KR20210133948A - Cns 전달을 위한 푸소좀 조성물 - Google Patents

Cns 전달을 위한 푸소좀 조성물 Download PDF

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제이콥 로젠블룸 루벤스
자게쉬 비제이쿠마르 샤
알버트 루조 마티아스
페르디난도 푸치
존 마일스 밀위드
마이클 트래비스 미
닐 프란시스 고든
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Abstract

본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 푸소좀의 생체내 전달을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 표적세포에 대한 특이성을 촉진시키는 요소의 조합, 예를 들어 푸소겐, 양성 표적세포 특이적 조절 요소 및 비표적세포 특이적 조절 요소 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀에 대한 면역반응을 감소시키는 하나 이상의 변형을 포함한다.

Description

CNS 전달용 푸소좀 조성물
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 11월 14일자 출원된 "FUSOSOME COMPOSITIONS FOR CNS CELL DELIVERY"라는 제목의 미국 가출원 제62/767,358호; 및 2019년 9월 13일자 출원된 "FUSOSOME COMPOSITIONS FOR CNS CELL DELIVERY"라는 제목의 미국 가출원 제62/900,064호를 우선권 주장하며, 상기 문헌들의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
서열목록의 참조에 의한 통합
본 출원은 전자문서 형식의 서열목록과 함께 제출된다. 서열목록은 2019년 11월 14일자 생성된, 크기 819킬로바이트의 파일명 186152003340SeqList.TXT의 파일로 제공된다. 서열목록의 전자문서 형식의 정보는 그 전체가 본원에 참조로서 인용된다.
복합 생물제제는 다양한 질환에 대한 유망한 치료 후보물질이다. 하지만, 원형질막이 세포와 세포외 공간 사이에서 장벽 역할을 하기 때문에, 큰 생물학적 작용제를 세포에 전달하는 것은 어렵다. 복합 생물제제를 대상의 세포에 전달하는 신규한 방법이 당업계에 필요하다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 푸소좀(fusosome)의 생체내 전달을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 표적세포에 대한 특이성을 촉진시키는 요소의 조합, 예를 들어 푸소겐(fusogen), 양성 표적세포 특이적 조절 요소 및 비(非)표적세포 특이적 조절 요소 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀에 대한 면역반응을 감소시키는 하나 이상의 변형을 포함한다.
구현예 열거
1. 푸소좀으로서,
a) 푸소겐을 포함하는 지질 이중층; 및
b) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 핵산을 포함하는, 푸소좀:
(i) 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자(payload gene), 예를 들어 표 5 또는 표 6의 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자로서, 선택적으로 여기서 외인성 작용제는 서열번호 134 내지 154 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 이의 기능성 단편, 또는 서열번호 134 내지 154 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 기능성 변이체인, 페이로드 유전자; 및
(ii) 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된(operatively linked) 양성 표적세포 특이적 조절 요소(예를 들어, 표적세포 특이적 프로모터)로서, 양성 표적세포 특이적 조절 요소가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 표적세포에서 페이로드 유전자의 발현을 증가시키며, 여기서 표적세포는 CNS세포인, 양성 표적세포 특이적 조절 요소.
2. 구현예 1에 있어서, 핵산이 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 비표적세포 특이적 조절 요소(NTCSRE)(예를 들어, 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열)를 추가로 포함하고, 여기서 NTCSRE는 NTCSRE가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 비표적세포에서 페이로드 유전자의 발현을 감소시키고, 선택적으로 여기서 표적세포는 첫 번째 유형의 CNS세포이고, 비표적세포는 두 번째 상이한 유형의 CNS세포 또는 비(非)CNS세포이며, 선택적으로 여기서
표적세포는 뉴런이고, 비표적세포는 아교세포(예를 들어, 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포)이거나,
표적세포는 아교세포(예를 들어, 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포)이고, 비표적세포는 뉴런인, 푸소좀.
3. 푸소좀으로서,
a) 푸소겐을 포함하는 지질 이중층; 및
b) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 핵산을 포함하는, 푸소좀:
(i) 외인성 작용제, 예를 들어 표 5 또는 표 6의 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자로서, 선택적으로 여기서 외인성 작용제는 서열번호 134 내지 154 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 이의 기능성 단편, 또는 서열번호 134 내지 154 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 기능성 변이체인, 페이로드 유전자; 및
(ii) 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터로서, SYN, NSE, CaMKII, α튜불린, PDGF, fSST, fNPY, GAD67, DLX5/6, VGLUT1, Dock10, ChAT, VAChT, Drd1a, TPH-2, GFAP, EAAT1, GS, CX3CR1, TMEM119, MBP, CNP 또는 CRFR2β 프로모터(예를 들어 표 3의 프로모터 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 서열에 따름)에서 선택되는, 프로모터.
4. 푸소좀으로서,
a) 푸소겐을 포함하는 지질 이중층; 및
b) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 핵산을 포함하는, 푸소좀:
(i) 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자, 예를 들어 표 5 또는 표 6의 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자로서, 선택적으로 여기서 외인성 작용제는 서열번호 134 내지 154 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 이의 기능성 단편, 또는 서열번호 134 내지 154 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 기능성 변이체인, 페이로드 유전자; 및
(ii) 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 비표적세포 특이적 조절 요소(NTCSRE)(예를 들어, 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열)로서, NTCSRE가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 비표적세포 또는 비표적조직에서 페이로드 유전자의 발현을 감소시키는, NTCSRE.
5. 푸소좀으로서,
a) 푸소겐을 포함하는 지질 이중층; 및
b) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 핵산을 포함하는, 푸소좀:
(i) 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자, 예를 들어 표 5 또는 표 6의 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자로서, 선택적으로 여기서 외인성 작용제는 서열번호 134 내지 154 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 이의 기능성 단편, 또는 서열번호 134 내지 154 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 기능성 변이체인, 페이로드 유전자; 및
(ii) 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 음성 표적세포 특이적 조절 요소(음성 TCSRE)(예를 들어, 조직 특이적 miRNA 인식 서열)로서, 음성 TCSRE가 결여된 다른 유사한 핵산에 비해 비표적세포 또는 비표적조직에서 외인성 작용제의 발현을 감소시키는, 음성 TCSRE.
6. 구현예 4 또는 구현예 5에 있어서, 핵산이 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 양성 표적세포 특이적 조절 요소(예를 들어, 표적세포 특이적 프로모터)를 추가로 포함하고, 여기서 양성 표적세포 특이적 조절 요소는 양성 표적세포 특이적 조절 요소가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 표적세포에서 페이로드 유전자의 발현을 증가시키며, 여기서 표적세포는 첫 번째 유형의 CNS세포이고, 선택적으로 여기서 비표적세포는 두 번째 상이한 유형의 CNS세포 또는 비CNS세포이며, 선택적으로 여기서
표적세포는 뉴런이고, 비표적세포는 아교세포(예를 들어, 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포)이거나,
표적세포는 아교세포(예를 들어, 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포)이고, 비표적세포는 뉴런인, 푸소좀.
7. 푸소좀으로서,
a) 푸소겐을 포함하는 지질 이중층;
b) 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자, 예를 들어 표 5 또는 표 6의 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자를 포함하는 핵산으로서, 선택적으로 여기서 외인성 작용제는 서열번호 134 내지 154 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 이의 기능성 단편, 또는 서열번호 134 내지 154 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 기능성 변이체인, 핵산; 및
c) 하기 (i) 또는 (ii) 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 푸소좀:
(i) 지질 이중층 상의 제1 외인성 또는 과발현된 면역억제 단백질; 또는
(ii) 존재하지 않거나, 다른 유사한 변형되지 않은 원천세포에서 생성된 푸소좀과 비교하여 감소된 수준으로(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된 수준으로) 존재하는 제1 면역자극 단백질.
8. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 하기 i) 내지 vi) 중 하나 이상을 특징으로 하는, 푸소좀:
i) 푸소좀은 비표적세포보다 표적세포와 더 높은 비율로, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 더 높은 비율로 융합함;
ii) 푸소좀은 또 다른 푸소좀보다 표적세포와 더 높은 비율로, 예를 들어 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 더 높은 비율로 융합함;
iii) 푸소좀은, 푸소좀 내 작용제가 24시간, 48시간 또는 72시간 후 표적세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%에 전달되도록 하는 비율로 표적세포와 융합함;
iv) 푸소좀은 비표적세포보다 더 높은 비율로, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 더 높은 비율로 표적세포에 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을 전달함;
v) 푸소좀은 또 다른 푸소좀보다 더 높은 비율로, 예를 들어 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 더 높은 비율로 표적세포에 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을 전달함; 또는
vi) 푸소좀은, 푸소좀 내 작용제가 24시간, 48시간 또는 72시간 후 표적세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%에 전달되도록 하는 비율로 표적세포에 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을 전달함.
9. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 다음 중 하나 이상(예를 들어, 2가지 또는 3가지 모두)이 적용되는, 푸소좀: 푸소좀은 레트로바이러스 벡터임, 지질 이중층은 외피(envelope), 예를 들어 바이러스 외피로 구성됨, 및 핵산은 레트로바이러스 핵산임.
10. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 5' LTR(예를 들어, U5를 포함하고 기능성 U3 도메인이 결여됨), Psi 패키징 요소(Psi), 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 중심 폴리퓨린관(cPPT) 프로모터, 페이로드 유전자(선택적으로 오픈리딩프레임(open reading frame) 전에 인트론을 포함함), Poly A 꼬리 서열, WPRE 및 3' LTR(예를 들어, U5를 포함하고 기능성 U3이 결여됨)과 같은 핵산 서열 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함하는, 푸소좀.
11. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 폴리머라아제(예를 들어, 역전사효소, 예를 들어 pol 또는 이의 일부), 인테그라아제(예를 들어, pol 또는 이의 일부, 예를 들어 기능성 또는 비(非)기능성 변이체), 매트릭스 단백질(예를 들어, gag 또는 이의 일부), 캡시드 단백질(예를 들어, gag 또는 이의 일부), 뉴클레오캡시드 단백질(예를 들어, gag 또는 이의 일부) 및 프로테아제(예를 들어, pro) 중 하나 이상(예를 들어 전부)을 포함하는, 푸소좀.
12. 구현예 7에 있어서, (i)과 (ii)를 포함하는, 푸소좀.
13. 구현예 7 내지 구현예 12 중 어느 하나에 있어서, 지질 이중층 상에 제2 외인성 또는 과발현된 면역억제 단백질을 추가로 포함하는, 푸소좀.
14. 구현예 7 내지 구현예 13 중 어느 하나에 있어서, 존재하지 않거나, 다른 유사한 변형되지 않은 원천세포에서 생성된 푸소좀과 비교하여 감소된 수준으로(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된 수준으로) 존재하는 제2 면역자극 단백질 추가로 포함하는, 푸소좀.
15. 구현예 7 내지 구현예 14 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 벡터가 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 양성 표적세포 특이적 조절 요소(예를 들어, 표적세포 특이적 프로모터)를 추가로 포함하고, 여기서 양성 표적세포 특이적 조절 요소는 양성 표적세포 특이적 조절 요소가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 표적세포에서 페이로드 유전자의 발현을 증가시키며, 여기서 표적세포는 CNS세포인, 푸소좀.
16. 구현예 7 내지 구현예 15 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 벡터가 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 비표적세포 특이적 조절 요소(NTCSRE)(예를 들어, 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열)를 추가로 포함하고, 여기서 NTCSRE는 NTCSRE가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 비표적세포 또는 비표적조직에서 페이로드 유전자의 발현을 감소시키고, 선택적으로 여기서 표적세포는 첫 번째 유형의 CNS세포이고, 비표적세포는 두 번째 상이한 유형의 CNS세포 또는 비CNS세포이며, 선택적으로 여기서
표적세포는 뉴런이고, 비표적세포는 아교세포(예를 들어, 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포)이거나,
표적세포는 아교세포(예를 들어, 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포)이고, 비표적세포는 뉴런인, 푸소좀.
17. 구현예 7 내지 구현예 15 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산이, 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 음성 표적세포 특이적 조절 요소(음성 TCSRE)(예를 들어, 조직 특이적 miRNA 인식 서열)로서, 음성 TCSRE가 결여된 다른 유사한 핵산, 레트로바이러스 핵산에 비해 비표적세포 또는 비표적조직에서 외인성 작용제의 발현을 감소시키는 음성 TCSRE를 추가로 포함하는, 푸소좀.
18. 구현예 7 내지 구현예 17 중 어느 하나에 있어서, 대상(예를 들어, 인간 대상 또는 마우스)에게 투여될 때, 하기 i) 내지 vi) 중 하나 이상을 특징으로 하는, 푸소좀:
i) 푸소좀이 (예를 들어, 단회투여 또는 다회투여 후) 검출 가능한 항체반응을 생성하지 않거나, 또는 배경 수준보다 높은 푸소좀에 대한 항체가, 예를 들어 FACS 항체 검출 검정, 예를 들어 실시예 13 또는 실시예 14의 검정으로 분석 시, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 수준으로 존재함;
ii) 푸소좀이 검출 가능한 세포성 면역반응(예를 들어, T세포 반응, NK세포 반응 또는 대식세포 반응)을 생성하지 않거나, 또는 배경 수준보다 높은 푸소좀에 대한 세포성 면역반응이, 예를 들어 PBMC 용해 검정(예를 들어, 실시예 5의 검정), NK세포 용해 검정(예를 들어, 실시예 6의 검정), CD8 살해T세포 용해 검정(예를 들어, 실시예 7의 검정) 또는 대식세포 포식작용 검정(예를 들어, 실시예 8의 검정)으로 분석 시, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 수준으로 존재함;
iii) 푸소좀이 (예를 들어, 단회투여 또는 다회투여 후) 검출 가능한 선천성 면역반응, 예를 들어 보체 활성화를 생성하지 않거나, 또는 배경 수준보다 높은 푸소좀에 대한 선천성 면역반응이, 예를 들어 보체 활성 검정(예를 들어, 실시예 9의 검정)으로 분석 시, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 수준으로 존재함;
iv) 푸소좀의 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이, 예를 들어 혈청 불활성화 검정, 예를 들어 실시예 11 또는 실시예 12의 검정으로 분석 시, 혈청에 의해 불활성화됨;
v) 푸소좀으로부터의 외인성 작용제를 수용한 표적세포가 (예를 들어, 단회투여 또는 다회투여 후) 검출 가능한 항체반응을 생성하지 않거나, 또는 배경 수준보다 높은 표적세포에 대한 항체가, 예를 들어 FACS 항체 검출 검정, 예를 들어 실시예 15의 검정으로 분석 시, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 수준으로 존재함; 또는
vi) 푸소좀으로부터의 외인성 작용제를 수용한 표적세포가 검출 가능한 세포성 면역반응(예를 들어, T세포 반응, NK세포 반응 또는 대식세포 반응)을 생성하지 않거나, 또는 배경 수준보다 높은 표적세포에 대한 세포성 반응이, 예를 들어 대식세포 포식작용 검정(예를 들어, 실시예 16의 검정), PBMC 용해 검정(예를 들어, 실시예 17의 검정), NK세포 용해 검정(예를 들어, 실시예 18의 검정) 또는 CD8 살해T세포 용해 검정(예를 들어, 실시예 19의 검정)으로 분석 시, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 수준으로 존재함.
19. 구현예 18에 있어서, 배경 수준이 푸소좀의 투여 전 동일한 대상에서의 상응하는 수준인, 푸소좀.
20. 구현예 7 내지 구현예 19 중 어느 하나에 있어서, 면역억제 단백질(예를 들어, 제1 면역억제 단백질 또는 제2 면역억제 단백질)이 보체 조절 단백질 또는 CD47인, 푸소좀.
21. 구현예 7 내지 구현예 20 중 어느 하나에 있어서, 면역자극 단백질(예를 들어, 제1 면역자극 단백질 또는 제2 면역자극 단백질)이 MHC I(예를 들어, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E 또는 HLA-G) 또는 MHC II(예를 들어, HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ 또는 HLA-DR) 단백질인, 푸소좀.
22. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 작용제가 SYNE1, SETX, FMR1, SLC6A8, UBE3A, SOD1, TDP43, C9orf72, FXN, MECP2, ASPA 또는 ALDH7A1에서 선택되거나; TPP1, FUCA1, GALC, HEXA, HEXB, MANBA, ARSA, GNPTAB 또는 MCOLN1에서 선택되는, 푸소좀.
23. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소겐이 VSV-G를 포함하는, 푸소좀.
24. 구현예 1, 구현예 2, 구현예 6, 구현예 15, 구현예 22 또는 구현예 23 중 어느 하나에 있어서, 양성 CNS세포 특이적 조절 요소가 CNS세포 특이적 프로모터, CNS세포 특이적 인핸서, CNS세포 특이적 스플라이스 부위, RNA 또는 단백질의 반감기를 연장시키는 CNS세포 특이적 부위, CNS세포 특이적 mRNA 핵 방출 촉진 부위, CNS세포 특이적 번역 증강 부위 또는 CNS세포 특이적 번역 후 변형 부위를 포함하는, 푸소좀.
25. 구현예 1, 구현예 2, 구현예 6, 구현예 15 또는 구현예 22 내지 구현예 24 중 어느 하나에 있어서, 양성 표적세포 특이적 조절 요소가 CNS세포 특이적 프로모터를 포함하는, 푸소좀.
26. 구현예 25에 있어서, CNS세포 특이적 프로모터가 표 3의 모티프를 포함하는, 푸소좀.
27. 구현예 25 또는 구현예 26에 있어서, 양성 CNS세포 특이적 조절 요소가 SYN, NSE, CaMKII, α튜불린, PDGF, fSST, fNPY, GAD67, DLX5/6, VGLUT1, Dock10, ChAT, VAChT, Drd1a, TPH-2, GFAP, EAAT1, GS, CX3CR1, TMEM119, MBP, CNP 또는 CRFR2β 프로모터에서 선택되는 프로모터를 포함하는, 푸소좀.
28. 구현예 4 내지 구현예 6, 또는 구현예 16 내지 구현예 21 중 어느 하나에 있어서, 음성 TCSRE 또는 NTCSRE가 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열, 비표적세포 특이적 프로테아제 인식 부위, 비표적세포 특이적 유비퀴틴 리가아제 부위, 비표적세포 특이적 전사 억제 부위 또는 비표적세포 특이적 후성적 억제 부위를 포함하는, 푸소좀.
29. 구현예 4 내지 구현예 6, 구현예 16 내지 구현예 21, 또는 구현예 28 중 어느 하나에 있어서, 음성 TCSRE 또는 NTCSRE가 조직 특이적 miRNA 인식 서열, 조직 특이적 프로테아제 인식 부위, 조직 특이적 유비퀴틴 리가아제 부위, 조직 특이적 전사 억제 부위 또는 조직 특이적 후성적 억제 부위를 포함하는, 푸소좀.
30. 구현예 4 내지 구현예 6, 또는 구현예 16 내지 구현예 21, 구현예 28 또는 구현예 29 중 어느 하나에 있어서, 음성 TCSRE 또는 NTCSRE가 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열, 비표적세포 특이적 프로테아제 인식 부위, 비표적세포 특이적 유비퀴틴 리가아제 부위, 비표적세포 특이적 전사 억제 부위 또는 비표적세포 특이적 후성적 억제 부위를 포함하는, 푸소좀.
31. 구현예 4 내지 구현예 6, 구현예 16 내지 구현예 21, 또는 구현예 28 내지 구현예 30 중 어느 하나에 있어서, 음성 TCSRE 또는 NTCSRE가 표 4의 miRNA, 예를 들어 miR-338-3p, miR-9, miR-125b-5p, miR-342-3p 또는 miR-124 중 하나 이상(예를 들어, 둘 이상)에 의해 결합된 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열을 포함하고, 선택적으로 여기서 miRNA는 서열번호 156 내지 162 중 어느 하나에 제시된 서열이거나 이를 포함하는, 푸소좀.
32. 구현예 28 내지 구현예 31 중 어느 하나에 있어서, 음성 TCSRE 또는 NTCSRE가 전사된 영역(예를 들어, 외인성 작용제를 인코딩하는 전사된 영역) 내에 위치하거나 내에서 인코딩되어, 예를 들어 전사된 영역에 의해 생성된 RNA가 UTR 또는 코딩 영역 내에 miRNA 인식 서열을 포함하는, 푸소좀.
33. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산이 하나 이상의 절연인자(insulator) 요소를 포함하는, 푸소좀.
34. 구현예 33에 있어서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산이 2개의 절연인자 요소, 예를 들어 페이로드 유전자의 업스트림에 있는 제1 절연인자 요소와 페이로드 유전자의 다운스트림에 있는 제2 절연인자 요소를 포함하고, 예를 들어 여기서 제1 절연인자 요소와 제2 절연인자 요소는 동일하거나 상이한 서열을 포함하는, 푸소좀.
35. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 유전독성이 아니거나, 표적세포에서 종양 형성률을 증가시키지 않는, 푸소좀.
36. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산이 표적세포의 게놈에 통합될 수 있는, 푸소좀.
37. 구현예 36에 있어서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산이 통합 가능 렌티바이러스 또는 통합 불능 렌티바이러스인, 푸소좀.
38. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표적세포가 CNS세포, 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포(choroid plexus cell)에서 선택되는, 푸소좀.
39. 구현예 4 내지 구현예 6 및 구현예 9 내지 구현예 38 중 어느 하나에 있어서, 하기 i) 내지 v) 중 하나 이상을 특징으로 하는, 푸소좀:
i) 대상에 검출 가능하게 존재하는 외인성 작용제의 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이 비표적세포에 존재함;
ii) 외인성 작용제를 검출 가능하게 포함하는 대상의 세포의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 표적세포(예를 들어, 단일 세포 유형의 세포)임;
iii) 외인성 작용제를 검출 가능하게 포함하는 대상의 세포 중 1,000,000개, 500,000개, 200,000개, 100,000개, 50,000개, 20,000개 또는 10,000개 미만의 세포가 비표적세포임;
iv) 대상의 모든 표적세포 내 외인성 작용제의 평균 수준이 대상의 모든 비표적세포 내 외인성 작용제의 평균 수준보다 적어도 100배, 200배, 500배 또는 1,000배 더 높음; 또는
v) 외인성 작용제가 대상의 어떠한 비표적세포에서도 검출 가능하지 않음.
40. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산이 양성 TCSRE 및/또는 NTCSRE 또는 음성 TCSRE를 인코딩하는, 푸소좀.
41. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산이 양성 TCSRE 및/또는 NTCSRE 또는 음성 TCSRE의 보체를 포함하는, 푸소좀.
42. 구현예 40 또는 구현예 41에 있어서, 양성 TCSRE가 비표적세포보다 표적세포에서 적어도 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 750%, 1000%(또는 그 이상) 활성인 표적세포 특이적 프로모터를 포함하는, 푸소좀.
43. 구현예 40 내지 구현예 42 중 어느 하나에 있어서, 음성 TCSRE 또는 NTCSRE가 표적세포와 비교하여 비표적세포에서 유전자 발현을 적어도 10%, 25%, 50%, 75% 또는 100% 감소시키는 miRNA 인식 서열을 포함하는, 푸소좀.
44. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을, 비표적세포, 예를 들어 뉴런, 아교세포, 항원제시세포, MHC 클래스 II+ 세포, 전문 항원제시세포, 비정형 항원제시세포, 대식세포, 수지상세포, 골수계 수지상세포, 형질세포양 수지상세포, CD11c+ 세포, CD11b+ 세포, 비장세포, B세포, 간세포, 내피세포 또는 비(非)암성세포로 전달하지 않는, 푸소좀.
45. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정량적 PCR, 예를 들어 실시예 1의 검정을 사용하여 측정 시, 비표적세포 유형(예를 들어, 뉴런, 아교세포, 항원제시세포, MHC 클래스 II+ 세포, 전문 항원제시세포, 비정형 항원제시세포, 대식세포, 수지상세포, 골수계 수지상세포, 형질세포양 수지상세포, CD11c+ 세포, CD11b+ 세포, 비장세포, B세포, 간세포, 내피세포 또는 비암성세포 중 하나 이상)의 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001%, 0.00001% 또는 0.000001% 미만이 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을 포함하는, 푸소좀.
46. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표적세포가 숙주세포 게놈당 0.00001개 내지 10개, 0.0001개 내지 10개, 0.001개 내지 10개, 0.01개 내지 10개, 0.1개 내지 10개, 0.5개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개 또는 1개 내지 2개의 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산 또는 이의 일부의 카피(copy)를 포함하며, 예를 들어 여기서 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산의 카피 수는 생체내 투여 후에 평가된 것인, 푸소좀.
47. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서,
비표적세포(예를 들어, 뉴런, 아교세포, 항원제시세포, MHC 클래스 II+ 세포, 전문 항원제시세포, 비정형 항원제시세포, 대식세포, 수지상세포, 골수계 수지상세포, 형질세포양 수지상세포, CD11c+ 세포, CD11b+ 세포, 비장세포, B세포, 간세포, 내피세포 또는 비암성세포)의 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01% 미만이 외인성 작용제를 포함하거나; 또는
외인성 작용제(예를 들어, 단백질)가 비표적세포, 예를 들어 뉴런, 아교세포, 항원제시세포, MHC 클래스 II+ 세포, 전문 항원제시세포, 비정형 항원제시세포, 대식세포, 수지상세포, 골수계 수지상세포, 형질세포양 수지상세포, CD11c+ 세포, CD11b+ 세포, 비장세포, B세포, 간세포, 내피세포 또는 비암성세포에 검출 가능하게 존재하지 않는, 푸소좀.
48. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을, 표적세포, 예를 들어 CNS세포, 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포로 전달하는, 푸소좀.
49. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 정량적 PCR, 예를 들어 실시예 3의 검정을 사용하여 측정 시, 표적세포(예를 들어, CNS세포, 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포 중 하나 이상)의 적어도 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을 포함하는, 푸소좀.
50. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표적세포(예를 들어, CNS세포, 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포)의 적어도 0.00001%, 0.0001%, 0.001%, 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 외인성 작용제를 포함하는, 푸소좀.
51. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 투여 시, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을 포함하는 표적세포 대 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을 포함하는 비표적세포의 비가, 예를 들어 정량적 PCR 검정에 따라, 예를 들어 실시예 1 및 실시예 3의 검정을 사용하여 측정 시, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000인, 푸소좀.
52. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표적세포 내 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산 또는 이의 일부의 평균 카피 수 대 비표적세포 내 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산 또는 이의 일부의 평균 카피 수의 비가, 예를 들어 정량적 PCR 검정에 따라, 예를 들어 실시예 1 및 실시예 3의 검정을 사용하여 측정 시, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000인, 푸소좀.
53. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표적세포 내 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산 또는 이의 일부의 카피 수의 중앙값 대 비표적세포 내 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산 또는 이의 일부의 카피 수의 중앙값의 비가, 예를 들어 정량적 PCR 검정에 따라, 예를 들어 실시예 1 및 실시예 3의 검정을 사용하여 측정 시, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000인, 푸소좀.
54. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 RNA 작용제를 포함하는 표적세포 대 외인성 RNA 작용제를 포함하는 비표적세포의 비가, 예를 들어 역전사 정량적 PCR 검정에 따라 측정 시, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000인, 푸소좀.
55. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표적세포의 평균 외인성 RNA 작용제 수준 대 비표적세포의 평균 외인성 RNA 작용제 수준의 비가, 예를 들어 역전사 정량적 PCR 검정에 따라 측정 시, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000인, 푸소좀.
56. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표적세포의 외인성 RNA 작용제 수준의 중앙값 대 비표적세포의 외인성 RNA 작용제 수준의 중앙값의 비가, 예를 들어 역전사 정량적 PCR 검정에 따라 측정 시, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000인, 푸소좀.
57. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 단백질 작용제를 포함하는 표적세포 대 외인성 단백질 작용제를 포함하는 비표적세포의 비가, 예를 들어 FACS 검정에 따라 측정 시, 예를 들어 실시예 2 및 실시예 4의 검정을 사용하여 측정 시, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000인, 푸소좀.
58. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표적세포의 평균 외인성 단백질 작용제 수준 대 비표적세포의 평균 외인성 단백질 작용제 수준의 비가, 예를 들어 FACS 검정에 따라 측정 시, 예를 들어 실시예 2 및 실시예 4의 검정을 사용하여 측정 시, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000인, 푸소좀.
59. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 표적세포의 외인성 단백질 작용제 수준의 중앙값 대 비표적세포의 외인성 단백질 작용제 수준의 중앙값의 비가, 예를 들어 FACS 검정에 따라 측정 시, 예를 들어 실시예 2 및 실시예 4의 검정을 사용하여 측정 시, 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10,000인, 푸소좀.
60. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 하기 i) 및 ii) 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 푸소좀:
i) 지질 이중층, 예를 들어 외피 상의 외인성 또는 과발현된 면역억제 단백질; 및
ii) 존재하지 않거나, 다른 유사한 변형되지 않은 원천세포에서 생성된 푸소좀과 비교하여 감소된 수준으로(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된 수준으로) 존재하는 면역자극 단백질.
61. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 하기 i) 내지 iii) 중 하나 이상을 포함하는, 푸소좀:
i) 지질 이중층, 예를 들어 외피 상의 제1 외인성 또는 과발현된 면역억제 단백질, 및 지질 이중층, 예를 들어 외피 상의 제2 외인성 또는 과발현된 면역억제 단백질;
ii) 지질 이중층, 예를 들어 외피 상의 제1 외인성 또는 과발현된 면역억제 단백질, 및 존재하지 않거나, 다른 유사한 변형되지 않은 원천세포에서 생성된 푸소좀과 비교하여 감소된 수준으로(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된 수준으로) 존재하는 제2 면역자극 단백질; 또는
iii) 존재하지 않거나, 다른 유사한 변형되지 않은 원천세포에서 생성된 푸소좀과 비교하여 감소된 수준으로(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된 수준으로) 존재하는 제1 면역자극 단백질, 및 존재하지 않거나, 다른 유사한 변형되지 않은 원천세포에서 생성된 푸소좀과 비교하여 감소된 수준으로(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된 수준으로) 존재하는 제2 면역자극 단백질.
62. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 대상에게 투여된 지 적어도 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 48시간 후에 순환되는, 푸소좀.
63. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀의 적어도 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 투여 30분 후에 순환되는, 푸소좀.
64. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀의 적어도 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 투여 1시간 후에 순환되는, 푸소좀.
65. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀의 적어도 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 투여 2시간 후에 순환되는, 푸소좀.
66. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀의 적어도 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 투여 4시간 후에 순환되는, 푸소좀.
67. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀의 적어도 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 투여 8시간 후에 순환되는, 푸소좀.
68. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀의 적어도 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 투여 12시간 후에 순환되는, 푸소좀.
69. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀의 적어도 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 투여 18시간 후에 순환되는, 푸소좀.
70. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀의 적어도 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 투여 24시간 후에 순환되는, 푸소좀.
71. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀의 적어도 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 투여 36시간 후에 순환되는, 푸소좀.
72. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀의 적어도 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 투여 48시간 후에 순환되는, 푸소좀.
73. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 적절한 동물 모델, 예를 들어 본원에 기재된 동물 모델에게의 푸소좀의 1회 이상의 투여 후, 참조 푸소좀, 예를 들어 상기 푸소좀과 달리 유사한 변형되지 않은 푸소좀과 비교하여 체액성 반응의 감소로 측정 시, 면역원성의 감소를 나타내는, 푸소좀.
74. 구현예 73에 있어서, 체액성 반응의 감소가 혈청 샘플에서 항-세포 항체 역가, 예를 들어 항-레트로바이러스 항체 역가, 예를 들어 ELISA로 측정된 것인, 푸소좀.
75. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀이 투여된 동물로부터의 혈청 샘플이, 변형되지 않은 세포가 투여된 대상으로부터의 혈청 샘플과 비교하여 항-푸소좀 항체 역가의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타내는, 푸소좀.
76. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀이 투여된 대상으로부터의 혈청 샘플이 증가된, 예를 들어 기준선으로부터 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 40% 증가된 항-세포 항체 역가를 나타내며, 예를 들어 여기서 기준선은 푸소좀의 투여 전 동일한 대상으로부터의 혈청 샘플을 나타내는, 푸소좀.
77. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서,
푸소좀 또는 푸소좀을 포함하는 약학적 조성물이 투여될 대상이 푸소좀과 반응성인 기존 항체(예를 들어, IgG 또는 IgM)를 갖고 있거나, 이를 갖는 것으로 공지되어 있거나, 또는 이에 대하여 시험되거나;
푸소좀이 투여될 대상이 푸소좀과 반응성인 기존 항체를 검출 가능한 수준으로 갖고 있지 않거나;
푸소좀 또는 푸소좀을 포함하는 약학적 조성물을 받은 대상이 푸소좀과 반응성인 항체(예를 들어, IgG 또는 IgM)를 갖고 있거나, 이를 갖는 것으로 공지되어 있거나, 또는 이에 대하여 시험되거나;
푸소좀 또는 푸소좀을 포함하는 약학적 조성물을 (예를 들어, 적어도 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상) 받은 대상이 푸소좀과 반응성인 항체를 검출 가능한 수준으로 갖고 있지 않거나; 또는
항체의 수준이 푸소좀의 첫 번째 투여 전인 첫 번째 시점과 푸소좀의 1회 이상의 투여 후인 두 번째 시점의 두 가지 시점 사이에서 1%, 2%, 5%, 10%, 20% 또는 50% 초과로 상승하지 않는, 푸소좀.
78. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 HLA-G 또는 HLA-E cDNA로 트랜스펙션된 세포에서, 실시예 5, 실시예 6 또는 실시예 7의 방법에 의해 생성되는, 푸소좀.
79. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, NMC-HLA-G 세포에서 생성된 푸소좀이 특정 시점에서 NMC 또는 NMC-빈 벡터에서 생성된 푸소좀과 비교하여 감소된 용해(예를 들어 PBMC 매개 용해, NK세포 매개 용해 및/또는 CD8+ T세포 매개 용해)율을 나타내는, 푸소좀.
80. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 변형된 푸소좀이 대식세포에 의한 포식작용을 회피하는, 푸소좀.
81. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 CD47 cDNA로 트랜스펙션된 세포에서, 실시예 8의 방법에 의해 생성되는, 푸소좀.
82. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 대식세포가 NMC-CD47에서 유도된 푸소좀과 함께 인큐베이션되는 경우, 대식세포가 NMC 또는 NMC 빈 벡터에서 유도된 푸소좀과 함께 인큐베이션되는 경우에 비해 포식세포지수(phagocytic index)가 감소되는, 푸소좀.
83. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 참조 푸소좀, 예를 들어 상기 푸소좀과 달리 유사한 변형되지 않은 푸소좀과 비교하여, 대식세포 포식작용의 감소, 예를 들어 대식세포 포식작용의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타내며, 여기서 대식세포 포식작용의 감소는, 예를 들어 실시예 8에 기재된 바와 같이 포식세포지수의 시험관내 검정으로 결정된 것인, 푸소좀.
84. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀 조성물이, 예를 들어 대식세포 포식작용의 시험관내 검정에서 대식세포와 함께 인큐베이션될 때, 실시예 8의 검정에 따라 측정 시, 0, 1, 10, 100 또는 그 이상의 포식세포지수를 갖는, 푸소좀.
85. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 변형된 것이고, 변형되지 않은 푸소좀과 비교하여 감소된 보체 활성을 나타내는, 푸소좀.
86. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 보체 조절 단백질, 예를 들어 DAF를 코딩하는 cDNA로 트랜스펙션된 세포에서, 실시예 9의 방법에 의해 생성되는, 푸소좀.
87. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 200 pg/ml의 C3a가 존재하는 푸소좀의 용량이, 상응하는 마우스 혈청(예를 들어, HEK293 마우스 혈청)과 함께 인큐베이션된 참조 푸소좀(예를 들어, HEK293 레트로바이러스 벡터)보다 상응하는 마우스 혈청(예를 들어, HEK-293 DAF 마우스 혈청)과 함께 인큐베이션된 변형된 푸소좀(예를 들어, HEK293-DAF)의 경우에 더 큰, 푸소좀.
88. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 200 pg/ml의 C3a가 존재하는 푸소좀의 용량이, 나이브(naive) 마우스 혈청과 함께 인큐베이션된 참조 푸소좀(예를 들어, HEK293 레트로바이러스 벡터)보다 나이브 마우스 혈청과 함께 인큐베이션된 변형된 푸소좀(예를 들어, HEK293-DAF)의 경우에 더 큰, 푸소좀.
89. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 실시예 9의 검정에 따라 측정 시, 투여 30분 후 환자 혈청에서 보체 매개 불활성화에 대한 내성이 생기는, 푸소좀.
90. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀의 적어도 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 보체 매개 불활성화에 대한 내성이 있는, 푸소좀.
91. 구현예 86 내지 구현예 90 중 어느 하나에 있어서, 보체 조절 단백질이 붕괴촉진인자(DAF, CD55)에 결합하는 단백질, 예를 들어 인자 H(FH) 유사 단백질-1(FHL-1), 예를 들어 C4b-결합 단백질(C4BP), 예를 들어 보체 수용체 1(CD35), 예를 들어 막 보조인자 단백질(MCP, CD46), 예를 들어 프로텍틴(Protectin)(CD59), 예를 들어 전형적 및 대안적 보체 경로 CD/C5 전환효소를 저해하는 단백질, 예를 들어 MAC 어셈블리를 조절하는 단백질 중 하나 이상을 포함하는, 푸소좀.
92. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 MHC 클래스 I을 표적으로 하는 shRNA를 코딩하는 DNA로 트랜스펙션된 세포에서, 실시예 10의 방법에 의해 생성된 것이며, 예를 들어 여기서 NMC-shMHC 클래스 I에서 유도된 레트로바이러스 벡터는 NMC 및 NMC 벡터 대조군과 비교하여 더 낮은 MHC 클래스 I의 발현을 나타내는, 푸소좀.
93. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀에 대한 면역원성의 척도가 혈청 불활성화, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실시예 11에 기재된 바와 같이 측정되는 혈청 불활성화인, 푸소좀.
94. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %가 푸소좀 나이브 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플과 상기 마우스로부터의 열-불활성화된 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플 사이에서 다르지 않은, 푸소좀.
95. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %가 푸소좀 나이브 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플과 무혈청 대조군 인큐베이션의 푸소좀 샘플 사이에서 다르지 않은, 푸소좀.
96. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %가 푸소좀 나이브 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플보다 양성 대조군 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플에서 더 낮은, 푸소좀.
97. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 변형된, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 변형된 푸소좀이, 변형된 푸소좀의 다회(예를 들어, 1회 초과, 예를 들어 2회 이상) 투여 후 감소된(예를 들어, 변형되지 않은 푸소좀의 투여와 비교하여 감소된) 혈청 불활성화를 나타내는, 푸소좀.
98. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 다회투여 후 혈청에 의해 불활성화되지 않는, 푸소좀.
99. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀에 대한 면역원성의 척도가 혈청 불활성화, 예를 들어 다회투여 후 혈청 불활성화, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실시예 12에 기재된 바와 같이 측정되는 다회투여 후 혈청 불활성화인, 푸소좀.
100. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %가 변형된(예를 들어, HEK293-HLA-G) 푸소좀으로 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플과 상기 마우스로부터의 열-불활성화된 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플 사이에서 다르지 않은, 푸소좀.
101. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %가 변형된(예를 들어, HEK293-HLA-G) 푸소좀으로 1회, 2회, 3회, 5회 또는 10회 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플 사이에서 다르지 않은, 푸소좀.
102. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %가 비히클로 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플과 변형된(예를 들어, HEK293-HLA-G) 푸소좀으로 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플 사이에서 다르지 않은, 푸소좀.
103. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %가 변형된(예를 들어, HEK293-HLA-G) 푸소좀보다 참조세포(예를 들어, HEK293)에서 유도된 푸소좀의 경우에 더 적은, 푸소좀.
104. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀에 대한 면역원성의 척도가 항체반응인, 푸소좀.
105. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 본원에 기재된 푸소좀을 받는 대상이, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실시예 13에 기재된 바와 같이 측정 시, 푸소좀에 결합하여 이를 인식하는 기존 항체를 갖는, 푸소좀.
106. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀 나이브 마우스로부터의 혈청이 음성 대조군, 예를 들어 IgM 및 IgG가 결핍된 마우스로부터의 혈청보다 더 큰 신호(예를 들어, 형광)를 나타내며, 예를 들어 이는 면역원성이 발생했음을 나타내는 것인, 푸소좀.
107. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소좀 나이브 마우스로부터의 혈청이 음성 대조군과 비교하여 유사한 신호(예를 들어, 형광)를 나타내며, 예를 들어 이는 면역원성이 검출 가능하게 발생하지 않았음을 나타내는, 푸소좀.
108. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 변형된, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 변형된 푸소좀이고, 변형된 푸소좀의 다회(예를 들어, 1회 초과, 예를 들어 2회 이상) 투여 후, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실시예 14에 기재된 바와 같이 측정 시, 감소된(예를 들어, 변형되지 않은 푸소좀의 투여와 비교하여 감소된) 체액성 반응을 나타내는, 푸소좀.
109. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 HLA-G 또는 HLA-E cDNA로 트랜스펙션된 세포에서, 실시예 5, 실시예 6, 실시예 7 또는 실시예 14의 방법에 의해 생성된 것인, 푸소좀.
110. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 체액성 반응이 항-푸소좀 항체(예를 들어, IgM, IgG1 및/또는 IgG2 항체) 수준에 대한 값의 결정에 의해 평가되는 것인, 푸소좀.
111. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 변형된(예를 들어, NMC-HLA-G) 푸소좀이, 대조군, 예를 들어 NMC 푸소좀 또는 NMC-빈 푸소좀과 비교하여, 주사 후 (예를 들어, FACS에서 형광 강도로 측정 시) 항-바이러스 IgM 또는 IgG1/2 항체 역가의 감소를 나타내는, 푸소좀.
112. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 수용세포(recipient cell)가 항체반응에 의해 표적화되지 않거나, 또는 항체반응이, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실시예 15에 기재된 바와 같이 측정 시 참조 수준 미만인, 푸소좀.
113. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 신호(예를 들어, 평균 형광 강도)가 푸소좀으로 처리된 마우스로부터의 수용세포와 PBS로 처리된 마우스로부터의 수용세포에 대하여 유사한, 푸소좀.
114. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 수용세포의 면역원성의 척도가 대식세포 반응인, 푸소좀.
115. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 수용세포가 대식세포에 의해 표적화되지 않거나, 참조 수준 미만으로 표적화되는, 푸소좀.
116. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실시예 16에 기재된 바와 같이 측정되는 포식세포지수가, 푸소좀으로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포와 PBS로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포에 대하여 유사한, 푸소좀.
117. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 수용세포의 면역원성의 척도가 PBMC 반응인, 푸소좀.
118. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 수용세포가 PBMC 반응을 유도하지 않는, 푸소좀.
119. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CD3+/CMG+ 세포의 %가, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실시예 17에 기재된 바와 같이 측정 시, 푸소좀으로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포와 PBS로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포에 대하여 유사한, 푸소좀.
120. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 수용세포의 면역원성의 척도가 자연살해세포 반응인, 푸소좀.
121. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 수용세포가 자연살해세포 반응을 유도하지 않거나, 예를 들어 참조 값 미만의 낮은 자연살해세포 반응을 유도하는, 푸소좀.
122. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CD3+/CMG+ 세포의 %가, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실시예 18에 기재된 바와 같이 측정 시, 푸소좀으로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포와 PBS로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포에 대하여 유사한, 푸소좀.
123. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 수용세포의 면역원성의 척도가 CD8+ T세포 반응인, 푸소좀.
124. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 수용세포가 CD8+ T세포 반응을 유도하지 않거나, 예를 들어 참조 값 미만의 낮은 CD8+ T세포 반응을 유도하는, 푸소좀.
125. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, CD3+/CMG+ 세포의 %가, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 실시예 19에 기재된 바와 같이 측정 시, 푸소좀으로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포와 PBS로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포에 대하여 유사한, 푸소좀.
126. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, 푸소겐이 재표적화된 푸소겐인, 푸소좀.
127. 상기 구현예 중 어느 하나에 있어서, (i) 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 양성 표적세포 특이적 조절 요소, 또는 (ii) 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 비표적세포 특이적 조절 요소 또는 음성 TCSRE 중 하나 또는 둘 모두를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을 포함하는, 푸소좀.
128. 상기 구현예 중 어느 하나의 푸소좀과, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
129. 외인성 작용제를 대상(예를 들어, 인간 대상)에게 전달하는 방법으로서, 구현예 1 내지 구현예 127 중 어느 하나의 푸소좀, 또는 구현예 128의 약학적 조성물을 대상에게 투여하여, 외인성 작용제를 대상에게 전달하는 것을 포함하는 방법.
130. 대상(예를 들어, 인간 대상), 표적조직 또는 표적세포(예를 들어, CNS세포, 예를 들어 뉴런 또는 아교세포)에서 기능을 조절하는 방법으로서, 구현예 1 내지 구현예 127 중 어느 하나의 푸소좀, 또는 구현예 128의 약학적 조성물을 대상, 표적조직 또는 표적세포와 접촉시키는, 예를 들어 대상, 표적조직 또는 표적세포에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
131. 구현예 130에 있어서, 표적조직 또는 표적세포가 대상에 존재하는, 방법.
132. 대상(예를 들어, 인간 대상)에서 유전자 결핍을 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 구현예 127 중 어느 하나의 푸소좀, 또는 구현예 128의 약학적 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
133. 구현예 132에 있어서, 유전자 결핍이 표 5 또는 표 6의 유전자 결핍인, 방법.
134. 구현예 132 또는 구현예 133에 있어서, 유전자 결핍이 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자에 의해 치료될 수 있는 유전자 결핍인, 방법.
135. 구현에 132 내지 구현예 134 중 어느 하나에 있어서, 유전자 결핍이 CNS 질환 또는 장애, 또는 리소좀 질환 또는 장애와 관련이 있고, 상기 방법이 CNS 질환 또는 장애, 또는 리소좀 질환 또는 장애를 치료하는, 방법.
136. 구현예 135에 있어서, CNS 질환 또는 장애, 또는 리소좀 질환 또는 장애가 척수소뇌성 운동실조증; 상염색체 열성 1형; 안구운동실행증 동반 운동실조증 2형; 취약X증후군; 뇌크레아틴결핍증후군 1; 엔젤만증후군(Angelman Syndrome); 근위축성 측삭경화증; 프리드리히 운동실조증(Friedreich's Ataxia); 레트증후군(Rett Syndrome); 카나반병(Canavan Disease); 피리독신 의존성 발작; 바텐병(Batten Disease), 푸코시드축적증; 크라베병(Krabbe Disease); 테이-삭스병(Tay Sachs Disease); 샌드호프병(Sandhoff Disease); 베타-만노스축적증; 이염성 백질디스트로피; 뮤코리피드증 IIIa형; 뮤코리피드증 IIIb형 또는 뮤코리피드증 IV형에서 선택되는, 방법.
137. 구현예 1 내지 구현예 127 또는 구현예 128에 있어서, 유전자 결핍이 있는 대상(예를 들어, 인간 대상)을 치료하는 데 사용하기 위한, 푸소좀 또는 약학적 조성물.
138. 유전자 결핍이 있는 대상(예를 들어, 인간 대상)을 치료하는 데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 구현예 1 내지 구현예 127 중 어느 하나의 푸소좀, 또는 구현예 128의 약학적 조성물의 용도.
139. 구현예 137 또는 구현예 138에 있어서, 푸소좀이 유전자 결핍을 치료하기 위한 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자를 포함하는, 푸소좀 또는 약학적 조성물, 또는 용도.
140. 구현예 137 내지 구현예 139 중 어느 하나에 있어서, 유전자 결핍이 CNS 질환 또는 장애, 또는 리소좀 질환 또는 장애와 관련이 있고, 상기 방법이 CNS 질환 또는 장애, 또는 리소좀 질환 또는 장애를 치료하는, 푸소좀 또는 약학적 조성물, 또는 용도.
141. 구현예 137 내지 구현예 140 중 어느 하나에 있어서, CNS 질환 또는 장애, 또는 리소좀 질환 또는 장애가 척수소뇌성 운동실조증; 상염색체 열성 1형; 안구운동실행증 동반 운동실조증 2형; 취약X증후군; 뇌크레아틴결핍증후군 1; 엔젤만증후군; 근위축성 측삭경화증; 프리드리히 운동실조증; 레트증후군; 카나반병; 피리독신 의존성 발작; 바텐병, 푸코시드축적증; 크라베병; 테이-삭스병; 샌드호프병; 베타-만노스축적증; 이염성 백질디스트로피; 뮤코리피드증 IIIa형; 뮤코리피드증 IIIb형 또는 뮤코리피드증 IV형에서 선택되는, 푸소좀 또는 약학적 조성물, 또는 용도.
142. 구현예 1 내지 구현예 127 중 어느 하나의 푸소좀을 제조하는 방법으로서,
a) 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산과 푸소좀을 포함하는 세포를 제공하는 단계;
b) 푸소좀의 생성을 가능하게 하는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계; 및
c) 세포로부터 푸소좀을 분리, 농축 또는 정제하여 푸소좀을 제조하는 단계를 포함하는, 푸소좀을 제조하는 방법.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명, 도면 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 예를 들어, 본원의 임의의 표에, 본원에 언급된 모든 GenBank, Unigene 및 Entrez 서열은 참조로서 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원의 임의의 표를 포함하여 본원에 명시된 서열 수탁번호는 2018년 5월 15일 현재의 데이터베이스 항목을 나타낸다. 하나의 유전자 또는 단백질이 복수의 서열 수탁번호로 표시되는 경우, 모든 서열 변이체가 포함된다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시적인 것으로, 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 발명의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 보다 잘 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위한 목적으로, 본원에 기재된 도면에는 현재 예시된 특정 구현예가 도시되어 있다. 하지만, 본 발명이 도면에 도시된 구현예의 정확한 배열 및 수단에 제한되는 것이 아니라는 것을 이해해야 한다.
도 1은, F-액틴용 염료로 푸소좀의 염색을 정량화한 것이다.
도 2는, 3시간, 5시간 및 24시간의 기간에 걸친, 폴리머라아제 액틴에 대한 푸소좀 및 모세포의 능력을 보여주는 그래프이다.
도 3은, NTA 및 현미경으로 측정된 푸소좀 및 모세포의 크기 분포 통계를 보여주는 표이다.
도 4는, 푸소좀 및 모세포의 평균 크기 및 부피를 보여주는 표이다.
도 5는, 푸소좀 또는 세포 집단에 대해 관찰된 가용성:불용성 비를 보여주는 일련의 다이어그램이다.
도 6은, 표적세포 또는 비표적세포에 대한 MvH(CD8)+F 푸소좀 융합, 및 표적화된 융합의 절대량을 보여주는 일련의 다이어그램이다.
도 7은, VSV-G 푸소좀에서 2-NBDG 평균 형광 강도를 보여주는 다이어그램이다.
도 8은, VSV-G 푸소좀의 시토졸에서 에스테라아제 활성을 보여주는 다이어그램이다.
도 9a 및 도 9b는, 마우스에서 생물발광 이미지화로 검출된, 푸소좀에 의한 Cre 재조합효소 전달을 보여주는 일련의 다이어그램이다. (도 9a) IV 푸소좀 처리된 마우스(1x 및 3x 농도)의 노출된 간 및 비장의 복부 이미지 및 발광 신호 오버레이. 하단 부분은 발광 신호 단독임. (도 9b) 푸소좀 표적화된 비장 및 간의 총 플럭스(flux) 신호; y축은 log10 스케일임. 3x 푸소좀 처리 농도로 처리된 마우스는 처리 72시간 후 배경보다 비장에서 유의하게 큰 신호(p=0.0004)를 나타냈다.
도 10a 및 도 10b는, 생물발광 이미지화로 검출된, 푸소좀에 의한 쥣과 간 및 비장으로의 Cre 재조합효소를 보여주는 일련의 다이어그램이다. (A) 좌측에서 우측으로; 안락사 5분 이내에 채취 및 이미지화된, 절제된 간, 심장, 폐, 신장, 소장, 췌장 및 비장의 등쪽 이미지 및 발광 신호 오버레이. 하단 부분은 발광 신호 단독임. (도 10b) 푸소좀 표적화된 비장, 간 및 다른 조직의 총 플럭스 신호; y축은 log10 스케일임. 3x 푸소좀 처리 농도로 처리된 마우스는 최저 신호를 나타낸 조직(심장)과 비교하여 비장에서 유의하게 큰 신호(p<0.0001)를 나타냈다.
도 11은, 비세포내이입 경로를 통한 NivG+F 푸소좀에 의한 Cre 카고(cargo)의 전달을 보여주는 표이다.
도 12는, 푸소좀 및 모세포에서 비신코닌산(bicinchoninic acid) 검정에 의해 측정된 GAPDH:총 단백질 비를 보여주는 그래프이다.
도 13은, 푸소좀 및 모세포에서 비신코닌산 검정에 의해 측정된 지질:단백질 비를 보여주는 그래프이다.
도 14는, 푸소좀 및 모세포에서 비신코닌산 검정에 의해 측정된 단백질:DNA 비를 보여주는 그래프이다.
도 15는, 푸소좀 및 모세포에서 비신코닌산 검정에 의해 측정된 지질:DNA 비를 보여주는 그래프이다.
도 16은, 엑소좀 및 푸소좀에서 엑소좀 마커 CD63의 단백질 수준을 보여주는 그래프이다.
도 17은, 푸소좀 및 모세포에서 검출된 칼넥신(calnexin) 신호의 강도를 보여주는 그래프이다.
도 18은, 푸소좀 및 모세포에 대해 결정된 지질:DNA 비를 보여주는 그래프이다.
도 19a 및 도 19b는, 모세포, 엑소좀 및 푸소좀에서 총 지질의 백분율로서 지질 종의 비율을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 20은, 표시된 바와 같은 특정 구획과 관련된 단백질에 대한 모세포, 엑소좀 및 푸소좀의 단백질 함량을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 21은, 모세포, 엑소좀 및 푸소좀의 총 단백질 함량의 백분율로서 ARRDC1(좌측 패널) 또는 TSG101(우측 패널)의 수준을 보여주는 일련의 그래프이다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 푸소좀의 생체내 전달을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 표적세포에 대한 특이성을 촉진시키는 요소의 조합, 예를 들어 재표적화된 푸소겐, 양성 표적세포 특이적 조절 요소 및 비표적세포 특이적 조절 요소 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀에 대한 면역반응을 감소시키는 하나 이상의 변형을 포함한다.
I. 정의
청구범위 및 명세서에 사용된 용어는, 달리 명시되지 않는 한, 하기에 제시되는 바와 같이 정의된다.
본원에 사용된 "검출 가능하게 존재하는"은, 검출 가능하게 존재하는 외인성 작용제의 맥락에서 사용될 때, 외인성 작용제 자체가 검출 가능하게 존재함을 의미한다. 예를 들어, 외인성 작용제가 단백질인 경우, 외인성 단백질 작용제는 이를 인코딩하는 핵산이 검출 가능하게 존재하는지 여부에 관계없이 검출 가능하게 존재할 수 있다.
본원에 사용된 "푸소좀"은, 내강(lumen) 또는 공동(cavity)을 둘러싸는 양친매성 지질의 이중층과, 양친매성 지질 이중층과 상호작용하는 푸소겐을 나타낸다. 구현예에서, 푸소좀은 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 막으로 둘러싸인 제제이다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 원천세포에서 유도된 것이다.
본원에 사용된 "푸소좀 조성물"은, 하나 이상의 푸소좀을 포함하는 조성물을 나타낸다.
본원에 사용된 "푸소겐"은, 2개의 막으로 둘러싸인 내강 사이에서 상호작용을 형성하는 작용제 또는 분자를 나타낸다. 구현예에서, 푸소겐은 막의 융합을 촉진시킨다. 다른 구현예에서, 푸소겐은 2개의 내강(예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 내강과 표적세포의 세포질) 사이에 연결, 예를 들어 공극을 형성한다. 일부 구현예에서, 푸소겐은 2개 이상의 단백질의 복합체를 포함하며, 예를 들어 여기서 어떠한 단백질도 단독으로는 융합 활성(fusogenic activity)을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 푸소겐은 표적화 도메인을 포함한다.
본원에 사용된 "절연인자 요소"는, 인핸서를 차단하거나 이질염색질(heterochromatin) 확산을 방지하는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 절연인자 요소는 야생형 또는 돌연변이일 수 있다.
본원에 사용된 "유효량"이란 용어는, 치료하고자 하는 증상 및/또는 병태를 유의하게 및 긍정적으로 변형시키는 데(예를 들어, 긍정적인 임상 반응을 제공하는 데) 충분한 양인 약학적 조성물의 양을 의미한다. 약학적 조성물에 사용되는 활성 성분의 유효량은 치료하고자 하는 특정 병태, 병태의 중증도, 치료 기간, 병용요법의 특징, 이용되는 특정 활성 성분(들), 이용되는 특정 약학적으로 허용 가능한 부형제(들) 및/또는 담체(들), 및 주치의의 지식 및 전문성과 같은 인자에 따라 달라질 것이다.
바이러스, VLP 또는 푸소좀에 대한 언급에서 본원에 사용된 "외인성 작용제"는, 상응하는 야생형 바이러스 또는 상응하는 야생형 원천세포에서 제조된 푸소겐으로 구성되지도 않고 이를 인코딩하지도 않는 작용제를 나타낸다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 (예를 들어, 삽입, 결실 또는 치환에 의해) 자연 발생 단백질에 비해 변경된 서열을 갖는 단백질 또는 핵산과 같이, 자연적으로 존재하지 않는 것이다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 원천세포에 자연적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 원천세포에 자연적으로 존재하지만, 바이러스에 대해서는 외인성이다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 수용세포에 자연적으로 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 수용세포에 자연적으로 존재하지만, 목적하는 수준으로 또는 목적하는 시간에 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 RNA 또는 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/위험 비율에 상응하여, 인간 및 동물의 조직과 접촉시켜 사용하는 데 적합한 부형제, 조성물 및/또는 투여 형태를 나타낸다.
본원에 사용된 "프로모터"는, 유전자 코딩 서열에 작동 가능하게 연결(operably linked)될 때, 유전자의 전사를 유도하는 시스-조절 DNA 서열을 나타낸다. 프로모터는 전사인자 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유전자에서 먼 거리에 있는 하나 이상의 인핸서와 협력하여 작동한다.
본원에 사용된 "양성 표적세포 특이적 조절 요소"(또는 양성 TCSRE)는, 비표적세포와 비교하여 표적세포에서 외인성 작용제의 수준을 증가시키는 핵산 서열을 나타내며, 여기서 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산은 양성 TCSRE에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 양성 TCSRE는 기능성 핵산 서열이며, 예를 들어 양성 TCSRE는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 양성 TCSRE는 기능성 RNA 서열을 인코딩하며, 예를 들어 양성 TCSRE는 표적세포에서 RNA의 정확한 스플라이싱을 촉진시키는 스플라이스 부위를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 양성 TCSRE는 기능성 단백질 서열을 인코딩하거나, 양성 TCSRE는 단백질의 정확한 번역 후 변형을 촉진시키는 단백질 서열을 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 양성 TCSRE는 외인성 작용제의 하향조절제 또는 저해제의 수준 또는 활성을 감소시킨다.
본원에 사용된 "음성 표적세포 특이적 조절 요소"(또는 음성 TCSRE)는, 표적세포와 비교하여 비표적세포에서 외인성 작용제의 수준을 감소시키는 핵산 서열을 나타내며, 여기서 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산은 음성 TCSRE에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 음성 TCSRE는 기능성 핵산 서열, 예를 들어 비표적세포에서 레트로바이러스 핵산의 분해 또는 저해를 야기하는 miRNA 인식 부위이다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 기능성 RNA 서열을 인코딩하고, 예를 들어 핵산은 외인성 단백질 작용제를 인코딩하는 mRNA에 존재하는 miRNA 서열을 인코딩하여, mRNA가 비표적세포에서 분해 또는 저해되도록 한다. 일부 구현예에서, 음성 TCSRE는 외인성 작용제의 하향조절제 또는 저해제의 수준 또는 활성을 증가시킨다.
본원에 사용된 "비표적세포 특이적 조절 요소"(또는 NTCSRE)는, 표적세포와 비교하여 비표적세포에서 외인성 작용제의 수준을 감소시키는 핵산 서열을 나타내며, 여기서 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산은 NTCSRE에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, NTCSRE는 기능성 핵산 서열, 예를 들어 비표적세포에서 레트로바이러스 핵산의 분해 또는 저해를 야기하는 miRNA 인식 부위이다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 기능성 RNA 서열을 인코딩하고, 예를 들어 핵산은 외인성 단백질 작용제를 인코딩하는 mRNA에 존재하는 miRNA 서열을 인코딩하여, mRNA가 비표적세포에서 분해 또는 저해되도록 한다. 일부 구현예에서, NTCSRE는 외인성 작용제의 하향조절제 또는 저해제의 수준 또는 활성을 증가시킨다. "음성 TCSRE" 및 "NTCSRE"라는 용어는, 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 "비CNS세포 특이적 조절 요소"는, 표적세포가 CNS세포인 경우의 비표적세포 특이적 조절 요소(NTCSRE)를 나타낸다. 따라서, 비CNS세포 특이적 조절 요소는, 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산이 비CNS세포 특이적 조절 요소에 작동 가능하게 연결되는 경우, CNS세포와 비교하여 비CNS세포에서 외인성 작용제의 수준을 감소시키는 핵산 서열을 나타낸다.
본원에 사용된 "재표적화된 푸소겐"은, 자연 발생 형태의 푸소겐의 일부가 아닌 서열을 갖는 표적화 모이어티를 포함하는 푸소겐을 나타낸다. 구현예에서, 푸소겐은 자연 발생 형태의 푸소겐에서의 표적화 모이어티와 상이한 표적화 모이어티를 포함한다. 구현예에서, 자연 발생 형태의 푸소겐에는 표적화 도메인이 결여되어 있고, 재표적화된 푸소겐은 자연 발생 형태의 푸소겐에 존재하지 않는 표적화 모이어티를 포함한다. 구현예에서, 푸소겐은 표적화 모이어티를 포함하도록 변형된다. 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 막관통 도메인, 융합 활성 도메인 또는 세포질 도메인에서, 자연 발생 형태의 푸소겐에 비해 표적화 모이어티의 외부에 하나 이상의 서열 변경을 포함한다.
본원에 사용된 "레트로바이러스 핵산"은, 단독으로, 또는 헬퍼 세포, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드와 조합으로, 레트로바이러스 또는 레트로바이러스 벡터로의 패키징을 위한 적어도 최소의 서열 요건을 함유하는 핵산을 나타낸다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산은 외인성 작용제, 양성 표적세포 특이적 조절 요소, 비표적세포 특이적 조절 요소 또는 음성 TCSRE를 추가로 포함하거나 인코딩한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산은 5' LTR(예를 들어, 통합을 촉진시키기 위함), U3(예를 들어, 바이러스 게놈 RNA 전사를 활성화시키기 위함), R(예를 들어, Tat-결합 영역), U5, 3' LTR(예를 들어, 통합을 촉진시키기 위함), 패키징 부위(예를 들어, psi(Ψ)), RRE(예를 들어, Rev에 결합하여 핵 방출을 촉진시키기 위함) 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함한다. 레트로바이러스 핵산은 RNA(예를 들어, 비리온의 일부인 경우) 또는 DNA(예를 들어, 원천세포에 도입될 때 또는 수용세포에서의 역전사 후)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산은 gap, pol 및 env 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함하는 헬퍼 세포, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드를 사용하여 패키징된다.
