EA039803B1 - Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv до слияния - Google Patents
Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv до слияния Download PDFInfo
- Publication number
- EA039803B1 EA039803B1 EA202090675A EA202090675A EA039803B1 EA 039803 B1 EA039803 B1 EA 039803B1 EA 202090675 A EA202090675 A EA 202090675A EA 202090675 A EA202090675 A EA 202090675A EA 039803 B1 EA039803 B1 EA 039803B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- rsv
- fusion
- seq
- amino acid
- protein
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 127
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 115
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 106
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 183
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 181
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 110
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims description 84
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 claims description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 35
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 25
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 abstract description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 247
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 119
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 58
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 56
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 56
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 56
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 40
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 40
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 38
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 34
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 29
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 25
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 24
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 17
- 102220082314 rs863224177 Human genes 0.000 description 17
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 16
- 101710189104 Fibritin Proteins 0.000 description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 16
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 15
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 10
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 10
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 9
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 9
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 102220029238 rs72554332 Human genes 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 102400001093 PAK-2p27 Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 241001559185 Mammalian rubulavirus 5 Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 102220087238 rs541028076 Human genes 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 241000144282 Sigmodon Species 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000012098 association analyses Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 238000003331 infrared imaging Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 241000724205 Rice stripe tenuivirus Species 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220370332 c.200C>T Human genes 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000008642 heat stress Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960001521 motavizumab Drugs 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 101100491335 Caenorhabditis elegans mat-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100495256 Caenorhabditis elegans mat-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102220499787 Carbonic anhydrase 2_N67H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220499772 Carbonic anhydrase 2_N67L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220499774 Carbonic anhydrase 2_N67Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100029604 Interferon alpha-inducible protein 27, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102220509369 Myeloid differentiation primary response protein MyD88_N67A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124679 RSV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- SPUUKOIOZNVGHK-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSSSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSSSSSSSSS SPUUKOIOZNVGHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000004783 Serene Substances 0.000 description 1
- 241000144290 Sigmodon hispidus Species 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K aluminum;potassium;phosphate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O NTGGOTYRTOXKMQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 102220346476 c.199A>T Human genes 0.000 description 1
- 102220411695 c.201C>A Human genes 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- -1 enhancer(s) Chemical class 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000012395 formulation development Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 102220227375 rs200294578 Human genes 0.000 description 1
- 102220101251 rs377614167 Human genes 0.000 description 1
- 102220053377 rs727504500 Human genes 0.000 description 1
- 102220192067 rs886057201 Human genes 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940036185 synagis Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
- C07K14/135—Respiratory syncytial virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к стабильным F-полипептидам респираторного синцитиального вируса (RSV) до слияния, иммуногенным композициям, содержащим указанные полипептиды, и их применениям для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной RSV.
Description
Настоящее изобретение относится к области медицины. Настоящее изобретение, в частности, относится к рекомбинантному F-полипептиду RSV до слияния и к его применениям, например, в иммуногенных композициях.
Предпосылки изобретения
Респираторный синцитиальный вирус (RSV) представляет собой оболочечный вирус с несегментированной одноцепочечной РНК с негативной полярностью из семейства Paramyxoviridae, рода Pneumovirus. По оценкам в мире ежегодно наблюдается 64 миллионов инфекций RSV, которые приводят к 160000 смертей (WHO Acute Respiratory Infections Update September 2009). Наиболее тяжело заболевание протекает, в частности, у недоношенных детей, пожилых индивидуумов и индивидуумов с ослабленным иммунитетом. У детей младше 2 лет RSV является наиболее распространенным возбудителем заболеваний респираторного тракта, который является причиной примерно 50% госпитализаций вследствие респираторных инфекций, с пиком госпитализации, наблюдающимся в 2-4-месячном возрасте. Сообщалось, что практически все дети к двухлетнему возрасту были инфицированы RSV. Повторные инфекции в течение жизни связаны с малоэффективным врожденным иммунитетом. У пожилых людей уровень тяжести заболевания, вызванного RSV, смертности и заболеваемости занимают второе место, уступая лишь инфекциям, вызываемым непандемическим гриппом А.
Для инфицирования клетки-хозяина RSV, подобно другим оболочечным вирусам, таким как вирус гриппа и HIV, требуют слияния вирусной мембраны с мембраной клетки-хозяина. Что касается RSV, консервативный белок слияния (F-белок RSV) подвергает слиянию вирусные мембраны и клеточные мембраны клетки-хозяина. В современных моделях на основе исследований парамиксовирусов F-белок RSV исходно уложен в конформацию до слияния. Во время проникновения в клетку предшествующая слиянию конформация подвергается рефолдингу и конформационным изменениям до своей конформации после слияния. Таким образом, F-белок RSV представляет собой метастабильный белок, который управляет слиянием мембран путем сочетания необратимого рефолдинга белка с соприкосновением мембран при помощи исходного фолдинга в метастабильную форму (конформация до слияния), которая в дальнейшем подвергается дискретным/стадийным конформационным изменениям до конформации с более низкой энергией (конформации после слияния).
Очевидно, исходя из электронной микроскопии RSV-F, что существуют значительные структурные различия между тримером F до слияния и после слияния, которые недавно были подтверждены с помощью кристаллографии (McLellan J.S. et al. Science, 340(6136):1113-7 (2013) и McLellan J.S. et al. Science, 342(6158):592-8 (2013)). Эти наблюдения указывают на то, что F-белок RSV до слияния и после слияния отличается в антигенном отношении (Calder, L.J. et al. Virology, 271, 122-131 (2000)).
Вакцина против инфекции RSV в настоящее время не доступна, хотя и очень желательна. Кандидаты вакцин на основе F-белка RSV оказались неэффективными вследствие проблем, например, связанных со стабильностью, чистотой, воспроизводимостью и эффективностью. Как указывали выше, кристаллические структуры выявили значительное конформационное изменение между состояниями до слияния и после слияния. Величина перестройки предполагала, что только часть антител, направленных на конформацию RSV-F после слияния будет способна к перекрестной реакции с нативной конформацией шиловидного отростка до слияния на поверхности вируса. Соответственно, усилия для получения вакцины против RSV сосредотачивались на разработке вакцин, которые содержат формы F-белка RSV до слияния (см., например, WO 2010/1149745, WO 2010/1149743, WO 2009/1079796, WO 2012/158613). Однако данные усилия не дали стабильных F-полипептидов RSV до слияния, которые можно было бы использовать в качестве кандидатов для испытания у людей.
Краткое описание настоящего изобретения
Настоящее изобретение представляет стабильные, рекомбинантные полипептиды слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) до слияния, т.е. F-полипептиды RSV, которые являются стабильными в конформации до слияния. F-полипептиды RSV по настоящему изобретению содержат по меньше мере один эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка до слияния. В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния являются растворимыми. В некоторых вариантах осуществления полипептиды являются мембранно-связанными. Настоящее изобретение также представляет молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие F-полипептиды RSV до слияния согласно настоящему изобретению и векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновых кислот.
Настоящее изобретение также относится к композициям, предпочтительно иммуногенным композициям, содержащим F-полипептид RSV, молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, и к их применению в индуцировании иммунного ответа против F-белка RSV, в частности их применению в качестве вакцины. Настоящее изобретение также относится к способам индуцирования у субъекта иммунного ответа против респираторного синцитиального вируса (RSV), включающим введение субъекту эффективного количества F-полипептида RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый F-полипептид RSV и/или вектор, содержащий молекулу упомянутой нуклеиновой кислоты. Предпочтительно индуцированный иммунный ответ характеризуется выработкой нейтрализующих антител к RSV и/или защитным иммунитетом против RSV. В конкретных аспектах настоящее изобретение относится к способу индуцирования у субъекта выработки антител к F-белку респираторного синцитиального
- 1 039803 вируса (RSV), включающий введение субъекту эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей F-полипептид RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый
F-полипептид RSV и/или вектор, содержащий молекулу упомянутой нуклеиновой кислоты.
Краткое описание фигур
Фиг. 1: А) гель-фильтрационная хроматограмма, полученная с использованием колонки Superdex200, элюата A2_F24 N67I+S215P из ионообменной колонки. Стрелки указывают точки элюации стандартного белка (1 - тироглобулин 669 кДа, 2 - ферритин 440 кДа и 3 - IgG 150 кДа); В) анализ SDS-PAGE F-белка до слияния, содержащего пик от хроматограммы SEC, в восстанавливающих условиях.
Фиг. 2: вестерн-блоттинг NativePAGE с загрузкой образцов, содержащих 1) супернатант из клеток, экспрессирующих конструкцию до слияния с изолейциновой застежкой (S) F43; 2) супернатант из клеток, экспрессирующих главным образом тримерный (верхняя полоса) F-белок после слияния RSV; и 3) очищенный тримерный A2_F24 N67I до слияния.
Фиг. 3: уровни экспрессии конструкций с точечными мутациями по отношению к немутировавшему A2_F24.
На фиг. 4 представлены результаты способа, описанного в примере 6, (А) определяющего температуру, при которой происходит 50% потеря связывания CR9501; (В) представлено сравнение стабильности F до слияния (A2_F24 N67I+S215P) и немодифицированного эктодомена при определении по 50% потере связывания специфического антитела CR9501 до слияния.
Фиг. 5: результаты анализа Octet, представляющие зависимую от времени хранения потерю связывания специфического антитела CR9501 до слияния по отношению к конструкциям до слияния; А) A2_F24 (SEQ ID NO: 19), В) A2_F24 K465Q, С) A2_F24 S46G, D) A2_F24 N67I и E) A2_F24 E92D на 1, 5 и 33 дни.
Фиг. 6: результаты анализа Octet, представляющие зависимую от времени хранения потерю связывания специфического моноклонального антитела CR9501 до слияния по отношению к конструкциям до слияния; A) A2_F24 K465Q, В) A2_F24 K465Q+N67I, С) A2_F24 S46G, D) A2_F24 S46G+E92D, Е) A2_F24 S46G+N67I, F) A2_F24 E92D, G) A2_F24 S46G+E92D, H) A2_F24 N67I+E92D и I) A2_F24 E92D+S215P на 1, 5 и 33 дни.
Фиг. 7: титры VNA у мышей на 6 неделе после прайм-бустерного введения на 0 и 4 неделе иммуногенов в дозах согласно табл. 14.
Фиг. 8: титры VNA хлопковых крыс на 7 неделе после прайм-буста на 0 и 4 неделе иммуногенами и дозами согласно табл. 15.
Фиг. 9: вирусная нагрузка в легких и носу на 5 день после i.n. контрольного заражения с использованием RSV.
Подробное описание настоящего изобретения
Белок слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) участвует в слиянии вирусной мембраны с мембраной клетки-хозяина, которое требуется для инфицирования. МРНК F RSV транслируется в белок-предшественник из 574 аминокислот, обозначенный F0, который содержит последовательность сигнального пептида на N-конце (например, аминокислотные остатки 1-26 с SEQ ID NO: 1), которая удаляется сигнальной пептидазой в эндоплазматическом ретикулуме. F0 отщепляется в двух сайтах (между аминокислотными остатками 109/110 и 136/137) с помощью клеточных протеаз (в частности, фурином) в транс-Гольджи, при этом удаляется короткая гликозилированная вставочная последовательность (также обозначенная как участок р27, содержащий аминокислотные остатки от 110 до 136), и образуется два домена или субъединицы, обозначенные F1 и F2. Домен F1 (аминокислотные остатки 137-574) содержит гидрофобный пептид слияния на своем N-конце, и С-конец содержит трансмембранный (ТМ) (аминокислотные остатки 530-550) и цитоплазматический участок (аминокислотные остатки 551-574). Домен F2 (аминокислотные остатки 27-109) ковалентно связан с F1 двумя дисульфидными мостиками. Гетеродимеры F1-F2 подвергаются сборке в вирионе в виде гомотримеров.
Вакцина против инфекции RSV в настоящее время не существует, хотя и является очень желательной. Одним потенциальным подходом к получению вакцины является субъединичная вакцина на основе очищенного F-белка RSV. Однако для этого подхода желательно, чтобы очищенный F-белок RSV находился в конформации, которая подобна конформации F-белка RSV в состоянии до слияния, который стабилен в течение продолжительного периода, и может быть получен в достаточных количествах. Кроме того, для вакцины на основе субъединицы необходимо осуществить усечение F-белка RSV путем делеции трансмембранного (ТМ) и цитоплазматического участка с получением растворимого секретируемого F-белка (sF). Поскольку участок ТМ отвечает за заякоривание в мембране и тримеризацию, незаякоренный растворимый F-белок является в значительной степени более лабильным, чем белок полной длины, и будет с легкостью подвергаться рефолдингу в конечное состояние после слияния. Для получения растворимого F-белка в стабильной конформации до слияния, который демонстрирует высокие уровни экспрессии и высокую стабильность, необходимо, таким образом, стабилизировать конформацию до слияния.
Стабилизация F-белка другого парамиксовируса в конформации до слияния была успешно выпол- 2 039803 нена для вируса парагриппа типа 5 (PIV5). Yin et al. (Nature, 439:38-44 (2006)) таким образом стабилизировали структуру F-белка до слияния PIV-5 с помощью мутации в сайта расщепления фурином в F0, что блокировало процессинг в F1 и F2. Кроме того, трансмембранный (ТМ) и цитоплазматический домен были замещены широко известным петлевым доменом тримеризации: GCN4pII. Этот домен образует тримерную спиральную суперспиральную структуру и является модификацией встречающегося в природе димерного спирального суперспирального пептида GCN4 (О'Shea et al., Science, 243:538-542 (1989)). Пептид GCN4-pII, в котором аминокислотная последовательность лейциновой застежки GCN4 была замещена изолейциновыми остатками в каждом положении a и d гептада, как показано, образует трехцепочечную параллельную альфа-петлевую суперспираль (Harbury et al., Science, 262:1401-1407 (1993)).
Для стабилизации F RSV в конформации до слияния использовали ту же стратегию, такую как, например, мутация в сайте расщепления фурином и слияние эктодомена RSV-F с доменом тримеризации GCN4pII (как раскрыто, например, в WO 2010/149743, WO 2010/149745, WO 2009/079796, WO 2012/158613) или с доменом тримеризации фибритина (MCLellan et al., Nature Struct. Biol. 17:2-248250 (2010)). Этот домен фибритина или Foldon получен из фибритина Т4 и описан ранее в качестве искусственного встречающегося в природе домена тримеризации (Letarov et al., Biochemistry Moscow, 64:817-823 (1993); S-Guthe et al., J. Mol. Biol. 337:905-915. (2004)). Однако эти усилия не привели к получению стабильного белка RSV-F до слияния. Более того, эти усилия даже не привели к получению кандидатов, пригодных для испытания у людей.
Настоящее изобретение далее представляет стабильные рекомбинантные F-полипептиды RSV до слияния, т.е. F-полипептиды RSV, которые являются стабилизированными в конформации до слияния. В исследовании, которое привело к настоящему изобретению, были введены и/или объединены несколько стадий модификации для получения упомянутых стабильных растворимых F-полипептидов RSV до слияния. Стабильные F-полипептиды RSV до слияния по настоящему изобретению находятся в конформации до слияния, т.е. они содержат (демонстрируют) по меньшей мере один эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка до слияния. Эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка до слияния, представляет собой эпитоп, который не представлен в конформации после слияния. Не ограничиваясь конкретной теорией, полагают, что конформация F-белка RSV до слияния может содержать эпитопы, которые являются такими же, как эпитопы на F-белке RSV, экспрессируемые на встречающихся в природе вирионах RSV, и таким образом, может предоставлять преимущества для активизации защитных нейтрализующих антител.
В определенных вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один эпитоп, который распознается специфическим моноклональным антителом до слияния, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 54, CDR2-участок тяжелой цепи с
SEQ ID NO: 55, CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 56 и CDR1-участок легкой цепи с
SEQ ID NO: 62, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 63 и CDR3-участок легкой цепи с
SEQ ID NO: 64 (далее в этом документе упоминаемый как CR9501), и/или специфическим моноклональным антителом до слияния, содержащим CDR1-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 58, CDR2-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 59, CDR3-участок тяжелой цепи с SEQ ID NO: 60 и CDR1-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 66, CDR2-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 67 и CDR3-участок легкой цепи с SEQ ID NO: 68 (упоминаемый как CR9502). CR9501 и CR9502 содержат вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, и таким образом, связывающие специфичности антител 58С5 и 30D8, соответственно, которые, как было показано ранее, специфично связываются с F-белком RSV в его конформации до слияния, но не в конформации после слияния (см. WO 2012/006596).
В определенных вариантах осуществления рекомбинантные F-полипептиды RSV до слияния содержат по меньшей мере один эпитоп, который распознается по меньшей мере одним специфичным моноклональным антителом до слияния, как описано выше, и полипептиды являются тримерными.
В определенных вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат мутацию аминокислотного остатка в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка в положении 215.
В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 67 подвергают мутированию до гидрофобной аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат мутацию аминокислотного остатка N или Т в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215.
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат домен F1 и домен F2 и связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислотных остатков, которая связывает указанный домен F1 с указанным доменом F2, где полипептиды дополнительно содержат мутацию аминокислотного остатка N или Т в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215.
В определенных вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат усеченный домен F1 и домен F2, и связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислотных остатков, связывающую указанный усеченный домен
- 3 039803
F1 с указанным доменом F2, где полипептиды дополнительно содержат мутацию аминокислотного остатка N или Т в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215.
Таким образом, полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию в домене F1 и/или домене F2 по сравнению с доменом F1 и/или F2 RSV в F-белке
RSV дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат мутацию аминокислотного остатка N или Т в положении 67 (N/T67I) в I и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215 в Р (S215P).
Известно, что RSV существуют в виде одного серотипа, имеющего две антигенные подгруппы: А и В. Аминокислотные последовательности зрелых процессированных F-белков двух групп являются идентичными на приблизительно 93%. Как используется во всей настоящей заявке, положения аминокислот приведены в отношении к последовательности F-белка RSV из штамма А2 (SEQ ID NO: 1). Как используется в настоящем изобретении, выражение аминокислота в положении х F-белка RSV, таким образом, означает аминокислоту, соответствующую аминокислоте в положении х в F-белке RSV штамма А2 RSV с SEQ ID NO: 1. Необходимо отметить, что в системе нумерации, используемой в настоящем документе, 1 относится к N-концевой аминокислоте незрелого F0-белка (SEQ ID NO: 1). При использовании штамма RSV, отличного от штамма А2, положения аминокислот F-белка следует нумеровать по отношению к нумерации F-белка штамма А2 SEQ ID NO: 1 с помощью выравнивания последовательностей другого штамма RSV с F-белком с SEQ ID NO: 1 со вставкой гэпов, при необходимости. Выравнивание последовательностей можно выполнять с помощью способов, хорошо известных в данной области, например, с помощью CLUSTALW, Bioedit или CLC Workbench.
Аминокислота в соответствии с настоящим изобретением может быть любой из 20 встречающихся в природе (или стандартных аминокислот) или их вариантов, таких как, например, D-аминокислоты (D-энантиомеры аминокислот с хиральным центром), или любым вариантом, которые не встречаются в природе в белках, таких как норлейцин. Стандартные аминокислоты можно разделить на несколько групп, исходя из их свойств. Важными факторами являются заряд, гидрофильность или гидрофобность, размер и функциональные группы. Эти свойства являются важными для структуры белков и белокбелковых взаимодействий. Некоторые аминокислоты обладают специфическими свойствами, такие как цистеин, который может образовывать ковалентные дисульфидные связи (или дисульфидные мостики) с другими цистеиновыми остатками, пролин, который индуцирует повороты полипептидного остова, и глицин, который является более гибким, чем другие аминокислоты. В табл. 11 представлены аббревиатуры и свойства стандартных аминокислот.
