JP6685903B2

JP6685903B2 - 立体構造的に安定化されたｒｓｖ融合前ｆタンパク質

Info

Publication number: JP6685903B2
Application number: JP2016530055A
Authority: JP
Inventors: マーシャル、クリストファー・パトリック; マクレラン、ジェイソン・スコット; アルフ、ピーター・ジョセフ; ベルトゥッチオリ、クラウディオ; マリアニ、ロベルト
Original assignee: アバター・メディカル・エルエルシー
Priority date: 2013-07-25
Filing date: 2014-07-24
Publication date: 2020-04-22
Anticipated expiration: 2034-07-24
Also published as: CA2919353A1; WO2015013551A1; US20150030622A1; US20220119454A1; EP3024483A1; EP3024483B1; US10125172B2; US20190292228A1; JP2016527253A; CA2919353C; ES2773309T3; EP3677279A1

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１３年７月２５日に提出された米国仮特許出願第６１／８５８，５３３号明細書の利益を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

連邦支援の研究に関する陳述
本発明は、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）によって与えられた認可番号１Ｒ４３ＡＩ１１２１２４−０１Ａ１の下で政府支援で行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
［配列表］
当該の出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１４年７月２４日に作成された前記ＡＳＣＩＩ写しは、Ａｖａｔａｒ＿００７＿ＷＯ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名され、サイズが１９６，４５２バイトである。
［著作権および参照による組込み］
本特許文書の開示の一部は、著作権保護の対象となる資料を含有する。著作権所有者は、それが特許商標庁の特許ファイルまたはレコードにおいて発表されるように、誰かによる特許文書または特許開示の複写による複製に反対しないが、そうでなければ全ての著作権の権利を一切留保する。

参照による組込みを可能にする管轄権のみの目的に関し、ここで引用した全ての文書の本文が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

発明の背景

毎年、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、米国において４〜５百万人の子供に感染し、乳幼児の入院の主な原因である（約１５０，０００の入院）。世界的に、それは、１歳未満の乳幼児における死亡の６．７％を占め、マラリアに次いで２番目である。さらに、それは、高齢者および免疫無防備状態の対象を含めた他の高リスク群への深刻な脅威を引き起こし、それは、米国においてさらにおよそ１８０，０００の入院および１２，０００人の死亡をもたらす。ＲＳＶのための現行の最先端の治療はなく、ＲＳＶのための唯一の現在承認されている予防的治療は、認可されたモノクローナル抗体シナジス（パリビズマブ）の受動的な投与であり、これは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質を認識し、約５０％のみ重度の疾患の発生率を減少させる。シナジスでの予防法の高いコストは、その使用を未熟児および先天性心疾患を有する２４ヶ月未満の乳幼児のみに限定する。総説に関して、Ｃｏｓｔｅｌｌｏｅｔａｌ．，“ＴａｒｇｅｔｉｎｇＲＳＶｗｉｔｈＶａｃｃｉｎｅｓａｎｄＳｍａｌｌＭｏｌｅｃｕｌｅＤｒｕｇｓ，ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｏｒｄｅｒｓ，”ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｓ，２０１２，ｖｏｌ．１２，ｎｏ．２を参照されたい。より効果的かつ、理想的には、より対費用効果の高いＲＳＶワクチンの開発は、甚大な価値のものであろう。ＲＳＶＦタンパク質特異的抗体が疾患から保護することができるという臨床的証拠は、この重要な未だ対処されていない医学的必要に取り組むために、追加のより良いモノクローナル抗体を同定するための、および予防ワクチンを開発するための一致した努力を促した。

本発明のいくつかの側面が以下に要約されている。さらなる側面は、ここで、発明の詳細な説明、実施例、図および特許請求の範囲において記載されている。

ＲＳＶＦタンパク質は、ＲＳＶからの保護と関連がある強力な中和抗体を誘導することが既知である。最近、ＲＳＶＦタンパク質三量体の融合前立体構造（ここで、「融合前Ｆ」または「前Ｆ（pre-F）」と称されてもよい）がヒト血清における中和活性の一次決定因子であることが示された。また、現在までに単離された最も強力な中和抗体（ｎＡｂ）は、融合前立体構造のみに特異的に結合する。しかしながら、可溶性の前Ｆは、非常に不安定であり、融合後立体構造に容易に移行し、ワクチン免疫原としてのその有用性を限定する。その融合前（前Ｆ）立体構造において安定化されたＲＳＶＦタンパク質は、非常に価値があり、候補ＲＳＶワクチン免疫原を提供する。同様に、かかる安定化されたＲＳＶ前Ｆタンパク質は、抗体、たとえば診断用および治療用抗体の産出にも有用である。その融合前立体構造における（強力なｎＡｂ−Ｄ２５に結合している）ＲＳＶＦタンパク質の結晶構造が最近報告された。その内容がそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４０，ｐ．１１１３−１１１７を参照されたい。この研究に基づいて、本発明者らは、ＲＳＶＦタンパク質の構造の広範な分析を行い、その前Ｆ立体構造におけるＲＳＶＦタンパク質を安定化させるまたは「ロックする」ためのいろいろな新規な設計戦略および新規な構築物を開発した。

いくつかの態様では、本発明は、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体、たとえば、標的架橋、たとえば標的ジチロシン架橋を使用して、融合前立体構造において安定化され得るもしくは「ロックされ得る」または安定化されたもしくは「ロックされた」ものを提供する。本発明は、かかるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を作製するおよび使用するための方法も提供する。

いくつかの態様では、本発明は、そこに、またはその間に、その前Ｆ立体構造におけるＲＳＶＦタンパク質を安定化させるために架橋を作製することができる、ＲＳＶＦタンパク質のアミノ酸配列内の特定の部位を提供する。いくつかの態様では、架橋は、標的ジチロシン架橋である。ジチロシン架橋が使用される場合、本発明は、既存のチロシン残基を含むかまたはジチロシン架橋が行われ得るようにチロシン残基に変異され得るもしくは変異された特定のアミノ酸残基（またはアミノ酸残基の対）を提供する。

いくつかの態様では、本発明は、少なくとも１つのジチロシン架橋を含む単離されたＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を提供し、ここで、少なくとも１つのジチロシン架橋の少なくとも１つのチロシンがチロシンへの点変異から生じる。

いくつかの態様では、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、またはそのアミノ酸残基１〜５１３（ＲＳＶＦ外部ドメインを含む）、と少なくとも約７５％の配列同一性を有する単離されたＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を提供し、ここで、タンパク質ポリペプチドは、チロシンへの点変異から生じる少なくとも１つのチロシン残基を含む。いくつかのかかる態様では、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、少なくとも１つのジチロシン架橋を含有し、ここで、少なくとも１つの架橋の少なくとも１つのチロシン残基は、チロシンへの点変異から生じる。

いくつかの態様では、本発明は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１もしくは３２のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基１〜５１３（ＲＳＶＦ外部ドメインを含む）を有する単離されたＲＳＶＦポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本発明は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１もしくは３２、またはそのアミノ酸残基１〜５１３（ＲＳＶＦ外部ドメインを含む）、と少なくとも約７５％の配列同一性を有する、単離されたＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドを提供する。いくつかのかかる態様では、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、少なくとも１つのジチロシン架橋を含有し、ここで、少なくとも１つの架橋の少なくとも１つのチロシン残基は、チロシンへの点変異から生じる。

いくつかの態様では、ジチロシン架橋が存在する場合、ジチロシン架橋は、２つの既存のチロシン残基を含む。いくつかの態様では、ジチロシン架橋は、チロシンへの点変異から生じるチロシンに架橋している既存のチロシンを含む。いくつかの態様では、ジチロシン架橋は、チロシンへの点変異から生じる２つのチロシンを含む。いくつかの態様では、ジチロシン架橋は、プロトマー内結合、プロトマー間結合、分子内結合、分子間結合、またはその任意の組合せを含む。いくつかの態様では、ジチロシン架橋は、ＲＳＶＦタンパク質Ｆ１ポリペプチドおよびＲＳＶＦタンパク質Ｆ２ポリペプチド内または間の結合を含む。いくつかの態様では、チロシンへの点変異は、配列番号１もしくは配列番号４のアミノ酸位置：７７、８８、９７、１４７、１５０、１５５、１５９、１８３、１８５、１８７、２２０、２２２、２２３、２２６、２５５、４２７もしくは４６９、または別のＲＳＶＦアミノ酸配列もしくはその外部ドメインにおけるかかるアミノ酸位置の１つに相当する任意のアミノ酸位置からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置に位置している。

いくつかの態様では、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０と少なくとも約７５％の配列同一性を有する、単離されたＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を提供し、ここで、ポリペプチドは、少なくとも１つのジチロシン架橋を含み、ここで、架橋の一方または両方のチロシンは、チロシンへの点変異から生じ、ここで、架橋は、アミノ酸位置：１４７および２８６；１９８および２２０；１９８および２２２；１９８および２２３；１９８および２２６；３３および４６９；７７および２２２；８８および２５５；９７および１５９；１８３および４２７；１
８５および４２７；または１８７および４２７に位置している１つ以上の対合チロシンアミノ酸残基間に位置している。いくつかの態様では、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、１つを超えるジチロシン架橋を含む。いくつかの態様では、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、２つ、３つ、４つ、５つ以上のジチロシン架橋を含む。いくつかの態様では、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、アミノ酸位置７７および２２２、ならびに３３および４６９に位置している対合チロシンアミノ酸残基でのジチロシン架橋を含む。

いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、１つ以上のさらなる架橋、たとえばジスルフィド結合をさらに含む。かかる態様では、１つ以上のジスルフィド結合の少なくとも１つのシステインは、システインへの点変異から生じる。いくつかの態様では、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、キャビティ充填疎水性アミノ酸置換（cavity-filling hydrophobic amino acid substitution）をさらに含む。いくつかの態様では、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、三量体形成ドメインをさらに含む。かかる態様では、三量体形成ドメインは、フォールドン（foldon）ドメインである。

いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、対象における保護免疫応答を引き出すかつ／または対象におけるＲＳＶ特異的中和抗体の産生を引き出す能力がある。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、中和抗体を結合する能力がある少なくとも１つの抗原性部位、たとえば、抗原性部位φを含む。

いくつかの態様では、本発明は、１つ以上の本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物（たとえば医薬組成物および／またはワクチン組成物）を提供する。いくつかの態様では、かかる組成物は、アジュバント、担体、免疫賦活剤、またはその任意の組合せを含む。いくつかの態様では、組成物は、呼吸器合胞体ウイルスのためのワクチンであるかまたはその部分を形成する。いくつかの態様では、本発明は、対象にＲＳＶに対するワクチン接種を施す方法であって、対象に本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体の１つ以上を含む組成物の有効量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、対象は、年齢が２４ヶ月未満のヒトまたは年齢が５０歳を超えるヒトである。いくつかの態様では、投与することは、単回の免疫化を含む。いくつかの態様では、本発明の方法は、対象に１つ以上の本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む医薬組成物を投与して、対象におけるＲＳＶ感染を治療するまたは防止することをさらに含む。いくつかの態様では、本発明は、対象における免疫応答を誘導するための医薬であって、１つ以上の本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む医薬を提供する。いくつかの態様では、医薬は、ワクチンである。

いくつかの態様では、本発明は、ＲＳＶワクチン免疫原を作製する方法であって、（ａ）融合前立体構造におけるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を同定することおよび取得すること；（ｂ）１つ以上の架橋（たとえばジチロシン架橋）の導入が融合前立体構造を安定化させる、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体における１つ以上の領域を選択すること；（ｃ）工程（ｂ）において選択された領域の１つ以上でＲＳＶＦタンパク質中に１つ以上の架橋（たとえばジチロシン架橋）を導入して、操作されたＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を形成すること；および（ｄ）操作されたＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、（ｉ）中和抗体に結合する増強された能力、（ｉｉ）広域中和に結合する増強された能力、（ｉｉｉ）Ｂ細胞受容体に結合し、これを活性化する増強された能力、（ｉｖ）動物における抗体応答を引き出す増強された能力、（ｖ）動物における保護抗体応答を引き出す増強された能力、（ｖｉ）動物における中和抗体の産生を引き出す増強された能力、（ｖｉｉ）動物における広域中和抗体の産生を引き出す増強された能力、（ｖｉｉｉ）動物における保護免疫応答を引き出す増強された能力、および（ｉｘ）動物における４要素中和エピトープ（quaternary neutralizing epitope）に結合し、これを認識する抗体の産生を引き出す増強された能力からなる群から選択される１つ以上の特性を有するかどうかを決定することを含む方法であり、操作されたＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が１つ以上の特性ｉからｉｘを有する場合、操作されたＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、ＲＳＶワクチン免疫原候補である方法を提供する。いくつかのかかる態様では、工程（ｄ）は、操作されたＲＳＶＦタンパク質が中和抗体に結合する、広域中和抗体に結合する、Ｂ細胞受容体に結合し、これを活性化して、動物における抗体応答を引き出す、動物における保護抗体応答を引き出す、動物における中和抗体の産生を引き出す、動物における広域中和抗体の産生を引き出す、動物における保護免疫応答を引き出す、かつ／または動物における４要素中和エピトープを認識する抗体の産生を引き出す能力を評価するための１つ以上のアッセイを行うことを含む。いくつかの態様では、ジチロシン架橋が使用される場合、工程（ｃ）において導入された１つ以上のジチロシン架橋の少なくとも１つのチロシンは、チロシンへの点変異から生じる。いくつかの態様では、方法は、工程（ｃ）の前に、工程（ｂ）において選択された領域の１つ以上でＲＳＶＦタンパク質中に１つ以上のチロシンへの点変異を導入することをさらに含む。

