CN113613633A - 用于cns递送的融合剂脂质体组合物 - Google Patents

用于cns递送的融合剂脂质体组合物 Download PDF

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CN113613633A CN201980088528.XA CN201980088528A CN113613633A CN 113613633 A CN113613633 A CN 113613633A CN 201980088528 A CN201980088528 A CN 201980088528A CN 113613633 A CN113613633 A CN 113613633A
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G.A.冯马尔特扎恩
J.R.鲁本斯
J.V.沙
A.鲁佐马蒂亚斯
F.普奇
J.M.米尔维德
M.T.米
N.F.戈登
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Flagship Pioneering Innovations V Inc
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Abstract

本公开至少部分地提供了用于体内递送融合剂脂质体的方法和组合物。在一些实施例中，所述融合剂脂质体包括促进靶细胞特异性的元件的组合，例如融合剂、阳性靶细胞特异性调节元件以及非靶细胞特异性调节元件中的一个或多个。在一些实施例中，所述融合剂脂质体包括减少针对所述融合剂脂质体的免疫应答的一种或多种修饰。

Description

用于CNS递送的融合剂脂质体组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求以下美国临时申请的优先权：于2018年11月14日提交的题为“用于CNS细胞递送的融合剂脂质体组合物(FUSOSOME COMPOSITIONS FOR CNS CELL DELIVERY)”的62/767,358；和于2019年9月13日提交的题为“用于CNS细胞递送的融合剂脂质体组合物(FUSOSOME COMPOSITIONS FOR CNS CELL DELIVERY)”的62/900,064，所述美国临时申请的内容出于所有目的通过全文引用的方式并入。
通过引用并入序列表
本申请与序列表一起以电子格式提交。序列表以名称为186152003340SeqList.TXT的文档提供，所述文档于2019年11月14日创建，大小为819千字节。电子格式的序列表的信息以全文引用的方式并入。
背景技术
复合生物制剂是用于多种疾病的有前景的治疗候选物。然而，由于质膜充当细胞与细胞外空间之间的屏障，因此难以将大的生物制剂递送到细胞中。所属领域中需要将复合生物制剂递送到个体的细胞中的新方法。
发明内容
本公开至少部分地提供了用于体内递送融合剂脂质体的方法和组合物。在一些实施例中，所述融合剂脂质体包括促进靶细胞特异性的元件的组合，例如融合剂、阳性靶细胞特异性调节元件以及非靶细胞特异性调节元件中的一种或多种。在一些实施例中，融合剂脂质体包括减少针对融合剂脂质体的免疫应答的一种或多种修饰。
列举的实施例
1.一种融合剂脂质体，其包括：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，所述核酸包括：
(i)对外源性药剂进行编码的有效负荷基因，例如，对以下进行编码的有效负荷基因：表5和表6的外源性药剂，任选地其中所述外源性药剂在SEQ ID NO:134-154中的任一个中示出；其功能片段；或其包括与SEQ ID NO:134-154中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的功能变体；以及
(ii)与所述有效负荷基因操作性地连接的阳性靶细胞特异性调节元件(例如，靶细胞特异性启动子)，其中相对于缺乏所述阳性靶细胞特异性调节元件的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述阳性靶细胞特异性调节元件使所述有效负荷基因在靶细胞中的表达增加，其中所述靶细胞是CNS细胞。
2.根据实施例1所述的融合剂脂质体，其中所述核酸进一步包括与所述有效负荷基因操作性地连接的非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)(例如，非靶细胞特异性miRNA识别序列)，其中相对于缺乏所述NTCSRE的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述NTCSRE使所述有效负荷基因在非靶细胞中的表达降低，任选地其中所述靶细胞是第一类型的CNS细胞，并且所述非靶细胞是第二不同类型的CNS细胞或非CNS细胞，任选地其中：
所述靶细胞是神经元，并且所述非靶细胞是神经胶质细胞(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞)，或者
所述靶细胞是神经胶质细胞(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞)，并且所述非靶细胞是神经元。
3.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，所述核酸包括：
(i)对以下进行编码的有效负荷基因：外源性药剂(例如，表5和表6的外源性药剂)，任选地其中所述外源性药剂在SEQ ID NO:134-154中的任一个中示出；其功能片段；或其包括与SEQ ID NO:134-154中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的功能变体；以及
(ii)与所述有效负荷基因操作性地连接的启动子，其中所述启动子选自SYN、NSE、CaMKII、aTubulin、PDGF、fSST、fNPY、GAD67、DLX5/6、VGLUT1、Dock10、ChAT、VAChT、Drd1a、TPH-2、GFAP、EAAT1、GS、CX3CR1、TMEM119、MBP、CNP或CRFR2β启动子，例如根据表3中的启动子的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
4.一种融合剂脂质体，其包括：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，所述核酸包括：
(i)对外源性药剂进行编码的有效负荷基因，例如，对以下进行编码的有效负荷基因：表5和表6的外源性药剂，任选地其中所述外源性药剂在SEQ ID NO:134-154中的任一个中示出；其功能片段；或其包括与SEQ ID NO:134-154中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的功能变体；以及
(ii)与所述有效负荷基因操作性地连接的非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)(例如，非靶细胞特异性miRNA识别序列)，其中相对于缺乏所述NTCSRE的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述NTCSRE使所述有效负荷基因在非靶细胞或组织中的表达降低。
5.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，所述核酸包括：
(i)对外源性药剂进行编码的有效负荷基因，例如，对以下进行编码的有效负荷基因：表5和表6的外源性药剂，任选地其中所述外源性药剂在SEQ ID NO:134-154中的任一个中示出；其功能片段；或其包括与SEQ ID NO:134-154中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的功能变体；以及
(ii)与所述有效负荷基因操作性地连接的阴性靶细胞特异性调节元件(阴性TCSRE)(例如，组织特异性miRNA识别序列)，其中相对于缺乏所述阴性TCSRE的在其它方面类似的核酸，所述阴性TCSRE使所述外源性药剂在非靶细胞或组织中的表达降低。
6.根据实施例4或5所述的融合剂脂质体，其中所述核酸进一步包括与所述有效负荷基因操作性地连接的阳性靶细胞特异性调节元件(例如，靶细胞特异性启动子)，其中相对于缺乏所述阳性靶细胞特异性调节元件的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述阳性靶细胞特异性调节元件使所述有效负荷基因在靶细胞中的表达增加，任选地其中所述靶细胞是第一类型的CNS细胞，任选地其中所述非靶细胞是第二不同类型的CNS细胞或非CNS细胞，任选地其中：
所述靶细胞是神经元，并且所述非靶细胞是神经胶质细胞(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞)，或者
所述靶细胞是神经胶质细胞(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞)，并且所述非靶细胞是神经元。
7.一种融合剂脂质体，其包括：
a)脂质双层，所述脂质双层包括融合剂；
b)核酸，所述核酸包括对外源性药剂进行编码的有效负荷基因，例如，对以下进行编码的有效负荷基因：表5和表6的外源性药剂，任选地其中所述外源性药剂在SEQ ID NO:134-154中的任一个中示出；其功能片段；或其包括与SEQ ID NO:134-154中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的功能变体；以及
c)以下中的一种或两种：
(i)所述脂质双层上的第一外源性或过度表达的免疫抑制蛋白；或
(ii)第一免疫刺激蛋白，所述第一免疫刺激蛋白不存在或以相比于由在其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在。
8.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中发生以下中的一项或多项：
i)所述融合剂脂质体与靶细胞融合的速率高于与非靶细胞融合的速率，例如高至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
ii)所述融合剂脂质体与靶细胞融合的速率高于另一种融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
iii)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率融合；
iv)所述融合剂脂质体使所述核酸(例如逆转录病毒核酸)递送到靶细胞的速率高于递送到非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
v)所述融合剂脂质体使所述核酸(例如逆转录病毒核酸)递送到靶细胞的速率高于另一种融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；或
vi)所述融合剂脂质体以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率将所述核酸(例如逆转录病毒核酸)递送到靶细胞。
9.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中以下中的一项或多项(例如，2项或所有3项)适用：所述融合剂脂质体是逆转录病毒载体，所述脂质双层被包膜(例如，病毒包膜)包括，以及所述核酸是逆转录病毒核酸。
10.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸包括以下核酸序列中的一种或多种(例如，全部)：5'LTR(例如包括U5并且缺乏功能U3结构域)、Psi封装元件(Psi)、与所述有效负荷基因操作性地连接的中心多嘌呤段(cPPT)启动子、有效负荷基因(任选地包括位于开放阅读框之前的内含子)、Poly A尾序列、WPRE和3'LTR(例如，包括U5并且缺乏功能U3)。
11.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其包括以下中的一种或多种(例如，全部)：聚合酶(例如逆转录酶，例如pol或其一部分)、整合酶(例如pol或其一部分，例如功能或非功能变体)、基质蛋白(例如gag或其一部分)、衣壳蛋白(例如gag或其一部分)、核衣壳蛋白(例如gag或其一部分)以及蛋白酶(例如pro)。
12.根据实施例7所述的融合剂脂质体，其包括(i)和(ii)。
13.根据实施例7到12中任一项所述的融合剂脂质体，其还包含所述脂质双层上的第二外源性或过度表达的免疫抑制蛋白。
14.根据实施例7到13中任一项所述的融合剂脂质体，其进一步包括第二免疫刺激蛋白，所述第二免疫刺激蛋白不存在或以相比于由在其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在。
15.根据实施例7到14中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸(例如，逆转录病毒载体)进一步包括与所述有效负荷基因操作性地连接的阳性靶细胞特异性调节元件(例如，靶细胞特异性启动子)，其中相对于缺乏所述阳性靶细胞特异性调节元件的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述阳性靶细胞特异性调节元件使所述有效负荷基因在靶细胞中的表达增加，其中所述靶细胞是CNS细胞。
16.根据实施例7到15中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸(例如，逆转录病毒核酸)进一步包括与所述有效负荷基因操作性地连接的非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)(例如，非靶细胞特异性miRNA识别序列)，其中相对于缺乏所述NTCSRE的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述NTCSRE使所述有效负荷基因在非靶细胞或组织中的表达降低，任选地其中所述靶细胞是第一类型的CNS细胞，并且所述非靶细胞是第二不同类型的CNS细胞或非CNS细胞，任选地其中：
所述靶细胞是神经元，并且所述非靶细胞是神经胶质细胞(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞)，或者
所述靶细胞是神经胶质细胞(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞)，并且所述非靶细胞是神经元。
17.根据实施例7到15中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸(例如，逆转录病毒核酸)进一步包括与所述有效负荷基因操作性地连接的阴性靶细胞特异性调节元件(阴性TCSRE)(例如，组织特异性miRNA识别序列)，其中相对于缺乏所述阴性TCSRE的在其它方面类似的核酸(例如，逆转录病毒核酸)，所述阴性TCSRE使所述外源性药剂在非靶细胞或组织中的表达降低。
18.根据实施例7到17中任一项所述的融合剂脂质体，其中，当施用受试者(例如，人类受试者或小鼠)时，以下中的一个或多个：
i)所述融合剂脂质体不产生可检测到的抗体应答(例如在单次施用或多次施用之后)，或针对所述融合剂脂质体的抗体以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在，例如通过FACS抗体检测分析，例如实例13或实例14的分析)；
ii)所述融合剂脂质体不产生可检测到的细胞免疫应答(例如T细胞应答、NK细胞应答或巨噬细胞应答)，或针对所述融合剂脂质体的细胞免疫应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在，例如通过PBMC溶解分析(例如实例5的分析)、NK细胞溶解分析(例如实例6的分析)、CD8杀手T细胞溶解分析(例如实例7的分析)或巨噬细胞吞噬分析(例如实例8的分析)；
iii)所述融合剂脂质体不产生可检测到的先天性免疫应答，例如补体活化(例如单次施用或多次施用之后)，或针对所述融合剂脂质体的先天性免疫应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在，例如通过补体活性分析(例如实例9的分析)；
iv)低于10％、5％、4％、3％、2％或1％的融合剂脂质体被血清灭活，例如通过血清灭活分析，例如实例11或实例12的分析；
v)已从所述融合剂脂质体接受所述外源药剂的靶细胞不产生可检测到的抗体应答(例如在单次施用或多次施用之后)，或针对所述靶细胞的抗体以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在，例如通过FACS抗体检测分析，例如实例15的分析；或
vi)已从所述融合剂脂质体接受所述外源药剂的靶细胞不产生可检测到的细胞免疫应答(例如T细胞应答、NK细胞应答或巨噬细胞应答)，或针对所述靶细胞的细胞应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在，例如通过巨噬细胞吞噬分析(例如实例16的分析)、PBMC溶解分析(例如实例17的分析)、NK细胞溶解分析(例如实例18的分析)或CD8杀手T细胞溶解分析(例如实例19的分析)。
19.根据实施例18所述的融合剂脂质体，其中所述背景水平是同一个体在施用所述融合剂脂质体之前的对应水平。
20.根据实施例7到19中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述免疫抑制蛋白(例如，第一免疫抑制蛋白或第二免疫抑制蛋白)是补体调节蛋白或CD47。
21.根据实施例7到20中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述免疫刺激蛋白(例如，第一免疫刺激蛋白或第二免疫刺激蛋白)是MHC I(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E或HLA-G)或MHC II(例如，HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ或HLA-DR)蛋白质。
22.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述外源性药剂选自：SYNE1、SETX、FMR1、SLC6A8、UBE3A、SOD1、TDP43、C9orf72、FXN、MECP2、ASPA或ALDH7A1；或者所述外源性药剂选自：TPP1、FUCA1、GALC、HEXA、HEXB、MANBA、ARSA、GNPTAB或MCOLN1。
23.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂包括VSV-G。
24.根据实施例1、2、6、15、22或23中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述阳性靶细胞特异性调节元件包括CNS细胞特异性启动子、CNS细胞特异性增强子、CNS细胞特异性剪接位点、延长RNA或蛋白质的半衰期的CNS细胞特异性位点、CNS细胞特异性mRNA核输出促进位点、CNS细胞特异性翻译增强位点或CNS细胞特异性翻译后修饰位点。
25.根据实施例1、2、6、15或22到24中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述阳性靶细胞特异性调节元件包括CNS细胞特异性启动子。
26.根据实施例25所述的融合剂脂质体，其中所述CNS细胞特异性启动子包括表3的基序。
27.根据实施例25或26所述的融合剂脂质体，其中所述阳性CNS细胞特异性调节元件包括选自以下的启动子：SYN、NSE、CaMKII、aTubulin、PDGF、fSST、fNPY、GAD67、DLX5/6、VGLUT1、Dock10、ChAT、VAChT、Drd1a、TPH-2、GFAP、EAAT1、GS、CX3CR1、TMEM119、MBP、CNP或CRFR2β启动子。
28.根据实施例4到6或16到21中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述负向TCSRE或NTCSRE包含非靶细胞特异性miRNA识别序列、非靶细胞特异性蛋白酶识别位点、非靶细胞特异性泛素连接酶位点、非靶细胞特异性转录抑制位点或非靶细胞特异性表观遗传抑制位点。
29.根据实施例4到6、16到21或28中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述负向TCSRE或NTCSRE包含组织特异性miRNA识别序列、组织特异性蛋白酶识别位点、组织特异性泛素连接酶位点、组织特异性转录抑制位点或组织特异性表观遗传抑制位点。
30.根据实施例4到6、16到21、28或29中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述阴性TCSRE或NTCSRE包括非靶细胞特异性miRNA识别序列、非靶细胞特异性蛋白酶识别位点、非靶细胞特异性泛素连接酶位点、非靶细胞特异性转录抑制位点或非靶细胞特异性表观遗传抑制位点。
31.根据实施例4到6、16到21或28到30中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述阴性TCSRE或NTCSRE包括由表4的miRNA(例如，miR-338-3p、miR-9、miR-125b-5p、miR-342-3p或miR-124中的一个或多个(例如，两个或更多个))结合的非靶细胞特异性miRNA识别序列，任选地其中所述miRNA是或包括SEQ ID NOS:156-162中的任一个中所示的序列。
32.根据实施例28到31中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述阴性TCSRE或NTCSRE位于转录区域(例如，对所述外源性药剂进行编码的所述转录区域)内或在所述转录区域内编码，例如使得由所述转录区域产生的RNA包括UTR或编码区域内的所述miRNA识别序列。
33.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸(例如，逆转录病毒核酸)包括一个或多个隔离元件。
34.根据实施例33所述的融合剂脂质体，其中所述核酸，例如逆转录病毒核酸包含两个隔离元件，例如所述有效负载基因上游的第一隔离元件和所述有效负载基因下游的第二隔离元件，例如其中所述第一隔离元件和所述第二隔离元件包含相同或不同的序列
35.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其不具有遗传毒性或不增加靶细胞的肿瘤形成速率。
36.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸，例如逆转录病毒核酸能够整合到靶细胞的基因组中。
37.根据实施例36所述的融合剂脂质体，其中所述核酸(例如，逆转录病毒核酸)是具有整合能力的慢病毒或整合缺陷型慢病毒。
38.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞选自CNS细胞、泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞。
39.根据实施例4到6和9到38中任一项所述的融合剂脂质体，其中发生以下中的一项或多项：
i)可检测到地存在于所述受试者中的低于10％、5％、4％、3％、2％或1％的所述外源性药剂处于非靶细胞中；
ii)所述受试者中的可检测到地包括所述外源性药剂的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％细胞是靶细胞(例如，单一细胞类型的细胞)；
iii)所述受试者中的可检测到地包括所述外源性药剂的细胞中低于1,000,000、500,000、200,000、100,000、50,000、20,000或10,000个细胞是非靶细胞；
iv)所述个体的所有靶细胞中的所述外源药剂的平均水平是所述个体的所有非靶细胞中的所述外源药剂的平均水平的至少100倍、200倍、500倍或1,000倍；或
v)所述受试者的任何非靶细胞中均检测不到所述外源性药剂。
40.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸(例如，逆转录病毒核酸)对阳性TCSRE和/或NTCSRE或阴性TCSRE进行编码。
41.根据前述实施例中任一项的融合剂脂质体，其中所述核酸(例如，逆转录病毒核酸)包括阳性TCSRE和/或NTCSRE或阴性TCSRE的补体。
42.根据实施例40或41所述的融合剂脂质体，其中所述阳性TCSRE包括靶细胞特异性启动子，与非靶细胞相比，所述靶细胞特异性启动子在靶细胞中具有至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、750％、1000％或更多活性。
43.根据实施例40到42中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述阴性TCSRE或NTCSRE包括miRNA识别序列，所述miRNA识别序列使非靶细胞中的基因表达相较于靶细胞降低至少10％、25％、50％、75％或100％。
44.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其不将核酸(例如，逆转录病毒核酸)递送到非靶细胞(例如，神经元、神经胶质细胞、抗原呈递细胞、II类MHC+细胞、专门的抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓性树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞或非癌细胞)。
45.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中低于10％、5％、2.5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％或0.000001％的非靶细胞类型(例如，神经元、神经胶质细胞、抗原呈递细胞、II类MHC+细胞、专门的抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓性树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞或非癌细胞中的一个或多个)包括核酸(例如，逆转录病毒核酸)，例如使用定量PCR，例如使用实例1的分析。
46.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞的每个宿主细胞基因组包括核酸(例如，逆转录病毒核酸或其一部分)的0.00001-10、.0001-10、.001-10、.01-10、.1-10、.5-5、1-4、1-3或1-2个拷贝，例如其中在体内施用之后评估所述核酸(例如，逆转录病毒核酸)的拷贝数。
47.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
小于10％、5％、2.5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％的非靶细胞(例如，神经元、神经胶质细胞、抗原呈递细胞、II类MHC+细胞、专门的抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓性树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞，或非癌细胞)包括所述外源性药剂；或
外源性药剂(例如，蛋白质)在非靶细胞(例如，神经元、神经胶质细胞、抗原呈递细胞、II类MHC+细胞、专门的抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓性树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞或非癌细胞)中检测不到。
48.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体将所述核酸(例如，逆转录病毒核酸)递送到靶细胞(例如，CNS细胞、泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞)。
49.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中至少0.00001％、0.0001％、0.001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞(例如，CNS细胞、泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞中的一个或多个)包括核酸(例如，逆转录病毒核酸)，例如使用定量PCR，例如使用实例3的分析。
50.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中至少0.00001％、0.0001％、0.001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞(例如，CNS细胞、泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞)包括所述外源性药剂。
51.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用后，包括所述核酸(例如，逆转录病毒核酸)的靶细胞与包括所述核酸(例如，逆转录病毒核酸)的非靶细胞的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据定量PCR分析，例如使用实例1和实例3的分析。
52.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞中的核酸(例如，逆转录病毒核酸)或其一部分的平均拷贝数与非靶细胞中的核酸(例如，逆转录病毒核酸)或其一部分的平均拷贝数的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据定量PCR分析，例如使用实例1和实例3的分析。
53.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞中的核酸(例如，逆转录病毒核酸)或其一部分的中值拷贝数与非靶细胞中的核酸(例如，逆转录病毒核酸)或其一部分的中值拷贝数的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据定量PCR分析，例如使用实例1和实例3的分析。
54.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中包括外源性RNA药剂的靶细胞与包括所述外源性RNA药剂的非靶细胞的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据逆转录定量PCR分析。
55.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞的平均外源性RNA药剂水平与非靶细胞的平均外源性RNA药剂水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据逆转录定量PCR分析。
56.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞的中值外源性RNA药剂水平与非靶细胞的中值外源性RNA药剂水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据逆转录定量PCR分析。
57.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中包括外源性蛋白质药剂的靶细胞与包括所述外源性蛋白质药剂的非靶细胞的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据FACS分析，例如使用实例2和实例4的分析。
58.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞的平均外源性蛋白质药剂水平与非靶细胞的平均外源性蛋白质药剂水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据FACS分析，例如使用实例2和实例4的分析。
59.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞的中值外源性蛋白质药剂水平与非靶细胞的中值外源性蛋白质药剂水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据FACS分析，例如使用实例2和实例4的分析。
60.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其包括以下中的一种或两种：
i)所述脂质双层(例如包膜)上的外源性免疫抑制蛋白或过度表达的免疫抑制蛋白；以及
(ii)免疫刺激蛋白，所述免疫刺激蛋白不存在或以相比于由在其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在。
61.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其包含以下中的一种或多种：
i)所述脂质双层(例如包膜)上的第一外源性免疫抑制蛋白或过度表达的免疫抑制蛋白，以及所述脂质双层(例如包膜)上的第二外源性免疫抑制蛋白或过度表达的免疫抑制蛋白；
ii)所述脂质双层(例如包膜)上的第一外源性或过度表达的免疫抑制蛋白，以及不存在或与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平(例如降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的第二免疫刺激性蛋白质；或
ⅲ)不存在的或与由在其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平(例如降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的第一免疫刺激蛋白，以及不存在的或与由在其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平(例如降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的第二免疫刺激蛋白。
62.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体在施用于受试者之后，在循环系统中存在至少0.5、1、2、3、4、6、12、18、24、36或48小时。
63.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在30分钟。
64.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在1小时。
65.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在2小时。
66.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在4小时。
67.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在8小时。
68.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在12小时。
69.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在18小时。
70.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在24小时。
71.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在36小时。
72.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在48小时。
73.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，在所述融合剂脂质体一次或多次施用于适当的动物模型(例如本文所描述的动物模型)之后，与参考融合剂脂质体，例如在其它方面类似于融合剂脂质体的未经修饰的融合剂脂质体相比，所述融合剂脂质体具有减少的免疫原性，如根据体液应答的减少所测量。
74.根据实施例73所述的融合剂脂质体，其中根据抗细胞抗体效价，例如抗逆转录病毒抗体效价，例如通过ELISA，测量出血清样品中的体液应答减少。
75.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中与施用未经修饰的细胞的来自受试者的血清样品相比，施用所述融合剂脂质体的来自动物的所述血清样品的抗融合剂脂质体抗体效价减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
76.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中施用所述融合剂脂质体的来自受试者的血清样品具有增加的抗细胞抗体效价，例如从基线增加了1％、2％、5％、10％、20％、30％或40％，例如其中基线是指施用所述融合剂脂质体之前的来自同一受试者的血清样品。
77.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
待施用所述融合剂脂质体或包括所述融合剂脂质体的药物组合物的所述受试者具有或已知具有或经测试具有对所述融合剂脂质体具有反应性的预先存在的抗体(例如IgG或IgM)；
待施用所述融合剂脂质体的所述个体并不具有对所述融合剂脂质体具有反应性的预先存在抗体的可检测到的水平；
已接受所述融合剂脂质体或包含所述融合剂脂质体的药物组合物的个体具有或已知具有或经测试具有对所述融合剂脂质体具有反应性的抗体(例如IgG或IgM)；
已接受所述融合剂脂质体或包含所述融合剂脂质体的药物组合物(例如至少一次、两次、三次、四次、五次或更多次)的所述个体并不具有对所述融合剂脂质体具有反应性的抗体的可检测到的水平；或
抗体水平在两个时间点之间升高不超过1％、2％、5％、10％、20％或50％，第一时间点是在第一次施用所述融合剂脂质体之前，而第二时间点是在一次或多次施用所述融合剂脂质体之后。
78.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体是通过实例5、6或7的方法，例如由经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞产生。
79.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中与由NMC或NMC-空白载体产生的融合剂脂质体相比，在特定时间点，由NMC-HLA-G细胞产生的融合剂脂质体具有减小的溶解百分比，例如PBMC介导的溶解、NK细胞介导的溶解和/或CD8+T细胞介导的溶解。
80.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述经修饰的融合剂脂质体规避了巨噬细胞的吞噬。
81.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体是通过实例8的方法，例如由经CD47 cDNA转染的细胞产生。
82.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中当巨噬细胞与来源于NMC-CD47的融合剂脂质体一起培育，相对于与来源于NMC或NMC-空白载体的那些融合剂脂质体一起培育时，吞噬指数降低。
83.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，与参考融合剂脂质体，例如其它方面与所述融合剂脂质体类似的未经修饰的融合剂脂质体相比，所述融合剂脂质体的巨噬细胞吞噬减少，例如巨噬细胞吞噬减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中巨噬细胞吞噬的所述减少是通过分析体外吞噬指数来确定，例如如实例8中所描述。
84.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中当在巨噬细胞吞噬的体外分析中与巨噬细胞一起培育时，所述融合剂脂质体组合物具有0、1、10、100或更大的吞噬指数，例如如根据实例8的分析所测量。
85.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其经修饰且与未经修饰的融合剂脂质体相比具有降低的补体活性。
86.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其是通过实例9的方法，例如由经对补体调节蛋白(例如DAF)进行编码cDNA转染的细胞产生。
87.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中与对应小鼠血清(例如HEK-293DAF小鼠血清)一起培育的所述经修饰的融合剂脂质体(例如HEK293-DAF)的存在200pg/ml C3a时的融合剂脂质体剂量大于与对应小鼠血清(例如HEK293小鼠血清)一起培育的参考融合剂脂质体(例如HEK293逆转录病毒载体)。
88.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中与未处理小鼠血清一起培育的所述经修饰的融合剂脂质体(例如HEK293-DAF)的存在200pg/ml C3a时的融合剂脂质体剂量大于与未处理小鼠血清一起培育的所述参考融合剂脂质体(例如HEK293逆转录病毒载体)。
89.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中根据实例9的分析，在施用之后30分钟，所述融合剂脂质体对患者血清中的补体介导灭活具有抗性。
90.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体对补体介导灭活具有抗性。
91.根据实施例86到90中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述补体调节蛋白包括结合加速衰减因子(DAF，CD55)的一种或多种蛋白质，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)，例如C4b结合蛋白(C4BP)，例如补体受体1(CD35)，例如膜辅因子蛋白质(MCP，CD46)，例如保护素(CD59)，例如抑制经典和旁路补体途径CD/C5转化酶的蛋白质，例如调节MAC组装的蛋白质。
92.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其是通过实例10的方法，例如由经对靶向shRNA的I类MHC进行编码的DNA转染的细胞产生，例如其中与NMC和NMC载体对照相比，来源于I类NMC-shMHC的逆转录病毒载体具有降低的I类MHC表达。
93.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中融合剂脂质体的免疫原性的量度是血清灭活，例如如本文所描述(例如如实例11中所描述)测量的血清灭活。
94.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在已与血清和来自未经融合剂脂质体处理的小鼠的热灭活血清一起培育的融合剂脂质体样品之间，接受所述外源性药剂的细胞的百分比没有差异。
95.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在已与来自未经融合剂脂质体处理的小鼠的血清一起培育的融合剂脂质体样品与无血清对照培育之间，接受所述外源性药剂的细胞的所述百分比没有差异。
96.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中已与阳性对照血清一起培育的融合剂脂质体样品中的接受所述外源性药剂的细胞的百分比小于已与未经融合剂脂质体处理的小鼠的血清一起培育的融合剂脂质体样品。
97.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在多次(例如，超过一次，例如2次或更多次)施用经修饰的融合剂脂质体之后，所述经修饰的融合剂脂质体，例如通过本文所描述的方法修饰，具有降低(例如，与未经修饰的融合剂脂质体施用相比的降低)的血清灭活。
98.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中本文所描述的融合剂脂质体在多次施用之后，不被血清灭活。
99.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在多次施用之后所述融合剂脂质体的免疫原性量度为血清灭活，例如在如本文所描述测量的多次施用之后的血清灭活，例如如实例12中所描述。
100.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在已和血清和来自用经修饰的(例如，HEK293-HLA-G)融合剂脂质体处理的小鼠的热灭活血清一起培育的融合剂脂质体样品之间，接受所述外源性药剂的细胞的所述百分比没有差异。
101.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在来自用经修饰的(例如，HEK293-HLA-G)融合剂脂质体处理1、2、3、5或10次的小鼠的已经培育的融合剂脂质体样品之间，接受所述外源性药剂的细胞的所述百分比没有差异。
102.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在来自经媒剂处理的小鼠和来自用经修饰的(例如，HEK293-HLA-G)融合剂脂质体处理的小鼠的已与血清一起培育的融合剂脂质体样品之间，接受所述外源性药剂的细胞的百分比没有差异。
103.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中对于来源于参考细胞(例如HEK293)的融合剂脂质体来说，接受所述外源性药剂的细胞的所述百分比小于经修饰的(例如HEK293-HLA-G)融合剂脂质体。
104.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中融合剂脂质体的免疫原性量度是抗体应答。
105.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受本文所描述的融合剂脂质体的受试者具有结合到并且识别融合剂脂质体的预先存在的抗体，例如如本文所描述测量，例如如实例13中所描述。
106.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来自未经融合剂脂质体处理的小鼠的血清展示的信号(例如荧光)强于阴性对照，例如来自IgM和IgG耗竭的小鼠的血清，例如表明已出现免疫原性。
107.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来自未经融合剂脂质体处理的小鼠的血清展示的信号(例如荧光)类似于阴性对照，例如表明未出现可检测的免疫原性。
108.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其为经修饰的融合剂脂质体，例如通过本文所述的方法修饰，并且其在多次(例如，超过一次，例如2次或更多次)施用所述经修饰的融合剂脂质体之后，具有降低的(例如，与施用未经修饰的融合剂脂质体相比降低的)体液应答，例如如本文所描述测量，例如如实例14中所描述。
109.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体是通过实例5、6、7或14的方法，例如由经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞产生。
110.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中通过测定抗融合剂脂质体抗体(例如IgM、IgG1和/或IgG2抗体)的水平的值来评估体液应答。
111.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中与对照物(例如NMC融合剂脂质体或无NMC融合剂脂质体)相比，经修饰的(例如NMC-HLA-G)融合剂脂质体在注射之后的抗病毒IgM或IgG1/2抗体效价减小(例如如根据FACS荧光强度所测量)。
112.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中抗体应答不靶向接受者细胞，或抗体应答将低于参考水平，例如如本文所描述测量，例如如实例15中所描述。
113.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来自经融合剂脂质体处理的小鼠和经PBS处理的小鼠的接受者细胞的信号(例如平均荧光强度)类似。
114.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞的免疫原性量度是巨噬细胞应答。
115.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中巨噬细胞不靶向接受者细胞，或以低于参考水平靶向接受者细胞。
116.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来源于经融合剂脂质体处理的小鼠和经PBS处理的小鼠的接受者细胞的吞噬指数类似，例如如本文所描述测量，例如如实例16中所描述。
117.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞的免疫原性量度是PBMC应答。
118.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞并不诱发PBMC应答。
119.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来源于经融合剂脂质体处理的小鼠和经PBS处理的小鼠的接受者细胞中的CD3+/CMG+细胞百分比类似，例如如本文所描述测量，例如如实例17中所描述。
120.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞的免疫原性量度是自然杀手细胞应答。
121.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞并不诱发自然杀手细胞应答或诱发较低的自然杀手细胞应答，例如低于参考值。
122.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来源于经融合剂脂质体处理的小鼠和经PBS处理的小鼠的接受者细胞中的CD3+/CMG+细胞百分比类似，例如如本文所描述测量，例如如实例18中所描述。
123.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞的免疫原性量度是CD8+T细胞应答。
124.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞并不诱发CD8+T细胞应答或诱发较低的CD8+T细胞应答，例如低于参考值。
125.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来源于经融合剂脂质体处理的小鼠和经PBS处理的小鼠的接受者细胞中的CD3+/CMG+细胞百分比类似，例如如本文所描述测量，例如如实例19中所描述。
126.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂是重新靶向融合剂。
127.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其包括对以下中的一种或两种进行编码的核酸，例如逆转录病毒核酸：(i)与对外源性药剂进行编码的核酸操作性地连接的阳性靶细胞特异性调节元件；或(ii)与对所述外源性药剂进行编码的所述核酸操作性地连接的非靶细胞特异性调节元件或阴性TCSRE。
128.一种药物组合物，其包括根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
129.一种将外源性药剂递送到受试者(例如，人类受试者)的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施例1到127中任一项所述的融合剂脂质体或根据实施例128所述的药物组合物，由此将所述外源性药剂递送到所述受试者。
130.一种调节在受试者(例如，人类受试者)中、靶组织或靶细胞(例如，CNS细胞，例如神经元或神经胶质细胞)中的功能的方法，所述方法包括使所述受试者的所述靶组织或所述靶细胞与根据实施例1到127中任一项所述的融合剂脂质体或根据实施例128所述的药物组合物接触，例如施用于所述受试者。
131.根据实施例130所述的方法，其中所述靶组织或所述靶细胞存在于受试者中。
132.一种治疗受试者(例如，人类受试者)的基因缺陷的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施例1到127中任一项所述的融合剂脂质体或根据实施例128所述的药物组合物。
133.根据实施例132所述的方法，其中所述基因缺陷为表5或表6的基因缺陷。
134.根据实施例132或133所述的方法，其中所述基因缺陷是能够由对所述外源性药剂进行编码的所述有效负荷基因治疗的基因缺陷。
135.根据实施例132到134中任一项所述的方法，其中所述基因缺陷与CNS疾病或病症或溶酶体疾病或病症相关，其中所述方法治疗所述CNS疾病或病症或溶酶体疾病或病症。
136.根据实施例135所述的方法，其中所述CNS疾病或病症或溶酶体疾病或病症是脊髓小脑性共济失调；常染色体隐性1型；共济失调伴眼球运动失用2型；脆性X综合征；脑肌酸缺乏综合征1；快乐木偶综合征；(Angelman Syndrome)肌萎缩性脊髓侧索硬化症；弗里德赖希共济失调(Friedreich's Ataxia)；雷特综合征(Rett Syndrome)；卡纳万病(CanavanDisease)；吡哆醇依赖性癫痫；贝敦氏病(Batten Disease)；岩藻糖苷贮积症；克拉伯病(Krabbe Disease)；戴萨克斯病(Tay Sachs Disease)；山德霍夫氏病(SandhoffDisease)；β-甘露糖苷贮积症；异染性脑白质营养不良；粘多糖症IIIa型；粘多糖症IIIb型；或粘多糖症IV型。
137.根据实施例1到127中任一项所述的融合剂脂质体或根据实施例128所述的药物组合物，其用于治疗患有基因缺陷的受试者(例如，人类受试者)。
138.一种根据实施例1到127中任一项所述的融合剂脂质体或根据实施例128所述的药物组合物的用途，其用于制造用于治疗患有基因缺陷的受试者(例如，人类受试者)的药物。
139.根据实施例137所述的供使用的融合剂脂质体或药物组合物或根据实施例138所述的用途，其中所述融合剂脂质体包括对用于治疗所述基因缺陷的外源性药剂进行编码的有效负荷基因。
140.根据实施例137或139所述的供使用的融合剂脂质体或药物组合物或根据实施例138或139所述的用途，其中所述基因缺陷与CNS疾病或病症或溶酶体疾病或病症相关，其中所述方法治疗所述CNS疾病或病症或溶酶体疾病或病症。
141.根据实施例137、139或140所述的供使用的融合剂脂质体或药物组合物或根据实施例138、139或140所述的用途，其中所述CNS疾病或病症或溶酶体疾病或病症是脊髓小脑性共济失调；常染色体隐性1型；共济失调伴眼球运动失用2型；脆性X综合征；脑肌酸缺乏综合征1；快乐木偶综合征；肌萎缩性脊髓侧索硬化症；弗里德赖希共济失调；雷特综合征；卡纳万病；吡哆醇依赖性癫痫；贝敦氏病；岩藻糖苷贮积症；克拉伯病；戴萨克斯病；山德霍夫氏病；β-甘露糖苷贮积症；异染性脑白质营养不良；粘多糖症IIIa型；粘多糖症IIIb型；或粘多糖症IV型。
142.一种制备根据实施例1到127中任一项所述的融合剂脂质体的方法，所述方法包括：
a)提供包括核酸(例如，逆转录病毒核酸)和融合剂的细胞；
b)在允许所述融合剂脂质体产生的条件下培养所述细胞，以及
c)从所述细胞中分离、富集或纯化所述融合剂脂质体，从而制备所述融合剂脂质体。
本发明的其它特征、目标和优势将在具体实施方式和附图以及权利要求书中显而易见。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文所提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献以全文引用的方式并入。举例来说，本文中(例如本文的任何表中)所提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列都以引用的方式并入。除非另外说明，否则本文中(包括本文的任何表中)所指定的序列登录号均指截至2018年5月15日的当前数据库条目。当一种基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变异体。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并且并不意欲是限制性的。
附图说明
当结合附图阅读时将更好地理解本发明的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在本文所描述的图式中示出了某些实施例，其为当前示例的。然而，应理解，本发明不限于图式中示出的实施例的精确布置和手段。
图1定量了对于F-肌动蛋白，用染料对融合剂脂质体的染色。
图2是示出在3、5和24小时的时段内，融合剂脂质体和亲本细胞对聚合酶肌动蛋白的能力的图示。
图3是示出根据NTA和显微法所测量的融合剂脂质体和亲本细胞的大小分布统计的表。
图4是示出融合剂脂质体和亲本细胞的平均大小和体积的表。
图5是一系列图，示出了对于融合剂脂质体或细胞制剂所观察到的可溶物:不溶物比率。
图6是一系列图，示出了MvH(CD8)+F融合剂脂质体与靶细胞或非靶细胞的融合和靶向融合的绝对量。
图7是示出VSV-G融合剂脂质体中的2-NBDG平均荧光强度的图。
图8是示出VSV-G融合剂脂质体的胞质溶胶中的酯酶活性的图。
图9A-9B是一系列图，示出了通过生物发光成像在小鼠中检测到的由融合剂脂质体递送的Cre重组酶。(A)静脉内融合剂脂质体处理的小鼠(1×和3×浓度)的暴露的肝脏和脾脏的腹侧图像和发光信号叠加图。下部部分是单独的发光信号。(B)靶向融合剂脂质体的脾脏和肝脏的总通量信号；y刻度为log10刻度。在处理后72小时，用3×浓度的融合剂脂质体处理进行处理的小鼠在脾脏中的信号显著大于背景(p＝0.0004)。
图10A-10B是一系列图，示出了通过生物发光成像检测到的融合剂脂质体对鼠类肝脏和脾脏的Cre重组酶。(A)从左到右；在安乐死的5分钟内收集和成像的切除的肝脏、心脏、肺、肾脏、小肠、胰脏和脾脏的背侧图像和发光信号叠加图。下部部分是单独的发光信号。(B)靶向融合剂脂质体的脾脏和肝脏以及其它组织的总通量信号；y刻度为log10刻度。相比于具有最低信号的组织(心脏)，用3×浓度的融合剂脂质体处理进行处理的小鼠在脾脏中的信号明显更大(p<0.0001)。
图11是示出通过NivG+F融合剂脂质体经由非内吞途径的Cre货物递送的表。
图12是示出融合剂脂质体和亲本细胞中通过二喹啉甲酸分析测量的GAPDH:总蛋白比率的图示。
图13是示出融合剂脂质体和亲本细胞中通过二喹啉甲酸分析测量的脂质:蛋白质比率的图示。
图14是示出融合剂脂质体和亲本细胞中通过二喹啉甲酸分析测量的蛋白质:DNA比率的图示。
图15是示出融合剂脂质体和亲本细胞中通过二喹啉甲酸分析测量的脂质:DNA比率的图示。
图16是示出外泌体和融合剂脂质体中的外泌体标记CD63的蛋白质水平的图示。
图17是示出融合剂脂质体和亲本细胞中检测到的钙联蛋白信号的强度的图示。
图18是示出针对融合剂脂质体和亲本细胞确定的脂质:DNA比率的图示。
图19A-19B是一系列图示，示出了亲本细胞、外泌体和融合剂脂质体中呈总脂质的百分比形式的脂质物中的比例。
图20是一系列图示，示出了相对于与特定区室相关的蛋白质，亲本细胞、外泌体和融合剂脂质体的蛋白质含量，如所指示。
图21是一系列图示，示出了亲本细胞、外泌体和融合剂脂质体中呈总蛋白质含量的百分比形式的ARRDC1(左图)或TSG101(右图)的水平。
具体实施方式
本公开至少部分地提供了用于体内递送融合剂脂质体的方法和组合物。在一些实施例中，所述融合剂脂质体包括促进靶细胞特异性的元件的组合，例如重新靶向融合剂、阳性靶细胞特异性调节元件以及非靶细胞特异性调节元件中的一种或多种。在一些实施例中，融合剂脂质体包括减少针对融合剂脂质体的免疫应答的一种或多种修饰。
I.定义
除非另外说明，否则权利要求书和说明书中所使用的术语定义如下。
如本文所用，“可检测到地存在”当在外源药剂可检测到地存在的上下文中使用时，意指外源药剂本身可检测到地存在。举例来说，如果外源药剂是蛋白质，则外源蛋白质药剂能够可检测到地存在，不论编码其的核酸是否可检测到地存在或不存在。
如本文所用，“融合剂脂质体”是指两亲脂质的双层，其包封内腔或空腔以及与两亲脂质双层相互作用的融合剂。在实施例中，融合剂脂质体包含核酸。在一些实施例中，融合剂脂质体是膜包封的制剂。在一些实施例中，融合剂脂质体来源于源细胞。
如本文所用，“融合剂脂质体组合物”是指包含一种或多种融合剂脂质体的组合物。
如本文所用，“融合剂”是指在两个膜封闭的内腔之间产生相互作用的药剂或分子。在实施例中，融合剂促进膜的融合。在其它实施例中，融合剂使两个内腔(例如逆转录病毒载体的内腔和靶细胞的细胞质)之间产生连接，例如孔。在一些实施例中，融合剂包含两种或更多种蛋白质的复合物，例如其中两种蛋白质都不具有单独的融合活性。在一些实施例中，融合剂包含靶向域。
如本文所用，“隔离元件”是指阻断增强子或阻止异染色质展开的核苷酸序列。隔离元件可以是野生型或突变体。
如本文所用，术语“有效量”是指足以显著地且积极地改善待治疗的症状和/或病状(例如得到积极的临床应答)的药物组合物的量。药物组合物中使用的活性成分的有效量将随以下因素而变：所治疗的特定病状、病状的严重程度、治疗的持续时间、并行疗法的性质、所采用的一种或多种特定活性成分、所利用的特定的药学上可接受的一种或多种赋形剂和/或一种或多种载剂，以及主治医师了解且擅长的类似因素。
如本文中提及病毒、VLP或融合剂脂质体时所用的“外源药剂”是指由对应野生型源细胞产生的对应野生型病毒或融合剂即不包含、也不编码的药剂。在一些实施例中，外源药剂并非天然地存在，如序列相对于天然存在的蛋白质改变(例如插入、缺失或取代)的蛋白质或核酸。在一些实施例中，外源药剂并非天然地存在于源细胞中。在一些实施例中，外源药剂天然地存在于源细胞中，但对于病毒来说是外源的。在一些实施例中，外源药剂并非天然地存在于接受者细胞中。在一些实施例中，外源药剂天然地存在于接受者细胞中，但不以所期望的水平或所期望的时间存在。在一些实施例中，外源药剂包含RNA或蛋白质。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的赋形剂、组合物和/或剂型。
如本文所使用，“启动子”是指在可操作地连接到基因编码序列时驱动基因转录的顺式调节DNA序列。启动子可以包含转录因子结合位点。在一些实施例中，启动子与在基因远侧的一种或多种增强子协同作用。
如本文所用，“正向靶细胞特异性调节元件”(或正向TCSRE)是指相较于非靶细胞，使靶细胞中的外源药剂水平增加的核酸序列，其中编码外源药剂的核酸可操作地连接到正向TCSRE。在一些实施例中，正向TCSRE是功能核酸序列，例如正向TCSRE可以包含启动子或增强子。在一些实施例中，正向TCSRE编码功能RNA序列，例如正向TCSRE可以编码促进靶细胞中的RNA正确剪接的剪接位点。在一些实施例中，正向TCSRE编码功能蛋白序列，或正向TCSRE可以编码促进蛋白质发生正确的翻译后修饰的蛋白质序列。在一些实施例中，正向TCSRE使外源药剂下调剂或抑制剂的水平或活性降低。
如本文所用，“负向靶细胞特异性调控元件”(或负向TCSRE)是指相较于靶细胞，使非靶细胞中的外源药剂水平降低的核酸序列，其中编码外源药剂的核酸可操作地连接到负向TCSRE。在一些实施例中，负向TCSRE是功能核酸序列，例如促使非靶细胞中的逆转录病毒核酸降解或抑制的miRNA识别位点。在一些实施例中，核酸序列编码功能RNA序列，例如核酸编码miRNA序列，所述miRNA序列存在于编码外源蛋白质药剂的mRNA中，使得mRNA在非靶细胞中被降解或抑制。在一些实施例中，负向TCSRE使外源药剂下调剂或抑制剂的水平或活性降低。
如本文所用，“非靶细胞特异性调控元件”(或NTCSRE)是指相较于靶细胞，使外源药剂在非靶细胞中的水平降低的核酸序列，其中编码外源药剂的核酸可操作地连接到NTCSRE。在一些实施例中，NTCSRE是功能核酸序列，例如促使非靶细胞中的逆转录病毒核酸被降解或抑制的miRNA识别位点。在一些实施例中，核酸序列编码功能RNA序列，例如核酸编码miRNA序列，所述miRNA序列存在于编码外源蛋白质药剂的mRNA中，使得mRNA在非靶细胞中被降解或抑制。在一些实施例中，NTCSRE使外源药剂下调剂或抑制剂的水平或活性降低。术语“阴性TCSRE”和“NTCSRE”在本文中可互换地使用。
如本文所用，“非CNS细胞特异性调节元件”是指非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)，其中靶细胞是CNS细胞。因此，非CNS细胞特异性调节元件是指与CNS细胞相比降低非CNS细胞中的外源性药剂的水平的核酸序列，其中编码外源性药剂的核酸与非CNS细胞特异性调节元件可操作地连接。
如本文所用，“重新靶向融合剂”是指包括靶向部分的融合剂，所述靶向部分的序列不是融合剂的天然存在形式的一部分。在实施例中，融合剂包含相对于融合剂的天然存在形式中的靶向部分不同的靶向部分。在实施例中，融合剂的天然存在形式缺乏靶向域，并且再靶向融合剂包含融合剂的天然存在形式中不存在的靶向部分。在实施例中，融合剂经修饰而包含靶向部分。在实施例中，相对于融合剂的天然存在形式，融合剂包含位于靶向部分外部(例如在跨膜域、融合活性域或细胞质域中)的一个或多个序列变化。
如本文所用，“逆转录病毒核酸”是指单独或与辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒组合的核酸，所述核酸至少含有用于封装于逆转录病毒或逆转录病毒载体中所需的最小序列。在一些实施例中，逆转录病毒核酸还包含或编码外源药剂、正向靶细胞特异性调节元件、非靶细胞特异性调节元件或负向TCSRE。在一些实施例中，逆转录病毒核酸包含以下中的一种或多种(例如全部)：5'LTR(例如，促进整合)、U3(例如，活化病毒基因组RNA转录)、R(例如，Tat结合区)、U5、3'LTR(例如，促进整合)、封装位点(例如，psi(Ψ))、RRE(例如，结合到Rev并促进核输出)。逆转录病毒核酸可以包含RNA(例如，当成为病毒粒子的一部分时)或DNA(例如，当引入源细胞中时或在接受者细胞中逆转录之后)。在一些实施例中，使用包含gag、pol和env中的一种或多种(例如全部)的辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒封装逆转录病毒核酸。
如本文所用，“靶细胞”是指期望外源性药剂被融合剂脂质体(例如慢病毒载体)递送到的类型的细胞。在实施例中，靶细胞是特定组织类型或类别的细胞，例如CNS细胞，例如神经元或神经胶质细胞。在一些实施例中，靶细胞是病变细胞，例如癌细胞。在一些实施例中，融合剂，例如再靶向融合剂(单独或与正向TCSRE、NTCSRE、负向TCSRE或其任何组合来组合)使外源药剂优先递送到靶细胞(相较于非靶细胞)。
如本文所用，“非靶细胞”是指不期望外源药剂被慢病毒载体递送到的类型的细胞。在一些实施例中，非靶细胞是特定组织类型或类别的细胞。在一些实施例中，非靶细胞是非病变细胞，例如非癌细胞。在一些实施例中，融合剂，例如再靶向融合剂(单独或与正向TCSRE、NTCSRE、负向TCSRE或其任何组合来组合)使外源药剂递送到非靶细胞低于递送到靶细胞。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指改善疾病或病症，例如减缓或遏制或减少疾病或病症的发展，例如病症或其至少一种临床症状的根本原因。
如本文所用，“细胞生物物质”是指包含内腔和细胞膜的细胞的一部分，或具有部分或完全核灭活的细胞。在一些实施例中，细胞生物物质包含细胞骨架组分、细胞器和核糖体中的一个或多个。在实施例中，细胞生物物质为去核细胞、微囊泡或细胞影。
II.融合剂脂质体，例如细胞源性融合剂脂质体
融合剂脂质体可以采用各种形式。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体来源于源细胞。融合剂脂质体可以是或包括例如细胞外囊泡、微囊泡、纳米囊泡、外泌体、细胞凋亡体(来自凋亡细胞)、微米颗粒(可以来源于例如血小板)、核外粒体(可来源于例如血清中的嗜中性粒细胞和单核细胞)、前列腺体(可获自前列腺癌细胞)、心脏体(可来源于心肌细胞)，或其任何组合。在一些实施例中，融合剂脂质体天然地从源细胞中释放，并且在一些实施例中，对源细胞进行处理以增强融合剂脂质体的形成。在一些实施例中，融合剂脂质体的直径在约10-10,000nm之间，例如直径在约30-100nm之间。在一些实施例中，融合剂脂质体包括一种或多种合成脂质。
在一些实施例中，融合剂脂质体是或包括病毒，例如逆转录病毒，例如慢病毒。举例来说，在一些实施例中，两亲脂质的融合剂脂质体双层是或包括病毒包膜。病毒包膜可以包括融合剂，例如病毒内源性融合剂或假型化融合剂。在一些实施例中，融合剂脂质体的内腔或空腔包含病毒核酸，例如逆转录病毒核酸，例如慢病毒核酸。病毒核酸可以是病毒基因组。在一些实施例中，所述融合剂脂质体的空腔或内腔中进一步包括一种或多种病毒非结构蛋白。
融合剂脂质体可以具有促进将有效负载荷递送到靶细胞的各种特性。举例来说，在一些实施例中，融合剂脂质体和源细胞一起包括足以制备可以与靶细胞融合的颗粒的一种或多种核酸。在实施例中，这些一种或多种核酸编码具有以下活性中的一种或多种(例如全部)的蛋白质：gag多聚蛋白活性、聚合酶活性、整合酶活性、蛋白酶活性和融合剂活性。
融合剂脂质体还可以包括有助于将有效负载递送到靶细胞的各种结构。举例来说，在一些实施例中，融合剂脂质体和源细胞一起包括足以制备可以与靶细胞融合的颗粒的一种或多种核酸。在实施例中，这些一种或多种核酸编码具有以下活性中的一种或多种(例如全部)的蛋白质：gag多聚蛋白活性、聚合酶活性、整合酶活性、蛋白酶活性和融合剂活性。
融合剂脂质体还可以包括有助于将有效负载递送到靶细胞的各种结构。举例来说，在一些实施例中，融合剂脂质体(例如病毒，例如逆转录病毒，例如慢病毒)包含以下蛋白质中的一种或多种(例如全部)：gag多聚蛋白、聚合酶(例如pol)、整合酶(例如功能或非功能变异体)、蛋白酶和融合剂。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含rev。在一些实施例中，前述蛋白质中的一种或多种是在逆转录病毒基因组中编码，并且在一些实施例中，前述蛋白质中的一种或多种以反式提供，例如通过辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)包含以下核酸序列中的一种或多种(例如全部)：5'LTR(例如包含U5并且缺乏功能U3域)、Psi封装元件(Psi)、可操作地连接到有效负载基因的中心多嘌呤段(cPPT)启动子、有效负载基因(任选地包含位于开放阅读框之前的内含子)、Poly A尾序列、WPRE和3'LTR(例如包含U5并且缺乏功能U3)。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)还包含一个或多个隔离元件。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)还包含一个或多个miRNA识别位点。在一些实施例中，一个或多个miRNA识别位点位于poly A尾序列的下游，例如介于poly A尾序列与WPRE之间。
在一些实施例中，本文所提供的融合剂脂质体施用于个体，例如哺乳动物，例如人类。在此类实施例中，受试者可能处于特定疾病或病状(例如本文所描述的疾病或病状)的风险中，可能具有所述疾病或病状的症状，或可能被诊断患有或鉴别患有所述疾病或病状。在一个实施例中，受试者具有基因缺陷，如在表5或表6中所列出的任何基因缺陷。在一些实施例中，融合剂脂质体含有编码用于治疗所述疾病或病状的外源性药剂的核酸序列，如用于治疗基因缺陷。
A.由病毒产生的融合剂脂质体。
举例来说，在一些实施例中，融合剂脂质体(例如病毒，例如逆转录病毒，例如慢病毒)包括以下蛋白质中的一种或多种(例如全部)：gag多聚蛋白、聚合酶(例如pol)、整合酶(例如功能或非功能变体)、蛋白酶和融合剂。在一些实施例中，融合剂脂质体进一步包括rev。在一些实施例中，前述蛋白质中的一种或多种是在逆转录病毒基因组中编码，并且在一些实施例中，前述蛋白质中的一种或多种以反式提供，例如通过辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)包含以下核酸序列中的一种或多种(例如全部)：5'LTR(例如包含U5并且缺乏功能U3域)、Psi封装元件(Psi)、可操作地连接到有效负载基因的中心多嘌呤段(cPPT)启动子、有效负载基因(任选地包含位于开放阅读框之前的内含子)、Poly A尾序列、WPRE和3'LTR(例如包含U5并且缺乏功能U3)。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)还包含一个或多个隔离元件。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)还包含一个或多个miRNA识别位点。在一些实施例中，一个或多个miRNA识别位点位于poly A尾序列的下游，例如介于poly A尾序列与WPRE之间。
i)慢病毒组分和辅助细胞
在一些实施例中，逆转录病毒核酸包括以下中的一种或多种(例如全部)：5'启动子(例如控制完整封装的RNA的表达)、5'LTR(例如包含R(聚腺苷酸化尾信号)和/或U5，所述U5包含引物活化信号)、引物结合位点、psi封装信号、用于核输出的RRE元件、直接位于转基因上游以控制转基因表达的启动子、转基因(或其它外源性药剂元件)、多嘌呤段和3'LTR(例如包含突变U3、R和U5)。在一些实施例中，逆转录病毒核酸进一步包括cPPT、WPRE和/或隔离元件中的一种或多种。
逆转录病毒典型地通过将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝来复制并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。适用于特定实施例中的说明性逆转录病毒包含(但不限于)：莫洛尼鼠(Moloney murine)白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠(Harvey murine)肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗兰德鼠(Friend murine)白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus；RSV)以及慢病毒。
在一些实施例中，逆转录病毒是γ逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是ε逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是α逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是β逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是δ逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是慢病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是唾液逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是内源性逆转录病毒。
说明性慢病毒包括(但不限于)：人免疫缺陷病毒(HIV；包括HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus；VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(caprinearthritis-encephalitis virus；CAEV)；马传染性贫血病毒(equine infectious anemiavirus；EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一些实施例中，使用基于HIV的载体主链(即，HIV顺式作用序列元件)。
在一些实施例中，本文中的载体是能够转移或输送另一种核酸分子的核酸分子。所转移的核酸通常连接到载体核酸分子，例如插入载体核酸分子中。载体可以包括在细胞中引导自主复制的序列，或可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘质粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。
病毒载体可以包含例如包括病毒来源的核酸元件的核酸分子(例如转移质粒)，所述核酸元件典型地促进核酸分子的转移或整合到细胞基因组中或介导核酸转移的病毒颗粒中。除了一种或多种核酸之外，病毒颗粒还将典型地包括各种病毒组分并且有时还包括宿主细胞组分。病毒载体可以包含例如能够将核酸转移到细胞中或已转移的核酸(例如作为裸DNA)的病毒或病毒颗粒。病毒载体和转移质粒可以包含主要来源于病毒的结构和/或功能基因元件。逆转录病毒载体可以包含含有主要来源于逆转录病毒的结构和功能基因元件或其一部分的病毒载体或质粒。慢病毒载体可以包含含有结构和功能基因元件或其一部分(包括主要来源于慢病毒的LTR)的病毒载体或质粒。
在实施例中，慢病毒载体(例如慢病毒表达载体)可以包含慢病毒转移质粒(例如作为裸DNA)或感染性慢病毒颗粒。关于如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等元件，应理解，这些元件的序列可以RNA形式存在于慢病毒颗粒中并且可以DNA形式存在于DNA质粒中。
在本文所描述的一些载体中，对复制有贡献或为复制所必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分相较于对应野生型病毒可能不存在。这使得病毒载体出现复制缺陷。在一些实施例中，载体能够转导靶标非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。
野生型逆转录病毒基因组的结构通常包含5'长末端重复序列(LTR)和3'LTR，其间或其内部定位了能够封装基因组的封装信号、引物结合位点、能够整合到宿主细胞基因组内的整合位点，以及编码促进病毒颗粒组装的封装组件的gag、pol和env基因。更复杂的逆转录病毒具有其它特征，例如HIV中的rev和RRE序列，其能够使整合的原病毒的RNA转录物从细胞核有效地输出到被感染的靶细胞的细胞质中。在原病毒中，病毒基因的两端侧接称为长末端重复(LTR)的区域。LTR涉及原病毒整合和转录。LTR还充当增强子-启动子序列并且可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化是借助于位于病毒基因组5'端的psi序列发生。
LTR本身是通常相似(例如一致)的序列，其可以分成三种元件，称为U3、R和U5。U3来源于RNA的3'端独有的序列。R来源于RNA两端重复的序列并且U5来源于RNA的5'端独有的序列。三种元件的大小在不同逆转录病毒之间可以显著不同。
对于病毒基因组来说，转录起始位点典型地位于一个LTR中的U3与R之间的边界处，并且poly(A)添加(终止)位点位于另一LTR中的R与U5之间的边界处。U3含有原病毒的大部分转录控制元件，包括启动子和多个增强子序列(响应于细胞的并且在一些情况下病毒的转录活化蛋白质)。一些逆转录病毒包含对涉及调节基因表达的蛋白质进行编码的以下基因中的任一种或多种：tot、rev、tax和rex。
关于结构基因gag、pol和env本身，gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白以蛋白水解方式处理成熟蛋白质MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码含有DNA聚合酶、相关核糖核酸酶H和整合酶(IN)的逆转录酶(RT)，其介导基因组复制。env基因编码病毒粒子的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，其形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合物。这个相互作用促进感染，例如病毒膜与细胞膜的融合。
在复制缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以不存在或无功能。RNA两端的R区通常是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组的5'和3'端处的独有序列。
逆转录病毒还可以含有除gag、pol和env之外的编码蛋白质的其它基因。其它基因的实例包括(在HIV中)vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef中的一种或多种。EIAV具有(除其它以外)其它基因S2。由其它基因编码的蛋白质发挥不同功能，其中一些可以是细胞蛋白所提供的功能的重复。在EIAV中，例如，tat充当病毒LTR的转录活化因子(Derse和Newbold1993《病毒学(Virology)》194:530-6；Maury等人，1994《病毒学》200:632-42)。其结合到稳定的茎环RNA二级结构，称为TAR。Rev通过rev应答元件(RRE)来调节并协调病毒基因的表达(Martarano等人，1994《病毒学杂志(J.Virol.)》68:3102-11)。这两种蛋白质的作用机理被认为广泛类似于灵长类动物病毒的类似机理。另外，已鉴别出由tat的第一外显子编码的EIAV蛋白Ttm，所述第一外显子与位于跨膜蛋白起点的env编码序列剪接。
除蛋白酶、逆转录酶和整合酶之外，非灵长类动物慢病毒还含有编码脱氧尿苷三磷酸酶的第四种pol基因产物。这可以对这些慢病毒感染某些非分裂细胞类型或缓慢分裂细胞类型的能力发挥作用。
在实施例中，重组慢病毒载体(RLV)是具有足够的逆转录病毒基因信息的载体，以允许RNA基因组在封装组分存在下封装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中。靶细胞的感染可以包含逆转录以及整合到靶细胞基因组中。RLV通常携有通过载体递送到靶细胞的非病毒编码序列。在实施例中，RLV不能独立复制以在靶细胞内产生感染性逆转录病毒颗粒。RLV通常缺乏功能gag-pol和/或env基因和/或涉及复制的其它基因。载体可以配置为分裂内含子载体，例如如PCT专利申请WO 99/15683中所描述，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，慢病毒载体包含最小病毒基因组，例如病毒载体已经操纵以便去除非必需元件并保留必需元件以便提供感染、转导和递送所关注核苷酸序列到靶宿主细胞所需的功能，例如如WO 98/17815中所描述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
最小的慢病毒基因组可以包含例如(5')R-U5-一个或多个第一核苷酸序列-U3-R(3')。然而，用于在源细胞内产生慢病毒基因组的质粒载体还可以包括转录调节控制序列，所述转录调节控制序列可操作地连接到慢病毒基因组以引导所述基因组在源细胞中的转录。这些调节序列可以包含与已转录的逆转录病毒序列有关的天然序列，例如5'U3区域，或其可以包含异源启动子，如另一种病毒启动子，例如CMV启动子。一些慢病毒基因组包含其它序列以促进病毒高效产生。举例来说，在HIV的情况下，可以包括rev和RRE序列。替代地或组合，可以使用密码子优化，例如编码外源药剂的基因可以是密码子优化的，例如如WO 01/79518中所描述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。还可以使用与rev/RRE系统执行类似或相同功能的替代序列。举例来说，在梅森辉瑞(Mason Pfizer)猴病毒中发现了rev/RRE系统的功能类似物。这称为CTE并且在基因组中包含RRE型序列，所述RRE型序列被认为与被感染的细胞中的因子相互作用。细胞因子可以被认为是rev类似物。因此，CTE可以用作rev/RRE系统的替代物。另外，HTLV-I的Rex蛋白可以在功能上替换HIV-I的Rev蛋白。Rev和Rex具有与IRE-BP类似的效应。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸(例如慢病毒核酸，例如灵长类动物或非灵长类动物慢病毒核酸)(1)包含缺失的gag基因，其中gag缺失使位于gag编码序列的核苷酸约350或354下游的一个或多个核苷酸去除；(2)不存在来自逆转录病毒核酸的一个或多个辅助基因；(3)缺乏tat基因，但包括介于5'LTR的末端与gag的ATG之间的前导序列；以及(4)(1)、(2)和(3)的组合。在一个实施例中，慢病毒载体包含特征(1)和(2)以及(3)的全部。这种策略更详细地描述于WO 99/32646中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，对载体产生来说或对于分裂和非分裂细胞的转导来说，灵长类动物慢病毒最小系统不需要额外的HIV/SIV基因vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef。在一些实施例中，对于载体产生来说或对于分裂和非分裂细胞的转导来说，EIAV最小载体系统不需要S2。
其它基因的缺失可以容许产生不含与慢病毒(例如HIV)感染疾病有关的基因的载体。具体地说，tat与疾病有关。第二，其它基因的缺失容许载体封装较大异源性的DNA。第三，功能未知的基因(如S2)可以省去，从而降低引起非期望效应的风险。最小慢病毒载体的实例公开于WO 99/32646和WO 98/17815中。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸至少缺乏tat和S2(如果其是EIAV载体系统)，并且还可能缺乏vif、vpr、vpx、vpu和nef。在一些实施例中，逆转录病毒核酸还缺乏rev、RRE或两者。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸包含vpx。Vpx多肽结合到SAMHD1限制因子并诱导SAMHD1限制因子降解，其使细胞质中的游离dNTP降解。因此，随着Vpx使SAMHD1降解并且逆转录活性增强，细胞质中的游离dNTP的浓度增加，从而促进逆转录病毒基因组的逆转录并整合到靶细胞基因组中。
不同的细胞在其特定密码子的利用率方面不同。这种密码子偏倚对应于细胞类型中的特定tRNA的相对丰度的偏倚。通过改变序列中的密码子以便定制其以与对应tRNA的相对丰度匹配，有可能增加表达。同样，可以通过有意选择密码子来减少表达，所述密码子的对应tRNA在特定细胞类型中已知是罕见的。从而能达到额外程度的翻译控制。密码子优化的其它描述见于例如WO 99/41397中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
许多病毒(包括HIV和其它慢病毒)使用许多罕见密码子，并且通过改变这些密码子以对应于常用的哺乳动物密码子，可以实现使封装组分在哺乳动物生产细胞中的表达增加。
密码子优化还有许多其它优点。编码封装组分的核苷酸序列凭借其序列的变化而可以减少或排除来自其的RNA不稳定性序列(INS)。同时，保留了封装组分的氨基酸序列编码序列，使得所述序列所编码的病毒组分保持相同或至少充分相似，以便封装组分的功能不受损。在一些实施例中，密码子优化还克服了针对输出的Rev/RRE要求，从而使得优化的序列Rev独立。在一些实施例中，密码子优化还减少了载体系统内的不同构建体之间(例如gag-pol和env开放阅读框中的重叠区域之间)的同源重组。在一些实施例中，密码子优化引起病毒效价增加和/或安全性提高。
在一些实施例中，对仅与INS有关的密码子进行密码子优化。在其它实施例中，对序列整体进行密码子优化，但涵盖gag-pol的框移位点的序列除外。
gag-pol基因包含编码gag-pol蛋白质的两个重叠阅读框。两种蛋白质的表达取决于翻译期间的框移。这种框移是作为翻译期间核糖体“滑移”的结果发生。这种滑移被认为至少部分地由核糖体中止的RNA二级结构引起。此类二级结构存在于gag-pol基因中的框移位点的下游。对于HIV来说，重叠区域从gag起点(核苷酸1是gag ATG中的A)下游的核苷酸1222延伸到gag的末端(nt 1503)。因此，跨越两个阅读框的框移位点和重叠区域的281bp片段优选不进行密码子优化。在一些实施例中，保留这个片段将能够使gag-pol蛋白质的表达更有效。对于EIAV来说，重叠的起点位于nt 1262(其中核苷酸1是gag ATG中的A)处。重叠的末端位于nt 1461处。为了确保框移位点和gag-pol重叠得以保留，可以保留从nt 1156到1465的野生型序列。
可以根据最优密码子使用进行衍生，例如以便容纳适宜的限制位点，并且可以将保守的氨基酸变化引入gag-pol蛋白质中。
在一些实施例中，密码子优化是基于哺乳动物系统中的密码子使用不良的密码子。可以改变第三碱基，并且有时可以改变第二和第三碱基。
由于遗传密码的简并性质，因此应了解，熟练的工作人员可以实现许多gag-pol序列。此外，所描述许多逆转录病毒变异体可以用作产生密码子优化的gag-pol序列的起点。慢病毒基因组可以是相当可变的。举例来说，HIV-I存在许多仍具有功能的准物种。EIAV也是如此。这些变异体可以用于增强转导过程的特定部分。HIV-I变异体的实例可以在LosAlamos国家实验室维护的HIV数据库中找到。EIAV克隆的详细信息可以在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)维护的NCBI数据库中找到。
gag-pol序列的密码子优化策略可以结合任何逆转录病毒使用，例如EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-I和HIV-2。另外，这种方法可以用于增加HTLV-I、HTLV-2、HFV、HSRV和人类内源性逆转录病毒(HERV)、MLV和其它逆转录病毒的基因的表达。
如上文所描述，逆转录病毒载体的封装组分可以包括gag、pol和env基因的表达产物。另外，封装可以利用4个茎环的短序列，继之为来自gag和env的部分序列作为封装信号。因此，缺失的gag序列纳入逆转录病毒载体基因组中(除封装构建体上的完整gag序列之外)可以加以使用。在实施例中，逆转录病毒载体包含封装信号，所述封装信号在仍保留env序列的载体中包含gag的255到360个核苷酸，或在剪接供体突变、gag和env缺失的特定组合中包含gag的约40个核苷酸。在一些实施例中，逆转录病毒载体包括包含一个或多个缺失的gag序列，例如gag序列包含可来源于N端的约360个核苷酸。
逆转录病毒载体、辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒可以包含逆转录病毒结构和辅助蛋白质，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef蛋白质或其它逆转录病毒蛋白质。在一些实施例中，逆转录病毒蛋白质来源于相同逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒蛋白质来源于超过一种逆转录病毒，例如2、3、4或更多种逆转录病毒。
gag和pol编码序列在原生慢病毒中通常被组构为Gag-Pol前体。gag序列编码55kD的Gag前体蛋白，也称为p55。p55在成熟过程期间被病毒编码的蛋白酶4(pol基因的产物)分裂成四种较小蛋白质，命名为MA(基质[p17])、CA(衣壳[p24])、NC(核衣壳[p9])和p6。pol前体蛋白被病毒编码的蛋白酶分裂而脱离Gag，并且还被消化而分离出蛋白酶(p10)、RT(p50)、核糖核酸酶H(p15)和整合酶(p31)活性。
原生Gag-Pol序列可以用于辅助载体(例如辅助质粒或辅助病毒)，或可以产生修饰。这些修饰包括嵌合Gag-Pol，其中Gag和Pol序列从不同病毒(例如不同物种、亚种、病毒株、分枝系等)获得，和/或其中所述序列已经修饰以改进转录和/或翻译，和/或减少重组。
在不同实例中，逆转录病毒核酸包括编码gag蛋白的150-250(例如168)核苷酸部分的多核苷酸，其(i)包括突变的INS1抑制性序列，相对于野生型INS1，其减少RNA核输出的限制；(ii)含有导致框移和过早终止的两个核苷酸插入；和/或(iii)不包括gag的INS2、INS3和INS4抑制性序列。
在一些实施例中，本文所描述的载体是既包含逆转录病毒(例如慢病毒)序列又包含非慢病毒序列的杂合载体。在一些实施例中，杂交载体包含用于逆转录、复制、整合和/或封装的逆转录病毒(例如慢病毒)序列。
根据某些特定实施例，大多数或全部病毒载体主链序列来源于慢病毒，例如HIV-1。然而，应理解，可以使用多种不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，或某些慢病毒序列可以容纳大量取代和变化的组合而不损害转移载体执行本文所描述功能的能力。多种慢病毒载体描述于Naldini等人(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人(1997)；Dull等人，1998，美国专利第6,013,516号；以及第5,994,136号中，其中多者可适于产生逆转录病毒核酸。
在原病毒的每一端处通常发现长末端重复(LTR)。LTR通常包含位于逆转录病毒核酸末端的域，在其天然序列的背景下，其是直接重复并且含有U3、R和U5区域。LTR通常促进逆转录病毒基因的表达(例如基因转录物的启动、起始和聚腺苷酸化)和病毒复制。LTR可以包含大量调节信号，包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号以及用于复制和整合病毒基因组的序列。病毒LTR通常分成三个区域，称为U3、R和U5。U3区域通常含有增强子和启动子元件。U5区域通常是引物结合位点与R区域之间的序列并且可以含有聚腺苷酸化序列。R(重复序列)区域可以与U3和U5区域侧接。LTR通常是由U3、R和U5区域组成，并且可以存在于病毒基因组的5'和3'端。在一些实施例中，与5'LTR相邻的是用于基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和用于病毒RNA有效封装到颗粒中(Psi位点)的序列。
封装信号可以包含位于逆转录病毒基因组内的序列，所述序列介导病毒RNA插入病毒衣壳或颗粒内，参见例如Clever等人，1995，《病毒学杂志》，第69卷，第4期；第2101-2109页。若干逆转录病毒载体使用最小封装信号(psi[Ψ]序列)进行病毒基因组的衣壳化。
在不同实施例中，逆转录病毒核酸包含经修饰的5'LTR和/或3'LTR。LTR中的任一种或两种可以包含一个或多个修饰，包括(但不限于)一个或多个缺失、插入或取代。通常对3'LTR进行修饰，以便通过使病毒变成复制缺陷型(例如病毒不能够完成有效复制，从而不产生感染性病毒粒子(例如复制缺陷型慢病毒子代))来改进慢病毒或逆转录病毒系统的安全性。
在一些实施例中，载体是自失活型(SIN)载体，例如复制缺陷型载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，其中右(3')LTR增强子-启动子区(称为U3区)已经修饰(例如缺失或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。这是因为右(3')LTR U3区可以用作左(5')LTRU3区在病毒复制期间的模板并且因此，U3增强子-启动子的缺乏抑制了病毒复制。在实施例中，对3'LTR进行修饰，使得U5区被去除、改变或经例如外源poly(A)序列置换。3'LTR、5'LTR，或3'与5'LTR可以是经修饰的LTR。
在一些实施例中，5'LTR的U3区经异源启动子置换以在病毒颗粒产生期间驱动病毒基因组转录。可以使用的异源启动子的实例包括例如病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如即刻早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。在一些实施例中，启动子能够以Tat非依赖性方式驱动高水平的转录。在某些实施例中，异源启动子在控制病毒基因组转录方式方面具有额外优势。举例来说，异源启动子可以是诱导型的，使得全部或部分病毒基因组的转录仅在诱导因子存在时发生。诱导因子包括(但不限于)一种或多种化合物或培养宿主细胞的生理条件，如温度或pH。
在一些实施例中，病毒载体包含TAR(反式活化应答)元件，例如位于慢病毒(例如HIV)LTR的R区域中。这种元件与慢病毒反式活化因子(tat)基因元件相互作用以增强病毒复制。然而，这种元件并非必需的，例如在5'LTR的U3区域被异源启动子置换的实施例中。
R区域，例如逆转录病毒LTR内的区域，其始于封端基团的起点(即，转录起点)并且随即在poly A段的起点前终止，可以与U3和U5区域侧接。R区域发挥了在逆转录期间将新生DNA从基因组的一端转移到另一端的作用。
逆转录病毒核酸还可以包含FLAP元件，例如其序列包括逆转录病毒(例如HIV-1或HIV-2)的中心多嘌呤段和中心终止序列(cPPT和CTS)的核酸。适合的FLAP元件描述于美国专利第6,682,907号以及Zennou等人，2000，《细胞(Cell)》，101:173中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在HIV-1逆转录期间，中心多嘌呤段(cPPT)处的正链DNA的中心起始和中心终止序列(CTS)处的中心终止可以引起三链DNA结构的形成：HIV-1中心DNA瓣。在一些实施例中，逆转录病毒或慢病毒载体主链包含位于编码外源药剂的基因上游或下游的一个或多个FLAP元件。举例来说，在一些实施例中，转移质粒包括FLAP元件，例如从HIV-1衍生或分离的FLAP元件。
在实施例中，逆转录病毒或慢病毒核酸包含一个或多个输出元件，例如顺式作用转录后调节元件，其调节RNA转录物从细胞核向细胞质的输送。RNA输出元件的实例包括(但不限于)人类免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参见例如Cullen等人，1991，《病毒学杂志》65:1053；以及Cullen等人，1991，《细胞》58:423)，以及乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)，所述文献以全文引用的方式并入本文中。一般来说，RNA输出元件定位于基因的3'UTR内，并且可以作为一个或多个拷贝插入。
在一些实施例中，通过将转录后调节元件、聚腺苷酸化位点和转录终止信号中的一个或多个(例如全部)并入载体中来增加异源序列在病毒载体中的表达。多种转录后调节元件可以增加异源核酸在蛋白质中的表达，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE；Zufferey等人，1999，《病毒学杂志》73:2886)；存在于乙型肝炎病毒中的转录后调节元件(HPRE)(Huang等人，《分子和细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》，5:3864)；和类似文献(Liu等人，1995，《基因与发育(Genes Dev.)》，9:1766)，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒核酸包含转录后调节元件，如WPRE或HPRE。
在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒核酸缺乏或不包含转录后调节元件，如WPRE或HPRE。
可以包括引导异源核酸转录物终止和聚腺苷酸化的元件，例如增加外源药剂表达的元件。转录终止信号可以在聚腺苷酸化信号的下游发现。在一些实施例中，载体包含编码外源药剂的多核苷酸3'的聚腺苷酸化序列。polyA位点可以包含引导RNA聚合酶II对新生RNA转录物进行终止和聚腺苷酸化的DNA序列。聚腺苷酸化序列可以通过将polyA尾添加到编码序列的3'端而提升mRNA稳定性，并且因此促成翻译效率增加。可以用于逆转录病毒核酸的polyA信号的说明性实例包括AATAAA、ATTAAA、AGTAAA、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)，或另一种适合的异源或内源polyA序列。
在一些实施例中，逆转录病毒或慢病毒载体还包含一个或多个隔离元件，例如本文所描述的隔离元件。
在不同实施例中，载体包含可操作地连接到编码外源药剂的多核苷酸的启动子。载体可以具有一个或多个LTR，其中任一LTR包含一个或多个修饰，如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体可以还包含增加转导效率(例如cPPT/FLAP)、病毒封装(例如Psi(Ψ)封装信号，RRE)的更多辅助元件之一，和/或增加外源基因表达的其它元件(例如poly(A)序列)，并且可以任选地包含WPRE或HPRE。
在一些实施例中，慢病毒核酸包括以下中的一个或多个(例如全部)：例如从5'到3'：启动子(例如CMV)、R序列(例如包括TAR)、U5序列(例如用于整合)、PBS序列(例如用于逆转录)、DIS序列(例如用于基因组二聚合)、psi封装信号、部分gag序列、RRE序列(例如用于核输出)、cPPT序列(例如用于核输入)、驱动外源性药剂表达的启动子、编码外源性药剂的基因、WPRE序列(例如用于有效的转基因表达)、PPT序列(例如用于逆转录)、R序列(例如用于聚腺苷酸化和终止)和U5信号(例如用于整合)。
ii)工程化以去除剪接位点的载体
一些慢病毒载体整合了内部活性基因并且具有强剪接和聚腺苷酸化信号，所述信号可能引起异常的并且可能截短的转录物形成。
原癌基因活化机理可以涉及产生嵌合体转录物，所述嵌合转录物来源于插入型突变原基因组中所含的启动子元件或剪接位点与整合所靶向的细胞转录单元的相互作用(Gabriel等人，2009，《自然·医学(Nat Med)》15:1431-1436；Bokhoven等人，《病毒学杂志》83:283-29)。通过始于载体序列的通读转录并进行到侧接的细胞基因(或反之亦然)可以产生包括载体序列和细胞mRNA的嵌合体融合转录物。
在一些实施例中，本文所描述的慢病毒核酸包括慢病毒主链，其中剪接位点中的至少两个已经排除，例如以改进慢病毒载体的安全分布。此类剪接位点的种类和鉴别方法描述于WO2012156839A2中，所述文献全部以引用的方式纳入。
iii)逆转录病毒产生方法
大规模病毒颗粒产生通常适用于实现所期望的病毒效价。通过将转移载体转染到包含病毒结构和/或辅助基因(例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因)或其它逆转录病毒基因的封装细胞系中而可以产生病毒颗粒。
在实施例中，封装载体是缺乏封装信号并且包含编码一种、两种、三种、四种或更多种病毒结构和/或辅助基因的多核苷酸的表达载体或病毒载体。典型地，将封装载体纳入封装细胞中，并且通过转染、转导或感染引入细胞中。逆转录病毒(例如慢病毒)转移载体可以通过转染、转导或感染引入封装细胞系中以产生源细胞或细胞系。封装载体可以通过标准方法引入人类细胞或细胞系中，标准方法包括例如磷酸钙转染、脂质体转染或电穿孔。在一些实施例中，封装载体连同显性可选标记(如新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、杀稻瘟菌素(blastocidin)、博莱霉素(zeocin)、胸苷激酶(thymidine kinase)、DHFR、Gln合成酶或ADA)一起引入细胞中，接着在适当药物存在下选择并且分离克隆。可选标记基因可以物理方式连接到由封装载体(例如IRES或自裂解病毒肽)编码的基因。
封装细胞系包括不含封装信号、但稳定或瞬时表达可以封装病毒颗粒的病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)的细胞系。可以采用任何适合的细胞系，例如哺乳动物细胞，例如人类细胞。可以使用的适合的细胞系包括例如CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。在实施例中，封装细胞是293细胞、293T细胞或A549细胞。
源细胞系包括能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系，包含封装细胞系和包含封装信号的转移载体构建体。病毒储备溶液制备方法说明于例如Y.Soneoka等人(1995)《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》23:628-633，和N.R.Landau等人(1992)《病毒学杂志》66:5110-5113种，所述文献以引入的方式并入本文中。感染性病毒颗粒可以从封装细胞中收集，例如通过细胞溶解或收集细胞培养的上清液。任选地，可以富集或纯化所收集的病毒颗粒。
iv)封装质粒和细胞系
在一些实施例中，源细胞包括一个或多个可以封装病毒颗粒的质粒，所述质粒编码病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)。在一些实施例中，编码gag、pol和env前体中的至少两种的序列处于同一质粒上。在一些实施例中，编码gag、pol和env前体的序列处于不同质粒上。在一些实施例中，编码gag、pol和env前体的序列具有相同的表达信号，例如启动子。在一些实施例中，编码gag、pol和env前体的序列具有不同的表达信号，例如不同的启动子。在一些实施例中，gag、pol和env前体的表达是可诱导的。在一些实施例中，编码病毒结构蛋白和复制酶的质粒在相同时间或不同时间时转染。在一些实施例中，编码病毒结构蛋白和复制酶的质粒在与封装载体相同的时间或不同的时间转染。
在一些实施例中，源细胞系包括一种或多种稳定整合的病毒结构基因。在一些实施例中，稳定整合的病毒结构基因的表达是可诱导的。
在一些实施例中，在转录水平下调节病毒结构基因的表达。在一些实施例中，在翻译水平下调节病毒结构基因的表达。在一些实施例中，在翻译后水平下调节病毒结构基因的表达。
在一些实施例中，通过四环素(Tet)依赖性系统调节病毒结构基因的表达，其中Tet调节的转录抑制因子(Tet-R)结合到启动子中所包括的DNA序列并且通过空间位阻来抑制转录(Yao等人，1998；Jones等人，2005)。多西环素(dox)添加后，Tet-R释放，从而允许转录。其它适合的多种转录调节启动子、转录因子和小分子诱导剂适于调节病毒结构基因的转录。
在一些实施例中，第三代慢病毒组分、1型人类免疫缺陷病毒(HIV)Rev、Gag/Pol，以及处于Tet调节的启动子控制下并与抗生素抗性盒偶联的包膜分别整合于源细胞基因组中。在一些实施例中，Rev、Gag/Pol和整合于基因组中的包膜蛋白中的每一种在源细胞中仅有一个拷贝。
在一些实施例中，编码外源药剂的核酸(例如编码外源药剂的逆转录病毒核酸)还整合于源细胞基因组中。在一些实施例中，编码外源药剂的核酸在染色体外得到维持。在一些实施例中，编码外源药剂的核酸转染到源细胞中，所述源细胞的基因组中具有稳定整合的Rev、Gag/Pol和包膜蛋白。参见例如Milani等人,《EMBO分子医药(EMBO MolecularMedicine)》,2017，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒核酸不能经历逆转录。在实施例中，此类核酸能够瞬时表达外源性药剂。逆转录病毒或VLP可以包含失去功能的逆转录酶蛋白质，或可以不包含逆转录酶蛋白质。在实施例中，逆转录病毒核酸包括失去功能的引物结合位点(PBS)和/或att位点。在实施例中，一种或多种病毒辅助基因，包括rev、tat、vif、nef、vpr、vpu、vpx和S2或其功能等效物，失去功能或从逆转录病毒核酸中缺失。在实施例中，选自S2、rev和tat的一种或多种辅助基因失去功能或从逆转录病毒核酸中缺失。
v)封装逆转录病毒核酸的策略
典型地，现代逆转录病毒载体系统是由以下组成：具有顺式作用载体序列的病毒基因组，用于转录、逆转录、整合、翻译和封装病毒RNA到病毒颗粒中，以及(2)生产细胞系，其表达为了产生病毒颗粒所需的反式作用逆转录病毒基因序列(例如gag、pol和env)。通过将顺式作用载体序列与反式作用载体序列完全分离，病毒不能维持复制超过一个感染循环。许多策略可以避免活病毒的产生，例如通过最小化顺式作用序列与反式作用序列之间的重叠以避免重组。
包含缺乏或缺少病毒RNA的序列的病毒载体颗粒可以是从所述序列中去除或排除病毒RNA的结果。在一个实施例中，这可以通过使用gag上的内源封装信号结合位点来实现。替代地，内源封装信号结合位点位于pol上。在这个实施例中，待递送的RNA将包含同源封装信号。在另一个实施例中，位于待递送的RNA上的异源结合域(对于gag来说是异源的)和位于gag或pol上的同源结合位点可以用于确保待递送的RNA的封装。异源序列可以是非病毒序列或其可以是病毒序列，在此情况下，其可以来源于不同病毒。载体颗粒可以用于递送治疗性RNA，在此情况下，功能整合酶和/或逆转录酶不是必需的。这些载体颗粒还可以用于递送所关注的治疗基因，在此情况下，典型地包括pol。
在一个实施例中，改变gag-pol，并且封装信号用对应的封装信号置换。在这个实施例中，颗粒可以将RNA与新封装信号封装在一起。这个方法的优点在于，能够封装缺乏病毒序列的RNA序列，例如RNAi。
替代方法是依赖于待封装的RNA的过度表达。在一个实施例中，待封装的RNA在含有封装信号的任何RNA不存在的情况下过度表达。这可以导致封装治疗性RNA达到显著的水平，并且这种量足以转导细胞并具有生物效应。
在一些实施例中，多核苷酸包含编码病毒gag蛋白质或逆转录病毒gag和pol蛋白质的核苷酸序列，其中gag蛋白质或pol蛋白质包含能够识别RNA序列中的对应序列的异源RNA结合域以促进RNA序列封装到病毒载体颗粒中。
在一些实施例中，异源RNA结合域包含来源于细菌噬菌体鞘蛋白的RNA结合域、Rev蛋白质、U1小核核糖核蛋白颗粒的蛋白质、Nova蛋白质、TF111A蛋白质、TIS11蛋白质、trpRNA结合减弱蛋白质(TRAP)或假尿苷合成酶。
在一些实施例中，本文中的方法包含检测或确认复制胜任型逆转录病毒的不存在。所述方法可以包括评估一种或多种靶基因(例如病毒基因，例如结构或封装基因)的RNA水平，其基因产物在经复制胜任型逆转录病毒(例如γ逆转录病毒或慢病毒)感染的某些细胞中表达，但不存在于用于转导具有异源核酸的细胞的病毒载体中并且不会或预期不会存在和/或表达于不含复制胜任型逆转录病毒的细胞中。如果一种或多种靶基因的RNA水平高于参考值，则可以确定复制胜任型逆转录病毒存在，所述RNA水平可以直接或间接地测得，例如从含有靶基因的阳性对照样品测得。关于进一步的公开内容，参见WO2018023094A1。
vi)对外源性药剂进行编码的基因在源细胞中的抑制
源细胞中(过度)表达的蛋白质可以对载体病毒颗粒组装和/或感染性产生间接或直接的影响。外源药剂并入载体病毒颗粒还可以影响载体颗粒的下游处理。
在一些实施例中，使用组织特异性启动子限制外源药剂在源细胞中的表达。在一些实施例中，在真核细胞培养物中使用异源翻译控制系统抑制外源性药剂在源细胞中的翻译。更具体地说，逆转录病毒核酸可以包含可操作地连接到编码外源药剂的基因的结合位点，其中结合位点能够与RNA结合蛋白相互作用，以便抑制或阻止外源药剂在源细胞中的翻译。
在一些实施例中，RNA结合蛋白是色氨酸RNA结合减弱蛋白质(TRAP)，例如细菌色氨酸RNA结合减弱蛋白质。使用RNA结合蛋白(例如细菌trp操纵子调节蛋白、色氨酸RNA结合减弱蛋白质TRAP)和其结合的RNA靶标将抑制或阻止转基因在源细胞内的翻译。这个系统称为转基因抑制载体内产生细胞系统或TRIP系统。
在实施例中，RNA结合蛋白的结合位点(例如TRAP结合序列tbs)定位于NOI翻译起始密码子的上游使得来源于内部表达盒的mRNA的翻译受到特异性抑制，同时对载体RNA的产生或稳定性不具有有害的影响。tbs与编码外源药剂的基因的翻译起始密码子之间的核苷酸数目可以是0到12个核苷酸不等。tbs可以定位于内部核糖体进入位点(IRES)下游以抑制编码外源性药剂的基因在多顺反子mRNA中的翻译。
vii)杀灭开关系统和扩增
在一些实施例中，多核苷酸或携带编码外源性药剂的基因的细胞利用自杀基因(包含诱导型自杀基因)降低直接毒性和/或不可控增殖的风险。在特定方面中，自杀基因对携带外源药剂的宿主细胞不具有免疫原性。自杀基因的实例包括胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-8或胞嘧啶脱氨酶。胱天蛋白酶-9可以使用特定的二聚合化学诱导剂(CID)活化。
在某些实施例中，载体包含使得靶细胞(例如免疫效应细胞，例如T细胞)容易接受体内负向选择的基因区段。举例来说，转导的细胞可以作为个体的体内状况变化的结果来排除。负向可选表型可以由赋予对所施用药剂(例如化合物)的敏感性的基因的插入产生。负向可选基因在所属领域中是已知的并且尤其包括以下：赋予更昔洛韦(ganciclovir)敏感性的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人，《细胞》11:223，1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)基因和细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)》89:33(1992))。
在一些实施例中，已转导细胞(例如免疫效应细胞，如T细胞)包含多核苷酸，所述多核苷酸还包含能够对负向可选表型的细胞进行体外选择的正向标记。向可选标记可以是一种基因，其在引入靶细胞后表达显性表型，从而允许对携带所述基因的细胞进行正向选择。这种类型的基因尤其包括：赋予潮霉素B抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)；编码抗生素G418的具有抗性的来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)；二氢叶酸还原酶(DHFR)基因；腺苷脱氨酶基因(ADA)；和多药抗性(MDR)基因。
在一个实施例中，正向可选标记与负向可选元件相连接使得负向可选元件的损失必然还伴随着正向可选标记的损失。举例来说，正向和负向可选标记可以融合以使得一者的损失必然导致另一者的损失。产生作为表达产物的多肽的所融合多核苷酸的实例是潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)，所述多肽赋予所期望的上文所描述的正向和负向选择特征。这种基因的表达所产生的多肽赋予潮霉素B抗性以用于体外正向选择和更昔洛韦敏感性以用于体内负向选择。参见Lupton S.D.等人，《分子和细胞生物学(Mol.andCell.Biology)》11:3374-3378,1991。另外，在实施例中，编码嵌合受体的多核苷酸存在于含有融合基因的逆转录病毒载体中，尤其赋予潮霉素B抗性以用于体外正向选择和更昔洛韦敏感性以用于体内负向选择的逆转录病毒载体(例如Lupton,S.D.等人(1991)(同上)中所描述的HyTK逆转录病毒载体)。还参见PCT U591/08442和PCT/U594/05601的公开案，其描述了由显性正向可选标记与负向可选标记融合而衍生的双官能可选融合基因的用途。
适合的正向可选标记可以来源于选自由hph、nco和gpt组成的群组的基因，并且适合的负向可选标记可以来源于选自由以下组成的群组的基因：胞嘧啶脱氨酶、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRT和gpt。其它适合的标记是双官能可选融合基因，其中阳性可选择标志物来源于hph或neo，并且阴性可选择标志物来源于胞嘧啶脱氨酶或TK基因或可选择标志物。
viii)调节慢病毒整合的策略
公开了逆转录病毒和慢病毒核酸，其缺少关键蛋白质/序列或在关键蛋白质/序列方面失去功能以便阻止逆转录病毒或慢病毒基因组整合到靶细胞基因组中。举例来说，缺少构成逆转录病毒整合酶的高度保守性DDE基序的氨基酸中的每一者的病毒核酸(Engelman和Craigie(1992)《病毒学杂志》66:6361-6369；Johnson等人(1986)《美国国家科学院院刊》83:7648-7652；Khan等人(1991)《核酸研究》19:851-860)能够产生整合缺陷型逆转录病毒核酸。
举例来说，在一些实施例中，本文中的逆转录病毒核酸包括含有突变的慢病毒整合酶，所述突变引起所述整合酶不能催化病毒基因组整合到细胞基因组中。在一些实施例中，所述突变是直接影响整合的I型突变，或触发多效性缺陷，从而影响病毒粒子形态发生和/或逆转录的II型突变。I型突变的说明性非限制实例是影响参与整合酶的催化核心结构域的三个残基中的任一个的那些突变：DX39-58DX35E(HIV-1的整合酶的D64、D116和E152残基)。在一个特定实施例中，引起所述整合酶不能催化病毒基因组整合到细胞基因组中的突变是整合酶的催化核心域的DDE基序的一个或多个氨基酸残基的取代，优选天冬酰胺残基对所述DEE基序的第一天冬氨酸残基的取代。在一些实施例中，逆转录病毒载体不包含整合酶蛋白质。
在一些实施例中，逆转录病毒整合到活性转录单元中。在一些实施例中，逆转录病毒的整合不靠近转录起始位点(基因的5'端)或DNAse1裂解位点。在一些实施例中，逆转录病毒整合并不活化原癌基因或灭活肿瘤抑制基因。在一些实施例中，逆转录病毒不具有遗传毒性。在一些实施例中，慢病毒整合到内含子中。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸以特定拷贝数整合到靶细胞的基因组中。平均拷贝数可以由单个细胞、细胞群或个别细胞集落确定。确定拷贝数的示例性方法包括聚合酶链反应(PCR)和流式细胞测量术。
在一些实施例中，将编码外源药剂的DNA整合到基因组中。在一些实施例中，编码外源药剂的DNA在染色体外得到维持。在一些实施例中，整合的DNA与编码外源药剂的游离型DNA的比率是至少0.01、0.1、0.5、1.0、2、5、10、100。
在一些实施例中，编码外源药剂的DNA呈线性。在一些实施例中，编码外源药剂的DNA呈环状。在一些实施例中，编码外源药剂的DNA的线性拷贝与环状拷贝的比率为至少0.01、0.1、0.5、1.0、2、5、10、100。
在实施例中，编码外源药剂的DNA与1个LTR连成环状。在一些实施例中，编码外源药剂的DNA与2个LTR连成环状。在一些实施例中，编码外源性药剂的包括1个LTR的环状DNA与编码外源性药剂的包括2个LTR的环状DNA的比率为至少0.1、0.5、1.0、2、5、10、20、50、100。
ix)游离型病毒的维持
在整合不足的逆转录病毒中，逆转录的环状cDNA副产物(例如1-LTR和2-LTR)可以在细胞核中积累而不整合到宿主基因组中(参见
Figure BDA0003155557330000431
R J等人,《自然·医学》2006,12:348-353)。像其它外源性DNA一样，那些中间体随后可以相同的频率(例如103至105/细胞)整合到细胞DNA中。
在一些实施例中，游离型逆转录病毒核酸并不复制。游离型病毒DNA可以经修饰以在复制细胞中维持，这通过包含真核复制起点和骨架/基质附着区(S/MAR)以便与核基质缔合。
因此，在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒核酸包括真核复制起点或其变体。所关注的真核复制起点的实例是如Aladjem等人(《科学(Science)》，1995，270:815-819)所描述的β球蛋白基因的复制起点；如Price等人，《生物化学杂志(Journal ofBiological Chemistry)》，2003，278(22):19649-59所描述的此前从猴CV-1细胞和人类皮肤成纤维细胞中分离出的与α-卫星序列结合的自主复制序列的共同序列；如McWinney和Leffak(McWinney C.和Leffak M.，《核酸研究》1990，18(5):1233-42)所描述的人类c-myc启动子区域的复制起点。在实施例中，变异体基本上维持了引发在真核细胞中复制的能力。引发复制的特定序列的能力可以通过任何适合的方法测定，例如基于溴脱氧尿苷并入和密度漂移的自主复制分析(Araujo F.D.等人，同上；Frappier L.等人，同上)。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸包含骨架/基质附着区(S/MAR)或其变异体，例如长度为数百个碱基对的非共同富AT样DNA元件，其通过周期性附着到细胞核的蛋白质骨架或基质而将真核基因组的核DNA组构到染色质域中。其通常在非编码区(如侧接区、染色质边界区和内含子)中找到。S/MAR区域的实例是如Bode等人(Bode J.等人，《科学》，1992，255:195-7)所描述的人类IFN-γ基因(hIFN-γ大)的1.8kbp S/MAR；如Ramezani(RamezaniA.等人，《血液(Blood)》2003，101:4717-24)所描述的人类IFN-γ基因(hIFN-γ短)的S/MAR的0.7Kbp最小区域；如Mesner L.D.等人，《美国国家科学院院刊》，2003，100:3281-86所描述的人类二氢叶酸还原酶基因(hDHFR)的S/MAR的0.2Kbp最小区域。在实施例中，S/MAR的功能等效变体是基于已提出的促成S/MAR功能的共同或单独的六组规则而选择的序列(Kramer等人(1996)《基因组学(Genomics)》33,305；Singh等人(1997)《核酸研究》25，1419)。这些规则已经合并到MAR-Wiz计算机程序中，所述程序可自由地在genomecluster.secs.oakland.edu/MAR-Wiz获得。在实施例中，变异体基本上维持与衍生其的S/MAR相同的功能，具体地说，特异性结合到核基质的能力。熟练的技术人员可以确定特定变异体是否能够特异性结合到核基质，例如根据Mesner等人所描述的体外或体内MAR分析(Mesner L.D.等人，同上)。在一些实施例中，如果特定变异体展示了DNA链分离倾向，则特定序列是S/MAR的变异体。基于平衡统计机构的方法，使用特定程序可以确定这个特性。应激诱导的双链体去稳定(SIDD)分析技术“[...]计算所施加的超螺旋应激水平减少为了在沿着DNA序列的每个位置打开双链体所必需的自由能的程度。结果作为SIDD特征曲线显示，其中强去稳定位点表现为深度最小值[...]”，如Bode等人(2005)《分子生物学杂志》358，597中所定义。SIDD算法和数学基础(Bi和Benham(2004)《生物信息学(Bioinformatics)》20，1477)和SIDD分布的分析可以使用可在WebSIDD(www.genomecenter.ucdavis.edu/benham)自由获得的因特网资源执行。因此，在一些实施例中，如果多核苷酸展示与S/MAR类似的SIDD分布，则其视为S/MAR序列的变体。
B.细胞源性融合剂脂质体
融合剂脂质体的组合物可以从培养的细胞，例如经培养的哺乳动物细胞，例如经培养的人类细胞产生。细胞可以为祖细胞或非祖(例如分化的)细胞。细胞可以为初级细胞或细胞系(例如本文所描述的哺乳动物，例如人类细胞系)。在实施例中，经培养的细胞为祖细胞，例如骨髓基质细胞、骨髓源性成年祖细胞(MAPC)、内皮祖细胞(EPC)、胚细胞、在室管膜下区中形成的中间祖细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、卫星细胞、肝干细胞、造血干细胞、骨髓基质细胞、表皮干细胞、胚胎干细胞、间质干细胞、脐带干细胞、前体细胞、肌肉前体细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经前体细胞、神经胶质前体细胞、神经元前体细胞、成肝细胞。
在一些实施例中，源细胞为内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞，例如衍生自个体的细胞的诱导多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、造红细胞组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、成髓细胞、骨髓前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、成巨核细胞、幼巨核细胞、成黑素细胞、成淋巴细胞、骨髓前体细胞、正成红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心肌祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、胚细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。
经培养的细胞可以来自上皮、结缔组织、肌肉或神经组织或细胞和其组合。融合剂脂质体可以由来自任何真核(例如哺乳动物)器官系统的经培养的细胞产生，例如来自心血管系统(心脏、血管系统)；消化系统(食道、胃、肝脏、胆囊、胰脏、肠、结肠、直肠和肛门)；内分泌系统(下丘脑、脑下垂体、松果体或松果体腺体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)；排泄系统(肾脏、输尿管、膀胱)；淋巴系统(淋巴、淋巴结、淋巴管、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏)；皮肤系统(皮肤、毛发、指甲)；肌肉系统(例如骨骼肌)；神经系统(脑、脊髓、神经)；生殖系统(卵巢、子宫、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺)；呼吸系统(咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜)；骨骼系统(骨骼、软骨)和其组合。在实施例中，细胞来自高度有丝分裂的组织(例如高度有丝分裂的健康组织，如上皮、胚胎组织、骨髓、肠隐窝)。在实施例中，组织样品为高代谢组织(例如骨骼组织、神经组织、心肌细胞)。
在一些实施例中，细胞来自年轻的供体，例如25岁、20岁、18岁、16岁、12岁、10岁、8岁、5岁、1岁或更年幼的供体。在一些实施例中，细胞来自胎儿组织。
在一些实施例中，细胞来源于个体并施用到相同个体或具有类似基因特征(例如MHC匹配的)的个体。
在某些实施例中，细胞具有平均大小为长度大于3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个核苷酸(例如长度在4,000-10,000个核苷酸之间、长度在6,000-10,000个核苷酸之间)的端粒。
在一些实施例中，融合剂脂质体由基于期望的表型或基因型而鉴别、挑选或选择的细胞克隆产生以用作本文所描述的融合剂脂质体组合物的来源。例如，基于低的线粒体突变负荷、长的端粒长度、分化状态或特定的基因特征(例如，与接受者匹配的基因特征)来鉴定、挑选或选择细胞克隆。
本文所描述的融合剂脂质体组合物可以包含来自一种细胞或组织来源或来自来源组合的融合剂脂质体。例如，融合剂脂质体组合物可以包括来自以下的融合剂脂质体：来自异种来源(例如，动物、上文所提到的物种的细胞的组织培养物)、同种异体、自体；来自特定组织，从而产生不同的蛋白质浓度和分布(肝、骨骼、神经、脂肪等)；来自不同代谢状态(例如，糖酵解、呼吸)的细胞。如本文其它地方所描述的，组合物还可以包括处于不同代谢状态(例如，偶联或非偶联)的融合剂脂质体。
在一些实施例中，融合剂脂质体由表达融合剂(例如，本文所描述的融合剂)的源细胞产生。在一些实施例中，融合剂被安置于源细胞的膜中，例如脂质双层膜，例如细胞表面膜或亚细胞膜(例如，溶酶体膜)。在一些实施例中，融合剂脂质体由具有安置于细胞表面膜中的融合剂的源细胞产生。
在一些实施例中，融合剂脂质体通过诱导外泌体、微囊泡、膜囊泡、细胞外膜囊泡、质膜囊泡、巨质膜囊泡、凋亡小体、线粒体、膜包裹核(pyrenocyte)、溶酶体或其它膜包裹囊泡的萌芽而产生。
在一些实施例中，融合剂脂质体通过诱导细胞去核而产生。去核可以使用如基因、化学等分析(例如使用放线菌素D，参见Bayona-Bafaluy等人,“一种用于将线粒体DNA转移到ρ°细胞的化学去核方法(A chemical enucleation method for the transfer ofmitochondrial DNA)”《核酸研究》2003年8月15日；31(16):e98)、机械方法(例如，挤压或抽吸，参见Lee等人,“猪体细胞核转移中的两种去核方法的效率的比较研究：挤压法和抽吸法的效果(Acomparative study on the efficiency of two enucleation methods in pigsomatic cell nuclear transfer:effects of the squeezing and the aspirationmethods).”《动物生物技术(Anim Biotechnol.)》2008；19(2):71-9)或其组合来进行。去核不仅是指细胞核的完全去除，而且是指细胞核从其典型位置位移，使得细胞含有细胞核，但其是无功能的。
在实施例中，制备融合剂脂质体包括产生细胞鬼影、巨质膜囊泡或凋亡小体。在实施例中，融合剂脂质体组合物包括细胞鬼影、巨质膜囊泡和凋亡小体中的一个或多个。
在一些实施例中，融合剂脂质体通过诱导细胞片段化来产生。在一些实施例中，可以使用以下方法来进行细胞片段化，所述方法包含但不限于：化学方法、机械方法(例如，离心(例如，超速离心或密度离心)、冻融或超声处理)或其组合。
在一些实施例中，融合剂脂质体可以通过以下方法中的任何一种、全部或组合由表达例如如本文所描述的融合剂的源细胞产生：
i)诱导线粒体、外泌体或其它膜包裹囊泡的萌芽；
ii)通过以下方法中的任何一种或其组合诱导核灭活(例如，去核)：
a)基因方法；
b)化学方法，例如使用放线菌素D；或
c)机械方法，例如挤压或抽吸；或
iii)例如通过以下方法中的任何一种或其组合诱导细胞片段化：
a)化学方法；
b)机械方法，例如离心(例如，超速离心或密度离心)；冻融；或超声处理。
i)在融合剂脂质体产生前对细胞进行修饰
在一些方面，在融合剂脂质体产生前对细胞进行修饰，如对受试者、组织或细胞进行修饰。此类修饰可以有效地例如改善融合、融合剂表达或活性、货物的结构或功能或靶细胞的结构或功能。
a)物理修饰
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前对细胞进行物理修饰。例如，如本文其它地方所描述的，融合剂可以与细胞的表面连接。
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体前用化学剂对细胞进行处理。例如，可以用化学或脂质融合剂对细胞进行处理，使得化学或脂质融合剂与细胞的表面非共价或共价相互作用或嵌入细胞的表面内。在一些实施例中，用药剂对细胞进行处理以增强细胞膜中的脂质的融合特性。
在一些实施例中，在产生具有针对细胞表面上的增强融合剂脂质体对器官、组织或细胞类型的靶向的合成或内源性小分子或脂质的一个或多个共价或非共价附着位点的融合剂脂质体之前对细胞进行物理修饰。
在实施例中，融合剂脂质体包括提高或降低水平的内源性分子。例如，所述融合剂脂质体可以包括内源性分子，所述内源性分子也天然存在于天然存在的源细胞中，但是其水平高于或低于在所述融合剂脂质体中。在一些实施例中，多肽由源细胞或融合剂脂质体中的外源性核酸表达。在一些实施例中，多肽从来源分离并装载到源细胞或融合剂脂质体或与其缀合。
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体前用化学剂(例如，小分子)对细胞进行处理以增加细胞中的内源性融合剂(例如，在一些实施例中，相对于源细胞是内源性的，并且在一些实施例中，相对于靶细胞是内源性的)的表达或活性。在一些实施例中，小分子可以增加内源性融合剂的转录激活因子的表达或活性。在一些实施例中，小分子可以降低内源性融合剂的转录抑制因子的表达或活性。在一些实施例中，小分子是增加内源性融合剂的表达的表观遗传修饰剂。
在一些实施例中，融合剂脂质体由用融合抑制化合物(例如，溶血磷脂酰胆碱)处理的细胞产生。在一些实施例中，融合剂脂质体由用不会切割融合剂的解离剂(例如，Accutase)处理的细胞产生。
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体前用例如CRISPR活化剂对来源细胞进行物理修饰以添加或增加融合剂的浓度。
在一些实施例中，对细胞进行物理修饰以增加或减少细胞器(例如，线粒体、高尔基体、内质网、细胞内囊泡(如溶酶体、自噬体))的量或增强细胞器的结构或功能。
b)基因修饰
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体以增加细胞中的内源性融合剂(例如，在一些实施例中，相对于源细胞是内源性的，并且在一些实施例中，相对于靶细胞是内源性的)的表达前对细胞进行基因修饰。在一些实施例中，基因修饰可以增加内源性融合剂的转录激活因子的表达或活性。在一些实施例中，基因修饰可以降低内源性融合剂的转录抑制因子的表达或活性。在一些实施例中，激活因子或抑制因子是连接到通过引导RNA靶向内源性融合剂的转录激活因子或抑制因子的核酸酶失活cas9(dCas9)。在一些实施例中，基因修饰对内源性融合剂进行表观遗传修饰以增加其表达。在一些实施例中，表观激活因子是连接到通过引导RNA靶向内源性融合剂的表观遗传修饰剂的核酸酶失活cas9(dCas9)。
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体以增加细胞中的外源性融合剂的表达(例如，转基因的递送)前对细胞进行基因修饰。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体前将核酸(例如，DNA、mRNA或siRNA)转移到细胞，例如以增加或减少用于器官、组织或细胞靶向的细胞表面分子(蛋白质、聚糖、脂质或低分子量分子)的表达。在一些实施例中，核酸靶向融合剂的抑制因子，例如shRNA、siRNA构建体。在一些实施例中，核酸对融合剂抑制因子的抑制剂进行编码。
在一些实施例中，方法包括将相对于对融合剂进行编码的源细胞是外源性的核酸引入到源细胞中。外源性核酸可以是例如DNA或RNA。在一些实施例中，外源性核酸可以是例如DNA、gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA、miRNA、siRNA等。在一些实施例中，外源性DNA可以是线性DNA、环状DNA或人工染色体。在一些实施例中，DNA以游离方式维持。在一些实施例中，DNA整合到基因组中。外源性RNA可以是经化学修饰的RNA，例如可以包括一种或多种主链修饰、糖修饰、非规范碱基或帽。主链修饰包含例如硫代磷酸酯、N3'亚磷酰胺、硼酸磷酸酯、膦酰基乙酸酯、硫代-PACE、吗啉代亚磷酰胺或PNA。糖修饰包含例如2'-O-Me、2'F、2'F-ANA、LNA、UNA和2'-O-MOE。非规范碱基包含例如5-溴-U和5-碘-U、2,6-二氨基嘌呤、C-5丙炔基嘧啶、二氟甲苯、二氟苯、二氯苯、2-硫代尿苷、假尿苷和二氢尿苷。帽包含例如ARCA。另外的修饰例如在Deleavey等人,“设计用于靶基因沉默的经化学修饰的寡核苷酸(DesigningChemically Modified Oligonucleotides for Targeted Gene Silencing)”，《化学与生物学(Chemistry&Biology)》,第19卷,第8期,2012年8月24日,第937-954页中进行了讨论，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体前用化学剂(例如，小分子)对细胞进行处理以增加细胞中的相对于源细胞是外源性的融合剂的表达或活性。在一些实施例中，小分子可以增加外源性融合剂的转录激活因子的表达或活性。在一些实施例中，小分子可以降低外源性融合剂的转录抑制因子的表达或活性。在一些实施例中，小分子是增加外源性融合剂的表达的表观遗传修饰剂。
在一些实施例中，核酸对经修饰的融合剂进行编码。例如，具有可调节的融合活性(例如特定的细胞类型、组织类型或局部微环境活性)的融合剂。此种可调节的融合活性可以包含通过低pH、高pH、热、红外光、细胞外酶活性(真核或原核)或小分子、蛋白质或脂质的暴露来活化和/或引发融合活性。在一些实施例中，小分子、蛋白质或脂质显示在靶细胞上。
在一些实施例中，在产生融合剂脂质体以改变(即，上调或下调)信号传导途径(例如，Wnt/β-连环蛋白途径)的表达前对细胞进行基因修饰。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体以改变(例如，上调或下调)一个或多个所关注基因的表达前对细胞进行基因修饰。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体以改变(例如，上调或下调)一个或多个所关注核酸(例如，miRNA或mRNA)的表达前对细胞进行基因修饰。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体例如以增加或减少信号传导途径、基因或核酸的表达前将核酸(例如，DNA、mRNA或siRNA)转移到细胞。在一些实施例中，核酸靶向信号传导途径、基因或核酸的抑制因子，或抑制信号传导途径、基因或核酸。在一些实施例中，核酸对上调或下调信号传导途径、基因或核酸的转录因子进行编码。在一些实施例中，激活因子或抑制因子是连接到通过引导RNA靶向信号传导途径、基因或核酸的转录激活因子或抑制因子的核酸酶失活cas9(dCas9)。在一些实施例中，基因修饰对内源性信号传导途径、基因或核酸进行表观遗传修饰以其表达。在一些实施例中，表观激活因子是连接到通过引导RNA靶向信号传导途径、基因或核酸的表观遗传修饰剂的核酸酶失活cas9(dCas9)。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体以改变(即，上调或下调)信号传导途径(例如，Wnt/β-连环蛋白途径)、基因或核酸的表达前对细胞的DNA进行编辑。在一些实施例中，使用引导RNA和CRISPR-Cas9/Cpf1或其它基因编辑技术对DNA进行编辑。
可以使用重组方法对细胞进行基因修饰。可以使用重组方法获得对期望的基因进行编码的核酸序列，例如通过从表达所述基因的细胞中筛选文库、通过从已知包含其的载体中衍生基因、或者通过使用标准技术直接从细胞或含有其的组织中分离。可替代地，所关注基因可以合成产生，而不是克隆。
天然或合成核酸的表达通常是通过将对所关注基因进行编码的核酸可操作地连接到启动子并将构建体掺入表达载体中来实现的。载体可以适合于在真核生物中复制和整合。典型的克隆载体含有用于表达期望的核酸序列的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
在一些实施例中，可以用一个或多个表达区域(例如，基因)对细胞进行基因修饰。在一些实施例中，可以用外源性基因(例如，能够表达外源性基因产物，如RNA或多肽产物)和/或外源性调节核酸对细胞进行基因修饰。在一些实施例中，可以用对相对于靶细胞是内源性的基因产物进行编码的外源性序列和/或能够调节内源性基因的表达的外源性调节核酸对细胞进行基因修饰。在一些实施例中，可以用外源性基因和/或调节外源性基因表达的调节核酸对细胞进行基因修饰。在一些实施例中，可以用外源性基因和/或调节内源性基因的表达的调节核酸对细胞进行基因修饰。本领域技术人员应理解，可以对本文所描述的细胞进行基因修饰以表达对蛋白质或调节分子进行编码的多种外源性基因，所述蛋白质或调节分子可以例如作用于靶细胞的内源性或外源性基因组的基因产物。在一些实施例中，此类基因赋予融合剂脂质体特征，例如调节与靶细胞的融合。在一些实施例中，可以对细胞进行基因修饰以表达内源性基因和/或调节核酸。在一些实施例中，内源性基因或调节核酸调节其它内源性基因的表达。在一些实施例中，可以对细胞进行基因修饰以表达与其它染色体上的内源性基因和/或调节核酸的形式不同地(例如，诱导性地、组织特异性地、组成性地或以更高或更低的水平)表达的内源性基因和/或调节核酸。
启动子元件(例如，增强子)调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔往往是灵活的，使得当元件相对于彼此反向或移动时能保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至50bp。取决于启动子，似乎各元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
适合的启动子的一个实例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与其操作性地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。适合的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包含但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)启动子、以及人类基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。
进一步地，本发明不应限于使用组成型启动子。还设想了诱导型启动子作为本发明的一部分。使用诱导型启动子提供了能够在期望此种表达时开启与其操作性地连接的多核苷酸序列的表达或者在不期望表达时关闭所述表达的分子开关。诱导型启动子的实例包含但不限于组织特异性启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。在一些实施例中，在产生融合剂脂质体之前，例如在产生融合剂脂质体之前3、6、9、12、24、26、48、60或72小时，融合剂的表达被上调。
要引入到来源中的表达载体还可以含有可选择标志物基因或报告基因或两者以促进从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴别和选择表达细胞。在其它方面，可选择标志物可以携带在单独的DNA片段上并在共转染程序中使用。可选择标志物和报告基因两者均可以侧接适当的调节序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标志物包含例如抗生素抗性基因，如neo等。
报告基因可以用于鉴别潜在转染的细胞和评价调节序列的功能。通常，报告基因是不存在于接受者来源中或不由接受者来源表达并且对其表达表现为通过一些易于检测到的特性(例如，酶促活性)的多肽进行编码的基因。在已经将DNA引入到接受者细胞中后的适合时间处测定报告基因的表达。适合的报告基因可以包含对荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶进行编码的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000《FEBS通讯(FEBS Letters)》479:79-82)。适合的表达系统是众所周知的，并且可以使用已知技术制备或商购获得。通常，将具有最小5'侧翼区域并示出最高水平的报告基因表达的构建体鉴别为启动子。此类启动子区域可以连接到报告基因并用于评价药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些实施例中，可以对细胞进行基因修饰以改变一种或多种蛋白质的表达。一种或多种蛋白质的表达可以在特定时间(例如，来源的发育或分化状态)内被修饰。在一些实施例中，融合剂脂质体由被基因修饰以改变影响融合活性、结构或功能的一种或多种蛋白质(例如，融合剂蛋白或非融合剂蛋白)的表达的细胞的来源产生。一种或多种蛋白质的表达可以被限制于一个或多个特定位置或在整个来源中广泛分布。
在一些实施例中，融合剂蛋白的表达被修饰。在一些实施例中，融合剂脂质体由具有融合剂蛋白的经修饰的表达(例如，融合剂的表达增加或减少至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更多)的细胞产生。
在一些实施例中，细胞可以被工程化成表达靶向融合剂蛋白的胞质酶(例如，蛋白酶、磷酸酶、激酶、脱甲基酶、甲基转移酶、乙酰酶)。在一些实施例中，胞质酶通过改变翻译后修饰来影响一种或多种融合剂。对蛋白质进行的翻译后蛋白质修饰可能影响对营养可利用性和氧化还原条件的响应以及蛋白质-蛋白质相互作用。在一些实施例中，融合剂脂质体包括具有改变的翻译后修饰(例如，翻译后修饰增加或减少至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更多)的融合剂。
将修饰引入到细胞中的方法包含物理、生物和化学方法。参见例如Geng.&Lu,用于细胞分析和递送的微流体电穿孔(Microfluidic electroporation for cellularanalysis and delivery).《芯片实验室(Lab on a Chip.)》13(19):3803-21.2013；Sharei,A.等人,用于细胞内递送的无载体微流体平台(A vector-free microfluidicplatform for intracellular delivery).《美国国家科学院院刊(PNAS)》第110卷第6号.2013；Yin,H.等人,基于基因的疗法的非病毒载体(Non-viral vectors for gene-basedtherapy).《自然评论：遗传学(Nature Reviews Genetics.)》15:541–555.2014。修饰用于产生本文所描述的融合剂脂质体的细胞的适合的方法包含例如扩散、渗透、渗透脉冲、渗透休克、低渗裂解、低渗透析、离子渗透、电穿孔、超声处理、显微注射、钙沉淀、膜插层、脂质介导的转染、洗涤剂处理、病毒感染、受体介导的内吞作用、蛋白质转导结构域的使用、粒子烧结、膜融合、冻融、机械破坏和过滤。
确认基因修饰的存在包含多种分析。此类分析包含例如分子生物学分析，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；生物化学分析，如例如通过免疫学方法(ELISA和Western印迹)或通过本文所描述的分析来检测特定肽的存在或不存在。
在一些方面，本公开提供一种融合剂脂质体，其包括：(a)脂质双层；(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如，包括胞质溶胶)；(c)外源性或过度表达的融合剂，例如其中所述融合剂安置于所述脂质双层中，其中所述融合剂脂质体来源于源细胞；并且其中所述融合剂脂质体具有部分或完全核灭活(例如，核去除)。
在一些方面，本公开提供了一种融合剂脂质体组合物，其包括来源于源细胞的多个融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包括：(a)脂质双层；(b)包括胞质溶胶的内腔，其中所述内腔被所述脂质双层包围；(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂；(d)核酸，例如包括有效负荷基因的核酸；并且其中所述融合剂脂质体不包括细胞核；其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量低于总蛋白质的1％；其中：(i)当所述多个融合剂脂质体与包括靶细胞和非靶细胞的细胞群接触时，货物存在于比非靶细胞或参考细胞高至少10倍的靶细胞中，或者(ii)所述多个融合剂脂质体与靶细胞融合的速率比非靶细胞或参考细胞高至少50％；其中所述靶细胞选自泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞。
在一些方面，本公开提供了一种融合剂脂质体组合物，其包括来源于源细胞的多个融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包括：(a)脂质双层；(b)包括胞质溶胶的内腔，其中所述内腔被所述脂质双层包围；(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂；(d)核酸，所述核酸包括对表5和表6的外源性药剂进行编码的有效负荷基因，其中所述融合剂脂质体不包括细胞核；并且其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量低于总蛋白质的1％。
在一些方面，本公开提供了一种融合剂脂质体组合物，其包括来源于源细胞的多个融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包括：(a)脂质双层；(b)包括胞质溶胶的内腔，其中所述内腔被所述脂质双层包围；(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂；(d)包括有效负荷基因的核酸，其中所述核酸包括与所述有效负荷基因可操作地连接的NTCSRE，其中所述NTCSRE包括非靶细胞特异性miRNA识别序列(例如，由相较于靶细胞较高的水平的存在于非靶细胞中的miRNA结合的非靶细胞特异性miRNA识别序列，例如由表4的miRNA结合的非靶细胞特异性miRNA识别序列)，其中所述靶细胞是第一类型的CNS细胞，任选地其中所述非靶细胞是第二不同类型的CNS细胞或非CNS细胞；并且其中所述融合剂脂质体不包括细胞核；并且其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量低于总蛋白质的1％。
在一些实施例中，miRNA存在于非靶细胞(例如，本文所描述的非靶细胞)中的水平比miRNA存在于靶细胞(例如，CNS细胞)中的水平高至少10、100、1,000或10,000倍。在一些实施例中，miRNA不可检测地存在于靶细胞(例如，CNS细胞，例如本文所描述的CNS细胞)中。在一些实施例中，miRNA不存在于靶细胞(例如，CNS细胞，例如本文所描述的CNS细胞)中。
在一些方面，本公开提供了一种融合剂脂质体组合物，其包括来源于源细胞的多个融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包括：(a)脂质双层；(b)包括胞质溶胶的内腔，其中所述内腔被所述脂质双层包围；(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂；(d)包括有效负荷基因的核酸，其中所述核酸包括与所述有效负荷基因可操作地连接的启动子，其中所述启动子是CNS细胞特异性启动子，例如是对CNS细胞、泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞具有特异性的启动子；其中所述融合剂脂质体不包括细胞核；并且其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量低于总蛋白质的1％。
在一些方面，本公开提供了一种融合剂脂质体组合物，其包括来源于源细胞的多个融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包括：(a)脂质双层；(b)包括胞质溶胶的内腔，其中所述内腔被所述脂质双层包围；(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂；(d)包括有效负荷基因的核酸，其中所述核酸包括具有表3中的启动子的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的启动子；其中所述融合剂脂质体不包括细胞核；并且其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量低于总蛋白质的1％；
在一些方面，本公开提供了一种融合剂脂质体组合物，其包括来源于源细胞的多个融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包括：(a)脂质双层；(b)包括胞质溶胶的内腔，其中所述内腔被所述脂质双层包围；(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂；(d)核酸，所述核酸包括：(i)有效负荷基因；(ii)与所述有效负荷基因可操作地连接的NTCSRE，其中所述NTCSRE包括非靶细胞特异性miRNA识别序列(例如，由表4的miRNA结合的非靶细胞特异性miRNA识别序列)，以及
(iii)任选地，阳性靶细胞特异性调节元件，例如与所述有效负荷基因操作性地连接的阳性靶细胞特异性调节元件(例如，靶细胞特异性启动子)，其中相对于缺乏所述阳性靶细胞特异性调节元件的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述阳性靶细胞特异性调节元件使所述有效负荷基因在靶细胞中的表达增加，其中所述靶细胞是第一类型的CNS细胞；任选地其中所述非靶细胞是第二不同类型的CNS细胞或非CNS细胞，任选地其中：所述靶细胞是神经元，并且所述非靶细胞是神经胶质细胞(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞)，或者所述靶细胞是神经胶质细胞(例如，少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞)并且所述非靶细胞是神经元；其中所述融合剂脂质体不包括细胞核；并且其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量低于总蛋白质的1％。
在一些实施例中，以下中的一个或多个存在：i)融合剂脂质体包括细胞生物物质或由细胞生物物质所包括；ii)融合剂脂质体包括去核细胞；iii)融合剂脂质体包括失活细胞核；iv)融合剂脂质体与靶细胞融合的速率比与非靶细胞融合的速率高，例如至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，例如在实例42的分析中；v)融合剂脂质体与靶细胞融合的速率比与其它融合剂脂质体融合的速率高，例如至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，例如在实例42的分析中；vi)融合剂脂质体与靶细胞融合的速率使得所述融合剂脂质体在24、48或72小时之后递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的靶细胞，例如在实例42的分析中；vii)融合剂脂质体以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数存在，例如，如通过实例26的分析测量的；viii)融合剂脂质体以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包括治疗剂，例如，如通过实例88的分析测量的；ix)融合剂的拷贝数与治疗剂的拷贝数的比介于1,000,000:1与100,000:1、100,000:1与10,000:1、10,000:1与1,000:1、1,000:1与100:1、100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1、5:1与2:1、2:1与1:1、1:1与1:2、1:2与1:5、1:5与1:10、1:10与1:20、1:20与1:50、1:50与1:100、1:100与1:1,000、1:1,000与1:10,000、1:10,000与1:100,000或1:100,000与1:1,000,000之间；x)融合剂脂质体所包括的脂质组合物基本上类似于源细胞的脂质组合物，或者其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应的脂质水平的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％内，例如使用实例87的分析；xii)融合剂脂质体所包括的脂质与蛋白质的比在源细胞中的对应的比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如，如使用实例40的分析测量的；xiii)融合剂脂质体所包括的蛋白质与核酸(例如，DNA)的比在源细胞中的对应的比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如，如使用实例41的分析测量的；xiv)融合剂脂质体所包括的脂质与核酸(例如，DNA)的比在源细胞中的对应的比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如，如使用实例91的分析测量的；xv)融合剂脂质体在受试者中(例如，在小鼠中)的半衰期在参考细胞(例如，源细胞)的半衰期的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如通过实例60的测定；xvi)融合剂脂质体跨膜转运葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的在其它方面类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(例如，多约11.6％)，例如，如使用实例50的分析测量的；xvii)融合剂脂质体在内腔中包括的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如使用实例51的分析；xviii)融合剂脂质体包括的代谢活性水平在参考细胞(例如，源细胞)中的柠檬酸合成酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如，如实例53中所描述的；xix)融合剂脂质体包括的呼吸水平(例如，耗氧速率)在参考细胞(例如，源细胞)中的呼吸水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如，如实例54中所描述的；xx)融合剂脂质体包括最多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实例55的分析，或其中相比于实例55的分析中的用甲萘醌处理的在其它方面类似的融合剂脂质体的膜联蛋白-V染色水平，融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实例55的分析中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平；xxi)融合剂脂质体的miRNA含量水平为源细胞的所述miRNA含量水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如根据实例33的分析；xxii)融合剂脂质体的可溶性:非可溶性蛋白质比率在源细胞的所述比率的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内，例如在源细胞的所述比的1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如根据实例38的分析；xxiii)融合剂脂质体的LPS水平为源细胞的LPS含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如如通过质谱分析所测量，例如在实例39的分析中；xxiv)融合剂脂质体能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如对胰岛素做出应答的AKT磷酸化，或响应于胰岛素而摄取葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的在其它方面类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实例49的分析；xxv)融合剂脂质体在向例如小鼠的受试者施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼部，例如其中在24、48或72小时之后，在施用融合剂脂质体的群体中，至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的融合剂脂质体存在于靶组织中，例如根据实例64的分析；xxvi)融合剂脂质体的近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如根据实例56的分析；xxvii)融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如根据实例57的分析；xxviii)相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中聚合肌动蛋白的水平，融合剂脂质体以在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例58的分析；xxix)融合剂脂质体的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例59的分析，或其中融合剂脂质体具有约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV的膜电位；xxx)融合剂脂质体能够从血管外渗，例如以源细胞或与源细胞类型相同的细胞的外渗率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率，例如使用实例44的分析，例如其中所述源细胞为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或NK细胞；xxxi)融合剂脂质体能够穿过细胞膜，例如内皮细胞膜或血脑屏障；xxxii)融合剂脂质体能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的速率，例如使用实例48的分析；xxxiii)融合剂脂质体符合药物或良好制造规范(GMP)标准；xxxiv)融合剂脂质体根据良好制造规范(GMP)制备；xxxv)融合剂脂质体的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体；xxxiv)融合剂脂质体的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物；xxxvii)融合剂脂质体具有低免疫原性，例如，如本文所描述的；xxxviii)源细胞选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间质干细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元(例如，视网膜神经元细胞)；或xxxix)源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或干细胞。
在一些方面，本公开还提供了一种融合剂脂质体，其包括：a)脂质双层和可与水溶液(例如水)混溶的内腔，其中所述融合剂脂质体来源于源细胞；b)安置于所述脂质双层中的外源性或过表达的融合剂；以及c)安置于所述内腔中的细胞器，例如治疗有效数量的细胞器。
在一些实施例中，以下中的一个或多个存在：i)源细胞选自内皮细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞、干细胞(例如，间质干细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞)、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元(例如，视网膜神经细胞)；ii)细胞器选自高尔基体、溶酶体、内质网、线粒体、液泡、核内体、顶体、自噬体、中心粒、糖体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素小体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒；iii)融合剂脂质体的大小大于5μm、10μm、20μm、50μm或100μm；iv)融合剂脂质体或包括多个融合剂脂质体的组合物或制剂的密度不介于1.08g/ml与1.12g/ml之间，例如融合剂脂质体的密度为1.25g/ml+/-0.05，例如，如根据实例30的分析测量的；v)融合剂脂质体不被循环中的清洗系统或肝窦中的库普弗细胞(Kupffer cell)捕获；vi)源细胞不是293细胞；vii)源细胞没有转化或永生化；viii)源细胞转化或使用除腺病毒介导的永生化之外的方法永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达永生化；ix)融合剂不是VSVG、SNARE蛋白或分泌颗粒蛋白；x)融合剂脂质体不包括Cre或GFP，例如EGFP；xi)融合剂脂质体进一步包括除Cre或GFP之外的外源性蛋白质，例如EGFP；xii)融合剂脂质体进一步包括外源性核酸(例如RNA，例如mRNA、miRNA或siRNA)或外源性蛋白质(例如抗体，例如抗体)，例如在内腔中；或xiii)融合剂脂质体不包括线粒体。
在一些方面，本公开还提供了一种融合剂脂质体，其包括：(a)脂质双层；(b)被所述脂质双层包围的内腔(例如，包括胞质溶胶)；(c)外源性或过度表达的融合剂，例如其中所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及(d)功能性细胞核，其中所述融合剂脂质体来源于源细胞。
在一些实施例中，以下中的一个或多个存在：i)源细胞不是树突状细胞或肿瘤细胞，例如，源细胞选自内皮细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞、干细胞(例如，间质干细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞)、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞；ii)融合剂不是促融合糖蛋白；iii)融合剂是除铁蛋白-β之外的哺乳动物蛋白；iv)融合剂脂质体具有低免疫原性，例如，如本文所描述的；v)融合剂脂质体符合药物或良好制造规范(GMP)标准；vi)融合剂脂质体根据良好制造规范(GMP)制备；vii)融合剂脂质体的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体；或viii)融合剂脂质体的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物。
在一些方面，本公开还提供了一种融合剂脂质体组合物，其包括来源于源细胞的多个融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包括：(a)脂质双层；(b)包括胞质溶胶的内腔，其中所述内腔被所述脂质双层包围；(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂；(d)货物；并且其中所述融合剂脂质体不包括细胞核；其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量低于总蛋白质的1％；其中所述多个融合剂脂质体当在内吞作用的抑制剂存在下与靶细胞群接触时并当与不用内吞作用抑制剂处理的参考靶细胞群接触时，相比于参考靶细胞群，将货物递送到至少靶细胞群中30％数目的细胞。
在一些方面，本公开提供了一种融合剂脂质体组合物，其包括来源于源细胞的多个融合剂脂质体，并且其中所述多个融合剂脂质体包括：(a)脂质双层；(b)包括胞质溶胶的内腔，其中所述内腔被所述脂质双层包围；(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的重新靶向融合剂；(d)货物；并且其中所述融合剂脂质体不包括细胞核；其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量低于总蛋白质的1％；其中：(i)当所述多个融合剂脂质体与包括靶细胞和非靶细胞的细胞群接触时，货物存在于比非靶细胞或参考细胞高至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的靶细胞中，或者(ii)所述多个融合剂脂质体与靶细胞融合的速率比非靶细胞高至少50％。
在一些方面，本公开提供了一种融合剂脂质体组合物，其包括来源于源细胞的多个融合剂脂质体，并且其中所述多个融合剂脂质体包括：(a)脂质双层；(b)被所述脂质双层包围的内腔；(c)外源性或过度表达的融合剂，其中所述融合剂安置于所述脂质双层中；以及(d)货物；其中所述融合剂脂质体不包括细胞核；并且其中发生以下中的一项或多项(例如，以下中的至少2项、3项、4项或5项)：i)融合剂以至少1,000个拷贝的拷贝数存在；ii)融合剂脂质体以至少1,000个拷贝的拷贝数包括治疗剂；iii)融合剂脂质体包括脂质，其中中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应脂质水平的75％内；iv)融合剂脂质体包括与源细胞类似的蛋白质组学组成；v)融合剂脂质体能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如对胰岛素做出应答的AKT磷酸化，或响应于胰岛素而摄取葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的在其它方面类似的融合剂脂质体)多至少10％；vi)融合剂脂质体在向例如小鼠的受试者施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼部，例如其中在24小时之后，在施用融合剂脂质体的群体中，至少0.1％或10％的融合剂脂质体存在于靶组织中；或者源细胞选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间质干细胞、骨髓干细胞、诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元(例如，视网膜神经元细胞)。
在实施例中，以下中的一个或多个：i)源细胞不是293细胞；ii)源细胞没有转化或永生化；iii)源细胞转化或使用除腺病毒介导的永生化之外的方法永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达永生化；iv)融合剂不是VSVG、SNARE蛋白或分泌颗粒蛋白；v)治疗剂不是Cre或EGFP；vi)治疗剂是核酸(例如RNA，例如mRNA、miRNA或siRNA)或外源性蛋白质(例如抗体，例如抗体)，例如在内腔中；或vii)融合剂脂质体不包括线粒体。
在实施例中，以下中的一个或多个：i)源细胞不是293或HEK细胞；ii)源细胞没有转化或永生化；iii)源细胞转化或使用除腺病毒介导的永生化之外的方法永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达永生化；iv)融合剂不是病毒融合剂；或v)融合剂脂质体的大小不在40与150nm之间，例如大于150nm、200nm、300nm、400nm或500nm。
在实施例中，以下中的一个或多个：i)治疗剂是由源细胞表达的可溶蛋白质；ii)融合剂不是TAT、TAT-HA2、HA-2、gp41、阿兹海默氏β-淀粉样肽、仙台病毒蛋白或两亲性净阴性肽(WAE 11)；iii)融合剂是哺乳动物融合剂；iv)融合剂脂质体在其内腔中包括选自酶、抗体或抗病毒多肽的多肽；v)融合剂脂质体不包括外源性治疗性跨膜蛋白；或vi)融合剂脂质体不包括CD63或GLUT4，或者融合剂脂质体包括小于或等于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％的CD63(例如，约0.048％或更少)，例如，如根据实例89中所描述的方法测定的。
在实施例中，融合剂脂质体：i)不包括病毒，不是感染性的，或不在宿主细胞中繁殖；ii)不是病毒载体；iii)不是VLP(病毒样颗粒)；iv)不包括病毒结构蛋白，例如来源于糖胺聚糖的蛋白质，例如病毒衣壳蛋白，例如病毒胶囊蛋白，例如病毒核衣壳蛋白，或其中病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白质的10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，例如通过质谱分析，例如使用实例93的分析；v)不包括病毒基质蛋白；vi)不包括病毒非结构蛋白，例如pol或其片段或变体、病毒逆转录酶蛋白、病毒整合酶蛋白或病毒蛋白酶蛋白；vii)不包括病毒核酸，例如病毒RNA或病毒DNA；viii)包括小于10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝/病毒结构蛋白的囊泡；或ix)融合剂脂质体不是病毒体。
在一些实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)小于约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％病毒衣壳蛋白(例如约0.05％病毒衣壳蛋白)。在实施例中，病毒衣壳蛋白为兔内源性慢病毒(RELIK)衣壳与亲环素A的复合物。在实施例中，病毒衣壳蛋白:总蛋白质比率为(或被鉴别为)约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.1。
在一些实施例中，融合剂脂质体不包括(或被鉴别为不包括)gag蛋白或其片段或变体，或gag蛋白或其片段或变体的量小于总蛋白质的10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，例如根据实例93的分析。
在实施例中，融合剂脂质体上的融合剂的拷贝数与病毒结构蛋白的拷贝数的比率为至少1,000,000:1、100,000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1或1:1；或在100:1与50:1、50:1与20:1、20:1与10:1、10:1与5:1或1:1之间。在实施例中，融合剂脂质体上的融合剂的拷贝数与病毒基质蛋白的拷贝数的比率为至少1,000,000:1、100.000:1、10,000:1、1,000:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1或1:1。
在实施例中，以下中的一个或多个：i)融合剂脂质体不包括与水不混溶的液滴；ii)融合剂脂质体包括水性内腔和亲水性外部；iii)融合剂是蛋白质融合剂；或iv)细胞器选自高尔基体、溶酶体、内质网、线粒体、液泡、核内体、顶体、自噬体、中心粒、糖体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素小体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒。
在实施例中，以下中的一个或多个：i)融合剂是哺乳动物融合剂或病毒融合剂；ii)融合剂脂质体不能通过用治疗或诊断物质装载融合剂脂质体来制备；iii)源细胞没有装载治疗或诊断物质；iv)融合剂脂质体不包括阿霉素(doxorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、环糊精(cyclodextrin)；聚乙二醇、微RNA(例如miR125)、VEGF受体、ICAM-1、E-选择素、氧化铁)、荧光蛋白(例如GFP或RFP)、纳米颗粒或RNase，或不包括上述中的任何一种的外源性形式；或v)融合剂脂质体进一步包括具有一种或多种翻译后修饰(例如糖基化)的外源性治疗剂。
在实施例中，融合剂脂质体为单层或多层的。
在实施例中，以下中的一个或多个：i)融合剂脂质体不是外泌体；ii)融合剂脂质体是微囊泡；iii)融合剂脂质体包括非哺乳动物融合剂；iv)融合剂脂质体已经被工程化成掺入融合剂；v)融合剂脂质体包括外源性融合剂：vi)融合剂脂质体的大小为至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm，或融合剂脂质体群的平均大小为至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm；vii)融合剂脂质体包括一个或多个细胞器，例如线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、核内体、顶体、自噬体、中心粒、糖体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素小体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒；viii)融合剂脂质体包括细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、肌营养不良蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；ix)融合剂脂质体或包括多个融合剂脂质体的组合物或制剂不具有1.08–1.22g/ml的浮选密度或其密度为至少1.18–1.25g/ml或1.05–1.12g/ml，例如在蔗糖梯度离心分析中，例如，如Théry等人,“从细胞培养上清液和生物流体中分离和表征外泌体(Isolation and characterization of exosomesfrom cell culture supernatants and biological fluids)”《细胞生物学实验指南(Curr Protoc CellBiol.)》2006年4月；第3章:第3.22单元中所描述的；x)与源细胞相比，脂质双层富集神经酰胺或鞘磷脂或其组合，或与源细胞相比，脂质双层不富集(例如耗尽)糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合；xi)融合剂脂质体包括磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体两者，例如当在实例92的分析中测量时；xii)与源细胞相比，融合剂脂质体富集PS，例如，在融合剂脂质体群中，至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS呈阳性，例如根据以下文献的分析：Kanada M等人(2015)通过细胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的不同命运(Differential fates of biomoleculesdelivered to target cells via extracellular vesicles)《美国国家科学院院刊》112:E1433–E1442；xiii)融合剂脂质体基本上不含乙酰胆碱酯酶(AChE)，或含有小于0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单位/ug蛋白质，例如根据实例52的分析；xiv)融合剂脂质体基本上不含四次穿膜蛋白家族蛋白(例如，CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如，TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、线粒体内膜蛋白质、同线蛋白-1、TSG101、ADAM10、EHD4、同线蛋白-1、TSG101、EHD1、脂阀结构蛋白-1、热休克70kDa蛋白质(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，或含有少于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％或10％的任何单独的外泌体标志物蛋白和/或少于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的所述蛋白质中的任何蛋白质的总外泌体标志物蛋白质，或与源细胞细胞，去富集这些蛋白质中的一种或多种蛋白质，或不富集这些蛋白质中的任何一种或多种蛋白质，例如根据实例89的分析；xv)融合剂脂质体所包括的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平低于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/ug总蛋白质或低于源细胞中的GAPDH的水平，例如比源细胞中的以ng/ug为单位的每个总蛋白质的GAPDH的水平低小于1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例36的分析；xvi)融合剂脂质体富集一个或多个内质网蛋白(例如钙联蛋白)、一个或多个蛋白酶体蛋白、或一个或多个线粒体蛋白或其任何组合，例如其中钙联蛋白的量小于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙联蛋白/ug总蛋白质，或其中与源细胞相比，融合剂脂质体所包括的以ng/ug为单位的钙联蛋白/总蛋白质少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例37或90的分析，或其中融合剂脂质体中的钙联蛋白的平均级分含量小于约1×10-4、1.5×10-4、2×10-4、2.1×10-4、2.2×10-4、2.3×10-4、2.4×10-4、2.43×10-4、2.5×10-4、2.6×10-4、2.7×10-4、2.8×10-4、2.9×10-4、3×10-4、3.5×10-4或4×10-4，或其中融合剂脂质体所包括的钙联蛋白/总蛋白质的量比亲本细胞的钙联蛋白/总蛋白质的量低约70％、75％、80％、85％、88％、90％、95％、99％或更多；xvii)融合剂脂质体包括外源性药剂(例如，外源性蛋白质、mRNA或siRNA)，例如使用实例34的分析测量的；或xviii)融合剂脂质体可以通过原子力显微术固定在云母表面上至少30分钟，例如根据以下文献的分析：Kanada M等人(2015)通过胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的差异命运.《美国国家科学院院刊》112:E1433–E1442。
在实施例中，以下中的一个或多个：i)融合剂脂质体是外泌体；ii)融合剂脂质体不是微囊泡；iii)融合剂脂质体的大小为小于80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm，或融合剂脂质体群的平均大小为小于80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm；iv)融合剂脂质体不包括细胞器；v)融合剂脂质体不包括细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、肌营养不良蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；vi)融合剂脂质体或包括多个融合剂脂质体的组合物或制剂具有1.08–1.22g/ml的浮选密度，例如在蔗糖梯度离心分析中，例如，如Théry等人,“从细胞培养上清液和生物流体中分离和表征外泌体”《细胞生物学实验指南》2006年4月；第3章:第3.22单元中所描述的；vii)与源细胞相比，脂质双层不富集(例如耗尽)神经酰胺或鞘磷脂或其组合，或与源细胞相比，脂质双层富集糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合；viii)融合剂脂质体不包括或相对于源细胞而言耗尽磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体两者，例如当在实例92的分析中测量时；ix)与源细胞相比，融合剂脂质体不富集(例如耗尽)PS，例如，在融合剂脂质体群中，小于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS呈阳性，例如根据以下文献的分析：Kanada M等人(2015)通过细胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的不同命运《美国国家科学院院刊》112:E1433–E1442；x)融合剂脂质体包括乙酰胆碱酯酶(AChE)，例如至少0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单位/ug蛋白质，例如根据实例52的分析；xi)融合剂脂质体包括四次穿膜蛋白家族蛋白(例如，CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如，TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、线粒体内膜蛋白质、同线蛋白-1、TSG101、ADAM10、EHD4、同线蛋白-1、TSG101、EHD1、脂阀结构蛋白-1、热休克70kDa蛋白质(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，例如与源细胞相比，含有多于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％或10％的任何单独的外泌体标志物蛋白和/或少于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的所述蛋白质中的任何蛋白质的总外泌体标志物蛋白质，或富集这些蛋白质中的任何一种或多种蛋白质，例如根据实例89的分析；xii)融合剂脂质体所包括的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平高于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/ug总蛋白质或低于源细胞中的GAPDH的水平，例如比源细胞中的以ng/ug为单位的每个总蛋白质的GAPDH的水平高至少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例36的分析；xiii)融合剂脂质体不富集(例如耗尽)一个或多个内质网蛋白(例如钙联蛋白)、一个或多个蛋白酶体蛋白、或一个或多个线粒体蛋白或其任何组合，例如其中钙联蛋白的量小于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙联蛋白/ug总蛋白质，或其中与源细胞相比，融合剂脂质体所包括的以ng/ug为单位的钙联蛋白/总蛋白质少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例90的分析，或其中融合剂脂质体中的钙联蛋白的平均级分含量小于约1×10-4、1.5×10-4、2×10-4、2.1×10-4、2.2×10-4、2.3×10-4、2.4×10-4、2.43×10-4、2.5×10-4、2.6×10-4、2.7×10-4、2.8×10-4、2.9×10-4、3×10-4、3.5×10-4或4×10-4，或其中融合剂脂质体所包括的钙联蛋白/总蛋白质的量比亲本细胞的钙联蛋白/总蛋白质的量低约70％、75％、80％、85％、88％、90％、95％、99％或更多；或xiv)融合剂脂质体不可以通过原子力显微术固定在云母表面上至少30分钟，例如根据以下文献的分析：Kanada M等人(2015)通过胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的差异命运.《美国国家科学院院刊》112:E1433-E1442。
在实施例中，以下中的一个或多个：i)融合剂脂质体不包括VLP；ii)融合剂脂质体不包括病毒；iii)融合剂脂质体不包括具有复制能力的病毒；iv)融合剂脂质体不包括病毒蛋白，例如病毒结构蛋白，例如衣壳蛋白或病毒基质蛋白；v)融合剂脂质体不包括来自包膜病毒的衣壳蛋白；vi)融合剂脂质体不包括核衣壳蛋白；或vii)融合剂不是病毒融合剂。
在实施例中，融合剂脂质体包括胞质溶胶。
在实施例中，以下中的一个或多个：i)融合剂脂质体或源细胞在植入受试者体内时不形成畸胎瘤，例如根据实例65的分析；ii)融合剂脂质体具有趋化性，例如在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内或比参考细胞(例如，巨噬细胞)高，使用实例45的分析；iii)融合剂脂质体能够例如在损伤部位处归巢，其中所述融合剂脂质体或细胞生物物质来自人类细胞，例如使用实例46的分析，例如其中源细胞是嗜中性粒细胞；或iv)融合剂脂质体具有吞噬作用，例如其中在使用实例47的分析中的0.5、1、2、3、4、5或6小时内可检测到所述融合剂脂质体的吞噬作用，例如其中源细胞是巨噬细胞。
在实施例中，在向受试者(例如人类受试者)施用之后，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物保留任何特征中的一、二、三、四、五、六个或更多个持续5天或更短，例如4天或更短、3天或更短、2天或更短、1天或更短，例如约12-72小时。
在实施例中，融合剂脂质体具有以下特征中的一个或多个特征：a)包括一种或多种来自源细胞的内源性蛋白，例如膜蛋白或胞质蛋白；b)包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的蛋白质；c)包括至少1、2、5、10、20、50或100种不同的糖蛋白；d)融合剂脂质体中的蛋白质的质量的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％是天然存在的蛋白质；e)包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的RNA；或f)包括至少2、3、4、5、10或20种不同的脂质，例如选自CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG。
在实施例中，融合剂脂质体已经被操纵成具有、或融合剂脂质体不是天然存在的细胞并且具有、或其中细胞核并非天然具有以下特性中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个特性：a)部分核灭活导致核功能减少至少50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如，转录或DNA复制或两者减少，例如其中转录是根据实例24的分析测量的并且DNA复制是根据实例25的分析测量的；b)融合剂脂质体无法进行转录或其转录活性为参考细胞(例如，源细胞)的转录活性的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例24的分析；c)融合剂脂质体无法进行核DNA复制或其核DNA复制为参考细胞(例如，源细胞)的核DNA复制的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例25的分析；d)融合剂脂质体缺乏染色质或其染色质含量低于参考细胞(例如，源细胞)染色质含量的1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例32的分析；e)融合剂脂质体缺乏核膜或其核膜量为参考细胞(例如，源细胞或Jurkat细胞)的小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％，例如根据实例31的分析；f)融合剂脂质体缺乏功能性核孔复合物或其核输入或输出活性减少例如至少50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％，根据实例31的分析，或融合剂脂质体缺乏核孔蛋白中的一个或多个(例如，NUP98或输入蛋白7)；g)融合剂脂质体不包括组蛋白或其组蛋白水平小于源细胞的组蛋白水平(例如，H1、H2a、H2b、H3或H4)的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如根据实例32的分析；h)融合剂脂质体包括小于20、10、5、4、3、2或1条染色体；i)核功能被消除；j)融合剂脂质体是去核的哺乳动物细胞；k)核被去除或灭活，例如通过机械力挤压、通过辐射或通过化学烧蚀；或l)融合剂脂质体来自哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞的DNA在间期或有丝分裂期间被完全或部分去除。
在实施例中，融合剂脂质体包括mtDNA或载体DNA。在实施例中，融合剂脂质体不包含DNA。
在实施例中，源细胞是初级细胞、永生化细胞或细胞系(例如成髓细胞细胞系，例如C2C12)。在实施例中，融合剂脂质体来自具有经修饰的基因组，例如具有降低的免疫原性(例如通过基因组编辑，例如以去除MHC蛋白或MHC复合物)的源细胞。在实施例中，源细胞来自用抗炎性信号处理的细胞培养物。在实施例中，源细胞来自用免疫抑制剂处理的细胞培养物。在实施例中，源细胞为基本上非免疫原性的，例如使用本文所描述的分析。在实施例中，源细胞包含外源药剂，例如治疗剂。在实施例中，源细胞为重组细胞。
在实施例中，融合剂脂质体还包含外源药剂，例如治疗剂，例如蛋白质或核酸(例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA，例如mRNA或miRNA)。在实施例中，外源药剂以至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝存在，例如由融合剂脂质体所包含，或以至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝/融合剂脂质体的平均水平存在。在实施例中，融合剂脂质体具有改变的(例如提高或降低的)水平的一种或多种内源分子，例如蛋白质或核酸，例如由用siRNA或基因编辑酶处理哺乳动物细胞所致。在实施例中，内源分子以例如至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝(例如由融合剂脂质体所包含的拷贝)的平均水平存在，或以至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝/融合剂脂质体的平均水平存在。在实施例中，内源分子(例如RNA或蛋白质)以比其于源细胞中的浓度大至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106、1.0×107、5.0×107或1.0×108的浓度存在。
在实施例中，活性剂是选自蛋白质、蛋白质复合物(例如，包含至少2、3、4、5、10、20或50种蛋白质，例如，至少至少2、3、4、5、10、20或50种不同的蛋白质)多肽、核酸(例如DNA、染色体或RNA，例如mRNA、siRNA或miRNA)或小分子。在实施例中，外源药剂包含位点特异性核酸酶，例如Cas9分子、TALEN或ZFN。
在实施例中，融合剂为病毒融合剂，例如HA、HIV-1ENV、HHV-4、gp120或VSV-G。在实施例中，融合剂为哺乳动物融合剂，例如SNARE、合胞素、成肌蛋白、肌混合蛋白、肌合并蛋白或FGFRL1。在实施例中，融合剂在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下具有活性。在实施例中，融合剂在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下不具有活性。在实施例中，融合剂脂质体在靶细胞的表面处融合到靶细胞。在实施例中，融合剂以溶酶体非依赖性方式促进融合。在实施例中，融合剂是蛋白质融合剂。在实施例中，融合剂为脂质融合剂，例如油酸、单油酸甘油酯、甘油酯、二酰甘油或经改性的不饱和脂肪酸。在实施例中，融合剂为化学融合剂，例如PEG。在实施例中，融合剂为小分子融合剂，例如氟烷，NSAID，如美洛昔康、吡罗昔康、替诺昔康和氯丙嗪。在实施例中，融合剂为重组的。在实施例中，融合剂以生物化学方式并入，例如融合剂以纯化蛋白的形式提供并在允许融合剂与脂质双层缔合的条件下与脂质双层接触。在实施例中，融合剂以生物合成方式并入，例如在允许融合剂与脂质双层结合的条件下在源细胞中表达。
在实施例中，融合剂脂质体结合靶细胞。在实施例中，靶细胞不是HeLa细胞，或靶细胞未被转化或永生化。
在涉及融合剂脂质体组合物的一些实施例中，多个融合剂脂质体是相同的。在一些实施例中，多个融合剂脂质体是不同的。在一些实施例中，多个融合剂脂质体是来自一个或多个源细胞。在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体的直径在融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均直径的10％、20％、30％、40％或50％内。在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体的体积在融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均体积的10％、20％、30％、40％或50％内。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物具有源细胞群的大小分布变化率的10％、50％或90％内的小于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％的大小分布变化率，例如基于实例28。在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体的融合剂拷贝数在融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均融合剂拷贝数的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％内。在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体的治疗剂拷贝数在融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均治疗剂拷贝数的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％内。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物包含至少105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个或更多个融合剂脂质体。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物的体积为至少1μl、2μl、5μl、10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、500μl、1ml、2ml、5ml或10ml。
在一些实施例中，相比于参考靶细胞群，融合剂脂质体组合物将货物递送到靶细胞群体中至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％数目的细胞中。
在一些实施例中，相比于参考靶细胞群或非靶细胞群，融合剂脂质体组合物将至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的货物递送到靶细胞群中。在一些实施例中，相比于参考靶细胞群或非靶细胞群，融合剂脂质体组合物将多至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的货物递送到靶细胞群中。
在一些实施例中，低于10％的货物通过内吞作用进入细胞。
在一些实施例中，内吞作用的抑制剂为溶酶体酸化的抑制剂，例如巴弗洛霉素A1。在一些实施例中，内吞作用的抑制剂为发动蛋白抑制剂，例如Dynasore。
在一些实施例中，靶细胞群在生理pH下(例如在7.3-7.5之间，例如在7.38-7.42之间)。
在一些实施例中，使用内吞作用抑制分析，例如实例80的分析来确定所递送的货物。
在一些实施例中，货物通过发动蛋白非依赖性途径或溶酶体酸化非依赖性途径、巨胞饮非依赖性途径(例如，其中内吞作用的抑制剂为巨胞饮抑制剂，例如5-(N-乙基-N-异丙基)胺氯吡脒(EIPA)，例如浓度为25μM)或肌动蛋白非依赖性途径(例如，其中内吞作用的抑制剂为肌动蛋白聚合抑制剂，例如Latrunculin B，例如浓度为6μM)进入细胞。
在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体进一步包括靶向部分。在实施例中，靶向部分被融合剂包含或被独立分子包含。
在一些实施例中，当所述多个融合剂脂质体与包含靶细胞和非靶细胞的细胞群接触时，相比于非靶细胞，货物存在于多至少10倍的靶细胞中。
在一些实施例中，当所述多个融合剂脂质体与包含靶细胞和非靶细胞的细胞群接触时，货物存在于比非靶细胞高至少2倍、5倍、10倍、20倍或50倍的靶细胞中和/或货物存在于比参考细胞高至少2倍、5倍、10倍、20倍或50倍的靶细胞中。
在一些实施例中，与非靶细胞相比，所述多个融合剂脂质体以高至少50％的速率与靶细胞融合。
在一些实施例中，当与靶细胞群接触时，融合剂脂质体将货物递送到除内体或溶酶体以外的靶细胞位置，例如胞质溶胶。在实施例中，将少于50％、40％、30％、20％或10％的货物递送到内体或溶酶体。
在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体包含外泌体、微囊泡或其组合。
在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体的平均大小为至少50nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm。在其它实施例中，所述多个融合剂脂质体的平均大小为小于100nm、80nm、60nm、40nm或30nm。
在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)包括哺乳动物融合剂。在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)包括病毒融合剂。在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)为蛋白质融合剂。在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)包括选自以下的序列：尼帕病毒(Nipah virus)蛋白F、麻疹病毒(measles virus)F蛋白、树鼩副粘病毒(tupaia paramyxovirus)F蛋白、副粘病毒(paramyxovirus)F蛋白、亨德拉病毒(Hendravirus)F蛋白、亨尼帕病毒(Henipavirus)F蛋白、麻疹病毒(Morbilivirus)F蛋白、呼吸道病毒(respirovirus)F蛋白、仙台病毒(Sendai virus)F蛋白、腮腺炎病毒(rubulavirus)F蛋白或禽腮腺炎病毒(avulavirus)F蛋白或其衍生物。
在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下具有活性。在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下不具有活性。
在一些实施例中，融合剂以至少1、2、5或10个拷贝/融合剂脂质体的拷贝数存在。
在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)包含尼帕病毒蛋白G、麻疹蛋白H、树鼩副粘病毒H蛋白、副粘病毒G蛋白、副粘病毒H蛋白、副粘病毒HN蛋白、麻疹病毒H蛋白、呼吸道病毒HN蛋白、仙台HN蛋白、腮腺炎病毒HN蛋白、禽腮腺炎病毒HN蛋白或其衍生物。在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)包含选自以下的序列：尼帕病毒F和G蛋白、麻疹病毒F和H蛋白、树鼩副粘病毒F和H蛋白、副粘病毒F和G蛋白或F和H蛋白或F和HN蛋白、亨德拉病毒F和G蛋白、亨尼帕病毒F和G蛋白、麻疹病毒F和H蛋白、呼吸道病毒F和HN蛋白、仙台病毒F和HN蛋白、腮腺炎病毒F和HN蛋白或禽腮腺炎病毒F和HN蛋白，或其衍生物，或其任何组合。
在一些实施例中，货物包含外源蛋白或外源核酸。在一些实施例中，货物包含或编码胞质蛋白。在一些实施例中，货物包含或编码膜蛋白。在一些实施例中，货物包括治疗剂。在一些实施例中，货物以至少1、2、5、10、20、50、100或200个拷贝/融合剂脂质体(例如至多约1,000个拷贝/融合剂脂质体)的拷贝数存在。在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)的拷贝数与货物的拷贝数的比率在1000:1与1:1之间、或在500:1与1:1之间、或在250:1与1:1之间、或在150:1与1:1之间、或在100:1与1:1之间、或在75:1与1:1之间、或在50:1与1:1之间、或在25:1与1:1之间、或在20:1与1:1之间、或在15:1与1:1之间、或在10:1与1:1之间、或在5:1与1:1之间、或在2:1与1:1之间、或在1:1与1:2之间。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物包括病毒衣壳蛋白或DNA整合多肽。在一些实施例中，货物包括病毒基因组。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物能够将核酸递送到靶细胞，例如以稳定地修饰靶细胞的基因组，例如用于基因疗法。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物不包括病毒核衣壳蛋白，或病毒核衣壳蛋白的量为总蛋白质的小于10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，例如根据质谱分析，例如使用实例93的分析。
在实施例中，融合剂脂质体组合物包括至少105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个融合剂脂质体。在实施例中，融合剂脂质体组合物包含至少10ml、20ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1L、2L、5L、10L、20L或50L。
在实施例中，融合剂脂质体来自哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞具有经修饰的基因组，例如以降低免疫原性(例如通过基因组编辑，例如以去除MHC蛋白或MHC复合物)。在实施例中，源细胞来自用抗炎性信号处理的细胞培养物。在实施例中，方法进一步包括使步骤a)的源细胞与免疫抑制剂或抗炎信号接触，例如在使细胞核灭活，例如使细胞去核之前或之后。
在一个方面，本文提供一种融合剂脂质体组合物，其包括多个来源于源细胞的融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包括：(a)脂质双层；(b)包括胞质溶胶的内腔，其中所述内腔被所述脂质双层包围；(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂；(d)货物；并且其中所述融合剂脂质体不包括细胞核；其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量低于总蛋白质的1％；其中所述多个融合剂脂质体当在内吞作用的抑制剂存在下与靶细胞群接触时并当与不用内吞作用抑制剂处理的参考靶细胞群接触时，相比于参考靶细胞群，将货物递送到至少靶细胞群中30％数目的细胞。
在实施例中，相比于参考靶细胞群或非靶细胞群，所述融合剂脂质体组合物将货物递送到靶细胞群中至少40％、50％、60％、70％、或80％数目的细胞；或相比于参考靶细胞群或非靶细胞群，其将货物(例如至少40％、50％、60％、70％或80％的货物)递送到靶细胞群。在实施例中，低于10％的货物通过内吞作用进入细胞。在实施例中，所述内吞作用抑制剂为溶酶体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1。在实施例中，使用内吞作用抑制分析，例如实例80的分析来确定所递送的货物。在实施例中，货物通过发动蛋白非依赖性途径或溶酶体酸化非依赖性途径、巨胞饮非依赖性途径(例如，其中内吞作用的抑制剂为巨胞饮抑制剂，例如5-(N-乙基-N-异丙基)胺氯吡脒(EIPA)，例如浓度为25μM)或肌动蛋白非依赖性途径(例如，其中内吞作用的抑制剂为肌动蛋白聚合抑制剂，例如Latrunculin B，例如浓度为6μM)进入细胞。
C.融合剂和假型化
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如，包括囊泡或细胞的一部分)包含一种或多种融合剂，例如以促进融合剂脂质体与膜(例如，细胞膜)的融合。这些组合物还可以包含在合成期间或之后进行的表面修饰以包含一种或多种融合剂。表面修饰可以包括对膜的修饰，例如将脂质或蛋白质插入到膜中。
在一些实施例中，融合剂脂质体在其外表面上包括一种或多种融合剂(例如整合到细胞膜中)以靶向特定细胞或组织类型(例如，CNS细胞)。在一些实施例中，一种或多种融合剂靶向的特异性细胞类型是CNS细胞、泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞。融合剂脂质体可以包括靶向结构域。融合剂包含(但不限于)：基于蛋白质、基于脂质和基于化学物质的融合剂。融合剂可以结合靶细胞的表面上的配偶体(例如，特征)。在一些实施例中，靶细胞的表面上的配偶体是靶细胞部分。在特定实施例中，融合剂是与来自CNS细胞、泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞靶细胞结合的融合剂或重新靶向融合剂。在一些实施例中，包括融合剂的融合剂脂质体会将膜整合到靶细胞的脂质双层中。在一些实施例中，本文所描述的融合剂中的一种或多种可以包含于融合剂脂质体中。
本文所描述的融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体)可以包括融合剂，例如内源性融合剂或假型化融合剂。
i)蛋白质融合剂
在一些实施例中，融合剂包括蛋白质(例如，糖蛋白)、脂质或小分子。融合剂可以是例如哺乳动物融合剂或病毒融合剂。在一些实施例中，融合剂是蛋白质融合剂，例如哺乳动物蛋白质或哺乳动物蛋白质同源物(例如具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性)；非哺乳动物蛋白质，如病毒蛋白质或病毒蛋白质同源物(例如具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性)；原生蛋白质或原生蛋白质衍生物；合成蛋白质；其片段；其变体；包括一种或多种融合剂或片段的蛋白质融合物，以及其任何组合。在一些实施例中，病毒融合剂是I类病毒膜融合蛋白、II类病毒膜蛋白、III类病毒膜融合蛋白、病毒膜糖蛋白或其它病毒融合蛋白，或其同源物、其片段、其变体或包括一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。
在实施例中，融合剂为病毒融合剂，例如HA、HIV-1ENV、HHV-4、gp120或VSV-G。在实施例中，融合剂为哺乳动物融合剂，例如SNARE、合胞素、成肌蛋白、肌混合蛋白、肌合并蛋白或FGFRL1。在实施例中，融合剂在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下具有活性。在实施例中，融合剂在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下不具有活性。在实施例中，融合剂脂质体在靶细胞的表面处融合到靶细胞。在实施例中，融合剂以溶酶体非依赖性方式促进融合。在实施例中，融合剂是蛋白质融合剂。在实施例中，融合剂为脂质融合剂，例如油酸、单油酸甘油酯、甘油酯、二酰甘油或经改性的不饱和脂肪酸。在实施例中，融合剂为化学融合剂，例如PEG。在实施例中，融合剂为小分子融合剂，例如氟烷，NSAID，如美洛昔康、吡罗昔康、替诺昔康和氯丙嗪。在实施例中，融合剂为重组的。在实施例中，融合剂以生物化学方式并入，例如融合剂以纯化蛋白的形式提供并在允许融合剂与脂质双层缔合的条件下与脂质双层接触。在实施例中，融合剂以生物合成方式并入，例如在允许融合剂与脂质双层结合的条件下在源细胞中表达。
在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)包括哺乳动物融合剂。在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)包括病毒融合剂。在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)为蛋白质融合剂。在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)包括选自以下的序列：尼帕病毒蛋白F、麻疹病毒F蛋白、树鼩副粘病毒F蛋白、副粘病毒F蛋白、亨德拉病毒F蛋白、亨尼帕病毒F蛋白、麻疹病毒F蛋白、呼吸道病毒F蛋白、仙台病毒F蛋白、腮腺炎病毒F蛋白或禽腮腺炎病毒F蛋白或其衍生物。
在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下具有活性。在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下不具有活性。
在一些实施例中，融合剂以至少1、2、5或10个拷贝/融合剂脂质体的拷贝数存在。
在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)包含尼帕病毒蛋白G、麻疹蛋白H、树鼩副粘病毒H蛋白、副粘病毒G蛋白、副粘病毒H蛋白、副粘病毒HN蛋白、麻疹病毒H蛋白、呼吸道病毒HN蛋白、仙台HN蛋白、腮腺炎病毒HN蛋白、禽腮腺炎病毒HN蛋白或其衍生物。在一些实施例中，融合剂(例如重新靶向融合剂)包括选自以下的序列：尼帕病毒F和G蛋白、麻疹病毒F和H蛋白、树鼩副粘病毒F和H蛋白、副粘病毒F和G蛋白或F和H蛋白或F和HN蛋白、亨德拉病毒F和G蛋白、亨尼帕病毒F和G蛋白、麻疹病毒F和H蛋白、呼吸道病毒F和HN蛋白、仙台病毒F和HN蛋白、腮腺炎病毒F和HN蛋白或禽腮腺炎病毒F和HN蛋白、或其衍生物或其任何组合。
非哺乳动物融合剂包含病毒融合剂、其同源物、其片段和包括一种或多种蛋白质或其片段的融合蛋白。病毒融合剂包括I类融合剂、II类融合剂、III类融合剂和IV类融合剂。在实施例中，I类融合剂(例如人类免疫缺陷病毒(HIV)gp41)具有特征性的融合后构形，其具有中心卷绕的卷曲结构的α-螺旋发夹的标志三聚体。I类病毒融合蛋白包含具有中心融合后六螺旋束的蛋白质。I类病毒融合蛋白包括流感HA、副流感F、HIV Env、埃博拉GP、来自正粘病毒的血球凝集素、来自副粘病毒的F蛋白(例如麻疹(Katoh等人，《BMC生物技术(BMC Biotechnology)》2010，10:37))、来自逆转录病毒的ENV蛋白，以及丝状病毒和冠状病毒的融合剂。在实施例中，II类病毒融合剂(如登革热E糖蛋白)的结构标志是β片，其形成细长的胞外结构域，所述胞外结构域再折叠以产生发夹三聚体。在实施例中，II类病毒融合剂缺乏中心卷绕的卷曲。II类病毒融合剂可以发现于α病毒(例如E1蛋白)和黄病毒(例如E糖蛋白)中。II类病毒融合剂包括来自胜利基森林病毒、辛比斯(Sinbis)、风疹病毒和登革热病毒的融合剂。在实施例中，III类病毒融合剂(如水泡性口炎病毒G糖蛋白)将I类和II类中发现的结构标志组合。在实施例中，III类病毒融合剂包含α螺旋(例如与I类病毒融合剂一样形成六螺旋束以折叠蛋白质)和在其末端具有两亲性融合肽的β片，使人联想到II类病毒融合剂。III类病毒融合剂可以发现于棒状病毒和疱疹病毒中。在实施例中，IV类病毒融合剂是融合相关的小跨膜(FAST)蛋白(数字对象标识符：10.1038/sj.emboj.7600767，Nesbitt,Rae L.，“使用以多官能FAST蛋白配制的脂质体进行的靶向细胞内治疗性递送(Targeted Intracellular Therapeutic Delivery Using Liposomes Formulated withMultifunctional FAST proteins)”(2012).电子论文和学位论文库(Electronic Thesisand Dissertation Repository).论文388)，其由非包膜呼肠孤病毒编码。在实施例中，IV类病毒融合剂足够小以致其不形成发夹(doi：10.1146/annurev-cellbio-101512-122422，doi：10.1016/j.devcel.2007.12.008)。
包含病毒包膜蛋白(env)的融合剂通常决定了可以被融合剂脂质体感染和转化的宿主细胞的范围。在慢病毒(如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV)的情况下，原生env蛋白包括gp41和gp120。在一些实施例中，由本文所描述的源细胞表达的病毒env蛋白在单独的载体上由病毒gag和pol基因编码，如此前已描述。
可以使用的逆转录病毒衍生的env基因的说明性实例包括(但不限于)：MLV包膜、10A1包膜、BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、埃博拉(Ebola)、仙台(Sendai)、禽瘟疫病毒(Fowlplague virus；FPV)和流感病毒包膜。类似地，可以利用编码来自以下病毒的包膜的基因：RNA病毒(例如，小RNA病毒科(Picornaviridae)、杯状病毒科(Calciviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)的RNA病毒)，以及DNA病毒(嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、环状病毒科(Circoviridae)、微小病毒科(Parvoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxyiridae)和虹彩病毒科(Iridoviridae))。代表性实例包括FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10和EIAV。