본원에 사용된 "표적세포"는, 푸소좀(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)이 외인성 작용제를 전달하는 것이 바람직한 유형의 세포를 나타낸다. 구현예에서, 표적세포는 특정 조직 유형 또는 부류의 세포, 예를 들어 CNS세포, 예를 들어 뉴런 또는 아교세포이다. 일부 구현예에서, 표적세포는 병든 세포, 예를 들어 암세포이다. 일부 구현예에서, 푸소겐, 예를 들어 재표적화된 푸소겐(단독으로, 또는 양성 TCSRE, NTCSRE, 음성 TCSRE 또는 이들의 임의의 조합과 조합으로)은 비표적세포와 비교하여 표적세포로의 외인성 작용제의 우선적 전달을 유도한다.
본원에 사용된 "비표적세포"는, 렌티바이러스 벡터가 외인성 작용제를 전달하는 것이 바람직하지 않은 유형의 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 비표적세포는 특정 조직 유형 또는 부류의 세포이다. 일부 구현예에서, 비표적세포는 병들지 않은 세포, 예를 들어 비암성세포이다. 일부 구현예에서, 푸소겐, 예를 들어 재표적화된 푸소겐(단독으로, 또는 양성 TCSRE, NTCSRE, 음성 TCSRE 또는 이들의 임의의 조합과 조합으로)은 표적세포와 비교하여 비표적세포로의 외인성 작용제의 더 적은 전달을 유도한다.
본원에 사용된 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는, 질환 또는 장애를 개선시키는 것, 예를 들어 질환 또는 장애, 예를 들어 장애의 원인 또는 이의 임상 증상 중 적어도 하나의 발달을 느리게 하거나 중단시키거나 감소시키는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 "세포생물제제(cytobiologic)"는, 내강 및 세포막을 포함하는 세포의 일부, 또는 부분적으로 또는 완전히 핵 불활성화된 세포를 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포생물제제는 세포골격 구성요소, 세포소기관 및 리보솜 중 하나 이상을 포함한다. 구현예에서, 세포생물제제는 제핵된(enucleated) 세포, 미세소포 또는 유령 세포(cell ghost)이다.
II. 푸소좀, 예를 들어 세포 유래 푸소좀
푸소좀은 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀은 원천세포에서 유도된 것이다. 푸소좀은, 예를 들어 세포외 소포, 미세소포, 나노소포, 엑소좀, 세포자멸체(세포자멸사 세포 유래), 미세입자(예를 들어, 혈소판에서 유도될 수 있음), 엑토좀(예를 들어, 혈청 내 호중구 및 단핵구에서 유도 가능함), 프로스타토좀(prostatosome)(전립선 암세포에서 수득 가능함), 카디오좀(cardiosome)(심장세포에서 유도 가능함) 또는 이들의 임의의 조합이거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 원천세포에서 자연적으로 방출되고, 일부 구현예에서 원천세포는 푸소좀의 형성을 증강시키도록 처리된다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 직경이 약 10 nm 내지 10,000 nm이며, 예를 들어 직경이 약 30 nm 내지 100 nm이다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 하나 이상의 합성 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 푸소좀의 양친매성 지질의 이중층은 바이러스 외피이거나 이를 포함한다. 바이러스 외피는 푸소겐, 예를 들어 바이러스에 내인성인 푸소겐 또는 위형화된(pseudotyped) 푸소겐을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀의 내강 또는 공동은 바이러스 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산, 예를 들어 렌티바이러스 핵산을 포함한다. 바이러스 핵산은 바이러스 게놈일 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 이의 공동 또는 내강에 하나 이상의 바이러스 비(非)구조 단백질을 추가로 포함한다.
푸소좀은 페이로드의 표적세포로의 전달을 용이하게 하는 다양한 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 푸소좀과 원천세포는 함께 표적세포와 융합할 수 있는 입자를 만드는 데 충분한 핵산(들)을 포함한다. 구현예에서, 이러한 핵산(들)은 gag 다단백질 활성, 폴리머라아제 활성, 인테그라아제 활성, 프로테아제 활성 및 푸소겐 활성과 같은 활성 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 갖는 단백질을 인코딩한다.
푸소좀은 또한 표적세포로의 페이로드의 전달을 용이하게 하는 다양한 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 푸소좀과 원천세포는 함께 표적세포와 융합할 수 있는 입자를 만드는 데 충분한 핵산(들)을 포함한다. 구현예에서, 이러한 핵산(들)은 gag 다단백질 활성, 폴리머라아제 활성, 인테그라아제 활성, 프로테아제 활성 및 푸소겐 활성과 같은 활성 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 갖는 단백질을 인코딩한다.
푸소좀은 또한 표적세포로의 페이로드의 전달을 용이하게 하는 다양한 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 푸소좀(예를 들어, 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스)은 gag 다단백질, 폴리머라아제(예를 들어, pol), 인테그라아제(예를 들어, 기능성 또는 비기능성 변이체), 프로테아제 및 푸소겐과 같은 단백질 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 rev를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 언급한 단백질 중 하나 이상은 레트로바이러스 게놈에서 인코딩되며, 일부 구현예에서, 상기 언급한 단백질 중 하나 이상은, 예를 들어 헬퍼 세포, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드에 의해 트랜스로 제공된다. 일부 구현예에서, 푸소좀 핵산(예를 들어, 레트로바이러스 핵산)은 5' LTR(예를 들어, U5를 포함하고 기능성 U3 도메인이 결여됨), Psi 패키징 요소(Psi), 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 중심 폴리퓨린관(cPPT) 프로모터, 페이로드 유전자(선택적으로 오픈리딩프레임 전에 인트론을 포함함), Poly A 꼬리 서열, WPRE 및 3' LTR(예를 들어, U5를 포함하고 기능성 U3이 결여됨)과 같은 핵산 서열 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀 핵산(예를 들어, 레트로바이러스 핵산)은 하나 이상의 절연인자 요소를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀 핵산(예를 들어, 레트로바이러스 핵산)은 하나 이상의 miRNA 인식 부위를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA 인식 부위 중 하나 이상은 poly A 꼬리 서열의 다운스트림에, 예를 들어 poly A 꼬리 서열과 WPRE 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 푸소좀은 대상, 예를 들어 포유류, 예를 들어 인간에게 투여된다. 상기와 같은 구현예에서, 대상은 특정 질환 또는 병태(예를 들어, 본원에 기재된 질환 또는 병태)의 위험이 있을 수 있거나, 이의 증상을 가질 수 있거나, 또는 이로 진단되거나 이를 앓고 있는 것으로 확인될 수 있다. 하나의 구현예에서, 대상은 표 5 또는 표 6에 열거된 임의의 것과 같은 유전자 결핍을 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 질환 또는 병태를 치료하기 위한, 예컨대 유전자 결핍을 치료하기 위한 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 함유한다.
A. 바이러스에서 생성된 푸소좀.
예를 들어, 일부 구현예에서, 푸소좀(예를 들어, 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스)은 gag 다단백질, 폴리머라아제(예를 들어, pol), 인테그라아제(예를 들어, 기능성 또는 비기능성 변이체), 프로테아제 및 푸소겐과 같은 단백질 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 rev를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 언급한 단백질 중 하나 이상은 레트로바이러스 게놈에서 인코딩되며, 일부 구현예에서, 상기 언급한 단백질 중 하나 이상은, 예를 들어 헬퍼 세포, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드에 의해 트랜스로 제공된다. 일부 구현예에서, 푸소좀 핵산(예를 들어, 레트로바이러스 핵산)은 5' LTR(예를 들어, U5를 포함하고 기능성 U3 도메인이 결여됨), Psi 패키징 요소(Psi), 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 중심 폴리퓨린관(cPPT) 프로모터, 페이로드 유전자(선택적으로 오픈리딩프레임 전에 인트론을 포함함), Poly A 꼬리 서열, WPRE 및 3' LTR(예를 들어, U5를 포함하고 기능성 U3이 결여됨)과 같은 핵산 서열 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀 핵산(예를 들어, 레트로바이러스 핵산)은 하나 이상의 절연인자 요소를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀 핵산(예를 들어, 레트로바이러스 핵산)은 하나 이상의 miRNA 인식 부위를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA 인식 부위 중 하나 이상은 poly A 꼬리 서열의 다운스트림에, 예를 들어 poly A 꼬리 서열과 WPRE 사이에 위치한다.
i) 렌티바이러스 구성요소 및 헬퍼 세포
일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산은 5' 프로모터(예를 들어, 전체 패키징된 RNA의 발현을 제어하기 위함), 5' LTR(예를 들어, R(폴리아데닐화 꼬리 신호) 및/또는 U5(이는 프라이머 활성화 신호를 포함함)를 포함함), 프라이머 결합 부위, psi 패키징 신호, 핵 방출용 RRE 요소, 전이유전자 발현을 제어하기 위해 전이유전자의 바로 업스트림에 있는 프로모터, 전이유전자(또는 다른 외인성 작용제 요소), 폴리퓨린관 및 3' LTR(예를 들어, 돌연변이된 U3, R 및 U5를 포함함) 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산은 cPPT, WPRE 및/또는 절연인자 요소 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
레트로바이러스는 전형적으로 이의 게놈 RNA를 선형 이중가닥 DNA 카피로 역전사하여 복제한 후, 게놈 DNA를 숙주 게놈에 공유결합으로 통합시킨다. 특정 구현예에 사용하는 데 적합한 예시적인 레트로바이러스에는, 비제한적으로, 몰로니(Moloney)쥐백혈병바이러스(M-MuLV), 몰로니쥐육종바이러스(MoMSV), 하베이(Harvey)쥐육종바이러스(HaMuSV), 쥐유선종양바이러스(MuMTV), 긴팔원숭이백혈병바이러스(GaLV), 고양이백혈병바이러스(FLV), 스푸마바이러스(spumavirus), 프리엔드(Friend)쥐백혈병바이러스, 쥐줄기세포바이러스(MSCV) 및 라우스육종(Rous Sarcoma) 바이러스(RSV) 및 렌티바이러스가 포함된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스는 감마레트로바이러스이다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 엡실론레트로바이러스이다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 알파레트로바이러스이다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 베타레트로바이러스이다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 델타레트로바이러스이다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 스푸마레트로바이러스이다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 내인성 레트로바이러스이다.
예시적인 렌티바이러스에는, 비제한적으로, HIV(인간면역결핍바이러스; 제1형 HIV 및 제2형 HIV 포함); 비스나-메디(visna-maedi)바이러스(VMV); 염소관절염-뇌염바이러스(CAEV); 말전염성빈혈바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍바이러스(FIV); 소 면역결핍바이러스(BIV) 및 원숭이 면역결핍바이러스(SIV)가 포함된다. 일부 구현예에서, HIV 기반 벡터 백본(즉, HIV 시스-작용 서열 요소)이 사용된다.
일부 구현예에서, 본원의 벡터는 또 다른 핵산 분자를 전달하거나 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결되며, 예를 들어 이에 삽입된다. 벡터는 세포에서 자가 복제를 지시하는 서열을 포함하거나, 숙주세포 DNA로의 통합을 가능하게 하는 데 충분한 서열을 포함할 수 있다. 유용한 벡터에는, 예를 들어 플라스미드(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존(transposon), 코스미드(cosmid), 박테리아 인공 염색체 및 바이러스 벡터가 포함된다. 유용한 바이러스 벡터에는, 예를 들어 복제 결함 레트로바이러스 및 렌티바이러스가 포함된다.
바이러스 벡터는, 예를 들어 전형적으로 핵산 분자의 전달, 또는 세포의 게놈으로의 통합 또는 핵산 전달을 매개하는 바이러스 입자에의 통합을 용이하게 하는 바이러스 유래 핵산 요소를 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 전달 플라스미드)를 포함할 수 있다. 바이러스 입자는 전형적으로 다양한 바이러스 구성요소를 포함하며, 때때로 핵산(들) 이외에 숙주세포 구성요소도 포함한다. 바이러스 벡터는, 예를 들어 핵산을 세포 내로 또는 전달된 핵산(예를 들어, 네이키드(naked) DNA로서)에 전달할 수 있는 바이러스 또는 바이러스 입자를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터 및 전달 플라스미드는 주로 바이러스에서 유도되는 구조적 및/또는 기능성 유전 요소를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 주로 레트로바이러스에서 유도되는 구조적 및 기능성 유전 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 주로 렌티바이러스에서 유도되는 LTR을 포함하여, 구조적 및 기능성 유전 요소, 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있다.
구현예에서, 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 발현 벡터)는 렌티바이러스 전달 플라스미드(예를 들어, 네이키드 DNA로서) 또는 감염성 렌티바이러스 입자를 포함할 수 있다. 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종 핵산 등과 같은 요소에 관하여, 이러한 요소의 서열은 렌티바이러스 입자에서 RNA 형태로 존재할 수 있고, DNA 플라스미드에서 DNA 형태로 존재할 수 있음을 이해해야 한다.
본원에 기재된 일부 벡터에서, 복제에 기여하거나 이에 필요한 하나 이상의 단백질 코딩 영역의 적어도 일부는 상응하는 야생형 바이러스와 비교하여 존재하지 않을 수 있다. 이는 바이러스 벡터 복제 결함을 만든다. 일부 구현예에서, 벡터는 표적 비(非)분열 숙주세포를 형질도입하고/하거나 이의 게놈을 숙주 게놈에 통합할 수 있다.
야생형 레트로바이러스 게놈의 구조는 종종 5' 긴말단반복(LTR: long terminal repeat) 및 3' LTR(이들 사이 또는 내부에 게놈이 패키징되는 것을 가능하게 하는 패키징 신호가 위치함), 프라이머 결합 부위, 숙주세포 게놈에의 통합을 가능하게 하는 통합 부위, 및 바이러스 입자의 어셈블리를 촉진시키는 패키징 구성요소를 인코딩하는 gag, pol 및 env 유전자를 포함한다. 더 복잡한 레트로바이러스는 HIV에서의 rev 및 RRE 서열과 같은 추가의 특징을 갖고 있으며, 이는 통합된 프로바이러스의 RNA 전사체를 핵에서 감염된 표적세포의 세포질로 효율적으로 방출할 수 있다. 프로바이러스에서, 바이러스 유전자에는 양쪽 말단에 긴말단반복(LTR)으로 불리는 영역이 있다. LTR은 프로바이러스 통합 및 전사에 관여한다. LTR은 또한 인핸서-프로모터 서열로서 작용하며, 바이러스 유전자의 발현을 제어할 수 있다. 레트로바이러스 RNA의 캡시드화(encapsidation)는 바이러스 게놈의 5' 말단에 위치하는 psi 서열에 의해 일어난다.
LTR 자체는 전형적으로 U3, R 및 U5로 불리는 3가지 요소로 나뉠 수 있는 유사한(예를 들어, 동일한) 서열이다. U3은 RNA의 3' 말단에 고유한 서열에서 유도된다. R은 RNA의 양쪽 말단에서 반복되는 서열에서 유도되고, U5는 RNA의 5' 말단에 고유한 서열에서 유도된다. 3가지 요소의 크기는 상이한 레트로바이러스에서 상당히 다를 수 있다.
바이러스 게놈의 경우, 전사 개시 부위는 전형적으로 하나의 LTR에서 U3과 R 사이의 경계에 존재하며, poly(A) 부가(종결)의 부위는 다른 LTR에서 R과 U5 사이에 존재한다. U3은 프로바이러스의 대부분의 전사 제어 요소를 함유하며, 이에는 세포, 및 일부 경우에 바이러스 전사 활성화 단백질에 반응하는 프로모터 및 다수의 인핸서 서열이 포함된다. 일부 레트로바이러스는 유전자 발현의 조절에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자인 tot, rev, tax 및 rex 중 하나 이상을 포함한다.
구조 유전자 gag, pol 및 env 자체와 관련하여, gag는 바이러스의 내부 구조 단백질을 인코딩한다. gag 단백질은 성숙 단백질 MA(매트릭스), CA(캡시드) 및 NC(뉴클레오캡시드)로 단백질분해된다. pol 유전자는 DNA 폴리머라아제를 함유하는 역전사효소(RT), 관련 RNase H, 및 게놈의 복제를 매개하는 인테그라아제(IN)를 인코딩한다. env 유전자는 세포 수용체 단백질과 특이적으로 상호작용하는 복합체를 형성하는, 비리온의 표면(SU) 당단백질과 막관통(TM) 단백질을 인코딩한다. 이러한 상호작용은, 예를 들어 바이러스막과 세포막의 융합에 의해 감염을 촉진시킨다.
복제 결함 레트로바이러스 벡터 게놈에서, gag, pol 및 env는 존재하지 않거나 기능성이 없을 수 있다. RNA의 양쪽 말단에 있는 R 영역은 전형적으로 반복되는 서열이다. U5 및 U3은, 각각, RNA 게놈의 5' 말단 및 3' 말단에 있는 고유한 서열을 나타낸다.
레트로바이러스는 또한 gag, pol 및 env 이외의 단백질을 코딩하는 추가 유전자를 함유할 수 있다. 추가 유전자의 예에는(HIV에서), vif, vpr, vpx, vpu, tat, rev 및 nef 중 하나 이상이 포함된다. EIAV는 (특히) 추가 유전자 S2를 갖는다. 추가 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 다양한 기능을 담당하며, 이 중 일부는 세포 단백질에 의해 제공되는 기능을 복제할 수 있다. EIAV에서, 예를 들어 tat은 바이러스 LTR의 전사 활성화제로서 작용한다(문헌[Derse and Newbold 1993 Virology 194:530-6]; 문헌[Maury et al. 1994 Virology 200:632-42]). 이는 TAR로 지칭되는 안정한 스템 루프(stem-loop) RNA 2차 구조에 결합한다. rev는 rev-반응 요소(RRE)를 통해 바이러스 유전자의 발현을 조절하고 조정한다(문헌[Martarano et al. 1994 J. Virol. 68:3102-11]). 이러한 2가지 단백질의 작용 메커니즘은 영장류 바이러스에서의 유사한 메커니즘과 상당히 유사한 것으로 여겨진다. 또한, 막관통 단백질의 시작에서 env 코딩 서열에 스플라이싱된 tat의 첫 번째 엑손에 의해 인코딩된 EIAV 단백질인 ttm이 확인되었다.
프로테아제, 역전사효소 및 인테그라아제에 더하여, 비(非)영장류 렌티바이러스는 dUTPase를 코딩하는 4번째 pol 유전자 산물을 함유한다. 이는 분열하지 않거나 서서히 분열하는 특정 세포 유형을 감염시키는 이러한 렌티바이러스의 능력에서 역할을 할 수 있다.
구현예에서, 재조합 렌티바이러스 벡터(RLV)는 패키징 구성요소의 존재 하에서, RNA 게놈의, 표적세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자로의 패키징을 가능하게 하는 데 충분한 레트로바이러스 유전 정보를 갖는 벡터이다. 표적세포의 감염은 역전사 및 표적세포 게놈으로의 통합을 포함할 수 있다. RLV는 전형적으로 벡터에 의해 전달되는 비(非)바이러스 코딩 서열을 표적세포로 운반한다. 구현예에서, RLV는 표적세포 내에서 감염성 레트로바이러스 입자를 생성하기 위한 독립적인 복제가 불가능하다. 통상적으로, RLV에는 기능성 gag-pol 및/또는 env 유전자 및/또는 복제에 관여하는 다른 유전자가 결여되어 있다. 상기 벡터는, 예를 들어 PCT 특허출원 WO 99/15683(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 바와 같이, 스플릿-인트론(split-intron) 벡터로 구성될 수 있다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 최소 바이러스 게놈을 포함하며, 예를 들어 바이러스 벡터는, 예를 들어 WO 98/17815(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 바와 같이, 관심 뉴클레오타이드 서열을 표적 숙주세포에 감염시키고, 형질도입하고, 전달하는 데 필요한 기능성을 제공하기 위해, 비필수 요소를 제거하고 필수 요소를 보유하도록 조작된다.
최소 렌티바이러스 게놈은, 예를 들어 (5')R-U5-하나 이상의 제1 뉴클레오타이드 서열-U3-R(3')을 포함할 수 있다. 하지만, 원천세포 내에서 렌티바이러스 게놈을 생성하는데 사용되는 플라스미드 벡터는 또한, 원천세포에서 게놈의 전사를 지시하도록 렌티바이러스 게놈에 작동 가능하게 연결된 전사 조절 제어 서열을 포함할 수 있다. 이러한 조절 서열은 전사된 레트로바이러스 서열과 관련된 천연 서열, 예를 들어 5' U3 영역을 포함하거나, 또 다른 바이러스 프로모터, 예를 들어 CMV 프로모터와 같은 이종 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 렌티바이러스 게놈은 효율적인 바이러스 생성을 촉진시키기 위해 추가의 서열을 포함한다. 예를 들어, HIV의 경우, rev 및 RRE 서열이 포함될 수 있다. 대안적으로 또는 조합으로, 코돈 최적화가 사용될 수 있으며, 예를 들어 외인성 작용제를 인코딩하는 유전자는, 예를 들어 WO 01/79518(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 바와 같이 코돈 최적화될 수 있다. rev/RRE 시스템과 유사하거나 동일한 기능을 수행하는 대안적인 서열이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, rev/RRE 시스템의 기능성 유사체는 메이슨 화이자(Mason Pfizer) 원숭이바이러스에서 발견된다. 이는 CTE로 공지되어 있으며, 감염된 세포의 인자와 상호작용하는 것으로 여겨지는 게놈의 RRE 유형 서열을 포함한다. 세포 인자는 rev 유사체로 여겨질 수 있다. 따라서, CTE는 rev/RRE 시스템에 대한 대안으로 사용될 수 있다. 또한, HTLV-I의 Rex 단백질은 HIV-I의 Rev 단백질을 기능적으로 대체할 수 있다. Rev와 Rex는 IRE-BP에 유사한 영향을 미친다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산(예를 들어, 렌티바이러스 핵산, 예를 들어 영장류 또는 비(非)영장류 렌티바이러스 핵산)은 다음과 같은 특징을 갖는다: (1) 결실된 gag 유전자를 포함하며, 여기서 gag에서의 결실은 gag 코딩 서열의 약 350번째 또는 354번째의 뉴클레오타이드의 다운스트림에 있는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 제거함; (2) 레트로바이러스 핵산에는 존재하지 않는 하나 이상의 보조 유전자를 가짐; (3) tat 유전자가 결여되어 있지만, 5' LTR의 말단과 gag의 ATG 사이에 리더 서열을 포함함; (4) (1), (2) 및 (3)의 조합. 일 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 (1), (2) 및 (3)의 모든 특징을 포함한다. 이러한 전략은 WO 99/32646(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 보다 상세하게 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 영장류 렌티바이러스 최소 시스템은 벡터 생성, 또는 분열 및 비분열 세포의 형질도입을 위해 HIV/SIV 추가 유전자 vif, vpr, vpx, vpu, tat, rev 및 nef 중 어느 것도 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, EIAV 최소 벡터 시스템은 벡터 생성, 또는 분열 및 비분열 세포의 형질도입을 위해 S2를 필요로 하지 않는다.
추가 유전자의 결실은 렌티바이러스(예를 들어, HIV) 감염에서 질환과 관련된 유전자 없이 벡터가 생성되는 것을 가능하게 할 수 있다. 특히, tat은 질환과 관련이 있다. 두 번째로, 추가 유전자의 결실은 벡터가 더 많은 이종 DNA를 패키징하는 것을 가능하게 한다. 세 번째로, S2와 같은 기능이 공지되어 있지 않은 유전자를 생략하여, 바람직하지 않은 영향을 유발할 위험을 감소시킬 수 있다. 최소 렌티바이러스 벡터의 예는, WO 99/32646 및 WO 98/17815에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산에는 적어도 tat 및 S2(EIAV 벡터 시스템인 경우), 및 가능하게는 또한 vif, vpr, vpx, vpu 및 nef가 없다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산에는 또한 rev, RRE 또는 둘 모두가 없다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산은 vpx를 포함한다. vpx 폴리펩타이드는 세포질에서 유리 dNTP를 분해하는 SAMHD1 제한인자에 결합하여 이의 분해를 유도한다. 따라서, vpx가 SAMHD1을 분해하여 역전사 활성이 증가함에 따라 세포질 내 유리 dNTP의 농도가 증가하여, 레트로바이러스 게놈의 역전사 및 표적세포 게놈에의 통합이 용이해진다.
상이한 세포는 특정 코돈의 사용법이 상이하다. 이러한 코돈 편향은 세포 유형에서 특정 tRNA의 상대적인 풍부함의 편향에 해당한다. 서열에서 코돈을 변경하여 상응하는 tRNA의 상대적인 풍부함과 일치하도록 조정함으로써, 발현을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, 특정 세포 유형에서 상응하는 tRNA가 드문 것으로 공지된 코돈을 고의적으로 선별하여 발현을 감소시킬 수 있다. 따라서, 추가 수준의 번역 제어가 이용 가능하다. 코돈 최적화에 대한 추가의 설명은, 예를 들어 WO 99/41397(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에서 확인할 수 있다.
HIV 및 다른 렌티바이러스를 포함하여 다수의 바이러스는 다수의 희귀 코돈을 사용하며, 통상적으로 사용되는 포유류 코돈에 상응하도록 이를 변경하여, 포유류 생산세포(producer cell)에서 패키징 구성요소의 발현을 증가시킬 수 있다.
코돈 최적화는 다수의 다른 이점을 갖는다. 서열 변경으로 인해, RNA 불안정성 서열(INS)이 패키징 구성요소를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열로부터 감소 또는 제거될 수 있다. 동시에, 패키징 구성요소에 대한 아미노산 서열 코딩 서열은, 이러한 서열에 의해 인코딩되는 바이러스 구성요소가 동일하게, 또는 패키징 구성요소의 기능이 손상되지 않도록 적어도 충분히 유사하게 유지되도록 보유된다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화는 또한 방출을 위한 rev/RRE 요건을 극복하여, 최적화된 서열 rev를 독립적으로 만든다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화는 또한 벡터 시스템 내 상이한 구조체 사이(예를 들어, gag-pol의 중첩 영역과 env 오픈리딩프레임 사이)의 동종 재조합을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화는 바이러스 역가의 증가 및/또는 안전성의 개선을 유도한다.
일부 구현예에서, INS와 관련된 코돈만 코돈 최적화된다. 다른 구현예에서, 상기 서열은, gag-pol의 프레임시프트(frameshift) 부위를 포함하는 서열을 제외하고는, 전체적으로 코돈 최적화된다.
gag-pol 유전자는 gag-pol 단백질을 인코딩하는 2개의 중첩 리딩 프레임을 포함한다. 두 가지 단백질의 발현은 번역 동안 프레임시프트에 따라 달라진다. 이러한 프레임시프트는 번역 동안 리보솜 "미끄러짐(slippage)"의 결과로 일어난다. 이러한 미끄러짐은 적어도 부분적으로 리보솜 중단(ribosome-stalling) RNA 2차 구조에 의해 야기되는 것으로 여겨진다. 이러한 2차 구조는 gag-pol 유전자에서 프레임시프트 부위의 다운스트림에 존재한다. HIV의 경우, 중첩 영역은 gag의 시작 부분의 다운스트림에 있는 1222번째 뉴클레오타이드(여기서, 1번째 뉴클레오타이드는 gag ATG의 A임)에서 gag의 말단(nt 1503)까지 확장된다. 결과적으로, 프레임시프트 부위와 2개의 리딩 프레임의 중첩 영역에 걸쳐있는 281 bp 단편은 바람직하게는 코돈 최적화되지 않는다. 일부 구현예에서, 이러한 단편을 보유하는 것은 gag-pol 단백질의 보다 효율적인 발현을 가능하게 할 것이다. EIAV의 경우, 중첩의 시작은 nt 1262(여기서, 1번째 뉴클레오타이드는 gag ATG의 A임)에 있다. 중첩의 끝은 nt 1461에 있다. 프레임시프트 부위와 gag-pol 중첩이 보존되는 것을 보장하기 위해, 야생형 서열은 nt 1156에서 nt 1465까지 유지될 수 있다.
예를 들어 편리한 제한 부위를 수용하기 위해 최적의 코돈 사용법이 유도될 수 있으며, 보존적 아미노산 변경이 gag-pol 단백질에 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 코돈 최적화는 포유류 시스템에서 코돈 사용이 불량한 코돈을 기반으로 한다. 제3, 및 때때로 제2 및 제3 염기가 변경될 수 있다.
유전자 코드의 축퇴성(degenerate nature)으로 인해, 당업자에 의해 다수의 gag-pol 서열이 달성될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 코돈 최적화된 gag-pol 서열을 생성하기 위해 시작 부분으로 사용될 수 있는 다수의 레트로바이러스 변이체가 기재되어 있다. 렌티바이러스 게놈은 매우 다양할 수 있다. 예를 들어, 여전히 기능성인 HIV-I의 다수의 유사 종이 존재한다. 이는 EIAV의 경우에도 마찬가지이다. 이러한 변이체는 형질도입 과정의 특정 부분을 증강시키는 데 사용될 수 있다. HIV-I 변이체의 예는 로스 앨러모스 국립연구소(Los Alamos National Laboratory)에서 관리하는 HIV 데이터베이스에서 확인할 수 있다. EIAV 클론에 대한 상세한 내용은 미국국립보건원(National Institutes of Health)에서 관리하는 NCBI 데이터베이스에서 확인할 수 있다.
코돈 최적화된 gag-pol 서열에 대한 전략은 임의의 레트로바이러스, 예를 들어 EIAV, FIV, BIV, CAEV, VMR, SIV, HIV-I 및 HIV-2와 관련하여 사용될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 HTLV-I, HTLV-2, HFV, HSRV 및 인간 내인성 레트로바이러스(HERV), MLV 및 다른 레트로바이러스로부터의 유전자 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 레트로바이러스 벡터용 패키징 구성요소는 gag, pol 및 env 유전자의 발현 산물을 포함할 수 있다. 또한, 패키징은 4개 스템 루프의 짧은 서열, 이어서 패키징 신호로서 gag 및 env의 부분 서열을 이용할 수 있다. 따라서, (패키징 구조체의 전장 gag 서열에 더하여) 레트로바이러스 벡터 게놈에 결실된 gag 서열을 포함하는 것이 사용될 수 있다. 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 env 서열을 여전히 보유하는 벡터에 255개 내지 360개의 gag 뉴클레오타이드, 또는 스플라이스 공여체 돌연변이, gag 및 env 결실의 특정 조합에 약 40개의 gag 뉴클레오타이드를 포함하는 패키징 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 하나 이상의 결실을 포함하는 gag 서열을 포함하며, 예를 들어gag 서열은 N-말단에서 유도될 수 있는 약 360개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
레트로바이러스 벡터, 헬퍼 세포, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드는 레트로바이러스 구조 및 보조 단백질, 예를 들어 gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx 또는 nef 단백질, 또는 다른 레트로바이러스 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 단백질은 동일한 레트로바이러스에서 유도된 것이다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 단백질은 1종 초과의 레트로바이러스, 예를 들어 2종, 3종, 4종 또는 그 이상의 레트로바이러스에서 유도된 것이다.
gag 및 pol 코딩 서열은 일반적으로 천연 렌티바이러스에서 gag-pol 전구체로 구성된다. gag 서열은 p55로도 불리는 55-kD gag 전구체 단백질을 코딩한다. p55는 성숙화 과정 동안 바이러스로 인코딩된 프로테아제 4(pol 유전자의 산물)에 의해 MA(매트릭스[p17]), CA(캡시드[p24]), NC(뉴클레오캡시드[p9]) 및 p6으로 지정된 4가지의 작은 단백질로 절단된다. pol 전구체 단백질은 바이러스로 인코딩된 프로테아제에 의해 gag에서 분리되고, 추가로 분해되어 프로테아제(p10), RT(p50), RNase H(p15) 및 인테그라아제(p31) 활성을 분리한다.
천연 gag-pol 서열은 헬퍼 벡터(예를 들어, 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스)에서 이용될 수 있거나, 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 변형에는, gag 및 pol 서열이 상이한 바이러스(예를 들어, 상이한 종, 하위종, 균주, 계통 등)에서 수득되고/되거나, 상기 서열이 전사 및/또는 번역을 개선시키고/시키거나 재조합을 감소시키도록 변형된, 키메라 gag-pol이 포함된다.
다양한 예에서, 레트로바이러스 핵산은, (i) 야생형 INS1에 비해 RNA의 핵 방출의 제한을 감소시키는 돌연변이된 INS1 저해 서열을 포함하고, (ii) 프레임시프트 및 조기 종결을 유도하는 2개의 뉴클레오타이드 삽입을 함유하고/하거나, (iii) gag의 INS2, INS3 및 INS4 저해 서열을 포함하지 않는, gag 단백질의 150번째 내지 250번째(예를 들어, 168번째) 뉴클레오타이드 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 벡터는 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스) 서열과 비(非)렌티바이러스 바이러스 서열을 모두 포함하는 하이브리드 벡터이다. 일부 구현예에서, 하이브리드 벡터는 역전사, 복제, 통합 및/또는 패키징을 위한 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 서열을 포함한다.
특정한 특정 구현예에 따르면, 바이러스 벡터 백본 서열의 대부분 또는 전부는 렌티바이러스, 예를 들어 HIV-1에서 유도된 것이다. 하지만, 레트로바이러스 및/또는 렌티바이러스 서열의 다수의 상이한 공급원이 사용되거나 조합될 수 있으며, 본원에 기재된 기능을 수행하기 위한 전달 벡터의 능력을 손상시키지 않으면서 특정한 렌티바이러스 서열에서 다수의 치환 및 변경이 수용될 수 있음을 이해해야 한다. 다양한 렌티바이러스 벡터는 Naldini 등의 문헌(1996a, 1996b 및 1998); Zufferey 등의 문헌(1997); Dull 등의 문헌(1998), 미국 특허 제6,013,516호; 및 제5,994,136호에 기재되어 있으며, 이들 중 다수가 레트로바이러스 핵산을 생산하기 위해 조정될 수 있다.
프로바이러스의 각 말단에서, 긴말단반복(LTR)이 전형적으로 발견된다. LTR은 전형적으로 레트로바이러스 핵산의 말단에 위치하는 도메인을 포함하며, 이는 이의 천연 서열의 맥락에서 직접 반복되고, U3, R 및 U5 영역을 함유한다. LTR은 일반적으로 레트로바이러스 유전자의 발현(예를 들어, 유전자 전사체의 촉진, 개시 및 폴리아데닐화) 및 바이러스 복제를 촉진시킨다. LTR은 전사 제어 요소, 폴리아데닐화 신호, 및 바이러스 게놈의 복제 및 통합을 위한 서열을 포함하는 다수의 조절 신호를 포함할 수 있다. 바이러스 LTR은 전형적으로 U3, R 및 U5로 불리는 3개의 영역으로 나뉜다. U3 영역은 전형적으로 인핸서 및 프로모터 요소를 함유한다. U5 영역은 전형적으로 프라이머 결합 부위와 R 영역 사이의 서열이며, 폴리아데닐화 서열을 함유할 수 있다. R(반복) 영역의 측면에는 U3 영역과 U5 영역이 있을 수 있다. LTR은 전형적으로 U3, R 및 U5 영역으로 구성되며, 바이러스 게놈의 5' 말단과 3' 말단에 모두 나타날 수 있다. 일부 구현예에서, 게놈의 역전사를 위한 서열(tRNA 프라이머 결합 부위) 및 바이러스 RNA의 입자로의 효율적인 패키징을 위한 서열(Psi 부위)이 5' LTR에 인접해 있다.
패키징 신호는 바이러스 RNA의 바이러스 캡시드 또는 입자에의 삽입을 매개하는 레트로바이러스 게놈 내에 위치한 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109] 참조). 몇몇 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 캡시드화를 위해 최소 패키징 신호(파이[Ψ] 서열)를 사용한다.
다양한 구현예에서, 레트로바이러스 핵산은 변형된 5' LTR 및/또는 3' LTR을 포함한다. LTR 중 어느 하나 또는 둘 모두는, 비제한적으로, 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 3' LTR의 변형은 종종 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 시스템의 안전성을 개선시키기 위해, 바이러스에 복제 결함, 예를 들어 감염성 비리온이 생성되지 않도록 완전하고 효과적인 복제를 불가능하게 하는 바이러스(예를 들어, 복제 결함 렌티바이러스 자손)를 부여함으로써 이루어진다.
일부 구현예에서, 벡터는 U3 영역으로 공지된 우측(3') LTR 인핸서-프로모터 영역이 바이러스 복제의 첫 번째 라운드를 넘어서는 바이러스 전사를 방지하기 위해 (예를 들어, 결실 또는 치환에 의해) 변형된, 자가-불활성화(SIN) 벡터, 예를 들어 복제 결함 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다. 이는, 우측(3') LTR U3 영역이 바이러스 복제 동안 좌측(5') LTR U3 영역에 대한 주형으로 사용될 수 있고, 따라서 U3 인핸서-프로모터의 부재가 바이러스 복제를 저해하기 때문이다. 구현예에서, 3' LTR 은 U5 영역이 제거되거나, 변경되거나, 예를 들어 외인성 poly(A) 서열로 대체되도록 변형된다. 3' LTR, 5' LTR, 또는 3' 및 5' LTR 둘 모두는 변형된 LTR일 수 있다.
일부 구현예에서, 5' LTR의 U3 영역은 바이러스 입자의 생성 동안 바이러스 게놈의 전사를 유도하기 위해 이종 프로모터로 대체된다. 사용될 수 있는 이종 프로모터의 예에는, 예를 들어 원숭이바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 거대세포바이러스(CMV)(예를 들어, 극초기), 몰로니쥐백혈병바이러스(MoMLV), 라우스육종바이러스(RSV) 및 단순헤르페스바이러스(HSV)(티미딘 키나아제) 프로모터가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 tat-독립적인 방식으로 높은 전사 수준을 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 이종 프로모터는 바이러스 게놈이 전사되는 방식을 제어하는 추가의 이점을 갖는다. 예를 들어, 이종 프로모터가 유도될 수 있기 때문에, 바이러스 게놈의 전부 또는 일부의 전사는 유도인자가 존재하는 경우에만 일어날 것이다. 유도인자에는, 비제한적으로, 하나 이상의 화학적 화합물, 또는 숙주세포가 배양되는 온도 또는 pH와 같은 생리학적 조건이 포함된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는, 예를 들어 렌티바이러스(예를 들어, HIV) LTR의 R 영역에 위치하는 TAR(트랜스-활성화 반응) 요소를 포함한다. 이러한 요소는 트랜스-활성화(tat) 유전 요소와 상호작용하여 바이러스 복제를 증강시킨다. 하지만, 이러한 요소는, 예를 들어 5' LTR의 U3 영역이 이종 프로모터로 대체되는 구현예에서는 필요하지 않다.
R 영역, 예를 들어 캡핑기의 시작(즉, 전사의 시작)에서 시작하여 poly A관의 시작 직전에 종결되는 레트로바이러스 LTR 내 영역의 측면에는 U3 영역과 U5 영역이 있을 수 있다. R 영역은 초기(nascent) DNA를 게놈의 한 말단에서 다른 말단으로 전달하는 역전사 동안 역할을 담당한다.
레트로바이러스 핵산은 또한 FLAP 요소, 예를 들어 이의 서열이 레트로바이러스, 예를 들어 HIV-1 또는 HIV-2의 중심 폴리퓨린관 및 중심 종결 서열(cPPT 및 CTS)을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 적합한 FLAP 요소는 미국 특허 제6,682,907호 및 문헌[Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173]에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. HIV-1 역전사 동안, 중심 폴리퓨린관(cPPT)에서 플러스가닥 DNA의 중심 개시 및 중심 종결 서열(CTS)에서의 중심 종결은, 삼중가닥 DNA 구조인 HIV-1 중심 DNA 플랩의 형성을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 백본은 외인성 작용제를 인코딩하는 유전자의 업스트림 또는 다운스트림에 하나 이상의 FLAP 요소를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 전달 플라스미드는 FLAP 요소, 예를 들어 HIV-1에서 유도되거나 단리된 FLAP 요소를 포함한다.
구현예에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 핵산은 하나 이상의 방출 요소, 예를 들어 세포의 핵에서 세포질로의 RNA 전사체의 수송을 조절하는 시스-작용 전사 후 조절 요소를 포함한다. RNA 방출 요소의 예에는, 비제한적으로, 인간면역결핍바이러스(HIV) rev 반응 요소(RRE)(예를 들어, 문헌[Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053]; 및 문헌[Cullen et al., 1991. Cell 58: 423] 참조), 및 B형 간염바이러스 전사 후 조절 요소(HPRE)가 포함되며, 상기 문헌들은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 일반적으로, RNA 방출 요소는 유전자의 3' UTR 내에서 대체되며, 하나 또는 복수의 카피로 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터에서 이종 서열의 발현은 전사 후 조절 요소, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 신호 중 하나 이상, 예를 들어 전부를 벡터에 혼입시킴으로써 증가된다. 예를 들어 우드척(Woodchuck) 간염바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE; 문헌[Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886]); B형 간염바이러스에 존재하는 전사 후 조절 요소(HPRE)(문헌[Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864]); 및 기타(문헌[Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766])와 같은 다양한 전사 후 조절 요소가 단백질에서 이종 핵산의 발현을 증가시킬 수 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 레트로바이러스 핵산은 WPRE 또는 HPRE와 같은 전사 후 조절 요소를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 레트로바이러스 핵산은 WPRE 또는 HPRE와 같은 전사 후 조절 요소가 결여되어 있거나 이를 포함하지 않는다.
예를 들어 외인성 작용제의 발현을 증가시키기 위해, 이종 핵산 전사체의 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소가 포함될 수 있다. 전사 종결 신호는 폴리아데닐화 신호의 다운스트림에서 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 외인성 작용제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 폴리아데닐화 서열 3'를 포함한다. polyA 부위는 RNA 폴리머라아제 II에 의한 초기 RNA 전사체의 종결 및 폴리아데닐화를 모두 지시하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 서열은 코딩 서열의 3' 말단에 polyA 꼬리를 부가하여 mRNA 안정성을 촉진시킴으로써, 번역 효율 증가에 기여할 수 있다. 레트로바이러스 핵산에 사용될 수 있는 polyA 신호의 예시적인 예에는, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA, 소 성장 호르몬 polyA 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 polyA 서열(rβgpA), 또는 또 다른 적합한 이종 또는 내인성 polyA 서열이 포함된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터는 하나 이상의 절연인자 요소, 예를 들어 본원에 기재된 절연인자 요소를 추가로 포함한다.
다양한 구현예에서, 상기 벡터는 외인성 작용제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 상기 벡터는 하나 이상의 LTR을 포함할 수 있으며, 여기서 LTR은 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 부가 또는 결실과 같은 하나 이상의 변형을 포함한다. 상기 벡터는 형질도입 효율을 증가시키는 하나 이상의 보조 요소(예를 들어, cPPT/FLAP), 바이러스 패키징(예를 들어, Psi(Ψ) 패키징 신호, RRE) 및/또는 외인성 유전자 발현을 증가시키는 다른 요소(예를 들어, poly (A) 서열)를 추가로 포함할 수 있으며, 선택적으로 WPRE 또는 HPRE를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 핵산은, 예를 들어 5'→3' 방향으로, 프로모터(예를 들어, CMV), R 서열(예를 들어, TAR 포함), U5 서열(예를 들어, 통합용), PBS 서열(예를 들어, 역전사용), DIS 서열(예를 들어, 게놈 이량체화용), psi 패키징 신호, 부분 gag 서열, RRE 서열(예를 들어, 핵 방출용), cPPT 서열(예를 들어, 핵 도입용), 외인성 작용제의 발현을 유도하는 프로모터, 외인성 작용제를 인코딩하는 유전자, WPRE 서열(예를 들어, 효율적인 전이유전자 발현용), PPT 서열(예를 들어, 역전사용), R 서열(예를 들어, 폴리아데닐화 및 종결용) 및 U5 신호(예를 들어, 통합용) 중 하나 이상, 예를 들어 전부를 포함한다.
ii) 스플라이스 부위를 제거하도록 조작된 벡터
일부 렌티바이러스 벡터는 활성 유전자 내부에서 통합되며, 비정상 및 가능하게는 절단된 전사체의 형성을 유도할 수 있는 강력한 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호를 보유한다.
원종양유전자 활성화의 메커니즘은, 삽입 돌연변이원의 게놈에 함유된 프로모터 요소 또는 스플라이스 부위와 통합에 의해 표적화된 세포 전사 유닛의 상호작용에서 비롯되는 키메라 전사체의 생성을 포함할 수 있다(문헌[Gabriel et al. 2009. Nat Med 15: 1431 -1436]; 문헌[Bokhoven, et al. J Virol 83:283-29]). 벡터 서열 및 세포 mRNA를 포함하는 키메라 융합 전사체는 벡터 서열에서 시작하여 측면에 있는 세포 유전자로 진행하는(또는 그 반대로) 연속판독 전사에 의해 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 핵산은, 예를 들어 렌티바이러스 벡터의 안전성 프로파일을 개선시키기 위해, 스플라이스 부위 중 적어도 2개가 제거된 렌티바이러스 백본을 포함한다. 이러한 스플라이스 부위의 종류 및 식별 방법은 WO2012156839A2(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재되어 있다.
iii) 레트로바이러스 생산 방법
대규모 바이러스 입자 생산은 종종 목적하는 바이러스 역가를 달성하는 데 유용하다. 바이러스 입자는 전달 벡터를 바이러스 구조 및/또는 보조 유전자, 예를 들어 gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx 또는 nef 유전자, 또는 다른 레트로바이러스 유전자를 포함하는 패키징 세포주에 트랜스펙션시킴으로써 생성될 수 있다.
구현예에서, 패키징 벡터는, 패키징 신호가 결여되어 있고, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 바이러스 구조 및/또는 보조 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 또는 바이러스 벡터이다. 전형적으로, 패키징 벡터는 패키징 세포에 포함되어 있으며, 트랜스펙션, 형질도입 또는 감염을 통해 세포에 도입된다. 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스 전달 벡터는 트랜스펙션, 형질도입 또는 감염을 통해 패키징 세포주에 도입되어, 원천세포 또는 세포주를 생성할 수 있다. 패키징 벡터는, 예를 들어 인산칼슘 트랜스펙션, 리포펙션 또는 전기천공을 포함하는 표준 방법에 의해 인간 세포 또는 세포주에 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 벡터는 네오마이신(neomycin), 히그로마이신(hygromycin), 퓨로마이신(puromycin), 블라스토시딘(blastocidin), 제오신(zeocin), 티미딘 키나아제, DHFR, Gln 합성효소 또는 ADA와 같은 우세한 선별 마커와 함께 세포에 도입된 후, 적절한 약물의 존재 하에서의 선별 및 클론의 단리가 이어진다. 선별 마커 유전자는 패키징 벡터, 예를 들어 IRES 또는 자가 절단 바이러스 펩타이드에 의해 인코딩되는 유전자에 물리적으로 연결될 수 있다.
패키징 세포주는 패키징 신호를 함유하지 않지만, 바이러스 입자를 패키징할 수 있는 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소(예를 들어, gag, pol 및 env)를 안정적으로 또는 일시적으로 발현하는 세포주를 포함한다. 임의의 적합한 세포주, 예를 들어 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포가 이용될 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 세포주에는, 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, Psi-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRC5 세포, A549 세포, HT1080 세포, 293 세포, 293T세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포 및 211A 세포가 포함된다. 구현예에서, 패키징 세포는 293 세포, 293T세포 또는 A549 세포이다.
원천세포주는 패키징 세포주와 패키징 신호를 포함하는 전달 벡터 구조체를 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자를 생성할 수 있는 세포주를 포함한다. 바이러스 스톡 용액의 제조 방법은, 예를 들어 문헌[Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633]및 문헌[N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113]에 예시되어 있으며, 상기 문헌들은 본원에 참조로서 인용된다. 감염성 바이러스 입자는, 예를 들어 세포 용해 또는 세포 배양물 상청액의 채취에 의해 패키징 세포에서 채취될 수 있다. 선택적으로, 채취된 바이러스 입자는 농축되거나 정제될 수 있다.
iv) 패키징 플라스미드 및 세포주
일부 구현예에서, 원천세포는 바이러스 입자를 패키징할 수 있는 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소(예를 들어, gag, pol 및 env)를 코딩하는 하나 이상의 플라스미드를 포함한다. 일부 구현예에서, gag, pol 및 env 전구체 중 적어도 2개를 코딩하는 서열은 동일한 플라스미드 상에 있다. 일부 구현예에서, gag, pol 및 env 전구체를 코딩하는 서열은 상이한 플라스미드 상에 있다. 일부 구현예에서, gag, pol 및 env 전구체를 코딩하는 서열은 동일한 발현 신호, 예를 들어 프로모터를 갖는다. 일부 구현예에서, gag, pol 및 env 전구체를 코딩하는 서열은 상이한 발현 신호, 예를 들어 상이한 프로모터를 갖는다. 일부 구현예에서, gag, pol 및 env 전구체의 발현은 유도 가능하다. 일부 구현예에서, 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소를 코딩하는 플라스미드는 동시에 또는 상이한 시간에 트랜스펙션된다. 일부 구현예에서, 바이러스 구조 단백질 및 복제 효소를 코딩하는 플라스미드는 패키징 벡터와 동시에 또는 상이한 시간에 트랜스펙션된다.
일부 구현예에서, 원천세포주는 하나 이상의 안정하게 통합된 바이러스 구조 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 안정하게 통합된 바이러스 구조 유전자의 발현은 유도 가능하다.
일부 구현예에서, 바이러스 구조 유전자의 발현은 전사 수준에서 조절된다. 일부 구현예에서, 바이러스 구조 유전자의 발현은 번역 수준에서 조절된다. 일부 구현예에서, 바이러스 구조 유전자의 발현은 번역 후 수준에서 조절된다.
일부 구현예에서, 바이러스 구조 유전자의 발현은 테트라사이클린(Tet) 조절된 전사 억제제(Tet-R)가 프로모터에 포함된 DNA 서열에 결합하여 입체장해에 의해 전사를 억제하는, 테트라사이클린(Tet)-의존성 시스템에 의해 조절된다(Yao 등의 문헌 (1998); Jones 등의 문헌 (2005)). 독시사이클린(dox)의 부가 시, Tet-R이 방출되어 전사가 가능해진다. 다수의 다른 적합한 전사 조절 프로모터, 전사인자 및 소분자 유도인자가 바이러스 구조 유전자의 전사를 조절하는 데 적합하다.
일부 구현예에서, 제3세대 렌티바이러스 구성요소, 제1형 인간면역결핍바이러스(HIV) rev, gag/pol, 및 Tet 조절된 프로모터의 제어 하에 있으며 항생제 내성 카세트와 결합된 외피는, 원천세포 게놈에 별도로 통합된다. 일부 구현예에서, 원천세포는 게놈에 통합된 rev, gag/pol 및 외피 단백질 각각 하나의 카피만을 갖는다.
일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 레트로바이러스 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산)은 또한 원천세포 게놈에 통합된다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산은 에피솜으로 유지된다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산은 게놈에 안정하게 통합된 rev, gag/pol 및 외피 단백질을 갖는 원천세포로 트랜스펙션된다. 예를 들어, 문헌[Milani et al. EMBO Molecular Medicine, 2017](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)을 참조.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 레트로바이러스 핵산은 역전사를 거칠 수 없다. 이러한 핵산은, 구현예에서, 외인성 작용제를 일시적으로 발현할 수 있다. 레트로바이러스 또는 VLP는 비활성화된(disabled) 역전사효소 단백질을 포함하거나, 역전사효소 단백질을 포함하지 않을 수 있다. 구현예에서, 레트로바이러스 핵산은 비활성화된 프라이머 결합 부위(PBS) 및/또는 att 부위를 포함한다. 구현예에서, rev, tat, vif, nef, vpr, vpu, vpx 및 S2, 또는 이의 기능적 등가물을 포함하는 하나 이상의 바이러스 보조 유전자는 레트로바이러스 핵산에서 비활성화되거나 이에 존재하지 않는다. 구현예에서, S2, rev 및 tat에서 선택되는 하나 이상의 보조 유전자는 레트로바이러스 핵산에서 비활성화되거나 이에 존재하지 않는다.
v) 레트로바이러스 핵산의 패키징 전략
전형적으로, 현대의 레트로바이러스 벡터 시스템은 바이러스 RNA의 바이러스 입자로의 전사, 역전사, 통합, 번역 및 패키징을 위한 시스-작용 벡터 서열을 보유하는 바이러스 게놈, 및 (2) 바이러스 입자의 생성에 필요한 트랜스-작용 레트로바이러스 유전자 서열(예를 들어, gag, pol 및 env)을 발현하는 생산 세포주로 이루어진다. 시스-작용 벡터 서열과 트랜스-작용 벡터 서열을 완벽히 분리하면, 바이러스는 1회 초과의 감염 주기 동안 복제를 유지할 수 없다. 살아있는 바이러스의 생성은, 예를 들어 재조합을 회피하기 위해 시스-작용 서열과 트랜스-작용 서열 사이의 중첩을 최소화하는 다수의 전략에 의해 회피될 수 있다.
RNA가 없거나 결여된 서열을 포함하는 바이러스 벡터 입자는 서열에서 바이러스 RNA를 제거하거나 배제한 결과일 수 있다. 하나의 구현예에서, 이는 gag에 내인성 패키징 신호 결합 부위를 사용함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 내인성 패키징 신호 결합 부위는 pol에 존재한다. 이러한 구현예에서, 전달되는 RNA는 동족 패키징 신호를 함유할 것이다. 또 다른 구현예에서, 전달되는 RNA의 패키징을 보장하기 위해, 전달되는 RNA에 위치하는 이종 결합 도메인(gag에 대하여 이종임), 및 gag 또는 pol에 위치하는 동족 결합 부위가 사용될 수 있다. 이종 서열은 바이러스가 아니거나 바이러스일 수 있으며, 바이러스인 경우, 이는 상이한 바이러스에서 유도될 수 있다. 벡터 입자는 치료용 RNA를 전달하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 경우 기능성 인테그라아제 및/또는 역전사효소가 필요하지 않다. 이러한 벡터 입자는 또한 관심 치료용 유전자를 전달하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 경우 pol이 전형적으로 포함된다.
일 구현예에서, gag-pol은 변경되며, 패키징 신호는 상응하는 패키징 신호로 대체된다. 이러한 구현예에서, 상기 입자는 새로운 패키징 신호로 RNA를 패키징할 수 있다. 이러한 접근법의 이점은, 바이러스 서열이 없는 RNA 서열, 예를 들어 RNAi를 패키징할 수 있다는 것이다.
대안적인 접근법은 패키징되는 RNA의 과발현에 의존하는 것이다. 하나의 구현예에서, 패키징되는 RNA는 패키징 신호를 함유하는 임의의 RNA의 부재 하에서 과발현된다. 이는 상당한 수준의 치료용 RNA를 패키징할 수 있으며, 이러한 양은 세포에 형질도입하고, 생물학적 효과를 나타내는 데 충분한 양이다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 gag 단백질, 또는 레트로바이러스 gag 및 pol 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 gag 단백질 또는 pol 단백질은 RNA 서열의 바이러스 벡터 입자로의 패키징을 용이하게 하기 위해, RNA 서열에 상응하는 서열을 인식할 수 있는 이종 RNA 결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 이종 RNA 결합 도메인은 박테리오파지 코트 단백질, Rev 단백질, U1 소핵 리보핵단백질 입자의 단백질, Nova 단백질, TF111A 단백질, TIS11 단백질, trp RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP) 또는 슈도우리딘(pseudouridine) 신타아제에서 유도된 RNA 결합 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원의 방법은 복제 가능 레트로바이러스의 부재를 검출하거나 확인하는 것을 포함한다. 상기 방법은 바이러스 유전자, 예를 들어 유전자 산물이 복제 가능 레트로바이러스, 예컨대 감마레트로바이러스 또는 렌티바이러스로 감염된 특정 세포에서 발현되지만, 세포에 이종 핵산을 형질도입하는 데 사용되는 바이러스 벡터에 존재하지 않고, 복제 가능 레트로바이러스를 함유하지 않는 세포에 존재 및/또는 발현되지 않거나, 존재 및/또는 발현되지 않을 것으로 예상되는 구조 또는 패키징 유전자와 같은 하나 이상의 표적 유전자의 RNA 수준을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 표적 유전자의 RNA 수준이, 예를 들어 표적 유전자를 함유하는 양성 대조군 샘플에서 직접 또는 간접적으로 측정될 수 있는 참조 값보다 높은 경우, 복제 가능 레트로바이러스가 존재하는 것으로 결정될 수 있다. 추가의 개시내용은, WO2018023094A1을 참조한다.
vi) 원천세포에서 외인성 작용제를 인코딩하는 유전자의 억제
원천세포에서 (과)발현된 단백질은 벡터 비리온 어셈블리 및/또는 감염성에 간접적 또는 직접적 영향을 미칠 수 있다. 외인성 작용제를 벡터 비리온에 혼입하는 것은 또한 벡터 입자의 다운스트림 처리에 영향을 미칠 수 있다.
일부 구현예에서, 조직 특이적 프로모터는 원천세포에서 외인성 작용제의 발현을 제한하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 원천세포에서 외인성 작용제의 번역을 억제하기 위해 이종 번역 제어 시스템이 진핵세포 배양물에 사용된다. 보다 구체적으로, 레트로바이러스 핵산은 외인성 작용제를 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 연결된 결합 부위를 포함할 수 있으며, 여기서 결합 부위는 RNA-결합 단백질과 상호작용하여, 외인성 작용제의 번역이 원천세포에서 억제 또는 방지되도록 할 수 있다.
일부 구현예에서, RNA-결합 단백질은 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP), 예를 들어 박테리아 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질이다. RNA-결합 단백질(예를 들어, 박테리아 trp 오페론 조절 단백질, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질, TRAP) 및 이에 결합하는 RNA 표적의 사용은, 원천세포 내에서 전이유전자 번역을 억제하거나 방지할 것이다. 이러한 시스템은 벡터 생산 중 전이유전자 억제(Transgene Repression In vector Production) 시스템 또는 TRIP 시스템으로 지칭된다.
구현예에서, NOI 번역 개시 코돈의 업스트림에의 RNA 결합 단백질(예를 들어, TRAP-결합 서열, tbs)에 대한 결합 부위의 배치는, 내부 발현 카세트에서 유도된 mRNA의 번역의 특이적 억제를 가능하게 하면서, 벡터 RNA의 생산 또는 안정성에 유해한 영향을 미치지 않는다. 외인성 작용제를 인코딩하는 유전자의 tbs와 번역 개시 코돈 사이의 뉴클레오타이드의 수는 0 내지 12개 뉴클레오타이드로 다양할 수 있다. tbs는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 다운스트림에 위치하여, 다시스트론(multicistronic) mRNA에서 외인성 작용제를 인코딩하는 유전자의 번역을 억제할 수 있다.
vii) 킬 스위치(kill switch) 시스템 및 증폭
일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 유전자를 보유하는 폴리뉴클레오타이드 또는 세포는 자살 유전자, 예를 들어 유도성 자살 유전자를 이용하여, 직접 독성 및/또는 제어되지 않은 증식의 위험을 감소시킨다. 특정 양태에서, 자살 유전자는 외인성 작용제를 보유하는 숙주세포에 대해 면역원성이 아니다. 자살 유전자의 예에는, 카스파아제(caspase)-9, 카스파아제-8 또는 시토신 데아미나아제가 포함된다. 카스파아제-9는 특정 이량체화의 화학적 유도인자(CID)를 사용하여 활성화될 수 있다.
특정 구현예에서, 벡터는 표적세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포, 예를 들어 T세포를 생체내 음성 선별에 민감하게 만드는 유전자 분절을 포함한다. 예를 들어, 형질도입된 세포는 개체의 생체내 조건의 변화의 결과로 제거될 수 있다. 음성 선별 표현형은 투여된 작용제, 예를 들어 화합물에 대한 감수성을 부여하는 유전자의 삽입으로 인해 유도될 수 있다. 음성 선별 유전자는 당업계에 공지되어 있으며, 이에는 특히 간시클로버(ganciclovir) 감수성을 부여하는 제1형 단순헤르페스바이러스 티미딘 키나아제(HSV-I TK) 유전자(문헌[Wigler et al., Cell 11:223, 1977]), 세포 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라아제(HPRT) 유전자, 세포 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(APRT) 유전자, 및 박테리아 시토신 데아미나아제(문헌[Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)])가 포함된다.
일부 구현예에서, 형질도입된 세포, 예를 들어 면역 이펙터 세포, 예컨대 T세포는, 시험관내에서 음성 선별 표현형 세포의 선별을 가능하게 하는 양성 마커를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 양성 선별 마커는, 표적세포에의 도입 시, 유전자를 운반하는 세포의 양성 선별을 가능하게 하는 우성 표현형을 발현하는 유전자일 수 있다. 이러한 유형의 유전자에는, 특히 히그로마이신(hygromycin) B에 대한 내성을 부여하는 히그로마이신-B 포스포트랜스퍼라아제 유전자(hph), 항생제 G418에 대한 내성을 코딩하는 Tn5로부터의 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라아제 유전자(neo 또는 aph), 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 유전자, 아데노신 데아미나아제 유전자(ADA) 및 다약제내성(MDR) 유전자가 포함된다.
일부 구현예에서, 양성 선별 마커 및 음성 선별 요소는, 음성 선별 요소의 손실이 반드시 또한 양성 선별 마커의 손실을 동반하도록 연결된다. 예를 들어, 양성 및 음성 선별 마커는 융합되어, 하나의 손실이 필수적으로 다른 하나의 손실로 이어지도록 할 수 있다. 발현 산물로서 상기 기재된 목적하는 양성 및 음성 선별 특징 둘 모두를 부여하는 폴리펩타이드를 생성하는 융합된 폴리뉴클레오타이드의 예는, 히그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 티미딘 키나아제 융합 유전자(HyTK)이다. 이러한 유전자의 발현은 시험관내 양성 선별에 대한 히그로마이신 B 내성 및 생체내 음성 선별에 대한 간시클로버 감수성을 부여하는 폴리펩타이드를 생성한다. 문헌[Lupton S. D., et al, Mol. and Cell. Biology 1 1:3374-3378, 1991] 참조. 또한, 구현예에서, 키메라 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 융합된 유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터, 특히 시험관내 양성 선별에 대한 히그로마이신 B 내성 및 생체내 음성 선별에 대한 간시클로버 감수성을 부여하는 것들, 예를 들어 상기 Lupton, S. D. 등의 문헌 (1991)에 기재된 HyTK 레트로바이러스 벡터에 존재한다. 또한, 우세한 양성 선별 마커를 음성 선별 마커와 융합하여 유도된 이중기능성 선별 융합 유전자의 사용이 기재된, PCT U591/08442 및 PCT/U594/05601의 공보를 참조한다.