本発明のこれらおよび他の態様は、本特許明細書を通して記載されている。

（Ａ）ＲＳＶサブタイプＡからの可溶性ＲＳＶＦタンパク質（ＷＴ）（配列番号１）、および（Ｂ）ＲＳＶサブタイプＡからの全長ＲＳＶＦタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）（受託番号ＡＨＪ６００４３．１）。両方の配列のアミノ酸残基１〜５１３は、可溶性と膜結合性（全長）型の両方に共通であるＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。配列番号１におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。配列番号２におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、膜貫通領域および細胞質尾部を含有する内在性ＲＳＶＦタンパク質配列を含む。（同上）（Ａ）ＲＳＶサブタイプＢからの可溶性ＲＳＶＦタンパク質（配列番号３）、および（Ｂ）ＲＳＶサブタイプＢからの全長ＲＳＶＦタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）（受託番号ＡＨＬ８４１９４）。両方の配列のアミノ酸残基１〜５１３は、可溶性と膜結合性（全長）型の両方に共通であるＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。配列番号３におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。配列番号４におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、膜貫通領域および細胞質尾部を含有する内在性ＲＳＶＦタンパク質配列を含む。（同上）（Ａ）可溶性ＤＳ−Ｃａｖ１修飾ＲＳＶＦタンパク質（配列番号５）、および（Ｂ）全長ＤＳ−Ｃａｖ１修飾ＲＳＶＦタンパク質（配列番号６）（ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３４２：５９２−５９８）のアミノ酸配列。両方の配列のアミノ酸残基１〜５１３は、可溶性と膜結合性（全長）型の両方に共通であるＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。配列番号５におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。配列番号６におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、膜貫通領域および細胞質尾部を含有する内在性ＲＳＶＦタンパク質配列を含む。（同上）（Ａ）可溶性Ｃａｖ１修飾ＲＳＶＦタンパク質（配列番号７）、および（Ｂ）全長Ｃａｖ１修飾ＲＳＶＦタンパク質配列（配列番号８）（ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３４２：５９２−５９８）のアミノ酸配列。両方の配列のアミノ酸残基１〜５１３は、可溶性と膜結合性（全長）型の両方に共通であるＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。配列番号７におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。配列番号８におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、膜貫通領域および細胞質尾部を含有する内在性ＲＳＶＦタンパク質配列を含む。（同上）（Ａ）可溶性ＤＳ修飾ＲＳＶＦタンパク質（配列番号９）、および（Ｂ）全長ＤＳ修飾ＲＳＶＦタンパク質配列（配列番号１０）（ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３４２：５９２−５９８）のアミノ酸配列。両方の配列のアミノ酸残基１〜５１３は、可溶性と膜結合性（全長）型の両方に共通であるＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。配列番号９におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。配列番号１０におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、膜貫通領域および細胞質尾部を含有する内在性ＲＳＶＦタンパク質配列を含む。（同上）ＲＳＶサブタイプＡ（配列番号１、図において「ＲＳＶ＿Ｆ＿ＷＴ」として同定される）およびサブタイプＢ（配列番号４）からのＲＳＶＦタンパク質の配列アラインメント。サブタイプＡ配列において太字および下線で示されたアミノ酸残基は、単一または二重変異のいずれかとしてジチロシン架橋結合のために標的とされ得る部位を示す。サブタイプＢにおける同等の部位も、ボックスで示されている。ジチロシン架橋結合のための標的とされる示された位置は、ＲＳＶサブタイプＡとＢ間に１００％保存されている。両方の配列のアミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。配列番号１におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。配列番号４におけるアミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、膜貫通領域および細胞質尾部を含有する内在性ＲＳＶＦタンパク質配列を含む。ＤＳ−Ｃａｖ１ＲＳＶＦタンパク質（配列番号５）、ならびにＲＳＶサブタイプＡ（配列番号１）およびサブタイプＢ（配列番号４）からのＲＳＶＦタンパク質の配列アラインメント。ＤＳ−Ｃａｖ１およびＲＳＶサブタイプＡ配列（残基５１４〜５６８）においてイタリック体で示されたＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）およびｓｔｒｅｐタグが後に続く外来性フォールドン三量体形成ドメインを含有する。ＲＳＶサブタイプＢ配列（残基５１４〜５７４）において太字および下線で示されたＣ末端配列は、膜貫通領域および細胞質尾部を含有する内在性Ｆタンパク質配列である。位置１４７（Ａ１４７Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号１１）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置２２０（Ｖ２２０Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号１２）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置２２２（Ｅ２２２Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号１３）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置２２３（Ｆ２２３Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号１４）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置２２６（Ｋ２２６Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号１５）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置４６９（Ｖ４６９Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号１６）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置７７（Ｋ７７Ｙ）および２２２（Ｅ２２２Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号１７）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置８８（Ｎ８８Ｙ）および２５５（Ｓ２５５Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号１８）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置９７（Ｍ９７Ｙ）および１５９（Ｈ１５９Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号１９）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置１８５（Ｖ１８５Ｙ）および４２７（Ｋ４２７Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号２０）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置１８７（Ｖ１８７Ｙ）および４２７（Ｋ４２７Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号２１）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置１８３（Ｎ１８３Ｙ）および４２７（Ｋ４２７Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号２２）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。チロシンへの単一または二重変異を含む、可溶性ＲＳＶＦタンパク質サブタイプＡ（配列番号１）およびそれに由来する修飾ＲＳＶＦタンパク質の例（配列番号１１〜２１）の配列アラインメント。ボックス内のチロシンは、ＷＴサブタイプＡ配列中に導入されている。２つの新しいチロシンが同じ配列中に導入されている場合、それらは、互いに架橋することが典型的に意図されている。単一のチロシンのみが導入されている場合、そのチロシンは、太字および下線で示されたその配列における内在性または既存のチロシンと架橋することが典型的に期待されている。各配列のアミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。（同上）（同上）位置１４７（Ａ１４７Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（ＤＳ−Ｃａｖ１）のアミノ酸配列（配列番号２３）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置２２０（Ｖ２２０Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（ＤＳ−Ｃａｖ１）のアミノ酸配列（配列番号２４）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置２２２（Ｅ２２２Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（ＤＳ−Ｃａｖ１）のアミノ酸配列（配列番号２５）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置２２３（Ｆ２２３Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（ＤＳ−Ｃａｖ１）のアミノ酸配列（配列番号２６）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置２２６（Ｋ２２６Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（ＤＳ−Ｃａｖ１）のアミノ酸配列（配列番号２７）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。位置４６９（Ｖ４６９Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（ＤＳ−Ｃａｖ１）のアミノ酸配列（配列番号２８）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。複数のジチロシン架橋の形成を促進するように設計されている位置２２２（Ｅ２２２Ｙ）および４６９（Ｖ４６９Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号２９）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。複数のジチロシン架橋の形成を促進するように設計されている位置２２６（Ｋ２２６Ｙ）および４６９（Ｖ４６９Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（サブタイプＡ）のアミノ酸配列（配列番号３０）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。複数のジチロシン架橋の形成を促進するように設計されている位置２２２（Ｅ２２２Ｙ）および４６９（Ｖ４６９Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（ＤＳ−Ｃａｖ１）のアミノ酸配列（配列番号３１）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。複数のジチロシン架橋の形成を促進するように設計されている位置２２６（Ｋ２２６Ｙ）および４６９（Ｖ４６９Ｙ）でのチロシンへの変異を含む、修飾可溶性ＲＳＶＦタンパク質（ＤＳ−Ｃａｖ１）のアミノ酸配列（配列番号３２）。アミノ酸残基１〜５１３は、ＲＳＶＦタンパク質のコア配列である。アミノ酸残基５１４から先からのＣ末端配列は、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグが後に続くフォールドン三量体形成ドメインを含む。プロトマー内およびプロトマー内ジチロシン架橋が導入され得る、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質三量体における２つの標的位置の例を示すリボンダイヤグラム。（Ａ）位置１８５（Ｖ１８５Ｙ）で導入されたチロシンと位置４２７（Ｋ４２７Ｙ）（配列番号２０）で導入されたチロシン間の操作されたＦ１−Ｆ１プロトマー間ジチロシン結合の側面図（および拡大）。（Ｂ）位置１９８（１９８Ｙ）での内在性チロシンと位置２２２（Ｅ２２２Ｙ）（配列番号１３）で導入されたチロシン間の操作されたＦ１−Ｆ１プロトマー内ジチロシン結合の上からの図（および拡大図）。標的チロシン残基は、四角のボックスで示されている。ＲＳＶＡ型Ｆタンパク質配列（配列番号４７）ならびに融合前および融合後二次構造のアラインメント。配列の下の円柱および矢印は、それぞれ、αヘリックスおよびβストランドを表す。アミノ酸配列の下の「Ｘ」は、構造が異常であるまたは欠損している場所を示す。灰色の影付けは、融合前から融合後立体構造への移行において５Åより多く移動する残基の位置を示す。黒の三角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示し、アミノ酸配列の上の文字および線は、抗原性部位を示し、矢印は、フューリン切断部位の位置を示す。補充的資料であるＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ３４０：１１１３−１１１７からの図。哺乳類細胞におけるＲＳＶＦタンパク質の発現のための例示的核酸構築物。ＲＳＶＦタンパク質の標的ジチロシン架橋結合。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｆ₁−Ｆ₁プロトマー内ＤＴ架橋（Ｅ２２２Ｙ（配列番号１３）およびＫ２２６Ｙ（配列番号１５））、Ｆ₁−Ｆ₂プロトマー内ＤＴ架橋（Ｖ４６９Ｙ（配列番号１６）およびＮ８８Ｙ−Ｓ２５５Ｙ（配列番号１８））、またはＦ₁−Ｆ₁分子間ＤＴ架橋（Ｖ１８５Ｙ−Ｋ４２７Ｙ（配列番号２０））を可能にするＲＳＶ−Ｆ変異体を発現するベクターでトランスフェクトした。バックグラウンド減算蛍光強度値を示す。（ＩＮＴ）強度、（ＤＴ）ジチロシン、（−）および（＋）は、それぞれ、ジチロシン架橋結合テクノロジーの適用前および後を示す。ジチロシン架橋結合は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質上の重要なエピトープを安定化させる。ＨＥＫ２９３細胞を野生型（ＷＴ）ＲＳＶ−ＦまたはＫ２２６Ｙ置換を含有する変異体を発現する構築物でトランスフェクトした。（Ａ）トランスフェクション後７２ｈで、上澄みを架橋した（ＤＴ）または架橋せず、総タンパク質を、ＲＳＶ−Ｆの融合前と融合後型の両方を認識する高親和性ヒト抗ｈＲＳＶ抗体（ＰＢＳ中の１００ｎｇ／ｍｌ）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。（Ｂ）４℃で１６日間の保管後に、部位φの提示を、部位φを認識する前Ｆ特異的ヒトモノクローナル抗体（ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。ＲＳＶサブタイプＡ（配列番号３３−図において「ＲＳＶ＿Ｆ＿ＷＴ＿サブタイプ＿Ａ」として同定される）およびＲＳＶサブタイプＢ（配列番号３４−図において「ＲＳＶ＿Ｆ＿ＷＴ＿サブタイプ＿Ｂ」として同定される）からのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列の配列アラインメント。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。（同上）ヒト細胞における発現にコドン最適化されたＲＳＶサブタイプＡからのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３５）。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。ハムスター細胞（たとえばＣＨＯ細胞）における発現にコドン最適化されたＲＳＶサブタイプＡからのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３６）。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。昆虫細胞（たとえばＳＦ９昆虫細胞）における発現にコドン最適化されたＲＳＶサブタイプＡからのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３７）。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。マウス細胞における発現にコドン最適化されたＲＳＶサブタイプＡからのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３８）。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。ヒト細胞における発現にコドン最適化されたＲＳＶサブタイプＢからのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３９）。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。ハムスター細胞（たとえばＣＨＯ細胞）における発現にコドン最適化されたＲＳＶサブタイプＢからのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４０）。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。昆虫細胞（たとえばＳＦ９昆虫細胞）における発現にコドン最適化されたＲＳＶサブタイプＢからのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４１）。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。マウス細胞における発現にコドン最適化されたＲＳＶサブタイプＢからのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４２）。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。ヒト細胞における発現にコドン最適化され、ＤＳ−ＣＡＶ１変異も含むＲＳＶサブタイプＡからのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４３）。変異を、太字で変異コドンを囲むボックスと共に示す。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。ヒト細胞における発現にコドン最適化され、ＤＳ変異も含むＲＳＶサブタイプＡからのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４４）。変異を、太字で変異コドンを囲むボックスと共に示す。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。ヒト細胞における発現にコドン最適化され、ＣＡＶ１変異も含むＲＳＶサブタイプＡからのＲＳＶＦタンパク質（全長−膜貫通および細胞質ドメインを有する）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４５）。変異を、太字で変異コドンを囲むボックスと共に示す。ヌクレオチド１〜１５３９は、アミノ酸残基１〜５１３をコードし、これらは、ＲＳＶＦタンパク質のコア外部ドメイン配列である。ヌクレオチド１５４０から先は、内在性ＲＳＶＦ膜貫通領域および細胞質尾部をコードする配列を含む。

発明の詳細な説明

本発明は、部分的には、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体、たとえば融合前立体構造において安定化され得るまたは安定化されるもの、かかるポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を作製する方法、かかるポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を含む組成物（たとえば医薬組成物およびワクチン組成物）、ならびにたとえばワクチン接種方法、治療方法および他の方法におけるかかるポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体の使用の方法を提供する。いくつかの態様では、ＲＳＶポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、たとえばＲＳＶワクチンにおける立体構造的に特異的な免疫原として有用であってもよい。

定義および略称
本明細書では、「約」および「およそ」という用語は、数値と関連して使用される場合、示された値の＋または−２０％以内を意味する。

ここでは、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、特に明記しない限り、互換的に使用される。ここでは、「タンパク質複合体」という用語は、２つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニット、たとえば２つ以上のモノマーまたはプロトマーの集合体を表す。特に明記しない限り、タンパク質に関するここでの全ての記述は、タンパク質複合体に等しく適応され、逆の場合も同様である。

ここでは、「安定化された」および「ロックされた」という用語は、たとえば、その融合前立体構造におけるＲＳＶＦタンパク質を安定化させるまたはロックすることにおける架橋結合の効果に関連して、互換的に使用される。これらの用語は、１００％の安定性を必要としない。むしろ、これらの用語は、改善されたまたは増加した安定性の程度を意味する。たとえば、いくつかの態様では、「安定化された」という用語がその融合前立体構造における架橋されたＲＳＶＦタンパク質と関連して使用される場合、その用語は、融合前立体構造が、それがかかる架橋結合の前またはこれなしに有するよりも大きい安定性を有することを意味する。安定性、および相対的な安定性は、たとえばＲＳＶ融合前立体構造の半減期に基づいて、本出願の他の節において記載した様々な方法で測定してもよい。安定性の改善または増加は、意図された適用に有用または重大である任意の程度までであってもよい。たとえば、いくつかの態様では、安定性は、約１０％、２５％、５０％、１００％、２００％（すなわち２倍）、３００％（すなわち３倍）、４００％（すなわち４倍）、５００％（すなわち５倍）、１０００％（すなわち１０倍）以上増加してもよい。

ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体
ＲＳＶ融合または「Ｆ」タンパク質は、呼吸器合胞体ウイルスのエンベロープ糖タンパク質である。ＲＳＶＦタンパク質は、可溶性（膜貫通ドメインを有さない）型または膜結合性（膜貫通ドメインを有する）型のいずれかである単一のポリペプチド前駆体として翻訳されてもよい。このポリペプチドは、三量体を形成し、これは、場合によって、保存フューリンコンセンサス切断部位で１つ以上の細胞プロテアーゼによってタンパク分解性に切断されて、Ｆ１（Ｃ末端）およびＦ２（Ｎ末端）断片として既知である２つのジスルフィド結合断片をもたらしてもよい。Ｆ２断片は、ＲＳＶＦ前駆体の最初のおよそ８３アミノ酸を含む。切断されていない前駆体タンパク質または切断されたＦ２およびＦ１断片のヘテロ二量体のいずれかは、ＲＳＶＦプロトマーを形成することができる。３つのかかるプロトマーは、集合して、最終ＲＳＶＦタンパク質複合体を形成し、これは、３つのプロトマーのホモ三量体である。

ＲＳＶＦタンパク質三量体は、ウイルスおよび細胞膜の融合を媒介する。ＲＳＶＦタンパク質三量体の融合前立体構造（ここで、「前Ｆ」と称されてもよい）は、高度に不安定（準安定性）である。しかしながら、いったんＲＳＶウイルスが細胞膜とドッキングすると、ＲＳＶＦタンパク質三量体は、高度に安定な融合後（「後Ｆ」）立体構造への一連の立体構造的変化および移行を経る。ＲＳＶＦタンパク質は、ＲＳＶ保護と関連する強力な中和抗体（ｎＡｂ）を誘導することが既知である。たとえば、ＲＳＶＦタンパク質での免疫化は、ヒトにおいて保護的であるｎＡｂ（たとえばシナジス）を誘導する。いくつかの中和エピトープ（部位Ｉ、ＩＩおよびＩＶ）は、ＲＳＶＦタンパク質の融合後型に存在する。しかしながら、最近、Ｍａｇｒｏｅｔａｌ．は、その融合後立体構造におけるＲＳＶＦタンパク質でのヒト血清のインキュベーションは、Ｆタンパク質に対する中和活性の大部分を枯渇させることに失敗したことを示し、これは、融合前立体構造に特有の中和抗原性部位の存在を示している（Ｍａｇｒｏｅｔａｌ．２０１２，ＰＮＡＳ１０９（８）：３０８９）。Ｘ線結晶解析によって、パリビズマブ（シナジス）、モタビズマブ（ヌマックス）によって認識されるエピトープ、より最近発見された１０１Ｆモノクローナル抗体のエピトープ（ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８４（２３）：１２２３６−４４ｌ；およびＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｆｅｂ１７（２）：２４８−５０）が位置づけられた。ごく最近、ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ３４０：１１１３−１１１７（２０１３））は、その融合前立体構造におけるＦタンパク質の構造を解明し、これは、融合前立体構造においてのみ示され、一連の抗体、たとえば、シナジスおよびヌマックスよりも最大５０倍より強力に中和する５Ｃ４が結合する新規な中和エピトープ−部位φ−を明らかにした。したがって、この融合前立体構造におけるＲＳＶワクチン免疫原および提示部位φが効果的な保護を引き出すというますます増加する証拠がある。しかしながら、現在まで、ＲＳＶＦタンパク質の融合前立体構造の高度に不安定な（準安定性）性質は、かかるワクチンの開発への重大な障壁であることが判明した。ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．の融合前および融合後ＲＳＶＦ構造の比較に基づいて、大きい立体構造的変化（＞５Å）を経るＦタンパク質の２つの領域があると思われる。これらの領域は、Ｆ１サブユニットのＮおよびＣ末端（それぞれ、残基１３７〜２１６および４６１〜５１３）に位置している（図３２を参照されたい）。部位φエピトープに結合しているＤ２５抗体によってその融合前立体構造において保持されているＲＳＶＦタンパク質の結晶構造では、Ｃ末端Ｆ１残基は、フォールドン三量体形成ドメインを付加することによって、融合前立体構造において安定化され得る。Ｆ１のＮ末端領域を安定化させるために、ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．は、抗体Ｄ２５の結合は、結晶学的研究に十分であることを発見した。しかしながら、ワクチン免疫原の生成に関して、代替の安定化戦略、たとえばＲＳＶＦタンパク質が大きい抗体分子に結合していることを要求しないものが必要である。試みられた１つの代替の手法は、対合システイン変異（ジスルフィド結合形成に関して）およびＦ１Ｎ末端近くのキャビティ充填変異の導入を伴った（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３４２：５９２−５９８において報告されているＤＳ−Ｃａｖ１ＲＳＶＦタンパク質変異体を参照されたい）。しかしながら、かかる変異体の結晶学的分析は、構造が部分的にのみ融合前立体構造であったことを明らかにした。したがって、臨床的ワクチン開発のための免疫原を獲得するために、ＲＳＶＦタンパク質のさらなる操作が必要である。

本発明は、架橋され得るまたは架橋されるべきＲＳＶＦタンパク質内の特定の部位を提供すること、およびかかる架橋の形成を促進することができるＲＳＶＦタンパク質の変異型を提供することを含めた、その融合前立体構造におけるＲＳＶＦタンパク質を安定化させるためのある特定の代替の手法を提供する。かかる架橋および変異は、単独で使用することができる（たとえば野生型ＲＳＶＦタンパク質の文脈で、またはいかなる人工の変異もしくは他の人工の修飾も含まないＲＳＶＦタンパク質の文脈で）、または１つ以上の他の人工の変異、修飾、架橋、もしくは安定化戦略と組み合わせて使用することができる。したがって、たとえば、ここで記載した手法は、付加されたフォールドン三量体形成ドメイン、安定化抗体（たとえばＤ２５）、および／または他の部分的もしくは潜在的安定化修飾もしくは変異−たとえばＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．によって報告されたＤＳ−Ｃａｖ１ＲＳＶＦタンパク質変異体におけるものの使用と関連して使用することができる。

本発明者らは、ＲＳＶＦタンパク質の構造の広範な分析を行い、いろいろな新規な設計戦略および新規な操作されたＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を開発した。本発明は、かかるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を作製するおよび使用するための方法も提供する。いくつかの態様では、本発明は、その前Ｆ立体構造におけるＲＳＶＦタンパク質を「ロックする」ために、そこに、またはその間に標的架橋が作製され得るＲＳＶＦタンパク質のアミノ酸配列内の特定の部位を提供する。いくつかの態様では、標的架橋は、ジチロシン架橋である。ジチロシン架橋が使用される場合、本発明は、既存のチロシン残基を含むまたはジチロシン架橋が作製され得るようにチロシン残基に変異され得るもしくは変異されている特定のアミノ酸残基（またはアミノ酸残基の対）を提供する。

本特許明細書を通して、それらの１つまたは複数のアミノ残基番号（たとえば、アミノ酸残基７７、８８、９７、または２２２）を参照することによってＲＳＶＦタンパク質における特定のアミノ酸残基または特定のアミノ酸領域を言及する場合、特に明記しない限り、番号付けは、配列表および図においてここで提供したＲＳＶアミノ酸配列に基づく（たとえば、図６および配列番号１を参照されたい）。しかしながら、当業者は理解することになるように、たとえば、配列番号１と比較して付加されたまたは除去されたさらなるアミノ酸残基がある場合、異なるＲＳＶ配列が異なる番号付けシステムを有してもよいことことに注目すべきである。それ自体として、特定のアミノ酸残基がそれらの番号によって参照される場合、記述は、所与のアミノ酸配列の最初から数える場合に正確にその番号を付けられた位置に位置するアミノ酸のみに限定されず、むしろ、その残基が同じ正確な番号を付けられた位置にない場合、たとえば、ＲＳＶ配列が配列番号１よりも短いもしくは長い、または配列番号１と比較して挿入もしくは欠失を有する場合でさえも、任意のおよび全てのＲＳＶＦ配列における同等の／相当するアミノ酸残基が意図されていることを理解すべきである。当業者は、たとえば所与のＲＳＶＦ配列を配列番号１またはここで提供した他のＲＳＶＦアミノ酸配列のいずれかに整列させることによって、何がここで列挙した特定の番号を付けられた残基のいずれかに相当する／同等のアミノ酸位置であるかを容易に決定することができる。

本発明は、ＲＳＶＦタンパク質およびポリペプチドアミノ酸配列、ならびにかかる配列を含む組成物および方法を提供する。しかしながら、本発明は、ここで開示した特定のＲＳＶＦ配列に限定されない。むしろ、本発明は、ここで提供した特定の配列の変形形態、変更形態および誘導体を企図する。

いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、限定なく、ＲＳＶサブタイプＡ（たとえば可溶性型（配列番号１、またはそのアミノ酸残基１〜５１３）であるまたは全長型（配列番号２）である）のアミノ酸配列；ＲＳＶサブタイプＢ（たとえば可溶性型（配列番号３、またはそのアミノ酸残基１〜５１３）であるまたは全長型（配列番号４）である）のアミノ酸配列；ＲＳＶ変異ＤＳ−Ｃａｖ１（たとえば可溶性型（配列番号５、またはそのアミノ酸残基１〜５１３）であるまたは全長型（配列番号６）である）のアミノ酸配列；ＲＳＶ変異Ｃａｖ１（たとえば可溶性型（配列番号７、またはそのアミノ酸残基１〜５１３）であるまたは全長型（配列番号８）である）のアミノ酸配列；またはＲＳＶ変異ＤＳ（たとえば可溶性型（配列番号９、またはそのアミノ酸残基１〜５１３）であるまたは全長型（配列番号１０）である）のアミノ酸配列、またはその任意の断片を含めた、当技術分野で既知の任意の適したＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体配列のアミノ酸配列に由来することができる（またはこれらを含む、本質的にこれらからなる、またはこれらからなることができる）。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦタンパク質およびポリペプチドは、任意の既知のＲＳＶＦ配列またはＲＳＶＦ外部ドメイン配列（配列番号１〜１０のアミノ酸残基１〜５１３、または配列番号１〜１０を含むがこれらに限定されない）と、または任意の既知のＲＳＶグループ、サブグループ、ファミリー、サブファミリー、タイプ、サブタイプ、属、種、株、および／もしくはクレード、もしくはその任意の断片からのＲＳＶＦ配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に由来することができる（またはこれらを含む、本質的にこれらからなる、またはこれらからなることができる）。ここで提供した様々なＲＳＶＦ配列のアミノ酸残基１〜５１３は、コアＲＳＶＦ外部ドメイン配列であることに注目すべきである。全てのかかる配列におけるアミノ酸残基５１４から先は、いくつかの態様では存在してもよいが他のものでは存在しなくてもよいさらなるドメインを含む。いくつかの態様では、かかるさらなるドメインの変異体が存在してもよい。たとえば、ここで提供した全ての可溶性ＲＳＶＦ配列におけるアミノ酸残基５１４から先は、任意のフォールドン三量体形成ドメイン、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグを含む。いくつかの態様では、これらのさらなる配列は、無くても、修飾されていても、再編成されていてもまたは置きかえられていてもよい。たとえば、いくつかの態様では、種々の三量体形成ドメインを使用してもよく、または種々のエピトープタグを使用してもよい。同様に、ここで提供した全ての「全長」または膜結合性ＲＳＶＦ配列におけるアミノ酸残基５１４から先は、任意のＲＳＶＦタンパク質膜貫通領域および細胞質尾部を含む。いくつかの態様では、これらのさらなる配列は、無くても、修飾されていても、再編成されていても、たとえば種々の膜貫通または細胞質ドメインで置きかえられていてもよい。

いくつかの態様では、本発明は、１つ以上の人工的に導入された架橋を含むＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供し、ここで、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体内の以下のアミノ酸残基の少なくとも１つがＲＳＶＦタンパク質における別のアミノ酸残基：Ｙ３３、Ｋ７７、Ｎ８８、Ｍ９７、Ａ１４７、Ｓ１５０、Ｓ１５５、Ｈ１５９、Ｎ１８３、Ｖ１８５、Ｖ１８７、Ｙ１９８、Ｖ２２０、Ｅ２２２、Ｆ２２３、Ｋ２２６、Ｓ２５５、Ｙ２８６、Ｋ４２７およびＶ４６９に人工的に架橋している。いくつかのかかる態様では、架橋は、ジチロシン架橋である。

いくつかの態様では、本発明は、１つ以上の人工的に導入された架橋を含むＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供し、ここで、かかる人工的に導入された架橋は、以下のアミノ酸残基：Ｙ３３、Ｋ７７、Ｎ８８、Ｍ９７、Ａ１４７、Ｓ１５０、Ｓ１５５、Ｈ１５９、Ｎ１８３、Ｖ１８５、Ｖ１８７、Ｙ１９８、Ｖ２２０、Ｅ２２２、Ｆ２２３、Ｋ２２６、Ｓ２５５、Ｙ２８６、Ｋ４２７およびＶ４６９の２つを連結する。いくつかのかかる態様では、架橋は、ジチロシン架橋である。

いくつかの態様では、本発明は、アミノ酸残基の以下の対の１つ以上におけるアミノ酸残基が人工的に導入された架橋：１４７／２８６、１９８／２２０、１９８／２２２、１９８／２２３、１９８／２２６、３３／４９６、７７／２２２、８８／２５５、９７／１５９、１８３／４２７、１８５／４２７、および１８７／４２７によって互いに架橋しているＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。いくつかのかかる態様では、架橋は、ジチロシン架橋である。

いくつかの態様では、本発明は、以下の領域：Ｆ１可動性Ｎ末端（残基１３７〜２１６）、α２（残基１４８〜１６０）、α３（残基１６３〜１７３）、β３（残基１７６〜１８２）、β４（残基１８６〜１９５）、α４（残基１９７〜２１１）、Ｆ１可動性Ｃ末端（残基４６１〜５１３）、β２２（残基４６４〜４７１）、α９（残基４７４〜４７９）、β２３（残基４８６〜４９１）、およびα１０（残基４９３〜５１４）の２つの間に人工的に導入された架橋を含むＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。いくつかのかかる態様では、架橋は、ジチロシン架橋である。

いくつかの態様では、本発明は、以下の領域：約位置６７から約位置８７までのアミノ酸残基、約位置７８から約位置９８までのアミノ酸残基、約位置８７から約位置１０７までのアミノ酸残基、約位置１３７から約位置１５７までのアミノ酸残基、約位置１４０から約位置１６０までのアミノ酸残基、約位置１４５から約位置１６５までのアミノ酸残基、約位置１４９から約位置１６９までのアミノ酸残基、約位置１７３から約位置１９３までのアミノ酸残基、約位置１７５から約位置１９５までのアミノ酸残基、約位置１７７から約位置１９７まで、約位置１８８から約位置２０８までのアミノ酸残基、約位置２１０から約位置２３０までのアミノ酸残基、約位置２１２から約位置２３２までのアミノ酸残基、約位置２１３から約位置２３３までのアミノ酸残基、約位置２１６から約位置２３６までのアミノ酸残基、約位置２４５から約位置２６５までのアミノ酸残基、約位置２７６から約位置２９６までのアミノ酸残基、約位置４１７から約位置４３７までのアミノ酸残基、および約位置４５９から約位置４７９までのアミノ酸残基の２つの間に人工的に導入された架橋を含むＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。いくつかのかかる態様では、架橋は、ジチロシン架橋である。

本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が１つ以上のジチロシン架橋を含む態様では、ジチロシン架橋は、２つの内在性チロシン残基間、２つの「チロシンへの」変異から生じるチロシン残基間、または「チロシンへの」変異から生じるチロシン残基と内在性チロシン残基間に導入されてもよい。いくつかの態様では、１つを超えるジチロシン架橋が、ＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチド中に導入されている。

本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が１つ以上のジチロシン架橋を含む態様では、「チロシンへの」変異が導入され得るアミノ酸位置の非限定的な例は、Ｋ７７、Ｎ８８、Ｍ９７、Ａ１４７、Ｓ１５０、Ｓ１５５、Ｈ１５９、Ｎ１８３、Ｖ１８５、Ｖ１８７、Ｖ２２０、Ｅ２２２、Ｆ２２３、Ｋ２２６、Ｓ２５５、Ｋ４２７およびＶ４６９（図６を参照されたい）、またはその任意の組合せを含む。

本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が１つ以上のジチロシン架橋を含む態様では、ジチロシン架橋を形成するために使用することができる既存のまたは内在性チロシン残基の非限定的な例は、Ｙ３３、Ｙ１９８およびＹ２８６（図６を参照されたい）、またはその任意の組合せを含む。

本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が１つ以上のジチロシン架橋を含む態様では、ジチロシン架橋がその間に導入され得る残基対の非限定的な例は、１４７／２８６、１９８／２２０、１９８／２２２、１９８／２２３、１９８／２２６、３３／４９６、７７／２２２、８８／２５５、９７／１５９、１８３／４２７、１８５／４２７、および１８７／４２７、またはその任意の組合せを含む。

本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が１つ以上のジチロシン架橋を含む態様では、そこからアミノ酸がチロシン置換および／またはジチロシン架橋結合のために選択されてもよいＲＳＶＦタンパク質の領域または二次構造の非限定的な例は、Ｆ１可動性Ｎ末端（残基１３７〜２１６）、α２（残基１４８〜１６０）、α３（残基１６３〜１７３）、β３（残基１７６〜１８２）、β４（残基１８６〜１９５）、α４（残基１９７〜２１１）、Ｆ１可動性Ｃ末端（残基４６１〜５１３）、β２２（残基４６４〜４７１）、α９（残基４７４〜４７９）、β２３（残基４８６〜４９１）、およびα１０（残基４９３〜５１４）を含む。そこから１つ以上のアミノ酸がチロシン置換および／または架橋結合のために選択されてもよいＲＳＶＦタンパク質の他の領域の非限定的な例は、約位置６７から約位置８７まで、約位置７８から約位置９８まで、約位置８７から約位置１０７まで、約位置１３７から約位置１５７まで、約位置１４０から約位置１６０まで、約位置１４５から約位置１６５まで、約位置１４９から約位置１６９まで、約位置１７３から約位置１９３まで、約位置１７５から約位置１９５まで、約位置１７７から約位置１９７まで、約位置１８８から約位置２０８まで、約位置２１０から約位置２３０まで、約位置２１２から約位置２３２まで、約位置２１３から約位置２３３まで、約位置２１６から約位置２３６まで、約位置２４５から約位置２６５まで、約位置２７６から約位置２９６まで、約位置４１７から約位置４３７まで、および約位置４５９から約位置４７９までの残基を含む。

いくつかの態様では、本発明は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２のアミノ酸配列、またはそのアミノ酸残基１〜５１３（そのそれぞれが、ジチロシン架橋結合を促進するためのおよびその前Ｆ立体構造におけるＲＳＶＦタンパク質の「ロッキング」を促進するための１つ以上の「チロシンへの」変異を含むＲＳＶＦアミノ酸配列の変異体である）、またはその任意の断片、たとえばそのアミノ酸残基１〜５１３を含む断片、および／またはＲＳＶＦタンパク質のＦ１もしくはＦ２断片を含む断片、またはタンパク分解性に産出されてもよいかつ／もしくは集合して機能的ＲＳＶＦタンパク質を構築してもよいまたはその部分を形成してもよいＲＳＶＦタンパク質の任意の他の断片に由来する、これらを含む、本質的にこれらからなる、またはこれらからなるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。いくつかの態様では、本発明は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２、またはそのアミノ酸残基１〜５１３、またはその任意の断片と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に由来する、これを含む、本質的にこれからなる、またはこれからなるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。

ジチロシン架橋が標的とされてもよいＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドにおけるアミノ酸位置の非限定的な例は、そこでＦ２−Ｆ１プロトマー内結合が形成することになる、Ｙ３３（既存のＴｙｒ残基）およびＶ４６９Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、そこでＦ１−Ｆ１分子内結合が形成する、位置Ｙ１９８（既存のＴｙｒ残基）およびＥ２２２Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、そこでＦ₂−Ｆ₁プロトマー間結合が形成する、位置Ｋ７７Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＥ２２２Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、そこでＦ₂−Ｆ₁プロトマー間結合が形成する、位置Ｎ８８Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＳ２５５Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、そこでＦ₂−Ｆ₁プロトマー間結合が形成する、位置Ｍ９７Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＨ１５９Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、そこでＦ₁−Ｆ₁プロトマー間結合が形成する、位置Ｖ１８５Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＫ４２７Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、ならびにそこでＦ１−Ｆ１プロトマー間結合が形成する、位置Ｎ１８３Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＫ４２７Ｙ（Ｔｙｒへの置換）を含む。これらの位置は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の原子レベルの構造の分析によって最初に同定された。さらなる非限定的な例は、位置Ａ１４７Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＹ２８６（既存のＴｙｒ）、Ｙ１９８（既存のＴｙｒ残基）およびＶ２２０Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、Ｙ１９８（既存のＴｙｒ残基）およびＦ２２３Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、Ｙ１９８（既存のＴｙｒ残基）およびＫ２２６Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、Ｖ１８７Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＫ４２７Ｙ（Ｔｙｒへの置換）ならびにＮ８８Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＳ２５５Ｙ（Ｔｙｒへの置換）を含む。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、上記に列挙したジチロシン架橋の１つを含む。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、上記に列挙したジチロシン架橋の２つを含む。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、上記に列挙したジチロシン架橋の３つを含む。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、上記に列挙したジチロシン架橋の４つを含む。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、上記に列挙したジチロシン架橋の５つ以上を含む。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、上記に列挙したジチロシン架橋の任意の組合せまたは１つ以上を含む。

１つを超えるジチロシン架橋を有するように設計されているＲＳＶＦタンパク質の非限定的な例は、たとえば、位置２２２で置換されたチロシンが位置１９８で内在性チロシンと対合するように設計されており、位置４６９で置換されたチロシンが位置３３で内在性チロシンと対合するように設計されており、したがって、２つのジチロシン架橋の形成によってＲＳＶＦタンパク質を安定化させるサブタイプＡ（配列番号２９）またはＤＳ−Ｃａｖ１（配列番号３１）に由来する２つの「チロシンへの」変異（Ｅ２２２Ｙ／Ｖ４６９Ｙ）を有するＲＳＶＦタンパク質；および、たとえば、位置２２６で置換されたチロシンが位置１９８で内在性チロシンと対合するように設計されており、位置４６９で置換されたチロシンが位置３３で内在性チロシンと対合するように設計されており、したがって、２つのジチロシン架橋の形成によってＦタンパク質を安定化させるサブタイプＡ（配列番号３０）またはＤＳ−Ｃａｖ１（配列番号３２）に由来する２つのチロシンへの変異（Ｋ２２６Ｙ／Ｖ４６９Ｙ）を有するＲＳＶＦタンパク質を含む。

上記のように、成熟したＲＳＶＦ三量体の各プロトマーは、非共有結合的に会合してプロトマーを形成するＦ１およびＦ２と称される２つの別個のポリペプチド鎖に切断されてもよい。同じプロトマー内のＦ１ポリペプチドとＦ２ポリペプチド間の結合は、分子間結合およびプロトマー内結合の例である。本発明は、限定なく、配列番号１６（位置４６９で導入されたチロシンが内在性チロシン３３と対合するように設計されているＶ４６９Ｙ）、配列番号１７（導入されたチロシン間にジチロシン対を形成するように設計されているＫ７７Ｙ／Ｅ２２２Ｙ）、配列番号１８（導入されたチロシン間にジチロシン対を形成するように設計されているＮ８８Ｙ／Ｓ２５５Ｙ）、および配列番号１９（導入されたチロシン間にジチロシン対を形成するように設計されているＭ９７Ｙ／Ｈ１５９Ｙ）を含めた、この相互作用を安定化させるように設計されている架橋を含む例示的なＲＳＶＦタンパク質およびポリペプチド、ならびにかかる配列に由来し、かかる配列に存在する特定の「チロシンへの」変異を含むＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を提供する。本発明は、限定なく、配列番号２０（Ｖ１８５Ｙ／Ｋ４２７Ｙ）、配列番号２１（Ｖ１８７Ｙ／Ｋ４２７Ｙ）、配列番号２２（Ｎ１８３Ｙ／Ｋ４２７Ｙ）を含めた、三量体の２つのプロトマーを一緒に保持するように設計されている架橋（分子間、プロトマー間結合）を含む、例示的なＲＳＶＦタンパク質およびポリペプチド、ならびにかかる配列に由来し、かかる配列に存在する特定の「チロシンへの」変異を含むＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体も提供する。これらのタンパク質のそれぞれでは、あるプロトマーにおけるある導入されたチロシンは、隣接するプロトマー上の他の導入されたチロシンと対合するように設計されている。たとえば、配列番号２０（Ｖ１８５Ｙ／Ｋ４２７Ｙ）では、「プロトマーＡ」上の位置１８５のチロシンは、「プロトマーＢ」上の位置４２７のチロシンとジチロシン結合を形成する（図３１Ａを参照されたい）。

いくつかの態様では、ＲＳＶＦタンパク質のＦ１ポリペプチドは、同じプロトマーのＦ２ポリペプチドと架橋している（分子間／プロトマー内結合）。いくつかの態様では、Ｆ１ポリペプチドは、分子内架橋している（たとえば、架橋の両方のチロシンは、同じＦ１ポリペプチド内に位置している）。いくつかの態様では、Ｆ２ポリペプチドは、分子内架橋している（たとえば、架橋の両方のチロシンは、同じＦ１ポリペプチド内に位置している）。いくつかの態様では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質のＦ１ポリペプチドは、隣接するプロトマーのＦ１ポリペプチドと架橋している（プロトマー間結合）。いくつかの態様では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質のＦ１ポリペプチドは、隣接するプロトマーのＦ２ポリペプチドと架橋している（プロトマー間結合）。

前Ｆから後Ｆ構造への移行は、ＲＳＶタンパク質、特にＦ₁のＣおよびＮ末端の部分の非常に著しい再編成を伴う一方、残りのタンパク質は、著しく少なく移動する。本発明の方法によって前Ｆ立体構造を安定化させるために、著しく移動する（たとえば５Åより多く）タンパク質の部分は、単一のプロトマーのＦ₁鎖の２つの残基間で、単一のプロトマーのＦ₂鎖の２つの残基間で、同じプロトマー内のＦ₁鎖の１つの残基とＦ₂鎖の１つの残基間で、または２つの隣接するプロトマーのＦ₁および／またはＦ₂残基間でのいずれかで、著しく少なく移動する（たとえば５Å未満）タンパク質の部分に結合され得る。あるいは、著しく移動する（たとえば５Åより多く）タンパク質の部分は、同様にＦ₁鎖の２つの残基間で、Ｆ₂鎖の２つの残基間で、同じプロトマー内のＦ₁鎖の１つの残基とＦ₂鎖の１つの残基間で、または２つの隣接するプロトマーのＦ₁および／またはＦ₂残基間でのいずれかで、著しく移動する（たとえば５Åより多く）タンパク質の他の部分にも結合され得る。移動または非移動部分のいずれかへの移動部分の共有結合は、融合前構造から中間構造または融合後構造のいずれかへの移行を妨げる。