Опытному специалисту следует принять во внимание, что мутации можно осуществлять с белком при помощи стандартных методик молекулярной биологии. Результатом мутаций в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является повышенные уровни экспрессии и/или повышенные стабилизации F-полипептидов RSV до слияния по сравнению с F-полипептидами RSV, которые не содержат данную (данные) мутацию (мутации).
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния являются растворимыми.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния дополнительно содержат гетерологичный домен тримеризации, связанный с упомянутым усеченным доменом F1. В соответствии с настоящим изобретением было показано, что путем связывания гетерологического домена тримеризации с С-концевым аминокислотным остатком усеченного домена F1, необязательно объединенного со связывающей последовательностью, связывающей домен F1 и F2, и стабилизирующей (стабилизирующими) мутацией (мутациями), представлены F-полипептиды RSV, которые демонстрируют высокую экспрессию и которые связываются со специфичными антителами до слияния, указывая, что полипептиды находятся в конформации до слияния. Кроме того, F-полипептиды RSV стабилизированы в конформации до слияния, т.е. даже после процессинга полипептидов они по-прежнему связаны со специфичными антителами CR9501 и/или CR9502 до слияния, указывая, что специфический эпитоп до слияния сохраняется.
В дополнительных вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат одну или несколько дополнительных мутаций (по сравнению с F-белком RSV дикого типа), выбранных из группы, состоящей из:
(a) мутации аминокислотного остатка в положении 46;
(b) мутации аминокислотного остатка в положении 77;
(c) мутации аминокислотного остатка в положении 80;
(d) мутации аминокислотного остатка в положении 92;
(e) мутации аминокислотного остатка в положении 175;
(f) мутации аминокислотного остатка в положении 184;
(g) мутации аминокислотного остатка в положении 185;
(h) мутации аминокислотного остатка в положении 201;
(i) мутации аминокислотного остатка в положении 209;
(j) мутации аминокислотного остатка в положении 421;
- 4 039803 (k) мутации аминокислотного остатка в положении 426;
(l) мутации аминокислотного остатка в положении 465;
(m) мутации аминокислотного остатка в положении 486;
(n) мутации аминокислотного остатка в положении 487 и (o) мутации аминокислотного остатка в положении 508.
В предпочтительных вариантах осуществления одна или несколько дополнительных мутаций выбраны из группы, состоящей из:
(a) мутации аминокислотного остатка S в положении 46 в G (S46G);
(b) мутации аминокислотного остатка K в положении 77 в Е (К77Е);
(c) мутации аминокислотного остатка K в положении 80 в Е (К8ОЕ);
(d) мутации аминокислотного остатка Е в положении 92 в D (E92D);
(е) мутации аминокислотного остатка N в положении 175 в Р (N175P);
(f) мутации аминокислотного остатка G в положении 184 в N (G184N);
(g) мутации аминокислотного остатка V в положении 185 в N (V185N);
(h) мутации аминокислотного остатка K в положении 201 в Q (K201Q);
(i) мутации аминокислотного остатка K в положении 209 в Q (K209Q);
(j) мутации аминокислотного остатка K в положении 421 в N (K421N);
(k) мутации аминокислотного остатка N в положении 426 в S (N426S);
(l) мутации аминокислотного остатка K в положении 465 в Е или Q (K465Q);
(m) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в N (D486N);
(n) мутации аминокислотного остатка Е в положении 487 в Q, N или I (E487Q/N/I) и (o) мутации аминокислотного остатка K в положении 508 в Е (К5О8Е).
Снова необходимо отметить, что для положений аминокислотных остатков отсчет выполняется по отношению к SEQ ID NO: 1. Специалист сможет определить соответствующие аминокислотные остатки в F-белках других штаммов RSV.
В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат по меньшей мере две мутации (по сравнению с F-белком RSV дикого типа). В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере двумя мутациями являются мутация аминокислоты N или Т в положении 67 в I (N/T67I) и мутация аминокислоты S в положении 215 в Р (S215P).
В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из:
(a) мутации аминокислотного остатка S в положении 46 в G;
(b) мутации аминокислотного остатка K в положении 77 в Е;
(c) мутации аминокислотного остатка K в положении 80 в Е;
(d) мутации аминокислотного остатка Е в положении 92 в D;
(e) мутации аминокислотного остатка N в положении 175 в Р;
(f) мутации аминокислотного остатка G в положении 184 в N;
(g) мутации аминокислотного остатка V в положении 185 в N;
(h) мутации аминокислотного остатка K в положении 201 в Q;
(i) мутации аминокислотного остатка K в положении 209 в Q;
(j) мутации аминокислотного остатка K в положении 421 в N;
(k) мутации аминокислотного остатка N в положении 426 в S;
(l) мутации аминокислотного остатка K в положении 465 в Е или Q;
(m) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в N;
(n) мутации аминокислотного остатка Е в положении 487 в Q, N или I и (о) мутации аминокислотного остатка K или R в положении 508 в Е.
В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат по меньшей мере три мутации.
В определенных вариантах осуществления гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4).
Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат усеченный домен F1. Как используется в данном документе, усеченный домен F1 относится к домену F1, который не является доменом F1 полной длины, т.е. где на N-конце или С-конце один или несколько аминокислотных остатков были удалены. В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере трансмембранный домен и цитоплазматический хвост были удалены для обеспечения экспрессии продукта в виде растворимого эктодомена.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекают после аминокислотного остатка 495 в F-белке RSV (обозначенного SEQ ID NO: 1), т.е. С-концевая часть домена F1, начиная с аминокислотного остатка 496 (обозначенного SEQ ID NO: 1) была удалена. В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекают после аминокислотного остатка 513 в F-белке RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекают после аминокислотного остатка 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496,
- 5 039803
497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519,
520, 521, 522, 523, 525 или 525.
В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации связан с аминокислотным остатком
495 домена F1 RSV. В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации содержит SEQ ID NO: 4 и связан с аминокислотным остатком 495 домена F1 RSV.
В некоторых других вариантах осуществления домен тримеризации связан с аминокислотным остатком 513 домена F1 RSV. В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации содержит SEQ ID NO: 3 и связан с аминокислотным остатком 513 домена F1 RSV.
В некоторых вариантах осуществления домен F1, который является необязательно усеченным, и домен F2 связаны при помощи связывающей последовательности, которая связывает С-концевую аминокислоту домена F2 с N-концевой аминокислотой (необязательно усеченного) домена F1. В некоторых вариантах связывающая последовательность (или линкер) содержит от 1 до 10 аминокислотных остатков, предпочтительно от 2 до 9 аминокислотных остатков, предпочтительно от 3 до 8 аминокислотных остатков, предпочтительно от 4 до 7 аминокислотных остатков, более предпочтительно линкер содержит 5 или 6 аминокислотных остатков. В данной области техники известны несколько конформационно нейтральных линкеров, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением без нарушения конформации F-полипептидов RVS до слияния. В предпочтительных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GSGSG (SEQ ID NO: 5).
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма A RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из штамма А2 RSV с SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма A RSV с SEQ ID NO: 69.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма В RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из штамма В RSV SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из одного штамма RSV. В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния являются химерными полипептидами, т.е. содержат домены F1 и F2, которые происходят из разных штаммов RSV.
В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии F-полипептидов RSV до слияния настоящего изобретения повышен по сравнению с эктодоменом F-полипептида RSV дикого типа (т.е. без трансмембранного или цитоплазматического участка) без мутации (мутаций). В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии повышен по меньшей мере в 5 раз, предпочтительно до 10 раз. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии повышен более чем в 10 раз.
F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением являются стабильными, т.е. не изменяются с легкостью в конформацию после слияния при процессинге полипептидов, таком как, например, очистка, циклы замораживания-оттаивания и/или хранение и т.д.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением имеют повышенную стабильность при хранении при 4°C по сравнению с F-полипептидом RSV без мутации (мутаций). В некоторых вариантах осуществления полипептиды являются стабильными при хранении при 4°C в течение по меньшей мере 30 дней, предпочтительно по меньшей мере 60 дней, предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев, даже более предпочтительно по меньшей мере 1 года. Под стабильными при хранении подразумевается, что полипептиды по-прежнему демонстрируют по меньшей мере один эпитоп, который является специфичным для специфичного антитела до слияния (например, CR9501) при хранении полипептида в растворе (например, среде для культивирования) при 4°C в течение по меньшей мере 30 дней, например, как определено с помощью способа, описанного в примере 7 или 9. В некоторых вариантах осуществления полипептиды демонстрируют по меньшей мере один специфичный эпитоп до слияния в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно в течение по меньшей мере 1 года при хранении F-полипептидов RSV до слияния при 4°C.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV в соответствии с настоящим изобретением обладают повышенной стабильностью при воздействии теплом по сравнению с F-полипептидами RSV без указанной (указанных) мутации (мутаций). В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния являются термостабильными в течение по меньшей мере 30 мин при температуре 55°C, предпочтительно при 58°C, более предпочтительно при 60°C. Под термостабильными подразумевается, что полипептиды по-прежнему демонстрируют по меньшей мере один специфичный эпитоп до слияния после воздействия повышенной температурой в течение по меньшей мере 30 мин (т.е. температуры 55°C или выше), например, как определено с помощью способа, описанного в примере 6.
В определенных вариантах осуществления полипептиды демонстрируют по меньшей мере один специфичный эпитоп до слияния после воздействия от 1 до 6 циклов замораживания-размораживания в подходящей буферной смеси.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептид RSV до слияния по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-52 и 71-89. В определенных вариантах осуществления F-полипептид RSV до слияния по настоящему изо- 6 039803 бретению состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из
SEQ ID NO: 21-52 и 71-89.
Как используется во всем документе, нуклеотидные последовательности представлены в направлении от 5' до 3' и аминокислотные последовательности - от N-конца к С-концу, как принято в данной области.
В некоторых вариантах осуществления кодируемые полипептиды в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержат лидерную последовательность, также называемую как сигнальная последовательность или сигнальный пептид, соответствующую аминокислотам 1-26 в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 69. Она представляет собой короткий (длиной, как правило, 5-30 аминокислот) пептид, присутствующий на N-конце большинства вновь синтезируемых белков, которые предназначены для поступления в секреторный путь. В некоторых вариантах осуществления полипептиды в соответствии с настоящим изобретением не содержат лидерную последовательность.
В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат HIS-метку. HIS-метка или полигистидиновая метка представляет собой аминокислотный мотив в белках, который состоит по меньшей мере из пяти остатков (Н) гистидина, часто на N- или С-конце белка, который обычно используют для целей очистки.
В определенных вариантах осуществления полипептиды не содержат HIS-метку. В соответствии с настоящим изобретением неожиданно было показано, что при удалении HIS-метки уровень экспрессии и стабильность повышаются по сравнению с полипептидами с HIS-меткой.
Настоящее изобретение дополнительно представляет молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей F-полипептиды RSV в соответствии с настоящим изобретением.
В предпочтительных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды в соответствии с настоящим изобретением, являются оптимизированными по кодонам для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно клетках человека. Способы оптимизации по кодонам известны или были описаны ранее (например, WO 96/09378). Последовательность считается оптимизированной по кодонам, если по меньшей мере один кодон, не являющийся предпочтительным, по сравнению с последовательностью дикого типа замещен кодоном, который является более предпочтительным. В данном документе кодон, не являющийся предпочтительным, представляет собой кодон, который используется менее часто в организме, чем другой кодон, кодирующий такую же аминокислоту, и кодон, являющийся более предпочтительным, представляет собой кодон, который используется более часто в организме, чем кодон, не являющийся предпочтительным. Частоту использования кодонов для конкретного организма можно найти в таблицах частоты использования кодонов, таких как в http://www.kazusa.or.jp/codon. Предпочтительно более одного кодона, не являющегося предпочтительным, предпочтительно большинство или все кодоны, не являющиеся предпочтительными, замещают кодонами, которые являются более предпочтительными. Предпочтительно наиболее часто используемые кодоны в организме используются в оптимизированной по кодонам последовательности. Замещение предпочтительными кодонами, как правило, приводит к более высокой экспрессии.
Специалисту в данной области будет понятно, что несколько различных молекул полинуклеотидов и нуклеиновых кислот могут кодировать один и тот же полипептид в результате вырожденности генетического кода. Также понятно, что специалисты в данной области могут при помощи традиционных методик проводить нуклеотидные замены, которые не влияют на последовательность полипептида, кодируемую молекулами нуклеиновых кислот, для отражения частоты использования кодонов любым конкретным организмом-хозяином, в котором полипептиды будут экспрессироваться. Следовательно, если конкретно не указано иное, нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и РНК, могут включать в себя или могут не включать в себя интроны.
Последовательности нуклеиновых кислот можно клонировать с помощью стандартных методик молекулярной биологии или получать de novo с помощью синтеза ДНК, который можно проводить с использованием стандартных процедур при помощи компаний, предоставляющих услуги в области синтеза ДНК и/или молекулярного клонирования (например, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).
Настоящее изобретение также представляет векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, как описано выше. Таким образом, в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением является частью вектора. Такими векторами можно легко манипулировать с помощью способов, хорошо известных специалисту в данной области, и например, их можно сконструировать так, чтобы они были способны к репликации в прокариотических и/или эукариотических клетках. Кроме того, многие векторы можно использовать для трансформации эукариотических клеток, и они будут интегрироваться целиком или частично в геном таких клеток, что приведет в результате к стабильным клеткам-хозяевам, содержащим в их геноме необходимую нуклеиновую кислоту. Используемый вектор может представлять собой любой вектор, который подходит для клонирования ДНК и который можно использовать для транскрипции нуклеиновой кислоты, представляющей
- 7 039803 интерес. Подходящими векторами в соответствии с настоящим изобретением являются, например, аденовекторы, такие как Ad26 или Ad35, альфа-вирус, парамиксовирус, вирус осповакцины, вирус герпеса, ретровирусные векторы и т.д. Специалист в данной области может выбрать подходящие векторы экспрессии и вставить последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения функциональным образом.
Клетки-хозяева, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие F-полипептиды RSV до слияния, также образуют часть настоящего изобретения. F-полипептиды RSV до слияния можно получить с помощью технологии рекомбинантной ДНК, включающей экспрессию молекул в клеткаххозяевах, например клетках яичников китайского хомячка (СНО), линиях опухолевых клеток, клетках BHK, клеточных линиях человека, таких как клетки HEK293, клетки PER.C6 или клетках дрожжей, грибов, насекомых и т.п. или трансгенных животных или растений. В некоторых вариантах осуществления клетки происходят из многоклеточного организма, в некоторых вариантах осуществления они происходят из позвоночных или беспозвоночных. В некоторых вариантах осуществления клетками являются клетки млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клетками являются клетки человека. В целом получение рекомбинантных белков, таких как F-полипептиды RSV до слияния по настоящему изобретению, в клетке-хозяине предусматривает введение гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид в экспрессируемом формате, в клетку-хозяина, культивирование клеток в условиях, способствующих экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты и обеспечение экспрессии полипептида в указанной клетке. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок в экспрессируемом формате, может находиться в форме кассеты экспрессии и обычно требует последовательностей, способствующих экспрессии нуклеиновой кислоты, таких как энхансер(ы), промотор, сигнал полиаденилирования и т.п. Специалист в данной области осведомлен о том, что разные промоторы можно использовать для обеспечения экспрессии гена в клетках-хозяевах. Промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми, и их можно получать из разных источников, в том числе вирусов, прокариотических или эукариотических источников, или получать искусственным путем.
Среды для культивирования клеток доступны от различных поставщиков, и подходящую среду можно стандартно выбрать для клетки-хозяина для экспрессии белка, представляющего интерес, в данном случае F-полипептидов RSV до слияния. Подходящая среда может содержать или может не содержать сыворотку.
Гетерологической молекулой нуклеиновой кислоты (также называемой в данном документе как трансген) является молекула нуклеиновой кислоты, которая в природе не присутствует в клеткехозяине. Ее вводят, например, в вектор с помощью стандартных методик молекулярной биологии. Трансген обычно функционально связан с последовательностями, контролирующими экспрессию. Это можно выполнить, например, путем помещения нуклеиновой кислоты, кодирующей трансген(ы), под контроль промотора. Можно добавлять дополнительные регуляторные последовательности. Многие промоторы можно использовать для экспрессии трансгена (трансгенов), и они известны специалисту, например, такие промоторы могут включать промоторы вирусов, млекопитающих, синтетические промоторы и т.п. Неограничивающим примером подходящего промотора для получения экспрессии в эукариотических клетках является промотор CMV (патент США № 5385839), например предранний промотор CMV, например, содержащий нуклеотиды от -735 до +95 из энхансера/промотора предраннего гена CMV. Сигнал полиаденилирования, например сигнал polyA гена бычьего гормона роста (патент США № 5122458), может располагаться позади трансгена(ов). В качестве альтернативы несколько широко используемых векторов экспрессии доступны в данной области и их получают из коммерческих источников, например серии векторов pcDNA и pEF Invitrogen, pMSCV и pTK-Hyg от BD Sciences, pCMV-Script от Stratagene и т.д., которые можно использовать для рекомбинантной экспрессии белка, представляющего интерес, или для получения подходящих промоторов и/или последовательностей терминаторов транскрипции, последовательностей polyA и т.п.
Культура клеток может представлять собой любой тип культуры клеток, в том числе адгезивную культуру клеток, например клетки, прикрепленные к поверхности культурального флакона или к микроносителям, а также суспензионную культуру. Манипуляции с суспензионными культурами наиболее крупного масштаба проводят в периодическом процессе или процессе с подпиткой, поскольку они являются наиболее простыми для управления и увеличения масштаба. В настоящее время непрерывные процессы на основе принципов перфузии становятся более распространенными, и они также являются подходящими. Подходящие питательные среды хорошо известны специалисту в данной области и могут, как правило, быть получены из коммерческих источников в больших количествах или произведены по заказу согласно стандартным протоколам. Культивирование можно проводить, например, в чашках, роллерфлаконах или в биореакторах, используя периодические, подпитываемые, непрерывные системы и т.п. Известны подходящие условия для культивирования клеток (см., например, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), и R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)).
Настоящее изобретение также представляет композиции, содержащие F-полипептиды RSV до слияния, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор, как описано выше. Настоящее изобретение
- 8 039803 также представляет композиции, содержащие F-полипептид RSV до слияния, который демонстрирует эпитоп, присутствующий в конформации F-белка RSV до слияния, но отсутствует в конформации после слияния. Настоящее изобретение также представляет композиции, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, кодирующие такой F-полипептид RSV до слияния. Настоящее изобретение также представляет иммуногенные композиции, содержащие F-полипептиды RSV до слияния, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор, как описано выше. Настоящее изобретение также представляет применение стабилизированного F-полипептида RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты и/или вектор в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования у субъекта иммунного ответа к F-белку RSV. Дополнительно представлены способы индуцирования у субъекта иммунного ответа к F-белку RSV, предусматривающие введение субъекту F-полипептида RSV до слияния, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор в соответствии с настоящим изобретением. Также представлены F-полипептиды RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования иммунного ответа у субъекта к F-белку RSV. Также представлено применение F-полипептидов RSV до слияния, и/или молекул нуклеиновой кислоты, и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением для получения лекарственного средства для применения в индуцировании у субъекта иммунного ответа к F-белку RSV.
F-полипептиды RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты или векторы по настоящему изобретению можно использовать для предупреждения (профилактики) и/или для лечения инфекций RSV. В определенных вариантах осуществления предупреждение и/или лечение может быть направлено на группы пациентов, которые восприимчивы к инфекции RSV. Такие группы пациентов включают, без ограничений, например, пожилых (например, >50 лет, >60 лет и предпочтительно >65 лет), молодых (например, <5 лет, <1 лет), госпитализированных пациентов и пациентов, которые получали лечение противовирусными соединениями, но проявили недостаточный ответ на лечение противовирусными соединениями.