적합한 양성 선별 마커는 hph, nco 및 gpt로 이루어지는 군에서 선택되는 유전자에서 유도될 수 있으며, 적합한 음성 선별 마커는 시토신 데아미나아제, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT 및 gpt로 이루어지는 군에서 선택되는 유전자에서 유도될 수 있다. 다른 적합한 마커는 양성 선별 마커가 hph 또는 neo에서 유도되고, 음성 선별 마커가 시토신 데아미나아제 또는 TK 유전자 또는 선별 마커에서 유도되는 이중기능성 선별 융합 유전자이다.
viii) 렌티바이러스 통합 조절을 위한 전략
레트로바이러스 또는 렌티바이러스 게놈의 표적세포 게놈으로의 통합을 방지하기 위해, 핵심 단백질/서열에 결여되어 있거나 이에서 비활성화된 레트로바이러스 및 렌티바이러스 핵산이 개시된다. 예를 들어, 레트로바이러스 인테그라아제의 고도로 보존된 DDE 모티프로 구성된 아미노산이 결여된 바이러스 핵산(문헌[Engelman and Craigie (1992) J. Virol. 66:6361-6369]; 문헌[Johnson et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7648-7652]; 문헌[Khan et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:851-860])은, 통합 결함 레트로바이러스 핵산의 생산을 가능하게 한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본원의 레트로바이러스 핵산은, 바이러스 게놈의 세포 게놈으로의 통합을 촉진시키는 것을 불가능하게 하는 돌연변이를 포함하는 렌티바이러스 인테그라아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 통합에 직접적으로 영향을 미치는 제1형 돌연변이, 또는 비리온 형태형성 및/또는 역전사에 영향을 미치는 다면발현성 결함을 유발하는 제2형 돌연변이이다. 제1형 돌연변이의 예시적인 비제한적인 예는, 인테그라아제의 촉매 코어 도메인 DX39-58DX35E에 참여하는 3개의 잔기(HIV-1의 인테그라아제의 D64, D116 및 E152 잔기) 중 임의의 것에 영향을 미치는 돌연변이이다. 특정 구현예에서, 상기 인테그라아제가 바이러스 게놈의 세포 게놈으로의 통합을 촉진시킬 수 없게 하는 돌연변이는, 인테그라아제의 촉매 코어 도메인의 DDE 모티프의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 바람직하게는 상기 DEE 모티프의 제1 아스파르트 잔기의 아스파라긴 잔기로의 치환이다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 인테그라아제 단백질을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스는 활성 전사 유닛으로 통합된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 전사 시작 부위, 유전자의 5' 말단 또는 DNAse1 절단 부위 근처에서 통합되지 않는다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 통합은 원종양유전자를 활성화시키거나 종양 억제 유전자를 불활성화시키지 않는다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 유전독성이 아니다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스는 인트론에 통합된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산은 특정 카피 수를 갖는 표적세포의 게놈에 통합된다. 평균 카피 수는 단일 세포, 세포 집단 또는 개별 세포 집락에서 결정될 수 있다. 예시적인 카피 수 결정 방법에는, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 및 유세포분석이 포함된다.
일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 DNA는 게놈에 통합된다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 DNA는 에피솜으로 유지된다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 에피솜 DNA에 통합된 비율은, 적어도 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2, 5, 10, 100이다.
일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 DNA는 선형이다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 DNA는 원형이다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 DNA의 선형 카피 대 원형 카피의 비율은, 적어도 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2, 5, 10, 100이다.
구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 DNA는 1개의 LTR을 갖는 원형이다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 DNA는 2개의 LTR을 갖는 원형이다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 인코딩하는 원형의 1개의 LTR 포함 DNA대 외인성 작용제를 인코딩하는 원형의 2개의 LTR 포함 DNA의 비율은, 적어도 0.1, 0.5, 1.0, 2, 5, 10, 20, 50, 100이다.
ix) 에피솜 바이러스의 유지
통합이 결핍된 레트로바이러스에서, 역전사의 원형 cDNA 부산물(예를 들어, 1-LTR 및 2-LTR)은 숙주 게놈에의 통합 없이 세포 핵에 축적될 수 있다(문헌[Yanez-Munoz R J et al., Nat. Med. 2006, 12: 348-353] 참조). 다른 외인성 DNA와 마찬가지로, 이러한 중간체는 세포 DNA에 동일한 빈도로 통합될 수 있다(예를 들어, 세포당 103개 내지 105개).
일부 구현예에서, 에피솜 레트로바이러스 핵산은 복제되지 않는다. 에피솜 바이러스 DNA는 핵 매트릭스와의 결합을 위해 진핵세포 복제기점 및 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S/MAR)을 포함함으로써 세포의 복제 시 유지되도록 변형될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 레트로바이러스 핵산은 진핵세포 복제기점 또는 이의 변이체를 포함한다. 관심 진핵세포 복제기점의 예는, 문헌[Aladjem et al., Science, 1995, 270: 815-819]에 기재된 바와 같은 β-글로빈 유전자의 복제기점, 문헌[Price et al Journal of Biological Chemistry, 2003, 278 (22): 19649-59]에 기재된 바와 같은 원숭이 CV-1 세포 및 인간 피부 섬유아세포에서 이전에 단리된 알파-위성 서열과 관련된 자가 복제 서열로부터의 공통 서열, McWinney 및 Leffak가 문헌[McWinney C. and Leffak M., Nucleic Acid Research 1990, 18(5): 1233-42]에 기재한 바와 같은 인간 c-myc 프로모터 영역의 복제기점이다. 구현예에서, 변이체는 진핵세포에서 복제를 개시하는 능력을 실질적으로 유지한다. 복제를 개시하는 특정 서열의 능력은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 브로모데옥시우리딘 혼입 및 밀도 이동을 기반으로 한 자가 복제 검정에 의해 평가될 수 있다(상기 Araujo F. D. 등의 문헌; 상기 Frappier L. 등의 문헌).
일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산은 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S/MAR) 또는 이의 변이체, 예를 들어 세포 핵의 단백질 스캐폴드 또는 매트릭스에의 주기적 부착에 의해 진핵세포 게놈의 핵 DNA를 염색질 도메인으로 구성하는 수백 개 염기쌍 길이의 비(非)공통 유사 AT-풍부 DNA 요소를 포함한다. 이는 전형적으로 측면 영역, 염색질 경계 영역 및 인트론과 같은 비(非)코딩 영역에서 발견된다. S/MAR 영역의 예는, 문헌[Bode J. et al., Science, 1992, 255: 195-7]에 기재된 바와 같은 인간 IFN-γ 유전자(hIFN-γlarge)의 1.8 kbp S/MAR, 문헌[Ramezani A. et al., Blood 2003, 101: 4717-24]에 기재된 바와 같은 인간 IFN-γ 유전자(hIFN-γshort)의 S/MAR의 0.7 Kbp 최소 영역, 문헌[Mesner L. D. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100: 3281-86]에 기재된 바와 같은 인간 데히드로폴레이트 리덕타아제 유전자(hDHFR)의 S/MAR의 0.2 Kbp 최소 영역이다. 구현예에서, S/MAR의 기능적으로 동등한 변이체는 함께 또는 단독으로 S/MAR 기능에 기여하는 것으로 제안된 6개의 규칙 세트를 기반으로 선택된 서열이다(문헌[Kramer et al (1996) Genomics 33, 305]; 문헌[Singh et al (1997) Nucl. Acids Res 25, 1419]). 이러한 규칙은 genomecluster.secs.oakland.edu/MAR-Wiz에서 무료로 입수 가능한 MAR-Wiz 컴퓨터 프로그램에 병합되었다. 구현예에서, 변이체는 특히 핵에 특이적으로 매트릭스를 결합하는 능력을 유도하는 S/MAR의 동일한 기능을 실질적으로 유지한다. 당업자는, 예를 들어 상기 Mesner L. D. 등의 문헌에 기재된 시험관내 또는 생체내 MAR 검정에 의해, 특정 변이체가 핵에 특이적으로 매트릭스를 결합할 수 있는 지를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 변이체가 DNA 가닥 분리에 대한 가능성을 나타내는 경우, 특정 서열은 S/MAR의 변이체이다. 이러한 특성은 평형 통계 역학의 방법을 기반으로 한 특정 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 응력 유발 이중체 불안정화(SIDD: stress-induced duplex destabilization) 분석 기법 "[ . . . ]은, 부과된 수준의 초나선 응력이 DNA 서열을 따라 각각의 위치에서 이중체를 개방하는 데 필요한 자유 에너지를 감소시키는 정도를 계산한다. 결과는 문헌[Bode et al (2005) J. Mol. Biol. 358,597]에 정의된 바와 같이 강력한 불안정화 부위가 극소값 [ . . . ]" 으로 나타나는, SIDD 프로파일로 표시된다. SIDD 알고리즘 및 수학적 기반(문헌[Bi and Benham (2004) Bioinformatics 20, 1477]), 및 SIDD 프로파일 분석은 WebSIDD(www.genomecenter.ucdavis.edu/benham)에서 무료로 이용 가능한 인터넷 리소스를 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 S/MAR과 유사한 SIDD 프로파일을 나타내는 경우, S/MAR 서열의 변이체로 간주된다.
B. 세포 유래 푸소좀
푸소좀의 조성물은 배양물 내 세포, 예를 들어 배양된 포유류 세포, 예를 들어 배양된 인간 세포에서 생성될 수 있다. 세포는 전구세포 또는 비(非)전구(예를 들어, 분화된) 세포일 수 있다. 세포는 원시세포 또는 세포주(예를 들어, 포유류, 예를 들어 본원에 기재된 인간 세포주)일 수 있다. 구현예에서, 배양된 세포는 전구세포, 예를 들어 골수간질세포, 골수 유래 성인전구세포(MAPC), 내피 전구세포(EPC), 아세포, 뇌실하 구역에서 형성된 중간 전구세포, 신경줄기세포, 근육줄기세포, 위성세포, 간줄기세포, 조혈줄기세포, 골수간질세포, 표피줄기세포, 배아줄기세포, 중간엽줄기세포, 제대줄기세포, 전구체세포, 근육전구체세포, 근아세포, 심근아세포, 신경전구체세포, 신경교전구체세포, 뉴런전구체세포, 간모세포이다.
일부 구현예에서, 원천세포는 내피세포, 섬유아세포, 혈액세포(예를 들어, 대식세포, 호중구, 과립구, 백혈구), 줄기세포(예를 들어 중간엽줄기세포, 제대줄기세포, 골수줄기세포, 조혈줄기세포, 유도된 다능성줄기세포, 예를 들어 대상의 세포에서 유래된 유도된 다능성줄기세포), 배아줄기세포(예를 들어, 배아난황주머니, 태반, 제대, 태아 피부, 청소년 피부, 혈액, 골수, 지방조직, 적혈구생성조직, 조혈조직 유래 줄기세포), 근아세포, 실질세포(예를 들어, 간세포), 폐포세포, 뉴런(예를 들어, 망막뉴런세포) 전구체세포(예를 들어, 망막전구체세포, 골수아세포, 골수전구체세포, 흉선세포, 감수모세포(meiocyte), 거대핵모세포, 풋거대핵모세포(promegakaryoblast), 멜라노모세포, 림프모세포, 골수전구체세포, 정상모세포 또는 혈관모세포), 전구세포(예를 들어, 심장전구세포, 위성세포, 방사형 신경교세포, 골수간질세포, 췌장전구세포, 내피전구세포, 아세포), 또는 불멸화된 세포(예를 들어, HeLa, HEK293, HFF-1, MRC-5, WI-38, IMR 90, IMR 91, PER.C6, HT-1080 또는 BJ 세포)이다.
배양된 세포는 상피, 결합, 근육 또는 신경 조직 또는 세포, 및 이들의 조합에서 유래될 수 있다. 푸소좀은 임의의 진핵세포(예를 들어, 포유류) 기관계, 예를 들어 심혈관계(심장, 혈관구조); 소화계(식도, 위, 간, 담낭, 췌장, 장, 결장, 직장 및 항문); 내분비계(시상하부, 뇌하수체, 송과체 또는 송과선, 갑상선, 부갑상선, 부신); 배설계(신장, 요관, 방광); 림프계(림프, 림프절, 림프관, 편도선, 아데노이드, 흉선, 비장); 외피계(피부, 모발, 손톱); 근육계(예를 들어, 골격근); 신경계(뇌, 척수, 신경); 생식계(난소, 자궁, 유선, 고환, 정관, 정낭, 전립선); 호흡계(인두, 후두, 기관, 기관지, 폐, 횡격막); 골격계(뼈, 연골), 및 이들의 조합에서 배양된 세포에서 생성될 수 있다. 구현예에서, 상기 세포는 고도로 유사분열하는 조직(예를 들어, 고도로 유사분열하는 건강한 조직, 예컨대 상피, 배아조직, 골수, 창자움(intestinal crypt))에서 유래된다. 구현예에서, 상기 조직 샘플은 고도로 대사성인 조직(예를 들어, 골격조직, 신경조직, 심근세포)이다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 젊은 공여자, 예를 들어 25세, 20세, 18세, 16세, 12세, 10세, 8세, 5세, 1세 또는 그 보다 어린 공여자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 태아조직에서 유래된다.
일부 구현예에서, 상기 세포는 한 대상에서 유도되어, 동일한 대상 또는 유사한 유전자 시그니처를 갖는(예를 들어, MHC 매칭된) 대상에게 투여된다.
특정 구현예에서, 상기 세포는 3000개, 4000개, 5000개, 6000개, 7000개, 8000개, 9000개 또는 10000개 뉴클레오타이드 길이 초과의 평균 크기(예를 들어, 4,000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 길이, 6,000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 길이)를 갖는 텔로미어를 갖는다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 본원에 기재된 푸소좀 조성물의 공급원으로 사용하기에 바람직한 표현형 또는 유전자형을 기반으로 식별, 선택 또는 선별된 세포 클론에서 생성된다. 예를 들어, 세포 클론은 낮은 미토콘드리아 돌연변이 부하, 긴 텔로미어 길이, 분화 상태 또는 특정 유전자 시그니처(예를 들어, 수용체와 매칭되는 유전자 시그니처)를 기반으로 식별, 선택 또는 선별된다.
본원에 기재된 푸소좀 조성물은 하나의 세포 또는 조직 공급원, 또는 공급원들의 조합으로부터의 푸소좀으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 푸소좀 조성물은 이종 공급원(예를 들어, 동물, 상기 언급된 종의 세포 조직 배양), 동종이계, 자가 유래의 푸소좀; 단백질 농도 및 분포가 상이한 특정 조직(간, 골격, 신경, 지방 등) 유래의 푸소좀; 상이한 대사 상태(예를 들어, 당분해, 호흡)의 세포 유래의 푸소좀을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 상이한 대사 상태의, 예를 들어 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 결합되거나 결합되지 않은 푸소좀을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 푸소겐, 예를 들어 본원에 기재된 푸소겐을 발현하는 원천세포에서 생성된다. 일부 구현예에서, 푸소겐은 원천세포의 막, 예를 들어 지질 이중층 막, 예를 들어 세포 표면 막 또는 세포하 막(예를 들어, 리소좀 막)에 배치되어 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 세포 표면 막에 배치된 푸소겐을 갖는 원천세포에서 생성된다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 엑소좀, 미세소포, 막 소포, 세포외 막 소포, 원형질막 소포, 거대 원형질막 소포, 세포자멸체, 미토입자(mitoparticle), 피레노사이트(pyrenocyte), 리소좀 또는 다른 막으로 둘러싸인 소포의 발아(budding)를 유도하는 방식으로 생성된다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 세포 제핵(enucleation)을 유도하는 방식으로 생성된다. 제핵은 유전적 화학적 검정(예를 들어, 악티노마이신 D를 사용하여, 문헌[Bayona-Bafaluyet al., "A chemical enucleation method for the transfer of mitochondrial DNA to ρ° cells" Nucleic Acids Res. 2003 Aug 15; 31(16): e98] 참조), 기계적 방법(예를 들어, 스퀴징(squeezing) 또는 흡인, 문헌[Lee et al., "A comparative study on the efficiency of two enucleation methods in pig somatic cell nuclear transfer: effects of the squeezing and the aspiration methods." Anim Biotechnol. 2008;19(2):71-9] 참조), 또는 이들의 조합을 사용하여 수행될 수 있다. 제핵은 핵의 완전한 제거뿐 아니라, 세포가 핵을 함유하지만, 핵이 기능하지 않도록, 이의 전형적인 위치에서 핵을 이동시키는 것을 나타낸다.
구현예에서, 푸소좀을 제조하는 것은 유령세포, 거대 원형질막 소포 또는 세포자멸체를 생산하는 것을 포함한다. 구현예에서, 푸소좀 조성물은 유령세포, 거대 원형질막 소포 및 세포자멸체 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 세포 단편화를 유도하는 방식으로 생성된다. 일부 구현예에서, 세포 단편화는, 비제한적으로, 화학적 방법, 기계적 방법(예를 들어, 원심분리(예를 들어, 초원심분리 또는 밀도 원심분리), 동결-해동 또는 초음파처리) 또는 이들의 조합을 포함하는 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 하기 방법 중 어느 하나, 전부 또는 이들의 조합에 의해, 푸소겐, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 푸소겐을 발현하는 원천세포에서 생성될 수 있다:
i) 미토입자, 엑소좀 또는 다른 막으로 둘러싸인 소포의 발아를 유도하는 방식;
ii) 하기 방법 a) 내지 c) 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해, 핵 불활성화, 예를 들어 제핵을 유도하는 방식:
a) 유전적 방법;
b) 화학적 방법, 예를 들어 악티노마이신 D를 사용함; 또는
c) 기계적 방법, 예를 들어 스퀴징 또는 흡인; 또는
iii) 예를 들어, 하기 방법 a) 및 b) 중 어느 하나 또는 이들의 조합에 의해, 단편화를 유도하는 방식:
a) 화학적 방법;
b) 기계적 방법, 예를 들어 원심분리(예를 들어, 초원심분리 또는 밀도 원심분리); 동결-해동 또는 초음파처리.
i) 푸소좀 생성 전 세포의 변형
일부 양태에서, 푸소좀 생성 전, 대상, 조직 또는 세포의 변형과 같은 변형이 세포에 대해 이루어진다. 이러한 변형은, 예를 들어 융합, 푸소겐 발현 또는 활성, 카고의 구조 또는 기능, 또는 표적세포의 구조 또는 기능을 개선시키는 데 효과적일 수 있다.
a) 물리적 변형
일부 구현예에서, 세포는 푸소좀 생성 전에 물리적으로 변형된다. 예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 푸소겐은 세포의 표면에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 푸소좀 생성 전에 화학적 작용제로 처리된다. 예를 들어, 세포는, 화학적 또는 지질 푸소겐이 세포의 표면과 비공유결합 또는 공유결합으로 상호작용하거나, 세포의 표면 내 포매되도록, 화학적 또는 지질 푸소겐으로 처리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 세포막에서 지질의 융합 특성을 증강시키는 작용제로 처리된다.
일부 구현예에서, 세포는 기관, 조직 또는 세포 유형에 대한 푸소좀의 표적화를 증강시키는 세포 표면 상의 합성 또는 내인성 소분자 또는 지질에 대한 하나 이상의 공유결합 또는 비공유결합 부착 부위를 갖는 푸소좀 생성 전에, 물리적으로 변형된다.
구현예에서, 푸소좀은 내인성 분자를 증가 또는 감소된 수준으로 포함한다. 예를 들어, 푸소좀은 자연 발생 원천세포에서도 자연적으로 발생하지만, 푸소좀에서 더 높거나 더 낮은 수준으로 발생하는 내인성 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 원천세포 또는 푸소좀의 외인성 핵산에서 발현된다. 일부 구현예에서, 폴리펩타이드는 공급원에서 단리되어, 원천세포 또는 푸소좀에 로딩되거나 접합된다.
일부 구현예에서, 세포는 세포 내 내인성 푸소겐(예를 들어, 일부 구현예에서, 원천세포에 대해 내인성이고, 일부 구현예에서, 표적세포에 대해 내인성임)의 발현 또는 활성을 증가시키기 위해, 푸소좀 생성 전에, 화학적 작용제, 예를 들어 소분자로 처리된다. 일부 구현예에서, 소분자는 내인성 푸소겐의 전사 활성화제의 발현 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 소분자는 내인성 푸소겐의 전사 억제제의 발현 또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 소분자는 내인성 푸소겐의 발현을 증가시키는 후성적 변형제이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 융합 정지 화합물, 예를 들어 리소포스파티딜콜린으로 처리된 세포에서 생성된다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 푸소겐을 절단하지 않는 해리 시약, 예를 들어 아큐타아제(Accutase)로 처리된 세포에서 생성된다.
일부 구현예에서, 원천세포는, 푸소겐의 농도를 추가하거나 증가시키기 위해, 푸소좀 생성 전에, 예를 들어 CRISPR 활성화제로 물리적으로 변형된다.
일부 구현예에서, 세포는 세포소기관, 예를 들어 미토콘드리아, 골지체, 소포체, 세포내 소포(예컨대, 리소좀, 자가포식소체)의 양을 감소 또는 증가시키거나, 이의 구조 또는 기능을 증강시키기 위해 물리적으로 변형된다.
b) 유전적 변형
일부 구현예에서, 세포는 세포 내 내인성 푸소겐(예를 들어, 일부 구현예에서, 원천세포에 대해 내인성이고, 일부 구현예에서, 표적세포에 대해 내인성임)의 발현을 증가시키기 위해, 푸소좀 생성 전에, 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 유전적 변형은 내인성 푸소겐의 전사 활성화제의 발현 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 유전적 변형은 내인성 푸소겐의 전사 억제제의 발현 또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화제 또는 억제제는 가이드 RNA에 의해 내인성 푸소겐에 표적화된 전사 활성화제 또는 억제제에 연결된 뉴클레아제-불활성 cas9(dCas9)이다. 일부 구현예에서, 유전적 변형은 내인성 푸소겐 유전자를 후성적으로 변형시켜, 이의 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 후성적 활성화제는 가이드 RNA에 의해 내인성 푸소겐에 표적화된 후성적 변형제에 연결된 뉴클레아제-불활성 cas9(dCas9)이다.
일부 구현예에서, 세포는 세포 내 외인성 푸소겐의 발현, 예를 들어 전이유전자의 전달을 증가시키기 위해, 푸소좀 생성 전에, 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 DNA, mRNA 또는 siRNA는, 예를 들어 기관, 조직 또는 세포 표적화에 사용되는 세포 표면 분자(단백질, 글리칸, 지질 또는 저분자량 분자)의 발현을 증가시키거나 감소시키기 위해, 푸소좀 생성 전에, 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산은 푸소겐의 억제제, 예를 들어 shRNA, siRNA 구조체를 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 핵산은 푸소겐 억제제의 저해제를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 푸소겐을 인코딩하는 원천세포에 대해 외인성인 핵산을 원천세포에 도입하는 것을 포함한다. 외인성 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 핵산은, 예를 들어 DNA, gDNA, cDNA, RNA, pre-mRNA, mRNA, miRNA, siRNA 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 DNA는 선형 DNA, 원형 DNA 또는 인공 염색체일 수 있다. 일부 구현예에서, DNA는 에피솜으로 유지된다. 일부 구현예에서, DNA는 게놈에 통합된다. 외인성 RNA는 화학적으로 변형된 RNA일 수 있으며, 예를 들어 하나 이상의 백본 변형, 당 변형, 비정규 염기 또는 캡을 포함할 수 있다. 백본 변형에는, 예를 들어 포스포로티오에이트, N3' 포스포르아미다이트, 보라노포스페이트, 포스포노아세테이트, 티오-PACE, 모르폴리노 포스포르아미다이트 또는 PNA가 포함된다. 당 변형에는, 예를 들어 2'-O-Me, 2'F, 2'F-ANA, LNA, UNA 및 2'-O-MOE가 포함된다. 비정규 염기에는, 예를 들어 5-브로모-U 및 5-요오도-U, 2,6-디아미노퓨린, C-5 프로피닐 피리미딘, 디플루오로톨루엔, 디플루오로벤젠, 디클로로벤젠, 2-티오우리딘, 슈도우리딘 및 디히드로우리딘이 포함된다. 캡에는, 예를 들어 ARCA가 포함된다. 추가의 변형은, 예를 들어 문헌 [Deleavey et al., "Designing Chemically Modified Oligonucleotides for Targeted Gene Silencing" Chemistry & Biology Volume 19, Issue 8, 24 August 2012, Pages 937-954]에 논의되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 세포는 세포 내 원천세포에 대해 외인성인 푸소겐의 발현 또는 활성을 증가시키기 위해, 푸소좀 생성 전에, 화학적 작용제, 예를 들어 소분자로 처리된다. 일부 구현예에서, 소분자는 외인성 푸소겐의 전사 활성화제의 발현 또는 활성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 소분자는 외인성 푸소겐의 전사 억제제의 발현 또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 소분자는 외인성 푸소겐의 발현을 증가시키는 후성적 변형제이다.
일부 구현예에서, 핵산은 변형된 푸소겐을 인코딩한다. 예를 들어, 조절 가능한 융합 활성, 예를 들어 특정 세포 유형, 조직 유형 또는 국소 미세환경 활성을 갖는 푸소겐. 이러한 조절 가능한 융합 활성은, 낮은 pH, 높은 pH, 가열, 적외선, 세포외 효소 활성(진핵 또는 원핵), 또는 소분자, 단백질 또는 지질의 노출에 의한 융합 활성의 활성화 및/또는 개시를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소분자, 단백질 또는 지질은 표적세포 상에 디스플레이된다.
일부 구현예에서, 세포는 신호전달 경로(예를 들어, Wnt/베타-카테닌 경로)의 발현을 변경(즉, 상향조절 또는 하향조절)하기 위해, 푸소좀 생성 전에, 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 세포는 관심 유전자 또는 유전자들의 발현을 변경(즉, 상향조절 또는 하향조절)하기 위해, 푸소좀 생성 전에, 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 세포는 관심 핵산(예를 들어, miRNA 또는 mRNA) 또는 핵산들의 발현을 변경(즉, 상향조절 또는 하향조절)하기 위해, 푸소좀 생성 전에, 유전적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어, DNA, mRNA 또는 siRNA는, 예를 들어 신호전달 경로, 유전자 또는 핵산의 발현을 증가시키거나 감소시키기 위해, 푸소좀 생성 전에, 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 핵산은 신호전달 경로, 유전자 또는 핵산의 억제제를 표적으로 하거나, 신호전달 경로, 유전자 또는 핵산을 억제한다. 일부 구현예에서, 핵산은 신호전달 경로, 유전자 또는 핵산을 상향조절하거나 하향조절하는 전사 인자를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 활성화제 또는 억제제는 가이드 RNA에 의해 신호전달 경로, 유전자 또는 핵산에 표적화된 전사 활성화제 또는 억제제에 연결된 뉴클레아제-불활성 cas9(dCas9)이다. 일부 구현예에서, 유전적 변형은 내인성 신호전달 경로, 유전자 또는 핵산을 이의 발현으로 후성적으로 변형시킨다. 일부 구현예에서, 후성적 활성화제는 가이드 RNA에 의해 신호전달 경로, 유전자 또는 핵산에 표적화된 후성적 변형제에 연결된 뉴클레아제-불활성 cas9(dCas9)이다. 일부 구현예에서, 세포의 DNA는 신호전달 경로(예를 들어, Wnt/베타-카테닌 경로), 유전자 또는 핵산의 발현을 변경(즉, 상향조절 또는 하향조절)하기 위해, 푸소좀 생성 전에, 편집된다. 일부 구현예에서, DNA는 가이드 RNA 및 CRISPR-Cas9/Cpf1, 또는 다른 유전자 편집 기술을 사용하여 편집된다.
세포는 재조합 방법을 사용하여 유전적으로 변형될 수 있다. 목적하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열은, 예를 들어 유전자를 발현하는 세포의 라이브러리를 스크리닝하는 방식, 유전자를 포함하는 것으로 알려진 벡터에서 유전자를 유도하는 방식, 또는 표준 기술을 사용하여 세포 및 세포를 함유하는 조직에서 직접 단리하는 방식과 같은 재조합 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 클로닝이 아닌 합성으로 생산될 수 있다.
천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 관심 유전자를 인코딩하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고, 구조체를 발현 벡터에 혼입하는 방식으로 달성된다. 벡터는 진핵생물의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 목적하는 핵산 서열의 발현에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 발현 영역, 예를 들어 유전자로 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 외인성 유전자(예를 들어, RNA 또는 폴리펩타이드 산물과 같은 외인성 유전자 산물을 발현할 수 있음) 및/또는 외인성 조절 핵산으로 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 표적세포에 대해 내인성인 유전자 산물을 인코딩하는 외인성 서열 및/또는 내인성 유전자의 발현을 조절할 수 있는 외인성 조절 핵산으로 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 외인성 유전자 및/또는 외인성 유전자의 발현을 조절하는 조절 핵산으로 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 외인성 유전자 및/또는 내인성 유전자의 발현을 조절하는 조절 핵산으로 유전적으로 변형될 수 있다. 당업자는, 본원에 기재된 세포가 단백질 또는 조절 분자를 인코딩하는 다양한 외인성 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있으며, 예를 들어 표적세포의 내인성 또는 외인성 게놈의 유전자 산물에 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 유전자는 푸소좀에 특징을 부여하며, 예를 들어 표적세포와의 융합을 조절한다. 일부 구현예에서, 세포는 내인성 유전자 및/또는 조절 핵산을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 내인성 유전자 또는 조절 핵산은 다른 내인성 유전자의 발현을 조절한다. 일부 구현예에서, 세포는 다른 염색체 상의 내인성 유전자 및/또는 조절 핵산의 버전과 상이하게(예를 들어, 유도성으로, 조직 특이적으로, 구성적으로, 또는 더 높거나 더 낮은 수준으로) 발현되는 내인성 유전자 및/또는 조절 핵산을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 시작 부위의 30 bp 내지 110 bp 업스트림 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터가 최근 시작 부위의 다운스트림에 기능성 요소를 함유하는 것으로 제시되었다. 프로모터 요소 사이의 간격은 종종 유연하여, 요소들이 서로에 대해 반전되거나 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나아제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp 간격으로 늘어날 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 협력적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화할 수 있는 것으로 보인다.
적합한 프로모터의 일례는, 극초기 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 이에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 높은 수준으로 유도할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 신장 성장인자-1α(Elongation Growth Factor, EF-1α)이다. 하지만, 비제한적으로, 원숭이바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스유선종양바이러스(MMTV), 인간면역결핍바이러스(HIV) 긴말단반복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류백혈병바이러스 프로모터, 엡스타인-바(Epstein-Barr virus)바이러스 극초기 프로모터, 라우스육종바이러스 프로모터뿐 아니라, 비제한적으로, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나아제 프로모터와 같은 인간 유전자 프로모터를 포함하는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다.
나아가, 본 발명이 구성적 프로모터의 사용으로 제한되어서는 안 된다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 바람직한 경우 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 개시할 수 있고, 발현이 바람직하지 않은 경우 발현을 중단시킬 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예에는, 비제한적으로, 조직 특이적 프로모터, 메탈로티오닌프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라시클린 프로모터가 포함된다. 일부 구현예에서, 푸소겐의 발현은 푸소좀이 생성되기 전, 예를 들어 푸소좀이 생성되기 3시간, 6시간, 9시간, 12시간, 24시간, 26시간, 48시간, 60시간 또는 72시간 전에 상향조절된다.
공급원에 도입되는 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 트랜스펙션 또는 감염시키고자 하는 세포의 집단에서 발현 세포의 식별 및 선별을 용이하게 하기 위해, 선별 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자, 또는 둘 모두를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 선별 가능한 마커는 별개의 DNA 조각 상에 운반되어, 동시 트랜스펙션 절차에 사용될 수 있다. 선별 가능한 마커와 리포터 유전자에는 모두 숙주세포에서 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열이 측면에 위치할 수 있다. 유용한 선별 가능한 마커에는, 예를 들어 네오 등과 같은 항생제 내성 유전자가 포함된다.
리포터 유전자는 잠재적으로 트랜스펙션된 세포를 식별하고, 조절 서열의 기능성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용체 공급원에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않으며, 일부 용이하게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소 활성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용세포에 도입되고 적절한 시간 후에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라아제, 베타-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제, 분비된 알칼리성 포스파타아제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 널리 공지되어 있으며, 공지된 기술을 사용하여 제조하거나 상업적으로 입수할 수 있다. 일반적으로, 가장 높은 수준의 리포터 유전자 발현을 나타내는 최소 5' 측면 영역을 갖는 구조체가 프로모터로 식별된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되어, 프로모터 구동 전사를 조절하는 능력에 대해 작용제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 단백질의 발현을 변경시키기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 하나 이상의 단백질의 발현은 특정 시간, 예를 들어 공급원의 발달 또는 분화 상태 동안 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 융합 활성, 구조 또는 기능에 영향을 미치는 하나 이상의 단백질, 예를 들어 푸소겐 단백질 또는 비푸소겐 단백질의 발현을 변경시키기 위해, 유전적으로 변형된 세포의 공급원에서 생성된다. 하나 이상의 단백질의 발현은 특정 위치(들)로 제한되거나, 공급원 전체에 널리 퍼져있을 수 있다.
일부 구현예에서, 푸소겐 단백질의 발현은 변형된다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 푸소겐 단백질의 발현이 변형된, 예를 들어 푸소겐의 발현이 적어도 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%(또는 그 이상) 증가 또는 감소된 세포에서 생성된다.
일부 구현예에서, 세포는 푸소겐 단백질을 표적으로 하는 시토졸 효소(예를 들어, 프로테아제, 포스파타아제, 키나아제, 데메틸라아제, 메틸트랜스퍼라아제, 아세틸라아제)를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 시토졸 효소는 번역 후 변형을 변경시키는 방식으로 하나 이상의 푸소겐에 영향을 미친다. 단백질의 번역 후 단백질 변형은 영양소 이용성 및 산화환원 조건에 대한 반응성, 및 단백질-단백질 상호작용에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 번역 후 변형이 변경된, 예를 들어 번역 후 변형이 적어도 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%(또는 그 이상) 증가 또는 감소된 푸소겐을 포함한다.
세포에 변형을 도입하는 방법에는, 물리적, 생물학적 및 화학적 방법이 포함된다. 예를 들어, 문헌[Geng. & Lu, Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab on a Chip. 13(19):3803-21. 2013]; 문헌[Sharei, A. et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. PNAS vol. 110 no. 6. 2013]; 문헌[Yin, H. et al., Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15: 541-555. 2014] 참조. 본원에 기재된 푸소좀의 생성에 사용하기 위한 세포를 변형시키는 적합한 방법에는, 예를 들어 확산, 삼투압, 삼투 펄싱, 삼투 충격, 저장성 용해, 저장성 투석, 이온영동, 전기천공, 초음파처리, 미세주입, 칼슘 침전, 막 삽입, 지질 매개 트랜스펙션, 세제 처리, 바이러스 감염, 수용체 매개 세포내이입, 단백질 형질도입 도메인의 사용, 입자 발사, 막 융합, 동결-해동, 기계적 파괴 및 여과가 포함된다.
유전적 변형의 존재를 확인하는 방법에는 다양한 검정이 포함된다. 이러한 검정에는, 예를 들어 서던(Southern) 및 노던(Northern) 블롯팅, RT-PCR 및 PCR과 같은 분자생물학적 검정; 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯) 또는 본원에 기재된 검정에 의한 특정 펩타이드의 존재 또는 부재의 검출과 같은 생화학적 검정이 포함된다.
본 개시내용은, 일부 양태에서, 푸소좀으로서, (a) 지질 이중층, (b) 지질 이중층으로 둘러싸인 내강(예를 들어, 시토졸을 포함함); 및 (c) 외인성 또는 과발현된 푸소겐(예를 들어, 여기서 푸소겐은 지질 이중층에 배치되어 있음)을 포함하며, 원천세포에서 유도된 것이고, 부분적 또는 완전한 핵 불활성화(예를 들어, 핵 제거)를 갖는 푸소좀을 제공한다.
본 개시내용은, 일부 양태에서, 원천세포에서 유도된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물로서, 여기서 복수의 푸소좀은, (a) 지질 이중층; (b) 시토졸을 포함하는 내강(여기서 내강은 지질 이중층으로 둘러싸여 있음); (c) 지질 이중층에 배치된 외인성 또는 과발현된 푸소겐; 및 (d) 핵산, 예를 들어 페이로드 유전자를 포함하는 핵산을 포함하며; 푸소좀은 핵을 포함하지 않고; 푸소좀 조성물 내 바이러스 캡시드 단백질의 양은 총 단백질의 1% 미만이며, 여기서 (i) 복수의 푸소좀이 표적세포와 비표적세포를 포함하는 세포 집단과 접촉하는 경우, 카고는 비표적세포 또는 참조세포보다 적어도 10배 더 많이 표적세포에 존재하거나, (ii) 복수의 푸소좀은 비표적세포 또는 참조세포보다 표적세포와 적어도 50% 더 높은 비율로 융합하고; 여기서 표적세포는 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포에서 선택되는, 푸소좀 조성물을 제공한다.
본 개시내용은, 일부 양태에서, 원천세포에서 유도된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물로서, 여기서 복수의 푸소좀은, (a) 지질 이중층; (b) 시토졸을 포함하는 내강(여기서 내강은 지질 이중층으로 둘러싸여 있음); (c) 지질 이중층에 배치된 외인성 또는 과발현된 푸소겐; 및 (d) 표 5 또는 표 6의 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자를 포함하는 핵산을 포함하며, 여기서 푸소좀은 핵을 포함하지 않고; 푸소좀 조성물 내 바이러스 캡시드 단백질의 양은 총 단백질의 1% 미만인, 푸소좀 조성물을 제공한다.
본 개시내용은, 일부 양태에서, 원천세포에서 유도된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물로서, 여기서 복수의 푸소좀은, (a) 지질 이중층; (b) 시토졸을 포함하는 내강(여기서 내강은 지질 이중층으로 둘러싸여 있음); (c) 지질 이중층에 배치된 외인성 또는 과발현된 푸소겐; 및 (d) 페이로드 유전자를 포함하는 핵산(여기서 핵산은 페이로드 유전자에 작동 가능하게 연결된 NTCSRE를 포함하고, 여기서 NTCSRE는 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열, 예를 들어 표적세포보다 높은 수준으로 비표적세포에 존재하는 miRNA에 의해 결합된 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열, 예를 들어 표 4의 miRNA에 의해 결합된 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열을 포함하며, 여기서 표적세포는 첫 번째 유형의 CNS세포이고, 선택적으로 여기서 비표적세포는 두 번째 상이한 유형의 CNS세포 또는 비CNS세포임)을 포함하며; 여기서 푸소좀은 핵을 포함하지 않고; 푸소좀 조성물 내 바이러스 캡시드 단백질의 양은 총 단백질의 1% 미만인, 푸소좀 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, miRNA는 표적세포(예를 들어, CNS세포)에 존재하는 miRNA의 수준보다 적어도 10배, 100배, 1,000배 또는 10,000배 더 높은 수준으로 비표적세포(예를 들어, 본원에 기재된 비표적세포)에 존재한다. 일부 구현예에서, miRNA는 표적세포(예를 들어, CNS세포, 예를 들어 본원에 기재된 CNS세포)에 검출 가능하게 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, miRNA는 표적세포(예를 들어, CNS세포, 예를 들어 본원에 기재된 CNS세포)에 존재하지 않는다.
본 개시내용은, 일부 양태에서, 원천세포에서 유도된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물로서, 여기서 복수의 푸소좀은, (a) 지질 이중층; (b) 시토졸을 포함하는 내강(여기서 내강은 지질 이중층으로 둘러싸여 있음); (c) 지질 이중층에 배치된 외인성 또는 과발현된 푸소겐; 및 (d) 페이로드 유전자를 포함하는 핵산(여기서 핵산은 페이로드 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하고, 여기서 프로모터는 CNS세포 특이적 프로모터, 예를 들어 CNS세포, 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포에 특이적인 프로모터임)을 포함하며, 여기서 푸소좀은 핵을 포함하지 않고; 푸소좀 조성물 내 바이러스 캡시드 단백질의 양은 총 단백질의 1% 미만인, 푸소좀 조성물을 제공한다.
본 개시내용은, 일부 양태에서, 원천세포에서 유도된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물로서, 여기서 복수의 푸소좀은, (a) 지질 이중층; (b) 시토졸을 포함하는 내강(여기서 내강은 지질 이중층으로 둘러싸여 있음); (c) 지질 이중층에 배치된 외인성 또는 과발현된 푸소겐; 및 (d) 페이로드 유전자를 포함하는 핵산(여기서 핵산은 표 3의 프로모터 서열, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 프로모터를 포함함)을 포함하며, 여기서 푸소좀은 핵을 포함하지 않고; 푸소좀 조성물 내 바이러스 캡시드 단백질의 양은 총 단백질의 1% 미만인, 푸소좀 조성물을 제공한다.
본 개시내용은, 일부 양태에서, 원천세포에서 유도된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물로서, 여기서 복수의 푸소좀은, (a) 지질 이중층; (b) 시토졸을 포함하는 내강(여기서 내강은 지질 이중층으로 둘러싸여 있음); (c) 지질 이중층에 배치된 외인성 또는 과발현된 푸소겐; 및 (d) 핵산으로서, (i) 페이로드 유전자; (ii) 페이로드 유전자에 작동 가능하게 연결된 NTCSRE(예를 들어, 여기서 NTCSRE는 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열, 예를 들어 표 4의 miRNA에 의해 결합된 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열을 포함함); 및
(iii) 선택적으로, 양성 표적세포 특이적 조절 요소, 예를 들어 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 양성 표적세포 특이적 조절 요소(예를 들어, 표적세포 특이적 프로모터)(여기서 양성 표적세포 특이적 조절 요소는 양성 표적세포 특이적 조절 요소가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 표적세포에서 페이로드 유전자의 발현을 증가시키며, 여기서 표적세포는 첫 번째 유형의 CNS세포이고, 선택적으로 여기서 비표적세포는 두 번째 상이한 유형의 CNS세포 또는 비CNS세포이며, 선택적으로 여기서 표적세포는 뉴런이고, 비표적세포는 아교세포(예를 들어, 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포)이거나, 표적세포는 아교세포(예를 들어, 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포)이고, 비표적세포는 뉴런임)를 포함하는 핵산을 포함하며; 여기서 푸소좀은 핵을 포함하지 않고; 푸소좀 조성물 내 바이러스 캡시드 단백질의 양은 총 단백질의 1% 미만인, 푸소좀 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 다음 중 하나 이상이 존재한다: i) 푸소좀은 세포생물제제를 포함하거나 이로 구성됨; ii) 푸소좀은 제핵된 세포를 포함함; iii) 푸소좀은 불활성화된 핵을 포함함; iv) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 42의 검정에 따라 측정 시, 비표적세포보다 표적세포와 더 높은 비율로, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 더 높은 비율로 융합함; v) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 42의 검정에 따라 측정 시, 다른 푸소좀보다 표적세포와 더 높은 비율로, 예를 들어 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 더 높은 비율로 융합함; vi) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 42의 검정에 따라 측정 시, 푸소좀 내 작용제가 24시간, 48시간 또는 72시간 후 표적세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%에 전달되도록 하는 비율로 표적세포와 융합함; vii) 푸소겐은, 예를 들어 실시예 26의 검정에 따라 측정 시, 최소 또는 최대 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 카피 수로 존재함; viii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 88의 검정에 따라 측정 시, 최소 또는 최대 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 카피 수로 치료제를 포함함; ix) 푸소겐의 카피 수 대 치료제의 카피 수의 비는, 1,000,000:1 내지 100,000:1, 100,000:1 내지 10,000:1, 10,000:1 내지 1,000:1, 1,000:1 내지 100:1, 100:1 내지 50:1, 50:1 내지 20:1, 20:1 내지 10:1, 10:1 내지 5:1, 5:1 내지 2:1, 2:1 내지 1:1, 1:1 내지 1:2, 1:2 내지 1:5, 1:5 내지 1:10, 1:10 내지 1:20, 1:20 내지 1:50, 1:50 내지 1:100, 1:100 내지 1:1,000, 1:1,000 내지 1:10,000, 1:10,000 내지 1:100,000 또는1:100,000 내지 1:1,000,000임; x) 푸소좀은 원천세포와 실질적으로 유사한 지질 조성을 포함하거나, 여기서 CL, Cer, DAG, HexCer, LPA, LPC, LPE, LPG, LPI, LPS, PA, PC, PE, PG, PI, PS, CE, SM 및 TAG 중 하나 이상은 원천세포에서 상응하는 지질 수준의 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 이내임; xi) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 87의 검정을 사용하여 측정 시, 원천세포와 유사한 프로테오믹 조성을 포함함; xii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 40의 검정을 사용하여 측정 시, 지질 대 단백질의 비를 원천세포에서 상응하는 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내로 포함함; xiii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 41의 검정을 사용하여 측정 시, 단백질 대 핵산(예를 들어, DNA)의 비를 원천세포에서 상응하는 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내로 포함함; xiv) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 91의 검정을 사용하여 측정 시, 지질 대 핵산(예를 들어, DNA)의 비를 원천세포에서 상응하는 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내로 포함함; xv) 푸소좀 조성물은, 예를 들어 실시예 60의 검정에 따라 측정 시, 대상, 예를 들어 마우스에서의 반감기를, 참조세포 조성물, 예를 들어 원천세포의 반감기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이내로 가짐; xvi) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 50의 검정을 사용하여 측정 시, 음성 대조군, 예를 들어 글루코오스 부재 하의 다른 유사한 푸소좀보다, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(예를 들어, 약 11.6%) 더 많이 막을 가로질러 글루코오스(예를 들어, 표지된 글루코오스, 예를 들어 2-NBDG)를 수송함; xvii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 51의 검정을 사용하여 측정 시, 내강에서의 에스테라아제 활성을, 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 마우스 배아 섬유아세포에서의 에스테라아제 활성의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이내로 포함함; xviii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 53에 기재된 바와 같이 측정 시, 대사 활성 수준을, 참조세포, 예를 들어 원천세포에서의 시트레이트 합성효소 활성 수준의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이내로 포함함; xix) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 54에 기재된 바와 같이 측정 시, 호흡 수준(예를 들어, 산소 소비율)을, 참조세포, 예를 들어 원천세포에서의 호흡 수준의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이내로 포함함; xx) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 55의 검정을 사용하여 측정 시, 최대 18,000 MFI, 17,000 MFI, 16,000 MFI, 15,000 MFI, 14,000 MFI, 13,000 MFI, 12,000 MFI, 11,000 MFI 또는 10,000 MFI의 아넥신-V 염색 수준을 포함하거나, 푸소좀은 실시예 55의 검정에서 메나디온으로 처리된 다른 유사한 푸소좀의 아넥신-V 염색 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 더 낮은 아넥신-V 염색 수준을 포함하거나, 또는 푸소좀은 실시예 55의 검정에서 메나디온으로 처리된 대식세포의 아넥신-V 염색 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 더 낮은 아넥신-V 염색 수준을 포함함; xxi) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 33의 검정에 따라 측정 시, miRNA 함량 수준을, 원천세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상으로 가짐; xxii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 38의 검정에 따라 측정 시, 가용성:불용성 단백질 비를, 원천세포의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상) 이내, 예를 들어 원천세포의 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80% 또는 80% 내지 90% 이내로 가짐; xxiii) 푸소좀은, 예를 들어 질량분석법, 예를 들어 실시예 39의 검정에 따라 측정 시, LPS 수준을, 원천세포의 LPS 함량의 5%, 1%, 0.5%, 0.01%, 0.005%, 0.0001%, 0.00001%(또는 그 이하) 미만으로 가짐; xxiv) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 49의 검정을 사용하여 측정 시, 신호 전달, 예를 들어 세포외 신호, 예를 들어 인슐린에 대한 반응으로 AKT 인산화, 또는 인슐린에 대한 반응으로 글루코오스(예를 들어, 표지된 글루코오스, 예를 들어 2-NBDG) 흡수를, 음성 대조군, 예를 들어 인슐린 부재 하의 다른 유사한 푸소좀보다, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 더 전달할 수 있음; xxv) 푸소좀은 조직, 예를 들어 간, 폐, 심장, 비장, 췌장, 위장관, 신장, 고환, 난소, 뇌, 생식기관, 중추신경계, 말초신경계, 골격근, 내피, 내이 또는 눈을 표적으로 하고, 대상, 예를 들어 마우스에게 투여될 때, 예를 들어 실시예 64의 검정에 따라 측정 시, 예를 들어 투여된 푸소좀 집단 내 푸소좀의 적어도 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 24시간, 48시간 또는 72시간 후 표적조직에 존재함; xxvi) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 56의 검정에 따라 측정 시, 적스타크린 신호전달 수준을, 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 골수간질세포(BMSC)에 의해 유도된 적스타크린 신호전달의 수준보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 큰 수준으로 가짐; xxvii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 57의 검정에 따라 측정 시, 파라크린 신호전달 수준을, 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 대식세포에 의해 유도된 파라크린 신호전달의 수준보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 더 큰 수준으로 가짐; xxviii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 58의 검정에 따라 측정 시, 액틴을, 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 C2C12 세포에서 중합된 액틴의 수준과 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이내의 수준으로 중합함; xxix) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 59의 검정에 따라 측정 시, 막 전위를 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 C2C12세포의 막 전위의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이내로 갖거나, 푸소좀의 막전위는 약 -20 mV 내지 -150 mV, -20 mV 내지 -50 mV, -50 mV 내지 -100 mV, 또는 -100 mV 내지 -150 mV임; xxx) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 44의 검정을 사용하여 측정 시, 예를 들어 원천세포의 혈관외유출 비율의 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 비율로 혈관으로부터의 혈관외유출이 가능하고, 예를 들어 여기서 원천세포는 호중구, 림프구, B세포, 대식세포 또는 NK세포임; xxxi) 푸소좀은 세포막, 예를 들어 내피세포막 또는 혈액뇌장벽을 가로지를 수 있음; xxxii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 48의 검정을 사용하여 측정 시, 단백질을, 예를 들어 참조세포, 예를 들어 마우스 배아 섬유아세포보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 큰 비율로 분비할 수 있음; xxxiii) 푸소좀은 제약 또는 우수제조관리기준(GMP) 표준을 충족시킴; xxxiv) 푸소좀은 우수제조관리기준(GMP)에 따라 제조되었음; xxxv) 푸소좀은 병원체를 선결된 참조 수준 미만으로 가지며, 예를 들어 푸소좀에는 병원체가 실질적으로 없음; xxxiv) 푸소좀은 오염물을 선결된 참조 수준 미만으로 가지며, 예를 들어 푸소좀에는 오염물이 실질적으로 없음; xxxvii) 푸소좀은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 낮은 면역원성을 가짐; xxxviii) 원천세포는 호중구, 과립구, 중간엽줄기세포, 골수줄기세포, 유도된 다능성줄기세포, 배아줄기세포, 골수아세포, 근아세포, 간세포 또는 뉴런, 예를 들어 망막신경세포에서 선택됨; 또는 xxxix) 원천세포는 293세포, HEK세포, 인간 내피세포 또는 인간 상피세포, 단핵구, 대식세포, 수지상세포 또는 줄기세포 이외의 것임.
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, 푸소좀으로서, a) 지질 이중층, 및 수용액, 예를 들어 물과 혼화 가능한 내강(여기서 푸소좀은 원천세포에서 유도된 것임), b) 지질 이중층에 배치된 외인성 또는 과발현된 푸소겐, 및 c) 내강에 배치된 세포소기관, 예를 들어 치료적으로 유효한 수의 세포소기관을 포함하는 푸소좀을 제공한다.
일부 구현예에서, 다음 중 하나 이상이 존재한다: i) 원천세포는 내피세포, 대식세포, 호중구, 과립구, 백혈구, 줄기세포(예를 들어, 중간엽줄기세포, 골수줄기세포, 유도된 다능성줄기세포, 배아줄기세포), 골수아세포, 근아세포, 간세포 또는 뉴런, 예를 들어 망막신경세포에서 선택됨; ii) 세포소기관은 골지체, 리소좀, 소포체, 미토콘드리아, 액포, 엔도좀, 첨단체(acrosome), 자가포식체, 중심체, 글리코좀, 글리옥시좀, 히드로게노좀(hydrogenosome), 멜라노좀, 미토좀, 자포(cnidocyst), 퍼옥시좀, 프로테아좀, 소포 및 스트레스 과립에서 선택됨; iii) 푸소좀은 5 um, 10 um, 20 um, 50 um 또는 100 um 초과의 크기를 가짐; iv) 푸소좀, 또는 복수의 푸소좀을 포함하는 조성물 또는 제제는, 예를 들어 실시예 30의 검정에 따라 측정 시, 1.08 g/ml 내지 1.12 g/ml 이외의 밀도를 갖고, 예를 들어 푸소좀은 1.25 g/ml +/- 0.05의 밀도를 가짐; v) 푸소좀은 순환 중인 스캐빈저 시스템 또는 간의 부비강 내 쿠퍼세포에 의해 포획되지 않음; vi) 원천세포는 293세포 이외의 것임; vii) 원천세포는 형질전환되거나 불멸화되지 않음; viii) 원천세포는 아데노바이러스 매개 불멸화 이외의 방법을 사용하여 형질전환되거나 불멸화되며, 예를 들어 자발적 돌연변이 또는 텔로머라아제 발현에 의해 불멸화됨; ix) 푸소겐은 VSVG, SNARE 단백질 또는 분비 과립 단백질 이외의 것임; x) 푸소좀은 Cre 또는 GFP, 예를 들어 EGFP를 포함하지 않음; xi) 푸소좀은 Cre 또는 GFP, 예를 들어 EGFP 이외의 외인성 단백질을 추가로 포함함; xii) 푸소좀은, 예를 들어 내강에 외인성 핵산(예를 들어, RNA, 예를 들어 mRNA, miRNA 또는 siRNA) 또는 외인성 단백질(예를 들어, 항체, 예를 들어 항체)을 추가로 포함함; 또는 xiii) 푸소좀은 미토콘드리아를 포함하지 않음.
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, 푸소좀으로서, (a) 지질 이중층, (b) 지질 이중층으로 둘러싸인 내강(예를 들어, 시토졸을 포함함), (c) 외인성 또는 과발현된 푸소겐(예를 들어, 여기서 푸소겐은 지질 이중층에 배치되어 있음), 및 (d) 기능성 핵을 포함하며, 원천세포에서 유도된 것인, 푸소좀을 제공한다.
일부 구현예에서, 다음 중 하나 이상이 존재한다: i) 원천세포는 수지상세포 또는 종양세포 이외의 것이며, 예를 들어 원천세포는 내피세포, 대식세포, 호중구, 과립구, 백혈구, 줄기세포(예를 들어, 중간엽줄기세포, 골수줄기세포, 유도된 다능성줄기세포, 배아줄기세포), 골수아세포, 근아세포, 간세포 또는 뉴런, 예를 들어 망막신경세포에서 선택됨; ii) 푸소겐은 융합성 당단백질 이외의 것임; iii) 푸소겐은 페르틸린(fertilin)-베타 이외의 포유류 단백질임; iv) 푸소좀은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 낮은 면역원성을 가짐; v) 푸소좀은 제약 또는 우수제조관리기준(GMP) 표준을 충족시킴; vi) 푸소좀은 우수제조관리기준(GMP)에 따라 제조되었음; vii) 푸소좀은 병원체를 선결된 참조 수준 미만으로 가지며, 예를 들어 푸소좀에는 병원체가 실질적으로 없음; 또는 viii) 푸소좀은 오염물을 선결된 참조 수준 미만으로 가지며, 예를 들어 푸소좀에는 오염물이 실질적으로 없음.
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, 원천세포에서 유도된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물로서, 여기서 복수의 푸소좀은, (a) 지질 이중층; (b) 시토졸을 포함하는 내강(여기서 내강은 지질 이중층으로 둘러싸여 있음); (c) 지질 이중층에 배치된 외인성 또는 과발현된 푸소겐; 및 (d) 카고를 포함하며; 푸소좀은 핵을 포함하지 않고; 푸소좀 조성물 내 바이러스 캡시드 단백질의 양은 총 단백질의 1% 미만이며; 여기서 복수의 푸소좀이, 세포내이입 저해제의 존재 하에 표적세포 집단과 접촉되고, 세포내이입 저해제로 처리되지 않은 참조 표적세포 집단과 접촉되는 경우, 참조 표적세포 집단과 비교하여 표적세포 집단 내 세포 수의 적어도 30%에 카고를 전달하는, 푸소좀 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, 원천세포에서 유도된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물로서, 여기서 복수의 푸소좀은, (a) 지질 이중층; (b) 시토졸을 포함하는 내강(여기서 내강은 지질 이중층으로 둘러싸여 있음); (c) 지질 이중층에 배치된 외인성 또는 과발현된 재표적화된 푸소겐; 및 (d) 카고를 포함하며; 푸소좀은 핵을 포함하지 않고; 푸소좀 조성물 내 바이러스 캡시드 단백질의 양은 총 단백질의 1% 미만이며; 여기서 (i) 복수의 푸소좀이 표적세포와 비표적세포를 포함하는 세포 집단과 접촉하는 경우, 카고는 비표적세포보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 더 많이 표적세포에 존재하거나, (ii) 복수의 푸소좀은 비표적세포보다 표적세포와 적어도 50% 더 높은 비율로 융합하는, 푸소좀 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, 원천세포에서 유도된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물로서, 여기서 복수의 푸소좀은, (a) 지질 이중층; (b) 지질 이중층으로 둘러싸인 내강; (c) 외인성 또는 과발현된 푸소겐(여기서 푸소겐은 지질 이중층에 배치되어 있음); 및 (d) 카고를 포함하며; 푸소좀은 핵을 포함하지 않고; 다음 중 하나 이상(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개)을 특징으로 하는, 푸소좀 조성물을 제공한다: i) 푸소겐은 적어도 1,000개 카피의 카피 수로 존재함; ii) 푸소좀은 치료제를 적어도 1,000개 카피의 카피 수로 포함함; iii) 푸소좀은 지질을 포함하며, 여기서 CL, Cer, DAG, HexCer, LPA, LPC, LPE, LPG, LPI, LPS, PA, PC, PE, PG, PI, PS, CE, SM 및 TAG 중 하나 이상은 원천세포에서 상응하는 지질 수준의 75% 이내임; iv) 푸소좀은 원천세포와 유사한 프로테오믹 조성을 포함함; v) 푸소좀은 신호 전달, 예를 들어 세포외 신호, 예를 들어 인슐린에 대한 반응으로 AKT 인산화, 또는 인슐린에 대한 반응으로 글루코오스(예를 들어, 표지된 글루코오스, 예를 들어 2-NBDG) 흡수를, 음성 대조군, 예를 들어 인슐린 부재 하의 다른 유사한 푸소좀보다, 예를 들어 적어도 10% 더 전달할 수 있음; vi) 푸소좀은 조직, 예를 들어 간, 폐, 심장, 비장, 췌장, 위장관, 신장, 고환, 난소, 뇌, 생식기관, 중추신경계, 말초신경계, 골격근, 내피, 내이 또는 눈을 표적으로 하고, 대상, 예를 들어 마우스에게 투여될 때, 예를 들어 24시간 후, 투여된 푸소좀의 집단 내 푸소좀의 적어도 0.1% 또는 10%가 표적조직에 존재함; 또는 원천세포는 호중구, 과립구, 중간엽줄기세포, 골수줄기세포, 유도된 다능성줄기세포, 배아줄기세포, 골수아세포, 근아세포, 간세포 또는 뉴런, 예를 들어 망막신경세포에서 선택됨.
구현예에서, 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: i) 원천세포는 293세포 이외의 것임; ii) 원천세포는 형질전환되거나 불멸화되지 않음; iii) 원천세포는 아데노바이러스 매개 불멸화 이외의 방법을 사용하여 형질전환되거나 불멸화되며, 예를 들어 자발적 돌연변이 또는 텔로머라아제 발현에 의해 불멸화됨; iv) 푸소겐은 VSVG, SNARE 단백질 또는 분비 과립 단백질 이외의 것임; v) 치료제는 Cre 또는 EGFP 이외의 것임; vi) 치료제는, 예를 들어 내강에 있는 핵산(예를 들어, RNA, 예를 들어 mRNA, miRNA 또는 siRNA) 또는 외인성 단백질(예를 들어, 항체, 예를 들어 항체)임; 또는 vii) 푸소좀은 미토콘드리아를 포함하지 않음.
구현예에서, 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: i) 원천세포는 293세포 또는 HEK세포 이외의 것임; ii) 원천세포는 형질전환되거나 불멸화되지 않음; iii) 원천세포는 아데노바이러스 매개 불멸화 이외의 방법을 사용하여 형질전환되거나 불멸화되며, 예를 들어 자발적 돌연변이 또는 텔로머라아제 발현에 의해 불멸화됨; iv) 푸소겐은 바이러스 푸소겐이 아님; 또는 v) 푸소좀의 크기는 40 nm 내지 150 nm 이외이고, 예를 들어 150 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm 또는 500 nm 초과임.
구현예에서, 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: i) 치료제는 원천세포에 의해 발현된 가용성 단백질임; ii) 푸소겐은 TAT, TAT-HA2, HA-2, gp41, 알츠하이머 베타-아밀로이드 펩타이드, 센다이바이러스 단백질 또는 양친매성 순 음성 펩타이드(WAE 11) 이외의 것임; iii) 푸소겐은 포유류 푸소겐임; iv) 푸소좀은 이의 내강에 효소, 항체 또는 항바이러스 폴리펩타이드에서 선택되는 폴리펩타이드를 포함함; v) 푸소좀은 외인성 치료용 막관통 단백질을 포함하지 않음; 또는 vi) 푸소좀은 CD63 또는 GLUT4를 포함하지 않거나, 예를 들어 실시예 89에 기재된 방법에 따라 결정 시, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 또는 10% 이하(예를 들어, 약 0.048% 이하)의 CD63을 포함함.
구현예에서, 푸소좀은 다음을 특징으로 한다: i) 바이러스를 포함하지 않거나, 감염성이 아니거나 또는 숙주세포에서 번식하지 않음; ii) 바이러스 벡터가 아님; iii) VLP(바이러스 유사 입자)가 아님; iv) 바이러스 구조 단백질, 예를 들어 gag에서 유도된 단백질, 예를 들어 바이러스 캡시드 단백질, 예를 들어 바이러스 캡슐 단백질, 예를 들어 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하지 않거나, 바이러스 캡시드 단백질의 양이, 예를 들어 질량분석법, 예를 들어 실시예 93의 검정을 사용하여 측정 시, 총 단백질의 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만임; v) 바이러스 매트릭스 단백질을 포함하지 않음; vi) 바이러스 비구조 단백질; 예를 들어 pol 또는 이의 단편 또는 변이체, 바이러스 역전사효소 단백질, 바이러스 인테그라아제 단백질 또는 바이러스 프로테아제 단백질을 포함하지 않음; vii) 바이러스 핵산; 예를 들어 바이러스 RNA 또는 바이러스 DNA를 포함하지 않음; viii) 바이러스 구조 단백질 소포당 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 미만의 카피를 포함함; 또는 ix) 푸소좀은 바이로좀이 아님.
