ES2773309T3 - Proteínas F de pre-fusión de VRS estabilizadas conformacionalmente - Google Patents

Abstract

Polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS que comprende: (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con los residuos de aminoácidos 1-513 de SEQ ID NO.1 (VRS tipo A) o residuos de aminoácidos 1-513 de SEQ ID NO.3 (VRS tipo B), en el que la secuencia de aminoácidos comprende una mutación puntual a tirosina en una posición de aminoácidos equivalente a la posición 226 en SEQ ID NO.1 o SEQ ID NO.3 y una tirosina en una posición de aminoácidos equivalente a la posición 198 en SEQ ID NO.1 o SEQ ID NO.3, y (b) un dominio de trimerización, en el que el polipéptido, proteína o complejo proteico es capaz de plegarse en la conformación de pre-F.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas F de pre-fusión de VRS estabilizadas conformacionalmente

Antecedentes de la invención

Cada año, el virus respiratorio sincitial (VRS) infecta a 4-5 millones de niños en los Estados Unidos, y es la causa principal de hospitalizaciones infantiles (-150.000 hospitalizaciones). A nivel mundial, representa el 6,7% de las muertes en lactantes menores de 1 año, en segundo lugar solo después de la malaria. Además, representa una grave amenaza para otros grupos de alto riesgo, incluyendo ancianos y sujetos inmunodeprimidos, donde da como resultado aproximadamente 180.000 hospitalizaciones adicionales y 12.000 muertes en los Estados Unidos. No existen tratamientos de primera línea actuales para VRS, y el único tratamiento profiláctico aprobado actualmente para VRS es la administración pasiva del anticuerpo monoclonal autorizado Synagis (palivizumab), que reconoce la proteína de fusión (F) de VRS, y reduce la incidencia de enfermedad grave en solo -50% . El alto coste de la profilaxis con Synagis limita su uso solo a lactantes prematuros y lactantes menores de 24 meses con cardiopatía congénita. Para una revisión, véase Costello et al., “Targeting RSV with Vaccines and Small Molecule Drugs, Infectious Disorders”, Drug Targets, 2012, vol. 12, núm. 2. El desarrollo de una vacuna contra VRS más eficaz e, idealmente, más rentable sería de enorme valor. La evidencia clínica de que los anticuerpos específicos de proteína F de VRS pueden proteger contra la enfermedad ha llevado a un esfuerzo concertado para identificar anticuerpos monoclonales adicionales y mejores, y para desarrollar una vacuna protectora para hacer frente a esta importante necesidad médica insatisfecha.

Breve sumario de la invención

A continuación se resumen algunos aspectos de la presente invención. Se describen aspectos adicionales en la descripción detallada de la invención, los ejemplos, las figuras y las reivindicaciones en el presente documento.

Se sabe que la proteína F de VRS induce potentes anticuerpos neutralizantes que se correlacionan con la protección contra VRS. Recientemente se ha demostrado que la conformación de pre-fusión del trímero de proteína F de VRS (que puede denominarse “pre-fusión F” o “pre-F” en el presente documento) es el principal determinante de actividad neutralizante en sueros humanos. Además, los anticuerpos neutralizantes más potentes (nAc) aislados hasta la fecha se unen específicamente solo a la conformación de pre-fusión. Sin embargo, pre-F soluble es altamente inestable y fácilmente pasa a la conformación de post-fusión, limitando su utilidad como inmunógeno de vacuna. Una proteína F de VRS estabilizada en su conformación de pre-fusión (pre-F) podría ser muy valiosa, proporcionando un inmunógeno de vacuna contra VRS candidato. De manera similar, una proteína pre-F de VRS estabilizada de este tipo también podría ser útil para la generación de anticuerpos, tales como anticuerpos de diagnóstico y terapéutico. Recientemente se describió la estructura cristalina de la proteína F de VRS (unida a un potente nAc, D25) en su conformación de pre­ fusión. Véase McLellan et al., 2013, Science, 340, págs. 1113-1117. A partir de este trabajo, los presentes inventores han realizado un extenso análisis de la estructura de la proteína F de VRS y han desarrollado una variedad de estrategias de diseño novedosas y constructos novedosos para estabilizar o “bloquear” la proteína F de VRS en su conformación de pre-F.

En algunas realizaciones la presente invención proporciona polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS, tales como aquellos que pueden estar o están estabilizados o “bloqueados” en una conformación de pre-fusión, por ejemplo, usando reticulaciones dirigidas, tales como reticulaciones de di-tirosina dirigidas. La presente descripción también proporciona métodos para preparar y usar tales polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS.

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona ubicaciones específicas dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína F de VRS en las que, o entre las cuales, pueden realizarse reticulaciones con el fin de estabilizar la proteína F de VRS en su conformación de pre-F. En algunas realizaciones, las reticulaciones son reticulaciones de di-tirosina dirigidas. Cuando se utilizan reticulaciones de di-tirosina, la presente invención proporciona residuos de aminoácidos específicos (o pares de residuos de aminoácidos) que o bien comprenden un residuo de tirosina preexistente o bien pueden estar o están mutados a un residuo de tirosina de manera que pueden realizarse reticulaciones de di-tirosina.

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS aislado que comprende al menos una reticulación de di-tirosina, donde al menos una tirosina de las al menos una reticulaciones de di-tirosina se origina a partir de una mutación puntual a tirosina.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS aislado que tiene al menos aproximadamente el 70% de identidad de secuencia con los residuos de aminoácidos 1-513 de SEQ ID NO. 1 (VRS tipo A) o residuos de aminoácidos 1-513 de SEQ ID NO: 3 (VRS tipo B), en el que el aminoácido comprende una mutación puntual a tirosina en una posición de aminoácidos equivalente a la posición 226 en SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 3 y una tirosina en una posición de aminoácidos equivalente a la posición 198 en SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO.3, y (b) un dominio de trimerización, en el que el polipéptido, proteína o complejo proteico es capaz de plegarse en la conformación de pre-F.

En algunas realizaciones, la descripción proporciona un polipéptido F de VRS aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32, o residuos de aminoácidos 1-513 de las mismas (que comprende el ectodominio F de VRS). En algunas realizaciones, la descripción proporciona una proteína o polipéptido F de VRS aislado que tiene al menos aproximadamente el 75% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32, o residuos de aminoácidos 1-513 de las mismas (que comprende el ectodominio F de VRS). En algunas de estas realizaciones los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS contienen al menos una reticulación de di-tirosina donde al menos un residuo de tirosina de la al menos una reticulación se origina a partir de una mutación puntual a tirosina.

En algunas realizaciones, donde están presentes reticulaciones de di-tirosina, la reticulación de di-tirosina comprende dos residuos de tirosina preexistentes. En algunas realizaciones, la reticulación de di-tirosina comprende una tirosina preexistente reticulada con una tirosina que se origina a partir de una mutación puntual a tirosina. En algunas realizaciones, la reticulación de di-tirosina comprende dos tirosinas que se originan a partir de mutaciones puntuales a tirosina. En algunas realizaciones, la reticulación de di-tirosina comprende un enlace intraprotómero, un enlace interprotómero, un enlace intramolecular, un enlace intermolecular, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la reticulación de di-tirosina comprende un enlace dentro o entre un polipéptido F1 de proteína F de VRS y un polipéptido F2 de proteína F de VRS. En algunas realizaciones, la mutación puntual a tirosina se ubica en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en posiciones de aminoácidos: 77, 88, 97, 147, 150, 155, 159, 183, 185, 187, 220, 222, 223, 226, 255, 427 o 469 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4, o cualquier posición de aminoácidos que corresponda a una de tales posiciones de aminoácidos en otro ectodominio o secuencia de aminoácidos F de VRS de las mismas.

En algunas realizaciones, la descripción proporciona un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS aislado que tiene al menos aproximadamente el 75% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, en el que el polipéptido comprende al menos una reticulación de di-tirosina, en el que una o ambas tirosinas de la reticulación se origina a partir de una mutación puntual a tirosina, y en el que las reticulaciones se ubican entre uno o más residuos de aminoácidos de tirosina emparejados ubicados en posiciones de aminoácidos: 147 y 286; 198 y 220; 198 y 222; 198 y 223; 198 y 226; 33 y 469; 77 y 222; 88 y 255; 97 y 159; 183 y 427; 185 y 427; o 187 y 427. En algunas realizaciones, el polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS comprende más de una reticulación de di-tirosina. En algunas realizaciones, el polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS comprende dos, tres, cuatro, cinco o más reticulaciones de di-tirosina. En algunas realizaciones, el polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS comprende reticulaciones de di-tirosina en residuos de aminoácidos de tirosina emparejados en posiciones de aminoácidos 77 y 222, y 33 y 469.

En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la invención comprenden además una o más reticulaciones adicionales, tales como enlaces disulfuro. En tales realizaciones, al menos una cisteína del uno o más enlaces disulfuro se origina a partir de una mutación puntual a cisteína. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS comprenden además sustituciones de aminoácidos hidrófobos de relleno de cavidades. En tales realizaciones, el dominio de trimerización es un dominio de Foldon.

En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la invención son capaces de provocar una respuesta inmunitaria protectora en un sujeto y/o provocar la producción de anticuerpos neutralizantes específicos de RVS en un sujeto. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la invención comprenden al menos un sitio antigénico capaz de unirse a un anticuerpo neutralizante, por ejemplo, el sitio antigénico 0.

En algunas realizaciones, la invención proporciona composiciones (tales como composiciones farmacéuticas y/o composiciones de vacunas) que comprenden uno o más polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la invención. En algunas realizaciones, tales composiciones comprenden un adyuvante, un portador, un agente inmunoestimulador o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la composición es, o forma parte de, una vacuna para el virus respiratorio sincicial. En algunas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS de la invención para su uso en la vacunación de un sujeto contra VRS. La descripción también proporciona un método que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición que comprende uno o más de los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la invención a un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano de menos de 24 meses de edad o un ser humano de más de 50 años de edad. En algunas realizaciones, la administración comprende una única inmunización. En algunas realizaciones, un método de la descripción comprende además administrar a un sujeto una composición farmacéutica que comprende uno o más polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la invención para tratar o prevenir una infección por VRS en el sujeto. En algunas realizaciones, la descripción proporciona un medicamento para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende uno o más de los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la invención. En algunas realizaciones, el medicamento es una vacuna.

En algunas realizaciones, la descripción proporciona un método para preparar un inmunógeno de vacuna contra VRS, que comprende (a) identificar u obtener un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS en una conformación de pre-fusión; (b) seleccionar una o más regiones en el polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS donde la introducción de una o más reticulaciones (tales como reticulaciones de di-tirosina) podría estabilizar la conformación de pre-fusión; (c) introducir en la proteína F de VRS una o más reticulaciones (tales como reticulaciones de di-tirosina) en una o más de las regiones seleccionadas en la etapa (b) para formar un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS modificado por ingeniería genética; y (d) determinar si el polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS modificado por ingeniería genética tiene una o más propiedades seleccionadas del grupo que consiste en: (i) capacidad potenciada de unión a un anticuerpo neutralizante, (ii) capacidad potenciada de unión a un neutralizador amplio, (iii) capacidad potenciada de unión a y activación de receptores de células B, (iv) capacidad potenciada para provocar una respuesta de anticuerpos en un animal, (v) capacidad potenciada para provocar una respuesta de anticuerpos protectores en un animal, (vi) capacidad potenciada para provocar la producción de anticuerpos neutralizantes en un animal, (vii) capacidad potenciada para provocar la producción de anticuerpos ampliamente neutralizantes en un animal, (viii) capacidad potenciada para provocar una respuesta inmunitaria protectora en un animal, y (ix) capacidad potenciada de unión a y para provocar la producción de anticuerpos que reconocen epítopos neutralizantes cuaternarios en un animal, donde si el polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS modificado por ingeniería genética tiene una o más propiedades i. a ix., el polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS modificado por ingeniería genética es un candidato a inmunógeno de vacuna contra VRS. En algunas de tales realizaciones, la etapa (d) comprende realizar uno o más ensayos para evaluar la capacidad de la proteína F de VRS modificada por ingeniería genética para unirse a un anticuerpo neutralizante, unirse a un anticuerpo ampliamente neutralizante, unirse a y activar receptores de células B para provocar una respuesta de anticuerpos en un animal, provocar una respuesta de anticuerpos protectores en un animal, provocar la producción de anticuerpos neutralizantes en un animal, provocar la producción de anticuerpos ampliamente neutralizantes en un animal, provocar una respuesta inmunitaria protectora en un animal, y/o provocar la producción de anticuerpos que reconocen epítopos neutralizantes cuaternarios en un animal. En algunas realizaciones, en las que se usan reticulaciones de di-tirosina, al menos una tirosina de la una o más reticulaciones de di-tirosina introducidas en la etapa (c) se origina a partir de una mutación puntual a tirosina. En algunas realizaciones, el método además comprende, antes de la etapa (c), introducir en la proteína F de VRS una o más mutaciones puntuales a tirosina en una o más de las regiones seleccionadas en la etapa (b).

Estas y otras realizaciones de la presente invención se describen a lo largo de la presente memoria descriptiva de patente.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A a 1B. Secuencias de aminoácidos de (A) proteína F de VRS soluble de subtipo A de VRS (WT) (SEQ ID NO: 1), y (B) proteína F de VRS de longitud completa de subtipo A de VRS (SEQ ID NO: 2) (n.° de adhesión AHJ60043.1). Los residuos de aminoácidos 1-513 de ambas secuencias son las secuencias centrales de la proteína F de VRS que son comunes a tanto las formas soluble como unida a la membrana (longitud completa). Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO. 1 comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO. 2 comprenden la secuencia de proteína F de VRS endógena que contiene la región transmembrana y la cola citoplasmática.

Figuras 2A a 2B. Secuencias de aminoácidos de (A) proteína F de VRS soluble a partir de subtipo B de VRS (SEQ ID NO: 3), y (B) proteína F de VRS de longitud completa a partir de subtipo B de VRS (SEQ ID NO: 4) (n.° de adhesión AHL84194). Los residuos de aminoácidos 1-513 de ambas secuencias son las secuencias centrales de la proteína F de VRS que son comunes a tanto las formas soluble como unida a la membrana (longitud completa). Las secuencias C-terminales a partir de residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO. 3 comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO. 4 comprenden la secuencia de proteína F de VRS endógena que contiene la región transmembrana y la cola citoplasmática.

Figuras 3A a 3B. Secuencias de aminoácidos de (A) proteína F de VRS modificada de DS-Cav1 soluble (SEQ ID NO: 5), y (B) proteína F de VRS modificada de DS-Cav1 de longitud completa (SEQ ID NO: 6) (McLellan et al. (2013) Science 342:592-598). Los residuos de aminoácidos 1-513 de ambas secuencias son las secuencias centrales de la proteína F de VRS que son comunes a tanto las formas soluble como unida a la membrana (longitud completa). Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO. 5 comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO. 6 comprenden la secuencia de proteína F de VRS endógena que contiene la región transmembrana y la cola citoplasmática.

Figuras 4A a 4B. Secuencias de aminoácidos de (A) proteína F de VRS modificada de Cav1 soluble (SEQ ID NO: 7), y (B) secuencia de proteína F de VRS modificada de Cav1 de longitud completa (SEQ ID NO: 8) (McLellan et al. (2013) Science 342:592-598).). Los residuos de aminoácidos 1-513 de ambas secuencias son las secuencias centrales de la proteína F de VRS que son comunes a tanto las formas soluble como unida a la membrana (longitud completa). Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO 7 comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO. 8 comprenden la secuencia de proteína F de VRS endógena que contiene la región transmembrana y la cola citoplasmática.

Figuras 5A - 5B. Secuencias de aminoácidos de (A) proteína F de VRS modificada de DS soluble (SEQ ID NO: 9), y (B) secuencia de proteína F de VRS modificada de DS de longitud completa (SEQ ID NO: 10) (McLellan et al. (2013) Science 342:592-598).). Los residuos de aminoácidos 1-513 de ambas secuencias son las secuencias centrales de la proteína F de VRS que son comunes a tanto a las formas soluble como unida a la membrana (longitud completa). Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO. 9 comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO. 10 comprenden la secuencia de proteína F de VRS endógena que contiene la región transmembrana y la cola citoplasmática.

Figura 6. Alineación de secuencias de proteínas F de VRS a partir de subtipo A de VRS (SEQ ID NO: 1 , identificada como “VRS F_WT” en la figura) y subtipo B (SEQ ID NO: 4). Los residuos de aminoácidos que aparecen en negrita y subrayados en la secuencia de subtipo A indican sitios que pueden seleccionarse como diana para la reticulación de di-tirosina, ya sea como mutantes simples o dobles. Los sitios equivalentes en el subtipo B también se muestran en los recuadros. Las posiciones designadas seleccionadas como diana para la reticulación de di-tirosina se conservan al 100% entre los subtipos A y B de VRS. Los residuos de aminoácidos 1-513 de ambas secuencias son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO. 1 comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante en SEQ ID NO. 4 comprenden la secuencia de proteína F de VRS endógena que contiene la región transmembrana y la cola citoplasmática.

Figura 7. Alineación de secuencias de proteína F de VRS de DS-Cav1 (SEQ ID NO: 5) y proteínas F de VRS a partir de subtipo A de VRS (SEQ ID NO: 1) y subtipo B (SEQ ID NO: 4). Las secuencias C-terminales mostradas en cursiva en las secuencias de subtipo A de VRS y DS-Cav1 (residuos 514 - 568) contienen el dominio de trimerización Foldon exógeno seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep. La secuencia C-terminal mostrada en negrita y subrayada en la secuencia de subtipo B de VRS (residuos 514 - 574) es la secuencia de proteína F endógena que contiene la región transmembrana y la cola citoplasmática.

Figura 8. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende una mutación a tirosina en la posición 147 (A147Y) (SEQ ID NO: 11). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID No : 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 9. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende un mutación a tirosina en la posición 220 (V220Y) (SEQ ID NO: 12). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID No : 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 10. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende una mutación a tirosina en la posición 222 (E222Y) (SEQ ID NO: 13). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID No : 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 11. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende una mutación a tirosina en la posición 223 (F223Y) (SEQ ID NO: 14). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID No : 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 12. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende una mutación a tirosina en la posición 226 (K226Y) (SEQ ID NO: 15). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID No : 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 13. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende una mutación a tirosina en la posición 469 (V469Y) (SEQ ID NO: 16). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID No : 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 14. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 77 (K77Y) y 222 (E222Y) (SEQ ID NO: 17). Los residuos de aminoácidos 1­ 513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 15. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 88 (N88Y) y 255 (S255Y) (SEQ ID NO: 18). Los residuos de aminoácidos 1­ 513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 16. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 97 (M97Y) y 159 (H159Y) (SEQ ID NO: 19). Los residuos de aminoácidos 1­ 513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 17. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende mutaciones con respecto a tirosina en las posiciones 185 (V185Y) y 427 (K427Y) (SEQ ID NO: 20). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir de residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46), y una etiqueta de estrep.

Figura 18. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 187 (V187Y) y 427 (K427Y) (SEQ ID NO: 21). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 19. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 183 (N183Y) y 427 (K427Y) (SEQ ID NO: 22). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figuras 20A - 20C. Alineación de secuencias de subtipo A de proteína F de VRS soluble (SEQ ID NO: 1) y ejemplos de proteínas F de VRS modificadas derivadas a partir del mismo (SEQ ID NOS:11 - 21) que comprenden mutaciones simples o dobles a tirosina. Las tirosinas en los recuadros se introducen en la secuencia de subtipo A de WT. Cuando dos nuevas tirosinas se introducen en la misma secuencia, están normalmente destinadas a reticularse entre sí. Cuando sólo se introduce una sola tirosina, se espera que la tirosina se reticule normalmente con una tirosina endógena o preexistente en esa secuencia que se muestra en negrita y subrayada. Los residuos de aminoácidos 1­ 513 de cada secuencia son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 21. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (DS-Cav1) que comprende una mutación a tirosina en la posición 147 (A147Y) (SEQ ID NO: 23). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID No : 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 22. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (DS-Cav1) que comprende una mutación a tirosina en la posición 220 (V220Y) (SEQ ID NO: 24). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID No : 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 23. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (DS-Cav1) que comprende una mutación a tirosina en la posición 222 (E222Y) (SEQ ID NO: 25). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 24. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (DS-Cav1) que comprende una mutación a tirosina en la posición 223 (F223Y) (SEQ ID NO: 26). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir de residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de09 trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 25. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (DS-Cav1) que comprende una mutación a tirosina en la posición 226 (K226Y) (SEQ ID NO: 27). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID No : 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 26. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (DS-Cav1) que comprende una mutación a tirosina en la posición 469 (V469Y) (SEQ ID NO: 28). Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID No : 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 27. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 222 (E222Y) y 469 (V469Y) (SEQ ID NO: 29) diseñada para facilitar la formación de múltiples reticulaciones de di-tirosina. Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 28. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (subtipo A) que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 226 (K226Y) y 469 (V469Y) (SEQ ID NO: 30) diseñada para facilitar la formación de múltiples reticulaciones de di-tirosina. Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 29. Secuencia de aminoácidos de una proteína F de VRS soluble modificada (DS-Cav1) que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 222 (E222Y) y 469 (V469Y) (SEQ ID NO: 31) diseñadas para facilitar la formación de múltiples reticulaciones de di-tirosina. Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figura 30. Secuencia de aminoácidos de proteína F de VRS soluble modificada (DS-Cav1) que comprende mutaciones a tirosina en las posiciones 226 (K226Y) y 469 (V469Y) (SEQ ID NO: 32) diseñadas para facilitar la formación de múltiples reticulaciones de di-tirosina. Los residuos de aminoácidos 1-513 son las secuencias centrales de la proteína F de VRS. Las secuencias C-terminales a partir del residuo de aminoácidos 514 en adelante comprenden un dominio de trimerización Foldon seguido de un sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep.

Figuras 31A - 31B. Diagramas de cinta que representan ejemplos de dos posiciones seleccionadas como diana en el trímero de proteína F de prefusión de VRS donde pueden introducirse reticulaciones de di-tirosina intraprotoméricas e intraprotoméricas. (A) Vista lateral (y ampliación) de un enlace de di-tirosina interprotomérico F1-F1 modificado por ingeniería genética entre una tirosina introducida en la posición 185 (V185Y) y una tirosina introducida en la posición 427 (K427Y) (SEQ ID NO: 20). (B) Vista descendente (y ampliación) de un enlace de di-tirosina intraprotomérico F1-F1 modificado por ingeniería genética entre una tirosina endógena en la posición 198 (198Y) y una tirosina introducida en la posición 222 (E222Y) (SEQ ID NO: 13). Los residuos de tirosina seleccionados como diana se representan en recuadros cuadrados.

Figura 32. Alineación de la secuencia de proteína F de tipo A de VRS (SEQ ID NO: 47), y de las estructuras secundarias de prefusión y postfusión. Los cilindros y las flechas debajo de la secuencia representan a-hélices y hebras p, respectivamente. Una “X” debajo de la secuencia de aminoácidos indica dónde está desordenada o falta la estructura. El sombreado gris indica la posición de residuos que se mueven más de 5Á en la transición de la conformación de prefusión a la de postfusión. Los triángulos negros indican sitios de glicosilación ligada a N, el texto y las líneas por encima de la secuencia de aminoácidos indican los sitios antigénicos, y las flechas indican la posición de los sitios de escisión de furina. Figura de McLellan et al., 2013, Science 340:1113-1117, materiales complementarios.

Figura 33. Constructo de ácido nucleico ilustrativo para la expresión de proteína F de VRS en células de mamíferos.

Figura 34. Reticulación de di-tirosina dirigida de la proteína F de VRS. Se transfectaron células HEK 293 con vectores que expresan variantes de VRS-F que permiten reticulaciones de DT intraprotómero F1-F1 (E222Y (SEQ ID NO: 13) y K226Y (SEQ ID NO: 15)), reticulaciones de DT intraprotómero F1-F2 (V469Y (SEQ ID NO: 16) y N88Y-S255Y (SEQ ID NO: 18)) o reticulaciones de DT intermoleculares F1-F1 (V185Y-K427Y (S^e Q ID NO: 20))). Se muestran los valores de intensidad de fluorescencia con el fondo restado. (INT) intensidad, (DT) di-tirosina, (-) y (+) indican antes y después de la aplicación de la tecnología de reticulación de di-tirosina, respectivamente.

Figuras 35A - 35B. La reticulación de di-tirosina estabiliza el epítopo clave en la proteína F de prefusión de VRS. Se transfectaron células HEK 293 con constructos que expresan VRS-F silvestre (WT) o una variante que contiene la sustitución K226Y. (A) 72 h después de la transfección, los sobrenadantes se reticularon (DT) o se dejan sin reticular y la proteína total se midió mediante ELISA usando un anticuerpo humano anti-HRSV de alta afinidad (100 ng/ml en PBS) que reconoce formas de tanto pre- como post-fusión de VRS-F. (B) Tras el almacenamiento a 4 grados C durante 16 días, se midió la presentación del sitio 0 mediante ELISA usando un anticuerpo monoclonal humano específico de preF (2 |ig/ml en PBS) que reconoce el sitio 0.

Figura 36. Alineación de secuencias de secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo A de VRS (SEQ ID NO: 33, identificado como “subtipo A-VRS_F_WT” en la figura) y subtipo B de VRS (SEQ ID No : 34, identificado como “subtipo B_VRS F_WT en la figura). Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana de F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Figura 37. Secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo A de VRS cuyos codones se han optimizado para su expresión en células humanas (SEQ ID NO: 35). Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Figura 38. Secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo A de VRS cuyos codones se han optimizado para su expresión en células de hámster (tales como células CHO) (SEQ ID NO: 36). Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Figura 39. Secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo A de VRS cuyos codones se han optimizado para su expresión en células de insectos (tales como células de insectos SF9) (SEQ ID NO: 37). Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Figura 40. Secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo A de VRS cuyos codones se han optimizado para su expresión en células de ratón (SEQ ID NO: 38). Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Figura 41. Secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo B de VRS cuyos codones se han optimizado para su expresión en células humanas (SEQ ID NO: 39). Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Figura 42. Secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo B de VRS cuyos codones se han optimizado para su expresión en células de hámster (tales como células CHO) (SEQ ID NO: 40). Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Figura 43. Secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo B de VRS cuyos codones se han optimizado para su expresión en células de insectos (tales como células de insectos SF9) (SEQ ID NO: 41). Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Figura 44. Secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo B de VRS cuyos codones se han optimizado para su expresión en células de ratón (SEQ ID NO: 42). Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Figura 45. Secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo A de VRS cuyos codones se han optimizado para su expresión en células humanas y también comprende mutaciones DS-CAV1 (SEQ ID NO: 43). Las mutaciones se muestran en negrita y con recuadros rodeando los codones mutados. Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Figura 46. Secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo A de VRS cuyos codones se han optimizado para su expresión en células humanas y también comprende mutaciones DS (SEQ ID NO: 44). Las mutaciones se muestran en negrita y con recuadros rodeando los codones mutados. Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Figura 47. Secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de VRS (longitud completa, con dominios transmembrana y citoplasmático) a partir del subtipo A de VRS cuyos codones se han optimizado para su expresión en células humanas y también comprende mutaciones CAV1 (SEQ ID NO: 45). Las mutaciones se muestran en negrita y con recuadros rodeando los codones mutados. Los nucleótidos 1-1539 codifican para los residuos de aminoácidos 1-513, que son las secuencias de ectodominio centrales de la proteína F de VRS. Los nucleótidos 1540 en adelante comprenden secuencias que codifican para la región transmembrana F de VRS endógena y la cola citoplasmática.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona, en parte, polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS, tales como los que pueden estar o están estabilizados en una conformación de pre-fusión, proteínas y complejos proteicos, composiciones (tales como composiciones farmacéuticas y composiciones de vacunas) que comprenden tales polipéptidos, proteínas y complejos proteicos. La descripción da a conocer métodos de uso de tales polipéptidos, proteínas y complejos de proteínas, por ejemplo en métodos de vacunación, métodos terapéuticos y otros métodos. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos de VRS pueden ser útiles como inmunógenos conformacionalmente específicos, por ejemplo en vacunas contra VRS.

Definiciones y abreviaturas

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos “alrededor de” y “aproximadamente”, cuando se usan en relación con valores numéricos, significan dentro de o - el 20% del valor indicado.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “proteína” y “polipéptido” se utilizan indistintamente, a menos que se indique lo contrario. Tal como se usa en el presente documento, el término “complejo proteico” se refiere a un conjunto de dos o más proteínas o subunidades proteicas, tal como dos o más monómeros o protómeros. A menos que se indique lo contrario, toda descripción en el presente documento que se refiere a las proteínas se aplica igualmente a los complejos proteicos, y viceversa.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “estabilizado” y “bloqueado” se utilizan indistintamente, por ejemplo en relación con el efecto de reticulación en la estabilización o bloqueo de la proteína F de VRS en su conformación de pre-fusión. Estos términos no requieren un 100% de estabilidad. En su lugar, estos términos indican un grado de estabilidad mejorada o aumentada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cuando el término “estabilizado” se usa en relación con una proteína F de VRS reticulada en su conformación de pre-fusión, el término indica que la conformación de pre-fusión tiene mayor estabilidad de la que hubiera tenido antes o sin tal reticulación. La estabilidad, y la estabilidad relativa, pueden medirse de diversas maneras tal como se describe en otras secciones de esta solicitud, por ejemplo, basándose en la semivida de la conformación de pre-fusión de VRS. La mejora o el aumento de la estabilidad puede ser en cualquier grado útil o significativo para la aplicación prevista. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la estabilidad puede aumentarse alrededor del 10%, 25%, 50%, 100%, 200% (es decir, 2 veces), 300% (es decir, 3 veces), 400% (es decir, 4 veces), 500% (es decir, 5 veces), 1000% (es decir, 10 veces), o más.

Polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS

La proteína de fusión o “F” de VRS es la glicoproteína de la envuelta del virus sincitial respiratorio. La proteína F de VRS puede traducirse como un solo precursor de polipéptido en o bien una forma soluble (sin el dominio transmembrana) o bien unida a la membrana (con el dominio transmembrana). Este polipéptido forma un trímero, que puede, en algunas situaciones, escindirse proteolíticamente por una o más proteasas celulares en sitios de escisión de consenso de furina conservados para producir dos fragmentos unidos por disulfuro conocidos como fragmentos F1 (C-terminal) y F2 (N-terminal). El fragmento F2 incluye aproximadamente los primeros 83 aminoácidos del precursor F de VRS. O bien la proteína de precursor sin escindir, o bien un heterodímero de los fragmentos escindidos F2 y F1, puede formar un protómero F de VRS. Tres de tales protómeros se ensamblan para formar el complejo proteico F de VRS final, que es un homotrímero de tres protómeros.

El trímero de proteína F de VRS media la fusión de membranas virales y celulares. La conformación de pre-fusión del trímero de proteína F de VRS (que puede denominarse en el presente documento “pre-F”) es altamente inestable (metaestable). Sin embargo, una vez que el virus VRS se acopla con la membrana celular, el trímero de proteína F de VRS experimenta una serie de cambios conformacionales y transiciones a una conformación de post-fusión altamente estable (“post-F”). Se sabe que la proteína F de VRS induce potentes anticuerpos neutralizantes (nAc) que se correlacionan con la protección frente a VRS. Por ejemplo, la inmunización con la proteína F de VRS induce nAc que son protectores en seres humanos (por ejemplo, Synagis). Varios epítopos neutralizantes (sitios I, II y IV) están presentes en la forma de post-fusión de la proteína F de VRS. Recientemente, sin embargo, Magro et al. mostraron que la incubación de sueros humanos con la proteína F de VRS en su conformación de post-fusión no pudo agotar la mayor parte de la actividad neutralizante frente a la proteína F, indicando la presencia de sitios antigénicos neutralizantes exclusivos de la conformación de pre-fusión (Magro et al. 2012, PNAS 109 (8): 3089). Por cristalografía de rayos X, se mapearon los epítopos reconocidos por palivizumab (Synagis), motavizumab (Numax) y el del anticuerpo monoclonal 101F descubierto más recientemente (McLellan et al., 2010, J. Virol., 84 (23): 12236 a 441; y McLellan et al., 2010, Nat. Struct. Mol. Biol., 17 de febrero (2): 248-50). Más recientemente, McLellan et al. (Science 340:1113-1117 (2013)) resolvieron la estructura de la proteína F en su conformación de pre-fusión, lo que reveló un epítopo neutralizante novedoso, sitio 0, que sólo se muestra en la conformación de pre-fusión, y al que se unen una serie de anticuerpos, por ejemplo 5C4, que tienen hasta 50 veces más potencia neutralizante que Synagis y Numax. Por consiguiente, hay cada vez más evidencia de que un inmunógeno de vacuna contra VRS en esta conformación de pre-fusión y que muestra el sitio 0 podría provocar una protección efectiva. Sin embargo, hasta la fecha la naturaleza altamente inestable (metaestable) de la conformación de pre-fusión de la proteína F de VRS ha demostrado ser una barrera significativa para el desarrollo de dicha vacuna. Basándose en una comparación de las estructuras F de VRS de pre y post-fusión de McLellan et al. parece haber dos regiones de la proteína F que experimentan grandes cambios conformacionales (>5 A). Estas regiones se encuentran en los extremos N- y C-terminales de la subunidad F1 (residuos 137-216 y 461-513, respectivamente) (véase la figura 32). En la estructura cristalina de la proteína F de VRS mantenida en su conformación de pre-fusión por el anticuerpo D25 unido al epítopo de sitio 0, los residuos F1 C-terminales pueden estabilizarse en la conformación de pre-fusión añadiendo un dominio de trimerización Foldon. Para estabilizar la región de N-terminal de F1, McLellan et al. encontraron que la unión del anticuerpo D25 era suficiente para estudios cristalográficos. Sin embargo, para la producción de un inmunógeno de vacuna se necesitan estrategias de estabilización alternativas, tales como aquellas que no requieren que la proteína F de VRS esté unida a una molécula de anticuerpo grande. Un enfoque alternativo que se ha intentado implicaba la introducción de mutaciones de cisteína emparejadas (para formación de enlaces disulfuro) y mutaciones de relleno de cavidades cerca del extremo N-terminal de F1 (véase la variante de proteína F de VRS de DS-Cav1 descrita en McLellan et al. (2013) Science 342:592-598). Sin embargo, el análisis cristalográfico de tales variantes reveló que la estructura estaba sólo parcialmente en la conformación de pre-fusión. Por consiguiente, se necesita una modificación por ingeniería genética adicional de la proteína F de VRS para lograr un inmunógeno para el desarrollo de vacunas clínicas.

La presente invención proporciona determinados enfoques alternativos para estabilizar la proteína F de VRS en su conformación de pre-fusión, incluyendo proporcionar ubicaciones específicas dentro de la proteína F de VRS que pueden estar o deben estar reticuladas, y proporcionar formas mutantes de la proteína F de VRS que pueden facilitar la formación de tales reticulaciones. Tales reticulaciones y mutaciones pueden utilizarse solas (por ejemplo, en el contexto de una proteína F de VRS silvestre o en el contexto de una proteína F de VRS que no comprende mutaciones artificiales u otras modificaciones artificiales), o pueden utilizarse en combinación con una o más mutaciones, modificaciones, reticulaciones o estrategias de estabilización artificiales. Por tanto, por ejemplo, los enfoques descritos en el presente documento pueden utilizarse conjuntamente con el uso de dominios de trimerización Foldon añadidos, anticuerpos estabilizantes (tales como D25) y/u otras modificaciones o mutaciones parcial o potencialmente estabilizadoras, tales como aquellas en la variante de proteína F de VRS de DS-Cav1 descrita por McLellan et al.

Los presentes inventores han realizado un amplio análisis de la estructura de la proteína F de VRS y han desarrollado una variedad de estrategias de diseño novedosas y polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS novedosos modificados por ingeniería genética. La presente descripción también proporciona métodos para preparar y utilizar tales polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona ubicaciones específicas dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína F de VRS en las que, o entre las cuales, pueden realizarse reticulaciones dirigidas para “bloquear” la proteína F de VRS en su conformación de pre-F. En algunas realizaciones, las reticulaciones dirigidas son reticulaciones de di-tirosina. Cuando se utilizan reticulaciones de di-tirosina, la presente invención proporciona residuos de aminoácidos específicos (o pares de residuos de aminoácidos) que o bien comprenden un residuo de tirosina preexistente o bien pueden estar o están mutados a un residuo de tirosina de manera que pueden realizarse reticulaciones de di-tirosina.