融合前から融合後への移行において５Åより多く移動するＦ₂における位置は、位置６２から７６を含む一方、位置２６から６１および７７から９７は、５Å未満移動する（位置９８〜１０９は、融合前構造において未だ決定されていない）。前Ｆから後Ｆ移行において５Åより多く移動するＦ₁における位置は、位置１３７から２１６（Ｆ₁可動性Ｎ末端）および４６１から５１３（Ｆ₁可動性Ｃ末端）を含む。前Ｆ構造のＦ₁可動性Ｎ末端は、Ｆタンパク質三量体（３つのプロトマーからなる複合体）の同じプロトマー内でまたはプロトマー間で、それぞれ互いに、または他の移動もしくは非移動部分に結合され得る、□２（位置１４８から１６０）、□３（位置１６３から１７３）、□３（位置１７６から１８２）、□４（位置１８６から１９５）、および□４（位置１９７から２１１）二次構造をさらに含む。前Ｆ構造のＦ₁可動性Ｃ末端は、Ｆタンパク質三量体の同じプロトマー内でまたはプロトマー間で、それぞれ互いに、または他の移動もしくは非移動部分に結合され得る、□２２（位置４６４から４７１）、□９（位置４７４から４７９）、□□３（位置４８６から４９１）、および□１０（位置４９３から５１４）二次構造をさらに含む。（図３２を参照されたい。）
いくつかの態様では（上記に記載したもの、およびここで列挙した特定のアミノ酸配列のいずれかを有するＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を伴うもの、およびここで提供した特定のアミノ酸配列との１００％未満の同一性を有する、かかるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の変異体または断片を伴うものの全てを含めて）、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、１つ以上の望ましい特性、たとえば（１）前Ｆ立体構造を形成する、（２）架橋結合によって前Ｆ立体構造において「ロックされる」、（３）前Ｆ特異的抗体に結合する、（４）部位φに結合する抗体に結合する、（５）中和抗体に結合する、（６）広域中和抗体に結合する、（７）Ｄ２５、ＡＭ２２、５Ｃ４、１０１Ｆからなる群から選択される抗体に結合する、（８）パリビズマブ（シナジス）に結合する、（９）Ｂ細胞受容体に結合するかつ／またはこれを活性化する、（１０）動物における抗体応答を引き出す、（１１）動物における保護抗体応答を引き出す、（１２）動物における中和抗体の産生を引き出す、（１３）動物における広域中和抗体の産生を引き出す、（１４）動物における４要素中和エピトープ（ＱＮＥ）を認識する抗体の産生を引き出す、および／または（１５）動物における保護免疫応答を引き出す能力があることを有するべきである。

特に明記しない限り、特定のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体に関するここでの全ての記述は、その全てのホモログ、オルソログ、アナログ、誘導体、変異型、断片、キメラ、融合タンパク質など、たとえばある特定の望ましい特性または特徴を有するもの（たとえば前Ｆ立体構造にある、または望ましい前Ｆ立体構造を有する複合体の部分を形成する能力がある、または１つ以上の抗ＲＳＶ抗体、たとえばＲＳＶ前Ｆ立体構造に特異的であるかつ／もしくはφ部位に結合する抗体に結合する、もしくはこれの産生を引き出す能力があることを含むが、これらに限定されない、望ましい機能的特性を有するもの）に等しく関する。

同様に、特定のポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体ポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体（たとえば特定のアミノ酸配列を有するものまたは特定のＲＳＶ型、サブタイプ、もしくは株からのもの）に関するここでの全ての記述は、天然に存在してもよい（たとえば種々のＲＳＶタイプ、サブタイプまたは株において）またはここで提供した特定の配列に関連しているが、ある方法において、たとえば組換え手段、化学的手段、または任意の他の手段によって人工的に改変されたかかるポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体の他の関連する形に等しく関する。ここで記載したポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体は、当技術分野で既知の任意の適したＲＳＶポリペプチド、タンパク質、および／またはタンパク質複合体のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を有する、またはこれに由来することができる。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、任意のかかるタンパク質、またはその断片と実質的に相同である（たとえば、様々な態様では、当業者に既知の任意の適した方法を使用して、たとえば、当技術分野で既知のコンピューターホモロジープログラムを使用して整列させた場合、ここで記載したまたは当技術分野で既知の任意の特定のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のアミノ酸または核酸配列と少なくとも約４０％または５０％または６０％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％の同一性を有するもの）またはそのコード核酸が高ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、もしくは低ストリンジェンシー条件下で本発明のタンパク質のコード核酸配列にハイブリダイズする能力があるタンパク質を含めて、ここで記載したまたは当技術分野で既知の特定の特定のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の誘導体および／またはアナログであってもよい、またはこれに由来してもよい。

いくつかの態様では、本発明は、ここで記載した特定のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体の断片、たとえば少なくとも約１０アミノ酸、２０アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸、２００アミノ酸、または５００アミノ酸を含む、本質的にこれらからなる、またはこれらからなるものを提供する。

いくつかの態様では、ここで記載したまたは当技術分野で既知の特定のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体内の１つ以上のアミノ酸残基は、欠失、付加、または別のアミノ酸で置換され得る。かかる変異が導入されている態様では、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体をミクロ配列決定して、部分的なアミノ酸配列を決定することができる。他の態様では、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸分子を配列決定して、変異の導入を同定するかつ／または確認することができる。

いくつかの態様では、１つ以上のアミノ酸残基を、同様の極性を有し、機能的同等物として働いてもよい別のアミノ酸によって置換することができ、これは、サイレント改変をもたらす。いくつかの態様では、配列内のアミノ酸に関する置換は、たとえば保存的置換を産み出すためにそのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されてもよい。たとえば、無極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。極性で中性のアミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電している（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む。負に荷電している（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。かかる置換は、保存的置換であると一般的に理解されている。

いくつかの態様では、人工的、合成的、もしくは非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログを使用して、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製することができる。非古典的アミノ酸は、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、フルオロ−アミノ酸、および「デザイナー」アミノ酸、たとえば一般にβ−メチルアミノ酸、Ｃγ−メチルアミノ酸、Ｎγ−メチルアミノ酸、およびアミノ酸アナログを含むが、これらに限定されない。非古典的アミノ酸のさらに非限定的な例は、α−アミノカプリル酸、Ａｃｐａ；（Ｓ）−２−アミノエチル−Ｌ−システイン／ＨＣｌ、Ａｅｃｙｓ；アミノフェニルアセテート、Ａｆａ；６−アミノヘキサン酸、Ａｈｘ；γ−アミノイソ酪酸およびα−アミノイソ酪酸、Ａｉｂａ；アロイソロイシン、Ａｉｌｅ；Ｌ−アリルグリシン、Ａｌｇ；２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、およびα−アミノ酪酸、Ａｂａ；ｐ−アミノフェニルアラニン、Ａｐｈｅ；ｂ−アラニン、Ｂａｌ；ｐ−ブロモフェニルアラニン、Ｂｒｐｈｅ；シクロヘキシルアラニン、Ｃｈａ；シトルリン、Ｃｉｔ；β−クロロアラニン、Ｃｌａｌａ；シクロロイシン、Ｃｌｅ；ｐ−クロロフェニルアラニン、Ｃｌｐｈｅ；システイン酸、Ｃｙａ；２，４−ジアミノ酪酸、Ｄａｂ；３−アミノプロピオン酸および２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｄａｐ；３，４−デヒドロプロリン、Ｄｈｐ；３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、Ｄｈｐｈｅ；ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｆｐｈｅ；Ｄ−グルコサミン酸、Ｇａａ；ホモアルギニン、Ｈａｇ；δ−ヒドロキシリシン／ＨＣｌ、Ｈｌｙｓ；ＤＬ−β−ヒドロキシノルバリン、Ｈｎｖｌ；ホモグルタミン、Ｈｏｇ；ホモフェニルアラニン、Ｈｏｐｈ；ホモセリン、Ｈｏｓ；ヒドロキシプロリン、Ｈｐｒ；ｐ−ヨードフェニルアラニン、Ｉｐｈｅ；イソセリン、Ｉｓｅ；α−メチルロイシン、Ｍｌｅ；ＤＬ−メチオニン−Ｓ−メチルスルホニウムクロリド、Ｍｓｍｅｔ；３−（１−ナフチル）アラニン、１Ｎａｌａ；３−（２−ナフチル）アラニン、２Ｎａｌａ；ノルロイシン、Ｎｌｅ；Ｎ−メチルアラニン、Ｎｍａｌａ；ノルバリン、Ｎｖａ；Ｏ−ベンジルセリン、Ｏｂｓｅｒ；Ｏ−ベンジルチロシン、Ｏｂｔｙｒ；Ｏ−エチルチロシン、Ｏｅｔｙｒ；Ｏ−メチルセリン、Ｏｍｓｅｒ；Ｏ−メチルトレオニン、Ｏｍｔｈｒ；Ｏ−メチルチロシン、Ｏｍｔｙｒ；オルニチン、Ｏｒｎ；フェニルグリシン；ペニシラミン、Ｐｅｎ；ピログルタミン酸、Ｐｇａ；ピペコリン酸、Ｐｉｐ；サルコシン、Ｓａｒ；ｔ−ブチルグリシン；ｔ−ブチルアラニン；３，３，３−トリフルオロアラニン、Ｔｆａ；６−ヒドロキシドーパ、Ｔｈｐｈｅ；Ｌ−ビニルグリシン、Ｖｉｇ；（−）−（２Ｒ）−２−アミノ−３−（２−アミノエチルスルホニル）プロパン酸ジヒドロキシクロリド、Ａａｓｐａ；（２Ｓ）−２−アミノ−９−ヒドロキシ−４，７−ジオキサノナン酸、Ａｈｄｎａ；（２Ｓ）−２−アミノ−６−ヒドロキシ−４−オキサヘキサン酸、Ａｈｏｈａ；（−）−（２Ｒ）−２−アミノ−３−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）プロパン酸、Ａｈｓｏｐａ；（−）−（２Ｒ）−２−アミノ−３−（２−ヒドロキシエチルスルファニル）プロパン酸、Ａｈｓｐａ；（２Ｓ）−２−アミノ−１２−ヒドロキシ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸、Ａｈｔｄａ；（２Ｓ）−２，９−ジアミノ−４，７−ジオキサノナン酸、Ｄａｄｎａ；（２Ｓ）−２，１２−ジアミノ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸、Ｄａｔｄａ；（Ｓ）−５，５−ジフルオロノルロイシン、Ｄｆｎｌ；（Ｓ）−４，４−ジフルオロノルバリン、Ｄｆｎｖ；（３Ｒ）−１−１−ジオキソ−［１，４］チアジン−３−カルボン酸、Ｄｔｃａ；（Ｓ）−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロノルロイシン、Ｈｆｎｌ；（Ｓ）−５，５，６，６，６−ペンタフルオロノルロイシン、Ｐｆｎｌ；（Ｓ）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロノルバリン、Ｐｆｎｖ；ならびに（３Ｒ）−１，４−チアジナン−３−カルボン酸、Ｔｃａを含むが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。古典的および非古典的アミノ酸の総説に関しては、Ｓａｎｄｂｅｒｇｅｔａｌ．，１９９８（Ｓａｎｄｂｅｒｇｅｔａｌ．，１９９８．Ｎｅｗｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓｒｅｌｅｖａｎｔｆｏｒｔｈｅｄｅｓｉｇｎｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ８７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＪＭｅｄＣｈｅｍ４１（１４）：ｐｐ．２４８１−９１）を参照されたい。

核酸
ここで記載したある特定のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供することに加えて、本発明は、かかるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸、ならびにかかる核酸を含む組成物およびベクターも提供する。かかる核酸は、当技術分野で既知の任意の適した方法を使用して取得または作製することができる。たとえば、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸分子は、クローン化ＤＮＡから取得することができるかまたは化学的合成によって作製することができる。いくつかの態様では、核酸は、当業者に既知の方法のいずれか、たとえばランダムまたはポリＡ−プライムド逆転写（poly A-primed reverse transcription）によって調製されたＲＮＡを逆転写することによって取得してもよい。供給源が何であっても、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸分子は、任意の適したベクター、たとえば核酸分子の増殖に使用されるものまたは核酸分子の発現に使用されるもの中にクローニングすることができる。核酸は、必要な場合、様々な制限酵素を使用して、特定の部位で切断されてもよい。発現を必要とする態様では、核酸は、望ましい細胞型、たとえば哺乳類細胞または昆虫細胞における発現を方向付けるのに適したプロモーターに作動可能に連結することができ、任意の適した発現ベクター、たとえば哺乳類または昆虫発現ベクター中に組み込まれてもよい。

いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、限定なく、ＲＳＶサブタイプＡ（たとえば、配列番号３３）からの野生型（ＷＴ）全長Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはＲＳＶサブタイプＢ（たとえば、配列番号３４）からの野生型（ＷＴ）全長Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列、または目的の任意の特定の種の細胞における発現にコドン最適化されている、もしくは目的の任意の変異を含有するかかる配列の変異体を含めて、当技術分野で既知の任意の適したＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質複合体配列、またはその任意の断片をコードする（またはこれをコードするヌクレオチド配列を含む、本質的にこれからなる、またはこれからなる）核酸配列に由来することができる。たとえば、いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、ＲＳＶＦＡ型のＦタンパク質をコードするが、ヒト（たとえば配列番号３５）、ハムスター（たとえば配列番号３６）、昆虫（たとえば配列番号３７）、もしくはマウス細胞（たとえば配列番号３８）における発現にコドン最適化されている、または任意の他の細胞型における発現に最適化されているヌクレオチド配列に由来することができる。同様に、いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、ＲＳＶＦＢ型のＦタンパク質をコードするが、ヒト（たとえば配列番号３９）、ハムスター（たとえば配列番号４０）、昆虫（たとえば配列番号４１）、もしくはマウス細胞（たとえば配列番号４２）における発現にコドン最適化されている、または任意の他の細胞型における発現に最適化されているヌクレオチド配列に由来することができる。同様に、いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、ＲＳＶＦＡまたはＢ型のＦタンパク質をコードし、目的の任意の所与の種の細胞における発現にコドン最適化されていてもされていなくてもよく、また１つ以上の目的の他の変異を含むヌクレオチド配列に由来することができる。たとえば、いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、ＤＳ−ＣＡＶ１（配列番号４３）、ＤＳ（配列番号４４）、および／またはＣＡＶ１（配列番号４５）変異配列を含むヌクレオチド配列に由来することができる。配列番号４３、４４、および４５において提供された３つの特定の配列は、ヒトコドン最適化全長ＲＳＶＡ型配列の文脈におけるＤＳ、ＣＡＶ１、およびＤＳ−ＣＡＶ１変異を含むが、かかる変異、または実際に、目的の任意の他の変異（本発明の「チロシンへの」変異の全てを含めて）は、目的の任意の種における発現に最適化されている、または目的の任意の変異を含む、またはＲＳＶＡ型もしくはＢ型配列のある特定の部分のみ、たとえば、ＲＳＶＦ外部ドメインのみ（膜貫通および／または細胞質ドメインなし）をコードするヌクレオチド１〜１５３９のみを含む配列を含むが、これらに限定されない、任意の他の適したＲＳＶＡ型またはＢ型配列の主鎖に等しく存在する。当業者は、ここで記載した様々なＲＳＶＦポリペプチドおよびタンパク質をコードすることができるいろいろなヌクレオチド配列があり、全てのかかるヌクレオチド配列は、本発明の範囲内にあることが意図されていることを理解することになる。たとえば、いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦタンパク質およびポリペプチドは、ここで示したもののいずれか（配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、および４５を含めて）を含むが、これらに限定されない、ＲＳＶＦタンパク質をコードする任意の既知のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する、またはそのヌクレオチド１〜１５３９（外部ドメイン配列をコードする）と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有する、または任意の既知のＲＳＶグループ、サブグループ、ファミリー、サブファミリー、タイプ、サブタイプ、属、種、株、および／もしくはクレード、もしくはその任意の断片からのＲＳＶＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列に由来することができる。

さらに、当業者は、たとえば、変異されるべき特定のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドコドンを位置づけ、必要に応じてそのコドンでヌクレオチドを変異させて、チロシンコードコドンをもたらすことによって、ここで記載した特定の「チロシンへの」変異の任意の１つ以上を含む核酸分子を容易に可視化するまたは作製することができる。

架橋結合
いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチドおよび／またはタンパク質は、集合して、望ましい立体構造的構造、たとえば前Ｆ立体構造を有するタンパク質複合体を構築し、その立体構造を安定化させるために架橋される。架橋され得るＲＳＶＦタンパク質の特定の領域、およびかかる架橋結合を促進するように設計されている特定のＲＳＶ変異体の詳細は、本出願の他の節に記載されている。いくつかの態様では、架橋は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の三次および／または四次構造を安定化させるために使用してもよい。いくつかの態様では、架橋結合は、分子内および／または分子間架橋結合であってもよい。いくつかの態様では、使用される架橋は、標的架橋である。いくつかの態様では、使用される架橋は、生理的条件下で安定である。いくつかの態様では、使用される架橋は、たとえば発現中におよび／または保管（たとえば高濃度のＲＳＶ融合前Ｆタンパク質を含む組成物の保管）中に、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の凝集体形成につながらない。いくつかの態様では、かかる架橋の導入は、免疫原、たとえばワクチン免疫原としての本発明のＲＳＶポリペプチド、タンパク質およびタンパク質の有効性を増強してもよい。いくつかの態様では、かかる架橋の導入は、エピトープが特定の抗体によって認識され、抗体の産生を引き出し、かつ／または抗体結合時にＢ細胞受容体を活性化することができるように、ＲＳＶＦタンパク質内のエピトープ（たとえばφエピトープ）を安定化させてもよい。

いくつかの態様では、標的架橋結合を使用することができる。標的架橋は、ＲＳＶＦタンパク質またはタンパク質複合体内の特定の１つまたは複数の位置で形成するように作製され得るものである。いくつかの戦略を、ＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドにおける特定の部位、たとえばここで記載した特定の部位への架橋を標的にするために使用してもよい。本発明は、架橋した場合、その前Ｆ立体構造における、ならびに／または中和抗体に結合するもしくは中和抗体の産生を引き出す能力がある、かつ／もしくは動物における中和抗体応答を生じる能力がある立体構造におけるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を安定化させることができるまたは安定化させてもよいＲＳＶＦタンパク質内の残基対を提供する。標的架橋は、ある特定のアミノ酸側鎖の物理的および／または化学的特性を利用することによって、たとえば特定のアミノ酸配列もしくは三次元構造を認識する酵素反応を利用することによって、または折り畳みタンパク質もしくはタンパク質複合体における架橋を形成する能力を有する非天然アミノ酸を組み込むことによって、ここで特定した部位または位置の１つ以上で導入されてもよい。