일부 구현예에서, 푸소좀은 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 미만의 바이러스 캡시드 단백질(예를 들어, 약 0.05%의 바이러스 캡시드 단백질)을 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 바이러스 캡시드 단백질은 토끼 내인성 렌티바이러스(RELIK: Rabbit Endogenous Lentivirus) 캡시드와 시클로필린 A의 복합체이다. 구현예에서, 바이러스 캡시드 단백질:총 단백질 비는 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09 또는 0.1이다(또는 인 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은 gag 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함하지 않거나(또는 포함하지 않는 것으로 확인되거나), gag 단백질, 또는 이의 단편 또는 변이체의 양이, 예를 들어 실시예 93의 검정에 따라 측정 시, 총 단백질의 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만이다.
구현예에서, 푸소좀 상의 푸소겐의 카피 수 대 바이러스 구조 단백질의 카피 수의 비는, 적어도 1,000,000:1, 100,000:1, 10,000:1, 1,000:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1 또는 1:1이거나; 100:1 내지 50:1, 50:1 내지 20:1, 20:1 내지 10:1, 10:1 내지 5:1, 또는 1:1이다. 구현예에서, 푸소좀 상의 푸소겐의 카피 수 대 바이러스 매트릭스 단백질의 카피 수의 비는, 적어도 1,000,000:1, 100.000:1, 10,000:1, 1,000:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1 또는 1:1이다.
구현예에서, 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: i) 푸소좀은 수-비(非)혼화성 액적을 포함하지 않음; ii) 푸소좀은 수성 내강과 친수성 외부를 포함함; iii) 푸소겐은 단백질 푸소겐임; 또는 iv) 세포소기관은 미토콘드리온, 골지체, 리소좀, 소포체, 액포, 엔도좀, 첨단체, 자가포식체, 중심체, 글리코좀, 글리옥시좀, 히드로게노좀, 멜라노좀, 미토좀, 자포, 퍼옥시좀, 프로테아좀, 소포 및 스트레스 과립에서 선택됨.
구현예에서, 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: i) 푸소겐은 포유류 푸소겐 또는 바이러스 푸소겐임; ii) 푸소좀은 푸소좀에 치료용 또는 진단용 물질을 로딩하는 방식으로 제조되지 않았음; iii) 원천세포에는 치료용 또는 진단용 물질이 로딩되지 않았음; iv) 푸소좀은 독소루비신(doxorubicin), 덱사메타손(dexamethasone), 시클로덱스트린(cyclodextrin); 폴리에틸렌 글리콜, 마이크로 RNA, 예를 들어 miR125, VEGF 수용체, ICAM-1, E-셀렉틴, 산화철, 형광 단백질, 예를 들어 GFP 또는 RFP, 나노입자, 또는 RNase를 포함하지 않거나, 상기 중 임의의 것의 외인성 형태를 포함하지 않음; 또는 v) 푸소좀은 하나 이상의 번역 후 변형, 예를 들어 글리코실화를 갖는 외인성 치료제를 추가로 포함함.
구현예에서, 푸소좀은 단일라멜라 또는 다중라멜라이다.
구현예에서, 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: i) 푸소좀은 엑소좀이 아님; ii) 푸소좀은 미세소포임; iii) 푸소좀은 비포유류 푸소겐을 포함함; iv) 푸소좀은 푸소겐을 포함하도록 조작되었음; v) 푸소좀은 외인성 푸소겐을 포함함; vi) 푸소좀의 크기는 적어도 80 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 1200 nm, 1400 nm 또는 1500 nm이거나, 푸소좀 집단의 평균 크기는 적어도 80 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 1200 nm, 1400 nm 또는 1500 nm임; vii) 푸소좀은 하나 이상의 세포소기관, 예를 들어 미토콘드리온, 골지체, 리소좀, 소포체, 액포, 엔도좀, 첨단체, 자가포식체, 중심체, 글리코좀, 글리옥시좀, 히드로게노좀, 멜라노좀, 미토좀, 자포, 퍼옥시좀, 프로테아좀, 소포 및 스트레스 과립을 포함함; viii) 푸소좀은 세포골격 또는 이의 구성요소, 예를 들어 액틴, Arp2/3, 포르민, 코로닌, 디스트로핀, 케라틴, 미오신 또는 튜불린을 포함함; ix) 푸소좀, 또는 복수의 푸소좀을 포함하는 조성물 또는 제제는, 예를 들어 문헌[Thery et al., "Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids." Curr Protoc Cell Biol. 2006 Apr; Chapter 3:Unit 3.22]에 기재된 바와 같이, 예를 들어 수크로오스 구배 원심분리 검정에 따라 측정 시, 1.08 g/ml 내지 1.22 g/ml의 부유 밀도를 갖지 않거나, 적어도 1.18 g/ml 내지 1.25 g/ml, 또는 1.05 g/ml 내지 1.12 g/ml의 밀도를 가짐; x) 지질 이중층은 원천세포와 비교하여 세라미드 또는 스핑고미엘린, 또는 이들의 조합이 강화되어 있거나, 지질 이중층은 원천세포와 비교하여 당지질, 유리 지방산 또는 포스파티딜세린, 또는 이들의 조합이 강화되어 있지 않음(예를 들어, 고갈되어 있음); xi) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 92의 검정에 따라 측정 시, 포스파티딜세린(PS) 또는 CD40 리간드, 또는 PS와 CD40 리간드 모두를 포함함; xii) 푸소좀은 원천세포와 비교하여 PS가 강화되어 있으며, 예를 들어 문헌[Kanada M, et al. (2015) Differential fates of biomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles. Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433-E1442]의 검정에 따라 측정 시, 예를 들어 푸소좀 집단에서, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 PS에 대해 양성임; xiii) 푸소좀은 아세틸콜린에스테라아제(AChE)를 실질적으로 포함하지 않거나, 예를 들어 실시예 52의 검정에 따라 측정 시, 단백질 1 ug당 0.001, 0.002, 0.005, 0.01,0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 또는 1000 미만의 AChE 활성 단위를 함유함; xiv) 푸소좀은 테트라스파닌(Tetraspanin) 계열 단백질(예를 들어, CD63, CD9 또는CD81), ESCRT 관련 단백질(예를 들어, TSG101, CHMP4A-B 또는 VPS4B), Alix, TSG101, MHCI, MHCII, GP96, 액티닌(actinin)-4, 미토필린(mitofilin), 신테닌(syntenin)-1, TSG101, ADAM10, EHD4, 신테닌-1, TSG101, EHD1, 플로틸린(flotillin)-1, 열충격 70-kDa 단백질(HSC70/HSP73, HSP70/HSP72), 또는 이들의 임의의 조합을 실질적으로 포함하지 않거나, 예를 들어 실시예 89의 검정에 따라 측정 시, 상기 단백질 중 임의의 것의 임의의 개별 엑소좀 마커 단백질의 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5% 또는 10% 미만, 및/또는 총 엑소좀 마커 단백질의 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만을 함유하거나, 원천세포와 비교하여 이러한 단백질 중 임의의 하나 이상이 강화되어 있지 않거나, 또는 이러한 단백질 중 임의의 하나 이상이 강화되어 있지 않음; xv) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 36의 검정을 사용하여 측정 시, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나아제(GAPDH)의 수준을, 총 단백질 1 ug당 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng, 20 ng, 10 ng, 5 ng 또는 1 ng의 미만의 GAPDH, 또는 원천세포의 GAPDH 수준 미만, 예를 들어 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만, 예를 들어 원천세포에서 총 단백질당 GAPDH의 수준(ng/ug) 미만으로 포함함; xvi) 푸소좀은 하나 이상의 소포체 단백질(예를 들어, 칼넥신), 하나 이상의 프로테아좀 단백질 또는 하나 이상의 미토콘드리아 단백질, 또는 이들의 임의의 조합이 강화되어 있으며, 예를 들어 여기서 칼넥신의 양은 총 단백질 1 ug당 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng, 20 ng, 10 ng, 5 ng 또는 1 ng 미만의 칼넥신이거나, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 37 또는 실시예 90의 검정을 사용하여 측정 시, 원천세포와 비교하여 총 단백질당 칼넥신(ng/ug)을 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 적게 포함하거나, 푸소좀 내 칼넥신의 평균 분율은 약 1x10-4, 1.5x10-4, 2x10-4, 2.1x10-4, 2.2x10-4, 2.3x10-4, 2.4x10-4, 2.43x10-4, 2.5x10-4, 2.6x10-4, 2.7x10-4, 2.8x10-4, 2.9x10-4, 3x10-4, 3.5x10-4 또는 4x10-4 미만이거나, 또는 푸소좀은 총 단백질당 칼넥신의 양을 모세포보다 약 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 적은 양으로 포함함; xvii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 34의 검정을 사용하여 측정 시, 외인성 작용제(예를 들어, 외인성 단백질, mRNA 또는 siRNA)를 포함함; 또는 xviii) 푸소좀은, 예를 들어 문헌[Kanada M, et al. (2015) Differential fates of biomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles. Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433-E1442]의 검정에 따라 측정 시, 원자력 현미경에 의해 마이카 표면 상에 적어도 30분 동안 고정될 수 있음.
구현예에서, 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: i) 푸소좀은 엑소좀임; ii) 푸소좀은 미세소포가 아님; iii) 푸소좀의 크기는 80 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 1200 nm, 1400 nm 또는 1500 nm 미만이거나, 푸소좀 집단의 평균 크기는 80 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 1200 nm, 1400 nm 또는 1500 nm 미만임; iv) 푸소좀은 세포소기관을 포함하지 않음; v) 푸소좀은 세포골격 또는 이의 구성요소, 예를 들어 액틴, Arp2/3, 포르민, 코로닌, 디스트로핀, 케라틴, 미오신 또는 튜불린을 포함하지 않음; vi) 푸소좀, 또는 복수의 푸소좀을 포함하는 조성물 또는 제제는, 예를 들어 문헌[Thery et al., "Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids." Curr Protoc Cell Biol. 2006 Apr; Chapter 3:Unit 3.22]에 기재된 바와 같이, 예를 들어 수크로오스 구배 원심분리 검정에 따라 측정 시, 1.08 g/ml 내지 1.22 g/ml의 부유 밀도를 가짐; vii) 지질 이중층은 원천세포와 비교하여 세라미드 또는 스핑고미엘린, 또는 이들의 조합이 강화되어 있지 않거나(예를 들어, 고갈되어 있음), 원천세포와 비교하여 당지질, 유리 지방산 또는 포스파티딜세린, 또는 이들의 조합이 강화되어 있음; viii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 92의 검정에 따라 측정 시, 포스파티딜세린(PS) 또는 CD40 리간드, 또는 PS와 CD40 리간드 모두를 포함하지 않거나 원천세포와 비교하여 고갈되어 있음; ix) 푸소좀은 원천세포와 비교하여 PS가 강화되어 있지 않으며(예를 들어, 고갈되어 있음), 예를 들어 문헌[Kanada M, et al. (2015) Differential fates of biomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles. Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433-E1442]의 검정에 따라 측정 시, 예를 들어 푸소좀 집단에서, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%미만이 PS에 대해 양성임; x) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 52의 검정에 따라 측정 시, 아세틸콜린에스테라아제(AChE)를, 예를 들어 단백질 1 ug당 적어도 0.001, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 또는 1000의 AChE 활성 단위로 포함함; xi) 푸소좀은 테트라스파닌 계열 단백질(예를 들어, CD63, CD9 또는CD81), ESCRT 관련 단백질(예를 들어, TSG101, CHMP4A-B 또는 VPS4B), Alix, TSG101, MHCI, MHCII, GP96, 액티닌-4, 미토필린, 신테닌-1, TSG101, ADAM10, EHD4, 신테닌-1, TSG101, EHD1, 플로틸린-1, 열충격 70-kDa 단백질(HSC70/HSP73, HSP70/HSP72), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하며, 예를 들어 실시예 89의 검정에 따라 측정 시, 예를 들어 상기 단백질 중 임의의 것의 임의의 개별 엑소좀 마커 단백질의 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 5% 또는 10% 초과, 및/또는 총 엑소좀 마커 단백질의 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 미만을 함유하거나, 원천세포와 비교하여 이러한 단백질 중 임의의 하나 이상이 강화되어 있음; xii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 36의 검정을 사용하여 측정 시, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나아제(GAPDH)의 수준을, 총 단백질 1 ug당 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng, 20 ng, 10 ng, 5 ng 또는 1 ng 초과의 GAPDH, 또는 원천세포의 GAPDH 수준 미만, 예를 들어 적어도 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 원천세포에서 총 단백질당 GAPDH의 수준(ng/ug)보다 더 큰 수준으로 포함함; xiii) 푸소좀은 하나 이상의 소포체 단백질(예를 들어, 칼넥신), 하나 이상의 프로테아좀 단백질 또는 하나 이상의 미토콘드리아 단백질, 또는 이들의 임의의 조합이 강화되어 있지 않으며(예를 들어, 고갈되어 있음), 예를 들어 실시예 90의 검정을 사용하여 측정 시, 예를 들어 여기서 칼넥신의 양은 총 단백질 1 ug당 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng, 20 ng, 10 ng, 5 ng 또는 1 ng 미만의 칼넥신이거나, 푸소좀은 원천세포와 비교하여 총 단백질당 칼넥신(ng/ug)을 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 적게 포함하거나, 푸소좀 내 칼넥신의 평균 분율은 약 1x10-4, 1.5x10-4, 2x10-4, 2.1x10-4, 2.2x10-4, 2.3x10-4, 2.4x10-4, 2.43x10-4, 2.5x10-4, 2.6x10-4, 2.7x10-4, 2.8x10-4, 2.9x10-4, 3x10-4, 3.5x10-4 또는 4x10-4 미만이거나, 또는 푸소좀은 총 단백질당 칼넥신의 양을 모세포보다 약 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 적은 양으로 포함함; 또는 xiv) 푸소좀은, 예를 들어 문헌[Kanada M, et al. (2015) Differential fates of biomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles. Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433-E1442]의 검정에 따라 측정 시, 원자력 현미경에 의해 마이카 표면 상에 적어도 30분 동안 고정될 수 없음.
구현예에서, 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: i) 푸소좀은 VLP를 포함하지 않음; ii) 푸소좀은 바이러스를 포함하지 않음; iii) 푸소좀은 복제 가능 바이러스를 포함하지 않음; iv) 푸소좀은 바이러스 단백질, 예를 들어 바이러스 구조 단백질, 예를 들어 캡시드 단백질 또는 바이러스 매트릭스 단백질을 포함하지 않음; v) 푸소좀은 외피 바이러스로부터의 캡시드 단백질을 포함하지 않음; vi) 푸소좀은 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하지 않음; 또는 vii) 푸소겐은 바이러스 푸소겐이 아님.
구현예에서, 푸소좀은 시토졸을 포함한다.
구현예에서, 다음 중 하나 이상을 특징으로 한다: i) 푸소좀 또는 원천세포는, 예를 들어 실시예 65의 검정에 따라 측정 시, 대상에게 이식될 때 기형종을 형성하지 않음; ii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 45의 검정을 사용하여 측정 시, 예를 들어 참조세포, 예를 들어 대식세포의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(또는 그 이상) 이내의 화학주성을 나타낼 수 있음; iii) 푸소좀은, 예를 들어 실시예 46의 검정을 사용하여 측정 시, 예를 들어 상처 부위에 귀소할 수 있으며, 여기서 푸소좀 또는 세포생물제제는 인간 세포에서 유래된 것이고, 예를 들어 원천세포는 호중구임; 또는 iv) 푸소좀은 식균작용을 할 수 있으며, 예를 들어 푸소좀에 의한 식균작용은, 실시예 47의 검정을 사용하여 측정 시, 0.5시간, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 또는 6시간 이내에 검출 가능하고, 예를 들어 여기서 원천세포는 대식세포임.
구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 조성물은, 대상, 예를 들어 인간 대상에게의 투여 후, 5일 이하, 예를 들어 4일 이하, 3일 이하, 2일 이하, 1일 이하, 예를 들어 약 12시간 내지 72시간 동안 상기 특징 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상을 보유한다.
구현예에서, 푸소좀은 하기 특징 중 하나 이상을 갖는다: a) 원천세포 유래의 하나 이상의 내인성 단백질, 예를 들어 막단백질 또는 시토졸 단백질을 포함함; b) 적어도 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 500개, 1000개, 2000개 또는 5000개의 상이한 단백질을 포함함; c) 적어도 1개, 2개, 5개, 10개, 20개, 50개 또는 100개의 상이한 당단백질을 포함함; d) 푸소좀 내 단백질 질량의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 자연 발생 단백질임; e) 적어도 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 500개, 1000개, 2000개 또는 5000개의 상이한 RNA를 포함함; 또는 f) 예를 들어 CL, Cer, DAG, HexCer, LPA, LPC, LPE, LPG, LPI, LPS, PA, PC, PE, PG, PI, PS, CE, SM 및 TAG에서 선택되는, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 10개 또는 20개의 상이한 지질을 포함함.
구현예에서, 푸소좀은 하기 특성 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상을 갖도록 조작되었거나, 자연 발생 세포가 아니며, 여기서 핵은 자연적으로 하기 특성 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상을 갖지 않는다: a) 부분 핵 불활성화는 핵 기능, 예를 들어 전사 또는 DNA 복제, 또는 둘 모두의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 이상의 감소를 유도하며, 예를 들어 여기서 전사는 실시예 24의 검정에 따라 측정되고, DNA 복제는 실시예 25의 검정에 따라 측정된 것임; b) 푸소좀은 전사할 수 없거나, 예를 들어 실시예 24의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 원천세포의 전사 활성의 1%, 2.5% 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만의 전사 활성을 가짐; c) 푸소좀은 핵 DNA 복제를 할 수 없거나, 예를 들어 실시예 25의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 원천세포의 핵 DNA 복제의 1%, 2.5% 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만의 핵 DNA 복제를 가짐; d) 푸소좀은 크로마틴이 결여되어 있거나, 예를 들어 실시예 32의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 원천세포의 크로마틴 함량의 1%, 2.5% 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만의 크로마틴 함량을 가짐; e) 푸소좀은 핵막이 결여되어 있거나, 예를 들어 실시예 31의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 Jurkat세포의 핵막의 양의 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 핵막을 가짐; f) 푸소좀은 기능성 핵 공극 복합체가 결여되어 있거나, 예를 들어 실시예 31의 검정에 따라 측정 시, 적어도 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 감소된 핵 유입 또는 방출을 나타내거나, 또는 푸소좀에는 하나 이상의 핵 공극 단백질, 예를 들어 NUP98 또는 Importin 7이 결여되어 있음; g) 푸소좀은 히스톤을 포함하지 않거나, 예를 들어 실시예 32의 검정에 따라 측정 시, 원천세포의 히스톤 수준(예를 들어, H1, H2a, H2b, H3 또는 H4)의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만의 히스톤 수준을 가짐; h) 푸소좀은 20개, 10개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 미만의 염색체를 포함함; i) 핵 기능이 제거됨; j) 푸소좀은 제핵된 포유류 세포임; k) 핵은 제거되거나 불활성되고, 예를 들어 기계적인 힘, 방사선 또는 화학적 절제에 의해 압출됨; 또는 l) 푸소좀은, 예를 들어 간기 또는 유사분열 동안 완전히 또는 부분적으로 제거된 DNA를 갖는 포유류 세포에서 유래된 것임.
구현예에서, 푸소좀은 mtDNA 또는 벡터 DNA를 포함한다. 구현예에서, 푸소좀은 DNA를 포함하지 않는다.
구현예에서, 원천세포는 원시세포, 불멸화된 세포 또는 세포주(예를 들어, 골수아세포 세포주, 예를 들어 C2C12)이다. 구현예에서, 푸소좀은 (예를 들어, MHC 단백질 또는 MHC 복합체를 제거하기 위한 게놈 편집에 의해) 게놈이 변형된, 예를 들어 면역원성이 감소된 원천세포에서 유래된다. 구현예에서, 원천세포는 항염증 신호로 처리된 세포 배양물에서 유래된 것이다. 구현예에서, 원천세포는 면역억제제로 처리된 세포 배양물에서 유래된 것이다. 구현예에서, 원천세포는, 예를 들어 본원에 기재된 검정을 사용하여 측정 시 실질적으로 비면역원성이다. 구현예에서, 원천세포는 외인성 작용제, 예를 들어 치료제를 포함한다. 구현예에서, 원천세포는 재조합 세포이다.
구현예에서, 푸소좀은 외인성 작용제, 예를 들어 치료제, 예를 들어 단백질 또는 핵산(예를 들어, DNA, 염색체(예를 들어, 인간 인공 염색체), RNA, 예를 들어 mRNA 또는 miRNA)를 추가로 포함한다. 구현예에서, 외인성 작용제는 최소 또는 최대 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피(예를 들어, 카피는 푸소좀으로 구성됨)로 존재하거나, 푸소좀당 최소 또는 최대 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개 또는 1,000,000개 카피의 평균 수준으로 존재한다. 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 포유류 세포의 siRNA 또는 유전자 편집 효소로의 처리에 의해, 하나 이상의 내인성 분자, 예를 들어 단백질 또는 핵산의 수준이 변경, 예를 들어 증가 또는 감소된다. 구현예에서, 내인성 분자는, 예를 들어 최소 또는 최대 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피(예를 들어, 카피는 푸소좀으로 구성됨)의 평균 수준으로 존재하거나, 푸소좀당 최소 또는 최대 10개, 20개, 50개, 100개, 200개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개 또는 1,000,000개 카피의 평균 수준으로 존재한다. 구현예에서, 내인성 분자(예를 들어, RNA 또는 단백질)는 원천세포에서 이의 농도보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 103, 5.0 x 103, 104, 5.0 x 104, 105, 5.0 x 105, 106, 5.0 x 106, 1.0 x 107, 5.0 x 107 또는 1.0 x 108 배 더 큰 농도로 존재한다.
구현예에서, 활성제는 단백질, 단백질 복합체(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 50개의 단백질, 예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 50개의 상이한 단백질을 포함함) 폴리펩타이드, 핵산(예를 들어, DNA, 염색체, RNA, 예를 들어 mRNA, siRNA 또는 miRNA) 또는 소분자에서 선택된다. 구현예에서, 외인성 작용제는 부위 특이적 뉴클레아제, 예를 들어 Cas9 분자, TALEN 또는 ZFN을 포함한다.
구현예에서, 푸소겐은 바이러스 푸소겐, 예를 들어 HA, HIV-1 ENV, HHV-4, gp120 또는 VSV-G이다. 구현예에서, 푸소겐은 포유류 푸소겐, 예를 들어 SNARE, 신시틴, 미오메이커, 미오믹서, 미오머저 또는 FGFRL1이다. 구현예에서, 푸소겐은 pH 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 또는 9 내지 10에서 활성이다. 구현예에서, 푸소겐은 pH 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 또는 9 내지 10에서 활성이 아니다. 구현예에서, 푸소좀은 표적세포의 표면에서 표적세포와 융합한다. 구현예에서, 푸소겐은 리소좀 독립적 방식으로 융합을 촉진시킨다. 구현예에서, 푸소겐은 단백질 푸소겐이다. 구현예에서, 푸소겐은 지질 푸소겐, 예를 들어 올레산, 글리세롤, 모노올레에이트, 글리세리드, 디아실글리세롤 또는 변형된 불포화 지방산이다. 구현예에서, 푸소겐은 화학물질 푸소겐, 예를 들어 PEG이다. 구현예에서, 푸소겐은 소분자 푸소겐, 예를 들어 할로탄, NSAID, 예컨대 멜록시캄, 피록시캄, 테녹시캄 및 클로로프로마진이다. 구현예에서, 푸소겐은 재조합된 것이다. 구현예에서, 푸소겐은 생화학적으로 혼입되며, 예를 들어 푸소겐은 정제된 단백질로서 제공되어, 푸소겐이 지질 이중층과 회합될 수 있는 조건 하에서 지질 이중층과 접촉된다. 구현예에서, 푸소겐은 생합성적으로 혼입되며, 예를 들어 푸소겐이 지질 이중층과 회합될 수 있는 조건 하에서 원천세포에서 발현된다.
구현예에서, 푸소좀은 표적세포와 결합한다. 구현예에서, 표적세포는 HeLa세포 이외의 것이거나, 형질전환되거나 불멸화되지 않는다.
푸소좀 조성물을 포함하는 일부 구현예에서, 복수의 푸소좀은 동일하다. 일부 구현예에서, 복수의 푸소좀은 상이하다. 일부 구현예에서, 복수의 푸소좀은 하나 이상의 원천세포에서 유래된다. 일부 구현예에서, 복수의 푸소좀의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%는, 푸소좀 조성물 내 푸소좀의 평균 직경의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 푸소좀의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%는, 푸소좀 조성물 내 푸소좀의 평균 부피의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은, 원천세포 집단의 10%, 50% 또는 90% 내에서, 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 미만의 크기 분포 가변성, 예를 들어 실시예 28에 기반한 크기 분포 가변성을 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 푸소좀의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%는, 푸소좀 조성물 내 푸소좀의 평균 푸소겐 카피 수의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이내의 푸소겐 카피 수를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 푸소좀의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%는, 푸소좀 조성물 내 푸소좀의 평균 치료제 카피 수의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이내의 치료제 카피 수를 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 적어도 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개, 1013개, 1014개 또는 1015개(또는 그 이상)의 푸소좀을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 적어도 1 ul, 2 ul, 5 ul, 10 ul, 20 ul, 50 ul, 100 ul, 200 ul, 500 ul, 1 ml, 2 ml, 5 ml 또는 10 ml의 부피로 존재한다.
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 참조 표적세포 집단과 비교하여 표적세포 집단 내 세포 수의 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%에 카고를 전달한다.
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 참조 표적세포 집단 또는 비표적세포 집단과 비교하여 표적세포 집단에 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 카고를 전달한다. 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 참조 표적세포 집단 또는 비표적세포 집단과 비교하여 표적세포 집단에 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 카고를 전달한다.
일부 구현예에서, 카고의 10% 미만이 세포내이입에 의해 세포에 들어간다.
일부 구현예에서, 세포내이입 저해제는 리소좀 산성화 저해제, 예를 들어 바필로마이신(bafilomycin) A1이다. 일부 구현예에서, 세포내이입 저해제는 디나민 저해제, 예를 들어 Dynasore이다.
일부 구현예에서, 표적세포 집단은 생리학적 pH(예를 들어, 7.3 내지 7.5, 예를 들어 7.38 내지 7.42)로 존재한다.
일부 구현예에서, 전달된 카고는 세포내이입 저해 검정, 예를 들어 실시예 80의 검정을 사용하여 결정된다.
일부 구현예에서, 카고는 디나민 독립적 경로 또는 리소좀 산성화 독립적 경로, 거대음작용(macropinocytosis) 독립적 경로(예를 들어, 여기서 세포내이입 저해제는 거대음작용 저해제, 예를 들어 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로리드(EIPA)임, 예를 들어 25 μM의 농도), 또는 액틴 독립적 경로(예를 들어, 여기서 세포내이입 저해제는 액틴 중합 저해제, 예를 들어 라트룬쿨린(Latrunculin) B임, 예를 들어 6 μM의 농도)를 통해 세포에 들어간다.
일부 구현예에서, 복수의 푸소좀은 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 구현예에서, 표적화 모이어티는 푸소겐으로 구성되거나, 별개의 분자로 구성된다.
일부 구현예에서, 복수의 푸소좀을 표적세포와 비표적세포를 포함하는 세포 집단과 접촉시키는 경우, 카고는 비표적세포보다 적어도 10배 더 많은 표적세포에 존재한다.
일부 구현예에서, 복수의 푸소좀을 표적세포와 비표적세포를 포함하는 세포 집단과 접촉시키는 경우, 카고는 비표적세포보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배 또는 50배 더 많이 표적세포에 존재하고/하거나, 참조세포보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배 또는 50배 더 많이 표적세포에 존재한다.
일부 구현예에서, 복수의 푸소좀은 비표적세포보다 표적세포와 적어도 50% 더 높은 비율로 융합한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 표적세포 집단과 접촉하는 경우, 엔도좀 또는 리소좀 이외의 표적세포 위치, 예를 들어 시토졸로 카고를 전달한다. 구현예에서, 카고의 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만은 엔도좀 또는 리소좀으로 전달된다.
일부 구현예에서, 복수의 푸소좀은 엑소좀, 미세소포 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 푸소좀의 평균 크기는 적어도 50 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 1200 nm, 1400 nm 또는 1500 nm이다. 다른 구현예에서, 복수의 푸소좀의 평균 크기는 100 nm, 80 nm, 60 nm, 40 nm 또는 30 nm 미만이다.
일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 포유류 푸소겐을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 바이러스 푸소겐을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 단백질 푸소겐이다. 일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 니파바이러스 단백질 F, 홍역바이러스 F 단백질, 투파이아 파라믹소바이러스 F 단백질, 파라믹소바이러스 F 단백질, 헨드라바이러스 F 단백질, 헤니파바이러스 F 단백질, 모빌리바이러스 F 단백질, 레스피로바이러스 F 단백질, 센다이바이러스 F 단백질, 루불라바이러스 F 단백질 또는 아불라바이러스 F 단백질, 또는 이의 유도체에서 선택되는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 pH 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 또는 9 내지 10에서 활성이다. 일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 pH 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 또는 9 내지 10에서 활성이 아니다.
일부 구현예에서, 푸소겐은 푸소좀당 적어도 1개, 2개, 5개 또는 10개 카피의 카피 수로 존재한다.
일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 니파바이러스 단백질 G, 홍역단백질 H, 투파이아 파라믹소바이러스 H 단백질, 파라믹소바이러스 G 단백질, 파라믹소바이러스 H 단백질, 파라믹소바이러스 HN 단백질, 모빌리바이러스 H 단백질, 레스피로바이러스 HN 단백질, 센다이바이러스 HN 단백질, 루불라바이러스 HN 단백질, 아불라바이러스 HN 단백질, 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 니파바이러스 F 및 G 단백질, 홍역바이러스 F 및 H 단백질, 투파이아 파라믹소바이러스 F 및 H 단백질, 파라믹소바이러스 F 및 G 단백질 또는 F 및 H 단백질 또는 F 및 HN 단백질, 헨드라바이러스 F 및 G 단백질, 헤니파바이러스 F 및 G 단백질, 모빌리바이러스 F 및 H 단백질, 레스피로바이러스 F 및 HN 단백질, 센다이바이러스 F 및 HN 단백질, 루불라바이러스 F 및 HN 단백질, 또는 아불라바이러스 F 및 HN 단백질, 또는 이의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 카고는 외인성 단백질 또는 외인성 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 카고는 시토졸 단백질을 포함하거나 인코딩한다. 일부 구현예에서, 카고는 막단백질을 포함하거나 인코딩한다. 일부 구현예에서, 카고는 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고는 푸소좀당 적어도 1개, 2개, 5개, 10개, 20개, 50개, 100개 또는 200개 카피(예를 들어, 푸소좀당 약 1,000개 이하의 카피)의 카피 수로 존재한다. 일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)의 카피 수 대 카고의 카피 수의 비는, 1000:1 내지 1:1, 또는 500:1 내지 1:1, 또는 250:1 내지 1:1, 또는 150:1 내지 1:1, 또는 100:1 내지 1:1, 또는 75:1 내지 1:1, 또는 50:1 내지 1:1, 또는 25:1 내지 1:1, 또는 20:1 내지 1:1, 또는 15:1 내지 1:1, 또는 10:1 내지 1:1, 또는 5:1 내지 1:1, 또는 2:1 내지 1:1, 또는 1:1 내지 1:2이다.
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 바이러스 캡시드 단백질 또는 DNA 통합 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고는 바이러스 게놈을 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은, 예를 들어 유전자 치료를 위해 표적세포의 게놈을 안정적으로 변형시키기 위해, 핵산을 표적세포에 전달할 수 있다.
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하지 않거나, 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 양은, 예를 들어 질량분석법에 따라, 예를 들어 실시예 93의 검정을 사용하여 측정 시, 총 단백질의 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만이다.
구현예에서, 푸소좀 조성물은 적어도 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개, 1013개, 1014개 또는 1015개의 푸소좀을 포함한다. 구현예에서, 푸소좀 조성물은 적어도 10 ml, 20 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 500 ml, 1 L, 2 L, 5 L, 10 L, 20 L 또는 50 L를 포함한다.
구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 면역원성을 감소시키기 위해(예를 들어, MHC 단백질 또는 MHC 복합체를 제거하기 위한 게놈 편집에 의해) 게놈이 변형된 포유류 세포에서 유래된다. 구현예에서, 원천세포는 항염증 신호로 처리된 세포 배양물에서 유래된 것이다. 구현예에서, 상기 방법은, 핵을 불활성시키는 단계, 예를 들어 세포에서 핵을 제거하는 단계 전 또는 후에, 단계 a)의 원천세포를 면역억제제 또는 항염증 신호와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 원천세포에서 유도된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물로서, 여기서 복수의 푸소좀은, (a) 지질 이중층; (b) 시토졸을 포함하는 내강(여기서 내강은 지질 이중층으로 둘러싸여 있음); (c) 지질 이중층에 배치된 외인성 또는 과발현된 푸소겐; 및 (d) 카고를 포함하며; 푸소좀은 핵을 포함하지 않고; 푸소좀 조성물 내 바이러스 캡시드 단백질의 양은 총 단백질의 1% 미만이며; 여기서 복수의 푸소좀이, 세포내이입 저해제의 존재 하에 표적세포 집단과 접촉되고, 세포내이입 저해제로 처리되지 않은 참조 표적세포 집단과 접촉되는 경우, 참조 표적세포 집단과 비교하여 표적세포 집단 내 세포 수의 적어도 30%에 카고를 전달하는, 푸소좀 조성물을 제공한다.
구현예에서, 푸소좀 조성물은 참조 표적세포 집단 또는 비표적세포 집단과 비교하여 표적세포 집단 내 세포 수의 적어도 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%에 카고를 전달하거나; 참조 표적세포 집단 또는 비표적세포 집단과 비교하여 표적세포 집단에 카고, 예를 들어 적어도 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 카고를 전달한다. 구현예에서, 카고의 10% 미만이 세포내이입에 의해 세포에 들어간다. 구현예에서, 세포내이입 저해제는 리소좀 산성화 저해제, 예를 들어 바필로마이신 A1이다. 구현예에서, 전달된 카고는 세포내이입 저해 검정, 예를 들어 실시예 80의 검정을 사용하여 결정된다. 구현예에서, 카고는 디나민 독립적 경로 또는 리소좀 산성화 독립적 경로, 거대음작용 독립적 경로(예를 들어, 여기서 세포내이입 저해제는 거대음작용 저해제, 예를 들어 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로리드(EIPA)임, 예를 들어 25 μM의 농도), 또는 액틴 독립적 경로(예를 들어, 여기서 세포내이입 저해제는 액틴 중합 저해제, 예를 들어 라트룬쿨린 B임, 예를 들어 6 μM의 농도)를 통해 세포에 들어간다.
C. 푸소겐 및 위형화
일부 구현예에서, 본원에 기재된(예를 들어, 소포 또는 세포의 일부를 포함하는) 푸소좀은, 예를 들어 푸소좀의 막, 예를 들어 세포막으로의 융합을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 푸소겐을 포함한다. 또한, 이러한 조성물은 하나 이상의 푸소겐을 포함하도록 합성 동안 또는 이후에 이루어진 표면 변형을 포함할 수 있다. 표면 변형은 막에 대한 변형, 예를 들어 지질 또는 단백질의 막 내 삽입을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 특정 세포 또는 조직 유형(예를 들어, CNS세포)을 표적화하기 위해 이의 외부 표면에 하나 이상의 푸소겐을 포함한다(예를 들어, 세포막에 통합됨). 일부 구현예에서, 하나 이상의 푸소겐에 의해 표적화되는 특정 세포 유형은 CNS세포, 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포이다. 푸소좀은 표적화 도메인을 포함할 수 있다. 푸소겐에는, 비제한적으로, 단백질 기반, 지질 기반 및 화합물 기반 푸소겐이 포함된다. 푸소겐은 표적세포의 표면 상의 파트너, 예를 들어 특징과 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적세포의 표면 상의 파트너는 표적세포 모이어티이다. 특정 구현예에서, 푸소겐은 CNS세포, 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포 중에서 선택되는 표적세포에 결합하는 푸소겐 또는 재표적화된 푸소겐이다. 일부 구현예에서, 푸소겐을 포함하는 푸소좀은 막을 표적세포의 지질 이중층으로 통합시킬 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소겐 중 하나 이상은 푸소좀에 포함될 수 있다.
본원에 기재된 푸소좀(예를 들어, 레트로바이러스 벡터)은, 푸소겐, 예를 들어 내인성 푸소겐 또는 위형화된 푸소겐을 포함할 수 있다.
i) 단백질 푸소겐
일부 구현예에서, 푸소겐은 단백질(예를 들어, 당단백질), 지질 또는 소분자를 포함한다. 푸소겐은, 예를 들어 포유류 푸소겐 또는 바이러스 푸소겐일 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소겐은 단백질 푸소겐, 예를 들어 포유류 단백질 또는 포유류 단백질의 상동체(예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가짐), 비포유류 단백질, 예컨대 바이러스 단백질 또는 바이러스 단백질의 상동체(예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 가짐), 천연 단백질 또는 천연 단백질의 유도체, 합성 단백질, 이의 단편, 이의 변이체, 하나 이상의 푸소겐 또는 단편을 포함하는 단백질 융합체, 및 이들의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 바이러스 푸소겐은 클래스 I 바이러스 막 융합 단백질, 클래스 II 바이러스 막단백질, 클래스 III 바이러스 막 융합 단백질, 바이러스 막 당단백질 또는 다른 바이러스 융합 단백질, 또는 이의 상동체, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 하나 이상의 단백질 또는 이들의 단편을 포함하는 단백질 융합체이다.
구현예에서, 푸소겐은 바이러스 푸소겐, 예를 들어 HA, HIV-1 ENV, HHV-4, gp120 또는 VSV-G이다. 구현예에서, 푸소겐은 포유류 푸소겐, 예를 들어 SNARE, 신시틴, 미오메이커, 미오믹서, 미오머저 또는 FGFRL1이다. 구현예에서, 푸소겐은 pH 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 또는 9 내지 10에서 활성이다. 구현예에서, 푸소겐은 pH 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 또는 9 내지 10에서 활성이 아니다. 구현예에서, 푸소좀은 표적세포의 표면에서 표적세포와 융합한다. 구현예에서, 푸소겐은 리소좀 독립적 방식으로 융합을 촉진시킨다. 구현예에서, 푸소겐은 단백질 푸소겐이다. 구현예에서, 푸소겐은 지질 푸소겐, 예를 들어 올레산, 글리세롤, 모노올레에이트, 글리세리드, 디아실글리세롤 또는 변형된 불포화 지방산이다. 구현예에서, 푸소겐은 화학물질 푸소겐, 예를 들어 PEG이다. 구현예에서, 푸소겐은 소분자 푸소겐, 예를 들어 할로탄, NSAID, 예컨대 멜록시캄, 피록시캄, 테녹시캄 및 클로로프로마진이다. 구현예에서, 푸소겐은 재조합된 것이다. 구현예에서, 푸소겐은 생화학적으로 혼입되며, 예를 들어 푸소겐은 정제된 단백질로서 제공되어, 푸소겐이 지질 이중층과 회합될 수 있는 조건 하에서 지질 이중층과 접촉된다. 구현예에서, 푸소겐은 생합성적으로 혼입되며, 예를 들어 푸소겐이 지질 이중층과 회합될 수 있는 조건 하에서 원천세포에서 발현된다.
일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 포유류 푸소겐을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 바이러스 푸소겐을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 단백질 푸소겐이다. 일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 니파바이러스 단백질 F, 홍역바이러스 F 단백질, 투파이아 파라믹소바이러스 F 단백질, 파라믹소바이러스 F 단백질, 헨드라바이러스 F 단백질, 헤니파바이러스 F 단백질, 모빌리바이러스 F 단백질, 레스피로바이러스 F 단백질, 센다이바이러스 F 단백질, 루불라바이러스 F 단백질 또는 아불라바이러스 F 단백질, 또는 이의 유도체에서 선택되는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 pH 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 또는 9 내지 10에서 활성이다. 일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 pH 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 또는 9 내지 10에서 활성이 아니다.
일부 구현예에서, 푸소겐은 푸소좀당 적어도 1개, 2개, 5개 또는 10개 카피의 카피 수로 존재한다.
일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 니파바이러스 단백질 G, 홍역단백질 H, 투파이아 파라믹소바이러스 H 단백질, 파라믹소바이러스 G 단백질, 파라믹소바이러스 H 단백질, 파라믹소바이러스 HN 단백질, 모빌리바이러스 H 단백질, 레스피로바이러스 HN 단백질, 센다이바이러스 HN 단백질, 루불라바이러스 HN 단백질, 아불라바이러스 HN 단백질, 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소겐(예를 들어, 재표적화된 푸소겐)은 니파바이러스 F 및 G 단백질, 홍역바이러스 F 및 H 단백질, 투파이아 파라믹소바이러스 F 및 H 단백질, 파라믹소바이러스 F 및 G 단백질 또는 F 및 H 단백질 또는 F 및 HN 단백질, 헨드라바이러스 F 및 G 단백질, 헤니파바이러스 F 및 G 단백질, 모빌리바이러스 F 및 H 단백질, 레스피로바이러스 F 및 HN 단백질, 센다이바이러스 F 및 HN 단백질, 루불라바이러스 F 및 HN 단백질, 또는 아불라바이러스 F 및 HN 단백질, 또는 이의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 서열을 포함한다.
비포유류 푸소겐에는, 바이러스 푸소겐, 이의 상동체, 이의 단편, 및 하나 이상의 단백질 또는 이들의 단편을 포함하는 융합 단백질이 포함된다. 바이러스 푸소겐에는, 클래스 I 푸소겐, 클래스 II 푸소겐, 클래스 III 푸소겐 및 클래스 IV 푸소겐이 포함된다. 구현예에서, 인간면역결핍바이러스(HIV) gp41과 같은 클래스 I 푸소겐은, 중앙 나선형 코일 구조를 갖는 α-나선 헤어핀의 특징적 삼량체를 포함하는 특징적인 융합 후 입체형태를 갖는다. 클래스 I 바이러스 융합 단백질에는, 중앙 융합 후 6-나선 다발을 갖는 단백질이 포함된다. 클래스 I 바이러스 융합 단백질에는, 인플루엔자 HA, 파라인플루엔자 F, HIV Env, 에볼라 GP, 오르토믹소바이러스로부터의 헤마글루티닌, 파라믹소바이러스로부터의 F 단백질(예를 들어, 홍역(문헌[Katoh et al. BMC Biotechnology 2010, 10:37])), 레트로바이러스로부터의 ENV 단백질, 및 필로바이러스 및 코로나바이러스의 푸소겐이 포함된다. 구현예에서, 뎅기 E 당단백질과 같은 클래스 II 바이러스 푸소겐은 헤어핀의 삼량체를 생성하기 위해 다시 접혀져 연장된 엑토도메인을 형성하는 β-시트의 구조 특징을 갖는다. 구현예에서, 클래스 II 바이러스 푸소겐에는 중앙 나선형 코일이 결여되어 있다. 클래스 II 바이러스 푸소겐은 알파바이러스(예를 들어, E1 단백질) 및 플라비바이러스(예를 들어, E 당단백질)에서 확인할 수 있다. 클래스 II 바이러스 푸소겐에는, 셈리키삼림바이러스, 신비스바이러스(Sinbis virus), 루벨라바이러스(rubella virus) 및 뎅기바이러스로부터의 푸소겐이 포함된다. 구현예에서, 수포성구내염바이러스 G 당단백질과 같은 클래스 III 바이러스 푸소겐은, 클래스 I 및 II에서 발견되는 구조 특징을 모두 가지고 있다. 구현예에서, 클래스 III 바이러스 푸소겐은 α-나선(예를 들어, 클래스 I 바이러스 푸소겐과 마찬가지로 단백질을 다시 접기 위해 6-나선 번들을 형성함), 및 이의 말단에 양친매성 융합 펩타이드를 갖는 β-시트(클래스 II 바이러스 푸소겐을 연상시킴)를 갖는다. 클래스 III 바이러스 푸소겐은 랍도바이러스 및 헤르페스바이러스에서 확인할 수 있다. 구현예에서, 클래스 IV 바이러스 푸소겐은 외피가 없는 레오바이러스에 의해 인코딩되는 융합 관련 작은 막관통(FAST) 단백질이다(doi:10.1038/sj.emboj.7600767, 문헌[Nesbitt, Rae L., "Targeted Intracellular Therapeutic Delivery Using Liposomes Formulated with Multifunctional FAST proteins" (2012). Electronic Thesis and Dissertation Repository. Paper 388]). 구현예에서, 클래스 IV 바이러스 푸소겐은 헤어핀을 형성하지 않을 만큼 충분히 작다(doi: 10.1146/annurev-cellbio-101512-122422, doi:10.1016/j.devcel.2007.12.008).
바이러스 외피 단백질(env)을 포함하는 푸소겐은, 일반적으로 푸소좀에 의해 감염 및 형질전환될 수 있는 숙주세포의 범위를 결정한다. HIV-1, HIV-2, SIV, FIV 및 EIV와 같은 렌티바이러스의 경우, 천연 env 단백질은 gp41 및 gp120을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 원천세포에 의해 발현된 바이러스 env 단백질은 상기 기재된 바와 같이, 바이러스 gag 및 pol 유전자와 별개의 벡터에서 인코딩된다.
이용될 수 있는 레트로바이러스 유래 env 유전자의 예시적인 예에는, 비제한적으로, MLV 외피, 10A1 외피, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, 에볼라, 센다이, FPV(조류흑사병 바이러스) 및 인플루엔자 바이러스 외피가 포함된다. 유사하게, RNA 바이러스(예를 들어, 피코르나바이러스과(Picornaviridae), 칼리시바이러스과(Caliciviridae), 아스트로바이러스과(Astroviridae), 토가바이러스과(Togaviridae), 플라비바이러스과(Flaviviridae), 코로나바이러스과(Coronaviridae), 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae), 랍도바이러스과(Rhabdoviridae), 필로바이러스과(Filoviridae), 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae), 분야바이러스과(Bunyaviridae), 아레나바이러스과(Arenaviridae), 레오바이러스과(Reoviridae), 버나바이러스과(Birnaviridae), 레트로바이러스과(Retroviridae)의 RNA 바이러스과) 및 DNA 바이러스(헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae), 써코바이러스과(Circoviridae), 파보바이러스과(Parvoviridae), 파포바바이러스과(Papovaviridae), 아데노바이러스과(Adenoviridae), 헤르페스바이러스과(Herpesviridae), 폭스바이러스과(Poxviridae) 및 이리도바이러스과(Iridoviridae))의 외피를 인코딩하는 유전자가 이용될 수 있다. 대표적인 예에는, FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, 광견병, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 및 EIAV가 포함된다.
일부 구현예에서, 푸소좀 상에 표시하기 위한 외피 단백질에는, 비제한적으로, 하기 공급원 중 임의의 것이 포함된다: A형 인플루엔자, 예컨대 H1N1, H1N2, H3N2 및 H5N1(조류독감), B형 인플루엔자, C형 인플루엔자 바이러스, A형 간염바이러스, B형 간염바이러스, C형 간염바이러스, D형 간염바이러스, E형 간염바이러스, 로타바이러스, 노워크바이러스(Norwalk virus) 군 중 임의의 바이러스, 장아데노바이러스(enteric adenoviruse), 파보바이러스, 뎅기열바이러스, 원숭이수두, 모노네가바이러스목(Mononegavirales), 광견병바이러스와 같은 리사바이러스(Lyssavirus), 라고스박쥐(Lagos bat)바이러스, 모콜라바이러스(Mokola virus), 두벤하게바이러스(Duvenhage virus), 유럽박쥐바이러스 1 & 2, 및 호주박쥐바이러스, 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 베시쿨로바이러스(Vesiculovirus), 수포성구내염바이러스(VSV: Vesicular Stomatitis Virus), 헤르페스바이러스, 예컨대 제1형 및 제2형 단순헤르페스바이러스, 대상포진, 거대세포바이러스, 엡스타인바바이러스(EBV: Epstein-Bar virus), 인간헤르페스바이러스(HHV), 제6형 및 제8형 인간헤르페스바이러스, 인간면역결핍바이러스(HIV), 유두종바이러스, 쥣과 감마헤르페스바이러스, 아레나바이러스, 예컨대 아르헨티나출혈열바이러스, 볼리비아출혈열바이러스, 사비아(Sabia)관련 출혈열바이러스, 베네수엘라출혈열바이러스, 라싸열바이러스(Lassa fever virus), 마추포바이러스(Machupo virus), 림프구맥락수막염바이러스(LCMV), 분야바이러스과, 예컨대 크리미안콩고(Crimean-Congo)출혈열바이러스, 한타바이러스(Hantavirus), 신증후군출혈열 유발 바이러스, 리프트계곡열바이러스(Rift Valley fever virus), 필로바이러스과(필로바이러스)(에볼라출혈열(Ebola hemorrhagic fever) 및 마르부르크출혈열(Marburg hemorrhagic fever) 포함), 플라비바이러스과(카야사나삼림병바이러스(Kaysanur Forest disease virus), 옴스크출혈열바이러스(Omsk hemorrhagic fever virus), 진드기매개뇌염(Tick-borne encephalitis) 유발 바이러스 포함), 및 파라믹소바이러스과, 예컨대 헨드라바이러스 및 니파바이러스, 대두창 및 소두창(두창(smallpox)), 알파바이러스, 예컨대 베네수엘라말뇌염바이러스, 동부말뇌염바이러스, 서부말뇌염바이러스, 사스관련(SARS 관련) 코로나바이러스(SARS-CoV), 웨스턴나일바이러스(West Nile virus), 임의의 뇌염 유발바이러스.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 원천세포는 VSV-G 당단백질로 위형화된 푸소좀, 예를 들어 재조합 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스를 생성한다.
푸소좀 또는 위형화된 바이러스는 일반적으로 하나 이상 외피 단백질에 대한 변형을 가지며, 예를 들어 외피 단백질은 또 다른 바이러스로부터의 외피 단백질로 치환된다. 예를 들어, HIV는 랍도바이러스로 유래의 융합 단백질, 예를 들어 수포성구내염바이러스 G-단백질(VSV-G) 외피 단백질로 위형화될 수 있으며, 이는 (env 유전자에 의해 인코딩된) HIV 외피 단백질이 일반적으로 바이러스를 CD4+ 제시세포에 대하여 표적화하기 때문에, HIV가 넓은 범위의 세포를 감염시키는 것을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 외피 단백질은 VSV-G로 위형화된 것이다. 하나의 구현예에서, 원천세포는 VSV-G 외피 당단백질로 위형화된 재조합 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스를 생성한다.
나아가, 푸소겐 또는 바이러스 외피 단백질은, 이의 정상 범위를 벗어난 숙주세포를 표적화하고 감염시키거나, 또는 세포 또는 조직 유형에 대한 형질도입을 더 특이적으로 제한하는 것을 가능하게 하는 폴리펩타이드 서열을 함유하도록 변형 또는 조작될 수 있다. 예를 들어, 푸소겐 또는 외피 단백질은 형질도입 벡터 코트 상에 표시될 때, 관심 표적세포에의 비리온 입자의 지시된 전달을 용이하게 하는, 수용체 리간드, 항체(항체의 항원-결합 부분, 또는 단일 사슬 항체와 같은 재조합 항체 유형의 분자 사용), 및 폴리펩타이드 모이어티 또는 이의 변형(예를 들어, 글리코실화 부위가 표적화 서열에 존재하는 경우)과 같은 표적화 서열과 프레임 내 결합될 수 있다. 나아가, 외피 단백질은 세포 기능을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 형질도입 벡터로 세포 기능을 조절하면, 혼합 세포 집단에서 특정 세포 유형에 대한 형질도입 효율을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 줄기세포에는 혈액 또는 골수에서 발견되는 다른 세포 유형보다 줄기세포에 특이적으로 결합하는 리간드 또는 결합 파트너를 함유하는 외피 서열이 더 특이적으로 형질도입될 수 있다. 비제한적인 예는, 줄기세포인자(SCF) 및 Flt-3 리간드이다. 다른 예에는, 예를 들어 항체(예를 들어, 세포 유형에 특이적인 단일 사슬 항체), 및 본질적으로 폐, 간, 췌장, 심장, 내피, 평활근, 유방, 전립선, 상피, 혈관 암 등과 같은 조직에 결합하는 임의의 항원(수용체 포함)이 포함된다.
단백질 푸소겐 또는 바이러스 외피 단백질은 융합 단백질 또는 표적화 단백질(예를 들어, 헤마글루티닌 단백질)에서 아미노산 잔기를 돌연변이화시킴으로써 재표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소겐은 무작위로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 푸소겐은 순리적으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 푸소겐은 유도 진화를 거친다. 일부 구현예에서, 푸소겐은 절단되어, 펩타이드의 서브세트만 레트로바이러스 벡터 또는 VLP에 사용된다. 예를 들어, 홍역 헤마글루티닌 단백질의 아미노산 잔기가 돌연변이되어, 단백질의 결합 특성을 변경시킴으로써 융합을 재지시할 수 있다(doi:10.1038/nbt942, 문헌[Molecular Therapy vol. 16 no. 8, 1427-1436 Aug. 2008], doi:10.1038/nbt1060, DOI: 10.1128/JVI.76.7.3558-3563.2002, DOI: 10.1128/JVI.75.17.8016-8020.2001, doi: 10.1073pnas.0604993103).
일부 구현예에서, 단백질 푸소겐 또는 바이러스 외피 단백질은, i) 천연 푸소겐 단백질 서열 또는 바이러스 외피 단백질 서열에 존재하는 아미노산을 돌연변이화시키고/시키거나, ii) 푸소겐 또는 바이러스 외피 단백질이 정상 범위를 벗어난 숙주세포를 표적화하고 융합하거나 감염시킬 수 있는 폴리펩타이드 서열을 함유하도록 푸소겐 단백질 또는 바이러스 외피 단백질을 조작함으로써 재표적화된다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 특정 세포 또는 조직 유형을 표적화하기 위해 이의 외부 표면(예를 들어, 세포막에 통합됨)에 하나 이상의 푸소겐을 포함한다. 푸소겐에는, 비제한적으로, 단백질 기반, 지질 기반 및 화합물 기반 푸소겐이 포함된다. 푸소겐은 표적세포의 표면에서 파트너와 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소겐을 포함하는 푸소좀은 막을 표적세포의 지질 이중층으로 통합시킬 것이다.
일부 구현예에서, 푸소겐은 파라믹소바이러스 푸소겐이다. 일부 구현예에서, 푸소겐은 니파바이러스 단백질 F, 홍역바이러스 F 단백질, 투파이아 파라믹소바이러스 F 단백질, 파라믹소바이러스 F 단백질, 헨드라바이러스 F 단백질, 헤니파바이러스 F 단백질, 모빌리바이러스 F 단백질, 레스피로바이러스 F 단백질, 센다이바이러스 F 단백질, 루불라바이러스 F 단백질 또는 아불라바이러스 F 단백질이다.
일부 구현예에서, 푸소겐은 폭스바이러스과 푸소겐이다.
추가의 예시적인 푸소겐은 US 9,695,446, US 2004/0028687, US 6,416,997, US 7,329,807, US 2017/0112773, US 2009/0202622, WO 2006/027202 및 US 2004/0009604에 개시되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소겐은 표 1의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기 서열의 일부, 예를 들어 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 600개 아미노산 길이의 부분과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소겐은 표 1의 임의의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 서열은 표 1의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기 서열의 일부, 예를 들어 40개, 50개, 60개, 80개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 600개 아미노산 길이의 부분과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소겐은 서열번호 1 내지 57 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기 서열의 일부, 예를 들어 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 600개 아미노산 길이의 부분과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소겐은 서열번호 1 내지 57 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 서열은 서열번호 1 내지 57 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기 서열의 일부, 예를 들어 40개, 50개, 60개, 80개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 600개 아미노산 길이의 부분과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다.
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일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소겐은 표 2의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기 서열의 일부, 예를 들어 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 600개 아미노산 길이의 부분과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소겐은 표 2의 임의의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 서열은 표 2의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기 서열의 일부, 예를 들어 40개, 50개, 60개, 80개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 600개 아미노산 길이의 부분과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소겐은 서열번호 58 내지 133 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기 서열의 일부, 예를 들어 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 600개 아미노산 길이의 부분과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소겐은 서열번호 58 내지 133 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산 서열은 서열번호 58 내지 133 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 상기 서열의 일부, 예를 들어 40개, 50개, 60개, 80개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 600개 아미노산 길이의 부분과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다.
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ii) 지질 푸소겐
일부 구현예에서, 푸소좀은 융합성 지질, 예컨대 포화 지방산으로 처리될 수 있다. 일부 구현예에서, 포화 지방산은 10개 내지 14개의 탄소를 갖는다. 일부 구현예에서, 포화 지방산은 장쇄 카르복실산을 갖는다. 일부 구현예에서, 포화 지방산은 모노에스테르이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 불포화 지방산으로 처리될 수 있다. 일부 구현예에서, 불포화 지방산은 C16 내지 C18 불포화 지방산을 갖는다. 일부 구현예에서, 불포화 지방산에는, 올레산, 글리세롤 모노올레에이트, 글리세리드, 디아실글리세롤, 변형된 불포화 지방산 및 이들의 임의의 조합이 포함된다.
이론에 구애됨 없이, 일부 구현예에서, 음의 곡률을 갖는 지질은 막 융합을 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 막에 하나 이상의 음의 곡률을 갖는 지질, 예를 들어 원천세포에 대해 외인성인 음의 곡률을 갖는 지질을 포함한다. 구현예에서, 음의 곡률을 갖는 지질 또는 이의 전구체가 원천세포 또는 푸소좀을 포함하는 배지에 첨가된다. 구현예에서, 원천세포는 하나 이상의 지질 합성 유전자를 발현 또는 과발현하도록 조작된다. 음의 곡률을 갖는 지질은, 예를 들어 디아실글리세롤(DAG), 콜레스테롤, 포스파티드산(PA), 포스파티딜에탄올아민(PE) 또는 지방산(FA)일 수 있다.
이론에 구애됨 없이, 일부 구현예에서, 양의 곡률을 갖는 지질은 막 융합을 저해한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 막에 감소된 수준의 하나 이상의 양의 곡률을 갖는 지질, 예를 들어 외인성 양의 곡률을 갖는 지질을 포함한다. 구현예에서, 상기 수준은 원천세포에서 지질의 합성을 저해함으로써, 예를 들어 지질 합성 유전자의 녹아웃 또는 녹다운에 의해 감소된다. 양의 곡률을 갖는 지질은, 예를 들어 리소포스파티딜콜린(LPC), 포스파티딜이노시톨(PtdIns), 리소포스파티드산(LPA), 리소포스파티딜에탄올아민(LPE) 또는 모노아실글리세롤(MAG)일 수 있다.
iii) 화학물질 푸소겐
일부 구현예에서, 푸소좀은 융합성 화학물질로 처리될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합성 화학물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 유도체이다.
일부 구현예에서, 화학물질 푸소겐은 2개의 막 사이에서 국소적 탈수를 유도하며, 이는 이중층의 바람직하지 않은 분자 패킹으로 이어진다. 일부 구현예에서, 화학물질 푸소겐은 지질 이중층 근처 영역의 탈수를 유도하여, 세포 사이의 수성 분자의 변위를 야기하고, 2개의 막 사이의 상호작용을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 화학물질 푸소겐은 양이온이다. 양이온의 일부 비제한적인 예에는, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, La3+, Sr3+ 및 H+이 포함된다.
일부 구현예에서, 화학물질 푸소겐은 표면 극성을 변경함으로써 표적 막에 결합하며, 이는 수화 의존성 막간 반발을 변경시킨다.
일부 구현예에서, 화학물질 푸소겐은 가용성 지질이다. 일부 비제한적인 예에는, 올레오일글리세롤, 디올레오일글리세롤, 트리올레오일글리세롤, 및 이의 변이체 및 유도체가 포함된다.
일부 구현예에서, 화학물질 푸소겐은 수용성 화학물질이다. 일부 비제한적인 예에는, 폴리에틸렌 글리콜, 디메틸술폭시드, 및 이의 변이체 및 유도체가 포함된다.
일부 구현예에서, 화학물질 푸소겐은 작은 유기 분자이다. 비제한적인 예에는, n-헥실 브로마이드가 포함된다.
일부 구현예에서, 화학물질 푸소겐은 푸소겐 또는 표적 막의 구성, 세포 생존능 또는 이온 수송 특성을 변경시키지 않는다.
일부 구현예에서, 화학물질 푸소겐은 호르몬 또는 비타민이다. 일부 비제한적인 예에는, 아브시스산, 레티놀(비타민 A1), 토코페롤(비타민 E), 및 이의 변이체 및 유도체가 포함된다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 액틴, 및 중합된 액틴을 안정화시키는 작용제를 포함한다. 이론에 구애됨 없이, 푸소좀에서 안정화된 액틴은 표적세포와의 융합을 촉진시킬 수 있다. 구현예에서, 중합된 액틴을 안정화시키는 작용제는 액틴, 미오신, 비오틴-스트렙타비딘, ATP, 뉴런의 비스코트-올드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군 단백질(N-WASP) 또는 포르민에서 선택된다. 예를 들어, 문헌[Langmuir. 2011 Aug 16;27(16):10061-71] 및 문헌[Wen et al., Nat Commun. 2016 Aug 31;7] 참조. 구현예에서, 푸소좀은 원천세포에 대해 외인성이거나 과발현된 액틴, 예를 들어 야생형 액틴 또는 중합을 촉진시키는 돌연변이를 포함하는 액틴을 포함한다. 구현예에서, 푸소좀은 ATP 또는 포스포크레아틴, 예를 들어 외인성 ATP 또는 포스포크레아틴을 포함한다.
iv) 소분자 푸소겐
일부 구현예에서, 푸소좀은 융합성 소분자로 처리될 수 있다. 일부 비제한적인 예에는, 할로탄(halothane), 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 예컨대 멜록시캄(meloxicam), 피록시캄(piroxicam), 테녹시캄(tenoxicam) 및 클로르프로마진(chlorpromazine)이 포함된다.