A lo largo de la presente memoria descriptiva de patente, cuando se hace referencia a residuos de aminoácidos específicos o regiones de aminoácidos específicas en la proteína F de VRS haciendo referencia a su número o números de residuo de aminoácidos (tal como los residuos de aminoácidos 77, 88, 97 o 222, por ejemplo), y a menos que se indique lo contrario, la numeración se basa en las secuencias de aminoácidos de VRS proporcionadas en el presente documento en la lista de secuencias y en las figuras (véase, por ejemplo, la figura 6 y s Eq ID NO: 1). Sin embargo, debe indicarse, y un experto en la técnica entenderá, que diferentes secuencias de VRS pueden tener diferentes sistemas de numeración, por ejemplo, si existen residuos de aminoácidos adicionales añadidos o retirados en comparación con SEQ ID NO: 1. Como tal, debe entenderse que cuando se hace referencia a residuos de aminoácidos específicos por su número, la descripción no se limita solo a los aminoácidos ubicados precisamente en esa posición numerada cuando se cuenta desde el comienzo de una secuencia de aminoácidos dada, sino que está previsto el residuo de aminoácidos equivalente/correspondiente en todas y cada una de las secuencias F de VRS, incluso si ese residuo no está en la misma posición numerada precisa, por ejemplo si la secuencia de VRS es más corta o más larga que SEQ ID NO. 1, o tiene inserciones o supresiones en comparación con SEQ ID NO. 1. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente cuál es la posición de aminoácidos correspondiente/equivalente a cualquiera de los residuos numerados específicos mencionados en el presente documento, por ejemplo, alineando una secuencia F de VRS dada con SEQ ID NO. 1 o con una cualquiera de las otras secuencias de aminoácidos F de VRS proporcionadas en el presente documento.

La presente invención proporciona secuencias de aminoácidos de polipéptido y proteína F de VRS, y composiciones que comprenden tales secuencias. Sin embargo, la invención no se limita a las secuencias F de VRS específicas dadas a conocer en el presente documento. En su lugar, la presente invención contempla variaciones, modificaciones y derivados de las secuencias específicas proporcionadas en el presente documento.

En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la presente invención pueden derivarse de (o pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en) las secuencias de aminoácidos de cualquier secuencia de polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS adecuada conocida en la técnica, incluyendo, sin limitación: la secuencia de aminoácidos de subtipo A de VRS (por ejemplo, en forma soluble (SEQ ID NO: 1, o residuos de aminoácidos 1-513 de la misma) o en una forma de longitud completa (SEQ ID NO: 2)); la secuencia de aminoácidos de subtipo B de VRS (por ejemplo, en forma soluble (SEQ ID NO: 3, o residuos de aminoácidos 1-513 de la misma) o en forma de longitud completa (SEQ ID NO: 4)); la secuencia de aminoácidos de DS-Cav1 de variante de VRS (por ejemplo, en forma soluble (SEQ ID NO: 5, o residuos de aminoácidos 1-513 de la misma) o en forma de longitud completa (SEQ ID NO: 6)); la secuencia de aminoácidos de Cav1 de variante de VRS (por ejemplo, en forma soluble (SEQ ID NO: 7, o residuos de aminoácidos 1-513 de la misma) o en forma de longitud completa (SEQ ID NO: 8)); o la secuencia de aminoácidos de DS de variante de VRS (por ejemplo, en forma soluble (SEQ ID NO: 9, o residuos de aminoácidos 1-513 de la misma) o en forma de longitud completa (SEQ ID NO: 10)), o cualquier fragmento de las mismas. En algunas realizaciones, las polipéptidos y proteínas F de VRS de la presente invención pueden derivarse de (o pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en) secuencias de aminoácidos que tienen al menos alrededor del 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquier secuencia F de VRS conocida o secuencias de ectodominio F de VRS (incluyendo pero sin limitarse a residuos de aminoácidos 1-513 de SEQ ID Nos:1 - 10, o SEQ ID Nos:1 - 10), o con secuencias F de VRS de cualquier grupo, subgrupo, familia, subfamilia, tipo, subtipo, género, especie, cepa y/o clado de VRS conocido o cualquier fragmento de las mismas. Debe indicarse que los residuos de aminoácidos 1-513 de las diversas secuencias F de VRS proporcionadas en el presente documento son secuencias de ectodominio F de VRS centrales. Residuos de aminoácidos 514 en adelante en todas las secuencias de este tipo comprenden dominios adicionales que pueden estar presentes en algunas realizaciones pero no en otras. En algunas realizaciones pueden estar presentes variantes de tales dominios adicionales. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos 514 en adelante en todas las secuencias F de VRS solubles proporcionadas en el presente documento comprenden un dominio de trimerización Foldon opcional, sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6x His (SEQ ID NO: 46) y una etiqueta de estrep. En algunas realizaciones estas secuencias adicionales pueden estar ausentes, modificadas, redispuestas o reemplazadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones pueden utilizarse diferentes dominios de trimerización, o pueden utilizarse diferentes etiquetas de epítopo. De manera similar, residuos de aminoácidos 514 en adelante en todas las secuencias F de VRS de “longitud completa” o unidas a la membrana proporcionadas en el presente documento comprenden una región transmembrana de proteína F de VRS opcional y cola citoplasmática. En algunas realizaciones estas secuencias adicionales pueden estar ausentes, modificadas, redispuestas o reemplazadas, por ejemplo con diferentes dominios transmembrana o citoplasmáticos.

En algunas realizaciones la presente descripción proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS que comprenden una o más reticulaciones introducidas artificialmente, donde al menos uno de los siguientes residuos de aminoácidos dentro de los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS está reticulado artificialmente con otro residuo de aminoácidos en la proteína F de VRS: Y33, K77, N88, M97, A147, S150, S155, H159, N183, V185, V187, Y198, V220, E222, F223, K226, S255, Y286, K427 y V469. En algunas de tales realizaciones la reticulación es una reticulación de di-tirosina.

En algunas realizaciones la presente descripción proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS que comprenden una o más reticulaciones introducidas artificialmente, donde tales reticulaciones introducidas artificialmente conectan dos de los siguientes residuos de aminoácidos: Y33, K77, N88, M97, A147, S150, S155, H159, N183, V185, V187, Y198, V220, E222, F223, K226, S255, Y286, K427 y V469. En algunas de tales realizaciones la reticulación es una reticulación de di-tirosina.

En algunas realizaciones la presente descripción proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS en los que los residuos de aminoácidos en uno o más de los siguientes pares de aminoácidos se reticulan entre sí mediante una reticulación introducida artificialmente: 147/286, 198/220, 198/222, 198/223, 198/226, 33/496, 77/222, 88/255, 97/159, 183/427, 185/427 y 187/427. En algunas de tales realizaciones, la reticulación es una reticulación de di-tirosina.

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS que comprenden una reticulación introducida artificialmente entre dos de las siguientes regiones: el extremo N-terminal móvil F1 (residuos 137-216), a2 (residuos 148-160), a3 (residuos 163-173), p3 (residuos 176-182), p4 (residuos 186-195), a4 (residuos 197-211), el extremo C-terminal móvil F1 (residuos 461-513), p22 (residuos 464­ 471), a9 (residuos 474-479), p23 (residuos 486-491) y a10 (residuos 493-514). En algunas de tales realizaciones, la reticulación es una reticulación de di-tirosina.

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS que comprenden una reticulación introducida artificialmente entre dos de las siguientes regiones: residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 67 hasta alrededor de la posición 87, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 78 hasta alrededor de la posición 98, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 87 hasta alrededor de la posición 107, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 137 hasta alrededor de la posición 157, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 140 hasta alrededor de la posición 160, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 145 hasta alrededor de la posición 165, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 149 hasta alrededor de la posición 169, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 173 hasta alrededor de la posición 193, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 175 hasta alrededor de la posición 195, desde alrededor de la posición 177 hasta alrededor de la posición 197, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 188 hasta alrededor de la posición 208, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 210 hasta alrededor de la posición 230, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 212 hasta alrededor de la posición 232, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 213 hasta alrededor de la posición 233, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 216 hasta alrededor de la posición 236, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 245 hasta alrededor de la posición 265, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 276 hasta alrededor de la posición 296, residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 417 hasta alrededor de la posición 437 y residuos de aminoácidos desde alrededor de la posición 459 hasta alrededor de la posición 479. En algunas de tales realizaciones la reticulación es una reticulación de di-tirosina.

En realizaciones en las que los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la descripción comprenden una o más reticulaciones de di-tirosina, pueden introducirse reticulaciones de di-tirosina introducirse entre dos residuos de tirosina endógenos, entre dos residuos de tirosina que se originan a partir de mutaciones “a tirosina” o entre un residuo de tirosina que se origina a partir de una mutación “a tirosina” y un residuo de tirosina endógeno. En algunas realizaciones, se introduce más de una reticulación de di-tirosina en un polipéptido o proteína F de VRS.

En realizaciones en las que los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención comprenden una o más reticulaciones de di-tirosina, los ejemplos no limitativos de posiciones de aminoácidos donde puede introducirse una mutación “a tirosina” incluyen K77, N88, M97, A147, S150, S155, H159, N183, V185, V187, V220, E222, F223, K226, S255, K427 y V469 (véase la figura 6), o cualquier combinación de las mismas.

En realizaciones en las que los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención comprenden una o más reticulaciones de di-tirosina, los ejemplos no limitativos de residuos de tirosina endógenos o preexistentes que pueden utilizarse para formar una reticulación de di-tirosina incluyen Y33, Y198 y Y286 (véase la figura 6), o cualquier combinación de los mismos.

En realizaciones en las que los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la descripción comprenden una o más reticulaciones de di-tirosina, los ejemplos no limitativos de pares de residuos entre los que puede introducirse una reticulación de di-tirosina incluyen 147/286, 198/220, 198/222, 198/223, 198/226, 33/496, 77/222, 88/255, 97/159, 183/427, 185/427 y 187/427, o cualquier combinación de los mismos.

En realizaciones en las que los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la descripción comprenden una o más reticulaciones de di-tirosina, los ejemplos no limitativos de regiones o estructuras secundarias de la proteína F de VRS a partir de la que pueden seleccionarse aminoácidos para substitución de tirosina y/o reticulación de ditirosina incluyen el extremo N-terminal móvil F1 (residuos 137-216), a2 (residuos 148-160), a3 (residuos 163-173), p3 (residuos 176-182), p4 (residuos 186-195), a4 (residuos 197-211), el extremo C-terminal móvil F1 (residuos 461-513), P22 (residuos 464-471), a9 (residuos 474 -479), p23 (residuos 486-491) y a10 (residuos 493-514). Los ejemplos no limitativos de otras regiones de proteína F de VRS a partir de las que pueden seleccionarse uno o más aminoácidos para la sustitución y/o reticulación de tirosina incluyen residuos desde alrededor de la posición 67 hasta alrededor de la posición 87, desde alrededor de la posición 78 hasta alrededor de la posición 98, desde alrededor de la posición 87 hasta alrededor de la posición 107, desde alrededor de la posición 137 hasta alrededor de la posición 157, desde alrededor de la posición 140 hasta alrededor de la posición 160, desde alrededor de la posición 145 hasta alrededor de la posición 165, desde alrededor de la posición 149 hasta alrededor de la posición 169, desde alrededor de la posición 173 hasta alrededor de la posición 193, desde alrededor de la posición 175 hasta alrededor de la posición 195, desde alrededor de la posición 177 hasta alrededor de la posición 197, desde alrededor de la posición 188 hasta alrededor de la posición 208, desde alrededor de la posición 210 hasta alrededor de la posición 230, desde alrededor de la posición 212 hasta alrededor de la posición 232, desde alrededor de la posición 213 hasta alrededor de la posición 233, desde alrededor de la posición 216 hasta alrededor de la posición 236, desde alrededor de la posición 245 hasta alrededor de la posición 265, desde alrededor de la posición 276 hasta alrededor de la posición 296, desde alrededor de la posición 417 hasta alrededor de la posición 437 y desde alrededor de la posición 459 hasta alrededor de la posición 479.

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS que se derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32, o residuos de aminoácidos 1-513 de las mismas, (cada uno de los cuales son mutantes de la secuencia de aminoácidos F de VRS que comprenden una o más mutaciones “a tirosina” para facilitar la reticulación de di-tirosina y para facilitar el “bloqueo” de la proteína F de VRS en su conformación de pre-F), o cualquier fragmento de las mismas, tales como fragmentos que comprenden residuos de aminoácidos 1-513 de las mismas, y/o fragmentos que comprenden los fragmentos F1 o F2 de la proteína F de VRS, o cualquier otro fragmento de la proteína F de VRS que pueden generarse proteolíticamente y/o que pueden ensamblarse o formar parte de una proteína F de VRS funcional. En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS que se derivan de, comprenden, consisten esencialmente en o consisten en, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor del 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad secuencial con SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32, o residuos de aminoácidos 1-513 de las mismas, o cualquier fragmento de las mismas.

Los ejemplos no limitativos de posiciones de aminoácidos en un polipéptido o proteína F de VRS a las que pueden dirigirse las reticulaciones de di-tirosina incluyen Y33 (residuo de Tyr preexistente) y V469Y (sustitución a Tyr), donde se formará una unión intraprotómero F2-F1, las posiciones Y198 (residuo de Tyr preexistente) y E222Y (sustitución a Tyr), donde se formaría una unión intramolecular F1-F1, las posiciones K77Y (sustitución a Tyr) y E222Y (sustitución a Tyr), donde se formaría una unión interprotómero F2-F1, las posiciones N88Y (sustitución a Tyr) y S255Y (sustitución a Tyr), donde se formaría una unión interprotómero F2-F1, las posiciones M97Y (sustitución a Tyr) y H159Y (sustitución a Tyr), donde se formaría una unión interprotómero F2-F1, las posiciones V185Y (sustitución a Tyr) y K427Y (sustitución a Tyr), donde se formaría una unión interprotómero F1-F1, y las posiciones N183Y (sustitución a Tyr) y K427Y (sustitución a Tyr), donde se formaría una unión interprotómero F1-F1. Estas posiciones se identificaron inicialmente por el análisis de la estructura a nivel atómico de la proteína F de prefusión de VRS. Otros ejemplos no limitativos incluyen las posiciones A147Y (sustitución a Tyr) y Y286 (Tyr preexistente), Y198 (residuo de Tyr preexistente) y V220Y (sustitución a Tyr), Y198 (residuo de Tyr preexistente) y F223Y (sustitución a Tyr), Y198 (residuo de Tyr preexistente) y K226Y (sustitución a Tyr), V187Y (sustitución a Tyr) y K427Y (sustitución a Tyr) y N88Y (sustitución a Tyr) y S255Y (sustitución a Tyr). En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos de VRS de la invención comprenden una de las reticulaciones de di-tirosina mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos de VRS de la invención comprenden dos de las reticulaciones de di-tirosina mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos de VRS de la invención comprenden tres de las reticulaciones de di-tirosina mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos de VRS de la descripción comprenden cuatro de las reticulaciones de di-tirosina mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos de VRS de la descripción comprenden cinco o más de las reticulaciones de di-tirosina mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos de VRS de la descripción comprenden cualquier combinación o una o más de las reticulaciones de di-tirosina mencionadas anteriormente.

Los ejemplos no limitativos de proteínas F de VRS diseñadas para tener más de una reticulación de di-tirosina incluyen proteínas F de VRS con dos mutaciones “a tirosina” (E222Y/V469Y), por ejemplo, derivadas a partir del subtipo A (SEQ ID NO: 29) o DS-Cav1 (SEQ ID NO: 31) donde la tirosina sustituida en la posición 222 está diseñada para emparejarse con la tirosina endógena en la posición 198, y la tirosina sustituida en la posición 469 está diseñada para emparejarse con la tirosina endógena en la posición 33, estabilizando de ese modo la proteína F de VRS mediante la formación de dos reticulaciones de di-tirosina; y proteínas F de VRS con dos mutaciones a tirosina (K226Y/V469Y), por ejemplo, derivadas del subtipo A (SEQ ID NO:30) o DS-Cav1 (SEQ ID NO:32) donde la tirosina sustituida en la posición 226 está diseñada para emparejarse con la tirosina endógena en la posición 198, y la tirosina sustituida en la posición 469 está diseñado para emparejarse con la tirosina endógena en la posición 33, estabilizando de ese modo la proteína F por la formación de dos reticulaciones de di-tirosina.

Tal como se describió anteriormente, cada protómero del trímero F de VRS maduro puede escindirse para dar dos cadenas polipeptídicas distintas denominadas F1 y F2 que se asocian de manera no covalente para formar un protómero. Una unión entre un polipéptido F1 y un polipéptido F2 dentro del mismo protómero es un ejemplo de unión intermolecular y unión intraprotómero. La descripción proporciona polipéptidos y proteínas F de VRS a modo de ejemplo que comprenden reticulaciones diseñadas para estabilizar esta interacción, incluyendo, sin limitación, SEQ ID NO:16 (V469Y, donde la tirosina introducida en la posición 469 está diseñada para emparejarse con la tirosina endógena 33), SEQ ID NO:17 (K77Y/E222Y, diseñada para formar un par de di-tirosina entre las tirosinas introducidas), SEQ ID NO:18 (N88Y/S255Y, diseñada para formar un par de di-tirosina entre las tirosinas introducidas), y SEQ ID NO:19 (M97Y/H159Y, diseñada para formar un par de di-tirosina entre las tirosinas introducidas) así como polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS derivados de tales secuencias y que incluyen las mutaciones “a tirosina” específicas presentes en tales secuencias. La descripción también proporciona polipéptidos y proteínas F de VRS a modo de ejemplo que comprenden reticulaciones diseñadas para contener dos protómeros del trímero juntos ^{(unión intermolecular, interprotómero), incluyendo sin limitación, SEQ ID NO:20 (V185Y/K427Y), SEQ ID} No:21 (V187Y/K427Y) SEQ ID ⁿO:22 (N183^y/K427^y), así como polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS derivados de tales secuencias y que incluyen las mutaciones “a tirosina” específicas presentes en tales secuencias. En cada una de estas proteínas, una tirosina introducida en un protómero está diseñada para emparejarse con la otra tirosina introducida en el protómero adyacente. Por ejemplo, en SEQ ID NO:20 (V185Y/K427Y), la tirosina en la posición 185 sobre el “protómero A” formaría una unión de di-tirosina con la tirosina en la posición 427 sobre el “protómero B” (véase la figura 31A).

