CN114230674B - 一种含Fc结构域的新型冠状病毒S蛋白受体结合域融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)刺突蛋白(S)的受体结合域(RBD)融合蛋白及其用途，具体公开了一种新型冠状病毒S蛋白RBD融合蛋白，由至少一个拷贝的源自新冠病毒S蛋白的RBD多肽、Fc结构域、和/或内源性佐剂组成，所述的内源性佐剂为RS09佐剂。该新型冠状病毒RBD融合蛋白可用于制备预防新型冠状病毒感染及感染诱发疾病的疫苗。

Description

一种含Fc结构域的新型冠状病毒S蛋白受体结合域融合蛋白 及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)受体结合域(RBD)融合蛋白，及由其形成的寡聚体，以及RBD融合蛋白或RBD融合蛋白寡聚体在制备预防新型冠状病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗中的用途。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)为有包膜的正链RNA病毒，病毒有4种结构蛋白(S、M、N、E)，其中S蛋白是感染入侵的关键蛋白，以三聚体形式分布在包膜表面，其N端含有细胞受体结合域(receptor binding domain,RBD)。RBD与宿主细胞的ACE2结合后，S蛋白发生变构，启动病毒感染入侵。S蛋白是冠状病毒疫苗研究的主要靶抗原。

Moderna及辉瑞的以S蛋白为基础的mRNA新冠疫苗的III期临床试验的中期结果显示，两种疫苗的保护效率均在90％以上，表明S蛋白作为疫苗抗原可成功地预防病毒的感染，且具有很好的安全性。包括上述两家公司在内的多家制药公司的S蛋白抗原都进行了突变修饰，在S2区域引入了2P突变，使S蛋白处于融合前的状态，以保证S蛋白中与ACE2受体结合的区域(RBD区)以正确的构象进行最大程度的暴露。因此，以RBD为基础的新冠疫苗备受关注，包括流感病毒载体疫苗、RBD蛋白疫苗等。新冠病毒RBD蛋白疫苗目前报道的有两种形式，分别是RBD单体疫苗及两个拷贝的RBD串联形成的二聚体疫苗，其中串联二聚体疫苗具有较强的诱发产生中和抗体的活性，其诱发产生中和抗体的滴度是康复者血清的3.9倍，较目前报道的其他形式的新冠疫苗，包括灭活疫苗、mRNA疫苗、腺病毒载体疫苗，均较高。因此，新冠病毒RBD蛋白疫苗具有研发前景。

RBD蛋白疫苗首先是以单体的形式在SARS-CoV中进行探索研究的。采用酵母表达体系进行SARS-CoV RBD单体的研究，选择了两种长度的RBD(aa.318-510/193mer、aa.318-536/219mer)及其3种敲除或突变不同N糖基化位点(N1、N2、N3)的RBD突变体，发现所有的去糖基化修饰均可显著降低RBD突变体的表达水平，其中N1糖基化位点(aa.318)的影响相对较小，对N1去糖基化位点突变体及野生型RBD的免疫血清的中和活性进行分析，发现：首先，去糖基化位点的修饰可增强219mer的免疫原性，但是降低了193mer的免疫原性；其次，两种长度的RBD，在N1位点去糖基化修饰的状态下，219mer高于193mer，而糖基化位点正常的野生型状态下，两者相同。上述结果表明，在酵母表达体系中，3种去糖基化修饰可降低RBD的表达量，N1去糖基化位点的修饰对RBD免疫原性的影响与RBD的长度相关，去糖基化修饰的突变体中，219mer的免疫原性较好。由于酵母是单细胞真核生物，其糖基化形成的支链寡糖，特别是最末端的寡糖类型具有酵母种属的特点，与多细胞真核生物来源的表达体系，如昆虫细胞、293T细胞等的糖基化类型及支链寡糖的构成特点具有明显不同。糖基化的不同不仅可影响其表观分子量，同时也可影响蛋白的整体理化性质。目前，有关去糖基化的RBD突变体在其他表达体系中，去糖基化对RBD的表达水平及免疫原性的影响未见报道。

MERS RBD-Fc融合蛋白的研究发现，以RBM为核心区，分别向N端和/或C端延长，获得的5种不同长度的RBD(aa.350-588、aa.358-588、aa.367-588、aa.367-606、aa.377-588)-Fc融合蛋白，免疫血清针对MERS-CoV的中和实验分析显示，RBD(aa.377-588)-Fc的中和活性显著高于其他4个RBD突变体-Fc，而其他4个突变体之间的中和活性无差异。提示免疫原性最高的MERS-CoV RBD肽段是不可预测的。目前，SARS-CoV RBD-Fc融合蛋白的研究仅报道了一种长度的RBD区(aa.318-510)，新冠病毒RBD蛋白疫苗研究以RBD单体及串联二聚体为主，其RBD-Fc融合蛋白疫苗也仅报道了一种长度的RBD区(aa.319-532)。因此，新冠病毒RBD-Fc融合蛋白疫苗的研究中，免疫活性最佳的RBD长度是无法预测的。另外，采用两个拷贝的免疫原性最高的RBD串联肽，在其C端融合Fc或其他寡聚化结构域，进行RBD四聚体、六聚体等蛋白疫苗的研究，尚未见有报道。

因此，本发明利用昆虫细胞表达体系，采用表达新冠病毒RBD-Fc融合蛋白的方法，获得不同长度、不同糖基化修饰、不同拷贝数RBD、含或不含分子内佐剂的Fc-RBD多聚体融合蛋白疫苗，包括Fc-RBD二聚体及Fc-RBD四聚体，优选免疫活性最佳的Fc-RBD多聚体蛋白疫苗题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒RBD融合蛋白及其形成的寡聚体，用于制备预防新型冠状病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗。

本发明人出人意料地发现，不同长度的RBD多肽、不同的糖基化修饰、不同的寡聚化结构域，均可显著影响RBD融合蛋白的表达水平及免疫活性，通过对多个候选RBD融合蛋白进行筛选，本发明获得了在昆虫细胞表达系统中高水平表达、并可诱发针对新型冠状病毒的中和抗体的RBD融合蛋白及其寡聚体。

基于上述目的，本发明提供了一种新型冠状病毒S蛋白受体结合域融合蛋白，其特征为，含有至少一个拷贝的源自新型冠状病毒S蛋白或S蛋白突变体的RBD多肽、寡聚化结构域、和/或内源性佐剂。

可选地，本发明涉及的新型冠状病毒S蛋白的氨基酸序列来自NCBI数据库中的QHD43416.1序列，新型冠状病毒S蛋白突变体序列可来自但不限于Alpha、Beta、Gamma、Delta、Epsilon、Eta、Iota、Kappa、Lambda、Zeta、Mu等新型冠状病毒变异株的S蛋白(如NCBI数据库中的QWA53375.2、QWA53387.1、QVI56963.1、QWM26437.1序列等)。优选地，所述的新型冠状病毒S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

可选地，所述S蛋白突变体为将其RBD区域的N糖基化或O糖基化位点删除或置换的突变体。优选地，所述删除或置换突变为将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位、和/或第343位、和/或第354位、和/或第360位的天冬氨酸(N)删除或置换为非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸，所述非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)及苏氨酸(T)。

可选地，所述S蛋白突变体为将其上与感染入侵相关或与RBD结构相关的关键位点进行删除或置换的突变体。优选地，所述突变为第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)和/或第614位天冬氨酸(D)置换为甘氨酸(G)

可选地，所述S蛋白突变体为上述RBD区域糖基化位点突变及S蛋白感染入侵或与RBD结构相关的关键位点突变联合的突变体。优选地，所述突变为将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位、和/或第343位、和/或第354位、和/或第360位的天冬氨酸(N)删除或置换为非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸，和/或将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)，和/或第614位天冬氨酸(D)置换为甘氨酸(G)，所述非极性氨基酸或极性不带电荷氨基酸选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酰胺(Q)及苏氨酸(T)。

可选地，所述RBD多肽选自新型冠状病毒S蛋白或S蛋白突变体序列的319至537位，或其N端延长或截短1至13个氨基酸、和/或C端截短1至13个氨基酸或延长1至82个氨基酸的序列。

优选地，所述RBD多肽选自：

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位至550位；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第332位至550位；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至591位；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至614位；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位至550位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第332位至550位，且第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位；且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至591位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)；

SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至614位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第343位天冬酰胺(N)置换为丝氨酸(S)，和/或第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，和/或第360位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)，和/或第417位赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N)，和/或第452位亮氨酸(L)置换为精氨酸(R)，和/或第468位异亮氨酸(I)置换为苯丙氨酸(F)，和/或第478位苏氨酸(T)置换为赖氨酸(K)，和/或第484位谷氨酸(E)突变为赖氨酸(K)，和/或第501位天冬氨酸(N)突变为酪氨酸(Y)，和/或第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)，和/或第614位天冬氨酸(D)置换为甘氨酸(G)。

可选地，所述寡聚化结构域为Fc结构域。优选地，所述寡聚化结构域选自人IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4的Fc结构域及这些结构域的突变体。进一步优选地，所述Fc结构域的氨基酸序列选自SEQ ID No.2。

可选地，所述寡聚化结构域融合在所述RBD多肽的N端或C端。优选地，所述寡聚化结构域融合在所述RBD多肽的C端。

可选地，所述内源性佐剂为具有免疫刺激活性的氨基酸序列，可选自但不限于：N端酯化信号肽、鞭毛蛋白、Fc受体靶向序列等。优选地，所述内源性佐剂为RS09佐剂，其序列如SEQ ID No.3所示。

可选地，所述RBD融合蛋白中含有至少1个拷贝的内源性佐剂。

可选地，所述内源性佐剂融合在所述RBD多肽的N端和/或所述寡聚化结构域的C端。

可选地，所述RBD融合蛋白的各个元件之间，例如RBD多肽之间、RBD多肽与寡聚化序列之间、RBD多肽与内源性佐剂之间、寡聚化序列与内源性佐剂之间，可采用直接融合的方式或插入连接子的方式进行连接。

可选地，所述连接子的长度为1-17个氨基酸。

可选地，所述的连接子由选自甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、苏氨酸(T)及脯氨酸(P)的氨基酸任意组合构成。优选地，所述连接子由4个甘氨酸(G)和1个丝氨酸(S)串联重复组成。

可选地，所述RBD融合蛋白的N端可融合适于不同表达系统的外泌信号肽。所述外泌信号肽可选自但不限于：冠状病毒S蛋白信号肽、CD5分子信号肽、IL-2信号肽、IgE信号肽、杆状病毒GP67信号肽等。优选地，所述外泌信号肽为杆状病毒GP67信号肽。

可选地，所述RBD融合蛋白的N端和/或C端可融合用于表达检测或便于纯化的标签蛋白或多肽。所述标签蛋白或多肽可选自但不限于：GST标签、His标签、T7标签、SUMO标签、MBP标签、Strep标签、HA标签、FLAG标签等。

可选地，所述RBD融合蛋白和标签蛋白或多肽之间含有蛋白酶切位点。所述蛋白酶切位点可选自但不限于：thrombin酶切位点、factor Xa酶切位点、SUMO蛋白酶酶切位点、enterokinase酶切位点等。

本发明的另一方面涉及编码上述的RBD融合蛋白的多核苷酸。

本发明还提供了包含上述的多核苷酸的载体，以及包含所述的载体的细胞。

本发明涉及的编码上述的RBD融合蛋白的多核苷酸序列适用于不同的表达系统。可选地，这些核苷酸序列采用大肠杆菌密码子进行全基因优化，可在大肠杆菌表达系统中高水平表达；或采用昆虫细胞密码子进行全基因优化，可在昆虫细胞表达系统中高水平表达；或采用酵母细胞密码子进行全基因优化，可在酵母细胞表达系统中高水平表达；或采用哺乳动物密码子进行全基因优化，可在哺乳动物细胞表达系统中高水平表达。

本发明还提供了一种新型冠状病毒RBD融合蛋白的寡聚物，优选地，该寡聚物为新型冠状病毒RBD融合蛋白的二聚体或四聚体。

本发明还提供了上述的新型冠状病毒RBD融合蛋白在制备预防新型冠状病毒感染或感染诱发的疾病的疫苗中的用途。

本发明还提供了还提供了一种用于预防新型冠状病毒感染或感染诱发的疾病的疫苗，其包含：

1)上述的新型冠状病毒RBD融合蛋白、编码RBD融合蛋白的多核苷酸、含有上述的载体、含有上述载体的病毒、和/或上述的新型冠状病毒RBD融合蛋白寡聚体；

2)任选地，佐剂；

3)任选地，疫苗用赋形剂或载体；

4)优选地，还包含至少一种来自于其他冠状病毒的S蛋白和/或RBD融合蛋白、编码相应蛋白的多核苷酸、含有相应多核苷酸的载体、含有相应载体的病毒、和/或相应的S蛋白和/或RBD融合蛋白寡聚体。

在一些实施方案中，上述新型冠状病毒RBD融合蛋白在所述疫苗中的含量为能诱发保护性免疫反应的有效量。

在一些实施方案中，所述佐剂为人用佐剂。优选，所述佐剂包括但不限于：铝佐剂；水包油乳剂或油包水乳剂及TLR刺激剂的佐剂组合物；氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物；或者MF59佐剂与聚肌苷酸-聚胞苷酸佐剂及稳定剂的组合物。

在一些实施方案中，本发明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，优选注射。

在一些实施方案中，本发明疫苗优选制备成单位剂型的形式，其中单位剂型中新型冠状病毒RBD融合蛋白或新型冠状病毒RBD融合蛋白寡聚体的剂量为5μg至500μg，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500μg、以及上述任意两个数值之间的范围；优选20μg至100μg每单位剂型。

发明中相关术语的说明及解释

根据本发明，术语“昆虫细胞表达系统”包括昆虫细胞、重组杆状病毒、重组Bacmid及表达载体。其中昆虫细胞来源于市场上可得到的细胞，在此举例但不限于：Sf9，Sf21，HighFive。

根据本发明，术语“原核表达系统”包括但不限于大肠杆菌表达系统。其中表达宿主菌来源于市场上可得到的菌株，在此举例但不限于：BL21(DE3)，BL21(DE3)plysS，C43(DE3)，Rosetta-gami B(DE3)。

根据本发明，术语“酵母表达系统”中，表达宿主菌来源于市场上可得到的菌株，在此举例但不限于：酿酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母。

根据本发明，术语“哺乳动物细胞表达系统”包括人源及各种动物细胞来源的表达系统。其中表达宿主细胞源于市场上可得到的细胞株，在此举例但不限于：CHO，HEK293，293T，Vero，MDCK。

根据本发明，术语“新型冠状病毒S蛋白”的例子包括但不限于NCBI数据库中编号为QWA53375.2、QWA53387.1、QVI56963.1、QWM26437.1的蛋白。

根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体”是指选自以下的一种或多种，包括但不限于：pH调节剂、表面活性剂、离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括阳离子、阴离子或非离子型表面活性剂，举例但不限于聚山梨酯80(Tween-80)。离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。

根据本发明，术语“人用佐剂”是指在临床上可应用于人体的佐剂，包括当前已获得批准的和将来可能获得批准的各种佐剂，例如但不限于铝佐剂、MF59及各种形式的佐剂组合物。

根据本发明，术语“乳剂”是指由水相成分、油相成分及乳化剂按适当比例混合，经乳化后形成的非均相液体分散体系。其中水相成分包括但不限于磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液等缓冲系统；油相成分为可代谢脂类，包括但不限于植物油、鱼油、动物油、合成油及其他脂类成分(例如但不限于角鲨烯、生育酚)。乳化剂为适宜的表面活性剂，例如但不限于山梨醇酐三油酸酯(Span-85)、聚山梨酯80(Tween-80)。