架橋または修飾は、望ましい結果、たとえば安定化または前Ｆ立体構造を達成するために、ＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドの構造における特定の部位を標的としてもよい。本発明は、好ましくは架橋または修飾が融合前立体構造におけるＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドを安定化させる、または融合前立体構造の増強された安定化を提供する、ＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドにおける任意の適した位置での１つ以上の架橋および／または他の安定化修飾の標的導入を企図する。本発明は、アミノ酸位置Ｙ３３、Ｋ７７、Ｎ８８、Ｍ９７、Ａ１４７、Ｓ１５０、Ｓ１５５、Ｈ１５９、Ｎ１８３、Ｖ１８５、Ｖ１８７、Ｙ１９８、Ｖ２２０、Ｅ２２２、Ｆ２２３、Ｋ２２６、Ｓ２５５、Ｙ２８６、Ｋ４２７およびＶ４６９、またはその任意の組合せ；残基対１４７／２８６、１９８／２２０、１９８／２２２、１９８／２２３、１９８／２２６、３３／４９６、７７／２２２、８８／２５５、９７／１５９、１８３／４２７、１８５／４２７、および１８７／４２７、またはその任意の組合せ；Ｆ１可動性Ｎ末端（残基１３７〜２１６）、α２（残基１４８〜１６０）、α３（残基１６３〜１７３）、β３（残基１７６〜１８２）、β４（残基１８６〜１９５）、α４（残基１９７〜２１１）、Ｆ１可動性Ｃ末端（残基４６１〜５１３）、β２２（残基４６４〜４７１）、α９（残基４７４〜４７９）、β２３（残基４８６〜４９１）、およびα１０（４９３〜５１４）を含む領域または二次構造；ならびに約位置６７から約位置８７まで、約位置７８から約位置９８まで、約位置８７から約位置１０７まで、約位置１３７から約位置１５７まで、約位置１４０から約位置１６０まで、約位置１４５から約位置１６５まで、約位置１４９から約位置１６９まで、約位置１７３から約位置１９３まで、約位置１７５から約位置１９５まで、約位置１７７から約位置１９７まで、約位置１８８から約位置２０８まで、約位置２１０から約位置２３０まで、約位置２１２から約位置２３２まで、約位置２１３から約位置２３３まで、約位置２１６から約位置２３６まで、約位置２４５から約位置２６５まで、約位置２７６から約位置２９６まで、約位置４１７から約位置４３７まで、および約位置４５９から約位置４７９までの残基を含むＲＳＶＦタンパク質の他の領域を含むが、これらに限定されない、ジチロシン架橋結合のためのここで記載した任意のＲＳＶＦタンパク質アミノ酸残基、残基対、二次構造または他の領域を、他の標的架橋もしくは結合または他の修飾の形成にも使用してもよいことを企図する。

タンパク質を分子内でおよび分子間で架橋する種々様々の方法は、異なる長さのスペーサーアームでの架橋を有するもの、ならびに精製のための蛍光および官能基を有するおよび有さないものを含めて、当技術分野で既知である。かかる方法は、ヘテロ二官能性架橋剤（たとえばスクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、ｔｒａｎｓ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、およびスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））、ホモ二官能性架橋剤（たとえばスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、光反応性架橋剤（たとえば４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、ＳＴＰエステル、ナトリウム塩（ＡＴＦＢ、ＳＴＰエステル）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、スクシンイミジルエステル（ＡＴＦＢ、ＳＥ）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロベンジルアミン、塩酸塩、ベンゾフェノン−４−イソチオシアネート、ベンゾフェノン−４−マレイミド、４−ベンゾイル安息香酸、スクシンイミジルエステル、Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリチルアミド（ＰＥＡＳ；ＡＥＴ）、チオール反応性架橋剤（たとえばマレイミドおよびヨードアセトアミド）、アミン反応性架橋剤（たとえばグルタルアルデヒド、ビス（イミドエステル）、ビス（スクシンイミジルエステル）、ジイソシアネートおよび二塩基酸塩化物）の使用を含むが、これらに限定されない。チオール基は、アミン基と比較すると、大多数のタンパク質において高反応性であり比較的まれであるので、チオール反応性架橋結合をいくつかの態様において使用してもよい。チオール基が欠損しているまたはＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の構造における適切な部位に存在しない場合、それらを、いくつかのチオレーション方法の１つを使用して導入することができる。たとえば、スクシンイミジルｔｒａｎｓ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを使用して、アミン部位でチオール反応性基を導入することができる。

いくつかの酸化的架橋、たとえばジスルフィド結合（自発的に形成し、ｐＨおよびレドックス感受性である）、およびジチロシン結合（生理的条件下で高度に安定であり、不可逆的である）が既知である。

いくつかの態様では、架橋は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の三次構造を安定化させる。いくつかの態様では、架橋は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の四次構造を安定化させる。いくつかの態様では、架橋は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の三次と四次構造の両方を安定化させる。

いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドは、熱安定性である架橋を有する。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドは、有毒ではない架橋を有する。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドは、標的架橋、または非標的架橋、または可逆的架橋、または不可逆的架橋、またはホモ二官能性架橋剤の使用によって形成される架橋、またはヘテロ二官能性架橋剤の使用によって形成される架橋、またはアミン基と反応する試薬の使用によって形成される架橋、またはチオール基と反応する試薬の使用によって形成される架橋、または光反応性である試薬の使用によって形成される架橋、またはアミノ酸残基間に形成される架橋、またはタンパク質もしくはタンパク質複合体の構造中に組み込まれた変異アミノ酸残基間に形成された架橋、または酸化的架橋、またはジチロシン結合、またはグルタルアルデヒド架橋、またはそれらの任意の組合せである架橋を有する。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドは、グルタルアルデヒド架橋を有さない。

いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドは、いかなる人工的に導入されたジスルフィド結合も有さない、またはそれがかかるジスルフィド結合を有する場合、さらに人工的に導入された架橋も有する。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドは、いかなる人工的に導入されたジスルフィド結合も有さないが、自然発生のジスルフィド結合を有してもよい。システイン側鎖が点変異によって操作されている場合、ジスルフィド結合は、人工的に導入することができる。しかしながら、ジスルフィド結合は、ｐＨ感受性であり、ある特定のレドックス条件下で溶解されることが既知であり、したがって、たとえばｉｎｖｉｖｏでの免疫原として使用される、ジスルフィド架橋で操作されたタンパク質および／またはタンパク質複合体の予防的および／または治療的有用性は、損なわれ得る。さらに、望まれないジスルフィド結合が凝集体形成を媒介する遊離のスルフヒドリル基を有するタンパク質間にしばしば形成し（たとえば、ＨａｒｒｉｓＲＪｅｔａｌ．２００４，Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇｓｃａｌｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｔｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＤｒｕｇＤｅｖＲｅｓ６１（３）：１３７−１５４；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ＆Ｐｉｋａｌ（Ｅｄｓ．），２００４．ＬｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ｅｄｉｔｏｒｓＣｏｓｔａｎｔｉｎｏ＆Ｐｅｋａｌ．ＬｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｓｅｒｉｅｓ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓＩＩ，ｓｅｅｐａｇｅｓ４５３−４５４；Ｔｒａｃｙｅｔａｌ．，２００２、米国特許第６，４６５，４２５号を参照されたい）、これは、ＨＩＶｇｐ１２０およびｇｐ４１での問題としても報告されている（Ｊｅｆｆｓｅｔａｌ．２００４．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃｅｎｖｅｌｏｐｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｐｒｉｍａｒｙｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＨＩＶ−１．Ｖａｃｃｉｎｅ２２：１０３２−１０４６；Ｓｃｈｕｌｋｅｅｔａｌ．，２００２．Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆａｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙｍａｔｕｒｅ，ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１ｇｐ１４０ｅｎｖｅｌｏｐｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．ＪＶｉｒｏｌ７６：７７６０−７７７６）。したがって、多くの態様では、ジスルフィド結合が使用されない、または架橋結合の唯一の方法として使用されないことが好ましい。

ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の構造および／または免疫原性が架橋によって損なわれるまたは改変される場合、その全体構造および機能を維持することは、架橋結合反応に関するアミノ酸側鎖の有効性を制御することによってまたはさらなる架橋もしくは他の安定化修飾を導入することによって達成され得る。たとえば、ＤＴ架橋結合の場合、反応に利用できるが、複合体の構造の歪みにつながり、ＲＳＶＦタンパク質の免疫原性／抗原性を損なうチロシル側鎖は、かかる残基を別のアミノ酸、たとえば、フェニルアラニンに変異させることによって除去することができる。さらに、点変異は、結合の形成が最も有益な結果を引き起こすように、アミノ酸側鎖が架橋剤とまたは互いに反応することになる位置で導入されてもよい。これらの位置も、ここで記載したように同定されてもよい。

選択された残基に反応性側鎖が既に存在していない場合、反応性側鎖が存在し、反応に利用可能であるように、たとえばかかる点変異をその発現を方向付ける核酸のｃＤＮＡ中に導入するための分子生物学的方法を使用して、点変異が導入されてもよい。

使用してもよい架橋は、アミンおよび／またはチオール基と反応するホモおよびヘテロ二官能性架橋剤、光反応性架橋試薬の使用から生じる可逆的架橋、タンパク質またはタンパク質複合体の構造中に組み込まれた非古典的アミノ酸間に形成してもよい任意の架橋、任意の酸化的架橋、たとえば、これらに限定されないが、ジチロシン架橋／結合、ヘテロ二官能性架橋剤（たとえばスクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、ｔｒａｎｓ−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、およびスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））、ホモ二官能性架橋剤（たとえばスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、光反応性架橋剤（たとえば４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、ＳＴＰエステル、ナトリウム塩（ＡＴＦＢ、ＳＴＰエステル）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、スクシンイミジルエステル（ＡＴＦＢ、ＳＥ）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロベンジルアミン、塩酸塩、ベンゾフェノン−４−イソチオシアネート、ベンゾフェノン−４−マレイミド、４−ベンゾイル安息香酸、スクシンイミジルエステル、Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリシルアミド（ＰＥＡＳ；ＡＥＴ）、チオール反応性架橋剤（たとえばマレイミドおよびヨードアセトアミド）、アミン反応性架橋剤（たとえばグルタルアルデヒド、ビス（イミドエステル）、ビス（スクシンイミジルエステル）、ジイソシアネートおよび二塩基酸塩化物）を含むが、これらに限定されない。

本発明は、タンパク質間相互作用および／または望ましいタンパク質もしくはペプチド立体構造、たとえばＲＳＶＦタンパク質の融合前立体構造を安定化させるための「架橋」としての標的非共有結合性チロシン−スタッキング相互作用の導入も企図する。架橋は、タンパク質もしくはタンパク質複合体内の導入された／操作されたチロシンおよび内在性チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、もしくはトリプトファンの芳香族側鎖間の、またはタンパク質もしくはタンパク質複合体内の導入された／操作されたチロシンおよび第２の導入された／操作されたチロシンの芳香族側鎖間の、Ｔ型、サンドイッチ、または平行置換ｐｉスタッキング相互作用（parallel displaced pi stacking interaction）を含むが、これらに限定されない標的ｐｉスタッキング相互作用を含む。

本出願の文脈において使用される不可逆的架橋は、生理学的に関連がある条件下で著しく溶解されないものを含む。使用される架橋の型は、発現中にまたは本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が高濃度で保管される場合に、凝集体形成につながらないことが好ましい。ジスルフィド結合は、不可逆的架橋ではない。むしろ、それらは、可逆的架橋であり、生理学的に関連がある条件下で溶解しても、かつ／あるいはタンパク質発現および／もしくは産生中にまたは高濃度で保管された場合に凝集体形成をもたらしてもよい。

いくつかの態様では、架橋は、望ましい立体構造的安定化および／または望ましい免疫原性特性（たとえば前Ｆ立体構造を維持するかつ／または広域中和抗体に結合する能力）を達成するために、ここで記載したＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の特定の領域を標的としてもよい。あるいは、ここで特定した部位で架橋を有するタンパク質は、たとえば化学的、物理的、および／または機能的特徴に基づいて、望ましい修飾を有するまたは有さない架橋したおよび架橋していないタンパク質の混合物から単離されてもよい。かかる特徴は、たとえば、三量体形成、前Ｆ立体構造の存在、および／または任意の望ましい抗原性、免疫原性、または生化学的特徴を含んでもよい。

あるいは、いくつかの態様では、架橋は、標的とされなくてもよく、望ましい架橋または特性を有するタンパク質は、非標的架橋結合系を使用して作製される修飾および非修飾タンパク質の混合物から単離されてもよい。

望ましい架橋を有するＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が架橋したおよび架橋していないタンパク質の混合物から単離されるべき態様では、かかる単離または分離は、分子量、分子容、クロマトグラフ的特性、電気泳動における移動度、抗原性および生化学的特徴、蛍光特徴、溶解性、抗体への結合、構造的特徴、免疫学的特徴、または任意の他の適した特徴を含むが、これらに限定されない１つ以上の特徴に基づいて行われてもよい。

ここで記載した特定の架橋結合位置に加えて、さらなる架橋を作製することができる、たとえば反応性側鎖がＲＳＶＦタンパク質／複合体上のどこか他で反応性側鎖との結合を形成することができるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体内のさらなる位置を同定することができる。いくつかの態様では、たとえば、タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質複合体の免疫原性／抗原性を維持するまたは改善するために、かかるさらなる位置を選択することができる。いくつかの態様では、架橋されるかかるさらなる位置は、対で選択することができる。

ジチロシン（ＤＴ）架橋結合
いくつかの態様では、本発明は、ジチロシン（ＤＴ）架橋を含むＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体、ならびにかかるＤＴ架橋ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製する方法を提供する。

ジチロシン架橋結合は、タンパク質またはタンパク質複合体中に１つ以上の共有結合の炭素−炭素結合を導入する。これは、それらの構造的および機能的完全性を維持しながら、ポリペプチド内および／または間のジチロシン結合の導入によってタンパク質、タンパク質複合体、および立体構造を安定化させるための方法を提供する（その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｓｈａｌｌｅｔａｌ．、米国特許第７，０３７，８９４号および第７，４４５，９１２号を参照されたい）。最小限に改変する、長さゼロのＤＴ架橋は、生理的条件下で加水分解されず、タンパク質の構造的完全性を維持することが液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によって実証された。ジチロシン架橋は、それらの特定の特徴を利用するように進化したタンパク質の状況において（たとえばＥｌｖｉｎＣＭｅｔａｌ．２００５，Ｎａｔｕｒｅ４３７：９９９−１００２；ＴｅｎｏｖｕｏＪ＆ＰａｕｎｉｏＫ１９７９，ＡｒｃｈＯｒａｌＢｉｏｌ．；２４（８）：５９１−４）と非特異的タンパク質酸化の結果として（Ｇｉｕｌｉｖｉｅｔａｌ．２００３，ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ２５（３−４）：２２７−３２）の両方で、それらがｉｎｖｉｖｏで天然に形成するので、およびそれらが我々の最も一般的な食物のいくつかに多量に存在する：ＤＴ結合がたとえば混合および焼きの間にパン生地においてコムギグルテンの構造−グルテニンサブユニットを含む四次タンパク質構造−を形成するので（Ｔｉｌｌｅｙｅｔａｌ．２００１，Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ４９，２６２７）、安全であることが既知である。ジチロシン結合は、ｉｎｖｉｔｒｏで自発的に形成しない。むしろ、酵素的架橋反応は、タンパク質構造および機能を保存するための最適化された条件下で実行される。したがって、非特異的結合／凝集は、生じず（ジスルフィド結合とは異なり）、したがって、ＤＴ安定化免疫原の大規模な製造は、経済的により実行可能であり得る。

チロシル側鎖は、多くのレドックス酵素に存在し、酵素特異的反応の触媒作用は、長命で、比較的低い反応性を有するチロシルラジカルをしばしば伴う。最適化された条件下で、ラジカル形成は、チロシル側鎖に特異的である。極めて近接して、チロシル側鎖は、ラジカルカップリングを受け、共有結合性の炭素−炭素結合を形成する。反応しないチロシルラジカルは、非ラジカル化チロシル側鎖に戻る（Ｍａｌｅｎｃｉｋ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ，２００３．Ｄｉ−ｔｙｒｏｓｉｎｅａｓａｐｒｏｄｕｃｔｏｆｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅ．ＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ２５：２３３−２４７）。したがって、チロシル側鎖は、単一の折り畳みポリペプチド鎖内または複合体内の密接に相互作用するタンパク質ドメイン上のいずれかに、ＤＴ結合を形成するために極めて近接して位置していなければならない。およそ５〜８ÅのＣα−Ｃα分離が、結合形成に必須であるので（Ｂｒｏｗｎｅｔａｌ．，１９９８．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｙｏｘｉｄａｔｉｖｅｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇｏｆａｇｌｙｃｉｎｅ−ｇｌｙｃｉｎｅ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３７，４３９７−４４０６；Ｍａｒｓｈａｌｌｅｔａｌ．２００６，米国特許第７，０３７，８９４号）、および原子がこれらの結合の形成において付加されないので、生じる「ステープル」は、「長さがゼロ」であり、タンパク質構造に非破壊的である。

架橋されるチロシン残基は、架橋されるタンパク質の一次構造に天然に存在してもよいまたは制御された点変異によって付加されてもよい。ＤＴ結合を形成するために、チロシル側鎖を有するタンパク質をＤＴ結合の形成につながる反応条件に供することができる。ＤＴ結合形成反応が酸化的架橋結合反応であるので、かかる条件は、酸化的反応条件である、または酸化的反応条件になる。いくつかの態様では、ＤＴ架橋結合反応条件は、さもなければ修飾されていない、または検出可能な程度に修飾されていないタンパク質を生じる。かかる条件は、Ｈ₂Ｏ₂の形成を触媒する酵素、たとえばペルオキシダーゼの使用によって取得されてもよい。ＤＴ結合形成は、約３２０ｎｍの励起波長、および約４００ｎｍの波長で測定された蛍光での分光光度法によってモニターされてもよい（たとえば、図３４を参照されたい）一方、チロシル蛍光の喪失は、標準的な手順によってもモニターされる。チロシル蛍光の喪失がＤＴ結合形成でもはや化学量論的ではない場合、反応は、当業者に既知の任意の方法によって、たとえば、還元剤の付加およびその後の試料の冷却（氷上）または凍結によって停止してもよい。ＤＴ架橋結合を行う方法のさらなる詳細は、当技術分野で既知であり、たとえば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｓｈａｌｌｅｔａｌ．２００６，米国特許第７，０３７，８９４号に報告されている。

タンパク質操作におけるジチロシン架橋結合の主要な利点は、（ｉ）架橋結合のための特定の残基を標的とする能力（タンパク質および複合体の一次、二次、三次、および／または四次構造に基づいて）、（ｉｉ）最小の構造的修飾、（ｉｉｉ）反応の特異性（チロシンは、特定の架橋結合条件下で架橋を形成することが既知である唯一のアミノ酸である）；（ｉｖ）連結の安定性、（ｖ）架橋の長さがゼロ（原子が付加されない）、および（ｖｉ）架橋結合化学的性質の拡張可能性を含む。