일부 구현예에서, 소분자 푸소겐은 미셀 유사 응집체에 존재하거나 응집체가 없을 수 있다.
v) 푸소겐 변형
일부 구현예에서, 푸소겐은 절단 가능한 단백질에 연결된다. 일부 경우에, 절단 가능한 단백질은 프로테아제에의 노출에 의해 절단될 수 있다. 조작된 융합 단백질은 막관통 단백질의 임의의 도메인에 결합할 수 있다. 조작된 융합 단백질은 절단 펩타이드에 의해 막사이 공간 내 위치한 단백질 도메인에 연결될 수 있다. 절단 펩타이드는 막사이 프로테아제 중 하나 또는 조합(예를 들어, P1 위치에 비극성 지방족 아미노산(발린, 이소류신 또는 메티오닌이 바람직함), 및 P2 위치 및 P3 위치에 친수성 잔기(아르기닌이 바람직함)를 필요로 하는 HTRA2/OMI)에 의해 절단될 수 있다.
일부 구현예에서, 푸소겐은 친화성 태그에 연결된다. 일부 구현예에서, 친화성 태그는 푸소좀 분리 및 단리를 돕는다. 일부 구현예에서, 친화성 태그는 절단 가능하다. 일부 구현예에서, 친화성 태그는 푸소겐에 비공유결합으로 연결된다. 일부 구현예에서, 친화성 태그는 푸소좀에 존재하며, 푸소겐과 분리되어 있다.
일부 구현예에서, 푸소겐 단백질은 단백질 분해 서열, 예를 들어 미토콘드리아 또는 시토졸 분해 서열을 포함하도록, 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 조작된다. 푸소겐 단백질은, 비제한적으로, 단백질 분해 서열, 예를 들어 카스파아제 2 단백질 서열(예를 들어, Val-Asp-Val-Ala-Asp-|-(서열번호 155)) 또는 다른 단백질 분해 서열(예를 들어, 문헌[Gasteiger et al., The Proteomics Protocols Handbook; 2005: 571-607] 참조), 야생형 단백질 분해 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%(또는 그 이상)의 동일성을 갖는 변형된 단백질 분해 서열, 시토졸 단백질 분해 서열, 예를 들어 유비퀴틴, 또는 야생형 단백질 분해 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%(또는 그 이상)의 동일성을 갖는 변형된 시토졸 단백질 분해 서열을 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 단백질 분해 서열, 예를 들어 야생형 단백질 분해 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%(또는 그 이상) 동일한 단백질 분해 서열, 시토졸 단백질 분해 서열, 예를 들어 유비퀴틴, 또는 야생형 단백질 분해 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 변형된 시토졸 단백질 분해 서열로 변형된 단백질을 포함하는 콘드리오솜 또는 원천세포 내 미토콘드리아를 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소겐은 특정 단백질, 예를 들어 프로테아제의 과발현, 예를 들어 프로테아제 활성을 갖는 조작된 융합 단백질을 인식하는 프로테아제 도메인으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제, 또는 프로테아제의 프로테아제 도메인, 예컨대 MMP, 미토콘드리아 처리 펩티다아제, 미토콘드리아 중간체 펩티다아제, 내막 펩티다아제.
문헌[Alfonzo, J.D. & Soll, D. Mitochondrial tRNA import - the challenge to understand has just begun. Biological Chemistry 390: 717-722. 2009]; 문헌[Langer, T. et al. Characterization of Peptides Released from Mitochondria. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol. 280, No. 4. 2691-2699, 2005]; 문헌[Vliegh, P. et al. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug Discovery Today. 15(1/2). 2010]; 문헌[Quiros P.M.m et al., New roles for mitochondrial proteases in health, ageing and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. V16, 2015]; 문헌[Weber-Lotfi, F. et al. DNA import competence and mitochondrial genetics. Biopolymers and Cell. Vol. 30. N 1. 71-73, 2014] 참조.
III. 양성 표적세포 특이적 조절 요소
일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀, 예를 들어 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스는, 조직 특이적 프로모터, 조직 특이적 인핸서, 조직 특이적 스플라이스 부위, RNA 또는 단백질의 반감기를 연장시키는 조직 특이적 부위, 조직 특이적 mRNA 핵 방출 촉진 부위, 조직 특이적 번역 증강 부위 또는 조직 특이적 번역 후 변형 부위와 같은 양성 표적세포 특이적 조절 요소를 포함하는 핵산(예를 들어, 외인성 작용제를 인코딩하는 유전자), 예를 들어 레트로바이러스 핵산을 함유한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀, 예를 들어 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스는, 영역, 예를 들어 복제 기점, 선별 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(샤인 달가노(Shine Dalgarno) 서열 또는 코작(Kozak) 서열), 인트론, 폴리아데닐화 서열, 5' 및 3' 미번역 영역과 같은 미번역 영역(이는 숙주세포 단백질과 상호작용하여 전사 및 번역을 수행하고, 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사 또는 발현을 지시, 증가, 조절 또는 제어할 수 있음)을 포함할 수 있는 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산을 함유한다. 이러한 요소는 이의 강도 및 특이성이 다양할 수 있다. 이용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 유비쿼터스 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함하는 임의의 수의 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 제어 요소는 세포 특이적 방식으로 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사 또는 발현을 지시, 증가, 조절 또는 제어할 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산은 특정 세포, 세포 유형 또는 세포 계통, 예를 들어 표적세포에 특이적인 하나 이상의 발현 제어 서열을 포함하며; 즉, 특정 세포, 세포 유형 또는 세포 계통에 특이적인 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드의 발현은 비표적세포가 아닌 표적세포에서 발현된다(또는 비표적세포에서 더 낮은 수준으로 발현됨).
특정 구현예에서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산은 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 외인성, 내인성 또는 이종 제어 서열을 포함할 수 있다.
구현예에서, 프로모터는 RNA 폴리머라아제에 결합하는 인식 부위를 포함한다. RNA 폴리머라아제는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 개시하고 전사한다. 특정 구현예에서, 포유류 세포에서 작동하는 프로모터는 전사가 개시되는 부위에서 대략 25개 내지 30개 염기 업스트림에 위치하는 AT 풍부 영역 및/또는 전사의 시작으로부터 70개 내지 80개 염기 업스트림에서 발견되는 또 다른 서열인, CNCAAT 영역(여기서 N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있음)을 포함한다.
구현예에서, 인핸서는 증강된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 분절을 포함하며, 일부 예에서 또 다른 제어 서열에 대한 배향에 관계없이 기능할 수 있다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협력적으로 또는 이에 부가적으로 기능할 수 있다. 일부 구현예에서, DNA의 프로모터/인핸서 분절은 프로모터 및 인핸서 기능을 모두 제공할 수 있는 서열을 함유한다.
예시적인 유비쿼터스 발현 제어 서열에는, 비제한적으로, 거대세포바이러스(CMV) 극초기 프로모터, 원숭이바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 또는 후기), 몰로니 쥐 백혈병바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 라우스육종 바이러스(RSV) LTR, 단순헤르페스바이러스(HSV)(티미딘 키나아제) 프로모터, 백시니아바이러스로부터의 H5, P7.5 및 P11 프로모터, 연장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1), 페리틴 H(FerH), 페리틴 L(FerL), 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나아제(GAPDH), 진핵세포 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1), 열충격 70 kDa 단백질 5(HSPA5), 열충격 단백질 90 kDa 베타, 멤버 1(HSP90B1), 열충격 단백질 70 kDa(HSP70), β-키네신(β-KIN), 인간 ROSA 26 유전자좌(문헌[Orions et al., Nature Biotechnology 25, 1477-1482 (2007)]), 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터, β-액틴 프로모터, 및 음성 대조군 영역이 결실되고, d1587rev 프라이머 결합 부위가 치환된 골수증식성 육종바이러스 인핸서(MND) 프로모터(문헌[Challita et al., J Virol. 69(2):748-55 (1995)])가 포함된다.
일부 구현예에서, 프로모터는 이종 유전자에 그 프로모터의 조절 기능을 부여하기 위해 이종 유전자와 쌍을 이룰 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 유전자의 프로모터로부터의 시스-조절 요소는 상이한 유전자의 프로모터의 분절에 연결되어 두 가지 프로모터의 특성을 갖는 키메라 프로모터를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터, 예를 들어 CNS세포, 예를 들어 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포에서 발현을 유도하는 프로모터이다. 다양한 적합한 CNS세포 특이적 프로모터는 하기 표 3에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀(예를 들어, 바이러스 벡터)은, 이의 핵산에, 표 3의 프로모터 서열을 갖는 프로모터, 또는 이의 전사 활성 단편, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀(예를 들어, 바이러스 벡터)은 이의 핵산에, 표 3에 열거된 유전자에 대한 전사 개시 부위의 3 kb 이내 영역에 전사인자 결합 부위를 갖는 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀(예를 들어, 바이러스 벡터)은 이의 핵산에, 표 3에 열거된 유전자에 대한 전사 개시 부위의 바로 업스트림에서 2.5 kb, 2 kb, 1.5 kb, 1 kb 또는 0.5 kb 이내 영역, 또는 이의 전사 활성 단편, 또는 이와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
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일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 문헌[Hioki et al., Ther. 2007 Jun;14(11):872-82](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 SYN, NSE, CaMKII, α튜불린 또는 PDGF 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 문헌[Nathanson et al., Front. Neural Circuits, 2009, 3:19. doi: 10.3389/neuro.04.019.2009](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 fSST 또는 fNPY 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 문헌[Delzor et al., Hum Gene Ther Methods. 2012 Aug;23(4):242-54](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 GAD67 또는 DLX5/6 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 문헌[Egashira et al., Sci Rep. 2018 Oct 11;8(1):15156](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 VGLUT1 또는 Dock10 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 문헌[Naciff et al., J. Neurochem., 1999 Jan;72(1):17-28](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 ChAT 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 VAChT 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 문헌[Delzor et al., Hum Gene Ther Methods. 2012 Aug; 23(4): 242-254](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 Drd1a 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 문헌[Benzekhroufa et al., Gene Ther. 2009 May;16(5):681-8](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 TPH-2 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 문헌[Merienne et al., Gene Ther. 2015 Oct;22(10):830-9](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 GFAP, EAAT1 또는 GS 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 Immgen 컨소시엄(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 CX3CR1 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 TMEM119 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 문헌[McIver et al., J Neurosci Res. 2005 Nov 1;82(3):397-403](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 MBP 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 문헌[Kagiava et al., J Gene Med. 2014 Nov-Dec;16(11-12):364-73](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 MBP 또는 CNP 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 문헌[Regev et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Mar 2;107(9):4424-9](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 프로모터이며, 예를 들어 CNS세포 특이적 프로모터는 CRFR2β 프로모터이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 상기 중 임의의 것의 전사 활성 단편이다. 일부 구현예에서, CNS세포 특이적 프로모터는 상기 중 임의의 것과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 변이체이다.
내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 전형적으로 시스트론(단백질 인코딩 영역)의 ATG와 같은 개시 코돈으로의 직접적인 내부 리보솜 진입을 촉진시켜, 유전자의 cap-독립적 번역을 유도한다. 예를 들어, 문헌[Jackson et al, (1990) Trends Biochem Sci 15(12):477-83] 및 문헌[Jackson and Kaminski. (1995) RNA 1 (10):985-1000] 참조. 특정 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 외인성 작용제를 인코딩하는 하나 이상의 외인성 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 외인성 단백질 작용제 각각의 효율적인 번역을 달성하기 위해, 폴리뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 IRES 서열 또는 자가 절단 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 분리될 수 있다.
본원의 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산은 또한 하나 이상의 코작 서열, 예를 들어 mRNA의 리보솜의 작은 서브유닛에의 초기 결합을 용이하게 하고 번역을 증가시키는 짧은 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 공통 코작 서열은 (GCC)RCCATGG이며, 여기서 R은 퓨린(A 또는 G)이다(문헌[Kozak, (1986) Cell. 44(2):283-92], 및 문헌[Kozak, (1987) Nucleic Acids Res. 15(20): 8125-48]).
이종 전사인자 및 유도인자에 반응하는 프로모터
일부 구현예에서, 핵산, 레트로바이러스 핵산은 외인성 작용제의 조건부 발현, 예를 들어, 비제한적으로, 유도성 발현; 억제성 발현; 세포 유형 특이적 발현 또는 조직 특이적 발현을 포함하는 임의의 유형의 조건부 발현을 가능하게 하는 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제의 조건부 발현을 달성하기 위해, 발현은 외인성 작용제의 발현을 유도하거나, 외인성 작용제의 발현을 증가 또는 감소시키는 처리 또는 조건에 세포, 조직 또는 유기체를 적용함으로써 제어된다.
유도성 프로모터/시스템의 예시적인 예에는, 비제한적으로, 글루코코르티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 인코딩하는 유전자에 대한 프로모터와 같은 스테로이드 유도성 프로모터(상응하는 호르몬으로의 처리에 의해 유도 가능), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속으로의 처리에 의해 유도 가능), MX-1 프로모터(인터페론에 의해 유도 가능), "GeneSwitch" 미페프리스톤(mifepristone)-조절 시스템(문헌[Sirin et al., 2003, Gene, 323:67]), 큐메이트 유도성 유전자 스위치(WO 2002/088346), 테트라사이클린 의존성 조절 시스템 등이 포함된다.
전이유전자 발현은 유도 분자의 존재 또는 부재에 의해 활성화 또는 억제될 수 있다. 일부 경우에, 유도 분자는 단계적으로 유전자 발현을 활성화시키거나 억제하고, 일부 경우에 유도 분자는 양자택일 방식으로 유전자 발현을 활성화시키거나 억제한다.
통상적으로 사용되는 유도성 프로모터/시스템은 테트라사이클린(Tet)-조절 시스템이다. Tet 시스템은 각각의 표적세포에서 다음 2가지 요소의 동시발현을 기반으로 한다: (i) 최소 프로모터에 융합되고 관심 유전자(예를 들어, 외인성 작용제를 인코딩하는 유전자)에 연결된 Tet-작동자 서열(TetO)의 반복을 함유하는 테트라사이클린 반응 요소, 및 (ii) Tet-억제자(TetR)와 단순헤르페스바이러스 유래 VP16 단백질의 트랜스활성화 도메인의 융합 단백질인 전사 트랜스활성화제(tTA). 본래 기재된 버전에서, 전이유전자 발현은 Tet-OFF 시스템으로 지칭되는, 테트라사이클린 또는 이의 강력한 유사체인 독시사이클린(Do)의 부재 하에서 활성이었으나, 트랜스활성화제 단백질 내 4가지 아미노산의 변형은 Dox의 존재 하에서 TetO에만 결합하는(Tet-ON 시스템) 역방향 tTA(rtTA)를 유도하였다. 일부 구현예에서, 트랜스활성화제에서, VP16 도메인이 최소 활성화 도메인으로 대체되고, 잠재적 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수용체 부위가 제거된 후, 단백질이 코돈 최적화되어, Dox에 대한 높은 감수성 및 낮은 기준선 활성을 갖는 개선된 트랜스활성화제 변이체 rtTA2S-M2가 생성되었다. 나아가, 조절을 증강시키기 위해 이웃하는 작동자로부터 36개 뉴클레오타이드 간격을 갖는 TetO에서의 변형을 포함하는 상이한 Tet-반응성 프로모터 요소가 생성되었다. 추가의 변형은 기저 활성을 추가로 감소시키고 발현 동적 범위를 추가로 증가시키는 데 유용할 수 있다. 예로서, pTet-T11(약어: TII) 변이체는 높은 동적 범위 및 낮은 배경 활성을 나타낸다.
조건부 발현은 또한 부위 특이적 DNA 재조합효소를 사용하여 달성될 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산은 부위 특이적 재조합효소, 예를 들어 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 7개, 10개, 12개, 15개, 20개, 30개, 50개 등)의 재조합 부위가 관여하는 재조합 반응에 관여하며, 야생형 단백질(문헌[Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)] 참조), 또는 이의 돌연변이, 유도체(예를 들어, 재조합 단백질 서열 또는 이의 단편을 함유하는 융합 단백질), 단편 및 변이체일 수 있는, 절단성 또는 통합성 단백질, 효소, 보조인자 또는 관련 단백질에 의해 매개되는 재조합을 위한 적어도 하나(전형적으로 2개)의 부위(들)를 포함한다. 재조합효소의 예시적인 예에는, 비제한적으로, Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 레솔베이즈(resolvase), TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 및 ParA가 포함된다.
외인성 작용제 발현을 조절하는 리보스위치(riboswitch)
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 일부는 하나 이상의 리보스위치, 또는 하나 이상의 리보스위치를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 리보스위치는 유전자 발현을 조절하는 박테리아의 일반적인 특징이며, 생물학적 기능의 RNA 제어를 달성하는 수단이다. 리보스위치는 mRNA의 5'-미번역 영역에 존재할 수 있으며, 리보스위치 활성을 유도하거나 억제하는 소분자 리간드의 결합을 통해 유전자 발현에 대한 조절 제어를 가능하게 할 수 있다. 일부 구현예에서, 리보스위치는 소분자 리간드의 생성에 관여하는 유전자 산물을 제어한다. 리보스위치는 전형적으로 시스-방식으로 작용하지만, 트랜스-방식으로 작용하는 리보스위치도 확인되었다. 천연 리보스위치는 3차원 접힘 RNA 구조를 통해 리간드에 결합하는 압타머 도메인과, 리간드의 존재 또는 부재를 기반으로 리보스위치의 활성을 유도하거나 억제하는 기능 전환 도메인의 2개의 도메인으로 이루어진다. 따라서, 리보스위치에 달성되는 온/오프 상태를 나타내는 2가지 리간드 민감성 입체형태가 존재한다(Garst 등의 문헌(2011)). 기능 전환 도메인은 내부 리보솜 진입 부위, 레트로바이러스 유전자 구조체에서의 pre-mRNA 스플라이스 공여체 접근성, 번역, 전사 종결, 전사체 분해, miRNA 발현 또는 shRNA 발현을 조절함으로써 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 미칠 수 있다(Dambach 및 Winkler의 문헌(2009)). 압타머 및 기능 전환 도메인은 합성 RNA 장치가 천연 압타머, 돌연변이된/진화된 천연 압타머, 또는 무작위 RNA 라이브러리 스크리닝에서 확인된 완전 합성 압타머로 유전자 발현을 제어할 수 있도록 모듈식 구성요소로서 사용될 수 있다(McKeague 등의 문헌(2016)).
퓨린 리보스위치 패밀리는 500개 초과의 서열이 발견된 가장 큰 패밀리 중 하나를 나타낸다(Mandal 등의 문헌(2003); US20080269258; 및 WO2006055351). 퓨린 리보스위치는 루프/접합 요소(J1-2, L2, J2-3, L3, J3-1)가 개재되는 3개의 보존된 나선 요소/줄기 구조(PI, P2, P3)로 이루어진 유사한 구조를 공유한다. 리보스위치의 퓨린 패밀리의 압타머 도메인은 서열 변이로 인한 아데닌, 구아닌, 아데노신, 구아노신, 데옥시아데노신, 데옥시구아노신 등과 같은 다양한 퓨린 화합물에 의해 이의 친화성/조절이 본질적으로 다양하다(Kim 등의 문헌(2007)).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산은 프로모터 및 리보스위치에 작동 가능하게 연결된 외인성 작용제를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 리보스위치는 다음 중 하나 이상, 예를 들어 전부를 포함한다: a) 압타머 도메인, 예를 들어 뉴클레오시드 유사체 항바이러스 약물에 결합할 수 있고, 뉴클레오시드 유사체 항바이러스 약물에 비해 구아닌 또는 2'-데옥시구아노신에 대한 결합이 감소된 압타머 도메인; 및 b) 기능 전환 도메인, 예를 들어 외인성 작용제의 발현을 조절할 수 있는 기능 전환 도메인(여기서, 압타머 도메인에 의한 뉴클레오시드 유사체의 결합이 기능 전환 도메인의 활성을 조절하는 발현을 유도하거나 억제하여, 외인성 작용제의 발현을 조절함). 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 폴리펩타이드, miRNA 또는 shRNA일 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 리보스위치는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 본원에 제공된 비제한적인 예시적인 예에서, 외인성 유전자는 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩한다. 예를 들어, 리보스위치와 하나 이상의 조작된 신호전달 폴리펩타이드를 인코딩하는 표적 폴리뉴클레오타이드는, 원천세포의 게놈에서, 복제 불능 재조합 레트로바이러스 입자에서, T세포 및/또는 NK세포에서 확인할 수 있다.
압타머 도메인은, 예를 들어 모듈식 구성요소로서 사용될 수 있고, RNA 전사체에 영향을 미치는 기능 전환 도메인 중 임의의 것과 조합될 수 있다. 본원에 개시된 임의의 구현예에서, 리보스위치는 내부 리보솜 진입 부위(IRES), pre-mRNA 스플라이스 공여체 접근성, 번역, 전사 종결, 전사체 분해, miRNA 발현 또는 shRNA 발현과 같은 활성 중 임의의 것을 조절하여 RNA 전사체에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 기능 전환 도메인은 항-IRES의 IRES에의 결합을 제어할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ogawa, RNA(2011), 17:478- 488](이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨) 참조). 본원에 개시된 임의의 구현예에서, 소분자 리간드의 존재 또는 부재는 리보스위치가 RNA 전사체에 영향을 미치게 할 수 있다. 일부 구현예에서, 리보스위치는 리보자임을 포함할 수 있다. 리보자임을 갖는 리보스위치는 소분자 리간드의 존재 하에서 표적 폴리뉴클레오타이드의 전사체 분해를 저해하거나 증강시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 리보자임은 피스톨(pistol)형 리보자임, 해머헤드(hammerhead)형 리보자임, 뒤틀린(twisted)형태의 리보자임, 손도끼(hatchet)형 리보자임 또는 HDV(간염 델타 바이러스)일 수 있다.
IV. 비표적세포 특이적 조절 요소
일부 구현예에서, 비표적세포 특이적 조절 요소 또는 음성 TCSRE는 조직 특이적 miRNA 인식 서열, 조직 특이적 프로테아제 인식 부위, 조직 특이적 유비퀴틴 리가아제 부위, 조직 특이적 전사 억제 부위 또는 조직 특이적 후성적 억제 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 비표적세포는 내인성 miRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀, 예를 들어 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스는, 해당 miRNA에 대한 인식 서열을 포함할 수 있는 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산(예를 들어, 외인성 작용제를 인코딩하는 유전자)을 함유한다. 따라서, 핵산, 레트로바이러스 핵산이 비표적세포에 들어가면, miRNA는 외인성 작용제의 발현을 하향조절할 수 있다. 이는 비표적세포에 비해 표적세포에 대하여 부가적인 특이성을 달성하는 것을 돕는다.
일부 구현예에서, miRNA는 전형적으로 pre-miRNA로 공지된 약 70개 뉴클레오타이드 폴드백(foldback) RNA 전구체 구조에서 절제된, 20개 내지 22개 뉴클레오타이드의 작은 비코딩 RNA이다. 일반적으로, miRNA는 miRNA와 표적 사이의 상보성 정도에 따라 2가지 방식 중 하나로 이의 표적을 부정적으로 조절한다. 첫 번째로, 단백질 코딩 mRNA 서열에 완벽하거나 거의 완벽하게 상보적으로 결합하는 miRNA는 전형적으로 RNA 매개 간섭(RNAi) 경로를 유도한다. mRNA 표적의 3' 미번역 영역(UTR) 내 불완전한 상보적 부위에 결합함으로써 이의 조절 효과를 발휘하는 miRNA는, 전형적으로 RNAi 경로에 사용되는 바와 유사하거나 가능하게는 동일한 RISC 복합체를 통해 명백히 번역 수준에서 전사 후 표적 유전자 발현을 억제한다. 번역 제어와 일치하게, 이러한 메커니즘에 사용되는 miRNA는 이의 표적 유전자의 단백질 수준을 감소시키지만, 이러한 유전자의 mRNA 수준은 최소한의 영향만을 받는다. miRNA(예를 들어, 자연 발생 miRNA 또는 인공적으로 설계된 miRNA)는 임의의 mRNA 서열을 특이적으로 표적화할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 당업자는 인간 miRNA(예를 들어, miR-30 또는 miR-21) 1차 전사체로서 발현되는 짧은 헤어핀 RNA 구조체를 설계할 수 있다. 이러한 설계는 헤어핀 구조체에 드로샤(Drosha) 처리 부위를 부가한 것으로, 이는 녹다운 효율을 크게 증가시키는 것으로 나타났다(Pusch 등의 문헌(2004)). 헤어핀 줄기는 22-nt의 dsRNA(예를 들어, 안티센스는 목적하는 표적에 대하여 완벽한 상보성을 나타냄)와 인간 miR로부터의 15 내지 19-nt 루프로 이루어진다. 헤어핀의 한쪽 또는 양쪽에 miR 루프와 miR30 측면 서열을 부가하면, 마이크로RNA가 없는 통상의 shRNA 설계에 비해, 발현된 헤어핀의 드로샤 및 다이서(Dicer) 처리가 10배 초과로 증가된다. 증가된 드로샤 및 다이서 처리는 보다 큰 siRNA/miRNA 생산 및 발현된 헤어핀의 보다 큰 효능으로 번역된다.
수백 개의 개별 miRNA 유전자는 발달 동안 조직 유형에 따라 차등적으로 발현된다. 몇몇 연구는 발달 시기, 세포 분화, 증식, 세포자멸사, 종양발생, 인슐린 분비 및 콜레스테롤 생합성을 포함하는 광범위한 생물학적 과정에서 miRNA에 대한 중요한 조절 역할을 시사하였다. (문헌[Bartel 2004 Cell 116:281-97]; 문헌[Ambros 2004 Nature 431:350-55]; 문헌[Du et al. 2005 Development 132:4645-52]; 문헌[Chen 2005 N. Engl. J. Med. 353:1768-71]; 문헌[Krutzfeldt et al. 2005 Nature 438:685-89] 참조). 분자 분석은, miRNA가 상이한 조직에서 별개의 발현 프로파일을 나타냄을 보여주었다. 대략 7,000개의 예측된 인간 miRNA 표적의 발현을 분석하기 위해 컴퓨터를 이용한 방법을 사용하였다. 데이터는, miRNA 발현이 다수의 인간 조직에서 mRNA 발현의 조직 특이성에 크게 기여함을 시사한다. (문헌[Sood et al. 2006 PNAS USA 103(8):2746-51] 참조).
따라서, 내인성 마이크로RNA 종을 사용하여 비표적세포 유형에서 외인성 작용제 발현을 침묵시킴으로써 표적세포 집단에 대한 외인성 작용제의 발현을 제한하기 위해 miRNA기반 접근법이 사용될 수 있다. 마이크로RNA는 메신저 RNA(mRNA)의 번역을 저해하거나 mRNA의 분해를 야기함으로써, 다수의 유기체에서 서열 특이적 전사 후 유전자침묵을 유도한다. 예를 들어, 문헌[Brown et al. 2006 Nature Med. 12(5):585-91] 및 WO2007/000668(상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨) 참조. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산은 하나 이상(예를 들어, 복수의) 조직 특이적 miRNA 인식 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 조직 특이적 miRNA 인식 서열은 약 20개 내지 25개, 21개 내지 24개, 또는 23개 길이의 뉴클레오타이드이다. 구현예에서, 조직 특이적 miRNA 인식 서열은 비표적세포에 존재하는 miRNA에 대하여 완벽한 상보성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 GFP를 포함하지 않고, 예를 들어 형광 단백질을 포함하지 않으며, 예를 들어 리포터 단백질을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 표적외(off-target)세포는 조혈세포가 아니고/아니거나 miRNA는 조혈세포에 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원의 방법은 외인성 작용제를 인코딩하는 뉴클레오타이드와 적어도 하나의 조직 특이적 마이크로RNA(miRNA) 표적 서열을 포함하는 복수의 푸소좀, 예를 들어 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스 벡터를, 표적세포 및 비표적세포를 포함하는 복수의 세포와 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 외인성 작용제는 표적세포에서 우선적으로 발현되며, 예를 들어 표적세포에 제한되는, 표적세포에서의 외인성 작용제의 조직 특이적 발현을 포함한다.
예를 들어, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산은 비표적세포, 예를 들어 조혈전구세포(HSPC), 조혈줄기세포(HSC)에 상응하는 miRNA를 갖는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 miRNA 인식 서열을 포함할 수 있으며, 이러한 서열은 표적세포, 예를 들어 분화된 세포가 아닌 비표적세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현을 방지하거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 레트로바이러스 핵산은 비표적세포에서 유효량(예를 들어, 내인성 miRNA의 농도가 전이유전자의 발현을 감소시키거나 방지하는 데 충분함)으로 존재하는 miRNA에 대한 적어도 하나의 miRNA 서열 표적을 포함하며, 전이유전자를 포함한다. 구현예에서, 이러한 시스템에 사용되는 miRNA는, 예를 들어 골수 및 림프 계통의 분화된 자손이 아닌, HSPC 및 HSC와 같은 비표적세포에서 강하게 발현되어, 표적세포에서 발현 및 치료 효능은 유지하면서, 민감한 줄기세포 집단에서 전이유전자의 발현을 방지하거나 감소시킨다.
일부 구현예에서, 음성 TSCRE 또는 NTSCRE는 miRNA 인식 부위를 포함한다. 예시적인 miRNA는 하기 표 4에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, 핵산(예를 들어, 푸소좀 핵산 또는 레트로바이러스 핵산)은 표 4의 miRNA에 상보적이거나, 이와 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상보성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산(예를 들어, 푸소좀 핵산 또는 레트로바이러스 핵산)은 내인성 miRNA, 예를 들어 표 4의 miRNA 내 씨드(seed) 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, miRNA는 서열번호 156 내지 162 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함한다. 구현예에서, 씨드 서열은 적어도 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 길이의 뉴클레오타이드이다.
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일부 구현예에서, 음성 TSCRE 또는 NTSCRE는 본원에 기재된 miRNA에 대한 miRNA 인식 부위를 포함한다. 예시적인 miRNA에는, 문헌[Butovsky et al., Nat Neurosci. 2014 Jan;17(1):131-43](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에서 확인되는 것들, 예를 들어 miR-338-3p, miR-9, miR-125b-5p 또는 miR-342-3p가 포함된다. 추가의 예시적인 miRNA는 문헌[Delzor et al., Curr. Drug Targets, 2013 Oct;14(11):1336-46](이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에서 확인할 수 있으며, 예를 들어 miR-124이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀은 페이로드 유전자와 양성 표적세포 특이적 조절 요소를 포함하는 핵산을 포함하며, 예를 들어 여기서 표적세포는 뉴런, 예를 들어 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런 또는 세로토닌성 뉴런이다. 일부 구현예에서, 핵산은 비표적세포 특이적 조절 요소(NTCSRE)를 추가로 포함하며, 예를 들어 여기서 NTSCRE는 아교세포, 예를 들어 별아교세포, 미세아교세포 또는 회소돌기아교세포에서 발현되는 miRNA에 대한 miRNA 인식 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀은 페이로드 유전자와 양성 표적세포 특이적 조절 요소를 포함하는 핵산을 포함하며, 예를 들어 여기서 표적세포는 아교세포, 예를 들어 별아교세포, 미세아교세포 또는 회소돌기아교세포이다. 일부 구현예에서, 핵산은 비표적세포 특이적 조절 요소(NTCSRE)를 추가로 포함하며, 예를 들어 여기서 NTSCRE는 뉴런, 예를 들어 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런 또는 세로토닌성 뉴런에서 발현되는 miRNA에 대한 miRNA 인식 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 음성 TSCRE 또는 NTSCRE는 본원에 기재된 miRNA에 대한 miRNA 인식 부위를 포함한다. 예시적인 miRNA에는, 문헌[Griffiths-Jones et al. Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1, 34]; 문헌[Chen and Lodish, Semin Immunol. 2005 Apr;17(2):155-65]; 문헌[Chen et al. Science. 2004 Jan 2;303(5654):83-6]; 문헌[Barad et al. Genome Res. 2004 Dec; 14(12): 2486-2494]; 문헌[Krichevsky et al., RNA. 2003 Oct;9(10):1274-81]; 문헌[Kasashima et al. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Sep 17;322(2):403-10]; 문헌[Houbaviy et al., Dev Cell. 2003 Aug;5(2):351-8]; 문헌[Lagos-Quintana et al., Curr Biol. 2002 Apr 30;12(9):735-9]; 문헌[Calin et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2;101(9):2999-3004]; 문헌[Sempere et al. Genome Biol. 2004; 5(3): R13]; 문헌[Metzler et al., Genes Chromosomes Cancer. 2004 Feb;39(2):167-9]; 문헌[Calin et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Nov 26;99(24):15524-9]; 문헌[Mansfield et al. Nat Genet. 2004 Oct;36(10):1079-83]; 문헌[Michael et al. Mol Cancer Res. 2003 Oct;1(12):882-91]; 및 www.miRNA.org에서 확인할 수 있는 것들이 포함된다.
일부 구현예에서, 음성 TSCRE 또는 NTSCRE는 miR-1b, miR-189b, miR-93, miR-125b, miR-130, miR-32, miR-128, miR-22, miR124a, miR-296, miR-143, miR-15, miR-141, miR-143, miR-16, miR-127, miR99a, miR-183, miR-19b, miR-92, miR-9, miR-130b, miR-21, miR-30b, miR-16, miR-99a, miR-212, miR-30c, miR-213, miR-20, miR-155, miR-152, miR-139, miR-30b, miR-7, miR-30c, miR-18, miR-137, miR-219, miR-1d, miR-178, miR-24, miR-122a, miR-215, miR-124a, miR-190, miR-149, miR-193, let-7a, miR-132, miR-27a, miR-9*, miR-200b, miR-266, miR-153, miR-135, miR-206, miR-24, miR-19a, miR-199, miR-26a, miR-194, miR-125a, miR-15a, miR-145, miR-133, miR-96, miR-131, miR-124b, miR-151, miR-7b, miR-103 및 miR-208에서 선택되는 miRNA에 대한 miRNA 인식 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산(예를 들어, 레트로바이러스 핵산)은 2개 이상의 miRNA 인식 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 miRNA 인식 부위와 제2 miRNA 인식 부위는 동일한 miRNA에 의해 인식되고, 일부 구현예에서, 제1 miRNA 인식 부위와 제2 miRNA 인식 부위는 상이한 miRNA에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 제1 miRNA 인식 부위와 제2 miRNA 인식 부위는 동일한 비표적세포에 존재하는 miRNA에 의해 인식되고, 일부 구현예에서, 제1 miRNA 인식 부위와 제2 miRNA 인식 부위는 상이한 비표적세포에 존재하는 miRNA에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 제1 miRNA 인식 부위 및 제2 miRNA 인식 부위 중 하나 또는 둘 모두는 표 4의 miRNA에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 푸소좀 핵산(예를 들어 레트로바이러스 핵산) 상의 miRNA 인식 부위 중 하나 이상은 외인성 작용제를 이용하여 시스로 전사된다. 일부 구현예에서, 푸소좀 핵산(예를 들어 레트로바이러스 핵산) 상의 miRNA 인식 부위 중 하나 이상은 poly A 꼬리 서열의 다운스트림, 예를 들어 poly A 꼬리 서열과 WPRE 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 푸소좀 핵산(예를 들어 레트로바이러스 핵산) 상의 miRNA 인식 부위 중 하나 이상은 WPRE의 다운스트림에 위치한다.
V. 면역 조절
일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 상승된 CD47을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제9,050,269호(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨) 참조. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 상승된 보체 조절 단백질을 포함한다. 예를 들어, ES2627445T3 및 US6790641(이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨) 참조. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP에는 MHC 단백질, 예를 들어 MHC-1 클래스 I 또는 클래스 II가 결여되어 있거나, 이들이 감소된 수준으로 포함되어 있다. 예를 들어, US20170165348(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨) 참조.
때때로, 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 대상의 면역계에 의해 인식된다. 외피가 있는 바이러스 벡터 입자(예를 들어, 레트로바이러스 벡터 입자)의 경우, 바이러스 외피의 표면에 표시되는 막 결합된 단백질이 인식될 수 있고, 바이러스 입자 자체가 중화될 수 있다. 나아가, 표적세포를 감염시킬 때, 바이러스 외피는 세포막과 융합되고, 그 결과 바이러스 외피 단백질이 세포의 표면에 표시되거나, 이와 밀접하게 회합된 상태로 유지될 수 있다. 따라서, 면역계는 또한 바이러스 벡터 입자가 감염된 세포를 표적으로 할 수 있다. 두 가지 영향은 모두 바이러스 벡터에 의한 외인성 작용제 전달의 효능의 감소로 이어질 수 있다.
바이러스 입자 외피는 전형적으로 원천세포의 막에서 유래된다. 따라서, 바이러스 입자가 발아하는 세포막에서 발현되는 막단백질은 바이러스 외피에 혼입될 수 있다.
면역 조절 단백질 CD47
세포외 물질을 세포로 내재화하는 것은 통상적으로 세포내이입으로 불리는 과정에 의해 수행된다(문헌[Rabinovitch, 1995, Trends Cell Biol. 5(3):85-7]; 문헌[Silverstein, 1995, Trends Cell Biol. 5(3):141-2]; 문헌[Swanson et al., 1995, Trends Cell Biol. 5(3):89-93]; 문헌[Allen et al., 1996, J. Exp. Med. 184(2):627-37]). 세포내이입은 입자의 흡수를 포함하는 포식작용과 유체 및 용질의 흡수를 포함하는 음세포작용(pinocytosis)의 2가지 일반적인 카테고리로 분류될 수 있다.
전문 식세포는, 막 수용체 CD47이 결여된 녹아웃 마우스를 이용한 연구에 근거하여, 비(非)자기 및 자기를 구분하는 것으로 나타났다(문헌[Oldenborg et al., 2000, Science 288(5473):2051-4]). CD47은 대식세포에서 발견되는 면역 저해 수용체 SIRPα(신호 조절 단백질)와 상호작용하는 Ig 수퍼패밀리의 유비쿼터스 멤버이다(문헌[Fujioka et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16(12):6887-99]; 문헌[Veillette et al., 1998, J. Biol. Chem. 273(35):22719-28]; 문헌[Jiang et al., 1999, J. Biol. Chem. 274(2):559-62]). CD47-SIRPα 상호작용이 마우스에서 자가 대식세포를 불활성화시키는 것으로 보이지만, 빈혈의 증거가 거의 없거나 없으며(문헌[Mouro-Chanteloup et al., 2003, Blood 101(1):338-344]), 또한 식세포 단핵구와의 증강된 세포 상호작용에 대한 증거가 거의 없거나 없는(문헌[Arndt et al., 2004, Br. J. Haematol. 125(3):412-4]) 일부 Rh 표현형의 인간 혈액세포에서 CD47의 심각한 감소(대략 90%)가 확인되었다.
일부 구현예에서, 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP(예를 들어, 반경이 약 1 μm, 400 nm 또는 150 nm 미만인 바이러스 입자)는, 예를 들어 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 노출된 표면 상에, CD47의 생물학적 활성 부분을 적어도 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스) 또는 VLP는 지질 코트를 포함한다. 구현예에서, 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP에서 생물학적으로 활성인 CD47의 양은, 1 μm2당 약 20개 내지 250개, 20개 내지 50개, 50개 내지 100개, 100개 내지 150개, 150개 내지 200개, 또는 200개 내지 250개의 분자이다. 일부 구현예에서, CD47은 인간 CD47이다.
본원에 기재된 방법은 식세포에 의한 입자의 포식작용을 회피하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은, 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP에 CD47의 생물학적 활성 부분을 적어도 포함하는 적어도 하나의 펩타이드를 발현시켜, CD47을 포함하는 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP가 식세포에 노출될 때, 푸소좀, 예를 들어 바이러스 입자가 식세포에 의한 포식작용을 회피하거나, 다른 유사한 변형되지 않은 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여 감소된 포식작용을 나타내도록 하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상에서 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 반감기는 다른 유사한 변형되지 않은 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여 연장된다.
MHC 결실
주조직적합복합체(major histocompatibility complex) 클래스 I(MHC-I)은 바이러스 외피에 혼입될 수 있는 숙주세포 막 단백질이며, 이는 본질적으로 고도로 다형성이기 때문에, 신체 면역반응의 주요 표적이다(문헌[McDevitt H. O. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 1-17]). 원천세포의 원형질막에 노출된 MHC-I 분자는 벡터 발아 과정 동안 바이러스 입자 외피에 혼입될 수 있다. 원천세포에서 유도되고 바이러스 입자에 혼입된 이러한 MHC-I 분자는 결과적으로 표적세포의 원형질막에 전달될 수 있다. 대안적으로, MHC-I 분자는 바이러스 입자가 표적 세포막을 흡수하고 이에 결합된 상태로 유지되는 경향의 결과로 표적 세포막과 밀접하게 회합된 상태로 유지될 수 있다.
형질도입된 세포의 원형질막 상의 또는 이에 근접한 외인성 MHC-I 분자의 존재는 대상에서 동종반응성 면역반응을 유도할 수 있다. 이는, 생체외 유전자 전달 후 대상에게의 형질도입된 세포의 투여 시, 또는 바이러스 입자의 직접 생체내 투여 시, 형질도입된 세포의 면역 매개 사멸 또는 포식작용을 유도할 수 있다. 나아가, MHC-I 보유 바이러스 입자를 혈류에 생체내 투여하는 경우, 바이러스 입자는 표적세포에 도달하기 전 기존 MHC-I 특이적 항체에 의해 중화될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 원천세포는 세포 표면에서 MHC-I의 발현을 감소시키도록 변형된다(예를 들어, 유전자 조작됨). 구현예에서, 원천세포는 β2-마이크로글로불린(β2M)을 인코딩하는 유전자의 유전자 조작된 파괴를 포함한다. 구현예에서, 원천세포는 MHC-I α 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 유전자 조작된 파괴를 포함한다. 상기 세포는 β2-마이크로글로불린을 인코딩하는 유전자의 모든 카피에서 유전자 조작된 파괴를 포함할 수 있다. 상기 세포는 MHC-I α 사슬을 인코딩하는 유전자의 모든 카피에서 유전자 조작된 파괴를 포함할 수 있다. 상기 세포는 β2-마이크로글로불린을 인코딩하는 유전자의 유전자 조작된 파괴와 MHC-I α 사슬을 인코딩하는 유전자의 유전자 조작된 파괴를 모두 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 감소된 수의 표면 노출된 MHC-I 분자를 포함한다. 표면 노출된 MHC-I 분자의 수는, MHC-I에 대한 면역반응이 치료적으로 적절한 정도로 감소되도록 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 외피가 있는 바이러스 벡터 입자에는 표면 노출된 MHC-I 분자가 실질적으로 없다.
HLA-G/E 과발현
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 이의 외피에 관용원성(tolerogenic) 단백질, 예를 들어 ILT-2 또는 ILT-4 아고니스트, 예를 들어 HLA-E 또는 HLA-G 또는 임의의 다른 ILT-2 또는 ILT-4 아고니스트를 표시한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 참조 레트로바이러스, 예를 들어 상기 레트로바이러스와 달리 유사한 변형되지 않은 레트로바이러스와 비교하여, HLA-E, HLA-G, ILT-2 또는 ILT-4의 증가된 발현을 나타낸다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 조성물은 변형되지 않은 레트로바이러스와 비교하여 감소된 MHC 클래스 I을 나타내고, 변형되지 않은 레트로바이러스와 비교하여 증가된 HLA-G를 나타낸다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 참조 레트로바이러스, 예를 들어 상기 레트로바이러스와 달리 유사한 변형되지 않은 레트로바이러스와 비교하여, HLA-G 또는 HLA-E의 증가된 발현, 예를 들어 HLA-G 또는 HLA-E의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 발현 증가를 나타내며, 여기서 HLA-G 또는 HLA-E의 발현은 유세포분석, 예를 들어 FACS를 사용하여 시험관내에서 검정된다.
일부 구현예에서, HLA-G 발현이 증가된 레트로바이러스는, 예를 들어 기형종 형성 검정에서 감소된 면역 세포 침윤으로 측정되는 바와 같이 감소된 면역원성을 나타낸다.
보체 조절 단백질
보체 활성은 통상적으로 다수의 보체 조절 단백질(CRP)에 의해 제어된다. 이러한 단백질은 허위 염증 및 숙주 조직 손상을 방지한다. CD55/붕괴촉진인자(DAF) 및 CD46/막 보조인자 단백질(MCP)을 포함하는 단백질의 한 그룹은, 전형적 및 대안적 경로 C3/C5 전환효소를 저해한다. CD59를 포함하는 또 다른 단백질 세트는 MAC 어셈블리를 조절한다. CRP는 이종이식된 조직의 거부반응을 방지하는 데 사용되었으며, 이는 또한 바이러스 및 바이러스 벡터를 보체 불활성화로부터 보호하는 것으로 나타났다.
막 상재 보체제어인자에는, 예를 들어 붕괴촉진인자(DAF) 또는 CD55, 인자 H(FH) 유사 단백질-1(FHL-1), C4b-결합 단백질(C4BP), 보체 수용체 1(CD35), 막 보조인자 단백질(MCP) 또는 CD46, 및 CD59(프로텍틴)(예를 들어, 막공격복합체(MAC)의 형성을 방지하고, 세포를 용해로부터 보호함)가 포함된다.
알부민 결합 단백질
일부 구현예에서, 렌티바이러스는 알부민과 결합한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스는 이의 표면에 알부민과 결합하는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스는 이의 표면에 알부민 결합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 단백질은 연쇄구균(streptococcal) 알부민 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 단백질은 연쇄구균 알부민 결합 도메인이다.
렌티바이러스 외피에서의 비(非) 푸소겐 단백질의 발현
일부 구현예에서, 렌티바이러스는 이의 표면에 하나 이상의 단백질을 포함하도록 조작된다. 일부 구현예에서, 단백질은 대상과의 면역 상호작용에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 단백질은 대상에서 렌티바이러스의 약리학에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 단백질은 수용체이다. 일부 구현예에서, 단백질은 아고니스트이다. 일부 구현예에서, 단백질은 신호전달 분자이다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 표면 상의 단백질은 OKT3 또는 IL7을 포함한다.
일부 구현예에서, 유사분열 막관통 단백질 및/또는 사이토카인 기반 막관통 단백질은 원천세포에 존재하며, 이는 원천세포 막에서 발아할 때 레트로바이러스에 혼입될 수 있다. 유사분열 막관통 단백질 및/또는 사이토카인 기반 막관통 단백질은 바이러스 외피 당단백질의 일부로서가 아니라 원천세포 상의 별개의 세포 표면 분자로서 발현될 수 있다.
예시적인 특성
본원에 기재된 임의의 양태의 일부 구현예에서, 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 실질적으로 비(非)면역원성이다. 면역원성은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 정량화될 수 있다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 표적세포와 융합하여 수용세포를 생성한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 레트로바이러스 벡터 또는 VLP에 융합된 수용세포가 면역원성에 대해 평가된다. 구현예에서, 수용세포는, 예를 들어 항-IgM 항체를 이용한 염색에 의해 세포 표면 상의 항체의 존재에 대하여 분석된다. 다른 구현예에서, 면역원성은 PBMC 세포 용해 검정으로 평가된다. 구현예에서, 수용세포는 말초혈액단핵세포(PBMC)와 함께 인큐베이션된 후, PBMC에 의한 세포의 용해에 대해 평가된다. 다른 구현예에서, 면역원성은 자연살해(NK) 세포 용해 검정으로 평가된다. 구현예에서, 수용세포는 NK세포와 함께 인큐베이션된 후, NK세포에 의한 세포의 용해에 대해 평가된다. 다른 구현예에서, 면역원성은 CD8+ T세포 용해 검정으로 평가된다. 구현예에서, 수용세포는 CD8+ T세포와 함께 인큐베이션된 후, CD8+ T세포에 의한 세포의 용해에 대해 평가된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 상기 원천세포와 달리 유사한 변형되지 않은 원천세포 또는 HEK293 세포에서 생성된 것과 비교하여 상승된 수준의 면역억제제(예를 들어, 면역억제 단백질)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상승된 수준은 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 3배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배이다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 참조세포에 존재하지 않는 면역억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 상기 원천세포와 달리 유사한 변형되지 않은 원천세포 또는 HEK293 세포에서 생성된 것과 비교하여 감소된 수준의 면역자극제(예를 들어, 면역자극 단백질)를 포함한다. 일부 구현예에서, 감소된 수준은 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%이다. 일부 구현예에서, 면역자극제는 레트로바이러스 벡터 또는 VLP에 실질적으로 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 또는 레트로바이러스 벡터 또는 VLP가 유도되는 원천세포는, 하기 특징 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 그 이상을 갖는다:
a. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 상기 원천세포와 달리 유사한 원천세포 또는 HeLa 세포 또는 HEK293 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
b. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포 또는 HEK 세포 또는 본원에 기재된 참조세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 비제한적으로, LAG3, ICOS-L, ICOS, Ox40L, OX40, CD28, B7, CD30, CD30L 4-1BB, 4-1BBL, SLAM, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, B7-H3 또는 B7-H4를 포함하는 하나 이상의 공동자극 단백질의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
c. 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 검출 가능한, 대식세포 포식을 억제하는 표면 단백질, 예를 들어 CD47의 발현을 나타냄; 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, Jurkat 세포 또는 HEK293 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 대식세포 포식을 억제하는 표면 단백질, 예를 들어 CD47의 발현이 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배(또는 그 이상) 초과임;
d. 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 검출 가능한, 가용성 면역억제성 사이토카인, 예를 들어 IL-10의 발현을 나타냄; 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포 또는 HEK293 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 가용성 면역억제성 사이토카인, 예를 들어 IL-10의 발현이 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배(또는 그 이상) 초과임;
e. 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 검출 가능한, 가용성 면역억제 단백질, 예를 들어 PD-L1의 발현을 나타냄; 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포 또는 HEK293 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 가용성 면역억제 단백질, 예를 들어 PD-L1의 발현이 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배(또는 그 이상) 초과임;
f. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포 또는 HEK293 세포 또는 U-266 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 가용성 면역자극 사이토카인, 예를 들어 IFN-감마 또는 TNF-a의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
g. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포 또는 HEK293 세포 또는 A549 세포 또는 SK-BR-3 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 내인성 면역자극 항원, 예를 들어 Zg16 또는 Hormad1의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
h. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 검출 가능한 HLA-E 또는 HLA-G의 발현을 나타냄;
i. 예를 들어 NK세포 활성화를 억제하도록 작용하는, 예를 들어 시알산을 함유하는 표면 글리코실화 프로파일;
j. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, TCRα/β의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
k. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 HeLa 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, ABO식 혈액형의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
l. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 부조직적합항원(MHA)의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임; 또는
m. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 미토콘드리아 MHA를 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%(또는 그 이하) 미만으로 갖거나, 검출 가능한 미토콘드리아 MHA를 갖지 않음.
구현예에서, 공동자극 단백질은 4-1BB, B7, SLAM, LAG3, HVEM 또는 LIGHT이고, 참조세포는 HDLM-2이다. 일부 구현예에서, 공동자극 단백질은 BY-H3이고, 참조세포는 HeLa이다. 일부 구현예에서, 공동자극 단백질은 ICOSL 또는 B7-H4이고, 참조세포는 SK-BR-3이다. 일부 구현예에서, 공동자극 단백질은 ICOS 또는 OX40이고, 참조세포는 MOLT-4이다. 일부 구현예에서, 공동자극 단백질은 CD28이고, 참조세포는 U-266이다. 일부 구현예에서, 공동자극 단백질은 CD30L 또는 CD27이고, 참조세포는 Daudi이다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 면역계, 예를 들어 선천성 면역계에 의한 면역원성 반응을 실질적으로 유도하지 않는다. 구현예에서, 면역원성 반응은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 정량화될 수 있다. 일부 구현예에서, 선천성 면역계에 의한 면역원성 반응은, 비제한적으로, NK세포, 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 수지상세포, 비만세포, 또는 감마/델타 T세포를 포함하는 선천성 면역세포에 의한 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 선천성 면역계에 의한 면역원성 반응은 가용성 혈액 구성요소 및 막 결합된 구성요소를 포함하는 보체 시스템에 의한 반응을 포함한다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 면역계, 예를 들어 후천성 면역계에 의한 면역원성 반응을 실질적으로 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 후천성 면역계에 의한 면역원성 반응은, 비제한적으로, 예를 들어 T림프구(예를 들어, CD4 T세포, CD8 T세포 및/또는 감마-델타 T세포) 또는 B림프구의 수 또는 활성의 변화, 예를 들어 증가를 포함하는, 후천성 면역세포에 의한 면역원성 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 후천성 면역계에 의한 면역원성 반응은, 비제한적으로, 예를 들어 사이토카인 또는 항체(예를 들어, IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD)의 수 또는 활성의 변화, 예를 들어 증가를 포함하는, 가용성 혈액 구성요소의 수준 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 면역원성이 감소하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 면역원성보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 미만의 면역원성을 갖는다.
본원에 기재된 임의의 양태의 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은, 면역원성을 감소, 예를 들어 줄이기 위해, 원천세포, 예를 들어 변형된, 예를 들어 본원에 기재된 방법을 사용하여 변형된 게놈을 갖는 포유류 세포에서 유도된다. 면역원성은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 정량화될 수 있다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은, 다음 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그 이상이 고갈된, 예를 들어 이의 녹아웃을 갖는 포유류 세포에서 유도된다:
a. MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 또는 MHA;
b. 비제한적으로, LAG3, ICOS-L, ICOS, Ox40L, OX40, CD28, B7, CD30, CD30L 4-1BB, 4-1BBL, SLAM, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, B7-H3 또는 B7-H4를 포함하는 하나 이상의 공동자극 단백질;
c. 가용성 면역자극 사이토카인, 예를 들어 IFN-감마 또는 TNF-a;
d. 내인성 면역자극 항원, 예를 들어 Zg16 또는 Hormad1;
e. T세포 수용체(TCR);
f. ABO식 혈액형을 인코딩하는 유전자, 예를 들어 ABO 유전자;
g. 면역 활성화를 유도하는 전사인자, 예를 들어 NFkB;
h. MHC 발현을 제어하는 전사인자, 예를 들어 클래스 II 트랜스 활성화제(CIITA), Xbox 5의 조절인자(RFX5), RFX 관련 단백질(RFXAP) 또는 RFX 안키린 반복(RFXANK; RFXB로도 공지됨); 또는
i. MHC 클래스 I 발현을 감소시키는 TAP 단백질, 예를 들어 TAP2, TAP1 또는 TAPBP.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는, 예를 들어 다음 중 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의, 면역억제제의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 갖는 원천세포에서 유도된다(예를 들어, 유전자 변형 전, 상기 세포는 해당 인자를 발현하지 않았음):
a. 대식세포 포식을 억제하는 표면 단백질, 예를 들어 CD47; 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여 증가된 CD47의 발현;
b. 가용성 면역억제성 사이토카인, 예를 들어 IL-10; 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여 증가된 IL-10의 발현;
c. 가용성 면역억제 단백질, 예를 들어 PD-1, PD-L1, CTLA4 또는 BTLA; 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여 증가된 면역억제 단백질의 발현;
d. 관용원성 단백질, 예를 들어, ILT-2 또는 ILT-4 아고니스트, 예를 들어 HLA-E 또는 HLA-G, 또는 임의의 다른 내인성 ILT-2 또는 ILT-4 아고니스트; 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여 증가된 HLA-E, HLA-G, ILT-2 또는 ILT-4의 발현; 또는
e. 보체 활성을 억제하는 표면 단백질, 예를 들어 보체 조절 단백질, 예를 들어 붕괴촉진인자(DAF, CD55)에 결합하는 단백질, 예를 들어 인자 H(FH) 유사 단백질-1(FHL-1), 예를 들어 C4b-결합 단백질(C4BP), 예를 들어 보체 수용체 1(CD35), 예를 들어 막 보조인자 단백질(MCP, CD46), 예를 들어 프로펙틴(CD59), 예를 들어 전형적 및 대안적 보체 경로 CD/C5 전환효소를 저해하는 단백질, 예를 들어 MAC 어셈블리를 조절하는 단백질; 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여 증가된 보체 조절 단백질의 발현.
일부 구현예에서, 증가된 발현 수준은 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 3배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 더 큰 것이다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는, 예를 들어 다음 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 이상을 특징으로 하는, 면역자극제의 발현이 감소하도록 변형된 원천세포에서 유도된다:
a. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 상기 원천세포와 달리 유사한 원천세포, HEK293 세포 또는 HeLa 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
b. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 본원에 기재된 참조세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 비제한적으로, LAG3, ICOS-L, ICOS, Ox40L, OX40, CD28, B7, CD30, CD30L 4-1BB, 4-1BBL, SLAM, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, B7-H3 또는 B7-H4를 포함하는 하나 이상의 공동자극 단백질의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
c. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 U-266 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 가용성 면역자극 사이토카인, 예를 들어 IFN-감마 또는 TNF-a의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
d. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 A549 세포 또는 SK-BR-3 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 내인성 면역자극 항원, 예를 들어 Zg16 또는 Hormad1의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
e. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, T세포 수용체(TCR)의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
f. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 HeLa 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, ABO식 혈액형의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
g. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 면역 활성화를 유도하는 전사인자, 예를 들어 NFkB의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임;
h. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포, HEK293 세포 또는 Jurkat 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, MHC 발현을 제어하는 전사인자, 예를 들어 클래스 II 트랜스 활성화제(CIITA), Xbox 5의 조절인자(RFX5), RFX 관련 단백질(RFXAP) 또는 RFX 안키린 반복(RFXANK; RFXB로도 공지됨)의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임; 또는
i. 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 상기 원천세포와 달리 유사한 원천세포, HEK293 세포 또는 HeLa 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, MHC 클래스 I 발현을 감소시키는 TAP 단백질, 예를 들어, TAP2, TAP1 또는 TAPBP의 발현이 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%(또는 그 이하) 미만임.
일부 구현예에서, MHC 클래스 I 발현을 감소시키기 위해 렌티바이러스를 발현하는 shRNA를 사용하여 변형된 포유류 세포, 예를 들어 HEK293에서 유도된 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은, 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 변형되지 않은 세포(예를 들어, 중간엽줄기세포)로부터의 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여 더 낮은 MHC 클래스 I의 발현을 나타낸다. 일부 구현예에서, HLA-G의 발현을 증가시키기 위해 HLA-G를 발현하는 렌티바이러스를 사용하여 변형된 포유류 세포, 예를 들어 HEK293에서 유도된 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는, 예를 들어 변형되지 않은 세포(예를 들어, HEK293)로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여 증가된 HLA-G의 발현을 나타낸다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 실질적으로 면역원성이 아닌 원천세포, 예를 들어 포유류 세포에서 유도되며, 여기서 원천세포는, 예를 들어 시험관내 IFN-감마 ELISPOT 검정으로 검정 시, 0 pg/mL 내지 >0 pg/mL의 수준으로 T세포 IFN-감마 분비를 자극, 예를 들어 유도한다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 원천세포, 예를 들어 포유류 세포에서 유도되며, 여기서 포유류 세포는 면역억제제, 예를 들어 글루코코르티코이드(예를 들어, 덱사메타손(dexamethasone)), 세포증식억제제(예를 들어, 메토트렉세이트(methotrexate)), 항체(예를 들어, 무로모납-CD3(Muromonab-CD3)) 또는 이뮤노필린 조절제(예를 들어, 시클로스포린(ciclosporine) 또는 라파마이신(rapamycin))로 처리된 세포 배양물에서 유래된 것이다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 원천세포, 예를 들어 포유류 세포에서 유도되며, 여기서 포유류 세포는 외인성 작용제, 예를 들어 치료제를 포함한다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 원천세포, 예를 들어 포유류 세포에서 유도되며, 여기서 포유류 세포는 재조합 세포이다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 바이러스 면역침투소(immunoevasin), 예를 들어 hCMV US2 또는 US11을 발현하도록 유전자 변형된 포유류 세포에서 유도된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 표면, 또는 원천세포의 표면은, 중합체, 예를 들어 면역원성 및 면역 매개 제거를 감소시키는 생체적합성 중합체, 예를 들어 PEG와 공유결합으로 또는 비(非)공유결합으로 변형된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 표면, 또는 원천세포의 표면은, 시알산, 예를 들어 NK 억제성 글리칸 에피토프를 함유하는 당중합체를 함유하는 시알산과 공유결합으로 또는 비공유결합으로 변형된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 표면, 또는 원천세포의 표면은, ABO식 혈액형을 제거하기 위해, 예를 들어 글리코시다아제 효소, 예를 들어 α-N-아세틸갈락토오스아미니다아제로 효소 처리된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 표면, 또는 원천세포의 표면은, 예를 들어 수용체의 혈액형과 일치하는 ABO식 혈액형의 발현을 야기하도록, 예를 들어 유도하도록 효소 처리된다.
면역원성 평가를 위한 매개변수
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 실질적으로 면역원성이 아니거나, 변형된, 예를 들어 면역원성을 감소시키기 위해 본원에 기재된 방법을 사용하여 변형된 원천세포, 예를 들어 포유류 세포에서 유도된다. 원천세포와 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 면역원성은 본원에 기재된 임의의 검정으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포로부터 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 생체내 이식편 생존의 증가, 예를 들어 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가를 나타낸다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의, 적절한 동물 모델, 예를 들어, 본원에 기재된 동물 모델에의 1회 이상의 이식 후 체액성 반응과 비교하여, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 적절한 동물 모델, 예를 들어 본원에 기재된 동물 모델에의 1회 이상의 이식 후 체액성 반응의 감소로 측정되는 면역원성의 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 체액성 반응의 감소는 혈청 샘플에서 항-세포 항체 역가, 예를 들어 항-레트로바이러스 또는 항-VLP 항체 역가, 예를 들어 ELISA로 측정된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP가 투여된 동물로부터의 혈청 샘플은 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP가 투여된 동물로부터의 혈청 샘플과 비교하여, 항-레트로바이러스 또는 항-VLP 항체 역가의, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP가 투여된 동물로부터의 혈청 샘플은, 예를 들어 기준선보다 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 40% 증가된 항-레트로바이러스 또는 항-VLP 항체 역가를 나타내며, 예를 들어 여기서 기준선은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 투여 전 동일한 동물로부터의 혈청 샘플을 나타낸다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포로부터 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 대식세포 포식작용의 감소, 예를 들어 대식세포 포식작용의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타내며, 여기서 대식세포 포식작용의 감소는, 예를 들어 실시예 8에 기재된 바와 같이 시험관내 포식세포지수를 검정함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는, 예를 들어 대식세포 포식작용의 시험관내 검정에서 대식세포와 함께 인큐베이션될 때, 실시예 8의 검정에 따라 측정 시, 0, 1, 10, 100 또는 그 이상의 포식세포지수를 갖는다.
일부 구현예에서, 원천세포 또는 수용세포는 PBMC에 의한 세포독성 매개 세포 용해의 감소, 예를 들어 실시예 17의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 변형되지 않은 세포, 또는 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP를 수용한 수용세포, 또는 중간엽줄기세포와 비교하여, 세포 용해의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타낸다. 구현예에서, 원천세포는 외인성 HLA-G를 발현한다.