F-полипептиды RSV до слияния, молекулы нуклеиновых кислот и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением можно использовать, например, в самостоятельном лечении и/или профилактике заболевания или состояния, вызванного RSV, или в комбинации с другими профилактическими и/или терапевтическими средствами лечения, такими как (существующими или будущими) вакцины, противовирусные средства и/или моноклональные антитела.
Настоящее изобретение дополнительно представляет способы предупреждения и/или лечения у субъекта инфекции RSV с использованием F-полипептидов RSV до слияния, молекул нуклеиновых кислот и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением. В конкретном варианте осуществления способ предупреждения и/или лечения у субъекта инфекции RSV предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества F-полипептида RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты и/или вектора, описанных выше.
Терапевтически эффективное количество относится к количеству полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, которое является эффективным для предупреждения, уменьшение интенсивности и/или лечения заболевания или состояния, возникшего в результате инфекции, вызванной RSV. Предупреждение охватывает подавление или уменьшение распространения RSV или подавление или уменьшение проявления, развития или прогрессирования одного или нескольких симптомов, связанных с инфекцией, вызванной RSV. Уменьшение интенсивности, как используется в данном документе, может относиться к уменьшению видимых или ощутимых симптомов заболевания, виремии или других поддающихся измерению проявлений инфекции гриппа.
Для введения субъектам, таким как люди, в настоящем изобретении могут использоваться фармацевтические композиции, содержащие F-полипептид RSV до слияния, молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В настоящем контексте выражение фармацевтически приемлемый означает, что носитель или наполнитель в используемых дозировках и концентрациях не вызовет каких-либо нежелательных или вредных эффектов у субъектов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и наполнители хорошо известны из уровня техники (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). F-полипептиды RSV или молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора, хотя также возможно использование лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают путем стерильной фильтрации или с помощью других способов, широко известных из уровня техники. Затем растворы лиофилизируют или расфасовывают по контейнерам, предназначенным для лекарственных форм. рН раствора обычно находится в диапазоне от 3,0 до 9,5, например от 5,0 до 7,5. F-полипептиды RSV обычно находятся в растворе, имеющем подходящий фармацевтически приемлемый буфер, и композиция может также содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизирующее средство, такое как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах
- 9 039803 осуществления F-полипептиды RSV можно составлять в виде инъекционного препарата.
В некоторых вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит один или несколько адъювантов. Адъюванты, известные из уровня техники, дополнительно повышают иммунный ответ к применяемой антигенной детерминанте. Выражения адьювант и иммуностимулятор используют в данном документе взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, вызывающих стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа к F-полипептидам RSV по настоящему изобретению. Примеры подходящих адъювантов включают соли алюминия, такие как гидроксид алюминия и/или фосфат алюминия; композиции на основе масляных эмульсий (или композиции типа масло в воде), в том числе сквален-водных эмульсий, таких как MF59 (см., например, WO 90/14837); составы с сапонинами, такие как, например, QS21 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS) (см., например, US 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); производные бактерий или микроорганизмов, примерами которых являются монофосфорил липид A (MPL), 3-О-деацилированный MPL (3dMPL), олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG, ADP-рибозилирующие токсины бактерий или их мутантные формы, такие как термолабильный энтеротоксин LT из E. coli, холерный токсин СТ и т.п.; белки эукариотов (например, антитела или их фрагменты (например, направленные против самого антигена или CD1a, CD3, CD7, CD80) и лиганды к рецепторам (например, CD40L, GMCSF, GCSF и др.)), которые стимулируют иммунный ответ при взаимодействии с клетками реципиентов. В определенных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат в качестве адъюванта алюминий, например в форме гидроксида алюминия, фосфата алюминия, фосфата алюминия-калия или их комбинации в концентрациях 0,05-5 мг, например, 0,075-1,0 мг алюминия из расчета на дозу.
F-полипептиды RSV до слияния можно также вводить в комбинации с наночастицами или конъюгированными с наночастицами, такими как, например, полимерами, липосомами, виросомами, вирусподобными частицами. F-полипептиды до слияния можно комбинировать с наночастицами, инкапсулировать в наночастицах или конъюгировать с наночастицами с адъювантом или без него. Инкапсулирование в липосомы описано, например, в документе US 4235877. Конъюгирование с макромолекулами раскрыто, например, в документах US 4372945 или US 4474757.
В других вариантах осуществления композиции не содержат адъюванты.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение представляет способы получения вакцины против респираторного синцитиального вируса (RSV), включающие обеспечение композиции в соответствии с настоящим изобретением и помещение ее в фармацевтически приемлемую композицию. Выражение вакцина относится к средству или композиции, содержащим активный компонент, который является эффективным для индуцирования у субъекта определенной степени иммунитета к определенному патогенному микроорганизму или заболеванию, которые приведут по меньшей мере к снижению (до полного отсутствия включительно) тяжести, продолжительности или другого проявления симптомов, связанных с инфекцией патогенным микроорганизмом или заболеванием. В настоящем изобретении вакцина содержит эффективное количество F-полипептида RSV до слияния и/или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей F-полипептид RSV до слияния, и/или вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, который приводит к образованию иммунного ответа к F-белку RSV. Это обеспечивает способ предупреждения тяжелого заболевания нижних дыхательных путей, приводящего к госпитализации, и снижает частоту осложнений, таких как пневмония и бронхиолит у субъекта вследствие инфекции и репликации RSV. Выражение вакцина согласно настоящему изобретению подразумевает, что она представляет собой фармацевтическую композицию и, таким образом, как правило, включает фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель. Она может содержать или не содержать дополнительные активные ингредиенты. В определенных вариантах осуществления она может представлять собой комбинированную вакцину, которая дополнительно содержит другие компоненты, которые индуцируют иммунный ответ, например, против других белков RSV и/или против других возбудителей инфекции. Введение дополнительных активных компонентов можно, например, осуществлять путем отдельного введения или путем введения комбинации продуктов из вакцин по настоящему изобретению и дополнительных активных компонентов.
Композиции можно вводить субъекту, например субъекту-человеку. Суммарная доза F-полипептидов RSV в композиции для однократного введения может, например, составлять от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 10 мг, например, 1 мкг - 1 мг, например, 10-100 мкг. Определение рекомендуемой дозы будет осуществляться в процессе эксперимента и является стандартным для специалистов в данной области.
Введение композиций в соответствии с настоящим изобретением можно осуществлять с использованием стандартных путей введения. Неограничивающие варианты осуществления включают парентеральное введение, такое как внутрикожное, внутримышечное, подкожное, чрескожное введение или введение через слизистые, например интраназальное, пероральное и т.п. В одном варианте осуществления композицию вводят путем внутримышечной инъекции. Специалисту известны различные возможности введения композиции, например вакцины, для индуцирования иммунного ответа к антигену (антигенам), присутствующему в вакцине.
- 10 039803
Субъект, как используется в данном документе, предпочтительно представляет собой млекопитающее, например грызуна, например мышь, хлопкового хомяка или примата, кроме человека, или человека.
Предпочтительно субъект представляет собой субъекта-человека.
Полипептиды, молекулы нуклеиновых кислот, векторы и/или комбинации можно также вводить в виде прайма или в виде буста в гомологичном или гетерологичном режиме прайм-буст. При проведении бустерной вакцинации обычно такую бустерную вакцину будут вводить одному и тому же субъекту с промежутком от одной недели до одного года, предпочтительно от двух недель до четырех месяцев после введения композиции субъекту в первый раз (которое в данном случае называется первичной вакцинацией). В некоторых вариантах осуществления введение включает прайм и по меньшей мере одно бустерное введение.
Кроме того, полипептиды по настоящему изобретению можно использовать в качестве диагностического средства, например, для проверки иммунного статуса индивидуума путем определения способности антител в сыворотке такого индивида к связыванию с полипептидами по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к in vitro диагностическому способу для выявления у пациента присутствия инфекции RSV, при этом указанный способ включает стадии а) приведения в контакт биологического образца, полученного от указанного пациента, с полипептидом в соответствии с настоящим изобретением; и b) выявления присутствия комплексов антитело-полипептид.
Настоящее изобретение дополнительно представляет способ стабилизации конформации F-полипептида RSV до слияния, включающий введение одной или нескольких мутаций в домен F1 и/или F2 RSV, по сравнению с доменом F1 и/или F2 RSV дикого типа, где одна или несколько мутаций выбраны группы, состоящей из:
(a) стабилизирующей мутации, которая блокирует вращение домена HRA в участке, прилегающем к консервативному дисульфидному мостику 69-212, при этом указанный мостик содержит аминокислотные остатки 66-68 и 214-216;
(b) мутации в спирали (в С-конце домена F2), содержащей аминокислотные остатки 76-98 в С-конце домена F2;
(c) мутации, которая снижает отталкивание отрицательных зарядов между верхними частями участка стебля HRB (N-концевой конец HRB), содержащего аминокислоты 486, 487 и 489; и (d) стабилизирующей мутации в участке HRA.
В определенных вариантах осуществления мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 67.
В определенных вариантах осуществления мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 215.
В определенных вариантах осуществления мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 66 или 68 и/или в положении 214 или 216.
В определенных вариантах осуществления мутация в спирали находится в положении 77.
В определенных вариантах осуществления мутация в спирали находится в положении 80.
В определенных вариантах осуществления аминокислотный остаток в положении 77 и/или 80 изменяется в отрицательно заряженную аминокислоту.
В определенных вариантах осуществления мутация находится в положении 92.
В определенных вариантах осуществления мутация, которая снижает отталкивание отрицательных зарядов между верхними частями участка стебля HRB, содержит аминокислоты 486, 487, 489.
В определенных вариантах осуществления мутация находится в положении 489.
В определенных вариантах осуществления мутация находится в положении 486.
В определенных вариантах осуществления мутация стабилизирует бета-повороты между аминокислотными остатками 175-193.
В определенных вариантах осуществления мутация стабилизирует поворот в положении 175.
В определенных вариантах осуществления мутация стабилизирует поворот в положении 184-185.
Стабилизированные F-полипептиды RSV до слияния, получаемые и/или полученные с помощью такого способа, также образуют часть настоящего изобретения, а также варианты их применения, как описано выше.
Далее настоящее изобретение поясняют следующими примерами. Данные примеры не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом. Они служат лишь для пояснения настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1.
Получение стабильных F-полипептидов RSV до слияния линкеры и домены тримеризации.
В исследовании, которое привело к настоящему изобретению, стабилизированные варианты растворимых F-белков (sF) до слияния конструировали путем стабилизации двух основных участков, которые инициируют рефолдинг. Первой стратегией было блокирование пептида слияния в его положении и предотвращение его высвобождения из головного участка путем фиксации и соединения доменов F1-F2 с помощью короткой петли. Высвобождение пептида слияния можно предотвратить с помощью перенесе
- 11 039803 ния ковалентного соединения N-конца F1 к С-концу F2. Как показано в этом примере, подвергли испытаниям ряд разных линкеров. Вставка 5-аминокислотной петли между F1 и F2, в частности, содержащей аминокислотную последовательность GSGSG (SEQ ID NO: 5), была наиболее успешной. Этот линкер конструировали исходя из расстояния, определенного в 3D модели гомологии, которая была получена для RSV-F типа А2 на основе выравнивания последовательности с F-последовательностью вируса парагриппа 5 типа, для которого опубликована 3D структура (Yin et. al., 2006).
ААА47 881PIV5 MGTIIQFLVVSCLLAGAGSLDPAALMQIGVIPTNVRQLMYYTEASSA
FUS_HRSV1B MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYT
ACO83301HRSVA2ref MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYT
| AAA47881PIV5 | FIWKLMPTIDSPISGCNI—TSISSYNATVTKLLQPIGENLETIRNQLIP--TRRRRR- |
| FUS_HRSV1B | SVITIELSNIKET--KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAP |
| ACO83301HRSVA2ref | SVITIELSNIKKN--KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELP |
| AAA47881PIV5 | -----------------FAGWIGLAALGVATAAQVTAAVALVKANENAAAILNLKNAIQ |
| FUS_HRSV1B | QYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALL |
| ACO83301HRSVA2ref | RFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALL |
| AAA47881PIV5 | KTNAAVADWQATQSLGTAVQAVQDHINSVVSPAITAANCKAQDAIIGSILNLYLTELTT |
| FUS_HRSV1B | STNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLE |
| ACO83301HRSVA2ref | STNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLE |
| AAA47881PIV5 | IFHNQITNP-ALSPITIQALRILLGSTLPTWEKSFNTQISAAELLSSGLLTGQIVGLDL |
| FUS_HRSV1B | ITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSII |
| ACO83301HRSVA2ref | ITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSII |
- 12 039803
AAA47881PIV5
FUS_HRSV1B
ACO83301HRSVA2ref
AAA47881PIV5
FUS_HRSV1B
ACO83301HRSVA2ref
AAA47881PIV5
FUS_HRSV1B
ACO83301HRSVA2ref
TYMQMVIKIELPTLTVQPATQIIDLATISAFI—NNQEVMAQL--PTRVMVTG—SLIQA KEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFF KEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFF
YPASQCTITPNTVYCRYNDAQVLSDDTMACLQGN---LTRCTFSPVVGSFLTRFVLFDGI PQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGVYANCRS-MLCKCMQPAAVILQPSSSPVTVIDMYKCVSLQLDNLRFTITQLANVTYNSTI AIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKG AIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKG
AAA47881PIV5
FUS_HRSV1B
ACO83301HRSVA2ref
KLESS—QILSIDPLDISQNLAAVNKSLSDALQHLAQSDTYLSAITSATTTS—VLSIΙΑ EPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTII
EPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTII
ICLGSLGLILIILLSVWWKLLTIWANRNRMENFVYHK--------------------IVIIWLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK----------------IVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN----------------AAA47881PIV5
FUS_HRSV1B
ACO83301HRSVA2ref
Выравнивание между F-последовательностью HRSV типа А и В с PIV5 (верхняя последовательность), которую использовали для конструирования модели гомологии RSV-F до слияния.
Другим нестабильным участком является второй гептадный повтор (HRB), который образует тримерный спиральный участок стебля в F-белке до слияния. Делеция трансмембранного домена (ТМ) в растворимом F-белке дополнительно дестабилизирует этот участок, что было восполнено добавлением различных гетерологических доменов тримеризации. Полностью процессированный зрелый эктодомен RSV-F сливали на С-конце с различными доменами тримеризации и в различных положениях (т.е. домен F1 усекали по различным аминокислотным остаткам).
Несколько конструкций получали на основе штаммов А2 или В1 RSV. Различные домены тримеризации связывали с доменом F1 RSV, который усекали по различным положениям. Домены тримеризации, которые исследовали, включали мотив фибритина (содержащий аминокислотную последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4)), и мотив фибритин длинный, более длинный, растянутый на N-конце домен фибритина, который включает его встречающиеся в природе спиральные участки (содержащие аминокислотную последовательность: SSLQGDVQALQEAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 6)), которые добавляли к F1-домену RSV в рамке (в регистре) с предполагаемым гептадным повтором участка HRB.
Полученные дополнительные конструкции содержали гептадные идеальные спиральные тримерные суперспирали или домен изолейциновой застежки (IZ) (Suzuki et al., Protein Engineering, 11:1051-1055 (1998)), содержащие аминокислотную последовательность IEAIEKK (SEQ ID NO: 7). В соответствии с настоящим изобретением использовали различные домены IZ, обозначенные как изолейциновая застежка (L), содержащая аминокислотную последовательность (I) EKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 8), и изолейциновая застежка (S), содержащая аминокислотную последовательность EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3).
Эти домены IZ сопоставимы по структуре с GCN4, однако домены IZ не являются встречающимися в природе последовательностями, а сконструированы для того, чтобы быть оптимальными доменами тримеризации и поэтому более стабильными.
- 13 039803
Дополнительные конструкции получали с другими известными доменами тримеризации: GCN4II
EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA (SEQ ID NO: 9)
Оптимизированный GCN4II
EDKVEELLSKIYHIENRIARIEKLVGEA (SEQ ID NO: 10) Матриллин -1 (длинная версия)
EEDPCECKSIVKFQTKVEELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO:
11)
Матриллин - 1 которая версия, которая содержит только домен застежки:
EELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID NO: 12)
Получали следующие конструкции.
Конструкция F18 содержала домен тримеризации фибритина (SEQ ID NO: 4), связанный с аминокислотным остатком 513 домена F1.
Конструкция F19 содержала домен тримеризации фибритина (SEQ ID NO: 4), связанный с аминокислотным остатком 499 домена F1.
Конструкция F20 содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID NO: 8), связанный с аминокислотным остатком 516 домена F1 и содержащий дополнительные модификации в HRB для оптимизации гидрофобной природы гептадных положений и облегчения слияния с доменом IZ с сохранением рамки считывания.
Конструкция F21 также содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID NO: 8), но связанный с аминокислотным остатком 501 домена F1 и без дополнительных модификаций в участке HRB.
Конструкция F22 содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID NO: 8), связанный с аминокислотным остатком 495 домена F1 и содержащий дополнительные модификации в HRB.
Конструкция F23 содержала домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3), связанный с аминокислотным остатком 495.
Конструкция F46 содержала домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3), но связанный с более длинным эктодоменом RSV-F, т.е. домен F1 усекали после аминокислотного остатка 513.
Все конструкции содержали HIS-метку.
Конструкции исследовали в отношении уровней экспрессии, стабильности при хранении и связывания с антителом CR9501. Аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепей и CDR тяжелой и легкой цепей этого антитела приведены ниже. CR9501 содержит связывающие участки антител, обозначенных как 58С5 в WO 2012/006596.
Конструкции синтезировали и оптимизировали по кодонам в Gene Art (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Конструкции клонировали в pCDNA2004 или создавали при помощи стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР, и секвенировали. Используемой системой экспрессии были клетки 293Freestyle (Life Technologies). Клетки временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали в течение 5 дней при 37°C и 10% CO2. Супернатант культуры собирали и центрифугировали в течение 5 мин при 300xg для удаления клеток и клеточного дебриса. Отцентрифугированный супернатант затем фильтровали в стерильных условиях с помощью 0,22 мкм вакуумного фильтра и хранили при 4°C до использования.
Супернатанты с 5 дня оценивали в отношении экспрессии F-белка с помощью вестерн-блоттинга, используя моноклональное антитело CR9503, которое содержит вариабельные участки тяжелой и легкой цепей антитела к F RSV мотавизумаб (обозначенного как CR9503). Приблизительные уровни экспрессии конструкций F-белка RSV до слияния определяли с использованием CR9503, вторичного антитела, конъюгированного с IR-красителем, к иммуноглобулину человека (Li-Cor, Линкольн, Небраска) или HRP-конъюгированного мышиного антитела к IgG человека (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания). Затем определяли количества белка с помощью серии разбавлений очищенного стандартного белка RSV, или визуально на глаз, или с использованием системы Odyssey CLx для инфракрасной визуализации. Альтернативно использовали количественный октет (интерферометрия BioLayer) для определения концентрации белка в супернатантах. Для определения стабильности конструкций и выявления положительных или отрицательных влияющих стабилизирующих эффектов введенных мотивов тримеризации, конструкции, способные к связыванию с CR9501, обрабатывали в диапазоне температур от 45 до 65°C в течение 30 мин для исследования стабильности эпитопа CR9501.
Эта процедура подробно описана в примере 8. Результаты обобщены в табл. 1.
