DE60313451T2 - Verfahren zur reinigung von adenovirus - Google Patents

Verfahren zur reinigung von adenovirus Download PDF

Info

Publication number
DE60313451T2
DE60313451T2 DE60313451T DE60313451T DE60313451T2 DE 60313451 T2 DE60313451 T2 DE 60313451T2 DE 60313451 T DE60313451 T DE 60313451T DE 60313451 T DE60313451 T DE 60313451T DE 60313451 T2 DE60313451 T2 DE 60313451T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
adenovirus
virus
dna
particles
product
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60313451T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60313451D1 (de
Inventor
John O. Rahway KONZ
Ann L. Rahway LEE
Aaron R. Rahway GOERKE
Chi Shung Brian Rahway TO
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Sharp and Dohme LLC
Original Assignee
Merck and Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29549953&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE60313451(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Merck and Co Inc filed Critical Merck and Co Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE60313451D1 publication Critical patent/DE60313451D1/de
Publication of DE60313451T2 publication Critical patent/DE60313451T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)

Description

  • QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
  • Diese Anmeldung beansprucht Priorität unter 35 U.S.C. §119(e) der vorläufigen US-Anmeldung 60/380 322, eingereicht am 14. Mai 2002.
  • ANGABEN BEZÜGLICH STAATLICH GEFÖRDERTER F & E
    • Nicht zutreffend
  • VERWEIS AUF MICROFICHE-ANHANG
    • Nicht zutreffend
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln, insbesondere rekombinanten Adenovirusvektorpartikeln. Dieses Verfahren wurde entwickelt, um Adenovirus von Zelllysat zu reinigen. Es setzt eine Kombination aus selektiver Ausfällung, Tiefenfiltration und/oder Zentrifugation, Ultrafiltration, Nukleasedigestion und Chromatographie ein, um stabil und wirtschaftlich ein hochgradig gereinigtes Produkt zu erzeugen. Bei diesem Verfahren werden kontaminierende Wirtszellen-DNA-Mengen durchwegs auf weniger als die Nachweisgrenze eines auf PCR basierenden Assays, das für menschliche DNA spezifisch ist, reduziert (<5 pg/1011 vp).
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Fortschritte auf den Gebieten der Verwendung von rekombinanten viralen Vektoren für Gentherapie- und DNA-Impfungsanwendungen haben einen Bedarf für die großtechnische Herstellung und Reinigung von Viren in klinischer Reinheit geschaffen. Eine solche Virusfamilie sind die Adenoviren. Die Adenoviren gehören zur Familie Adenoviridae, die in die Gattungen Aviadenovirus (Vögel) und Mastadenovirus (Menschen, Affen, Rinder, Pferde, Schweine, Schafe, Hunde und Opossum) unterteilt ist. Ein Überblick über die Familie Adenoviridae findet sich in Fundamental Biology, 3. Aufl., Fields, B.N., Knipe, D.M., und Howley, P.M., Hrsg., in Kapitel 30, S. 979-1016 (1996), welcher hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist. Von besonderem Interesse bei Genimpfungs- und/oder Gentherapieanwendungen ist die Verwendung eines replikationsunfähigen Adenovirus der ersten Generation (FG), der durch E1- und/oder E1/E3- Gendeletionen verkrüppelt ist, basierend auf dem Adenovirus-Serotyp 5. Das Adenovirus hat einen breiten Zelltropismus, einschließlich professioneller antigenpräsentierender Zellen, wie z.B. Makrophagen und dendritische Zellen, es kann Zellen der meisten Tierarten befallen (wenn nicht sogar darin replizieren), und es kann in großen Mengen in passenden menschlichen Zelllinien produziert werden, welche dafür ausgelegt sind, das E1-Genprodukt in trans zu ergeben. Das Adenovirusgenom ist im Allgemeinen mit benignen Pathologien bei Menschen verbunden, und die Genomorganisation des Virus wurde seit dessen Entdeckung in den frühen 1950iger Jahren eingehend untersucht. Darüber hinaus ist das Genom für die Manipulation zugänglich, abhängig von der verwendeten Strategie zur Konstruktion des entsprechenden Vektors. Ein replikationsunfähiges Virus (wie z.B. ein E1/E3 deletierter Ad5gag-Vektor, der ein HIV-gag-Transgen exprimiert, wie hier veranschaulicht) benötigt eine Zelllinie, die die Deletionen komplementiert. Jede derartige Zelllinie kann verwendet werden, um rekombinante Virusvektoren zu erzeugen, wobei bevorzugte, jedoch nicht limitierende Zelllinien 293-Zellen und PER.C6TM-Zellen sind. Zu diesem Zweck wurden zahlreiche rekombinante Adenovirusvektoren der 1. Generation in der Literaturbeschrieben (siehe z.B. Bett, et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8802-8806; WO 01/02607 und WO 02/22080 ). "Gutless"-Adenovirusvektoren sind ein Adenovirusvektor der 2. Generation, im Allgemeinen ohne Virusprotein kodierende Sequenzen, häufig durch ein Helfervirus (oft ein E1 deletiertes Adenovirus), gewachsen mit dem helferabhängigen (HD) Adenovektor in einer Verpackungszelllinie (z.B. PER.C6TM), mit Virusproteinen in trans supplementiert. Bei fehlenden Virusproteinen können diese Virusvektoren als Alternative in trans durch eine Zelllinie und/oder ein "Helfervirus", der/die in der Lage ist, die strukturellen und funktionellen Adenovirusproteine zu exprimieren, die für eine erfolgreiche Replikation, Verpackung und Rettung notwendig sind, supplementiert werden. Angesichts der zunehmenden Popularität dieser Virusvektoren und am Ende der Notwendigkeit, großtechnische Mengen entweder eines Impfstoffs auf Virusbasis oder eines Gentherapievehikels herzustellen, wurde es zwingend notwendig, wirtschaftliche und vergrößerbare Verfahren zur Herstellung und Reinigung zu entwickeln.
  • Erste Berichte über eine chromatographische Adenovirusreinigung im kleinen Maßstab erschienen in den späten 1950iger Jahren und frühen 1960iger Jahren (siehe z.B. Klemperer und Pereira 1959, Virology 9: 536-545; Philipson, 1960, Virology 10: 459-465; Haruna et al., 1961, Virology 13: 264-267), sie wurde jedoch durch Zentrifugation in einem CsCl-Gradienten abgelöst. Im vergangenen Jahrzehnt wurde erneut über eine chromatographische Adenovirusreinigung berichtet.
  • Das US-Patent Nr. 5 837 520 (siehe auch Huyghe et al., 1995, Human Gene Therapy 6: 1403-1416) offenbart ein Verfahren zur Adenovirusreinigung, das die Behandlung des Zelllysats mit einer Nuklease umfasst, gefolgt von (1) Anionenaustausch und (2) Metallionenchromatographie.
  • Das US-Patent 6 261 823 offenbart ein Verfahren zur Adenovirusreinigung, welches das Durchführen einer Anionenaustauschchromatographie, gefolgt von Größenausschlusschromatographie, bei einem Viruspräparat umfasst.
  • Das US-Patent 6 194 191 offenbart Verfahren zur Adenovirusreinigung durch Verwendung niedriger Perfusionsgeschwindigkeiten während der Zellkultur, eines Detergentienlyseschritts und/oder eines einzelnen Chromatographieschritts.
  • Shabram et al., 1997 (Human Gene Therapy 8: 453-465) offenbart ein Verfahren zur Messung der Ad5-Konzentration mit analytischer Anionenaustauschchromatographie.
  • Trotz dieser und anderer Berichte bleibt ein Bedarf für die Entwicklung eines großtechnischen Verfahrens zur Reinigung von Virusvektoren, die in Wirtszellenkultursystemen erzeugt werden, welches sowohl quantitative als auch qualitative Probleme behandelt, die durch einen kommerzialisierten Impfstoff oder Gentherapieprodukt entstehen. Die vorliegende Erfindung befasst sich mit und deckt diesen Bedarf, indem es ein Reinigungsverfahren offenbart, das zum Teil auf einem selektiven Fällungsschritt beruht, welcher die Entfernung riesiger Mengen an kontaminierender/unreiner DNA durch Klärung ermöglicht.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln. Für diesen Zweck betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln aus einem Wirtszellenlysat, umfassend selektives Ausfällen von verunreinigenden Nukleinsäure(DNA)-Molekülen weg von den Viruspartikeln innerhalb des nach der Lyse vorliegenden Wirtszellenkulturmediums durch Zugabe eines selektiven Fällungsmittels, so dass mindestens etwa 80% der Wirtszellen-Nukleinsäuremoleküle aus dem Medium, das die Viruspartikel enthält, ausgefällt werden. So wie hierin offenbart, ermöglich dieser erste Schritt die selektive Ausfällung von verunreinigender DNA, wie z.B. Wirtszellen-DNA, mit einer wenigstens 80%igen Verringerung der kontaminierenden DNA und, wie hierin veranschaulicht, sogar einer wenigstens 80%igen Verringerung bis zu einer etwa 90%igen Verringerung von verunreinigender DNA nach der Klärung. Ein bevorzugtes Virus für die Reinigung durch die hierin offenbarten Verfahren ist ein beliebiger Serotyp von Adenovirus. Der zu reinigende Adenovirus-Serotyp ist entweder eine Wildtyp-, eine modifizierte oder eine rekombinante Form des entsprechenden Adenovirus-Serotyps. Die vorliegende Erfindung wird durch ein Verfahren zur Reinigung von rekombinanten Adnovirus-5-Vektorpartikeln, Adenovirus-6-Vektorpartikeln und Adenovirus-35-Vektorpartikeln veranschaulicht, ohne dass sie sich jedoch darauf beschränken möchte. Andere bevorzugte Adenoviruspartikel zur Reinigung durch die hierin offenbarten Verfahren sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Adenovirus-26-Partikel und Adenovirus-36-Partikel.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einesteils einen bevorzugten Schritt bei dem Reinigungsverfahren, nämlich die Einbeziehung eines selektiven Ausfällungsschrittes nach der Lyse durch Zugabe von wenigstens einem selektiven Fällungsmittel (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf ein kationisches Detergens), der, vorzugsweise gekoppelt mit Klärung, zur Entfernung von restlichen Nukleinsäuren und anderen Zellbruchstücken, die auch Viruskapsiden umfassen kann, führt. Das hierin offenbarte Verfahren führt zu einem stabileren und wirtschaftlicheren Verfahren zur Herstellung großtechnischer Mengen an hochgradig gereinigten Adenoviruspartikeln. Verbleibende Wirtszellen-DNA-Mengen werden durchwegs auf weniger als die Nachweisgrenze eines Q-PCR-basierenden Tests (<5 pg/1011 vp) reduziert. So wie hierin offenbart, bedeutet ein Verweis auf einen "selektiven Ausfällungsschritt nach der Lyse", auf einen "selektiven Ausfällungsschritt", auf "selektive Ausfällung" oder dergleichen einen Ausfällungsschritt, bei dem ein selektives Fällungsmittel (SPA) zu einem bestimmten Konzentrationsbereich bei der Herstellung zugegeben wird, was dazu führt, dass ein hoher Prozentsatz an kontaminierenden Nukleinsäuremolekülen (z.B. DNA) selektiv weg von dem entsprechenden Virus ausgefällt wird.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Verfahrensschritte, ohne dass diese zwingend erforderlich sind: (1) Freisetzen von Viruspartikeln aus infizierten Zellen durch einen Lyseschritt, wie z.B. einen Detergentienlyseschritt; (2) selektives Ausfällen, um einen hohen Prozentsatz an kontaminierenden Nukleinsäuren zu entfernen; (3) Tiefenfiltration und/oder Zentrifugation, um Zellbruchstücke und ausgefallene Nukleinsäure zu entfernen; (4) Ultrafiltration, um das Volumen zu verringern und Puffer auszutauschen; (5) Nukleasebehandlung, um verbliebene Nukleinsäuren zu digerieren und die Entfernung zu erleichtern; (6) Anionenaustauschchromatographie, um das Virus von Zellverunreinigungen, nicht zusammengesetzten Viruskomponenten und leeren Kapsiden zu befreien; (7) Tangentialfluss-Ultrafiltration, um weitere Verunreinigungen zu entfernen sowie einen Formulierungspuffer einzubringen; (8) Sterilfiltration des Viruspräparats; (9) gegebenenfalls einen oder mehrere Schritte zur weiteren Reinigung des Viruspräparats, wie z. B. einen Durchfluss-Kationenaustauschchromatographieschritt, einen Umkehrphasen-Adsorptionsschritt und/oder einen Hydroxyapatit-Chromatographieschritt; und (10) gegebenenfalls einen Schritt vor oder in Verbindung mit der Anionenaustauschchromatographie, welcher ein Filtrationsschritt ist, um Teilchen vor dem Aufbringen auf die Anionenaustauschchromatographiesäule zu entfernen. Tabelle 1 skizziert ein beispielhaftes Schritt-für-Schritt-AdV-Reinigungsverfahren.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Wildtyp- oder rekombinantem Virus, insbesondere Wildtyp- oder rekombinantem Adenovirus, wobei ein oder mehrere Schritt des veranschaulichten Verfahrens (siehe Tabelle 1) weggelassen werden. Eine solche Weglassung kann durch den Fachmann auf "Mix and Match"-Basis erfolgen, um ein vollständiges Protokoll für die Adenovirusreinigung zu erzeugen, das qualitativ annehmbar ist und in einer Konzentration formuliert ist, die für klinische und/oder kommerzielle Anwendungen offen ist. Jedes solche modifizierte Verfahren enthält vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, wenigstens die folgenden Schritte: (1) Zelllyse, (2) eine selektive DNA-Fällung nach der Lyse, (3) Klären des verbliebenen virushaltigen Überstands, wie z.B. durch Tiefenfiltration, um Zellbruchstücke und weiteren Nukleinsäureniederschlag zu entfernen, und (4) einen Ultrafiltrationsschritt, um das gereinigte Virus in Konzentrationen zu bringen, die für klinische und/oder kommerzielle Gaben geeignet sind und/oder um das Virus durch Austausch in einen geeigneten Puffer zu bringen.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Einbeziehung der vier oben beschriebenen Schritte, nämlich (1) Zelllyse, (2) selektive DNA-Fällung, (3) Klärung, (4) einen Konzentrationsschritt (mit oder ohne einer Nukleasebehandlung), mit dem zusätzlichen Schritt (5), der ein Anionenaustauschchromatographieschritt ist, in einer beliebigen vernünftigen Reihenfolge, die zur Gewinnung von Adenovirusmengen in kommerzieller Güte führt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Einbeziehung weiterer nachgeschalteter Verfahren, die über die in dem obigen Abschnitt erörterten Schritte 1-5 hinaus gehen, so dass einer oder mehrere der folgenden Schritte in einer beliebigen vernünftigen Kombination und/oder Reihenfolge umfasst sind: ein Ultrafiltrationsschritt, ein Filtrationsschritt, um Teilchen vor dem Aufbringen auf eine Anionenaustauschchromatographiesäule zu entfernen, ein alternativer oder orthogonaler Chromatographieschicht (einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, eines Kationenaustauschchromatographieschritts, Hydroxyapatitchromatographie- und/oder Umkehrphasen-Adsorptionschromatographie schritte (z.B. unter Verwendung von Amberlite XAD) und/oder eines Sterilfiltrationsschritts).
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung verschiedene Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln, wie z.B. Adenovirus, die wirtschaftlicher und stabiler sind als die bekannten Verfahren. Früher beruhten chromatographische Anwendungen zur Adenovirusreinigung auf der Kombination aus hohen Nukleasekonzentrationen und niedrigen Adenovirus-Beladungen, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. Diese Faktoren führen zu Verfahren, die beim Übergang zu größeren Maßstäben unwirtschaftlich und unpraktisch sind. Die vorliegende Erfindung bewältigt diese Probleme durch Offenbarung von Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln, insbesondere Adenoviruspartikeln, umfassend einen vorgeschalteten selektiven Ausfällungsschritt, der die überwiegende Mehrheit der Wirtszellen-DNA entfernt, wenn er mit einem Klärungsschritt gekoppelt ist. Dieser frühe Schritt zur Entfernung von Wirtszellenverunreinigungen ermöglicht die Einbeziehung oder den Ausschluss verschiedener nachgeschalteter Schritte in verschiedenen Kombinationen und/oder Schrittfolgen, abhängig von dem benötigten Reinheitsgrad des fertigen gereinigten Virusprodukts. Als Beispiele, jedoch nicht als Einschränkungen, sind zusätzliche nachgeschaltete Schritte u.a. die Anionenaustauschchromatographie, die Ultrafiltration und eine nachgeschaltete Behandlung mit Nuklease in geringer Konzentration. Speziell ist ein bevorzugter zusätzlicher Schritt im Anschluss an den Schritt der selektiven Ausfällung ein Anionenaustauschchromatographieschritt, bei dem wenig oder keine Nuklease zugegeben wird. Es wird hier gezeigt, dass dieses Verfahren aufgrund der vorhergehenden Ausfällung von Verunreinigungen das Aufbringen der etwa 5-20-fachen Menge an Adenovirus, bezogen auf die früher berichtete Menge, auf die Säule ermöglicht. Ein solcher Schritt wird zur Erzeugung eines Produkts mit hohem Reinheitsgrad geeignet sein. Ein Verfahren, das die selektive DNA-Ausfällung/Klärung beinhaltet, verbessert auch die Effizienz eines nachfolgenden Ultrafiltrationsschrittes deutlich. Und wie hierin angegeben, ist ein Nukleasebehandlungsschritt nicht erforderlich, er kann jedoch gegebenenfalls durchgeführt werden, um eine Verfahrensstabilität zu gewährleisten. Für viele Anwendungen kann die Reinheit des ultrafiltrierten Produkts ausreichend sein und eine chromatographische Reinigung als unnötig erachtet werden. Für eine hohe Reinheit erfordernde Anwendungen, wie z.B. Chargen in klinischer Güte oder kommerzielle Befüllungen, oder aus anderen Gründen, wie z.B. zur weiteren Reinigung, können ein oder mehrere Chromatographieschritte zugefügt werden. Wie oben angegeben, ist die Anionenaustauschchromatographie bei einem solchen Verfahren extrem nützlich, abhängig von der sorgsamen Harzauswahl und den Verfahrensbedingungen (NaCl-Konzentration), sowie die Einbeziehung eines Detergens (z.B. PS-80) in die Laufpuffer, um die Aggregation während der Beladung und Flution zu inhibieren. Wiederum wird die AEX-Harznutzung insgesamt um das 5-20-fache gegenüber den besten berichteten Verfahren verbessert, wobei eine veranschaulichte ausnutzbare Kapazität bei 2,0 × 1013 vp/ml Harz liegt, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Als eine Alternative oder zusätzlich zur Anionenaustauschchromatographie kann auch die Umkehrphasenadsorption zur Verringerung der Konzentration von Verunreinigungen geeignet sein. Speziell können Detergentien, die während der Kultur, Lyse oder Ausfällung eingebracht werden, mittels eines Adsorptionsschrittes auf Chargen- oder Säulenbasis entfernt werden.
  • Zu diesem Zweck betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln, insbesondere Adenoviruspartikeln, das durch einen frühen selektiven Ausfällungsschritt nach der Lyse gekennzeichnet ist, der in weiterer Kombination mit einem Klärungsschritt und optionalen Ultrafiltrations-, Nukleasebehandlungs-, Volumenverringerungs- und/oder Pufferaustauschschritten verwendet werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln, insbesondere Adenoviruspartikeln, bei dem ein selektiver DNA-Ausfällungsschritt nach der Lyse in Kombination mit einem Klärungsschritt, einem Anionenaustauschchromatographieschicht und einem Ultrafiltrationsschritt verwendet wird, wobei optionale Behandlungen u.a. die Nukleasebehandlung, die Volumenverringerung und/oder den Pufferaustausch umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
  • Die vorliegend Erfindung betrifft ferner ein veranschaulichtes Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln, insbesondere rekombinanten Adenovirusvektorpartikeln, wie es in Tabelle 1 beschrieben ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner verschiedene Modifizierungen, die sich dem Fachmann beim Studium dieser Patentschrift offenbaren werden, wobei solche Modifizierungen ein Kernelement aus einem frühen selektiven DNA-Ausfällungsschritt nach der Lyse verwenden; ein Schritt, der, wenn mit einem Klärungsschritt kombiniert, den Rest des Reinigungsverfahrens bildet, indem ein relativ reines Produkt für weitere Manipulationen erzeugt wird. Beim Studium dieser Patentschrift wird daher deutlich werden, dass kein, ein oder mehr als ein zusätzlicher Reinigungsschritt nach Belieben des Fachmanns zugefügt werden kann, um ein gereinigtes Virusprodukt zu erzeugen. Solche zusätzlichen Schritte können hierin offenbarte Schritte sein (siehe z.B. Tabelle 1) oder solche, die im Stand der Technik bekannte sein würden.
  • Daher betreffen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Reinigung von Adenoviruschargen mit klinischer Qualität in kommerziell geeigneten Mengen, wobei das Verfahren wenigstens einen selektiven Ausfällungsschritt als Schritt nach der Lyse durch Zugabe eines SPA, das den Großteil der Wirtszellen-DNA entfernt, wenn er mit wenigstens den zusätzlichen Schritten der Klärung und Ultrafiltration gekoppelt wird, umfasst. Die Einbeziehung dieses Ausfällungsschritts nach der Lyse verbessert die Wirksamkeit von etwaigen ein oder mehreren nachfolgenden Ultrafiltrationsschritten wesentlich. Daher erfüllt das hierin offenbarte Verfahren den Bedarf nach einem Virusreinigungsschema, das den Anforderungen einer großtechnischen kommerziellen Produktion gerecht wird. Die hierin beschriebenen Verfahren eignen sich besonders auf dem Gebiet der Genimpfstoffe/Gentherapie, um viele Nachteile von bekannten Virusreinigungsverfahren zu beheben. Wie innerhalb dieser Patentschrift vermerkt, führen die hierin offenbarten Verfahren zu konzentrierten Adenoviruspräparaten mit vernachlässigbaren Mengen an DNA-Verunreinigung. Es ist bevorzugt, dass die Adenoviruspräparate der vorliegenden Erfindung Adenovirus in einer Konzentration von wenigstens 1 × 1011 vp/ml und vorzugsweise von mehr als 1 × 1012 vp/ml enthalten, bei einer Konzentration von restlicher Wirtszellen-DNA von wenigstens weniger als 100 Picogramm/1011 vp oder ferner weniger als 30 Picogramm/1011 vp, vorzugsweise von weniger als 10 Picogramm/1011 vp und besonders bevorzugt von weniger als 5 Picogramm/1011 vp.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Adenovirusreinigung zur Verfügung zu stellen, das wenigstens die Einbeziehung eines selektiven Ausfällungsschritts nach der Lyse durch Zugabe eines SPA umfasst, welcher gekoppelt sein kann mit einem oder mehreren zusätzlichen Klärungsschritten und einem oder mehreren Ultrafiltrationsschritten. Dieses Verfahren begünstigt die Entfernung von verbliebenen Nukleinsäuren und anderen Zellbruchstücken, was zu stabileren Mengen hochgradig gereinigter Adenoviruspartikel in kommerzieller Güte führt.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Adenovirusreinigung zur Verfügung zu stellen, das wenigstens die Einbeziehung der vier oben beschriebenen Schritte, nämlich (1) Zelllyse, (2) selektive Ausfällung von Nukleinsäuremolekülen durch Zugabe eines SPA, (3) Klärung, (4) einen Konzentrationsschritt (mit oder ohne eine Nukleasebehandlung), mit dem zusätzlichen Schritt (5) eines Anionenaustauschchromatographieschritts umfasst.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Adenovirusreinigung zu Verfügung zu stellen, das wenigstens die Einbeziehung von Schritten zusätzlich zu den Schritten 1-5 des vorherigen Abschnitts umfasst, welche in einer beliebigen vernünftigen Kombination und Reihenfolge ein oder mehrere Ultrafiltrationsschritte, einen Filtrationsschritt zur Entfernung von Teilchen vor dem Aufbringen auf eine Anionenaustauschchromatographiesäule, einen alternativen oder orthogonalen Chromatographieschicht (einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, eines Kationenaustauschchromatographieschritts, Hydroxyapatitchromatographie, und/oder eines Umkehrphasen-Adsorptionschromatographieschritts und/oder eines Sterilfiltrationsschritts) umfasst.
  • Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist als ein Verfahren zur Adenovirusreinigung veranschaulicht, welches die folgenden Verfahrensschritte umfasst, ohne dass diese zwingend erforderlich sind: (1) Freisetzen von Viruspartikeln aus infizierten Zellen durch einen Lyseschritt, wie z.B. einem Detergentienlyseschritt; (2) selektives Ausfällen, um einen hohen Prozentsatz an kontaminierenden Nukleinsäuren zu entfernen; (3) Tiefenfiltration und/oder Zentrifugation, um Zellbruchstücke und ausgefallene Nukleinsäure zu entfernen; (4) Ultrafiltration, um das Volumen zu verringern und Puffer auszutauschen; (5) Nukleasebehandlung, um verbliebene Nukleinsäuren zu digerieren und die Entfernung zu erleichtern; (6) Anionenaustauschchromatographie, um das Virus von Zellverunreinigungen und nicht zusammengesetzten Viruskomponenten zu befreien; (7) Tangentialfluss-Ultrafiltration, um weitere Verunreinigungen zu entfernen sowie einen Formulierungspuffer einzubringen; (8) Sterilfiltration des Viruspräparats; (9) gegebenenfalls einen oder mehrere Schritte zur weiteren Reinigung des Viruspräparats, wie z.B. einen Durchfluss-Kationenaustauschchromatographieschritt, einen Umkehrphasen-Adsorptionsschritt und/oder einen Hydroxyapatit-Chromatographieschritt; und (10) gegebenenfalls einen Schritt vor oder in Verbindung mit der Anionenaustauschchromatographie, welcher ein Filtrationsschritt ist, um Teilchen vor dem Aufbringen auf die Anionenaustauschchromatographiesäule zu entfernen. Tabelle 1 skizziert ein beispielhaftes Schritt-für-Schritt-Ad-Reinigungsverfahren, wobei die Kombination und/oder Reihenfolge eines jeden einzelnen Verfahrensschritts offen für eine Anpassung durch den Fachmann sind/ist.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "vp" – Viruspartikel –.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "AEX" – Anionenaustauschchromatographie –.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "CEX" – Kationenaustauschchromatographie –.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "TFF" – Tangentialflussfiltration –.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "TNBP" – Tri-n-butylphosphat –.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "CPC" – Cetylpyridiniumchlorid –.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "DB" – Domiphenbromid –.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "CTAB" – Cetyltrimethylammoniumbromid –.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "BTC" – Benzethoniumchlorid –.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "TTA" Tetradecyltrimethylammoniumchlorid –.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "PS-80" – Polysorbat 80 –.
    So wie hierin verwendet, bedeutet "SPA" – selektives Fällungsmittel –. Ein selektives Fällungsmittel ist hier definiert als ein beliebiges Mittel, eine beliebige Verbindung oder dergleichen, das/die, wenn es/sie zu einem Präparat zugegeben wird, das eine Viruspopulation, wie z.B. Adenovirus, und kontaminierende Nukleinsäuremoleküle enthält, die selektive Ausfällung von wenigstens einer wesentlichen Menge der kontaminierenden Nukleinsäuremoleküle weg von dem entsprechenden Virus bewirkt.
    So wie hierin verwendet, bedeutet die Bezeichnung "Adenovirus" oder "Ad" oder "AdV" einen beliebigen Adenovirus, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, einen beliebigen Adenovirus-Serotyp, der ein Wildtypvirus, ein modifiziertes Virus (wie z.B. als ein geschwächtes Virus) und/oder ein rekombinantes Virus, wie z.B. irgendein Adenovirus-Serotyp, der zum Beispiel ein rekombinanter Adenovirusvektor der 1. oder 2. Generation ist, welcher ein oder mehrere heterologe Transgene, insertiert in den entsprechenden rekombinanten Adenovirusvektor, enthalten kann oder nicht.
    So wie hierin verwendet, bedeutet die Bezeichnung "Wirtszelle" oder "Wirtszelllinie" eine beliebige Säuger-Zelllinie, welche die Replikation eines entsprechenden Virus, wie z.B. eines Wildtyp-, modifizierten oder rekombinanten Adenovirus, unterstützt. Man wird erkennen, dass jede solche Wirtszelllinie bis zu einer im Fach bekannten Wachstumsphase kultiviert wird, gefolgt von der Infektion mit einem Impfstamm des entsprechenden Virus, dann gefolgt von einer weiteren Kultur unter physiologisch annehmbaren Bedingungen, die zur Erzeugung einer zusätzlichen Viruspopulation führt, welche durch die hierin offenbarten Verfahren geerntet werden kann.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt ein Beispiel für eine präparative Anionenaustausch(AEX)-Chromatographie. Das Feed wurde auf etwa 38 mS/cm eingestellt und auf Source15Q gepackt. Die Säule wurde mit 5 Volumen 50 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,39M NaCl, 0,1% PS-80, pH 7,5, gewaschen, und ein linearer Gradient wurde bis 0,47M NaCl eluiert.
  • Die 2A, 2B und 2C zeigen Ergebnisse von Anionenaustauschassay-Chromatogrammen für den Schritt der präparativen AEX-Chromatographie. (A) Feed, (B) Durchfluss, (C) Produktpool. Peak-IDs sind wie folgt: 1 Minute – versch. Verunreinigungen, PS-80; 7 Minuten – Hexon-Protein; 11 Minuten – AdV-Partikel; 16 Minuten – Nukleinsäure.
  • 3 zeigt ein Profil des präparativen Anionenaustauschs für Beispiel 2. Das Beladen, das Waschen und die Flution sind gezeigt.
  • 4 zeigt Adenovirus-Ausfällungsprofile für die kationischen Detergentien BTC, DB, CTAB, CPC und TTA.
  • 5 zeigt die DNA-Ausfällungsprofile für die kationischen Detergentien BTC, DC, CTAB, CPC und TTA.
  • 6 zeigt verschiedene Kapazitäten für eine CE-25- und DE-45-Tiefenfiltration unter verschiedenen Mischbedingungen.
  • 7 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse eines Schritt-für-Schritt-Adenovirus(MRKAd5gag)-Reinigungsverfahrens aus einer 300-Liter-Zellkultur. Die Beladung wurde auf 6,34E9 vp normalisiert.
  • 8 zeigt eine SDS-PAGE-Gelproteinanalyse bei dem Anionenaustauschprodukt(AEP)-Zwischenprodukt für drei als Beispiele gewählte Adenovirus-Präparate. Alle Proben wurden bei 1,19e10 Gesamt-vp beladen. Spur (1) MG-Markierungen; (2) 0112A; (3) 0112C; (4) 0114; (5) 0113A1; (6) 0113A2; (7) 0113A3; (8) 0113B; (9) 0113C; (10) 0113D.
  • 9 zeigt Trennzeiten für verschiedene rekombinante Adenovirus-Serotypen (Ad5, Ad24 und Ad35) durch Anionenaustauschchromatographie.
  • 10 zeigt die Konzentrationsauswirkung von Domiphenbromid auf verschiedene Serotypen von rekombinantem Adenovirus und DNA aus jedem entsprechenden rekombinanten Virus.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln aus einem Zelllysat. Dazu betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln aus einem Zelllysat von einem Zellkulturmedium, das die selektive Ausfällung von Verunreinigungsmolekülen (DNA-Molekülen) (wie z.B. genomischer Wirtszellen-DNA) weg von den Viruspartikeln innerhalb des Zelllysats durch Zugabe eines selektiven Fällungsmittels zu dem Wirtszellenkulturmedium nach der Lyse umfasst, so dass mindestens etwa 80% der DNA-Verunreinigungsmoleküle aus dem die Viruspartikel enthaltenden Medium ausgefällt werden. So wie hierin offenbart, ermöglicht dieser erste Schritt die selektive Ausfällung von kontaminierender DNA bei einer mindestens 80%igen Reduzierung der kontaminierenden DNA und, wie hierin veranschaulicht, sogar einer etwa 90%igen Reduzierung der DNA nach der Klärung (z.B. Tiefenfiltration oder Zentrifugation und ein klärender Tiefenfiltrationsschritt). Zu diesem Zweck betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Virusreinigung, insbesondere Adenovirusreinigung, bei denen wenigstens 70% oder wenigstens 80% oder sogar wenigstens 90% der kontaminierenden (z.B. Verunreinigungs-) DNA nach einem anfänglichen selektiven Ausfällungsschritt nach der Lyse oder einem selektiven Ausfällungsschritt nach der Lyse, gefolgt von einem Klärungsschritt (z.B. Tiefenfiltration oder Zentrifugation und einem klärenden Tiefenfiltrationsschritt) von den Viruspartikeln entfernt werden.
  • Obwohl jede beliebige Zahl von Wildtyp- oder modifizierten Viren und/oder rekombinanten Virusvektoren für dieses Verfahren verwendbar ist, ist ein bevorzugtes Virus ein Wildtyp- oder modifizierter Adenovirus oder rekombinanter Adenovirusvektor, der hierin durch einen rekombinanten Serotyp-5-, -6- und -35-Adenovirusvektor veranschaulicht ist. Ein bevorzugtes Virus zur Reinigung ist ein beliebiger Wildtyp-, modifizierter, mutierter und/oder rekombinanter Adenovirus (siehe wiederum Fundamental Biology, 3. Aufl., Fields, B.N., Knipe, D.M. und Howley, P.M., Hrsg, in Kapitel 30, S. 979-1016 (1996)). Die vorliegende Erfindung betrifft teilweise ein Reinigungsverfahren, bei dem ein nach der Lyse stattfindender Schritt wenigstens einen selektiven Ausfällungsschritt durch Einbau eines selektiven Fällungsmittels, das vorzugsweise ein kationisches Detergens ist, welches wirksam den Großteil der freien Nukleinsäuremoleküle sowie andere Zellbruchstücke entfernt, umfasst. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung führt zur Gewinnung von kommerziell brauchbaren Mengen von Adenovirusvektor mit hervorragenden Reinheitseigenschaften, was dieses Verfahren besonders zur Füllung und Verteilung von Impfstoffen auf Adenovirusbasis oder Gentherapieprodukten auf Adenovirusbasis geeignet macht. Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, um gereinigtes Virus aus großtechnischen Produktionsanlagen zu erhalten, welche in einem bevorzugten Aspekt eine Kombination aus Ausfällung, Tiefenfiltration und/oder Zentrifugation, Ultrafiltration, Nukleasedigestion und Chromatographie umfasst, um stabil und wirtschaftlich ein hochgradig gereinigtes Produkt zu erzeugen. Die verbleibenden Wirtszellen-DNA-Konzentrationen liegen durchwegs unter 5 pg/1011 vp, wenn die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die in Tabelle 1 veranschaulicht sind. Es wird dem Fachmann offensichtlich sein, dass eine Größenangabe für den restlichen Wirtszellen-DNA-Gehalt nicht als eine Einschränkung dieses Verfahrens gedacht ist. Stattdessen stützen diese Daten das Wesentliche der vorliegende Erfindung: ein großtechnisches Verfahren zur Erzeugung von Viruspartikeln, das zu einem hochgradig gereinigten Produkt führt, welches im klinischen und kommerziellen Rahmen verwendet werden kann. Es kann angemerkt werden, dass die Bedeutung, bestimmte DNA-Konzentrationen in dem Endprodukt zu erzielen, produktspezifisch ist. Produkte zur parenteralen Verwen dung in Menschen werden die strengsten Anforderungen erfüllen müssen, doch selbst in diesem Fall werden die Ziele von 100 pg/Dosis bis zu 10 ng/Dosis ("WHO Requirements for the Use of Animal Cells as in vitro Substrates for the Production of Biologicals (Requirements for Biological Substances No. 50), WHO Technical Report Series, No. 878, 1998) oder höher variieren und werden vermutlich angepasst werden, abhängig von der Produktindikation. Darüber hinaus kann für Produkte auf Adenovirusbasis die Dosierung über mehrere Größenordnungen variieren. Es ist daher nicht von besonderer Bedeutung, spezifische Rest-DNA-Konzentrationen von unter diesem Wert (z.B. von unter 5 pg/1011 vp) zu erzielen, und bei den meisten Anwendungen ist es unwahrscheinlich, dass Variationen von einem Mehrfachen um diesen Wert herum von Charge zu Charge Folgen haben werden. Wie oben angegeben, ist es daher bevorzugt, dass die Adenoviruspräparate der vorliegenden Erfindung Adenovirus in einer Menge von 1 × 1011 vp/ml und vorzugsweise von mehr als 1 × 1012 vp/ml enthalten, während sie eine Rest-Wirtszellen-DNA-Konzentration von wenigstens 100 Picogramm/1011 vp oder ferner weniger als 30 Picogramm/1011 vp, vorzugsweise weniger als 10 Picogramm/1011 vp und ganz besonders bevorzugt weniger als 5 Picogramm/1011 vp besitzen.
  • Ein Teil der vorliegenden Erfindung betrifft einen bevorzugten Schritt bei dem Reinigungsverfahren, nämlich die Einbeziehung eines selektiven Ausfällungsschritts nach der Lyse, der, wenn er vorzugsweise mit einer Klärung gekoppelt wird, zur Entfernung von verbliebenen Nukleinsäuren und anderen Zellbruchstücken führt und somit die Verwirklichung eines stabileren und wirtschaftlich brauchbaren Verfahrens zur Herstellung großer Mengen hochgradiger gereinigter Adenoviruspartikel in kommerzieller Qualität ermöglicht. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann, muss jedoch nicht, die folgenden Verfahrensschritte umfassen: (1) Freisetzen von Viruspartikeln aus infizierten Zellen durch einen Lyseschritt, wie z.B. einem Detergentienlyseschritt; (2) selektives Ausfällen mit einem SPA, um einen hohen Prozentsatz an kontaminierenden Nukleinsäuren zu entfernen; (3) Tiefenfiltration, um Zellbruchstücke und ausgefallene Nukleinsäure zu entfernen; (4) Ultrafiltration, um das Volumen zu verringern und Puffer auszutauschen; (5) Nukleasebehandlung, um verbliebene Nukleinsäuren zu digerieren und die Entfernung zu erleichtern; (6) Anionenaustauschchromatographie, um das Virus von Zellverunreinigungen und nicht zusammengesetzten Viruskomponenten zu befreien; (7) Tangentialfluss-Ultrafiltration, um weitere Verunreinigungen zu entfernen sowie einen Formulierungspuffer einzubringen; (8) Sterilfiltration des Viruspräparats; (9) gegebenenfalls gefolgt von oder ergänzt als ein früherer Schritt mit einem unabhängigen zusätzlichen Schritt zur weiteren Reinigung des Viruspräparats, wie z. B. einen Durchfluss-Kationenaustauschchromato graphieschritt, einen Umkehrphasen-Adsorptionsschritt und/oder einen Hydroxyapatit-Chromatographieschritt; und (10) gegebenenfalls eine Schritt vor oder in Verbindung mit der Anionenaustauschchromatographie, welcher ein Filtrationsschritt ist, um Teilchen vor dem Aufbringen auf die Anionenaustauschchromatographiesäule zu entfernen. Tabelle 1 skizziert ein beispielhaftes Schritt-für-Schritt-Ad-Reinigungsverfahren. So wie hierin angegeben, ist eine weitere Option zum hierin offenbarten Verfahren das Hinzufügen eines Filtrationsschritts vor oder in Verbindung mit der Anionenaustauschchromatographie. Es ist möglich, dass in manchen Fällen (die von den speziellen Komponenten des Kulturmediums sowie von den Eigenschaften sowohl der produzierenden Zelllinie als auch des Produkts abhängen könnten) kleine Teilchen oder "Aggregate" entweder durch den primären Klärschritt gelangen können oder sich während der Nukleasebehandlung oder Ultrafiltration bilden können, insbesondere wenn die Ultrafiltration einen Konzentrationsschritt umfasst. In diesem Fall ist ein zusätzlicher Filtrationsschritt vorgesehen, um diese Teilchen vor dem Aufbringen auf die Anionenaustauschchromatographiesäule zu entfernen. Das Filter könnte bei der Beladung der Säule vorgeschaltet werden, oder es könnte in einem unabhängigen Arbeitsgang verwendet werden. Die Filtration würde im Allgemeinen durch Verwendung von Einweg-Kapseln oder Patronenfilter stattfinden. Diese Dead-End-Filter könnten entweder auf Tiefenfiltration oder Membranfiltration beruhen. Das Medium in diesen Filtern könnte(n) Polypropylen, Cellulose, Celluloseester, modifiziertes Polyvinylidenfluorid, Nylon, Polyethersulfon oder irgendein anderes Material sein, das mit einer geringen Produktbindung konform geht; darüber hinaus könnten alle diese Medien mit oder ohne Modifizierungsmittel, wie z.B. Diatomeenerde und/oder Harze, um die Filtereigenschaften zu verbessern, vorliegen. Die nominale Größe eines solchen Filters würde zwischen 0,2 und 1 Mikron liegen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Reinigung von Wildtyp- oder rekombinantem Virus, insbesondere Wildtyp- oder rekombinantem Adenovirus, wobei einer oder mehrere Schritte eines veranschaulichten Verfahrens (siehe Tabelle 1) weggelassen werden. Eine solche Weglassung kann durch den Fachmann auf "Mix and Match"-Basis erfolgen, um ein vollständiges Protokoll für die Adenovirusreinigung zu erzeugen, das qualitativ annehmbar ist und in einer Konzentration formuliert ist, die für klinische und/oder kommerzielle Anwendungen offen ist. Jedes solche modifizierte Verfahren enthält vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, wenigstens die folgenden Schritte: (1) Zelllyse, (2) eine selektive DNA-Fällung nach der Lyse, (3) Klären des verbliebenen virushaltigen Überstands, wie z. B. durch Tiefenfiltration, um Zellbruchstücke und weiteren Nukleinsäureniederschlag zu entfernen, und (4) einen Ultrafiltrationsschritt, um das gereinigte Virus derart einzuengen, dass die Konzentrationen für klinische und/oder kommerzielle Gaben geeignet sind und/oder um das Virus durch Austausch in einen geeigneten Puffer zu bringen.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Einbeziehung der vier oben beschriebenen Schritte, nämlich (1) Zelllyse, (2) selektive DNA-Fällung, (3) Klärung, (4) einen Konzentrationsschritt (mit oder ohne einer Nukleasebehandlung) mit dem zusätzlichen Schritt (5), der ein Anionenaustauschchromatographieschritt ist Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Einbeziehung weiterer nachgeschalteter Verfahren, die über die in dem obigen Abschnitt erörterten Schritte 1-5 hinaus gehen, so dass einer oder mehrere der folgenden Schritte in einer beliebigen vernünftigen Kombination und/oder Reihenfolge umfasst sind: ein Ultrafiltrationsschritt, ein alternativer oder orthogonaler Chromatographieschicht (einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, eines Kationenaustauschchromatographieschritts, Hydroxyapatitchromatographie- und/oder Umkehrphasen-Adsorptionschromatographieschritten (z. B. unter Verwendung von Amberlite XAD) und/oder eines Sterilfiltrationsschritts).
  • Die Schritte 1-4 können auf ein beliebiges Produkt mit Eigenschaften ausgedehnt werden, die die selektive Ausfällung von DNA basierend auf Ladung und/oder Hydrophobizität ermöglichen, mit der Maßgabe, dass das Produkt nicht durch das selektive Mittel desaktiviert wird. Zum Beispiel sollte jedes kationische Produkt (oder Anion mit einer niedrigeren Ladungsdichte als DNA) in Lösung frei bleiben, wenn DNA mit kationischen Detergentien oder Polymeren gefällt wird. Beispielhafte Produkte können u.a. adenoassoziiertes Virus (AAV), humanes Papilloma-Virus (HPV) oder VLPs, hergeleitet von deren Strukturprotein(en), und Hepatitis-A-Virus (HAV) sein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Von besonderem Interesse ist AAV, da die Reinigung mittels Kationenaustauschchromatographie beschrieben wurde und großtechnische Produktionsanlagen notwendig sein können, wenn es als ein Vektor für entweder die Gentherapie oder Impfstoffprodukte zugelassen wird. In diesem Fall könnten kationische Detergentien verwendet werden, um sowohl Wirtszellen-DNA als auch das kontaminierende Helfer-Adenovirus auszufällen. Nach der Klärung könnte das AAV durch Ultrafiltration und Chromatographie weiterbehandelt werden, wobei der Kationenaustausch der bevorzugte Schritt ist und die Anionenaustauschchromatographie nur angehängt wird, wenn zusätzliche Stabilität erwünscht ist. Dabei sollte angemerkt werden, dass ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die spezifische Verwendung von Domiphenbromid als ein selektives Fällungsmittel für Reinigungsverfahren ist, bei denen die Entfernung einer beliebigen Zahl von Zellkomponenten, insbesondere Nukleinsäuren, aus einer beliebigen Zahl von verschiedenen Arten von biologischen Produkten, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Viruspartikeln, virusartiger Teilchen (z.B. auf HPV basierende Impfstoffe) oder beliebiger anderer biologischer Produkte, die von einer kontaminierenden kulturbasierenden Komponente durch einen selektiven Ausfällungsschritt im Wesentlichen abgetrennt werden können, notwendig ist. Obwohl eine große Zahl von möglichen SPAs zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist Domiphenbromid aufgrund seiner Verfügbarkeit als ein Rohmaterial von GMP-Güte und seiner derzeitigen Verwendung in anderen, zur Verwendung am Menschen vorgesehenen Produkten von besonderem Interesse. Da Domiphenbromid als ein Wirkstoff in Mundhygieneprodukten sowie als topische antibiotische Cremes ausgiebig Verwendung findet, wird speziell dieses Molekül in großen Mengen produziert und unter cGMP-Bedingungen freigegeben. Dessen Verwendung als selektives Fällungsmittel und speziell als Mittel zur Ausfällung von Nukleinsäuren aus einem Virus ist im Stand der Technik nicht bekannt. Die erhöhte Selektivität von DB rührt von seiner Fähigkeit her, leicht zwischen Stromkomponenten zu unterscheiden, die kleine Unterschiede bei den Ladungsdichten oder der Gesamtladung besitzen. Die erfolgreiche Anwendung dieser Technologie bei Strömen, die minimale Unterschiede in der Ladungsdichte besitzen (z.B. Adenovirus und DNA), unterstreicht dessen mögliche Verwendung bei einer Reihe von derzeitigen und zukünftigen kommerziellen Anwendungen. Das breite Verarbeitungsfenster, das eine solche Anwendung begleitet, kann nur breiter werden, wenn größere Ladungsunterschiede zwischen Produkt und Verunreinigungen untersucht werden. Die Selektivität kann durch die Zugabe von anorganischen Salzen mit variierenden Ionenstärken weiter erhöht werden. Es ist bekannt, dass während der Ausfällung bei Verbindungen, die auch eine Ammoniumgruppe enthalten, positive Ladungen auf den Detergentienmolekülen die negativ geladenen Gruppen auf den Molekülen, die einen Elektronegativitätsgrad besitzen, neutralisieren. Sobald die Ladungen auf den Molekülen neutralisiert sind, Wechselwirken die hydrophoben Enden der Detergentienmoleküle miteinander durch hydrophobe Wechselwirkungen, so dass die löslichen Komponenten ausfallen. Die DB-Moleküle besitzen eine strukturelle Verwandtheit mit vielen üblicherweise verwendeten kationischen Detergentien, dadurch dass sie eine geladene Ammoniumgruppe besitzen, die Kombination aus Ammoniumgruppe(n), Ester(n) und Benzolring(en) ergibt jedoch eine zusätzliche Selektivität und Stabilität gegen ladungsbasierende Wechselwirkungen, so dass eine neue Technologie angewandt werden kann (z.B. einschließlich DNA, RNA, Proteinen, VLPs und Polysaccharidmolekülen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft somit Verfahren, die zur Reinigung von Adenovirusvektorteilchen aus großtechnischen Produktionsanlagen führen und kommerziell brauchbare Mengen an gewonnenem Virus liefern, die auch hervorragende Reinheitseigenschaften aufweisen. Die Bezeichnung "großtechnisch", so wie sie hierin verwendet wird, soll Wirtszellenkultur-Gesamtvolumina von mehr als etwa 10 Liter bis etwa 50000 Liter umfassen, wobei etwa 300 Liter bis etwa 20000 Liter die Norm sind.
  • Bei einem veranschaulichten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Kombination aus Zelllyse, Ausfällung mit einem SPA, Tiefenfiltration und/oder Zentrifugation, Ultrafiltration, Nukleasedigerierung und Chromatographieschritte verwendet, um hochgrad gereinigtes Produkt stabil und wirtschaftlich herzustellen, was zu Konzentrationen an verbleibender Wirtszellen-DNA von weniger als nachweisbare Konzentrationen führt, wenn ein Q-PCR-Assay für Wirtszellen-DNA verwendet wird. Ein vorausgehender Lyseschritt sorgt für die maximale Freisetzung von intrazellulärem Adenovirus von den Wirtszellen und macht es möglich, die potentiellen adventiven Mittel (insbesondere komplexe Viren, wie z.B. Herpesviren oder Retroviren), die hypothetisch die Zellkultur in einer niedrigen Konzentration verunreinigen könnten, zu deaktivieren.