En algunas realizaciones, el polipéptido F1 de una proteína F de VRS se reticula con el polipéptido F2 del mismo protómero (unión intermolecular/intraprotómero). En algunas realizaciones, el polipéptido F1 se reticula intramolecularmente (por ejemplo, ambas tirosinas de la reticulación se ubican dentro del mismo polipéptido F1). En algunas realizaciones, el polipéptido F2 se reticula intramolecularmente (por ejemplo, ambas tirosinas de la reticulación se ubican dentro del mismo polipéptido F1). En algunas realizaciones, el polipéptido F1 de la proteína F de prefusión de VRS se reticula con el polipéptido F1 de un protómero adyacente (unión interprotómero). En algunas realizaciones, el polipéptido F1 de la proteína F de prefusión de VRS se reticula con el polipéptido F2 de un protómero adyacente (unión interprotómero).

La transición de las estructuras pre-F a post-F implica una redisposición muy significativa de partes de la proteína de VRS, en particular los extremos C y N-terminales de F1, mientras que el resto de proteína se mueve significativamente menos. Con el fin de estabilizar la conformación de pre-F mediante los métodos de esta invención, partes de la proteína que se mueven significativamente (por ejemplo, más de 5Á) pueden unirse a partes de la proteína que se mueven significativamente menos (por ejemplo, menos de 5Á), o bien entre dos residuos de la cadena Fi de un solo protómero, entre dos residuos de la cadena F2 de un solo protómero, entre un residuo de la cadena Fi y un residuo de la cadena F2 dentro del mismo protómero, o bien entre los residuos Fi y/o F2 de dos protómeros adyacentes. Alternativamente, partes de la proteína que se mueven significativamente (por ejemplo, más de 5Á) pueden unirse a otras partes de la proteína que también se mueven significativamente (por ejemplo, más de 5Á), también o bien entre dos residuos de la cadena Fi, entre dos residuos de la cadena F2, entre un residuo de la cadena Fi y un residuo de la cadena F2 de dentro del mismo protómero, o bien entre los residuos Fi y/o F2 de dos protómeros adyacentes. La unión covalente de partes móviles a o bien partes móviles o bien no móviles impide la transición de la estructura de prefusión a o bien estructuras intermedias o bien a la estructura de postfusión.

Las posiciones en F2 que se mueven más de 5Á en la transición de prefusión a postfusión incluyen las posiciones 62 a 76, mientras que las posiciones 26 a 6 i y 77 a 97 se mueven menos de 5Á (y las posiciones 98-i09 aún no se han determinado en la estructura de pre-fusión). Las posiciones en Fi que se mueven más de 5Á en la transición de pre-F a post-F incluyen las posiciones i37 a 2 i6 (extremo N-terminal móvil Fi) y 46i a 5 i3 (extremo C-terminal móvil Fi). El extremo N-terminal móvil F i de la estructura de preF comprende además las estructuras secundarias D2 (posiciones i48 a i60), D3 (posiciones i63 a i73), D3 (posiciones i76 a i82), D4 (posiciones i86 a i95) y D4 (posiciones i97 a 2 i i ) que pueden estar cada una o bien unidas entre sí, o bien a otras partes móviles o no móviles dentro del mismo protómero o entre protómeros del trímero de proteína F (complejo que consiste en tres protómeros). El extremo C-terminal móvil Fi de la estructura de PreF comprende además las estructuras secundarias D22 (posiciones 464 a 47i), □9 (posiciones 474 a 479), DD3 (posiciones 486 a 49 i) y Di0 (posiciones 493 a 5 i4 ) que pueden estar cada una o bien unidas entre sí, o bien a otras partes móviles o no móviles dentro del mismo protómero o entre protómeros del trímero de proteína F. (Véase la figura 32).

En algunas realizaciones (incluyendo todas de las descritas anteriormente, y aquellas que implican polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS que tienen cualquiera de las secuencias de aminoácidos específicas enumeradas en el presente documento, y aquellas que implican variantes o fragmentos de tales polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS que tienen menos del i00% de identidad con la secuencia de aminoácidos específica proporcionada en el presente documento), los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención deben tener una o más propiedades deseadas como ser capaces de ( i) formar la conformación de pre-F, (2) estar “bloqueado” en la conformación de pre-F mediante reticulación, (3) unirse a un anticuerpo específico de pre-F, (4) unirse a un anticuerpo que se une al sitio 0, (5) unirse a un anticuerpo neutralizante, (6) unirse a un anticuerpo

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ampliamente neutralizante, (7) unirse a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en D25, AM22, 5C4, 101F (8) unirse a palivizumab (Synagis), (9) unirse a y/o activar un receptor de células B, (10) provocar una respuesta de anticuerpos en un animal, (11) provocar una respuesta de anticuerpos protectores en un animal, (12) provocar la producción de anticuerpos neutralizantes en un animal, (13) provocar la producción de anticuerpos ampliamente neutralizantes en un animal, (14) provocar la producción de anticuerpos que reconocen epítopos neutralizantes cuaternarios (QNE) en un animal y/o (15) provocar una respuesta inmunitaria protectora en un animal.

A menos que se indique lo contrario, toda descripción en el presente documento que se refiera a polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS específicos, se refiere igualmente a todos los homólogos, ortólogos, análogos, derivados, formas mutantes, fragmentos, quimeras, proteínas de fusión, etc. de los mismos, tales como aquellos que tienen determinadas propiedades o rasgos deseadas (por ejemplo, aquellos que están en la conformación de pre-F, o que son capaces de formar parte de un complejo que tiene la conformación de pre-F deseada, o que tienen propiedades funcionales deseadas, incluyendo, pero sin limitarse a, ser capaces de unirse a, o provocar la producción de, uno o más anticuerpos anti-VRS, tales como anticuerpos que son específicos para la conformación de pre-F de VRS y/o que se unen al sitio 0).

De manera similar, toda descripción en el presente documento que se refiere a polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos específicos, polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos (por ejemplo, aquellos que tienen secuencias de aminoácidos específicos o aquellos de un tipo, subtipo o cepa de VRS específico) se refiere igualmente a otras formas relacionadas de tales polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos que pueden existir en la naturaleza (por ejemplo, en diferentes tipos, subtipos o cepas de VRS) o que están relacionadas con las secuencias específicas proporcionadas en el presente documento pero se han alterado artificialmente de alguna manera, tal como por medios recombinantes, medios químicos o cualquier otro medio. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos descritos en el presente documento pueden tener, o pueden derivarse de, las secuencias de aminoácidos y/o nucleótidos de cualquier polipéptido, proteína y/o complejo proteico de VRS adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención pueden ser, o pueden derivarse de, derivados y/o análogos de polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS específicos descritos en el presente documento o conocidos en la técnica, incluyendo proteínas que son sustancialmente homólogas a cualquiera de tales proteínas, o fragmentos de las mismas (por ejemplo, en diversas realizaciones, aquellas que tienen al menos alrededor del 40% o 50% o 60% o 70% o 75% o 80% o 85% o 90% o 95% o 98% o 99% de identidad con una secuencia de aminoácidos o ácido nucleico de cualquier polipéptido, proteína y/o complejo proteico F de VRS específico descrito en el presente documento o conocido en la técnica, cuando se alinea utilizando cualquier método adecuado conocido por un experto habitual en la técnica, tal como, por ejemplo, utilizando un programa informático de homología conocido en la técnica) o cuyo ácido nucleico codificante es capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico codificante de una proteína de la invención, en condiciones de alta rigurosidad, moderada rigurosidad o baja rigurosidad.

En algunas realizaciones, la descripción proporciona fragmentos de los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS específicos descritos en el presente documento, tales como los que comprenden, que consisten esencialmente en o que consisten en, al menos alrededor de 10 aminoácidos, 20 aminoácidos, 50 aminoácidos, 100 aminoácidos, 200 aminoácidos o 500 aminoácidos.

En algunas realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos dentro de un polipéptido, proteína y/o complejo proteico F de VRS específico tal como se describe en el presente documento, o tal como se conoce en la técnica, pueden delecionarse, añadirse o sustituirse por otro aminoácido. En realizaciones en las que se introducen tales mutaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS pueden microsecuenciarse para determinar una secuencia de aminoácidos parcial. En otras realizaciones pueden secuenciarse las moléculas de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS para identificar y/o confirmar la introducción de mutaciones.

En algunas realizaciones, uno o más residuos de aminoácidos pueden sustituirse por otro aminoácido que tiene una polaridad similar y que puede actuar como equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. En algunas realizaciones, pueden seleccionarse sustituciones por un aminoácido dentro de la secuencia a partir de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido, por ejemplo, para crear una sustitución conservativa. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados (ácidos) negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Tales sustituciones se entiende generalmente que son sustituciones conservativas.

En algunas realizaciones pueden utilizarse aminoácidos artificiales, sintéticos o no clásicos o análogos de aminoácidos químicos para preparar los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, fluoro-aminoácidos y aminoácidos de “diseño” tales como p-metilaminoácidos, Cy-metilaminoácidos, Ny-metilaminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Los ejemplos no limitativos adicionales de aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a: ácido a-aminocaprílico, Acpa; (S)-2-aminoetil-L-cisteina/HCl, Aecys; aminofenilacetato, Afa; ácido 6-aminohexanoico, Ahx; ácido y-aminoisobutírico y ácido a-aminoisobitírico, Aiba, aloisoleucina, Aile; L-alilglicina, Alg; ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico y ácido a-aminobutírico, Aba; p-aminofenilalanina, Aphe; b-alanina, Bal; p-bromofenilalaína, Brphe; ciclohexilalanina, Cha; citrulina, Cit; p-cloroalanina, Clala; cicloleucina, Cle; pclorofenilalanina, Clphe; ácido cisteico, Cya; ácido 2,4-diaminobutírico, Dab; ácido 3-aminopropiónico y ácido 2,3-diaminopropiónico, Dap; 3,4-deshidroprolina, Dhp; 3,4-dihidroxilfenilalanina, Dhphe; p-fluorofenilalanina, Fphe; ácido D-glucosaamínico, Gaa; homoarginina, Hag; 8-hidroxilisina/HCl, Hlys; DL-p-hidroxinorvalina, Hnvl; homoglutamina, Hog; homofenilalanina, Hoph; homoserina, Hos; hidroxiprolina, Hpr; p-yodofenilalanina, Iphe; isoserina, Ise; ametileucina, Mle; cloruro de DL-metionina-S-metilsulfonio, Msmet; 3-(1-naftil)alanina, 1Nala; 3-(2-naftil)alanina, 2Nala; norleucina, Nle; N-metilalanina, Nmala; Norvalina, Nva; O-bencilserina, Obser; O-benciltirosina, Obtyr; O-etiltirosina, Oetyr; O-metilserina, Omser; O-metiltreonina, Omthr; O-metiltirosina, Omtyr; ornitina, Orn; fenilglicina; penicilamina, Pen; ácido piroglutámico, Pga; ácido pipecólico, Pip; sarcosina, Sar; t-butilglicina; t-butilalanina; 3,3,3-trifluoralanina, Tfa; 6-hidroxidopa, Thphe; L-vinilglicina, Vig; dihidroxocloruro de ácido (-)-(2R)-2-amino-3-(2-aminoetilsulfonil)propanoico, Aaspa; ácido (2S)-2-amino-9-hidroxi-4,7-dioxanonanoico, Ahdna; ácido (2S)-2-amino-6-hidroxi-4-oxahexanoico, Ahoha; ácido (-)-(2R)-2-amino-3-(2-hidroxietilsulfonil)propanoico, Ahsopa; ácido (-)-(2R)-2-amino-3-(2-hidroxietilsulfanil)propanoico, Ahspa; ácido (2S)-2-amino-12-hidroxi-4,7,10-trioxadodecanoico, Ahtda; ácido (2S)-2,9-diamino-4,7-dioxanonanoico, Dadna; ácido (2S)-2,12-diamino-4,7,10-trioxadodecanoico, Datda; (S)-5,5-difluoronorleucina, Dfnl; (S)-4,4-difluoronorvalina, Dfnv; ácido (3R)-1-1-dioxo-[1,4]tiazian-3-carboxílico, Dtca; (S)-4,4,5,5,6,6,6-heptafluoronorleucina, Hfnl; (S)-5,5,6,6,6-pentafluoronorleucina, Pfnl; (S)-4,4,5,5,5-pentafluoronorvalina, Pfnv; y ácido (3R)-1,4-tiazinano-3-carboxílico, Tca. Además, el aminoácido puede ser D (dextrógiro) o L (levógiro). Para una revisión de aminoácidos clásicos y no clásicos, véase Sandberg et al., 1998 (Sandberg et al., 1998. New chemical descriptors relevant for the design of biologically active peptides. A multivariate characterization of 87 amino acids. J Med Chem 41(14): págs. 2481-91).

Ácidos nucleicos

Además de proporcionar determinados polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS, tal como se describe en el presente documento, la presente invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican para tales polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS, y composiciones y vectores que comprenden tales ácidos nucleicos. Tales ácidos nucleicos pueden obtenerse o prepararse utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden obtenerse moléculas de ácido nucleico que codifican para polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS a partir de ADN clonado o prepararse por síntesis química. En algunas realizaciones los ácidos nucleicos pueden obtenerse mediante transcripción inversa de ARN preparado por cualquiera de los métodos conocidos por un experto habitual en la técnica, tal como transcripción inversa con cebado de poli A o aleatorio. Cualquiera que sea la fuente, una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido, proteína y/o complejo proteico F de VRS de la presente invención puede clonarse en cualquier vector adecuado, tal como los que se utilizan para la propagación de la molécula de ácido nucleico o los que se utilizan para la expresión de la molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico puede escindirse en sitios específicos utilizando diversas enzimas de restricción, si es necesario. En realizaciones que requieren expresión, el ácido nucleico puede unirse operativamente a un promotor adecuado para dirigir la expresión en el tipo de célula deseado, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto, y puede incorporarse en cualquier vector de expresión adecuado, tal como un vector de expresión de mamífero o insecto.

En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la presente invención pueden derivarse de secuencias nucleicas que codifican para (o que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en secuencias de nucleótido que codifican para) cualquier secuencia de polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS adecuado conocida en la técnica, o cualquier fragmento de la misma, incluyendo, sin limitación: una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína F de longitud completa silvestre (WT) a partir de subtipo A de VRS (por ejemplo, SEQ ID NO: 33), o una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína F de longitud completa silvestre (WT) a partir de subtipo B de VRS (por ejemplo, SEQ ID NO: 34), o variantes de tales secuencias cuyos codones se han optimizado para su expresión en células de cualquier especie de interés particular, o que contienen cualquier mutación de interés. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la presente invención pueden derivarse de secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de tipo A de F de VRS, pero cuyos codones se han optimizado para su expresión en células de ser humano (por ejemplo, SEQ ID NO:35), hámster (por ejemplo, SEQ iD NO:36), insecto (por ejemplo, SEQ ID NO:37) o ratón (por ejemplo, SEQ ID NO:38), u optimizado para su expresión en cualquier otro tipo de célula. De manera similar, en algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la presente invención pueden derivarse de secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de tipo B de F de VRS, pero cuyos codones se han optimizado para su expresión en células de ser humano (por ejemplo, SEQ ID NO:39), hámster (por ejemplo, SEQ ID NO:40), insecto (por ejemplo, SEQ ID NO:41) o ratón (por ejemplo, SEQ ID NO:42), u optimizado para su expresión en cualquier otro tipo de célula. De manera similar, en algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la presente invención pueden derivarse de secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína F de tipo A o B de F de VRS, y que puede o no que sus codones se hayan optimizado para su expresión de células de cualquier especie de interés dada, y que también comprenden una o más mutaciones de interés distintas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS de la presente invención pueden derivarse de secuencias de nucleótidos que comprenden secuencias mutantes de DS-CAV1 (SEQ ID NO:43), DS (SEQ ID NO: 44) y/o CAV1 (SEQ ID NO:45). Aunque las tres secuencias específicas proporcionadas en SEQ ID NO:43, 44 y 45 comprenden las mutaciones de DS, CAV1 y DS-CAV1 en el contexto de un secuencia de tipo A de VRS de longitud completa de codones optimizados humana, tales mutaciones, o de hecho cualquier otra mutaciones de interés (incluyendo todas las mutaciones “a tirosina” de la invención), también podrían estar presentes en una estructura principal de cualquier otra secuencia de tipo A o tipo B de VRS adecuada, incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas secuencias que se han optimizado para su expresión en cualquier especie de interés, o que incluyen cualquier mutación de interés, o que incluyen sólo determinadas partes de las secuencias de tipo A o B de VRS, tal como, por ejemplo, sólo los nucleótidos 1-1539 que codifican para solo el ectodominio F de VRS (sin los dominios citoplasmáticos y/o transmembrana). Un experto en la técnica reconocerá que existen una variedad de secuencias de nucleótidos que pueden codificar para los diversos polipéptidos y proteínas F de VRS descritos en el presente documento, y se pretende que todas las secuencias de nucleótidos de este tipo se encuentren dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los polipéptidos y proteínas F de VRS de la presente invención pueden derivarse de secuencias de nucleótidos que tienen al menos alrededor del 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con cualquier secuencia de nucleótidos conocida que codifica para una proteína F de VRS, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de las ilustradas en el presente documento (incluyendo SEQ ID NO: 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44 y 45), o que tienen al menos alrededor del 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con los nucleótidos 1-1539 de las mismas (que codifican para las secuencias de ectodominio), o que tienen al menos alrededor del 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 85%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con secuencias de nucleótidos que codifican para proteínas F de VRS de cualquier grupo, subgrupo, familia, subfamilia, tipo, subtipo, género, especie, cepa y/o clado de VRS conocido, o cualquier fragmento de los mismos.

Además, alguien o un experto en la técnica puede visualizar fácilmente, o preparar, moléculas de ácido nucleico que comprenden cualquiera de una o más de las mutaciones “a tirosina” específicas descritas en el presente documento, por ejemplo, ubicando el codón de nucleótidos que codifica para el residuo de aminoácido específico que va a mutarse, y mutando los nucleótidos en ese codón según sea necesario para dar como resultado un codón que codifica para tirosina.

Reticulación

En algunas realizaciones las polipéptidos y/o proteínas F de VRS de la invención se ensamblan para dar complejos proteicos que tienen una estructura conformacional deseada, tal como la conformación de pre-F, y se reticulan para estabilizar esa conformación. En otras secciones de esta solicitud se describen detalles de regiones particulares de la proteína F de VRS que pueden reticularse, así como de mutantes de VRS particulares diseñados para facilitar tal reticulación. En algunas realizaciones las reticulaciones pueden utilizarse para estabilizar las estructuras terciaria y/o cuaternaria de la proteína F de prefusión de VRS. En algunas realizaciones, la reticulación puede ser reticulación intray/o intermolecular. En algunas realizaciones, las reticulaciones que se utilizan son reticulaciones dirigidas. En algunas realizaciones, las reticulaciones que se utilizan son estables en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, las reticulaciones que se utilizan no conducen a la formación de agregados de la proteína F de prefusión de VRS, por ejemplo, durante la expresión y/o durante el almacenamiento (tal como el almacenamiento de composiciones que comprende altas concentraciones de la proteína F de prefusión de VRS). En algunas realizaciones, la introducción de tales reticulaciones puede potenciar la eficacia de los polipéptidos, proteínas y proteínas de VRS de la invención como inmunógenos, tales como inmunógenos de vacuna. En algunas realizaciones la introducción de tales reticulaciones puede estabilizar epítopos (tales como el epítopo ^) dentro de la proteína F de VRS de manera que los epítopos pueden reconocerse por anticuerpos particulares, provocar la producción de anticuerpos y/o activar receptores de células B tras la unión de anticuerpos.

En algunas realizaciones puede utilizarse reticulación dirigida. Una reticulación dirigida es una que puede prepararse para formarse en una posición o posiciones particulares dentro de la proteína o complejo proteico F de VRS. Diversas estrategias pueden utilizarse para dirigir reticulaciones a ubicaciones específicas en un polipéptido o proteína F de VRS, tal como las ubicaciones específicas descritas en el presente documento. La presente invención proporciona pares de residuos dentro de la proteína F de VRS que, cuando se reticulan, pueden estabilizar un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS en su conformación de pre-F, y/o en una conformación que es capaz de unirse a, o provocar la producción de, neutralizar anticuerpos y/o que es capaz de generar una respuesta de anticuerpos neutralizantes en un animal. Una reticulación dirigida puede introducirse en una o más de las ubicaciones o posiciones especificadas en el presente documento aprovechando las propiedades químicas y/o físicas de determinadas cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo, haciendo uso de reacciones enzimáticas que reconocen secuencias de aminoácidos o estructuras tridimensionales específicas, o incorporando aminoácidos no naturales que tienen la capacidad de formar reticulaciones en un complejo proteico o proteína plegado.

Las reticulaciones o modificaciones pueden dirigirse a sitios específicos de la estructura del polipéptido o proteína F de VRS con el fin de lograr el resultado deseado, por ejemplo, la estabilización o la conformación de pre-F. La presente invención contempla la introducción dirigida de una o más reticulaciones y/u otras modificaciones estabilizantes en cualquier posición/posiciones adecuada(s) en un polipéptido o proteína F de VRS, preferiblemente donde la reticulación o modificación estabiliza el polipéptido o proteína F de VRS en un conformación de prefusión, o proporciona una estabilización potenciada de la conformación de prefusión. La invención contempla que cualquier residuo de aminoácido de proteína F de VRS, par de residuos, estructura secundaria u otra región descrita en el presente documento para la reticulación de di-tirosina también pueda utilizarse en la formación de otras reticulaciones o uniones u otras modificaciones, incluyendo pero sin limitarse a las posiciones de aminoácidos Y33, K77, N88, M97, A147, S150, S155, H159, N183, V185, V187, Y198, V220, E222, F223, K226, S255, Y286, K427 y V469, o cualquier combinación de las mismas; pares de residuos 147/286, 198/220, 198/222, 198/223, 198/226, 33/496, 77/222, 88/255, 97/159, 183/427, 185/427 y 187/427, o cualquier combinación de los mismos; regiones o estructuras secundarias, incluyendo el extremo N-terminal móvil F1 (residuos 137-216), a2 (residuos 148-160), a3 (residuos 163-173), p3 (residuos 176-182), p4 (residuos 186-195), a4 (residuos 197-211), el extremo C-terminal móvil F1 (residuos 461-513), P22 (residuos 464-471), a9 (residuos 474-479), p23 (residuos 486-491) y a10 (493 a 514); y otras regiones de proteína F de VRS incluyendo residuos desde alrededor de la posición 67 hasta alrededor de la posición 87, desde alrededor de la posición 78 hasta alrededor de la posición 98, desde alrededor de la posición 87 hasta alrededor de la posición 107, desde alrededor de la posición 137 hasta alrededor de la posición 157, desde alrededor de la posición 140 hasta alrededor de la posición 160, desde alrededor de la posición 145 hasta alrededor de la posición 165, desde alrededor de la posición 149 hasta alrededor de la posición 169, desde alrededor de la posición 173 hasta alrededor de la posición 193, desde alrededor de la posición 175 hasta alrededor de la posición 195, desde alrededor de la posición 177 hasta alrededor de la posición 197, desde alrededor de la posición 188 hasta alrededor de la posición 208, desde alrededor de la posición 210 hasta alrededor de la posición la posición 230, desde alrededor de la posición 212 hasta alrededor de la posición 232, desde alrededor de la posición 213 hasta alrededor de la posición 233, desde alrededor de la posición 216 hasta alrededor de la posición 236, desde alrededor de la posición 245 hasta alrededor de la posición 265, desde alrededor de la posición 276 hasta alrededor de la posición 296, desde alrededor de la posición 417 hasta alrededor de la posición 437 y desde alrededor de la posición 459 hasta alrededor de la posición 479.

Una amplia variedad de métodos de reticulación de proteínas intra e intermolecularmente se conocen en la técnica, incluyendo aquellos que tiene reticulaciones con longitudes variables de brazos espaciadores, y aquellos con y sin grupos fluorescentes y funcionales para la purificación. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, el uso de agentes de reticulación heterobifuncionales (por ejemplo, acetiltioacetato de succinimidilo (SATA), ciclohexano-1-carboxilato de trans-4-(maleimidometilo) (SMCC) y 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo (SPDP)), agentes de reticulación homobifuncionales (por ejemplo, 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo), agentes de reticulación fotorreactivos (por ejemplo, ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico, éster STP, sal sódica (ATFB, éster STP), ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico, éster succinimidílico (ATFB, SE), 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobencilamina, clorhidrato, benzofenona-4-isotiocianato benzofenona-4-maleimida, ácido 4-benzoilbenzoico, éster succinimidílico, N-((2-piridilditio)etil)-4-azidosalicilamida (PEAS; AET), agentes de reticulación reactivos con tiol (por ejemplo, maleimidas y yodoacetamidas), agentes de reticulación reactivos con amina (por ejemplo, glutaraldehído, bis(ésteres de imido), bis(ésteres succinimidílicos), diisocianatos y cloruros de diácido). Debido a que los grupos tiol son altamente reactivos y relativamente poco comunes en la mayoría de las proteínas en comparación con los grupos amina, la reticulación reactiva con tiol puede utilizarse en algunas realizaciones. En los casos en los que faltan o no están presentes grupos tioles en sitios apropiados en las estructuras de proteína F de prefusión de VRS, pueden introducirse utilizando uno de varios métodos de tiolación. Por ejemplo, puede utilizarse trans-4-(maleimidilmetil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo para introducir grupos reactivos con tiol en sitios de amina.

Se conocen varias reticulaciones oxidativas, tales como enlaces disulfuro (que se forman espontáneamente y son sensibles al pH y a reducción-oxidación), y uniones de di-tirosina (que son altamente estables e irreversibles en condiciones fisiológicas).

En algunas realizaciones, las reticulaciones estabilizan la estructura terciaria de una proteína F de prefusión de VRS. En algunas realizaciones, las reticulaciones estabilizan la estructura cuaternaria de una proteína F de prefusión de VRS. En algunas realizaciones, las reticulaciones estabilizan tanto la estructura terciaria como la cuaternaria de una proteína F de prefusión de VRS.

En algunas realizaciones, un polipéptido o proteína F de VRS de la invención tiene reticulaciones que son termoestables. En algunas realizaciones, un polipéptido o proteína F de VRS de la invención tiene reticulaciones que no son tóxicas. En algunas realizaciones un polipéptido o proteína F de VRS de la invención tiene reticulaciones que son reticulaciones dirigidas, o reticulaciones no dirigidas, o reticulaciones reversibles, o reticulaciones irreversibles, o reticulaciones formadas por el uso de agentes de reticulación homobifuncionales, o reticulaciones formadas por el uso de agentes de reticulación heterobifuncionales, o reticulaciones formadas por el uso de reactivos que reaccionan con grupos amino, o reticulaciones formadas por el uso de reactivos que reaccionan con grupos tiol, o reticulaciones formadas por el uso de reactivos que son fotorreactivos, o reticulaciones formadas entre residuos de aminoácidos, o reticulaciones formadas entre residuos de aminoácidos mutados incorporados en la estructura de las proteínas o complejos proteicos, o reticulaciones oxidativas, o uniones de di-tirosina, o reticulaciones de glutaraldehído, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido o proteína F de VRS de la invención no tiene reticulaciones de glutaraldehído.

En algunas realizaciones, el polipéptido o proteína F de VRS de la invención no tiene ningún enlace disulfuro introducido artificialmente, o si tiene tales enlaces disulfuro, también tiene reticulaciones adicionales introducidas artificialmente. En algunas realizaciones, el polipéptido o proteína F de VRS de la invención no tiene ningún enlace disulfuro introducido artificialmente, pero puede tener enlaces disulfuro que se producen de manera natural. Pueden introducirse enlaces disulfuro artificialmente cuando las cadenas laterales de cisteína se modifican por ingeniería genética mediante mutación puntual. Sin embargo, se sabe que los enlaces disulfuro son sensibles al pH y que se disuelven en determinadas condiciones de reducción-oxidación, y la utilidad terapéutica y/o preventiva de proteínas y/o complejos proteicos modificados por ingeniería genética con reticulaciones de disulfuro, por ejemplo que van a usarse como inmunógenos in vivo, por tanto, puede verse comprometida. Además, a menudo se forman enlaces disulfuro no deseados entre proteínas con grupos sulfhidrilos libres que median en la formación de agregados (véase, por ejemplo, Harris RJ et al. 2004, Commercial manufacturing scale formulation and analytical characterization of therapeutic recombinant antibodies. Drug Dev Res 61 (3): 137 a 154; Costantino & Pikal (Eds.), 2004. Lyophilization of Biopharmaceuticals, editores Costantino & Pekal. Lyophilization of Biopharmaceuticals. Series: Biotechnology: Pharmaceutical Aspects II, véanse las páginas 453-454; Tracy et al., 2002, patente estadounidense 6.465.425), que también se ha notificado como un problema con gp120 y gp41 de VIH (Jeffs et al. 2004. Expression and characterization of recombinant oligomeric envelope glycoproteins derived from primary isolates of h IV-1. Vaccine 22:1032-1046; Schulke et al., 2002. Oligomeric and conformational properties of a proteolytically mature, disulfidestabilized human immunodeficiency virus type 1 gp140 envelope glycoprotein. J Virol 76:7760-7776). Por tanto, en muchas realizaciones se prefiere que no se utilicen enlaces disulfuro, o no se utilicen como el único método de reticulación.

Si la estructura y/o inmunogenicidad de la proteína F de prefusión de VRS se ve comprometida o alterada por una reticulación, el mantenimiento de su estructura y función general puede lograrse controlando la disponibilidad de cadenas laterales de aminoácidos para la reacción de reticulación o mediante la introducción de reticulaciones adicionales u otras modificaciones estabilizantes. Por ejemplo, en el caso de reticulación de DT, cadenas laterales de tirosilo que están disponibles para la reacción, pero que conducen a la distorsión de la estructura del complejo, y que comprometen la inmunogenicidad/antigenicidad de la proteína F de VRS, pueden eliminarse mutando tales residuos a otro aminoácido tal como, por ejemplo, fenilalanina. Además, pueden introducirse mutaciones puntuales en posiciones donde las cadenas laterales de aminoácidos reaccionarán con agentes de reticulación o entre sí, de manera que la formación del/de los enlaces provoca el resultado más beneficioso. Estas posiciones también pueden definirse tal como se describe en el presente documento.

Cuando en un residuo seleccionado una cadena lateral reactiva no está ya presente, puede introducirse una mutación puntual, por ejemplo utilizando métodos biológicos moleculares para introducir una mutación puntual de este tipo en el ADNc de un ácido nucleico que dirige su expresión, de manera que una cadena lateral reactiva está presente y disponible para la reacción.

Las reticulaciones que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, reticulaciones reversibles resultantes del uso de agentes de reticulación homo- y heterobifuncionales que reaccionan con grupos amino y/o tiol, reactivos de reticulación fotorreactivos, cualquier reticulación que pueda formarse entre aminoácidos no clásicos incorporados a la estructura de un complejo proteico o proteína, cualquier reticulación oxidativa, tal como, pero sin limitarse a, reticulaciones/uniones de di-tirosina, agentes de reticulación heterobifuncionales (por ejemplo, acetiltioacetato de succinimidilo (SATA), ciclohexano-1-carboxilato de trans-4-(maleimidilmetilo) (SMCC) y 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo (SPDP)), agentes de reticulación homobifuncionales (por ejemplo, 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo), agentes de reticulación fotorreactivos (por ejemplo, ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico, éster STP, sal sódica (ATFB, éster STP), ácido 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoico, éster succinimidílico (ATFB, SE), 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobencilamina, clorhidrato, benzofenona-4-isotiocianato, benzofenona-4-maleimida, ácido 4-benzoilbenzoico, éster succinimidílico, N-((2-piridilditio)etil)-4-azidosalicilamida (PEAS; AET), agentes de reticulación reactivos con tiol (por ejemplo, maleimidas y yodoacetamidas), agentes de reticulación reactivos con amina (por ejemplo, glutaraldehído, bis(ésteres de imido), bis(ésteres succinimidílicos), diisocianatos y cloruros de diácido).

La presente invención también contempla la introducción de interacciones de apilamiento de tirosinas no covalentes dirigidas como “reticulaciones” para estabilizar las interacciones proteína-proteína y/o conformaciones de proteína o péptido deseadas, tal como la conformación de prefusión de proteína F de VRS. La reticulación comprende una interacción de apilamiento pi dirigida que incluye pero no se limita a una interacción de apilamiento de pi desplazada en forma de T, sándwich o paralela entre las cadenas laterales aromáticas de una tirosina introducida/modificada por ingeniería genética y una tirosina, fenilalanina, histidina o triptófano endógena dentro del proteína o complejo proteico, o entre la cadena lateral aromática de una tirosina introducida/modificada por ingeniería genética y una segunda tirosina introducida/modificada por ingeniería genética dentro de la proteína o complejo proteico.

Las reticulaciones irreversibles, tal como se usan en el contexto de esta solicitud, incluyen aquellas que no se disuelven significativamente en condiciones fisiológicamente relevantes. Se prefiere que el tipo de reticulaciones utilizado no conduzca a la formación de agregados durante la expresión o cuando los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención se almacenan a altas concentraciones. Los enlaces disulfuro no son reticulaciones irreversibles. En su lugar son reticulaciones reversibles y pueden disolverse en condiciones fisiológicamente relevantes y/o conducir a la formación de agregados durante la producción y/o expresión proteica o cuando se almacenan en altas concentraciones.

En algunas realizaciones, pueden dirigirse reticulaciones a las regiones específicas de polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de v Rs descritos en el presente documento con el fin de lograr la estabilización conformacional deseada y/o las propiedades inmunogénicas deseadas (por ejemplo, la capacidad de mantener la conformación de pre-F y/o de unirse a anticuerpos ampliamente neutralizantes). Alternativamente, proteínas con las reticulaciones en las ubicaciones especificadas en el presente documento pueden aislarse de una mezcla de proteínas reticuladas y no reticuladas con y sin modificaciones deseadas, por ejemplo, basándose en características químicas, físicas y/o funcionales. Tales características pueden incluir, por ejemplo, la trimerización, la presencia de la conformación de pre-F y/o cualquier característica antigénica, inmunogénica o bioquímica deseada.

Alternativamente, en algunas realizaciones, las reticulaciones pueden no estar dirigidas, y pueden aislarse proteínas con las reticulaciones o propiedades deseadas de una mezcla de proteínas modificadas y no modificadas preparadas utilizando un sistema de reticulación no dirigido.

En realizaciones en las que polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS con las reticulaciones deseadas van a aislarse de una mezcla de proteínas reticuladas y no reticuladas, tal aislamiento o separación puede realizarse basándose en una o más características incluyendo, pero sin limitarse a, peso molecular, volumen molecular, propiedades cromatográficas, movilidad en electroforesis, características antigénicas y bioquímicas, características de fluorescencia, solubilidad, unión a anticuerpos, características estructurales, características inmunológicas o cualquier otra característica adecuada.

Además de las posiciones de reticulación específicas descritas en el presente documento, pueden identificarse posiciones adicionales dentro de polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS en las que pueden hacerse reticulaciones adicionales, por ejemplo, cuando una cadena lateral reactiva podría formar una unión con una cadena lateral reactiva en otra parte en la proteína/complejo F de VRS. En algunas realizaciones, pueden seleccionarse tales posiciones adicionales, por ejemplo, para mantener o mejorar la inmunogenicidad/antigenicidad de la proteína, polipéptido o complejo proteico. En algunas realizaciones, tales posiciones adicionales que van a reticularse pueden seleccionarse en pares.

Reticulación de di-tirosina (DT)

En algunas realizaciones la presente invención proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS que comprenden reticulaciones de di-tirosina (DT), y métodos para preparar tales polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS con reticulaciones de DT.

La reticulación de ditirosina introduce enlaces covalentes de carbono-carbono en proteínas o complejos proteicos. Esto proporciona un método para estabilizar proteínas, complejos proteicos y conformaciones, mediante la introducción de enlaces intra- y/o interpolipéptidos de di-tirosina, manteniendo al mismo tiempo su integridad estructural y funcional (véase Marshall et al., patentes estadounidense n.os 7.037.894 y 7.445.912). La reticulación de DT de longitud cero y de alteración mínima no se hidroliza en condiciones fisiológicas, y se ha demostrado que mantiene la integridad estructural de las proteínas mediante cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (CL/EM). Se sabe que las reticulaciones de ditirosina son seguras, ya que se forman de manera natural in vivo, tanto en el contexto de proteínas evolucionadas para utilizar sus características específicas (por ejemplo, Elvin CM et al.

2005, Nature 437:999-1002; Tenovuo J y Paunio K 1979, Arch Oral Biol.; 24(8):591-4), y como consecuencia de la oxidación inespecífica de proteínas (Giulivi et al. 2003, Amino Acids 25(3-4):227-32), y ya que están presentes en grandes cantidades en algunos de los alimentos más comunes: las uniones de DT forman la estructura del gluten de trigo, la estructura proteica cuaternaria que comprende las subunidades de glutenina, por ejemplo, en masa de pan durante el mezclado y la cocción (Tilley et al. 2001, Agric. Food Chem 49, 2627). No se forman espontáneamente uniones de ditirosina in vitro. En su lugar, la reacción de reticulación enzimática se lleva a cabo en condiciones optimizadas para preservar la estructura y la función de las proteínas. Por tanto, no se produce unión/agregación inespecífica (a diferencia de los enlaces disulfuro), y por tanto la fabricación a gran escala de un inmunógeno estabilizado con DT puede ser económicamente más factible.