- 14 039803
Таблица 1
Экспрессия и стабильность конструкций F RSV с различными мотивами тримеризации
| Белок RSV | Описание | Стабильность* | |||
| Мотив тримеризации | Модификации | Точка терминации | Экспрессия (мкг/мл) | ||
| F18 | Фибритин | Отсутствуют | 513 | 2 | Нестабильный |
| F19 | Фибритин | Отсутствуют | 499 | 0 | ND |
| F2 0 | Изолейциновая застежка (L) | 502 509 516 Не | 516 | 0 | ND |
| F21 | Изолейциновая застежка (L) | Отсутствуют | 501 | 0 | ND |
| F22 | Изолейциновая застежка (L) | К483Е+Е488К | 495 | 0 | ND |
| F2 3 | Изолейциновая застежка (S) | Отсутствуют | 495 | 0,3 1 | Стабильный |
| F4 6 | Изолейциновая застежка (S) | Отсутствуют | 513 | Не экспрессировал | ND |
Стабильность определяли, как описано в примере 7;
ND: не определяли.
1Уровень экспрессии определяли с помощью вестерн-блоттинга, как описано в примере 1.
Как можно увидеть в табл. 1, единственными конструкциями, которые экспрессировались, были вариант фибритина (F18) и F23. Несмотря на то, что F18 был тримерным и демонстрировал экспрессию, он был нестабильным при хранении при 4°C. В противоположность этому, F23 был стабильным при 4°C, связывался со специфичными антителами до слияния, но, по-видимому, был мономерным. Таким образом, оба варианта F18 и F23 использовали для оптимизации стабильности и тримеризации.
Затем получали несколько конструкций, в которых пептид слияния на N-конце F1 был прикреплен путем слияния с С-концом домена F2. Все конструкции содержали His-метку.
Получали несколько конструкций, в том числе конструкции, в которых сайты расщепления фурином подвергали мутации, что приводило к образованию растворимого F-белка, который по-прежнему содержал пептид р27 (т.е. F12, F15.1 и F17). В других конструкциях участок из 27 остатков (петля Р27), который отщеплялся от предшественника F0, замещали альтернативной закрытой петлей или связывающей последовательностью: с помощью замещения участка RSV-F гомологичным участком PIV-5 F, F-белком до слияния, который получали и успешно кристаллизовали (F25), или путем замещения участка минимальной (GS)n петлей, которая бы связывала с помощью мостика концы F2 и F1 (F24), или путем замещения участка центральным консервативным участком RSV-G (F26). Моделирование гомологии RSV-F на основе PIV-5 и измерений in silico привело в результате к выбору минимальной петли из 5 аминокислотных остатков между остатками 108 и 136. В качестве линкера выбирали остатки Gly (G) и Ser (S), которые являются гибкими и полярными и имеют высокую вероятность быть внесенными (F24). Кроме того, F137 подвергали мутации в S, поскольку локальные модификации, вызванные петлей, могли смещать гидрофобный F и вызывать нестабильности. Это представлено ниже. Также R106 подвергали мутированию в Q и замещали 27 остатков (109-135), используя GSGSG.
PAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRR13 eFLG FLLGVG
PAANNQAR GSGSGR136SLGFLLGVG
Как представлено в табл. 2, все варианты не демонстрировали экспрессию или демонстрировали очень низкую экспрессию, за исключением варианта с короткой петлей GSGSG (F24), которая демонстрировала намного более высокую экспрессию (44 мкг/мл) по сравнению с конструкцией на основе F дикого типа RSV, т.е. подобной конструкцией, но без указанного линкера (F11). F24, который являлся тримерным, был, однако, нестабильным при хранении подобно всем другими вариантам с С-конценвым мотивом тримеризации фибритина. Все варианты содержали HIS-метку.
- 15 039803
Таблица 2
Экспрессия и стабильность конструкций на основе F RSV с различными линкерами F1-F2
| Белок RSV | Вариант | Мотив тримеризации | Линкер Fl, F2 | Описание Модификации | Точка терминации | Экспрессия (мкг/мл) | Стабильность* |
| F11 | В1 | Отсутствует | Отсутствует | Отсутствует | 513 | 2,5 | Стабильный |
| F18 | В1 | Фибритин | Отсутствует | Отсутствует | 513 | 2 | Нестабильный |
| F12 | В1 | Фибритин | р27 | КО сайта для фурина | 513 | 0, 1 | Нестабильный |
| F15, 1 | В1 | Отсутствует | р27 | КО сайта для фурина | 525 | 0,5 | ND |
| F17 | А2 | Фибритин | р27 | КО сайта для фурина | 513 | 0 | ND |
| F2 4 | В1 | Фибритин | Q__GSGSG_S | Отсутствует | 513 | 44 | Нестабильный |
| F2 5 | В1 | Фибритин | PIV | Отсутствует | 513 | 0 | ND |
| F2 6 | В1 | Фибритин | G CR | Отсутствует | 513 | 0 | ND |
Стабильность определяли, как описано в примере 7. Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1. ND - не определено.
Затем, наиболее подходящие модификации комбинировали для поиска оптимальных F-полипептидов до слияния. Комбинации получали из вариантов с петлей GSGSG, С-концевым усечением F1 и добавлением мотива фибритина (SEQ ID NO: 4) или изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3) (см. табл. 3).
Таблица 3
Экспрессия и стабильность конструкций на основе F RSV с комбинациями оптимизаций согласно табл. 1 и 2
| Белок RSV | Вариант | Точка терминации | Описание | Стабильность эпитопа CR9501 | |||
| Мотив тримеризации | Линкер F1, F2 | (мкг/мл) | Термостабильность (°C) | Хранение | |||
| Fil | Bl | 513 | Отсутствует | Отсутствует | 2,5 | 48 | Стабильный |
| F2 3 | Bl | 495 | Изолейциновая застежка (S) | Отсутствует | 0,3 | ND | Стабильный |
| F2 4 | Bl | 513 | Фибритин | Q__GSGSG_S | 44 | 51 | Нестабильный |
| F4 5 | Bl | 495 | Фибритин | Отсутствует | 0 | ND | ND |
| F4 4 | Bl | 495 | Фибритин | Q__GSGSG_S | 0 | ND | ND |
| F4 9 | Bl | 495 | Отсутствует | Отсутствует | 2 | ND | Стабильный |
| F50 | A2 | 495 | Отсутствует | Отсутствует | 2 | ND | Стабильный |
| F4 3 | Bl | 495 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | 0,4 | 53 | Стабильный |
| F4 7 | A2 | 495 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | 5 | 52 | Стабильный |
| F5 6 | Bl | 513 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | 0,4 | ND | Стабильный |
| F4 6 F42 | Bl Bl | 513 513 | Изолейциновая застежка (S) Отсутствует | Отсутствует Q__GSGSG_S | 0 20 | ND 54 | Нестабильный Стабильный |
| F57 | A2 | 513 | Отсутствует | Q__GSGSG_S | 2-10 | 54 | Стабильный |
ND - не определено.
Стабильность при хранении, как определяли в примере 7; термостабильность, как определяли в примере 8. Уровень экспрессии определяли с помощью вестерн-блоттинга (описано в примере 1).
Добавление петли GSGSG всегда повышало экспрессию функциональных конструкций, а также термостабильность белка. Комбинация петли GSGSG с усеченным F и мотивом изолейциновой застежки (S) (F43, F47) продемонстрировала высокую экспрессию, термостабильность и значительную стабильность в хранении при 4°C. Однако эти варианты были по-прежнему мономерными. Мотив тримеризации с изолейциновой застежкой (S) демонстрировал более высокую экспрессию с вариантом F, который представлял собой F, усеченный на С-конце в положении 495 (ср. F43 с F56 и F23 с F46). В противоположность этому, для вариантов с доменом тримеризации фибритина усечение в положении 513 продемонстрировало высокую экспрессию по сравнению с усечением в положении 495, которое не демонстрировало экспрессии (ср. F24 с F44).
Поскольку HIS-метку могла нарушать нативный фолдинг тримеров, то конструировали варианты без HIS-метки для фибритина и варианта изолейциновой застежки (S) (табл. 4).
- 16 039803
Таблица 4
| Экспрессия и стабильность конструкций на основе F RSV с HIS-меткой и без HIS-метки | |||||||||
| Белок RSV | Вариант | Мотив тримеризации | Линкер F1, F2 | Точка терминации | Экспрес- сия мкг/мл | % тримеризации | Термостабильность (°C) | Хранение | Метки |
| F2 4 | В1 | Фибритин | Q__GSGSG_S | 513 | 44 | Тримерный (SEC) | 51 | Неста- бильный | His-метка |
| F24- | В1 | Фибритин | Q__GSGSG_S | 513 | 55 | 100% (нативный) | ND | Нестабильный | Отсут- ствует |
| F4 7 | А2 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | 495 | 5 | 0% (Odyssey) | 52 | Стабильный | His-метка |
| F47- | А2 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | 495 | 10 | 2-5% (Odyssey) | 53 | Стабильный | Отсут- ствует |
| A2_F24 | А2 | Фибритин | Q__GSGSG_S | 513 | 5, 3 | Тримерный (нативный) | 48,75 | Неста- бильный | Отсут- ствует |
*Стабильность при хранении определяли, как описано в примере 7; термостабильность определяли, как описано в примере 8.
ND: не определено.
Удивительным являлось то, что делеция HIS-метки повышала экспрессию в F47. Более того, для F47 она немного повышала содержание тримеров, и для F24 она умеренно повышала только уровень экспрессии.
Затем изучали несколько альтернативных доменов тримеризации и усечений в комбинации со стабилизированным петлей GSGSG вариантом F (F47) (см. табл. 5). Все варианты имеют петлю GSGSG и содержат HIS-метку.
Таблица 5
| Экспрессия и стабильность вариантов на основе F RSV с альтернативными доменами тримеризации | ||||||||
| Белок RSV | Вариант | Описание | % тримеризации | Связывание антитела | ||||
| Мотив тримеризации | Модификации | Точка терминации | Экспрессия (мкг/мл) | CR9501 | CR9503 | |||
| F47 | А2 | Изолейциновая застежка (S) | Нет | 495 | 5 | 0% | + | + |
| Р1 | Bl | Изолейциновая застежка (S) | S502T | 502 | 3,5 | 0% | + | + |
| Matl | А2 | Матриллин длинный | Отсутствует | 520 | 12 | Три- и гексадимеры | - | + |
| Mat2 | А2 | Матриллин короткий | Отсутствует | 516 | 0 | ND | - | - |
| Mat3 | А2 | Матриллин короткий | Отсутствует | 495 | 1,5 | ND | - | - |
| Оптимизированный GCN | А2 | Оптимизированный GCN4II | Отсутствует | 516 | 0 | ND | - | - |
| Оптимизированный GCN+L512K | А2 | Оптимизированный GCN4II | L512K | 516 | 1 | ND | + | - |
Связывание антитела определяли как связывание в день сбора клеток (как описано в примере 7); + указывает связывание.
- указывает отсутствие связывания.
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1.
ND: не определено.
Только домен матриллина 1 (Dames-SA et. al., Nat. Struc. Biol., 5(8), 1998), который содержит и N-концевой домен застежки, и С-концевую часть с остатками цистеина, которые могут потенциально образовывать дисульфидные мостики между тримерами, как было обнаружено, способен к более высоким уровням экспрессии, чем F47 (табл. 5, матриллин длинный). Более того, вариант с мотивом тримериации матриллина длинного демонстрирует тримерные F-белки. Однако продукт не связывался со специфическим Mab CR9501 до слияния и также демонстрировал гексамерные молекулы, которые делают домен тримеризации матриллина 1 не подходящим для получения тримерного нативного F-белка. Никакой из мотивов застежки на основе матриллина или на основе GCN4II не демонстрировал повышенной экспрессии или стабильности по отношению к F47 (табл. 5, матриллин короткий, GCN4II- 17039803 оптимизированный). Снова усечение на 495 приводит к более высоким уровням экспрессии. Добавление мотива GCN4, который содержал оптимизированную триггерную последовательность, не продемонстрировало экспрессии.
GCN4II представляет собой домен тримеризации, который успешно используют для стабилизации тримера вируса парагриппа типа 5 до слияния (Yin et al., Nature, 439:38-44, 2006), и его испытывали другие для стабилизации F RSV до слияния (как раскрыто, например, в WO 2010/149743, WO 2010/14975, WO 2009/079796, WO 2010/158613). Домен тримеризации GCN4II оценивали и сравнивали с другими конструкциями, которые содержат домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3) или домен фибритина (SEQ ID NO: 4) (результаты представлены в табл. 6). Эти варианты также сравнивали с другими модификациями, т.е. коротким линкером на основе одной мутации лизина и L512K. Все варианты содержали HIS-метку.
Таблица 6
Экспрессия и стабильность вариантов F RSV с замещением GCN4II, L512K и р27 (один аминокислотный линкер (K) между F1 и F2)
| Белок RSV | Вариант | Описание | Стабильность | |||||
| Мотив тримеризации | Линкер F1, F2 | Модификации | Точка терминации | Экспрессия (мкг/мл) | Термостабильность (°C) | Хранение* | ||
| F18 | В1 | Фибритин | Отсутствует | Отсутствует | 513 | 2 | ND | Нестабильный |
| F2 4 | В1 | Фибритин | Q__GSGSG_S | Отсутствует | 513 | 44 | 51 | Нестабильный |
| F4 3 | В1 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | Отсутствует | 495 | 0,4 | 53 | Стабильный |
| Р1 | В1 | Изолейциновая застежка (S) | Q__GSGSG_S | S502T | 502 | 3,5 | 54 | ND |
| F42 | В1 | Отсутствует | Q GSGSG S | Отсутствует | 513 | 16, 1 | 54 | Стабильный |
| Р2 | В1 | Отсутствует | К | Отсутствует | 513 | 14,3 | 54 | Стабильный |
| РЗ | В1 | GCN4II | Отсутствует | L512K | 516 | 0 | ND | ND |
| Р4 | В1 | GCN4II | К | L512K | 516 | 0 | ND | ND |
| Р5 | В1 | GCN4II | К | L512K | 516 | 0 | ND | ND |
| Р6 | А2 4 | GCN4II | К | L512K | 516 | 0 | ND | ND |
| Р7 | А2 | GCN4II | К | L512K | 516 | 0 | ND | ND |
Стабильность при хранении определяли, как описано в примере 7; уровни экспрессии определяли, как описано в примере 1; термостабильность определяли, как описано в примере 8.
ND: не определено.
Короткая связь между F1 и F2, по-видимому, сопоставима с петлей GSGSG. Добавление мотива GCN4II не приводит в результате к какой-либо экспрессии F-белка в какой-либо из исследованных конструкций (т.е. ни в последовательности F RSV А2, описанной в WO 2010/149743 или WO 2010/149745, ни в последовательности F RSV А2, используемой в соответствии с настоящим изобретением, ни последовательности F RSV B1).
Было показано в соответствии с настоящим изобретением, что введение этих двух типов модификаций, т.е. введение связывающей последовательности и гетерологического домена тримеризации, было недостаточно для обеспечения экспрессии стабильного тримерного F-белка до слияния. Помимо этих двух основных участков нестабильности, которые были стабилизированы, т.е. HRB и пептида слияния, как описано выше, другие участки в F-белке до слияния также способствуют значительному рефолдингу и/или вносят значительный рефолдинг в F после слияния, и можно оптимизировать больше положений в последовательности для остановки рефолдинга F-белка до слияния. Таким образом, разные аминокислотные остатки в домене HRA и HRB и во всех доменах, которые контактируют с этими участками в F до слияния, подвергали мутированию для повышения структурной стабильности до слияния, как описано в следующих примерах.
Пример 2.
Получение стабильных F-полипептидов RSV до слияния стабилизирующие мутации.
Поскольку содержание тримеров (для конструкции F47) и стабильность при хранении (для конструкции F24) не были оптимальными, создавали дополнительные варианты, которые содержали точечные мутации для повышения уровней экспрессии, стабильности и нативной тримерной структуры. Результаты представлены в табл. 7 и 8.
- 18 039803
Таблица 7
Экспрессия и стабильность вариантов F47-_______________
| Белок RSV | Экспрессия (мкг/мл) | тримеризации | Термостабильность (°C) |
| F47- | 10 | 2-5% | 53 |
| F47-+K465E | 6 | 2,4% | ND |
| F47-+D479K | 5 | 29% | 50,77 |
| F47-+K176M | 13 | 5% | ND |
| F47-+K209Q | 9 | 3% | 52,9 |
| F47-+S46G | 38 | 11% | 59, 38 |
| F47-+S215P | 8 | 1-2% | 57,21 |
| F47-+N67I | 15 | 2% | 59, 84 |
| F47-+K465Q | 18 | 2% | 54,3 |
| F47- S46G+N67I | 31 | 6% | >60 |
| F47- S46G+S215P | 38 | 6% | >60 |
| F47- K465Q+K209Q | 12 | 1% | 53,3 |
| F47- K465Q+S46G | 28 | 7% | 57,7 |
| F47- K465Q+N67I | 17 | 2% | 59 |
| F47- K209Q+N67I | 15 | 4% | >60 |
| F47- K209Q+S215P | 15 | 2% | 56, 7 |
ND: не определено.
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1; термостабильность определяли, как описано в примере 8.
Номенклатура мутаций на основе последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 1).
Все конструкции являются вариантами F47-: тип А2, мотив изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3), линкер GSGSG; точка терминации 495, без HIS-метки (SEQ ID NO: 16). Как представлено в табл. 7, многие мутации повышали экспрессию F47-, но только вариант F47_S46G одновременно демонстрировал более высокий уровень тримеров, помимо высокой экспрессии.
В табл. 8 представлены результаты экспрессии и стабильности вариантов для F24. Все варианты представляли собой RSV типа А2, с мотивом фибритина, линкером GSGSG; точкой терминации 513, без HIS-метки.
- 19 039803
Таблица 8
Экспрессия и стабильность вариантов A2_ F24- (SEQ ID NO: 19)
| Белок RSV | Экспрессия (мкг/мл) | Хранение | |
| Конечная точка | Фазовая ассоциация | ||
| A2_F24 | 5, 3 | 69 | ND |
| A2_F24 K508E | 5, 3 | 64 | ND |
| A2_F24 K498E | 1,7 | ND | ND |
| A2_F24 E487I | 25, 0 | 10 | ND |
| A2_F24 E487K | 7,1 | ND | ND |
| A2_F24 E487N | 42,4 | 22 | ND |
| A2_F24 E487P | 12,8 | 46 | ND |
| A2_F24 E487Q* | 14, 8 | 50 | ND |
| A2_F24 E487R | 8,7 | 59 | ND |
| A2_F24 E487S | 6, 7 | 46 | ND |
| A2_F24 E487Y | 10,5 | 36 | ND |
| A2_F24 D486N | 31,2 | 19 | ND |
| A2_F24 D479N | 5, 2 | ND | ND |
| A2_F24 D479K | 1,5 | 62 | ND |
| A2_F24 E472Q | 1,9 | ND | ND |
| A2_F24 E472K | 0, 9 | ND | ND |
| A2_F24 K465E | 14,8 | 76 | ND |
| A2_F24 K465Q* | 13, 6 | 92 | Нестабильный |
| A2_F24 E463K | 3, 1 | ND | ND |
| A2_F24 E463Q | 6, 0 | ND | ND |
| A2_F24 G430S | 4,8 | ND | ND |
| A2_F24 N428R | 5, 2 | 35 | ND |
| A2_F24 N426S | 18, 6 | 71 | ND |
| A2_F24 K421N | 9, 2 | 75 | ND |
| A2_F24 E328K | 9, 5 | 21 | ND |
| A2_F24 T311S | 3,5 | 70 | ND |
| A2_F24 I309V | 11,3 | 69 | ND |
| A2_F24 D269V | 0, 0 | ND | ND |
| A2_F24 S215P* | 18,7 | 99 | Стабильный |
- 20 039803
| A2_F24 K209Q | 31,4 | 63 | ND |
| A2_F24 V207P | 3,3 | 79 | ND |
| A2_F24 I206P | 5, 4 | 55 | ND |
| A2_F24 L204P | 5, 9 | ND | ND |
| A2_F24 L203P | 0, 8 | ND | ND |
| A2_F24 Q202P | 4,4 | ND | ND |
| A2_F24 K201Q | 21,3 | 62 | ND |
| A2_F24 D194P | 1,9 | ND | ND |
| A2_F24 L193P | 6, 5 | 42 | ND |
| A2_F24 V192P | 0, 6 | 32 | ND |
| A2_F24 V185N | 50,2 | 38 | ND |
| A2_F24 GV184EG | 3,5 | ND | ND |
| A2_F24 G184N | 59, 8 | 37 | ND |
| A2_F24 V178P | 14,8 | 23 | ND |
| A2_F24 A177P | 2,0 | ND | ND |
| A2_F24 K176M | 14,7 | 58 | ND |
| A2_F24 K176E | 0,7 | ND | ND |
| A2_F24 N175P | 34,3 | 55 | ND |
| A2_F24 S169P | 0,5 | ND | ND |
| A2_F24 K168P | 0, 1 | ND | ND |
| A2_F24 K166P | 12,3 | 45 | ND |
| A2_F24 V157P | 0,2 | ND | ND |
| A2_F24 E92D | 47,4 | 94 | Нестабильный |
| A2_F24 K85E | 1,1 | ND | ND |
| A2_F24 K80E | 51,9 | 60 | ND |
| A2_F24 K77E | 22,4 | ND | ND |
| A2_F24 N67I* | 89, 8 | 101 | Стабильный |
| A2_F24 I57V | ND | ND | |
| A2_F24 VI56IV | 16, 5 | 54 | ND |
| A2_F24 S46G* | 40,7 | 96 | Нестабильный |
Помеченные * конструкции подвергали тестированию в отношении тримеризации и было установлено, что все являлись тримерными
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1.