  • Wie oben angegeben, ermöglicht ein erster Schritt zur Lyse infizierter Zellen die Ernte von sowohl zellassoziiertem (intrazellulärem) als auch nicht zellassoziiertem (extrazellulärem) Virus aus dem Wirtszellenkulturmedium. Als Folge davon ergibt dies eine Flexibilität bei der Auswahl von Kulturbedingungen, die für die Virusgesamtproduktivität optimal sind. Darüber hinaus minimiert die Gegenwart von Detergens während des Verfahrens die Assoziierung des Virus mit der Wirtszellen-DNA. Die Wirtszellen-Detergentienlyse kann, obwohl sie das bevorzugte Verfahren zur Lyse AdV-haltiger Wirtszellen ist, durch nichtmechanische Lyseverfahren, die für Reinigungsverfahren im großtechnischen Maßstab geeignet sind (wie z.B. Enzymbehandlung), und/oder durch mechanische Scherverfahren (wie z.B. Hohlfaser-Ultrafiltration) ersetzt werden, um maximale Mengen an Adenovirus freizusetzen. Jede zelllysierende Komponente, die in ein biologisches System, wie z.B. eine Gentherapie oder ein Impfstoffreinigungsverfahren, eingebracht werden kann, kann zur Lyse der infizierten Wirtszellen verwendet werden, insbesondere ist ein Detergens oder ein Enzym, von dem im Fachgebiet bekannt ist, dass es bei biologischen Anwendungen geeignet ist, vorgesehen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Detergentien Triton und/oder Polysorbat-80. Darüber hinaus kann ein Lösungsmittel, wie z.B. TNBP, zu dem Lysat oder dem geklärten Lysat in niedrigen Konzentrationen (z.B. 0,3%) zugegeben werden, um diese Detergentien in ihrer Fähigkeit zu unterstützen, komplexe Viren zu desaktivieren. Auch die Autolyse der infizierten Wirtszellen kann für eine bedeutende Freisetzung von intrazellulärem Virus sorgen. Somit kann jede beliebige Form von Wirtszellenlyse, die im Stand der Technik bekannt ist, verwendet werden, um intrazellulären Virus in das Wirtszellenkulturmedium freizusetzen, damit dieser schließlich durch die hierin offenbarten Verfahren geerntet werden kann.
  • Nach der Lyse wird DNA durch Zugabe einer konzentrierten SPA-Lösung selektiv ausgefällt, während das Adenovirus in der flüssigen Phase verbleibt. Dieser Schritt ermöglicht die selektive Ausfällung von Wirtszellen-DNA und verbessert auch die Stabilität stromabwärts. Wie hierin veranschaulicht, führt dieser frühe Ausfällungsschritt zu einer etwa 90%igen Reduktion der Nukleinsäure nach der Klärung. Nukleasen (einschließlich, ohne jedoch beschränkt zu sein auf, BenzonaseTM (EM Industries), DNasen und RNasen) werden nicht länger benötigt, können jedoch für eine maximale DNA-Verringerung dennoch von Vorteil sein. Angesichts der Fähigkeit dieses Ausfällungsschrittes zur Entfernung der überwiegenden Mehrheit der kontaminierenden Nukleinsäuren, ist die Anionenaustauschchromatographie möglicherweise für die Produktreinheit nicht essentiell, abhängig von der letztendlichen Dosis. Ein AEX-Schritt kann jedoch aus Gründen der Stabilität in dem Verfahren bleiben.
  • Obwohl man nicht durch eine Theorie gebunden sein möchte, wird angenommen, dass die Zugabe eines SPA nach der Zelllyse zu den positiv geladenen Gruppen (und aromatischen Ringen, falls vorhanden) an den Verbindungen führt, die sich an die negativ geladenen Phosphatgruppen (und Basenpaare) an den DNA-Molekülen binden. Die hydrophoben Enden an den Detergentien Wechselwirken dann miteinander, was zur Ausfällung führt. Hierin offenbarte Versuchsergebnisse zeigen, dass DNA-Moleküle eine höhere Affinität für die SPAs besitzen als der Adenovirus. Daher werden die Moleküle nicht mit dem Adenovirus Wechselwirken, bis die DNA-Konzentration in der flüssigen Phase niedrig ist. Gemischte Mizellen ergeben ebenfalls eine erhöhte Stabilität. Dieser Mechanismus sorgt für die erforderliche Selektivität während der Ausfällung. Die SPAs, die zur Durchführung der hierin beschriebenen Erfindung geeignet sein können, sind u.a., ohne jedoch in irgendeiner Weise einschränkend zu sein, Amincopolymere, quaternäre Ammoniumverbindungen und jegliche entsprechende Mischungen davon. Mischung aus SPAs ergeben eine ähnliche Leistung wie reine SPAs, wobei sie mehrere Ausfällungsmechanismen umfassen (z.B. primäre Bindungsstellen). Eine Mischung aus SPAs kann zu dem Zelllysat als der Fällungspuffer zugegeben werden, oder ein High-cut/Low-cut-Zugabeverfahren kann aufgenommen werden. Speziell haben sich die vielen Formen von Polyethylenimin (PEI) als sehr wirkungsvoll zur Neutralisation von überschüssiger anionischer Ladung (DNA-Verunreinigungen) erwiesen, insbesondere unter sauren und neutralen pH-Bedingungen. Theoretisch können modifizierte PEI-Copolymere mit relativ hohen Molekülmassen genauso effizient sein.
  • Die quaternären Ammoniumverbindungen der folgenden sieben Klassen waren für die vorliegende Erfindung die nützlichsten. Diese sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die folgenden Klassen und Beispiele für im Handel erhältliche Produkte: Monoalkyltrimethylammoniumsalze (Beispiele für im Handel erhältliche Produkt sind u.a. Cetyltrimethylammoniumbromid oder -chlorid als CTAB, Tetradecyltrimethylammoniumbromid oder -chlorid (TTA), Alkyltrimethylammoniumchlorid, Alkylaryltrimethylammoniumchlorid, Dodecyltrimethylammoniumbromid oder -chlorid, Dodecyldimethyl-2-phenoxyethylammoniumbromid, Hexadecylamin-, -chlorid- oder -bromidsalz, Dodecylamin- oder -chloridsalz und Cetyldimethylethylammoniumbromid- oder -chlorid), Monoalkyldimethylbenzylammoniumsalze (Beispiele sind u.a. Alkyldimethylbenzylammoniumchloride und Benzethoniumchlorid als BTC), Dialkyldimethylammoniumsalze (im Handel erhältliche Produkt sind u.a. Domiphenbromid als DB, Didecyldimethylammoniumhalogenide und Octyldodecyldimethylammoniumchlorid oder -bromid), heteroaromatische Ammoniumsalze (im Handel erhältliche Produkte sind u.a. Cetylpyridiumhalogenide (CPC oder Bromidsalz und Hexadecylpyridiniumbromid oder -chlorid), cis-Isomer von 1-[3-Chlorallyl]-3,5,7-triaza-1-azoniumadamantan, Alkylisochinoliniumbromid und Alkyldimethylnaphthylmethylammoniumchlorid (BTC 1110), polysubstituierte quaternäre Ammoniumsalze (im Handel erhältliche Produkte sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Alkyldimethylbenzylammoniumsaccharinat und Alkyldimethylethylbenzylammoniumcyclohexylsulfamat), bisquaternäre Ammoniumsalze (Produktbeispiele sind u.a. 1,10-Bis(2-methyl-4-aminochinoliniumchlorid)decan, 1,6-Bis{1-methyl-3-(2,2,6-trimethylcyclohexyl)propyldimethylammoniumchlorid]hexan oder Triclobisoniumchlorid, und das Bis-quat, das als CDQ bezeichnet wird, von Buckman Brochures.), und polymere quaternäre Ammoniumsalze (einschließlich Polyionen, wie z. B. Poly[oxyethylen(dimethylimino)ethylen(dimethylimino)ethylendichlorid], Poly[N-3-dimethylammonio)propyl]-N-[3-ethylneoxyethylendimethylammonio)propyl]harnstoffdichlorid und alpha-4-[1-Tris(2-hydroxyethylen)ammoniumchlorid).
  • Das SPA-behandelte Zelllysat wird durch Tiefenfiltration geklärt, um ausgefallene Verunreinigungen und Zellbruchstücke zu entfernen. Die Zentrifugation mit oder ohne klärender Tiefenfiltration ist ebenfalls geeignet. Daher kann die Klärung von ausgefallenem Lysat unter Verwendung von Zentrifugation alleine oder von Zentrifugation in Verbindung mit einem Klärfiltrationsschritt, wie z.B. Tiefenfiltration, bewirkt werden. Für größere Flüssigkeitsvolumen (mehr als etwa 50 l) ist eine kontinuierliche Zentrifugation gegenüber den Chargenverfahren bevorzugt. Die kontinuierliche Zentrifuge kann eine röhrenförmige Gestalt haben, wie z.B. bei der CARR Powerfuge, oder scheibenförmig sein, wie bei der Westfalia CSA-1, obwohl vermutlich auch andere Hersteller und Modelle zufrieden stellend funktionieren werden. Im Allgemeinen werden die Verweilzeiten und die benötigte Zentrifugalkraft von der Effizienz der einzelnen Anlage sowie von der Größenverteilung des Niederschlags abhängen, und das Verfahren zur Auswahl geeigneter Bedingungen zur Entfernung des Niederschlags, nicht jedoch von Adenovirus, wird jedem Fachmann offensichtlich sein. Beispiel 15 zeigt die Verwendung einer kontinuierlichen Zentrifugation, gefolgt von einer klärenden Tiefenfiltration. Die Verwendung einer kontinuierlichen Zentrifugation ist bei Anwendungen bevorzugt, bei denen die Zelldichte hoch ist (z.B. bei einer Fed-batch-Kultur oder einer Perfusionskultur) und/oder wenn die Volumen sehr groß sind (größer als 1000 l). Das geklärte Zelllysat wird dann passend eingeengt (in Abhängigkeit von der Zellmasse und der Adenovirusproduktivität der Kultur, wobei 10-20-Fach typisch für einfache Chargenverfahren ist), gegebenenfalls mit Nuklease behandelt und diafiltriert. Die Kombination aus der Ausfällung und der Klärung entfernt etwa 90% der Gesamt-DNA, und in Abhängigkeit von den Ultrafiltrations/Nukleasebehandlungsbedingungen kann die Reinheit dieses Stroms für viele Anwendungen ausreichend sein. Das Verfahren erfordert keine Nuklease, obwohl kleine Mengen verwendet werden können, um die Verfahrensstabilität zu gewährleisten. Für viele Anwendungen kann die Reinheit des ultrafiltrierten Produkts ausreichend sein und eine chromatographische Reinigung als unnötig betrachtet werden. Für Anwendungen mit sehr hohen Reinheitsanforderungen (oder aus anderen Gründen, wie z.B. Clearance-Validierung) können ein oder mehrere Chromatographieschritte zugefügt werden, wie es hierin erörtert ist. Es bleibt dem Fachmann überlassen, mögliche Ersatzstoffe für die hierin offenbarten SPAs zu testen, um eine Verbindung zu identifizieren, die wirksam Nukleinsäuremoleküle und andere Zellbruchstücke durch Ausfällung von Viruspartikeln entfernt, wie es hier für Domiphenbromid (DB) veranschaulicht ist. Daher betrifft ein Teil dieser vorliegenden Erfindung Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln aus einem Wirtszellenkulturmedium, das die selektive Ausfällung von Wirtszellennukleinsäuremolekülen weg von den Viruspartikeln innerhalb des Wirtszellenkulturmediums nach der Lyse durch Zugabe eines selektiven Fällungsmittels zu dem Wirtszellenkulturmedium nach der Lyse umfasst. Unter solchen Bedingungen wird erwartet werden, dass eine deutliche Mehrheit der kontaminierenden Nukleinsäuren aus dem Virus ausgefällt werden wird, wenigstens 70%, eher wenigstens 80% solcher verunreinigender DNA und bis zu wenigstens 90% solcher kontaminierender/Verunreinigungs-DNA, insbesondere wenn ein Klärschritt folgt, wie z.B. Tiefenfiltration alleine oder Tiefenfiltration in Kombination mit einem klärenden Tiefenfiltrationsschritt.
  • Es ist hierin veranschaulicht und bevorzugt, dass der selektive Ausfällungsschritt als erster Schritt nach der Zelllyse stattfindet. Diese Bevorzugung ist jedoch keinesfalls eine Einschränkung, da der Schritt der selektiven Ausfällung auch an anderen Stellen des Reinigungsverfahrens eingefügt werden kann, um verbliebene Nukleinsäuremoleküle und Zellbruchstücke besser aus einem gepufferten Zelllysat oder einer in einem späteren Stadium vorliegenden Ad-haltigen Pufferlösung zu entfernen. Zum Beispiel kann eine Detergentienausfällung alternativ nach der Klärung oder Ultrafiltration (Konzentration/Diafiltration) unter Zufügung einer nachfolgenden Klärung platziert werden. Die zusätzliche Klärung kann irgendeine von mehreren Formen besitzen, einschließlich Tiefen- oder Membranfiltration.
  • Ein Filtrationsschritt kann in Betracht gezogen werden, um Zellbruchstücke und Nukleinsäureniederschlag zu entfernen. Dieser Schritt stellt ein zweckmäßiges Mittel zur wirtschaftlichen Entfernung von Zellbruchstücken und Niederschlag dar. Bei der Wahl eines Filters oder eines Filtrationsverfahrens war es notwendig, sicherzustellen, dass eine stabile Leistung stattfindet, falls Änderungen oder Variationen stromaufwärts stattfinden. Das Aufrechterhalten des Gleichgewichts zwischen einer guten Klärleistung und einer guten Verfahrensschrittausbeute erfordert die Untersuchung einer großen Vielzahl von Filterarten mit verschiedenen internen Medien. Geeignete Filter können Cellulosefilter, regenerierte Cellulosefasern, Cellulosefasern in Kombination mit anorganischen Filtrierhilfsmitteln (z.B. Diatomeenerde, Perlite, pyrogene Kieselsäure), Cellulosefasern in Kombination mit anorganischen Filtrierhilfsmitteln und organischen Harzen oder irgendeine Kombination davon, und Polymerfilter (Beispiele sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Nylon, Polypropylen, Polyethersulfon) sein, um eine effektive Entfernung und annehmbare Virusgewinnungen zu erzielen. Im Allgemeinen ist ein mehrstufiges Verfahren bevorzugt, jedoch nicht erforderlich. Ein beispielhaftes zwei- oder dreistufiges Verfahren würde aus einem oder mehreren Grobfiltern, um großen Niederschlag und Zellbruchstücke zu entfernen, gefolgt von einer oder mehreren klärenden zweiten Filterstufen mit nominalen Porengrößen von mehr als 0,2 Mikron, jedoch weniger als 1 Mikron. Die optimale Kombination wird eine Funktion der Niederschlagsgrößenverteilung sowie von anderen Variablen sein. Darüber hinaus können auch einstufige Verfahren, die ein relativ dichtes Filter oder Zentrifugation einsetzen, ein Produkt mit guter Qualität erzeugen. Allgemeiner gesagt, wird jeder beliebige Klärungsversuch, einschließ lich Dead-End-Filtration, Mikrofiltration, Zentrifugation oder ein Bodensatz aus Filterhilfsmitteln (z.B. Diatomeenerde) in Kombination mit Dead-End- oder Tiefenfiltration, der ein Filtrat mit geeigneter Klarheit ergibt, so dass die Membran und/oder das Harz in den nachfolgenden Schritten nicht fault, für die Praxis der vorliegenden Erfindung annehmbar sein.
  • Die Tiefenfiltration oder Tiefenfiltrationen in Kombination mit Zentrifugation waren die stabilsten Klärverfahren für die vorliegende Erfindung. Diese sind u.a., ohne jedoch auf die folgenden Beispiele beschränkt zu sein, die folgenden im Handel erhältlichen Produkte: Tiefenfilter aus der CUNO Incorporated AP-Reihe (Beispiele sind u.a. AP01), Tiefenfilter aus der CUNO Incorporated CP-Reihe (Beispiele sind u.a. CP10, CP30, CP50, CP60, CP70, CP90), Tiefenfilter aus der CUNO Incorporated HP-Reihe (Beispiele sind u.a. HP10, HP30, HP50, HP60, HP70, HP90), Tiefenfilter aus der CUNO Incorporated CA-Reihe (Beispiele sind u.a. CA10, CA30, CA50, CA60, CA70, CA90), Tiefenfilter aus der CUNO Incorporated SP-Reihe (Beispiele sind u.a. SP10, SP30, SP50, SP60, SP70, SP90), CUNO-Delipid- und -Delipid-Plus-Filter, Tiefenfilter aus der Millipore Corporation CE-Reihe (Beispiele sind u.a. CE15, CD20, CE25, CE30, CE35, CE40, CE45, CE50, CE70, CE75), Tiefenfilter aus der Millipore Corporation DE-Reihe (Beispiele sind u.a. DE25, DE30, DE35, DE40, DE45, DE50, DE55, DE560, DE65, DE70, DE75), Millipore Corporation HC-Filter (Beispiele sind u.a. A1HC, B1HC, COHC), CUNO-Polynet-Filter (ein Beispiel ist Polynet-PB), Millipore-Clarigard- und -Polygard-Filter, CUNO-Life-Assure-Filter, Tiefenfilter von ManCel Associates (Beispiele sind u.a. PR 12 UP, PR12, PR 5 UP, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, und Filter von PALL oder SeitzSchenk Incorporated (Beispiele sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Bio20, SUPRA EKIP, KS50P).
  • Ein weiterer Aspekt des offenbarten Verfahrens ist eine Reihe von Schritten zur Konzentration des Adenovirus und eine zusätzliche Nukleasebehandlung (z.B. BenzonaseTM, EM Industries) und zur Einführung eines Austauschpuffers mittels Diafiltration. Die ausgewählte Membrangröße ermöglicht die Befreiung von nicht zusammengesetzten Virusstrukturproteinen, Detergens und Nuklease. Die Zugabe von BenzonaseTM ist nicht nötig, um zu einem Produkt zu gelangen, das durch Anionenaustausch-HPLC hochgradig rein ist, sie führt jedoch zu niedrigeren Rest-DNA-Konzentrationen am Ende dieses Schritts und vermutlich in dem fertigen gereinigten Produkt.
  • Die spezielle ausgewählte Ultrafiltrationsmembran wird eine Größe besitzen, die ausreichend klein ist, um Adenovirus zurück zu halten, die jedoch ausreichend groß ist, um Verunreinigungen wirksam zu entfernen. In Abhängigkeit vom Hersteller und vom Membrantyp können Nominal-Molecular-Weight-Cutoffs (NMWCO) zwischen 100 und 1000 kDa geeignet sein. Die Membranzusammensetzung kann, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, regenerierte Cellulose, Polyethersulfon, Polysulfon oder Derivate davon umfassen. Diese Membranen können Flächengebilde oder Hohlfasern sein. Die Ultrafiltration im Tangentialflussmodus ist bevorzugt. Turbulenzen fördernde Siebe können ebenfalls geeignet sein, um die Entfernung von Verunreinigungen zu optimieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden 300-kDa- oder 500-kDa-NMWCO-PES-Flächengebildemembrane mit einem Turbulenzen fördernden Sieb (z.B. Millipore Pellicon 2 Biomax mit C-Sieb) im Tangentialflussmodus verwendet. Im Tangentialflussmodus kann der Schritt durch Einstellen eines festen Querstroms mit oder ohne Gegendruck auf das zurückkehrende Retentat, durch Einstellen eines festen Transmembrandrucks oder durch Festsetzen sowohl des Querstroms als auch des Permeatflusses gesteuert werden.
  • Der anvisierte Konzentrationsfaktor während der Ultrafiltration wird eine Funktion der Kulturbedingungen, einschließlich des verwendeten Mediums, der Zellendichte und der Virusproduktivität sein. Für eine Chargenkultur mit einer Infektionszellendichte von etwa 106 Zellen/ml ist eine 5- bis 40-fache Konzentration bevorzugt, eine 10- und 25-fache Konzentration ist besonders bevorzugt.
  • Auch die Einbeziehung einer Nukleasebehandlung in das Verfahren kann in Betracht gezogen werden, sie ist jedoch keinesfalls erforderlich. Die Nukleasebehandlung kann die Verwendung einer Breitspektrum-Nuklease (z.B. BenzonaseTM), einer DNase, einer RNase oder irgendeiner Kombination davon umfassen. Eine Nuklease oder ein Cocktail mit sowohl RNase als auch DNase-Aktivität ist bevorzugt. Ein Nukleasebehandlungsschritt kann an einem beliebigen Punkt in dem Verfahren vorgesehen sein, solange der Nuklease-Restgehalt im Endprodukt für die Anwendung annehmbar ist. Es ist bevorzugt, dass die Nukleasebehandlung nach der Klärung erfolgt, und es ist besonders bevorzugt, dass die Nukleasebehandlung nach der Klärung und einem Konzentrationsschritt erfolgt, jedoch vor einem Anionenaustauschchromatographieschritt. Eine geeignete Manifestation des Verfahrens sieht eine Nukleasebehandlung in der Ultrafiltrationsapparatur nach der Konzentration vor. Die Permeation kann vorübergehend für eine angemessene Inkubationszeit angehalten und dann für die Diafiltration erneut gestartet werden.
  • Die Diafiltration in einen Puffer unter Verwendung von Ultrafiltration kann erwünscht sein. Bei den meisten Anwendungen werden mehrere Chargenvolumen Puffer verwendet werden, um einen vollständigen Austausch zu gewährleisten. Wenn das Verfahren an diesem Punkt enden soll, kann ein passender Formulierungspuffer (siehe z.B. die PCT-Veröffentlichung WO 01/66137 ) verwendet werden, um die Produktstabilität zu maximieren. Wenn der Strom auf eine Chromatographiesäule geladen werden soll, sollte die Diafiltration in einen für diese Anwendung geeigneten Puffer erfolgen. Wenn zum Beispiel das Produkt auf eine Anionenaustauschsäule geladen werden soll, ist eine Diafiltration in einen Puffer mit einem pH-Wert zwischen 6,5 und 8,0 bevorzugt, jedoch nicht erforderlich. Speziell kann eine Diafiltration in 50 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1M NaCl, pH 7,5, mit oder ohne Detergens zur Aggregationsverhinderung (wie z.B. 0,1% PS-80) angemessen sein.
  • Tabelle 1
    Figure 00240001
  • Wie in dieser Patentschrift angegeben und in Tabelle 1 gezeigt, kann auch ein Anionenaustauschchromatographieschritt für viele Anwendungen geeignet sein. Für die Reinigung von Typ-5-Adenovirus mit Source15Q könnte die NaCl-Konzentration für die Beladung und das Waschen vermutlich irgendwo von 0,33 bis 0,41M bei pH 7,5 liegen, und dieser Bereich würde sich bei anderen pH-Werten verschieben. Der pH-Wert der Puffer muss ausreichend hoch sein, damit das Adenovirus binden kann (größer als etwa 6,5). Außerdem sollte der pH-Wert des Puffersystems ausreichend niedrig sein, um eine virale Instabilität zu verhindern. Der genaue maximale pH, der verwendet werden kann, wird von dem speziellen Stabilitätsprofil des Adenovirus-Serotyps und von den Pufferkomponenten abhängen und kann leicht vom Fachmann für diese spezielle Anwendung ermittelt werden. Als Richtlinie und sicherlich nicht als Einschränkung könnte ein pH-Bereich von Ad5 möglicherweise von etwa 6-10 reichen, wobei 6,5-9 bevorzugte Werte und 6,5-8,0 noch bevorzugter sind. Die Gegenwart von 0,1% PS-80 in den Puffern ist entscheidend, um niedrige Rest-DNA-Konzentrationen in dem Produkt zu erzielen, da es die Virus/DNA-Assoziation und die Virusaggregation unterbindet. Es wird für den Durchschnittsfachmann durch Routineversuche möglich sein, höhere oder niedrigere Detergentienkonzentrationen oder alternative Detergentien einzusetzen, die zur Förderung der Dissoziation von Viruspartikeln weg von anderen Viren sowie verschiedenen Zellverunreinigungen geeignet wären. Dem Fachmann wird es auch möglich sein, durch Versuche ein alternatives Detergens für den Verfahrenspuffer auszuwählen. Als Beispiel, das jedoch keinesfalls als Einschränkung gedacht ist, sind nichtionische Tenside, die verwendet werden können, um die Aggregation beim Anionenaustausch und während des Verfahrens zu inhibieren, u.a. Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Polysorbat-80 (Tween 80®) [wie hierin veranschaulicht, Polysorbat-60 (Tween 60®), Polysorbat-40 (Tween 40®) und Polysorbat-20 (Tween 20®), Polyoxyethylenalkylether, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Brij 58®, Brij 35®, sowie andere, wie z.B. Triton X-100®, Triton X-114®, NP40®, Span 85 und die Pluronic-Reihe von nichtionischen Tensiden (z.B. Pluronic 121). Von diesen ist die Polysorbat-Reihe bevorzugt. Es ist hierin offenbart, dass ein Harz, wie z.B. ein Source-15Q-Harz (Amersham Biosciences) eine extrem hohe Bindungskapazität für Adenovirus besitzt, die aufgrund der Aggregationsinhibierung wirksam eingesetzt werden kann. Einzelne Hinweise und der bekannte Stand der Technik legen nahe, dass geringe Beladungen (< 1 × 1012 vp/ml Harz) die Industrienorm darstellen. Für Source 15Q sind Säulen mit Betthöhen von mehr als 5 cm bevorzugt, wenn der Säulendurchmesser 10 cm übersteigt. Säulen mit Betthöhen zwischen 10 und 25 cm funktionieren besonders gut. Obwohl nicht notwendig, ist es dennoch bevorzugt, eine Strategie anzuwenden, die den Hauptproduktpeak von chromatographischen Verunreinigungen fraktioniert, zum Beispiel indem ein Cutoff-Wert für die UV-Extinktion eingesetzt wird. Andere Harze, die sich zur Adenovirusreinigung bei diesem Verfahren eignen, sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Source 30Q (Amersham Biosciences), Fractogel TMAE (EM Industries) und Q-Sepharose XL (Amersham Biosciences). Jeder beliebige Anionenaustauscher sollte verwendbar sein, andere, die wir vorgeführt haben sind u.a. Fractogel DEAE (EM Industries), Q-Hyper D/F (Biosepra), Toyopearl DEAE-650M (Tosohaas), Toyopearl DEAE-750C (Tosohaas) und Toyopearl QAE-550C (Tosohaas). Darüber hinaus eignen sich Anionenaustausch membranchromatographieprodukte, wie z.B. diejenigen, die von Pall (z.B. die MustangTM-Reihe) und Sartorius (z.B. die Sartobind-Reihe) erzeugt werden, für die Adenovirusreinigung.