いくつかの態様では、標的ＤＴ架橋は、ここで列挙したＲＳＶＦタンパク質における特定の部位の１つ以上で導入されてもよい。他の態様では、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体内の架橋を作製することができるさらなる位置を同定することができる。いくつかの態様では、ジチロシン結合または架橋は、ＤＴ結合がたとえばそれらの近接近によって形成することになる、または形成することが期待されている、ＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドの構造内の特定の残基対を標的とする。いくつかの態様では、チロシル側鎖は、連結されるアミノ酸残基に既に存在している。いくつかの場合では、自然発生のチロシン残基は、ジチロシン結合形成に必要な対合チロシン残基の一方または両方のいずれかを構成してもよい。しかしながら、他の場合では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、１つ以上のチロシン残基を付加するように、またはチロシン残基を１つ以上の非チロシン残基で置換するように変異または操作されている。かかる変異は、ここで「チロシンへの」変異と称され、ジチロシン架橋／結合を形成することが望ましい部位で導入することができる。いくつかの態様では、本発明は、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体をコードする核酸配列におけるチロシンへの点変異を導入することによって望ましい架橋結合位置でチロシル側鎖が導入された、変異ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。あるいは、いくつかの態様では、ＲＳＶタンパク質、ポリペプチドもしくはタンパク質複合体、またはその部分は、望ましい架橋結合位置でチロシル側鎖を有するチロシン残基またはアミノ酸を含むように合成されてもよい。逆に、いくつかの態様では、本発明は、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体をコードする核酸配列におけるチロシンからの点変異を導入することによってチロシル側鎖が望ましくない架橋結合位置で除去されている、変異ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する、またはＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質、もしくはタンパク質複合体は、架橋結合が望まれない位置でチロシル側鎖を有するチロシン残基またはアミノ酸を除外するように合成されていてもよい。たとえば、チロシル側鎖の少なくとも１つは、別の側鎖、たとえばフェニルアラニン側鎖で置きかえることができる（たとえば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＭａｒｓｈａｌｌＣＰｅｔａｌ．米国特許出願第０９／８３７，２３５号を参照されたい）。したがって、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、「チロシンへの」または「チロシンからの」点変異を含んでもよい。かかる変異は、当技術分野で既知の任意の適した変異誘発方法を使用して、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸配列を改変することによって作製することができる。あるいは、変異ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、当技術分野で既知の任意の他の適した方法によって合成、精製かつ／または産生されてもよい。

いくつかの態様では、本発明は、架橋がその融合前立体構造におけるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を安定化させることになるまたは安定化させてもよい、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体における任意の適した位置での１つ以上のジチロシン架橋の標的導入を企図する。かかる安定化は、たとえば、ＲＳＶＦタンパク質Ｆ１およびＦ２ポリペプチド間または内の相互作用を安定化させる架橋を導入することによってかつ／またはＲＳＶＦタンパク質プロトマー間または内の相互作用を安定化させる架橋を導入することによって、達成されてもよい。いくつかの態様では、ＲＳＶＦタンパク質のＦ１ポリペプチドは、同じプロトマーのＦ２ポリペプチドと架橋している（分子間／プロトマー内結合）。いくつかの態様では、Ｆ１ポリペプチドは、分子内架橋している（たとえば、架橋の両方のチロシンは、同じＦ１ポリペプチド内に位置している）。いくつかの態様では、Ｆ２ポリペプチドは、分子内架橋している（たとえば、架橋の両方のチロシンは、同じＦ１ポリペプチド内に位置している）。いくつかの態様では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質のＦ１ポリペプチドは、隣接するプロトマーのＦ１ポリペプチドと架橋している（プロトマー間結合）。いくつかの態様では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質のＦ１ポリペプチドは、隣接するプロトマーのＦ２ポリペプチドと架橋している（プロトマー間結合）。

ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を作製するおよび分析すること
いくつかの態様では、本発明は、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を作製するための方法を提供する。本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、当技術分野で既知の任意の適した手段によって作製することができる。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、組換え手段によって作製することができる。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体、またはその任意の部分は、化学的合成手段によって作製することができる。たとえば、ここで記載したタンパク質またはタンパク質複合体の部分に相当するペプチドは、ペプチドシンセサイザーの使用によって合成することができる。

組換え生成方法
本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体が組換え手段によって作製される態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体をコードする核酸は、哺乳類細胞および昆虫細胞（たとえば、バキュロウイルス発現系を使用した、ＳＦ９またはＨｉ５細胞）を含むが、これらに限定されない任意の適した細胞型において発現され得る。核酸分子からポリペプチドおよびタンパク質を発現させるための方法は、通例であり、当技術分野で既知であり、当技術分野で既知の任意の適した方法、ベクター、系、および細胞型を使用することができる。たとえば、典型的に、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸配列は、適したプロモーターを含有する適した発現構築物中に配置されることになり、次いでこれは、発現のための細胞に送達されることになる。

キメラ／融合タンパク質およびオリゴマー形成ドメイン
いくつかの態様では、たとえばここで記載したＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の分析および／または単離および／または精製を促進するためにキメラタンパク質／融合タンパク質を生成するために、ここで記載したＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体にキメラドメインを付加することが望ましいことがある。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、リーダー配列、前駆体ポリペプチド配列、分泌シグナル、局在化シグナル、エピトープタグなどを含んでもよい。使用することができるエピトープタグは、ＦＬＡＧタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、赤血球凝集素Ａ（ＨＡ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ルシフェラーゼタグ、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、タンパク質Ａタグ、タンパク質Ｇタグ、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐ）タグなどを含むが、これらに限定されない。

いくつかの態様では、ここで記載したＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の集合を促進するために、および／または前Ｆ立体構造の安定化を促進するために、ならびに／またはＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体の他の構造的特徴を安定化させるために、オリゴマー形成ドメインを付加することが望ましいことがある。いくつかの態様では、オリゴマー形成ドメインは、Ｔ４フォールドンモチーフを含むが、これに限定されない三量体形成モチーフである。Ｈａｂａｚｅｔｔｌｅｔａｌ．，２００９（Ｈａｂａｚｅｔｔｌｅｔａｌ．，２００９．ＮＭＲＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆａＭｏｎｏｍｅｒｉｃＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｏｎｔｈｅＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙＯｐｔｉｍｉｚｅｄＡｓｓｅｍｂｌｙＰａｔｈｗａｙｏｆａＳｍａｌｌＴｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎＤｏｍａｉｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｐｐ．ｎｕｌｌ）、Ｋａｍｍｅｒｅｒｅｔａｌ．，２００５（Ｋａｍｍｅｒｅｒｅｔａｌ．，２００５．Ａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｍｏｔｉｆｃｏｎｔｒｏｌｓｔｈｅｔｏｐｏｌｏｇｙｏｆｓｈｏｒｔｃｏｉｌｅｄｃｏｉｌｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０２（３９）：１３８９１−１３８９６）、Ｉｎｎａｍｏｒａｔｉｅｔａｌ．，２００６（Ｉｎｎａｍｏｒａｔｉｅｔａｌ．，２００６．ＡｎｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｏｌｅｆｏｒｔｈｅＣ１ｑ−ｇｌｏｂｕｌａｒｄｏｍａｉｎ．Ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ１８（６）：７６１−７７０）、およびＳｃｈｅｌｌｉｎｇｅｔａｌ．，２００７（Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇｅｔａｌ．，２００７．Ｔｈｅｒｅｏｖｉｒｕｓ σ−１ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄｓａｎｄｗｉｃｈ：Ａｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｍｏｔｉｆｐｏｉｓｅｄｆｏｒｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｃｈａｎｇｅ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ２８２（１５）：１１５８２−１１５８９）に報告されているものを含むが、これらに限定されないこれらの目的に使用することができる天然タンパク質における種々様々の三量体形成ドメインがある。三量体タンパク質複合体を安定化させることは、ＧＣＮ４およびＴ４フィブリニチン（fibrinitin）モチーフを使用して達成することもできる（Ｐａｎｃｅｒａｅｔａｌ．，２００５．ＳｏｌｕｂｌｅＭｉｍｅｔｉｃｓｏｆＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓＴｙｐｅ１ＶｉｒａｌＳｐｉｋｅｓＰｒｏｄｕｃｅｄｂｙＲｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅＮａｔｉｖｅＴｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎＤｏｍａｉｎｗｉｔｈａＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓＴｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎＭｏｔｉｆ：ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄＬｉｇａｎｄＢｉｎｄｉｎｇＡｎａｌｙｓｉｓ．ＪＶｉｒｏｌ７９（１５）：９９５４−９９６９；Ｇｕｔｈｅｅｔａｌ．，２００４．ＶｅｒｙｆａｓｔｆｏｌｄｉｎｇａｎｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆａｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｆｒｏｍｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＴ４ｆｉｂｒｉｔｉｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖ３３７ｐｐ．９０５−１５；Ｐａｐａｎｉｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕｅｔａｌ．，２００８．Ｃｒｅａｔｉｏｎｏｆｈｙｂｒｉｄｎａｎｏｒｏｄｓｆｒｏｍｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｎａｔｕｒａｌｔｒｉｍｅｒｉｃｆｉｂｒｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｓｕｓｉｎｇｔｈｅｆｉｂｒｉｔｉｎｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｍｏｔｉｆ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ４７４：１５−３３）。本発明のタンパク質のタンパク質間相互作用を安定化させるために、異種性のオリゴマー形成モチーフを当業者に既知の任意の組換え方法によって導入してもよい。

キメラＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、当業者に既知の任意の方法によって作製することができ、たとえば、別のタンパク質または他のタンパク質ドメインもしくはモチーフのアミノ酸配列へのペプチド結合を介してそのアミノまたはカルボキシ末端で連結している、１つまたはいくつかの本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体、ならびに／または任意の断片、誘導体、もしくはそのアナログ（たとえば、少なくとも本発明のポリペプチド、タンパク質、もしくはタンパク質複合体のドメイン、またはその少なくとも６、好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなる）を含んでもよい。いくつかの態様では、かかるキメラタンパク質は、キメラタンパク質（たとえば第２のコード配列にインフレームで連結されている第１のコード配列を含む）をコードする核酸の組換え発現；望ましいアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いに適切なコードフレームにおいてライゲーションすること、およびキメラ産物を発現させることを含むが、これらに限定されない当業者に既知の任意の方法によって生成することができる。

翻訳後修飾
いくつかの態様では、ここで記載したＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、翻訳後修飾を付加することまたは除去することによって、化学的修飾または付加物を付加することまたは除去することによって、および／または当業者に既知の任意の他の修飾を導入することによって改変されてもよい。たとえば、グリコシル化（または脱グリコシル化）、アセチル化（または脱アセチル化）、リン酸化（または脱リン酸化）、アミド化（または脱アミド）、ペグ化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断によって、または当技術分野で既知の任意の他の手段によって翻訳もしくは合成中または後に修飾されるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、本発明の範囲内に含まれる。たとえば、いくつかの態様では、ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、ツニカマイシンなどの存在下でのブロモシアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、代謝的合成による化学的切断に供されてもよい。いくつかの態様では、かかる翻訳後修飾を使用して、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を、より免疫原性、より安定、かつ／または中和および広域中和抗体に結合する能力がよりあるもしくは中和および広域中和抗体の産生を引き出す能力がよりある状態にすることができる。

その前Ｆ立体構造におけるＲＳＶＦを取得すること
いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチドおよび／またはタンパク質は、集合して望ましい立体構造的構造、たとえば前Ｆ立体構造を有するタンパク質複合体を構築し、その立体構造を安定化させるために架橋される。本出願において他で記載したように、ＲＳＶＦタンパク質の前Ｆ立体構造は、３つのプロトマーから形成された三量体を含む。いくつかの態様では、酵素的架橋結合反応の前および／または間に、ＲＳＶＦタンパク質は、たとえば架橋結合が行われる間に、前Ｆ立体構造において取得されてもよい（かつ／または維持されてもよい）。いくつかの態様では、ＲＳＶＦタンパク質は、ＲＳＶＦ分子の大部分または実質的に全てが前Ｆ立体構造において存在するように、産生かつ／または単離されてもよい。いくつかの態様では、前Ｆ立体構造におけるＲＳＶＦ分子は、前Ｆ立体構造にあるいくつかおよび他の立体構造にあるいくつかを含むＲＳＶＦタンパク質分子の混合された集団から分離されてもよい。いくつかの態様では、ＲＳＶＦタンパク質は、細胞において発現され（たとえばその膜結合性または可溶性型として）、自発的に集合してその正常な前Ｆ立体構造を構築する。いくつかの態様では、さらなる安定化は、その前Ｆ型におけるＲＳＶＦタンパク質を保持するために必要ではなくてもよい。いくつかの態様では、発現されたかつ集合した／折り畳まれたＲＳＶＦタンパク質は、前Ｆ立体構造の形成および／または維持を支持する特定の条件下でまたは特定の組成物において保持されてもよい。たとえば、いくつかの態様では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質は、それとの接触がさもなければ後Ｆ立体構造へのスイッチをトリガーする細胞の非存在下で維持されてもよい。ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質は、標準的なタンパク質精製方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、および／またはアフィニティークロマトグラフィー方法を含むが、これらに限定されない当技術分野で既知の任意の適した方法を使用して、前Ｆ立体構造において取得かつ／または単離かつ／または維持されてもよい。いくつかの態様では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質は、抗体、小分子、ペプチド、および／またはペプチド模倣体を含むが、これらに限定されない、ＲＳＶＦタンパク質に結合し、その前Ｆ立体構造においてそれを安定化させる分子の存在下で発現されても、これと共発現されても、またはこれと接触させられてもよい。融合前ＲＳＶＦタンパク質に結合する抗体の非限定的な例は、５Ｃ４、ＡＭ２２、およびＤ２５抗体を含む（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３４２：５９２−５９８を参照されたい）。いくつかの態様では、ＲＳＶＦタンパク質は、タンパク質が存在する培地／緩衝液のイオン強度を制御することによって（たとえば高または低イオン強度培地を使用することによって）、その前Ｆ立体構造において取得、単離、または維持されてもよい。いくつかの態様では、ＲＳＶＦタンパク質は、前Ｆ立体構造の保存を支持する１つ以上の温度で取得、単離、または維持されてもよい。いくつかの態様では、ＲＳＶＦタンパク質は、前Ｆ立体構造が損なわれる程度を減らす期間にわたって、取得、単離、または維持されてもよい。

いくつかの態様では、分析が、望ましい立体構造、たとえば前Ｆ立体構造がＲＳＶＦタンパク質において形成されたかつ／または維持されていることを確認するために行われてもよい。かかる分析は、架橋結合の前に、架橋結合プロセス中に、架橋結合プロセス後に、またはかかる段階の任意の組合せで行われてもよい。かかる分析は、機能分析、結晶学的分析などを含めた、タンパク質またはタンパク質複合体の三次元構造を評価するための当技術分野で既知の任意の適した方法を含んでもよい。いくつかの態様では、かかる分析は、５Ｃ４、ＡＭ２２、およびＤ２５抗体を含むが、これらに限定されない、ここで他で記載したいくつかの抗体、たとえば前Ｆ立体構造に特異的なものおよび／またはφ部位に結合することが既知であるものへのＲＳＶタンパク質の結合を評価することを含んでもよい。

タンパク質精製
いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を作製するための方法は、製造プロセスにおける１つ以上の工程の前、中、または後にＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を精製することを含んでもよい。たとえば、いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、製造工程の全ての完了後に精製されてもよい。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、架橋結合プロセスを開始する前にまたはプロセスにおける中間方法工程の１つ以上の後に、たとえば、ＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質の発現後に、タンパク質複合体の集合後に、その前Ｆ立体構造におけるＲＳＶＦタンパク質を取得した後に、または架橋結合反応中もしくはこれを行った後に精製されてもよい。本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、当技術分野で既知の任意の適した方法を使用して、単離または精製されてもよい。かかる方法は、クロマトグラフィー（たとえばイオン交換、親和性、および／またはサイジングカラムクロマトグラフィー）、硫安塩析、遠心分離、差次的溶解性、またはタンパク質の精製のための当業者に既知の任意の他の技法によるものを含むが、これらに限定されない。特定の態様では、十分に架橋されなかったもの、または前Ｆ立体構造が十分に安定化されなかったものから、本発明の望ましいインフルエンザＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を分離することが必要であってもよい。これは、当技術分野で既知の任意の適した系を使用して行うことができる。たとえば、前Ｆ立体構造におけるＲＳＶタンパク質は、前Ｆまたは後Ｆ特異的抗体を使用する抗体に基づく分離方法を使用して、前Ｆ立体構造ではないものから単離することができる。本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、それらを作製するために使用した任意の供給源から精製されてもよい。たとえば、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、昆虫、原核、真核、単細胞、多細胞、動物、植物、真菌、脊椎動物、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、イヌ、トリ、もしくは組織培養細胞、または任意の他の供給源を含めた供給源から精製されてもよい。純度の程度は、変動してもよいが、様々な態様では、本発明の精製されたＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、それらが最終組成物における総タンパク質の約１０％、２０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％より多くを構成する形で提供される。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、クロマトグラフィー、グリセロール勾配、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない標準的な方法によって、またはタンパク質の精製のための当技術分野で既知の任意の他の標準的な技法によって、他のタンパク質、または任意の他の望ましくない産物（たとえば非架橋または非前ＦＲＳＶＦ）から単離および精製されてもよい。単離されるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、高または低イオン性培地において発現されても、または高もしくは低イオン性緩衝液もしくは溶液において単離されてもよい。本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、望ましい立体構造の保存を支持する１つ以上の温度でも単離されてもよい。それらは、調製物が望ましい立体構造を失う程度を減らす期間にわたっても単離されてもよい。タンパク質の調製物が１つ以上の望ましい立体構造（たとえば前Ｆ立体構造および／または中和抗体への結合、もしくは他の望ましい特性を支持する立体構造）を保持する程度は、たとえば、生化学的、生物物理学的、免疫的、およびウイルス学的分析を含むが、これらに限定されない当技術分野で既知の任意の適した方法によってアッセイされてもよい。かかるアッセイは、たとえば、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、または酵素免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ、結晶学的分析（抗体での共結晶化を含めた）、遠心沈降、分析超遠心分離法、動的光散乱法（ＤＬＳ）、電子顕微鏡法（ＥＭ）、クライオＥＭ断層撮影法、熱量測定法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、円二色性分析、およびＸ線小角散乱分析、中和アッセイ、抗体依存性細胞傷害アッセイ、および／またはｉｎｖｉｖｏウイルス学的負荷研究を含むが、これらに限定されない。

本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の収量は、当技術分野で既知の任意の手段によって、たとえば、出発材料の量と比較して、または生成方法の任意の先行する工程に存在する材料の量と比較して最終の操作されたタンパク質（たとえば架橋された前ＦＲＳＶ）の量を比較することによって、決定することができる。タンパク質濃度は、標準的な手順、たとえば、ＢｒａｄｆｏｒｄまたはＬｏｗｒｉｅタンパク質アッセイによって決定することができる。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイは、還元剤および変性剤に適合する（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ，１９７６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８）。Ｌｏｗｒｙアッセイは、界面活性剤とのより良い適合性を有し、反応は、タンパク質濃度および読み取りに関してより線形である（Ｌｏｗｒｙ，ＯＪ，１９５１．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５）。