Las cadenas laterales de tirosilo están presentes en muchas enzimas de reducción-oxidación, y la catálisis de las reacciones específicas de enzimas a menudo implica radicales tirosilo que son de larga duración y tienen una reactividad comparativamente baja. En condiciones optimizadas, la formación de radicales es específica para las cadenas laterales de tirosilo. En proximidad estrecha, cadenas laterales de tirosilo experimentan acoplamiento de radicales y forman un enlace covalente carbono-carbono. Los radicales tirosilo que no reaccionan revierten a cadenas laterales de tirosilo no radicalizadas (Malencik & Anderson, 2003. Di-tyrosine as a product of oxidative stress and fluorescent probe. Amino Acids 25: 233-247). Por tanto, cadenas laterales de tirosilo deben estar situadas en proximidad estrecha para formar uniones de DT, o bien dentro de una única cadena polipeptídica plegada, o bien en dominios proteicos que interaccionan estrechamente dentro de un complejo. Debido a que una separación de Ca-Ca de aproximadamente 5-8 A es un requisito previo para la formación de enlaces (Brown et al., 1998. Determining protein-protein interactions by oxidative cross-linking of a glycine-glycine-histidine fusion protein. Biochemistry 37, 4397-4406; Marshall et al. 2006, patente estadounidense 7.037.894), y debido a que no se añaden átomos en la formación de estos enlaces, la “grapa” resultante es de “longitud cero” y no disruptiva para la estructura proteica.

Los residuos de tirosinas que van a reticularse pueden estar presentes de manera natural en la estructura primaria de la proteína que van a reticularse o pueden añadirse mediante mutación puntual controlada. Para formar uniones de DT, proteínas con cadenas laterales de tirosilo pueden someterse a condiciones de reacción que conducen a la formación de uniones de DT. Tales condiciones son, o pasan a ser, condiciones de reacción oxidativa, ya que la reacción de formación de uniones de DT es una reacción de reticulación oxidativa. En algunas realizaciones, las condiciones de reacción de reticulación de DT producen proteínas que no se modifican por lo demás, o no de manera detectable. Tales condiciones pueden obtenerse mediante el uso de enzimas que catalizan la formación de H2O2, tales como peroxidasas. La formación de uniones de DT puede monitorizarse mediante espectrofotometría con una longitud de onda de excitación de alrededor de 320 nm, y la fluorescencia medida a una longitud de onda de alrededor de 400 nm (véase, por ejemplo, la figura 34), mientras que la pérdida de fluorescencia de tirosilo también se monitoriza mediante procedimientos convencionales. Cuando la pérdida de florescencia de tirosilo ya no sea estequiométrica con la formación de uniones de DT, la reacción puede detenerse por cualquier método conocido por un experto en la técnica, tal como, por ejemplo, mediante la adición de un agente reductor y el enfriamiento posterior (sobre hielo) o la congelación de la muestra. En la técnica se conocen detalles adicionales sobre cómo crear reticulaciones de DT y se describen, por ejemplo, en Marshall et al. 2006, patente estadounidense 7.037.894.

Las principales ventajas de la reticulación de di-tirosina en ingeniería genética de proteínas incluyen (i) la capacidad de seleccionar como diana residuos específicos para la reticulación (basándose en las estructuras primarias, secundarias, terciarias y/o cuaternarias de proteínas y complejos), (ii) modificación estructural mínima, (iii) especificidad de la reacción (la tirosina es el único aminoácido que se sabe que forma reticulaciones en condiciones de reticulación específicas); (iv) estabilidad del enlace, (v) longitud cero de la reticulación (no se añade átomos) y (vi) la escalabilidad de la química de reticulación.

En algunas realizaciones, pueden introducirse reticulaciones de DT dirigidas en una o más de las ubicaciones específicas en la proteína F de VRS que se enumeran en el presente documento. En otras realizaciones, pueden identificarse posiciones adicionales dentro de polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS en las que pueden hacerse reticulaciones de DT. En algunas realizaciones, se dirigen uniones o reticulaciones de di-tirosina a pares de residuos específicos dentro de la estructura de un polipéptido o proteína F de VRS donde se formarán, o se espera que se formen, uniones de DT debido, por ejemplo, a su proximidad estrecha. En algunas realizaciones, ya están presentes cadenas laterales de tirosilo en residuos de aminoácidos que van a reticularse. En algunos casos, residuos de tirosina que se producen de manera natural pueden constituir o bien uno o bien ambos de los residuos de tirosina emparejados necesarios para la formación de uniones de di-tirosina. Sin embargo, en otros casos los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención se mutan o se modifican por ingeniería genética para añadir uno o más residuos de tirosina, o para sustituir uno o más residuos distintos de tirosina por residuos de tirosina. Tales mutaciones se denominan en el presente documento mutaciones “a tirosina”, y pueden introducirse en ubicaciones donde es deseable formar reticulaciones/uniones de di-tirosina. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS mutantes en los que se introducen cadenas laterales de tirosilo en posiciones de reticulación deseadas mediante la introducción de mutaciones puntuales a tirosina en una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS. Alternativamente, en algunas realizaciones, proteínas, polipéptidos o complejos proteicos de VRS, o partes de los mismos, pueden sintetizarse para que incluyan residuos de tirosina o aminoácidos que tienen cadenas laterales de tirosilo en posiciones de reticulación deseadas. A la inversa, en algunas realizaciones la presente invención proporciona polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS mutantes en los que se retiran cadenas laterales de tirosilo en posiciones de reticulación no deseadas mediante la introducción de mutaciones puntuales a partir de tirosina en una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS, o pueden sintetizarse polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS para que excluyan residuos de tirosina o aminoácidos que tienen cadenas laterales de tirosilo en posiciones en las que no se desea reticulación. Por ejemplo, al menos una de las cadenas laterales de tirosilo puede sustituirse por otra cadena lateral, tal como una cadena lateral de fenilalanina (véase, por ejemplo, Marshall CP et al., solicitud de patente estadounidense n.° 09/837.235). Por consiguiente, los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención pueden comprender mutaciones puntuales “a tirosina” o “de tirosina”. Tales mutaciones pueden hacerse alterando las secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención utilizando cualquier método adecuado de mutagénesis conocido en la técnica. Alternativamente, polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS mutantes pueden sintetizarse, purificarse y/o producirse por cualquier otro método adecuado conocido en la técnica.

En algunas realizaciones, la presente invención contempla la introducción dirigida de una o más reticulaciones de ditirosina en cualquier posición/posiciones adecuada(s) en un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS donde la reticulación estabilizará o puede estabilizar el polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS en su conformación de pre-fusión. Tal estabilización puede lograrse, por ejemplo, introduciendo reticulaciones que estabilizan interacciones entre o dentro de los polipéptidos F1 y F2 de proteína F de VRS y/o mediante la introducción de reticulaciones que estabilizan las interacciones entre o dentro de los protómeros de proteína F de VRS. En algunas realizaciones, el polipéptido F1 de una proteína F de VRS se reticula con el polipéptido F2 del mismo protómero (unión intermolecular/intraprotómero). En algunas realizaciones, el polipéptido F1 se reticula intramolecularmente (por ejemplo, ambas tirosinas de la reticulación se ubican dentro del mismo polipéptido F1). En algunas realizaciones, el polipéptido F2 se reticula intramolecularmente (por ejemplo, ambas tirosinas de la reticulación se ubican dentro del mismo polipéptido F1). En algunas realizaciones, el polipéptido F1 de la proteína F de prefusión de VRS se reticula con el polipéptido F1 de un protómero adyacente (unión interprotómero). En algunas realizaciones, el polipéptido F1 de la proteína F de prefusión de VRS se reticula con el polipéptido F2 de un protómero adyacente (unión interprotómero).

Preparación y análisis de polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos para preparar los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención. Los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención pueden prepararse por cualquier medio adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención pueden prepararse por medios recombinantes. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención, o cualquier parte de los mismos, pueden ser prepararse por síntesis química. Por ejemplo, un péptido correspondiente a una parte de una proteína o complejo proteico descrito en el presente documento puede sintetizarse mediante el uso de un sintetizador de péptidos.

Métodos de producción recombinantes

En realizaciones, en las que los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención se preparan por medios recombinantes, pueden expresarse ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de v Rs de la invención en cualquier tipo celular adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a células de mamíferos e insectos (tales como células SF9 o Hi5, usando un sistema de expresión de baculovirus). Los métodos para expresar polipéptidos y proteínas a partir de moléculas de ácido nucleico son rutinarios y bien conocidos en la técnica, y puede utilizarse cualquier método, vector, sistema y tipo celular adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, normalmente secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención se colocarán en un constructo de expresión adecuado que contiene un promotor adecuado, que luego se suministrará a las células para su expresión.

Proteínas de fusión/quiméricas y dominios de oligomerización

En algunas realizaciones, puede ser deseable añadir dominios quiméricos a los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS descritos en el presente documento, para producir proteínas quiméricas/proteínas de fusión, por ejemplo, para facilitar el análisis y/o aislamiento y/o purificación de los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención pueden comprender secuencias líderes, secuencias de polipéptidos precursores, señales de secreción, señales de localización, etiquetas de epítopo, y similares. Las etiquetas de epítopo que pueden utilizarse incluyen, pero sin limitarse a, etiquetas FLAG, etiquetas de glutatión S-transferasa (GST), etiquetas de proteína fluorescente verde (GFP), etiquetas de hemaglutinina A (HA), etiquetas de histidina (His), etiquetas de luciferasa, etiquetas de proteína de unión a maltosa (MBP), etiquetas de c-Myc, etiquetas de proteína A, etiquetas de proteína G, etiquetas de estreptavidina (estrep.), y similares.

En algunas realizaciones, puede ser deseable añadir dominios de oligomerización para facilitar el ensamblaje de polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS tal como se describe en el presente documento, y/o para facilitar la estabilización de la conformación de pre-F, y/o para estabilizar otros rasgos estructurales de los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS. En algunas realizaciones los dominios de oligomerización son motivos de trimerización, incluyendo, pero sin limitarse a, el motivo Foldon de T4. Hay una amplia variedad de dominios de trimerización en proteínas naturales que pueden utilizarse para estos fines, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en Habazettl et al., 2009 (Habazettl et al., 2009. NMR Structure of a Monomeric Intermediate on the Evolutionarily Optimized Assembly Pathway of a Small Trimerization Domain. J.Mol.Biol. págs. sin valor), Kammerer et al., 2005. (Kammerer et al., 2005. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci USA 102 (39): 13891-13896), Innamorati et al., 2006. (Innamorati et al., 2006. An intracellular role for the C1qglobular domain. Cell signal 18(6): 761-770) y Schelling et al., 2007 (Schelling et al., 2007. The reovirus a-1 aspartic acid sandwich: A trimerization motif poised for conformational change. Biol Chem 282(15): 11582-11589). La estabilización de complejos proteicos triméricos también puede lograrse utilizando los motivos de fibrinitina GCN4 y T4 (Pancera et al., 2005. Soluble Mimetics of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Viral Spikes Produced by Replacement of the Native Trimerization Domain with a Heterologous Trimerization Motif: Characterization and Ligand Binding Analysis. J Virol 79(15): 9954-9969; Guthe et al., 2004. Very fast folding and association of a trimerization domain from bacteriophage T4 fibritin. J.Mol.Biol. v337 págs. 905-15; Papanikolopoulou et al., 2008. Creation of hybrid nanorods from sequences of natural trimeric fibrous proteins using the fibritin trimerization motif. Methos Mol Biol 474:15-33). Pueden introducirse motivos de oligomerización heterólogos por cualquier método recombinante conocido por un experto habitual en la técnica con el fin de estabilizar las interacciones proteína-proteína de las proteínas de la presente invención.

Pueden prepararse polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS quiméricos por cualquier método conocido por un experto habitual en la técnica, y pueden comprender, por ejemplo, uno o varios polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención, y/o cualquier fragmento, derivado o análogo de los mismos (por ejemplo, que consiste en al menos un dominio de un polipéptido, proteína o complejo proteico de la invención, o al menos 6, y preferiblemente al menos 10 aminoácidos de los mismos) unidos en su extremo amino o carboxilo-terminal por medio de un enlace peptídico a una secuencia de aminoácidos de otra proteína u otro dominio o motivo proteico. En algunas realizaciones tales proteínas quiméricas pueden producirse por cualquier método conocido por un experto habitual en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, expresión recombinante de un ácido nucleico que codifica para una proteína quimérica (por ejemplo, que comprende una primera secuencia codificante unida en marco a una segunda secuencia codificante); ligando las secuencias de ácido nucleico apropiadas que codifican para las secuencias de aminoácidos deseadas entre sí en el marco de codificación adecuado, y expresando el producto quimérico.

Modificaciones postraduccionales

En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS descritos en el presente documento pueden alterarse añadiendo o retirando modificaciones postraduccionales, añadiendo o retirando apéndices o modificaciones químicas y/o introduciendo cualquier otra modificación conocida por los expertos habituales en la técnica. Se incluyen dentro del alcance de la invención polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS que se modifican durante o después de la traducción o síntesis, por ejemplo, mediante glicosilación (o desglicosilación), acetilación (o desacetilación), fosforilación (o desfosforilación), amidación (o desamidización), pegilación, derivatización por grupos de protección/bloqueo conocidos, escisión proteolítica, o mediante cualquier otro medio conocido en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS pueden someterse a escisión química por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc. En algunas realizaciones, tales modificaciones postraduccionales pueden utilizarse para hacer que los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la presente invención sean más inmunogénicos, más estables y/o más capaces de unirse a, o provocar la producción de, anticuerpos neutralizantes y ampliamente neutralizantes.

Obtención de F de VRS en su conformación de pre-F

En algunas realizaciones los polipéptidos y/o proteínas F de VRS de la invención se ensamblan para dar complejos proteicos que tiene una estructura conformacional deseada, como la conformación de pre-F, y se reticulan para estabilizar esa conformación. Tal como se describe en otra parte de la presente solicitud, la conformación de pre-F de la proteína F de VRS comprende un trímero formado a partir de tres protómeros. Tal como se describe en otra parte de la presente solicitud, la conformación de pre-F de la proteína F de VRS comprende un trímero formado a partir de tres protómeros. En algunas realizaciones, antes de y/o durante la reacción de reticulación enzimática, la proteína F de VRS puede obtenerse en (y/o mantenerse en) la conformación de pre-F, por ejemplo mientras que se realiza la reticulación. En algunas realizaciones la proteína F de VRS puede producirse y/o aislarse de tal manera que la mayoría, o sustancialmente todas, de las moléculas F de VRS están presentes en la conformación de pre-F. En algunas realizaciones, las moléculas F de VRS en la conformación de pre-F pueden separarse de una población mixta de moléculas de proteína F de VRS que comprenden algunas que están en la conformación de pre-F y otras que están en otras conformaciones. En algunas realizaciones, la proteína F de VRS se expresa en células (por ejemplo, como su forma unida a la membrana o soluble) y se ensambla espontáneamente para dar su conformación de pre-F normal. En algunas realizaciones puede no ser necesaria ninguna estabilización adicional para retener la proteína F de VRS en su forma de pre-F. En algunas realizaciones la proteína F de VRS expresada y ensamblada/plegada puede mantenerse en condiciones particulares, o en composiciones particulares, que favorecen la formación y/o mantenimiento de la conformación de pre-F. Por ejemplo, en algunas realizaciones la proteína F de prefusión de VRS puede mantenerse en ausencia de células, contacto con el que de otro modo se desencadenaría un cambio en la conformación de post-F. La proteína F de prefusión de VRS puede obtenerse y/o aislarse y/o mantenerse en la conformación de pre-F utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos convencionales de purificación de proteínas, tales como métodos de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular y/o cromatografía de afinidad. En algunas realizaciones la proteína F de prefusión de VRS puede expresarse en presencia de, expresarse de manera conjunta con o ponerse en contacto con, moléculas que se unen a la proteína F de VRS y estabilizan la misma en su conformación de pre-F, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos, moléculas pequeñas, péptidos, y/o peptidomiméticos. Los ejemplos no limitativos de anticuerpos que se unen a la proteína F de VRS de prefusión incluyen los anticuerpos 5C4, AM22 y D25 (véase McLellan et al. (2013) Science 342:592-598). En algunas realizaciones, la proteína F de VRS puede obtenerse, aislarse o mantenerse en su conformación de pre-F controlando la fuerza iónica del medio/tampón en el que está presente la proteína (tal como usando medios de fuerza iónica alta o baja). En algunas realizaciones la proteína F de VRS puede obtenerse, aislarse o mantenerse a una o más temperaturas que favorecen la preservación de la conformación de pre-F. En algunas realizaciones la proteína F de VRS puede obtenerse, aislarse o mantenerse a lo largo de un período de tiempo que disminuye el grado en que la conformación de pre-F se pierde.

En algunas realizaciones pueden realizar análisis para confirmar que la conformación deseada, tal como la conformación de pre-F, se ha formado y/o mantenido en la proteína F de VRS. Tal análisis puede realizarse antes de la reticulación, durante el proceso de reticulación, después del proceso de reticulación o en cualquier combinación de tales fases. Tal análisis puede comprender cualquier método adecuado conocido en la técnica para evaluar la estructura tridimensional de un complejo proteico o proteína, incluyendo análisis funcional, análisis cristalográfico, y similares. En algunas realizaciones tal análisis puede incluir la evaluación de la unión de la proteína de VRS a determinados anticuerpos, como los que son específicos para la conformación de pre-F y/o aquellos que se sabe que se unen al sitio 0, tal como se describe en otra parte en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a los anticuerpos 5C4, AM22 y D25.