일부 구현예에서, 원천세포 또는 수용세포는 참조세포, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 변형되지 않은 세포, 또는 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP를 수용한 수용세포와 비교하여, NK 매개 세포 용해의 감소, 예를 들어 NK 매개 세포 용해의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타내며, 여기서 NK 매개 세포 용해는, 예를 들어 실시예 18의 검정을 사용하여 크롬 방출 검정 또는 유로퓸 방출 검정에 의해 시험관내에서 검정된다.
일부 구현예에서, 원천세포 또는 수용세포는 참조세포, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 변형되지 않은 세포, 또는 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP를 수용한 수용세포와 비교하여, CD8+ T세포 매개 세포 용해의 감소, 예를 들어 CD8+ T세포 매개 세포 용해의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타내며, 여기서 CD8+ T세포 매개 세포 용해는 실시예 19의 검정을 사용하여 시험관내에서 검정된다.
일부 구현예에서, 원천세포 또는 수용세포는 참조세포, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 변형되지 않은 세포, 또는 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP를 수용한 수용세포와 비교하여, CD4+ T세포 증식 및/또는 활성화의 감소, 예를 들어 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타내며, 여기서 CD4+ T세포 증식은 시험관내에서 검정된다(예를 들어, 변형되거나 변형되지 않은 포유류 원천세포와, CD4+T세포의 CD3/CD28 Dynabead를 이용한 공동배양 검정).
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 T세포 IFN-감마 분비의 감소, 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, T세포 IFN-감마 분비의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 야기하며, 여기서 T세포 IFN-감마 분비는, 예를 들어 IFN-감마 ELISPOT에 의해 시험관내에서 검정된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 면역원성 사이토카인 분비의 감소, 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 면역원성 사이토카인 분비의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 야기하며, 여기서 면역원성 사이토카인 분비는 ELISA 또는 ELISPOT를 사용하여 시험관내에서 검정된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 면역억제성 사이토카인 분비의 증가, 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 세포로부터의 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 면역억제성 사이토카인 분비의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가를 유도하며, 여기서 면역억제성 사이토카인 분비는 ELISA 또는 ELISPOT를 사용하여 시험관내에서 검정된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 HLA-G 또는 HLA-E의 발현 증가, 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, HLA-G 또는 HLA-E의 발현의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가를 나타내며, 여기서 HLA-G 또는 HLA-E의 발현은 유세포분석, 예를 들어 FACS를 사용하여 시험관내에서 검정된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는, 예를 들어 변형되지 않은 세포와 비교하여 HLA-G 또는 HLA-E의 발현이 증가하도록, 예를 들어 HLA-G 또는 HLA-E의 발현이 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 증가하도록 변형된 원천세포에서 유도되며, 여기서 HLA-G 또는 HLA-E의 발현은 유세포분석, 예를 들어 FACS를 사용하여 시험관내에서 검정된다. 일부 구현예에서, HLA-G의 발현이 증가하도록 변형된 세포에서 유도된 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 감소된 면역원성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 T세포 저해제 리간드(예를 들어 CTLA4, PD1, PD-L1)의 발현 증가, 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, T세포 저해제 리간드 발현의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가를 나타내거나 이를 야기하며, 여기서 T세포 저해제 리간드의 발현은 유세포분석, 예를 들어 FACS를 사용하여 시험관내에서 검정된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 공동자극 리간드의 발현의 감소, 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포와 달리 유사한 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, 공동자극 리간드 발현의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타내며, 여기서 공동자극 리간드의 발현은 유세포분석, 예를 들어 FACS를 사용하여 시험관내에서 검정된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 발현 감소, 예를 들어 참조 레트로바이러스 벡터 또는 VLP, 예를 들어 원천세포 또는 HeLa 세포와 달리 유사한 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 비교하여, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 발현의 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소를 나타내며, 여기서 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 발현은 유세포분석, 예를 들어 FACS를 사용하여 시험관내에서 검정된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP는 실질적으로 비면역원성인 세포 공급원, 예를 들어 포유류 세포 공급원에서 유도된다. 일부 구현예에서, 면역원성은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 정량화될 수 있다. 일부 구현예에서, 포유류 세포 공급원은 하기 특징 중 어느 하나, 또는 전부 또는 이들의 조합을 포함한다:
a. 원천세포는 자가 세포 공급원에서 수득되며; 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP를 받게 되는, 예를 들어 투여받게 되는 수용체에서 수득된 세포임;
b. 원천세포는 수용체, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP를 받게 되는, 예를 들어 투여받게 되는 본원에 기재된 수용체와 일치하는, 예를 들어 유사한 성별의 동종이계 세포 공급원에서 수득됨;
c. 원천세포는, 예를 들어 하나 이상의 대립유전자에서 수용체의 HLA와 일치하는 HLA인 동종이계 세포 공급원에서 수득됨;
d. 원천세포는 HLA 동형접합체인 동종이계 세포 공급원에서 수득됨;
e. 원천세포는 MHC 클래스 I 및 II가 결여된(또는 참조세포와 비교하여 감소된 수준을 나타내는) 동종이계 세포 공급원에서 수득됨; 또는
f. 원천세포는, 비제한적으로, 줄기세포, 중간엽줄기세포, 유도된 다능성줄기세포, 배아줄기세포, 세르톨리세포 또는 망막색소상피세포를 포함하는, 실질적으로 비면역원성으로 공지된 세포 공급원에서 수득됨.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP를 투여받게 되는 대상은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 반응성인 기존 항체(예를 들어, IgG 또는 IgM)를 갖고 있거나, 이를 갖는 것으로 공지되어 있거나, 또는 이에 대하여 시험된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP를 투여받게 되는 대상은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 반응성인 기존 항체를 검출 가능한 수준으로 갖고 있지 않다. 항체에 대한 시험은, 예를 들어 실시예 13에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP를 받은 대상은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 반응성인 항체(예를 들어, IgG 또는 IgM)를 갖고 있거나, 이를 갖는 것으로 공지되어 있거나, 또는 이에 대하여 시험된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 또는 VLP를 (예를 들어, 적어도 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 그 이상) 받은 대상은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP와 반응하는 항체를 검출 가능한 수준으로 갖고 있지 않다. 일부 구현예에서, 항체의 수준은 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 첫 번째 투여 전인 첫 번째 시점과 레트로바이러스 벡터 또는 VLP의 1회 이상의 투여 후인 두 번째 시점의 두 가지 시점 사이에서 1%, 2%, 5%, 10%, 20% 또는 50% 초과로 상승하지 않는다. 항체에 대한 시험은, 예를 들어 실시예 14에 기재되어 있다.
VI. 외인성 작용제
일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 외인성 작용제를 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은 외인성 작용제를 인코딩하는 핵산을 함유한다.
A. 외인성 단백질 작용제
일부 구현예에서, 외인성 작용제는 시토졸 단백질, 예를 들어 수용세포에서 생성되고 수용세포 세포질에 위치하는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 분비된 단백질, 예를 들어 수용세포에 의해 생성되고 분비되는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 핵 단백질, 예를 들어 수용세포에서 생성되고 수용세포의 핵에 도입되는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 세포소기관 단백질(예를 들어, 미토콘드리아 단백질), 예를 들어 수용세포에서 생성되고 수용세포의 세포소기관(예를 들어, 미토콘드리아) 내에 도입되는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 야생형 단백질 또는 돌연변이 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 융합 또는 키메라 단백질이다.
일부 구현예에서, 외인성 작용제는 SYNE1, SETX, FMR1, SLC6A8, UBE3A, SOD1, TDP43, C9orf72, FXN, MECP2, ASPA, ALDH7A1, TPP1, FUCA1, GALC, HEXA, HEXB, MANBA, ARSA, GNPTAB 또는 MCOLN1 중에서 선택되는 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 중의 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 SYNE1, SETX, FMR1, SLC6A8, UBE3A, SOD1, TDP43, C9orf72, FXN, MECP2, ASPA 또는 ALDH7A1 중에서 선택되는 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 TPP1, FUCA1, GALC, HEXA, HEXB, MANBA, ARSA, GNPTAB 또는 MCOLN1 중에서 선택되는 유전자에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, 외인성 작용제는 하기 표 5의 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 표 5의 임의의 단백질의 야생형 인간 서열, 이의 기능성 단편(예를 들어, 이의 효소적으로 활성인 단편) 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 표 5의 아미노산 서열, 예를 들어 표 5의 컬럼 2의 Uniprot 단백질 수탁번호 서열 또는 표 5의 컬럼 3의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 페이로드 유전자는 표 5의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다.
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
일부 구현예에서, 표적세포는, 예를 들어 외인성 작용제가 SYNE1인 경우, 예를 들어 척수소뇌성 운동실조증, 상염색체 열성 1형의 치료를 위한 소뇌의 세포이다. 일부 구현예에서, 표적세포는, 예를 들어 외인성 작용제가 SETX인 경우, 예를 들어 안구운동실행증 동반 운동실조증 2형의 치료를 위한 뇌, 척수 및/또는 근육의 세포이다. 일부 구현예에서, 표적세포는, 예를 들어 외인성 작용제가 FMR1인 경우, 예를 들어 취약X증후군의 치료를 위한 뉴런 또는 별아교세포이다. 일부 구현예에서, 표적세포는, 예를 들어 외인성 작용제가 SOD1, TDP43 또는 C9orf72인 경우, 예를 들어 근위축성 측삭경화증의 치료를 위한 운동 뉴런이다. 일부 구현예에서, 표적세포는, 예를 들어 외인성 작용제가 FXN인 경우, 예를 들어 프리드리히 운동실조증의 치료를 위한 신경계, 심장, 간 및/또는 골격근의 세포이다. 일부 구현예에서, 표적세포는, 예를 들어 외인성 작용제가 MECP2인 경우, 예를 들어 레트증후군의 치료를 위한 뇌의 뉴런이다. 일부 구현예에서, 표적세포는, 예를 들어 외인성 작용제가 ASPA인 경우, 예를 들어 카나반병의 치료를 위한 회소돌기아교세포 또는 뉴런이다.
일부 구현예에서, 외인성 작용제는 하기 표 6의 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 표 6의 임의의 단백질의 야생형 인간 서열, 이의 기능성 단편(예를 들어, 이의 효소적으로 활성인 단편) 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제는 표 6의 아미노산 서열, 예를 들어 표 6의 컬럼 2의 Uniprot 단백질 수탁번호 서열 또는 표 6의 컬럼 3의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 페이로드 유전자는 표 6의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다.
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Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
일부 구현예에서, 표적세포는, 예를 들어 외인성 작용제가 GALC인 경우, 예를 들어 크라베병의 치료를 위한 회소돌기아교세포이다. 일부 구현예에서, 표적세포는, 예를 들어 외인성 작용제가 HEXA인 경우, 예를 들어 테이-삭스병의 치료를 위한 뉴런이다. 일부 구현예에서, 표적세포는, 예를 들어 외인성 작용제가 HEXB인 경우 예를 들어 샌드호프병의 치료를 위한 뉴런이다.
일부 구현예에서, 단백질 작용제는 응고 인자 이외의 것, 예를 들어 인자 VII 또는 인자 IX 이외의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질 작용제는 리포터 단백질, 예를 들어 형광 단백질, 예를 들어 GFP 또는 루시퍼라아제 이외의 것이다. 일부 구현예에서, 단백질 작용제는 세포 표면 수용체, NGF 수용체, 갈락토세레브로시다아제(galactocerebrosidase), gp91 phox, IFN-알파, TK, GCV, 자가면역 항원, 사이토카인, 혈관형성 저해제 또는 항암제, 또는 이의 단편 또는 변이체 이외의 것이다.
VII. 절연인자 요소
일부 구현예에서, 푸소좀, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 VLP는 하나 이상의 절연인자 요소, 예를 들어 본원에 기재된 절연인자 요소를 추가로 포함한다. 절연인자 요소는 게놈 DNA에 존재하는 시스-작용 요소에 의해 매개되어, 전달된 서열의 탈조절된 발현(예를 들어, 위치 효과; 예를 들어 문헌[Burgess- Beusse et al, 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99: 16433]; 및 문헌[Zhan et al, 2001, Hum. Genet., 109:471] 참조) 또는 전달된 서열에 인접한 내인성 서열의 탈조절된 발현을 유도할 수 있는 통합 부작용으로부터, 렌티바이러스 발현된 서열, 예를 들어 치료용 폴리펩타이드를 보호하는 데 기여할 수 있다. 일부 구현예에서, 전달 벡터는 3' LTR에 하나 이상의 절연인자 요소를 포함하며, 프로바이러스의 숙주 게놈에의 통합 시, 프로바이러스는 3' LTR의 복제로 인해 5' LTR 및/또는 3' LTR에 하나 이상의 절연인자를 포함한다. 적합한 절연인자에는, 비제한적으로, 닭 β-글로빈 절연인자(문헌[Chung et al, 1993. Cell 74:505]; 문헌[Chung et al, 1997. N4S 94:575]; 문헌[Bell et al., 1999. Cell 98:387](이들은 본원에 참조로서 인용됨) 참조) 또는 닭 HS4와 같은 인간 β-글로빈 유전자좌로부터의 절연인자가 포함된다. 일부 구현예에서, 절연인자는 CCCTC 결합인자(CTCF)에 결합한다. 일부 구현예에서, 절연인자는 장벽 절연인자이다. 일부 구현예에서, 절연인자는 인핸서 차단 절연인자이다. 예를 들어, 문헌[Emery et al., Human Gene Therapy, 2011], 및 문헌[Browning and Trobridge, Biomedicines, 2016](상기 문헌은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨) 참조.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 핵산의 절연인자는 수용세포에서 유전독성을 감소시킨다. 유전독성은, 예를 들어 문헌[Cesana et al, "Uncovering and dissecting the genotoxicity of self-inactivating lentiviral vectors in vivo" Mol Ther. 2014 Apr;22(4):774-85](doi: 10.1038/mt.2014.3. Epub 2014 Jan 20)에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.
VIII. 표적세포의 푸소좀 함량 평가
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, 대상에서 표적세포의 푸소좀 함량(예를 들어, 표적세포에 대한 푸소좀 융합)을 평가하는 방법으로서, 푸소좀 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 푸소좀 조성물)을 받은 대상으로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 생물학적 샘플 내 표적세포와 본원에 기재된 바와 같은 푸소좀의 융합에 의해 생성된 생물학적 샘플의 하나 이상의 특성을 결정하기 위해 검정을 수행하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은, 예를 들어 실시예 71에 기재된 바와 같이, 표적세포와의 융합을 측정하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플의 하나 이상의 특성을 결정하는 것은, 푸소겐의 존재, 카고 또는 페이로드의 수준, 또는 카고 또는 페이로드와 관련된 활성을 결정하는 것을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상에서 표적세포의 푸소좀 함량(예를 들어, 표적세포에 대한 푸소좀 융합)을 평가하는 방법으로서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 푸소좀 조성물을 받은 대상으로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 생물학적 샘플을 푸소겐, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 푸소겐의 존재에 대해 시험하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 검출된 푸소겐의 수준은 푸소좀 조성물을 받지 않은 대상으로부터의 상응하는 생물학적 샘플에서 관찰된 것보다 더 크다(예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000%, 10,000%, 50,000% 또는 100,000% 더 큼). 일부 구현예에서, 대상은 푸소좀 조성물의 투여 전과 동일한 대상이며, 일부 구현예에서, 대상은 상이한 대상이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상에서 표적세포의 푸소좀 함량(예를 들어, 표적세포에 대한 푸소좀 융합)을 평가하는 방법으로서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 푸소좀 조성물을 받은 대상으로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 생물학적 샘플을, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 푸소좀에 의해 전달된 카고 또는 페이로드의 존재에 대해 시험하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 검출된 카고 또는 페이로드의 수준은 푸소좀 조성물을 받지 않은 대상으로부터의 상응하는 생물학적 샘플에서 관찰된 것보다 더 크다 (예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000%, 10,000%, 50,000% 또는 100,000% 더 큼). 일부 구현예에서, 대상은 푸소좀 조성물의 투여 전과 동일한 대상이며, 일부 구현예에서, 대상은 상이한 대상이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 대상에서 표적세포의 푸소좀 함량(예를 들어, 표적세포에 대한 푸소좀 융합)을 평가하는 방법으로서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 푸소좀 조성물을 받은 대상으로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 생물학적 샘플을 푸소좀 조성물과 관련된 활성, 예를 들어 푸소좀 조성물에 의해 전달된 카고 또는 페이로드와 관련된 활성의 변경에 대해 시험하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 예에서, 검출된 활성 수준은 푸소좀 조성물을 받지 않은 대상(예를 들어, 푸소좀 조성물의 투여 전과 동일한 대상)으로부터의 상응하는 생물학적 샘플에 비해, 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000%, 10,000%, 50,000% 또는 100,000% 증가된다. 일부 예에서, 검출된 활성 수준은 푸소좀 조성물을 받지 않은 대상으로부터의 상응하는 생물학적 샘플에 비해, 예를 들어 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, 2000%, 3000%, 4000%, 5000%, 10,000%, 50,000% 또는 100,000% 감소된다. 일부 구현예에서, 대상은 푸소좀 조성물의 투여 전과 동일한 대상이며, 일부 구현예에서, 대상은 상이한 대상이다.
하나의 양태에서, 본 개시내용은 대상에서 표적세포의 푸소좀 함량을 평가하는 방법으로서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 푸소좀 조성물을 받은 대상으로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계, 및 생물학적 샘플에서 융합되지 않은 푸소좀의 수준을 평가하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
대상에서, 수용세포의 형성으로 이어지는, 표적세포의 푸소좀 함량(예를 들어, 표적세포에 대한 푸소좀 융합)을 평가하는 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상으로부터 생물학적 샘플을 채취하는 단계를 추가로 포함한다. 구현예에서, 생물학적 샘플은 하나 이상의 수용세포를 포함한다.
대상에서 표적세포의 푸소좀 함량(예를 들어, 표적세포에 대한 푸소좀 융합)을 평가하는 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은, 예를 들어 원심분리에 의해 생물학적 샘플 내 융합되지 않은 푸소좀으로부터 생물학적 샘플 내 수용세포를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 예를 들어 원심분리에 의해 생물학적 샘플에서 융합되지 않은 푸소좀에 비해 수용세포를 강화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 예를 들어 FACS에 의해 생물학적 샘플에서 비표적세포에 비해 표적세포를 강화시키는 단계를 추가로 포함한다.
대상에서 표적세포의 푸소좀 함량(예를 들어, 표적세포에 대한 푸소좀 융합)을 평가하는 방법의 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물과 관련된 활성은, 대사산물의 존재 또는 수준, 바이오마커(예를 들어, 단백질 수준 또는 번역 후 변형, 예를 들어 인산화 또는 절단)의 존재 또는 수준에서 선택된다.
대상에서 표적세포의 푸소좀 함량(예를 들어, 표적세포에 대한 푸소좀 융합)을 평가하는 방법의 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물과 관련된 활성은 면역원성이다. 구현예에서, 표적세포는 CD3+ 세포이고, 생물학적 샘플은 대상에서 채취된 혈액 샘플이다. 구현예에서, 혈액세포를, 예를 들어 염화암모늄 완충 용액을 사용하여 혈액 샘플에서 강화시킨다. 구현예에서, 강화된 혈액세포를 항-CD3 항체(예를 들어, 쥣과 항-CD3-FITC 항체)와 함께 인큐베이션하고, 예를 들어 형광 활성화 세포 분류에 의해 CD3+ 세포를 선별한다. 구현예에서, 세포, 예를 들어 분류된 세포, 예를 들어 CD3+ 세포를, 예를 들어 항-IgM 항체로 염색하여 세포 표면 상의 항체의 존재에 대해 분석한다. 일부 구현예에서, 항체가 참조 수준보다 높은 수준으로 존재하는 경우, 대상은 수용세포에 대한 면역반응을 갖는 것으로 식별된다.
구현예에서, 면역원성은 세포 용해 검정으로 검정된다. 구현예에서, 생물학적 샘플로부터의 수용세포를 다른 세포를 용해시킬 수 있는 면역 이펙터 세포와 함께 인큐베이션한다. 구현예에서, 면역 이펙터 세포는 상기 대상 또는 푸소좀 조성물을 투여받지 않는 대상에서 유래된다. 예를 들어, 구현예에서, 면역원성은 PBMC 세포 용해 검정으로 평가된다. 구현예에서, 생물학적 샘플로부터의 수용세포를 상기 대상으로부터의 말초혈액단핵세포(PBMC) 또는 푸소좀 조성물을 투여받지 않은 대상으로부터의 대조군 PBMC와 함께 인큐베이션한 후, PBMC에 의한 수용세포의 용해에 대해 평가한다. 구현예에서, 면역원성은 자연살해(NK) 세포 용해 검정으로 평가된다. 구현예에서, 수용세포를 상기 대상으로부터의 NK세포 또는 푸소좀 조성물을 투여받지 않은 대상으로부터의 대조군 NK세포와 함께 인큐베이션한 후, NK세포에 의한 수용세포의 용해에 대해 평가한다. 구현예에서, 면역원성은 CD8+ T세포 용해 검정으로 평가된다. 구현예에서, 수용세포를 상기 대상으로부터의 CD8+ T세포 또는 푸소좀 조성물을 투여받지 않은 대상으로부터의 대조군 CD8+ T세포와 함께 인큐베이션한 후, CD8+ T세포에 의한 표적세포의 용해에 대해 평가한다. 일부 구현예에서, 세포 용해가 참조 수준보다 높은 수준으로 일어나는 경우, 대상은 수용세포에 대한 면역반응을 갖는 것으로 식별된다.
일부 구현예에서, 면역원성은, 예를 들어 대식세포에 의한 수용세포의 포식작용으로 검정된다. 구현예에서, 수용세포는 포식작용에 대한 대식세포에 의해 표적화되지 않는다. 구현예에서, 생물학적 샘플은 대상에서 채취된 혈액 샘플이다. 구현예에서, 혈액세포를, 예를 들어 염화암모늄 완충 용액을 사용하여 혈액 샘플에서 강화시킨다. 구현예에서, 강화된 혈액세포를 항-CD3 항체(예를 들어, 쥣과 항-CD3-FITC 항체)와 함께 인큐베이션하고, 예를 들어 형광 활성화 세포 분류에 의해 CD3+ 세포를 선별한다. 구현예에서, 형광 표지된 CD3+ 세포를 대식세포와 함께 인큐베이션한 후, 예를 들어 유세포분석으로 대식세포 내 세포내 형광에 대해 시험한다. 일부 구현예에서, 대식세포 포식작용이 참조 수준보다 높은 수준으로 일어나는 경우, 대상은 수용세포에 대한 면역반응을 갖는 것으로 식별된다.
IX. 푸소좀의 물리적 및 기능적 특징
일부 구현예에서, 푸소좀은 작용제, 예를 들어 단백질, 핵산(예를 들어, mRNA), 세포소기관 또는 대사산물을 표적세포의 시토졸에 전달할 수 있다(예를 들어, 전달한다). 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 작용제를 표적세포의 시토졸에 전달하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 작용제는 표적세포에 존재하지 않거나, 표적세포에서 돌연변이되거나, 또는 표적세포에서 야생형에 비해 낮은 수준으로 존재하는 단백질(또는 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어 단백질을 인코딩하는 mRNA)이다. 일부 구현예에서, 표적세포는 유전자 질환, 예를 들어 단일유전자 질환, 예를 들어 단일유전자 세포내 단백질 질환을 앓고 있는 대상에서 유래된다. 일부 구현예에서, 작용제는 전사인자, 예를 들어 외인성 전사인자 또는 내인성 전사인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 하나 이상(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 50개)의 추가 전사인자, 예를 들어 외인성 전사인자, 내인성 전사인자 또는 이들의 조합을 추가로 포함하거나, 상기 방법은 하나 이상(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 50개)의 추가 전사인자, 예를 들어 외인성 전사인자, 내인성 전사인자 또는 이들의 조합을 전달하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 복수의 작용제(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 50개의 작용제)를 포함하고(예를 들어, 이를 표적세포에 전달할 수 있음), 여기서 복수의 작용제는 각각 표적세포에서의 경로의 단계에서 작용하며, 예를 들어 여기서 경로는 생합성 경로, 이화작용 경로 또는 신호전달 캐스케이드이다. 구현예에서, 복수의 작용제는 각각 상기 경로를 상향조절하거나 상기 경로를 하향조절한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 상기 경로의 단계에서 작용하지 않는, 예를 들어 제2 경로의 단계에서 작용하는 하나 이상의 추가 작용제를 추가로 포함하거나(예를 들어, 제2 복수의 작용제를 포함함), 상기 방법은 상기 경로의 단계에서 작용하지 않는, 예를 들어 제2 경로의 단계에서 작용하는 하나 이상의 추가 작용제를 전달하는 것을 추가로 포함한다(예를 들어, 제2 복수의 작용제를 전달하는 것을 포함함). 일부 구현예에서, 푸소좀은 복수의 작용제(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 50개의 작용제)를 포함하거나(예를 들어, 이를 표적세포에 전달할 수 있음), 상기 방법은 복수의 작용제(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 50개의 작용제)를 전달하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 복수의 작용제는 단일 경로의 일부이며, 예를 들어 여기서 경로는 생합성 경로, 이화작용 경로 또는 신호전달 캐스케이드이다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 단일 경로의 일부가 아닌, 예를 들어 제2 경로의 일부인 하나 이상의 추가 작용제를 추가로 포함하거나(예를 들어, 제2 복수의 작용제를 포함함), 상기 방법은 단일 경로의 일부가 아닌, 예를 들어 제2 경로의 일부인 하나 이상의 추가 작용제를 전달하는 것을 추가로 포함한다(예를 들어, 제2 복수의 작용제를 전달하는 것을 포함함).
일부 구현예에서, 표적세포는 응집되거나 잘못폴딩된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 표적세포에서 응집되거나 잘못폴딩된 단백질의 수준을 감소시킬 수 있거나(예를 들어, 이의 수준을 감소시킴), 본원의 방법은 표적세포에서 응집되거나 잘못폴딩된 단백질의 수준을 감소시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 작용제는 전사인자, 효소(예를 들어, 핵 효소 또는 시토졸 효소), DNA에 대한 서열 특이적 변형을 매개하는 시약(예를 들어, Cas9, ZFN 또는 TALEN), mRNA(예를 들어, 세포내 단백질을 인코딩하는 mRNA), 세포소기관 또는 대사산물에서 선택된다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 작용제, 예를 들어 단백질을 표적세포의 세포막에 전달할 수 있다(예를 들어, 전달한다). 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 작용제를 표적세포의 세포막에 전달하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질을 전달하는 것은, 표적세포가 단백질을 생성하고 이를 막에 국소화시키도록, 단백질을 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)을 표적세포에 전달하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 단백질을 포함하거나, 상기 방법은 단백질을 전달하는 것을 추가로 포함하며, 푸소좀과 표적세포의 융합은 단백질을 표적세포의 세포막에 전달한다. 일부 구현예에서, 작용제는 세포 표면 수용체에 결합하는 세포 표면 리간드 또는 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 세포 표면 수용체에 결합하는 제2 세포 표면 리간드 또는 항체를 포함하거나 인코딩하고, 선택적으로 세포 표면 수용체에 결합하는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 50개 또는 그 이상)의 추가 세포 표면 리간드 또는 항체를 추가로 포함하거나 인코딩하는 제2 작용제를 추가로 포함하거나, 상기 방법은, 세포 표면 수용체에 결합하는 제2 세포 표면 리간드 또는 항체를 포함하거나 인코딩하고, 선택적으로 세포 표면 수용체에 결합하는 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 50개 또는 그 이상)의 추가 세포 표면 리간드 또는 항체를 추가로 포함하거나 인코딩하는 제2 작용제를 전달하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 작용제와 제2 작용제는 복합체를 형성하며, 선택적으로 복합체는 하나 이상의 추가 세포 표면 리간드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 작용제는 세포 표면 수용체, 예를 들어 외인성 세포 표면 수용체를 포함하거나 인코딩한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 제2 세포 표면 수용체를 포함하거나 인코딩하고, 선택적으로 하나 이상의 추가 세포 표면 수용체(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 50개 또는 그 이상의 추가 세포 표면 수용체)를 추가로 포함하거나 인코딩하는 제2 작용제를 추가로 포함하거나, 상기 방법은 제2 세포 표면 수용체를 포함하거나 인코딩하고, 선택적으로 하나 이상의 추가 세포 표면 수용체(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 50개 또는 그 이상의 추가 세포 표면 수용체)를 추가로 포함하거나 인코딩하는 제2 작용제를 전달하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 작용제와 제2 작용제는 복합체를 형성하며, 선택적으로 복합체는 하나 이상의 추가 세포 표면 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 작용제는 항원 또는 항원제시 단백질을 포함하거나 인코딩한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 단백질을 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)을 표적세포가 단백질을 생성하고 분비하도록 하는 조건 하에서 표적세포에 전달함으로써, 분비된 작용제, 예를 들어 분비된 단백질을 표적 부위(예를 들어, 세포외 영역)에 전달할 수 있다(예를 들어, 전달한다). 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 본원에 기재된 바와 같은 분비된 작용제를 전달하는 것을 포함한다. 구현예에서, 분비된 단백질은 내인성 또는 외인성이다. 구현예에서, 분비된 단백질은 단백질 치료제, 예를 들어 항체 분자, 사이토카인 또는 효소를 포함한다. 구현예에서, 분비된 단백질은 오토그린 신호전달 분자 또는 파라그린 신호전달 분자를 포함한다. 구현예에서, 분비된 작용제는 분비성 과립을 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 전사인자 또는 mRNA, 또는 복수의 상기 작용제에서 선택되는 작용제를 전달함으로써, 표적세포(예를 들어, 면역세포)를 재프로그래밍할 수 있다(예를 들어, 재프로그래밍한다). 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 표적세포를 재프로그래밍하는 것을 포함한다. 구현예에서, 재프로그래밍은 췌장 내분비 세포가 췌장 베타 세포의 하나 이상의 특징을 취하도록 유도하거나, 비(非)도파민성 뉴런이 도파민성 뉴런의 하나 이상의 특징을 취하도록 유도하거나, 또는 소진된 T세포가 비(非)소진된 T세포, 예를 들어 킬러 T세포의 하나 이상의 특징을 취하도록 유도하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 작용제는 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 항원을 포함하는 제1 작용제와, 항원제시 단백질을 포함하는 제2 작용제를 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 하나 이상의 세포 표면 수용체를 표적세포(예를 들어, 면역세포)에 공여할 수 있다(예를 들어, 공여한다). 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 하나 이상의 세포 표면 수용체를 공여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 표적 종양세포를 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 변형시킨다. 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 표적 종양세포를 변형시키는 것을 포함한다. 구현예에서, 푸소좀은 면역자극 리간드, 항원제시 단백질, 종양억제 단백질 또는 세포자멸유도 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 표적세포에서 면역억제 리간드, 유사분열 신호 또는 성장인자의 수준을 감소시킬 수 있는 miRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 면역조절성이며, 예를 들어 면역자극성인 작용제를 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 표적세포가 항원을 제시하도록 야기할 수 있다(예를 들어, 야기한다). 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 표적세포에 항원을 제시하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 표적조직에서 재생을 촉진시킨다. 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 표적조직에서 재생을 촉진시키는 것을 포함한다. 구현예에서, 표적세포는 심장세포, 예를 들어 심근세포(예를 들어, 정지성 심근세포), 간모세포(예를 들어, 담관 간모세포), 상피세포, 나이브 T세포, 대식세포(예를 들어, 종양침윤성 대식세포) 또는 섬유아세포(예를 들어, 심장 섬유아세포)이다. 구현예에서, 원천세포는 T세포(예를 들어, Treg), 대식세포 또는 심장 근세포이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 유전자 치료를 위해 표적세포의 게놈을 안정적으로 변형시키기 위해, 핵산을 표적세포에 전달할 수 있다(예를 들어, 전달한다). 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 핵산을 표적세포에 전달하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적세포는 효소 결핍을 가지며, 예를 들어 효소의 감소된 활성(예를 들어, 활성이 없음)을 유도하는 효소의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 표적세포에서 DNA에 대한 서열 특이적 변형을 매개하는 시약(예를 들어, Cas9, ZFN 또는 TALEN)을 전달할 수 있다(예를 들어, 전달한다). 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 시약을 표적세포에 전달하는 것을 포함한다. 구현예에서, 표적세포는 CNS세포이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 표적세포에서 유전자 발현을 일시적으로 변형시키기 위해, 핵산을 표적세포에 전달할 수 있다(예를 들어, 전달한다).
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 단백질 결핍을 일시적으로 구제하기 위해, 단백질을 표적세포에 전달할 수 있다(예를 들어, 전달한다). 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 단백질을 표적세포에 전달하는 것을 포함한다. 구현예에서, 단백질은 막단백질(예를 들어, 막 수송 단백질), 세포질 단백질(예를 들어, 효소) 또는 분비된 단백질(예를 들어, 면역억제 단백질)이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 세포소기관을 표적세포에 전달할 수 있으며(예를 들어, 전달하며), 예를 들어 표적세포는 결함이 있는 세포소기관 네트워크를 갖는다. 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 세포소기관을 표적세포에 전달하는 것을 포함한다. 구현예에서, 원천세포는 간세포, 골격근세포 또는 뉴런이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 핵을 표적세포에 전달할 수 있으며(예를 들어, 전달하며), 예를 들어 표적세포는 유전자 돌연변이를 갖는다. 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 핵을 표적세포에 전달하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵은 자가조직이고, 표적세포에 비해 하나 이상의 유전자 변경을 포함하며, 예를 들어 이는 DNA에 대한 서열 특이적 변형(예를 들어, Cas9, ZFN 또는 TALEN), 인공 염색체, 게놈에 통합된 추가 유전자 서열, 결실, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 구현예에서, 자가 핵의 공급원은 줄기세포, 예를 들어 조혈줄기세포이다. 구현예에서, 표적세포는 근육세포(예를 들어, 골격근세포 또는 심근세포), 간세포 또는 뉴런이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 세포내 분자 전달이 가능하며, 예를 들어 단백질 작용제를 표적세포에 전달한다. 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 분자를 표적세포의 세포내 영역에 전달하는 것을 포함한다. 구현예에서, 단백질 작용제는 저해제이다. 구현예에서, 단백질 작용제는 나노바디, scFv, 낙타 항체, 펩타이드, 거대고리 또는 소분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 표적세포가 단백질, 예를 들어 치료용 단백질을 분비하도록 야기할 수 있다(예를 들어, 야기한다). 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 표적세포가 단백질을 분비하게 하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 작용제, 예를 들어 단백질을 분비할 수 있다(예를 들어, 분비한다). 일부 구현예에서, 작용제, 예를 들어 분비된 작용제는 대상의 표적 부위에 전달된다. 일부 구현예에서, 작용제는 재조합적으로 제조될 수 없거나 재조합적으로 제조하기 어려운 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질을 분비하는 푸소좀은 MSC 또는 연골세포에서 선택되는 원천세포에서 유래된다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 이의 막에 하나 이상의 세포 표면 리간드(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 50개 또는 그 이상의 세포 표면 리간드)를 포함한다. 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 하나 이상의 세포 표면 리간드를 표적세포에 제시하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 표면 리간드를 갖는 푸소좀은 호중구(예를 들어, 표적세포는 종양침윤림프구임), 수지상세포(예를 들어, 표적세포는 나이브 T세포임) 또는 호중구(예를 들어, 표적은 종양세포 또는 바이러스 감염된 세포임)에서 선택되는 원천세포에서 유래된다. 일부 구현예에서 푸소좀은 막 복합체, 예를 들어 적어도 2개, 3개, 4개 또는 5개의 단백질, 예를 들어 동종이량체, 이종이량체, 동종삼량체, 이종삼량체, 동종사량체 또는 이종사량체를 포함하는 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 항체, 예를 들어 독성 항체를 포함하고, 예를 들어 푸소좀은, 예를 들어 표적 부위로 귀소함으로써 항체를 표적 부위에 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 원천세포는 NK세포 또는 호중구이다.
일부 구현예에서, 본원의 방법은 표적세포의 표면 상의 표적세포 또는 리간드 제시로부터 단백질의 분비를 야기하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 표적세포의 세포 사멸을 야기할 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 NK 원천세포에서 유래된다.
일부 구현예에서, 푸소좀 또는 표적세포는 (예를 들어, 병원체의) 포식작용을 할 수 있다. 유사하게, 일부 구현예에서, 본원의 방법은 포식작용을 야기하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 이의 주위 환경을 감지하고, 이에 반응한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 대사산물, 인터류킨 또는 항원의 수준을 감지할 수 있다.
구현예에서, 푸소좀은 화학주성, 혈관외유출 또는 하나 이상의 대사활동이 가능하다. 구현예에서, 대사활성은 키뉴리닌(kyneurinine), 글루코오스신합성, 프로스타글란딘 지방산 산화, 아데노신 대사, 요소 회로 및 발열성 호흡에서 선택된다. 일부 구현예에서, 원천세포는 호중구이고, 푸소좀은 상처 부위로 귀소할 수 있다. 일부 구현예에서, 원천세포는 대식세포이고, 푸소좀은 포식작용을 할 수 있다. 일부 구현예에서, 원천세포은 갈색지방조직이고, 푸소좀은 지방분해가 가능하다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 복수의 작용제(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개 또는 50개의 작용제)를 포함한다(예를 들어, 이를 표적세포에 전달할 수 있음). 구현예에서, 푸소좀은 저해 핵산(예를 들어, siRNA 또는 miRNA) 및 mRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 막단백질 또는 막단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다(예를 들어, 이를 표적세포에 전달할 수 있음). 구현예에서, 푸소좀은 표적세포를 재프로그래밍하거나 전환분화시킬 수 있고, 예를 들어 푸소좀은 표적세포의 재프로그래밍 또는 전환분화를 유도하는 하나 이상의 작용제를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상은 재생을 필요로 한다. 일부 구현예에서, 대상은 암, 자가면역질환, 감염성 질환, 대사질환, 신경변성질환 또는 유전자질환(예를 들어, 효소 결핍)으로 고통을 받고 있다.
일부 구현예(예를 들어, 카고의 비세포내이입 전달을 검정하기 위한 구현예)에서, 카고 전달은 하기 단계 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 사용하여 검정된다: (a) 30,000개의 HEK-293T 표적세포를 100 nM 바필로마이신 A1이 포함된 96-웰 플레이트의 첫 번째 웰에 위치시키고, 유사한 수의 유사한 세포를 바필로마이신 A1이 결여된 96-웰 플레이트의 두 번째 웰에 위치시키는 단계, (b) 표적세포를 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 배양하는 단계, (c) 표적세포를 카고를 포함하는 푸소좀 10 ug과 접촉시키는 단계, (d) 표적세포와 푸소좀을 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하는 단계, 및 (e) 카고를 포함하는 첫 번째 웰과 두 번째 웰에서 세포의 백분율을 결정하는 단계. 단계 (e)는, 현미경을 사용하여, 예를 들어 면역형광을 사용하여 카고를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 단계 (e)는, 카고를 간접적으로 검출하는 것, 예를 들어 카고의 다운스트림 효과, 예를 들어 리포터 단백질의 존재를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 단계 (a) 내지 단계 (e) 중 하나 이상은 실시예 80에 기재된 바와 같이 수행된다.
일부 구현예에서, 세포내이입 저해제(예를 들어, 클로로퀸 또는 바필로마이신 A1)는 엔도좀 산성화를 저해한다. 일부 구현예에서, 카고 전달은 리소좀 산성화와 독립적이다. 일부 구현예에서, 세포내이입 저해제(예를 들어, Dynasore)는 디나민을 저해한다. 일부 구현예에서, 카고 전달은 디나민 활성과 독립적이다.
일부 구현예(예를 들어, 표적세포 대 비표적세포로의 카고의 특이적 전달에 대한 구현예)에서, 카고 전달은 하기 단계 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 사용하여 검정된다: (a) CD8a와 CD8b를 과발현하는 30,000개의 HEK-293T 표적세포를 96-웰 플레이트의 첫 번째 웰에 위치시키고, CD8a와 CD8b를 과발현하지 않는 30,000 HEK-293T 비표적세포를 96-웰 플레이트의 두 번째 웰에 위치시키는 단계, (b) 세포를 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 배양하는 단계, (c) 표적세포를 카고를 포함하는 푸소좀 10 ug과 접촉시키는 단계, (d) 표적세포와 푸소좀을 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하는 단계, 및 (e) 카고를 포함하는 첫 번째 웰과 두 번째 웰에서 세포의 백분율을 결정하는 단계. 단계 (e)는, 현미경을 사용하여, 예를 들어 면역형광을 사용하여 카고를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 단계 (e)는, 카고를 간접적으로 검출하는 것, 예를 들어 카고의 다운스트림 효과, 예를 들어 리포터 단백질의 존재를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 단계 (a) 내지 단계 (e) 중 하나 이상은 실시예 71에 기재된 바와 같이 수행된다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 42의 검정에 따라 측정 시, 비표적세포보다 표적세포와 더 높은 비율로, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 더 높은 비율로 융합한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 42의 검정에 따라 측정 시, 다른 푸소좀보다 표적세포와 더 높은 비율로, 예를 들어 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 더 높은 비율로 융합한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 42의 검정에 따라 측정 시, 푸소좀 내 작용제가 24시간, 48시간 또는 72시간 후 표적세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%에 전달되도록 하는 비율로 표적세포와 융합한다. 구현예에서, 표적화된 융합의 양은, 예를 들어 실시예 42의 검정에 따라 측정 시, 약 30% 내지 70%, 35% 내지 65%, 40% 내지 60%, 45% 내지 55% 또는 45% 내지 50%, 예를 들어 약 48.8%이다. 구현예에서, 표적화된 융합의 양은, 예를 들어 실시예 43의 검정에 따라 측정 시, 약 20% 내지 40%, 25% 내지 35% 또는 30% 내지 35%, 예를 들어 약 32.2%이다.
일부 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 실시예 26의 검정에 따라 측정 시, 최소 또는 최대 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 카피 수로 존재한다. 일부 구현예에서, 푸소좀으로 구성된 푸소겐의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 세포막에 배치되어 있다. 구현예에서, 푸소좀은 또한 내부적으로, 예를 들어 세포질 또는 세포소기관에 푸소겐을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소겐은, 실시예 94에 기재된 방법 및/또는 질량분석법 검정에 따라 결정 시, 푸소좀 내 총 단백질의 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20% 또는 그 이상, 또는 약 1 내지 30%, 5 내지 20%, 10 내지 15%, 12 내지 15%, 13 내지 14% 또는 13.6%를 차지한다(또는 차지하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소겐은 푸소좀 내 총 단백질의 약 13.6%를 차지한다(또는 차지하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 실시예 94에 기재된 방법에 따라 결정 시, 하나 이상 추가 관심 단백질보다 다소 풍부하다(또는 풍부한 것으로 확인된다). 일 구현예에서, 푸소겐은 약 140, 145, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157(예를 들어, 156.9), 158, 159, 160, 165 또는 170의 EGFP에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 또 다른 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 질량분석법 검정에 따라 측정 시, 약 2700, 2800, 2900, 2910(예를 들어, 2912), 2920, 2930, 2940, 2950, 2960, 2970, 2980, 2990 또는 3000, 또는 약 1000 내지 5000, 2000 내지 4000, 2500 내지 3500, 2900 내지 2930, 2910 내지 2915, 또는 2912.0의 CD63에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 일 구현예에서, 푸소겐은 약 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660(예를 들어, 664.9), 670, 680, 690 또는 700의 ARRDC1에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 또 다른 구현예에서, 푸소겐은 약 50, 55, 60, 65, 70(예를 들어, 69), 75, 80 또는 85, 또는 약 1% 내지 30%, 5% 내지 20%, 10% 내지 15%, 12% 내지 15%, 13% 내지 14% 또는 13.6%의 GAPDH에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 또 다른 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 질량분석법 검정에 따라 측정 시, 약 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560(예를 들어, 558.4), 570, 580, 590 또는 600, 또는 약 300 내지 800, 400 내지 700, 500 내지 600, 520 내지 590, 530 내지 580, 540 내지 570, 550 내지 560, 또는 558.4의 CNX에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 88의 검정에 따라 측정 시, 최소 또는 최대 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 카피 수로 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 88의 검정에 따라 측정 시, 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 카피 수로 단백질 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 카피 수로 핵산 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 카피 수로 DNA 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 카피 수로 RNA 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 카피 수로 외인성 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 카피 수로 외인성 단백질 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 카피 수로 외인성 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소겐의 카피 수 대 치료제의 카피 수의 비는, 1,000,000:1 내지 100,000:1, 100,000:1 내지 10,000:1, 10,000:1 내지 1,000:1, 1,000:1 내지 100:1, 100:1 내지 50:1, 50:1 내지 20:1, 20:1 내지 10:1, 10:1 내지 5:1, 5:1 내지 2:1, 2:1 내지 1:1, 1:1 내지 1:2, 1:2 내지 1:5, 1:5 내지 1:10, 1:10 내지 1:20, 1:20 내지 1:50, 1:50 내지 1:100, 1:100 내지 1:1,000, 1:1,000 내지 1:10,000, 1:10,000 내지 1:100,000 또는1:100,000 내지 1:1,000,000이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 치료제를 표적세포에 전달한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 단백질 치료제를 표적세포에 전달한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 핵산 치료제를 표적세포에 전달한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 RNA 치료제를 표적세포에 전달한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 10개, 50개, 100개, 500개, 1,000개, 2,000개, 5,000개, 10,000개, 20,000개, 50,000개, 100,000개, 200,000개, 500,000개, 1,000,000개, 5,000,000개, 10,000,000개, 50,000,000개, 100,000,000개, 500,000,000개 또는 1,000,000,000개 카피의 DNA 치료제를 표적세포에 전달한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀으로 구성된 카고(예를 들어, 치료제, 예를 들어 내인성 치료제 또는 외인성 치료제)의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 표적세포에 전달한다. 일부 구현예에서, 표적세포(들)과 융합하는 푸소좀은 표적세포(들)과 융합하는 푸소좀으로 구성된 카고(예를 들어, 치료제, 예를 들어 내인성 치료제 또는 외인성 치료제)의 평균 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 표적세포에 전달한다. 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 푸소좀 조성물로 구성된 카고(예를 들어, 치료제, 예를 들어 내인성 치료제 또는 외인성 치료제)의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 표적조직에 전달한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀 내 총 단백질 1 mg당 0.00000001 mg의 푸소겐 내지 1 mg의 푸소겐, 예를 들어 푸소좀 내 총 단백질 1 mg당 0.00000001 mg 내지 0.0000001 mg, 0.0000001 mg 내지 0.000001 mg, 0.000001 mg 내지 0.00001 mg, 0.00001 mg 내지 0.0001 mg, 0.0001 mg 내지 0.001 mg, 0.001 mg 내지 0.01 mg, 0.01 mg 내지 0.1 mg, 또는 0.1 mg 내지 1 mg의 푸소겐을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀 내 지질 1 mg당 0.00000001 mg의 푸소겐 내지 5 mg의 푸소겐, 예를 들어 푸소좀 내 지질 1 mg당 0.00000001 mg 내지 0.0000001 mg, 0.0000001 mg 내지 0.000001 mg, 0.000001 mg 내지 0.00001 mg, 0.00001 mg 내지 0.0001 mg, 0.0001 mg 내지 0.001 mg, 0.001 mg 내지 0.01 mg, 0.01 mg 내지 0.1 mg, 0.1 mg 내지 1 mg, 또는 1 mg 내지 5 mg의 푸소겐을 포함한다.
일부 구현예에서, 카고는 단백질 카고이다. 구현예에서, 카고는 내인성 또는 합성 단백질 카고이다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀당 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 50개, 100개 또는 그 이상의 단백질 카고 분자를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 일 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 88에 기재된 방법에 따라 정량화 시, 푸소좀당 약 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 166개, 170개, 180개, 190개 또는 200개의 단백질 작용제 분자를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 내인성 또는 합성 단백질 카고는 푸소좀 내 총 단백질의 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 그 이상을 차지한다(또는 차지하는 것으로 확인된다). 일 구현예에서, 합성 단백질 카고는 푸소좀 내 총 단백질의 약 13.6%를 차지한다(또는 차지하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 합성 단백질 카고는 약 4 x 10-3, 5 x 10-3, 6 x 10-3(예를 들어, 6.37 x 10-3), 7 x 10-3, 또는 8 x 10-3의 VSV-G에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 합성 단백질 카고는 약 10, 15, 16, 17, 18(예를 들어, 18.6), 19, 20, 25 또는 30, 또는 약 10 내지 30, 15 내지 25, 16 내지 19, 18 내지 19, 또는 18.6의 CD63에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 합성 단백질 카고는 약 2, 3, 4(예를 들어, 4.24), 5, 6 또는 7의 ARRDC1에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 합성 단백질 카고는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4(예를 들어, 0.44), 0.5, 0.6 또는 0.7의 GAPDH에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 합성 단백질 카고는 약 1, 2, 3(예를 들어, 3.56), 4, 5 또는 6의 CNX에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 합성 단백질 카고는 약 10, 15, 16, 17, 18, 19(예를 들어, 19.52), 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 30의 TSG101에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 질량분석법 검정에 따라 측정 시, 푸소좀 내 총 단백질의 적어도 0.5%, 1%, 5%, 10% 또는 그 이상을 차지한다(또는 차지하는 것으로 확인된다). 일 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 질량분석법 검정에 따라 측정 시, 푸소좀 내 총 단백질의 약 1% 내지 30%, 5% 내지 20%, 10% 내지 15%, 12% 내지 15%, 13% 내지 14% 또는 13.6%를 차지한다(또는 차지하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소겐은 다른 관심 단백질보다 더 풍부하다. 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 질량분석법 검정에 따라 측정 시, 약 145 내지 170, 150 내지 165, 155 내지 160, 156.9의 페이로드 단백질, 예를 들어 EGFP에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 질량분석법 검정에 따라 측정 시, 약 1000 내지 5000, 2000 내지 4000, 2500 내지 3500, 2900 내지 2930, 2910 내지 2915, 또는 2912.0의 CD63에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 질량분석법 검정에 따라 측정 시, 약 300 내지 1000, 400 내지 900, 500 내지 800, 600 내지 700, 640 내지 690, 650 내지 680, 660 내지 670, 또는 664.9의 ARRDC1에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 질량분석법 검정에 따라 측정 시, 약 20 내지 120, 40 내지 100, 50 내지 90, 60 내지 80, 65 내지 75, 68내지 70, 또는 69.0의 GAPDH에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소겐은, 예를 들어 질량분석법 검정에 따라 측정 시, 약 200 내지 900, 300 내지 800, 400 내지 700, 500 내지 600, 520 내지 590, 530 내지 580, 540 내지 570, 550 내지 560, 또는 558.4의 CNX에 대한 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 질량분석법 검정은 실시예 94의 검정이다.
일부 구현예에서, 푸소좀과 원천세포 둘 모두에 존재하는(예를 들어, 이들 사이에 공유된) 지질 종의 수는, 예를 들어 질량분석법 검정을 사용하여 측정 시, 적어도 300개, 400개, 500개, 550개, 560개 또는 569개이거나, 500개 내지 700개, 550개 내지 600개, 또는 560개 내지 580개이다(또는 인 것으로 확인된다). 구현예에서, 원천세포 내 상응하는 지질 수준의 적어도 25%의 수준으로 푸소좀에 존재하는 지질 종의 수(둘 모두 샘플 내 총 지질 수준으로 정규화됨)는, 예를 들어 질량분석법 검정을 사용하여 측정 시, 적어도 300개, 400개, 500개, 530개, 540개 또는 548개이거나, 400개 내지 700개, 500개 내지 600개, 520개 내지 570개, 530개 내지 560개, 또는 540개 내지 550개이다(또는 인 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 원천세포 내 총 지질 종에 대한 푸소좀과 원천세포 둘 모두에 존재하는(예를 들어, 이들 사이에 공유된) 지질 종의 분율은, 예를 들어 질량분석법 검정을 사용하여 측정 시, 약 0.4 내지 1.0, 0.5 내지 0.9, 0.6 내지 0.8, 또는 0.7이거나, 적어도 0.4, 0.5, 0.6 또는 0.7이다(또는 인 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 질량분석법 검정은 실시예 86의 검정이다.
일부 구현예에서, 푸소좀과 원천세포 둘 모두에 존재하는(예를 들어, 이들 사이에 공유된) 단백질 종의 수는, 예를 들어 질량분석법 검정을 사용하여 측정 시, 적어도 500개, 1000개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1487개, 1500개 또는 1600개이거나(또는 인 것으로 확인되거나), 1200개 내지 1700개, 1300개 내지 1600개, 1400개 내지 1500개, 1450개 내지 1500개, 또는 1480개 내지 1490개이다(또는 인 것으로 확인된다). 구현예에서, 원천세포 내 상응하는 단백질 수준의 적어도 25%의 수준으로 푸소좀에 존재하는 단백질 종의 수(둘 모두 샘플 내 총 단백질 수준으로 정규화됨)는, 예를 들어 질량분석법 검정을 사용하여 측정 시, 적어도 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 950개, 957개, 1000개 또는 1200개이다. 일부 구현예에서, 원천세포 내 총 단백질 종에 대한 푸소좀과 원천세포 둘 모두에 존재하는(예를 들어, 이들 사이에 공유된) 단백질 종의 분율은, 예를 들어 질량분석법 검정을 사용하여 측정 시, 약 0.1 내지 0.6, 0.2 내지 0.5, 0.3 내지 0.4, 또는 0.333이거나, 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.333 또는 0.4이다(또는 인 것으로 확인된다). 구현예에서, 질량분석법 검정은 실시예 87의 검정이다.
일부 구현예에서, CD63은, 예를 들어 질량분석법 검정, 예를 들어 실시예 89의 검정에 따라 측정 시, 푸소좀 내 총 단백질 양의 0.048%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 또는 10% 미만으로 존재한다(또는 존재하는 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은 필터, 예를 들어 약 1 um 내지 10 um, 2 um 내지 8 um, 3 um 내지 7 um, 4 um 내지 6 um, 또는 5 um의 필터를 통한 압출에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 약 1 um 내지 5 um, 2 um 내지 5 um, 3 um 내지 5 um, 4 um 내지 5 um, 또는 5 um의 평균 직경을 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 적어도 1 um, 2 um, 3 um, 4 um 또는 5 um의 평균 직경을 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은 원천세포와 비교하여 하기 지질 중 하나 이상(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 전부)이 강화되어 있다(또는 강화된 것으로 확인된다): 콜레스테릴 에스테르, 유리(free) 콜레스테롤, 에테르 결합된 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜세린, 포스파티데이트, 에테르 결합된 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 및 스핑고미엘린. 일부 구현예에서, 푸소좀은 원천세포와 비교하여 하기 지질 중 하나 이상(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 전부)이 고갈되어 있다(또는 고갈된 것으로 확인된다): 세라미드, 카르디오리핀(cardiolipin), 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜이노시톨, 에테르 결합된 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 및 트리아실글리세롤. 일부 구현예에서, 푸소좀은 상기 언급된 강화된 지질 중 하나 이상이 강화되어 있고(또는 강화된 것으로 확인되고), 상기 언급된 고갈된 지질 중 하나 이상이 고갈되어 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 원천세포에서 상응하는 수준보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 5배 또는 10배 더 큰 총 지질의 백분율로 강화된 지질을 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 원천세포에서 상응하는 수준의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만의 수준으로의 총 지질의 백분율로 고갈된 지질을 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 지질 강화는 질량분석법 검정, 예를 들어 실시예 96의 검정에 따라 측정된다.
일부 구현예에서, CE 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀보다 푸소좀에서 약 2배 더 높고/높거나 모세포보다 푸소좀에서 약 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 세라미드 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 푸소좀보다 모세포에서 약 2배, 3배, 4배 또는 5배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 콜레스테롤 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 푸소좀보다 엑소좀에서 약 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배 또는 2배 더 높고/높거나 모세포보다 푸소좀에서 약 2배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, CL 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 푸소좀보다 모세포에서 적어도 약 5배, 10배, 20배, 30배 또는 40배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, DAG 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 푸소좀보다 엑소좀에서 약 2배 또는 3배 더 높고/높거나 푸소좀보다 모세포에서 약 1.5배 또는 2배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, PC 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀과 푸소좀 사이에서 거의 동일하고/하거나 푸소좀보다 모세포에서 약 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배 또는 1.8배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, PC O- 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀과 푸소좀 사이에서 거의 동일하고/하거나 푸소좀보다 모세포에서 약 2배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, PE 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀보다 푸소좀에서 약 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배 또는 1.8배 더 높고/높거나 푸소좀보다 모세포에서 약 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배 또는 1.8배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, PE O- 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀과 푸소좀 사이에서 거의 동일하고/하거나 푸소좀보다 모세포에서 약 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배 또는 2배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, PG 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀과 푸소좀 사이에서 거의 동일하고/하거나 푸소좀보다 모세포에서 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, PI 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀과 푸소좀 사이에서 거의 동일하고/하거나 푸소좀보다 모세포에서 약 3배, 4배, 5배, 6배 또는 7배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, PS 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀과 푸소좀 사이에서 거의 동일하고/하거나 모세포보다 푸소좀에서 약 2배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, SM 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀과 푸소좀 사이에서 거의 동일하고/하거나 모세포보다 푸소좀에서 약 2배, 2.5배 또는 3배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, TAG 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀과 푸소좀 사이에서 거의 동일하고/하거나 푸소좀보다 모세포에서 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배 또는 그 이상 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은 엑소좀과 비교하여 하기 지질 중 하나 이상(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 전부)이 강화되어 있다(또는 강화된 것으로 확인된다): 콜레스테릴 에스테르, 세라미드, 디아실글리세롤, 리소포스파티데이트, 포스파티딜에탄올아민 및 트리아실글리세롤. 일부 구현예에서, 푸소좀은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀과 비교하여 하기 지질 중 하나 이상(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개 또는 전부)이 고갈되어 있다(또는 고갈된 것으로 확인된다): 유리 콜레스테롤, 헥소실세라미드, 리소포스파티딜콜린, 에테르 결합된 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 에테르 결합된 리소포스파티딜에탄올아민 및 리소포스파티딜세린. 일부 구현예에서, 푸소좀은 상기 언급된 강화된 지질 중 하나 이상이 강화되어 있고(또는 강화된 것으로 확인되고), 상기 언급된 고갈된 지질 중 하나 이상이 고갈되어 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 엑소좀에서 상응하는 수준보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 5배 또는 10배 더 큰 총 지질의 백분율로 강화된 지질을 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 엑소좀에서 상응하는 수준의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만의 수준으로의 총 지질의 백분율로 고갈된 지질을 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 지질 강화는 질량분석법 검정, 예를 들어 실시예 96의 검정에 따라 측정된다.
일부 구현예에서, 세라미드 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀보다 푸소좀에서 약 2배 더 높고/높거나 푸소좀보다 모세포에서 약 2배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, HexCer 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 푸소좀보다 엑소좀에서 약 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배 또는 2배 더 높고/높거나 모세포와 푸소좀에서 거의 동일하다(동일한 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, LPA 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀보다 푸소좀에서 약 3배 또는 4배 더 높고/높거나 모세포보다 푸소좀에서 약 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배 또는 1.8배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, LPC 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 푸소좀보다 엑소좀에서 약 2배 더 높고/높거나 푸소좀보다 모세포에서 약 1.5배, 1.6배, 1.7배. 1.8배, 1.9배 또는 2배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, LPC O- 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 푸소좀보다 엑소좀에서 약 3배 또는 4배 더 높고/높거나 모세포와 푸소좀 사이에서 거의 동일하다(동일한 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, LPE 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 푸소좀보다 엑소좀에서 약 1.5배, 1.6배, 1.7배. 1.8배, 1.9배 또는 2배 더 높고/높거나 푸소좀보다 모세포에서 약 1.5배, 1.6배, 1.7배. 1.8배, 1.9배 또는 2배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, LPE O- 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 푸소좀보다 엑소좀에서 약 2배 또는 3배 더 높고/높거나 모세포와 푸소좀 사이에서 거의 동일하다(동일한 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, LPS 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 푸소좀보다 엑소좀에서 약 3배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, PA 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 엑소좀보다 푸소좀에서 약 1.5배, 1.6배, 1.7배. 1.8배, 1.9배 또는 2배 더 높고/높거나 모세포보다 푸소좀에서 약 2배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, PG 지질 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 푸소좀과 엑소좀 사이에서 거의 동일하고/하거나 푸소좀보다 모세포에서 약 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배 더 높다(또는 높은 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은 원천세포와 실질적으로 유사한 지질 조성을 포함하거나, 여기서 CL, Cer, DAG, HexCer, LPA, LPC, LPE, LPG, LPI, LPS, PA, PC, PE, PG, PI, PS, CE, SM 및 TAG 중 하나 이상은 원천세포에서 상응하는 지질 수준의 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 이내이다. 구현예에서, 푸소좀의 지질 조성은 이들이 유도된 세포와 유사하다. 구현예에서, 예를 들어 실시예 86에 따라 결정 시, 모세포의 임의의 복제 샘플에서 확인된 지질 종의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 이상이 푸소좀의 임의의 복제 샘플에 존재하는 경우(또는 존재하는 것으로 확인된 경우), 푸소좀과 모세포는 유사한 지질 조성을 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 확인된 지질의 푸소좀 내 평균 수준은 (샘플 내 총 지질에 비해) 모세포 내 상응하는 평균 지질 종 수준의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 초과이다. 일 구현예에서, 푸소좀의 지질 조성은 (샘플 내 총 지질에 비해) 모세포에 비해 특정 지질이 강화 및/또는 고갈되어 있다.
일부 구현예에서, 푸소좀의 지질 조성은, 예를 들어 실시예 96에 기재된 방법에 따라 결정 시, 모세포에 비해 특정 지질이 강화 및/또는 고갈되어 있다(또는 그러한 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은 모세포보다 더 큰 포스파티딜세린 대 총 지질의 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은 포스파티딜세린 대 총 지질의 비를 모세포에 비해 약 110%, 115%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 130%, 135%, 140% 또는 그 이상으로 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 모세포에 비해 콜레스테릴 에스테르, 유리 콜레스테롤, 에테르 결합된 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜세린, 포스파티데이트, 에테르 결합된 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 및/또는 스핑고미엘린이 강화되어 있다(또는 강화된 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 모세포에 비해 세라미드, 카르디오리핀, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜이노시톨, 에테르 결합된 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 및/또는 트리아실글리세롤이 고갈되어 있다(또는 고갈된 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 엑소좀에 비해 콜레스테릴 에스테르, 세라미드, 디아실글리세롤, 리소포스파티데이트, 포스파티딜에탄올아민 및/또는 트리아실글리세롤이 강화되어 있다(또는 강화된 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 엑소좀에 비해 유리 콜레스테롤, 헥소실세라미드, 리소포스파티딜콜린, 에테르 결합된 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 에테르 결합된 리소포스파티딜에탄올아민 및/또는 리소포스파티딜세린이 고갈되어 있다(또는 고갈된 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은 원천세포 내 카르디오리핀:세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:디아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:디아실글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:헥소실세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:헥소실세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:리소포스파티데이트 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:리소포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:리소포스파티딜콜린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:리소포스파티딜콜린 의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:리소포스파티딜에탄올아민의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:리소포스파티딜에탄올아민의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:리소포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:리소포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:리소포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:리소포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:리소포스파티딜세린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:리소포스파티딜세린의 비를 갖거나; 카르디오리핀:포스파티데이트의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:포스파티딜콜린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:포스파티딜콜린의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:포스파티딜에탄올아민의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:포스파티딜에탄올아민의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:포스파티딜세린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:포스파티딜세린의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:콜레스테롤 에스테르의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:콜레스테롤 에스테르의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:스핑고미엘린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:스핑고미엘린의 비를 갖거나; 원천세포 내 카르디오리핀:트리아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:트리아실글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:디아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:디아실글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:헥소실세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:헥소실세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:리소포스파티데이트의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:리소포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:리소포스파티딜콜린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:리소포스파티딜콜린의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:리소포스파티딜에탄올아민의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:리소포스파티딜에탄올아민의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:리소포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:리소포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:리소포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:리소포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:리소포스파티딜세린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:리소포스파티딜세린의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:포스파티데이트의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:포스파티딜에탄올아민의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:포스파티딜에탄올아민의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 카르디오리핀:포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:포스파티딜세린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:포스파티딜세린의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:콜레스테롤 에스테르의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:콜레스테롤 에스테르의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:스핑고미엘린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:스핑고미엘린의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜콜린:트리아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜콜린:트리아실글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:디아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:디아실글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:헥소실세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:헥소실세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티데이트의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티딜콜린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티딜콜린의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티딜에탄올아민의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티딜에탄올아민의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티딜세린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:리소포스파티딜세린의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:포스파티데이트의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:포스파티딜세린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:포스파티딜세린의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:콜레스테롤 에스테르의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:콜레스테롤 에스테르의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:스핑고미엘린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:스핑고미엘린의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜에탄올아민:트리아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜에탄올아민:트리아실글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:디아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:디아실글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:헥소실세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:헥소실세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:리소포스파티데이트의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:리소포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:리소포스파티딜콜린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:리소포스파티딜콜린의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:리소포스파티딜에탄올아민의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:리소포스파티딜에탄올아민의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:리소포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:리소포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:리소포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:리소포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:리소포스파티딜세린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:리소포스파티딜세린의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:포스파티데이트의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:콜레스테롤 에스테르의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:콜레스테롤 에스테르의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:스핑고미엘린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:스핑고미엘린의 비를 갖거나; 원천세포 내 포스파티딜세린:트리아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 포스파티딜세린:트리아실글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:디아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:디아실글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:헥소실세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:헥소실세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:리소포스파티데이트의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:리소포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:리소포스파티딜콜린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:리소포스파티딜콜린의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:리소포스파티딜에탄올아민의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:리소포스파티딜에탄올아민의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:리소포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:리소포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:리소포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:리소포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:리소포스파티딜세린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:리소포스파티딜세린의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:포스파티데이트의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:콜레스테롤 에스테르의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:콜레스테롤 에스테르의 비를 갖거나; 원천세포 내 스핑고미엘린:트리아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 스핑고미엘린:트리아실글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:디아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:디아실글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:헥소실세라미드의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:헥소실세라미드의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티데이트의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티딜콜린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티딜콜린의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티딜에탄올아민의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티딜에탄올아민의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티딜세린의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:리소포스파티딜세린의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:포스파티데이트의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:포스파티데이트의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:포스파티딜글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:포스파티딜글리세롤의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:포스파티딜이노시톨의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:포스파티딜이노시톨의 비를 갖거나; 원천세포 내 콜레스테롤 에스테르:트리아실글리세롤의 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내인 콜레스테롤 에스테르:트리아실글리세롤의 비를 갖는다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 87의 검정을 사용하여 측정 시, 원천세포와 유사한 프로테오믹 조성을 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀의 단백질 조성은 이들이 유도된 모세포와 유사하다. 일부 구현예에서, 복수의 단백질 카테고리의 각각의 분획 함량은, 예를 들어 실시예 87에 기재된 바와 같이, 샘플 내 모든 확인된 단백질의 강도 신호의 합으로 나눈 각각의 카테고리로부터의 강도 신호의 합으로 결정된다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 97에 기재된 방법에 따라 결정 시, 모세포 및/또는 엑소좀에 비해 다양한 양의 구획 특이적 단백질을 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 모세포 및 엑소좀과 비교하여 소포체 단백질이 고갈되어 있다(또는 고갈된 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 엑소좀과 비교하여 엑소좀 단백질이 고갈되어 있다(또는 고갈된 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀 내 단백질의 15%, 20% 또는 25% 미만을 엑소좀 단백질로서 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 모세포와 비교하여 미토콘드리아 단백질이 고갈되어 있다(또는 고갈된 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 모세포와 비교하여 핵 단백질이 강화되어 있다(또는 강화되어 있는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 모세포 및 엑소좀과 비교하여 리보솜 단백질이 강화되어 있다(또는 강화되어 있는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀 내 단백질의 적어도 0.025%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% 8%, 9% 또는 10%는 리보솜 단백질이거나, 푸소좀 내 단백질의 약 0.025 내지 0.2%, 0.05 내지 0.15%, 0.06 내지 1.4%, 0.07% 내지 1.3%, 0.08% 내지 1.2%, 0.09% 내지 1.1%, 1% 내지 20%, 3% 내지 15%, 5% 내지 12.5%, 7.5% 내지 11% 또는 8.5% 내지 10.5% 또는 9% 내지 10%는 리보솜 단백질이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 40의 검정을 사용하여 측정 시, 지질 대 단백질의 비를 원천세포에서 상응하는 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내로 포함한다. 구현예에서, 푸소좀은 유핵세포에 대한 지질 질량 대 단백질의 비와 거의 동일한 지질 질량 대 단백질의 비를 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은 모세포보다 더 큰 지질:단백질 비를 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은 지질:단백질 비를 모세포의 지질:단백질 비의 약 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 131%, 132%, 132.5%, 133%, 134%, 135%, 140%, 145% 또는 150%로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 조성물은, 예를 들어 실시예 83의 검정에 따라 측정 시, 인지질:단백질 비를 약 100 μmol/g 내지 180 μmol/g, 110 μmol/g 내지 170 μmol/g, 120 μmol/g 내지 160 μmol/g, 130 μmol/g 내지 150 μmol/g, 135 μmol/g 내지 145 μmol/g, 140 μmol/g 내지 142 μmol/g, 또는 141 μmol/g으로 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 조성물은, 예를 들어 실시예 83의 검정에 따라 측정 시, 인지질:단백질 비를 원천세포에서 상응하는 비의 약 60% 내지 90%, 70% 내지 80% 또는 75%로 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 41의 검정을 사용하여 측정 시, 단백질 대 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)의 비를 원천세포에서 상응하는 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내로 포함한다. 구현예에서, 푸소좀은 단백질 질량 대 DNA 질량의 비를 모세포와 유사한 비로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은 단백질:DNA의 비를 모세포의 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.2%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105% 또는 110%로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 41의 검정을 사용하여 측정 시, 단백질 대 DNA의 비를 원천세포에서 상응하는 비보다 큰 비로, 예를 들어 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 더 큰 비로 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 조성물은, 예를 들어 실시예 84의 검정에 따라 측정 시, 단백질:DNA의 비를 약 20 g/g 내지 35 g/g, 25 g/g 내지 30 g/g, 26 g/g 내지 29 g/g, 27 g/g 내지 28 g/g, 또는 27.8 g/g으로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 조성물은, 예를 들어 실시예 84의 검정에 따라 측정 시, 단백질:DNA의 비를 원천세포에서 상응하는 비의 약 1%, 2%, 5%, 10% 또는 20% 이내로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 91의 검정을 사용하여 측정 시, 지질 대 핵산(예를 들어, DNA)의 비를 원천세포에서 상응하는 비의 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이내로 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 조성물은, 예를 들어 실시예 85의 검정에 따라 측정 시, 지질:DNA의 비를 약 2.0 μmol/mg 내지 6.0 μmol/mg, 3.0 μmol/mg 내지 5.0 μmol/mg, 3.5 μmol/mg 내지 4.5 μmol/mg, 3.8 μmol/mg 내지 4.0 μmol/mg, 또는 3.92 μmol/mg로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 91의 검정을 사용하여 측정 시, 지질 대 핵산(예를 들어, DNA)의 비를 원천세포에서 상응하는 비보다 큰 비로, 예를 들어 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 더 큰 비로 포함한다. 구현예에서, 푸소좀은 지질:DNA 비를 모세포보다 더 큰 비로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은 지질:DNA 비를 모세포와 비교하여 약 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150% 또는 그 이상으로 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은, 예를 들어 실시예 60의 검정에 따라 측정 시, 대상, 예를 들어 마우스에서의 반감기를, 참조세포 조성물, 예를 들어 원천세포의 반감기의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이내로 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은, 예를 들어 실시예 60의 검정에 따라 측정 시, 인간 대상 또는 마우스에서 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간 또는 24시간의 반감기를 갖는다. 구현예에서, 푸소좀 조성물은, 예를 들어 실시예 79의 검정에 따라 측정 시, 대상에서 적어도 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간 또는 24시간의 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 치료제는 대상에서 푸소좀 조성물의 반감기보다, 예를 들어 적어도 10%, 20%, 50%, 2배, 5배 또는 10배 더 긴 반감기를 갖는다. 예를 들아, 푸소좀은 치료제를 표적세포에 전달하고, 치료제는 푸소좀이 더 이상 존재하지 않거나 검출 가능하지 않은 후에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 50의 검정을 사용하여 측정 시, 음성 대조군, 예를 들어 글루코오스 부재 하의 다른 유사한 푸소좀보다, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 더 많이 막을 가로질러 글루코오스(예를 들어, 표지된 글루코오스, 예를 들어 2-NBDG)를 수송한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 72의 검정을 사용하여 측정 시, 플로레틴(phloretin)으로 처리된 다른 유사한 푸소좀보다 더 큰 수준으로 막을 가로질러 글루코오스(예를 들어, 표지된 글루코오스, 예를 들어 2-NBDG)를 수송한다(또는 수송하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 플로레틴으로 처리되지 않은 푸소좀은, 예를 들어 실시예 72의 검정을 사용하여 측정 시, 플로레틴으로 처리된 다른 유사한 푸소좀보다 적어도 1%, 2%, 3%, 5% 또는 10% 더 높은(및 선택적으로 최대 15% 더 높은) 수준으로 글루코오스를 수송한다(또는 수송하지 않는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 51의 검정을 사용하여 측정 시, 내강에서의 에스테라아제 활성을, 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 마우스 배아 섬유아세포에서의 에스테라아제 활성의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이내로 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 73의 검정을 사용하여 측정 시, 내강 내 에스테라아제 활성을, 염색되지 않은 대조군보다 적어도 10배, 20배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1000배, 2000배 또는 5000배 더 높은 수준으로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 73의 검정에 따라 측정 시, 내강 내 에스테라아제 활성을 원천세포보다 약 10배 내지 100배 낮은 수준으로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 74의 검정에 따라 측정 시, 아세틸콜린에스테라아제 활성을 엑소좀 등가물의 약 1E5-1E6, 6E5-8E5, 6.5E5-7E5 또는 6.83E5로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 53에 기재된 바와 같이 측정 시, 대사 활성 수준(예를 들어, 시트레이트 합성효소 활성)을, 참조세포, 예를 들어 원천세포에서의 대사 활성 수준의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이내로 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 53에 기재된 바와 같이 측정 시, 대사 활성 수준(예를 들어, 시트레이트 합성효소 활성)을, 참조세포, 예를 들어 원천세포에서의 대사 활성 수준의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%로 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 75의 검정에 따라 측정 시, 시트레이트 합성효소 활성을, 분당 푸소좀 1 ug당 약 1E-2 umol 내지 2 E-2 umol, 1.3E-2 umol 내지 1.8E-2 umol, 1.4E-2 umol 내지 1.7E-2 umol, 1.5E-2 umol 내지 1.6E-2 umol, 또는 1.57E-2 umol로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 54에 기재된 바와 같이 측정 시, 호흡 수준(예를 들어, 산소 소비율), 예를 들어 기저, 비결합(uncoupled) 또는 최대 호흡 수준을 참조세포, 예를 들어 원천세포에서의 호흡 수준의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이내로 포함한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 54에 기재된 바와 같이 측정 시, 호흡 수준(예를 들어, 산소 소비율), 예를 들어 기초, 비결합 또는 최대 호흡 수준을 참조세포, 예를 들어 원천세포에서의 호흡 수준의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%로 포함한다. 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 76의 검정에 따라 측정 시, 푸소좀 20 μg당 분당 약 8 pmol 내지 15 pmol, 9 pmol 내지 14 pmol, 10 pmol 내지 13 pmol, 11 pmol 내지 12 pmol, 또는 11.3 pmol의 기초 호흡률을 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 76의 검정에 따라 측정 시, 푸소좀 20 μg당 분당 약 8 pmol 내지 13 pmol, 9 pmol 내지 12 pmol, 10 pmol 내지 11 pmol, 10 pmol 내지 10.2 pmol, 또는 10.1 pmol의 비결합 호흡률을 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 76의 검정에 따라 측정 시, 푸소좀 20 μg당 분당 약 15 pmol 내지 25 pmol, 16 pmol 내지 24 pmol, 17 pmol 내지 23 pmol, 18 pmol 내지 22 pmol, 19 pmol 내지 21 pmol, 또는 20 pmol의 최대 호흡률을 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 76의 검정에 따라 측정 시, 비결합 호흡률보다, 예를 들어 약 1%, 2%, 5% 또는 10%, 예를 들어 최대 약 15% 더 높은 기초 호흡률을 갖는다(갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 76의 검정에 따라 측정 시, 기초 호흡률보다, 예를 들어 약 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 더 높은 최대 호흡률을 갖는다(갖는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 55의 검정에 따라 측정 시, 최대 18,000 MFI, 17,000 MFI, 16,000 MFI, 15,000 MFI, 14,000 MFI, 13,000 MFI, 12,000 MFI, 11,000 MFI 또는 10,000 MFI의 아넥신-V 염색 수준을 포함하거나, 푸소좀은 실시예 55의 검정에서 메나디온으로 처리된 다른 유사한 푸소좀의 아넥신-V 염색 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 더 낮은 아넥신-V 염색 수준을 포함하거나, 또는 푸소좀은 실시예 55의 검정에서 메나디온으로 처리된 대식세포의 아넥신-V 염색 수준보다 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 더 낮은 아넥신-V 염색 수준을 포함한다. 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 77의 검정에 따라 측정 시, 아넥신-V 염색 수준을, 안티마이신 A로 처리된 다른 유사한 푸소좀의 아넥신-V 염색 수준보다 적어도 약 1%, 2%, 5% 또는 10% 더 낮은 수준으로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 77의 검정에 따라 측정 시, 아넥신-V 염색 수준을, 안티마이신 A로 처리된 다른 유사한 푸소좀의 아넥신-V 염색 수준의 약 1%, 2%, 5% 또는 10% 이내인 수준으로 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 33의 검정에 따라 측정 시, miRNA 함량 수준을, 원천세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)로 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 33의 검정에 따라 측정 시, miRNA 함량 수준을, 원천세포의 miRNA 함량 수준의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)(예를 들어, 원천세포 miRNA 함량 수준의 최대 100%)으로 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 66의 검정에 따라 측정 시, 총 RNA 함량 수준을, 원천세포의 총 RNA 함량 수준의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)(예를 들어, 원천세포 총 RNA 함량 수준의 최대 100%)으로 갖는다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 38의 검정에 따라 측정 시, 가용성:불용성 단백질 비를, 원천세포의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상) 이내, 예를 들어 원천세포의 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80% 또는 80% 내지 90% 이내로 갖는다. 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 38의 검정에 따라 측정 시, 약 0.3 내지 0.8, 0.4 내지 0.7, 또는 0.5 내지 0.6, 예를 들어 약 0.563의 가용성:불용성 단백질 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀 집단은 약 0.3 내지 0.8, 0.4 내지 0.7, 또는 0.5 내지 0.6, 또는 0.563, 또는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5 초과의 가용성:불용성 단백질 질량 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀 집단은 원천세포보다 더 높은, 예를 들어 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배 또는 20배 더 높은 가용성:불용성 단백질 질량 비를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 가용성:불용성 단백질 질량 비는 실시예 70의 검정에 따라 결정된다. 구현예에서, 가용성:불용성 단백질 질량 비는 모세포보다 푸소좀 집단에서 더 낮다(또는 낮은 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀 대 모세포의 비가 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7% 또는 8%인 경우(인 것으로 확인된 경우), 푸소좀 집단의 가용성:불용성 비는 모세포의 가용성:불용성 비와 거의 동일하다(또는 동일한 것으로 확인된다).
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 질량분석법, 예를 들어 실시예 39의 검정에 따라 측정 시, LPS 수준을, 원천세포의 LPS 함량의 5%, 1%, 0.5%, 0.01%, 0.005%, 0.0001%, 0.00001%(또는 그 이하) 미만으로 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 49의 검정을 사용하여 측정 시, 신호 전달, 예를 들어 세포외 신호, 예를 들어 인슐린에 대한 반응으로 AKT 인산화, 또는 인슐린에 대한 반응으로 글루코오스(예를 들어, 표지된 글루코오스, 예를 들어 2-NBDG) 흡수를, 음성 대조군, 예를 들어 인슐린 부재 하의 다른 유사한 푸소좀보다, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 더 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 조직, 예를 들어 간, 폐, 심장, 비장, 췌장, 위장관, 신장, 고환, 난소, 뇌, 생식기관, 중추신경계, 말초신경계, 골격근, 내피, 내이 또는 눈을 표적으로 하고, 예를 들어 실시예 64의 검정에 따라 측정 시, 대상, 예를 들어 마우스에게 투여될 때, 예를 들어 24시간, 48시간 또는 72시간 후, 투여된 푸소좀의 집단 내 푸소좀의 적어도 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 표적조직에 존재한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 56의 검정에 따라 측정 시, 적스타크린 신호전달 수준을, 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 골수간질세포(BMSC)에 의해 유도된 적스타크린 신호전달의 수준보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 큰 수준으로 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 56의 검정에 따라 측정 시, 적스타크린 신호전달 수준을, 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 골수간질세포(BMSC)에 의해 유도된 적스타크린 신호전달의 수준의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%(예를 들어, 최대 100%)의 수준으로 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 57의 검정에 따라 측정 시, 파라크린 신호전달 수준을, 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 대식세포에 의해 유도된 파라크린 신호전달의 수준보다 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 더 큰 수준으로 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 57의 검정에 따라 측정 시, 파라크린 신호전달 수준을, 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 대식세포에 의해 유도된 파라크린 신호전달의 수준의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%(예를 들어, 최대 100%)의 수준으로 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 58의 검정에 따라 측정 시, 액틴을, 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 C2C12세포에서 중합된 액틴의 수준과 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이내의 수준으로 중합한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 81의 검정에 따라 측정 시, 시간에 걸쳐, 예를 들어 적어도 3시간, 5시간 또는 24시간에 걸쳐 일정한 수준으로 액틴을 중합한다(또는 액틴을 중합하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 액틴 중합 수준은, 예를 들어 실시예 81의 검정에 따라 측정 시, 5시간 기간에 걸쳐 1%, 2%, 5%, 10% 또는 20% 미만으로 변한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 59의 검정에 따라 측정 시, 막 전위를 참조세포, 예를 들어 원천세포 또는 C2C12세포의 막 전위의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이내로 갖거나, 푸소좀의 막전위는 약 -20 mV 내지 -150 mV, -20 mV 내지 -50 mV, -50 mV 내지 -100 mV, 또는 -100 mV 내지 -150 mV이거나, 또는 푸소좀의 막 전위는 -1 mV, -5 mV, -10 mV, -20 mV, -30 mV, -40 mV, -50 mV, -60 mV, -70 mV, -80 mV, -90 mV, -100 mV 미만이다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 78의 검정에 따라 측정 시, 약 -25 mV 내지 -35 mV, -27 mV 내지 -32 mV, -28 mV 내지 -31 mV, -29 mV 내지 -30 mV, 또는 -29.6 mV의 막 전위를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 푸소좀은, 예를 들어 실시예 44의 검정을 사용하여 측정 시, 예를 들어 원천세포의 혈관외유출 비율의 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 비율로 혈관으로부터의 혈관외유출이 가능하고, 예를 들어 여기서 원천세포는 호중구, 림프구, B세포, 대식세포 또는 NK세포이다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 45의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 대식세포와 비교하여, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%(예를 들어, 최대 100%)의 화학주성을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 47의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 대식세포와 비교하여, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%(예를 들어, 최대 100%)의 포식작용을 할 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 세포막, 예를 들어 내피세포막 또는 혈액뇌장벽을 가로지를 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 48의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 마우스 배아 섬유아세포보다 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 큰 비율로 단백질을 분비할 수 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 48의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 마우스 배아 섬유아세포와 비교하여, 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%(예를 들어, 최대 100%)의 비율로 단백질을 분비할 수 있다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 전사할 수 없거나, 예를 들어 실시예 24의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 원천세포의 전사 활성의 1%, 2.5% 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만의 전사 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 핵 DNA 복제를 할 수 없거나, 예를 들어 실시예 25의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 원천세포의 핵 DNA 복제의 1%, 2.5% 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만의 핵 DNA 복제를 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 크로마틴이 결여되어 있거나, 예를 들어 실시예 32의 검정을 사용하여 측정 시, 참조세포, 예를 들어 원천세포의 크로마틴 함량의 1%, 2.5% 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만의 크로마틴 함량을 갖는다.
일부 구현예에서, 푸소좀의 특징은 참조세포와 비교하여 기재되어 있다. 구현예에서, 참조세포는 원천세포이다. 구현예에서, 참조세포는 HeLa, HEK293, HFF-1, MRC-5, WI-38, IMR 90, IMR 91, PER.C6, HT-1080 또는 BJ 세포이다. 일부 구현예에서, 푸소좀 집단의 특징은 참조세포 집단, 예를 들어 원천세포 집단, 또는 HeLa, HEK293, HFF-1, MRC-5, WI-38, IMR 90, IMR 91, PER.C6, HT-1080 또는 BJ 세포의 집단과 비교하여 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 제약 또는 우수제조관리기준(GMP) 표준을 충족시킨다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 우수제조관리기준(GMP)에 따라 제조되었다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 병원체를 선결된 참조 수준 미만으로 가지며, 예를 들어 푸소좀에는 병원체가 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 오염물을 선결된 참조 수준 미만으로 가지며, 예를 들어 푸소좀에는 오염물이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 낮은 면역원성을 갖는다.
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물의 면역원성은 혈청 불활성화 검정(예를 들어, 항체 매개 중화 또는 보체 매개 중화를 검출하는 검정)에 따라 검정된다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 혈청에 의해 불활성화되지 않거나, 선결된 값보다 낮은 수준으로 불활성화된다. 일부 구현예에서, 푸소좀 나이브 대상(예를 들어, 인간 또는 마우스)의 혈청을 시험 푸소좀 조성물과 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 1회 이상의 푸소좀 투여를 받은, 예를 들어 적어도 2회의 푸소좀 투여를 받은 대상의 혈청을, 시험 푸소좀 조성물과 접촉시킨다. 구현예에서, 이어서, 혈청 노출된 푸소좀을 표적세포에 카고를 전달하는 능력에 대해 시험한다. 일부 구현예에서, 혈청 인큐베이션된 푸소좀으로의 처리 후 카고를 검출 가능하게 포함하는 세포의 백분율은, 혈청과 접촉시키지 않은 양성 대조군 푸소좀으로의 처리 후 카고를 검출 가능하게 포함하는 세포의 백분율의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%이다. 일부 구현예에서, 혈청 불활성화는 실시예 99의 검정을 사용하여 측정된다.
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물의 면역원성은 푸소좀에 대한 반응으로 보체 활성화를 검출하여 검정한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 보체를 활성화시키지 않거나, 선결된 값보다 낮은 수준으로 보체를 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 푸소좀 나이브 대상(예를 들어, 인간 또는 마우스)의 혈청을 시험 푸소좀 조성물과 접촉시킨다. 일부 구현예에서, 1회 이상의 푸소좀 투여를 받은, 예를 들어 적어도 2회의 푸소좀 투여를 받은 대상의 혈청을, 시험 푸소좀 조성물과 접촉시킨다. 구현예에서, 이어서, 혈청과 푸소좀을 포함하는 조성물을, 예를 들어 ELISA로 활성화된 보체 인자(예를 들어, C3a)에 대해 시험한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 변형(예를 들어, 참조세포와 비교하여 보체 조절 단백질의 상승된 수준)을 포함하는 푸소좀은, 변형이 결여되어 있는 다른 유사한 푸소좀과 비교하여 감소된, 예를 들어 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 감소된 보체 활성화를 거친다. 일부 구현예에서, 보체 활성화는 실시예 100의 검정을 사용하여 측정된다.
일부 구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 집단은 혈청에 의해 실질적으로 불활성되지 않을 것이다. 일부 구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 집단은, 예를 들어 실시예 99에 기재된 방법에 따라 정량화 시, 혈청 불활성화에 대한 내성이 있다. 구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 집단은, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 따라 측정 시, 푸소좀 또는 푸소좀 집단의 대상에게의 다회투여 후, 혈청에 의해 실질적으로 불활성되지 않거나, 혈청 불활성화에 대한 내성이 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 99에 기재된 방법에 따라 정량화 시, 예를 들어 변형된 푸소좀의 다회투여 후, 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 푸소좀과 비교하여 혈청 불활성화가 감소되도록 변형된다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 100에 기재된 방법에 따라 측정 시, 실질적으로 보체 활성을 유도하지 않는다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 상응하는 변형되지 않은 푸소좀과 비교하여 감소된 보체 활성을 유도하도록 변형된다. 구현예에서, 보체 활성은 세포에서 보체 단백질(예를 들어, DAF, 붕괴촉진인자(DAF, CD55)에 결합하는 단백질, 인자 H(FH) 유사 단백질-1(FHL-1), C4b-결합 단백질(C4BP), 보체 수용체 1(CD35), 막 보조인자 단백질(MCP, CD46), 프로텍틴(CD59), 전형적 및 대안적 보체 경로 CD/C5 전환효소를 저해하는 단백질, MAC 어셈블리를 조절하는 단백질)의 발현 또는 활성을 결정하여 측정한다.
일부 구현예에서, 원천세포는 내피세포, 섬유아세포, 혈액세포(예를 들어, 대식세포, 호중구, 과립구, 백혈구), 줄기세포(예를 들어 중간엽줄기세포, 제대줄기세포, 골수줄기세포, 조혈줄기세포, 유도된 다능성줄기세포, 예를 들어 대상의 세포에서 유래된 유도된 다능성줄기세포), 배아줄기세포(예를 들어, 배아난황주머니, 태반, 제대, 태아 피부, 청소년 피부, 혈액, 골수, 지방조직, 적혈구생성조직, 조혈조직 유래 줄기세포), 근아세포, 실질세포(예를 들어, 간세포), 폐포세포, 뉴런(예를 들어, 망막뉴런세포) 전구체세포(예를 들어, 망막전구체세포, 골수아세포, 골수전구체세포, 흉선세포, 감수모세포, 거대핵모세포, 풋거대핵모세포, 멜라노모세포, 림프모세포, 골수전구체세포, 정상모세포 또는 혈관모세포), 전구세포(예를 들어, 심장전구세포, 위성세포, 방사형 신경교세포, 골수간질세포, 췌장전구세포, 내피전구세포, 아세포), 또는 불멸화된 세포(예를 들어, HeLa, HEK293, HFF-1, MRC-5, WI-38, IMR 90, IMR 91, PER.C6, HT-1080 또는 BJ 세포)이다. 일부 구현예에서, 원천세포는 293세포, HEK세포, 인간 내피세포, 인간 상피세포, 단핵구, 대식세포, 수지상세포 또는 줄기세포 이외의 것이다.
일부 구현예에서, 원천세포는 ARRDC1 또는 이의 활성 단편 또는 변이체를 발현한다(예를 들어, 과발현한다). 일부 구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 조성물은, 예를 들어 질량분석법 검정에 따라 측정 시, 약 1 내지 3, 1 내지 10, 1 내지 100, 3 내지 10, 4 내지 9, 5 내지 8, 6 내지 7, 15 내지 100, 60 내지 200, 80 내지 180, 100 내지 160, 120 내지 140, 3 내지 100, 4 내지 100, 5 내지 100, 6 내지 100, 15 내지 100, 80 내지 100, 3 내지 200, 4 내지 200, 5 내지 200, 6 내지 200, 15 내지 200, 80 내지 200, 100 내지 200, 120 내지 200, 300 내지 1000, 400 내지 900, 500 내지 800, 600 내지 700, 640 내지 690, 650 내지 680, 660 내지 670, 100 내지 10,000, 또는 약 664.9의, 푸소겐 대 ARRDC1의 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 총 단백질 함량의 백분율로서 ARRDC1의 수준은, 예를 들어 질량분석법, 예를 들어 실시예 98에 기재된 방법에 따라 측정 시, 적어도 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%; 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%이거나; 약 0.05% 내지 1.5%, 0.1% 내지 0.3%, 0.05 내지 0.2%, 0.1 내지 0.2%, 0.25 내지 7.5%, 0.5% 내지 1.5%, 0.25 내지 1%, 0.5 내지 1%, 0.05 내지 1.5%, 10% 내지 30%, 5 내지 20% 또는 10 내지 20%이다. 일부 구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 조성물은, 예를 들어 질량분석법 검정, 예를 들어 실시예 94의 검정을 사용하여 측정 시, 약 100 내지 1,000, 100 내지 400, 100 내지 500, 200 내지 400, 200 내지 500, 200 내지 1,000, 300 내지 400, 1,000 내지 10,000, 2,000 내지 5,000, 3,000 내지 4,000, 3,050 내지 3,100, 3,060 내지 3,070, 또는 약 3,064, 10,000 내지 100,000, 10,000 내지 200,000, 10,000 내지 500,000, 20,000 내지 500,000, 30,000 내지 400,000의, 푸소겐 대 TSG101의 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀 또는 푸소좀 조성물은, 예를 들어 질량분석법 검정, 예를 들어 실시예 95의 검정을 사용하여 측정 시, 약 1 내지 3, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 25, 1.5 내지 30, 10 내지 30, 15 내지 25, 18 내지 21, 19 내지 20, 10 내지 300, 10 내지 200, 15 내지 300, 15 내지 200, 100 내지 300, 100 내지 200, 150 내지 300, 또는 약 19.5의, 카고 대 tsg101의 비를 갖는다. 일부 구현예에서, 총 단백질 함량의 백분율로서 TSG101의 수준은, 예를 들어 질량분석법, 예를 들어 실시예 98에 기재된 방법에 따라 측정 시, 적어도 약 0.0001%, 0.0002%, 0.0003%, 0.0004%, 0.0005%, 0.0006%, 0.0007%, 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%; 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%이거나; 약 0.0001% 내지 0.001%, 0.0001% 내지 0.002%, 0.0001% 내지 0.01%, 0.0001% 내지 0.1%, 0.001% 내지 0.01%, 0.002% 내지 0.006%, 0.003% 내지 0.005%, 0.001% 내지 0.1%, 0.01% 내지 0.1%, 0.02% 내지 0.06%, 0.03% 내지 0.05%, 또는 0.004%이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 카고, 예를 들어 치료제, 예를 들어 내인성 치료제 또는 외인성 치료제를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 하나 이상의 단백질, 예를 들어 효소, 막관통 단백질, 수용체, 항체; 핵산, 예를 들어, DNA, 염색체(예를 들어, 인간 인공 염색체), RNA, mRNA, siRNA, miRNA 또는 소분자에서 선택된다. 일부 구현예에서, 치료제는 미토콘드리온 이외의 세포소기관, 예를 들어 핵, 골지체, 리소좀, 소포체, 액포, 엔도좀, 첨단체, 자가포식체, 중심체, 글리코좀, 글리옥시좀, 히드로게노좀, 멜라노좀, 미토좀, 자포, 퍼옥시좀, 프로테아좀, 소포 및 스트레스 과립에서 선택되는 세포소기관이다. 일부 구현예에서, 세포소기관은 미토콘드리온이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 세포내이입에 의해 표적세포에 들어가며, 예를 들어 여기서 세포내이입 경로를 통해 전달되는 치료제의 수준은, 예를 들어 실시예 62의 검정을 사용하여 측정 시, 0.01 내지 0.6, 0.01 내지 0.1, 0.1 내지 0.3, 또는 0.3 내지 0.6이거나, 유사한 푸소좀과 접촉시킨 클로로퀸 처리된 참조세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)이다. 일부 구현예에서, 표적세포에 들어가는 푸소좀 조성물 내 푸소좀의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%는 비세포내이입 경로를 통해 들어가고, 예를 들어 푸소좀은 세포 표면 내 융합을 통해 표적세포에 들어간다. 일부 구현예에서, 주어진 푸소좀에 대해 비세포내이입 경로를 통해 전달되는 치료제의 수준은, 예를 들어 실시예 61의 검정을 사용하여 측정 시, 0.1 내지 0.95, 0.1 내지 0.2, 0.2 내지 0.3, 0.3 내지 0.4, 0.4 내지 0.5, 0.5 내지 0.6, 0.6 내지 0.7, 0.7 내지 0.8, 0.8 내지 0.9, 0.9 내지 0.95이거나, 클로로퀸 처리된 참조세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)이다.
일부 구현예에서, 표적세포에 들어가는 푸소좀 조성물 내 푸소좀의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%는, 세포질에 들어간다(예를 들어, 엔도좀 또는 리소좀에 들어가지 않는다). 일부 구현예에서, 표적세포에 들어가는 푸소좀 조성물 내 푸소좀의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만은, 엔도좀 또는 리소좀에 들어간다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 비세포내이입 경로를 통해 표적세포에 들어가고, 예를 들어 여기서 전달되는 치료제의 수준은, 예를 들어 실시예 62의 검정을 사용하여 측정 시, 클로로퀸 처리된 참조세포의 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99%이다. 일 구현예에서, 푸소좀은 디나민 매개 경로를 통해 작용제를 표적세포에 전달한다. 일 구현예에서, 디나민 매개 경로를 통해 전달되는 작용제의 수준은, 예를 들어 실시예 63의 검정을 사용하여 측정 시, 0.01 내지 0.6 범위이거나, 유사한 푸소좀과 접촉시킨 Dynasore 처리된 표적세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)이다. 일 구현예에서, 푸소좀은 거대음작용을 통해 작용제를 표적세포에 전달한다. 일 구현예에서, 거대음작용을 통해 전달되는 작용제의 수준은, 예를 들어 실시예 63의 검정을 사용하여 측정 시, 0.01 내지 0.6 범위이거나, 유사한 푸소좀과 접촉시킨 EIPA 처리된 표적세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)이다. 일 구현예에서, 푸소좀은 액틴 매개 경로를 통해 작용제를 표적세포에 전달한다. 일 구현예에서, 액틴 매개 경로를 통해 전달되는 작용제의 수준은, 예를 들어 실시예 63의 검정을 사용하여 측정 시, 0.01 내지 0.6 범위이거나, 유사한 푸소좀과 접촉시킨 라트룰린 B 처리된 표적세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)이다.
일부 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 30의 검정에 따라 측정 시, 1 g/ml 미만, 1 내지 1.1 g/ml, 1.05 내지 1.15 g/ml, 1.1 내지 1.2 g/ml, 1.15 내지 1.25 g/ml, 1.2 내지 1.3 g/ml, 1.25 내지 1.35 g/ml, 또는 1.35 g/ml 초과의 밀도를 갖는다.
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 단백질 질량 기준으로 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5% 또는 10% 미만의 원천세포를 포함하거나, 세포의 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5% 또는 10% 미만은 기능성 핵을 갖는다. 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물 내 푸소좀의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%는, 세포소기관, 예를 들어 미토콘드리온을 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 외인성 치료제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 치료제는 하나 이상의 단백질, 예를 들어 효소, 막관통 단백질, 수용체, 항체; 핵산, 예를 들어, DNA, 염색체(예를 들어, 인간 인공 염색체), RNA, mRNA, siRNA, miRNA 또는 소분자에서 선택된다.
구현예에서, 푸소좀은 세포내이입 경로 또는 비세포내이입 경로로 세포에 들어간다.
구현예에서, 푸소좀 조성물은 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 6시간 또는 12시간; 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는6일; 1주, 2주, 3주 또는 4주; 1개월, 2개월, 3개월 또는 6개월; 또는 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년 동안 4℃ 미만의 온도에서 안정하다. 구현예에서, 푸소좀 조성물은 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 6시간 또는 12시간; 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는6일; 1주, 2주, 3주 또는 4주; 1개월, 2개월, 3개월 또는 6개월; 또는 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년 동안 -20℃ 미만의 온도에서 안정하다. 구현예에서, 푸소좀 조성물은 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 6시간 또는 12시간; 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는6일; 1주, 2주, 3주 또는 4주; 1개월, 2개월, 3개월 또는 6개월; 또는 1년, 2년, 3년, 4년 또는 5년 동안 -80℃ 미만의 온도에서 안정하다.
구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 27의 검정에 따라 측정 시, 원천세포의 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이내의 크기(또는 평균 크기)를 갖는다. 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 27의 검정에 따라 측정 시, 원천세포의 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 미만의 크기(또는 평균 크기)를 갖는다. 구현예에서, 푸소좀은 모세포보다 작은 크기를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은 모세포의 약 50%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80% 또는 90% 이내의 크기를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 샘플의 약 90% 내에서, 모세포의 크기 분포 가변성의 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%(또는 그 이하) 미만을 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 샘플의 약 90% 내에서, 모세포의 크기 분포 가변성의 약 40%, 45%, 50%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 65% 또는 70%(또는 그 이하)를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 일부 구현예에서, 푸소좀은 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm 또는 70 nm 초과의 평균 직경 크기를 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은 약 100 nm, 110 nm, 120 nm, 125 nm, 126 nm, 127 nm, 128 nm, 129 nm, 130 nm, 131 nm, 132 nm, 133 nm, 134 nm, 135 nm, 140 nm 또는 150 nm의 평균 직경 크기를 갖는다. 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 27의 검정에 따라 측정 시, 원천세포 크기의 약 0.01% 내지 0.05%, 0.05% 내지 0.1%, 0.1% 내지 0.5%, 0.5% 내지 1%, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80% 또는 80% 내지 90% 이내의 크기(또는 평균 크기)를 갖는다. 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 27의 검정에 따라 측정 시, 원천세포 크기의 약 0.01% 내지 0.05%, 0.05% 내지 0.1%, 0.1% 내지 0.5%, 0.5% 내지 1%, 1% 내지 2%, 2% 내지 3%, 3% 내지 4%, 4% 내지 5%, 5% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80% 또는 80% 내지 90% 미만의 크기(또는 평균 크기)를 갖는다. 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 69의 검정에 따라 측정 시, 약 500 nm 미만(예를 들어, 약 10 nm, 50 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm 또는 450 nm 미만)의 직경(또는 평균 직경)을 갖는다. 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 69의 검정에 따라 측정 시, 약 80 nm 내지 180 nm, 90 nm 내지 170 nm, 100 nm 내지 160 nm, 110 nm 내지 150 nm, 120 nm 내지 140 nm, 또는 130 nm의 직경(또는 평균 직경)을 갖는다. 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 69의 검정에 따라 측정 시, 약 11,000 nm 내지 21,000 nm의 직경(또는 평균 직경)을 갖는다. 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 69의 검정에 따라 측정 시, 약 10 nm 내지 22,000 nm, 12 nm 내지 20,000 nm, 14 nm 내지 18,720 nm, 20 nm 내지 16,000 nm의 직경(또는 평균 직경)을 갖는다. 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 69의 검정에 따라 측정 시, 약 0.01 μm3 내지 0.1 μm3, 0.02 μm3 내지 1 μm3, 0.03 μm3 내지 1 μm3, 0.04 μm3 내지 1 μm3, 0.05 μm3 내지 0.09 μm3, 0.06 μm3 내지 0.08 μm3, 0.07 μm3의 부피(또는 평균 부피)를 갖는다. 구현예에서, 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 29의 검정에 따라 측정 시, 적어도 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm 또는 250 nm의 직경(또는 평균 직경)을 갖는다. 구현예에서, 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 29의 검정에 따라 측정 시, 약 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm 또는 250 nm(예를 들어, ±20%)의 직경(또는 평균 직경)을 갖는다. 구현예에서, 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 29의 검정에 따라 측정 시, 적어도 약 500 nm, 750 nm, 1,000 nm, 1,500 nm, 2,000 nm, 2,500 nm, 3,000 nm, 5,000 nm, 10,000 nm 또는 20,000 nm의 직경(또는 평균 직경)을 갖는다. 구현예에서, 구현예에서, 푸소좀(또는 푸소좀 집단)은, 예를 들어 실시예 29의 검정에 따라 측정 시, 약 500 nm, 750 nm, 1,000 nm, 1,500 nm, 2,000 nm, 2,500 nm, 3,000 nm, 5,000 nm, 10,000 nm 또는 20,000 nm(예를 들어, ±20%)의 직경(또는 평균 직경)을 갖는다. 구현예에서, 푸소좀 집단은, 예를 들어 실시예 68의 검정에 따라 측정 시, 다음 중 하나 이상을 갖는다(또는 갖는 것으로 확인된다): 약 40 내지 90 nm, 45 내지 60 nm, 50 내지 55 nm 또는 53 nm의 10% 분위수 직경; 약 70 내지 100 nm, 80 내지 95 nm, 85 내지 90 nm, 또는 88 nm의 25% 분위수 직경; 약 200 내지 250 nm, 210 내지 240 nm, 220 내지 230 nm, 또는 226 nm의 75% 분위수 직경; 또는 약 4000 내지 5000 nm, 4300 내지 4600 nm, 4400 내지 4500 nm, 4450 nm의 90% 분위수 직경.
구현예에서, 푸소좀은, 예를 들어 실시예 82의 검정에 따라 측정 시, 약 35 ng/mL 내지 40 ng/mL, 36 ng/mL 내지 39 ng/mL, 37 ng/mL 내지 38 ng/mL, 또는 37.2 ng/mL의 GAPDH 농도를 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀 조성물의 GAPDH 농도는, 예를 들어 실시예 82의 검정에 따라 측정 시, 원천세포의 GAPDH 농도의 약 1%, 2%, 5%, 10% 또는 20% 이내이다(또는 인 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀 조성물의 GAPDH 농도는, 예를 들어 실시예 82의 검정에 따라 측정 시, 원천세포의 GAPDH 농도보다 적어도 1%, 2%, 5%, 10% 또는 20% 낮다. 구현예에서, 푸소좀 조성물은 총 단백질 1 g당 약 30 μg, 35 μg, 40 μg, 45 μg, 46 μg, 47 μg, 48 μg, 49 μg, 50 μg, 55 μg, 60 μg, 65 μg 또는 70 μg 미만의 GAPDH를 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀 조성물은 총 단백질 1 g당 약 500 μg, 250 μg, 100 μg 또는 50 μg 미만의 GAPDH를 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다). 구현예에서, 모세포는 푸소좀 조성물보다 총 단백질당 적어도 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 30%, 50%(또는 그 이상)의 GAPDH를 포함한다(또는 포함하는 것으로 확인된다).
구현예에서, 푸소좀 내 칼넥신의 평균 분획 함량은 약 1x10-4, 1.5x10-4, 2x10-4, 2.1x10-4, 2.2x10-4, 2.3x10-4,; 2.4x10-4, 2.43x10-4, 2.5x10-4, 2.6x10-4, 2.7x10-4, 2.8x10-4, 2.9x10-4, 3x10-4, 3.5x10-4 또는 4x10-4 미만이다(또는 미만인 것으로 확인된다). 구현예에서, 푸소좀은 총 단백질당 칼넥신의 양을, 모세포보다 약 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 더 적은 양으로 포함한다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 막 곡률에 영향을 미치는 지질을 포함하거나 이러한 지질이 강화되어 있다(예를 들어, 문헌[Thiam et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology, 14(12): 775-785, 2013] 참조). 일부 지질은 작은 친수성 헤드기와 큰 소수성 테일을 갖는데, 이는 국소 영역에 집중되어 융합 공극의 형성을 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 콜레스테롤, 포스파티딜에탄올아민(PE), 디글리세리드(DAG), 포스파티드산(PA), 지방산(FA)과 같은 음의 곡률을 갖는 지질을 포함하거나 이러한 지질이 강화되어 있다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 리소포스파티딜콜린(LPC), 포스파티딜이노시톨(Ptdlns), 리소포스파티드산(LPA), 리소포스파티딜에탄올아민(LPE), 모노아실글리세롤(MAG)과 같은 양의 곡률을 갖는 지질을 포함하지 않거나, 이러한 지질이 고갈되어 있거나, 또는 이러한 지질을 거의 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 지질은 푸소좀에 부가된다. 일부 구현예에서, 지질은, 푸소좀의 형성 전 또는 동안에 지질을 이의 막에 혼입시키는 배양물 내 원천세포에 부가된다. 일부 구현예에서, 지질은 리포좀 형태의 세포 또는 푸소좀에 부가된다. 일부 구현예에서, 메틸-베타시클로덱스트란(mβ-CD)을 사용하여 지질을 강화하거나 고갈시킨다(예를 들어, 문헌[Kainu et al, Journal of Lipid Research, 51(12): 3533-3541, 2010] 참조).
X. 약학적 조성물 및 이의 제조 방법
본 개시내용은 또한, 일부 양태에서, 본원에 기재된 푸소좀 조성물과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 본원에 기재된 임의의 푸소좀, 예를 들어 레트로바이러스 벡터 또는 VLP를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터의 하나 이상의 형질도입 유닛이 대상에게 투여된다. 일부 구현예에서, 1 kg당 적어도 1개, 10개, 100개, 1000개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개, 1013개 또는 1014개의 형질도입 유닛이 대상에게 투여된다. 일부 구현예에서, 혈액 1 ml당 표적세포당 적어도 1개, 10개, 100개, 1000개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개, 1011개, 1012개, 1013개 또는 1014개의 형질도입 유닛이 대상에게 투여된다.
레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스의 농축 및 정제
일부 구현예에서, 본원에 기재된 레트로바이러스 벡터 제형은 다음 단계 (i) 내지 (vi) 중 하나 이상, 예를 들어 전부를, 예를 들어 시간순으로 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
(i) 레트로바이러스 벡터를 생성하는 세포를 배양하는 단계;
(ii) 레트로바이러스 벡터 함유 상청액을 채취하는 단계;
(iii) 선택적으로 상청액을 정화시키는 단계;
(iv) 레트로바이러스 벡터를 정제하여 레트로바이러스 벡터 제제를 제공하는 단계;
(v) 선택적으로 레트로바이러스 벡터 제제를 여과-살균하는 단계; 및
(vi) 레트로바이러스 벡터 제제를 농축시켜 최종 벌크 생성물을 생산하는 단계.
일부 구현예에서, 상기 방법은 정화시키는 단계 (iii)를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 정화시키는 단계 (iii)를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (vi)는 한외여과 또는 접선 유동 여과, 더욱 바람직하게는 중공 섬유 한외여과를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iv)의 정제 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 더욱 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 단계 (v)의 여과-살균은 0.22 μm 또는 0.2 μm 살균 필터를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iii)는 필터 정화에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (iv)는 크로마토그래피, 한외여과/정용여과 또는 원심분리에서 선택되는 방법 또는 방법들의 조합을 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 방법 또는 방법의 조합은 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 원심분리 방법은 구역 원심분리, 등밀도 원심분리 및 펠릿화 원심분리에서 선택된다. 일부 구현예에서, 한외여과/정용여과 방법은 접선 유동 정용여과, 교반식 세포 정용여과 및 투석에서 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 방법에는 정제를 개선시키기 위해 핵산을 분해하는 적어도 하나의 단계가 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 단계는 뉴클레아제 처리이다.
일부 구현예에서, 벡터의 농축은 여과 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 벡터의 농축은 여과 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 농축 및 여과 단계는 반복된다.
일부 구현예에서, 최종 농축 단계는 여과-살균 단계 후 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 치료제로서 인간에게 투여하는 데 적합한 임상 등급의 제형을 생산하기 위한 대규모 공정이다. 일부 구현예에서, 여과-살균 단계는 농축 단계 전에 일어난다. 일부 구현예에서, 농축 단계는 공정의 마지막 단계이며, 여과-살균 단계는 공정의 끝에서 두 번째 단계이다. 일부 구현예에서, 농축 단계는 한외여과, 바람직하게는 접선 유동 여과, 더욱 바람직하게는 중공 섬유 한외여과를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 여과-살균 단계는 최대 공극 크기가 약 0.22 μm인 살균 필터를 사용하여 수행된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 최대 공극 크기는 0.2 μm이다.
일부 구현예에서, 벡터 농도는 여과-살균 전 제제 1 ml당 약 4.6×1011개 이하의 RNA 게놈 카피이다. 적절한 농도 수준은, 적절한 경우, 예를 들어 희석 단계를 사용하여 벡터 농도를 제어함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 제제는 여과 살균 전에 희석된다.
정화는 세포 잔여물 및 다른 불순물을 제거하는 여과 단계에 의해 수행될 수 있다. 적합한 필터는, 효과적인 제거 및 허용 가능한 회수물을 달성하기 위해, 셀룰로오스 필터, 재생 셀룰로오스 필터, 무기 필터 보조제(예를 들어, 규조토, 펄라이트, 흄드 실리카)와 조합된 셀룰로오스 필터, 무기 필터 보조제 및 유기 수지와 조합된 셀룰로오스 필터, 또는 이들의 임의의 조합, 및 중합체 필터(예에는, 비제한적으로, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에테르술폰이 포함됨)를 이용할 수 있다. 다단계 공정이 사용될 수 있다. 예시적인 2단계 또는 3단계 공정은 큰 침전물 및 세포 잔여물을 제거하기 위해 거친 필터(들), 이어서 0.2 미크론 초과 1 미크론 미만 공칭 공극 크기를 갖는 제2 단계 폴리싱 필터(들)로 이루어질 수 있다. 최적의 조합은 침전물 크기 분포와 다른 변수의 함수일 수 있다. 또한, 비교적 작은 공극 크기를 갖는 필터 또는 원심분리를 이용하는 단일 단계 작업이 또한 정화를 위해 사용될 수 있다. 보다 일반적으로, 비제한적으로, 억류(dead-end) 여과, 미세여과, 원심분리, 또는 억류 또는 심층 여과와 조합된 여과 보조제(예를 들어, 규조토)의 보디피드(body feed) 여과(이는 후속 단계에서 막 및/또는 수지를 오염시키지 않기 위해 적합한 정화도의 여과액을 제공함)를 포함하는 임의의 정화 접근법이, 본 발명의 정화 단계에서 사용하는 데 허용될 것이다.
일부 구현예에서, 심층 여과 및 막 여과가 사용된다. 이와 관련하여 유용한 상업적으로 입수 가능한 제품은, 예를 들어 WO 03/097797, p. 20-21에 언급되어 있다. 사용될 수 있는 막은 상이한 재료로 구성될 수 있고, 공극 크기가 상이할 수 있으며, 조합으로 사용될 수도 있다. 이는 몇몇 공급업체에서 상업적으로 입수할 수 있다. 일부 구현예에서, 정화에 사용되는 필터는 1.2 μm 내지 0.22 μm 범위이다. 일부 구현예에서, 정화에 사용되는 필터는 1.2/0.45 μm 필터 또는 최소 공칭 공극 크기가 0.22 μm 이내인 비대칭 필터이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 오염된 DNA/RNA, 즉, 주로 숙주세포 핵산을 분해하기 위해 뉴클레아제를 이용한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 예시적인 뉴클레아제에는, 모든 형태의 DNA 및 RNA(단일가닥, 이중가닥, 선형 또는 원형)를 공격하여 분해하는 Benzonase® 뉴클레아제(EP 0229866), 또는 제제로부터 원치 않는 또는 오염된 DNA 및/또는 RNA를 제거하기 위한 목적으로 당업계에서 통상적으로 사용되는 임의의 다른 DNase 및/또는 RNase가 포함된다. 바람직한 구현예에서, 뉴클레아제는 특정 뉴클레오타이드 사이의 내부 포스포디에스테르 결합을 가수분해하여 핵산을 신속하게 가수분해시킴으로써, 벡터 함유 상청액 중 폴리뉴클레오타이드의 크기를 감소시키는 Benzonase® 뉴클레아제이다. Benzonase® 뉴클레아제는 Merck KGaA(코드 W214950)에서 상업적으로 입수할 수 있다. 이용되는 뉴클레아제의 농도는 바람직하게는 1 ml당 1개 내지 100개 유닛 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 벡터 현탁액은, 예를 들어 벡터 농축 및/또는 완충액 교환을 위한 공정 동안 적어도 1회 한외여과(때때로 완충액 교환을 위해 사용될 때 정용여과로 지칭됨)에 적용된다. 벡터를 농축시키는 데 사용되는 공정은, 희석제가 벡터 제제로부터 제거되는 방식으로 희석제는 필터를 통과하지만, 벡터는 필터를 통해 통과할 수 없어, 벡터 제제에 농축된 형태로 남아있게 되도록 강제함으로써, 벡터의 농도가 증가하게 되는 임의의 여과 공정(예를 들어, 한외여과(UF))을 포함할 수 있다. UF는, 예를 들어 문헌[Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996)]; 및 문헌[Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9)]에 상세하게 기재되어 있다. 적합한 여과 공정은, 예를 들어 문헌[MILLIPORE catalogue, "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue" pp. 177-202 (Bedford, Mass., 1995/96)]에 기재된 바와 같은 접선 유동 여과("TFF")이다. TFF는 바이러스를 비롯한 생성물의 세포 채취, 정화, 정제 및 농축을 위한 생물가공 산업에 널리 사용된다. 상기 시스템은 공급 용액, 투과물 및 잔류물의 3가지 별개의 공정 스트림으로 구성된다. 적용에 따라, 공극 크기가 상이한 필터가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 잔류물은 생성물(렌티바이러스 벡터)을 함유한다. 선택된 특정 한외여과 막은 벡터를 보유하도록 충분히 작지만, 불순물을 효과적으로 제거하도록 충분히 큰 공극 크기를 갖는다. 제조업체 및 막 유형에 따라, 레트로바이러스 벡터의 공칭 분자량 컷오프(NMWC)가 100 kDa 내지 1000 kDa인 막, 예를 들어 300 kDa 또는 500 kDa NMWC인 막이 적절할 수 있다. 막 조성물은, 비제한적으로, 재생 셀룰로오스, 폴리에테르술폰 또는 이의 유도체일 수 있다. 막은 편평한 시트(평판 스크린으로도 불림) 또는 중공 섬유일 수 있다. 적합한 UF는 중공 섬유 UF, 예를 들어 공극 크기가 0.1 μm 보다 작은 필터를 사용하는 여과이다. 생성물은 일반적으로 보유되지만, 투과를 통해 부피가 감소될 수 있다(또는 완충액 및 불순물을 함유하는 투과물이 투과물 측에서 제거되는 속도와 동일한 속도로 완충액을 첨가함으로써, 정용여과 동안 일정하게 유지될 수 있음).
생물약제학 산업에서 TFF에 가장 널리 사용되는 기하구조는 플레이트 및 프레임(평판 스크린), 및 중공 섬유 모듈이다. 한외여과 및 미세여과를 위한 중공 섬유 유닛은 Amicon and Ramicon에서 1970년대 초에 개발되었으며(Cheryan, M. Ultrafiltration Handbook), 현재는 Spectrum 및 GE Healthcare를 비롯한 여러 공급업체가 존재한다. 중공 섬유 모듈은 밀도가 높은 피부층을 갖는 자가-지지 섬유의 어레이로 이루어져 있다. 섬유 직경은 0.5 mm 내지 3 mm 범위이다. 특정 구현예에서, 중공 섬유가 TFF에 사용된다. 특정 구현예에서, 공극 크기가 500 kDa(0.05 μm)인 중공 섬유가 사용된다. 한외여과는 정용여과(DF)를 포함할 수 있다. UF 속도와 동일한 속도로 한외여과되는 용액에 용매를 첨가하여 미세용질을 제거할 수 있다. 이는 용액으로부터의 미세종을 일정한 부피로 세척함으로써, 남아있는 벡터를 정제하는 것이다.
UF/DF는 정제 공정의 상이한 단계에서 벡터 현탁액을 농축 및/또는 완충액 교환하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 크로마토그래피 또는 다른 정제 단계 후 상청액의 완충액을 교환하기 위해 DF 단계를 이용할 수 있지만, 이는 크로마토그래피 전에 사용될 수도 있다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 단계로부터의 용출액은 농축되고, 한외여과-정용여과에 의해 추가로 정제된다. 이러한 공정 동안, 벡터는 제형 완충액으로 교환된다. 최종 목적하는 농도로의 농축은 여과-살균 단계 후에 일어날 수 있다. 상기 멸균 여과 후, 여과 살균된 물질은 무균 UF에 의해 농축되어, 벌크 벡터 생성물이 생성된다.
구현예에서, 한외여과/정용여과는 접선 유동 정용여과, 교반식 세포 정용여과 및 투석일 수 있다.
정제 기술은 벡터 입자를 세포 환경에서 분리하고, 필요한 경우, 벡터 입자를 추가로 정제하는 것을 포함하는 경향이 있다. 다양한 크로마토그래피 방법 중 하나 이상이 이러한 정제에 사용될 수 있다. 이온 교환, 더욱 특히 양이온 교환 크로마토그래피가 적합한 방법이며, 다른 방법이 사용될 수도 있다. 일부 크로마토그래피 기법에 대한 설명이 하기에 제시된다.
이온 교환 크로마토그래피는, 생체분자 및 바이러스 벡터와 같은 하전된 종이, 이의 표면에 고정된, 반대 전하를 갖는 그룹을 갖는 고정상(예컨대 막 또는 컬럼 내 패킹)에 가역적으로 결합할 수 있다는 사실을 이용한다. 2가지 유형이 이온 교환기가 존재한다. 음이온 교환기는 양전하를 갖는 그룹을 보유하는 고정상이기 때문에, 음전하를 갖는 종과 결합할 수 있다. 양이온 교환기는 음전하를 갖는 그룹을 보유하기 때문에, 양전하를 갖는 종과 결합할 수 있다. 매질의 pH는 종에 대한 전하를 변경할 수 있기 때문에, 이에 영향을 미친다. 따라서, 단백질과 같은 종의 경우, pH가 pI보다 높은 경우, 순 전하는 음일 것이며, pI보다 낮은 경우, 순 전하는 양일 것이다.
결합된 종의 변위(용리)는 적합한 완충액의 사용에 영향을 받을 수 있다. 따라서, 통상적으로, 완충액의 이온 농도는 고정상에서 이온 부위에 대한 완충액 이온의 경쟁을 통해 종이 대체될 때까지 증가한다. 대안적인 용리 방법은 종의 순 전하가 더 이상 고정상에 결합하는 것을 선호하지 않을 때까지 완충액의 pH를 변경하는 것을 포함한다. 예는, 종을 순 양전하로 가정하고, 음이온 교환기에 더 이상 결합하지 않을 때까지 pH를 감소시키는 것일 수 있다.
불순물이 하전되지 않은 경우, 또는 목적하는 종의 전하와 반대 부호의 전하를 보유하지만, 이온 교환기와는 동일한 부호를 갖는 경우에, 일부 정제가 달성될 수 있다. 이는, 하전되지 않은 종과 이온 교환기와 동일한 부호의 전하를 갖는 종이 통상적으로 결합하지 않기 때문이다. 서로 상이하게 결합된 종의 경우, 결합의 강도는 전하 밀도 및 다양한 종에 대한 전하의 분포와 같은 요인에 따라 달라진다. 따라서, 이온 또는 pH 구배를 적용하여(연속 구배, 또는 일련의 단계), 목적하는 종을 불순물과 별도로 용리할 수 있다.
크기 배제 크로마토그래피는 크기에 따라 종을 분리하는 기술이다. 전형적으로, 이는 공극의 크기가 명확한 입자로 패킹된 컬럼을 사용하여 수행된다. 크로마토그래피 분리를 위해, 분리하고자 하는 혼합물에서 종의 크기에 대하여 적절한 공극 크기를 갖는 입자가 선택된다. 혼합물을 용액(또는 바이러스의 경우 현탁액)으로 컬럼에 적용한 후, 완충액을 이용하여 용리할 때, 가장 큰 입자가 공극에 대한 접근이 제한되기 때문에(또는 접근할 수 없음) 먼저 용리될 것이다. 더 작은 입자는, 이들이 공극에 들어갈 수 있어 컬럼을 통해 더 긴 경로를 거치기 때문에, 더 늦게 용리될 것이다. 따라서, 바이러스 벡터의 정제를 위한 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 고려할 때, 벡터는 단백질과 같은 더 작은 불순물보다 먼저 용리될 것으로 예측된다.
단백질과 같은 종은, 이의 표면에, 고정상의 약한 소수성 부위에 가역적으로 결합할 수 있는 소수성 영역을 갖는다. 비교적 높은 염 농도를 갖는 매질에서, 이러한 결합이 촉진된다. 전형적으로, HIC에서, 정제하고자 하는 샘플은 높은 염 환경에서 고정상에 결합된다. 이어서, 염 농도를 감소시키는 구배(연속, 또는 일련의 단계)를 적용하여 용리가 달성된다. 통상적으로 사용되는 염은 황산암모늄이다. 소수성 수준이 상이한 종들은 상이한 염 농도에서 용리되는 경향이 있기 때문에, 표적 종이 불순물로부터 정제될 수 있다. pH, 온도, 및 세제, 무질서유발(chaotropic) 염 및 유기물과 같은 용리 매질에 대한 첨가제와 같은 다른 인자가, 또한 HIC 고정상에 대한 종의 결합 강도에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 인자 중 하나 이상이 생성물의 용리 및 정제를 최적화하는 데 적용되거나 이용될 수 있다.
바이러스 벡터는 이의 표면에, 단백질과 같은 소수성 모이어티를 갖기 때문에, HIC는 잠재적으로 정제의 수단으로서 이용될 수 있다.
HIC와 마찬가지로, RPC는 소수성의 차이에 따라 종을 분리한다. HIC에 이용되는 것보다 소수성이 더 큰 고정상이 사용된다. 고정상은 종종 알킬기 또는 페닐기와 같은 소수성 모이어티가 결합되는 재료, 전형적으로 실리카로 이루어진다. 대안적으로, 고정상은 부착된 기가 없는 유기 중합체일 수 있다. 용리하고자 하는 종들의 혼합물을 함유한 샘플이 결합을 촉진시키는 비교적 높은 극성의 수성 매질 중의 고정상에 적용된다. 이어서, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 유기 용매의 첨가에 의해 수성 매질의 극성을 감소시킴으로써 용리가 달성된다. 통상적으로, 유기 용매 농도를 증가시키는 구배(연속, 또는 일련의 단계)가 사용되며, 각각의 소수성의 순서대로 종들이 용리된다.