  • Bei einer beliebigen speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Anionenaustauschprodukt in Formulierungspuffer diafiltriert und steril filtriert werden. Alternativ kann ein zusätzlicher Chromatographieschritt (z.B. Kationenaustausch) entweder vor oder nach der Diafiltration eingebaut werden, so dass die Möglichkeit besteht, die Stabilität der Entfernung von Verunreinigungen und/oder Virus/Prion zu verbessern. Die Tangentialfluss-Ultrafiltration eignet sich zur Entfernung von verbliebenem Protein und verbliebener Nukleinsäure und zum Austausch des Virus in einen Formulierungspuffer. Dieser Schritt sorgt für PS-80-Kontrolle und kann eine Entfernung der verbliebenen Verunreinigungen, einschließlich DNA, verbliebenen Detergentien und Wirtszellenproteinen, ergeben. Die Gegenwart von PS-80 in dem Feed und dem Diafiltrationspuffer minimiert die Möglichkeit einer Produktaggregation. Die Steuerung des Durchflusses ist für die wirksame Reduzierung von PS-80 in Gegenwart von hohen Adenovirus-Konzentrationen wichtig. Die Wahl zwischen 300 kD- und 500 kD-Membranen wird durch die Kompromisse zwischen der Ausbeute und der verbesserten Verunreinigungsentfernung diktiert. Andere Membrankonfigurationen (wie z.B. eine Hohlfaser) sind ein annehmbarer Ersatz. Allgemeiner ausgedrückt, ist die Auswahl von Bedingungen für diese Ultrafiltration ähnlich wie weiter oben beschrieben. Das heißt, die spezielle Ultrafiltrationsmembran wird eine Größe besitzen, die ausreichend klein ist, um Adenovirus zurückzuhalten, die jedoch ausreichend groß ist, um Verunreinigungen wirksam zu entfernen. Abhängig vom Hersteller und vom Membrantyp, können Nominal-Molecular-Weight-Cutoffs (NMWCO) zwischen 100 und 1000 kDa geeignet sein. Die Membranzusammensetzung kann, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, regenerierte Cellulose, Polyethersulfon, Polysulfon oder Derivate davon umfassen. Diese Membranen können Flächengebilde oder Hohlfasern sein. Die Ultrafiltration im Tangentialflussmodus ist bevorzugt. Turbulenzen fördernde Siebe können ebenfalls geeignet sein, um die Entfernung von Verunreinigungen zu optimieren. Bei einer Ausführungsform werden 300-kDa- oder 500-kDa-NMWCO-PES-Flächengebildemembrane mit einem Turbulenzen fördernden Sieb (z.B. Millipore Pellicon 2 Biomax mit C-Sieb) im Tangentialflussmodus verwendet. Im Tangentialflussmodus kann der Schritt durch Einstellen eines festen Querstroms (mit oder ohne Gegendruck auf das zurückkehrende Retentat), durch Einstellen eines festen Transmembrandrucks oder durch Festsetzen sowohl des Querstroms als auch der Permeatflusses gesteuert werden. Die Steuerung des Querstroms und des Permeatflus ses ist bevorzugt. Der speziell ausgewählte Diafiltrationspuffer sollte ein geeigneter Formulierungspuffer (siehe die WO 0166137 ) oder ein Teilsatz aus den erwünschten Komponenten sein. Beispiele sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, (1) 5 mM Tris, 1 mM MgCl2, 75 mM NaCl, 5% Saccharose, 0,005% PS-80, pH 8,0, (2) 10 mM Tris, 10 mM Histidin, 1 mM MgCl2, 75 mM NaCl, 5% Saccharose, 0,005% PS-80, pH 7,4, (3) 5 mM Tris, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% Saccharose, 0,005% PS-80, pH 7,4, und (4) 10 mM Tris, 10 mM Histidin, 1 mM MgCl2, 75 mM NaCl, 5% Saccharose, 0,02% PS-80, 0,1 mM EDTA, 0,5% (Vol./Vol.) Ethanol, pH 7,4.
  • Ein Sterilfiltrationsschritt kann aufgenommen werden, der bei der Beseitigung der Keimbelastung hilfreich ist. Das Produkt kann durch eine modifizierte 0,22-Mikron-Polyvinylidenfluorid(PVDF)-Membran (z.B. Millipore Millipak) filtriert werden. Neben modifiziertem PVDF kann das Sterilfilter aus einer Reihe von anderen Materialien konstruiert sein, die im Stand der Technik bekannt sind und dem Fachmann zur Verfügung stehen. Diese können u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Polypropylen, Cellulose, Celluloseester, Nylon, Polyethersulfon oder irgendein anderes Material sein, das mit einer geringen Produktbindung konform geht. Das Filter kann eine einzelne Membranschicht besitzen oder einen Vorfilter aus demselben oder einem anderen Material enthalten. Das Produkt kann für die nachfolgende Formulierung und Füllung gefroren bleiben oder bei etwa 4°C gehalten werden. Ein zusätzlicher optionaler Schritt stromabwärts bei dem Verfahren ist die Aufnahme eines orthogonalen Reinigungsschritts, um jegliche verbleibenden Verunreinigungen und/oder andere Mittel zu entfernen. Ein solcher Schritt umfasst, ohne jedoch notwendigerweise darauf beschränkt zu sein, einen Kationenaustauschchromatographieschritt. Wenn dieser gewählt wird, sollte die Durchführung des Kationenaustauschschritts im Durchflussmodus erfolgen. Die zweite Ultrafiltration wird wie zuvor durchgeführt, außer dass die Salzkonzentration des diafiltrierten Puffers verringert werden kann (zum Beispiel auf 10 mM). Nach der Ultrafiltration und unmittelbar vor dem Kationenaustausch wird der pH-Wert der Charge durch Zugabe eines Puffers mit niedrigem pH-Wert (Histidin) auf 6,5 verringert. Niedrigere pH-Werte können erzielt werden, dabei besteht jedoch ein Risiko des Adenovirusverlusts in dem veranschaulichten Formulierungspuffer; höhere pH-Werte verringern die Wirksamkeit des Schritts, verbessern jedoch die Adenovirusstabilität. Ähnlich kann die NaCl-Konzentration variiert werden. Bislang wurde eine Reihe von Harzen auf die Adenovirusgewinnung untersucht, wie u.a. Poros 50HS, Source 30S, Source 15S, SP Sepharose HP, SP Sepharose XL, SP Sepharose FF; wobei Source 30S bevorzugt ist. Unmittelbar nach dem Kationenaustausch wird der pH-Wert auf das Formulierungsziel erhöht, indem ein Tris-Puffer mit hohem pH zugegeben wird. Zusätzlich und wie oben angegebenen sind Anionenaustauschmembranchromatographieprodukte, wie z.B. diejenigen, die von Pall (z.B. die MustangTM-Reihe) und Sartorius (z.B. die Sartobind-Reihe) produziert werden, zur Adenovirusreinigung geeignet. Das Produkt kann dann wie zuvor steril filtriert werden.
  • Auch ein Umkehrphasen-Adsorptionsschritt kann zugefügt werden, vorzugsweise nach der Klärung oder dem ersten Ultrafiltrationsschritt. Die Umkehrphasenadsorption kann Detergentien, einschließlich Triton X-100, und Domiphenbromid sowie Kulturmediumkomponenten, wie z.B. Pluronic und Phenolrot, sowie eine Reihe von anderen hydrophoben Verunreinigungen entfernen. Daher stellt es ein zweckmäßiges Verfahren zur Steigerung der Verfahrensstabilität oder zur Eliminierung von stromabwärts gelegenen Schritten dar. Der Adsorptionsschritt kann entweder im Chargenmodus oder im Säulenmodus durchgeführt werden. Im Chargenmodus würde das Adsorptionsmittel anschließend mittels einer Filtration, vorzugsweise im Dead-End-Modus, entfernt werden. Im Säulenmodus würde die Charge mit einer geeigneten Verweilzeit über das Harz gepumpt, um die Adsorption von Detergentien und anderen Verunreinigungen zu ermöglichen. Geeignete Harze sollten eine Porengröße besitzen, die das Produkt ausschließt, und können irgendwelche aus der Amberlite XAD-Reihe, z.B. XAD4, XAD16, XAD1600, XAD1180 (Rohm und Haas), oder ähnliche Harze anderer Hersteller, z.B. Bio-Beads SM2 (Bio-Rad), sein.
  • Ein Hydroxyapatit-Chromatographieschritt kann ebenfalls zur Entfernung weiterer Verunreinigungen in Erwägung gezogen werden. Dieser Schritt kann entweder im Bindungs/Elutions- oder im Durchflussmodus durchgeführt werden. Der Schritt kann nach jedem Ultrafiltrationsschritt durch Beenden der UF mit einer Diafiltration in einen Puffer mit etwa 10 mM Phosphat und 0,5M NaCl bei einem bevorzugten pH-Wert zwischen 6,5 und 8 platziert werden. Ein Phosphatgradient bis 0,4M ist für die Adenoviruselution ausreichend.
  • Beim Durchlesen dieser Patentschrift wird klar werden, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung skalierbar sind, wobei die Skala von Zellkulturen im kleineren Maßstab (z.B. Durchgänge mit etwa 5-10 Liter) hinauf bis zu Ansätzen im großtechnischen Maßstab, wie z.B. Durchgänge mit 10000 bis 50000 l Produktionsvolumen, reicht. Die Beispielabschnitte 2 und 5 zeigen Daten von Durchgängen durchwegs im kleineren Maßstab, während die sich daran anschließende Erörterung in diesem Abschnitt als Beispiel und sicherlich nicht als Einschränkung ein Adenovirusreinigungsverfahren einer 1000-Liter(l)-Kultur (800 l Arbeitsvolumen) aus PER.C6TM-Zellen (Crucell), die zuvor mit dem entsprechenden Adenovirusvektor infiziert worden waren, behandelt. Dafür fasst Tabelle 1 die Verfahrensdeskriptoren für einen prophetischen 1000-l-Bioreaktor-Durchgang (800 l Arbeitsvolumen) zusammen, sie wird jedoch linear skalierbar sein. Der Maßstab der ersten Verfahrensschritte (Lyse, Tiefenfiltration und Ultrafiltration) wird vom Kulturvolumen bestimmt, während der Maßstab der Anionenaustauschchromatographie und der nachfolgenden Schritte durch den Viruspartikeleinsatz bestimmt werden. Daher wird die Größe der letzteren Schritte auf einer Bioreaktorproduktivitätseinschätzung von 4 × 1013 Viruspartikel pro Liter (vp/l) basieren. Gemäß diesen Einschätzungen werden etwa 1,6 × 1016 vp pro Charge erzeugt werden. Ferner zeigt Beispiel 9 Daten, die in einem 600-l-Ad5-Durchgang erhalten wurden.
  • Ein erster Schritt bei einem Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist ein Wirtszellenlyseschritte, der für eine maximale Freisetzung von Adenoviruspartikeln aus den Zellen sorgt sowie die Möglichkeit bietet, adventive Mittel potentiell zu desaktivieren. Wie oben erwähnt, kann auch ein Lösungsmittel (z.B. TNBP) in einer niedrigen Konzentration (z.B. 0,3%) zugegeben werden, um die Wirksamkeit der Deaktivierung von adventiven Mitteln zu steigern. Die längere Haltezeit eines Lysat- oder geklärten Lysatstroms, der TNBP enthält, kann möglicherweise zu einer Abnahme der Produktinfektiosität führen. Aus einem 800-l-Adenovirus-Kulturverfahren werden etwa 8 Liter 10% Triton X-100 und 40 Liter 0,5M Tris, 40 mM MgCl2, 1% PS-80, unter leichtem Rühren zu dem Bioreaktor zugegeben. Die Zelllyse wird innerhalb von 2 Stunden beendet sein, kann für die Zwecke einer weiteren Virusreinigung jedoch auch eine längere Zeit aufrechterhalten werden. Das Zelllysat kann dann bei 4°C gehalten oder sofort gereinigt werden. Dieser anfängliche Lyseschritt ermöglicht, ungeachtet des Maßstabs der Adenoviruskultur, das Ernten von sowohl zellassoziiertem (intrazellulärem) als auch nicht assoziiertem Virus (extrazellulär). Folglich wird er Flexibilität bei der Auswahl der Kulturbedingungen, die für die Gesamtvirusproduktivität optimal sind, ermöglichen. Darüber hinaus wird die Gegenwart eines Detergens während des Verfahrens die Assoziation des Virus mit der Wirtszellen-DNA minimieren.
  • Wie oben vermerkt, umfasst ein bevorzugtes Reinigungsschema einen Schritt zur Ausfällung von Wirtszellennukleinsäuremolekülen und anderen Zellbruchstücken sowie zur Verbesserung der Stabilität stromabwärts. Als Fortsetzung der Beschreibung eines geplanten Reinigungsverfahrens für einen 800-l-Durchgang werden etwa 60 l 0,5%iges Domiphenbromid (an dessen Stelle kann auch CTAB oder CPC eingesetzt werden, wobei einige Anpassungen bei der Endkonzentration erfolgen müssen) langsam zu dem Bioreaktor oder Erntetank zugegeben, so dass eine Endkonzentration von etwa 0,04% erreicht wird. Falls notwenig, kann die optimale SPA-Konzentration für einen speziellen Durchgang mittels Probenuntersuchungen im 1-ml-Maßstab ermittelt werden. Die Zugabe des SPA unterhalb der Oberfläche ist bevorzugt, jedoch nicht erforderlich. Das ausgefallene Lysat wird sofort geklärt. Eine solche Ausfällung wird nach der Klärung eine etwa 90%ige Verringerung der Nukleinsäure ergeben. Darüber hinaus können andere Verunreinigungen (Zellbruchstücke usw.) ebenfalls während dieser Ausfällung ausgeflockt werden. Verglichen mit nicht ausgefällten Kontrollen, kann der Durchsatz der Tiefenfiltration drastisch erhöht werden und die Ausbeuten bei der Tiefenfiltration verbessert werden. Das geklärte Produkt aus einem solchen 800-l-Durchgang wird deutlich weniger trüb sein, und die Leistung bei einer nachfolgenden Ultrafiltration wird ebenfalls deutlich besser sein. Nukleasen (z.B. BenzonaseTM und RNasen) werden nicht länger erforderlich sein, sie können für eine maximale DNA-Verringerung aber dennoch von Nutzen sein. Eine Anionenaustauschchromatographie ist für die Produktreinheit eventuell nicht ausschlaggebend, abhängig von der letztendlichen Dosis, sie kann jedoch aus Gründen der Stabilität in dem Verfahren bleiben, wie es in diesem prophetischen Beispiel sowie in den Beispielabschnitten 2 und 5 gezeigt ist.
  • Das mit SPA behandelte Zelllysat wird gereinigt, um Verunreinigungen und Zellbruchstücke zu entfernen. Dieser Schritt kann entweder einen Tiefenfiltrationsschritt oder einen Zentrifugationsschritt mit oder ohne einen klärenden Tiefenfiltrationsschritt umfassen. Ungeachtet des aufgenommenen Schritts wird das geklärte Zelllysat dann auf das 10-20-Fache eingeengt, gegebenenfalls mit Nuklease behandelt und diafiltriert. Die Kombination aus der Ausfällung und der Klärung wird etwa 90% der gesamten DNA entfernen, und, abhängig von den Bedingungen der Ultrafiltration/Nukleasebehandlung, kann die Reinheit dieses Stroms für viele Anwendungen ausreichend sein. Insbesondere wird ein Tiefenfiltrationsschritt geeignet sein, um Zellbruchstücke und Wirt-Nukleinsäuren zu entfernen. Wenn die Tiefenfiltration als Option gewählt wird, wird das Zelllysat durch zwei Tiefenfilter in Reihe filtriert, um Zellbruchstücke zu entfernen. Bei der Filtration werden zwei 16-Inch-Millipore-Millistak-CE20-Filterpatronen (75 ft2) eingesetzt, gefolgt von zwei 16-Inch-Millistak-CE50-Patronen (75 ft2). Diese Bereiche enthalten einen Sicherheitsfaktor von wenigstens 2. Die Filtration wird bei einer konstanten Fließgeschwindigkeit von etwa 9 l/h/ft2 durchgeführt. Die in dem Gehäuse verbleibende Flüssigkeit wird mit Druckluft verdrängt. Die Tiefenfiltration stellt ein zweckmäßiges Mittel zur wirtschaftlichen Entfernung von Zellbruchstücken und Niederschlag dar. Der Fachmann wird wenigstens beim Studium dieser Patentschrift erkennen, dass die tatsächliche Filterwahl geändert werden kann, um die Ausbeute oder die Entfernung von Verunreinigungen weiter zu optimieren. Wie zuvor vermerkt, ist die Zentrifugation eine brauchbare Alternative zur Tiefenfiltration, deren Anwendung sich besonders bei Durchgängen im größeren Maßstab empfiehlt.
  • Bei dem in Tabelle 1 gezeigten Reinigungsschema sind die Schritte Konzentration, Nukleasebehandlung und Diafiltration aufgenommen, um das Chargenvolumen zu verringern, verbliebene Nukleinsäuren zu digerieren und entfernen und einen Pufferaustausch zu begünstigen. Speziell wird das geklärte Lysat mittels Ultrafiltration bei konstantem Volumen mit einer 300-kd-NMWCO-Polyethersulfon(PES)-Membran unter konstanten Fließbedingungen von etwa 800 l auf etwa 40 l eingeengt. Nach dem Einengen werden 0,6-MM-Einheiten von BenzonaseTM (15 U/ml) direkt zu dem Retentat zugegeben und langsam unter Vermischen wieder in dem Ultrafiltrationssystem verteilt. Nach 1-2 Stunden bei Raumtemperatur wird die Charge gegen 5 Volumen (200 l) 50 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1M NaCl, pH 7,5, unter konstanten Fließbedingungen diafiltriert. Es sollte erwähnt werden, dass die gewählte Membrangröße die Entfernung von nicht zusammengesetzten Virusstrukturproteinen, Detergentienmizellen und BenzonaseTM ermöglicht. Eine größere MWCO (z.B. 500 kD) kann ebenfalls eine geeignete Leistung erbringen. Die Zugabe von BenzonaseTM ist nicht notwendig, um einen Peak zu erhalten, der bei der Anionenaustausch-HPLC hochgradig rein ist, sie wird jedoch am Ende dieses Schritts und vermutlich in dem fertigen gereinigten Produkt zu niedrigeren Rest-DNA-Konzentrationen führen.
  • Der Anionenaustauschchromatographie(AEX)-Schritt von Tabelle 1 wird zur Reinigung des Virus von Wirtszellenproteinen, Nukleinsäuren und nicht zusammengesetzten Viruskomponenten geeignet sein. Die Leitfähigkeit der Charge wird durch die Zugabe von etwa 62 l 50 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,1% PS-80, pH 7,5, auf 38 mS eingestellt. Nach dem Verdünnen wird die Charge auf eine Säule aus Source-15Q-Harz (Amersham Biosciences) mit einer Beladung von etwa 5 × 1012 Teilchen pro ml Harz geladen. Für MRKAd5gag entspricht dies ca. einer 5-Liter-Säule (ca. 20 cm H × 16 cm D). Nach dem Beladen wird die Säule mit 5 Volumen 50 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,39M NaCl, 0,1% PS-80, pH 7,5, gewaschen werden, um verbliebene Triton- und Proteinverunreinigungen zu entfernen. Das Produkt wird dann in einem 4-Volumen-Lineargradienten bis 0,47M NaCl gewaschen und basierend auf dem A260-Signal gesammelt. Die Notwendigkeit, die Temperatur während dieses Verfahrens zu steuern, wird von der Verfahrensdauer und der Stabilität des AdV in dieser Stufe diktiert werden. Die Beladung bei einer Leitfähigkeit von 38 mS entspricht etwa 0,38M NaCl. Die Salzkonzentration ist geeignet, um Adenoviruspartikel zu binden, nicht jedoch verwandte Verunreinigungen; übertragen bedeutet dies eine höhere Bindungskapazität für das Adenovirus. Die Gegenwart von 0,1% PS-80 (oder einer verwandten Verbindung in einer biologisch wirksamen Konzentration) in den Puffern wird für das Erzielen niedriger Rest-DNA-Konzentrationen in dem Produkt entscheidend sein, da es die Virus/DNA-Assoziation und die Virusaggregation unterbindet. Das Source-15Q-Harz hat eine extrem hohe Bindungskapazität für Adenovirus, die effektiv ausgenutzt werden kann, da wir die Aggregation inhibieren.
  • Die Tangentialfluss-Ultrafiltration ist ein in Tabelle 1 gezeigter Schritt, der sich ebenfalls eignet, um restliches Protein und restliche Nukleinsäure zu entfernen, sowie um Virus in einen Formulierungspuffer auszutauschen. Kurz gesagt, wird die Fläche der Membran (300 kD MWCO PES) für eine Beladung von 1-2 × 1016 vp pro m2 ausgewählt. Das AEX-Produkt wird auf ca. 1,1 × 1012 vp/ml (etwa 16 Liter) verdünnt und dann unter Verwendung von Flussteuerung gegen 5 Volumen Formulierungspuffer (5 mM Tris, 1 mM MgCl2, 75 mM NaCl, 5% Saccharose, 0,005% PS-80, pH 8,0) diafiltriert. Dieser Schritt wird bei etwa 4°C durchgeführt, und das Produkt wird bis zur Sterilfiltration bei 4°C gehalten. Dieser Schritt wird für eine PS-80-Kontrolle sorgen und kann eine Beseitigung verbliebener Verunreinigungen, einschließlich DNA und Wirtszellenproteinen, ergeben. Die Gegenwart von PS-80 in dem Feed und dem Diafiltrationspuffer wird die Möglichkeit einer Produktaggregation minimieren. Die Flusssteuerung ist für die wirksame Reduktion von PS-80 in Gegenwart von hohen Adenoviruskonzentrationen wichtig. 500-kD-Membrane können ersatzweise verwendet werden, dabei besteht jedoch eine gewisse Möglichkeit für eine Viruspermeation. Andere Membrankonfigurationen (z. B. Hohlfasern) stellen einen annehmbaren Ersatz dar.
  • Die Sterilfiltration kann, wie in Tabelle 1, zugefügt werden, um die Keimbelastung zu eliminieren. Das fertige Retentat wird durch eine modifizierte 0,22-Mikron-Polyvinylidenfluorid(PVDF)-Membran (z.B. Millipore Millipak 200) unter Verwendung einer Filterbeladung von etwa 3 × 1013 vp/cm2 filtriert. Zusätzlich zu modifiziertem PVDF, kann das Sterilfilter aus einer Reihe von anderen Materialien konstruiert sein, die im Stand der Technik bekannt sind und dem Fachmann zur Verfügung stehen. Diese können u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Polypropylen, Cellulose, Celluloseester, Nylon, Polyethersulfon oder irgendein anderes Material sein, das mit einer geringen Produktbindung konform geht. Das Filter kann eine einzelne Membranschicht besitzen oder einen Vorfilter aus demselben oder einem anderen Material enthalten. Das Produkt kann für die nachfolgende Formulierung und Füllung gefroren bleiben oder bei etwa 4°C gehalten werden.
  • Ein orthogonaler Reinigungsschritt kann zugefügt werden, um die Entfernung von Verunreinigungen sowie die Entfernung eines adventiven Mittels vorzunehmen. Orthogonale Reinigungsschritte sind nicht unbedingt erforderlich und können vom Fachmann erwogen und dann, falls diese benötigt werden, aufgenommen werden. Die Konzentration der höchsten klinischen Dosis, die Stabilität der Verunreinigungs-Entfernung und Zellsubstratangelegenheiten, welche die Tumorigenität, adventive Viren und Prionen betreffen, können alle dem Fachmann diese Notwendigkeit vermitteln. Mögliche Schritte sind u.a. Durchfluss-Kationenaustauschchromatographie, Umkehrphasen-Adsorption und Hydroxyapatitchromatographie. Der Durchfluss-Kationenaustausch ist besonders wünschenswert, da er einen hohen Beseitigungsfaktor für PrP und viele mögliche adventive Viren, einschließlich adenoassoziiertes Virus (AAV), ergeben sollte.