Конечная стабильность представлена в данном документе в виде процента связывания антитела до слияния (CR9501) через 5 дней хранения при 4°С по отношению к 1 дню; стабильность фазовой ассоциации определяют, как описано в примере 9.
Многие мутации повышали экспрессию A2_F24-. Для большинства мутаций наблюдали видимую взаимосвязь между повышенной экспрессией на фоне F47- (табл. 7) и на фоне A2_F24- (табл. 8). N67I оказывала более положительное влияние на экспрессию F на фоне A2_F24-. Наиболее значимого повышения экспрессии достигали с использованием единичных точечных мутаций: S46G, S215P, N67I, К80Е, E92D, D486N, G184N, V185N, E487N, N175P, K209Q, E487I, E487Q, К77Е, K201Q, N426S и K465Q. При первичном скрининге с помощью анализа конечной стабильности (пример 7) варианты с наиболее высокой экспрессией также демонстрировали лучшую стабильность при хранении (E92D, K465Q, К465Е, N426S, S46G, S215P и N67I). Для того чтобы оценить, действительно ли эти мутации стабилизировали конформацию до слияния, супернатанты культур разводили до 5 и 10 мкг/мл, исходя из результатов количественного вестерн-блоттинга, и их хранили до 33 дней при 4°С. В качестве точечных мутантов только N67I и S215P были полностью стабильны со временем (см. пример 9).
Затем несколько мутаций, которые демонстрировали высокую экспрессию и надлежащую стабильность конформации до слияния, комбинировали для того чтобы оценить, были ли стабилизации аддитивными или имели ли возможный синергетический эффект (табл. 9).
-21 039803
Таблица 9
Экспрессия и стабильность вариантов A2_F24 с двумя дополнительными мутациями
| Белок RSV | Экспрессия (мкг/мл) | Стабильность* |
| A2_F24 K465Q+S46G | 21,8 | Нестабильный |
| A2_F24 K465Q+N67I | 122,3 | Стабильный |
| A2_F24 K465Q+E92D | 10,5 | Стабильный |
| A2_F24 K465Q+S215P | 59, 8 | Стабильный |
| A2_F24 S46G+N67I | 115, 5 | Стабильный |
| A2_F24 S46G+E92D | 14,3 | Нестабильный |
| A2_F24 N67I+E92D | 134,2 | Стабильный |
| A2_F24 N67I+S215P | 152,1 | Стабильный |
| A2_F24 E92D+S215P | 49, 1 | Стабильный |
| A2_F24 K465Q+S215P | 53,3 | Стабильный |
| A2_F24 S46G+S215P | 43, 8 | Стабильный |
Стабильность при хранении относится к анализу фазовой ассоциации, представленной в примере 9.
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1.
Все варианты являлись вариантами F24-: А2 типа, мотив фибритина, линкер GSGSG; точка терминации 513, связывание со всеми Mab, без HIS-метки (SEQ ID NO: 19).
При комбинировании ранее выявленных точечных мутаций можно было наблюдать очень интересные синергетические эффекты в отношении уровней экспрессии с комбинациями, включающими N67I в качестве наиболее эффективной. Все полученные двойные мутанты, независимо от того была ли включена N67I или S215P, были стабильными спустя более 30 дней при хранении при 4°C (пример 9). Неожиданным образом, было установлено, мутация N67I оказывала наиболее сильный эффект на уровни экспрессии F до слияния при включении в двойные мутанты. Также комбинации с мутациями S215P приводили к умеренной экспрессии. Выбирали комбинацию N67I с S215P, поскольку она приводила к очень высокому уровню экспрессии, и поскольку обе точечные мутации были стабильными при хранении. Кроме того, было отмечено, что N67I и S215P обладали способностью стабилизировать некоторые мутанты, которые в качестве единичных мутаций были нестабильными, указывая на то, что участок, где эти две мутации встречались, является центральным для конформационных изменений, которым подвергается белок во время перехода к конформации после слияния.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением было показано, что по меньшей мере некоторые мутации приводили в результате к повышенным уровням экспрессии и повышенной стабилизации белка RSV до слияния. Предполагается, что эти явления связаны. Мутации, описанные в этом примере, все в результате приводили к повышенному продуцированию F-полипептидов до слияния. Только выбор этих полипептидов оставался стабильным при длительном хранении (смотри пример 9). Используемый анализ стабильности основывается на потере специфического эпитопа CR9501 до слияния в верхней части F до слияния в анализе связывания, и он может быть недостаточно чувствительным для определения всех вкладов в стабильность всего белка. Мутации, для которых наблюдали только повышенную экспрессию, являются, таким образом (вероятно стабилизирующими), потенциальными мутациями, которые можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями для получения F-конструкции до слияния с высокой стабильностью и высокими уровнями экспрессии.
Затем проверяли, была ли способна двойная мутация N67I-S215P, подобно единичным мутациям, стабилизировать точечные мутации, которые, как единичные мутации считались нестабильными на основании использованных критериев. Выбирали дополнительные мутации на основе подходящих уровней экспрессии и стабильности в соответствии с табл. 8. Разрабатывали и исследовали в отношении уровней экспрессии и стабильности варианты тройных мутантных RSV-F (табл. 10).
- 22 039803
Таблица 10
Экспрессия и стабильность вариантов F24_N67I+S215P с одной дополнительной мутацией
| Белок RSV | Экспрессия (мкг/мл) | Стабильность* |
| A2_F24 N67I+S215P+K507E | 344, 6 | + + |
| A2_F24 N67I+S215P+E487I | 239, 4 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+E487N | 285, 2 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+E487Q | 360,7 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+E487R | 130, 9 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+D486N | 292, 6 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+D479N | 97,1 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+K465Q | 283,3 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+N426S | 316, 3 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+K421N | 288,4 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+K209Q | 245, 0 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+K201Q | 231,9 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+V185N | 445, 1 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+G184N | 326, 7 | + + + |
| A2_F24 N67I+S215P+E92D | 308,8 | + |
| A2_F24 N67I+S215P+K80E | 210, 6 | + |
| A2_F24 N67I+S215P+S46G | 199, 4 | + + + |
Все варианты были вариантами A2_F24_N67I +S215P А2 типа, мотив фибритина, линкер GSGSG; точка терминации 513, связывание со всеми Mab, без HISметки (SEQ ID NO: 21).
Стабильность относится к анализу фазовой ассоциации, представленной в примере 9.
+ означает <10% потери связывания CR9501 через 5 дней;
++ означает <5% потери связывания CR9501 через 5 дней;
+++ означает 0% потери связывания CR9501 через 5 дней.
Снова наблюдали аддитивный эффект в отношении уровней экспрессии. Как ожидалось, тройные мутанты D479N и E487R экспрессируют при несколько меньших уровнях, поскольку единичные мутанты также находились среди наиболее низких из выбранных мутаций (табл. 8). В связи со стабилизирующим эффектом мутации N67I+S215P, дополнительные мутации, которые являются нестабильными в качестве единичных мутаций, приводили к образованию стабильных вариантов F до слияния при добавлении к фону A2_F24 N67I+S215P. Некоторыми наиболее иллюстративными примерами являются тройные мутанты с дополнительной V185N, G184N или E487N, которые демонстрировали высокую экспрессию, но низкую стабильность в качестве единичных мутантов (табл. 8), но демонстрировали даже более высокую экспрессию и были высокостабильными при добавлении к фону A2_F24 N67I+S215P.
Стабилизирующие мутации также стабилизируют белок RSV-F из других штаммов и также в процессированном варианте F
Несколько мутаций, которые демонстрировали высокую экспрессию и значительную стабильность конформации до слияния, использовали в отношении F-белков RSV из других штаммов (SEQ ID NO 69 и 70) и использовали в отношении варианта F RSV А2 без мутаций в сайте расщепления фурином (F18: SEQ ID NO 71) для оценки являются ли модификации универсальным решением для стабилизации F RSV до слияния (табл. 11).
- 23 039803
Таблица 11
Экспрессия и стабильность вариантов A2_F 18 с дополнительными мутациями и F из штамма B1 (SEQ ID NO: 2) и CL57-v224 типа А (SEQ ID NO: 69)
| Белок RSV | Seq ID | Относительная* экспрессия (CR9503) | Стабильность** через 5 дней, | ||
| А2_Е18 | 71 | 0, 018 | 0, 0 | ||
| А2_Е18 | N67I | 0,449 | 73,2 | ||
| A2_F18 | S215P | 0, 129 | 9, 1 | ||
| А2_Е18 | E487Q | 0, 006 | ΝΑ | ||
| A2_F18 | N67I, S215P | 72 | 0,484 | 103,4 | |
| A2_F18 | N67I, E487Q | 0,340 | 92,1 | ||
| A2_F18 E487Q | N67I, | S215P, | 76 | 0,355 | 92,7 |
| A2_F18 E92D | N67I, | S215P, | 78 | 0,318 | 96, 0 |
| A2_F18 D4 8 6N | N67I, | S215P, | 79 | 0,522 | 101,3 |
| A2_F18 K201N | N67I, | S215P, | 77 | 0, 643 | 102,7 |
| A2_F18 K66E | N67I, | S215P, | 0, 800 | 103, 0 | |
| A2_F18 N67I, S46G, K66E | S215P, | 0, 820 | 103,5 | ||
| A2_F18 E487Q, | N67I, K66E | S215P, | 0,704 | 99, 5 | |
| A2_F18 N67I, E92D, K66E | S215P, | 0, 905 | 98,8 | ||
| A2_F18 | N67I, | S215P, | 0,863 | 96, 6 | |
| D486N, | K66E | ||||
| A2_F18 K201N, | N67I, K66E | S215P, | 1,021 | 105, 5 | |
| A2_F18 D486N, | N67I, S215P, K66E, I76V | 0,594 | 95, 0 | ||
| Bl_ N67I, S215P | 73 | 0,434 | 90, 9 | ||
| Bl_ N67I, петлевой | S215P | 22 | 0,552 | 108,2 | |
| CL57v224_ N67I, | S215P | 74 | 0, 698 | 94,9 | |
| CL57v224_ N67I, петлевой | S215P | 75 | 0, 615 | 98,4 |
Экспрессию белка (концентрация в супернатанте временно трансфицированных клеток) определяли с помощью количественной методики Octet.
Относительную экспрессию нормализуют по отношению к экспрессии
A2_F24_N67I, S215P, E487Q (SEQ ID NO: 33).
**Стабильность выражают в виде % концентрации белка, определенного после хранения при 4°C в течение 5 дней, относительно дня сбора клеток. Концентрации определяли с помощью количественной методики Octet с использованием антитела CR9501. NA - данные отсутствуют: связывания CR9501 не выявили.
При введении ранее выявленных точечных мутаций в A2_F18 (SEQ ID No. 71), стабильность и уровни экспрессии были сопоставимыми с вариантом одноцепочечного F24 (SEQ ID NO: 21), который содержал короткую петлю между F1 и F2. Снова наблюдали синергизм, демонстрируя более высокую экспрессию и стабильность при добавлении мутаций к вариантам, которые содержали N67I или двойную мутацию N67I, S215P. Двойная точечная мутация N67I, S215P не только стабилизировала F до слияния
- 24 039803 штамма А2, но также F до слияния штамма В1 и CL57-v224 (табл. 11).
Стабилизирующие мутации также стабилизируют полноразмерный белок RSV-F.
Несколько мутаций, которые демонстрировали высокую экспрессию и значительную стабильность конформации до слияния в растворимой версии RSV-F, соответствующей эктодомену, использовали по отношению к полноразмерному белку RSV-F. Мутации вводили в полноразмерный RSV-F с наличием или без мутаций в сайте отщепления фурином. Ни один домен тримеризации не сливался с этими вариантами (табл. 12).
Таблица 12
Экспрессия и стабильность вариантов полноразмерных версий A2_F18 и A2_F24 с дополнительными мутациями
| I Вариант F-белка RSV* | Свойства | |||
| Аминокислотные замены | SEQ ID No | Линкер Fl, F2 | Экспрессия, кратность увеличения** | Термостабильность* * * |
| Нет (F А2 дикого типа, полноразмерный) | 1 | Отсутствует | 1 | - |
| N67I | Отсутствует | 1,4 | N.D. | |
| S215P | Отсутствует | 1,4 | N.D. | |
| E92D | Отсутствует | 1,4 | N.D. | |
| N67I, K465Q | Отсутствует | 1,4 | N.D. | |
| N67I, S46G | Отсутствует | 0,2 | N.D. | |
| N67I, E92D | Отсутствует | 1,4 | N.D. | |
| N67I, К80Е | Отсутствует | 2,3 | N.D. | |
| N67I, G184N | Отсутствует | 1,5 | N.D. | |
| N67I, V185N | Отсутствует | 1,4 | N.D. | |
| N67I, E487Q | Отсутствует | 2,5 | N.D. | |
| N67I, S215P,V185N | Отсутствует | 2,7 | N.D. | |
| N67I, S215P,K508E | Отсутствует | 3, 0 | N.D. | |
| N67I, S215P,K80E | Отсутствует | 3, 1 | N.D. | |
| N67I, S215P,K465Q | Отсутствует | 2,9 | N.D. | |
| N67I, S215P | 80 | Отсутствует | 2,4 | + + |
| N67I, S215P, G184N | Отсутствует | 7, 6 | + + | |
| N67I, S215P, E92D | 82 | Отсутствует | 6, 8 | N.D. |
| N67I, S215P, S46G | 88 | Отсутствует | 6, 8 | + |
| N67I, S215P, D486N | 86 | Отсутствует | 5, 9 | + + + |
| N67I, S215P, E487Q | 84 | Отсутствует | 6, 2 | N.D. |
| N67I, S215P, S46G, K66E | Отсутствует | 12,1 | + + + | |
| N67I, S215P, D486N, K66E | Отсутствует | 9, 2 | + + + | |
| N67I, S215P, S46G, E92D, K66E | Отсутствует | 11,8 | + + + | |
| N67I, S215P, S46G, E487Q, K66E | Отсутствует | 11,0 | + + + | |
| N67I, S215P, S46G, D486N, K66E | Отсутствует | 10,5 | + + + | |
| N67I, S215P, D486N, K66E, I76V | Отсутствует | 7,2 | + + + | |
| N67I, S215P, S46G, K66E, I76V | Отсутствует | 9, 7 | + + + | |
| N67I, S215P, S46G, K80E | Отсутствует | 4,5 | N.D. | |
| N67I+S215P+G184N+K80E+E92D+E487Q+S46G | Отсутствует | 9, 1 | N.D. | |
| Отсутствует | Q__GSGSG_S | 3, 8 | - | |
| N67I, S215P | 81 | Q__GSGSG_S | 6, 2 | N.D. |
| N67I, S215P, G184N | Q__GSGSG_S | 7,2 | + + | |
| N67I, S215P, E92D | 83 | Q__GSGSG_S | 5, 9 | N.D. |
| N67I, S215P, S46G | 89 | Q__GSGSG_S | 5, 3 | + + |
| N67I, S215P, D486N | 87 | Q__GSGSG_S | 5, 2 | + + + |
| N67I, S215P, E487Q | 85 | Q__GSGSG_S | 4, 6 | N.D. |
| N67I, S215P, S46G, K66E | Q__GSGSG_S | 11,7 | + + + | |
| N67I, S215P, D486N, K66E | Q__GSGSG_S | 13, 8 | + + + | |
| N67I, S215P, D486N, K66E, I76V | Q__GSGSG_S | 6, 8 | + + + | |
| N67I+S215P+G184N+K80E+E92D+E487Q+S46G | Q__GSGSG_S | 3, 6 | N.D. |
Уровень экспрессии определяли с помощью FACS. N.D. - не определено.
- 25 039803 *Все варианты основаны на последовательности F-белка RSV А2.
**По сравнению с белком дикого типа кратность увеличения MFI в отношении 9503.
Стабильность определяли с помощью тепловой обработки клеток HEK293T в течение 5-10 мин при 46, 55,3,
60°C.
***Обозначение для данных стабильности.
- снижение связывания до слияния - связывание специфического Mab CR9501 после нагревания до 46°С (например, дикий тип) + небольшое снижение связывания CR9501 после нагревания до 46°C, но не в той же степени, как дикого типа ++ без изменения в связывании CR9501 до 60°C включительно, при 60°C некоторое снижение связывания CR9501.
+++ без изменения в связывании CR9501 при 60°C.
Ранее выявленные стабилизирующие точечные мутации также были стабилизирующими в полноразмерном F-белке. Повышение уровня экспрессии было менее выраженным, но демонстрировало ту же тенденцию. Это может быть вызвано различным фоном, при котором вводили мутации, но причина может также быть в различной методике количественной оценки (FACS по сравнению с вестернблоттингом) и биологическим максимумом экспрессии вследствие рециклинга поверхностных белков. Введение связывающей последовательности (или короткой петли) повышало экспрессию и стабильность, и точечные мутации оказывали то же действие. Точечные мутации не были или вряд ли были синергетическими с короткой петлей (подобно тому, как было обнаружено для растворимого белка (табл. 9-11))
Поскольку точечная мутация в положении 67 оказывала такой положительный эффект в отношении уровня экспрессии и стабильности, все аминокислотные замены исследовали в отношении этого положения для изучения того, были ли выбраны наиболее оптимальные положения или можно было бы улучшить эти положения (табл. 13).
Таблица 13
Анализ полной замены экспрессии и стабильности ___________ для положения 67 на фоне A2_F24________________
| Аминокислотная замена | Относительная экспрессия* | Стабильность** через 4 дня, % | Стабильность** через 10 дня, % |
| N67A | 1, 696 | 0, 0 | 0, 0 |
| N67C | 1,759 | 16,7 | 0, 0 |
| N67D | 1,702 | 0, 0 | 0, 0 |
| N67E | 1,357 | 0, 0 | 0, 0 |
| N67F | 2,565 | 102,2 | 108,1 |
| N67G | 0, 853 | NA | NA |
| N67H | 1,509 | 0, 0 | 0, 0 |
| N67I | 3,773 | 98,2 | 102,7 |
| N67K | 0,487 | NA | NA |
| N67L | 3, 609 | 107,5 | 96, 4 |
| N67M | 2,579 | 87,3 | 78,7 |
| N67P | 2,414 | 14,3 | 0, 0 |
| N67Q | 0, 955 | NA | NA |
| N67R | 0,523 | NA | NA |
| N67S | 1,277 | 0, 0 | 0, 0 |
| N67T | 1,577 | 0, 0 | 0, 0 |
| N67V | 2,457 | 84,2 | 77,0 |
| N67W | 1,794 | 99, 9 | 104,3 |
| N67Y | 1,830 | 61,3 | 45, 8 |
^Относительная экспрессия - концентрацию белка определяли с помощью метода количественного октета с использованием антитела CR9503 и экспрессию по отношению к концентрации A2_F24 (SEQ ID NO: 19).