例示的な作製方法
いくつかの態様では、本発明は、その融合前立体構造において安定化されたＲＳＶＦタンパク質を生成するための方法であって、（ａ）その前Ｆ立体構造におけるＲＳＶＦタンパク質を取得すること、（ｂ）１つ以上の架橋の導入が前Ｆ立体構造を安定化させる、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の三次および／または四次構造における１つ以上の領域を同定すること、および（ｃ）工程（ｂ）において同定された領域の１つ以上でＲＳＶ融合前Ｆタンパク質中に１つ以上の架橋を導入して、その融合前立体構造においてロックされた操作されたＲＳＶＦタンパク質を形成することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、工程（ｂ）において同定される領域は、ここで記載した特定の領域または特定のアミノ酸残基の１つ以上を含む。いくつかの態様では、架橋は、標的架橋である。いくつかの態様では、架橋は、標的ＤＴ架橋である。いくつかの態様では、架橋は、生理的条件下で安定である。いくつかの態様では、その融合前立体構造において安定化された操作されたＲＳＶＦタンパク質は、ワクチン免疫原として有用である。いくつかの態様では、その融合前立体構造においてロックされた操作されたＲＳＶＦタンパク質は、以下の特性の１つ以上を有する：（ｉ）そのように操作されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して（すなわち架橋の導入を有さないまたは架橋の導入前のＲＳＶＦタンパク質と比較して）、中和抗体に結合する増強された能力、（ｉｉ）そのように操作されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して、広域中和抗体に結合する増強された能力、（ｉｉｉ）そのように操作されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して、Ｂ細胞受容体に結合し、これを活性化する増強された能力、（ｉｖ）そのように操作されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して、動物における抗体応答を引き出す増強された能力、（ｖ）そのように操作されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して、動物における保護抗体応答を引き出す増強された能力、（ｖｉ）そのように操作されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して、動物における中和抗体の産生を引き出す増強された能力、（ｖｉｉ）そのように操作されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して、動物における広域中和抗体の産生を引き出す増強された能力、（ｖｉｉｉ）そのように操作されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して、動物における保護免疫応答を引き出す増強された能力、および（ｉｘ）そのように操作されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して、動物における４要素中和エピトープを認識する抗体に結合し、この産生を引き出す増強された能力。いくつかの態様では、ここで記載したその融合前立体構造において安定化されたＲＳＶＦタンパク質を生成するための方法は、その融合前立体構造において安定化された操作されたＲＳＶＦタンパク質が上記に列挙した特性の１つ以上を有するかどうかを決定するためのアッセイを行うことも含む。

ＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の特性
いくつかの態様では、特にここで記載したように架橋されたものを含めた、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、ある特定の構造的、物理的、機能的、および／または生物学的特性を有する。かかる特性は、以下のものの１つ以上、または以下のものの任意の組合せを含んでもよい：前Ｆ立体構造の存在、ＲＳＶ前Ｆ立体構造の安定性；ＲＳＶ前Ｆ立体構造の改善された安定性（架橋されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して）；ＲＳＶ前Ｆ立体構造の改善された半減期（架橋されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して）；改善された熱安定性（架橋されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して）；延長された有効期間（架橋されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して）；対象の身体内での延長された半減期（架橋されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して）；凝集体を形成することなく溶液中で保管される能力（溶液中で高濃度で存在する場合を含めて）；溶液中での減少した凝集（架橋されていないＲＳＶＦタンパク質と比較して）；抗体への結合；中和抗体への結合；広域中和抗体への結合；前Ｆ特異的抗体への結合；部位φを認識する抗体への結合；立体構造的に特異的な抗体への結合；準安定性エピトープを認識する抗体への結合；Ｄ２５、ＡＭ２２および５Ｃ４からなる群から選択される抗体への結合（その抗体は、そのそれぞれの内容がその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４０，ｐ．１１１３；Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓｅｔａｌ．，２０１０，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，１６，ｐ．１２３；Ｓｐｉｔｓ＆Ｂｅａｕｍｏｎｔ，米国特許出願第１２／６００，９５０号；Ｂｅａｕｍｏｎｔ，Ｂａｋｋｅｒ＆Ｙａｓｕｄａ，米国特許出願第１２／８９８，３２５号において報告されている）；パリビズマブ（シナジス）への結合；中和抗体１０１Ｆへの結合；Ｂ細胞受容体への結合；Ｂ細胞受容体の活性化；動物における抗体応答を引き出すこと；動物における保護抗体応答を引き出すこと；動物における中和抗体の産生を引き出すこと；動物における広域中和抗体の産生を引き出すこと；動物における４要素中和エピトープ（ＱＮＥ）を認識する抗体の産生を引き出すこと；動物における保護免疫応答を引き出すこと；および／または動物における体液性免疫応答を引き出すこと。抗体分子への結合の場合、いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、高特異性でおよび／または高親和性で抗体（たとえば前Ｆ特異的抗体、部位φに結合する抗体、および／またはＤ２５、ＡＭ２２もしくは５Ｃ４）に結合する。

特性に関するアッセイ
いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体、またはそれらの製造における任意の中間体は、それらが望ましい特性、たとえば望ましい構造的、物理的、機能的、および／または生物学的特性−たとえば上記で列挙したまたは本特許明細書において他で同定した特性を有することを確認するために分析されてもよい。たとえば、いくつかの態様では、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏアッセイを行って、ＲＳＶＦタンパク質の立体構造的構造、安定性（たとえば熱安定性）、半減期（たとえば対象の身体内の）、溶液中での凝集、抗体（たとえば中和抗体、広域中和抗体；前Ｆ特異的抗体；部位φを認識する抗体、立体構造的に特異的な抗体、準安定性エピトープを認識する抗体、Ｄ２５、ＡＭ２２、５Ｃ４、１０１Ｆまたはパリビズマブ）への結合、Ｂ細胞受容体への結合、Ｂ細胞受容体の活性化、抗原性、免疫原性、抗体応答を引き出す能力、保護抗体／免疫応答を引き出す能力、中和抗体の産生を引き出す能力、または広域中和抗体の産生を引き出す能力を評価することができる。本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体がｉｎｖｉｖｏで動物において試験される態様では、動物は、哺乳類（たとえばげっ歯類種（たとえばマウスまたはラット）、ウサギ、ケナガイタチ、ブタ種、ウシ種、ウマ種、ヒツジ種、または霊長類種（たとえばヒトまたは非ヒト霊長類）、またはトリ種（たとえばニワトリ）を含むが、これらに限定されない任意の適した動物種であってもよい。

タンパク質の立体構造的構造を評価するためのアッセイは、当技術分野で既知であり、結晶学的分析（たとえばＸ線結晶解析または電子結晶解析）、遠心沈降分析、分析超遠心分離法、電子顕微鏡法（ＥＭ）、クライオ電子顕微鏡法（クライオＥＭ）、クライオＥＭ断層撮影法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、Ｘ線小角散乱分析、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイなどを含むが、これらに限定されない任意の適したアッセイを使用することができる。

タンパク質の安定性を評価するためのアッセイは、当技術分野で既知であり、変性および非変性電気泳動、等温滴定熱量測定法、および変動するタンパク質濃度、温度、ｐＨまたはレドックス条件でタンパク質がインキュベートされ、経時的に分析される時間経過実験を含むが、これらに限定されない任意の適したアッセイを使用することができる。タンパク質は、タンパク質分解への感受性に関しても分析されてもよい。

抗体へのタンパク質の結合を評価するためのアッセイは、当技術分野で既知であり、免疫沈降アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、結晶学的アッセイ（抗体での共結晶化を含めて）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイなどを含むが、これらに限定されない任意の適したアッセイを使用することができる。

中和活性を評価するためのアッセイは、当技術分野で既知であり、任意の適したアッセイを使用することができる。たとえば、アッセイを行って、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体による動物に対するワクチン接種／免疫化によって産出された抗体または抗血清の中和活性を決定することができる。当技術分野で既知の中和アッセイは、Ｄｅｙｅｔａｌ．２００７（Ｄｅｙｅｔａｌ．，２００７，ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓＴｙｐｅ１ＭｏｎｏｍｅｒｉｃａｎｄＴｒｉｍｅｒｉｃｇｐ１２０ＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓＳｔａｂｉｌｉｚｅｄｉｎｔｈｅＣＤ４−ＢｏｕｎｄＳｔａｔｅ：Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ａｎｄＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．ＪＶｉｒｏｌ８１（１１）：５５７９−５５９３）およびＢｅｄｄｏｗｓｅｔａｌ．，２００６（Ｂｅｄｄｏｗｓｅｔａｌ．，２００７，Ａｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｓｔｕｄｙｉｎｒａｂｂｉｔｓｏｆｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙｃｌｅａｖｅｄ，ｓｏｌｕｂｌｅｔｒｉｍｅｒｉｃｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１ｇｐ１４０，ｔｒｉｍｅｒｉｃｃｌｅａｖａｇｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅｇｐ１４０ａｎｄｍｏｍｏｍｅｒｉｃｇｐ１２０．Ｖｉｒｏｌ３６０：３２９−３４０）によって報告されたものを含むが、これらに限定されない。

ワクチン免疫原が免疫応答を引き出すかつ／または保護免疫を明らかにする能力があるかどうかを評価するためのアッセイは、当技術分野で既知であり、任意の適したアッセイを使用することができる。たとえば、アッセイを行って、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体による動物に対するワクチン接種／免疫化がＲＳＶの感染に対する免疫応答および／または保護免疫を提供するかどうかを決定することができる。いくつかの態様では、比較は、感染または抗体陽転またはウイルス負荷のそれらの割合に関してプラセボと試験ワクチン接種群間で行われてもよい。

タンパク質の薬物動態および体内分布を評価するためのアッセイも当技術分野で既知であり、任意の適したアッセイを使用して、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のこれらの特性を評価することができる。

組成物
いくつかの態様では、本発明は、ここで記載したＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のいずれかを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、かかる組成物は、免疫原性組成物、ワクチン組成物および／または治療的組成物であってもよい。いくつかの態様では、かかる組成物は、対象に投与してもよい。

いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、１つ以上のさらなる活性成分、たとえば１つ以上のさらなるワクチン免疫原または治療薬を含む組成物で提供されてもよい。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、薬学的に許容される担体、アジュバント、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、および／または組成物の意図された使用に適した任意の他の成分を含むが、これらに限定されない１つ以上の他の成分を含む組成物で提供されてもよい。かかる組成物は、溶液、懸濁液、エマルションなどの形をとることができる。「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体がそれらの中でまたはそれらとともに提供され得る様々な希釈液、賦形剤および／またはビヒクルを含む。「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒトおよび／または他の動物対象への送達に安全であることが既知である、および／または連邦または州政府の規制当局によって承認された、ならびに／または米国薬局方および／もしくは他の一般に認識された薬局方に列挙された、ならびに／またはヒトおよび／もしくは他の動物における使用に関して１つ以上の一般に認識された規制当局から特定のまたは個々の承認を受けている担体を含むが、これらに限定されない。かかる薬学的に許容される担体は、水、水溶液（たとえば生理食塩水、緩衝液など）、有機溶媒（たとえば石油、動物、野菜または合成的起源のもの、たとえばピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油を含めた、ある特定のアルコールおよび油）などを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、本発明の組成物は、１つ以上のアジュバントも含む。例示的なアジュバントは、無機または有機アジュバント、油に基づくアジュバント、ビロソーム、リポソーム、リポ多糖（ＬＰＳ）、抗原に関する分子ケージ（たとえば免疫刺激複合体（「ＩＳＣＯＭＳ」））、流入領域リンパ節に輸送される安定なケージ様構造を形成するＡｇ修飾サポニン／コレステロールミセル）、細菌細胞壁の成分、飲食された核酸（たとえば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド含有ＤＮＡ）、ＡＵＭ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、およびスクアレンを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ビロソームがアジュバントとして使用される。本発明に従って使用することができるさらなる市販のアジュバントは、Ｒｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ、２％スクアレン中の解毒されたエンドトキシン（ＭＰＬ）およびマイコバクテリア細胞壁成分を含有する水中油型エマルション（ＳｉｇｍａＭ６５３６））、ＴｉｔｅｒＭａｘ（安定な、代謝可能な油中水型アジュバント（ＣｙｔＲｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ１５０ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰａｒｋｗａｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰａｒｋ／ＡｔｌａｎｔａＮｏｒｃｒｏｓｓ，Ｇｅｏｒｇｉａ３００９２））、Ｓｙｎｔｅｘアジュバント製剤（ＳＡＦ、Ｔｗｅｅｎ８０およびプルロニックポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロックコポリマーＬ１２１によって安定化された水中油型エマルション（ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ））、フロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュバント、ＡＬＵＭ−水酸化アルミニウム、Ａｌ（ＯＨ）３（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ，ＡｃｃｕｒａｔｅＣｈｅｍｉｃａｌ＆ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹとして入手可能）、ＳｕｐｅｒＣａｒｒｉｅｒ（ＳｙｎｔｅｘＲｅｓｅａｒｃｈ３４０１ＨｉｌｌｖｉｅｗＡｖｅ．Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１０８５０ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）、Ｅｌｖａｘ４０Ｗ１，２（エチレン酢酸ビニルコポリマー（ＤｕＰｏｎｔＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））、抗原と共に共沈したＬ−チロシン（多くの化学メーカーから入手可能）；Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（マニド−オレイン酸、ＩＳＡＳｅｐｐｉｃＦａｉｒｆｉｅｌｄ，ＮＪ））、ＡｄｊｕＰｒｉｍｅ（炭水化物ポリマー）、ニトロセルロース吸収タンパク質、Ｇｅｒｂｕアジュバント（Ｃ−ＣＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｏｗａｙ，ＣＡ）などを含むが、これらに限定されない。

いくつかの態様では、本発明の組成物は、「有効量」の本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を含む。「有効量」は、望ましい最終結果を達成するために必要な量である。望ましい最終結果の例は、体液性免疫応答の産出、中和抗体応答の産出、広域中和抗体応答の産出、および保護免疫の産出を含むが、これらに限定されない。望ましい最終結果を達成するために有効である、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の量は、保護またはいくつかの他の治療効果が探求されるＲＳＶウイルスの型、サブタイプ、および株、意図された対象の種（たとえばヒトであろうといくつかの他の動物種であろうと）、意図された対象の年齢および／または性別、計画された投与ルート、計画された投与レジメン、任意の進行中のインフルエンザ感染の重篤度（たとえば治療的使用の場合）などを含むが、これらに限定されない様々な因子に依存することになる。有効量−有効量の範囲であってもよい−は、いかなる過度の実験も有さない標準的な技法によって、たとえば意図された対象種または任意の適した動物モデル種におけるｉｎｖｉｔｒｏアッセイおよび／またはｉｎｖｉｖｏアッセイを使用して決定することができる。適したアッセイは、ｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎｖｉｖｏモデル系由来の用量応答曲線および／または他のデータからの外挿を伴うものを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、有効量は、特定の状況に基づいて医学または獣医学の従事者の判断に従って決定されてもよい。

本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体の使用
いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、研究ツールとして、診断用ツールとして、治療薬として、抗体試薬もしくは治療用抗体の作製のための標的として、および／またはワクチンもしくはワクチン組成物の成分として有用であってもよい。たとえば、いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、動物対象、たとえばヒトを含めた哺乳類対象におけるワクチン免疫原として有用である。本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体のこれらのおよび他の使用は、以下でより完全に記載されている。当業者は、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体がいろいろな他の適用にも有用であってもよく、全てのかかる適用および使用が本発明の範囲内にあることが意図されていることを理解することになる。

ＲＳＶＦ抗体を研究するためのツール
一態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、たとえばＥＬＩＳＡアッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ／ＳＰＲ結合アッセイ、および／または当技術分野で既知の抗体結合に関する任意の他のアッセイにおいて、抗ＲＳＶＦ抗体の結合および／または力価をアッセイするかつ／または測定するための分析物として有用であってもよい。たとえば、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、抗ＲＳＶＦ抗体の有効性を分析するかつ／または比較するために使用される。

抗体の産出のためのツール
本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、治療用抗体および／または研究ツールとして使用することができる抗体の産出にまたは任意の他の望ましい使用にも有用であってもよい。たとえば、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、研究ツールとしておよび／または治療学としての使用のためのＲＳＶＦタンパク質に対する抗体を取得するための免疫化に使用することができる。いくつかの態様では、抗体を産出するために、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を使用して、非ヒト動物、たとえばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、非ヒト霊長類などを含むが、これらに限定されない脊椎動物を免疫化することができる。次いで、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよいかかる抗体および／またはかかる抗体を産生する細胞は、動物から取得することができる。たとえば、いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を使用して、マウスを免疫化してもならびにモノクローナル抗体、および／またはかかるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製かつ取得してもよい。かかる方法は、ハイブリドーマ産生のための標準的な方法を含めたマウスモノクローナル抗体の産生のための当技術分野で既知の標準的な方法を使用して行うことができる。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、たとえば、ＣＤＲ移植方法、ファージディスプレイ方法、トランスジェニックマウス方法（たとえば完全なヒト抗体の産生を可能にするために遺伝子改変されたマウス、たとえばＸｅｎｏｍｏｕｓｅを使用する）および／または当技術分野で既知の任意の他の適した方法を含むが、これらに限定されない、キメラ、ヒト化および完全なヒト抗体の産生のための現在当技術分野で既知の方法のいずれかを使用して、キメラ（たとえば部分ヒト）、ヒト化、または完全なヒト抗体の産生に使用してもよい。かかる系を使用して作製された、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体に対する抗体は、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体自体を好ましくは含むいくつかの抗原の１つまたはセットを使用して、抗原性に特徴付けることができる。かかる抗体のさらなる特徴付けは、ＥＬＩＳＡに基づく方法、ＳＰＲに基づく方法、生化学的方法（たとえば、これらに限定されないが、等電点決定）、ならびにたとえば前臨床および臨床研究における抗体の体内分布、安全性、および有効性を研究するための当技術分野で既知の方法を含むが、これらに限定されない当業者に既知の任意の標準的な方法によって行ってもよい。

対象への投与
いくつかの態様では、本発明は、対象に本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体（またはかかるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体を含む組成物）を投与することを含む方法を提供する。かかる方法は、ＲＳＶを有する個体を治療するための方法（すなわち治療方法）および／またはさらなるＲＳＶ感染から個体を保護するための方法（すなわち予防的方法）を含んでもよい。

本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体、またはかかるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体を含む組成物を投与することができる対象（たとえば治療の方法またはワクチン接種の方法の過程で）は、特に、ＲＳＶ感染に感受性であるまたはＲＳＶ感染の研究のためのモデル動物系を提供することができるものを含めた任意のおよび全ての動物種を含む。いくつかの態様では、対象は、哺乳類種である。いくつかの態様では、対象は、トリ種である。哺乳類対象は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、ウサギ、およびケナガイタチを含むが、これらに限定されない。トリ対象は、ニワトリ、たとえば養鶏場にいるものを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体、またはかかるＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体を含む組成物を投与する対象は、ＲＳＶを有するかまたはＲＳＶ感染のリスクがあるかのいずれかである。いくつかの態様では、対象は、免疫無防備状態である。いくつかの態様では、対象は、心疾患または障害を有する。いくつかの態様では、対象は、年齢が約５０歳を超える、年齢が約５５を超える、年齢が約６０歳を超える、年齢が約６５歳を超える、年齢が約７０を超える、年齢が約７５歳を超える、年齢が約８０歳を超える、年齢が約８５歳を超える、または年齢が約９０歳を超えるヒトである。いくつかの態様では、対象は、年齢が約１ヶ月未満、年齢が約２ヶ月未満、年齢が約３ヶ月未満、年齢が約４ヶ月未満、年齢が約５ヶ月未満、年齢が約６ヶ月未満、年齢が約７ヶ月未満、年齢が約８ヶ月未満、年齢が約９ヶ月未満、年齢が約１０ヶ月未満、年齢が約１１ヶ月未満、年齢が約１２ヶ月未満、年齢が約１３ヶ月未満、年齢が約１４ヶ月未満、年齢が約１５ヶ月未満、年齢が約１６ヶ月未満、年齢が約１７ヶ月未満、年齢が約１８ヶ月未満、年齢が約１９ヶ月未満、年齢が約２０ヶ月未満、年齢が約２１ヶ月未満、年齢が約２２ヶ月未満、年齢が約２３ヶ月未満、または年齢が約２４ヶ月未満のヒトである。

