CN114349868B - 一种含寡聚化结构域的新型冠状病毒s蛋白受体结合域融合蛋白及其用途 - Google Patents

一种含寡聚化结构域的新型冠状病毒s蛋白受体结合域融合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种SARS‑CoV‑2刺突蛋白(S)的受体结合域(RBD)融合蛋白及其用途，具体公开了一种SARS‑CoV‑2S蛋白RBD融合蛋白，由至少一个拷贝的源自SARS‑CoV‑2S蛋白的RBD多肽、寡聚化结构域、和/或内源性佐剂组成，所述的内源性佐剂为RS09佐剂，所述的寡聚化结构域选自噬菌体三聚化结构域(Foldon domain)、GCN4亮氨酸拉链序列、或人胶原蛋白三聚化结构域。该SARS‑CoV‑2RBD融合蛋白可用于制备预防SARS‑CoV‑2感染及感染诱发疾病的疫苗。

Description

一种含寡聚化结构域的新型冠状病毒S蛋白受体结合域融合 蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)受体结合域(RBD)融合蛋白，及由其形成的寡聚体，以及RBD融合蛋白或RBD融合蛋白寡聚体在制备预防新型冠状病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗中的用途。
背景技术
SARS-CoV-2为有包膜的正链RNA病毒，病毒有4种结构蛋白(S、M、N、E)，其中S蛋白是感染入侵的关键蛋白，以三聚体形式分布在包膜表面，其N端含有细胞受体结合域(receptor binding domain,RBD)。RBD与宿主细胞的ACE2结合后，S蛋白发生变构，启动病毒感染入侵。S蛋白是冠状病毒疫苗研究的主要靶抗原。
Moderna及辉瑞的以S蛋白为基础的mRNA新冠疫苗的III期临床试验的中期结果显示，两种疫苗的保护效率均在90％以上，表明S蛋白作为疫苗抗原可成功地预防病毒的感染，且具有很好的安全性。包括上述两家公司在内的多家制药公司的S蛋白抗原都进行了突变修饰，在S2区域引入了2P突变，使S蛋白处于融合前的状态，以保证S蛋白中与ACE2受体结合的区域(RBD区)以正确的构象进行最大程度的暴露。因此，以RBD为基础的新冠疫苗备受关注，包括流感病毒载体疫苗、RBD蛋白疫苗等。新冠病毒RBD蛋白疫苗目前报道的有两种形式，分别是RBD单体疫苗及两个拷贝的RBD串联形成的二聚体疫苗，其中串联二聚体疫苗具有较强的诱发产生中和抗体的活性，其诱发产生中和抗体的滴度是康复者血清的3.9倍，较目前报道的其他形式的新冠疫苗，包括灭活疫苗、mRNA疫苗、腺病毒载体疫苗，均较高。因此，新冠病毒RBD蛋白疫苗具有研发前景。
RBD蛋白疫苗首先是以单体的形式在SARS-CoV中进行探索研究的。采用酵母表达体系进行SARS-CoV RBD单体的研究，选择了两种长度的RBD(aa.318-510/193mer、aa.318-536/219mer)及其3种敲除或突变不同N糖基化位点(N1、N2、N3)的RBD突变体，发现所有的去糖基化修饰均可显著降低RBD突变体的表达水平，其中N1糖基化位点(aa.318)的影响相对较小，对N1去糖基化位点突变体及野生型RBD的免疫血清的中和活性进行分析，发现：首先，去糖基化位点的修饰可增强219mer的免疫原性，但是降低了193mer的免疫原性；其次，两种长度的RBD，在N1位点去糖基化修饰的状态下，219mer高于193mer，而糖基化位点正常的野生型状态下，两者相同。上述结果表明，在酵母表达体系中，3种去糖基化修饰可降低RBD的表达量，N1去糖基化位点的修饰对RBD免疫原性的影响与RBD的长度相关，去糖基化修饰的突变体中，219mer的免疫原性较好。由于酵母是单细胞真核生物，其糖基化形成的支链寡糖，特别是最末端的寡糖类型具有酵母种属的特点，与多细胞真核生物来源的表达体系，如昆虫细胞、293T细胞等的糖基化类型及支链寡糖的构成特点具有明显不同。糖基化的不同不仅可影响其表观分子量，同时也可影响蛋白的整体理化性质。目前，有关去糖基化的RBD突变体在其他表达体系中，去糖基化对RBD的表达水平及免疫原性的影响未见报道。
MERS RBD-Fc融合蛋白的研究发现，以RBM为核心区，分别向N端和/或C端延长，获得的5种不同长度的RBD(aa.350-588、aa.358-588、aa.367-588、aa.367-606、aa.377-588)-Fc融合蛋白，免疫血清针对MERS-CoV的中和实验分析显示，RBD(aa.377-588)-Fc的中和活性显著高于其他4个RBD突变体-Fc，而其他4个突变体之间的中和活性无差异。提示免疫原性最高的MERS-CoV RBD肽段是不可预测的。目前，SARS-CoV RBD-Fc融合蛋白的研究仅报道了一种长度的RBD区(aa.318-510)，新冠病毒RBD蛋白疫苗研究以RBD单体及串联二聚体为主，其RBD-Fc融合蛋白疫苗也仅报道了一种长度的RBD区(aa.319-532)。因此，新冠病毒RBD-Fc融合蛋白疫苗的研究中，免疫活性最佳的RBD长度是无法预测的。另外，采用两个拷贝的免疫原性最高的RBD串联肽，在其C端融合Fc或其他寡聚化结构域，进行RBD四聚体、六聚体等蛋白疫苗的研究，尚未见有报道。
本发明利用昆虫细胞表达体系，采用表达新冠病毒RBD寡聚体蛋白的方法，获得含不同寡聚化结构域的、不同RBD长度、不同RBD拷贝数、不同糖基化修饰、含或不含分子内佐剂的RBD三聚体、六聚体或十二聚体，优选免疫活性最佳的RBD寡聚体蛋白疫苗。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种SARS-CoV-2RBD融合蛋白及其形成的寡聚体，用于制备预防新型冠状病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗。
本发明人出人意料地发现，不同长度的RBD多肽、不同的糖基化修饰、不同的寡聚化结构域，均可显著影响RBD融合蛋白的表达水平及免疫活性，通过对多个候选RBD融合蛋白进行筛选，本发明获得了在昆虫细胞表达系统中高水平表达、并可诱发针对SARS-CoV-2的中和抗体的RBD融合蛋白及其寡聚体。
基于上述目的，本发明提供了一种SARS-CoV-2S蛋白受体结合域融合蛋白，其特征为，含有至少一个拷贝的源自SARS-CoV-2S蛋白或S蛋白突变体的RBD多肽、寡聚化结构域、和/或内源性佐剂。
可选地，本发明涉及的SARS-CoV-2S蛋白的氨基酸序列来自NCBI数据库中的QHD43416.1序列，SARS-CoV-2S蛋白突变体序列可来自但不限于Alpha、Beta、Gamma、Delta、Epsilon、Eta、Iota、Kappa、Lambda、Zeta、Mu等新型冠状病毒变异株的S蛋白(如NCBI数据库中的QWA53375.2、QWA53387.1、QVI56963.1、QWM26437.1序列等)。优选地，所述的新型冠状病毒S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
可选地，所述S蛋白突变体为将其RBD区域的N糖基化或O糖基化位点删除或置换的突变体。优选地，所述删除或置换突变为将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位、和/或第343位、和/或第354位、和/或第360位的天冬氨酸(N)删除或置换为非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸，所述非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)及苏氨酸(T)。
可选地，所述S蛋白突变体为将其上与感染入侵相关或与RBD结构相关的关键位点进行删除或置换的突变体。优选地，所述突变为第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)和/或第614位天冬氨酸(D)置换为甘氨酸(G)
可选地，所述S蛋白突变体为上述RBD区域糖基化位点突变及S蛋白感染入侵或与RBD结构相关的关键位点突变联合的突变体。优选地，所述突变为将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位、和/或第343位、和/或第354位、和/或第360位的天冬氨酸(N)删除或置换为非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)，和/或第614位天冬氨酸(D)置换为甘氨酸(G)，所述非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)及苏氨酸(T)。
可选地，所述RBD多肽选自SARS-CoV-2S蛋白或S蛋白突变体序列的319至537位，或其N端延长或截短1至13个氨基酸、和/或C端截短1至13个氨基酸或延长1至82个氨基酸的序列。
优选地，所述RBD多肽选自：
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位至550位；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第332位至550位；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至591位；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至614位；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位至550位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第332位至550位，且第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位；且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至591位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；
SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至614位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)，和/或第614位天冬氨酸(D)置换为甘氨酸(G)。
可选地，所述寡聚化结构域为可使融合蛋白二聚化、三聚化、四聚化、五聚化、六聚化、八聚化的结构域。优选地，所述寡聚化结构域选自噬菌体三聚化结构域(Foldondomain)、GCN4亮氨酸拉链序列、人胶原蛋白三聚化结构域及这些结构域的突变体。进一步优选地，所述寡聚化结构域的氨基酸序列选自：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、及SEQ ID No.6。
可选地，所述寡聚化结构域融合在所述RBD多肽的N端或C端。优选地，所述寡聚化结构域融合在所述RBD多肽的C端。
可选地，所述内源性佐剂为具有免疫刺激活性的氨基酸序列，可选自但不限于：N端酯化信号肽、鞭毛蛋白、Fc受体靶向序列等。优选地，所述内源性佐剂为RS09佐剂，其序列如SEQ ID No.7所示。
可选地，所述RBD融合蛋白中含有至少1个拷贝的内源性佐剂。
可选地，所述内源性佐剂融合在所述RBD多肽的N端和/或所述寡聚化结构域的C端。
可选地，所述RBD融合蛋白的各个元件之间，例如RBD多肽之间、RBD多肽与寡聚化序列之间、RBD多肽与内源性佐剂之间、寡聚化序列与内源性佐剂之间，可采用直接融合的方式或插入连接子的方式进行连接。
可选地，所述连接子的长度为1-17个氨基酸。
可选地，所述的连接子由选自甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、苏氨酸(T)及脯氨酸(P)的氨基酸任意组合构成。优选地，所述连接子由4个甘氨酸(G)和1个丝氨酸(S)串联重复组成。
可选地，所述RBD融合蛋白的N端可融合适于不同表达系统的外泌信号肽。所述外泌信号肽可选自但不限于：冠状病毒S蛋白信号肽、CD5分子信号肽、IL-2信号肽、IgE信号肽、杆状病毒GP67信号肽等。优选地，所述外泌信号肽为杆状病毒GP67信号肽。
可选地，所述RBD融合蛋白的N端和/或C端可融合用于表达检测或便于纯化的标签蛋白或多肽。所述标签蛋白或多肽可选自但不限于：GST标签、His标签、T7标签、SUMO标签、MBP标签、Strep标签、HA标签、FLAG标签等。
可选地，所述RBD融合蛋白和标签蛋白或多肽之间含有蛋白酶切位点。所述蛋白酶切位点可选自但不限于：thrombin酶切位点、factorXa酶切位点、SUMO蛋白酶酶切位点、enterokinase酶切位点等。
本发明的另一方面涉及编码上述的RBD融合蛋白的多核苷酸。
本发明还提供了包含上述的多核苷酸的载体，以及包含所述的载体的细胞。
本发明涉及的编码上述的RBD融合蛋白的多核苷酸序列适用于不同的表达系统。可选地，这些核苷酸序列采用大肠杆菌密码子进行全基因优化，可在大肠杆菌表达系统中高水平表达；或采用昆虫细胞密码子进行全基因优化，可在昆虫细胞表达系统中高水平表达；或采用酵母细胞密码子进行全基因优化，可在酵母细胞表达系统中高水平表达；或采用哺乳动物密码子进行全基因优化，可在哺乳动物细胞表达系统中高水平表达。