**Стабильность - выражают в виде % концентрации белка, определенного после хранения при 4°C в течение 5 и 10 дней, относительно дня сбора клеток. Концентрации определяли с помощью количественной методики Octet с использованием антитела CR9501.
NA - данные отсутствуют: связывания CR9501 не выявили.
Как представлено в табл. 13, преимущественно гидрофобные остатки и, в частности, Ile, Leu и Met в положении 67 могли повышать экспрессию и стабильности. Не представляет собой остаток, который в
- 26 039803 наибольшей степени повышал экспрессию и стабильность. Остатки Glu и Gln, самый маленький остаток
Gly и положительно заряженные остатки Arg и Lys обладали наибольшим дестабилизирующим эффектом в положении 67 в отношении конформации до слияния.
В соответствии с настоящим изобретением мутации аминокислот, которые стабилизируют конформацию F-белка RSV до слияния, можно группировать в различные категории, которые стабилизируют конформацию различным образом. Стратегии для стабилизации F до слияния основаны на модели гомологии RSV-F, которая была основана на кристаллической структуре PIV5 (Yin et. al., 2006) и выравнивании на странице 27.
Аминокислотные остатки 67 и 215.
Аминокислотные остатки в положениях 67 и 215 являются очень близкими по 3D структуре модели до слияния и кристаллической структуры после слияния. Остатки являются близкими по консервативному дисульфидному мостику в верхней части участка DIII, который образует шарнир, по которому участок HRA подвергается рефолдингу в удлиненный суперспиральный растянутый спиральный тример. Мутации в этом участке будут влиять на функцию шарнира и, таким образом, мутации, которые были введены, стабилизируют конформацию до слияния с помощью блокады шарнирной функции.
Аминокислотные остатки 77, 80.
Аминокислотные остатки в положениях 77 и 80 расположены в длинной спирали (остатки 76-98) на С-конце F2, который находится в непосредственном контакте с группой вторичных структур в DIII на N-конце F1, который подвергается рефолдингу в длинную суперспиральную структуру конформации после слияния. Поскольку эти два участка подлежат разделению во время рефолдинга с конформации до слияния в конформацию после слияния, аминокислоты в этом участке, которые предотвращают это разделение, стабилизировали бы конформацию до слияния. Поскольку эти два участка должны разделяться во время рефолдинга, некоторые из остатков можно оптимизировать для усиления взаимодействия. Примером отталкивания, которое наблюдалось, являлось отталкивание между положительно заряженным Lys80. Мутация Lys80 до отрицательно заряженного остатка Glu повышала экспрессию F до слияния. Вследствие последовательного перехода к конформации после слияния, эти мутации можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями, например, N67I и S215P, для получения полного эффекта этой стабилизации, как показано в табл. 10.
Аминокислотный остаток 92.
Аминокислотный остаток в положении 92 также расположен в длинной спирали (остатки 76-98) на С-конце F2, который находится в непосредственном контакте с группой вторичных структур в DIII на N-конце F1, который подвергается рефолдингу в длинную суперспиральную структуру конформации после слияния.
При отделении спирали от участка HRA, он передвигается к участку DIII, который содержит эпитоп Synagis (эпитоп II) (Arbiza et al., J. Gen. Virol. 73:2225-2234, 1992), и отрицательно заряженный Glu92 перемещается очень близко к положительно заряженному Arg282 в положении после конформации. Мутации, которые уменьшают это перемещение, будут стабилизировать конформацию до слияния. Мутация Glu92 в консервативный остаток Asp будет уменьшать перемещение, поскольку он не сможет достигнуть Arg282.
Аминокислотные остатки 486, 487.
Аминокислотные остатки 486, 487 и 489 в верхней части HRB в конформации до слияния создают мутацию отрицательно заряженного фрагмента Glu487 в Asn или Ile, повышающую экспрессию F до слияния. Мутации Asp486 в Asn или Gln и/или Glu489 в Asn, Ile или Gln будут иметь такой же самый эффект. Вследствие последовательного перехода к конформации после слияния, эти мутации можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями, например N67I и S215P, для получения полного эффекта этой стабилизации, как показано в табл. 10, например D486N.
Аминокислотные остатки 175, 184, 185.
Для рефолдинга от конформации до слияния в конформацию после слияния участок между остатком 175 и 193 необходимо преобразовать от петли - бета-шпильки в спираль.
Этот участок демонстрирует наиболее существенный структурный переход. Часть этого участка фактически имеет наиболее высокую степень прогнозирования образования альфа-спирали. Фактические спиральные структуры в модели до слияния представлены ниже выделением серого цвета. Весь данный участок преобразуется в одну большую спираль, когда он подвергается рефолдингу в конформацию после слияния. В нижней последовательности остатки выделены серым цветом с наиболее высокой степенью прогнозирования образования спирали на основе Agadir (http://agadir.crg.es/). Из этого сравнения ясно, что С-концевая часть, которая сохраняется в бета-шпильке в конформации до слияния (остатки 187-202), имеет высокую склонность к образованию альфа-шпильки.
150 160 170 180 190 200 210
SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSC hhhhhh hhhhhhh hhhhh sssssss ssssssss hhhhhhhh
SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSC
- 27 039803
Последовательность остатков 150-212 RSV-F представлена выше. На второй строке вторичные структуры верхней строки указаны с помощью h (для спирали) и s (для нитей) на основании 3D модели гомологии PIV-5. Спирали выделены серым затенением. Нижняя строка является той же самой последовательностью, в которой спирали затенены серым цветом, на основе свойств спирали последовательности.
Таким образом, пролин вводили в положение 175 для стабилизации этого поворота и для предотвращения рефолдинга в спираль, которая в качестве единичной мутации повысила уровень экспрессии, указывая, что она стабилизирует конформацию до слияния и обеспечивает лучший процессинг белка. Для поворота в шпильке (остатки 184, 185) в базе данных Brookhaven проводили поиск в отношении структурно гомологичной шпильки от стабильного белка, который не подвергается рефолдингу. Была обнаружена высокая структурная гомология с петлей шпильки в протеинкиназе А (код pdb 3FHI). В соответствии с выравниванием, представленным ниже, остатки 184 Gly или 185Val замещали Asn для того, чтобы стабилизировать этот поворот и предотвратить его рефолдинг.
WSLSNGVSVLTSKV HRAblb2 178-192
EMDVYVNNEWATSVG 3fhi:B 179-193
Эти мутации можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями, например, N67I и S215P, для получения полного эффекта этой стабилизации, как показано в табл. 10.
Аминокислотные остатки 421, 426 и 46.
Аминокислотные остатки в положениях 421 и 426 расположены в петле в участке DII. Остаток S46 расположен на нити, которая переходит от DI к DIII. Аминокислотный остаток в положении 426 подвергали мутации в серин и аминокислотный остаток в положении 46 подвергали мутации в глицин. Эти мутации повышали стабильность и уровни экспрессии до слияния.
Аминокислотный остаток 465.
Аминокислотный остаток Lys465 расположен в другом участке, который проходит через большое конформационное изменение. Lys465 расположен на перекрещенной петле, которая связывает верхнюю часть участка DII с HRB. Поскольку участок HRB движется от нижней части к верхней часть и образует комплексы с HRA для образования пучка из шести спиралей, перекрещенная петля также перемещается с верхней части в нижнюю часть. Эта петля должна, таким образом, быть метастабильной для обеспечения отделения DII и смены положения в другом окружении. Lys465 на перекрещенной петле расположен непосредственно рядом с Lys445 на участке DII. Мутация Lys465 в Gln или Glu нейтрализует отталкивание и повышало стабильность и уровни экспрессии F до слияния.
Пример 3.
Экспрессия F-белка до слияния.
Плазмиды экспрессии, кодирующие рекомбинантный F-белок RSV до слияния, создавали с помощью стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР. Используемой системой для экспрессии были клетки 293Freestyle (Life Technologies, Ренфрушир, Великобритания). Клетки временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали во встряхивателе-инкубаторе в течение 5 дней при 37°C и 10% CO2. Супернатант культуры собирали и центрифугировали в течение 5 мин при 300 g для удаления клеток и клеточного дебриса. Отцентрифугированный супернатант затем фильтровали в стерильных условиях с помощью 0,22 мкм вакуумного фильтра и хранили при 4°C до использования.
Пример 4.
Очистка F-белка RSV до слияния.
Рекомбинантные полипептиды очищали с помощью 2-стадийного протокола очистки с применением катион-обменной колонки для первичной очистки, а затем колонки superdex200 для завершающей стадии с удалением остаточных примесей. Для исходного ионобменной стадии супернатант культуры разбавляли 2 объемами по 50 мМ NaOAc, pH 5,0, и пропускали через 5 мл колонку HiTrap Capto S при скорости 5 мл в минуту. Затем колонки отмывали 10 объемами, соответствующими объему колонки (CV), по 20 мМ NaOAc, 50 мМ NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 5 и элюировали 2 CV по 20 мМ NaOAc, 1 M NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 5. Элюат концентрировали с помощью концентратора-центрифуги, а затем белок очищали с помощью колонки superdex200 с использованием 40 мМ Tris, 500 мМ NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, pH 7,4, в качестве подвижного буфера. На фиг. 1А представлена хроматограмма гель-фильтрационной колонки, и главный пик содержит F-белок RSV до слияния. Фракции, содержащие этот пик, снова объединяли и концентрацию белка определяли при OD280 и сохраняли при 4°C до использования. На фиг. 1В представлен сокращенный результат анализа SDS-PAGE конечного препарата белка, и можно видеть, что чистота составляла >95%. Идентичность полосы подтверждали с помощью вестерн-блоттинга и специфических к F-белку антител (не показано).
Пример 5.
NativePAGE.
Для исходного определения мультимерного состояния F-полипептидов до слияния в соответствии с настоящим изобретением супернатанты культур от временно трансфицированных клеток анализировали
- 28 039803 в гель-системе NativePAGE Bis-Tris (Life Technologies). Затем гели подвергали блоттингу с использованием iBlot technolog в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies). Антитело CR9503, специфичное к F-белку RSV (последовательность приведена ниже в табл. 17), использовали в качестве первичного зонда для выявления F-белка RSV до слияния, а затем использовали HRP-конъюгированное мышиное антитело к IgG человека (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания) или IRDye800CW-конъюгированное аффинно очищенное антитело к IgG человека (кроличье) (Rockland Immunochemicals, Гилбертсвилл, Пенсильвания). Блоты проявляли с использованием стандартной пленки (Codak) или с использованием инфракрасной системы для визуализации Odyssey CLx. На фиг. 2 представлен анализ NativePAGE супернатантов от мономерного F47- (линия 1), F-белка RSV после слияния и первично тримерного F-белка RSV (линия 2) и очищенного F-белка RSV до слияния (линия 3), показывающий, что после очистки только тримерные молекулы присутствуют в препарате F-белка RSV до слияния, поскольку он мигрирует подобным образом к тримерной полосе после слияния. Это также подтверждается объемом элюирования из гель-фильтрационной колонки (фиг. 1А).
Пример 6.
Количественный вестерн-блоттинг.
Для количественного определения конструкций F-белка RSV до слияния использовали количественный вестерн-блоттинг.
Разбавления супернатантов культур прогоняли в 4-12% (вес./об.) градиентных гелях Bis-Tris NuPAGE (Life Technology) и проводили блоттинг с помощью технологии iBlot (Life Technology). Блоты инкубировали с CR9503 (как описано выше) и проявляли с использованием конъюгированного мышиного антитела к IgG человека (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания) или IRDye800CWконъюгированного аффинно очищенного антитела к IgG человека (кроличье) (Rockland Immunochemicals, Гилбертсвилл, Пенсильвания). Количества белка затем определяли с помощью серии разбавлений очищенного стандартного белка RSV или с использованием системы инфракрасной визуализации Odyssey CLx или на глаз. На фиг. 3 можно увидеть эффекты по отношению к конструкции A2_F24 (SEQ ID NO: 19) по показателю общих уровней экспрессии. Было показано, что единичные мутации повышали уровень экспрессии до 5 раз. Если создавали двойные мутанты по некоторым из этих мутаций, то могли наблюдаться синергетические эффекты и в некоторых случаях дополнительное повышение экспрессии до 11 раз по сравнению с A2_F24.
Пример 7.
Анализ конечной стабильности.
Подтверждение конформации до слияния экспрессируемых полипептидов в соответствии с настоящим изобретением выполняли с помощью технологии интерферометрии BioLayer (Octet) с использованием специфичных антител CR9501 или CR9502 до слияния, или неконформационного специфического антитела CR9503, которое содержит вариабельные участки тяжелой и легкой цепей мотавизумаба. Антитела биотинилировали с помощью стандартных протоколов и иммобилизировали на стрептавидиновых биосенсорах (ForteBio, Портсмут, Великобритания). Процедура заключалась в следующем. После уравновешивания сенсоров в кинетическом буфере (ForteBio) в течение 60 с наконечники переносили в PBS с 5 мкг/мл предпочтительного антитела. Загрузку проводили в течение 250 с. Затем включали другую стадию уравновешивания в течение 200 с в кинетическом буфере. В конечном итоге наконечники переносили в супернатант культуры для экспрессии, содержащий F-полипептиды RSV до слияния и записывали ответ связывания (нм) через 1200 с. Эта фаза также обозначается как фазовая ассоциация. Это выполняли непосредственно после сбора клеток (1 день), а также спустя 5 дней (5 день), и разницу в связывании CR9501 использовали в качестве скринингового средства для выявления мутаций, способных стабилизировать конформацию до слияния. Конструкцию считали стабильной, если наблюдали менее 20% потери связывания на 5 день, а если наблюдали менее 20% потери связывания, ее считали нестабильной. Стабильные конструкции затем подвергали более строгому исследованию при необходимости. Анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio).
Пример 8.
Анализ термостабильности.
Стабилизирующий потенциал введенных характеристик в F-полипептиды RSV определяли по тепловому стрессу. Для этой цели супернатант культур от временно трансфицированных клеток или очищенный белок нагревали с использованием диапазона температур. Образцы затем охлаждали на льду для предотвращения дополнительных индуцированных теплом конформационных изменений и инкубировали с антителом CR9501 в системе по технологии Octet, как описано в примере 7. Ответы, полученные в конце фазовой ассоциации при различных температурах, изображали на графике в виде функции температуры и приближали с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения Prism. Это приводило к определению температуры, где уровень связывания антител составляет 50% от максимума и эту величину можно было использовать для сравнения различных конструкций в отношении термостабильности до слияния. На фиг. 4 сравнивают немодифицированный эктодомен (SEQ ID NO: 13) и конструкцию A2_F24 N67I + S215P (SEQ ID NO: 21). Можно заметить, что индуцированный температурой стресс оказывал меньший эффект на конструкцию A2_F24 N67I+S215P
- 29 039803 (SEQ ID NO: 21) по сравнению с немодифицированным эктодоменом. Таким образом, можно сделать заключение, что стабилизирующие мотивы, введенные в полипептиды в соответствии с настоящим изобретением, т.е. сайт тримеризации, линкер F1-F2 и две точечные мутации, приводили к более стабильному F-белку до слияния.
Пример 9.
Анализ стабильности фазовой ассоциации.
Для определения стабильности различных точечных мутаций использовали анализ связывания Octet, разновидность ранее описанного анализа конечной стабильности (пример 7). Анализ фазовой ассоциации выполняли вследствие очень высоких уровней экспрессии некоторых точечных мутантов, поскольку он более строгий и полностью предотвращает смещение уровня экспрессии. Также использовали антитело CR9501, однако вместо выбора связывающего ответа в конце фазовой ассоциации использовали всю кривую ассоциации для снижения потенциального смещения концентраций конечного анализа. Это выполняли с использованием значений из всей фазовой ассоциации эксперимента с помощью указанных точечных мутаций A2_F24. Данные восполняли за счет количества связанного антитела на чипе. Измерения выполняли в 1, 5 и 33 дни, и сравнивали формы кривых по этим трем дням. Если получали идентичные кривые, то конструкцию считали стабильной, а если нет, то нестабильной. На фиг. 5 можно увидеть анализ четырех различных вариантов. Нестабильные белковые конструкции до слияния можно выявить с помощью зависимой от времени потери связывания CR9501 (A2_F24, K465Q, S46G), в то время как стабильные конструкции до слияния (N67I) не демонстрировали такого снижения. Мутация E92D, по-видимому, попадала в группу между двумя мутациями, имеющими промежуточную стабильность, поскольку наблюдали лишь незначительные изменения в форме кривой. На фиг. 6 выбранные точечные мутации комбинировали для получения двойных мутантов и их анализировали. Как можно увидеть, различные мутации проявляли различные фенотипы в отношении стабильности и индуцирования стабильности. Если полипептиды содержат мутации K465Q или S46G по отдельности или в комбинации, все трое, т.е. два единичных и двойной мутанты, являются нестабильными и связывание специфического антитела до слияния со временем теряется. Если мутацию S46G комбинируют с E92D, которая ранее, как было показано, имеет промежуточную стабильность в виде единичной мутации, изменения стабильности могло не наблюдаться, указывая, что мутация E92D не может корректировать нестабильные белковые конструкции. Если мутацию N67I комбинировали с мутацией S46G или E92D, то результатом была полностью стабильная конструкция. Это могло также наблюдаться, если мутацию S215P комбинировали с мутацией E92D, показывая уникальный потенциал этих двух мутаций для стабилизации нестабильных конструкций до слияния.
Пример 10.
Количественный анализ с использованием Octet.
Для определения концентрации F-белка RSV в супернатантах клеточных культур использовали количественный метод на основе Octet. Антитела CR9501 и CR9503 биотинилировали с помощью стандартных протоколов и иммобилизовали на стрептавидиновых биосенсорах (ForteBio, Портсмут, Великобритания). После этого покрытые биосенсоры блокировали в супернатанте ложно трансфицированных клеточных культур. Количественный эксперимент выполняли следующим образом: температура 30°C, скорость встряхивания 1000 об/мин, время анализа 300 с. Концентрацию белка в супернатанте клеточной культуры рассчитывали с помощью стандартной кривой. Стандартную кривую получали для каждого покрытого антитела с использованием белка A2_F24_N67I+S215P (SEQ ID NO: 21), разбавленного в супернатанте ложно трансфицированных клеточных культур. Измерения проводили в день сбора супернатанта (1 день) и после хранения супернатанта при 4°C в течение 5 дней или дольше. Разницу в концентрации, определенную с помощью CR9501, использовали в качестве скринингового средства для выявления мутаций, способных к стабилизации конформации до слияния. Конструкция считалась стабильной, если наблюдалось менее, чем 20% снижение определяемой концентрации на 5 день. Анализ данных выполняли с помощью компьютерной программы ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio).
Пример 11.
Анализ FACS и термостабильность.
