이어서, 개체는 MERS-CoV 감염, MERS-CoV 감염과 관련된 증상, 또는 모두에 대하여 모니터링 될 수 있다.
방법들이 적용하여 타겟 또는 의심되는 질병이나 컨디션과 관련된 위험 요소들을 결정하거나, 또는 그 개체에서 이미 존재하는 질병이나 컨디션의 상태를 결정한다. 이러한 스크리닝 방법들에는, 예를 들어, 타겟 또는 의심되는 질병이나 컨디션과 관련될 수 있는 환경적, 가족적인, 직업적인 및 다른 그러한 위험요소들을 결정하기 위해 전통적인 신체검사는 물론, MERS-CoV 감염을 검출 및/또는 규명하는데 이 분야에서 가능하고 잘 알려진 여러 가지 ELISA 및 다른 면역에세이 방법들과 같은 진단 방법들이 포함된다. 이러한 일상적인 방법들은 임상가들이 본 공시의 방법들 및 약학적 조성물들을 사용하여 치료를 필요로 하는 개체를 선택하게 한다. 이러한 방법들과 원리들에 따라, 여기서 가르쳐주는 대에 따라, 또는 이 분야에 전문적인 일반사람이 아는 다른 전통적인 방법들에 따라, 독립적인 예방 또는 치료 프로그램으로, 또는 다른 프로그램의 후속, 부속, 또는 동반 치료 섭생법으로 한 조성물이 투여될 수 있다.
공시되는 면역원들(예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)의 투여는 예방적 또는 치료적 목적으로 투여될 수 있다. 예방적으로 제공될 때는, 공시되는 치료적 제제들은 어떤 증상에 앞서, 예를 들어 감염 전에 제공된다. 공시되는 치료적 제제들의 예방적 투여는 뒤이은 감염을 예방하거나 완화 시키는 역할을 한다. 그러므로 어떤 예시들에서는, 이 방법들에는 MERS-CoV 감염에 걸릴 위험이 있는 개체를 선택하고, 및 치료적으로 효과적인 양의 공시되는 면역원(예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)을 개체에 투여하는 것이 관여된다. 그러므로 치료적 제제들은 예상되는 심각성, 감염의 지속기간 또는 정도 및/또는 관련되는 질병의 증상들을 완화 시키기 위해, 예상되는 MERS-CoV 에의 노출 전에, 바이러스에 노출된 또는 노출 의심이 있은 후에, 또는 실제 감염이 시작된 후에 제공된다.
치료적으로 제공될 때는, 공시되는 면역원들은 질병의 증상이 시작되기 전 또는 후에, 예를 들어, MERS-CoV 감염 증상 전개 후에, 또는 MERS-CoV 감염이 진단된 후에, 제공된다. MERS-CoV 복제 또는 감염을 억제시켜 MERS-CoV를 치료하는 것에는 개체에서 MERS-CoV 감염의 증후들이나 증상들을 연기 및/또는 감소시키는 것이 포함될 수 있다. 몇 예들에서는, 여기서 공시되는 방법들을 사용한 치료는 개체의 생존 시간을 늘려 준다.
하나 또는 그 이상의 공시되는 제제들(예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)을 포함하는 면역원성 조성물들은 면역 접종 프로토콜과 동반하여 또는 조합적인 제형들로(combinatorial formulations) 사용될 수 있다. 어떤 예시들에서는, 새로운 조합적인 면역원성 조성물들 및 동반되는 면역접종 프로토콜들은, MERS-CoV S 단백질에 대한 면역반응과 같은, 항-MERS-CoV 면역 반응을 각각 끌어내도록 지시하는 별도의 면역원 또는 제형을 사용한다. 항-MERS-CoV 면역 반응을 끌어내도록 지시하는 별도의 면역원성 조성물은 개체에 일회 면역 접종 단계로 투여되는 다가의 (polyvalenta) 면역원성 조성물에 합쳐 질 수 있거나, 또는 이들은 동반하는 면역 접종 프로토콜로 따로(단가 면역원성 조성물에) 투여될 수 있다.
한 예시에서, 적절한 면역접종 섭생법(regimen)에는 하나 또는 그 이상의 면역원성 조성물들을, 1차 접종 후 2차 접종은 약 2주 이상, 약 3 내지 8주, 또는 4주 이후에 투여하는, 적어도 두 개의 별도의 접종이 포함된다. 3차 접종은 2차 접종 후 몇 달 (2-3 개월, 또는 4, 5, 또는 6개월 과 같은) 후에 투여될 수 있으며, 특별한 예시에서는 1차 접종 후 약 5개월 이상, 1차 접종 후 약 6개월에서 약 2년 이상, 또는 1차 접종 후 8개월에서 약 1년 후에 투여될 수 있다. 개체의" 면역 기억 (immune memory)" 을 강화시키기 위해 3차 후에 주기적인 접종들 또한 바람직하다. 선택된 접종 변수(parameters)들, 예, 제형, 용량, 섭생법 및 이와 같은 것, 의 타당성은 면역접종 프로그램 과정 동안 개체로부터 일정량 (aliquots)의 혈청을 취하여 항체 타이터 에세이를 하여 결정될 수 있다. 다른 한편으로는, 전형적인 방법으로 T 세포 집단을 모니터링 할 수 있다. 추가로, 바람직한 효과, 예, MERS-CoV 감염 예방 또는 질병 상태의 개선(예, 바이러스 로드의 감소)에 대한 개체의 임상적 컨디션이 모니터 될 수 있다. 만약 그런 모니터링이 면역 접종이 최적에 미달임을 제시하면, 개체는 추가 용량의 면역원성 조성물로 부스트 될 수 있으며, 면역접종 변수는 면역 반응을 강화시키도록 예상되는 형태로 수정될 수 있다. 그러므로 예를 들어, 공시되는 면역원 (예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)의 용량이 증가 되거나 또는 투여 경로가 변경될 수 있다.
몇 가지 부스트들이 있을 수 있다는 것이 심사숙고되며, 각 부스트는 다른 공시되는 면역원(예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)이 될 수 있다. 어떤 예에서는 부스트는 다른 부스트 또는 프라임과 같은 면역원(예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)이 될 수 있다는 것이 또한 심사숙고된다.
프라임 및 부스트는 일회 용량으로 또는 복합 용량, 예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 6 회 또는 그 이상으로서, 개체에 몇 일, 몇 주, 몇 개월에 걸쳐 투여될 수 있다. 한번에서 다섯 번(1, 2, 3, 4 또는 5 부스터들), 또는 그 이상과 같은 복합 부스트들도 엮시 주어질 수 있다. 순차적인 시리즈에서는 다른 투약법들도 사용될 수 있다. 예를 들어, 프라임 접종에서 상대적으로 많은 용량 및 그 후 상대적으로 더 적은 용량으로 부스트. 개체에 한번 또는 그 이상 접종으로 선택된 항원성 표면에 대한 면역반응은 일어날 수 있다.
한 예에서, 이 방법에는 개체에 프라임-부스트 면역접종 투여가 포함될 수 있으며, 여기에는 개체에 치료적으로 효과적인 양의 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 투여; 및 개체에 치료적으로 효과적인 양의 MERS-CoV S1 단백질 투여가 포함된다. 예를 들어, 이 방법에는 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 프라임 투여 및 MERS-CoV S1 단백질을 포함하는 부스트 투여가 포함될 수 있다. 이 방법에는 두 번 또는 그 이상의 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자 또는 MERS-CoV S1 단백질의 투여가 포함될수 있다.
제한적이지 않은 예에서, 이 방법은 개체에 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자 투여를 포함하는 프라임 투여, MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자 투여를 포함하는 제 1차 부스트 투여, 및 MERS-CoV S1 단백질 투여를 포함 하는.제 2차 부스트 투여를 포함한다
몇 예시들에서, 프라임 및/또는 제1 부스트는 서열번호 14로 정해진 아미노산 서열 또는 서열번호 14 와 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90% 적어도 95%, 또는 적어도 98% 와 같은)동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 구성하는 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자 투여가 포함될 수 있다. 더 많은 예들에서, 제 2차 부스트에는 서열번호 16으로 정해진 아미노산 서열, 또는 서열번호 16과 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90% 적어도 95%, 또는 적어도 98% 와 같은)동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 구성하는 MERS-CoV S1 단백질을 암호화하는 핵산 분자 투여가 포함될 수 있다. 더 많은 예시들에서, 프라임 및/또는 제1 부스트는 서열번호 14로 정해진 아미노산 서열, 또는 서열번호 14 와 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90% 적어도 95%, 또는 적어도 98% 와 같은)동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 구성하는 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자 투여를 포함 할 수 있고, 제2 부스트는 서열번호 16으로 정해진 아미노산 서열, 또는 서열번호 16과 적어도 80% (적어도 85%, 적어도 90% 적어도 95%, 또는 적어도 98% 와 같은)동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 구성하는 MERS-CoV S1 단백질을 암호화하는 핵산 분자 투여가 포함 될 수 있다.
본 공시에 공시되는 면역원 (예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)투여 시, 개체의 면역계는 전형적으로 MERS-CoV S 단백질 에 특이적인 항체를 생산함으로서 면역원성 조성물 대한 반응을 한다. 그러한 반응은 면역학적으로 효과적인 용량이 개체에 전달되었음을 의미한다.
면역학적으로 효과적인 투약은 일회 또는 복합 투여로 (한 예로, 하루에 여러번을 포함한) 매일, 또는 매주 면역원을 투여하여 달성할 수 있다. 각 특별한 개체를 위해, 특별한 투약 섭생법이 평가되고 개인적인 필요에 따라 및 면역원 조성물을 투여하는 또는 투여를 감독하는 전문가의 판단에 따라 조절될 수 있다. 몇 예시들에서, 개체의 항체반응은 효과적인 투약/면역접종 프로토콜들을 평가하는 관점에서 결정될 것이다. 대부분의 경우, 개체로부터 얻은 혈청 또는 플라즈마에 있는 항체의 타이터를 평가하는 것으로 충분하다. 부스터 투여를 할것인가 및/또는 각 개인에 투여되는 치료제의 양을 변경할 것인가에 대한 결정은 적어도 부분적으로는 항체 타이터 수준에 근거한다. 항체 타이터 수준은, 예를 들어, MERS-CoV S 단백질을 포함하는 항원에 결합하는 혈청에 있는 항체들의 농도를 측정하는 예를 들어 면역결합 에세이에 근거한다. 면역원성 조성물, 및 관련되는 조성물을 사용하는 방법들과 공시되는 방법들은 동물 숙주들에서 MERS-CoV 에 의한 감염과 질병에 저항성을 증가시키고, 예방하고, 완화시키고, 및/또는 치료에, 및 다른 실험관내 응용들에 또한 유용하다.
몇몇 예시들에서, 공시되는 면역원은 개체에 아주번트 투여와 동시에 투여 될수 있다. 다른 예시들에서는, 면역원은(예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)개체에 아주번트 투여 후에 및 면역 반응을 유도하기 충분한 시간 내에 투여된다. 아주번트의 제한적이지 않은 예들에는 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxid) 또는 알루미늄 포스페이트(aluminum phosphate), TLR9 작동제(TLR9 agonist) (CpG 같은), TLR7 및/또는 TLR8 작동제 TLR5 작동제 (후라젤린(flagellin)과같은), 어느 TLR4 작동제 (lipid A의 어느 변형체), TLR3 작동제(이중나선- RNA 와 비슷한 polyI:C 변형체), 어느 물-내-오일 에멀젼(oil-in-water immulsion) (많은 경우 스쿠알렌 (squalene) 사용)), ISCOMS, 또는 QS21를 포함하는 어느 것, 바이로좀 (virosomes) 과 같은 지질 멤브레인과 혼합된 어느 것 이 포함된다.
예방 및 치료 목적을 위해, 치료적으로 효과 있는 양의 공시되는 면역원은(예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들) 개체에게, 연속적인 전달을 통해(예를 들어, 연속적인 경피. 점막, 또는 정맥 전달) 연장된 시간 기간 동안에 걸쳐 일 회 큰 환약으로 전달하거나, 또는 반복적인 투여 프로토콜(예를 들어, 한 시간씩, 하루씩, 또는 일주일씩 반복 투여하는 프로토콜)로 투여 될 수 있다. 치료적으로 효과 있는 치료제들의 투약은 여기서 정한 타겟 질병 또는 컨디션과 관련되는 증상들이나 검출될만한 컨디션 하나 또는 그 이상을 완화하는 임상적으로 의미 있는 결과들을 낼 장기적인 예방 또는 치료 섭생법 내에서 반복 용량으로 제공될 수 있다.
이러한 상황 내에서 효과적인 투약법을 결정하는 것은, 전형적으로 동물 연구에 이은 인간 임상시험에 근거하며, 개체에서 타겟 질병의 증상들 또는 컨티션들의 발생이나 심각성을 의미 있게 감소시커나, 또는 개체에서 바람직한 반응을 유도하는 (면역 반응을 중화하는 것과 같은) 투여 프로토콜들에 따른다. 이런 관점에서 적절한 모델들은, 예를 들어, 생쥐 (murine), 쥐 (rat), 돼지 (porcine), 고양이(feline), 흰담비(ferret), 비-인간 영장류, 및 이 분야에서 알려진 다른 수용될만한 동물 모델 개체가 포함된다. 다른 한편으로는, 효과적인 투약법들은 실험관 내 모델들을(예를 들어, 면역학적 및 조직학적 에세이) 사용하여 결정될 수 있다. 그런 모델들의 사용은, 오직 일반적인 계산들이며 치료적으로 효과 있는 양의 조성물을 투여하기 위한 적절한 농도와 용량을 (예를 들어, 바람직한 면역 반응을 끌어내기 위한 또는 타겟 질병의 증상들 하나 또는 그 이상을 완화시키 위한 효과적인 양) 결정하기 위해 조정이 필요하다. 다른 예시들에는, 효과적인 양 또는 효과적인 용량의 조성물은 여기서 정해진 대로 치료적 또는 진단적 목적으로 질병 또는 컨디션과 관련되는 하나 또는 그 이상의 선택된 생물학적 활성을 단지 억제 또는 증강 시킨다.
투약법은 타겟 부위 (예, 전신 순환)에 바람직한 농도 유지하기 위해 주치의에 따라 변할 수 있다. 높은 또는 낮은 농도가 전달하는 방법, 예를 들어, 표피내(trans-epidermal), 직장내(rectal), 구강(rectal), 폐, 또는 비강내(intranasal) 전달 대비 정맥 또는 피하 전달, 에 따라 선택될 수 있다. 공시되는 면역원의(예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들) 실제 투약법은 질병의 징후 및 개체의 특이적인 상태(예를 들어, 개체의 나이, 크기, 건강, 증상의 정도, 민감성 요소들 및 유사한 것), 투여 시간 및 루트, 동시에 투여되는 다른 약물들 및 치료제들은 물론, 개체에서 바람직한 활성이나 생물학적 반응을 끌어내는 조성물들의 특정한 약리작용에 따라 변할 것이다. 투약 섭생법들은 최적의 예방적 또는 치료적 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 앞선 용어의 리스트에서 상기 서술된 대로, 치료적으로 효과적인 양은 또한 공시되는 면역원들 및/또는 다른 어느 생물학적 활성이 있는 제제가 임상적인 용어로서 독성 또는 치명적인 부작용들보다 치료적으로 유익한 효과가 뛰어나는 그런 양이다.
본 공시의 방법들 및 면역원성 조성물 내에서 공시되는 폴리펩타이드 면역원 (예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)의 치료적으로 효과적인 양의 제한적이지 않은 범위는, 약 0.01 mg/kg, 약 0.02 mg/kg, 약 0.03 mg/kg, 약 0.04 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.06 mg/kg, 약 0.07 mg/kg, 약 0.08 mg/kg, 약 0.09 mg/kg,약 0.1 mg/kg, 약 0.2 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 약 0.5 mg/kg,약 0.6 mg/kg, 약 0.7 mg/kg, 약 0.8 mg/kg, 약 0.9 mg/kg, 약 1 mg/kg,약 1.5 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg 과 같은 약 0.0001 mg/kg body weight(몸무게)에서 10 mg/kg body weight 이다, 예를 들어, 0.01 mg/kg 에서 약 1 mg/kg body weight, 약 0.05 mg/kg 에서 약 5 mg/kg body weight, 약 0.2 mg/kg에서 약 2 mg/kg body weight, 또는 약 1.0 mg/kg에서 약 10 mg/kg body weight 이다.
몇 예시들에서는, 투약법은 공시되는 면역원 (예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)의 양의 셋트, 1-300 μg으로부터, 예를 들어, 용량 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 또는 약 300μg와 같은 세트의 양을 포함한다.
용법 및 용량의 수는 셋팅에 의존한다, 예를 들어, 성인 또는 사전 MERS-CoV 감염 또는 면역접종으로 프라임된 어느 사람은 일 회 용량이 충분한 부스터가 될 수 있다. 순진한 개체들(naive subject)에서, 몇 예들에서, 적어도 두 번의 용량이, 예를 들어 적어도 세 번의 용량 주어진다. 몇 예시들에서는, 예를 들어, 매년 인플랜자 면역접종과 함께 매년 부스터가 주어진다.
투여할만한 조성물들 제조하는 실제적인 방법들은 잘 알져질 것이거나 또는 이 분야 전문가들에게는 분명할 것이며 Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1995 와 같은 논문에 좀 더 상세하게 서술된다.
공시되는 면역원(예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)의 치료적으로 효과적인 양의 투여는 병리적인 감염을 치료 또는 억제 또는 예방, 예를 들어, 감염을 억제 및/또는 감염의 증후 및/또는 증상을 감소, 하기에 충분한 면역 반응을 유도한다, 이 용도에 효과적인 양은 질병의 심각성, 개체건강의 일반적인 상태, 및 개체의 면역 시스템의 강건함에 의존할 것이다.
이 방법이 효과적이기 위해 MERS-CoV 감염이 완전히 제거되거나 또는 감소 또는 예방되야 할 필요는 없다. 예를 들어, 공시되는 치료제 하나 또는 그 이상으로의 치료는 MERS-CoV 감염 감소나 억제를 바람직한 만큼, 예를 들어, 치료제 없는 MERS-CoV 감염에 비교하여, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 또는 100% 까지 (검출 가능한 MERS-CoV 감염세포 제거 또는 예방), 할 수 있다. 추가 예들에서, MERS-CoV 복제가 공시되는 방법으로 감소 또는 억제될 수 있다. 이 방법이 효과적이기 위해 MERS-CoV 복제가 완전히 제거될 필요는 없다. 예를 들어, 공시되는 면역원(예, MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 같은 것들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 단백질 나노입자들, 바이러스-유사 입자들, 또는 벡터들)의 하나 또는 그 이상으로의 치료는 MERS-CoV 복제를 바람직한 만큼, 예를 들어, 치료제 없는 MERS-CoV 복제에 비교하여, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 100% 까지 (검출 가능한 MERS-CoV 복제 제거 또는 예방)도 감소시킬 수 있다.
몇몇 예시들에서, 공시되는 면역원으로 개체에 면역접종을 한 후, 적절한 시간 포인트에서 개체로부터 혈청을 모을 수 있고, 냉동시키고, 및 중화 테스트를 위해 저장시킨다. 중화 활성을 에세이 하는 방법들은 이 분야에 익숙한 일반적인 사람에게 알려졌으며, 여기서 더 서술되며, 이것에만 국한하지는 않으나, 프라크 감소 중화에세이((plaque reduction neutralization (PRNT) assays)), 마이크로중화 에세이(microneutralization assays), 풀루오사이토메트리 근거 에세이(flow cytometry based assays), 일회-사이클 감염 에세이 (single-cycle infection assays) 및 슈도바이러스 중화 에세이(pseudovirus neutralization assays) (예, 예1 에 서술한대로)가 포함된다.
몇 예시들에서는, 치료적으로 효과적인 양의 하나 또는 그 이상의 면역원을 개체에 투여하는 것은 ((예, 공시되는 면역원을 암호화하는 DNA 벡터를 투여(프라임)하고 이어서 MERS-CoV S 단백질이나 또는 이의 단편 (S1 단백질과 같은) 또는 MERS-CoV S 단백질이나 또는 이의 단편을 포함하는 단백질 나노입자(부스트)를 투여하는 프라임-부스트로 투여로) 개체에서 중화 면역 반응을 유도한다. 몇몇 예시들에서, 중화 면역 반응은 예를 들어, 예 1 에서 서술된 대로, 여러 다른 MERS-CoV 균주의 MERS-CoV S 단백질을 포함하는 MERS-CoV 슈도바이러스 패널에 대한 중화면역 반응 에세이 (pseudovirus neutralization assay )를 사용하여 검출될 수 있다몇 예시들에서는, 치료적으로 효과적인 양의 하나 또는 그 이상의 면역원을, 공시되는 면역원을 암호화하는 DNA 벡터를 투여(프라임)하고 이어서 MERS-CoV S 단백질이나 또는 이의 단편 (S1 단백질과 같은) 또는 MERS-CoV S 단백질이나 또는 이의 단편을 포함하는 단백질 나노입자(부스트)를 투여하는, 프라임-부스트로 투여로 개체에 투여하여 개체에서 중화 면역 반응을 유도하는데, 여기서 개체로부터 얻은 혈청은, 도 1C에 리스트 된 MERS-CoV S 단백질을 포함하는 슈도바이러스 패널 에서, ID50 ≥ 40 로, 적어도 30% (적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 과 같은)의 슈도바이러스를 중화한다.
핵산을 투여하는 한 방법은 포유류 발현 플라즈미드와 같은 플라즈미드 DNA로 직접 면역접종 하는 것이다. 상기 서술한 대로, 공시되는 재조합 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 프로모터 조절하에 놓이게 하여 이 분자들의 발현을 증가 시킬 수있다.
핵산 구조물로의 면역접종은 이 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, U.S. Patent No. 5,643,578 (세포-중개 되는 (cell-mediated) 또는 체액 반응을 끌어내기 위해 원하는 항원을 암호화하는 DNA를 도입시켜 척추동물을 면역접종하는 방법을 서술)에서 및 U.S. Patent No. 5,593,972 및 U.S. Patent No. 5,817,637 (항원을 암호화하는 핵산 서열을 발현을 가능하게 하는 조절 서열에 작동적으로 연결시키는 방법 서술) 에서 가르치고 있다. U.S. Patent No. 5,880,103은 면역원 펩타이드 또는 다른 항원을 암호화하는 핵산을 생물에 전달하는 몇 가지 방법들을 서술하고 있다. 이 방법은 핵산의 (또는 합성 펩타이드 그 자체 )리포좀 전달, 및 면역-자극하는 구조물, 또는 ISCOMSTM, 콜레스테롤과 Quil ATM (saponin)를 섞었을 때 자동으로 형성되는 크기 30-40 nm 의 음성 전기를 띤 새장-같은 구조물, 을 포함한다. RNA-근거한 기술로의 면역접종 역시 공시되는 예시에서 사용될 수 있다. 톡소플라스마증(toxoplasmosis) 및 Epstein-Barr 바이러스 유도된 종양을 포함하는 다양한 감염 실험모델에서, ISCOMSTM 를 항원의 운반체로 사용하여, 예방적 면역성 생성되었다 (Mowat and Donachie, Immunol . Today 12:383, 1991). ISCOMSTM 에 둘러 쌓인 항원 1μg까지의 낮은 용량으로도 Class I 매개 CTL 반응이 생산되는 것이 발견되었다(Takahashi et al., Nature 344:873, 1990).