根据本发明，术语“稳定剂”是指可与佐剂中的聚肌苷酸-聚胞苷酸结合并起到稳定作用的成分，包括但不限于抗生素(例如但不限于卡那霉素、新霉素、庆大霉素)、无机盐(例如但不限于氯化钙、氯化镁、磷酸钙)、阳离子的有机复合物(例如但不限于硬脂酸钙、葡萄糖酸钙)。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1：本发明实施例4中RBD融合蛋白在昆虫细胞中的表达鉴定。结果显示，11种RBD融合蛋白均可在昆虫细胞中表达。1至10分别表示RS-RBD-Fc、RS-RBDN1-Fc、RS-RBDN1.3-Fc、RS-2RBD-Fc、RS-2RBDN1-Fc、RS-2RBDN1.3-Fc、RBDdCys-Fc、RS-RBDN1.3dCys-Fc、DRL-Fc、DRL2-Fc、RS-2sRBDN1.3-Fc，采用羊抗人IgG多克隆抗体检测。

图2：本发明实施例9中RBD融合蛋白高剂量免疫诱发的RBD特异性IgG抗体水平检测，*P<0.05。

图3：本发明实施例9中RBD融合蛋白高剂量免疫诱发的新型冠状病毒假病毒中和抗体水平检测，*P<0.05，**P<0.01。

图4A-图4B：本发明实施例9中RBD融合蛋白低剂量免疫诱发的RBD特异性IgG抗体水平检测，***P<0.001。

图5：本发明实施例9中RBD融合蛋白低剂量免疫诱发的新型冠状病毒假病毒中和抗体水平检测，*P<0.05。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：RBD融合蛋白的基因合成及表达载体构建

本发明涉及的各种融合蛋白分别按如下的方式构建：

1)RS-RBD-Fc：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第331位至550位，在其C端融合如SEQ ID No.2所示的人IgG1的Fc结构域，在所述RBD多肽的N端融合1个拷贝如SEQ ID No.3所示的佐剂序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RS-RBD-Fc表达质粒；

2)RS-RBDN1-Fc：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第332位至550位，在其C端融合如SEQ ID No.2所示的人IgG1的Fc结构域，在所述RBD多肽的N端融合1个拷贝如SEQ ID No.3所示的佐剂序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RS-RBDN1-Fc表达质粒；

3)RS-RBDN1.3-Fc：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)、第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)，在其C端融合如SEQ ID No.2所示的人IgG1的Fc结构域，在所述RBD多肽的N端融合1个拷贝如SEQ ID No.3所示的佐剂序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RS-RBDN1.3-Fc表达质粒；

4)RBDdCys-Fc：所述RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)，在所述RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.2所示的人IgG1的Fc结构域，在第RBD多肽与寡聚化结构域之间含有甘氨酸(G)-苏氨酸(T)连接子，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，获得的核苷酸序列如SEQ IDNo.18所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RBDdCys-Fc表达质粒；

5)RS-RBDN1.3dCys-Fc：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)、第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q)、第538位半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)，在其C端融合如SEQ ID No.2所示的人IgG1的Fc结构域，在所述RBD多肽的N端融合1个拷贝如SEQ ID No.3所示的佐剂序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RS-RBDN1.3dCys-Fc表达质粒；

6)RS-2RBD-Fc：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位直接串联融合SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，在第2个RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.2所示的人IgG1的Fc结构域，在第1个RBD多肽的N端融合1个拷贝如SEQID No.3所示的佐剂序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RS-2RBD-Fc表达质粒；

7)RS-2RBDN1-Fc：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位直接串联融合SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且两个拷贝的RBD序列第331位天冬酰胺(N)均置换为丙氨酸(A)，在第2个RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.2所示的人IgG1的Fc结构域，在第1个RBD多肽的N端融合1个拷贝如SEQ ID No.3所示的佐剂序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RS-2RBDN1-Fc表达质粒；

8)RS-2RBDN1.3-Fc：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位直接串联融合SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且两个拷贝的RBD序列第331位天冬酰胺(N)均置换为丙氨酸(A)、第354位天冬酰胺(N)均置换为谷氨酰胺(Q)，在第2个RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.2所示的人IgG1的Fc结构域，在第1个RBD多肽的N端融合1个拷贝如SEQ ID No.3所示的佐剂序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQID No.11所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RS-2RBDN1.3-Fc表达质粒；

9)DRL-Fc：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位，2个拷贝的RBD多肽串联重复，在第2个RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.2所示的人IgG1的Fc结构域，在第2个RBD多肽与寡聚化结构域之间插入17个氨基酸的连接子(GGGGSGGGGSGGGGSGT)，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-DRL-Fc表达质粒；

10)DRL2-Fc：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位，2个拷贝的RBD多肽串联重复，在第2个RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.2所示的人IgG1的Fc结构域，在第1个RBD多肽与第2个RBD多肽之间插入5个氨基酸的连接子(GGGGS)，在第2个RBD多肽与寡聚化结构域之间插入17个氨基酸的连接子(GGGGSGGGGSGGGGSG T)，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-DRL2-Fc表达质粒；

11)RS-2sRBDN1.3-Fc：采用的RBD多肽为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位直接串联融合SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且两个拷贝的RBD序列第331位天冬酰胺(N)均置换为丙氨酸(A)、第354位天冬酰胺(N)均置换为谷氨酰胺(Q)，第417位赖氨酸(K)置换为天冬氨酸(N)，第484位谷氨酸(E)置换为赖氨酸(K)，第501位天冬氨酸(N)置换为酪氨酸(Y)，在第2个RBD多肽的C端融合如SEQ ID No.2所示的人IgG1的Fc结构域，在第1个RBD多肽的N端融合1个拷贝如SEQ ID No.3所示的佐剂序列，获得的单体融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.14所示，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-RS-2sRBDN1.3-Fc表达质粒；

12)S2P：采用的S蛋白序列为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第16位至第1208位，且第614位天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G)，第682至685位氨基酸突变为GSAS，第986位及987位氨基酸均突变为脯氨酸(P)，在其C端融合如SEQ ID No.2所示的三聚化序列，其相应的核苷酸序列采用昆虫细胞密码子优化，并在其上游融合GP67编码序列，下游融合Strep-tag标签编码序列，采用全基因合成，并通过BamHI/HindIII酶切位点插入pFastBac1载体，获得pFastBac1-S2P表达质粒。

实施例2：RBD融合蛋白的基因的重组Bacmid及重组杆状病毒的构建

分别使用包含RBD融合蛋白基因的重组表达载体pFastBac1-RS-RBD-Fc、pFastBac1-RS-RBDN1-Fc、pFastBac1-RS-RBDN1.3-Fc、pFastBac1-RS-2RBD-Fc、pFastBac1-RS-2RBDN1-Fc、pFastBac1-RS-2RBDN1.3-Fc、pFastBac1-RBDdCys-Fc、pFastBac1-RS-RBDN1.3dCys-Fc、pFastBac1-DRL-Fc、pFastBac1-DRL2-Fc、pFastBac1-RS-2sRBDN1.3-Fc、pFastBac1-S2P，转化大肠杆菌DH10Bac感受态，筛选获得重组Bacmid，然后用重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9，在Sf9内扩增重组杆状病毒。重组Bacmid的筛选及重组杆状病毒的扩增方法都是公知的，例如专利CN101148661 B。

实施例3：RBD融合蛋白的基因在Sf9细胞中的表达

Sf9细胞分别接种融合蛋白基因的重组杆状病毒，进行融合蛋白的表达，27℃培养约88h后收发酵液，3000rpm离心15min，收集上清，用于表达鉴定及纯化。感染表达的方法是公开的，例如专利CN 101148661 B。

实施例4：RBD融合蛋白的表达鉴定

取实施例3中所述表达不同RBD融合蛋白的细胞培养上清各80μl，加入6×LoadingBuffer 20μl，75℃变性8分钟，分别取20μl进行SDS-PAG E电泳及Western blot鉴定。结果如图1所示，S2P-Fd融合蛋白及11种RB D融合蛋白均可在昆虫细胞中表达。SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定的方法是公开的，例如专利CN101148661 B。

实施例5：RBD融合蛋白在昆虫细胞中的表达量比较

取实施例3中表达的RBD融合蛋白的细胞培养上清，采用间接ELISA法检测上清中的RBD融合蛋白含量，ELISA检测的方法是公知的。

使用本发明人制备的RBD单体蛋白作为标准品进行倍比稀释包被酶标板，起始包被量100ng/孔，同时将待测培养上清倍比稀释包被酶标板，4℃孵育过夜；使用5％BSA-PBST室温封闭2h，再用PBST洗板3次。加入本发明人制备的RBD多克隆抗体(1：3000稀释)，每孔100μl，室温孵育2h。用PBST洗板3次，加入1：3000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1：3000稀释，中杉金桥公司)，37℃孵育45分钟。用PBST洗板5次，每孔加入100μl OPD底物(Sigma公司)，37℃显色5分钟，用50μl 2M硫酸终止反应，在490nm处测定吸光值。依据标准曲线计算培养上清中RBD融合蛋白的含量，检测结果如表1所示。

比较分析发现，采用来自SEQ ID No.1所示S蛋白原始序列的RBD片段构建的RS-RBD-Fc及RS-2RBD-Fc融合蛋白的表达水平较低(分别为3.7mg/L和10mg/L)；对RBD区进行了氨基酸突变改造的融合蛋白的表达水平分析发现，RBD区关键糖基化位点敲除突变可提高RBD-Fc融合蛋白的表达水平(如RS-RBDN1.3-Fc、RS-2RBDN1.3-Fc)；对RBD区第538位半胱氨酸进行敲除突变(RBDdCys-Fc)也可显著提高RBD-Fc二聚体的表达水平；同时敲除关键糖基化位点及第538位半胱氨酸，获得的RS-RBDN1.3dCys-Fc融合蛋白表达水平进一步提高，可达84.7mg/L。此外，连接子的使用也对融合蛋白的表达水平有一定影响，例如在RBD多肽与Fc之间、在2个串联的RBD片段之间增加连接子，获得的融合蛋白DRL-Fc及DRL2-Fc表达水平均高于RS-2RBD-Fc。值得注意的是，按照B.1.351突变株的氨基酸序列对RBD融合蛋白进行改造(第417位赖氨酸(K)置换为天冬氨酸(N)，第484位谷氨酸(E)置换为赖氨酸(K)，第501位天冬氨酸(N)置换为酪氨酸(Y))，并且联合去糖基化突变(第331位天冬酰胺(N)置换为丙氨酸(A)、第354位天冬酰胺(N)置换为谷氨酰胺(Q))，获得的2sRBDN1.3-Fc融合蛋白表达水平也很高(77mg/L)。

上述结果表明，RBD-Fc融合蛋白在昆虫细胞表达体系中的表达水平受到糖基化水平、氨基酸突变及连接子等多个因素的影响，因此设计获得表达水平高的RBD-Fc融合蛋白是难以预测的。

表1.RBD融合蛋白表达量分析

实施例6：RBD融合蛋白的纯化

取适量的RBD融合蛋白表达上清，使用200倍体积的PBS，4℃透析过夜，使用0.22μm滤器过滤样品，采用Protein G亲和层析纯化，纯化步骤在室温进行。Protein G亲和层析的平衡液为：20mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH7.0；洗脱液为：100mM甘氨酸，pH2.7。以上纯化方法是公开的，参照层析填料生产公司的说明书进行。

实施例7：免疫血清的RBD特异性抗体检测方法

采用间接ELISA法检测血清中的RBD特异性抗体。

使用本发明人制备的RBD单体蛋白包被酶标板，包被量100ng/孔，4℃孵育过夜；使用5％BSA-PBST室温封闭2h，再用PBST洗板3次。加入用PBST倍比稀释的待测血清，每孔100μl，起始稀释度为1：50，4℃孵育过夜。用PBST洗板3次，加入1：3000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1：3000稀释，中杉金桥公司)，37℃孵育45分钟。用PBST洗板5次，每孔加入100μlOPD底物(Sigma公司)，37℃显色5分钟，用50μl 2M硫酸终止反应，在490nm处测定吸光值。吸收值大于0.2且大于阴性对照2倍的稀释倍数视为待测血清的RBD特异性IgG抗体滴度。

实施例8：免疫血清的假病毒中和抗体检测方法

采用新型冠状病毒假病毒对免疫血清的中和抗体滴度进行检测，假病毒购自博奥龙免疫技术有限公司，假病毒中和实验的方法是公开的，例如文献Nie et al.,Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay,Nature Protocols,2020。

实施例9：RBD-Fc融合蛋白的免疫活性分析

RBD-Fc融合蛋白的免疫活性分析(高剂量)：取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分组，每组4只，用10μg RBD融合蛋白(RS-RBD-Fc、RS-RBDN1.3-Fc、RS-2RBD-Fc、RS-RBDN1.3-Fc及RBD单体对照)，联合Al(OH)₃50μg及CpG7909佐剂10μg免疫小鼠。皮下注射，于第0，3周免疫，共2次。第2次疫后2周尾静脉采血，分离血清。

采用ELISA检测血清中的RBD特异性IgG抗体水平，结果如图2所示，RS-RBDN1.3-Fc融合蛋白诱发的RBD特异性抗体水平最高，显著高于RBD单体(P<0.05)。

采用假病毒中和试验检测血清的中和抗体水平，结果如图3所示，RS-RBDN1.3-Fc融合蛋白诱发的中和抗体滴度最高(8100)，显著高于未去糖基化的RS-RBDN-Fc及RS-2RBDN-Fc融合蛋白(P<0.05)，也显著高于RBD单体(P<0.01)。

RBD-Fc融合蛋白的免疫活性分析(低剂量)：取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分组，每组5只，用3μg RBD融合蛋白(RS-RBD-Fc、RS-RBDN1.3-Fc、RS-2RBD-Fc、RS-RBDN1.3-Fc、DRL-Fc、DRL2-Fc、RBDdCys-Fc、RS-RBDN1.3dCys-Fc、S2P对照、RBD串联二聚体对照)，联合Al(OH)₃25μg及CpG 7909佐剂5μg免疫小鼠。皮下注射，于第0，3周免疫，共2次。第2次免疫后2周尾静脉采血，分离血清。

采用ELISA检测血清中的RBD特异性IgG抗体水平，结果如图4A所示，RS-RBDN1.3-Fc及RS-RBDN1.3dCys-Fc融合蛋白诱发的RBD特异性抗体水平最高，均显著高于其余7种RBD-Fc融合蛋白(P<0.001)；如图4B所示，与已有临床应用的重组蛋白疫苗抗原对照相比，优选的RS-RBDN1.3-Fc及RS-RBDN1.3dCys-Fc融合蛋白诱发的RBD特异性抗体水平更高(P<0.05)。

采用假病毒中和试验检测血清的中和抗体水平，结果如图5所示，RS-RBDN1.3-Fc及RS-RBDN1.3dCys-Fc融合蛋白诱发的中和抗体滴度最高，分别为1212和1400，显著高于未去糖基化的RS-RBDN-Fc融合蛋白(P<0.05)

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院基础医学研究所

<120> 一种含Fc结构域的新型冠状病毒S蛋白受体结合域融合蛋白及其用途

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1273

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu

1010 1015 1020

Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val

1025 1030 1035 1040

Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala

1045 1050 1055

Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu

1060 1065 1070

Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His

1075 1080 1085

Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val

1090 1095 1100

Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr

1105 1110 1115 1120

Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr

1125 1130 1135

Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

1140 1145 1150

Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp

1155 1160 1165

Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

1170 1175 1180

Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu

1185 1190 1195 1200

Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile

1205 1210 1215

Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile

1220 1225 1230

Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

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<400> 19

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

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<210> 22

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

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<400> 23

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<400> 24

atgctactcg ttaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60

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tgctatggag tgagccctac caaactgaat gacctctgct tcaccaacgt ctatgcagat 360

tcatttgtaa ttagaggtga cgaagtcaga cagatcgccc caggccagac tggaaagatc 420

gctgattaca actataagct gccagatgat ttcacaggct gcgtcatcgc ttggaattcg 480

aacaacctcg actcgaaggt gggtggtaat tataactacc tgtaccgctt gttcaggaag 540

tctaacctca aacctttcga gagagatatc agcaccgaga tctatcaggc cggtagcaca 600

ccttgtaatg gtgttgaagg tttcaactgt tactttcctt tgcaatcata cggtttccaa 660

cccactaatg gtgtcggtta ccagccatac cgcgtagtag tactgtcctt cgaactgttg 720

cacgcaccag cgactgtgtg cggacctaag aagtcgacta atttggtaaa gaacaaagga 780

ggcggttcac gtgttcagcc cacggagtct atagttcgtt ttcctaacat cacaaatctt 840

tgtccgttcg gtgaagtatt caacgcgacc cgttttgcgt cggtttatgc atggaaccgc 900

aaacgtatca gtaactgtgt cgctgactac agcgtgctct ataattctgc ctcattcagt 960

acattcaaat gctacggtgt ttctcctact aagctcaatg atctgtgctt tactaacgta 1020

tatgctgaca gctttgtaat tcgcggtgac gaggtaaggc agattgcacc tggtcagacg 1080

ggtaaaatcg cggattacaa ttacaaactg ccggacgatt ttaccggttg tgtaatcgca 1140

tggaactcca ataatcttga ttctaaggtc ggcggcaatt acaattatct ttacagactt 1200

ttccgcaaat ccaacctgaa gccgttcgag agggacataa gtaccgaaat ataccaagca 1260

ggcagcacgc cttgtaacgg tgtcgagggc ttcaattgct acttcccctt gcaaagttat 1320

ggctttcagc cgacaaacgg cgtgggttat caaccgtaca gggtggtggt cctctctttt 1380

gagctgttgc atgctcccgc tactgtttgt ggaccgaaga agagcacaaa cctggttaaa 1440

aataaaggtg gaggaggttc cggcggtgga ggatctggag gtggtggatc cggtaccgac 1500

aagactcaca catgtccacc ttgccctgcg ccagaactgc tcggtggccc gagcgtattc 1560

ctgtttcccc ctaagcctaa agataccctg atgatctctc gcacgcccga ggttacttgc 1620

gtggtggttg acgtatccca tgaagaccct gaggtcaaat tcaactggta tgtagatggc 1680

gtggaagtgc acaatgccaa gacaaagcct cgtgaggaac aatataattc tacttatagg 1740

gttgtttctg tattgacggt cctgcaccag gactggttga atggtaagga atacaagtgc 1800

aaagtcagca ataaggctct ccctgcacct atcgaaaaga ccattagcaa ggctaaggga 1860

caacctcgcg agccacaagt gtacacactc cctccaagcc gcgaagaaat gactaagaat 1920

caggtctctc tgacatgtct cgtgaaagga ttctatcctt cagacatcgc agtggagtgg 1980

gaaagcaatg gtcagcctga aaataattac aaaactaccc cgcccgtttt ggacagcgat 2040

ggtagcttct ttctgtactc taagttgacc gtggacaagt ccagatggca acagggtaat 2100

gtgttctcct gttccgtcat gcacgaggcg ctgcataatc actatacaca aaagtccctt 2160

tccctctccc caggtaaatg a 2181

<210> 25

<211> 2184

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atgctactcg ttaaccagtc tcaccaaggt ttcaataagg aacacactag caagatggtt 60

agcgctattg tcctgtatgt gctcttggca gctgcggccc attctgcctt tgcgtctaga 120

gcgccacccc atgccttgtc tagggtgcag cctaccgaaa gcattgtgag gtttccagct 180

attaccaatc tgtgcccttt cggagaggtg tttaacgcca ctagatttgc aagcgtctac 240

gcatggcaaa ggaagaggat tagcaattgc gtggccgact acagcgtcct gtacaatagc 300

gcatctttta gcacctttaa atgctacgga gtctctccca ccaagctgaa tgacttgtgc 360

ttcaccaacg tgtacgcaga ctcattcgtc atcaggggcg acgaagtcag acaaatcgct 420

cccggacaaa ctggaaacat tgctgattac aattacaaac tcccagatga cttcaccgga 480

tgcgtcatcg cttggaatag caacaacctg gactcaaagg tgggcggaaa ctacaactac 540

ctgtacaggc tctttagaaa gtccaatctg aagccatttg aaagggatat tagcactgag 600

atttaccaag ctggatcaac cccatgcaac ggcgtcaaag gattcaactg ctactttcca 660

ttgcagtctt acggcttcca gcccacatac ggagtgggat accagcccta cagggtggtc 720

gtgttgagct tcgagctcct gcacgctccc gccactgtct gcggacctaa gaagagcacc 780

aatctcgtga aaaacaagag ggtccagcca acagaaagca tcgtgagatt tcctgccatt 840

acaaatctgt gcccatttgg cgaagtgttc aacgccacta gattcgcatc cgtgtacgca 900

tggcaaagaa agagaatctc caactgcgtc gccgattaca gcgtcctgta caactcagct 960

tctttttcca cttttaagtg ctacggagtg agcccaacca agttgaatga tctctgcttt 1020

acaaacgtct acgcagattc atttgtgatc aggggcgacg aagtcagaca gatcgcaccc 1080

ggacaaacag gaaacattgc agattacaac tacaaactgc ctgatgactt caccggctgc 1140

gtcatcgcat ggaattctaa taatctggat tctaaggtcg gcggaaatta caactacctc 1200

tacagattgt ttagaaaatc caatttgaag ccattcgaga gagatatctc aactgaaatt 1260

taccaggcag gcagcactcc atgcaatggc gtgaaaggct ttaactgcta ctttcccctg 1320

cagtcatacg gatttcagcc cacctacggc gtcggctacc agccatacag ggtggtggtg 1380

ctctccttcg aactgctgca cgctcccgct accgtctgcg gacccaaaaa gtcaactaac 1440

ctcgtcaaga ataagtgcgt caattttaat tttaacggtc tcacaggaac aggcggtacc 1500

gacaagactc acacatgtcc accttgccct gcgccagaac tgctcggtgg cccgagcgta 1560

ttcctgtttc cccctaagcc taaagatacc ctgatgatct ctcgcacgcc cgaggttact 1620

tgcgtggtgg ttgacgtatc ccatgaagac cctgaggtca aattcaactg gtatgtagat 1680

ggcgtggaag tgcacaatgc caagacaaag cctcgtgagg aacaatataa ttctacttat 1740

agggttgttt ctgtattgac ggtcctgcac caggactggt tgaatggtaa ggaatacaag 1800

tgcaaagtca gcaataaggc tctccctgca cctatcgaaa agaccattag caaggctaag 1860

ggacaacctc gcgagccaca agtgtacaca ctccctccaa gccgcgaaga aatgactaag 1920

aatcaggtct ctctgacatg tctcgtgaaa ggattctatc cttcagacat cgcagtggag 1980

tgggaaagca atggtcagcc tgaaaataat tacaaaacta ccccgcccgt tttggacagc 2040

gatggtagct tctttctgta ctctaagttg accgtggaca agtccagatg gcaacagggt 2100

aatgtgttct cctgttccgt catgcacgag gcgctgcata atcactatac acaaaagtcc 2160

ctttccctct ccccaggtaa atga 2184

Claims (11)

1. 一种新型冠状病毒S蛋白受体结合域（RBD）融合蛋白，其特征为：含有至少一个拷贝的源自如SEQ ID No.1所示的新型冠状病毒S蛋白或S蛋白突变体的RBD多肽，在所述RBD多肽的C端融合如SEQ ID No. 2所示的Fc结构域，且在所述RBD多肽的N端融合1个拷贝如SEQID No.3所示的内源性佐剂；

所述RBD多肽选自：

如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且第331位天冬酰胺（N）置换为丙氨酸（A）、第354位天冬酰胺（N）置换为谷氨酰胺（Q）；

如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且第331位天冬酰胺（N）置换为丙氨酸（A）、第354位天冬酰胺（N）置换为谷氨酰胺（Q），第538位半胱氨酸（C）突变为甘氨酸（G）；

如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位直接串联融合SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且两个拷贝的RBD序列第331位天冬酰胺（N）均置换为丙氨酸（A）、第354位天冬酰胺（N）均置换为谷氨酰胺（Q）；

如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至537位直接串联融合SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的第319位至550位，且两个拷贝的RBD序列第331位天冬酰胺（N）均置换为丙氨酸（A）、第354位天冬酰胺（N）均置换为谷氨酰胺（Q），第417位赖氨酸（K）置换为天冬氨酸（N），第484位谷氨酸（E）置换为赖氨酸（K），第501位天冬氨酸（N）置换为酪氨酸（Y）；

所述RBD融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.11或SEQ IDNo.14所示。

2.一种多核苷酸，其编码权利要求1中所述的RBD融合蛋白。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，所述多核苷酸的序列采用昆虫细胞密码子进行全基因优化。

4. 如权利要求3所述的多核苷酸，其序列上游融合杆状病毒GP67信号肽编码序列，和/或其序列上游或下游融合标签蛋白编码序列，获得的核苷酸序列如SEQ ID No.17、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.22或SEQ ID No.25所示。

5.一种载体，其包含如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸。

6.一种细胞，其包含如权利要求5所述的载体。

7.一种由权利要求1中所述的新型冠状病毒RBD融合蛋白形成的寡聚体。

8.如权利要求1中所述的新型冠状病毒RBD融合蛋白或如权利要求2-4所述的多核苷酸或如权利要求5所述的载体或如权利要求7所述的RBD融合蛋白形成的寡聚体在制备预防新型冠状病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗中的用途。

9.一种用于预防新型冠状病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗，其包含如权利要求1中所述的新型冠状病毒RBD融合蛋白或如权利要求2-4所述的多核苷酸或如权利要求5所述的载体或如权利要求7所述的RBD融合蛋白形成的寡聚体。

10.根据权利要求9所述的用于预防新型冠状病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗，还包含至少一种来自其他冠状病毒的S蛋白或RBD融合蛋白的单体、寡聚体、相应的多核苷酸或相应的表达载体。

11.根据权利要求10所述的用于预防新型冠状病毒感染及感染诱发的疾病的疫苗，所述佐剂为人用佐剂。