  • Wie hierin vermerkt, betrifft die vorliegende Erfindung die Reinigung von Wildtyp-, modifiziertem oder rekombinantem Virus. Von speziellem Interesse bei Genimpfungs- und/oder Gentherapieanwendungen ist die Verwendung eines replikationsunfähigen Adenovirus der 1. oder 2. Generation, der durch E1 oder weitere Deletionen verkrüppelt ist, einschließlich "Gutless"-Adenovirusvektoren. Das Adenovirusgenom ist im Allgemeinen mit benignen Pathologien bei Menschen verbunden, und die Genomorganisation des Virus wurde seit dessen Entdeckung in den frühen 1950iger Jahren eingehend untersucht. Darüber hinaus ist das Genom für die Manipulation zugänglich, abhängig von der verwendeten Strategie zur Konstruktion des entsprechenden Vektors. Ein replikationsunfähiges Virus (wie z.B. ein E1/E3 deletierter Ad5gag-Vektor, der ein HIV-gag-Transgen exprimiert, wie hier veranschaulicht) benötigt eine Zelllinie, die die Deletionen komplementiert. Jede derartige Zelllinie kann verwendet werden, um rekombinante Virusvektoren zu erzeugen, wobei bevorzugte, jedoch nicht limitierende Zelllinien 293-Zellen und PER.C6TM-Zellen sind. Zu diesem Zweck wurden zahlreiche rekombinante Adenovirusvektoren der 1. Generation in der Literatur beschrieben (siehe z.B. Bett, et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:8802-8806; WO 01/02607 und WO 02/22080 ). "Gutless"-Adenovirusvektoren sind ein Adenovirusvektor der 2. Generation, im Allgemeinen ohne Virusprotein kodierende Sequenzen, häufig durch ein Helfervirus (oft ein E1 deletiertes Adenovirus), gewachsen mit dem helferabhängigen (HD) Adenovektor in einer Verpackungszelllinie (z.B. PER.C6TM), mit Virusproteinen in trans supplementiert. Bei fehlenden Virusproteinen können diese Virusvektoren als Alternative in trans durch eine Zelllinie, die in der Lage ist, die strukturellen und funktionellen Adenovirusproteine zu exprimieren, die für eine erfolgreiche Replikation, Verpackung und Rettung notwendig sind, supplementiert werden. Angesichts der zunehmenden Popularität dieser Virusvektoren und am Ende der Notwendigkeit, großtechnische Mengen entweder eines Impfstoffs auf Virusbasis oder eines Gentherapievehikels herzustellen, wurde es zwingend notwendig, effizientere qualitative und quantitative Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Adenovirusvek toren kommerzielle Güte zu entwickeln. Man wird erkennen, dass alternative Serotypen, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Serotypen 2, 4, 12, 6, 17, 24, 26, 31, 33, 34, 36 und 16, für die Reinigung durch die hierin offenbarten großtechnischen Verfahren zugänglich sind. Die Adenovirus-Serotypen 2, 5 und 6, 24, 26, 35 und 36, insbesondere 5, sind zur Verwendung in dieser Erfindung bevorzugt, da zu diesem Zeitpunkt im Allgemeinen mehr über diese Serotypen bekannt ist als über andere Serotypen und deren komplette DNA-Sequenzen bekannt sind. Der Prototyp-Serotyp-5-Adenovirus ist vollständig sequenziert worden (Chroboczek et al., 1992, J. Virology 186:280, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist). Sie gehören auch zur Untergruppe der C-Adenoviren, die nicht mit bösartigen menschlichen oder Nager-Tumoren assoziiert sind. Wie oben angegeben, ist jedoch vorgesehen, dass jede Art von Adenovirus-Serotyp bei dieser Erfindung verwendet werden kann, einschließlich chimeren (wie z.B. einem "switched" rekombinanten Ad-Virus, bei dem z.B. der E4-Bereich eines Serotyps (z.B. Ad5) einen ähnlichen Bereich eines anderen Serotyps (z.B. Ad24) ersetzt, so dass das Wachstum des chimeren Ad24Virus in einer Zelllinie (z.B. PERC6), die einen Ad5-E1-Bereich exprimieren kann, möglich sein kann. Darüber hinaus können auch nichtmenschliche Serotypen (z.B. Adenovirus-Stämme, die Schimpansen befallen) durch die hierin offenbarten Verfahren gereinigt werden. Ein als Beispiel genannter, dabei jedoch in keiner Weise als Einschränkung gedachter, rekombinanter Ad5-Vektor ist MRKAd5gag sowie MRKAd5pol, die beide in der WO 02/22080 offenbart sind. Ein weiterer verwandter Ad-Vektor ist Ad5gag, der in der WO 01/02607 offenbart ist. Diese beiden PCT-Veröffentlichungen sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Die Wirtszelle zur Verwendung bei dem hier vorgelegten Verfahren umfasst eine beliebige Zelllinie eines Säugers, welche die entsprechende Replikation fördert, insbesondere eine beliebige, im Stand der Technik bekannte Wirtszelllinie, welche die Infektion und Replikation eines Adenovirusvektors der 1. oder 2. Generation fördert. Eine bevorzugte Wirtszelle ist eine Wirtszelllinie, welche die Infektion und Replikation eines E1- und/oder E1/E3-deletierten rekombinanten Adenovirus fördert. So wie hierin offenbart, benötigt ein replikationsunfähiger Virus (wie z.B. Ad5gag, wie hierin veranschaulicht) eine Helferzelle, welche die Ad5 E1-Deletion ergänzt. Jede beliebige derartige Zelllinie kann zur Erzeugung des rekombinanten Virus verwendet werden, wobei bevorzugte Zelllinien u.a. 293-Zellen, PER.C6TM-Zellen, 911-Zellen für eine menschliche embryonale retinale Zelllinie (Fallaux et al. 1996, Human Gene Therapy 7:215-222); E1-transformierte Amniozyten (Schiedner et al. 2000, Human Gene Therapy 11:2105-2116); eine E1-transformierte A549-Zelllinie für ein menschliches Lungenkarzinom (Imler et al. 1996, Gene Therapy 3:75-84) und GH329:HeLa (Gao et al. 2000, Human Gene Therapy 11:213-219) sind, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Eine solche Zelllinie ist transformiert, um die Replikation und Verpackung eines entsprechenden rekombinanten Adenovirus, wie z.B. eines E1- oder E1/E3-deletierten rekombinanten Adenovirus, zu fördern. Weitere Zelllinien, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind erneut Zelllinien, die so angepasst wurden, dass sie als Wirtszellen für ein besonderes thermostabiles Virus dienen können. Es ist bevorzugt, dass die Zelllinie eine kontinuierliche Zelllinie ist, und noch bevorzugter, dass der Ursprung der kultivierten Zelle von einem nicht neoplastischen Gewebe stammt. Es ist auch bevorzugt, dass der Ursprung ein Säuger, höchstwahrscheinlich ein Primat, ist und insbesondere menschlichen Ursprungs ist. Abermals, eine bevorzugte Zelllinie ist eine Zelllinie, die zur Propagierung eines Ad-E1- oder -E1/E3-deletierten rekombinanten Virus geeignet ist; ein rekombinantes Virus, dessen E1-deletierter Adenovirusvektor mit Zelllinien ergänzt sind, die mit dem Ad E1 kodierenden Gen transfektiert sind und die für diesen transformierten Phänotyp ausgewählt wurden, wie z.B. 293-Zellen (Epithelzellen aus der menschlichen Niere) und PER.C6TM (menschliche embryonale Retinoblasten). Andere Zelltypen sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, HeLa-Zellen, A549-Zellen, KB-Zellen, CKT1-Zellen, NIH/sT3-Zellen, Vero-Zellen, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) oder irgendwelche eukaryotischen Zellen, welche den Adenovirus-Lebenszyklus fördern.
  • Jedes beliebige stromaufwärts liegende Virusproduktionsverfahren, das im Stand der Technik bekannt ist und das für eine Zellkultur von Säuger-Wirtszellen im großtechnischen Maßstab angepasst werden kann, kann verwendet werden, um das Ausgangsmaterial (d.h. eine virusinfizierte Wirtszellenkultur, die nach der Infektionsperiode einem Kulturwachstum unterworfen wurde, um die Menge an intrazellulärem und extrazellulärem Virus zu maximieren) für das Reinigungsverfahren der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, wobei dem Fachmann bekannte Modifizierungen in Betracht gezogen werden, um, soweit erforderlich, zum Beispiel Änderungen der Zelldichte oder die Gegenwart von Mikroträgern zu berücksichtigten. Dieses Verfahren ist im Stand der Technik bekannt (siehe z.B. US-Patent Nr. 6 194 191 für einen Überblick über im Stand der Technik bekannte Zellkulturverfahren, sowie "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques", 2000, Hrsg. R.I. Freshney, Wiley-Liss, wobei beide Dokumente hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind) und kann von Virus zu Virus und von Ort zu Ort angepasst werden, um die Virusproduktion zu optimieren. Zum Beispiel können PER.C6TM-Zellen in einem 300-l-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 240 l kultiviert und mit einem rekombinanten Adenovirus, das ein HIV-Transgen-gag kodiert (wie z.B. MRKAd5gag oder Ad5gag), bei einer Lebendzelienkonzentration von 0,59 × 106 Zellen/ml bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 280 vp/Zelle infiziert werden. Etwa fünfzig Stunden nach der Infektion (hpi) wird der Bioreaktor bei einer Gesamtzellenkonzentration von etwa 0,55 × 106 Zellen/ml mit einer 55%igen Lebensfähigkeit geerntet. Zum Zeitpunkt der Inbetriebsetzung dieser Einheit befinden sich laut AEX-Assay etwa 25% der Viren im Überstand. Ähnlich werden PER.C6TM-Zellen in 20-l-Wave-Bioreaktoren mit einem Arbeitsvolumen von 10 l kultiviert und mit einem rekombinanten Adenovirusvektor, der ein HIV-Transgen-nef bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von etwa 290 Viruspartikel pro Zelle (vp/Zell) und einer Lebendzellenkonzentration von etwa 0,72 × 106 Zellen/ml infiziert werden. Etwa fünfzig Stunden nach der Infektion (hpi) werden zwei Wave-Bioreaktoren mit einer Gesamtzellenkonzentration von etwa 0,66 × 106 Zellen/ml mit einer Lebensfähigkeit von 81% geerntet. Zum Zeitpunkt des Starts des Einengens befanden sich laut Anionenaustausch(AEX)-Assays 20,4% der Viren im Überstand.
  • Die folgenden nichtlimitierenden Beispiele sind zur besseren Veranschaulichung der Erfindung angegeben.
  • BEISPIEL 1
  • AEX-Chromatoqraphie ohne einen selektiven Ausfällungsschritt
  • Eine Anionenaustausch(AEX)-Chromatographie mit bestimmten Harzauswahl- und Säulenbetriebsbedingungen (NaG-Konzentration und pH) ermöglicht hohe Virusbeladungskapazitäten. Es wird hier auch gezeigt, dass die Einbeziehung eines Detergens (z.B. PS-80) in den Laufpuffern Aggregationen während der Beladung und Flution inhibiert. Allgemein wird hierin offenbart, dass die praktizierte Verwendung eines AEX-Harzes eine 5-20-fache Verbesserung gegenüber den bislang berichteten Verfahren bringt, wobei die anwendbare Kapazität, die hier gezeigt wird, bei 2,0 × 1013 vp/ml Harz liegt (ohne notwendigerweise darauf beschränkt zu sein). Entscheidend für die Durchführung eines wirtschaftlich effizienten und stabilen Verfahrens sind die Wahl eines Harzes mit einer hohen dynamischen Kapazität für Adenovirus und Methoden, um sicherzustellen, dass die Kapazität ohne Produktaggregation ausgeschöpft werden kann. Drei bedeutende Fortschritte eignen sich hierfür: (1) Source 15Q (Amersham Biosciences) wurde aufgrund seiner hohen Kapazität ausgewählt – andere Harze, wie z.B. Source 30Q (Amersham Biosciences) und Fractogel TMAE (EM Industries), liefern ebenfalls annehmbare Ergebnisse, wenn auch mit niedrigeren Kapazitäten, die wahrscheinlich durch kleinere Verhältnisse von effektivem Oberflächenbereich zu Volumen verursacht werden; (2) PS-80 wurde zu den Laufpuffern in einer Konzentration von 0,1% zugegeben, um eine Aggregation zu verhindern, und (3) das Produkt wird bei einer Leitfähigkeit beladen, die ausreichend hoch ist, um sicherzustellen, dass freies Adenovirus-Hexon und chromatographisch ähnliche Verunreinigungen sich nicht an das Harz binden. Zum Beispiel entspricht eine Beladung bei einer Leitfähigkeit von 38 mS etwa 0,38M NaCl. Die Salzkonzentration eignet sich für die Bindung von Adenoviruspartikeln, nicht jedoch von verwandten Verunreinigungen; daraus resultiert eine höhere Bindungskapazität für Adenovirus. Die optimale Leitfähigkeit wird vom Adenovirus-Serotyp abhängen (z.B. sollte Adenovirus Typ 6 bei etwa 0,33M NaCl beladen werden, da bei dieser Konzentration freies Hexon ungebunden bleiben kann, die Viruspartikel sich jedoch leicht binden können). Diese Bedingungen führen zu einem Schritt, der deutlich effizienter als andere berichtete Bedingungen arbeitet. 1 zeigt, wie dieses Verfahren funktioniert. Für Veranschaulichungszwecke ist ein präparatives Chromatogramm unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens an einem Strom, bei dem keine selektive Ausfällung stattgefunden hat, gezeigt. Stattdessen wurde das geklärte Lysat mit hohen Konzentrationen an Nuklease behandelt. Ferner sind das Feed (2A), der Durchfluss (2B) und das Eluat (2C) des präparativen Durchgangs bei einem 10-Volumen-Gradienten von 0,3-0,6M NaCl in den 2A-C gezeigt. Es ist offensichtlich, dass durch Anwendung dieser Methode der Peak, der überwiegend aus Adenovirus-Hexon bestand, zum Durchfluss verschoben werden kann, wodurch jegliche Bindungskonkurrenz eliminiert und die Abtrennung von Adenovirus von diesen Verunreinigungen sowie die Säulenkapazität deutlich verbessert werden können. Das Anionenaustauschprodukt kann dann in Formulierungspuffer diafiltriert und steril filtriert werden. Alternativ kann ein zusätzlicher Chromatographieschritt (z.B. Kationenaustausch) entweder vor oder nach der Diafiltration hinzugefügt werden, so dass die Möglichkeit besteht, die Stabilität der Entfernung von Verunreinigungen und/oder Virus/Prion zu verbessern.
  • BEISPIEL 2
  • Reinigung von MRKAd5gag-Adenovirusvektor aus Wirtszellenlysat
  • Etwa 12,5 Liter MRKAd5gag-Triton-lysiertes Material (Charge 0114) wurden aus einem 300-l-Bioreaktordurchgang erhalten und in 9,5- und 3-l-Aliquote aufgeteilt. Die Aliquote wurden getrennt in 20-Liter-Nalgen-Bechergläsern ausgefällt. Die Mischparameter für jedes Aliquot wurden durch Verkleinerung von sinnvollen 1000-l-Ausfällungsbedingungen durch Beibehaltung einer konstanten volumetrischen Turnoverzeit spezifiziert. Beide Aliquote wurden durch Zugabe von DB bis zu einer Endkonzentration von 0,0435% Gew./Vol. unter Verwendung einer konzentrierten Lösung (2% DB in 40 mM NaCl) ausgefällt. Die Zugabegeschwindigkeit dieser Mischung betrug 0,3 ml/Minute für jeden Liter Lysat. Die DB-Lösung wurde unterhalb der Oberfläche zugegeben. Die Verwendung einer Zugabe unterhalb der Oberfläche wird durch die von den Erfindern erzeugten Daten gestützt.
  • Nach dem Ende der Ausfällung wurde eine Tiefenfiltration der Reihe nach mit jedem Aliquot durchgeführt, wobei dieselbe Filtriereinrichtung verwendet wurde. Die Klärung wurde mittels eines Millipore-Opticap-CE-25-Filters in Reihe mit einem Millipore Opticap DE-45 durchgeführt. Beide Filter stellen Filtrieroberflächen von 1 ft2 zur Verfügung. Alle 12,5 Liter an ausgefälltem Material wurden erfolgreich mit einem maximalen Druckaufbau in jedem Filter von 1 psi verarbeitet. Nach der Klärung wurde die Trübung von etwa 540 auf 3,6 NTU verringert. Wie in Tabelle 2 gezeigt, betrug die Ausbeute bei diesem Schritt nur etwa 60%, dies schien jedoch durch ein Adsorptionsphänomen hervorgerufen zu werden und wurde daher durch den bei diesem Beispiel verwendeten geringen Durchsatz verstärkt.
  • Nur 9,5 Liter dieses Materials wurden bis zum Endprodukt verarbeitet. Die Konzentration und Diafiltration wurden mit einem 0,1-m2-500-kDa-NMWCO-PES-Ultrafilter (Millipore Pellicon 2) durchgeführt. Diese Membran wurde in eine TFF-Apparatur eingebaut, die ein Membranfiltergehäuse und eine Kolbenpumpe enthielt. Ein Konzentrationsfaktor von 20 wurde auf das geklärte Material angewandt, um das Gesamtvolumen der Charge zu verringern. Nach dem Einengen wurde BenzonaseTM in einer Menge von 15 U/ml Material zugegeben und die Charge langsam in dem System zwei Stunden lang mit geschlossener Permeatleitung rezirkuliert. Nach der Inkubation wurde die Charge gegen 5 Volumen 50 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1M NaCl, pH 7,5, diafiltriert.
  • Die Anionenaustauschchromatographie wurde bei einer Beladung von 2,4 × 1012 vp/ml Harz durchgeführt. Der Druckabfall über die Säule hinweg stieg während der Beladung nicht an, was zeigt, dass der Strom im Wesentlichen frei von Bruchstücken und faulenden Mitteln war. Darüber hinaus wurde während der Produktbeladung, dem Waschen oder der nachfolgenden Produktelution nahezu keine UV-Extinktion (bei 260 oder 280 nm) beobachtet (3). Diese Beobachtungen zeigen, dass die Masse der Verunreinigungen durch die Anionenaustauschchromatographie stromaufwärts entfernt worden war, und sie stimmen überein mit den nachstehenden Verunreinigungsdaten.
  • Die zweite Ultrafiltration wurde unter Verwendung von fünf 50-cm2-500-kD-PES-Membranen durchgeführt. Fünf Diafiltrationsvolumen wurden durchgeführt, um den Virus in den Formulierungspuffer auszutauschen. Wie in Tabelle 2 gezeigt, war die Ausbeute bei diesem Schritt gering, dies war jedoch vermutlich eine Folge der Viruspermeation und/oder der geringen Membranbeladung. Das Produkt wurde anschließend mit einem 10-cm2-Millipore-Sterivex-GV-0,22-Mikron-Filter steril filtriert. Während der Sterilfiltration wurde kein Druckaufbau beobachtet, was auf ein Fehlen von aggregiertem Virus hindeutet. Man beachte, dass die tatsächlichen Verfahrensausbeuten konservativ sind, da sie nicht die beträchtlichen Probenentnahmen für analytische Zwecke berücksichtigen. Tabelle 2: Ausbeutetabelle für MRKAd5gag
    Figure 00390001
    • 1. Niederschlag vor dem Assay durch 0,45-Mikron-Spritzenfilter filtriert
    • 2. Nur geklärtes Lysat A wurde in diesem Beispiel weiterverarbeitet
    • 3. Nur 166 ml AEP wurden der zweiten Ultrafiltration unterworfen
  • Die Daten zur Protein- und DNA-Entfernung sind in Tabelle 3 veranschaulicht. Man beachte, dass die Rest-DNA-Konzentrationen nach dem Anionenaustausch unter der Nachweisgrenze des Assays liegen, was zeigt, dass das veranschaulichte Verfahren eine bedeutende Verfahrensstabilität besitzt. Die spezifischen Proteinkonzentrationen ändern sich nicht vom UF1-Produkt zum Endprodukt und liegen nahe bei den theoretischen Werten für Adenovirus. Diese Beobachtung steht in gutem Einklang mit dem Fehlen eines auftretenden UV-Signals in dem Durchfluss und der Waschlösung bei der präparativen AEX. Es wird angenommen, dass die erweiterte "Reinigung" des Stroms durch Ausfällung und Klärung der Hauptgrund für diese Verbesserung ist. Tabelle 3 zeigt auch, dass die Infektiosität während des Verfahrens beibehalten wird. Tabelle 3: Infektiositäts- und Verunreinigungsentfernungsdaten aus der MRKAd5gag-Reinigung
    Zwischenprodukt Rest-DNA, pg/1011 vp Protein (BOA) μg/1011 vp AEX/QPA, vp/IU
    Lysat 5,52e6 1292 –
    DB ppt 4,30e5 811 –
    Geklärtes Lysat – 1802 –
    UF1 FR 229 14 19
    AEP 2,0(<5) 13 19
    UF2 FR – 16 –
    SFP 2,2 (<5) 15 16
  • BEISPIEL 3
  • Kationische Tenside für die Ausfällung von Nukleinsäuremolekülen
  • Alternative Tenside wurden untersucht, um die relative Spezifität verschiedener Arten von kationischen Detergentien zu erforschen. Dieses Beispiel sorgt für ein besseres Verständnis der erhöhten Selektivität von DB. Tabelle 4 enthält die Liste von in diesem Beispiel verwendeten Tensiden zusammen mit ihren Formelgewichten und ihren entsprechenden Molekularstrukturen. Tabelle 4: Strukturelle Unterschiede der kationischen Detergentien
    Figure 00400001
    Figure 00410001
  • Aliquote aus 1 ml Zelllysat wurden mit einer Reihe von Tensidkonzentrationen behandelt und sofort gevortext. Nach der Filtration mit 0,45-Mikron-Spritzenfilter wurden Proben mittels des Picogreen-Assays (Molecular Probes) auf DNA-Konzentration analysiert und die Adenoviruskonzentration mittels eines Anionenaustausch-HPLC-Assays ermittelt. 4 zeigt die Adenovirus-Fällungsprofile. Eine kürzere Kettenlänge (z.B. CTAB vs. TTA) zeigt ein ausgeprägteres Fällungsprofil. Obwohl 0,03% die maximal erlaubte Tensidkonzentration vor der Adenovirusausfällung sowohl für CTAB als auch für TTA sind, unterscheiden sich die DNA-Profile (siehe 5). Beim Vergleich der DB- und der BTC-Fällungsprofile wurde festgestellt, dass sie nahezu identisch sind. Dennoch ist, wenn man zurückgeht bis über den Punkt hinaus, bei dem die Adenovirusausfällung beginnt, bei allen Konzentrationen die Selektivität für DNA bei DB höher als bei BTC (siehe 5). Das heißt, ein Kontakt zwischen dem positiv geladenen Stickstoff des BTC und der Phosphorgruppe der DNA kann durch die größere Nähe des Benzolrings in BTC sterisch gehindert sein. Ein Ergebnis der abgeschirmten Ladung oder das Fehlen eines ausgeprägten hydrophoben Endes kann ebenfalls dafür verantwortlich gemacht werden. Es kann jedoch die Schlussfolgerung gezogen werden, dass ringförmige Strukturen stabiler und für DNA selektiver sind. Die vorgeschlagene hydrophobe Wechselwirkung könnte die treibende Kraft für dieses Phänomen sein. Ein einziger, jedoch wichtiger Unterschied zwischen den CPC und den CTAB-Molekülen ist die Gegenwart eines Pyridiniumrings. Die positive Ladung wird innerhalb dieses Rings verteilt. Wie in 5 gezeigt, beginnt die erste Ausfällung von Adenovirus durch CPC und CTAB bei 0,03%. Darüber hinaus ist das Fällungsprofil viel weniger aggressiv, wenn die positive Ladung verteilt ist. Wie jedoch in 5 gezeigt, fällt CTAB über den Großteil der Tensidkonzentrationen mehr DNA aus.
  • BEISPIEL 4
  • Auswirkungen der Mischgeschwindigkeit auf die Tiefenfiltration von ausgefällten Adenoviruspräparaten
  • Die Ausfällung von DNA durch Domiphenbromid (DB) in dem PErC.6TM-Lysat ist abhängig von den Mischbedingungen. Die Leistung der Tiefenfiltration für verschiedene Mischbedingungen, die durch verschiedene Rührflügelgeschwindigkeiten erzeugt werden, wird in diesem Beispiel untersucht. MRKAd5gag0114 wurde bei verschiedenen Rührflügelgeschwindigkeiten von 30, 65 und 250 U/Minute ausgefällt. Die Klärung bestand aus einer zweistufigen Tiefenfiltration. Die Niederschläge wurden zunächst mittels eines CE-25 Millipore Millistak +50 (0,02 ft2) bei 9 l/Stunde/ft2 filtriert. Das Material wurde gesammelt und mittels eines DE-45 Millipore Millistak +50 (0,02 ft2) bei derselben Fließgeschwindigkeit filtriert. Die Druckabfälle als eine Funktion des Durchsatzes für die verschiedenen Mischbedingungen werden in 6 mit der Kontrolle vor der Ausfällung verglichen. Das Mischen bei 30 U/Minute zeigte einen bedeutenden Anstieg des Durchsatzes für das CE-25-Filter bei 20 psig, verglichen mit der Kontrolle, es zeigte jedoch größere Verluste bei der Gesamtausbeute, verglichen mit den 65- und 250-U/Minute-Mischbedingungen. Die anderen Mischbedingungen zeigten geringere Durchsätze als die Kontrolle für das CE-25-Filter, wiesen jedoch höhere Gesamtausbeuten zwischen der Ausfällung und der Tiefenfiltration als die Kontrolle auf. Die Abhängigkeit der Klärung von den Mischbedingungen unterstreicht die Bedeutung einer erneuten Optimierung, nachdem die Mischbedingungen ermittelt worden sind. Beim Durchsatz des DE-45 wurde ein geringer Druckaufbau (< 1 psi) bei allen untersuchten Suspensionen beobachtet. Da das DE-45 nie nahe an seine Kapazität heran kam, ist das CE-25-Filter der limitierende Faktor bei dem Klärungsschema. Obwohl die CE-25-Filter die Trübung in unterschiedlichem Maße verringerten, wie es in Tabelle 5 zu sehen ist, verringerten die folgenden DE-45-Filter die Trübung des ausgefällten Lysats auf weniger als 6 NTU, während sie die Trübung des nicht ausgefällten Lysats auf nur 10 verringerten. Tabelle 5: Trübungsverringerung für verschiedene Fällungsbedingungen
    Parameter Nicht ausgefällt Mischgeschwindigkeit
    30 U/Minute 65 U/Minute 250 U/Minute
    Feed (NTU) 41 237 200 600
    CE25-Pool (NTU) 14 22 24 4,4
    Verringerung 66% 91% 88% 99%
    DE45-Pool (NTU) 10 5,2 4,8 2,2
    Verringerung 29% 76% 80% 50%
  • BEISPIEL 5
  • Herstellung von rekombinantem Adenovirus aus einem 300-Liter-Bioreaktor
  • Eine Zellkultur im 240-l-Maßstab wurde in dem 300-l-Bioreaktor durchgeführt.
  • Diese Charge bestätigte die Skalierbarkeit des Reinigungsverfahrens mit einzelnen Betriebseinheiten, die mit dem Äquivalent von 60 bis 214 Liter Zellsuspension durchgeführt wurden. Die Verfahrensgesamtausbeute betrugt 54%, gemessen durch Anionenaustausch-HPLC. Das Infektiositätsverhältnis (vp/IU) und der spezifische DNA-Gehalt des Endprodukts betrugen (31 vp/IU) bzw. (<16,5 pg/1011 vp) und waren vergleichbar mit früheren Daten.
  • Lyse – Die Lyse wurde durch die Zugabe von konzentrierten Puffern absolviert, um Endkonzentrationen von 0,1% Triton X-100 und 0,05% Polysorbat-80 zu erzielen. Das Lysat wurde vor dem Detergentienausfällschritt über Nacht bei Raumtemperatur gehalten.
  • Ausfällung – Die DNA-Ausfällung erfolgte in einem 214-l-Maßstab in dem Bioreaktor. Eine 0,5%ige Domiphenbromidlösung mit 40 mM NaCl wurde über der Oberfläche innerhalb von etwa zwei Stunden bis zu einer Endkonzentration von 0,04% Domiphenbromid zugegeben. Der Rührer wurde dabei mit 80 U/Minute betrieben. Die Rührgeschwindigkeit wurde durch Betrieb bei einer volumetrischen Turnover-Zeit ausgewählt, welche sich im kleineren Maßstab als wirksam erwiesen hatte und die sich auf einen größeren Maßstab übertragen lässt. Nach dem Ausfällen wurden etwa 153 kg ausgefälltes Lysat der Tiefenfiltration übergeben.
  • Tiefenfiltration – Das ausgefällte Lysat wurde durch ein zweistufiges Tiefenfiltrationsschema geklärt. Für diesen Schritt wurden Zwölf-Inch-Millistak-Patronen mit einem 6,8-Quadratfuß-CE20-Filter, gefolgt von einem 6,8-Quadratfuß-CE-50-Filter, verwendet.
  • Die Filtration wurde bei einer konstanten Fließgeschwindigkeit von 2 l/Minute durchgeführt, und 144,2 kg geklärtes Lysat wurden gewonnen. Die Gesamtausbeute betrug 84%.
  • Ultrafiltration – Eta 60 l geklärtes Lysat wurden mit 0,3 m2 Membranfläche (Millipore Pellicon II 500 kDa PES) 20-fach konzentriert. Die Rezirkulationsgeschwindigkeit wurde bei 1 l/Minute gehalten und der Permeatfluss bei 0,3 l/Minute eingeregelt. Die Nukleasedigestion wurde durch die Zugabe von 15 U/ml BenzonaseTM, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur, durchgeführt. Anschließend wurde der Puffer durch 5 Diafiltrationsvolumen von 50 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1M NaCl, pH 7,5, ausgetauscht, um Verunreinigungen zu entfernen. Das Produkt wurde über Nacht bei 4°C gehalten.
  • Anionenaustauschchromatographie – Das UF1-Produkt wurde bis zu einer Leitfähigkeit von 38 mS/cm unter Verwendung von 50 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,1% PS-80, pH 7,5, verdünnt. Eine FineLine-Säule mit einem Durchmesser von 10 cm (Amersham Biosciences) wurde mit insgesamt 863,5 ml Source-15Q-Harz (Amersham Biosciences) gepackt. Das Produkt wurde mit einer linearen Geschwindigkeit von 1,5 cm/Minute aufgetragen, mit 5 Säulenvolumen 50 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,39M NaCl, 0,1% PS-80, pH 7,5, gewaschen und anschließend während eines Vier-Säulen-Gradienten bis 0,47M NaCl eluiert.
  • Ultrafiltration – Der Produktpeak wurde verdünnt und auf eine Adenoviruskonzentration von etwa 1,05 × 1012 vp/ml und eine Salzkonzentration von 1M NaCl eingestellt. Die Charge wurde in Formulierungspuffer (5 mM Tris, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% Saccharose, 0,005% PS-80, pH 8,0) durch eine 0,1-m2-500-kDa-PES-Membran (Millipore Pellicon II Biomax) diafiltriert. Der Permeatfluss wurde bei 80 ml/Minute gehalten.
  • Sterilfiltration – Das Ultrafiltrations-Retentat wurde mit einem Millipore-Millipak-20-Filter (100 cm2) bei einer konstanten Feedfließgeschwindigkeit von 150 ml/Minute steril filtriert.
  • Tabelle 6 zeigt den Schritt und die Gesamtausbeuten an MRKAd5gag. Diese Charge erzeugte 1,91E15 Viruspartikel bei einer Gesamtausbeute von 54%. Man beachte, dass in mehreren Fällen aufgrund von Probenentnahmen die Einsatzmenge bei einem Schritt deutlich kleiner ist als der Ertrag aus dem vorherigen Schritt. Tabelle 6: MRKAd5gag-Ausbeutetabelle
    Probe Volumen, ml AEX, vp/ml Ad, vp Schrittausbeute Gesamtausbeute
    Lysat 214200 6,40 × 1010 1,37 × 1016
    Niederschlags 232850 5,08 × 1010 1,18 × 1016 86% 86%
    Tiefenfiltrationsfeed 152906 5,08 × 1010 7,77 × 1015
    Geklärtes Lysat 144224 4,70 × 1010 3,39 × 1015 85% 73%
    UF1-Feed 59885 5,08 × 1010 3,04 × 1015 108% 79%
    UF1-Retentat 2925 9,82 × 1011 2,87 × 1015
    UF1-Waschlösung 501 5,58 × 1010 2,79 × 1015
    UF1 Gesamt 3429 8,46 × 1011 2,90 × 1015 96% 75%
    AE-Feed 8357 3,37 × 1011 2,81 × 1015 97% 73%
    AE-Produkt 1198 1,77 × 1012 2,12 × 1015 75% 55%
    Verdünntes AEP2 2000 1,05 × 1012 2,10 × 1015
    UF2-Feed2 1900 1,05 × 1012 1,99 × 1015
    UF2-Retentat 1876 1,05 × 1012 1,97 × 1015 99% 55%
    SF-Feed 1864 1,05 × 1012 1,96 × 1015
    Steril filtriertes Produkt 1935 9,95E+11 1,92E+15 98% 54%
    • 1. Vor dem Assay durch ein 0,45-Mikron-PVDF-Spritzenfilter filtriert
    • 2. Berechneter Wert
  • 7 zeigt die Analyse durch SDS-PAGE der veranschaulichten Charge sowie einiger weiterer Versuche, die hier nicht beschrieben sind. Speziell zeigen die Spuren 2-4 Verfahrens-Zwischenprodukte aus diesem Beispiel und zeigen die hohe Reinheit des Produkts, da alle signifikanten Banden als Adenovirus-Strukturproteine identifiziert sind.
  • Tabelle 7 fasst die DNA-Entfernung für die Charge zusammen. Durch Ausfällung und Tiefenfiltration wurde eine DNA-Verringerung von über 2 Log erreicht. Erneut werden Konzentration an oder nahe an der Nachweisgrenze des Assays erzielt. Tabelle 7 zeigt auch das Detergentien-Reinigungsprofil während des veranschaulichten Schritts. Die Detergentien wurden beide bei dem Anionenaustausch und der zweiten Ultrafiltration wirksam entfernt. Die Menge an Detergens in dem Produktstrom wurde nach der UF2 auf unter die Nachweisgrenze des Assays (etwa 0,001%) verringert. Tabelle 7: Entfernung von Verunreinigungen während der Charge MRKAd5gag0123A
    Zwischenprodukt DNA (QPCR) (pg/1011 vp) Triton (%) DB (%)
    Lysat 1,9 × 107 0,109 <0,001%
    Geklärtes Lysat 8,3 × 104 0,078 0,011
    UF1-Produkt 3410 0,297 0,122
    AEP 30 0,007 0,008
    UF2-Retentat <5 <0,001% <0,001%
    Steril filtriertes Produkt 5 <0,001% <0,001%
  • Beispiel 6
  • CTAB-Ausfällung vs. Verwendung von viel Nuklease
  • MRKAD5gag wurde verwendet, um ein Verfahren, das die CTAB-Ausfällung und keine Nukleasebehandlung (Zweig C) beinhaltet, mit einem Verfahren zu vergleichen, das hohe Konzentrationen an Nuklease (150 U/ml BenzonaseTM, 150 U/ml RNase), jedoch keine Ausfällung einsetzte (Zweig A). Tabelle 8 enthält die Daten für die Entfernung verbliebener DNA für beide Reinigungszweige. Man beachte, dass die CTAB-Ausfällung die Gesamt-DNA früher in dem Verfahren verringert, während im letzteren Fall der Großteil der Reinigung durch die Nukleasebehandlung (UF1 CR bis UF1 DR) erreicht wird. Die DNA-Konzentrationen in dem Anionenaustauschprodukt (AEP) liegen innerhalb der Assayschwankungen. Diese Daten zeigen, dass ein auf Detergens basierender Ausfällungsschritt eine Behandlung mit Nuklease in hoher Konzentration vollständig ohne Auswirkungen auf die Produktqualität ersetzen kann. Tabelle 8: Rest-DNA Ergebnisse der BenzonaseTM-Digestion vs. DNA-Ausfällung mittels CTAB
    Verfahrens-Zwischenprodukt MRKAd5gag0112A MRKAd5gag01120
    Rest-DNA (pg/1E11 vp) Rest-DNA (pg/1E11 vp)
    Lysat 9,87 × 107 9,87 × 107
    Geklärtes Lysat 7,25 × 106 1,10 × 106
    Retentat der UF1-Konzentration 1,01 × 107 –
    UF1-Retentat 2,58 × 103 5,38 × 105
    AEP (Anionenaustausch-Produkt) 595 260
  • BEISPIEL 7
  • CPC- und Domiphenbromid-Ausfällung
  • Bei diesem Beispiel werden Verfahren, die eine CPC- oder DB-Ausfällung verwenden (ohne Verwendung von Nuklease), mit einem Kontrollverfahren, bei dem viel Nuklease verwendet wird, verglichen. Speziell werden die folgenden Reinigungsszenarien verglichen:
    0113A: Keine Ausfällung, Benzonase und RNase in einer Menge von jeweils 150 U/Minute, AEX-Beladung bei etwa 5 × 1012 vp/ml.
    0113C: Ausgefällt mit CPC, keine Verwendung von Nuklease, AEX-Beladung bei etwa 5 × 1012 vp/ml.
    0113D: Ausgefällt mit DB, keine Verwendung von Nuklease, AEX-Beladung bei etwa 5 × 1012 vp/ml.
  • Die Schrittausbeuten waren für die drei Zweige vergleichbar, außer die ungewöhnlich niedrigen UF1-Ausbeuten in Zweig A (siehe Tabelle 9). Tabelle 9. Ausbeutetabelle für MRKAd5gag0113
    SCHRITT 0113A1 0113C 0113D
    PPT 102% 100%
    CL 83% 84% 93%
    UF1 FR 60% 109% 110%
    AEP 76% 88% 80%
    NET 38% 82% 82%
  • Die Rest-DNA-Daten für die Charge sind in Tabelle 10 aufgeführt. Diese Daten lassen auf eine hohe Gesamteffizienz für auf Ausfällung beruhende Verfahren selbst in Abwesenheit einer Nukleaseverwendung schließen. Das Anionenaustauschprodukt wurde in diesem Beispiel nicht durch UF2 verarbeitet, so dass Endproduktwerte nicht zur Verfügung stehen. Tabelle 10. DNA-Entfernung für MRKAd5gag0113
    Zwischenprodukt Rest-PER.c6-DNA pg/1e11 vp
    0113A 0113C 0113D
    LYS 8,20 × 106 8,20 × 106 8,20 × 106
    UF1-Retentat 116 4,88e5 4,98e5
    AEP 8,7 59 26
  • Die Proteinentfernung ist in der nachstehenden Tabelle 11 gezeigt. Die Wirksamkeit der Proteinentfernung im UF1-Schritt scheint vor der Ausfällung deutlich verbessert zu werden, die Reinheitsunterschiede beim AEP-Schritt können jedoch anhand des Gesamtproteins nicht erkannt werden, da die überwiegende Mehrheit des vorhandenen Proteins das Produkt ist. Als Folge davon wird die relative Proteinverunreinigung für die AEPs durch die SDS-PAGE-Analyse in Beispiel 8 ermittelt. Tabelle 11. Gesamtproteinentfernung für MRKAd5gag0113-Chargen (BCA-Assay)
    Zwischenprodukt 0113A μg/1011 vp 01130 μg/1011 vp 0113D μg/1011 vp
    LYS 1370 1255 1450
    CL 1201 1183 1210
    UF1 DR 228 66 113
    AEP 15 13 13
  • Während gezeigt wurde, dass CTAB keine Auswirkung auf die Adenovirus-Infektiosität (Charge 0112) hat, rechtfertigten Strukturunterschiede und mögliche Unterschiede im Mechanismus der CPC- und DB-Ausfällung weitere Daten zur Infektiosität. Für diese drei Reinigungen war das Verhältnis von Viruspartikeln zu infektiösen Einheiten wie folgt: A-26 vp/IU, C-32 vp/IU; D-29 vp/IU. Diese Verhältnisse sind statistisch äquivalent und zeigen, dass die hierin skizzierten Verfahren die Produkt-Infektiosität nicht beeinflussen.
  • BEISPIEL 8
  • SDA-PAGE-Analyse für die Chargen MRKAd5gag0112, MRKAd5gag0113 und MRKAd5gag0114
  • Eine SDS-PAGE-Gelproteinanalyse wurde an Zwischenproben aus der stattfindenden Reinigung der Chargen MRKAd5gag0112, MRKAd5gag0113 (Beispiel 7) und MRKAd5gag0114 (Beispiel 2) durchgeführt, wie es in 8 gezeigt ist. Mehrere wichtige Beobachtungen können gemacht werden. Erstens scheint die Einbeziehung einer CTAB-Ausfällung (0112C, Spur 3) zu höherer Proteinreinheit beim Anionenaustauschprodukt (AEP) zu führen als beim Kontrollzweig (0112A, Spur 2). Zweitens weisen die Spuren 5-10 eine ähnliche Reinheit für die AEP auf, trotz der folgenden Verfahrensvarianten: (a) AEX-Beladung bei 5, 10 und 15 × 1012 vp pro ml Harz bei Behandlung mit 150 U/ml BenzonaseTM und ohne Ausfällung (0113A1-A3-Spuren 5-7); (b) Verwendung von ausschließlich 5 U/ml Benzonase ohne Ausfällung (0113B-Spur 8); (c) CPC- oder DB-Ausfällung ohne Verwendung von Nuklease (0113C & D-Spuren 9 und 10). Drittens weist das AEP von Charge 0114 (Spur 4), das sowohl eine DB-Ausfällung als auch die Verwendung von Benzonase in niedriger Konzentration beinhaltete, eine bessere Proteinreinheit auf (z.B. weniger 39- und 50-kDa-Verunreinigungen).
  • BEISPIEL 9
  • Reinigung von Adenovirus Typ 5 im 600-Liter-Maßstab
  • Das Verfahren wurde vergrößert, wobei von 600 l Zelllysat ausgegangen wurde. Die verwendeten Verfahrensdetails sind ähnlich den in Beispiel 5 beschriebenen, umfassten jedoch die folgenden Unterschiede: (1) die Tiefenfiltration wurde mit einem Millipore-CE20-Filter, gefolgt von einem CUNO-CP50-Filter (enthält eine positive Ladung) mit einem Flächenverhältnis von 2:1 durchgeführt, (2) 300 kDa-Ultrafilter wurden verwendet, (3) 0,1% PS-80 ist in dem Diafiltrationspuffer enthalten, und (4) ein rekombinantes Adenovirus, das der Reinigung unterworfen wurde, war MRKAd5pol, das im Detail in der PCT-Veröffentlichung WO 02/22080 beschrieben ist.
  • Die Ausbeuten für dieses Verfahren sind in Tabelle 12 gezeigt. Die Infektiosität des Endprodukts wurde durch ein TCID50-Assay bestätigt, wobei ein Infektiositätsverhältnis von 4 vp/IU vorlag. Die mittlere Teilchengröße gemäß Dynamic-Light-Scattering betrug 123 nm, was mit den theoretischen Erwartungen im Einklang steht. Die spezifischen Rest-DNA-Konzentrationen, die Gesamtproteinkonzentrationen und die Verfahrensrückstände sind in Tabelle 13 gezeigt. Diese Daten bestätigen weiter die Skalierbarkeit dieses Verfahrens. Tabelle 12. MRKAd5pol-Ausbeutetabelle für die Reinigung im 600-l-Maßstab
    Probe Vol, I AEX, vp/ml Ad, vp Schrittausbeute, Gesamtausbeute
    Lysat 615 2,62 × 1010 1,61 × 1016 – –
    Niederschlags 668 2,32 × 1010 1,55 × 1016 96% 96%
    Geklärtes Lysat 672 1,83 × 1010 1,23 × 1016 80% 77%
    UF1-Produkt 30,6 3,53 × 1011 1,08 × 1016 93% 71%
    AE-Produkt 2,64 3,55 × 1012 9,37 × 1015 89% 64%
    UF2-Produkt 11,3 7,22 × 1011 8,16 × 1015 92% 59%
    Steril filtriertes Produkt 10,3 7,10 × 1011 7,31 × 1015 98% 58%
    • 1. Vor dem Assay filtriert durch ein 0,45-Mikron-PVDF-Spritzenfilter.
    • 2. Die Schrittausbeuten berücksichtigen, dass große Proben der Verfahrenszwischenprodukte entnommen werden (umfasst Niederschlag: 2,2 l, geklärtes Lysat: 37,3 l; UF1-Produkt: 0,8 l; AE-Produkt: 0,15 l; UF2-Produkt: 1,0 l).
    Tabelle 13. Entfernung von Verunreinigungen während der Reinigung im 600-l-Maßstab
    Probe DNA (QPCR) pg/1011 vp Protein (BCA) μg/1011 vp Triton % DB %
    Lysat 3,5E+07 2313 0,134 –
    Geklärtes Lysat 8,4E+04 2404 0,082 0,021
    UF1-Produkt 736 114 0,113 0,031
    AE-Produkt 20 9 0,003 0,003
    UF2-Produkt 17 8 < 0,0012 < 0,0008
    Steril filtriertes Produkt 14 8 < 0,0012 < 0,0008
  • BEISPIEL 10
  • Adenovirus Typ 6
  • Bei diesem Beispiel wird Adenovirus Typ 6 (aus der Untergruppe C) gereinigt. Verfahrensänderungen in diesem Beispiel betreffen hauptsächlich den Schritt der präparativen Anionenaustauschchromatographie. Dort wurde das UF1-Produkt auf etwa 30,7 mS/cm verdünnt und auf das Source-15Q-Harz geladen. Die Säule wurde mit einem Puffer gewaschen, der 0,32M NaCl enthielt. Die Produktelution fand über einen Vier-Säulenvolumen-Gradienten bis zu einer NaCl-Endkonzentration von 0,41M statt. Ansonsten wurde das Verfahren im Wesentlichen wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt.
  • Die Ausbeuten aus dieser Reinigung zeigen, dass die Verfahrensleistung mit Ad5 vergleichbar ist (Tabelle 14). Speziell wurden die Rest-DNA-Konzentrationen durch Q-PCR nach der Ausfällung und Klärung um mehr als 2 Log verringert. Die Konzentrationen werden auf 3 pg/1011 vp in dem Produktverringert. Spezifische Gesamtproteinwerte (Tabelle 15) zeigen auch, dass die überwiegende Mehrheit des Gesamtproteins am Ende der UF1 entfernt wird und dass die restlichen Verunreinigungen nach der AEX normalisiert werden. Wie auch beim Adenovirus Typ 5 zu sehen ist, zeigen diese Daten, dass Adenovirustypen in derselben Untergruppe gereinigt werden können. Tabelle 14. Ad6-Ausbeutetabelle für die Reinigung im 20-l-Maßstab
    Probe Vol., ml AEX vp/ml2 Ad, vp Schrittausbeutet Gesamtausbeute
    Lysat 3664 1,06 × 1011 3,88 × 1014 – –
    Niederschlag1 3952 1,01 × 1011 3,99 × 1014 103% 103%
    Geklärtes Lysat 3898 8,71 × 1010 3,40 × 1014 85% 88%
    UF1-Produkt 185,7 1,58 × 1012 2,93 × 1014 87% 77%
    AE-Produkt 101,6 1,76 × 1012 1,79 × 1014 63% 48%
    UF2-Produkt 135,9 1,13 × 1012 1,54 × 1014 92% 44%
    Steril filtriertes Produkt 141,4 1,01 × 1012 1,43 × 1014 100% 44%
    • 1. Vor dem Assay durch ein 0,45-Mikron-PVDF-Spritzenfilter filtriert.
    • 2. Aus der Ad5-Eichkurve berechnete Ergebnisse.
    • 3. Schrittausbeuten berücksichtigen die Probennahme von Zwischenprodukten (nicht gezeigt).
    Tabelle 15. Entfernung von Verunreinigungen während der Ad6-Reinigung im 20-l-Maßstab
    Probe DNA (QPCR) pg/1011 vp Protein (BOA), μg/1011 vp Triton % DB %
    Lysat 5,8E+06 641 0,135 –
    Geklärtes Lysat 4,2E+04 439 0,084 0,016
    UF1-Produkt 310 37 0,017 0,041
    AE-Produkt 20 10 < 0,0012 < 0,0008
    UF2-Produkt 5 10 < 0,0012 < 0,0008
    Steril filtriertes Produkt 3 7 < 0,0012 < 0,0008
  • BEISPIEL 11
  • Adenovirus Typ 35 (Ad35pol)
  • In diesem Beispiel wird Adenovirus Typ 35 (aus Untergruppe B) gereinigt. Die Verfahrensänderungen, verglichen mit Beispiel 5, betrafen vorwiegend den Schritt der präparativen Anionenaustauschchromatographie. Dort wurde das UF1-Produkt auf etwa 28 mS/cm verdünnt und auf das Source-15Q-Harz geladen. Die Säule wurde mit 0,29M NaCl gewaschen und in einem Vier-Säulen-Volumengradienten bis 0,38M NaCl eluiert. Ansonsten wurde das Verfahren im Wesentlichen wie in den Beispielen 5 und 9 beschrieben durchgeführt.
  • Ausbeuten aus dieser Reinigung zeigen, dass das Leistungsvermögen des Verfahrens mit dem für Ad5 vergleichbar ist (Tabelle 16). Spezifische Rest-DNA-Konzentrationen durch Q-PCR wurden um mehr als 3 Log nach der Ausfällung und Klärung auf 11 ng/1011 vp reduziert. Die Werte werden nach der ersten Ultrafiltration (UF1) auf 1,0 ng/1011 vp verringert. Die spezifischen Gesamtproteinwerte (Tabelle 17) zeigen ebenfalls, dass die große Mehrheit des Gesamtproteins am Ende der UF1 entfernt wird; diese Daten zeigen, dass dieses Produkt bereits ohne irgendeine chromatographische Reinigung eine relativ hohe Reinheit erreicht und dass viele Adenovirus-Untergruppen durch das bestehende Verfahren, nämlich durch Unterwerfen eines geklärten SPA-gefällten Lysats einem einzigen Ultrafiltrationsschritt, gereinigt werden können. Tabelle 16. Ad35-Ausbeutetabelle für eine Reinigung im 20-l-Maßstab
    Probe Vol, ml AEX Vp/ml2 Ad, vp Schrittausbeute2 Gesamtausbeute
    Lysat 20723 4,31 × 1010 8,93 × 1014 – –
    Niederschlag1 22371 3,64 × 1010 8,14 × 1014 91% 91%
    Geklärtes Lysat 22259 2,86 × 1010 6,37 × 1014 78% 71%
    UF1-Produkt 949 4,54 × 1011 4,31 × 1014 75% 53%
    AE-Produkt 137 2,85 × 19012 3,91 × 1014 93% 49%
    UF2-Produkt 448 6,64 × 1011 2,97 × 1014 78% 39%
    Steril filtriertes Produkt 438 6,43 × 1011 2,81 × 1014 99% 38%
    • 1. Vor dem Assay durch ein 0,45-Mikron-PVDF-Spritzenfilter filtriert.
    • 2. Aus der Ad5-Eichkurve berechnete Ergebnisse.
    • 3. Schrittausbeuten berücksichtigen die Probennahme von Zwischenprodukten (nicht gezeigt).
    Tabelle 17. Proteinentfernung während der Ad35-Reinigung im 20-l-Maßstab
    Probe Protein (BOA), μg/1011 vp
    Lysat 1803
    Geklärtes Lysat 1549
    UF1-Produkt 24
    AE-Produkt 17
    UF2-Produkt 14
    Steril filtriertes Produkt 15
  • BEISPIEL 12
  • Trennung der Adenovirus-Typen 5, 24 und 36 durch Anionenaustausch
  • Kleine Mengen von durch Chromatographie oder CsCl-Ultrazentrifugation gereinigtem Adenovirus wurden auf eine Source-15Q-Säule (siehe 9) im analytischen Maßstab injiziert (siehe 9). Bei diesem Beispiel wurde ein NaCl-Gradient von 0,2 bis 0,6M verwendet. Das Verfahren ist eindeutig in der Lage, Virus aus der Untergruppe C (Ad5), Untergruppe D (Ad24) oder Untergruppe B (Ad35) zu binden/eluieren. Darüber hinaus kann durch Injektion neuer Typen mit einem bekannten Typ (in diesem Falle Ad5) die relative Elutionszeit berechnet werden; aus der relativen Elutionszeit und dem Wissen über präparative Puffer für Ad5 können präparative Puffer für jeden anderen Serotyp leicht ermittelt werden. Diese Änderung ist die einzige erwähnenswerte Modifizierung, die notwendig ist, um diese Erfindung an andere Adenovirus-Serotypen anzupassen.
  • BEISPIEL 13
  • Domiphenbromid-Ausfällung der Adenovirus-Typen 5, 35 und 6
  • Eine Reihe von DB-Konzentrationen (0 bis 0,065%) wurde zu 1-ml-Röhrchen mit verschiedenen Adenovirus-Zelllysaten zugegeben, die etwa 0,1% Triton, 0,05% PS-80, 2 mM MgCl2 und 25 mM Tris, pH 8, enthielten. Die Zellen wurden in Suspensionskultur mit einer Infektion bei etwa 106 Zellen/ml hergestellt. Diese Proben wurden sofort gevortext und mit 0,45-Mikron-Spritzenfiltern filtriert. Zur Bestimmung von Adenovirus- und DNA-Konzentrationen durch AEX-HPLC und Picogreen-Assays wurden Aliquote entfernt.
  • Wie in 10 gezeigt, fällt bei Domiphenbromid-Konzentrationen von unter 0,05% kein Adenovirus messbar aus. Daher wird die Zugabe von Domiphenbromid in Konzentrationen zwischen 0,03 und 0,05% zur selektiven Ausfällung von DNA führen. Für die hier verwendeten speziellen Stromeigenschaften ist eine Zugabe in einer Konzentration von 0,04% für alle Serotypen geeignet. Die erwähnte Ausfällung von restlichen Verunreinigungen durch CPC, CTAB und alternative SPAs zeigt ebenfalls ähnliche Leistungseigenschaften für mehrere Adenovirus-Untergruppen.
  • BEISPIEL 14
  • Ad5-Reinigungsverfahren mit Kationenaustausch
  • Die Reinigung von Adenovirus mittels eines Verfahrens, das Kationenaustausch umfasst, kann durch Anionenaustauschchromatographie erfolgen, wie es in den vorherigen Beispielen beschrieben ist. Dieses Beispiel beschreibt die Verarbeitung des Anionenaustauschprodukts durch eine zweite Ultrafiltration, eine pH-Einstellung, Durchfluss-Kationenaustausch und eine zweite pH/Puffer-Einstellung, um zu einem Produkt in einem fertigen Formulierungspuffer zu gelangen.
  • Das Anionenaustauschprodukt wurde verdünnt und auf eine Adenoviruskonzentration von etwa 1,77 × 1012 vp/ml und eine Salzkonzentration von 1M NaCl eingestellt. Die Charge wurde durch drei 0,05-m2-300-kDa-PES-Membranen (Millipore Pellicon XL) in Puffer diafiltriert (5 mM Tris, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% Saccharose, 0,005% PS-80, pH 7,4). Der Permeatfluss wurde bei 80 ml/Minute-m2 gehalten.
  • Der pH-Wert des ultrafiltrierten Retentats wurde vor dem Kationenaustauschchromatographieschritt mit Puffer (5 mM Tris, 0,2M Histidin, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% Saccharose, 0,005% PS-80, 50 mM HCl, pH 6,5) auf etwa 6,5 eingestellt. Eine Vantage-L-Säule (Millipore Corporation) mit einem Durchmesser von 1,6 cm wurde mit 18,8 ml Source-30S-Harz (Amersham Biosciences) beschickt. Das Produkt wurde mit einer linearen Geschwindigkeit von 1 cm/Minute beladen und mit 6 Säulenvolumen Puffer (5 mM Tris, 10 mM Histidin, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5% Saccharose, 0,02% PS-80, pH 6,5) gewaschen. Der Betrieb erfolgte im Durchflussmodus, und das Sammeln des Produkts wurde gestoppt, sobald das A260-Signal den Grundlinienwert erreichte. Das Produkt wurde durch Zugabe von 0,17M Tris, 10 mM Histidin, 2,27M NaCl, 1 mM MgCl2, 5% Saccharose, 0,02% PS-80, pH 9,3-Puffer, auf Formulierungsbedingungen eingestellt. Tabelle 18 zeigt die Ausbeute für dieses Verfahren. Tabelle 18: MRKAd5gag-Ausbeutetabelle für die Ultrafiltration und den Kationenaustausch
    Probe Vol, ml AEX vp/ml Ad, vp Schrittausbeute* Gesamtausbeute
    AEP 80,6 3,96E12 3,19E14 – –
    UF2-Feed 179,5 1,77E12 3,17E14 99% 99%
    UF2-Retentat 206,9 1,26E12 2,61E14 83% 83%
    Vor CEX-Einstellung 199,1 1,18E12 2,35E14 97% 80%
    CEP 224,2 8,55E11 1,92E14 88% 71%
    Nach CEX-Einstellung 223,0 8,49E11 1,89E14 102% 72%
    • * Die Verfahrensschritte berücksichtigen die Entnahme von Proben zwischen den Schritten (nicht gezeigt).
  • BEISPIEL 15
  • Klärung von ausgefälltem Lysat durch kontinuierliche Zentrifugation – MRK Ad5pol
  • Dieses Beispiel zeigt, dass eine kontinuierliche Zentrifuge mit einem klärenden Tiefenfilter verwendet werden kann, um das ausgefällte Zelllysat zu klären. Ausgefallenes Zelllysat aus einer Ad5-Charge wurde mittels einer kontinuierlichen CARR-Pilot-Powerfuge-Zentrifuge bei einer Verweilzeit von 2 Minuten und sowohl 20000 G als auch 10000 G zentrifugiert. Der Behälter hatte ein Volumen von etwa 1 l. Das Zentrifugat wurde kontinuierlich einem CUNO-CP50-Tiefenfilter mit 0,14 LPM/ft2 mit einer Beschickung von 60 l/ft2 zugeführt. Periodisch wurden Zentrifugat- und Filtrat-Proben entnommen, um den Klärungsprozess zu überwachen. Die Adenovirusausbeuten bei der Zentrifugation betrugen über 90% bei einer Gesamtklärungsausbeute von 80%. Die Trübung des geklärten Lysats betrug weniger als 2 NTU. Das gesammelte geklärte Lysat wurde dann wie in anderen Beispielen beschrieben weiterverarbeitet, wobei ähnliche Ergebnisse in Bezug auf Rest-DNA-Entfernung, Proteinreinheit und Produkt-Infektiosität erhalten wurden.

Claims (25)

  1. Verfahren zur Reinigung von Viruspartikeln aus einem Wirtszellenlysat, umfassend selektives Ausfällen von verunreinigender DNA weg von den Viruspartikeln durch Zugabe eines selektiven Fällungsmittels zu dem nach der Lyse vorliegenden Wirtszellenkulturmedium, so dass mindestens 80 % der verunreinigenden DNA aus dem Medium, das die Viruspartikel enthält, ausgefällt werden, wobei das selektive Fällungsmittel ausgewählt ist aus PEI, Monoalkyltrimethylammoniumsalzen, Monoalkyldimethylbenzylammoniumsalzen, Dialkyldimethylammoniumsalzen, heteroaromatischen Ammoniumsalzen, bisquaternären Ammoniumsalzen und polymeren quaternären Ammoniumsalzen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das selektive Fällungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus DB, CPC, CTAB, BTC, TTA und PEI.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Viruspartikel Adenoviruspartikel sind.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das selektive Fällungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus DB, CPC, CTAB, BTC, TTA und PEI.
  5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, umfassend: a) Lysieren der Wirtszellen im Zellkulturansatz; b) selektives Ausfallen von DNA aus dem Zellkulturansatz und weg von den Adenviruspartikeln durch Zugabe des selektiven Fällungsmittels; c) Klären des Mediums, das die Adenoviruspartikel enthält; und d) Ausführen von Ultrafiltration mit dem Adenovirus enthaltenden Medium aus Schritt c), wodurch eine Population konzentrierter, gereinigter Adenoviruspartikel erhalten wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei Schritt c) mit einem Verfahren durchgeführt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Tiefenfiltration, Dead-End Filtration, Mikrofiltration, Zentrifugation oder einer Kombination hiervon.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei Schritt c) durch Tiefenfiltration ausgeführt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei Schritt c) durch die Kombination von Zentrifugation und Tiefenfiltration ausgeführt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die gereinigten Adenviruspartikel aus Schritt d) einer Kationenaustausch-Chromatographie unterworfen werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das geklärte Medium aus Schritt c) mit einer Nuklease behandelt wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, umfassend: a) Lysieren der Zellen im Zellkulturansatz; b) selektives Ausfallen von DNA aus dem Zellkulturansatz und weg von den Adenoviruspartikeln durch Zugabe des selektiven Fällungsmittels; c) Klären des Mediums, das die Adenviruspartikel enthält; d) Unterwerfen des Adenovirus enthaltenden Mediums aus Schritt c) einer Anionenaustausch-Chromatographie; und e) Diafiltration des nach Schritt d) erhaltenen, Adenvirus enthaltenden Eluats, wodurch eine Population konzentrierter, gereinigter Adenoviruspartikel erhalten wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei Schritt c) mit einem Verfahren durchgeführt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Tiefenfiltration, Dead-End Filtration, Mikrofiltration, Zentrifugation oder einer Kombination hiervon.
  13. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, umfassend: a) Lysieren der Wirtszellen im Wirtszellen-Zellkulturansatz; b) selektives Ausfüllen von Wirtszellendebris aus dem Wirtszellen-Zellkulturansatz und weg von den Adenoviruspartikeln durch Zugabe des selektiven Fällungsmittels; c) Klären des Mediums, das die Adenoviruspartikel enthält; d) Durchführen eines ersten Ultrafiltrationsverfahrens mit dem Adenovirus enthaltenden Medium aus Schritt c); e) Unterwerfen des nach Schritt d) erhaltenen, Adenovirus enthaltenden Medium einer Anionenaustausch-Chromatographie; f) Durchführen eines zweiten Ultrafiltrationsverfahrens mit dem nach Schritt e) erhaltenen, Adenovirus enthaltenden Medium; und g) gegebenenfalls Unterwerfen der Adenviruspartikel aus Schritt f) einer Kationenaustausch-Chromatographie, wodurch eine Population konzentrierter, gereinigter Adenoviruspartikel erhalten wird.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei Schritt c) mit einem Verfahren durchgeführt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Tiefenfiltration, Dead-End Filtration, Mikrofiltration, Zentrifugation oder einer Kombination hiervon.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei Schritt c) durch Tiefenfiltration ausgeführt wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei Schritt c) durch die Kombination von Zentrifugation und Tiefenfiltration ausgeführt wird.
  17. Verfahren nach Anspruch 11 oder Anspruch 13, wobei bei der Anionenaustausch-Chromatographie von Schritt d) beziehungsweise Schritt e) ein Puffer verwendet wird, der ein Detergenz beinhaltet.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Detergenz ein nicht-ionisches Tensid ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Detergenz Polysorbat-80 (PS-80) ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Konzentration von PS-80 0,1 % beträgt.
  21. Verfahren nach Anspruch 13, wobei Schritt d) eine Diafiltration in einen Puffer mit einem pH zwischen 6,5 und 8,0 umfasst.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei Schritt d) eine Diafiltration in einen Puffer, der 50 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 1M NaCl, pH 7,5 enthält, umfasst.
  23. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Puffer ferner Polysorbat-80 (PS-80) enthält.
  24. Verfahren nach Anspruch 13, wobei Schritt f) eine Diafiltration in einen Puffer, der Polysorbat-80 (PS-80) enthält, umfasst.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Puffer 5 mM Tris, 1 mM MgCl2, 75 mM NaCl, 5 % Sucrose, 0,005 % PS-80, pH 8,0 enthält.
DE60313451T 2002-05-14 2003-05-13 Verfahren zur reinigung von adenovirus Expired - Lifetime DE60313451T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38033202P 2002-05-14 2002-05-14
US380332P 2002-05-14
PCT/US2003/015061 WO2003097797A2 (en) 2002-05-14 2003-05-13 Methods of adenovirus purification