Плазмиды экспрессии, кодирующие рекомбинантный полноразмерный F-белок RSV, создавали с помощью стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР. Клетки HEK293-T временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали в течение 48 ч при 37°C и 10% CO2. Клетки отделяли от чашек для культивирования с помощью буфера FACS (5 мМ EDTA, 1% FBS в PBS), отмывали и ресуспендировали в том же буфере. Клетки окрашивали в отношении поверхностного F-белка RSV с использованием биотинилированных антител CR9501 или CR9503, с последующим окрашиванием АРС-меченым стрептавидином. Для дифференцировки живых и мертвых клеток пропидия йодид добавляли в суспензию клеток в конце процедуры окрашивания. Клетки анализировали на FACS Canto (BD Biosciences) в соответствии со стандартными способами, хорошо известными любому специалисту в данной области. Анализ данных выполняли с использование программного обеспечения FlowJo 9.0 (Tree Star Inc.). Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) рассчитывали для популяции живых
- 30 039803
АРС-положительных клеток.
Стабилизирующий потенциал введенных характеристик в полноразмерный мембранно-связанный F RSV определяли по тепловому стрессу. Через 48 ч после трансфекции клетки отделяли от чашек культивирования, как описано выше, и суспензию клеток нагревали в течение 5-10 мин с использованием диапазона температур (37, 46, 55,3, 60°С). Клетки затем окрашивали и анализировали с помощью FASC, как описано выше. MFI рассчитывали для популяции живых АРС-положительных клеток. Процент АРС-положительных клеток рассчитывали для популяции живых клеток. Окрашивание с помощью CR9503 приводило к подобным MFI и % АРС-положительных клеток в образцах, подвергнутых тепловому шоку возрастающими температурами. Окрашивание с помощью CR9501 уменьшало образцы клеток, трансфицированных нестабильными белками. Потеря связывания CR9501 указывала на потерю Fбелка RSV до слияния на поверхности клетки.
Пример 12.
Доклиническая оценка иммуногенности F до слияния.
Для определения иммуногенности стабилизированного F RSV до слияния (A2F24, N67I, S215P) (SEQ ID NO: 21) мышей иммунизировали в соответствии с табл. 14 0,5 или 5 мкг в прайм-бустерном режиме на 0 неделе и на 4 неделе. Как представлено на фиг. 7, мыши, иммунизированные F до слияния, демонстрировали более высокие титры VNA, чем мыши, иммунизированные F после слияния RSV.
Таблица 14
Схема иммунизации
| Группа | Препарат | Доза | Адъювант | N |
| 1 | F после слияния | 0,5 мкг | - | 9 |
| 2 | F после слияния | 5 мкг | - | 9 |
| 3 | F до слияния | 0,5 мкг | - | 9 |
| 4 | F до слияния | 5 мкг | - | 9 |
| 5 | F после слияния | 0,5 мкг | Поли (I:С) | 9 |
| 6 | F до слияния | 0,5 мкг | Поли(I:С) | 9 |
| 8 | FI-RSV | 1/75 | - | 8 |
| 9 | PBS | - | 3 |
Затем хлопковых крыс иммунизировали двумя различными дозами RSV-F в конформации после слияния и до слияния (табл. 15). Животных иммунизировали i.m. на 0 неделе и 4 неделе. На фиг. 8 представлены высокие титры нейтрализующих антител в день контрольного заражения (7 неделя).
Таблица 15
Группы, иммуноген и доза для определения иммуногенности и эффективности у хлопковых крыс
| Группа | Препарат | Доза | Адъювант |
| 1 | F после слияния | 0,5 мкг | - |
| 2 | F после слияния | 5 мкг | - |
| 3 | F до слияния | 0,5 мкг | - |
| 4 | F до слияния | 5 мкг | - |
| 9 | F до слияния | 0,5 мкг | Поли IC |
| 10 | F до слияния | 5 мкг | Поли IC |
| 11 | F до слияния | 0,5 мкг | Фосфатный адъювант |
| 12 | F до слияния | 5 мкг | Фосфатный адъювант |
| 13 | Ad2 6 . RSV. Fa2 | 10л8 | - |
| 14 | PBS | - | - |
Вирусную нагрузку в легких и носу определяли через пять дней после контрольного заражения (смотри фиг. 9).
Показано, что F-полипептиды до слияния в соответствии с настоящим изобретением способны индуцировать мощный иммунный ответ, который снижал вирусную нагрузку в легких и даже в носу.
-31 039803
Таблица 16
Стандартные аминокислоты, аббревиатуры и свойства
| Аминокислота | 3- буквенная | 1- буквенная | Полярность боковой цепи | Заряд боковой цепи (pH 7,4) |
| Аланин | Ala | A | Неполярная | Нейтральный |
| Аргинин | Arg | R | Полярная | Положит ель ный |
| Аспарагин | Asn | N | Полярная | Нейтральный |
| Аспарагиновая кислота | Asp | D | Полярная | Отрицательный |
| Цистеин | Cys | C | Неполярная | Нейтральный |
| Глутаминовая кислота | Glu | E | Полярная | Отрицательный |
| Глутамин | Gin | Q | Полярная | Нейтральный |
| Глицин | Gly | G | Неполярная | Нейтральный |
| Гистидин | His | H | Полярная | Положит ель ный (10%) Нейтральный (90%) |
| Изолейцин | lie | I | Неполярная | Нейтральный |
| Лейцин | Leu | L | Неполярная | Нейтральный |
| Лизин | Lys | К | Полярная | Положит ель ный |
| Метионин | Met | M | Неполярная | Нейтральный |
| Фенилаланин | Phe | F | Неполярная | Нейтральный |
| Пролин | Pro | P | Неполярная | Нейтральный |
| Серин | Ser | S | Полярная | Нейтральный |
| Треонин | Thr | T | Полярная | Нейтральный |
| Триптофан | Trp | w | Неполярная | Нейтральный |
| Тирозин | Tyr | Y | Полярная | Нейтральный |
| Валин | Vai | V | Неполярная | Нейтральный |
Последовательности антител
Таблица 17
| Антитело | Домен VH | CDR1 VH | CDR2 VH | CDR3 VH |
| CR9501 | Аминокислоты 1-125 с SEQ ID NO: 53 | GASINSDNYYWT (SEQ ID NO:54) | HISYTGNTYYTPSLKS (SEQ ID NO:55) | CGAYVLISNCGWFDS (SEQ ID NO:56) |
| CR9502 | Аминокислоты 1-121 с SEQ ID NO: 57 | GFTFSGHTIA (SEQ ID NO:58) | WVS TNNGNTEYAQKIQG (SEQ ID NO:59) | EWLVMGGFAFDH (SEQ ID NO:60) |
| Антитело | Домен VL | CDR1 VL | CDR2 VL | CDR3 VL |
| CR9501 | Аминокислоты 1-107 SEQ ID NO: 61 | QASQDISTYLN (SEQ ID NO: 62) | GASNLET (SEQ ID NO:63) | QQYQYLPYT (SEQ ID NO:64) |
| CR9502 | Аминокислоты 1-110 SEQ ID NO: 65 | GANNIGSQNVH (SEQ ID NO:66) | DDRDRPS (SEQ ID NO:67) | QVWDSSRDQAVI (SEQ ID NO:68) |
Аминокислотная последовательность нескольких конструкций F RSV до слияния приведена ниже. Следует отметить, что нумерация аминокислот в различных конструкциях, описанных в данном документе, основана на последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 1), которая означает, что все аминокислоты с 1 положения до 108 положения включительно конструкций до слияния соответствуют положениям аминокислот 1-108 последовательности дикого типа, где нумерация аминокислот с 138 положения до конца смещена на 22 аминокислоты, т.е. L138 в последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 1) соответствует L116 во всех конструкциях до слияния. Это связано с тем фактом, что была выполнена делеция в конструкциях до слияния, т.е. вставка линкера GSGSG, при этом фактическая нумерация F1 не является одинаковой между конструкциями. Таким образом, нумерация, используемая по отношению к специфическим мутациям в соответствии с настоящим изобретением, например S215P, относится к положению аминокислоты в последовательности дикого типа.
- 32 039803
Последовательности
Полноразмерная последовательность F-белка RSV А2 (SEQ ID NO 1)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Полноразмерная последовательность F-белка RSV Bl (SEQ ID NO 2)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNI KETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVS ISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKV LDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSP
- 33 039803
LCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNT DIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDEL LHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIWLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK
SEQ ID NO: 3
EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA
SEQ ID NO: 4
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO: 5
GSGSG
F8: RSV A2, эктодомен дикого типа (SEQ ID NO: 13)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LHHHHHHHH
Fil: RSV Bl, эктодомен дикого типа (SEQ ID NO: 14)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNI KETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVS ISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNT DIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDEL LHHHHHHHH
F47: RSV A2, стабилизированный линкером, IZ (S) (SEQ ID NO 15)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI SNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV
- 34 039803
QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGGIEGRHHHHHHHH
F47-: RSV A2, стабилизированный линкером, IZ (S) (SEQ ID NO: 16)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI SNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGG
F43: RSV Bl, стабилизированный линкером, IZ(S) (SEQ ID NO: 17)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNI KETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRI SNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVK GEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGGIEGRHHHHHH
F24: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 18)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNI KETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRI SNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVK GEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGRHHHHHH
A2_F24: RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID
- 35 039803
NO: 19)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI SNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
F24-: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 20)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNI KETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRI SNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVK GEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2 F24 N67I+S215P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 21)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKJKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
F24-N67I+S215P: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 22)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNI KEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS
- 36 039803
GIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRI PNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVK GEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+E92D: RSV A2 , стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 23)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKHCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI SNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+E92D RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 24)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNI KEXKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRI SNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVK GEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+K465Q RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 25)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY
- 37 039803
CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGQSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+K465Q RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 26)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNI KE^KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRI PNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGQNLYVK GEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S46G RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 27)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNI KK^KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI SNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+S46G RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 28)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFGALRTGWYTSVITIELSNI KEXKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRI SNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVK GEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD
- 38 039803
GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 E92D+S215P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 29)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
F24-E92D+S215P: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 30)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNI KETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRI PNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVK GEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K508E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 31)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487I: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 32)
- 39 039803
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDXFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 33)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIE LSNIKKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGS AIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ SCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTD RGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDV SSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKS LYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAY VRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 34)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDNFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+D486N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 35)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI
- 40 039803
PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K465E: A2 , стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 36)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGESLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K465Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 37)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGQSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+N426S: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 38)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KK^KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV
- 41 039803
ITSLGAIVSCYGKTKCTASSKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K421N: A2 , стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 39)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTNCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K209Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 40)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNQQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K201Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 41)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDQQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
- 42 039803
A2_F24 N67I+S215P+V185N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 42)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGNSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+G184N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 43)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNNVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+N175P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 44)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTPKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E92D: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 45)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI
- 43 039803
KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K80E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 46)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIEQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K77E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 47)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIELIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+S46G: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 48)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNI KKXKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV
- 44 039803
QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 : RSV S4 6G A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 49)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNI KKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI SNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV K4 65Q A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 50)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI SNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGQSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV N67I A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 51)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KK^KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI SNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK
- 45 039803
GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV E92D A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 52)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI SNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFLGGIEGR
Полноразмерная последовательность белка F RSV CL57-v224 (SEQ ID NO: 69)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNI DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LHNVNVGKSTTNIMITTIIIVIIVILLLLIAVGLFLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Эктодомен, RSV CL57-v224 (SEQ ID NO: 70)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNI DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL L
PreF, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 71)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI
- 46 039803
KKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS TFL
PreF N67I S215P, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 72)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS T FL
PreF N67I S215P, RSV Bl, фибритин (SEQ ID NO: 73)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNI KEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVS ISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYINNQLLPIVNQQSCRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNT DIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDEL LSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS T FL
RSV N67I S215P, RSV CL57-v224, фибритин (SEQ ID NO: 74)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNI DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD
- 47 039803
TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreFL N67I S215P, RSV Bl, фибритин, петля (SEQ ID NO: 22)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNI KEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRI PNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVK GEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFL
PreFL N67I S215P, RSV CL57-v224, фибритин, петля (SEQ ID NO 75)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKD GEWVLLSTFL
PreF N67I S215P E487Q, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 76)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N67I S215P K201N, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 77)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT
- 48 039803
LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDNQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N67I S215P E92D, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO:78)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N67I S215P D486N, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 79)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
Fwt N67I S215P, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO 80)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD
- 49 039803
TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fsl N67I S215P, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 81)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVI IVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N67I S215P E92D, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 82)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fsl N67I S215P E92D, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 83)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVI IVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N67I S215P E487Q, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID
- 50 039803
NO: 84)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fsl N67I S215P E487Q, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 85)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVI IVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N67I S215P D486N, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 86)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fsl N67I S215P D486N, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 87)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS
- 51 039803
GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVI IVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N67I S215P S46G, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID
NO: 88)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVT LSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKV LDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSE LLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSP LCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNV DIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVD TVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL LHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fsl N67I S215P S46G, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID
NO: 89)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSNI KKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAIAS GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSI PNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNV QIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVK GEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVI IVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
CR9501, тяжелая цепь (SEQ ID NO: 53):
QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTPS LKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
CR9501, легкая цепь (SEQ ID NO: 61):
EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFTG SGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
CR9502, тяжелая цепь (SEQ ID NO: 57):
EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQKI QGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
CR9502, легкая цепь (SEQ ID NO: 65):
QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLWYDDRDRPSGIPDRFSGS NSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEEL QANKATLVCLIS D FYPGAVTVAWKADS S PVKAGVE TTTPSKQSNNKYAAS SYLSLTPEQWKSHR SYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS
Claims (5)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ стабилизации конформации F-полипептида RSV до слияния, включающий введение одной или нескольких мутаций в домен F1 и/или F2 RSV по сравнению с доменом F1 и/или F2 RSV дикого типа, где одна или несколько мутаций содержат мутацию аминокислоты N или Т в положении 67 в I- 52 039803 и/или мутацию аминокислоты S в положении 215 в Р, где положения аминокислот приведены в отношении к последовательности F-белка RSV из штамма А2 (SEQ ID NO: 1).
- 2. Способ по п.1, где способ дополнительно содержит введение мутации аминокислоты D в положении 486 в N.
- 3. Способ по п.1 или 2, где домен F1 является усеченным после аминокислотного остатка 513 F-белка RSV.
- 4. Способ по п.3, где домен тримеризации, содержащий SEQ ID NO: 4, связан с аминокислотным остатком 513 домена F1 RSV.
