CN116171384A - 冠状病毒纳米抗体及其使用和鉴定方法 - Google Patents

冠状病毒纳米抗体及其使用和鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了冠状病毒中和抗体及其用于治疗和预防受试者中的冠状病毒感染的用途。

Description

冠状病毒纳米抗体及其使用和鉴定方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月19日提交的美国临时申请号63/067,567的权益，所述临时申请明确地以引用的方式整体并入本文。
背景技术
纳米抗体(Nb)是源自骆驼科动物仅重链抗体(HcAb)的VHH域的天然抗原结合片段。它们的特征在于小尺寸和出色的结构牢固性、优异的溶解度和稳定性、易于生物工程化和制造、在人体中低免疫原性以及快速组织渗透。由于这些原因，Nb已成为尖端生物医学、诊断和治疗应用的有前景的剂。
一种新型高度感染性冠状病毒SARS-COV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2){Zhu,2020；Zhou,2020}已经感染了超过2000万人并且夺走了超过700,000人的生命，而且数字还在上升。尽管采取了有助于遏制病毒传播的诸如隔离和封锁的预防措施，但病毒往往会在社会限制解除后反弹。仍然迫切需要安全且有效的治疗剂和疫苗。
与其他人畜共患冠状病毒一样，SARS-COV-2产生表面刺突糖蛋白(S)，其然后被切割成S1和S2亚基，从而形成同源三聚体病毒刺突以与宿主细胞相互作用。所述相互作用由S1受体结合结构域(RBD)介导，其结合血管紧张素转化酶-2(hACE2)的肽酶结构域(PD)作为宿主受体{Wrapp,2020}。结构研究揭示了刺突三聚体的不同阶段{Walls,2020；Cai,2020}。在融合前阶段，RBD在非活性、封闭构象和与hACE2相互作用所必需的活性开放结构之间切换。在融合后阶段，S1从三聚体解离，并且S2经历显著构象变化以触发宿主膜融合。最近，对COVID-19恢复期个体血清的研究导致鉴定出主要靶向RBD以及刺突三聚体的N末端结构域(NTD)的高效中和IgG抗体(NAb){Cao,2020；Robbiani,2020；Hansen,2020；Liu,2020；Brouwer,2020；Chi,2020}。高质量NAb可克服Fc相关抗体依赖性增强(ADE)的风险，并且是有前景的治疗和预防候选物{Zohar,2020；Eroshenko,2020}。
VHH抗体或纳米抗体(Nb)是源自骆驼科动物单链抗体的最小单体抗原结合片段{Muyldermans,2013}。与IgG抗体不同，Nb的特征在于小尺寸(约15kDa)、高溶解度和稳定性、易于生物工程化为二价/多价形式和低成本微生物生产。由于稳健的物理化学性质，Nb可灵活用于药物施用如雾化，使其针对呼吸道、病毒靶标的用途具有吸引力{Vanlandschoot,2011；Detalle,2016}。以前的努力已经产生了针对不同激发病毒(包括登革热、RSV和HIV)的广泛中和Nb{Vanlandschoot,2011}。然而，与人NAb相当的高效骆驼科动物Nb仍然不可用{Huo,2020；Wrapp,2020；Konwarh,2020}。高效抗SARS-COV-2Nb的开发可为用于治疗学和即时诊断的高效且经济的策略提供新颖手段。
发明内容
本文提供了冠状病毒(例如，SARS-CoV-2或SARS-CoV)中和纳米抗体及其用于预防或治疗冠状病毒感染的用途。本文公开的纳米抗体在降低冠状病毒载量以及预防和治疗冠状病毒感染方面出人意料地有效。在一些实施方案中，所述冠状病毒中和纳米抗体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:185和SEQ IDNO:186。在一些实施方案中，所述纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:82至SEQ ID NO:152、SEQID NO:185和SEQ ID NO:186。在一些实施方案中，所述纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体(包括例如同二聚体、异二聚体、同三聚体或异三聚体)，所述一个或多个氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:71。在一些实施方案中，所述纳米抗体包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81或SEQID NO:186的序列。在一些实施方案中，所述冠状病毒中和纳米抗体与人血清白蛋白结合纳米抗体或纳米抗体片段缀合或连接。在一些实例中，本文所述的纳米抗体表现出高效力，IC50小于约1ng/1ml。
本文提供的方法包括本文所述的纳米抗体用于治疗或预防冠状病毒感染(例如，SARS-CoV-2或SARS-CoV)的用途。在一些实例中，所述方法包括以约0.2mg/kg体重的剂量施用所述纳米抗体。可气管内、鼻内或通过吸入途径将纳米抗体施用于受试者。与对照相比，所述纳米抗体具有增加的血清半衰期或体内稳定性。
附图说明
图1(A-F)示出用于SARS-CoV-2中和的高亲和力RBD Nb的生产和表征。图1a示出通过ELISA，71种Nb对RBD的结合亲和力。饼图示出根据亲和力和溶解度的Nb的数量。图1B示出通过SARS-CoV-2-GFP假病毒中和测定筛选49种可溶性、高亲和力Nb。对于中和效力IC50<＝50nM的Nb，n＝1；对于中和效力IC50>50nM的Nb，n＝2。图1C示出基于假型化SARS-CoV-2中和测定(荧光素酶)计算18种高效Nb的中和效力。紫色、红色和黄色线表示IC50<0.2nM的Nb20、21和89。使用假病毒的两种不同纯化。显示每个数据点的平均中和百分比(对于Nb 20、21，n＝5；对于所有其他Nb，n＝2)。图1D示出通过SARS-CoV-2噬斑减少中和试验(PRNT)，排名前14的中和Nb的中和效力。显示每个数据点的平均中和百分比(对于Nb 20、21和89，n＝4；对于其他Nb，n＝2)。图1E示出18种Nb的假型化和SARS-CoV-2中和效力的表格总结。N/A：未测试。图1F示出Nb21的SPR结合动力学测量。
图2(A-G)示出通过整合结构蛋白质组学进行的Nb表位作图。图2A示出基于尺寸排阻色谱(SEC)分析的Nb表位的总结。浅鲑鱼色：结合相同RBD表位的Nb。海绿色：不同表位的Nb。图2B示出RBD、RBD-Nb21复合物和RBD-Nb21-Nb105复合物的SEC谱分析的图示。y轴表示UV 280nm吸光度单位(mAu)。图2C示出草图模型，其显示结合不同表位的五种Nb的定位：与RBD(灰色)复合的Nb20(中紫色)、Nb34(浅海绿色)、Nb93(鲑鱼色)、Nb105(淡菊黄色)和Nb95(浅粉色)。蓝线和红线分别表示短于或长于
Figure BDA0004126816630000041
的DSS交联。图2D示出在RBD表面顶部每种Nb(草图)的评分前10的基于交联的模型。图2E示出与hACE2复合的RBD上的不同Nb中和表位的表面展示(蓝色的草图模型)。图2e：Nb结合的五个独特RBD表位的示意图。示出了RBD的残基编号(从aa 333至aa 533)。图2F示出Nb结合的五个独特RBD表位的示意图。示出了RBD的残基编号(从aa 333至aa 533)。图2G示出通过交联揭示的Nb中和表位的概述。
图3(A-F)示出与RBD复合的超高亲和力Nb的晶体结构分析。图3A示出与RBD复合的Nb20的草图演示。CDR1、2和3分别呈红色、绿色和橙色。图3B示出以Nb20的R35为中心的广泛极性相互作用网络的放大视图。图3C示出疏水相互作用的放大视图。图3D示出Nb20-RBD和hACE2-RBD复合物(PDB:6M0J)的表面展示。图3E示出RBD的表面展示，其中hACE2结合表位呈钢蓝色，并且Nb20表位呈中紫色。图3F示出Nb20的CDR1和CDR3残基(分别球体中的中紫粉色和浅菊黄色)与RBD(灰色)上的hACE2结合位点(浅蓝色)重叠。
图4(A-F)示出Nb中和SARS-CoV-2的机制。图4A示出hACE2(灰色)与一个RBD向上(PDB 6VSB、6LZG)的刺突三聚体构象(小麦色、李子色和浅蓝色)结合。图4B示出Nb20(表位I，中紫色)与hACE2结合位点部分重叠，并且可结合所有RBD向下的闭合刺突构象(PDB6VXX)。图4C示出可接近(+)不同表位的Nb的刺突构象的总结。图4D示出Nb93(表位II，鲑鱼色)与hACE2结合位点部分重叠，并且可结合至至少一个RBD向上(PDB 6VSB)的刺突构象。图4(E-F)示出Nb34(表位III，浅海蓝色)和Nb95(表位IV，浅粉色)不与hACE2结合位点重叠，并且结合至具有至少两个开放RBD(PDB 6XCN)的刺突构象。
图5(A-E)示出用于高效SARS-CoV-2中和的多价Nb混合物的开发。图5A示出混合物设计的示意图。图5B示出多价Nb的假型化SARS-CoV-2中和测定。显示每个数据点的平均中和百分比(n＝2)。图5C示出Nb 20和21的单体和三聚体形式的SARS-CoV-2PRNT。显示每个数据点的平均中和百分比(对于三聚体，n＝2；对于单体，n＝4)。图5D示出多价Nb的中和效力测量值的汇总表。N/A：未测试。图5E示出对突变进行作图以定位RBD上的Nb表位。x轴对应于RBD残基编号(333至533)。呈不同颜色的行代表不同的表位残基。表位I：351、449-450、452-453、455-456、470、472、483-486、488-496；表位II：403、405-406、408、409、413-417、419-421、424、427、455-461、473-478、487、489、505；表位III：53、355、379-383、392-393、396、412-413、424-431、460-466、514-520；表位IV：333-349、351-359、361、394、396-399、464-466、468、510-511、516；表位V：353、355-383、387、392-394、396、420、426-431、457、459-468、514、520。
图6(A-C)示出用于有效SARS-COV-2中和的RBD特异性Nb的开发。图6A示出SARS-CoV-2RBD免疫后强且特异性血清学活性的检测。图6B示出经免疫骆驼科动物血清针对假型化SARS-CoV-2-荧光素酶的中和效力。图6C示出Nb针对假型化SARS-CoV-2-荧光素酶的中和效力。
图7(A-C)示出通过蛋白质组学鉴定大的高亲和力Nb组库。图7A示出通过骆驼科动物免疫和定量Nb蛋白质组学进行高亲和力RBD-Nb鉴定的示意图。简言之，将骆驼科动物通过RBD免疫。从经免疫血清中亲和分离高亲和力RBD特异性单链VHH抗体，并通过定量蛋白质组学进行分析以鉴定高亲和力RBD特异性Nb(参见方法)。创建了来自经免疫骆驼科动物的血浆B细胞的VHH(Nb)cDNA文库，以促进蛋白质组学分析。图7B示出120种高亲和力RBD Nb的序列标识和序列标识。显示每个位置处的氨基酸存在。CDR：互补决定区。FR：框架。图7C示出通过最大似然模型构建的Nb的系统发生树。
图8示出18种高效SARS-CoV-2中和Nb的相关性分析。显示假型化病毒中和测定与SARS-CoV-2PRNT之间的Nb中和IC50的线性相关性的图。
图9(A-D)示出出色的中和Nb的生物物理分析。图9(A-B)示出通过表面等离子体共振(SPR)，Nb 20和89的结合动力学。图9C示出Nb 20、21和89的热稳定性分析。这些值表示基于三次重复实验的平均热稳定性(Tm，℃)。对于Nb 20、21和89，测量值的标准偏差(SD)分别为是0.17℃、0.93℃和0.8℃。图9D示出通过SEC对Nb21的稳定性分析。将纯化的重组Nb21在进行SEC分析之前在室温下储存约6周。主峰代表Nb 21单体。
图10示出RBD-Nb复合物的SEC分析。
图11(A-I)示出RBD-Nb复合物的SEC分析。RBD-Nb复合物的SEC图谱显示与Nb21具有重叠表位的9种Nb。图11(A-H)示出RBD-Nb复合物的SEC图谱显示与Nb21具有独特且不重叠表位的五种Nb。图11I示出18种高效中和Nb的CDR3的序列比对和比较来自表位I和其他表位的Nb的CDR3长度。
图12(A-C)示出针对RBD结合的hACE2和Nb的竞争性ELISA分析以及RBD跨不同冠状病毒的保守分析。图12A示出针对RBD结合的hACE2和Nb(20、21、93和95)的竞争性ELISA。Y轴：归一化ACE2信号的百分比。X轴：Nb浓度(nM)。图12B示出与hACE2复合的RBD上的不同Nb中和表位的表面展示(蓝色的草图模型)。图12C示出使用ConSurf网络服务器对刺突蛋白RBD的保守分析，如图12B中所定向。保守是基于通过ConSurf服务器自动提取的150个序列。
图13示出Nb20与已公布的RBD Nb结构的结构比较。Nb20(紫色条带)和与RBD复合的三种其他RBD-Nb(PDB 6YZ5、7C8V和7C8W)(黄色/灰色条带)的重叠。
图14(A-D)示出基于Nb20-RBD晶体结构的Nb21-RBD相互作用的结构模拟。在图14A中，Nb21与Nb20的比对。显示两种Nb之间的四个残基差异。图14B示出放大视图，显示在N52(Nb21)与N450(RBD)之间添加了新的极性相互作用。Nb21的模型是基于Nb20的晶体结构叠加的。图14C示出RBD的表面展示。hACE2结合表位呈钢蓝色，并且Nb20表位中紫色。图14D示出Nb20-RBD复合物与hACE2-RBD复合物的结构比对。Nb20的CDR1和CDR3残基(分别球体中的中紫粉色和浅菊黄色)与RBD(灰色条带)上的hACE2结合位点(钢蓝色)重叠。
图15(A-D)示出多价Nb的生物物理性质。图15A示出来自大肠杆菌全细胞裂解物的多价Nb的表达水平。图15B示出纯化的多价Nb的SDS-PAGE分析。图15C示出ANTE-CoV2-Nab21TEK、ANTE-CoV2-Nab20TEK、ANTE-CoV2-Nab21TGS和ANTE-CoV2-Nab20TGS的热稳定性分析。这些值表示基于三次重复实验的平均热稳定性(Tm，℃)。测量值的标准偏差分别为0.6℃、0.27℃、0.169℃和0.72℃。图15D示出多价Nb在假病毒中和条件下的高稳定性。将不同Nb构建体在没有病毒的假病毒中和测定条件下孵育72小时。使用抗His6小鼠单克隆抗体(Genscript)来通过免疫印迹检测Nb构建体(C端的Hi s6标签)。
图16(A-G)示出多价Nb的稳定性测试。图16A示出具有EK接头的Nb 20和21的同三聚体形式的SARS-CoV-2PRNT。显示每个数据点的平均中和百分比和标准偏差(n＝2)。图16(B-C)示出在冻干或雾化之前和之后，ANTE-CoV2-Nab20TGS和ANTE-CoV2-Nab21TEK的SEC分析。图16(D-E)示出在冻干或雾化之前和之后，使用ANTE-CoV2-Nab20TGS和ANTE-CoV2-Nab21TEK的假型化SARS-CoV-2中和测定(n＝2)。图16F示出同三聚体Nb的中和效力测量值的汇总表。图16G示出研究中使用的便携式网孔式雾化器(产生≤5μm气溶胶颗粒)。
图17示出绘制在RBD晶体结构上的中和表位和病毒突变。虚线(上图)表示与表位III和IV部分重叠的表位V。突变(下图)以渐变蓝色着色(来自GISAID的0-100突变计数)，其中较深的蓝色表示更频繁的突变。
图18(A-D)示出在1.0σ下设定轮廓的RBD-Nb20复合物的代表性区域的复合2Fc-Fo电子密度图谱。图18A示出显示为紫色网孔的整个复合物的图谱。图18B示出作为紫色网孔的Nb20的三个CDR的图谱。图18C示出显示为紫色网孔的RBD的延伸的外部环区域的图谱。图18D示出显示为红色网孔的参与RBD与Nb20之间的相互作用的残基的图谱。RBD呈灰色，并且Nb20呈蓝色。
图19(A-C)示出18种高效SARS-CoV-2中和Nb的相关性分析。图19A描绘显示两种不同SARS-COV-2病毒测定(假型病毒对真实病毒)之间的Nb中和效力(IC50)的线性相关性的图。图19B示出显示SHM与Nb假病毒中和效力之间的相关性的热图，皮尔逊r＝-0.408。图19C示出显示ELISA亲和力与Nb假病毒中和效力之间的相关性的热图，皮尔逊r＝-0.639。
图20(A-B)示出基于Nb 20-RBD晶体结构的Nb 21的结构建模。图20A示出与RbD复合的Nb 21的结构模型。图20B示出放大视图，显示在N52(Nb21)与N450(RBD)之间添加了新的极性相互作用。Nb21的模型是基于Nb20的晶体结构叠加的。
图21(A-B)示出Nb 20与已公布的RBD Nb结构的结构比较。图21A示出显示嵌在Nb20-RBD的相互作用中的二甲胂酸盐离子的放大视图。图21B示出Nb 20和其他RBD-Nb的结构叠加。
图22描绘执行在本公开的某些实施方案中描述的方法和程序的计算系统的实例。
图23(A-E)示出PiN-21保护叙利亚仓鼠免受SARS-CoV-2感染。图23A示出实验设计的概述。气管内接种9x 104p.f.u的SARS-CoV-2，然后鼻内递送100μg PiN-21(以蓝点显示)或对照Nb(以灰色圆圈显示)。每天监测动物体重变化。在感染后第2天和第4天收集鼻洗液和咽拭子。在感染后第5天(n＝3)和第10天(n＝3)对动物实施安乐死以进行尸检，测量肺组织的病毒滴度和gRNA。图23B示出对用PiN-21治疗的受感染仓鼠的体重减轻的保护作用。***表示p值<0.001。图23(C-E)示出通过噬斑测定测量病毒滴度。**表示p值<0.01。虚线表示测定的检测限。所有图的配色方案是一致的。
图24(A-D)示出对仓鼠呼吸系统中的Nb递送的评估。图24A示出仓鼠模型中PiN-21(以红色三角形显示)和PiN-21Alb(以蓝色正方形显示)雾化的示意性设计。图24B示出通过PRNT50测定测量的雾化之前和之后的Nb中和效力。图24(C-D)示出通过雾化后不同时间点的PiN-21和PiN-21Alb的噬斑测定，归一化的总体中和活性。
图25(A-F)示出雾化PiN-21在SARS-CoV-2的仓鼠模型中的治疗功效。图25A示出实验设计的概述。鼻内接种3x 104p.f.u.的SARS-CoV-2。在感染后6小时将PiN-21(以红色三角形显示)或对照Nb(以灰色圆圈显示)雾化至笼子中的仓鼠。监测动物体重变化，每天取得鼻洗液和咽拭子。在感染后第3天对动物实施安乐死以进行尸检，测量肺组织的病毒滴度和gRNA。图25B示出与对照相比，PiN-21气溶胶治疗的动物的体重变化百分比(n＝6)。图25C示出仓鼠肺中病毒滴度的降低(感染后第3天)。在治疗组与对照组之间观察到显著性差异。**，P<0.01；*，P<0.05。虚线表示测定的检测限。图25D示出治疗组和对照组的肺病理学得分。显著性差异由****，P<0.0001表示。图25E示出对照组中附属于细支气管上皮中的丰富SARS-CoV-2S抗原以及肺泡1型和2型肺细胞的坏死性支气管间质性肺炎的H&E染色。所有图像以20x、比例尺＝100μm获取。由方框标记的区域在最右侧的图中以更高的放大率显示(比例尺＝25μm)。图25F示出支气管间质隔室的免疫染色(感染后第3天)。橙色，SARS-CoV-2S；品红色，CD68/巨噬细胞；红色，CD3e+T细胞；蓝绿色，ACE2；灰色，DAPI。细支气管由白色散列勾勒出轮廓。总放大率200x，比例尺＝100μm。
图26(A-D)示出PiN-21用于保护仓鼠中的SARS-CoV-2感染的功效。图26(A-B)示出在感染后第5天和第10天，通过RT-qPCR测量gRNA(在每个组中n＝3)。图26(C-D)示出在感染后第2天和第4天，通过RT-qPCR测量gRNA。*表示p值<0.05。****表示p值<0.0001。虚线表示测定的检测限。
图27(A-E)示出PiN-21用于治疗仓鼠中的SARS-CoV-2感染的功效。图27A示出在仓鼠中鼻内递送PiN-21进行治疗的示意性设计。鼻内接种3x 104p.f.u.的SARS-CoV-2。感染后第6小时鼻内递送100μg的PiN-21(以黑点显示)或对照Nb(以灰色圆圈显示)。每天监测动物体重变化，并在感染后第6天对动物实施安乐死以进行尸检，测量肺组织的病毒滴度。图27B示出对PiN-21治疗组中体重减轻的保护作用。显著性差异表示为**，P<0.01；***，P<0.001。图27(C-D)示出在感染后第2天和第4天，通过噬斑测定测量鼻洗液和咽拭子中的病毒滴度(n＝6)。图27E示出在感染后第6天，通过噬斑测定测量肺组织中的病毒滴度(n＝6)。
图28(A-B)示出通过便携式网孔式雾化器雾化后Nb构建体的表征。图28A示出雾化后的蛋白质回收率。图28B示出通过假病毒中和测定测量的雾化之前和之后的Nb中和效力。
图29(A-C)示出雾化PiN-21在SARS-CoV-2感染的叙利亚仓鼠模型中的治疗功效。图29(A-B)示出使用噬斑测定，鼻洗液和咽拭子中的病毒滴度的测量。使用*，P<0.05；****，P<0.0001表示显著性差异。图29C示出在感染后第3天，通过RT-qPCR测量肺组织中的gRNA(n＝6)。
图30(A-H)示出在感染SARS-CoV-2的叙利亚仓鼠中PiN-21的雾化治疗预防LRT中的严重组织病理学表现。苏木精和曙红染色。总放大率200x，比例尺＝100μm(A和E)，或在图30(B、C、D、F、G、H)中400x，比例尺＝50μm。图30A示出气管增生和肥大。图30B示出细支气管增生、变性和合胞体细胞坏死(箭头)。图30C示出血管周围水肿和反应性内皮的炎症浸润(箭头)。图30D示出严重间质性肺炎伴肺泡内纤维蛋白和出血。图30E示出组织学上正常的气管。图30F示出轻度细支气管变性伴管腔内上皮剥脱。图30G示出轻度血管周围单个核细胞浸润。图30H示出轻度局灶性间质性肺炎。
图31(A-B)示出感染后第3天(图31A)和感染后第5天(图31B)仓鼠模型中体重减轻与病毒滴度的相关性分析。
图32(A-B)示出RBD流行变体对Nb结合和中和的影响。图32A示出刺突变体的ELISA结合(总结热图)。数据显示为相对于RBD WT，结合亲和力倍数变化。图32B示出相对于野生型SARS-CoV-2假病毒颗粒，Nb针对两种主要流行变体(UK和SA毒株)的中和效力的倍数变化。负值表示亲和力或中和效力的损失，并且正值表示亲和力或中和效力的增加。基于所测试的最高Nb浓度，大于1000倍的亲和力或中和效力降低表示为“<-1000”。
图33(A-D)示出超强效I类Nb(21)的结构。图33A示出Nb21:S复合物的冷冻电镜(Cryo-EM)结构揭示“1-向上和2-向下”RBD构象。图33B示出Nb21的三个CDR参与RBD结合。图33C示出额外Nb21:RBD相互作用：R97、N52和N55(Nb21)的侧链分别与L492和Y449的主链羰基以及T470(RBD)的侧链形成氢键。A29(Nb21)的主链羰基也与Q493(RBD)形成氢键。除了这些极性相互作用外，Nb21的F45和L59以及RBD的V483形成一组疏水相互作用，共同为RBD结合提供超高亲和力和选择性。图33D示出hACE2与Nb21:RBD复合物的结构重叠。
图34(A-F)示出II类Nb(95、34和105)的结构。图34A示出与S复合的Nb 95和34的冷冻电镜结构。图34B示出Nb105:Nb21:RBD复合物的冷冻电镜结构。图34C示出Nb95:RBD相互作用。呈粉色的残基表示用于RBD结合的Nb95。图34D示出Nb105:RBD相互作用。呈黄色的残基表示用于RBD结合的Nb105。图34E示出II类Nb:RBD相互作用主要由CDR3介导。Nb被表示为条带。CDR3环显示为表面图示。图34F示出II类Nb对hACE2:RBD相互作用的空间位阻效应。N322糖基化(ACE2)以红色密度呈现。
图35(A-H)示出III类Nb(17和36)的结构。图35A示出与S复合的Nb17的冷冻电镜结构。图35B示出Nb17:RBD相互作用由所有三个CDR介导。图35C示出Nb17:Nb105:RBD复合物的冷冻电镜结构。图35D示出Nb17在结构上不与ACE2重叠。图35E示出Nb36:Nb21:RBD复合物的冷冻电镜结构。图35F示出RBD表面上Nb36的表位。图35G示出通过其框架在NTD上的Nb17堆叠，同时分离的Nb36:RBD复合物表明Nb36将与S上的邻近NTD发生冲突。图35H示出与S的ACE2竞争测定。
图36(A-E)示出III类Nb结合Nb所特有的新型和半保守的中和表位。图36A示出RBDNb的表位簇集分析以及与RBD序列保守性和ACE2结合位点的相关性。SARS-CoV-2刺突RBD氨基酸的保守得分由ConSurf服务器使用经验贝叶斯方法从多序列比对计算得出，并通过z评分方法归一化。图36B示出与RBD结合的三种Nb类别的概述，RBD表面基于保守性(ConSurf得分)着色。图36(C-E)示出不同类别的Nb与用于RBD结合的最接近mAb的结构比较。
图37(A-F)示出与RBD结合的mAb和Nb受流行变体中的突变不同地影响。图37A示出主要流行变体发生突变的六个RBD残基的定位。图37B示出不同RBD残基对Nb的包埋表面积。图37C示出不同RBD残基对Fab的包埋表面积。图37(D-E)示出不同类别的Nb的代表性结构，其中主要变体残基显示为球体。在侧面显示与I类Nb类似结合的两种Fab结构。图37F示出显示表位残基与变体突变一致的概率的箱线图。
图38(A-G)示出RBD中和Nb与mAb的比较。图38A示出RBD:Nb和RBD:Fab复合物的包埋表面积。VH：重链。VL：轻链。图38B示出Nb和Fab的每界面残基的包埋表面积。图38C示出Nb和Fab的CDR和FR在RBD结合中的接触贡献(使用
Figure BDA0004126816630000131
截断值)。接触贡献％被计算为CDR或FR区上的接触残基数/接触残基总数。图38D示出界面腔的定量。Y轴是曲率值。图38E示出CDR和FR对体内成熟Nb与体外选择的Nb之间RBD结合的贡献的比较。图38F示出7d的代表性结构，显示Nb和Fab的不同结合模式(表位曲率)。Nb靶向凹RBD表面以实现高亲和力结合。图38G示出7e的代表性结构，显示来自体外选择的Nb(PDB#7A29)的FR2直接参与RBD相互作用。
图39(A-G)示出对于RBD突变体结合，Nb的ELISA曲线。
图40(A-B)示出SARS-CoV-2刺突三聚体糖蛋白的结构图示和两种盛行流行毒株的突变。图40A示出以红色突出显示的VOC B.1.1.7和501Y.V2的所有突变。B.1.1.7UK的突变包括del69-70、delY144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。SA501Y.V2的突变包括L18F、D80A、del241-243、D215G、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V。图40B示出以红色突出显示的ACE2亲和力成熟的RBD B62的所有突变。突变包括I358F、V445K、N460K、I468T、T470M、S477N、E484K、Q498R和N501Y。
图41(A-G)示出单独Nb的假病毒测定结果。
图42(A-F)示出具有Nb21的S的冷冻电镜结构测定、具有Nb21的RBD的局部细化以及Nb21与Nb20的比较。图42A示出冷冻电镜数据处理工作流程，显示用于生成本工作中讨论的图谱的策略和颗粒群组大小。基于具有Nb21的S的2D类平均值拾取约900K颗粒用于3D分类。进一步细化了具有最大比例的两个主要类别。细化为
Figure BDA0004126816630000142
的一种类别对应于具有1-向上-2-向下RBD的S，并且细化至
Figure BDA0004126816630000143
的另一类别对应于具有2-向上-1-向下RBD的S。S呈深灰色。Nb21蓝色。图42B示出S和NB21复合物的傅里叶壳相关性和局部分辨率估计。红线代表FSC＝0.143。图42C示出具有Nb21的一个向下RBD的聚焦细化。图42(D-F)示出具有Nb21和具有Nb20的RBD的结构比较。Nb21呈蓝色，而Nb20呈黄色。RBD在具有Nb21和Nb20的结构中分别呈深灰色和青色。Nb21与Nb20的不同之处在于四个残基(都在CDR上)。它的RBD结合与Nb20非常相似。两种结构可良好地比对，均方根偏差(RMSD)为
Figure BDA0004126816630000141
(所有原子)。在此，Nb20中的CDR2上的S52和M55被Nb21中的N52和N55取代，它们与RBD(e)形成额外极性相互作用。Nb20的A27(CDR1)和I105(CDR3)被Nb21(f)中的L27和T105替代。虽然所述两个残基不直接结合RBD，但L27的侧链包埋在Nb21内部，以与V24、V32和I77形成额外疏水相互作用。T105的小短侧链允许相邻残基Y106指向第一N-末端残基Q1以形成氢键。这种相互作用在Nb20:RBD的结构中缺失，因为其受I105的大侧链在Nb20 I105的类似位置中的存在阻碍。这些额外相互作用可有助于稳定CDR1和CDR3环以加强Nb21:RBD相互作用。
图43(A-B)示出使用计算结合能计算和实验诱变对RBD:Nb21相互作用的评估。图43A示出对于大于-1kcal/mol的这些，来自RBD(上，灰色)和Nb21(下，蓝色)的单独残基的相对结合自由能贡献的分解。图43B描绘ELISA测定，其显示Nb21点突变体R31D无法结合RBD。