本发明还提供了一种SARS-CoV-2RBD融合蛋白的寡聚物，优选地，该寡聚物为SARS-CoV-2RBD融合蛋白的二聚体、三聚体、四聚体、六聚体或十二聚体。
本发明还提供了上述的SARS-CoV-2RBD融合蛋白在制备预防SARS-CoV-2感染或感染诱发的疾病的疫苗中的用途。
本发明还提供了还提供了一种用于预防新型冠状病毒感染或感染诱发的疾病的疫苗，其包含：
1)上述的SARS-CoV-2RBD融合蛋白、编码RBD融合蛋白的多核苷酸、含有上述的载体、含有上述载体的病毒、和/或上述的SARS-CoV-2RBD融合蛋白寡聚体；
2)任选地，佐剂；
3)任选地，疫苗用赋形剂或载体；
4)优选地，还包含至少一种来自于其他冠状病毒的S蛋白和/或RBD融合蛋白、编码相应蛋白的多核苷酸、含有相应多核苷酸的载体、含有相应载体的病毒、和/或相应的S蛋白和/或RBD融合蛋白寡聚体。
在一些实施方案中，上述新型冠状病毒RBD融合蛋白在所述疫苗中的含量为能诱发保护性免疫反应的有效量。
在一些实施方案中，所述佐剂为人用佐剂。优选，所述佐剂包括但不限于：铝佐剂；水包油乳剂或油包水乳剂及TLR刺激剂的佐剂组合物；氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物；或者MF59佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物。
在一些实施方案中，本发明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，优选注射。
在一些实施方案中，本发明疫苗优选制备成单位剂型的形式，其中单位剂型中新型冠状病毒RBD融合蛋白或新型冠状病毒RBD融合蛋白寡聚体的剂量为5μg至500μg，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500μg、以及上述任意两个数值之间的范围；优选20μg至100μg每单位剂型。
发明中相关术语的说明及解释
根据本发明，术语“昆虫细胞表达系统”包括昆虫细胞、重组杆状病毒、重组Bacmid及表达载体。其中昆虫细胞来源于市场上可得到的细胞，在此举例但不限于：Sf9，Sf21，High Five。
根据本发明，术语“原核表达系统”包括但不限于大肠杆菌表达系统。其中表达宿主菌来源于市场上可得到的菌株，在此举例但不限于：BL21(DE3)，BL21(DE3)plysS，C43(DE3)，Rosetta-gami B(DE3)。
根据本发明，术语“酵母表达系统”中，表达宿主菌来源于市场上可得到的菌株，在此举例但不限于：酿酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母。
根据本发明，术语“哺乳动物细胞表达系统”包括人源及各种动物细胞来源的表达系统。其中表达宿主细胞源于市场上可得到的细胞株，在此举例但不限于：CHO，HEK293，293T，Vero，MDCK。
根据本发明，术语“新型冠状病毒S蛋白”的例子包括但不限于NCBI数据库中编号为QWA53375.2、QWA53387.1、QVI56963.1、QWM26437.1的蛋白。
根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体”是指选自以下的一种或多种，包括但不限于：pH调节剂、表面活性剂、离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括阳离子、阴离子或非离子型表面活性剂，举例但不限于聚山梨酯80(Tween-80)。离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。
根据本发明，术语“人用佐剂”是指在临床上可应用于人体的佐剂，包括当前已获得批准的和将来可能获得批准的各种佐剂，例如但不限于铝佐剂、MF59及各种形式的佐剂组合物。
根据本发明，术语“乳剂”是指由水相成分、油相成分及乳化剂按适当比例混合，经乳化后形成的非均相液体分散体系。其中水相成分包括但不限于磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液等缓冲系统；油相成分为可代谢脂类，包括但不限于植物油、鱼油、动物油、合成油及其他脂类成分(例如但不限于角鲨烯、生育酚)。乳化剂为适宜的表面活性剂，例如但不限于山梨醇酐三油酸酯(Span-85)、聚山梨酯80(Tween-80)。
根据本发明，术语“稳定剂”是指可与佐剂中的聚肌苷酸-聚胞苷酸结合并起到稳定作用的成分，包括但不限于抗生素(例如但不限于卡那霉素、新霉素、庆大霉素)、无机盐(例如但不限于氯化钙、氯化镁、磷酸钙)、阳离子的有机复合物(例如但不限于硬脂酸钙、葡萄糖酸钙)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1A-1B：本发明实施例4中RBD融合蛋白在昆虫细胞中的表达鉴定。结果显示，S2P融合蛋白及10种RBD融合蛋白可在昆虫细胞中表达，3种R BD融合蛋白不表达；图1A：1至8分别表示RBD-Fd、RBDN1-Fd、RBDN2-Fd、RBDN3-Fd、RBDS-Fd、Sf9培养上清对照、RBDN1-Fd-eye、RBDN1.3-Fd-eye，采用his标签抗体检测；图1B：1至8分别表示2RBD-Fd、2RBD-G CN4pLL、2RBD-GCN4pLLC、2RBD-GCN4pII、2RBD-GCN4pLI、S2P、RS-2RBDN1.3-ColT、RBD-GCN4pLLC，采用Strep-tag标签抗体检测；
图2A-2B：本发明实施例9中RBD融合蛋白三聚体诱发的RBD特异性I gG抗体水平检测；图2A：不同糖基化修饰的RBD三聚体诱发的IgG特异性抗体水平检测；图2B：含不同长度RBD的融合蛋白三聚体诱发的IgG特异性抗体水平检测，**P<0.01；
图3：本发明实施例9中RBD融合蛋白三聚体诱发的新型冠状病毒假病毒中和抗体水平检测，**P<0.01，***P<0.001；
图4：本发明实施例9中，含三聚化结构域的RBD融合蛋白寡聚体诱发的IgG抗体水平检测，***P<0.001；
图5：本发明实施例9中，优选的RBD融合蛋白与对照组诱发的IgG抗体水平检测，*P<0.05。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：RBD融合蛋白的基因合成及表达载体构建
本发明涉及的各种融合蛋白分别按如下的方式构建：
1)RBD-Fd：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位至550位，在其C端融合如SEQ ID No.2所示的三聚化序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ IDNo.8所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合his标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，采用全基因合成，并通过Ba mHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RBD-Fd表达质粒；
2)RBDN1-Fd：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第332位至550位，在其C端融合如SEQ ID No.2所示的三聚化序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQID No.9所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合his标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RBDN1-Fd表达质粒；
3)RBDN2-Fd：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第332位至550位，且第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，在其C端融合如SEQ ID No.2所示的三聚化序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合his标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RBDN2-Fd表达质粒；
4)RBDN3-Fd：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第332位至550位，且第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)、第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，在其C端融合如SEQ ID No.2所示的三聚化序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ IDNo.11所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合his标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RBDN3-Fd表达质粒；
5)RBDS-Fd：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至591位，在其C端融合如SEQ ID No.2所示的三聚化序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ IDNo.12所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合his标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RBDS-Fd表达质粒；
6)RBDN1-Fd-eye：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，在所述RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.2所示的三聚化序列，在所述RBD多肽的N端及所述寡聚化序列的C端各融合1个拷贝如SEQ IDNo.7所示的佐剂序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合his标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RBDN1-Fd-eye表达质粒；
7)RBDN1.3-Fd-eye：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)、第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，在所述RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.2所示的三聚化序列，在所述RBD多肽的N端及所述寡聚化序列的C端各融合1个拷贝如SEQ ID No.7所示的佐剂序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合his标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RBDN1.3-Fd-eye表达质粒；
8)RS-2RBDN1.3-ColT：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位直接串联融合SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且两个拷贝的RBD序列第331位天冬酰胺(N)均置换为丙氨酸(A)、第354位天冬酰胺(N)均置换为谷氨酰胺(Q)，在第2个RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.6所示的三聚化序列，在第2个RBD多肽与三聚化结构域之间含有9个氨基酸的连接子(GT TSGGGGS)，在第1个RBD多肽的N端融合1个拷贝如SEQ ID No.7所示的佐剂序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合thrombi n酶切位点及Strep-tag标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RS-2RBDN1.3-ColT表达质粒。