핵산을 면역화에 사용하는 다른 접근 방법에서, 공시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편이 약화 된 바이러스 숙주들 또는 벡터들 또는 박테리아 벡터들에 의해 발현될 수 있다. 재조합 박시니아 바이러스 (vaccinia virus), 아데노-어소시에티드 (adeno-associated) 바이러스 (AAV), 허피(herpes) 바이러스, 레트로바이러스 (retrovirus), 사이토메갈로 바이러스 (cytomegalovirus), 알파바이러스 (alphavirus) (예, Lundstrom, Viruses, 7(5):2321-2333, 2015에 서술된 대로), 또는 다른 바이러스 벡터들이 펩타이드나 단백질 발현에 사용될 수 있으며, 그러므로서 CTL 반응을 끌어 낸다. 예를 들어, 박시니아 벡터들 및 면역화 프로토콜에 유용한 방법들이 U.S. Patent No. 4,722,848.에 제공 된다. BCG (Bacillus Calmette Guerin)도 펩타이드를 발현하는 또 다른 벡터로 제공된다 (Stover, Nature 351:456-460, 1991를 보시오).
한 예시에서, 공시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 직접 세포로 도입된다. 예를 들어, 핵산은 금 마이크로스피어(gold microspheres)에 표준 방법들로 올리고 Bio-Rad's HeliosTM 유전자 총과 같은 장치로 피부에 도입시킨다. 핵산은 강한 프로모터 컨트롤 하의 플라즈미드로 구성된 "naked" 이 상태이기도 한다. 전형적으로, DNA는 다른 부위로 직접 주사될 수도 있지만 전형적으로 근육으로 주사된다. 주사 용량들은 보통 약 0.5g/kg 에서 약 50 mg/kg, 및 전형적으로 0.005 mg/kg 에서 약 5 mg/kg(예, U.S. Patent No. 5,589,466를 참조)이다.
어떤 예시들에서, 면역원은 다른 제제에 앞서 또는 후에와 같이, 다른 항-MERS-CoV 치료제와 연속적으로 투여된다. 이 분야에 숙련된 일반인은 연속적 투여는 바로 이어서 또는 적절한 시간 기간 후, 몇 시간, 몇일, 몇 달, 또는 몇 년 까지도 후를 의미할 수 있다는 것을 알 것이다.
Ⅳ. 폴리뉴클레오티드 및 발현
개시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노입자 (또는 그의 서브유닛), 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편 또는 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 제공된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 개시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노입자(또는 그의 서브유닛), 또는 MERS-CoV S에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편, 또는 접합체를 코딩하는 DNA, cDNA 및 RNA 서열을 포함한다. 이들 분자를 코딩하는 핵산은 본 명세서에서 제공된 아미노산 서열(예를 들어, 항체 생산을 위한 CDR 및 중쇄 및 경쇄 서열), 당업계에서 이용 가능한 서열(예를 들어, 프레임워크 서열), 및 유전적 암호를 이용하여 쉽게 생산될 수 있다. 당업자는 서열이 다르나 동일한 항체 서열을 암호화하거나 핵산 서열을 포함하는 접합체 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산과 같은 다양한 기능적으로 동등한 핵산을 제조하기 위해 유전자 코드를 용이하게 사용할 수 있다.
개시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편 또는 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 적절한 서열의 클로닝 또는 다음과 같은 방법으로 직접적인 화학적 합성에 의해 적합하게 준비될 수 있다; 포스포디에스테르(phosphotriester) 방법(Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979); 포스포디에스테르 방법(Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979); the 디에틸포스포르아미다이트(diethylphosphoramidite) 방법(Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981); 고체상 포스포아미다이트 트리에스테르 방법(Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862, 1981), 예를 들어, 설명된대로 자동화된 합성기를 사용, 예를 들어 Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984; 및 고체 지지 방법(U.S. Patent No. 4,458,066). 화학적 합성은 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 생산한다. 이것은 상보적 서열과의 혼성화에 의해 또는 단일 가닥을 주형으로 사용하는 DNA 중합 효소와의 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학적 합성은 일반적으로 약 100 염기의 서열로 제한되지만, 보다 긴 서열은 보다 짧은 서열의 라이게이션에 의해 수득 될 수 있음을 알 수 있을 것이다.
적절한 클로닝 및 시퀀싱 기술, 및 많은 클로닝 트레이닝을 통해 숙련된 기술자를 지시하기에 충분한 명령어의 예가 공지되어 있다(see, e.g, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012) and Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, through supplement 104, 2013). 생물학적 시약 및 실험 장비 제조업체의 제품 정보 또한 유용한 정보를 제공한다. 이러한 제조업체는 SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), Invitrogen (Carlsbad, CA), 및 Applied Biosystems (Foster City, CA), 그리고 많은 다른 상업적 출처를 포함한다.
핵산은 또한 증폭 방법으로 제조할 수 있다. 증폭 방법은 중합 효소 연쇄 반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전사-기반 증폭 시스템(TAS), 자가-유지 서열 복제 시스템(3SR)을 포함한다. 다양한 클로닝 방법, 숙주 세포 및 시험관 내 증폭 방법이 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있다.
핵산 분자는 박테리아, 식물, 효모, 곤충 및 포유동물 세포와 같은 재조합 조작 세포에서 발현될 수 있다. 원핵 생물에서 진핵 또는 바이러스 서열을 갖는 DNA 서열을 발현하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포의 비 제한적인 예는 박테리아, archea, 곤충, 진균(예, 효모), 식물 및 동물 세포 (예를 들어, 인간과 같은 포유류 세포)를 포함한다. 예시적인 세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), SF9 세포, C129 세포, 293 세포, 뉴로스포라(Neurospora) 및 불멸화 된 포유류 골수 및 림프구 세포주가 있다. 포유류 세포를 배양하는 기술은 잘 알려져있다(Helgason and Miller (Eds.), 2012, Basic Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology), 4th Ed., Humana Press 참조). 통상적으로 사용되는 포유동물 숙주 세포주의 예로는 VERO 및 HeLa 세포, CHO 세포 및 WI38, BHK 및 COS 세포주가 있지만, 보다 높은 발현, 바람직한 글리코실화 패턴 또는 다른 특징을 제공하도록 고안된 세포가 있다. 일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 GnTI-/- 세포 (ATCC® 번호 CRL-3022) 또는 HEK-293F 세포와 같은 HEK293 세포 또는 이의 유도체를 포함한다.
본 명세서에 기재된 단백질을 코딩하는 핵산의 발현은 DNA 또는 cDNA를 프로모터(구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible))에 작동 가능하게 연결시키고 발현 카세트에 혼입시킴으로써 달성될 수 있다. 프로모터는 사이토메갈로 바이러스(cytomegalovirus) 프로모터 및 인간 T 세포 림프구 바이러스 프로모터 (HTLV) -1을 포함하는 임의의 프로모터일 수 있다. 임의로, 사이토메갈로 바이러스 증강 인자와 같은 증강 인자가 구조물에 포함된다. 카세트는 원핵생물 또는 진핵 생물에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 발현 카세트는 단백질을 코딩하는 DNA의 발현 조절에 유용한 특정 서열을 포함한다. 예를 들어, 발현 카세트는 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 터미네이터, 개시 서열, 단백질 코딩 유전자 앞에 있는 개시 코돈 (즉, ATG), 인트론에 대한 스플라이싱 시그널, mRNA의 적절한 번역을 허용하기 위해 그 유전자의 틀을 읽으며 올바른 것의 유지를 위한 서열 및 스탑 코돈을 포함한다. 벡터는 약제 내성 (예컨대, 암피실린 또는 테트라사이클린 내성)을 코딩하는 마커와 같은 선택 가능한 마커를 인코딩할 수 있다.
클로닝된 유전자의 높은 수준의 발현을 얻기 위해서는 최소한 전사를 유도하는 강력한 프로모터, 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위 (내부 리보솜 결합 서열) 및 전사/번역 터미네이터을 포함하는 발현 카세트를 작제하는 것이 바람직하다. 대장균의 경우, 이것은 T7, trp, lac 또는 λ 프로모터와 같은 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 바람직하게는 전사 종결 신호를 포함한다. 진핵세포의 경우, 제어 서열은 예를 들어 면역 글로불린 유전자, HTLV, SV40 또는 사이토메갈로 바이러스 및 폴리아데닐화(polyadenylation) 서열로부터 유도된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함할 수 있으며, 스플라이스 도너(splice donor) 및/또는 수용체 서열을 추가로 포함할 수 있다(예 : CMV 및/또는 HTLV 접합 수용체 및 공여체 서열). 카세트는 E. coli 및 인산 칼슘 처리를 위한 형질 전환 또는 일렉트로 포레이션, 포유동물 세포를 위한 일렉트로 포레이션 또는 리포펙션과 같은 잘 알려진 방법에 의해 선택된 숙주 세포로 옮길 수 있다. 카세트에 의해 형질전환된 세포는 amp, gpt, neo 및 hyg 유전자와 같은 카세트에 포함된 유전자에 의해 부여된 항생제에 대한 저항성에 의해 선택될 수 있다.
숙주가 진핵생물인 경우, 인산칼슘 공 침착물(coprecipitates), 마이크로 인젝션(microinjection), 일렉트로 포레이션(electroporation), 리포좀에 담긴 플라스미드의 삽입과 같은 통상적인 기계적 절차 또는 바이러스 벡터와 같은 DNA의 형질 전환 방법이 사용될 수 있다. 진핵 세포는 또한 개시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자(또는 그의 서브유닛), 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편, 또는 접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 함께 형질전환될 수 있고, 및 헤르페스 심플 렉스 티미딘 키나아제 유전자(herpes simplex thymidine kinase gene)와 같은 선택 가능한 표현형을 암호화하는 제 2 외래 DNA 분자를 포함한다. 또 다른 방법은 일시적으로 진핵 세포를 감염시키거나 변형시키고 단백질을 발현시키기 위해 시미안 바이러스 40 (simian virus 40; SV40) 또는 소유두종 바이러스(bovine papilloma virus)와 같은 진핵 생물 바이러스 벡터를 사용하는 것이다(예를 들어, Viral Expression Vectors, Springer press, Muzyczka ed., 2011 참조). 당업자는 COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주와 같은 고등 진핵 세포를 비롯한 세포에서 단백질을 생산하는데 사용되는 플라스미드 및 벡터와 같은 발현 시스템을 용이하게 사용할 수 있다.
항체, 항원 결합 단편 및 접합체는 개별 VH 및/또는 VL 사슬 (필요한 경우 작동 분자 또는 검출 가능 마커에 연결됨)로 발현되거나 융합 단백질로 발현될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편을 발현 및 정제하는 방법은 공지되어 있으며 본원에 추가로 기재되어있다(예를 들어, Al-Rubeai (ed), Antibody Expression and Production, Springer Press, 2011 참조). 면역부착소(immunoadhesin)도 발현될 수 있다. 따라서, 일부 실시 예에서, VH 및 VL을 코딩하는 핵산 및 면역부착소가 제공된다. 핵산 서열은 임의로 리더 서열을 코딩할 수 있다.
scFv를 생성하기 위해, VH- 및 VL- 암호화 DNA 절편은 플렉서블 링커(flexible linker)를 코딩하는 다른 단편, 예를 들어 아미노산 서열(Gly4-Ser) 3을 코딩하는 다른 단편과 작동 가능하게 연결될 수 있어, VH 및 VL 서열은 플렉시블 링커에 의해 결합 된 VL 및 VH 도메인을 갖는 인접 단일 쇄 단백질과 같이 발현될 수 있다 (see, e.g., Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990; Kontermann and Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2nd Ed., Springer Press, 2010; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013,). 선택적으로, 분열 부위(cleavage site)는 퓨린(furin) 분열 부위와 같은 링커에 포함될 수 있다.
VH 및/또는 VL을 코딩하는 핵산은 선택적으로 Fc 도메인 (면역부착소)을 코딩할 수 있다. Fc 도메인은 IgA, IgM 또는 IgG Fc 도메인일 수 있다. Fc 도메인은 본 명세서에 참고로 인용된 미국 공개 특허 출원 제 20100/093979 호에 기술된 바와 같이 최적화된 Fc 도메인일 수 있다. 한 예에서, 면역 부착 소는 IgG1 Fc이다.
단쇄 항체는 단일 VH 및 VL 만 사용되는 경우 1가(monovalent), 2개 VH 및 VL이 사용되는 경우 2가(bivalent), 또는 2개 이상 VH 및 VL이 사용되는 경우 다가(polyvalent)일 수 있다. MERS-CoV S 단백질 및 CD3와 같은 다른 항원에 특이적으로 결합하는 이중 특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다. 암호화된 VH 및 VL은 선택적으로 VH 및 VL 도메인 사이의 퓨린(furin) 절단 부위를 포함할 수 있다.
포유류 세포 및 대장균과 같은 박테리아로부터의 항체, 항원 결합 단편 및 콘쥬 게이트의 발현 및/또는 적절한 활성 형태로의 리폴딩 방법이 기재되어 있고, 본 명세서에 개시된 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013, Simpson ed., Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual, Cold Harbor Press, 2008, 및 Ward et al., Nature 341:544, 1989를 참고할 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 숙주 세포를 포함하는 세포 집단이 제공된다. 세포 집단은 적어도 하나의 다른 세포, 예를 들어 숙주 세포 (예를 들어, T 세포) 이외에 기술된 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 이종집단일 수 있으며, 재조합 발현 벡터, 또는 B 세포, 대식세포, 호중구, 적혈구, 간세포, 내피세포, 상피 세포, 근육 세포, 뇌 세포 등과 같은 T 세포 이외의 세포일 수 있다. 다르게는, 세포 집단은 실질적으로 균질 집단일 수 있으며, 집단은 재조합 발현 벡터를 포함하는 주로 숙주 세포를 포함한다(예를 들어, 본질적으로 구성된다). 상기 집단은 또한 모집단의 모든 세포가 재조합 발현 벡터를 포함하는 단일 숙주 세포의 클론인 집단의 모든 세포가 재조합 발현 벡터를 포함하는 클론 성 세포 집단 일 수 있다. 본 발명의 한 구체 예에서, 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 클론 집단이다.
생물학적 활성을 감소시키지 않으면서 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 변형시킬 수 있다. 융합 단백질 내로 표적화 분자의 클로닝, 발현 또는 편입을 용이하게 하기 위해 약간의 변형이 이루어질 수 있다. 그러한 변형은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 종결 코돈, 개시, 부위, 편리하게 위치한 위치 제한 사이트를 생성하기 위한 양쪽 말단에 위치한 추가 아미노산을 제공하기 위해 아미노 말단에 첨가된 메티오닌 또는 정제 단계를 돕기 위해 추가 아미노산(예 : poly His)이 있다. 재조합 방법 외에도, 본 개시의 면역 접합체, 이펙터 잔기 및 항체는 당 업계에 널리 공지된 표준 펩타이드 합성을 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 제조될 수 있다.
몇몇 실시 태양에서, 핵산 분자는 적절한 세포에서 발현될 때 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편으로 가공될 수 있는 개시된 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 단편의 전구체를 코딩한다. 예를 들어, 핵산 분자는 세포 분비 시스템에 들어가기위한 N- 말단 신호 서열을 포함하는 MERS-CoVS 단백질 또는 이의 단편을 코딩할 수 있고, 이는 세포에서의 MERS-CoV S 단백질 또는 단편의 처리 중에 단백질 분해 적으로 절단된다. 일부 실시 양태에서, 신호 펩티드는 서열번호 24 또는 25로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
이러한 S 단백질 또는 단편에 연결된 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 단편, 또는 단백질 나노 입자 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 벡터, 자립 복제 플라스미드 또는 바이러스, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 혼입된 재조합 DNA를 포함할 수 있거나, 다른 서열과는 독립적인 별도의 분자(예 : mRNA 또는 cDNA)로 존재한다. 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시 리보뉴클레오티드 또는 어느 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 이 용어에는 단일 및 이중 형태의 DNA가 포함된다. 하나의 비 제한적 실시예에서, 개시되는 면역원은 pVRC8400 벡터(Barouch et al., J. Virol, 79, 8828-8834, 2005, 본원에서 참조로 인용됨)를 사용하여 발현된다.
일단 발현되면, 개시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편, 또는 접합체를 표준 절차인 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토 그래피 등을 포함하는 당 업계의 통상적인 방법(문헌 [Simpson ed., Protein Purification and Analysis : A Laboratory Manual, Cold Harbor Press, 2008]의 기본 방법 참조)에 따라 정제될 수 있다. MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편 또는 접합체는 100% 순수할 필요는 없다. 원하는 대로 부분적으로 또는 균질성으로 정제되면, 치료학적으로 사용되는 경우, 폴리펩타이드는 실질적으로 내 독소가 없어야 한다.
대장균 또는 다른 박테리아의 기능적 이종 단백질은 종종 봉입체 (inclusion body)로부터 분리되고 강한 변성제 및 후속 리폴딩을 사용하여 가용화(solubilization)를 요구한다. 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, 가용화 단계 동안, 환원제는 디설파이드 결합을 분리하기 위해 존재해야 한다. 환원제를 갖는 예시적인 완충액은 0.1M 트리스 pH 8, 6M 구아니딘, 2mM EDTA, 0.3M DTE (디티오에리트리톨)이다. 디설파이드 결합의 재산화(Reoxidation)는 Saxena 등, Biochemistry 9 : 5015-5021, 1970, 및 특히 Buchner et al., 상기 문헌에 기술된 바와 같이 환원되고 산화된 형태의 저 분자량 티올 시약의 존재하에 일어날 수 있다.
재조합 방법 외에도, 항체, 항원 결합 단편 및/또는 접합체는 표준 펩타이드 합성을 사용하여 전체 또는 부분적으로 구성될 수 있다. 폴리펩타이드의 고상 합성은 서열의 C- 말단 아미노산을 불용성 지지체에 부착시킨 후 서열에 남아있는 아미노산을 순차적으로 첨가함으로써 달성될 수 있다. 고체상 합성 기술은 하기에 기술되어 있다: Barany & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963, and Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., 1984. 더 긴 길이의 단백질은 더 짧은 단편의 아미노 및 카르복실 말단의 축합에 의해 합성될 수 있다. 카르복실 터미널 말단의 활성화에 의해 펩타이드 결합을 형성하는 방법(커플링 시약 N, N'- 디시클로헥실카르보디미드의 사용과 같은 방법)은 당업계에 잘 알려져 있다.
Ⅴ. 조성물 및 투여
개시되는 제제는 종종 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 비히클 및 임의로 다른 치료 성분(예: 항생제 또는 항 바이러스제)과 함께 조합된 약학 조성물(치료 및 예방 제제 포함)에 포함될 수 있다. 여러 실시 양태에서, 하나 이상의 개시된 면역원을 포함하는 약학 조성물은 면역 원성 조성물이다. 조성물은 예를 들어, MERS-CoV 감염의 치료 또는 검출 또는 대상에서 MERS-CoV에 대한 면역 반응의 유도에 유용하다.
조성물은 환자에게 투여하기 위한 단위 투약 형태로 제조될 수 있다. 투여량 및 투여시기는 치료 의사가 원하는 목적을 달성할 수 있는 재량에 달려있다. 개시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편, 또는 접합체 또는 이러한 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 전신 또는 국부 투여를 위해 제형화될 수 있다. 한 예에서, 개시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편, 또는 접합체, 또는 그러한 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 정맥 내 투여(intravenous administration)와 같은 비경구 투여를 위해 제형화된다.
M개시된 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 또는 ERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편, 또는 상기 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이와 같은 분자들을 포함하는 조성물은 예를 들어 피하, 정맥 내, 동맥 내, 비강 내, 복강 내, 근육 내, 피내 또는 경 막강 내 투여에 의해 국소 및 전신 투여를 포함하는 다양한 방법으로 피험자에게 투여될 수 있다. 한 실시 양태에서, 치료제는 단일 피하, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 피내 또는 척수강 내 주사에 의해 하루에 1 회 투여된다. 치료제는 또한 질환 부위 또는 그 근처에서 직접 주사함으로써 투여될 수 있다.
추가 투여 방법은 삼투압 펌프(예: Alzet 펌프) 또는 미니 펌프 (예: Alzet 미니 삼투 펌프)에 의해 이루어지며 미리 결정된 기간 동안 치료제 또는 약학적 조성물의 제어, 연속 및/또는 서방형 전달(slow-release delivery)을 허용한다. 삼투압 펌프 또는 미니 펌프는 피하 또는 목표 부위 근처에 이식할 수 있다.
치료제 또는 그의 조성물은 또한 다른 방식으로 투여될 수 있다. 치료제 또는 그의 조성물의 가장 효과적인 투여 방식의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 치료제는 예를 들어 경구(협측 및 설하 포함), 직장, 비강, 국소, 폐, 질 또는 비경 구 투여, 또는 흡입 또는 통기에 의한 투여에 적합한 형태로 적합한 약학 제제로서 투여될 수 있다. 의도된 투여 방식에 따라, 약제 학적 제형은 고체, 반고체 또는 액체 투약 형태, 예를 들어 정제, 좌약, 환제, 캡슐, 분말, 액체, 현탁액, 유제, 크림, 연고, 로션 등의 제형이 될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 조성물은 개시되는 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이 적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편, 또는 접합체, 또는 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 순도로 그러한 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구체예에서, 조성물은 다른 포유동물(예: 인간) 단백질과 같은 고분자 오염물(macromolecular contaminants)을 약 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 미만으로 함유한다.
일부 구체 예에서, 조성물은 대상에서 면역 반응을 유도하기 위해, 예를 들어 대상에서 MERS-CoV 감염을 예방, 억제 또는 치료하기 위해 사용하기 위한 단위 투여형으로 제공될 수 있다. 단위 투약 형태는 환자에게 투여하기 위한 적절한 단일의 미리 선택된 투약량, 또는 적절한 표시 또는 측정된 둘 이상의 미리 선택된 단위 투약량의 배수 및/또는 단위 투약량 또는 그 배수를 투여하기 위한 계량 메카니즘(metering mechanism)을 함유한다. 다른 실시 양태에서, 조성물은 보조제를 추가로 포함한다.
항체 또는 그의 항원 결합 단편의 정맥 내 투여를 위한 전형적인 조성물은 1 일 당 약 0.01 내지 약 30 mg/kg의 항체 또는 항원 결합 단편 또는 접합체를 포함한다(또는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 접합체의 상응하는 투여량). 투여 가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 공지되거나 명백할 것이며, Remington 's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1995)와 같은 간행물에보다 상세히 기술되어있다. 일부 구체 예에서, 조성물은 하나 이상의 항체, 항원 결합 단편(항체 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이 적으로 결합하는 항원 결합 단편)을 포함하는 액체 제제일 수 있으며, 약 0.1 mg/ml 약 20mg/ml, 또는 약 0.5mg/ml 내지 약 20mg/ml, 또는 약 1mg/ml 내지 약 20mg/ml, 또는 약 0.1mg/ml 내지 약 10mg/ml, 또는 약 0.5 mg/ml 내지 약 10 mg/ml, 또는 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml이다.
항체 용액 또는 항원 결합 단편은 0.9% 염화나트륨, USP를 함유하는 주입 백(infusion bag)에 첨가될 수 있고, 전형적으로 0.5 내지 15 mg/kg 체중으로 투여된다. 1997년 RITUXAN®의 승인 이후 미국에서 판매된 항체 약물의 투여에 대한 상당한 경험이 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 정맥 내 누름(intravenous push) 또는 볼루스(bolus)가 아닌 천천히 주입하여 투여할 수 있습니다. 한 가지 예에서, 보다 높은 적재 선량이 투여되고, 이후의 유지 선량이 더 낮은 수준에서 투여된다. 예를 들어 4mg/kg의 초기 적재 선량을 약 90분 동안 주입 한 다음, 이전 복용량이 양호한 경우 30분 동안 주입 한 4 ~ 8주간 2mg/kg의 주간 유지 용량을 주입할 수 있다.
몇몇 실시 태양에서, 면역 원성 조성물(예를 들어, 개시된 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛) 또는 이러한 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함함)는 보조제(adjuvant)를 포함한다. 당업자는 면역 원성 조성물에 포함될 수 있는 보조제를 잘 알고 있다. 보조제의 선택은 이러한 상이한 적용에서 상이할 수 있고, 각 상황에 대한 최적의 보조제 및 농도는 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 수산화 알루미늄(ALHYDROGEL®, available from Brenntag Biosector, Copenhagen, Denmark and Amphogel®, Wyeth Laboratories, Madison, NJ), 프로인트 보조제(Freund's adjuvant), MPLTM(3-O-deacylated monophosphoryl lipid A; Corixa, Hamilton, IN) 및 IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA), 당업계에서 잘 알려진 많은 다른 적절한 보조제가 조성물에 포함될 수 있다.
인간 피험자에게 투여하기 위한 면역 원성 조성물을 포함하는 면역 원성 조성물의 제조는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면; Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Encapsulation within liposomes is described, for example, by Fullerton, U.S. Pat. No. 4,235,877. Conjugation of proteins to macromolecules is disclosed, for example, by Likhite, U.S. Pat. No. 4,372,945 and by Armor et al., U.S. Pat. No. 4,474,757. 전형적으로, 면역 원성 조성물의 각 투여량 중의 항원의 양은 유의 한 부작용 없이 면역 반응을 유도하는 양으로 선택된다.
면역 원성 조성물에 포함된 개시되는 면역 원성(예를 들어 개시되는 MERS-CoVS 단백질 또는 이의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 또는 그러한 분자를 코딩하는 바이러스 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드)의 양은 사용된 특정 항원, 투여 경로 및 프로토콜, 및 예를 들어 표적 집단을 포함한다. 단백질 치료제의 경우, 전형적으로, 각각의 인간 투여량은 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 예를 들어, 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 예컨대 약 1 ㎍, 약 2 ㎍ 약 5 ㎍, 약 10 ㎍, 약 15 ㎍, 약 20 ㎍, 약 25 ㎍, 약 30 ㎍, 약 40 ㎍ 또는 약 50 ㎍이다. 면역 원성 조성물에 사용되는 양은 대상 집단(예: 유아 또는 노인)에 기초하여 선택 될 수 있다. 특정 조성물에 대한 최적의 양은 항체가 및 다른 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 개시된 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛) 또는 이러한 분자를 암호화하는 바이러스 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 치료 학적 유효량의 개시된 면역원은 예를 들어 프라임-부스트 투여 프로토콜에서 제 2 면역원의 복합 투여 또는 다중 투여의 투여시에 효과적이다.
약제 학적 조성물, 개시된 MERS-CoV S 단백질 또는 그의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 바이러스 벡터 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편, 또는 접합체를 제제화하기 위해, 또는 이러한 분자를 코딩하는 폴리 뉴클레오타이드는 접합체의 분산을 위한 염기 또는 비히클 뿐만 아니라 다양한 제약 상 허용되는 첨가제와 조합될 수 있다. 바람직한 첨가제는 아르기닌, 수산화 나트륨, 글리신, 염산, 시트르산 등과 같은 pH 조절제를 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 국소 마취제 (예: 벤질 알코올), 등장제 (예: 염화나트륨, 만니톨, 소르비톨), 흡착 억제제 (예: TWEEN 80), 용해도 증진제 (예: 시클로 덱스트린 및 그 유도체), 안정화제 (예: 혈청 알부민) 및 환원제 (예: 글루타티온)가 포함될 수 있다.
투여용 조성물은 개시된 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역원 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 바이러스 벡터 또는 MERS-CoV S에 특이 적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편 또는 접합체, 또는 수성 담체와 같은 약학적으로 허용 가능한 담체에 용해된 이러한 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 완충 식염수 등이 사용될 수 있다. 상기 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 독성 조절제 등과 같은 생리학적 조건을 근사화하는데 필요한 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 아세트산 나트륨, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화칼슘, 락트산 나트륨 등을 함유할 수 있다. 개시된 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 바이러스 벡터 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편, 또는 접합체의 농도 이들 제형의 분자는 광범위하게 다양할 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 대상의 요구에 따라 유체 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 주로 선택될 것이다.
개시된 MERS-CoV S 단백질 또는 이의 면역 원성 단편, 또는 단백질 나노 입자 (또는 그의 서브유닛), 바이러스 벡터 또는 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 결합 단편, 또는 접합체 또는 이러한 분자를 암호화하는 폴리 뉴클레오타이드는 동결 건조된 형태로 제공되고, 공지된 농도의 멸균 용액으로 제공되지만, 투여 전에 멸균 수로 재수화된다.
제어 방출 비경 구 제형은 임플란트, 유성 주사 또는 미립자 시스템으로 제조될 수있다. 단백질 전달 시스템에 대한 광범위한 개요는 Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, (1995)를 참조할 수 있다. 미립자 시스템은 마이크로 스피어, 마이크로 입자, 마이크로 캡슐, 나노 캡슐, 나노 스피어 및 나노 입자를 포함한다. 마이크로 캡슐은 중심핵으로서 세포 독소 또는 약물과 같은 치료용 단백질을 함유한다. 마이크로 스피어에서 치료제는 입자 전체에 분산되어 있다. 약 1㎛보다 작은 입자, 미소 구 및 미소 캡슐은 일반적으로 각각 나노 입자, 나노 구체 및 나노 캡슐이라고 한다. 모세 혈관의 직경은 약 5 ㎛이므로 나노 입자만 정맥 주사할 수 있다. 미세 입자는 일반적으로 약 100 ㎛ 직경이며 피하 또는 근육 내 투여된다. 예를 들어, Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, pp. 219-342 (1994); and Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 315-339, (1992)를 참조할 수 있다.
중합체는 본 명세서에 개시된 항체 조성물의 이온 제어 방출에 사용될 수 있다. 제어된 약물 전달에 사용하기 위한 다양한 분해성 및 비분해성 중합체 매트릭스가 당 업계에 공지되어있다(Langer, Accounts Chem. Res.26 : 537-542, 1993). 예를 들어, 블록 공중 합체, 폴록사머 407은 저온에서 점성이면서 유동성이 있는 액체로 존재하지만 체온에서 반고체 겔을 형성한다. 이는 재조합 인터루킨-2 및 우레아제의 제제 및 지속 전달에 효과적인 운반체인 것으로 나타났다(Johnston et al., Pharm. Res. 9 : 425-434, 1992 및 Pec et al., J. Parent. Sci Tech 44(2) : 58-65, 1990). 대안적으로, 하이드록시 아파타이트는 단백질의 제어 방출을위한 미세 전달체로서 사용되어왔다(Ijntema et al., Int. J. Pharm.112 : 215-224, 1994). 또 다른 측면에서, 리포좀은 지질 캡슐 약물의 약물 표적화뿐만 아니라 제어된 방출을 위해 사용된다(Betageri 등, Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). 치료용 단백질의 제어 된 전달을 위한 수많은 추가 시스템이 알려져 있다(미국 특허 제 5,055,303 호, 미국 특허 제 5,188,837 호, 미국 특허 제 4,235,871 호, 미국 특허 제 4,501,728 호, 미국 특허 제 4,837,028 호, 미국 특허 제 4,957,735 호, 미국 특허 제 4,957,735 호). 미국 특허 제 5,019,369 호, 미국 특허 제 5,055,303 호, 미국 특허 제 5,514,670 호, 미국 특허 제 5,413,797 호, 미국 특허 제 5,268,164 호, 미국 특허 제 5,004,697 호, 미국 특허 제 4,902,505 호, 미국 특허 제 5,506,206 호, 5,271,961 호, 미국 특허 제 5,254,342 호 및 미국 특허 제 5,534,496 호).
상기 조성물이 액체일 때, 0.9% (w/v) 생리 식염수 용액의 단위로 측정된 상기 제제의 긴장도는 전형적으로 실질적인 비가역적인 조직 손상이 없을 정도로 조정된다 투여 부위에서 유도된다. 일반적으로, 용액의 장력은 약 0.3 내지 약 3.0, 예컨대 약 0.5 내지 약 2.0, 또는 약 0.8 내지 약 1.7의 값으로 조정된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 전형적으로 제조, 보관 및 사용 조건 하에서 멸균되고 안정하다. 멸균 용액은 필요에 따라 본 명세서에 열거된 성분 중 하나 또는 조합물을 적절한 용매에 필요한 양으로 넣고 여과 살균을 실시하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 개시된 항원 및/또는 다른 생물학적 활성제를 염기성 분산 매질 및 본 명세서에 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 무균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조를 포함하며, 개시된 항원 분말 및 임의로 추가로 원하는 성분을 미리 멸균 여과된 용액으로부터 수득한다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티 메로 살 등에 의해 달성될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 특정 실시 양태의 특정 특징을 예시하기 위해 제공되나, 청구 범위는 예시된 특징으로 제한되어서는 안된다.
중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 백신의 개발
SARS-CoV 발생 10년 후 중증 호흡기 질환의 원인이 되는 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스의 출현은 베타-코로나 바이러스에 대한 신속한 백신 개발을 촉진하기 위한 기존 플랫폼의 필요성을 강조한다. 이 예는 MERS-CoV 스파이크 당단백질(S)에 기초한 MERS-CoV 면역 전략을 예시하며, 전체 길이의 S DNA 프라임 및 S1 서브유닛 단백질 부스트로 구성된다. 개시되는 면역화 전략은 8개의 상이한 MERS-CoV 균주에 대한 중화 항체의 높은 역가를 유도하였다. 백신-유도된 쥐 단일 클론 항체(mAb)는 S1 또는 S2의 수용체 결합 도메인(RBD), 비RBD 포션을 표적으로 하여 바이러스를 중화시키는 것으로 특성화되어 나타냈다. RBD와 복합체로된 D12 단클론 항체의 원자 구조는 항체가 MERS-CoV 수용체인 DPP4에 대한 결합을 차단하는 여러 메커니즘을 나타내는 탈출 돌연변이 데이터를 지원했다. 따라서, 전장 S 및 S1 단백질 서브유닛 부스팅을 갖는 유전자 기반 프라이밍은 다양한 중화 기작을 갖는 항체를 유도 하였다.
소개(Introduction)
중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (MERS-CoV)는 심각한 급성 호흡기 감염의 치명적인 원인으로 나타났다. 2012년 4월 이후 1018 ~ 1034 명 건 및 새로운 베타 코로나 바이러스로 인한 사망자는 366 ~ 409 명이다. 바이러스의 인간 대 인간 전염이 지속되지 않기 때문에 큰 동물군 저장통(large zoonotic reservoir)이 전염병의 주요 원인이 될 수 있다(Assiri et al., Lancet infectious diseases 13, 752, 2013; Breban, Lancet 382, 694, 2013; Cauchemez et al., Lancet infectious diseases 14, 50, 2014; Memish et al., Emerging infectious diseases 20, 1012, 2014). 막대한 사망률, 막연하게 정의된 역학, 이 새로운 바이러스에 대한 예방적 또는 치료적 조치의 부재는 유행이 대유행적 비율로 확대되면 효과적인 백신에 대한 시급한 필요성을 야기했다.
코로나 바이러스 백신을 개발하기 위한 과거의 노력은 전체 불활화된 바이러스, 약독화 바이러스, 재조합 단백질 서브유닛 또는 유전적 접근법을 사용했다(Graham et al., Nature reviews, Microbiology 11, 836, 2013). 중화 항체의 주된 표적은 스파이크 (S) 당 단백질로, 두 개의 서브유닛으로 분리된다: 바이러스 멤브레인의 말단인 S1; 및 트렌스멤브레인 도메인 및 클래스 I 융합 당단백질의 전형적인 두 개의 헵타드-반복 서열(heptad-repeat sequences)을 모두 포함하는 S2((Cavanagh, J general virology 64 (Pt 12), 2577, 1983; Buchholz et al., PNAS 101, 9804, 2004). S1 서브유닛은 MERS-CoV에 대한 대부분의 면역화 전략의 초점이 되어왔고(Coleman et al., Vaccine 32, 3169, 2014; Du et al., PloS one 8, e81587, 2013; Ma et al., Vaccine 32, 2100 , 2014), 이는 숙주 수용체인 dipeptidyl peptidase-4 (DPP4) (Mou 등, J virology 87, 9379, 2013)에 대한 바이러스 부착을 매개하는 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함하고 있기 때문이다. 여러 백신 플랫폼에서 RBD를 발현하면 바이러스성 균주를 통한 바이러스 부착을 방지하지만 융합 억제를 중재하여 중화에 기여하는 항체를 유도하지 않는 높은 역가의 중화 항체를 유도할 수 있다(Du et al., J virology 88, 7045, 2014; Ohnuma et al., J virology 87, 13892, 2013; Ying et al., J virology 88, 7796, 2014; Jiang et al., Science translational medicine 6, 234ra59, 2014; Briese et al., mBio 5, e01146, 2014). 바이러스 중화의 다양한 메카니즘으로 항체의 광범위한 레퍼토리를 이끌어 내기 위해, 전장 S DNA 및 절단된 S1 서브유닛 당단백질을 기초로 한 대안적인 백신 요법이 본 명세서에 개시되어 있다.
결과
스파이크 당 단백질에 기초한 백신의 구조(Construction) 및 특성. MERS-CoV S 당 단백질로부터의 서열에 기초하여 5가지 백신 구조물을 설계 하였다(도 1A). 잉글랜드 1 스트레인(GenBank ID : AFY13307)는 공지된 서열들 사이에서, 특히 RBD 내에서 이들의 서열의 이용 가능성 및 이들의 일치에 근접함을 기초로 선택되었다. 1) 전장, 막 고정 S; 2) 전체 세포 외 영역을 함유하는 막 투과성 결실형(ΔTM) S; 및 3) S1 서브유닛만을 인코딩하는 3가지 플라스미드 백신이 제작되었다. 3개의 모든 플라스미드는 바늘 및 주사기에 의해 근육 내로 전달되고, 이어서 전기 천공 법에 의해 전달되었다. 두 개의 단백질 서브유닛 백신은 S-ΔTM과 S1을 포함하며 Ribi 보조제를 바늘과 주사기를 통해 근육 내로 전달했다. 이들 5가지 후보 백신은 8가지 면역 요법에 따라 마우스에서 체계적으로 평가되었다(도 1B). Biosafety level 3 시설을 요구하지 않고 여러 MERS-CoV 균주에 대한 백신 후보 물질의 면역 원성을 시험하기 위해 이전에 SARS-CoV에 대해 개발된 것과 유사한 슈도타입 리포서 바이러스 중화법(pseudotyped reporter virus neutralization) 분석법이 개발되었다(Martin et al., Vaccine 26, 6338, 2008; Yang et al., Nature 428, 561, 2004; Naldini 등, PNAS 93, 11382, 1996; Yang 등, PNAS 102, 797, 2005). 상기 분석은 HEK 293 세포가 효율적인 감염을 위해 그들의 표면상에 DPP4 발현을 요구하고, 가용성 DPP4 또는 항-DPP4 항체가 감염을 예방한다는 것을 입증함으로써 MERS-CoV 수용체, DPP4를 통한 바이러스 유입을 측정 하였다(도 6A-D ).
전장 S DNA와 S1 단백질은 마우스에서 가장 면역원성 백신이다. 마우스는 S1 단백질로 1 회 또는 S DNA로 2 회 프라이밍 한 다음, S1 단백질로 1 회 부스트하여 모든 그룹 중에서 가장 높은 중화 항체 역가를 생성시켰다(도 1B). 전장 S DNA 처리는 절단된 S-ΔTM 또는 S1 DNA 처리보다 유의하게 높은 항체 반응을 유도했다. 항체가(titer)는 DNA의 첫 번째 투여 후에 낮거나 감지할 수 없지만 S1 단백질로 면역화한 후 10 배 증가했다. S1 단백질의 2회 투여 량은 DNA/단백질 요법의 IC90에 가까운 IC90을 달성하였다. 8가지 백신 요법 중 3가지 (1) S DNA, (2) S DNA/S1 단백질, (3) S1 단백질만이 상세한 평가를 위해 다음 실험에 이용되었다. S-ΔTM은 형질전환된 HEK 293 세포로부터 낮은 생산 수율을 나타내었고 더 이상 평가되지 않았다. 이들 3가지 요법으로부터의 면역 혈청(최종 부스팅 후 5 주)을 8개의 가성 바이러스 패널에 대해 시험하고 모든 균주에 대해 동등하게 강력한 중화 항체가를 생성하는 것을 발견하였다(도 1C). 균주에 걸친 서열 상동성(도 7)은 중화의 폭을 설명하는 것으로 보인다. SARS-CoV pseudovirus는 면역된 마우스의 혈청에 의해 중화되지 않았다. pseudovirus 중화 결과는 JordanN3 균주 (GenBank ID: KC776174.1)에 대한 생 바이러스(live virus) 미세 중화(microneutralization) 분석과 비교되었다. 슈도 바이러스 중화 분석은 실제 바이러스보다 중화에 약 10 배 더 민감하였지만, 두 가지 분석은 상대적 크기에 기초하여 서로 잘 상관되었다(도 8).
S DNA 프라임 및 S1 단백질 부스트는 S 당 단백질의 다른 도메인 상의 항원 부위에 중화 항체를 유도한다. MERS-CoV S 당 단백질의 상이한 서브유닛에 대한 중화 항체 반응의 특이성을 여러 방법으로 분석하였다. 먼저, 혈청을 S, S1, S2 및 RBD(도 1A 및 9A)의 막 관통-고정된 버전을 발현하는 HEK 293T 세포에 흡착시키고 중화에 대해 스크리닝하였다(도 2A). 감염되지 않은 세포에 흡착된 혈청은 초기 중화 활성의 95%를 유지하고, 음성 대조 면역 전 혈청은 바이러스 중화 용량을 나타내지 않았다. RBD는 세포막 상에 자체적으로 발현되는 것이 중화 활성의 약 절반만을 흡착하는 반면, 전장 S- 형질 감염 세포는 3개의 모든 백신 군의 면역 혈청으로부터 거의 모든 중화 활성을 흡착하며, S1 단백질 군에서만, 전체 길이의 S 및 절단된 버전에서 제시된 RBD의 형태가 다를 수 있다는 가능성을 제시한다. S1의 흡착은 S1 단백질 그룹의 모든 중화 활성을 제거하고 두 개의 DNA 프라이머 그룹의 중화 용량의 약 60%를 제거했다. 대조적으로, S2는 DNA 단독으로 백신 접종된 마우스를 제외하고 모든 그룹에서 중화 활성을 고갈시키지 않았다. 세포 자체에 S2가 발현되면 융합 후(post-fusion) 구조가 재배열되어 융합 전 구조에 존재하는 중화 에피토프가 흡착에 이용 가능하지 않았을 가능성이 있다. 상이한 S 서브유닛을 발현하는 세포에 결합하는 혈청의 유동 세포 계측 분석은 일관된 결과를 나타냈다(도 9C).
단백질 경쟁 중화 검정(Protein competition neutralization assay)은 또한 S- 트랜스펙션된 세포 흡착 검정의 발견을 반복했다(도 2B). 2 ㎍/㎖ 이상의 수용성 RBD(도 9B)와의 경쟁은 S1 단백질 백신 군에서 면역 혈청 중화 활성을 약 50-60% 감소시켰다. 세포 흡착 분석에서 볼 수 있듯이, 가용성 S1 단백질은 S DNA로 프라이밍된 그룹에 비해 S1 단백질만 면역화된 마우스에서 3가지 모든 백신 그룹으로부터의 혈청 중화 활성을 제거하였다. 가용성 S2 (도 9B)는 혈청 중화 용량에 영향을 미치지 않았고, 전장 S는 가용성 형태로 표현될 수 없기 때문에 경쟁자로 사용되지 않았다. 전반적으로, 이들 데이터는 단백질-유일한 면역화 군에서 혈청 중화 활성이 주로 RBD에 대해 지시되었음을 나타냈다. S DNA 단독 또는 S DNA/S1 단백질에 의해 유도된 면역 혈청은 중화 활성의 절반 이상이 S1에 대한 것이기 때문에 더 복잡했지만 S1에 의해 흡수되거나 경쟁되지 않은 잔류 활성이 있었다. 왜 S2가 이들 혈청에 흡착하지 않았거나 경쟁하지 않았는지를 결정적으로 알 수는 없지만, 발현된 S2 단백질의 구조는 상기한 바와 같이 후 재관류였을 가능성이 있다.
DNA 및 단백질 백신 요법은 다른 IgG 하위 클래스의 항체를 유도했다. 혈청은 또한 상이한 면역 요법에 의해 유도된 체액 성 반응의 품질에 대해 분석되었고 상이한 IgG 서브 클래스 반응 패턴을 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 5A 및 5B). S DNA 면역화는 IgG2a 우성 반 (기하 평균 titer (GMT) IgG2a/IgG1 비율 6)을 유도하는 반면 S1 단백질 면역화는 IgG1 지배 반응(GMT IgG2a/IgG1 비율 0.06)을 유발했다. IgG 서브 클래스 반응 패턴은 S DNA 프라임/S1 단백질 부화 요법이 S DNA 단독 요법과 유사한 패턴 및 IgG2a 편극의 크기를 유도한다는 관찰에 기초하여 프라이밍 면역화에 의해 결정되었다. IgG2a 및 IgG1 서브 클래스 반응은 각각 마우스에서 Th1 및 Th2 바이어스 면역 반응 패턴을 반영한다(Stevens et al., Nature 334, 255, 1988). DNA 함유 요법에 의해 유도된 IgG2a 또는 Th1 바이어스된 반응은 CD4 T 세포 분화를 조절하는 IFN-γ 생산 CD8 T 세포의 유도에 의한 것 같다 (Davis et al., Human gene therapy 6, 1447, 1995; Shedlock et al., J leukocyte biology 68, 793, 2000). 놀랍게도, 모노 포스포릴 지질 A-기제 Ribi 면역 보강제는 예상되는 바와 같이 Th1 표현형에 대한 IgG 아형 분화에 영향을 미치기에 충분하지 않았다(Cargnelutti et al., The new microbiologica 36, 145, 2013; Chaitra et al., Vaccine 25, 7168, 2007). 따라서 단백질 프라이밍에 비해 DNA 프라이밍은 일반적으로 바이러스 감염 보다 효과적인 제어와 관련된 T 헬퍼 반응을 나타냈다.
마우스 단일 클론 항체 기능적 특성. S DNA/S1 단백질 백신에 대한 체액성 반응은 다른 특이성의 단클론 항체(monoclonal antibody, mAb)를 분리하고 특성화함으로써 더 조사되었다. 하이브리도마는 S DNA 프라이밍 및 S1 단백질 부스팅 마우스로부터 생성되고 S1, RBD 및 S2 도메인에 대한 결합에 대해 스크리닝되었다. 최종 라운드 스크린은 45개의 서브 클론(도 11)을 생성하였고, 그 중 4개 (D12, F11, G2, G4)는 그들의 결합 특이성 및 중화 효능에 기초하여 추가 특성화를 위해 선택되었다(도 3A-3B 및 12). 4개의 모든 단클론 항체는 면역 형광에 의해 살아있는 바이러스 (EMC 균주) 감염 세포에 결합 함을 입증하였다(도 13). D12 및 F11은 RBD 내의 S1 서브유닛을 제한했다. 단클론 항체 G2는 또한 S1에 특이적이지만 RBD 외부로 결합했다. G4는 S2 서브유닛만을 결합시켰다 (도 3A). RBD 특이적 단클론 항체(도 3b)만큼 강력하지는 않았지만, RBD 외부의 에피토프 표적에도 불구하고 MERS-CoV에 대해 보고된 다른 단클론 항체와 비교하여 G2 및 G4는 바이러스를 중화시키는 능력이 독특하였다(Du et al., J virology 88, 7045, 2014; Ohnuma et al., J virology 87, 13892, 2013; Ying et al., J virology 88, 7796, 2014; Jiang et al., Science translational medicine 6, 234ra59, 2014). 가용성 단백질 경쟁 중화 결과는 결합 검정의 결과와 일치 하였다(도 14a). D12 및 F11 중화는 RBD 및 S1 존재 하에서 감소하였고, G2는 S1에 의해 경쟁되었고, G4 중화 활성은 S2의 고농축에 의해서만 폐지되었다.
두 개의 가장 강력한 중화 mAb-D12 및 F11-RBD를 표적으로 하였지만, 중화 프로필은 단클론 항체 중화 능력을 8개의 슈도 유형 리포터 바이러스 패널(도 1C)에 대해 시험했을 때 상이했다. 주목할 만하게도, F11은 MERS-CoV의 Bisha1 균주 (GenBank ID : KF600620.1)를 중화할 수 없었으며 (도 14B), 아스파르트산과 잔기 509의 글리신 치환에 의해 다른 균주와 다르며, F11에 내성을 갖지만 D12 중화에 약하다. 이 발견은 야생형 잉글리시 1에 대한 F11 중화 활성이 D509G 돌연변이의 도입으로 제거된 슈도 타이프 바이러스 중화 분석에서 반복되었다(도 14B). 대조적으로, D12는 509 위치의 아미노산 변화와 무관하게 두 바이러스 모두를 중화시켰다. 또한, RBD 509G 돌연변이는 ELISA에 의한 F11 결합을 배제하였으나 D12 결합에는 영향을 미치지 않았다(도 4E).
S RBD와 접촉하여 D12 항체의 구조 및 돌연변이 분석. 중화 활성에 대한 원자 수준(atomic-level)의 이해를 제공하기 위해 D12 항체를 England1 RBD와 복합체로 항원 결합 단편(Fab)으로 결정화시켰다(도 20, 도 4A-4B). 또한, 잉글랜드 1 RBD의 언바운드 구조가 풀리고(도 4C), 그 자체로 또는 DPP4와 복합체 중 어느 하나에 의해 EMC 균주(GenBank ID : JX869059.2)의 RBD와 거의 동일한 것으로 밝혀졌으며(Lu 등 ., Nature 500, 227-231, 2013), 이는 RBD에서 단지 하나의 아미노산 차이 (F506L)를 갖는다(도 7). D12 항체는 RBD의 수용체 결합 모티프 (RBM)와 직접 접촉을 형성하고, 중쇄는 Lu 및 그의 동료에 의해 정의된 바와 같이 MERS RBD 및 인간 DPP4 사이의 접촉 영역과 중첩된다(Lu 등, Nature 500, 227-231, 2013). DPP4 상의 보존된 글리칸에 결합하는 RBD 잔기 W535 및 E536은 D12 파라토프 내의 CDR H2 및 CDR H3에 의해 결합된다(도 4C). 두 잔기의 돌연변이는 D12가 결합하고(도 4D-4E) 바이러스를 중화하는 능력을 배제하였다(도 14C). 부가적인 돌연변이 탈출 분석은 에피토프 내의 또 다른 잔기가 D12 중화 활성에 대해 중요하다는 것을 입증 하였다. MERS-CoV의 EMC 균주는 532 위치의 세린이 프롤린 또는 트립토판으로 돌연변이되었을 때 D12에 의한 중화를 벗어났다. 531 위치에 프롤린의 도입은 D12 항체에 대한 2개의 수소 결합을 제거하고(도 4C 및 21), 531 및 532에서의 프롤린(프롤린 532는 RBD에 고유함)은 D15와의 W535 및 E536 상호 작용에 영향을 줄 가능성이있다. 부피가 큰 트립토판 측쇄로의 돌연변이는 CDR L3과 직접적인 충돌을 유발하여 D12의 결합을 배제할 수 있다(도 4C-4E). 또한 RBD를 목표로 하지만 F11은 D12와 다른 메커니즘으로 MERS-CoV를 무력화한다. 부위 특이적 돌연변이 유발(Site-directed mutagenesis) 및 경쟁 결합(competition binding) 연구는 F11이 잔기 509 및 그 주변에서 D12의 결합 부위의 대향 측면상의 RBD와 접촉함을 나타낸다. 결합 연구는 또한 D12 및 F11이 동시에 RBD에 결합할 수 있음을 보여 주었고(도 15A-15C), 이는 중화에 대한 부가 효과의 가능성을 제시한다. MERS-CoV RBD에서 F11과 D12에 의해 만들어진 서로 다른 접촉점은 SARS-CoV RBD에 특이적인 다른 단클론 항체와 유사하며(Prabakaran et al., J Biol Chem 281, 15829, 2006; Zhu et al. PNAS 104, 12123, 2007), 이는 중립화의 수렴 메커니즘을 제시한다. 또한, 이 데이터는 MERS-CoV RBD의 N 말단과 그 숙주 수용체 DPP4 사이의 결합의 붕괴를 포함하는 바이러스 중화를 위한 기전을 설명한다.
전장 S DNA 또는 S1 단백질 프라임 및 S1 단백질 부스트는 비인간 영장류에서 강력하고 내구성 있는 중화 항체가를 유발한다. 마우스에서 테스트된 8가지 백신 요법 중, 가장 면역성이 강한 3가지 요법이 NHP에서의 평가를 위해 앞으로 이용되었다(도 5A). 쥐와 비교하여 S1 단백질 (플러스 알루미늄 인산염 보조제) 또는 S DNA (전기천공법이 뒤따르는) 및 S1 단백질(인산 알루미늄 보조제으로 자극된 NHP는 슈도 타이프 바이러스 중화에 의해 측정된 경우 슈도 타이프 바이러스 중화 분석에 의해 측정된 바와 같이, S DNA-유일한 그룹(도 5B)과 비교 하여 중화 항체가가 가장 높았다. 두 그룹 모두 처음에는 부스팅 후 10 ~ 100 배 증가한 뇌척수강 항체 역가를 보였다. 최종 부스트 후의 IC90 값은 두 동물 연구에서 사용된 다른 동물 모델, 백신 용량 또는 보조제로 인해 NHP보다 생쥐에서 약 1 log10 높았다. 그러나 항체 역가는 접종 후 10주에 2.5 log10 이상으로 높게 유지되었으며 DNA- 단백질 군에서 더 높은 수준으로 유지되었다. MERS-CoV JordanN3 균주를 이용한 미세 중화 분석을 pseudotyped 중화 분석과 비교하여 유사한 결과를 보였다. S DNA로 면역화된 두 그룹의 혈청은 이전에 특성화된 4가지 쥐 항체에 의해 인식된 모든 에피토프에 결합하였다(도 17). 그러나, S1 단백질만으로 면역화된 NHP의 혈청은 RBD (D12, F11) 및 비 RBD S1 서브유닛(G2)를 표적으로 하지만, S2 서브유닛(G4)는 표적화되지 않은 mAb를 차단하였다.
전장 S DNA 또는 S1 단백질 프라임과 S1 단백질 부스트는 MERS - CoV로 시험 된 비인간 영장류를 보호한다. 면역화된 NHP는 부스트 후 19주에 MERS-CoV의 JordanN3 균주를 접종하고, 예방 접종하지 않은 NHP와 비교하여 조기에 폐 침윤을 감소시키는 것으로 나타났다(도 5C). 고해상도 컴퓨터 단층 촬영(도 5D 및 도 5C)에 의해 입증된 바와 같이, S1/S1 단백질 또는 S DNA/S1 단백질로 면역화함으로써 폐렴의 피크 비례 부피가 각각 4 내지 6배 감소되었고(도 5C 및 도 18A-18C), 이전에 기술된 폐 절개 방법(Mansoor 등, IEEE imaging on medical imaging, 33, 2293-2310, 2014)에 의해 분석하였다. S DNA/S1 단백질로 면역화된 NHP는 S1/S1 단백질 군에 비해 폐질환의 피크 볼륨이 낮았으며 폐 침윤 물을 더 빨리 제거했다. 세 그룹 모두 항원 자극 후 항 S1 IgG 항체와 바이러스 중화 역가를 증가시켰다. 역가가 증가하는 비율은 접종받지 않은 그룹에서 관찰되었다. 감염된 세 그룹 중 어느 하나에서 구강, 비 인두 또는 기관 면봉에서 바이러스 분리 균을 일관되게 얻을 수는 없었지만 접종하지 않은 그룹에서 항원 투여 후 2주 후에 항-S1 IgI 및 중화 항체가 검출되었고 백신 접종 그룹에서 추가 접종을 받았으며(도 19A-19B), 이는 바이러스 항원이 감염에 의해 생성되었음을 시사한다. 임상 증상, 검사실값 또는 조직 병리학적 매개 변수에서 접종전과 접종하지 않은 NHP의 차이점은 관찰되지 않았다. 또한, 중성화 항체가 챌린지 당일 또는 비정상적인 폐 부피의 백분율(도 19C-19D)의 피크(마지막 부스트로부터 2주 후)에서 통계적으로 유의한 상관 관계가 없었다.
토론
요약하면, DNA 발현 벡터 및 가용성 단백질 면역원은 MERS-CoV의 공지된 순환 균주에 대한 교차 반응성 중화 항체를 유도하기 위해 개발되었다. 유도된 중화 항체는 MERS-CoV 스파이크 단백질의 여러 영역을 표적으로 삼았다. 전장 S를 발현하는 DNA 및 S1 서브유닛 단백질로 면역화함으로써 마우스 및 NHP 모두에서 강력한 중화 mAb를 수득하였다. 생쥐에서 그 mAb는 여러 MERS-CoV 균주에 대해 교차 반응을 일으키고 S1 당단백과 S2 소단위의 RBD 바깥의 에피토프에 대한 S 당 단백질 예방 부착의 RBD를 향하게 되었다. 또한, 현재의 면역 전략은 잠재적으로 면역 원성을 향상시키고 탈출 돌연변이의 가능성을 감소시킬 수 있는, RBD 내외의 다중 에피토프를 표적으로 하는 MERS-CoV 중화 항체를 최초로 유도하는 것이다.
Co-crystal 구조와 탈출 돌연변이의 분석은 RBD 유도 중화 항체에 의한 중화에 대한 기계론적 설명을 제공했다. 우리가 단리한 RBD 특이 항체는 문헌에서 보고 된 다른 것들, 특히 인간 항체 파지 라이브러리(Tang et al., PNAS, 111, E2018-2026, 2014)로부터 분리된 것들과 비교 가능하지만, D12와 F11은 약간 다른 에피토프를 표적으로 하며, 중화 용량이 약 1000배 더 강력하다. D12는 인식에서 매우 신규한 것으로 보이지만 F11은 T512 루프 영역에서 단클론 항체 3B12와의 일부 에피토프 겹침을 나타내지만 540 및 542 위치에서의 돌연변이에 대한 3B12의 추가 민감도는 F11에서 보이지 않으므로 각각의 에피토프의 차이점을 강조한다.
단백질 단독에 비해 S DNA 프라임/S1 단백질 면역 강화는 기능적으로 다양한 중화 항체의 레파토리를 만들어 냈으며 또한 Th1-편향 면역 반응을 일으켰다. DNA 프라이밍 처방은 또한 도전되는 NHP에서 보다 빠르고 더 빠른 보호를 제공하여 이펙터 CD8+ T 세포의 활성화를 제안했다. 따라서 단백질 전용 MERS 백신이 더 간단한 접근일 수 있는 반면에, DNA 프라임(prime)을 포함하는 잠재적 이점이 있다. DNA 프라이밍은 면역 반응의 내구성을 향상시킬 수 있으며(Caulfield et al., J virology 76, 10038, 2002), 부스트 간격의 변형을 통해 기존의 인플루엔자 백신과 마찬가지로 항체 반응의 크기와 기능적 특성을 향상시킬 수 있다 (Ledgerwood et al., Lancet infectious diseases 11, 916, 2011; Ledgerwood et al., J infectious diseases 208, 418, 2013); Khurana et al., J of infectious diseases 208, 413, 2013)).
DNA 면역화 후 표면상의 천연 구조로 S 삼량체를 제시함으로써 RBD 외부의 에피토프를 표적화함으로써 MERS-CoV를 중화시킬 수 있는 다양한 항체를 생성하는데 기여할 수 있다. 기능적 항체 반응보다 광범위한 배열을 제공하는 것 외에도, 비 RBD 항체는 4차 항원 결정기를 표적화하고 예비 융합 형태를 안정화시킴으로써 삼량체성 S 당 단백질 구조를 해결하는 데 도움을 줄 수 있다.
재료 및 방법
윤리 선언문. 동물 실험은 모든 관련 미국 국립 보건 연구원 (National Institutes of Health) 규정 및 정책을 준수하여 수행되었다.
DNA 및 단백질 벡터 구조체. 어떤 백신 후보 물질과 면역 요법이 강력한 중화 항체 반응을 일으킬 수 있는지 평가하기 위해 MERS-CoV England1 strain S 및 두 개의 절단된 버전인 S-ΔTM과 S1의 DNA 백신을 만들었다(도 1A). S-ΔTM 및 S1에 대한 단백질 서브유닛 백신도 또한 작제되었다(도 1A). MERS-CoV S 유전자 (균주 England1, GenBank ID : AFY13307)를 이전에 기술된 방법(Yang 등, J Virol., 78, 5642-5650, 2004)에 따라 합성하였다. 간략하게, 인간 세포 발현을 위해 역전사 및 코돈-최적화된 GenBank ™로부터 아미노산 서열을 수득하였다. 25-염기 쌍 중첩을 갖는 75 염기쌍의 올리고 뉴클레오티드 세트를 합성하고 겔 정제 하였다. 올리고 뉴클레오티드는 Pfu Turbo Hotstart DNA 중합 효소(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 50℃-65℃ 구배 어닐링 온도에서 DNA 조각으로 조립되었다. DNA 단편을 pCR-Blunt II-Topo 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 클로닝하고 서열을 결정하였다. 각 유전자에 대해 완전히 보정된 DNA 단편을 궁극적으로 포유류 발현 벡터 VRC8400 (Barouch 등, J virology 79, 8828, 2005; Catanzaro 등, Vaccine 25, 4085, 2007)에 클로닝 하였다.
다른 모든 절단된 형질 전환 및 도메인-교환 돌연변이는 전체 길이 S를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 합성되었다(도 1A). PCR 단편을 XbaI 및 BamHI로 절단하고 VRC8400에 클로닝하였다. 모든 돌연변이 및 융합된 구조는 서열 분석에 의해 확인되었다. 단백질은 상응하는 유전자를 코딩하는 발현 벡터로 형질 감염시킴으로써 Expi293 세포주에서 발현되었다. 형질 감염된 세포 배양 상등액을 수집하고 HisTrap HP 칼럼 및 Hiload 16/60 Superdex 칼럼(GE healthcare, Piscataway NJ)을 통해 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
제조자 프로토콜에 따라, QuikChange XL 키트 (Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 S를 코딩하는 cDNA를 합성하고, 다른 균주((strain Batin1, GenBank ID KF600628), (strain Bisha1, GenBank ID: KF600620), (strain Buraidah1, GenBank ID: KF600630), (strain EMC, GenBank ID: AFS88936), (strain Hasa14b, GenBank ID: KF600643), (strain JordanN3, GenBank ID: KC776174), (strain Munich, GenBank ID: KF192507))의 번역된 서열로부터 예측된 모 균주 S (영국 1)에 발현된 아미노산을 도입하였다. 모든 구조는 서열 분석에 의해 확인되었다.
세포주 및 슈도바이러스 ( pseudovirus ) 생산. 293, 293T (ATCC) 및 Huh7.5 세포를 10% 소태아 혈청, 2mM 글루타민 및 1x 페니실린/스트렙토 마이신이 보충된 DMEM에서 5% CO2 함유 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 슈도 바이러스를 생산하기 위해 15x 플레이트에 15x106 개의 293T 세포를 분주하고 3개의 플라스미드(17.5 ㎍의 packaging 플라스미드 pCMV TRR8.2, 17.5μg의 형질 전환 플라스미드 pHR'CMV-Luc 및 1 ㎍의 CMV/R-MERS-CoV S 플라스미드) 및 인산 칼슘 시약 (Invitrogen, Carlsbad CA)를 형질감염하였다(Naldini et al., PNAS 93, 11382, 1996; Yang 등, PNAS 102, 797, 2005). 하룻밤 배양 후, 배지를 신선한 10% FBS-DMEM으로 대체 하였다. 48시간 후 pseudovirus를 함유 한 상등액을 모으고 0.45μm 필터로 여과하고 분액하고 -80℃에서 동결시켰다. Pseudovirus를 96-웰 백색/흑 Isoplate (PerkinElmer, Waltham, MA)에서 1 웰당 1x104 Huh7.5 세포를 플레이팅하고 밤새 배양하여 적정하였다. 배지를 제거하고 pseudovirus의 2배 단계 희석액을 세포에 첨가하였다. 배양 2 시간 후, 100 ㎕의 신선한 배지를 첨가하였다. 72 시간 후에 세포를 용해시키고 루시퍼라제 기질(Promega, Madison, WI) 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 루시퍼 라제 활성은 Microbeta luminescence counter(PerkinElmer, Waltham, MA)에 의해 상대 루시퍼라제 단위(CPS)에 따라 측정되었다.
계통 발생 분석(Phylogenetic Analysis). MAFFT L-INS-i (버전 6.8.6.4, trex.uqam.ca)를 사용하여 MERS-CoV 균주 England1, Munich, EMC, Buraidah1, Bisha1, Batin1, Hasa14b 및 Jordan N3으로부터 S의 전장 아미노산 서열을 정렬하였다. 계통 발생 수는 평균 연결법 (UPGMA)에 의해 생성되었다. phylogenetic tree는 iTOL 서버 (itol.embl.de)에 그려져 있다.
마우스 면역(Mouse Immunizations). 3가지 범주에 속하는 여러 가지 다른 요법에 따라 6-8 주령의 여성 BALB/cJ 마우스 (Jackson Laboratory, ME, Bar Harbor)는 면역화되었다: (i) 3xSDNA, (ii) 2xSDNA-S1 단백질 및 (iii) 2x S1 단백질. 첫 번째 DNA-only 카테고리(i)에서 MERS-CoV 전장 S (그룹 1), 결실된 transmembrane unit (S-ΔTM)을 가진 S (그룹 2) 또는 S1 (그룹 3)으로 인코ㅋ딩되는 플라스미드 DNA로 주입되었다. 주사를 근육 내 주사하고, 0, 3 및 6주에 AgilePulse System (Harvard Apparatus, Holliston, MA)을 사용하여 전기천공하였다. 이종 요법 DNA- 단백질 그룹 (ii)을 0 주와 3 주에 MERS-CoV 전장 S (그룹 4), S-ΔTM (그룹 5) 또는 S1 (그룹 6)을 암호화하는 플라스미드 DNA를 2번 접종하고, 6주째에 MERS-CoV S-ΔTM (그룹 5) 또는 S1 (그룹 4 및 6) 단백질 + Ribi 애쥬번트 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 중 하나를 사용하여 추가 및 부스팅 하였다. 동종 단백질 그룹 (iii)에는 0주와 4주에 MERS-CoV S-ΔTM (그룹 7) 또는 S1 단백질 (그룹 8) + Ribi 보조제를 2회 주입했다.
DNA 면역은 총 부피 100 ㎕의 PBS (양측 50 ㎕)에서 20 ㎍의 플라스미드 DNA를 양측 대퇴 사두근 주사로 투여했다. 단백질 면역은 총 부피 100 ㎕ (양측 50 ㎕)에서 같은 부피의 Ribi 애주 번트와 혼합된 50 ㎕ PBS에 10 ug의 단백질을 양측 대퇴사 사를 주사하여 투여했다. 각 주사 후 2 주, 항체 반응의 측정을 위해 혈청을 수집하였다.
비인간 영장류 (Non-human primate; NHP ) 면역화. 3.2-4.8kg의 체중과 4.4 년의 평균 연령을 가진 18 마리의 암컷 인종 (Macaca mulatta) 18 마리를 성별 및 체중에 따라 세 그룹에 무작위 배정하고 3가지 백신 요법 중 하나에 따라 면역시켰다 : 3x S DNA, 2x S DNA-S1 단백질 및 2 x S1 단백질. 표본 크기는 문헌 내에서의 관습에 기반을 두었다. DNA-only 그룹 내에서 여섯 개의 NHP에 MERS-CoV 전장 S을 암호화하는 플라스미드 DNA를 주사했다. 주사는 근육 내로 주어졌고 AgilePulse System (Harvard Apparatus, Holliston, MA)을 사용하여 0, 4 및 8주에 일렉트로 포 레이션 (제조업체 권장 설정)을 수행하였다. S DNA-S1 단백질 그룹의 6 개의 NHP에는 0 주 및 4 주에 MERS-CoV 전장 S를 코딩하는 플라스미드 DNA가 주입되었고, 8주에는 MERS-CoV S1 단백질 및 알루미늄 포스페이트 보조제 (Brenntag Biosector, Frederikssund, Denmark)가 부스팅되었다. 단백질 단독 군의 6 개의 NHP에 100μg의 MERS-CoV S1 단백질과 알루미늄 포스페이트 보조제를 0 주와 8 주에 주사했다. DNA 예방 접종은 양 1000 ㎕의 PBS (각 250 ㎕)에서 1 ㎎의 플라스미드 DNA를 양측 대퇴 사두근과 이두근 근주 주사로 투여했다. 단백질 예방 접종은 총 부피 1000 ㎕ (각 부위 250 μL)에서 동량의 인산 알루미늄 보강제와 혼합된 500 ㎕ PBS에 양측 대퇴 사두근 및 단백질 100 ㎍의 이두근 주사로 투여했다. 혈청은 매 주사 후 2주 및 그 이후 매 2주마다 18주에 걸쳐 항체 반응의 측정을 위해 수집되었다.
비인간 영장류 ( NHP ) 바이러스 챌린지 (challenge). 18개의 인디언 붉은 털 원숭이(백신 접종하지 않음 6마리, S DNA/S1 단백질로 백신 접종 6마리, S1/S1 단백질 접종 6마리)가 승인된 고수준 시설에서 MERS-CoV의 Jordan N3 strain(GenBank ID : KC776174.1)를 이용한 바이러스 접종 실험에 포함되었다. 수행된 영상 연구의 높은 강도로 인해, NHP는 별도의 챌린지 코호트(challenge cohorts)로 나뉘어졌다. 챌린지 전에, 스톡 바이러스를 목표 농도 5 x 106 PFU/mL로 희석하였다.마지막 백신 접종 후 약 19주 후에, 후두경 및 윤활 카테터를 사용하여 기관 내 투여에 의해 NHP에 challenge inoculum 1 mL를 접종하였다. 챌린지 후에, 바이러스 challenge inoculum을 실제 전달된 용량을 결정하기 위해 분석하였다. 코호트 1, 2 및 3 각각에 대해 전달된 투여량은 각각 3.1 x 106, 3.6 x 106 및 3.4 x 106 PFU였다. 바이러스 챌린싱 후, 세 그룹 각각의 모든 NHP는 챌린지 후 3, 6, 9 및 14 일에 임상, 실험실 및 방사선학적 파라미터에 의해 모니터링 되고 평가되었다. 챌린징 후 28일째에 모든 NHP는 부검을 받았다.
비인간 영장류 방사선 평가. 바이러스 챌린지 전후에 세 그룹의 NHP는 PET/CT Gemini TOF 이미 저 (Philips, Andover, MA)를 사용하여 전산화 단층 촬영으로 흉부 이미징을 시행했다. 데이터 수집의 결론에서 이미지는 두 명의 공인 방사선 전문가가 평가하고 분석했다. 폐 병리학은 이전에 기술된 폐 영상 진단 기술 (Zhu et al., PNAS, 104, 12123-12128, 2007)을 사용하여 세로로 정량적으로 평가되었다. 간략하게, 자동화된 이미지 묘사 알고리즘을 사용하여 관심의 폐 영역 ROI)을 결정 하였다. 이 절차 다음에는 ROI 내의 모든 CT 이미지 픽셀의 조직 클래스(즉, 정상 또는 비정상)를 평가하는 "무작위 포리스트(random forest)"라는 기계 학습 알고리즘이 뒤따른다. 일단 학습 알고리즘이 완료되면, 전체 폐 용량, 병리학 적 부피 (존재하는 경우) 및 그 비율 (병리학 적 부피/총 폐적 부피)은 질병의 중증도를 기술하기 위한 정량적 측정법으로 계산된다. 또한, 우리는 이 알고리즘의 결과를 기반으로 폐 병리의 3차원 시각화를 개발했습니다. 이전 실험에서 지상 유리 불투명 (ground glass opacities, GGO)과 병합은 CT 스캔에서 비정상적인 영상 패턴을 구성했다. 따라서 기계 학습 알고리즘은 이러한 패턴에 따라 최적화되었다. 또한, 허위 양성 소견을 최소화하고 컴퓨터 보조 검출 시스템의 효율을 높이기 위해기도 및 혈관 인식에 대한 추가 식별 단계가 포함되었다.
슈도 바이러스 중화 분석. 감염 전날 Huh7.5 세포(웰 당 10,000 세포)를 96-웰 백색/흑 Isoplates (PerkinElmer, Waltham, MA)에 도말하였다. 혈청의 연속 희석액을 적정된 슈도 바이러스의 상이한 균주 (선형 적정 범위에서 200,000의 목표 CPS)와 혼합하고, 실온에서 30분간 배양하고, Huh7.5 세포에 3중으로 첨가하였다. 배양 2시간 후, 웰을 100 ㎕의 신선한 배지로 보충하였다. 세포를 72시간 후에 용해시키고 루시퍼라제 기질(Promega, Madison, WI) 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 루시퍼라제 활성은 Microbeta luminescence counter (PerkinElmer, Waltham, MA)에 의해 상대 루시퍼라제 단위 (CPS)에 따라 측정되었다. 각 마우스 혈청 샘플에 대해 IC90 중화 역가를 계산하였다.
미세 중화 분석( Microneutralization assay). 96 웰 플레이트에서 희석 당 4개의 웰을 사용하여 Vero 세포 단층에서 MERS-CoV JordanN3 균주의 100x TCID50의 감염성을 중화시킨 항체 존재에 대한 미세 중화 분석에서 열-불 활성화된 그룹화된 혈청의 2 배 희석을 시험하였다. 바이러스성 세포 병리학적 효과 (CPE)는 3일과 4일에 판독되었다. 웰의 50%에서 CPE를 완전히 방지한(completely prevented) 혈청 희석은 Reed-Muench 공식에 의해 계산되었다.
세포 흡착 및 단백질 경쟁 중화 분석. 3x 전장 S DNA, 2x 전장 S DNA + S1 단백질 및 2x S1 단백질로 면역화된 마우스로부터의 마우스 혈청을 Huh7.5 세포에서 90-95%의 중화 활성을 나타내는 농도로 희석시켰다(3xDNA 및 사전 면역화 혈청의 경우 1 : 400, 2xDNA- 단백질 및 2x 단백질 혈청의 경우 1 : 4000). 희석된 혈청을 MERS-CoV S, RBD-HATM, S1-TM, S2-TM로 트랜스펙션한 293 세포와 함께 4℃에서 1시간 동안 로커에서 배양하였다. 세포가 스핀다운 된 후, 중화 분석을 위해 상층 액을 수집하였다. 흡착이 완료되었는지 여부를 시험하기 위해 잔류 혈청을 사용하여 MERS-CoV S, RBD-HATM, S1-TM, S2-TM- 트랜스펙션된 293 세포에 대해 착색시켰다. 면역 전 혈청 및 형질 감염되지 않은 세포를 음성 대조군으로 포함시켰다.
단백질 경쟁 분석은 90-95% 중화 활성을 얻기 위해 희석된 마우스 혈청 또는 단클론 항체로 37℃에서 1시간 동안 희석 및 배양 한 가용성 MERS-CoV S1, RBD 및 S2를 포함하였다. 이어서, 혈청/단백질 혼합물을 실온에서 30분 동안 적정 가성 바이러스와 함께 배양하였다. 전처리된 세포의 96- 웰 백색/흑 Isoplate (PerkinElmer, Waltham, MA)에 단백질, 혈청 및 가성 바이러스의 최종 혼합물을 첨가하였다. 배양 2시간 후, 100 ㎕의 신선한 배지를 각 웰에 첨가 하였다. 그 후 세포를 72시간 후에 용해시키고 50 ㎕의 루시퍼라제 기질 (Promega, Madison, WI)을 각 웰에 첨가하였다. 루시퍼라제 활성은 Microbeta luminescence counter (PerkinElmer, Waltham, MA)에 의해 상대 루시퍼라제 단위 (CPS)에 따라 측정되었다.
FACS에 의한 세포 표면 결합. 293 세포를 MERS-CoV S, RBD-HATM, S1-TM 및 S2-TM을 발현하는 플라스미드로 형질 감염시켰다. 24시간 후, PBS 중의 4mM EDTA로 세포를 떼내어 Vivid® 생존 염료 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 염색 하였다. 그 다음, 세포를 2X 전장 S DNA + S1 단백질 및 2x S1 단백질을 갖는 3x 전장 S DNA로 면역화된 마우스로부터의 혈청(1 : 200 희석)으로 염색하였다. 이어서 세포를 항 마우스 PE(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로 염색하고 LSR(BD Biosciences, San Jose, CA)로 분류 하였다. FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Inc, Ashland, OR)를 사용하여 데이터를 분석했다.
경쟁 ELISA. 경쟁에 대한 자세한 방법 ELISA 분석은 다른 곳에서도 발표되었다(Tomaras et al., PNAS, 110, 9019-9024, 2013; Kong et al., J. Virol., 86, 12115-12128, 2012). 간략하게, mAb F11, D12, G2 및 G4를 EZ- 링크 설포 -NHS- 바이오티닐화 키트 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, CA)로 바이오티닐화시키고 MERS-CoV S1 코팅된 플레이트상에서 적정하였다. 발색을 가능하게 하기 위해 Avidin D HRP 컨쥬게이트 (Vector Laboratories, Burlingame CA) 및 TMB (KPL, Gaithersburg MD)를 사용하였다. OD 450nm는 SpectraMax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale CA)로 검출되었다. 적정 곡선의 선형 범위에서의 비오틴-mAb의 농도는 경쟁 ELISA를 위해 선택되었다. 3개의 백신 접종된 그룹으로부터의 NHP 혈청을 설계 농도의 비오틴-mAb에 연속적으로 희석하고 S1- 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 결합 조절제로는 Biotin-mAb 만 사용하였다. NHP 혈청에 의한 저해 백분율은 다음과 같이 계산되었다: 100-(NHP 혈청 + 바이오틴-mAb 판독)/바이오틴-mAb 판독값) × 100.
현미경(Microscopy). 12 밀리미터 유리 커버 슬립에서 60% 컨플루언스까지 성장한 WHO-Vero 세포를 1 PFU/세포의 MOI로 MERS-CoV (EMC 균주)에 감염시켰다. 감염 24시간 후, 배지를 흡인하고, 세포를 -20℃에서 밤새 메탄올 중에서 고정시키고 투과시켰다. MERS-CoV의 바이러스 연구는 BSL-3 실험실에서 Mers-CoV의 안전한 연구 및 유지 관리를 위해 Vanderbilt University의 Institutional Biosafety Committee 및 Disease Control 센터에서 검토 및 승인 한 프로토콜을 사용하여 수행되었다. 세포를 20분 동안 PBS에서 재수화시키고 5% 소혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS에서 차단시켰다. 차단 용액을 흡인하고, 세포를 실온에서 면역 형광 (IF) 분석 세척 용액 (1% BSA 및 0.05% Nonidet P-40을 함유하는 PBS)으로 세척하였다. 세포는 IF 세척 용액에서 세척 당 5분 동안 3회 세척하고 30분 동안 2차 항체 (Goat α-mouse-AlexaFluors 546 (1 : 1500), Invitrogen Molecular Probes)에서 배양했다. 세포를 세척 당 5분 동안 3번 세척 한 다음 PBS로 최종 세척 한 다음 증류수로 헹구었다. Coverslips는 Aquapolymount (Polysciences)로 탑재하고 Nikon Eclipse TE-2000S 와이드 필드 형광 현미경으로 면역 형광 현미경으로 시각화했다. DIC, Cy3 및 DAPI 필터를 통해 40X 오일 침지 렌즈를 사용하여 세포를 이미지화했다. Nikon Elements, ImageJ 및 Adobe Photoshop CS2를 사용하여 결과 이미지를 병합하고 어셈블했다. 감염(Infected) 및 mock-infected 세포를 병행 처리했다.
Biolayer interferometry를 사용하여 MERS - CoV 항원에 대한 백신 유도 마우스 단일 클론 항체의 결합 연구. forteBio Octet Red384 장비를 사용하여 중화 항체 (F11, D12, G2 및 G4)에 대한 RBD, S1 및 S2 MERS-CoV 분자의 결합 동역학을 측정했다. 비특이적 상호 작용을 최소화하기 위해 1% 소혈청 알부민 (BSA)이 보충된 phosphate-buffered saline (PBS) 완충액에서 1,000 rpm으로 교반하면서 모든 분석을 수행했다. 모든 용액의 최종 부피는 40-50㎕/웰이었다. 검정 검정색 바닥의 384-well plate (Geiger Bio-One)에서 30℃에서 분석하였다. PBS 완충액 중 마우스 항체(40-50 μg/ml)를 300 μM 동안 항 마우스 IgG Fc 포획 (AMC) 탐침을 로드하는 데 사용했다. 일반적인 포획 수준은 1 ~ 1.5 nm이었고, 8개의 팁 열 내의 변동성은 0.1 nm를 초과하지 않았다. 그런 다음 바이오 센서 팁을 PBS/1% BSA 완충액에서 180초 동안 평형화시킨 후 RBD와 S1, MERS-CoV 분자를 용액(250에서 7.8 nM)에 300 초 동안 결합시켰다. 결합은 그 때 300s를 위해 분리되는 것이 허용되었다. 인간 -Fc-MERS-CoV S2 키메라 분자 (S2-hFc)를 사용하여 항 인간 IgG Fc 포획 (AHC) 프로브를 300 초 동안 로딩하고, G4 Fab (X에서 YnM)에 대한 결합은 다른 항체에 대한 것과 같이 측정되었다. Dissociation 웰은 오염을 방지하기 위해 한 번만 사용되었다. PBS/1% BSA에서 배양한 마우스 단일 클론 항체 또는 hFc-S2로 로딩된 센서에 대해 기록된 측정치를 빼냄으로써 시스템 적베이스 라인 드리프트 (baseline drift)를 빼는 병렬 보정을 수행하였다. 데이터 분석 및 커브 피팅은 Octet 소프트웨어 버전 8.0을 사용하여 수행되었습니다.
실험 데이터는 1 : 1 상호 작용을 설명하는 결합 방정식에 맞추어졌다. 각 실험에서 사용된 모든 농도에 대해 단일 세트의 결합 매개 변수가 동시에 얻어 지도록 비선형 최소 자승법을 사용하여 결합이 가역적(완전 해리; full dissociation)이라고 가정한 완전한 데이터 세트의 전체 분석을 수행했다.
하이브리도마의 생성. 세 번째 DNA 또는 두 번째 단백질 면역화 후, 면역 혈청을 ELISA 및 MERS-CoV 의사 바이러스 중화 용량에 의해 S1 결합 활성에 대해 평가하였다. 우수한 결합 활성 및 높은 중화 역가를 갖는 항혈청을 생성 한 마우스를 근육 내 전달 된 S1 20μg을 추가로 추가하였다. 3 일 후 증후 된 비장 세포를 수확하고, 표준 방법에 따라서 PEG 1450 (50% (w/v), Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 Sp2/0 골수종 세포 (ATCC, Manassas, VA, USA)와 융합시켰다. 세포를 배양하고 20% FCS 및 1X HAT (100 μM hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, 16μM thymidine, Sigma)가 함유 된 RPMI 완전 배지에서 스크리닝하였다. 생성된 하이브리도마로부터의 상청액을 중화 활성뿐만 아니라 MERS-CoV S1, RBD 또는 S-ΔTM에 대한 ELISA에 의한 결합에 대해 스크리닝하였다. 서브 클론은 한계 희석법에 의해 생성되었다. 3 회 스크리닝 및 서브 클로닝 후, 안정한 항체 생산 클론을 분리하고 하이브리도마-혈청 무함유 배지(Life technologies, Grand Island, NY, USA)에 적합시켰다. 선택된 하이브리도마 클론으로부터 상등액을 수집하고 단백질 A-세파로스컬럼 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)을 통해 정제하였다. 생성된 단클론 항체를 제조사의 지침에 따라 Pierce rapid isotyping kit로 이소타입화하였다. G2, G4, D12 및 F11 항체의 DNA 및 단백질 서열은 서열번호 114-129로서 제공된다.
X 선 결정학(X-ray crystallography). C- 말단 HRV-3c 절단 부위 및 His6 정제 태그를 갖는 잔기 367 내지 606을 스패닝하는 MERS-CoV Eng1 스파이크 당단백질의 수용체-결합 도메인 (RBD)을 코딩하는 구조물을 293 세포 발현에 대해 이전에 기재된 바와 같이 GnTi-세포에서 생성시켰다. 단백질을 NiNTA 친화성 크로마토 그래피에 의해 정제한 후, 완충액으로서 1xPBS를 사용하여 겔 여과하였다. 결정화 연구에 사용된 단일 클론 항체는 Protein G 수지를 사용하여 정제했다. Fab는 일반적인 프로토콜에 따라 Pierce Mouse IgG1 Fab 키트를 사용하여 준비했다. 정제 후, RBD England1은 결정화 시험을 위해 ~ 5 mg/ml로 농축되었다. 결정화 연구를 위해 RBD England1 Fab 복합체를 제조하기 위해, RBD 분자를 1 : 1.5 몰비의 Fab과 혼합하고, 실온에서 30 분 동안 정치시켰다. 복합체를 크기 배제 크로마토 그래피 (Superdex S200, GE Healthcare)로 정제하고 약 5-8 mg/ml로 농축시켰다.
결정화 스크리닝은 모세 결정화 로봇을 사용하여 0.1 μ l의 단백질 복합체를 0.1 μl의 저장기 용액과 혼합하여 20℃에서 hanging drop vapor diffusion 방법을 사용하여 수행했다. 초기 결정 조건이 관찰되면 결정 크기 및 모양을 개선하기 위한 추가 결정화 시험을 0.5 μl의 저수지 용액으로 0.5 μl의 단백질 복합체를 사용하여 손으로 수행했다.
RBD England1의 결정은 0.1M Tris-HCl pH 8.5, 10% MPD, 29% PEG 1,500의 저장 용액을 사용하여 얻어졌다. 결정은 동결 방지제로서 20% 에틸렌 글리콜을 함유하는 모액을 사용하여 액체 질소에서 저온 냉각되었다. D12 Fab : RBD England1 복합체의 결정 형태 1은 0.1M 아세트산 나트륨 pH5.5, 50mM 염화나트륨, 10% PEG 400, 11% PEG 8,000의 저장 용액을 사용하여 수득하였다. 동결 방지제로서 에틸렌 글리콜 22%를 함유 한 모액을 사용하여 액체 질소 중에서 결정을 냉동 냉각시켰다. D12 Fab : RBD England1의 결정 형태 2는 0.1M 나트륨 카코딜레이트 pH 6.5, 80mM 마그네슘 아세테이트, 14.5% PEG 8,000의 저장 용액을 사용하여 수득하였다. 결정은 동결 방지제로서 15% 2R-3R 부탄디올을 함유하는 모액을 사용하여 액체 질소에서 냉각 냉각시켰다.
모든 결정에 대한 데이터는 SER-CAT 빔라인 ID-22 및 BM-22 (Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory)에서 1.00A의 파장에서 수집되었다. 모든 회절 데이터는 HKL2000 슈트 (Otwinowski et al., Methods Enzymol. 276, 307, 1997)로 처리되었으며, PHASER를 사용하여 분자 치환에 의해 구조가 해결되었고(McCoy et al., J applied crystallography 40, 658, 2007), 반복적인 모델 구축 및 정제가 COOT (Emsley et al., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 486, 2010) 및 BUSTER-TNT(Blanc et al., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 60, 2210, 2004)에서 각각 수행되었다. RBD England1 결정체의 경우, 비대칭 단위 당 2 분자를 갖는 분자 치환 용액이 PDB ID 4KR0 (Lu et al., Nature 500, 227, 2013) 분자 B를 탐색 모델로 사용하여 얻어졌다. D12 : RBD England1 복합체의 두 가지 결정 형태에 대해 RBD를 위한 탐색 모델로서 PDB ID 4KR0 분자(Fan et al., J mol biol 228, 188, 1992) B, Fab 가변 도메인을 위한 탐색 모델로서 PDB ID 1IGM 및 마우스를 사용하여 분자 치환 용액을 수득하였고 Fab 불변 도메인에 대한 탐색 모델로서 Fab F26G19 PDB ID 3BGF(Pak et al., J mol biol 388, 815, 2009) 의 불변 영역을 포함한다. 두 결정 형태 모두 비대칭 단위 당 두 개의 RBD-Fab 복합체가 얻어졌다.
정제 과정에서 데이터의 5%로 구성된 교차 검증(Rfree) 테스트 세트를 사용하여 MolProbity를 사용하여 수행된 구조 모델 검증을 통해 모델 정제 프로세스를 평가했다(Adams et al., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 213, 2010; Chen et al., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography 66, 12, 2010). RBD England1 모델은 19.5%의 최종 Rfactor 값과 25%의 Rfree 값으로 정제되었으며, 특이점이 없는 Ramachandran 플롯의 선호 영역에서 99% 잔류물을 가지고 있다. 1로부터의 D12: RBD England1 결정은 17.8%의 최종 Rfactor 값 및 23.8%의 Rfree 값을 갖는 구조 모델을 제공하고, 이상치가 없는 Ramachandran 플롯의 선호 영역에서 99% 잔류 물을 갖는다. D12 : RBD England1 결정 형태 2는 22.5%의 최종 Rfactor 및 26.1%의 Rfree 값을 갖는 구조 모델을 제공하고, Ramachandran 음영의 선호 영역에서 99% 잔류물을 갖는다.
MERS - CoV 단일 클론 항체 탈출 돌연변이(escape mutations). 세포와 바이러스. 감염된 클론으로부터 생성된 MERS-CoV EMC 균주(Scobey et al., 1997)는 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B가 보충된 7% FBS를 함유한 둘베코 변형 이글의 배지(Invitrogen)에서 WHO-Vero 또는 Vero81 세포 (Vero) PNAS 110, 16157, 2013)을 Vero 세포에서 플라크 분석에 의해 증식시키고 평가하였다. 세포와 바이러스의 모든 배양은 5% CO2 대기에서 37℃였다. 모든 바이러스 연구는 인증된 BSL3 실험실에서 수행되었으며, 안전한 연구, 유지 관리 및 이전을 위한 프로토콜을 사용하여 생물 안전성 캐비닛 내에서만 수행되었으며 밴더빌트 대학의 기관 안전성위원회 (Biasafety Committees)에서 검토 및 승인되었다.
플라크 감소(Plaque reduction) 중화 분석. 10 ㎍/㎖의 농도에서 시작하여, mAb를 5배 희석하여 동량의 바이러스와 총 6 회 혼합하였다. Virus-mAb 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 각 혼합물 200 μl를 사용하여 6 웰 플레이트에 Vero 세포 단층을 2 회 접종하였다. 1시간 배양 후, 세포를 1% 한천을 첨가한 완전한 배지로 덮었다. 플라크는 감염 후 48-52 시간 사이에 시각화되고 계수되었다. 각 단클론 항체 농도의 존재하에 감염성 바이러스의 양을 계산하고 그래프로 나타냈다.
항체 탈출 경로(Passage). Vero 세포를 감염 전날 25cm2 플라스크에 넣었다. 감염 직전에 배지를 3.5% 혈청을 함유한 3ml DMEM으로 교체하였다. 이어서, 각 단클론 항체를 각 플라스크에 첨가하고 세포를 0.1 PFU/ml의 MOI로 MERS-CoV로 감염시켰다. 이틀 후, mAb를 Vero 세포의 새로운 플라스크에 첨가하고, 이전 감염으로부터의 상등액 10 ㎕를 새로운 플라스크에 첨가하였다. 3개의 분리된 혈통이 병행으로 운반되었다. 각 구절에서 단클론 항체 양이 증가하면서 5개의 구절이 완료되었습니다. 다섯 번째 통과 다음에, 상등액을 제거하고, 분액하고 동결시켰다. 각 바이러스의 작은 샘플을 해동하고 단클론 항체의 존재 및 부재하에 플라크 분석에 의해 역가를 측정 하였다.
각 계통의 10개의 플라크를 단클론 항체 존재 하에서 적정된 웰로부터 골랐다. 각 플라크는 감염 전날 세포가 파종 된 25cm2 플라스크에 접종하기 위해 사용되었다. 바이러스를 2 일간 복제 한 다음, 상등액을 제거하고, 분액하고 동결시켰다. TRIzol 시약 (Life Technologies Corp.)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 세포를 용해시키고 용 해물을 동결시켰다.
스파이크 당단백질(Spike glycoprotein )의 생거 ( dideoxy ) 서열 분석. TRIzol 시약을 사용하여 단클론 항체-내성 플라크 클론의 용해물로부터 전체 세포 RNA를 추출하였다. RNA를 SuperscriptIII(Life Technologies Corp.) 및 EasyA (Agilent Technologies, Inc.)를 사용하여 다음의 조건에서 RT-PCR을 수행하였다: 50℃ × 30분, 95℃ × 5분, 40 사이클 95℃ x 30초, 45℃ x 30초, 72℃ x 1분, 72℃ x 10분. MERS-CoV Spike 유전자는 길이가 약 3 킬로베이스인 두 개의 앰플리콘으로 증폭되었다. 각 amplicon은 2 또는 4 primers를 사용하여 유전자의 완전한 범위를 제공하기 위해 시퀀싱되었다. 결과 시퀀스를 조립하고 MERS-CoV Spike에 대한 예상, 이론적 시퀀스와 비교하여 차이점을 기록했다.
통계 분석. 기하 평균(GMT) 및 95% 신뢰 구간(CI)을 모든 항체가에 대해 계산하였다. 다른 모든 데이터에 대한 평균 및 표준 오차가 계산되었다. P 값은 Prism 소프트웨어 (버전 6.04, GraphPad, La Jolla, CA)를 사용하여 양측, 쌍을 이룰 수없는 논-파라 메트릭(nonparametric) Mann-Whitney 검정으로 계산하였다. 통계적으로 유의미한 차이는 0.05의 임계 알파 값을 만족했습니다. 각 데이터 세트 내의 통계적 변이는 각 그림의 표준 오류로 표시된다. 피어슨 상관 계수 및 관련 p 값은 프리즘 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 차이(Variances)는 일반적으로 논-파라 메트릭 통계 테스트의 사용을 정당화하기 위해 유사했다.
MERS - CoV S 단백질 특이적 항체
이 실시예에서는 MERS-CoV S 단백질 특이적 항체의 분리 및 특성 규명에 대해 설명한다.
항체 단리(isolation)
G2, G4, D12, 및 F11 쥐 항체의 단리는 상기에 기재되어 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 DNA 및 단백질 서열은 서열번호 114-129로서 제공된다.
JC57-13, JC57-11, JC57-14, FIB_B2 및 FIB_H1 항체는 단일 B 세포 분류 및 IgG 중쇄 및 경쇄 클로닝 기술을 사용하여 MERS-CoV 2xDNA-단백질(도 5B)로 백신 접종한 붉은 모피 원숭이로부터 분리하였다(Wu, et al. Science 2010 DOI : 10.1126/science.1187659). 간단히 말하면, MERS-CoV 항원 특이성 B 세포는 CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, IgM, IgG 및 두 개의 프로브, MERS- CoV RBD 및 S1 단백질에 대해 형광 표지된 항체의 패널이 뒤따르는 live/death marker (VIVID)의 염색에 의해 식별된다. RBD+ 및/또는 S1+ 단일 B 세포를 용해 완충액을 포함하는 96-웰 PCR 플레이트로 분류하였다. 역전사 (Reverse transcription; RT) 반응을 수행하여 cDNA를 생성한 후, 중첩된 PCR을 2 회 반복하여 IgG 중쇄 및 경쇄 유전자를 증폭시켰다. 2 차 PCR 산물을 서열 분석하였다. 생산적인 IgH, Igκ 또는 Igλ 재조합 서열을 제공하는 PCR 산물은 독특한 제한 효소 소화 부위를 함유하는 맞춤형 프라이머를 사용하여 1차 PCR으로부터 재증폭되었고 이어서 상응하는 Igγ1, Igκ 또는 Igλ 발현 벡터에 클로닝되었다. 단일 클론 IgG 항체는 Expi-293 세포와 쌍을 이루는 중공 및 경질 플라스미드의 동시 트랜스펙션에 의해 발현되어 재조합 단백질-A 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 정제되었다. JC57-13, JC57-11, JC57-14, FIB_B2 및 FIB_H1 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 단백질 및 핵산 서열은 서열번호 1-12 및 51-58로서 제공된다. IMGT CDR 서열은 표 1에 제시되어있다.
C (CDC_C2), C5 (CDC_C5), A2 (CDC_A2) 및 A10 (CDC_A10) 항체는 앞서 자세히 설명한 대로 단일 B 세포 분류 및 IgG 중쇄 및 경쇄 복제 기술을 사용하여 인간 MERS-CoV 생존자로부터 분리하였다(Wu, et al. Science 2010 DOI : 10.1126/science.1187659). 간단히 말하면, MERS-CoV 항원 특이적 B 세포는 CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, IgG 및 두 개의 프로브인 MERS-CoV RBD에 대한 형광 표지 항체 패널(live/death marker)(VIVID) 및 S1 단백질. RBD+ 및/또는 S1+ 단일 B 세포를 용해 완충액을 포함하는 96-웰 PCR 플레이트로 분류하였다. 역전사(Reverse transcription; RT) 반응을 수행하여 cDNA를 생성한 후, 중첩된 PCR을 2회 반복하여 IgG 중쇄 및 경쇄 유전자를 증폭시켰다. 2 차 PCR 산물을 서열분석하였다. 생산적인 IgH, Igκ 또는 Igλ 재조합 서열을 제공하는 PCR 산물은 독특한 제한 효소 소화 부위를 함유하는 맞춤형 프라이머를 사용하여 1차 PCR으로부터 재증폭되었고이어서 상응하는 Igγ1, Igκ 또는 Igλ 발현 벡터에 클로닝되었다. 단일 클론 IgG 항체는 Expi-293 세포와 쌍을 이루는 중공 및 경질 플라스미드의 동시 트랜스펙션에 의해 발현되어 재조합 단백질-A 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 정제되었다. C2, C5, A2 및 A10 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 단백질 및 핵산 서열은 서열번호 35 내지 50으로 제공된다. IMGT CDR 서열은 표 1에 제시되어있다.
달리 명시하지 않는 한, 확인된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 하기 기술된 특성 분석을 위한 인간 IgG1 불변 영역(Wu, et al. Science 2010 DOI : 10.1126/science.1187659)으로 발현시켰다.
항체 특성
항체 특이성은 MERS-CoV RBD, S1 또는 S2 코팅된 ELISA 플레이트에 결합함으로써 검출되었다(도 22 참조). RBD-특이적 항체는 F11, D12, JC57-11, JC57-14, C2 및 C5를 포함한다. RBD에 결합하지 않는 S1 특이적 항체에는 G2, JC57-13, FIB_B2 및 FIB_H1이 포함된다. G4는 S2 특이적 항체이다.
항체 중화 효능은 MERS-CoV EMC 균주를 사용하여 슈도 타이프 중화 분석(도 23)에 의해 평가하였다. 전반적으로, RBD 특이적 단클론 항체는 S1(비 RBD) 및 S2 특이 적 단클론 항체보다 높은 역가를 보였다. 시험된 항체 중 C2가 가장 강력한 RBD 특이적 단클론 항체이고, G2가 가장 강력한 S1 특이 단클론 항체였다.
항체 중화 폭(neutralization breadth)은 슈도 타이프 중화 분석에 의해 평가되었다. RBD-특이적 항체들(도 24) 중, C2 항체는 한국 및 중국으로부터의 가장 최근의 균주를 포함하여 높은 효능을 갖는 10개의 MERS-CoV 균주를 중화시켰지만, 부분적으로 중화된 Bisha1 (D509G와 함께) 만 중화시켰다. C5, JC57-11 및 JC57-14 항체는 모두 8개의 모든 균주를 높은 효능으로 교차 중화시켰으나 C2보다 낮았다. S1 (비 RBD) 특이적 항체(도 25) 중, G2 항체는 MERS-CoV S 단백질의 NTD 도메인에서 돌연변이를 갖는 균주를 포함하여 8가지 MERS-CoV 균주를 중화시켰다. 그러나 A2, A10 및 JC57-13 항체는 NTD 돌연변이가 있는 MERS-CoV 계통의 가난한 중화제였다.
RBD 도메인에 돌연변이가 있는 EMC MERS-CoV 균주를 사용하는 중화시험을 수행하여 RBD 특이적 항체의 결합 부위를 확인하였다. EMC S 단백질은 하기 표에 표시된 바와 같이 돌연변이 되었으며, 항체 중화는 전술한 것처럼 슈도 바이러스 중화 분석을 사용하여 분석하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 6개의 RBD-특이적 mAb는 3가지 패턴으로 분류될 수 있다:
1. D12, JC57-14 및 C5는 유사한 잔기, 534, 535, 536 및 539와 상호 작용
2. F11 및 JC57-11은 다른 단클론 항체와 다름
3. C2는 RBD 상의 고형화된(비선형) 에피토프를 표적으로 함
다음 표에서 "+"는 중화에서 knock off, "+/-"는 중화에서 knock down, "E"는 강화된 중화(neutralization), 빈 셀에서는 중화에서 변화 없음을 나타낸다.
L506F D509G T512A S532P S534A E535R E536R D539R Y540H R542G P547G N582I
D12 +/- +/- + + +
JC57-14 +/- + +/- +/-
C5 + + + +
C2 +/- +/- +/- +/- +/- +/- + +/- +
F11 E + +/- +/- E +/-
JC57-11 + +/- +/-
결합 패턴을 조사하기 위해 확인된 항체를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 경쟁 결합 분석을 수행하였다. 표 3에서 볼 수 있듯이 RBD 특이적 mAb와 S1 (비 RBD) 특이적 단클론 항체는 MERS-CoV S1 단백질과의 결합에 경쟁하지 않는다. RBD 특이 mAb는 4가지 패턴으로 그룹화할 수 있다: D12, JC57-14, C5; C2; F11; 및 JC57-11. S1 특이적 단클론 항체는 두 가지 패턴으로 분류할 수 있다: G2, JC57-13, 및 FIB_H1; 및 A10.
Biotinylated mAbs
Competitor mAb (10mg/ml) F11 D12 JC57-11 JC57-14 C2 C5 G2 JC57-13 FIB_H1 A2 A10
F11 94.2 4.01 54.61 29.21 95.53 54.11 10.05 10.76 10.75 17.1 21.18
D12 -3.1 97.86 52.15 88.73 97.42 95.62 9.11 8.41 3.18 1.98 24.6
JC57-11 100 98.9 98.1 96.06 98.49 96.17 26.55 21.85 22.96 7.96 27.6
JC57-14 2.51 99.2 61.29 98.15 98.45 95.67 16.38 19.59 15.35 23.71 33.76
C2 78 62.61 39.6 48.65 98.1 95.07 14.42 8.75 7.63 -13.9 3.39
C5 24.5 63.13 26.6 48.51 94.44 95.56 1.8 7.07 7.62 7.38 16.88
G2 15.2 7.61 18.93 28.71 2.87 29.97 86.02 98.56 98.84 32.36 20.28
JC57-13 13 6.1 8.97 11.55 19.26 23.03 85.72 95.53 97.53 52.13 52.07
FIB_H1 19 8.84 7.83 16.94 20.76 22.53 82.07 96.49 95.41 8.34 46.42
A2 9.05 2.95 7.6 9.95 7.08 39.82 -1.37 6.89 9.37 1.514 3.836
A10 11.7 5.38 5.19 5.1 1614.6 28.8 3.74 7.72 4.02 85.7 91.29
deamidation 위험을 줄이기 위한 C2의 변이.
C2의 LCDR1에 있는 NG 모티프는 C2 항체의 탈아미노화 위험을 감소시키기 위해 돌연변이되었다. 테스트된 돌연변이는 NG33-34NGS, NG33-34NA 및 NG33-34DG 였다. NG33-34DG 돌연변이는 C2 항체의 중화 효율을 감소시켰다. 그러나 NG33-34NGS 및 NG33-34NA 돌연변이는 중화 효율에 영향을 미치지 않았다(표 4 참조).
mAb MERS CoV Strain
Eng1 EMC Jordan N3 Buraid1 Bisha1 Batin Munich Hasa 14b China-GD01 FloridaUSA-2 Korea 002
C2 IC50 0.023 0.002 0.0017 0.0041 0.1145 0.0037 0.0019 0.0074 0.0035 0.0117 0.0115
IC80 0.057 0.01 0.0059 0.0161 0.3361 0.0098 0.0071 0.0476 0.0112 0.0375 0.019
IC90 0.102 0.016 0.0142 0.0278 0.6116 0.0195 0.0164 0.077 0.0236 0.0599 0.0217
C2 CDRL1-NS IC50 0.01 0.004 0.0017 0.0049 0.1503 0.0042 0.0024 0.0073 0.0062 0.0049 0.0098
IC80 0.037 0.011 0.0122 0.0125 0.3785 0.0111 0.0098 0.0349 0.0152 0.0229 0.0259
IC90 0.067 0.015 0.0379 0.0249 0.6529 0.0212 0.0225 0.0867 0.0202 0.0624 0.0387
C2 CDRL1-NA IC50 0.047 0.004 0.0015 0.0015 0.3178 0.0079 0.0018 0.0067 0.0038 0.0083 0.0164
IC80 0.09 0.011 0.0085 0.0148 0.9897 0.0205 0.0071 0.0356 0.0138 0.0484 0.0464
IC90 0.109 0.015 0.0282 0.034 1.5093 0.0268 0.0164 0.0801 0.0216 0.1296 0.067
쥐( murine ) G2 항체에 기초한 인간 키메라 항체
쥐 G2 항체의 VH 및 인간 IgG1 불변 도메인을 포함하는 인간 키메라 항체가 G2 VH를 인간 IgG1 불변 도메인에 연결시킴으로써 생성되었다. 키메라 중쇄의 DNA 및 단백질 서열은 서열번호 153 및 154로 제공된다. 키메라 VH는 인간 중쇄 및 마우스 경쇄의 양립성을 향상시키기 위해 불변 도메인의 시작 부분에 KG-TP 치환을 포함한다. G2 마우스-인간 키메라 단클론 항체(G2-huIgG KG/TP)는 의사 바이러스 중화 분석(표 5 참조)을 사용하여 분석했을 때, IC50이 비슷하지만 IC80 및 IC90이 G2로 약간 낮아 11개의 MERS-CoV 균주를 중화시킨다.
mAb MERS CoV Strain
Eng1 EMC Jordan N3 Buraid 1 Bisha1 Batin Munich Hasa 14b China GD01 Florida USA-2 Korea 002
Mouse G2 IC50 0.012 0.0126 0.0372 0.0112 0.0119 0.0161 0.018 0.0247 0.0202 0.0272 0.0144
IC80 0.043 0.0431 0.3636 0.0582 0.0317 0.0904 0.1113 0.0809 0.0592 0.0624 0.0367
IC90 0.095 0.1013 2.8861 0.0903 0.0518 0.9324 0.593 0.11 0.1433 0.1059 0.0604
hIgG1-G2 KG/TP IC50 0.014 0.0164 0.0499 0.0029 0.0129 0.0112 0.0457 0.1595 0.017 0.0268 0.0153
IC80 0.0807 0.0506 0.0508 0.1181 0.1025
IC90 0.1258 0.1333
기술된 방법 또는 조성물의 정확한 세부 사항은 설명된 실시예의 정신을 벗어나지 않는다면 다양하거나 수정될 수 있음이 명백할 것이다. 본 발명자는 이하의 청구 범위의 사상 및 범위 내에 있는 그러한 모든 수정 및 변형을 청구한다.
수반하는 서열 목록에 리스트된 핵산 및 아미노산 서열들은 37 C.F.R. 1.822 에서 정의된 대로 핵산 염기의 표준 약어 글자 및 아미노산을 코드 하는 세 글자를 사용하여 보여준다. 각 핵산 서열은 단지 한 가닥만 보여주지만 반대 가닥은 보여주는 가닥을 참조하여 포함되는 것으로 이해된다. 서열 목록은 화일 이름이 "Sequence.txt"(~164 kb)" 형태로 ASCII 텍스트 화일(text file)로서 제출되며, 2016년 2월 24일에 만들어졌으며, 여기에서 참조문헌으로 포함되었다. 수반되는 서열의 목록은 다음과 같다:
서열번호 1은 JC57-13 비인간 영장류 (NHP) 항체 (VRC 4230)의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcgccgtctctggtggctccatcagcagtaactactggaactggatccgccagtccccagggaaggggctagagtggattgggtatatctatggtggtagtgggagcaccacctacaacccctccctcaagagtcgagtcgccatttcaacagacacgtccaaggaccagttttccctgaagctgagctctgtgaccgccgcggacaccgccgtatattactgtgcgagactgctgcccttaggggggggatactgctttgactactggggccagggagtcctggtcaccgtctcctca
서열번호 2는 JC57-13 NHP 항체 (VRC 4230)의 VH의 아미노산 서열이다.
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGGSISSNYWNWIRQSPGKGLEWIGYIYGGSGSTTYNPSLKSRVAISTDTSKDQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLLPLGGGYCFDYWGQGVLVTVSS
서열번호 3은 JC57-13 NHP 항체 (VRC 4231)의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
Gatattgtgatgacccagactccattcaccctgcccgtcacccctggagaggcggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcttcgatagtgattatggaaacacctatttggattggtatctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctatatgctttccaaccgggcctctggagtccctgataggttcagtggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttgggttatattactgcatgcaaagtgtagagtatccattcactttcggccccgggaccaaactggatatcaaa
서열번호 4는 JC57-13 NHP 항체 (VRC 4231)의 VL의 아미노산 서열이다.
DIVMTQTPFTLPVTPGEAASISCRSSQSLFDSDYGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGLYYCMQSVEYPFTFGPGTKLDIK
서열번호 5는 JC57-11 NHP 항체 (VRC 4232)의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
Gaggtgcagctgctggagtcgggcccaggagtggtgaggccttcggagaccctgtccctctcctgcgctgtctctggtggctccatcagcgatagttaccggtggagctggatccgccagcccccagggaagggactggagtgggttggctacatctttgctactggtacgaccaccaactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatttcaaaagacacgtccaagaaccagttctccttgaagctgagctctgtgaccgccgcggacacggccgtttactactgtgcgagagagccgttcaaatattgtagtggtggtgtctgctatgcccacaaggacaactcattggatgtctggggccagggagttctggtcaccgtctcctca
서열번호 6은 JC57-11 NHP 항체 (VRC 4232)의 VH의 아미노산 서열이다.
EVQLLESGPGVVRPSETLSLSCAVSGGSISDSYRWSWIRQPPGKGLEWVGYIFATGTTTNYNPSLKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREPFKYCSGGVCYAHKDNSLDVWGQGVLVTVSS
서열번호 7은 JC57-11 NHP 항체 (VRC 4233)의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
Gaaattgtgatgacgcagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccactctctcctgcagggccagtcagagtgttagtagcaacttagcctggtaccagcagaaacctgggcaggctcccaggctcctcatccacagtgcgtccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagcgggtctgggacagagttcagtctcaccatcagcagtctggaggctgaagatgttggagtttatcactgctatcagcatagcagcgggtacactttcggccccgggaccaaactggatatcaaa
서열번호 8은 JC57-11 NHP 항체 (VRC 4233)의 VL의 아미노산 서열이다.
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIHSASSRATGIPDRFSGSGSGTEFSLTISSLEAEDVGVYHCYQHSSGYTFGPGTKLDIK
서열번호 9는 JC57-14 NHP 항체 (VRC 4234)의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
Gaggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcgctgtctctggtgactccatcagcagtaactactggagctggatccgccagcccccagggaagggactggagtggattggacgtttctctggtagtggtgggagcaccgacttcaacccctccctcaagagtcgggtcaccatttcaacagacacgtccaagaaccagttctccctgaacctgaggtctgtgaccgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgaaaacctatagcggcacctttgactactggggccagggagtcctggtcaccgtctcctca
서열번호 10은 JC57-14 NHP 항체 (VRC 4234)의 VH의 아미노산 서열이다.
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGDSISSNYWSWIRQPPGKGLEWIGRFSGSGGSTDFNPSLKSRVTISTDTSKNQFSLNLRSVTAADTAVYYCAKTYSGTFDYWGQGVLVTVSS
서열번호 11은 JC57-14 NHP 항체 (VRC 4235)의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
Gacattcagatgacgcagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcgagtcaggacattaacaattatttaagttggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagcccctgatctattatgcatccagtttggaaacaggagtaccttcaaggttcagtggaagtagatctgggacagattacactctcaccatcagcagtctgcagcttgaagattttgcaacatattactgtcaacagtataataattccccgtacagttttggccaggggaccaaagtggagatcaaa
서열번호 12는 JC57-14 NHP 항체 (VRC 4235)의 VL의 아미노산 서열이다.
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNYLSWYQQKPGKAPKPLIYYASSLETGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQLEDFATYYCQQYNNSPYSFGQGTKVEIK
서열번호 13 및 14는 전장 MERS-CoV S 단백질, England1 균주의 핵산 및 단백질 서열이다.
서열번호 15 및 16은 MERS-CoV S 단백질 인 England1 균주의 S1 서브 유닛의 핵산 및 단백질 서열이다.
서열번호 17 및 18은 수용체 결합 도메인 (RBD)을 포함하는 MERS-CoV S 단백질, 잉글랜드 (England) 균주의 단편의 핵산 및 단백질 서열이다.
서열번호 19 및 20은 MERS-CoV S 단백질, England1 균주의 S-TMTM 단편의 핵산 및 단백질 서열이다.
서열번호 21은 페리틴 나노 입자 서브 유닛의 아미노산 서열이다.
서열번호 22 및 23은 페리틴 나노 입자 서브유닛에 연결된 MERS-CoV S 단백질 RBD 도메인의 아미노산 서열이다.
서열번호 24 및 25는 신호 펩티드의 아미노산 서열이다.
서열번호 26 및 27은 페리틴 나노 입자 서브유닛에 연결된 MERS-CoV S 단백질 RBD 도메인을 코딩하는 폴리 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 28은 루신 신타 제 나노 입자 서브 유닛의 아미노산 서열이다.
서열번호 29는 캡슐 린 나노 입자 서브 유닛의 아미노산 서열이다.
서열번호 30 및 31은 캡슐 린 나노 입자 서브 유닛에 연결된 MERS-CoV S 단백질 RBD 도메인의 아미노산 서열이다.
서열번호 32 및 33은 캡슐 린 나노 입자 서브 유닛에 연결된 MERS-CoV S 단백질 RBD 도메인을 코딩하는 폴리 뉴클레오타이드 서열이다.
서열번호 34는 Sulfur Oxygenase Reductase 나노 입자 서브 유닛의 아미노산 서열이다.
서열번호 35는 C2 인간 항체 (VRC 4792)의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
Caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggcaccttcagcatctatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagggatcatccctatctttggtacagcaaactacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagagaggggggccaccagggatattgtagtggtggtagctgctacgactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
서열번호 36은 C2 인간 항체 (VRC 4792)의 VH의 아미노산 서열이고,
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSIYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGHQGYCSGGSCYDFDYWGQGTLVTVSS
서열번호 37은 C2 인간 항체 (VRC 4793)의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagtaatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattattgcatgcaagctctacaaactcctgcgttcggcggagggaccaagctggagatcaaa
서열번호 38은 C2 인간 항체 (VRC 4793)의 VL의 아미노산 서열이다.
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPAFGGGTKLEIK
서열번호 39는 C5 인간 항체 (VRC 4794)의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
cagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcagcagtagtagttactactggggctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatctattatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatccgtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgaccgccgcagacacggctgtgtattactgtgcgagcctcttaaggcccctgatttattgtagtggtggtagctgcaccgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
서열번호 40은 C5 인간 항체의 VH의 아미노산 서열 (VRC 4794)이다.
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCASLLRPLIYCSGGSCTDYWGQGTLVTVSS
서열번호 41은 C5 인간 항체의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열 (VRC 4795)이다.
Cagtctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgacgttggtggttataactatgtctcctggtgccaacagcacccaggcaaagcccccaaactcatgatttatgaggtcagtaatcggccctcaggggtttctaatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgaccatctctgggctccaggctgaggacgaggctgattattactgcagctcatatacaagcaacatcactcttgtcttcggaactgggaccaaggtcaccgtccta
서열번호 42는 C5 인간 항체의 VL의 아미노산 서열 (VRC 4795)이다.
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWCQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSNITLVFGTGTKVTVL
서열번호 43은 A2 인간 항체 (VRC 4796)의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtcaagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtgactactacatgagctggatccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtttcatacattagtagtagtggtagtaccatatactacgcagactctgtgaagggccgattcaccatctccagggacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagagtagggttaggcagtggctggtacgactggttcgacccctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca
서열번호 44는 A2 인간 항체 (VRC 4796)의 VH의 아미노산 서열이다.
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGLGSGWYDWFDPWGQGTLVTVSS
서열번호 45는 A2 인간 항체 (VRC 4797)의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
cagtctgccctgactcagccgccctcagtgtctggggccccagggcagagggtcaccatctcctgcactgggagcagctccaacatcggggcaagttatgatgtacactggtaccagcaccttccaggaacagcccccaaactcctcatctatggtaacaccaatcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcactgggctccaggctgaggatgaggctgattattactgccagtcctatgacagcagcctgagtggtgtggtattcagcggagggaccaagctgaccgtcctag
서열번호 46은 A2 인간 항체의 VL의 아미노산 서열 (VRC 4797)이다.
QSALTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGASYDVHWYQHLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGVVFSGGTKLTVL
서열번호 47은 A10 인간 항체 (VRC 4798)의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggcaccttcagcacctatgctctcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagggatcatccctatctttggtacagcaaactacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacgaatccacgagcacggcctacatggagttgaacagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggaagccggagcagctcttccgctgaatacttccagcactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctca
서열번호 48은 A10 인간 항체 (VRC 4798)의 VH의 아미노산 서열이다.
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYALSWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELNSLRSEDTAVYYCARGSRSSSSAEYFQHWGQGTLVTVSS
서열번호 49는 A10 인간 항체 (VRC 4799)의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
cagtctgccctgactcagcctcgctcagtgtccgggtctcctggacagtcagtcaccatctcctgcactggaaccagcagtgatgttggtggttataactatgtctcctggtaccaacagcacccaggcaaagcccccaaactcatgatttatgatgtcagtaagcggccctcaggggtccctgatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgaccatctctgggctccaggctgaggatgaggctgattattactgctgctcatatgcaggcagctacactttagaagtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtcctag
서열번호 50은 A10 인간 항체의 VL의 아미노산 서열 (VRC 4799)이다.
QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTLEVVFGGGTKLTVL
서열번호 51은 FIB_B2 NHP 항체 (VRC 5069)의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtctctcacctgcgctgtttctggtggctccatcagcagcaactactggtactggatccgccagtccccagtgaaggggctggagtggattgggtatatctatggtggtagtgggggcaccgaatacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatttcaacagacacgtccaagaaccagtttttcctgaagctgagctctgtgaccgccgcggacaccgccgtatattactgtgcgagatccttttatagctggaacggggaatcctggggccaaggggtcgtcgtcaccgtctcctca
서열번호 52는 FIB_B2 NHP 항체 (VRC 5069)의 VH의 아미노산 서열이다.
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGGSISSNYWYWIRQSPVKGLEWIGYIYGGSGGTEYNPSLKSRVTISTDTSKNQFFLKLSSVTAADTAVYYCARSFYSWNGESWGQGVVVTVSS
서열번호 53은 FIB_B2 NHP 항체 (VLC 5070)의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
gacattcagatgtcccagactccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagggcattaacgattatttaaattggtatcagcagaaaccggggaaagcccctaagctcctgatctattatggaaacagtttggcaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggttctgggacagatttctctctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgtcaacagggtgatagtttccctctcactttcggcggagggaccaaagtggatatcaaa
서열번호 54는 FIB_B2 NHP 항체 (VLC 5070)의 VL의 아미노산 서열이다.
DIQMSQTPSSLSASVGDRVTITCRASQGINDYLNWYQQKPGKAPKLLIYYGNSLASGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYYCQQGDSFPLTFGGGTKVDIK
서열번호 55는 FIB_H1 NHP 항체 (VRC 5071)의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
gaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaagcttctggacacattttcaccagttatgttatcaactggctgcaagaggcccctggacaagggtttgagtggatgggaggaatccaccctggtaatggtggcagagactacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacatgtccacgagcacagtctacatggagctgagaagtctgagatctgaggacatggccgtgtattactgtgcagcatccagtggtagttatggtgttagctcattggatgtctggggccggggagttctggtcaccgtctcctca
서열번호 56은 FIB_H1 NHP 항체 (VRC 5071)의 VH의 아미노산 서열이다.
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGHIFTSYVINWLQEAPGQGFEWMGGIHPGNGGRDYAQKFQGRVTITADMSTSTVYMELRSLRSEDMAVYYCAASSGSYGVSSLDVWGRGVLVTVSS
서열번호 57은 FIB_H1 NHP 항체 (VRC 5072)의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
cagtctgccctgactcagccaccctccctgtctgcatccccgggagcatcggccagactcccctgcaccctgagcagtgacctcagtgttggtagtaaaaacatgtactggtaccagcagaagccagggagcgctcccaggttattcctgtactactactccgactcagacaagcagctgggacctggggtccccaatcgagtctctggctccaaggagacctcaagtaacacagcgtttttgctcatctctgggctccagcctgaggacgaggccgattattactgtcaggtgtatgacagtagtgctaattgggtattcggcggagggacccggctgacagtacta
서열번호 58은 FIB_H1 NHP 항체의 VL의 아미노산 서열 (VRC 5072)이다.
QSALTQPPSLSASPGASARLPCTLSSDLSVGSKNMYWYQQKPGSAPRLFLYYYSDSDKQLGPGVPNRVSGSKETSSNTAFLLISGLQPEDEADYYCQVYDSSANWVFGGGTRLTVL
서열번호 59-109는 중쇄 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열이다.
서열번호 110은 G29S 돌연변이를 갖는 C2 항체의 VL의 아미노산 서열이다.
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNSYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPAFGGGTKLEIK
서열번호 111은 G29A 돌연변이를 갖는 C2 항체의 VL의 아미노산 서열이다.
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNAYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPAFGGGTKLEIK
서열번호 112 및 113은 경쇄 CDR의 아미노산 서열이다.
서열번호 114는 G2 항체의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
cattcccaggtgcagctgcagcagtctggaggtgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcctgcaagacttctggcttcaccttcagcagtagctatataagttggttgaagcaaaagcctggacagagtcttgagtggattgcatggatttatgctggaactggtggtactgaatataatcagaagttcacaggcaaggcccaagtgactgtagacacatcctccagcacagcctacatgcaattcagcagcctgacaactgaggactctgccatctattactgtgcaagaggaggtagtagcttcgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
서열번호 115는 G2 항체의 VH의 아미노산 서열이다.
QVQLQQSGGELVKPGASVKLSCKTSGFTFSSSYISWLKQKPGQSLEWIAWIYAGTGGTEYNQKFTGKAQVTVDTSSSTAYMQFSSLTTEDSAIYYCARGGSSFAMDYWGQGTSVTVSS
서열번호 116은 G2 항체의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
caacttgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatctcctgcagagccagcgaaagtgttgataattatggcattagttttatgaactggttccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatccatactgcatccaaccaaggatccggggtccctgccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggacgatgatactgcaatgtatttctgtcagcaaagtgaggaggttcctctcacgttcggtgctgggaccaagctggaaatcaaa
서열번호 117은 G2 항체의 VL의 아미노산 서열이다.
QLVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIHTASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEDDDTAMYFCQQSEEVPLTFGAGTKLELK
서열번호 118은 G4 항체의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
caggtccagctgcagcagtctgggcctgagctggtgaggcctggggtctcagtgaagatttcctgcaagggttccggctacacattcactgattatgctatacactgggtgaagcagagtcatgcaaagagtctagagtggattggggtttttagtacttactatggtaatacaaactacaaccagaagtttaagggcagggccacaatgactgtagacaaatcctccagcacagcctatatggaacttgccagattgacatctgaggattctgccatctattactgtgcaagaaagtcctactatgttgactacgttgatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca
서열번호 119는 G4 항체의 VH의 아미노산 서열이다.
QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGSGYTFTDYAIHWVKQSHAKSLEWIGVFSTYYGNTNYNQKFKGRATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCARKSYYVDYVDAMDYWGQGTSVTVSS
서열번호 120은 G4 항체의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatctcctgcagagccagcgaaagtgttgataattatggcattagttttatgaactggttccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctctgctacatccaaccaaggatccggggtccctgccaggtttattggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatactgcaatgtatttctgtcagcaaagtaaggaggttcctcggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaac
서열번호 121은 G4 항체의 VL의 아미노산 서열이다.
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLISATSNQGSGVPARFIGSGSGTDFSLNIHPVEEDDTAMYFCQQSKEVPRTFGGGTKLEIK
서열번호 122는 D12 항체의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
gaggtgaagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttacacctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccgagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgtaagagatggtaattctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagc
서열번호 123은 D12 항체의 VH의 아미노산 서열이다.
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAENTLYLQMSSLRSEDTAMYYCVRDGNSMDYWGQGTSVTVSS
서열번호 124는 D12 항체의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcatttgcagggcaagtcaggacattaacaattatttaaactggtatcaacagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggatcagattattctctcaccattagcaacctggaacaagaagatattgccacttacttttgccaacaggctaatacgcttcctcccacgttcggtgctgggaccaagctggaactgaga
서열번호 125는 D12 항체의 VL의 아미노산 서열이다.
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTIICRASQDINNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGSDYSLTISNLEQEDIATYFCQQANTLPPTFGAGTKLELR
서열번호 126은 F11 항체의 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
cattccgaggtgaagctggaggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtaggtatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattaataatggtggtagttacagttactatccagacagtgtgaagggtcgactcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccttgtattactgtgcaagacactatgattacgacggatattactatactatggacttctggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagc
서열번호 127은 F11 항체의 VH의 아미노산 서열이다.
EVKLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVATINNGGSYSYYPDSVKGRLTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYCARHYDYDGYYYTMDFWGQGTSVTVSS
서열번호 128은 F11 항체의 VL을 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
gatgttttgatgacccaaattccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatttcttgcagatctagtcagagcattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagcccctgatctacaaagtttccaaccgaatttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccgtacacgttcggaggggggaccaacctggaaataaaacg
서열번호 129는 F11 항체의 VL의 아미노산 서열이다.
DVLMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKPLIYKVSNRISGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTNLEIKR
서열번호 130-152는 중쇄 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열이다.
서열번호 153은 G2 중쇄 가변 도메인 및 인간 IgG1 불변 도메인 (VRC 5068)을 포함하는 키메라 성 VH를 코딩하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열이다.
aggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
서열번호 154는 G2 중쇄 가변 도메인 및 인간 IgG1 불변 도메인 (VRC 5068)을 포함하는 키메라 VH이다.
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQQSGGELVKPGASVKLSCKTSGFTFSSSYISWLKQKPGQSLEWIAWIYAGTGGTEYNQKFTGKAQVTVDTSSSTAYMQFSSLTTEDSAIYYCARGGSSFAMDYWGQGTSVTVSSASTTPPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
<110> The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Graham, Barney Kong, Wing-Pui Modjarrad, Kayvon Wang, Lingshu Shi, Wei Joyce, Michael Kanekiyo, Masaru Mascola, John <120> MIDDLE EAST RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS IMMUNOGENS, ANTIBODIES, AND THEIR USE <130> 2017FPI-08-005 <150> US 62/120,353 <151> 2015-02-28 <150> PCT/US 2016/019395 <151> 2016-02-24 <160> 154 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> macaca mulatta <400> 1 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgccg tctctggtgg ctccatcagc agtaactact ggaactggat ccgccagtcc 120 ccagggaagg ggctagagtg gattgggtat atctatggtg gtagtgggag caccacctac 180 aacccctccc tcaagagtcg agtcgccatt tcaacagaca cgtccaagga ccagttttcc 240 ctgaagctga gctctgtgac cgccgcggac accgccgtat attactgtgc gagactgctg 300 cccttagggg ggggatactg ctttgactac tggggccagg gagtcctggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> macaca mulatta <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Ala Ile Ser Thr Asp Thr Ser Lys Asp Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Leu Pro Leu Gly Gly Gly Tyr Cys Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 339 <212> DNA <213> macaca mulatta <400> 3 gatattgtga tgacccagac tccattcacc ctgcccgtca cccctggaga ggcggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctcttc gatagtgatt atggaaacac ctatttggat 120 tggtatctgc agaagccagg ccagtctcca cagctcctga tctatatgct ttccaaccgg 180 gcctctggag tccctgatag gttcagtggc agtgggtcag gcactgattt cacactgaaa 240 atcagccggg tggaggctga ggatgttggg ttatattact gcatgcaaag tgtagagtat 300 ccattcactt tcggccccgg gaccaaactg gatatcaaa 339 <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> macaca mulatta <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Phe Thr Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser 20 25 30 Asp Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Met Leu Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 Ser Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Asp Ile 100 105 110 Lys <210> 5 <211> 393 <212> DNA <213> macaca mulatta <400> 5 gaggtgcagc tgctggagtc gggcccagga gtggtgaggc cttcggagac cctgtccctc 60 tcctgcgctg tctctggtgg ctccatcagc gatagttacc ggtggagctg gatccgccag 120 cccccaggga agggactgga gtgggttggc tacatctttg ctactggtac gaccaccaac 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atttcaaaag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccttgaagc tgagctctgt gaccgccgcg gacacggccg tttactactg tgcgagagag 300 ccgttcaaat attgtagtgg tggtgtctgc tatgcccaca aggacaactc attggatgtc 360 tggggccagg gagttctggt caccgtctcc tca 393 <210> 6 <211> 131 <212> PRT <213> macaca mulatta <400> 6 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Arg Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asp Ser 20 25 30 Tyr Arg Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Gly Tyr Ile Phe Ala Thr Gly Thr Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Pro Phe Lys Tyr Cys Ser Gly Gly Val Cys Tyr Ala 100 105 110 His Lys Asp Asn Ser Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr 115 120 125 Val Ser Ser 130 <210> 7 <211> 318 <212> DNA <213> macaca mulatta <400> 7 gaaattgtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccact 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120 gggcaggctc ccaggctcct catccacagt gcgtccagca gggccactgg catcccagac 180 aggttcagtg gcagcgggtc tgggacagag ttcagtctca ccatcagcag tctggaggct 240 gaagatgttg gagtttatca ctgctatcag catagcagcg ggtacacttt cggccccggg 300 accaaactgg atatcaaa 318 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> macaca mulatta <400> 8 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 His Ser Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Tyr Gln His Ser Ser Gly Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 351 <212> DNA <213> macaca mulatta <400> 9 gaggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtga ctccatcagc agtaactact ggagctggat ccgccagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattggacgt ttctctggta 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Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus <400> 19 atgattcact ccgtgttcct gctgatgttc ctgctgactc ctacagagag ctatgtggat 60 gtgggacctg attccgtcaa gagcgcctgc atcgaagtgg acattcagca gaccttcttt 120 gataagacat ggccaagacc catcgacgtg agcaaagccg atggcatcat ctaccctcag 180 gggaggacct attccaatat cacaattact taccagggcc tgttcccata tcagggagac 240 cacggcgata tgtacgtgta ttctgctggc catgcaacag ggaccacacc tcagaagctg 300 tttgtggcta actacagcca ggacgtcaaa cagttcgcaa atggatttgt ggtccgcatc 360 ggcgccgctg caaactctac cggcacagtg atcatttcac ctagcacttc cgcaaccatc 420 cgaaaaatct acccagcctt catgctggga agctccgtgg gcaattttag cgacgggaaa 480 atgggacggt tctttaacca caccctggtg ctgctgcctg atggatgcgg cacactgctg 540 agggctttct actgtatcct ggagccacgc agcggaaacc actgccccgc aggaaatagc 600 tacacctcct ttgccacata tcatactcca gctaccgact gttccgatgg caactacaat 660 cgaaacgcct ctctgaatag tttcaaggaa tacttcaacc tgcggaattg cacattcatg 720 tacacttata acatcaccga ggacgaaatt ctggagtggt tcggaatcac tcagaccgca 780 cagggcgtgc acctgttttc tagtcgctac 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cagtcaccgt cgtcgacacg tgtgatcaga tatcgcggcc gctctagaga 1380 tatcgccacc atggacagca agggcagcag ccagaagggc agcagactgc tgctgctgct 1440 ggtggtgagc aacctgctgc tgcctcaggg cgtgctagcc gaggccaagc cctctgggag 1500 tgtggtcgag caggctgaag gagtggagtg cgatttcagt cctctgctgt cagggacccc 1560 ccctcaggtg tacaacttca agcggctggt ctttactaac tgtaactaca atctgaccaa 1620 gctgctgtca ctgttcagcg tgaatgactt tacatgctcc cagatcagcc ccgcagccat 1680 tgctagtaac tgttactcct ctctgatcct ggactacttc tcatatccac tgagtatgaa 1740 gagcgacctg agcgtgagtt cagccggccc catcagccag ttcaactata aacagagctt 1800 cagcaatcct acatgcctga ttctggctac tgtgccacat aatctgacta ccatcactaa 1860 gcccctgaaa tactcctata ttaacaagtg cagccggttc ctgtccgacg atagaaccga 1920 agtgccacag ctggtcaacg ccaatcagta ctctccctgt gtgagtatcg tcccttcaac 1980 cgtgtgggaa gacggggatt actatagaaa acagctgagc cccctggagg gaggaggatg 2040 gctggtggca tccggatcta cagtcgccat gactgagcag ctgcagatgg ggttcggaat 2100 cacagtgcag tacggcacag acactaactc tgtctgtccc aagctggaat tcgctaacga 2160 tactaagatc gcaagtcagc tgggatccgg agagagccag gtgaggcagc agttcagcaa 2220 ggacatcgag aagctgctga acgagcaggt gaacaaggag atgcagagca gcaacctgta 2280 catgagcatg agcagctggt gctacaccca cagcctggac ggcgccggcc tgttcctgtt 2340 cgaccacgcc gccgaggagt acgagcacgc caagaagctg atcatcttcc tgaacgagaa 2400 caacgtgccc gtgcagctga ccagcatcag cgcccccgag cacaagttcg agggcctgac 2460 ccagatcttc cagaaggcct acgagcacga gcagcacatc agcgagagca tcaacaacat 2520 cgtggaccac gccatcaaga gcaaggacca cgccaccttc aacttcctgc agtggtacgt 2580 ggccgagcag cacgaggagg aggtgctgtt caaggacatc ctggacaaga tcgagctgat 2640 cggcaacgag aaccacggcc tgtacctggc cgaccagtac gtgaagggca tcgccaagag 2700 caggaagagc ggatcctagc atcatcatca tcattagtct ggaagggcga attgatccag 2760 atctgctgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 2820 gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 2880 ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 2940 ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg gtacccaggt 3000 gctgaagaat 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caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt 4740 tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga tcctggtatc 4800 ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa 4860 taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa 4920 gcttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat 4980 cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc 5040 gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg 5100 ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc tggaatgctg 5160 ttttcccggg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct 5220 tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc tcatctgtaa 5280 catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc 5340 catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc 5400 catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct cgagcaagac gtttcccgtt 5460 gaatatggct cataacaccc cttgtattac tgtttatgta agcagacagt tttattgttc 5520 atgatgatat 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caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 540 cacttgggaa tttccaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 600 ggaacttcca taagcttgca ttatgcccag tacatgacct tatgggaatt tcctacttgg 660 cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc 720 aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg gaacttccaa gtctccaccc cattgacgtc 780 aatgggagtt tgttttgact caccaaaatc aacgggaatt cccaaaatgt cgtaacaact 840 ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag 900 ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata 960 gaagacaccg ggaccgatcc agcctccatc ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg 1020 ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg 1080 tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct 1140 ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac 1200 cctgcttgct caactctagt taacggtgga gggcagtgta gtctgagcag tactcgttgc 1260 tgccgcgcgc gccaccagac ataatagctg acagactaac agactgttcc tttccatggg 1320 tcttttctgc agtcaccgtc gtcgacacgt gtgatcagat atcgcggccg ctctagagat 1380 atcgccacca tggacagcaa gggcagcagc cagaagggca gcagactgct gctgctgctg 1440 gtggtgagca acctgctgct gcctcagggc gtgctagccg tggagtgcga tttcagtcct 1500 ctgctgtcag ggaccccccc tcaggtgtac aacttcaagc ggctggtctt tactaactgt 1560 aactacaatc tgaccaagct gctgtcactg ttcagcgtga atgactttac atgctcccag 1620 atcagccccg cagccattgc tagtaactgt tactcctctc tgatcctgga ctacttctca 1680 tatccactga gtatgaagag cgacctgagc gtgagttcag ccggccccat cagccagttc 1740 aactataaac agagcttcag caatcctaca tgcctgattc tggctactgt gccacataat 1800 ctgactacca tcactaagcc cctgaaatac tcctatatta acaagtgcag ccggttcctg 1860 tccgacgata gaaccgaagt gccacagctg gtcaacgcca atcagtactc tccctgtgtg 1920 agtatcgtcc cttcaaccgt gtgggaagac ggggattact atagaaaaca gctgagcccc 1980 ctggagggag gaggatggct ggtggcatcc ggatctacag tcgccatgac tgagcagctg 2040 cagatggggt tcggaatcac agtgcagtac ggcacagaca ctaactctgt ctgtcccaag 2100 ctgtccggag agagccaggt gaggcagcag ttcagcaagg acatcgagaa gctgctgaac 2160 gagcaggtga acaaggagat gcagagcagc aacctgtaca tgagcatgag cagctggtgc 2220 tacacccaca gcctggacgg cgccggcctg ttcctgttcg accacgccgc cgaggagtac 2280 gagcacgcca agaagctgat catcttcctg aacgagaaca acgtgcccgt gcagctgacc 2340 agcatcagcg cccccgagca caagttcgag ggcctgaccc agatcttcca gaaggcctac 2400 gagcacgagc agcacatcag cgagagcatc aacaacatcg tggaccacgc catcaagagc 2460 aaggaccacg ccaccttcaa cttcctgcag tggtacgtgg ccgagcagca cgaggaggag 2520 gtgctgttca aggacatcct ggacaagatc gagctgatcg gcaacgagaa ccacggcctg 2580 tacctggccg accagtacgt gaagggcatc gccaagagca ggaagagcgg atcctagcat 2640 catcatcatc attagtctgg aagggcgaat tgatccagat ctgctgtgcc ttctagttgc 2700 cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc 2760 actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct 2820 attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg 2880 catgctgggg atgcggtggg ctctatgggt acccaggtgc tgaagaattg acccggttcc 2940 tcctgggcca gaaagaagca ggcacatccc cttctctgtg acacaccctg tccacgcccc 3000 tggttcttag ttccagcccc actcatagga cactcatagc 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105 110 <210> 118 <211> 366 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 118 caggtccagc tgcagcagtc tgggcctgag ctggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg gttccggcta cacattcact gattatgcta tacactgggt gaagcagagt 120 catgcaaaga gtctagagtg gattggggtt tttagtactt actatggtaa tacaaactac 180 aaccagaagt ttaagggcag ggccacaatg actgtagaca aatcctccag cacagcctat 240 atggaacttg ccagattgac atctgaggat tctgccatct attactgtgc aagaaagtcc 300 tactatgttg actacgttga tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 119 <211> 122 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 119 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Phe Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Ser Tyr Tyr Val Asp Tyr Val Asp Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 120 <211> 334 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 120 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaactggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctacatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttat tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctgtggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttcctcgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaac 334 <210> 121 <211> 111 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 121 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Ser Ala Thr Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 122 <211> 350 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 122 gaggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtactta cacctactat 180 ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccgagaa caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgt aagagatggt 300 aattctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc 350 <210> 123 <211> 116 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 123 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Gly Asn Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 124 <211> 321 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 124 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcatttgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca acagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggatcagat tattctctca ccattagcaa cctggaacaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag gctaatacgc ttcctcccac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggaactgag a 321 <210> 125 <211> 107 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 125 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ile Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Asn Thr Leu Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg 100 105 <210> 126 <211> 374 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 126 cattccgagg tgaagctgga ggagtctggg ggaggcttag tgaagcctgg agggtccctg 60 aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtaggt atgccatgtc ttgggttcgc 120 cagactccgg agaagaggct ggagtgggtc gcaaccatta ataatggtgg tagttacagt 180 tactatccag acagtgtgaa gggtcgactc accatctcca gagacaatgc caagaacacc 240 ctgtacctgc aaatgagcag tctgaggtct gaggacacgg ccttgtatta ctgtgcaaga 300 cactatgatt acgacggata ttactatact atggacttct ggggtcaagg aacctcagtc 360 accgtctcct cagc 374 <210> 127 <211> 122 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 127 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Asn Asn Gly Gly Ser Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 128 <211> 338 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 128 gatgttttga tgacccaaat tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atttcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag cccctgatct acaaagtttc caaccgaatt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caacctggaa ataaaacg 338 <210> 129 <211> 113 <212> PRT <213> Mus Musculus <400> 129 Asp Val Leu Met Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 130 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 130 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 131 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 131 Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Gly Thr 1 5 <210> 132 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 132 Ala Arg Gly Gly Ser Ser Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 133 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 133 Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe 1 5 10 <210> 134 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 134 Thr Ala Ser 1 <210> 135 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 135 Gln Gln Ser Glu Glu 1 5 <210> 136 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 136 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala 1 5 <210> 137 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 137 Phe Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr 1 5 <210> 138 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 138 Ala Arg Lys Ser Tyr Tyr Val Asp Tyr Val Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 139 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 139 Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe 1 5 10 <210> 140 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 140 Ala Thr Ser 1 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 141 Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Arg Thr 1 5 <210> 142 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 142 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 143 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 143 Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr 1 5 <210> 144 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 144 Val Arg Asp Gly Asn Ser Met Asp Tyr 1 5 <210> 145 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 145 Tyr Thr Ser 1 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 146 Gln Gln Ala Asn Thr Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 147 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 147 Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Ala 1 5 <210> 148 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 148 Ile Asn Asn Gly Gly Ser Tyr Ser 1 5 <210> 149 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 149 Ala Arg His Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Phe 1 5 10 15 <210> 150 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 150 Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 151 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 151 Lys Val Ser 1 <210> 152 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody CDR <400> 152 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 153 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain <400> 153 atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggtgt acattcccag 60 gtgcagctgc agcagtctgg aggtgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaagactt ctggcttcac cttcagcagt agctatataa gttggttgaa gcaaaagcct 180 ggacagagtc ttgagtggat tgcatggatt tatgctggaa ctggtggtac tgaatataat 240 cagaagttca caggcaaggc ccaagtgact gtagacacat cctccagcac agcctacatg 300 caattcagca gcctgacaac tgaggactct gccatctatt actgtgcaag aggaggtagt 360 agcttcgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc agcgtcgacc 420 acgcccccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaacccg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404 <210> 154 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody heavy chain <400> 154 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Ser Tyr Ile Ser Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Ala Trp Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Glu Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Thr Gly Lys Ala Gln Val Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Ser Ser Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Pro Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465

Claims (54)

  1. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 MERS-CoV S 단백질에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법:
    (a) 개체에 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 투여하는 단계; 및
    (b) 개체에 MERS-CoV S1 단백질을 투여하는 단계;
    를 포함하며, 이로 인해 개체에서 MERS-CoV S 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는, 개체에 프라임-부스트(prime-boost) 백신 접종하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 여기서
    상기 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 투여하는 단계는 개체에서 핵산 분자의 2회 이상 투여를 포함; 및/또는
    상기 MERS-CoV S1 단백질을 투여하는 단계는 개체에서 MERS-CoV S1 단백질의 2회 이상 투여를 포함하는 것인, 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 프라임-부스트 백신 접종은 하기의 단계를 포함하며, 이로 인해 MERS-CoV S 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 것인, 방법:
    개체에 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 프라임(prime) 단계;
    개체에 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 투여하는 단계를 포함하는, 제1부스트(first boost) 단계;
    개체에 MERS-CoV S1 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 제2부스트(second boost) 단계.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어떤 항에 있어서, 상기 면역 반응은 MERS-CoV 바이러스를 중화시키고 및/또는 개체에서 MERS-CoV 매개의 감염 또는 질환을 감소시키는 것인, 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어떤 항에 있어서, 개체에서 면역 반응을 유도하는 것은 개체에서의 MERS-CoV 감염을 예방 또는 치료하는 것인, 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어떤 항에 있어서,
    상기 MERS-CoV S 단백질은 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 구성되는; 및/또는
    상기 MERS-CoV S1 단백질은 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 구성되는, 방법
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어떤 항에 있어서, 상기 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 인간 개체에서의 발현을 위해 코돈 최적화된(codon-optimized) 것인, 방법.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어떤 항에 있어서, 상기 MERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 13으로 기재된 핵산 염기서열을 포함하는 것인, 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어떤 항에 있어서, 개체에게 상기 ERS-CoV S 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 투여하는 단계는 개체에게 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  10. 제 9항에있어서, 상기 벡터는 pVRC8400 벡터인, 방법.
  11. 제 1항 내지 제 11항 중 어떤 항에 있어서, 상기 MERS-CoV S 단백질 또는 MERS-CoV S1 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 보조제를 포함하는 면역원성 조성물로 개체에게 투여되는 것인, 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 보조제가 명반(alum), TLR4 경쟁자(agonist) 또는 스쿠알렌 수중유 에멀젼(oil-in-water immersion)인, 방법.
  13. 단백질 나노입자 서브유닛에 연결된 MERS-CoV S 단백질의 RBD 도메인을 포함하는 폴리펩타이드.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 RBD 도메인은 서열번호 14의 잔기 367-601, 367-606 또는 381-588로 기재되는 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 구성되는, 폴리펩타이드.
  15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서, 상기 단백질 나노입자 서브유닛이 페리틴(ferritin) 서브유닛 또는 인캡슐린(encapsulin) 서브유닛인, 폴리펩티드.
  16. 제 13항에 있어서, 서열번호 22-23 또는 30-31 중 하나로 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 22-23 또는 30-31 중 하나로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 90% 상동한 아미노산 서열을 포함하거나 그 서열로 구성되는 것인, 폴리펩티드.
  17. 제 13항 내지 제16항 중 어떤 항의 폴리펩타이드를 포함하는, 단백질 나노입자.
  18. 제 13항 내지 제 16항 중 어떤 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
  19. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 MERS-CoV S 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 방법:
    치료학적 유효한 양의 제 17항의 단백질 나노입자를 개체에게 투여하여 면역 반응을 유도하는 단계.
  20. 제 1항 내지 제 12항 또는 제 19항 중 어떤 항에 있어서, 상기 개체는 인간(human), 낙타(camel) 또는 박쥐(bat)인, 방법.
  21. 하기 중 하나로 기재되는 VH 및 VL의 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2 및 HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2 및 LCDR3을 포함하며 MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는, 중쇄 가변영역(heavy chain variable region) 및 경쇄 가변영역(light chain variable region)을 포함하는 분리된 단클론 항체:
    (a) 각각이 서열번호 2 및 4 (JC57-13);
    (b) 각각이 서열번호 6 및 8 (JC57-11);
    (c) 각각이 서열번호 10 및 12 (JC57-14);
    (d) 각각이 서열번호 36 및 38 (C2);
    (e) 각각이 서열번호 40 및 42 (C5);
    (f) 각각이 서열번호 44 및 46 (A2);
    (g) 각각이 서열번호 48 및 50 (A10);
    (h) 각각이 서열번호 52 및 54 (FIB_B2);
    (ⅰ) 각각이 서열번호 56 및 58 (FIB_H1);
    (j) 각각이 서열번호 36 및 110 (C2 LCDR1 NG-NS);
    (k) 각각이 서열번호 36 및 111 (C2 LCDR1 NG-NA);
    (l) 각각이 서열번호 115 및 117 (G2);
    (m) 각각이 서열번호 119 및 121 (G4);
    (n) 각각이 서열번호 123 및 125 (D12); 또는
    (o) 각각이 서열번호 127 및 129 (F11).
  22. 제 21항에 있어서, 상기 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 하기와 같은 서열번호로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 단클론 항체:
    (a) 각각이 서열번호 59, 60, 61, 62, 63 및 64 (JC57-13);
    (b) 각각이 서열번호 65, 66, 67, 68, 69 및 70 (JC57-11);
    (c) 각각이 서열번호 71, 72, 73, 74, 75 및 76 (JC57-14);
    (d) 각각이 서열번호 77, 78, 79, 80, 81 및 82 (C2);
    (e) 각각이 서열번호 83, 84, 85, 86, 87 및 88 (C5);
    (f) 각각이 서열번호 89, 90, 91, 92, 93 및 94 (A2);
    (g) 각각이 서열번호 95, 78, 96, 86, 97 및 98 (A10);
    (h) 각각이 서열번호 59, 99, 100, 101, 102 및 103 (FIB_B2);
    (i) 각각이 서열번호 104, 105, 106, 107, 108 및 109 (FIB_H1);
    (j) 각각이 서열번호 77, 78, 79, 112, 81 및 82 (C2 LCDR1 NG-NS);
    (k) 각각이 서열번호 77, 78, 79, 113, 81 및 82 (C2 LCDR1 NG-NA);
    (l) 각각이 서열번호 130, 131, 132, 133, 134 및 135 (G2);
    (m) 각각이 서열번호 136, 137, 138, 139, 140 및 141 (G4)
    (n) 각각이 서열번호 142, 143, 144, 74, 145 및 146 (D12); 또는
    (o) 각각이 서열번호 147, 148, 149, 150, 151 및 152 (F11).
  23. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 상기 VH 및 VL이 하기와 같은 서열번호로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 단클론 항체:
    (a) 각각이 서열번호 2 및 4 (JC57-13);
    (b) 각각이 서열번호 6 및 8 (JC57-11);
    (c) 각각이 서열번호 10 및 12 (JC57-14);
    (d) 각각이 서열번호 36 및 38 (C2);
    (e) 각각이 서열번호 40 및 42 (C5);
    (f) 각각이 서열번호 44 및 46 (A2);
    (g) 각각이 서열번호 48 및 50 (A10);
    (h) 각각이 서열번호 52 및 54 (FIB_B2);
    (ⅰ) 각각이 서열번호 56 및 58 (FIB_H1);
    (j) 각각이 서열번호 36 및 110 (C2 LCDR1 NG-NS);
    (k) 각각이 서열번호 36 및 111 (C2 LCDR1 NG-NA);
    (l) 각각이 서열번호 115 및 117 (G2);
    (m) 각각이 서열번호 119 및 121 (G4);
    (n) 각각이 서열번호 123 및 125 (D12); 또는
    (o) 각각이 서열번호 127 및 129 (F11).
  24. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 인간 프레임워크 영역(human framework region)을 포함하는, 분리된 단클론 항체.
  25. 제 21항 내지 제 24항 중 어떤 항에 있어서, 상기 항체가 인간 불변 도메인(human constant domain)을 포함하는 인간화 항체(humanized antibody)인, 분리된 단클론 항체.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 항체의 중쇄가 서열번호 154로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 단클론 항체.
  27. 제 21항 내지 제 26항 중 어떤 항에 있어서, 상기 항체가 IgG인, 분리된 단클론 항체.
  28. 제 21항 내지 제 27항 중 어떤 항에 있어서, 항체의 반감기(half-life)를 증가시키는 변형(modification)을 포함하는 재조합 불변 도메인(recombinant constant domain)을 포함하고, 특히 여기서 상기 변형이 신생아 Fc 수용체(neonatal Fc receptor)에 대한 결합을 증가시키는, 분리된 단클론 항체.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 재조합 불변 도메인은 M428L 및 N434S 돌연변이를 포함하는 IgG1 불변 도메인인, 분리된 단클론 항체 또는 항원 결합 단편.
  30. 제 21항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 항원 결합 단편.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 항원 결합 단편이 Fv, Fab, F(ab')2, scFV 또는 scFV2 단편인, 항원 결합 단편.
  32. 제 21항 내지 제 31항 중 어떤 항에 있어서, 작동체 분자(effector molecule) 또는 검출 가능한 마커(detectable marker)에 접합된, 항체 또는 항원 결합 단편.
  33. 제 21항 내지 제 32항 중 어떤 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  34. 제 21항 내지 제 32항 중 어떤 항의 항체 또는 항원 결합 단편의 VH 및/또는 VL을 암호화하는, 분리된 핵산 분자.
  35. 제 33항 또는 제 34항에 있어서, 상기 핵산 분자가 재조합 핵산 분자인, 분리된 핵산 분자.
  36. 제 33항 내지 제 35항 중 어떤 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 cDNA 분자를 포함하는, 분리된 핵산 분자.
  37. 제 33항 내지 제 36항 중 어떤 항에 있어서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 분리된 핵산 분자.
  38. 제 33항 내지 제 37항 중 어떤 항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터(expression vector).
  39. 제 33항 내지 제 38항 중 어떤 항의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  40. 하기 단계를 포함하는, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제조하는 방법:
    숙주 세포에서 제 21항 내지 제 32항 중 어떤 항의 항체 또는 항원 결합 단편의 VH 및 VL을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 발현시켜 항체 또는 항원 결합 단편을 생성하는 단계.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산 분자가 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 VH 및 VL을 암호화하는 하나 이상의 cDNA 분자인, 방법.
  42. 제 40항 또는 제 41항에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유동물 세포인, 방법.
  43. 제 21항 내지 제 38항 중 어떤 항의 항체, 항원 결합 단편, 핵산 분자 또는 벡터의 유효량; 및
    약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, MERS-CoV 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 조성물이 무균인, 약학적 조성물.
  45. 제 43항 또는 제 44항에 있어서, 상기 조성물이 단위 투약 형태(unit dosage form) 또는 이의 복합(multiple)인 약학적 조성물.
  46. 제 43항 내지 제 45항 중 어떤 항에 있어서,
    각각의 서열번호 36 및 38(C2)로 기재되는 VH 및 VL의, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는, 제1 분리된 단클론 항체; 및
    각각의 서열번호 115 및 117(G2)로 기재되는 VH 및 VL의, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, MERS-CoV S 단백질에 특이적으로 결합하는, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는, 제2 분리된 단클론 항체를 포함하는, 약학적 조성물.
  47. 제 46항에 있어서,
    상기 제1 분리된 단클론 항체의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열번호 77, 78, 79, 80, 81 및 82로 기재되는 아미노산 서열을 포함; 및
    상기 제2 분리된 단클론 항체의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열번호 130, 131, 132, 133, 134 및 135로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  48. 제 46항 또는 제 47항에 있어서,
    상기 제1 분리된 단클론 항체의 VH 및 VL은 각각 서열번호 36 및 38(C2)로 기재되는 아미노산 서열을 포함; 및
    상기 제2 분리된 단클론 항체의 VH 및 VL은 각각 서열번호 115 및 117(G2)로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  49. 제 46항 내지 제 48항 중 어떤 항에 있어서,
    상기 제2 분리된 단클론 항체의 중쇄는 서열번호 154로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  50. 하기 단계를 포함하는, 생물학적 시료(biological sample)에서 MERS-CoV의 존재를 검출하는 방법:
    면역 복합체(immune complex)를 형성하기에 충분한 조건 하에서 생물학적 시료를 제 21항 내지 제 32항 중 어떤 항의 항체 또는 항원 결합 단편의 유효량과 접촉시키는 단계; 및
    생물학적 시료 상의 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계, 여기서 생물학적 시료 상 면역 복합체의 존재는 샘플에서의 MERS-CoV의 존재를 나타냄.
  51. 제 50항에 있어서, 생물학적 시료 상의 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계는 개체가 MERS-CoV 감염을 가짐을 나타내는 것인, 방법.
  52. 하기 단계를 포함하는, 개체에서 MERS-CoV 감염을 치료 또는 억제하는 방법:
    MERS-CoV 감염되었거나 감염의 위험이 있는 개체를 선별하는 단계; 및
    면역 복합체를 형성하기에 충분한 조건하에 제 21항 내지 제 38항 또는 제 43항 내지 제 49항 중 어떤 항의 치료학적으로 유효량의 항체, 항원 결합 단편, 핵산 분자, 벡터 또는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계, 여기서 면역 복합체는 개체에서 MERS-CoV 감염을 치료하거나 억제함.
  53. 하기를 포함하는, 시료에서 MERS-CoV를 검출하거나, 개체에서 MERS-CoV 감염을 검출하거나, 또는 개체에서 MERS-CoV 감염을 치료 또는 억제하기 위한 키트:
    항체, 항원 결합 단편, 핵산 분자, 벡터, 또는 제 21항 내지 제 38항 또는 제 43항 내지 49항 중 어떤 항의 약학적 조성물을 포함하는 용기, 및 상기 키트의 사용 설명서(instructions).
  54. 개체에서의 MERS-CoV 감염을 치료 또는 억제하기 위해, 또는 생물학적 시료에서 MERS-CoV의 존재를 검출하기 위해, 또는 개체에서의 MERS-CoV 감염을 검출하기 위한, 제 21항 내지 제 38항 또는 제 43항 내지 제 49항 중 어떤 항의 항체, 항원 결합 단편, 핵산 분자, 벡터 또는 약학적 조성물의 용도.
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