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60313451D1 DE60313451D1 (de) 2007-06-06
DE60313451T2 true DE60313451T2 (de) 2008-01-03

Family

ID=29549953

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60335672T Expired - Lifetime DE60335672D1 (de) 2002-05-14 2003-05-13 Verfahren zur reinigung von adenovirus
DE60313451T Expired - Lifetime DE60313451T2 (de) 2002-05-14 2003-05-13 Verfahren zur reinigung von adenovirus

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60335672T Expired - Lifetime DE60335672D1 (de) 2002-05-14 2003-05-13 Verfahren zur reinigung von adenovirus

Country Status (9)

Country Link
US (3) US7326555B2 (de)
EP (2) EP1506287B1 (de)
AT (2) ATE494362T1 (de)
AU (1) AU2003229060A1 (de)
DE (2) DE60335672D1 (de)
DK (1) DK1506287T3 (de)
ES (2) ES2285120T3 (de)
PT (1) PT1506287E (de)
WO (1) WO2003097797A2 (de)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60335672D1 (de) * 2002-05-14 2011-02-17 Merck Sharp & Dohme Verfahren zur reinigung von adenovirus
ES2329607T3 (es) * 2004-02-23 2009-11-27 Crucell Holland B.V. Metodos de purificacion de virus.
MX360727B (es) * 2004-06-01 2018-11-14 Genzyme Corp Composiciones y metodos para evitar la agregacion del vector aav.
AU2005305347A1 (en) * 2004-11-03 2006-05-18 Introgen Therapeutics Inc. Method of producing and purifying of adenoviral vectors
JP2008538894A (ja) * 2005-02-11 2008-11-13 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド アデノウイルス血清型２６ベクター、核酸およびそれにより製造されたウイルス
ATE412737T1 (de) * 2005-04-11 2008-11-15 Crucell Holland Bv Virusreinigung mit ultrafiltration
US7673757B2 (en) * 2006-02-17 2010-03-09 Millipore Corporation Adsorbent filter media for removal of biological contaminants in process liquids
ES2377356T3 (es) * 2006-04-20 2012-03-26 Wyeth Llc Procedimiento de purificación para el aislamiento del virus purificado de la estomatitis vesicular de un cultivo celular
EA017322B1 (ru) * 2007-06-15 2012-11-30 Амген Инк. Способы обработки сред для культур клеток, применяемых в биореакторах
DK3192874T3 (da) 2008-06-18 2019-12-16 Oxford Biomedica Ltd Virusoprensning
PL2350268T3 (pl) * 2008-11-03 2015-05-29 Crucell Holland Bv Sposób wytwarzania wektorów adenowirusowych
JP2010207800A (ja) * 2009-02-16 2010-09-24 Kuraray Co Ltd ろ過ユニットおよびこれを備えたろ過装置
ES2445713T3 (es) 2009-10-15 2014-03-04 Crucell Holland B.V. Proceso para la purificación de adenovirus a partir de cultivos de alta densidad celular
WO2011045378A1 (en) * 2009-10-15 2011-04-21 Crucell Holland B.V. Method for the purification of adenovirus particles
NZ601424A (en) 2010-02-15 2014-07-25 Crucell Holland Bv Method for the production of ad26 adenoviral vectors
BR112012026095A2 (pt) 2010-04-14 2015-09-15 Emd Millipore Corp métodos de produção de estoques de vírus de alta pureza e altos títulos e métodos de uso dos mesmos.
NZ603620A (en) 2010-07-20 2015-01-30 Bavarian Nordic As Method for harvesting expression products
TWI503411B (zh) 2010-08-11 2015-10-11 Nat Health Research Institutes Ｂ群腦膜炎球菌次單位疫苗之製造及純化
DE102010046817A1 (de) * 2010-09-28 2012-03-29 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Verfahren zur Abtrennung von Viren aus einem Kontaminanten enthaltenden flüssigen Medium
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
SG11201405228VA (en) 2012-03-12 2014-11-27 Crucell Holland Bv Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
EP2827895B1 (de) 2012-03-22 2017-08-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Impfstoff gegen rsv
US9125870B2 (en) 2012-03-22 2015-09-08 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
WO2014063125A1 (en) * 2012-10-18 2014-04-24 Innovaprep Llc Liquid to liquid biological particle fractionation and concentration
AP2015008815A0 (en) 2013-04-25 2015-10-31 Crucell Holland Bv Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides
MY171210A (en) 2013-06-17 2019-10-02 Janssen Vaccines & Prevention Bv Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
CN116656627A (zh) * 2013-07-11 2023-08-29 宝生物工程株式会社 制备无包膜病毒的方法
AU2014333884B2 (en) * 2013-10-07 2020-11-26 Seqirus UK Limited Treated filter
EP3653723B1 (de) * 2014-02-10 2022-07-20 Zymo Research Corporation Verfahren zur nukleinsäureerfassung
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
WO2016006658A1 (ja) 2014-07-10 2016-01-14 タカラバイオ株式会社 非エンベロープウイルス粒子の製造方法
CA2955877A1 (en) 2014-07-24 2016-01-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Process for the purification of poliovirus from cell cultures
CN107106689A (zh) 2014-11-05 2017-08-29 沃雅戈治疗公司 用于治疗帕金森病的aadc多核苷酸
SG11201703419UA (en) 2014-11-14 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
MX2017006216A (es) 2014-11-14 2018-08-29 Voyager Therapeutics Inc Composiciones y métodos para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ela).
EP3230441A4 (de) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung von scaav
EP3243904A4 (de) * 2015-01-09 2018-06-27 Takara Bio Inc. Verfahren zur herstellung von unbehüllten viruspartikeln
WO2016114992A2 (en) 2015-01-13 2016-07-21 Alfa Wassermann, Inc. Methods of purifying adeno-associated virus (aav) and/or recombinant adeno-associated virus (raav) and gradients and flow-through buffers therefore
EP3054007A1 (de) 2015-02-09 2016-08-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Reinigung von rekombinanten, adeno-assoziierten viren mit einem immunaffinen reinigungsschritt
EP3054006A1 (de) 2015-02-09 2016-08-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Reinigung von rekombinanten adeno-assoziierten viruspartikeln mittels mehrstufiger anionischer austauschchromatografie
SI3283634T1 (sl) 2015-04-14 2019-08-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Rekombinantni adenovirus, ki izraža dva transgena z dvosmernim promotorjem
JP7189014B2 (ja) 2015-07-07 2022-12-13 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｒｓｖに対するワクチン
EP3319634B1 (de) 2015-07-07 2019-08-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilisierte lösliche präfusionierte rsv-f-polypeptide
EP3368054A4 (de) 2015-10-28 2019-07-03 Voyager Therapeutics, Inc. Regulierbare expression unter verwendung des adeno-assoziierten virus (aav)
JP7233928B2 (ja) 2016-04-05 2023-03-07 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｒｓｖに対するワクチン
DK3439672T3 (da) 2016-04-05 2021-02-15 Janssen Vaccines & Prevention Bv Stabiliserede opløselige præfusions-rsv-f-proteiner
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11326182B2 (en) 2016-04-29 2022-05-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
KR102573534B1 (ko) 2016-05-12 2023-08-31 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 강력하고 균형 잡힌 양방향성 프로모터
SG11201809643UA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
KR102392236B1 (ko) 2016-05-18 2022-05-03 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
ES2836598T3 (es) 2016-05-30 2021-06-25 Janssen Vaccines & Prevention Bv Proteínas F de RSV prefusión estabilizadas
CN109312362B (zh) 2016-06-20 2022-06-28 扬森疫苗与预防公司 有效和平衡的双向启动子
JP7229151B2 (ja) 2016-07-14 2023-02-27 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｈｐｖワクチン
EP3831281A1 (de) 2016-08-30 2021-06-09 The Regents of The University of California Verfahren für biomedizinisches targeting und freisetzung sowie vorrichtungen und systeme zur ausführung davon
CN110168081B (zh) * 2016-11-04 2024-08-16 武田药品工业株式会社 腺相关病毒纯化方法
US10294452B2 (en) 2016-11-22 2019-05-21 Dao-Yao He Lysis, extraction and purification of adeno-associated virus and adenovirus from host cells
CN108085301B (zh) * 2016-11-22 2021-10-26 贺道耀 从宿主细胞提取和纯化腺相关病毒和腺病毒的方法及其组分和试剂盒
AU2018217935B2 (en) 2017-02-09 2020-04-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
EP3619308A4 (de) 2017-05-05 2021-01-27 Voyager Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur behandlung von morbus huntington
CA3061652A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
JP2020519663A (ja) 2017-05-17 2020-07-02 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． Ｒｓｖ感染に対する防御免疫を誘導するための方法及び組成物
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
JP7229989B2 (ja) 2017-07-17 2023-02-28 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 軌道アレイガイドシステム
KR20200044793A (ko) 2017-08-03 2020-04-29 보이저 테라퓨틱스, 인크. Aav의 전달을 위한 조성물 및 방법
SG11202001458SA (en) 2017-09-15 2020-03-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Method for the safe induction of immunity against rsv
JP7502991B2 (ja) 2017-10-16 2024-06-19 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
EP3762500A1 (de) 2018-03-06 2021-01-13 Voyager Therapeutics, Inc. Aus insektenzelle hergestellte teilweise selbstkomplementäre aav-genome
JP7048889B2 (ja) * 2018-04-16 2022-04-06 日本電信電話株式会社 バクテリア産生セルロースカーボンの製造方法
US12060583B2 (en) 2018-04-24 2024-08-13 Merck Sharp & Dohme Llc Scalable chromatography process for purification of human cytomegalovirus
CA3098565A1 (en) * 2018-04-29 2019-11-07 Claire G. ZHANG Scalable clarification process for recombinant aav production
CN112367973A (zh) 2018-05-15 2021-02-12 旗舰先锋创新V股份有限公司 融合剂脂质体组合物和其用途
US20210207167A1 (en) 2018-05-16 2021-07-08 Voyager Therapeutics, Inc. Aav serotypes for brain specific payload delivery
EP3793615A2 (de) 2018-05-16 2021-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Gerichtete entwicklung von aav zur verbesserung des tropismus für zns
EP3818161A1 (de) 2018-07-02 2021-05-12 Voyager Therapeutics, Inc. Behandlung von amyotropher lateralsklerose und rückenmarksassoziierten erkrankungen
CA3107462A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
EP3861113A1 (de) 2018-10-04 2021-08-11 Voyager Therapeutics, Inc. Verfahren zur messung des titers und der potenz von viralen vektorpartikeln
CN113613633A (zh) 2018-11-14 2021-11-05 旗舰先锋创新V股份有限公司 用于cns递送的融合剂脂质体组合物
WO2020102485A1 (en) 2018-11-14 2020-05-22 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Fusosome compositions for hematopoietic stem cell delivery
US20230043255A1 (en) 2018-11-14 2023-02-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Fusosome compositions for t cell delivery
SG11202107645RA (en) 2019-01-18 2021-08-30 Voyager Therapeutics Inc Methods and systems for producing aav particles
US20220243225A1 (en) 2019-04-29 2022-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. SYSTEMS AND METHODS FOR PRODUCING BACULOVIRAL INFECTED INSECT CELLS (BIICs) IN BIOREACTORS
GB201909081D0 (en) * 2019-06-25 2019-08-07 Psioxus Therapeutics Ltd Method
US20220290182A1 (en) 2019-08-09 2022-09-15 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
WO2021041485A1 (en) 2019-08-26 2021-03-04 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CN111394390A (zh) * 2020-03-26 2020-07-10 赛诺（深圳）生物医药研究有限公司 用于新型冠状病毒基因疫苗的批量生产重组腺病毒的方法
EP3919613B1 (de) 2020-06-05 2024-08-07 Sartorius BIA Separations d.o.o. Verbesserte reinigung von adeno-assoziiertem virus um kontaminierende dna effektiver zu entfernen
EP4192514A1 (de) 2020-08-06 2023-06-14 Voyager Therapeutics, Inc. Zellkulturmedium zur verwendung bei der herstellung von gentherapieprodukten in bioreaktoren
RU2745307C1 (ru) * 2020-12-01 2021-03-23 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ очистки рекомбинантного аденовируса 26 серотипа (Ad26)
WO2022120176A2 (en) * 2020-12-04 2022-06-09 Gritstone Bio, Inc. Compositions and methods of use thereof
IL303912A (en) * 2020-12-21 2023-08-01 Pfizer Methods and preparations for preventing excess sedimentation of nucleic acids
WO2022187548A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
EP4301768A2 (de) 2021-03-03 2024-01-10 Voyager Therapeutics, Inc. Kontrollierte expression von viralen proteinen
GB202117844D0 (en) 2021-12-09 2022-01-26 Oxford Biomedica Ltd Purification method
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
CN115747017B (zh) * 2022-10-25 2023-06-09 上海华新生物高技术有限公司 一种腺病毒纯化装置

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4064232A (en) * 1974-01-14 1977-12-20 Sandoz Ltd. Process for isolating the immunogenic components of influenza viruses
US5837520A (en) 1995-03-07 1998-11-17 Canji, Inc. Method of purification of viral vectors
JP4223550B2 (ja) * 1996-02-29 2009-02-12 タカラバイオ株式会社 ウイルスの精製および除去方法
DE69737107T2 (de) 1996-11-20 2007-07-12 Introgen Therapeutics Inc., Austin Ein verbessertes verfahren zur produktion und reinigung von adenoviralen vektoren
US6261823B1 (en) * 1996-12-13 2001-07-17 Schering Corporation Methods for purifying viruses
WO2001002607A1 (en) 1999-07-06 2001-01-11 Merck & Co., Inc. Adenovirus carrying gag gene hiv vaccine
US20020041884A1 (en) 2000-03-07 2002-04-11 Evans Robert K. Adenovirus formulations
AU2001285263A1 (en) 2000-08-25 2002-03-13 The General Hospital Corporation Selective precipitation of viruses
AU9456201A (en) 2000-09-15 2002-03-26 Merck & Co Inc Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized hiv1-gag, pol, nef and modifications
DE60335672D1 (de) * 2002-05-14 2011-02-17 Merck Sharp & Dohme Verfahren zur reinigung von adenovirus

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003097797A3 (en) 2004-02-19
EP1783212B1 (de) 2011-01-05
EP1506287A2 (de) 2005-02-16
DK1506287T3 (da) 2007-08-20
ATE494362T1 (de) 2011-01-15
ATE360683T1 (de) 2007-05-15
AU2003229060A8 (en) 2003-12-02
US20050153420A1 (en) 2005-07-14
EP1506287A4 (de) 2005-06-08
AU2003229060A1 (en) 2003-12-02
US20050196854A1 (en) 2005-09-08
ES2357366T3 (es) 2011-04-25
EP1783212A1 (de) 2007-05-09
DE60313451D1 (de) 2007-06-06
EP1506287B1 (de) 2007-04-25
DE60335672D1 (de) 2011-02-17
PT1506287E (pt) 2007-07-17
ES2285120T3 (es) 2007-11-16
WO2003097797A2 (en) 2003-11-27
US20080118970A1 (en) 2008-05-22
US7326555B2 (en) 2008-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60313451T2 (de) Verfahren zur reinigung von adenovirus
JP5393896B2 (ja) アデノウイルス粒子の精製方法
JP5465331B2 (ja) 高細胞密度の培養物からのアデノウイルスの精製方法
DE69737364T2 (de) Methoden zur virus-reinigung
DE60029195T2 (de) Verfahren zur Gewinnung von purifizierter Virenzusammensetzung
DE69737107T2 (de) Ein verbessertes verfahren zur produktion und reinigung von adenoviralen vektoren
US9750800B2 (en) Method for purifying the rabies virus
DE60128945T2 (de) Verfahren zur abtrennung von extrachromosomaler dns aus einer zellsuspension
DE69921435T2 (de) Verfahren zur Inaktivierung vom umhüllten Viren in einem Viruspräparat mit Adenoviren
EP0853123A1 (de) Reinigung von DNA durch Cross-Flow-Filtration
DE69626022T3 (de) Verfahren zur industriellen herstellung eines japanischen enkephalitis impfstoffes, und so erhaltener impfstoff
DE102011105525B4 (de) Verfahren zur Abtrennung von Biopolymer-Aggregaten und Viren aus einem Fluid
JP2018511347A (ja) ウイルス用無菌精製プロセス
DE19709186C2 (de) Filtrationsverfahren zur Trennung von Viren
DE60036226T2 (de) Verfahren zur skalierbaren reinigung von plasmid-dns
MX2011010571A (es) Metodo para purificar el virus de rabia.

Legal Events

Date Code Title Description
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: MERCK & CO., INC., RAHWAY, N.J., US

8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: MERCK SHARP & DOHME CORP., NEW JERSEY, N.J., US

R081 Change of applicant/patentee

Ref document number: 1506287

Country of ref document: EP

Owner name: SCHERING CORPORATION, US

Free format text: FORMER OWNER: MERCK SHARP & DOHME CORP., 07065-0900 RAHWAY, US

Effective date: 20121213

R082 Change of representative

Ref document number: 1506287

Country of ref document: EP

Representative=s name: ABITZ & PARTNER, DE

Effective date: 20121213