9)2RBD-Fd：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位，2个拷贝的RBD多肽串联重复，在所述RBD多肽的C端融合SEQ ID No.2所示的三聚化序列，在RBD多肽之间、RBD多肽与三聚化序列之间含有2个氨基酸的连接子，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.16所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合thrombin酶切位点及Strep-tag标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-2RBD-Fd表达质粒。
10)2RBD-GCN4pII：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位，2个拷贝的RBD多肽串联重复，在所述RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.3所示的三聚化序列，在RBD多肽之间、RBD多肽与三聚化序列之间含有2个氨基酸的连接子，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合thrombin酶切位点及Strep-tag标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-2RBD-GCN4pII表达质粒；
11)2RBD-GCN4pLI：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位，2个拷贝的RBD多肽串联重复，在所述RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.4所示的四聚化序列，在RBD多肽之间、RBD多肽与四聚化序列之间含有2个氨基酸的连接子，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.18所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合thrombin酶切位点及Strep-tag标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-2RBD-GCN4pLI表达质粒；
12)2RBD-GCN4pLL：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位，2个拷贝的RBD多肽串联重复，在所述RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.5所示的三聚化序列，在RBD多肽之间、RBD多肽与三聚化序列之间含有2个氨基酸的连接子，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合thrombin酶切位点及Strep-tag标签编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-2RBD-GCN4pLL表达质粒；
13)2RBD-GCN4pLLC：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位，2个拷贝的RBD多肽串联重复，在所述RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.5所示的三聚化序列，在RBD多肽之间、RBD多肽与三聚化序列之间含有2个氨基酸的连接子，在三聚化序列的下游融合1个半胱氨酸(使融合蛋白能通过C端的半胱氨酸形成分子间二硫键，进一步形成六聚化结构)，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.20所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67、Stre p-tag标签及thrombin酶切位点编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-2RBD-GCN4pLLC表达质粒；
14)RBD-GCN4pLLC：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位，在RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.5所示的三聚化序列，在RBD多肽与三聚化序列之间含有2个氨基酸的连接子，在三聚化序列的下游融合1个半胱氨酸，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.34所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67、Strep-tag标签及thrombin酶切位点编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ IDNo.35所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RBD-GCN4pLLC表达质粒；
15)S2P：采用的S蛋白序列为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第16位至第1208位，且第614位天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G)，第682至685位氨基酸突变为GSAS，第986位及987位氨基酸均突变为脯氨酸(P)，在其C端融合如SEQ ID No.2所示的三聚化序列，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合Strep-tag标签编码序列，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFast Bac1载体，获得pFastBac1-S2P表达质粒。
实施例2：RBD融合蛋白的基因的重组Bacmid及重组杆状病毒的构建
分别使用包含RBD融合蛋白基因的重组表达载体pFastBac1-RBD-Fd、p FastBac1-RBDT-N1、pFastBac1-RBDN2-Fd、pFastBac1-RBDN3-Fd、pFastBac1-RBDS-Fd、pFastBac1-RBDN1-Fd-eye、pFastBac1-RBDN1.3-Fd-eye、pFastB ac1-RS-2RBDN1.3-ColT、pFastBac1-2RBD-Fd、pFastBac1-2RBD-GCN4pII、p FastBac1-2RBD-GCN4pLI、pFastBac1-2RBD-GCN4pLL、pFastBac1-2RBD-GC N4pLLC、pFastBac1-RBD-GCN4pLLC、pFastBac1-S2P，转化大肠杆菌DH10Bac感受态，筛选获得重组Bacmid，然后用重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9，在Sf9内扩增重组杆状病毒。重组Bacmid的筛选及重组杆状病毒的扩增方法都是公知的，例如专利CN101148661 B。
实施例3：RBD融合蛋白的基因在Sf9细胞中的表达
Sf9细胞分别接种14种融合蛋白基因的重组杆状病毒，进行融合蛋白的表达，27℃培养约88h后收发酵液，3000rpm离心15min，收集上清，用于表达鉴定及纯化。感染表达的方法是公开的，例如专利CN 101148661 B。
实施例4：RBD融合蛋白的表达鉴定
取实施例3中所述表达不同RBD融合蛋白的细胞培养上清各80μl，加入6×LoadingBuffer 20μl，75℃变性8分钟，分别取20μl进行SDS-PAG E电泳及Western blot鉴定。结果如图1所示，S2P融合蛋白及11种RBD融合蛋白可在昆虫细胞中表达，但未检测到2RBD-Fd、2RBD-GCN4pLI、2RBD-GCN4pLL融合蛋白的表达。表明RBD多肽的拷贝数及使用的寡聚化结构域均可能影响RBD融合蛋白的表达。SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定的方法是公开的，例如专利CN101148661 B。
实施例5：RBD融合蛋白在昆虫细胞中的表达量比较
取实施例3中表达的RBD融合蛋白的细胞培养上清，采用间接ELISA法检测上清中的RBD融合蛋白含量，ELISA检测的方法是公知的。
使用本发明人制备的RBD单体蛋白作为标准品进行倍比稀释包被酶标板，起始包被量100ng/孔，同时将待测培养上清倍比稀释包被酶标板，4℃孵育过夜；使用5％BSA-PBST室温封闭2h，再用PBST洗板3次。加入本发明人制备的RBD多克隆抗体(1：3000稀释)，每孔100μl，室温孵育2h。用PBST洗板3次，加入1：3000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1：3000稀释，中杉金桥公司)，37℃孵育45分钟。用PBST洗板5次，每孔加入100μl OPD底物(Sigma公司)，37℃显色5分钟，用50μl 2M硫酸终止反应，在490nm处测定吸光值。依据标准曲线计算培养上清中RBD融合蛋白的含量，检测结果如表1所示。
比较分析发现，采用来自SEQ ID No.1所示S蛋白原始序列的RBD片段构建寡聚体，其中2种RBD六聚体(2RBD-Fd、2RBD-GCN4pLL)及RB D八聚体(2RBD-GCN4pLI)未表达；2种含不同长度RBD多肽的三聚体(R BD-Fd、RBDS-Fd)的表达水平也不理想(分别为15.3mg/L和18.3mg/L)；但2RBD-GCN4pII、RBD-GCN4pLLC六聚体和2RBD-GCN4pLLC十二聚体的表达量较高(分别为26.7mg/L和26mg/L)，表明RBD融合蛋白含有的寡聚化结构域是影响融合蛋白表达水平的重要因素。对RBD区进行了氨基酸突变改造的融合蛋白的表达水平分析发现，RBD区关键糖基化位点敲除突变可提高RBD-Fd三聚体融合蛋白的表达水平。
上述结果表明，RBD寡聚体融合蛋白在昆虫细胞表达体系中的表达水平受到寡聚化结构域、糖基化水平、氨基酸序列长度等多个因素的影响，因此设计获得表达水平高的RBD寡聚体融合蛋白是难以预测的。
表1.RBD融合蛋白表达量分析
实施例6：RBD融合蛋白的纯化
取适量的RBD融合蛋白表达上清，使用200倍体积的PBS，4℃透析过夜，使用0.22μm滤器过滤样品，采用Ni-Sepharose 6FF或Strep-Tactin XT Sepharose亲和层析纯化，纯化步骤在室温进行。Ni-Sepharose 6FF亲和层析的平衡液为：20mM磷酸钠，20mM咪唑，150mM氯化钠，pH7.0；洗脱液为：20mM磷酸钠，200mM咪唑，150mM氯化钠，pH7.0。Strep-Tactin XTSepharose亲和层析的平衡液为：100mM Tris-HCl，150mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，pH8.0；洗脱液为：100mM Tris-HCl,150mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸,50mM生物素,pH 8.0。以上纯化方法均是公开的，参照层析填料生产公司的说明书进行。
实施例7：免疫血清的RBD特异性抗体检测方法
采用间接ELISA法检测血清中的RBD特异性抗体。
使用本发明人制备的RBD单体蛋白包被酶标板，包被量100ng/孔，4℃孵育过夜；使用5％BSA-PBST室温封闭2h，再用PBST洗板3次。加入用PBST倍比稀释的待测血清，每孔100μl，起始稀释度为1：50，4℃孵育过夜。用PBST洗板3次，加入1：3000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1：3000稀释，中杉金桥公司)，37℃孵育45分钟。用PBST洗板5次，每孔加入100μlOPD底物(Sigma公司)，37℃显色5分钟，用50μl 2M硫酸终止反应，在490nm处测定吸光值。吸收值大于0.2且大于阴性对照2倍的稀释倍数视为待测血清的RBD特异性IgG抗体滴度。
实施例8：免疫血清的假病毒中和抗体检测方法
采用SARS-CoV-2假病毒对免疫血清的中和抗体滴度进行检测，假病毒购自博奥龙免疫技术有限公司，假病毒中和实验的方法是公开的，例如文献Nie et al.,Quantification of SARS-CoV-2neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay,Nature Protocols,2020。
实施例9：RBD融合蛋白寡聚体的免疫活性分析
RBD三聚体的免疫活性分析：取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分组，每组5只，用10μgRBD融合蛋白(RBD-Fd、RBDN1-Fd、RBDN2-Fd、RBDN3-Fd、RBDS-Fd)，联合Al(OH)350μg及MPL佐剂5μg免疫小鼠。皮下注射，于第0，3，6周免疫，共3次。第3次免疫后2周尾静脉采血，分离血清。
采用ELISA检测血清中的RBD特异性IgG抗体水平，结果显示，进行不同的去糖基化修饰的RBD融合蛋白三聚体(RBDN1-Fd、RBDN2-Fd、RBDN3-Fd)与RBD-Fd融合蛋白三聚体效诱发的RBD特异性IgG抗体水平相当(图2A)；含有较长RBD片段的融合蛋白RBDS-Fd诱发的特异性IgG抗体滴度显著高于含较短RBD片段的RBD-Fd(图2B，P<0.001)。
采用假病毒中和试验检测血清的中和抗体水平，结果如图3所示，RBDS-Fd诱发的中和抗体水平最高，显著高于其余4种较短的RBD融合蛋白；不同去糖基化修饰的RBD融合蛋白三聚体诱发的中和抗体水平无统计学差异。
含不同三聚化结构域的RBD寡聚体免疫活性分析：取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分组，每组5只，用3μg RBD融合蛋白(2RBD-GCN4pLLC、2RBD-GCN4pII、RS-2RBDN1.3-ColT、RBDS-Fd、RBDN1-Fd-eye、RBDN1.3-Fd-eye、RBD-GCN4pLLC、S2P对照、RBD串联二聚体对照)，联合Al(OH)325μg及CpG 7909佐剂5μg免疫小鼠。皮下注射，于第0，3周免疫，共2次。第2次免疫后2周尾静脉采血，分离血清。
采用ELISA检测血清中的RBD特异性IgG抗体水平，结果如图4所示，2RBD-GCN4pLLC诱发的RBD特异性抗体水平显著高于其余5种RBD融合蛋白(P<0.001)，而其余5种RBD融合蛋白诱发的抗体水平之间无显著性差异。如图5所示，与已有临床应用的重组蛋白疫苗抗原对照相比，2RBD-GCN4pLLC及RBD-GCN4pLLC融合蛋白诱发的RBD特异性抗体水平更高，其中2RBD-GCN4pLLC与两个对照组相比有显著性差异(P<0.05)。GCN4-pLL(SEQ ID No.5)为三聚化结构域，在其C端融合一个半胱氨酸，可通过二硫键进一步交联形成六聚化结构，在其N端融合2个拷贝串联的RBD多肽，最终可形成含有12个拷贝RBD多肽的寡聚体。本发明采用该策略获得的2RBD-GCN4pLLC融合蛋白寡聚体的免疫活性显著优于含其他三聚化结构域的融合蛋白及对照组，表明2RBD-GCN4pLLC融合蛋白寡聚体是一种较为理想的SARS-CoV-2候选疫苗。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院基础医学研究所
<120> 一种含寡聚化结构域的新型冠状病毒S蛋白受体结合域融合蛋白及其用途
<160> 35
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His
1 5 10 15
Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Val
20 25 30
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Gln Ile Glu Asp Lys Leu Glu Glu Ile Leu Ser Lys Leu Tyr His
1 5 10 15
Ile Glu Asn Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Leu Leu Gly Glu Val
20 25 30
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Gln Leu Glu Asp Lys Leu Glu Glu Leu Leu Ser Lys Leu Tyr His
1 5 10 15
Leu Glu Asn Glu Leu Ala Arg Leu Lys Lys Leu Leu Gly Glu Val
20 25 30
<210> 6
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly
1 5 10 15
Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro
20 25 30
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe Ser Phe Leu
35 40 45
Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg Tyr Tyr Arg
50 55 60
Ala Asp Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr
65 70 75 80
Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu
85 90 95
Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys
100 105 110
His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly
115 120 125
Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu
130 135 140
Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser
165 170 175
Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro
180 185 190
Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu
195 200 205
Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met
210 215 220
Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Gln Gly Ser
225 230 235 240
Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser
245 250 255
Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr
260 265 270
Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp
275 280 285
Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp
290 295 300
Val Gly Pro Val Cys Phe Leu
305 310
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Pro Pro His Ala Leu Ser
1 5
<210> 8
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
1 5 10 15
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
20 25 30
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys
35 40 45
Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn
50 55 60
Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile
65 70 75 80
Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro
85 90 95
Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp
100 105 110
Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys
115 120 125
Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
130 135 140
Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln
165 170 175
Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
180 185 190
Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys
195 200 205
Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Gly Ser Gly Tyr
210 215 220
Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly
225 230 235 240
Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
245
<210> 9
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
1 5 10 15
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
20 25 30
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
35 40 45
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
65 70 75 80
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
85 90 95
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
115 120 125
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
130 135 140
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
165 170 175
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
180 185 190
Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val
195 200 205
Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Gly Ser Gly Tyr Ile
210 215 220
Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu
225 230 235 240
Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
245
<210> 10
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Ser Ala Thr Arg Phe
1 5 10 15
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala
20 25 30
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
35 40 45
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
65 70 75 80
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
85 90 95
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
115 120 125
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
130 135 140
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
165 170 175
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
180 185 190
Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val
195 200 205
Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Gly Ser Gly Tyr Ile
210 215 220
Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu
225 230 235 240
Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
245
<210> 11
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Ser Ala Thr Arg Phe
1 5 10 15
Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Ala Cys Val Ala
20 25 30
Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys
35 40 45
Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val
50 55 60
Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
65 70 75 80
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
85 90 95
Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser
115 120 125
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
130 135 140
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
165 170 175
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr
180 185 190
Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val
195 200 205
Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Gly Ser Gly Tyr Ile
210 215 220
Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu
225 230 235 240
Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
245
<210> 12
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn
210 215 220
Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys
225 230 235 240
Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp
245 250 255
Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys
260 265 270
Ser Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr
275 280 285
Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
290 295 300
<210> 13
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ala Pro Pro His Ala Leu Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val
1 5 10 15
Arg Phe Pro Ala Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
20 25 30
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
35 40 45
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
50 55 60
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
65 70 75 80
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
85 90 95
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
100 105 110
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
115 120 125
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
130 135 140
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
145 150 155 160
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
165 170 175
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
180 185 190
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
195 200 205
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys
210 215 220
Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg
245 250 255
Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Ala Pro Pro His Ala Leu Ser
275 280
<210> 14
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Pro Pro His Ala Leu Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val
1 5 10 15
Arg Phe Pro Ala Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
20 25 30
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Gln Arg Lys Arg Ile Ser
35 40 45
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
50 55 60
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
65 70 75 80
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
85 90 95
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
100 105 110
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
115 120 125
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
130 135 140
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
145 150 155 160
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
165 170 175
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
180 185 190
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
195 200 205
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys
210 215 220
Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg
245 250 255
Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Ala Pro Pro His Ala Leu Ser
275 280
<210> 15
<211> 778
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ala Pro Pro His Ala Leu Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val
1 5 10 15
Arg Phe Pro Ala Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
20 25 30
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Gln Arg Lys Arg Ile Ser
35 40 45
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
50 55 60
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
65 70 75 80
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
85 90 95
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
100 105 110
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
115 120 125
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
130 135 140
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
145 150 155 160
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
165 170 175
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
180 185 190
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
195 200 205
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys
210 215 220
Asn Lys Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Ala Ile
225 230 235 240
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
245 250 255
Ser Val Tyr Ala Trp Gln Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
260 265 270
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
275 280 285
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
290 295 300
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
305 310 315 320
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
325 330 335
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
340 345 350
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
355 360 365
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
370 375 380
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
385 390 395 400
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
405 410 415
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
420 425 430
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
435 440 445
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly
465 470 475 480
Pro Arg Gly Arg Thr Gly Asp Ala Gly Pro Val Gly Pro Pro Gly Pro
485 490 495
Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Ser Ala Gly Phe Asp Phe
500 505 510
Ser Phe Leu Pro Gln Pro Pro Gln Glu Lys Ala His Asp Gly Gly Arg
515 520 525
Tyr Tyr Arg Ala Asp Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu
530 535 540
Val Asp Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg
545 550 555 560
Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu
565 570 575
Lys Met Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro
580 585 590
Asn Gln Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu
595 600 605
Thr Gly Glu Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys
610 615 620
Asn Trp Tyr Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe
625 630 635 640
Gly Glu Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly
645 650 655
Ser Asp Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met
660 665 670
Ser Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val
675 680 685
Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu
690 695 700
Gln Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe
705 710 715 720
Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp
725 730 735
Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Thr Ser Arg Leu Pro
740 745 750
Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe
755 760 765
Gly Phe Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu
770 775
<210> 16
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Gly Thr Arg Val Gln
210 215 220
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
225 230 235 240
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
245 250 255
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
260 265 270
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
275 280 285
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
290 295 300
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
305 310 315 320
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
325 330 335
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
340 345 350
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
355 360 365
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
370 375 380
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
385 390 395 400
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
405 410 415
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
420 425 430
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala
435 440 445
Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu
450 455 460
Leu Ser Thr Phe Leu
465
<210> 17
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
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195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Gly Thr Arg Val Gln
210 215 220
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
225 230 235 240
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
245 250 255
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
260 265 270
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
275 280 285
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
290 295 300
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
305 310 315 320
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
325 330 335
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
340 345 350
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
355 360 365
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370 375 380
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
385 390 395 400
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
405 410 415
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
420 425 430
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Thr Ser Lys Gln Ile Glu Asp Lys
435 440 445
Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala
450 455 460
Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Val
465 470
<210> 18
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
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100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
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195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Gly Thr Arg Val Gln
210 215 220
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
225 230 235 240
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
245 250 255
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
260 265 270
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
275 280 285
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290 295 300
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
305 310 315 320
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
325 330 335
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
340 345 350
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
355 360 365
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370 375 380
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Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
405 410 415
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420 425 430
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Thr Ser Lys Gln Ile Glu Asp Lys
435 440 445
Leu Glu Glu Ile Leu Ser Lys Leu Tyr His Ile Glu Asn Glu Leu Ala
450 455 460
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465 470
<210> 19
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
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35 40 45
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Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
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245 250 255
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
260 265 270
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
275 280 285
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290 295 300
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
305 310 315 320
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
325 330 335
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
340 345 350
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
355 360 365
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370 375 380
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
385 390 395 400
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
405 410 415
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
420 425 430
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Thr Ser Lys Gln Leu Glu Asp Lys
435 440 445
Leu Glu Glu Leu Leu Ser Lys Leu Tyr His Leu Glu Asn Glu Leu Ala
450 455 460
Arg Leu Lys Lys Leu Leu Gly Glu Val
465 470
<210> 20
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
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Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
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100 105 110
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115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Gly Thr Arg Val Gln
210 215 220
Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro
225 230 235 240
Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
245 250 255
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
260 265 270
Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr
275 280 285
Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val
290 295 300
Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
305 310 315 320
Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val
325 330 335
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
340 345 350
Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu
355 360 365
Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn
370 375 380
Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe
385 390 395 400
Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu
405 410 415
Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys
420 425 430
Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Thr Ser Lys Gln Leu Glu Asp Lys
435 440 445
Leu Glu Glu Leu Leu Ser Lys Leu Tyr His Leu Glu Asn Glu Leu Ala
450 455 460
Arg Leu Lys Lys Leu Leu Gly Glu Val Cys
465 470
<210> 21
<211> 888
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
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accaacttgt gcccttttgg tgaagtgttc aacgccaccc gcttcgcatc tgtttatgct 180
tggaacagga agcgcatcag caactgcgtg gctgattatt ctgtcttgta caactccgcg 240
tcattctcca ccttcaagtg ctatggagtg agccctacca aactgaatga cctctgcttc 300
accaacgtct atgcagattc atttgtaatt agaggtgacg aagtcagaca gatcgcccca 360
ggccagactg gaaagatcgc tgattacaac tataagctgc cagatgattt cacaggctgc 420
gtcatcgctt ggaattcgaa caacctcgac tcgaaggtgg gtggtaatta taactacctg 480
taccgcttgt tcaggaagtc taacctcaaa cctttcgaga gagatatcag caccgagatc 540
tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt gttgaaggtt tcaactgtta ctttcctttg 600
caatcatacg gtttccaacc cactaatggt gtcggttacc agccataccg cgtagtagta 660
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ttggtaaaga acaaatgcgt caacttcaac ttcaatggtc tgaccggcac aggtggttct 780
ggctacattc ctgaagctcc ccgtgatgga caagcctacg tccgcaaaga cggtgagtgg 840
gtattgcttt ccaccttcct ccaccaccat caccatcacc accattaa 888
<210> 22
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
agcgctattg tcctgtatgt gctcttggca gctgcggccc attctgcctt tgcgatcacc 120
aacttgtgcc cttttggtga agtgttcaac gccacccgct tcgcatctgt ttatgcttgg 180
aacaggaagc gcatcagcaa ctgcgtggct gattattctg tcttgtacaa ctccgcgtca 240
ttctccacct tcaagtgcta tggagtgagc cctaccaaac tgaatgacct ctgcttcacc 300
aacgtctatg cagattcatt tgtaattaga ggtgacgaag tcagacagat cgccccaggc 360
cagactggaa agatcgctga ttacaactat aagctgccag atgatttcac aggctgcgtc 420
atcgcttgga attcgaacaa cctcgactcg aaggtgggtg gtaattataa ctacctgtac 480
cgcttgttca ggaagtctaa cctcaaacct ttcgagagag atatcagcac cgagatctat 540
caggccggta gcacaccttg taatggtgtt gaaggtttca actgttactt tcctttgcaa 600
tcatacggtt tccaacccac taatggtgtc ggttaccagc cataccgcgt agtagtactg 660
tccttcgaac tgttgcacgc accagcgact gtgtgcggac ctaagaagtc gactaatttg 720
gtaaagaaca aatgcgtcaa cttcaacttc aatggtctga ccggcacagg tggttctggc 780
tacattcctg aagctccccg tgatggacaa gcctacgtcc gcaaagacgg tgagtgggta 840
ttgctttcca ccttcctcca ccaccatcac catcaccacc attaa 885
<210> 23
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
agcgctattg tcctgtatgt gctcttggca gctgcggccc attctgcctt tgcgatcacc 120
aacttgtgcc cttttggtga agtgttctcc gccacccgct tcgcatctgt ttatgcttgg 180
aacaggaagc gcatcagcaa ctgcgtggct gattattctg tcttgtacaa ctccgcgtca 240
ttctccacct tcaagtgcta tggagtgagc cctaccaaac tgaatgacct ctgcttcacc 300
aacgtctatg cagattcatt tgtaattaga ggtgacgaag tcagacagat cgccccaggc 360
cagactggaa agatcgctga ttacaactat aagctgccag atgatttcac aggctgcgtc 420
atcgcttgga attcgaacaa cctcgactcg aaggtgggtg gtaattataa ctacctgtac 480
cgcttgttca ggaagtctaa cctcaaacct ttcgagagag atatcagcac cgagatctat 540
caggccggta gcacaccttg taatggtgtt gaaggtttca actgttactt tcctttgcaa 600
tcatacggtt tccaacccac taatggtgtc ggttaccagc cataccgcgt agtagtactg 660
tccttcgaac tgttgcacgc accagcgact gtgtgcggac ctaagaagtc gactaatttg 720
gtaaagaaca aatgcgtcaa cttcaacttc aatggtctga ccggcacagg tggttctggc 780
tacattcctg aagctccccg tgatggacaa gcctacgtcc gcaaagacgg tgagtgggta 840
ttgctttcca ccttcctcca ccaccatcac catcaccacc attaa 885
<210> 24
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
agcgctattg tcctgtatgt gctcttggca gctgcggccc attctgcctt tgcgatcacc 120
aacttgtgcc cttttggtga agtgttctcc gccacccgct tcgcatctgt ttatgcttgg 180
aacaggaagc gcatcagcgc ttgcgtggct gattattctg tcttgtacaa ctccgcgtca 240
ttctccacct tcaagtgcta tggagtgagc cctaccaaac tgaatgacct ctgcttcacc 300
aacgtctatg cagattcatt tgtaattaga ggtgacgaag tcagacagat cgccccaggc 360
cagactggaa agatcgctga ttacaactat aagctgccag atgatttcac aggctgcgtc 420
atcgcttgga attcgaacaa cctcgactcg aaggtgggtg gtaattataa ctacctgtac 480
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caggccggta gcacaccttg taatggtgtt gaaggtttca actgttactt tcctttgcaa 600
tcatacggtt tccaacccac taatggtgtc ggttaccagc cataccgcgt agtagtactg 660
tccttcgaac tgttgcacgc accagcgact gtgtgcggac ctaagaagtc gactaatttg 720
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tacattcctg aagctccccg tgatggacaa gcctacgtcc gcaaagacgg tgagtgggta 840
ttgctttcca ccttcctcca ccaccatcac catcaccacc attaa 885
<210> 25
<211> 1047
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
agcgctattg tcctgtatgt gctcttggca gctgcggccc attctgcctt tgcgcgcgtc 120
caaccaacag agtctattgt gagatttcct aatatcacca acttgtgccc ttttggtgaa 180
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caccaccatc accatcacca ccattaa 1047
<210> 26
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
agcgctattg tcctgtatgt gctcttggca gctgcggccc attctgcctt tgcggcgcca 120
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<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
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catcatcacc accaccatta a 981
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
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<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
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<210> 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
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<210> 31
<211> 1584
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
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<210> 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
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cccactaatg gtgtcggtta ccagccatac cgcgtagtag tactgtcctt cgaactgttg 720
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acccgcgtcc aaccaacaga gtctattgtg agatttccta atatcaccaa cttgtgccct 840
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tcgaacaacc tcgactcgaa ggtgggtggt aattataact acctgtaccg cttgttcagg 1200
aagtctaacc tcaaaccttt cgagagagat atcagcaccg agatctatca ggccggtagc 1260
acaccttgta atggtgttga aggtttcaac tgttactttc ctttgcaatc atacggtttc 1320
caacccacta atggtgtcgg ttaccagcca taccgcgtag tagtactgtc cttcgaactg 1380
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<211> 1587
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
agcgctattg tcctgtatgt gctcttggca gctgcggccc attctgcctt tgcgtctaga 120
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tgcggaccta agaagtcgac taatttggta aagaacaaag gtacccgcgt ccaaccaaca 840
gagtctattg tgagatttcc taatatcacc aacttgtgcc cttttggtga agtgttcaac 900
gccacccgct tcgcatctgt ttatgcttgg aacaggaagc gcatcagcaa ctgcgtggct 960
gattattctg tcttgtacaa ctccgcgtca ttctccacct tcaagtgcta tggagtgagc 1020
cctaccaaac tgaatgacct ctgcttcacc aacgtctatg cagattcatt tgtaattaga 1080
ggtgacgaag tcagacagat cgccccaggc cagactggaa agatcgctga ttacaactat 1140
aagctgccag atgatttcac aggctgcgtc atcgcttgga attcgaacaa cctcgactcg 1200
aaggtgggtg gtaattataa ctacctgtac cgcttgttca ggaagtctaa cctcaaacct 1260
ttcgagagag atatcagcac cgagatctat caggccggta gcacaccttg taatggtgtt 1320
gaaggtttca actgttactt tcctttgcaa tcatacggtt tccaacccac taatggtgtc 1380
ggttaccagc cataccgcgt agtagtactg tccttcgaac tgttgcacgc accagcgact 1440
gtgtgcggac ctaagaagtc gactaatttg gtaaagaaca aaactagtaa acagcttgag 1500
gacaaacttg aggaactgct ttcgaagctc taccatcttg agaacgagct tgcccgtctc 1560
aagaaacttc tcggtgaggt atgctaa 1587
<210> 34
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Thr Ser Lys Gln Leu
210 215 220
Glu Asp Lys Leu Glu Glu Leu Leu Ser Lys Leu Tyr His Leu Glu Asn
225 230 235 240
Glu Leu Ala Arg Leu Lys Lys Leu Leu Gly Glu Val Cys
245 250
<210> 35
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atgctactcg tgaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60
agcgctattg tcctgtatgt gctcttggca gctgcggccc attctgcctt tgcgtctaga 120
ctcgtcccga ggggttcatg gagtcatcca cagtttgaga agcgcgtcca accaacagag 180
tctattgtga gatttcctaa tatcaccaac ttgtgccctt ttggtgaagt gttcaacgcc 240
acccgcttcg catctgttta tgcttggaac aggaagcgca tcagcaactg cgtggctgat 300
tattctgtct tgtacaactc cgcgtcattc tccaccttca agtgctatgg agtgagccct 360
accaaactga atgacctctg cttcaccaac gtctatgcag attcatttgt aattagaggt 420
gacgaagtca gacagatcgc cccaggccag actggaaaga tcgctgatta caactataag 480
ctgccagatg atttcacagg ctgcgtcatc gcttggaatt cgaacaacct cgactcgaag 540
gtgggtggta attataacta cctgtaccgc ttgttcagga agtctaacct caaacctttc 600
gagagagata tcagcaccga gatctatcag gccggtagca caccttgtaa tggtgttgaa 660
ggtttcaact gttactttcc tttgcaatca tacggtttcc aacccactaa tggtgtcggt 720
taccagccat accgcgtagt agtactgtcc ttcgaactgt tgcacgcacc agcgactgtg 780
tgcggaccta agaagtcgac taatttggta aagaacaaaa ctagtaaaca gcttgaggac 840
aaacttgagg aactgctttc gaagctctac catcttgaga acgagcttgc ccgtctcaag 900
aaacttctcg gtgaggtatg ctaa 924

Claims (11)

1. 一种SARS-CoV-2病毒S蛋白受体结合域（RBD）融合蛋白，其序列如SEQ ID No.20或SEQ ID No.34所示。
2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的RBD融合蛋白。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，所述多核苷酸的序列采用昆虫细胞密码子进行全基因优化。
4. 如权利要求3所述的多核苷酸，其序列上游融合杆状病毒GP67信号肽编码序列、标签蛋白编码序列、thrombin酶切位点编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.33或SEQID No.35所示。
5.一种载体，其包含如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸。
6.一种细胞，其包含如权利要求5所述的载体。
7.一种由权利要求1所述的RBD融合蛋白形成的寡聚体。
8.如权利要求1所述的RBD融合蛋白、如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸、如权利要求5所述的载体或如权利要求7所述的RBD融合蛋白形成的寡聚体在制备预防SARS-CoV-2感染的疫苗中的用途。
9.一种用于预防SARS-CoV-2感染的疫苗，其包含如权利要求1所述的RBD融合蛋白、如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸、如权利要求5所述的载体或如权利要求7所述的RBD融合蛋白形成的寡聚体、佐剂、以及疫苗用赋形剂或载体。
10.根据权利要求9所述的用于预防SARS-CoV-2感染的疫苗，还包含至少一种来自其他冠状病毒的S蛋白或RBD融合蛋白的单体、寡聚体、相应的多核苷酸或相应的表达载体。
11.根据权利要求10所述的用于预防SARS-CoV-2感染的疫苗，所述佐剂为人用佐剂。
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