在一些实施例中，呈现于融合剂脂质体上的包膜蛋白包括(但不限于)以下来源中的任一种：甲型流感(如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感))、乙型流感、丙型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒组(Norwalk virus group)的任何病毒、肠溶腺病毒、细小病毒、登革热(Denguefever)病毒、猴痘、单链负义病毒目(Mononegavirales)、狂犬病毒属(Lyssavirus)(如狂犬病病毒)、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat virus)、莫科拉病毒(Mokola virus)、杜文黑基病毒(Duvenhage virus)、欧洲蝙蝠病毒1与2和澳大利亚蝙蝠病毒、短暂热病毒属(Ephemerovirus)、水泡病毒属(Vesiculovirus)、水泡性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒1型和2型)、水痘带状疱疹、巨细胞病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Bar virus，EBV)、人类疱疹病毒(HHV)、人类疱疹病毒6型和8型、人类免疫缺陷病毒(HIV)、乳头瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒病毒(如阿根廷出血热病毒、玻利维亚出血热病毒、萨比亚(Sabia)相关的出血热病毒、委内瑞拉出血热病毒、拉沙热病毒(Lassa fever virus)、马丘波病毒(Machupo virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、布尼亚病毒科(Bunyaviridiae)(如克里米亚-刚果(Crimean-Congo)出血热病毒)、汉坦病毒(Hantavirus)、导致出血热与肾综合征的病毒、裂谷(Rift Valley)热病毒、丝状病毒科(丝状病毒)(包括埃博拉出血热和马堡(Marburg)出血热)、黄病毒科(包括卡依萨努森林病(Kaysanur Forest disease)病毒)、鄂木斯克(Omsk)出血热病毒、导致蜱传脑炎的病毒和副粘病毒科(如亨德拉病毒(Hendra virus)和尼帕病毒(Nipah virus)、重型天花和轻型天花(天花))、甲病毒(alphavirus)(如委内瑞拉马脑炎病毒)、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗病毒(West Nile virus)、任何导致脑炎的病毒。
在一些实施例中，本文所描述的源细胞产生融合剂脂质体，例如使用VSV-G糖蛋白假型化的重组逆转录病毒，例如慢病毒。
融合剂脂质体或假型化病毒的一种或多种包膜蛋白通常已被修饰，例如包膜蛋白被来自另一种病毒的包膜蛋白取代。举例来说，HIV可以通过来自例如水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白的棒状病毒的融合蛋白假型化，从而允许HIV感染更广泛范围的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常使病毒靶向CD4+呈递细胞。在一些实施例中，慢病毒包膜蛋白通过VSV-G假型化。在一个实施例中，源细胞产生了重组逆转录病毒，例如慢病毒，所述病毒通过VSV-G包膜糖蛋白假型化。
另外，融合剂或病毒包膜蛋白可以被修饰或工程改造以含有多肽序列，所述多肽序列允许转导载体以靶向并感染其正常范围之外的宿主细胞，或更具体地说，将转导局限于一定的细胞或组织类型。举例来说，融合剂或包膜蛋白可以与靶向序列同框接合，如受体配体、抗体(使用抗体或重组抗体型分子的抗原结合部分，如单链抗体)，和其多肽部分或修饰(例如其中糖基化位点存在于靶向序列中)，所述靶向序列当在转导载体包衣上呈现时，促进病毒粒子颗粒定向递送到所关注的靶细胞。此外，包膜蛋白可以还包含调节细胞功能的序列。用转导载体调节细胞功能可以增加或降低混合细胞群中某些细胞类型的转导效率。举例来说，干细胞可以更具体地说用含有包膜序列的配体或结合搭配物转导，所述配体或结合搭配物特异性地结合到干细胞，而非血液或骨髓中找到的其它细胞类型。非限制性实例是干细胞因子(SCF)和Flt-3配体。其它实例包含例如抗体(例如，对一定细胞类型具有特异性的单链抗体)，和基本上任何结合肺、肝脏、胰脏、心脏、内皮细胞、平滑肌、乳房、前列腺、上皮、血管癌等组织的抗原(包含受体)。
可以通过使融合蛋白或靶向蛋白(例如红血球凝集素蛋白)中的氨基酸残基突变来重新靶向蛋白质融合剂或病毒包膜蛋白。在一些实施例中，使融合剂随机突变。在一些实施例中，使融合剂被合理地突变。在一些实施例中，使融合剂经历定向演化。在一些实施例中，融合剂被截短并且逆转录病毒载体或VLP中仅使用肽的亚群。举例来说，可以使麻疹红血球凝集素蛋白中的氨基酸残基突变以改变蛋白质的结合特性，从而使融合重定向(doi：10.1038/nbt942,《分子治疗学》第16卷,第8期,1427-1436 2008年8月,doi:10.1038/nbt1060,DOI:10.1128/JVI.76.7.3558–3563.2002,DOI:10.1128/JVI.75.17.8016–8020.2001,doi:10.1073pnas.0604993103)。
在一些实施例中，蛋白质融合剂或病毒包膜蛋白是通过以下再靶向i)突变氨基酸驻留于天然融合剂蛋白质序列或病毒包膜蛋白序列中和/或ii)工程改造融合剂蛋白或病毒包膜蛋白以含有允许融合剂或病毒包膜蛋白靶向并且融合或感染其正常范围外的宿主细胞的的多肽序列。
在一些实施例中，融合剂脂质体在其外表面上包括一种或多种融合剂(例如整合到细胞膜中)以靶向特定细胞或组织类型。融合剂包括(但不限于)：基于蛋白质、基于脂质和基于化学物质的融合剂。融合剂可以结合靶细胞表面上的搭配物。在一些实施例中，包含融合剂的融合剂脂质体会将膜整合到靶细胞的脂质双层中。
在一些实施例中，融合剂是副粘病毒融合剂。在一些实施例中，融合剂是尼帕病毒蛋白F、麻疹病毒F蛋白、树鼩副粘病毒F蛋白、副粘病毒F蛋白、亨德拉病毒F蛋白、亨尼帕病毒F蛋白、麻疹病毒F蛋白、呼吸道病毒F蛋白、仙台病毒F蛋白、腮腺炎病毒F蛋白或禽腮腺炎病毒F蛋白。
在一些实施例中，融合剂是痘病毒科融合剂。
其它示例性融合剂公开于US 9,695,446、US 2004/0028687、US 6,416,997、US 7,329,807、US 2017/0112773、US 2009/0202622、WO 2006/027202和US 2004/0009604中，所述文献的全部的完整内容特此以引用的方式并入。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括表1的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括与表1的任何氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码表1的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括SEQ ID NO:1-57中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括与SEQ ID NO:1-57中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码SEQ ID NO:1-57中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
表1：副粘病毒F序列群集.第1列：基因库ID，包含病毒的完整基因组序列的基因库ID，所述完整基因组序列是群集的中心序列。第2列：CDS核苷酸，提供了与完整基因组中的基因的CDS对应的核苷酸。第3列：全基因名称，提供了基因的全称，包含基因库ID、病毒物种、病毒株和蛋白质名称。第4列：序列，提供了基因的氨基酸序列。第5列：序列/群集编号，提供了以这个中心序列群集的序列的编号。
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在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括表2的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂包含与表2的任何氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码表2的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括SEQ ID NO:58-133中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂包括与SEQ ID NO:58-133中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码SEQ ID NO:58-133中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
表2：副粘病毒蛋白G、H和HN序列群集。第1列：基因库ID，包括病毒的完整基因组序列的基因库ID，所述完整基因组序列是群集的中心序列。第2列：CDS核苷酸，提供了与完整基因组中的基因的CDS对应的核苷酸。第3列：全基因名称，提供了基因的全称，包括基因库ID、病毒物种、病毒株和蛋白质名称。第4列：序列，提供了基因的氨基酸序列。
第5列：序列/群集编号，提供了以这个中心序列群集的序列的编号。
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ii)脂质融合剂
在一些实施例中，融合剂脂质体可以用促融合脂质(如饱和脂肪酸)处理。在一些实施例中，饱和脂肪酸具有10-14个碳。在一些实施例中，饱和脂肪酸具有更长链的羧酸。在一些实施例中，饱和脂肪酸是单酯。
在一些实施例中，融合剂脂质体可以用不饱和脂肪酸处理。在一些实施例中，不饱和脂肪酸具有C16与C18之间的不饱和脂肪酸。在一些实施例中，不饱和脂肪酸包括油酸、单油酸甘油酯、甘油酯、二酰甘油、改性不饱和脂肪酸和其任何组合。
不希望被理论所束缚，在一些实施例中，负曲率脂质促进膜融合。在一些实施例中，融合剂脂质体在膜中包括一种或多种负曲率脂质，例如相对于源细胞是外源性的负曲率脂质。在实施例中，将负曲率脂质或其前体添加到包括源细胞或融合剂脂质体的培养基。在实施例中，源细胞经工程改造以表达或过度表达一种或多种脂质合成基因。负曲率脂质可以是例如二酰甘油(DAG)、胆固醇、磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)或脂肪酸(FA)。
不希望被理论所束缚，在一些实施例中，正曲率脂质抑制膜融合。在一些实施例中，融合剂脂质体在膜中包含降低水平的一种或多种正曲率脂质，例如外源性正曲率脂质。在实施例中，通过抑制脂质合成，例如通过源细胞中的脂质合成基因的基因敲除或基因敲落来降低水平。正曲率脂质可以是例如溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(PtdIns)、溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)或单酰基甘油(MAG)。
iii)化学融合剂
在一些实施例中，融合剂脂质体可以用融合化学物质处理。在一些实施例中，融合化学物质为聚乙二醇(PEG)或其衍生物。
在一些实施例中，化学融合剂诱导两个膜之间的局部脱水，这导致双层的不利分子堆积。在一些实施例中，化学融合剂诱导脂质双层附近区域的脱水，导致两个细胞之间的水分子移位并允许两个膜之间相互作用。
在一些实施例中，化学融合剂是阳离子。阳离子的一些非限制性实例包括Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、La3+、Sr3+和H+。
在一些实施例中，化学融合剂通过改变表面极性而结合到靶膜，其改变了水合依赖性膜间排斥。
在一些实施例中，化学融合剂为可溶脂溶性的。一些非限制性实例包括油酰甘油、二油酰甘油、三油酰甘油以及其变异体和衍生物。
在一些实施例中，化学融合剂是水溶性化学物质。一些非限制性实例包括聚乙二醇、二甲亚砜以及其变异体和衍生物。
在一些实施例中，化学融合剂是有机小分子。非限制性实例包括正己基溴化物。
在一些实施例中，化学融合剂不改变融合剂或靶膜的构成、细胞活力或离子迁移特性。
在一些实施例中，化学融合剂是激素或维生素。一些非限制性实例包括脱落酸、视黄醇(维生素A1)、生育酚(维生素E)以及其变异体和衍生物。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含肌动蛋白和使聚合的肌动蛋白稳定的药剂。不希望被理论所束缚，融合剂脂质体中的稳定的肌动蛋白可以促进与靶细胞的融合。在实施例中，使聚合的肌动蛋白稳定的药剂是选自肌动蛋白、肌球蛋白、生物素-抗生蛋白链菌素、ATP、神经元韦斯考特-奥德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)蛋白(N-WASP)或形成蛋白。参见例如Langmuir.2011年8月16日；27(16):10061-71和Wen等人，《自然通信(Nat Commun.)》2016年8月31日；7。在实施例中，融合剂脂质体包括相对于源细胞是外源性或过度表达的肌动蛋白，例如野生型肌动蛋白或包括促进聚合的突变的肌动蛋白。在实施例中，融合剂脂质体包括ATP或磷酸肌酸，例如外源性ATP或磷酸肌酸。
iv)小分子融合剂
在一些实施例中，融合剂脂质体可以用融合小分子处理。一些非限制性实例包括卤烷、非类固醇消炎药(NSAID)，如美洛昔康(meloxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、替诺昔康(tenoxicam)和氯丙嗪(chlorpromazine)。
在一些实施例中，小分子融合剂可以胶束状聚集体存在或不含聚集体。
v)融合剂修饰
在一些实施例中，融合剂与可切割蛋白质连接。在一些情况下，可切割蛋白质可以通过暴露于蛋白酶而被切割。经工程化的融合蛋白可以结合跨膜蛋白的任何结构域。经工程化的融合蛋白可以通过切割肽与位于膜间空间内的蛋白质结构域连接。切割肽可以被一种或多种膜间蛋白酶组合(例如，需要非极性脂肪族氨基酸的HTRA2/OMI-缬氨酸、异亮氨酸或蛋氨酸是优选的-在位置P1处，并且亲水性残基-精氨酸是优选的-在P2和P3位置处)。
在一些实施例中，融合剂与亲和标签连接。在一些实施例中，亲和标签有助于融合剂脂质体分离和隔离。在一些实施例中，亲和标签是可切割的。在一些实施例中，亲和标签与融合剂非共价连接。在一些实施例中，亲和标签存在于融合剂脂质体上并与融合剂分离。
在一些实施例中，融合剂蛋白通过本领域已知的任何方法或本文所描述的任何方法被工程化成包括蛋白水解降解序列，例如线粒体或细胞溶质降解序列。融合剂蛋白可以被工程化成包含但不限于蛋白水解降解序列(例如，胱天蛋白酶2蛋白序列(例如，Val-Asp-Val-Ala-Asp-|-(SEQ ID NO:155))或其它蛋白水解序列(参见例如Gasteiger等人,《蛋白质组学协议手册(The Proteomics Protocols Handbook)；2005:571-607))、与野生型蛋白水解降解序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高同一性的经修饰的蛋白水解降解序列、细胞溶质蛋白水解降解序列(例如，泛素)或与野生型蛋白水解降解序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高同一性的经修饰的细胞溶质蛋白水解降解序列。在一些实施例中，组合物包括源细胞或线粒体系中的线粒体，所述组合物包括经例如与野生型蛋白水解降解序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高同一性的蛋白水解降解序列、细胞溶质蛋白水解降解序列(例如，泛素)或与野生型蛋白水解降解序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更高同一性的经修饰的细胞溶质蛋白水解降解序列修饰的蛋白质。
在一些实施例中，融合剂可以用识别特定蛋白质的蛋白酶结构域修饰，例如蛋白酶的过表达，例如具有蛋白酶活性的经工程化的融合蛋白。例如，蛋白酶或来自蛋白酶(如MMP)的蛋白酶结构域、线粒体加工肽酶、线粒体中间肽酶、内膜肽酶。
参见Alfonzo,J.D.和Soll,D.线粒体tRNA输入-理解的挑战才刚刚开始(Mitochondrial tRNA import–the challenge to understand has just begun).《生物化学》390:717-722.2009；Langer,T.等人从线粒体释放的肽的表征(Characterization ofPeptides Released from Mitochondria).《生物化学杂志》第280卷,第4号.2691–2699,2005；Vliegh,P.等人合成治疗肽：科学与市场(Synthetic therapeutic peptides:science and market).《今日药物发现(Drug Discov Today)》15(1/2).2010；QuirosP.M.m等人,线粒体蛋白酶在健康、衰老和疾病中的新作用(New roles for mitochondrialproteases in health,ageing and disease).《自然综述分子细胞生物学(NatureReviews Molecular Cell Biology.)》第16版,2015；Weber-Lotfi,F.等人DNA输入能力和线粒体遗传学(DNA import competence and mitochondrial genetics).《生物聚合物与细胞(Biopolymers and Cell.)》第30卷.N 1.71–73,2014。
III.阳性靶细胞特异性调节元件
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如病毒，例如逆转录病毒)含有核酸(例如，对外源性药剂进行编码的基因)，例如逆转录病毒核酸，所述核酸包括阳性靶细胞特异性调节元件，如组织特异性启动子、组织特异性增强子、组织特异性剪接位点、延长RNA或蛋白质半衰期的组织特异性位点、组织特异性mRNA核输出启动位点、组织特异性翻译增强位点或组织特异性翻译后修饰位点。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如病毒，例如逆转录病毒)含有核酸，例如逆转录病毒核酸，所述核酸可以包括各种区域，例如非翻译区域，如复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)、内含子、聚腺苷酸化序列、5'和3'非翻译区，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译并且能够引导、增加、调节或控制操作性地连接的多核苷酸的转录或表达。此类元件的强度和特异性可以不同。视所用载体系统和宿主而定，可以使用任何数目个适合的转录与翻译元件，包括广泛型启动子和诱导型启动子。
在特定实施例中，控制元件能够以细胞特异性方式引导、增加、调节或控制操作性地连接的多核苷酸的转录或表达。在特定实施例中，核酸(例如逆转录病毒核酸)包括一个或多个对特定细胞、细胞类型或细胞谱系(例如靶细胞)具有特异性的表达控制序列；即，与对特定细胞、细胞类型或细胞谱系具有特异性的表达控制序列的操作性地连接的多核苷酸的表达是在靶细胞中表达，而在非靶细胞中不表达(或表达水平更低)。
在特定实施例中，核酸(例如逆转录病毒核酸)可以包含外源性、内源性或异源控制序列，如启动子和/或增强子。
在实施例中，启动子包括RNA聚合酶所结合的识别位点。RNA聚合酶起始并且转录可操作地连接到启动子的多核苷酸。在特定实施例中，在哺乳动物细胞中可操作的启动子包含位于转录起始位点上游大致25到30个碱基处的富AT区域和/或在转录起点上游70到80个碱基处所发现的另一序列：CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。
在实施例中，增强子包含含有能够提供增强的转录的序列并且在一些情况下可以独立于取向(相对于另一种控制序列)发挥作用的DNA区段。增强子可以与启动子和/或其它增强子元件协同地或叠加地发挥作用。在一些实施例中，DNA的启动子/增强子区段含有能够提供启动子与增强子功能的序列。
说明性的广泛型表达控制序列包括(但不限于)：巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子；病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)；莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子；劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR；单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子；来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子；延伸因子1-α(EF1a)启动子；早期生长应答1(EGR1)；铁蛋白H(FerH)；铁蛋白L(FerL)；甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)；真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)；热休克70kDa蛋白质5(HSPA5)；热休克蛋白90kDaβ成员1(HSP90B1)；热休克蛋白70kDa(HSP70)；β-驱动蛋白(β-KIN)；人类ROSA 26基因座(Irions等人，《自然·生物技术(Nature Biotechnology)》25，1477-1482(2007))；泛素C启动子(UBC)；磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子；β-肌动蛋白启动子和骨髓增生性肉瘤病毒增强子；负向控制区缺失的、经d1587rev引物结合位点取代(MND)的启动子(Challita等人，《病毒学杂志》69(2):748-55(1995))。
在一些实施例中，启动子可以与异源基因配对以赋予所述启动子对异源基因的调节功能。在一些实施例中，来自第一基因的启动子的顺式调节元件可以连接到不同基因的启动子的片段以产生具有两种启动子的特性的嵌合启动子。
在一些实施例中，启动子是组织特异性启动子，例如驱动CNS细胞(例如泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞)中的表达的启动子。各种适合的CNS细胞特异性启动子在下表3中进行了描述。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如病毒载体)在其核酸中包括具有表3中的启动子的序列的启动子或其转录活性片段，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的变体。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如病毒载体)在其核酸中包括具有转录因子结合位点的启动子，所述转录因子结合位点来自表3中所列基因的转录起始位点3kb内的区域。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如病毒载体)在其核酸中包括表3中所列基因的转录起始位点上游紧邻的2.5kb、2kb、1.5kb、1kb或0.5kb内的区域，或其转录活性片段，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的变体。
表3：示例性启动子，例如CNS细胞特异性启动子
靶细胞类型 示例性启动子
泛神经元 SYN、NSE、CaMKII、aTubulin、PDGF
GABA能神经元 fSST、fNPY、GAD67、DLX5/6
谷氨酸能神经元 VGLUT1、Dock10
胆碱能神经元 ChAT、VAChT
多巴胺能神经元 Drd1a
血清素能神经元 TPH-2
星形胶质细胞 GFAP、EAAT1、GS
小神经胶质细胞 CX3CR1、TMEM119
少突胶质细胞 MBP、CNP
脉络丛 CRFR2β
在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是Hioki等人,《疗法(Ther.)》2007年6月；14(11):872-82中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是SYN、NSE、CaMKII、aTubulin或PDGF启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是Nathanson等人,《神经回路前沿(Front.Neural Circuits)》,2009,3:19.doi:10.3389/neuro.04.019.2009,中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是fSST或fNPY启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是Delzor等人,《人类基因疗法方法(Hum Gene Ther Methods.)》2012年8月；23(4):242-54中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是GAD67或DLX5/6启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是Egashira等人,《科学报告(Sci Rep.)》2018年10月11日；8(1):15156中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是VGLUT1或Dock10启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是Naciff等人,《神经化学杂志(J.Neurochem.)》,1999年1月；72(1):17-28中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是ChAT启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是VAChT启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是Delzor等人,《人类基因疗法方法》2012年8月；23(4):242-254中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是Drd1a启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是Benzekhroufa等人,《基因疗法(Gene Ther.)》2009年5月；16(5):681-8中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是TPH-2启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是Merienne等人,《基因疗法》2015年10月；22(10):830-9中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是GFAP、EAAT1或GS启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是免疫基因组计划联盟(Immgen consortium)中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是CX3CR1启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是TMEM119启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是McIver等人,《神经科学研究期刊(J Neurosci Res.)》2005年11月1日；82(3):397-403中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是MBP启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是Kagiava等人,《基因医学杂志(J Gene Med.)》2014年11月-12月；16(11-12):364-73中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是MBP或CNP启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是Regev等人,《美国国家科学院院刊》2010年3月2日；107(9):4424-9中所描述的启动子(所述文献以全文引用的方式并入本文中)，例如，CNS细胞特异性启动子是CRFR2β启动子。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是上述中的任何一种的转录活性片段。在一些实施例中，CNS细胞特异性启动子是与上述中的任何一种具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的变体。
内部核糖体进入位点(IRES)通常促进内部核糖体直接进入顺反子(蛋白质编码区)的起始密码子，如ATG，从而引起基因发生帽非依赖性翻译。参见例如Jackson等人，(1990)《生化科学趋势(Trends BiochemSci)》15(12):477-83，以及Jackson和Kaminski.(1995)《RNA》1(10):985-1000。在特定的实施例中，载体包括编码一种或多种外源药剂的一种或多种外源基因。在特定实施例中，为了实现多种外源性蛋白质药剂中的每一种的高效翻译，多核苷酸序列可以通过一个或多个编码自裂解多肽的IRES序列或多核苷酸序列隔开。
本文中的核酸(例如逆转录病毒核酸)还可以包括一个或多个Kozak序列，例如促进mRNA与核糖体的小亚基初始结合并增加翻译的短核苷酸序列。共同Kozak序列是(GCC)RCCATGG，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak,(1986)《细胞》44(2):283-92，以及Kozak,(1987)《核酸研究》15(20):8125-48)。
对异源转录因子和诱导剂有应答的启动子
在一些实施例中，核酸(例如逆转录病毒核酸)包括允许外源性药剂进行条件表达的元件，例如任何类型的条件表达，包含但不限于：诱导型表达；阻抑型表达；细胞类型特异性表达或组织特异性表达。在一些实施例中，为了实现外源性药剂的条件表达，通过使细胞、组织或生物体经历引起外源性药剂表达或引起外源性药剂表达增加或减少的处理或条件来控制表达。
诱导型启动子/系统的说明性实例包括(但不限于)：类固醇诱导型启动子，如用于编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(通过用对应激素处理而可诱导)；金属硫蛋白启动子(通过用各种重金属处理而可诱导)；MX-1启动子(可通过干扰素诱导)；“基因开关”米非司酮(mifepristone)可调节的系统(Sirin等人，2003，《基因(Gene)》，323:67)；二甲氨基二硫代甲酸铜诱导型基因开关(WO 2002/088346)；四环素依赖性调节系统等。
可以通过诱导剂分子的存在或不存在来活化或抑制转基因表达。在一些情况下，诱导剂分子以梯度方式活化或抑制基因表达，并且在一些情况下，诱导剂分子以全有或全无方式活化或抑制基因表达。
常用的诱导型启动子/系统是四环素(Tet)调节的系统。Tet系统是基于两个元件在相应靶细胞中的共表达：(i)与最小启动子融合并连接到所关注基因(例如编码外源性药剂的基因)的含有Tet操纵子序列(TetO)重复序列的四环素应答元件；以及(ii)转录反式活化因子(tTA)、Tet抑制因子(TetR)的融合蛋白，和单纯疱疹病毒衍生的VP16蛋白的反式活化结构域。虽然在最初描述的形式中，转基因表达在缺乏四环素或其强类似物多西环素(Do)的情况下(称为Tet关闭系统)活化，但反式活化因子蛋白质内的四个氨基酸的修饰产生逆tTA(rtTA)，其仅在Dox存在下(Tet开启系统)结合到TetO。在一些实施例中，在反式活化因子中，VP16域已被最小活化域置换，潜在的剪接供体位点和剪接受体位点已被去除，并且蛋白质已得以密码子优化，从而得到改进的反式活化因子变异体rtTA2S-M2，其对Dox的敏感性更高并且基线活性更低。另外，已产生了不同的Tet应答启动子元件，包括TetO中的修饰，为了增强调节而距离相邻操纵子间隔36个核苷酸。其它修饰可以用于进一步减少基本活性并增加表达动态范围。作为实例，pTet-T11(短：TII)变异体显示了高动态范围和低背景活性。
条件表达还可以通过使用位点特异性DNA重组酶来实现。根据某些实施例，核酸(例如逆转录病毒核酸)包括至少一个(通常两个)重组位点，所述重组由位点特异性重组酶介导，例如涉及重组反应的切除性或整合性蛋白质、酶、辅因子或相关蛋白质，所述重组反应涉及一个或多个重组位点(例如二个、三个、四个、五个、七个、十个、十二个、十五个、二十个、三十个、五十个等)，所述位点特异性重组酶可以是野生型蛋白质(参见Landy,《生物技术新见(Current Opinion in Biotechnology)》3:699-707(1993))，或其突变体、衍生物(例如含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和变体。重组酶的说明性实例包含(但不限于)：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、Φ31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1和ParA。
调节外源药剂表达的核糖开关
本文所提供的一些组合物和方法包括一个或多个核糖开关或包括一个或多个核糖开关的多核苷酸。核糖开关是调节基因表达的细菌中的常见特征并且是实现生物功能的RNA控制的手段。核糖开关可以存在于mRNA的5'非翻译区并且通过诱导或抑制核糖开关活性的小分子配体的结合而可以对基因表达实现调节控制。在一些实施例中，核糖开关控制涉及产生小分子配体的基因产物。核糖开关通常以顺式方式发挥作用，但已经鉴别出以反式方式发挥作用的核糖开关。天然核糖开关由两个域组成：通过三维折叠的RNA结构结合配体的适体域和基于配体的缺乏或存在而诱导或抑制核糖开关活性的功能转换域。因此，核糖开关实现了两个配体敏感性构型，分别代表开启和关闭状态(Garst等人，2011)。功能切换域可以通过调节以下来影响多核苷酸的表达：内部核糖体进入位点、前mRNA剪接供体在逆转录病毒基因构建体中的可及性、翻译、转录终止、转录物降解、miRNA表达或shRNA表达(Dambach和Winkler 2009)。适体和功能切换域可以与原生适体、突变/演化的原生适体或通过筛选随机RNA库而鉴别的全合成适体一样用作允许合成RNA装置来控制基因表达的模块化组件(McKeague等人，2016)。
嘌呤核糖开关家族代表了最大家族之一，其中发现了超过500种序列(Mandal等人，2003；US20080269258；以及WO2006055351)。嘌呤核糖开关共享类似结构，其由三个保守的螺旋元件/茎结构(PI、P2、P3)和中间环/接合元件(Jl-2、L2、J2-3、L3、J3-1)组成。核糖开关的嘌呤家族的适体结构域由于序列变异而在不同嘌呤化合物(如腺嘌呤、鸟嘌呤、腺苷、鸟苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷等)对其亲和力/调节方面天然地不同(Kim等人，2007)。
在一些实施例中，本文所描述的核酸(例如逆转录病毒核酸)包括对与启动子和核糖开关可操作地连接的外源性药剂进行编码的多核苷酸。核糖开关包含以下中的一种或多种(例如全部)：a.)适体结构域，例如能够结合核苷类似物抗病毒药物并且对鸟嘌呤或2'-脱氧鸟苷的结合相对于核苷类似物抗病毒药物已减少的适体结构域；以及b.)功能切换结构域，例如能够调节外源性药剂表达的功能切换结构域，其中适体结构域对核苷类似物的结合诱导或抑制了功能切换结构域的表达调节活性，由此调节外源性药剂的表达。在一些实施例中，外源药剂可以是多肽、miRNA或shRNA。举例来说，在一个实施例中，核糖开关可操作地连接到编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸。在本文所提供的非限制性说明性实例中，外源基因编码一种或多种经工程改造的信号传导多肽。举例来说，核糖开关和编码一种或多种经工程改造的信号传导多肽的靶多核苷酸可以在源细胞基因组、复制不胜任型重组逆转录病毒颗粒、T细胞和/或NK细胞中找到。
适体域可以用作例如模块组件，并且与功能切换域中的任一种组合以影响RNA转录物。在本文公开的任何实施例中，核糖开关可以通过调节以下活性中的任一种来影响RNA转录物：内部核糖体进入位点(IRES)、前mRNA剪接供体的可及性、翻译、转录终止、转录物降解、miRNA表达，或shRNA表达。在一些实施例中，功能切换域可以控制抗IRES对IRES的结合(参见例如Ogawa，《RNA》(2011)，17:478-488，其公开内容以全文引用的方式并入本文)。在本文所公开的实施例中的任一个中，小分子配体的存在或不存在可以导致核糖开关影响RNA转录物。在一些实施例中，核糖开关可以包括核糖核酸酶。具有核糖核酸酶的核糖开关可以抑制或增强靶多核苷酸在小分子配体存在下的转录物降解。在一些实施例中，核糖核酸酶可以是手枪类的核糖核酸酶、锤头类的核糖核酸酶、扭转类的核糖核酸酶、短柄斧类的核糖核酸酶，或HDV(肝炎δ病毒)。
IV.非靶细胞特异性调节元件
在一些实施例中，非靶细胞特异性调节元件或阴性TCSRE包括组织特异性miRNA识别序列、组织特异性蛋白酶识别位点、组织特异性泛素连接酶位点、组织特异性转录抑制位点或组织特异性表观遗传抑制位点。
在一些实施例中，非靶细胞包括内源性miRNA。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如病毒，例如逆转录病毒)含有核酸(例如逆转录病毒核酸)(例如，对外源性药剂进行编码的基因)，所述核酸可以包括所述miRNA的识别序列。因此，如果核酸(逆转录病毒核酸)进入非靶细胞，则miRNA可以下调外源性药剂的表达。相对于非靶细胞，这有助于实现针对靶细胞的额外特异性。
在一些实施例中，miRNA是20-22个核苷酸的非编码小RNA，其通常从约70个核苷酸回折RNA前体结构(称为前miRNA)切得。一般来说，miRNA以两种方式中的一种负向调节其靶标，这视miRNA与靶标之间的互补程度而定。首先，通过与编码蛋白质的mRNA序列完全或几乎完全互补而结合的miRNA通常诱导RNA介导的干扰(RNAi)途径。通过结合到其mRNA靶标的3'非翻译区(UTR)内的不完全互补位点来发挥其调节作用的miRNA通常在转录后、明显地在翻译水平下、通过类似于或可能与RNAi途径所用相同的RISC复合物抑制靶基因表达。与翻译控制一致，使用这个机制的miRNA降低了其靶基因的蛋白质水平，但这些基因的mRNA水平受到的影响很小。miRNA(例如，天然存在的miRNA或人工设计的miRNA)可以特异性地靶向任何mRNA序列。举例来说，在一个实施例中，熟练的技术人员可以设计出表达为人类miRNA(例如miR-30或miR-21)初级转录物的短发夹RNA构建体。这个设计向发夹构建体增添了Drosha处理位点并且展示极大地增加基因敲落效率(Pusch等人，2004)。发夹茎由22nt的dsRNA(例如反义链与所期望的标靶完全互补)和来自人类miR的15-19nt环组成。当与不具有微RNA的常规shRNA设计相比时，在发夹的任一侧或两侧添加miR环和miR30侧接序列使得所表达的发夹的Drosha和Dicer处理增加大于10倍。增加的Drosha和Dicer处理转换成更大的siRNA/miRNA产生和所表达发夹的更大效能。
数百种不同的miRNA基因的表达在开发期间并且在所有组织类型中有差异。若干研究已经表明miRNA在广泛范围的生物过程中的重要调节作用，包括发育时序、细胞分化、增殖、细胞凋亡、瘤形成、胰岛素分泌和胆固醇生物合成。(参见Bartel 2004《细胞》116:281-97；Ambros 2004《自然(Nature)》431:350-55；Du等人，2005《发育(Development)》132:4645-52；Chen 2005《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》353:1768-71；Krutzfeldt等人，2005《自然》438:685-89)。分子分析已表明miRNA在不同组织中具有独特的表达谱。计算方法已用于分析约7,000个预测的人类miRNA靶标的表达。数据表明miRNA表达广泛地促成了许多人体组织中的mRNA表达的组织特异性。(参见Sood等人，2006，《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》103(8):2746-51)。
因此，基于miRNA的方法可以用于将外源药剂的表达局限于靶细胞群，这是通过使用内源微RNA物种使外源药剂在非靶细胞类型中的表达沉默来实现。微RNA通过抑制信使RNA(mRNA)翻译或通过引起mRNA降解来诱导许多生物体的序列特异性转录后基因沉默。参见例如Brown等人,2006《自然·医学》12(5):585-91，和WO2007/000668，其中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，核酸(例如逆转录病毒核酸)包括组织特异性miRNA识别序列中的一种或多种(例如，多种)组织特异性miRNA识别序列。在一些实施例中，组织特异性miRNA识别序列长度为约20-25、21-24或23个核苷酸。在实施例中，组织特异性miRNA识别序列与存在于非靶细胞中的miRNA完全互补。在一些实施例中，外源药剂不包含GFP，例如不包含荧光蛋白，例如不包含报道蛋白。在一些实施例中，非靶细胞不是造血细胞和/或miRNA不存在于造血细胞中。
在一些实施例中，本文中的方法包括外源性药剂在靶细胞中的组织特异性表达，所述方法包括：使包括对外源性药剂进行编码的核苷酸和至少一个组织特异性微RNA(miRNA)靶序列的多个融合剂脂质体(例如病毒，例如逆转录病毒载体)与包括靶细胞和非靶细胞的多个细胞接触，其中外源性药剂优先在靶细胞中表达，例如限于靶细胞。
例如，核酸(例如逆转录病毒核酸)可以包括与核苷酸序列可操作地连接的至少一个miRNA识别序列，所述核苷酸序列在非靶细胞(例如造血祖细胞(HSPC)、造血干细胞(HSC))中具有对应miRNA，其阻止或减少核苷酸序列在非靶细胞中的表达，但不阻止或减少核苷酸序列在靶细胞(例如分化细胞)中的表达。在一些实施例中，核酸(例如逆转录病毒核酸)包括miRNA的至少一个miRNA序列靶标，所述miRNA序列靶标以有效量(例如内源性miRNA的浓度足以减少或阻止转基因的表达)存在于非靶细胞中，并且包括转基因。在实施例中，这一系统中所用的miRNA在非靶细胞(如HSPC和HSC)中强烈表达，但在例如骨髓和淋巴谱系的分化子代中则不然，从而阻止或减少了转基因在敏感性干细胞群中的表达，同时维持其在靶细胞中的表达和治疗功效。
在一些实施例中，阴性TSCRE或NTSCRE包括miRNA识别位点。下表4中提供了示例性miRNA。在一些实施例中，核酸(例如融合剂脂质体核酸或逆转录病毒核酸)包括与表4的miRNA互补的序列，或与其具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％互补。在一些实施例中，核酸(例如融合剂脂质体核酸或逆转录病毒核酸)包括与内源性miRNA(例如表4的miRNA)内的种子序列完全互补的序列。在一些实施例中，miRNA包括SEQ ID NO:156-162中的任一个中所示的序列。在实施例中，种子序列长度为至少6、7、8、9或10个核苷酸。
表4：示例性miRNA
Figure BDA0003155557330001511
在一些实施例中，阴性TSCRE或NTSCRE包括本文所描述的miRNA的miRNA识别位点。示例性miRNA包含在Butovsky等人,《自然神经科学(Nat Neurosci)》2014年1月；17(1):131-43中发现的那些，所述文献以全文引用的方式并入本文中，例如miR-338-3p、miR-9、miR-125b-5p或miR-342-3p。另外的示例性miRNA可以在Delzor等人,《当代药物靶标(Curr.Drug Targets)》,2013年10月；14(11):1336-46中发现，所述文献以全文引用的方式并入本文中，例如miR-124。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体包括核酸，所述核酸包括有效负荷基因和阳性靶细胞特异性调节元件，例如其中所述靶细胞是神经元，例如泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元或血清素能神经元。在一些实施例中，核酸进一步包括非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)，例如其中NTSCRE包括在神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞、小神经胶质细胞或少突胶质细胞)中表达的miRNA的miRNA识别位点。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体包括核酸，所述核酸包括有效负荷基因和阳性靶细胞特异性调节元件，例如其中所述靶细胞是神经胶质细胞(例如，星形胶质细胞、小神经胶质细胞或少突胶质细胞)。在一些实施例中，核酸进一步包括非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)，例如其中NTSCRE包括在神经元(例如，泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元或血清素能神经元)中表达的miRNA的miRNA识别位点。
在一些实施例中，阴性TSCRE或NTSCRE包括本文所描述的miRNA的miRNA识别位点。示例性miRNA包括以下文献中所发现的那些miRNA：Griffiths-Jones等人，《核酸研究》2006年1月1日，34；Chen和Lodish，《免疫学研讨文辑(Semin Immunol.)》2005年4月；17(2):155-65；Chen等人，《科学》2004年1月2日；303(5654):83-6；Barad等人，《基因组研究(GenomeRes.)》2004年12月；14(12):2486-2494；Krichevsky等人，《RNA》2003年10月；9(10):1274-81；Kasashima等人，《生物化学与生物物理学研究通信(Biochem Biophys Res Commun.)》2004年9月17日；322(2):403-10；Houbaviy等人，《发育的细胞(Dev Cell.)》2003年8月；5(2):351-8；Lagos-Quintana等人，《当代生物学(Curr Biol.)》2002年4月30日；12(9):735-9；Calin等人，《美国国家科学院院刊》2004年3月2日；101(9):2999-3004；Sempere等人，《基因组生物学(Genome Biol)》2004；5(3)：R13；Metzler等人，《基因染色体与癌症(GenesChromosomes Cancer)》2004年2月；39(2):167-9；Calin等人，《美国国家科学院院刊》2002年11月26日；99(24):15524-9；Mansfield等人，《自然·遗传学(Nat Genet.)》2004年10月；36(10):1079-83；Michael等人,《分子癌症研究(Mol Cancer Res.)》2003年10月；1(12):882-91；以及www.miRNA.org。
I在一些实施例中，阴性TSCRE或NTSCRE包括miRNA的miRNA识别位点，所述miRNA选自miR-1b、miR-189b、miR-93、miR-125b、miR-130、miR-32、miR-128、miR-22、miR124a、miR-296、miR-143、miR-15、miR-141、miR-143、miR-16、miR-127、miR99a、miR-183、miR-19b、miR-92、miR-9、miR-130b、miR-21、miR-30b、miR-16、miR-99a、miR-212、miR-30c、miR-213、miR-20、miR-155、miR-152、miR-139、miR-30b、miR-7、miR-30c、miR-18、miR-137、miR-219、miR-1d、miR-178、miR-24、miR-122a、miR-215、miR-124a、miR-190、miR-149、miR-193、let-7a、miR-132、miR-27a、miR-9*、miR-200b、miR-266、miR-153、miR-135、miR-206、miR-24、miR-19a、miR-199、miR-26a、miR-194、miR-125a、miR-15a、miR-145、miR-133、miR-96、miR-131、miR-124b、miR-151、miR-7b、miR-103和miR-208，
在一些实施例中，核酸(例如逆转录病毒核酸)包括两个或更多个miRNA识别位点。在一些实施例中，第一miRNA识别位点和第二miRNA识别位点被相同的miRNA识别，并且在一些实施例中，第一miRNA识别位点和第二miRNA识别位点被不同的miRNA识别。在一些实施例中，第一miRNA识别位点和第二miRNA识别位点被存在于相同的非靶细胞中的miRNA识别，并且在一些实施例中，第一miRNA识别位点和第二miRNA识别位点被存在于不同的非靶细胞中的miRNA识别。在一些实施例中，第一miRNA识别位点和第二miRNA识别位点中的一个或两个都被表4的miRNA识别。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)上的miRNA识别位点中的一个或多个与外源性药剂以顺式转录。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)上的一个或多个miRNA识别位点位于poly A尾序列的下游，例如在poly A尾序列和WPRE之间。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)上的miRNA识别位点中的一个或多个位于WPRE的下游。
V.免疫调节
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如逆转录病毒载体或VLP)包括升高的CD47。参见例如美国专利第9,050,269号，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如逆转录病毒载体或VLP)包括升高的补体调节蛋白。参见例如ES2627445T3和US6790641，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如逆转录病毒载体或VLP)缺乏MHC蛋白(例如MHC-1 1类或II类)或包括降低水平的MHC蛋白。参见例如US20170165348，其以全文引用的方式并入本文中。
有时，融合剂脂质体(例如逆转录病毒载体或VLP)被受试者的免疫系统识别。在包封的病毒载体颗粒(例如逆转录病毒载体颗粒)的情况下，可以识别病毒包膜表面上所呈现的膜结合蛋白并且可以中和病毒颗粒本身。此外，在感染靶细胞时，病毒包膜与细胞膜整合在一起，并且因此病毒包膜蛋白可以呈现于细胞表面上或与细胞表面保持紧密缔合。因此，免疫系统也可以靶向病毒载体颗粒已感染的细胞。两种作用都可能导致病毒载体递送外源药剂的功效降低。
病毒颗粒包膜通常来源于源细胞的膜。因此，病毒颗粒萌芽于其中的细胞膜上所表达的膜蛋白可以并入病毒包膜中。
免疫调节蛋白CD47
细胞外材料内化到细胞中通常是通过称为胞吞的过程进行(Rabinovitch，1995，《细胞生物学趋势(Trends Cell Biol.)》5(3):85-7；Silverstein，1995，《细胞生物学趋势》5(3):141-2；Swanson等人，1995，《细胞生物学趋势》5(3):89-93；Allen等人，1996，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》184(2):627-37)。内吞可以分为两大类：吞噬，其涉及颗粒的摄取；以及胞饮，其涉及流体和溶质的摄取。
基于对缺乏膜受体CD47的基因敲除小鼠的研究，专业吞噬细胞已展示出与非自我和自我的区别(Oldenborg等人，2000，《科学》288(5473):2051-4)。CD47是Ig超家族的广泛成员，其与巨噬细胞上所发现的免疫抑制受体SIRPα(信号调节蛋白)相互作用(Fujioka等人，1996，《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》16(12):6887-99；Veillette等人，1998，《生物化学杂志》273(35):22719-28；Jiang等人，1999，《生物化学杂志》274(2):559-62)。虽然CD47-SIRPα相互作用似乎使小鼠的自体巨噬细胞失活，但在一些Rh基因型的人类血细胞上发现CD47严重降低(可能90％)，所述Rh基因型展示很少的贫血迹象或不展示贫血迹象(Mouro-Chanteloup等人，2003，《血液》101(1):338-344)并且还展示很少的或不展示与吞噬单核细胞的细胞相互作用增强的迹象(Arndt等人，2004，《英国血液学杂志(Br.J.Haematol.)》125(3):412-4)。
在一些实施例中，融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体或VLP(例如，半径小于约1μm，400nm或150nm的病毒颗粒))至少包括CD47的生物活性部分，例如在融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体或VLP)的暴露表面上。在一些实施例中，融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体(例如，慢病毒)或VLP)包含脂质包衣。在实施例中，生物活性CD47在融合剂脂质体例如(逆转录病毒载体或VLP)中的量介于约20-250、20-50、50-100、100-150、150-200或200-250个分子/μm2。在一些实施例中，CD47是人类CD47。
本文所描述的方法可以包括规避吞噬细胞对颗粒的吞噬。所述方法可以包含在融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体或VLP中表达至少一种包含CD47的至少生物活性部分的肽，使得当包括CD47的融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体或VLP)暴露于吞噬细胞时，融合剂脂质体(例如，病毒颗粒)规避吞噬细胞的吞噬，或相较于在其它方面类似的未经修饰的融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体或VLP示出减少的吞噬。在一些实施例中，融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体或VLP)在受试者中的半衰期相较于在其它方面类似的未经修饰融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体或VLP)延长。
MHC缺失
主要组织相容性复合物I类(MHC-I)是宿主细胞膜蛋白，其可以并入病毒包膜中并且由于其具有高度多形性质，因此其是身体免疫应答的主要靶标(McDevitt H.O.(2000)《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》18:1-17)。源细胞的质膜上所暴露的MHC-I分子可以在载体出芽过程中并入病毒颗粒包膜中。来源于源细胞并且并入病毒颗粒中的这些MHC-I分子继而可以转移到靶细胞的质膜上。替代地，由于病毒颗粒倾向于吸附并保持结合到靶细胞膜上，因此MHC-I分子可以与靶细胞膜保持紧密缔合。
外源MHC-I分子存在于或靠近已转导细胞的质膜存在可以诱发个体产生同种异体反应性免疫应答。进行离体基因转移、随后将已转导细胞施用于个体后，或直接体内施用病毒颗粒后，这可以引起免疫介导的已转导细胞的杀灭或吞噬。另外，在携带病毒颗粒的MHC-I体内施用到血流中的情况下，病毒颗粒在达到其靶细胞之前可以通过预先存在的MHC-I特异性抗体中和。
因此，在一些实施例中，对源细胞进行修饰(例如基因工程改造)以减少细胞表面上MHC-I的表达。在实施例中，源细胞包含基因工程改造的对编码β2-微球蛋白(β2M)的基因的破坏。在实施例中，源细胞包括基因工程改造的对编码MHC-Iα链的一种或多种基因的破坏。细胞可以包含基因工程改造的对编码β2-微球蛋白的基因的所有拷贝的破坏。细胞可以包含基因工程改造的对编码MHC-Iα链的基因的所有拷贝的破坏。细胞可以包含基因工程改造的对编码β2-微球蛋白的基因的破坏和基因工程改造的对编码MHC-Iα链的基因的破坏。在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP包含数目减少的表面暴露MHC-I分子。可以减少表面暴露的MHC-I分子的数目，以使得对MHC-I的免疫应答降低到治疗上相关的程度。在一些实施例中，被包封的病毒载体颗粒基本上不含表面暴露的MHC-I分子。
HLA-G/E过度表达
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP在其包膜上呈现致耐受性蛋白质，例如ILT-2或ILT-4促效剂，例如HLA-E或HLA-G或任何其它ILT-2或ILT-4促效剂。在一些实施例中，相较于参考逆转录病毒(例如其它方面类似于逆转录病毒的未经修饰逆转录病毒)，逆转录病毒载体或VLP的HLA-E、HLA-G、ILT-2或ILT-4表达增强。
在一些实施例中，逆转录病毒组合物的MHC I类相较于未经修饰的逆转录病毒减少，而逆转录病毒组合物的HLA-G相较于未经修饰的逆转录病毒增加。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的HLA-G或HLA-E表达相较于参考逆转录病毒(例如其它方面类似于逆转录病毒的未经修饰逆转录病毒)增加，例如HLA-G或HLA-E的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中利用流式细胞测量术(例如FACS)对HLA-G或HLA-E表达进行体外分析。
在一些实施例中，具有HLA-G表达增加的逆转录病毒展现减少的免疫原性，例如在畸胎瘤形成分析中根据减少的免疫细胞浸润所测量。
补体调节蛋白
补体活性通常由多种补体调节蛋白(CRP)控制。这些蛋白质防止假性炎症和宿主组织损伤。一组蛋白质，包括CD55/衰变加速因子(DAF)和CD46/膜辅因子蛋白质(MCP)，抑制经典和旁路途径C3/C5转化酶。包括CD59的另一组蛋白质调节MAC组装。CRP已用于阻止异种移植组织的排斥反应并且也已展示保护病毒和病毒载体免于被补体灭活。
膜驻留的补体控制因子包括例如加速衰减因子(DAF)或CD55、因子H(FH)样蛋白质-1(FHL-1)、C4b结合蛋白(C4BP)、补体受体1(CD35)、膜辅因子蛋白质(MCP)或CD46，以及CD59(保护素)(例如阻止攻膜复合物(MAC)形成并保护细胞免于溶解)。
白蛋白结合蛋白
在一些实施例中，慢病毒结合白蛋白。在一些实施例中，慢病毒的表面上包含结合白蛋白的蛋白质。在一些实施例中，慢病毒的表面上包含白蛋白结合蛋白。在一些实施例中，白蛋白结合蛋白是链球菌白蛋白结合蛋白。在一些实施例中，白蛋白结合蛋白是链球菌白蛋白结合域。
非融合剂蛋白质在慢病毒包膜上的表达
在一些实施例中，慢病毒经工程改造以在其表面上包含一种或多种蛋白质。在一些实施例中，蛋白质影响与受试者的免疫相互作用。在一些实施例中，蛋白质影响慢病毒在个体中的药理学。在一些实施例中，蛋白质是受体。在一些实施例中，蛋白质是促效剂。在一些实施例中，蛋白质是信号传导分子。在一些实施例中，慢病毒表面上的蛋白质包括OKT3或IL7。
在一些实施例中，包括促有丝分裂跨膜蛋白和/或基于细胞因子的跨膜蛋白存在于源细胞中，其当从源细胞膜萌芽时可以并入逆转录病毒中。促有丝分裂跨膜蛋白和/或基于细胞因子的跨膜蛋白可以作为单独的细胞表面分子在源细胞上表达，而非作为病毒包膜糖蛋白的一部分表达。
示例性特征
在本文所描述的任一方面的一些实施例中，融合剂脂质体(例如逆转录病毒载体、VLP或药物组合物)基本上无免疫原性。免疫原性可以被定量，例如如本文所描述。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP与靶细胞融合以产生接受者细胞。在一些实施例中，评估与一种或多种逆转录病毒载体或VLP融合的接受者细胞的免疫原性。在实施例中，分析接受者细胞的细胞表面上的抗体的存在，例如通过用抗IgM抗体染色来分析。在其它实施例中，通过PBMC细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将接受者细胞与周边血液单核细胞(PBMC)一起培育，并且随后评估PBMC对所述细胞的溶解。在其它实施例中，通过自然杀手(NK)细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将接受者细胞与NK细胞一起培育，并且随后评估NK细胞对所述细胞的溶解。在其它实施例中，通过CD8+T细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将接受者细胞与CD8+T细胞一起培育，并且随后评估CD8+T细胞对所述细胞的溶解。
在一些实施例中，相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如由其它方面类似于源细胞的未经修饰源细胞或HEK293细胞产生的逆转录病毒载体或VLP)，逆转录病毒载体或VLP包含升高水平的免疫抑制剂(例如免疫抑制蛋白)。在一些实施例中，含量升高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP包含参考细胞中不存在的免疫抑制剂。在一些实施例中，相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如由其它方面类似于源细胞的未经修饰源细胞或HEK293细胞产生的逆转录病毒载体或VLP)，逆转录病毒载体或VLP包含降低水平的免疫刺激剂(例如免疫刺激性蛋白质)。在一些实施例中，相较于参考逆转录病毒载体或VLP，含量降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP中基本上不存在免疫刺激剂。
在一些实施例中，逆转录病毒载体，或VLP或逆转录病毒载体或VLP所来源的源细胞具有以下特征中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多个：
a.MHC I类或MHC II类的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的源细胞或HeLa细胞或HEK293细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
b.一种或多种共刺激蛋白的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK细胞或本文所描述参考细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小，所述共刺激蛋白包括(但不限于)：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白(例如CD47)的表达，例如本文所描述方法可检测到的表达，例如抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白(例如CD47)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、杰卡特细胞(Jurkat cell)或HEK293细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍；
d.可溶性免疫抑制性细胞因子(例如IL-10)的表达，例如本文所描述方法可检测到的表达，例如可溶性免疫抑制性细胞因子(例如IL-10)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍；
e.可溶性免疫抑制蛋白(例如PD-L1)的表达，例如本文所描述方法可检测到的表达，例如可溶性免疫抑制蛋白(例如PD-L1)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍；
f.可溶性免疫刺激性细胞因子(例如IFN-γ或TNF-a)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的源细胞或HEK293细胞或U-266细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
g.内源性免疫刺激性抗原(例如Zg16或Hormad1)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞或A549细胞或SK-BR-3细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
h.相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，HLA-E或HLA-G的表达，例如本文所描述方法可检测到的表达；
i.表面糖基化分布，例如含有唾液酸，其用以例如抑制NK细胞活化；
j.TCRα/β的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
k.ABO血型的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
l.次要组织相容性抗原(MHA)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
m.线粒体MHA相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，或检测不到线粒体MHA。
在实施例中，共刺激蛋白是4-1BB、B7、SLAM、LAG3、HVEM或LIGHT，而参考细胞是HDLM-2。在一些实施例中，共刺激蛋白是BY-H3，而参考细胞是HeLa细胞。在一些实施例中，共刺激蛋白是ICOSL或B7-H4，而参考细胞是SK-BR-3。在一些实施例中，共刺激蛋白是ICOS或OX40，而参考细胞是MOLT-4。在一些实施例中，共刺激蛋白是CD28，而参考细胞是U-266。在一些实施例中，共刺激蛋白是CD30L或CD27，而参考细胞是道迪细胞(Daudi)。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物基本上不诱发免疫系统(例如先天免疫系统)的免疫原性应答。在实施例中，可以定量免疫原性应答，例如如本文所描述。在一些实施例中，先天免疫系统的免疫原性应答包含先天免疫细胞的应答，所述先天免疫细胞包括(但不限于)：NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞或γ/δT细胞。在一些实施例中，先天免疫系统的免疫原性应答包含补体系统的应答，所述补体系统包括可溶性血液组分和膜结合组分。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物基本上不诱发免疫系统(例如适应性免疫系统)的免疫原性应答。在一些实施例中，适应性免疫系统的免疫原性应答包含适应性免疫细胞的免疫原性应答，包括(但不限于)T淋巴细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞和或γ-δT细胞)或B淋巴细胞的数目或活性的变化，例如增加。在一些实施例中，适应性免疫系统的免疫原性应答包括增加水平的可溶血液组分，包括(但不限于)细胞因子或抗体(例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)的数目或活性的变化，例如增加。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物经修饰以具有降低的免疫原性。在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物的免疫原性比参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)的免疫原性小不到5％、10％、20％、30％、40％或50％。
在本文所描述的任一方面的一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其基因组经修饰(例如使用本文所描述的方法修饰)以降低(例如减轻)免疫原性。免疫原性可以被定量，例如如本文所描述。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞的以下中的一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种耗竭，例如被基因敲除：
a.MHC I类、MHC II类或MHA；
b.一种或多种共刺激蛋白，包括(但不限于)：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.可溶性免疫刺激细胞因子，例如IFN-γ或TNF-a；
d.内源性免疫刺激抗原，例如Zg16或Hormad1；
e.T细胞受体(TCR)；
f.编码ABO血型的基因，例如ABO基因；
g.驱动免疫活化的转录因子，例如NFkB；
h.控制MHC表达的转录因子，例如II类反式活化子(CIITA)、Xbox 5的调节因子(RFX5)、RFX相关蛋白(RFXAP)或RFX锚蛋白重复序列(RFXANK；也称为RFXB)；或
i.TAP蛋白，例如TAP2、TAP1或TAPBP，其减少MHC I类表达。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP来源于具有基因修饰的源细胞，所述基因修饰引起免疫抑制剂的表达增加，例如以下中的一种、两种、三种或更多种(例如其中在基因修饰之前，细胞不表达因子)：
a.抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白，例如CD47；例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，CD47的表达增加；
b.可溶性免疫抑制细胞因子，例如IL-10，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，IL-10的表达增加；
c.可溶性免疫抑制蛋白，例如PD-1、PD-L1、CTLA4或BTLA；例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，免疫抑制蛋白的表达增加；
d.致耐受性蛋白质，例如ILT-2或ILT-4促效剂，例如HLA-E或HLA-G或任何其它内源ILT-2或ILT-4促效剂，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，HLA-E、HLA-G、ILT-2或ILT-4的表达增加；或
e.抑制补体活性的表面蛋白，例如补体调节蛋白，例如结合加速衰减因子(DAF，CD55)的蛋白质，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)，例如C4b结合蛋白(C4BP)，例如补体受体1(CD35)，例如膜辅因子蛋白(MCP、CD46)，例如凸出蛋白(CD59)，例如抑制经典和旁路补体途径CD/C5转化酶的蛋白质，例如调节MAC组装的蛋白质；例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，补体调节蛋白的表达增加。
在一些实施例中，增加的表达量比参考逆转录病毒载体或VLP高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP来源于源细胞，所述源细胞经修饰以具有减小的免疫刺激剂表达，例如以下中的一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种：
a.MHC I类或MHC II类的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
b.一种或多种共刺激蛋白的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞或本文所描述参考细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小，所述共刺激蛋白包括(但不限于)：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.可溶性免疫刺激性细胞因子(例如IFN-γ或TNF-a)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞或U-266细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
d.内源性免疫刺激性抗原(例如Zg16或Hormad1)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞或A549细胞或SK-BR-3细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
e.T细胞受体(TCR)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
f.ABO血型的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
g.驱动免疫活化的转录因子(例如NFkB)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小
h.控制MHC表达的转录因子(例如II类反式活化因子(CIITA)、Xbox 5的调节因子(RFX5)、RFX相关蛋白(RFXAP)或RFX锚蛋白重复(RFXANK；也称为RFXB))的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；或
i.减少MHC I类表达的TAP蛋白(例如TAP2、TAP1或TAPBP)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
在一些实施例中，来源于使用表达shRNA的慢病毒减少MHC I类表达而经修饰的哺乳动物细胞(例如HEK293)的逆转录病毒载体、VLP或药物组合物的MHC I类表达小于未修饰的逆转录病毒载体或VLP，例如来自尚未修饰的细胞(例如间叶干细胞)的逆转录病毒载体或VLP。在一些实施例中，来源于使用表达HLA-G的慢病毒增加HLA-G表达而经修饰的哺乳动物细胞(例如HEK293)的逆转录病毒载体或VLP的HLA-G表达相较于未修饰的逆转录病毒载体或VLP(例如来自尚未修饰的细胞(例如HEK293))增加。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于基本上无免疫原性的源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述源细胞刺激(例如诱导)T细胞分泌IFN-γ的水平为0pg/mL到>0pg/mL，例如如通过IFN-γELISPOT分析来进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞来自用免疫抑制剂处理的细胞培养物，例如糖皮质激素(例如地塞米松(dexamethasone))、细胞生长抑制剂(例如甲氨喋呤(methotrexate))、抗体(例如莫罗单抗(Muromonab)-CD3)或免疫亲和素调节剂(例如环孢菌素(Ciclosporin)或雷帕霉素(rapamycin))。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞包含外源药剂，例如治疗剂。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是重组细胞。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物来源于哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞经基因修饰以表达病毒免疫逃避素，例如hCMV US2或US11。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的表面或源细胞的表面用聚合物(例如减少免疫原性和免疫介导清除的生物相容性聚合物，例如PEG)进行共价或非共价修饰。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的表面或源细胞的表面用唾液酸(例如包含糖聚合物的唾液酸，其含有NK抑制性聚糖抗原决定基)进行共价或非共价修饰。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的表面或源细胞的表面经酶(例如糖苷酶，例如α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶)处理以去除ABO血型。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的表面或源细胞的表面经酶处理以产生与接受者的血液类型匹配的ABO血型，例如诱导所述ABO血型的表达。
评估免疫原性的参数
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP来源于基本上无免疫原性或经修饰(例如使用本文所描述的方法修饰以使免疫原性减少)的源细胞，例如哺乳动物细胞。源细胞和逆转录病毒载体或VLP的免疫原性可以通过本文所描述的任何分析来确定。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的体内移植存活期相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)增加，例如增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的免疫原性减少，如根据逆转录病毒载体或VLP的一次或多次植入适当动物模型(例如本文所描述的动物模型)之后的体液应答相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)的一次或多次植入适当动物模型(例如本文所描述的动物模型)之后的体液应答的减少所测量。在一些实施例中，体液应答的减少是使用血清样品、根据抗细胞抗体效价(例如抗逆转录病毒或抗VLP抗体效价)测量，例如通过ELISA测量。在一些实施例中，相较于施用未经修饰逆转录病毒载体或VLP的动物的血清样品，施用逆转录病毒载体或VLP的动物的血清样品的抗逆转录病毒或抗VLP抗体效价减小1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施例中，施用逆转录病毒载体或VLP的动物的血清样品的抗逆转录病毒或抗VLP抗体效价增加，例如相对于基线增加1％、2％、5％、10％、20％、30％或40％，例如其中基线是指同一动物在施用逆转录病毒载体或VLP之前的血清样品。
在一些实施例中，所述逆转录病毒载体或VLP使巨噬细胞吞噬减少，例如巨噬细胞吞噬相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中巨噬细胞吞噬的减少是通过分析体外吞噬指数来确定，例如如实例8中所描述。在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP在巨噬细胞吞噬的体外分析中当与巨噬细胞一起培育时，具有0、1、10、100或更大的吞噬指数，例如如通过实例8的分析所测量。
在一些实施例中，细胞毒性介导的PBMC对所述源细胞或接受者细胞的细胞溶解减少，例如相较于参考细胞(例如其它方面类似于所述源细胞的未经修饰细胞，或接受未经修饰逆转录病毒载体或VLP的接受者细胞，或间叶干细胞)，细胞溶解减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如使用实例17的分析。在实施例中，源细胞表达外源HLA-G。
在一些实施例中，NK对源细胞或接受者细胞介导的细胞溶解减少，例如相较于参考细胞(例如其它方面类似于所述源细胞的未经修饰细胞，或接受未经修饰逆转录病毒载体或VLP的接受者细胞)，NK介导的细胞溶解减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中通过铬释放分析或铕释放分析(例如使用实例18的分析)对NK介导的细胞溶解进行体外分析。
在一些实施例中，CD8+T细胞对源细胞或接受者细胞介导的细胞溶解减少，例如相较于参考细胞(例如其它方面类似于所述源细胞的未经修饰细胞，或接受未经修饰逆转录病毒载体或VLP的接受者细胞)，CD8 T细胞介导的细胞溶解减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中通过实例19的分析对CD8 T细胞介导的细胞溶解进行体外分析。
在一些实施例中，源细胞或接受者细胞中的CD4+T细胞增殖和/或活化减少，例如相较于参考细胞(例如其它方面类似于所述源细胞的未经修饰细胞，或接受未经修饰逆转录病毒载体或VLP的接受者细胞)，减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中对CD4 T细胞增殖进行体外分析(例如经修饰或未经修饰的哺乳动物源细胞和CD4+T细胞与CD3/CD28戴诺珠粒(Dynabead)的共培养分析)。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得T细胞的IFN-γ分泌减少，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，T细胞的IFN-γ分泌减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中例如通过IFN-γELISPOT对T细胞的IFN-γ分泌进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得免疫原性细胞因子的分泌减少，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，免疫原性细胞因子的分泌减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用ELISA或ELISPOT对免疫原性细胞因子的分泌进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得免疫抑制性细胞因子的分泌增加，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，免疫抑制性细胞因子的分泌增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用ELISA或ELISPOT对免疫抑制性细胞因子的分泌进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得HLA-G或HLA-E的表达增加，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，HLA-G或HLA-E的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用流式细胞测量术(例如FACS)对HLA-G或HLA-E的表达进行体外分析。在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP来源于经修饰而使HLA-G或HLA-E表达增加的源细胞，例如相较于未经修饰的细胞，HLA-G或HLA-E的表达例如增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用流式细胞测量术(例如FACS)对HLA-G或HLA-E的表达进行体外分析。在一些实施例中，来源于HLA-G表达增加的经修饰细胞的逆转录病毒载体或VLP展现减少的免疫原性。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得或引起T细胞抑制剂配体(例如CTLA4、PD1、PD-L1)的表达增加，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，使T细胞抑制剂配体的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用流式细胞测量术(例如FACS)对T细胞抑制剂配体的表达进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得共刺激配体的表达减少，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，使共刺激配体的表达减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用流式细胞测量术(例如FACS)对共刺激配体的表达进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得MHC I类或MHC II类的表达减少，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HeLa细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，使MHC I类或MHC II类的表达减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用流式细胞测量术(例如FACS)对MHC I类或II类的表达进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP来源于基本上无免疫原性的细胞源，例如哺乳动物细胞源。在一些实施例中，免疫原性可以被定量，例如如本文所描述。在一些实施例中，哺乳动物细胞源包含以下特征中的任何一个、全部或组合：
a.其中源细胞是从自体细胞源获得；例如从将接受(例如施用)逆转录病毒载体或VLP的接受者获得的细胞；
b.其中源细胞是从与接受者(例如本文所描述的接受者，其将接受(例如施用)逆转录病毒载体或VLP)匹配(例如性别相似)的同种异体细胞源获得；
c.其中源细胞是从HLA与接受者的HLA匹配(例如在一个或多个等位基因处)的同种异体细胞源获得；
d.其中源细胞是从作为HLA同型接合子的同种异体细胞源获得；
e.其中源细胞是从缺乏MHC I类和II类(或MHC I类和II类水平相较于参考细胞降低)的同种异体细胞源获得；或
f.其中源细胞是从已知基本上无免疫原性的细胞源获得，包括(但不限于)：干细胞、间叶干细胞、诱导型多能干细胞、胚胎干细胞、塞特利氏细胞(sertoli cell)或视网膜色素上皮细胞。
在一些实施例中，待施用逆转录病毒载体或VLP的个体具有或已知具有或经测试具有与逆转录病毒载体或VLP呈反应性的预先存在的抗体(例如IgG或IgM)。在一些实施例中，对逆转录病毒载体或VLP具有反应性的预先存在的抗体在待施用逆转录病毒载体或VLP的个体中不具有可检测到的水平。抗体的测试描述于例如实例13中。
在一些实施例中，已接受逆转录病毒载体或VLP的个体具有或已知具有或经测试具有与逆转录病毒载体或VLP具有反应性的抗体(例如IgG或IgM)。在一些实施例中，接受逆转录病毒载体或VLP(例如至少一次、两次、三次、四次、五次或更多次)的个体中的对逆转录病毒载体或VLP具有反应性的抗体不具有可检测到的水平。在实施例中，抗体水平在两个时间点之间升高不超过1％、2％、5％、10％、20％或50％，第一时间点是在第一次施用逆转录病毒载体或VLP之前，而第二时间点是在一次或多次施用逆转录病毒载体或VLP之后。抗体的测试描述于例如实例14中。
VI.外源性药剂
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物)包含外源性药剂。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物)含有对外源性药剂进行编码的核酸。
A.外源性蛋白质药剂
在一些实施例中，外源性药剂包括胞质蛋白，例如在接受者细胞中产生并且定位于接受者细胞的细胞质中的蛋白质。在一些实施例中，外源药剂包含分泌性蛋白，例如由接受者细胞产生并分泌的蛋白质。在一些实施例中，外源药剂包含核蛋白，例如在接受者细胞中产生并输入接受者细胞的细胞核中的蛋白质。在一些实施例中，外源药剂包含细胞器蛋白(例如线粒体蛋白)，例如在接受者细胞中产生并输入接受者细胞的细胞器(例如线粒体)中的蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是野生型蛋白质或突变型蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是融合或嵌合蛋白。
在一些实施例中，外源性药剂由来自以下的基因编码：SYNE1、SETX、FMR1、SLC6A8、UBE3A、SOD1、TDP43、C9orf72、FXN、MECP2、ASPA、ALDH7A1、TPP1、FUCA1、GALC、HEXA、HEXB、MANBA、ARSA、GNPTAB或MCOLN1。在一些实施例中，外源性药剂由来自以下的基因编码在一些实施例中，外源性药剂由来自以下的基因编码：SYNE1、SETX、FMR1、SLC6A8、UBE3A、SOD1、TDP43、C9orf72、FXN、MECP2、ASPA或ALDH7A1。在一些实施例中，外源性药剂由来自以下的基因编码：TPP1、FUCA1、GALC、HEXA、HEXB、MANBA、ARSA、GNPTAB或MCOLN1。
在一些实施例中，外源性药剂包括下表5的蛋白质。在一些实施例中，外源性药剂包括表5的蛋白质中的任一种的野生型人类序列、其功能片段(例如其酶活性片段)或其功能变体。在一些实施例中，外源性药剂包括与表5的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，例如表5的第2列的Uniprot蛋白质寄存编号序列或表5的第3列的氨基酸序列。在一些实施例中，对外源性药剂进行编码的有效负荷基因对与表5的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列进行编码。
表5：CNS疾病或病症。第一列列出可以根据本文中的方法和用途递送以治疗第五列中的适应征的外源性药剂。表5的每个Uniprot寄存编号以全文引用的方式并入本文中。
Figure BDA0003155557330001681
Figure BDA0003155557330001691
Figure BDA0003155557330001701
Figure BDA0003155557330001711
Figure BDA0003155557330001721
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Figure BDA0003155557330001751
Figure BDA0003155557330001761
Figure BDA0003155557330001771
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Figure BDA0003155557330001791
在一些实施例中，靶细胞是小脑中的细胞，例如当外源性药剂是SYNE1时例如用于治疗脊髓小脑性共济失调、常染色体隐性1型。在一些实施例中，靶细胞是脑、脊髓和/或肌肉中的细胞，例如用于例如当外源性药剂是SETX时例如用于治疗共济失调伴眼球运动失用2型。在一些实施例中，靶细胞是神经元或星形胶质细胞，例如当外源性药剂是FMR1时例如用于治疗脆性X综合征。在一些实施例中，靶细胞是运动神经元，例如当外源性药剂是SOD1、TDP43或C9orf72时例如用于治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症。在一些实施例中，靶细胞是神经系统、心脏、肝脏和/或骨骼肌中的细胞，例如当外源性药剂是FXN时用于治疗弗里德赖希共济失调。在一些实施例中，靶细胞是脑中的神经元，例如当外源性药剂是MECP2时例如用于治疗雷特综合征。在一些实施例中，靶细胞是少突胶质细胞或神经元，例如当外源性药剂是ASPA时用于治疗卡纳万病。
在一些实施例中，外源性药剂包括下表6的蛋白质。在一些实施例中，外源性药剂包括表6的蛋白质中的任一种的野生型人类序列、其功能片段(例如其酶活性片段)或其功能变体。在一些实施例中，外源性药剂包括与表6的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，例如表6的第2列的Uniprot蛋白质寄存编号序列或表6的第3列的氨基酸序列。在一些实施例中，对外源性药剂进行编码的有效负荷基因对与表6的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列进行编码。
表6：溶酶体贮积病或病症和/或CNS疾病或病症。第一列列出可以根据本文中的方法和用途递送以治疗第五列中的适应征的外源性药剂。表6的每个Uniprot寄存编号以全文引用的方式并入本文中。
Figure BDA0003155557330001801
Figure BDA0003155557330001811
Figure BDA0003155557330001821
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Figure BDA0003155557330001841
在一些实施例中，靶细胞是少突胶质细胞，例如当外源性药剂是GALC时例如用于治疗克拉伯病。在一些实施例中，靶细胞是神经元，例如当外源性药剂是HEXA时用于治疗戴萨克斯病。在一些实施例中，靶细胞是神经元，例如当外源性药剂是HEXB时用于治疗山德霍夫氏病。
在一些实施例中，蛋白质药剂不是凝血因子，例如不是因子VII或因子IX。在一些实施例中，蛋白质药剂不是报道蛋白，例如荧光蛋白，例如GFP或荧光素酶。在一些蛋白质药剂不是细胞表面受体、NGF受体、半乳糖脑苷脂酶、gp91 phox、IFN-αTK、GCV和自身免疫抗原、细胞因子、血管生成抑制剂或抗癌剂或其片段或变体。
VII.隔离元件
在一些实施例中，融合剂脂质体，逆转录病毒或慢病毒载体或VLP进一步包括一个或多个隔离元件，例如本文所描述的隔离元件。隔离元件可以有助于保护慢病毒表达的序列(例如治疗多肽)以免整合位点效应，所述整合位点效应可以由存在于基因组DNA中的顺式作用元件介导并且导致所转移序列的表达失调(例如位置效应；参见例如Burgess-Beusse等人，2002，《美国国家科学院院刊》99:16433；和Zhan等人，2001，《人类遗传学(Hum.Genet.)》，109:471)或导致与所转移序列相邻的内源序列的表达失调。在一些实施例中，转移载体包含一个或多个隔离元件3'LTR，并且在原病毒整合到宿主基因组中后，原病毒凭借复制3'LTR而在5'LTR和/或3'LTR处包含一个或多个隔离子。适合的隔离子包括(但不限于)鸡β-球蛋白隔离子(参见Chung等人，1993.《细胞》74:505；Chung等人，1997.N4S94:575；以及Bell等人，1999.《细胞》98:387，所述文献以引用的方式并入本文中)或来自人类β-球蛋白基因座的隔离子，如鸡HS4。在一些实施例中，隔离子结合CCTCC结合因子(CTCF)。在一些实施例中，隔离子是阻挡型隔离子。在一些实施例中，隔离子是增强子阻断的隔离子。参见例如Emery等人，《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》，2011，以及Browning和Trobridge，《生物医药(Biomedicines)》，2016，两者均以全文引用的方式包括在内。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸中的隔离子减少接受者细胞的基因毒性。基因毒性可以如例如以下文献中所描述测量：Cesana等人，“发现以及剖析自失活慢病毒载体的体内基因毒性(Uncovering and dissecting the genotoxicity of self-inactivatinglentiviral vectors in vivo)”，《分子治疗学》，2014年4月；22(4):774-85.doi：10.1038/mt.2014.3.2014年1月20日电子出版。
VIII.评估靶细胞的融合剂脂质体含量
在一些方面，本公开还提供一种评估受试者的靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法，其包括提供来自已接受融合剂脂质体组合物(例如本文所描述的融合剂脂质体组合物)的受试者的生物样品，和进行分析以确定由生物样品中的靶细胞与如本文所描述的融合剂脂质体融合而产生的生物样品的一种或多种特性。在一些方面，本公开提供一种测量与靶细胞的融合的方法，例如如实例71中所描述。在一些实施例中，确定生物样品的一种或多种特性包括确定：融合剂的存在、货物或有效负载水平或与货物或有效负载相关的活性。
在一些方面，本公开提供一种评估个体的靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法，其包含提供来自已接受融合剂脂质体组合物(例如如本文所描述)的个体的生物样品，和关于融合剂，例如本文所描述的融合剂的存在对生物样品进行测试。在一些情况下，所检测到的融合剂的水平大于(例如，大至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、10,000％、50,000％或100,000％)在来自尚未接受融合剂脂质体组合物的个体的对应生物样品所观测到的水平。在一些实施例中，个体与施用融合剂脂质体组合物之前是同一个体，并且在一些实施例中，个体是不同的个体。
在一些方面，本公开提供一种评估个体的靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法，其包含提供来自已接受融合剂脂质体组合物(例如如本文所描述)的个体的生物样品，和关于货物或有效负载(例如如本文所描述的融合剂脂质体所递送)的存在对生物样品进行测试。在一些情况下，所检测到的货物或有效负载的水平大于(例如，大至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、10,000％、50,000％或100,000％)在来自尚未接受融合剂脂质体组合物的个体的对应生物样品所观测到的水平。在一些实施例中，个体与施用融合剂脂质体组合物之前是同一个体，并且在一些实施例中，个体是不同的个体。
在一些方面，本公开提供一种评估靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与个体的靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法，其包含提供来自已接受融合剂脂质体组合物(例如如本文所描述)的个体的生物样品，和关于与融合剂脂质体组合物相关的活性，例如与由融合剂脂质体组合物递送的货物或有效负载相关的活性的改变对生物样品进行测试。在一些情况下，相对于来自尚未接受融合剂脂质体组合物的个体(例如，在施用融合剂脂质体组合物之前的同一个体)的对应生物样品的活性水平，所检测到的活性水平增加例如至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、10,000％、50,000％或100,000％。在一些情况下，相对于来自尚未接受融合剂脂质体组合物的个体的对应生物样品的活性水平，所检测到的活性水平减小例如至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、10,000％、50,000％或100,000％。在一些实施例中，个体与施用融合剂脂质体组合物之前是同一个体，并且在一些实施例中，个体是不同的个体。
在一个方面，本公开提供一种评估融合剂脂质体与个体的靶细胞的融合的方法，其包含提供来自已接受融合剂脂质体组合物(例如如本文所描述)的个体的生物样品和评估生物样品中未融合的融合剂脂质体的水平。
在评估个体中引起接受者细胞形成的靶细胞的融合剂脂质体含量(例如例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法的一些实施例中，所述方法还包含从个体收集生物样品。在实施例中，生物样品包括一个或多个接受者细胞。
在评估个体中靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法的一些实施例中，所述方法还包含将生物样品中的接受者细胞与生物样品中未融合的融合剂脂质体分离，例如通过离心。在一些实施例中，方法还包含相对于生物样品中未融合的融合剂脂质体富集接受者细胞，例如通过离心。在一些实施例中，方法还包含相对于生物样品中的非靶细胞富集靶细胞，例如通过FACS。
在评估个体中靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法的一些实施例中，与融合剂脂质体组合物相关的活性是选自代谢物的存在或水平、生物标记的存在或水平(例如蛋白质水平或翻译后修饰，例如磷酸化或分裂)。
在评估个体中靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法的一些实施例中，与融合剂脂质体组合物相关的活性为免疫原性。在实施例中，靶细胞为CD3+细胞并且生物样品为从个体收集的血液样品。在实施例中，从血液样品富集血细胞，例如使用缓冲氯化铵溶液。在实施例中，将富集的血细胞与抗CD3抗体(例如鼠类抗CD3-FITC抗体)一起培育并选择CD3+细胞，例如通过荧光激活细胞分选术。在实施例中，关于细胞表面上抗体的存在对细胞，例如分选的细胞，例如CD3+细胞进行分析，例如通过用抗IgM抗体染色。在一些实施例中，如果抗体以高于参考水平的水平存在，那么将个体鉴别为具有针对接受者细胞的免疫应答。
在实施例中，通过细胞溶解分析来分析免疫原性。在实施例中，将来自生物样品的接受者细胞与能够溶解其它细胞的免疫效应细胞共培育。在实施例中，免疫效应细胞来自所述个体或来自未施用融合剂脂质体组合物的个体。例如，在实施例中，通过PBMC细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将来自生物样品的接受者细胞与来自个体的外周血单核细胞(PBMC)或来自未施用融合剂脂质体组合物的个体的对照PBMC共培育，并且接着评估PBMC对接受者细胞的溶解。在实施例中，通过自然杀手(NK)细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将接受者细胞与来自个体的NK细胞或来自未施用融合剂脂质体组合物的个体的对照NK细胞共培育，并且接着评估NK细胞对接受者细胞的溶解。在实施例中，通过CD8+T细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将接受者细胞与来自个体的CD8+T细胞或来自未施用融合剂脂质体组合物的个体的对照CD8+T细胞共培育，并且接着评估CD8+T细胞对靶细胞的溶解。在一些实施例中，如果细胞溶解以高于参考水平的水平发生，那么将个体鉴别为具有针对接受者细胞的免疫应答。
在一些实施例中，通过接受者细胞的吞噬作用(例如通过巨噬细胞)来分析免疫原性。在实施例中，用于吞噬作用的巨噬细胞未靶向接受者细胞。在实施例中，生物样品为从个体收集的血液样品。在实施例中，从血液样品富集血细胞，例如使用缓冲氯化铵溶液。在实施例中，将富集的血细胞与抗CD3抗体(例如鼠类抗CD3-FITC抗体)一起培育并选择CD3+细胞，例如通过荧光激活细胞分选术。在实施例中，将荧光标记的CD3+细胞与巨噬细胞一起培育并且接着测试巨噬细胞内的细胞内荧光，例如通过流式细胞测量术。在一些实施例中，如果巨噬细胞吞噬作用以高于参考水平的水平发生，那么将受试者鉴别为具有针对接受者细胞的免疫应答。
IX.融合剂脂质体的物理和功能特征
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将药剂，例如蛋白质、核酸(例如mRNA)、细胞器或代谢物递送(例如递送)到靶细胞的胞质溶胶。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将药剂递送到靶细胞的胞质溶胶。在一些实施例中，药剂是靶细胞中不存在、突变或水平低于野生型的蛋白质(或编码蛋白质的核酸，例如编码蛋白质的mRNA)。在一些实施例中，靶细胞来自患有遗传病，例如单基因病，例如单基因细胞内蛋白质疾病的个体。在一些实施例中，药剂包含转录因子，例如外源转录因子或内源转录因子。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含或方法还包含递送一个或多个(例如至少2、3、4、5、10、20或50个)额外转录因子，例如外源转录因子、内源转录因子或其组合。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含多种药剂(例如至少2、3、4、5、10、20或50种药剂)(例如能够将其递送到靶细胞)，其中多种药剂中的每一种作用于靶细胞中的途径的步骤，例如其中途径为生物合成途径、分解代谢途径或信号转导级联。在实施例中，多种药剂中的每一种上调所述途径或下调所述途径。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含或方法还包含递送一种或多种额外药剂(例如包含第二多种药剂)，所述药剂不作用于所述途径的步骤，例如作用于第二途径的步骤。在一些实施例中，融合剂脂质体包含多种药剂(例如至少2、3、4、5、10、20或50种药剂)(例如能够将其递送到靶细胞)或方法还包含递送所述多种药剂，多种药剂中的每一种为单一途径的一部分，例如其中所述途径为生物合成途径、分解代谢途径或信号转导级联。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含或方法还包含递送一种或多种额外药剂(例如包含第二多种药剂)，所述药剂不是单一途径的一部分，例如是第二途径的一部分。
在一些实施例中，靶细胞包含聚集或错误折叠的蛋白质。在一些实施例中，融合剂脂质体能够降低靶细胞中的聚集或错误折叠的蛋白质的水平(例如降低其水平)，或本文的方法包含降低靶细胞中的聚集或错误折叠的蛋白质的水平。
在一些实施例中，药剂是选自转录因子、酶(例如核酶或胞质酶)、介导对DNA的序列特异性修饰的试剂(例如Cas9、ZFN或TALEN)、mRNA(例如编码细胞内蛋白质的mRNA)、细胞器或代谢物。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将药剂，例如蛋白质递送(例如递送)到靶细胞的细胞膜。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将药剂递送到靶细胞的细胞膜。在一些实施例中，递送蛋白质包含将编码蛋白质的核酸(例如mRNA)递送到靶细胞，使得靶细胞产生蛋白质并将其定位到膜。在一些实施例中，融合剂脂质体包含或方法还包含递送蛋白质，并且融合剂脂质体与靶细胞的融合将蛋白质转移到靶细胞的细胞膜。在一些实施例中，药剂包含细胞表面配体或结合细胞表面受体的抗体。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含或方法还包含递送第二药剂，所述药剂包含或编码第二细胞表面配体或结合细胞表面受体的抗体，并且任选地还包含或编码一个或多个额外细胞表面配体或结合细胞表面受体的抗体(例如1、2、3、4、5、10、20、50或更多个)。在一些实施例中，第一药剂和第二药剂形成复合物，其中任选地，复合物还包含一个或多个额外细胞表面配体。在一些实施例中，药剂包含或编码细胞表面受体，例如外源细胞表面受体。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含或方法还包含递送第二药剂，所述第二药剂包含或编码第二细胞表面受体，并且任选地还包含或编码一个或多个额外细胞表面受体(例如1、2、3、4、5、10、20、50或更多个细胞表面受体)。
在一些实施例中，第一药剂和第二药剂形成复合物，其中任选地，复合物还包含一个或多个额外细胞表面受体。在一些实施例中，药剂包含或编码抗原或抗原呈递蛋白。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将分泌性药剂，例如分泌性蛋白质递送(例如递送)到目标位点(例如胞外区)，例如通过在允许靶细胞产生和分泌蛋白质的条件下将编码蛋白质的核酸(例如mRNA)递送到靶细胞。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含递送如本文所描述的分泌性药剂。在实施例中，分泌性蛋白是内源或外源的。在实施例中，分泌性蛋白包含蛋白质治疗剂，例如抗体分子、细胞因子或酶。在实施例中，分泌性蛋白包含自分泌信号传导分子或旁分泌信号传导分子。在实施例中，分泌药剂包含分泌性颗粒。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够对靶细胞(例如免疫细胞)重编程(例如重编程)，例如通过递送选自转录因子或mRNA的药剂，或多种所述药剂。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含对靶细胞重编程。在实施例中，重编程包含通过诱导非多巴胺能神经元具有多巴胺能神经元的一个或多个特征，或通过诱导耗尽的T细胞具有非耗尽的T细胞(例如杀手T细胞)的一个或多个特征来诱导胰腺内分泌细胞具有胰腺β细胞的一个或多个特征。在一些实施例中，药剂包含抗原。在一些实施例中，融合剂脂质体包含有包含抗原的第一药剂和包含抗原呈递蛋白的第二药剂。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够向靶细胞(例如免疫细胞)供给(例如供给)一个或多个细胞表面受体。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含供给一个或多个细胞表面受体。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够修饰(例如修饰)靶肿瘤细胞。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含修饰靶肿瘤细胞。在实施例中，融合剂脂质体包含编码免疫刺激配体、抗原呈递蛋白、肿瘤抑制蛋白或促凋亡蛋白的mRNA。在一些实施例中，融合剂脂质体包含能够降低靶细胞中免疫抑制配体、促有丝分裂信号或生长因子的水平的miRNA。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含免疫调节剂，例如免疫刺激剂。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够引起(例如引起)靶细胞呈递抗原。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将抗原呈递到靶细胞上。
在一些实施例中，融合剂脂质体促进靶组织中的再生。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含促进靶组织中的再生。在实施例中，靶细胞为心肌细胞(cardiac cell)，例如心肌细胞(cardiomyocyte)(例如休眠心肌细胞)；成肝细胞(例如胆管成肝细胞)；上皮细胞；未处理的T细胞；巨噬细胞(例如肿瘤浸润性巨噬细胞)；或成纤维细胞(例如心肌成纤维细胞)。在实施例中，源细胞为T细胞(例如Treg)、巨噬细胞或心肌细胞。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将核酸递送(例如递送)到靶细胞，例如以稳定地修饰靶细胞的基因组，例如用于基因疗法。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将核酸递送到靶细胞。在一些实施例中，靶细胞具有酶缺陷，例如在酶中包含导致酶活性降低(例如无活性)的突变。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够递送(例如递送)在靶细胞中介导对DNA(例如Cas9、ZFN或TALEN)的序列特异性修饰的试剂。类似地，在一些实施例中，本文的方法包括将试剂递送到靶细胞。在实施例中，靶细胞是CNS细胞。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将核酸递送(例如递送)到靶细胞，例如以暂时修饰靶细胞中的基因表达。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将蛋白质递送(例如递送)到靶细胞，例如以短暂拯救蛋白质缺乏。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将蛋白质递送到靶细胞。在实施例中，蛋白质为膜蛋白(例如膜转运蛋白)、胞质蛋白(例如酶)或分泌蛋白(例如免疫抑制蛋白)。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将细胞器递送(例如递送)到靶细胞，例如其中靶细胞具有缺陷的细胞器网络。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将细胞器递送到靶细胞。在实施例中，源细胞为肝细胞、骨骼肌细胞或神经元。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将细胞核递送(例如递送)到靶细胞，例如其中靶细胞具有基因突变。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将细胞核递送到靶细胞。在一些实施例中，细胞核是自体的并且包含一个或多个相对于靶细胞的基因变化，例如其包含对DNA(例如Cas9、ZFN或TALEN)的序列特异性修饰，或人工染色体、整合到基因组中的额外基因序列、缺失或其任何组合。在实施例中，自体细胞核的来源是干细胞，例如造血干细胞。在实施例中，靶细胞是肌细胞(例如骨骼肌细胞或心肌细胞)、肝细胞或神经元。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够进行细胞内分子递送，例如将蛋白质药剂递送到靶细胞。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将分子递送到靶细胞的胞内区。在实施例中，蛋白质药剂为抑制剂。在实施例中，蛋白质药剂包含纳米抗体、scFv、骆驼抗体、肽、大环或小分子。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够引起(例如引起)靶细胞分泌蛋白质，例如治疗蛋白。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含促使靶细胞分泌蛋白质。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够分泌(例如分泌)药剂，例如蛋白质。在一些实施例中，药剂(例如分泌药剂)被递送到个体的靶位点。在一些实施例中，药剂是不能以重组方式制备或难以以重组方式制备的蛋白质。在一些实施例中，分泌蛋白质的融合剂脂质体是来自选自MSC或软骨细胞的源细胞。
在一些实施例中，融合剂脂质体在其膜上包含一个或多个细胞表面配体(例如1、2、3、4、5、10、20、50或更多个细胞表面配体)。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将一个或多个细胞表面配体呈递到靶细胞。在一些实施例中，具有细胞表面配体的融合剂脂质体来自选自嗜中性粒细胞(例如，并且靶细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞)、树突状细胞(例如，并且靶细胞为未处理的T细胞)或嗜中性粒细胞(例如，并且靶细胞为肿瘤细胞或病毒感染的细胞)的源细胞。在一些实施例中，融合剂脂质体包含膜复合物，例如包含至少2、3、4或5个蛋白质的复合物，例如同二聚体、异二聚体、同三聚体、异三聚体、同四聚体或异四聚体。在一些实施例中，融合剂脂质体包含抗体，例如毒性抗体，例如融合剂脂质体能够将抗体递送到靶位点，例如通过归巢到靶位点。在一些实施例中，源细胞为NK细胞或嗜中性粒细胞。
在一些实施例中，本文的方法包含引起蛋白质从靶细胞分泌或配体呈递到靶细胞表面上。在一些实施例中，融合剂脂质体能够引起靶细胞的细胞死亡。在一些实施例中，融合剂脂质体来自NK源细胞。
在一些实施例中，融合剂脂质体或靶细胞能够进行吞噬作用(例如吞噬病原体)。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含引起吞噬作用。
在一些实施例中，融合剂脂质体感测其局部环境并对其作出反应。在一些实施例中，融合剂脂质体能够感测代谢物、白介素或抗原的水平。
在实施例中，融合剂脂质体能够进行趋化性、外渗或一种或多种代谢活动。在实施例中，代谢代谢活动是选自犬尿氨酸(kyneurinine)、葡糖新生、前列腺素脂肪酸氧化、腺苷代谢、尿素循环和产热呼吸。在一些实施例中，源细胞为嗜中性粒细胞并且融合剂脂质体能够归巢到损伤部位。在一些实施例中，源细胞为巨噬细胞并且融合剂脂质体能够进行吞噬作用。在一些实施例中，源细胞为棕色脂肪组织细胞并且融合剂脂质体能够进行脂解。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含多种药剂(例如至少2、3、4、5、10、20或50种药剂)(例如能够将其递送到靶细胞)。在实施例中，融合剂脂质体包含抑制性核酸(例如siRNA或miRNA)和mRNA。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含膜蛋白或编码膜蛋白的核酸(例如能够将其递送到靶细胞)。在实施例中，融合剂脂质体能够重编程或转分化靶细胞，例如融合剂脂质体包含一种或多种诱导靶细胞重编程或转分化的药剂。
在一些实施例中，个体需要再生。在一些实施例中，个体罹患癌症、自身免疫病、传染病、代谢疾病、神经退化性疾病或遗传病(例如酶缺乏症)。
在一些实施例(例如用于分析货物的非内吞递送的实施例)中，使用以下步骤中的一个或多个(例如全部)来分析货物递送：(a)将30,000个HEK-293T靶细胞置于包含100nM巴弗洛霉素A1的96孔盘的第一孔中，和将类似数目的类似细胞置于缺少巴弗洛霉素A1的96孔盘的第二孔中，(b)在DMEM培养基中在37℃和5％CO2下培养靶细胞四小时，(c)使靶细胞与10μg包含货物的融合剂脂质体接触，(d)在37℃和5％CO2下培育靶细胞和融合剂脂质体24小时，和(e)确定第一孔和第二孔中包含货物的细胞的百分比。步骤(e)可以包含使用显微法，例如使用免疫荧光来检测货物。步骤(e)可以包括间接检测货物，例如检测货物的下游效应，例如报道蛋白的存在。在一些实施例中，如实例80中所描述地进行以上步骤(a)-(e)中的一个或多个。
在一些实施例中，内吞作用的抑制剂(例如氯奎或巴弗洛霉素A1)抑制抑制内体酸化。在一些实施例中，货物递送独立于溶酶体酸化。在一些实施例中，内吞作用的抑制剂(例如Dynasore)抑制发动蛋白。在一些实施例中，货物递送独立于发动蛋白活性。
在一些实施例(例如用于相对于非靶细胞，向靶细胞特异性递送货物的实施例)中，使用以下步骤中的一个或多个(例如全部)来分析货物递送：(a)将30,000个过度表现CD8a和CD8b的HEK-293T靶细胞置于96孔盘的第一孔中，并将不过度表现CD8a和CD8b的30,000个HEK-293T非靶细胞置于96孔盘的第二孔中，(b)在DMEM培养基中在37℃和5％CO2下培养靶细胞四小时，(c)使靶细胞与10μg包含货物的融合剂脂质体接触，(d)在37℃和5％CO2下培育靶细胞和融合剂脂质体24小时，和(e)确定第一孔和第二孔中包含货物的细胞的百分比。步骤(e)可以包含使用显微法，例如使用免疫荧光来检测货物。步骤(e)可以包括间接检测货物，例如检测货物的下游效应，例如报道蛋白的存在。在一些实施例中，如实例71中所描述地进行以上步骤(a)-(e)中的一个或多个。
在一些实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞融合的速率，例如高至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，例如在实例42的分析中在一些实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于其它融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如在实例42的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体与靶细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率融合，例如在实例42的分析中。在实施例中，靶向融合的量为约30％-70％、35％-65％、40％-60％、45％-55％或45％-50％，例如约48.8％，例如在实例42的分析中。在实施例中，靶向融合的量为约20％-40％、25％-35％或30％-35％，例如约32.2％，例如在实例43的分析中。
在一些实施例中，融合剂以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数存在，例如如实例26的分析所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体包括的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的融合剂被安置于细胞膜中。在实施例中，融合剂脂质体还在内部，例如在细胞质或细胞器中包括融合剂。在一些实施例中，融合剂包括(或被鉴别为包括)融合剂脂质体中总蛋白质的约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％或更大，或约1-30％、5-20％、10-15％、12-15％、13-14％或13.6％，例如如根据实例94中所描述的方法和/或通过质谱分析确定。在实施例中，融合剂包括(或被鉴别为包括)融合剂脂质体中的总蛋白质的约13.6％。在一些实施例中，融合剂比一种或多种额外的所关注的蛋白质更丰富或更不丰富(或被鉴别为如此)，例如如根据实例94中描述的方法所确定。在一个实施例中，融合剂与EGFP具有(或被鉴别为具有)约140、145、150、151、152、153、154、155、156、157(例如156.9)、158、159、160、165或170的比率。在另一实施例中，融合剂与CD63具有(或被鉴别为具有)约2700、2800、2900、2910(例如2912)、2920、2930、2940、2950、2960、2970、2980、2990或3000，或约1000-5000、2000-4000、2500-3500、2900-2930、2910-2915或2912.0的比，例如根据质谱分析。在一个实施例中，融合剂与ARRDC1具有(或被鉴别为具有)约600、610、620、630、640、650、660(例如664.9)、670、680、690或700的比率。在另一实施例中，融合剂与GAPDH具有(或被鉴别为具有)约50、55、60、65、70(例如69)、75、80或85，或约1-30％、5-20％、10-15％、12-15％、13-14％或13.6％的比率。在另一实施例中，融合剂与CNX具有(或被鉴别为具有)约500、510、520、530、540、550、560(例如558.4)、570、580、590或600，或约300-800、400-700、500-600、520-590、530-580、540-570、550-560或558.4的比率，例如根据质谱分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包括治疗剂，例如如通过实例88的分析所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包括蛋白质治疗剂，例如如通过实例88的分析所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包括核酸治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含DNA治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含RNA治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含外源治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含外源蛋白质治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含外源核酸(例如DNA或RNA)治疗剂。在一些实施例中，融合剂的拷贝数与治疗剂的拷贝数的比在1,000,000:1与100,000:1之间、在100,000:1与10,000:1之间、在10,000:1与1,000:1之间、在1,000:1与100:1之间、在100:1与50:1之间、在50:1与20:1之间、在20:1与10:1之间、在10:1与5:1之间、在5:1与2:1之间、在2:1与1:1之间、在1:1与1:2之间、在1:2与1:5之间、在1:5与1:10之间、在1:10与1:20之间、在1:20与1:50之间、在1:50与1:100之间、在1:100与1:1,000之间、在1:1,000与1:10,000之间、在1:10,000与1:100,000之间或在1:100,000与1:1,000,000之间。
在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的蛋白质治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的核酸治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的RNA治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的DNA治疗剂。
在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的融合剂脂质体所包含的货物(例如治疗剂，例如内源性治疗剂或外源性治疗剂)。在一些实施例中，与一个或多个靶细胞融合的融合剂脂质体向靶细胞递送平均至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的与一个或多个靶细胞融合的融合剂脂质体所包含的货物(例如治疗剂，例如内源性治疗剂或外源性治疗剂)。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物向靶组织递送至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的融合剂脂质体组合物所包含的货物(例如治疗剂，例如内源性治疗剂或外源性治疗剂)。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含0.00000001mg融合剂到1mg融合剂/mg融合剂脂质体中的总蛋白，例如0.00000001-0.0000001、0.0000001-0.000001、0.000001-0.00001、0.00001-0.0001、0.0001-0.001、0.001-0.01、0.01-0.1、或0.1-1mg融合剂/mg融合剂脂质体中的总蛋白。在一些实施例中，融合剂脂质体包括0.00000001mg融合剂到5mg融合剂/mg融合剂脂质体中的脂质，例如0.00000001-0.0000001、0.0000001-0.000001、0.000001-0.00001、0.00001-0.0001、0.0001-0.001、0.001-0.01、0.01-0.1、0.1-1或1-5mg融合剂/mg融合剂脂质体中的脂质。
在一些实施例中，货物为蛋白质货物。在实施例中，货物为内源性或合成蛋白质货物。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)至少1、2、3、4、5、10、20、50、100或更多个蛋白质货物分子/融合剂脂质体。在一个实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)约100、110、120、130、140、150、160、166、170、180、190或200个蛋白质药剂分子/融合剂脂质体，例如如根据实例88中所描述的方法所定量。在一些实施例中，内源性或合成蛋白质货物包括(或被鉴别为包括)融合剂脂质体中的总蛋白质的约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％或更大。在一个实施例中，合成蛋白质货物占(或被鉴别为占)融合剂脂质体中的总蛋白的约13.6％。在一些实施例中，合成蛋白质货物与VSV-G具有(或被鉴别为具有)约4×10-3、5×10-3、6×10-3(例如6.37×10-3)、7×10-3或8×10-3的比率。在实施例中，合成蛋白质货物与CD63具有(或被鉴别为具有)约10、15、16、17、18(例如18.6)、19、20、25或30，或约10-30、15-25、16-19、18-19或18.6的比。在实施例中，合成蛋白质货物与ARRDC1具有(或被鉴别为具有)约2、3、4(例如4.24)、5、6或7的比率。在实施例中，合成蛋白质货物与GAPDH具有(或被鉴别为具有)约0.1、0.2、0.3、0.4(例如0.44)、0.5、0.6或0.7的比。在实施例中，合成蛋白质货物与CNX具有(或被鉴别为具有)约1、2、3(例如3.56)、4、5或6的比率。在实施例中，合成蛋白质货物与TSG101具有(或被鉴别为具有)约10、15、16、17、18、19(例如19.52)、20、21、22、23、24、25或30的比率。
在一些实施例中，融合剂包括(或被鉴别为包括)融合剂脂质体中的总蛋白质的至少0.5％、1％、5％、10％或更大，例如根据质谱分析。在一个实施例中，融合剂包括(或被鉴别为包括)融合剂脂质体中的总蛋白质的约1-30％、5-20％、10-15％、12-15％、13-14％或13.6％，例如根据质谱分析。在一些实施例中，融合剂比其它所关注的蛋白质更丰富。在实施例中，融合剂与有效负载蛋白(例如EGFP)具有(或被鉴别为具有)约145-170、150-165、155-160、156.9的比，例如根据质谱分析。在实施例中，融合剂与CD63具有(或被鉴别为具有)约1000-5000、2000-4000、2500-3500、2900-2930、2910-2915或2912.0的比，例如根据质谱分析。在实施例中，融合剂与ARRDC1具有约300-1000、400-900、500-800、600-700、640-690、650-680、660-670或664.9的比率，例如根据质谱分析。在实施例中，融合剂与GAPDH具有(或被鉴别为具有)约20-120、40-100、50-90、60-80、65-75、68-70或69.0的比率，例如根据质谱分析。在实施例中，融合剂与CNX具有约200-900、300-800、400-700、500-600、520-590、530-580、540-570、550-560或558.4的比率，例如根据质谱分析。在实施例中，质谱分析为实例94的分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体和源细胞两者中所存在(例如在其之间共有)的脂质物质的数目为(或被鉴别为)至少300、400、500、550、560或569，或在500-700、550-600或560-580之间，例如使用质谱分析。在实施例中，以源细胞中的对应脂质水平的至少25％的水平(均被标准化为样品内的总脂质水平)存在于融合剂脂质体中的脂质物质的数目为(或被鉴别为)至少300、400、500、530、540或548，或在400-700、500-600、520-570、530-560或540-550之间，例如使用质谱分析。在一些实施例中，融合剂脂质体和源细胞两者中所存在(例如在其之间共有)的脂质物质相对于源细胞中的总脂质物质的分率为(或被鉴别为)约0.4-1.0、0.5-0.9、0.6-0.8或0.7，或至少0.4、0.5、0.6或0.7，例如使用质谱分析。在一些实施例中，质谱分析是实例86的分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体和源细胞两者中所存在(例如在其之间共有)的蛋白质物质的数目为(或被鉴别为)至少500、1000、1100、1200、1300、1400、1487、1500或1600，或为(或被鉴别为)在1200-1700、1300-1600、1400-1500、1450-1500或1480-1490之间，例如使用质谱分析。在实施例中，以源细胞中的对应蛋白质水平的至少25％的水平(均被标准化为样品内的总蛋白质水平)存在于融合剂脂质体中的蛋白质物质的数目为(或被鉴别为)至少500、600、700、800、900、950、957、1000或1200，例如使用质谱分析。在一些实施例中，融合剂脂质体和源细胞两者中所存在(例如在其之间共有)的蛋白质物质相对于源细胞中的总蛋白质物质的分率为(或被鉴别为)约0.1-0.6、0.2-0.5、0.3-0.4或0.333，或至少约0.1、0.2、0.3、0.333或0.4，例如使用质谱分析。在实施例中，质谱分析为实例87的分析。
在一些实施例中，CD63以(或被鉴别为以)融合剂脂质体中的总蛋白质的量的小于0.048％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％存在，例如根据质谱分析，例如实例89的分析。
在一些实施例中，通过经由过滤器，例如约1-10、2-8、3-7、4-6或5μm的过滤器挤压来产生融合剂脂质体。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)约1-5、2-5、3-5、4-5或5μm的平均直径。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)至少1、2、3、4或5μm的平均直径。
在一些实施例中，相比于源细胞，融合剂脂质体富含(或被鉴别为富含)以下脂质中的一种或多种(例如至少2、3、4、5种或全部)：胆固醇酯、游离胆固醇、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酸酯、醚连接的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。在一些实施例中，相比于源细胞，融合剂脂质体耗尽(或被鉴别为耗尽)以下脂质中的一种或多种(例如至少2、3、4、5种或全部)：神经酰胺、心磷脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰肌醇、醚连接的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和三酰甘油。在一些实施例中，融合剂脂质体富含(或被鉴别为富含)前述富集的脂质中的一种或多种并耗尽前述耗尽的脂质中的一种或多种。在一些实施例中，相比于源细胞中的对应水平，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍或10倍的总脂质的百分比形式的富集的脂质。在一些实施例中，融合剂脂质体以源细胞中的对应水平的小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的水平包括(或被鉴别为包括)总脂质的百分比形式的耗尽的脂质。在实施例中，脂质富集是通过质谱分析，例如实例96的分析来测量。
在一些实施例中，融合剂脂质体中的CE脂质水平比(或被鉴别为比)外泌体中高约2倍和/或融合剂脂质体中的CE脂质水平比亲本细胞中高约5、6、7、8、9或10倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，亲本细胞中的神经酰胺脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约2、3、4或5倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的胆固醇水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍和/或融合剂脂质体中的胆固醇水平比亲本细胞中高约2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，亲本细胞中的CL脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高至少约5、10、20、30或40倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的DAG脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约2或3倍和/或亲本细胞中的DAG脂质水平比融合剂脂质体中高约1.5或2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PC脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PC脂质水平比融合剂脂质体中高约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PC O-脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PC O-脂质水平比融合剂脂质体中高约2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，融合剂脂质体中的PE脂质水平比(或被鉴别为比)外泌体中高约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8倍和/或亲本细胞中的PE脂质水平比融合剂脂质体中高约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PE O-脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PE O-脂质水平比融合剂脂质体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PG脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PG脂质水平比融合剂脂质体中高约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PI脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PI脂质水平比融合剂脂质体中高约3、4、5、6或7倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PS脂质水平为(或被鉴别为)(或被鉴别为)约相等和/或融合剂脂质体中的PS脂质水平比亲本细胞中高约2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的SM脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或融合剂脂质体中的SM脂质水平比亲本细胞中高约2、2.5或3倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的TAG脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的TAG脂质水平比融合剂脂质体中高约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更大(相对于样品中的总脂质)。
在一些实施例中，相比于外泌体，融合剂脂质体富含(或被鉴别为富含)以下脂质中的一种或多种(例如至少2、3、4、5种或全部)：胆固醇酯、神经酰胺、二酰甘油、溶血磷脂酸酯和磷脂酰乙醇胺，以及三酰甘油。在一些实施例中，相比于外泌体，融合剂脂质体耗尽(或被鉴别为耗尽)以下脂质中的一种或多种(例如至少2、3、4、5种或全部)(相对于样品中的总脂质)：游离胆固醇、己糖基神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱、醚连接的溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰丝氨酸。在一些实施例中，融合剂脂质体富含(或被鉴别为富含)前述富集的脂质中的一种或多种并耗尽前述耗尽的脂质中的一种或多种。在一些实施例中，相比于外泌体中的对应水平，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍或10倍的总脂质的百分比形式的富集的脂质。在一些实施例中，融合剂脂质体以外泌体中的对应水平的小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的水平包括(或被鉴别为包括)总脂质的百分比形式的耗尽的脂质。在实施例中，脂质富集是通过质谱分析，例如实例96的分析来测量。
在一些实施例中，融合剂脂质体中的神经酰胺脂质水平比(或被鉴别为比)外泌体中高约2倍和/或亲本细胞中的神经酰胺脂质水平比融合剂脂质体中高约2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的HexCer脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍和/或亲本细胞与融合剂脂质体中的HexCer脂质水平约相等(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，融合剂脂质体中的LPA脂质水平比(或被鉴别为比)外泌体中高约3倍或4倍和/或融合剂脂质体中的LPA脂质水平比亲本细胞中高约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的LPC脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约2倍和/或亲本细胞中的LPC脂质水平比融合剂脂质体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的LPC O-脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约3倍或4倍和/或亲本细胞与融合剂脂质体之间的LPC O-脂质水平约相等(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的LPE脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍和/或亲本细胞中的LPE脂质水平比融合剂脂质体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的LPE O-脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约2倍或3倍和/或亲本细胞与融合剂脂质体之间的LPE O-脂质水平约相等(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的LPS脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约3倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，融合剂脂质体中的PA脂质水平比(或被鉴别为比)外泌体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍和/或融合剂脂质体中的PA脂质水平比亲本细胞中高约2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，融合剂脂质体与外泌体之间的PG脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PG脂质水平比融合剂脂质体中高约10、11、12、13、14或15倍(相对于样品中的总脂质)。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含与源细胞基本上类似的脂质组成，或其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应脂质水平的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％内。在实施例中，融合剂脂质体的脂质组成与衍生其的细胞类似。在实施例中，如果亲本细胞的任何复制样品中所鉴别的大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的脂质物质存在(或被鉴别为存在)于融合剂脂质体的任何复制样品中，那么融合剂脂质体和亲本细胞具有(或被鉴别为具有)类似脂质组成，例如根据实例86所确定。在实施例中，融合剂脂质体中的所鉴别的脂质的平均水平大于亲本细胞中的对应平均脂质物质水平约10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％(相对于样品中的总脂质)。在一个实施例中，相对于亲本细胞，融合剂脂质体的脂质组成富含和/或耗尽特定脂质(相对于样品中的总脂质)。
在一些实施例中，相对于亲本细胞，融合剂脂质体的脂质组成(或被鉴别为)富含和/或耗尽特定脂质，例如如根据实例96中描述的方法所确定。
在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)比亲本细胞更大的磷脂酰丝氨酸与总脂质的比率。在实施例中，相对于亲本细胞，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)约110％、115％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、130％、135％、140％或更大的磷脂酰丝氨酸与总脂质的比率。在一些实施例中，相对于亲本细胞，融合剂脂质体(或被鉴别为)富含胆固醇酯、游离胆固醇、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酸酯、醚连接的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和/或鞘磷脂。在一些实施例中，相对于亲本细胞，融合剂脂质体(或被鉴别为)耗尽神经酰胺、心磷脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰肌醇、醚连接的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和/或三酰甘油。在一些实施例中，相对于外泌体，融合剂脂质体(或被鉴别为)富含胆固醇酯、神经酰胺、二酰甘油、溶血磷脂酸酯、磷脂酰乙醇胺和/或三酰甘油。在一些实施例中，相对于外泌体，融合剂脂质体(或被鉴别为)耗尽游离胆固醇、己糖基神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱、醚连接的溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺和/或溶血磷脂酰丝氨酸。
在一些实施例中，融合剂脂质体的心磷脂:神经酰胺的比率在源细胞中的心磷脂:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:二酰甘油的比率在源细胞中的心磷脂:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的心磷脂:己糖基神经酰胺鹅比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内或心磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的心磷脂:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酸酯的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:胆固醇酯的比率在源细胞中的心磷脂:胆固醇酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:鞘磷脂的比率在源细胞中的心磷脂:鞘磷脂的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:三酰甘油的比率在源细胞中的心磷脂:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:二酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:己糖基神经酰胺鹅比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:磷脂酸酯的比率在源细胞中的心磷脂:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:胆固醇酯的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:胆固醇酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:鞘磷脂的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:鞘磷脂的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱:三酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰胆碱:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:二酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:己糖基神经酰胺鹅比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:磷脂酸酯的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:胆固醇酯的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:胆固醇酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:鞘磷脂的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:鞘磷脂的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺:三酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰乙醇胺:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:二酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:己糖基神经酰胺鹅比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:磷脂酸酯的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:胆固醇酯的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:胆固醇酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:鞘磷脂的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:鞘磷脂的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸:三酰甘油的比率在源细胞中的磷脂酰丝氨酸:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:神经酰胺的比率在源细胞中的鞘磷脂:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:二酰甘油的比率在源细胞中的鞘磷脂:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的鞘磷脂:己糖基神经酰胺鹅比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内或鞘磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的鞘磷脂:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:磷脂酸酯的比率在源细胞中的鞘磷脂:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的鞘磷脂:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的鞘磷脂:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:胆固醇酯的比率在源细胞中的鞘磷脂:胆固醇酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂:三酰甘油的比率在源细胞中的鞘磷脂:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:神经酰胺的比率在源细胞中的胆固醇酯:神经酰胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:二酰甘油的比率在源细胞中的胆固醇酯:二酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:己糖基神经酰胺的比率在源细胞中的胆固醇酯:己糖基神经酰胺鹅比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:溶血磷脂酸酯的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内或胆固醇酯:溶血磷脂酰胆碱的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰胆碱的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:溶血磷脂酰乙醇胺的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰乙醇胺的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:溶血磷脂酰甘油的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:溶血磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:溶血磷脂酰丝氨酸的比率在源细胞中的胆固醇酯:溶血磷脂酰丝氨酸的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:磷脂酸酯的比率在源细胞中的胆固醇酯:磷脂酸酯的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:磷脂酰甘油的比率在源细胞中的胆固醇酯:磷脂酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:磷脂酰肌醇的比率在源细胞中的胆固醇酯:磷脂酰肌醇的比率的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯:三酰甘油的比率在源细胞中的胆固醇酯:三酰甘油的比率的10％、20％、30％、40％或50％内。
在一些实施例中，融合剂脂质体包括与源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例87的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的蛋白质组成与衍生其的亲本细胞类似。在一些实施例中，将多个类别的蛋白质中的每一类别的分数含量确定为来自每一类别的强度信号的总和除以样品中所有鉴别的蛋白质的强度信号的总和，例如如实例87中所描述。在一些实施例中，相对于亲本细胞和/或外泌体，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)不同量的区室特异性蛋白质，例如如根据实例97中所描述的方法所确定。在一些实施例中，相比于亲本细胞和外泌体，融合剂脂质体(或被鉴别为)耗尽内质网蛋白。在一些实施例中，相比于外泌体，融合剂脂质体(或被鉴别为)耗尽外泌体蛋白。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或鉴别为具有)小于15％、20％或25％的融合剂脂质体中的蛋白质作为外泌体蛋白。在一些实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体(或被鉴别为)耗尽线粒体蛋白。在一些实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体(或被鉴别为)富含核蛋白。在一些实施例中，相比于亲本细胞和外泌体，融合剂脂质体(或被鉴别为)富含核糖体蛋白。在一些实施例中，融合剂脂质体中至少0.025％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的蛋白质为核糖体蛋白，或融合剂脂质体中约0.025-0.2％、0.05-0.15％、0.06-1.4％、0.07％-1.3％、0.08％-1.2％、0.09％-1.1％、1％-20％、3％-15％、5％-12.5％、7.5％-11％、或8.5％-10.5％、或9％-10％的蛋白质为核糖体蛋白。
在一些实施例中，融合剂脂质体包括的脂质:蛋白质的比率在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例40的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)大致等于有核细胞的脂质质量:蛋白质比的脂质质量:蛋白质比率。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)比亲本细胞更大的脂质:蛋白质比。在实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)亲本细胞的脂质:蛋白质比率的约110％、115％、120％、125％、130％、131％、132％、132.5％、133％、134％、135％、140％、145％或150％的脂质:蛋白质比。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物具有(或被鉴别为具有)约100-180、110-170、120-160、130-150、135-145、140-142或141μmol/g的磷脂:蛋白质比率，例如在实例83的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物具有(或被鉴别为具有)源细胞中的对应比的约60-90％、70-80％或75％的磷脂:蛋白质比率，例如在实例83的分析中。
在一些实施例中，融合剂脂质体包括的蛋白质:核酸(例如DNA或RNA)比率在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例41的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)与亲本细胞类似的蛋白质质量:DNA质量比率。在实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)亲本细胞的约约85％、90％、95％、96％、97％、98％、98.2％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％或110％的蛋白质:DNA比率。在一些实施例中，融合剂脂质体包括的蛋白质:DNA比率大于源细胞中的对应比，例如大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如如使用实例41的分析所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物包括(或被鉴别为包括)约20-35、25-30、26-29、27-28或27.8g/g的蛋白质:DNA比率，例如根据实例84的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物包括(或被鉴别为包括)在源细胞中的对应比的约1％、2％、5％、10％或20％内的蛋白质:DNA比率，例如根据实例84的分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体包括的脂质:核酸(例如DNA)比率在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例91的分析所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物包括(或被鉴别为包括)约2.0-6.0、3.0-5.0、3.5-4.5、3.8-4.0或3.92μmol/mg的脂质:DNA比率，例如根据实例85的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包括的脂质:核酸(例如DNA)比率大于源细胞中的对应比，例如大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如如使用实例91的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)比亲本细胞更大的脂质:DNA比率。在实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体包括约105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％或更大的脂质:DNA比率。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物在受试者(例如小鼠)中的半衰期在参考细胞组合物(例如源细胞)的半衰期的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例60的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物在受试者中(例如在小鼠中)的半衰期为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时或24小时，例如在人类受试者或小鼠中，例如根据实例60的分析。在实施例中，融合剂脂质体组合物在受试者中的半衰期为至少1、2、4、6、12或24小时，例如在实例79的分析中。在一些实施例中，治疗剂在受试者中的半衰期比融合剂脂质体组合物的半衰期更长，例如长至少10％、20％、50％、2倍、5倍或10倍。例如，融合剂脂质体可以将治疗剂递送到靶细胞，并且治疗剂可以在融合剂脂质体不再存在或可检测之后存在。
在一些实施例，融合剂脂质体跨膜转运葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在葡萄糖的其它方面类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如如使用实例50的分析所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体以比用根皮素处理的其它方面类似的融合剂脂质体更高的水平跨膜转运(或被鉴别为转运)葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如在实例72的分析中。在实施例中，相比于用根皮素处理的在其它方面类似的融合剂脂质体，未用根皮素处理的融合剂脂质体以高至少1％、2％、3％、5％或10％(并且任选地高至多15％)的水平转运(或被鉴别为不转运)葡萄糖，例如在实例72的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体在内腔中包括的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如使用实例51的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)比未染色对照高至少10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍或5000倍的内腔中的酯酶活性，例如根据实例73的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)比源细胞低约10-100倍的内腔中的酯酶活性，例如根据实例73的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)约1E5-1E6、6E5-8E5、6.5E5-7E5或6.83E5外泌体当量的乙酰胆碱酯酶活性，例如根据实例74的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包括的代谢活性水平(例如柠檬酸合成酶活性)在参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例53中所描述。在一些实施例中，融合剂脂质体包括的代谢活性水平(例如柠檬酸合成酶活性)为参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如如实例53中所描述。在一些实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)约1E-2-2E-2、1.3E-2-1.8E-2、1.4E-2-1.7E-2、1.5E-2-1.6E-2、或1.57E-2μmol/μg融合剂脂质体/分钟的柠檬酸合成酶活性，例如根据实例75的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包括的呼吸水平(例如耗氧速率)，例如基础、非偶联或最大呼吸水平在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例54中所描述。在一些实施例中，融合剂脂质体包括的呼吸水平(例如耗氧速率)，例如基础、非偶联或最大呼吸水平为参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如如实例54中所描述。在实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)约8-15、9-14、10-13、11-12或11.3pmol/分钟/20μg融合剂脂质体的基础呼吸速率，例如根据实例76的分析。在实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)约8-13、9-12、10-11、10-10.2或10.1pmol/分钟/20μg融合剂脂质体的非偶联呼吸速率，例如根据实例76的分析。在实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)约15-25、16-24、17-23、18-22、19-21或20pmol/分钟/20μg融合剂脂质体的最大呼吸速率，例如根据实例76的分析。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)比非偶联呼吸速率更高的基础呼吸速率，例如高约1％、2％、5％或10％，例如至多约15％，例如根据实例76的分析。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)比基础呼吸速率更高的最大呼吸速率，例如高约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如根据实例76的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包括最多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实例55的分析，或其中相比于实例55的分析中的用甲萘醌处理的在其它方面类似的融合剂脂质体的膜联蛋白-V染色水平，融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实例55的分析中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，融合剂脂质体包括低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的膜联蛋白-V染色水平。在实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)比用抗霉素A处理的其它方面类似的融合剂脂质体的膜联蛋白V染色水平低至少约1％、2％、5％或10％的膜联蛋白V染色水平，例如在实例77的分析中。在实施例中，融合剂脂质体包括(或被鉴别为包括)在用抗霉素A处理的其它方面类似的融合剂脂质体的膜联蛋白V染色水平的约1％、2％、5％或10％内的膜联蛋白V染色水平，例如在实例77的分析中。
在一些实施例中，融合剂脂质体的miRNA含量水平为源细胞的所述miRNA含量水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如根据实例33的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的miRNA含量水平为源细胞的所述miRNA含量水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大(例如源细胞的miRNA含量水平的至多100％)，例如根据实例33的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的总RNA含量水平为源细胞的所述总RNA含量水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大(例如源细胞的总RNA含量水平的至多100％)，例如如根据实例66的分析所测量。
在一些实施例中，融合剂脂质体的可溶性:非可溶性蛋白质比在源细胞的所述比率的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内，例如在源细胞的所述比的1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如根据实例38的分析。在实施例中，融合剂脂质体具有约0.3-0.8、0.4-0.7或0.5-0.6，例如约0.563的可溶性:非可溶性蛋白质比率，例如根据实例38的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体群具有(或被鉴别为具有)约0.3-0.8、0.4-0.7、0.5-0.6或0.563，或大于约0.1、0.2、0.3、0.4或0.5的可溶性:不溶性蛋白质质量比率。在一些实施例中，融合剂脂质体群具有(或被鉴别为具有)比源细胞更高的可溶性:不溶性蛋白质质量比率，例如高至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或20倍。在实施例中，通过实例70的分析来测定可溶性:不溶性蛋白质质量比率。在实施例中，融合剂脂质体群中的可溶性:不溶性蛋白质质量比(或被鉴别为)低于亲本细胞。在实施例中，当融合剂脂质体:亲本细胞比为(或被鉴别为)约3％、4％、5％、6％、7％或8％时，融合剂脂质体群的可溶性:不溶性比为(或被鉴别为)约等于亲本细胞的可溶性:不溶性比率。
在一些实施例中，融合剂脂质体的LPS水平为源细胞的LPS含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如如根据质谱分析所测量，例如在实例39的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素而摄取葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的在其它方面类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实例49的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体在向例如小鼠的受试者施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼部，例如其中在24、48或72小时之后，在施用融合剂脂质体的群体中，至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的融合剂脂质体存在于靶组织中，例如根据实例64的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如根据实例56的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的近分泌信号传导水平是由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，至多100％)，例如根据实例56的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如根据实例57的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平为由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，至多100％)，例如根据实例57的分析。在一些实施例中，相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中聚合肌动蛋白的水平，融合剂脂质体以在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例58的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体以随时间推移(例如在至少3、5或24小时内)恒定的水平聚合肌动蛋白(或被鉴别为聚合肌动蛋白)，例如根据实例81的分析。在实施例中，肌动蛋白聚合的水平在5小时时段内改变小于1％、2％、5％、10％或20％，例如根据实例81的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例59的分析，或其中融合剂脂质体具有约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV的膜电位，或其中融合剂脂质体具有小于-1mv、-5mv、-10mv、-20mv、-30mv、-40mv、-50mv、-60mv、-70mv、-80mv、-90mv、-100mv的膜电位。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)约-25至-35、-27至-32、-28至-31、-29至-30或-29.6毫伏的膜电位，例如在实例78的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体能够从血管外渗，例如以源细胞的外渗率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率，例如使用实例44的分析，例如其中源细胞为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或NK细胞。在一些实施例中，融合剂脂质体能够进行趋化，例如相比于参考细胞(例如巨噬细胞)的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至多100％)，例如使用实例45的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体能够进行吞噬作用，例如相比于参考细胞(例如巨噬细胞)的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至多100％)，例如使用实例47的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体能够穿过细胞膜，例如内皮细胞膜或血脑屏障。在一些实施例中，融合剂脂质体能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的速率，例如使用实例48的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体能够分泌蛋白质，例如以相比于参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至多100％)的速率，例如使用实例48的分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体不能够转录或具有参考细胞(例如源细胞)的转录活性的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转录活性，例如使用实例24的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体不能够进行核DNA复制或具有参考细胞(例如源细胞)的核DNA复制的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的核DNA复制，例如使用实例25的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体缺乏染色质或具有为参考细胞(例如源细胞)的染色质含量的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的染色质含量，例如使用实例32的分析。
在一些实施例中，通过与参考细胞进行比较来描述融合剂脂质体的特征。在实施例中，参考细胞为源细胞。在实施例中，参考细胞为HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞。在一些实施例中，通过与参考细胞群，例如源细胞群，或HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞群进行比较来描述融合剂脂质体群的特征。
在一些实施例中，融合剂脂质体符合药物或良好生产规范(GMP)标准。在一些实施例中，融合剂脂质体是根据良好生产规范(GMP)制得。在一些实施例中，融合剂脂质体的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体。在一些实施例中，融合剂脂质体的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物。在一些实施例中，融合剂脂质体具有低免疫原性，例如如本文所描述。
在一些实施例中，通过血清灭活分析(例如检测抗体介导的中和或补体介导的降解的分析)来分析融合剂脂质体组合物的免疫原性。在一些实施例中，融合剂脂质体不被血清灭活，或以低于预定值的水平灭活。在一些实施例中，未用融合剂脂质体处理的个体(例如人类或小鼠)的血清与测试融合剂脂质体组合物接触。在一些实施例中，已接受一次或多次融合剂脂质体施用，例如已接受至少两次融合剂脂质体施用的个体的血清与测试融合剂脂质体组合物接触。在实施例中，接着对暴露于血清的融合剂脂质体测试将货物递送到靶细胞的能力。在一些实施例中，在用血清培育的融合剂脂质体处理之后可检测地包括货物的细胞的百分比为在用不与血清接触的阳性对照融合剂脂质体处理之后可检测地包括货物的细胞的百分比的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，使用实例99的分析来测量血清灭活。
在一些实施例中，通过检测回应于融合剂脂质体的补体活化来分析融合剂脂质体组合物的免疫原性。在一些实施例中，融合剂脂质体并不活化补体，或以低于预定值的水平活化补体。在一些实施例中，未用融合剂脂质体处理的个体(例如人类或小鼠)的血清与测试融合剂脂质体组合物接触。在一些实施例中，已接受一次或多次融合剂脂质体施用，例如已接受至少两次融合剂脂质体施用的受试者的血清与测试融合剂脂质体组合物接触。在实施例中，包括血清和融合剂脂质体的组合物
然后例如通过ELISA关于活化的补体因子(例如C3a)进行测试。在一些实施例中，包括本文所描述的修饰(例如相比于参考细胞，补体调节蛋白的水平升高)的融合剂脂质体相比于缺乏修饰的在其它方面类似的融合剂脂质体经历降低的补体活化，例如降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在一些实施例中，使用实例100的分析来测量补体活化。
在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体群不会被血清基本上灭活。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体群对血清灭活具有抗性，例如如根据实例99中所描述的方法所定量。在实施例中，例如根据本文所描述的方法向受试者多次施用融合剂脂质体或融合剂脂质体群后，融合剂脂质体或融合剂脂质体群未被血清基本上灭活或对血清灭活具有抗性。在一些实施例中，融合剂脂质体经修饰以具有降低的血清灭活，例如相比于对应的未经修饰的融合剂脂质体，例如在多次施用经修饰的融合剂脂质体后，例如如根据实例99中所描述的方法所定量。
在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体群对血清灭活具有抗性，例如如根据实例100中所描述的方法所定量。在一些实施例中，融合剂脂质体经修饰以相比于对应的未经修饰的融合剂脂质体诱导降低的补体活性。在实施例中，通过测定补体蛋白(例如DAF，结合衰变加速因子(DAF，CD55)的蛋白质，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)、C4b结合蛋白(C4BP)、补体受体1(CD35)、膜辅因子蛋白(MCP，CD46)、凸出蛋白(CD59)、抑制经典和旁路补体途径CD/C5转化酶的蛋白质或调节MAC组装的蛋白质)在细胞中的表达或活性来测量补体活性。
在一些实施例中，源细胞为内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导性多能干细胞，例如衍生自受试者的细胞的诱导性多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、造红细胞组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、成髓细胞、骨髓前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、成巨核细胞、幼巨核细胞、成黑素细胞、成淋巴细胞、骨髓前体细胞、正成红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心肌祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、胚细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。在一些实施例中，源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或干细胞。
在一些实施例中，源细胞表达(例如过度表达)ARRDC1或其活性片段或变异体。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物具有约1-3、1-10、1-100、3-10、4-9、5-8、6-7、15-100、60-200、80-180、100-160、120-140、3-100、4-100、5-100、6-100、15-100、80-100、3-200、4-200、5-200、6-200、15-200、80-200、100-200、120-200、300-1000、400-900、500-800、600-700、640-690、650-680、660-670、100-10,000或约664.9的融合剂:ARRDC1比率，例如根据质谱分析。在一些实施例中，呈总蛋白质含量百分比形式的ARRDC1的水平为至少约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％；0.1％、0.15％、0.2％、0.25％；0.5％、1％、2％、3％、4％、5％；或呈总蛋白质含量的百分比形式的ARRDC1的水平为约0.05％-1.5％、0.1％-0.3％、0.05％-0.2％、0.1％-0.2％、0.25％-7.5％、0.5％-1.5％、0.25％-1％、0.5-1％、0.05％-1.5％、10％-30％、5-20％或10-20％，例如根据质谱分析，例如如根据实例98中所描述的方法所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物具有约100-1,000、100-400、100-500、200-400、200-500、200-1,000、300-400、1,000-10,000、2,000-5,000、3,000-4,000、3,050-3,100、3,060-3,070或约3,064、10,000-100,000、10,000-200,000、10,000-500,000、20,000-500,000、30,000-400,000的融合剂:TSG101比率，例如使用质谱分析，例如实例94的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物具有约1-3、1-30、1-20、1-25、1.5-30、10-30、15-25、18-21、19-20、10-300、10-200、15-300、15-200、100-300、100-200、150-300或约19.5的货物:tsg101比率，例如使用质谱分析，例如实例95的分析。在一些实施例中，呈总蛋白质含量的百分比形式的TSG101的水平为至少约0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％；0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％；或呈总蛋白质含量的百分比形式的TSG101的水平为约0.0001-0.001、0.0001-0.002、0.0001-0.01、0.0001-0.1、0.001-0.01、0.002-0.006、0.003-0.005、0.001-0.1、0.01-0.1、0.02-0.06、0.03-0.05或0.004，例如根据质谱分析，例如根据实例98中所描述的方法所测量。
在一些实施例中，融合剂脂质体包括货物，例如治疗剂，例如内源性治疗剂或外源性治疗剂。在一些实施例中，治疗剂是选自以下中的一种或多种：蛋白质，例如酶、跨膜蛋白、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA或小分子。在一些实施例中，治疗剂是除线粒体以外的细胞器，例如选自以下的细胞器：细胞核、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒。在一些实施例中，细胞器是线粒体。
在一些实施例中，融合剂脂质体通过内吞作用进入靶细胞，例如其中相比于与类似融合剂脂质体接触的经氯奎处理的参考细胞，经由通过途径递送的治疗剂的水平为0.01-0.6、0.01-0.1、0.1-0.3或0.3-0.6，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如使用实例62的分析。在一些实施例中，进入靶细胞的融合剂脂质体组合物中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的融合剂脂质体通过非内吞途径进入，例如融合剂脂质体通过与细胞表面融合而进入靶细胞。在一些实施例中，治疗剂的水平通过非内吞途径输送。
相比于经氯奎处理的参考细胞，对于给定融合剂脂质体为0.1-0.95、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-
0.95，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或
更大，例如使用实例61的分析。在一些实施例中，进入靶细胞的融合剂脂质体组合物中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的融合剂脂质体进入细胞质(例如并不进入内体或溶酶体)。在一些实施例中，进入靶细胞的融合剂脂质体组合物中小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的融合剂脂质体进入内体或溶酶体。在一些实施例中，融合剂脂质体通过非内吞途径进入靶细胞，例如其中所递送的治疗剂的水平为经氯奎处理的参考细胞的至少90％、95％、98％或99％，例如使用实例62的分析。在一个实施例中，融合剂脂质体通过发动蛋白介导的途径将药剂递送到靶细胞。在一个实施例中，相比于与类似融合剂脂质体接触的经Dynasore处理的靶细胞，通过发动蛋白介导的途径递送的药剂的水平在0.01-0.6范围内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如在实例63的分析中所测量。在一个实施例中，融合剂脂质体通过巨胞饮将药剂递送到靶细胞。在一个实施例中，相比于与类似融合剂脂质体接触的经EIPA处理的靶细胞，通过巨胞饮递送的药剂的水平在0.01-0.6范围内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如在实例63的分析中所测量。在一个实施例中，融合剂脂质体通过肌动蛋白介导的途径将药剂递送到靶细胞。在一个实施例中，相比于与类似融合剂脂质体接触的经Latrunculin B处理的靶细胞，通过肌动蛋白介导的途径递送的药剂的水平在0.01-0.6单位内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如在实例63的分析中所测量。
在一些实施例中，融合剂脂质体具有<1、1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3、1.25-1.35或>1.35g/ml的密度，例如根据实例30的分析。
在一些实施例中，按蛋白质质量计，融合剂脂质体组合物包括小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％源细胞，或小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的细胞具有功能性细胞核。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体包含细胞器，例如线粒体。
在一些实施例中，融合剂脂质体还包含外源治疗剂。在一些实施例中，外源治疗剂是选自以下中的一种或多种：蛋白质，例如酶、跨膜蛋白、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA或小分子。
在实施例中，融合剂脂质体通过内吞作用或非内吞途径进入细胞。
在实施例中，融合剂脂质体组合物在低于4℃的温度下稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。在实施例中，融合剂脂质体组合物在低于-20℃的温度下稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。在实施例中，融合剂脂质体组合物在低于-80℃的温度下稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。
在实施例中，融合剂脂质体的大小，或融合剂脂质体群的平均大小在源细胞的大小的约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％内，例如如根据实例27的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的大小，或融合剂脂质体群的平均大小为源细胞的大小的小于约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，例如如根据实例27的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)小于亲本细胞的大小。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)在亲本细胞的约50％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％或90％内的大小。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)亲本细胞的大小分布变化率的小于约70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％或更小，例如在样品的约90％内。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)比亲本细胞小约40％、45％、50％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、65％或70％的大小分布变化率，例如在样品的约90％内。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)大于30、35、40、45、50、55、60、65或70nm直径的平均大小。在实施例中，融合剂脂质体具有约100、110、120、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、140或150nm直径的平均大小。在实施例中，融合剂脂质体的大小，或融合剂脂质体群的平均大小在源细胞的大小的约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如如根据实例27的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的大小，或融合剂脂质体群的平均大小为源细胞的大小的小于约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％，例如如根据实例27的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体直径，或融合剂脂质体群的平均直径为小于约500nm(例如小于约10、50、100、150、200、250、300、350、400或450nm)，例如如根据实例69的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径为约80-180、90-170、100-160、110-150、120-140或130nm，例如如根据实例69的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径在约11,000nm与21,000nm之间，例如如根据实例69的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径在约10-22,000nm、12-20,000nm、14-18,720nm、20-16,000nm之间，例如根据实例69的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的体积，或融合剂脂质体群的平均体积为约0.01-0.1μm3、0.02-1μm3、0.03-1μm3、0.04-1μm3、0.05-0.09μm3、0.06-0.08μm3、0.07μm3，例如如根据实例69的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径为至少约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm或250nm，例如如根据实例29的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径为约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm或250nm(例如±20％)，例如如根据实例29的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径为至少约500nm、750nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm、3,000nm、5,000nm、10,000nm或20,000nm，例如如根据实例29的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径为约500nm、750nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm、3,000nm、5,000nm、10,000nm或20,000nm(例如±20％)，例如如根据实例29的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体群具有(或被鉴别为具有)以下中的一个或多个：约40-90nm、45-60nm、50-55nm或53nm的10％分位数直径；约70-100nm、80-95nm、85-90nm或88nm的25％分位数直径；约200-250nm、210-240nm、220-230nm或226nm的75％分位数直径；或约4000-5000nm、4300-4600nm、4400-4500nm、4450nm的90％分位数，例如根据实例68的分析。
在实施例中，融合剂脂质体组合物包括(或被鉴别为包括)约35-40、36-39、37-38或37.2ng/mL的GAPDH浓度，例如在实例82的分析中。在实施例中，融合剂脂质体组合物的GAPDH浓度(或被鉴别为)在源细胞的GAPDH浓度的约1％、2％、5％、10％或20％内，例如在实例82的分析中。在实施例中，融合剂脂质体组合物的GAPDH浓度(或被鉴别为)比源细胞的GAPDH浓度低至少约1％、2％、5％、10％或20％，例如在实例82的分析中。在实施例中，融合剂脂质体组合物包括(或被鉴别为包括)小于约30、35、40、45、46、47、48、49、50、55、60、65或70μg GAPDH/g总蛋白质。在实施例中，融合剂脂质体组合物包含(或被鉴别为包含)小于约500、250、100或50μg GAPDH/g总蛋白质。在实施例中，相比于融合剂脂质体组合物，亲本细胞包含(或被鉴别为包含)至少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、30％、50％或更多的GAPDH/总蛋白质。
在实施例中，融合剂脂质体中钙联蛋白的平均分数含量为(或被鉴别为)小于约1×10-4、1.5×10-4、2×10-4、2.1×10-4、2.2×10-4、2.3×10-4、2.4×10-4、2.43×10-4、2.5×10-4、2.6×10-4、2.7×10-4、2.8×10-4、2.9×10-4、3×10-4、3.5×10-4或4×10-4。在实施例中，融合剂脂质体包括的钙联蛋白/总蛋白质的量比亲本细胞低约70％、75％、80％、85％、88％、90％、95％、99％或更大。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含或富集影响膜曲率的脂质(参见例如Thiam等人,《自然综述分子细胞生物学(Nature Reviews Molecular Cell Biology)》,14(12):775-785,2013)。一些脂质具有较小的亲水性头基和较大的疏水性尾，其通过集中于局部区域而促进融合孔的形成。在一些实施例中，融合剂脂质体包括或富集负曲率脂质，如胆固醇、磷脂酰乙醇胺(PE)、甘油二酯(DAG)、磷脂酸(PA)、脂肪酸(FA)。在一些实施例中，融合剂脂质体不包括、耗尽或具有少量正曲率脂质，如溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(Ptdlns)、溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、单酰基甘油(MAG)。
在一些实施例中，将脂质添加到融合剂脂质体。在一些实施例中，将脂质添加到培养的源细胞，所述源细胞在形成融合剂脂质体之前或期间将脂质并入到其膜中。在一些实施例中，将脂质以脂质体的形式添加到细胞或融合剂脂质体。在一些实施例中，甲基-β环糊精(mβ-CD)用于富集或耗尽脂质(参见例如Kainu等人,《脂质研究杂志(Journal of LipidResearch)》,51(12):3533-3541,2010)。
X.药物组合物和其制备方法
在一些方面，本公开还提供一种药物组合物，其包括本文所描述的融合剂脂质体组合物和药学上可接受的载剂。药物组合物可以包含任何所描述的融合剂脂质体，例如逆转录病毒载体或VLP。
在一些实施例中，向受试者施用逆转录病毒载体的一个或多个转导单元。在一些实施例中，向个体施用至少1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个转导单元/kg。在一些实施例中，向受试者施用至少1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个转导单元/靶细胞/ml。
逆转录病毒(例如慢病毒)的浓缩和纯化
在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体调配物可以通过包括(例如按时间顺序)以下步骤(i)到(vi)中的一个或多个(例如全部)的方法来产生：
(i)培养产生逆转录病毒载体的细胞；
(ii)收获含有逆转录病毒载体的上清液；
(iii)任选地澄清上清液；
(iv)纯化所述逆转录病毒载体，以得到逆转录病毒载体制剂；
(v)任选地对所述逆转录病毒载体制剂进行过滤灭菌；以及
(vi)浓缩所述逆转录病毒载体制剂以产生最终批量产品。
在一些实施例中，所述方法不包含澄清步骤(iii)。在其它实施例中，所述方法包括澄清步骤(iii)。在一些实施例中，使用超滤或切向流过滤(更优选中空纤维超滤)执行步骤(vi)。在一些实施例中，步骤(iv)中的纯化方法是离子交换色谱，更优选地阴离子交换色谱。在一些实施例中，使用0.22μm或0.2μm灭菌过滤器执行步骤(v)中的过滤灭菌。在一些实施例中，通过过滤器澄清来执行步骤(iii)。在一些实施例中，使用选自色谱、超滤/透滤或离心的方法或方法组合执行步骤(iv)。在一些实施例中，色谱法或方法组合是选自离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、逆相色谱和固定化金属离子亲和色谱。在一些实施例中，离心方法是选自区带离心、等密度离心和沉淀离心。在一些实施例中，超滤/透滤方法是选自切向流透滤、搅拌式细胞透滤和透析。在一些实施例中，所述方法中包括至少一个使核酸降解的步骤以改进纯化。在一些实施例中，所述步骤是核酸酶处理。
在一些实施例中，在过滤之前完成载体的浓缩。在一些实施例中，载体的浓缩是在过滤后进行。在一些实施例中，重复浓缩和过滤步骤。
在某些实施例中，最后的浓缩步骤是在过滤灭菌步骤之后执行。在一些实施例中，所述方法是用于生产适合作为治疗剂施用于人类的临床级配制物的大规模方法。在一些实施例中，过滤灭菌步骤是在浓缩步骤之前进行。在一些实施例中，浓缩步骤是所述方法中的最后步骤，并且过滤灭菌步骤是所述方法中的倒数第二个步骤。在一些实施例中，浓缩步骤是使用超滤进行，优选切向流过滤，更优选中空纤维超滤。在一些实施例中，使用最大孔隙大小为约0.22μm的灭菌过滤器执行过滤灭菌步骤。在另一个优选的实施例中，最大孔隙大小为0.2μm。
在一些实施例中，在过滤灭菌之前，载体浓度小于或等于约4.6×1011个RNA基因组拷贝/ml制剂。适当的浓度水平可以通过使用例如稀释步骤(如果适当)控制载体浓度来实现。因此，在一些实施例中，在过滤灭菌之前将逆转录病毒载体制剂稀释。
可以通过过滤步骤去除细胞碎片和其它杂质来进行澄清。适合的过滤器可以使用纤维素过滤器、再生纤维素纤维、纤维素纤维与无机过滤助剂(例如硅藻土、珍珠岩、烟雾状二氧化硅)的组合、纤维素过滤器与无机过滤助剂和有机树脂的组合，或其任何组合，以及聚合物过滤器(实例包括(但不限于)：尼龙、聚丙烯、聚醚砜)，以实现有效的去除和可接受的回收。可以使用多阶段方法。示例性的两阶段或三阶段方法由以下组成：用一个或多个粗过滤器以去除大沉淀物和细胞碎片，随后抛光标称孔隙大小大于0.2微米，但小于1微米的一个或多个第二阶段过滤器。最佳组合可以是沉淀物大小分布以及其它变量的函数。此外，采用相对较小孔隙大小过滤器或离心的单阶段操作也可以用于澄清。更一般来说，任何澄清方法可接受地用于本发明的澄清步骤中，包括(但不限于)：死端过滤、微滤、离心，或过滤助剂(例如硅藻土)的主体加料与死端或深度过滤的组合，其在后续步骤中提供适合的澄清度的滤液而不使膜和/或树脂积垢。
在一些实施例中，使用深度过滤和膜过滤。就此而言适用的可商购的产品提及于例如WO 03/097797，第20-21页中。可以使用的膜可以由不同材料构成，可以具有不同的孔隙大小，并且可以组合使用。它们可以购自若干个供应商。在一些实施例中，用于澄清的过滤器在1.2μm到0.22μm的范围内。在一些实施例中，用于澄清的过滤器是1.2/0.45μm过滤器或最小平均孔隙大小为0.22μm的不对称过滤器。
在一些实施例中，所述方法使用核酸酶以降解污染性DNA/RNA(即，主要是宿主细胞核酸)。适用于本发明的示例性核酸酶包括攻击并降解DNA和RNA的所有形式(单链、双链线性或环状)的
Figure BDA0003155557330002211
核酸酶(EP 0229866)，或所属领域内常用于从制剂中排除非所需或污染性DNA和/或RNA的目的任何其它DNA酶和/或RNA酶。在优选实施例中，核酸酶是
Figure BDA0003155557330002212
核酸酶，其通过使特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键水解而使核酸快速水解，由此减小多核苷酸在含有载体的上清液中的大小。
Figure BDA0003155557330002213
核酸酶可以购自默克集团(Merck KGaA)(代码W214950)。所用核酸酶的浓度优选在1-100单位/ml的范围内。
在一些实施例中，在所述方法期间，对载体悬浮液进行至少一次超滤(当用于缓冲液交换时，有时称为透滤)，例如用于浓缩载体和/或缓冲液交换。用于浓缩载体的方法可以包括任何过滤方法(例如超滤(UF))，其中通过迫使稀释剂穿过过滤器来增加载体浓度，其方式为使得从载体制剂中去除稀释剂，而载体不能穿过过滤器并由此以浓缩形式保留于载体制剂中。UF详细描述于例如《微滤和超滤：原理和应用(Microfiltration andUltrafiltration:Principles and Applications)》，L.Zeman和A.Zydney(Marcel Dekker有限公司，纽约州纽约市，1996)；以及《超滤手册(Ultrafiltration Handbook)》，MunirCheryan(Technomic出版，1986；ISBN第87762-456-9号)。适合的过滤方法是切向流过滤(“TFF”)，如例如名称为“制药方法过滤目录”第177-202页中所描述的MILLIPORE目录(贝德福(Bedford)，马萨诸塞州(Mass.)，1995/96)。TFF广泛用于生物处理产业中，用于细胞收获、澄清、纯化和产物浓缩，包括病毒。系统是由三个不同的过程流构成：进料溶液、渗透液和截留物。取决于应用，可以使用具有不同孔隙大小的过滤器。在一些实施例中，截留物含有产物(慢病毒载体)。所选择的特定超滤膜可以具有足够小的孔隙大小以截留载体，但足够大以有效地清除杂质。视制造商和膜类型而定，逆转录病毒载体的标称分子量截止值(NMWC)在100kDa与1000kDa之间可以是适当的，例如具有300kDa或500kDa NMWC的膜。膜组合物可以是(但不限于)：再生纤维素、聚醚砜、聚砜或其衍生物。膜可以是平板(也称为平筛)或中空纤维。适合的UF是中空纤维UF，例如，使用孔隙大小小于0.1μm的过滤器过滤。产物通常被截留，同时体积可以通过渗透而减小(或在透滤期间通过以与含有缓冲液和杂质的渗透液在渗透侧去除速度相同的速度添加缓冲液而保持恒定)。
TFF在生物制药行业中使用最广泛的两种几何形状是板框(平筛)和中空纤维模块。尽管现在存在多个供应商，包括Spectrum和通用电气医疗集团(GE Healthcare)，但Amicon和Ramicon在二十世纪七十年代早期开发出用于超滤和微滤的中空纤维单元(Cheryan,M.《超滤手册》)。中空纤维模块是由具有致密表皮层的自支撑纤维阵列组成。纤维直径范围为0.5mm-3mm。在某些实施例中，TFF使用中空纤维。在某些实施例中，使用500kDa(0.05μm)孔隙大小的中空纤维。超滤可以包含透滤(DF)。可以通过以等于UF速率的速率向超滤溶液中添加溶剂来去除微溶质。这在恒定的体积下将微物质从溶液中洗去，从而纯化了所截留的载体。
UF/DF可以用于在纯化过程的不同阶段浓缩和/或缓冲交换载体悬浮液。所述方法可以在色谱或其它纯化步骤之后使用DF步骤交换上清液中的缓冲液，但还可以在色谱之前使用。
在一些实施例中，浓缩来自色谱步骤的洗脱液，并通过超滤-透滤进一步纯化。在这个过程中，载体被交换到配制缓冲液中。可以在过滤灭菌步骤之后浓缩到最终所需浓度。在所述灭菌过滤之后，将灭菌过滤的物质通过无菌UF浓缩以产生批量载体产物。
在实施例中，超滤/透滤可以是切向流透滤、搅拌式细胞透滤和透析。
纯化技术倾向于涉及从细胞环境中分离载体颗粒，并且如果需要的话，进一步纯化载体颗粒。多种色谱方法中的一种或多种可以用于这种纯化。离子交换，尤其是阴离子交换，色谱是适合的方法，并且可以使用其它方法。下面给出一些色谱技术的描述。
离子交换色谱利用的事实是，带电物质(如生物分子和病毒载体)可以可逆地结合到固定相(如膜，要不就堆积在柱中)，所述固定相的表面上已固定有带有相反电荷的基团。有两种类型的离子交换剂。阴离子交换剂是固定相，其具有带正电的基团，因此可以结合带负电的物质。阳离子交换剂具有带负电的基团，因此可以结合带正电的物质。培养基的pH值对这具有影响，因为其可以改变物质的电荷。因此，对于如蛋白质的物质，如果pH值高于pI，那么净电荷将为负，而如果低于pI，那么净电荷将为正。
所结合物质的置换(洗脱)可以通过使用适合的缓冲液来实现。因此，通常增加缓冲液的离子浓度，直到缓冲液离子竞争到固定相上的离子位点而使物质置换为止。替代的洗脱方法是改变缓冲液的pH值，直到物质的净电荷不再有利于保持于固定相为止。一个实例是降低pH值，直到物质带有净正电荷并且不再与阴离子交换剂结合为止。
如果杂质不带电荷，或如果它们带有与所需物质相反符号的电荷，但与离子交换剂符号相同的电荷，那么能够实现一定的纯化。这是因为不带电的物质和带有与离子交换剂相同符号的电荷的物质通常不会结合。所结合的物质不同，则结合的强度随各因素而变，如不同物质上的电荷密度和电荷分布。因此，通过施加离子梯度或pH梯度(连续梯度或一系列步骤)，可以从杂质中分别洗脱出所需的物质。
尺寸排阻色谱是一种根据物质大小将其分离的技术。通常，通过使用填充有明确大小的孔隙的颗粒的柱来执行。对于色谱分离，选择具有适当孔隙大小的颗粒，所述适当是就待分离的混合物中的物质大小而言的。当将混合物作为溶液(或在病毒的情况下为悬浮液)施加到柱上，并且随后用缓冲液洗脱时，最大的颗粒将首先洗脱，因为它们被限制(或不)进入孔隙。较小的颗粒稍后会洗脱，因为它们能够进入孔隙并因此通过柱的路径更长。因此，在考虑使用尺寸排阻色谱纯化病毒载体时，可以预期在较小杂质(如蛋白质)之前先洗脱载体。
如蛋白质的物质在其表面上具有疏水区域，所述区域可以可逆地结合到固定相上的弱疏水位点。在盐浓度相对较高的介质中，这种结合得到促进。通常在HIC中，要纯化的样品在高盐环境中与固定相结合。随后通过应用递减的盐浓度的梯度(连续或一系列步骤)来实现洗脱。常用的盐是硫酸铵。具有不同疏水性水平的物质将倾向于在不同的盐浓度下洗脱，因此可以从杂质中纯化目标物质。其它因素(如洗脱介质的pH值、温度和添加剂，如去污剂、离液盐和有机物)也可以影响物质与HIC固定相结合的强度。可以调节或利用这些因素中的一个或多个来优化产物的洗脱和纯化。
病毒载体在其表面上具有疏水部分，如蛋白质，因此HIC可以潜在地用作纯化手段。
像HIC一样，RPC根据疏水性的不同来分离物质。使用疏水性比HIC中所用的更高的固定相。固定相通常由典型为二氧化硅的材料组成，所述材料上结合了疏水部分，如烷基或苯基。替代地，固定相可以是没有连接基团的有机聚合物。将含有待解析物质混合物的样品在极性相对较高以促进结合的水性介质中施加于固定相。随后通过加入有机溶剂(如异丙醇或乙腈)降低水性介质的极性来实现洗脱。通常，使用增加有机溶剂浓度的梯度(连续或一系列步骤)，并按其各自的疏水性顺序洗脱物质。
其它因素，如洗脱介质的pH值和添加剂的使用，也可以影响物质与RPC固定相结合的强度。可以调节或利用这些因素中的一个或多个来优化产物的洗脱和纯化。常见的添加剂是三氟乙酸(TFA)。这抑制样品中的酸性基团(如羧基部分)的电离。它还降低了洗脱介质中的pH，并且这抑制了可能存在于具有二氧化硅基质的固定相表面上的游离硅烷醇基团的电离。TFA是一类称为离子配对剂的添加剂之一。这些与存在于样品中的物质上的携带相反电荷的离子基团相互作用。相互作用倾向于掩盖电荷，增加了物质的疏水性。阴离子离子配对剂(如TFA和五氟丙酸)与物种上带正电的基团相互作用。阳离子配对剂(如三乙胺)与带负电的基团相互作用。
病毒载体在其表面上具有疏水部分，如蛋白质，因此RPC可以潜在地用作纯化手段。
亲和色谱利用的事实是，可以将与生物分子(如蛋白质或核苷酸)特异性结合的某些配体固定在固定相上。经修饰的固定相随后可以用于从混合物中分离出相关的生物分子。高特异性配体的实例是用于纯化靶抗原的抗体和用于纯化酶的酶抑制剂。也可以利用更一般的相互作用，如使用蛋白A配体来分离广泛范围的抗体。
通常，亲和色谱是通过将含有所关注物质的混合物施加到附着有相关配体的固定相上来进行。在适当的条件下，这将引起物质与固定相的结合。随后在施加洗脱介质之前将未结合的组分洗掉。选择洗脱介质以破坏配体与靶物质的结合。通常通过选择适当的离子强度、pH或使用与靶物质竞争配体位点的物质来实现。对于某些所结合的物质，使用离液剂(如尿素)来实现对配体的置换。但是，这可以导致物质的不可逆变性。
病毒载体在其表面上具有如蛋白质的部分，这些部分可能能够与适当的配体特异性结合。这意味着亲和色谱可以潜在地用于其分离。
生物分子，如蛋白质，在其表面上可以具有可以与金属离子形成配位键的给电子部分。这可以促进它们与载有固定金属离子(如Ni2+、Cu2+、Zn2+或Fe3+)的固定相结合。IMAC中使用的固定相具有螯合剂，通常是共价附着在其表面的次氮基乙酸或亚氨基二乙酸，并且是螯合剂固持了金属离子。螯合的金属离子必须有至少一个配位位点可用于与生物分子形成配位键。在生物分子的表面上潜在地存在可能能够与固定的金属离子结合的若干部分。这些包括组氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基以及磷酸酯基团。但是，对于蛋白质而言，主要的供体似乎是组氨酸残基的咪唑基。如果原生蛋白在其表面上呈现了适合的供体部分，那么可以使用IMAC对其进行分离。否则，IMAC可以用于分离带有几个连接的组氨酸残基链的重组蛋白。
通常，通过将包含所关注物质的混合物施加于固定相来执行IMAC。在适当的条件下，这将引起物质与固定相的配位键结。随后在施加洗脱介质之前将未结合的组分洗掉。对于洗脱，可以使用递增的盐浓度或递减的pH的梯度(连续的或一系列步骤)。同样常用的程序是应用递增的咪唑浓度的梯度。具有不同供体特性的生物分子，例如在不同环境中具有组氨酸残基的生物分子，能够通过使用梯度洗脱来分离。
病毒载体在其表面上具有能与IMAC固定相结合的部分(如蛋白质)。这意味着IMAC可以潜在地在其分离时使用。
适合的离心技术包括区带离心、等密度超离心和沉淀离心。
过滤器灭菌适用于制药级材料的过程。过滤器灭菌使所得配制物基本上不含污染物。过滤器灭菌后的污染物水平应使得配制物适用于临床使用。过滤器灭菌步骤之后的进一步浓缩(例如通过超滤)可以在无菌条件下进行。在一些实施例中，无菌过滤器的最大孔隙大小为0.22μm。