图44(A-C)示出具有Nb95的S的冷冻电镜结构确定和聚焦细化。图44A示出基于具有Nb95的S的2D类平均值拾取约880K颗粒用于3D分类。进一步细化了具有最大比例的两个主要类别。细化为
Figure BDA0004126816630000153
Figure BDA0004126816630000154
的一种类别对应于具有2-向上-1-向下RBD的S，并且细化至
Figure BDA0004126816630000151
的另一类别对应于具有3-向上RBD的S。S呈深灰色。Nb95呈蓝绿色。这两种复合物的FSC估计值显示在左下角。红线代表FSC＝0.143。图44B示出两种S和Nb95复合物的局部分辨率分布。图44C示出具有NB95的一个向下RBD的聚焦细化。与向上RBD相比，向下RBD显示出更好的密度。
图45(A-C)示出具有Nb34的S的冷冻电镜结构确定和聚焦细化。图45A示出基于具有Nb34的S的2D类平均值拾取约756K颗粒用于3D分类。观察到两个主要类别，具有3-向上RBD和2-向上-1-向下RBD的明显特征。我们集中于2-向上-1-向下类别用于3D细化，并获得了全局分辨率为
Figure BDA0004126816630000152
的结构，对应于左下图所示的0.143FSC。图45B示出S和Nb34复合物的局部分辨率分布。图45C示出具有NB34的一个向下RBD的聚焦细化。与向上RBD相比，向下RBD显示出更好的密度。
图46(A-F)示出Nb105:S和Nb105:RBD:Nb21复合物的冷冻电镜分析。图46A示出Nb105:S复合物的代表性显微照片和2D类平均值。图46B示出黄金标准傅立叶壳相关性(FSC)和欧拉角分布。图46C示出Nb105:RBD:Nb21复合物的代表性显微照片和2D类平均值。图46D示出黄金标准傅立叶壳相关性(FSC)和欧拉角分布。图46E示出Nb105:RBD:Nb21复合物的局部分辨率估计。图46F示出Nb105:RBD复合物刚性对接至二聚体S的界面。用绿色线突出显示的界面位于Nb框架与RBS之间。
图47(A-H)示出Nb17:S和Nb17:RBD:Nb105复合物的冷冻电镜分析。图47A示出Nb17:S复合物的代表性显微照片和2D类平均值。图47B示出黄金标准傅立叶壳相关性(FSC)和欧拉角分布。图47C示出Nb17:S复合物的局部分辨率估计。图47D示出Nb17:S复合物中的柔性区域的聚焦分类。1类(青色)中Nb17的密度由于沿y方向的运动而变得模糊，2类(品红色)具有良好分辨的RBD、Nb17和NTD密度，并且RBD和Nb17的密度均由于沿x方向的运动而损失。图47E示出Nb17:RBD:Nb105样品的代表性显微照片和2D类平均值。图47F示出Nb105:RBD:Nb21样品的局部分辨率估计。图47G示出Nb17:RBD复合物的界面残基。图47H示出Nb17:RBD与Nb21:RBD的比对，其显示Nb17 CDR3与Nb21 CDR2和部分Nb21 CDR1之间的大量重叠。
图48(A-C)示出局部细化后RBD与Nb之间的界面区域的结构模型与冷冻电镜密度。图48A示出Nb21:RBD相互作用的密度图谱。图48B示出Nb95:RBD相互作用的密度图谱。图48C示出Nb105:RBD相互作用的密度图谱。
图49(A-E)示出带有S和RBD的Nb36的EM分析。图49A示出在递增脓毒的Nb36存在下刺突蛋白的代表性负染色EM显微照片。完整三聚体刺突颗粒的实例用蓝色箭头突出显示，并且被破坏的刺突颗粒的实例用红色箭头突出显示。图49B示出在递增浓度的Nb36存在下S蛋白的热解链曲线。图49C示出Nb36:RBD:Nb21复合物的代表性显微照片和2D类平均值。图49D示出黄金标准傅立叶壳相关性(FSC)和欧拉角分布。图49E示出Nb36:RBD:Nb21复合物的局部分辨率估计。
图50(A-D).图50A通过免疫印迹示出Nb17促进SARS-CoV-2S转变为融合后状态。稳定SARS-CoV-2S三聚体(hexapro)直接用蛋白酶K消化，或在室温下与hACE2或Nb一起孵育15分钟或60分钟后用蛋白酶K消化。抗S2 SARS-CoV-2多克隆抗体用于免疫印迹分析。图50B示出L452(RBD)与S30、V96、Q98(Nb17)之间形成的疏水相互作用。图50C示出S、添加Nb36后即刻的S、在室温下孵育2小时的具有Nb36的S以及在PBS缓冲液中0.6mg/mL浓度的S和6:1摩尔比的Nb下的具有Nb21的S的根据强度的流体动力学半径分布。图50D示出S(黑色)、具有Nb21的S(绿色)和具有Nb36的S(红色)的尺寸排阻色谱图谱，使用Shimadzu HPLC上的superdex200GL10/300柱，PBS缓冲液中0.25mL/min流速。蛋白质标准图谱显示为灰色重叠仅刺突图谱。
图51(A-D)示出针对RBDSARS-CoV的7种Nb的结合的分析。图51A示出来自沙贝病毒(Sarbecovirus)家族的RBD序列比对。突出显示了三类Nb的主要表位，并显示了不同RBD上的表位同一性。图51B示出对于不同类别的Nb，12种代表性沙贝病毒的RBD序列同一性的分析。图51C示出SARS-CoV-2和SARS-CoV的序列比对，其中非保守的SARS-CoV氨基酸残基以红色字母突出显示。SARS-CoV-2RBD上的单个Nb表位足迹沿一级序列以颜色编码的点表示。图51D示出通过ELISA测量的不同Nb对SARS-CoV和SARS-CoV-2的结合亲和力(IC50)。以nM单位报告IC50值。ND：未检测到信号。
图52(A-C)示出针对RBD结合的中和Nb和mAb的比较。图52A示出热图，其显示Nb和Fab之间在互补位残基效用方面的结合差异，尽管表位区域总体相似。图52B示出热图，其显示Nb与Fab之间表位-互补位残基偏好的差异。分别对RBS结合剂和非RBS结合剂进行比较。与ACE2结合位点具有至少30％重叠残基的Nb被认为是RBS结合剂。图52C示出在来自Nb CDR的精氨酸与RBD残基之间形成的主导静电相互作用的图示。RBD呈深灰色，Nb呈卡其色，E484(RBD)呈红色，F490(RBD)呈蓝绿色，并且R(Nb CDR)呈蓝色。
图53示出E484(RBD)与中和Nb和mAb的相互作用的分析。Fab-RBD结构的叠加显示E484(RBD)形成氢和/或与Fab的相应残基的疏水相互作用。与E484紧密接触的残基酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸和精氨酸的侧链以棒状图示显示。RBD：深灰色，Fab VH：浅蓝色，Fab LH：浅绿色，并且残基E484(RBD)：红色。
具体实施方式
本文描述了对SARS-CoV-2刺突蛋白具有特异性的新型纳米抗体(Nb)的发现。这些纳米抗体是通过应用我们的整合蛋白质组学平台对抗原接合的Nb组库进行深入探索、分类和高通量结构表征而阐明的。开发并表征了一系列靶向SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合结构域(RBD)的多样化、可溶性、稳定和高亲和力的骆驼科动物Nb。大多数高亲和力RBD Nb有效地中和SARS-CoV-2，并且在一些实施方案中，有效地中和另一种冠状病毒。一个子集具有出色的中和效力，与最有效的人NAb相比相当或更好。使用了一种整合结构方法，并且绘制了中和Nb的多个表位。具有亚-ng/ml中和效力的优秀Nb的原子结构在与RBD的复合物中确定。结果揭示，虽然高效中和Nb主要识别凹hACE2结合位点，但也可通过其他RBD表位实现有效中和。最后，结构表征促进了将多价Nb生物工程化为多表位混合物，所述多表位混合物实现了低至0.058ng/ml(1.3pM)的显著中和效力，其可足以防止逃逸突变体的产生。
术语
除非上下文另外明确规定，否则如在本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数个提及物。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
如本文所用的术语“约”在涉及诸如量、百分比等的可测量值时，意在涵盖相对于所述可测量值的±20％、±10％、±5％或±1％的变化。
“施用”于受试者或“施用”包括向受试者引入或递送剂的任何途径。施用可通过任何合适的途径进行，包括经口、静脉内、腹膜内、鼻内、吸入等。施用包括自我施用和他人施用。
术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”在本文中以广义使用并且包括多克隆抗体、单克隆抗体和双特异性抗体。除了完整的免疫球蛋白分子以外，术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及免疫球蛋白分子或其片段的人型式或人源化型式。抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，然后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)并且在其另一端具有恒定结构域。
可使用本文描述的体外测定或通过类似方法来针对其所需活性测试抗体，然后根据已知临床测试方法来测试其体内治疗和/或预防活性。存在五种主要类别的人免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干种可进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG-1、IgG-2、IgG-3，和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本领域技术人员了解小鼠的可比较类别。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中也可互换使用，是指由抗原结合分子(如本发明的纳米抗体)识别的抗原或靶标上的位置。表位可由连续氨基酸(“线性表位”)或通过蛋白质三级折叠并列的非连续氨基酸形成。后一种表位(由至少一些非连续氨基酸产生的表位)在本文中被描述为“构象表位”。一个表位典型地包括至少3个，且更通常至少5个或8-10个呈独特空间构象的氨基酸。确定表位空间构象的方法包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷,Glenn E.Morris编(1996)。
术语“抗原结合位点”、“结合位点”和“结合结构域”是指结合抗原决定簇或表位的多肽如纳米抗体的特定元件、部分或氨基酸残基。
术语“CDR”和“互补决定区”可互换使用，并且是指参与结合至抗原的抗体的可变链的一部分。因此，CDR是“抗原结合位点”的一部分，或者是“抗原结合位点”。在一些实施方案中，纳米抗体包含三个共同形成抗原结合位点的CDR。
如本文所用的术语“包含”和其变化形式与术语“包括”和其变化形式同义使用，并且是开放的非限制性术语。尽管本文使用术语“包含”和“包括”来描述各种实施方案，但可使用术语“基本上由……组成”和“由……组成”来代替“包含”和“包括”，以提供更加具体的实施方案，并且也被公开。
“组合物”是指具有有益生物效应的任何剂。有益生物效应包括治疗效应(例如，治疗病症或其他不良生理疾患)和预防效应(例如，预防病症或其他不良生理疾患)两者。所述术语还包括本文具体提及的有益剂的药学上可接受的药理学活性衍生物，包括但不限于细菌、载体、多核苷酸、细胞、盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“组合物”时，或者当具体鉴定特定组合物时，则应理解，所述术语包括组合物本身以及药学上可接受的药理学活性载体、多核苷酸、盐、酯、酰胺、前药、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。在一些方面，本文公开的组合物包含重组多肽，所述重组多肽包含人血清白蛋白(HSA)结合多肽和IL-2多肽。
“有效量”涵盖不限于可改善、逆转、减轻、预防或诊断医学疾患或病症(癌症)的疾患或病状。除非另有明确规定或上下文规定，否则“有效量”不限于足以改善疾患的最小量。疾病或病症的严重性以及治疗以预防、治疗或减轻疾病或病症的能力可通过生物标志物或临床参数来测量，而不暗示任何限制。在一些实施方案中，术语“重组纳米抗体的有效量”是指足以预防、治疗或减轻癌症的重组纳米抗体的量。
“片段”或“功能片段”无论是否连接到其他序列，都可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他所选修饰，条件是所述片段的活性与未修饰的肽或蛋白质相比没有显著改变或受损。这些修饰可提供一些额外性质，如去除或添加能够二硫键合的氨基酸、增加其生物寿命、改变其分泌特征等。在任何情况下，功能片段必须具有生物活性性质，如结合至HSA和/或改善癌症。
如本文所用，“功能选择步骤”是基于功能特征将纳米抗体分成不同部分或组的方法。在一些实施方案中，功能特征是纳米抗体或CD3区抗原亲和力。在其他实施方案中，功能特征是纳米抗体热稳定性。在其他实施方案中，功能特征是纳米抗体细胞内渗透。因此，本发明包括一种鉴定一组互补决定区(CDR)3区纳米抗体氨基酸序列(CDR3序列)的方法，其中与对照相比，减少数目的CDR3序列为假阳性，所述方法包括：从用抗原免疫的骆驼科动物获得血液样品；使用所述血液样品获得纳米抗体cDNA文库；鉴定所述文库中每种cDNA的序列；从来自用所述抗原免疫的骆驼科动物的同一或第二血液样品中分离纳米抗体；执行功能选择步骤；用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化所述纳米抗体以产生一组消化产物；对所述消化产物进行质谱分析以获得质谱数据；选择在步骤c.中鉴定的与所述质谱数据相关的序列；鉴定来自步骤g.的序列中的CDR3区的序列；以及从来自步骤h.的CDR3区序列中排除那些具有小于计算的片段化覆盖百分比的序列；其中未排除的序列包括具有减少数目的假阳性CDR3序列的组。应理解，功能选择步骤之后的方法步骤可对由功能选择产生的每个不同部分或组分别执行。
本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的“半衰期”通常可定义为例如由于序列或化合物的降解和/或序列或化合物通过自然机制的清除或隔离，氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内降低50％所需的时间。本发明的纳米抗体、氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以任何已知的方式确定，例如通过药物动力学分析。这些为例如Kenneth,A等人，Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists；Peters等人，Pharmacokinete analysis:A Practical Approach(1996)；“Pharmacokinetics”,MGibaldi和D Perron,由Marcel Dekker出版,第2修订版(1982)。
术语“同一性”或“同源性”应解释为意指在比对序列并且必要时引入空位以实现整个序列的最大同一性百分比并且不考虑将任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与所比较的相应序列的碱基或残基相同的核苷酸碱基或氨基酸残基的百分比。与另一个序列具有一定百分比(例如80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)是指在比较两个序列时，一定百分比的碱基(或氨基酸)在比对时是相同的。在一些实施方案中，同一性或同源性是在整个所比较序列上确定的，或者换句话说，比较序列的全长。这种比对和同源性或序列同一性百分比可使用本领域中已知的软件程序来确定。此类比对可使用例如Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来提供，通过诸如比对程序(DNAstar公司)的计算机程序来方便地实现。
如本文所用，术语“纳米抗体”、“VHH”、“VHH抗体片段”和“单结构域抗体”被无差别地使用并表示在骆驼科中发现的类型的抗体的单个重链的可变结构域，其不含任何轻链，如源自骆驼科动物的那些，如以引用的方式整体并入本文的PCT公布第WO 94/04678中所述。
如本文所用，“可操作地连接”是指多肽区段在单个多肽链内的排列，其中单独多肽区段可以是但不限于蛋白质、其片段、连接肽和/或信号肽。术语可操作地连接可指不同单独多肽在单个多肽或其片段内直接融合，其中不同区段之间没有间插氨基酸，以及当单独多肽通过“接头”彼此连接时，所述接头包含一个或多个间插氨基酸。在一些实施方案中，接头介于约10个与约40个氨基酸之间。在一些实施方案中，接头介于约15个与约35个氨基酸之间。在一些实施方案中，接头是约25个氨基酸。在一些实施方案中，接头是约31个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:184(EGKSSGSGSESKSTGGGGSEGKSSGSGSESKST)。
术语“中和”是指纳米抗体降低SARS CoV-2或另一种冠状病毒的感染性的能力。应理解，“中和”不要求100％中和，并且仅要求部分中和。在一些实施方案中，获得约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％中和。在一些实施方案中，感染性降低约100％、约90％、约80％、约70％或约60％。“感染性”是指病毒结合至细胞并进入细胞的能力。作为实例，与对照相比，使病毒的感染性降低100％的纳米抗体使病毒进入细胞降低100％。因此，本文包括与对照相比，纳米抗体使SARS CoV-2或冠状病毒的感染性降低约100％、约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％或约50％的实施方案。在一些实施方案中，实现SARS CoV-2或冠状病毒中和约50％所需的纳米抗体的浓度(例如，IC50)小于1ng/1ml。
如本文所用的术语“核酸”意指由核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)构成的聚合物。如本文所用的术语“核糖核酸”和“RNA”意指由核糖核苷酸构成的聚合物。如本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”意指由脱氧核糖核苷酸构成的聚合物。
术语“药学有效量”、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指研究人员、兽医、医生或其他临床医师所探寻的将引发组织、系统、动物或人的生物或医学反应的化合物(如SARS-CoV-2或冠状病毒中和纳米抗体)的量。在一些实施方案中，所需反应是与SARS-CoV-2或冠状病毒感染相关的不良症状的临床改善或减轻。在一些实施方案中，所需反应是预防SARS-CoV-2或冠状病毒感染。在一些情况下，在数天、数周或数年的时间段内向受试者施用多剂量的组合物后实现所需的生物学或医学反应。术语“药学有效量”、“治疗有效量”或“治疗有效剂量”包括当施用时足以预防所治疗的疾患或病状的一种或多种症状的发展，或在某种程度上减轻所述一种或多种症状的化合物(如SARS-CoV-2或冠状病毒中和纳米抗体)的量。治疗有效量将取决于化合物如选择性细菌β-葡糖醛酸糖苷酶抑制剂、病症或疾患及其严重程度、施用途径、施用时间、排泄速率、药物组合、治疗医师的判断、剂型以待治疗受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和/或饮食。在本方法的上下文中，SARS-CoV-2或冠状病毒中和纳米抗体的药学或治疗有效量或剂量包括足以减轻由SARS-CoV-2或冠状病毒感染引起的呼吸急促、肺炎、咳嗽、疲劳、肌肉或身体疼痛、头痛、味觉或嗅觉丧失、咽喉痛、恶心、呕吐、腹泻、胸部持续疼痛或压迫、呼吸困难以及死亡中的一种或多种的量。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的聚合形式的核苷酸，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，且可执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸序列可间杂有非核苷酸成分。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。所述术语还指双链和单链分子。除非另有规定或要求，否则本发明的任何多核苷酸实施方案都包括双链形式和已知或预期构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
术语“多肽”以其最广义使用，是指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚基可通过肽键连接。在另一实施方案中，亚基可通过其他键，例如酯、醚等连接。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。如果肽链较短，则三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链较长，则肽通常被称为多肽或蛋白质。
关于多肽使用的“重组”在本文中是指两种或更多种多肽的组合，所述组合不是天然存在的。
术语“片段化覆盖百分比”是指使用下式获得的百分比：
f(x,酶)是计算由酶消化的肽的片段化覆盖率(％)的函数
x是肽作图的CDR3的长度
f(x,胰凝乳蛋白酶)＝0.0023x2-0.0497x+0.7723,x[5,30]
f(x,胰蛋白酶)＝0.00006x2-0.00444x+0.9194,x[5,30]
术语“特异性结合”、“特异性结合”、“选择性结合”和“选择性地结合”意指纳米抗体显示对特定抗原或表位的明显亲和力，且大体上不显示与其他非刺突蛋白受体结合结构域抗原和表位的显著交叉反应性。明显结合亲和力包括以至少106M-1，特别是至少107M-1、更特别是至少108M-1、还更特别是至少109M-1或甚至还更特别是至少1010M-1的亲和力结合。结合亲和力也可表示为亲和力的范围，例如，106M-1至1010M-1，特别是107M-1至1010M-1，更特别是108M-1至1010M-1。“不表现出显著交叉反应性”的纳米抗体是不会明显结合至不合乎需要的实体(例如，不合乎需要的蛋白质实体，如非刺突蛋白受体结合域)的纳米抗体。对特定表位具有特异性的纳米抗体例如将不会与在相同蛋白质或肽上的其他表位显著地交叉反应。特异性结合可根据用于测定这种结合的任何本领域认可的方法测定。在一些实施方案中，特异性结合根据Scatchard分析和/或竞争性结合测定来测定。
术语“受试者”在本文定义为包括动物如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在一些实施方案中，受试者是人。
如本文所用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”以及其语法变型包括部分或完全延迟、减缓、减轻SARS-CoV-2或冠状病毒感染的一种或多种伴随性症状或减小其强度和/或减缓、减轻或阻碍SARS-CoV-2或冠状病毒感染的一种或多种原因。在一些情况下，术语“(treat/treating/treatment)”及其语法变型是指减少受试者体内可检测到的SARS-CoV-2或冠状病毒。在一些情况下，术语“(treat/treating/treatment)”及其语法变型是指实现受试者体内SARS-CoV-2或冠状病毒的阴性测试结果。在一些情况下，术语“(treat/treating/treatment)”及其语法变型是指降低受试者体内的SARS-CoV-2或冠状病毒病毒载量。在一些情况下，术语“(treat/treating/treatment)”及其语法变型是指减轻由SARS-CoV-2或冠状病毒感染引起的呼吸急促、肺炎、咳嗽、疲劳、肌肉或身体疼痛、头痛、味觉或嗅觉丧失、咽喉痛、恶心、呕吐、腹泻、胸部持续疼痛或压迫、呼吸困难以及死亡中的一种或多种的量。
组合物和方法
本文提供了靶向SARS-CoV-2刺突蛋白或冠状病毒刺突蛋白的S1受体结合结构域(RBD)的大量多样、高亲和力的骆驼科动物Nb的开发和表征。特别地，本文描述的冠状病毒Nb(例如，SARS-CoV-2Nb)能够中和细胞培养系统中的冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)感染性。因此，本发明的冠状病毒Nb(例如，SARS-CoV-2Nbs)可用于治疗或预防冠状病毒感染(例如，SARS-COV-2感染)，并且本文包括治疗冠状病毒感染(例如，SARS-COV-2感染)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的中和纳米抗体。本文还包括预防受试者中的冠状病毒感染(例如，SARS-COV-2感染)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的中和纳米抗体。
本发明包括SARS-CoV-2中和纳米抗体，所述纳米抗体包含选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:152组成的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，SARS-CoV-2纳米抗体包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性的序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:186。在一些实施方案中，纳米抗体包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性的序列：SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:104或SEQ ID NO:185。在一些实施方案中，纳米抗体包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:147、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:185。在一些实施方案中，纳米抗体包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性的序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，纳米抗体包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，纳米抗体包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性的氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)：SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:103、SEQ IDNO:140、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:185。在一些实施方案中，纳米抗体包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性的氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQID NO:12和SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:185中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ IDNO:95中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:96中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:103中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:140中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:147中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ IDNO:93中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:104中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:185中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。
在一些实施方案中，纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:82至SEQ ID NO:152和SEQID NO:185。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:185中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:95中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:96中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:103中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:140中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:147中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:93中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:104中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，纳米抗体包含SEQ ID NO:185中所列氨基酸序列的多聚体(例如，同二聚体或同三聚体)。在一些实施方案中，SARS-CoV-2纳米抗体包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性的序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:71。在一些实施方案中，纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQID NO:1至SEQ ID NO:71。在一些实施方案中，纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括SEQ ID NO:14中所列的序列。在一些实施方案中，纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括SEQ ID NO:15中所列的序列。在一些实施方案中，纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括SEQ ID NO:22中所列的序列。在一些实施方案中，纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括SEQ ID NO:59中所列的序列。在一些实施方案中，纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括SEQ IDNO:66中所列的序列。在一些实施方案中，纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括SEQ ID NO:12中所列的序列。在一些实施方案中，纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括SEQ ID NO:23中所列的序列。在一些实施方案中，多聚体是二聚体或三聚体。多聚体可以是例如同二聚体、同三聚体、异二聚体或异三聚体。
在一些实施方案中，接头介于约10个与约40个氨基酸之间。在一些实施方案中，接头介于约15个与约35个氨基酸之间。在一些实施方案中，接头是约25个氨基酸。在一些实施方案中，接头是约31个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含SEQ ID NO:184(EGKSSGSGSESKSTGGGGSEGKSSGSGSESKST)或其片段。
因此，本文包括包含一个氨基酸序列的三个拷贝的同三聚体纳米抗体，其中所述一个氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:71或其片段，并且其中所述三个拷贝由接头序列隔开。还包括包含三个不同氨基酸序列的异三聚体纳米抗体，其中每个不同氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:71或其片段，并且其中所述不同氨基酸序列由接头序列隔开。还包括包含一个氨基酸序列的两个拷贝的同二聚体纳米抗体，其中所述一个氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:71或其片段，并且其中所述两个拷贝由接头序列隔开。进一步包括包含两个不同氨基酸序列的异二聚体纳米抗体，其中每个不同氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:71或其片段，并且其中所述不同氨基酸序列由接头序列隔开。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2中和纳米抗体包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:186的序列或其片段。在一些实施方案中，SARS-CoV-2纳米抗体包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性的序列：SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:186。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2中和纳米抗体缀合或连接至特异性结合至人血清白蛋白的纳米抗体或纳米抗体片段，目的是增加SARS-CoV-2中和纳米抗体的半衰期。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2中和纳米抗体使SARS-CoV-2的感染性降低约100％、约90％、约80％、约70％、约60％或约50％。在一些实施方案中，SARS-CoV-2Nb使SARSCoV-2的感染性降低约100％、约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％或约50％。感染性降低可使用任何方法来确定，包括用于测定病毒中和的细胞培养系统。在一些实施方案中，实现使SARS CoV-2的感染性降低约50％所需的纳米抗体的浓度(例如，IC50)小于1ng/1ml。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2中和纳米抗体特异性结合至凹hACE2结合位点。在一些实施方案中，结合亲和力是飞摩尔结合。
如上所述，本文还包括治疗和/或预防受试者中的SARS-CoV-2感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文公开的SARS-CoV-2中和纳米抗体。在所述方法的一些实施方案中，SARS-CoV-2中和纳米抗体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:1至SEQ ID NO:152。在所述方法的一些实施方案中，SARS-CoV-2中和纳米抗体包含选自由以下组成的组的两个或更多个氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:152、SEQ IDNO:185和SEQ ID NO:186。
在一些实施方案中，本文公开的纳米抗体包含特异性结合至病毒蛋白(例如，SARS-CoV-2刺突蛋白)上的表位的互补位。在一些实施方案中，纳米抗体特异性结合至SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ ID NO:189)。在一些实施方案中，纳米抗体特异性结合至SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)，其中所述RBD包含SEQ ID NO:189的残基编号334-527的氨基酸序列。术语“表位”，也称为抗原决定簇，是指被免疫系统(例如，抗体)识别的抗原的部分。结合至表位的抗体的部分在本文中称为“互补位”。抗体-抗原相互作用在抗体上的序列区(互补位)与结合界面处的抗原(表位)之间发生。因此，互补位和表位可以两种方式表现：(1)作为相互作用残基的连续链段或(2)不连续，由于蛋白质折叠而被一个或多个非相互作用残基(空位)隔开。
在一些实施方案中，纳米抗体包含在相对于SEQ ID NO:12的位置28、30、31、32、33、34、35、37、47、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、71、73、74、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、107和109处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中纳米抗体特异性结合至SEQ ID NO:189的位置345、346、347、348、349、351、352、353、354、355、356、399、448、449、450、451、452、453、454、455、466、467、468、469、470、471、472、482、483、484、489、490、491、492、493、493和494处的氨基酸。
在一些实施方案中，纳米抗体包含在相对于SEQ ID NO:66的位置44、45、46、47、57、58、59、60、62、65、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112和113处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中纳米抗体特异性结合至SEQ ID NO:189的位置369、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、403、404、405、407、408、411、412、414、432、435、501、502、503、504、505、508和510处的氨基酸。
在一些实施方案中，纳米抗体包含相对于SEQ ID NO:59在位置53、60、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113和114处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中纳米抗体特异性结合至SEQ ID NO:189的位置368、369、370、371、372、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、404、405、406、407、408、409、414、435、436和508处的氨基酸。
在一些实施方案中，纳米抗体包含相对于SEQ ID NO:22在位置38、43、44、45、46、47、48、59、60、61、62、63、65、102、103、109、110、111、112、113和116处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中纳米抗体特异性结合至SEQ ID NO:189的位置366、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、412、436和437处的氨基酸。
在一些实施方案中，纳米抗体包含在相对于SEQ ID NO:23的位置28、33、39、40、104、105、106、107、108、109、110、111、113、114、115、116和118处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中纳米抗体特异性结合至SEQ ID NO:189的位置344、345、346、347、348、349、351、352、353、354、355、356、357、396、451、457、464、465、466、467、468和470处的氨基酸。
在一些实施方案中，纳米抗体包含在相对于SEQ ID NO:15的位置27、28、29、30、31、33、35、44、45、46、47、48、50、51、52、55、56、57、58、59、70、72、97、98、99、100、101、102、103和104处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中纳米抗体特异性结合至SEQ IDNO:189的位置351、446、447、448、449、450、451、452、453、455、456、470、472、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、505和531处的氨基酸。
在一些实施方案中，纳米抗体包含相对于SEQ ID NO:14在位置27、28、29、30、31、32、33、35、45、47、48、49、51、52、55、56、57、58、59、60、72、97、98、99、100、102、103、104处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中纳米抗体特异性结合至SEQ ID NO:189的位置351、417、449、450、451、452、453、455、456、470、472、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495和496处的氨基酸。
应当理解，在一些实施方案中，本文公开的SARS-CoV-2纳米抗体可与其他冠状病毒刺突蛋白交叉反应。因此，本发明包括用本文公开的纳米抗体治疗除SARS-CoV-2以外的冠状病毒。冠状病毒构成冠状病毒科、巢病毒目和核糖病毒界中的正冠状病毒亚科。它们是具有正义单链RNA基因组和螺旋对称的核衣壳的包膜病毒。冠状病毒的基因组大小范围从大约27至34千碱基。冠状病毒的结构一般由以下组成：刺突蛋白、血凝素-酯酶二聚体(HE)、膜糖蛋白(M)、包膜蛋白(E)、核衣壳蛋白(N)和RNA。冠状病毒家族包括属，所述属包括例如α冠状病毒属(例如，人冠状病毒229E、人冠状病毒NL63、长翼蝠冠状病毒1、长翼蝠属蝙蝠冠状病毒HKU8、猪流行性腹泻病毒、菊头蝠属蝙蝠冠状病毒HKU2、黄蝠属蝙蝠冠状病毒512)、β冠状病毒(例如，SARS-CoV-2、β冠状病毒1、人冠状病毒HKU1、鼠冠状病毒、伏翼属蝙蝠冠状病毒HKU5、果蝠属蝙蝠冠状病毒HKU9、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒、扁颅蝠属蝙蝠冠状病毒HKU4、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS)、人冠状病毒OC43、刺猬冠状病毒1(EriCoV))、γ冠状病毒(例如，白鲸冠状病毒SW1、感染性支气管炎病毒)和δ冠状病毒(例如，夜莺冠状病毒HKU11、猪冠状病毒HKU15)。在一些实施方案中，本文公开的纳米抗体可与其他冠状病毒或其他冠状病毒刺突蛋白交叉反应。在一些实施方案中，纳米抗体与Ratq13、panq17、SARS-CoV、WIVI、SHC014、Rs4081、RmYNo2、RF1、Yun11、BtKy72、BM4831交叉反应。因此，在一些方面，本文公开了纳米抗体及其用于治疗和/或预防冠状病毒感染的用途。在一些实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV。在一些实施方案中，冠状病毒是MERS-CoV。
在一些实施方案中，纳米抗体以约0.01mg/kg体重、约0.05mg/kg体重、约0.1mg/kg体重、约0.15mg/kg体重、约0.2mg/kg体重、约0.25mg/kg体重、约0.3mg/kg体重、约0.35mg/kg体重、约0.4mg/kg体重、约0.45mg/kg体重、约0.5mg/kg体重、约0.55mg/kg体重、约0.6mg/kg体重、约0.65mg/kg体重、约0.7mg/kg体重、约0.75mg/kg体重、约0.8mg/kg体重、约0.85mg/kg体重、约0.9mg/kg体重、约0.95mg/kg体重、约1mg/kg体重、约2mg/kg体重、约3mg/kg体重、约4mg/kg体重、约5mg/kg体重、约6mg/kg体重、约7mg/kg体重、约8mg/kg体重、约9mg/kg体重、约10mg/kg体重或约20mg/kg体重的剂量施用。在一些实施方案中，纳米抗体以至少约0.01mg/kg体重(例如，至少约0.1mg/kg体重、至少约0.2mg/kg体重、至少约0.3mg/kg体重、至少约0.5mg/kg体重、至少约1.0mg/kg体重、至少约2mg/kg体重、至少约5mg/kg体重、至少约10mg/kg体重、至少约50mg/kg体重或至少约100mg/kg体重)的剂量施用。
所公开的方法可在COVID-19症状出现之前60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1年；12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个月；30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3天；60、48、36、30、24、18、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2小时采用；或在COVID-19症状出现之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、105、120分钟；3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、24、30、36、48、60小时；3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、45、60、90天或更多天；4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月；60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1年采用。在一些实施方案中，所公开的方法可在施用另一种抗SARS-CoV-2剂之前或之后采用。
本文所述的冠状病毒或SARS-CoV-2中和纳米抗体可通过任何途径施用于受试者，所述途径包括口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌内、关节内、胃肠外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入或通过植入储库。在一些实施方案中，纳米抗体通过气管内、鼻内或通过吸入途径施用。在一些实施方案中，冠状病毒或SARS-CO-V2中和纳米抗体呈气雾剂形式。术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。
任何前述方面的冠状病毒或SARS-CoV-2中和纳米抗体的给药频率包括但不限于至少每年一次、每两年一次、每三年一次、每四年一次、每五年一次、每六年一次、每七年一次、每八年一次、每九年一次、每十年一次、至少每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每七个月一次、每八个月一次、每九个月一次、每十个月一次、每十一个月一次、至少每月一次、每三周一次、每两周一次、每周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次、每天一次、一天两次、一天三次、一天四次或一天五次。施用也可以是连续的并进行调整以将化合物的水平维持在任何所需和指定的范围内。
实施例
实施例1.多功能多价纳米抗体混合物有效地中和SARS-CoV-2。
开发并表征了一系列靶向RBD的多样化、可溶性、稳定和高亲和力的骆驼科动物Nb。大多数高亲和力RBD Nb有效地中和SARS-CoV-2。一个子集具有出色的中和效力，与最有效的人NAb相比相当或更好。使用了整合结构方法，并且绘制了中和Nb的多个表位。具有亚-ng/ml中和效力的优秀Nb的原子结构在与RBD的复合物中确定。结果揭示，虽然高效中和Nb主要识别凹hACE2结合位点，但也可通过其他RBD表位实现有效中和。最后，结构表征促进了将多价Nb生物工程化为多表位混合物，所述多表位混合物实现了低至0.058ng/ml(1.3pM)的显著中和效力ng/ml(1.3pM)，其可足以防止逃逸突变体的产生。
高效SARS-COV-2中和Nb的开发
为了产生高质量SARS-CoV-2中和Nb，用在人293T细胞中表达的重组RBD蛋白对美洲驼进行了免疫。与免疫前血相比，亲和力成熟后，免疫后血清显示出对RBD结合的有效和特异性血清学活性，滴度为1.75×106(图6A)。所述血清有效地中和了假型化SARS-CoV-2，半数最大中和滴度(NT50)为310,000(图6B)，与从恢复的COVID-19患者获得的恢复期血清相比高几个数量级(Y.Cao等人，2020；D.F.Robbiani等人，2020)。为了进一步表征这些活性，将单链VHH抗体与来自血清的IgG抗体分离。经证实，单链抗体实现与RBD的特异性、高亲和力结合，并且针对假型化病毒具有亚-nM半数最大抑制浓度(IC50＝509pM)(图6C)。
使用稳健蛋白质组学策略从经RBD免疫的美洲驼血清中鉴定出数千个高亲和力VHH Nb(Y.Xiang等人，2020)(图7a)。此组库包括约350个独特CDR3(互补决定区)。对于大肠杆菌表达，从具有独特CDR3的组库中选择了109个高度多样化的Nb序列，以涵盖Nb组库的各种生物物理学、结构和不同抗病毒性质。对九十四种Nb进行纯化并通过ELISA测试RBD结合，从中确认了71种RBD特异性结合剂(图7b-7c，表1)。在这些RBD特异性结合剂中，49种Nb具有高溶解度和高亲和力(ELISA IC50低于30nM，图1a)，并且是功能表征的候选物。SARS-CoV-2-GFP假病毒中和测定用于筛选和表征这些高亲和力Nb的抗病毒活性。绝大部分(94％)经测试的Nb可在3μM以下中和假型病毒(图1b)。它们中的90％在500nM以下阻断了假病毒。据报告，从患者血清中鉴定的高亲和力RBD特异性mAb中只有20％-40％具有相当的效力(Y.Cao等人,2020；D.F.Robbiani等人,2020)。超过四分之三(76％)的Nb在50nM以下有效地中和了假病毒，并且6％具有低于0.5nM的中和活性。最后，使用PRNT50测定测试了14中和SARS-CoV-2慕尼黑毒株的潜力(W.B.Klimstra等人,2020)。所有Nb均达到100％中和，并且以剂量依赖性方式中和病毒。IC50跨越个位数ng/ml至亚-ng/ml,其中Nb 89、20和21的三种不寻常的中和剂为2.0ng/ml(0.129nM)、1.6ng/ml(0.102nM)和0.7ng/ml(0.045nM)，分别基于假病毒测定(图1c，图1e)。使用SARS-CoV-2可重复获得类似的值(对于Nb 89、20和21，0.154nM、0.048nM和0.021nM)(图1d，图1e)。两种中和测定之间存在极好的相关性(R2＝0.92，图8)。
通过表面等离子体共振(SPR)测量Nb 89、20和21的结合动力学(图9a-9b)。虽然Nb89和20具有108pM和10.4pM的亲和力，但在20分钟SPR分析期间，最佳中和Nb21未显示可检测到的与RBD的解离。Nb21的飞摩尔亲和力可能解释其不寻常的中和效力(图1f)。所述实验确定来自大肠杆菌周质制剂的前三种中和Nb(89、20和21)的热稳定性分别为65.9℃、71.8℃和72.8℃(图9c)。最后，Nb21的货架稳定性，其在纯化后在室温下储存约6周后保持可溶，并且能够良好地耐受冻干。通过尺寸排阻色谱法(SEC)未检测到多聚体形式或聚集体(图9d)。这些结果共同表明，这些中和Nb具有高级治疗应用所需的必要物理化学性质。
Nb中和表位的整合结构表征
基于X射线晶体学和冷冻电子显微镜(冷冻电镜(CryoEM))的原子分辨率结构测定的表位作图高度准确，但通量较低。在此，整合来自SEC、交联质谱(CXMS)、形状和物理化学互补性以及统计数据的信息以确定RBD-Nb复合物的结构模型(M.P.Rout,A.Sali,2019；C.Yu等人,2017；A.Leitner,M.Faini,F.2016；B.T.Chait等人，2016)。首先，进行SEC实验以区分与Nb21共享相同表位(因此在SEC上与Nb 21竞争)的Nb和与非重叠表位结合的那些Nb。基于SEC图谱，Nb 9、16、17、20、64、82、89、99和107与Nb21竞争RBD结合(图2a，图10)，从而表明它们的表位显著重叠。相比之下，与由Nb21、RBD和Nb之一(34、36、93、105和95)组成的三聚体复合物相对应的更高质量物质(来自早期洗脱体积)是明显的(图2b、11a-11h)。此外，Nb105与不竞争RBD相互作用的Nb34和Nb95竞争，从而表明存在两个不同且不重叠的表位。其次，Nb-RBD复合物通过DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)交联，并通过MS鉴定了Nb 20、93、34、95和105的平均四个分子间交联。交联用于对源自SEC数据(方法)的RBD表位进行作图。交联模型鉴定了五个表位(对应于Nb 20、93、34、95和105的I、II、III、IV和V)(图2c)。这些模型满足90％的交联，平均精度为
Figure BDA0004126816630000391
(图2d，表2)。所述分析证实了与hACE2结合位点重叠的显性表位I(例如，Nb 20和21的表位)的存在。表位II也与hACE2结合位点共定位，而表位III-V则不(图2e)。与其他表位结合剂相比，表位I Nb的CDR3显著更短(短四个氨基酸，p＝0.005)(图11i)。尽管如此，绝大多数的所选Nb都能有效地抑制病毒，IC50低于30ng/ml(2nM)(表1)。
RBD-Nb20的晶体结构以及Nb 20和21针对RBD结合的MD分析
为了探索表位I Nb的异常有效的中和活性背后的分子机制，通过分子置换确定了分辨率为
Figure BDA0004126816630000392
的RBD-Nb20复合物的晶体结构(方法，表3)。RBD(N334-G526)和整个Nb20中的大部分残基，特别是蛋白质相互作用界面处的残基，都得到了良好分辨。在一个不对称单元中存在RBD-Nb20复合物的两个拷贝，这与287个Cα原子上
Figure BDA0004126816630000393
Figure BDA0004126816630000394
的RMSD几乎相同。在所述结构中，Nb20的所有三个CDR通过与其具有两条短β链的大延伸外部环结合而与RBD相互作用(图3a)(Q.H.Wang等人,2020)。RBD的E484与Nb20的R31(CDR1)和Y104(CDR3)的侧链形成氢键合和离子相互作用，而RBD的Q493与Nb20的A29(CDR1)的主链羰基和R97(CDR3)的侧链形成氢键。这些相互作用在RBD和Nb20界面构成主要极性相互作用网络。Nb20的R31还与RBD的F490的侧链在阳离子-π相互作用中接合(图3b)。此外，来自Nb20的CDR2的M55抵靠RBD的残基L452、F490和L492堆积，在界面处形成疏水相互作用)。在RBD的残基V483和来自Nb20的框架β-折叠的F45和L59之间形成了另一小片疏水相互作用(图3c)。
在RBD和Nb20界面处观察到具有强电子密度的小空腔，其被Nb20的带电残基R31和R97以及RBD的E484围绕。根据蛋白质结晶条件对二甲胂酸盐基团进行建模以拟合密度，从而与Nb20的两个主链胺基和RBD形成氢键。在生理条件下，这个空腔被有序的水分子占据，以介导与周围残基的广泛氢键合相互作用，从而促进RBD与Nb20之间的相互作用。类似地，在与其他Nb结合的RBD的两个晶体结构(PDB ID 6YZ5和7C8V0)中，也存在小分子，如在RBD和Nb界面处建模的甘油。
Nb20与RBD的结合模式不同于所有其他报告的SARS-CoV-2中和Nb，后者通常识别RBD外部环区域中的相似表位(T.Li等人,2020；J.D.Walter等人,2020；J.Huo等人,2020)(图12)。RBD与Nb20之间的广泛疏水性和极性相互作用(图3b-3c)源于所有CDR与外部RBD环之间的显著形状互补性(图3d)，从而导致超高亲和力(约10pM)。基于晶体结构(方法)对具有RBD的最佳中和剂Nb21的结构进行了进一步建模。Nb20与Nb21之间只有四个残基不同(图13a)，所述残基全部在CDR上。RBD结合界面处有两个取代。Nb20的CDR2中的S52和M55被Nb21中的两个天冬酰胺残基N52和N55替代。在这个建模结构中，N52与RBD的N450形成新的氢键(图13b)。虽然N55不参与同RBD的额外相互作用，但它与R31的侧链形成盐桥，其使Nb21的R31和Y104与RBD的Q484之间的极性相互作用网络稳定(图13b)。所有这些都可促成Nb21对比Nb20的更慢解离速率(图2f、9a)和更强的中和效力。RBD-Nb20/21和RBD-hACE2(PDB6LZG)的结构比较(QH Wang等人,2020)清楚地表明，Nb20/21和hACE2的界面部分重叠(图3d-3e)。值得注意的是，Nb20/21的CDR1和CDR3可与hACE2的第一螺旋严重冲突，hACE2是RBD的主要结合位点(图3f)。这项高分辨率结构研究表明表位I Nb的出色结合亲和力促成亚-ng/ml中和能力。
为了进一步探索我们的Nb的出色中和活性背后的分子机制，我们在
Figure BDA0004126816630000401
的分辨率下确定了RBD-Nb20复合物的X射线晶体结构，其中所有残基侧链都被分辨。我们的结构揭示，Nb20采用广泛疏水和极性相互作用网络来实现亚-nM、高亲和力RBD结合。与交联一致，Nb20与RBD上由延伸环(区域1：残基432-438和区域2：残基464-484，图4)形成的大空腔相互作用。所有三个CDR环都参与结合。例如，CDR1的A29与Y436和S481两者形成疏水相互作用，并且R31(最后一个CDR1残基)将自身插入RBD腔的深袋中，从而与E471形成盐桥并与F477形成阳离子-π相互作用。CDR2上的9个残基中有5个通过疏水相互作用(即，A 48-E 471、A 51-S481、S 52-N436、M55-L479和N57-F477对)与RBD环接触，促进其环渗透至RBD槽中。尽管CDR3相对较短，但至少三个残基(R94、I96和Y101)通过氢键和疏水相互作用直接与RBD腔结合。此外，Nb20与RBD之间的相互作用通过FR2上的保守F47和FR3上与V483和XYZ配对的残基X进一步稳定。总之，Nb 20采用一系列显著疏水和极性相互作用，使凸Nb与RBD槽之间的形状互补性达到完美。
Nb中和SARS-CoV-2的潜在机制。
为了更好地了解这些Nb的出色抗病毒功效，基于冷冻电镜结构将RBD-Nb复合物叠加至不同的刺突构象。发现Nb20/21的三个拷贝可同时结合呈其“向下”构象的所有三个RBD(PDB 6VXX)(A.C.Walls等人,2020)，其对应于无活性刺突(图4b)。此分析表明Nb 20和21(表位I)以超高亲和力将RBD锁定在其向下构象中的机制。与空间干扰RBD开放构象中的hACE2结合组合(图4a)，这些机制可解释表位I Nb的出色中和效力。
其他表位结合剂在没有空间冲突的情况下不适合这种无活性构象，并且似乎利用不同的中和策略(图4c)。例如，表位II:Nb 93与hACE2结合位点共定位，并且可结合一个RBD“向上”构象中的刺突(图4d，PDB 6VSB)(D.Wrapp等人,2020)。它可通过阻断hACE2结合位点来中和病毒。仅在两个或三个RBD处于其暴露表位的“向上”构象(PDB 6XCN)(PDB 6XCN)(C.O.Barnes等人,2020)时，表位III和IV Nb才能结合。在所有RBD“向上”构象中，Nb的三个拷贝可直接与三聚体刺突相互作用。通过RBD结合，表位III:Nb34可容纳在三聚体的顶部，以在融合前阶段锁定S2的螺旋，从而防止它们在膜融合时发生大的构象变化(图4e)。当叠加到所有“向上”构象上时，表位IV:Nb95靠近三聚体的刚性NTD，可能限制刺突结构域的柔性(图4f)。
开发柔性多价Nb形式以用于高效病毒中和
表位作图使我们能够对一系列多价Nb进行生物工程化(图5a)。具体地，设计了基于最有效的Nb构建的两组构建体。其中柔性接头序列(31或25个氨基酸，方法)分隔每个单体Nb(如Nb21或Nb20)的同三聚体Nb旨在通过与三聚体刺突的亲合力结合来增加抗病毒活性。异二聚体形式通过12个残基的柔性接头缀合具有独特、非重叠表位的两种Nb。
合成了多种构建体并测试了它们的中和效力。通过假病毒荧光素酶测定，发现Nb213(IC50＝1.3pM)和Nb203(IC50＝3pM)的同三聚体构建体与相应的单体形式相比改进了高达约30倍(图5b，图5d)。从SARS-CoV-2PRNT获得了类似的结果(图5c、5d、15a)。改进大于所指示的这些值，因为所测量的值可反映测定的检测下限。对于异二聚体构建体，观察到高达4倍的效力增加(即，Nb21-Nb34)。重要的是，多价构建体保留了单体Nb的出色物理化学性质，包括高溶解度、产量和热稳定性(图14)。它们在标准冻干和雾化后仍保持完全活性(方法，图15b-15e)，表明施用的出色稳定性和柔性。在GISAID(Y.L.Shu等人，2017)中观察到的大多数RBD突变频率非常低(<0.0025)。因此，由覆盖不同表位的2-3种Nb组成的混合物发生突变逃逸的概率极低(图5e)(J.Hansen等人,2020)。
开发有效、安全且廉价的疫苗和治疗剂对于结束COVID-19大流行至关重要。在此，体内(骆驼科动物)抗体亲和力成熟，然后是高级蛋白质组学(Y.Xiang等人,2020)能够快速鉴定大量多样、高亲和力RBD Nb用于中和SARS-CoV-2。大多数高亲和力Nb有效地中和SARS-CoV-2，并且呈其单体形式的一些优秀Nb可在个位数至亚-ng/ml浓度下抑制病毒感染。
通过整合生物物理学、结构蛋白质组学、建模和X射线晶体学，鉴定了多个中和表位。这项研究显示Nb以飞摩尔亲和力靶向RBD以实现对SARS-CoV-2的低传代临床分离株的显著中和效力的机制。结构分析揭示，hACE2结合位点与免疫原性和中和作用相关。虽然最有效的Nb通过与hACE2结合位点的高亲和力结合来抑制病毒，但也观察到了经由非hACE2表位的其他中和机制。
一份预印本报告了广泛生物工程化的同三聚体Nb构建体，达到可与我们的单一单体Nb20相当的抗病毒活性(M.Schoof等人,2020)。在此，本研究开发了一系列在两位数pg/ml下具有出色稳定性和中和效力的新型多价Nb构建体。这代表了迄今为止可用的最有效的SARS-CoV-2生物治疗药物。使用多价、多表位的Nb混合物可防止病毒逃逸(A.Baum等人,2020；Y.Bar-On等人,2018；M.Marovich等人，2020)。灵活且高效施用(如直接吸入)可用于提高抗病毒药物功效，并使临床应用的剂量、成本和潜在毒性最小化。Nb与IgG之间的高序列相似性可限制免疫原性(I.Jovcevska等人，2020)。对于静脉内药物递送，有可能将我们的抗病毒Nb与白蛋白-Nb构建体融合(Z.Shen等人,2020)，所述构建体已经开发用于改善体内半衰期。由于高稳定性、特异性和低制造成本，这些Nb还可用作快速即时诊断学。这些高质量Nb剂有助于遏制当前的大流行。
方法
高亲和力RBD-Nb的骆驼科动物免疫和蛋白质组学鉴定。用初始剂量为0.2mg(与完全弗氏佐剂一起)的RBD-Fc融合蛋白(Acro Biosystems，目录号SPD-c5255)、然后每2周三次连续0.1mg加强对雄性美洲驼“Wally”进行免疫。在最后一次加强后10天，从动物采集约480ml血液。所有上述程序均由Capralogics公司按照IACUC方案执行。使用Ficoll梯度(Sigma)分离约1x109个外周单个核细胞。使用RNeasy试剂盒(Qiagen)从单个核细胞中纯化mRNA，并通过MaximaTMH Minus cDNA合成试剂盒(Thermo)将所述mRNA逆转录为cDNA。对VHH基因进行PCR扩增，并且P5和P7衔接子在测序前添加索引(Y.Xiang等人.,2020)。VHH组库的下一代测序(NGS)由Illumina MiSeq在UPMC基因组中心使用300bp配对末端模型进行。对于RBD特异性Nb的蛋白质组学分析，首先通过Ficoll梯度(Sigma)从免疫血液中纯化血浆。然后使用蛋白G和蛋白A琼脂糖珠(Marvelgent)通过两步纯化方案从血浆中分离VHH抗体(P.C.Fridy等人，2014)。对RBD特异性VHH抗体进行亲和分离，随后通过增加高pH缓冲液或盐的严格性进行洗脱。在定量蛋白质组学分析之前，将所有洗脱的VHH中和并透析至1xDPBS中。使用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶对RBD特异性VHH抗体进行还原、烷基化和溶液内消化(Y.Xiang等人,2020)。蛋白水解后，肽混合物通过自填充stage-tips或Sep-pak C18柱(Waters)脱盐，并使用与Q ExactiveTMHF-X Hybrid Quadrupole OrbitrapTM质谱仪(Thermo Fisher)在线耦合的nano-LC1200进行分析。如前所述并通过使用Augur Llama进行蛋白质组学分析，Augur Llama是我们开发用于促进高亲和力Nb的可靠鉴定、无标记定量和分类的一种专用软件(25)。这一分析产生了数以千计的RBD特异性、高亲和力Nb候选物，它们属于约350个独特CDR3家族。从这些中，我们选择了109个具有独特CDR3的Nb序列用于DNA合成和表征。
Nb DNA合成和克隆。对单体Nb基因以及具有(GGGGS，(SEQ ID NO:175))5接头的同三聚体Nb 20和21进行密码子优化和合成(Synbio)。使用EcoRI和HindIII限制位点将所有Nb DNA序列克隆到pET-21b(+)载体中。还将单体Nb 20、21和89以及同三聚体Nb 20和21在BamHI和XhoI位点克隆到pET-22b(+)载体中用于周质纯化。
对Nb基因进行密码子优化以在大肠杆菌中表达，并且在体外合成(Synbio)。将不同合成的Nb基因在BamHI和XhoI限制位点克隆到pET-21b(+)载体中或克隆到pET-22b(+)载体中。为了产生异二聚体Nb形式，从pET21(a+)Nb构建体扩增Nb(如Nb34)的DNA片段，同时引入新的XhoI/HindIII限制位点加(GGGGS，(SEQ ID NO:175))2接头序列。然后将片段在XhoI和HindIII限制位点插入pET21(a+)_Nb21中以产生异二聚体形式[Nb21-(GGGGS，(SEQ IDNO:175))2-Nb]。同三聚体构建体直接合成或通过重组DNA方法在内部产生。使用以下两种寡核苷酸对接头序列EGKSSGSGSESKSTGGGGSEGK SSGSGSESKST(SEQ ID NO:176)的DNA片段进行退火和延伸：
CCGCTCGAGTGCTGCGGCCGCGGTGCTTTTGCTTTCGCCGCTACCGCTGCTTTTACCTTCGCTGCCACC(SEQ ID NO:177)和CCCAAGCTTGAAGGTAAAAGCAGCGGTAGCGGCGAAAGCAAA AGCACCGGTGGCGGTGGCAGCGAAGGT(SEQ ID NO:178)(整合DNA技术)。
然后将经消化的XhoI/HindIII接头片段插入pET21(a+)_Nb21或pET21(a+)_Nb20上的相应位点中。为了将第二Nb21或20改组至这一Nb_接头载体，我们从pET21(a+)扩增了Nb21或20并引入了XhoI/NotI限制位点。消化后，将XhoI/NotI Nb片段插入Nb_接头载体中以产生同二聚体构建体。随后对新的Nb构建体进行了序列验证。
蛋白质的表达和纯化。将Nb DNA构建体转化到BL21(DE3)细胞中，并在37℃下涂铺在含50μg/ml氨苄西林的琼脂上过夜。将细胞在LB肉汤中培养以达到约0.5-0.6的O.D.，之后在16℃下IPTG(0.5mM)诱导过夜。然后收获细胞，超声处理并用裂解缓冲液(1xPBS，150mMNaCl，含蛋白酶抑制剂的0.2％ TX-100)在冰上裂解。细胞裂解后，通过以15,000X g离心10分钟收集蛋白质提取物，并通过钴树脂纯化his标记的Nb，并通过咪唑缓冲液(Thermo)自然洗脱。随后将洗脱的Nb在透析缓冲液(例如1x DPBS，pH 7.4)中透析。对于Nb(Nb 20、21和89以及同三聚体构建体)的周质制备，将细胞沉淀重悬于TES缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH 8.0；0.25mM EDTA，pH 8.0；0.25M蔗糖)并在冰上孵育30分钟。通过离心收集上清液且随后透析至DPBS。然后如上所述通过钴树脂纯化所得Nb。
使用Bac-to-bac杆状病毒方法(Invitrogen)，将SARS-Cov-2 S蛋白的RBD(残基319-541)在草地贪夜蛾Sf9细胞(表达系统)中表达为分泌蛋白质。为了促进蛋白质纯化，将FLAG标签和8×His-标签融合至其N末端，并在His标签与RBD之间引入烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点。将细胞用杆状病毒感染并在收获前在27℃下孵育60小时。向条件培养基添加20mM Tris pH 7.5，并在1mM NiSO4和5mM CaCl2存在下在室温下孵育1小时。通过以25,000g离心30分钟收集上清液，然后与镍-NTA琼脂糖树脂(Clontech)一起在4℃下孵育过夜。用含有20mM Hepes pH 7.5、200mM NaCl和50mM咪唑的缓冲液洗涤后，用含有400mM咪唑的相同缓冲液洗脱RBD蛋白。将洗脱的蛋白质用TEV蛋白酶处理过夜以除去额外标签，并使用Superdex 75柱(Fisher)以及含有20mM HEPES pH 7.5和150mM NaCl的缓冲液通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。为了获得RBD和Nb20复合物，将纯化的RBD与纯化的Nb20以1:1.5的摩尔比混合，然后在冰上孵育2小时。使用Superdex 75柱以及含有20mM Hepes pH 7.5和150mM NaCl的缓冲液进一步纯化复合物。将纯化的RBD-Nb20复合物浓缩至10-15mg/ml用于结晶。
ELISA(酶联免疫吸附测定)。进行间接ELISA以测量Nb的相对亲和力。在4℃下将RBD在包被缓冲液(15mM碳酸钠，35mM碳酸氢钠，pH 9.6)中以2ng/孔包被到96孔ELISA板(R&D system)上过夜，并用封闭缓冲液(DPBS，0.05％ Tween 20，5％乳)在室温下封闭2小时。将Nb在封闭缓冲液中连续10倍稀释，从1μM开始到0.1pM，并且将每个浓度的100μl与RBD包被的板一起孵育2小时。将针对T7-标签的HRP缀合的二级抗体(Thermo)1:7500稀释并在室温下与孔一起孵育1小时。在PBST(DPBS，0.05％ Tween 20)洗涤后，在黑暗下将样品与新鲜制备的w3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物一起进一步孵育10分钟以产生信号。在终止溶液(R&D system)后，在酶标仪(Multiskan GO，Thermo Fisher)上以多个波长读取板(550nm波长下的光密度从450nm下的密度中减去)。如果满足以下两个标准中的任一个，则定义非结合剂：i)ELISA信号在1μM浓度下检测不足。ii)ELISA信号只能在1μM浓度下检测到，并且在0.1μM浓度下检测不足。原始数据通过Prism 7(GraphPad)处理以拟合至4PL曲线中并计算logIC50。
hACE2的竞争性ELISA。COVID-19刺突-ACE2结合测定试剂盒购自RayBiotech(目录号CoV-SACE2-1)。将96孔板用重组RBD预包被。将Nb在含有饱和量的hACE2的测定缓冲液中10倍稀释(从1μM至1pM)，然后在室温下与板一起孵育2.5小时。用洗涤缓冲液洗涤板以除去未结合的hACE2。将山羊抗hACE2抗体与板在室温下孵育1小时。将HRP缀合的抗山羊IgG添加至板中并孵育1小时。添加TMB溶液以与HRP缀合物反应0.5小时。然后通过终止溶液终止反应。与结合的hACE2的量相对应的信号通过酶标仪在450nm处测量。所得数据通过Prism 7(GraphPad)进行分析并绘制。
假型化SARS-CoV-2中和测定。293T-hsACE2稳定细胞系(目录号C-HA101，批号TA060720C)和含有GFP(目录号RVP-701G，批号CG-113A)或荧光素酶(目录号RVP-701L，批号CL109A和CL-114A)报告基因的假型化SARS-CoV-2(武汉-Hu-1毒株)颗粒购自IntegralMolecular。根据制造商的方案进行中和测定。简言之，将10倍连续稀释的Nb与假型化SARS-CoV-2-GFP一起在37℃下孵育1小时以进行筛选，而将3倍或5倍连续稀释的Nb/免疫血清/免疫VHH混合物与假型化SARS-CoV-2-荧光素酶一起孵育以进行准确测量。每种Nb测试了至少八个浓度。不含Nb的培养基中的假病毒用作阴性对照。然后将100μl的混合物与100μl293T-hsACE2细胞以2.5x10e5个细胞/ml在96孔板中孵育。感染在37℃与5％ CO2下进行了约72小时。GFP信号(ex488/em530)使用具有自动优化设置的Tecan Spark20M读取，同时使用Renilla-Glo荧光素酶测定系统(Promega，目录号E2720)和发光计以1ms积分时间测量荧光素酶信号。将来自阴性对照孔的所获得的相对荧光/发光信号(RFU/RLU)归一化并用于计算每个浓度下的中和百分比。对于SARSCoV-2-GFP筛选，将49种经测试的Nb根据其100％中和的最低测试浓度分为6组。对于SARS-CoV-2-荧光素酶，数据通过Prism7(GraphPad)进行处理以拟合至4PL曲线中并计算logIC50(半数最大抑制浓度)。
SARS-CoV-2慕尼黑噬斑减少中和试验(PRNT)。将Nb在Opti-MEM(Thermo)中以2倍或3倍系列稀释。将每种Nb稀释液(110μl)与110μl的含有100噬斑形成单位(pfu)病毒的SARS-CoV-2(慕尼黑毒株)在Opti-MEM中混合。将血清-病毒混合物(总共220μl)在37℃下孵育1小时，然后将它们逐滴添加到六孔板中的汇合Vero E6细胞(
Figure BDA0004126816630000481
CRL-1586TM)单层上。在37℃、5％(v/v)CO2下孵育1小时后，将2ml的含10％(v/v)FBS和1×pen-strep的杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)(Thermo)中的0.1％(w/v)免疫扩散琼脂糖(MPBiomedicals)添加至每个孔中。将细胞在37℃、5％ CO2下孵育72小时。除去琼脂糖覆盖层，并在室温下将细胞单层用1ml/孔甲醛(Fisher)固定20分钟。丢弃固定剂，并添加1ml/孔的于10％(v/v)甲醇中的1％(w/v)结晶紫。将板在室温下孵育20分钟并用水充分冲洗。然后对噬斑进行计数并计算50％噬斑减少中和滴度(PRNT50)。经验证的SARS-CoV-2抗体阴性人血清对照、经验证的NIBSC SARS-CoV-2血浆对照获自英国国家生物标准与控制研究所)，并且还进行了未感染的细胞对照，以确保抗体对病毒的中和具有特异性。
Nb的热稳定性分析。通过差示扫描荧光法(DSF)测量Nb热稳定性。为了制备DSF样品，将Nb与PBS中的SYPRO橙色染料(Invitrogen)混合以达到2.5-15μM的最终浓度。如前所述{引用Allen的论文}，使用7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)一式三份分析样品。然后通过一阶导数法计算熔点{Niesen，2007}。
表面等离子体共振(SPR)。表面等离子体共振(SPR，Biacore 3000系统，GEHealthcare)用于测量Nb亲和力。简言之，将重组RBD固定至激活的CM5传感器芯片的流动通道中。将RBD在10mM乙酸钠(pH 4.5)中稀释至10μg/ml，并以5μl/min注入SPR系统中持续420秒。然后通过1M乙醇胺-HCl(pH 8.5)封闭表面。对于每种Nb分析物，将一系列稀释液(跨越约1,000倍浓度范围)与HBS-EP+运行缓冲液(GE-Healthcare)一起以20-30μl/min的流速一式三份注入持续120-180秒，然后10-20分钟的解离时间。在每次注射之间，将传感器芯片表面用含有10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5-2.5)的低pH缓冲液以40-50μl/min的流速再生两次持续30秒-1分钟。使用BIAevaluation通过与1:1朗缪尔模型拟合处理和分析每种Nb的结合传感图。
系统发生树分析和序列标识。首先通过ANARCI根据Martin编号方案对序列进行比对和编号(J.Dunbar等人，2016)。系统发生树是通过分子进化遗传学分析(MEGA)(S.Kumar等人，2018)使用最大似然法从经比对的序列构建的。序列标识通过logomaker从经比对序列绘制(A.Tareen等人，2020)。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)筛选表位。将重组RBD和Nb蛋白以1:1(w:w)的比率混合并在4℃下孵育1小时。使用20mM HEPES、150mM NaCl(pH 7.5)的运行缓冲液将复合物通过SEC(Superdex75，GE Healthcare)以0.4ml/min的低速率分析1小时。通过280nm处的紫外光吸光度检测蛋白质信号。
聚类和系统发生树分析。通过Clustal Omega{Sievers,2014}生成了系统发生树，输入独特的NbHSA CDR3序列和相邻的框架序列(即，CDR3的N末端的YYCAA(SEQ ID NO:179)和C端的WGQG(SEQ ID NO:180))来帮助比对。数据通过ITol(Interactive Tree ofLife){Letunic,2007}绘制。使用BioPython文库计算CDR3的等电点和疏水性。序列标识是使用WebLogo{Crooks,2004}绘制的。
化学交联和质谱法(CXMS)。首先将重组Nb与胰蛋白酶树脂预孵育大约2-5分钟，以除去N末端T7标签，所述标签对交联剂具有高度反应性。将Nb与PBS中的RBD一起在4℃下孵育1小时，以形成复合物。然后将重构复合物与2mM辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS，ThermoFisher Scientific)一起在25℃轻轻搅拌下交联25分钟。然后在室温下用50mM碳酸氢铵(ABC)淬灭反应10分钟。在蛋白质还原和烷基化后，将交联的样品通过4％-12％ SDS-PAGE凝胶(NuPAGE，Thermo Fisher)分离。将对应于单体、交联物种(约45-50kDa)的区域切片并用胰蛋白酶和Lys-C或胰凝乳蛋白酶在凝胶中消化{Shi,2014；Shi,2015；Xiang,2020}。在有效蛋白水解后，将交联肽混合物脱盐并使用与Q ExactiveTMHF-X HybridQuadrupole-OrbitrapTM质谱仪(Thermo Fisher)耦合的nano-LC 1200(Thermo Fisher)进行分析。将交联肽负载到picochip柱(C18，3μm粒度，
Figure BDA0004126816630000501
孔径，50μm×10.5cm；NewObjective)上，并使用60min LC梯度洗脱：5％ B–8％ B，0–5分钟；8％ B–32％ B，5–45分钟；32％ B–100％ B，45–49分钟；100％ B，49-54分钟；100％ B-5％B，54分钟-54分钟10秒；5％B，54分钟10秒-60分钟10秒；流动相A由0.1％甲酸(FA)组成，且流动相B由80％乙腈中的0.1％ FA组成。QE HF-X仪器以数据依赖性模式运行。将前8种最丰富的离子(质量范围为380至2,000，且电荷状态为+3至+7)通过高能碰撞解离(归一化HCD能量27)碎裂。MS的目标分辨率为120,000，并且MS/MS分析的目标分辨率为15,000。四极分离窗口为1.8Th，并且MS/MS的最大注入时间设置为120ms。MS分析后，通过pLink搜索数据以鉴定交联肽。MS和MS/MS的质量精度分别指定为10和20p.p.m.。其他搜索参数包括作为固定修饰的半胱氨酸脲基甲基化和作为可变修饰的甲硫氨酸氧化。最多允许三个胰蛋白酶缺失切割位点。初始搜索结果是使用默认5％错误发现率获得的，使用靶标-诱饵搜索策略进行估计。如前所述{Shi,2014；Shi,2015；Xiang,2020}手动检查交联光谱。
整合结构建模。使用MODELLER的多模板比较建模方案{Sali,1993}获得Nb的结构模型。接下来，对CDR3环{Fiser,2003}进行了细化，并且除了来自比较建模的5个模型外，还选择了评分前5的环构象用于下游对接。然后通过PatchDock软件的抗体-抗原对接方案将每个Nb模型对接至RBD结构(PDB 6lzg)，所述软件将搜索集中于CDR并优化基于CXMS的距离抑制满意度{Schneidman-Duhovny,2012；Schneidman-Duhovny,2020}。如果DSS交联剂的交联残基之间的Ca-Ca距离在
Figure BDA0004126816630000511
以内，则认为满足抑制。然后通过统计势能SOAP{Dong,2013}对模型进行重新评分。根据SOAP得分，使用评分前10的模型中的抗原界面残基(与Nb原子的距离<
Figure BDA0004126816630000512
)来确定表位。收敛性测量为十个评分最高的模型中的平均RMSD。
RBD-Nb20复合物的结晶、数据采集和结构确定。使用Crystal Gryphon机器人(ArtRobbins)进行结晶试验。RBD-Nb20复合物在17℃下使用沉滴蒸汽扩散法结晶。在含有100mM二甲胂酸钠(pH 6.5)和1M柠檬酸钠的条件下获得晶体。为了采集数据，将晶体转移至补充有20％甘油的储库溶液中，然后在液氮中冷冻。X射线衍射数据是使用10μm直径微光束在GM/CA的先进光子源(APS)颗粒束23IDB处收集的。使用HKL2000处理数据(A.J.McCoy等人，2007)。合并来自六个晶体的衍射数据以获得分辨率为
Figure BDA0004126816630000513
的完整数据集。
使用RBD(PDB 6LZG)和Nb(VHH-72,PDB 6WAQ)的晶体结构作为搜索模型，通过Phaser(P.D.Adams等人，2010)中的分子置换法确定结构。初始模型在Phenix(P.Emsley等人，2004)中进行了细化，并在COOT(C.J.Williams等人，2018)中进行了调整。模型质量通过MolProbity(T.D.Goddard等人，2018)进行检查。表3在列出最终细化统计数据。
Nb21比较建模是在MODELLER中使用Nb20结构作为模板进行的。所有结构可视化图均使用UCSF ChimeraX(F.H.Niesen等人，2007)制备。
Nb稳定性测试。对于稳定性测试，将Nb洗脱并收集在SEC运行缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.5)中，然后浓缩至1ml(1mg/ml)。将0.5ml的浓缩Nb通过在液氮中快速冷冻冻干，然后在真空离心蒸发浓缩器(speed-vac)中干燥。然后使用ddH2O来重构Nb。另外0.5ml通过使用便携式网孔式雾化器喷雾器(MayLuck)雾化。没有观察到明显死体积。将气雾剂收集在微量离心管中。如上所述进行SEC分析和假病毒中和测定。
尺寸排阻色谱法(SEC)。将重组RBD和所选Nb以1:2的摩尔比混合并在4℃下在SEC缓冲液中孵育1小时。通过SEC(Superdex75，GE LifeSciences)对复合物进行分析。通过280nm处的紫外光吸光度检测蛋白质信号。
数据采集和结构确定。收集晶体并在液氮中冷冻。数据采集是在先进光子源的GM/CA@APS的颗粒束23-ID处进行的。使用直径为10或20μM的微光束来获取所有衍射数据。
表1.单体RBDNb和多价构建体的生物物理性质、生物化学性质和功能性质的总结
Figure BDA0004126816630000521
Figure BDA0004126816630000531
Figure BDA0004126816630000541
Figure BDA0004126816630000551
Figure BDA0004126816630000561
Figure BDA0004126816630000571
Figure BDA0004126816630000581
Figure BDA0004126816630000591
Figure BDA0004126816630000601
Figure BDA0004126816630000611
Figure BDA0004126816630000621
表2.来自不同表位的Nb的交联的总结
Figure BDA0004126816630000622
Figure BDA0004126816630000631
Figure BDA0004126816630000641
表3.X射线衍射数据采集和细化统计
Figure BDA0004126816630000651
括号中的数字表示最高分辨率壳层的值。
Figure BDA0004126816630000652
其中
Figure BDA0004126816630000653
是测量的反射的强度，并且
Figure BDA0004126816630000654
是所有对称相关反射的平均强度。
bCC1/2是半个数据集的相关系数。
Figure BDA0004126816630000655
实测
Figure BDA0004126816630000656
计算|
Figure BDA0004126816630000657
实测
Figure BDA0004126816630000658
其中F实测和F计算是实测的和计算的结构因子。
Figure BDA0004126816630000659
实测
Figure BDA00041268166300006510
实测
Figure BDA00041268166300006511
其中
Figure BDA00041268166300006512
是在细化之前随机选择并留出的总反射的约5％的测试数据集。
表4.
Figure BDA0004126816630000661
Figure BDA0004126816630000671
Figure BDA0004126816630000681
Figure BDA0004126816630000691
Figure BDA0004126816630000701
Figure BDA0004126816630000711
Figure BDA0004126816630000721
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实施例2.可吸入纳米抗体(PiN-21)在超低剂量下预防和治疗叙利亚仓鼠中的SARS-CoV-2感染
到2021年1月，即首次报告严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)爆发一年后(P.Zhou等人，2020)，已有接近1亿人感染了这种高度传播性病毒，导致全世界显著发病率和死亡率。除疫苗以外，还迫切需要开发创新性且具有成本效益的治疗剂来对抗COVID-19大流行(L.DeFrancesco 2020；F.Krammer 2020)。使用高滴度恢复期血浆(CP)进行早期治疗可降低老年人患严重疾病的风险(R.Libster等人，2021)，但是CP受供应限制。主要从COVID-19患者中分离出来用于重组生产的强效中和单克隆抗体(mAb)已被开发用于被动免疫疗法(J.Hansen等人，2020；B.Ju等人，2020；S.J.Zost等人，2020；L.Liu等人，2020；D.F.Robbiani等人，2020；T.F.Rogers等人，2020；Y.Cao等人，2020；P.J.M.Brouwer等人，2020；M.A.Tortorici等人，2020；S.Jiang等人，2020)。在诸如鼠类、仓鼠和非人灵长类动物(NHP)的COVID-19疾病动物模型中对mAb的体内评估提供了对功效以及其改变感染过程的机制的重要见解(A.Baum等人，2020；K.H.Dinnon,3rd等人，2020；J.F.Chan等人，2020；V.J.Munster等人，2020；J.Yu等人，2020；W.Deng等人，2020；C.Munoz-Fontela等人，2020；A.L.Hartman等人，2020；S.H.Sun等人，2020；A.Chandrashekar等人，2020)。虽然mAb疗法为治疗患者的轻度症状发作带来了希望，但它们仍然需要极高的施用剂量-通常几克用于静脉内(iv)注射(P.Chen等人，2021；D.M.Weinreich等人，2021)。有效中和需要高剂量反映了SARS-CoV-2毒力、发病机制以及众所周知的静脉内递送这些相对较大的生物分子穿过血浆-肺屏障以治疗肺部感染的低效率(J.S.Patton等人，2007)。此外，批量生产的相关高成本和挑战可进一步限制mAb在全球范围内的广泛临床使用(L.DeFrancesco,2020)。
开发了骆驼科动物单结构域抗体片段或纳米抗体(Nb)，其主要靶向SARS-CoV-2刺突(S)糖蛋白的受体结合结构域(RBD)进行病毒中和(S.Jiang,C.Hillyer,L.Du,2020；Y.Xiang等人，2020；M.Schoof等人，2020；R.Konwarh,2020；D.Wrapp等人，2020)。高度选择的Nb和多价形式获得的高中和效力与一些最成功的SARS-CoV-2中和mAb相当或甚至更好(根据质量)。特别地，一种超强效同三聚体构建体匹兹堡可吸入纳米抗体21(PiN-21)在低于0.1ng/ml下在体外有效阻断了SARS-CoV-2感染性(Y.Xiang等人，2020)。与mAb相比，Nb的生产成本要低得多。此外，亲和力成熟的超强效Nb的特征在于高溶解度和稳定性(Y.Xiang等人，2021)，其有助于药物缩放、储存和运输，所有这些对于应对流行病都至关重要。Nb的优异物理化学性质和小尺寸提高通过雾化有效肺部递送的令人兴奋的可能性，具有快速起效、高局部药物浓度/生物利用度和提高的患者依从性(无针)的特征,这可使大量SARS-CoV-2感染患者受益(J.S.Patton,P.R.Byron,2007；Y.Xiang等人，2020；M.Schoof等人，2020；W.Liang等人，2020)。然而，尽管有前景，但迄今为止还没有报告成功的体内研究。由于它们的小尺寸和缺乏Fc介导的免疫效应子的功能(所述功能通常是增强mAb的体内中和活性所需的)，所以单体Nb的药代动力学较差(约15kDa)(F.Nimmerjahn,2005；A.Schafer等人，2021；S.Bournazos等人，2017)，引发了对基于Nb的疗法的担忧。尚不清楚SARS-CoV-2Nb的高体外中和效力是否能够转化为体内治疗益处。
本研究系统性地评价了PiN-21用于预防和治疗感染SARS-CoV-2的叙利亚仓鼠的功效，所述仓鼠模拟中度至重度COVID-19疾病。这项研究提供了直接证据，表明PiN-21的超低施用可有效治疗病毒感染。值得注意的是，可吸入PiN-21气雾剂来靶向呼吸道感染，从而大大降低病毒载量并预防肺损伤和病毒性肺炎。这种基于Nb的新型疗法显示出治疗早期感染的巨大潜力，并且可提供稳健且可负担的解决方案来解决当前健康危机。
PiN21可有效保护和治疗叙利亚仓鼠中的SARS-CoV-2感染。为了评估PiN-21的体内功效，将12只仓鼠分为两组，并通过气管内(IT)途径感染9x 104噬斑形成单位(p.f.u.)的SARS-CoV-2。感染后不久，将Nb以0.6mg/kg的平均剂量鼻内(IN)递送(图23A)。每天监测动物的体重变化和疾病的临床体征。感染后5天(d.p.i.)对一半动物实施安乐死，并且其余动物在感染后10天实施安乐死。通过噬斑测定测量来自安乐死动物的肺样品中的病毒滴度。在感染后2天和感染后4天收集鼻洗液和咽拭子以测定上呼吸道中的病毒载量。与已公布的研究(T.F.Custodio等人,2020；L.Hanke等人,2020)一致，将仓鼠IT接种SARS-CoV-2导致强烈感染，感染后7天所有动物的体重迅速减轻高达16％并且在恢复前到感染后10天所致的体重减轻恢复和逆转。然而，同时IN递送PiN-21消除了受感染动物中的任何显著体重减轻(图23B)。这种显著保护伴随着肺中病毒滴度的降低，与感染后5天的对照相比，肺组织中的病毒滴度相应平均降低4个数量级。(图23C)。感染性病毒到感染后10天基本被清除。(图23C)。一致地，通过逆转录酶(RT)-qPCR，病毒基因组RNA(gRNA)的3-对数减少在感染后5天和感染后10天明显。(图26A-26B)。
值得注意的是，在感染后2天在所有PiN-21治疗的动物的上呼吸道(URT)，包括鼻洗液和咽拭子中检测不到病毒。这与存在不同水平的感染性病毒的对照组明显不同(图23D-23E)。此外，六只PiN-21治疗的动物中有五只在感染后4天仍然被保护免于可检测到的感染。URT中gRNA的急剧减少进一步支持了所述结果(图26C-26D)。总之，这证明PiN-21的高体外中和效力可转化为体内治疗益处，而与Fc介导的免疫反应无关。PiN-21可通过快速和大幅抑制URT和下呼吸道(LRT)两者中的病毒复制而有效保护仓鼠中的SARS-CoV-2感染。
先前的研究揭示，在动物模型中，临床mAb对COVID-19治疗(感染后)的效果不如预防(感染前)，这可能反映了SARS-CoV-2的毒力、病毒复制速度和快速症状发作(A.Baum等人,2020；A.L.Hartman等人,2020；W.Guan等人,2020)。因此，评估了PiN-21的治疗潜力，因为它在共同施用时非常有效。为了探索第二种感染途径，将仓鼠IN接种3x 104p.f.u.的SARS-CoV-2。将PiN-21或对照Nb(0.6mg/kg)在感染后6小时(h.p.i.)IN递送至动物。每天监测动物体重，收集咽拭子和鼻洗液，然后在感染后6天实施安乐死。(图27A)。与IT途径类似，将仓鼠IN感染SARS-CoV-2导致对照动物中的急剧体重减轻。使用PiN-21的鼻内治疗在整个评估期间显著减少体重减轻(图27B)，与同一模型中临床mAb的结果相似，尽管使用显著更高的剂量。在感染后2天和感染后4天，在鼻洗液和咽拭子中发现病毒滴度的小于100倍降低。(图27C-27D)。此外，在感染后6天在肺组织中检测不到感染性(图27E)，表明病毒已被主要清除。可能需要对早期时间点进行分析，以更好地了解Nb治疗对病毒的抑制作用。
PiN21雾化以超低剂量有效地治疗感染SARS-CoV-2的仓鼠。评价了通过吸入进行的肺递送。为了评价构建体尺寸和药代动力学对肺摄取的影响，将单体Nb21和PiN-21与Nb融合，所述Nb以高亲和力结合人和啮齿动物的血清白蛋白(Alb)，以生成两种血清稳定构建体(Nb-21Alb和PiN-21Alb)(Z.Shen等人,2020)。使用便携式网孔式雾化器，将Nb21Alb、PiN-21和PiN-21Alb雾化，并通过假病毒中和测定评价其雾化后中和活性。所有构建体在体外都保留了高中和效力(图28B)。雾化后回收的Nb的量与构建体的尺寸呈负相关(图28A)。此外，虽然Nb-21Alb的回收率最高，但雾化后体外中和活性大大低于其他构建体，因此Nb-21Alb被排除在下游治疗分析以外。
接下来，比较了两种超强效构建体PiN-21和PiN-21Alb在仓鼠中的靶向雾化递送。将Nb使用雾化器(Aerogen，Solo)雾化，其产生质量中值空气动力学直径为约3μm的小气雾剂颗粒(表5)。将动物在施用后8小时和24小时处死，以评估从各种呼吸隔室和血清中回收时的Nb分布和活性(图24A)。与使用便携式雾化器的结果一致，发现PiN-21的吸入剂量为PiN-21Alb的大约两倍(在第8小时，41.0μg或0.24mg/kg(对于PiN-21)对比23.7μg或0.13mg/kg(对于PiN-21Alb))(表5)，而如通过噬斑减少中和试验(PRNT50)评估的SARS-CoV-2中和活性在两种Nb构建体雾化后基本保持不变(图24B)。
在整个呼吸道中和血清中检测到两种Nb构建体的中和活性。在气道内，中和活性主要与支气管肺泡灌洗(BAL)液相关，其次是气管抽吸液、喉部洗液和鼻洗液样品(图24C-24D)。与吸入后8小时相比，发现吸入后24小时BAL(而非血清)中Nb的量和活性显著降低，表明更快清除。此外，Nb与血清白蛋白的缀合不影响气道中的活性，同时血清中的稳定性得到增强。这些数据强调需要超低剂量的超强效PiN-21构建体在体内有效地中和SARS-CoV-2感染性。最后，由于对临床应用至关重要的高稳定性和抗雾化性，PiN-21被优先选择用于进一步评价。
为了通过吸入评估PiN-21的治疗功效，将12只仓鼠IN接种SARS-CoV-2(3x104p.f.u.)，然后在感染后6小时进行PiN-21或对照Nb的单剂量雾化治疗(约0.2mg/kg)。监测动物的体重减轻，每天收集咽拭子和鼻洗液。对动物实施安乐死(感染后3天)并收集肺和气管用于病毒学、组织病理学和免疫组织化学分析(图25A)。值得注意的是，肺部递送PiN-21气雾剂，尽管只有极少量，仍导致经治疗动物体重减轻的显著逆转。在感染后3天在PiN-21中平均体重增加2％，相比之下在对照中5％减轻(图25B)。当与上述实验相比时，对照组中的体重减轻具有高度可重复性。至关重要的是，雾化治疗将肺组织中的感染性病毒减少了6个数量级(图25C)。所述治疗还大大减少了肺中的病毒gRNA(图29C)。此外，观察到鼻洗液和咽拭子中病毒滴度的显著降低(图29A-29B)。这表明通过雾化施用Nb可限制SARS-CoV-2的人际传播。
有效控制PiN-21雾化动物的LRT中的SARS-CoV-2感染。为了了解Nb气雾剂更好地预防和/或改善由SARS-CoV-2感染引起的下呼吸道疾病的机制，对在感染后3天实施安乐死的对照(n＝6)和PiN-21(n＝6)处理的动物进行全肺半定量有序组织学分析(表6-7)。累积得分包括气道、血管和肺泡/肺间质的病理特征。PiN-21雾化保护了大多数动物(5/6)免于严重COVID相关组织病理学疾病，由与Nb治疗的对照相比等级得分下降反映(P<0.0001)(图25D，表8)。对照组中的组织病理学结果与叙利亚仓鼠中SARS-CoV-2接种的先前报告相似(M.Imai等人，2020；S.F.Sia等人，2020)。在PiN-21治疗的动物中观察到的肺部疾病非常轻微(图3E，图30)，其特征在于在大多数动物中没有严重坏死性细支气管炎(5/6),这是在所有对照动物中普遍观察到的病理发现。此外，与在大多数Nb对照中观察到的多灶性和双侧分布相比，单个PiN-21治疗的患有坏死性细支气管炎的动物患有局部疾病(4/6)。与Nb对照相比，细支气管炎还与不太严重的支气管增生和肥大以及合胞体细胞缺失有关。PiN-21治疗的动物中的主要组织学发现是由巨噬细胞和淋巴细胞组成的轻微至轻度血管周围和支气管周围单核细胞炎症。此外，除了已经提及的一只动物外，PiN-21组的间质炎症明显减少且血管通透性降低，如由没有血管周围和肺泡内水肿、出血和纤维蛋白渗出所指示(图30)。
在对照动物中，S抗原在细支气管上皮的细胞质中丰富，在肺泡1型和2型肺细胞中不常检测到。间质和细支气管周围浸润物由大量CD3e+T细胞和CD68+巨噬细胞组成，在病毒S丰富的区域中在细支气管上皮的顶端细胞质中完全没有血管紧张素转化酶2(ACE2)(图25F，上图)。与雾化后惊人的6-log病毒减少一致，S抗原在所有PiN-21治疗的动物中极其稀疏(<1％的允许细胞)，T细胞和巨噬细胞免疫细胞浸润减少，并保留天然顶端细支气管ACE2表达(图25F，下图)。
为了确定PiN-21对下呼吸道的上呼吸道的影响，还对气管进行了组织学检查。在PiN-21治疗的动物中，所有动物的气管都在正常范围内，而在所有对照动物中观察到轻度至中度嗜中性粒细胞和淋巴组织细胞性气管炎，伴随不同程度的变性和坏死，以及节段性增生和肥大(图25F)。总之，这些数据清楚地证明，在早期病程期间给予的PiN-21雾化在减少SARS-CoV-2进入、下呼吸道的允许上皮细胞中的随后复制方面非常有效，并且这进而对病毒脱落具有重大影响。结果是预防疾病，包括对允许上皮细胞的细胞病变效应减少，保留允许细支气管上的ACE2表达，以及炎症细胞向复制位点的募集减少。
这项工作证明三聚体Nb针对叙利亚仓鼠针对SARS-CoV-2感染的高治疗功效。这些研究利用PiN-21的鼻内和气雾剂递送，并且证明Nb治疗有效地靶向深部和局部肺结构如终泡，所述终泡衬有富含ACE2受体的肺泡细胞以有效阻断病毒进入和复制。此外，感染引起的体重减轻与肺病毒滴度相关(皮尔逊r＝-0.7)(图31)，并且这一临床体征可用于指示感染的发生(M.A.Tortorici等人，2020)。值得注意的是，PiN-21在仓鼠中的URT和LRT中几乎完全根除病毒复制和肺病理的能力与最近由临床抗体显示的效果形成对比，所述临床抗体尽管以高剂量(例如，10至50mg/kg)施用，但在同一模型中治疗SARS-CoV-2感染仍然特别具有挑战性(A.Baum等人，2020)。
由于气道解剖结构与小型啮齿动物有很大不同，在小型啮齿动物中使用液滴可看到高度的惯性碰撞，因此可在NHP和人中预期雾化后显著改进的递送。几种具有出色安全性特征的吸入治疗剂已上市销售，并且其中许多正在进行临床试验(J.S.Patton等人，2007；B.L.Laube,2015)。极低沉积剂量的组合可使潜在不利影响最小化。然而，在将这一技术应用于人体试验之前，可能需要进一步临床前分析，包括优先在NHP模型中的广泛毒理病理学研究。PiN-21雾化治疗可为减轻疾病发作和减少病毒传播提供方便且成本有效的解决方案，特别是对于构成主要感染群体的轻度COVID-19患者而言。它还可使住院和门诊环境中的高危人群如老年人、免疫功能低下的个体和婴儿受益。最后，随着逃避临床抗体并减弱疫苗引起的血清学反应的SARS-CoV-2的盛行流行变体出现(N.G.Davies等人，2020；Z.Wang等人，2021；H.Tegally等人，2020；A.J.Greaney等人，2021；E.C.Thomson等人，2020)，这项概念验证研究显示稳定的多表位和多价Nb构建体与PiN-21组合作为气雾剂混合物的用途，所述气雾剂混合物可快速产生以阻断病毒突变逃逸(Y.Xiang等人，2020)。
材料和方法。
伦理学。所进行的动物工作遵守最高水平的人道动物护理标准。匹兹堡大学获得了实验动物护理评估和认证协会(AAALAC)的完全认可。所有动物工作均按照美国国立卫生研究院(NIH)发布的实验室动物护理和使用指南的标准并且根据动物福利法指南进行。所有动物研究均遵守公共卫生服务政策中关于实验室动物人道护理和使用的原则。匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准并监督了这些研究的动物方案(#20067405)。
生物安全性。所有与SARS-CoV-2相关的工作都是在匹兹堡大学疫苗研究中心(CVR)和区域生物防护实验室(RBL)的生物安全3级(BSL-3)条件下进行的。在处理感染性样品或与动物打交道时通过电动空气净化呼吸器(PAPRs；Versaflo TR-300；3M，St.Paul，MN)为所有人员提供呼吸保护。使用Peroxigard消毒剂(1:16稀释)进行液体和表面消毒，而固体废物、笼养和动物粪便则在高压灭菌器中进行蒸汽灭菌。
纳米抗体生产。PiN-21基因(ANTE-CoV2-Nab21TGS)由Synbio Biotechnologies合成，并如前所述克隆到pET-21b载体中(Y.Xiang等人,2020；Y.Xiang等人,2021)。Nb21Alb和PiN-21Alb是通过将人血清白蛋白结合Nb(Z.Shen等人,2020)亚克隆到Nb21和PiN-21构建体的N末端中而产生的。将质粒转化到BL21(DE3)细胞中，并在37℃下涂铺在含有50μg/ml氨苄西林的LB-琼脂上过夜。挑取单个菌落并在LB肉汤中培养以达到约0.5-0.6的OD，之后在16℃下IPTG(0.5mM)诱导过夜。然后收获细胞，超声处理并用裂解缓冲液(1xPBS，150mM NaCl，含蛋白酶抑制剂的0.2％ TX-100)在冰上裂解。细胞裂解后，将his标记的Nb通过钴树脂纯化，并使用咪唑缓冲液自然洗脱。随后将洗脱的Nb透析到1x DPBS，pH 7.4中。对于动物研究，使用ToxinEraserTM内毒素去除试剂盒(Genscript)除去内毒素，并使用ToxinSensorTM显色LAL内毒素测定试剂盒(Genscript)测量内毒素水平，以确保<1EU/ml。使用前使用0.22μm离心过滤器(Costar)对蛋白质进行无菌过滤。
病毒学。将SARS-CoV-2/慕尼黑-1.1/2020/929(慕尼黑)(MOI为0.03)添加至25T175中Vero E6细胞的汇合单层。在37℃、5％(v/v)CO2下孵育1小时后，添加20ml/烧瓶补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS；Life technologies)、1％(v/v)l-谷氨酰胺(Gibco)和1％(v/v)青霉素/链霉素(pen-strep；Life technologies)的病毒生长培养基[DMEM(杜尔贝科氏改良的伊格尔氏培养基；Gibco)并继续孵育66-72小时，直到观察到细胞病变效应。收集含有病毒的上清液，并通过在4℃下以3500rpm离心30分钟来澄清。将澄清的病毒上清液等分并储存在-80℃。
噬斑测定：将样品在Opti-MEM(Gibco)中制备并一式两份添加至六孔板(Fisher；200μl/孔)中的汇合Vero E6单层。在37℃、5％CO2下孵育1小时后，添加2ml/孔含有0.1％(w/v)免疫扩散琼脂糖(MP Biomedicals)的病毒生长培养基并继续孵育72小时。在室温下将板用2ml/孔甲醛(用10％-15％(v/v)甲醇稳定的37％(w/v)甲醛；Fisher Scientific)固定15分钟。丢弃琼脂糖和固定剂，并添加1ml/孔于10％(v/v)甲醇中的1％(w/v)结晶紫(均为Fisher Scientific)。将板在室温下孵育20分钟，然后用水充分冲洗。然后对噬斑进行计数。
一般动物工序。叙利亚仓鼠(3-6个月大的雄性和雌性)获自Charles River,MA。对于程序(病毒感染、咽拭子和鼻洗液收集)，每只动物都用3％-5％异氟烷镇静。在感染前测量所有动物的基线体重。在用SARS-CoV-2激发后，每天两次监测动物是否有COVID-19疾病的迹象(毛皮褶皱、驼背姿势、呼吸困难、厌食、嗜睡)。在研究期间每天一次测量体重。在尸检时，收集小块肺用于病毒载量测定。使用超薄拭子(PuritanTMPurFlockTM超无菌植绒拭子)收集咽拭子，将其置于含有双强度抗生素-抗真菌剂(anti-anti；Life technologies)的Opti-MEM(Invitrogen)中。使用500μl含有anti-anti的PBS收集鼻洗液。将所有样品储存在-80℃直到病毒载量测定。将整个气管和肺收集在Opti-MEM、Trizol或4％ PFA中分别用于病毒滴定、RT-qPCR和组织病理学检查。
在异氟烷麻醉下，将仓鼠通过IT施用来用9x 104p.f.u.(300μl)的SARS-CoV-2感染，然后立即IN施用100μg(每鼻孔50μl)的PiN-21或对照Nb。
在异氟烷麻醉下，将仓鼠用3x 104p.f.u.的SARS-CoV-2感染(每鼻孔50μl)。在感染后6天，向动物施用100μg(每鼻孔50μl)的PiN-21(n＝6)或对照Nb(n＝6)。
通过气雾剂途径向仓鼠施用PiN-21和PiN-21Alb，并在施用后8小时(n＝3)和24小时(n＝3)处死。
在异氟烷麻醉下，将仓鼠用3x 104p.f.u.的SARS-CoV-2鼻内感染(每鼻孔50ul)。在感染后6天，通过气雾剂途径向动物施用PiN-21(n＝6)或对照Nb(n＝6)。
支气管肺泡灌洗(BAL)收集。带有气管的肺是从安乐死的动物收获的。将Sovereign进料管(Covetrus)切成最佳长度，并在放入气管之前连接至含有3ml含anti-anti的PBS的5ml注射器(BD)。将PBS轻轻推入肺部，直到它们完全膨胀，然后将液体(BAL)抽回到注射器中。
样品提取和加工。对于组织，收获100-200mg组织，悬浮于补充有2X anti-anti的1ml Opti-MEM中，并使用D2400匀浆器(Benc hmark Scientific)均质化。直接分析来自拭子和鼻洗液的洗脱液。通过将组织匀浆(100μl)接种到Vero E6细胞上来进行病毒分离(Hartma n等人，2020)。为了制备RNA，将组织匀浆、拭子洗脱液或鼻洗液(100μl)添加至400μl的Trizol LS(Ambion)中，并通过涡旋充分混合。为确保病毒灭活，将样品在室温下孵育10分钟，并在从BSL-3设施中取出之前在-80℃下储存过夜。随后在-80℃下储存或在BSL-2进行RNA分离和一步RT-qPCR分析。根据制造商的说明书，使用Direct-zol RNA纯化试剂盒(Zymo Research)从这些样品中提取RNA。如前所述(W.B.Klimstra等人，2020)，通过靶向SARS-CoV-2核衣壳(N)区段的RT-qPCR检测病毒RNA。所使用的引物为正向引物：2019-nCoV_N2F(TTACAAACATTGGCCGCAAA,SEQ ID NO:181)，反向引物：2019-nCoV_N2R(GCGCGACATTCCGAAGAA,SEQ IDNO:182)和探针：2019-nCoV_N2probe(FAM-ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-BHQ1,SEQ ID NO:183)。PCR条件和标准曲线生成如前所述进行(W.B.Klimstra等人，2020)。数据按组织重量归一化，并如前所述(W.B.Klimstra等人，2020)报告为通过将来自未知样品的循环阈值(CT)与来自正义SARS-CoV-2vRNA标准曲线的CT值进行比较而确定的RNA拷贝数。使用GraphPad Prism，版本9生成图。
中和测定。将Nb或仓鼠血清稀释液(100μl)与100μl的含有75p.f.u.病毒的SARS-CoV-2(慕尼黑：P3病毒)在Opti-MEM中混合。将血清-病毒混合物(总共200μl)在37℃下孵育1小时，然后将它们逐滴添加到六孔板中的汇合Vero E6细胞单层上。在37℃、5％(v/v)CO2下孵育1小时后，将2ml的补充有10％(v/v)FBS和2×anti-anti的DMEM中的0.1％(w/v)免疫扩散琼脂糖添加至每个孔中。在37℃、5％(v/v)CO2下孵育72小时后，除去琼脂糖覆盖物，并在室温下将细胞单层用1ml/孔甲醛[用10％-15％(v/v)甲醇稳定的37％(w/v)甲醛]固定20分钟。丢弃固定剂，并添加1ml/孔于10％(v/v)甲醇中的1％(w/v)结晶紫。将板在室温下孵育20分钟并用水充分冲洗。然后对噬斑进行计数，并计算80％和/或50％噬斑减少中和滴度(PRNT80或PRNT50)(Y.Xiang等人，2020；W.B.Klimstra等人，2020)。SARS-CoV-2阳性恢复期患者血清和初始人血清分别用作阳性对照和阴性对照，并进行未感染的细胞以确保病毒中和具有特异性。
纳米抗体雾化。仓鼠气雾剂暴露于纳米抗体是如之前针对啮齿动物所述(S.A.Faith,2019)在Aero3G气雾剂管理平台(Biaera Technologies,Hagerstown,MD)的控制下进行的。将仓鼠装入金属暴露笼中，并通过移动转运车运送至RBL中的空气生物学室。在那里，它们被转移到III级生物安全柜中，并被放置在啮齿动物全身暴露室内。将仓鼠暴露于由Aerogen Solo振动网孔式雾化器(Aerogen,Chicago,IL)产生的含纳米抗体的小颗粒气雾剂12-15分钟(J.Yu等人，2020)。所述系统被设置成推/拉配置，其中在暴露室中具有等体积的输入空气(总计19.5升/分钟(lpm)：7.5lpm发生器，12lpm稀释空气)和等于0.5换气次数/分钟的排气(总计19.5lpm：6lpm采样器，5lpm粒度仪，8.5附加真空)。为了确定吸入剂量，含有10ml的PBS+0.001％消泡剂的全玻璃撞击式滤尘器(AGI；目录号7541-10,AceGlass,Vineland,NJ)附着至腔室，并在6lpm、-6至-15psi下运行。在每次暴露期间，使用在5lpm下运行的空气动力学粒度仪(TSI，Shoreview，MN)在5分钟测量一次粒度。每种气雾剂后进行5分钟空气洗涤，之后将动物放回笼子。评估AGI样品以确定从气雾剂中回收的纳米抗体的浓度。吸入剂量被确定为纳米抗体气雾剂浓度、暴露持续时间和个体仓鼠的分钟通气量的乘积(J.D.Bowling等人，2019)。分钟通气量使用Guyton的公式(A.C.Guyton,1947)确定。
组织学加工和分析。将组织样品在4％ PFA中固定至少24小时，之后从BSL-3中移除且随后在Tissue-Tek VIP-6自动真空渗透处理器(Sakura Finetek)中进行加工，并使用HistoCore Arcadia石蜡包埋机(Leica)包埋在石蜡中。使用RM2255旋转切片机(Leica)生成5μm组织切片，并转移至带正电荷的载玻片上，在二甲苯中脱石蜡，并在分级乙醇中脱水。将组织切片用苏木精和曙红染色用于组织学检查，另外的连续切片用于免疫组织化学(IHC)。Ventana Discovery Ultra(Roche)组织自动染色机用于IHC。表9-11中概述具体方案细节。组织形态学分析由单一委员会认证的兽医病理学家(NAC)进行，他使用施用同种型对照的动物作为基线开发了涵盖组织学发现的多样性和严重性的有序分级得分。组织学标准分为三个部分：气道、血管和间质，结果用于生成累积肺损伤得分。此得分还包括对SARS-CoV-2S抗原的总体免疫反应性程度。表6-7中包括个体动物得分和用于肺评分的具体标准的总结。
多光谱全身成像。使用Mantra 2.0TM定量病理学成像系统(Akoya Biosciences)获取明场和荧光图像。为了使信噪比最大化，使用对用于每个测定和用于DAPI的Opal荧光团具有特异性的合成文库对荧光图像进行光谱分离。将未染色的叙利亚仓鼠肺切片用于创建自发荧光特征，随后使用InForm软件版本2.4.8(Akoya Biosciences)从图像中删除所述特征。
使用网孔式雾化器的纳米抗体雾化。将Nb(Nb21Alb、PiN-21和PiN-21Alb)在1xDPBS中浓缩至1ml(1.5mg/ml)。保存0.5ml作为ELISA和假病毒中和测定的对照。另外0.5ml通过使用便携式网孔式雾化器喷雾器(MayLuck)雾化。没有观察到明显死体积。将雾化液滴收集在微量离心管中。测量浓度以计算蛋白质的回收率。
假型化SARS-CoV-2中和测定。进行了假型中和测定，并如前所述计算IC50(Y.Xiang等人，2020)。
表5.雾化概述。
PiN21 PiN21Alb
暴露时间 10 10
AGl体积（ml） 10 10
AGl浓度(μg/ml） 223.0 129.0
气雾剂浓度(ug/ml) 37.2 21.5
喷雾因子 4.1E-06 2.4E-06
吸入剂量（μg/动物） 41.0 23.7
表6.半定量组织学分析。
Figure BDA0004126816630000861
Figure BDA0004126816630000871
表7.对SARS-CoV-2刺突具有免疫反应性的允许细胞的％。
Figure BDA0004126816630000872
表8.动物组织病理学得分。
Figure BDA0004126816630000873
表9.单重SARS-CoV-2刺突DAB IHC
Figure BDA0004126816630000874
表10.4重荧光IHC肺组
Figure BDA0004126816630000881
实施例3.有效中和纳米抗体通过靶向新的且保守的表位来抵抗SARS-CoV-2的趋同流行变体
2019冠状病毒疾病(COVID-19)大流行对全球健康和经济造成了毁灭性后果。除了疫苗开发外，从恢复期血浆中分离的强效中和mAb(Huang,A.T.等人2020)已被批准用于紧急治疗用途，更多候选物正在准备中(Cohen,M.S.2021；Chen,P.等人2021；Weinreich,D.M.等人2021)。骆驼科动物VHH单结构域抗体或纳米抗体(Nb)也已成功开发用于病毒中和(Koenig,P.A.等人,2021；Bracken,C.J.等人，2021；Schoof,M.等人,2021；Xiang,Y.等人,2020；Walter,J.D.等人，2020；Ahmad,J.等人，2021；Custodio,T.F.等人,2020；Huo,J.等人,2020)。使用RBDSARS-CoV2进行的骆驼科动物免疫和高级蛋白质组学研发生产系统鉴定了>8,000种高亲和力RBD Nb，包括超强效Nb组库(Xiang,Y.等人，2020)。亲和力成熟的Nb具有高度可溶性、稳定性，并且可在微生物中以低成本快速生产(Xiang,Y.等人，2021)。稳定Nb可对用于SARS-CoV-2感染的吸入疗法的雾化具有高度抗性。最近，超强效Nb构建体(PiN-21)的高临床前功效已在敏感COVID-19动物模型中得到成功证明。在非常低的剂量(0.2mg/kg)下,PiN-21吸入治疗在SARS-CoV-2感染后迅速保护动物免于体重减轻，使肺部病毒滴度降低一百万倍，从而大大减轻肺部病理，同时预防病毒性肺炎(Nambulli,S.等人，2021)。因此，有效中和Nb代表了方便且具有成本效益的治疗选择以有助于缓解不断变化的大流行。
刺突糖蛋白(S)上的ACE2受体结合位点(RBS)是COVID-19患者中的血清学反应的主要靶标。RBS是SARS-CoV-2的流行变体中的趋同突变的主要区域。所述变体可增强ACE2结合，导致更高的传播性，逃避临床mAb并降低恢复期和疫苗引发的多克隆血清的中和活性(Wang,P.等人2021；Wang,Z.等人，2021；Zhou,D.等人，2021)。特别关注的变体包括B.1.1.7、B.1.351和P.1(Davies,N.G.等人，2021；Wibmer,C.K.等人，2021；Cele,S.等人，2021)。大流行的长期控制需要开发针对不断变化的毒株具有广泛中和活性的有效干预措施(Davies,N.G.等人，2021)。在此评估了所关注的趋同变体和关键受体结合结构域(RBD)点突变对超强中和Nb的影响。随后通过冷冻电镜确定9种高分辨率结构(包括与S或RBD结合的6种Nb)为高效中和Nb的抗病毒机制提供了重要见解。中和mAb与Nb之间的结构比较揭示了两种抗体种类之间的显著性差异。
有效中和Nb对SARS-CoV-2的趋同流行变体和高度变化的RBD变体具有高度抗性。
进行ELISA以评价6种关键RBD突变(表11)如何影响7种不同且有效的中和Nb的结合(Walter,J.D.等人，2020)。令人感兴趣地，中和Nb通常不受突变影响(图32A、图39)。E484K是例外，它消除了Nb 20和21的超高亲和力。此外，还发现三种Nb(17、20和21)受到双突变体L452R和E484Q的影响，所述突变体是最近在印度毒株中发现的关键RBD突变(Vaidyanathan,G.,2021)。此外，使用假型化病毒中和测定关于Nb中和评价了全球关注的两种流行变体(B.1.1.7UK和B.1.351SA)。这些假病毒完全概括了天然刺突变体的主要突变(图40)。初始SARS-CoV-2毒株(武汉-Hu-1)用作对照。与ELISA结果一致，发现具有关键RBD突变N501Y的UK毒株(B.1.1.7)对所有7种有效中和Nb几乎没有影响(图32B，图41)。含有三个RBD突变(K417N、E484K和N501Y)的SA毒株(B.1.351)大大降低了Nb 20和21的功效，但对其他Nb的功效影响很小。所述结果与最近对源自恢复期和疫苗引发的多克隆血清的中和mAb组库的研究形成对比，其中大多数分离的mAb受到VOC中发现的至少一种突变的显著影响(Wang,Z.等人,2021)。
为了评估抵抗未来突变的潜力，评价了高度中和Nb与潜在未来RBD变体(B62)的结合。B62具有看不见的突变，所述突变在体外变化而获得高ACE2结合亲和力和潜在增强的感染性(图40)。这种高度变化的RBD变体含有9个点突变(I358F、V445K、N460K、I468T、T470M、S477N、E484K、Q498R、N501Y)，包括已确定的和潜在的突变，所述突变共同使ACE2结合的亲和力提高600倍(Zahradník,J.等人，2021)。虽然若干Nb受到B62的显著影响，但Nb 34和105保留了针对这种进化变体的高亲和力。这些惊人的结果促使对这些Nb的广泛中和活性的结构基础的进一步研究。与融合前稳定的S(Hsieh,C.L.等人,2020)或RBD复合的Nb的高分辨率冷冻电镜图谱揭示了三种受变体不同影响的Nb类别，并提供了对其抗病毒机制的见解。
超强效I类Nb和“致命要害”。
I类在高亲和力RBD Nb中占主导地位，并且代表了一些最有效的SARS-CoV-2中和剂。例如，Nb21可以亚-ng/ml中和SARS-CoV-2的临床分离株,这对于单体抗体片段来说是前所未有的。为了更好地理解I类Nb在S三聚体背景下的中和机制，我们使用冷冻电镜分辨了与S结合的Nb21的结构。
Nb21结合呈向上和向下构象的RBD。存在两大类与Nb21结合的刺突：i)一个向上RBD和两个向下RBD(分辨率为
Figure BDA0004126816630000901
)和ii)两个向上RBD和一个向下RBD
Figure BDA0004126816630000902
(图33A，图42(A-C))。由于RBD的高柔性，我们用Nb21对一个向下RBD进行了局部细化以分辨结合界面(图42C)。Nb21通过两条β链结合RBD的延伸外部环区。相互作用由所有三个CDR环介导(图33B)。局部密度图谱显示Nb21的R31与RBD的F490之间的潜在阳离子-π相互作用，以及Nb21的R31和Y104与RBD的E484之间的极性相互作用网络。这四个残基位于Nb21:RBD界面的中心，构成主要相互作用位点(图33C，图48A)。
与ELISA和假病毒测定结果一致，相对结合能计算(方法)揭示RBD上的E484是超强效Nb21的“致命要害”(图43A)。E484在RBD上的所有界面残基中提供最高结合能。此外，它促进诸如F490、F489、N487、Y486和V483的相邻残基的网络参与Nb21结合。E484K突变可通过与R31(CDR1)的静电排斥显著破坏界面堆积的稳定性，随后破坏R31与F490(RBD)之间的阳离子-π堆积相互作用。R31(R31D)上的简单电荷反转未能恢复盐桥和与E484K突变体的结合(图43B)。同样，E484Q(来自印度变体)也可破坏E484:R31的关键盐桥和邻近的相互作用网络，导致与RBD结合的重大损失(图32)。
总之，I类Nb结合RBS表位，并且可通过直接阻断ACE2结合而有效抑制病毒(图33D)。然而，由于表位是刺突上保守性最低的区域之一，因此临界点突变(E484K/Q)可显著降低I类Nb的超高亲和力。关键E484K/Q突变在B.1.1.7VOC(其是在美国和欧洲感染病例中占主导地位的变体)中明显不存在，并且仍然可被Nb 20和21有效中和(Washington,N.L.等人，2021)。
II类Nb结合非RBS表位，但仍有效地阻断ACE2结合。
II类Nb(95、34和105)可在低于150ng/ml下有效中和SARS-CoV-2。具有S的Nb 95和34的冷冻电镜分析揭示了总体分辨率分别为
Figure BDA0004126816630000911
和
Figure BDA0004126816630000912
的两大类复合物：1)二个-向上-一个-向下RBD(图34A，图44(A-B)，图45A)和2)具有高柔性的三个-向上RBD(图44C)。另一方面，Nb105形成细长结构，在所有RBD向上构象中具有S的两个拷贝(图46(A-B))。这种延伸的二聚体结构在EM网格上的强烈偏好取向限制了高分辨率重建以准确定义Nb105:RBD界面。因此，为了对表位作图，组装了Nb21:Nb105:RBD的三聚体复合物。所得的约60KDa复合物是稳定的，并通过冷冻电镜在
Figure BDA0004126816630000921
下分辨(图34B，图46(C-F))。
II类Nb主要通过相对长的CDR3环(17个或更多个残基)上的疏水性残基结合RBD(图34(C-E))。Nb95:RBD和Nb105:RBD的主要相互作用通过局部细化(方法)分辨。在分配大体积侧链如酪氨酸和苯丙氨酸(图48C)后，可基于建模推断出潜在极性相互作用。对于Nb95，CDR3残基D99和K100的侧链分别与RBD的K378和Y380的侧链形成离子或氢键合相互作用(图34C)。Nb95的Y55的侧链也与RBD的F374的主链羰基形成氢键。除了那些极性相互作用以外，Nb95的CDR3残基P110和F109与RBD残基V503和Y508形成疏水相互作用，并且Nb95的残基Y55和Y106与RBD残基Y369簇集形成芳香族相互作用(图34C，图48B)。与Nb95类似，Nb105识别具有分别位于M379-P384和Y369-F377的两个疏水性补片中的CDR3 W104和Y106的RBD(图34D)。另一个疏水残基F111夹在V407与R408(RBD)之间，从而形成阳离子-π堆积相互作用。三个疏水相互作用补片围绕RBD的E112与K378之间的静电相互作用(图34D)。
虽然II类Nb不直接与ACE2竞争，但它们仍然可在低nM浓度下有效阻断ACE2结合，与其高中和效力一致(图35H)。ACE2:RBD叠加至Nb:RBD复合物中揭示Nb 105和95与RBD的结合与ACE2的亚结构域II(残基308-326)和N322聚糖重叠，在任何情况下Nb34可与聚糖发生冲突(图3f)。骆驼科动物Nb(Koenig,P.A.等人，2021)和合成构建体(sybodies)(Walter,J.D.等人，2021)的最新晶体结构揭示了类似的结合模式，其中与亲和力成熟的II类Nb(95、34和105)相比中和效力显著更低(即超过100倍)。
III类Nb利用不同的机制来有效地中和病毒。
Nb17锁定所有RBD-向上构象中的刺突。Nb17可在体外中和病毒，IC50为约25ng/ml。值得注意的是，S三聚体上的所有三个RBD均处于开放构象，其中两个具有特别强的密度(图35A、图47(A-D))。Nb17结合半保守表位，包括跨越残基345-356和通常不与RBS重叠的额外残基的区段。此表位位于II类Nb表位的对侧上(图35B)。与Nb21类似，Nb17也利用所有三个CDR进行RBD识别。没有大体积侧链直接涉及界面堆积并有助于超高RBD结合亲和力。相反，小的疏水性残基如Ala、Val和Pro以及极性相互作用是Nb17:RBD界面的主要促成因素(图47G)。3D可变性分析表明，当Nb17结合时，相邻NTD上的Nb17密度堆积更喜欢所有RBD的开放构象。
对Nb17:Nb105:RBD复合物进行重构以表征界面相互作用(图35C，图47(E-F))。Nb17:RBD复合物叠加至ACE2:RBD复合物表明Nb17不能干扰ACE2相互作用(图35D)。结构比对揭示Nb17的CDR3与Nb21重叠以竞争RBD结合(图47H)。
为了进一步探索Nb17有效中和SARS-CoV-2的机制，构建了Nb17:S(超稳定hexapro变体)复合物，并使用蛋白酶K进行了有限蛋白水解实验，以评估全部-RBD-向上构象的影响(方法)。与难以消化的S本身或S:Nb105复合物相比，Nb17与S的结合似乎以类似于hACE2结合的方式增加S的蛋白水解速率。在此，具有超高亲和力，Nb17可将S1锁定在特定开放构象中，其促进未编程的刺突融合后转变和S1的不成熟切割(图50A)(Zhou,H.等人，2019；Walls,A.C.等人，2019；Piccoli,L.等人，2020)。
由于L452R突变，Nb17对测试的所有显性天然RBD突变具有抗性，印度变体除外。在此，R在位置452的长侧链可破坏与Nb17上的S30、V96和Q98的相邻残基的界面堆积(图50B)。相比于Nb21:RBD界面，其中E484包埋在界面的核心内部，E484位于Nb17:RBD界面的边缘(图47H)。因此，虽然E484直接接触Nb17，但突变(E484K和E484Q)不影响RBD结合(图32A)。与B62的超级变体结合的丧失是由两个点突变(I468和T470)引起的(图51B)。
Nb36破坏刺突三聚体的稳定性。尽管Nb36:S复合物高度可溶，但在低温条件下在EM网格上未检测到颗粒。因此，为了表征Nb36:S相互作用，滴定不同浓度的Nb36与S蛋白，并通过负染色EM对复合物进行成像。递增浓度的Nb36与颗粒的增强模糊相一致，这损害了电子显微照片的对比度(图49A)。这一观察结果表明Nb36可破坏刺突的完整性。为了对此进行测试，在与用于负染色EM的条件类似的条件下采用了热漂移熔化测定。一致地，Nb36浓度的增加与蛋白质解链温度的降低相关，从而表明Nb36促进S复合物的不稳定性(图49B)。为了对表位进行作图，对Nb36:Nb21:RBD复合物进行重构并通过冷冻电镜成像(图35E，图49(C-E))。分析揭示Nb36表位与Nb17部分重叠，而未表现出与Nb21不重叠(图35F)。所述表位覆盖非RBS区域上的小区段(RBD的残基353-360)以及接触Nb17的不同非RBS表位残基。Nb36以与Nb17明显不同的取向结合RBD。将所述结构叠加到S上揭示Nb36可与三聚体S复合物中的相邻NTD具有显著空间位阻冲突(图35G)。得益于小尺寸，Nb36可将其凸互补位残基插入RBD与相邻的NTD之间，以破坏刺突的稳定性。
分析型SEC被用来检查Nb:RBD复合物的尺寸。分析揭示，Nb36与S的结合导致形成与Nb21:S复合物且令人感兴趣地S本身相比更小的复合物(图50C)。动态光散射(DLS)用于进一步证实负染色和SEC结果。在室温下孵育两小时后，Nb36:S复合物显示比Nb21:S复合物显著更小的半径(Rh)，所述Nb21:S复合物与瞬时形成的Nb36:S复合物具有相同的半径(图50D)。总之，这些数据表明Nb36可通过破坏刺突稳定来有效地中和SARS-CoV-2。由于本研究使用了超级稳定的S变体(HexaPro)，因此Nb36结合可对高度柔性的野生型刺突具有更显著的影响(Hsieh,C.L.等人，2020)。此外，这种去稳定机制是对mAb CR3022的回忆。然而，Nb36以显著更高的中和效力(约7nM)靶向与CR3022完全不同的表位(Xiang,Y.等人，2020；Yuan,M.等人，2020；Huo,J.等人，2020)。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2RBD上的单独Nb互补位及其相关表位(图51C；表1)如下所列：
Nb17
Seq:
HVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSSNAMSWYRQAP GKQRELVASITSGGNADYADSVKGRFTISRDKNTVYPEMSSLKPA DTAVYYCHAVGQEASAYAPRAYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:12)
互补位残基编号：
28、30、31、32、33、34、35、37、47、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、71、73、74、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、107、109
表位残基编号：
345、346、347、348、349、351、352、353、354、355、356、399、448、449、450、451、452、453、454、455、466、467、468、469、470、471、472、482、483、484、489、490、491、492、493、493、494
Nb95
Seq:
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYSMGWFRQAQGKEREFVATINGNGRDTYYTNSVKGRFTISRDDATNTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAADKDVYYGYTSFPNEYEYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:66)
互补位残基编号：
44、45、46、47、57、58、59、60、62、65、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113
表位残基编号：
369、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、403、404、405、407、408、411、412、414、432、435、501、502、503、504、505、508、510
Nb105
Seq:
HVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGRTFSTYGMAWFRQAP GKERDFVATITRSGETTLYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSL KIEDTAVYYCAVRRDSSWGYSRDLFEYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:59)
互补位残基编号：
53、60、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114
表位残基编号：
368、369、370、371、372、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、404、405、406、407、408、409、414、435、436、508
Nb34
Seq:
DVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGFTFSNYVMYWGRQAPGKGREWVSGIDSDGSDTAYASSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNNLKPEDTALYYCVKSKDPYGSPWTRSEFDDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:22)
互补位残基编号：
38、43、44、45、46、47、48、59、60、61、62、63、65、102、103、109、110、111、112、113、116
表位残基编号：
366、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、412、436、437
Nb36
Seq:
HVQLVESGGGLVQAGGSLTLTCAASGRTFSSETMDMGWFRQAPGKEREFVAADSWNDGSTYYADSVKGRFTISRDSAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAAETYSIYEKDDSWGYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:23)
互补位残基编号：
28、33、39、40、104、105、106、107、108、109、110、111、113、114、115、116、118
表位残基编号：
344、345、346、347、348、349、351、352、353、354、355、356、357、396、451、457、464、465、466、467、468、470
Nb21
Seq:
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGLGAHRVGWFRRAPG KEREFVAAIGANGGNTNYLDSVKGRFTISRDNAKNTIYLQMNSLK PQDTAVYYCAARDIETAEYTYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:15)
互补位残基编号：
27、28、29、30、31、33、35、44、45、46、47、48、50、51、52、55、56、57、58、59、70、72、97、98、99、100、101、102、103、104
表位残基编号：
351、446、447、448、449、450、451、452、453、455、456、470、472、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、505、531
Nb20
Seq:
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGAGAHRVGWFRRAPG KEREFVAAIGASGGMTNYLDSVKGRFTISRDNAKNTIYLQMNSLK PQDTAVYYCAARDIETAEYIYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:14)
互补位残基编号：
27、28、29、30、31、32、33、35、45、47、48、49、51、52、55、56、57、58、59、60、72、97、98、99、100、102、103、104
表位残基编号：
351、417、449、450、451、452、453、455、456、470、472、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496
III类RBD Nb属于一类新的中和Nb。
为了系统地研究RBD表位和Nb中和机制，分析了包括Nb:RBD相互作用的所有可用结构(图36A)。表位簇集支持三种不同类别的中和Nb的概念。大多数Nb结合主要覆盖RBS的I类表位(图36(A-B))。I类和II类表位在Nb与mAb之间共享(图36(C-D))。相比之下，III类Nb在所有已表征的中和Nb和mAb中是新颖且独特的(图36E)。III类表位靠近相邻NTD。因此，由于它们的大尺寸强加的空间位阻，接近这些表位对于mAb来说是难以捉摸的。在此，凭借最佳取向和显著更小的尺寸，Nb可靶向相对保守的表位(图51)，其中病毒可具有相对较低的突变耐受性(Starr,T.N.等人，2020)。
与I类Nb相比，II和III类Nb靶向更保守的RBD表位。
为了评估表位保守性，选择并比对了来自沙贝病毒家族的主要进化枝(即，β-冠状病毒或SARS样病毒的谱系B)的12个RBD(Boni,M.F.等人，2020)。每类Nb的主要RBD表位残基以及与RBDSARS-CoV-2的表位序列同一性在图51(A-B)中示出。I、II和III类Nb的中值表位同一性分别为50％(σ＝11.1％)、82.6％(σ＝5.7％)和76.5％(σ＝10.3％)。
还评价了强效中和Nb与RBDSARS-CoV的结合，所述RBD SARS-CoV与RBDSARS-CoV-2共有约73％序列同一性。与表位保守性分析一致，ELISA结果表明，与I和III类Nb不同，有效中和II类Nb(特别是Nb95和Nb105，但不是Nb34)通过靶向高度保守的RBD表位与RBDSARS-CoV-2强烈结合(图51(C-D))。特异性和超强效II类Nb可用于泛-沙贝病毒Nb构建体的进一步生物工程化。
Nb和mAb受流行变体中的突变不同地影响。
为了解独特结合模式如何转化为针对SARS-CoV-2突变体的高抗性，将三种Nb类别与mAb进行了比较。系统地计算和比较了来自Nb和mAb结合的结构的RBD界面残基的包埋表面积(BSA)(图37(A-C))。分析揭示，大多数mAb(83％)使用至少一个突变的RBD残基进行结合，其中60％使用两个或更多个变体残基进行RBD相互作用。相比之下，Nb靶向这些位点的频率要低得多(图37B)，I类Nb除外，它主要识别由E484培养的热点(图37D)。其他类别不直接结合这些变体残基(图37B和图37E)。
许多关键突变位于RBS上这一事实令人感兴趣(图36A)。在选择压力下，所述病毒似乎已经进化出有效的策略来通过优先靶向这种关键功能区域来逃避宿主免疫。特定RBS突变(如K417N和E484K)可帮助优化宿主适应(改进ACE2结合)以实现更高的传播性(Greaney,A.J.等人,2021)。同时，由于RBS是血清学反应的主要目标，所述突变为所得变体提供一种有效的方式来逃避来自血清多克隆抗体的中和压力(Zahradník,J.等人,2021；Starr,T.N.等人，2020；Greaney,A.J.等人,2021；Greaney,A.J.等人,2021)。由于大多数临床mAb源自恢复期血浆，因此它们针对趋同流行变体不太有效(Wang,P.等人,2021；Wang,Z.等人,2021)。从根本上说，这与未与病毒共同进化的中和Nb不同，并且因此对血浆逃逸变体可能不太敏感。实际上，与变体突变一致的中和Nb表位的概率大大低于mAb(图37F)。对于高效和体内亲和力成熟的Nb尤其如此。所述分析与功能数据(图32)一起提供结构基础，以了解有效中和Nb可如何抵抗趋同变体。可以想象，对于SARS-CoV-2的进化变体，相对于mAb，Nb可提供额外的治疗益处。
针对RBD结合的mAb和Nb的系统比较。
编译并分析了所有可用结构，包括56种不同的mAb结合的复合物和23种Nb结合的复合物(表14)。Nb具有的BSA值低于Fab(
Figure BDA0004126816630001001
对比
Figure BDA0004126816630001002
p＝0.055)(图38A)。此外，Nb的BSA分布与Fab不同，并且明显更窄
Figure BDA0004126816630001003
(Mitchell,L.S.和Colwell,L.J.,2018)(图38A)。尽管尺寸较小，但Nb已经进化出多种高亲和力RBD结合策略。它们利用表面残基(尤其是使用CDR3环)比Fab显著更有效地进行RBD接合(图38(B-C))。Nb还具有更高的BSA每界面残基(图38B)。框架(FR)区参与RBD结合(特别是FR2)也明显可能是由于不存在轻链配对(图38C)。与体内亲和力成熟的RBD Nb相比，体外选择的Nb倾向于更广泛地使用高度保守的FR序列进行相互作用，这可导致特异性降低。保守FR的更主导参与表明，体外选择的Nb可能不太特异地与RBD相互作用(图38E和38G)。与Fab相比，Nb结合更凹的表面(方法)以加强相互作用(图38D、38F)。最后，中和Nb更广泛地使用静电相互作用，而两种类型的抗体主要使用疏水相互作用来实现高特异性(图52-53)。
遏制大流行的前景取决于开发抵抗当前和未来的流行SARS-CoV-2变体的有效疫苗和治疗剂。高选择性中和Nb和多价Nb形式代表迄今为止开发的一些最有效的抗病毒剂(Bracken,C.J.等人,2021；Schoof,M.等人，2020；Xiang,Y.等人,2020；Lu,Q.等人,2021)。至关重要地，最近的研究证明了在敏感COVID-19模型中使用超强效可雾化Nb进行SARS-CoV-2感染的吸入治疗的临床前功效和效率(Nambulli,S.等人,2021)。在此，结构分析揭示中和Nb可分组为三个表位类别。I类含有一些迄今为止已鉴定的最有效的SARS-CoV-2中和Nb。诸如Nb 20和21的超强效I类Nb可中和SARS-CoV-2(慕尼黑毒株)，IC50分别为66和22pM(Xiang,Y.等人,2020)。它们靶向可变RBS并且超高结合亲和力不受高度传播性UK变体的影响。然而，I类Nb的RBD结合可通过存在于巴西、南非和印度变体中的单点突变(E484K/Q)消除。II和III类Nb靶向对当前VOC和突变逃逸具有抗性的保守表位。I和II类Nb均通过空间干扰ACE2结合有效地中和SARS-CoV-2。III类Nb结合大型常规抗体无法接近的隐蔽表位。发现III类Nb可采用不依赖于ACE2竞争的不同且独特的中和机制。III类可在100ng/ml或以下有效中和SARS-CoV-2。具体而言，Nb17可将刺突锁定在全RBD向上构象中，这可导致S1的不成熟切割和蛋白酶活性所致的刺突功能丧失。另一方面，Nb36可破坏刺突的稳定性，从而有效地中和病毒。此外，虽然已经证明了超强效三聚体Nb21构建体(PiN-21)的临床前功效(Nambulli,S.等人,2021)，但研究评价了靶向更保守表位的强效II和III类Nb，即用于中和SARS-CoV-2，尤其是已显示逃避临床mAb的巴西、南非和印度毒株的VOC的多表位/多价形式及其组合的体内功效。
总之，结构-功能研究提供了框架来系统地对中和表位进行作图，并了解Nb有效且独特地靶向刺突以抑制病毒及其变体的结构基础和机制。在此提供的新颖结构信息还可帮助“泛-沙贝病毒”和“泛-冠状病毒”疗法和疫苗的合理设计。
方法和材料。
蛋白质表达和纯化。具有编码SARS-Cov-2刺突HexaPro(S)的cDNA的质粒(Hsieh,C.L.等人，2020)是从Addgene获得的。为了表达S蛋白，使用聚乙烯亚胺和3.5mM丙戊酸钠盐用质粒瞬时转染HEK293-ES细胞以提高蛋白质产量。转染3小时后，添加1μM几夫碱以进一步加强蛋白质表达。转染后三天收获细胞培养物，并通过以13,000rpm高速离心30分钟收集上清液。使用Ni-NTA琼脂糖柱纯化上清液中的分泌S蛋白。然后浓缩蛋白质洗脱液，并在由20mM Hepes pH 7.5和200mM NaCl组成的缓冲液中使用Superose 6 10/300柱(Cytiva)通过尺寸排阻色谱法进一步纯化。然后合并纯化的S蛋白并浓缩至1mg/ml。
表达了SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)并且如前所述8纯化。简言之，使用杆状病毒方法，RBD在Sf9昆虫细胞中表达为分泌蛋白质。将FLAG标签和8x His-标签融合至RBD序列的N末端，并且将TEV蛋白酶切割位点插入His-标签与RBD之间。通过镍亲和树脂纯化蛋白质，然后进行过夜TEV蛋白酶处理和尺寸排阻色谱法(Superdex 75)。将纯化的蛋白质浓缩在含有20mM Hepes pH 7.5和150mM NaCl的缓冲液中。RBD突变体(具有His标签)通过Sino Biologics或Acro Biosystems购买。
如前所述8，对纳米抗体基因进行密码子优化并由Synbio合成。使用EcoRI和HindIII限制位点将所有纳米抗体序列克隆到pET-21b(+)载体中。将质粒转化到BL21(DE3)细胞中并涂铺到含有50μg/ml氨苄西林的琼脂凝胶培养基上。将琼脂板在37℃下孵育过夜，并挑取单个菌落用于蛋白质纯化。将细胞培养物在37℃下生长至0.5-0.6的OD600，此时将温度降至16℃并添加0.5-1mM IPTG以诱导蛋白质表达过夜。然后将细胞沉淀，重新悬浮于裂解缓冲液(1x PBS、150mM NaCl、0.2％ Triton-X100和蛋白酶抑制剂)中，并在冰上超声处理。通过以15,000x g离心10分钟收集澄清的细胞裂解物。使用钴树脂捕获His标记的纳米抗体，并用含有咪唑(50mM NaPO4、300mM NaCl、150mM咪唑，pH 7.4)的预冷缓冲液洗脱。使用过滤的1x PBS，使用Superdex 75凝胶过滤柱进一步纯化从His-钴树脂洗脱的纳米抗体。纳米抗体在使用前新鲜使用或快速冷冻并储存在-80℃。
冷冻电镜样品制备和成像。对于与Nb21、Nb34和Nb95复合的S，将每种Nb与S蛋白以5:1的分子比混合，并在4度下孵育30分钟。然后将复合物在含有20mM Hepes pH 7.5和200mM NaCl的缓冲液中稀释，以使S蛋白的浓度达到0.2mg/ml。然后使用FEI VitrobotMark IV将样品施加至1.2/1.3UltrAuFoil栅格(Electron Microscopy Sciences)，所述栅格已进行新鲜辉光放电且投入冷冻于液态乙烷中。所有冷冻电镜数据均在以300kV操作的Titan Krios透射电子显微镜(Thermo Fisher)上收集。对于S和Nb21复合物，图像是在Falcon 3检测器上采集的，标称放大倍数为96,000，对应于
Figure BDA0004126816630001031
/像素的最终像素尺寸。对于每个图像堆栈，约62个电子的总剂量被平均分级分离成约
Figure BDA0004126816630001032
部分的70个部分。EPU 2软件用于自动数据采集。用于采集数据集的散焦值范围为-0.5至-3.5μm。
对于S与Nb95和Nb34的复合物，样品制备和数据采集同S与Nb21的复合物相似，除了数据是在Gatan K3-Summit检测器上采集的。表12-13中总结了数据采集参数的更多细节。
对于S与Nb17和105的复合物，将纯化的纳米抗体与SARS-CoV-2S HexaPro三聚体以2:1摩尔比的纳米抗体与最终浓度为0.1mg/mL的S蛋白混合并在室温下孵育2小时。将冷冻电镜栅格(Quanti foil AU 1.2/1.3 300网格)辉光放电并按照来自参考Bokori-Brown,M.等人，2016(figshare.Media.doi.org/10.6084/m9.figshare.3178669.v1)的方案用氧化石墨烯薄层薄片涂覆。使用FEI Vitrobot Mark IV和3.5μl新鲜制备的纳米抗体:S复合物制备冷冻电镜试样。在投入冷冻之前，将栅格在4℃下在100％湿度中用印迹力-5印迹3秒。将冷冻脱水的栅格转移至配备有Gatan K3direct-电子计数照相机和BioQuan tum能量过滤器的Titan Krios(Thermo Fisher Scientific)透射电子显微镜用于数据采集。使用带有光束倾斜图像偏移数据采集策略的Ser ialEM以3x 3模式和每孔1次拍摄，以-0.5至-2.0μm范围内的标称散焦设置记录试样的影片。影片堆栈是在K3相机的相关双采样(CDS)超分辨率模式下在81,000的标称放大倍数下收集的，得到
Figure BDA0004126816630001041
Figure BDA0004126816630001042
/像素的物理像素尺寸。使每个堆栈曝光5秒，每帧曝光0.1秒，从而生成50帧影片。对于不使用CDS模式的数据集，影片堆栈是在超分辨率模式下以81,000的标称放大倍数收集的，曝光时间为2.5秒并且每帧曝光0.05秒。对于每个堆栈，试样上的总累积剂量为
Figure BDA0004126816630001043
对于三聚体Nb复合物(Nb105:RBD:Nb21、Nb17:RBD:Nb105和Nb36:RBD:Nb21),将两种纯化的Nb与纯化的RBD以1.1:1.1:1摩尔比混合，随后通过尺寸排阻色谱法(SEC)进行精制。对应于三聚体复合物的峰级分用于cryo-栅格制备。使用带有光束倾斜图像偏移数据采集策略的SerialEM以3x 3模式和每孔3次拍摄，以-0.5至-2.5μm范围内的标称散焦设置记录试样的影片。影片堆栈是在K3相机的相关双采样(CDS)超分辨率模式下在165,000的标称放大倍数下收集的，得到
Figure BDA0004126816630001044
/像素的物理像素尺寸。使每个堆栈曝光2.8秒，每帧曝光0.1秒，从而生成28帧影片。对于每个堆栈，试样上的总累积剂量为
Figure BDA0004126816630001045
冷冻电镜数据处理。对于具有Nb21、Nb34和Nb95的S蛋白样品，使用Relion 3.1进行冷冻电镜数据处理。使用在Relion中实施的运动校正程序执行光束诱导的运动校正，以生成来自所有帧的平均显微照片和剂量加权显微照片。使用来自平均显微照片的CTFFIND4估计对比度传递函数(CTF)参数。基于loG的自动拾取程序用于无参考颗粒拾取。对初始颗粒堆栈进行2维分类，并选择代表不同视图的最佳类别平均值作为模板，以用于从剂量加权显微照片进行第二轮自动颗粒拾取。
对于带有Nb21数据的S蛋白，从2,574张显微照片中自动拾取大约900,000个颗粒用于进一步处理。通过使用2x分仓颗粒的2D分类和3D分类，清洁整组颗粒以去除污染物或无意义颗粒。最后，大约135,000个颗粒用于3D自动细化，EMD-22221(EMBD ID)的结构低通过滤至
Figure BDA0004126816630001051
作为参考。这产生了约
Figure BDA0004126816630001052
分辨率(修正的金标准FSC0.143标准)。颗粒被重新提取并用于进一步3D分类为四个类别。含有53％(1-向上-向下RBD)和29％(2-向上-1-向下RBD)颗粒的群集最多的两个类别进行了进一步3D自动细化。为了提高Nb21和RBD的局部密度，通过将软掩模应用于一个向下RBD和Nb21来进行聚焦细化，从而得到RBD和Nb21界面的在
Figure BDA0004126816630001053
至
Figure BDA0004126816630001054
范围内的提高的局部分辨率。将所有图谱使用Relion或DeepEMhancer中的后处理程序进行锐化。局部分辨率由Relion中的ResMap估计。类似的方法也被用于分辨具有Nb95和Nb34的S蛋白的结构。数据处理的详细信息在图42和44-48以及表6-7中示出。
对于其他结构，每个影片堆栈都是使用CryoSPARC live(版本3.0.0)即时处理的(Punjani等人，2017；Punjani等人，2020)。影片堆栈使用补片运动校正对齐，F裁切系数为0.5。使用补片CTF估计每个颗粒的对比度传递函数(CTF)参数。对于Nb:S和2Nb:RBD复合物，分别使用220和
Figure BDA0004126816630001055
高斯斑点自动拾取颗粒。表12中包括2D分类后选择的bin2颗粒数。初始3D体积和诱饵是使用一组重新平衡的2D类别使用从头重建生成的，小批量大小为1000。将2D清理后的颗粒提交给一轮异质细化，使用来自良好2D类别的从头3D体积和来自不良2D类别的诱饵3D体积。基于这些颗粒的坐标和角度信息，从剂量加权显微照片中重新提取具有良好分辨的二级结构特征的3D类别的bin1颗粒。对于小的三聚体复合物，可达到样品的分辨率极限的像素尺寸(而不是bin1像素)用于最终重建以防止过度拟合。对最终颗粒集进行非均匀3D细化(Punjani,A.等人，2020)，然后进行局部3D细化，从而使用金标准傅立叶壳层相关性(FSC)的0.143标准生成具有报告的全局分辨率的最终图谱(表12)。半图谱用于确定每个图谱的局部分辨率，并使用Relion 3.0进行聚焦分类(Kimanius,D.等人，2016；Zivanov,J.等人2018)。对于Nb17:S复合物，将最终颗粒(45,362)与C3对称轴对齐，以将颗粒集扩展至136,086(图48C)。然后创建集中于包括RBD、Nb17和NTD的弧形的掩模，其中二进制图谱扩展10个像素并且软边缘为10个像素。使用pyem(github.com/asar now/pyem)将cryoparc颗粒集转换为relion星型文件,并且聚焦分类通过Relion执行，其中k＝3。所有三个靶向结构域的密度都得到良好分辨的类别被选择用于在CryoSPARC中进一步局部细化。
模型构建和结构细化。为了对具有Nb的全S蛋白进行建模，通过使用Chimera(UCSF)将SARS-Cov2 RBD(PDB ID 7JVB，链B)的原子模型对接到细化冷冻电镜密度中生成RBD模型。使用基于局部细化的冷冻电镜图谱在Coot中对Nb结构从头开始建模，并在Phenix中细化。细化后，将序列更新模型的每个残基在Coot和Phenix中进行手动检查和迭代细化。通过MolProbity验证结构模型。表12-13中列出最终细化统计数据。
CDR3环建模。为优化CDR3环构象，使用'RosettaAntibody3'H3环建模用由NanoNet生成的抑制(距离、二面角和平面角对其进行从头建模(Yang,J.等人2020))。NanoNet是在来自PDB的抗体和纳米抗体的分辨的CDR3环上进行训练的深度残差神经网络，类似于DeepH3(Ruffolo,J.A.等人，2020)。NanoNet独特性来自于它仅将没有框架区的CDR序列(每个均在单个独热编码矩阵中)作为输入。此外，它使用MSE损失并直接预测成对距离和角度(对于角度，它预测正弦值和余弦值以克服循环损失)，而不是使用分类交叉熵损失并尝试预测成对概率分布。NanoNet架构由两个2D残差块组成，随后是每个输出的两个卷积层，以及用于角度的tanh激活函数和用于距离的ReLU(修正线性激活函数)。对于每种纳米抗体，生成100个模型，并手动选择在冷冻电镜密度图谱中最佳拟合的模型。
对于Nb20、Nb21、Nb95、Nb105、Nb34，所生成的模型与没有优化的模型相似。对于Nb17和36，使用NanoNet从'RosettaAntibody3'生成的模型在冷冻电镜图谱中更好拟合，并在密度图谱中进一步细化。
接触热图。如果RBD残基和Ab/Nb残基的任一对原子之间的距离低于
Figure BDA0004126816630001072
的阈值，则所述残基被定义为接触。每个RBD残基的Ab/Nb接触值被计算为所有Ab/Nb接触的平均值。Nb类别使用k均值(k＝3)聚类。
SARS-CoV-2RBD的保守得分。保守得分是通过查询RBD序列从Consurf服务器获得的(Ashkenazy,H.等人，2016)。构建了不同RBD的多序列比对，并使用经验贝叶斯方法计算了进化率。然后通过z-得分方法对进化率进行归一化以计算保守得分，其中较高的得分表示更高的保守性，并且较低的得分表示更高的变异性。
包埋表面积(BSA)的测量。分子的溶剂可及表面积(SASA)由FreeSASA计算(Mitternacht,S.等人，2016)。然后使用等式计算在Nb-RBD复合物情况下的包埋表面积：
Figure BDA0004126816630001071
Nb与相应的最佳匹配Fab之间的结构重叠的测量。使用表位相似性(Jaccard-指数)获得了Nb的最佳匹配Fab。Nb-RBD复合物结构叠加在其最佳匹配的Fab-RBD结构上，并使用ProteinVolume(Chen,C.R.等人，2015)计算蛋白质体积。然后使用等式计算结构重叠：
结构重叠＝[体积(Nb)+体积(RBD)-体积(复合物)]/体积(BD)
界面曲率的测量。界面曲率被计算为抗原或Nb的界面原子的形状函数的平均值。为此，将半径为R
Figure BDA0004126816630001081
的球体放置在界面原子的表面点处。蛋白质的溶剂排除体积内的球体分数是相应原子的形状函数(Connolly,M.L,1986)。
ELISA(酶联免疫吸附测定)。在4℃下将蛋白质(SARS-CoV-2RBD和RBD变体，SARS-CoV RBD)以在包被缓冲液(15mM碳酸钠、35mM碳酸氢钠，pH 9.6)中每孔150ng蛋白质包被到96孔ELISA板上过夜。倾析板，用缓冲液(1x PBS，0.05％ Tween 20)洗涤，并在室温下封闭2小时(1x PBS，0.05％ Tween 20，5％奶粉)。将纳米抗体以至少8种不同的浓度在封闭缓冲液中连续5倍稀释，从10、2.5或0.5μM开始。将抗T7标签HRP缀合的二级抗体1:5000稀释并在室温下孵育1小时。洗涤后，将样品与新鲜制备的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)底物在黑暗中进一步孵育10分钟。在用终止溶液淬灭反应后，在450nm的波长下测量板，其中在550nm处的背景减去。使用Prism Graphpad 9.0处理原始数据并将其拟合到4PL曲线中。计算IC50并计算结合亲和力的倍数变化以生成热图。
对于ACE2竞争性ELISA测定，将超稳定刺突以80ng/ml包被在板上。将纳米抗体在封闭缓冲液中从500nM至32pM连续5倍稀释，添加60ng/孔生物素化hACE2用于竞争。无Nb用作阴性对照。Pierce高灵敏度中性抗生物素蛋白-HRP抗体以1:8000使用。通过将每种Nb浓度的读数除以阴性对照的读数来计算hACE2百分比。然后使用Prism Graphpad 9.0处理数据并将其拟合到4PL曲线中。
分子动力学(MD)模拟设置。SARS-CoV-2RBD和纳米抗体复合物的MD模拟的输入文件是使用CHARMM-GUI(Jo,S.等人，2008)制备的。使用NAMD(Phillips,J.C.等人2005)和amber ff19sb(Tian,C.等人2020)、GLYCAM_06j(Kirschner,K.N.等人2008)、ions(Aqvist,J.1990)与TIP3P水模型(Jorgensen,W.L.,1983)进行MD模拟。将蛋白质在立方体水箱中溶剂化，在所有方向上具有
Figure BDA0004126816630001091
填充。添加钠离子和氯离子以达到150mM的生理盐条件。将所述系统能量最小化10,000步，以去除不良接触。然后，使系统平衡，其中所有重原子被谐波约束，并且使用温度重赋值将温度从0K开始每10,000步升高10K至300K。达到所需温度后，使用从1.0至0的标度逐渐降低谐波抑制，每50,000步递减0.2。MD模拟是在NPT系综下进行的(Martyna,G.J.等人，1994；Feller,S.E.附图,1995)。Langevin动力学用于恒温控制，其中Langevin耦合系数的值和Langevin温度分别设置为5ps和300K。使用周期为100fs且衰减时间为50fs的Langevin活塞法将压力保持在1atm。通过使用SHAKE算法(Ryckaert,J.-P.等人，1977)来约束涉及氢原子的键，所有模拟都使用2fs的时间步长。
MM-PBSA计算的相对能量贡献。对于每个快照，SARS-CoV-2RBD和纳米抗体复合物的200ns轨迹中的每1ns，使用等式计算MM/PBSA的结合能(Gohlke,H.和Case,D.A.2004；Kollman,P.A.等人2000)：
ΔG结合＝G复合物-GRBD-GNb
＝ΔEMM+ΔGPB+ΔG非极性-TΔS
其中是在RBD与纳米抗体之间的气相中计算的分子力学(MM)相互作用能，包括静电和范德瓦尔斯能量；去溶剂化自由能由极性(和非极性)项组成；是纳米抗体结合的构象熵的变化，其在此没有考虑，因为RBD上的结合表位非常稳定，并且比较是在内部进行的。使用AMBER18中的MMPBSA.py模块将结合自由能分解为来自单独残基的相对能量贡献(Miller,B.R.,3rd等人2012)。
假病毒中和测定。293T-hsACE2稳定细胞系和带有荧光素酶报告基因的假型化SARS-CoV-2颗粒(野生型和突变体)购自Integral Molecular。B.1.1.7UK假型化病毒含有所述毒株的所有天然流行突变。SA 501Y.V2含有除del241-243以外的所有天然流行突变，所述del241-243被假病毒的L242H取代所替代(扩展数据图2)。根据制造商的方案一式两份进行中和测定。简言之，将3倍或5倍连续稀释的Nb与假型化SARS-CoV-2-荧光素酶一起在37℃下孵育1小时。每种Nb测试了至少八个浓度。不含Nb的培养基中的假病毒用作阴性对照。然后将100μl的混合物与100μl 293T-hsACE2细胞以3x10e5个细胞/ml在96孔板中孵育。感染在37℃与5％ CO2下进行约72小时。使用海肾-Glo荧光素酶测定系统和发光计以1ms积分时间测量荧光素酶信号。根据阴性对照对来自孔的所获得的相对发光信号(RLU)进行归一化，并计算各浓度下的中和百分比。然后通过Prism GraphPad9.0处理数据以拟合至4PL曲线中并计算logIC50(半数最大抑制浓度)。
通过免疫印迹进行的刺突构象变化分析。将SARS-CoV-2超稳定hexapro(6P)刺突三聚体与hACE2胞外结构域(Acro biosystem，1:10摩尔比)或Nb(1:8摩尔比)在室温下孵育过夜。然后将蛋白质用蛋白酶K(PK，1:50酶与底物比率)在室温下消化15分钟和60分钟。通过与SDS-PAGE负载缓冲液混合并在98℃下加热10分钟来使PK失活。在用Sypro Ruby染料染色或进行免疫印迹分析之前将灭活样品在4％–12％ Bis-Tris凝胶(螺栓)上运行。对于免疫印迹，将抗S2SARS-CoV-2多克隆抗体(Sino biologics，1:2,000稀释)在4℃下用作一级抗体过夜。HRP缀合的山羊抗兔二级抗体以1:5,000稀释度在室温下(Pierce)下使用1小时。ECL底物(Bio-rad)用于产生S2信号，所述信号通过Bio-rad成像仪可视化。将实验重复四次。
蛋白质热漂移测定。使用蛋白质热漂移TM染料试剂盒通过差示扫描荧光法监测在递增浓度的Nb36存在下S蛋白的热变性(Niesen,F.H.等人，2007)。简言之，将用于负染色EM的相同蛋白质样品在含有1mM DTT和1:1000荧光染料(TFS 4461146)的PBS中稀释至100nM的最终测定浓度。最终测定体积为20μL，将1、5、10、100和600nM的Nb36添加至100nM S蛋白的最终浓度。使用实时PCR仪器(StepOneTM)应用1℃/min的温度梯度记录热变性曲线。使用Excel进行数据的分析。蛋白质样品的解链温度由–d(RFU)/dT的图的拐点确定。
负染电子显微镜。对于负染色电子显微镜，将3μl特定浓度的Nb36与S蛋白应用于涂覆有碳膜的辉光放电栅格。将样品留在碳膜上60秒，然后用2％甲酸双氧铀负染色。在以100keV操作的FEI Tecnai 12电子显微镜中，在Gatan Ultrascan CCD相机上在22,000×放大倍率下记录电子显微镜显微照片。
统计分析。在图38(A-D)中在包埋面积和表位曲率的分析中进行双侧学生t检验(假设不等方差)。
表11.显性RBD突变的总结
Figure BDA0004126816630001111
表12.Nb:S复合物的3D重建和模型细化的统计数据。
Figure BDA0004126816630001121
表13.2Nb:RBD复合物的3D重建和模型细化的统计数据。
Figure BDA0004126816630001122
表14.IgG和Nb的结构特征的总结。
Figure BDA0004126816630001123
Figure BDA0004126816630001131
Figure BDA0004126816630001141
Figure BDA0004126816630001151
Figure BDA0004126816630001161
实施例4.鉴定SARS-CoV-2中和纳米抗体的方法和计算机实施方法
本文公开的SARS-CoV-2中和纳米抗体是使用我们的整合蛋白质组学平台对抗原接合的Nb组库进行深入探索、分类和高通量结构表征而开发的。此平台包括一种鉴定一组互补决定区(CDR)3区SARS-CoV-2纳米抗体氨基酸序列(CDR3序列)的方法，其中与对照相比，减少数目的CDR3序列为假阳性，所述方法包括：
a.从用SARS-CoV-2抗原免疫的骆驼科动物获得血液样品；
b.使用所述血液样品获得纳米抗体cDNA文库；
c.鉴定所述文库中每种cDNA的序列；
d.从来自用所述抗原免疫的骆驼科动物的同一或第二血液样品中分离纳米抗体；
e.用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化所述纳米抗体以产生一组消化产物；
f.对所述消化产物进行质谱分析以获得质谱数据；
g.选择在步骤c.中鉴定的与所述质谱数据相关的序列；
h.鉴定来自步骤g.的序列中的CDR3区的序列；以及
i.从步骤h.的CDR3区序列中选择那些具有等于或大于所需的片段化覆盖百分比的序列；其中所述选择的序列包括具有减少数目的假阳性CDR3序列的组。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括产生具有步骤i中鉴定的序列的CDR3肽。CDR3肽可包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:82至SEQ ID NO:152。在一些实施方案中，所述方法进一步包括产生包含具有步骤i中鉴定的序列的CDR3区的SARS-CoV-2纳米抗体。SARS-CoV-2中和纳米抗体可包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:81。
本文还包括计算机实现的方法，所述方法包括：
a.接收SARS-CoV-2纳米抗体肽序列；
b.鉴定所述纳米抗体肽序列的多个互补决定区(CDR)，所述CDR区包括CDR3区；
c.应用片段化过滤器以丢弃所述纳米抗体肽序列的一个或多个假阳性CDR3区；
d.定量所述纳米抗体肽序列的一个或多个未丢弃CDR3区的丰度；以及
e.基于所述纳米抗体肽序列的一个或多个未丢弃CDR3区的定量丰度来推断抗原亲和力。
应当了解，本文相对于各图描述的逻辑操作可实施为(1)运行在计算装置(例如，图22中描述的计算装置)上的计算机实施的动作或程序模块(即，软件)的序列，(2)计算装置内的互连机器逻辑电路或电路模块(即，硬件)，和/或(3)计算装置的软件和硬件的组合。因此，本文所论述的逻辑操作并不限于硬件和软件的任何特定组合。实现是取决于计算装置的性能和其他要求的选择问题。因此，本文中描述的逻辑操作以不同的方式称为操作、结构装置、动作或模块。这些操作、结构装置、动作和模块可实施在软件、固件、专用数字逻辑以及其任何组合中。还应了解，可执行比附图中示出且本文中描述的更多或更少的操作。这些操作也可以与本文中描述的不同的次序来执行。
参考图22，示出了可在其上实现本文所述的方法的示例性计算装置500。应理解，示例性计算装置500只是可在其上实现本文所述的方法的合适计算环境的一个实例。任选地，计算装置500可为众所周知的计算系统，包括但不限于个人计算机、服务器、手持或膝上型装置、多处理器系统、基于微处理器的系统、网络个人计算机(PC)、小型计算机、大型计算机、嵌入式系统和/或分布式计算环境，包括多个上述系统或装置中的任一者。分布式计算环境使连接至通信网络或其他数据传输介质的远程计算装置能够执行各种任务。在分布式计算环境中，程序模块、应用程序和其他数据可存储在本地和/或远程计算机存储介质上。
在计算装置500最基本的配置中，所述计算装置典型地包括至少一个处理单元506和系统存储器504。根据计算装置的确切配置和类型，系统存储器504可为易失性的(如随机存取存储器(RAM))、非易失性的(如只读存储器(ROM)、闪存等)，或这两者的某个组合。这种最基本的配置在图22中以虚线502示出。处理单元506可为执行对计算装置500的操作必要的算术和逻辑操作的标准可编程处理器。计算装置500还可包括用于在计算装置500的各种部件之间传达信息的总线或其他通信机构。
计算装置500可具有另外的特征/功能。例如，计算装置500可包括另外的存储装置，如可移动存储装置508和不可移动存储装置510，包括但不限于磁性或光学盘或带。计算装置500还可包含允许装置与其他装置通信的网络连接516。计算装置500还可具有输入装置514，如键盘、鼠标、触摸屏等。还可包括输出装置512，如显示器、扬声器、打印机等。额外装置可连接至总线，以便有助于在计算装置500的部件之间的数据通信。所有这些装置是本领域中众所周知的，并且无需在此详述。
处理单元506可配置成执行编码在有形计算机可读介质中的程序代码。有形计算机可读介质是指能够提供致使计算装置500(即，机器)以特定方式操作的数据的任何介质。可利用各种计算机可读介质来向处理单元506提供指令以供执行。示例性有形计算机可读介质可包括但不限于在任何方法或技术中实施的易失性介质、非易失性介质、可移动介质和不可移动介质，用以存储信息如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据。系统存储器504、可移动存储装置508以及不可移动存储装置510均为有形计算机存储介质的实例。示例性有形计算机可读记录介质包括但不限于集成电路(例如，现场可编程门阵列或专用IC)、硬盘、光盘、磁光盘、软盘、磁带、全息存储介质、固态装置、RAM、ROM、电可擦除编程只读存储器(EEPROM)、闪存或其他存储器技术、CD-ROM、数字多功能盘(DVD)或其他光学存储装置、磁盒、磁带、磁盘存储装置或其他磁性存储装置。
在示例实现中，处理单元506可执行存储在系统存储器504中的程序代码。例如，总线可将数据运载至系统存储器504，处理单元506从所述系统存储器接收指令并且执行指令。系统存储器504接收到的数据可在由处理单元506执行之前或之后任选地存储在可移动存储装置508或不可移动存储装置510上。
应理解，本文中描述的各种技术可结合硬件或软件，或在适当时结合其组合来实施。本发明公开的主题的方法和设备，或其某些方面或部分可采取实施在有形介质中的程序代码(即，指令)的形式，所述有形介质如软盘、CD-ROM、硬盘驱动器或任何其他机器可读存储介质，其中当将程序代码加载到机器(如计算装置)中并由所述机器执行时，所述机器变为一种用于实践本文公开的主题的设备。在程序代码在可编程计算机上执行的情况下，计算装置通常包括处理器、可由处理器读取的存储介质(包括易失性和非易失性存储器和/或存储元件)、至少一个输入装置以及至少一个输出装置。一个或多个程序可实施或利用结合本发明公开的主题而描述的过程，例如，通过使用应用编程接口(API)、可再用控件等。此类程序可以高级过程或面向对象的编程语言来实施以与计算机系统通信。然而，如果期望的话，程序可以汇编或机器语言来实施。在任何情况下，语言可为编译或解释语言，并且其可与硬件实现组合。
序列表
<110> 匹兹堡大学联邦系统高等教育(UNIVERSITY OF PITTSBURGH-OF THECOMMONWEALTH SYSTEM OF HIGHER EDUCATION)
<120> 冠状病毒纳米抗体及其使用和鉴定方法
<130> 10504-053WO1
<160> 189
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ile His Met Asn Trp Ser Asn Gly Asn Thr Ala Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
His Ala Thr Thr Asn Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Glu Pro Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Val Ala Pro Arg Ile Asn Pro Arg Gly Ser Pro Thr Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Glu Pro Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ala Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Val Gly Pro Arg Phe Asn Pro Arg Gly Ser Pro Thr Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ser Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asp Ile Asn
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ser Ser Trp Thr Gly Val Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Asn Ile Asp Arg Leu His Ser Ala Gly Ser Asp Tyr
100 105 110
Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr His
20 25 30
Ala Thr Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu
35 40 45
Ala Thr Ser Val Trp Leu Asp Asp Ile Ser Arg Asp Ser Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
65 70 75 80
Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Ala Val Lys Gln Arg Val Gly Pro Gly Ile Met Ser
100 105 110
Ala Pro Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 6
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Pro Thr Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Arg Trp Asn Gly Gly Ser Arg Asp Tyr Thr Glu Tyr Ala
50 55 60
Asp Phe Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
65 70 75 80
Met Ile Tyr Leu Gln Met Ile Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser His Gly Val Val Asp Gly Thr Ser Val Asn
100 105 110
Gly Tyr Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Ser Thr Phe Asn Phe Asn
20 25 30
His Ile Asp Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Ser Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Asn Thr Asp Val Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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Ala Trp Arg Phe Gly Pro Thr Gly Val Lys Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ala Ser Ala Glu Arg Val
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Gly Ala Asn Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
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Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Ser
20 25 30
Thr Met Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Val Asp Ser Trp Asn Asp Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Thr Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Arg Thr Glu Arg Gly Val Tyr Asp Tyr Trp Gly Arg
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Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Ala Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Pro Ser Thr Asn Ile Phe Ser Ala Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asp Thr Val Ile Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gly
85 90 95
Thr Ala Tyr Ser Thr Thr Tyr Asn Ser Val Arg Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Met Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Gly Val Ala Tyr Asp Tyr Ser Trp Gly Arg Pro Arg Asn Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Ser Gly Gly Asn Ala Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Asn Thr Val Tyr Pro Glu Met
65 70 75 80
Ser Ser Leu Lys Pro Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Ala Val
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Gly Gln Glu Ala Ser Ala Tyr Ala Pro Arg Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Trp Ser Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Thr Ser Arg Thr Met Ile His Thr Ser Gln Ala Met Pro Ile
100 105 110
Asn Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 14
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ala Gly Ala His Arg Val
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Gly Ala Ser Gly Gly Met Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
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Arg Asp Ile Glu Thr Ala Glu Tyr Ile Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val
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Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Gly Ala Asn Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<220>
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<400> 16
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20 25 30
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35 40 45
Phe Val Ala Leu Asp Ser Trp Asn Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp
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<220>
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Phe Val Ala Ala Asp Ala Trp Asn Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp
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<220>
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<400> 19
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<400> 21
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1 5 10 15
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1 5 10 15
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
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<400> 25
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Arg Phe Ser
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
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<220>
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<400> 29
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Leu Gly Ile Asn
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115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Arg His Tyr
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Ile Asn
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Ser Thr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
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<220>
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<400> 36
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
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<223> 合成构建体
<400> 39
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
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<400> 68
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Pro Gly Arg Thr Phe Ser Thr Ser
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Trp Ser Asn Thr Asn Ile His Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Thr Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gln Gly Gly Trp Gly Leu Thr Gln Pro Ile Ser Val Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 69
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Gly Ala Ile Ser Arg Ser Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Leu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
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1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
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35 40 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ala Gly Ala His Arg Val
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Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
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<223> 合成构建体
<400> 74
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg
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195 200 205
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
275 280 285
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290 295 300
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val Gly
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
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130 135 140
Ser Gly Glu Ser Lys Ser Thr Ser Asn Ser Gln Val Gln Leu Val Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
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Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val Gly Trp Phe Arg Arg Ala
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Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly Ala Asn Gly Gly
195 200 205
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Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Ile Glu Thr Ala
245 250 255
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260 265 270
Leu Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Glu Ser Lys Ser Thr
290 295 300
Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
305 310 315 320
Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala
325 330 335
His Arg Val Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
340 345 350
Val Ala Ala Ile Gly Ala Asn Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Leu Asp Ser
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Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
420
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ala Gly Ala His Arg Val
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
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Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
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195 200 205
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
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Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly Ala Asn Gly Gly Asn
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val
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<210> 79
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
<210> 80
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
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<210> 81
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val
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Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn
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Tyr Tyr Cys Ala Ala Glu Thr Tyr Ser Ile Tyr Glu Lys Asp Asp Ser
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Asn Lys Cys Val Asn Phe
1 5
<210> 165
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 165
Ser Gly Glu Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
1 5 10
<210> 166
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 166
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
1 5 10 15
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<211> 7
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<223> 合成构建体
<400> 167
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
<400> 168
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 169
Glu Trp Val Ala Gly Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Gly Arg
20
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<220>
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<400> 170
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Ser Leu Glu Ile Asn Ser Leu Lys Pro
1 5 10 15
Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25
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Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp
1 5 10
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<223> 合成构建体
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Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
1 5 10 15
Lys Ile Ala Asp Tyr
20
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Ser Leu Glu Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
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Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
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Gly Gly Gly Gly Ser
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Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser
20 25 30
Thr
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ccgctcgagt gctgcggccg cggtgctttt gctttcgccg ctaccgctgc ttttaccttc 60
gctgccacc 69
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cccaagcttg aaggtaaaag cagcggtagc ggcgaaagca aaagcaccgg tggcggtggc 60
agcgaaggt 69
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Tyr Tyr Cys Ala Ala
1 5
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Trp Gly Gln Gly
1
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gcgcgacatt ccgaagaa 18
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<211> 23
<212> DNA
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acaatttgcc cccagcgctt cag 23
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<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 184
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser
20 25 30
Thr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成构建体
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Glu Thr Tyr Ser Ile Tyr Glu Lys Asp Asp Ser Trp Gly Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 186
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Gly Ala Asn Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Arg Asp Ile Glu Thr Ala Glu Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly
115 120 125
Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly
130 135 140
Ser Gly Glu Ser Lys Ser Thr Ser Asn Ser Gln Val Gln Leu Val Glu
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
165 170 175
Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val Gly Trp Phe Arg Arg Ala
180 185 190
Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly Ala Asn Gly Gly
195 200 205
Asn Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
210 215 220
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
225 230 235 240
Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Ile Glu Thr Ala
245 250 255
Glu Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Lys
260 265 270
Leu Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Glu Ser Lys Ser Thr
290 295 300
Ala Ala Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
305 310 315 320
Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala
325 330 335
His Arg Val Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
340 345 350
Val Ala Ala Ile Gly Ala Asn Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Leu Asp Ser
355 360 365
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile
370 375 380
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
385 390 395 400
Cys Ala Ala Arg Asp Ile Glu Thr Ala Glu Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln
405 410 415
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
420
<210> 187
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 187
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Gly Ala Asn Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Arg Asp Ile Glu Thr Ala Glu Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Trp
165 170 175
Val Ala Gly Ile Thr Pro Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Ser
195 200 205
Leu Glu Ile Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Lys Cys Arg Gln Glu Phe Ser Trp Asp Phe Ser Ser Arg Asp Pro
225 230 235 240
Asp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
<210> 188
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成构建体
<400> 188
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Gly Ala His Arg Val
20 25 30
Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
35 40 45
Ile Gly Ala Asn Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Gln Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Arg Asp Ile Glu Thr Ala Glu Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr
145 150 155 160
Tyr Gly Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe
165 170 175
Val Ala Thr Ile Thr Arg Ser Gly Glu Thr Thr Leu Tyr Ala Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ile Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Val Arg Arg Asp Ser Ser Trp Gly Tyr Ser Arg Asp Leu Phe
225 230 235 240
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
<210> 189
<211> 1273
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)
<400> 189
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270

Claims (34)

1.一种冠状病毒中和纳米抗体，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:186。
2.如权利要求1所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:82至SEQID NO:152和SEQ IDNO:185。
3.如权利要求2所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:104和SEQ ID NO:185。
4.如权利要求1或2所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1至SEQID NO:71。
5.如权利要求4所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含一个或多个氨基酸序列的多聚体，所述一个或多个氨基酸序列包括选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:23。
6.如权利要求1-5中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体是包含一个氨基酸序列的三个拷贝的同三聚体，其中所述一个氨基酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQID NO:1至SEQ ID NO:71。
7.如权利要求6所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含SEQ ID NO:186的序列。
8.如权利要求1或权利要求5所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体是包含三个不同氨基酸序列的异三聚体，其中每个不同的氨基酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:71。
9.如权利要求1或权利要求5所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体是包含一个氨基酸序列的两个拷贝的同二聚体，其中所述一个氨基酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQID NO:1至SEQ IDNO:71。
10.如权利要求1或权利要求5中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体是包含两个不同氨基酸序列的异二聚体，其中每个不同的氨基酸序列包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:71。
11.如权利要求1-10中任一项所述的纳米抗体，其中所述氨基酸序列由一个或多个接头序列隔开。
12.如权利要求1所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80或SEQ ID NO:81的序列。
13.如权利要求1-12中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含在相对于SEQID NO:12的位置28、30、31、32、33、34、35、37、47、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、71、73、74、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、107和109处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中所述纳米抗体特异性结合至SEQ ID NO:189的位置345、346、347、348、349、351、352、353、354、355、356、399、448、449、450、451、452、453、454、455、466、467、468、469、470、471、472、482、483、484、489、490、491、492、493、493和494处的氨基酸。
14.如权利要求1-12中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含在相对于SEQID NO:66的位置44、45、46、47、57、58、59、60、62、65、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112和113处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中所述纳米抗体特异性结合至SEQ ID NO:189的位置369、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、403、404、405、407、408、411、412、414、432、435、501、502、503、504、505、508和510处的氨基酸。
15.如权利要求1-12中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含在相对于SEQID NO:59的位置53、60、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113和114处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中所述纳米抗体特异性结合至SEQ IDNO:189的位置368、369、370、371、372、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、404、405、406、407、408、409、414、435、436和508处的氨基酸。
16.如权利要求1-12中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含在相对于SEQID NO:22的位置38、43、44、45、46、47、48、59、60、61、62、63、65、102、103、109、110、111、112、113和116处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中所述纳米抗体特异性结合至SEQID NO:189的位置366、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、412、436和437处的氨基酸。
17.如权利要求1-12中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含在相对于SEQID NO:23的位置28、33、39、40、104、105、106、107、108、109、110、111、113、114、115、116和118处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中所述纳米抗体特异性结合至SEQ IDNO:189的位置344、345、346、347、348、349、351、352、353、354、355、356、357、396、451、457、464、465、466、467、468和470处的氨基酸。
18.如权利要求1-12中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含在相对于SEQID NO:15的位置27、28、29、30、31、33、35、44、45、46、47、48、50、51、52、55、56、57、58、59、70、72、97、98、99、100、101、102、103和104处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中所述纳米抗体特异性结合至SEQ ID NO:189的位置351、446、447、448、449、450、451、452、453、455、456、470、472、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、505和531处的氨基酸。
19.如权利要求1-12中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体包含在相对于SEQID NO:14的位置27、28、29、30、31、32、33、35、45、47、48、49、51、52、55、56、57、58、59、60、72、97、98、99、100、102、103、104处具有相同氨基酸残基的氨基酸序列，并且其中所述纳米抗体特异性结合至SEQ ID NO:189的位置351、417、449、450、451、452、453、455、456、470、472、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495和496处的氨基酸。
20.如权利要求1-19中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体具有小于约1ng/1ml的IC50。
21.如权利要求1-20中任一项所述的纳米抗体，其中所述纳米抗体使冠状病毒的感染性降低约85％、90％、95％或100％。
22.如权利要求1-21中任一项所述的纳米抗体，其中所述冠状病毒中和纳米抗体与人血清白蛋白结合纳米抗体或纳米抗体片段缀合或连接。
23.如权利要求22所述的纳米抗体，其包含SEQ ID NO:74的序列。
24.如权利要求1-23中任一项所述的纳米抗体，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2或SARS-CoV。
25.一种治疗受试者中的冠状病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-24中任一项所述的纳米抗体。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述纳米抗体以约0.2mg/kg体重的剂量施用。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述纳米抗体通过气管内、鼻内或通过吸入途径施用。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2或SARS-CoV。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述纳米抗体与人血清白蛋白结合纳米抗体或纳米抗体片段缀合或连接，并且与对照相比，所述缀合物具有增加的血清半衰期或体内稳定性。
30.一种预防受试者中的冠状病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-24中任一项所述的纳米抗体。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述纳米抗体以约0.2mg/kg体重的剂量施用。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述纳米抗体通过气管内、鼻内或通过吸入途径施用。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述纳米抗体与人血清白蛋白结合纳米抗体或纳米抗体片段缀合或连接，并且与对照相比，所述缀合物具有增加的血清半衰期或体内稳定性。
34.如权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2或SARS-CoV。
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