Purificación de proteínas

En algunas realizaciones los métodos para preparar polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención pueden comprender purificar los polipéptidos, proteínas o complejos proteicos F de VRS antes, durante o después de una o más etapas del proceso de fabricación. Por ejemplo, en algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención pueden purificarse una vez completadas todas las etapas de fabricación. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención pueden purificarse antes de iniciar el proceso de reticulación o después de una o más de las etapas intermedias del método en el proceso, por ejemplo, después de la expresión de un polipéptido o proteína F de VRS, después de ensamblar un complejo proteico, después de obtener la proteína F de VRS en su conformación de pre-F, o durante o después de la realización de una reacción de reticulación. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención pueden aislarse o purificarse utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, afinidad y/o columna de dimensionamiento), precipitación con sulfato de amonio, centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica para la purificación de proteínas conocida por un experto habitual en la técnica. En realizaciones específicas puede ser necesario separar los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de influenza deseables de la invención de aquellos que no estaban suficientemente reticulados, o aquellos en los que la conformación de pre-F no estaba suficientemente estabilizada. Esto puede hacerse utilizando cualquier sistema adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, proteínas de VRS en la conformación de pre-F pueden separarse de las que no están en la conformación de pre-F utilizando métodos de separación basados en anticuerpos utilizando anticuerpos específicos de pre-F o post-F. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención pueden purificarse de cualquier fuente utilizada para producirlos. Por ejemplo, los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención pueden purificarse de fuentes que incluyen insectos, procariotas, eucariotas, monocelulares, multicelulares, animales, plantas, hongos, vertebrados, mamíferos, humanos, porcinos, bovinos, felinos, equinos, caninos, aviares o células de cultivo tisular, o cualquier otra fuente. El grado de pureza puede variar, pero en diversas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS purificados de la invención se proporcionan en una forma en la que comprenden más de alrededor del 10%, 20%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 99,9% de la proteína total en la composición final. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención pueden aislarse y purificarse de otras proteínas, o cualquier otro producto no deseado (como F de VRS no reticulado o distinto de pre-F), por métodos convencionales que incluyen, pero sin limitarse a, cromatografía, gradientes de glicerol, cromatografía de afinidad, centrifugación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de afinidad, o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas conocida en la técnica. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS que van a aislarse pueden expresarse en medios iónicos altos o bajos, o aislarse en tampones iónicos altos o bajos. Los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención también pueden aislarse a una o más temperaturas que favorezcan la conservación de la conformación deseada. También pueden aislarse a lo largo de un período de tiempo que disminuye el grado en el que una preparación habría perdido la conformación deseada. El grado en el que una preparación de proteínas conserva una o más conformaciones deseadas (tales como la conformación y/o conformaciones de pre-F que favorecen la unión a anticuerpos neutralizantes, o las propiedades deseadas) puede evaluarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse a análisis bioquímicos, biofísicos, inmunológicos y virológicos. Estos ensayos incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, inmunoprecipitación, ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA) o ensayos de puntos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISPOT), análisis cristalográfico (incluyendo cristalización de manera conjunta con anticuerpos), sedimentación, ultracentrifugación analítica, dispersión dinámica de luz (DLS), microscopía electrónica (EM), tomografía crio-EM, calorimetría, resonancia de plasmón superficial (SPR), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), análisis de dicroísmo circular y dispersión de rayos X de ángulo pequeño, ensayos de neutralización, ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y/o estudios de exposición virológica in vivo.

El rendimiento de los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención puede determinarse por cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, comparando la cantidad de las proteínas modificadas por ingeniería genética finales (como VRS de pre-F reticulado) en comparación con la cantidad del material de partida, o en comparación con la cantidad de los materiales presentes en cualquier etapa anterior de los métodos de producción. Las concentraciones de proteínas pueden determinarse mediante procedimientos convencionales, tales como, por ejemplo, los ensayos de proteínas de Bradford o Lowrie. El ensayo de Bradford es compatible con agentes reductores y desnaturalizantes (Bradford, M, 1976. Anal. Biochem. 72: 248). El ensayo de Lowry tiene una mejor compatibilidad con detergentes y la reacción es más lineal con respecto a las concentraciones de proteínas y la lectura (Lowry, O J, 1951. Biol. Chem. 193: 265).

Métodos de producción a modo de ejemplo

En algunas realizaciones la presente descripción proporciona un método de producción de una proteína F de VRS estabilizada en su conformación de pre-fusión, comprendiendo el método: (a) obtener una proteína F de VRS en su conformación de pre-F, (b) identificar una o más regiones en la estructura terciaria y/o cuaternaria de la proteína F de prefusión de VRS en la que la introducción de una o más reticulaciones podría estabilizar la conformación de pre-F, y (c) introducir en la proteína F de prefusión de VRS una o más reticulaciones en una o más de las regiones identificadas en la etapa (b) para formar una proteína F de VRS modificada por ingeniería genética bloqueada en su conformación de pre-fusión. En algunas realizaciones, las regiones identificadas en la etapa (b) comprenden uno o más de las regiones específicas o residuos de aminoácidos específicos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones las reticulaciones son reticulaciones dirigidas. En algunas realizaciones las reticulaciones son reticulaciones de DT dirigidas. En algunas realizaciones, las reticulaciones son estables en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, la proteína F de VRS modificada por ingeniería genética estabilizada en su conformación de pre-fusión es útil como inmunógeno de vacuna. En algunas realizaciones, la proteína F de VRS modificada por ingeniería genética bloqueada en su conformación prefusión tiene una o más de las siguientes propiedades: (i) capacidad potenciada de unión a un anticuerpo neutralizante en comparación con la proteína F de VRS no modificada por ingeniería genética de esta manera (es decir, en comparación con la proteína F de VRS sin o antes de la introducción de las reticulaciones), (ii) capacidad potenciada de unión a un anticuerpo ampliamente neutralizante en comparación con la proteína F de VRS no modificada por ingeniería genética de esta manera, (iii) capacidad potenciada de unión a y activación de receptores de células B en comparación con la proteína F de VRS no modificada por ingeniería genética de esta manera, (iv) capacidad potenciada para provocar una respuesta de anticuerpos en un animal en comparación con la proteína F de VRS no modificada por ingeniería genética de esta manera, (v) capacidad potenciada para provocar una respuesta de anticuerpos protectores en un animal en comparación con la proteína F de VRS no modificada por ingeniería genética de esta manera, (vi) capacidad potenciada para provocar la producción de anticuerpos neutralizantes en un animal en comparación con la proteína F de VRS no modificada por ingeniería genética de esta manera, (vii) capacidad potenciada para provocar la producción de anticuerpos ampliamente neutralizantes en un animal en comparación con la proteína F de VRS no modificada por ingeniería genética de esta manera, (viii) capacidad potenciada para provocar una respuesta inmunitaria protectora en un animal en comparación con la proteína F de VRS no modificada por ingeniería genética de esta manera y (ix) capacidad potenciada para unirse y provocar la producción de anticuerpos que reconocen epítopos neutralizantes cuaternarios en un animal en comparación con la proteína F de VRS no modificada por ingeniería genética de esta manera. En algunas realizaciones los métodos para producir una proteína F de VRS estabilizada en su conformación de pre-fusión descritos en el presente documento también comprenden realizar un ensayo para determinar si la proteína F de VRS modificada por ingeniería genética se estabilizó en su conformación de prefusión y/o tiene una o más de las propiedades mencionadas anteriormente.

Propiedades de polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS

En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención, incluyendo en particular aquellos que están reticulados tal como se describe en el presente documento, tienen determinadas propiedades estructurales, físicas, funcionales y/o biológicas. Tales propiedades pueden incluir una o más de las siguientes, o cualquier combinación de las siguientes: existencia de la conformación de pre-F, estabilidad de la conformación de pre-F de VRS; estabilidad mejorada de la conformación de pre-F de VRS (en comparación con proteínas F de v Rs no reticuladas); semivida mejorada de la conformación de pre-F de VRS (en comparación con proteínas F de VRS no reticuladas); termoestabilidad mejorada (en comparación con proteínas F de VRS no reticuladas); vida útil prolongada (en comparación con proteínas F de VRS no reticuladas); semivida prolongada dentro del cuerpo de un sujeto (en comparación con proteínas F de VRS no reticuladas); capacidad para almacenarse en disolución sin formar agregados (incluyendo cuando está presente a una alta concentración en disolución); agregación reducida en la disolución (en comparación con proteínas F de VRS no reticuladas); unión a un anticuerpo; unión a un anticuerpo neutralizante; unión a un anticuerpo ampliamente neutralizante; unión a un anticuerpo específico de pre-F; unión a un anticuerpo que reconoce el sitio 0; unión a un anticuerpo conformacionalmente específico; unión a un anticuerpo que reconoce un epítopo metaestable; unión a un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en D25, AM22 y 5^c 4 (anticuerpos que se describen en McLellan et al., 20l3, Science, 340, pág. l1 l3 ; Kwakkenbos et al., 2010, Nature Medicine, 16, pág. 123; Spits & Beaumont, solicitud de patente estadounidense 12/600.950; Beaumont, Bakker & Yasuda, solicitud de patente estadounidense 12/898.325); unión a palivizumab (Synagis); unión al anticuerpo neutralizante 101F; unión a un receptor de células B; activación de un receptor de células B; provocación de una respuesta de anticuerpos en un animal; provocación de una respuesta de anticuerpos protectores en un animal; provocación de la producción de anticuerpos neutralizantes en un animal; provocación de la producción de anticuerpos ampliamente neutralizantes en un animal; provocación de la producción de anticuerpos que reconocen epítopos neutralizantes cuaternarios (QNE) en un animal; provocación de una respuesta inmunitaria protectora en un animal; y/o provocación de una respuesta inmunitaria humoral en un animal. En el caso de la unión a moléculas de anticuerpos, en algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención se unen a los anticuerpos (tales como anticuerpos específicos de pre-F, anticuerpos que se unen al sitio 0 y/o D25, AM22 o 5C4) con alta especificidad y/o con alta afinidad.

Ensayos de propiedades

En algunas realizaciones pueden analizarse los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención, o cualquier producto intermedio en su fabricación, para confirmar que tienen propiedades deseadas, tales como las propiedades estructurales, físicas, funcionales y/o biológicas deseadas, tales como las propiedades enumeradas anteriormente o identificadas en otra parte de esta memoria descriptiva de patente. Por ejemplo, en algunas realizaciones pueden realizarse ensayos in vitro o in vivo para evaluar la estructura conformacional, la estabilidad (por ejemplo, termoestabilidad), la semivida (por ejemplo, dentro del cuerpo de un sujeto), la agregación en disolución, la unión a un anticuerpo (tal como un anticuerpo neutralizante, anticuerpo ampliamente neutralizante; anticuerpo específico de pre-F; anticuerpo que reconoce el sitio 0, anticuerpo conformacionalmente específico, anticuerpo que reconoce un epítopo metaestable, D25, AM22, 5C4, 101F o palivizumab), la unión a un receptor de células B, la activación de un receptor de células B, la antigenicidad, la inmunogenicidad, la capacidad para provocar una respuesta de anticuerpos, la capacidad para provocar una respuesta protector/inmunitaria de anticuerpos, la capacidad para provocar la producción de anticuerpos neutralizantes o la capacidad para provocar la producción de anticuerpos ampliamente neutralizantes de la proteína F de VRS. En realizaciones en las que los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención se someten a prueba en un animal in vivo, el animal puede ser cualquier especie animal adecuada, incluyendo, pero sin limitarse a un mamífero (tal como una especie de roedor (por ejemplo, un ratón o una rata), un conejo, un hurón, una especie porcina, una especie bovina, una especie equina, una especie ovina o una especie de primate (por ejemplo, un primate humano o no humano), o una especie aviar (como un pollo).

Los ensayos para evaluar la estructura conformacional de una proteína se conocen bien en la técnica y puede usarse cualquier ensayo adecuado incluyendo, pero sin limitarse a, análisis cristalográfico (por ejemplo, cristalografía de rayos X o cristalografía electrónica), análisis de sedimentación, ultracentrifugación analítica, microscopía electrónica (EM), microscopía crio-electrónica (crio-EM), tomografía crio-EM, resonancia magnética nuclear (RMN), dispersión de rayos X de ángulo pequeño, ensayos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), y similares.

Los ensayos para evaluar la estabilidad de una proteína se conocen bien en la técnica y puede usarse cualquier ensayo adecuado incluyendo, pero sin limitarse a, electroforesis desnaturalizante y no desnaturalizante, calorimetría de titulación isotérmica y experimentos de evolución temporal en los que proteínas se incuban y analizan a lo largo del tiempo a diferentes concentraciones de proteínas, temperaturas, pH o condiciones de reducción-oxidación. También pueden analizarse proteínas para determinar su susceptibilidad a la degradación proteolítica.

Los ensayos para evaluar la unión de proteínas a anticuerpos se conocen bien en la técnica y puede usarse cualquier ensayo adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, ensayos de inmunoprecipitación, ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA), ensayos de puntos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISPOT), ensayos cristalográficos (incluyendo cristalización de manera conjunta con anticuerpos), ensayos de resonancia de plasmón superficial (SPR), ensayos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y similares.

Los ensayos para evaluar la actividad de neutralización se conocen bien en la técnica y puede usar cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos para determinar la actividad neutralizante de anticuerpos o antisueros generados por vacunación/inmunización de animales con los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención. Los ensayos de neutralización conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, los descritos por Dey et al. 2007 (Dey et al., 2007, Characterization of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Monomeric and Trimeric gp120 Glycoproteins Stabilized in the CD4-Bound State: Antigenicity, Biophysics, and Immunogenicity. J Virol 81(1l): 5579-5593) y Beddows et al. , 2006 (Beddows et al., A comparative immunogenicity study in rabbits of disulfide-stabilized proteolytically cleaved, soluble trimeric human immunodeficiency virus type 1 gpl40, trimeric cleavage-defective gp140 and momomeric gp120. Virol 360: 329-340).

Los ensayos para evaluar si un inmunógeno de vacuna es capaz de provocar una respuesta inmunitaria y/o demostrar inmunidad protectora se conocen bien en la técnica, y puede usare cualquier ensayo adecuado. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos para determinar si la vacunación/inmunización de animales con los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención proporcionan una respuesta inmunitaria y/o inmunidad protectora contra la infección con VRS. En algunas realizaciones pueden hacerse comparaciones entre grupos vacunados de prueba y placebo con respecto a sus tasas de infección o seroconversión o cargas virales.

Los ensayos para evaluar la farmacocinética y la biodistribución de una proteína también se conocen bien en la técnica, y puede usarse cualquier ensayo adecuado para evaluar estas propiedades de los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención.

Composiciones

En algunas realizaciones la presente invención proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS descritos en el presente documento. En algunas realizaciones tales composiciones pueden ser composiciones inmunogénicas, composiciones de vacuna y/o composiciones terapéuticas. En algunas realizaciones, tales composiciones pueden administrarse a sujetos.

En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención pueden proporcionarse en una composición que comprende uno o más componentes activos adicionales, tal como uno o más inmunógenos de vacuna o agentes terapéuticos adicionales. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención pueden proporcionarse en una composición que comprende uno o más componentes distintos, incluyendo, sin limitarse a, portadores, adyuvantes, agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, conservantes y/o cualquier otro componente adecuado farmacéuticamente aceptables para el uso previsto de las composiciones. Tales composiciones pueden adoptar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsiones y similares. El término “portador farmacéuticamente aceptable” incluye diversos diluyentes, excipientes y/o vehículos en los que, o con los que, pueden proporcionarse los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención. El término “portador farmacéuticamente aceptable” incluye, pero no se limita a, portadores que se sabe que son seguros para su administración a seres humanos y/u otros sujetos animales, y/o aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, y/o enumerados en la farmacopea de los Estados Unidos, y/u otra farmacopea reconocida generalmente, y/o que recibe la aprobación específica o individual de uno o más agencias reguladoras generalmente reconocidas para su uso en humanos y/u otros animales. Tales portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitarse a, agua, disoluciones acuosas (tales como disoluciones salinas, tampones y similares), disolventes orgánicos (tales como determinados alcoholes y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo), y similares. En algunas realizaciones las composiciones de la invención también comprenden uno o más adyuvantes. Los adyuvantes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes inorgánicos u orgánicos, adyuvantes a base de aceite, virosomas, liposomas, lipopolisacáridos (LPS), jaulas moleculares para antígenos (tales como complejos inmunoestimulantes (“ ISCo MS”)), micelas de saponina/colesterol modificadas por Ag que forman estructuras de tipo jaula que se transportan a los ganglios linfáticos drenantes), componentes de paredes celulares bacterianas, ácidos nucleicos sometidos a endocitosis (tales como ARN bicatenario (ARNbc), ADN monocatenario (ADNmc) y ADN que contiene dinucleótido de CpG no metilado), AUM, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio y escualeno. En algunas realizaciones se utilizan virosomas como adyuvante. Los adyuvantes disponibles comercialmente adicionales que pueden utilizarse según la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, el sistema de adyuvantes Ribi (RAS, una emulsión de aceite en agua que contiene endotoxina detoxificada (MPL) y componentes de pared celular micobacteriana en escualeno al 2% (Sigma M6536)), TiterMax (un adyuvante de agua en aceite estable y metabolizable (CytRx Corporation 150 Technology Parkway Technology Park/Atlanta Norcross, Georgia 30092)), formulación de adyuvante Syntex (SAF, una emulsión de aceite en agua estabilizada por Tween 80 y un copolímero de bloque de polioxietileno/polioxipropileno plurónico L121 (Chiron Corporation, Emeryville, CA)), adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, ALUM- hidróxido de aluminio, Al(OH)3 (disponible como Alhydrogel, Accurate Chemical & Scientific Co, Westbury, NY), SuperCarrier (Syntex Research 3401 Hillview Ave. Apartado de correos 10850 Palo Alto, CA 94303), Elvax 40W1,2 (un copolímero de etileno-acetato de vinilo (DuPont Chemical Co. Wilmington, DE)), L-tirosina precipitada de manera conjunta con el antígeno (disponible de numerosas empresas químicas); Montanide (un manida-oleato, ISA Seppic Fairfield, NJ)), AdjuPrime (un polímero de hidratos de carbono), proteína absorbida en nitrocelulosa, adyuvante de Gerbu (C-C Biotech, Poway, CA), y similares.