- 5. Стабилизированный F-полипептид RSV до слияния, получаемый с помощью способа по любому из пп.1-4.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP13165402 | 2013-04-25 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA202090675A2 EA202090675A2 (ru) | 2020-06-30 |
| EA202090675A3 EA202090675A3 (ru) | 2020-08-31 |
| EA039803B1 true EA039803B1 (ru) | 2022-03-15 |
Family
ID=48326107
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201592048A EA035522B1 (ru) | 2013-04-25 | 2014-04-24 | Стабильные растворимые f-полипептиды rsv в конформации "до слияния" |
| EA202090675A EA039803B1 (ru) | 2013-04-25 | 2014-04-24 | Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv до слияния |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201592048A EA035522B1 (ru) | 2013-04-25 | 2014-04-24 | Стабильные растворимые f-полипептиды rsv в конформации "до слияния" |
Country Status (33)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10899800B2 (ru) |
| EP (2) | EP3488864A1 (ru) |
| JP (1) | JP6469081B2 (ru) |
| KR (1) | KR102236497B1 (ru) |
| CN (2) | CN110590916A (ru) |
| AP (1) | AP2015008815A0 (ru) |
| AR (1) | AR096113A1 (ru) |
| AU (1) | AU2014259474B2 (ru) |
| CA (1) | CA2910067C (ru) |
| CL (1) | CL2015003124A1 (ru) |
| CY (1) | CY1121600T1 (ru) |
| DK (1) | DK2988780T3 (ru) |
| EA (2) | EA035522B1 (ru) |
| ES (1) | ES2715378T3 (ru) |
| HK (1) | HK1220124A1 (ru) |
| HR (1) | HRP20190175T1 (ru) |
| HU (1) | HUE041659T2 (ru) |
| IL (1) | IL242186B (ru) |
| LT (1) | LT2988780T (ru) |
| ME (1) | ME03442B (ru) |
| MX (1) | MX361774B (ru) |
| MY (2) | MY181066A (ru) |
| PE (1) | PE20151867A1 (ru) |
| PH (1) | PH12015502377B1 (ru) |
| PL (1) | PL2988780T3 (ru) |
| PT (1) | PT2988780T (ru) |
| RS (1) | RS58436B1 (ru) |
| SG (1) | SG11201508567XA (ru) |
| SI (1) | SI2988780T1 (ru) |
| TR (1) | TR201902513T4 (ru) |
| TW (1) | TWI663175B (ru) |
| WO (1) | WO2014174018A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201507912B (ru) |
Families Citing this family (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK3067064T3 (da) | 2008-12-09 | 2020-06-08 | Novavax Inc | Modificerede rsv-f-proteiner og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| US11446374B2 (en) | 2008-12-09 | 2022-09-20 | Novavax, Inc. | Modified RSV F proteins and methods of their use |
| US9738689B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-08-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion RSV F proteins and their use |
| US10017543B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-07-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion RSV F proteins and their use |
| EA035522B1 (ru) * | 2013-04-25 | 2020-06-29 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Стабильные растворимые f-полипептиды rsv в конформации "до слияния" |
| CN105408348B (zh) | 2013-06-17 | 2021-07-06 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
| WO2016160166A1 (en) * | 2015-03-30 | 2016-10-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Immunogenic rsv polypeptides |
| EP3821906A1 (en) * | 2015-07-07 | 2021-05-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine against rsv comprising modified f polypeptide |
| US10457708B2 (en) | 2015-07-07 | 2019-10-29 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides |
| EP3344288A1 (en) | 2015-09-02 | 2018-07-11 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized viral class i fusion proteins |
| EP3344291A4 (en) | 2015-09-03 | 2019-04-10 | Novavax, Inc. | VACCINE COMPOSITIONS WITH IMPROVED STABILITY AND IMMUNOGENICITY |
| AU2016379097C1 (en) | 2015-12-23 | 2021-04-08 | Pfizer Inc. | RSV F protein mutants |
| EP3411028B1 (en) | 2016-02-03 | 2021-05-05 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Combination product for treating or ameliorating respiratory syncytial virus infection |
| EP3436064A1 (en) | 2016-03-29 | 2019-02-06 | The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Substitutions-modified prefusion rsv f proteins and their use |
| IL262109B2 (en) | 2016-04-05 | 2023-04-01 | Janssen Vaccines Prevention B V | vaccine against rsv |
| PE20190420A1 (es) * | 2016-04-05 | 2019-03-19 | Janssen Vaccines And Prevention B V | Proteinas f de prefusion del virus respiratorio sincicial (vrs) solubles y estabilizadas |
| WO2017207477A1 (en) | 2016-05-30 | 2017-12-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion rsv f proteins |
| MY194419A (en) * | 2016-05-30 | 2022-11-30 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabilized pre-fusion rsv f proteins |
| CN108265079A (zh) * | 2017-01-02 | 2018-07-10 | 刘昕 | 一种新型呼吸道合胞体病毒pre-F融合蛋白载体的制备方法 |
| EP3595713A4 (en) | 2017-03-15 | 2021-01-13 | ModernaTX, Inc. | RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINE |
| WO2018170347A1 (en) | 2017-03-17 | 2018-09-20 | Modernatx, Inc. | Zoonotic disease rna vaccines |
| CA3058794A1 (en) | 2017-04-04 | 2018-10-11 | University Of Washington | Self-assembling protein nanostructures displaying paramyxovirus and/or pneumovirus f proteins and their use |
| EP3624844A1 (en) * | 2017-05-17 | 2020-03-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection |
| WO2019023196A1 (en) | 2017-07-24 | 2019-01-31 | Novavax, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING RESPIRATORY DISEASE |
| MX2020002876A (es) | 2017-09-15 | 2020-07-22 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Metodo para la induccion segura de inmunidad contra el vsr. |
| KR102700187B1 (ko) * | 2017-09-29 | 2024-08-28 | 에스케이바이오사이언스(주) | 가용성 변형 호흡기 융합세포 바이러스 (ｒｓｖ) ｆ 단백질 항원 |
| WO2019148101A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-08-01 | Modernatx, Inc. | Rsv rna vaccines |
| IL305911B1 (en) | 2018-03-19 | 2024-09-01 | Novavax Inc | Multifunctional nanoparticle vaccines for influenza |
| EP3873517A4 (en) * | 2018-10-29 | 2022-09-28 | Emory University | RSV VIRUS-LIKE PARTICLES AND METHODS OF PRODUCTION THEREOF |
| KR20210091749A (ko) | 2018-11-13 | 2021-07-22 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 안정화된 융합전 rsv f 단백질 |
| CN109851678A (zh) * | 2019-03-07 | 2019-06-07 | 苏州宇之波生物科技有限公司 | 一种改良的亚稳定态牛呼吸道合胞病毒融合前体f蛋白质及编码的dna分子和其应用 |
| WO2020229579A1 (en) | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Prophylactic treatment of respiratory syncytial virus infection with an adenovirus based vaccine |
| CN113924113A (zh) | 2019-05-15 | 2022-01-11 | 扬森疫苗与预防公司 | 季节性流感疫苗与基于腺病毒的呼吸道合胞病毒疫苗的共同施用 |
| EP4025587A1 (en) | 2019-09-04 | 2022-07-13 | University of Washington | Self-assembling protein nanostructures displaying paramyxovirus and/or pneumovirus f proteins and their use |
| CN111303245B (zh) * | 2020-02-21 | 2023-06-27 | 成都奥达生物科技有限公司 | 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂 |
| WO2021198413A1 (en) | 2020-04-02 | 2021-10-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized vaccine compositions |
| CN116096406A (zh) | 2020-06-29 | 2023-05-09 | 扬森疫苗与预防公司 | 针对呼吸道合胞病毒感染的疫苗组合 |
| CN112220921B (zh) * | 2020-08-25 | 2022-08-16 | 北京交通大学 | 一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗 |
| JP2022060169A (ja) | 2020-10-02 | 2022-04-14 | ファイザー・インク | Ｒｓｖ ｆタンパク質生産のための細胞培養工程 |
| WO2022175479A1 (en) | 2021-02-19 | 2022-08-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine combinations against respiratory syncytial virus strain a and b infections |
| CN114195867B (zh) * | 2021-12-15 | 2024-05-03 | 北京交通大学 | 一种rsv融合前f蛋白、表达质粒、细胞株和rsv疫苗组合物 |
| EP4448802A1 (en) | 2021-12-16 | 2024-10-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins |
| WO2024069420A2 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-04 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising an rsv f protein trimer |
| WO2024067725A1 (zh) * | 2022-09-29 | 2024-04-04 | 北京百邑无忧科技发展有限公司 | 一种融合前构象的呼吸道合胞病毒重组融合蛋白、其制备方法及用途 |
| CN116478296B (zh) * | 2022-10-17 | 2024-02-23 | 厦门大学 | 截短的呼吸道合胞病毒f蛋白及其用途 |
| WO2024089633A1 (en) | 2022-10-27 | 2024-05-02 | Pfizer Inc. | Rna molecules encoding rsv-f and vaccines containing them |
| WO2024089634A1 (en) | 2022-10-27 | 2024-05-02 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions against influenza and rsv |
| CN116284266B (zh) * | 2022-11-21 | 2024-01-19 | 怡道生物科技(苏州)有限公司 | 突变型呼吸道合胞病毒融合前f蛋白及其应用 |
| WO2024127181A1 (en) | 2022-12-11 | 2024-06-20 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions against influenza and rsv |
| WO2024155561A2 (en) * | 2023-01-17 | 2024-07-25 | The Scripps Research Institute | Engineered paramyxovirus soluble fusion (f) proteins and related vaccines |
| US20240252614A1 (en) | 2023-01-18 | 2024-08-01 | Pfizer Inc. | Vaccines against respiratory diseases |
| CN116785421B (zh) * | 2023-08-21 | 2024-01-09 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 一种牛呼吸道合胞体病毒的mRNA疫苗及其应用 |
| CN117736278A (zh) * | 2023-12-25 | 2024-03-22 | 英诺特（唐山）生物技术有限公司 | 一种用于检测呼吸道合胞病毒感染的试剂盒及检测方法 |
| CN117586357B (zh) * | 2024-01-19 | 2024-07-09 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（rsv）多肽 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011050168A2 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic | Rsv immunogens, antibodies and compositions thereof |
| WO2012158613A1 (en) * | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Novartis Ag | Pre-fusion rsv f antigens |
Family Cites Families (84)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4235877A (en) | 1979-06-27 | 1980-11-25 | Merck & Co., Inc. | Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit |
| US4372945A (en) | 1979-11-13 | 1983-02-08 | Likhite Vilas V | Antigen compounds |
| IL61904A (en) | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
| EP0173552B1 (en) | 1984-08-24 | 1991-10-09 | The Upjohn Company | Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa |
| US5168062A (en) | 1985-01-30 | 1992-12-01 | University Of Iowa Research Foundation | Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence |
| US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
| NZ230747A (en) | 1988-09-30 | 1992-05-26 | Bror Morein | Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina |
| HU212924B (en) | 1989-05-25 | 1996-12-30 | Chiron Corp | Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion |
| FR2705686B1 (fr) | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| WO1995034671A1 (en) | 1994-06-10 | 1995-12-21 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral vector systems and cell lines |
| US5851806A (en) | 1994-06-10 | 1998-12-22 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral systems and cell lines |
| US5559099A (en) | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
| US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| US5965541A (en) | 1995-11-28 | 1999-10-12 | Genvec, Inc. | Vectors and methods for gene transfer to cells |
| US5786464C1 (en) | 1994-09-19 | 2012-04-24 | Gen Hospital Corp | Overexpression of mammalian and viral proteins |
| AUPM873294A0 (en) | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
| US5837520A (en) | 1995-03-07 | 1998-11-17 | Canji, Inc. | Method of purification of viral vectors |
| DK0833934T4 (da) | 1995-06-15 | 2012-11-19 | Crucell Holland Bv | Pakningssystemer til human rekombinant adenovirus til anvendelse ved genterapi |
| US5837511A (en) | 1995-10-02 | 1998-11-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Non-group C adenoviral vectors |
| CA2177085C (en) | 1996-04-26 | 2007-08-14 | National Research Council Of Canada | Adenovirus e1-complementing cell lines |
| CZ438398A3 (cs) | 1996-07-01 | 1999-03-17 | Rhone-Poulenc Rorer S. A. | Způsob přípravy rekombinantních adenovirů |
| FR2751343B1 (fr) | 1996-07-16 | 1998-12-18 | Transgene Sa | Procede de conservation de virus recombinants infectieux, suspension aqueuse virale et utilisation comme medicament |
| AU4255397A (en) | 1996-09-06 | 1998-03-26 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Chimpanzee adenovirus vectors |
| US7732129B1 (en) | 1998-12-01 | 2010-06-08 | Crucell Holland B.V. | Method for the production and purification of adenoviral vectors |
| EP1760151B1 (en) | 1996-11-20 | 2012-03-21 | Crucell Holland B.V. | Adenovirus compositions obtainable by an improved production and purification method |
| US6261823B1 (en) | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
| WO1998039411A1 (en) | 1997-03-04 | 1998-09-11 | Baxter International Inc. | Adenovirus e1-complementing cell lines |
| US6020191A (en) | 1997-04-14 | 2000-02-01 | Genzyme Corporation | Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression |
| US6210683B1 (en) | 1997-09-05 | 2001-04-03 | Merck & Co., Inc. | Stabilizers containing recombinant human serum albumin for live virus vaccines |
| WO1999041416A2 (en) | 1998-02-17 | 1999-08-19 | Schering Corporation | Compositions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations |
| US5981225A (en) | 1998-04-16 | 1999-11-09 | Baylor College Of Medicine | Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same |
| US6113913A (en) | 1998-06-26 | 2000-09-05 | Genvec, Inc. | Recombinant adenovirus |
| ES2323991T3 (es) | 1998-11-16 | 2009-07-28 | Introgen Therapeutics, Inc. | Formulacion de adenovirus para terapia genica. |
| US6225289B1 (en) | 1998-12-10 | 2001-05-01 | Genvec, Inc. | Methods and compositions for preserving adenoviral vectors |
| PT1816204E (pt) | 1999-05-17 | 2011-01-24 | Crucell Holland Bv | Adenovírus recombinante do serótipo ad26 |
| US6492169B1 (en) | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| US6913922B1 (en) | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| DE19955558C2 (de) | 1999-11-18 | 2003-03-20 | Stefan Kochanek | Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren |
| JP5118798B2 (ja) | 2000-03-07 | 2013-01-16 | メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション | アデノウイルス製剤 |
| JP2004519204A (ja) | 2000-05-08 | 2004-07-02 | ダビスコ フーズ インターナショナル インコーポレーテッド | 抗高血圧ペプチドの生成のための乳漿タンパク質の酵素処理、得られた産物、および哺乳動物における高血圧の処置 |
| AUPR878401A0 (en) | 2001-11-09 | 2001-12-06 | Biota Holdings Ltd | Methods for identifying or screening anti-viral agents |
| WO2003049763A1 (en) | 2001-12-12 | 2003-06-19 | Fh Faulding & Co Limited | Composition for the preservation of viruses |
| AR038153A1 (es) | 2002-01-18 | 2004-12-29 | Schering Ag | Formulaciones estabilizadas de adenovirus |
| US20030180936A1 (en) | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Memarzadeh Bahram Eric | Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses |
| AU2003271738C1 (en) | 2002-04-25 | 2008-04-17 | Crucell Holland B.V. | Stable adenoviral vectors and methods for propagation thereof |
| ES2335657T3 (es) | 2002-04-25 | 2010-03-31 | Crucell Holland B.V. | Medios y metodos para la produccion de vectores de adenovirus. |
| DE60313451T2 (de) | 2002-05-14 | 2008-01-03 | Merck & Co., Inc. | Verfahren zur reinigung von adenovirus |
| SE0202110D0 (sv) | 2002-07-05 | 2002-07-05 | Isconova Ab | Iscom preparation and use thereof |
| EP1585964A4 (en) | 2002-08-28 | 2008-07-16 | Introgen Therapeutics Inc | CHROMATOGRAPHIC METHODS FOR PURIFYING ADENOVIRUSES |
| SE0301998D0 (sv) | 2003-07-07 | 2003-07-07 | Isconova Ab | Quil A fraction with low toxicity and use thereof |
| PT1711518E (pt) | 2004-01-23 | 2010-02-26 | Isti Di Ric Di Bio Moleco P An | Transportadores de vacinas de adenovírus de chimpanzé |
| DE602005015332D1 (de) | 2004-02-23 | 2009-08-20 | Crucell Holland Bv | Verfahren zur Reinigung von Viren |
| ES2317517T5 (es) | 2005-04-11 | 2016-01-21 | Crucell Holland B.V. | Purificación de virus usando ultrafiltración |
| US20100143302A1 (en) | 2006-03-16 | 2010-06-10 | Crucell Holland B.V. | Recombinant Adenoviruses Based on Serotype 26 and 48, and Use Thereof |
| EP1998804B1 (en) | 2006-03-27 | 2014-04-16 | Crucell Holland B.V. | Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant |
| WO2008133663A2 (en) | 2006-11-30 | 2008-11-06 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, | Codon modified immunogenic compositions and methods of use |
| US7901388B2 (en) | 2007-07-13 | 2011-03-08 | Bacoustics, Llc | Method of treating wounds by creating a therapeutic solution with ultrasonic waves |
| ES2597439T3 (es) | 2007-12-24 | 2017-01-18 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Antígenos recombinantes del VSR |
| WO2010014975A2 (en) | 2008-08-01 | 2010-02-04 | Academia Sinica | Use of microrna signatures for assessing risk levels of neuroblastoma patients |
| DK2350268T3 (en) | 2008-11-03 | 2015-03-23 | Crucell Holland Bv | PROCEDURE FOR PRODUCING ADENOVIRUS VECTORS |
| ES2898235T3 (es) | 2009-02-02 | 2022-03-04 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de adenovirus de simio, vectores que las contienen, y sus usos |
| MA33449B1 (fr) | 2009-06-24 | 2012-07-03 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Antigènes recombinants du vrs |
| CA2766205A1 (en) | 2009-06-24 | 2010-12-29 | Id Biomedical Corporation Of Quebec | Vaccine comprising at least two paramyxovirus f protein antigens |
| ES2918381T3 (es) * | 2009-07-15 | 2022-07-15 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Composiciones de proteína F de VRS y métodos para producir las mismas |
| EP2464664B1 (en) | 2009-08-13 | 2015-09-23 | Crucell Holland B.V. | Antibodies against human respiratory syncytial virus (rsv) and methods of use |
| JP5465331B2 (ja) | 2009-10-15 | 2014-04-09 | クルセル ホランド ベー ヴェー | 高細胞密度の培養物からのアデノウイルスの精製方法 |
| PL2488636T3 (pl) | 2009-10-15 | 2014-07-31 | Crucell Holland Bv | Sposób oczyszczania cząsteczek adenowirusów z hodowli o wysokim zagęszczeniu komórkowym |
| EA023816B1 (ru) | 2010-02-15 | 2016-07-29 | Круселл Холланд Б.В. | СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Ad26 |
| NZ703035A (en) | 2010-07-09 | 2016-06-24 | Crucell Holland Bv | Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use |
| SG11201405228VA (en) | 2012-03-12 | 2014-11-27 | Crucell Holland Bv | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| CN105431169B (zh) | 2012-03-22 | 2019-04-02 | 扬森疫苗与预防公司 | 抗rsv疫苗 |
| JP2013247240A (ja) | 2012-05-25 | 2013-12-09 | Gigaphoton Inc | レーザ装置 |
| WO2014005643A1 (en) | 2012-07-05 | 2014-01-09 | Okairos Ag | Novel prime-boosting regimens involving immunogenic polypeptides encoded by polynucleotides |
| US10017543B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-07-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion RSV F proteins and their use |
| US9738689B2 (en) * | 2013-03-13 | 2017-08-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Prefusion RSV F proteins and their use |
| US10196438B2 (en) | 2013-04-15 | 2019-02-05 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Human antibodies binding to RSV G protein |
| EA035846B1 (ru) | 2013-04-15 | 2020-08-20 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Антитела человека, связывающиеся с g-белком rsv |
| EA035522B1 (ru) | 2013-04-25 | 2020-06-29 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Стабильные растворимые f-полипептиды rsv в конформации "до слияния" |
| CN105408348B (zh) | 2013-06-17 | 2021-07-06 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
| US10125172B2 (en) | 2013-07-25 | 2018-11-13 | Calder Biosciences Inc. | Conformationally stabilized RSV pre-fusion F proteins |
| PT3046536T (pt) | 2013-09-19 | 2019-02-25 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Formulações de adenovírus melhoradas |
| IL262109B2 (en) * | 2016-04-05 | 2023-04-01 | Janssen Vaccines Prevention B V | vaccine against rsv |
| PE20190420A1 (es) * | 2016-04-05 | 2019-03-19 | Janssen Vaccines And Prevention B V | Proteinas f de prefusion del virus respiratorio sincicial (vrs) solubles y estabilizadas |
-
2014
- 2014-04-24 EA EA201592048A patent/EA035522B1/ru unknown
- 2014-04-24 CN CN201910911639.8A patent/CN110590916A/zh active Pending
- 2014-04-24 SG SG11201508567XA patent/SG11201508567XA/en unknown
- 2014-04-24 HU HUE14719022A patent/HUE041659T2/hu unknown
- 2014-04-24 DK DK14719022.7T patent/DK2988780T3/en active
- 2014-04-24 KR KR1020157032796A patent/KR102236497B1/ko active IP Right Grant
- 2014-04-24 LT LTEP14719022.7T patent/LT2988780T/lt unknown
- 2014-04-24 US US14/786,955 patent/US10899800B2/en active Active
- 2014-04-24 CN CN201480023229.5A patent/CN105188745B/zh active Active
- 2014-04-24 PL PL14719022T patent/PL2988780T3/pl unknown
- 2014-04-24 MY MYPI2015703748A patent/MY181066A/en unknown
- 2014-04-24 EP EP18205858.6A patent/EP3488864A1/en active Pending
- 2014-04-24 AU AU2014259474A patent/AU2014259474B2/en active Active
- 2014-04-24 EA EA202090675A patent/EA039803B1/ru unknown
- 2014-04-24 EP EP14719022.7A patent/EP2988780B1/en active Active
- 2014-04-24 JP JP2016509467A patent/JP6469081B2/ja active Active
- 2014-04-24 RS RS20190170A patent/RS58436B1/sr unknown
- 2014-04-24 ES ES14719022T patent/ES2715378T3/es active Active
- 2014-04-24 WO PCT/EP2014/058353 patent/WO2014174018A1/en active Application Filing
- 2014-04-24 SI SI201431056T patent/SI2988780T1/sl unknown
- 2014-04-24 CA CA2910067A patent/CA2910067C/en active Active
- 2014-04-24 PT PT14719022T patent/PT2988780T/pt unknown
- 2014-04-24 MX MX2015014890A patent/MX361774B/es active IP Right Grant
- 2014-04-24 PE PE2015002278A patent/PE20151867A1/es unknown
- 2014-04-24 TR TR2019/02513T patent/TR201902513T4/tr unknown
- 2014-04-24 AP AP2015008815A patent/AP2015008815A0/xx unknown
- 2014-04-24 ME MEP-2019-73A patent/ME03442B/me unknown
- 2014-04-25 AR ARP140101738A patent/AR096113A1/es unknown
- 2014-04-25 TW TW103115087A patent/TWI663175B/zh active
-
2015
- 2015-10-13 PH PH12015502377A patent/PH12015502377B1/en unknown
- 2015-10-20 IL IL242186A patent/IL242186B/en active IP Right Grant
- 2015-10-22 CL CL2015003124A patent/CL2015003124A1/es unknown
- 2015-10-23 ZA ZA2015/07912A patent/ZA201507912B/en unknown
-
2016
- 2016-07-13 HK HK16108218.1A patent/HK1220124A1/zh unknown
-
2018
- 2018-11-29 MY MYPI2018002243A patent/MY201791A/en unknown
-
2019
- 2019-01-28 HR HRP20190175TT patent/HRP20190175T1/hr unknown
- 2019-03-13 CY CY20191100303T patent/CY1121600T1/el unknown
-
2020
- 2020-12-18 US US17/126,128 patent/US20210101940A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-08-23 US US17/821,694 patent/US20230265127A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011050168A2 (en) * | 2009-10-21 | 2011-04-28 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic | Rsv immunogens, antibodies and compositions thereof |
| WO2012158613A1 (en) * | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Novartis Ag | Pre-fusion rsv f antigens |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| M. MAGRO et. al. Neutralizing antibodies against the preactive form of respiratory syncytial virus fusion protein offer unique possibilities for clinical intervention. Proceeding of the National Academy of Sciences, vol. 109, n. 8, p. 3089-3094, abstract, p. 3091, fig. 4 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210101940A1 (en) | Stabilized Soluble Pre-Fusion RSV F Polypeptides | |
| CA2914792C (en) | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides | |
| EA035909B1 (ru) | Стабилизированные растворимые f-полипептиды rsv до слияния | |
| KR102421049B1 (ko) | 안정화된 융합-전 rsv f 단백질 | |
| BR112021008975A2 (pt) | proteínas f do rsv pré-fusão estabilizadas | |
| OA17539A (en) | Stabilized soluble prefusion RSV F polypeptides. | |
| NZ752808A (en) | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides | |
| NZ713371B2 (en) | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides | |
| NZ752808B2 (en) | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides | |
| NZ714594B2 (en) | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides | |
| OA17598A (en) | Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides |