CN105543248A - 基于优化MERS-CoV棘突蛋白编码基因的重组5型腺病毒载体疫苗 - Google Patents

Abstract

发明名称：基于优化MERS-CoV棘突蛋白编码基因的重组5型腺病毒载体疫苗。本发明首先优化合成了中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)棘突蛋白(S)的编码基因，将其插入pShuttle-CMV载体，获得重组质粒pAd5-MERS-S；转染HEK293细胞，获得拯救病毒Ad5-MERS-S。证实S蛋白高效表达后制备纯化的病毒Ad5-MERS-S，经肌肉注射或灌胃途径免疫B？ALB/c小鼠，通过ELISPot、IgG及中和抗体检测，证明该重组腺病毒载体疫苗有较强免疫原性，可在小鼠体内诱导有效的免疫应答(体液免疫，细胞免疫及粘膜免疫)，可作为理想的疫苗用于预防或治疗MERS-CoV感染。

Description

基于优化MERS-CoV棘突蛋白编码基因的重组5型腺病毒载体疫苗

技术领域本发明涉及一种可表达MERS-CoV棘突蛋白的重组5型腺病毒载体疫苗

背景技术中东呼吸系统综合症冠状病毒(MiddleEastRespiratorySyndromeCoranavirus，MERS-CoV)是2012年4月在中东地区，从一名患有急性呼吸窘迫综合征病人体内分离获得的一种新型冠状病毒，其病死率较高。据WHO官方数据显示，截止至2015年2月26日，全球实验室确诊MERS-CoV感染者共计1030例，其中包括381例死亡病例。研究表明单峰驼可能为该病毒的动物传染源和储存宿主，但其传染途径尚不明确，目前亦无有效药物对抗其感染，因此研制一种有效疫苗预防MERS-CoV感染迫在眉睫。

MERS-CoV与其他冠状病毒相似，是一种有包膜的单股正链RNA病毒。病毒表面的棘突蛋白S蛋白是病毒包膜上特异性的组织结构，在病毒的表面形成大量刺突，在病毒入侵靶细胞以及病毒与细胞发生交互作用时发挥着重要的作用。多项研究表明，S蛋白疫苗可以产生高效价的抗SARS-CoV病毒中和抗体，有效的预防SARS-CoV感染。因此冠状病毒疫苗的研发通常以S抗原作为主要靶抗原。

人腺病毒载体具有高效价、易构建的特性，并且其基因组中有合适的基因插入位点，因此，被广泛地用于基因治疗或疫苗研制。用腺病毒载体研制的预防急性呼吸综合症的疫苗，已经过临床测验.目前，已知人腺病毒50余种，分为7个亚型(A-G)，其中人腺病毒5型是一种呼吸道病原体，是目前为止应用最多，效果最为理想的一种腺病毒载体。为评价应用人腺病毒载体制备抗MERS-CoV重组疫苗，本发明构建了载有MERS-CoVS基因的复制缺陷型重组5型腺病毒载体疫苗rAd5/MERS-S。大量扩增和纯化后，经肌肉注射或灌胃途径免疫，6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，通过细胞免疫和体液免疫指标的检测，在小鼠体内评估该重组疫苗的免疫原性。

发明内容：

研发一种表达MERS-CoV棘突蛋白的重组5型腺病毒载体疫苗，并在小鼠体内检测该疫苗的免疫效果。

附图说明

图1：Ad5-GFP及Ad5-MERS-S的构建

图2Ad5-GFP及Ad5-MERS-S的westernblot(A)和免疫荧光(B)鉴定结果

图3：动物免疫和标本检测示意图

图4：免疫后4w(A)和16w(B)血清IgG抗体检测

图5：免疫后4w(A)和16w(B)血清IgA抗体检测

图6：图6免疫后4w和16w肺泡灌洗液(A，B)，小肠灌洗液(C，D)和大肠灌洗液(E，F)IgA抗体检测

图7：免疫后4w(A)和16w(B)血清中和抗体检测

图8：免疫后4w和16w脾细胞ELISpot检测

具体实施方式：

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。

实施例1：携带优化的MERS-CoVS基因的重组5型腺病毒的包装及鉴定

依据GenBank(JX869059)中MERS-CoV基因序列，优化并人工合成S基因。将优化后的S基因插入到pShuttle-CMV载体构建重组质粒pSh5-MERS-S(见图1)。将其线性化处理后与pAdEasy-1共同转染大肠杆菌BJ5183，获得重组质粒pAd5-MERS-S.。PacI线性化处理重组质粒pAd5-MERS-S后，用脂质体2000转染HEK293细胞，获得重组病毒Ad5-MERS-S。经过2次CsCl梯度离心后，获得纯化的重组病毒Ad5-MERS-S。同样方法获得重组病毒Ad5-GFP用于对照。

重组病毒Ad5-MERS-S感染HEK293细胞，剂量为10vp/细胞。转染48小时后，提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳后，电转至PVDF膜，用1∶200兔抗MERS-CoV抗体及1∶200的山羊抗兔二抗鉴定S蛋白的表达。转染重组病毒Ad5-MERS-S的HEK293细胞经固定后，用兔抗MERS-CoV一抗以及FITC标记山羊抗兔二抗结合后，荧光显微镜下观察蛋白的表达情况。同时用重组病毒Ad5-GFP转染HEK293细胞做对照。WesternBlot和免疫荧光均见S目的蛋白的表达(见图2)。

实施例2：动物免疫与样品收集：

2.1以BALB/c小鼠为实验动物，将纯化后的重组病毒免疫小鼠，以检测其所诱导的体液免疫和细胞免疫应答，具体的免疫方案如下

选取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，如表1所示随机分为5组，每组10只，分别肌肉或灌胃注射免疫重组病毒Ad5-MERS-S或Ad5-GFP。免疫后4周，每组随机抽取5只小鼠，处死后分离小鼠血清，肺泡灌洗液，大肠和小肠灌洗液以及脾脏淋巴细胞。用于检测疫苗所诱导的体液免疫和细胞免疫水平。免疫后16周，处死剩余小鼠，分离血清，肺泡灌洗液，大肠和小肠灌洗液以及脾脏淋巴细胞。用于疫苗诱导的长效免疫效果检测(见图3)。

表1动物免疫分组

实施例3：免疫血清中抗原特异性抗体的检测：

3.1免疫血清中抗原特异性IgG的ELISA测定：受体结合结构域(Receptorbingdingdomain，RBD)为棘突蛋白S的部分片段，采用重组RBD蛋白包被ELISA板，100ng/孔。将免疫血清用稀释液从1∶100作倍比稀释，二抗为辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，以未免疫小鼠血清稀释后检测的A450/630值的平均值的2.1倍作为界值，各组实验动物血清检测IgG抗体见图4。由图可见，重组病毒Ad5-MERS-S免疫后，无论肌肉注射还是灌胃途径，均在小鼠体内诱导了高效价的抗原特异性IgG抗体，抗体在小鼠体内可持续至少16w。短期内(4w)肌肉注射可诱导较高水平的IgG抗体(见图4A)，长期后(16w)两种免疫方式诱导的特异性IgG抗体未见明显差别(见图4B)。

3.2系统和粘膜抗原特异性IgA的ELISA测定：采用重组RBD蛋白包被ELISA板，100ng/孔。检测免疫后小鼠血清，肺泡灌洗液，大肠和小肠灌洗液中IgA的表达。二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgA二抗。如图5所示，重组病毒Ad5-MERS-S经灌胃途径免疫小鼠，可在其体内诱导系统(血清)抗原特异性IgA的表达，且IgA抗体在小鼠血清中可持续至少16w。同样，在重组病毒Ad5-MERS-S灌胃途径免疫小鼠的大肠和小肠灌洗液中均检测到IgA的表达，且在体内持续时间至少达免疫后16w。

实施例4.免疫血清中和抗体的检测：

4.1假病毒中和实验：

免疫小鼠血清以PBS进行倍比稀释，各取50ul与等体积的MERS-CoV假病毒悬液(病毒含量为200TCID50)混匀，37℃孵育1h后加入于96孔培养的Huh7细胞培养板中进行感染。37℃5％CO₂孵育48h后，将所感染的细胞裂解并进行荧光素酶活性分析。每个样本均做3孔进行重复，避免误差。血清的中和活性采用以下计算方法获得：

将阴性对照血清与MERS-CoV假病毒悬液共孵育所获得的相对荧光素酶读值作为RLU1，以免疫血清与MERS-CoV假病毒悬液共孵育所获得的相对荧光素酶读值作为RLU2，则各血清的中和率(NeutralisationRate)NR＝(RLU1-RLU2)/RLU1。

将血清中和率达50％时，抗体的稀释倍数计算于图7，可见重组病毒Ad5-MERS-S无论经肌肉注射或经灌胃途径免疫小鼠，均可诱导小鼠中和抗体的产生，且该中和抗体在小鼠血清中可持续至少16w。

实施例4.免疫小鼠细胞免疫水平检测：

采用ELISpot实验：处死小鼠，无菌条件下分离脾细胞，调整淋巴细胞浓度至1X10⁷/ml。用稀释的PurifiedAnti-mouseIFN-γ包被ELISpot板过夜。将小鼠淋巴细胞(5X10⁵/孔)加入到包含抗原肽的肽池(终浓度4μg/ml)中刺激24h后，用BiotinylatedAnti-mouseIFN-γ做二抗，ELISPOT计数仪读数分析产生IFN-γ的细胞数。如图8所示，重组病毒Ad5-MERS-S经灌胃途径免疫小鼠则未能在小鼠体内诱导有效的细胞免疫应答。经肌肉注射免疫小鼠，可在其体内诱导较高水平的细胞免疫应答，且该细胞免疫应答在小鼠体内可持续至少16w。

Claims (3)

1.一种优化的编码中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV)S蛋白的合成基因。

2.高效表达MERS-CoVS蛋白的重组5型腺病毒载体疫苗的制备。

3.该制剂作为常规疫苗(肌肉注射)或粘膜疫苗(口服或灌胃)在MERS-CoV预防与治疗中的应用。