还可以使用流过式超离心和高速离心以及切向流过滤，对本文的逆转录病毒载体进行浓缩和纯化慢病毒载体的方法。流过式超离心可以用于纯化RNA肿瘤病毒(Toplin等人，《应用微生物学(Applied Microbiology)》15:582-589，1967；Burger等人，《国家癌症研究所杂志(Journal of the National Cancer Institute)》45:499-503，1970)。流过式超离心可以用于纯化慢病毒载体。这种方法可以包含以下一个或多个步骤。举例来说，可以使用细胞工厂或生物反应器系统从细胞产生慢病毒载体。可以使用瞬时转染系统，或也可以类似地使用封装或生产细胞系。如果需要，在材料加载到超离心机之前，可以使用预澄清步骤。流过式超离心可以使用连续流或分批沉降进行。用于沉降的材料是例如氯化铯、酒石酸钾和溴化钾，尽管它们都是腐蚀性的，但它们产生的密度高并且粘度低。CsCl经常用于工艺开发，由于可以产生宽的密度梯度(1.0至1.9g/cm3)，因此可以实现高纯度。溴化钾可以在高密度下使用，例如在升高的温度(例如25℃)下使用，这可能与某些蛋白质的稳定性不兼容。蔗糖由于价格便宜、无毒并且可以形成适用于分离大多数蛋白质、亚细胞洗脱份和全细胞的梯度而被广泛使用。通常，最大密度为约1.3g/cm3。蔗糖的渗透势可以对细胞有毒，在这种情况下，可以使用复杂的梯度材料，例如Nycodenz。梯度可以与梯度中的1个或多个步骤一起使用。一个实施例是使用逐步蔗糖梯度。材料的体积可以是每次操作0.5升到超过200升。流速可以是每小时5升到超过25升。适合的操作速度在25,000rpm到40,500rpm之间，从而产生高达122,000×g的力。转子可以所需的体积分率静态卸载。一个实施例是以100ml分率卸载所离心的材料。含有纯化和浓缩的慢病毒载体的分离洗脱份随后可以在所需缓冲液中使用凝胶过滤或尺寸排阻色谱来交换。阴离子或阳离子交换色谱也可以用作缓冲液交换或进一步纯化的替代或附加方法。另外，如果需要，切向流过滤也可以用于缓冲液交换和最终配制。切向流过滤(TFF)也可以用作超速离心或高速离心的替代步骤，其中将执行两步TFF程序。第一步将减少载体上清液的体积，而第二步将用于缓冲液交换、最终配制和材料的部分进一步浓缩。TFF膜的膜大小可以在100与500千道尔顿之间，其中第一TFF步骤的膜大小可以是500千道尔顿，而第二TFF膜的膜大小可以在300到500千道尔顿之间。最终缓冲液应含有允许载体为了长期存储而存储的材料。
在实施例中，所述方法使用含有附着细胞的细胞工厂，或含有悬浮细胞的生物反应器，所述悬浮细胞用载体和辅助构建体转染或转导以产生慢病毒载体。非限制性实例或生物反应器包括Wave生物反应器系统和Xcellerex生物反应器。两者都是一次性系统。但是，也可以使用非一次性系统。构建体可以是本文所描述的构建体，以及其它慢病毒转导载体。替代地，可以对细胞系进行工程改造以产生慢病毒载体，而无需转导或转染。转染后，可以收获慢病毒载体并且过滤以去除颗粒，随后使用连续流高速离心或超离心进行离心。一个优选的实施例是使用高速连续流装置，如JCF-A带状和连续流转子联合高速离心机。还优选将Contifuge Stratus离心机用于中等规模的慢病毒载体生产。还适合的是离心速度大于5,000×g RCF并且小于26,000×g RCF的任何连续流离心机。优选地，连续流离心力为约10,500×g到23,500×gRCF，旋转时间在20小时与4小时之间，其中较长的离心时间联合较慢的离心力使用。慢病毒载体可以在较致密材料(非限制性实例是蔗糖，但其它试剂可以用于形成缓冲垫，并且这些试剂在所属领域中是众所周知的)的缓冲垫上离心，使得慢病毒载体不形成无法过滤的聚集体，因为载体直接离心有时会导致病毒载体沉淀。在缓冲垫上进行的连续流离心允许载体避免形成较大聚集体，而且允许载体从产生慢病毒载体的大体积的转染材料中浓缩到高水平。另外，第二个不太致密的蔗糖层可以用于结合慢病毒载体制剂。连续流离心机的流动速率可以在每分钟1ml与100ml之间，但是也可以使用更高和更低的流动速率。调节流动速率以使载体有足够的时间进入离心机的核心，而不会由于高流动速率而损失大量载体。如果需要更高的流动速率，那么可以将从连续流式离心机中流出的物料进行再循环，并再次通过离心机。使用连续流离心浓缩病毒后，可以使用切向流过滤(TFF)来进一步浓缩载体，或者可以将TFF系统简单地用于缓冲液交换。TFF系统的非限制性实例是通用电气医疗集团生产的Xampler滤芯系统。优选的滤芯是MW截止值为500,000MW或更低的那些。优选地，使用MW截止值为300,000MW的滤芯。也可以使用100,000MW截止值的滤芯。体积越大，则可以使用越大的滤芯，并且在最终填充载体制剂之前，所属领域的技术人员容易为这种最终缓冲液交换和/或浓缩步骤找到合适的TFF系统。最终填充制剂可以包含稳定载体的因子，通常使用糖并且是所属领域已知的。
蛋白质含量
在一些实施例中，逆转录病毒颗粒包括各种源细胞基因组来源的蛋白质、外源蛋白质和病毒基因组来源的蛋白质。在一些实施例中，逆转录病毒颗粒所含的源细胞基因组来源的蛋白质相与病毒基因组来源的蛋白质、源细胞基因组来源的蛋白质与外源性蛋白质以及外源性蛋白质与病毒基因组来源的蛋白质的比率不同。
在一些实施例中，病毒基因组来源的蛋白质是GAG多聚蛋白前体、HIV-1整合酶、POL多聚蛋白前体、衣壳、核衣壳、p17基质、p6、p2、VPR、Vif。
在一些实施例中，源细胞来源的蛋白质是亲环素A、热休克70kD、人类延伸因子-1α(EF-1R)、组蛋白H1、H2A、H3、H4、β-血球蛋白、胰蛋白酶前体、细小蛋白、甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶、Lck、泛素、SUMO-1、CD48、同线蛋白-1、核仁磷酸蛋白、异源核核糖核蛋白C1/C2、核仁素、可能的ATP依赖性解螺旋酶DDX48、基质蛋白-3、移行的ER ATP酶、GTP结合的核蛋白Ran、异源核核糖核蛋白U、介白素增强子结合因子2、含有非POU结构域的八聚体结合蛋白、RuvB样2、HSP 90-b、HSP 90-a、延伸因子2、D-3-磷酸甘油酸脱氢酶、a-烯醇酶、C-1-四氢叶酸合成酶、细胞质、丙酮酸激酶、同功酶M1/M2、泛素活化酶E1、26S蛋白酶调节亚单元S10B、60S酸性核糖体蛋白质P2、60S酸性核糖体蛋白质P0、40S核糖体蛋白质SA、40S核糖体蛋白质S2、40S核糖体蛋白质S3、60S核糖体蛋白质L4、60S核糖体蛋白质L3、40S核糖体蛋白质S3a、40S核糖体蛋白质S7、60S核糖体蛋白质L7a、60S酸性核糖体蛋白质L31、60S核糖体蛋白质L10a、60S核糖体蛋白质L6、26S蛋白酶体非ATP酶调节单元1、微管蛋白b-2链、肌动蛋白、胞浆1、肌动蛋白、主动脉平滑肌、微管蛋白a-广泛链、网格蛋白重链1、组蛋白H2B.b、组蛋白H4、组蛋白H3.1、组蛋白H3.3、组蛋白H2A 8型、26S蛋白酶调节亚单元6A、泛素-4、RuvB样1、26S蛋白酶调节亚单元7、亮氨酰基-tRNA合成酶、胞浆、60S核糖体蛋白质L19、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚单元13、组蛋白H2B.F、U5小核核糖核蛋白200kDa解螺旋酶、聚[ADP-核糖]聚合酶-1、ATP依赖性DNA解螺旋酶II、DNA复制许可因子MCM5、核酸酶敏感元件结合蛋白1、ATP依赖性RNA解螺旋酶A、介白素增强子结合因子3、转录延伸因子B多肽1、加工前mRNA的剪接因子8、含有葡萄球菌核酸酶结构域的蛋白质1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、RNA聚合酶II转录亚单元8同源物的介体、核仁RNA解螺旋酶II、内质网素、DnaJ同源物亚家族A成员1、热休克70kDa蛋白质1L、T-复合蛋白1e亚单元、GCN1样蛋白质1、血清铁传递蛋白、果糖二磷酸醛缩酶A、肌苷-5'单磷酸脱氢酶2、26S蛋白酶调节亚单元6B、脂肪酸合成酶、DNA依赖性蛋白激酶催化亚单元、40S核糖体蛋白质S17、60S核糖体蛋白质L7、60S核糖体蛋白质L12、60S核糖体蛋白质L9、40S核糖体蛋白质S8、40S核糖体蛋白质S4 X同功异型物、60S核糖体蛋白质L11、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚单元2、外被体a亚单元、组蛋白H2A.z、组蛋白H1.2、胞质动力蛋白重链。参见：Saphire等人,《蛋白质组研究杂志(Journal of Proteome Research)》,2005以及Wheeler等人,《蛋白质组学临床应用(Proteomics Clinical Applications)》,2007。
在一些实施例中，逆转录病毒载体是聚乙二醇化的。
粒度
在一些实施例中，逆转录病毒载体的中值直径在10nm与1000nM、25nm与500nm、40nm与300nm、50nm与250nm、60nm与225nm、70nm与200nm之、80nm与175nm或90nm与150nm之间。
在一些实施例中，90％的逆转录病毒载体落入逆转录病毒的中值直径的50％以内。在一些实施例中，90％的逆转录病毒载体落入逆转录病毒的中值直径的25％以内。在一些实施例中，90％的逆转录病毒载体落入逆转录病毒的中值直径的20％以内。在一些实施例中，90％的逆转录病毒载体落入逆转录病毒的中值直径的15％以内。在一些实施例中，90％的逆转录病毒载体落入逆转录病毒的中值直径的10％以内。
XI.适应症和用途
本文所描述的融合剂脂质体、逆转录病毒载体、VLP或药物组合物可以施用受试者，例如哺乳动物，例如人类。在此类实施例中，受试者可能处于特定疾病或病状(例如本文所描述的疾病或病状)的风险中，可能具有所述疾病或病状的症状，或可能被诊断患有或鉴别患有所述疾病或病状。在一些实施例中，疾病是基因缺陷，例如在表5或表6中所列出的基因缺陷。
在某些方面，本公开还提供一种向受试者(例如人类受试者)、靶组织或细胞施用融合剂脂质体组合物的方法，所述方法包括向受试者施用包括多个本文所描述的融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物、本文所描述的融合剂脂质体组合物或本文所描述的药物组合物或使靶组织或细胞与其接触，由此向受试者施用融合剂脂质体组合物。
在某些方面，本公开还提供向受试者、靶组织或细胞递送治疗剂(例如多肽、核酸、代谢物、细胞器或亚细胞结构)的方法，所述方法包括向受试者施用多个本文所描述的融合剂脂质体、包括多个本文所描述的融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物、本文所描述的融合剂脂质体组合物或本文所描述的药物组合物或使靶组织或细胞与其接触，其中融合剂脂质体组合物以使得治疗剂被递送的量和/或时间施用。
在某些方面，本公开还提供向受试者递送功能的方法，所述方法包括向受试者施用多个本文所描述的融合剂脂质体、包括多个本文所描述的融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物、本文所描述的融合剂脂质体组合物或本文所描述的药物组合物或使靶组织或细胞与其接触，其中融合剂脂质体组合物以使得功能被递送的量和/或时间施用。
来自哺乳动物(例如人类)组织的靶细胞包含来自上皮、结缔组织、肌肉或神经组织或细胞，以及其组合的细胞。靶标哺乳动物(例如人)细胞和器官系统包括心血管系统(心脏、脉管)；消化系统(食道、胃、肝脏、胆囊、胰、肠、结肠、直肠和肛门)；内分泌系统(下丘脑、垂体腺、松果体或松果体腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)；排泄系统(肾脏、输尿管、膀胱)；淋巴系统(淋巴、淋巴结、淋巴管、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏)；外皮系统(皮肤、头发、指甲)；肌肉系统(例如骨骼肌)；神经系统(脑、脊髓、神经)；生殖系统(卵巢、子宫、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺)；呼吸系统(咽、喉、气管、支气管、肺、横隔膜)；骨骼系统(骨骼、软骨)及其组合。在一些实施例中、非靶细胞或器官系统选自心血管系统(心脏、脉管)；消化系统(食道、胃、肝脏、胆囊、胰脏、肠、结肠、直肠和肛门)；内分泌系统(下丘脑、脑下垂体、松果体或松果体腺体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)；排泄系统(肾脏、输尿管、膀胱)；淋巴系统(淋巴、淋巴结、淋巴管、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏)；皮肤系统(皮肤、毛发、指甲)；肌肉系统(例如骨骼肌)；神经系统(脑、脊髓、神经)；生殖系统(卵巢、子宫、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺)；呼吸系统(咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜)；骨骼系统(骨骼、软骨)和其组合。
本文所描述的药物组合物的施用可以通过口服、吸入、经皮或非经肠(包含静脉内、瘤内、腹膜内、肌肉内、腔内和皮下)施用。融合剂脂质体可以单独施用或被配制成药物组合物。
在实施例中，融合剂脂质体组合物介导对靶细胞的作用，并且所述作用持续至少1、2、3、4、5、6或7天；2、3或4周；或1、2、3、6或12个月。在一些实施例中(例如其中融合剂脂质体组合物包含外源蛋白)，所述作用持续小于1、2、3、4、5、6或7天；2、3或4周；或1、2、3、6或12个月。
在实施例中，将本文所描述的融合剂脂质体组合物离体递送到细胞或组织，例如人类细胞或组织。
可以向个体，例如哺乳动物，例如人类施用本文所描述的融合剂脂质体组合物。在此类实施例中，个体可能处于特定疾病或病状(例如本文所描述的疾病或病状)的风险中，可能具有所述疾病或病状的症状，或可能被诊断患有或鉴别患有所述疾病或病状。
在一些实施例中，融合剂脂质体的来源来自施用了融合剂脂质体组合物的同一个体。在其它实施例中，其为不同的。举例来说，融合剂脂质体和接受者组织的来源可以为自体的(来自同一个体)或异源的(来自不同个体)。在任一情况下，本文所描述的融合剂脂质体组合物的供体组织可以是与接受者组织不同的组织类型。例如，供体组织可以是肌肉组织，而接受者组织可以是结缔组织(例如脂肪组织)。在其它实施例中，供体组织和接受者组织可以是相同或不同的类型，但是来自不同器官系统。
在一些实施例中，融合剂脂质体与抑制膜融合的蛋白质的抑制剂共同施用。举例来说，抑制素(Suppressyn)为抑制细胞-细胞融合的人类蛋白质(Sugimoto等人,“抑制细胞-细胞融合的新颖人类内源性逆转录病毒蛋白(A novel human endogenous retroviralprotein inhibits cell-cell fusion)”《科学报告(Scientific Reports)》3:1462DOI:10.1038/srep01462)。因此，在一些实施例中，融合剂脂质体与抑制素的抑制剂，例如siRNA或抑制抗体共同施用。
本文所描述的组合物还可以用于类似地调节包括但不限于以下的多种其它生物体的细胞或组织功能或生理技能：农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)、宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟类、狮子、老虎和熊等)、水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)、植物物种(树木、农作物、观赏花卉等)、发酵物种(酵母等)。本文所描述的融合剂脂质体组合物可以由此类非人类来源制成并且向非人类靶细胞或组织或个体施用。
融合剂脂质体组合物对靶标来说可以是自体的、同种异体的或异种的。
XII.另外的治疗剂
在一些实施例中，将融合剂脂质体组合物与其它药剂(例如治疗剂)共同施用于受试者，例如接受者，例如本文所描述的接受者。在一些实施例中，共同施用的治疗剂是免疫抑制剂，例如糖皮质激素(例如地塞米松)、细胞生长抑制剂(例如甲氨蝶呤)、抗体(例如莫罗单抗-CD3)或免疫亲和素调节剂(例如环孢菌素或雷帕霉素)。在实施例中，免疫抑制剂减少了免疫介导的融合剂脂质体清除。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物与免疫刺激剂，例如佐剂、白介素、细胞因子或趋化因子共同施用。
在一些实施例中，在相同时间施用，例如同时施用融合剂脂质体组合物和免疫抑制剂。在一些实施例中，在施用免疫抑制剂之前施用融合剂脂质体组合物。在一些实施例中，在施用免疫抑制剂之后施用融合剂脂质体组合物。
在一些实施例中，免疫抑制剂是小分子，如布洛芬(ibuprofen)、乙酰胺苯酚(acetaminophen)、环孢灵(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、雷帕霉素、霉酚酸酯(mycophenolate)、环磷酰胺、糖皮质激素、西罗莫司(sirolimus)、硫唑嘌呤(azathriopine)或甲氨蝶呤。
在一些实施例中，免疫抑制剂为抗体分子，包括(但不限于)：莫罗诺单抗(muronomab)(抗CD3)、达利珠单抗(Daclizumab)(抗IL12)、巴利昔单抗(Basiliximab)、英利昔单抗(Infliximab)(抗TNFa)或利妥昔单抗(rituximab)(抗CD20)。
在一些实施例中，相比于融合剂脂质体组合物的单独施用，融合剂脂质体组合物与免疫抑制剂的共同施用使得融合剂脂质体组合物在个体中的持久性增强。在一些实施例中，相比于单独施用时融合剂脂质体组合物的持久性，共同施用的融合剂脂质体组合物的持久性增强至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更长。在一些实施例中，相较于融合剂脂质体组合物单独施用时的生存期，共同施用的融合剂脂质体组合物的持久性增强至少1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25或30天或更久。
实例
提出以下实例以帮助理解本发明，但不希望并且不应解释为以任何方式限制其范围。
实例1：分析非靶细胞以检测逆转录病毒核酸递送的特异性
这个实例描述了通过测量单一细胞的载体拷贝数来定量非靶接受者细胞中的核酸。
在一个实施例中，已处理的小鼠的非靶细胞中的载体拷贝数与未经处理小鼠的那些细胞中的载体拷贝数类似，例如无载体或载体数目类似于阴性对照水平。在一个实施例中，已处理的小鼠的含有载体的非靶细胞的百分比与未经处理小鼠的那些细胞的百分比类似，例如无细胞或细胞数量类似于阴性对照水平。
在这个实例中，非靶接受者细胞是CD11c+细胞。然而，这种方案可以适于存在适合表面标记并且可以从个体中分离的任何细胞类型。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
用如本文所描述产生的逆转录病毒载体或用PBS(阴性对照物)处理小鼠。在处理后28天，从接受逆转录病毒载体的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。细胞在细胞染色缓冲液(Biolegend目录号：420201)中用Fc阻断(Biolegend目录号：101319)10分钟之后，在4℃下、在黑暗中用鼠类CD11c:APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：117323)或同型对照APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：400230)染色30分钟。细胞用PBS洗涤两次后，在FACS Aria(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞(San Jose,CA.))上通过运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)加以分析，激光激发为640nm并且在780-/+60nm收集发射，使用同型对照APC-Cy7抗体标记的细胞设定负门。将APC-Cy7阳性细胞分选到培养盘的单一孔中用于载体拷贝数分析。
使用单一细胞嵌套式PCR评估载体拷贝数。使用对载体和内源对照基因具有特异性的引物和探针，通过qPCR进行PCR。通过将载体qPCR信号的量除以内源对照基因qPCR信号的量来确定载体拷贝数。接受载体的细胞的载体拷贝数至少为1.0。通过求取多个细胞的载体拷贝数的平均值来评估整个群体的载体拷贝数。
在一些实施例中，经逆转录病毒载体处理的小鼠的非靶细胞中的平均载体拷贝数与经媒剂处理的小鼠的平均载体拷贝数类似。在一些实施例中，经逆转录病毒载体处理的小鼠的接受载体的非靶细胞的百分比与经媒剂处理的小鼠的那些细胞的百分比类似。
实例2：分析非靶细胞以检测外源蛋白药剂递送的特异性
这个实例描述了根据单一细胞中的外源药剂表达来定量非靶接受者细胞中的外源药剂表达。
在一个实施例中，经处理的小鼠的非靶细胞中的外源药剂表达与未经处理的小鼠的那些非靶细胞的表达类似。在一个实施例中，经处理小鼠的表达外源药剂的非靶细胞的百分比与未处理小鼠的那些非靶细胞的百分比类似。
在这个实例中，非靶接受者细胞是CD11c+细胞。然而，这种方案可以适于存在适合表面标记并且可以从个体中分离的任何细胞类型。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。在这个实例中，外源药剂是荧光蛋白并且通过流式细胞测量术测量表达。在其它实施例中，外源蛋白质药剂的表达可以通过蛋白质的免疫染色来测量。在其它实施例中，外源蛋白质药剂的表达可以通过显微镜或蛋白质印迹测量。
小鼠用通过本申请所描述的任一种方法产生的具有tdtomato荧光蛋白药剂的逆转录病毒载体处理或用PBS(阴性对照物)处理。在处理后28天，从接受逆转录病毒载体的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。细胞在细胞染色缓冲液(Biolegend目录号：420201)中用Fc阻断(Biolegend目录号：101319)10分钟之后，在4℃下、在黑暗中用鼠类CD11c:APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：117323)或同型对照APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：400230)染色30分钟。细胞用PBS洗涤两次之后，在运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)的FACS Aria(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)上加以分析。使用同型对照APC-Cy7抗体标记的细胞设定CD11c的负门，激光激发640nm并且在780-/+60收集发射。使用从经媒剂处理的小鼠分离的细胞设定tdtomato表达的负门，激光激发552nm并且在585-/+42nm收集发射。
测量呈tdtomato阳性的CD11c+细胞的百分比。在一些实施例中，在来自经处理的小鼠和未经处理的小鼠的细胞中，呈tdtomato阳性的CD11c+细胞的百分比类似。测量CD11c+细胞的中值tdtomato荧光水平。在一些实施例中，在来自经处理的小鼠和未经处理的小鼠的细胞中，CD11c+细胞的中值tdtomato荧光水平类似。
实例3：分析靶细胞以检测逆转录病毒核酸递送的特异性
这个实例描述了通过测量单一细胞的载体拷贝数来定量靶接受者细胞中的核酸。
在一个实施例中，经处理的小鼠的靶细胞的载体拷贝数大于未经处理的小鼠的那些靶细胞的载体拷贝数。在一个实施例中，经处理的小鼠的含有载体的靶细胞的百分比大于未经处理的小鼠的那些靶细胞的百分比。
在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。然而，这种方案可以适于存在适合表面标记并且可以从个体中分离的任何细胞类型。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
小鼠经逆转录病毒载体处理并且如上文在实例1中所描述的收集血液样品。使用上文在实例1中所描述的方案，用鼠类CD3:APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：100330)或同型对照物将细胞染色。使用单一细胞嵌套式PCR，如实例1中所描述评估载体拷贝数。
在一些实施例中，经逆转录病毒载体处理的小鼠的靶细胞中的平均载体拷贝数大于经媒剂处理的小鼠的那些靶细胞中的平均载体拷贝数。在一些实施例中，经逆转录病毒载体处理的小鼠的接受载体的靶细胞的百分比大于经媒剂处理的小鼠的那些靶细胞的百分比。
实例4：分析靶细胞以检测外源蛋白质药剂递送的特异性
这个实例描述了根据外源蛋白质药剂在单一细胞中的表达来定量外源蛋白质药剂在靶接受者细胞中的表达。
在一个实施例中，经处理的小鼠的靶细胞中的外源蛋白质药剂表达大于未经处理的小鼠的那些靶细胞中的外源蛋白质药剂表达。在一个实施例中，经处理的小鼠的表达外源蛋白质药剂的靶细胞的百分比大于未经处理的小鼠的那些靶细胞的百分比。
在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。然而，这种方案可以适于存在适合表面标记并且可以从个体中分离的任何细胞类型。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。在这个实例中，外源药剂是荧光蛋白并且通过流式细胞测量术测量表达。在其它实施例中，外源蛋白质药剂的表达可以通过蛋白质的免疫染色来测量。在其它实施例中，外源蛋白质药剂的表达可以通过显微镜或蛋白质印迹测量。
小鼠经逆转录病毒载体处理并且如上文在实例2中所描述的收集血液样品。细胞用鼠类CD3:APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：100330)或同型对照物染色并且使用实例2中所描述的方案，通过流式细胞测量术加以分析。
测量呈tdtomato阳性的CD3+细胞的百分比。在一些实施例中，经处理小鼠的细胞中的呈tdtomato阳性的CD3+细胞的百分比大于未经处理的小鼠。测量CD3+细胞的中值tdtomato荧光水平。在一些实施例中，经处理小鼠的细胞中的CD3+细胞的中值tdtomato荧光水平大于未经处理的小鼠。
实例5：用HLA-G或HLA-E修饰逆转录病毒载体以降低PBMC细胞溶解介导的细胞毒 性
这个实例描述了来源于经修饰以使由于周边血液单核细胞(PBMC)引起的细胞溶解而导致的细胞毒性减少的细胞的逆转录病毒载体。
在一个实施例中，细胞毒性介导的PBMC对逆转录病毒载体的细胞溶解是逆转录病毒载体的免疫原性的量度，因为溶解将减少(例如抑制或中止)逆转录病毒载体的活性。
逆转录病毒载体是由以下产生：未修饰的细胞(下文称为NMC，阳性对照)、经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞(下文称为NMC-HLA-G)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC空白载体，阴性对照)。
PMBC介导的逆转录病毒载体溶解是通过如以下文献中所描述的铕释放分析来测定：Bouma等人《人类免疫学(Hum.Immunol.)》35(2):85-92；1992以及van Besouw等人，《移植(Transplantation)》70(1):136-143；2000。从适当供体中分离出PBMC(下文称为效应细胞)，并且在37℃下在圆底96孔盘中用γ照射的同种异体PMBC和200IU/mL IL-2(阿地介白素(proleukin)，Chiron BV，荷兰阿姆斯特丹(Amsterdam,The Netherlands))刺激7天。用二亚乙基三胺五乙酸铕(DTPA)(西格玛(sigma)，美国密苏里州圣路易斯)标记逆转录病毒载体。
在第7天，在以1000:1-1:1和1:1.25-1:1000范围内的效应子/靶标比率接种之后，通过将63Eu标记的逆转录病毒载体与效应细胞一起在96孔盘中培育1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、24或48小时来进行细胞毒性介导的溶解分析。在培育后，将培养盘离心并且将上清液样品转移到具有低背景荧光的96孔盘(荧光免疫盘，Nunc,丹麦罗斯基勒(Roskilde,Denmark))。
随后，将增强溶液(珀金埃尔默仪器有限公司(PerkinElmer),荷兰格罗宁根(Groningen,The Netherlands))添加到每个孔。用时间分辨荧光计(Victor 1420多标记计数器，芬兰LKB-Wallac)测量所释放的铕。荧光以每秒计数(CPS)表示。通过将适当数量(1×102-1×108)的逆转录病毒载体与1％曲通(triton)(西格玛-奥德里奇(sigma-aldrich))培育适当的时间来测定靶逆转录病毒载体释放郁的最大百分比。通过在没有效应细胞的情况下培育经标记的靶逆转录病毒载体来测量靶逆转录病毒载体自发释放的铕。随后按照：(自发释放/最大释放)×100％来计算渗漏百分比。细胞毒性介导的溶解百分比如下计算：溶解％＝[(测量的溶解-自发溶解-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100％。通过观察溶解百分比与不同效应子靶标比率的关系来分析数据。
在一个实施例中，相比于NMC产生的逆转录病毒载体或NMC空白载体，NMC-HLA-G细胞产生的逆转录病毒载体在特定时间点被靶细胞溶解的百分比减小。
实例6：用HLA-G或HLA-E修饰逆转录病毒载体以降低NK裂解活性
这个实例描述了来源于经修饰的细胞源的逆转录病毒载体组合物的产生，所述细胞源经修饰以使细胞毒性介导的NK细胞的细胞溶解减少。在一个实施例中，细胞毒性介导的NK细胞对逆转录病毒载体的细胞溶解是逆转录病毒载体的免疫原性的量度。
逆转录病毒载体是由以下产生：未修饰的细胞(下文称为NMC，阳性对照)、经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞(下文称为NMC-HLA-G)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC空白载体，阴性对照)。
NK细胞介导的逆转录病毒载体溶解是通过如以下文献中所描述的铕释放分析来测定：Bouma等人《人类免疫学》35(2):85-92；1992以及van Besouw等人，《移植》70(1):136-143；2000。根据Crop等人《细胞移植(Cell transplantation)》(20):1547-1559；2011中的方法从适当供体分离出NK细胞(下文称为效应细胞)，并且在37℃下在圆底96孔盘中用γ照射的同种异体PMBC和200IU/mL IL-2(阿地介白素，Chiron BV，荷兰阿姆斯特丹)刺激7天。用二亚乙基三胺五乙酸铕(DTPA)(西格玛，美国密苏里州圣路易斯)标记逆转录病毒载体。如上文在实例5中所描述来进行细胞毒性介导的溶解分析和数据分析。
在一个实施例中，相比于NMC产生的逆转录病毒载体或NMC空白载体，NMC-HLA-G细胞产生的逆转录病毒载体在特定时间点被靶细胞溶解的百分比减小。
实例7：用HLA-G或HLA-E修饰逆转录病毒载体以使CD8杀手T细胞溶解减少
这个实例描述了来源于经修饰的细胞源的逆转录病毒载体组合物的产生，所述细胞源经修饰以使细胞毒性介导的CD8+T细胞的细胞裂解减少。在一个实施例中，细胞毒性介导的CD8+T细胞对逆转录病毒载体的细胞溶解是逆转录病毒载体的免疫原性的量度。
逆转录病毒载体是由以下产生：未修饰的细胞(下文称为NMC，阳性对照)、经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞(下文称为NMC-HLA-G)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC空白载体，阴性对照)。
CD8+T细胞介导的逆转录病毒载体溶解是通过如以下文献中所描述的铕释放分析来测定：Bouma等人《人类免疫学》35(2):85-92；1992以及vanBesouw等人，《移植》70(1):136-143；2000。根据Crop等人《细胞移植》(20):1547-1559；2011中的方法从适当供体分离出CD8+T细胞(下文称为效应细胞)，并且在37℃下在圆底96孔盘中用γ照射的同种异体PMBC和200IU/mL IL-2(阿地介白素，Chiron BV，荷兰阿姆斯特丹)刺激7天。用二亚乙基三胺五乙酸铕(DTPA)(西格玛，美国密苏里州圣路易斯)标记逆转录病毒载体。如上文在实例5中所描述来进行细胞毒性介导的溶解分析和数据分析。
在一个实施例中，相比于NMC产生的逆转录病毒载体或NMC空白载体，NMC-HLA-G细胞产生的逆转录病毒载体在特定时间点被靶细胞溶解的百分比减小。
实例8：用CD47修饰逆转录病毒载体以规避巨噬细胞吞噬
这个实例描述了经修饰的逆转录病毒载体规避吞噬的定量。在一个实施例中，经修饰的逆转录病毒载体将规避巨噬细胞的吞噬。
细胞参与吞噬，吞噬颗粒，从而能够封存和破坏外来侵入物，如细菌或死细胞。在一些实施例中，慢病毒载体被巨噬细胞吞噬会使其活性减小。在一些实施例中，慢病毒载体的吞噬是逆转录病毒载体的免疫原性的量度。
逆转录病毒载体是由以下细胞产生：缺乏CD47的细胞(下文称为NMC，阳性对照)、经CD47 cDNA转染的细胞(下文称为NMC-CD47)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC-空白载体，阴性对照)。产生逆转录病毒载体之前，用CSFE标记细胞。
根据以下方案，通过吞噬分析来测定巨噬细胞介导的免疫清除的减少。将巨噬细胞在收获后立即接种于共聚焦玻璃底培养皿中。在DMEM+10％FBS+1％P/S中培育巨噬细胞1小时以附着。如方案所指示将由NMC、NMC-CD47、NMC-空白载体产生的适当数目个逆转录病毒载体添加到巨噬细胞中，并培育2小时，tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf。
2小时后，轻轻地洗涤培养皿并检查细胞内荧光。通过共聚焦显微镜在488激发下对被吞噬的逆转录病毒颗粒所发出的细胞内荧光进行成像。使用成像软件对吞噬阳性巨噬细胞的数目进行定量。数据被表示为吞噬指数＝(吞噬细胞的总数/计数的巨噬细胞的总数)×(含有吞噬细胞的巨噬细胞的数目/计数的巨噬细胞的总数)×100。
在一个实施例中，当巨噬细胞与来源于NMC-CD47的逆转录病毒载体一起培育时，吞噬指数相对于来源于NMC或NMC-空白载体的那些逆转录病毒载体将减小。
实例9：用补体调节蛋白修饰逆转录病毒载体以规避补体
这个实例描述了使用体外分析定量针对逆转录病毒载体的补体活性。在一些实施例中，本文所描述的经修饰的逆转录病毒载体的补体活性相比于未经修饰的逆转录病毒载体减小。
在这个实例中，评估小鼠血清针对逆转录病毒载体的补体活性。所述实例测量补体C3a的水平，其是所有补体途径的中心节点。通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
在这个实例中，逆转录病毒载体是由以下细胞产生：经编码补体调节蛋白DAF的cDNA转染的HEK293细胞(HEK293-DAF逆转录病毒载体)或不表达互补调节蛋白的HEK 293细胞(HEK293逆转录病毒载体)。在其它实施例中，可以使用其它补体调节蛋白，如结合加速衰减因子的蛋白质(DAF，CD55)，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)，例如C4b结合蛋白(C4BP)，例如补体受体1(CD35)，例如膜辅因子蛋白(MCP，CD46)，例如凸出蛋白(CD59)，例如抑制经典和旁路补体途径CD/C5转化酶的蛋白质，例如调节MAC组装的蛋白质。
从未经处理的小鼠、施用HEK293-DAF逆转录病毒载体的小鼠或施用HEK293逆转录病毒载体的小鼠回收血清。通过收集新鲜全血并使其完全凝结数小时来从小鼠收集血清。通过离心沉淀凝块，并去除血清上清液。阴性对照为热灭活的小鼠血清。将阴性对照样品在56℃下加热1小时。血清可以等分试样冷冻。
以使靶细胞群中的50％细胞接受逆转录病毒载体中的外源药剂的剂量测试不同逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以含有本文所描述的外源药剂中的任一种。本文还描述了用于分析逆转录病毒将外源药剂递送到接受者细胞的许多方法。在这个特定实例中，外源药剂是Cre蛋白(由逆转录病毒核酸编码)并且靶细胞是RPMI8226细胞，所述细胞在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，通过Cre重组后，从GFP表达切换为RFP表达，作为递送的标志。50％的接受者细胞呈RFP阳性时所鉴别的剂量用于进一步实验。在一些实施例中，在所有逆转录病毒载体中，50％的接受者细胞接受外源药剂时所鉴别的剂量是类似的。
将逆转录病毒载体在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中的两倍稀释液(从50％靶细胞接受外源药剂时的逆转录病毒载体的剂量开始)与经相同逆转录病毒载体处理的小鼠或未处理小鼠的血清的1:10稀释液(分析体积，20μl)混合并在37℃下培育1小时。将样品进一步以1:500稀释并用于对C3a具有特异性的酶联免疫吸附分析(ELISA)。ELISA为由LifeSpan生物科学公司出售的小鼠补体C3a ELISA试剂盒产品LS-F4210，其测量样品中的C3a的浓度。在从小鼠分离的所有血清当中，比较存在200pg/ml C3a时的逆转录病毒载体的剂量。
在一些实施例中，对于与HEK-293DAF小鼠血清一起培育的HEK293-DAF逆转录病毒载体来说，存在200pg/ml C3a时的逆转录病毒载体的剂量将大于与HEK293小鼠血清一起培育的HEK293逆转录病毒载体，表明经HEK293逆转录病毒载体处理的小鼠中的靶向逆转录病毒载体的补体活性大于HEK293-DAF逆转录病毒载体。在一些实施例中，对于与未经处理小鼠血清一起培育的HEK293-DAF逆转录病毒载体来说，存在200pg/ml C3a时的逆转录病毒载体的剂量将大于与未经处理小鼠血清一起培育的HEK293逆转录病毒载体，表明经HEK293逆转录病毒载体处理的小鼠中的靶向逆转录病毒载体的补体活性大于HEK293-DAF逆转录病毒载体。
实例10：修饰逆转录病毒载体以敲低免疫原性蛋白质，从而减少免疫原性
这个实例描述了来源于经修饰以减少免疫原性分子表达的细胞源的逆转录病毒载体组合物的产生，和所减少的表达的定量。在一个实施例中，逆转录病毒载体可以来源于经修饰以减少免疫原性分子表达的细胞源。
刺激免疫应答的疗法可以降低治疗功效或对接受者产生毒性。因此，免疫原性是安全并且有效的治疗性逆转录病毒载体的重要特性。某些免疫活化剂的表达可以产生免疫应答。MHC I类代表免疫活化剂的一个实例。
逆转录病毒载体是由以下细胞产生：正常表达MHC-1的未经修饰细胞(下文称为NMC，阳性对照)、经编码靶向MHC I类的shRNA的DNA转染的细胞(下文称为NMC-shMHC I类)，以及经编码扰乱的非靶向shRNA载体对照物的DNA转染的细胞(下文称为NMC-载体对照，阴性对照)。在逆转录病毒产生之前，用CSFE标记细胞。
使用流式细胞测量术分析逆转录病毒载体对MHC I类的表达。洗涤适当数目个逆转录病毒载体并且再悬浮于PBS中，与针对MHC I类的荧光偶联单克隆抗体(Harlan Sera-Lab，英国贝尔顿(Belton,UK))的1:10-1:4000稀释液一起在冰上保存30分钟。将逆转录病毒载体在PBS中洗涤三次并且再悬浮于PBS中。使用逆转录病毒载体制剂的相同等分试样测定非特异性荧光，所述逆转录病毒载体制剂与适当的荧光偶联同型对照抗体的等效稀释液一起培育。在流式细胞仪(FACSort，百克顿-迪金森公司(Becton-Dickinson))中分析逆转录病毒载体并且用流程分析软件(百克顿-迪金森公司)来分析数据。
对来源于NMC、NMC-shMHC I类和NMC-载体对照的逆转录病毒载体的平均荧光数据进行比较。在一个实施例中，来源于NMC-shMHC I类的逆转录病毒载体对MHC I类的表达低于NMC和NMC-载体对照。
实例11：测量预先存在的血清对逆转录病毒载体的灭活
这个实例描述了使用体外递送分析定量预先存在的血清对逆转录病毒载体的灭活。
在一些实施例中，逆转录病毒载体的免疫原性的量度是血清灭活。血清对逆转录病毒载体的灭活可能由于抗体介导的中和作用或补体介导的降解作用。在一个实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体的一些接受者在其血清中具有结合到逆转录病毒载体并将逆转录病毒载体灭活的因子。
在这个实例中，评估未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清中是否存在将逆转录病毒载体灭活的因子。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
阴性对照是热灭活的小鼠血清，并且阳性对照是来源于已接受由异种源细胞产生的逆转录病毒载体的多次注射的小鼠的血清。通过收集新鲜全血并使其完全凝结数小时来从小鼠收集血清。通过离心沉淀凝块，并去除血清上清液。将阴性对照样品在56℃下加热1小时。血清可以等分试样冷冻。
以靶细胞群中的50％细胞接受逆转录病毒载体中的外源药剂时的剂量测试逆转录病毒载体，如上文在实例9中所描述。
为了评估血清对逆转录病毒载体的灭活，将逆转录病毒载体在正常或热灭活血清(或含有10％热灭活FBS的培养基作为无血清对照)中1:5稀释并在37℃下培育混合物1小时。在培育之后，将培养基添加到反应物中进行额外的1:5稀释，并且随后以1:10比率连续稀释两次。在这个步骤之后，逆转录病毒载体应以50％接受者细胞已接受外源药剂(例如呈RFP阳性)时的预先鉴别剂量存在。
已暴露于血清的逆转录病毒载体随后与靶细胞一起培育。计算接受外源药剂并因此呈RFP阳性的细胞的百分比。在一些实施例中，在已和血清一起培育的逆转录病毒载体样品与来自未经逆转录病毒载体处理的小鼠的热灭活血清之间，接受外源药剂的细胞的百分比没有差异，表明不窜在血清对逆转录病毒载体的灭活。在一些实施例中，在已和未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清一起培育的逆转录病毒载体样品与无血清对照培育之间，接受外源药剂的细胞的百分比没有差异，表明不存在血清对逆转录病毒载体的灭活。在一些实施例中，在已与阳性对照血清一起培育的逆转录病毒载体样品中，接受外源药剂的细胞的百分比小于已与未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清一起培育的逆转录病毒载体样品，表明不存在血清对逆转录病毒载体的灭活。
实例12：多次施用之后，测量血清对逆转录病毒载体的灭活
这个实例描述了在多次施用逆转录病毒载体后，使用体外递送分析来定量血清对逆转录病毒载体的灭活。在一个实施例中，经修饰的逆转录病毒载体多次(例如超过一次，例如2次或更多次)施用之后，经修饰的逆转录病毒载体(例如通过本文所描述的方法修饰)的血清灭活减少(例如，相比于未经修饰的逆转录病毒载体施用而言减少)。在一个实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体在多次施用之后，不被血清灭活。
在一些实施例中，逆转录病毒载体的免疫原性的量度是血清灭活。在一个实施例中，逆转录病毒载体的重复注射可以产生抗逆转录病毒载体抗体，例如识别逆转录病毒载体的抗体。在一个实施例中，识别逆转录病毒载体的抗体可以能限制逆转录病毒载体活性或寿命并且介导补体降解的方式结合。
在这个实例中，在一次或多次施用逆转录病毒载体之后检查血清灭活。逆转录病毒载体是通过前述实例中的任何一个产生。在这个实例中，逆转录病毒由以下细胞产生：经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞(下文称为NMC-HLA-G)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC-空白载体，阴性对照)。在一些实施例中，逆转录病毒载体来源于正表达其它免疫调节蛋白的细胞。
血清取自不同的群组：全身和/或局部注射1、2、3、5或10次媒剂注射剂(逆转录病毒载体未经处理组)、HEK293-HLA-G逆转录病毒载体或HEK293逆转录病毒载体的小鼠。通过收集新鲜全血并使其完全凝结数小时来从小鼠收集血清。通过离心沉淀凝块，并去除血清上清液。阴性对照为热灭活的小鼠血清。将阴性对照样品在56℃下加热1小时。血清可以等分试样冷冻。
以靶细胞群中的50％细胞接受逆转录病毒载体中的外源药剂时的剂量测试逆转录病毒载体，如上文在实例9中所描述。
为了评估血清对逆转录病毒载体的灭活，将逆转录病毒载体暴露于血清并与靶细胞一起培育，如上述实例11中所描述。
计算接受外源药剂并因此呈RFP阳性的细胞的百分比。在一些实施例中，在已和血清一起培育的逆转录病毒载体样品与经HEK293-HLA-G逆转录病毒载体处理的小鼠的热灭活血清之间，接受外源药剂的细胞的百分比没有差异，表明不存在血清对逆转录病毒载体的灭活或适应性免疫应答。在一些实施例中，在来自经HEK293-HLA-G逆转录病毒载体处理1、2、3、5或10次的小鼠的已培育的逆转录病毒载体样品之间，接受外源药剂的细胞的百分比没有差异，表明不存在血清对逆转录病毒载体的灭活或适应性免疫应答。在一些实施例中，在已和来自媒剂处理小鼠与经HEK293-HLA-G逆转录病毒载体处理的小鼠的血清一起培育的逆转录病毒载体样品之间，接受外源药剂的细胞的百分比没有差异，表明不存在血清对逆转录病毒载体的灭活或适应性免疫应答。在一些实施例中，对于来源于HEK293的逆转录病毒载体来说，接受外源药剂的细胞的百分比小于HEK293-HLA-G逆转录病毒载体，表明不存在血清对HEK293-HLA-G逆转录病毒载体的灭活或适应性免疫应答。
实例13：测量对逆转录病毒载体具有反应性的预先存在的IgG和IgM抗体
这个实例描述了使用流式细胞测量术所测量的预先存在的抗逆转录病毒载体抗体效价的定量。
在一些实施例中，逆转录病毒载体的免疫原性的量度是抗体应答。识别逆转录病毒载体的抗体可以能限制逆转录病毒载体活性或寿命的方式结合。在一个实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体的一些接受者将具有结合到并识别逆转录病毒载体的预先存在的抗体。
在这个实例中，使用利用异种源细胞所产生的逆转录病毒载体测试抗逆转录病毒载体抗体效价。在这个实例中，评估未经逆转录病毒载体处理的小鼠是否存在抗逆转录病毒载体抗体。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
阴性对照是IgM和IgG已耗竭的小鼠血清，并且阳性对照是来源于已接受由异种源细胞产生的逆转录病毒载体的多次注射的小鼠的血清。
为了评估结合到逆转录病毒载体的预先存在的抗体的存在，首先通过加热到56℃维持30分钟将未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清去除补体并且随后在含有3％FCS和0.1％NaN3的PBS中稀释33％。将等量的血清和逆转录病毒载体(1×102-1×108个逆转录病毒载体/mL)悬浮液在4℃下培育30分钟并且通过小牛血清缓冲，用PBS洗涤。
通过将逆转录病毒载体与对小鼠IgM(BD生物科学)的Fc部分具有特异性的PE偶联山羊抗体一起在4℃下培育45分钟而使IgM异种反应性抗体染色。值得注意的是，还可以使用抗小鼠IgG1或IgG2二级抗体。来自所有组的逆转录病毒载体用含有2％FCS的PBS洗涤两次，并且随后在FACS系统(BD生物科学)上进行分析。通过使用对数扩增来收集荧光数据并表示为平均荧光强度。
在一个实施例中，阴性对照血清将展示与无血清或单独的次级对照类似的可忽略的荧光。在一个实施例中，阳性对照展示的荧光大于阴性对照，并且大于无血清对照或单独二抗对照。在一个实施例中，在存在免疫原性的情况下，未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清展示的荧光大于阴性对照。在一个实施例中，在不存在免疫原性的情况下，未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清展示的荧光类似于阴性对照。
实例14：逆转录病毒载体多次施用之后，测量IgG和IgM抗体应答
这个实例描述了在多次施用经修饰的逆转录病毒载体后，对经修饰的逆转录病毒载体的体液应答的定量。在一个实施例中，经修饰的逆转录病毒载体多次(例如超过一次，例如2次或更多次)施用之后，经修饰的逆转录病毒载体(例如通过本文所描述的方法修饰)的体液应答减少(例如相比于未经修饰的逆转录病毒载体施用而言减少)。
在一些实施例中，逆转录病毒载体的免疫原性的量度是抗体应答。在一个实施例中，逆转录病毒载体的重复注射可以产生抗逆转录病毒载体抗体，例如识别逆转录病毒载体的抗体。在一个实施例中，识别逆转录病毒载体的抗体可以能限制逆转录病毒载体活性或寿命的方式结合。
在这个实例中，一次或多次施用逆转录病毒载体之后，检查抗逆转录病毒载体抗体效价。逆转录病毒载体是通过前述实例中的任何一个产生。在这个实例中，逆转录病毒由以下细胞产生：未经免疫调节蛋白(NMC)转染的细胞、经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞(下文称为NMC-HLA-G)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC-空白载体，阴性对照)。在一些实施例中，逆转录病毒载体来源于正表达其它免疫调节蛋白的细胞。
血清取自不同的群组：全身和/或局部注射1、2、3、5、10次媒剂注射剂(逆转录病毒载体未经处理组)、NMC逆转录病毒载体、NMC-HLA-G逆转录病毒载体，或NMC-空白载体逆转录病毒载体的小鼠。
为了评估抗逆转录病毒载体抗体的存在和丰度，首先通过加热到56℃维持30分钟将小鼠的血清去除补体并且随后在含有3％FCS和0.1％NaN3的PBS中稀释33％。将等量的血清和逆转录病毒载体(1×102-1×108个逆转录病毒载体/mL)在4℃下培育30分钟并且通过小牛血清缓冲、用PBS洗涤。
通过将逆转录病毒载体与对小鼠IgM(BD生物科学)的Fc部分具有特异性的PE偶联山羊抗体一起在4℃下培育45分钟而使逆转录病毒载体反应性IgM抗体染色。值得注意的是，还可以使用抗小鼠IgG1或IgG2二级抗体。来自所有组的逆转录病毒载体用含有2％FCS的PBS洗涤两次，并且随后在FACS系统(BD生物科学)上进行分析。通过使用对数扩增来收集荧光数据并表示为平均荧光强度。
在一个实施例中，相比于NMC逆转录病毒载体或NMC-空白逆转录病毒载体，NMC-HLA-G逆转录病毒载体在注射之后的抗病毒IgM(或IgG1/2)抗体效价降低(如根据FACS荧光强度所测量)。
实例15：测量IgG和IgM效价(接受者细胞对逆转录病毒载体的抗体应答)
这个实例描述了使用流式细胞测量术定量针对接受者细胞(已与逆转录病毒载体融合的细胞)的抗体效价。在一些实施例中，接受者细胞的免疫原性的量度是抗体应答。识别接受者细胞的抗体可以能够限制细胞活性或寿命的方式结合。在一个实施例中，抗体应答将不靶向接受者细胞，或抗体应答将低于参考水平。
在这个实例中，测试个体(例如人类、大鼠或猴)的抗接受者细胞抗体效价。另外，所述方案可以适于存在适合的表面标记的任何细胞类型。在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。
小鼠每日用通过本申请所描述的方法中的任一种产生的逆转录病毒载体处理或用PBS(阴性对照)处理，历时5天。在最终处理后28天，从接受逆转录病毒载体的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。在用牛血清白蛋白阻断10分钟之后，将细胞在4℃下在黑暗中用鼠类CD3-FITC抗体(赛默飞世尔(ThermoFisher)目录号：11-0032-82)染色30分钟。在用PBS洗涤两次之后，在使用488nm激光激发并且在530+/-30nm收集发射、运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)的LSRII(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)上分析细胞。分选CD3+细胞。
随后通过将反应混合物与针对小鼠IgM(BD生物科学)的Fc部分的具有特异性的PE结合的山羊抗体一起在4℃下培育45分钟而用IgM抗体对分选的CD3+细胞进行染色。值得注意的是，还可以使用抗小鼠IgG1或IgG2二级抗体。来自所有组的细胞用含有2％FCS的PBS洗涤两次，并且随后在FACS系统(BD生物科学)上进行分析。通过使用对数扩增来收集荧光数据并表示为平均荧光强度。对来自用逆转录病毒载体处理的小鼠和用PBS处理的小鼠的分选CD3细胞计算平均荧光强度。
低平均荧光强度指示针对接受者细胞的低体液应答。预期经PBS处理的小鼠具有低平均荧光强度。在一个实施例中，来自经逆转录病毒载体处理的小鼠与经PBS处理的小鼠的接受者细胞的平均荧光强度类似。
实例16：测量吞噬细胞对逆转录病毒载体接受者细胞的应答
这个实例描述了通过吞噬分析来定量巨噬细胞对接受者细胞的应答。
在一些实施例中，接受者细胞的免疫原性的量度是巨噬细胞应答。巨噬细胞参与吞噬作用，吞噬细胞并且使得能够封存和破坏外来侵入物，如细菌或死细胞。在一些实施例中，通过巨噬细胞吞噬接受者细胞将降低接受者细胞的活性。
在一个实施例中，巨噬细胞不靶向接受者细胞。在这个实例中，测试巨噬细胞对个体的接受者细胞的应答。另外，所述方案可以适于存在适合的表面标记的任何细胞类型。在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。
小鼠每日用通过本申请所描述的方法中的任一种产生的逆转录病毒载体处理或用PBS(阴性对照)处理，历时5天。在最终处理后28天，从接受逆转录病毒载体的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。
在用牛血清白蛋白阻断10分钟之后，将细胞在4℃下在黑暗中用鼠类CD3-FITC抗体(赛默飞世尔目录号：11-0032-82)染色30分钟。在用PBS洗涤两次之后，在使用488nm激光激发并且在530+/-30nm收集发射、运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)的LSR II(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)上分析细胞。随后分选CD3+细胞。
根据以下方案进行吞噬分析以评估巨噬细胞介导的免疫清除。将巨噬细胞在收获后立即接种于共聚焦玻璃底培养皿中。在DMEM+10％FBS+1％P/S中培育巨噬细胞1小时以附着。如方案中所指示，将来源于接受逆转录病毒载体和PBS的小鼠的适当数目个经分选的并且经FITC染色的CD3+细胞添加到巨噬细胞中并培育2小时，例如如VybrantTM吞噬分析试剂盒产品信息插页中所描述(分子探针公司(Molecular Probes)，2001年3月18日修订，见于tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf)。
在2小时之后，轻轻地洗涤培养皿并检查细胞内荧光。为了鉴别巨噬细胞，首先将细胞与Fc受体阻断抗体(eBioscence目录号14-0161-86，克隆体93)一起在冰上培育15分钟，以阻断经标记的mAb与Fc受体的结合，所述Fc受体大量表达于巨噬细胞上。在这个步骤之后，添加抗F4/80-PE(赛默飞世尔目录号12-4801-82，克隆体BM8)和抗CD11b-PerCP-Cy5.5(BD生物科学目录号550993，克隆体M1/70)结合抗体以对巨噬细胞表面抗原进行染色。在4℃下、在黑暗中培育细胞30分钟，随后离心并在PBS中洗涤。随后将细胞再悬浮于PBS中。随后对样品执行流式细胞测量术，并且分别使用533nm和647nm激光激发，通过F4/80-PE和CD11b-PerCP-Cy5.5的阳性荧光信号鉴别巨噬细胞。对巨噬细胞设门之后，根据488nm激光激发来评估被吞噬的接受者细胞所发出的细胞内荧光。使用成像软件对吞噬阳性巨噬细胞的数目进行定量。数据被表示为吞噬指数＝(吞噬细胞的总数/计数的巨噬细胞的总数)×(含有吞噬细胞的巨噬细胞的数目/计数的巨噬细胞的总数)×100。
低吞噬指数表明低吞噬作用和巨噬细胞靶向。预期经PBS处理的小鼠具有低吞噬指数。在一个实施例中，来源于经逆转录病毒载体处理的小鼠与经PBS处理的小鼠的接受者细胞的吞噬指数类似。
实例17：测量PBMC对逆转录病毒载体接受者细胞的应答
这个实例描述了用细胞溶解分析来定量PBMC对接受者细胞的应答。
在一些实施例中，接受者细胞的免疫原性的量度是PBMC应答。在一个实施例中，细胞毒性介导的PBMC对接受者细胞的细胞溶解是免疫原性的量度，因为溶解将减少(例如抑制或中止)逆转录病毒载体的活性。
在一个实施例中，接受者细胞并不引发PBMC应答。在这个实例中，测试PBMC对个体的接受者细胞的应答。
另外，所述方案可以适于存在适合的表面标记的任何细胞类型。在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。
小鼠每日用通过本申请所描述的方法中的任一种产生的逆转录病毒载体处理或用PBS(阴性对照)处理，历时5天。在最终处理后28天，从接受逆转录病毒载体的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。细胞在细胞染色缓冲液(Biolegend目录号：420201)中用Fc阻断(Biolegend目录号：101319)10分钟之后，在4℃下、在黑暗中用鼠类CD3:APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：100330)或同型对照APC-Cy7(IC:APC-Cy7)抗体(Biolegend目录号：400230)染色30分钟。细胞用PBS洗涤两次之后，使用同型对照APC-Cy7抗体标记的细胞设定负门，在具有640nm激光激发并且在780-/+60nm收集发射、运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)的FACS Aria(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)上加以分析，随后分选并且收集APC-Cy7阳性细胞。分选的CD3+细胞随后用CellMaskTM绿色质膜染色剂(CMG，赛默飞世尔目录号：C37608)或DMSO(作为阴性对照)标记。
从经逆转录病毒载体或PBS处理的小鼠中分离出CD3+细胞之前的7天，根据Crop等人《细胞移植》(20):1547-1559；2011中的方法，从经逆转录病毒载体或PBS处理的小鼠中分离出PBMC，并且在37℃下、在圆底96孔培养盘中、在IL-2重组小鼠蛋白(安迪生物公司(R&DSystems)，目录号：402-ML-020)和CD3/CD28珠粒(赛默飞世尔目录号：11456D)存在下刺激7天。在第7天，将刺激的PBMC与CD3+/CMG+或CD3+/DMSO对照细胞共培育1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、24、48小时，PBMC:CD3+/CMG+或PBMC:CD3+/DMSO对照细胞的接种比介于1000:1-1:1与1:1.25-1:1000范围内。作为阴性对照，一组孔仅接受CD3+/CMG+和CD3+/DMSO对照细胞，不接受PBMC。在培育后，将培养盘离心并处理，以使其被鼠类CD3:APC-Cy7抗体或IC:APC-Cy7抗体标记，如上所述。用PBS洗涤两次之后，将细胞再悬浮于PBS中，并且在运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)的FACS Aria(APC-Cy7：640nm激光激发/在780-/+60nm收集的发射，和CMG 561nm激光激发/在585-/+16nm收集的发射)上进行分析。FSC/SSC事件数据将接着首先用于对标记为“细胞”的事件设门。随后利用这个“细胞”门显示事件以根据640nm和561nm激光设定PMT电压，从而分析仅经IC:APC-Cy7/DMSO标记的样品。这个样品还将用于对APC-Cy7和CMG两者的阴性细胞设门。随后使用不接受任何PBMC的CD3+/CMG+细胞对CD3+和CMG+细胞设正门。
通过观察总细胞群中的CD3+/CMG+细胞的百分比来分析数据。当比较处理组时，在PBMC:CD3+/CMG+细胞的任何给定的分析比下，相对较低百分比的CD3+/CMG+细胞指示接受者细胞溶解。在一个实施例中，来源于经逆转录病毒载体处理的小鼠与经PBS处理的小鼠的接受者细胞的CD3+/CMG+百分比类似。
实例18：测量NK细胞对逆转录病毒载体接受者细胞的应答
这个实例描述了利用细胞溶解分析来定量自然杀手细胞对接受者细胞的应答。
在一些实施例中，接受者细胞的免疫原性的量度是自然杀手细胞应答。在一个实施例中，细胞毒性介导的自然杀手细胞对接受者细胞的细胞溶解是免疫原性的量度，因为溶解将减少(例如抑制或中止)逆转录病毒载体的活性。
在一个实施例中，接受者细胞并不引发自然杀手细胞应答。在这个实例中，测试个体的自然杀手对接受者细胞的应答。另外，所述方案可以适于存在适合的表面标记的任何细胞类型。在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。
用逆转录病毒载体处理小鼠，抽取血液样品，并且分选CD3+细胞，如上文在实例17中所描述。分离出NK细胞，与CD3+细胞一起培养，并且根据上文在实例17中所描述的方案、通过FACS来分析，例外为使用NK细胞替代实例17中所用的PBMC细胞。
通过观察总细胞群中的CD3+/CMG+细胞的百分比来分析数据。当比较处理组时，在NK细胞:CD3+/CMG+细胞的任何给定的分析比下，相对较低百分比的CD3+/CMG+细胞指示接受者细胞溶解。在一个实施例中，来源于经逆转录病毒载体处理的小鼠与经PBS处理的小鼠的接受者细胞的CD3+/CMG+百分比类似。
实例19：测量CD8 T细胞对逆转录病毒载体接受者细胞的应答
这个实例描述了用细胞溶解分析来定量CD8+T细胞对接受者细胞(与逆转录病毒载体融合的细胞)的应答。
在一些实施例中，接受者细胞的免疫原性的量度是CD8+T细胞应答。在一个实施例中，细胞毒性介导的CD8+T细胞对接受者细胞的细胞溶解是免疫原性的量度，因为溶解将减少(例如抑制或中止)逆转录病毒载体的活性。
在一个实施例中，接受者细胞并不引发CD8+T细胞应答。在这个实例中，测试CD8+T细胞对个体的接受者细胞的应答。另外，所述方案可以适于存在适合的表面标记的任何细胞类型。在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。
用逆转录病毒载体处理小鼠，抽取血液样品，并且分选CD3+细胞，如上文在实例17中所描述。分离出CD8+T细胞，与CD3+细胞一起培养，并且根据上文在实例17中所描述的方案、通过FACS来分析，例外为使用CD8+T细胞替代实例17中所用的PBMC细胞。
通过观察总细胞群中的CD3+/CMG+细胞的百分比来分析数据。当比较处理组时，在CD8+细胞:CD3+/CMG+细胞的任何给定的分析比下，相对较低百分比的CD3+/CMG+细胞指示接受者细胞溶解。在一个实施例中，来源于经逆转录病毒载体处理的小鼠与经PBS处理的小鼠的接受者细胞的CD3+/CMG+百分比类似。
实例20：测量CNS细胞特异性启动子活性
这个实例描述了相比于非靶细胞，CNS特异性启动子(阳性TCSRE)在CNS细胞中的活性的测量结果。
将两种细胞类型单独地培养并用如本文所描述产生的逆转录病毒载体处理。将逆转录病毒载体用VSV-G假型化，并且在CNS特异性启动子(例如表3的CNS特异性启动子)的控制下编码tdtomato荧光蛋白质报道子。
在转导之后两天，通过流式细胞测量术测量细胞中的基因表达并且用定量PCR测量细胞中的平均载体拷贝数。将细胞群中每细胞的中值tdtomato基因表达相对于群载体拷贝数标准化。
在一些实施例中，CNS细胞群将具有比非靶细胞群大的tdtomato表达与载体拷贝数的比率。这将证实CNS细胞特异性启动子在CNS细胞中更具活性。
实例21：测量来自限制性微RNA的表达变化
这个实例描述了相比于非靶细胞，非靶细胞限制性微RNA(NTCSRE)在CNS细胞中的活性的测量结果。
将两种细胞类型单独地培养并用如本文所描述产生的逆转录病毒载体处理。将逆转录病毒载体用VSV-G假型化，并且在广泛活性的启动子和非靶细胞限制性微RNA(例如表4的微RNA)的控制下编码tdtomato荧光蛋白质报道子。
在转导之后两天，通过流式细胞测量术测量细胞中的基因表达并且用定量PCR测量细胞中的平均载体拷贝数。将细胞群中每细胞的中值tdtomato基因表达相对于群载体拷贝数标准化。
在一些实施例中，CNS细胞群将具有比非靶细胞群大的tdtomato表达与载体拷贝数的比率。这将证实非靶细胞限制性微RNA减少非靶细胞中的表达。
实例22：用VSV-G假型体外治疗弗里德赖希共济失调
这个实例描述了将治疗性转基因体外递送到细胞。在这个实例中，治疗性转基因为共济蛋白(fxn)。
将来自YG8R小鼠的脑中的神经元培养并用如本文所描述的产生的逆转录病毒载体或用PBS转导。逆转录病毒载体用VSV-G假型化，并且在神经元特异性启动子(阳性TCSRE)和小神经胶质细胞限制性微RNA序列(NTCSRE)的控制下携带fxn基因。
在Fxn表达足够时间之后，制备细胞以进行成像。将细胞固定、渗透、阻断并且用抗Fxn抗体(例如，abcam目录号ab175402)免疫染色。在免疫染色之后，细胞用结合到AlexaFluor488的二级抗体(例如，abcam目录号ab150077)进行反向染色。将细胞在维持于37℃和5％CO2下时，在具有63×油浸物镜的Zeiss LSM 710共聚焦显微镜上成像。对Alexa Fluor进行488nm激光激发并且在510±15nm下捕获发射。计算每细胞的Alexa Flour平均强度以测定每细胞的Fxn表达水平。对于每个组，使至少30-40个细胞成像并分析。
在一些实施例中，用编码Fxn基因的逆转录病毒载体处理的神经元中的每细胞的Fxn表达水平将高于用PBS处理的神经元中的Fxn表达水平。
实例23：用VSV-G假型化逆转录病毒体内治疗弗里德赖希共济失调
这个实例描述了将治疗性转基因体内递送到细胞。在这个实例中，治疗性转基因为共济蛋白(fxn)。
用VSV-G假型化的逆转录病毒载体对YG8R小鼠进行小脑内注射，并且在神经元特异性启动子(阳性TCSRE)和小神经胶质细胞限制性微RNA序列(NTCSRE)的控制下携带fxn基因药剂。逆转录病毒载体是通过本申请案中所描述的方法中的任一种产生。阴性对照小鼠用PBS处理。
在处理后28天，从用逆转录病毒或PBS处理的小鼠获得脑切片并且进行如先前实例中所描述的Fxn表达染色。在一些实施例中，来自用对Fxn基因进行编码的逆转录病毒载体处理的小鼠的脑中的每细胞的Fxn表达水平将高于用PBS处理的小鼠的脑中的Fxn表达水平。
在单独的一组小鼠中，用逆转录病毒或PBS处理后28天，对小鼠进行神经行为测试，如Rocca等人,2017,《科学转化医学(Sci.Transl.Med.)》9(413),doi:10.1126/scitranslmed.aaj2347中所描述的。在一些实施例中，与用PBS处理的小鼠相比，用逆转录病毒处理的小鼠在神经行为测试中示出显著改善。
实例24：融合剂脂质体中缺乏转录活性
这个实例定量相比于用于融合剂脂质体产生的亲本细胞(例如源细胞)，融合剂脂质体中的转录活性。在一个实施例中，相比于亲本细胞(例如源细胞)，融合剂脂质体中的转录活性将较低或不存在的。
融合剂脂质体为递送治疗剂的基础。可以高效率递送到细胞或局部组织环境的治疗剂(如miRNA、mRNA、蛋白质和/或细胞器)可以用于调节在接受者组织中通常不活跃或在病理性低或高水平下不活跃的途径。在一个实施例中，融合剂脂质体不能转录，或融合剂脂质体的转录活性小于其亲本细胞的观察结果将证实已充分发生了核物质的去除。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。随后在37℃和5％CO2下持续1小时将足够数量的融合剂脂质体和用于产生融合剂脂质体的亲本细胞在6孔低附着多孔板中接种到含有20％胎牛血清、1×青霉素/链霉素和可荧光标记的炔烃-核苷EU的DMEM中。对于阴性对照，也将足够数量的融合剂脂质体和亲本细胞在多孔板中接种于含有20％胎牛血清、1×青霉素/链霉素但不具有炔烃-核苷EU的DMEM中。
在1小时培育之后，按照制造商的成像试剂盒(赛默飞世尔科技(ThermoFisherScientific))说明书对样品进行处理。将包括阴性对照的细胞和融合剂脂质体样品用1×PBS缓冲液洗涤三次并且再悬浮于1×PBS缓冲液中并通过流式细胞测量术(百克顿-迪金森公司，美国加利福尼亚州圣何塞)，使用488nm氩气激光激发，以及530+/-30nm发射进行分析。BD FACSDiva软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。
在一个实施例中，由于省略了炔烃-核苷EU，阴性对照中如根据530+/-30nm发射所测量的转录活性将为零。在一些实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体的转录活性将为小于约70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。
另外参见《美国国家科学院院刊》,2008年10月14日；105(41):15779-84.doi:10.1073/pnas.0808480105.电子版2008年10月7日。
实例25：缺乏DNA复制或复制活性
这个实例定量融合剂脂质体中的DNA复制。在一个实施例中，相比于细胞，融合剂脂质体将以低速率复制DNA。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。通过并入可荧光标记的核苷酸(赛默飞世尔科技编号C10632)来评估融合剂脂质体和亲本细胞DNA复制活性。在用二甲亚砜制备EdU储备溶液之后，将融合剂脂质体和相等数目的细胞与EdU以10μM的最终浓度一起培育2小时。样品随后使用3.7％PFA固定15分钟，用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤并且在0.5％清洁剂于1×PBS缓冲液，pH 7.4中的溶液中渗透15分钟。
在渗透之后，将悬浮于含有0.5％洗涤剂的PBS缓冲液中的融合剂脂质体和细胞用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤并且在21℃下在反应混合液、1×PBS缓冲液、CuSO4(组分F)、叠氮化物-荧光剂488、1×反应缓冲液添加剂中培育30分钟。
用与上文相同地处理但在1×反应混合液中没有叠氮化物-荧光剂488的样品制得融合剂脂质体和细胞DNA复制活性的阴性对照。
随后将细胞和融合剂脂质体样品洗涤并且再悬浮于1×PBS缓冲液中并通过流式细胞测量术分析。用FACS细胞仪(百克顿-迪金森公司美国加利福尼亚州圣何塞)以488nm氩气激光激发进行流式细胞测量术，并且收集530+/-30nm发射光谱。FACS分析软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。基于每个样品中叠氮化物-荧光剂488的中值强度来计算相对DNA复制活性。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(替代地，可以应用门来仅选择融合剂脂质体群)。通过从融合剂脂质体的中值荧光强度值减去对应阴性对照样品的中值荧光强度值来确定融合剂脂质体的标准化荧光强度值。随后将融合剂脂质体样品的标准化相对DNA复制活性相对于对应有有核细胞样品进行标准化，以便产生DNA复制活性的定量测量结果。
在一个实施例中，融合剂脂质体的DNA复制活性低于亲本细胞。
另外参见Salic,2415-2420,doi:10.1073/pnas.0712168105。
实例26：融合剂的定量
这个实例描述每个融合剂脂质体中融合剂的绝对数的定量。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生融合剂脂质体组合物，除了如前述实例中所描述地对融合剂脂质体进行工程改造以表达用GFP标记的融合剂(VSV-G)。另外，在不存在融合剂(VSV-G)或GFP的情况下对阴性对照融合剂脂质体进行工程改造。
随后如下地分析具有GFP标记的融合剂的融合剂脂质体和一个或多个阴性对照的融合剂的绝对数。连续稀释商业上获得的重组GFP以产生蛋白质浓度的校准曲线。随后使用GFP光立方体(469/35激发滤光片和525/39发射滤光片)在荧光计中测量校准曲线和已知数量的融合剂脂质体的样品的GFP荧光，以计算融合剂脂质体制剂中GFP分子的平均摩尔浓度。随后将摩尔浓度转换为GFP分子的数目并且除以每个样品的融合剂脂质体数目，以获得每个融合剂脂质体的GFP标记的融合剂分子的平均数目，并且因此提供每个融合剂脂质体的融合剂数目的相对估算。
在一个实施例中，相比于其中不存在融合剂或GFP的阴性对照，具有GFP标签的融合剂脂质体中的GFP荧光将更高。在一个实施例中，GFP荧光是相对于存在的融合剂分子的数目。
替代地，根据制造商的说明书使用单一细胞制备系统(富鲁达(Fluidigm))分离个别融合剂脂质体，并且使用可商购的探针组(塔克曼(Taqman))和被设计成基于Ct值定量融合剂或GFPcDNA水平的预混液进行qRT-PCR。通过合成(Amsbio)产生与融合剂基因或GFP基因的克隆片段具有相同序列的RNA标准品，并且随后以连续稀释添加到单一细胞制备系统qRT-PCR实验反应，以建立Ct相对于融合剂或GFPRNA浓度的标准曲线。
将来自融合剂脂质体的Ct值与标准曲线进行比较以确定每个融合剂脂质体的融合剂或GFP RNA的量。
在一个实施例中，相比于其中不存在融合剂或GFP的阴性对照，被工程改造以表达融合剂的融合剂脂质体中的融合剂和GFP RNA将更高。
通过如先前所描述地分析脂质双层结构和如本文其它实例中所描述地通过LC-MS定量脂质双层中的融合剂，可以进一步定量脂质双层中的融合剂。
实例27：测量融合剂脂质体的平均大小
这个实例描述融合剂脂质体平均大小的测量。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。使用可商购的系统(iZON Science)测量融合剂脂质体以确定平均大小。将系统与软件(根据制造商的说明)和纳米孔一起使用，被设计成分析40nm至10μm尺寸范围内的颗粒。将融合剂脂质体和亲本细胞再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以达到0.01-0.1μg蛋白质/mL的最终浓度范围。如下表中所指示地调节其它仪器设置：
表7：融合剂脂质体测量参数和设置
测量参数 设置
压力 6
纳米孔类型 NP300
校准样品 CPC400_6P
黄金标准分析 无
捕获助手 无
在分离后的2小时内分析所有融合剂脂质体。在一个实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体的大小将在约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内。
实例28：测量融合剂脂质体的平均大小分布
这个实例描述融合剂脂质体大小分布的测量。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生融合剂脂质体，并且使用如先前实例中所描述的可商购的系统进行测试以确定颗粒的平均大小。在一个实施例中，将以围绕中值为中心的10％、50％和90％的融合剂脂质体的大小阈值与亲本细胞进行比较以评估融合剂脂质体大小分布。
在一个实施例中，融合剂脂质体将在10％、50％或90％的样品内具有亲本细胞的大小分布变化率的小于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更小。
实例29：融合剂脂质体的平均体积
这个实例描述测量融合剂脂质体的平均体积。不希望受理论所束缚，改变融合剂脂质体的大小(例如体积)可以使其对于不同的货物装载、治疗设计或应用为通用的。
如先前实例中所描述地制备融合剂脂质体。阳性对照为HEK293细胞或具有已知大小的聚苯乙烯珠粒。阴性对照为穿过36号针大致50次的HEK293细胞。
如先前实例中所描述的用透射式电子显微镜分析用于确定融合剂脂质体的大小。测量融合剂脂质体的直径并且随后计算体积。
在一个实施例中，融合剂脂质体将具有大致50nm或更大直径的平均大小。
实例30：融合剂脂质体的平均密度
通过如Théry等人,《细胞生物学实验指南》2006年4月；第3章：第3.22节中所描述的连续蔗糖梯度离心分析来测量融合剂脂质体密度。如先前实例中所描述地获得融合剂脂质体。
首先，制备蔗糖梯度。分别通过混合4ml HEPES/蔗糖储备溶液和1ml HEPES储备溶液或0.5ml HEPES/蔗糖储备溶液和4.5ml HEPES储备溶液来产生2M和0.25蔗糖溶液。将这两个部分装入关闭所有挡板的梯度仪中，2M蔗糖溶液在具有磁力搅拌棒的近端隔室中，并且0.25M蔗糖溶液在远端隔室中。将梯度仪置于磁性搅拌板上，打开近端与远端隔室之间的挡板并且打开磁性搅拌板。如下制得HEPES储备溶液：2.4g N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES；最终20mM)，300H2O，用10N NaOH将pH调节到7.4并且最后用H2O将体积调节到500ml。如下制得HEPES/蔗糖储备溶液：2.4g羟基乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES；最终20mM)，428g无蛋白酶的蔗糖(ICN；最终2.5M)，150ml H2O，用10N NaOH将pH调节到7.4并且最后用H2O将体积调节到500ml。
将融合剂脂质体再悬浮于2ml HEPES/蔗糖储备溶液中并且倒入SW 41离心管的底部。将外管置于SW 41管中，恰好在2ml融合剂脂质体上方。打开外挡板，并且将连续的2M(底部)到0.25M(顶部)蔗糖梯度缓慢倒入融合剂脂质体的顶部上。SW 41管在倒入梯度时降低，以使得管始终略高于液体顶部。
所有具有梯度的管彼此平衡，或与具有相同重量的蔗糖溶液的其它管平衡。将梯度在4℃下在制动器设置于低位的SW 41旋转铲斗转子中以210,000×g离心整夜(≥14小时)。
使用微量移液器从上到下收集十一份1ml洗脱份并且置于用于TLA-100.3转子的3ml管中。将样品放在一旁，并且在96孔盘的单独孔中将50μl的每一份洗脱份用于测量折射率。培养盘用粘性箔覆盖以防止蒸发并且在室温下存储不超过1小时。折射计用于测量10μl到20μl的来自96孔盘中存储的材料的每一份洗脱份的折射率(因此测量蔗糖浓度和密度)。
在可从Beckman网站下载的超速离心目录中可获得将折射率转换为g/ml的表格。
随后制备每一份洗脱份以进行蛋白质含量分析。将两毫升20mM HEPES，pH 7.4添加到每个1ml梯度洗脱份，并且通过上下移液二到三次而混合。每个管的一侧标记有永久性标记，并且将管置于TLA-100.3转子，标记侧朝上。
将具有经稀释的洗脱份的3ml管在110,000×g，4℃下离心1小时。TLA-100.3转子容纳六个管，因此每个梯度进行两次离心，将其它管保持于4℃下知道其可以离心。
从每个3ml管吸出上清液，在集结粒顶部留一滴。集结粒很可能不可见，但可以从管上的标记推断出其位置。将不可见的集结粒再悬浮并且转移到微量离心管。将每个再悬浮的洗脱份的一半用于通过二喹啉甲酸分析进行蛋白质含量分析，描述于另一实例中。这提供跨融合剂脂质体制剂的各个梯度洗脱份的分布。这个分布用于确定融合剂脂质体的平均密度。将另外一半体积的洗脱份存储于-80℃下并且一旦蛋白质分析揭露跨洗脱份的融合剂脂质体分布便用于其它目的(例如功能分析，或通过免疫分离进一步纯化)。
在一个实施例中，使用这个分析，融合剂脂质体的平均密度将为1.25g/ml+/-0.05标准差。在一个实施例中，融合剂脂质体的平均密度将在1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3或1.25-1.35范围内。在一个实施例中，融合剂脂质体的平均密度将小于1或大于1.35。
实例31：测量核包膜含量
这个实例描述测量去核的融合剂脂质体中的核包膜含量。核包膜从细胞的细胞质分离DNA。
在一个实施例中，经纯化的融合剂脂质体组合物包含已如本文所描述去核的哺乳动物细胞，如HEK-293T(293[HEK-293](
Figure BDA0003155557330002551
CRL-1573TM)。这个实例描述不同核膜蛋白的定量，作为测量在融合剂脂质体产生之后剩余的完整核膜的量的代替。
在这个实例中，将10×106个HEK-293T和等量的由10×106个HEK-293T制备的融合剂脂质体用3.7％PFA固定15分钟，用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤并且同时渗透，并且随后使用含有1％牛血清白蛋白和0.5％
Figure BDA0003155557330002552
X-100的1×PBS缓冲液，pH 7.4阻断15分钟。在渗透之后，将融合剂脂质体和细胞与不同的一级抗体，例如(抗RanGAP1抗体[EPR3295](Abcam-ab92360)、抗NUP98抗体[EPR6678]-核孔标记(Abcam-ab124980)、抗核孔复合物蛋白抗体[Mab414]-(Abcam-ab24609)、抗输入蛋白7抗体(Abcam-ab213670)一起在4°℃下培育12小时，所述一级抗体以制造商建议的浓度在含有1％牛血清白蛋白和0.5％
Figure BDA0003155557330002553
X-100的1×PBS缓冲液，pH 7.4中稀释。随后将融合剂脂质体和细胞用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤，并且与适当的荧光二级抗体一起在21°℃下培育2小时，所述二级抗体检测先前指定的一级抗体，以制造商建议的浓度在含有1％牛血清白蛋白和0.5％清洗涤剂的1×PBS缓冲液，pH 7.4中稀释。随后将融合剂脂质体和细胞用1×PBS缓冲液洗涤，再悬浮于300μL含有1μg/ml Hoechst 33342的1×PBS缓冲液，pH 7.4中，通过20μm FACS管过滤并且通过流式细胞测量术分析。
阴性对照使用相同染色程序产生，但不添加一级抗体。在FACS细胞仪(百克顿-迪金森公司，美国加利福尼亚州圣何塞)上以488nm氩气激光激发进行流式细胞测量术，并且收集530+/-30nm发射光谱。FACS采集软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。相对完整的核膜含量是基于每个样品中荧光的中值强度来计算。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件。
通过从融合剂脂质体的中值荧光强度值减去对应阴性对照样品的中值荧光强度值来确定融合剂脂质体的标准化荧光强度值。随后将融合剂脂质体样品的标准化荧光相对于对应有核细胞样品进行标准化，以产生完整核膜含量的定量测量结果。
在一个实施例中，相比于有核亲本细胞，去核的融合剂脂质体将包括小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％荧光强度或核包膜含量。
实例32：测量染色质水平
这个实例描述测量去核的融合剂脂质体中的染色质。
DNA可以浓缩成染色质以使其在细胞核内适合。在一个实施例中，通过本文所描述的方法中的任一种产生的纯化融合剂脂质体组合物将包含低水平的染色质。
使用具有针对组蛋白H3或组蛋白H4具有特异性的抗体的ELISA分析通过先前所描述的方法中的任一种制备的去核的融合剂脂质体和阳性对照细胞(例如亲本细胞)的染色质含量。组蛋白为染色质的主要蛋白质组分，并且H3和H4为主要的组蛋白。
使用商业试剂盒(例如Abcam组蛋白提取试剂盒(ab113476))或所属领域已知的其它方法从融合剂脂质体制剂和细胞制剂提取组蛋白。将这些等分试样存储在-80℃下直到使用。通过在分析缓冲液的溶液中将纯化的组蛋白(H3或H4)稀释为1ng/μl到50ng/μl来制备标准连续稀释液。分析缓冲液可以来源于由制造商供应的试剂盒(例如Abcam组蛋白H4总定量试剂盒(ab156909)或Abcam组蛋白H3总定量试剂盒(ab115091))。将分析缓冲液添加到涂布有用抗组蛋白H3或抗H4抗体的48孔盘或96孔盘的每个孔，并且将样品或标准对照物添加到孔以使每个孔的总体积达到50μl。随后将培养盘覆盖并且在37℃下培育90到120分钟。
在培育之后，制备结合到与培养盘连接的抗组蛋白抗体的任何组蛋白以进行检测。吸出上清液并且将培养盘用150μl洗涤缓冲液洗涤。随后将包括抗组蛋白H3或抗H4捕获抗体的捕获缓冲液以50μl的体积和1μg/mL的浓度添加到培养盘。随后将培养盘在室温下在定轨振荡器上培育60分钟。
随后，将培养盘吸出并且使用洗涤缓冲液洗涤6次。随后将可被捕获抗体活化的信号报道分子添加到每个孔。将培养盘覆盖并且在室温下培育30分钟。随后将培养盘吸出并且使用洗涤缓冲液洗涤4次。通过添加终止溶液来终止反应。读取培养盘中的每个孔在450nm处的吸光度，并且根据450nm处的吸光度相对于标准样品中组蛋白的浓度的标准曲线计算每个样品中组蛋白的浓度。
在一个实施例中，融合剂脂质体样品将包括有核亲本细胞的组蛋白浓度的小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
实例33：测量融合剂脂质体中的miRNA含量
这个实例描述融合剂脂质体中的微RNA(miRNA)的定量。在一个实施例中，融合剂脂质体包含miRNA。
miRNA为控制信使RNA(mRNA)翻译成蛋白质的速率(以及其它活动)的调节元件。在一个实施例中，携带miRNA的融合剂脂质体可以用于将miRNA递送到靶位点。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。如先前所描述地制备来自融合剂脂质体或亲本细胞的RNA。至少一个miRNA基因是选自www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml处的Sanger Center miRNA Registry。如Chen等人,《核酸研究》,33(20),2005中所描述地制备miRNA。通过赛默飞世尔(A25576。马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))可获得所有TaqMan miRNA分析。
根据制造商的说明书对miRNA cDNA进行qPCR，并且使用实时PCR系统如本文所描述地产生和分析CT值。
在一个实施例中，融合剂脂质体的miRNA含量将为其亲本细胞的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
实例34：定量融合剂脂质体中的内源性RNA或合成RNA的表达
这个实例描述定量具有改变的表达的内源性RNA或在融合剂脂质体中表达的合成RNA的水平。
融合剂脂质体或亲本细胞被工程改造以改变介导融合剂脂质体的细胞功能的内源性或合成RNA的表达。
转座酶载体(系统生物科学公司(System Biosciences,Inc.))包含嘌呤霉素抗性基因的开放阅读框连同蛋白质药剂的克隆片段的开放阅读框。使用电穿孔器(Amaxa)和293T细胞系特异性核转染试剂盒(龙沙(Lonza))将载体电穿孔到293T中。
在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中用嘌呤霉素选择3-5天后，通过先前实例中所描述的方法中的任一种由稳定表达的细胞系制备融合剂脂质体。
如先前实例中所描述地分离个别融合剂脂质体并且定量每个融合剂脂质体的蛋白质药剂或RNA。
在一个实施例中，融合剂脂质体将具有至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106或更多个RNA/融合剂脂质体。
实例35：测量融合剂脂质体中的蛋白质组学组成
这个实例描述定量融合剂脂质体的蛋白质组成。在一个实施例中，融合剂脂质体的蛋白质组成将与衍生其的细胞类似。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。将融合剂脂质体再悬浮于溶解缓冲液(7M脲、2M硫脲、于50mM Tris中的4％(w/v)Chaps，pH 8.0)中并且在室温下在偶尔涡旋的情况下培育15分钟。随后通过在冰浴中超声处理5分钟将混合物溶解并且以13,000RPM短暂离心5分钟。通过比色分析(皮尔斯(Pierce))确定蛋白质含量并且将每个样品的蛋白质转移到新试管中并用50mM Tris pH 8平衡体积。
将蛋白质在65℃下用10mM DTT还原15分钟并且在室温下在黑暗中用15mM碘乙酰胺烷基化30分钟。通过逐渐添加6体积的冷(-20℃)丙酮使蛋白质沉淀，并且在-80℃下培育整夜。用冷(-20℃)甲醇洗涤蛋白质集结粒3次。将蛋白质再悬浮于50mM Tris pH 8.3中。
随后，在消化的前4小时内在37℃下在搅拌下将胰蛋白酶/lysC添加到蛋白质。将样品用50mM Tris pH 8稀释，并且将0.1％脱氧胆酸钠与更多胰蛋白酶/lysC一起添加以在37℃下在搅拌下消化整夜。停止消化并且通过添加2％v/v甲酸来去除脱氧胆酸钠。将样品涡旋并且通过以13,000RPM离心1分钟来清除。通过逆相固相萃取(SPE)来纯化肽并干燥。将样品在20μl的3％DMSO、0.2％甲酸的水溶液中复原并且通过LC-MS分析。
为了进行定量测量，还在仪器上运行蛋白质标准物。将标准肽(皮尔斯(Pierce)，等摩尔，LC-MS级，#88342)稀释到4、8、20、40和100fmol/μl并且通过LC-MS/MS进行分析。对于每种浓度，计算每种蛋白质的5个最佳肽(3个MS/MS过渡/肽)的平均AUC(曲线下面积)以产生标准曲线。
用高分辨率质谱仪(ABSciex，美国加利福尼亚州福斯特市(Foster City,CA,USA))进行采集，所述质谱仪配备有具有25μm iD毛细管的电喷雾接口并且与微超高效液相色谱仪(μUHPLC)(Eksigent,美国加利福尼亚州雷德伍德城(Redwood City,CA,USA))耦接。分析软件用于控制仪器以及进行数据处理和采集。将源电压设置为5.2kV并且维持于225℃下，将气帘气设置为27psi，将气体一设置为12psi并将气体二设置为10psi。对于蛋白质数据库，以信息相关采集(Information Dependent Acquisition；IDA)模式进行采集，并且对于样品，以SWATH采集模式进行采集。在维持于60℃下的0.3μm i.d.，2.7μm颗粒，150mm长的逆相色谱柱(特拉华州威明顿的先进材料技术(Advance Materials Technology,Wilmington,DE))上进行分离。样品通过环路过满注入5μL环路中。对于120分钟(样品)LC梯度，移动相包括以下：流动速率为3μL/分钟的溶剂A(于水中的0.2％v/v甲酸和3％DMSO v/v)和溶剂B(于EtOH中的0.2％v/v甲酸和3％DMSO)。
对于蛋白质的绝对定量，使用每种蛋白质的5个最佳肽(3MS/MS离子/肽)的AUC的总和产生标准曲线(5点，R2>0.99)。为了产生用于样品分析的数据库，对12个样品中的每一个运行DIAUmpire算法并且与输出MGF文件合并到一个数据库中。这个数据库与软件(ABSciex)一起使用，以使用5个过渡/肽和5个肽/蛋白质最大值定量每个样品中的蛋白质。如果计算的评分高于1.5或FDR<1％，则将肽视为被充分测量。将每个充分测量的肽的AUC的总和绘制于标准曲线上，并且报告为fmol。
随后如下地分析所得蛋白质定量数据，以确定已知类别的蛋白质的蛋白质水平和比例：酶被鉴别为用酶委员会(EC)编号注释的蛋白质；ER相关蛋白被鉴别为具有ER而非线粒体的基因本体(GO；http://www.geneontology.org)细胞区室分类的蛋白质；外泌体相关蛋白被鉴别为具有外泌体而非线粒体的基因本体细胞区室分类的蛋白质；并且线粒体蛋白被鉴别为在MitoCarta数据库中被鉴别为线粒体的蛋白质(Calvo等人,NAR 2015ldoi:10.1093/nar/gkv1003)。将这些类别中的每一个的摩尔比确定为每类中的所有蛋白质的摩尔量的总和除以每个样品中所有鉴别的蛋白质的摩尔量的总和。
将融合剂脂质体蛋白质组学组成与亲本细胞蛋白质组学组成进行比较。在一个实施例中，当>50％的鉴别的蛋白质存在于融合剂脂质体中时，在融合剂脂质体与亲本细胞之间观察到类似的蛋白质组学组成，并且在那些鉴别的蛋白质中，水平为亲本细胞中的对应蛋白质水平的>25％。
实例36：测量融合剂脂质体中的GAPDH
这个分析描述定量融合剂脂质体中的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平，和与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的GAPDH的相对水平。
根据制造商的说明，使用用于GAPDH的标准可商购的ELISA(ab176642，Abcam)在亲本细胞和融合剂脂质体中测量GAPDH。
以用于测量GAPDH的样品的相同体积，如先前所描述地通过二喹啉甲酸分析来类似地测量总蛋白质水平。在实施例中，使用这个分析，融合剂脂质体中的GAPDH/总蛋白质的水平将为<100ng GAPDH/μg总蛋白质。类似地，在实施例中，从亲本细胞到融合剂脂质体的GAPDH水平相对于总蛋白质的降低将为大于10％降低。
在一个实施例中，以ng GAPDH/μg总蛋白质为单位的制剂中的GAPDH含量将为小于500、小于250、小于100、小于50、小于20、小于10、小于5或小于1。
在一个实施例中，从亲本细胞到制剂的以ng/μg为单位的GAPDH/总蛋白质的降低将为大于1％、大于2.5％、大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。
实例37：测量融合剂脂质体中的钙联蛋白
这个分析描述定量融合剂脂质体中的钙联蛋白(CNX)水平，和与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的CNX的相对水平。
根据制造商的说明，使用用于钙联蛋白的标准可商购的ELISA(MBS721668，MyBioSource)在起始细胞和制剂中测量钙联蛋白。
以用于测量钙联蛋白的样品的相同体积，如先前所描述地通过二喹啉甲酸分析来类似地测量总蛋白质水平。在实施例中，使用这个分析，融合剂脂质体中的钙联蛋白/总蛋白质的水平将为<100ng钙联蛋白/μg总蛋白质。类似地，在实施例中，从亲本细胞到融合剂脂质体的钙联蛋白水平相对于总蛋白质的增加将为大于10％增加。
在一个实施例中，以ng钙联蛋白/μg总蛋白质为单位的制剂中的钙联蛋白含量将为小于500、250、100、50、20、10、5或1。
在一个实施例中，从亲本细胞到制剂的以ng/μg为单位的钙联蛋白/总蛋白质的减少将为大于1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
实例38：比较可溶性与不溶性蛋白质质量
这个实例描述定量融合剂脂质体中的可溶性:不溶性蛋白质质量比率。在一个实施例中，融合剂脂质体中的可溶性:不溶性蛋白质质量比将与有核细胞类似。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。使用标准二喹啉甲酸分析(BCA)(例如使用可商购的PierceTM BCA蛋白质分析试剂盒，赛默飞世尔产品编号23225)测试融合剂脂质体制剂以确定可溶性:不溶性蛋白质的比。通过将制备的融合剂脂质体或亲本细胞以1×107个细胞或融合剂脂质体/mL的浓度悬浮于PBS中，并且以1600g离心以将融合剂脂质体或细胞制成集结粒来制备可溶性蛋白质样品。以可溶蛋白质洗脱份形式收集上清液。
通过剧烈移液并且在具有2％Triton-X-100的PBS中涡旋来溶解集结粒中的融合剂脂质体或细胞。溶解的洗脱份表示不溶性蛋白质洗脱份。
使用供应的BSA，每孔0到20μg(一式三份)来产生标准曲线。融合剂脂质体或细胞制剂被稀释，使得测量的量在标准范围内。一式三份地分析融合剂脂质体制剂并且使用平均值。将可溶性蛋白质浓度除以不溶性蛋白质浓度以得到可溶性:不溶性蛋白质比。
在一个实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体可溶性:不溶性蛋白质比率将在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内。
实例39：测量融合剂脂质体中的LPS
这个实例描述定量与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的脂多糖(LPS)的水平。在一个实施例中，融合剂脂质体将具有相比于亲本细胞较低水平的LPS。
LPS是细菌膜的组分和先天免疫应答的强力诱导剂。
如先前实例中所描述，LPS测量是基于质谱分析。
在一个实施例中，融合剂脂质体的脂质含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小将为LPS。
实例40：融合剂脂质体中的脂质与蛋白质的比率
这个实例描述定量融合剂脂质体中的脂质质量与蛋白质质量的比率。在一个实施例中，融合剂脂质体将具有与有核细胞类似的脂质质量与蛋白质质量的比。
总脂质含量计算为在先前实例中概述的脂质组学数据集中鉴别的所有脂质的摩尔含量的总和。通过如本文所描述的二喹啉甲酸分析来测量融合剂脂质体的总蛋白含量。
替代地，脂质与蛋白质的比可以被描述为特定脂质物种与特定蛋白质的比。特定脂质物种是选自先前实例中所产生的脂质组学数据。特定蛋白质是选自先前实例中所产生的蛋白质组学数据。所选脂质物种和蛋白质的不同组合用于定义特定的脂质:蛋白质比。
实例41：融合剂脂质体中的蛋白质与DNA的比率
这个实例描述定量融合剂脂质体中的蛋白质质量与DNA质量的比率。在一个实施例中，融合剂脂质体将具有比细胞大得多的蛋白质质量与DNA质量的比。
如先前实例中所描述地测量融合剂脂质体和细胞的总蛋白质含量。如先前实例中所描述地测量融合剂脂质体和细胞的DNA质量。随后通过将总蛋白质含量除以总DNA含量来确定蛋白质与总核酸的比，以得到典型融合剂脂质体制剂的在给定范围内的比。
替代地，通过使用半定量实时PCR(RT-PCR)将核酸水平定义为特定管家基因，如GAPDH的水平来确定蛋白质与核酸的比。
随后通过将总蛋白质含量除以总GAPDH DNA含量来确定蛋白质与GAPDH核酸的比率，以定义典型融合剂脂质体制剂的蛋白质:核酸比的特定范围。
实例42：测量与靶细胞的融合
这个实例描述定量相比于非靶细胞，融合剂脂质体与靶细胞的融合。
在一个实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的融合允许将融合剂脂质体的内腔中携带的货物细胞特异性地递送到接受者细胞的胞质溶胶。如下分析通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体与靶细胞的融合速率。
在这个实例中，融合剂脂质体包含在其质膜上表达成肌蛋白的HEK293T细胞。另外，融合剂脂质体表达mTagBFP2荧光蛋白和Cre重组酶。靶细胞为成肌细胞，其表达成肌蛋白和肌混合蛋白二者，并且非靶细胞为成纤维细胞，其既不表达成肌蛋白也不表达肌混合蛋白。预测表达成肌蛋白的融合剂脂质体与表达成肌蛋白和肌混合蛋白两者的靶细胞融合但不与非靶细胞融合(Quinn等人,2017,《自然通信(Nature Communications)》,8,15665.doi.org/10.1038/ncomms15665)(Millay等人,2013,《自然》,499(7458),301-305.doi.org/10.1038/nature12343)。靶细胞和非靶细胞类型均从小鼠分离并且在CMV启动子下稳定表达“LoxP-stop-Loxp-tdTomato”盒，所述启动子在通过Cre重组后开启tdTomato表达，指示融合。
将靶接受者细胞或非靶接受者细胞接种于黑色的透明底部96孔盘中。靶细胞和非靶细胞均对于不同融合基团进行接种。随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达Cre重组酶蛋白和成肌蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的靶接受者细胞或非靶接受者细胞。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施用融合剂脂质体之后，将细胞盘以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。
从融合剂脂质体应用后四小时开始，对细胞孔成像以阳性地鉴别区域或孔中的RFP阳性细胞相对于GFP阳性细胞。
在这个实例中，使用自动显微镜(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/)对细胞盘进行成像。通过首先在DMEM培养基中用Hoechst 33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。在染色之后，将Hoechst培养基用常规DMEM培养基替换。
使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来采集靶细胞孔和非靶细胞孔的图像。
设定采集设置，以使得RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。随后使用确立的设置对所关注的孔成像。每4小时对孔成像以采集融合活性速率的时程数据。
用配备有荧光显微镜的软件或其它软件(Rasband,W.S.,ImageJ,美国国家卫生研究院(U.S.National Institutes of Health),美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Maryland,USA),rsb.info.nih.gov/ij/,1997-2007)进行GFP和RFP阳性孔的分析。
使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。在Hoechst阳性细胞上设置总细胞掩码。Hoechst强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为Hoechst阳性细胞的区域。
在总细胞掩码内，通过对显著高于背景的细胞再次取阈值并且将Hoechst(细胞核)掩码扩展到整个细胞区域以包括整个GFP和RFP细胞荧光来鉴别GFP和RFP阳性细胞。在含有靶接受者细胞或非靶接受者细胞的对照孔中鉴别的RFP阳性细胞的数目用于从含有融合剂脂质体的孔中减去RFP阳性细胞的数目(以减去非特异性Loxp重组)。随后在每个时间点将RFP阳性细胞(融合的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(未融合的接受者细胞)与RFP阳性细胞的总和，以定量接受者细胞群内的融合剂脂质体融合速率。将速率标准化为施加到接受者细胞的融合剂脂质体的给定剂量。对于靶向融合(融合剂脂质体与所靶向的细胞融合)的速率，从与靶细胞的融合速率减去与非靶细胞的融合速率，以定量靶向融合的速率。
在一个实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的平均融合速率将在0.01-4.0RFP/GFP细胞/小时范围内(对于靶细胞融合)，或为非靶接受者细胞与融合剂脂质体的平均融合速率的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一个实施例中，未施用融合剂脂质体的组将展示<0.01RFP/GFP细胞/小时的背景速率。
实例43：递送膜蛋白的体外融合
这个实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一个实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合使得将活性膜蛋白递送到接受者细胞。
在这个实例中，融合剂脂质体是从表达仙台病毒HVJ-E蛋白的HEK293T细胞产生(Tanaka等人,2015,《基因疗法》,22(2014年10月),1-8.doi.org/10.1038/gt.2014.12)。在一个实施例中，产生融合剂脂质体以表达膜蛋白GLUT4，其主要发现于肌肉和脂肪组织中并且负责胰岛素调节的葡萄糖向细胞内的转运。如先前实例中所描述的方法种的任一种所描述，由HEK293T细胞制备具有或不具有GLUT4的融合剂脂质体。
随后用表达GLUT4的融合剂脂质体、不表达GLUT4的融合剂脂质体、PBS(阴性对照)或胰岛素(阳性对照)处理肌肉细胞，如C2C12细胞。通过荧光2-脱氧葡萄糖类似物，2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)的摄取来测量GLUT4对C2C12细胞的活性。使用先前实例中所描述的方法，通过显微镜评估C2C12细胞的荧光。
在一个实施例中，预期相比于用PBS或不表达GLUT4的融合剂脂质体处理的C2C12细胞，用表达GLUT4和胰岛素的融合剂脂质体处理的C2C12细胞展示增加的荧光。
另外参见Yang等人,《先进材料(Advanced Materials)》29,1605604,2017。
实例44：测量从血管的外渗
这个实例描述用体外微流体系统测试的跨内皮单层的融合剂脂质体外渗的定量(J.S Joen等人2013,journals.plos.org/plosone/article？id＝10.1371/journal.pone.0056910)。
细胞从血管系统外渗到周围组织中。不希望受理论束缚，外渗为融合剂脂质体到达血管外组织的一种方式。
系统包括三个可独立寻址的介质通道，所述通道由可以将ECM模拟凝胶注入其中的腔室分隔。简单来说，微流体系统具有模制的PDMS(聚二甲基硅氧烷；Silgard 184；密歇根州的陶氏化学(Dow Chemical,MI))，通过其钻取进入口并且结合到盖玻璃以形成微流体通道。通道截面尺寸为1mm(宽度)×120μm(高度)。为了增强基质黏着，PDMS通道涂布有PDL(聚D-赖氨酸氢溴酸盐；1mg/ml；密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))溶液。
随后，将I型胶原蛋白(BD生物科学，美国加利福尼亚州圣何塞)溶液(2.0mg/ml)伴以磷酸盐缓冲盐水(PBS；Gibco)和NaOH通过四个单独的填充口注入装置的凝胶区域中，并且培育30分钟以形成水凝胶。当凝胶聚合时，立即将内皮细胞培养基(从如龙沙或西格玛的供应商获得)吸移到通道中以防止凝胶脱水。吸出培养基后，将稀水凝胶(BD科学)溶液(3.0mg/ml)引入到细胞通道中并且使用冷培养基将过量的水凝胶溶液洗掉。
将内皮细胞引入到中间通道中并且使其沉降以形成内皮。在内皮细胞接种后两天，将融合剂脂质体或巨噬细胞(阳性对照)引入到相同通道中，其中内皮细胞已在所述通道中形成完整的单层。引入融合剂脂质体以使其附着并且跨单层转移到凝胶区域中。将培养物保持于37℃和5％CO2下的含湿气培育箱中。融合剂脂质体的GFP表达型式用于使得能够通过荧光显微镜进行活细胞成像。第二天，将细胞固定并在腔室中使用DAPI染色对细胞核染色，并且使用共聚焦显微镜对多个所关注区域成像以确定多少融合剂脂质体穿过了内皮单层。
在一个实施例中，DAPI染色将指示在接种后，融合剂脂质体和阳性对照细胞能够穿过内皮屏障。
实例45：测量趋化性细胞迁移率
这个实例描述融合剂脂质体趋化性的定量。细胞可以通过趋化性而朝向或远离化学梯度移动。在一个实施例中，趋化性将使融合剂脂质体归巢到损伤部位或追踪病原体。如下地分析通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的纯化融合剂脂质体组合物的趋化能力。
根据制造商提供的方案在DMEM培养基(ibidi.com/img/cms/products/labware/channel_slides/S_8032X_Chemotaxis/IN_8032X_Chemotaxis.pdf)中，将足够数量的融合剂脂质体或巨噬细胞(阳性对照)装入显微镜玻片孔中。将融合剂脂质体在37℃和5％CO2下放置1小时以使其附着。在细胞附着后，将DMEM(阴性对照)或含DMEM的MCP1化学引诱剂装载至中心通道的相邻储集器中，并且使用Zeiss倒置宽视野显微镜对融合剂脂质体连续成像2小时。使用ImageJ软件(Rasband,W.S.,ImageJ,美国国家卫生研究院,美国马里兰州贝塞斯达,http://rsb.info.nih.gov/ij/,1997-2007)分析图像。用手动追踪插件(FabriceCordelières,Institut Curie,法国(奥赛Orsay,France))获取每个观察到的融合剂脂质体或细胞的迁移协调数据。趋化图和迁移速度是由趋化性和迁移工具(ibidi)确定。
在一个实施例中，融合剂脂质体的平均累积距离和迁移速度将在阳性对照细胞对趋化因子的应答的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内。细胞对趋化因子的应答描述于例如Howard E.Gendelman等人,《神经免疫药理学杂志(Journal of Neuroimmune Pharmacology)》,4(1):47-59,2009中。
实例46：测量归巢潜力
这个实例描述将融合剂脂质体归巢到损伤部位。细胞可以从远端部位迁移和/或积聚于特定部位，例如归巢到部位。通常，位点为损伤部位。在一个实施例中，融合剂脂质体将归巢到，例如迁移到或积聚于损伤部位。
通过使用30G针以2μg/mL的浓度将肌肉内(IM)注射到右胫骨前肌(TA)中而向八周龄C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratories))给药含黑牙蛇毒素(NTX)(精密化学科技公司(Accurate Chemical&Scientific Corp))，一种含肌肉毒素的无菌生理盐水。通过使用化学脱毛剂对区域脱毛45秒，接着用水冲洗3次而制备胫骨前肌(TA)上的皮肤。选择这个浓度以确保肌纤维的最大变性，以及对其卫星细胞、运动神经元轴突和血管的最小损伤。
在NTX注射后的第1天，小鼠接受表达萤火虫荧光素酶的融合剂脂质体或细胞的静脉内注射。通过先前实例所描述的方法中的任一种从稳定表达萤火虫荧光素酶的细胞产生融合剂脂质体。生物发光成像系统(珀金埃尔默(Perkin Elmer))用于在注射后0、1、3、7、21和28处获得生物发光的整个动物图像。
在成像前五分钟，小鼠接受以150mg/kg剂量腹膜内注射的生物发光底物(珀金埃尔默)以使荧光素酶可视化。成像系统被校准以补偿所有装置设置。使用辐射光子(Radiance Photons)测量生物发光信号，并且将总通量用作测量值。通过围绕ROI的信号产生感兴趣区域(ROI)，以得到以光子数/秒计的值。对用NTX处理的TA肌肉和对侧TA肌肉都评估了ROI，并且计算NTX处理的TA肌肉与未用NTX处理的TA肌肉之间的光子数/秒的比，作为归巢到NTX处理的肌肉的量度。
在一个实施例中，融合剂脂质体和细胞中的NTX处理的TA肌肉与未用NTX处理的TA肌肉之间的光子数/秒的比将大于1，指示表达荧光素酶的融合剂脂质体在损伤处的位点特异性积聚。
参见例如Plant等人,《肌肉神经(Muscle Nerve)》34(5)L 577-85,2006。
实例47：测量吞噬活性
这个实例表明融合剂脂质体的吞噬活性。在一个实施例中，融合剂脂质体具有吞噬活性，例如能够进行吞噬作用。细胞参与吞噬，吞噬颗粒，从而能够封存和破坏外来侵入物，如细菌或死细胞。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的包含来自具有部分或完全核灭活的哺乳动物巨噬细胞的融合剂脂质体的纯化融合剂脂质体组合物能够进行吞噬作用(通过病原体生物粒子所分析)。根据以下方案，通过使用荧光吞噬分析来进行这个评估。
将巨噬细胞(阳性对照)和融合剂脂质体在收获后立即接种于单独的共聚焦玻璃底培养皿中。将巨噬细胞和融合剂脂质体在DMEM+10％FBS+1％P/S中培育1小时以附着。如制造商的方案中所指示地将荧光素标记的大肠杆菌K12和非荧光素标记的大肠杆菌K-12(阴性对照)添加到巨噬细胞/融合剂脂质体，并且培育2小时，tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf。在2小时之后，通过添加锥虫蓝将游离的荧光颗粒淬灭。通过共聚焦显微镜在488激发下对由吞噬颗粒发出的细胞内荧光成像。使用image J软件对吞噬阳性融合剂脂质体的数目进行定量。
在引入生物粒子后2小时，吞噬融合剂脂质体的平均数目为至少30％，并且在阳性对照巨噬细胞中为大于30％。
实例48：测量蛋白质分泌的潜力
这个实例描述由融合剂脂质体的分泌的定量。在一个实施例中，融合剂脂质体将能够分泌，例如分泌蛋白质。细胞可以通过分泌来处置或排出物质。在一个实施例中，融合剂脂质体将通过分泌在其环境中化学相互作用和通信。
使用来自赛默飞世尔科技的Gaussia荧光素酶快速分析(目录号16158)确定融合剂脂质体以给定速率分泌蛋白质的能力。将通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的小鼠胚胎成纤维细胞(阳性对照)或融合剂脂质体在生长培养基中培育，并通过首先以1600g粒化融合剂脂质体5分钟并且随后收集上清液来每15分钟收集培养基样品。将收集的样品吸移到透明底96孔盘中。随后根据制造商的说明书制备分析缓冲液的工作溶液。
简单来说，将考伦特嗪(colenterazine)，一种荧光素或发光分子与快速分析缓冲液混合并将混合物吸移到含有样品的96孔盘的每个孔中。缺乏细胞或融合剂脂质体的阴性对照孔包括生长培养基或分析缓冲液以确定背景Gaussia荧光素酶信号。另外，制备纯化的Gaussia荧光素酶(Athena Enzyme Systems,目录号0308)的标准曲线以便将每小时发光信号转化为Gaussia荧光素酶分泌的分子。
使用500毫秒积分来分析培养盘的发光。从所有样品减去背景Gaussia荧光素酶信号并且随后计算Gaussia荧光素酶标准曲线的线性最佳拟合曲线。如果样品读数在标准曲线内不拟合，那么将其适当稀释并再分析。使用这个分析，确定融合剂脂质体以给定范围内的速率(分子数/小时)分泌Gaussia荧光素酶的能力。
在一个实施例中，融合剂脂质体将能够以阳性对照细胞的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的速率分泌蛋白质。
实例49：测量信号转导潜力
这个实例描述融合剂脂质体中的信号转导的定量。在一个实施例中，融合剂脂质体能够进行信号转导。细胞可以通过信号级联(如磷酸化)在称为信号转导的过程中从细胞外环境发送和接收分子信号。通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的包含来自具有部分或完全核灭活的哺乳动物细胞的融合剂脂质体的纯化融合剂脂质体组合物能够进行胰岛素诱导的信号转导。通过测量AKT磷酸化水平，胰岛素受体信号级联中的关键途径和回应于胰岛素的葡萄糖摄取来评估胰岛素诱导的信号转导。
为了测量AKT磷酸化，将细胞，例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(阳性对照)和融合剂脂质体接种于48孔盘中并且在37℃和5％CO2下的含湿气培育箱中放置2小时。在细胞粘着后，将胰岛素(例如10nM)或不含胰岛素的阴性对照溶液添加到含有细胞或融合剂脂质体的孔种持续30分钟。在30分钟后，由融合剂脂质体或细胞制得蛋白质溶解物，并且通过蛋白质印迹法测量胰岛素刺激和对照物未刺激的样品中的磷酸化AKT水平。
如在葡萄糖摄取部分中所阐述，通过使用经标记的葡萄糖(2-NBDG)来测量回应于胰岛素或阴性对照溶液的葡萄糖摄取。(S.Galic等人,《分子细胞生物学》25(2):819-829,2005)。
在一个实施例中，相比于阴性对照，融合剂脂质体将增强AKT磷酸化和回应于胰岛素的葡萄糖摄取至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大。
实例50：测量跨细胞膜转运葡萄糖的能力
这个实例描述2-NBDG(2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)的水平的定量，2-NBDG为一种可以用于监测活细胞中的葡萄糖摄取，并且因此测量跨脂质双层的主动转运的荧光葡萄糖类似物。在一个实施例中，这个分析可以用于测量葡萄糖摄取的水平和跨融合剂脂质体的脂质双层的主动转运。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体组合物。随后将足够数量的融合剂脂质体在不含葡萄糖、20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中在37℃和5％CO2下培育2小时。在2小时葡萄糖饥饿时段之后，更换培养基以使其包含不含葡萄糖、20％胎牛血清、1×青霉素/链霉的DMEM和20μM 2-NBDG(赛默飞世尔)并且再在37℃和5％CO2下培育2小时。
相同地处理阴性对照融合剂脂质体，除了添加等量的DMSO来代替2-NBDG。
随后将融合剂脂质体用1×PBS洗涤三次并且再悬浮于适当缓冲液中，并转移到96孔成像培养盘中。随后使用GFP光立方体(469/35激发滤光片和525/39发射滤光片)在荧光计中测量2-NBDG荧光，以定量在1小时装载时段内已跨融合剂脂质体膜转运并累积于融合剂脂质体中的2-NBDG的量。
在一个实施例中，相比于阴性(DMSO)对照，经2-NBDG处理的融合剂脂质体中的2-NBDG荧光将更高。用525/39发射滤光片的荧光测量将与存在的2-NBDG分子的数目相关。
实例51：测量胞质溶胶中的酯酶活性
这个实例描述融合剂脂质体中的酯酶活性的定量，作为代谢活性的替代。通过钙黄绿素-AM染色的定量评估来确定融合剂脂质体中的胞质酯酶活性(Bratosin等人,《细胞测量术(Cytometry)》66(1):78-84,2005)。
膜渗透性染料钙黄绿素-AM(分子探针公司，尤金或美国)制备为10mM的二甲亚砜储备溶液和100mM的PBS缓冲液，pH 7.4的工作溶液。将通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体或阳性对照亲本小鼠胚胎成纤维细胞悬浮于PBS缓冲液中，并且与钙黄绿素-AM工作溶液(钙黄绿素-AM中的最终浓度：5mM)一起在37℃下在黑暗中培育30分钟，并且随后在PBS缓冲液中稀释以立即进行钙黄绿素荧光保留的流式细胞测量分析。
如(Jacob等人,《细胞测量术(Cytometry)》12(6):550-558,1991)中所描述，用皂苷将融合剂脂质体和对照亲本小鼠胚胎成纤维细胞实验性透化为零酯酶活性的阴性对照。将融合剂脂质体和细胞在含有0.05％叠氮化钠的1％皂苷于PBS缓冲液，pH 7.4中的溶液中培育15分钟。由于质膜透化的可逆性质，在用于另外染色和洗涤步骤的所有缓冲液中均包括皂苷。在皂苷透化后，将融合剂脂质体和细胞悬浮于含有0.1％皂苷和0.05％叠氮化钠PBS缓冲液中并且与钙黄绿素-AM一起培育(37℃在黑暗中持续45分钟)到5mM的最终浓度，用相同的含有0.1％皂苷和0.05％叠氮化钠的PBS缓冲液洗涤三次，并且通过流式细胞测量术进行分析。在FACS细胞仪(百克顿-迪金森公司，美国加利福尼亚州圣何塞)上进行流式细胞测量术分析，在530+/-30nm处收集488nm氩气激光激发和发射。FACS软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。基于每个样品中的钙黄绿素-AM的强度计算相对酯酶活性。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(替代地，可以应用门来仅选择融合剂脂质体群)。通过减去对应的阴性对照皂苷处理的样品的荧光强度(FI)值来确定融合剂脂质体的FI值。将融合剂脂质体样品的标准化酯酶活性相对于对应的阳性对照细胞样品进行标准化，以产生胞质酯酶活性的定量测量结果。
在一个实施例中，融合剂脂质体制剂相比于阳性对照细胞将具有1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内的酯酶活性。
另外参见Bratosin D,Mitrofan L,Palii C,Estaquier J,Montreuil J.使用钙黄绿素-AM的新型荧光分析，用于测定人类红细胞活力和衰老(Novel fluorescence assayusing calcein-AM for the determination of human erythrocyte viability andaging.)《细胞测量术A》2005年7月；66(1):78-84；以及Jacob BC,Favre M,Bensa JC.用皂苷的膜细胞透化和通过流式细胞测量术的多参数分析(Membrane cell permeabilisationwith saponin and multiparametric analysis by flow cytometry.)《细胞测量术》1991；12:550-558。
实例52：测量融合剂脂质体中的乙酰胆碱酯酶活性
遵循先前描述的程序(Ellman等人,《生化药理学(Biochem.Pharmacol.)》7,88,1961)并遵循制造商的建议使用试剂盒(MAK119，西格玛)测量乙酰胆碱酯酶活性。
简单来说，将融合剂脂质体悬浮于含1.25mM乙酰硫代胆碱的PBS，pH 8中，与含0.1mM5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)的PBS，pH 7混合。在室温下进行培育，但在开始光学密度读取之前，将融合剂脂质体和底物溶液在37℃下预温热10分钟。
用盘读取器分光光度计(ELX808，BIO-TEK instruments,美国佛蒙特州威努斯基(Winooski,VT,USA))在450nm处监测吸收变化10分钟。单独地，样品用于通过二喹啉甲酸分析来确定融合剂脂质体的蛋白质含量以进行标准化。使用这个分析，融合剂脂质体被确定为具有<100AChE活性单位/μg蛋白质。
在一个实施例中，AChE活性单位/μg蛋白质值将小于0.001、0.01、0.1、1、10、100或1000。
实例53：测量代谢活性水平
这个实例描述融合剂脂质体中的柠檬酸合成酶活性的测量的定量。
柠檬酸合成酶为三羧酸(TCA)循环内的一种酶，其催化草酰乙酸(OAA)与乙酰基-CoA之间的反应以产生柠檬酸盐。在乙酰基-CoA水解后，会释放具有硫醇基的CoA(CoA-SH)。硫醇基与化学试剂5,5-二硫基双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应，以形成5-硫基-2-硝基苯甲酸(TNB)，其为可以分光光度法在412nm处测量的黄色产物(Green 2008)。可商购的试剂盒，如Abcam人类柠檬酸合成酶活性分析试剂盒(产品编号ab119692)提供了执行这个测量所需的所有试剂。
根据制造商的建议进行分析。如下制备融合剂脂质体样品溶解物：收集通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体并将其在提取缓冲液(Abcam)中在冰上溶解20分钟。在离心之后收集上清液，并通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔科技)评估蛋白质含量，并且将制剂保持于冰上直到引发以下定量方案。
简单来说，将融合剂脂质体溶解物样品在提供的微盘孔中的1×培育缓冲液(Abcam)中稀释，其中一组孔仅接受1×培育缓冲液。将板密封并且在室温下在300rpm振荡下培育4小时。随后从孔中吸出缓冲液并添加1×洗涤缓冲液。再次重复这个洗涤步骤。随后，将1×活性溶液添加到每个孔，并且通过每20秒测量412nm处的吸光度持续30分钟，并在读取之间振荡而在微盘读取器上分析培养盘。
从所有孔减去背景值(仅具有1×培育缓冲液的孔)，并且将柠檬酸合成酶活性表示为每微克装载的融合剂脂质体溶解物样品每分钟吸光度的变化(ΔmOD@412nm/分钟/μg蛋白质)。仅使用动力学测量的100-400秒的线性部分来计算活性。
在一个实施例中，融合剂脂质体制剂相比于对照细胞将具有在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内的合成酶活性。
参见例如Green HJ等人，在运动和恢复的连续三天内，人体肌肉中的代谢、酶和转运体反应(Metabolic,enzymatic,and transporter response in human muscle duringthree consecutive days of exercise and recovery.)《美国生理调节、综合和比较生理学杂志(Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol)》295:R1238-R1250,2008。
实例54：测量呼吸水平
这个实例描述融合剂脂质体中的呼吸水平的测量的定量。细胞中的呼吸水平可以为耗氧量的量度，其促进代谢。通过Seahorse细胞外通量分析仪(安捷伦(Agilent))测量融合剂脂质体呼吸的耗氧量(Zhang 2012)。
将通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体或细胞接种于96孔Seahorse微盘(安捷伦)中。将微盘短暂离心以将孔底部的融合剂脂质体和细胞制成集结粒。如下起始耗氧量分析：通过去除生长培养基，用含有25mM葡萄糖和2mM谷氨酰氨(安捷伦)的低缓冲DMEM基本培养基代替并且在37℃下培育微盘60分钟以使温度和pH平衡。
随后在细胞外通量分析仪(安捷伦)中分析微盘，所述分析仪测量紧贴在附着的融合剂脂质体和细胞周围的培养基中的细胞外氧和pH的变化。在获得稳态耗氧量(基础呼吸速率)和细胞外酸化速率后，将抑制ATP合成酶的寡霉素(5μM)和将线粒体解偶联的质子离子载体FCCP(羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙；2μM)添加到微盘的每个孔，以获得最大耗氧率的值。
最后，添加5μM抗霉素A(线粒体复合物III的抑制剂)以确认呼吸变化主要是由于线粒体呼吸。从所有耗氧量测量结果中减去添加抗霉素A后的最低耗氧率，以去除非线粒体呼吸组分。分析中不包括对寡霉素(耗氧率相比于基础至少降低25％)或FCCP(耗氧率相比于基础至少增加50％)的应答不恰当的细胞样品。随后将融合剂脂质体呼吸水平测量为pmol O2/min/1e4融合剂脂质体。
随后将这个呼吸水平标准化为对应的细胞呼吸水平。在一个实施例中，融合剂脂质体相比于各别细胞样品将具有在至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内的呼吸水平。
参见例如Zhang J,Nuebel E,Wisidagama DRR等人测量经培养的细胞，包括人类多能干细胞和分化细胞中的能量代谢(Measuring energy metabolism in culturedcells,including human pluripotent stem cells and differentiated cells.)《自然实验手册(Nature protocols.)》2012；7(6):10.1038/nprot.2012.048.doi:10.1038/nprot.2012.048。
实例55：测量融合剂脂质体的磷脂酰丝氨酸水平
这个实例描述膜联蛋白-V结合到融合剂脂质体表面的水平的定量。
染色细胞可以在细胞表面上显示磷脂酰丝氨酸，其为程序性细胞死亡途径中细胞凋亡的标记。膜联蛋白-V结合到磷脂酰丝氨酸，并且因此，膜联蛋白-V结合为细胞活力的代理。
如本文所描述地产生融合剂脂质体。为了检测凋亡信号，用5％膜联蛋白V荧光剂594(A13203，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)对融合剂脂质体或阳性对照细胞进行染色。每组(详述于下表中)包括用凋亡诱导剂甲萘醌处理的实验组。将甲萘醌以100μM甲萘醌添加4小时。所有样品在流式细胞仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)上运行，并且用YL1激光在561nm的波长和585/16nm的发射滤光片测量荧光强度。通过比较所有组中的膜联蛋白V的荧光强度来定量细胞外磷脂酰丝氨酸的存在。
阴性对照未染色的融合剂脂质体对膜联蛋白V染色不呈阳性。
在一个实施例中，融合剂脂质体能够回应于甲萘醌上调细胞表面上的磷脂酰丝氨酸显示，指示非甲萘醌刺激的融合剂脂质体未经历凋亡。在一个实施例中，用甲萘醌刺激的阳性对照细胞展现比未用甲萘醌刺激的融合剂脂质体更高水平的膜联蛋白V染色。
表8：膜联蛋白V染色参数
实验组 膜联蛋白V信号的平均荧光强度(和标准差)
未染色的融合剂脂质体(阴性对照) 941(937)
染色的融合剂脂质体 11257(15826)
染色的融合剂脂质体+甲萘醌 18733(17146)
染色的巨噬细胞+甲萘醌(阳性对照) 14301(18142)
实例56：测量近分泌信号传导水平
这个实例描述融合剂脂质体中的近分泌信号传导的定量。
细胞可以通过近分泌信号传导形成细胞接触依赖性信号传导。在一个实施例中，融合剂脂质体中近分泌信号传导的存在将证明融合剂脂质体可以刺激、抑制与其紧邻的细胞并且与所述细胞通信。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种从具有部分或完全核灭活的哺乳动物骨髓基质细胞(BMSC)产生的融合剂脂质体通过巨噬细胞中的近分泌信号传导触发IL-6分泌。将初级巨噬细胞与BMSC共培养。首先将骨髓源性巨噬细胞接种到6孔盘中，并且培育24小时，随后将初级小鼠BMS源性融合剂脂质体或BMSC细胞(阳性对照亲本细胞)置于具有10％FBS的DMEM培养基中的巨噬细胞上。在不同时间点(2、4、6、24小时)收集上清液并通过ELISA分析来分析IL-6分泌。(Chang J.等人,2015)。
在一个实施例中，通过增加培养基中的巨噬细胞分泌的IL-6水平来测量由BMSC融合剂脂质体诱导的近分泌信号传导的水平。在一个实施例中，近分泌信号传导的水平将为由阳性对照骨髓基质细胞(BMSC)诱导的水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大。
实例57：测量旁分泌信号传导水平
这个实例描述融合剂脂质体中的旁分泌信号传导的定量。
细胞可以通过旁分泌信号传导与局部微环境中的其它细胞通信。在一个实施例中，融合剂脂质体将能够旁进行分泌信号传导，例如以与其局部环境中的细胞通信。在一个实施例中，融合剂脂质体通过以下方案通过旁分泌衍生的分泌在内皮细胞中触发Ca2+信号传导的能力将通过钙指示剂fluo-4AM来测量Ca2+信号传导。
为了制备实验培养盘，将鼠类肺微血管内皮细胞(MPMVEC)接种于0.2％明胶涂布的25mm玻璃底共聚焦培养皿上(80％汇合)。将MPMVEC在室温下在含有2％BSA和0.003％普朗尼克酸(pluronic acid)的ECM中培育30分钟，最终浓度为5μM fluo-4AM(英杰公司(Invitrogen))，以允许装载fluo-4AM。在装载之后，将MPMVEC用含有苯磺唑酮的成像溶液(含有0.25％BSA的ECM)洗涤，以使染料损失降到最低。在装载fluo-4之后，将500μl预温热的实验成像溶液添加到培养盘，并且通过Zeiss共聚焦成像系统对培养盘进行成像。
在单独的试管中，将新鲜分离的鼠类巨噬细胞在培养基(DMEM+10％FBS)中用1μg/ml LPS处理或不用LPS处理(阴性对照)。在刺激后，通过先前实例中所描述的方法中的任一种从巨噬细胞产生融合剂脂质体。
随后在含有2％BSA和0.003％普朗尼克酸的ECM中用cell tracker red CMTPX(英杰公司)标记融合剂脂质体或亲本巨噬细胞(阳性对照)。随后将融合剂脂质体和巨噬细胞洗涤并且再悬浮于实验成像溶液中。将标记的融合剂脂质体和巨噬细胞添加到共聚焦培养盘中的装有fluo-4AM的MPMVEC上。
使用具有氩离子激光源的Zeiss共聚焦成像系统每3秒记录一次绿色和红色荧光信号，持续10-20分钟，其中分别针对fluo-4AM和cell tracker red荧光在488nm和561nm处激发。使用成像软件分析Fluo-4荧光强度变化(Mallilankaraman,K.等人,《可视化实验杂志(J Vis Exp.)》(58):3511,2011)。从LPS刺激的融合剂脂质体和细胞组中减去阴性对照融合剂脂质体和细胞组中测量的Fluo-4强度水平。
在一个实施例中，相比于阳性对照细胞组，融合剂脂质体，例如活化的融合剂脂质体将诱导至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的Fluo-4荧光强度增加。
实例58：针对迁移率测量使肌动蛋白聚合的能力
这个实例描述融合剂脂质体中的细胞骨架组分(如肌动蛋白)的定量。在一个实施例中，融合剂脂质体包含如肌动蛋白的细胞骨架组分，并且能够进行肌动蛋白聚合。
细胞将肌动蛋白(其为细胞骨架组分)用于运动性和其它细胞质过程。细胞骨架对于产生运动驱动力和协调运动过程至关重要。
如本文所描述地使C2C12细胞去核。将从12.5％和15％Ficoll层获得的融合剂脂质体合并标记为‘轻’，而将来自16-17％层的融合剂脂质体合并并标记为‘中等’。将融合剂脂质体或细胞(亲本C2C12细胞，阳性对照)再悬浮于DMEM+Glutamax+10％胎牛血清(FBS)中，接种于24孔超低附着培养盘(#3473，纽约州康宁的康宁公司(Corning Inc,Corning,NY))中并且在37°℃+5％CO2下培育。定期(5.25小时、8.75小时、26.5小时)获取样品并且用165μM若丹明鬼笔环肽染色(阴性对照不染色)，并且在流式细胞仪(#A24858，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)上用FC激光YL1(561nm，具有585/16滤光片)测量以测量F-肌动蛋白细胞骨架含量。测量融合剂脂质体以及未染色的融合剂脂质体和染色的亲本C2C12细胞中若丹明鬼笔环肽的荧光强度。
融合剂脂质体荧光强度在所有时间点均大于阴性对照(图1)，并且融合剂脂质体能够以与亲本C2C12细胞类似的速率聚合肌动蛋白。
通过可商购的ELISA系统(Cell Signaling Technology and MyBioSource)，根据制造商的说明书测量其它细胞骨架组分，如下表中所列的那些。
表9：细胞骨架组分
Figure BDA0003155557330002751
随后将100μL适当稀释的溶解物从微孔条带添加到适当的孔中。将微孔用胶带密封并且在37℃下培育2小时。在培育之后，去除密封胶带并且丢弃内含物。每个微孔用200μL的1×洗涤缓冲液洗涤四次。在每次单独洗涤之后，将培养盘在吸水布上敲打，以便从每个孔中去除残留的洗涤溶液。但是，孔在实验期间的任何时候都不是完全干燥的。
随后，将100μl复原的检测抗体(绿色)添加到每个单独的孔中，阴性对照孔除外。随后将孔密封并且在37℃下培育1小时。在培育完成之后重复洗涤程序。将100μL复原的HRP连接的二级抗体(红色)添加到每个孔中。将孔用胶带密封并且在37℃下培育30分钟。随后去除密封胶带并且重复洗涤程序。随后将100μL TMB底物添加到每个孔中。将孔用胶带密封，随后在37℃下培育10分钟。一旦完成这个最终培育，将100μL终止溶液添加到每个孔中并且将培养盘轻轻振荡几秒。
在添加终止溶液的30分钟内进行所述分析的分光光度法分析。用无绒组织擦拭孔的底面并且随后在450nm处读取吸光度。在一个实施例中，已用检测抗体染色的融合剂脂质体样品将在450nm处吸收比阴性对照融合剂脂质体样品更多的光，并且比已用检测抗体染色的细胞样品吸收更少的光。
实例59：测量平均膜电位
这个实例描述融合剂脂质体的线粒体膜电位的定量。在一个实施例中，包含线粒体膜的融合剂脂质体将维持线粒体膜电位。
线粒体代谢活性可以通过线粒体膜电位来测量。使用可商购的染料TMRE定量融合剂脂质体制剂的膜电位，以评估线粒体膜电位(TMRE：四甲基若丹明，乙酯，高氯酸盐，Abcam，目录号T669)。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。在生长培养基(具有10％胎牛血清的无酚红DMEM)中以6等份(未处理和FCCP处理的一式三份)稀释融合剂脂质体或亲本细胞。将样品的一个等分试样与FCCP一起培育，所述FCCP是消除线粒体膜电位并且防止TMRE染色的解偶联剂。对于经FCCP处理的样品，将2μM FCCP添加到样品并且在分析之前培育5分钟。随后用30nM TMRE对融合剂脂质体和亲本细胞进行染色。对于每个样品，还并行地制备未染色的(无TMRE)样品。将样品在37℃下培育30分钟。随后将样品在具有488nm氩激光的流式细胞仪上分析，并且在530+/-30nm处收集激发和发射。
基于TMRE的强度计算膜电位值(以毫伏，mV为单位)。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(替代地，可以应用门来排除小碎屑)。通过从未经处理和经FCCP处理的样品的几何平均值减去未染色的样品的荧光强度的几何平均值来将未经处理和经FCCP处理的样品的荧光强度(FI)值标准化。使用标准化荧光强度值用修正的能斯特方程式(Nernstequation)(参见下文)来计算每种制剂的膜电位状态，所述方程式可以用于基于TMRE荧光来确定融合剂脂质体或细胞的线粒体膜电位(因为TMRE以能斯特方式在线粒体中积聚)。
用下式计算融合剂脂质体或细胞膜电位：(mV)＝-61.5*log(FI未处理-标准化/FIFCCP处理-标准化)。在一个实施例中，对来自C2C12小鼠成肌细胞的融合剂脂质体制剂使用这个分析，融合剂脂质体制剂的膜电位状态将在亲本细胞的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内。在一个实施例中，膜电位的范围为约-20mV到-150mV。
实例60：测量受试者中的持久性半衰期
这个实例描述融合剂脂质体半衰期的测量。
融合剂脂质体来源于表达Gaussia荧光素酶的细胞，通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生，并且在缓冲溶液中制备纯、1:2、1:5和1:10稀释液。将缺少融合剂脂质体的缓冲溶液用作阴性对照。
将每个剂量静脉内施用至三只八周龄雄性C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室)。在静脉内施用融合剂脂质体后1、2、3、4、5、6、12、24、48和72小时从眼眶后静脉收集血液。在实验结束时通过CO2吸入将动物处死。
将血液在室温下离心20分钟。立即将血清样品冷冻于-80℃下直到生物分析。随后，在将样品与Gaussia荧光素酶底物(Nanolight，亚利桑那州派恩托普(Pinetop,AZ))混合后，将每个血液样品用于进行Gaussia荧光素酶活性分析。简单来说，将考伦特嗪，一种荧光素或发光分子与快速分析缓冲液混合并且将混合物吸移到含有血液样品的96孔盘的孔中。缺少血液的阴性对照孔含有分析缓冲液以确定背景Gaussia荧光素酶信号。
另外，制备阳性对照纯化的Gaussia荧光素酶(Athena Enzyme Systems,目录号0308)的标准曲线以便将每小时发光信号转化为Gaussia荧光素酶分泌的分子。使用500毫秒积分来分析培养盘的发光。从所有样品减去背景Gaussia荧光素酶信号并且随后计算Gaussia荧光素酶标准曲线的线性最佳拟合曲线。如果样品读数在标准曲线内不拟合，那么将其适当稀释并再分析。将来自1、2、3、4、5、6、12、24、48和72小时处获取的样品的荧光素酶信号内插到标准曲线。使用一室模型的以下方程式计算消除速率常数ke(h-1)：C(t)＝C0 xe-kext，其中C(t)(ng/mL)为时间t(h)处的融合剂脂质体浓度并且C0为在时间＝0时的融合剂脂质体浓度(ng/mL)。将消除半衰期t1/2,e(h)计算为ln(2)/ke。
在一个实施例中，相比于阴性对照细胞，融合剂脂质体将具有至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的半衰期。
实例61：通过非内吞途径递送融合剂脂质体
这个实例描述通过非内吞途径将融合剂脂质体递送Cre到接受者细胞的定量。
在一个实施例中，融合剂脂质体将通过融合剂脂质体介导的非内吞途径递送药剂。不希望受理论束缚，在不需要任何内吞作用介导的融合剂脂质体摄取的情况下将融合剂脂质体的内腔中携带的药剂(例如Cre)直接递送到接受者细胞的胞质溶胶将通过融合剂脂质体介导的非内吞途径递送来发生。
在这个实例中，融合剂脂质体在其质膜上包含表达仙台病毒H和F蛋白的HEK293T细胞(Tanaka等人,2015,《基因疗法》,22(2014年10月),1-8.https://doi.org/10.1038/gt.2014.123)。另外，融合剂脂质体表达mTagBFP2荧光蛋白和Cre重组酶。靶细胞为RPMI8226细胞，其在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，所述启动子在通过Cre重组后从GFP转换为RFP表达，指示融合和Cre作为递送标记。
如下地对通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体分析通过非内吞途径的Cre递送。将接受者细胞接种到黑色的透明底96孔盘中。随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达Cre重组酶蛋白并且具有特定融合剂蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的接受者细胞。为了确定通过非内吞途径的Cre递送水平，用内体酸化抑制剂氯奎(30μg/mL)处理接受融合剂脂质体的接受者细胞的平行组。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施用融合剂脂质体之后，将细胞盘以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。随后将细胞培育16小时并且通过成像评估药剂递送Cre。
对细胞进行成像以在视场或孔中阳性鉴别RFP阳性细胞相对于GFP阳性细胞。在这个实例中，使用自动化荧光显微镜对细胞培养盘进行成像。通过首先在DMEM培养基中用Hoechst33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。在染色之后，将Hoechst培养基用常规DMEM培养基替换。
使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来采集不同细胞组的图像。
设定采集设置，以使得RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。随后使用确立的设置对所关注的孔成像。
用配备有荧光显微镜的软件或其它软件(Rasband,W.S.,ImageJ,美国国家卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达1997-2007)进行GFP和RFP阳性孔的分析。使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。在Hoechst阳性细胞上设置总细胞掩码。Hoechst强度显著高于背景强度的细胞用于设置阈值，并且排除太小或太大而无法成为Hoechst阳性细胞的区域。
在总细胞掩码内，通过对显著高于背景的细胞再次设置阈值并且将Hoechst(细胞核)掩码扩展到整个细胞区域以包括整个GFP和RFP细胞荧光来鉴别GFP和RFP阳性细胞。
在含有接受者细胞的对照孔中鉴别的RFP阳性细胞的数目用于从含有融合剂脂质体的孔中的RFP阳性细胞的数目减去(以减去非特异性Loxp重组)。随后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(未接受Cre的接受者细胞)与RFP阳性细胞的总和，以定量递送到接受者细胞群的融合剂脂质体Cre的比例。将水平标准化为施加到接受者细胞的融合剂脂质体的给定剂量。为了计算通过非内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+CQ)以及在不存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-CQ)。为了确定通过非内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的标准化值，使用以下方程式：[(FusL-CQ)-(FusL+CQ)]/(FusL-CQ)。
在一个实施例中，对于给定融合剂脂质体，通过非内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的平均水平将在经氯奎处理的接受者细胞的0.1-0.95范围内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
实例62：通过内吞途径递送融合剂脂质体
这个实例描述通过内吞途径融合剂脂质体递送Cre到接受者细胞。
在一个实施例中，融合剂脂质体将通过融合剂脂质体介导的内吞途径递送药剂。不希望受理论束缚，在摄取途径具有内吞作用依赖性的情况下将融合剂脂质体的内腔中携带的药剂(例如货物)递送到接受者细胞将通过融合剂脂质体介导的内吞途径递送来发生。
在这个实例中，融合剂脂质体包含微囊泡，所述微囊泡通过将在质膜上表达融合剂蛋白的HEK293T细胞挤出通过2μm过滤器而产生(Lin等人,2016,《生物医学微装置(Biomedical Microdevices)》18(3).doi.org/10.1007/s10544-016-0066-y)(Riedel,Kondor-Koch和Garoff,1984,《欧洲分子生物学学会杂志(The EMBO Journal)》,3(7),1477-83.从www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6086326检索)。另外，融合剂脂质体表达mTagBFP2荧光蛋白和Cre重组酶。靶细胞为PC3细胞，其在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，所述启动子在通过Cre重组后从GFP转换为RFP表达，指示融合和Cre作为递送标记。
如下地对通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体分析通过内吞途径的Cre递送。将接受者细胞接种于与待使用的成像系统相容的细胞培养多孔盘中(在这个实例中，将细胞接种于黑色的透明底96孔盘中)。随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达Cre重组酶蛋白并且具有特定融合剂蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的接受者细胞。为了确定通过内吞途径的Cre递送水平，用内体酸化抑制剂氯奎(30μg/mL)处理接受融合剂脂质体的接受者细胞的平行组。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施用融合剂脂质体之后，将细胞盘以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。随后将细胞培育16小时并且通过成像评估药剂递送Cre。
对细胞进行成像以在视场或孔中阳性鉴别RFP阳性细胞相对于GFP阳性细胞。在这个实例中，使用自动化荧光显微镜对细胞培养盘进行成像。通过首先在DMEM培养基中用Hoechst33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。在染色之后，将Hoechst培养基用常规DMEM培养基替换。
使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来采集不同细胞组的图像。
设定采集设置，以使得RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。随后使用确立的设置对所关注的孔成像。
用配备有荧光显微镜的软件或其它软件(Rasband,W.S.,ImageJ,美国国家卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达，1997-2007)进行GFP和RFP阳性孔的分析。使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。在Hoechst阳性细胞上设置总细胞掩码。Hoechst强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为Hoechst阳性细胞的区域。
在总细胞掩码内，通过对显著高于背景的细胞再次取阈值并且将Hoechst(细胞核)掩码扩展到整个细胞区域以包括整个GFP和RFP细胞荧光来鉴别GFP和RFP阳性细胞。
在含有接受者细胞的对照孔中鉴别的RFP阳性细胞的数目用于从含有融合剂脂质体的孔中的RFP阳性细胞的数目减去(以减去非特异性Loxp重组)。随后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(未接受Cre的接受者细胞)与RFP阳性细胞的总和，以定量递送到接受者细胞群的融合剂脂质体Cre的比例。将水平标准化为施加到接受者细胞的融合剂脂质体的给定剂量。为了计算通过内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+CQ)以及在不存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-CQ)。为了确定通过内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的标准化值，使用以下方程式：(FusL+CQ)/(FusL-CQ)。
在一个实施例中，对于给定融合剂脂质体，通过内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的平均水平将在经氯奎处理的接受者细胞的0.01-0.6范围内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
实例63：通过发动蛋白介导的途径、巨胞饮途径或肌动蛋白介导的途径递送融合 剂脂质体
这个实例描述通过发动蛋白介导的途径融合剂脂质体递送Cre到接受者细胞。可以如先前实例中所描述地产生包含微囊泡的融合剂脂质体。根据先前实例对融合剂脂质体分析通过发动蛋白介导的途径递送Cre，除了一组接受融合剂脂质体的接受者细胞用发动蛋白抑制剂Dynasore(120μM)处理。为了计算通过发动蛋白介导的途径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在Dynasore的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+DS)以及在不存在Dynasore的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-DS)。可以如先前实例中所描述地计算所递送的融合剂脂质体Cre的标准化值。
这个实例还描述通过巨胞饮将Cre递送到接受者细胞。可以如先前实例中所描述地产生包括微囊泡的融合剂脂质体。根据先前实例对融合剂脂质体分析通过巨胞饮递送Cre，除了一组接受融合剂脂质体的接受者细胞用巨胞饮抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)(25μM)处理。为了计算通过巨胞饮递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在EIPA的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+EPIA)以及在不存在EPIA的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-EIPA)。可以如先前实例中所描述地计算所递送的融合剂脂质体Cre的标准化值。
这个实例描述通过肌动蛋白介导的途径融合剂脂质体递送Cre到接受者细胞。可以如先前实例中所描述地产生包含微囊泡的融合剂脂质体。根据先前实例对融合剂脂质体分析通过巨胞饮递送Cre，除了一组接受融合剂脂质体的接受者细胞用肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin B(6μM)处理。为了计算通过肌动蛋白介导的途径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在Latrunculin B的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+LatB)以及在不存在Latrunculin B的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-LatB)。可以如先前实例中所描述地计算所递送的融合剂脂质体Cre的标准化值。
实例64：蛋白质的体内递送
这个实例描述通过融合剂脂质体将治疗剂递送的眼部。
融合剂脂质体使用先前实例中所描述的方法中的任一种来源于造血干细胞和祖细胞并且装载有缺乏小鼠基因敲除的蛋白质。
将融合剂脂质体视网膜下注射到缺乏蛋白质的小鼠右眼中，并且将媒剂对照注射到小鼠左眼中。当小鼠达到2个月大时，对其中的子组进行安乐死。
对收集的视网膜组织进行组织学和H&E染色，以计数小鼠的每个视网膜中拯救的细胞的数目(描述于Sanges等人,《临床调查杂志(The Journal of ClinicalInvestigation)》,126(8):3104-3116,2016中)。
通过用对PDE6B蛋白具有特异性的抗体进行蛋白质印迹，在从2个月大时安乐死的小鼠收集的视网膜中测量所注射的蛋白质的水平。
在一个实施例中，相比于用媒剂处理的小鼠右眼，施用融合剂脂质体的小鼠左眼将具有存在于视网膜的外核层中的增加数目的细胞核。增加的蛋白质暗示突变的PBE6B蛋白质的互补。
实例65：评估施用融合剂脂质体后的畸胎瘤形成
这个实例描述不存在通过融合剂脂质体形成畸胎瘤。在一个实施例中，融合剂脂质体在向个体施用时将不会导致畸胎瘤形成。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。将融合剂脂质体、肿瘤细胞(阳性对照)或媒剂(阴性对照)在PBS中皮下注射到小鼠(12-20周龄)的左侧腹中。在融合剂脂质体、肿瘤细胞或媒剂注射后的八周，通过用测径规测量法测定肿瘤体积而每周分析畸胎瘤(例如肿瘤)生长2-3次。
在一个实施例中，通过测径规测量法，施用融合剂脂质体或媒剂的小鼠将不具有可测量的肿瘤形成，例如畸胎瘤。在一个实施例中，用肿瘤细胞处理的阳性对照动物将展示可观的肿瘤(例如畸胎瘤)大小，如通过卡尺在八周的观察中所测量。
实例66：测量融合剂脂质体和源细胞中的总RNA
这个实例描述定量融合剂脂质体相对于源细胞中的RNA的量的方法。在一个实施例中，融合剂脂质体将具有与源细胞类似的RNA水平。在这个分析中，通过测量总RNA来确定RNA水平。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。如根据融合剂脂质体和源细胞的蛋白质所测量的相同质量的制剂用于分离总RNA(例如使用试剂盒，如Qiagen RNeasy目录号74104)，接着使用标准光谱法测定RNA浓度，以评估RNA的吸光度(例如使用赛默科技NanoDrop)。
在一个实施例中，以蛋白质的质量计，融合剂脂质体中的RNA的浓度将为源细胞的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。
实例67：分离从细胞自由释放的融合微囊泡
这个实例描述分离从细胞自由释放的融合微囊泡。如下地分离融合微囊泡。将9.2×106个HEK-293T(ATCC，目录号CRL-3216)在100mm胶原蛋白涂布的培养皿(康宁)中使用Xfect转染试剂(Takara，目录号631317)反向转染，所述转染试剂在7.5mL完全培养基(补充有GlutaMAX(赛默飞世尔)、10％胎牛血清(赛默飞世尔)和青霉素/链霉素抗生素(赛默飞世尔)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM))中具有10μg含有用于VSVg的开放阅读框的pcDNA3.1表达质粒和15μg含有用于具有SV40核定位序列的噬菌体P1 Cre重组酶的开放阅读框的pcDNA3.1表达质粒。在接种后十二小时，小心地添加另外7.5mL完全培养基。通过以200×g离心10分钟而使细胞与培养基分离。收集上清液并且依序以500×g离心10分钟两次、以2,000×g离心15分钟一次、以10,000×g离心30分钟一次以及以70,000×g离心60分钟一次。在最终离心步骤期间将自由释放的融合剂脂质体粒化、再悬浮于PBS中并且以70,000×g再粒化。将最终集结粒再悬浮于PBS中。
另外参见Wubbolts R等人人类B细胞源性外泌体的蛋白质组学和生化分析：对其功能和多囊体形成的潜在影响(Proteomic and Biochemical Analyses of Human BCell-derived Exosomes:Potential Implications for their Function andMultivesicular Body Formation.)《生物化学杂志》278:10963-10972 2003。
实例68：测量融合剂脂质体的平均大小分布
这个实例描述融合剂脂质体大小分布的测量。
如本文所描述地通过用VSV-G瞬时转染HEK293T、去核并用Ficoll后续分级分离来制备融合剂脂质体。使用实例27的方法测量融合剂脂质体以确定大小分布，如图3中所示。预期融合剂脂质体在90％的样品内可以具有亲本细胞的大小分布变化率的小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％或更小。预期在90％的样品内，融合剂脂质体的大小分布变化率可以比亲本细胞小58％。
实例69：融合剂脂质体的平均体积
这个实例描述测量融合剂脂质体的平均体积。改变融合剂脂质体的大小(例如体积)可以使其对于不同的货物装载、治疗设计或应用为通用的。
如本文所描述地通过用VSV-G瞬时转染HEK293T、去核并用Ficoll后续分级分离来制备融合剂脂质体。阳性对照为HEK293T细胞。
如实例27中所描述，通过NTA和共聚焦显微镜的组合的分析用于确定融合剂脂质体的大小。测量融合剂脂质体的直径并计算体积，如图4中所示。预期融合剂脂质体的平均大小可以大于50nm直径。预期融合剂脂质体的平均大小可以为129nm直径。
实例70：比较可溶性与不溶性蛋白质质量
这个实例描述定量融合剂脂质体中的可溶性:不溶性蛋白质质量比率。融合剂脂质体中的可溶性:不溶性蛋白质质量比可以在一些情况下与有核细胞类似。
如本文所描述地通过用VSV-G瞬时转染HEK293T、去核并用Ficoll后续分级分离来制备融合剂脂质体。使用标准二喹啉甲酸分析(BCA)(PierceTM BCA蛋白质分析试剂盒，赛默飞世尔产品编号23225)测试融合剂脂质体制剂以确定可溶性:不溶性蛋白质比。通过将制备的融合剂脂质体或亲本细胞以1×107个细胞或约1mg/mL总融合剂脂质体的浓度悬浮于PBS中并且以1,500×g离心以将细胞制成集结粒，或以16,000×g离心以将融合剂脂质体制成集结粒来制备可溶性蛋白质样品。以可溶蛋白质洗脱份形式收集上清液。
随后将融合剂脂质体或细胞再悬浮于PBS中。这种悬浮液代表不溶性蛋白质洗脱份。
使用供应的BSA产生标准曲线，每孔0到15μg BSA(一式两份)。融合剂脂质体或细胞制剂被稀释，使得所测量的量在标准范围内。一式两份地分析融合剂脂质体制剂并使用平均值。将可溶性蛋白质浓度除以不溶性蛋白质浓度以得到可溶性:不溶性蛋白质比率(图5)。
实例71：测量与靶细胞的融合
产生衍生自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达经工程改造的麻疹病毒的红血球凝集素糖蛋白(MvH)和融合蛋白(F)并且含有Cre重组酶蛋白，如本文所描述。MvH经工程改造以消除其天然受体结合，并且通过识别细胞表面抗原的单链抗体(scFv)提供靶细胞特异性，在这种情况下，scFv被设计成靶向CD8，一种用于T细胞受体的共受体。使用对照融合剂脂质体，其衍生自在表面上表达融合剂VSV-G并且含有Cre重组酶蛋白的HEK-293T细胞。靶细胞为HEK-293T细胞，其经工程改造以在CMV启动子下表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒，并且经工程改造以过度表现共受体CD8a和CD8b。非靶细胞为相同的HEK-293T细胞，其表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒但没有CD8a/b过度表达。将靶接受者细胞或非靶接受者细胞以30,000个细胞/孔接种于黑色的透明底96孔盘中，并且在37℃和5％CO2下在具有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。在接种接受者细胞之后四到六小时，将表达Cre重组酶蛋白和MvH+F的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的靶接受者细胞或非靶接受者细胞。将接受者细胞用10μg融合剂脂质体处理并且在37℃和5％CO2下培育24小时。
使用自动显微镜(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/)对细胞培养盘进行成像。通过在DMEM培养基中用Hoechst 33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群。Hoechst33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来获得靶细胞和非靶细胞孔的图像。
设定采集设置，以使得Hoescht、RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。随后使用确立的设置对所关注的孔成像。通过自动聚焦在Hoescht通道上并且随后使用GFP和RFP通道的已确立的焦平面将焦点设置在每个孔上。用配备有自动荧光显微镜的Gen5软件进行GFP和RFP阳性细胞的分析(https://www.biotek.com/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/)。
使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。GFP强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为GFP阳性细胞的区域。将相同分析步骤应用于RFP通道。随后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(不展示递送的接受者细胞)和RFP阳性细胞的总和以定量RFP转化百分比，其描述靶接受者细胞群和非靶接受者细胞群内的融合剂脂质体融合的量。对于靶向融合(融合剂脂质体与靶向接受者细胞的融合)的量，将RFP转化百分比值标准化为作为靶接受者细胞(即，表达CD8)的接受者细胞的百分比，其通过用结合到藻红蛋白(PE)的抗CD8抗体染色而评估并且通过流式细胞测量术进行分析。最后，通过从靶细胞融合量减去非靶细胞融合量来确定靶向融合的绝对量(任何<0的值均被视为0)。
通过这个分析，当接受者细胞为表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒的靶HEK-293T细胞时，衍生自在表面上表达经工程改造的MvH(CD8)+F并且含有Cre重组酶蛋白的HEK-293T细胞的融合剂脂质体展示25.2+/-6.4％的RFP转化百分比，并且观察到这些接受者细胞中的51.1％为CD8阳性的。根据这些结果，针对靶向融合的标准化RFP转化百分比或靶向融合的量被确定为49.3+/-12.7％。当接受者是表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”但不表达CD8的非靶HEK-293T细胞时，相同融合剂脂质体展示0.5+/-0.1％的RFP转化百分比。基于以上，MvH(CD8)+F融合剂脂质体的靶向融合的绝对量被确定为48.8％并且对照VSV-G融合剂脂质体的靶向融合的绝对量被确定为0％(图6)。
实例72：测量跨细胞膜转运葡萄糖的能力
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)并且表达Cre重组酶蛋白，以获得如本文所描述的小颗粒融合剂脂质体。为了测量融合剂脂质体跨细胞膜转运葡萄糖的能力，对可以用于监测活细胞中的葡萄糖摄取的2-NBDG(2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)荧光葡萄糖类似物的水平定量，以评估跨脂质双层的主动转运。来自Biovision公司的可商购的试剂盒(目录号K682)用于根据制造商的说明书进行分析。
简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白质含量。随后，通过在台式离心机中以3000g离心5分钟将40μg融合剂脂质体总蛋白质粒化，接着再悬浮于400μL补充有0.5％胎牛血清的DMEM中。这对于每个样品一式两份地进行，并且将复制品中的一个用4μL根皮素(配备有试剂盒)，一种抑制葡萄糖摄取的天然酚处理，作为葡萄糖摄取抑制的对照。随后将样品在室温下培育1小时。在培育之后，将融合剂脂质体样品粒化并且再悬浮于400μL先前制备的葡萄糖摄取混合液中(关于配方，参见下表10)。将用根皮素预处理的样品再悬浮于具有根皮素的葡萄糖摄取混合液中；将未预处理的样品再悬浮于具有20μL PBS而非根皮素的葡萄糖摄取混合液中。另外，将一个平行组的融合剂脂质体样品再悬浮于仅具有0.5％FBS的DMEM培养基中，作为流式细胞测量术分析的阴性对照。
表10：葡萄糖摄取混合液配方
试剂 体积(μL)
具有0.5％FBS的DMEM培养基 1880
2-NBDG试剂 20
葡萄糖摄取增强剂 100
任选的：根皮素 20
随后将样品在37℃与5％CO2下培育30分钟。在培育至后，将细胞粒化，用1mL的1×分析缓冲液(配备有试剂盒)洗涤一次，再次粒化，并且再悬浮于400μL的1×分析缓冲液中。
随后通过流式细胞测量术分析使用Invitrogen Attune NxT声聚焦细胞仪测量样品的2-NBDG摄取。2-NBDG用488nm激光激发，并且在513±26nm处捕获发射。正向和侧向散射门控最初用于捕获融合剂脂质体尺寸化事件和丢弃小碎屑。对2-NBDG呈阳性的事件是通过门控于最低水平确定的，对于所述最低水平，2-NBDG阴性对照样品展示对2-NBDG染色呈阳性的事件的<0.5％。随后评估对2-NBDG荧光呈阳性的门控细胞的2-NBDG的平均荧光强度(F.I.)，以计算经过和未经过根皮素处理的融合剂脂质体的葡萄糖摄取值。
通过这个分析，衍生自表达VSV-G和Cre的HEK-293T细胞的融合剂脂质体在未经根皮素处理的情况下展示631.0+/-1.4的2-NBDG平均F.I.，并且在经根皮素处理的情况下展示565.5+/-4.9的平均F.I.(图7)。
实例73：测量胞质溶胶中的酯酶活性
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自C2C12细胞的融合剂脂质体，以获得如本文所描述的小颗粒融合剂脂质体。为了测量融合剂脂质体的胞质溶胶中的酯酶活性，将样品用钙黄绿素AM(BD Pharmigen,目录号564061)染色，钙黄绿素AM是一种荧光素衍生物和非荧光的活体染料，其被动地穿过活细胞的细胞膜并且被胞质酯酶转化为绿色荧光钙黄绿素，所述绿色荧光钙黄绿素被具有完整膜和失活多药耐药蛋白的细胞保留。
简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。随后，通过在台式离心机中以3000g离心5分钟将20μg融合剂脂质体总蛋白粒化，接着再悬浮于400μL补充有0.5％胎牛血清的DMEM中。膜渗透性染料钙黄绿素-AM制备为10mM的二甲亚砜储备溶液和1mM的PBS缓冲液，pH 7.4的工作溶液。将VSV-G融合剂脂质体用DMEM培养基中稀释的1μM钙黄绿素-AM溶液染色。将样品在37℃下在黑暗中培育30分钟，并且随后通过离心粒化。在用PBS缓冲液洗涤两次至后，将融合剂脂质体再悬浮于PBS中并且通过流式细胞测量术分析。
使用Invitrogen Attune NxT声聚焦细胞仪测量样品的钙黄绿素荧光保留。钙黄绿素AM用488nm激光激发，并且在513±26nm处捕获发射。正向和侧向散射门控最初用于捕获融合剂脂质体尺寸化事件和丢弃小碎屑。对钙黄绿素呈阳性的事件是通过门控于最低水平确定的，对于所述最低水平，钙黄绿素阴性对照样品展示对钙黄绿素染色呈阳性的事件的<0.5％。随后评估对钙黄绿素荧光呈阳性的门控细胞的钙黄绿素的平均荧光强度(F.I.)，以计算融合剂脂质体的胞质溶胶中的酯酶活性的值。
通过这个分析，衍生自C2C12细胞的融合剂脂质体展示631.0+/-1.4的酯酶活性(平均钙黄绿素F.I.)(图8)。
实例74：测量融合剂脂质体中的乙酰胆碱酯酶活性
如本文所描述地产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达胎盘细胞-细胞融合蛋白合胞素-1(Syn1)并且表达Cre重组酶蛋白。使用FluoroCet定量试剂盒(System Biosciences,目录号FCET96A-1)按照制造商的建议测量乙酰胆碱酯酶活性。
简单来说，通过以120,000g超速离心90分钟将融合剂脂质体粒化并且小心地再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。随后，通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书定量融合剂脂质体的总蛋白含量。在对蛋白质浓度进行BCA定量之后，将1000ng总融合剂脂质体蛋白用PBS稀释到60μL的体积，接着添加60μL溶解缓冲液以溶解颗粒。在冰上培育30分钟之后，样品准备好在FluoroCet分析中运行。
在96孔盘的重复孔中，将50μL溶解的融合剂脂质体样品与50μL缓冲液A的工作储备液和50μL缓冲液B的工作储备液混合。并行地，通过在126μL的1×反应缓冲液中吸移2μL所提供的标准品来拟制标准曲线。随后将这个标准溶液连续稀释5×，以制成由2.0E+08、1.0E+08、5.0E+07、2.5E+07、1.25E+07和6.25E+06外泌体当量的乙酰胆碱酯酶活性组成的六点标准曲线。随后将50μL的每种标准液与50μL缓冲液A的工作储备液和50μL缓冲液B的工作储备液在96孔盘的重复孔中混合。将50μL的1×反应缓冲液用作空白。通过轻敲侧面将培养盘混合，接着在室温下在黑暗中培育20分钟。随后立即使用设置于激发：530-570nm和发射：590-600nm的荧光板读取器测量培养盘。在读取前将培养盘振荡30秒。
随后在从空白孔中减去RFU值后，相对于已知外泌体当量的乙酰胆碱酯酶活性标绘相对荧光单位(RFU)。随后计算线性回归线并且方程式用于根据测得的RFU值来确定融合剂脂质体样品的乙酰胆碱酯酶活性(以外泌体当量计)。表11中示出了针对Syn1融合剂脂质体的测得的乙酰胆碱酯酶活性：
表11：融合剂脂质体和对照颗粒中的乙酰胆碱酯酶活性
样品 乙酰胆碱酯酶活性(外泌体当量)
Syn1融合剂脂质体 6.83E+05+/-2.21E+05
实例75：测量代谢活性水平
如本文所描述地产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)并且表达Cre重组酶蛋白。为了确定融合剂脂质体制剂的代谢活性水平，使用提供所有所需试剂的可商购自西格玛(目录号CS0720)的试剂盒来评估柠檬酸合成酶活性。柠檬酸合成酶为三羧酸(TCA)循环内的一种酶，其催化草酰乙酸(OAA)与乙酰基-CoA之间的反应以产生柠檬酸盐。在乙酰基-CoA水解后，会释放具有硫醇基的CoA(CoA-SH)。硫醇基与化学试剂5,5-二硫基双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应，以形成5-硫基-2-硝基苯甲酸(TNB)，其具有可以分光光度法在412nm处测量的黄色产物。
根据制造商的建议进行分析。简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。随后，在台式离心机中通过以3000g离心5分钟使400μg融合剂脂质体总蛋白质粒化。通过再次粒化并且再悬浮于冰冷的PBS中，将融合剂脂质体洗涤一次。将融合剂脂质体再次粒化并且去除上清液。将集结粒溶解于具有1×蛋白酶抑制剂的100μL CellLytic M缓冲液中。在通过移液混合之后，将溶解的样品在室温下培育15分钟以完成溶解。随后将样品以12,000g离心10分钟并且将上清液转移到新微量离心管中并存储于-80℃下直到进行后续分析。
为了引发柠檬酸合成酶活性分析，将所有分析溶液在使用之前升温到室温。根据下表12将溶解的融合剂脂质体样品与分析溶液混合：
表12：96孔板中的柠檬酸合成酶活性测量的反应方案
Figure BDA0003155557330002891
表12中的体积代表96孔板的单个孔的体积。一式两份地测量样品。将反应的所有组分混合并且吸移到96孔盘的单个孔中。随后在微盘读取器上分析412nm处的吸光度1.5分钟，以测量基线反应。随后，将10μL的10mM OAA溶液添加到每个孔以引发反应。将培养盘在微盘读取器中振荡10秒，随后读取412nm处的吸光度1.5分钟，每10秒测量一次。
为了计算柠檬酸合成酶活性，对每个反应标绘相对于时间的412nm处的吸光度。对于添加OAA之前(内源活性)和之后(总活性)的图的线性范围计算每分钟的吸光度变化。随后通过从样品的总活性减去内源活性来计算柠檬酸合成酶的净活性。随后基于由制造商提供的方程式和常数值，将这个值用于计算柠檬酸合成酶活性。VSV-G融合剂脂质体的所测量的柠檬酸合成酶活性为1.57E-02+/-1.86E-03μmol/μg融合剂脂质体/min。
实例76：测量呼吸水平
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)，以获得如本文所描述的小颗粒融合剂脂质体。通过用Seahorse细胞外通量分析仪(安捷伦)测量线粒体耗氧速率来确定融合剂脂质体制剂中的呼吸水平。
简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白质含量。随后通过在台式离心机中以3000g离心5分钟将20μg融合剂脂质体总蛋白粒化，接着再悬浮(一式四份)于150μL补充有25mM葡萄糖和2mM谷氨酰氨(pH 7.4)的XF分析培养基(安捷伦目录号103575-100)中。随后将再悬浮的样品添加到96孔Seahorse培养盘(安捷伦)的一个孔中。
通过将具有样品的96孔Seahorse培养盘在37℃下培育60分钟以使温度和pH达到平衡来引发耗氧量分析。随后在XF96细胞外通量分析仪(安捷伦)中分析微盘，以测量紧贴在融合剂脂质体周围的培养基中的氧和pH的细胞外通量变化。在获得稳态耗氧量和细胞外酸化率之后，将抑制ATP合成酶的寡霉素(5μM)和解偶联线粒体的质子离子载体FCCP(羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙；2μM)通过试剂递送室依次注入微盘的每个孔，以获得最大耗氧率的值。最后，注入5μM抗霉素A(线粒体复合物III的抑制剂)以确认呼吸变化主要是由于线粒体呼吸。从其它三个呼吸率减去抗霉素A呼吸率，以确定基础、解偶联(寡霉素抗性)和最大(FCCP诱导的)线粒体呼吸率。
使用这个分析，根据下表13确定了供体VSV-G融合剂脂质体所展示的基础、解偶联和最大耗氧(呼吸)率。
表13：VSV-G融合剂脂质体的呼吸率
Figure BDA0003155557330002901
实例77：测量融合剂脂质体的磷脂酰丝氨酸水平
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)并且表达Cre重组酶蛋白，以获得如本文所描述的小颗粒融合剂脂质体。为了测量融合剂脂质体的磷脂酰丝氨酸水平，使用与Alexa Fluor 647染料(目录号A23204)结合的可商购的膜联蛋白V根据制造商的说明书进行膜联蛋白V染色。膜联蛋白V是一种细胞蛋白，其可在暴露于质膜的外叶上时结合磷脂酰丝氨酸；因此，读取与样品结合的膜联蛋白V可以提供样品中的磷脂酰丝氨酸水平的评估。
简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。随后，通过在台式离心机中以3000g离心(样品一式三份)5分钟使40μg融合剂脂质体总蛋白质粒化，接着再悬浮于400μL补充有2％胎牛血清的DMEM中。用40μM抗霉素A处理一个样品。随后将样品在37℃下培育1小时。在培育之后，随后再次通过离心使样品粒化并且再悬浮于100μL膜联蛋白结合缓冲液(ABB；10mMHEPES、140mM NaCl、2.5mM CaCl2，pH 7.4)中。随后，将5μL与Alexa Fluor 647结合的膜联蛋白V添加到每个样品(除了未进行膜联蛋白V染色的阴性对照)。将样品在室温下培育15分钟，接着添加400μL ABB。
随后通过流式细胞测量术分析使用Invitrogen Attune NxT声聚焦细胞仪测量样品的膜联蛋白V染色。与Alexa Fluor 647结合的膜联蛋白V用638nm激光激发，并且在670±14nm处捕获发射。正向和侧向散射门控最初用于捕获融合剂脂质体尺寸化事件和丢弃小碎屑。对Alexa Fluor 647(膜联蛋白V)染色呈阳性的事件是通过门控于最低水平确定的，对于所述最低水平，未染色的膜联蛋白V阴性对照样品展示<0.5％的对Alexa Fluor 647染色呈阳性的事件。随后关于总亲本群体的膜联蛋白V阳性事件的百分比(正向/侧向散射门中的融合剂脂质体尺寸化事件)评估对Alexa Fluor 647染色呈阳性的门控事件，并且将这个值用作融合剂脂质体样品中的磷脂酰丝氨酸水平的定量。
通过这个分析，衍生自表达VSV-G和Cre的HEK-293T细胞的融合剂脂质体在未用抗霉素A处理的情况下展示63.3±2.3％的膜联蛋白V阳性融合剂脂质体百分比并且在用抗霉素A处理的情况下展示67.6±5.7％的膜联蛋白V阳性融合剂脂质体百分比。
实例78：测量平均线粒体膜电位
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)并且表达Cre重组酶蛋白，以获得如本文所描述的小颗粒融合剂脂质体。为了测量融合剂脂质体的平均线粒体膜电位水平，将线粒体膜电位敏感的可商购的染料四甲基若丹明，乙酯，高氯酸盐(TMRE；Abcam，目录号T669)用于评估线粒体膜电位。为了将TMRE荧光强度(FI)相对于样品中的线粒体的量标准化，将MitoTracker GreenFM染料(MTG；赛默飞世尔，目录号M7514)用于共染色样品，以将TMRE FI相对于MTG FI标准化并且因此相对于样品中的线粒体的量标准化。另外，羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP；西格玛目录号C2920)用于处理一个平行组的样品，以使线粒体膜电位完全去极化，并且因此允许基于TMRE FI的减小来以毫伏为单位定量线粒体膜电位。
简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白质含量。随后，通过在台式离心机中以3000g离心(对于未处理和经FCCP处理的复制品，以样品一式四份)5分钟使40μg融合剂脂质体总蛋白质粒化，接着再悬浮于100μL补充有2％胎牛血清并且含有最终浓度分别为30nM和200nM的TMRE和MTG染料的DMEM中。一个平行组的融合剂脂质体样品保持未染色，作为阴性对照。将样品在37℃下培育45分钟。在培育之后，通过离心使样品粒化并且再悬浮于400μL含有30nmTMRE的无酚红DMEM培养基中。一组重复样品用20μM FCCP处理5分钟，随后通过流式细胞测量术进行评估。
随后通过流式细胞测量术分析使用Invitrogen Attune NxT声聚焦细胞仪测量样品的膜联蛋白V染色。MTG用488nm激光激发并且在530±30nm处捕获发射。TMRE用561nm激光激发并且在585±16nm处捕获发射。正向和侧向散射门控最初用于捕获融合剂脂质体尺寸化事件和丢弃小碎屑。对MTG和TMRE染色呈阳性的事件是通过门控于最低水平确定的，对于所述最低水平，未染色的对照样品展示<0.5％的对MTG或TMRE染色呈阳性的事件。随后评估对MTG和TMRE染色呈阳性的门控事件的MTG和TMRE的平均FI。
基于将TMRE FI值相对于MTG FI值标准化后的TMRE的强度计算膜电位值(以毫伏，mV为单位)。这个TMRE/MTG比值允许将TMRE强度标准化为样品中的线粒体的量。计算未处理和FCCP处理的样品的TMRE/MTG比值，并且用于使用修正的能斯特方程式(参见下文)确定以毫伏为单位的膜电位，所述方程式可以基于TMRE荧光确定线粒体膜电位(因为TMRE以能斯特方式积聚于线粒体中)。用下式计算融合剂脂质体膜电位：(mV)＝-61.5*log(FI(未处理)/FI(FCCP处理))。使用这个方程式，VSV-G融合剂脂质体样品的所计算的线粒体膜电位为-29.6±1.5毫伏。
实例79：测量受试者的靶向潜力(BiV-Cre纳米囊泡)
这个实例评估融合剂脂质体靶向特定身体部位的能力。融合剂脂质体使用如本文所描述的方法衍生并且装载有cre重组酶蛋白。
将两个剂量的融合剂脂质体(1×和3×)递送到Loxp荧光素酶(杰克逊实验室，005125)小鼠，通过尾静脉静脉内(I.V.)注射。将小鼠置于加热灯(使用250W(红外)加热灯泡)下约5分钟(或直到小鼠开始过度梳理胡须)以扩张尾静脉。将小鼠置于限制器上并且用70％乙醇擦拭尾巴以更好地观察静脉。
使用结核菌素注射器，静脉内注射200μL的融合剂脂质体1×溶液(8.5e8±1.4e8个颗粒/μL，平均值(SEM)))或3×溶液(2.55e9±1.4e8个颗粒/μL，平均值(SEM))。在完成注射后，移开注射器并向注射部位施加压力。
在融合之后，CRE蛋白易位到细胞核以进行重组，其引起荧光素酶的组成性表达。治疗后三天，通过对区域脱毛(Nair Hair Remover乳膏持续45秒，接着用70％乙醇清洁所述区域)来制备个体的腹侧区域。随后用通过腹膜内施用的D-荧光素(珀金埃尔默，150mg/kg)处理个体。这使得能够通过体内生物发光成像来检测荧光素酶表达。将动物置于体内生物发光成像室(珀金埃尔默)中，所述室装有锥形麻醉器(异氟醚)以防止动物运动。在注射后3-15分钟之间进行光子收集，以观察由D-荧光素药物动力学清除所致的最大生物发光信号。以光子数/秒/平方厘米/弧度记录最大辐射率。使用Living Image Software(珀金埃尔默)中的感兴趣区域(ROI)工具定量整合了区域内的辐射率的总通量并且以光子数/秒为单位报告。
通过在动物的接受者组织中进行生物发光成像来检测通过融合剂脂质体递送蛋白质(Cre重组酶)的证据，如图9A-9B中所示。主要在脾脏和肝脏中可见信号，其在3×组展示最高信号。
在全身成像后，将小鼠颈椎脱臼，并且在安乐死的5分钟内收集肝脏、心脏、肺脏、肾脏、小肠、胰脏和脾脏并成像。通过在动物的提取的接受者组织中进行生物发光成像来检测通过融合剂脂质体向肝脏和脾脏递送蛋白质(Cre重组酶)的证据。这可以见于图10A-10B中。信号在脾脏中最高并且在心脏中最低，其中3×组展示最高显著信号(相比于心脏，p＝0.0004)。
实例80：通过独立于溶酶体酸化的途径递送融合剂脂质体
通常，通过内吞作用来实现复杂的生物货物进入靶细胞。内吞作用需要货物进入内体，内体成熟为酸化的溶酶体。不利的是，通过内吞作用进入细胞的货物可能会被困在内体或溶酶体中并且不能到达细胞质。货物也可能被溶酶体中的酸性条件破坏。一些病毒能够非内吞进入靶细胞；然而，这个过程尚未被完全理解。这个实例表明病毒融合剂可以与病毒的其余部分分离并且在缺乏其它病毒蛋白的融合剂脂质体上赋予非内吞进入。
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达尼帕病毒受体结合G蛋白和融合F蛋白(NivG+F)并且表达Cre重组酶蛋白，以获得小颗粒融合剂脂质体，如本文所描述。为了证实通过非内吞途径将融合剂脂质体递送到接受者细胞，NivG+F融合剂脂质体用于处理接受者HEK-293T细胞，所述细胞被工程改造以在CMV启动子下表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒。NivF蛋白为pH非依赖性包膜糖蛋白，已展示其活化和后续融合活性不需要环境酸化(Tamin,2002)。
将接受者细胞以30,000个细胞/孔接种于黑色的透明底96孔板中。在接种接受者细胞之后四至六小时，将表达Cre重组酶蛋白的NivG+F融合剂脂质体施用到DMEM培养基中的靶接受者细胞或非靶接受者细胞。首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。将接受者细胞用10μg融合剂脂质体处理并且在37℃和5％CO2下培育24小时。为了证实通过非内吞途径经由NivG+F融合剂脂质体递送Cre，将一个平行孔的接受NivG+F融合剂脂质体处理的接受者细胞用内体/溶酶体酸化抑制剂巴弗洛霉素A1(Baf；100nM；西格玛，目录号B1793)共处理。
使用自动显微镜(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/)对细胞培养盘进行成像。通过在DMEM培养基中用Hoechst 33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群。Hoechst33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst染色成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nmLED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔上确立LED强度和积分时间来采集靶细胞和非靶细胞孔的图像，所述阳性对照孔含有用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞。
设定采集设置，以使得Hoescht、RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。随后使用确立的设置对所关注的孔成像。通过自动聚焦在Hoescht通道上并且随后使用GFP和RFP通道的已确立的焦平面将焦点设置在每个孔上。用配备有自动荧光显微镜的Gen5软件进行GFP和RFP阳性细胞的分析(https://www.biotek.com/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/)。
使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。GFP强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为GFP阳性细胞的区域。将相同分析步骤应用于RFP通道。随后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(不展示递送的接受者细胞)和RFP阳性细胞的总和以定量RFP转化百分比，其指示融合剂脂质体与接受者细胞的融合量。
通过这个分析，衍生自在表面上表达NivG+F并且含有Cre重组酶蛋白的HEK-293T细胞的融合剂脂质体展示通过溶酶体非依赖性途径的显著递送，这与通过非内吞途径的进入一致，如通过即使在用Baf共处理接受者细胞以抑制内吞作用介导的摄取时仍由NivG+F融合剂脂质体显著递送Cre货物来证明(图11)。在这种情况下，Baf共处理对货物递送的抑制为23.4％。
实例81：针对迁移率测量使肌动蛋白聚合的能力
如本文所描述，通过收获和制备由HEK-293T细胞产生的融合剂脂质体的标准程序来产生融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)。对照颗粒(非融合性融合剂脂质体)是产自经pcDNA3.1空载体反向瞬时转染的HEK-293T细胞。随后使用若丹明鬼笔环肽-流式细胞测量术分析和微管蛋白ELISA分析融合剂脂质体和亲本细胞聚合肌动蛋白(随时间推移)的能力。简单来说，将对应于60μL标准VSV-G融合剂脂质体制剂的大致1×106个融合剂脂质体和用于产生融合剂脂质体的1×105个亲本细胞在1mL完全培养基中完全接种于96孔低附着多孔板中并且在37℃和5％CO2下培育。在接种后3小时、5小时和24小时定期获取样品。将样品以21,000×g离心10分钟，再悬浮于200μL含4％(v/v)PFA的磷酸盐缓冲盐水中10分钟，用1mL磷酸盐缓冲盐水洗涤，以21,000×g离心10分钟，再次洗涤并且存储于4℃下直到进一步使用。
对于若丹明-鬼笔环肽染色，将样品以21,000×g离心10分钟，并且在100μL含0.1％(v/v)Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水中培育20分钟。在20分钟培育后，将另外100μL含有165μM若丹明-鬼笔环肽的含0.1％(v/v)Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水添加到样品并且进行吸移混合，接收阴性对照和另外100μL 100μL仅含0.1％(v/v)Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水。将样品培育45分钟，随后用1mL磷酸盐缓冲盐水洗涤，以21,000×g离心10分钟，再次洗涤并且再悬浮于300μL磷酸盐缓冲盐水中并通过流式细胞仪(Attune，赛默飞世尔)使用561nm激光激发和585+/-16nm滤光片发射进行分析，如下表中所示：
流式细胞仪设置
染料 Attune激光/滤光片 激光波长 发射滤光片(nm)
AF47 YL1 585 585/16
Attune NxT软件用于采集并且FlowJo用于分析。为进行数据采集，将FSC和SSC通道设置在线性轴上，以确定代表细胞或融合剂脂质体的群体。随后对这个群体进行门控，并且仅将这个门内的事件用于以对数标度显示585+/-16nm发射通道中的事件。在每种情况下，收集细胞或融合剂脂质体门内的至少10,000个事件。为进行数据分析，将FSC和SSC通道设置在线性轴上，以确定代表细胞或融合剂脂质体的群体。随后对这个群体进行门控，并且仅将这个门内的事件用于以对数标度显示585+/-16nm发射通道中的事件。阴性对照585+/-16nm发射用于确定直方图上门的放置位置，以使得较少门包括小于1％阳性。使用以上列出的分析标准，亲本细胞分别在3小时、5小时和24小时的时间点展示19.9％、24.8％和82.5％若丹明-鬼笔环肽阳性事件。在3小时、5小时和24小时的时间点，融合剂脂质体分别为44.6％、41.9％和34.9％若丹明-鬼笔环肽(图2)。这个实例表明融合剂脂质体不随时间推移增加肌动蛋白的量，而亲本细胞增加所述量。
实例82：测量融合剂脂质体中的GAPDH
这个实例描述定量融合剂脂质体中的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平，和与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的GAPDH的相对水平。如实例67和86中所描述地制备融合剂脂质体。
根据制造商的说明，使用用于GAPDH的标准可商购的ELISA(ab176642，Abcam)在亲本细胞和融合剂脂质体中测量GAPDH。通过二喹啉甲酸分析类似地测量总蛋白水平。所测量的GAPDH和蛋白质水平在下表中示出：
[蛋白质](mg/mL) [GAPDH](ng/mL) GAPDH:蛋白质(μg/g)
融合剂脂质体 0.82 37.2 45.3
细胞 0.45 50.4 112.0
GAPDH:总蛋白质比率还展示于图12中。
实例83：融合剂脂质体中的脂质与蛋白质的比率
这个实例描述定量融合剂脂质体中的脂质质量与蛋白质质量的比率。预期融合剂脂质体可以具有与有核细胞类似的脂质质量与蛋白质质量的比率。如本文实例67和86中所描述地制备融合剂脂质体和亲本细胞。
使用可商购的磷脂分析试剂盒(MAK122，密苏里州圣路易斯的西格玛)根据制造商的说明书，使用含胆碱的磷脂作为总脂质的子组来计算脂质含量。通过如本文所描述的二喹啉甲酸分析来测量融合剂脂质体的总蛋白含量。所测量的磷脂水平、蛋白质水平和磷脂与蛋白质的比在图13和下表中示出：
磷脂(μM) 蛋白质(g/L) 磷脂:蛋白质(μmol/g)
融合剂脂质体 115.6 0.82 141.0
细胞 47.9 0.45 106.4
实例84：融合剂脂质体中的蛋白质与DNA的比率
这个实例描述定量融合剂脂质体中的蛋白质质量与DNA质量的比率。预期融合剂脂质体可以具有比细胞大得多的蛋白质质量与DNA质量的比率。如实例67和86中所描述地制备融合剂脂质体。
通过如本文所描述的二喹啉甲酸来测量融合剂脂质体和细胞的总蛋白质含量。在使用可商购的分离试剂盒(#69504德国希尔登的凯杰(Qiagen Hilden Germany))根据制造商的说明书提取总DNA之后，通过280nm处的吸收测量融合剂脂质体和细胞的DNA质量。通过将总蛋白质含量除以总DNA含量来确定蛋白质与总核酸的比，以得到典型融合剂脂质体制剂的在给定范围内的比。所测量的蛋白质水平、DNA水平和蛋白质与DNA的比在图14和下表中示出：
[蛋白质](mg/mL) [DNA](ng/μL) 蛋白质:DNA(g/g)
融合剂脂质体 0.82 29.5 27.8
细胞 0.45 15.9 28.3
实例85：融合剂脂质体中脂质与DNA的比率
这个实例描述定量与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的脂质与DNA的比率。在一个实施例中，与亲本细胞相比，融合剂脂质体将具有更大的脂质与DNA的比率。如先前实例67和86中所描述地制备融合剂脂质体。
这个比率被定义为实例40中概述的脂质含量，并且如实例41中所描述地测定核酸含量。所测量的脂质水平、DNA水平和脂质与DNA的比率在图15和下表中示出：
[脂质](μM) [DNA](ng/μL) 脂质:DNA(μmol/mg)
融合剂脂质体 115.6 29.5 3.92
细胞 47.9 15.9 3.01
实例86：测量融合剂脂质体中的脂质组成
这个实例描述定量融合剂脂质体的脂质组成。预期融合剂脂质体的脂质组成可以与衍生其的细胞类似。脂质组成影响融合剂脂质体和细胞的重要生物物理学参数，如大小、静电相互作用和胶体特性。
脂质测量是基于质谱分析。如本文所描述地通过在10cm培养皿中瞬时转染VSV-G和GFP，接着在转染后48小时过滤和超速离心条件培养基以获得融合剂脂质体，来制备融合剂脂质体。与条件培养基并行地收获经转染的细胞并且用于进行分析。还从未用VSV-G或GFP转染的细胞收获外泌体。
如(Sampaio等人2011)所描述，由Lipotype股份有限公司(德国德累斯顿(Dresden,Germany))进行基于质谱分析的脂质分析。使用两步氯仿/甲醇程序来提取脂质(Ejsing等人2009)。用含有以下的内部脂质标准混合物加标样品：心磷脂16:1/15:0/15:0/15:0(CL)、神经酰胺18:1；2/17:0(Cer)、二酰甘油17:0/17:0(DAG)、己糖基神经酰胺18:1；2/12:0(HexCer)、溶血磷脂酸酯17:0(LPA)、溶血磷脂酰胆碱12:0(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺17:1(LPE)、溶血磷脂酰甘油17:1(LPG)、溶血磷脂酰肌醇17:1(LPI)、溶血磷脂酰丝氨酸17:1(LPS)、磷脂酸酯17:0/17:0(PA)、磷脂酰胆碱17:0/17:0(PC)、磷脂酰乙醇胺17:0/17:0(PE)、磷脂酰甘油17:0/17:0(PG)、磷脂酰肌醇16:0/16:0(PI)、磷脂酰丝氨酸17:0/17:0(PS)、胆固醇酯20:0(CE)、鞘磷脂18:1；2/12:0；0(SM)、三酰甘油17:0/17:0/17:0(TAG)和胆固醇D6(Chol)。
在提取之后，将有机相转移到输注培养盘并且在速度真空浓缩器中干燥。将第1步干提取物再悬浮于含7.5mM乙酸铵的氯仿/甲醇/丙醇(1:2:4，V:V:V)中，并且将第2步干提取物再悬浮于甲胺/氯仿/甲醇的33％乙醇溶液(0.003:5:1；V:V:V)中。使用具有用于有机溶剂吸移的防液滴控制(Anti Droplet Control)特征的Hamilton Robotics STARlet机器人平台进行所有液体处理步骤。
通过在配备有TriVersa NanoMate离子源(Advion Biosciences)的QExactive质谱仪(赛默科技)上直接输注来分析样品。在单次采集中，以正离子和负离子模式分析样品，其中MS的分辨率为Rm/z＝200＝280000并且MSMS实验的分辨率为Rm/z＝200＝17500。MSMS由包含列表触发，所述列表涵盖以1Da增量扫描的对应MS质量范围(Surma等人,2015)。将MS和MSMS数据组合，以监测作为铵加合物的CE、DAG和TAG离子；作为乙酸盐加合物的PC、PCO-；和作为去质子化阴离子的CL、PA、PE、PE O-、PG、PI和PS。仅MS用于监测作为去质子化阴离子的LPA、LPE、LPE O-、LPI和LPS；作为乙酸盐加合物的Cer、HexCer、SM、LPC和LPC O-，以及作为乙酰化衍生物的铵加合物的胆固醇(Liebisch等人2006)。
用基于LipidXplorer的内部开发的脂质鉴别软件来分析数据(Herzog等人2011；Herzog等人2012)。使用内部开发的数据管理系统来进行数据后处理和标准化。仅将信噪比>5，并且信号强度比对应空白样品中高5倍的脂质鉴别视为用于进一步的数据分析。
将融合剂脂质体脂质组成与亲本细胞的脂质组成进行比较，其中将未检测到的脂质物种赋值为零。融合剂脂质体和亲本细胞中所鉴别的脂质物种在下表中示出：
Figure BDA0003155557330002981
如果≥亲本细胞的任何重复样品中所鉴别的脂质物质的70％存在于融合剂脂质体的任何重复样品中，并且在那些所鉴别的脂质中，融合剂脂质体中的平均水平可以为亲本细胞中的对应平均脂质物种水平的>25％，那么预期融合剂脂质体和亲本细胞可以具有类似的脂质组成。
实例87：测量融合剂脂质体中的蛋白质组学组成
这个实例描述定量融合剂脂质体的蛋白质组成。预期融合剂脂质体的蛋白质组成可以与衍生其的亲本细胞类似。
通过实例67和86的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体和亲本细胞。
将每个样品再悬浮于溶解缓冲液(6M脲、2M硫脲、4％CHAPS、50mM Tris pH 8.0)中，在冰浴上超声处理并穿过小口径注射器。将蛋白质在65℃下用10mM DTT还原15分钟并且在室温下在黑暗中用15mM碘乙酰胺(IAA)烷基化30分钟。用另外的10mM DTT淬灭过量的IAA。随后通过添加8体积冰冷的丙酮+1体积冰冷的甲醇使蛋白质沉淀并且在-80℃下放置整夜。通过离心使沉淀的蛋白质粒化。将剩余的溶解缓冲液用200μl冰冷的甲醇洗涤3次。将蛋白质再悬浮于0.75M脲+50mM Tris pH 8.0+1μg胰蛋白酶/LysC中，并且在搅拌下在37℃下预消化4小时。将另外1μg胰蛋白酶/LysC添加到蛋白质中并且继续消化整夜。将肽通过逆相SPE纯化并且通过LC-MS分析。
溶解每种条件的重复样品并且合并于一个试管中。随后对这个集合体进行与样品相同的制备方案，并且通过LC-MS以信息依赖性采集进行分析，或在如下文所描述的凝胶上分离。
将总共100μg汇集的蛋白质置于2×Laemmli加样缓冲液中并且在12.5％SDS PAGE上分离。用考马斯蓝(Coomassie blue)对蛋白质进行短暂染色，并且将蛋白质通道分成12个部分。随后将每个部分用50％乙腈脱水并且用10mM DTT再水合以进行还原。将凝胶片置于65℃下15分钟，并且在室温下在黑暗中用15mM IAA烷基化30分钟。凝胶另外用50％乙腈脱水并且在37℃下在具有1μg胰蛋白酶/LysC的50mM Tris pH 8中再水合整夜。通过脱水和超声处理从凝胶中提取肽。将肽通过逆相SPE纯化并且通过LC-MS/MS分析(1×IDA/部分)。
用ABSciex TripleTOF 5600(ABSciex，美国加利福尼亚州的福斯特市(FosterCity,CA,USA))进行采集，其配备有具有25μm iD毛细管的电喷雾接口且与EksigentμUHPLC(Eksigent，美国加利福尼亚州的雷德伍德城(Redwood City,CA,USA))耦接。Analyst TF1.7软件用于控制仪器以及进行数据处理和采集。对于来自凝胶的12个部分或未分离的集合体，以信息依赖性采集(IDA)模式进行采集。以SWATH采集模式分析样品。对于IDA模式，将源电压设置为5.2kV并且维持在225°℃下，将帘气设置于27psi，气体一设置于12psi并且气体二设置于10psi。对于SWATH模式，将源电压设置为5.5kV并且维持在225°℃下，将气帘气设置为25psi，将气体一设置于16psi并且将气体二设置于15psi。在维持于60°℃下的0.3mmi.d.，2.7μm颗粒，150mm长的逆相HALO C18-ES柱(特拉华州威明顿的先进材料技术)上进行分离。样品通过环路过满注射到5μL环路中。对于60分钟LC梯度，移动相由流动速率为3μL/分钟的溶剂A(于水中的0.2％v/v甲酸和3％DMSO v/v)和溶剂B(于EtOH中的0.2％v/v甲酸和3％DMSO)组成。
为了产生用于样品分析的离子库，在通过IDA运行生成的wiff文件上运行ProteinPilot软件。在Peakview软件(ABSciex)上使用这个数据库，以使用3个跃迁/肽和15个肽/蛋白质对每个样品中的蛋白质进行定量。为了使定量的蛋白质的数目最大化，在具有相同参数的可公开获得的人类SWATH数据库(Atlas)上定量样品。如果由Peakview计算的得分高于1.5并且FDR<1％，则将肽视为被充分测量的。使用来自两个数据库的蛋白质名称，将来自每个数据库的定量合并为一个最终定量。通过在相比于每个样品的总信号的平均值时考虑所述样品中的每种蛋白质的总信号，计算每个样品的校正系数。
将融合剂脂质体蛋白质组学组成与亲本细胞蛋白质组学组成进行比较。当>33％的所鉴别的蛋白质存在于融合剂脂质体中时，在融合剂脂质体与亲本细胞之间观察到类似的蛋白质组学组成，并且在那些所鉴别的蛋白质中，水平为亲本细胞中的对应蛋白质水平的>25％，如下表中所示。
Figure BDA0003155557330003001
实例88：定量每个融合剂脂质体的内源性或合成蛋白水平
这个实例描述定量融合剂脂质体中的内源性或合成蛋白货物。在一些情况下，融合剂脂质体可以包含内源或合成蛋白货物。这个实例中所描述的融合剂脂质体或亲本细胞被工程改造以改变内源性蛋白的表达或表达介导治疗或新颖细胞功能的合成货物。
通过实例67和86的方法如本文所描述地制备表达GFP的融合剂脂质体和亲本细胞。使用可商购的ELISA试剂盒(ab171581Abcam英国剑桥(Cambridge,United Kingdom))根据制造商的说明书完成融合剂脂质体中的GFP的定量。使用NanoSight NS300(英国伍斯特郡马尔文的马尔文仪器公司(Malvern Instruments,Malvern,Worcestershire,UnitedKingdom))通过纳米粒子追踪分析来进行融合剂脂质体定量。结果展示于下表中。
浓度(#/mL)
GFP蛋白 4.41×10<sup>13</sup>
融合剂脂质体 2.66×10<sup>11</sup>
GFP:融合剂脂质体 165.8
预期融合剂脂质体可以具有至少1、2、3、4、5、10、20、50、100或更多个蛋白质药剂分子/融合剂脂质体。在一个实施例中，融合剂脂质体将具有166个蛋白质药剂分子/融合剂脂质体。
实例89：测量融合剂脂质体中的外泌体蛋白的标记
这个分析描述定量已知为外泌体的特定标记的蛋白质的比例。
通过实例67和86的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体。通过实例67和86的方法如关于融合剂脂质体在本文所描述地制备外泌体，不同之处在于亲本细胞未用VSV-G或GFP转染。如本文实例35中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体和外泌体的蛋白质定量。
分析所得的蛋白质定量数据，以确定已知外泌体标记CD63的蛋白质水平和比例。通过将质谱的亮度值加1、通过log10转换并且计算跨重复样本的平均值来计算每组的平均对数强度。结果展示于图16中。
实例90：测量融合剂脂质体中的钙联蛋白
这个分析描述定量融合剂脂质体中的钙联蛋白(CNX)水平，和与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的CNX的相对水平。
如本文实例67和86中所描述地制备融合剂脂质体和亲本细胞。使用根据实例35的方法进行的质谱分析来测量钙联蛋白和总蛋白质。针对亲本细胞和融合剂脂质体所测定的钙联蛋白信号强度展示于图17中。
在实施例中，使用这个分析，融合剂脂质体中的CNX的平均分数含量(如本文实例35中所描述地计算)将为<2.43×10-4。
在一个实施例中，从亲本细胞到制剂，以ng/μg为单位的钙联蛋白/总蛋白质的减少将大于88％。
实例91：融合剂脂质体中脂质与DNA的比率
这个实例描述定量与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的脂质与DNA的比率。在一个实施例中，与亲本细胞相比，融合剂脂质体将具有更大的脂质与DNA的比率。如先前实例67和86中所描述地制备融合剂脂质体。
这个比率被定义为实例40中概述的脂质含量，并且如实例41中所描述地测定核酸含量。
如图18和下表中所示，发现融合剂脂质体展现比亲本细胞更大的脂质:DNA比率。
[脂质](μM) [DNA](ng/μL) 脂质:DNA(μmol/mg)
融合剂脂质体 115.6 29.5 3.92
细胞 47.9 15.9 3.01
实例92：分析融合剂脂质体上的表面标记
这个分析描述鉴别融合剂脂质体上的表面标记。
如本文实例67和86中所描述地制备融合剂脂质体。如本文实例67和86中所描述地通过质谱来测量磷脂酰丝氨酸。融合剂脂质体中相对于总脂质的磷脂酰丝氨酸的量被确定为比亲本细胞中相对于总脂质的磷脂酰丝氨酸的量大121％，如下表中所示。
Figure BDA0003155557330003021
实例93：分析融合剂脂质体中的病毒衣壳蛋白
在这个实例中，分析了样品制剂的组成并评估了衍生自病毒衣壳来源的蛋白质的比例。
通过实例67和86的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体。如本文实例35中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体的蛋白质定量。如本文实例35中所描述地计算病毒衣壳蛋白的分数含量，将其在融合剂脂质体样品中取平均值并表示为百分比。
使用这个方法，发现样品含有0.05％病毒衣壳蛋白，如下表中所示。唯一检测到的病毒衣壳蛋白为兔内源性慢病毒(RELIK)衣壳与亲Cyclophilin环素A(PDB 2XGY|B)的复合物。
Figure BDA0003155557330003022
实例94：定量融合剂脂质体中的融合剂蛋白比率
这个实例描述定量融合剂脂质体中的融合剂蛋白与总蛋白质或其它所关注蛋白的比率。其它所关注蛋白可以包含(但不限于)：EGFP、CD63、ARRDC1、GAPDH、钙联蛋白(CNX)和TSG101。通过实例67和86的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体。如本文实例35中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体的蛋白质定量。如本文实例35中所描述地计算所有蛋白质的定量，将其在融合剂脂质体样品中取平均值并表示为分数。
如下表中所示，发现融合剂与EGFP的比率为156.9，与CD63的比率为2912.0，与ARRDC1的比率为664.9，与GAPDH的比率为69.0，与CNX的比率为558.4，并且与TSG101的比率为3064.1。
蛋白质 原始MS强度 融合剂:一种或多种蛋白质比
VSV-G 1.29×10<sup>8</sup> N/A
总蛋白 9.46×10<sup>8</sup> 0.136
EGFP 8.22×10<sup>5</sup> 156.9
CD63 4.43×10<sup>4</sup> 2912.0
ARRDC1 1.94×10<sup>5</sup> 664.9
GAPDH 1.87×10<sup>6</sup> 69.0
CNX 2.31×10<sup>5</sup> 558.4
TSG101 4.21×10<sup>4</sup> 3064.1
实例95：定量融合剂脂质体中的内源性蛋白与合成蛋白的比率
这个实例描述定量融合剂脂质体中的内源性或合成蛋白货物相对于总蛋白质或其它所关注蛋白。其它所关注蛋白可以包含(但不限于)：VSV-G、CD63、ARRDC1、GAPDH、钙联蛋白(CNX)或TSG101。通过实例67和86的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体。如本文实例35中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体的蛋白质定量。如本文实例35中所描述地计算所有蛋白质的定量，将其在融合剂脂质体样品中取平均值并表示为分数。
如下表中所示，发现合成蛋白货物与VSV-G的比率为6.37×10-3，与CD63的比率为18.6，与ARRDC1的比率为4.24，与GAPDH的比率为0.44，与CNX的比率为3.56，并且与TSG101的比率为19.52。
蛋白质 原始MS强度 蛋白质货物:一种或多种蛋白质比
EGFP 8.22×10<sup>5</sup> N/A
总蛋白 9.46×10<sup>8</sup> 8.69×10<sup>-4</sup>
VSV-G 1.29×10<sup>8</sup> 6.37×10<sup>-3</sup>
CD63 4.43×10<sup>4</sup> 18.6
ARRDC1 1.94×10<sup>5</sup> 4.24
GAPDH 1.87×10<sup>6</sup> 0.44
CNX 2.31×10<sup>5</sup> 3.56
TSG101 4.21×10<sup>4</sup> 19.52
实例96：融合剂脂质体中富集的脂质组成
这个实例描述定量融合剂脂质体、亲本细胞和外泌体的脂质组成。预期相对于衍生融合剂脂质体的细胞，融合剂脂质体的脂质组成可以富集和/或耗尽特定脂质。脂质组成影响融合剂脂质体和细胞的重要生物物理学参数，如大小、静电相互作用和胶体特性。
如实例67和86中所描述地测量脂质组成。如本文所描述地通过在10cm培养皿中瞬时转染VSV-G和GFP，接着在转染后48小时过滤和超速离心条件培养基以获得融合剂脂质体，来制备融合剂脂质体。与条件培养基并行地收获经转染的细胞并且用于进行分析。如关于融合剂脂质体在本文所描述地制备外泌体，不同之处在于亲本细胞未用VSV-G或GFP转染。
融合剂脂质体、外泌体和亲本细胞的脂质组成展示于图19A-19B中。相比于亲本细胞，融合剂脂质体富集了胆固醇酯、游离胆固醇、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酸酯、醚连接的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。相比于亲本细胞，融合剂脂质体耗尽了神经酰胺、心磷脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰肌醇、醚连接的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和三酰甘油。相比于外泌体，融合剂脂质体富集了胆固醇酯、神经酰胺、二酰甘油、溶血磷脂酸酯和磷脂酰乙醇胺、三酰甘油。相比于外泌体，融合剂脂质体耗尽了游离胆固醇、己糖基神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱、醚连接的溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰丝氨酸。
实例97：测量融合剂脂质体的区室特异性蛋白质组学含量
这个实例描述定量已知来源于融合剂脂质体、融合剂脂质体亲本细胞和外泌体中的特定细胞区室的蛋白质的比例。
通过实例67和86的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体和亲本细胞。通过实例67和86的方法如关于融合剂脂质体在本文所描述地制备外泌体，不同之处在于亲本细胞未用VSV-G或GFP转染。如本文实例35中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体和外泌体的蛋白质定量。分析所得的蛋白质定量数据，以确定已知外泌体、内质网、核糖体、细胞核和线粒体蛋白的蛋白质水平和比例，如由基因本体细胞区室注释术语(外泌体：GO:0070062，内质网：GO:0005783，核糖体：GO:0005840、GO:0022625、GO:0022626、GO:0022627、GO:0044391、GO:0042788、GO:0000313)以证据代码IDA(由直接分析推断)所注释。对于融合剂脂质体样品、外泌体样品和亲本细胞确定每个样品中区室特异性蛋白相对于总蛋白的比率。
如图20中所示，发现相比于亲本细胞和外泌体，融合剂脂质体耗尽了内质网蛋白。还发现相比于外泌体，融合剂脂质体耗尽了外泌体蛋白。相比于亲本细胞，融合剂脂质体耗尽了线粒体蛋白。相比于亲本细胞，融合剂脂质体富集了核蛋白。相比于亲本细胞和外泌体，融合剂脂质体富集了核糖体蛋白。
实例98：测量融合剂脂质体中的TSG101和ARRDC1含量
这个实例描述定量已知在从细胞释放融合剂脂质体中重要的蛋白质的比例。
通过实例67和86的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体和亲本细胞。通过实例67和86的方法如关于融合剂脂质体在本文所描述地制备外泌体，不同之处在于亲本细胞未用VSV-G或GFP转染。如本文实例35中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体和外泌体的蛋白质定量。分析所得的蛋白质定量数据，以确定蛋白质TSG101和ARRDC1的蛋白质水平和比例。通过将质谱的亮度值加1、通过log10转换并且计算跨重复样本的平均值来计算每组的平均对数强度。将相对于外泌体或亲本细胞，融合剂脂质体中的TSG101或ARRDC1的总蛋白含量的百分比确定为每个样品的TSG101或ARRDC1的平均对数强度，除以相同样品中所有蛋白质的强度的总和，在重复样本中取平均值并且表示为百分比。
如图21中所示，发现ARRDC1以比亲本细胞或外泌体中更高的水平(呈总蛋白含量的百分比形式)存在于融合剂脂质体中。融合剂脂质体中呈总蛋白含量的百分比形式的ARRDC1水平为至少0.02％。发现TSG101以比亲本细胞或外泌体中更高的水平(呈总蛋白含量的百分比形式)存在于融合剂脂质体中。融合剂脂质体中呈总蛋白质含量的百分比形式的TSG101水平为至少0.004％。
实例99：在多次施用之后测量融合剂脂质体的血清灭活
这个实例描述在多次施用融合剂脂质体后，使用体外递送分析来定量融合剂脂质体的血清灭活。预期经修饰的融合剂脂质体(例如通过本文所描述的方法修饰)可以在多次(例如超过一次，例如2次或更多次)施用经修饰的融合剂脂质体后具有降低的(例如相比于施用未经修饰的融合剂脂质体降低的)血清灭活。在一些情况下，在多次施用后，本文所描述的融合剂脂质体不会被血清灭活。
融合剂脂质体的免疫原性的量度为血清灭活。在一个实施例中，重复注射融合剂脂质体可以使得产生抗融合剂脂质体抗体，例如识别融合剂脂质体的抗体。在一个实施例中，识别融合剂脂质体的抗体可以能够限制融合剂脂质体活性或寿命并且介导补体降解的方式结合。
在此实例中，在一次或多次施用融合剂脂质体之后检查血清灭活。通过先前实例中的任一个产生融合剂脂质体。在这个实例中，融合剂脂质体是由以下产生：被慢病毒介导的HLA-G表达修饰的HEK293细胞(下文称为HEK293-HLA-G)，和被慢病毒介导的空载体表达修饰的HEK293(下文称为HEK293)。在一些实施例中，融合剂脂质体来源于表达其它免疫调节蛋白的细胞。
血清取自不同的群组：全身和/或局部注射1、2、3、5、10次媒剂(未用融合剂脂质体处理的组)、HEK293-HLA-G融合剂脂质体或HEK293融合剂脂质体注射液的小鼠。通过收集新鲜全血并且使其完全凝血若干小时来从小鼠收集血清。通过离心沉淀凝块，并去除血清上清液。阴性对照为热灭活的小鼠血清。将阴性对照样品在56℃下加热1小时。血清可以等分试样冷冻。
测试融合剂脂质体的剂量，在所述剂量下，接受者群体中50％的细胞接受融合剂脂质体中的有效负载。融合剂脂质体可以通过本文所描述的任何其它实例产生，并且可以含有本文所描述的任何有效负载。本文还描述了许多用于分析融合剂脂质体递送有效负载到接受者细胞的方法。在这个特定实例中，有效负载为Cre蛋白并且接受者细胞为RPMI8226细胞，其在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，在通过Cre重组后从GFP转换为RFP表达，指示融合和递送的Cre(作为标记)。50％的接受者细胞呈RFP阳性时所鉴别的剂量用于进一步实验。在其它实施例中，将50％的接受者细胞接受有效负载的所鉴别的剂量用于进一步实验。
为了评估融合剂脂质体的血清灭活，将融合剂脂质体1:5稀释成正常或热灭活的血清(或含有10％热灭活的FBS的培养基，作为无血清对照)，并且将混合物在37℃下培育1小时。在培育之后，将培养基添加到反应物中进行额外的1:5稀释，并且随后以1:10比率连续稀释两次。在这个步骤之后，融合剂脂质体应以先前鉴别的剂量存在，在所述剂量下，50％的接受者细胞接受有效负载(例如为RFP阳性)。预期50％的接受者细胞接受有效负载的所鉴别的剂量可以在融合剂脂质体之间是类似的。
随后将已暴露于血清的融合剂脂质体与接受者细胞一起培育。计算接受有效负载并且因此为RFP阳性的细胞的百分比。接受有效负载的细胞的百分比在已与来自用HEK293-HLA-G融合剂脂质体处理的小鼠的血清和热灭活的血清一起培育的融合剂脂质体样品之间可能没有差异，指示不存在融合剂脂质体的血清灭活或适应性免疫应答。接受有效负载的细胞的百分比在从用HEK293-HLA-G融合剂脂质体处理1、2、3、5或10次的小鼠培育的融合剂脂质体样品之间可能没有差异，其将指示不存在融合剂脂质体的血清灭活或适应性免疫应答。在一些情况下，接受有效负载的细胞的百分比在已与来自用媒剂处理的小鼠和来自用HEK293-HLA-G融合剂脂质体处理的小鼠的血清一起培育的融合剂脂质体样品之间没有差异，指示不存在融合剂脂质体的血清灭活或适应性免疫应答。在一些情况下，用HEK293衍生的融合剂脂质体的接受有效负载的细胞的百分比少于HEK293-HLA-G融合剂脂质体，指示不存在HEK293-HLA-G融合剂脂质体的血清灭活或适应性免疫应答。
实例100：测量融合剂脂质体的补体靶向
这个实例描述了使用体外分析定量针对融合剂脂质体的补体活性。预期本文所描述的经修饰的融合剂脂质体可以相比于对应未经修饰的融合剂脂质体诱导降低的补体活性。
在这个实例中，评估小鼠血清针对融合剂脂质体的补体活性。所述实例测量补体C3a的水平，其是所有补体途径的中心节点。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
在这个实例中，通过前述实例中的任一个来产生融合剂脂质体。融合剂脂质体是由以下产生：被慢病毒介导的补体调节蛋白DAF的表达修饰的HEK293细胞(HEK293-DAF融合剂脂质体)或不表达补体调节蛋白的HEK 293细胞(HEK293融合剂脂质体)。还可以使用其它补体调节蛋白，如结合加速衰减因子的蛋白质(DAF，CD55)，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)，例如C4b结合蛋白(C4BP)，例如补体受体1(CD35)，例如膜辅因子蛋白(MCP，CD46)，例如凸出蛋白(CD59)，例如抑制经典和旁路补体途径CD/C5转化酶的蛋白质，例如调节MAC组装的蛋白质。
从未经处理的小鼠、施用HEK293-DAF融合剂脂质体的小鼠或施用HEK293融合剂脂质体的小鼠回收血清。通过收集新鲜全血并且使其完全凝血若干小时来从小鼠收集血清。通过离心沉淀凝块，并去除血清上清液。阴性对照为热灭活的小鼠血清。将阴性对照样品在56℃下加热1小时。血清可以等分试样冷冻。
测试不同融合剂脂质体的剂量，在所述剂量下，接受者群体中50％的细胞接受融合剂脂质体中的有效负载。融合剂脂质体可以通过本文所描述的任何其它实例产生，并且可以含有本文所描述的任何有效负载。本文还描述了许多用于分析融合剂脂质体递送有效负载到接受者细胞的方法。在这个特定实例中，有效负载为Cre蛋白并且接受者细胞为RPMI8226细胞，其在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，在通过Cre重组后从GFP转换为RFP表达，指示融合和递送的Cre(作为标记)。50％的接受者细胞呈RFP阳性时所鉴别的剂量用于进一步实验。在其它实施例中，将50％的接受者细胞接受有效负载的所鉴别的剂量用于进一步实验。在优选实施例中，50％的接受者细胞接受有效负载的所鉴别的剂量为跨融合剂脂质体类似的。
开始于50％的接受者细胞接受有效负载的融合剂脂质体剂量的融合剂脂质体于磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中的两倍稀释液与来自用相同融合剂脂质体处理的小鼠或未处理的小鼠的血清的1:10稀释液混合(分析体积，20μl)，并且在37℃下培育1小时。将样品进一步以1:500稀释并用于对C3a具有特异性的酶联免疫吸附分析(ELISA)。ELISA为由LifeSpan生物科学公司出售的小鼠补体C3a ELISA试剂盒产品LS-F4210，其测量样品中的C3a的浓度。跨越从小鼠分离的血清比较存在200pg/ml C3a的融合剂脂质体的剂量。
在一些情况下，相比于与HEK293小鼠血清一起培育的HEK293融合剂脂质体，与HEK-293DAF小鼠血清一起培育的HEK293-DAF融合剂脂质体的存在200pg/ml C3a的融合剂脂质体的剂量更大，指示相比于HEK293-DAF融合剂脂质体，用HEK293融合剂脂质体处理的小鼠中靶向融合剂脂质体的补体活性更大。在一些情况下，相比于与未处理的小鼠血清一起培育的HEK293融合剂脂质体，与未处理的小鼠血清一起培育的HEK293-DAF融合剂脂质体的存在200pg/ml C3a的融合剂脂质体的剂量更大，指示相比于HEK293-DAF融合剂脂质体，用HEK293融合剂脂质体处理的小鼠中靶向融合剂脂质体的补体活性更大。
序列表
<110> 旗舰先锋创新V股份有限公司（FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS V, INC.）
<120> 用于CNS递送的融合剂脂质体组合物
<130> V2050-7029WO_VL39023-03
<140> 尚未指定
<141> 与此同时
<150> 62/767,358
<151> 2018-11-14
<150> 62/900,064
<151> 2019-09-13
<160> 162
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 589
<212> PRT
<213> 人类呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytal virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合糖蛋白
<400> 1
Met Ile Pro Gln Ala Arg Thr Glu Leu Asn Leu Gly Gln Ile Thr Met
1 5 10 15
Glu Leu Leu Ile His Arg Ser Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala Ile
20 25 30
Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr
35 40 45
Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg
50 55 60
Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys
65 70 75 80
Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln
85 90 95
Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met
100 105 110
Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro Gln
115 120 125
Tyr Met Asn Tyr Thr Ile Asn Thr Thr Gly Ser Leu Asn Val Ser Ile
130 135 140
Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly
145 150 155 160
Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu
165 170 175
Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Asn Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala
180 185 190
Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu
195 200 205
Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Gln
210 215 220
Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln
225 230 235 240
Lys Asn Ser Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala
245 250 255
Gly Val Thr Thr Pro Leu Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu
260 265 270
Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu
275 280 285
Met Ser Ser Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met
290 295 300
Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Ile
305 310 315 320
Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu
325 330 335
Cys Thr Thr Asn Ile Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr
340 345 350
Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro
355 360 365
Gln Ala Asp Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr
370 375 380
Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Ser Leu Cys Asn Thr Asp
385 390 395 400
Ile Phe Asn Ser Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp
405 410 415
Ile Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr
420 425 430
Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys
435 440 445
Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr
450 455 460
Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Leu Glu Gly Lys
465 470 475 480
Asn Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Tyr Tyr Asp Pro Leu
485 490 495
Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu
500 505 510
Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Arg Ser Asp Glu Leu Leu
515 520 525
His Asn Val Asn Thr Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr Ala
530 535 540
Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Val Leu Leu Ser Leu Ile Ala Ile Gly
545 550 555 560
Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Val Thr Leu Ser Lys
565 570 575
Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Lys
580 585
<210> 2
<211> 553
<212> PRT
<213> 新城疫病毒（Newcastle disease virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 2
Met Asp Pro Lys Pro Ser Thr Ser Tyr Leu His Ala Phe Pro Leu Ile
1 5 10 15
Phe Val Ala Ile Ser Leu Val Phe Met Ala Gly Arg Ala Ser Ala Leu
20 25 30
Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys
35 40 45
Ala Val Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Thr Ile Ile Ile Lys
50 55 60
Leu Leu Pro Asn Met Pro Lys Asp Lys Glu Gln Cys Ala Lys Ser Pro
65 70 75 80
Leu Asp Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Ala Pro Leu Gly
85 90 95
Asp Ser Ile Arg Arg Ile Gln Glu Ser Val Thr Thr Ser Gly Gly Glu
100 105 110
Arg Gln Glu Arg Leu Val Gly Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Leu Gly
115 120 125
Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ser Ala Leu Ile Gln Ala
130 135 140
Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Lys Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala
145 150 155 160
Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Ser Gly Leu Ser Gln Leu Ala
165 170 175
Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Lys
180 185 190
Thr Ala Gln Glu Ile Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val
195 200 205
Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln
210 215 220
Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn
225 230 235 240
Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Met Leu Thr Lys Leu Gly Val Gly
245 250 255
Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Ser Ser Gly Leu Ile Ser Gly Asn
260 265 270
Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Thr
275 280 285
Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu
290 295 300
Thr Leu Ser Val Ser Thr Asn Lys Gly Phe Ala Ser Ala Leu Val Pro
305 310 315 320
Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser
325 330 335
Tyr Cys Ile Glu Thr Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr
340 345 350
Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Phe Ser Cys Leu Gly Gly Asn Thr Ser
355 360 365
Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met
370 375 380
Thr Leu Lys Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Met Thr Thr Cys Arg
385 390 395 400
Cys Ala Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val
405 410 415
Ser Leu Ile Asp Lys Lys Val Cys Asn Ile Leu Thr Leu Asp Gly Ile
420 425 430
Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile
435 440 445
Ser Ile Gln Asp Ser Gln Val Val Ile Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser
450 455 460
Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Lys
465 470 475 480
Leu Glu Glu Ser Asn Ser Lys Leu Asp Lys Val Asn Val Arg Leu Thr
485 490 495
Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Thr Ile Ala Leu
500 505 510
Ile Cys Gly Ile Val Ser Leu Val Leu Ala Cys Tyr Ile Met Tyr Lys
515 520 525
Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu
530 535 540
Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Lys Met
545 550
<210> 3
<211> 553
<212> PRT
<213> 麻疹病毒株AIK-C（measels virus strain AIK-C）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 3
Met Ser Ile Met Gly Leu Lys Val Asn Val Ser Ala Ile Phe Met Ala
1 5 10 15
Val Leu Leu Thr Leu Gln Thr Pro Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Asn
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Gly Val Val Gly Ile Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val
35 40 45
Met Thr Arg Ser Ser His Gln Ser Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Asn
50 55 60
Ile Thr Leu Leu Asn Asn Cys Thr Arg Val Glu Ile Ala Glu Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Leu Leu Arg Thr Val Leu Glu Pro Ile Arg Asp Ala Leu Asn Ala
85 90 95
Met Thr Gln Asn Ile Arg Pro Val Gln Ser Val Ala Ser Ser Arg Arg
100 105 110
His Lys Arg Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu Gly Val
115 120 125
Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Met
130 135 140
Leu Asn Ser Gln Ala Ile Asp Asn Leu Arg Ala Ser Leu Glu Thr Thr
145 150 155 160
Asn Gln Ala Ile Glu Ala Ile Arg Gln Ala Gly Gln Glu Met Ile Leu
165 170 175
Ala Val Gln Gly Val Gln Asp Tyr Ile Asn Asn Glu Leu Ile Pro Ser
180 185 190
Met Asn Gln Leu Ser Cys Asp Leu Ile Gly Gln Lys Leu Gly Leu Lys
195 200 205
Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser Leu Phe Gly Pro Ser Leu
210 215 220
Arg Asp Pro Ile Ser Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala
225 230 235 240
Leu Gly Gly Asp Ile Asn Lys Val Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser Gly
245 250 255
Gly Asp Leu Leu Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile
260 265 270
Thr His Val Asp Thr Glu Ser Tyr Phe Ile Val Leu Ser Ile Ala Tyr
275 280 285
Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly
290 295 300
Val Ser Tyr Asn Ile Gly Ser Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Val Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Ala Thr Gln Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Ser Ser
325 330 335
Cys Thr Phe Met Pro Glu Gly Thr Val Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr
340 345 350
Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln Glu Cys Leu Arg Gly Tyr Thr Lys Ser
355 360 365
Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser Gly Ser Phe Gly Asn Arg Phe Ile Leu
370 375 380
Ser Gln Gly Asn Leu Ile Ala Asn Cys Ala Ser Ile Leu Cys Lys Cys
385 390 395 400
Tyr Thr Thr Gly Thr Ile Ile Asn Gln Asp Pro Asp Lys Ile Leu Thr
405 410 415
Tyr Ile Ala Ala Asp Asn Cys Pro Val Val Glu Val Asn Gly Val Thr
420 425 430
Ile Gln Val Gly Ser Arg Arg Tyr Pro Asp Ala Val Tyr Leu His Arg
435 440 445
Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Leu Leu Glu Arg Leu Asp Val Gly Thr
450 455 460
Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp Ala Lys Glu Leu Leu
465 470 475 480
Glu Ser Ser Asp Gln Ile Leu Arg Ser Met Lys Gly Leu Ser Ser Thr
485 490 495
Cys Ile Val Tyr Ile Leu Ile Ala Val Cys Leu Gly Gly Leu Ile Gly
500 505 510
Ile Pro Ala Leu Ile Cys Cys Cys Arg Gly Arg Cys Asn Lys Lys Gly
515 520 525
Glu Gln Val Gly Met Ser Arg Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly
530 535 540
Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu
545 550
<210> 4
<211> 539
<212> PRT
<213> 人类偏肺病毒（Human metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合糖蛋白前体
<400> 4
Met Ser Trp Lys Val Val Ile Ile Phe Ser Leu Leu Ile Thr Pro Gln
1 5 10 15
His Gly Leu Lys Glu Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Cys Ser Thr Ile Thr
20 25 30
Glu Gly Tyr Leu Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe
35 40 45
Thr Leu Glu Val Gly Asp Val Glu Asn Leu Thr Cys Ser Asp Gly Pro
50 55 60
Ser Leu Ile Lys Thr Glu Leu Asp Leu Thr Lys Ser Ala Leu Arg Glu
65 70 75 80
Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Leu Ala Arg Glu Glu Gln Ile Glu
85 90 95
Lys Pro Arg Gln Ser Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val
100 105 110
Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Ile Ala Lys Thr Ile
115 120 125
Arg Leu Glu Ser Glu Val Thr Ala Ile Lys Asn Ala Leu Lys Thr Thr
130 135 140
Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr
145 150 155 160
Ala Val Arg Glu Leu Lys Asp Phe Val Ser Lys Asn Leu Thr Arg Ala
165 170 175
Ile Asn Lys Asn Lys Cys Asp Ile Asp Asp Leu Lys Met Ala Val Ser
180 185 190
Phe Ser Gln Phe Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser
195 200 205
Asp Asn Ala Gly Ile Thr Pro Ala Ile Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp
210 215 220
Ala Glu Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Met Pro Thr Ser Ala Gly Gln
225 230 235 240
Ile Lys Leu Met Leu Glu Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe
245 250 255
Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Gly Ser Ser Val Ile Tyr Met Val Gln
260 265 270
Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Ile Val Lys Ala
275 280 285
Ala Pro Ser Cys Ser Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Ala Cys Leu Leu Arg
290 295 300
Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Gln Asn Ala Gly Ser Thr Val Tyr Tyr
305 310 315 320
Pro Asn Glu Lys Asp Cys Glu Thr Arg Gly Asp His Val Phe Cys Asp
325 330 335
Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Glu Gln Ser Lys Glu Cys Asn Ile
340 345 350
Asn Ile Ser Thr Thr Asn Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His
355 360 365
Pro Ile Ser Met Val Ala Leu Ser Pro Leu Gly Ala Leu Val Ala Cys
370 375 380
Tyr Lys Gly Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Arg Val Gly Ile Ile
385 390 395 400
Lys Gln Leu Asn Lys Gly Cys Ser Tyr Ile Thr Asn Gln Asp Ala Asp
405 410 415
Thr Val Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Glu Gly
420 425 430
Glu Gln His Val Ile Lys Gly Arg Pro Val Ser Ser Ser Phe Asp Pro
435 440 445
Ile Lys Phe Pro Glu Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe
450 455 460
Glu Asn Ile Glu Asn Ser Gln Ala Leu Val Asp Gln Ser Asn Arg Ile
465 470 475 480
Leu Ser Ser Ala Glu Lys Gly Asn Thr Gly Phe Ile Ile Val Ile Ile
485 490 495
Leu Ile Ala Val Leu Gly Ser Ser Met Ile Leu Val Ser Ile Phe Ile
500 505 510
Ile Ile Lys Lys Thr Lys Lys Pro Thr Gly Ala Pro Pro Glu Leu Ser
515 520 525
Gly Val Thr Asn Asn Gly Phe Ile Pro His Ser
530 535
<210> 5
<211> 540
<212> PRT
<213> 牛副流感病毒3（Bovine parainfluenza virus 3）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 5
Met Ile Ile Ile Val Ile Thr Met Ile Leu Ser Leu Thr Pro Ser Ser
1 5 10 15
Leu Cys Gln Ile Asp Ile Thr Lys Leu Gln Ser Val Gly Val Leu Val
20 25 30
Asn Ser Pro Lys Gly Ile Lys Ile Ser Gln Asn Phe Glu Thr Arg Tyr
35 40 45
Leu Ile Leu Ser Leu Ile Pro Lys Ile Glu Asp Ser His Ser Cys Gly
50 55 60
Asn Gln Gln Ile Asp Gln Tyr Lys Lys Leu Leu Asp Arg Leu Ile Ile
65 70 75 80
Pro Leu Tyr Asp Gly Leu Lys Leu Gln Lys Asp Val Ile Val Val Asn
85 90 95
His Glu Ser His Asn Asn Thr Asn Leu Arg Thr Lys Arg Phe Phe Gly
100 105 110
Glu Ile Ile Gly Thr Ile Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ser Ala Gln Ile
115 120 125
Thr Ala Ala Val Ala Leu Val Glu Ala Lys Gln Ala Arg Ser Asp Ile
130 135 140
Asp Lys Leu Lys Glu Ala Ile Lys Asp Thr Asn Lys Ala Val Gln Ser
145 150 155 160
Ile Gln Ser Ser Val Gly Asn Leu Ile Val Ala Val Lys Ser Val Gln
165 170 175
Asp Tyr Val Asn Asn Glu Ile Val Pro Ser Ile Thr Arg Leu Gly Cys
180 185 190
Glu Ala Ala Gly Leu Gln Leu Gly Ile Ala Leu Thr Gln His Tyr Ser
195 200 205
Glu Leu Thr Asn Ile Phe Gly Asp Asn Ile Gly Thr Leu Gly Glu Lys
210 215 220
Gly Val Lys Leu Gln Gly Ile Ala Ser Leu Tyr Arg Thr Asn Ile Thr
225 230 235 240
Glu Val Phe Thr Thr Ser Thr Val Asp Gln Tyr Asp Ile Tyr Asp Leu
245 250 255
Leu Phe Thr Glu Ser Ile Lys Met Arg Val Ile Asp Val Asp Leu Ser
260 265 270
Asp Tyr Ser Ile Thr Leu Gln Val Arg Leu Pro Leu Leu Thr Lys Val
275 280 285
Ser Asn Thr Gln Ile Tyr Lys Val Asp Ser Ile Ser Tyr Asn Ile Gln
290 295 300
Gly Lys Glu Trp Tyr Ile Pro Leu Pro His His Ile Met Thr Lys Gly
305 310 315 320
Ala Phe Leu Gly Gly Ala Asp Ile Lys Glu Cys Ile Glu Ser Phe Ser
325 330 335
Asn Tyr Ile Cys Pro Ser Asp Pro Gly Phe Ile Leu Asn His Glu Met
340 345 350
Glu Asn Cys Leu Ser Gly Asn Ile Thr Gln Cys Pro Lys Thr Ile Val
355 360 365
Thr Ser Asp Ile Val Pro Arg Tyr Ala Phe Val Asp Gly Gly Val Ile
370 375 380
Ala Asn Cys Ile Pro Thr Thr Cys Thr Cys Asn Gly Ile Asp Asn Arg
385 390 395 400
Ile Asn Gln Ser Pro Asp Gln Gly Ile Lys Ile Ile Thr Tyr Lys Glu
405 410 415
Cys Gln Ile Val Gly Ile Asn Gly Met Leu Phe Lys Thr Asn Gln Glu
420 425 430
Gly Thr Leu Ala Lys Tyr Thr Phe Asp Asn Ile Lys Leu Asn Asn Ser
435 440 445
Val Ala Leu Asn Pro Ile Asp Ile Ser Leu Glu Leu Asn Lys Ala Lys
450 455 460
Ser Asp Leu Glu Glu Ser Lys Arg Trp Ile Glu Lys Ser Asn Gln Lys
465 470 475 480
Leu Asp Ser Ile Gly Ser Trp His Gln Ser Ser Val Thr Ile Ile Ile
485 490 495
Ile Ile Val Met Ile Val Val Leu Leu Ile Ile Asn Ala Ile Ile Ile
500 505 510
Met Ile Met Ile Arg Tyr Leu Arg Asp Arg Asn Arg His Leu Asn Asn
515 520 525
Lys Asp Ser Glu Pro Tyr Val Leu Thr Asn Arg Gln
530 535 540
<210> 6
<211> 538
<212> PRT
<213> 腮腺炎病毒（mumps virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 6
Met Lys Val Phe Leu Val Thr Cys Leu Gly Phe Ala Val Phe Ser Ser
1 5 10 15
Ser Val Cys Val Asn Ile Asn Ile Leu Gln Gln Ile Gly Tyr Ile Lys
20 25 30
Gln Gln Val Arg Gln Leu Ser Tyr Tyr Ser Gln Ser Ser Ser Ser Tyr
35 40 45
Ile Val Val Lys Leu Leu Pro Asn Ile Gln Pro Thr Asp Asn Ser Cys
50 55 60
Glu Phe Lys Ser Val Thr Gln Tyr Asn Lys Thr Leu Ser Asn Leu Leu
65 70 75 80
Leu Pro Ile Ala Glu Asn Ile Asn Asn Ile Ala Ser Pro Ser Ser Gly
85 90 95
Ser Arg Arg His Lys Arg Phe Ala Gly Ile Ala Ile Gly Ile Ala Ala
100 105 110
Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Val Thr Ala Ala Val Ser Leu Val
115 120 125
Gln Ala Gln Thr Asn Ala Arg Ala Ile Ala Ala Met Lys Asn Ser Ile
130 135 140
Gln Ala Thr Asn Arg Ala Val Phe Glu Val Lys Glu Gly Thr Gln Arg
145 150 155 160
Leu Ala Ile Ala Val Gln Ala Ile Gln Asp His Ile Asn Thr Ile Met
165 170 175
Asn Thr Gln Leu Asn Asn Met Ser Cys Gln Ile Leu Asp Asn Gln Leu
180 185 190
Ala Thr Ser Leu Gly Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gln
195 200 205
Pro Gln Leu Ile Asn Pro Ala Leu Ser Pro Ile Ser Ile Gln Ala Leu
210 215 220
Arg Ser Leu Leu Gly Ser Met Thr Pro Ala Val Val Gln Ala Thr Leu
225 230 235 240
Ser Thr Ser Ile Ser Ala Ala Glu Ile Leu Ser Ala Gly Leu Met Glu
245 250 255
Gly Gln Ile Val Ser Val Leu Leu Asp Glu Met Gln Met Ile Val Lys
260 265 270
Ile Asn Ile Pro Thr Ile Val Thr Gln Ser Asn Ala Leu Val Ile Asp
275 280 285
Phe Tyr Ser Ile Ser Ser Phe Ile Asn Asn Gln Glu Ser Ile Ile Gln
290 295 300
Leu Pro Asp Arg Ile Leu Glu Ile Gly Asn Glu Gln Trp Ser Tyr Pro
305 310 315 320
Ala Lys Asn Cys Lys Leu Thr Arg His His Ile Phe Cys Gln Tyr Asn
325 330 335
Glu Ala Glu Arg Leu Ser Leu Glu Ser Lys Leu Cys Leu Ala Gly Asn
340 345 350
Ile Ser Ala Cys Val Phe Ser Pro Ile Ala Gly Ser Tyr Met Arg Arg
355 360 365
Phe Val Ala Leu Asp Gly Thr Ile Val Ala Asn Cys Arg Ser Leu Thr
370 375 380
Cys Leu Cys Lys Ser Pro Ser Tyr Pro Ile Tyr Gln Pro Asp His His
385 390 395 400
Ala Val Thr Thr Ile Asp Leu Thr Ala Cys Gln Thr Leu Ser Leu Asp
405 410 415
Gly Leu Asp Phe Ser Ile Val Ser Leu Ser Asn Ile Thr Tyr Ala Glu
420 425 430
Asn Leu Thr Ile Ser Leu Ser Gln Thr Ile Asn Thr Gln Pro Ile Asp
435 440 445
Ile Ser Thr Glu Leu Ser Lys Val Asn Ala Ser Leu Gln Asn Ala Val
450 455 460
Lys Tyr Ile Lys Glu Ser Asn His Gln Leu Gln Ser Val Asn Val Asn
465 470 475 480
Ser Lys Ile Gly Ala Ile Ile Val Ala Ala Leu Val Leu Ser Ile Leu
485 490 495
Ser Ile Ile Ile Ser Leu Leu Phe Cys Cys Trp Ala Tyr Val Ala Thr
500 505 510
Lys Glu Ile Arg Arg Ile Asn Phe Lys Thr Asn His Ile Asn Thr Ile
515 520 525
Ser Ser Ser Val Asp Asp Leu Ile Arg Tyr
530 535
<210> 7
<211> 671
<212> PRT
<213> 犬瘟热病毒（canine distemper virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 7
Met Asn Pro His Glu Gln Thr Ile Pro Met His Glu Lys Ile Pro Lys
1 5 10 15
Arg Ser Lys Thr Gln Thr His Thr Gln Gln Asp Leu Pro Gln Gln His
20 25 30
Ser Thr Lys Ser Ala Glu Ser Lys Thr Ser Arg Ala Arg His Ser Ile
35 40 45
Thr Ser Ala Gln Arg Ser Thr His Tyr Asp Pro Arg Thr Ala Asp Trp
50 55 60
Pro Asp Tyr Tyr Ile Met Lys Arg Thr Arg Ser Cys Lys Gln Ala Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Ser Asp Asn Ile Pro Ala His Gly Asp His Asp Gly Ile Ile
85 90 95
His His Thr Pro Glu Ser Val Ser Gln Gly Ala Lys Ser Arg Leu Lys
100 105 110
Met Gly Gln Ser Asn Ala Val Lys Ser Gly Ser Gln Cys Thr Trp Leu
115 120 125
Val Leu Trp Cys Ile Gly Val Ala Ser Leu Phe Leu Cys Ser Lys Ala
130 135 140
Gln Ile His Trp Asn Asn Leu Ser Thr Ile Gly Ile Ile Gly Thr Asp
145 150 155 160
Ser Val His Tyr Lys Ile Met Thr Arg Pro Ser His Gln Tyr Leu Val
165 170 175
Ile Lys Leu Met Pro Asn Val Ser Leu Ile Asp Asn Cys Thr Lys Ala
180 185 190
Glu Leu Asp Glu Tyr Glu Lys Leu Leu Ser Ser Ile Leu Glu Pro Ile
195 200 205
Asn Gln Ala Leu Thr Leu Met Thr Lys Asn Val Lys Pro Leu Gln Ser
210 215 220
Val Gly Ser Gly Arg Arg Gln Arg Arg Phe Ala Gly Val Val Leu Ala
225 230 235 240
Gly Ala Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile
245 250 255
Ala Leu His Gln Ser Asn Leu Asn Ala Gln Ala Ile Gln Ser Leu Arg
260 265 270
Thr Ser Leu Glu Gln Ser Asn Lys Ala Ile Glu Glu Ile Arg Glu Ala
275 280 285
Thr Gln Glu Thr Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gln Asp Tyr Val Asn
290 295 300
Asn Glu Leu Val Pro Ala Met Gln His Met Ser Cys Glu Leu Val Gly
305 310 315 320
Gln Arg Leu Gly Leu Lys Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Leu Leu Ser
325 330 335
Ile Phe Gly Pro Ser Leu Arg Asp Pro Ile Ser Ala Glu Ile Ser Ile
340 345 350
Gln Ala Leu Ser Tyr Ala Leu Gly Gly Glu Ile His Lys Ile Leu Glu
355 360 365
Lys Leu Gly Tyr Ser Gly Asn Asp Met Ile Ala Ile Leu Glu Ser Arg
370 375 380
Gly Ile Lys Thr Lys Ile Thr His Val Asp Leu Pro Gly Lys Phe Ile
385 390 395 400
Ile Leu Ser Val Ser Tyr Pro Thr Leu Ser Glu Val Lys Gly Val Ile
405 410 415
Val His Arg Leu Glu Ala Val Ser Tyr Asn Ile Gly Ser Gln Glu Trp
420 425 430
Tyr Thr Thr Val Pro Arg Tyr Val Ala Thr Asn Gly Tyr Leu Ile Ser
435 440 445
Asn Phe Asp Glu Ser Ser Cys Val Phe Val Ser Glu Ser Ala Ile Cys
450 455 460
Ser Gln Asn Ser Leu Tyr Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln Gln Cys Ile
465 470 475 480
Arg Gly Asp Thr Ser Ser Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser Gly Thr Met
485 490 495
Gly Asn Lys Phe Ile Leu Ser Lys Gly Asn Ile Val Ala Asn Cys Ala
500 505 510
Ser Ile Leu Cys Lys Cys Tyr Ser Thr Ser Thr Ile Ile Asn Gln Ser
515 520 525
Pro Asp Lys Leu Leu Thr Phe Ile Ala Ser Asp Thr Cys Pro Leu Val
530 535 540
Glu Ile Asp Gly Val Thr Ile Gln Val Gly Ser Arg Gln Tyr Pro Asp
545 550 555 560
Met Val Tyr Glu Ser Lys Val Ala Leu Gly Pro Ala Ile Ser Leu Glu
565 570 575
Arg Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Leu Lys Lys Leu Asp
580 585 590
Asp Ala Lys Val Leu Ile Asp Ser Ser Asn Gln Ile Leu Glu Thr Val
595 600 605
Arg Arg Ser Ser Phe Asn Phe Gly Ser Leu Leu Ser Val Pro Ile Leu
610 615 620
Ser Cys Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ile Cys Cys Cys Lys Arg
625 630 635 640
Arg Tyr Gln Gln Thr His Lys Gln Asn Thr Lys Val Asp Pro Thr Phe
645 650 655
Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Arg Ser Tyr Val Arg Ser Leu
660 665 670
<210> 8
<211> 546
<212> PRT
<213> 小反刍兽疫病毒（Peste-des-petits-ruminants virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 8
Met Thr Arg Val Ala Ile Leu Thr Phe Leu Phe Leu Phe Pro Asn Ala
1 5 10 15
Val Ala Cys Gln Ile His Trp Gly Asn Leu Ser Lys Ile Gly Ile Val
20 25 30
Gly Thr Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val Met Thr Arg Pro Ser His Gln
35 40 45
Thr Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Asn Ile Thr Ala Ile Asp Asn Cys
50 55 60
Thr Lys Ser Glu Ile Ala Glu Tyr Lys Arg Leu Leu Ile Thr Val Leu
65 70 75 80
Lys Pro Val Glu Asp Ala Leu Ser Val Ile Thr Lys Asn Val Arg Pro
85 90 95
Ile Gln Thr Leu Thr Pro Gly Arg Arg Thr Arg Arg Phe Ala Gly Ala
100 105 110
Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr
115 120 125
Ala Gly Val Ala Leu His Gln Ser Leu Met Asn Ser Gln Ala Ile Glu
130 135 140
Ser Leu Lys Thr Ser Leu Glu Lys Ser Asn Gln Ala Ile Glu Glu Ile
145 150 155 160
Arg Leu Ala Asn Lys Glu Thr Ile Leu Ala Val Gln Gly Val Gln Asp
165 170 175
Tyr Ile Asn Asn Glu Leu Val Pro Ser Val His Arg Met Ser Cys Glu
180 185 190
Leu Val Gly His Lys Leu Gly Leu Lys Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu
195 200 205
Ile Leu Ser Ile Phe Gly Pro Ser Leu Arg Asp Pro Ile Ala Ala Glu
210 215 220
Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala Leu Gly Gly Asp Ile Asn Arg
225 230 235 240
Ile Leu Asp Lys Leu Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Phe Leu Ala Ile Leu
245 250 255
Glu Ser Lys Gly Ile Lys Ala Arg Val Thr Tyr Val Asp Thr Arg Asp
260 265 270
Tyr Phe Ile Ile Leu Ser Ile Ala Tyr Pro Thr Leu Ser Glu Ile Lys
275 280 285
Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Ala Ile Thr Tyr Asn Ile Gly Ala
290 295 300
Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Ile Pro Lys Tyr Val Ala Thr Gln Gly Tyr
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Thr Ser Cys Val Phe Thr Pro Asp Gly
325 330 335
Thr Val Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln
340 345 350
Glu Cys Phe Gln Gly Ser Thr Lys Ser Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser
355 360 365
Gly Thr Ile Ser Asn Arg Phe Ile Leu Ser Lys Gly Asn Leu Ile Ala
370 375 380
Asn Cys Ala Ser Val Leu Cys Lys Cys Tyr Thr Thr Glu Thr Val Ile
385 390 395 400
Ser Gln Asp Pro Asp Lys Leu Leu Thr Val Val Ala Ser Asp Lys Cys
405 410 415
Pro Val Val Glu Val Asp Gly Val Thr Ile Gln Val Gly Ser Arg Glu
420 425 430
Tyr Pro Asp Ser Val Tyr Leu His Lys Ile Asp Leu Gly Pro Ala Ile
435 440 445
Ser Leu Glu Lys Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Val Thr
450 455 460
Arg Leu Glu Asn Ala Lys Glu Leu Leu Asp Ala Ser Asp Gln Ile Leu
465 470 475 480
Lys Thr Val Lys Gly Val Pro Phe Gly Gly Asn Met Tyr Ile Ala Leu
485 490 495
Ala Ala Cys Ile Gly Val Ser Leu Gly Leu Val Thr Leu Ile Cys Cys
500 505 510
Cys Lys Gly Arg Cys Lys Asn Lys Glu Val Pro Ile Ser Lys Ile Asn
515 520 525
Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg
530 535 540
Ser Leu
545
<210> 9
<211> 546
<212> PRT
<213> 亨德拉病毒（Hendra virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 9
Met Ala Thr Gln Glu Val Arg Leu Lys Cys Leu Leu Cys Gly Ile Ile
1 5 10 15
Val Leu Val Leu Ser Leu Glu Gly Leu Gly Ile Leu His Tyr Glu Lys
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Ile Thr Arg Lys Tyr Lys Ile
35 40 45
Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val Ile Lys Met Ile Pro Asn
50 55 60
Val Ser Asn Val Ser Lys Cys Thr Gly Thr Val Met Glu Asn Tyr Lys
65 70 75 80
Ser Arg Leu Thr Gly Ile Leu Ser Pro Ile Lys Gly Ala Ile Glu Leu
85 90 95
Tyr Asn Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly Asp Val Lys Leu Ala Gly
100 105 110
Val Val Met Ala Gly Ile Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln Ile
115 120 125
Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met Lys Asn Ala Asp Asn Ile
130 135 140
Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr Asn Glu Ala Val Val Lys
145 150 155 160
Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr Val Leu Thr Ala Leu Gln
165 170 175
Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr Ile Asp Gln Ile Ser Cys
180 185 190
Lys Gln Thr Glu Leu Ala Leu Asp Leu Ala Leu Ser Lys Tyr Leu Ser
195 200 205
Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asp Pro Val Ser Asn
210 215 220
Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Glu
225 230 235 240
Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr Glu Asp Phe Asp Asp Leu
245 250 255
Leu Glu Ser Asp Ser Ile Ala Gly Gln Ile Val Tyr Val Asp Leu Ser
260 265 270
Ser Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe Pro Ile Leu Thr Glu Ile
275 280 285
Gln Gln Ala Tyr Val Gln Glu Leu Leu Pro Val Ser Phe Asn Asn Asp
290 295 300
Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn Phe Val Leu Ile Arg Asn
305 310 315 320
Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Val Lys Tyr Cys Leu Ile Thr Lys Lys
325 330 335
Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr Pro Met Thr Ala Ser Val
340 345 350
Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Asp Lys Cys Pro Arg Glu Leu Val
355 360 365
Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu Ser Gly Gly Val Leu Phe
370 375 380
Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys Gln Thr Thr Gly Arg Ala
385 390 395 400
Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu Met Ile Asp Asn Thr Thr
405 410 415
Cys Thr Thr Val Val Leu Gly Asn Ile Ile Ile Ser Leu Gly Lys Tyr
420 425 430
Leu Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Ser Glu Ser Ile Ala Val Gly Pro Pro
435 440 445
Val Tyr Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser Gln Ile Ser Ser Met Asn
450 455 460
Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile Lys Glu Ala Gln Lys Ile
465 470 475 480
Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser Met Leu Ser Met Ile Ile
485 490 495
Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ala Leu Cys Ile Gly Leu Ile Thr Phe
500 505 510
Ile Ser Phe Val Ile Val Glu Lys Lys Arg Gly Asn Tyr Ser Arg Leu
515 520 525
Asp Asp Arg Gln Val Arg Pro Val Ser Asn Gly Asp Leu Tyr Tyr Ile
530 535 540
Gly Thr
545
<210> 10
<211> 565
<212> PRT
<213> 仙台病毒（Sendai virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 10
Met Ala Thr Tyr Ile Gln Arg Val Gln Cys Ile Ser Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Val Leu Thr Thr Leu Val Ser Cys Gln Ile Pro Arg Asp Arg Leu
20 25 30
Ser Asn Ile Gly Val Ile Val Asp Glu Gly Lys Ser Leu Lys Ile Ala
35 40 45
Gly Ser His Glu Ser Arg Tyr Ile Val Leu Ser Leu Val Pro Gly Ile
50 55 60
Asp Leu Glu Asn Gly Cys Gly Thr Ala Gln Val Ile Gln Tyr Lys Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Arg Leu Leu Ile Pro Leu Arg Asp Ala Leu Asp Leu Gln
85 90 95
Glu Ala Leu Ile Thr Val Thr Asn Asp Thr Met Thr Gly Ala Asp Val
100 105 110
Pro Gln Ser Arg Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly
115 120 125
Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu Ala Glu Ala
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ala Leu Ile Lys Glu Ser Met Thr Lys
145 150 155 160
Thr His Lys Ser Ile Glu Leu Leu Gln Asn Ala Val Gly Glu Gln Ile
165 170 175
Leu Ala Leu Lys Thr Leu Gln Asp Phe Val Asn Asp Glu Ile Lys Pro
180 185 190
Ala Ile Ser Glu Leu Gly Cys Glu Thr Ala Ala Leu Arg Leu Gly Ile
195 200 205
Lys Leu Thr Gln His Tyr Ser Glu Leu Leu Thr Ala Phe Gly Ser Asn
210 215 220
Phe Gly Thr Ile Gly Glu Lys Ser Leu Thr Leu Gln Ala Leu Ser Ser
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Ala Asn Ile Thr Glu Ile Met Thr Thr Ile Arg Thr Gly
245 250 255
Gln Ser Asn Ile Tyr Asp Val Ile Tyr Thr Glu Gln Ile Lys Gly Thr
260 265 270
Val Ile Asp Val Asp Leu Glu Arg Tyr Met Val Thr Leu Ser Val Lys
275 280 285
Ile Pro Ile Leu Ser Glu Val Pro Gly Val Leu Ile His Lys Ala Ser
290 295 300
Ser Ile Ser Tyr Asn Ile Asp Gly Glu Glu Trp Tyr Val Thr Val Pro
305 310 315 320
Ser His Ile Leu Ser Arg Ala Ser Phe Leu Gly Gly Ala Asn Ile Ala
325 330 335
Asp Cys Val Glu Ser Arg Leu Thr Tyr Ile Cys Pro Arg Asp Pro Ala
340 345 350
Gln Leu Ile Pro Asp Ser Gln Gln Lys Cys Ile Leu Gly Asp Thr Thr
355 360 365
Arg Cys Pro Val Thr Lys Val Val Asp Asn Ile Ile Pro Lys Phe Ala
370 375 380
Phe Val Asn Gly Gly Val Val Ala Asn Cys Ile Ala Ser Thr Cys Thr
385 390 395 400
Cys Gly Thr Gly Arg Arg Pro Ile Ser Gln Asp Arg Ser Lys Gly Val
405 410 415
Val Phe Leu Thr His Asp Asn Cys Gly Leu Ile Gly Val Asn Gly Ile
420 425 430
Glu Leu Tyr Ala Asn Arg Lys Gly His Asp Ala Thr Trp Gly Val Gln
435 440 445
Asn Leu Thr Val Gly Pro Ala Ile Ala Ile Arg Pro Val Asp Ile Ser
450 455 460
Leu Asn Leu Ala Ala Ala Thr Asp Phe Leu Gln Asp Ser Arg Ala Glu
465 470 475 480
Leu Glu Lys Ala Arg Lys Ile Leu Ser Glu Val Gly Arg Trp Tyr Asn
485 490 495
Ser Gly Ala Thr Leu Ile Thr Ile Ile Val Val Met Ile Val Val Leu
500 505 510
Val Val Ile Ile Val Ile Val Ile Val Leu Tyr Arg Leu Arg Arg Ser
515 520 525
Met Leu Met Ser Asn Pro Ala Gly Arg Ile Ser Arg Asp Thr Tyr Thr
530 535 540
Leu Glu Pro Lys Ile Arg His Met Tyr Thr Asn Gly Gly Phe Asp Ala
545 550 555 560
Met Thr Glu Lys Arg
565
<210> 11
<211> 555
<212> PRT
<213> 人类副流感病毒1病毒株华盛顿/1964（Human parainfluenza virus 1 strainWashington/1964）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> F糖蛋白
<400> 11
Met Gln Lys Ser Glu Ile Leu Phe Leu Val Tyr Ser Ser Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Ser Ser Leu Cys Gln Ile Pro Val Glu Lys Leu Ser Asn Val Gly
20 25 30
Val Ile Ile Asn Glu Gly Lys Leu Leu Lys Ile Ala Gly Ser Tyr Glu
35 40 45
Ser Arg Tyr Ile Val Leu Ser Leu Val Pro Ser Ile Asp Leu Gln Asp
50 55 60
Gly Cys Gly Thr Thr Gln Ile Ile Gln Tyr Lys Asn Leu Leu Asn Arg
65 70 75 80
Leu Leu Ile Pro Leu Lys Asp Ala Leu Asp Leu Gln Glu Ser Leu Ile
85 90 95
Thr Ile Thr Asn Asp Thr Thr Val Thr Asn Asp Asn Pro Gln Thr Arg
100 105 110
Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala
115 120 125
Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu Ala Glu Ala Arg Glu Ala Arg
130 135 140
Lys Asp Ile Ala Leu Ile Lys Asp Ser Ile Val Lys Thr His Asn Ser
145 150 155 160
Val Glu Leu Ile Gln Arg Gly Ile Gly Glu Gln Ile Ile Ala Leu Lys
165 170 175
Thr Leu Gln Asp Phe Val Asn Asp Glu Ile Arg Pro Ala Ile Gly Glu
180 185 190
Leu Arg Cys Glu Thr Thr Ala Leu Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Gln
195 200 205
His Tyr Ser Glu Leu Ala Thr Ala Phe Ser Ser Asn Leu Gly Thr Ile
210 215 220
Gly Glu Lys Ser Leu Thr Leu Gln Ala Leu Ser Ser Leu Tyr Ser Ala
225 230 235 240
Asn Ile Thr Glu Ile Leu Ser Thr Thr Lys Lys Asp Lys Ser Asp Ile
245 250 255
Tyr Asp Ile Ile Tyr Thr Glu Gln Val Lys Gly Thr Val Ile Asp Val
260 265 270
Asp Leu Glu Lys Tyr Met Val Thr Leu Leu Val Lys Ile Pro Ile Leu
275 280 285
Ser Glu Ile Pro Gly Val Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Ser Ile Ser Tyr
290 295 300
Asn Ile Glu Gly Glu Glu Trp His Val Ala Ile Pro Asn Tyr Ile Ile
305 310 315 320
Asn Lys Ala Ser Ser Leu Gly Gly Ala Asp Val Thr Asn Cys Ile Glu
325 330 335
Ser Lys Leu Ala Tyr Ile Cys Pro Arg Asp Pro Thr Gln Leu Ile Pro
340 345 350
Asp Asn Gln Gln Lys Cys Ile Leu Gly Asp Val Ser Lys Cys Pro Val
355 360 365
Thr Lys Val Ile Asn Asn Leu Val Pro Lys Phe Ala Phe Ile Asn Gly
370 375 380
Gly Val Val Ala Asn Cys Ile Ala Ser Thr Cys Thr Cys Gly Thr Asn
385 390 395 400
Arg Ile Pro Val Asn Gln Asp Arg Ser Arg Gly Val Thr Phe Leu Thr
405 410 415
Tyr Thr Asn Cys Gly Leu Ile Gly Ile Asn Gly Ile Glu Leu Tyr Ala
420 425 430
Asn Lys Arg Gly Arg Asp Thr Thr Trp Gly Asn Gln Ile Ile Lys Val
435 440 445
Gly Pro Ala Val Ser Ile Arg Pro Val Asp Ile Ser Leu Asn Leu Ala
450 455 460
Ser Ala Thr Asn Phe Leu Glu Glu Ser Lys Thr Glu Leu Met Lys Ala
465 470 475 480
Arg Ala Ile Ile Ser Ala Val Gly Gly Trp His Asn Thr Glu Ser Thr
485 490 495
Gln Ile Ile Met Ile Ile Ile Val Cys Ile Leu Ile Ile Ile Ile Cys
500 505 510
Gly Ile Leu Tyr Tyr Leu Tyr Arg Val Arg Arg Leu Leu Val Met Ile
515 520 525
Asn Ser Thr His Asn Ser Pro Val Asn Ala Tyr Thr Leu Glu Ser Arg
530 535 540
Met Arg Asn Pro Tyr Met Gly Asn Asn Ser Asn
545 550 555
<210> 12
<211> 543
<212> PRT
<213> 猫科麻疹病毒（Feline morbillivirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 12
Met Gly Lys Ile Arg Val Ile Ile Ile Ser Ser Leu Leu Leu Ser Asn
1 5 10 15
Ile Thr Thr Ala Gln Val Gly Trp Asp Asn Leu Thr Ser Ile Gly Val
20 25 30
Ile Ser Thr Lys Gln Tyr Asp Tyr Lys Ile Thr Thr Leu Asn Thr Asn
35 40 45
Gln Leu Met Val Ile Lys Met Val Pro Asn Ile Ser Ser Ile Ile Asn
50 55 60
Cys Thr Lys Pro Glu Leu Met Lys Tyr Arg Glu Leu Val Leu Gly Val
65 70 75 80
Ile Arg Pro Ile Asn Glu Ser Leu Glu Leu Met Asn Ser Tyr Ile Asn
85 90 95
Met Arg Ala Gly Ser Glu Arg Phe Ile Gly Ala Val Ile Ala Gly Val
100 105 110
Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ser Gly Ile Ala Leu
115 120 125
His Asn Ser Ile Met Asn Lys Arg Gln Ile Gln Glu Leu Arg Lys Ala
130 135 140
Leu Ser Thr Thr Asn Lys Ala Ile Asp Glu Ile Arg Ile Ala Gly Glu
145 150 155 160
Arg Thr Leu Ile Ala Val Gln Gly Val Gln Asp Tyr Ile Asn Asn Ile
165 170 175
Ile Ile Pro Met Gln Asp Lys Leu Gln Cys Asp Ile Leu Ser Ser Gln
180 185 190
Leu Ala Ile Ala Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Asn Ile Leu Thr Val Phe
195 200 205
Gly Pro Ser Ile Arg Asp Pro Val Thr Ser Ile Ile Ser Ile Gln Ala
210 215 220
Leu Ser Gln Ala Phe Asn Gly Asn Leu Gln Ala Leu Leu Asp Gly Leu
225 230 235 240
Gly Tyr Thr Gly Arg Asp Leu Arg Asp Leu Leu Glu Ser Arg Ser Ile
245 250 255
Thr Gly Gln Ile Ile His Ala Asp Met Thr Asp Leu Phe Leu Val Leu
260 265 270
Arg Ile Asn Tyr Pro Ser Ile Thr Glu Met Gln Gly Val Thr Ile Tyr
275 280 285
Glu Leu Asn Ser Ile Thr Tyr His Ile Gly Pro Glu Glu Trp Tyr Thr
290 295 300
Ile Met Pro Asn Phe Ile Ala Val Gln Gly Phe Leu Thr Ser Asn Phe
305 310 315 320
Asp Glu Arg Lys Cys Ser Ile Thr Lys Ser Ser Ile Leu Cys Gln Gln
325 330 335
Asn Ser Ile Tyr Pro Met Ser Thr Glu Met Gln Arg Cys Ile Lys Gly
340 345 350
Glu Ile Arg Phe Cys Pro Arg Ser Lys Ala Val Gly Thr Leu Val Asn
355 360 365
Arg Phe Ile Leu Thr Lys Gly Asn Leu Met Ala Asn Cys Leu Gly Val
370 375 380
Ile Cys Arg Cys Tyr Ser Ser Gly Gln Ile Ile Thr Gln Asp Pro Ser
385 390 395 400
Lys Leu Ile Thr Ile Ile Ser Gln Glu Glu Cys Lys Glu Val Gly Val
405 410 415
Asp Gly Ile Arg Ile Met Val Gly Pro Arg Lys Leu Pro Asp Val Ile
420 425 430
Phe Asn Ala Arg Leu Glu Val Gly Val Pro Ile Ser Leu Ser Lys Leu
435 440 445
Asp Val Gly Thr Asp Leu Ala Ile Ala Ser Ala Lys Leu Asn Asn Ser
450 455 460
Lys Ala Leu Leu Glu Gln Ser Asp Lys Ile Leu Asp Ser Met Ser Lys
465 470 475 480
Leu Asp Ser Ile Asn Ser Arg Ile Thr Gly Leu Ile Leu Ala Ile Met
485 490 495
Ala Ile Phe Ile Ile Thr Val Thr Ile Ile Trp Ile Ile Tyr Lys Arg
500 505 510
Cys Arg Asn Lys Asp Asn Lys Phe Ser Thr Ser Ile Glu Pro Leu Tyr
515 520 525
Ile Pro Pro Ser Tyr Asn Ser Pro His Ser Val Val Lys Ser Ile
530 535 540
<210> 13
<211> 534
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒2（Avian paramyxovirus 2）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 13
Met Ile Ala Ala Leu Phe Ile Ser Leu Phe Ala Thr Cys Gly Ala Leu
1 5 10 15
Asp Asn Ser Val Leu Ala Pro Val Gly Ile Ala Ser Ala Gln Glu Trp
20 25 30
Gln Leu Ala Ala Tyr Thr Asn Thr Leu Ser Gly Thr Ile Ala Val Arg
35 40 45
Phe Val Pro Val Leu Pro Gly Asn Leu Ser Thr Cys Ala Gln Ala Thr
50 55 60
Leu Ala Glu Tyr Asn Lys Thr Val Thr Asn Ile Leu Gly Pro Leu Lys
65 70 75 80
Glu Asn Leu Glu Thr Leu Leu Ser Glu Pro Thr Lys Thr Ala Ala Arg
85 90 95
Phe Val Gly Ala Ile Ile Gly Thr Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ser
100 105 110
Ala Gln Ile Thr Ala Ala Val Ala Leu Asn Gln Ala Gln Glu Asn Ala
115 120 125
Arg Asn Ile Trp Arg Leu Lys Glu Ser Ile Arg Lys Thr Asn Glu Ala
130 135 140
Val Leu Glu Leu Lys Asp Gly Leu Ala Ser Thr Ala Ile Ala Leu Asp
145 150 155 160
Lys Val Gln Lys Phe Ile Asn Glu Asp Ile Ile Pro Gln Ile Lys Glu
165 170 175
Ile Asp Cys Gln Val Val Ala Asn Lys Leu Gly Val Tyr Leu Ser Leu
180 185 190
Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Ile Phe Gly Ala Gln Ile Thr Asn Pro
195 200 205
Ala Leu Thr Pro Leu Ser Tyr Gln Ala Leu Tyr Asn Leu Cys Gly Gly
210 215 220
Asp Met Gly Lys Leu Thr Glu Leu Ile Gly Val Lys Ala Lys Asp Ile
225 230 235 240
Asn Ser Leu Tyr Glu Ala Asn Leu Ile Thr Gly Gln Val Ile Gly Tyr
245 250 255
Asp Ser Glu Ser Gln Ile Ile Leu Ile Gln Val Ser Tyr Pro Ser Val
260 265 270
Ser Glu Val Thr Gly Val Arg Ala Thr Glu Leu Val Thr Val Ser Val
275 280 285
Thr Thr Pro Lys Gly Glu Gly Arg Ala Ile Ala Pro Lys Tyr Val Ala
290 295 300
Gln Ser Arg Val Val Thr Glu Glu Leu Asp Thr Ser Thr Cys Arg Phe
305 310 315 320
Ser Lys Thr Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Ile Ile Thr Arg Pro Leu Pro
325 330 335
Pro Leu Ile Ala Asn Cys Leu Asn Gly Leu Tyr Gln Asp Cys Gln Tyr
340 345 350
Thr Thr Glu Ile Gly Ala Leu Ser Ser Arg Phe Ile Thr Val Asn Gly
355 360 365
Gly Ile Ile Ala Asn Cys Arg Ala Thr Ile Cys Lys Cys Val Asn Pro
370 375 380
Pro Lys Ile Ile Val Gln Ser Asp Ala Ser Ser Leu Thr Val Ile Asp
385 390 395 400
Ser Ala Ile Cys Lys Asp Val Val Leu Asp Asn Val Gln Leu Arg Leu
405 410 415
Glu Gly Lys Leu Ser Ala Gln Tyr Phe Thr Asn Ile Thr Ile Asp Leu
420 425 430
Ser Gln Ile Thr Thr Ser Gly Ser Leu Asp Ile Ser Ser Glu Ile Gly
435 440 445
Ser Ile Asn Asn Thr Val Asn Lys Val Glu Glu Leu Ile Ala Glu Ser
450 455 460
Asn Ala Trp Leu Gln Ala Val Asn Pro His Leu Val Asn Asn Thr Ser
465 470 475 480
Ile Ile Val Leu Cys Val Leu Ala Ala Ile Phe Val Val Trp Leu Val
485 490 495
Ala Leu Thr Gly Cys Leu Ala Tyr Tyr Ile Lys Lys Ser Ser Ala Thr
500 505 510
Arg Met Val Gly Ile Gly Ser Ser Pro Ala Gly Asn Pro Tyr Val Ala
515 520 525
Gln Ser Ala Thr Lys Met
530
<210> 14
<211> 555
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒6（avian paramyxovirus 6）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 14
Met Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Ala Met Ala Pro Gly Arg Tyr Val
1 5 10 15
Ile Ile Phe Asn Leu Ile Leu Leu His Arg Val Val Ser Leu Asp Asn
20 25 30
Ser Arg Leu Leu Gln Gln Gly Ile Met Ser Ala Thr Glu Arg Glu Ile
35 40 45
Lys Val Tyr Thr Asn Ser Ile Thr Gly Ser Ile Ala Val Arg Leu Ile
50 55 60
Pro Asn Leu Pro Gln Glu Val Leu Lys Cys Ser Ala Gly Gln Ile Lys
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Asp Thr Leu Asn Arg Ile Phe Thr Pro Ile Lys Ala Asn
85 90 95
Leu Glu Arg Leu Leu Ala Thr Pro Ser Met Leu Glu Asp Asn Gln Asn
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Pro Arg Leu Ile Gly Ala Ile Ile Gly Thr Ala Ala
115 120 125
Leu Gly Leu Ala Thr Ala Ala Gln Val Thr Ala Ala Leu Ala Leu Asn
130 135 140
Gln Ala Gln Asp Asn Ala Lys Ala Ile Leu Asn Leu Lys Glu Ser Ile
145 150 155 160
Thr Lys Thr Asn Glu Ala Val Leu Glu Leu Lys Asp Ala Thr Gly Gln
165 170 175
Ile Ala Ile Ala Leu Asp Lys Thr Gln Arg Phe Ile Asn Asp Asn Ile
180 185 190
Leu Pro Ala Ile Asn Asn Leu Thr Cys Glu Val Ala Gly Ala Lys Val
195 200 205
Gly Val Glu Leu Ser Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Ser Thr Val Phe Gly
210 215 220
Ser Gln Ile Thr Asn Pro Ala Leu Ser Thr Leu Ser Ile Gln Ala Leu
225 230 235 240
Met Ser Leu Cys Gly Asn Asp Phe Asn Tyr Leu Leu Asn Leu Met Gly
245 250 255
Ala Lys His Ser Asp Leu Gly Ala Leu Tyr Glu Ala Asn Leu Ile Asn
260 265 270
Gly Arg Ile Ile Gln Tyr Asp Gln Ala Ser Gln Ile Met Val Ile Gln
275 280 285
Val Ser Val Pro Ser Ile Ser Ser Ile Ser Gly Leu Arg Leu Thr Glu
290 295 300
Leu Phe Thr Leu Ser Ile Glu Thr Pro Val Gly Glu Gly Lys Ala Val
305 310 315 320
Val Pro Gln Phe Val Val Glu Ser Gly Gln Leu Leu Glu Glu Ile Asp
325 330 335
Thr Gln Ala Cys Thr Leu Thr Asp Thr Thr Ala Tyr Cys Thr Ile Val
340 345 350
Arg Thr Lys Pro Leu Pro Glu Leu Val Ala Gln Cys Leu Arg Gly Asp
355 360 365
Glu Ser Arg Cys Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Gly Met Leu Glu Ser Arg
370 375 380
Phe Gly Val Phe Asp Gly Leu Val Ile Ala Asn Cys Lys Ala Thr Ile
385 390 395 400
Cys Arg Cys Leu Ala Pro Glu Met Ile Ile Thr Gln Asn Lys Gly Leu
405 410 415
Pro Leu Thr Val Ile Ser Gln Glu Thr Cys Lys Arg Ile Leu Ile Asp
420 425 430
Gly Val Thr Leu Gln Ile Glu Ala Gln Val Ser Gly Ser Tyr Ser Arg
435 440 445
Asn Ile Thr Val Gly Asn Ser Gln Ile Ala Pro Ser Gly Pro Leu Asp
450 455 460
Ile Ser Ser Glu Leu Gly Lys Val Asn Gln Ser Leu Ser Asn Val Glu
465 470 475 480
Asp Leu Ile Asp Gln Ser Asn Gln Leu Leu Asn Arg Val Asn Pro Asn
485 490 495
Ile Val Asn Asn Thr Ala Ile Ile Val Thr Ile Val Leu Leu Val Leu
500 505 510
Leu Val Leu Trp Cys Leu Ala Leu Thr Ile Ser Ile Leu Tyr Val Ser
515 520 525
Lys His Ala Val Arg Met Ile Lys Thr Val Pro Asn Pro Tyr Val Met
530 535 540
Gln Ala Lys Ser Pro Gly Ser Ala Thr Gln Phe
545 550 555
<210> 15
<211> 545
<212> PRT
<213> 矛头蛇副粘病毒（Fer-de-Lance paramyxovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白F
<400> 15
Met Thr Arg Ile Thr Ile Leu Gln Ile Ile Leu Thr Leu Thr Leu Pro
1 5 10 15
Val Met Cys Gln Val Ser Phe Asp Asn Leu Glu Gln Val Gly Val Met
20 25 30
Phe Asp Lys Pro Lys Phe Leu Lys Ile Thr Gly Pro Ala Ser Thr Ala
35 40 45
Thr Met Ile Ile Lys Leu Ile Pro Thr Leu Gly Thr Met Glu Ser Cys
50 55 60
Gly Thr Ser Ala Val Asn Glu Tyr Lys Lys Thr Leu Asp Thr Ile Leu
65 70 75 80
Val Pro Leu Arg Asp Thr Ile Asn Lys Leu Ser Thr Asp Ile Thr Val
85 90 95
Val Glu Gly Thr Ser Asn Ile Ser Asn Lys Arg Glu Lys Arg Phe Val
100 105 110
Gly Ile Ala Ile Ala Val Gly Ala Val Ala Leu Ala Thr Ser Ala Gln
115 120 125
Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu Ser Asn Thr Ile Lys Asn Ala Glu Ala
130 135 140
Ile Glu Ser Ile Lys Ser Ser Ile Gln Ala Ser Asn Gln Ala Ile Gln
145 150 155 160
Lys Val Ile Asp Ala Gln Gly Arg Thr Val Thr Val Ile Asn Gly Ile
165 170 175
Gln Asp His Ile Asn Ser Val Ile Asn Pro Ala Leu Asn Gln Leu Gly
180 185 190
Cys Asp Val Ala Lys Asn Thr Leu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Tyr Phe
195 200 205
Ser Lys Leu Ser Leu Leu Phe Gly Pro Asn Leu Arg Asn Pro Val Glu
210 215 220
Gln Pro Leu Ser Val Gln Ala Ile Ala Gly Leu Met Asp Gly Asp Ile
225 230 235 240
Asn Ala Val Val Ser Gln Leu Gly Tyr Thr Gln Ser Asp Leu Leu Asp
245 250 255
Leu Leu Ser Thr Glu Ser Ile Val Gly Thr Val Thr Ala Ile Asp Met
260 265 270
Val Asn Tyr Met Ile Gln Ile Glu Met Ser Phe Pro Gln Tyr Ile Thr
275 280 285
Ile Pro Asp Thr Lys Val Leu Glu Gly His Lys Ile Thr Phe Asn Asp
290 295 300
Lys Gly Ser Glu Trp Gln Thr Gln Val Pro Ser Thr Ile Ala Val Arg
305 310 315 320
Asp Ile Leu Ile Ala Gly Val Asp Pro Asp Gly Cys Ser Ile Thr Ser
325 330 335
Thr Ser Tyr Ile Cys Lys Asn Asp Pro Thr Tyr Ala Met Ser Glu Val
340 345 350
Leu Thr Asn Cys Phe Arg Gly Asn Thr Gln Glu Cys Pro Arg Ala Arg
355 360 365
Ile Thr Ser Thr Phe Ala Thr Arg Phe Ala Ile Ala Arg Ser Thr Val
370 375 380
Ile Ala Asn Cys Val Ala Ala Val Cys Leu Cys Gly Asp Pro Gly Ile
385 390 395 400
Pro Val Val Gln Lys Ala Glu Val Thr Leu Thr Ala Met Thr Leu Asp
405 410 415
Gln Cys Ser Leu Ile Thr Val Asp Gly Leu Gln Ile Lys Pro Ser Lys
420 425 430
Ser Ile Ala Asn Val Thr Ala Asn Phe Gly Asn Ile Thr Leu Gly Pro
435 440 445
Val Val Ser Val Gly Asp Leu Asp Leu Ser Ala Glu Leu Thr Lys Val
450 455 460
Gln Ser Asp Leu Lys Glu Ala Gln Asp Lys Leu Asp Glu Ser Asn Ala
465 470 475 480
Ile Leu Gln Gly Ile Asn Asn Lys Ile Leu Thr Ala Pro Thr Ser Ile
485 490 495
Ala Leu Ile Val Val Ser Val Val Val Ile Leu Leu Ile Ile Gly Met
500 505 510
Ile Ser Trp Leu Val Trp Leu Thr Lys Ala Val Arg Arg Ser Asn Thr
515 520 525
Arg Ser Glu Arg Val Thr Pro Ser Ala Tyr Asn Asn Leu Gly Phe Ile
530 535 540
Lys
545
<210> 16
<211> 566
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒4（Avian paramyxovirus 4）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 16
Met Arg Leu Ser Arg Thr Ile Leu Thr Leu Ile Leu Gly Thr Leu Thr
1 5 10 15
Gly Tyr Leu Met Gly Ala His Ser Thr Asn Val Asn Glu Gly Pro Lys
20 25 30
Ser Glu Gly Ile Arg Gly Asp Leu Ile Pro Gly Ala Gly Ile Phe Val
35 40 45
Thr Gln Val Arg Gln Leu Gln Ile Tyr Gln Gln Ser Gly Tyr His Asp
50 55 60
Leu Val Ile Arg Leu Leu Pro Leu Leu Pro Ala Glu Leu Asn Asp Cys
65 70 75 80
Gln Arg Glu Val Val Thr Glu Tyr Asn Asn Thr Val Ser Gln Leu Leu
85 90 95
Gln Pro Ile Lys Thr Asn Leu Asp Thr Leu Leu Ala Asp Gly Gly Thr
100 105 110
Arg Asp Ala Asp Ile Gln Pro Arg Phe Ile Gly Ala Ile Ile Ala Thr
115 120 125
Gly Ala Leu Ala Val Ala Thr Val Ala Glu Val Thr Ala Ala Gln Ala
130 135 140
Leu Ser Gln Ser Lys Thr Asn Ala Gln Asn Ile Leu Lys Leu Arg Asp
145 150 155 160
Ser Ile Gln Ala Thr Asn Gln Ala Val Phe Glu Ile Ser Gln Gly Leu
165 170 175
Glu Ala Thr Ala Thr Val Leu Ser Lys Leu Gln Thr Glu Leu Asn Glu
180 185 190
Asn Ile Ile Pro Ser Leu Asn Asn Leu Ser Cys Ala Ala Met Gly Asn
195 200 205
Arg Leu Gly Val Ser Leu Ser Leu Tyr Leu Thr Leu Met Thr Thr Leu
210 215 220
Phe Gly Asp Gln Ile Thr Asn Pro Val Leu Thr Pro Ile Ser Tyr Ser
225 230 235 240
Thr Leu Ser Ala Met Ala Gly Gly His Ile Gly Pro Val Met Ser Lys
245 250 255
Ile Leu Ala Gly Ser Val Thr Ser Gln Leu Gly Ala Glu Gln Leu Ile
260 265 270
Ala Ser Gly Leu Ile Gln Ser Gln Val Val Gly Tyr Asp Ser Gln Tyr
275 280 285
Gln Leu Leu Val Ile Arg Val Asn Leu Val Arg Ile Gln Glu Val Gln
290 295 300
Asn Thr Arg Val Val Ser Leu Arg Thr Leu Ala Val Asn Arg Asp Gly
305 310 315 320
Gly Leu Tyr Arg Ala Gln Val Pro Pro Glu Val Val Glu Arg Ser Gly
325 330 335
Ile Ala Glu Arg Phe Tyr Ala Asp Asp Cys Val Leu Thr Thr Thr Asp
340 345 350
Tyr Ile Cys Ser Ser Ile Arg Ser Ser Arg Leu Asn Pro Glu Leu Val
355 360 365
Lys Cys Leu Ser Gly Ala Leu Asp Ser Cys Thr Phe Glu Arg Glu Ser
370 375 380
Ala Leu Leu Ser Thr Pro Phe Phe Val Tyr Asn Lys Ala Val Val Ala
385 390 395 400
Asn Cys Lys Ala Ala Thr Cys Arg Cys Asn Lys Pro Pro Ser Ile Ile
405 410 415
Ala Gln Tyr Ser Ala Ser Ala Leu Val Thr Ile Thr Thr Asp Thr Cys
420 425 430
Ala Asp Leu Glu Ile Glu Gly Tyr Arg Phe Asn Ile Gln Thr Glu Ser
435 440 445
Asn Ser Trp Val Ala Pro Asn Phe Thr Val Ser Thr Ser Gln Ile Val
450 455 460
Ser Val Asp Pro Ile Asp Ile Ser Ser Asp Ile Ala Lys Ile Asn Ser
465 470 475 480
Ser Ile Glu Ala Ala Arg Glu Gln Leu Glu Leu Ser Asn Gln Ile Leu
485 490 495
Ser Arg Ile Asn Pro Arg Ile Val Asn Asp Glu Ser Leu Ile Ala Ile
500 505 510
Ile Val Thr Ile Val Val Leu Ser Leu Leu Val Ile Gly Leu Ile Val
515 520 525
Val Leu Gly Val Met Tyr Lys Asn Leu Lys Lys Val Gln Arg Ala Gln
530 535 540
Ala Ala Met Met Met Gln Gln Met Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Thr
545 550 555 560
Lys Leu Gly Thr Pro Phe
565
<210> 17
<211> 551
<212> PRT
<213> 人类副流感病毒2（Human parainfluenza virus 2）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 17
Met His His Leu His Pro Met Ile Val Cys Ile Phe Val Met Tyr Thr
1 5 10 15
Gly Ile Val Gly Ser Asp Ala Ile Ala Gly Asp Gln Leu Leu Asn Ile
20 25 30
Gly Val Ile Gln Ser Lys Ile Arg Ser Leu Met Tyr Tyr Thr Asp Gly
35 40 45
Gly Ala Ser Phe Ile Val Val Lys Leu Leu Pro Asn Leu Pro Pro Ser
50 55 60
Asn Gly Thr Cys Asn Ile Thr Ser Leu Asp Ala Tyr Asn Val Thr Leu
65 70 75 80
Phe Lys Leu Leu Thr Pro Leu Ile Glu Asn Leu Ser Lys Ile Ser Thr
85 90 95
Val Thr Asp Thr Lys Thr Arg Gln Lys Arg Phe Ala Gly Val Val Val
100 105 110
Gly Leu Ala Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala
115 120 125
Val Ala Ile Val Lys Ala Asn Ala Asn Ala Ala Ala Ile Asn Asn Leu
130 135 140
Ala Ser Ser Ile Gln Ser Thr Asn Lys Ala Val Ser Asp Val Ile Asp
145 150 155 160
Ala Ser Arg Thr Ile Ala Thr Ala Val Gln Ala Ile Gln Asp Arg Ile
165 170 175
Asn Gly Ala Ile Val Asn Gly Ile Thr Ser Ala Ser Cys Arg Ala His
180 185 190
Asp Ala Leu Ile Gly Ser Ile Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr
195 200 205
Thr Ile Phe His Asn Gln Ile Thr Asn Pro Ala Leu Thr Pro Leu Ser
210 215 220
Ile Gln Ala Leu Arg Ile Leu Leu Gly Ser Thr Leu Pro Ile Val Ile
225 230 235 240
Glu Ser Lys Leu Asn Thr Asn Phe Asn Thr Ala Glu Leu Leu Ser Ser
245 250 255
Gly Leu Leu Thr Gly Gln Ile Ile Ser Ile Ser Pro Met Tyr Met Gln
260 265 270
Met Leu Ile Gln Ile Asn Val Pro Thr Phe Ile Met Gln Pro Gly Ala
275 280 285
Lys Val Ile Asp Leu Ile Ala Ile Ser Ala Asn His Lys Leu Gln Glu
290 295 300
Val Val Val Gln Val Pro Asn Arg Ile Leu Glu Tyr Ala Asn Glu Leu
305 310 315 320
Gln Asn Tyr Pro Ala Asn Asp Cys Val Val Thr Pro Asn Ser Val Phe
325 330 335
Cys Arg Tyr Asn Glu Gly Ser Pro Ile Pro Glu Ser Gln Tyr Gln Cys
340 345 350
Leu Arg Gly Asn Leu Asn Ser Cys Thr Phe Thr Pro Ile Ile Gly Asn
355 360 365
Phe Leu Lys Arg Phe Ala Phe Ala Asn Gly Val Leu Tyr Ala Asn Cys
370 375 380
Lys Ser Leu Leu Cys Arg Cys Ala Asp Pro Pro His Val Val Ser Gln
385 390 395 400
Asp Asp Thr Gln Gly Ile Ser Ile Ile Asp Ile Lys Arg Cys Ser Glu
405 410 415
Met Met Leu Asp Thr Phe Ser Phe Arg Ile Thr Ser Thr Phe Asn Ala
420 425 430
Thr Tyr Val Thr Asp Phe Ser Met Ile Asn Ala Asn Ile Val His Leu
435 440 445
Ser Pro Leu Asp Leu Ser Asn Gln Ile Asn Ser Ile Asn Lys Ser Leu
450 455 460
Lys Ser Ala Glu Asp Trp Ile Ala Asp Ser Asn Phe Phe Ala Asn Gln
465 470 475 480
Ala Arg Thr Ala Lys Thr Leu Tyr Ser Leu Ser Ala Ile Ala Leu Ile
485 490 495
Leu Ser Val Ile Thr Leu Val Val Val Gly Leu Leu Ile Ala Tyr Ile
500 505 510
Ile Lys Leu Val Ser Gln Ile His Gln Phe Arg Ser Leu Ala Ala Thr
515 520 525
Thr Met Phe His Arg Glu Asn Pro Ala Phe Phe Ser Lys Asn Asn His
530 535 540
Gly Asn Ile Tyr Gly Ile Ser
545 550
<210> 18
<211> 541
<212> PRT
<213> 猪腮腺炎病毒（Porcine rubulavirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 18
Met Pro Gln Gln Gln Val Ala His Thr Cys Val Met Leu Trp Gly Ile
1 5 10 15
Ile Ser Thr Val Ser Gly Ile Asn Thr Glu Ala Leu Ser Gln Tyr Gly
20 25 30
Val Val Val Thr Asn Val Arg Gln Leu Thr Tyr Tyr Thr Gln Ala Gly
35 40 45
Ser Thr Tyr Leu Ala Val Arg Leu Leu Pro Ser Leu Ala Ser Pro Asp
50 55 60
Gln Ser Cys Ala Leu His Ser Ile Ile Asn Tyr Asn Ala Thr Leu Gln
65 70 75 80
Ala Ile Leu Ser Pro Ile Ala Glu Asn Leu Asn Leu Ile Ser Thr Ala
85 90 95
Leu Arg Glu Gln His Arg Lys Lys Arg Phe Ala Gly Val Ala Ile Gly
100 105 110
Leu Thr Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala Val
115 120 125
Ala Leu Val Arg Ala Asn Lys Asn Ala Glu Lys Val Glu Gln Leu Ser
130 135 140
Gln Ala Leu Gly Glu Thr Asn Ala Ala Ile Ser Asp Leu Ile Asp Ala
145 150 155 160
Thr Lys Asn Leu Gly Phe Ala Val Gln Ala Ile Gln Asn Gln Ile Asn
165 170 175
Thr Ala Ile Leu Pro Gln Ile His Asn Leu Ser Cys Gln Val Ile Asp
180 185 190
Ala Gln Leu Gly Asn Ile Leu Ser Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr
195 200 205
Val Phe Gln Pro Gln Leu Thr Asn Pro Ala Leu Ser Pro Leu Thr Ile
210 215 220
Gln Ala Leu Arg Ala Val Leu Gly Thr Thr Leu Pro Ala Leu Leu Ser
225 230 235 240
Glu Lys Leu Lys Ser Asn Ile Pro Leu Gly Asp Leu Met Ser Ser Gly
245 250 255
Leu Leu Lys Gly Gln Leu Val Gly Leu Asn Leu Gln Asn Met Leu Met
260 265 270
Ile Ile Glu Leu Tyr Ile Pro Thr Leu Ser Thr His Ser Thr Ala Lys
275 280 285
Val Leu Asp Leu Val Thr Ile Ser Ser His Val Asn Gly Arg Glu Val
290 295 300
Glu Ile Gln Val Pro Asn Arg Val Leu Glu Leu Gly Ser Glu Val Leu
305 310 315 320
Gly Tyr Gly Gly Ser Glu Cys Ala Leu Thr Met Ser His Ile Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Asn Asp Ala Arg Val Leu Ser Thr Asp Met Lys Tyr Cys Leu
340 345 350
Gln Gly Asn Ile Thr His Cys Ile Phe Ser Pro Val Val Gly Ser Phe
355 360 365
Leu Arg Arg Phe Ala Leu Val Asn Gly Val Val Ile Ala Asn Cys Ala
370 375 380
Asp Met Ser Cys Val Cys Phe Asp Pro Gln Glu Ile Ile Tyr Gln Asn
385 390 395 400
Phe Gln Glu Pro Thr Thr Val Ile Asp Ile Lys Lys Cys Gly Lys Val
405 410 415
Gln Leu Asp Thr Leu Thr Phe Thr Ile Ser Thr Phe Ala Asn Arg Thr
420 425 430
Tyr Gly Pro Pro Ala Tyr Val Pro Pro Asp Asn Ile Ile Gln Ser Glu
435 440 445
Pro Leu Asp Ile Ser Gly Asn Leu Ile Ala Val Asn Asn Ser Leu Ser
450 455 460
Ser Ala Leu Asn His Leu Ala Thr Ser Glu Ile Leu Arg Asn Glu Gln
465 470 475 480
Ile Trp Thr Ser Ser Leu Gly Ile Ser Thr Ile Val Ala Leu Val Ile
485 490 495
Ile Gly Ile Leu Ile Ile Cys Leu Val Val Thr Trp Ala Ala Leu Trp
500 505 510
Ala Leu Leu Lys Glu Val Arg Gly Leu Asn Ser Ala Val Asn Ser Gln
515 520 525
Leu Ser Ser Tyr Val Met Gly Asp Lys Phe Ile Arg Tyr
530 535 540
<210> 19
<211> 551
<212> PRT
<213> 副流感病毒5（Parainfluenza virus 5）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 19
Met Gly Thr Arg Ile Gln Phe Leu Met Val Ser Cys Leu Leu Ala Gly
1 5 10 15
Thr Gly Ser Leu Asp Pro Ala Ala Leu Met Gln Ile Gly Val Ile Pro
20 25 30
Thr Asn Val Arg Gln Leu Met Tyr Tyr Thr Glu Ala Ser Ser Ala Phe
35 40 45
Ile Val Val Lys Leu Met Pro Thr Ile Asp Ser Pro Ile Ser Gly Cys
50 55 60
Asn Ile Thr Ser Ile Ser Ser Tyr Asn Ala Thr Met Thr Lys Leu Leu
65 70 75 80
Gln Pro Ile Gly Glu Asn Leu Glu Thr Ile Arg Tyr Gln Leu Ile Pro
85 90 95
Thr Arg Arg Arg Arg Arg Phe Val Gly Val Val Ile Gly Leu Ala Ala
100 105 110
Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Val Thr Ala Ala Val Ala Leu Val
115 120 125
Lys Ala Asn Lys Asn Ala Ala Ala Ile Leu Asn Leu Lys Asn Ala Ile
130 135 140
Gln Lys Thr Asn Ala Ala Val Ala Asp Val Val Gln Ala Thr Gln Ser
145 150 155 160
Leu Gly Thr Ala Val Gln Ala Val Gln Asp His Ile Asn Ser Val Val
165 170 175
Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Asn Cys Lys Ala Gln Asp Ala Ile Ile
180 185 190
Gly Ser Ile Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Ile Phe His
195 200 205
Asn Gln Ile Thr Asn Pro Ala Leu Ser Pro Ile Thr Ile Gln Ala Leu
210 215 220
Arg Ile Leu Leu Gly Ser Thr Leu Pro Thr Val Val Arg Lys Ser Phe
225 230 235 240
Asn Thr Gln Ile Ser Ala Ala Glu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Leu Thr
245 250 255
Gly Gln Ile Val Gly Leu Asp Leu Thr Tyr Met Gln Met Val Ile Lys
260 265 270
Ile Glu Leu Pro Thr Leu Thr Val Gln Pro Ala Thr Gln Ile Ile Asp
275 280 285
Leu Val Thr Ile Ser Ala Phe Ile Asn Asn Arg Glu Val Met Ala Gln
290 295 300
Leu Pro Thr Arg Ile Ile Val Thr Gly Ser Leu Ile Gln Ala Tyr Pro
305 310 315 320
Ala Ser Gln Cys Thr Ile Thr Pro Asn Thr Val Tyr Cys Arg Tyr Asn
325 330 335
Asp Ala Gln Val Leu Ser Asp Asp Thr Met Ala Cys Leu Gln Gly Asn
340 345 350
Leu Thr Arg Cys Thr Phe Ser Pro Val Val Gly Ser Phe Leu Thr Arg
355 360 365
Phe Val Leu Phe Asp Gly Ile Val Tyr Ala Asn Cys Arg Ser Met Leu
370 375 380
Cys Lys Cys Met Gln Pro Ala Ala Val Ile Leu Gln Pro Ser Ser Ser
385 390 395 400
Pro Val Thr Val Ile Asp Met His Lys Cys Val Ser Leu Gln Leu Asp
405 410 415
Asn Leu Arg Phe Thr Ile Thr Gln Leu Ala Asn Ile Thr Tyr Asn Ser
420 425 430
Thr Ile Lys Leu Glu Thr Ser Gln Ile Leu Pro Ile Asp Pro Leu Asp
435 440 445
Ile Ser Gln Asn Leu Ala Ala Val Asn Lys Ser Leu Ser Asp Ala Leu
450 455 460
Gln His Leu Ala Gln Ser Asp Thr Tyr Leu Ser Ala Ile Thr Ser Ala
465 470 475 480
Thr Thr Thr Ser Val Leu Ser Ile Ile Ala Ile Cys Leu Gly Ser Leu
485 490 495
Gly Leu Ile Leu Ile Ile Leu Ile Ser Val Val Val Trp Lys Leu Leu
500 505 510
Thr Ile Val Ala Ala Asn Arg Asn Arg Met Glu Asn Phe Val Tyr His
515 520 525
Asn Ser Ala Phe His His Ser Arg Ser Asp Leu Ser Glu Lys Asn Gln
530 535 540
Pro Ala Thr Leu Gly Thr Arg
545 550
<210> 20
<211> 537
<212> PRT
<213> 鼠类肺炎病毒（Murine pneumonia virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合糖蛋白前体
<400> 20
Met Ile Pro Gly Arg Ile Phe Leu Val Leu Leu Val Ile Phe Asn Thr
1 5 10 15
Lys Pro Ile His Pro Asn Thr Leu Thr Glu Lys Phe Tyr Glu Ser Thr
20 25 30
Cys Ser Val Glu Thr Ala Gly Tyr Lys Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp
35 40 45
His Met Thr Val Met Ser Ile Lys Leu Ser Gln Ile Asn Ile Glu Ser
50 55 60
Cys Lys Ser Ser Asn Ser Leu Leu Ala His Glu Leu Ala Ile Tyr Ser
65 70 75 80
Ser Ala Val Asp Glu Leu Arg Thr Leu Ser Ser Asn Ala Leu Lys Ser
85 90 95
Lys Arg Lys Lys Arg Phe Leu Gly Leu Ile Leu Gly Leu Gly Ala Ala
100 105 110
Val Thr Ala Gly Val Ala Leu Ala Lys Thr Val Gln Leu Glu Ser Glu
115 120 125
Ile Ala Leu Ile Arg Asp Ala Val Arg Asn Thr Asn Glu Ala Val Val
130 135 140
Ser Leu Thr Asn Gly Met Ser Val Leu Ala Lys Val Val Asp Asp Leu
145 150 155 160
Lys Asn Phe Ile Ser Lys Glu Leu Leu Pro Lys Ile Asn Arg Val Ser
165 170 175
Cys Asp Val His Asp Ile Thr Ala Val Ile Arg Phe Gln Gln Leu Asn
180 185 190
Lys Arg Leu Leu Glu Val Ser Arg Glu Phe Ser Ser Asn Ala Gly Leu
195 200 205
Thr His Thr Val Ser Ser Phe Met Leu Thr Asp Arg Glu Leu Thr Ser
210 215 220
Ile Val Gly Gly Met Ala Val Ser Ala Gly Gln Lys Glu Ile Met Leu
225 230 235 240
Ser Ser Lys Ala Ile Met Arg Arg Asn Gly Leu Ala Ile Leu Ser Ser
245 250 255
Val Asn Ala Asp Thr Leu Val Tyr Val Ile Gln Leu Pro Leu Phe Gly
260 265 270
Val Met Asp Thr Asp Cys Trp Val Ile Arg Ser Ser Ile Asp Cys His
275 280 285
Asn Ile Ala Asp Lys Tyr Ala Cys Leu Ala Arg Ala Asp Asn Gly Trp
290 295 300
Tyr Cys His Asn Ala Gly Ser Leu Ser Tyr Phe Pro Ser Pro Thr Asp
305 310 315 320
Cys Glu Ile His Asn Gly Tyr Ala Phe Cys Asp Thr Leu Lys Ser Leu
325 330 335
Thr Val Pro Val Thr Ser Arg Glu Cys Asn Ser Asn Met Tyr Thr Thr
340 345 350
Asn Tyr Asp Cys Lys Ile Ser Thr Ser Lys Thr Tyr Val Ser Thr Ala
355 360 365
Val Leu Thr Thr Met Gly Cys Leu Val Ser Cys Tyr Gly His Asn Ser
370 375 380
Cys Thr Val Ile Asn Asn Asp Lys Gly Ile Ile Arg Thr Leu Pro Asp
385 390 395 400
Gly Cys His Tyr Ile Ser Asn Lys Gly Val Asp Arg Val Gln Val Gly
405 410 415
Asn Thr Val Tyr Tyr Leu Ser Lys Glu Val Gly Lys Ser Ile Val Val
420 425 430
Arg Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Tyr Asp Pro Leu Ser Phe Pro Asp
435 440 445
Asp Lys Phe Asp Val Ala Ile Arg Asp Val Glu His Ser Ile Asn Gln
450 455 460
Thr Arg Thr Phe Leu Lys Ala Ser Asp Gln Leu Leu Asp Leu Ser Glu
465 470 475 480
Asn Arg Glu Asn Lys Asn Leu Asn Lys Ser Tyr Ile Leu Thr Thr Leu
485 490 495
Leu Phe Val Val Met Leu Ile Ile Ile Met Ala Val Ile Gly Phe Ile
500 505 510
Leu Tyr Lys Val Leu Lys Met Ile Arg Asp Asn Lys Leu Lys Ser Lys
515 520 525
Ser Thr Pro Gly Leu Thr Val Leu Ser
530 535
<210> 21
<211> 543
<212> PRT
<213> 人类副流感病毒4a（Human parainfluenza virus 4a）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 21
Met Gly Val Lys Gly Leu Ser Leu Ile Met Ile Gly Leu Leu Ile Ser
1 5 10 15
Pro Ile Thr Asn Leu Asp Ile Thr His Leu Met Asn Leu Gly Thr Val
20 25 30
Pro Thr Ala Ile Arg Ser Leu Val Tyr Tyr Thr Tyr Thr Lys Pro Ser
35 40 45
Tyr Leu Thr Val Asp Leu Ile Pro Asn Leu Lys Asn Leu Asp Gln Asn
50 55 60
Cys Asn Tyr Ser Ser Leu Asn Tyr Tyr Asn Lys Thr Ala Leu Ser Leu
65 70 75 80
Ile Gln Pro Ile Ala Asp Asn Ile Asn Arg Leu Thr Lys Pro Ile Thr
85 90 95
Ser Ser Glu Ile Gln Ser Arg Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile
100 105 110
Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Val Thr Ala Ala Ile Gly Leu
115 120 125
Ala Lys Ala Gln Glu Asn Ala Lys Leu Ile Leu Thr Leu Lys Lys Ala
130 135 140
Ala Thr Glu Thr Asn Glu Ala Val Arg Asp Leu Ala Asn Ser Asn Lys
145 150 155 160
Ile Val Val Lys Met Ile Ser Ala Ile Gln Asn Gln Ile Asn Thr Ile
165 170 175
Ile Gln Pro Ala Ile Asp Gln Ile Asn Cys Gln Ile Lys Asp Leu Gln
180 185 190
Val Ala Asn Ile Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Ile Thr Thr Val Phe
195 200 205
His Asn Gln Leu Thr Asn Pro Ala Leu Glu Ser Ile Ser Ile Gln Ala
210 215 220
Leu Lys Ser Leu Leu Gly Pro Thr Leu Pro Glu Val Leu Ser Lys Leu
225 230 235 240
Asp Leu Asn Asn Ile Ser Ala Ala Ser Val Met Ala Ser Gly Leu Ile
245 250 255
Lys Gly Gln Ile Ile Ala Val Asp Ile Pro Thr Met Thr Leu Val Leu
260 265 270
Met Val Gln Ile Pro Ser Ile Ser Pro Leu Arg Gln Ala Lys Ile Ile
275 280 285
Asp Leu Thr Ser Ile Thr Ile His Thr Asn Ser Gln Glu Val Gln Ala
290 295 300
Val Val Pro Ala Arg Phe Leu Glu Ile Gly Ser Glu Ile Leu Gly Phe
305 310 315 320
Asp Gly Ser Val Cys Gln Ile Thr Lys Asp Thr Ile Phe Cys Pro Tyr
325 330 335
Asn Asp Ala Tyr Glu Leu Pro Ile Gln Gln Lys Arg Cys Leu Gln Gly
340 345 350
Gln Thr Arg Asp Cys Val Phe Thr Pro Val Ala Gly Thr Phe Pro Arg
355 360 365
Arg Phe Leu Thr Thr Tyr Gly Thr Ile Val Ala Asn Cys Arg Asp Leu
370 375 380
Val Cys Ser Cys Leu Arg Pro Pro Gln Ile Ile Tyr Gln Pro Asp Glu
385 390 395 400
Asn Pro Val Thr Ile Ile Asp Lys Asp Leu Cys Thr Thr Leu Thr Leu
405 410 415
Asp Ser Ile Thr Ile Glu Ile Gln Lys Ser Ile Asn Ser Thr Phe Arg
420 425 430
Arg Glu Val Val Leu Glu Ser Thr Gln Val Arg Ser Leu Thr Pro Leu
435 440 445
Asp Leu Ser Thr Asp Leu Asn Gln Tyr Asn Gln Leu Leu Lys Ser Ala
450 455 460
Glu Asp His Ile Gln Arg Ser Thr Asp Tyr Leu Asn Ser Ile Asn Pro
465 470 475 480
Ser Ile Val Asn Asn Asn Ala Ile Ile Ile Leu Ile Ile Leu Cys Ile
485 490 495
Leu Leu Ile Leu Thr Val Thr Ile Cys Ile Ile Trp Leu Lys Tyr Leu
500 505 510
Thr Lys Glu Val Lys Asn Val Ala Arg Asn Gln Arg Leu Asn Arg Asp
515 520 525
Ala Asp Leu Phe Tyr Lys Ile Pro Ser Gln Ile Pro Val Pro Arg
530 535 540
<210> 22
<211> 538
<212> PRT
<213> 刁曼病毒（Tioman virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 22
Met Arg Ile Ala Leu Thr Ala Val Ile Val Ser Ile His Phe Asp Leu
1 5 10 15
Ala Phe Pro Met Asn Lys Asn Ser Leu Leu Ser Val Gly Leu Val His
20 25 30
Lys Ser Val Lys Asn Leu Tyr Phe Tyr Ser Gln Gly Ser Pro Ser Tyr
35 40 45
Ile Val Val Lys Leu Val Pro Thr Leu Gly Asn Val Pro Gly Asn Cys
50 55 60
Thr Leu Asn Ser Leu Val Arg Tyr Lys Ser Thr Val Ser Ser Leu Leu
65 70 75 80
Ser Pro Leu Ala Glu Asn Leu Glu Tyr Leu Gln Lys Thr Leu Thr Val
85 90 95
Ser Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Phe Ala Gly Val Ala Ile Gly Leu
100 105 110
Ala Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala Val Ala
115 120 125
Leu Val Glu Ala Arg Gln Asn Ala Ala Gln Ile Gln Ser Leu Ser Glu
130 135 140
Ala Ile Gln Asn Thr Asn Leu Ala Val Asn Glu Leu Lys Thr Ala Ile
145 150 155 160
Gly Ala Ser Ala Thr Ala Ile Gln Ala Ile Gln Thr Gln Ile Asn Glu
165 170 175
Val Ile Asn Pro Ala Ile Asn Arg Leu Ser Cys Glu Ile Leu Asp Ala
180 185 190
Gln Leu Ala Ser Met Leu Asn Leu Tyr Leu Ile His Leu Thr Thr Val
195 200 205
Phe Gln Asn Gln Leu Thr Asn Pro Ala Leu Thr Pro Leu Ser Ile Gln
210 215 220
Ser Leu Gln Ser Leu Leu Gln Gly Thr Ser Ser Val Leu Thr Asn Ile
225 230 235 240
Thr Ser Ser Ser Lys Leu Ala Leu Asn Asp Ala Leu Val Thr Gly Leu
245 250 255
Ile Thr Gly Gln Val Val Gly Leu Asn Met Thr Ser Leu Gln Ile Val
260 265 270
Ile Ala Ala Tyr Val Pro Ser Val Ala Lys Leu Ser Asn Ala Val Val
275 280 285
His Asn Phe Ile Arg Ile Thr Thr Ser Val Asn Gly Thr Glu Val Ile
290 295 300
Ile Gln Ser Pro Thr Ile Ile Met Glu Gln Asn Glu Val Met Tyr Asp
305 310 315 320
Leu Lys Thr Gly His Cys Thr Glu Ser Asp Leu Asn Ile Tyr Cys Pro
325 330 335
Tyr Val Asp Ala Gln Leu Leu Ser Pro Gly Met Thr Asn Cys Ile Asn
340 345 350
Gly Arg Leu Asn Asp Cys Thr Phe Ser Lys Val Val Gly Ser Phe Pro
355 360 365
Thr Arg Phe Ala Ala Val Glu Gly Ala Ile Leu Ala Asn Cys Lys Tyr
370 375 380
Leu Gln Cys Asn Cys Leu Thr Pro Pro Tyr Ile Ile Thr Pro Leu Asn
385 390 395 400
Gly Glu Met Ile Ser Met Ile Asp Leu Ser Lys Cys Gln Arg Leu Asp
405 410 415
Leu Gly Thr Ile Val Phe Asp Ile Asn Asn Pro Val Asn Val Thr Phe
420 425 430
Asn Gly Asn Tyr Arg Ala Asp Val Gly Gln Met Ile Val Thr Asn Pro
435 440 445
Leu Asp Ile Ser Ala Glu Leu Asn Gln Ile Asn Thr Ser Leu Ser Asn
450 455 460
Ala Gln Gly Phe Leu Ser Lys Ser Asp Ala Trp Leu His Val Ser Gln
465 470 475 480
Trp Val Thr Asn Ser Gly Thr Ile Phe Ile Ile Leu Ile Ile Gly Leu
485 490 495
Ile Val Gly Ile Val Tyr Met Ile Ile Asn Thr Tyr Val Val Val Gln
500 505 510
Ile Ile Lys Glu Ile Asn Arg Met Arg Thr Ser Asp Arg Ala His Leu
515 520 525
Leu Lys Gly Ser Ile Ser Ser Ile Ser Thr
530 535
<210> 23
<211> 543
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒8（Avian paramyxovirus 8）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 23
Met Gly Gln Ile Ser Val Tyr Leu Ile Asn Ser Val Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Val Tyr Pro Val Asn Ser Ile Asp Asn Thr Leu Ile Ala Pro Ile Gly
20 25 30
Val Ala Ser Ala Asn Glu Trp Gln Leu Ala Ala Tyr Thr Thr Ser Leu
35 40 45
Ser Gly Thr Ile Ala Val Arg Phe Leu Pro Val Leu Pro Asp Asn Met
50 55 60
Thr Thr Cys Leu Arg Glu Thr Ile Thr Thr Tyr Asn Asn Thr Val Asn
65 70 75 80
Asn Ile Leu Gly Pro Leu Lys Ser Asn Leu Asp Ala Leu Leu Ser Ser
85 90 95
Glu Thr Tyr Pro Gln Thr Arg Leu Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Ile
100 105 110
Ala Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr Ala Ala Val Ala Leu
115 120 125
Lys Gln Ala Gln Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Ala Leu Lys Glu Ala
130 135 140
Leu Ser Lys Thr Asn Glu Ala Val Lys Glu Leu Ser Ser Gly Leu Gln
145 150 155 160
Gln Thr Ala Ile Ala Leu Gly Lys Ile Gln Ser Phe Val Asn Glu Glu
165 170 175
Ile Leu Pro Ser Ile Asn Gln Leu Ser Cys Glu Val Thr Ala Asn Lys
180 185 190
Leu Gly Val Tyr Leu Ser Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Ile Phe
195 200 205
Gly Ala Gln Leu Thr Asn Pro Ala Leu Thr Ser Leu Ser Tyr Gln Ala
210 215 220
Leu Tyr Asn Leu Cys Gly Gly Asn Met Ala Met Leu Thr Gln Lys Ile
225 230 235 240
Gly Ile Lys Gln Gln Asp Val Asn Ser Leu Tyr Glu Ala Gly Leu Ile
245 250 255
Thr Gly Gln Val Ile Gly Tyr Asp Ser Gln Tyr Gln Leu Leu Val Ile
260 265 270
Gln Val Asn Tyr Pro Ser Ile Ser Glu Val Thr Gly Val Arg Ala Thr
275 280 285
Glu Leu Val Thr Val Ser Val Thr Thr Asp Lys Gly Glu Gly Lys Ala
290 295 300
Ile Val Pro Gln Phe Val Ala Glu Ser Arg Val Thr Ile Glu Glu Leu
305 310 315 320
Asp Val Ala Ser Cys Lys Phe Ser Ser Thr Thr Leu Tyr Cys Arg Gln
325 330 335
Val Asn Thr Arg Ala Leu Pro Pro Leu Val Ala Ser Cys Leu Arg Gly
340 345 350
Asn Tyr Asp Asp Cys Gln Tyr Thr Thr Glu Ile Gly Ala Leu Ser Ser
355 360 365
Arg Tyr Ile Thr Leu Asp Gly Gly Val Leu Val Asn Cys Lys Ser Ile
370 375 380
Val Cys Arg Cys Leu Asn Pro Ser Lys Ile Ile Ser Gln Asn Thr Asn
385 390 395 400
Ala Ala Val Thr Tyr Val Asp Ala Thr Ile Cys Lys Thr Ile Gln Leu
405 410 415
Asp Asp Ile Gln Leu Gln Leu Glu Gly Ser Leu Ser Ser Val Tyr Ala
420 425 430
Arg Asn Ile Ser Ile Glu Ile Ser Gln Val Thr Thr Ser Gly Ser Leu
435 440 445
Asp Ile Ser Ser Glu Ile Gly Asn Ile Asn Asn Thr Val Asn Arg Val
450 455 460
Glu Asp Leu Ile His Gln Ser Glu Glu Trp Leu Ala Lys Val Asn Pro
465 470 475 480
His Ile Val Asn Asn Thr Thr Leu Ile Val Leu Cys Val Leu Ser Ala
485 490 495
Leu Ala Val Ile Trp Leu Ala Val Leu Thr Ala Ile Ile Ile Tyr Leu
500 505 510
Arg Thr Lys Leu Lys Thr Ile Ser Ala Leu Ala Val Thr Asn Thr Ile
515 520 525
Gln Ser Asn Pro Tyr Val Asn Gln Thr Lys Arg Glu Ser Lys Phe
530 535 540
<210> 24
<211> 546
<212> PRT
<213> 大榄病毒（Tailam virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 24
Met Lys Leu Ser Val Val Tyr Thr Thr Leu Leu Val Ser Thr Phe Tyr
1 5 10 15
Ser Asp Leu Ala Arg Ser Gln Leu Ala Leu Ser Glu Leu Thr Lys Ile
20 25 30
Gly Val Ile Pro Gly Arg Ser Tyr Asp Leu Lys Ile Ser Thr Gln Ala
35 40 45
Ser Tyr Gln Tyr Met Val Val Lys Leu Ile Pro Asn Leu Thr Gly Leu
50 55 60
Asn Asn Cys Thr Asn Gly Thr Ile Glu Ala Tyr Lys Lys Met Leu Asn
65 70 75 80
Arg Leu Leu Ser Pro Ile Asp Ala Ala Leu Arg Lys Met Lys Asp Ala
85 90 95
Val Asn Asp Lys Pro Pro Glu Ser Val Gly Asn Val Lys Phe Trp Gly
100 105 110
Ala Val Ile Gly Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile
115 120 125
Thr Ala Gly Val Ala Leu His Asn Ser Ile Gln Asn Ala Asn Ala Ile
130 135 140
Leu Ala Leu Lys Asp Ser Ile Arg Gln Ser Asn Lys Ala Ile Gln Glu
145 150 155 160
Leu Gln Thr Ala Met Ser Thr Thr Val Val Val Leu Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Asp Gln Ile Asn Asn Gln Leu Val Pro Ala Ile Asn Ser Leu Gly Cys
180 185 190
Gln Val Val Ala Asn Thr Leu Gly Leu Lys Leu Asn Gln Tyr Phe Ser
195 200 205
Glu Ile Ser Leu Val Phe Gly Pro Asn Leu Arg Asp Pro Thr Ser Glu
210 215 220
Thr Leu Ser Ile Gln Ala Leu Ser Arg Ala Phe Asn Gly Asp Phe Asp
225 230 235 240
Ser Met Leu Ser Lys Leu Lys Tyr Asp Asp Ser Asp Phe Leu Asp Leu
245 250 255
Leu Glu Ser Asp Ser Ile Arg Gly Arg Ile Ile Asp Val Ser Leu Ser
260 265 270
Asp Tyr Leu Ile Thr Ile Gln Ile Glu Tyr Pro Ala Leu Leu Ser Ile
275 280 285
Lys Asp Ala Val Ile Gln Thr Phe Asn Leu Ile Ser Tyr Asn Thr Arg
290 295 300
Gly Thr Glu Trp Ile Ser Ile Phe Pro Lys Gln Leu Leu Val Arg Gly
305 310 315 320
Thr Tyr Ile Ser Asn Ile Asp Ile Ser Gln Cys Val Ile Ala Ala Thr
325 330 335
Ser Ile Ile Cys Lys Ser Asp Thr Ser Thr Pro Ile Ser Ser Ala Thr
340 345 350
Trp Ser Cys Ala Thr Gly Asn Ile Thr Asn Cys Ala Arg Thr Arg Val
355 360 365
Val Asn Ala His Val Pro Arg Phe Ala Leu Tyr Gly Gly Val Val Phe
370 375 380
Ala Asn Cys Ala Pro Val Val Cys Lys Cys Gln Asp Pro Leu Tyr Ser
385 390 395 400
Ile Asn Gln Glu Pro Lys Val Thr Asn Val Met Val Asp Val Asp Ala
405 410 415
Cys Lys Glu Met Tyr Leu Asp Gly Leu Tyr Ile Thr Leu Gly Lys Thr
420 425 430
Gln Ile Ser Arg Ala Met Tyr Ala Glu Asp Val Ser Leu Gly Gly Pro
435 440 445
Ile Ser Val Asp Pro Ile Asp Leu Gly Asn Glu Ile Asn Ser Ile Asn
450 455 460
Ser Ala Ile Asn Arg Ser Glu Glu His Leu Asn His Ala Asn Glu Leu
465 470 475 480
Leu Asp Lys Val Asn Pro Arg Ile Val Asn Val Lys Thr Phe Gly Val
485 490 495
Met Ile Gly Leu Leu Val Leu Val Val Leu Trp Cys Val Ile Thr Leu
500 505 510
Val Trp Leu Ile Cys Leu Thr Lys Gln Leu Ala Arg Thr Ala Tyr Ala
515 520 525
Gly Ser Met Gly Ser Arg Ala Ser Thr Val Asn Ser Leu Ser Gly Phe
530 535 540
Val Gly
545
<210> 25
<211> 557
<212> PRT
<213> 猪副流感病毒1（Porcine parainfluenza virus 1）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 25
Met Gln Val Thr Thr Leu Arg Pro Ala Ile Ile Leu Ser Ile Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Gly Gln Val Pro Arg Asp Lys Leu Ala Asn Leu Gly Ile
20 25 30
Ile Ile Lys Asp Ser Lys Ala Leu Lys Ile Ala Gly Ser Tyr Glu Asn
35 40 45
Arg Tyr Ile Val Leu Ser Leu Val Pro Thr Ile Asp Asn Val Asn Gly
50 55 60
Cys Gly Ser Ile Gln Ile Ala Lys Tyr Lys Glu Met Leu Glu Arg Leu
65 70 75 80
Leu Ile Pro Ile Lys Asp Ala Leu Asp Leu Gln Glu Ser Leu Ile Val
85 90 95
Ile Asp Asn Glu Thr Val Asn Asn Asn Tyr Ser Pro Gln Tyr Arg Phe
100 105 110
Val Gly Ala Ile Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala
115 120 125
Gln Val Thr Ala Gly Val Ala Leu Met Glu Ala Arg Glu Ala Lys Arg
130 135 140
Asp Ile Ser Met Leu Lys Glu Ala Ile Glu Lys Thr Gln Asn Ser Ile
145 150 155 160
Glu Lys Leu Gln Asn Ser Ala Gly Glu Gln Ile Leu Ala Leu Lys Met
165 170 175
Leu Gln Asp Tyr Val Asn Gly Glu Ile Lys Pro Ala Ile Glu Glu Leu
180 185 190
Gly Cys Glu Thr Ala Ala Leu Lys Leu Gly Ile Ala Leu Thr Gln His
195 200 205
Tyr Thr Glu Leu Thr Asn Ala Phe Gly Ser Asn Leu Gly Ser Ile Gly
210 215 220
Glu Lys Ser Leu Thr Leu Gln Ala Leu Ser Ser Leu Tyr Lys Thr Asn
225 230 235 240
Ile Thr Asn Ile Leu Thr Ala Thr Asn Leu Gly Lys Thr Asp Ile Tyr
245 250 255
Asp Ile Ile Tyr Ala Glu Gln Val Lys Gly Arg Val Ile Asp Val Asp
260 265 270
Leu Lys Arg Tyr Met Val Thr Ile Ser Val Lys Ile Pro Ile Leu Ser
275 280 285
Glu Ile Pro Gly Val Leu Ile Tyr Glu Val Ser Ser Ile Ser Tyr Asn
290 295 300
Ile Asp Gly Ala Glu Trp Tyr Ala Ala Val Pro Asp His Ile Leu Ser
305 310 315 320
Lys Ser Ala Tyr Ile Gly Gly Ala Asp Ile Ser Asp Cys Ile Glu Ser
325 330 335
Arg Leu Thr Tyr Ile Cys Pro Gln Asp Pro Ala Gln Ile Ile Ala Asp
340 345 350
Asn Gln Gln Gln Cys Phe Phe Gly His Leu Asp Lys Cys Pro Ile Thr
355 360 365
Lys Val Ile Asp Asn Leu Val Pro Lys Phe Ala Phe Ile Asn Gly Gly
370 375 380
Val Val Ala Asn Cys Ile Ala Ser Thr Cys Thr Cys Gly Glu Glu Arg
385 390 395 400
Ile Gln Val Ser Gln Asp Arg Asn Lys Gly Val Thr Phe Leu Thr His
405 410 415
Asn Asn Cys Gly Leu Ile Gly Ile Asn Gly Ile Glu Phe His Ala Asn
420 425 430
Lys Lys Gly Ser Asp Ala Thr Trp Asn Val Ser Pro Ile Gly Val Gly
435 440 445
Pro Ala Val Ser Leu Arg Pro Val Asp Ile Ser Leu Gln Ile Val Ala
450 455 460
Ala Thr Asn Phe Leu Asn Ser Ser Arg Lys Asp Leu Met Lys Ala Lys
465 470 475 480
Glu Ile Leu Asn Gln Val Gly Asn Leu Lys Asp Leu Thr Thr Ile Thr
485 490 495
Ile Ile Asn Ile Val Ile Ile Ile Ile Leu Leu Ile Cys Val Ile Gly
500 505 510
Leu Gly Ile Leu Tyr His Gln Leu Arg Ser Ala Leu Gly Met Arg Asp
515 520 525
Lys Met Ser Val Leu Asn Asn Ser Ser Tyr Ser Leu Glu Pro Arg Thr
530 535 540
Ala Gln Val Gln Val Ile Lys Pro Thr Ser Phe Met Gly
545 550 555
<210> 26
<211> 538
<212> PRT
<213> 禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> F蛋白
<400> 26
Met Asp Val Arg Ile Cys Leu Leu Leu Phe Leu Ile Ser Asn Pro Ser
1 5 10 15
Ser Cys Ile Gln Glu Thr Tyr Asn Glu Glu Ser Cys Ser Thr Val Thr
20 25 30
Arg Gly Tyr Lys Ser Val Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Asn Val Phe
35 40 45
Asn Leu Glu Ile Gly Asn Val Glu Asn Ile Thr Cys Asn Asp Gly Pro
50 55 60
Ser Leu Ile Asp Thr Glu Leu Val Leu Thr Lys Asn Ala Leu Arg Glu
65 70 75 80
Leu Lys Thr Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Lys Glu Ser Arg Leu Ser
85 90 95
Ser Pro Arg Arg Arg Arg Phe Val Leu Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val
100 105 110
Ala Thr Ala Ala Ala Val Thr Ala Gly Val Ala Leu Ala Lys Thr Ile
115 120 125
Arg Leu Glu Gly Glu Val Lys Ala Ile Lys Asn Ala Leu Arg Asn Thr
130 135 140
Asn Glu Ala Val Ser Thr Leu Gly Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Thr
145 150 155 160
Ala Val Asn Asp Leu Lys Glu Phe Ile Ser Lys Lys Leu Thr Pro Ala
165 170 175
Ile Asn Gln Asn Lys Cys Asn Ile Ala Asp Ile Lys Met Ala Ile Ser
180 185 190
Phe Gly Gln Asn Asn Arg Arg Phe Leu Asn Val Val Arg Gln Phe Ser
195 200 205
Asp Ser Ala Gly Ile Thr Ser Ala Val Ser Leu Asp Leu Met Thr Asp
210 215 220
Asp Glu Leu Val Arg Ala Ile Asn Arg Met Pro Thr Ser Ser Gly Gln
225 230 235 240
Ile Ser Leu Met Leu Asn Asn Arg Ala Met Val Arg Arg Lys Gly Phe
245 250 255
Gly Ile Leu Ile Gly Val Tyr Asp Gly Thr Val Val Tyr Met Val Gln
260 265 270
Leu Pro Ile Phe Gly Val Ile Glu Thr Pro Cys Trp Arg Val Val Ala
275 280 285
Ala Pro Leu Cys Arg Lys Arg Arg Gly Asn Tyr Ala Cys Ile Leu Arg
290 295 300
Glu Asp Gln Gly Trp Tyr Cys Thr Asn Ala Gly Ser Thr Ala Tyr Tyr
305 310 315 320
Pro Asn Lys Asp Asp Cys Glu Val Arg Asp Asp Tyr Val Phe Cys Asp
325 330 335
Thr Ala Ala Gly Ile Asn Val Ala Leu Glu Val Asp Gln Cys Asn Tyr
340 345 350
Asn Ile Ser Thr Ser Lys Tyr Pro Cys Lys Val Ser Thr Gly Arg His
355 360 365
Pro Val Ser Met Val Ala Leu Thr Pro Leu Gly Gly Leu Val Ser Cys
370 375 380
Tyr Glu Ser Val Ser Cys Ser Ile Gly Ser Asn Lys Val Gly Ile Ile
385 390 395 400
Lys Gln Leu Gly Lys Gly Cys Thr His Ile Pro Asn Asn Glu Ala Asp
405 410 415
Thr Ile Thr Ile Asp Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ser Lys Val Val Gly
420 425 430
Glu Gln Arg Thr Ile Lys Gly Ala Pro Val Val Asn Asn Phe Asn Pro
435 440 445
Ile Leu Phe Pro Val Asp Gln Phe Asn Val Ala Leu Asp Gln Val Phe
450 455 460
Glu Ser Ile Asp Arg Ser Gln Asp Leu Ile Asp Lys Ser Asn Asp Leu
465 470 475 480
Leu Gly Ala Asp Ala Lys Ser Lys Ala Gly Ile Ala Ile Ala Ile Val
485 490 495
Val Leu Val Ile Leu Gly Ile Phe Phe Leu Leu Ala Val Ile Tyr Tyr
500 505 510
Cys Ser Arg Val Arg Lys Thr Lys Pro Lys His Asp Tyr Pro Ala Thr
515 520 525
Thr Gly His Ser Ser Met Ala Tyr Val Ser
530 535
<210> 27
<211> 545
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒13鹅/哈萨克斯坦/5751/2013（Avian paramyxovirus 13 goose/Kazakhstan/5751/2013）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 27
Met Ala Arg Phe Ser Trp Glu Ile Phe Arg Leu Ser Thr Ile Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ala Gln Thr Cys Gln Gly Ser Ile Asp Gly Arg Leu Thr Leu Ala
20 25 30
Ala Gly Ile Val Pro Val Gly Asp Arg Pro Ile Ser Ile Tyr Thr Ser
35 40 45
Ser Gln Thr Gly Ile Ile Val Val Lys Leu Ile Pro Asn Leu Pro Asp
50 55 60
Asn Lys Lys Asp Cys Ala Lys Gln Ser Leu Gln Ser Tyr Asn Glu Thr
65 70 75 80
Leu Ser Arg Ile Leu Thr Pro Leu Ala Thr Ala Met Ser Ala Ile Arg
85 90 95
Gly Asn Ser Thr Thr Gln Val Arg Glu Asn Arg Leu Val Gly Ala Ile
100 105 110
Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala
115 120 125
Ala Thr Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Ala Asn Ile Ala Arg
130 135 140
Leu Ala Asn Ser Ile Ala Lys Thr Asn Glu Ala Val Thr Asp Leu Thr
145 150 155 160
Glu Gly Leu Gly Thr Leu Ala Ile Gly Val Gly Lys Leu Gln Asp Tyr
165 170 175
Val Asn Glu Gln Phe Asn Asn Thr Ala Val Ala Ile Asp Cys Leu Thr
180 185 190
Leu Glu Ser Arg Leu Gly Ile Gln Leu Ser Leu Tyr Leu Thr Glu Leu
195 200 205
Met Gly Val Phe Gly Asn Gln Leu Thr Ser Pro Ala Leu Thr Pro Ile
210 215 220
Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn Leu Ala Gly Gly Asn Leu Asn Ala Leu
225 230 235 240
Leu Ser Arg Leu Gly Ala Ser Glu Thr Gln Leu Gly Ser Leu Ile Asn
245 250 255
Ser Gly Leu Ile Lys Gly Met Pro Ile Met Tyr Asp Asp Ala Asn Lys
260 265 270
Leu Leu Ala Val Gln Val Glu Leu Pro Ser Ile Gly Lys Leu Asn Gly
275 280 285
Ala Arg Ser Thr Leu Leu Glu Thr Leu Ala Val Asp Thr Thr Arg Gly
290 295 300
Pro Ser Ser Pro Ile Ile Pro Ser Ala Val Ile Glu Ile Gly Gly Ala
305 310 315 320
Met Glu Glu Leu Asp Leu Ser Pro Cys Ile Thr Thr Asp Leu Asp Met
325 330 335
Phe Cys Thr Lys Ile Ile Ser Tyr Pro Leu Ser Gln Ser Thr Leu Ser
340 345 350
Cys Leu Asn Gly Asn Leu Ser Asp Cys Val Phe Ser Arg Ser Glu Gly
355 360 365
Val Leu Ser Thr Pro Tyr Met Thr Ile Lys Gly Lys Ile Val Ala Asn
370 375 380
Cys Lys Gln Val Ile Cys Arg Cys Met Asp Pro Pro Gln Ile Leu Ser
385 390 395 400
Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Leu Leu Leu Ile Asp Glu Asn Thr Cys Arg
405 410 415
Ser Leu Glu Leu Ser Gly Val Ile Leu Lys Leu Ala Gly Thr Tyr Glu
420 425 430
Ser Glu Tyr Thr Arg Asn Leu Thr Val Asp Pro Ser Gln Val Ile Ile
435 440 445
Thr Gly Pro Leu Asp Ile Ser Ala Glu Leu Ser Lys Val Asn Gln Ser
450 455 460
Ile Asp Ser Ala Lys Glu Asn Ile Ala Glu Ser Asn Lys Phe Leu Ser
465 470 475 480
Gln Val Asn Val Lys Leu Leu Ser Ser Ser Ala Met Ile Thr Tyr Ile
485 490 495
Val Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Ile Ala Ile Thr Gly Cys Val Ile
500 505 510
Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Lys Leu Lys Ser Gln Gln Lys Thr Leu Leu
515 520 525
Trp Leu Gly Asn Asn Ala Glu Met His Gly Ser Arg Ser Lys Thr Ser
530 535 540
Phe
545
<210> 28
<211> 554
<212> PRT
<213> 梅南高病毒（Menangle virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 28
Met Met Pro Arg Val Leu Gly Met Ile Val Leu Tyr Leu Thr His Ser
1 5 10 15
Gln Ile Leu Cys Ile Asn Arg Asn Thr Leu Tyr Gln Ile Gly Leu Ile
20 25 30
His Arg Ser Val Lys Lys Val Asn Phe Tyr Ser Gln Gly Ser Pro Ser
35 40 45
Tyr Ile Val Val Lys Leu Val Pro Thr Leu Ala Ala Ile Pro Pro Asn
50 55 60
Cys Ser Ile Lys Ser Leu Gln Arg Tyr Lys Glu Thr Val Thr Ser Leu
65 70 75 80
Val Gln Pro Ile Ser Asp Asn Leu Gly Tyr Leu Gln Asp Lys Leu Val
85 90 95
Thr Gly Gln Ser Arg Arg Arg Arg Arg Phe Ala Gly Val Ala Ile Gly
100 105 110
Leu Ala Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala Val
115 120 125
Ala Leu Val Glu Thr Arg Glu Asn Ala Gly Lys Ile Gln Ala Leu Ser
130 135 140
Glu Ser Ile Gln Asn Thr Asn Gln Ala Val His Ser Leu Lys Thr Ala
145 150 155 160
Leu Gly Phe Ser Ala Thr Ala Ile Gln Ala Ile Gln Asn Gln Val Asn
165 170 175
Glu Val Ile Asn Pro Ala Ile Asn Lys Leu Ser Cys Glu Val Leu Asp
180 185 190
Ser Gln Leu Ala Ser Met Leu Asn Leu Tyr Leu Ile His Leu Thr Thr
195 200 205
Val Phe Gln Thr Gln Leu Thr Asn Pro Ala Leu Thr Pro Leu Ser Ile
210 215 220
Gln Ala Leu Thr Ser Val Leu Gln Gly Thr Ser Gly Val Leu Met Asn
225 230 235 240
Ser Thr Asn Ser Thr Leu Thr Gln Pro Ile Asp Leu Leu Ala Thr Gly
245 250 255
Leu Ile Thr Gly Gln Ile Ile Ser Val Asn Met Thr Ser Leu Gln Leu
260 265 270
Ile Ile Ala Thr Phe Met Pro Ser Ile Ala Glu Leu Pro Asn Ala Val
275 280 285
Leu His Ser Phe Phe Arg Ile Thr Thr Ser Val Asn Leu Thr Glu Val
290 295 300
Met Ile Gln Ser Pro Glu Phe Ile Met Glu Gln Asn Gly Val Phe Tyr
305 310 315 320
Asp Phe Asn Thr Ala His Cys Gln Leu Gly Asp Asn Asn Val Tyr Cys
325 330 335
Pro Tyr Ile Asp Ala Ala Arg Leu Ser Ser Met Met Thr Asn Cys Ile
340 345 350
Asn Gly Asn Leu Gly Glu Cys Val Phe Ser Arg Val Ile Gly Ser Phe
355 360 365
Pro Ser Arg Phe Val Ser Leu Asn Gly Ala Ile Leu Ala Asn Cys Lys
370 375 380
Phe Met Arg Cys Asn Cys Leu Ser Pro Glu Lys Ile Ile Thr Pro Leu
385 390 395 400
Asp Gly Glu Met Ile Ser Leu Ile Asp Leu Arg Val Cys Gln Lys Leu
405 410 415
Thr Leu Gly Thr Ile Thr Phe Glu Ile Ser Gln Pro Val Asn Val Ser
420 425 430
Phe Gln Gly Gly Phe Val Ala Asn Ala Gly Gln Ile Ile Val Thr Asn
435 440 445
Pro Phe Asp Ile Ser Ala Glu Leu Gly Gln Ile Asn Asn Ser Leu Asn
450 455 460
Asp Ala Gln Gly Phe Leu Asp Gln Ser Asn Asn Trp Leu Lys Val Ser
465 470 475 480
Gly Trp Ile Asn Asn Ser Gly Ser Leu Phe Ile Ala Gly Ile Val Val
485 490 495
Ile Gly Leu Ile Val Leu Cys Ile Val Ile Ile Ile Tyr Ile Asn Val
500 505 510
Gln Ile Ile Arg Glu Val Asn Arg Leu Arg Ser Phe Ile Tyr Arg Asp
515 520 525
Tyr Val Leu Asp His Asp Lys Ala Pro Tyr Ser Pro Glu Ser Ser Ser
530 535 540
Pro His Arg Lys Ser Leu Lys Thr Val Ser
545 550
<210> 29
<211> 544
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒5（Avian paramyxovirus 5）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 29
Met Leu Gln Leu Pro Leu Thr Ile Leu Leu Ser Ile Leu Ser Ala His
1 5 10 15
Gln Ser Leu Cys Leu Asp Asn Ser Lys Leu Ile His Ala Gly Ile Met
20 25 30
Ser Thr Thr Glu Arg Glu Val Asn Val Tyr Ala Gln Ser Ile Thr Gly
35 40 45
Ser Ile Val Val Arg Leu Ile Pro Asn Ile Pro Ser Asn His Lys Ser
50 55 60
Cys Ala Thr Ser Gln Ile Lys Leu Tyr Asn Asp Thr Leu Thr Arg Leu
65 70 75 80
Leu Thr Pro Ile Lys Ala Asn Leu Glu Gly Leu Ile Ser Ala Val Ser
85 90 95
Gln Asp Gln Ser Gln Asn Ser Gly Lys Arg Lys Lys Arg Phe Val Gly
100 105 110
Ala Val Ile Gly Ala Ala Ala Leu Gly Leu Ala Thr Ala Ala Gln Val
115 120 125
Thr Ala Thr Val Ala Leu Asn Gln Ala Gln Glu Asn Ala Arg Asn Ile
130 135 140
Leu Arg Leu Lys Asn Ser Ile Gln Lys Thr Asn Glu Ala Val Met Glu
145 150 155 160
Leu Lys Asp Ala Val Gly Gln Thr Ala Val Ala Ile Asp Lys Thr Gln
165 170 175
Ala Phe Ile Asn Asn Gln Ile Leu Pro Ala Ile Ser Asn Leu Ser Cys
180 185 190
Glu Val Leu Gly Asn Lys Ile Gly Val Gln Leu Ser Leu Tyr Leu Thr
195 200 205
Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Asn Gln Leu Thr Asn Pro Ala Leu Thr
210 215 220
Thr Leu Ser Leu Gln Ala Leu Tyr Asn Leu Cys Gly Asp Asp Phe Asn
225 230 235 240
Tyr Leu Ile Asn Leu Leu Asn Ala Lys Asn Arg Asn Leu Ala Ser Leu
245 250 255
Tyr Glu Ala Asn Leu Ile Gln Gly Arg Ile Thr Gln Tyr Asp Ser Met
260 265 270
Asn Gln Leu Leu Ile Ile Gln Val Gln Ile Pro Ser Ile Ser Thr Val
275 280 285
Ser Gly Met Arg Val Thr Glu Leu Phe Thr Leu Ser Val Asp Thr Pro
290 295 300
Ile Gly Glu Gly Lys Ala Leu Val Pro Lys Tyr Val Leu Ser Ser Gly
305 310 315 320
Arg Ile Met Glu Glu Val Asp Leu Ser Ser Cys Ala Ile Thr Ser Thr
325 330 335
Ser Val Phe Cys Ser Ser Ile Ile Ser Arg Pro Leu Pro Leu Glu Thr
340 345 350
Ile Asn Cys Leu Asn Gly Asn Val Thr Gln Cys Gln Phe Thr Ala Asn
355 360 365
Thr Gly Thr Leu Glu Ser Arg Tyr Ala Val Ile Gly Gly Leu Val Ile
370 375 380
Ala Asn Cys Lys Ala Ile Val Cys Arg Cys Leu Asn Pro Pro Gly Val
385 390 395 400
Ile Ala Gln Asn Leu Gly Leu Pro Ile Thr Ile Ile Ser Ser Asn Thr
405 410 415
Cys Gln Arg Ile Asn Leu Glu Gln Ile Thr Leu Ser Leu Gly Asn Ser
420 425 430
Ile Leu Ser Thr Tyr Ser Ala Asn Leu Ser Gln Val Glu Met Asn Leu
435 440 445
Ala Pro Ser Asn Pro Leu Asp Ile Ser Val Glu Leu Asn Arg Val Asn
450 455 460
Thr Ser Leu Ser Lys Val Glu Ser Leu Ile Lys Glu Ser Asn Ser Ile
465 470 475 480
Leu Asp Ser Val Asn Pro Gln Ile Leu Asn Val Lys Thr Val Ile Ile
485 490 495
Leu Ala Val Ile Ile Gly Leu Ile Val Val Trp Cys Phe Ile Leu Thr
500 505 510
Cys Leu Ile Val Arg Gly Phe Met Leu Leu Val Lys Gln Gln Lys Phe
515 520 525
Lys Gly Leu Ser Val Gln Asn Asn Pro Tyr Val Ser Asn Asn Ser His
530 535 540
<210> 30
<211> 557
<212> PRT
<213> 松湾病毒（Cedar virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合糖蛋白
<400> 30
Met Ser Asn Lys Arg Thr Thr Val Leu Ile Ile Ile Ser Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Phe Tyr Leu Asn Asn Ala Ala Ile Val Gly Phe Asp Phe Asp Lys Leu
20 25 30
Asn Lys Ile Gly Val Val Gln Gly Arg Val Leu Asn Tyr Lys Ile Lys
35 40 45
Gly Asp Pro Met Thr Lys Asp Leu Val Leu Lys Phe Ile Pro Asn Ile
50 55 60
Val Asn Ile Thr Glu Cys Val Arg Glu Pro Leu Ser Arg Tyr Asn Glu
65 70 75 80
Thr Val Arg Arg Leu Leu Leu Pro Ile His Asn Met Leu Gly Leu Tyr
85 90 95
Leu Asn Asn Thr Asn Ala Lys Met Thr Gly Leu Met Ile Ala Gly Val
100 105 110
Ile Met Gly Gly Ile Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr
115 120 125
Ala Gly Phe Ala Leu Tyr Glu Ala Lys Lys Asn Thr Glu Asn Ile Gln
130 135 140
Lys Leu Thr Asp Ser Ile Met Lys Thr Gln Asp Ser Ile Asp Lys Leu
145 150 155 160
Thr Asp Ser Val Gly Thr Ser Ile Leu Ile Leu Asn Lys Leu Gln Thr
165 170 175
Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Val Pro Asn Leu Glu Leu Leu Ser Cys Arg
180 185 190
Gln Asn Lys Ile Glu Phe Asp Leu Met Leu Thr Lys Tyr Leu Val Asp
195 200 205
Leu Met Thr Val Ile Gly Pro Asn Ile Asn Asn Pro Val Asn Lys Asp
210 215 220
Met Thr Ile Gln Ser Leu Ser Leu Leu Phe Asp Gly Asn Tyr Asp Ile
225 230 235 240
Met Met Ser Glu Leu Gly Tyr Thr Pro Gln Asp Phe Leu Asp Leu Ile
245 250 255
Glu Ser Lys Ser Ile Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Val Asp Met Glu Asn
260 265 270
Leu Tyr Val Val Ile Arg Thr Tyr Leu Pro Thr Leu Ile Glu Val Pro
275 280 285
Asp Ala Gln Ile Tyr Glu Phe Asn Lys Ile Thr Met Ser Ser Asn Gly
290 295 300
Gly Glu Tyr Leu Ser Thr Ile Pro Asn Phe Ile Leu Ile Arg Gly Asn
305 310 315 320
Tyr Met Ser Asn Ile Asp Val Ala Thr Cys Tyr Met Thr Lys Ala Ser
325 330 335
Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ser Leu Pro Met Ser Gln Asn Leu Arg
340 345 350
Ser Cys Tyr Gln Gly Glu Thr Glu Tyr Cys Pro Val Glu Ala Val Ile
355 360 365
Ala Ser His Ser Pro Arg Phe Ala Leu Thr Asn Gly Val Ile Phe Ala
370 375 380
Asn Cys Ile Asn Thr Ile Cys Arg Cys Gln Asp Asn Gly Lys Thr Ile
385 390 395 400
Thr Gln Asn Ile Asn Gln Phe Val Ser Met Ile Asp Asn Ser Thr Cys
405 410 415
Asn Asp Val Met Val Asp Lys Phe Thr Ile Lys Val Gly Lys Tyr Met
420 425 430
Gly Arg Lys Asp Ile Asn Asn Ile Asn Ile Gln Ile Gly Pro Gln Ile
435 440 445
Ile Ile Asp Lys Val Asp Leu Ser Asn Glu Ile Asn Lys Met Asn Gln
450 455 460
Ser Leu Lys Asp Ser Ile Phe Tyr Leu Arg Glu Ala Lys Arg Ile Leu
465 470 475 480
Asp Ser Val Asn Ile Ser Leu Ile Ser Pro Ser Val Gln Leu Phe Leu
485 490 495
Ile Ile Ile Ser Val Leu Ser Phe Ile Ile Leu Leu Ile Ile Ile Val
500 505 510
Tyr Leu Tyr Cys Lys Ser Lys His Ser Tyr Lys Tyr Asn Lys Phe Ile
515 520 525
Asp Asp Pro Asp Tyr Tyr Asn Asp Tyr Lys Arg Glu Arg Ile Asn Gly
530 535 540
Lys Ala Ser Lys Ser Asn Asn Ile Tyr Tyr Val Gly Asp
545 550 555
<210> 31
<211> 546
<212> PRT
<213> 牛瘟麻疹病毒（Rinderpest morbillivirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> F蛋白
<400> 31
Met Gly Ile Leu Phe Ala Ala Leu Leu Ala Met Thr Asn Pro His Leu
1 5 10 15
Ala Thr Gly Gln Ile His Trp Gly Asn Leu Ser Lys Ile Gly Val Val
20 25 30
Gly Thr Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val Met Thr Gln Ser Ser His Gln
35 40 45
Ser Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Asn Val Thr Ala Ile Asp Asn Cys
50 55 60
Thr Lys Thr Glu Ile Met Glu Tyr Lys Arg Leu Leu Gly Thr Val Leu
65 70 75 80
Lys Pro Ile Arg Glu Ala Leu Asn Ala Ile Thr Lys Asn Ile Lys Pro
85 90 95
Ile Gln Ser Ser Thr Thr Ser Arg Arg His Lys Arg Phe Ala Gly Val
100 105 110
Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr
115 120 125
Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Met Met Asn Ser Gln Ala Ile Glu
130 135 140
Ser Leu Lys Ala Ser Leu Glu Thr Thr Asn Gln Ala Ile Glu Glu Ile
145 150 155 160
Arg Gln Ala Gly Gln Glu Met Val Leu Ala Val Gln Gly Val Gln Asp
165 170 175
Tyr Ile Asn Asn Glu Leu Val Pro Ala Met Gly Gln Leu Ser Cys Glu
180 185 190
Ile Val Gly Gln Lys Leu Gly Leu Lys Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu
195 200 205
Ile Leu Ser Leu Phe Gly Pro Ser Leu Arg Asp Pro Val Ser Ala Glu
210 215 220
Leu Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala Leu Gly Gly Asp Ile Asn Lys
225 230 235 240
Ile Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser Gly Ser Asp Leu Leu Ala Ile Leu
245 250 255
Glu Ser Lys Gly Ile Lys Ala Lys Ile Thr Tyr Val Asp Ile Glu Ser
260 265 270
Tyr Phe Ile Val Leu Ser Ile Ala Tyr Pro Ser Leu Ser Glu Ile Lys
275 280 285
Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Ser Val Ser Tyr Asn Ile Gly Ser
290 295 300
Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Val Pro Arg Tyr Val Ala Thr Gln Gly Tyr
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Phe Asp Asp Thr Pro Cys Ala Phe Thr Pro Glu Gly
325 330 335
Thr Ile Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr Pro Met Ser Pro Leu Leu Gln
340 345 350
Glu Cys Phe Arg Gly Ser Thr Arg Ser Cys Ala Arg Thr Leu Val Ser
355 360 365
Gly Ser Ile Gly Asn Arg Phe Ile Leu Ser Lys Gly Asn Leu Ile Ala
370 375 380
Asn Cys Ala Ser Ile Leu Cys Lys Cys Tyr Thr Thr Gly Ser Ile Ile
385 390 395 400
Ser Gln Asp Pro Asp Lys Ile Leu Thr Tyr Ile Ala Ala Asp Gln Cys
405 410 415
Pro Val Val Glu Val Gly Gly Val Thr Ile Gln Val Gly Ser Arg Glu
420 425 430
Tyr Ser Asp Ala Val Tyr Leu His Glu Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile
435 440 445
Ser Leu Glu Lys Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu Trp Asn Ala Val Thr
450 455 460
Lys Leu Glu Lys Ala Lys Asp Leu Leu Asp Ser Ser Asp Leu Ile Leu
465 470 475 480
Glu Asn Ile Lys Gly Val Ser Val Thr Asn Thr Gly Tyr Ile Leu Val
485 490 495
Gly Val Gly Leu Ile Ala Val Val Gly Ile Leu Ile Ile Thr Cys Cys
500 505 510
Cys Lys Lys Arg Arg Ser Asp Asn Lys Val Ser Thr Met Val Leu Asn
515 520 525
Pro Gly Leu Arg Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser Lys Ser Tyr Val Arg
530 535 540
Ser Leu
545
<210> 32
<211> 536
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒10（Avian paramyxovirus 10）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 32
Met Thr Arg Thr Arg Leu Leu Phe Leu Leu Thr Cys Tyr Ile Pro Gly
1 5 10 15
Ala Val Ser Leu Asp Asn Ser Ile Leu Ala Pro Ala Gly Ile Ile Ser
20 25 30
Ala Ser Glu Arg Gln Ile Ala Ile Tyr Thr Gln Thr Leu Gln Gly Thr
35 40 45
Ile Ala Leu Arg Phe Ile Pro Val Leu Pro Gln Asn Leu Ser Ser Cys
50 55 60
Ala Lys Asp Thr Leu Glu Ser Tyr Asn Ser Thr Val Ser Asn Leu Leu
65 70 75 80
Leu Pro Ile Ala Glu Asn Leu Asn Ala Leu Leu Lys Asp Ala Asp Lys
85 90 95
Pro Ser Gln Arg Ile Ile Gly Ala Ile Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly
100 105 110
Val Ala Thr Thr Ala Gln Val Thr Ala Ala Leu Ala Met Thr Gln Ala
115 120 125
Gln Gln Asn Ala Arg Asn Ile Trp Lys Leu Lys Glu Ser Ile Lys Asn
130 135 140
Thr Asn Gln Ala Val Leu Glu Leu Lys Asp Gly Leu Gln Gln Ser Ala
145 150 155 160
Ile Ala Leu Asp Lys Val Gln Ser Phe Ile Asn Ser Glu Ile Leu Pro
165 170 175
Gln Ile Asn Gln Leu Gly Cys Glu Val Ala Ala Asn Lys Leu Gly Ile
180 185 190
Phe Leu Ser Leu Tyr Leu Thr Glu Ile Thr Thr Val Phe Lys Asn Gln
195 200 205
Ile Thr Asn Pro Ala Leu Ser Thr Leu Ser Tyr Gln Ala Leu Tyr Asn
210 215 220
Leu Cys Gly Gly Asn Met Ala Ala Leu Thr Lys Gln Ile Gly Ile Lys
225 230 235 240
Asp Thr Glu Ile Asn Ser Leu Tyr Glu Ala Glu Leu Ile Thr Gly Gln
245 250 255
Val Ile Gly Tyr Asp Ser Ala Asp Gln Ile Leu Leu Ile Gln Val Ser
260 265 270
Tyr Pro Ser Val Ser Arg Val Gln Gly Val Arg Ala Val Glu Leu Leu
275 280 285
Thr Val Ser Val Ala Thr Pro Lys Gly Glu Gly Lys Ala Ile Ala Pro
290 295 300
Ser Phe Ile Ala Gln Ser Asn Ile Ile Ala Glu Glu Leu Asp Thr Gln
305 310 315 320
Pro Cys Lys Phe Ser Lys Thr Thr Leu Tyr Cys Arg Gln Val Asn Thr
325 330 335
Arg Thr Leu Pro Val Arg Val Ala Asn Cys Leu Lys Gly Lys Tyr Asn
340 345 350
Asp Cys Gln Tyr Thr Thr Glu Ile Gly Ala Leu Ala Ser Arg Tyr Val
355 360 365
Thr Ile Thr Asn Gly Val Val Ala Asn Cys Arg Ser Ile Ile Cys Arg
370 375 380
Cys Leu Asp Pro Glu Gly Ile Val Ala Gln Asn Ser Asp Ala Ala Ile
385 390 395 400
Thr Val Ile Asp Arg Ser Thr Cys Lys Leu Ile Gln Leu Gly Asp Ile
405 410 415
Thr Leu Arg Leu Glu Gly Lys Leu Ser Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Ile
420 425 430
Thr Ile Asp Ile Ser Gln Val Thr Thr Ser Gly Ser Leu Asp Ile Ser
435 440 445
Ser Glu Leu Gly Ser Ile Asn Asn Thr Ile Thr Lys Val Glu Asp Leu
450 455 460
Ile Ser Lys Ser Asn Asp Trp Leu Ser Lys Val Asn Pro Thr Leu Ile
465 470 475 480
Ser Asn Asp Thr Ile Ile Ala Leu Cys Val Ile Ala Gly Ile Val Val
485 490 495
Ile Trp Leu Val Ile Ile Thr Ile Leu Ser Tyr Tyr Ile Leu Ile Lys
500 505 510
Leu Lys Asn Val Ala Leu Leu Ser Thr Met Pro Lys Lys Asp Leu Asn
515 520 525
Pro Tyr Val Asn Asn Thr Lys Phe
530 535
<210> 33
<211> 552
<212> PRT
<213> 海豚麻疹病毒（Dolphin morbillivirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 33
Met Ala Ala Ser Asn Gly Gly Val Met Tyr Gln Ser Phe Leu Thr Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Val Ile Met Thr Glu Gly Gln Ile His Trp Gly Asn Leu
20 25 30
Ser Lys Ile Gly Ile Val Gly Thr Gly Ser Ala Ser Tyr Lys Val Met
35 40 45
Thr Arg Pro Asn His Gln Tyr Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Asn Val
50 55 60
Thr Met Ile Asp Asn Cys Thr Arg Thr Glu Val Thr Glu Tyr Arg Lys
65 70 75 80
Leu Leu Lys Thr Val Leu Glu Pro Val Lys Asn Ala Leu Thr Val Ile
85 90 95
Thr Lys Asn Ile Lys Pro Ile Gln Ser Leu Thr Thr Ser Arg Arg Ser
100 105 110
Lys Arg Phe Ala Gly Val Val Leu Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala
115 120 125
Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu His Gln Ser Ile Met
130 135 140
Asn Ser Gln Ser Ile Asp Asn Leu Arg Thr Ser Leu Glu Lys Ser Asn
145 150 155 160
Gln Ala Ile Glu Glu Ile Arg Gln Ala Ser Gln Glu Thr Val Leu Ala
165 170 175
Val Gln Gly Val Gln Asp Phe Ile Asn Asn Glu Leu Ile Pro Ser Met
180 185 190
His Gln Leu Ser Cys Glu Met Leu Gly Gln Lys Leu Gly Leu Lys Leu
195 200 205
Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser Ile Phe Gly Pro Ser Leu Arg
210 215 220
Asp Pro Val Ser Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala Leu
225 230 235 240
Gly Gly Asp Ile Asn Lys Ile Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser Gly Ala
245 250 255
Asp Leu Leu Ala Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Lys Val Thr
260 265 270
His Val Asp Leu Glu Gly Tyr Phe Ile Val Leu Ser Ile Ala Tyr Pro
275 280 285
Thr Leu Ser Glu Val Lys Gly Val Ile Val His Lys Leu Glu Ala Val
290 295 300
Ser Tyr Asn Leu Gly Ser Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Leu Pro Lys Tyr
305 310 315 320
Val Ala Thr Asn Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Ser Ser Cys
325 330 335
Ala Phe Met Ser Glu Val Thr Ile Cys Ser Gln Asn Ala Leu Tyr Pro
340 345 350
Met Ser Pro Leu Leu Gln Gln Cys Leu Arg Gly Ser Thr Ala Ser Cys
355 360 365
Ala Arg Ser Leu Val Ser Gly Thr Ile Gly Asn Arg Phe Ile Leu Ser
370 375 380
Lys Gly Asn Leu Ile Ala Asn Cys Ala Ser Val Leu Cys Lys Cys Tyr
385 390 395 400
Ser Thr Gly Thr Ile Ile Ser Gln Asp Pro Asp Lys Leu Leu Thr Phe
405 410 415
Val Ala Ala Asp Lys Cys Pro Leu Val Glu Val Asp Gly Ile Thr Ile
420 425 430
Gln Val Gly Ser Arg Glu Tyr Pro Asp Ser Val Tyr Val Ser Arg Ile
435 440 445
Asp Leu Gly Pro Ala Ile Ser Leu Glu Lys Leu Asp Val Gly Thr Asn
450 455 460
Leu Gly Ser Ala Leu Thr Lys Leu Asp Asn Ala Lys Asp Leu Leu Asp
465 470 475 480
Ser Ser Asn Gln Ile Leu Glu Asn Val Arg Arg Ser Ser Phe Gly Gly
485 490 495
Ala Met Tyr Ile Gly Ile Leu Val Cys Ala Gly Ala Leu Val Ile Leu
500 505 510
Cys Val Leu Val Tyr Cys Cys Arg Arg His Cys Arg Lys Arg Val Gln
515 520 525
Thr Pro Pro Lys Ala Thr Pro Gly Leu Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr
530 535 540
Thr Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu
545 550
<210> 34
<211> 552
<212> PRT
<213> 莫斯曼病毒（Mossman virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 34
Met Ser Asn Tyr Phe Pro Ala Arg Val Ile Ile Ile Val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Thr Ala Val Ser Cys Gln Ile Ser Phe Gln Asn Leu Ser Thr Ile Gly
20 25 30
Val Phe Lys Phe Lys Glu Tyr Asp Tyr Arg Val Ser Gly Asp Tyr Asn
35 40 45
Glu Gln Phe Leu Ala Ile Lys Met Val Pro Asn Val Thr Gly Val Glu
50 55 60
Asn Cys Thr Ala Ser Leu Ile Asp Glu Tyr Arg His Val Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Leu Leu Gln Pro Ile Asn Thr Thr Leu Thr Ala Ser Thr Ser Asn Val
85 90 95
Asp Pro Tyr Ala Gly Asn Lys Lys Phe Phe Gly Ala Val Ile Ala Gly
100 105 110
Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Val Thr Ala Gly Val Ala
115 120 125
Leu Tyr Glu Ala Arg Gln Asn Ala Ala Ala Ile Ala Glu Ile Lys Glu
130 135 140
Ser Leu His Tyr Thr His Lys Ala Ile Glu Ser Leu Gln Ile Ser Gln
145 150 155 160
Lys Gln Thr Val Val Ala Ile Gln Gly Ile Gln Asp Gln Ile Asn Thr
165 170 175
Asn Ile Ile Pro Gln Ile Asn Ala Leu Thr Cys Glu Ile Ala Asn Gln
180 185 190
Arg Leu Arg Leu Met Leu Leu Gln Tyr Tyr Thr Glu Met Leu Ser Ser
195 200 205
Phe Gly Pro Ile Ile Gln Asp Pro Leu Ser Gly His Ile Thr Val Gln
210 215 220
Ala Leu Ser Gln Ala Ala Gly Gly Asn Ile Thr Gly Leu Met Arg Glu
225 230 235 240
Leu Gly Tyr Ser Ser Lys Asp Leu Arg Tyr Ile Leu Ser Val Asn Gly
245 250 255
Ile Ser Ala Asn Ile Ile Asp Ala Asp Pro Glu Ile Gly Ser Ile Ile
260 265 270
Leu Arg Ile Arg Tyr Pro Ser Met Ile Lys Ile Pro Asp Val Ala Val
275 280 285
Met Glu Leu Ser Tyr Leu Ala Tyr His Ala Ala Gly Gly Asp Trp Leu
290 295 300
Thr Val Gly Pro Arg Phe Ile Leu Lys Arg Gly Tyr Ser Leu Ser Asn
305 310 315 320
Leu Asp Ile Thr Ser Cys Thr Ile Gly Glu Asp Phe Leu Leu Cys Ser
325 330 335
Lys Asp Val Ser Ser Pro Met Ser Leu Ala Thr Gln Ser Cys Leu Arg
340 345 350
Gly Asp Thr Gln Met Cys Ser Arg Thr Ala Val Gln Asp Arg Glu Ala
355 360 365
Pro Arg Phe Leu Leu Leu Gln Gly Asn Leu Ile Val Asn Cys Met Ser
370 375 380
Val Asn Cys Lys Cys Glu Asp Pro Glu Glu Thr Ile Thr Gln Asp Pro
385 390 395 400
Ala Tyr Pro Leu Met Val Leu Gly Ser Asp Thr Cys Lys Ile His Tyr
405 410 415
Ile Asp Gly Ile Arg Ile Lys Leu Gly Lys Val Gln Leu Pro Pro Ile
420 425 430
Thr Val Leu Asn Thr Leu Ser Leu Gly Pro Ile Val Val Leu Asn Pro
435 440 445
Ile Asp Val Ser Asn Gln Leu Ser Leu Val Glu Thr Thr Val Lys Glu
450 455 460
Ser Glu Asp His Leu Lys Asn Ala Ile Gly Ala Leu Arg Ser Gln Ser
465 470 475 480
Arg Val Gly Gly Val Gly Ile Val Ala Ile Val Gly Leu Ile Ile Ala
485 490 495
Thr Val Ser Leu Val Val Leu Val Ile Ser Gly Cys Cys Leu Val Lys
500 505 510
Tyr Phe Ser Arg Thr Ala Thr Leu Glu Ser Ser Leu Thr Thr Ile Glu
515 520 525
His Gly Pro Thr Leu Ala Pro Lys Ser Gly Pro Ile Ile Pro Thr Tyr
530 535 540
Ile Asn Pro Val Tyr Arg His Asp
545 550
<210> 35
<211> 544
<212> PRT
<213> J-病毒（J-virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 35
Met Lys Pro Val Ala Leu Ile Tyr Leu Thr Ile Leu Ala Phe Thr Val
1 5 10 15
Lys Val Arg Ser Gln Leu Ala Leu Ser Asp Leu Thr Lys Ile Gly Ile
20 25 30
Ile Pro Ala Lys Ser Tyr Glu Leu Lys Ile Ser Thr Gln Ala Ala Gln
35 40 45
Gln Leu Met Val Ile Lys Leu Ile Pro Asn Val Asn Gly Leu Thr Asn
50 55 60
Cys Thr Ile Pro Val Met Asp Ser Tyr Lys Lys Met Leu Asp Arg Ile
65 70 75 80
Leu Lys Pro Ile Asp Asp Ala Leu Asn His Val Lys Asn Ala Ile Gln
85 90 95
Asp Lys Gln Gly Asp Gly Val Pro Gly Val Arg Phe Trp Gly Ala Ile
100 105 110
Ile Gly Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr Ala
115 120 125
Gly Val Ala Leu His Asn Ser Ile Gln Asn Ala Asn Ala Ile Leu Gln
130 135 140
Leu Lys Glu Ser Ile Arg Asn Ser Asn Lys Ala Ile Glu Glu Leu Gln
145 150 155 160
Ala Gly Leu Gln Ser Thr Val Leu Val Ile Asn Ala Leu Gln Asp Gln
165 170 175
Ile Asn Ser Gln Leu Val Pro Ala Ile Asn Thr Leu Gly Cys Ser Val
180 185 190
Ile Ala Asn Thr Leu Gly Leu Arg Leu Asn Gln Tyr Phe Ser Glu Ile
195 200 205
Ser Leu Val Phe Gly Pro Asn Leu Arg Asp Pro Thr Ser Gln Thr Leu
210 215 220
Ser Ile Gln Ala Ile Ala Lys Ala Phe Asn Gly Asp Phe Asp Ser Met
225 230 235 240
Met Lys Lys Met His Tyr Thr Asp Ser Asp Phe Leu Asp Leu Leu Glu
245 250 255
Ser Asp Ser Ile Arg Gly Arg Ile Ile Ser Val Ser Leu Glu Asp Tyr
260 265 270
Leu Ile Ile Ile Gln Ile Asp Tyr Pro Gly Leu Thr Thr Ile Pro Asn
275 280 285
Ser Val Val Gln Thr Phe Asn Leu Ile Thr Tyr Asn Tyr Lys Gly Thr
290 295 300
Glu Trp Glu Ser Ile Phe Pro Arg Glu Leu Leu Ile Arg Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Ile Ser Asn Ile Asp Ile Ser Gln Cys Val Gly Thr Ser Lys Ser Met
325 330 335
Ile Cys Lys Ser Asp Thr Ser Thr Thr Ile Ser Pro Ala Thr Trp Ala
340 345 350
Cys Ala Thr Gly Asn Leu Thr Ser Cys Ala Arg Thr Arg Val Val Asn
355 360 365
Ser His Ser Thr Arg Phe Ala Leu Ser Gly Gly Val Leu Phe Ala Asn
370 375 380
Cys Ala Pro Ile Ala Cys Arg Cys Gln Asp Pro Gln Tyr Ser Ile Asn
385 390 395 400
Gln Glu Pro Lys Thr Thr Asn Val Met Val Thr Ser Glu Asp Cys Lys
405 410 415
Glu Leu Tyr Ile Asp Gly Phe Tyr Leu Thr Leu Gly Lys Lys Met Leu
420 425 430
Asp Arg Ala Met Tyr Ala Glu Asp Val Ala Leu Gly Gly Ser Val Ser
435 440 445
Val Asp Pro Ile Asp Ile Gly Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asn Glu Ser
450 455 460
Ile Asn Lys Ser His Glu Tyr Leu Asp Lys Ala Asn Glu Leu Leu Glu
465 470 475 480
Gln Val Asn Pro Asn Ile Val Asn Val Ser Ser Phe Ser Phe Ile Leu
485 490 495
Val Ile Ser Ile Leu Leu Ile Ile Trp Phe Ile Val Thr Leu Val Trp
500 505 510
Leu Ile Tyr Leu Thr Lys His Met Asn Phe Ile Val Gly Lys Val Ala
515 520 525
Met Gly Ser Arg Ser Ser Thr Val Asn Ser Leu Ser Gly Phe Val Gly
530 535 540
<210> 36
<211> 537
<212> PRT
<213> 马普埃拉病毒（Mapuera virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 36
Met Arg Ser Ser Leu Phe Leu Val Leu Thr Leu Leu Val Pro Phe Ala
1 5 10 15
His Ser Ile Asp Ser Ile Thr Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Val Ile Thr
20 25 30
Ser Val Arg Ser Leu Ala Tyr Phe Leu Glu Thr Asn Pro Thr Tyr Ile
35 40 45
Ser Val Arg Leu Met Pro Ala Ile Gln Thr Asp Ser Ser His Cys Ser
50 55 60
Tyr His Ser Ile Glu Asn Tyr Asn Leu Thr Leu Thr Lys Leu Leu Leu
65 70 75 80
Pro Leu Gln Glu Asn Leu His Gln Ile Thr Asp Ser Leu Ser Ser Arg
85 90 95
Arg Arg Lys Lys Arg Phe Ala Gly Val Ala Val Gly Leu Ala Ala Leu
100 105 110
Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Val Thr Ala Ala Ile Ala Val Val Lys
115 120 125
Ala Lys Glu Asn Ser Ala Lys Ile Ala Gln Leu Thr Ser Ala Ile Ser
130 135 140
Glu Thr Asn Arg Ala Val Gln Asp Leu Ile Glu Gly Ser Lys Gln Leu
145 150 155 160
Ala Val Ala Val Gln Ala Ile Gln Asp Gln Ile Asn Asn Val Ile Gln
165 170 175
Pro Gln Leu Thr Asn Leu Ser Cys Gln Val Ala Asp Ala Gln Val Gly
180 185 190
Thr Ile Leu Asn Met Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe His Pro
195 200 205
Gln Ile Thr Asn Ser Ala Leu Thr Pro Ile Thr Ile Gln Ala Leu Arg
210 215 220
Ser Leu Leu Gly Ser Thr Leu Pro Gln Val Val Thr Ser Thr Ile Lys
225 230 235 240
Thr Asp Val Pro Leu Gln Asp Leu Leu Thr Ser Gly Leu Leu Lys Gly
245 250 255
Gln Ile Val Tyr Leu Asp Leu Gln Ser Met Ile Met Val Val Ser Val
260 265 270
Ser Val Pro Thr Ile Ala Leu His Ser Met Ala Lys Val Tyr Thr Leu
275 280 285
Lys Ala Ile Ser Ala His Val Asn Asn Ala Glu Val Gln Met Gln Val
290 295 300
Pro Ser Arg Val Met Glu Leu Gly Ser Glu Ile Met Gly Tyr Asp Ile
305 310 315 320
Asp Gln Cys Glu Glu Thr Ser Arg Tyr Leu Phe Cys Pro Tyr Asn Gly
325 330 335
Gly Ser Ile Leu Ser Ala Thr Met Lys Met Cys Leu Asn Gly Asn Ile
340 345 350
Ser Gln Cys Val Phe Thr Pro Ile Tyr Gly Ser Phe Leu Gln Arg Phe
355 360 365
Val Leu Val Asp Gly Val Ile Val Ala Asn Cys Arg Asp Met Thr Cys
370 375 380
Ala Cys Lys Ser Pro Ser Lys Ile Ile Thr Gln Pro Asp Ser Leu Pro
385 390 395 400
Val Thr Ile Ile Asp Ser Thr Ser Cys Ser Asn Leu Val Leu Asp Thr
405 410 415
Leu Glu Leu Pro Ile Ile Ser Ile Asn Asn Ala Thr Tyr Arg Pro Val
420 425 430
Gln Tyr Val Gly Pro Asn Gln Ile Ile Phe Ser Gln Pro Leu Asp Leu
435 440 445
Leu Ser Gln Leu Gly Lys Ile Asn Ser Ser Leu Ser Asp Ala Ile Glu
450 455 460
His Leu Ala Lys Ser Asp Glu Ile Leu Glu Gln Ile Gln Trp Asp Ser
465 470 475 480
Pro Gln Gly Tyr Thr Leu Ile Ala Leu Thr Ser Val Leu Ala Phe Val
485 490 495
Val Val Ala Ile Val Gly Leu Leu Ile Ser Thr Arg Tyr Leu Ile Phe
500 505 510
Glu Ile Arg Arg Ile Asn Thr Thr Leu Thr Gln Gln Leu Ser Ser Tyr
515 520 525
Val Leu Ser Asn Lys Ile Ile Gln Tyr
530 535
<210> 37
<211> 566
<212> PRT
<213> 那立发病毒（Nariva virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 37
Met Ala Glu Gln Glu Lys Thr Pro Leu Arg Tyr Lys Ile Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ile Ile Val Ile Asn His Tyr Asn Ile Thr Asn Val Phe Gly Gln Ile
20 25 30
His Leu Ala Asn Leu Ser Ser Ile Gly Val Phe Val Thr Lys Thr Leu
35 40 45
Asp Tyr Arg Thr Thr Ser Asp Pro Thr Glu Gln Leu Leu Val Ile Asn
50 55 60
Met Leu Pro Asn Ile Ser Asn Ile Gln Asp Cys Ala Gln Gly Val Val
65 70 75 80
Asn Glu Tyr Lys His Leu Ile Ser Ser Leu Leu Thr Pro Ile Asn Asp
85 90 95
Thr Leu Asp Leu Ile Thr Ser Asn Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Arg Asn
100 105 110
Lys Leu Phe Gly Glu Ile Ile Ala Gly Ala Ala Leu Thr Val Ala Thr
115 120 125
Ser Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Arg Gln Asn
130 135 140
Ala Lys Asp Ile Ala Ala Ile Lys Glu Ser Leu Gly Tyr Ala Tyr Lys
145 150 155 160
Ala Ile Asp Lys Leu Thr Thr Ala Thr Arg Glu Ile Thr Val Val Ile
165 170 175
Asn Glu Leu Gln Asp Gln Ile Asn Asn Arg Leu Ile Pro Arg Ile Asn
180 185 190
Asp Leu Ala Cys Glu Val Trp Ala Thr Arg Leu Gln Ala Met Leu Leu
195 200 205
Gln Tyr Tyr Ala Glu Ile Phe Ser Val Ile Gly Pro Asn Leu Gln Asp
210 215 220
Pro Leu Ser Gly Lys Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ala Arg Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Asn Ile Lys Leu Met Val Asp Glu Leu Asn Tyr Ser Gly Gln Asp
245 250 255
Leu Ser Arg Leu Val Lys Val Gly Ala Ile Lys Gly Gln Ile Ile Asp
260 265 270
Ala Asp Pro Ser Leu Gly Val Val Ile Ile Lys Met Arg Tyr Pro Asn
275 280 285
Ile Ile Lys Ile Pro Asn Val Ala Ile Ser Glu Leu Ser Tyr Val Ser
290 295 300
Tyr Ser Ser Asp Gly Gln Asp Trp Ile Thr Thr Gly Pro Asn Tyr Ile
305 310 315 320
Val Thr Arg Gly Tyr Ser Ile Ala Asn Ile Gln Thr Ser Ser Cys Ser
325 330 335
Val Gly Asp Asp Phe Val Leu Cys Asp Arg Asp Met Thr Tyr Pro Met
340 345 350
Ser Gln Val Thr Gln Asp Cys Leu Arg Gly Asn Ile Ala Leu Cys Ser
355 360 365
Arg Met Val Val Arg Asp Arg Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Ile Leu Gln
370 375 380
Gly Asn Met Val Ala Asn Cys Met Ser Ile Thr Cys Arg Cys Glu Glu
385 390 395 400
Pro Glu Ser Glu Ile Tyr Gln Ser Pro Asp Gln Pro Leu Thr Leu Leu
405 410 415
Thr Arg Asp Thr Cys Asp Thr His Val Val Asp Gly Ile Arg Ile Arg
420 425 430
Leu Gly Val Arg Lys Leu Pro Thr Ile Ser Val Ile Asn Asn Ile Thr
435 440 445
Leu Gly Pro Ile Ile Thr Thr Asp Pro Ile Asp Val Ser Asn Gln Leu
450 455 460
Asn Ala Val Val Ser Thr Ile Asp Gln Ser Ala Glu Leu Leu His Gln
465 470 475 480
Ala Gln Arg Val Leu Ser Glu Arg Ala Arg Gly Ala Arg Asp His Ile
485 490 495
Leu Ala Thr Ala Ala Ile Val Ile Cys Val Val Leu Ala Val Leu Ile
500 505 510
Leu Val Leu Leu Ile Gly Leu Val Tyr Leu Tyr Arg Thr Gln Asn Glu
515 520 525
Ile Leu Val Lys Thr Thr Met Leu Glu Gln Val Pro Thr Phe Ala Pro
530 535 540
Lys Ser Phe Pro Met Glu Ser Gln Ile Tyr Ser Gly Lys Thr Asn Lys
545 550 555 560
Gly Tyr Asp Pro Ala Glu
565
<210> 38
<211> 662
<212> PRT
<213> 蝙蝠副粘病毒Eid_hel/GH-M74a/GHA/2009（Bat paramyxovirus Eid_hel/GH-M74a/GHA/2009）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 38
Met Lys Lys Lys Thr Asp Asn Pro Thr Ile Ser Lys Arg Gly His Asn
1 5 10 15
His Ser Arg Gly Ile Lys Ser Arg Ala Leu Leu Arg Glu Thr Asp Asn
20 25 30
Tyr Ser Asn Gly Leu Ile Val Glu Asn Leu Val Arg Asn Cys His His
35 40 45
Pro Ser Lys Asn Asn Leu Asn Tyr Thr Lys Thr Gln Lys Arg Asp Ser
50 55 60
Thr Ile Pro Tyr Arg Val Glu Glu Arg Lys Gly His Tyr Pro Lys Ile
65 70 75 80
Lys His Leu Ile Asp Lys Ser Tyr Lys His Ile Lys Arg Gly Lys Arg
85 90 95
Arg Asn Gly His Asn Gly Asn Ile Ile Thr Ile Ile Leu Leu Leu Ile
100 105 110
Leu Ile Leu Lys Thr Gln Met Ser Glu Gly Ala Ile His Tyr Glu Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Ile Gly Leu Ile Lys Gly Ile Thr Arg Glu Tyr Lys Val
130 135 140
Lys Gly Thr Pro Ser Ser Lys Asp Ile Val Ile Lys Leu Ile Pro Asn
145 150 155 160
Val Thr Gly Leu Asn Lys Cys Thr Asn Ile Ser Met Glu Asn Tyr Lys
165 170 175
Glu Gln Leu Asp Lys Ile Leu Ile Pro Ile Asn Asn Ile Ile Glu Leu
180 185 190
Tyr Ala Asn Ser Thr Lys Ser Ala Pro Gly Asn Ala Arg Phe Ala Gly
195 200 205
Val Ile Ile Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Ala Gln Ile
210 215 220
Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Glu Ala Arg Gln Asn Ala Glu Arg Ile
225 230 235 240
Asn Leu Leu Lys Asp Ser Ile Ser Ala Thr Asn Asn Ala Val Ala Glu
245 250 255
Leu Gln Glu Ala Thr Gly Gly Ile Val Asn Val Ile Thr Gly Met Gln
260 265 270
Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Gln Ile Asp Lys Leu Gln Cys
275 280 285
Ser Gln Ile Lys Thr Ala Leu Asp Ile Ser Leu Ser Gln Tyr Tyr Ser
290 295 300
Glu Ile Leu Thr Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asn Pro Val Thr Thr
305 310 315 320
Ser Met Ser Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ser Phe Gly Gly Asn Ile Asp
325 330 335
Leu Leu Leu Asn Leu Leu Gly Tyr Thr Ala Asn Asp Leu Leu Asp Leu
340 345 350
Leu Glu Ser Lys Ser Ile Thr Gly Gln Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Glu
355 360 365
His Tyr Phe Met Val Ile Arg Val Tyr Tyr Pro Ile Met Thr Thr Ile
370 375 380
Ser Asn Ala Tyr Val Gln Glu Leu Ile Lys Ile Ser Phe Asn Val Asp
385 390 395 400
Gly Ser Glu Trp Val Ser Leu Val Pro Ser Tyr Ile Leu Ile Arg Asn
405 410 415
Ser Tyr Leu Ser Asn Ile Asp Ile Ser Glu Cys Leu Ile Thr Lys Asn
420 425 430
Ser Val Ile Cys Arg His Asp Phe Ala Met Pro Met Ser Tyr Thr Leu
435 440 445
Lys Glu Cys Leu Thr Gly Asp Thr Glu Lys Cys Pro Arg Glu Ala Val
450 455 460
Val Thr Ser Tyr Val Pro Arg Phe Ala Ile Ser Gly Gly Val Ile Tyr
465 470 475 480
Ala Asn Cys Leu Ser Thr Thr Cys Gln Cys Tyr Gln Thr Gly Lys Val
485 490 495
Ile Ala Gln Asp Gly Ser Gln Thr Leu Met Met Ile Asp Asn Gln Thr
500 505 510
Cys Ser Ile Val Arg Ile Glu Glu Ile Leu Ile Ser Thr Gly Lys Tyr
515 520 525
Leu Gly Ser Gln Glu Tyr Asn Thr Met His Val Ser Val Gly Asn Pro
530 535 540
Val Phe Thr Asp Lys Leu Asp Ile Thr Ser Gln Ile Ser Asn Ile Asn
545 550 555 560
Gln Ser Ile Glu Gln Ser Lys Phe Tyr Leu Asp Lys Ser Lys Ala Ile
565 570 575
Leu Asp Lys Ile Asn Leu Asn Leu Ile Gly Ser Val Pro Ile Ser Ile
580 585 590
Leu Phe Ile Ile Ala Ile Leu Ser Leu Ile Leu Ser Ile Ile Thr Phe
595 600 605
Val Ile Val Met Ile Ile Val Arg Arg Tyr Asn Lys Tyr Thr Pro Leu
610 615 620
Ile Asn Ser Asp Pro Ser Ser Arg Arg Ser Thr Ile Gln Asp Val Tyr
625 630 635 640
Ile Ile Pro Asn Pro Gly Glu His Ser Ile Arg Ser Ala Ala Arg Ser
645 650 655
Ile Asp Arg Asp Arg Asp
660
<210> 39
<211> 539
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒7（Avian paramyxovirus 7）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 39
Met Arg Val Arg Pro Leu Ile Ile Ile Leu Val Leu Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Trp Leu Asn Ile Leu Pro Val Ile Gly Leu Asp Asn Ser Lys Ile Ala
20 25 30
Gln Ala Gly Ile Ile Ser Ala Gln Glu Tyr Ala Val Asn Val Tyr Ser
35 40 45
Gln Ser Asn Glu Ala Tyr Ile Ala Leu Arg Thr Val Pro Tyr Ile Pro
50 55 60
Pro His Asn Leu Ser Cys Phe Gln Asp Leu Ile Asn Thr Tyr Asn Thr
65 70 75 80
Thr Ile Gln Asn Ile Phe Ser Pro Ile Gln Asp Gln Ile Thr Ser Ile
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Leu Pro Ser Ser Arg Phe Ala Gly Leu Val Val
100 105 110
Gly Ala Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr Ala Ala
115 120 125
Val Ala Leu Thr Lys Ala Gln Gln Asn Ala Gln Glu Ile Ile Arg Leu
130 135 140
Arg Asp Ser Ile Gln Asn Thr Ile Asn Ala Val Asn Asp Ile Thr Val
145 150 155 160
Gly Leu Ser Ser Ile Gly Val Ala Leu Ser Lys Val Gln Asn Tyr Leu
165 170 175
Asn Asp Val Ile Asn Pro Ala Leu Gln Asn Leu Ser Cys Gln Val Ser
180 185 190
Ala Leu Asn Leu Gly Ile Gln Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Ile Thr
195 200 205
Thr Ile Phe Gly Pro Gln Ile Thr Asn Pro Ser Leu Thr Pro Leu Ser
210 215 220
Ile Gln Ala Leu Tyr Thr Leu Ala Gly Asp Asn Leu Met Gln Phe Leu
225 230 235 240
Thr Arg Tyr Gly Tyr Gly Glu Thr Ser Val Ser Ser Ile Leu Glu Ser
245 250 255
Gly Leu Ile Ser Ala Gln Ile Val Ser Phe Asp Lys Gln Thr Gly Ile
260 265 270
Ala Ile Leu Tyr Val Thr Leu Pro Ser Ile Ala Thr Leu Ser Gly Ser
275 280 285
Arg Val Thr Lys Leu Met Ser Val Ser Val Gln Thr Gly Val Gly Glu
290 295 300
Gly Ser Ala Ile Val Pro Ser Tyr Val Ile Gln Gln Gly Thr Val Ile
305 310 315 320
Glu Glu Phe Ile Pro Asp Ser Cys Ile Phe Thr Arg Ser Asp Val Tyr
325 330 335
Cys Thr Gln Leu Tyr Ser Lys Leu Leu Pro Asp Ser Ile Leu Gln Cys
340 345 350
Leu Gln Gly Ser Met Ala Asp Cys Gln Phe Thr Arg Ser Leu Gly Ser
355 360 365
Phe Ala Asn Arg Phe Met Thr Val Ala Gly Gly Val Ile Ala Asn Cys
370 375 380
Gln Thr Val Leu Cys Arg Cys Tyr Asn Pro Val Met Ile Ile Pro Gln
385 390 395 400
Asn Asn Gly Ile Ala Val Thr Leu Ile Asp Gly Ser Leu Cys Lys Glu
405 410 415
Leu Glu Leu Glu Gly Ile Arg Leu Thr Met Ala Asp Pro Val Phe Ala
420 425 430
Ser Tyr Ser Arg Asp Leu Ile Ile Asn Gly Asn Gln Phe Ala Pro Ser
435 440 445
Asp Ala Leu Asp Ile Ser Ser Glu Leu Gly Gln Leu Asn Asn Ser Ile
450 455 460
Ser Ser Ala Thr Asp Asn Leu Gln Lys Ala Gln Glu Ser Leu Asn Lys
465 470 475 480
Ser Ile Ile Pro Ala Ala Thr Ser Ser Trp Leu Ile Ile Leu Leu Phe
485 490 495
Val Leu Val Ser Ile Ser Leu Val Ile Gly Cys Ile Ser Ile Tyr Phe
500 505 510
Ile Tyr Lys His Ser Thr Thr Asn Arg Ser Arg Asn Leu Ser Ser Asp
515 520 525
Ile Ile Ser Asn Pro Tyr Ile Gln Lys Ala Asn
530 535
<210> 40
<211> 539
<212> PRT
<213> 吐霍科病毒2（Tuhoko virus 2）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 40
Met Ala Pro Cys Val Leu Phe Leu Ser Ser Leu Leu Leu Ile Ser Thr
1 5 10 15
Ile Ser Pro Ser His Gly Ile Asn Gln Pro Ala Leu Arg Arg Ile Gly
20 25 30
Ala Ile Val Ser Ser Val Lys Gln Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Thr Lys
35 40 45
Pro Asn Tyr Ile Ile Val Lys Leu Leu Pro Thr Ile Asn Leu Ser Lys
50 55 60
Ser Asn Cys Asn Leu Thr Ser Ile Asn Arg Tyr Lys Glu Ser Val Ile
65 70 75 80
Glu Ile Ile Lys Pro Leu Ala Asp Asn Ile Asp Asn Leu Asn Gln Lys
85 90 95
Leu Leu Pro Lys Asn Arg Arg Lys Arg Met Ala Gly Val Ala Ile Gly
100 105 110
Leu Ala Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala Val
115 120 125
Ala Leu Val Glu Ala Arg Lys Asn Thr Gln Met Ile Gln Ser Leu Ala
130 135 140
Asp Ser Ile Gln Asp Thr Asn Ala Ala Val Gln Ala Val Asn Ile Gly
145 150 155 160
Leu Gln Asn Ser Ala Val Ala Ile Gln Ala Ile Gln Asn Gln Ile Asn
165 170 175
Asn Val Ile Asn Pro Ala Leu Asp Arg Leu Asn Cys Glu Val Leu Asp
180 185 190
Ala Gln Ile Ala Ser Ile Leu Asn Leu Tyr Leu Ile Lys Ser Val Thr
195 200 205
Ile Phe Gln Asn Gln Leu Thr Asn Pro Ala Leu Gln Gln Leu Ser Ile
210 215 220
Gln Met Leu Ser Ile Val Met Gln Asp Thr Ala Lys Ile Leu Gly Asn
225 230 235 240
Phe Thr Ile Gly Asp Lys Phe Asp Gln His Asp Leu Leu Gly Ser Gly
245 250 255
Leu Ile Thr Gly Gln Val Val Gly Val Asn Leu Thr Asn Leu Gln Leu
260 265 270
Ile Ile Ala Ala Phe Ile Pro Ser Ile Ala Pro Leu Pro Gln Ala Tyr
275 280 285
Ile Ile Asp Leu Ile Ser Ile Thr Ile Ser Val Asn Asp Thr Glu Ala
290 295 300
Val Ile Gln Ile Pro Glu Arg Ile Met Glu His Gly Ser Ser Ile Tyr
305 310 315 320
Gln Phe Gly Gly Lys Gln Cys Val Tyr Gly Gln Phe Ser Ala Tyr Cys
325 330 335
Pro Phe Ser Asp Ala Val Leu Met Thr Gln Asp Leu Gln Leu Cys Met
340 345 350
Lys Gly Asn Ile Glu His Cys Ile Phe Ser Ser Val Leu Gly Ser Phe
355 360 365
Pro Asn Arg Phe Ala Ser Val Asp Gly Val Phe Tyr Ala Asn Cys Lys
370 375 380
Tyr Met Ser Cys Ala Cys Ser Asp Pro Leu Gln Val Ile His Gln Asp
385 390 395 400
Asp Ser Val Asn Leu Met Val Ile Asp Ser Ser Val Cys Arg Ser Leu
405 410 415
Thr Leu Gly His Val Thr Phe Pro Ile Ile Ala Phe Ser Asn Val Ser
420 425 430
Tyr Gln Met Lys Thr Asn Ile Ser Ile Glu Gln Met Ile Val Thr Ser
435 440 445
Pro Leu Asp Leu Ser Thr Glu Leu Lys Gln Ile Asn Asn Ser Val Asn
450 455 460
Ile Ala Asn Thr Phe Leu Asp Ser Ser Asn Arg Ala Leu Lys Thr Ser
465 470 475 480
Ile Phe Gly Thr Ser Ser Gln Ile Ile Leu Ile Val Leu Leu Ile Phe
485 490 495
Thr Cys Leu Leu Ile Leu Tyr Val Ile Phe Leu Thr Tyr Ile Ile Lys
500 505 510
Ile Leu Ile Lys Glu Val Lys Arg Leu Arg Asp Gly Asn Ser Arg Thr
515 520 525
Gly Ser Lys Leu Ser Phe Ile Asn Pro Asp Val
530 535
<210> 41
<211> 537
<212> PRT
<213> 吐霍科病毒3（Tuhoko viirus 3）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 41
Met Leu Trp Leu Thr Ile Leu Ile Ala Leu Val Gly Asn His Glu Ser
1 5 10 15
Thr Cys Met Asn Ile Asn Phe Leu Gln Ser Leu Gly Gln Ile Asn Ser
20 25 30
Gln Lys Arg Phe Leu Asn Phe Tyr Thr Gln Gln Pro Pro Ser Tyr Met
35 40 45
Val Ile Arg Leu Val Pro Thr Leu Gln Leu Ser Ala Asn Asn Cys Thr
50 55 60
Leu Gly Ser Ile Val Arg Tyr Arg Asn Ala Ile Lys Glu Leu Ile Gln
65 70 75 80
Pro Met Asp Glu Asn Leu Arg Trp Leu Ser Ser Asn Leu Ile Pro Gln
85 90 95
Arg Arg Gly Lys Arg Phe Ala Gly Val Ala Val Gly Leu Ala Ala Leu
100 105 110
Gly Val Ala Val Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala Val Ala Leu Val Glu
115 120 125
Ala Arg Ala Asn Ala Glu Lys Ile Ala Ser Met Ser Gln Ser Ile Gln
130 135 140
Glu Thr Asn Lys Ala Val Thr Ser Leu Ser Gln Ala Val Ser Ala Ser
145 150 155 160
Gly Ile Ala Ile Gln Ala Ile Gln Asn Glu Ile Asn Asn Val Ile His
165 170 175
Pro Ile Leu Asn Gln Val Gln Cys Asp Val Leu Asp Ala Arg Val Gly
180 185 190
Asn Ile Leu Asn Leu Tyr Leu Ile Lys Val Thr Thr Ile Phe Gln Asn
195 200 205
Gln Leu Thr Asn Pro Ala Leu Gln Arg Leu Ser Thr Gln Ala Leu Ser
210 215 220
Met Leu Met Gln Ser Thr Ser Ser Tyr Leu Arg Asn Leu Ser Ser Ser
225 230 235 240
Glu Ser Ala Ile Asn Ala Asp Leu Ser Met Thr Asn Leu Ile Glu Ala
245 250 255
Gln Ile Val Gly Ile Asn Met Thr Asn Leu Gln Leu Val Leu Ala Val
260 265 270
Phe Ile Pro Ser Ile Ala Arg Leu Asn Gly Ala Leu Leu Tyr Asp Phe
275 280 285
Ile Ser Ile Thr Ile Ser Ser Asn Gln Thr Glu Val Met Leu Gln Ile
290 295 300
Pro His Arg Val Leu Glu Ile Gly Asn Ser Leu Tyr Thr Phe Glu Gly
305 310 315 320
Thr Gln Cys Glu Met Thr Lys Leu Asn Ala Tyr Cys Leu Tyr Ser Asp
325 330 335
Ala Ile Pro Val Thr Glu Ser Leu Arg Asp Cys Met Asn Gly Leu Phe
340 345 350
Ser Gln Cys Gly Phe Val Arg Ile Ile Gly Ser Phe Ala Asn Arg Phe
355 360 365
Ala Ser Val Asn Gly Val Ile Tyr Ala Asn Cys Lys His Leu Thr Cys
370 375 380
Ser Cys Leu Gln Pro Asp Glu Ile Ile Thr Gln Asp Thr Asn Val Pro
385 390 395 400
Leu Thr Ile Ile Asp Thr Lys Arg Cys Thr Lys Ile Ser Leu Gly His
405 410 415
Leu Thr Phe Thr Ile Arg Glu Tyr Ala Asn Val Thr Tyr Ser Leu Arg
420 425 430
Thr Glu Ile Ala Asn Ser Gln Ile Thr Val Val Ser Pro Leu Asp Leu
435 440 445
Ser Ser Gln Leu Thr Thr Ile Asn Asn Ser Leu Ala Asp Ala Thr Asn
450 455 460
His Ile Met Asn Ser Asp Arg Ile Leu Asp Arg Leu Asn Ser Gly Leu
465 470 475 480
Tyr Ser Lys Trp Val Ile Ile Phe Leu Ile Cys Ala Ser Ile Val Ser
485 490 495
Leu Ile Gly Leu Val Phe Leu Gly Phe Leu Ile Arg Gly Leu Ile Leu
500 505 510
Glu Leu Arg Ser Lys His Arg Ser Asn Leu Asn Lys Ala Ser Thr Tyr
515 520 525
Ser Ile Asp Ser Ser Ile Gly Leu Thr
530 535
<210> 42
<211> 545
<212> PRT
<213> 墨江病毒（Mojiang virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 42
Met Ala Leu Asn Lys Asn Met Phe Ser Ser Leu Phe Leu Gly Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Val Tyr Ala Thr Thr Val Gln Ser Ser Ile His Tyr Asp Ser Leu
20 25 30
Ser Lys Val Gly Val Ile Lys Gly Leu Thr Tyr Asn Tyr Lys Ile Lys
35 40 45
Gly Ser Pro Ser Thr Lys Leu Met Val Val Lys Leu Ile Pro Asn Ile
50 55 60
Asp Ser Val Lys Asn Cys Thr Gln Lys Gln Tyr Asp Glu Tyr Lys Asn
65 70 75 80
Leu Val Arg Lys Ala Leu Glu Pro Val Lys Met Ala Ile Asp Thr Met
85 90 95
Leu Asn Asn Val Lys Ser Gly Asn Asn Lys Tyr Arg Phe Ala Gly Ala
100 105 110
Ile Met Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Thr Val Thr
115 120 125
Ala Gly Ile Ala Leu His Arg Ser Asn Glu Asn Ala Gln Ala Ile Ala
130 135 140
Asn Met Lys Ser Ala Ile Gln Asn Thr Asn Glu Ala Val Lys Gln Leu
145 150 155 160
Gln Leu Ala Asn Lys Gln Thr Leu Ala Val Ile Asp Thr Ile Arg Gly
165 170 175
Glu Ile Asn Asn Asn Ile Ile Pro Val Ile Asn Gln Leu Ser Cys Asp
180 185 190
Thr Ile Gly Leu Ser Val Gly Ile Arg Leu Thr Gln Tyr Tyr Ser Glu
195 200 205
Ile Ile Thr Ala Phe Gly Pro Ala Leu Gln Asn Pro Val Asn Thr Arg
210 215 220
Ile Thr Ile Gln Ala Ile Ser Ser Val Phe Asn Gly Asn Phe Asp Glu
225 230 235 240
Leu Leu Lys Ile Met Gly Tyr Thr Ser Gly Asp Leu Tyr Glu Ile Leu
245 250 255
His Ser Glu Leu Ile Arg Gly Asn Ile Ile Asp Val Asp Val Asp Ala
260 265 270
Gly Tyr Ile Ala Leu Glu Ile Glu Phe Pro Asn Leu Thr Leu Val Pro
275 280 285
Asn Ala Val Val Gln Glu Leu Met Pro Ile Ser Tyr Asn Ile Asp Gly
290 295 300
Asp Glu Trp Val Thr Leu Val Pro Arg Phe Val Leu Thr Arg Thr Thr
305 310 315 320
Leu Leu Ser Asn Ile Asp Thr Ser Arg Cys Thr Ile Thr Asp Ser Ser
325 330 335
Val Ile Cys Asp Asn Asp Tyr Ala Leu Pro Met Ser His Glu Leu Ile
340 345 350
Gly Cys Leu Gln Gly Asp Thr Ser Lys Cys Ala Arg Glu Lys Val Val
355 360 365
Ser Ser Tyr Val Pro Lys Phe Ala Leu Ser Asp Gly Leu Val Tyr Ala
370 375 380
Asn Cys Leu Asn Thr Ile Cys Arg Cys Met Asp Thr Asp Thr Pro Ile
385 390 395 400
Ser Gln Ser Leu Gly Ala Thr Val Ser Leu Leu Asp Asn Lys Arg Cys
405 410 415
Ser Val Tyr Gln Val Gly Asp Val Leu Ile Ser Val Gly Ser Tyr Leu
420 425 430
Gly Asp Gly Glu Tyr Asn Ala Asp Asn Val Glu Leu Gly Pro Pro Ile
435 440 445
Val Ile Asp Lys Ile Asp Ile Gly Asn Gln Leu Ala Gly Ile Asn Gln
450 455 460
Thr Leu Gln Glu Ala Glu Asp Tyr Ile Glu Lys Ser Glu Glu Phe Leu
465 470 475 480
Lys Gly Val Asn Pro Ser Ile Ile Thr Leu Gly Ser Met Val Val Leu
485 490 495
Tyr Ile Phe Met Ile Leu Ile Ala Ile Val Ser Val Ile Ala Leu Val
500 505 510
Leu Ser Ile Lys Leu Thr Val Lys Gly Asn Val Val Arg Gln Gln Phe
515 520 525
Thr Tyr Thr Gln His Val Pro Ser Met Glu Asn Ile Asn Tyr Val Ser
530 535 540
His
545
<210> 43
<211> 546
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒12（Avian paramyxovirus 12）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 43
Met Ala Ile Pro Val Pro Ser Ser Thr Ala Leu Met Ile Phe Asn Ile
1 5 10 15
Leu Val Ser Leu Ala Pro Ala Ser Ala Leu Asp Gly Arg Leu Leu Leu
20 25 30
Gly Ala Gly Ile Val Pro Thr Gly Asp Arg Gln Val Asn Val Tyr Thr
35 40 45
Ser Ser Gln Thr Gly Ile Ile Ala Leu Lys Leu Leu Pro Asn Leu Pro
50 55 60
Lys Asp Lys Glu Asn Cys Ala Glu Val Ser Ile Arg Ser Tyr Asn Glu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Arg Ile Leu Thr Pro Leu Ala Gln Ser Met Ala Ala Ile
85 90 95
Arg Gly Asn Ser Thr Val Ser Thr Arg Gly Arg Glu Pro Arg Leu Val
100 105 110
Gly Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln
115 120 125
Ile Thr Ala Ala Thr Ala Leu Ile Gln Ala Asn Gln Asn Ala Glu Asn
130 135 140
Ile Ala Arg Leu Ala Lys Gly Leu Ala Ala Thr Asn Glu Ala Val Thr
145 150 155 160
Asp Leu Thr Lys Gly Val Gly Ser Leu Ala Ile Gly Val Gly Lys Leu
165 170 175
Gln Asp Tyr Val Asn Glu Gln Phe Asn Arg Thr Gly Glu Ala Ile Glu
180 185 190
Cys Leu Thr Ile Glu Ser Arg Val Gly Val Gln Leu Ser Leu Tyr Leu
195 200 205
Thr Glu Val Ile Gly Val Phe Gly Asp Gln Ile Thr Ser Pro Ala Leu
210 215 220
Ser Asp Ile Ser Ile Gln Ala Leu Tyr Asn Leu Ala Gly Gly Asn Leu
225 230 235 240
Asn Val Leu Leu Gln Lys Met Gly Ile Glu Gly Thr Gln Leu Gly Ser
245 250 255
Leu Ile Asn Ser Gly Leu Ile Lys Gly Arg Pro Ile Met Tyr Asp Asp
260 265 270
Gly Asn Lys Ile Leu Gly Ile Gln Val Thr Leu Pro Ser Val Gly Arg
275 280 285
Ile Asn Gly Ala Arg Ala Thr Leu Leu Glu Ala Ile Ala Val Ala Thr
290 295 300
Pro Lys Gly Asn Ala Ser Pro Leu Ile Pro Arg Ala Val Ile Ser Val
305 310 315 320
Gly Ser Leu Val Glu Glu Leu Asp Met Thr Pro Cys Val Leu Thr Pro
325 330 335
Thr Asp Ile Phe Cys Thr Arg Ile Leu Ser Tyr Pro Leu Ser Asp Ser
340 345 350
Leu Thr Thr Cys Leu Lys Gly Asn Leu Ser Ser Cys Val Phe Ser Arg
355 360 365
Thr Glu Gly Ala Leu Ser Thr Pro Tyr Val Ser Val His Gly Lys Ile
370 375 380
Val Ala Asn Cys Lys Ser Val Val Cys Arg Cys Val Glu Pro Gln Gln
385 390 395 400
Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Leu Ser Leu Ile Asp Glu Ser
405 410 415
Leu Cys Arg Ile Leu Glu Leu Asn Gly Val Ile Leu Lys Met Asp Gly
420 425 430
Gln Phe Thr Ser Glu Tyr Thr Lys Asn Ile Thr Ile Asp Pro Val Gln
435 440 445
Val Ile Ile Ser Gly Pro Ile Asp Ile Ser Ser Glu Leu Ser Gln Val
450 455 460
Asn Gln Ser Leu Asp Ser Ala Leu Glu Asn Ile Lys Glu Ser Asn Ser
465 470 475 480
Tyr Leu Ser Lys Val Asn Val Lys Leu Ile Ser Ser Ser Ala Met Ile
485 490 495
Thr Tyr Ile Val Ile Thr Val Ile Cys Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala
500 505 510
Leu Val Leu Gly Ile Tyr Ser Tyr Thr Lys Ile Arg Ser Gln Gln Lys
515 520 525
Thr Leu Ile Trp Met Gly Asn Asn Ile Ala Arg Ser Lys Glu Gly Asn
530 535 540
Arg Phe
545
<210> 44
<211> 538
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒3（Avian paramyxovirus 3）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<220>
<221> misc_feature
<222> (287)..(287)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 44
Met Ala Ser Pro Met Val Pro Leu Leu Ile Ile Thr Val Val Pro Ala
1 5 10 15
Leu Ile Ser Ser Gln Ser Ala Asn Ile Asp Lys Leu Ile Gln Ala Gly
20 25 30
Ile Ile Met Gly Ser Gly Lys Glu Leu His Ile Tyr Gln Glu Ser Gly
35 40 45
Ser Leu Asp Leu Tyr Leu Arg Leu Leu Pro Val Ile Pro Ser Asn Leu
50 55 60
Ser His Cys Gln Ser Glu Val Ile Thr Gln Tyr Asn Ser Thr Val Thr
65 70 75 80
Arg Leu Leu Ser Pro Ile Ala Lys Asn Leu Asn His Leu Leu Gln Pro
85 90 95
Arg Pro Ser Gly Arg Leu Phe Gly Ala Val Ile Gly Ser Ile Ala Leu
100 105 110
Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Ser Ala Ala Ile Ala Leu Val Arg
115 120 125
Ala Gln Gln Asn Ala Asn Asp Ile Leu Ala Leu Lys Ala Ala Ile Gln
130 135 140
Ser Ser Asn Glu Ala Ile Lys Gln Leu Thr Tyr Gly Gln Glu Lys Gln
145 150 155 160
Leu Leu Ala Ile Ser Lys Ile Gln Lys Ala Val Asn Glu Gln Val Ile
165 170 175
Pro Ala Leu Thr Ala Leu Asp Cys Ala Val Leu Gly Asn Lys Leu Ala
180 185 190
Ala Gln Leu Asn Leu Tyr Leu Ile Glu Met Thr Thr Ile Phe Gly Asp
195 200 205
Gln Ile Asn Asn Pro Val Leu Thr Pro Ile Pro Leu Ser Tyr Leu Leu
210 215 220
Arg Leu Thr Gly Ser Glu Leu Asn Asp Val Leu Leu Gln Gln Thr Arg
225 230 235 240
Ser Ser Leu Ser Leu Ile His Leu Val Ser Lys Gly Leu Leu Ser Gly
245 250 255
Gln Ile Ile Gly Tyr Asp Pro Ser Val Gln Gly Ile Ile Ile Arg Ile
260 265 270
Gly Leu Ile Arg Thr Gln Arg Ile Asp Arg Ser Leu Val Phe Xaa Pro
275 280 285
Tyr Val Leu Pro Ile Thr Ile Ser Ser Asn Ile Ala Thr Pro Ile Ile
290 295 300
Pro Asp Cys Val Val Lys Lys Gly Val Ile Ile Glu Gly Met Leu Lys
305 310 315 320
Ser Asn Cys Ile Glu Leu Glu Arg Asp Ile Ile Cys Lys Thr Ile Asn
325 330 335
Thr Tyr Gln Ile Thr Lys Glu Thr Arg Ala Cys Leu Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Thr Met Cys Lys Tyr Gln Gln Ser Arg Thr Gln Leu Ser Thr Pro Phe
355 360 365
Ile Thr Tyr Asn Gly Val Val Ile Ala Asn Cys Asp Leu Val Ser Cys
370 375 380
Arg Cys Ile Arg Pro Pro Met Ile Ile Thr Gln Val Lys Gly Tyr Pro
385 390 395 400
Leu Thr Ile Ile Asn Arg Asn Leu Cys Thr Glu Leu Ser Val Asp Asn
405 410 415
Leu Ile Leu Asn Ile Glu Thr Asn His Asn Phe Ser Leu Asn Pro Thr
420 425 430
Ile Ile Asp Ser Gln Ser Arg Leu Ile Ala Thr Ser Pro Leu Glu Ile
435 440 445
Asp Ala Leu Ile Gln Asp Ala Gln His His Ala Ala Ala Ala Leu Leu
450 455 460
Lys Val Glu Glu Ser Asn Ala His Leu Leu Arg Val Thr Gly Leu Gly
465 470 475 480
Ser Ser Ser Trp His Ile Ile Leu Ile Leu Thr Leu Leu Val Cys Thr
485 490 495
Ile Ala Trp Leu Ile Gly Leu Ser Ile Tyr Val Cys Arg Ile Lys Asn
500 505 510
Asp Asp Ser Thr Asp Lys Glu Pro Thr Thr Gln Ser Ser Asn Arg Gly
515 520 525
Ile Gly Val Gly Ser Ile Gln Tyr Met Thr
530 535
<210> 45
<211> 552
<212> PRT
<213> 塞勒姆病毒（Salem virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 45
Met Asn Pro Leu Asn Gln Thr Leu Ile Ala Lys Val Leu Gly Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Ser Ser Phe Thr Val Gly Gln Ile Gly Phe Glu Asn Leu
20 25 30
Thr Arg Ile Gly Val His Gln Val Lys Gln Tyr Gly Tyr Lys Leu Ala
35 40 45
His Tyr Asn Ser His Gln Leu Leu Leu Ile Arg Met Ile Pro Thr Val
50 55 60
Asn Gly Thr His Asn Cys Thr His Gln Val Ile Thr Arg Tyr Arg Glu
65 70 75 80
Met Val Arg Glu Ile Ile Thr Pro Ile Lys Gly Ala Leu Asp Ile Met
85 90 95
Lys Lys Ala Val Ser Pro Asp Leu Val Gly Ala Arg Ile Phe Gly Ala
100 105 110
Ile Val Ala Gly Ala Ala Leu Gly Ile Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr
115 120 125
Ala Gly Val Ala Leu His Arg Thr Lys Leu Asn Gly Gln Glu Ile Ser
130 135 140
Lys Leu Lys Glu Ala Val Ser Leu Thr Asn Glu Ala Val Glu Gln Leu
145 150 155 160
Gln Tyr Ser Gln Gly Lys Ser Ile Leu Ala Ile Gln Gly Ile Gln Asp
165 170 175
Phe Ile Asn Phe Asn Val Val Pro Leu Leu Glu Glu His Thr Cys Gly
180 185 190
Ile Ala Lys Leu His Leu Glu Met Ala Leu Met Glu Tyr Phe Gln Lys
195 200 205
Leu Ile Leu Val Phe Gly Pro Asn Leu Arg Asp Pro Ile Gly Ser Thr
210 215 220
Ile Gly Ile Gln Ala Leu Ala Thr Leu Phe Gln Asn Asn Met Phe Glu
225 230 235 240
Val Ser Leu Arg Leu Gly Tyr Ala Gly Asp Asp Leu Glu Asp Val Leu
245 250 255
Gln Ser Asn Ser Ile Arg Ala Asn Ile Ile Glu Ala Glu Pro Asp Ser
260 265 270
Gly Phe Ile Val Leu Ala Ile Arg Tyr Pro Thr Leu Thr Leu Val Glu
275 280 285
Asp Gln Val Ile Thr Glu Leu Ala His Ile Thr Phe Asn Asp Gly Pro
290 295 300
Gln Glu Trp Val Ala Thr Ile Pro Gln Phe Val Thr Tyr Arg Gly Leu
305 310 315 320
Val Leu Ala Asn Ile Asp Val Ser Thr Cys Thr Phe Thr Glu Arg Asn
325 330 335
Val Ile Cys Ala Arg Asp Gln Thr Tyr Pro Met Ile Ile Asp Leu Gln
340 345 350
Leu Cys Met Arg Gly Asn Ile Ala Lys Cys Gly Arg Thr Arg Val Thr
355 360 365
Gly Ser Thr Ala Ser Arg Phe Leu Leu Lys Asp Gly Asn Met Tyr Ala
370 375 380
Asn Cys Ile Ala Thr Met Cys Arg Cys Met Ser Ser Ser Ser Ile Ile
385 390 395 400
Asn Gln Glu Pro Ser His Leu Thr Thr Leu Ile Val Lys Glu Thr Cys
405 410 415
Ser Glu Val Met Ile Asp Thr Ile Arg Ile Thr Leu Gly Glu Arg Lys
420 425 430
His Pro Pro Ile Asp Tyr Gln Thr Thr Ile Thr Leu Gly Gln Pro Ile
435 440 445
Ala Leu Ala Pro Leu Asp Val Gly Thr Glu Leu Ala Asn Ala Val Ser
450 455 460
Tyr Leu Asn Lys Ser Lys Val Leu Leu Glu His Ser Asn Glu Val Leu
465 470 475 480
Ser Ser Val Ser Thr Ala His Thr Ser Leu Thr Ala Thr Ile Val Leu
485 490 495
Gly Ile Val Val Gly Gly Leu Ala Ile Leu Ile Val Val Met Phe Leu
500 505 510
Phe Leu Glu Ala Gln Val Ile Lys Val Gln Arg Ala Met Met Leu Cys
515 520 525
Pro Ile Thr Asn His Gly Tyr Leu Pro Asn Glu Asp Leu Leu Thr Arg
530 535 540
Gly His Ser Ile Pro Thr Ile Gly
545 550
<210> 46
<211> 551
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒9（Avian paramyxovirus 9）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 46
Met Gly Tyr Phe His Leu Leu Leu Ile Leu Thr Ala Ile Ala Ile Ser
1 5 10 15
Ala His Leu Cys Tyr Thr Thr Thr Leu Asp Gly Arg Lys Leu Leu Gly
20 25 30
Ala Gly Ile Val Ile Thr Glu Glu Lys Gln Val Arg Val Tyr Thr Ala
35 40 45
Ala Gln Ser Gly Thr Ile Val Leu Arg Ser Phe Arg Val Val Ser Leu
50 55 60
Asp Arg Tyr Ser Cys Met Glu Ser Thr Ile Glu Ser Tyr Asn Lys Thr
65 70 75 80
Val Tyr Asn Ile Leu Ala Pro Leu Gly Asp Ala Ile Arg Arg Ile Gln
85 90 95
Ala Ser Gly Val Ser Val Glu Arg Ile Arg Glu Gly Arg Ile Phe Gly
100 105 110
Ala Ile Leu Gly Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile
115 120 125
Thr Ala Ala Ile Ala Leu Ile Gln Ala Asn Glu Asn Ala Lys Asn Ile
130 135 140
Leu Arg Ile Lys Asp Ser Ile Thr Lys Thr Asn Glu Ala Val Arg Asp
145 150 155 160
Val Thr Asn Gly Val Ser Gln Leu Thr Ile Ala Val Gly Lys Leu Gln
165 170 175
Asp Phe Val Asn Lys Glu Phe Asn Lys Thr Thr Glu Ala Ile Asn Cys
180 185 190
Val Gln Ala Ala Gln Gln Leu Gly Val Glu Leu Ser Leu Tyr Leu Thr
195 200 205
Glu Ile Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln Ile Thr Ser Pro Ala Leu Ser
210 215 220
Lys Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn Leu Ala Gly Val Ser Leu Asp
225 230 235 240
Val Leu Leu Gly Arg Leu Gly Ala Asp Asn Ser Gln Leu Ser Ser Leu
245 250 255
Val Ser Ser Gly Leu Ile Thr Gly Gln Pro Ile Leu Tyr Asp Ser Glu
260 265 270
Ser Gln Ile Leu Ala Leu Gln Val Ser Leu Pro Ser Ile Ser Asp Leu
275 280 285
Arg Gly Val Arg Ala Thr Tyr Leu Asp Thr Leu Ala Val Asn Thr Ala
290 295 300
Ala Gly Leu Ala Ser Ala Met Ile Pro Lys Val Val Ile Gln Ser Asn
305 310 315 320
Asn Ile Val Glu Glu Leu Asp Thr Thr Ala Cys Ile Ala Ala Glu Ala
325 330 335
Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Thr Thr Phe Pro Ile Ala Ser Ala Val
340 345 350
Ser Ala Cys Ile Leu Gly Asp Val Ser Gln Cys Leu Tyr Ser Lys Thr
355 360 365
Asn Gly Val Leu Thr Thr Pro Tyr Val Ala Val Lys Gly Lys Ile Val
370 375 380
Ala Asn Cys Lys His Val Thr Cys Arg Cys Val Asp Pro Thr Ser Ile
385 390 395 400
Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Ala Thr Leu Ile Asp Asp Gln Leu
405 410 415
Cys Lys Val Ile Asn Leu Asp Gly Val Ser Ile Gln Leu Ser Gly Thr
420 425 430
Phe Glu Ser Thr Tyr Val Arg Asn Val Ser Ile Ser Ala Asn Lys Val
435 440 445
Ile Val Ser Ser Ser Ile Asp Ile Ser Asn Glu Leu Glu Asn Val Asn
450 455 460
Ser Ser Leu Ser Ser Ala Leu Glu Lys Leu Asp Glu Ser Asp Ala Ala
465 470 475 480
Leu Ser Lys Val Asn Val His Leu Thr Ser Thr Ser Ala Met Ala Thr
485 490 495
Tyr Ile Val Leu Thr Val Ile Ala Leu Ile Leu Gly Phe Val Gly Leu
500 505 510
Gly Leu Gly Cys Phe Ala Met Ile Lys Val Lys Ser Gln Ala Lys Thr
515 520 525
Leu Leu Trp Leu Gly Ala His Ala Asp Arg Ser Tyr Ile Leu Gln Ser
530 535 540
Lys Pro Ala Gln Ser Ser Thr
545 550
<210> 47
<211> 533
<212> PRT
<213> 阿奇莫塔病毒1（Achimota virus 1）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 47
Met Trp Ile Met Ile Ile Leu Ser Leu Phe Gln Ile Ile Pro Gly Val
1 5 10 15
Thr Pro Ile Asn Ser Lys Val Leu Thr Gln Leu Gly Val Ile Thr Lys
20 25 30
His Thr Arg Gln Leu Lys Phe Tyr Ser His Ser Thr Pro Ser Tyr Leu
35 40 45
Val Val Lys Leu Val Pro Thr Ile Asn Thr Glu Ser Thr Val Cys Asn
50 55 60
Phe Thr Ser Leu Ser Arg Tyr Lys Asp Ser Val Arg Glu Leu Ile Thr
65 70 75 80
Pro Leu Ala Lys Asn Ile Asp Asn Leu Asn Ser Ile Leu Thr Ile Pro
85 90 95
Lys Arg Arg Lys Arg Met Ala Gly Val Val Ile Gly Leu Ala Ala Leu
100 105 110
Gly Val Ala Ala Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala Val Ala Leu Ile Glu
115 120 125
Ala Lys Lys Asn Thr Glu Gln Ile Gln Ala Leu Ser Glu Ser Ile Gln
130 135 140
Asn Thr Asn Lys Ala Val Ser Ser Ile Glu Lys Gly Leu Ser Ser Ala
145 150 155 160
Ala Ile Ala Val Gln Ala Ile Gln Asn Gln Ile Asn Asn Val Ile Asn
165 170 175
Pro Ala Leu Thr Ala Leu Asp Cys Gly Val Thr Asp Ala Gln Leu Gly
180 185 190
Asn Ile Leu Asn Leu Tyr Leu Ile Lys Thr Leu Thr Val Phe Gln Lys
195 200 205
Gln Ile Thr Asn Pro Ala Leu Gln Pro Leu Ser Ile Gln Ala Leu Asn
210 215 220
Ile Ile Met Gln Glu Thr Ser Ser Val Leu Arg Asn Phe Thr Lys Thr
225 230 235 240
Asp Glu Ile Glu His Thr Asp Leu Leu Thr Ser Gly Leu Ile Thr Gly
245 250 255
Gln Val Val Gly Val Asn Leu Thr Asn Leu Gln Leu Ile Ile Ala Ala
260 265 270
Phe Ile Pro Ser Ile Ala Pro Leu Asn Gln Ala Tyr Ile Leu Asp Phe
275 280 285
Ile Arg Ile Thr Val Asn Ile Asn Asn Ser Glu Ser Met Ile Gln Ile
290 295 300
Pro Glu Arg Ile Met Glu His Gly Ile Ser Leu Tyr Gln Phe Gly Gly
305 310 315 320
Asp Gln Cys Thr Phe Ser Asp Trp Ser Ala Tyr Cys Pro Tyr Ser Asp
325 330 335
Ala Thr Leu Met Ala Pro Gly Leu Gln Asn Cys Phe Arg Gly Gln Ala
340 345 350
Ala Asp Cys Val Phe Ser Thr Val Met Gly Ser Phe Pro Asn Arg Phe
355 360 365
Val Ser Val Gln Gly Val Phe Tyr Val Asn Cys Lys Phe Ile Arg Cys
370 375 380
Ala Cys Thr Gln Pro Gln Arg Leu Ile Thr Gln Asp Asp Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Thr Gln Ile Asp Ala Lys Thr Cys Arg Met Leu Thr Leu Gly Phe
405 410 415
Val Gln Phe Ser Ile Asn Glu Tyr Ala Asn Val Thr Tyr Ser Phe Lys
420 425 430
Asn Asn Val Thr Ala Gly Gln Leu Ile Met Thr Asn Pro Ile Asp Leu
435 440 445
Ser Thr Glu Ile Lys Gln Met Asn Asp Ser Val Asp Glu Ala Ala Arg
450 455 460
Tyr Ile Glu Lys Ser Asn Ala Ala Leu Asn Lys Leu Met Tyr Gly Gly
465 470 475 480
Arg Ser Asp Ile Val Thr Thr Val Leu Leu Val Gly Phe Ile Leu Leu
485 490 495
Val Val Tyr Val Ile Phe Val Thr Tyr Ile Leu Lys Ile Leu Met Lys
500 505 510
Glu Val Ala Arg Leu Arg Asn Ser Asn His Pro Asp Leu Ile Lys Pro
515 520 525
Tyr Asn Tyr Pro Met
530
<210> 48
<211> 531
<212> PRT
<213> 阿奇莫塔病毒2（Achimota virus 2）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 48
Met Leu Asn Ser Phe Tyr Gln Ile Ile Cys Leu Ala Val Cys Leu Thr
1 5 10 15
Thr Tyr Thr Val Ile Ser Ile Asp Gln His Asn Leu Leu Lys Ala Gly
20 25 30
Val Ile Val Lys Ser Ile Lys Gly Leu Asn Phe Tyr Ser Arg Gly Gln
35 40 45
Ala Asn Tyr Ile Ile Val Lys Leu Ile Pro Asn Val Asn Val Thr Asp
50 55 60
Thr Asp Cys Asp Ile Gly Ser Ile Lys Arg Tyr Asn Glu Thr Val Tyr
65 70 75 80
Ser Leu Ile Lys Pro Leu Ala Asp Asn Ile Asp Tyr Leu Arg Thr Gln
85 90 95
Phe Ala Pro Thr Lys Arg Lys Lys Arg Phe Ala Gly Val Ala Ile Gly
100 105 110
Leu Thr Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Val Thr Ala Ala Val
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Gln Glu Asn Ala Arg Lys Leu Asp Ala Leu Ala
130 135 140
Asp Ser Ile Gln Ala Thr Asn Glu Ala Val Gln Asp Leu Ser Thr Gly
145 150 155 160
Leu Gln Ala Gly Ala Ile Ala Ile Gln Ala Ile Gln Ser Glu Ile Asn
165 170 175
His Val Ile Asn Pro Ala Leu Glu Arg Leu Ser Cys Glu Ile Ile Asp
180 185 190
Thr Arg Val Ala Ser Ile Leu Asn Leu Tyr Leu Ile Arg Leu Thr Thr
195 200 205
Val Phe His Arg Gln Leu Val Asn Pro Ala Leu Thr Pro Leu Ser Ile
210 215 220
Gln Ala Leu Asn His Leu Leu Gln Gly Glu Thr Glu Gly Leu Val Lys
225 230 235 240
Asn Glu Ser Lys Met Thr Asp Ser Lys Ile Asp Leu Leu Met Ser Gly
245 250 255
Leu Ile Thr Gly Gln Val Val Gly Val Asn Ile Lys His Met Gln Leu
260 265 270
Met Ile Ala Val Phe Val Pro Thr Thr Ala Gln Leu Pro Asn Ala Tyr
275 280 285
Val Ile Asn Leu Leu Thr Ile Thr Ala Asn Ile Asn Asn Ser Glu Val
290 295 300
Leu Val Gln Leu Pro Asn Gln Ile Leu Glu Arg Ser Gly Ile Ile Tyr
305 310 315 320
Gln Phe Arg Gly Lys Asp Cys Val Ser Ser Pro Asn His Met Tyr Cys
325 330 335
Pro Tyr Ser Asp Ala Ser Ile Leu Ser Pro Glu Leu Gln Leu Cys Leu
340 345 350
Gln Gly Arg Leu Glu Met Cys Leu Phe Thr Gln Val Val Gly Ser Phe
355 360 365
Pro Thr Arg Phe Ala Ser Asp Lys Gly Ile Val Tyr Ala Asn Cys Arg
370 375 380
His Leu Gln Cys Ala Cys Ser Glu Pro Glu Gly Ile Ile Tyr Gln Asp
385 390 395 400
Asp Thr Ser Ala Ile Thr Gln Ile Asp Ala Ser Lys Cys Ser Thr Leu
405 410 415
Lys Leu Asp Met Leu Thr Phe Lys Leu Ser Thr Tyr Ala Asn Lys Thr
420 425 430
Phe Asp Ala Ser Phe Ser Val Gly Lys Asp Gln Met Leu Val Thr Asn
435 440 445
Leu Leu Asp Leu Ser Ala Glu Leu Lys Thr Met Asn Ala Ser Val Ala
450 455 460
His Ala Asn Lys Leu Ile Asp Lys Ser Asn Leu Leu Ile Gln Ser Asn
465 470 475 480
Ala Leu Ile Gly His Ser Asn Thr Ile Phe Ile Val Val Ile Val Ile
485 490 495
Leu Ala Val Met Val Leu Tyr Leu Ile Ile Val Thr Tyr Ile Ile Lys
500 505 510
Val Ile Met Val Glu Val Ser Arg Leu Lys Arg Met Asn Ile Tyr Ser
515 520 525
Ile Asp Lys
530
<210> 49
<211> 532
<212> PRT
<213> 吐霍科病毒1（Tuhoko virus 1）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 49
Met Val Thr Ile Ile Lys Pro Leu Ile Leu Leu Val Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Gln Ile Ser Gly His Ile Asp Thr Thr Ala Leu Thr Ser Ile Gly Ala
20 25 30
Val Ile Ala Ser Ser Lys Glu Ile Met Tyr Tyr Ala Gln Ser Thr Pro
35 40 45
Asn Tyr Ile Val Ile Lys Leu Ile Pro Asn Leu Pro Asn Ile Pro Ser
50 55 60
Gln Cys Asn Phe Ser Ser Ile Ala Tyr Tyr Asn Lys Thr Leu Leu Asp
65 70 75 80
Leu Phe Thr Pro Ile Ser Asp Asn Ile Asn Met Leu His Gln Arg Leu
85 90 95
Ser Asn Thr Gly Arg Asn Arg Arg Phe Ala Gly Val Ala Ile Gly Leu
100 105 110
Ala Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Gln Val Thr Ala Ala Phe Ala
115 120 125
Leu Val Glu Ala Lys Ser Asn Thr Ala Lys Ile Ala Gln Ile Gly Gln
130 135 140
Ala Ile Gln Asn Thr Asn Ala Ala Ile Asn Ser Leu Asn Ala Gly Ile
145 150 155 160
Gly Gly Ala Val Thr Ala Ile Gln Ala Ile Gln Thr Gln Ile Asn Gly
165 170 175
Ile Ile Thr Asp Gln Ile Asn Ala Ala Thr Cys Thr Ala Leu Asp Ala
180 185 190
Gln Ile Gly Thr Leu Leu Asn Met Tyr Leu Leu Gln Leu Thr Thr Thr
195 200 205
Phe Gln Pro Gln Ile Gln Asn Pro Ala Leu Gln Pro Leu Ser Ile Gln
210 215 220
Ala Leu His Arg Ile Met Gln Gly Thr Ser Ile Val Leu Ser Asn Leu
225 230 235 240
Thr Asp Ser Ser Lys Tyr Gly Leu Asn Asp Ala Leu Ser Ala Gly Leu
245 250 255
Ile Thr Gly Gln Ile Val Ser Val Asp Leu Arg Leu Met Gln Ile Thr
260 265 270
Ile Ala Ala Asn Val Pro Thr Leu Ser Arg Leu Glu Asn Ala Ile Ala
275 280 285
His Asp Ile Met Arg Ile Thr Thr Asn Val Asn Asn Thr Glu Val Ile
290 295 300
Val Gln Leu Pro Glu Thr Ile Met Glu His Ala Gly Arg Leu Tyr Gln
305 310 315 320
Phe Asn Lys Asp His Cys Leu Ser Ser Thr Gln Arg Phe Phe Cys Pro
325 330 335
Tyr Ser Asp Ala Lys Leu Leu Thr Ser Lys Ile Ser Ser Cys Leu Ser
340 345 350
Gly Ile Arg Gly Asp Cys Ile Phe Ser Pro Val Val Gly Asn Phe Ala
355 360 365
Thr Arg Phe Ile Ser Val Lys Gly Val Ile Ile Ala Asn Cys Lys Phe
370 375 380
Ile Arg Cys Thr Cys Leu Gln Pro Glu Gly Ile Ile Ser Gln Leu Asp
385 390 395 400
Asp His Thr Leu Thr Val Ile Asp Leu Lys Leu Cys Asn Lys Leu Asp
405 410 415
Leu Gly Leu Ile Gln Phe Asp Leu Gln Val Leu Ser Asn Ile Ser Tyr
420 425 430
Glu Met Thr Leu Asn Thr Ser Gln Asn Gln Leu Ile Leu Thr Asp Pro
435 440 445
Leu Asp Leu Ser Ser Glu Leu Gln Thr Met Asn Gln Ser Ile Asn Asn
450 455 460
Ala Ala Asn Phe Ile Glu Lys Ser Asn Ser Leu Leu Asn Ser Ser Thr
465 470 475 480
Tyr Glu Phe Asn Arg Ser Val Ala Leu Leu Val Ala Leu Ile Leu Leu
485 490 495
Ser Leu Thr Ile Leu Tyr Val Ile Val Leu Thr Cys Val Val Lys Leu
500 505 510
Leu Val His Glu Val Ser Lys Asn Arg Arg His Ile Gln Asp Leu Glu
515 520 525
Ser His His Lys
530
<210> 50
<211> 631
<212> PRT
<213> 海豹瘟热病毒（Phpcine distemper virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 50
Met Thr Arg Val Lys Lys Leu Pro Val Pro Thr Asn Pro Pro Met His
1 5 10 15
His Ser Leu Asp Ser Pro Phe Leu Asn Pro Glu His Ala Thr Gly Lys
20 25 30
Ile Ser Ile Thr Asp Asp Thr Ser Ser Gln Leu Thr Asn Phe Leu Tyr
35 40 45
His Lys Tyr His Lys Thr Thr Ile Asn His Leu Ser Arg Thr Ile Ser
50 55 60
Gly Thr Asp Pro Pro Ser Ala Lys Leu Asn Lys Phe Gly Ser Pro Ile
65 70 75 80
Leu Ser Thr Tyr Gln Ile Arg Ser Ala Leu Trp Trp Ile Ala Met Val
85 90 95
Ile Leu Val His Cys Val Met Gly Gln Ile His Trp Thr Asn Leu Ser
100 105 110
Thr Ile Gly Ile Ile Gly Thr Asp Ser Ser His Tyr Lys Ile Met Thr
115 120 125
Arg Ser Ser His Gln Tyr Leu Val Leu Lys Leu Met Pro Asn Val Ser
130 135 140
Ile Ile Asp Asn Cys Thr Lys Ala Glu Leu Asp Glu Tyr Glu Lys Leu
145 150 155 160
Leu Asn Ser Val Leu Glu Pro Ile Asn Gln Ala Leu Thr Leu Met Thr
165 170 175
Lys Asn Val Lys Ser Leu Gln Ser Leu Gly Ser Gly Arg Arg Gln Arg
180 185 190
Arg Phe Ala Gly Val Val Ile Ala Gly Ala Ala Leu Gly Val Ala Thr
195 200 205
Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Gln Ser Asn Leu Asn
210 215 220
Ala Gln Ala Ile Gln Ser Leu Arg Ala Ser Leu Glu Gln Ser Asn Lys
225 230 235 240
Ala Ile Asp Glu Val Arg Gln Ala Ser Gln Asn Ile Ile Ile Ala Val
245 250 255
Gln Gly Val Gln Asp Tyr Val Asn Asn Glu Ile Val Pro Ala Leu Gln
260 265 270
His Met Ser Cys Glu Leu Ile Gly Gln Arg Leu Gly Leu Lys Leu Leu
275 280 285
Arg Tyr Tyr Thr Glu Leu Leu Ser Val Phe Gly Pro Ser Leu Arg Asp
290 295 300
Pro Val Ser Ala Glu Ile Ser Ile Gln Ala Leu Ser Tyr Ala Leu Gly
305 310 315 320
Gly Glu Ile His Lys Ile Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Ser Gly Asn Asp
325 330 335
Met Val Ala Ile Leu Glu Thr Lys Gly Ile Arg Ala Lys Ile Thr His
340 345 350
Val Asp Leu Ser Gly Lys Phe Ile Val Leu Ser Ile Ser Tyr Pro Thr
355 360 365
Leu Ser Glu Val Lys Gly Val Val Val His Arg Leu Glu Ala Val Ser
370 375 380
Tyr Asn Ile Gly Ser Gln Glu Trp Tyr Thr Thr Val Pro Arg Tyr Val
385 390 395 400
Ala Thr Asn Gly Tyr Leu Ile Ser Asn Phe Asp Glu Ser Ser Cys Val
405 410 415
Phe Val Ser Glu Ser Ala Ile Cys Ser Gln Asn Ser Leu Tyr Pro Met
420 425 430
Ser Pro Ile Leu Gln Gln Cys Leu Arg Gly Glu Thr Ala Ser Cys Ala
435 440 445
Arg Thr Leu Val Ser Gly Thr Leu Gly Asn Lys Phe Ile Leu Ser Lys
450 455 460
Gly Asn Ile Ile Ala Asn Cys Ala Ser Ile Leu Cys Lys Cys His Ser
465 470 475 480
Thr Ser Lys Ile Ile Asn Gln Ser Pro Asp Lys Leu Leu Thr Phe Ile
485 490 495
Ala Ser Asp Thr Cys Ser Leu Val Glu Ile Asp Gly Val Thr Ile Gln
500 505 510
Val Gly Ser Arg Gln Tyr Pro Asp Val Val Tyr Ala Ser Lys Val Ile
515 520 525
Leu Gly Pro Ala Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp Val Gly Thr Asn Leu
530 535 540
Gly Ser Ala Leu Lys Lys Leu Asn Asp Ala Lys Val Leu Ile Glu Ser
545 550 555 560
Ser Asp Gln Ile Leu Asp Thr Val Lys Asn Ser Tyr Leu Ser Leu Gly
565 570 575
Thr Leu Ile Ala Leu Pro Val Ser Ile Gly Leu Gly Leu Ile Leu Leu
580 585 590
Leu Leu Ile Cys Cys Cys Lys Lys Arg Tyr Gln His Leu Phe Ser Gln
595 600 605
Ser Thr Lys Val Ala Pro Val Phe Lys Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ser
610 615 620
Lys Ser Tyr Val Arg Ser Leu
625 630
<210> 51
<211> 541
<212> PRT
<213> 山羊副流感病毒（Caprine parainfluenza virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 51
Met Ile Lys Lys Ile Ile Cys Ile Phe Ser Met Pro Ile Leu Leu Ser
1 5 10 15
Phe Cys Gln Val Asp Ile Ile Lys Leu Gln Arg Val Gly Ile Leu Val
20 25 30
Ser Lys Pro Lys Ser Ile Lys Ile Ser Gln Asn Phe Glu Thr Arg Tyr
35 40 45
Leu Val Leu Asn Leu Ile Pro Asn Ile Glu Asn Ala Gln Ser Cys Gly
50 55 60
Asp Gln Gln Ile Lys Gln Tyr Lys Lys Leu Leu Asp Arg Leu Ile Ile
65 70 75 80
Pro Leu Tyr Asp Gly Leu Arg Leu Gln Gln Asp Ile Ile Val Val Asp
85 90 95
Asn Asn Leu Lys Asn Asn Thr Asn His Arg Ala Lys Arg Phe Phe Gly
100 105 110
Glu Ile Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile
115 120 125
Thr Ala Ala Val Ala Leu Val Glu Ala Lys Gln Ala Arg Ser Asp Ile
130 135 140
Glu Arg Val Lys Asn Ala Val Arg Asp Thr Asn Lys Ala Val Gln Ser
145 150 155 160
Ile Gln Gly Ser Val Gly Asn Leu Ile Val Ala Val Lys Ser Val Gln
165 170 175
Asp Tyr Val Asn Asn Glu Ile Val Pro Ser Ile Lys Arg Leu Gly Cys
180 185 190
Glu Ala Ala Gly Leu Gln Leu Gly Ile Ala Leu Thr Gln His Tyr Ser
195 200 205
Glu Leu Thr Asn Ile Phe Gly Asp Asn Ile Gly Thr Leu Lys Glu Lys
210 215 220
Gly Ile Lys Leu Gln Gly Ile Ala Ser Leu Tyr His Thr Asn Ile Thr
225 230 235 240
Glu Ile Phe Thr Thr Ser Thr Val Asp Gln Tyr Asp Ile Tyr Asp Leu
245 250 255
Leu Phe Thr Glu Ser Ile Lys Met Arg Val Ile Asp Val Asp Leu Asn
260 265 270
Asp Tyr Ser Ile Thr Leu Gln Val Arg Leu Pro Leu Leu Thr Lys Ile
275 280 285
Ser Asp Ala Gln Ile Tyr Asn Val Asp Ser Val Ser Tyr Asn Ile Gly
290 295 300
Gly Thr Glu Trp Tyr Ile Pro Leu Pro Arg Asn Ile Met Thr Lys Gly
305 310 315 320
Ala Phe Leu Gly Gly Ala Asn Leu Gln Asp Cys Ile Glu Ser Phe Ser
325 330 335
Asp Tyr Ile Cys Pro Ser Asp Pro Gly Phe Ile Leu Asn Arg Asp Ile
340 345 350
Glu Asn Cys Leu Ser Gly Asn Ile Thr Gln Cys Pro Lys Thr Leu Val
355 360 365
Ile Ser Asp Ile Val Pro Arg Tyr Ala Phe Val Asp Gly Gly Val Ile
370 375 380
Ala Asn Cys Leu Ser Thr Thr Cys Thr Cys Asn Gly Ile Asp Asn Arg
385 390 395 400
Ile Asn Gln Ala Pro Asp Gln Gly Ile Lys Ile Ile Thr Tyr Lys Asp
405 410 415
Cys Gln Thr Ile Gly Ile Asn Gly Met Leu Phe Lys Thr Asn Gln Glu
420 425 430
Gly Thr Leu Ala Ala Tyr Thr Pro Val Asp Ile Thr Leu Asn Asn Ser
435 440 445
Val Asn Leu Asp Pro Ile Asp Leu Ser Ile Glu Leu Asn Arg Ala Arg
450 455 460
Ser Asp Leu Ala Glu Ser Lys Glu Trp Ile Lys Arg Ser Glu Ala Lys
465 470 475 480
Leu Asp Ser Val Gly Ser Trp Tyr Gln Ser Ser Thr Thr Glu Ile Ile
485 490 495
Gln Ile Val Met Ile Ile Val Leu Phe Ile Ile Asn Ile Ile Val Leu
500 505 510
Ile Val Leu Ile Lys Tyr Ser Arg Ser Gln Asn Gln Ser Met Asn Asn
515 520 525
His Met Asn Glu Pro Tyr Ile Leu Thr Asn Lys Val Gln
530 535 540
<210> 52
<211> 553
<212> PRT
<213> 树鼩副粘病毒（Tupaia paramyxovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 52
Met Ala Ser Leu Leu Lys Thr Ile Cys Tyr Ile Tyr Leu Ile Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Lys Leu Glu Pro Thr Pro Lys Ser Gln Leu Asp Leu Asp Ser Leu
20 25 30
Ala Ser Ile Gly Val Val Asp Ala Gly Lys Tyr Asn Tyr Lys Leu Met
35 40 45
Thr Thr Gly Ser Glu Lys Leu Met Val Ile Lys Leu Val Pro Asn Ile
50 55 60
Thr Tyr Ala Thr Asn Cys Asn Leu Thr Ala His Thr Ala Tyr Thr Lys
65 70 75 80
Met Ile Glu Arg Leu Leu Thr Pro Ile Asn Gln Ser Leu Tyr Glu Met
85 90 95
Arg Ser Val Ile Thr Glu Arg Asp Gly Gly Thr Ile Phe Trp Gly Ala
100 105 110
Ile Ile Ala Gly Ala Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Ala Ile Thr
115 120 125
Ala Gly Val Ala Leu His Arg Ala Glu Gln Asn Ala Arg Asn Ile Ala
130 135 140
Ala Leu Lys Asp Ala Leu Arg Asn Ser Asn Glu Ala Ile Gln His Leu
145 150 155 160
Lys Asp Ala Gln Gly His Thr Val Leu Ala Ile Gln Gly Leu Gln Glu
165 170 175
Gln Ile Asn Asn Asn Ile Ile Pro Lys Leu Lys Glu Ser His Cys Leu
180 185 190
Gly Val Asn Asn Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gln Tyr Tyr Ser Glu
195 200 205
Ile Leu Thr Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asn Pro Val Ser Ala Ser
210 215 220
Leu Thr Ile Gln Ala Ile Ala Lys Ala Phe Asn Gly Asp Phe Asn Ser
225 230 235 240
Leu Met Thr Asn Leu Asn Tyr Asp Pro Thr Asp Leu Leu Asp Ile Leu
245 250 255
Glu Ser Asn Ser Ile Asn Gly Arg Ile Ile Asp Val Asn Leu Asn Glu
260 265 270
Lys Tyr Ile Ala Leu Ser Ile Glu Ile Pro Asn Phe Ile Thr Leu Thr
275 280 285
Asp Ala Lys Ile Gln Thr Phe Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Tyr Gly Ser
290 295 300
Asn Glu Trp Leu Thr Leu Ile Pro Asp Asn Ile Leu Glu Tyr Gly Asn
305 310 315 320
Leu Ile Ser Asn Val Asp Leu Thr Ser Cys Val Lys Thr Lys Ser Ser
325 330 335
Tyr Ile Cys Asn Gln Asp Thr Ser Tyr Pro Ile Ser Ser Glu Leu Thr
340 345 350
Arg Cys Leu Arg Gly Asp Thr Ser Ser Cys Pro Arg Thr Pro Val Val
355 360 365
Asn Ser Arg Ala Pro Thr Phe Ala Leu Ser Gly Gly His Ile Tyr Ala
370 375 380
Asn Cys Ala Lys Ala Ala Cys Arg Cys Glu Lys Pro Pro Met Ala Ile
385 390 395 400
Val Gln Pro Ala Thr Ser Thr Leu Thr Phe Leu Thr Glu Lys Glu Cys
405 410 415
Gln Glu Val Val Ile Asp Gln Ile Asn Ile Gln Leu Ala Pro Asn Arg
420 425 430
Leu Asn Lys Thr Ile Ile Thr Asp Gly Ile Asp Leu Gly Pro Glu Val
435 440 445
Ile Ile Asn Pro Ile Asp Val Ser Ala Glu Leu Gly Asn Ile Glu Leu
450 455 460
Glu Met Asp Lys Thr Gln Lys Ala Leu Asp Arg Ser Asn Lys Ile Leu
465 470 475 480
Asp Ser Met Ile Thr Glu Val Thr Pro Asp Lys Leu Leu Ile Ala Met
485 490 495
Ile Val Val Phe Gly Ile Leu Leu Leu Trp Leu Phe Gly Val Ser Tyr
500 505 510
Tyr Ala Phe Lys Ile Trp Ser Lys Leu His Phe Leu Asp Ser Tyr Val
515 520 525
Tyr Ser Leu Arg Asn Pro Ser His His Arg Ser Asn Gly His Gln Asn
530 535 540
His Ser Phe Ser Thr Asp Ile Ser Gly
545 550
<210> 53
<211> 543
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒3（Avian paramyxovirus 3）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 53
Met Gln Pro Gly Ser Ala Leu His Leu Pro His Leu Tyr Ile Ile Ile
1 5 10 15
Ala Leu Val Ser Asp Gly Thr Leu Gly Gln Thr Ala Lys Ile Asp Arg
20 25 30
Leu Ile Gln Ala Gly Ile Val Leu Gly Ser Gly Lys Glu Leu His Ile
35 40 45
Ser Gln Asp Ser Gly Thr Leu Asp Leu Phe Val Arg Leu Leu Pro Val
50 55 60
Leu Pro Ser Asn Leu Ser His Cys Gln Leu Glu Ala Ile Thr Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Lys Thr Val Thr Arg Leu Leu Ala Pro Ile Gly Lys Asn Leu Glu
85 90 95
Gln Val Leu Gln Ala Arg Pro Arg Gly Arg Leu Phe Gly Pro Ile Ile
100 105 110
Gly Ser Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr Ala Ala
115 120 125
Ile Ala Leu Val Arg Ala Gln Gln Asn Ala Asn Asp Ile Leu Ala Leu
130 135 140
Lys Asn Ala Leu Gln Ser Ser Asn Glu Ala Ile Arg Gln Leu Thr Tyr
145 150 155 160
Gly Gln Asp Lys Gln Leu Leu Ala Ile Ser Lys Ile Gln Lys Ala Val
165 170 175
Asn Glu Gln Ile Leu Pro Ala Leu Asp Gln Leu Asp Cys Ala Val Leu
180 185 190
Gly Thr Lys Leu Ala Val Gln Leu Asn Leu Tyr Leu Ile Glu Met Thr
195 200 205
Thr Ile Phe Gly Glu Gln Ile Asn Asn Pro Val Leu Ala Thr Ile Pro
210 215 220
Leu Ser Tyr Ile Leu Arg Leu Thr Gly Ala Glu Leu Asn Asn Val Leu
225 230 235 240
Met Lys Gln Ala Arg Ser Ser Leu Ser Leu Val Gln Leu Val Ser Lys
245 250 255
Gly Leu Leu Ser Gly Gln Val Ile Gly Tyr Asp Pro Ser Val Gln Gly
260 265 270
Leu Ile Ile Arg Val Asn Leu Met Arg Thr Gln Lys Ile Asp Arg Ala
275 280 285
Leu Val Tyr Gln Pro Tyr Val Leu Pro Ile Thr Leu Asn Ser Asn Ile
290 295 300
Val Thr Pro Ile Ala Pro Glu Cys Val Ile Gln Lys Gly Thr Ile Ile
305 310 315 320
Glu Gly Met Ser Arg Lys Asp Cys Thr Glu Leu Glu Gln Asp Ile Ile
325 330 335
Cys Arg Thr Val Thr Thr Tyr Thr Leu Ala Arg Asp Thr Arg Leu Cys
340 345 350
Leu Gln Gly Asn Ile Ser Ser Cys Arg Tyr Gln Gln Ser Gly Thr Gln
355 360 365
Leu His Thr Pro Phe Ile Thr Tyr Asn Gly Ala Val Ile Ala Asn Cys
370 375 380
Asp Leu Val Ser Cys Arg Cys Leu Arg Pro Pro Met Ile Ile Thr Gln
385 390 395 400
Val Lys Gly Tyr Pro Leu Thr Ile Ile Thr Arg Ser Val Cys Gln Glu
405 410 415
Leu Ser Val Asp Asn Leu Val Leu Asn Ile Glu Thr His His Asn Phe
420 425 430
Ser Leu Asn Pro Thr Ile Ile Asp Pro Leu Thr Arg Val Ile Ala Thr
435 440 445
Thr Pro Leu Glu Ile Asp Ser Leu Ile Gln Glu Ala Gln Asp His Ala
450 455 460
Asn Ala Ala Leu Ala Lys Val Glu Glu Ser Asp Lys Tyr Leu Arg Ala
465 470 475 480
Val Thr Gly Gly Asn Tyr Ser Asn Trp Tyr Ile Val Leu Val Ile Val
485 490 495
Leu Leu Phe Gly Asn Leu Gly Trp Ser Leu Leu Leu Thr Val Leu Leu
500 505 510
Cys Arg Ser Arg Lys Gln Gln Arg Arg Tyr Gln Gln Asp Asp Ser Val
515 520 525
Gly Ser Glu Arg Gly Val Gly Val Gly Thr Ile Gln Tyr Met Ser
530 535 540
<210> 54
<211> 541
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒14（Avian paramyxovirus 14）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 54
Met Glu Lys Gly Thr Val Leu Phe Leu Ala Ala Leu Thr Leu Tyr Asn
1 5 10 15
Val Lys Ala Leu Asp Asn Thr Lys Leu Leu Gly Ala Gly Ile Ala Ser
20 25 30
Gly Lys Glu His Glu Leu Lys Ile Tyr Gln Ser Ser Val Asn Gly Tyr
35 40 45
Ile Ala Val Lys Leu Ile Pro Phe Leu Pro Ser Thr Lys Arg Glu Cys
50 55 60
Tyr Asn Glu Gln Leu Lys Asn Tyr Asn Ala Thr Ile Asn Arg Leu Met
65 70 75 80
Gly Pro Ile Asn Asp Asn Ile Lys Leu Val Leu Ser Gly Val Lys Thr
85 90 95
Arg Thr Arg Glu Gly Lys Leu Ile Gly Ala Ile Ile Gly Thr Ala Ala
100 105 110
Leu Gly Leu Ala Thr Ala Ala Gln Val Thr Ala Ala Ile Ala Leu Glu
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Asn Ala Arg Ala Ile Leu Thr Leu Lys Glu Ser Ile
130 135 140
Arg Asn Thr Asn Asn Ala Val Ser Glu Leu Lys Thr Gly Leu Ser Glu
145 150 155 160
Val Ser Ile Ala Leu Ser Lys Thr Gln Asp Tyr Ile Asn Thr Gln Ile
165 170 175
Met Pro Ala Leu Ser Asn Leu Ser Cys Glu Ile Val Gly Leu Lys Ile
180 185 190
Gly Ile Gln Leu Ser Gln Tyr Leu Thr Glu Val Thr Ala Val Phe Gly
195 200 205
Asn Gln Ile Thr Asn Pro Ala Leu Gln Pro Leu Ser Met Gln Ala Leu
210 215 220
Tyr Gln Leu Cys Gly Gly Asp Phe Ser Leu Leu Leu Asp Lys Ile Gly
225 230 235 240
Ala Asp Arg Asn Glu Leu Glu Ser Leu Tyr Glu Ala Asn Leu Val Thr
245 250 255
Gly Arg Ile Val Gln Tyr Asp Thr Ala Asp Gln Leu Val Ile Ile Gln
260 265 270
Val Ser Ile Pro Ser Val Ser Thr Leu Ser Gly Tyr Arg Val Thr Glu
275 280 285
Leu Gln Ser Ile Ser Val Asp Met Asp His Gly Glu Gly Lys Ala Val
290 295 300
Ile Pro Arg Tyr Ile Val Thr Ser Gly Arg Val Ile Glu Glu Met Asp
305 310 315 320
Ile Ser Pro Cys Val Leu Thr Ala Thr Ala Val Tyr Cys Asn Arg Leu
325 330 335
Leu Thr Thr Ser Leu Pro Glu Ser Val Leu Lys Cys Leu Asp Gly Asp
340 345 350
His Ser Ser Cys Thr Tyr Thr Ser Asn Ser Gly Val Leu Glu Thr Arg
355 360 365
Tyr Ile Ala Phe Asp Gly Met Leu Ile Ala Asn Cys Arg Ser Ile Val
370 375 380
Cys Lys Cys Leu Asp Pro Pro Tyr Ile Ile Pro Gln Asn Lys Gly Lys
385 390 395 400
Pro Leu Thr Ile Ile Ser Lys Glu Val Cys Lys Lys Val Thr Leu Asp
405 410 415
Gly Ile Thr Leu Leu Ile Asp Ala Glu Phe Thr Gly Glu Tyr Gly Leu
420 425 430
Asn Ile Thr Ile Gly Pro Asp Gln Phe Ala Pro Ser Gly Ala Leu Asp
435 440 445
Ile Ser Thr Glu Leu Gly Lys Leu Asn Asn Ser Ile Asn Lys Ala Glu
450 455 460
Asp Tyr Ile Asp Lys Ser Asn Glu Leu Leu Asn Arg Val Asn Val Asp
465 470 475 480
Ile Val Asn Asp Thr Ala Val Ile Val Leu Cys Val Met Ser Ala Leu
485 490 495
Val Val Val Trp Cys Ile Gly Leu Thr Val Gly Leu Ile Tyr Val Ser
500 505 510
Lys Asn Thr Leu Arg Ala Val Ala Ile Lys Gly Thr Ser Ile Glu Asn
515 520 525
Pro Tyr Val Ser Ser Gly Lys His Ala Lys Asn Ser Ser
530 535 540
<210> 55
<211> 551
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒UPO216（Avian paramyxovirus UPO216）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 55
Met Ile Phe Thr Met Tyr His Val Thr Val Leu Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Thr Leu Pro Leu Gly Ile Gln Leu Ala Arg Ala Ser Ile Asp Gly
20 25 30
Arg Gln Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Glu Lys Ala Ile
35 40 45
Asn Leu Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Thr Ile Val Val Lys Leu Leu
50 55 60
Pro Asn Val Pro Gln Gly Arg Glu Ala Cys Met Arg Asp Pro Leu Thr
65 70 75 80
Ser Tyr Asn Lys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Ser Pro Leu Gly Glu Ala
85 90 95
Ile Arg Arg Ile His Glu Ser Thr Thr Glu Thr Ala Gly Leu Val Gln
100 105 110
Ala Arg Leu Val Gly Ala Ile Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly Val Ala
115 120 125
Thr Ser Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala Asn Lys
130 135 140
Asn Ala Glu Asn Ile Leu Lys Leu Lys Gln Ser Ile Ala Ala Thr Asn
145 150 155 160
Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val Ala
165 170 175
Val Gly Lys Met Gln Asp Phe Ile Asn Thr Gln Phe Asn Asn Thr Ala
180 185 190
Gln Glu Ile Asp Cys Ile Arg Ile Ser Gln Gln Leu Gly Val Glu Leu
195 200 205
Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln Ile Thr
210 215 220
Ser Pro Ala Leu Ser Pro Leu Ser Ile Gln Ala Leu Tyr Asn Leu Ala
225 230 235 240
Gly Gly Asn Leu Asp Val Leu Leu Ser Lys Ile Gly Val Gly Asn Asn
245 250 255
Gln Leu Ser Ala Leu Ile Ser Ser Gly Leu Ile Ser Gly Ser Pro Ile
260 265 270
Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Thr Leu Pro
275 280 285
Ser Val Ser Ser Leu Asn Asn Met Arg Ala Ile Phe Leu Glu Thr Leu
290 295 300
Ser Val Ser Thr Asp Lys Gly Phe Ala Ala Ala Leu Ile Pro Lys Val
305 310 315 320
Val Thr Thr Val Gly Thr Val Thr Glu Glu Leu Asp Thr Ser Tyr Cys
325 330 335
Ile Glu Thr Asp Ile Asp Leu Phe Cys Thr Arg Ile Val Thr Phe Pro
340 345 350
Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ala Cys Leu Asn Gly Asn Thr Ser Glu Cys
355 360 365
Met Tyr Ser Lys Thr Gln Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met Ser Val
370 375 380
Lys Gly Ser Ile Val Ala Asn Cys Lys Met Thr Thr Cys Arg Cys Ala
385 390 395 400
Asp Pro Ala Ser Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val Ser Leu
405 410 415
Ile Asp Ser Ser Val Cys Arg Val Ile Thr Leu Asp Gly Val Thr Leu
420 425 430
Arg Leu Ser Gly Ser Phe Asp Ser Thr Tyr Gln Lys Asn Ile Thr Ile
435 440 445
Arg Asp Ser Gln Val Ile Ile Thr Gly Ser Leu Asp Ile Ser Thr Glu
450 455 460
Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Asn Asn Ala Leu Asp Lys Ile Glu
465 470 475 480
Glu Ser Asn Gln Ile Leu Glu Ser Val Asn Val Ser Leu Thr Ser Thr
485 490 495
Asn Ala Leu Ile Val Tyr Ile Ile Cys Thr Ala Leu Ala Leu Ile Cys
500 505 510
Gly Ile Thr Gly Leu Ile Leu Ser Cys Tyr Ile Met Tyr Lys Met Arg
515 520 525
Ser Gln Gln Lys Thr Leu Met Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu Asp Gln
530 535 540
Met Arg Ala Gln Thr Lys Met
545 550
<210> 56
<211> 552
<212> PRT
<213> 大西洋鲑副粘病毒（Atlantic salmon paramyxovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合蛋白
<400> 56
Met Asp Gly Pro Lys Phe Arg Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Thr Ala
1 5 10 15
Pro Ala Arg Gly Gln Val Asp Tyr Asp Lys Leu Leu Lys Val Gly Ile
20 25 30
Phe Glu Lys Gly Thr Ala Asn Leu Lys Ile Ser Val Ser Ser Gln Gln
35 40 45
Arg Tyr Met Val Ile Lys Met Met Pro Asn Leu Gly Pro Met Asn Gln
50 55 60
Cys Gly Ile Lys Glu Val Asn Leu Tyr Lys Glu Ser Ile Leu Arg Leu
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ile Ser Thr Thr Leu Asn Tyr Ile Lys Ser Glu Ile Gln
85 90 95
Val Glu Arg Glu Val Ala Leu Gln Pro Asn Gly Thr Ile Val Arg Phe
100 105 110
Phe Gly Leu Ile Val Ala Ala Gly Ala Leu Thr Leu Ala Thr Ser Ala
115 120 125
Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Asn Ser Leu Glu Asn Ala Lys
130 135 140
Ala Ile Lys Gly Leu Thr Asp Ala Ile Lys Glu Ser Asn Leu Ala Ile
145 150 155 160
Gln Lys Ile Gln Asp Ala Thr Ala Gly Thr Val Ile Ala Leu Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Asp Gln Val Asn Thr Asn Ile Ile Pro Ala Ile Asn Thr Leu
180 185 190
Gly Cys Thr Ala Ala Gly Asn Thr Leu Gly Ile Ala Leu Thr Arg Tyr
195 200 205
Tyr Ser Glu Leu Ile Met Ile Phe Gly Pro Ser Leu Gly Asn Pro Val
210 215 220
Glu Ala Pro Leu Thr Ile Gln Ala Leu Ala Gly Ala Phe Asn Gly Asp
225 230 235 240
Leu His Gly Met Ile Arg Glu Tyr Gly Tyr Thr Pro Ser Asp Ile Glu
245 250 255
Asp Ile Leu Arg Thr Asn Ser Val Thr Gly Arg Val Ile Asp Val Asp
260 265 270
Leu Val Gly Met Asn Ile Val Leu Glu Ile Asn Leu Pro Thr Leu Tyr
275 280 285
Thr Leu Arg Asp Thr Lys Ile Val Asn Leu Gly Lys Ile Thr Tyr Asn
290 295 300
Val Asp Gly Ser Glu Trp Gln Thr Leu Val Pro Glu Trp Leu Ala Ile
305 310 315 320
Arg Asn Thr Leu Met Gly Gly Val Asp Leu Ser Arg Cys Val Val Ser
325 330 335
Ser Arg Asp Leu Ile Cys Lys Gln Asp Pro Val Phe Ser Leu Asp Thr
340 345 350
Ser Ile Ile Ser Cys Leu Asn Gly Asn Thr Glu Ser Cys Pro Arg Asn
355 360 365
Arg Val Val Asn Ser Val Ala Pro Arg Tyr Ala Val Ile Arg Gly Asn
370 375 380
Ile Leu Ala Asn Cys Ile Ser Thr Thr Cys Leu Cys Gly Asp Pro Gly
385 390 395 400
Val Pro Ile Ile Gln Lys Gly Asp Asn Thr Leu Thr Ala Met Ser Ile
405 410 415
Asn Asp Cys Lys Leu Val Gly Val Asp Gly Tyr Val Phe Arg Pro Gly
420 425 430
Pro Lys Ala Val Asn Val Thr Phe Asn Leu Pro His Leu Asn Leu Gly
435 440 445
Pro Glu Val Asn Val Asn Pro Val Asp Ile Ser Gly Ala Leu Gly Lys
450 455 460
Val Glu Gln Asp Leu Ala Ser Ser Arg Asp His Leu Ala Lys Ser Glu
465 470 475 480
Lys Ile Leu Ser Gly Ile Asn Pro Asn Ile Ile Asn Thr Glu Met Val
485 490 495
Leu Val Ala Val Ile Leu Ser Leu Val Cys Ala Met Val Val Ile Gly
500 505 510
Ile Val Cys Trp Leu Ser Ile Leu Thr Lys Trp Val Arg Ser Cys Arg
515 520 525
Ala Asp Cys Arg Arg Pro Asn Lys Gly Pro Asp Leu Gly Pro Ile Met
530 535 540
Ser Ser Gln Asp Asn Leu Ser Phe
545 550
<210> 57
<211> 546
<212> PRT
<213> 尼帕病毒（Nipah virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 融合糖蛋白F0
<400> 57
Met Val Val Ile Leu Asp Lys Arg Cys Tyr Cys Asn Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ile Leu Met Ile Ser Glu Cys Ser Val Gly Ile Leu His Tyr Glu Lys
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Val Thr Arg Lys Tyr Lys Ile
35 40 45
Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val Ile Lys Met Ile Pro Asn
50 55 60
Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser Val Met Glu Asn Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile Lys Gly Ala Leu Glu Ile
85 90 95
Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly Asp Val Arg Leu Ala Gly
100 105 110
Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln Ile
115 120 125
Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met Lys Asn Ala Asp Asn Ile
130 135 140
Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr Asn Glu Ala Val Val Lys
145 150 155 160
Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr Val Leu Thr Ala Leu Gln
165 170 175
Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr Ile Asp Lys Ile Ser Cys
180 185 190
Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala Leu Ser Lys Tyr Leu Ser
195 200 205
Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asp Pro Val Ser Asn
210 215 220
Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Glu
225 230 235 240
Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr Glu Asp Phe Asp Asp Leu
245 250 255
Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Val Asp Leu Ser
260 265 270
Ser Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe Pro Ile Leu Thr Glu Ile
275 280 285
Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro Val Ser Phe Asn Asn Asp
290 295 300
Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn Phe Ile Leu Val Arg Asn
305 310 315 320
Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe Cys Leu Ile Thr Lys Arg
325 330 335
Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr Pro Met Thr Asn Asn Met
340 345 350
Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys Cys Pro Arg Glu Leu Val
355 360 365
Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu Ser Asn Gly Val Leu Phe
370 375 380
Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys Gln Thr Thr Gly Arg Ala
385 390 395 400
Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu Met Ile Asp Asn Thr Thr
405 410 415
Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile Ile Ser Leu Gly Lys Tyr
420 425 430
Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly Ile Ala Ile Gly Pro Pro
435 440 445
Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser Gln Ile Ser Ser Met Asn
450 455 460
Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile Lys Glu Ala Gln Arg Leu
465 470 475 480
Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser Met Leu Ser Met Ile Ile
485 490 495
Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys Ile Gly Leu Ile Thr Phe
500 505 510
Ile Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg Asn Thr Tyr Ser Arg Leu
515 520 525
Glu Asp Arg Arg Val Arg Pro Thr Ser Ser Gly Asp Leu Tyr Tyr Ile
530 535 540
Gly Thr
545
<210> 58
<211> 321
<212> PRT
<213> 人类呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 58
Met Ser Lys Thr Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Arg Thr
1 5 10 15
Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met
35 40 45
Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ala Ser
50 55 60
Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr
65 70 75 80
Asn Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr Tyr Leu Thr Gln Asn Pro Gln
85 90 95
Leu Gly Ile Ser Phe Ser Asn Leu Ser Gly Thr Thr Leu Gln Ser Thr
100 105 110
Thr Ile Leu Ala Ser Thr Thr Pro Ser Ala Glu Ser Thr Pro Gln Ser
115 120 125
Thr Thr Val Lys Ile Ile Asn Thr Thr Thr Thr Gln Ile Leu Pro Ser
130 135 140
Lys Pro Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Gln Asn Lys Pro Asn
145 150 155 160
Asn Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys
165 170 175
Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu
195 200 205
Lys Thr Thr Lys Lys Asp Pro Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu
210 215 220
Ala Leu Thr Thr Lys Pro Thr Gly Lys Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys
225 230 235 240
Thr Asn Ile Arg Thr Thr Leu Leu Thr Ser Asn Thr Lys Gly Asn Pro
245 250 255
Glu His Thr Ser Gln Glu Glu Thr Leu His Ser Thr Thr Ser Glu Gly
260 265 270
Tyr Leu Ser Pro Ser Gln Val Tyr Thr Thr Ser Gly Gln Glu Glu Thr
275 280 285
Leu His Ser Thr Thr Ser Glu Gly Tyr Leu Ser Pro Ser Gln Val Tyr
290 295 300
Thr Thr Ser Glu Tyr Leu Ser Gln Ser Leu Ser Ser Ser Asn Thr Thr
305 310 315 320
Lys
<210> 59
<211> 616
<212> PRT
<213> 新城疫病毒（Newcastle disease virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 59
Met Glu Arg Gly Val Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Asp Glu Arg Glu
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Val Phe Arg Val Thr Val Leu Phe Leu
20 25 30
Thr Ile Val Thr Leu Ala Ile Ser Ala Ala Ala Leu Ala Phe Ser Met
35 40 45
Asn Ala Ser Thr Pro Gln Asp Leu Glu Gly Ile Pro Val Ala Ile Ser
50 55 60
Lys Val Glu Asp Lys Ile Thr Ser Ala Leu Gly Ala Ser Gln Asp Val
65 70 75 80
Met Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Asn Thr Glu Ser Thr Ile Met Asn Ala Leu Thr Ser Leu Ser Tyr
100 105 110
Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Ala Ser Gly Cys Gly Ala Pro Val Pro
115 120 125
Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp
130 135 140
Thr Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Phe Gln Glu His Leu
145 150 155 160
Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro
165 170 175
Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile
180 185 190
Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala Leu
195 200 205
Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu
210 215 220
Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val
225 230 235 240
Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu
245 250 255
Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Gln Ser Thr Asp Pro Thr Leu Met Val His
260 265 270
Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Arg Asp Leu Asp Val
275 280 285
His Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Phe Ile Asn Asn Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu
305 310 315 320
Lys Pro Gly Ser Pro Thr Asp Lys Arg Gln Glu Gly Gln Tyr Ala Ile
325 330 335
Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Asp Gln Glu Tyr Gln Val
340 345 350
Arg Met Ala Lys Ser Ala Tyr Lys Pro Asn Arg Phe Gly Gly Lys Arg
355 360 365
Val Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Gly Val Ser Thr Thr Leu Ala Asp
370 375 380
Asp Pro Val Leu Thr Val Thr Ser Asn Thr Ile Thr Leu Met Gly Ala
385 390 395 400
Glu Gly Arg Val Met Thr Val Gly Thr Ser His Tyr Leu Tyr Gln Arg
405 410 415
Gly Ser Ser Tyr Tyr Ser Pro Ala Ile Leu Tyr Pro Leu Thr Ile Ala
420 425 430
Asn Lys Thr Ala Thr Leu Gln Asp Pro Tyr Lys Phe Asn Ala Phe Thr
435 440 445
Arg Pro Gly Ser Val Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser
450 455 460
Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Ile Val Phe His Lys
465 470 475 480
Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Asp Glu Gln
485 490 495
Ala Arg Leu Asn Pro Val Ser Ala Val Phe Asp Ser Ile Ala Arg Ser
500 505 510
Arg Val Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr
515 520 525
Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Gly Lys Val Tyr Cys Leu Ser
530 535 540
Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro
545 550 555 560
Leu Leu Val Glu Ile Leu Arg Asp Glu Gly Arg Ser Glu Ala Arg Ser
565 570 575
Ala Leu Thr Thr Gln Gly His Pro Gly Trp Asn Asp Glu Val Val Asp
580 585 590
Pro Ile Phe Cys Ala Val Thr Asn Gln Thr Asp His Arg Gln Lys Leu
595 600 605
Glu Glu Tyr Ala Gln Ser Trp Pro
610 615
<210> 60
<211> 316
<212> PRT
<213> 人类呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 受体结合糖蛋白
<400> 60
Met Ser Lys Asn Lys Asn Gln Arg Thr Ala Arg Thr Leu Glu Lys Thr
1 5 10 15
Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Ile Val Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Ala Leu Ser Val Leu Ala Met
35 40 45
Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ile Ser
50 55 60
Ala Asn His Lys Val Thr Leu Thr Thr Val Thr Val Gln Thr Ile Lys
65 70 75 80
Asn His Thr Glu Lys Asn Ile Thr Thr Tyr Leu Thr Gln Val Ser Pro
85 90 95
Glu Arg Val Ser Pro Ser Lys Gln Pro Thr Thr Thr Pro Pro Ile His
100 105 110
Thr Asn Ser Ala Thr Ile Ser Pro Asn Thr Lys Ser Glu Thr His His
115 120 125
Thr Thr Ala Gln Thr Lys Gly Arg Thr Thr Thr Pro Thr Gln Asn Asn
130 135 140
Lys Pro Ser Thr Lys Pro Arg Pro Lys Asn Pro Pro Lys Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Asp Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys
165 170 175
Gly Asn Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Asn Asn
180 185 190
Lys Pro Lys Lys Lys Pro Thr Thr Lys Pro Thr Asn Lys Pro Pro Thr
195 200 205
Lys Thr Thr Asn Lys Arg Asp Pro Lys Thr Pro Ala Lys Thr Leu Lys
210 215 220
Lys Glu Thr Thr Ile Asn Pro Thr Thr Lys Lys Pro Thr Pro Lys Thr
225 230 235 240
Thr Glu Arg Asp Thr Ser Thr Pro Gln Ser Thr Val Leu Asp Thr Thr
245 250 255
Thr Ser Lys His Thr Glu Arg Asp Thr Ser Thr Pro Gln Ser Thr Val
260 265 270
Leu Asp Thr Thr Thr Ser Lys His Thr Ile Gln Gln Gln Ser Leu His
275 280 285
Ser Ile Thr Pro Glu Asn Thr Pro Asn Ser Thr Gln Thr Pro Thr Ala
290 295 300
Ser Glu Pro Ser Thr Ser Asn Ser Thr Gln Lys Leu
305 310 315
<210> 61
<211> 621
<212> PRT
<213> 麻疹病毒（Measels virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素
<400> 61
Met Ser Pro His Arg Asp Arg Ile Asn Ala Phe Tyr Arg Asp Asn Pro
1 5 10 15
His Pro Lys Gly Ser Arg Ile Val Ile Asn Arg Glu His Leu Met Ile
20 25 30
Asp Arg Pro Tyr Val Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Phe Leu Ser
35 40 45
Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala
50 55 60
Ile Tyr Thr Ala Glu Ile His Lys Ser Leu Ser Thr Asn Leu Asp Val
65 70 75 80
Thr Asn Ser Ile Glu His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe
85 90 95
Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr
100 105 110
Asp Leu Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp
115 120 125
Arg Glu Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Thr Trp Cys Ile Asn Pro Pro Glu
130 135 140
Arg Ile Lys Leu Asp Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala Asp Val Ala Ala Glu
145 150 155 160
Glu Leu Met Asn Ala Leu Val Asn Ser Thr Leu Leu Glu Ala Arg Ala
165 170 175
Thr Asn Gln Phe Leu Ala Val Ser Lys Gly Asn Cys Ser Gly Pro Thr
180 185 190
Thr Ile Arg Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu
195 200 205
Tyr Leu Ser Arg Gly Tyr Asn Val Ser Ser Ile Val Thr Met Thr Ser
210 215 220
Gln Gly Met Tyr Gly Gly Thr Tyr Leu Val Gly Lys Pro Asn Leu Ser
225 230 235 240
Ser Lys Gly Ser Glu Leu Ser Gln Leu Ser Met His Arg Val Phe Glu
245 250 255
Val Gly Val Ile Arg Asn Pro Gly Leu Gly Ala Pro Val Phe His Met
260 265 270
Thr Asn Tyr Phe Glu Gln Pro Val Ser Asn Asp Phe Ser Asn Cys Met
275 280 285
Val Ala Leu Gly Glu Leu Arg Phe Ala Ala Leu Cys His Arg Glu Asp
290 295 300
Ser Val Thr Val Pro Tyr Gln Gly Ser Gly Lys Gly Val Ser Phe Gln
305 310 315 320
Leu Val Lys Leu Gly Val Trp Lys Ser Pro Thr Asp Met Gln Ser Trp
325 330 335
Val Pro Leu Ser Thr Asp Asp Pro Val Ile Asp Arg Leu Tyr Leu Ser
340 345 350
Ser His Arg Gly Val Ile Ala Asp Asn Gln Ala Lys Trp Ala Val Pro
355 360 365
Thr Thr Arg Thr Asp Asp Lys Leu Arg Met Glu Thr Cys Phe Gln Gln
370 375 380
Ala Cys Lys Gly Lys Asn Gln Ala Leu Cys Glu Asn Pro Glu Trp Ala
385 390 395 400
Pro Leu Lys Asp Asn Arg Ile Pro Ser Tyr Gly Val Leu Ser Val Asn
405 410 415
Leu Ser Leu Thr Val Glu Leu Lys Ile Lys Ile Ala Ser Gly Phe Gly
420 425 430
Pro Leu Ile Thr His Gly Ser Gly Met Asp Leu Tyr Lys Thr Asn His
435 440 445
Asp Asn Val Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Met Lys Asn Leu Ala Leu
450 455 460
Gly Val Ile Asn Thr Leu Glu Trp Ile Pro Arg Phe Lys Val Ser Pro
465 470 475 480
Asn Leu Phe Thr Val Pro Ile Lys Glu Ala Gly Glu Asp Cys His Ala
485 490 495
Pro Thr Tyr Leu Pro Ala Glu Val Asp Gly Asp Val Lys Leu Ser Ser
500 505 510
Asn Leu Val Ile Leu Pro Gly Gln Asp Leu Gln Tyr Val Leu Ala Thr
515 520 525
Tyr Asp Thr Ser Arg Val Glu His Ala Val Val Tyr Tyr Val Tyr Ser
530 535 540
Pro Ser Arg Ser Phe Ser Tyr Phe Tyr Pro Phe Arg Leu Pro Ile Lys
545 550 555 560
Gly Val Pro Ile Glu Leu Gln Val Glu Cys Phe Thr Trp Asp Gln Lys
565 570 575
Leu Trp Cys Arg His Phe Cys Val Leu Ala Asp Ser Glu Ser Gly Gly
580 585 590
His Ile Thr His Ser Gly Met Val Gly Met Gly Val Ser Cys Thr Val
595 600 605
Thr Arg Glu Asp Gly Thr Asn Arg Arg Gln Gly Cys Gln
610 615 620
<210> 62
<211> 582
<212> PRT
<213> 腮腺炎病毒（mumps virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 62
Met Glu Pro Ser Lys Leu Phe Thr Met Ser Asp Asn Ala Thr Phe Ala
1 5 10 15
Pro Gly Pro Val Ile Asn Ala Ala Asp Lys Lys Thr Phe Arg Thr Cys
20 25 30
Phe Arg Ile Leu Val Leu Ser Val Gln Ala Val Thr Leu Ile Leu Val
35 40 45
Ile Val Thr Leu Gly Glu Leu Val Arg Met Ile Asn Asp Gln Gly Leu
50 55 60
Ser Asn Gln Leu Ser Ser Ile Ala Asp Lys Ile Arg Glu Ser Ala Thr
65 70 75 80
Met Ile Ala Ser Ala Val Gly Val Met Asn Gln Val Ile His Gly Val
85 90 95
Thr Val Ser Leu Pro Leu Gln Ile Glu Gly Asn Gln Asn Gln Leu Leu
100 105 110
Ser Thr Leu Ala Thr Ile Cys Thr Gly Lys Lys Gln Val Ser Asn Cys
115 120 125
Ser Thr Asn Ile Pro Leu Val Asn Asp Leu Arg Phe Ile Asn Gly Ile
130 135 140
Asn Lys Phe Ile Ile Glu Asp Tyr Ala Thr His Asp Phe Ser Ile Gly
145 150 155 160
His Pro Leu Asn Met Pro Ser Phe Ile Pro Thr Ala Thr Ser Pro Asn
165 170 175
Gly Cys Thr Arg Ile Pro Ser Phe Ser Leu Gly Lys Thr His Trp Cys
180 185 190
Tyr Thr His Asn Val Ile Asn Ala Asn Cys Lys Asp His Thr Ser Ser
195 200 205
Asn Gln Tyr Ile Ser Met Gly Ile Leu Val Gln Thr Ala Ser Gly Tyr
210 215 220
Pro Met Phe Lys Thr Leu Lys Ile Gln Tyr Leu Ser Asp Gly Leu Asn
225 230 235 240
Arg Lys Ser Cys Ser Ile Ala Thr Val Pro Asp Gly Cys Ala Met Tyr
245 250 255
Cys Tyr Val Ser Thr Gln Leu Glu Thr Asp Asp Tyr Ala Gly Ser Ser
260 265 270
Pro Pro Thr Gln Lys Leu Thr Leu Leu Phe Tyr Asn Asp Thr Val Thr
275 280 285
Glu Arg Thr Ile Ser Pro Thr Gly Leu Glu Gly Asn Trp Ala Thr Leu
290 295 300
Val Pro Gly Val Gly Ser Gly Ile Tyr Phe Glu Asn Lys Leu Ile Phe
305 310 315 320
Pro Ala Tyr Gly Gly Val Leu Pro Asn Ser Ser Leu Gly Val Lys Ser
325 330 335
Ala Arg Glu Phe Phe Arg Pro Val Asn Pro Tyr Asn Pro Cys Ser Gly
340 345 350
Pro Gln Gln Asp Leu Asp Gln Arg Ala Leu Arg Ser Tyr Phe Pro Ser
355 360 365
Tyr Phe Ser Asn Arg Arg Val Gln Ser Ala Phe Leu Val Cys Ala Trp
370 375 380
Asn Gln Ile Leu Val Thr Asn Cys Glu Leu Val Val Pro Ser Asn Asn
385 390 395 400
Gln Thr Leu Met Gly Ala Glu Gly Arg Val Leu Leu Ile Asn Asn Arg
405 410 415
Leu Leu Tyr Tyr Gln Arg Ser Thr Ser Trp Trp Pro Tyr Glu Leu Leu
420 425 430
Tyr Glu Ile Ser Phe Thr Phe Thr Asn Ser Gly Gln Ser Ser Val Asn
435 440 445
Met Ser Trp Ile Pro Ile Tyr Ser Phe Thr Arg Pro Gly Ser Gly Asn
450 455 460
Cys Ser Gly Glu Asn Val Cys Pro Thr Ala Cys Val Ser Gly Val Tyr
465 470 475 480
Leu Asp Pro Trp Pro Leu Thr Pro Tyr Ser His Gln Ser Gly Ile Asn
485 490 495
Arg Asn Phe Tyr Phe Thr Gly Ala Leu Leu Asn Ser Ser Thr Thr Arg
500 505 510
Val Asn Pro Thr Leu Tyr Val Ser Ala Leu Asn Asn Leu Lys Val Leu
515 520 525
Ala Pro Tyr Gly Asn Gln Gly Leu Phe Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Thr
530 535 540
Cys Phe Gln Asp Thr Gly Asp Ala Ser Val Tyr Cys Val Tyr Ile Met
545 550 555 560
Glu Leu Ala Ser Asn Ile Val Gly Glu Phe Gln Ile Leu Pro Val Leu
565 570 575
Thr Arg Leu Thr Ile Thr
580
<210> 63
<211> 572
<212> PRT
<213> 人类呼吸道病毒3（Human respirovirus 3）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 63
Met Glu Tyr Trp Lys His Thr Asn His Gly Lys Asp Ala Gly Asn Glu
1 5 10 15
Leu Glu Thr Ala Thr Ala Thr His Gly Asn Arg Leu Thr Asn Lys Ile
20 25 30
Thr Tyr Ile Leu Trp Thr Ile Thr Leu Val Leu Leu Ser Ile Val Phe
35 40 45
Ile Ile Val Leu Ile Asn Ser Ile Lys Ser Glu Lys Ala His Glu Ser
50 55 60
Leu Leu Gln Asp Ile Asn Asn Glu Phe Met Glu Val Thr Glu Lys Ile
65 70 75 80
Gln Val Ala Ser Asp Asn Thr Asn Asp Leu Ile Gln Ser Gly Val Asn
85 90 95
Thr Arg Leu Leu Thr Ile Gln Ser His Val Gln Asn Tyr Ile Pro Ile
100 105 110
Ser Leu Thr Gln Gln Ile Ser Asp Leu Arg Lys Phe Ile Ser Glu Ile
115 120 125
Thr Ile Arg Asn Asp Asn Gln Glu Val Pro Pro Gln Arg Ile Thr His
130 135 140
Asp Val Gly Ile Lys Pro Leu Asn Pro Asp Asp Phe Trp Arg Cys Thr
145 150 155 160
Ser Gly Leu Pro Ser Leu Met Arg Thr Pro Lys Ile Arg Leu Met Pro
165 170 175
Gly Pro Gly Leu Leu Ala Met Pro Thr Thr Val Asp Gly Cys Val Arg
180 185 190
Thr Pro Ser Leu Val Ile Asn Asp Leu Ile Tyr Ala Tyr Thr Ser Asn
195 200 205
Leu Ile Thr Arg Gly Cys Gln Asp Ile Gly Lys Ser Tyr Gln Val Leu
210 215 220
Gln Ile Gly Ile Ile Thr Val Asn Ser Asp Leu Val Pro Asp Leu Asn
225 230 235 240
Pro Arg Ile Ser His Thr Phe Asn Ile Asn Asp Asn Arg Lys Ser Cys
245 250 255
Ser Leu Ala Leu Leu Asn Thr Asp Val Tyr Gln Leu Cys Ser Thr Pro
260 265 270
Lys Val Asp Glu Arg Ser Asp Tyr Ala Ser Ser Gly Ile Glu Asp Ile
275 280 285
Val Leu Asp Ile Val Asn Tyr Asp Gly Ser Ile Ser Thr Thr Arg Phe
290 295 300
Lys Asn Asn Asn Ile Ser Phe Asp Gln Pro Tyr Ala Ala Leu Tyr Pro
305 310 315 320
Ser Val Gly Pro Gly Ile Tyr Tyr Lys Gly Lys Ile Ile Phe Leu Gly
325 330 335
Tyr Gly Gly Leu Glu His Pro Ile Asn Glu Asn Ala Ile Cys Asn Thr
340 345 350
Thr Gly Cys Pro Gly Lys Thr Gln Arg Asp Cys Asn Gln Ala Ser His
355 360 365
Ser Pro Trp Phe Ser Asp Arg Arg Met Val Asn Ser Ile Ile Val Val
370 375 380
Asp Lys Gly Leu Asn Ser Val Pro Lys Leu Lys Val Trp Thr Ile Ser
385 390 395 400
Met Arg Gln Asn Tyr Trp Gly Ser Glu Gly Arg Leu Leu Leu Leu Gly
405 410 415
Asn Lys Ile Tyr Ile Tyr Thr Arg Ser Thr Ser Trp His Ser Lys Leu
420 425 430
Gln Leu Gly Ile Ile Asp Ile Thr Asp Tyr Ser Asp Ile Arg Ile Lys
435 440 445
Trp Thr Trp His Asn Val Leu Ser Arg Pro Gly Asn Asn Glu Cys Pro
450 455 460
Trp Gly His Ser Cys Pro Asp Gly Cys Ile Thr Gly Val Tyr Thr Asp
465 470 475 480
Ala Tyr Pro Leu Asn Pro Thr Gly Ser Ile Val Ser Ser Val Ile Leu
485 490 495
Asp Ser Gln Lys Ser Arg Val Asn Pro Val Ile Thr Tyr Ser Thr Ala
500 505 510
Thr Glu Arg Val Asn Glu Leu Ala Ile Arg Asn Lys Thr Leu Ser Ala
515 520 525
Gly Tyr Thr Thr Thr Ser Cys Ile Thr His Tyr Asn Lys Gly Tyr Cys
530 535 540
Phe His Ile Val Glu Ile Asn His Lys Ser Leu Asn Thr Phe Gln Pro
545 550 555 560
Met Leu Phe Lys Thr Glu Ile Pro Lys Ser Cys Ser
565 570
<210> 64
<211> 220
<212> PRT
<213> 人类偏肺病毒（Human metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白G
<400> 64
Met Glu Val Lys Val Glu Asn Ile Arg Ala Ile Asp Met Leu Lys Ala
1 5 10 15
Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser
20 25 30
Leu Ile Leu Ile Gly Ile Thr Thr Leu Ser Ile Ala Leu Asn Ile Tyr
35 40 45
Leu Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Gln Lys Thr Thr Ser Glu Ser Glu His
50 55 60
His Thr Ser Ser Pro Pro Thr Glu Ser Asn Lys Glu Thr Ser Thr Ile
65 70 75 80
Pro Ile Asp Asn Pro Asp Ile Thr Pro Asn Ser Gln His Pro Thr Gln
85 90 95
Gln Ser Thr Glu Ser Leu Thr Leu Tyr Pro Ala Ser Ser Met Ser Pro
100 105 110
Ser Glu Thr Glu Pro Ala Ser Thr Pro Gly Ile Thr Asn Arg Leu Ser
115 120 125
Leu Ala Asp Arg Ser Thr Thr Gln Pro Ser Glu Ser Arg Thr Lys Thr
130 135 140
Asn Ser Thr Val His Lys Lys Asn Lys Lys Asn Ile Ser Ser Thr Ile
145 150 155 160
Ser Arg Thr Gln Ser Pro Pro Arg Thr Thr Ala Lys Ala Val Ser Arg
165 170 175
Thr Thr Ala Leu Arg Met Ser Ser Thr Gly Glu Arg Pro Thr Thr Thr
180 185 190
Ser Val Gln Ser Asp Ser Ser Thr Thr Ala Gln Asn His Glu Glu Thr
195 200 205
Gly Pro Ala Asn Pro Gln Ala Ser Val Ser Thr Met
210 215 220
<210> 65
<211> 607
<212> PRT
<213> 犬瘟热病毒（canine distemper virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素
<400> 65
Met Leu Ser Tyr Gln Asp Lys Val Gly Ala Phe Tyr Lys Asp Asn Ala
1 5 10 15
Arg Ala Asn Ser Ser Lys Leu Ser Leu Val Thr Glu Glu Gln Gly Gly
20 25 30
Arg Arg Pro Pro Tyr Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Leu Leu Val Gly
35 40 45
Ile Leu Ala Leu Leu Ala Ile Ala Gly Val Arg Phe Arg Gln Val Ser
50 55 60
Thr Ser Asn Val Glu Phe Gly Arg Leu Leu Lys Asp Asp Leu Glu Lys
65 70 75 80
Ser Glu Ala Val His His Gln Val Met Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe
85 90 95
Lys Ile Ile Gly Asp Glu Ile Gly Leu Arg Leu Pro Gln Lys Leu Asn
100 105 110
Glu Ile Lys Gln Phe Ile Leu Gln Lys Thr Asn Phe Phe Asn Pro Asn
115 120 125
Arg Glu Phe Asp Phe Arg Asp Leu His Trp Cys Ile Asn Pro Pro Ser
130 135 140
Lys Ile Lys Val Asn Phe Thr Asn Tyr Cys Asp Ala Ile Gly Val Arg
145 150 155 160
Lys Ser Ile Ala Ser Ala Ala Asn Pro Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ser
165 170 175
Gly Gly Arg Gly Asp Ile Phe Pro Pro Tyr Arg Cys Ser Gly Ala Thr
180 185 190
Thr Ser Val Gly Arg Val Phe Pro Leu Ser Val Ser Leu Ser Met Ser
195 200 205
Leu Ile Ser Lys Thr Ser Glu Ile Ile Ser Met Leu Thr Ala Ile Ser
210 215 220
Asp Gly Val Tyr Gly Lys Thr Tyr Leu Leu Val Pro Asp Tyr Ile Glu
225 230 235 240
Arg Glu Phe Asp Thr Gln Lys Ile Arg Val Phe Glu Ile Gly Phe Ile
245 250 255
Lys Arg Trp Leu Asn Asp Met Pro Leu Leu Gln Thr Thr Asn Tyr Met
260 265 270
Val Leu Pro Glu Asn Ser Lys Ala Lys Val Cys Thr Ile Ala Val Gly
275 280 285
Glu Leu Thr Leu Ala Ser Leu Cys Val Asp Glu Ser Thr Val Leu Leu
290 295 300
Tyr His Asp Ser Asn Gly Ser Gln Asp Ser Ile Leu Val Val Thr Leu
305 310 315 320
Gly Ile Phe Gly Ala Thr Pro Met Asn Gln Val Glu Glu Val Ile Pro
325 330 335
Val Ala His Pro Ser Val Glu Arg Ile His Ile Thr Asn His Arg Gly
340 345 350
Phe Ile Lys Asp Ser Val Ala Thr Trp Met Val Pro Ala Leu Val Ser
355 360 365
Glu Gln Gln Glu Gly Gln Lys Asn Cys Leu Glu Ser Ala Cys Gln Arg
370 375 380
Lys Ser Tyr Pro Met Cys Asn Gln Thr Ser Trp Glu Pro Phe Gly Gly
385 390 395 400
Val Gln Leu Pro Ser Tyr Gly Arg Leu Thr Leu Pro Leu Asp Ala Ser
405 410 415
Ile Asp Leu Gln Leu Asn Ile Ser Phe Thr Tyr Gly Pro Val Ile Leu
420 425 430
Asn Gly Asp Gly Met Asp Tyr Tyr Glu Asn Pro Leu Leu Asp Ser Gly
435 440 445
Trp Leu Thr Ile Pro Pro Lys Asn Gly Thr Ile Leu Gly Leu Ile Asn
450 455 460
Lys Ala Ser Arg Gly Asp Gln Phe Thr Val Thr Pro His Val Leu Thr
465 470 475 480
Phe Ala Pro Arg Glu Ser Ser Gly Asn Cys Tyr Leu Pro Ile Gln Thr
485 490 495
Ser Gln Ile Met Asp Lys Asp Val Leu Thr Glu Ser Asn Leu Val Val
500 505 510
Leu Pro Thr Gln Asn Phe Arg Tyr Val Val Ala Thr Tyr Asp Ile Ser
515 520 525
Arg Glu Asn His Ala Ile Val Tyr Tyr Val Tyr Asp Pro Ile Arg Thr
530 535 540
Ile Ser Tyr Thr Tyr Pro Phe Arg Leu Thr Thr Lys Gly Arg Pro Asp
545 550 555 560
Phe Leu Arg Ile Glu Cys Phe Val Trp Asp Asp Asp Leu Trp Cys His
565 570 575
Gln Phe Tyr Arg Phe Glu Ser Asp Ile Thr Asn Ser Thr Thr Ser Val
580 585 590
Glu Asp Leu Val Arg Ile Arg Phe Ser Cys Asn Arg Ser Lys Pro
595 600 605
<210> 66
<211> 609
<212> PRT
<213> 小反刍兽疫病毒（Peste-des-petits-ruminants virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素
<400> 66
Met Ser Ala Gln Arg Glu Arg Ile Asn Ala Phe Tyr Lys Asp Asn Pro
1 5 10 15
His Asn Lys Asn His Arg Val Ile Leu Asp Arg Glu Arg Leu Val Ile
20 25 30
Glu Arg Pro Tyr Ile Leu Leu Gly Val Leu Leu Val Met Phe Leu Ser
35 40 45
Leu Ile Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Thr
50 55 60
Val Gly Thr Ser Glu Ile Gln Ser Arg Leu Asn Thr Asn Ile Glu Leu
65 70 75 80
Thr Glu Ser Ile Asp His Gln Thr Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe
85 90 95
Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly Ile Arg Ile Pro Gln Lys Phe Ser
100 105 110
Asp Leu Val Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp
115 120 125
Arg Glu Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Arg Trp Cys Met Asn Pro Pro Glu
130 135 140
Arg Val Lys Ile Asn Phe Asp Gln Phe Cys Glu Tyr Lys Ala Ala Val
145 150 155 160
Lys Ser Ile Glu His Ile Phe Glu Ser Pro Leu Asn Lys Ser Lys Lys
165 170 175
Leu Gln Ser Leu Thr Leu Gly Pro Gly Thr Gly Cys Leu Gly Arg Thr
180 185 190
Val Thr Arg Ala His Phe Ser Glu Leu Thr Leu Thr Leu Met Asp Leu
195 200 205
Asp Leu Glu Met Lys His Asn Val Ser Ser Val Phe Thr Val Val Glu
210 215 220
Glu Gly Leu Phe Gly Arg Thr Tyr Thr Val Trp Arg Ser Asp Ala Arg
225 230 235 240
Asp Pro Ser Thr Asp Leu Gly Ile Gly His Phe Leu Arg Val Phe Glu
245 250 255
Ile Gly Leu Val Arg Asp Leu Gly Leu Gly Pro Pro Val Phe His Met
260 265 270
Thr Asn Tyr Leu Thr Val Asn Met Ser Asp Asp Tyr Arg Arg Cys Leu
275 280 285
Leu Ala Val Gly Glu Leu Lys Leu Thr Ala Leu Cys Ser Ser Ser Glu
290 295 300
Thr Val Thr Leu Gly Glu Arg Gly Val Pro Lys Arg Glu Pro Leu Val
305 310 315 320
Val Val Ile Leu Asn Leu Ala Gly Pro Thr Leu Gly Gly Glu Leu Tyr
325 330 335
Ser Val Leu Pro Thr Ser Asp Leu Met Val Glu Lys Leu Tyr Leu Ser
340 345 350
Ser His Arg Gly Ile Ile Lys Asp Asp Glu Ala Asn Trp Val Val Pro
355 360 365
Ser Thr Asp Val Arg Asp Leu Gln Asn Lys Gly Glu Cys Leu Val Glu
370 375 380
Ala Cys Lys Thr Arg Pro Pro Ser Phe Cys Asn Gly Thr Gly Ser Gly
385 390 395 400
Pro Trp Ser Glu Gly Arg Ile Pro Ala Tyr Gly Val Ile Arg Val Ser
405 410 415
Leu Asp Leu Ala Ser Asp Pro Gly Val Val Ile Thr Ser Val Phe Gly
420 425 430
Pro Leu Ile Pro His Leu Ser Gly Met Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Phe
435 440 445
Ser Arg Ala Val Trp Leu Ala Val Pro Pro Tyr Glu Gln Ser Phe Leu
450 455 460
Gly Met Ile Asn Thr Ile Gly Phe Pro Asn Arg Ala Glu Val Met Pro
465 470 475 480
His Ile Leu Thr Thr Glu Ile Arg Gly Pro Arg Gly Arg Cys His Val
485 490 495
Pro Ile Glu Leu Ser Arg Arg Val Asp Asp Asp Ile Lys Ile Gly Ser
500 505 510
Asn Met Val Ile Leu Pro Thr Ile Asp Leu Arg Tyr Ile Thr Ala Thr
515 520 525
Tyr Asp Val Ser Arg Ser Glu His Ala Ile Val Tyr Tyr Ile Tyr Asp
530 535 540
Thr Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Phe Tyr Pro Val Arg Leu Asn Phe Lys
545 550 555 560
Gly Asn Pro Leu Ser Leu Arg Ile Glu Cys Phe Pro Trp Arg His Lys
565 570 575
Val Trp Cys Tyr His Asp Cys Leu Ile Tyr Asn Thr Ile Thr Asp Glu
580 585 590
Glu Val His Thr Arg Gly Leu Thr Gly Ile Glu Val Thr Cys Asn Pro
595 600 605
Val
<210> 67
<211> 575
<212> PRT
<213> 仙台病毒（Sendai virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 67
Met Asp Gly Asp Arg Ser Lys Arg Asp Ser Tyr Trp Ser Thr Ser Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Thr Thr Lys Leu Val Ser Asp Ser Glu Arg Ser Gly Lys
20 25 30
Val Asp Thr Trp Leu Leu Ile Leu Ala Phe Thr Gln Trp Ala Leu Ser
35 40 45
Ile Ala Thr Val Ile Ile Cys Ile Val Ile Ala Ala Arg Gln Gly Tyr
50 55 60
Ser Met Glu Arg Tyr Ser Met Thr Val Glu Ala Leu Asn Thr Ser Asn
65 70 75 80
Lys Glu Val Lys Glu Ser Leu Thr Ser Leu Ile Arg Gln Glu Val Ile
85 90 95
Thr Arg Ala Ala Asn Ile Gln Ser Ser Val Gln Thr Gly Ile Pro Val
100 105 110
Leu Leu Asn Lys Asn Ser Arg Asp Val Ile Arg Leu Ile Glu Lys Ser
115 120 125
Cys Asn Arg Gln Glu Leu Thr Gln Leu Cys Asp Ser Thr Ile Ala Val
130 135 140
His His Ala Glu Gly Ile Ala Pro Leu Glu Pro His Ser Phe Trp Arg
145 150 155 160
Cys Pro Ala Gly Glu Pro Tyr Leu Ser Ser Asp Pro Glu Val Ser Leu
165 170 175
Leu Pro Gly Pro Ser Leu Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Ser Gly Cys
180 185 190
Val Arg Leu Pro Ser Leu Ser Ile Gly Glu Ala Ile Tyr Ala Tyr Ser
195 200 205
Ser Asn Leu Ile Thr Gln Gly Cys Ala Asp Ile Gly Lys Ser Tyr Gln
210 215 220
Val Leu Gln Leu Gly Tyr Ile Ser Leu Asn Ser Asp Met Phe Pro Asp
225 230 235 240
Leu Asn Pro Val Val Ser His Thr Tyr Asp Ile Asn Asp Asn Arg Lys
245 250 255
Ser Cys Ser Val Val Ala Thr Gly Thr Arg Gly Tyr Gln Leu Cys Ser
260 265 270
Met Pro Ile Val Asp Glu Arg Thr Asp Tyr Ser Ser Asp Gly Ile Glu
275 280 285
Asp Leu Val Leu Asp Ile Leu Asp Leu Lys Gly Arg Thr Lys Ser His
290 295 300
Arg Tyr Ser Asn Ser Glu Ile Asp Leu Asp His Pro Phe Ser Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Pro Ser Val Gly Ser Gly Ile Ala Thr Glu Gly Ser Leu Ile Phe
325 330 335
Leu Gly Tyr Gly Gly Leu Thr Thr Pro Leu Gln Gly Asp Thr Lys Cys
340 345 350
Arg Ile Gln Gly Cys Gln Gln Val Ser Gln Asp Thr Cys Asn Glu Ala
355 360 365
Leu Lys Ile Thr Trp Leu Gly Gly Lys Gln Val Val Ser Val Leu Ile
370 375 380
Gln Val Asn Asp Tyr Leu Ser Glu Arg Pro Arg Ile Arg Val Thr Thr
385 390 395 400
Ile Pro Ile Thr Gln Asn Tyr Leu Gly Ala Glu Gly Arg Leu Leu Lys
405 410 415
Leu Gly Asp Gln Val Tyr Ile Tyr Thr Arg Ser Ser Gly Trp His Ser
420 425 430
Gln Leu Gln Ile Gly Val Leu Asp Val Ser His Pro Leu Thr Ile Ser
435 440 445
Trp Thr Pro His Glu Ala Leu Ser Arg Pro Gly Asn Glu Asp Cys Asn
450 455 460
Trp Tyr Asn Thr Cys Pro Lys Glu Cys Ile Ser Gly Val Tyr Thr Asp
465 470 475 480
Ala Tyr Pro Leu Ser Pro Asp Ala Ala Asn Val Ala Thr Val Thr Leu
485 490 495
Tyr Ala Asn Thr Ser Arg Val Asn Pro Thr Ile Met Tyr Ser Asn Thr
500 505 510
Thr Asn Ile Ile Asn Met Leu Arg Ile Lys Asp Val Gln Leu Glu Ala
515 520 525
Ala Tyr Thr Thr Thr Ser Cys Ile Thr His Phe Gly Lys Gly Tyr Cys
530 535 540
Phe His Ile Ile Glu Ile Asn Gln Lys Ser Leu Asn Thr Leu Gln Pro
545 550 555 560
Met Leu Phe Lys Thr Ser Ile Pro Lys Leu Cys Lys Ala Glu Ser
565 570 575
<210> 68
<211> 575
<212> PRT
<213> 人类副流感病毒1病毒株华盛顿/1964（Human parainfluenza virus 1 strainWashington/1964）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HN糖蛋白
<400> 68
Met Ala Glu Lys Gly Lys Thr Asn Ser Ser Tyr Trp Ser Thr Thr Arg
1 5 10 15
Asn Asp Asn Ser Thr Val Asn Thr His Ile Asn Thr Pro Ala Gly Arg
20 25 30
Thr His Ile Trp Leu Leu Ile Ala Thr Thr Met His Thr Val Leu Ser
35 40 45
Phe Ile Ile Met Ile Leu Cys Ile Asp Leu Ile Ile Lys Gln Asp Thr
50 55 60
Cys Met Lys Thr Asn Ile Met Thr Val Ser Ser Met Asn Glu Ser Ala
65 70 75 80
Lys Ile Ile Lys Glu Thr Ile Thr Glu Leu Ile Arg Gln Glu Val Ile
85 90 95
Ser Arg Thr Ile Asn Ile Gln Ser Ser Val Gln Ser Gly Ile Pro Ile
100 105 110
Leu Leu Asn Lys Gln Ser Arg Asp Leu Thr Gln Leu Ile Glu Lys Ser
115 120 125
Cys Asn Arg Gln Glu Leu Ala Gln Ile Cys Glu Asn Thr Ile Ala Ile
130 135 140
His His Ala Asp Gly Ile Ser Pro Leu Asp Pro His Asp Phe Trp Arg
145 150 155 160
Cys Pro Val Gly Glu Pro Leu Leu Ser Asn Asn Pro Asn Ile Ser Leu
165 170 175
Leu Pro Gly Pro Ser Leu Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Ser Gly Cys
180 185 190
Val Arg Leu Pro Ser Leu Ser Ile Gly Asp Ala Ile Tyr Ala Tyr Ser
195 200 205
Ser Asn Leu Ile Thr Gln Gly Cys Ala Asp Ile Gly Lys Ser Tyr Gln
210 215 220
Val Leu Gln Leu Gly Tyr Ile Ser Leu Asn Ser Asp Met Tyr Pro Asp
225 230 235 240
Leu Asn Pro Val Ile Ser His Thr Tyr Asp Ile Asn Asp Asn Arg Lys
245 250 255
Ser Cys Ser Val Ile Ala Ala Gly Thr Arg Gly Tyr Gln Leu Cys Ser
260 265 270
Leu Pro Thr Val Asn Glu Thr Thr Asp Tyr Ser Ser Glu Gly Ile Glu
275 280 285
Asp Leu Val Phe Asp Ile Leu Asp Leu Lys Gly Lys Thr Lys Ser His
290 295 300
Arg Tyr Lys Asn Glu Asp Ile Thr Phe Asp His Pro Phe Ser Ala Met
305 310 315 320
Tyr Pro Ser Val Gly Ser Gly Ile Lys Ile Glu Asn Thr Leu Ile Phe
325 330 335
Leu Gly Tyr Gly Gly Leu Thr Thr Pro Leu Gln Gly Asp Thr Lys Cys
340 345 350
Val Ile Asn Arg Cys Thr Asn Val Asn Gln Ser Val Cys Asn Asp Ala
355 360 365
Leu Lys Ile Thr Trp Leu Lys Lys Arg Gln Val Val Asn Val Leu Ile
370 375 380
Arg Ile Asn Asn Tyr Leu Ser Asp Arg Pro Lys Ile Val Val Glu Thr
385 390 395 400
Ile Pro Ile Thr Gln Asn Tyr Leu Gly Ala Glu Gly Arg Leu Leu Lys
405 410 415
Leu Gly Lys Lys Ile Tyr Ile Tyr Thr Arg Ser Ser Gly Trp His Ser
420 425 430
Asn Leu Gln Ile Gly Ser Leu Asp Ile Asn Asn Pro Met Thr Ile Lys
435 440 445
Trp Ala Pro His Glu Val Leu Ser Arg Pro Gly Asn Gln Asp Cys Asn
450 455 460
Trp Tyr Asn Arg Cys Pro Arg Glu Cys Ile Ser Gly Val Tyr Thr Asp
465 470 475 480
Ala Tyr Pro Leu Ser Pro Asp Ala Val Asn Val Ala Thr Thr Thr Leu
485 490 495
Tyr Ala Asn Thr Ser Arg Val Asn Pro Thr Ile Met Tyr Ser Asn Thr
500 505 510
Ser Glu Ile Ile Asn Met Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Glu Ala
515 520 525
Ala Tyr Thr Thr Thr Ser Cys Ile Thr His Phe Gly Lys Gly Tyr Cys
530 535 540
Phe His Ile Val Glu Ile Asn Gln Ala Ser Leu Asn Thr Leu Gln Pro
545 550 555 560
Met Leu Phe Lys Thr Ser Ile Pro Lys Ile Cys Lys Ile Thr Ser
565 570 575
<210> 69
<211> 240
<212> PRT
<213> 人类偏肺病毒（Human metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白G
<400> 69
Met Glu Val Arg Val Glu Asn Ile Arg Ala Ile Asp Met Phe Lys Ala
1 5 10 15
Lys Met Lys Asn Arg Ile Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr
20 25 30
Leu Ile Leu Ile Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn Ile Phe
35 40 45
Leu Ile Ile Asp Tyr Ala Thr Leu Lys Asn Met Thr Lys Val Glu His
50 55 60
Cys Val Asn Met Pro Pro Val Glu Pro Ser Lys Lys Ser Pro Met Thr
65 70 75 80
Ser Ala Ala Asp Leu Asn Thr Lys Leu Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln
85 90 95
Leu Thr Thr Glu Asp Ser Thr Ser Leu Ala Ala Thr Ser Glu Asn His
100 105 110
Leu His Thr Glu Thr Thr Pro Thr Ser Asp Ala Thr Ile Ser Gln Gln
115 120 125
Ala Thr Asp Glu His Thr Thr Leu Leu Arg Pro Ile Asn Arg Gln Thr
130 135 140
Thr Gln Thr Thr Thr Glu Lys Lys Pro Thr Gly Ala Thr Thr Lys Lys
145 150 155 160
Asp Lys Glu Lys Glu Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr
165 170 175
Gln Thr Leu Asn Thr Thr Asn Gln Thr Ser Asn Gly Arg Glu Ala Thr
180 185 190
Thr Thr Ser Ala Arg Ser Arg Asn Gly Ala Thr Thr Gln Asn Ser Asp
195 200 205
Gln Thr Ile Gln Ala Ala Asp Pro Ser Ser Lys Pro Tyr His Thr Gln
210 215 220
Thr Asn Thr Thr Thr Ala His Asn Thr Asp Thr Ser Ser Leu Ser Ser
225 230 235 240
<210> 70
<211> 604
<212> PRT
<213> 亨德拉病毒（Hendra virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 糖蛋白
<400> 70
Met Met Ala Asp Ser Lys Leu Val Ser Leu Asn Asn Asn Leu Ser Gly
1 5 10 15
Lys Ile Lys Asp Gln Gly Lys Val Ile Lys Asn Tyr Tyr Gly Thr Met
20 25 30
Asp Ile Lys Lys Ile Asn Asp Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Gly
35 40 45
Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Ile Ile Ile Val
50 55 60
Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln
65 70 75 80
Ala Leu Ile Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala
85 90 95
Leu Thr Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile
100 105 110
Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly
115 120 125
Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp
130 135 140
Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile
145 150 155 160
Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln
165 170 175
Gly Val Ser Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys
180 185 190
Thr Thr Ser Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
Ile Asn Thr Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val
210 215 220
Asp Asn Gly Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys
225 230 235 240
Thr Arg Gly Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu
245 250 255
Asp Arg Gly Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr
260 265 270
Pro Pro Asn Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu
275 280 285
Asp Phe Tyr Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile
290 295 300
Leu Asn Ser Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala
305 310 315 320
Val Arg Pro Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala
325 330 335
Ile Thr Lys Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly
340 345 350
Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly
355 360 365
Phe Leu Pro Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile
370 375 380
Ile His Cys Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly
385 390 395 400
Val Asn Ser Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr
405 410 415
Asn Leu Ser Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala
420 425 430
Asp Asn Arg Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu
435 440 445
Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile
450 455 460
Lys Leu Gly Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg
465 470 475 480
Asn Asn Ser Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe
485 490 495
Asn Val Cys Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe
500 505 510
Leu Ile Asp Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser
515 520 525
Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu
530 535 540
Ile Leu Tyr Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys
545 550 555 560
Thr Ile Thr Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser
565 570 575
Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu
580 585 590
Phe Ala Val Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser
595 600
<210> 71
<211> 602
<212> PRT
<213> 尼帕病毒（Nipah virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 71
Met Pro Ala Glu Asn Lys Lys Val Arg Phe Glu Asn Thr Thr Ser Asp
1 5 10 15
Lys Gly Lys Ile Pro Ser Lys Val Ile Lys Ser Tyr Tyr Gly Thr Met
20 25 30
Asp Ile Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser
35 40 45
Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val
50 55 60
Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln
65 70 75 80
Ala Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly
85 90 95
Leu Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile
100 105 110
Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly
115 120 125
Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu
130 135 140
Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile
145 150 155 160
Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu
165 170 175
Gly Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys
180 185 190
Thr Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
Val Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met
210 215 220
Asp Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys
225 230 235 240
Ser Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu
245 250 255
Asp Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr
260 265 270
Pro Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn
275 280 285
Glu Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile
290 295 300
Leu Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala
305 310 315 320
Val Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala
325 330 335
Leu Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly
340 345 350
Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly
355 360 365
Phe Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile
370 375 380
Thr Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly
385 390 395 400
Ile Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr
405 410 415
Asn Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser
420 425 430
Asp Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu
435 440 445
Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile
450 455 460
Lys Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg
465 470 475 480
Asn Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe
485 490 495
Asn Thr Cys Pro Glu Ile Cys Trp Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe
500 505 510
Leu Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser
515 520 525
Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu
530 535 540
Ile Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys
545 550 555 560
Thr Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser
565 570 575
Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu
580 585 590
Phe Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr
595 600
<210> 72
<211> 572
<212> PRT
<213> 猪副流感病毒3（Swine parainfluenza virus 3）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶HN
<400> 72
Met Glu Tyr Trp Lys His Thr Asn Ser Thr Lys Asp Thr Asn Asn Glu
1 5 10 15
Leu Gly Thr Thr Arg Asp Arg His Ser Ser Lys Ala Thr Asn Ile Ile
20 25 30
Met Tyr Ile Phe Trp Thr Thr Thr Ser Thr Ile Leu Ser Val Ile Phe
35 40 45
Ile Met Ile Leu Ile Asn Leu Ile Gln Glu Asn Asn His Asn Lys Leu
50 55 60
Met Leu Gln Glu Ile Lys Lys Glu Phe Ala Val Ile Asp Thr Lys Ile
65 70 75 80
Gln Lys Thr Ser Asp Asp Ile Ser Thr Ser Ile Gln Ser Gly Ile Asn
85 90 95
Thr Arg Leu Leu Thr Ile Gln Ser His Val Gln Asn Tyr Ile Pro Leu
100 105 110
Ser Leu Thr Gln Gln Met Ser Asp Leu Arg Lys Phe Ile Asn Asp Leu
115 120 125
Thr Thr Lys Arg Glu His Gln Glu Val Pro Ile Gln Arg Met Thr His
130 135 140
Asp Ser Gly Ile Glu Pro Leu Asn Pro Asp Lys Phe Trp Arg Cys Thr
145 150 155 160
Ser Gly Asn Pro Ser Leu Thr Ser Ser Pro Lys Ile Arg Leu Ile Pro
165 170 175
Gly Pro Gly Leu Leu Ala Thr Ser Thr Thr Val Asn Gly Cys Ile Arg
180 185 190
Ile Pro Ser Leu Ala Ile Asn Asn Leu Ile Tyr Ala Tyr Thr Ser Asn
195 200 205
Leu Ile Thr Gln Gly Cys Gln Asp Ile Gly Lys Ser Tyr Gln Val Leu
210 215 220
Gln Ile Gly Ile Ile Thr Ile Asn Ser Asp Leu Val Pro Asp Leu Asn
225 230 235 240
Pro Arg Val Thr His Thr Phe Asn Ile Asp Asp Asn Arg Lys Ser Cys
245 250 255
Ser Leu Ala Leu Leu Asn Thr Asp Val Tyr Gln Leu Cys Ser Thr Pro
260 265 270
Lys Val Asp Glu Arg Ser Asp Tyr Ala Ser Thr Gly Ile Glu Asp Ile
275 280 285
Val Leu Asp Ile Val Thr Ser Asn Gly Leu Ile Ile Thr Thr Arg Phe
290 295 300
Thr Asn Asn Asn Ile Thr Phe Asp Lys Pro Tyr Ala Ala Leu Tyr Pro
305 310 315 320
Ser Val Gly Pro Gly Ile Tyr Tyr Lys Asp Lys Val Ile Phe Leu Gly
325 330 335
Tyr Gly Gly Leu Glu His Glu Glu Asn Gly Asp Val Ile Cys Asn Thr
340 345 350
Thr Gly Cys Pro Gly Lys Thr Gln Arg Asp Cys Asn Gln Ala Ser Tyr
355 360 365
Ser Pro Trp Phe Ser Asn Arg Arg Met Val Asn Ser Ile Ile Val Val
370 375 380
Asp Lys Ser Ile Asp Thr Thr Phe Ser Leu Arg Val Trp Thr Ile Pro
385 390 395 400
Met Arg Gln Asn Tyr Trp Gly Ser Glu Gly Arg Leu Leu Leu Leu Gly
405 410 415
Asp Arg Ile Tyr Ile Tyr Thr Arg Ser Thr Ser Trp His Ser Lys Leu
420 425 430
Gln Leu Gly Val Ile Asp Ile Ser Asp Tyr Asn Asn Ile Arg Ile Asn
435 440 445
Trp Thr Trp His Asn Val Leu Ser Arg Pro Gly Asn Asp Glu Cys Pro
450 455 460
Trp Gly His Ser Cys Pro Asp Gly Cys Ile Thr Gly Val Tyr Thr Asp
465 470 475 480
Ala Tyr Pro Leu Asn Pro Ser Gly Ser Val Val Ser Ser Val Ile Leu
485 490 495
Asp Ser Gln Lys Ser Arg Glu Asn Pro Ile Ile Thr Tyr Ser Thr Ala
500 505 510
Thr Asn Arg Val Asn Glu Leu Ala Ile Tyr Asn Arg Thr Leu Pro Ala
515 520 525
Ala Tyr Thr Thr Thr Asn Cys Ile Thr His Tyr Asp Lys Gly Tyr Cys
530 535 540
Phe His Ile Val Glu Ile Asn His Arg Ser Leu Asn Thr Phe Gln Pro
545 550 555 560
Met Leu Phe Lys Thr Glu Val Pro Lys Asn Cys Ser
565 570
<210> 73
<211> 231
<212> PRT
<213> 人类偏肺病毒（Human metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白G
<400> 73
Met Glu Val Arg Val Glu Asn Ile Arg Ala Ile Asp Met Phe Lys Ala
1 5 10 15
Lys Ile Lys Asn Arg Ile Arg Ser Ser Arg Cys Tyr Arg Asn Ala Thr
20 25 30
Leu Ile Leu Ile Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn Ile Phe
35 40 45
Leu Ile Ile Asp His Ala Thr Leu Arg Asn Met Ile Lys Thr Glu Asn
50 55 60
Cys Ala Asn Met Pro Ser Ala Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr
65 70 75 80
Ser Thr Ala Gly Pro Ser Thr Lys Pro Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln
85 90 95
Trp Thr Thr Glu Asn Ser Thr Ser Pro Ala Ala Thr Leu Glu Gly His
100 105 110
Pro Tyr Thr Gly Thr Thr Gln Thr Pro Asp Thr Thr Ala Pro Gln Gln
115 120 125
Thr Thr Asp Lys His Thr Ala Leu Pro Lys Ser Thr Asn Glu Gln Ile
130 135 140
Thr Gln Thr Thr Thr Glu Lys Lys Thr Thr Arg Ala Thr Thr Gln Lys
145 150 155 160
Arg Glu Lys Arg Lys Glu Asn Thr Asn Gln Thr Thr Ser Thr Ala Ala
165 170 175
Thr Gln Thr Thr Asn Thr Thr Asn Gln Thr Arg Asn Ala Ser Glu Thr
180 185 190
Ile Thr Thr Ser Asp Gly Pro Arg Ile Asp Thr Thr Thr Gln Ser Ser
195 200 205
Glu Gln Thr Ala Arg Ala Thr Glu Pro Gly Ser Ser Pro Tyr His Ala
210 215 220
Arg Arg Gly Ala Gly Pro Arg
225 230
<210> 74
<211> 595
<212> PRT
<213> 猫科麻疹病毒（Feline morbillivirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素蛋白
<400> 74
Met Lys Asn Ile Asn Ile Lys Tyr Tyr Lys Asp Ser Asn Arg Tyr Leu
1 5 10 15
Gly Lys Ile Leu Asp Glu His Lys Ile Val Asn Ser Gln Leu Tyr Ser
20 25 30
Leu Ser Ile Lys Val Ile Thr Ile Ile Ala Ile Ile Val Ser Leu Ile
35 40 45
Ala Thr Ile Met Thr Ile Ile Asn Ala Thr Ser Gly Arg Thr Thr Leu
50 55 60
Asn Ser Asn Thr Asp Ile Leu Leu Asn Gln Arg Asp Glu Ile His Ser
65 70 75 80
Ile His Glu Met Ile Phe Asp Arg Val Tyr Pro Leu Ile Thr Ala Met
85 90 95
Ser Thr Glu Leu Gly Leu His Ile Pro Thr Leu Leu Asp Glu Leu Thr
100 105 110
Lys Ala Ile Asp Gln Lys Ile Lys Ile Met Asn Pro Pro Val Asp Thr
115 120 125
Val Thr Ser Asp Leu Ser Trp Cys Ile Lys Pro Pro Asn Gly Ile Ile
130 135 140
Ile Asp Pro Lys Gly Tyr Cys Glu Ser Met Glu Leu Ser Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Lys Leu Leu Leu Asp Gln Leu Asp Val Ser Arg Lys Lys Ser Leu Thr
165 170 175
Ile Asn Arg Lys Asn Ile Asn Gln Cys Gln Leu Val Asp Asp Ser Glu
180 185 190
Ile Ile Phe Ala Thr Val Asn Ile Gln Ser Thr Pro Arg Phe Leu Asn
195 200 205
Phe Gly His Thr Val Ser Asn Gln Arg Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr
210 215 220
Tyr Ser Ser Thr Tyr Ile Leu Thr Ile Gln Glu Asp Gly Ile Thr Asp
225 230 235 240
Val Gln Tyr Arg Val Phe Glu Ile Gly Tyr Ile Ser Asp Gln Phe Gly
245 250 255
Val Phe Pro Ser Leu Ile Val Ser Arg Val Leu Pro Ile Arg Met Val
260 265 270
Leu Gly Met Glu Ser Cys Thr Leu Thr Ser Asp Arg Gln Gly Gly Tyr
275 280 285
Phe Leu Cys Met Asn Thr Leu Thr Arg Ser Ile Tyr Asp Tyr Val Asn
290 295 300
Ile Arg Asp Leu Lys Ser Leu Tyr Ile Thr Leu Pro His Tyr Gly Lys
305 310 315 320
Val Asn Tyr Thr Tyr Phe Asn Phe Gly Lys Ile Arg Ser Pro His Glu
325 330 335
Ile Asp Lys Leu Trp Leu Thr Ser Asp Arg Gly Gln Ile Ile Ser Gly
340 345 350
Tyr Phe Ala Ala Phe Val Thr Ile Thr Ile Arg Asn Tyr Asn Asn Tyr
355 360 365
Pro Tyr Lys Cys Leu Asn Asn Pro Cys Phe Asp Asn Ser Glu Asn Tyr
370 375 380
Cys Arg Gly Trp Tyr Lys Asn Ile Thr Gly Thr Asp Asp Val Pro Ile
385 390 395 400
Leu Ala Tyr Leu Leu Val Glu Met Tyr Asp Glu Glu Gly Pro Leu Ile
405 410 415
Thr Leu Val Ala Ile Pro Pro Tyr Asn Tyr Thr Ala Pro Ser His Asn
420 425 430
Ser Leu Tyr Tyr Asp Asp Lys Ile Asn Lys Leu Ile Met Thr Thr Ser
435 440 445
His Ile Gly Tyr Ile Gln Ile Asn Glu Val His Glu Val Ile Val Gly
450 455 460
Asp Asn Leu Lys Ala Ile Leu Leu Asn Arg Leu Ser Asp Glu His Pro
465 470 475 480
Asn Leu Thr Ala Cys Arg Leu Asn Gln Gly Ile Lys Glu Gln Tyr Lys
485 490 495
Ser Asp Gly Met Ile Ile Ser Asn Ser Ala Leu Ile Asp Ile Gln Glu
500 505 510
Arg Met Tyr Ile Thr Val Lys Ala Ile Pro Pro Val Gly Asn Tyr Asn
515 520 525
Phe Thr Val Glu Leu His Ser Arg Ser Asn Thr Ser Tyr Ile Leu Leu
530 535 540
Pro Lys Gln Phe Asn Ala Lys Tyr Asp Lys Leu His Leu Glu Cys Phe
545 550 555 560
Asn Trp Asp Lys Ser Trp Trp Cys Ala Leu Ile Pro Gln Phe Ser Leu
565 570 575
Ser Trp Asn Glu Ser Leu Ser Val Asp Thr Ala Ile Phe Asn Leu Ile
580 585 590
Asn Cys Lys
595
<210> 75
<211> 613
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒6（avian paramyxovirus 6）
<400> 75
Met Ala Ser Pro Ser Glu Leu Asn Arg Ser Gln Ala Thr Leu Tyr Glu
1 5 10 15
Gly Asp Pro Asn Ser Lys Arg Thr Trp Arg Thr Val Tyr Arg Ala Ser
20 25 30
Thr Leu Ile Leu Asp Leu Ala Ile Leu Cys Val Ser Ile Val Ala Ile
35 40 45
Val Arg Met Ser Thr Leu Thr Pro Ser Asp Val Thr Asp Ser Ile Ser
50 55 60
Ser Ser Ile Thr Ser Leu Ser Asp Thr Tyr Gln Ser Val Trp Ser Asp
65 70 75 80
Thr His Gln Lys Val Asn Ser Ile Phe Lys Glu Val Gly Ile Ser Ile
85 90 95
Pro Val Thr Leu Asp Lys Met Gln Val Glu Met Gly Thr Ala Val Asn
100 105 110
Ile Ile Thr Asp Ala Val Arg Gln Leu Gln Gly Val Asn Gly Ser Ala
115 120 125
Gly Phe Ser Ile Thr Asn Ser Pro Glu Tyr Ser Gly Gly Ile Asp Ala
130 135 140
Leu Ile Tyr Pro Gln Lys Ser Leu Asn Gly Lys Ser Leu Ala Ile Ser
145 150 155 160
Asp Leu Leu Glu His Pro Ser Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Ser His
165 170 175
Gly Cys Thr Arg Ile Pro Thr Phe His Leu Gly Tyr Arg His Trp Cys
180 185 190
Tyr Ser His Asn Thr Ile Glu Ser Gly Cys His Asp Ala Gly Glu Ser
195 200 205
Ile Met Tyr Leu Ser Met Gly Ala Val Gly Val Gly His Gln Gly Lys
210 215 220
Pro Val Phe Thr Thr Ser Ala Ala Val Ile Leu Asp Asp Gly Lys Asn
225 230 235 240
Arg Lys Ser Cys Ser Val Val Ala Asn Pro Asn Gly Cys Asp Val Leu
245 250 255
Cys Ser Leu Val Lys Gln Thr Glu Asp Gln Asp Tyr Ala Asp Pro Thr
260 265 270
Pro Thr Pro Met Ile His Gly Arg Leu His Phe Asn Gly Thr Tyr Thr
275 280 285
Glu Ser Met Leu Asp Gln Ser Leu Phe Thr Gly His Trp Val Ala Gln
290 295 300
Tyr Pro Ala Val Gly Ser Gly Ser Val Ser His Gly Arg Leu Phe Phe
305 310 315 320
Pro Leu Tyr Gly Gly Ile Ser Lys Ser Ser Ser Leu Phe Pro Lys Leu
325 330 335
Arg Ala His Ala Tyr Phe Thr His Asn Glu Glu Leu Glu Cys Lys Asn
340 345 350
Leu Thr Ser Lys Gln Arg Glu Asp Leu Phe Asn Ala Tyr Met Pro Gly
355 360 365
Lys Ile Ala Gly Ser Leu Trp Ala Gln Gly Ile Val Ile Cys Asn Leu
370 375 380
Thr Thr Leu Ala Asp Cys Lys Ile Ala Val Ala Asn Thr Ser Thr Met
385 390 395 400
Met Met Ala Ala Glu Gly Arg Leu Gln Leu Val Gln Asp Lys Val Val
405 410 415
Leu Tyr Gln Arg Ser Ser Ser Trp Trp Pro Val Leu Ile Tyr Tyr Asp
420 425 430
Ile Leu Val Ser Glu Leu Val Asn Ala Arg His Leu Asp Ile Val Asn
435 440 445
Trp Val Pro Tyr Pro Gln Ser Lys Phe Pro Arg Pro Thr Trp Thr Lys
450 455 460
Gly Leu Cys Glu Lys Pro Ser Ile Cys Pro Ala Val Cys Val Thr Gly
465 470 475 480
Val Tyr Gln Asp Val Trp Val Val Ser Val Gly Asp Phe Ser Asn Glu
485 490 495
Thr Val Val Ile Gly Gly Tyr Leu Glu Ala Ala Ser Glu Arg Lys Asp
500 505 510
Pro Trp Ile Ala Ala Ala Asn Gln Tyr Asn Trp Leu Thr Arg Arg Gln
515 520 525
Leu Phe Thr Ala Gln Thr Glu Ala Ala Tyr Ser Ser Thr Thr Cys Phe
530 535 540
Arg Asn Thr His Gln Asp Lys Val Phe Cys Leu Thr Ile Met Glu Val
545 550 555 560
Thr Asp Asn Leu Leu Gly Asp Trp Arg Ile Ala Pro Leu Leu Tyr Glu
565 570 575
Val Thr Val Val Asp Arg Gln Gln Ser Ser Arg Lys Ala Val Ala Met
580 585 590
Ser Glu Ala His Arg Thr Arg Phe Lys Tyr Tyr Ser Pro Glu Asn Lys
595 600 605
Phe Thr Pro Gln His
610
<210> 76
<211> 564
<212> PRT
<213> 矛头蛇副粘病毒（Fer-de-Lance paramyxovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 76
Met Asp Pro Lys Ser Tyr Tyr Cys Asn Glu Asp Leu Arg Ser Asp Gly
1 5 10 15
Gly Glu Lys Ser Pro Gly Gly Asp Leu Tyr Lys Gly Ile Ile Leu Val
20 25 30
Ser Thr Val Ile Ser Leu Ile Ile Ala Ile Ile Ser Leu Ala Phe Ile
35 40 45
Ile Asp Asn Lys Ile Asn Ile Gln Ser Leu Asp Pro Leu Arg Gly Leu
50 55 60
Glu Asp Ser Tyr Leu Val Pro Ile Lys Asp Lys Ser Glu Ser Ile Ser
65 70 75 80
Gln Asp Ile Gln Glu Gly Ile Phe Pro Arg Leu Asn Leu Ile Thr Ala
85 90 95
Ala Thr Thr Thr Thr Ile Pro Arg Ser Ile Ala Ile Gln Thr Lys Asp
100 105 110
Leu Ser Asp Leu Ile Met Asn Arg Cys Tyr Pro Ser Val Val Asn Asn
115 120 125
Asp Thr Ser Cys Asp Val Leu Ala Gly Ala Ile His Ser Asn Leu Phe
130 135 140
Ser Gln Leu Asp Pro Ser Thr Tyr Trp Thr Cys Ser Ser Gly Thr Pro
145 150 155 160
Thr Met Asn Gln Thr Val Lys Leu Leu Pro Asp Asn Ser Gln Ile Pro
165 170 175
Gly Ser Thr Tyr Ser Thr Gly Cys Val Arg Ile Pro Thr Phe Ser Leu
180 185 190
Gly Ser Met Ile Tyr Ser Tyr Ser His Asn Val Ile Tyr Glu Gly Cys
195 200 205
Asn Asp His Ser Lys Ser Ser Gln Tyr Trp Gln Leu Gly Tyr Ile Ser
210 215 220
Thr Ser Lys Thr Gly Glu Pro Leu Gln Gln Val Ser Arg Thr Leu Thr
225 230 235 240
Leu Asn Asn Gly Leu Asn Arg Lys Ser Cys Ser Thr Val Ala Gln Gly
245 250 255
Arg Gly Ala Tyr Leu Leu Cys Thr Asn Val Val Glu Asp Glu Arg Thr
260 265 270
Asp Tyr Ser Thr Glu Gly Ile Gln Asp Leu Thr Leu Asp Tyr Ile Asp
275 280 285
Ile Phe Gly Ala Glu Arg Ser Tyr Arg Tyr Thr Asn Asn Glu Val Asp
290 295 300
Leu Asp Arg Pro Tyr Ala Ala Leu Tyr Pro Ser Val Gly Ser Gly Thr
305 310 315 320
Val Tyr Asn Asp Arg Ile Leu Phe Leu Gly Tyr Gly Gly Leu Met Thr
325 330 335
Pro Tyr Gly Asp Gln Ala Met Cys Gln Ala Pro Glu Cys Thr Ser Ala
340 345 350
Thr Gln Glu Gly Cys Asn Ser Asn Gln Leu Ile Gly Tyr Phe Ser Gly
355 360 365
Arg Gln Ile Val Asn Cys Ile Ile Glu Ile Ile Thr Val Gly Thr Glu
370 375 380
Lys Pro Ile Ile Arg Val Arg Thr Ile Pro Asn Ser Gln Val Trp Leu
385 390 395 400
Gly Ala Glu Gly Arg Ile Gln Thr Leu Gly Gly Val Leu Tyr Leu Tyr
405 410 415
Ile Arg Ser Ser Gly Trp His Ala Leu Ala Gln Thr Gly Ile Ile Leu
420 425 430
Thr Leu Asp Pro Ile Arg Ile Ser Trp Ile Val Asn Thr Gly Tyr Ser
435 440 445
Arg Pro Gly Asn Gly Pro Cys Ser Ala Ser Ser Arg Cys Pro Ala Gln
450 455 460
Cys Ile Thr Gly Val Tyr Thr Asp Ile Phe Pro Leu Ser Gln Asn Tyr
465 470 475 480
Gly Tyr Leu Ala Thr Val Thr Leu Leu Ser Gly Val Asp Arg Val Asn
485 490 495
Pro Val Ile Ser Tyr Gly Thr Ser Thr Gly Arg Val Ala Asp Ser Gln
500 505 510
Leu Thr Ser Ser Ser Gln Val Ala Ala Tyr Thr Thr Thr Thr Cys Phe
515 520 525
Thr Phe Asn Gln Lys Gly Tyr Cys Tyr His Ile Ile Glu Leu Ser Pro
530 535 540
Ala Thr Leu Gly Ile Phe Gln Pro Val Leu Val Val Thr Glu Ile Pro
545 550 555 560
Lys Ile Cys Ser
<210> 77
<211> 569
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒4（Avian paramyxovirus 4）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 77
Met Gln Gly Asn Met Glu Gly Ser Arg Asp Asn Leu Thr Val Asp Asp
1 5 10 15
Glu Leu Lys Thr Thr Trp Arg Leu Ala Tyr Arg Val Val Ser Leu Leu
20 25 30
Leu Met Val Ser Ala Leu Ile Ile Ser Ile Val Ile Leu Thr Arg Asp
35 40 45
Asn Ser Gln Ser Ile Ile Thr Ala Ile Asn Gln Ser Ser Asp Ala Asp
50 55 60
Ser Lys Trp Gln Thr Gly Ile Glu Gly Lys Ile Thr Ser Ile Met Thr
65 70 75 80
Asp Thr Leu Asp Thr Arg Asn Ala Ala Leu Leu His Ile Pro Leu Gln
85 90 95
Leu Asn Thr Leu Glu Ala Asn Leu Leu Ser Ala Leu Gly Gly Asn Thr
100 105 110
Gly Ile Gly Pro Gly Asp Leu Glu His Cys Arg Tyr Pro Val His Asp
115 120 125
Thr Ala Tyr Leu His Gly Val Asn Arg Leu Leu Ile Asn Gln Thr Ala
130 135 140
Asp Tyr Thr Ala Glu Gly Pro Leu Asp His Val Asn Phe Ile Pro Ala
145 150 155 160
Pro Val Thr Thr Thr Gly Cys Thr Arg Ile Pro Ser Phe Ser Val Ser
165 170 175
Ser Ser Ile Trp Cys Tyr Thr His Asn Val Ile Glu Thr Gly Cys Asn
180 185 190
Asp His Ser Gly Ser Asn Gln Tyr Ile Ser Met Gly Val Ile Lys Arg
195 200 205
Ala Gly Asn Gly Leu Pro Tyr Phe Ser Thr Val Val Ser Lys Tyr Leu
210 215 220
Thr Asp Gly Leu Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val Ala Ala Gly Ser Gly
225 230 235 240
His Cys Tyr Leu Leu Cys Ser Leu Val Ser Glu Pro Glu Pro Asp Asp
245 250 255
Tyr Val Ser Pro Asp Pro Thr Pro Met Arg Leu Gly Val Leu Thr Trp
260 265 270
Asp Gly Ser Tyr Thr Glu Gln Ala Val Pro Glu Arg Ile Phe Lys Asn
275 280 285
Ile Trp Ser Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Ser Gly Ala Ile Val Gly
290 295 300
Asn Lys Val Leu Phe Pro Phe Tyr Gly Gly Val Arg Asn Gly Ser Thr
305 310 315 320
Pro Glu Val Met Asn Arg Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ile Gln Asp Pro Asn
325 330 335
Asp Tyr Cys Pro Asp Pro Leu Gln Asp Gln Ile Leu Arg Ala Glu Gln
340 345 350
Ser Tyr Tyr Pro Thr Arg Phe Gly Arg Arg Met Val Met Gln Gly Val
355 360 365
Leu Ala Cys Pro Val Ser Asn Asn Ser Thr Ile Ala Ser Gln Cys Gln
370 375 380
Ser Tyr Tyr Phe Asn Asn Ser Leu Gly Phe Ile Gly Ala Glu Ser Arg
385 390 395 400
Ile Tyr Tyr Leu Asn Gly Asn Ile Tyr Leu Tyr Gln Arg Ser Ser Ser
405 410 415
Trp Trp Pro His Pro Gln Ile Tyr Leu Leu Asp Ser Arg Ile Ala Ser
420 425 430
Pro Gly Thr Gln Asn Ile Asp Ser Gly Val Asn Leu Lys Met Leu Asn
435 440 445
Val Thr Val Ile Thr Arg Pro Ser Ser Gly Phe Cys Asn Ser Gln Ser
450 455 460
Arg Cys Pro Asn Asp Cys Leu Phe Gly Val Tyr Ser Asp Ile Trp Pro
465 470 475 480
Leu Ser Leu Thr Ser Asp Ser Ile Phe Ala Phe Thr Met Tyr Leu Gln
485 490 495
Gly Lys Thr Thr Arg Ile Asp Pro Ala Trp Ala Leu Phe Ser Asn His
500 505 510
Ala Ile Gly His Glu Ala Arg Leu Phe Asn Lys Glu Val Ser Ala Ala
515 520 525
Tyr Ser Thr Thr Thr Cys Phe Ser Asp Thr Ile Gln Asn Gln Val Tyr
530 535 540
Cys Leu Ser Ile Leu Glu Val Arg Ser Glu Leu Leu Gly Ala Phe Lys
545 550 555 560
Ile Val Pro Phe Leu Tyr Arg Val Leu
565
<210> 78
<211> 571
<212> PRT
<213> 人类副流感病毒2（Human parainfluenza virus 2）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 78
Met Glu Asp Tyr Ser Asn Leu Ser Leu Lys Ser Ile Pro Lys Arg Thr
1 5 10 15
Cys Arg Ile Ile Phe Arg Thr Ala Thr Ile Leu Gly Ile Cys Thr Leu
20 25 30
Ile Val Leu Cys Ser Ser Ile Leu His Glu Ile Ile His Leu Asp Val
35 40 45
Ser Ser Gly Leu Met Asp Ser Asp Asp Ser Gln Gln Gly Ile Ile Gln
50 55 60
Pro Ile Ile Glu Ser Leu Lys Ser Leu Ile Ala Leu Ala Asn Gln Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Asn Val Ala Ile Ile Ile Pro Leu Lys Ile Asp Ser Ile Glu
85 90 95
Thr Val Ile Phe Ser Ala Leu Lys Asp Met His Thr Gly Ser Met Ser
100 105 110
Asn Thr Asn Cys Thr Pro Gly Asn Leu Leu Leu His Asp Ala Ala Tyr
115 120 125
Ile Asn Gly Ile Asn Lys Phe Leu Val Leu Lys Ser Tyr Asn Gly Thr
130 135 140
Pro Lys Tyr Gly Pro Leu Leu Asn Ile Pro Ser Phe Ile Pro Ser Ala
145 150 155 160
Thr Ser Pro Asn Gly Cys Thr Arg Ile Pro Ser Phe Ser Leu Ile Lys
165 170 175
Thr His Trp Cys Tyr Thr His Asn Val Met Leu Gly Asp Cys Leu Asp
180 185 190
Phe Thr Thr Ser Asn Gln Tyr Leu Ala Met Gly Ile Ile Gln Gln Ser
195 200 205
Ala Ala Ala Phe Pro Ile Phe Arg Thr Met Lys Thr Ile Tyr Leu Ser
210 215 220
Asp Gly Ile Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val Thr Ala Ile Pro Gly Gly
225 230 235 240
Cys Val Leu Tyr Cys Tyr Val Ala Thr Arg Ser Glu Lys Glu Asp Tyr
245 250 255
Ala Thr Thr Asp Leu Ala Glu Leu Arg Leu Ala Phe Tyr Tyr Tyr Asn
260 265 270
Asp Thr Phe Ile Glu Arg Val Ile Ser Leu Pro Asn Thr Thr Gly Gln
275 280 285
Trp Ala Thr Ile Asn Pro Ala Val Gly Ser Gly Ile Tyr His Leu Gly
290 295 300
Phe Ile Leu Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu Ile Ser Gly Thr Pro Ser
305 310 315 320
Tyr Asn Lys Gln Ser Ser Arg Tyr Phe Ile Pro Lys His Pro Asn Ile
325 330 335
Thr Cys Ala Gly Asn Ser Ser Glu Gln Ala Ala Ala Ala Arg Ser Ser
340 345 350
Tyr Val Ile Arg Tyr His Ser Asn Arg Leu Ile Gln Ser Ala Val Leu
355 360 365
Ile Cys Pro Leu Ser Asp Met His Thr Ala Arg Cys Asn Leu Val Met
370 375 380
Phe Asn Asn Ser Gln Val Met Met Gly Ala Glu Gly Arg Leu Tyr Val
385 390 395 400
Ile Asp Asn Asn Leu Tyr Tyr Tyr Gln Arg Ser Ser Ser Trp Trp Ser
405 410 415
Ala Ser Leu Phe Tyr Arg Ile Asn Thr Asp Phe Ser Lys Gly Ile Pro
420 425 430
Pro Ile Ile Glu Ala Gln Trp Val Pro Ser Tyr Gln Val Pro Arg Pro
435 440 445
Gly Val Met Pro Cys Asn Ala Thr Ser Phe Cys Pro Ala Asn Cys Ile
450 455 460
Thr Gly Val Tyr Ala Asp Val Trp Pro Leu Asn Asp Pro Glu Pro Thr
465 470 475 480
Ser Gln Asn Ala Leu Asn Pro Asn Tyr Arg Phe Ala Gly Ala Phe Leu
485 490 495
Arg Asn Glu Ser Asn Arg Thr Asn Pro Thr Phe Tyr Thr Ala Ser Ala
500 505 510
Ser Ala Leu Leu Asn Thr Thr Gly Phe Asn Asn Thr Asn His Lys Ala
515 520 525
Ala Tyr Thr Ser Ser Thr Cys Phe Lys Asn Thr Gly Thr Gln Lys Ile
530 535 540
Tyr Cys Leu Ile Ile Ile Glu Met Gly Ser Ser Leu Leu Gly Glu Phe
545 550 555 560
Gln Ile Ile Pro Phe Leu Arg Glu Leu Ile Pro
565 570
<210> 79
<211> 565
<212> PRT
<213> 副流感病毒5（Parainfluenza virus 5）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 79
Met Val Ala Glu Asp Ala Pro Val Arg Ala Thr Cys Arg Val Leu Phe
1 5 10 15
Arg Thr Thr Thr Leu Ile Phe Leu Cys Thr Leu Leu Ala Leu Ser Ile
20 25 30
Ser Ile Leu Tyr Glu Ser Leu Ile Thr Gln Lys Gln Ile Met Ser Gln
35 40 45
Ala Gly Ser Thr Gly Ser Asn Ser Gly Leu Gly Ser Ile Thr Asp Leu
50 55 60
Leu Asn Asn Ile Leu Ser Val Ala Asn Gln Ile Ile Tyr Asn Ser Ala
65 70 75 80
Val Ala Leu Pro Leu Gln Leu Asp Thr Leu Glu Ser Thr Leu Leu Thr
85 90 95
Ala Ile Lys Ser Leu Gln Thr Ser Asp Lys Leu Glu Gln Asn Cys Ser
100 105 110
Trp Ser Ala Ala Leu Ile Asn Asp Asn Arg Tyr Ile Asn Gly Ile Asn
115 120 125
Gln Phe Tyr Phe Ser Ile Ala Glu Gly Arg Asn Leu Thr Leu Gly Pro
130 135 140
Leu Leu Asn Met Pro Ser Phe Ile Pro Thr Ala Thr Thr Pro Glu Gly
145 150 155 160
Cys Thr Arg Ile Pro Ser Phe Ser Leu Thr Lys Thr His Trp Cys Tyr
165 170 175
Thr His Asn Val Ile Leu Asn Gly Cys Gln Asp His Val Ser Ser Asn
180 185 190
Gln Phe Val Ser Met Gly Ile Ile Glu Pro Thr Ser Ala Gly Phe Pro
195 200 205
Phe Phe Arg Thr Leu Lys Thr Leu Tyr Leu Ser Asp Gly Val Asn Arg
210 215 220
Lys Ser Cys Ser Ile Ser Thr Val Pro Gly Gly Cys Met Met Tyr Cys
225 230 235 240
Phe Val Ser Thr Gln Pro Glu Arg Asp Asp Tyr Phe Ser Ala Ala Pro
245 250 255
Pro Glu Gln Arg Ile Ile Ile Met Tyr Tyr Asn Asp Thr Ile Val Glu
260 265 270
Arg Ile Ile Asn Pro Pro Gly Val Leu Asp Val Trp Ala Thr Leu Asn
275 280 285
Pro Gly Thr Gly Ser Gly Val Tyr Tyr Leu Gly Trp Val Leu Phe Pro
290 295 300
Ile Tyr Gly Gly Val Ile Lys Gly Thr Ser Leu Trp Asn Asn Gln Ala
305 310 315 320
Asn Lys Tyr Phe Ile Pro Gln Met Val Ala Ala Leu Cys Ser Gln Asn
325 330 335
Gln Ala Thr Gln Val Gln Asn Ala Lys Ser Ser Tyr Tyr Ser Ser Trp
340 345 350
Phe Gly Asn Arg Met Ile Gln Ser Gly Ile Leu Ala Cys Pro Leu Arg
355 360 365
Gln Asp Leu Thr Asn Glu Cys Leu Val Leu Pro Phe Ser Asn Asp Gln
370 375 380
Val Leu Met Gly Ala Glu Gly Arg Leu Tyr Met Tyr Gly Asp Ser Val
385 390 395 400
Tyr Tyr Tyr Gln Arg Ser Asn Ser Trp Trp Pro Met Thr Met Leu Tyr
405 410 415
Lys Val Thr Ile Thr Phe Thr Asn Gly Gln Pro Ser Ala Ile Ser Ala
420 425 430
Gln Asn Val Pro Thr Gln Gln Val Pro Arg Pro Gly Thr Gly Asp Cys
435 440 445
Ser Ala Thr Asn Arg Cys Pro Gly Phe Cys Leu Thr Gly Val Tyr Ala
450 455 460
Asp Ala Trp Leu Leu Thr Asn Pro Ser Ser Thr Ser Thr Phe Gly Ser
465 470 475 480
Glu Ala Thr Phe Thr Gly Ser Tyr Leu Asn Thr Ala Thr Gln Arg Ile
485 490 495
Asn Pro Thr Met Tyr Ile Ala Asn Asn Thr Gln Ile Ile Ser Ser Gln
500 505 510
Gln Phe Gly Ser Ser Gly Gln Glu Ala Ala Tyr Gly His Thr Thr Cys
515 520 525
Phe Arg Asp Thr Gly Ser Val Met Val Tyr Cys Ile Tyr Ile Ile Glu
530 535 540
Leu Ser Ser Ser Leu Leu Gly Gln Phe Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg
545 550 555 560
Gln Val Thr Leu Ser
565
<210> 80
<211> 576
<212> PRT
<213> 猪腮腺炎病毒（Porcine rubulavirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着蛋白
<400> 80
Met Ser Gln Leu Gly Thr Asp Gln Ile Met His Leu Ala Gln Pro Ala
1 5 10 15
Ile Ala Arg Arg Thr Trp Arg Leu Cys Phe Arg Ile Phe Ala Leu Phe
20 25 30
Ile Leu Ile Ala Ile Val Ile Thr Gln Ile Phe Met Leu Thr Phe Asp
35 40 45
His Thr Leu Leu Thr Thr Thr Gln Phe Leu Thr Ser Ile Gly Asn Leu
50 55 60
Gln Ser Thr Ile Thr Ser Trp Thr Pro Asp Val Gln Ala Met Leu Ser
65 70 75 80
Ile Ser Asn Gln Leu Ile Tyr Thr Thr Ser Ile Thr Leu Pro Leu Lys
85 90 95
Ile Ser Thr Thr Glu Met Ser Ile Leu Thr Ala Ile Arg Asp His Cys
100 105 110
His Cys Pro Asp Cys Ser Ser Ala Cys Pro Thr Arg Gln Met Leu Leu
115 120 125
Asn Asp Pro Arg Tyr Met Ser Gly Val Asn Gln Phe Ile Gly Ala Pro
130 135 140
Thr Glu Ser Ile Asn Ile Thr Phe Gly Pro Leu Phe Gly Ile Pro Ser
145 150 155 160
Phe Ile Pro Thr Ser Thr Thr Thr Gln Gly Cys Thr Arg Ile Pro Ser
165 170 175
Phe Ala Leu Gly Pro Ser His Trp Cys Tyr Thr His Asn Phe Ile Thr
180 185 190
Ala Gly Cys Ala Asp Gly Gly His Ser Asn Gln Tyr Leu Ala Met Gly
195 200 205
Thr Ile Gln Ser Ala Ser Asp Gly Ser Pro Leu Leu Ile Thr Ala Arg
210 215 220
Ser Tyr Tyr Leu Ser Asp Gly Val Asn Arg Lys Ser Cys Ser Ile Ala
225 230 235 240
Val Val Pro Gly Gly Cys Ala Met Tyr Cys Tyr Val Ala Thr Arg Ser
245 250 255
Glu Thr Asp Tyr Tyr Ala Gly Asn Ser Pro Pro Gln Gln Leu Leu Thr
260 265 270
Leu Val Phe Ser Asn Asp Thr Ile Ile Glu Arg Thr Ile His Pro Thr
275 280 285
Gly Leu Ala Asn Gly Trp Val Met Leu Val Pro Gly Val Gly Ser Gly
290 295 300
Thr Leu Tyr Asn Glu Tyr Leu Leu Phe Pro Ala Tyr Gly Gly Met Gln
305 310 315 320
Gln Ile Leu Ala Asn Gln Ser Gly Glu Ile Asn Gln Phe Phe Thr Pro
325 330 335
Tyr Asn Ala Thr Val Arg Cys Ala Met Ala Gln Pro Gln Phe Ser Gln
340 345 350
Arg Ala Ala Ala Ser Tyr Tyr Pro Arg Tyr Phe Ser Asn Arg Trp Ile
355 360 365
Arg Ser Ala Ile Val Ala Cys Pro Tyr Arg Ala Ile Tyr Gln Thr Gln
370 375 380
Cys Thr Leu Ile Pro Leu Pro Asn Arg Met Val Met Met Gly Ser Glu
385 390 395 400
Gly Arg Ile Phe Thr Leu Gly Asp Arg Leu Phe Tyr Tyr Gln Arg Ser
405 410 415
Ser Ser Trp Trp Pro Tyr Pro Leu Leu Tyr Gln Val Gly Leu Asn Phe
420 425 430
Leu Thr Thr Pro Pro Ser Val Ser Ser Met Thr Gln Val Pro Leu Glu
435 440 445
His Leu Ala Arg Pro Gly Lys Gly Gly Cys Pro Gly Asn Ser His Cys
450 455 460
Pro Ala Thr Cys Val Thr Gly Val Tyr Ala Asp Val Trp Pro Leu Thr
465 470 475 480
Asp Pro Arg Ser Gly Val Gly Gly Thr Ser Leu Val Ala Ala Gly Gly
485 490 495
Leu Asp Ser Thr Ser Glu Arg Met Ala Pro Val Asn Tyr Leu Ala Ile
500 505 510
Gly Glu Ser Leu Leu Ser Lys Thr Tyr Leu Leu Ser Lys Thr Gln Pro
515 520 525
Ala Ala Tyr Thr Thr Thr Thr Cys Phe Arg Asp Thr Asp Thr Gly Lys
530 535 540
Ile Tyr Cys Ile Thr Ile Ala Glu Leu Gly Lys Val Leu Leu Gly Glu
545 550 555 560
Phe Gln Ile Val Pro Phe Leu Arg Glu Ile Lys Ile Gln Ser Arg Tyr
565 570 575
<210> 81
<211> 580
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒2（Avian paramyxovirus 2）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 81
Met Asp Phe Pro Ser Arg Glu Asn Leu Ala Ala Gly Asp Ile Ser Gly
1 5 10 15
Arg Lys Thr Trp Arg Leu Leu Phe Arg Ile Leu Thr Leu Ser Ile Gly
20 25 30
Val Val Cys Leu Ala Ile Asn Ile Ala Thr Ile Ala Lys Leu Asp His
35 40 45
Leu Asp Asn Met Ala Ser Asn Thr Trp Thr Thr Thr Glu Ala Asp Arg
50 55 60
Val Ile Ser Ser Ile Thr Thr Pro Leu Lys Val Pro Val Asn Gln Ile
65 70 75 80
Asn Asp Met Phe Arg Ile Val Ala Leu Asp Leu Pro Leu Gln Met Thr
85 90 95
Ser Leu Gln Lys Glu Ile Thr Ser Gln Val Gly Phe Leu Ala Glu Ser
100 105 110
Ile Asn Asn Val Leu Ser Lys Asn Gly Ser Ala Gly Leu Val Leu Val
115 120 125
Asn Asp Pro Glu Tyr Ala Gly Gly Ile Ala Val Ser Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Asp Ala Ser Ala Gly Leu Asn Phe Gln Pro Ile Ser Leu Ile Glu His
145 150 155 160
Pro Ser Phe Val Pro Gly Pro Thr Thr Ala Lys Gly Cys Ile Arg Ile
165 170 175
Pro Thr Phe His Met Gly Pro Ser His Trp Cys Tyr Ser His Asn Ile
180 185 190
Ile Ala Ser Gly Cys Gln Asp Ala Ser His Ser Ser Met Tyr Ile Ser
195 200 205
Leu Gly Val Leu Lys Ala Ser Gln Thr Gly Ser Pro Ile Phe Leu Thr
210 215 220
Thr Ala Ser His Leu Val Asp Asp Asn Ile Asn Arg Lys Ser Cys Ser
225 230 235 240
Ile Val Ala Ser Lys Tyr Gly Cys Asp Ile Leu Cys Ser Ile Val Ile
245 250 255
Glu Thr Glu Asn Glu Asp Tyr Arg Ser Asp Pro Ala Thr Ser Met Ile
260 265 270
Ile Gly Arg Leu Phe Phe Asn Gly Ser Tyr Thr Glu Ser Lys Ile Asn
275 280 285
Thr Gly Ser Ile Phe Ser Leu Phe Ser Ala Asn Tyr Pro Ala Val Gly
290 295 300
Ser Gly Ile Val Val Gly Asp Glu Ala Ala Phe Pro Ile Tyr Gly Gly
305 310 315 320
Val Lys Gln Asn Thr Trp Leu Phe Asn Gln Leu Lys Asp Phe Gly Tyr
325 330 335
Phe Thr His Asn Asp Val Tyr Lys Cys Asn Arg Thr Asp Ile Gln Gln
340 345 350
Thr Ile Leu Asp Ala Tyr Arg Pro Pro Lys Ile Ser Gly Arg Leu Trp
355 360 365
Val Gln Gly Ile Leu Leu Cys Pro Val Ser Leu Arg Pro Asp Pro Gly
370 375 380
Cys Arg Leu Lys Val Phe Asn Thr Ser Asn Val Met Met Gly Ala Glu
385 390 395 400
Ala Arg Leu Ile Gln Val Gly Ser Thr Val Tyr Leu Tyr Gln Arg Ser
405 410 415
Ser Ser Trp Trp Val Val Gly Leu Thr Tyr Lys Leu Asp Val Ser Glu
420 425 430
Ile Thr Ser Gln Thr Gly Asn Thr Leu Asn His Val Asp Pro Ile Ala
435 440 445
His Thr Lys Phe Pro Arg Pro Ser Phe Arg Arg Asp Ala Cys Ala Arg
450 455 460
Pro Asn Ile Cys Pro Ala Val Cys Val Ser Gly Val Tyr Gln Asp Ile
465 470 475 480
Trp Pro Ile Ser Thr Ala Thr Asn Asn Ser Asn Ile Val Trp Val Gly
485 490 495
Gln Tyr Leu Glu Ala Phe Tyr Ser Arg Lys Asp Pro Arg Ile Gly Ile
500 505 510
Ala Thr Gln Tyr Glu Trp Lys Val Thr Asn Gln Leu Phe Asn Ser Asn
515 520 525
Thr Glu Gly Gly Tyr Ser Thr Thr Thr Cys Phe Arg Asn Thr Lys Arg
530 535 540
Asp Lys Ala Tyr Cys Val Val Ile Ser Glu Tyr Ala Asp Gly Val Phe
545 550 555 560
Gly Ser Tyr Arg Ile Val Pro Gln Leu Ile Glu Ile Arg Thr Thr Thr
565 570 575
Gly Lys Ser Glu
580
<210> 82
<211> 236
<212> PRT
<213> 人类偏肺病毒（Human metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白G
<400> 82
Met Glu Val Lys Val Glu Asn Ile Arg Thr Ile Asp Met Leu Lys Ala
1 5 10 15
Arg Val Lys Asn Arg Val Ala Arg Ser Lys Cys Phe Lys Asn Ala Ser
20 25 30
Leu Ile Leu Ile Gly Ile Thr Thr Leu Ser Ile Ala Leu Asn Ile Tyr
35 40 45
Leu Ile Ile Asn Tyr Thr Met Gln Glu Asn Thr Ser Glu Ser Glu His
50 55 60
His Thr Ser Ser Ser Pro Met Glu Ser Ser Arg Glu Thr Pro Thr Val
65 70 75 80
Pro Ile Asp Asn Ser Asp Thr Asn Pro Ser Ser Gln Tyr Pro Thr Gln
85 90 95
Gln Ser Thr Glu Gly Ser Thr Leu Tyr Phe Ala Ala Ser Ala Ser Ser
100 105 110
Pro Glu Thr Glu Pro Thr Ser Thr Pro Asp Thr Thr Ser Arg Pro Pro
115 120 125
Phe Val Asp Thr His Thr Thr Pro Pro Ser Ala Ser Arg Thr Lys Thr
130 135 140
Ser Pro Ala Val His Thr Lys Asn Asn Pro Arg Ile Ser Ser Arg Thr
145 150 155 160
His Ser Pro Pro Trp Ala Met Thr Arg Thr Val Arg Arg Thr Thr Thr
165 170 175
Leu Arg Thr Ser Ser Ile Arg Lys Arg Ser Ser Thr Ala Ser Val Gln
180 185 190
Pro Asp Ser Ser Ala Thr Thr His Lys His Glu Glu Ala Ser Pro Val
195 200 205
Ser Pro Gln Thr Ser Ala Ser Thr Thr Arg Pro Gln Arg Lys Ser Met
210 215 220
Glu Ala Ser Thr Ser Thr Thr Tyr Asn Gln Thr Ser
225 230 235
<210> 83
<211> 414
<212> PRT
<213> 犬肺炎病毒（Canine pneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着蛋白
<400> 83
Met Arg Pro Ala Glu Gln Leu Ile Gln Glu Asn Tyr Lys Leu Thr Ser
1 5 10 15
Leu Ser Met Gly Arg Asn Phe Glu Val Ser Gly Ser Thr Thr Asn Leu
20 25 30
Asn Phe Glu Arg Thr Gln Tyr Pro Asp Thr Phe Arg Ala Val Val Lys
35 40 45
Val Asn Gln Met Cys Lys Leu Ile Ala Gly Val Leu Thr Ser Ala Ala
50 55 60
Val Ala Val Cys Val Gly Val Ile Met Tyr Ser Val Phe Thr Ser Asn
65 70 75 80
His Lys Ala Asn Ser Met Gln Asn Ala Thr Ile Arg Asn Ser Thr Ser
85 90 95
Ala Pro Pro Gln Pro Thr Ala Gly Pro Pro Thr Thr Glu Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Pro Lys Phe Thr Lys Pro Pro Thr Lys Thr Thr Thr His His Glu
115 120 125
Ile Thr Glu Pro Ala Lys Met Val Thr Pro Ser Glu Asp Pro Tyr Gln
130 135 140
Cys Ser Ser Asn Gly Tyr Leu Asp Arg Pro Asp Leu Pro Glu Asp Phe
145 150 155 160
Lys Leu Val Leu Asp Val Ile Cys Lys Pro Pro Gly Pro Glu His His
165 170 175
Ser Thr Asn Cys Tyr Glu Lys Arg Glu Ile Asn Leu Gly Ser Val Cys
180 185 190
Pro Asp Leu Val Thr Met Lys Ala Asn Met Gly Leu Asn Asn Gly Gly
195 200 205
Gly Glu Glu Ala Ala Pro Tyr Ile Glu Val Ile Thr Leu Ser Thr Tyr
210 215 220
Ser Asn Lys Arg Ala Met Cys Val His Asn Gly Cys Asp Gln Gly Phe
225 230 235 240
Cys Phe Phe Leu Ser Gly Leu Ser Thr Asp Gln Lys Arg Ala Val Leu
245 250 255
Glu Leu Gly Gly Gln Gln Ala Ile Met Glu Leu His Tyr Asp Ser Tyr
260 265 270
Trp Lys His Tyr Trp Ser Asn Ser Asn Cys Val Val Pro Arg Thr Asn
275 280 285
Cys Asn Leu Thr Asp Gln Thr Val Ile Leu Phe Pro Ser Phe Asn Asn
290 295 300
Lys Asn Gln Ser Gln Cys Thr Thr Cys Ala Asp Ser Ala Gly Leu Asp
305 310 315 320
Asn Lys Phe Tyr Leu Thr Cys Asp Gly Leu Ser Arg Asn Leu Pro Leu
325 330 335
Val Gly Leu Pro Ser Leu Ser Pro Gln Ala His Lys Ala Ala Leu Lys
340 345 350
Gln Ser Thr Gly Thr Thr Thr Ala Pro Thr Pro Glu Thr Arg Asn Pro
355 360 365
Thr Pro Ala Pro Arg Arg Ser Lys Pro Leu Ser Arg Lys Lys Arg Ala
370 375 380
Leu Cys Gly Val Asp Ser Ser Arg Glu Pro Lys Pro Thr Met Pro Tyr
385 390 395 400
Trp Cys Pro Met Leu Gln Leu Phe Pro Arg Arg Ser Asn Ser
405 410
<210> 84
<211> 228
<212> PRT
<213> A型呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus type A）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 截短附着糖蛋白
<400> 84
Met Ser Lys Thr Lys Asp Gln Arg Ala Ala Lys Thr Leu Glu Lys Thr
1 5 10 15
Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys
20 25 30
Ser Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Thr Leu Ser Ile Leu Ala Met
35 40 45
Thr Ile Pro Thr Ser Leu Ile Ile Val Ala Thr Thr Phe Ile Ala Ser
50 55 60
Ala Asn Asn Lys Val Thr Pro Thr Thr Ala Ile Ile Gln Asp Ala Thr
65 70 75 80
Ser Gln Ile Lys Asn Thr Thr Pro Thr His Leu Thr Gln Asn Pro Gln
85 90 95
Pro Gly Ile Ser Phe Phe Asn Leu Ser Gly Thr Ile Ser Gln Thr Thr
100 105 110
Ala Ile Leu Ala Pro Thr Thr Pro Ser Val Glu Pro Ile Leu Gln Ser
115 120 125
Thr Thr Val Lys Thr Lys Asn Thr Thr Thr Thr Gln Ile Gln Pro Ser
130 135 140
Lys Leu Thr Thr Lys Gln Arg Gln Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro Asn
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys
165 170 175
Ser Asn Asn Pro Thr Cys Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Ser Lys
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Lys Thr Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Gln Thr Ile
195 200 205
Lys Thr Thr Lys Lys Asp Leu Lys Pro Gln Thr Thr Lys Pro Lys Glu
210 215 220
Ala Pro Thr Thr
225
<210> 85
<211> 577
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒8（Avian paramyxovirus 8）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 85
Met Ser Asn Ile Ala Ser Ser Leu Glu Asn Ile Val Glu Gln Asp Ser
1 5 10 15
Arg Lys Thr Thr Trp Arg Ala Ile Phe Arg Trp Ser Val Leu Leu Ile
20 25 30
Thr Thr Gly Cys Leu Ala Leu Ser Ile Val Ser Ile Val Gln Ile Gly
35 40 45
Asn Leu Lys Ile Pro Ser Val Gly Asp Leu Ala Asp Glu Val Val Thr
50 55 60
Pro Leu Lys Thr Thr Leu Ser Asp Thr Leu Arg Asn Pro Ile Asn Gln
65 70 75 80
Ile Asn Asp Ile Phe Arg Ile Val Ala Leu Asp Ile Pro Leu Gln Val
85 90 95
Thr Ser Ile Gln Lys Asp Leu Ala Ser Gln Phe Ser Met Leu Ile Asp
100 105 110
Ser Leu Asn Ala Ile Lys Leu Gly Asn Gly Thr Asn Leu Ile Ile Pro
115 120 125
Thr Ser Asp Lys Glu Tyr Ala Gly Gly Ile Gly Asn Pro Val Phe Thr
130 135 140
Val Asp Ala Gly Gly Ser Ile Gly Phe Lys Gln Phe Ser Leu Ile Glu
145 150 155 160
His Pro Ser Phe Ile Ala Gly Pro Thr Thr Thr Arg Gly Cys Thr Arg
165 170 175
Ile Pro Thr Phe His Met Ser Glu Ser His Trp Cys Tyr Ser His Asn
180 185 190
Ile Ile Ala Ala Gly Cys Gln Asp Ala Ser Ala Ser Ser Met Tyr Ile
195 200 205
Ser Met Gly Val Leu His Val Ser Ser Ser Gly Thr Pro Ile Phe Leu
210 215 220
Thr Thr Ala Ser Glu Leu Ile Asp Asp Gly Val Asn Arg Lys Ser Cys
225 230 235 240
Ser Ile Val Ala Thr Gln Phe Gly Cys Asp Ile Leu Cys Ser Ile Val
245 250 255
Ile Glu Lys Glu Gly Asp Asp Tyr Trp Ser Asp Thr Pro Thr Pro Met
260 265 270
Arg His Gly Arg Phe Ser Phe Asn Gly Ser Phe Val Glu Thr Glu Leu
275 280 285
Pro Val Ser Ser Met Phe Ser Ser Phe Ser Ala Asn Tyr Pro Ala Val
290 295 300
Gly Ser Gly Glu Ile Val Lys Asp Arg Ile Leu Phe Pro Ile Tyr Gly
305 310 315 320
Gly Ile Lys Gln Thr Ser Pro Glu Phe Thr Glu Leu Val Lys Tyr Gly
325 330 335
Leu Phe Val Ser Thr Pro Thr Thr Val Cys Gln Ser Ser Trp Thr Tyr
340 345 350
Asp Gln Val Lys Ala Ala Tyr Arg Pro Asp Tyr Ile Ser Gly Arg Phe
355 360 365
Trp Ala Gln Val Ile Leu Ser Cys Ala Leu Asp Ala Val Asp Leu Ser
370 375 380
Ser Cys Ile Val Lys Ile Met Asn Ser Ser Thr Val Met Met Ala Ala
385 390 395 400
Glu Gly Arg Ile Ile Lys Ile Gly Ile Asp Tyr Phe Tyr Tyr Gln Arg
405 410 415
Ser Ser Ser Trp Trp Pro Leu Ala Phe Val Thr Lys Leu Asp Pro Gln
420 425 430
Glu Leu Ala Asp Thr Asn Ser Ile Trp Leu Thr Asn Ser Ile Pro Ile
435 440 445
Pro Gln Ser Lys Phe Pro Arg Pro Ser Tyr Ser Glu Asn Tyr Cys Thr
450 455 460
Lys Pro Ala Val Cys Pro Ala Thr Cys Val Thr Gly Val Tyr Ser Asp
465 470 475 480
Ile Trp Pro Leu Thr Ser Ser Ser Ser Leu Pro Ser Ile Ile Trp Ile
485 490 495
Gly Gln Tyr Leu Asp Ala Pro Val Gly Arg Thr Tyr Pro Arg Phe Gly
500 505 510
Ile Ala Asn Gln Ser His Trp Tyr Leu Gln Glu Asp Ile Leu Pro Thr
515 520 525
Ser Thr Ala Ser Ala Tyr Ser Thr Thr Thr Cys Phe Lys Asn Thr Ala
530 535 540
Arg Asn Arg Val Phe Cys Val Thr Ile Ala Glu Phe Ala Asp Gly Leu
545 550 555 560
Phe Gly Glu Tyr Arg Ile Thr Pro Gln Leu Tyr Glu Leu Val Arg Asn
565 570 575
Asn
<210> 86
<211> 576
<212> PRT
<213> 猪副流感病毒1（Porcine parainfluenza virus 1）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素蛋白
<400> 86
Met Glu Glu Thr Lys Val Lys Thr Ser Glu Tyr Trp Ala Arg Ser Pro
1 5 10 15
Gln Ile His Ala Thr Asn His Pro Asn Val Gln Asn Arg Glu Lys Ile
20 25 30
Lys Glu Ile Leu Thr Ile Leu Ile Ser Phe Ile Ser Ser Leu Ser Leu
35 40 45
Val Leu Val Ile Ala Val Leu Ile Met Gln Ser Leu His Asn Gly Thr
50 55 60
Ile Leu Arg Cys Lys Asp Val Gly Leu Glu Ser Ile Asn Lys Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Ser Ile Ser Asn Ala Ile Leu Asp Val Ile Lys Gln Glu Leu Ile
85 90 95
Thr Arg Ile Ile Asn Thr Gln Ser Ser Val Gln Val Ala Leu Pro Ile
100 105 110
Leu Ile Asn Lys Lys Ile Gln Asp Leu Ser Leu Ile Ile Glu Lys Ser
115 120 125
Ser Lys Val His Gln Asn Ser Pro Thr Cys Ser Gly Val Ala Ala Leu
130 135 140
Thr His Val Glu Gly Ile Lys Pro Leu Asp Pro Asp Asp Tyr Trp Arg
145 150 155 160
Cys Pro Ser Gly Glu Pro Tyr Leu Glu Asp Glu Leu Thr Leu Ser Leu
165 170 175
Ile Pro Gly Pro Ser Met Leu Ala Gly Thr Ser Thr Ile Asp Gly Cys
180 185 190
Val Arg Leu Pro Ser Leu Ala Ile Gly Lys Ser Leu Tyr Ala Tyr Ser
195 200 205
Ser Asn Leu Ile Thr Lys Gly Cys Gln Asp Ile Gly Lys Ser Tyr Gln
210 215 220
Val Leu Gln Leu Gly Ile Ile Thr Leu Asn Ser Asp Leu His Pro Asp
225 230 235 240
Leu Asn Pro Ile Ile Ser His Thr Tyr Asp Ile Asn Asp Asn Arg Lys
245 250 255
Ser Cys Ser Val Ala Val Ser Glu Thr Lys Gly Tyr Gln Leu Cys Ser
260 265 270
Met Pro Arg Val Asn Glu Lys Thr Asp Tyr Thr Ser Asp Gly Ile Glu
275 280 285
Asp Ile Val Phe Asp Val Leu Asp Leu Lys Gly Ser Ser Arg Ser Phe
290 295 300
Lys Phe Ser Asn Asn Asp Ile Asn Phe Asp His Pro Phe Ser Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Pro Ser Val Gly Ser Gly Ile Ile Trp Lys Asn Glu Leu Tyr Phe
325 330 335
Leu Gly Tyr Gly Ala Leu Thr Thr Ala Leu Gln Gly Asn Thr Lys Cys
340 345 350
Asn Leu Met Gly Cys Pro Gly Ala Thr Gln Asp Asn Cys Asn Lys Phe
355 360 365
Ile Ser Ser Ser Trp Leu Tyr Ser Lys Gln Met Val Asn Val Leu Ile
370 375 380
Gln Val Lys Gly Tyr Leu Ser Ser Lys Pro Ser Ile Ile Val Arg Thr
385 390 395 400
Ile Pro Ile Thr Glu Asn Tyr Val Gly Ala Glu Gly Lys Leu Val Gly
405 410 415
Thr Arg Glu Arg Ile Tyr Ile Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Trp His Thr
420 425 430
Asn Leu Gln Ile Gly Val Leu Asn Ile Asn His Pro Ile Thr Ile Thr
435 440 445
Trp Thr Asp His Arg Val Leu Ser Arg Pro Gly Arg Ser Pro Cys Ala
450 455 460
Trp Asn Asn Lys Cys Pro Arg Asn Cys Thr Thr Gly Val Tyr Thr Asp
465 470 475 480
Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Asp Ala Asn Tyr Val Ala Thr Val Thr Leu
485 490 495
Leu Ser Asn Ser Thr Arg Asn Asn Pro Thr Ile Met Tyr Ser Ser Ser
500 505 510
Asp Arg Val Tyr Asn Met Leu Arg Leu Arg Asn Thr Glu Leu Glu Ala
515 520 525
Ala Tyr Thr Thr Thr Ser Cys Ile Val His Phe Asp Arg Gly Tyr Cys
530 535 540
Phe His Ile Ile Glu Ile Asn Gln Lys Glu Leu Asn Thr Leu Gln Pro
545 550 555 560
Met Leu Phe Lys Thr Ala Ile Pro Lys Ala Cys Arg Ile Ser Asn Leu
565 570 575
<210> 87
<211> 579
<212> PRT
<213> 人类副流感病毒4b（Human parainfluenza virus 4b）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 87
Met Gln Asp Ser Arg Gly Asn Thr Gln Ile Phe Ser Gln Ala Asn Ser
1 5 10 15
Met Val Lys Arg Thr Trp Arg Leu Leu Phe Arg Ile Val Thr Leu Ile
20 25 30
Leu Leu Ile Ser Ile Phe Val Leu Ser Leu Ile Ile Val Leu Gln Ser
35 40 45
Thr Pro Gly Asn Leu Gln Ser Asp Val Asp Ile Ile Arg Lys Glu Leu
50 55 60
Asp Glu Leu Met Glu Asn Phe Glu Thr Thr Ser Lys Ser Leu Leu Ser
65 70 75 80
Val Ala Asn Gln Ile Thr Tyr Asp Val Ser Val Leu Thr Pro Ile Arg
85 90 95
Gln Glu Ala Thr Glu Thr Asn Ile Ile Ala Lys Ile Lys Asp His Cys
100 105 110
Lys Asp Arg Val Val Lys Gly Glu Ser Thr Cys Thr Leu Gly His Lys
115 120 125
Pro Leu His Asp Val Ser Phe Leu Asn Gly Phe Asn Lys Phe Tyr Phe
130 135 140
Thr Tyr Arg Asp Asn Val Gln Ile Arg Leu Asn Pro Leu Leu Asp Tyr
145 150 155 160
Pro Asn Phe Ile Pro Thr Ala Thr Thr Pro His Gly Cys Ile Arg Ile
165 170 175
Pro Ser Phe Ser Leu Ser Gln Thr His Trp Cys Tyr Thr His Asn Thr
180 185 190
Ile Leu Arg Gly Cys Glu Asp Thr Ala Ser Ser Lys Gln Tyr Val Ser
195 200 205
Leu Gly Thr Leu Gln Thr Leu Glu Asn Gly Asp Pro Tyr Phe Lys Val
210 215 220
Glu Tyr Ser His Tyr Leu Asn Asp Arg Lys Asn Arg Lys Ser Cys Ser
225 230 235 240
Val Val Ala Val Leu Asp Gly Cys Leu Leu Tyr Cys Val Ile Met Thr
245 250 255
Lys Asn Glu Thr Glu Asn Phe Lys Asp Pro Gln Leu Ala Thr Gln Leu
260 265 270
Leu Thr Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Thr Ile Lys Glu Arg Ile Ile Asn
275 280 285
Pro Pro Gly Ser Ser Arg Asp Trp Val His Ile Ser Pro Gly Val Gly
290 295 300
Ser Gly Ile Leu Tyr Ser Asn Tyr Ile Ile Phe Pro Leu Tyr Gly Gly
305 310 315 320
Leu Met Glu Asn Ser Met Ile Tyr Asn Asn Gln Ser Gly Lys Tyr Phe
325 330 335
Phe Pro Asn Ser Thr Lys Leu Pro Cys Ser Asn Lys Thr Ser Glu Lys
340 345 350
Ile Thr Gly Ala Lys Asp Ser Tyr Thr Ile Thr Tyr Phe Ser Lys Arg
355 360 365
Leu Ile Gln Ser Ala Phe Leu Ile Cys Asp Leu Arg Gln Phe Leu Ser
370 375 380
Glu Asp Cys Glu Ile Leu Ile Pro Ser Asn Asp His Met Leu Val Gly
385 390 395 400
Ala Glu Gly Arg Leu Tyr Asn Ile Glu Asn Asn Ile Phe Tyr Tyr Gln
405 410 415
Arg Gly Ser Ser Trp Trp Pro Tyr Pro Ser Leu Tyr Arg Ile Lys Leu
420 425 430
Asn Ser Asn Lys Lys Tyr Pro Arg Ile Ile Glu Ile Lys Phe Thr Lys
435 440 445
Ile Glu Ile Ala Pro Arg Pro Gly Asn Lys Asp Cys Pro Gly Asn Lys
450 455 460
Ala Cys Pro Lys Glu Cys Ile Thr Gly Val Tyr Gln Asp Ile Trp Pro
465 470 475 480
Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Ala Phe Pro His Lys Lys Arg Ala Tyr Tyr
485 490 495
Thr Gly Phe Tyr Leu Asn Asn Ser Leu Ala Arg Arg Asn Pro Thr Phe
500 505 510
Tyr Thr Ala Asp Asn Leu Asp Tyr His Gln Gln Glu Arg Leu Gly Lys
515 520 525
Phe Asn Leu Thr Ala Gly Tyr Ser Thr Thr Thr Cys Phe Lys Gln Thr
530 535 540
Thr Thr Ala Arg Leu Tyr Cys Leu Tyr Ile Leu Glu Val Gly Asp Ser
545 550 555 560
Val Ile Gly Asp Phe Gln Ile Phe Pro Phe Leu Arg Ser Ile Asp Gln
565 570 575
Ala Ile Thr
<210> 88
<211> 582
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒2（Avian paramyxovirus 2）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 88
Met Asp Ala Leu Ser Arg Glu Asn Leu Thr Glu Ile Ser Gln Gly Gly
1 5 10 15
Arg Arg Thr Trp Arg Met Leu Phe Arg Ile Leu Thr Leu Val Leu Thr
20 25 30
Leu Val Cys Leu Ala Ile Asn Ile Ala Thr Ile Ala Lys Leu Asp Ser
35 40 45
Ile Asp Thr Ser Lys Val Gln Thr Trp Thr Thr Thr Glu Ser Asp Arg
50 55 60
Val Ile Gly Ser Leu Thr Asp Thr Leu Lys Ile Pro Ile Asn Gln Val
65 70 75 80
Asn Asp Met Phe Arg Ile Val Ala Leu Asp Leu Pro Leu Gln Met Thr
85 90 95
Thr Leu Gln Lys Glu Ile Ala Ser Gln Val Gly Phe Leu Ala Glu Ser
100 105 110
Ile Asn Asn Phe Leu Ser Lys Asn Gly Ser Ala Gly Ser Val Leu Val
115 120 125
Asn Asp Pro Glu Tyr Ala Gly Gly Ile Gly Thr Ser Leu Phe His Gly
130 135 140
Asp Ser Ala Ser Gly Leu Asp Phe Glu Ala Pro Ser Leu Ile Glu His
145 150 155 160
Pro Ser Phe Ile Pro Gly Pro Thr Thr Ala Lys Gly Cys Ile Arg Ile
165 170 175
Pro Thr Phe His Met Ser Ala Ser His Trp Cys Tyr Ser His Asn Ile
180 185 190
Ile Ala Ser Gly Cys Gln Asp Ala Gly His Ser Ser Met Tyr Ile Ser
195 200 205
Met Gly Val Leu Lys Ala Thr Gln Ala Gly Ser Pro Ser Phe Leu Thr
210 215 220
Thr Ala Ser Gln Leu Val Asp Asp Lys Leu Asn Arg Lys Ser Cys Ser
225 230 235 240
Ile Ile Ser Thr Thr Tyr Gly Cys Asp Ile Leu Cys Ser Leu Val Val
245 250 255
Glu Asn Glu Asp Ala Asp Tyr Arg Ser Asp Pro Pro Thr Asp Met Ile
260 265 270
Leu Gly Arg Leu Phe Phe Asn Gly Thr Tyr Ser Glu Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Thr Ser Ala Ile Phe Gln Leu Phe Ser Ala Asn Tyr Pro Ala Val Gly
290 295 300
Ser Gly Ile Val Leu Gly Asp Glu Ile Ala Phe Pro Val Tyr Gly Gly
305 310 315 320
Val Lys Gln Asn Thr Trp Leu Phe Asn Gln Leu Lys Asp Tyr Gly Tyr
325 330 335
Phe Ala His Asn Asn Val Tyr Lys Cys Asn Asn Ser Asn Ile His Gln
340 345 350
Thr Val Leu Asn Ala Tyr Arg Pro Pro Lys Ile Ser Gly Arg Leu Trp
355 360 365
Ser Gln Val Val Leu Ile Cys Pro Met Arg Leu Phe Ile Asn Thr Asp
370 375 380
Cys Arg Ile Lys Val Phe Asn Thr Ser Thr Val Met Met Gly Ala Glu
385 390 395 400
Ala Arg Leu Ile Gln Val Gly Ser Asp Ile Tyr Leu Tyr Gln Arg Ser
405 410 415
Ser Ser Trp Trp Val Val Gly Leu Thr Tyr Lys Leu Asp Phe Gln Glu
420 425 430
Leu Ser Ser Lys Thr Gly Asn Ile Leu Asn Asn Val Ser Pro Ile Ala
435 440 445
His Ala Lys Phe Pro Arg Pro Ser Tyr Ser Arg Asp Ala Cys Ala Arg
450 455 460
Pro Asn Ile Cys Pro Ala Val Cys Val Ser Gly Val Tyr Gln Asp Ile
465 470 475 480
Trp Pro Ile Ser Thr Ala His Asn Leu Ser Gln Val Val Trp Val Gly
485 490 495
Gln Tyr Leu Glu Ala Phe Tyr Ala Arg Lys Asp Pro Trp Ile Gly Ile
500 505 510
Ala Thr Gln Tyr Asp Trp Lys Lys Asn Val Arg Leu Phe Asn Ala Asn
515 520 525
Thr Glu Gly Gly Tyr Ser Thr Thr Thr Cys Phe Arg Asn Thr Lys Arg
530 535 540
Asp Lys Ala Phe Cys Val Ile Ile Ser Glu Tyr Ala Asp Gly Val Phe
545 550 555 560
Gly Ser Tyr Arg Ile Val Pro Gln Leu Ile Glu Ile Arg Thr Thr Ser
565 570 575
Lys Lys Gly Leu Pro Ser
580
<210> 89
<211> 610
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒鹅/岛根/67/2000（Avian paramyxovirus goose/Shimane/67/2000）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 89
Met Gln Pro Gly Ile Ser Glu Val Ser Phe Val Asn Asp Glu Arg Ser
1 5 10 15
Glu Arg Gly Thr Trp Arg Leu Leu Phe Arg Ile Leu Thr Ile Val Leu
20 25 30
Cys Leu Thr Ser Ile Gly Ile Gly Ile Pro Ala Leu Ile Tyr Ser Lys
35 40 45
Glu Ala Ala Thr Ser Gly Asp Ile Asp Lys Ser Leu Glu Ala Val Lys
50 55 60
Thr Gly Met Ser Thr Leu Ser Ser Lys Ile Asp Glu Ser Ile Asn Thr
65 70 75 80
Glu Gln Lys Ile Tyr Arg Gln Val Ile Leu Glu Ala Pro Val Ser Gln
85 90 95
Leu Asn Met Glu Ser Asn Ile Leu Ser Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr
100 105 110
Gln Ile Asp Gly Thr Ser Asn Ser Ser Gly Cys Gly Ser Pro Met His
115 120 125
Asp Gln Asp Phe Val Gly Gly Ile Asn Lys Glu Ile Trp Thr Thr Asp
130 135 140
Asn Val Asn Leu Gly Glu Ile Thr Leu Thr Pro Phe Leu Glu His Leu
145 150 155 160
Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Asn Gly Cys Thr Arg Ile Pro
165 170 175
Ser Phe Asp Leu Gly Leu Thr His Trp Cys Tyr Thr His Asn Val Ile
180 185 190
Leu Ser Gly Cys Gln Asp Tyr Ser Ser Ser Phe Gln Tyr Ile Ala Leu
195 200 205
Gly Val Leu Lys Ile Ser Ala Thr Gly His Val Phe Leu Ser Thr Met
210 215 220
Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Glu Arg Asn Arg Lys Ser Cys Ser Ile
225 230 235 240
Ser Ala Thr Ser Ile Gly Cys Asp Ile Ile Cys Ser Leu Val Thr Glu
245 250 255
Arg Glu Val Asp Asp Tyr Asn Ser Pro Ala Ala Thr Pro Met Ile His
260 265 270
Gly Arg Leu Asp Phe Ser Gly Lys Tyr Asn Glu Val Asp Leu Asn Val
275 280 285
Gly Gln Leu Phe Gly Asp Trp Ser Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Phe Leu Asn Gly Arg Val Trp Phe Pro Ile Tyr Gly Gly Val
305 310 315 320
Lys Glu Gly Thr Pro Thr Phe Lys Glu Asn Asp Gly Arg Tyr Ala Ile
325 330 335
Tyr Thr Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Ser Glu Ser Glu Gln Val
340 345 350
Ser Arg Ala Lys Ser Ser Tyr Arg Pro Ser Tyr Phe Gly Gly Lys Leu
355 360 365
Val Gln Gln Ala Val Leu Ser Ile Lys Ile Asp Asp Thr Leu Gly Leu
370 375 380
Asp Pro Val Leu Thr Ile Ser Asn Asn Ser Ile Thr Leu Met Gly Ala
385 390 395 400
Glu Ser Arg Val Leu Gln Ile Glu Glu Lys Leu Tyr Phe Tyr Gln Arg
405 410 415
Gly Thr Ser Trp Phe Pro Ser Leu Ile Met Tyr Pro Leu Thr Val Asp
420 425 430
Asp Lys Met Val Arg Phe Glu Pro Pro Thr Ile Phe Asp Gln Phe Thr
435 440 445
Arg Pro Gly Asn His Pro Cys Ser Ala Asp Ser Arg Cys Pro Asn Ala
450 455 460
Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Gly Tyr Pro Ile Val Phe His Asn
465 470 475 480
Asn His Ser Ile Ala Ala Val Tyr Gly Met Gln Leu Asn Asp Val Thr
485 490 495
Asn Arg Leu Asn Pro Arg Ser Ala Val Trp Tyr Gly Val Ser Met Ser
500 505 510
Asn Val Ile Arg Val Ser Ser Ser Thr Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr
515 520 525
Ser Thr Cys Phe Lys Val Lys Lys Thr Gln Arg Val Tyr Cys Leu Ser
530 535 540
Ile Gly Glu Ile Gly Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro
545 550 555 560
Leu Leu Leu Glu Val Tyr Ser Glu Lys Gly Lys Ser Leu Lys Ser Ser
565 570 575
Phe Asp Gly Trp Glu Asp Ile Ser Ile Asn Asn Pro Leu Arg Pro Leu
580 585 590
Asp Asn His Arg Val Asp Pro Ile Leu Ile Ser Asn Tyr Thr Ser Ser
595 600 605
Trp Pro
610
<210> 90
<211> 257
<212> PRT
<213> 牛呼吸道合胞病毒（Bovine respiratory syncytial virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 90
Met Ser Asn His Thr His His Leu Lys Phe Lys Thr Leu Lys Arg Ala
1 5 10 15
Trp Lys Ala Ser Lys Tyr Phe Ile Val Gly Leu Ser Cys Leu Tyr Lys
20 25 30
Phe Asn Leu Lys Ser Leu Val Gln Thr Ala Leu Thr Thr Leu Ala Met
35 40 45
Ile Thr Leu Thr Ser Leu Val Ile Thr Ala Ile Ile Tyr Ile Ser Val
50 55 60
Gly Asn Ala Lys Ala Lys Pro Thr Ser Lys Pro Thr Ile Gln Gln Thr
65 70 75 80
Gln Gln Pro Gln Asn His Thr Ser Pro Phe Phe Thr Glu His Asn Tyr
85 90 95
Lys Ser Thr His Thr Ser Ile Gln Ser Thr Thr Leu Ser Gln Leu Pro
100 105 110
Asn Thr Asp Thr Thr Arg Glu Thr Thr Tyr Ser His Ser Ile Asn Glu
115 120 125
Thr Gln Asn Arg Lys Ile Lys Ser Gln Ser Thr Leu Pro Ala Thr Arg
130 135 140
Lys Pro Pro Ile Asn Pro Ser Gly Ser Asn Pro Pro Glu Asn His Gln
145 150 155 160
Asp His Asn Asn Ser Gln Thr Leu Pro Tyr Val Pro Cys Ser Thr Cys
165 170 175
Glu Gly Asn Leu Ala Cys Leu Ser Leu Cys Gln Ile Gly Pro Glu Arg
180 185 190
Ala Pro Ser Arg Ala Pro Thr Ile Thr Leu Lys Lys Thr Pro Lys Pro
195 200 205
Lys Thr Thr Lys Lys Pro Thr Lys Thr Thr Ile His His Arg Thr Ser
210 215 220
Pro Glu Ala Lys Leu Gln Pro Lys Asn Asn Thr Ala Ala Pro Gln Gln
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ser Ser Pro Glu His His Thr Asn Gln Ser Thr Thr Gln
245 250 255
Ile
<210> 91
<211> 595
<212> PRT
<213> 梅南高病毒（Menangle virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着蛋白
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着蛋白
<400> 91
Met Trp Asn Ser Ile Pro Gln Leu Val Ser Asp His Glu Glu Ala Lys
1 5 10 15
Gly Lys Phe Thr Asp Ile Pro Leu Gln Asp Asp Thr Asp Ser Gln His
20 25 30
Pro Ser Gly Ser Lys Ser Thr Cys Arg Thr Leu Phe Arg Thr Val Ser
35 40 45
Ile Ile Leu Ser Leu Val Ile Leu Val Leu Gly Val Thr Ser Thr Met
50 55 60
Phe Ser Ala Lys Tyr Ser Gly Gly Cys Ala Thr Asn Ser Gln Leu Leu
65 70 75 80
Gly Val Ser Asn Leu Ile Asn Gln Ile Gln Lys Ser Ile Asp Ser Leu
85 90 95
Ile Ser Glu Val Asn Gln Val Ser Ile Thr Thr Ala Val Thr Leu Pro
100 105 110
Ile Lys Ile Met Asp Phe Gly Lys Ser Val Thr Asp Gln Val Thr Gln
115 120 125
Met Ile Arg Gln Cys Asn Thr Val Cys Lys Gly Pro Gly Gln Lys Pro
130 135 140
Gly Ser Gln Asn Val Arg Ile Met Pro Ser Asn Asn Leu Ser Thr Phe
145 150 155 160
Gln Asn Ile Asn Met Ser Ala Arg Gly Ile Ala Tyr Gln Asp Val Pro
165 170 175
Leu Thr Phe Val Arg Pro Ile Lys Asn Pro Gln Ser Cys Ser Arg Phe
180 185 190
Pro Ser Tyr Ser Val Ser Phe Gly Val His Cys Phe Ala Asn Ala Val
195 200 205
Thr Asp Gln Thr Cys Glu Leu Asn Gln Asn Thr Phe Tyr Arg Val Val
210 215 220
Leu Ser Val Ser Lys Gly Asn Ile Ser Asp Pro Ser Ser Leu Glu Thr
225 230 235 240
Lys Ala Glu Thr Arg Thr Pro Lys Gly Thr Pro Val Arg Thr Cys Ser
245 250 255
Ile Ile Ser Ser Val Tyr Gly Cys Tyr Leu Leu Cys Ser Lys Ala Thr
260 265 270
Val Pro Glu Ser Glu Glu Met Lys Thr Ile Gly Phe Ser Gln Met Phe
275 280 285
Ile Leu Tyr Leu Ser Met Asp Ser Lys Arg Ile Ile Tyr Asp Asn Ile
290 295 300
Val Ser Ser Thr Ser Ala Ile Trp Ser Gly Leu Tyr Pro Gly Glu Gly
305 310 315 320
Ala Gly Ile Trp His Met Gly Gln Leu Phe Phe Pro Leu Trp Gly Gly
325 330 335
Ile Pro Phe Leu Thr Pro Leu Gly Gln Lys Ile Leu Asn Ser Thr Leu
340 345 350
Asp Ile Pro Glu Val Gly Ser Lys Cys Lys Ser Asp Leu Thr Ser Asn
355 360 365
Pro Ala Lys Thr Lys Asp Met Leu Phe Ser Pro Tyr Tyr Gly Glu Asn
370 375 380
Val Met Val Phe Gly Phe Leu Thr Cys Tyr Leu Leu Ser Asn Val Pro
385 390 395 400
Thr Asn Cys His Ala Asp Tyr Leu Asn Ser Thr Val Leu Gly Phe Gly
405 410 415
Ser Lys Ala Gln Phe Tyr Asp Tyr Arg Gly Ile Val Tyr Met Tyr Ile
420 425 430
Gln Ser Ala Gly Trp Tyr Pro Phe Thr Gln Ile Phe Arg Ile Thr Leu
435 440 445
Gln Leu Lys Gln Asn Arg Leu Gln Ala Lys Ser Ile Lys Arg Ile Glu
450 455 460
Val Thr Ser Thr Thr Arg Pro Gly Asn Arg Glu Cys Ser Val Leu Arg
465 470 475 480
Asn Cys Pro Tyr Ile Cys Ala Thr Gly Leu Phe Gln Val Pro Trp Ile
485 490 495
Val Asn Ser Asp Ala Ile Thr Ser Lys Glu Val Asp Asn Met Val Phe
500 505 510
Val Gln Ala Trp Ala Ala Asp Phe Thr Glu Phe Arg Lys Gly Ile Leu
515 520 525
Ser Leu Cys Ser Gln Val Ser Cys Pro Ile Asn Asp Leu Leu Ser Lys
530 535 540
Asp Asn Ser Tyr Met Arg Asp Thr Thr Thr Tyr Cys Phe Pro Gln Thr
545 550 555 560
Val Pro Asn Ile Leu Ser Cys Thr Ser Phe Val Glu Trp Gly Gly Asp
565 570 575
Ser Gly Asn Pro Ile Asn Ile Leu Glu Ile His Tyr Glu Val Ile Phe
580 585 590
Val Ala Ser
595
<210> 92
<211> 574
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒5（Avian paramyxovirus 5）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 92
Met Asp Lys Ser Tyr Tyr Thr Glu Pro Glu Asp Gln Arg Gly Asn Ser
1 5 10 15
Arg Thr Trp Arg Leu Leu Phe Arg Leu Ile Val Leu Thr Leu Leu Cys
20 25 30
Leu Ile Ala Cys Thr Ser Val Ser Gln Leu Phe Tyr Pro Trp Leu Pro
35 40 45
Gln Val Leu Ser Thr Leu Ile Ser Leu Asn Ser Ser Ile Ile Thr Ser
50 55 60
Ser Asn Gly Leu Lys Lys Glu Ile Leu Asn Gln Asn Ile Lys Glu Asp
65 70 75 80
Leu Ile Tyr Arg Glu Val Ala Ile Asn Ile Pro Leu Thr Leu Asp Arg
85 90 95
Val Thr Val Glu Val Gly Thr Ala Val Asn Gln Ile Thr Asp Ala Leu
100 105 110
Arg Gln Leu Gln Ser Val Asn Gly Ser Ala Ala Phe Ala Leu Ser Asn
115 120 125
Ser Pro Asp Tyr Ser Gly Gly Ile Glu His Leu Val Phe Gln Arg Asn
130 135 140
Thr Leu Ile Asn Arg Ser Val Ser Val Ser Asp Leu Ile Glu His Pro
145 150 155 160
Ser Phe Ile Pro Thr Pro Thr Thr Gln His Gly Cys Thr Arg Ile Pro
165 170 175
Thr Phe His Leu Gly Thr Arg His Trp Cys Tyr Ser His Asn Ile Ile
180 185 190
Gly Gln Gly Cys Ala Asp Ser Gly Ala Ser Met Met Tyr Ile Ser Met
195 200 205
Gly Ala Leu Gly Val Ser Ser Leu Gly Thr Pro Thr Phe Thr Thr Ser
210 215 220
Ala Thr Ser Ile Leu Ser Asp Ser Leu Asn Arg Lys Ser Cys Ser Ile
225 230 235 240
Val Ala Thr Thr Glu Gly Cys Asp Val Leu Cys Ser Ile Val Thr Gln
245 250 255
Thr Glu Asp Gln Asp Tyr Ala Asp His Thr Pro Thr Pro Met Ile His
260 265 270
Gly Arg Leu Trp Phe Asn Gly Thr Tyr Thr Glu Arg Ser Leu Ser Gln
275 280 285
Ser Leu Phe Leu Gly Thr Trp Ala Ala Gln Tyr Pro Ala Val Gly Ser
290 295 300
Gly Ile Met Thr Pro Gly Arg Val Ile Phe Pro Phe Tyr Gly Gly Val
305 310 315 320
Ile Pro Asn Ser Pro Leu Phe Leu Asp Leu Glu Arg Phe Ala Leu Phe
325 330 335
Thr His Asn Gly Asp Leu Glu Cys Arg Asn Leu Thr Gln Tyr Gln Lys
340 345 350
Glu Ala Ile Tyr Ser Ala Tyr Lys Pro Pro Lys Ile Arg Gly Ser Leu
355 360 365
Trp Ala Gln Gly Phe Ile Val Cys Ser Val Gly Asp Met Gly Asn Cys
370 375 380
Ser Leu Lys Val Ile Asn Thr Ser Thr Val Met Met Gly Ala Glu Gly
385 390 395 400
Arg Leu Gln Leu Val Gly Asp Ser Val Met Tyr Tyr Gln Arg Ser Ser
405 410 415
Ser Trp Trp Pro Val Gly Ile Leu Tyr Arg Leu Ser Leu Val Asp Ile
420 425 430
Ile Ala Arg Asp Ile Gln Val Val Ile Asn Ser Glu Pro Leu Pro Leu
435 440 445
Ser Lys Phe Pro Arg Pro Thr Trp Thr Pro Gly Val Cys Gln Lys Pro
450 455 460
Asn Val Cys Pro Ala Val Cys Val Thr Gly Val Tyr Gln Asp Leu Trp
465 470 475 480
Ala Ile Ser Ala Gly Glu Thr Leu Ser Glu Met Thr Phe Phe Gly Gly
485 490 495
Tyr Leu Glu Ala Ser Thr Gln Arg Lys Asp Pro Trp Ile Gly Val Ala
500 505 510
Asn Gln Tyr Ser Trp Phe Met Arg Arg Arg Leu Phe Lys Thr Ser Thr
515 520 525
Glu Ala Ala Tyr Ser Ser Ser Thr Cys Phe Arg Asn Thr Arg Leu Asp
530 535 540
Arg Asn Phe Cys Leu Leu Ile Phe Glu Leu Thr Asp Asn Leu Leu Gly
545 550 555 560
Asp Trp Arg Ile Val Pro Leu Leu Phe Glu Leu Thr Ile Val
565 570
<210> 93
<211> 622
<212> PRT
<213> 松湾病毒（Cedar virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 93
Met Leu Ser Gln Leu Gln Lys Asn Tyr Leu Asp Asn Ser Asn Gln Gln
1 5 10 15
Gly Asp Lys Met Asn Asn Pro Asp Lys Lys Leu Ser Val Asn Phe Asn
20 25 30
Pro Leu Glu Leu Asp Lys Gly Gln Lys Asp Leu Asn Lys Ser Tyr Tyr
35 40 45
Val Lys Asn Lys Asn Tyr Asn Val Ser Asn Leu Leu Asn Glu Ser Leu
50 55 60
His Asp Ile Lys Phe Cys Ile Tyr Cys Ile Phe Ser Leu Leu Ile Ile
65 70 75 80
Ile Thr Ile Ile Asn Ile Ile Thr Ile Ser Ile Val Ile Thr Arg Leu
85 90 95
Lys Val His Glu Glu Asn Asn Gly Met Glu Ser Pro Asn Leu Gln Ser
100 105 110
Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Leu Thr Asn Met Ile Asn Thr Glu Ile
115 120 125
Thr Pro Arg Ile Gly Ile Leu Val Thr Ala Thr Ser Val Thr Leu Ser
130 135 140
Ser Ser Ile Asn Tyr Val Gly Thr Lys Thr Asn Gln Leu Val Asn Glu
145 150 155 160
Leu Lys Asp Tyr Ile Thr Lys Ser Cys Gly Phe Lys Val Pro Glu Leu
165 170 175
Lys Leu His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Ala Asp Pro Lys Ile Ser Lys
180 185 190
Ser Ala Met Tyr Ser Thr Asn Ala Tyr Ala Glu Leu Ala Gly Pro Pro
195 200 205
Lys Ile Phe Cys Lys Ser Val Ser Lys Asp Pro Asp Phe Arg Leu Lys
210 215 220
Gln Ile Asp Tyr Val Ile Pro Val Gln Gln Asp Arg Ser Ile Cys Met
225 230 235 240
Asn Asn Pro Leu Leu Asp Ile Ser Asp Gly Phe Phe Thr Tyr Ile His
245 250 255
Tyr Glu Gly Ile Asn Ser Cys Lys Lys Ser Asp Ser Phe Lys Val Leu
260 265 270
Leu Ser His Gly Glu Ile Val Asp Arg Gly Asp Tyr Arg Pro Ser Leu
275 280 285
Tyr Leu Leu Ser Ser His Tyr His Pro Tyr Ser Met Gln Val Ile Asn
290 295 300
Cys Val Pro Val Thr Cys Asn Gln Ser Ser Phe Val Phe Cys His Ile
305 310 315 320
Ser Asn Asn Thr Lys Thr Leu Asp Asn Ser Asp Tyr Ser Ser Asp Glu
325 330 335
Tyr Tyr Ile Thr Tyr Phe Asn Gly Ile Asp Arg Pro Lys Thr Lys Lys
340 345 350
Ile Pro Ile Asn Asn Met Thr Ala Asp Asn Arg Tyr Ile His Phe Thr
355 360 365
Phe Ser Gly Gly Gly Gly Val Cys Leu Gly Glu Glu Phe Ile Ile Pro
370 375 380
Val Thr Thr Val Ile Asn Thr Asp Val Phe Thr His Asp Tyr Cys Glu
385 390 395 400
Ser Phe Asn Cys Ser Val Gln Thr Gly Lys Ser Leu Lys Glu Ile Cys
405 410 415
Ser Glu Ser Leu Arg Ser Pro Thr Asn Ser Ser Arg Tyr Asn Leu Asn
420 425 430
Gly Ile Met Ile Ile Ser Gln Asn Asn Met Thr Asp Phe Lys Ile Gln
435 440 445
Leu Asn Gly Ile Thr Tyr Asn Lys Leu Ser Phe Gly Ser Pro Gly Arg
450 455 460
Leu Ser Lys Thr Leu Gly Gln Val Leu Tyr Tyr Gln Ser Ser Met Ser
465 470 475 480
Trp Asp Thr Tyr Leu Lys Ala Gly Phe Val Glu Lys Trp Lys Pro Phe
485 490 495
Thr Pro Asn Trp Met Asn Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Asn Gln Gly
500 505 510
Asn Cys Pro Arg Tyr His Lys Cys Pro Glu Ile Cys Tyr Gly Gly Thr
515 520 525
Tyr Asn Asp Ile Ala Pro Leu Asp Leu Gly Lys Asp Met Tyr Val Ser
530 535 540
Val Ile Leu Asp Ser Asp Gln Leu Ala Glu Asn Pro Glu Ile Thr Val
545 550 555 560
Phe Asn Ser Thr Thr Ile Leu Tyr Lys Glu Arg Val Ser Lys Asp Glu
565 570 575
Leu Asn Thr Arg Ser Thr Thr Thr Ser Cys Phe Leu Phe Leu Asp Glu
580 585 590
Pro Trp Cys Ile Ser Val Leu Glu Thr Asn Arg Phe Asn Gly Lys Ser
595 600 605
Ile Arg Pro Glu Ile Tyr Ser Tyr Lys Ile Pro Lys Tyr Cys
610 615 620
<210> 94
<211> 595
<212> PRT
<213> 特维奥特病毒（teviot virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着蛋白
<400> 94
Met Trp Ser Thr Gln Ala Ser Lys His Pro Ala Met Val Asn Ser Ala
1 5 10 15
Thr Asn Leu Val Asp Ile Pro Leu Asp His Pro Ser Ser Ala Gln Phe
20 25 30
Pro Ile Asn Arg Lys Arg Thr Gly Arg Leu Ile Tyr Arg Leu Phe Ser
35 40 45
Ile Leu Cys Asn Leu Ile Leu Ile Ser Ile Leu Ile Ser Leu Val Val
50 55 60
Ile Trp Ser Arg Ser Ser Arg Asp Cys Ala Lys Ser Asp Gly Leu Ser
65 70 75 80
Ser Val Asp Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ser Arg Ser Ile Asn Ser Leu
85 90 95
Ile Thr Glu Val Asn Gln Ile Ser Val Thr Thr Ala Ile Asn Leu Pro
100 105 110
Ile Lys Leu Ser Glu Phe Gly Lys Ser Val Val Asp Gln Val Thr Gln
115 120 125
Met Ile Arg Gln Cys Asn Ala Ala Cys Lys Gly Pro Gly Glu Lys Pro
130 135 140
Gly Ile Gln Asn Val Arg Ile Asn Ile Pro Asn Asn Phe Ser Thr Tyr
145 150 155 160
Ser Glu Leu Asn Arg Thr Ala Asn Ser Leu Asn Phe Gln Ser Arg Thr
165 170 175
Ala Leu Phe Ala Arg Pro Asn Pro Tyr Pro Lys Thr Cys Ser Arg Phe
180 185 190
Pro Ser Tyr Ser Val Tyr Phe Gly Ile His Cys Phe Ser His Ala Val
195 200 205
Thr Asp Ser Ser Cys Glu Leu Ser Asp Ser Thr Tyr Tyr Arg Leu Val
210 215 220
Ile Gly Val Ala Asp Lys Asn Leu Ser Asp Pro Ala Asp Val Lys Tyr
225 230 235 240
Ile Gly Glu Thr Thr Thr Pro Val Arg Val Gln Thr Arg Gly Cys Ser
245 250 255
Val Val Ser Ser Ile Tyr Gly Cys Tyr Leu Leu Cys Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Asp Tyr Gln Asp Asp Phe Arg Glu Gln Gly Phe His Gln Met Phe
275 280 285
Ile Leu Phe Leu Ser Arg Glu Leu Lys Thr Thr Phe Phe Asp Asp Met
290 295 300
Val Ser Ser Thr Thr Val Thr Trp Asn Gly Leu Tyr Pro Gly Glu Gly
305 310 315 320
Ser Gly Ile Trp His Met Gly His Leu Val Phe Pro Leu Trp Gly Gly
325 330 335
Ile Arg Phe Gly Thr His Ala Ser Glu Gly Ile Leu Asn Ser Thr Leu
340 345 350
Glu Leu Pro Pro Val Gly Pro Ser Cys Lys Arg Ser Leu Ala Asp Asn
355 360 365
Gly Leu Ile Asn Lys Asp Val Leu Phe Ser Pro Tyr Phe Gly Asp Ser
370 375 380
Val Met Val Phe Ala Tyr Leu Ser Cys Tyr Met Leu Ser Asn Val Pro
385 390 395 400
Thr His Cys Gln Val Glu Thr Met Asn Ser Ser Val Leu Gly Phe Gly
405 410 415
Ser Arg Ala Gln Phe Tyr Asp Leu Lys Gly Ile Val Tyr Leu Tyr Ile
420 425 430
Gln Ser Ala Gly Trp Phe Ser Tyr Thr Gln Leu Phe Arg Leu Ser Leu
435 440 445
Gln Ser Lys Gly Tyr Lys Leu Ser Val Lys Gln Ile Lys Arg Ile Pro
450 455 460
Ile Ser Ser Thr Ser Arg Pro Gly Thr Glu Pro Cys Asp Ile Ile His
465 470 475 480
Asn Cys Pro Tyr Thr Cys Ala Thr Gly Leu Phe Gln Ala Pro Trp Ile
485 490 495
Val Asn Gly Asp Ser Ile Arg Asp Arg Asp Val Arg Asn Met Ala Phe
500 505 510
Val Gln Ala Trp Ser Gly Ala Ile Asn Thr Phe Gln Arg Pro Phe Met
515 520 525
Ser Ile Cys Ser Gln Tyr Ser Cys Pro Leu Ser Glu Leu Leu Asp Ser
530 535 540
Glu Ser Ser Ile Met Arg Ser Thr Thr Thr Tyr Cys Phe Pro Ser Leu
545 550 555 560
Thr Glu Ser Ile Leu Gln Cys Val Ser Phe Ile Glu Trp Gly Gly Pro
565 570 575
Val Gly Asn Pro Ile Ser Ile Asn Glu Val Tyr Ser Ser Ile Ser Phe
580 585 590
Arg Pro Asp
595
<210> 95
<211> 632
<212> PRT
<213> 莫斯曼病毒（Mossman virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 95
Met Val Asp Pro Pro Ala Val Ser Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Arg Asn
1 5 10 15
Asp Arg Val Lys Val Val Thr Thr Gln Ser Thr Asn Pro Tyr Trp Ala
20 25 30
His Asn Pro Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Ile Asp Met Val Val Asn
35 40 45
Val Ile Met Val Thr Gly Val Ile Phe Ala Leu Ile Asn Ile Ile Leu
50 55 60
Gly Ile Val Ile Ile Ser Gln Ser Ala Gly Ser Arg Gln Asp Thr Ser
65 70 75 80
Lys Ser Leu Asp Ile Ile Gln His Val Asp Ser Ser Val Ala Ile Thr
85 90 95
Lys Gln Ile Val Met Glu Asn Leu Glu Pro Lys Ile Arg Ser Ile Leu
100 105 110
Asp Ser Val Ser Phe Gln Ile Pro Lys Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly
115 120 125
Pro Gly Lys Thr Asp Pro Pro Ile Ala Leu Pro Thr Lys Ala Ser Thr
130 135 140
Pro Val Ile Pro Thr Glu Tyr Pro Ser Leu Asn Thr Thr Thr Cys Leu
145 150 155 160
Arg Ile Glu Glu Ser Val Thr Gln Asn Ala Ala Ala Leu Phe Asn Ile
165 170 175
Ser Phe Asp Leu Lys Thr Val Met Tyr Glu Leu Val Thr Arg Thr Gly
180 185 190
Gly Cys Val Thr Leu Pro Ser Tyr Ser Glu Leu Tyr Thr Arg Val Arg
195 200 205
Thr Phe Ser Thr Ala Ile Arg Asn Pro Lys Thr Cys Gln Arg Ala Gly
210 215 220
Gln Glu Thr Asp Leu Asn Leu Ile Pro Ala Phe Ile Gly Thr Asp Thr
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ile Asn Ser Cys Val Arg Gln Pro Val Ile Ala Thr Gly
245 250 255
Asp Gly Ile Tyr Ala Leu Thr Tyr Leu Thr Met Arg Gly Thr Cys Gln
260 265 270
Asp His Arg His Ala Val Arg His Phe Glu Ile Gly Leu Val Arg Arg
275 280 285
Asp Ala Trp Trp Asp Pro Val Leu Thr Pro Ile His His Phe Thr Glu
290 295 300
Pro Gly Thr Pro Val Phe Asp Gly Cys Ser Leu Thr Val Gln Asn Gln
305 310 315 320
Thr Ala Leu Ala Leu Cys Thr Leu Thr Thr Asp Gly Pro Glu Thr Asp
325 330 335
Ile His Asn Gly Ala Ser Leu Gly Leu Ala Leu Val His Phe Asn Ile
340 345 350
Arg Gly Glu Phe Ser Lys His Lys Val Asp Pro Arg Asn Ile Asp Thr
355 360 365
Gln Asn Gln Gly Leu His Leu Val Thr Thr Ala Gly Lys Ser Ala Val
370 375 380
Lys Lys Gly Ile Leu Tyr Ser Phe Gly Tyr Met Val Thr Arg Ser Pro
385 390 395 400
Glu Pro Gly Asp Ser Lys Cys Val Thr Glu Glu Cys Asn Gln Asn Asn
405 410 415
Gln Glu Lys Cys Asn Ala Tyr Ser Lys Thr Thr Leu Asp Pro Asp Lys
420 425 430
Pro Arg Ser Met Ile Ile Phe Gln Ile Asp Val Gly Ala Glu Tyr Phe
435 440 445
Thr Val Asp Lys Val Val Val Val Pro Arg Thr Gln Tyr Tyr Gln Leu
450 455 460
Thr Ser Gly Asp Leu Phe Tyr Thr Gly Glu Glu Asn Asp Leu Leu Tyr
465 470 475 480
Gln Leu His Asn Lys Gly Trp Tyr Asn Lys Pro Ile Arg Gly Arg Val
485 490 495
Thr Phe Asp Gly Gln Val Thr Leu His Glu His Ser Arg Thr Tyr Asp
500 505 510
Ser Leu Ser Asn Gln Arg Ala Cys Asn Pro Arg Leu Gly Cys Pro Ser
515 520 525
Thr Cys Glu Leu Thr Ser Met Ala Ser Tyr Phe Pro Leu Asp Lys Asp
530 535 540
Phe Lys Ala Ala Val Gly Val Ile Ala Leu Arg Asn Gly Met Thr Pro
545 550 555 560
Ile Ile Thr Tyr Ser Thr Asp Asp Trp Arg Asn His Trp Lys Tyr Ile
565 570 575
Lys Asn Ala Asp Leu Glu Phe Ser Glu Ser Ser Leu Ser Cys Tyr Ser
580 585 590
Pro Asn Pro Pro Leu Asp Asp Tyr Val Leu Cys Thr Ala Val Ile Thr
595 600 605
Ala Lys Val Met Ser Asn Thr Asn Pro Gln Leu Leu Ala Thr Ser Trp
610 615 620
Tyr Gln Tyr Asp Lys Cys His Thr
625 630
<210> 96
<211> 709
<212> PRT
<213> J-病毒（J-virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 96
Met Asn Pro Val Ala Met Ser Asn Phe Tyr Gly Ile Asn Gln Ala Asp
1 5 10 15
His Leu Arg Glu Lys Gly Asp Gln Pro Glu Lys Gly Pro Ser Val Leu
20 25 30
Thr Tyr Val Ser Leu Ile Thr Gly Leu Leu Ser Leu Phe Thr Ile Ile
35 40 45
Ala Leu Asn Val Thr Asn Ile Ile Tyr Leu Thr Gly Ser Gly Gly Thr
50 55 60
Met Ala Thr Ile Lys Asp Asn Gln Gln Ser Met Ser Gly Ser Met Arg
65 70 75 80
Asp Ile Ser Gly Met Leu Val Glu Asp Leu Lys Pro Lys Thr Asp Leu
85 90 95
Ile Asn Ser Met Val Ser Tyr Thr Ile Pro Ser Gln Ile Ser Ala Met
100 105 110
Ser Ala Met Ile Lys Asn Glu Val Leu Arg Gln Cys Thr Pro Ser Phe
115 120 125
Met Phe Asn Asn Thr Ile Cys Pro Ile Ala Glu His Pro Val His Thr
130 135 140
Ser Tyr Phe Glu Glu Val Gly Ile Glu Ala Ile Ser Met Cys Thr Gly
145 150 155 160
Thr Asn Arg Lys Leu Val Val Asn Gln Gly Ile Asn Phe Val Glu Tyr
165 170 175
Pro Ser Phe Ile Pro Gly Ser Thr Lys Pro Gly Gly Cys Val Arg Leu
180 185 190
Pro Ser Phe Ser Leu Gly Leu Glu Val Phe Ala Tyr Ala His Ala Ile
195 200 205
Thr Gln Asp Asp Cys Thr Ser Ser Ser Thr Pro Asp Tyr Tyr Phe Ser
210 215 220
Val Gly Arg Ile Ala Asp His Gly Thr Asp Val Pro Val Phe Glu Thr
225 230 235 240
Leu Ala Glu Trp Phe Leu Asp Asp Lys Met Asn Arg Arg Ser Cys Ser
245 250 255
Val Thr Ala Ala Gly Lys Gly Gly Trp Leu Gly Cys Ser Ile Leu Val
260 265 270
Gly Ser Phe Thr Asp Glu Leu Thr Ser Pro Glu Val Asn Arg Ile Ser
275 280 285
Leu Ser Tyr Met Asp Thr Phe Gly Lys Lys Lys Asp Trp Leu Tyr Thr
290 295 300
Gly Ser Glu Val Arg Ala Asp Gln Ser Trp Ser Ala Leu Phe Phe Ser
305 310 315 320
Val Gly Ser Gly Val Val Ile Gly Asp Thr Val Tyr Phe Leu Val Trp
325 330 335
Gly Gly Leu Asn His Pro Ile Asn Val Asp Ala Met Cys Arg Ala Pro
340 345 350
Gly Cys Gln Ser Pro Thr Gln Ser Leu Cys Asn Tyr Ala Ile Lys Pro
355 360 365
Gln Glu Trp Gly Gly Asn Gln Ile Val Asn Gly Ile Leu His Phe Lys
370 375 380
His Asp Thr Asn Glu Lys Pro Thr Leu His Val Arg Thr Leu Ser Pro
385 390 395 400
Asp Asn Asn Trp Met Gly Ala Glu Gly Arg Leu Phe His Phe His Asn
405 410 415
Ser Gly Lys Thr Phe Ile Tyr Thr Arg Ser Ser Thr Trp His Thr Leu
420 425 430
Pro Gln Val Gly Ile Leu Thr Leu Gly Trp Pro Leu Ser Val Gln Trp
435 440 445
Val Asp Ile Thr Ser Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Pro Cys Glu Tyr
450 455 460
Asp Asn Arg Cys Pro His Gln Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Leu
465 470 475 480
Phe Pro Leu Gly Val Ser Tyr Glu Tyr Ser Val Thr Ala Tyr Leu Asp
485 490 495
Gln Val Gln Ser Arg Met Asn Pro Lys Ile Ala Leu Val Gly Ala Gln
500 505 510
Glu Lys Ile Tyr Glu Lys Thr Ile Thr Thr Asn Thr Gln His Ala Asp
515 520 525
Tyr Thr Thr Thr Ser Cys Phe Ala Tyr Lys Leu Arg Val Trp Cys Val
530 535 540
Ser Ile Val Glu Met Ser Pro Gly Val Ile Thr Thr Arg Gln Pro Val
545 550 555 560
Pro Phe Leu Tyr His Leu Asn Leu Gly Cys Gln Asp Thr Ser Thr Gly
565 570 575
Ser Leu Thr Pro Leu Asp Ala His Gly Gly Thr Tyr Leu Asn Thr Asp
580 585 590
Pro Val Gly Asn Lys Val Asp Cys Tyr Phe Val Leu His Glu Gly Gln
595 600 605
Ile Tyr Phe Gly Met Ser Val Gly Pro Ile Asn Tyr Thr Tyr Ser Ile
610 615 620
Val Gly Arg Ser Arg Glu Ile Gly Ala Asn Met Asn Val Ser Leu Asn
625 630 635 640
Gln Leu Cys His Ser Val Tyr Thr Glu Phe Leu Lys Glu Lys Glu His
645 650 655
Pro Gly Thr Arg Asn Asn Ile Asp Val Glu Gly Trp Leu Leu Lys Arg
660 665 670
Ile Glu Thr Leu Asn Gly Thr Lys Ile Phe Gly Leu Asp Asp Leu Glu
675 680 685
Gly Ser Gly Pro Gly His Gln Ser Gly Pro Glu Asp Pro Ser Ile Ala
690 695 700
Pro Ile Gly His Asn
705
<210> 97
<211> 264
<212> PRT
<213> 禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 97
Met Glu Val Lys Val Glu Asn Val Gly Lys Ser Gln Glu Leu Lys Val
1 5 10 15
Lys Val Lys Asn Phe Ile Lys Arg Ser Asp Cys Lys Lys Lys Leu Phe
20 25 30
Ala Leu Ile Leu Gly Leu Val Ser Phe Glu Leu Thr Met Asn Ile Met
35 40 45
Leu Ser Val Met Tyr Val Glu Ser Asn Glu Ala Leu Ser Leu Cys Arg
50 55 60
Ile Gln Gly Thr Pro Ala Pro Arg Asp Asn Lys Thr Asn Thr Glu Asn
65 70 75 80
Ala Thr Lys Glu Thr Thr Leu His Thr Thr Thr Thr Thr Arg Asp Pro
85 90 95
Glu Val Arg Glu Thr Lys Thr Thr Lys Pro Gln Ala Asn Glu Gly Ala
100 105 110
Thr Asn Pro Ser Arg Asn Leu Thr Thr Lys Gly Asp Lys His Gln Thr
115 120 125
Thr Arg Ala Thr Thr Glu Ala Glu Leu Glu Lys Gln Ser Lys Gln Thr
130 135 140
Thr Glu Pro Gly Thr Ser Thr Gln Lys His Thr Pro Ala Arg Pro Ser
145 150 155 160
Ser Lys Ser Pro Thr Thr Thr Gln Ala Thr Ala Gln Pro Thr Thr Pro
165 170 175
Thr Ala Pro Lys Ala Ser Thr Ala Pro Lys Asn Arg Gln Ala Thr Thr
180 185 190
Lys Lys Thr Glu Thr Asp Thr Thr Thr Ala Ser Arg Ala Arg Asn Thr
195 200 205
Asn Asn Pro Thr Glu Thr Ala Thr Thr Thr Pro Lys Ala Thr Thr Glu
210 215 220
Thr Gly Lys Gly Lys Glu Gly Pro Thr Gln His Thr Thr Lys Glu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Thr Thr Ala Arg Glu Thr Thr Thr Pro Gln Pro Arg Arg Thr
245 250 255
Ala Gly Ala Ser Pro Arg Ala Ser
260
<210> 98
<211> 391
<212> PRT
<213> 禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着蛋白
<400> 98
Met Gly Ser Lys Leu Tyr Met Val Gln Gly Thr Ser Ala Tyr Gln Thr
1 5 10 15
Ala Val Gly Phe Trp Leu Asp Ile Gly Arg Arg Tyr Ile Leu Ala Ile
20 25 30
Val Leu Ser Ala Phe Gly Leu Thr Cys Thr Val Thr Ile Ala Leu Thr
35 40 45
Val Ser Val Ile Val Glu Gln Ser Val Leu Glu Glu Cys Arg Asn Tyr
50 55 60
Asn Gly Gly Asp Arg Asp Trp Trp Ser Thr Thr Gln Glu Gln Pro Thr
65 70 75 80
Thr Ala Pro Ser Ala Thr Pro Ala Gly Asn Tyr Gly Gly Leu Gln Thr
85 90 95
Ala Arg Thr Arg Lys Ser Glu Ser Cys Leu His Val Gln Ile Ser Tyr
100 105 110
Gly Asp Met Tyr Ser Arg Ser Asp Thr Val Leu Gly Gly Phe Asp Cys
115 120 125
Met Gly Leu Leu Val Leu Cys Lys Ser Gly Pro Ile Cys Gln Arg Asp
130 135 140
Asn Gln Val Asp Pro Thr Ala Leu Cys His Cys Arg Val Asp Leu Ser
145 150 155 160
Ser Val Asp Cys Cys Lys Val Asn Lys Ile Ser Thr Asn Ser Ser Thr
165 170 175
Thr Ser Glu Pro Gln Lys Thr Asn Pro Ala Trp Pro Ser Gln Asp Asn
180 185 190
Thr Asp Ser Asp Pro Asn Pro Gln Gly Ile Thr Thr Ser Thr Ala Thr
195 200 205
Leu Leu Ser Thr Ser Leu Gly Leu Met Leu Thr Ser Lys Thr Gly Thr
210 215 220
His Lys Ser Gly Pro Pro Gln Ala Leu Pro Gly Ser Asn Thr Asn Gly
225 230 235 240
Lys Thr Thr Thr Asp Arg Glu Leu Gly Ser Thr Asn Gln Pro Asn Ser
245 250 255
Thr Thr Asn Gly Gln His Asn Lys His Thr Gln Arg Met Thr Leu Pro
260 265 270
Pro Ser Tyr Asp Asn Thr Arg Thr Ile Leu Gln His Thr Thr Pro Trp
275 280 285
Glu Lys Thr Phe Ser Thr Tyr Lys Pro Thr His Ser Pro Thr Asn Glu
290 295 300
Ser Asp Gln Ser Leu Pro Thr Thr Gln Asn Ser Ile Asn Cys Glu His
305 310 315 320
Phe Asp Pro Gln Gly Lys Glu Lys Ile Cys Tyr Arg Val Gly Ser Tyr
325 330 335
Asn Ser Asn Ile Thr Lys Gln Cys Arg Ile Asp Val Pro Leu Cys Ser
340 345 350
Thr Tyr Asn Thr Val Cys Met Lys Thr Tyr Tyr Thr Glu Pro Phe Asn
355 360 365
Cys Trp Arg Arg Ile Trp Arg Cys Leu Cys Asp Asp Gly Val Gly Leu
370 375 380
Val Glu Trp Cys Cys Thr Ser
385 390
<210> 99
<211> 1052
<212> PRT
<213> 大榄病毒（Tailam virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 99
Met Ser Gln Leu Ala Ala His Asn Leu Ala Met Ser Asn Phe Tyr Gly
1 5 10 15
Ile His Gln Gly Gly Gln Ser Thr Ser Gln Lys Glu Glu Glu Gln Pro
20 25 30
Val Gln Gly Val Ile Arg Tyr Ala Ser Met Ile Val Gly Leu Leu Ser
35 40 45
Leu Phe Thr Ile Ile Ala Leu Asn Val Thr Asn Ile Ile Tyr Met Thr
50 55 60
Glu Ser Gly Gly Thr Met Gln Ser Ile Lys Asn Ala Gln Gly Ser Ile
65 70 75 80
Asp Gly Ser Met Lys Asp Leu Ser Gly Thr Ile Met Glu Asp Ile Lys
85 90 95
Pro Lys Thr Asp Leu Ile Asn Ser Met Val Ser Tyr Asn Ile Pro Ala
100 105 110
Gln Leu Ser Met Ile His Gln Ile Ile Lys Asn Asp Val Leu Lys Gln
115 120 125
Cys Thr Pro Ser Phe Met Phe Asn Asn Thr Ile Cys Pro Leu Ala Glu
130 135 140
Asn Pro Thr His Ser Arg Tyr Phe Glu Glu Val Asn Leu Asp Ser Ile
145 150 155 160
Ser Glu Cys Ser Gly Asn Glu Met Ser Leu Glu Leu Gly Thr Glu Pro
165 170 175
Glu Phe Ile Glu Tyr Pro Ser Phe Ala Pro Gly Ser Thr Lys Pro Gly
180 185 190
Ser Cys Val Arg Leu Pro Ser Phe Ser Leu Ser Ser Thr Val Phe Ala
195 200 205
Tyr Thr His Thr Ile Met Gly His Gly Cys Ser Glu Leu Asp Val Gly
210 215 220
Asp His Tyr Leu Ala Ile Gly Arg Ile Ala Asp Ala Gly His Glu Ile
225 230 235 240
Pro Gln Phe Glu Thr Ile Ser Ser Trp Phe Ile Asn Asp Lys Ile Asn
245 250 255
Arg Arg Ser Cys Thr Val Ala Ala Gly Val Met Glu Thr Trp Met Gly
260 265 270
Cys Val Ile Met Thr Glu Thr Phe Tyr Asp Asp Leu Asp Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Gly Lys Ile Thr Ile Ser Tyr Leu Asp Val Phe Gly Arg Lys Lys
290 295 300
Glu Trp Ile Tyr Thr Arg Ser Glu Ile Leu Tyr Asp Tyr Thr Tyr Thr
305 310 315 320
Ser Val Tyr Phe Ser Ile Gly Ser Gly Val Val Val Gly Asp Thr Val
325 330 335
Tyr Phe Leu Leu Trp Gly Ser Leu Ser Ser Pro Ile Glu Glu Thr Ala
340 345 350
Tyr Cys Tyr Ala Pro Gly Cys Ser Asn Tyr Asn Gln Arg Met Cys Asn
355 360 365
Glu Ala Gln Arg Pro Ala Lys Phe Gly His Arg Gln Met Ala Asn Ala
370 375 380
Ile Leu Arg Phe Lys Thr Asn Ser Met Gly Lys Pro Ser Ile Ser Val
385 390 395 400
Arg Thr Leu Ser Pro Thr Val Ile Pro Phe Gly Thr Glu Gly Arg Leu
405 410 415
Ile Tyr Ser Asp Phe Thr Lys Ile Ile Tyr Leu Tyr Leu Arg Ser Thr
420 425 430
Ser Trp Tyr Val Leu Pro Leu Thr Gly Leu Leu Ile Leu Gly Pro Pro
435 440 445
Val Ser Ile Ser Trp Val Thr Gln Glu Ala Val Ser Arg Pro Gly Glu
450 455 460
Tyr Pro Cys Gly Ala Ser Asn Arg Cys Pro Lys Asp Cys Ile Thr Gly
465 470 475 480
Val Tyr Thr Asp Leu Phe Pro Leu Gly Ala Arg Tyr Glu Tyr Ala Val
485 490 495
Thr Val Tyr Leu Asn Ala Glu Thr Tyr Arg Val Asn Pro Thr Leu Ala
500 505 510
Leu Ile Asp Arg Ser Lys Ile Ile Ala Arg Lys Lys Ile Thr Thr Glu
515 520 525
Ser Gln Lys Ala Gly Tyr Thr Thr Thr Thr Cys Phe Val Phe Lys Leu
530 535 540
Arg Ile Trp Cys Met Ser Val Val Glu Leu Ala Pro Ala Thr Met Thr
545 550 555 560
Ala Phe Glu Pro Val Pro Phe Leu Tyr Gln Leu Asp Leu Thr Cys Lys
565 570 575
Arg Asn Asn Gly Thr Thr Ala Met Gln Phe Ser Gly Gln Asp Gly Met
580 585 590
Tyr Lys Ser Gly Arg Tyr Lys Ser Pro Arg Asn Glu Cys Phe Phe Glu
595 600 605
Lys Val Ser Asn Lys Tyr Tyr Phe Val Val Ser Thr Pro Glu Gly Ile
610 615 620
Gln Pro Tyr Glu Val Arg Asp Leu Thr Pro Glu Arg Val Ser His Val
625 630 635 640
Ile Met Tyr Ile Ser Asp Val Cys Ala Pro Ala Leu Ser Ala Phe Lys
645 650 655
Lys Leu Ile Pro Ala Met Arg Pro Ile Thr Thr Leu Thr Ile Gly Asn
660 665 670
Trp Gln Phe Arg Pro Val Asp Ile Ser Gly Gly Leu Arg Val Asn Ile
675 680 685
Tyr Arg Asn Leu Thr Arg Tyr Gly Asp Leu Ser Met Ser Ala Pro Glu
690 695 700
Asp Pro Gly Thr Asp Thr Phe Pro Gly Thr His Ala Pro Ser Lys Gly
705 710 715 720
His Glu Glu Val Gly His Tyr Thr Leu Pro Asn Glu Lys Leu Ser Glu
725 730 735
Val Thr Thr Ala Ala Val Lys Thr Lys Glu Ser Leu Asn Leu Ile Pro
740 745 750
Asp Thr Lys Asp Thr Arg Gly Glu Glu Glu Asn Gly Ser Gly Leu Asn
755 760 765
Glu Ile Ile Thr Gly His Thr Thr Pro Gly His Ile Lys Thr His Pro
770 775 780
Ala Glu Thr Lys Val Thr Lys His Thr Val Ile Ile Pro Gln Ile Glu
785 790 795 800
Glu Asp Gly Ser Gly Ala Thr Thr Ser Thr Glu Leu Gln Asp Glu Thr
805 810 815
Gly Tyr His Thr Glu Asp Tyr Asn Thr Thr Asn Thr Asn Gly Ser Leu
820 825 830
Thr Ala Pro Asn Glu Arg Asn Asn Tyr Thr Ser Gly Asp His Thr Val
835 840 845
Ser Gly Glu Asp Ile Thr His Thr Ile Thr Val Ser Asp Arg Thr Lys
850 855 860
Thr Thr Gln Thr Leu Pro Thr Asp Asn Thr Phe Asn Gln Thr Pro Thr
865 870 875 880
Lys Ile Gln Glu Gly Ser Pro Lys Ser Glu Ser Thr Pro Lys Asp Tyr
885 890 895
Thr Ala Ile Glu Ser Glu Asp Ser His Phe Thr Asp Pro Thr Leu Ile
900 905 910
Arg Ser Thr Pro Glu Gly Thr Ile Val Gln Val Ile Gly Asp Gln Phe
915 920 925
His Ser Ala Val Thr Gln Leu Gly Glu Ser Asn Ala Ile Gly Asn Ser
930 935 940
Glu Pro Ile Asp Gln Gly Asn Asn Leu Ile Pro Thr Thr Asp Arg Gly
945 950 955 960
Thr Met Asp Asn Thr Ser Ser Gln Ser His Ser Ser Thr Thr Ser Thr
965 970 975
Gln Gly Ser His Ser Ala Gly His Gly Ser Gln Ser Asn Met Asn Leu
980 985 990
Thr Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ser Val Thr Asp Gln Ser Thr Ser Thr
995 1000 1005
Gln Glu Ile Asp His Glu His Glu Asn Val Ser Ser Ile Leu Asn
1010 1015 1020
Pro Leu Ser Arg His Thr Arg Val Met Arg Asp Thr Val Gln Glu
1025 1030 1035
Ala Leu Thr Gly Ala Trp Gly Phe Ile Arg Gly Met Ile Pro
1040 1045 1050
<210> 100
<211> 242
<212> PRT
<213> 人类偏肺病毒（Human metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 100
Met Glu Val Arg Val Glu Asn Ile Arg Ala Ile Asp Met Phe Lys Ala
1 5 10 15
Lys Ile Lys Asn Arg Ile Arg Asn Ser Arg Cys Tyr Arg Asn Ala Thr
20 25 30
Leu Ile Leu Ile Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn Ile Phe
35 40 45
Leu Ile Ile Asp His Ala Thr Leu Arg Asn Met Ile Lys Thr Glu Asn
50 55 60
Cys Ala Asn Met Pro Ser Ala Glu Pro Ser Lys Lys Thr Pro Met Thr
65 70 75 80
Ser Ile Ala Gly Pro Ser Thr Lys Pro Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln
85 90 95
Trp Thr Thr Glu Asn Ser Thr Ser Pro Ala Ala Thr Leu Glu Gly His
100 105 110
Pro Tyr Thr Gly Thr Thr Gln Thr Pro Asp Thr Thr Ala Pro Gln Gln
115 120 125
Thr Thr Asp Lys His Thr Ala Leu Pro Lys Ser Thr Asn Glu Gln Ile
130 135 140
Thr Gln Thr Thr Thr Glu Lys Lys Thr Thr Arg Ala Thr Thr Gln Lys
145 150 155 160
Arg Lys Lys Glu Lys Lys Thr Gln Thr Lys Pro Gln Val Gln Leu Gln
165 170 175
Pro Lys Gln Pro Thr Pro Pro Thr Lys Ser Glu Met Gln Val Arg Gln
180 185 190
Ser Gln His Pro Thr Asp Pro Glu Leu Thr Pro Leu Pro Lys Ala Val
195 200 205
Asn Arg Gln Pro Gly Gln Gln Asn Gln Ala Pro His His Ile Met His
210 215 220
Gly Glu Val Gln Asp Pro Gly Glu Arg Asn Thr Gln Val Ser His Pro
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 101
<211> 585
<212> PRT
<213> C型禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus type C）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 101
Met Glu Val Lys Ile Glu Asn Val Gly Lys Ser Gln Glu Leu Arg Val
1 5 10 15
Lys Val Lys Asn Phe Ile Lys Arg Ser Asp Cys Lys Lys Lys Leu Phe
20 25 30
Ala Leu Ile Leu Gly Leu Ile Ser Phe Asp Ile Thr Met Asn Ile Met
35 40 45
Leu Ser Val Met Tyr Val Glu Ser Asn Glu Ala Leu Ser Ser Cys Arg
50 55 60
Val Gln Gly Thr Pro Ala Pro Arg Asp Asn Arg Thr Asn Thr Glu Asn
65 70 75 80
Thr Ala Lys Glu Thr Thr Leu His Thr Met Thr Thr Thr Arg Asn Thr
85 90 95
Glu Ala Gly Gly Thr Lys Thr Thr Lys Pro Gln Ala Asp Glu Arg Ala
100 105 110
Thr Ser Pro Ser Lys Asn Pro Thr Ile Gly Ala Asp Lys His Lys Thr
115 120 125
Thr Arg Ala Thr Thr Glu Ala Glu Gln Glu Lys Gln Ser Lys Gln Thr
130 135 140
Thr Glu Pro Gly Thr Ser Thr Pro Lys His Ile Pro Ala Arg Pro Ser
145 150 155 160
Ser Lys Ser Pro Ala Thr Thr Lys Thr Thr Thr Gln Pro Thr Thr Pro
165 170 175
Thr Val Ala Lys Gly Gly Thr Ala Pro Lys Asn Arg Gln Thr Thr Thr
180 185 190
Lys Lys Thr Glu Ala Asp Thr Pro Thr Thr Ser Arg Ala Lys Gln Thr
195 200 205
Asn Lys Pro Thr Gly Thr Glu Thr Thr Pro Pro Arg Ala Thr Thr Glu
210 215 220
Thr Asp Lys Asp Lys Glu Gly Pro Thr Gln His Thr Thr Lys Glu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Thr Thr Ala Gly Gly Thr Thr Thr Pro Gln Pro Arg Arg Thr
245 250 255
Thr Ser Arg Pro Ala Pro Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ala Glu Thr
260 265 270
Thr Gly Thr Arg Thr Thr Lys Ser Thr Gln Thr Ser Ala Ser Pro Pro
275 280 285
Arg Pro Thr Arg Ser Thr Pro Ser Lys Thr Ala Thr Gly Thr Asn Lys
290 295 300
Arg Ala Thr Thr Thr Lys Gly Pro Asn Thr Ala Ser Thr Asp Arg Arg
305 310 315 320
Gln Gln Thr Arg Thr Thr Pro Lys Gln Asp Gln Gln Thr Gln Thr Lys
325 330 335
Ala Lys Thr Thr Thr Asn Lys Ala His Ala Lys Ala Ala Thr Thr Pro
340 345 350
Glu His Asn Thr Asp Thr Thr Asp Ser Met Lys Glu Asn Ser Lys Glu
355 360 365
Asp Lys Thr Thr Arg Asp Pro Ser Ser Lys Ala Thr Thr Lys Gln Glu
370 375 380
Asn Thr Ser Lys Gly Thr Thr Ala Thr Asn Leu Gly Asn Asn Thr Glu
385 390 395 400
Ala Gly Ala Arg Thr Pro Pro Thr Thr Thr Pro Thr Arg His Thr Thr
405 410 415
Glu Pro Ala Thr Ser Thr Ala Gly Gly His Thr Lys Ala Arg Thr Thr
420 425 430
Arg Trp Lys Ser Thr Ala Ala Arg Gln Pro Thr Arg Asn Asn Thr Thr
435 440 445
Ala Asp Thr Lys Thr Ala Gln Ser Lys Gln Thr Thr Pro Ala Gln Leu
450 455 460
Gly Asn Asn Thr Thr Pro Glu Asn Thr Thr Pro Pro Asp Asn Lys Ser
465 470 475 480
Asn Ser Gln Thr Asn Val Ala Pro Thr Glu Glu Ile Glu Ile Gly Ser
485 490 495
Ser Leu Trp Arg Arg Arg Tyr Val Tyr Gly Pro Cys Arg Glu Asn Ala
500 505 510
Leu Glu His Pro Met Asn Pro Cys Leu Lys Asp Asn Thr Thr Trp Ile
515 520 525
Tyr Leu Asp Asn Gly Arg Asn Leu Pro Ala Gly Tyr Tyr Asp Ser Lys
530 535 540
Thr Asp Lys Ile Ile Cys Tyr Gly Ile Tyr Arg Gly Asn Ser Tyr Cys
545 550 555 560
Tyr Gly Arg Ile Glu Cys Thr Cys Lys Asn Gly Thr Gly Leu Leu Ser
565 570 575
Tyr Cys Cys Asn Ser Tyr Asn Trp Ser
580 585
<210> 102
<211> 609
<212> PRT
<213> 牛瘟麻疹病毒（Rinderpest morbillivirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> H蛋白
<400> 102
Met Ser Ser Pro Arg Asp Arg Val Asn Ala Phe Tyr Lys Asp Asn Leu
1 5 10 15
Gln Phe Lys Asn Thr Arg Val Val Leu Asn Lys Glu Gln Leu Leu Ile
20 25 30
Glu Arg Pro Tyr Met Leu Leu Ala Val Leu Phe Val Met Phe Leu Ser
35 40 45
Leu Val Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Ile Arg Leu His Arg Ala Ala
50 55 60
Val Asn Thr Ala Glu Ile Asn Ser Gly Leu Thr Thr Ser Ile Asp Ile
65 70 75 80
Thr Lys Ser Ile Glu Tyr Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe
85 90 95
Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Thr Pro Gln Arg Phe Thr
100 105 110
Asp Leu Thr Lys Phe Ile Ser Asp Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp
115 120 125
Lys Glu Tyr Asp Phe Arg Asp Ile Asn Trp Cys Ile Ser Pro Pro Glu
130 135 140
Arg Ile Lys Ile Asn Tyr Asp Gln Tyr Cys Ala His Thr Ala Ala Glu
145 150 155 160
Glu Leu Ile Thr Met Leu Val Asn Ser Ser Leu Ala Gly Thr Ala Val
165 170 175
Leu Arg Thr Ser Leu Val Asn Leu Gly Arg Ser Cys Thr Gly Ser Thr
180 185 190
Thr Thr Lys Gly Gln Phe Ser Asn Met Ser Leu Ala Leu Ser Gly Ile
195 200 205
Tyr Ser Gly Arg Gly Tyr Asn Ile Ser Ser Met Ile Thr Ile Thr Glu
210 215 220
Lys Gly Met Tyr Gly Ser Thr Tyr Leu Val Gly Lys His Asn Gln Gly
225 230 235 240
Ala Arg Arg Pro Ser Thr Ala Trp Gln Arg Asp Tyr Arg Val Phe Glu
245 250 255
Val Gly Ile Ile Arg Glu Leu Gly Val Gly Thr Pro Val Phe His Met
260 265 270
Thr Asn Tyr Leu Glu Leu Pro Arg Gln Pro Glu Leu Glu Ile Cys Met
275 280 285
Leu Ala Leu Gly Glu Phe Lys Leu Ala Ala Leu Cys Leu Ala Asp Asn
290 295 300
Ser Val Ala Leu His Tyr Gly Gly Leu Arg Asp Asp His Lys Ile Arg
305 310 315 320
Phe Val Lys Leu Gly Val Trp Pro Ser Pro Ala Asp Ser Asp Thr Leu
325 330 335
Ala Thr Leu Ser Ala Val Asp Pro Thr Leu Asp Gly Leu Tyr Ile Thr
340 345 350
Thr His Arg Gly Ile Ile Ala Ala Gly Lys Ala Val Trp Ala Val Pro
355 360 365
Val Thr Arg Thr Asp Asp Gln Arg Lys Met Gly Gln Cys Arg Arg Glu
370 375 380
Ala Cys Arg Glu Lys Pro Pro Pro Phe Cys Asn Ser Thr Asp Trp Glu
385 390 395 400
Pro Leu Glu Ala Gly Arg Ile Pro Ala Tyr Gly Ile Leu Thr Ile Arg
405 410 415
Leu Gly Leu Ala Asp Lys Pro Glu Ile Asp Ile Ile Ser Glu Phe Gly
420 425 430
Pro Leu Ile Thr His Asp Ser Gly Met Asp Leu Tyr Thr Pro Leu Asp
435 440 445
Gly Asn Glu Tyr Trp Leu Thr Ile Pro Pro Leu Gln Asn Ser Ala Leu
450 455 460
Gly Thr Val Asn Thr Leu Val Leu Glu Pro Ser Leu Lys Ile Ser Pro
465 470 475 480
Asn Ile Leu Thr Leu Pro Ile Arg Ser Gly Gly Gly Asp Cys Tyr Thr
485 490 495
Pro Thr Tyr Leu Ser Asp Leu Ala Asp Asp Asp Val Lys Leu Ser Ser
500 505 510
Asn Leu Val Ile Leu Pro Ser Arg Asn Leu Gln Tyr Val Ser Ala Thr
515 520 525
Tyr Asp Thr Ser Arg Val Glu His Ala Ile Val Tyr Tyr Ile Tyr Ser
530 535 540
Thr Gly Arg Leu Ser Ser Tyr Tyr Tyr Pro Val Lys Leu Pro Ile Lys
545 550 555 560
Gly Asp Pro Val Ser Leu Gln Ile Gly Cys Phe Pro Trp Gly Leu Lys
565 570 575
Leu Trp Cys His His Phe Cys Ser Val Ile Asp Ser Gly Thr Gly Lys
580 585 590
Gln Val Thr His Thr Gly Ala Val Gly Ile Glu Ile Thr Cys Asn Ser
595 600 605
Arg
<210> 103
<211> 575
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒10（Avian paramyxovirus 10）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 103
Met Asp Ser Ser Gln Met Asn Ile Leu Asp Ala Met Asp Arg Glu Ser
1 5 10 15
Ser Lys Arg Thr Trp Arg Gly Val Phe Arg Val Thr Thr Ile Ile Met
20 25 30
Val Val Thr Cys Val Val Leu Ser Ala Ile Thr Leu Ser Lys Val Ala
35 40 45
His Pro Gln Gly Phe Asp Thr Asn Glu Leu Gly Asn Gly Ile Val Asp
50 55 60
Arg Val Ser Asp Lys Ile Thr Glu Ala Leu Thr Val Pro Asn Asn Gln
65 70 75 80
Ile Gly Glu Ile Phe Lys Ile Val Ala Leu Asp Leu His Val Leu Val
85 90 95
Ser Ser Ser Gln Gln Ala Ile Ala Gly Gln Ile Gly Met Leu Ala Glu
100 105 110
Ser Ile Asn Ser Ile Leu Ser Gln Asn Gly Ser Ala Ser Thr Ile Leu
115 120 125
Ser Ser Ser Pro Glu Tyr Ala Gly Gly Ile Gly Val Pro Leu Phe Ser
130 135 140
Asn Lys Leu Thr Asn Gly Thr Val Ile Lys Pro Ile Thr Leu Ile Glu
145 150 155 160
His Pro Ser Phe Ile Pro Gly Pro Thr Thr Ile Gly Gly Cys Thr Arg
165 170 175
Ile Pro Thr Phe His Met Ala Ser Ser His Trp Cys Tyr Ser His Asn
180 185 190
Ile Ile Glu Lys Gly Cys Lys Asp Ser Gly Ile Ser Ser Met Tyr Ile
195 200 205
Ser Leu Gly Val Leu Gln Val Leu Lys Lys Gly Thr Pro Val Phe Leu
210 215 220
Val Thr Ala Ser Ala Val Leu Ser Asp Asp Arg Asn Arg Lys Ser Cys
225 230 235 240
Ser Ile Ile Ser Ser Arg Phe Gly Cys Glu Ile Leu Cys Ser Leu Val
245 250 255
Thr Glu Ala Glu Ser Asp Asp Tyr Lys Ser Asp Thr Pro Thr Gly Met
260 265 270
Val His Gly Arg Leu Tyr Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Val
275 280 285
Asp Thr Glu Thr Ile Phe Arg Asp Phe Ser Ala Asn Tyr Pro Gly Val
290 295 300
Gly Ser Gly Glu Ile Val Glu Gly His Ile His Phe Pro Ile Tyr Gly
305 310 315 320
Gly Val Lys Gln Asn Thr Gly Leu Tyr Asn Ser Leu Thr Pro Tyr Trp
325 330 335
Leu Asp Ala Lys Asn Lys Tyr Asp Tyr Cys Lys Leu Pro Tyr Thr Asn
340 345 350
Gln Thr Ile Gln Asn Ser Tyr Lys Pro Pro Phe Ile His Gly Arg Phe
355 360 365
Trp Ala Gln Gly Ile Leu Ser Cys Glu Leu Asp Leu Phe Asn Leu Gly
370 375 380
Asn Cys Asn Leu Lys Ile Ile Arg Ser Asp Lys Val Met Met Gly Ala
385 390 395 400
Glu Ser Arg Leu Met Leu Val Gly Ser Lys Leu Leu Met Tyr Gln Arg
405 410 415
Ala Ser Ser Trp Trp Pro Leu Gly Ile Thr Gln Glu Ile Asp Ile Ala
420 425 430
Glu Leu His Ser Ser Asn Thr Thr Ile Leu Arg Glu Val Lys Pro Ile
435 440 445
Leu Ser Ser Lys Phe Pro Arg Pro Ser Tyr Gln Pro Asn Tyr Cys Thr
450 455 460
Lys Pro Ser Val Cys Pro Ala Val Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp
465 470 475 480
Met Trp Pro Ile Ser Ile Thr Gly Asn Ile Ser Asp Tyr Ala Trp Ile
485 490 495
Ser His Tyr Leu Asp Ala Pro Thr Ser Arg Gln Gln Pro Arg Ile Gly
500 505 510
Ile Ala Asn Gln Tyr Phe Trp Ile His Gln Thr Thr Ile Phe Pro Thr
515 520 525
Asn Thr Gln Ser Ser Tyr Ser Thr Thr Thr Cys Phe Arg Asn Gln Val
530 535 540
Arg Ser Arg Met Phe Cys Leu Ser Ile Ala Glu Phe Ala Asp Gly Val
545 550 555 560
Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro Leu Leu Tyr Glu Leu Arg Val
565 570 575
<210> 104
<211> 593
<212> PRT
<213> 刁曼病毒（Tioman virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着蛋白
<400> 104
Met Trp Ala Thr Ser Glu Ser Lys Ala Pro Ile Pro Ala Asn Ser Thr
1 5 10 15
Leu Asn Leu Val Asp Val Pro Leu Asp Glu Pro Gln Thr Ile Thr Lys
20 25 30
His Arg Lys Gln Lys Arg Thr Gly Arg Leu Val Phe Arg Leu Leu Ser
35 40 45
Leu Val Leu Ser Leu Met Thr Val Ile Leu Val Leu Val Ile Leu Ala
50 55 60
Ser Trp Ser Gln Lys Ile Asn Ala Cys Ala Thr Lys Glu Gly Phe Asn
65 70 75 80
Ser Leu Asp Leu Gln Ile Ser Gly Leu Val Lys Ser Ile Asn Ser Leu
85 90 95
Ile Thr Glu Val Asn Gln Ile Ser Ile Thr Thr Ala Ile Asn Leu Pro
100 105 110
Ile Lys Leu Ser Asp Phe Gly Lys Ser Ile Val Asp Gln Val Thr Gln
115 120 125
Met Ile Arg Gln Cys Asn Ala Val Cys Lys Gly Pro Gly Glu Lys Pro
130 135 140
Gly Ile Gln Asn Ile Arg Ile Asn Ile Pro Asn Asn Phe Ser Thr Tyr
145 150 155 160
Leu Glu Leu Asn Asn Thr Val Lys Ser Ile Glu Leu Gln Arg Arg Pro
165 170 175
Ala Leu Leu Ala Arg Pro Asn Pro Ile Pro Lys Ser Cys Ser Arg Phe
180 185 190
Pro Ser Tyr Ser Val Asn Phe Gly Ile His Cys Phe Ala His Ala Ile
195 200 205
Thr Asp Gln Ser Cys Glu Leu Ser Asp Lys Thr Tyr Tyr Arg Leu Ala
210 215 220
Ile Gly Ile Ser Asp Lys Asn Leu Ser Asp Pro Ser Asp Val Lys Tyr
225 230 235 240
Ile Gly Glu Ala Phe Thr Pro Met Gly Leu Gln Ala Arg Gly Cys Ser
245 250 255
Val Ile Ser Ser Ile Tyr Gly Cys Tyr Leu Leu Cys Ser Lys Ser Asn
260 265 270
Gln Gly Tyr Glu Ala Asp Phe Gln Thr Gln Gly Phe His Gln Met Tyr
275 280 285
Ile Leu Phe Leu Ser Arg Asp Leu Lys Thr Thr Leu Phe Asn Asp Met
290 295 300
Ile Ser Ser Thr Thr Val Val Trp Asn Gly Leu Tyr Pro Gly Glu Gly
305 310 315 320
Ala Gly Ile Trp His Met Gly Tyr Leu Ile Phe Pro Leu Trp Gly Gly
325 330 335
Ile Lys Ile Gly Thr Pro Ala Ser Thr Ser Ile Leu Asn Ser Thr Leu
340 345 350
Asp Leu Pro Leu Val Gly Pro Ser Cys Lys Ser Thr Leu Glu Glu Asn
355 360 365
Asn Leu Ile Asn Lys Asp Val Leu Phe Ser Pro Tyr Phe Gly Glu Ser
370 375 380
Val Met Val Phe Gly Phe Leu Ser Cys Tyr Met Leu Ser Asn Val Pro
385 390 395 400
Thr His Cys Gln Val Glu Val Leu Asn Ser Ser Val Leu Gly Phe Gly
405 410 415
Ser Arg Ser Gln Leu Met Asp Leu Lys Gly Ile Val Tyr Leu Tyr Ile
420 425 430
Gln Ser Ala Gly Trp Tyr Ser Tyr Thr Gln Leu Phe Arg Leu Ser Leu
435 440 445
Gln Ser Arg Gly Tyr Lys Leu Thr Val Lys Gln Ile Arg Arg Ile Pro
450 455 460
Ile Ser Ser Thr Thr Arg Pro Gly Thr Ala Pro Cys Asp Val Val His
465 470 475 480
Asn Cys Pro Tyr Thr Cys Ala Thr Gly Leu Phe Gln Ala Pro Trp Ile
485 490 495
Val Asn Gly Asp Ser Ile Leu Asp Arg Asp Val Arg Asn Leu Val Phe
500 505 510
Val Gln Ala Trp Ser Gly Asn Phe Asn Thr Phe Gln Lys Gly Leu Ile
515 520 525
Ser Ile Cys Asn Gln Tyr Thr Cys Pro Leu Thr Thr Leu Leu Asp Asn
530 535 540
Asp Asn Ser Ile Met Arg Ser Thr Thr Thr Tyr Cys Tyr Pro Ser Leu
545 550 555 560
Ser Glu Tyr Asn Leu Gln Cys Gln Ser Phe Ile Glu Trp Gly Gly Pro
565 570 575
Val Gly Asn Pro Ile Gly Ile Leu Glu Val His Tyr Ile Ile Lys Phe
580 585 590
Lys
<210> 105
<211> 604
<212> PRT
<213> 海豚麻疹病毒（Dolphin morbillivirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素蛋白
<400> 105
Met Ser Ser Pro Arg Asp Lys Val Asp Ala Phe Tyr Lys Asp Ile Pro
1 5 10 15
Arg Pro Arg Asn Asn Arg Val Leu Leu Asp Asn Glu Arg Val Ile Ile
20 25 30
Glu Arg Pro Leu Ile Leu Val Gly Val Leu Ala Val Met Phe Leu Ser
35 40 45
Leu Val Gly Leu Leu Ala Ile Ala Gly Val Arg Leu Gln Lys Ala Thr
50 55 60
Thr Asn Ser Ile Glu Val Asn Arg Lys Leu Ser Thr Asn Leu Glu Thr
65 70 75 80
Thr Val Ser Ile Glu His His Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe
85 90 95
Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Met Pro Gln Lys Leu Thr
100 105 110
Glu Ile Met Gln Phe Ile Ser Asn Lys Ile Lys Phe Leu Asn Pro Asp
115 120 125
Arg Glu Tyr Asp Phe Asn Asp Leu His Trp Cys Val Asn Pro Pro Asp
130 135 140
Gln Val Lys Ile Asp Tyr Ala Gln Tyr Cys Asn His Ile Ala Ala Glu
145 150 155 160
Glu Leu Ile Val Thr Lys Phe Lys Glu Leu Met Asn His Ser Leu Asp
165 170 175
Met Ser Lys Gly Arg Ile Phe Pro Pro Lys Asn Cys Ser Gly Ser Val
180 185 190
Ile Thr Arg Gly Gln Thr Ile Lys Pro Gly Leu Thr Leu Val Asn Ile
195 200 205
Tyr Thr Thr Arg Asn Phe Glu Val Ser Phe Met Val Thr Val Ile Ser
210 215 220
Gly Gly Met Tyr Gly Lys Thr Tyr Phe Leu Lys Pro Pro Glu Pro Asp
225 230 235 240
Asp Pro Phe Glu Phe Gln Ala Phe Arg Ile Phe Glu Val Gly Leu Val
245 250 255
Arg Asp Val Gly Ser Arg Glu Pro Val Leu Gln Met Thr Asn Phe Met
260 265 270
Val Ile Asp Glu Asp Glu Gly Leu Asn Phe Cys Leu Leu Ser Val Gly
275 280 285
Glu Leu Arg Leu Ala Ala Val Cys Val Arg Gly Arg Pro Val Val Thr
290 295 300
Lys Asp Ile Gly Gly Tyr Lys Asp Glu Pro Phe Lys Val Val Thr Leu
305 310 315 320
Gly Ile Ile Gly Gly Gly Leu Ser Asn Gln Lys Thr Glu Ile Tyr Pro
325 330 335
Thr Ile Asp Ser Ser Ile Glu Lys Leu Tyr Ile Thr Ser His Arg Gly
340 345 350
Ile Ile Arg Asn Ser Lys Ala Arg Trp Ser Val Pro Ala Ile Arg Ser
355 360 365
Asp Asp Lys Asp Lys Met Glu Lys Cys Thr Gln Ala Leu Cys Lys Ser
370 375 380
Arg Pro Pro Pro Ser Cys Asn Ser Ser Asp Trp Glu Pro Leu Thr Ser
385 390 395 400
Asn Arg Ile Pro Ala Tyr Ala Tyr Ile Ala Leu Glu Ile Lys Glu Asp
405 410 415
Ser Gly Leu Glu Leu Asp Ile Thr Ser Asn Tyr Gly Pro Leu Ile Ile
420 425 430
His Gly Ala Gly Met Asp Ile Tyr Glu Gly Pro Ser Ser Asn Gln Asp
435 440 445
Trp Leu Ala Ile Pro Pro Leu Ser Gln Ser Val Leu Gly Val Ile Asn
450 455 460
Lys Val Asp Phe Thr Ala Gly Phe Asp Ile Lys Pro His Thr Leu Thr
465 470 475 480
Thr Ala Val Asp Tyr Glu Ser Gly Lys Cys Tyr Val Pro Val Glu Leu
485 490 495
Ser Gly Ala Lys Asp Gln Asp Leu Lys Leu Glu Ser Asn Leu Val Val
500 505 510
Leu Pro Thr Lys Asp Phe Gly Tyr Val Thr Ala Thr Tyr Asp Thr Ser
515 520 525
Arg Ser Glu His Ala Ile Val Tyr Tyr Val Tyr Asp Thr Ala Arg Ser
530 535 540
Ser Ser Tyr Phe Phe Pro Phe Arg Ile Lys Ala Arg Gly Glu Pro Ile
545 550 555 560
Tyr Leu Arg Ile Glu Cys Phe Pro Trp Ser Arg Gln Leu Trp Cys His
565 570 575
His Tyr Cys Met Ile Asn Ser Thr Val Ser Asn Glu Ile Val Val Val
580 585 590
Asp Asn Leu Val Ser Ile Asn Met Ser Cys Ser Arg
595 600
<210> 106
<211> 734
<212> PRT
<213> 北龙病毒（Beilong virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 106
Met Ser Gln Leu Ala Ala His Asn Leu Ala Met Ser Asn Phe Tyr Gly
1 5 10 15
Thr His Gln Gly Asp Leu Ser Gly Ser Gln Lys Gly Glu Glu Gln Gln
20 25 30
Val Gln Gly Val Ile Arg Tyr Val Ser Met Ile Val Ser Leu Leu Ser
35 40 45
Leu Phe Thr Ile Ile Ala Leu Asn Val Thr Asn Ile Ile Tyr Met Thr
50 55 60
Glu Ser Gly Gly Thr Met Gln Ser Ile Lys Thr Ala Gln Gly Ser Ile
65 70 75 80
Asp Gly Ser Met Arg Glu Ile Ser Gly Val Ile Met Glu Asp Val Lys
85 90 95
Pro Lys Thr Asp Leu Ile Asn Ser Met Val Ser Tyr Asn Ile Pro Ala
100 105 110
Gln Leu Ser Met Ile His Gln Ile Ile Lys Asn Asp Val Pro Lys Gln
115 120 125
Cys Thr Pro Ser Phe Met Phe Asn Asn Thr Ile Cys Pro Leu Ala Glu
130 135 140
Asn Pro Thr His Ser Arg Tyr Phe Glu Glu Val Asn Leu Asp Ser Ile
145 150 155 160
Ser Glu Cys Ser Gly Pro Asp Met His Leu Gly Leu Gly Val Asn Pro
165 170 175
Glu Phe Ile Glu Phe Pro Ser Phe Ala Pro Gly Ser Thr Lys Pro Gly
180 185 190
Ser Cys Val Arg Leu Pro Ser Phe Ser Leu Ser Thr Thr Val Phe Ala
195 200 205
Tyr Thr His Thr Ile Met Gly His Gly Cys Ser Glu Leu Asp Val Gly
210 215 220
Asp His Tyr Phe Ser Val Gly Arg Ile Ala Asp Ala Gly His Glu Ile
225 230 235 240
Pro Gln Phe Glu Thr Ile Ser Ser Trp Phe Ile Asn Asp Lys Ile Asn
245 250 255
Arg Arg Ser Cys Thr Val Ala Ala Gly Ala Met Glu Ala Trp Met Gly
260 265 270
Cys Val Ile Met Thr Glu Thr Phe Tyr Asp Asp Arg Asn Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Gly Lys Leu Thr Ile Ser Tyr Leu Asp Val Phe Gly Arg Lys Lys
290 295 300
Glu Trp Ile Tyr Thr Arg Ser Glu Ile Leu Tyr Asp Tyr Thr Tyr Thr
305 310 315 320
Ser Val Tyr Phe Ser Val Gly Ser Gly Val Val Val Gly Asp Thr Val
325 330 335
Tyr Phe Leu Ile Trp Gly Ser Leu Ser Ser Pro Ile Glu Glu Thr Ala
340 345 350
Tyr Cys Phe Ala Pro Asp Cys Ser Asn Tyr Asn Gln Arg Met Cys Asn
355 360 365
Glu Ala Gln Arg Pro Ser Lys Phe Gly His Arg Gln Met Val Asn Gly
370 375 380
Ile Leu Lys Phe Lys Thr Thr Ser Thr Gly Lys Pro Leu Leu Ser Val
385 390 395 400
Gly Thr Leu Ser Pro Ser Val Val Pro Phe Gly Ser Glu Gly Arg Leu
405 410 415
Met Tyr Ser Glu Ile Thr Lys Ile Ile Tyr Leu Tyr Leu Arg Ser Thr
420 425 430
Ser Trp His Ala Leu Pro Leu Thr Gly Leu Phe Val Leu Gly Pro Pro
435 440 445
Thr Ser Ile Ser Trp Ile Val Gln Arg Ala Val Ser Arg Pro Gly Glu
450 455 460
Phe Pro Cys Gly Ala Ser Asn Arg Cys Pro Lys Asp Cys Val Thr Gly
465 470 475 480
Val Tyr Thr Asp Leu Phe Pro Leu Gly Ser Arg Tyr Glu Tyr Ala Ala
485 490 495
Thr Val Tyr Leu Asn Ser Glu Thr Tyr Arg Val Asn Pro Thr Leu Ala
500 505 510
Leu Ile Asn Gln Thr Asn Ile Ile Ala Ser Lys Lys Val Thr Thr Glu
515 520 525
Ser Gln Arg Ala Gly Tyr Thr Thr Thr Thr Cys Phe Val Phe Lys Leu
530 535 540
Arg Val Trp Cys Ile Ser Val Val Glu Leu Ala Pro Ser Thr Met Thr
545 550 555 560
Ala Tyr Glu Pro Ile Pro Phe Leu Tyr Gln Leu Asp Leu Thr Cys Lys
565 570 575
Gly Lys Asn Gly Ser Leu Ala Met Arg Phe Ala Gly Lys Glu Gly Thr
580 585 590
Tyr Lys Ser Gly Arg Tyr Lys Ser Pro Arg Asn Glu Cys Phe Phe Glu
595 600 605
Lys Val Ser Asn Lys Tyr Tyr Phe Ile Val Ser Thr Pro Glu Gly Ile
610 615 620
Gln Pro Tyr Glu Ile Arg Asp Leu Thr Pro Asp Arg Met Pro His Ile
625 630 635 640
Ile Met Tyr Ile Ser Asp Val Cys Ala Pro Ala Leu Ser Ala Phe Lys
645 650 655
Lys Leu Leu Pro Ala Met Arg Pro Ile Thr Thr Leu Thr Ile Gly Asn
660 665 670
Trp Gln Phe Arg Pro Val Glu Val Ser Gly Gly Leu Arg Val Asn Ile
675 680 685
Gly Arg Asn Leu Thr Lys Glu Gly Asp Leu Thr Met Ser Ala Pro Glu
690 695 700
Asp Pro Gly Ser Asn Thr Phe Pro Gly Asn His Ile Pro Gly Asn Gly
705 710 715 720
Ile Leu Asp Ala Gly Tyr Tyr Thr Val Glu Tyr Pro Lys Glu
725 730
<210> 107
<211> 582
<212> PRT
<213> 马普埃拉病毒（Mapuera virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着蛋白
<400> 107
Met Ala Ser Leu Gln Ser Glu Pro Gly Ser Gln Lys Pro His Tyr Gln
1 5 10 15
Ser Asp Asp Gln Leu Val Lys Arg Thr Trp Arg Ser Phe Phe Arg Phe
20 25 30
Ser Val Leu Val Val Thr Ile Thr Ser Leu Ala Leu Ser Ile Ile Thr
35 40 45
Leu Ile Gly Val Asn Arg Ile Ser Thr Ala Lys Gln Ile Ser Asn Ala
50 55 60
Phe Ala Ala Ile Gln Ala Asn Ile Leu Ser Ser Ile Pro Asp Ile Arg
65 70 75 80
Pro Ile Asn Ser Leu Leu Asn Gln Leu Val Tyr Thr Ser Ser Val Thr
85 90 95
Leu Pro Leu Arg Ile Ser Ser Leu Glu Ser Asn Val Leu Ala Ala Ile
100 105 110
Gln Glu Ala Cys Thr Tyr Arg Asp Ser Gln Ser Ser Cys Ser Ala Thr
115 120 125
Met Ser Val Met Asn Asp Gln Arg Tyr Ile Glu Gly Ile Gln Val Tyr
130 135 140
Ser Gly Ser Phe Leu Asp Leu Gln Lys His Thr Leu Ser Pro Pro Ile
145 150 155 160
Ala Phe Pro Ser Phe Ile Pro Thr Ser Thr Thr Thr Val Gly Cys Thr
165 170 175
Arg Ile Pro Ser Phe Ser Leu Thr Lys Thr His Trp Cys Tyr Thr His
180 185 190
Asn Tyr Ile Lys Thr Gly Cys Arg Asp Ala Thr Gln Ser Asn Gln Tyr
195 200 205
Ile Ala Leu Gly Thr Ile Tyr Thr Asp Pro Asp Gly Thr Pro Gly Phe
210 215 220
Ser Thr Ser Arg Ser Gln Tyr Leu Asn Asp Gly Val Asn Arg Lys Ser
225 230 235 240
Cys Ser Ile Ser Ala Val Pro Met Gly Cys Ala Leu Tyr Cys Phe Ile
245 250 255
Ser Val Lys Glu Glu Val Asp Tyr Tyr Lys Gly Thr Val Pro Pro Ala
260 265 270
Gln Thr Leu Ile Leu Phe Phe Phe Asn Gly Thr Val His Glu His Arg
275 280 285
Ile Val Pro Ser Ser Met Asn Ser Glu Trp Val Met Leu Ser Pro Gly
290 295 300
Val Gly Ser Gly Val Phe Tyr Asn Asn Tyr Ile Ile Phe Pro Leu Tyr
305 310 315 320
Gly Gly Met Thr Lys Asp Lys Ala Glu Lys Arg Gly Glu Leu Thr Arg
325 330 335
Phe Phe Thr Pro Lys Asn Ser Arg Ser Leu Cys Lys Met Asn Asp Ser
340 345 350
Val Phe Ser Asn Ala Ala Gln Ser Ala Tyr Tyr Pro Pro Tyr Phe Ser
355 360 365
Ser Arg Trp Ile Arg Ser Gly Leu Leu Ala Cys Asn Trp Asn Gln Ile
370 375 380
Ile Thr Thr Asn Cys Glu Ile Leu Thr Phe Ser Asn Gln Val Met Met
385 390 395 400
Met Gly Ala Glu Gly Arg Leu Ile Leu Ile Asn Asp Asp Leu Phe Tyr
405 410 415
Tyr Gln Arg Ser Thr Ser Trp Trp Pro Arg Pro Leu Val Tyr Lys Leu
420 425 430
Asp Ile Glu Leu Asn Tyr Pro Asp Ser His Ile Gln Arg Val Asp Gln
435 440 445
Val Glu Val Thr Phe Pro Thr Arg Pro Gly Trp Gly Gly Cys Val Gly
450 455 460
Asn Asn Phe Cys Pro Met Ile Cys Val Ser Gly Val Tyr Gln Asp Val
465 470 475 480
Trp Pro Val Thr Asn Pro Val Asn Thr Thr Asp Ser Arg Thr Leu Trp
485 490 495
Val Gly Gly Thr Leu Leu Ser Asn Thr Thr Arg Glu Asn Pro Ala Ser
500 505 510
Val Val Thr Ser Gly Gly Ser Ile Ser Gln Thr Val Ser Trp Phe Asn
515 520 525
Gln Thr Val Pro Gly Ala Tyr Ser Thr Thr Thr Cys Phe Asn Asp Gln
530 535 540
Val Gln Gly Arg Ile Phe Cys Leu Ile Ile Phe Glu Val Gly Gly Gly
545 550 555 560
Leu Leu Gly Glu Tyr Gln Ile Val Pro Phe Leu Lys Glu Leu Lys Tyr
565 570 575
Gln Gly Ala Val His Ala
580
<210> 108
<211> 657
<212> PRT
<213> 那立发病毒（Nariva virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着蛋白
<400> 108
Met Ala Pro Ile Asn Tyr Pro Ala Ser Tyr Tyr Thr Asn Asn Ala Glu
1 5 10 15
Arg Pro Val Val Ile Thr Thr Lys Ser Thr Glu Ser Lys Gly Gln Arg
20 25 30
Pro Leu Pro Leu Gly Asn Ala Arg Phe Trp Glu Tyr Phe Gly His Val
35 40 45
Cys Gly Thr Leu Thr Phe Cys Met Ser Leu Ile Gly Ile Ile Val Gly
50 55 60
Ile Ile Ala Leu Ala Asn Tyr Ser Ser Asp Lys Asp Trp Lys Gly Arg
65 70 75 80
Ile Gly Gly Asp Ile Gln Val Thr Arg Met Ala Thr Glu Lys Thr Val
85 90 95
Lys Leu Ile Leu Glu Asp Thr Thr Pro Lys Leu Arg Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Ser Val Leu Phe Gln Leu Pro Lys Met Leu Ala Ser Ile Ala Ser Lys
115 120 125
Ile Asn Thr Gln Thr Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Gly His Ser Thr
130 135 140
Ala Leu Ala Thr Gln Cys Ser Ser Asn Cys Glu Asn Arg Pro Glu Ile
145 150 155 160
Gly Tyr Asp Tyr Leu Arg Gln Val Glu Gln Ser Leu Gln Arg Ile Thr
165 170 175
Asn Ile Ser Ile Gln Leu Leu Glu Ala Ser Glu Ile His Ser Met Ala
180 185 190
Gly Ala Tyr Pro Asn Ala Leu Tyr Lys Ile Arg Thr Gln Asp Ser Trp
195 200 205
Ser Val Thr Ala Lys Glu Cys Pro Leu Gln Ala Phe Gln Pro Asn Leu
210 215 220
Asn Leu Ile Pro Ala Met Ile Gly Thr Ala Thr Gly Ala Leu Ile Arg
225 230 235 240
Asn Cys Val Arg Gln Pro Val Ile Val Val Asp Asp Gly Val Tyr Met
245 250 255
Leu Thr Tyr Leu Ala Met Arg Gly Ser Cys Gln Asp His Gln Lys Ser
260 265 270
Val Arg His Phe Glu Met Gly Val Ile Thr Ser Asp Pro Phe Gly Asp
275 280 285
Pro Val Pro Thr Pro Leu Arg His Trp Thr Lys Arg Ala Leu Pro Ala
290 295 300
Tyr Asp Gly Cys Ala Leu Ala Val Lys Gly His Ala Gly Phe Ala Leu
305 310 315 320
Cys Thr Glu Thr Ser Val Gly Pro Leu Arg Asp Arg Thr Ala Lys Arg
325 330 335
Lys Pro Asn Ile Val Leu Phe Lys Ala Ser Leu Val Gly Glu Leu Ser
340 345 350
Glu Arg Val Ile Pro Pro Gln Ser Trp Leu Ser Gly Phe Ser Phe Phe
355 360 365
Ser Val Tyr Thr Val Ala Gly Lys Gly Tyr Ala Tyr His Ser Lys Phe
370 375 380
His Ala Phe Gly Asn Val Val Arg Val Gly Gln Ser Glu Tyr Gln Ala
385 390 395 400
Lys Cys Arg Gly Thr Gly Cys Pro Thr Ala Asn Gln Asp Asp Cys Asn
405 410 415
Thr Ala Gln Arg Val Ser Gln Glu Asp Asn Thr Tyr Leu His Gln Ala
420 425 430
Ile Leu Ser Val Asp Ile Asp Ser Val Ile Asp Pro Glu Asp Val Val
435 440 445
Tyr Val Ile Glu Arg Asp Gln Tyr Tyr Gln Ala Ser Ala Gly Asp Leu
450 455 460
Tyr Arg Val Pro Glu Thr Gly Glu Ile Leu Tyr Asn Leu His Asn Gly
465 470 475 480
Gly Trp Ser Asn Glu Val Gln Val Gly Arg Ile Gln Pro Ser Asp Arg
485 490 495
Phe Tyr Met Arg Glu Ile Gln Leu Thr Ser Thr Arg Val Pro Ala Pro
500 505 510
Asn Gly Cys Asn Arg Val Lys Gly Cys Pro Gly Gly Cys Val Ala Val
515 520 525
Ile Ser Pro Ala Phe Thr Pro Met His Pro Glu Phe Asn Val Gly Val
530 535 540
Gly Ile Phe Pro Met Asn Gln Pro His Asn Pro Ser Ile Met His Val
545 550 555 560
Gln Gln Gln Thr Glu Leu Phe Trp Lys Pro Ile Val Gly Gly Asn Ile
565 570 575
Thr Leu His Glu Ser Ser Ile Ala Cys Tyr Ser Thr Val Pro Pro Asn
580 585 590
Pro Ser Tyr Asp Leu Cys Ile Gly Val Met Thr Leu Leu Leu His Gln
595 600 605
Gly Gln Leu Pro Gln Phe Gln Ala Leu Ser Trp Tyr Gln Pro Thr Met
610 615 620
Cys Asn Gly Asn Ala Pro Gln Asn Arg Arg Ala Leu Ile Pro Val Ile
625 630 635 640
Val Glu Asp Ser Lys Ala Met Ser Val Ser Ser Asp Ala Pro Arg Thr
645 650 655
Pro
<210> 109
<211> 632
<212> PRT
<213> 蝙蝠副粘病毒Eid_hel/GH-M74a/GHA/2009（Bat paramyxovirus Eid_hel/GH-M74a/GHA/2009）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 糖蛋白
<400> 109
Met Pro Gln Lys Thr Val Glu Phe Ile Asn Met Asn Ser Pro Leu Glu
1 5 10 15
Arg Gly Val Ser Thr Leu Ser Asp Lys Lys Thr Leu Asn Gln Ser Lys
20 25 30
Ile Thr Lys Gln Gly Tyr Phe Gly Leu Gly Ser His Ser Glu Arg Asn
35 40 45
Trp Lys Lys Gln Lys Asn Gln Asn Asp His Tyr Met Thr Val Ser Thr
50 55 60
Met Ile Leu Glu Ile Leu Val Val Leu Gly Ile Met Phe Asn Leu Ile
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Val Tyr Tyr Gln Asn Asp Asn Ile Asn Gln Arg Met
85 90 95
Ala Glu Leu Thr Ser Asn Ile Thr Val Leu Asn Leu Asn Leu Asn Gln
100 105 110
Leu Thr Asn Lys Ile Gln Arg Glu Ile Ile Pro Arg Ile Thr Leu Ile
115 120 125
Asp Thr Ala Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ser Ala Ile Thr Tyr Ile Leu
130 135 140
Ala Thr Leu Thr Thr Arg Ile Ser Glu Leu Leu Pro Ser Ile Asn Gln
145 150 155 160
Lys Cys Glu Phe Lys Thr Pro Thr Leu Val Leu Asn Asp Cys Arg Ile
165 170 175
Asn Cys Thr Pro Pro Leu Asn Pro Ser Asp Gly Val Lys Met Ser Ser
180 185 190
Leu Ala Thr Asn Leu Val Ala His Gly Pro Ser Pro Cys Arg Asn Phe
195 200 205
Ser Ser Val Pro Thr Ile Tyr Tyr Tyr Arg Ile Pro Gly Leu Tyr Asn
210 215 220
Arg Thr Ala Leu Asp Glu Arg Cys Ile Leu Asn Pro Arg Leu Thr Ile
225 230 235 240
Ser Ser Thr Lys Phe Ala Tyr Val His Ser Glu Tyr Asp Lys Asn Cys
245 250 255
Thr Arg Gly Phe Lys Tyr Tyr Glu Leu Met Thr Phe Gly Glu Ile Leu
260 265 270
Glu Gly Pro Glu Lys Glu Pro Arg Met Phe Ser Arg Ser Phe Tyr Ser
275 280 285
Pro Thr Asn Ala Val Asn Tyr His Ser Cys Thr Pro Ile Val Thr Val
290 295 300
Asn Glu Gly Tyr Phe Leu Cys Leu Glu Cys Thr Ser Ser Asp Pro Leu
305 310 315 320
Tyr Lys Ala Asn Leu Ser Asn Ser Thr Phe His Leu Val Ile Leu Arg
325 330 335
His Asn Lys Asp Glu Lys Ile Val Ser Met Pro Ser Phe Asn Leu Ser
340 345 350
Thr Asp Gln Glu Tyr Val Gln Ile Ile Pro Ala Glu Gly Gly Gly Thr
355 360 365
Ala Glu Ser Gly Asn Leu Tyr Phe Pro Cys Ile Gly Arg Leu Leu His
370 375 380
Lys Arg Val Thr His Pro Leu Cys Lys Lys Ser Asn Cys Ser Arg Thr
385 390 395 400
Asp Asp Glu Ser Cys Leu Lys Ser Tyr Tyr Asn Gln Gly Ser Pro Gln
405 410 415
His Gln Val Val Asn Cys Leu Ile Arg Ile Arg Asn Ala Gln Arg Asp
420 425 430
Asn Pro Thr Trp Asp Val Ile Thr Val Asp Leu Thr Asn Thr Tyr Pro
435 440 445
Gly Ser Arg Ser Arg Ile Phe Gly Ser Phe Ser Lys Pro Met Leu Tyr
450 455 460
Gln Ser Ser Val Ser Trp His Thr Leu Leu Gln Val Ala Glu Ile Thr
465 470 475 480
Asp Leu Asp Lys Tyr Gln Leu Asp Trp Leu Asp Thr Pro Tyr Ile Ser
485 490 495
Arg Pro Gly Gly Ser Glu Cys Pro Phe Gly Asn Tyr Cys Pro Thr Val
500 505 510
Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Val Tyr Ser Leu Thr Pro Asn Asn
515 520 525
Asp Leu Phe Val Thr Val Tyr Leu Lys Ser Glu Gln Val Ala Glu Asn
530 535 540
Pro Tyr Phe Ala Ile Phe Ser Arg Asp Gln Ile Leu Lys Glu Phe Pro
545 550 555 560
Leu Asp Ala Trp Ile Ser Ser Ala Arg Thr Thr Thr Ile Ser Cys Phe
565 570 575
Met Phe Asn Asn Glu Ile Trp Cys Ile Ala Ala Leu Glu Ile Thr Arg
580 585 590
Leu Asn Asp Asp Ile Ile Arg Pro Ile Tyr Tyr Ser Phe Trp Leu Pro
595 600 605
Thr Asp Cys Arg Thr Pro Tyr Pro His Thr Gly Lys Met Thr Arg Val
610 615 620
Pro Leu Arg Ser Thr Tyr Asn Tyr
625 630
<210> 110
<211> 569
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒7（Avian paramyxovirus 7）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 110
Met Glu Ser Ile Gly Lys Gly Thr Trp Arg Thr Val Tyr Arg Val Leu
1 5 10 15
Thr Ile Leu Leu Asp Val Val Ile Ile Ile Leu Ser Val Ile Ala Leu
20 25 30
Ile Ser Leu Gly Leu Lys Pro Gly Glu Arg Ile Ile Asn Glu Val Asn
35 40 45
Gly Ser Ile His Asn Gln Leu Val Pro Leu Ser Gly Ile Thr Ser Asp
50 55 60
Ile Gln Ala Lys Val Ser Ser Ile Tyr Arg Ser Asn Leu Leu Ser Ile
65 70 75 80
Pro Leu Gln Leu Asp Gln Ile Asn Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ala Arg
85 90 95
Gln Ile Ala Asp Thr Ile Asn Ser Phe Leu Ala Leu Asn Gly Ser Gly
100 105 110
Thr Phe Ile Tyr Thr Asn Ser Pro Glu Phe Ala Asn Gly Phe Asn Arg
115 120 125
Ala Met Phe Pro Thr Leu Asn Gln Ser Leu Asn Met Leu Thr Pro Gly
130 135 140
Asn Leu Ile Glu Phe Thr Asn Phe Ile Pro Thr Pro Thr Thr Lys Ser
145 150 155 160
Gly Cys Ile Arg Ile Pro Ser Phe Ser Met Ser Ser Ser His Trp Cys
165 170 175
Tyr Thr His Asn Ile Ile Ala Ser Gly Cys Gln Asp His Ser Thr Ser
180 185 190
Ser Glu Tyr Ile Ser Met Gly Val Val Glu Val Thr Asp Gln Ala Tyr
195 200 205
Pro Asn Phe Arg Thr Thr Leu Ser Ile Thr Leu Ala Asp Asn Leu Asn
210 215 220
Arg Lys Ser Cys Ser Ile Ala Ala Thr Gly Phe Gly Cys Asp Ile Leu
225 230 235 240
Cys Ser Val Val Thr Glu Thr Glu Asn Asp Asp Tyr Gln Ser Pro Glu
245 250 255
Pro Thr Gln Met Ile Tyr Gly Arg Leu Phe Phe Asn Gly Thr Tyr Ser
260 265 270
Glu Met Ser Leu Asn Val Asn Gln Met Phe Ala Asp Trp Val Ala Asn
275 280 285
Tyr Pro Ala Val Gly Ser Gly Val Glu Leu Ala Asp Phe Val Ile Phe
290 295 300
Pro Leu Tyr Gly Gly Val Lys Ile Thr Ser Thr Leu Gly Ala Ser Leu
305 310 315 320
Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ile Pro Lys Val Pro Thr Val Asn Cys Ser Glu
325 330 335
Thr Asp Ala Gln Gln Ile Glu Lys Ala Lys Ala Ser Tyr Ser Pro Pro
340 345 350
Lys Val Ala Pro Asn Ile Trp Ala Gln Ala Val Val Arg Cys Asn Lys
355 360 365
Ser Val Asn Leu Ala Asn Ser Cys Glu Ile Leu Thr Phe Asn Thr Ser
370 375 380
Thr Met Met Met Gly Ala Glu Gly Arg Leu Leu Met Ile Gly Lys Asn
385 390 395 400
Val Tyr Phe Tyr Gln Arg Ser Ser Ser Tyr Trp Pro Val Gly Ile Ile
405 410 415
Tyr Lys Leu Asp Leu Gln Glu Leu Thr Thr Phe Ser Ser Asn Gln Leu
420 425 430
Leu Ser Thr Ile Pro Ile Pro Phe Glu Lys Phe Pro Arg Pro Ala Ser
435 440 445
Thr Ala Gly Val Cys Ser Lys Pro Asn Val Cys Pro Ala Val Cys Gln
450 455 460
Thr Gly Val Tyr Gln Asp Leu Trp Val Leu Tyr Asp Leu Gly Lys Leu
465 470 475 480
Glu Asn Thr Thr Ala Val Gly Leu Tyr Leu Asn Ser Ala Val Gly Arg
485 490 495
Met Asn Pro Phe Ile Gly Ile Ala Asn Thr Leu Ser Trp Tyr Asn Thr
500 505 510
Thr Arg Leu Phe Ala Gln Gly Thr Pro Ala Ser Tyr Ser Thr Thr Thr
515 520 525
Cys Phe Lys Asn Thr Lys Ile Asp Thr Ala Tyr Cys Leu Ser Ile Leu
530 535 540
Glu Leu Ser Asp Ser Leu Leu Gly Ser Trp Arg Ile Thr Pro Leu Leu
545 550 555 560
Tyr Asn Ile Thr Leu Ser Ile Met Ser
565
<210> 111
<211> 588
<212> PRT
<213> 吐霍科病毒（Tuhoko virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 111
Met Pro Pro Val Pro Thr Val Ser Gln Ser Ile Asp Glu Gly Ser Phe
1 5 10 15
Thr Asp Ile Pro Leu Ser Pro Asp Asp Ile Lys His Pro Leu Ser Lys
20 25 30
Lys Thr Cys Arg Lys Leu Phe Arg Ile Val Thr Leu Ile Gly Val Gly
35 40 45
Leu Ile Ser Ile Leu Thr Ile Ile Ser Leu Ala Gln Gln Thr Gly Ile
50 55 60
Leu Arg Lys Val Asp Ser Ser Asp Phe Gln Ser Tyr Val Gln Glu Ser
65 70 75 80
Phe Lys Gln Val Leu Asn Leu Met Lys Gln Phe Ser Ser Asn Leu Asn
85 90 95
Ser Leu Ile Glu Ile Thr Ser Val Thr Leu Pro Phe Arg Ile Asp Gln
100 105 110
Phe Gly Thr Asp Ile Lys Thr Gln Val Ala Gln Leu Val Arg Gln Cys
115 120 125
Asn Ala Val Cys Arg Gly Pro Ile Lys Gly Pro Thr Thr Gln Asn Ile
130 135 140
Val Tyr Pro Ala Leu Tyr Glu Thr Ser Leu Asn Lys Thr Leu Glu Thr
145 150 155 160
Lys Asn Val Arg Ile Gln Glu Val Arg Gln Glu Val Asp Pro Val Pro
165 170 175
Gly Pro Gly Leu Ser Asn Gly Cys Thr Arg Asn Pro Ser Phe Ser Val
180 185 190
Tyr His Gly Val Trp Cys Tyr Thr His Ala Thr Ser Ile Gly Asn Cys
195 200 205
Asn Gly Ser Leu Gly Thr Ser Gln Leu Phe Arg Ile Gly Asn Val Leu
210 215 220
Glu Gly Asp Gly Gly Ala Pro Tyr His Lys Ser Leu Ala Thr His Leu
225 230 235 240
Leu Thr Thr Arg Asn Val Ser Arg Gln Cys Ser Ala Thr Ala Ser Tyr
245 250 255
Tyr Gly Cys Tyr Phe Ile Cys Ser Glu Pro Val Leu Thr Glu Arg Asp
260 265 270
Asp Tyr Glu Thr Pro Gly Ile Glu Pro Ile Thr Ile Phe Arg Leu Asp
275 280 285
Pro Asp Gly Asn Trp Val Val Phe Pro Asn Ile Asn Arg Phe Thr Glu
290 295 300
Tyr Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Pro Gly Ile Gly Ser Gly Val Leu Phe
305 310 315 320
Gln Gly Lys Leu Ile Phe Pro Met Tyr Gly Gly Ile Asp Lys Glu Arg
325 330 335
Leu Ser Ala Leu Gly Leu Gly Asn Ile Gly Leu Ile Glu Arg Arg Met
340 345 350
Ala Asp Thr Cys Asn His Thr Glu Lys Glu Leu Gly Arg Ser Phe Pro
355 360 365
Gly Ala Phe Ser Ser Pro Tyr Tyr His Asp Ala Val Met Leu Asn Phe
370 375 380
Leu Leu Ile Cys Glu Met Ile Glu Asn Leu Pro Gly Asp Cys Asp Leu
385 390 395 400
Gln Ile Leu Asn Pro Thr Asn Met Ser Met Gly Ser Glu Ser Gln Leu
405 410 415
Ser Val Leu Asp Asn Glu Leu Phe Leu Tyr Gln Arg Ser Ala Ser Trp
420 425 430
Trp Pro Tyr Thr Leu Ile Tyr Arg Leu Asn Met Arg Tyr Thr Gly Lys
435 440 445
Tyr Leu Lys Pro Lys Ser Ile Ile Pro Met Val Ile Lys Ser Asn Thr
450 455 460
Arg Pro Gly Tyr Glu Gly Cys Asn His Glu Arg Val Cys Pro Lys Val
465 470 475 480
Cys Val Thr Gly Val Phe Gln Ala Pro Trp Ile Leu Ser Ile Gly Arg
485 490 495
Asp His Lys Glu Arg Val Ser Asn Val Thr Tyr Met Val Ala Trp Ser
500 505 510
Met Asp Lys Ser Asp Arg Thr Tyr Pro Ala Val Ser Val Cys Gly Ser
515 520 525
Asp Thr Cys Lys Leu Thr Val Pro Leu Gly Asp Ser Lys Val His Ser
530 535 540
Ala Tyr Ser Val Thr Arg Cys Tyr Leu Ser Arg Asp His Met Ser Ala
545 550 555 560
Tyr Cys Leu Val Ile Phe Glu Leu Asp Ala Arg Pro Trp Ala Glu Met
565 570 575
Arg Ile Gln Ser Phe Leu Tyr Lys Leu Ile Leu Thr
580 585
<210> 112
<211> 582
<212> PRT
<213> 吐霍科病毒3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 112
Met His Asn Arg Thr Gln Ser Val Ser Ser Ile Asp Thr Ser Ser Asp
1 5 10 15
Val Tyr Leu Pro Arg Arg Lys Lys Ala Val Thr Lys Phe Thr Phe Lys
20 25 30
Lys Ile Phe Arg Val Leu Ile Leu Thr Leu Leu Leu Ser Ile Ile Ile
35 40 45
Ile Ile Ala Val Ile Phe Pro Lys Ile Asp His Ile Arg Glu Thr Cys
50 55 60
Asp Asn Ser Gln Ile Leu Glu Thr Ile Thr Asn Gln Asn Ser Glu Ile
65 70 75 80
Lys Asn Leu Ile Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Asn Val Leu Leu Thr
85 90 95
Ser Thr Thr Val Asp Leu Pro Ile Lys Leu Asn Asn Phe Gly Lys Ser
100 105 110
Ile Val Asp Gln Val Thr Met Met Val Arg Gln Cys Asn Ala Val Cys
115 120 125
Arg Gly Pro Gly Asp Arg Pro Thr Gln Asn Ile Glu Leu Phe Lys Gly
130 135 140
Leu Tyr His Thr Ser Pro Pro Ser Asn Thr Ser Thr Lys Leu Ser Met
145 150 155 160
Ile Thr Glu Ala Ser Asn Pro Asp Asp Ile Val Pro Arg Pro Gly Lys
165 170 175
Leu Leu Gly Cys Thr Arg Phe Pro Ser Phe Ser Val His Tyr Gly Leu
180 185 190
Trp Cys Tyr Gly His Met Ala Ser Thr Gly Asn Cys Ser Gly Ser Ser
195 200 205
Pro Ser Val Gln Ile Ile Arg Ile Gly Ser Ile Gly Thr Asn Lys Asp
210 215 220
Gly Thr Pro Lys Tyr Val Ile Ile Ala Ser Ala Ser Leu Pro Glu Thr
225 230 235 240
Thr Arg Leu Tyr His Cys Ser Val Thr Met Thr Ser Ile Gly Cys Tyr
245 250 255
Ile Leu Cys Thr Thr Pro Ser Val Ser Glu Thr Asp Asp Tyr Ser Thr
260 265 270
Met Gly Ile Glu Lys Met Ser Ile Ser Phe Leu Ser Leu Asp Gly Tyr
275 280 285
Leu Thr Gln Leu Gly Gln Pro Thr Gly Leu Asp Asn Gln Asn Leu Tyr
290 295 300
Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Gly Ser Gly Val Ile Phe Arg Asp Phe Leu
305 310 315 320
Ile Phe Pro Met Met Gly Gly Ile Arg Leu Met Asp Ala Gln Lys Met
325 330 335
Leu Asn Arg Asn Ile Thr Tyr Arg Gly Phe Pro Pro Ser Glu Thr Cys
340 345 350
Thr Glu Ser Glu Leu Lys Leu Lys Gln Glu Val Ala Asn Met Leu Thr
355 360 365
Ser Pro Tyr Tyr Gly Glu Val Leu Val Leu Asn Phe Leu Tyr Val Cys
370 375 380
Ser Leu Leu Asp Asn Ile Pro Gly Asp Cys Ser Val Gln Leu Ile Pro
385 390 395 400
Pro Asp Asn Met Thr Leu Gly Ala Glu Ser Arg Leu Tyr Val Leu Asn
405 410 415
Gly Ser Leu Ile Met Tyr Lys Arg Gly Ser Ser Trp Trp Pro Tyr Thr
420 425 430
Glu Leu Tyr Gln Ile Asn Tyr Arg Val Asn Asn Arg Ala Phe Arg Val
435 440 445
Arg Glu Ser Val Arg Ile Asn Thr Thr Ser Thr Ser Arg Pro Gly Val
450 455 460
Gln Gly Cys Asn Leu Glu Lys Val Cys Pro Lys Val Cys Val Ser Gly
465 470 475 480
Ile Tyr Gln Ser Pro Gly Ile Ile Ser Ala Pro Val Asn Pro Thr Arg
485 490 495
Gln Glu Glu Gly Leu Leu Tyr Phe Leu Val Trp Thr Ser Ser Met Ser
500 505 510
Ser Arg Thr Gly Pro Leu Ser Ser Leu Cys Asp His Ser Thr Cys Arg
515 520 525
Ile Thr Tyr Pro Ile Gly Asp Asp Thr Ile Phe Ile Gly Tyr Thr Asp
530 535 540
Ser Ser Cys Phe Met Ser Ser Ile Lys Glu Gly Ile Tyr Cys Ile Ala
545 550 555 560
Phe Leu Glu Leu Asp Asn Gln Pro Tyr Ser Met Met Ala Ile Arg Ser
565 570 575
Leu Ser Tyr Ile Ile Asn
580
<210> 113
<211> 625
<212> PRT
<213> 墨江病毒（Mojiang virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 113
Met Ala Thr Asn Arg Asp Asn Thr Ile Thr Ser Ala Glu Val Ser Gln
1 5 10 15
Glu Asp Lys Val Lys Lys Tyr Tyr Gly Val Glu Thr Ala Glu Lys Val
20 25 30
Ala Asp Ser Ile Ser Gly Asn Lys Val Phe Ile Leu Met Asn Thr Leu
35 40 45
Leu Ile Leu Thr Gly Ala Ile Ile Thr Ile Thr Leu Asn Ile Thr Asn
50 55 60
Leu Thr Ala Ala Lys Ser Gln Gln Asn Met Leu Lys Ile Ile Gln Asp
65 70 75 80
Asp Val Asn Ala Lys Leu Glu Met Phe Val Asn Leu Asp Gln Leu Val
85 90 95
Lys Gly Glu Ile Lys Pro Lys Val Ser Leu Ile Asn Thr Ala Val Ser
100 105 110
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115 120 125
Lys Tyr Val Tyr Leu Glu Glu Ser Ile Thr Lys Gln Cys Thr Cys Asn
130 135 140
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Phe Ser Ile Gly Ser Ser Ile Tyr Met Phe Ser Gln Glu Ile Arg Lys
225 230 235 240
Thr Asp Cys Thr Ala Gly Glu Ile Leu Ser Ile Gln Ile Val Leu Gly
245 250 255
Arg Ile Val Asp Lys Gly Gln Gln Gly Pro Gln Ala Ser Pro Leu Leu
260 265 270
Val Trp Ala Val Pro Asn Pro Lys Ile Ile Asn Ser Cys Ala Val Ala
275 280 285
Ala Gly Asp Glu Met Gly Trp Val Leu Cys Ser Val Thr Leu Thr Ala
290 295 300
Ala Ser Gly Glu Pro Ile Pro His Met Phe Asp Gly Phe Trp Leu Tyr
305 310 315 320
Lys Leu Glu Pro Asp Thr Glu Val Val Ser Tyr Arg Ile Thr Gly Tyr
325 330 335
Ala Tyr Leu Leu Asp Lys Gln Tyr Asp Ser Val Phe Ile Gly Lys Gly
340 345 350
Gly Gly Ile Gln Lys Gly Asn Asp Leu Tyr Phe Gln Met Tyr Gly Leu
355 360 365
Ser Arg Asn Arg Gln Ser Phe Lys Ala Leu Cys Glu His Gly Ser Cys
370 375 380
Leu Gly Thr Gly Gly Gly Gly Tyr Gln Val Leu Cys Asp Arg Ala Val
385 390 395 400
Met Ser Phe Gly Ser Glu Glu Ser Leu Ile Thr Asn Ala Tyr Leu Lys
405 410 415
Val Asn Asp Leu Ala Ser Gly Lys Pro Val Ile Ile Gly Gln Thr Phe
420 425 430
Pro Pro Ser Asp Ser Tyr Lys Gly Ser Asn Gly Arg Met Tyr Thr Ile
435 440 445
Gly Asp Lys Tyr Gly Leu Tyr Leu Ala Pro Ser Ser Trp Asn Arg Tyr
450 455 460
Leu Arg Phe Gly Ile Thr Pro Asp Ile Ser Val Arg Ser Thr Thr Trp
465 470 475 480
Leu Lys Ser Gln Asp Pro Ile Met Lys Ile Leu Ser Thr Cys Thr Asn
485 490 495
Thr Asp Arg Asp Met Cys Pro Glu Ile Cys Asn Thr Arg Gly Tyr Gln
500 505 510
Asp Ile Phe Pro Leu Ser Glu Asp Ser Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ile Gly
515 520 525
Ile Thr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Lys Asn Phe Val Ala Val Arg Asp
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Ser Asp Gly His Ile Ala Ser Ile Asp Ile Leu Gln Asn Tyr Tyr Ser
545 550 555 560
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595 600 605
Ser Ala Thr Val Thr Val Gly Asn Ala Lys Asn Ile Thr Ile Arg Arg
610 615 620
Tyr
625
<210> 114
<211> 614
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒12（Avian paramyxovirus 12）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 114
Met Glu Ser Ala Thr Ser Gln Val Ser Phe Glu Asn Asp Lys Thr Ser
1 5 10 15
Asp Arg Arg Thr Trp Arg Ala Val Phe Arg Val Leu Met Ile Ile Leu
20 25 30
Ala Leu Ser Ser Leu Cys Val Thr Val Ala Ala Leu Ile Tyr Ser Ala
35 40 45
Lys Ala Ala Ile Pro Gly Asn Ile Asp Ala Ser Glu Gln Arg Ile Leu
50 55 60
Ser Ser Val Glu Ala Val Gln Val Pro Val Ser Arg Leu Glu Asp Thr
65 70 75 80
Ser Gln Lys Ile Tyr Arg Gln Val Ile Leu Glu Ala Pro Val Thr Gln
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Leu Asn Met Glu Thr Asn Ile Leu Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr
100 105 110
Gln Ile Asp Ala Ser Ala Asn Ser Ser Gly Cys Gly Ala Pro Val His
115 120 125
Asp Ser Asp Phe Thr Gly Gly Val Gly Arg Glu Leu Leu Gln Glu Ala
130 135 140
Glu Val Asn Leu Thr Ile Ile Arg Pro Ser Lys Phe Leu Glu His Leu
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165 170 175
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180 185 190
Leu Asn Gly Cys Arg Asp Arg Gly His Ser Phe Gln Tyr Val Ala Leu
195 200 205
Gly Ile Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Ser Val Phe Leu Ser Thr Leu
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Arg Ser Val Asn Leu Asp Asp Asp Arg Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val
225 230 235 240
Ser Ala Thr Pro Ile Gly Cys Glu Met Leu Cys Ser Leu Val Thr Glu
245 250 255
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260 265 270
Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Lys Tyr Arg Glu Val Asp Leu Ser Glu
275 280 285
Lys Glu Ile Phe Ala Asp Trp Arg Ala Asn Tyr Pro Ala Val Gly Gly
290 295 300
Gly Ala Phe Phe Gly Asn Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu
305 310 315 320
Lys Glu Gly Thr Gln Ser Glu Arg Asp Ala Glu Lys Gly Tyr Ala Ile
325 330 335
Tyr Lys Arg Phe Asn Asn Thr Cys Pro Asp Asp Asn Thr Thr Gln Ile
340 345 350
Ala Asn Ala Lys Ala Ser Tyr Arg Pro Ser Arg Phe Gly Gly Arg Phe
355 360 365
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370 375 380
Asp Pro Ile Leu Ser Leu Thr Asp Asn Ser Ile Thr Leu Met Gly Ala
385 390 395 400
Glu Ala Arg Val Met Asn Ile Glu Asn Lys Leu Tyr Leu Tyr Gln Arg
405 410 415
Gly Thr Ser Trp Phe Pro Ser Ala Leu Val Tyr Pro Leu Asp Val Ala
420 425 430
Asn Thr Ala Val Lys Val Arg Ala Pro Tyr Ile Phe Asp Lys Phe Thr
435 440 445
Arg Pro Gly Gly His Pro Cys Ser Ala Ser Ser Arg Cys Pro Asn Val
450 455 460
Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Ala Tyr Pro Leu Val Phe Ser Arg
465 470 475 480
Ser His Asp Ile Val Ala Val Tyr Gly Met Gln Leu Ala Ala Gly Thr
485 490 495
Ala Arg Leu Asp Pro Gln Ala Ala Ile Trp Tyr Gly Asn Glu Met Ser
500 505 510
Thr Pro Thr Lys Val Ser Ser Ser Thr Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr
515 520 525
Ser Thr Cys Phe Lys Val Thr Lys Thr Lys Arg Ile Tyr Cys Ile Ser
530 535 540
Ile Ala Glu Ile Gly Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro
545 550 555 560
Leu Leu Ile Glu Val Gln Lys Thr Pro Leu Thr Arg Arg Ser Glu Leu
565 570 575
Arg Gln Gln Met Pro Gln Pro Pro Ile Asp Leu Val Ile Asp Asn Pro
580 585 590
Phe Cys Ala Pro Ser Gly Asn Leu Ser Arg Lys Asn Ala Ile Asp Glu
595 600 605
Tyr Ala Asn Ser Trp Pro
610
<210> 115
<211> 577
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素
<400> 115
Met Glu Pro Thr Gly Ser Lys Val Asp Ile Val Pro Ser Gln Gly Thr
1 5 10 15
Lys Arg Thr Cys Arg Thr Phe Tyr Arg Leu Leu Ile Leu Ile Leu Asn
20 25 30
Leu Ile Ile Ile Ile Leu Thr Ile Ile Ser Ile Tyr Val Ser Ile Ser
35 40 45
Thr Asp Gln His Lys Leu Cys Asn Asn Glu Ala Asp Ser Leu Leu His
50 55 60
Ser Ile Val Glu Pro Ile Thr Val Pro Leu Gly Thr Asp Ser Asp Val
65 70 75 80
Glu Asp Glu Leu Arg Glu Ile Arg Arg Asp Thr Gly Ile Asn Ile Pro
85 90 95
Ile Gln Ile Asp Asn Thr Glu Asn Ile Ile Leu Thr Thr Leu Ala Ser
100 105 110
Ile Asn Ser Asn Ile Ala Arg Leu His Asn Ala Thr Asp Glu Ser Pro
115 120 125
Thr Cys Leu Ser Pro Val Asn Asp Pro Arg Phe Ile Ala Gly Ile Asn
130 135 140
Lys Ile Thr Lys Gly Ser Met Ile Tyr Arg Asn Phe Ser Asn Leu Ile
145 150 155 160
Glu His Val Asn Phe Ile Pro Ser Pro Thr Thr Leu Ser Gly Cys Thr
165 170 175
Arg Ile Pro Ser Phe Ser Leu Ser Lys Thr His Trp Cys Tyr Ser His
180 185 190
Asn Val Ile Ser Thr Gly Cys Gln Asp His Ala Ala Ser Ser Gln Tyr
195 200 205
Ile Ser Ile Gly Ile Val Asp Thr Gly Leu Asn Asn Glu Pro Tyr Leu
210 215 220
Arg Thr Met Ser Ser Arg Leu Leu Asn Asp Gly Leu Asn Arg Lys Ser
225 230 235 240
Cys Ser Val Thr Ala Gly Ala Gly Val Cys Trp Leu Leu Cys Ser Val
245 250 255
Val Thr Glu Ser Glu Ser Ala Asp Tyr Arg Ser Arg Ala Pro Thr Ala
260 265 270
Met Ile Leu Gly Arg Phe Asn Phe Tyr Gly Asp Tyr Thr Glu Ser Pro
275 280 285
Val Pro Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Phe Thr Ala Asn Tyr Pro Gly
290 295 300
Val Gly Ser Gly Thr Gln Leu Asn Gly Thr Leu Tyr Phe Pro Ile Tyr
305 310 315 320
Gly Gly Val Val Asn Asp Ser Asp Ile Glu Leu Ser Asn Arg Gly Lys
325 330 335
Ser Phe Arg Pro Arg Asn Pro Thr Asn Pro Cys Pro Asp Pro Glu Val
340 345 350
Thr Gln Ser Gln Arg Ala Gln Ala Ser Tyr Tyr Pro Thr Arg Phe Gly
355 360 365
Arg Leu Leu Ile Gln Gln Ala Ile Leu Ala Cys Arg Ile Ser Asp Thr
370 375 380
Thr Cys Thr Asp Tyr Tyr Leu Leu Tyr Phe Asp Asn Asn Gln Val Met
385 390 395 400
Met Gly Ala Glu Ala Arg Ile Tyr Tyr Leu Asn Asn Gln Met Tyr Leu
405 410 415
Tyr Gln Arg Ser Ser Ser Trp Trp Pro His Pro Leu Phe Tyr Arg Phe
420 425 430
Ser Leu Pro His Cys Glu Pro Met Ser Val Cys Met Ile Thr Asp Thr
435 440 445
His Leu Ile Leu Thr Tyr Ala Thr Ser Arg Pro Gly Thr Ser Ile Cys
450 455 460
Thr Gly Ala Ser Arg Cys Pro Asn Asn Cys Val Asp Gly Val Tyr Thr
465 470 475 480
Asp Val Trp Pro Leu Thr Glu Gly Thr Thr Gln Asp Pro Asp Ser Tyr
485 490 495
Tyr Thr Val Phe Leu Asn Ser Pro Asn Arg Arg Ile Ser Pro Thr Ile
500 505 510
Ser Ile Tyr Ser Tyr Asn Gln Lys Ile Ser Ser Arg Leu Ala Val Gly
515 520 525
Ser Glu Ile Gly Ala Ala Tyr Thr Thr Ser Thr Cys Phe Ser Arg Thr
530 535 540
Asp Thr Gly Ala Leu Tyr Cys Ile Thr Ile Ile Glu Ala Val Asn Thr
545 550 555 560
Ile Phe Gly Gln Tyr Arg Ile Val Pro Ile Leu Val Gln Leu Ile Ser
565 570 575
Asp
<210> 116
<211> 620
<212> PRT
<213> 塞勒姆病毒（Salem virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 116
Met Lys Ala Met His Tyr Tyr Lys Asn Asp Phe Ala Asp Pro Gly Thr
1 5 10 15
Asn Asp Asn Ser Ser Asp Leu Thr Thr Asn Pro Phe Ile Ser Asn Gln
20 25 30
Ile Lys Ser Asn Leu Ser Pro Pro Val Leu Ala Glu Gly His Leu Ser
35 40 45
Pro Ser Pro Ile Pro Lys Phe Arg Lys Ile Leu Leu Thr Ile Ser Phe
50 55 60
Val Ser Thr Ile Val Val Leu Thr Val Ile Leu Leu Val Leu Thr Ile
65 70 75 80
Arg Ile Leu Thr Ile Ile Glu Ala Ser Ala Gly Asp Glu Lys Asp Ile
85 90 95
His Thr Ile Leu Ser Ser Leu Leu Asn Thr Phe Met Asn Glu Tyr Ile
100 105 110
Pro Val Phe Lys Asn Leu Val Ser Ile Ile Ser Leu Gln Ile Pro Gln
115 120 125
Met Leu Ile Asp Leu Lys Thr Ser Ser Thr Gln Met Met Gln Ser Leu
130 135 140
Lys Thr Phe Pro Arg Asp Leu Glu Thr Leu Ser Thr Val Thr Gln Ser
145 150 155 160
Val Ala Val Leu Leu Glu Lys Ala Lys Ser Thr Ile Pro Asp Ile Asn
165 170 175
Lys Phe Tyr Lys Asn Val Gly Lys Val Thr Phe Asn Asp Pro Asn Ile
180 185 190
Lys Val Leu Thr Leu Glu Val Pro Ala Trp Leu Pro Ile Val Arg Gln
195 200 205
Cys Leu Lys Gln Asp Phe Arg Gln Val Ile Ser Asn Ser Thr Gly Phe
210 215 220
Ala Leu Ile Gly Ala Leu Pro Ser Gln Leu Phe Asn Glu Phe Glu Gly
225 230 235 240
Tyr Pro Ser Leu Ala Ile Val Ser Glu Val Tyr Ala Ile Thr Tyr Leu
245 250 255
Lys Gly Val Met Phe Glu Asn Gln Glu Asn Phe Leu Tyr Gln Tyr Phe
260 265 270
Glu Ile Gly Thr Ile Ser Pro Asp Gly Tyr Asn Lys Pro Tyr Phe Leu
275 280 285
Arg His Thr Ser Val Met Leu Ser Thr Phe Lys Leu Ser Gly Lys Cys
290 295 300
Thr Ala Ala Val Asp Tyr Arg Gly Gly Ile Phe Leu Cys Thr Pro Ser
305 310 315 320
Pro Lys Ile Pro Lys Ile Leu Gln Asn Pro Pro Asp Leu Pro Thr Leu
325 330 335
Thr Val Val Ser Ile Pro Phe Asp Gly Arg Tyr Thr Ile Arg Asn Ile
340 345 350
Ser Leu Met Leu Thr Asp Glu Ala Asp Ile Ile Tyr Asp Leu Asp Thr
355 360 365
Leu Gln Gly Arg Gly Val Leu Gln Ala Met Arg Phe Tyr Ala Leu Val
370 375 380
Arg Val Ile Ser Ser Ser Ser Pro Arg His Phe Pro Phe Cys Lys Asn
385 390 395 400
Ser Trp Cys Pro Thr Ala Asp Asp Lys Ile Cys Asp Gln Ser Arg Arg
405 410 415
Leu Gly Ala Asp Gly Asn Tyr Pro Val Met Tyr Gly Leu Ile Ser Ile
420 425 430
Pro Ala His Ser Ser Tyr Gln Gly Asn Val Ser Leu Lys Leu Ile Asp
435 440 445
Pro Lys Tyr Tyr Ala Tyr Thr Arg Asp Ala Ser Leu Phe Tyr Asn Ser
450 455 460
Met Thr Asp Thr Tyr His Tyr Ser Phe Gly Thr Arg Gly Trp Val Ser
465 470 475 480
Arg Pro Ile Ile Gly Glu Leu Leu Leu Gly Asp Asp Ile Val Leu Thr
485 490 495
Arg Tyr Thr Val Arg Ser Val Ser Arg Ala Thr Ala Gly Asp Cys Thr
500 505 510
Thr Val Ser Met Cys Pro Gln Ala Cys Ser Gly Gly Met Asn Ser Ile
515 520 525
Phe Tyr Pro Leu Asn Phe Asp Lys Pro Gln Val Thr Gly Val Ala Ile
530 535 540
Arg Gln Tyr Glu Arg Gln Gln Glu Gly Ile Ile Val Val Thr Met Asn
545 550 555 560
Asp His Tyr Tyr Tyr Ser Val Pro Ile Ile Lys Asn Gly Thr Leu Leu
565 570 575
Ile Ser Ser Val Thr Asp Cys Phe Trp Leu Met Gly Asp Leu Trp Cys
580 585 590
Met Ser Leu Met Glu Lys Asn Asn Leu Pro Leu Gly Val Arg Ser Leu
595 600 605
Ala His Leu Thr Trp Asn Ile His Trp Ser Cys Ser
610 615 620
<210> 117
<211> 579
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒9（Avian paramyxovirus 9）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 117
Met Glu Ser Gly Ile Ser Gln Ala Ser Leu Val Asn Asp Asn Ile Glu
1 5 10 15
Leu Arg Asn Thr Trp Arg Thr Ala Phe Arg Val Val Ser Leu Leu Leu
20 25 30
Gly Phe Thr Ser Leu Val Leu Thr Ala Cys Ala Leu His Phe Ala Leu
35 40 45
Asn Ala Ala Thr Pro Ala Asp Leu Ser Ser Ile Pro Val Ala Val Asp
50 55 60
Gln Ser His His Glu Ile Leu Gln Thr Leu Ser Leu Met Ser Asp Ile
65 70 75 80
Gly Asn Lys Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Asp Ser Pro Val Ala Leu
85 90 95
Leu Asn Thr Glu Ser Thr Leu Met Ser Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr
100 105 110
Gln Ile Asn Asn Ala Ala Asn Asn Ser Gly Cys Gly Ala Pro Val His
115 120 125
Asp Lys Asp Phe Ile Asn Gly Val Ala Lys Glu Leu Phe Val Gly Ser
130 135 140
Gln Tyr Asn Ala Ser Asn Tyr Arg Pro Ser Arg Phe Leu Glu His Leu
145 150 155 160
Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Lys Gly Cys Thr Arg Ile Pro
165 170 175
Ser Phe Asp Leu Ala Ala Thr His Trp Cys Tyr Thr His Asn Val Ile
180 185 190
Leu Asn Gly Cys Asn Asp His Ala Gln Ser Tyr Gln Tyr Ile Ser Leu
195 200 205
Gly Ile Leu Lys Val Ser Ala Thr Gly Asn Val Phe Leu Ser Thr Leu
210 215 220
Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Asp Glu Asn Arg Lys Ser Cys Ser Ile
225 230 235 240
Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Leu Leu Cys Ala Lys Val Thr Glu
245 250 255
Arg Glu Glu Ala Asp Tyr Asn Ser Asp Ala Ala Thr Arg Leu Val His
260 265 270
Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Val Tyr His Glu Gln Ala Leu Pro Val
275 280 285
Glu Ser Leu Phe Ser Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Ser Val Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Tyr Phe Asp Asn Arg Val Trp Phe Gly Val Tyr Gly Gly Ile
305 310 315 320
Arg Pro Gly Ser Gln Thr Asp Leu Leu Gln Ser Glu Lys Tyr Ala Ile
325 330 335
Tyr Arg Arg Tyr Asn Asn Thr Cys Pro Asp Asn Asn Pro Thr Gln Ile
340 345 350
Glu Arg Ala Lys Ser Ser Tyr Arg Pro Gln Arg Phe Gly Gln Arg Leu
355 360 365
Val Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Arg Val Glu Pro Ser Leu Gly Asn
370 375 380
Asp Pro Lys Leu Ser Val Leu Asp Asn Thr Val Val Leu Met Gly Ala
385 390 395 400
Glu Ala Arg Ile Met Thr Phe Gly His Val Ala Leu Met Tyr Gln Arg
405 410 415
Gly Ser Ser Tyr Phe Pro Ser Ala Leu Leu Tyr Pro Leu Ser Leu Thr
420 425 430
Asn Gly Ser Ala Ala Ala Ser Lys Pro Phe Ile Phe Glu Gln Tyr Thr
435 440 445
Arg Pro Gly Ser Pro Pro Cys Gln Ala Thr Ala Arg Cys Pro Asn Ser
450 455 460
Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Ala Tyr Pro Leu Phe Trp Ser Glu
465 470 475 480
Asp His Lys Val Asn Gly Val Tyr Gly Met Met Leu Asp Asp Ile Thr
485 490 495
Ser Arg Leu Asn Pro Val Ala Ala Ile Phe Asp Arg Tyr Gly Arg Ser
500 505 510
Arg Val Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr
515 520 525
Asn Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Lys Arg Val Tyr Cys Leu Ser
530 535 540
Ile Ala Glu Ile Glu Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Thr Pro
545 550 555 560
Leu Leu Ser Glu Ile Ile Phe Asp Pro Asn Leu Glu Pro Ser Asp Thr
565 570 575
Ser Arg Asn
<210> 118
<211> 595
<212> PRT
<213> 阿奇莫塔病毒（Achimota virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着蛋白
<400> 118
Met Ala Thr Asn Leu Ser Thr Ile Thr Asn Gly Lys Phe Ser Gln Asn
1 5 10 15
Ser Asp Glu Gly Ser Leu Thr Glu Leu Pro Phe Phe Glu His Asn Arg
20 25 30
Lys Val Ala Thr Thr Lys Arg Thr Cys Arg Phe Val Phe Arg Ser Val
35 40 45
Ile Thr Leu Cys Asn Leu Thr Ile Leu Ile Val Thr Val Val Val Leu
50 55 60
Phe Gln Gln Ala Gly Phe Ile Lys Arg Thr Glu Ser Asn Gln Val Cys
65 70 75 80
Glu Thr Leu Gln Asn Asp Met His Gly Val Val Thr Met Ser Lys Gly
85 90 95
Val Ile Thr Thr Leu Asn Asn Leu Ile Glu Ile Thr Ser Val Asn Leu
100 105 110
Pro Phe Gln Met Lys Gln Phe Gly Gln Gly Ile Val Thr Gln Val Thr
115 120 125
Gln Met Val Arg Gln Cys Asn Ala Val Cys Lys Gly Pro Thr Ile Gly
130 135 140
Pro Asp Ile Gln Asn Ile Val Tyr Pro Ala Ser Tyr Glu Ser Met Ile
145 150 155 160
Lys His Pro Val Asn Asn Ser Asn Ile Leu Leu Ser Glu Ile Arg Gln
165 170 175
Pro Leu Asn Phe Val Pro Asn Thr Gly Lys Leu Asn Gly Cys Thr Arg
180 185 190
Thr Pro Ser Phe Ser Val Tyr Asn Gly Phe Trp Cys Tyr Thr His Ala
195 200 205
Glu Ser Asp Trp Asn Cys Asn Gly Ser Ser Pro Tyr Met Gln Val Phe
210 215 220
Arg Val Gly Val Val Thr Ser Asp Tyr Asp Tyr Asn Val Ile His Lys
225 230 235 240
Thr Leu His Thr Lys Thr Ser Arg Leu Ala Asn Val Thr Tyr Gln Cys
245 250 255
Ser Thr Ile Ser Thr Gly Tyr Glu Cys Tyr Phe Leu Cys Ser Thr Pro
260 265 270
Asn Val Asp Glu Ile Thr Asp Tyr Lys Thr Pro Gly Ile Glu Ser Leu
275 280 285
Gln Ile Tyr Lys Ile Asp Asn Arg Gly Thr Phe Ala Lys Phe Pro Ile
290 295 300
Thr Asp Gln Leu Asn Lys Glu Leu Leu Thr Ala Leu Tyr Pro Gly Pro
305 310 315 320
Gly Asn Gly Val Leu Tyr Gln Gly Arg Leu Leu Phe Pro Met His Gly
325 330 335
Gly Met Gln Ser Ser Glu Leu Asn Lys Val Asn Leu Asn Asn Thr Val
340 345 350
Leu Ser Gln Phe Asn Asp Asn Lys Gly Cys Asn Ala Thr Glu Ile Lys
355 360 365
Leu Glu Ser Glu Phe Pro Gly Thr Phe Thr Ser Pro Tyr Tyr Ser Asn
370 375 380
Gln Val Met Leu Asn Tyr Ile Leu Ile Cys Glu Met Ile Glu Asn Leu
385 390 395 400
Pro Gly Asn Cys Asp Leu Gln Ile Val Ala Pro Lys Asn Met Ser Met
405 410 415
Gly Ser Glu Ser Gln Leu Tyr Ser Ile Asn Asn Lys Leu Tyr Leu Tyr
420 425 430
Gln Arg Ser Ser Ser Arg Trp Pro Tyr Pro Leu Ile Tyr Glu Val Gly
435 440 445
Thr Arg Leu Thr Asn Arg Gln Phe Arg Leu Arg Ala Ile Asn Arg Phe
450 455 460
Leu Ile Lys Ser Thr Thr Arg Pro Gly Ser Glu Gly Cys Asn Ile Tyr
465 470 475 480
Arg Val Cys Pro Lys Val Cys Val Thr Gly Val Tyr Gln Ala Pro Trp
485 490 495
Ile Leu His Val Ser Lys Ala Gly Ser Gln Ser Ile Ala Lys Val Leu
500 505 510
Tyr Ala Val Ala Trp Ser Lys Asp His Met Ser Arg Lys Gly Pro Leu
515 520 525
Phe Ser Ile Cys Asp Asn Asp Thr Cys Phe Leu Thr Lys Ser Leu Ala
530 535 540
Ser Glu His Val His Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Arg Cys Tyr Leu Glu
545 550 555 560
Asn Ser Glu Arg His Ile Ile Cys Val Val Ile Met Glu Leu Asp Ala
565 570 575
Ser Pro Trp Ala Glu Met Arg Ile Gln Ser Val Ile Tyr Asn Ile Thr
580 585 590
Leu Pro Ser
595
<210> 119
<211> 583
<212> PRT
<213> 阿奇莫塔病毒2（Achimota virus 2）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着蛋白
<400> 119
Met Asp Asn Ser Met Ser Ile Ser Thr Ile Ser Leu Asp Ala Gln Pro
1 5 10 15
Arg Ile Trp Ser Arg His Glu Ser Arg Arg Thr Trp Arg Asn Ile Phe
20 25 30
Arg Ile Thr Ser Leu Val Leu Leu Gly Val Thr Val Ile Ile Cys Ile
35 40 45
Trp Leu Cys Cys Glu Val Ala Arg Glu Ser Glu Leu Glu Leu Leu Ala
50 55 60
Ser Pro Leu Gly Ala Leu Ile Met Ala Ile Asn Thr Ile Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Val Lys Met Thr Thr Glu Leu Asn Gln Val Thr Phe Thr Thr Ser
85 90 95
Ile Ile Leu Pro Asn Lys Val Asp Gln Phe Gly Gln Asn Val Val Ser
100 105 110
Gln Val Ala Gln Leu Val Lys Gln Cys Asn Ala Val Cys Arg Gly His
115 120 125
Gln Asp Thr Pro Glu Leu Glu Gln Phe Ile Asn Gln Lys Asn Pro Thr
130 135 140
Trp Ile Leu Gln Pro Asn Tyr Thr Thr Lys Leu Thr Asn Leu His Glu
145 150 155 160
Ile Asp Ser Ile Ile Pro Leu Val Asp Tyr Pro Gly Phe Ser Lys Ser
165 170 175
Cys Thr Arg Phe Pro Ser Phe Ser Glu Gly Ser Lys Phe Trp Cys Phe
180 185 190
Thr Tyr Ala Val Val Lys Glu Pro Cys Ser Asp Ile Ser Ser Ser Ile
195 200 205
Gln Val Val Lys Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Asn His Ser Asp Gly Asn
210 215 220
Pro Tyr Leu Val Leu Gly Thr Lys Val Leu Asp Asp Gly Lys Phe Arg
225 230 235 240
Arg Gly Cys Ser Ile Thr Ser Ser Leu Tyr Gly Cys Tyr Leu Leu Cys
245 250 255
Ser Thr Ala Asn Val Ser Glu Val Asn Asp Tyr Ala His Thr Pro Ala
260 265 270
Tyr Pro Leu Thr Leu Glu Leu Ile Ser Lys Asp Gly Ile Thr Thr Asp
275 280 285
Leu Ser Pro Thr Tyr Thr Val Gln Leu Asp Lys Trp Ser Ala Leu Tyr
290 295 300
Pro Gly Ile Gly Ser Gly Val Ile Phe Lys Gly Tyr Leu Met Phe Pro
305 310 315 320
Val Tyr Gly Gly Leu Pro Phe Lys Ser Pro Leu Ile Ser Ala Ser Trp
325 330 335
Val Gly Pro Gly Asn Lys Trp Pro Val Asp Phe Ser Cys Ser Glu Asp
340 345 350
Gln Tyr Ser Thr Phe Asn Phe Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Leu Tyr Ser
355 360 365
Pro His Phe Ser Asn Asn Ile Val Val Ser Ala Leu Phe Val Cys Pro
370 375 380
Leu Asn Glu Asn Leu Pro Tyr Ser Cys Glu Val Gln Val Leu Pro Gln
385 390 395 400
Gly Asn Leu Thr Ile Gly Ala Glu Gly Arg Leu Tyr Val Ile Asp Gln
405 410 415
Asp Leu Tyr Tyr Tyr Gln Arg Ser Thr Ser Trp Trp Pro Tyr Leu Gln
420 425 430
Leu Tyr Lys Leu Asn Ile Arg Ile Thr Asn Arg Val Phe Arg Val Arg
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Leu Pro Ile Lys Ser Thr Thr Arg Pro Gly Tyr Gly
450 455 460
Asn Cys Thr Tyr Phe Lys Leu Cys Pro His Ile Cys Val Thr Gly Val
465 470 475 480
Tyr Gln Ser Pro Trp Leu Ile Ser Ile Arg Asp Lys Arg Pro His Glu
485 490 495
Glu Lys Asn Ile Leu Tyr Phe Ile Gly Trp Ser Pro Asp Glu Gln Ile
500 505 510
Arg Gln Asn Pro Leu Val Ser Leu Cys His Glu Thr Ala Cys Phe Ile
515 520 525
Asn Arg Ser Leu Ala Thr Asn Lys Thr His Ala Gly Tyr Ser Glu Ser
530 535 540
His Cys Val Gln Ser Phe Glu Arg Asn Lys Leu Thr Cys Thr Val Phe
545 550 555 560
Tyr Glu Leu Thr Ala Lys Pro Trp Ala Glu Met Arg Val Gln Ser Leu
565 570 575
Leu Phe Gln Val Asp Phe Leu
580
<210> 120
<211> 580
<212> PRT
<213> 吐霍科病毒1（Tuhoko virus 1）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 120
Met Asp Ser Arg Ser Asp Ser Phe Thr Asp Ile Pro Leu Asp Asn Arg
1 5 10 15
Ile Glu Arg Thr Val Thr Ser Lys Lys Thr Trp Arg Ser Ile Phe Arg
20 25 30
Val Thr Ala Ile Ile Leu Leu Ile Ile Cys Val Val Val Ser Ser Ile
35 40 45
Ser Leu Asn Gln His Asn Asp Ala Pro Leu Asn Gly Ala Gly Asn Gln
50 55 60
Ala Thr Ser Gly Phe Met Asp Ala Ile Lys Ser Leu Glu Lys Leu Met
65 70 75 80
Ser Gln Thr Ile Asn Glu Leu Asn Gln Val Val Met Thr Thr Ser Val
85 90 95
Gln Leu Pro Asn Arg Ile Thr Lys Phe Gly Gln Asp Ile Leu Asp Gln
100 105 110
Val Thr Gln Met Val Arg Gln Cys Asn Ala Val Cys Arg Gly Pro Gly
115 120 125
Val Gly Pro Ser Ile Gln Asn Tyr Val Ile Gln Gly His Ala Pro Thr
130 135 140
Val Ser Phe Asp Pro Ile Ser Ala Glu Tyr Gln Lys Phe Val Phe Gly
145 150 155 160
Ile Thr Glu Lys Thr Leu Ile Thr Ala Tyr His Asn Pro Trp Glu Cys
165 170 175
Leu Arg Phe Pro Ser Gln His Leu Phe Asp Thr Thr Trp Cys Val Ser
180 185 190
Tyr Gln Ile Leu Thr Gln Asn Cys Ser Asp His Gly Pro Arg Ile Thr
195 200 205
Val Ile Gln Leu Gly Glu Ile Met Ile Ala Asn Asn Leu Ser Thr Val
210 215 220
Phe Arg Asp Pro Val Ile Lys Tyr Ile Arg His His Ile Trp Leu Arg
225 230 235 240
Ser Cys Ser Val Val Ala Tyr Tyr Ser Gln Cys Thr Ile Phe Cys Thr
245 250 255
Ser Thr Asn Lys Ser Glu Pro Ser Asp Tyr Ala Asp Thr Gly Tyr Glu
260 265 270
Gln Leu Phe Leu Ala Thr Leu Gln Ser Asp Gly Thr Phe Thr Glu His
275 280 285
Ser Met His Gly Val Asn Ile Val His Gln Trp Asn Ala Ile Tyr Gly
290 295 300
Gly Val Gly Asn Gly Val Ile Ile Gly Arg Asn Met Leu Ile Pro Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Gly Ile Asn Tyr Tyr Asp His Asn Thr Thr Ile Val Gln Thr
325 330 335
Val Asp Leu Arg Pro Tyr Pro Ile Pro Asp Ser Cys Ser Gln Thr Asp
340 345 350
Asn Tyr Gln Thr Asn Tyr Leu Pro Ser Met Phe Thr Asn Ser Tyr Tyr
355 360 365
Gly Thr Asn Leu Val Val Ser Gly Tyr Leu Ser Cys Arg Leu Met Ala
370 375 380
Gly Thr Pro Thr Ser Cys Ser Ile Arg Val Ile Pro Ile Glu Asn Met
385 390 395 400
Thr Met Gly Ser Glu Gly Gln Phe Tyr Leu Ile Asn Asn Gln Leu Tyr
405 410 415
Tyr Tyr Lys Arg Ser Ser Asn Trp Ile Arg Asp Thr Gln Val Tyr Leu
420 425 430
Leu Ser Tyr Ser Asp Lys Gly Asn Ile Ile Glu Ile Thr Ser Ala Glu
435 440 445
Arg Tyr Ile Phe Lys Ser Val Thr Ser Pro Asp Glu Gly Asp Cys Val
450 455 460
Thr Asn His Gly Cys Pro Ser Asn Cys Ile Gly Gly Leu Phe Gln Ala
465 470 475 480
Pro Trp Ile Leu Asn Asp Phe Lys Leu Cys Gly Ser Asn Ile Thr Cys
485 490 495
Pro Lys Ile Val Thr Val Trp Ala Asp Gln Pro Asp Lys Arg Ser Asn
500 505 510
Pro Met Leu Ser Ile Ala Glu Thr Asp Lys Leu Leu Leu His Lys Ser
515 520 525
Tyr Ile Asn Tyr His Thr Ala Val Gly Tyr Ser Thr Val Leu Cys Phe
530 535 540
Asp Ser Pro Lys Leu Asn Leu Lys Thr Cys Val Val Leu Gln Glu Leu
545 550 555 560
Met Ser Asp Asp Lys Leu Leu Ile Arg Ile Ser Tyr Ser Ile Val Ser
565 570 575
Ile Met Val Glu
580
<210> 121
<211> 607
<212> PRT
<213> 海豹瘟热病毒（Phocine distemper virus）
<400> 121
Met Phe Ser His Gln Asp Lys Val Gly Ala Phe Tyr Lys Asn Asn Ala
1 5 10 15
Arg Ala Asn Ser Ser Lys Leu Ser Leu Val Thr Asp Glu Val Glu Glu
20 25 30
Arg Arg Ser Pro Trp Phe Leu Ser Ile Leu Leu Ile Leu Leu Val Gly
35 40 45
Ile Leu Ile Leu Leu Ala Ile Thr Gly Ile Arg Phe His Gln Val Val
50 55 60
Lys Ser Asn Leu Glu Phe Asn Lys Leu Leu Ile Glu Asp Met Glu Lys
65 70 75 80
Thr Lys Ala Val His His Gln Val Lys Asp Val Leu Thr Pro Leu Phe
85 90 95
Lys Ile Ile Gly Asp Glu Val Gly Leu Arg Leu Pro Gln Lys Leu Asn
100 105 110
Glu Ile Lys Gln Phe Ile Val Gln Lys Thr Asn Phe Phe Asn Pro Asn
115 120 125
Arg Glu Phe Asp Phe Arg Glu Leu His Trp Cys Ile Asn Pro Pro Ser
130 135 140
Lys Val Lys Val Asn Phe Thr Gln Tyr Cys Glu Ile Thr Glu Phe Lys
145 150 155 160
Glu Ala Thr Arg Ser Val Ala Asn Ser Ile Leu Leu Leu Thr Leu Tyr
165 170 175
Arg Gly Arg Asp Asp Ile Phe Pro Pro Tyr Lys Cys Arg Gly Ala Thr
180 185 190
Thr Ser Met Gly Asn Val Phe Pro Leu Ala Val Ser Leu Ser Met Ser
195 200 205
Leu Ile Ser Lys Pro Ser Glu Val Ile Asn Met Leu Thr Ala Ile Ser
210 215 220
Glu Gly Ile Tyr Gly Lys Thr Tyr Leu Leu Val Thr Asp Asp Thr Glu
225 230 235 240
Glu Asn Phe Glu Thr Pro Glu Ile Arg Val Phe Glu Ile Gly Phe Ile
245 250 255
Asn Arg Trp Leu Gly Asp Met Pro Leu Phe Gln Thr Thr Asn Tyr Arg
260 265 270
Ile Ile Ser Asn Asn Ser Asn Thr Lys Ile Cys Thr Ile Ala Val Gly
275 280 285
Glu Leu Ala Leu Ala Ser Leu Cys Thr Lys Glu Ser Thr Ile Leu Leu
290 295 300
Asn Leu Gly Asp Glu Glu Ser Gln Asn Ser Val Leu Val Val Ile Leu
305 310 315 320
Gly Leu Phe Gly Ala Thr His Met Asp Gln Leu Glu Glu Val Ile Pro
325 330 335
Val Ala His Pro Ser Ile Glu Lys Ile His Ile Thr Asn His Arg Gly
340 345 350
Phe Ile Lys Asp Ser Val Ala Thr Trp Met Val Pro Ala Leu Ala Leu
355 360 365
Ser Glu Gln Gly Glu Gln Ile Asn Cys Leu Arg Ser Ala Cys Lys Arg
370 375 380
Arg Thr Tyr Pro Met Cys Asn Gln Thr Ser Trp Glu Pro Phe Gly Asp
385 390 395 400
Lys Arg Leu Pro Ser Tyr Gly Arg Leu Thr Leu Ser Leu Asp Val Ser
405 410 415
Thr Asp Leu Ser Ile Asn Val Ser Val Ala Gln Gly Pro Ile Ile Phe
420 425 430
Asn Gly Asp Gly Met Asp Tyr Tyr Glu Gly Thr Leu Leu Asn Ser Gly
435 440 445
Trp Leu Thr Ile Pro Pro Lys Asn Gly Thr Ile Leu Gly Leu Ile Asn
450 455 460
Gln Ala Ser Lys Gly Asp Gln Phe Ile Val Thr Pro His Ile Leu Thr
465 470 475 480
Phe Ala Pro Arg Glu Ser Ser Thr Asp Cys His Leu Pro Ile Gln Thr
485 490 495
Tyr Gln Ile Gln Asp Asp Asp Val Leu Leu Glu Ser Asn Leu Val Val
500 505 510
Leu Pro Thr Gln Ser Phe Glu Tyr Val Val Ala Thr Tyr Asp Val Ser
515 520 525
Arg Ser Asp His Ala Ile Val Tyr Tyr Val Tyr Asp Pro Ala Arg Thr
530 535 540
Val Ser Tyr Thr Tyr Pro Phe Arg Leu Arg Thr Lys Gly Arg Pro Asp
545 550 555 560
Ile Leu Arg Ile Glu Cys Phe Val Trp Asp Gly His Leu Trp Cys His
565 570 575
Gln Phe Tyr Arg Phe Gln Leu Asp Ala Thr Asn Ser Thr Ser Val Val
580 585 590
Glu Asn Leu Ile Arg Ile Arg Phe Ser Cys Asp Arg Leu Asp Pro
595 600 605
<210> 122
<211> 574
<212> PRT
<213> 山羊副流感病毒3（Caprine parainfluenza virus 3）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶
<400> 122
Met Glu Tyr Trp Gly His Thr Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asn Arg Lys
1 5 10 15
Val Gly Val Asp Gln Val Arg Asp Arg Ser Lys Thr Leu Lys Ile Ile
20 25 30
Thr Phe Ile Ile Ser Met Met Thr Ser Ile Met Ser Thr Val Ala Leu
35 40 45
Ile Leu Ile Leu Ile Met Phe Ile Gln Asn Asn Asn Asn Asn Arg Ile
50 55 60
Ile Leu Gln Glu Leu Arg Asp Glu Thr Asp Ala Ile Glu Ala Arg Ile
65 70 75 80
Gln Lys Ala Ser Asn Asp Ile Gly Val Ser Ile Gln Ser Gly Ile Asn
85 90 95
Thr Arg Leu Leu Thr Ile Gln Asn His Val Gln Asn Tyr Ile Pro Leu
100 105 110
Ala Leu Thr Gln Gln Val Ser Ser Leu Arg Glu Ser Ile Asn Asp Val
115 120 125
Ile Thr Lys Arg Glu Glu Thr Gln Ser Lys Met Pro Ile Gln Arg Met
130 135 140
Thr His Asp Asp Gly Ile Glu Pro Leu Ile Pro Asp Asn Phe Trp Lys
145 150 155 160
Cys Pro Ser Gly Ile Pro Thr Ile Ser Ala Ser Pro Lys Ile Arg Leu
165 170 175
Ile Pro Gly Pro Gly Leu Leu Ala Thr Ser Thr Thr Ile Asn Gly Cys
180 185 190
Ile Arg Leu Pro Ser Leu Val Ile Asn Asn Leu Ile Tyr Ala Tyr Thr
195 200 205
Ser Asn Leu Ile Thr Gln Gly Cys Gln Asp Ile Gly Lys Ser Tyr Gln
210 215 220
Val Leu Gln Ile Gly Ile Ile Thr Ile Asn Ser Asp Leu Val Pro Asp
225 230 235 240
Leu Asn Pro Arg Ile Thr His Thr Phe Asp Ile Asp Asp Asn Arg Lys
245 250 255
Ser Cys Ser Leu Ala Leu Arg Asn Ala Asp Val Tyr Gln Leu Cys Ser
260 265 270
Thr Pro Lys Val Asp Glu Arg Ser Asp Tyr Ser Ser Ile Gly Ile Glu
275 280 285
Asp Ile Val Leu Asp Ile Val Thr Ser Glu Gly Thr Val Ser Thr Thr
290 295 300
Arg Phe Thr Asn Asn Asn Ile Thr Phe Asp Lys Pro Tyr Ala Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Pro Ser Val Gly Pro Gly Ile Tyr Tyr Asp Asn Lys Ile Ile Phe
325 330 335
Leu Gly Tyr Gly Gly Leu Glu His Glu Glu Asn Gly Asp Val Ile Cys
340 345 350
Asn Ile Thr Gly Cys Pro Gly Lys Thr Gln His Asp Cys Asn Gln Ala
355 360 365
Ser Tyr Ser Pro Trp Phe Ser Asn Arg Arg Met Val Asn Ala Ile Ile
370 375 380
Leu Val Asn Lys Gly Leu Asn Lys Val Pro Ser Leu Gln Val Trp Thr
385 390 395 400
Ile Pro Met Arg Gln Asn Tyr Trp Gly Ser Glu Gly Arg Leu Leu Leu
405 410 415
Leu Gly Asn Lys Ile Tyr Ile Tyr Thr Arg Ser Thr Ser Trp His Ser
420 425 430
Lys Leu Gln Leu Gly Thr Leu Asp Ile Ser Asn Tyr Asn Asp Ile Arg
435 440 445
Ile Arg Trp Thr His His Asp Val Leu Ser Arg Pro Gly Ser Glu Glu
450 455 460
Cys Pro Trp Gly Asn Thr Cys Pro Arg Gly Cys Ile Thr Gly Val Tyr
465 470 475 480
Asn Asp Ala Tyr Pro Leu Asn Pro Ser Gly Ser Val Val Ser Ser Val
485 490 495
Ile Leu Asp Ser Arg Thr Ser Arg Glu Asn Pro Ile Ile Thr Tyr Ser
500 505 510
Thr Asp Thr Ser Arg Val Asn Glu Leu Ala Ile Arg Asn Asn Thr Leu
515 520 525
Ser Ala Ala Tyr Thr Thr Thr Asn Cys Val Thr His Tyr Gly Lys Gly
530 535 540
Tyr Cys Phe His Ile Ile Glu Ile Asn His Lys Ser Leu Asn Thr Leu
545 550 555 560
Gln Pro Met Leu Phe Lys Thr Glu Ile Pro Lys Ser Cys Asn
565 570
<210> 123
<211> 414
<212> PRT
<213> 禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 123
Met Gly Ser Glu Leu Tyr Ile Ile Glu Gly Val Ser Ser Ser Glu Ile
1 5 10 15
Val Leu Lys Gln Val Leu Arg Arg Ser Lys Lys Ile Leu Leu Gly Leu
20 25 30
Val Leu Ser Ala Leu Gly Leu Thr Leu Thr Ser Thr Ile Val Ile Ser
35 40 45
Ile Cys Ile Ser Val Glu Gln Val Lys Leu Arg Gln Cys Val Asp Thr
50 55 60
Tyr Trp Ala Glu Asn Gly Ser Leu His Pro Gly Gln Ser Thr Glu Asn
65 70 75 80
Thr Ser Thr Arg Gly Lys Thr Thr Thr Lys Asp Pro Arg Arg Leu Gln
85 90 95
Ala Thr Gly Ala Gly Lys Phe Glu Ser Cys Gly Tyr Val Gln Val Val
100 105 110
Asp Gly Asp Met His Asp Arg Ser Tyr Ala Val Leu Gly Gly Val Asp
115 120 125
Cys Leu Gly Leu Leu Ala Leu Cys Glu Ser Gly Pro Ile Cys Gln Gly
130 135 140
Asp Thr Trp Ser Glu Asp Gly Asn Phe Cys Arg Cys Thr Phe Ser Ser
145 150 155 160
His Gly Val Ser Cys Cys Lys Lys Pro Lys Ser Lys Ala Thr Thr Ala
165 170 175
Gln Arg Asn Ser Lys Pro Ala Asn Ser Lys Ser Thr Pro Pro Val His
180 185 190
Ser Asp Arg Ala Ser Lys Glu His Asn Pro Ser Gln Gly Glu Gln Pro
195 200 205
Arg Arg Gly Pro Thr Ser Ser Lys Thr Thr Ile Ala Ser Thr Pro Ser
210 215 220
Thr Glu Asp Thr Ala Lys Pro Thr Ile Ser Lys Pro Lys Leu Thr Ile
225 230 235 240
Arg Pro Ser Gln Arg Gly Pro Ser Gly Ser Thr Lys Ala Ala Ser Ser
245 250 255
Thr Pro Ser His Lys Thr Asn Thr Arg Gly Thr Ser Lys Thr Thr Asp
260 265 270
Gln Arg Pro Arg Thr Gly Pro Thr Pro Glu Arg Pro Arg Gln Thr His
275 280 285
Ser Thr Ala Thr Pro Pro Pro Thr Thr Pro Ile His Lys Gly Arg Ala
290 295 300
Pro Thr Pro Lys Pro Thr Thr Asp Leu Lys Val Asn Pro Arg Glu Gly
305 310 315 320
Ser Thr Ser Pro Thr Ala Ile Gln Lys Asn Pro Thr Thr Gln Ser Asn
325 330 335
Leu Val Asp Cys Thr Leu Ser Asp Pro Asp Glu Pro Gln Arg Ile Cys
340 345 350
Tyr Gln Val Gly Thr Tyr Asn Pro Ser Gln Ser Gly Thr Cys Asn Ile
355 360 365
Glu Val Pro Lys Cys Ser Thr Tyr Gly His Ala Cys Met Ala Thr Leu
370 375 380
Tyr Asp Thr Pro Phe Asn Cys Trp Arg Arg Thr Arg Arg Cys Ile Cys
385 390 395 400
Asp Ser Gly Gly Glu Leu Ile Glu Trp Cys Cys Thr Ser Gln
405 410
<210> 124
<211> 665
<212> PRT
<213> 树鼩副粘病毒（Tupaia paramyxovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素
<400> 124
Met Asp Tyr His Ser His Thr Thr Gln Thr Gly Ser Asn Glu Thr Leu
1 5 10 15
Tyr Gln Asp Pro Leu Gln Ser Gln Ser Gly Ser Arg Asp Thr Leu Asp
20 25 30
Gly Pro Pro Ser Thr Leu Gln His Tyr Ser Asn Pro Pro Pro Tyr Ser
35 40 45
Glu Glu Asp Gln Gly Ile Asp Gly Pro Gln Arg Ser Gln Pro Leu Ser
50 55 60
Thr Pro His Gln Tyr Asp Arg Tyr Tyr Gly Val Asn Ile Gln His Thr
65 70 75 80
Arg Val Tyr Asn His Leu Gly Thr Ile Tyr Lys Gly Leu Lys Leu Ala
85 90 95
Phe Gln Ile Leu Gly Trp Val Ser Val Ile Ile Thr Met Ile Ile Thr
100 105 110
Val Thr Thr Leu Lys Lys Met Ser Asp Gly Asn Ser Gln Asp Ser Ala
115 120 125
Met Leu Lys Ser Leu Asp Glu Asn Phe Asp Ala Ile Gln Glu Val Ala
130 135 140
Asn Leu Leu Asp Asn Glu Val Arg Pro Lys Leu Gly Val Thr Met Thr
145 150 155 160
Gln Thr Thr Phe Gln Leu Pro Lys Glu Leu Ser Glu Ile Lys Arg Tyr
165 170 175
Leu Leu Arg Leu Glu Arg Asn Cys Pro Val Cys Gly Thr Glu Ala Thr
180 185 190
Pro Gln Gly Ser Lys Gly Asn Ala Ser Gly Asp Thr Ala Phe Cys Pro
195 200 205
Pro Cys Leu Thr Arg Gln Cys Ser Glu Asp Ser Thr His Asp Gln Gly
210 215 220
Pro Gly Val Glu Gly Thr Ser Arg Asn His Lys Gly Lys Ile Asn Phe
225 230 235 240
Pro His Ile Leu Gln Ser Asp Asp Cys Gly Arg Ser Asp Asn Leu Ile
245 250 255
Val Tyr Ser Ile Asn Leu Val Pro Gly Leu Ser Phe Ile Gln Leu Pro
260 265 270
Ser Gly Thr Lys His Cys Ile Ile Asp Val Ser Tyr Thr Phe Ser Asp
275 280 285
Thr Leu Ala Gly Tyr Leu Ile Val Gly Gly Val Asp Gly Cys Gln Leu
290 295 300
His Asn Lys Ala Ile Ile Tyr Leu Ser Leu Gly Tyr Tyr Lys Thr Lys
305 310 315 320
Met Ile Tyr Pro Pro Asp Tyr Ile Ala Ile Ala Thr Tyr Thr Tyr Asp
325 330 335
Leu Val Pro Asn Leu Arg Asp Cys Ser Ile Ala Val Asn Gln Thr Ser
340 345 350
Leu Ala Ala Ile Cys Thr Ser Lys Lys Thr Lys Glu Asn Gln Asp Phe
355 360 365
Ser Thr Ser Gly Val His Pro Phe Tyr Ile Phe Thr Leu Asn Thr Asp
370 375 380
Gly Ile Phe Thr Val Thr Val Ile Glu Gln Ser Gln Leu Lys Leu Asp
385 390 395 400
Tyr Gln Tyr Ala Ala Leu Tyr Pro Ala Thr Gly Pro Gly Ile Phe Ile
405 410 415
Gly Asp His Leu Val Phe Leu Met Trp Gly Gly Leu Met Thr Lys Ala
420 425 430
Glu Gly Asp Ala Tyr Cys Gln Ala Ser Gly Cys Asn Asp Ala His Arg
435 440 445
Thr Ser Cys Asn Ile Ala Gln Met Pro Ser Ala Tyr Gly His Arg Gln
450 455 460
Leu Val Asn Gly Leu Leu Met Leu Pro Ile Lys Glu Leu Gly Ser His
465 470 475 480
Leu Ile Gln Pro Ser Leu Glu Thr Ile Ser Pro Lys Ile Asn Trp Ala
485 490 495
Gly Gly His Gly Arg Leu Tyr Tyr Asn Trp Glu Ile Asn Thr Thr Tyr
500 505 510
Ile Tyr Ile Glu Gly Lys Thr Trp Arg Ser Arg Pro Asn Leu Gly Ile
515 520 525
Ile Ser Trp Ser Lys Pro Leu Ser Ile Arg Trp Ile Asp His Ser Val
530 535 540
Ala Arg Arg Pro Gly Ala Arg Pro Cys Asp Ser Ala Asn Asp Cys Pro
545 550 555 560
Glu Asp Cys Leu Val Gly Gly Tyr Tyr Asp Met Phe Pro Met Ser Ser
565 570 575
Asp Tyr Lys Thr Ala Ile Thr Ile Ile Pro Thr His His Gln Trp Pro
580 585 590
Ser Ser Pro Ala Leu Lys Leu Phe Asn Thr Asn Arg Glu Val Arg Val
595 600 605
Val Met Ile Leu Arg Pro Pro Asn Asn Val Lys Lys Thr Thr Ile Ser
610 615 620
Cys Ile Arg Ile Met Gln Thr Asn Trp Cys Leu Gly Phe Ile Ile Phe
625 630 635 640
Lys Glu Gly Asn Asn Ala Trp Gly Gln Ile Tyr Ser Tyr Ile Tyr Gln
645 650 655
Val Glu Ser Thr Cys Pro Asn Thr Lys
660 665
<210> 125
<211> 585
<212> PRT
<213> 禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 125
Met Glu Val Lys Val Glu Asn Val Gly Lys Ser Gln Glu Leu Lys Val
1 5 10 15
Lys Val Lys Asn Phe Ile Lys Arg Ser Asp Cys Lys Lys Lys Leu Phe
20 25 30
Ala Leu Ile Leu Gly Leu Val Ser Phe Glu Leu Thr Met Asn Ile Met
35 40 45
Leu Ser Val Met Tyr Val Glu Ser Asn Glu Ala Leu Ser Leu Cys Arg
50 55 60
Ile Gln Gly Thr Pro Ala Pro Arg Asp Asn Lys Thr Asn Thr Glu Asn
65 70 75 80
Ala Thr Lys Glu Thr Thr Leu His Thr Thr Thr Thr Thr Arg Asp Pro
85 90 95
Glu Val Arg Glu Thr Lys Thr Thr Lys Pro Gln Ala Asn Glu Gly Ala
100 105 110
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115 120 125
Thr Arg Ala Thr Thr Glu Ala Glu Leu Glu Lys Gln Ser Lys Gln Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Ser Lys Ser Pro Thr Thr Thr Gln Ala Ile Ala Gln Leu Thr Thr Pro
165 170 175
Thr Thr Pro Lys Ala Ser Thr Ala Pro Lys Asn Arg Gln Ala Thr Thr
180 185 190
Lys Lys Thr Glu Thr Asp Thr Thr Thr Ala Ser Arg Ala Arg Asn Thr
195 200 205
Asn Asn Pro Thr Glu Thr Ala Thr Thr Thr Pro Lys Ala Thr Thr Glu
210 215 220
Thr Gly Lys Ser Lys Glu Gly Pro Thr Gln His Thr Thr Lys Glu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Thr Thr Ala Gly Glu Thr Thr Thr Pro Gln Pro Arg Arg Thr
245 250 255
Ala Ser Arg Pro Ala Pro Thr Thr Lys Ile Glu Glu Glu Ala Glu Thr
260 265 270
Thr Lys Thr Arg Thr Thr Lys Ser Thr Gln Thr Ser Thr Gly Pro Pro
275 280 285
Arg Pro Thr Gly Gly Ala Pro Ser Gly Ala Ala Thr Glu Gly Ser Gly
290 295 300
Arg Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Ser Ala Ala Ser Ala Gly Gly Arg
305 310 315 320
Arg Arg Thr Glu Ala Ala Ala Glu Arg Asp Arg Arg Thr Arg Ala Gly
325 330 335
Ala Gly Pro Thr Ala Gly Gly Ala Arg Ala Arg Thr Ala Ala Ala Ser
340 345 350
Glu Arg Gly Ala Asp Thr Ala Gly Ser Ala Gly Gly Gly Pro Gly Gly
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Ala Asp Gly Arg Ala Pro Pro Ala Ala Ala Leu Ala Gly Arg Thr Thr
405 410 415
Glu Ser Ala Ala Gly Ala Ala Gly Asp Ser Gly Arg Ala Gly Thr Ala
420 425 430
Gly Trp Gly Ser Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Gly Gly Asn Ala Ala
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Ser Gly Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Glu Glu Val Gly Val Gly Ser
485 490 495
Gly Leu Trp Arg Gly Arg Tyr Val Cys Gly Pro Cys Gly Glu Ser Val
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Cys Gly Arg Val Glu Cys Thr Cys Gly Gly Gly Ala Gly Leu Leu Ser
565 570 575
Cys Cys Cys Gly Ser Tyr Ser Trp Ser
580 585
<210> 126
<211> 577
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒3（Avian paramyxovirus 3）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 126
Met Glu Ser Pro Pro Ser Gly Lys Asp Ala Pro Ala Phe Arg Glu Pro
1 5 10 15
Lys Arg Thr Cys Arg Leu Cys Tyr Arg Ala Thr Thr Leu Ser Leu Asn
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35 40 45
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115 120 125
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165 170 175
Arg Ile Pro Ser Phe Ser Leu Ser Lys Thr His Trp Cys Tyr Thr His
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195 200 205
Ile Ser Ile Gly Ile Val Asp Thr Gly Leu Asn Asn Glu Pro Tyr Phe
210 215 220
Arg Thr Met Ser Ser Lys Ser Leu Asn Asp Gly Leu Asn Arg Lys Ser
225 230 235 240
Cys Ser Val Thr Ala Ala Ala Asn Ala Cys Trp Leu Leu Cys Ser Val
245 250 255
Val Thr Glu Tyr Glu Ala Ala Asp Tyr Arg Ser Arg Thr Pro Thr Ala
260 265 270
Met Val Leu Gly Arg Phe Asp Phe Asn Gly Glu Tyr Thr Glu Ile Ala
275 280 285
Val Pro Ser Ser Leu Phe Asp Gly Arg Phe Ala Ser Asn Tyr Pro Gly
290 295 300
Val Gly Ser Gly Thr Gln Val Asn Gly Thr Leu Tyr Phe Pro Leu Tyr
305 310 315 320
Gly Gly Val Leu Asn Gly Ser Asp Ile Glu Thr Ala Asn Lys Gly Lys
325 330 335
Ser Phe Arg Pro Gln Asn Pro Lys Asn Arg Cys Pro Asp Ser Glu Ala
340 345 350
Ile Gln Ser Phe Arg Ala Gln Asp Ser Tyr Tyr Pro Thr Arg Phe Gly
355 360 365
Lys Val Leu Ile Gln Gln Ala Ile Ile Ala Cys Arg Ile Ser Asn Lys
370 375 380
Ser Cys Thr Asp Phe Tyr Leu Leu Tyr Phe Asp Asn Asn Arg Val Met
385 390 395 400
Met Gly Ala Glu Ala Arg Leu Tyr Tyr Leu Asn Asn Gln Leu Tyr Leu
405 410 415
Tyr Gln Arg Ser Ser Ser Trp Trp Pro His Pro Leu Phe Tyr Ser Ile
420 425 430
Ser Leu Pro Ser Cys Gln Ala Leu Ala Val Cys Gln Ile Thr Glu Ala
435 440 445
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450 455 460
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Ser Leu Tyr Thr Tyr Asp Arg Arg Ile Lys Ser Lys Leu Ala Val Gly
515 520 525
Ser Asp Ile Gly Ala Ala Tyr Thr Thr Ser Thr Cys Phe Gly Arg Ser
530 535 540
Asp Thr Gly Ala Val Tyr Cys Leu Thr Ile Met Glu Thr Val Asn Thr
545 550 555 560
Ile Phe Gly Gln Tyr Arg Ile Val Pro Ile Leu Leu Arg Val Thr Ser
565 570 575
Arg
<210> 127
<211> 585
<212> PRT
<213> 禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 127
Met Glu Val Lys Val Glu Asn Val Gly Lys Ser Gln Glu Leu Lys Val
1 5 10 15
Lys Val Lys Asn Phe Ile Lys Arg Ser Asp Cys Lys Lys Lys Leu Phe
20 25 30
Ala Leu Ile Leu Gly Leu Val Ser Phe Glu Leu Thr Met Asn Ile Met
35 40 45
Leu Ser Val Met Tyr Val Glu Ser Asn Glu Ala Leu Ser Leu Cys Arg
50 55 60
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100 105 110
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115 120 125
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Arg Arg Arg Ser Ala Ala Asp Arg Arg Pro Thr Gly Gly Ser Thr Ala
435 440 445
Ala Glu Ala Gly Thr Ala Gln Ser Gly Arg Ala Thr Pro Lys Gln Pro
450 455 460
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Gly Asn Thr Ala Pro Pro Asn Asn Glu Ser
465 470 475 480
Ser Gly Arg Ala Asp Ala Ala Pro Ala Glu Glu Ala Gly Val Gly Pro
485 490 495
Ser Ile Arg Arg Gly Arg His Ala Cys Gly Pro Arg Arg Glu Ser Ala
500 505 510
Pro Glu His Pro Thr Asn Pro Cys Pro Gly Asp Gly Thr Ala Trp Thr
515 520 525
Arg Ser Asp Gly Gly Gly Asn Leu Pro Ala Gly Arg His Asp Ser Gly
530 535 540
Ala Asp Gly Ala Ala Arg Arg Gly Ala Arg Gly Gly Asn Pro Arg Arg
545 550 555 560
Arg Gly Arg Ala Glu Arg Thr Arg Gly Gly Gly Ala Gly Pro Pro Ser
565 570 575
Cys Arg Cys Gly Ser His Asn Arg Ser
580 585
<210> 128
<211> 389
<212> PRT
<213> D型禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus type D）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 128
Met Gly Ala Lys Leu Tyr Ala Ile Ser Gly Ala Ser Asp Ala Gln Leu
1 5 10 15
Met Lys Lys Thr Cys Ala Lys Leu Leu Glu Lys Val Val Pro Ile Ile
20 25 30
Ile Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Thr Thr Thr Ile Ala Leu Ser
35 40 45
Ile Ser Ile Ser Ile Glu Arg Ala Val Leu Ser Asp Cys Thr Thr Gln
50 55 60
Leu Arg Asn Gly Thr Thr Ser Gly Ser Leu Ser Asn Pro Thr Arg Ser
65 70 75 80
Thr Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Arg Asp Ile Arg Gly Leu Gln Thr
85 90 95
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100 105 110
Gly Tyr Leu His Asp Ser Ser Asn Pro Val Leu Asp Ser Ile Gly Cys
115 120 125
Leu Gly Leu Leu Ala Leu Cys Glu Ser Gly Pro Phe Cys Gln Arg Asn
130 135 140
Tyr Asn Pro Arg Asp Arg Pro Lys Cys Arg Cys Thr Leu Arg Gly Lys
145 150 155 160
Asp Ile Ser Cys Cys Lys Glu Pro Pro Thr Ala Val Thr Thr Ser Lys
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Thr Ser Ser Asn Pro Glu Gln Gln Thr Glu Pro Pro Pro Ser Pro Gln
225 230 235 240
His Pro Pro Thr Thr Thr Ser Gln Asp Gln Ser Thr Glu Thr Ala Asp
245 250 255
Gly Gln Glu His Thr Pro Thr Arg Lys Thr Pro Thr Ala Thr Ser Asn
260 265 270
Arg Arg Ser Pro Thr Pro Lys Arg Gln Glu Thr Gly Arg Ala Thr Pro
275 280 285
Arg Asn Thr Ala Thr Thr Gln Ser Gly Ser Ser Pro Pro His Ser Ser
290 295 300
Pro Pro Gly Val Asp Ala Asn Met Glu Gly Gln Cys Lys Glu Leu Gln
305 310 315 320
Ala Pro Lys Pro Asn Ser Val Cys Lys Gly Leu Asp Ile Tyr Arg Glu
325 330 335
Ala Leu Pro Arg Gly Cys Asp Lys Val Leu Pro Leu Cys Lys Thr Ser
340 345 350
Thr Ile Met Cys Val Asp Ala Tyr Tyr Ser Lys Pro Pro Ile Cys Phe
355 360 365
Gly Tyr Asn Gln Arg Cys Phe Cys Met Glu Thr Phe Gly Pro Ile Glu
370 375 380
Phe Cys Cys Lys Ser
385
<210> 129
<211> 197
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 129
Met Ser Lys Asn Lys Asn Gln Arg Thr Ala Arg Thr Leu Glu Lys Thr
1 5 10 15
Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Ile Val Ile Ser Ser Cys Leu Tyr Lys
20 25 30
Leu Asn Leu Lys Ser Ile Ala Gln Ile Ala Leu Ser Val Leu Ala Met
35 40 45
Ile Ile Ser Thr Ser Leu Ile Ile Ala Ala Ile Ile Phe Ile Ile Ser
50 55 60
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100 105 110
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130 135 140
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Tyr His Phe Glu Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Gly Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Cys Lys Ser Ile Cys Lys Thr Ile Pro Ser Asn Lys Pro
180 185 190
Arg Lys Asn Gln Pro
195
<210> 130
<211> 580
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒14（Avian paramyxovirus 14）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 130
Met Glu Gly Ser Arg Thr Val Ile Tyr Gln Gly Asp Pro Asn Glu Lys
1 5 10 15
Asn Thr Trp Arg Leu Val Phe Arg Thr Leu Thr Leu Ile Leu Asn Leu
20 25 30
Ala Ile Leu Ser Val Thr Ile Ala Ser Ile Ile Ile Thr Ser Lys Ile
35 40 45
Thr Leu Ser Glu Val Thr Thr Leu Lys Thr Glu Gly Val Glu Glu Val
50 55 60
Ile Thr Pro Leu Met Ala Thr Leu Ser Asp Ser Val Gln Gln Glu Lys
65 70 75 80
Met Ile Tyr Lys Glu Val Ala Ile Ser Ile Pro Leu Val Leu Asp Lys
85 90 95
Ile Gln Thr Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Gln Ile Thr Asp Ala Leu
100 105 110
Arg Gln Ile Gln Gly Val Asn Gly Thr Gln Ala Phe Ala Leu Ser Asn
115 120 125
Ala Pro Glu Tyr Ser Gly Gly Ile Glu Val Pro Leu Phe Gln Ile Asp
130 135 140
Ser Phe Val Asn Lys Ser Met Ser Ile Ser Gly Leu Leu Glu His Ala
145 150 155 160
Ser Phe Ile Pro Ser Pro Thr Thr Leu His Gly Cys Thr Arg Ile Pro
165 170 175
Ser Phe His Leu Gly Pro Arg His Trp Cys Tyr Thr His Asn Ile Ile
180 185 190
Gly Ser Arg Cys Arg Asp Glu Gly Phe Ser Ser Met Tyr Ile Ser Ile
195 200 205
Gly Ala Ile Thr Val Asn Arg Asp Gly Asn Pro Leu Phe Ile Thr Thr
210 215 220
Ala Ser Thr Ile Leu Ala Asp Asp Asn Asn Arg Lys Ser Cys Ser Ile
225 230 235 240
Ile Ala Ser Ser Tyr Gly Cys Asp Leu Leu Cys Ser Ile Val Thr Glu
245 250 255
Ser Glu Asn Asp Asp Tyr Ala Asn Pro Asn Pro Thr Lys Met Val His
260 265 270
Gly Arg Phe Leu Tyr Asn Gly Ser Tyr Val Glu Gln Ala Leu Pro Asn
275 280 285
Ser Leu Phe Gln Asp Lys Trp Val Ala Gln Tyr Pro Gly Val Gly Ser
290 295 300
Gly Ile Thr Thr His Gly Lys Val Leu Phe Pro Ile Tyr Gly Gly Ile
305 310 315 320
Lys Lys Asn Thr Gln Leu Phe Tyr Glu Leu Ser Lys Tyr Gly Phe Phe
325 330 335
Ala His Asn Lys Glu Leu Glu Cys Lys Asn Met Thr Glu Glu Gln Ile
340 345 350
Arg Asp Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Pro Ser Lys Thr Ser Gly Asn Leu
355 360 365
Phe Ala Gln Gly Ile Ile Tyr Cys Asn Ile Ser Lys Leu Gly Asp Cys
370 375 380
Asn Val Ala Val Leu Asn Thr Ser Thr Thr Met Met Gly Ala Glu Gly
385 390 395 400
Arg Leu Gln Met Met Gly Glu Tyr Val Tyr Tyr Tyr Gln Arg Ser Ser
405 410 415
Ser Trp Trp Pro Val Gly Ile Val Tyr Lys Lys Ser Leu Ala Glu Leu
420 425 430
Met Asn Gly Ile Asn Met Glu Val Leu Ser Phe Glu Pro Ile Pro Leu
435 440 445
Ser Lys Phe Pro Arg Pro Thr Trp Thr Ala Gly Leu Cys Gln Lys Pro
450 455 460
Ser Ile Cys Pro Asp Val Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Leu Phe
465 470 475 480
Ser Val Thr Ile Gly Ser Thr Thr Asp Lys Asp Thr Tyr Phe Gly Val
485 490 495
Tyr Leu Asp Ser Ala Thr Glu Arg Lys Asp Pro Trp Val Ala Ala Ala
500 505 510
Asp Gln Tyr Glu Trp Arg Asn Arg Val Arg Leu Phe Glu Ser Thr Thr
515 520 525
Glu Ala Ala Tyr Thr Thr Ser Thr Cys Phe Lys Asn Thr Val Asn Asn
530 535 540
Arg Val Phe Cys Val Ser Ile Val Glu Leu Arg Glu Asn Leu Leu Gly
545 550 555 560
Asp Trp Lys Ile Val Pro Leu Leu Phe Gln Ile Gly Val Ser Gln Gly
565 570 575
Pro Pro Pro Lys
580
<210> 131
<211> 1046
<212> PRT
<213> 北龙病毒（Beilong virus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 附着糖蛋白
<400> 131
Met Ser Gln Leu Ala Ala His Asn Leu Ala Met Ser Asn Phe Tyr Gly
1 5 10 15
Thr His Gln Gly Asp Leu Ser Gly Ser Gln Lys Gly Glu Glu Gln Gln
20 25 30
Val Gln Gly Val Ile Arg Tyr Val Ser Met Ile Val Gly Leu Leu Ser
35 40 45
Leu Phe Thr Ile Ile Ala Leu Asn Val Thr Asn Ile Ile Tyr Met Thr
50 55 60
Glu Ser Gly Gly Thr Met Gln Ser Ile Lys Thr Ala Gln Gly Ser Ile
65 70 75 80
Asp Gly Ser Met Arg Glu Ile Ser Gly Val Ile Met Glu Asp Val Lys
85 90 95
Pro Lys Thr Asp Leu Ile Asn Ser Met Val Ser Tyr Asn Ile Pro Ala
100 105 110
Gln Leu Ser Met Ile His Gln Ile Ile Lys Asn Asp Val Leu Lys Gln
115 120 125
Cys Thr Pro Ser Phe Met Phe Asn Asn Thr Ile Cys Pro Leu Ala Glu
130 135 140
Asn Pro Thr His Ser Arg Tyr Phe Glu Glu Val Asn Leu Asp Ser Ile
145 150 155 160
Ser Glu Cys Ser Gly Pro Asp Met His Leu Gly Leu Gly Val Asn Pro
165 170 175
Glu Phe Ile Glu Phe Pro Ser Phe Ala Pro Gly Ser Thr Lys Pro Gly
180 185 190
Ser Cys Val Arg Leu Pro Ser Phe Ser Leu Ser Thr Thr Val Phe Ala
195 200 205
Tyr Thr His Thr Ile Met Gly His Gly Cys Ser Glu Leu Asp Val Gly
210 215 220
Asp His Tyr Phe Ser Val Gly Arg Ile Ala Asp Ala Gly His Glu Ile
225 230 235 240
Pro Gln Phe Glu Thr Ile Ser Ser Trp Phe Ile Asn Asp Lys Ile Asn
245 250 255
Arg Arg Ser Cys Thr Val Ala Ala Gly Ala Met Glu Ala Trp Met Gly
260 265 270
Cys Val Ile Met Thr Glu Thr Phe Tyr Asp Asp Leu Asn Ser Leu Asp
275 280 285
Thr Gly Lys Leu Thr Ile Ser Tyr Leu Asp Val Phe Gly Arg Lys Lys
290 295 300
Glu Trp Ile Tyr Thr Arg Ser Glu Ile Leu Tyr Asp Tyr Thr Tyr Thr
305 310 315 320
Ser Val Tyr Phe Ser Val Gly Ser Gly Val Val Val Gly Asp Thr Val
325 330 335
Tyr Phe Leu Ile Trp Gly Ser Leu Ser Ser Pro Ile Glu Glu Thr Ala
340 345 350
Tyr Cys Phe Ala Pro Asp Cys Ser Asn Tyr Asn Gln Arg Met Cys Asn
355 360 365
Glu Ala Gln Arg Pro Ser Lys Phe Gly His Arg Gln Met Val Asn Gly
370 375 380
Ile Leu Lys Phe Lys Thr Thr Ser Thr Gly Lys Pro Leu Leu Ser Val
385 390 395 400
Gly Thr Leu Ser Pro Ser Val Val Pro Phe Gly Ser Glu Gly Arg Leu
405 410 415
Met Tyr Ser Glu Ile Thr Lys Ile Ile Tyr Leu Tyr Leu Arg Ser Thr
420 425 430
Ser Trp His Ala Leu Pro Leu Thr Gly Leu Phe Val Leu Gly Pro Pro
435 440 445
Thr Ser Ile Ser Trp Ile Val Gln Arg Ala Val Ser Arg Pro Gly Glu
450 455 460
Phe Pro Cys Gly Ala Ser Asn Arg Cys Pro Lys Asp Cys Val Thr Gly
465 470 475 480
Val Tyr Thr Asp Leu Phe Pro Leu Gly Ser Arg Tyr Glu Tyr Ala Ala
485 490 495
Thr Val Tyr Leu Asn Ser Glu Thr Tyr Arg Val Asn Pro Thr Leu Ala
500 505 510
Leu Ile Asn Gln Thr Asn Ile Ile Ala Ser Lys Lys Val Thr Thr Glu
515 520 525
Ser Gln Arg Ala Gly Tyr Thr Thr Thr Thr Cys Phe Val Phe Lys Leu
530 535 540
Arg Val Trp Cys Ile Ser Val Val Glu Leu Ala Pro Ser Thr Met Thr
545 550 555 560
Ala Tyr Glu Pro Ile Pro Phe Leu Tyr Gln Leu Asp Leu Thr Cys Lys
565 570 575
Gly Lys Asn Gly Ser Leu Ala Met Arg Phe Thr Gly Lys Glu Gly Thr
580 585 590
Tyr Lys Ser Gly Arg Tyr Lys Ser Pro Arg Asn Glu Cys Phe Phe Glu
595 600 605
Lys Val Ser Asn Lys Tyr Tyr Phe Ile Val Ser Thr Pro Glu Gly Ile
610 615 620
Gln Pro Tyr Glu Ile Arg Asp Leu Thr Pro Asp Arg Met Pro His Ile
625 630 635 640
Ile Met Tyr Ile Ser Asp Val Cys Ala Pro Ala Leu Ser Ala Phe Lys
645 650 655
Lys Leu Leu Pro Ala Met Arg Pro Ile Thr Thr Leu Thr Ile Gly Asn
660 665 670
Trp Gln Phe Arg Pro Val Glu Val Ser Gly Gly Leu Arg Val Ser Ile
675 680 685
Gly Arg Asn Leu Thr Lys Glu Gly Asp Leu Thr Met Ser Ala Pro Glu
690 695 700
Asp Pro Gly Ser Asn Thr Phe Pro Gly Gly His Ile Pro Gly Asn Gly
705 710 715 720
Leu Phe Asp Ala Gly Tyr Tyr Thr Val Glu Tyr Pro Lys Glu Trp Lys
725 730 735
Gln Thr Thr Pro Lys Pro Ser Glu Gly Gly Asn Ile Ile Asp Lys Asn
740 745 750
Lys Thr Pro Val Ile Pro Ser Arg Asp Asn Pro Thr Ser Asp Ser Ser
755 760 765
Ile Pro His Arg Glu Ser Ile Glu Pro Val Arg Pro Thr Arg Glu Val
770 775 780
Leu Lys Ser Ser Asp Tyr Val Thr Ile Val Ser Thr Asp Ser Gly Ser
785 790 795 800
Gly Ser Gly Asp Phe Ala Thr Gly Val Pro Trp Thr Gly Val Ser Pro
805 810 815
Lys Ala Pro Gln Asn Gly Ile Asn Leu Pro Gly Thr Glu Leu Pro His
820 825 830
Pro Thr Val Leu Asp Arg Ile Asn Thr Pro Ala Pro Ser Asp Pro Lys
835 840 845
Val Ser Ala Asp Ser Asp His Thr Arg Asp Thr Ile Asp Pro Thr Ala
850 855 860
Leu Ser Lys Pro Leu Asn His Asp Thr Thr Gly Asp Thr Asp Thr Arg
865 870 875 880
Ile Asn Thr Gly Thr Ala Thr Tyr Gly Phe Thr Pro Gly Arg Glu Ala
885 890 895
Thr Ser Ser Gly Lys Leu Ala Asn Asp Leu Thr Asn Ser Thr Ser Val
900 905 910
Pro Ser Glu Ala His Pro Ser Ala Ser Thr Ser Glu Ala Ser Lys Pro
915 920 925
Glu Lys Asn Thr Asp Asn Arg Val Thr Gln Asp Pro Thr Ser Gly Thr
930 935 940
Ala Glu Arg Pro Thr Thr Asn Ala Pro Val Asp Gly Lys His Ser Thr
945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
Ser Thr Thr Glu Ala Ser Thr His Gln Arg Thr Glu Ala Ala Thr Pro
995 1000 1005
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1010 1015 1020
Arg Ser Val Arg Ser Leu Met Gln Asp Ala Ile Ala Gln Ala Trp
1025 1030 1035
Asn Phe Val Arg Gly Val Thr Pro
1040 1045
<210> 132
<211> 618
<212> PRT
<213> 禽副粘病毒UPO216（Avian paramyxovirus UPO216）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 132
Met Glu Arg Gly Ile Ser Glu Val Ala Leu Ala Asn Asp Arg Thr Glu
1 5 10 15
Glu Lys Asn Thr Trp Arg Leu Ile Phe Arg Ile Thr Val Leu Val Val
20 25 30
Ser Val Ile Thr Leu Gly Leu Thr Ala Ala Ser Leu Val Tyr Ser Met
35 40 45
Asn Ala Ala Gln Pro Ala Asp Phe Asp Gly Ile Ile Pro Ala Val Gln
50 55 60
Gln Val Gly Thr Ser Leu Thr Asn Ser Ile Gly Gly Met Gln Asp Val
65 70 75 80
Leu Asp Arg Thr Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Thr Leu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ala Gly Cys Thr Arg Ile Pro
165 170 175
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180 185 190
Leu Ser Gly Cys Gln Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Ile Ala Leu
195 200 205
Gly Val Leu Lys Leu Ser Asp Thr Gly Asn Val Phe Phe Ser Thr Leu
210 215 220
Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Ala Asn Arg Lys Ser Cys Ser Ile
225 230 235 240
Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Ile Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu
245 250 255
Thr Glu Leu Glu Asp Tyr Lys Ser Glu Glu Pro Thr Pro Met Val His
260 265 270
Gly Arg Leu Ser Phe Asp Gly Thr Tyr Ser Glu Lys Asp Leu Asp Val
275 280 285
Asn Asn Leu Phe Ser Asp Trp Thr Ala Asn Tyr Pro Ser Val Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Tyr Ile Gly Asn Arg Val Trp Tyr Ala Val Tyr Gly Gly Leu
305 310 315 320
Lys Pro Gly Ser Asn Thr Asp Gln Ser Gln Arg Asp Lys Tyr Val Ile
325 330 335
Tyr Lys Arg Tyr Asn Asn Thr Cys Pro Asp Pro Glu Asp Tyr Gln Ile
340 345 350
Asn Lys Ala Lys Ser Ser Tyr Thr Pro Ser Tyr Phe Gly Ser Lys Arg
355 360 365
Val Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Ala Val Ser Pro Thr Leu Gly Ser
370 375 380
Asp Pro Val Leu Thr Pro Leu Ser Asn Asp Val Val Leu Met Gly Ala
385 390 395 400
Glu Gly Arg Val Met His Ile Gly Gly Tyr Thr Tyr Leu Tyr Gln Arg
405 410 415
Gly Thr Ser Tyr Tyr Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Leu Asn Ile Gln
420 425 430
Asp Lys Ser Ala Thr Ala Ser Ser Pro Tyr Lys Phe Asp Ala Phe Thr
435 440 445
Arg Pro Gly Ser Val Pro Cys Gln Ala Asp Ala Arg Cys Pro Gln Ser
450 455 460
Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe Ala Lys
465 470 475 480
Asp His Ser Ile Arg Gly Val Tyr Gly Met Met Leu Asn Asp Val Thr
485 490 495
Ala Arg Leu Asn Pro Ile Ala Ala Val Phe Ser Asn Ile Ser Arg Ser
500 505 510
Gln Ile Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr
515 520 525
Ser Thr Cys Phe Lys Val Ile Lys Thr Asn Arg Ile Tyr Cys Met Ser
530 535 540
Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro
545 550 555 560
Leu Leu Val Glu Ile Leu Ser Asn Gly Gly Asn Thr Ala Arg Ser Ala
565 570 575
Gly Gly Thr Pro Val Lys Glu Ser Pro Lys Gly Trp Ser Asp Ala Ile
580 585 590
Ala Glu Pro Leu Phe Cys Thr Pro Thr Asn Val Thr Arg Tyr Asn Ala
595 600 605
Asp Ile Arg Arg Tyr Ala Tyr Ser Trp Pro
610 615
<210> 133
<211> 576
<212> PRT
<213> 大西洋鲑副粘病毒（Atlantic salmon paramyxovirus）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 血球凝集素-神经氨酸酶蛋白
<400> 133
Met Pro Pro Ala Pro Ser Pro Val His Asp Pro Ser Ser Phe Tyr Gly
1 5 10 15
Ser Ser Leu Phe Asn Glu Asp Thr Ala Ser Arg Lys Gly Thr Ser Glu
20 25 30
Glu Ile His Leu Leu Gly Ile Arg Trp Asn Thr Val Leu Ile Val Leu
35 40 45
Gly Leu Ile Leu Ala Ile Ile Gly Ile Gly Ile Gly Ala Ser Ser Phe
50 55 60
Ser Ala Ser Gly Ile Thr Gly Asn Thr Thr Lys Glu Ile Arg Leu Ile
65 70 75 80
Val Glu Glu Met Ser Tyr Gly Leu Val Arg Ile Ser Asp Ser Val Arg
85 90 95
Gln Glu Ile Ser Pro Lys Val Thr Leu Leu Gln Asn Ala Val Leu Ser
100 105 110
Ser Ile Pro Ala Leu Val Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ile Ile Asn Ala
115 120 125
Val Lys Asn His Cys Asn Ser Pro Pro Thr Pro Pro Pro Pro Thr Glu
130 135 140
Ala Pro Leu Lys Lys His Glu Thr Gly Met Ala Pro Leu Asp Pro Thr
145 150 155 160
Thr Tyr Trp Thr Cys Thr Ser Gly Thr Pro Arg Phe Tyr Ser Ser Pro
165 170 175
Asn Ala Thr Phe Ile Pro Gly Pro Ser Pro Leu Pro His Thr Ala Thr
180 185 190
Pro Gly Gly Cys Val Arg Ile Pro Ser Met His Ile Gly Ser Glu Ile
195 200 205
Tyr Ala Tyr Thr Ser Asn Leu Ile Ala Ser Gly Cys Gln Asp Ile Gly
210 215 220
Lys Ser Tyr Gln Asn Val Gln Ile Gly Val Leu Asp Arg Thr Pro Glu
225 230 235 240
Gly Asn Pro Glu Met Ser Pro Met Leu Ser His Thr Phe Pro Ile Asn
245 250 255
Asp Asn Arg Lys Ser Cys Ser Ile Val Thr Leu Lys Arg Ala Ala Tyr
260 265 270
Ile Tyr Cys Ser Gln Pro Lys Val Thr Glu Phe Val Asp Tyr Gln Thr
275 280 285
Pro Gly Ile Glu Pro Met Ser Leu Asp His Ile Asn Ala Asn Gly Thr
290 295 300
Thr Lys Thr Trp Ile Tyr Ser Pro Thr Glu Val Val Thr Asp Val Pro
305 310 315 320
Tyr Ala Ser Met Tyr Pro Ser Val Gly Ser Gly Val Val Ile Asp Gly
325 330 335
Lys Leu Val Phe Leu Val Tyr Gly Gly Leu Leu Asn Gly Ile Gln Val
340 345 350
Pro Ala Met Cys Leu Ser Pro Glu Cys Pro Gly Ile Asp Gln Ala Ala
355 360 365
Cys Asn Ala Ser Gln Tyr Asn Gln Tyr Leu Ser Gly Arg Gln Val Val
370 375 380
Asn Gly Ile Ala Thr Val Asp Leu Met Asn Gly Gln Lys Pro His Ile
385 390 395 400
Ser Val Glu Thr Ile Ser Pro Ser Lys Asn Trp Phe Gly Ala Glu Gly
405 410 415
Arg Leu Val Tyr Met Gly Gly Arg Leu Tyr Ile Tyr Ile Arg Ser Thr
420 425 430
Gly Trp His Ser Pro Ile Gln Ile Gly Val Ile Tyr Thr Met Asn Pro
435 440 445
Leu Ala Ile Thr Trp Val Thr Asn Thr Val Leu Ser Arg Pro Gly Ser
450 455 460
Ala Gly Cys Asp Trp Asn Asn Arg Cys Pro Lys Ala Cys Leu Ser Gly
465 470 475 480
Val Tyr Thr Asp Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Asp Tyr Asn His Leu Ala
485 490 495
Thr Met Ile Leu His Ser Thr Ser Thr Arg Ser Asn Pro Val Met Val
500 505 510
Tyr Ser Ser Pro Thr Asn Met Val Asn Tyr Ala Gln Leu Thr Thr Thr
515 520 525
Ala Gln Ile Ala Gly Tyr Thr Thr Thr Ser Cys Phe Thr Asp Asn Glu
530 535 540
Val Gly Tyr Cys Ala Thr Ala Leu Glu Leu Thr Pro Gly Thr Leu Ser
545 550 555 560
Ser Val Gln Pro Ile Leu Val Met Thr Lys Ile Pro Lys Glu Cys Val
565 570 575
<210> 134
<211> 8797
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SYNE1
<400> 134
Met Ala Thr Ser Arg Gly Ala Ser Arg Cys Pro Arg Asp Ile Ala Asn
1 5 10 15
Val Met Gln Arg Leu Gln Asp Glu Gln Glu Ile Val Gln Lys Arg Thr
20 25 30
Phe Thr Lys Trp Ile Asn Ser His Leu Ala Lys Arg Lys Pro Pro Met
35 40 45
Val Val Asp Asp Leu Phe Glu Asp Met Lys Asp Gly Val Lys Leu Leu
50 55 60
Ala Leu Leu Glu Val Leu Ser Gly Gln Lys Leu Pro Cys Glu Gln Gly
65 70 75 80
Arg Arg Met Lys Arg Ile His Ala Val Ala Asn Ile Gly Thr Ala Leu
85 90 95
Lys Phe Leu Glu Gly Arg Lys Ile Lys Leu Val Asn Ile Asn Ser Thr
100 105 110
Asp Ile Ala Asp Gly Arg Pro Ser Ile Val Leu Gly Leu Met Trp Thr
115 120 125
Ile Ile Leu Tyr Phe Gln Ile Glu Glu Leu Thr Ser Asn Leu Pro Gln
130 135 140
Leu Gln Ser Leu Ser Ser Ser Ala Ser Ser Val Asp Ser Ile Val Ser
145 150 155 160
Ser Glu Thr Pro Ser Pro Pro Ser Lys Arg Lys Val Thr Thr Lys Ile
165 170 175
Gln Gly Asn Ala Lys Lys Ala Leu Leu Lys Trp Val Gln Tyr Thr Ala
180 185 190
Gly Lys Gln Thr Gly Ile Glu Val Lys Asp Phe Gly Lys Ser Trp Arg
195 200 205
Ser Gly Val Ala Phe His Ser Val Ile His Ala Ile Arg Pro Glu Leu
210 215 220
Val Asp Leu Glu Thr Val Lys Gly Arg Ser Asn Arg Glu Asn Leu Glu
225 230 235 240
Asp Ala Phe Thr Ile Ala Glu Thr Glu Leu Gly Ile Pro Arg Leu Leu
245 250 255
Asp Pro Glu Asp Val Asp Val Asp Lys Pro Asp Glu Lys Ser Ile Met
260 265 270
Thr Tyr Val Ala Gln Phe Leu Lys His Tyr Pro Asp Ile His Asn Ala
275 280 285
Ser Thr Asp Gly Gln Glu Asp Asp Glu Ile Leu Pro Gly Phe Pro Ser
290 295 300
Phe Ala Asn Ser Val Gln Asn Phe Lys Arg Glu Asp Arg Val Ile Phe
305 310 315 320
Lys Glu Met Lys Val Trp Ile Glu Gln Phe Glu Arg Asp Leu Thr Arg
325 330 335
Ala Gln Met Val Glu Ser Asn Leu Gln Asp Lys Tyr Gln Ser Phe Lys
340 345 350
His Phe Arg Val Gln Tyr Glu Met Lys Arg Lys Gln Ile Glu His Leu
355 360 365
Ile Gln Pro Leu His Arg Asp Gly Lys Leu Ser Leu Asp Gln Ala Leu
370 375 380
Val Lys Gln Ser Trp Asp Arg Val Thr Ser Arg Leu Phe Asp Trp His
385 390 395 400
Ile Gln Leu Asp Lys Ser Leu Pro Ala Pro Leu Gly Thr Ile Gly Ala
405 410 415
Trp Leu Tyr Arg Ala Glu Val Ala Leu Arg Glu Glu Ile Thr Val Gln
420 425 430
Gln Val His Glu Glu Thr Ala Asn Thr Ile Gln Arg Lys Leu Glu Gln
435 440 445
His Lys Asp Leu Leu Gln Asn Thr Asp Ala His Lys Arg Ala Phe His
450 455 460
Glu Ile Tyr Arg Thr Arg Ser Val Asn Gly Ile Pro Val Pro Pro Asp
465 470 475 480
Gln Leu Glu Asp Met Ala Glu Arg Phe His Phe Val Ser Ser Thr Ser
485 490 495
Glu Leu His Leu Met Lys Met Glu Phe Leu Glu Leu Lys Tyr Arg Leu
500 505 510
Leu Ser Leu Leu Val Leu Ala Glu Ser Lys Leu Lys Ser Trp Ile Ile
515 520 525
Lys Tyr Gly Arg Arg Glu Ser Val Glu Gln Leu Leu Gln Asn Tyr Val
530 535 540
Ser Phe Ile Glu Asn Ser Lys Phe Phe Glu Gln Tyr Glu Val Thr Tyr
545 550 555 560
Gln Ile Leu Lys Gln Thr Ala Glu Met Tyr Val Lys Ala Asp Gly Ser
565 570 575
Val Glu Glu Ala Glu Asn Val Met Lys Phe Met Asn Glu Thr Thr Ala
580 585 590
Gln Trp Arg Asn Leu Ser Val Glu Val Arg Ser Val Arg Ser Met Leu
595 600 605
Glu Glu Val Ile Ser Asn Trp Asp Arg Tyr Gly Asn Thr Val Ala Ser
610 615 620
Leu Gln Ala Trp Leu Glu Asp Ala Glu Lys Met Leu Asn Gln Ser Glu
625 630 635 640
Asn Ala Lys Lys Asp Phe Phe Arg Asn Leu Pro His Trp Ile Gln Gln
645 650 655
His Thr Ala Met Asn Asp Ala Gly Asn Phe Leu Ile Glu Thr Cys Asp
660 665 670
Glu Met Val Ser Arg Asp Leu Lys Gln Gln Leu Leu Leu Leu Asn Gly
675 680 685
Arg Trp Arg Glu Leu Phe Met Glu Val Lys Gln Tyr Ala Gln Ala Asp
690 695 700
Glu Met Asp Arg Met Lys Lys Glu Tyr Thr Asp Cys Val Val Thr Leu
705 710 715 720
Ser Ala Phe Ala Thr Glu Ala His Lys Lys Leu Ser Glu Pro Leu Glu
725 730 735
Val Ser Phe Met Asn Val Lys Leu Leu Ile Gln Asp Leu Glu Asp Ile
740 745 750
Glu Gln Arg Val Pro Val Met Asp Ala Gln Tyr Lys Ile Ile Thr Lys
755 760 765
Thr Ala His Leu Ile Thr Lys Glu Ser Pro Gln Glu Glu Gly Lys Glu
770 775 780
Met Phe Ala Thr Met Ser Lys Leu Lys Glu Gln Leu Thr Lys Val Lys
785 790 795 800
Glu Cys Tyr Ser Pro Leu Leu Tyr Glu Ser Gln Gln Leu Leu Ile Pro
805 810 815
Leu Glu Glu Leu Glu Lys Gln Met Thr Ser Phe Tyr Asp Ser Leu Gly
820 825 830
Lys Ile Asn Glu Ile Ile Thr Val Leu Glu Arg Glu Ala Gln Ser Ser
835 840 845
Ala Leu Phe Lys Gln Lys His Gln Glu Leu Leu Ala Cys Gln Glu Asn
850 855 860
Cys Lys Lys Thr Leu Thr Leu Ile Glu Lys Gly Ser Gln Ser Val Gln
865 870 875 880
Lys Phe Val Thr Leu Ser Asn Val Leu Lys His Phe Asp Gln Thr Arg
885 890 895
Leu Gln Arg Gln Ile Ala Asp Ile His Val Ala Phe Gln Ser Met Val
900 905 910
Lys Lys Thr Gly Asp Trp Lys Lys His Val Glu Thr Asn Ser Arg Leu
915 920 925
Met Lys Lys Phe Glu Glu Ser Arg Ala Glu Leu Glu Lys Val Leu Arg
930 935 940
Ile Ala Gln Glu Gly Leu Glu Glu Lys Gly Asp Pro Glu Glu Leu Leu
945 950 955 960
Arg Arg His Thr Glu Phe Phe Ser Gln Leu Asp Gln Arg Val Leu Asn
965 970 975
Ala Phe Leu Lys Ala Cys Asp Glu Leu Thr Asp Ile Leu Pro Glu Gln
980 985 990
Glu Gln Gln Gly Leu Gln Glu Ala Val Arg Lys Leu His Lys Gln Trp
995 1000 1005
Lys Asp Leu Gln Gly Glu Ala Pro Tyr His Leu Leu His Leu Lys
1010 1015 1020
Ile Asp Val Glu Lys Asn Arg Phe Leu Ala Ser Val Glu Glu Cys
1025 1030 1035
Arg Thr Glu Leu Asp Arg Glu Thr Lys Leu Met Pro Gln Glu Gly
1040 1045 1050
Ser Glu Lys Ile Ile Lys Glu His Arg Val Phe Phe Ser Asp Lys
1055 1060 1065
Gly Pro His His Leu Cys Glu Lys Arg Leu Gln Leu Ile Glu Glu
1070 1075 1080
Leu Cys Val Lys Leu Pro Val Arg Asp Pro Val Arg Asp Thr Pro
1085 1090 1095
Gly Thr Cys His Val Thr Leu Lys Glu Leu Arg Ala Ala Ile Asp
1100 1105 1110
Ser Thr Tyr Arg Lys Leu Met Glu Asp Pro Asp Lys Trp Lys Asp
1115 1120 1125
Tyr Thr Ser Arg Phe Ser Glu Phe Ser Ser Trp Ile Ser Thr Asn
1130 1135 1140
Glu Thr Gln Leu Lys Gly Ile Lys Gly Glu Ala Ile Asp Thr Ala
1145 1150 1155
Asn His Gly Glu Val Lys Arg Ala Val Glu Glu Ile Arg Asn Gly
1160 1165 1170
Val Thr Lys Arg Gly Glu Thr Leu Ser Trp Leu Lys Ser Arg Leu
1175 1180 1185
Lys Val Leu Thr Glu Val Ser Ser Glu Asn Glu Ala Gln Lys Gln
1190 1195 1200
Gly Asp Glu Leu Ala Lys Leu Ser Ser Ser Phe Lys Ala Leu Val
1205 1210 1215
Thr Leu Leu Ser Glu Val Glu Lys Met Leu Ser Asn Phe Gly Asp
1220 1225 1230
Cys Val Gln Tyr Lys Glu Ile Val Lys Asn Ser Leu Glu Glu Leu
1235 1240 1245
Ile Ser Gly Ser Lys Glu Val Gln Glu Gln Ala Glu Lys Ile Leu
1250 1255 1260
Asp Thr Glu Asn Leu Phe Glu Ala Gln Gln Leu Leu Leu His His
1265 1270 1275
Gln Gln Lys Thr Lys Arg Ile Ser Ala Lys Lys Arg Asp Val Gln
1280 1285 1290
Gln Gln Ile Ala Gln Ala Gln Gln Gly Glu Gly Gly Leu Pro Asp
1295 1300 1305
Arg Gly His Glu Glu Leu Arg Lys Leu Glu Ser Thr Leu Asp Gly
1310 1315 1320
Leu Glu Arg Ser Arg Glu Arg Gln Glu Arg Arg Ile Gln Val Thr
1325 1330 1335
Leu Arg Lys Trp Glu Arg Phe Glu Thr Asn Lys Glu Thr Val Val
1340 1345 1350
Arg Tyr Leu Phe Gln Thr Gly Ser Ser His Glu Arg Phe Leu Ser
1355 1360 1365
Phe Ser Ser Leu Glu Ser Leu Ser Ser Glu Leu Glu Gln Thr Lys
1370 1375 1380
Glu Phe Ser Lys Arg Thr Glu Ser Ile Ala Val Gln Ala Glu Asn
1385 1390 1395
Leu Val Lys Glu Ala Ser Glu Ile Pro Leu Gly Pro Gln Asn Lys
1400 1405 1410
Gln Leu Leu Gln Gln Gln Ala Lys Ser Ile Lys Glu Gln Val Lys
1415 1420 1425
Lys Leu Glu Asp Thr Leu Glu Glu Asp Ile Lys Thr Met Glu Met
1430 1435 1440
Val Lys Thr Lys Trp Asp His Phe Gly Ser Asn Phe Glu Thr Leu
1445 1450 1455
Ser Val Trp Ile Thr Glu Lys Glu Lys Glu Leu Asn Ala Leu Glu
1460 1465 1470
Thr Ser Ser Ser Ala Met Asp Met Gln Ile Ser Gln Ile Lys Val
1475 1480 1485
Thr Ile Gln Glu Ile Glu Ser Lys Leu Ser Ser Ile Val Gly Leu
1490 1495 1500
Glu Glu Glu Ala Gln Ser Phe Ala Gln Phe Val Thr Thr Gly Glu
1505 1510 1515
Ser Ala Arg Ile Lys Ala Lys Leu Thr Gln Ile Arg Arg Tyr Gly
1520 1525 1530
Glu Glu Leu Arg Glu His Ala Gln Cys Leu Glu Gly Thr Ile Leu
1535 1540 1545
Gly His Leu Ser Gln Gln Gln Lys Phe Glu Glu Asn Leu Arg Lys
1550 1555 1560
Ile Gln Gln Ser Val Ser Glu Phe Glu Asp Lys Leu Ala Val Pro
1565 1570 1575
Ile Lys Ile Cys Ser Ser Ala Thr Glu Thr Tyr Lys Val Leu Gln
1580 1585 1590
Glu His Met Asp Leu Cys Gln Ala Leu Glu Ser Leu Ser Ser Ala
1595 1600 1605
Ile Thr Ala Phe Ser Ala Ser Ala Arg Lys Val Val Asn Arg Asp
1610 1615 1620
Ser Cys Val Gln Glu Ala Ala Ala Leu Gln Gln Gln Tyr Glu Asp
1625 1630 1635
Ile Leu Arg Arg Ala Lys Glu Arg Gln Thr Ala Leu Glu Asn Leu
1640 1645 1650
Leu Ala His Trp Gln Arg Leu Glu Lys Glu Leu Ser Ser Phe Leu
1655 1660 1665
Thr Trp Leu Glu Arg Gly Glu Ala Lys Ala Ser Ser Pro Glu Met
1670 1675 1680
Asp Ile Ser Ala Asp Arg Val Lys Val Glu Gly Glu Leu Gln Leu
1685 1690 1695
Ile Gln Ala Leu Gln Asn Glu Val Val Ser Gln Ala Ser Phe Tyr
1700 1705 1710
Ser Lys Leu Leu Gln Leu Lys Glu Ser Leu Phe Ser Val Ala Ser
1715 1720 1725
Lys Asp Asp Val Lys Met Met Lys Leu His Leu Glu Gln Leu Asp
1730 1735 1740
Glu Arg Trp Arg Asp Leu Pro Gln Ile Ile Asn Lys Arg Ile Asn
1745 1750 1755
Phe Leu Gln Ser Val Val Ala Glu His Gln Gln Phe Asp Glu Leu
1760 1765 1770
Leu Leu Ser Phe Ser Val Trp Ile Lys Leu Phe Leu Ser Glu Leu
1775 1780 1785
Gln Thr Thr Ser Glu Ile Ser Ile Met Asp His Gln Val Ala Leu
1790 1795 1800
Thr Arg His Lys Asp His Ala Ala Glu Val Glu Ser Lys Lys Gly
1805 1810 1815
Glu Leu Gln Ser Leu Gln Gly His Leu Ala Lys Leu Gly Ser Leu
1820 1825 1830
Gly Arg Ala Glu Asp Leu His Leu Leu Gln Gly Lys Ala Glu Asp
1835 1840 1845
Cys Phe Gln Leu Phe Glu Glu Ala Ser Gln Val Val Glu Arg Arg
1850 1855 1860
Gln Leu Ala Leu Ser His Leu Ala Glu Phe Leu Gln Ser His Ala
1865 1870 1875
Ser Leu Ser Gly Ile Leu Arg Gln Leu Arg Gln Thr Val Glu Ala
1880 1885 1890
Thr Asn Ser Met Asn Lys Asn Glu Ser Asp Leu Ile Glu Lys Asp
1895 1900 1905
Leu Asn Asp Ala Leu Gln Asn Ala Lys Ala Leu Glu Ser Ala Ala
1910 1915 1920
Val Ser Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Ala Gln Tyr His Leu Lys
1925 1930 1935
Ile Gly Ser Ser Glu Gln Arg Thr Ser Cys Arg Ala Thr Ala Asp
1940 1945 1950
Gln Leu Cys Gly Glu Val Glu Arg Ile Gln Asn Leu Leu Gly Thr
1955 1960 1965
Lys Gln Ser Glu Ala Asp Ala Leu Ala Val Leu Lys Lys Ala Phe
1970 1975 1980
Gln Asp Gln Lys Glu Glu Leu Leu Lys Ser Ile Glu Asp Ile Glu
1985 1990 1995
Glu Arg Thr Asp Lys Glu Arg Leu Lys Glu Pro Thr Arg Gln Ala
2000 2005 2010
Leu Gln Gln Arg Leu Arg Val Phe Asn Gln Leu Glu Asp Glu Leu
2015 2020 2025
Asn Ser His Glu His Glu Leu Cys Trp Leu Lys Asp Lys Ala Lys
2030 2035 2040
Gln Ile Ala Gln Lys Asp Val Ala Phe Ala Pro Glu Val Asp Arg
2045 2050 2055
Glu Ile Asn Arg Leu Glu Val Thr Trp Asp Asp Thr Lys Arg Leu
2060 2065 2070
Ile His Glu Asn Gln Gly Gln Cys Cys Gly Leu Ile Asp Leu Met
2075 2080 2085
Arg Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Ser Ala Val Ser Lys Val Leu Glu
2090 2095 2100
Asn Ala Ser Ser Val Ile Val Thr Arg Thr Thr Ile Lys Asp Gln
2105 2110 2115
Glu Asp Leu Lys Trp Ala Phe Ser Lys His Glu Thr Ala Lys Asn
2120 2125 2130
Lys Met Asn Tyr Lys Gln Lys Asp Leu Asp Asn Phe Thr Ser Lys
2135 2140 2145
Gly Lys His Leu Leu Ser Glu Leu Lys Lys Ile His Ser Ser Asp
2150 2155 2160
Phe Ser Leu Val Lys Thr Asp Met Glu Ser Thr Val Asp Lys Trp
2165 2170 2175
Leu Asp Val Ser Glu Lys Leu Glu Glu Asn Met Asp Arg Leu Arg
2180 2185 2190
Val Ser Leu Ser Ile Trp Asp Asp Val Leu Ser Thr Arg Asp Glu
2195 2200 2205
Ile Glu Gly Trp Ser Asn Asn Cys Val Pro Gln Met Ala Glu Asn
2210 2215 2220
Ile Ser Asn Leu Asp Asn His Leu Arg Ala Glu Glu Leu Leu Lys
2225 2230 2235
Glu Phe Glu Ser Glu Val Lys Asn Lys Ala Leu Arg Leu Glu Glu
2240 2245 2250
Leu His Ser Lys Val Asn Asp Leu Lys Glu Leu Thr Lys Asn Leu
2255 2260 2265
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2270 2275 2280
Lys Leu Glu His Ala Lys Glu Ile Thr Glu Val Ala Lys Gly Thr
2285 2290 2295
Leu Lys Asp Phe Thr Ala Gln Ser Thr Gln Val Glu Lys Phe Ile
2300 2305 2310
Asn Asp Ile Thr Thr Trp Phe Thr Lys Val Glu Glu Ser Leu Met
2315 2320 2325
Asn Cys Ala Gln Asn Glu Thr Cys Glu Ala Leu Lys Lys Val Lys
2330 2335 2340
Asp Ile Gln Lys Glu Leu Gln Ser Gln Gln Ser Asn Ile Ser Ser
2345 2350 2355
Thr Gln Glu Asn Leu Asn Ser Leu Cys Arg Lys Tyr His Ser Ala
2360 2365 2370
Glu Leu Glu Ser Leu Gly Arg Ala Met Thr Gly Leu Ile Lys Lys
2375 2380 2385
His Glu Ala Val Ser Gln Leu Cys Ser Lys Thr Gln Ala Ser Leu
2390 2395 2400
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2405 2410 2415
Gln Glu Trp Phe Leu Gly Ala Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ser Ser
2420 2425 2430
Asp Arg Thr Gly Asp Ser Lys Val Leu Glu Ala Lys Leu His Asp
2435 2440 2445
Leu Gln Asn Ile Leu Asp Ser Val Ser Asp Gly Gln Ser Lys Leu
2450 2455 2460
Asp Ala Val Thr Gln Glu Gly Gln Thr Leu Tyr Ala His Leu Ser
2465 2470 2475
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2480 2485 2490
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2510 2515 2520
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2525 2530 2535
Asn Thr Glu Asn Leu Gly Glu Ser Lys Gln His Ile Pro Glu Lys
2540 2545 2550
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2570 2575 2580
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2585 2590 2595
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2600 2605 2610
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2615 2620 2625
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2630 2635 2640
Gln Asp Arg Leu Ala Cys Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ser Lys Asp
2645 2650 2655
Thr Leu Glu Lys Arg Leu Ser Gln Ile Gln Asp Ile Leu Leu Met
2660 2665 2670
Lys Gly Glu Gly Glu Val Lys Leu Asn Met Ala Ile Gly Lys Gly
2675 2680 2685
Glu Gln Ala Leu Arg Ser Ser Asn Lys Glu Gly Gln Arg Val Ile
2690 2695 2700
Gln Thr Gln Leu Glu Thr Leu Lys Glu Val Trp Ala Asp Ile Met
2705 2710 2715
Ser Ser Ser Val His Ala Gln Ser Thr Leu Glu Ser Val Ile Ser
2720 2725 2730
Gln Trp Asn Asp Tyr Val Glu Arg Lys Asn Gln Leu Glu Gln Trp
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2750 2755 2760
Pro Gly Leu Lys Glu Lys Phe Val Leu Leu Asp His Leu Gln Ser
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2780 2785 2790
Ile Ala Lys Ser Arg Glu Leu Tyr Glu Lys Thr Glu Asp Glu Ser
2795 2800 2805
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2810 2815 2820
Ile Met Thr Val Ala Lys Glu Lys Met Arg Lys Val Glu Glu Ile
2825 2830 2835
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Met Ser Gly Asp Ser Ser Ala Thr Gln Lys Lys Leu Ser Lys Ile
2870 2875 2880
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3440 3445 3450
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3455 3460 3465
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3635 3640 3645
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3980 3985 3990
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4010 4015 4020
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4025 4030 4035
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4040 4045 4050
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4070 4075 4080
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4250 4255 4260
Ala Arg Ser Asp Ala Glu Ser Thr Ala Val His Leu Glu Ala Leu
4265 4270 4275
Lys Lys Leu Ala Leu Ala Leu Gln Glu Arg Lys Tyr Ala Ile Glu
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Asp Leu Lys Asp Gln Lys Gln Lys Met Ile Glu His Leu Asn Leu
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Asp Asp Lys Glu Leu Val Lys Glu Gln Thr Ser His Leu Glu Gln
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Arg Trp Phe Gln Leu Glu Asp Leu Ile Lys Arg Lys Ile Gln Val
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Leu Met Asp His Leu Ala Ile Cys Ser Glu Leu Glu Ala Lys Gln
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Met Leu Leu Lys Ser Leu Ile Lys Asp Ala Asp Arg Val Met Ala
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Asp Leu Gly Leu Asn Glu Arg Gln Val Ile Gln Lys Ala Leu Ser
4415 4420 4425
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4430 4435 4440
Arg Arg Lys Tyr Leu Asn Lys Ala Leu Ser Glu Lys Thr Gln Phe
4445 4450 4455
Leu Met Ala Val Phe Gln Ala Thr Ser Gln Ile Gln Gln His Glu
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Arg Lys Ile Met Phe Arg Glu His Ile Cys Leu Leu Pro Asp Asp
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Gly Lys Leu Gln Glu Leu Gln Ser Val Tyr Asp Ser Val Leu Gln
4535 4540 4545
Lys Cys Ser His Arg Leu Gln Glu Leu Glu Lys Asn Leu Val Ser
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Arg Lys His Phe Lys Glu Asp Phe Asp Lys Ala Cys His Trp Leu
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Glu Leu Ser Glu Leu Asp Gly Asp Ile Gln Glu Ala Leu Arg Thr
4970 4975 4980
Arg Gln Ala Thr Leu Thr Glu Ile Tyr Ser Gln Cys Gln Arg Tyr
4985 4990 4995
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Glu Leu Leu Gln Leu Ala Gly Asn Gly Leu Asp Val Glu Ser Ala
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Lys Val Ala Ser Leu Glu Leu Arg Ser Gln Arg Met Ser Arg Asp
5075 5080 5085
Ser Gly Ala Gln Val Asp Leu Leu Gln Arg Cys Thr Ala Gln Trp
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Glu Lys Ala Ser Gln Leu Glu Lys Thr Gly Asn Asp Ala Ser Lys
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Ile Leu Lys Trp Ile Glu Lys Ala Lys Val Leu Ala His Gly Thr
5540 5545 5550
Ile Ala Trp Asn Ser Ala Ser Gln Leu Arg Glu Gln Tyr Ile Leu
5555 5560 5565
His Gln Thr Leu Leu Glu Glu Ser Lys Glu Ile Asp Ser Glu Leu
5570 5575 5580
Glu Ala Met Thr Glu Lys Leu Gln Tyr Leu Thr Ser Val Tyr Cys
5585 5590 5595
Thr Glu Lys Met Ser Gln Gln Val Ala Glu Leu Gly Arg Glu Thr
5600 5605 5610
Glu Glu Leu Arg Gln Met Ile Lys Ile Arg Leu Gln Asn Leu Gln
5615 5620 5625
Asp Ala Ala Lys Asp Met Lys Lys Phe Glu Ala Glu Leu Lys Lys
5630 5635 5640
Leu Gln Ala Ala Leu Glu Gln Ala Gln Ala Thr Leu Thr Ser Pro
5645 5650 5655
Glu Val Gly Arg Leu Ser Leu Lys Glu Gln Leu Ser His Arg Gln
5660 5665 5670
His Leu Leu Ser Glu Met Glu Ser Leu Lys Pro Lys Val Gln Ala
5675 5680 5685
Val Gln Leu Cys Gln Ser Ala Leu Arg Ile Pro Glu Asp Val Val
5690 5695 5700
Ala Ser Leu Pro Leu Cys His Ala Ala Leu Arg Leu Gln Glu Glu
5705 5710 5715
Ala Ser Arg Leu Gln His Thr Ala Ile Gln Gln Cys Asn Ile Met
5720 5725 5730
Gln Glu Ala Val Val Gln Tyr Glu Gln Tyr Glu Gln Glu Met Lys
5735 5740 5745
His Leu Gln Gln Leu Ile Glu Gly Ala His Arg Glu Ile Glu Asp
5750 5755 5760
Lys Pro Val Ala Thr Ser Asn Ile Gln Glu Leu Gln Ala Gln Ile
5765 5770 5775
Ser Arg His Glu Glu Leu Ala Gln Lys Ile Lys Gly Tyr Gln Glu
5780 5785 5790
Gln Ile Ala Ser Leu Asn Ser Lys Cys Lys Met Leu Thr Met Lys
5795 5800 5805
Ala Lys His Ala Thr Met Leu Leu Thr Val Thr Glu Val Glu Gly
5810 5815 5820
Leu Ala Glu Gly Thr Glu Asp Leu Asp Gly Glu Leu Leu Pro Thr
5825 5830 5835
Pro Ser Ala His Pro Ser Val Val Met Met Thr Ala Gly Arg Cys
5840 5845 5850
His Thr Leu Leu Ser Pro Val Thr Glu Glu Ser Gly Glu Glu Gly
5855 5860 5865
Thr Asn Ser Glu Ile Ser Ser Pro Pro Ala Cys Arg Ser Pro Ser
5870 5875 5880
Pro Val Ala Asn Thr Asp Ala Ser Val Asn Gln Asp Ile Ala Tyr
5885 5890 5895
Tyr Gln Ala Leu Ser Ala Glu Arg Leu Gln Thr Asp Ala Ala Lys
5900 5905 5910
Ile His Pro Ser Thr Ser Ala Ser Gln Glu Phe Tyr Glu Pro Gly
5915 5920 5925
Leu Glu Pro Ser Ala Thr Ala Lys Leu Gly Asp Leu Gln Arg Ser
5930 5935 5940
Trp Glu Thr Leu Lys Asn Val Ile Ser Glu Lys Gln Arg Thr Leu
5945 5950 5955
Tyr Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gln Lys Tyr Gln Asp Ser Leu Gln
5960 5965 5970
Ser Ile Ser Thr Lys Met Glu Ala Ile Glu Leu Lys Leu Ser Glu
5975 5980 5985
Ser Pro Glu Pro Gly Arg Ser Pro Glu Ser Gln Met Ala Glu His
5990 5995 6000
Gln Ala Leu Met Asp Glu Ile Leu Met Leu Gln Asp Glu Ile Asn
6005 6010 6015
Glu Leu Gln Ser Ser Leu Ala Glu Glu Leu Val Ser Glu Ser Cys
6020 6025 6030
Glu Ala Asp Pro Ala Glu Gln Leu Ala Leu Gln Ser Thr Leu Thr
6035 6040 6045
Val Leu Ala Glu Arg Met Ser Thr Ile Arg Met Lys Ala Ser Gly
6050 6055 6060
Lys Arg Gln Leu Leu Glu Glu Lys Leu Asn Asp Gln Leu Glu Glu
6065 6070 6075
Gln Arg Gln Glu Gln Ala Leu Gln Arg Tyr Arg Cys Glu Ala Asp
6080 6085 6090
Glu Leu Asp Ser Trp Leu Leu Ser Thr Lys Ala Thr Leu Asp Thr
6095 6100 6105
Ala Leu Ser Pro Pro Lys Glu Pro Met Asp Met Glu Ala Gln Leu
6110 6115 6120
Met Asp Cys Gln Asn Met Leu Val Glu Ile Glu Gln Lys Val Val
6125 6130 6135
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6140 6145 6150
Gly Lys Ala His Thr Lys Asp Glu Ala Glu Gln Leu Ala Gly Lys
6155 6160 6165
Leu Arg Arg Leu Lys Gly Ser Leu Leu Glu Leu Gln Arg Ala Leu
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His Asp Lys Gln Leu Asn Met Gln Gly Thr Ala Gln Glu Lys Glu
6185 6190 6195
Glu Ser Asp Val Asp Leu Thr Ala Thr Gln Ser Pro Gly Val Gln
6200 6205 6210
Glu Trp Leu Ala Gln Ala Arg Thr Thr Trp Thr Gln Gln Arg Gln
6215 6220 6225
Ser Ser Leu Gln Gln Gln Lys Glu Leu Glu Gln Glu Leu Ala Glu
6230 6235 6240
Gln Lys Ser Leu Leu Arg Ser Val Ala Ser Arg Gly Glu Glu Ile
6245 6250 6255
Leu Ile Gln His Ser Ala Ala Glu Thr Ser Gly Asp Ala Gly Glu
6260 6265 6270
Lys Pro Asp Val Leu Ser Gln Glu Leu Gly Met Glu Gly Glu Lys
6275 6280 6285
Ser Ser Ala Glu Asp Gln Met Arg Met Lys Trp Glu Ser Leu His
6290 6295 6300
Gln Glu Phe Ser Thr Lys Gln Lys Leu Leu Gln Asn Val Leu Glu
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Gln Glu Gln Glu Gln Val Leu Tyr Ser Arg Pro Asn Arg Leu Leu
6320 6325 6330
Ser Gly Val Pro Leu Tyr Lys Gly Asp Val Pro Thr Gln Asp Lys
6335 6340 6345
Ser Ala Val Thr Ser Leu Leu Asp Gly Leu Asn Gln Ala Phe Glu
6350 6355 6360
Glu Val Ser Ser Gln Ser Gly Gly Ala Lys Arg Gln Ser Ile His
6365 6370 6375
Leu Glu Gln Lys Leu Tyr Asp Gly Val Ser Ala Thr Ser Thr Trp
6380 6385 6390
Leu Asp Asp Val Glu Glu Arg Leu Phe Val Ala Thr Ala Leu Leu
6395 6400 6405
Pro Glu Glu Thr Glu Thr Cys Leu Phe Asn Gln Glu Ile Leu Ala
6410 6415 6420
Lys Asp Ile Lys Glu Met Ser Glu Glu Met Asp Lys Asn Lys Asn
6425 6430 6435
Leu Phe Ser Gln Ala Phe Pro Glu Asn Gly Asp Asn Arg Asp Val
6440 6445 6450
Ile Glu Asp Thr Leu Gly Cys Leu Leu Gly Arg Leu Ser Leu Leu
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Asp Ser Val Val Asn Gln Arg Cys His Gln Met Lys Glu Arg Leu
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Gln Gln Ile Leu Asn Phe Gln Asn Asp Leu Lys Val Leu Phe Thr
6485 6490 6495
Ser Leu Ala Asp Asn Lys Tyr Ile Ile Leu Gln Lys Leu Ala Asn
6500 6505 6510
Val Phe Glu Gln Pro Val Ala Glu Gln Ile Glu Ala Ile Gln Gln
6515 6520 6525
Ala Glu Asp Gly Leu Lys Glu Phe Asp Ala Gly Ile Ile Glu Leu
6530 6535 6540
Lys Arg Arg Gly Asp Lys Leu Gln Val Glu Gln Pro Ser Met Gln
6545 6550 6555
Glu Leu Ser Lys Leu Gln Asp Met Tyr Asp Glu Leu Met Met Ile
6560 6565 6570
Ile Gly Ser Arg Arg Ser Gly Leu Asn Gln Asn Leu Thr Leu Lys
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6605 6610 6615
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Arg Lys Ile Ile Ser Phe Ala Val Gln Lys Glu Thr Gln Phe His
6650 6655 6660
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Lys Arg Gly Val Glu Leu Glu Tyr Ile Leu Glu Thr Trp Ser His
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Arg Leu Ile Asp Arg Ile Thr Leu Tyr Gln His Leu Lys Ser Ser
6725 6730 6735
Leu Asn Glu Tyr Gln Pro Lys Leu Tyr Gln Val Leu Asp Asp Gly
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Lys Arg Leu Leu Ile Ser Ile Ser Cys Ser Asp Leu Glu Ser Gln
6755 6760 6765
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Ser Lys Glu Leu His Arg Leu Glu Thr Ile Leu Lys His Trp Thr
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Arg Tyr Gln Ser Glu Ser Ala Asp Leu Ile His Trp Leu Gln Ser
6800 6805 6810
Ala Lys Asp Arg Leu Glu Phe Trp Thr Gln Gln Ser Val Thr Val
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6830 6835 6840
Glu Phe Ser Lys Glu Val Asp Ala Gln Ser Ser Leu Lys Ser Ser
6845 6850 6855
Val Leu Ser Thr Gly Asn Gln Leu Leu Arg Leu Lys Lys Val Asp
6860 6865 6870
Thr Ala Thr Leu Arg Ser Glu Leu Ser Arg Ile Asp Ser Gln Trp
6875 6880 6885
Thr Asp Leu Leu Thr Asn Ile Pro Ala Val Gln Glu Lys Leu His
6890 6895 6900
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6920 6925 6930
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Tyr Leu Gln Lys Tyr Lys Gly Phe Lys Ile Asp Ile Asn Cys Lys
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Ser Gln Asp Val Glu Ser Lys Arg Ser Asp Lys Thr Asp Phe Ala
6980 6985 6990
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6995 7000 7005
Leu Val Thr Glu Lys Ile Gln Leu Leu Glu Gly Leu Leu Glu Ser
7010 7015 7020
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7025 7030 7035
Glu Thr Gln Glu Lys Arg Leu Lys Gln Gln His Arg Ile Gly Asp
7040 7045 7050
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7055 7060 7065
Asp Leu Ile Lys Ala Lys Glu Lys Glu Val Glu Lys Ile Glu Gln
7070 7075 7080
Asn Gly Leu Ala Leu Ile Gln Asn Lys Lys Glu Asp Val Ser Ser
7085 7090 7095
Ile Val Met Ser Thr Leu Arg Glu Leu Gly Gln Thr Trp Ala Asn
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Leu Asp His Met Val Gly Gln Leu Lys Ile Leu Leu Lys Ser Val
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Ser Tyr Leu Met Glu Ala Arg Tyr Ser Leu Ser Arg Phe Arg Leu
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Leu Thr Gly Ser Leu Glu Ala Val Gln Val Gln Val Asp Asn Leu
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Gln Asn Leu Gln Asp Asp Leu Glu Lys Gln Glu Arg Ser Leu Gln
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Lys Phe Gly Ser Ile Thr Asn Gln Leu Leu Lys Glu Cys His Pro
7190 7195 7200
Pro Val Thr Glu Thr Leu Thr Asn Thr Leu Lys Glu Val Asn Met
7205 7210 7215
Arg Trp Asn Asn Leu Leu Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Gln Ser
7220 7225 7230
Ser Lys Ala Leu Leu Gln Leu Trp Gln Arg Tyr Lys Asp Tyr Ser
7235 7240 7245
Lys Gln Cys Ala Ser Thr Val Gln Gln Gln Glu Asp Arg Thr Asn
7250 7255 7260
Glu Leu Leu Lys Ala Ala Thr Asn Lys Asp Ile Ala Asp Asp Glu
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Val Ala Thr Trp Ile Gln Asp Cys Asn Asp Leu Leu Lys Gly Leu
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Gln Leu Lys Gln Gln Val Asp Ala Ser Ala Ala Ser Ala Ile Gln
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Ser Asp Gln Leu Ser Leu Ser Gln His Leu Cys Ala Leu Glu Gln
7325 7330 7335
Ala Leu Cys Lys Gln Gln Thr Ser Leu Gln Ala Gly Val Leu Asp
7340 7345 7350
Tyr Glu Thr Phe Ala Lys Ser Leu Glu Ala Leu Glu Ala Trp Ile
7355 7360 7365
Val Glu Ala Glu Glu Ile Leu Gln Gly Gln Asp Pro Ser His Ser
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Ser Asp Leu Ser Thr Ile Gln Glu Arg Met Glu Glu Leu Lys Gly
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7400 7405 7410
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7415 7420 7425
Arg Met Gln Asn Leu Asn Arg His Trp Ser Leu Ile Ser Ser Gln
7430 7435 7440
Thr Thr Glu Arg Phe Ser Lys Leu Gln Ser Phe Leu Leu Gln His
7445 7450 7455
Gln Thr Phe Leu Glu Lys Cys Glu Thr Trp Met Glu Phe Leu Val
7460 7465 7470
Gln Thr Glu Gln Lys Leu Ala Val Glu Ile Ser Gly Asn Tyr Gln
7475 7480 7485
His Leu Leu Glu Gln Gln Arg Ala His Glu Leu Phe Gln Ala Glu
7490 7495 7500
Met Phe Ser Arg Gln Gln Ile Leu His Ser Ile Ile Ile Asp Gly
7505 7510 7515
Gln Arg Leu Leu Glu Gln Gly Gln Val Asp Asp Arg Asp Glu Phe
7520 7525 7530
Asn Leu Lys Leu Thr Leu Leu Ser Asn Gln Trp Gln Gly Val Ile
7535 7540 7545
Arg Arg Ala Gln Gln Arg Arg Gly Ile Ile Asp Ser Gln Ile Arg
7550 7555 7560
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Leu Val Glu Val Ser Tyr Leu Pro Met Ser Gly Leu Gly Ser Val
7580 7585 7590
Pro Ile Pro Leu Gln Gln Ala Arg Thr Leu Phe Asp Glu Val Gln
7595 7600 7605
Phe Lys Glu Lys Val Phe Leu Arg Gln Gln Gly Ser Tyr Ile Leu
7610 7615 7620
Thr Val Glu Ala Gly Lys Gln Leu Leu Leu Ser Ala Asp Ser Gly
7625 7630 7635
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7640 7645 7650
Trp Lys Ser Ala Ser Met Arg Leu Glu Glu Gln Lys Lys Lys Leu
7655 7660 7665
Ala Phe Leu Leu Lys Asp Trp Glu Lys Cys Glu Lys Gly Ile Ala
7670 7675 7680
Asp Ser Leu Glu Lys Leu Arg Thr Phe Lys Lys Lys Leu Ser Gln
7685 7690 7695
Ser Leu Pro Asp His His Glu Glu Leu His Ala Glu Gln Met Arg
7700 7705 7710
Cys Lys Glu Leu Glu Asn Ala Val Gly Ser Trp Thr Asp Asp Leu
7715 7720 7725
Thr Gln Leu Ser Leu Leu Lys Asp Thr Leu Ser Ala Tyr Ile Ser
7730 7735 7740
Ala Asp Asp Ile Ser Ile Leu Asn Glu Arg Val Glu Leu Leu Gln
7745 7750 7755
Arg Gln Trp Glu Glu Leu Cys His Gln Leu Ser Leu Arg Arg Gln
7760 7765 7770
Gln Ile Gly Glu Arg Leu Asn Glu Trp Ala Val Phe Ser Glu Lys
7775 7780 7785
Asn Lys Glu Leu Cys Glu Trp Leu Thr Gln Met Glu Ser Lys Val
7790 7795 7800
Ser Gln Asn Gly Asp Ile Leu Ile Glu Glu Met Ile Glu Lys Leu
7805 7810 7815
Lys Lys Asp Tyr Gln Glu Glu Ile Ala Ile Ala Gln Glu Asn Lys
7820 7825 7830
Ile Gln Leu Gln Gln Met Gly Glu Arg Leu Ala Lys Ala Ser His
7835 7840 7845
Glu Ser Lys Ala Ser Glu Ile Glu Tyr Lys Leu Gly Lys Val Asn
7850 7855 7860
Asp Arg Trp Gln His Leu Leu Asp Leu Ile Ala Ala Arg Val Lys
7865 7870 7875
Lys Leu Lys Glu Thr Leu Val Ala Val Gln Gln Leu Asp Lys Asn
7880 7885 7890
Met Ser Ser Leu Arg Thr Trp Leu Ala His Ile Glu Ser Glu Leu
7895 7900 7905
Ala Lys Pro Ile Val Tyr Asp Ser Cys Asn Ser Glu Glu Ile Gln
7910 7915 7920
Arg Lys Leu Asn Glu Gln Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Glu Lys
7925 7930 7935
His Ser Thr Gly Val Ala Ser Val Leu Asn Leu Cys Glu Val Leu
7940 7945 7950
Leu His Asp Cys Asp Ala Cys Ala Thr Asp Ala Glu Cys Asp Ser
7955 7960 7965
Ile Gln Gln Ala Thr Arg Asn Leu Asp Arg Arg Trp Arg Asn Ile
7970 7975 7980
Cys Ala Met Ser Met Glu Arg Arg Leu Lys Ile Glu Glu Thr Trp
7985 7990 7995
Arg Leu Trp Gln Lys Phe Leu Asp Asp Tyr Ser Arg Phe Glu Asp
8000 8005 8010
Trp Leu Lys Ser Ser Glu Arg Thr Ala Ala Phe Pro Ser Ser Ser
8015 8020 8025
Gly Val Ile Tyr Thr Val Ala Lys Glu Glu Leu Lys Lys Phe Glu
8030 8035 8040
Ala Phe Gln Arg Gln Val His Glu Cys Leu Thr Gln Leu Glu Leu
8045 8050 8055
Ile Asn Lys Gln Tyr Arg Arg Leu Ala Arg Glu Asn Arg Thr Asp
8060 8065 8070
Ser Ala Cys Ser Leu Lys Gln Met Val His Glu Gly Asn Gln Arg
8075 8080 8085
Trp Asp Asn Leu Gln Lys Arg Val Thr Ser Ile Leu Arg Arg Leu
8090 8095 8100
Lys His Phe Ile Gly Gln Arg Glu Glu Phe Glu Thr Ala Arg Asp
8105 8110 8115
Ser Ile Leu Val Trp Leu Thr Glu Met Asp Leu Gln Leu Thr Asn
8120 8125 8130
Ile Glu His Phe Ser Glu Cys Asp Val Gln Ala Lys Ile Lys Gln
8135 8140 8145
Leu Lys Ala Phe Gln Gln Glu Ile Ser Leu Asn His Asn Lys Ile
8150 8155 8160
Glu Gln Ile Ile Ala Gln Gly Glu Gln Leu Ile Glu Lys Ser Glu
8165 8170 8175
Pro Leu Asp Ala Ala Ile Ile Glu Glu Glu Leu Asp Glu Leu Arg
8180 8185 8190
Arg Tyr Cys Gln Glu Val Phe Gly Arg Val Glu Arg Tyr His Lys
8195 8200 8205
Lys Leu Ile Arg Leu Pro Leu Pro Asp Asp Glu His Asp Leu Ser
8210 8215 8220
Asp Arg Glu Leu Glu Leu Glu Asp Ser Ala Ala Leu Ser Asp Leu
8225 8230 8235
His Trp His Asp Arg Ser Ala Asp Ser Leu Leu Ser Pro Gln Pro
8240 8245 8250
Ser Ser Asn Leu Ser Leu Ser Leu Ala Gln Pro Leu Arg Ser Glu
8255 8260 8265
Arg Ser Gly Arg Asp Thr Pro Ala Ser Val Asp Ser Ile Pro Leu
8270 8275 8280
Glu Trp Asp His Asp Tyr Asp Leu Ser Arg Asp Leu Glu Ser Ala
8285 8290 8295
Met Ser Arg Ala Leu Pro Ser Glu Asp Glu Glu Gly Gln Asp Asp
8300 8305 8310
Lys Asp Phe Tyr Leu Arg Gly Ala Val Gly Leu Ser Gly Asp His
8315 8320 8325
Ser Ala Leu Glu Ser Gln Ile Arg Gln Leu Gly Lys Ala Leu Asp
8330 8335 8340
Asp Ser Arg Phe Gln Ile Gln Gln Thr Glu Asn Ile Ile Arg Ser
8345 8350 8355
Lys Thr Pro Thr Gly Pro Glu Leu Asp Thr Ser Tyr Lys Gly Tyr
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Met Lys Leu Leu Gly Glu Cys Ser Ser Ser Ile Asp Ser Val Lys
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Arg Leu Glu His Lys Leu Lys Glu Glu Glu Glu Ser Leu Pro Gly
8390 8395 8400
Phe Val Asn Leu His Ser Thr Glu Thr Gln Thr Ala Gly Val Ile
8405 8410 8415
Asp Arg Trp Glu Leu Leu Gln Ala Gln Ala Leu Ser Lys Glu Leu
8420 8425 8430
Arg Met Lys Gln Asn Leu Gln Lys Trp Gln Gln Phe Asn Ser Asp
8435 8440 8445
Leu Asn Ser Ile Trp Ala Trp Leu Gly Asp Thr Glu Glu Glu Leu
8450 8455 8460
Glu Gln Leu Gln Arg Leu Glu Leu Ser Thr Asp Ile Gln Thr Ile
8465 8470 8475
Glu Leu Gln Ile Lys Lys Leu Lys Glu Leu Gln Lys Ala Val Asp
8480 8485 8490
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8495 8500 8505
Phe Thr Gln Ala Asp Ser Lys Glu Ser Arg Asp Leu Gln Asp Arg
8510 8515 8520
Leu Ser Gln Met Asn Gly Arg Trp Asp Arg Val Cys Ser Leu Leu
8525 8530 8535
Glu Glu Trp Arg Gly Leu Leu Gln Asp Ala Leu Met Gln Cys Gln
8540 8545 8550
Gly Phe His Glu Met Ser His Gly Leu Leu Leu Met Leu Glu Asn
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Ile Asp Arg Arg Lys Asn Glu Ile Val Pro Ile Asp Ser Asn Leu
8570 8575 8580
Asp Ala Glu Ile Leu Gln Asp His His Lys Gln Leu Met Gln Ile
8585 8590 8595
Lys His Glu Leu Leu Glu Ser Gln Leu Arg Val Ala Ser Leu Gln
8600 8605 8610
Asp Met Ser Cys Gln Leu Leu Val Asn Ala Glu Gly Thr Asp Cys
8615 8620 8625
Leu Glu Ala Lys Glu Lys Val His Val Ile Gly Asn Arg Leu Lys
8630 8635 8640
Leu Leu Leu Lys Glu Val Ser Arg His Ile Lys Glu Leu Glu Lys
8645 8650 8655
Leu Leu Asp Val Ser Ser Ser Gln Gln Asp Leu Ser Ser Trp Ser
8660 8665 8670
Ser Ala Asp Glu Leu Asp Thr Ser Gly Ser Val Ser Pro Thr Ser
8675 8680 8685
Gly Arg Ser Thr Pro Asn Arg Gln Lys Thr Pro Arg Gly Lys Cys
8690 8695 8700
Ser Leu Ser Gln Pro Gly Pro Ser Val Ser Ser Pro His Ser Arg
8705 8710 8715
Ser Thr Lys Gly Gly Ser Asp Ser Ser Leu Ser Glu Pro Gly Pro
8720 8725 8730
Gly Arg Ser Gly Arg Gly Phe Leu Phe Arg Val Leu Arg Ala Ala
8735 8740 8745
Leu Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Gly Leu Ala Cys
8750 8755 8760
Leu Val Pro Met Ser Glu Glu Asp Tyr Ser Cys Ala Leu Ser Asn
8765 8770 8775
Asn Phe Ala Arg Ser Phe His Pro Met Leu Arg Tyr Thr Asn Gly
8780 8785 8790
Pro Pro Pro Leu
8795
<210> 135
<211> 2677
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SETX
<400> 135
Met Ser Thr Cys Cys Trp Cys Thr Pro Gly Gly Ala Ser Thr Ile Asp
1 5 10 15
Phe Leu Lys Arg Tyr Ala Ser Asn Thr Pro Ser Gly Glu Phe Gln Thr
20 25 30
Ala Asp Glu Asp Leu Cys Tyr Cys Leu Glu Cys Val Ala Glu Tyr His
35 40 45
Lys Ala Arg Asp Glu Leu Pro Phe Leu His Glu Val Leu Trp Glu Leu
50 55 60
Glu Thr Leu Arg Leu Ile Asn His Phe Glu Lys Ser Met Lys Ala Glu
65 70 75 80
Ile Gly Asp Asp Asp Glu Leu Tyr Ile Val Asp Asn Asn Gly Glu Met
85 90 95
Pro Leu Phe Asp Ile Thr Gly Gln Asp Phe Glu Asn Lys Leu Arg Val
100 105 110
Pro Leu Leu Glu Ile Leu Lys Tyr Pro Tyr Leu Leu Leu His Glu Arg
115 120 125
Val Asn Glu Leu Cys Val Glu Ala Leu Cys Arg Met Glu Gln Ala Asn
130 135 140
Cys Ser Phe Gln Val Phe Asp Lys His Pro Gly Ile Tyr Leu Phe Leu
145 150 155 160
Val His Pro Asn Glu Met Val Arg Arg Trp Ala Ile Leu Thr Ala Arg
165 170 175
Asn Leu Gly Lys Val Asp Arg Asp Asp Tyr Tyr Asp Leu Gln Glu Val
180 185 190
Leu Leu Cys Leu Phe Lys Val Ile Glu Leu Gly Leu Leu Glu Ser Pro
195 200 205
Asp Ile Tyr Thr Ser Ser Val Leu Glu Lys Gly Lys Leu Ile Leu Leu
210 215 220
Pro Ser His Met Tyr Asp Thr Thr Asn Tyr Lys Ser Tyr Trp Leu Gly
225 230 235 240
Ile Cys Met Leu Leu Thr Ile Leu Glu Glu Gln Ala Met Asp Ser Leu
245 250 255
Leu Leu Gly Ser Asp Lys Gln Asn Asp Phe Met Gln Ser Ile Leu His
260 265 270
Thr Met Glu Arg Glu Ala Asp Asp Asp Ser Val Asp Pro Phe Trp Pro
275 280 285
Ala Leu His Cys Phe Met Val Ile Leu Asp Arg Leu Gly Ser Lys Val
290 295 300
Trp Gly Gln Leu Met Asp Pro Ile Val Ala Phe Gln Thr Ile Ile Asn
305 310 315 320
Asn Ala Ser Tyr Asn Arg Glu Ile Arg His Ile Arg Asn Ser Ser Val
325 330 335
Arg Thr Lys Leu Glu Pro Glu Ser Tyr Leu Asp Asp Met Val Thr Cys
340 345 350
Ser Gln Ile Val Tyr Asn Tyr Asn Pro Glu Lys Thr Lys Lys Asp Ser
355 360 365
Gly Trp Arg Thr Ala Ile Cys Pro Asp Tyr Cys Pro Asn Met Tyr Glu
370 375 380
Glu Met Glu Thr Leu Ala Ser Val Leu Gln Ser Asp Ile Gly Gln Asp
385 390 395 400
Met Arg Val His Asn Ser Thr Phe Leu Trp Phe Ile Pro Phe Val Gln
405 410 415
Ser Leu Met Asp Leu Lys Asp Leu Gly Val Ala Tyr Ile Ala Gln Val
420 425 430
Val Asn His Leu Tyr Ser Glu Val Lys Glu Val Leu Asn Gln Thr Asp
435 440 445
Ala Val Cys Asp Lys Val Thr Glu Phe Phe Leu Leu Ile Leu Val Ser
450 455 460
Val Ile Glu Leu His Arg Asn Lys Lys Cys Leu His Leu Leu Trp Val
465 470 475 480
Ser Ser Gln Gln Trp Val Glu Ala Val Val Lys Cys Ala Lys Leu Pro
485 490 495
Thr Thr Ala Phe Thr Arg Ser Ser Glu Lys Ser Ser Gly Asn Cys Ser
500 505 510
Lys Gly Thr Ala Met Ile Ser Ser Leu Ser Leu His Ser Met Pro Ser
515 520 525
Asn Ser Val Gln Leu Ala Tyr Val Gln Leu Ile Arg Ser Leu Leu Lys
530 535 540
Glu Gly Tyr Gln Leu Gly Gln Gln Ser Leu Cys Lys Arg Phe Trp Asp
545 550 555 560
Lys Leu Asn Leu Phe Leu Arg Gly Asn Leu Ser Leu Gly Trp Gln Leu
565 570 575
Thr Ser Gln Glu Thr His Glu Leu Gln Ser Cys Leu Lys Gln Ile Ile
580 585 590
Arg Asn Ile Lys Phe Lys Ala Pro Pro Cys Asn Thr Phe Val Asp Leu
595 600 605
Thr Ser Ala Cys Lys Ile Ser Pro Ala Ser Tyr Asn Lys Glu Glu Ser
610 615 620
Glu Gln Met Gly Lys Thr Ser Arg Lys Asp Met His Cys Leu Glu Ala
625 630 635 640
Ser Ser Pro Thr Phe Ser Lys Glu Pro Met Lys Val Gln Asp Ser Val
645 650 655
Leu Ile Lys Ala Asp Asn Thr Ile Glu Gly Asp Asn Asn Glu Gln Asn
660 665 670
Tyr Ile Lys Asp Val Lys Leu Glu Asp His Leu Leu Ala Gly Ser Cys
675 680 685
Leu Lys Gln Ser Ser Lys Asn Ile Phe Thr Glu Arg Ala Glu Asp Gln
690 695 700
Ile Lys Ile Ser Thr Arg Lys Gln Lys Ser Val Lys Glu Ile Ser Ser
705 710 715 720
Tyr Thr Pro Lys Asp Cys Thr Ser Arg Asn Gly Pro Glu Arg Gly Cys
725 730 735
Asp Arg Gly Ile Ile Val Ser Thr Arg Leu Leu Thr Asp Ser Ser Thr
740 745 750
Asp Ala Leu Glu Lys Val Ser Thr Ser Asn Glu Asp Phe Ser Leu Lys
755 760 765
Asp Asp Ala Leu Ala Lys Thr Ser Lys Arg Lys Thr Lys Val Gln Lys
770 775 780
Asp Glu Ile Cys Ala Lys Leu Ser His Val Ile Lys Lys Gln His Arg
785 790 795 800
Lys Ser Thr Leu Val Asp Asn Thr Ile Asn Leu Asp Glu Asn Leu Thr
805 810 815
Val Ser Asn Ile Glu Ser Phe Tyr Ser Arg Lys Asp Thr Gly Val Gln
820 825 830
Lys Gly Asp Gly Phe Ile His Asn Leu Ser Leu Asp Pro Ser Gly Val
835 840 845
Leu Asp Asp Lys Asn Gly Glu Gln Lys Ser Gln Asn Asn Val Leu Pro
850 855 860
Lys Glu Lys Gln Leu Lys Asn Glu Glu Leu Val Ile Phe Ser Phe His
865 870 875 880
Glu Asn Asn Cys Lys Ile Gln Glu Phe His Val Asp Gly Lys Glu Leu
885 890 895
Ile Pro Phe Thr Glu Met Thr Asn Ala Ser Glu Lys Lys Ser Ser Pro
900 905 910
Phe Lys Asp Leu Met Thr Val Pro Glu Ser Arg Asp Glu Glu Met Ser
915 920 925
Asn Ser Thr Ser Val Ile Tyr Ser Asn Leu Thr Arg Glu Gln Ala Pro
930 935 940
Asp Ile Ser Pro Lys Ser Asp Thr Leu Thr Asp Ser Gln Ile Asp Arg
945 950 955 960
Asp Leu His Lys Leu Ser Leu Leu Ala Gln Ala Ser Val Ile Thr Phe
965 970 975
Pro Ser Asp Ser Pro Gln Asn Ser Ser Gln Leu Gln Arg Lys Val Lys
980 985 990
Glu Asp Lys Arg Cys Phe Thr Ala Asn Gln Asn Asn Val Gly Asp Thr
995 1000 1005
Ser Arg Gly Gln Val Ile Ile Ile Ser Asp Ser Asp Asp Asp Asp
1010 1015 1020
Asp Glu Arg Ile Leu Ser Leu Glu Lys Leu Thr Lys Gln Asp Lys
1025 1030 1035
Ile Cys Leu Glu Arg Glu His Pro Glu Gln His Val Ser Thr Val
1040 1045 1050
Asn Ser Lys Glu Glu Lys Asn Pro Val Lys Glu Glu Lys Thr Glu
1055 1060 1065
Thr Leu Phe Gln Phe Glu Glu Ser Asp Ser Gln Cys Phe Glu Phe
1070 1075 1080
Glu Ser Ser Ser Glu Val Phe Ser Val Trp Gln Asp His Pro Asp
1085 1090 1095
Asp Asn Asn Ser Val Gln Asp Gly Glu Lys Lys Cys Leu Ala Pro
1100 1105 1110
Ile Ala Asn Thr Thr Asn Gly Gln Gly Cys Thr Asp Tyr Val Ser
1115 1120 1125
Glu Val Val Lys Lys Gly Ala Glu Gly Ile Glu Glu His Thr Arg
1130 1135 1140
Pro Arg Ser Ile Ser Val Glu Glu Phe Cys Glu Ile Glu Val Lys
1145 1150 1155
Lys Pro Lys Arg Lys Arg Ser Glu Lys Pro Met Ala Glu Asp Pro
1160 1165 1170
Val Arg Pro Ser Ser Ser Val Arg Asn Glu Gly Gln Ser Asp Thr
1175 1180 1185
Asn Lys Arg Asp Leu Val Gly Asn Asp Phe Lys Ser Ile Asp Arg
1190 1195 1200
Arg Thr Ser Thr Pro Asn Ser Arg Ile Gln Arg Ala Thr Thr Val
1205 1210 1215
Ser Gln Lys Lys Ser Ser Lys Leu Cys Thr Cys Thr Glu Pro Ile
1220 1225 1230
Arg Lys Val Pro Val Ser Lys Thr Pro Lys Lys Thr His Ser Asp
1235 1240 1245
Ala Lys Lys Gly Gln Asn Arg Ser Ser Asn Tyr Leu Ser Cys Arg
1250 1255 1260
Thr Thr Pro Ala Ile Val Pro Pro Lys Lys Phe Arg Gln Cys Pro
1265 1270 1275
Glu Pro Thr Ser Thr Ala Glu Lys Leu Gly Leu Lys Lys Gly Pro
1280 1285 1290
Arg Lys Ala Tyr Glu Leu Ser Gln Arg Ser Leu Asp Tyr Val Ala
1295 1300 1305
Gln Leu Arg Asp His Gly Lys Thr Val Gly Val Val Asp Thr Arg
1310 1315 1320
Lys Lys Thr Lys Leu Ile Ser Pro Gln Asn Leu Ser Val Arg Asn
1325 1330 1335
Asn Lys Lys Leu Leu Thr Ser Gln Glu Leu Gln Met Gln Arg Gln
1340 1345 1350
Ile Arg Pro Lys Ser Gln Lys Asn Arg Arg Arg Leu Ser Asp Cys
1355 1360 1365
Glu Ser Thr Asp Val Lys Arg Ala Gly Ser His Thr Ala Gln Asn
1370 1375 1380
Ser Asp Ile Phe Val Pro Glu Ser Asp Arg Ser Asp Tyr Asn Cys
1385 1390 1395
Thr Gly Gly Thr Glu Val Leu Ala Asn Ser Asn Arg Lys Gln Leu
1400 1405 1410
Ile Lys Cys Met Pro Ser Glu Pro Glu Thr Ile Lys Ala Lys His
1415 1420 1425
Gly Ser Pro Ala Thr Asp Asp Ala Cys Pro Leu Asn Gln Cys Asp
1430 1435 1440
Ser Val Val Leu Asn Gly Thr Val Pro Thr Asn Glu Val Ile Val
1445 1450 1455
Ser Thr Ser Glu Asp Pro Leu Gly Gly Gly Asp Pro Thr Ala Arg
1460 1465 1470
His Ile Glu Met Ala Ala Leu Lys Glu Gly Glu Pro Asp Ser Ser
1475 1480 1485
Ser Asp Ala Glu Glu Asp Asn Leu Phe Leu Thr Gln Asn Asp Pro
1490 1495 1500
Glu Asp Met Asp Leu Cys Ser Gln Met Glu Asn Asp Asn Tyr Lys
1505 1510 1515
Leu Ile Glu Leu Ile His Gly Lys Asp Thr Val Glu Val Glu Glu
1520 1525 1530
Asp Ser Val Ser Arg Pro Gln Leu Glu Ser Leu Ser Gly Thr Lys
1535 1540 1545
Cys Lys Tyr Lys Asp Cys Leu Glu Thr Thr Lys Asn Gln Gly Glu
1550 1555 1560
Tyr Cys Pro Lys His Ser Glu Val Lys Ala Ala Asp Glu Asp Val
1565 1570 1575
Phe Arg Lys Pro Gly Leu Pro Pro Pro Ala Ser Lys Pro Leu Arg
1580 1585 1590
Pro Thr Thr Lys Ile Phe Ser Ser Lys Ser Thr Ser Arg Ile Ala
1595 1600 1605
Gly Leu Ser Lys Ser Leu Glu Thr Ser Ser Ala Leu Ser Pro Ser
1610 1615 1620
Leu Lys Asn Lys Ser Lys Gly Ile Gln Ser Ile Leu Lys Val Pro
1625 1630 1635
Gln Pro Val Pro Leu Ile Ala Gln Lys Pro Val Gly Glu Met Lys
1640 1645 1650
Asn Ser Cys Asn Val Leu His Pro Gln Ser Pro Asn Asn Ser Asn
1655 1660 1665
Arg Gln Gly Cys Lys Val Pro Phe Gly Glu Ser Lys Tyr Phe Pro
1670 1675 1680
Ser Ser Ser Pro Val Asn Ile Leu Leu Ser Ser Gln Ser Val Ser
1685 1690 1695
Asp Thr Phe Val Lys Glu Val Leu Lys Trp Lys Tyr Glu Met Phe
1700 1705 1710
Leu Asn Phe Gly Gln Cys Gly Pro Pro Ala Ser Leu Cys Gln Ser
1715 1720 1725
Ile Ser Arg Pro Val Pro Val Arg Phe His Asn Tyr Gly Asp Tyr
1730 1735 1740
Phe Asn Val Phe Phe Pro Leu Met Val Leu Asn Thr Phe Glu Thr
1745 1750 1755
Val Ala Gln Glu Trp Leu Asn Ser Pro Asn Arg Glu Asn Phe Tyr
1760 1765 1770
Gln Leu Gln Val Arg Lys Phe Pro Ala Asp Tyr Ile Lys Tyr Trp
1775 1780 1785
Glu Phe Ala Val Tyr Leu Glu Glu Cys Glu Leu Ala Lys Gln Leu
1790 1795 1800
Tyr Pro Lys Glu Asn Asp Leu Val Phe Leu Ala Pro Glu Arg Ile
1805 1810 1815
Asn Glu Glu Lys Lys Asp Thr Glu Arg Asn Asp Ile Gln Asp Leu
1820 1825 1830
His Glu Tyr His Ser Gly Tyr Val His Lys Phe Arg Arg Thr Ser
1835 1840 1845
Val Met Arg Asn Gly Lys Thr Glu Cys Tyr Leu Ser Ile Gln Thr
1850 1855 1860
Gln Glu Asn Phe Pro Ala Asn Leu Asn Glu Leu Val Asn Cys Ile
1865 1870 1875
Val Ile Ser Ser Leu Val Thr Thr Gln Arg Lys Leu Lys Ala Met
1880 1885 1890
Ser Leu Leu Gly Ser Arg Asn Gln Leu Ala Arg Ala Val Leu Asn
1895 1900 1905
Pro Asn Pro Met Asp Phe Cys Thr Lys Asp Leu Leu Thr Thr Thr
1910 1915 1920
Ser Glu Arg Ile Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Phe Asn Glu Asp Gln
1925 1930 1935
Lys Lys Ala Ile Glu Thr Ala Tyr Ala Met Val Lys His Ser Pro
1940 1945 1950
Ser Val Ala Lys Ile Cys Leu Ile His Gly Pro Pro Gly Thr Gly
1955 1960 1965
Lys Ser Lys Thr Ile Val Gly Leu Leu Tyr Arg Leu Leu Thr Glu
1970 1975 1980
Asn Gln Arg Lys Gly His Ser Asp Glu Asn Ser Asn Ala Lys Ile
1985 1990 1995
Lys Gln Asn Arg Val Leu Val Cys Ala Pro Ser Asn Ala Ala Val
2000 2005 2010
Asp Glu Leu Met Lys Lys Ile Ile Leu Glu Phe Lys Glu Lys Cys
2015 2020 2025
Lys Asp Lys Lys Asn Pro Leu Gly Asn Cys Gly Asp Ile Asn Leu
2030 2035 2040
Val Arg Leu Gly Pro Glu Lys Ser Ile Asn Ser Glu Val Leu Lys
2045 2050 2055
Phe Ser Leu Asp Ser Gln Val Asn His Arg Met Lys Lys Glu Leu
2060 2065 2070
Pro Ser His Val Gln Ala Met His Lys Arg Lys Glu Phe Leu Asp
2075 2080 2085
Tyr Gln Leu Asp Glu Leu Ser Arg Gln Arg Ala Leu Cys Arg Gly
2090 2095 2100
Gly Arg Glu Ile Gln Arg Gln Glu Leu Asp Glu Asn Ile Ser Lys
2105 2110 2115
Val Ser Lys Glu Arg Gln Glu Leu Ala Ser Lys Ile Lys Glu Val
2120 2125 2130
Gln Gly Arg Pro Gln Lys Thr Gln Ser Ile Ile Ile Leu Glu Ser
2135 2140 2145
His Ile Ile Cys Cys Thr Leu Ser Thr Ser Gly Gly Leu Leu Leu
2150 2155 2160
Glu Ser Ala Phe Arg Gly Gln Gly Gly Val Pro Phe Ser Cys Val
2165 2170 2175
Ile Val Asp Glu Ala Gly Gln Ser Cys Glu Ile Glu Thr Leu Thr
2180 2185 2190
Pro Leu Ile His Arg Cys Asn Lys Leu Ile Leu Val Gly Asp Pro
2195 2200 2205
Lys Gln Leu Pro Pro Thr Val Ile Ser Met Lys Ala Gln Glu Tyr
2210 2215 2220
Gly Tyr Asp Gln Ser Met Met Ala Arg Phe Cys Arg Leu Leu Glu
2225 2230 2235
Glu Asn Val Glu His Asn Met Ile Ser Arg Leu Pro Ile Leu Gln
2240 2245 2250
Leu Thr Val Gln Tyr Arg Met His Pro Asp Ile Cys Leu Phe Pro
2255 2260 2265
Ser Asn Tyr Val Tyr Asn Arg Asn Leu Lys Thr Asn Arg Gln Thr
2270 2275 2280
Glu Ala Ile Arg Cys Ser Ser Asp Trp Pro Phe Gln Pro Tyr Leu
2285 2290 2295
Val Phe Asp Val Gly Asp Gly Ser Glu Arg Arg Asp Asn Asp Ser
2300 2305 2310
Tyr Ile Asn Val Gln Glu Ile Lys Leu Val Met Glu Ile Ile Lys
2315 2320 2325
Leu Ile Lys Asp Lys Arg Lys Asp Val Ser Phe Arg Asn Ile Gly
2330 2335 2340
Ile Ile Thr His Tyr Lys Ala Gln Lys Thr Met Ile Gln Lys Asp
2345 2350 2355
Leu Asp Lys Glu Phe Asp Arg Lys Gly Pro Ala Glu Val Asp Thr
2360 2365 2370
Val Asp Ala Phe Gln Gly Arg Gln Lys Asp Cys Val Ile Val Thr
2375 2380 2385
Cys Val Arg Ala Asn Ser Ile Gln Gly Ser Ile Gly Phe Leu Ala
2390 2395 2400
Ser Leu Gln Arg Leu Asn Val Thr Ile Thr Arg Ala Lys Tyr Ser
2405 2410 2415
Leu Phe Ile Leu Gly His Leu Arg Thr Leu Met Glu Asn Gln His
2420 2425 2430
Trp Asn Gln Leu Ile Gln Asp Ala Gln Lys Arg Gly Ala Ile Ile
2435 2440 2445
Lys Thr Cys Asp Lys Asn Tyr Arg His Asp Ala Val Lys Ile Leu
2450 2455 2460
Lys Leu Lys Pro Val Leu Gln Arg Ser Leu Thr His Pro Pro Thr
2465 2470 2475
Ile Ala Pro Glu Gly Ser Arg Pro Gln Gly Gly Leu Pro Ser Ser
2480 2485 2490
Lys Leu Asp Ser Gly Phe Ala Lys Thr Ser Val Ala Ala Ser Leu
2495 2500 2505
Tyr His Thr Pro Ser Asp Ser Lys Glu Ile Thr Leu Thr Val Thr
2510 2515 2520
Ser Lys Asp Pro Glu Arg Pro Pro Val His Asp Gln Leu Gln Asp
2525 2530 2535
Pro Arg Leu Leu Lys Arg Met Gly Ile Glu Val Lys Gly Gly Ile
2540 2545 2550
Phe Leu Trp Asp Pro Gln Pro Ser Ser Pro Gln His Pro Gly Ala
2555 2560 2565
Thr Pro Pro Thr Gly Glu Pro Gly Phe Pro Val Val His Gln Asp
2570 2575 2580
Leu Ser His Ile Gln Gln Pro Ala Ala Val Val Ala Ala Leu Ser
2585 2590 2595
Ser His Lys Pro Pro Val Arg Gly Glu Pro Pro Ala Ala Ser Pro
2600 2605 2610
Glu Ala Ser Thr Cys Gln Ser Lys Cys Asp Asp Pro Glu Glu Glu
2615 2620 2625
Leu Cys His Arg Arg Glu Ala Arg Ala Phe Ser Glu Gly Glu Gln
2630 2635 2640
Glu Lys Cys Gly Ser Glu Thr His His Thr Arg Arg Asn Ser Arg
2645 2650 2655
Trp Asp Lys Arg Thr Leu Glu Gln Glu Asp Ser Ser Ser Lys Lys
2660 2665 2670
Arg Lys Leu Leu
2675
<210> 136
<211> 632
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> FMR1
<400> 136
Met Glu Glu Leu Val Val Glu Val Arg Gly Ser Asn Gly Ala Phe Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Phe Val Lys Asp Val His Glu Asp Ser Ile Thr Val Ala Phe
20 25 30
Glu Asn Asn Trp Gln Pro Asp Arg Gln Ile Pro Phe His Asp Val Arg
35 40 45
Phe Pro Pro Pro Val Gly Tyr Asn Lys Asp Ile Asn Glu Ser Asp Glu
50 55 60
Val Glu Val Tyr Ser Arg Ala Asn Glu Lys Glu Pro Cys Cys Trp Trp
65 70 75 80
Leu Ala Lys Val Arg Met Ile Lys Gly Glu Phe Tyr Val Ile Glu Tyr
85 90 95
Ala Ala Cys Asp Ala Thr Tyr Asn Glu Ile Val Thr Ile Glu Arg Leu
100 105 110
Arg Ser Val Asn Pro Asn Lys Pro Ala Thr Lys Asp Thr Phe His Lys
115 120 125
Ile Lys Leu Asp Val Pro Glu Asp Leu Arg Gln Met Cys Ala Lys Glu
130 135 140
Ala Ala His Lys Asp Phe Lys Lys Ala Val Gly Ala Phe Ser Val Thr
145 150 155 160
Tyr Asp Pro Glu Asn Tyr Gln Leu Val Ile Leu Ser Ile Asn Glu Val
165 170 175
Thr Ser Lys Arg Ala His Met Leu Ile Asp Met His Phe Arg Ser Leu
180 185 190
Arg Thr Lys Leu Ser Leu Ile Met Arg Asn Glu Glu Ala Ser Lys Gln
195 200 205
Leu Glu Ser Ser Arg Gln Leu Ala Ser Arg Phe His Glu Gln Phe Ile
210 215 220
Val Arg Glu Asp Leu Met Gly Leu Ala Ile Gly Thr His Gly Ala Asn
225 230 235 240
Ile Gln Gln Ala Arg Lys Val Pro Gly Val Thr Ala Ile Asp Leu Asp
245 250 255
Glu Asp Thr Cys Thr Phe His Ile Tyr Gly Glu Asp Gln Asp Ala Val
260 265 270
Lys Lys Ala Arg Ser Phe Leu Glu Phe Ala Glu Asp Val Ile Gln Val
275 280 285
Pro Arg Asn Leu Val Gly Lys Val Ile Gly Lys Asn Gly Lys Leu Ile
290 295 300
Gln Glu Ile Val Asp Lys Ser Gly Val Val Arg Val Arg Ile Glu Ala
305 310 315 320
Glu Asn Glu Lys Asn Val Pro Gln Glu Glu Glu Ile Met Pro Pro Asn
325 330 335
Ser Leu Pro Ser Asn Asn Ser Arg Val Gly Pro Asn Ala Pro Glu Glu
340 345 350
Lys Lys His Leu Asp Ile Lys Glu Asn Ser Thr His Phe Ser Gln Pro
355 360 365
Asn Ser Thr Lys Val Gln Arg Val Leu Val Ala Ser Ser Val Val Ala
370 375 380
Gly Glu Ser Gln Lys Pro Glu Leu Lys Ala Trp Gln Gly Met Val Pro
385 390 395 400
Phe Val Phe Val Gly Thr Lys Asp Ser Ile Ala Asn Ala Thr Val Leu
405 410 415
Leu Asp Tyr His Leu Asn Tyr Leu Lys Glu Val Asp Gln Leu Arg Leu
420 425 430
Glu Arg Leu Gln Ile Asp Glu Gln Leu Arg Gln Ile Gly Ala Ser Ser
435 440 445
Arg Pro Pro Pro Asn Arg Thr Asp Lys Glu Lys Ser Tyr Val Thr Asp
450 455 460
Asp Gly Gln Gly Met Gly Arg Gly Ser Arg Pro Tyr Arg Asn Arg Gly
465 470 475 480
His Gly Arg Arg Gly Pro Gly Tyr Thr Ser Gly Thr Asn Ser Glu Ala
485 490 495
Ser Asn Ala Ser Glu Thr Glu Ser Asp His Arg Asp Glu Leu Ser Asp
500 505 510
Trp Ser Leu Ala Pro Thr Glu Glu Glu Arg Glu Ser Phe Leu Arg Arg
515 520 525
Gly Asp Gly Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gln Gly Gly Arg
530 535 540
Gly Arg Gly Gly Gly Phe Lys Gly Asn Asp Asp His Ser Arg Thr Asp
545 550 555 560
Asn Arg Pro Arg Asn Pro Arg Glu Ala Lys Gly Arg Thr Thr Asp Gly
565 570 575
Ser Leu Gln Ile Arg Val Asp Cys Asn Asn Glu Arg Ser Val His Thr
580 585 590
Lys Thr Leu Gln Asn Thr Ser Ser Glu Gly Ser Arg Leu Arg Thr Gly
595 600 605
Lys Asp Arg Asn Gln Lys Lys Glu Lys Pro Asp Ser Val Asp Gly Gln
610 615 620
Gln Pro Leu Val Asn Gly Val Pro
625 630
<210> 137
<211> 635
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SLC6A8
<400> 137
Met Ala Lys Lys Ser Ala Glu Asn Gly Ile Tyr Ser Val Ser Gly Asp
1 5 10 15
Glu Lys Lys Gly Pro Leu Ile Ala Pro Gly Pro Asp Gly Ala Pro Ala
20 25 30
Lys Gly Asp Gly Pro Val Gly Leu Gly Thr Pro Gly Gly Arg Leu Ala
35 40 45
Val Pro Pro Arg Glu Thr Trp Thr Arg Gln Met Asp Phe Ile Met Ser
50 55 60
Cys Val Gly Phe Ala Val Gly Leu Gly Asn Val Trp Arg Phe Pro Tyr
65 70 75 80
Leu Cys Tyr Lys Asn Gly Gly Gly Val Phe Leu Ile Pro Tyr Val Leu
85 90 95
Ile Ala Leu Val Gly Gly Ile Pro Ile Phe Phe Leu Glu Ile Ser Leu
100 105 110
Gly Gln Phe Met Lys Ala Gly Ser Ile Asn Val Trp Asn Ile Cys Pro
115 120 125
Leu Phe Lys Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Met Val Ile Val Phe Tyr Cys
130 135 140
Asn Thr Tyr Tyr Ile Met Val Leu Ala Trp Gly Phe Tyr Tyr Leu Val
145 150 155 160
Lys Ser Phe Thr Thr Thr Leu Pro Trp Ala Thr Cys Gly His Thr Trp
165 170 175
Asn Thr Pro Asp Cys Val Glu Ile Phe Arg His Glu Asp Cys Ala Asn
180 185 190
Ala Ser Leu Ala Asn Leu Thr Cys Asp Gln Leu Ala Asp Arg Arg Ser
195 200 205
Pro Val Ile Glu Phe Trp Glu Asn Lys Val Leu Arg Leu Ser Gly Gly
210 215 220
Leu Glu Val Pro Gly Ala Leu Asn Trp Glu Val Thr Leu Cys Leu Leu
225 230 235 240
Ala Cys Trp Val Leu Val Tyr Phe Cys Val Trp Lys Gly Val Lys Ser
245 250 255
Thr Gly Lys Ile Val Tyr Phe Thr Ala Thr Phe Pro Tyr Val Val Leu
260 265 270
Val Val Leu Leu Val Arg Gly Val Leu Leu Pro Gly Ala Leu Asp Gly
275 280 285
Ile Ile Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Trp Ser Lys Leu Gly Ser Pro Gln
290 295 300
Val Trp Ile Asp Ala Gly Thr Gln Ile Phe Phe Ser Tyr Ala Ile Gly
305 310 315 320
Leu Gly Ala Leu Thr Ala Leu Gly Ser Tyr Asn Arg Phe Asn Asn Asn
325 330 335
Cys Tyr Lys Asp Ala Ile Ile Leu Ala Leu Ile Asn Ser Gly Thr Ser
340 345 350
Phe Phe Ala Gly Phe Val Val Phe Ser Ile Leu Gly Phe Met Ala Ala
355 360 365
Glu Gln Gly Val His Ile Ser Lys Val Ala Glu Ser Gly Pro Gly Leu
370 375 380
Ala Phe Ile Ala Tyr Pro Arg Ala Val Thr Leu Met Pro Val Ala Pro
385 390 395 400
Leu Trp Ala Ala Leu Phe Phe Phe Met Leu Leu Leu Leu Gly Leu Asp
405 410 415
Ser Gln Phe Val Gly Val Glu Gly Phe Ile Thr Gly Leu Leu Asp Leu
420 425 430
Leu Pro Ala Ser Tyr Tyr Phe Arg Phe Gln Arg Glu Ile Ser Val Ala
435 440 445
Leu Cys Cys Ala Leu Cys Phe Val Ile Asp Leu Ser Met Val Thr Asp
450 455 460
Gly Gly Met Tyr Val Phe Gln Leu Phe Asp Tyr Tyr Ser Ala Ser Gly
465 470 475 480
Thr Thr Leu Leu Trp Gln Ala Phe Trp Glu Cys Val Val Val Ala Trp
485 490 495
Val Tyr Gly Ala Asp Arg Phe Met Asp Asp Ile Ala Cys Met Ile Gly
500 505 510
Tyr Arg Pro Cys Pro Trp Met Lys Trp Cys Trp Ser Phe Phe Thr Pro
515 520 525
Leu Val Cys Met Gly Ile Phe Ile Phe Asn Val Val Tyr Tyr Glu Pro
530 535 540
Leu Val Tyr Asn Asn Thr Tyr Val Tyr Pro Trp Trp Gly Glu Ala Met
545 550 555 560
Gly Trp Ala Phe Ala Leu Ser Ser Met Leu Cys Val Pro Leu His Leu
565 570 575
Leu Gly Cys Leu Leu Arg Ala Lys Gly Thr Met Ala Glu Arg Trp Gln
580 585 590
His Leu Thr Gln Pro Ile Trp Gly Leu His His Leu Glu Tyr Arg Ala
595 600 605
Gln Asp Ala Asp Val Arg Gly Leu Thr Thr Leu Thr Pro Val Ser Glu
610 615 620
Ser Ser Lys Val Val Val Val Glu Ser Val Met
625 630 635
<210> 138
<211> 875
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> UBE3A
<400> 138
Met Glu Lys Leu His Gln Cys Tyr Trp Lys Ser Gly Glu Pro Gln Ser
1 5 10 15
Asp Asp Ile Glu Ala Ser Arg Met Lys Arg Ala Ala Ala Lys His Leu
20 25 30
Ile Glu Arg Tyr Tyr His Gln Leu Thr Glu Gly Cys Gly Asn Glu Ala
35 40 45
Cys Thr Asn Glu Phe Cys Ala Ser Cys Pro Thr Phe Leu Arg Met Asp
50 55 60
Asn Asn Ala Ala Ala Ile Lys Ala Leu Glu Leu Tyr Lys Ile Asn Ala
65 70 75 80
Lys Leu Cys Asp Pro His Pro Ser Lys Lys Gly Ala Ser Ser Ala Tyr
85 90 95
Leu Glu Asn Ser Lys Gly Ala Pro Asn Asn Ser Cys Ser Glu Ile Lys
100 105 110
Met Asn Lys Lys Gly Ala Arg Ile Asp Phe Lys Asp Val Thr Tyr Leu
115 120 125
Thr Glu Glu Lys Val Tyr Glu Ile Leu Glu Leu Cys Arg Glu Arg Glu
130 135 140
Asp Tyr Ser Pro Leu Ile Arg Val Ile Gly Arg Val Phe Ser Ser Ala
145 150 155 160
Glu Ala Leu Val Gln Ser Phe Arg Lys Val Lys Gln His Thr Lys Glu
165 170 175
Glu Leu Lys Ser Leu Gln Ala Lys Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu
180 185 190
Lys Glu Lys Ala Ala Cys Ser Ala Ala Ala Met Glu Glu Asp Ser Glu
195 200 205
Ala Ser Ser Ser Arg Ile Gly Asp Ser Ser Gln Gly Asp Asn Asn Leu
210 215 220
Gln Lys Leu Gly Pro Asp Asp Val Ser Val Asp Ile Asp Ala Ile Arg
225 230 235 240
Arg Val Tyr Thr Arg Leu Leu Ser Asn Glu Lys Ile Glu Thr Ala Phe
245 250 255
Leu Asn Ala Leu Val Tyr Leu Ser Pro Asn Val Glu Cys Asp Leu Thr
260 265 270
Tyr His Asn Val Tyr Ser Arg Asp Pro Asn Tyr Leu Asn Leu Phe Ile
275 280 285
Ile Val Met Glu Asn Arg Asn Leu His Ser Pro Glu Tyr Leu Glu Met
290 295 300
Ala Leu Pro Leu Phe Cys Lys Ala Met Ser Lys Leu Pro Leu Ala Ala
305 310 315 320
Gln Gly Lys Leu Ile Arg Leu Trp Ser Lys Tyr Asn Ala Asp Gln Ile
325 330 335
Arg Arg Met Met Glu Thr Phe Gln Gln Leu Ile Thr Tyr Lys Val Ile
340 345 350
Ser Asn Glu Phe Asn Ser Arg Asn Leu Val Asn Asp Asp Asp Ala Ile
355 360 365
Val Ala Ala Ser Lys Cys Leu Lys Met Val Tyr Tyr Ala Asn Val Val
370 375 380
Gly Gly Glu Val Asp Thr Asn His Asn Glu Glu Asp Asp Glu Glu Pro
385 390 395 400
Ile Pro Glu Ser Ser Glu Leu Thr Leu Gln Glu Leu Leu Gly Glu Glu
405 410 415
Arg Arg Asn Lys Lys Gly Pro Arg Val Asp Pro Leu Glu Thr Glu Leu
420 425 430
Gly Val Lys Thr Leu Asp Cys Arg Lys Pro Leu Ile Pro Phe Glu Glu
435 440 445
Phe Ile Asn Glu Pro Leu Asn Glu Val Leu Glu Met Asp Lys Asp Tyr
450 455 460
Thr Phe Phe Lys Val Glu Thr Glu Asn Lys Phe Ser Phe Met Thr Cys
465 470 475 480
Pro Phe Ile Leu Asn Ala Val Thr Lys Asn Leu Gly Leu Tyr Tyr Asp
485 490 495
Asn Arg Ile Arg Met Tyr Ser Glu Arg Arg Ile Thr Val Leu Tyr Ser
500 505 510
Leu Val Gln Gly Gln Gln Leu Asn Pro Tyr Leu Arg Leu Lys Val Arg
515 520 525
Arg Asp His Ile Ile Asp Asp Ala Leu Val Arg Leu Glu Met Ile Ala
530 535 540
Met Glu Asn Pro Ala Asp Leu Lys Lys Gln Leu Tyr Val Glu Phe Glu
545 550 555 560
Gly Glu Gln Gly Val Asp Glu Gly Gly Val Ser Lys Glu Phe Phe Gln
565 570 575
Leu Val Val Glu Glu Ile Phe Asn Pro Asp Ile Gly Met Phe Thr Tyr
580 585 590
Asp Glu Ser Thr Lys Leu Phe Trp Phe Asn Pro Ser Ser Phe Glu Thr
595 600 605
Glu Gly Gln Phe Thr Leu Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ala Ile Tyr
610 615 620
Asn Asn Cys Ile Leu Asp Val His Phe Pro Met Val Val Tyr Arg Lys
625 630 635 640
Leu Met Gly Lys Lys Gly Thr Phe Arg Asp Leu Gly Asp Ser His Pro
645 650 655
Val Leu Tyr Gln Ser Leu Lys Asp Leu Leu Glu Tyr Glu Gly Asn Val
660 665 670
Glu Asp Asp Met Met Ile Thr Phe Gln Ile Ser Gln Thr Asp Leu Phe
675 680 685
Gly Asn Pro Met Met Tyr Asp Leu Lys Glu Asn Gly Asp Lys Ile Pro
690 695 700
Ile Thr Asn Glu Asn Arg Lys Glu Phe Val Asn Leu Tyr Ser Asp Tyr
705 710 715 720
Ile Leu Asn Lys Ser Val Glu Lys Gln Phe Lys Ala Phe Arg Arg Gly
725 730 735
Phe His Met Val Thr Asn Glu Ser Pro Leu Lys Tyr Leu Phe Arg Pro
740 745 750
Glu Glu Ile Glu Leu Leu Ile Cys Gly Ser Arg Asn Leu Asp Phe Gln
755 760 765
Ala Leu Glu Glu Thr Thr Glu Tyr Asp Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Ser
770 775 780
Val Leu Ile Arg Glu Phe Trp Glu Ile Val His Ser Phe Thr Asp Glu
785 790 795 800
Gln Lys Arg Leu Phe Leu Gln Phe Thr Thr Gly Thr Asp Arg Ala Pro
805 810 815
Val Gly Gly Leu Gly Lys Leu Lys Met Ile Ile Ala Lys Asn Gly Pro
820 825 830
Asp Thr Glu Arg Leu Pro Thr Ser His Thr Cys Phe Asn Val Leu Leu
835 840 845
Leu Pro Glu Tyr Ser Ser Lys Glu Lys Leu Lys Glu Arg Leu Leu Lys
850 855 860
Ala Ile Thr Tyr Ala Lys Gly Phe Gly Met Leu
865 870 875
<210> 139
<211> 154
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> SOD1
<400> 139
Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
1 5 10 15
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
20 25 30
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val
35 40 45
His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His
50 55 60
Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg
65 70 75 80
His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala
85 90 95
Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys
100 105 110
Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly
115 120 125
Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg
130 135 140
Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln
145 150
<210> 140
<211> 414
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TDP43
<400> 140
Met Ser Glu Tyr Ile Arg Val Thr Glu Asp Glu Asn Asp Glu Pro Ile
1 5 10 15
Glu Ile Pro Ser Glu Asp Asp Gly Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Thr
20 25 30
Ala Gln Phe Pro Gly Ala Cys Gly Leu Arg Tyr Arg Asn Pro Val Ser
35 40 45
Gln Cys Met Arg Gly Val Arg Leu Val Glu Gly Ile Leu His Ala Pro
50 55 60
Asp Ala Gly Trp Gly Asn Leu Val Tyr Val Val Asn Tyr Pro Lys Asp
65 70 75 80
Asn Lys Arg Lys Met Asp Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ala Val Lys Val
85 90 95
Lys Arg Ala Val Gln Lys Thr Ser Asp Leu Ile Val Leu Gly Leu Pro
100 105 110
Trp Lys Thr Thr Glu Gln Asp Leu Lys Glu Tyr Phe Ser Thr Phe Gly
115 120 125
Glu Val Leu Met Val Gln Val Lys Lys Asp Leu Lys Thr Gly His Ser
130 135 140
Lys Gly Phe Gly Phe Val Arg Phe Thr Glu Tyr Glu Thr Gln Val Lys
145 150 155 160
Val Met Ser Gln Arg His Met Ile Asp Gly Arg Trp Cys Asp Cys Lys
165 170 175
Leu Pro Asn Ser Lys Gln Ser Gln Asp Glu Pro Leu Arg Ser Arg Lys
180 185 190
Val Phe Val Gly Arg Cys Thr Glu Asp Met Thr Glu Asp Glu Leu Arg
195 200 205
Glu Phe Phe Ser Gln Tyr Gly Asp Val Met Asp Val Phe Ile Pro Lys
210 215 220
Pro Phe Arg Ala Phe Ala Phe Val Thr Phe Ala Asp Asp Gln Ile Ala
225 230 235 240
Gln Ser Leu Cys Gly Glu Asp Leu Ile Ile Lys Gly Ile Ser Val His
245 250 255
Ile Ser Asn Ala Glu Pro Lys His Asn Ser Asn Arg Gln Leu Glu Arg
260 265 270
Ser Gly Arg Phe Gly Gly Asn Pro Gly Gly Phe Gly Asn Gln Gly Gly
275 280 285
Phe Gly Asn Ser Arg Gly Gly Gly Ala Gly Leu Gly Asn Asn Gln Gly
290 295 300
Ser Asn Met Gly Gly Gly Met Asn Phe Gly Ala Phe Ser Ile Asn Pro
305 310 315 320
Ala Met Met Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ser Trp Gly Met
325 330 335
Met Gly Met Leu Ala Ser Gln Gln Asn Gln Ser Gly Pro Ser Gly Asn
340 345 350
Asn Gln Asn Gln Gly Asn Met Gln Arg Glu Pro Asn Gln Ala Phe Gly
355 360 365
Ser Gly Asn Asn Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ser Gly Ala Ala Ile Gly
370 375 380
Trp Gly Ser Ala Ser Asn Ala Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Gly Gly
385 390 395 400
Phe Gly Ser Ser Met Asp Ser Lys Ser Ser Gly Trp Gly Met
405 410
<210> 141
<211> 481
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> C9orf72
<400> 141
Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu
1 5 10 15
Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr
20 25 30
Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys
35 40 45
Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn
50 55 60
His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile
65 70 75 80
Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser
85 90 95
Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu
100 105 110
Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His
115 120 125
Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile
130 135 140
Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Ile Leu Glu
145 150 155 160
Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu
165 170 175
Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ser Ser Met Lys Ser
180 185 190
His Ser Val Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp
195 200 205
Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile
210 215 220
Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser
225 230 235 240
Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr
245 250 255
Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe
260 265 270
Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ser Thr
275 280 285
Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro
290 295 300
Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro
305 310 315 320
Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu
325 330 335
Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr
340 345 350
Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln
355 360 365
Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val
370 375 380
Phe Gln Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln
385 390 395 400
Phe Leu Leu Val Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile
405 410 415
Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn
420 425 430
Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile
435 440 445
Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe
450 455 460
Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr
465 470 475 480
Phe
<210> 142
<211> 210
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> FXN
<400> 142
Met Trp Thr Leu Gly Arg Arg Ala Val Ala Gly Leu Leu Ala Ser Pro
1 5 10 15
Ser Pro Ala Gln Ala Gln Thr Leu Thr Arg Val Pro Arg Pro Ala Glu
20 25 30
Leu Ala Pro Leu Cys Gly Arg Arg Gly Leu Arg Thr Asp Ile Asp Ala
35 40 45
Thr Cys Thr Pro Arg Arg Ala Ser Ser Asn Gln Arg Gly Leu Asn Gln
50 55 60
Ile Trp Asn Val Lys Lys Gln Ser Val Tyr Leu Met Asn Leu Arg Lys
65 70 75 80
Ser Gly Thr Leu Gly His Pro Gly Ser Leu Asp Glu Thr Thr Tyr Glu
85 90 95
Arg Leu Ala Glu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Ala Glu Phe Phe Glu Asp
100 105 110
Leu Ala Asp Lys Pro Tyr Thr Phe Glu Asp Tyr Asp Val Ser Phe Gly
115 120 125
Ser Gly Val Leu Thr Val Lys Leu Gly Gly Asp Leu Gly Thr Tyr Val
130 135 140
Ile Asn Lys Gln Thr Pro Asn Lys Gln Ile Trp Leu Ser Ser Pro Ser
145 150 155 160
Ser Gly Pro Lys Arg Tyr Asp Trp Thr Gly Lys Asn Trp Val Tyr Ser
165 170 175
His Asp Gly Val Ser Leu His Glu Leu Leu Ala Ala Glu Leu Thr Lys
180 185 190
Ala Leu Lys Thr Lys Leu Asp Leu Ser Ser Leu Ala Tyr Ser Gly Lys
195 200 205
Asp Ala
210
<210> 143
<211> 486
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> MECP2
<400> 143
Met Val Ala Gly Met Leu Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln
1 5 10 15
Asp Leu Gln Gly Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys
20 25 30
Lys Asp Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro
35 40 45
Ser Ala His His Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr
50 55 60
Ser Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser
65 70 75 80
Pro Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp
85 90 95
Asp Pro Thr Leu Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys
100 105 110
Ser Gly Arg Ser Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln
115 120 125
Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys
130 135 140
Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr
145 150 155 160
Gly Arg Gly Ser Pro Ser Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro Lys Lys Pro
165 170 175
Lys Ser Pro Lys Ala Pro Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys
180 185 190
Gly Ser Gly Thr Thr Arg Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu Gly Val Gln
195 200 205
Val Lys Arg Val Leu Glu Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu Val Lys Met
210 215 220
Pro Phe Gln Thr Ser Pro Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly Gly Ala Thr
225 230 235 240
Thr Ser Thr Gln Val Met Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys
245 250 255
Ala Glu Ala Asp Pro Gln Ala Ile Pro Lys Lys Arg Gly Arg Lys Pro
260 265 270
Gly Ser Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Lys Lys Ala Val
275 280 285
Lys Glu Ser Ser Ile Arg Ser Val Gln Glu Thr Val Leu Pro Ile Lys
290 295 300
Lys Arg Lys Thr Arg Glu Thr Val Ser Ile Glu Val Lys Glu Val Val
305 310 315 320
Lys Pro Leu Leu Val Ser Thr Leu Gly Glu Lys Ser Gly Lys Gly Leu
325 330 335
Lys Thr Cys Lys Ser Pro Gly Arg Lys Ser Lys Glu Ser Ser Pro Lys
340 345 350
Gly Arg Ser Ser Ser Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Glu His His His
355 360 365
His His His His Ser Glu Ser Pro Lys Ala Pro Val Pro Leu Leu Pro
370 375 380
Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Glu Pro Glu Ser Ser Glu Asp Pro Thr
385 390 395 400
Ser Pro Pro Glu Pro Gln Asp Leu Ser Ser Ser Val Cys Lys Glu Glu
405 410 415
Lys Met Pro Arg Gly Gly Ser Leu Glu Ser Asp Gly Cys Pro Lys Glu
420 425 430
Pro Ala Lys Thr Gln Pro Ala Val Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Glu
435 440 445
Lys Tyr Lys His Arg Gly Glu Gly Glu Arg Lys Asp Ile Val Ser Ser
450 455 460
Ser Met Pro Arg Pro Asn Arg Glu Glu Pro Val Asp Ser Arg Thr Pro
465 470 475 480
Val Thr Glu Arg Val Ser
485
<210> 144
<211> 313
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> ASPA
<400> 144
Met Thr Ser Cys His Ile Ala Glu Glu His Ile Gln Lys Val Ala Ile
1 5 10 15
Phe Gly Gly Thr His Gly Asn Glu Leu Thr Gly Val Phe Leu Val Lys
20 25 30
His Trp Leu Glu Asn Gly Ala Glu Ile Gln Arg Thr Gly Leu Glu Val
35 40 45
Lys Pro Phe Ile Thr Asn Pro Arg Ala Val Lys Lys Cys Thr Arg Tyr
50 55 60
Ile Asp Cys Asp Leu Asn Arg Ile Phe Asp Leu Glu Asn Leu Gly Lys
65 70 75 80
Lys Met Ser Glu Asp Leu Pro Tyr Glu Val Arg Arg Ala Gln Glu Ile
85 90 95
Asn His Leu Phe Gly Pro Lys Asp Ser Glu Asp Ser Tyr Asp Ile Ile
100 105 110
Phe Asp Leu His Asn Thr Thr Ser Asn Met Gly Cys Thr Leu Ile Leu
115 120 125
Glu Asp Ser Arg Asn Asn Phe Leu Ile Gln Met Phe His Tyr Ile Lys
130 135 140
Thr Ser Leu Ala Pro Leu Pro Cys Tyr Val Tyr Leu Ile Glu His Pro
145 150 155 160
Ser Leu Lys Tyr Ala Thr Thr Arg Ser Ile Ala Lys Tyr Pro Val Gly
165 170 175
Ile Glu Val Gly Pro Gln Pro Gln Gly Val Leu Arg Ala Asp Ile Leu
180 185 190
Asp Gln Met Arg Lys Met Ile Lys His Ala Leu Asp Phe Ile His His
195 200 205
Phe Asn Glu Gly Lys Glu Phe Pro Pro Cys Ala Ile Glu Val Tyr Lys
210 215 220
Ile Ile Glu Lys Val Asp Tyr Pro Arg Asp Glu Asn Gly Glu Ile Ala
225 230 235 240
Ala Ile Ile His Pro Asn Leu Gln Asp Gln Asp Trp Lys Pro Leu His
245 250 255
Pro Gly Asp Pro Met Phe Leu Thr Leu Asp Gly Lys Thr Ile Pro Leu
260 265 270
Gly Gly Asp Cys Thr Val Tyr Pro Val Phe Val Asn Glu Ala Ala Tyr
275 280 285
Tyr Glu Lys Lys Glu Ala Phe Ala Lys Thr Thr Lys Leu Thr Leu Asn
290 295 300
Ala Lys Ser Ile Arg Cys Cys Leu His
305 310
<210> 145
<211> 539
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> ALDH7A1
<400> 145
Met Trp Arg Leu Pro Arg Ala Leu Cys Val His Ala Ala Lys Thr Ser
1 5 10 15
Lys Leu Ser Gly Pro Trp Ser Arg Pro Ala Ala Phe Met Ser Thr Leu
20 25 30
Leu Ile Asn Gln Pro Gln Tyr Ala Trp Leu Lys Glu Leu Gly Leu Arg
35 40 45
Glu Glu Asn Glu Gly Val Tyr Asn Gly Ser Trp Gly Gly Arg Gly Glu
50 55 60
Val Ile Thr Thr Tyr Cys Pro Ala Asn Asn Glu Pro Ile Ala Arg Val
65 70 75 80
Arg Gln Ala Ser Val Ala Asp Tyr Glu Glu Thr Val Lys Lys Ala Arg
85 90 95
Glu Ala Trp Lys Ile Trp Ala Asp Ile Pro Ala Pro Lys Arg Gly Glu
100 105 110
Ile Val Arg Gln Ile Gly Asp Ala Leu Arg Glu Lys Ile Gln Val Leu
115 120 125
Gly Ser Leu Val Ser Leu Glu Met Gly Lys Ile Leu Val Glu Gly Val
130 135 140
Gly Glu Val Gln Glu Tyr Val Asp Ile Cys Asp Tyr Ala Val Gly Leu
145 150 155 160
Ser Arg Met Ile Gly Gly Pro Ile Leu Pro Ser Glu Arg Ser Gly His
165 170 175
Ala Leu Ile Glu Gln Trp Asn Pro Val Gly Leu Val Gly Ile Ile Thr
180 185 190
Ala Phe Asn Phe Pro Val Ala Val Tyr Gly Trp Asn Asn Ala Ile Ala
195 200 205
Met Ile Cys Gly Asn Val Cys Leu Trp Lys Gly Ala Pro Thr Thr Ser
210 215 220
Leu Ile Ser Val Ala Val Thr Lys Ile Ile Ala Lys Val Leu Glu Asp
225 230 235 240
Asn Lys Leu Pro Gly Ala Ile Cys Ser Leu Thr Cys Gly Gly Ala Asp
245 250 255
Ile Gly Thr Ala Met Ala Lys Asp Glu Arg Val Asn Leu Leu Ser Phe
260 265 270
Thr Gly Ser Thr Gln Val Gly Lys Gln Val Gly Leu Met Val Gln Glu
275 280 285
Arg Phe Gly Arg Ser Leu Leu Glu Leu Gly Gly Asn Asn Ala Ile Ile
290 295 300
Ala Phe Glu Asp Ala Asp Leu Ser Leu Val Val Pro Ser Ala Leu Phe
305 310 315 320
Ala Ala Val Gly Thr Ala Gly Gln Arg Cys Thr Thr Ala Arg Arg Leu
325 330 335
Phe Ile His Glu Ser Ile His Asp Glu Val Val Asn Arg Leu Lys Lys
340 345 350
Ala Tyr Ala Gln Ile Arg Val Gly Asn Pro Trp Asp Pro Asn Val Leu
355 360 365
Tyr Gly Pro Leu His Thr Lys Gln Ala Val Ser Met Phe Leu Gly Ala
370 375 380
Val Glu Glu Ala Lys Lys Glu Gly Gly Thr Val Val Tyr Gly Gly Lys
385 390 395 400
Val Met Asp Arg Pro Gly Asn Tyr Val Glu Pro Thr Ile Val Thr Gly
405 410 415
Leu Gly His Asp Ala Ser Ile Ala His Thr Glu Thr Phe Ala Pro Ile
420 425 430
Leu Tyr Val Phe Lys Phe Lys Asn Glu Glu Glu Val Phe Ala Trp Asn
435 440 445
Asn Glu Val Lys Gln Gly Leu Ser Ser Ser Ile Phe Thr Lys Asp Leu
450 455 460
Gly Arg Ile Phe Arg Trp Leu Gly Pro Lys Gly Ser Asp Cys Gly Ile
465 470 475 480
Val Asn Val Asn Ile Pro Thr Ser Gly Ala Glu Ile Gly Gly Ala Phe
485 490 495
Gly Gly Glu Lys His Thr Gly Gly Gly Arg Glu Ser Gly Ser Asp Ala
500 505 510
Trp Lys Gln Tyr Met Arg Arg Ser Thr Cys Thr Ile Asn Tyr Ser Lys
515 520 525
Asp Leu Pro Leu Ala Gln Gly Ile Lys Phe Gln
530 535
<210> 146
<211> 563
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TPP1
<400> 146
Met Gly Leu Gln Ala Cys Leu Leu Gly Leu Phe Ala Leu Ile Leu Ser
1 5 10 15
Gly Lys Cys Ser Tyr Ser Pro Glu Pro Asp Gln Arg Arg Thr Leu Pro
20 25 30
Pro Gly Trp Val Ser Leu Gly Arg Ala Asp Pro Glu Glu Glu Leu Ser
35 40 45
Leu Thr Phe Ala Leu Arg Gln Gln Asn Val Glu Arg Leu Ser Glu Leu
50 55 60
Val Gln Ala Val Ser Asp Pro Ser Ser Pro Gln Tyr Gly Lys Tyr Leu
65 70 75 80
Thr Leu Glu Asn Val Ala Asp Leu Val Arg Pro Ser Pro Leu Thr Leu
85 90 95
His Thr Val Gln Lys Trp Leu Leu Ala Ala Gly Ala Gln Lys Cys His
100 105 110
Ser Val Ile Thr Gln Asp Phe Leu Thr Cys Trp Leu Ser Ile Arg Gln
115 120 125
Ala Glu Leu Leu Leu Pro Gly Ala Glu Phe His His Tyr Val Gly Gly
130 135 140
Pro Thr Glu Thr His Val Val Arg Ser Pro His Pro Tyr Gln Leu Pro
145 150 155 160
Gln Ala Leu Ala Pro His Val Asp Phe Val Gly Gly Leu His Arg Phe
165 170 175
Pro Pro Thr Ser Ser Leu Arg Gln Arg Pro Glu Pro Gln Val Thr Gly
180 185 190
Thr Val Gly Leu His Leu Gly Val Thr Pro Ser Val Ile Arg Lys Arg
195 200 205
Tyr Asn Leu Thr Ser Gln Asp Val Gly Ser Gly Thr Ser Asn Asn Ser
210 215 220
Gln Ala Cys Ala Gln Phe Leu Glu Gln Tyr Phe His Asp Ser Asp Leu
225 230 235 240
Ala Gln Phe Met Arg Leu Phe Gly Gly Asn Phe Ala His Gln Ala Ser
245 250 255
Val Ala Arg Val Val Gly Gln Gln Gly Arg Gly Arg Ala Gly Ile Glu
260 265 270
Ala Ser Leu Asp Val Gln Tyr Leu Met Ser Ala Gly Ala Asn Ile Ser
275 280 285
Thr Trp Val Tyr Ser Ser Pro Gly Arg His Glu Gly Gln Glu Pro Phe
290 295 300
Leu Gln Trp Leu Met Leu Leu Ser Asn Glu Ser Ala Leu Pro His Val
305 310 315 320
His Thr Val Ser Tyr Gly Asp Asp Glu Asp Ser Leu Ser Ser Ala Tyr
325 330 335
Ile Gln Arg Val Asn Thr Glu Leu Met Lys Ala Ala Ala Arg Gly Leu
340 345 350
Thr Leu Leu Phe Ala Ser Gly Asp Ser Gly Ala Gly Cys Trp Ser Val
355 360 365
Ser Gly Arg His Gln Phe Arg Pro Thr Phe Pro Ala Ser Ser Pro Tyr
370 375 380
Val Thr Thr Val Gly Gly Thr Ser Phe Gln Glu Pro Phe Leu Ile Thr
385 390 395 400
Asn Glu Ile Val Asp Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe
405 410 415
Pro Arg Pro Ser Tyr Gln Glu Glu Ala Val Thr Lys Phe Leu Ser Ser
420 425 430
Ser Pro His Leu Pro Pro Ser Ser Tyr Phe Asn Ala Ser Gly Arg Ala
435 440 445
Tyr Pro Asp Val Ala Ala Leu Ser Asp Gly Tyr Trp Val Val Ser Asn
450 455 460
Arg Val Pro Ile Pro Trp Val Ser Gly Thr Ser Ala Ser Thr Pro Val
465 470 475 480
Phe Gly Gly Ile Leu Ser Leu Ile Asn Glu His Arg Ile Leu Ser Gly
485 490 495
Arg Pro Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Arg Leu Tyr Gln Gln His Gly
500 505 510
Ala Gly Leu Phe Asp Val Thr Arg Gly Cys His Glu Ser Cys Leu Asp
515 520 525
Glu Glu Val Glu Gly Gln Gly Phe Cys Ser Gly Pro Gly Trp Asp Pro
530 535 540
Val Thr Gly Trp Gly Thr Pro Asn Phe Pro Ala Leu Leu Lys Thr Leu
545 550 555 560
Leu Asn Pro
<210> 147
<211> 466
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> FUCA1
<400> 147
Met Arg Ala Pro Gly Met Arg Ser Arg Pro Ala Gly Pro Ala Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Phe Leu Gly Ala Ala Glu Ser Val Arg Arg Ala Gln
20 25 30
Pro Pro Arg Arg Tyr Thr Pro Asp Trp Pro Ser Leu Asp Ser Arg Pro
35 40 45
Leu Pro Ala Trp Phe Asp Glu Ala Lys Phe Gly Val Phe Ile His Trp
50 55 60
Gly Val Phe Ser Val Pro Ala Trp Gly Ser Glu Trp Phe Trp Trp His
65 70 75 80
Trp Gln Gly Glu Gly Arg Pro Gln Tyr Gln Arg Phe Met Arg Asp Asn
85 90 95
Tyr Pro Pro Gly Phe Ser Tyr Ala Asp Phe Gly Pro Gln Phe Thr Ala
100 105 110
Arg Phe Phe His Pro Glu Glu Trp Ala Asp Leu Phe Gln Ala Ala Gly
115 120 125
Ala Lys Tyr Val Val Leu Thr Thr Lys His His Glu Gly Phe Thr Asn
130 135 140
Trp Pro Ser Pro Val Ser Trp Asn Trp Asn Ser Lys Asp Val Gly Pro
145 150 155 160
His Arg Asp Leu Val Gly Glu Leu Gly Thr Ala Leu Arg Lys Arg Asn
165 170 175
Ile Arg Tyr Gly Leu Tyr His Ser Leu Leu Glu Trp Phe His Pro Leu
180 185 190
Tyr Leu Leu Asp Lys Lys Asn Gly Phe Lys Thr Gln His Phe Val Ser
195 200 205
Ala Lys Thr Met Pro Glu Leu Tyr Asp Leu Val Asn Ser Tyr Lys Pro
210 215 220
Asp Leu Ile Trp Ser Asp Gly Glu Trp Glu Cys Pro Asp Thr Tyr Trp
225 230 235 240
Asn Ser Thr Asn Phe Leu Ser Trp Leu Tyr Asn Asp Ser Pro Val Lys
245 250 255
Asp Glu Val Val Val Asn Asp Arg Trp Gly Gln Asn Cys Ser Cys His
260 265 270
His Gly Gly Tyr Tyr Asn Cys Glu Asp Lys Phe Lys Pro Gln Ser Leu
275 280 285
Pro Asp His Lys Trp Glu Met Cys Thr Ser Ile Asp Lys Phe Ser Trp
290 295 300
Gly Tyr Arg Arg Asp Met Ala Leu Ser Asp Val Thr Glu Glu Ser Glu
305 310 315 320
Ile Ile Ser Glu Leu Val Gln Thr Val Ser Leu Gly Gly Asn Tyr Leu
325 330 335
Leu Asn Ile Gly Pro Thr Lys Asp Gly Leu Ile Val Pro Ile Phe Gln
340 345 350
Glu Arg Leu Leu Ala Val Gly Lys Trp Leu Ser Ile Asn Gly Glu Ala
355 360 365
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370 375 380
Ser Val Trp Tyr Thr Ser Lys Gly Ser Ala Val Tyr Ala Ile Phe Leu
385 390 395 400
His Trp Pro Glu Asn Gly Val Leu Asn Leu Glu Ser Pro Ile Thr Thr
405 410 415
Ser Thr Thr Lys Ile Thr Met Leu Gly Ile Gln Gly Asp Leu Lys Trp
420 425 430
Ser Thr Asp Pro Asp Lys Gly Leu Phe Ile Ser Leu Pro Gln Leu Pro
435 440 445
Pro Ser Ala Val Pro Ala Glu Phe Ala Trp Thr Ile Lys Leu Thr Gly
450 455 460
Val Lys
465
<210> 148
<211> 685
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> GALC
<400> 148
Met Ala Glu Trp Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln Arg Arg Ala Lys Ala
1 5 10 15
Met Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ala Ala Val Pro Leu Leu
20 25 30
Leu Cys Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly Ala Tyr Val Leu Asp Asp Ser
35 40 45
Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly Ile Gly Ala Val Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr Pro Glu Pro Tyr Arg Ser
65 70 75 80
Gln Ile Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn Phe Gly Ala Ser Leu His
85 90 95
Ile Leu Lys Val Glu Ile Gly Gly Asp Gly Gln Thr Thr Asp Gly Thr
100 105 110
Glu Pro Ser His Met His Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Arg Gly
115 120 125
Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys Lys Arg Asn Pro Asn Ile
130 135 140
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145 150 155 160
Phe Asp Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gln Leu Thr Ala Tyr Tyr Val Val
165 170 175
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180 185 190
Ile Gly Ile Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Tyr Ile Lys Ile
195 200 205
Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gln Gly Leu Gln Arg Val Lys Ile Ile
210 215 220
Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Ser Ile Ser Ala Ser Met Leu Leu Asp
225 230 235 240
Ala Glu Leu Phe Lys Val Val Asp Val Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
245 250 255
Thr His Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Thr Gly Lys Lys Leu Trp Ser
260 265 270
Ser Glu Asp Phe Ser Thr Leu Asn Ser Asp Met Gly Ala Gly Cys Trp
275 280 285
Gly Arg Ile Leu Asn Gln Asn Tyr Ile Asn Gly Tyr Met Thr Ser Thr
290 295 300
Ile Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr Glu Gln Leu Pro Tyr Gly
305 310 315 320
Arg Cys Gly Leu Met Thr Ala Gln Glu Pro Trp Ser Gly His Tyr Val
325 330 335
Val Glu Ser Pro Val Trp Val Ser Ala His Thr Thr Gln Phe Thr Gln
340 345 350
Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly His Leu Glu Lys Gly Gly
355 360 365
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370 375 380
Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys Ile Arg Pro Phe Leu Pro
385 390 395 400
Tyr Phe Asn Val Ser Gln Gln Phe Ala Thr Phe Val Leu Lys Gly Ser
405 410 415
Phe Ser Glu Ile Pro Glu Leu Gln Val Trp Tyr Thr Lys Leu Gly Lys
420 425 430
Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gln Leu Asp Ser Leu Trp Leu Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Leu Phe
450 455 460
Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys Gly Ser Tyr Pro Leu Pro
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Pro Lys Ser Gln Pro Phe Pro Ser Thr Tyr Lys Asp Asp Phe Asn Val
485 490 495
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500 505 510
Val Phe Glu Tyr Phe Thr Asn Ile Glu Asp Pro Gly Glu His His Phe
515 520 525
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530 535 540
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Thr Ile Lys Cys Asp Val Tyr Ile Glu Thr Pro Asp Thr Gly Gly Val
565 570 575
Phe Ile Ala Gly Arg Val Asn Lys Gly Gly Ile Leu Ile Arg Ser Ala
580 585 590
Arg Gly Ile Phe Phe Trp Ile Phe Ala Asn Gly Ser Tyr Arg Val Thr
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Gly Asp Leu Ala Gly Trp Ile Ile Tyr Ala Leu Gly Arg Val Glu Val
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Phe Ala Gln Phe Asp Asn Phe Leu Val Glu Ala Thr Arg
675 680 685
<210> 149
<211> 529
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HEXA
<400> 149
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1 5 10 15
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Ser Asp Gln Arg Tyr Val Leu Tyr Pro Asn Asn Phe Gln Phe Gln Tyr
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Leu Val Trp Lys Ser Ala Glu Gly Thr Phe Phe Ile Asn Lys Thr Glu
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165 170 175
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195 200 205
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Gly Ser Tyr Asn Pro Val Thr His Ile Tyr Thr Ala Gln Asp Val Lys
225 230 235 240
Glu Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Ala Glu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Phe Leu Glu Val Ser Ser Val Phe Pro Asp Phe Tyr Leu His Leu Gly
305 310 315 320
Gly Asp Glu Val Asp Phe Thr Cys Trp Lys Ser Asn Pro Glu Ile Gln
325 330 335
Asp Phe Met Arg Lys Lys Gly Phe Gly Glu Asp Phe Lys Gln Leu Glu
340 345 350
Ser Phe Tyr Ile Gln Thr Leu Leu Asp Ile Val Ser Ser Tyr Gly Lys
355 360 365
Gly Tyr Val Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asn Lys Val Lys Ile Gln
370 375 380
Pro Asp Thr Ile Ile Gln Val Trp Arg Glu Asp Ile Pro Val Asn Tyr
385 390 395 400
Met Lys Glu Leu Glu Leu Val Thr Lys Ala Gly Phe Arg Ala Leu Leu
405 410 415
Ser Ala Pro Trp Tyr Leu Asn Arg Ile Ser Tyr Gly Pro Asp Trp Lys
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Asp Phe Tyr Ile Val Glu Pro Leu Ala Phe Glu Gly Thr Pro Glu Gln
435 440 445
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Tyr Glu Arg Leu Ser His Phe Arg Cys Glu Leu Leu Arg Arg Gly Val
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515 520 525
Thr
<210> 150
<211> 556
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> HEXB
<400> 150
Met Glu Leu Cys Gly Leu Gly Leu Pro Arg Pro Pro Met Leu Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Leu Ala Leu Leu Thr Gln
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Val Ala Leu Val Val Gln Val Ala Glu Ala Ala Arg Ala Pro Ser Val
35 40 45
Ser Ala Lys Pro Gly Pro Ala Leu Trp Pro Leu Pro Leu Ser Val Lys
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Ser Asp Glu Ser Tyr Thr Leu Leu Val Lys Glu Pro Val Ala Val Leu
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165 170 175
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180 185 190
Thr Ile Ile Asp Ser Pro Arg Phe Ser His Arg Gly Ile Leu Ile Asp
195 200 205
Thr Ser Arg His Tyr Leu Pro Val Lys Ile Ile Leu Lys Thr Leu Asp
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Ala Met Ala Phe Asn Lys Phe Asn Val Leu His Trp His Ile Val Asp
225 230 235 240
Asp Gln Ser Phe Pro Tyr Gln Ser Ile Thr Phe Pro Glu Leu Ser Asn
245 250 255
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260 265 270
Met Val Ile Glu Tyr Ala Arg Leu Arg Gly Ile Arg Val Leu Pro Glu
275 280 285
Phe Asp Thr Pro Gly His Thr Leu Ser Trp Gly Lys Gly Gln Lys Asp
290 295 300
Leu Leu Thr Pro Cys Tyr Ser Arg Gln Asn Lys Leu Asp Ser Phe Gly
305 310 315 320
Pro Ile Asn Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Ser Phe Leu Thr Thr Phe
325 330 335
Phe Lys Glu Ile Ser Glu Val Phe Pro Asp Gln Phe Ile His Leu Gly
340 345 350
Gly Asp Glu Val Glu Phe Lys Cys Trp Glu Ser Asn Pro Lys Ile Gln
355 360 365
Asp Phe Met Arg Gln Lys Gly Phe Gly Thr Asp Phe Lys Lys Leu Glu
370 375 380
Ser Phe Tyr Ile Gln Lys Val Leu Asp Ile Ile Ala Thr Ile Asn Lys
385 390 395 400
Gly Ser Ile Val Trp Gln Glu Val Phe Asp Asp Lys Ala Lys Leu Ala
405 410 415
Pro Gly Thr Ile Val Glu Val Trp Lys Asp Ser Ala Tyr Pro Glu Glu
420 425 430
Leu Ser Arg Val Thr Ala Ser Gly Phe Pro Val Ile Leu Ser Ala Pro
435 440 445
Trp Tyr Leu Asp Leu Ile Ser Tyr Gly Gln Asp Trp Arg Lys Tyr Tyr
450 455 460
Lys Val Glu Pro Leu Asp Phe Gly Gly Thr Gln Lys Gln Lys Gln Leu
465 470 475 480
Phe Ile Gly Gly Glu Ala Cys Leu Trp Gly Glu Tyr Val Asp Ala Thr
485 490 495
Asn Leu Thr Pro Arg Leu Trp Pro Arg Ala Ser Ala Val Gly Glu Arg
500 505 510
Leu Trp Ser Ser Lys Asp Val Arg Asp Met Asp Asp Ala Tyr Asp Arg
515 520 525
Leu Thr Arg His Arg Cys Arg Met Val Glu Arg Gly Ile Ala Ala Gln
530 535 540
Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Cys Asn His Glu Asn Met
545 550 555
<210> 151
<211> 879
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> MANBA
<400> 151
Met Arg Leu His Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Cys Gly Ala Gly Thr
1 5 10 15
Thr Ala Ala Glu Leu Ser Tyr Ser Leu Arg Gly Asn Trp Ser Ile Cys
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Asn Gly Asn Gly Ser Leu Glu Leu Pro Gly Ala Val Pro Gly Cys Val
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Phe Asn Asp Leu Asn Tyr Arg Trp Val Ser Leu Asp Asn Trp Thr Tyr
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Asp Ile Thr Asn Val Val Arg Asp Val Asn Ser Ile Glu Leu Arg Phe
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Gln Ser Ala Val Leu Tyr Ala Ala Gln Gln Ser Lys Ala His Thr Arg
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Tyr Gln Val Pro Pro Asp Cys Pro Pro Leu Val Gln Lys Gly Glu Cys
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His Val Asn Phe Val Arg Lys Glu Gln Cys Ser Phe Ser Trp Asp Trp
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Gly Pro Ser Phe Pro Thr Gln Gly Ile Trp Lys Asp Val Arg Ile Glu
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210 215 220
Asp Lys Ser Ala Gln Glu Trp Asn Leu Glu Ile Glu Ser Thr Phe Asp
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Val Val Ser Ser Lys Pro Val Gly Gly Gln Val Ile Val Ala Ile Pro
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Lys Leu Gln Thr Gln Gln Thr Tyr Ser Ile Glu Leu Gln Pro Gly Lys
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Arg Ile Val Glu Leu Phe Val Asn Ile Ser Lys Asn Ile Thr Val Glu
275 280 285
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290 295 300
Val Leu Phe Glu Leu Asp Gly Gly Leu Asn Ile Glu Lys Ser Ala Lys
305 310 315 320
Val Tyr Phe Arg Thr Val Glu Leu Ile Glu Glu Pro Ile Lys Gly Ser
325 330 335
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340 345 350
Lys Gly Ser Asn Trp Ile Pro Ala Asp Ser Phe Gln Asp Arg Val Thr
355 360 365
Ser Glu Leu Leu Arg Leu Leu Leu Gln Ser Val Val Asp Ala Asn Met
370 375 380
Asn Thr Leu Arg Val Trp Gly Gly Gly Ile Tyr Glu Gln Asp Glu Phe
385 390 395 400
Tyr Glu Leu Cys Asp Glu Leu Gly Ile Met Val Trp Gln Asp Phe Met
405 410 415
Phe Ala Cys Ala Leu Tyr Pro Thr Asp Gln Gly Phe Leu Asp Ser Val
420 425 430
Thr Ala Glu Val Ala Tyr Gln Ile Lys Arg Leu Lys Ser His Pro Ser
435 440 445
Ile Ile Ile Trp Ser Gly Asn Asn Glu Asn Glu Glu Ala Leu Met Met
450 455 460
Asn Trp Tyr His Ile Ser Phe Thr Asp Arg Pro Ile Tyr Ile Lys Asp
465 470 475 480
Tyr Val Thr Leu Tyr Val Lys Asn Ile Arg Glu Leu Val Leu Ala Gly
485 490 495
Asp Lys Ser Arg Pro Phe Ile Thr Ser Ser Pro Thr Asn Gly Ala Glu
500 505 510
Thr Val Ala Glu Ala Trp Val Ser Gln Asn Pro Asn Ser Asn Tyr Phe
515 520 525
Gly Asp Val His Phe Tyr Asp Tyr Ile Ser Asp Cys Trp Asn Trp Lys
530 535 540
Val Phe Pro Lys Ala Arg Phe Ala Ser Glu Tyr Gly Tyr Gln Ser Trp
545 550 555 560
Pro Ser Phe Ser Thr Leu Glu Lys Val Ser Ser Thr Glu Asp Trp Ser
565 570 575
Phe Asn Ser Lys Phe Ser Leu His Arg Gln His His Glu Gly Gly Asn
580 585 590
Lys Gln Met Leu Tyr Gln Ala Gly Leu His Phe Lys Leu Pro Gln Ser
595 600 605
Thr Asp Pro Leu Arg Thr Phe Lys Asp Thr Ile Tyr Leu Thr Gln Val
610 615 620
Met Gln Ala Gln Cys Val Lys Thr Glu Thr Glu Phe Tyr Arg Arg Ser
625 630 635 640
Arg Ser Glu Ile Val Asp Gln Gln Gly His Thr Met Gly Ala Leu Tyr
645 650 655
Trp Gln Leu Asn Asp Ile Trp Gln Ala Pro Ser Trp Ala Ser Leu Glu
660 665 670
Tyr Gly Gly Lys Trp Lys Met Leu His Tyr Phe Ala Gln Asn Phe Phe
675 680 685
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850 855 860
Glu Leu Glu Gln Ser Phe His Val Thr Ser Leu Thr Asp Ile Tyr
865 870 875
<210> 152
<211> 507
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> ARSA
<400> 152
Met Gly Ala Pro Arg Ser Leu Leu Leu Ala Leu Ala Ala Gly Leu Ala
1 5 10 15
Val Ala Arg Pro Pro Asn Ile Val Leu Ile Phe Ala Asp Asp Leu Gly
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Tyr Gly Asp Leu Gly Cys Tyr Gly His Pro Ser Ser Thr Thr Pro Asn
35 40 45
Leu Asp Gln Leu Ala Ala Gly Gly Leu Arg Phe Thr Asp Phe Tyr Val
50 55 60
Pro Val Ser Leu Cys Thr Pro Ser Arg Ala Ala Leu Leu Thr Gly Arg
65 70 75 80
Leu Pro Val Arg Met Gly Met Tyr Pro Gly Val Leu Val Pro Ser Ser
85 90 95
Arg Gly Gly Leu Pro Leu Glu Glu Val Thr Val Ala Glu Val Leu Ala
100 105 110
Ala Arg Gly Tyr Leu Thr Gly Met Ala Gly Lys Trp His Leu Gly Val
115 120 125
Gly Pro Glu Gly Ala Phe Leu Pro Pro His Gln Gly Phe His Arg Phe
130 135 140
Leu Gly Ile Pro Tyr Ser His Asp Gln Gly Pro Cys Gln Asn Leu Thr
145 150 155 160
Cys Phe Pro Pro Ala Thr Pro Cys Asp Gly Gly Cys Asp Gln Gly Leu
165 170 175
Val Pro Ile Pro Leu Leu Ala Asn Leu Ser Val Glu Ala Gln Pro Pro
180 185 190
Trp Leu Pro Gly Leu Glu Ala Arg Tyr Met Ala Phe Ala His Asp Leu
195 200 205
Met Ala Asp Ala Gln Arg Gln Asp Arg Pro Phe Phe Leu Tyr Tyr Ala
210 215 220
Ser His His Thr His Tyr Pro Gln Phe Ser Gly Gln Ser Phe Ala Glu
225 230 235 240
Arg Ser Gly Arg Gly Pro Phe Gly Asp Ser Leu Met Glu Leu Asp Ala
245 250 255
Ala Val Gly Thr Leu Met Thr Ala Ile Gly Asp Leu Gly Leu Leu Glu
260 265 270
Glu Thr Leu Val Ile Phe Thr Ala Asp Asn Gly Pro Glu Thr Met Arg
275 280 285
Met Ser Arg Gly Gly Cys Ser Gly Leu Leu Arg Cys Gly Lys Gly Thr
290 295 300
Thr Tyr Glu Gly Gly Val Arg Glu Pro Ala Leu Ala Phe Trp Pro Gly
305 310 315 320
His Ile Ala Pro Gly Val Thr His Glu Leu Ala Ser Ser Leu Asp Leu
325 330 335
Leu Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Gly Ala Pro Leu Pro Asn Val Thr
340 345 350
Leu Asp Gly Phe Asp Leu Ser Pro Leu Leu Leu Gly Thr Gly Lys Ser
355 360 365
Pro Arg Gln Ser Leu Phe Phe Tyr Pro Ser Tyr Pro Asp Glu Val Arg
370 375 380
Gly Val Phe Ala Val Arg Thr Gly Lys Tyr Lys Ala His Phe Phe Thr
385 390 395 400
Gln Gly Ser Ala His Ser Asp Thr Thr Ala Asp Pro Ala Cys His Ala
405 410 415
Ser Ser Ser Leu Thr Ala His Glu Pro Pro Leu Leu Tyr Asp Leu Ser
420 425 430
Lys Asp Pro Gly Glu Asn Tyr Asn Leu Leu Gly Gly Val Ala Gly Ala
435 440 445
Thr Pro Glu Val Leu Gln Ala Leu Lys Gln Leu Gln Leu Leu Lys Ala
450 455 460
Gln Leu Asp Ala Ala Val Thr Phe Gly Pro Ser Gln Val Ala Arg Gly
465 470 475 480
Glu Asp Pro Ala Leu Gln Ile Cys Cys His Pro Gly Cys Thr Pro Arg
485 490 495
Pro Ala Cys Cys His Cys Pro Asp Pro His Ala
500 505
<210> 153
<211> 1256
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> GNPTAB
<400> 153
Met Leu Phe Lys Leu Leu Gln Arg Gln Thr Tyr Thr Cys Leu Ser His
1 5 10 15
Arg Tyr Gly Leu Tyr Val Cys Phe Leu Gly Val Val Val Thr Ile Val
20 25 30
Ser Ala Phe Gln Phe Gly Glu Val Val Leu Glu Trp Ser Arg Asp Gln
35 40 45
Tyr His Val Leu Phe Asp Ser Tyr Arg Asp Asn Ile Ala Gly Lys Ser
50 55 60
Phe Gln Asn Arg Leu Cys Leu Pro Met Pro Ile Asp Val Val Tyr Thr
65 70 75 80
Trp Val Asn Gly Thr Asp Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Gln Val
85 90 95
Arg Glu Gln Met Glu Glu Glu Gln Lys Ala Met Arg Glu Ile Leu Gly
100 105 110
Lys Asn Thr Thr Glu Pro Thr Lys Lys Ser Glu Lys Gln Leu Glu Cys
115 120 125
Leu Leu Thr His Cys Ile Lys Val Pro Met Leu Val Leu Asp Pro Ala
130 135 140
Leu Pro Ala Asn Ile Thr Leu Lys Asp Leu Pro Ser Leu Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Phe His Ser Ala Ser Asp Ile Phe Asn Val Ala Lys Pro Lys Asn Pro
165 170 175
Ser Thr Asn Val Ser Val Val Val Phe Asp Ser Thr Lys Asp Val Glu
180 185 190
Asp Ala His Ser Gly Leu Leu Lys Gly Asn Ser Arg Gln Thr Val Trp
195 200 205
Arg Gly Tyr Leu Thr Thr Asp Lys Glu Val Pro Gly Leu Val Leu Met
210 215 220
Gln Asp Leu Ala Phe Leu Ser Gly Phe Pro Pro Thr Phe Lys Glu Thr
225 230 235 240
Asn Gln Leu Lys Thr Lys Leu Pro Glu Asn Leu Ser Ser Lys Val Lys
245 250 255
Leu Leu Gln Leu Tyr Ser Glu Ala Ser Val Ala Leu Leu Lys Leu Asn
260 265 270
Asn Pro Lys Asp Phe Gln Glu Leu Asn Lys Gln Thr Lys Lys Asn Met
275 280 285
Thr Ile Asp Gly Lys Glu Leu Thr Ile Ser Pro Ala Tyr Leu Leu Trp
290 295 300
Asp Leu Ser Ala Ile Ser Gln Ser Lys Gln Asp Glu Asp Ile Ser Ala
305 310 315 320
Ser Arg Phe Glu Asp Asn Glu Glu Leu Arg Tyr Ser Leu Arg Ser Ile
325 330 335
Glu Arg His Ala Pro Trp Val Arg Asn Ile Phe Ile Val Thr Asn Gly
340 345 350
Gln Ile Pro Ser Trp Leu Asn Leu Asp Asn Pro Arg Val Thr Ile Val
355 360 365
Thr His Gln Asp Val Phe Arg Asn Leu Ser His Leu Pro Thr Phe Ser
370 375 380
Ser Pro Ala Ile Glu Ser His Ile His Arg Ile Glu Gly Leu Ser Gln
385 390 395 400
Lys Phe Ile Tyr Leu Asn Asp Asp Val Met Phe Gly Lys Asp Val Trp
405 410 415
Pro Asp Asp Phe Tyr Ser His Ser Lys Gly Gln Lys Val Tyr Leu Thr
420 425 430
Trp Pro Val Pro Asn Cys Ala Glu Gly Cys Pro Gly Ser Trp Ile Lys
435 440 445
Asp Gly Tyr Cys Asp Lys Ala Cys Asn Asn Ser Ala Cys Asp Trp Asp
450 455 460
Gly Gly Asp Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Ser Arg Tyr Ile Ala Gly
465 470 475 480
Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ile Gly Val Gly Gln Pro Trp Gln Phe Gly
485 490 495
Gly Gly Ile Asn Ser Val Ser Tyr Cys Asn Gln Gly Cys Ala Asn Ser
500 505 510
Trp Leu Ala Asp Lys Phe Cys Asp Gln Ala Cys Asn Val Leu Ser Cys
515 520 525
Gly Phe Asp Ala Gly Asp Cys Gly Gln Asp His Phe His Glu Leu Tyr
530 535 540
Lys Val Ile Leu Leu Pro Asn Gln Thr His Tyr Ile Ile Pro Lys Gly
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Tyr Phe Ser Phe Ala Glu Val Ala Lys Arg Gly Val
565 570 575
Glu Gly Ala Tyr Ser Asp Asn Pro Ile Ile Arg His Ala Ser Ile Ala
580 585 590
Asn Lys Trp Lys Thr Ile His Leu Ile Met His Ser Gly Met Asn Ala
595 600 605
Thr Thr Ile His Phe Asn Leu Thr Phe Gln Asn Thr Asn Asp Glu Glu
610 615 620
Phe Lys Met Gln Ile Thr Val Glu Val Asp Thr Arg Glu Gly Pro Lys
625 630 635 640
Leu Asn Ser Thr Ala Gln Lys Gly Tyr Glu Asn Leu Val Ser Pro Ile
645 650 655
Thr Leu Leu Pro Glu Ala Glu Ile Leu Phe Glu Asp Ile Pro Lys Glu
660 665 670
Lys Arg Phe Pro Lys Phe Lys Arg His Asp Val Asn Ser Thr Arg Arg
675 680 685
Ala Gln Glu Glu Val Lys Ile Pro Leu Val Asn Ile Ser Leu Leu Pro
690 695 700
Lys Asp Ala Gln Leu Ser Leu Asn Thr Leu Asp Leu Gln Leu Glu His
705 710 715 720
Gly Asp Ile Thr Leu Lys Gly Tyr Asn Leu Ser Lys Ser Ala Leu Leu
725 730 735
Arg Ser Phe Leu Met Asn Ser Gln His Ala Lys Ile Lys Asn Gln Ala
740 745 750
Ile Ile Thr Asp Glu Thr Asn Asp Ser Leu Val Ala Pro Gln Glu Lys
755 760 765
Gln Val His Lys Ser Ile Leu Pro Asn Ser Leu Gly Val Ser Glu Arg
770 775 780
Leu Gln Arg Leu Thr Phe Pro Ala Val Ser Val Lys Val Asn Gly His
785 790 795 800
Asp Gln Gly Gln Asn Pro Pro Leu Asp Leu Glu Thr Thr Ala Arg Phe
805 810 815
Arg Val Glu Thr His Thr Gln Lys Thr Ile Gly Gly Asn Val Thr Lys
820 825 830
Glu Lys Pro Pro Ser Leu Ile Val Pro Leu Glu Ser Gln Met Thr Lys
835 840 845
Glu Lys Lys Ile Thr Gly Lys Glu Lys Glu Asn Ser Arg Met Glu Glu
850 855 860
Asn Ala Glu Asn His Ile Gly Val Thr Glu Val Leu Leu Gly Arg Lys
865 870 875 880
Leu Gln His Tyr Thr Asp Ser Tyr Leu Gly Phe Leu Pro Trp Glu Lys
885 890 895
Lys Lys Tyr Phe Gln Asp Leu Leu Asp Glu Glu Glu Ser Leu Lys Thr
900 905 910
Gln Leu Ala Tyr Phe Thr Asp Ser Lys Asn Thr Gly Arg Gln Leu Lys
915 920 925
Asp Thr Phe Ala Asp Ser Leu Arg Tyr Val Asn Lys Ile Leu Asn Ser
930 935 940
Lys Phe Gly Phe Thr Ser Arg Lys Val Pro Ala His Met Pro His Met
945 950 955 960
Ile Asp Arg Ile Val Met Gln Glu Leu Gln Asp Met Phe Pro Glu Glu
965 970 975
Phe Asp Lys Thr Ser Phe His Lys Val Arg His Ser Glu Asp Met Gln
980 985 990
Phe Ala Phe Ser Tyr Phe Tyr Tyr Leu Met Ser Ala Val Gln Pro Leu
995 1000 1005
Asn Ile Ser Gln Val Phe Asp Glu Val Asp Thr Asp Gln Ser Gly
1010 1015 1020
Val Leu Ser Asp Arg Glu Ile Arg Thr Leu Ala Thr Arg Ile His
1025 1030 1035
Glu Leu Pro Leu Ser Leu Gln Asp Leu Thr Gly Leu Glu His Met
1040 1045 1050
Leu Ile Asn Cys Ser Lys Met Leu Pro Ala Asp Ile Thr Gln Leu
1055 1060 1065
Asn Asn Ile Pro Pro Thr Gln Glu Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Leu
1070 1075 1080
Pro Pro Val Thr Lys Ser Leu Val Thr Asn Cys Lys Pro Val Thr
1085 1090 1095
Asp Lys Ile His Lys Ala Tyr Lys Asp Lys Asn Lys Tyr Arg Phe
1100 1105 1110
Glu Ile Met Gly Glu Glu Glu Ile Ala Phe Lys Met Ile Arg Thr
1115 1120 1125
Asn Val Ser His Val Val Gly Gln Leu Asp Asp Ile Arg Lys Asn
1130 1135 1140
Pro Arg Lys Phe Val Cys Leu Asn Asp Asn Ile Asp His Asn His
1145 1150 1155
Lys Asp Ala Gln Thr Val Lys Ala Val Leu Arg Asp Phe Tyr Glu
1160 1165 1170
Ser Met Phe Pro Ile Pro Ser Gln Phe Glu Leu Pro Arg Glu Tyr
1175 1180 1185
Arg Asn Arg Phe Leu His Met His Glu Leu Gln Glu Trp Arg Ala
1190 1195 1200
Tyr Arg Asp Lys Leu Lys Phe Trp Thr His Cys Val Leu Ala Thr
1205 1210 1215
Leu Ile Met Phe Thr Ile Phe Ser Phe Phe Ala Glu Gln Leu Ile
1220 1225 1230
Ala Leu Lys Arg Lys Ile Phe Pro Arg Arg Arg Ile His Lys Glu
1235 1240 1245
Ala Ser Pro Asn Arg Ile Arg Val
1250 1255
<210> 154
<211> 580
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> MCOLN1
<400> 154
Met Thr Ala Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ser Glu Thr Glu Arg Leu Leu
1 5 10 15
Thr Pro Asn Pro Gly Tyr Gly Thr Gln Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Pro Pro Glu Glu Glu Asp Leu Arg Arg Arg Leu Lys Tyr Phe
35 40 45
Phe Met Ser Pro Cys Asp Lys Phe Arg Ala Lys Gly Arg Lys Pro Cys
50 55 60
Lys Leu Met Leu Gln Val Val Lys Ile Leu Val Val Thr Val Gln Leu
65 70 75 80
Ile Leu Phe Gly Leu Ser Asn Gln Leu Ala Val Thr Phe Arg Glu Glu
85 90 95
Asn Thr Ile Ala Phe Arg His Leu Phe Leu Leu Gly Tyr Ser Asp Gly
100 105 110
Ala Asp Asp Thr Phe Ala Ala Tyr Thr Arg Glu Gln Leu Tyr Gln Ala
115 120 125
Ile Phe His Ala Val Asp Gln Tyr Leu Ala Leu Pro Asp Val Ser Leu
130 135 140
Gly Arg Tyr Ala Tyr Val Arg Gly Gly Gly Asp Pro Trp Thr Asn Gly
145 150 155 160
Ser Gly Leu Ala Leu Cys Gln Arg Tyr Tyr His Arg Gly His Val Asp
165 170 175
Pro Ala Asn Asp Thr Phe Asp Ile Asp Pro Met Val Val Thr Asp Cys
180 185 190
Ile Gln Val Asp Pro Pro Glu Arg Pro Pro Pro Pro Pro Ser Asp Asp
195 200 205
Leu Thr Leu Leu Glu Ser Ser Ser Ser Tyr Lys Asn Leu Thr Leu Lys
210 215 220
Phe His Lys Leu Val Asn Val Thr Ile His Phe Arg Leu Lys Thr Ile
225 230 235 240
Asn Leu Gln Ser Leu Ile Asn Asn Glu Ile Pro Asp Cys Tyr Thr Phe
245 250 255
Ser Val Leu Ile Thr Phe Asp Asn Lys Ala His Ser Gly Arg Ile Pro
260 265 270
Ile Ser Leu Glu Thr Gln Ala His Ile Gln Glu Cys Lys His Pro Ser
275 280 285
Val Phe Gln His Gly Asp Asn Ser Phe Arg Leu Leu Phe Asp Val Val
290 295 300
Val Ile Leu Thr Cys Ser Leu Ser Phe Leu Leu Cys Ala Arg Ser Leu
305 310 315 320
Leu Arg Gly Phe Leu Leu Gln Asn Glu Phe Val Gly Phe Met Trp Arg
325 330 335
Gln Arg Gly Arg Val Ile Ser Leu Trp Glu Arg Leu Glu Phe Val Asn
340 345 350
Gly Trp Tyr Ile Leu Leu Val Thr Ser Asp Val Leu Thr Ile Ser Gly
355 360 365
Thr Ile Met Lys Ile Gly Ile Glu Ala Lys Asn Leu Ala Ser Tyr Asp
370 375 380
Val Cys Ser Ile Leu Leu Gly Thr Ser Thr Leu Leu Val Trp Val Gly
385 390 395 400
Val Ile Arg Tyr Leu Thr Phe Phe His Asn Tyr Asn Ile Leu Ile Ala
405 410 415
Thr Leu Arg Val Ala Leu Pro Ser Val Met Arg Phe Cys Cys Cys Val
420 425 430
Ala Val Ile Tyr Leu Gly Tyr Cys Phe Cys Gly Trp Ile Val Leu Gly
435 440 445
Pro Tyr His Val Lys Phe Arg Ser Leu Ser Met Val Ser Glu Cys Leu
450 455 460
Phe Ser Leu Ile Asn Gly Asp Asp Met Phe Val Thr Phe Ala Ala Met
465 470 475 480
Gln Ala Gln Gln Gly Arg Ser Ser Leu Val Trp Leu Phe Ser Gln Leu
485 490 495
Tyr Leu Tyr Ser Phe Ile Ser Leu Phe Ile Tyr Met Val Leu Ser Leu
500 505 510
Phe Ile Ala Leu Ile Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Lys His Pro Gly
515 520 525
Gly Ala Gly Ala Glu Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Ile Ala Gln Cys
530 535 540
Gln Asp Ser Pro Thr Ser Gly Lys Phe Arg Arg Gly Ser Gly Ser Ala
545 550 555 560
Cys Ser Leu Leu Cys Cys Cys Gly Arg Asp Pro Ser Glu Glu His Ser
565 570 575
Leu Leu Val Asn
580
<210> 155
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 胱天蛋白酶2蛋白序列
<400> 155
Val Asp Val Ala Asp
1 5
<210> 156
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> miR-338-3p
<400> 156
uccagcauca gugauuuugu ug 22
<210> 157
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> miR-9-5p
<400> 157
ucuuugguua ucuagcugua uga 23
<210> 158
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> miR-9-3p
<400> 158
auaaagcuag auaaccgaaa gu 22
<210> 159
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> miR-125b-5p
<400> 159
ucccugagac ccuaacuugu ga 22
<210> 160
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> miR-342-3p
<400> 160
ucucacacag aaaucgcacc cgu 23
<210> 161
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> miR-124-3p
<400> 161
uaaggcacgc ggugaaugcc aa 22
<210> 162
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> miR-124-5p
<400> 162
cguguucaca gcggaccuug au 22

Claims (62)

1.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，其包含：
(i)对外源性药剂进行编码的有效负荷基因；以及
(ii)与所述有效负荷基因操作性地连接的阳性靶细胞特异性调节元件，其中相对于缺乏所述阳性靶细胞特异性调节元件的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述阳性靶细胞特异性调节元件使所述有效负荷基因在靶细胞中的表达增加，其中所述靶细胞是CNS细胞。
2.根据权利要求1所述的融合剂脂质体，其中所述核酸进一步包括与所述有效负荷基因操作性地连接的非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)，其中相对于缺乏所述NTCSRE的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述NTCSRE使所述有效负荷基因在非靶细胞中的表达降低，其中所述靶细胞是第一类型的CNS细胞，并且所述非靶细胞是第二不同类型的CNS细胞或非CNS细胞，任选地其中：
所述靶细胞是神经元，并且所述非靶细胞是神经胶质细胞，任选地其中所述神经胶质细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞，或者
所述靶细胞是神经胶质细胞，任选地其中所述神经胶质细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞，并且所述非靶细胞是神经元。
3.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，其包含：
(i)对外源性药剂进行编码的有效负荷基因；以及
(ii)与所述有效负荷基因操作性地连接的启动子，其中所述启动子选自SYN、NSE、CaMKII、aTubulin、PDGF、fSST、fNPY、GAD67、DLX5/6、VGLUT1、Dock10、ChAT、VAChT、Drd1a、TPH-2、GFAP、EAAT1、GS、CX3CR1、TMEM119、MBP、CNP或CRFR2β启动子。
4.一种融合剂脂质体，其包括：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，其包含：
(i)对外源性药剂进行编码的有效负荷基因；以及
(ii)与所述有效负荷基因操作性地连接的非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)，其中：
相对于缺乏所述NTCSRE的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述NTCSRE使所述有效负荷基因在非靶细胞或组织中的表达降低，其中所述靶细胞是第一类型的CNS细胞，并且所述非靶细胞是第二不同类型的CNS细胞或非CNS细胞；并且
所述NTCSRE包括非靶细胞特异性miRNA识别序列、非靶细胞特异性蛋白酶识别位点、非靶细胞特异性泛素连接酶位点、非靶细胞特异性转录抑制位点或非靶细胞特异性表观遗传抑制位点。
5.根据权利要求4所述的融合剂脂质体，其中所述核酸进一步包括与所述有效负荷基因操作性地连接的阳性靶细胞特异性调节元件，其中相对于缺乏所述阳性靶细胞特异性调节元件的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述阳性靶细胞特异性调节元件使所述有效负荷基因在靶细胞中的表达增加，其中所述靶细胞是CNS细胞。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体进一步包括以下中的一种或两种：
(i)所述脂质双层上的第一外源性免疫抑制蛋白或过度表达的免疫抑制蛋白；或者
(ii)第一免疫刺激蛋白，所述第一免疫刺激蛋白不存在或以相比于由在其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体降低的水平存在，任选地其中所述降低的水平为降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述有效负荷基因是治疗溶酶体贮积病或病症或CNS疾病或病症的基因，任选地其中所述疾病或病症是基因缺陷。
8.一种融合剂脂质体，其包括：
a)脂质双层，所述脂质双层包括融合剂；
b)核酸，所述核酸包括对用于治疗溶酶体贮积病或病症或CNS疾病或病症的外源性药剂进行编码的有效负荷基因；以及
c)以下中的一种或两种：
(i)所述脂质双层上的第一外源性或过度表达的免疫抑制蛋白；或
(ii)第一免疫刺激性蛋白质，其不存在或与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在。
9.根据权利要求6到8中任一项所述的融合剂脂质体，其包括(i)和(ii)。
10.根据权利要求6到8中任一项所述的融合剂脂质体，其包括(i)并且进一步包括所述脂质双层上的第二外源性免疫抑制蛋白或过度表达的免疫抑制蛋白。
11.根据权利要求6到10中任一项所述的融合剂脂质体，其包括(ii)并且进一步包括第二免疫刺激蛋白，所述第二免疫刺激蛋白不存在或以相比于由在其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体降低的水平存在，任选地其中所述降低的水平为降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
12.根据权利要求8到11中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸进一步包括与所述有效负荷基因操作性地连接的阳性靶细胞特异性调节元件，其中相对于缺乏所述阳性靶细胞特异性调节元件的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述阳性靶细胞特异性调节元件使所述有效负荷基因在靶细胞中的表达增加，其中所述靶细胞是CNS细胞。
13.根据权利要求8到12中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸进一步包括与所述有效负荷基因操作性地连接的非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)，其中相对于缺乏所述NTCSRE的在其它方面类似的融合剂脂质体，所述NTCSRE使所述有效负荷基因在非靶细胞或组织中的表达降低，其中所述靶细胞是第一类型的CNS细胞，并且所述非靶细胞是第二不同类型的CNS细胞或非CNS细胞，任选地其中：
所述靶细胞是神经元，并且所述非靶细胞是神经胶质细胞，任选地其中所述神经胶质细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞，或者
所述靶细胞是神经胶质细胞，任选地其中所述神经胶质细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞或小神经胶质细胞，并且所述非靶细胞是神经元。
14.根据权利要求6到13中任一项所述的融合剂脂质体，其中当向受试者施用时，发生以下中的一项或多项：
i)所述融合剂脂质体不产生可检测的抗体应答，或者针对所述融合剂脂质体的抗体以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；
ii)所述融合剂脂质体不产生可检测的细胞免疫应答，或者针对所述融合剂脂质体的细胞免疫应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；
iii)所述融合剂脂质体不产生可检测的先天性免疫应答，或者针对所述融合剂脂质体的先天性免疫应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；
iv)小于10％、5％、4％、3％、2％或1％的融合剂脂质体被血清灭活；
v)已从所述融合剂脂质体接受所述外源药剂的靶细胞不产生可检测到的抗体应答，或针对所述靶细胞的抗体以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；或
vi)已从所述融合剂脂质体接受所述外源性药剂的靶细胞不产生可检测的细胞免疫应答，或者针对所述靶细胞的细胞应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在。
15.根据权利要求14所述的融合剂脂质体，其中所述背景水平是同一个体在施用所述融合剂脂质体之前的对应水平。
16.根据权利要求6到15中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述免疫抑制蛋白是补体调节蛋白或CD47。
17.根据权利要求6到16中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述免疫刺激蛋白为MHCI或MHC II蛋白。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的融合剂脂质体，其中发生以下中的一项或多项：
i)所述融合剂脂质体与所述CNS靶细胞融合的速率高于与非靶细胞融合的速率，任选地其中所述速率高至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
ii)所述融合剂脂质体与所述CNS靶细胞融合的速率高于与另一种融合剂脂质体融合的速率，任选地其中所述速率高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
iii)所述融合剂脂质体与CNS靶细胞融合的速率使得在24小时、48小时或72小时之后，所述融合剂脂质体中的所述外源性药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的CNS靶细胞；
iv)所述融合剂脂质体将所述核酸递送到所述CNS靶细胞的速率高于将其递送到非靶细胞的速率，任选地其中所述速率高至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
v)所述融合剂脂质体将所述核酸递送到所述CNS靶细胞的速率高于将其递送到另一种融合剂脂质体的速率，任选地其中所述速率高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；或者
vi)所述融合剂脂质体将所述核酸递送CNS到靶细胞的速率使得在24小时、48小时或72小时之后，所述融合剂脂质体中的所述外源性药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述外源性药剂选自：SYNE1、SETX、FMR1、SLC6A8、UBE3A、SOD1、TDP43、C9orf72、FXN、MECP2、ASPA或ALDH7A1；或者所述外源性药剂选自：TPP1、FUCA1、GALC、HEXA、HEXB、MANBA、ARSA、GNPTAB或MCOLN1。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述有效负荷基因选自SYNE1、SETX、FMR1、SLC6A8、UBE3A、SOD1、TDP43、C9orf72、FXN、MECP2、ASPA和ALDH7A1。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述有效负荷基因对包括SEQ ID NO:134-145中的任一个中所示的序列的外源性药剂、其功能片段或其包括与SEQID NO:134-145中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的功能变体进行编码。
22.根据权利要求1到19中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述有效负荷基因选自TPP1、FUCA1、GALC、HEXA、HEXB、MANBA、ARSA、GNPTAB和MCOLN1。
23.根据权利要求1到19和22中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述有效负荷基因对包括SEQ ID NO:146-154中的任一个中所示的序列的外源性药剂、其功能片段或其包括与SEQ ID NO:146-154中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的功能变体进行编码。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂靶向CNS细胞，任选地其中所述CNS细胞是神经元或神经胶质细胞，任选地其中所述CNS细胞是泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞。
25.根据权利要求1到24中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂是病毒包膜蛋白。
26.根据权利要求1到25中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂包括VSV-G。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂包括选自以下的序列：尼帕病毒(Nipah virus)F和G蛋白、麻疹病毒(measles virus)F和H蛋白、树鼩副粘病毒(tupaia paramyxovirus)F和H蛋白、副粘病毒(paramyxovirus)F和G蛋白或F和H蛋白或F和HN蛋白、亨德拉病毒(Hendra virus)F和G蛋白、亨尼帕病毒(Henipavirus)F和G蛋白、麻疹病毒(Morbilivirus)F和H蛋白、呼吸道病毒(respirovirus)F和HN蛋白、仙台病毒(Sendai virus)F和HN蛋白、腮腺炎病毒(rubulavirus)F和HN蛋白或禽腮腺炎病毒(avulavirus)F和HN蛋白、或其衍生物或其任何组合。
28.根据权利要求1到24和27中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂包括长度为至少100个氨基酸的结构域，所述结构域与野生型副粘病毒融合剂具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，任选地其中所述野生型副粘病毒融合剂在SEQ ID NO:1-133中的任一个中示出。
29.根据权利要求27所述的融合剂脂质体，其中所述野生型副粘病毒是尼帕病毒，任选地其中所述尼帕病毒是亨尼帕病毒。
30.根据权利要求1到29中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂被重新靶向以递送到CNS细胞，任选地其中所述CNS细胞是神经元或神经胶质细胞，任选地其中所述CNS细胞是泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞。
31.根据权利要求1、2、5、6、7和12到30中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述阳性靶细胞特异性调节元件包括CNS细胞特异性启动子、CNS细胞特异性增强子、CNS细胞特异性剪接位点、延长RNA或蛋白质的半衰期的CNS细胞特异性位点、CNS细胞特异性mRNA核输出促进位点、CNS细胞特异性翻译增强位点或CNS细胞特异性翻译后修饰位点。
32.根据权利要求1、2、5、6、7和12到31中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述阳性靶细胞特异性调节元件包括CNS细胞特异性启动子。
33.根据权利要求32所述的融合剂脂质体，其中所述阳性CNS细胞特异性调节元件包括选自以下的启动子：SYN、NSE、CaMKII、aTubulin、PDGF、fSST、fNPY、GAD67、DLX5/6、VGLUT1、Dock10、ChAT、VAChT、Drd1a、TPH-2、GFAP、EAAT1、GS、CX3CR1、TMEM119、MBP、CNP或CRFR2β启动子。
34.根据权利要求2、4到7和13到33中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述NTCSRE包括非靶细胞特异性miRNA识别序列、非靶细胞特异性蛋白酶识别位点、非靶细胞特异性泛素连接酶位点、非靶细胞特异性转录抑制位点或非靶细胞特异性表观遗传抑制位点。
35.根据权利要求2、4到7和13到34中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述NTCSRE包括组织特异性miRNA识别序列、组织特异性蛋白酶识别位点、组织特异性泛素连接酶位点、组织特异性转录抑制位点或组织特异性表观遗传抑制位点。
36.根据权利要求2、4到7和13到35中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述NTCSRE包括非靶细胞特异性miRNA识别序列、非靶细胞特异性蛋白酶识别位点、非靶细胞特异性泛素连接酶位点、非靶细胞特异性转录抑制位点或非靶细胞特异性表观遗传抑制位点。
37.根据权利要求2、4到7和13到35中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述NTCSRE包括非靶细胞特异性miRNA识别序列，并且所述miRNA识别序列能够被miR-338-3p、miR-9、miR-125b-5p、miR-342-3p或miR-124中的一个或多个结合；任选地其中所述miRNA是或包括SEQ ID NO:156-162中的任一个中所示的序列。
38.根据权利要求34到37中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述NTCSRE位于对所述外源性药剂进行编码的转录区域内或在所述转录区域内被编码，任选地其中由所述转录区域产生的RNA包括位于UTR或编码区域内的所述miRNA识别序列。
39.根据权利要求1到38中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸包括一个或多个隔离元件。
40.根据权利要求39所述的融合剂脂质体，其中所述核酸包括两个隔离元件，任选地其中所述两个隔离元件包括所述有效负荷基因上游的第一隔离元件和所述有效负荷基因下游的第二隔离元件，任选地其中所述第一隔离元件和所述第二隔离元件包括相同或不同的序列。
41.根据权利要求1到40中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体是逆转录病毒载体颗粒。
42.根据权利要求1到41中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸能够整合到CNS细胞的基因组中。
43.根据权利要求1到42中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞选自CNS细胞，任选地其中所述CNS细胞是神经元或神经胶质细胞，任选地其中所述CNS细胞是泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞。
44.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到43中任一项所述的融合剂脂质体以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
45.一种将外源性药剂递送到受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1到43中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求44所述的药物组合物，由此将所述外源性药剂递送到所述受试者。
46.一种调节受试者、CNS组织或CNS细胞中的功能的方法，所述方法包括使所述受试者的所述CNS组织或所述CNS细胞与根据权利要求1到43中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求45所述的药物组合物接触。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述CNS细胞是神经元或神经胶质细胞，任选地其中所述CNS细胞是泛神经元细胞、GABA能神经元、谷氨酸能神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元、血清素能神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、小神经胶质细胞、少突胶质细胞或脉络丛细胞。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的方法，其中所述CNS组织或所述CNS细胞存在于受试者中。
49.一种治疗CNS疾病或病症或溶酶体疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1到43中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求44所述的药物组合物。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述CNS疾病或病症或所述溶酶体疾病或病症是由基因缺陷引起的。
51.一种治疗受试者的基因缺陷的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1到43中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求44所述的药物组合物。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的方法，其中所述基因缺陷是能够由对所述外源性药剂进行编码的所述有效负荷基因治疗的基因缺陷。
53.根据权利要求49、权利要求50或权利要求52所述的方法，其中所述疾病或病症选自脊髓小脑性共济失调；常染色体隐性1型；共济失调伴眼球运动失用2型；脆性X综合征；脑肌酸缺乏综合征1；快乐木偶综合征(Angelman Syndrome)；肌萎缩性脊髓侧索硬化症；弗里德赖希共济失调(Friedreich's Ataxia)；雷特综合征(Rett Syndrome)；卡纳万病(CanavanDisease)；吡哆醇依赖性癫痫；贝敦氏病(Batten Disease)；岩藻糖苷贮积症；克拉伯病(Krabbe Disease)；戴萨克斯病(Tay Sachs Disease)；山德霍夫氏病(SandhoffDisease)；β-甘露糖苷贮积症；异染性脑白质营养不良；粘多糖症IIIa型；粘多糖症IIIb型；或粘多糖症IV型。
54.根据权利要求49到53中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
55.根据权利要求1到43中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求44所述的药物组合物，其用于治疗患有CNS疾病或病症或溶酶体疾病或病症的受试者。
56.一种根据权利要求1到43中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求44所述的药物组合物的用途，其用于制造用于治疗患有CNS疾病或病症或溶酶体疾病或病症的受试者的药物。
57.根据权利要求55所述的供使用的融合剂脂质体或药物组合物或根据权利要求56所述的用途，其中所述CNS疾病或病症或溶酶体疾病或病症是由基因缺陷引起的。
58.根据权利要求55或权利要求57所述的供使用的融合剂脂质体或药物组合物或根据权利要求56或权利要求57所述的用途，其中所述疾病或病症选自脊髓小脑性共济失调；常染色体隐性1型；共济失调伴眼球运动失用2型；脆性X综合征；脑肌酸缺乏综合征1；快乐木偶综合征；肌萎缩性脊髓侧索硬化症；弗里德赖希共济失调；雷特综合征；卡纳万病；吡哆醇依赖性癫痫；贝敦氏病；岩藻糖苷贮积症；克拉伯病；戴萨克斯病；山德霍夫氏病；β-甘露糖苷贮积症；异染性脑白质营养不良；粘多糖症IIIa型；粘多糖症IIIb型；或粘多糖症IV型。
59.根据权利要求1到43中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求44所述的药物组合物，其用于治疗基因缺陷。
60.一种根据权利要求1到43中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求44所述的药物组合物的用途，其用于制造用于治疗基因缺陷的药物。
61.根据权利要求57到59中任一项所述的供使用的融合剂脂质体或药物组合物或根据权利要求57、58和60所述的用途，其中所述基因缺陷是能够由对所述外源性药剂进行编码的所述有效负荷基因治疗的基因缺陷。
62.一种制备根据权利要求1到43中任一项所述的融合剂脂质体的方法，所述方法包括：
a)提供包括所述核酸和所述融合剂的细胞；
b)在允许所述融合剂脂质体产生的条件下培养所述细胞，以及
c)从所述细胞中分离、富集或纯化所述融合剂脂质体，从而制备所述融合剂脂质体。
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