様々な送達系が当技術分野で既知であり、任意の適した送達系を使用して、対象に本発明の組成物を投与することができる。かかる送達系は、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口送達系を含むが、これらに限定されない。本発明の組成物は、任意の便利な経路によって、たとえば注入またはボーラス注入によって、上皮または粘膜皮膚裏打ち（mucocutaneous lining）（たとえば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通した吸収によって投与してもよく、他の生物活性薬剤と一緒に投与してもよい。投与は、全身的または局所的とすることができる。肺投与も、たとえば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤（aerosolizing agent）を有する製剤の使用によって用いることができる。

いくつかの態様では、本発明の医薬組成物をＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドが望ましい結果の産出において最も効果的であり得る組織に局所的に投与することが望ましいことがある。これは、たとえば、カテーテルを使用した局所的注入、注射、送達によって、あるいは移植片、たとえば多孔性、非多孔性、もしくはゼラチン質の移植片またはそこからもしくはそこを通してタンパク質もしくはタンパク質複合体が局所的に遊離されてもよい１つ以上の膜（たとえばシアラスティック膜（sialastic membrane））もしくは繊維を含む移植片を用いて達成されてもよい。いくつかの態様では、徐放系を使用してもよい。いくつかの態様では、ポンプを使用してもよい（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７．ＣＲＣＣｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄｅｔａｌ．，１９８０．Ｓｕｒｇｅｒｙ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋｅｔａｌ．，１９８９．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照されたい）。いくつかの態様では、高分子材料を使用して、本発明のＲＳＶ融合前Ｆタンパク質の放出を促進かつ／または制御してもよい（ＭｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒａｎｄＷｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４．ＣＲＣＰｒｅｓ．，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ；ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇＢｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，１９８４．ＤｒｕｇＰｒｏｄｕｃｔＤｅｓｉｇｎａｎｄＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎａｎｄＢａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｒａｎｇｅｒ＆Ｐｅｐｐａｓ，１９８３Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい；Ｌｅｖｙｅｔａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇｅｔａｌ．，１９８９．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄｅｔａｌ．，１９８９．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ７１：１０５も参照されたい）。いくつかの態様では、徐放系は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質またはポリペプチドが送達されることになる組織／器官の近くに置くことができる（たとえば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４．ＭｅｄｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２：１１５１３８を参照されたい）。本発明と共に使用してもよいいくつかの適した徐放系が、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ；ｖｏｌ．２４９：ｐｐ．５２７−１５３３に報告されている。

いくつかの態様では、本発明の組成物の投与は、１つ以上の免疫賦活剤の投与と共に行うことができる。かかる免疫賦活剤の非限定的な例は、免疫賦活性、免疫増強、および炎症促進性活性を有する、様々なサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン、たとえばインターロイキン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；増殖因子（たとえば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＣＳＦ））；および他の免疫賦活剤、たとえばマクロファージ（ＧＭ）炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２を含む。免疫賦活剤は、ＲＳＶＦタンパク質またはポリペプチドと同じ製剤で投与することができる、または別々に投与することができる。

いくつかの態様では、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体、またはそれらを含む組成物は、いろいろな異なるＲＳＶワクチン接種方法またはレジメンで対象に投与することができる。いくつかのかかる態様では、単回用量の投与が好ましい。しかしながら、他の態様では、さらなる用量を同じまたは異なる経路によって投与して、望ましい予防的効果を達成することができる。新生児および乳幼児では、たとえば、複数の投与が免疫の十分なレベルを引き出すために必要とされ得る。投与は、ＲＳＶ感染に対する保護の十分なレベルを維持するために必要に応じて、小児期を通して間隔を置いて継続することができる。同様に、ＲＳＶ感染に特に感受性である成人、たとえば、高齢者および免疫無防備状態の個体は、保護免疫応答を樹立するかつ／または維持するために複数の免疫化を必要とし得る。誘導された免疫のレベルは、たとえば、中和分泌および血清抗体の量を測定することによってモニターすることができ、保護の望ましいレベルを引き出すかつ維持するために必要に応じて、用量を調節するまたはワクチン接種を繰り返すことができる。

いくつかの態様では、投与レジメンは、単回の投与／免疫化を含んでもよい。他の態様では、投与レジメンは、多回の投与／免疫化を含んでもよい。たとえば、ワクチンは、一次免疫化、続いて１回以上のブースターとして与えてもよい。本発明のいくつかの態様では、かかる「プライムブースト」ワクチン接種レジメンを使用してもよい。たとえば、いくつかのかかるプライムブーストレジメンでは、ここで記載したＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物は、個体に時間的に離れている複数の機会（たとえば２、３、またはさらにそれを超える機会）で投与してもよく、第１の投与が「プライミング」投与であり、その後の投与が「ブースター」投与である。他のかかるプライムブーストレジメンでは、ここで記載したＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物は、ここで記載したＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物の１つ以上のその後の「ブースター」投与と共に、「プライミング」投与としての個体へのＲＳＶポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体をコードするウイルスまたはＤＮＡベクターを含む組成物の第一の投与後に個体に投与してもよい。ブースターは、一次免疫と同じおよび／または異なる経路を通して送達してもよい。ブースターは、一次免疫または以前に投与されたブースター後のある期間後に一般に投与する。たとえば、ブースターは、一次免疫後約２週間以上で与えることができる、かつ／または第２のブースターは、第１のブースター後約２週間以上で与えることができる。ブースターは、対象の生涯の全体を通してある期間、たとえば、約２週間以上で繰り返し与えてもよい。ブースターは、一次免疫後または以前のブースター後、一定間隔で、たとえば、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１年、約１．５年、約２年、約２．５年、約３年、約３．５年、約４年、約４．５年、約５年以上で行ってもよい。

好ましい単位用量製剤（unit dosage formulation）は、本発明のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の、用量もしくは単位（たとえば有効量）、またはその適切な画分を含有するものである。かかる成分に加えて、本発明の製剤は、当業者によって通例使用される他の薬剤を含んでもよい。本発明によって提供される医薬組成物は、従来の医薬技法を使用して調製される好ましい単位用量製剤で便利に提示してもよい。かかる技法は、活性成分および医薬担体または賦形剤または他の成分を結合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体と均一にかつ完全に結合させることによって調製される。非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝液、抗菌剤および製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含有してもよい水性および非水性無菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性無菌懸濁液を含む。製剤は、単位用量または複数用量容器、たとえば、密封されたアンプルおよびバイアルで提示してもよく、使用の直前に無菌液体担体、たとえば、注射用水の付加のみを必要とするフリーズドライした（凍結乾燥した）状態で保管してもよい。即時注射溶液および懸濁液は、当業者によって通例使用される、無菌パウダー、顆粒および錠剤から調製してもよい。

キット
本発明は、本発明のＲＳＶポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質複合体、またはかかるポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質複合体を含有する組成物を含むキットをさらに提供する。本発明の方法および組成物の使用を促進するために、ここで記載した成分および／または組成物のいずれか、および実験または治療またはワクチン目的に有用なさらなる成分をキットの形でまとめることができる。典型的に、キットは、上記の成分に加えて、たとえば、成分を使用するための説明書、包装材料、容器、および／または送達デバイスを含むことができるさらなる材料を含有する。

本発明の様々な態様も以下の非限定的な例によってさらに記載されてもよい：
［実施例］
ＲＳＶＦタンパク質変異体Ｅ２２２Ｙ（配列番号１３）、Ｋ２２６Ｙ（配列番号１５）、Ｖ４６９Ｙ（配列番号１６）、Ｎ８８Ｙ／Ｓ２５５Ｙ（配列番号１８）、Ｖ１８５Ｙ／Ｋ４２７Ｙ（配列番号２０）を以下で記載したようにジチロシン結合の導入によって改変されたヒト細胞において発現させた。

発現プラスミド。Ｔ４フィブリチン（fibritin）フォールドン三量体形成モチーフへのＷＴヒトＲＳＶ−Ｆ外部ドメインまたはＤＳ−Ｃ_AV１タンパク質外部ドメインのＣ末端融合物、トロンビン切断部位、６ＸＨｉｓタグ（配列番号４６）、およびｓｔｒｅｐタグをコードするｃＤＮＡを、ヒト発現にコドン最適化し、合成した（Ｇｅｎｅａｒｔ）。ＲＳＶＦタンパク質変異体Ｅ２２２Ｙ（配列番号１３）、Ｋ２２６Ｙ（配列番号１５）、Ｖ４６９Ｙ（配列番号１６）、Ｎ８８Ｙ／Ｓ２５５Ｙ（配列番号１８）、Ｖ１８５Ｙ／Ｋ４２７Ｙ（配列番号２０）をコードするｃＤＮＡも合成した。これらのＤＮＡ配列を、標準的な方法を使用して５’ＢａｍＨＩおよび３’ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を通してｐＣＤＮＡ３．１／ｚｅｏ＋発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした（図３３）。

細胞およびトランスフェクション。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ウシ胎仔血清および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンで補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において増殖させた。細胞を６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に播種し、８０％コンフルエントまで増殖させた（約２４ｈ）。細胞に、１：４比（Ｍ／Ｖ）のＤＮＡ対ポリエチレンイミン（２５ｋＤａ、直鎖状）を使用して、ウェル当たり２μｇの各ＲＳＶ−Ｆ発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション後１６ｈで、培地を除去し、２ｍｌ／ウェルの無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ−２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で置きかえた。細胞を、採取および分析の前に５％ＣＯ₂中で３７℃でさらに４８ｈ〜７２ｈ培養した。

ＥＬＩＳＡによる細胞上清中のＲＳＶ−Ｆの検出。採取後、総ＲＳＶ−Ｆタンパク質を細胞上清からＥＩＡ／ＲＩＡ高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で室温で１ｈ、直接的に捕捉した。その後、タンパク質含有および対照ウェルをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）中の４％脱脂乳で室温で１ｈブロックした。プレートをＰＢＳ−Ｔ（４００μｌ／ウェル）で３×洗浄した。総ＲＳＶ−Ｆを、ＲＳＶ−Ｆの融合前と融合後型の両方を認識する高親和性ヒト抗ｈＲＳＶ抗体（ＰＢＳ中の１００ｎｇ／ｍｌ）を使用して１ｈ検出した。融合前Ｆを部位φを認識する前Ｆ特異的ヒトモノクローナル抗体（ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ）を使用して検出した。ウェルを再びＰＢＳ−Ｔ中で３×洗浄し、その後、ＰＢＳ中の１：５０００希釈でのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）₂（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で室温で１ｈインキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで６×洗浄し、総ＲＳＶ−Ｆを検出し、比色シグナルを作製するために１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して定量化した。比色反応を等体積４Ｎ硫酸の付加によって停止した。最終光学濃度読みをＢｉｏＲａｄＢｅｎｃｈｍａｒｋＰｌｕｓマイクロプレート吸光度分光光度計を使用して４５０ｎｍで得た。各上清に関する２×連続希釈シリーズを使用して、試料間のＲＳＶ−Ｆの相対量の正確な比較を可能にする各試料に関する検出可能なシグナルの線形範囲を決定した（図３５）。

細胞上清におけるジチロシン架橋結合。採取後すぐに、１００μｌのトランスフェクトおよび対照細胞上清を黒、平底、非結合９６ウェルＦＩＡプレートのウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒｂｉｏ−ｏｎｅ）に移した。３００ｎｇのアルトロマイセス・ラモス（Arthromyces ramosus）スペルオキシダーゼを各試料に加えて、架橋した。次いで１μｌの１．２ｍＭＨ₂０₂を１２０μＭＨ₂０₂の最終反応濃度のために対照とＤＴ反応物の両方に加えた。反応を室温で２０分間進行させておき、その後ｐＨ１０での等体積リン酸ナトリウム緩衝液の付加によって反応物をアルカリ化した。ジチロシン特異的蛍光をＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＡｓｃｅｎｔＦＬを使用して３２０ｎｍの励起波長および４０５ｎｍの放射波長で読んだ（図３４）。

トランスフェクション後７２ｈで、上澄みを架橋するか（ＤＴ）または架橋せず、総タンパク質を、ＲＳＶ−Ｆの融合前と融合後型の両方を認識する高親和性ヒト抗ｈＲＳＶ抗体（ＰＢＳ中の１００ｎｇ／ｍｌ）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。図３５Ａを参照されたい。４℃で１６日間の保管後、部位φの提示を部位φを認識する前Ｆ特異的ヒトモノクローナル抗体（ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌ）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。ジチロシン架橋は、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質上の重要なエピトープを安定化させることが発見された。図３５Ｂを参照されたい。

前述の発明を明瞭さおよび理解の目的のためにいくらか詳細に記載したが、形および詳細における様々な変更を本発明の真の範囲から逸脱することなく行うことができることが本開示を読めば当業者には明らかとなる。本発明は、以下の特許請求の範囲の観点からもさらに定義されてもよい。
以下に、本願出願の発明の実施態様を付記する。
［１］
配列番号１（ＲＳＶＡ型）のアミノ酸残基１〜５１３または配列番号３（ＲＳＶＢ型）のアミノ酸残基１〜５１３、と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体であって、前記アミノ酸配列がアミノ酸位置７７、８８、９７、１４７、１５０、１５５、１５９、１８３、１８５、１８７、２２０、２２２、２２３、２２６、２５５、４２７または４６９の１つ以上でのチロシンへの点変異を含むＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［２］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が前Ｆ立体構造に折り畳まれており、少なくとも１つのジチロシン架橋を含み、前記少なくとも１つの架橋の一方または両方のチロシンがチロシンへの点変異から生じ、前記架橋が、アミノ酸位置：１４７および２８６；１９８および２２０；１９８および２２２；１９８および２２３；１９８および２２６；３３および４６９；７７および２２２；８８および２５５；９７および１５９；１８３および４２７；１８５および４２７；８８および２５５；または１８７および４２７に位置している１つ以上の対合チロシンアミノ酸残基間に位置している、［１］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［３］
配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２９、３０、３１または３２の配列のアミノ酸残基１〜５１３を含む、［１］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［４］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が前記前Ｆ立体構造に折り畳む能力がある、［１］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［５］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が１つ以上のシステインへの点変異をさらに含む、［１］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［６］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が１つ以上のキャビティ充填疎水性アミノ酸置換をさらに含む、［１］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［７］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が三量体形成ドメインをさらに含む、［１］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［８］
前記三量体形成ドメインがフォールドンドメインである、［７］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［９］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が対象におけるＲＳＶ特異的抗体の産生を引き出す能力がある、［１］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［１０］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が抗原性部位φを認識する抗体に結合する能力がある、［１］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［１１］
［１］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体をコードする核酸分子。
［１２］
［１］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物。
［１３］
前記組成物がワクチン組成物である、［１２］に記載の組成物。
［１４］
前記組成物がアジュバント、担体、免疫賦活剤、またはその任意の組合せをさらに含む、［１３］に記載の組成物。
［１５］
対象にＲＳＶに対するワクチン接種を施す方法であって、対象に有効量の［１］に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物を投与することを含む方法。
［１６］
前記対象が、年齢が２４ヶ月未満のヒトである、［１５］に記載の方法。
［１７］
前記対象が、年齢が５０歳を超えるヒトである、［１５］に記載の方法。
［１８］
前記投与することが前記組成物の単回用量を投与することを含む、［１５］に記載の方法。
［１９］
前記投与することが、前記組成物の第１の「プライミング」用量および前記組成物の１回以上のその後の「ブースティング」用量を投与することを含む、［１５］に記載の方法。

Claims

配列番号１（ＲＳＶＡ型）のアミノ酸残基１〜５１３または配列番号３（ＲＳＶＢ型）のアミノ酸残基１〜５１３、と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体であって、前記アミノ酸配列が
（ａ）配列番号１または配列番号３の位置２２６に相当するアミノ酸位置にチロシンへの点変異と、（ｂ）配列番号１または配列番号３の位置１９８に相当するアミノ酸位置にあるチロシンと、を含むＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体。
前記ポリペプチドまたはタンパク質複合体が前Ｆ立体構造に折り畳まれており、少なくとも１つのジチロシン架橋を含み、前記少なくとも１つの架橋の一方または両方のチロシンがチロシンへの点変異から生じ、少なくとも１つの架橋は、配列番号１または配列番号３の位置１９８および２２６と同等のアミノ酸位置に設けられる対合チロシンアミノ酸残基間に位置される請求項１に記載のＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体。
配列番号１５のアミノ酸残基１〜５１３を含む、請求項１または請求項２に記載のＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体。
前記ポリペプチドまたはタンパク質複合体が前記前Ｆ立体構造に折り畳む能力がある、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体。
前記ポリペプチドまたはタンパク質複合体が１つ以上のシステインへの点変異をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体。
前記ポリペプチドまたはタンパク質複合体が１つ以上のキャビティ充填疎水性アミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体。
前記ポリペプチドまたはタンパク質複合体が三量体形成ドメインをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体。
前記三量体形成ドメインがフォールドンドメインである、請求項７に記載のＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体。
前記ポリペプチドまたはタンパク質複合体が対象におけるＲＳＶ特異的抗体の産生を引き出す能力がある、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体。
前記ポリペプチドまたはタンパク質複合体が抗原性部位φを認識する抗体に結合する能力がある、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体。
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体をコードする核酸分子。
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＳＶＦポリペプチド、タンパク質複合体、または請求項１１に記載の核酸分子を含む組成物。
前記組成物がワクチン組成物である、請求項１２に記載の組成物。
前記組成物がアジュバント、担体、免疫賦活剤、またはその任意の組合せをさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
対象にＲＳＶに対するワクチンとして使用するための組成物であって、対象に有効量の請求項１に記載のＲＳＶＦポリペプチドまたはタンパク質複合体を含む組成物。
前記対象が、年齢が２４ヶ月未満のヒトである、請求項１５に記載の組成物。
前記対象が、年齢が５０歳を超えるヒトである、請求項１５に記載の組成物。
前記使用することが前記組成物の単回用量を投与することを含む、請求項１５に記載の組成物。
前記使用することが、前記組成物の第１の「プライミング」用量および前記組成物の１回以上のその後の「ブースティング」用量を投与することを含む、請求項１５に記載の組成物。