En algunas realizaciones las composiciones de la invención comprenden una “cantidad eficaz” de un polipéptido, proteína y/o complejo proteico F de VRS de la invención. Una “cantidad eficaz” es una cantidad requerida para lograr un resultado final deseado. Los ejemplos de resultados finales deseados incluyen, sin limitarse a, la generación de una respuesta inmunitaria humoral, la generación de una respuesta de anticuerpos neutralizantes, la generación de una respuesta de anticuerpos ampliamente neutralizantes y la generación de inmunidad protectora. La cantidad de un polipéptido, proteína y/o complejo proteico F de VRS de la invención que es eficaz para lograr el resultado final deseado dependerá de una variedad de factores incluyendo, sin limitase a, el tipo, subtipo y cepa del virus VRS contra el cual se busca la protección o algún otro efecto terapéutico, la especie del sujeto previsto (por ejemplo, si es un ser humano o alguna otra especie animal), la edad y/o sexo del sujeto previsto, la vía de administración prevista, el régimen de dosificación previsto, la gravedad de cualquier infección por influenza en curso (por ejemplo, en el caso de usos terapéuticos), y similares. La cantidad eficaz, que puede ser un intervalo de cantidades eficaces, puede determinarse mediante técnicas convencionales sin ninguna experimentación excesiva, por ejemplo, utilizando ensayos in vitro y/o ensayos in vivo en la especie objeto prevista o cualquier especie modelo animal adecuada. Los ensayos adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos que implican extrapolación a partir de curvas de dosis-respuesta y/u otros datos derivados de sistemas de modelos in vivo y/o in vitro. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz puede determinarse según el criterio de un profesional médico o veterinario basándose en las circunstancias específicas.

Usos de los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención

En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención pueden ser útiles como herramientas de investigación, como herramientas de diagnóstico, como agentes terapéuticos, como dianas para la producción de reactivos de anticuerpos o anticuerpos terapéuticos, y/o como vacunas o componentes de composiciones de vacuna. Por ejemplo, en algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención son útiles como inmunógenos de vacuna en sujetos animales, tales como sujetos mamíferos, incluyendo seres humanos. Estos y otros usos de los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención se describen más detalladamente a continuación. Los expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención pueden ser útiles también para una variedad de otras aplicaciones, y se pretende que todas de tales aplicaciones y usos se encuentren dentro del alcance de esta invención.

Herramientas para el estudio de anticuerpos F de VRS

En una realización, los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención pueden ser útiles como analitos para el ensayo y/o de la medición de la unión de y/o títulos de, anticuerpos anti-F de VRS, por ejemplo en ensayos ELISA, ensayos de unión Biacore/SPR, y/o cualquier otro ensayo de unión de anticuerpos conocido en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención podrían utilizarse para analizar y/o comparar la eficacia de anticuerpos anti-F de VRS.

Herramientas para la generación de anticuerpos

Los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención también pueden ser útiles para la generación de anticuerpos terapéuticos y/o anticuerpos que pueden utilizarse como herramientas de investigación o para cualquier otro uso deseado. Por ejemplo, los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención pueden utilizarse para inmunizaciones para obtener anticuerpos contra la proteína F de VRS para su uso como herramientas de investigación y/o productos terapéuticos. En algunas realizaciones los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención pueden utilizarse para inmunizar a un animal no humano, tal como un vertebrado, incluyendo, pero sin limitarse a, un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, una cabra, un primate no humano, etc. para generar anticuerpos. Tales anticuerpos, que pueden ser monoclonales o policlonales, y/o células que producen tales anticuerpos, entonces pueden obtenerse a partir del animal. Por ejemplo, en algunas realizaciones, puede utilizarse polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención para inmunizar a un ratón y producir y obtener anticuerpos monoclonales, y/o hibridomas que producen tales anticuerpos monoclonales. Tales métodos pueden llevarse a cabo utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales de ratón, incluyendo métodos convencionales para la producción de hibridomas. En algunas realizaciones, pueden utilizarse polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención para la producción de un anticuerpo quimérico (por ejemplo, parcialmente humano), humanizado o totalmente humano, por ejemplo, utilizando cualquiera de los métodos actualmente conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos quiméricos, humanizados y totalmente humanos, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de injerto de CDR, métodos de presentación en fagos, métodos de ratón transgénico (por ejemplo, que utilizan un ratón que se ha alterado genéticamente para permitir la producción de anticuerpos totalmente humanos, tal como el Xenomouse) y/o cualquier otro método adecuado conocido en la técnica. Los anticuerpos contra los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos

F de VRS de la invención preparados utilizando tales sistemas pueden caracterizarse de manera antigénica utilizando uno o un conjunto de varios antígenos, preferiblemente incluyendo los polipéptidos, proteínas y complejos proteicos F de VRS de la invención por sí mismos. Puede llevarse a cabo una caracterización adicional de tales anticuerpos mediante cualquier método convencional conocido para un experto habitual en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos basados en ELISA, métodos basados en SPR, métodos bioquímicos (tales como, pero sin limitarse a, la determinación de puntos isoeléctricos) y métodos conocidos en la técnica para estudiar la biodistribución, la seguridad y la eficacia de anticuerpos, por ejemplo en estudios preclínicos y clínicos.

Administración a sujetos

En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos que comprenden administrar los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención (o composiciones que comprenden tales polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS) a sujetos. Tales métodos pueden incluir métodos para tratar a individuos que tienen VRS (es decir, métodos terapéuticos) y/o métodos para proteger a individuos contra futuras infecciones de

VRS (es decir, métodos profilácticos).

Los sujetos a los que pueden administrarse los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención, o composiciones que comprenden tales polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS (por ejemplo, en el transcurso de un método de tratamiento o un método de vacunación) incluyen todas y cada una de las especies animales, incluyendo, en particular, aquellas que son susceptibles a la infección de v Rs o que pueden proporcionar sistemas animales modelo para el estudio de la infección de VRS. En algunas realizaciones, los sujetos son especies de mamíferos. En algunas realizaciones, los sujetos son especies aviares. Los sujetos mamíferos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, primates no humanos, roedores, conejos y hurones. Los sujetos aviares incluyen, pero no se limitan a, pollos, tales como aquellos de las granjas avícolas. En algunas realizaciones, los sujetos a los que se administran los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención, o composiciones que comprenden tales polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS, o bien tienen VRS, o bien están en riesgo de infección de VRS. En algunas realizaciones, los sujetos están inmunodeprimidos. En algunas realizaciones, los sujetos tienen un trastorno o enfermedad cardíaca. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano de más de alrededor de 50 años de edad, más de alrededor de 55 años de edad, más de alrededor de 60 años de edad, más

alrededor d, menos

meses de edad, menos de alrededor de 19 meses de edad, menos de alrededor de 20 meses de edad, menos de alrededor de 21 meses de edad, menos de alrededor de 22 meses de edad, menos de alrededor de 23 meses de edad o menos de alrededor de 24 meses de edad.

Se conocen diversos sistemas de administración en la técnica y puede usarse cualquier sistema de administración adecuado para administrar las composiciones de la presente invención a sujetos. Tales sistemas de administración incluyen, pero sin limitarse a, sistemas de administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de los revestimientos epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. También puede emplearse administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de aerosolización.

En algunas realizaciones, puede ser deseable administrar localmente las composiciones farmacéuticas de la invención a un tejido en el que el polipéptido o proteína F de VRS puede ser más eficaz en la generación de un resultado deseable. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante infusión, inyección, administración local utilizando un catéter, o por medio de un implante, como un implante poroso, no poroso o gelatinoso o un implante que comprende una o más membranas (tales como membranas sialásticas) o fibras desde o a través de las cuales la proteína o complejos proteicos pueden liberarse localmente. En algunas realizaciones, puede usarse un sistema de liberación controlada. En algunas realizaciones, puede usarse una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987. CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980. Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989. N. Engl. J. Med. 321:574). En algunas realizaciones, pueden utilizarse materiales poliméricos para facilitar y/o controlar la liberación de la proteína F de prefusión de VRS de la invención (véanse Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974. CRC Pres., Boca Raton, Florida; Controlled Drug Bioavailability, 1984. Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York; Ranger y Peppas, 1983 Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; véanse también Levy et al., 1985. Science 228:190; During et al., 1989. Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989. J. Neurosurg 71:105). En algunas realizaciones, puede colocarse un sistema de liberación controlada en proximidad al tejido/órgano al que va a suministrarse el polipéptido o proteína F de prefusión de VRS (véase, por ejemplo, Goodson, 1984. Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2: 115-138). Algunos sistemas adecuados de liberación controlada que pueden utilizarse junto con la presente invención se describen en Langer, 1990, Science; vol. 249: págs. 527-1533

En algunas realizaciones, la administración de las composiciones de la invención puede realizarse junto con la administración de uno o más agentes inmunoestimulantes. Los ejemplos no limitativos de tales agentes inmunoestimulantes incluyen diversas citocinas, linfocinas y quimiocinas con actividades inmunoestimulantes, inmunopotenciadoras y proinflamatorias, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulante de colonias (CSF) de granulocitos-macrófagos (GM)); y otros agentes inmunoestimulantes, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2. Los agentes inmunoestimulantes pueden administrarse en la misma formulación que el polipéptido o proteína F de VRS, o pueden administrarse por separado.

En algunas realizaciones, los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención, o composiciones que los comprenden, pueden administrarse a sujetos en una variedad de diferentes métodos o regímenes de vacunación de VRS. En algunas de tales realizaciones, se prefiere la administración de una única dosis. Sin embargo, en otras realizaciones, pueden administrarse dosis adicionales, por la misma vía o diferente, para lograr el efecto profiláctico deseado. En recién nacidos y lactantes, por ejemplo, pueden requerirse múltiples administraciones para provocar niveles suficientes de inmunidad. La administración puede continuar a intervalos a lo largo de la infancia, según sea necesario para mantener niveles suficientes de protección contra la infección de VRS. De manera similar, adultos que son particularmente susceptibles a la infección de VRS, tales como, por ejemplo, los ancianos y los individuos inmunodeprimidos, pueden requerir múltiples inmunizaciones para establecer y/o mantener respuestas inmunitarias protectoras. Los niveles de inmunidad inducida pueden monitorizarse, por ejemplo, midiendo cantidades de anticuerpos secretores y séricos neutralizantes, y ajustarse las dosificaciones o repetirse las vacunaciones según sea necesario para provocar y mantener los niveles de protección deseados.

En algunas realizaciones, los regímenes de dosificación pueden comprender una sola administración/inmunización. En otras realizaciones, los regímenes de dosificación pueden comprender múltiples administraciones/inmunizaciones. Por ejemplo, las vacunas pueden administrarse como una inmunización primaria seguida de uno o más refuerzos. En algunas realizaciones de la presente invención, puede utilizarse un régimen de vacunación de “sensibilizaciónrefuerzo” de este tipo. Por ejemplo, en algunos de estos regímenes de sensibilización-refuerzo puede administrarse una composición que comprende un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS tal como se describe en el presente documento a un individuo en múltiples ocasiones (tal como dos, tres o incluso más ocasiones) separadas en el tiempo, siendo la primera administración la administración de “sensibilización” y siendo las administraciones subsecuentes las administraciones de “refuerzo”. En otros regímenes de sensibilización-refuerzo puede administrarse una composición que comprende un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS tal como se describe en el presente documento a un individuo después de administrar en primer lugar al individuo una composición que comprende un vector viral o de ADN que codifica para un polipéptido, proteína o complejo proteico v Rs como una administración de “sensibilización”, con una o más administraciones de “refuerzo” posteriores de una composición que comprende un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS tal como se describe en el presente documento.

Pueden administrarse refuerzos a través de la misma ruta y/o diferente que la inmunización primaria. Los refuerzos se administran generalmente después de un período de tiempo después de la inmunización primaria o el refuerzo previamente administrado. Por ejemplo, puede administrarse un refuerzo alrededor de dos semanas o más después de una inmunización primaria, y/o puede administrarse un refuerzo segundo alrededor de dos semanas o más después de los primeros refuerzos. Los refuerzos pueden administrarse repetidamente en períodos de tiempo, por ejemplo, alrededor de dos semanas o más a lo largo de toda la vida de un sujeto. Los refuerzos pueden estar espaciados, por ejemplo, alrededor de dos semanas, alrededor de tres semanas, alrededor de cuatro semanas, alrededor de un mes, alrededor de dos meses, alrededor de tres meses, alrededor de cuatro meses, alrededor de cinco meses, alrededor de seis meses, alrededor de siete meses, alrededor de ocho meses, alrededor de nueve meses, alrededor de diez meses, alrededor de once meses, alrededor de un año , alrededor de un año y medio, alrededor de dos años, alrededor de dos años y medio, alrededor de tres años, alrededor de tres años y medio, alrededor de cuatro años, alrededor de cuatro años y medio, alrededor de cinco años o más después de una inmunización primaria o después de un refuerzo previo.

Formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad (por ejemplo, una cantidad eficaz), o una fracción apropiada de la misma, de los polipéptidos, proteínas y/o complejos proteicos F de VRS de la invención. Además de tales componentes, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes comúnmente utilizados por un experto habitual en la técnica. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas por la invención pueden presentarse convenientemente en formulaciones de dosificación unitaria preferidas preparadas utilizando técnicas farmacéuticas convencionales. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación el principio activo y el(los) excipiente(s) o portador(es) farmacéutico(s) u otros componentes. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el principio activo con portadores líquidos. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen disoluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que requiere únicamente la adición del portador de líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones de inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles comúnmente utilizados por un experto habitual en la técnica.

Kits

La presente descripción proporciona además kits que comprenden polipéptidos, proteínas o complejos proteicos de VRS de la descripción, o composiciones que contienen tales polipéptidos, proteínas o complejos proteicos. Para facilitar el uso de los métodos y composiciones de la descripción, cualquiera de los componentes y/o composiciones descritos en el presente documento, y componentes adicionales útiles para fines experimentales o terapéuticos o de vacuna, pueden envasarse en forma de un kit. Normalmente, el kit contiene, además de los componentes anteriores, materiales adicionales que pueden incluir, por ejemplo, instrucciones para utilizar los componentes, material de envasado, un recipiente y/o un dispositivo de administración.

Diversas realizaciones de la presente invención también pueden describirse adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos:

Ejemplo

Se expresaron las variantes de proteína F de VRS E222Y (SEQ ID NO:13), K226Y (SEQ ID NO:15), V469Y (SEQ ID NO:16), N88Y/S255Y (SEQ ID NO:18), V185Y/K427Y (SEQ ID NO:20) en células humanas modificadas mediante la introducción de uniones de ditirosina tal como se describe a continuación.

Plásmidos de expresión. Se optimizaron los codones de ADNc que codifica para una fusión C-terminal del ectodominio F de VRS humano WT o ectodominio de proteína DS-Cav1 al motivo de trimerización Foldon de fibritina T4, sitio de escisión de trombina, etiqueta de 6X HIS (SEQ ID NO: 46) y etiqueta de estrep. para expresión en seres humanos y se sintetizó (Geneart). También se sintetizó ADNc que codifica para las variantes de proteína F de VRS E222Y (SEQ ID NO:13), K226Y (SEQ ID NO:15), V469Y (SEQ ID NO:16), N88Y/S255Y (SEQ ID NO:18), V185Y/K427Y (SEQ ID NO:20). Estas secuencias de ADN se clonaron en el vector de expresión pCDNA3.1/zeo+ (Invitrogen) a través de sitios de endonucleasas de restricción 5' BamHI y 3'XhoI utilizando métodos convencionales (figura 33).

Células y transfecciones. Se hicieron crecer células HEK 293 (ATCC) en medio Eagle con modificación de Dulbecco (DMEM, Invitrogen) suplementadas con suero bovino fetal al 10% y gentamicina 50 |ig/ml. Se sembraron las células en placas de cultivo tisular de 6 pocillos (Corning) y se hicieron crecer hasta que eran confluentes al 80% (~24 h). Se transfectaron las células con 2 |ig de cada plásmido de expresión de F de VRS por pocillo utilizando una razón 1:4 (M/V) de ADN con respecto a polietilenimina (25 kDa, lineal). 16 h después de la transfección, se retiró el medio y se reemplazó por 2 ml/pocillo de medio de expresión Freestyle-293 libre de suero (Invitrogen). Se cultivaron células a 37 grados C durante unas 48 h-72 h adicionales en el 5% de CO2 antes de la recolección y el análisis.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   i. Polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS que comprende: (a) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia con los residuos de aminoácidos 1-513 de SEQ ID NO.1 (VRS tipo A) o residuos de aminoácidos 1-513 de SEQ ID NO.3 (VRS tipo B), en el que la secuencia de aminoácidos comprende una mutación puntual a tirosina en una posición de aminoácidos equivalente a la posición 226 en SEQ ID NO.1 o SEQ ID NO.3 y una tirosina en una posición de aminoácidos equivalente a la posición 198 en SEQ ID NO.1 o SEQ ID NO.3, y (b) un dominio de trimerización, en el que el polipéptido, proteína o complejo proteico es capaz de plegarse en la conformación de pre-F.
2. 2. Polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con los residuos de aminoácidos 1-513 de SEQ ID NO.1 (VRS tipo A) o residuos de aminoácidos 1-513 de SEQ ID NO.3 (VRS tipo B).
3. 3. Polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido, proteína o complejo proteico se pliega en la conformación de pre-F y comprende al menos una reticulación de di-tirosina, en el que una o ambas tirosinas de la al menos una reticulación se originan a partir de una mutación puntual a tirosina, y en el que al menos una reticulación se ubica entre residuos de aminoácidos de tirosina emparejados ubicados en posiciones de aminoácidos equivalentes a las posiciones 198 y 226 en SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO.3.
4. 4. Polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS según la reivindicación 1, 2 o 3, que comprende los residuos de aminoácidos 1-513 de la secuencia de SEQ ID NO. 15.
5. 5. Polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS según cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido, proteína o complejo proteico comprende además una o más mutaciones puntuales a cisteína; y/o en el que el polipéptido, proteína o complejo proteico comprende además una o más sustituciones de aminoácidos hidrófobos de relleno de cavidades.
6. 6. Polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS según la reivindicación 1, en el que el dominio de trimerización es un dominio Foldon.
7. 7. Polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS según cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido, proteína o complejo proteico es capaz de provocar la producción de anticuerpos específicos de VRS en un sujeto; y/o en el que el polipéptido, proteína o complejo proteico es capaz de unirse a un anticuerpo que reconoce el sitio antigénico 0.
8. 8. Molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS según cualquier reivindicación anterior.
9. 9. Composición que comprende un polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. 10. Composición según la reivindicación 9, en la que la composición es una composición de vacuna.
11. 11. Composición según la reivindicación 10, en la que la composición comprende además un adyuvante, un portador, un agente inmunoestimulador, o cualquier combinación de los mismos.
12. 12. Polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 9, 10 u 11 para su uso en la vacunación de un sujeto contra VRS.
13. 13. Polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS para su uso según la reivindicación 12, en el que el sujeto es un ser humano de menos de 24 meses de edad, o en el que el sujeto es un ser humano de más de 50 años de edad.
14. 14. Polipéptido, proteína o complejo proteico F de VRS para su uso según la reivindicación 12, en el que la composición se administra como una sola dosis.