용리 매질의 pH, 첨가제의 사용과 같은 다른 인자가, 또한 RPC 고정상에 대한 종의 결합 강도에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 인자 중 하나 이상이 생성물의 용리 및 정제를 최적화하는 데 적용되거나 이용될 수 있다. 통상적인 첨가제는 트리플루오로아세트산(TFA)이다. 이는 샘플에서 카르복실 모이어티와 같은 산성 기의 이온화를 억제한다. 이는 또한 용리 매질의 pH 감소시키며, 이는 실리카 매트릭스를 갖는 고정상의 표면에 존재할 수 있는 유리 실란올 기의 이온화를 억제한다. TFA는 이온 쌍 형성제로 공지된 첨가제 부류 중 하나이다. 이는, 샘플의 종에 존재하는, 반대 전하를 보유하는 이온 기와 상호작용한다. 상호작용은 전하를 차폐하여, 종들의 소수성을 증가시키는 경향이 있다. TFA 및 펜타플루오로프로피온산과 같은 음이온 쌍 형성제는 종에서 양으로 하전된 기와 상호작용한다. 트리에틸아민과 같은 양이온 쌍 형성제는 음으로 하전된 기와 상호작용한다.
바이러스 벡터는 이의 표면에, 단백질과 같은 소수성 모이어티를 갖기 때문에, RPC는 잠재적으로 정제의 수단으로서 이용될 수 있다.
친화성 크로마토그래피는, 단백질 또는 뉴클레오타이드와 같은 생체분자와 특이적으로 결합하는 특정 리간드가 고정상에 고정될 수 있다는 사실을 이용한다. 이어서, 변형된 고정상은 혼합물로부터 관련 생체분자를 분리하는 데 사용될 수 있다. 고도로 특이적인 리간드의 예는, 표적 항원의 정제를 위한 항체, 및 효소의 정제를 위한 효소 저해제이다. 넓은 범위의 항체의 단리를 위해 단백질 A 리간드를 사용하는 것과 같은 보다 일반적인 상호작용이 이용될 수 있다.
전형적으로, 친화성 크로마토그래피는 관심 종을 함유하는 혼합물을 관련 리간드가 부착된 고정상에 적용함으로써 수행된다. 적절한 조건 하에서, 이는 종의 고정상에의 결합을 유도할 것이다. 이어서, 용리 매질이 적용되기 전, 결합되지 않은 구성요소가 세척된다. 용리 매질은 리간드의 표적 종에의 결합을 방해하기 위해 선택된다. 이는 통상적으로 적절한 이온 강도, pH의 선택, 또는 리간드 부위에 대하여 표적 종과 경쟁하게 될 물질의 사용에 의해 달성된다. 일부 결합된 종의 경우, 리간드로부터의 이동을 위해 우레아와 같은 무질서유발제가 사용된다. 하지만, 이는 종의 비가역적인 변성을 유도할 수 있다.
바이러스 벡터는 이의 표면에, 적절한 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질과 같은 모이어티를 갖는다. 이는, 잠재적으로, 친화성 크로마토그래피가 이의 단리에 사용될 수 있음을 의미한다.
단백질과 같은 생체분자는, 이의 표면에, 금속 이온과 배위 결합을 형성할 수 있는 전자 공여 모이어티를 가질 수 있다. 이는, Ni2+, Cu2+, Zn2+ 또는 Fe3+와 같은 고정된 금속 이온을 운반하는 고정상에의 결합을 용이하게 할 수 있다. IMAC에 사용되는 고정상은 킬레이트제, 전형적으로 표면에 공유결합으로 부착되며 금속 이온을 보유하는 킬레이트제인 니트릴로아세트산 또는 이미노디아세트산을 갖는다. 킬레이트된 금속 이온은 생체분자에의 배위 결합을 형성하는 데 이용 가능한 적어도 하나의 배위 부위를 가질 필요가 있다. 잠재적으로, 고정된 금속 이온에 결합할 수 있는 생체분자의 표면에는 몇몇 모이어티가 존재한다. 이에는, 히스티딘, 트립토판 및 시스테인 잔기뿐 아니라, 포스페이트기가 포함된다. 하지만, 단백질의 경우, 우세한 공여체는 히스티딘 잔기의 이미다졸기인 것으로 보인다. 천연 단백질은, 이의 표면에 적합한 공여체 모이어티를 나타내는 경우, IMAC를 사용하여 분리될 수 있다. 다르게는, IMAC는 몇몇 연결된 히스티딘 잔기의 사슬을 보유하는 재조합 단백질의 분리를 위해 사용될 수 있다.
전형적으로, IMAC는 관심 종을 함유하는 혼합물을 고정상에 적용함으로써 수행된다. 적절한 조건 하에서, 이는 종의 고정상에의 배위 결합을 유도할 것이다. 이어서, 용리 매질이 적용되기 전, 결합되지 않은 구성요소가 세척된다. 용리를 위해, 염 농도를 증가시키거나 pH를 감소시키는 구배(연속, 또는 일련의 단계)가 사용될 수 있다. 또한, 통상적으로 사용되는 절차는 이미다졸 농도를 증가시키는 구배의 적용이다. 상이한 공여체 특성을 갖는, 예를 들어 상이한 환경에 있는 히스티딘 잔기를 갖는 생체분자는, 구배 용리를 사용하여 분리될 수 있다.
바이러스 벡터는 이의 표면에, IMAC 고정상에 결합할 수 있는 단백질과 같은 모이어티를 갖는다. 이는, 잠재적으로, IMAC가 이의 단리에 사용될 수 있음을 의미한다.
적합한 원심분리 기술에는, 구역 원심분리, 등밀도 초원심분리 및 펠릿화 원심분리가 포함된다.
여과-살균은 약학적 등급의 재료를 위한 공정에 적합하다. 여과-살균은 수득되는 제형에 실질적으로 오염물이 없게 한다. 여과-살균 후 오염물의 수준은, 제형이 임상용으로 적합한 정도이다. 여과-살균 단계 후 추가의 농축(예를 들어, 한외여과)이 무균 조건 하에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 살균 필터의 최대 공극 크기는 0.22 μm이다.
본원의 레트로바이러스 벡터는 또한 관류 초원심분리 및 고속 원심분리, 및 접선 유동 여과를 사용하여 렌티바이러스 벡터를 농축시키고 정제하는 방법에 적용될 수 있다. 관류 초원심분리는 RNA 종양 바이러스의 정제에 사용될 수 있다(문헌[Toplin et al, Applied Microbiology 15:582-589, 1967]; 문헌[Burger et al., Journal of the National Cancer Institute 45: 499-503, 1970]). 관류 초원심분리는 렌티바이러스 벡터의 정제에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 하기 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 세포공장(cell factory) 또는 생물반응기 시스템을 사용하여 세포에서 생산될 수 있다. 일시적 트랜스펙션 시스템이 사용될 수 있거나, 패키징 또는 생산 세포주도 유사하게 사용될 수 있다. 목적하는 경우, 재료를 초원심분리기에 로딩하기 전, 사전 정화 단계가 사용될 수 있다. 관류 초원심분리는 연속 흐름 또는 배치식 침강을 사용하여 수행될 수 있다. 침강에 사용되는 재료는, 예를 들어 염화세슘, 타르타르산칼륨 및 브롬화칼륨이며, 이들은 모두 부식성이지만, 낮은 점도와 함께 높은 밀도를 형성한다. CsCl은 형성될 수 있는 광범위한 밀도 구배(1.0 g/cm3 내지 1.9 g/cm3)로 인해 고순도가 달성될 수 있기 때문에, 공정 개발에 자주 사용된다. 브롬화칼륨은, 예를 들어 25℃와 같은 승온에서 높은 밀도로 사용될 수 있으며, 이는 일부 단백질의 안정성과 양립할 수 없다. 수크로오스는 저렴하고 무독성이기 때문에 널리 사용되며, 대부분의 단백질, 준세포 분획 및 전체 세포의 분리에 적합한 구배를 형성할 수 있다. 전형적으로, 최대 밀도는 약 1.3 g/cm3이다. 수크로오스의 삼투 가능성은 세포에 독성일 수 있으며, 이러한 경우 복합 구배 물질, 예를 들어 Nycodenz가 사용될 수 있다. 구배는 구배가 있는 하나 이상의 단계와 함께 사용될 수 있다. 일 구현예는 수크로오스 구배 단계를 사용하는 것이다. 재료의 부피는 실행당 0.5 리터 내지 200 리터 초과일 수 있다. 유속은 시간당 5 리터 내지 25 리터 초과일 수 있다. 적합한 작동 속도는 25,000 rpm 내지 40,500 rpm으로, 이는 최대 122,000×g의 힘을 생성한다. 로터는 목적하는 부피율로 정적으로 언로딩될 수 있다. 일 구현예는, 원심분리된 물질을 100 ml 분획으로 언로딩하는 것이다. 이어서, 정제되고 농축된 렌티바이러스 벡터를 함유하는 단리된 분획은 겔 여과 또는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 목적하는 완충액에서 교환될 수 있다. 완충액 교환 또는 추가의 정제를 위한 대안적인 또는 추가의 방법으로 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우, 완충액 교환 및 최종 제형을 위해 접선 유동 여과가 사용될 수 있다. 접선 유동 여과(TFF)는 또한 초고속 또는 고속 원심분리에 대한 대안적인 단계로 사용될 수 있으며, 여기서 2단계 TFF 절차가 실행될 수 있다. 제1 단계는 벡터 상청액의 부피를 감소시킬 수 있는 반면, 제2 단계는 완충액 교환, 최종 제형 및 일부 경우 재료의 추가 농축을 위해 사용될 수 있다. TFF 막의 막 크기는 100 킬로달톤 내지 500 킬로달톤일 수 있으며, 여기서 제1 TFF 단계의 막 크기는 500 킬로달톤일 수 있고, 제2 TFF의 막 크기는 300 킬로달톤 내지 500 킬로달톤일 수 있다. 최종 완충액은 장기 보관을 위해 벡터를 저장할 수 있는 재료를 함유해야 한다.
구현예에서, 상기 방법은 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위해 부착세포를 함유하는 세포공장, 또는 벡터 또는 헬퍼 구조체로 트랜스펙션 또는 형질도입된 현탁액 세포를 함유하는 생물반응기를 사용한다. 비제한적인 생물반응기의 예에는, Wave 생물반응기 시스템 및 Xcellerex 생물반응기가 포함된다. 둘 모두 1회용 시스템이다. 하지만, 1회용이 아닌 시스템이 사용될 수도 있다. 상기 구조체는 본원에 기재된 것뿐 아니라, 다른 렌티바이러스 형질도입 벡터일 수 있다. 대안적으로, 형질도입 또는 트랜스펙션 필요 없이 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위해 세포주를 조작할 수 있다. 트랜스펙션 후, 렌티바이러스 벡터를 채취하고, 여과하여 미립자를 제거한 후, 연속 흐름 고속 또는 초고속 원심분리를 사용하여 원심분리한다. 바람직한 구현예는, 고속 원심분리기가 장착된, JCF-A 구역 및 연속 흐름 로터와 같은 고속 연속 흐름 장치를 사용하는 것이다. 또한, 중간 규모의 렌티바이러스 벡터 생산을 위해서는 Contifuge Stratus 원심분리기를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 원심분리 속도가 5,000×g RCF 초과 내지 26,000×g RCF 미만인 임의의 연속 흐름 원심분리기가 적합하다. 바람직하게는, 연속 흐름 원심력은 약 10,500×g 내지 23,500×g RCF이고, 회전 시간은 20시간 내지 4시간이며, 원심력이 느릴수록 사용되는 원심분리 시간은 더 길어진다. 렌티바이러스 벡터가 여과 가능하지 않은 응집체를 형성하지 않도록 렌티바이러스 벡터는 밀도가 높은 재료의 쿠션(비제한적인 예는 수크로오스이지만, 쿠션을 형성하기 위해 다른 시약이 사용될 수 있으며, 이는 당업계에 널리 공지되어 있음)에서 원심분리될 수 있으며, 벡터의 직선 원심분리를 통해 바이러스 벡터 펠릿을 생성하는 경우도 있다. 쿠션 상에서의 연속 흐름 원심분리는 벡터가 큰 응집체 형성하는 것을 회피할 수 있지만, 렌티바이러스 벡터를 생성하는 큰 부피의 트랜스펙션된 재료로부터 벡터를 높은 수준으로 농축시킬 수 있다. 또한, 제2 저밀도 수크로오스 층을 사용하여 렌티바이러스 벡터 제제를 묶을 수 있다. 연속 흐름 원심분리기의 유속은 분당 1 ml 내지 100 ml일 수 있지만, 더 높거나 낮은 유속이 사용될 수도 있다. 유속은 높은 유속으로 인한 유의한 양의 벡터 손실 없이, 벡터가 원심분리기의 코어에 들어가는데 충분한 시간을 제공하도록 조정된다. 더 높은 유속을 원하는 경우, 연속 흐름 원심분리기에서 배출되는 재료를 재순환시켜 원심분리기를 2회 통과하게 할 수 있다. 연속 흐름 원심분리를 사용하여 바이러스를 농축시킨 후, 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 벡터를 추가로 농축시킬 수 있거나, 완충액 교환을 위해 TFF 시스템을 간단히 사용할 수 있다. TFF 시스템의 비제한적인 예는, GB-Healthcare에서 제조된 Xampler 카트리지 시스템이다. 바람직한 카트리지는 MW 컷오프가 500,000 MW 이하인 것들이다. 바람직하게는, MW 컷오프가 300,000 MW인 카트리지가 사용된다. MW 컷오프가 100,000 MW인 카트리지가 또한 사용될 수 있다. 부피가 더 큰 경우, 더 큰 카트리지가 사용될 수 있으며, 당업자는 벡터 제제의 최종 충전 전, 이러한 최종 완충액 교환 및/또는 농축 단계에 적합한 TFF 시스템을 쉽게 찾을 수 있을 것이다. 최종 충전 제제는 벡터를 안정화시키는 요소를 함유할 수 있고, 당이 일반적으로 사용되며 당업계에 공지되어 있다.
단백질 함량
일부 구현예에서, 레트로바이러스 입자는 다양한 원천세포 게놈 유래 단백질, 외인성 단백질 및 바이러스 게놈 유래 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 입자는 원천세포 게놈 유래 단백질 대 바이러스 게놈 유래 단백질, 원천세포 게놈 유래 단백질 대 외인성 단백질, 및 외인성 단백질 대 바이러스-게놈 유래 단백질의 다양한 비를 함유한다.
일부 구현예에서, 바이러스 게놈 유래 단백질은 GAG 다단백질 전구체, HIV-1 인테그라아제, POL 다단백질 전구체, 캡시드, 뉴클레오캡시드, p17 매트릭스, p6, p2, VPR, Vif이다.
일부 구현예에서, 원천세포 유래 단백질은 시클로필린 A, 열충격 70 kD, 인간 연장인자-1 알파(EF-1R) 히스톤 H1, H2A, H3, H4, 베타-글로빈, 트립신 전구체, 파르불린(Parvulin), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제, Lck, 유비퀴틴, SUMO-1, CD48, 신테닌-1, 뉴클레오포스민(Nucleophosmin), 이종 핵 리보핵단백질 C1/C2, 뉴클레오린(Nucleolin), 가능한 ATP-의존성 헬리카아제 DDX48, 매트린(Matrin)-3, 이행성 ER ATPase, GTP-결합 핵 단백질 Ran, 이종 핵 리보핵단백질 U, 인터류킨 인핸서 결합인자 2, 비(非)POU 도메인 함유 8량체 결합 단백질, RuvB 유사 2, HSP 90-b, HSP 90-a, 연장인자 2, D-3-포스포글리세레이트 데히드로게나아제, a-에놀라아제, C-1-테트라히드로폴레이트 신타아제, 세포질, 피루베이트 키나아제, 이소자임 M1/M2, 유비퀴틴 활성화 효소 E1, 26S 프로테아제 조절 서브유닛 S10B, 60S 산성 리보솜 단백질 P2, 60S 산성 리보솜 단백질 P0, 40S 리보솜 단백질 SA, 40S 리보솜 단백질 S2, 40S 리보솜 단백질 S3, 60S 리보솜 단백질 L4, 60S 리보솜 단백질 L3, 40S 리보솜 단백질 S3a, 40S 리보솜 단백질 S7, 60S 리보솜 단백질 L7a, 60S 산성 리보솜 단백질 L31, 60S 리보솜 단백질 L10a, 60S 리보솜 단백질 L6, 26S 프로테아좀 비(非)ATPase 조절 서브유닛 1, 튜불린 b-2 사슬, 액틴, 세포질 1, 액틴, 대동맥 평활근, 튜불린 a-유비쿼터스 사슬, 클라트린(Clathrin) 중쇄 1, 히스톤 H2B.b, 히스톤 H4, 히스톤 H3.1, 히스톤 H3.3, 히스톤 H2A 제8형, 26S 프로테아제 조절 서브유닛 6A, 유비퀴틴-4, RuvB 유사 1, 26S 프로테아제 조절 서브유닛 7, 류실-tRNA 합성효소, 세포질, 60S 리보솜 단백질 L19, 26S 프로테아좀 비ATPase 조절 서브유닛 13, 히스톤 H2B.F, U5 작은 핵 리보핵단백질 200 kDa 헬리카아제, 폴리[ADP-리보오스]폴리머라아제-1, ATP-의존성 DNA 헬리카아제 II, DNA 복제 라이센싱 인자 MCM5, 뉴클레아제 민감 요소 결합 단백질 1, ATP-의존성 RNA 헬리카아제 A, 인터류킨 인핸서 결합인자 3, 전사 연장인자 B 폴리펩타이드 1, Pre-mRNA 처리 스플라이싱 인자 8, 포도상구균 뉴클레아제 도메인 함유 단백질 1, 프로그래밍된 세포 사멸 6-상호작용 단백질, RNA 폴리머라아제 II 전사 서브유닛 8 동족체의 매개체, 핵소체 RNA 헬리카아제 II, 엔도플라스민(Endoplasmin), DnaJ 동족체 서브패밀리 A 멤버 1, 열충격 70 kDa 단백질 1L, T-복합 단백질 1 e 서브유닛, GCN1 유사 단백질 1, 세로트랜스페린(Serotransferrin), 프룩토오스 비스포스페이트 알돌라아제 A, 이노신-5'모노포스페이트 데히드로게나아제 2, 26S 프로테아제 조절 서브유닛 6B, 지방산 신타아제, DNA-의존성 단백질 키나아제 촉매 서브유닛, 40S 리보솜 단백질 S17, 60S 리보솜 단백질 L7, 60S 리보솜 단백질 L12, 60S 리보솜 단백질 L9, 40S 리보솜 단백질 S8, 40S 리보솜 단백질 S4 X 이소형, 60S 리보솜 단백질 L11, 26S 프로테아좀 비ATPase 조절 서브유닛 2, 코토머(Coatomer) a 서브유닛, 히스톤 H2A.z, 히스톤 H1.2, 시토졸 디네인(Dynein) 중쇄이다. 문헌[Saphire et al., Journal of Proteome Research, 2005] 및 문헌[Wheeler et al., Proteomics Clinical Applications, 2007] 참조.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 peg화된다.
입자 크기
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 직경의 중앙값은 10 nm 내지 1000 nm, 25 nm 내지 500 nm, 40 nm 내지 300 nm, 50 nm 내지 250 nm, 60 nm 내지 225 nm, 70 nm 내지 200 nm, 80 nm 내지 175 nm, 또는 90 nm 내지 150 nm이다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터의 90%는 레트로바이러스 직경의 중앙값 50% 내에 속한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터의 90%는 레트로바이러스 직경의 중앙값 25% 내에 속한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터의 90%는 레트로바이러스 직경의 중앙값 20% 내에 속한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터의 90%는 레트로바이러스 직경의 중앙값 15% 내에 속한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터의 90%는 레트로바이러스 직경의 중앙값 10% 내에 속한다.
XI. 적응증 및 용도
본원에 기재된 푸소좀, 레트로바이러스 벡터, VLP 또는 약학적 조성물은, 대상, 예를 들어 포유류, 예를 들어 인간에게 투여될 수 있다. 상기와 같은 구현예에서, 대상은 특정 질환 또는 병태(예를 들어, 본원에 기재된 질환 또는 병태)의 위험이 있을 수 있거나, 이의 증상을 가질 수 있거나, 또는 이로 진단되거나 이를 앓고 있는 것으로 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 질환은 유전자 결핍, 예를 들어 표 5 또는 표 6에 열거된 유전자 결핍이다.
본 개시내용은 또한, 특정 양태에서, 푸소좀 조성물을 대상(예를 들어, 인간 대상), 표적조직 또는 세포에 전달하는 방법으로서, 본원에 기재된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물, 본원에 기재된 푸소좀 조성물 또는 본원에 기재된 약학적 조성물을, 대상에게 투여하거나, 표적조직 또는 세포와 접촉시켜, 푸소좀 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한, 특정 양태에서, 치료제(예를 들어, 폴리펩타이드, 핵산, 대사산물, 세포소기관 또는 세포하 구조)를 대상, 표적조직 또는 세포에 전달하는 방법으로서, 본원에 기재된 복수의 푸소좀, 본원에 기재된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물, 본원에 기재된 푸소좀 조성물 또는 본원에 기재된 약학적 조성물을, 대상에게 투여하거나, 표적조직 또는 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 푸소좀 조성물은 치료제가 전달되도록 하는 양 및/또는 시간으로 투여되는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한, 특정 양태에서, 기능을 대상, 표적조직 또는 세포에 전달하는 방법으로서, 본원에 기재된 복수의 푸소좀, 본원에 기재된 복수의 푸소좀을 포함하는 푸소좀 조성물, 본원에 기재된 푸소좀 조성물 또는 본원에 기재된 약학적 조성물을, 대상에게 투여하거나, 표적조직 또는 세포와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 푸소좀 조성물은 기능이 전달되도록 하는 양 및/또는 시간으로 투여되는 방법을 제공한다.
포유류(예를 들어, 인간) 조직으로부터의 표적세포에는, 상피, 결합, 근육 또는 신경 조직 또는 세포, 및 이들의 조합이 포함된다. 표적 포유류(예를 들어, 인간) 세포 및 기관계에는, 심혈관계(심장, 혈관구조); 소화계(식도, 위, 간, 담낭, 췌장, 장, 결장, 직장 및 항문); 내분비계(시상하부, 뇌하수체, 송과체 또는 송과선, 갑상선, 부갑상선, 부신); 배설계(신장, 요관, 방광); 림프계(림프, 림프절, 림프관, 편도선, 아데노이드, 흉선, 비장); 외피계(피부, 모발, 손톱); 근육계(예를 들어, 골격근); 신경계(뇌, 척수, 신경); 생식계(난소, 자궁, 유선, 고환, 정관, 정낭, 전립선); 호흡계(인두, 후두, 기관, 기관지, 폐, 횡격막); 골격계(뼈, 연골), 및 이들의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, 비표적세포 또는 기관계는, 심혈관계(심장, 혈관구조); 소화계(식도, 위, 간, 담낭, 췌장, 장, 결장, 직장 및 항문); 내분비계(시상하부, 뇌하수체, 송과체 또는 송과선, 갑상선, 부갑상선, 부신); 배설계(신장, 요관, 방광); 림프계(림프, 림프절, 림프관, 편도선, 아데노이드, 흉선, 비장); 외피계(피부, 모발, 손톱); 근육계(예를 들어, 골격근); 신경계(뇌, 척수, 신경); 생식계(난소, 자궁, 유선, 고환, 정관, 정낭, 전립선); 호흡계(인두, 후두, 기관, 기관지, 폐, 횡격막); 골격계(뼈, 연골), 및 이들의 조합에서 선택된다.
본원에 기재된 약학적 조성물의 투여는, 경구, 흡입, 경피 또는 비경구(정맥내, 종양내, 복강내, 근육내, 공동내 및 피하 포함) 투여에 의해 이루어질 수 있다. 푸소좀은 단독으로 투여되거나 약학적 조성물로 제형화될 수 있다.
구현예에서, 푸소좀 조성물은 표적세포에 대한 효과를 매개하며, 이의 효과는 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일, 2주, 3주 또는 4주, 또는 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 또는 12개월 동안 지속된다. 일부 구현예에서(예를 들어, 푸소좀 조성물이 외인성 단백질을 포함하는 경우), 효과는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일, 2주, 3주 또는 4주, 또는 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 또는 12개월 미만 동안 지속된다.
구현예에서, 본원에 기재된 푸소좀 조성물은 세포 또는 조직, 예를 들어 인간 세포 또는 조직에 생체외로 전달된다.
본원에 기재된 푸소좀 조성물은 대상, 예를 들어 포유류, 예를 들어 인간에게 투여될 수 있다. 상기와 같은 구현예에서, 대상은 특정 질환 또는 병태(예를 들어, 본원에 기재된 질환 또는 병태)의 위험이 있을 수 있거나, 이의 증상을 가질 수 있거나, 또는 이로 진단되거나 이를 앓고 있는 것으로 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 푸소좀의 공급원은 푸소좀 조성물이 투여되는 동일한 대상에서 유래된 것이다. 다른 구현예에서, 이들은 상이하다. 예를 들어, 푸소좀 및 수용조직의 공급원은 자가(동일한 대상 유래) 또는 이종(상이한 대상 유래)일 수 있다. 어느 경우든, 본원에 기재된 푸소좀 조성물에 대한 공여조직은 수용조직과 상이한 조직 유형일 수 있다. 예를 들어, 공여조직은 근육 조직일 수 있고, 수용조직은 결합 조직(예를 들어, 지방 조직)일 수 있다. 다른 구현예에서, 공여조직과 수용조직은 동일하거나 상이한 유형일 수 있으나, 상이한 기관계에서 유래한 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 푸소좀은 막 융합을 저해하는 단백질의 저해제와 병용투여된다. 예를 들어, 서프레신(suppressyn)은 세포-세포 융합을 저해하는 인간 단백질이다(문헌[Sugimoto et al., "A novel human endogenous retroviral protein inhibits cell-cell fusion" Scientific Reports 3:1462 DOI: 10.1038/srep01462]). 따라서, 일부 구현예에서, 푸소좀은 시프레신의 저해제, 예를 들어 siRNA 또는 저해 항체와 병용투여된다.
본원에 기재된 조성물은 또한, 비제한적으로, 가축 또는 일하는 동물(말, 소, 돼지, 닭 등), 애완동물 또는 동물원 동물(고양이, 개, 도마뱀, 새, 사자, 호랑이 및 곰 등), 양식 동물(어류, 크랩, 새우, 굴 등), 식물 종(나무, 곡식, 관상용 꽃 등), 발효 종(사카로마이세스(saccharomyces) 등)을 포함하는 다양한 다른 유기체의 세포 또는 조직의 기능 또는 생리를 유사하게 조절하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 푸소좀 조성물은 이러한 비인간 공급원에서 제조될 수 있고, 비인간 표적세포 또는 표적조직 또는 대상에게 투여될 수 있다.
푸소좀 조성물은 표적에 대하여 자가, 동종이계 또는 이종일 수 있다.
XII. 추가의 치료제
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 대상, 예를 들어 수용체, 예를 들어 본원에 기재된 수용체에게, 추가의 작용제, 예를 들어 치료제와 병용투여된다. 일부 구현예에서, 병용투여되는 치료제는 면역억제제, 예를 들어 글루코코르티코이드(예를 들어, 덱사메타손), 세포증식억제제(예를 들어, 메토트렉세이트), 항체(예를 들어, 무로모납-CD3) 또는 이뮤노필린 조절제(예를 들어, 시클로스포린 또는 라파마이신)이다. 구현예에서, 면역억제제는 푸소좀의 면역 매개 제거를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 면역자극제, 예를 들어 아쥬반트, 인터류킨, 사이토카인 또는 케모카인과 병용투여된다.
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물과 면역억제제는 동일한 시간에 투여되며, 예를 들어 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 면역억제제의 투여 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 푸소좀 조성물은 면역억제제의 투여 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 면역억제제는 이부프로펜(ibuprofen), 아세트아미노펜(acetaminophen), 시클로스포린, 타크롤리무스(tacrolimus), 라파마이신, 마이코페놀레이트(mycophenolate), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 글루코코르티코이드, 시롤리무스(sirolimus), 아자티오프린 또는 메토트렉세이트와 같은 소분자이다.
일부 구현예에서, 면역억제제는, 비제한적으로, 무로노맙(항-CD3), 다클리주맙(daclizumab)(항-IL12), 바실릭시맙(basiliximab), 인플릭시맙(infliximab)(항-TNFa) 또는 리툭시맙(rituximab)(항-CD20)을 포함하는 항체 분자이다.
일부 구현예에서, 푸소좀 조성물과 면역억제제의 병용투여는 푸소좀 조성물 단독 투여와 비교하여 대상에서 푸소좀 조성물의 지속성을 증강시킨다. 일부 구현예에서, 병용투여에서 푸소좀 조성물의 증강된 지속성은, 단독 투여 시 푸소좀 조성물의 지속성과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 더 길다. 일부 구현예에서, 병용투여에서 푸소좀 조성물의 증강된 지속성은, 단독 투여 시 푸소좀 조성물의 생존기간과 비교하여 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 15일, 20일, 25일 또는 30일 더 길다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것으로, 어떠한 방식으로든 이의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1. 레트로바이러스 핵산 전달의 특이성을 검출하기 위한 표적외 세포 검정
본 실시예는 단일 세포 내 벡터 카피 수 측정에 의한 표적외 수용세포 내 핵산의 정량화를 설명한다.
일 구현예에서, 처리된 마우스는, 예를 들어 벡터가 없거나 음성 대조군 수준과 유사한 벡터 수를 갖는 미처리 마우스와 표적외 세포에서 벡터 카피 수가 유사하다. 일 구현예에서, 처리된 마우스는, 예를 들어 세포가 없거나 음성 대조군 수준과 유사한 세포 수를 갖는 미처리 마우스와 벡터를 함유하는 표적외 세포의 %가 유사하다.
본 실시예에서, 표적외 수용세포는 CD11c+ 세포이다. 하지만, 이러한 프로토콜은 적합한 표면 마커가 존재하고, 대상에서 단리될 수 있는 임의의 세포 유형에 적용될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 방법은 프로토콜을 최적화하여 인간, 래트, 원숭이에게 동일하게 적용 가능하다.
마우스를 본원에 기재된 바와 같이 생성된 레트로바이러스 벡터 또는 PBS(음성 대조군)로 처리하였다. 처리 28일 후, 레트로바이러스 벡터를 받은 마우스와 PBS 처리를 받은 마우스에서 말초혈액을 채취하였다. 5 μM EDTA가 함유된 1 ml PBS에 혈액을 채취하고, 응고를 방지하기 위해 즉시 혼합하였다. 튜브를 얼음에 보관하고, 염화암모늄(ACK) 완충 용액을 사용하여 적혈구를 제거하였다. 세포를 세포 염색 완충액(Biolegend 카탈로그 번호: 420201) 중에서 10분 동안 Fc 차단한 후(Biolegend 카탈로그 번호: 101319), 쥣과 CD11c:APC-Cy7 항체(Biolegend 카탈로그 번호: 117323) 또는 아이소타입 대조군인 APC-Cy7 항체(Biolegend 카탈로그 번호: 400230)를 이용하여 암실에서 4℃에서 30분 동안 염색하였다. PBS로 2회 세척한 후, 아이소타입 대조군인 APC-Cy7 항체 표지된 세포를 사용하여 음성 게이트를 설정하기 위해, 세포를 FACSDiva™ 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA)를 실행하여 640 nm 레이저 여기 및 780 -/+ 60 nm에서 수집된 방출을 이용하여 FACS Aria(BD Biosciences, San Jose, CA.)에서 분석하였다. APC-Cy7 양성 세포를 벡터 카피 수 분석을 위해 플레이트의 단일 웰로 분류하였다.
단일세포 중첩 PCR(single-cell nested PCR)을 사용하여 벡터 카피 수를 평가하였다. PCR은 벡터 및 내인성 제어 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 qPCR로 수행하였다. 벡터 카피 수는 벡터 qPCR 신호의 양을 내인성 제어 유전자 qPCR 신호의 양으로 나누어 결정하였다. 벡터를 수용한 세포는 벡터 카피 수가 적어도 1.0이 된다. 복수의 세포의 벡터 카피 수를 평균 내어 집단 전체에 걸쳐 벡터 카피 수를 평가하였다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스는 비히클로 처리된 마우스와 표적외 세포에서 평균 벡터 카피 수가 유사하다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스는 비히클로 처리된 마우스와 벡터를 수용한 표적외 세포의 %가 유사하다.
실시예 2. 외인성 단백질 작용제 전달의 특이성을 검출하기 위한 표적외 세포 검정
본 실시예는 단일 세포에서의 외인성 작용제 발현에 의한 표적외 수용세포에서의 외인성 작용제 발현의 정량화를 설명한다.
일 구현예에서, 처리된 마우스는 미처리 마우스와 표적외 세포에서 외인성 작용제 발현이 유사하다. 일 구현예에서, 처리된 마우스는 미처리 마우스와 외인성 작용제를 발현하는 표적외 세포의 %가 유사하다.
본 실시예에서, 표적외 수용세포는 CD11c+ 세포이다. 하지만, 이러한 프로토콜은 적합한 표면 마커가 존재하고, 대상에서 단리될 수 있는 임의의 세포 유형에 적용될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 방법은 프로토콜을 최적화하여 인간, 래트, 원숭이에게 동일하게 적용 가능하다. 본 실시예에서, 외인성 작용제는 형광 단백질이고, 발현은 유세포분석으로 측정하였다. 다른 구현예에서, 단백질에 대한 면역염색으로 외인성 단백질 작용제의 발현을 측정할 수 있다. 다른 구현예에서, 현미경법 또는 웨스턴 블롯을 통해 외인성 단백질 작용제의 발현을 측정할 수 있다.
마우스를 본 출원에 기재된 임의의 방법을 통해 생성된 tdTomato 형광 단백질 작용제를 갖는 레트로바이러스 벡터 또는 PBS(음성 대조군)로 처리하였다. 처리 28일 후, 레트로바이러스 벡터를 받은 마우스와 PBS 처리를 받은 마우스에서 말초혈액을 채취하였다. 5 μM EDTA가 함유된 1 ml PBS에 혈액을 채취하고, 응고를 방지하기 위해 즉시 혼합하였다. 튜브를 얼음에 보관하고, 염화암모늄(ACK) 완충 용액을 사용하여 적혈구를 제거하였다. 세포를 세포 염색 완충액(Biolegend 카탈로그 번호: 420201) 중에서 10분 동안 Fc 차단한 후(Biolegend 카탈로그 번호: 101319), 쥣과 CD11c:APC-Cy7 항체(Biolegend 카탈로그 번호: 117323) 또는 아이소타입 대조군인 APC-Cy7 항체(Biolegend 카탈로그 번호: 400230)를 이용하여 암실에서 4℃에서 30분 동안 염색하였다. PBS로 2회 세척한 후, FACSDiva™ 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA)를 실행하여 FACS Aria(BD Biosciences, San Jose, CA.)에서 세포를 분석하였다. 아이소타입 대조군인 APC-Cy7 항체 표지된 세포와, 640 nm 레이저 여기 및 780 -/+ 60 nm에서 수집된 방출을 이용하여 CD11c에 대한 음성 게이트를 설정하였다. 비히클로 처리된 마우스에서 단리된 세포와, 552 nm 레이저 여기 및 585 -/+ 42 nm에서 수집된 방출을 이용하여 tdTomato 발현에 대한 음성 게이트를 설정하였다.
tdTomato 양성인 CD11c+ 세포의 %를 측정하였다. 일부 구현예에서, tdTomato 양성인 CD11c+ 세포의 %는 처리된 마우스와 미처리 마우스의 세포에서 유사하였다. tdTomato 형광 수준의 중앙값을 CD11c+ 세포에서 측정하였다. 일부 구현예에서, CD11c+ 세포에서 tdTomato 형광 수준의 중앙값은 처리된 마우스와 미처리 마우스의 세포에서 유사하였다.
실시예 3. 레트로바이러스 핵산 전달의 특이성을 검출하기 위한 표적세포 검정
본 실시예는 단일 세포 내 벡터 카피 수 측정에 의한 표적 수용세포 내 핵산의 정량화를 설명한다.
일 구현예에서, 처리된 마우스는 미처리 마우스보다 표적세포 내 벡터 카피 수가 더 크다. 일 구현예에서, 처리된 마우스는 미처리 마우스보다 벡터를 함유하는 표적세포의 %가 더 크다.
본 실시예에서, 표적 수용세포는 CD3+ 세포이다. 하지만, 이러한 프로토콜은 적합한 표면 마커가 존재하고, 대상에서 단리될 수 있는 임의의 세포 유형에 적용될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 방법은 프로토콜을 최적화하여 인간, 래트, 원숭이에게 동일하게 적용 가능하다.
마우스를 레트로바이러스 벡터로 처리하고, 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 혈액 샘플을 채취하였다. 상기 실시예 1에 기재된 프로토콜을 사용하여 세포를 쥣과 CD3:APC-Cy7 항체(Biolegend 카탈로그 번호: 100330) 또는 아이소타입 대조군으로 염색하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 단일세포 중첩 PCR을 사용하여 벡터 카피 수를 평가하였다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스는 비히클로 처리된 마우스보다 표적세포 내 평균 벡터 카피 수가 더 컸다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스는 비히클로 처리된 마우스보다 벡터를 수용한 표적세포의 %가 더 컸다.
실시예 4. 외인성 단백질 작용제 전달의 특이성을 검출하기 위한 표적세포 검정
본 실시예는 단일 세포에서의 외인성 단백질 작용제 발현에 의한 표적 수용세포에서의 외인성 단백질 작용제 발현의 정량화를 설명한다.
일 구현예에서, 처리된 마우스는 미처리 마우스보다 표적세포에서 외인성 단백질 작용제 발현이 더 크다. 일 구현예에서, 처리된 마우스는 미처리 마우스보다 외인성 단백질 작용제를 발현하는 표적세포의 %가 더 크다.
본 실시예에서, 표적 수용세포는 CD3+ 세포이다. 하지만, 이러한 프로토콜은 적합한 표면 마커가 존재하고, 대상에서 단리될 수 있는 임의의 세포 유형에 적용될 수 있다. 특히, 본원에 기재된 방법은 프로토콜을 최적화하여 인간, 래트, 원숭이에게 동일하게 적용 가능하다. 본 실시예에서, 외인성 단백질 작용제는 형광 단백질이고, 발현은 유세포분석으로 측정하였다. 다른 구현예에서, 단백질에 대한 면역염색으로 외인성 단백질 작용제의 발현을 측정할 수 있다. 다른 구현예에서, 현미경법 또는 웨스턴 블롯을 통해 외인성 단백질 작용제의 발현을 측정할 수 있다.
마우스를 레트로바이러스 벡터로 처리하고, 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 혈액 샘플을 채취하였다. 세포를 쥣과 CD3:APC-Cy7 항체(Biolegend 카탈로그 번호: 100330) 또는 아이소타입 대조군으로 염색하고, 실시예 2에 기재된 프로토콜을 사용하여 유세포분석으로 분석하였다.
tdTomato 양성인 CD3+ 세포의 %를 측정하였다. 일부 구현예에서, tdTomato 양성인 CD3+ 세포의 %는 미처리 마우스보다 처리된 마우스의 세포에서 더 컸다. tdTomato 형광 수준의 중앙값을 CD3+ 세포에서 측정하였다. 일부 구현예에서, CD3+ 세포에서 tdTomato 형광 수준의 중앙값은 미처리 마우스보다 처리된 마우스의 세포에서 더 컸다.
실시예 5. PBMC 세포 용해에 의해 매개되는 세포독성을 감소시키기 위한 HLA-G 또는 HLA-E를 이용한 레트로바이러스 벡터의 변형
본 실시예는 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 의한 세포 용해로 인해 세포독성이 감소하도록 변형된 세포에서 유도된 레트로바이러스 벡터를 설명한다.
일 구현예에서, PBMC에 의한 레트로바이러스 벡터의 세포독성 매개 세포 용해는, 용해가 레트로바이러스 벡터의 활성을 감소, 예를 들어 저해하거나 중단시키기 때문에, 레트로바이러스 벡터의 면역원성의 척도이다.
레트로바이러스 벡터를 변형되지 않은 세포(이하 NMC, 양성 대조군), HLA-G 또는 HLA-E cDNA로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-HLA-G), 및 빈 벡터 대조군으로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-빈 벡터, 음성 대조군)로부터 생성하였다.
레트로바이러스 벡터의 PBMC 매개 용해는 문헌[Bouma, et al. Hum. Immunol. 35(2):85-92; 1992] 및 문헌[van Besouw et al. Transplantation 70(1):136-143; 2000]에 기재된 바와 같이 유로퓸 방출 검정으로 결정하였다. PBMC(이하 이펙터 세포)를 적절한 공여체에서 단리하고, 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 동종이계 감마선 조사된 PMBC 및 200IU/mL IL-2(프로류킨, Chiron BV Amsterdam, The Netherlands)로 37℃에서 7일 동안 자극하였다. 레트로바이러스 벡터를 유로퓸-디에틸렌트리아민펜타아세테이트(DTPA)(sigma, St. Louis, MO, USA)로 표지하였다.
7일차에, 63Eu-표지된 레트로바이러스 벡터와 이펙터 세포를(1000:1-1:1 내지 1:1.25-1:1000 범위의 이펙터/표적 비로 플레이팅한 후) 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 10시간, 15시간, 20시간, 24시간 또는 48시간 동안 96-웰 플레이트에서 인큐베이션하여 세포독성 매개 용해 검정을 수행하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 원심분리하고, 상청액 샘플을 배경 형광이 낮은 96-웰 플레이트(형광면역플레이트(fluoroimmunoplate), Nunc, Roskilde, Denmark)로 옮겼다.
이어서, 증강 용액(PerkinElmer, Groningen, The Netherlands)을 각각의 웰에 첨가하였다. 방출된 유로퓸을 시간 분해 형광측정기(Victor 1420 multilabel counter, LKB-Wallac, Finland)로 측정하였다. 형광을 1초당 카운트 수(CPS)로 표시하였다. 적절한 수(1x 102개 내지 1x 108개)의 레트로바이러스 벡터를 1% 트리톤(sigma-aldrich)과 함께 적절한 시간 동안 인큐베이션하여 표적 레트로바이러스 벡터에 의한 유로퓸의 최대 방출%를 결정하였다. 이펙터 세포 없이 표지된 표적 레트로바이러스 벡터를 인큐베이션하여 표적 레트로바이러스 벡터에 의한 유로퓸의 자발적 방출을 측정하였다. 이어서, 누출%를 다음과 같이 계산하였다: (자발적 방출/최대 방출)x100%. 세포독성 매개 용해%를 다음과 같이 계산하였다: 용해% = [(측정된 용해-자발적 용해-자발적 방출)/(최대 방출-자발적 방출)]x100%. 용해%를 상이한 이펙터 표적 비의 함수로 검토하여 데이터를 분석하였다.
일 구현예에서, NMC-HLA-G 세포에서 생성된 레트로바이러스 벡터는 NMC 또는 NMC-빈 벡터에서 생성된 레트로바이러스 벡터와 비교하여 특정 시점에서 표적세포에 의한 용해%가 감소할 것이다.
실시예 6. NK 용해 활성을 감소시키기 위한 HLA-G 또는 HLA-E를 이용한 레트로바이러스 벡터의 변형
본 실시예는 NK세포에 의한 세포독성 매개 세포 용해를 감소시키도록 변형된 세포 공급원에서 유도된 레트로바이러스 벡터 조성물의 생성을 설명한다. 일 구현예에서, NK세포에 의한 레트로바이러스 벡터의 세포독성 매개 세포 용해는 레트로바이러스 벡터의 면역원성의 척도이다.
레트로바이러스 벡터를 변형되지 않은 세포(이하 NMC, 양성 대조군), HLA-G 또는 HLA-E cDNA로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-HLA-G), 및 빈 벡터 대조군으로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-빈 벡터, 음성 대조군)로부터 생성하였다.
레트로바이러스 벡터의 NK세포 매개 용해는 문헌[Bouma, et al. Hum. Immunol. 35(2):85-92; 1992] 및 문헌[van Besouw et al. Transplantation 70(1):136-143; 2000]에 기재된 바와 같이 유로퓸 방출 검정으로 결정하였다. 문헌[Crop et al. Cell transplantation (20):1547-1559; 2011]의 방법에 따라 NK세포(이하 이펙터 세포)를 적절한 공여체에서 단리하고, 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 동종이계 감마선 조사된 PMBC 및 200IU/mL IL-2(프로류킨, Chiron BV Amsterdam, The Netherlands)로 37℃에서 7일 동안 자극하였다. 레트로바이러스 벡터를 유로퓸-디에틸렌트리아민펜타아세테이트(DTPA)(sigma, St. Louis, MO, USA)로 표지하였다. 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 세포독성 매개 용해 검정 및 데이터 분석을 수행하였다.
일 구현예에서, NMC-HLA-G 세포에서 생성된 레트로바이러스 벡터는 NMC 또는 NMC-빈 벡터에서 생성된 레트로바이러스 벡터와 비교하여 특정 시점에서 표적세포에 의한 용해%가 감소할 것이다.
실시예 7. CD8 살해 T세포 용해를 감소시키기 위한 HLA-G 또는 HLA-E를 이용한 레트로바이러스 벡터의 변형
본 실시예는 CD8+ T세포에 의한 세포독성 매개 세포 용해를 감소시키도록 변형된 세포 공급원에서 유도된 레트로바이러스 벡터 조성물의 생성을 설명한다. 일 구현예에서, CD8+ T세포에 의한 레트로바이러스 벡터의 세포독성 매개 세포 용해는 레트로바이러스 벡터의 면역원성의 척도이다.
레트로바이러스 벡터를 변형되지 않은 세포(이하 NMC, 양성 대조군), HLA-G 또는 HLA-E cDNA로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-HLA-G), 및 빈 벡터 대조군으로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-빈 벡터, 음성 대조군)로부터 생성하였다.
레트로바이러스 벡터의 CD8+ T세포 매개 용해는 문헌[Bouma, et al. Hum. Immunol. 35(2):85-92; 1992] 및 문헌[van Besouw et al. Transplantation 70(1):136-143; 2000]에 기재된 바와 같이 유로퓸 방출 검정으로 결정하였다. 문헌[Crop et al. Cell transplantation (20):1547-1559; 2011]의 방법에 따라 CD8+ T세포(이하 이펙터 세포)를 적절한 공여체에서 단리하고, 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 동종이계 감마선 조사된 PMBC 및 200IU/mL IL-2(프로류킨, Chiron BV Amsterdam, The Netherlands)로 37℃에서 7일 동안 자극하였다. 레트로바이러스 벡터를 유로퓸-디에틸렌트리아민펜타아세테이트(DTPA)(sigma, St. Louis, MO, USA)로 표지하였다. 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 세포독성 매개 용해 검정 및 데이터 분석을 수행하였다.
일 구현예에서, NMC-HLA-G 세포에서 생성된 레트로바이러스 벡터는 NMC 또는 NMC-빈 벡터에서 생성된 레트로바이러스 벡터와 비교하여 특정 시점에서 표적세포에 의한 용해%가 감소할 것이다.
실시예 8: 대식세포 포식작용을 회피하기 위한 CD47을 이용한 레트로바이러스 벡터의 변형
본 실시예는 변형된 레트로바이러스 벡터에 의한 포식작용 회피의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 변형된 레트로바이러스 벡터는 대식세포에 의한 포식작용을 회피할 것이다.
세포는 포식작용에 관여하여, 입자를 삼킴으로써, 박테리아 또는 사멸한 세포와 같은 외인성 침입자의 격리 및 파괴를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 대식세포에 의한 렌티바이러스 벡터의 포식작용은 이의 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터의 포식작용은 레트로바이러스 벡터의 면역원성의 척도이다.
레트로바이러스 벡터를 CD47이 결여된 세포(이하 NMC, 양성 대조군), CD47 cDNA로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-CD47), 및 빈 벡터 대조군으로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-빈 벡터, 음성 대조군)로부터 생성하였다. 레트로바이러스 벡터 생성 전, 세포를 CSFE로 표지하였다.
대식세포 매개 면역제거의 감소를 다음 프로토콜에 따라 포식작용 검정으로 결정하였다. 대식세포를 채취 직후 공초점 유리 바닥 접시에 플레이팅하였다. 대식세포를 DMEM+10%FBS+1%P/S에서 1시간 동안 인큐베이션하여 부착시켰다. NMC, NMC-CD47, NMC-빈 벡터에서 생성된 적절한 수의 레트로바이러스 벡터를, 프로토콜에 제시된 바와 같이 대식세포에 부가하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다(tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf).
2시간 후, 접시를 가볍게 세척하고, 세포내 형광을 조사하였다. 포식된 레트로바이러스 입자에 의해 방출된 세포내 형광을 488 여기에서 공초점 현미경법으로 이미지화하였다. 포식작용 양성 대식세포의 수를 이미지화 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 데이터를 다음과 같이 표시하였다: 포식세포지수 = (포식된 세포의 총 수/계수된 대식세포의 총 수) × (포식된 세포를 함유하는 대식세포의 수/계수된 대식세포의 총 수) × 100.
일 구현예에서, 포식세포지수는 대식세포를 NMC 또는 NMC-빈 벡터에서 유도된 레트로바이러스 벡터와 함께 인큐베이션한 경우보다, NMC-CD47에서 유도된 레트로바이러스 벡터와 함께 인큐베이션한 경우에 감소할 것이다.
실시예 9: 보체를 회피하기 위한 보체 조절 단백질을 이용한 레트로바이러스 벡터의 변형
본 실시예는 시험관내 검정을 사용한 레트로바이러스 벡터에 대한 보체 활성의 정량화를 설명한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 레트로바이러스 벡터는 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터와 비교하여 보체 활성이 감소할 것이다.
본 실시예에서, 마우스의 혈청을 레트로바이러스 벡터에 대한 보체 활성에 대해 평가하였다. 본 실시예에서는 모든 보체 경로의 중심 노드인 보체 C3a의 수준을 측정하였다. 본원에 기재된 방법은 프로토콜을 최적화하여 인간, 래트, 원숭이에게 동일하게 적용 가능하다.
본 실시예에서, 레트로바이러스 벡터를 보체 조절 단백질 DAF를 코딩하는 cDNA로 트랜스펙션된 HEK293 세포(HEK293-DAF 레트로바이러스 벡터) 또는 상보적 조절 단백질을 발현하지 않는 HEK293 세포(HEK293 레트로바이러스 벡터)로부터 생성하였다. 다른 구현예에서, 붕괴촉진인자(DAF, CD55)에 결합하는 단백질, 예를 들어 인자 H(FH) 유사 단백질-1(FHL-1), 예를 들어 C4b-결합 단백질(C4BP), 예를 들어 보체 수용체 1(CD35), 예를 들어 막 보조인자 단백질(MCP, CD46), 예를 들어 프로텍틴(CD59), 예를 들어 전형적 및 대안적 보체 경로 CD/C5 전환효소를 저해하는 단백질, 예를 들어 MAC 어셈블리를 조절하는 단백질과 같은 다른 보체 조절 단백질을 사용할 수 있다.
나이브 마우스, HEK293-DAF 레트로바이러스 벡터를 투여한 마우스 또는 HEK293 레트로바이러스 벡터를 투여한 마우스에서 혈청을 회수하였다. 마우스에서 신선한 전혈을 채취하고, 수 시간 동안 완전히 응고시켜, 혈청을 채취하였다. 혈전을 원심분리로 펠릿화하고, 혈청 상청액을 제거하였다. 음성 대조군은 열 불활성화 마우스 혈청이었다. 음성 대조군 샘플을 56℃에서 1시간 동안 가열하였다. 혈청은 분취량으로 동결시킬 수 있다.
표적세포 집단의 세포의 50%가 레트로바이러스 벡터에서 외인성 작용제를 수용하는 용량에 대해 상이한 레트로바이러스 벡터를 시험하였다. 레트로바이러스 벡터는 본원에 기재된 임의의 외인성 작용제를 함유할 수 있다. 수용세포에의 외인성 작용제의 레트로바이러스 전달을 검정하기 위한 다수의 방법이 또한 본원에 기재되어 있다. 이러한 특정 예에서, 외인성 작용제는 Cre 단백질(레트로바이러스 핵산으로 인코딩됨)이고, 표적세포는, 전달 마커로서 Cre에 의한 재조합이 GFP에서 RFP 발현으로 전환될 때, CMV 프로모터 하에서 "LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP" 카세트를 안정적으로 발현하는 RPMI8226 세포이다. 수용세포의 50%가 RFP 양성으로 확인된 용량을 추가 실험에 사용하였다. 일부 구현예에서, 수용세포의 50%가 외인성 작용제를 수용하는 것으로 확인된 용량은 레트로바이러스 벡터에 걸쳐 유사할 것이다.
표적세포의 50%가 외인성 작용제를 수용하는 레트로바이러스 벡터의 용량에서 시작하여, 레트로바이러스 벡터의 포스페이트 완충 염수(PBS, pH 7.4) 중의 2배 희석액을, 동일한 레트로바이러스 벡터로 처리한 마우스 또는 나이브 마우스의 혈청과 1:10 희석으로 혼합하고(검정 부피, 20 μl), 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 1:500로 추가로 희석하고, C3a에 대하여 특이적인 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 사용하였다. ELISA는 LifeSpan BioSciences Inc 사에서 시판되는 마우스 보체 C3a ELISA 키트 제품 LS-F4210으로, 이는 샘플에서 C3a의 농도를 측정한다. 200 pg/ml의 C3a가 존재하는 레트로바이러스 벡터의 용량을 마우스로부터 단리된 혈청에서 비교하였다.
일부 구현예에서, 200 pg/ml의 C3a가 존재하는 레트로바이러스 벡터의 용량은 HEK293 마우스 혈청과 함께 인큐베이션된 HEK293 레트로바이러스 벡터보다 HEK293 DAF 마우스 혈청과 함께 인큐베이션된 HEK293-DAF 레트로바이러스 벡터에서 더 크며, 이는 보체 활성 표적화 레트로바이러스 벡터가 HEK293-DAF 레트로바이러스 벡터보다 HEK293 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스에 더 많다는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 200 pg/ml의 C3a가 존재하는 레트로바이러스 벡터의 용량은 나이브 마우스 혈청과 함께 인큐베이션된 HEK293 레트로바이러스 벡터보다 나이브 마우스 혈청과 함께 인큐베이션된 HEK293-DAF 레트로바이러스 벡터에서 더 크며, 이는 보체 활성 표적화 레트로바이러스 벡터가 HEK293-DAF 레트로바이러스 벡터보다 HEK293 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스에 더 많다는 것을 나타낸다.
실시예 10: 면역원성을 감소시키기 위한 레트로바이러스 벡터의 녹다운 면역원성 단백질로의 변형
본 실시예는 면역원성인 분자의 발현을 감소시키도록 변형된 세포 공급원에서 유도된 레트로바이러스 벡터 조성물의 생성, 및 감소된 발현의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 면역원성인 분자의 발현을 감소시키도록 변형된 세포 공급원에서 유도될 수 있다.
면역반응을 자극하는 요법은 치료 효능을 감소시키거나 수용체에게 독성을 야기할 수 있다. 따라서, 면역원성은 안전하고 효과적인 치료용 레트로바이러스 벡터를 위한 중요한 특성이다. 특정 면역 활성화제의 발현은 면역반응을 일으킬 수 있다. MHC 클래스 I은 면역 활성화제의 한 예이다.
레트로바이러스 벡터를 정상적으로 MHC-1을 발현하는 변형되지 않은 세포(이하 NMC, 양성 대조군), shRNA 표적화 MHC 클래스 I을 코딩하는 DNA로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC- shMHC 클래스 I), 및 비표적 스크램블된 shRNA 벡터 대조군을 코딩하는 DNA로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC 벡터 대조군, 음성 대조군)로부터 생성하였다. 레트로바이러스 생성 전, 세포를 CSFE로 표지하였다.
레트로바이러스 벡터를 유세포분석을 사용하여 MHC 클래스 I의 발현에 대해 검정하였다. 적절한 수의 레트로바이러스 벡터를 PBS로 세척하고 PBS 중에 재현탁시킨 후, MHC 클래스 I에 대하여 형광 접합된 단클론 항체(Harlan Sera-Lab, Belton, UK)와 1:10 내지 1:4000 희석으로 30분 동안 얼음 위에서 유지시켰다. 레트로바이러스 벡터를 PBS로 3회 세척하고 PBS 중에 재현탁시켰다. 동등한 희석으로 적절한 형광 접합된 아이소타입 대조군 항체와 함께 인큐베이션된 레트로바이러스 벡터 제제의 동일한 분취액을 사용하여 비특이적 형광을 결정하였다. 레트로바이러스 벡터를 유세포분석기(FACSort, Becton-Dickinson)에서 검정하고, 데이터를 유속 분석 소프트웨어(Becton-Dickinson)로 분석하였다.
NMC, NMC-shMHC 클래스 I 및 NMC 벡터 대조군에서 유도된 레트로바이러스 벡터의 평균 형광 데이터를 비교하였다. 일 구현예에서, NMC-shMHC 클래스 I에서 유도된 레트로바이러스 벡터는 NMC 및 NMC 벡터 대조군과 비교하여 더 낮은 MHC 클래스 I의 발현을 나타낼 것이다.
실시예 11: 레트로바이러스 벡터의 기존 혈청 불활성화 측정
본 실시예는 시험관내 전달 검정을 사용한 레트로바이러스 벡터의 기존 혈청 불활성화의 정량화를 설명한다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터에 대한 면역원성의 척도는 혈청 불활성화이다. 레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화는 항체 매개 중화 또는 보체 매개 분해로 인한 것일 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 레트로바이러스 벡터의 수용체 중 일부는 이의 혈청에 레트로바이러스 벡터에 결합하여 이를 불활성화시키는 인자를 가지고 있을 것이다.
본 실시예에서, 레트로바이러스 벡터 나이브 마우스를 혈청에서 레트로바이러스 벡터를 불활성화시키는 인자의 존재에 대해 평가하였다. 특히, 본원에 기재된 방법은 프로토콜을 최적화하여 인간, 래트, 원숭이에게 동일하게 적용 가능하다.
음성 대조군은 열 불활성화 마우스 혈청이고, 양성 대조군은 이종 원천세포에서 생성된 레트로바이러스 벡터가 여러 번 주사된 마우스에서 유도된 혈청이다. 마우스에서 신선한 전혈을 채취하고, 수 시간 동안 완전히 응고시켜, 혈청을 채취하였다. 혈전을 원심분리로 펠릿화하고, 혈청 상청액을 제거하였다. 음성 대조군 샘플을 56℃에서 1시간 동안 가열하였다. 혈청은 분취량으로 동결시킬 수 있다.
상기 실시예 9에 기재된 바와 같이, 표적세포 집단에서 세포의 50%가 레트로바이러스 벡터에서 외인성 작용제를 수용하는 용량에 대해 레트로바이러스 벡터를 시험하였다.
레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화를 평가하기 위해, 레트로바이러스 벡터를 정상 또는 열 불활성화된 혈청(또는 무혈청 대조군과 같이 10% 열 불활성화된 FBS가 함유된 배지)으로 1:5로 희석하고, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 추가의 1:5 희석을 위해 반응액에 배지를 첨가한 후, 1:10 비로 2회 연속 희석하였다. 이러한 단계 후, 레트로바이러스 벡터는 수용세포의 50%가 외인성 작용제를 수용한(예를 들어, RFP 양성인) 이전에 확인된 용량으로 존재해야 한다.
이어서, 혈청에 노출된 레트로바이러스 벡터를 표적세포와 함께 인큐베이션하였다. 외인성 작용제를 수용해서 RFP 양성인 세포의 %를 계산하였다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %는 레트로바이러스 벡터 나이브 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 레트로바이러스 벡터 샘플과, 상기 마우스로부터의 열 불활성화된 혈청과 함께 인큐베이션된 레트로바이러스 벡터 샘플 사이에서 상이하지 않을 것이며, 이는 레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화가 존재하지 않음을 나타낸다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %는 레트로바이러스 벡터 나이브 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 레트로바이러스 벡터 샘플과 무혈청 대조군 인큐베이션의 벡터 샘플 사이에서 상이하지 않을 것이며, 이는 레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화가 존재하지 않음을 나타낸다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %는 레트로바이러스 벡터 나이브 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 레트로바이러스 벡터 샘플보다 양성 대조군 혈청과 함께 인큐베이션된 레트로바이러스 벡터 샘플에서 더 낮을 것이며, 이는 레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화가 존재하지 않음을 나타낸다.
실시예 12: 다회투여 후 레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화 측정
본 실시예는 레트로바이러스 벡터의 다회투여 후 시험관내 전달 검정을 사용한 레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 변형된, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 변형된 레트로바이러스 벡터는, 변형된 레트로바이러스 벡터의 다회(예를 들어, 1회 초과, 예를 들어 2회 이상) 투여 후 감소된(예를 들어, 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터의 투여와 비교하여 감소된) 혈청 불활성화를 나타낼 것이다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 레트로바이러스 벡터는 다회투여 후 혈청에 의해 불활성화되지 않을 것이다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터에 대한 면역원성의 척도는 혈청 불활성화이다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터의 반복된 주사는 항-레트로바이러스 벡터 항체, 예를 들어 레트로바이러스 벡터를 인식하는 항체의 발달을 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터를 인식하는 항체는 레트로바이러스 벡터 활성 또는 수명을 제한하고, 보체 분해를 매개할 수 있는 방식으로 결합할 수 있다.
본 실시예에서, 레트로바이러스 벡터의 1회 이상의 투여 후 혈청 불활성화를 조사하였다. 레트로바이러스 벡터는 이전 실시예 중 어느 하나에 따라 생성하였다. 본 실시예에서, 레트로바이러스를 HLA-G 또는 HLA-E cDNA로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-HLA-G) 및 빈 벡터 대조군으로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-빈 벡터, 음성 대조군)로부터 생성하였다. 일부 구현예에서, 다른 면역조절 단백질을 발현하는 세포에서 레트로바이러스 벡터를 유도하였다.
혈청을 다음과 같은 상이한 코호트에서 추출하였다: 비히클(레트로바이러스 벡터 나이브 군), HEK293-HLA-G 레트로바이러스 벡터 또는 HEK293 레트로바이러스 벡터를 1회, 2회, 3회, 5회 또는 10회 전신 및/또는 국소 주사한 마우스. 마우스에서 신선한 전혈을 채취하고, 수 시간 동안 완전히 응고시켜, 혈청을 채취하였다. 혈전을 원심분리로 펠릿화하고, 혈청 상청액을 제거하였다. 음성 대조군은 열 불활성화 마우스 혈청이었다. 음성 대조군 샘플을 56℃에서 1시간 동안 가열하였다. 혈청은 분취량으로 동결시킬 수 있다.
상기 실시예 9에 기재된 바와 같이, 표적세포 집단에서 세포의 50%가 레트로바이러스 벡터에서 외인성 작용제를 수용하는 용량에 대해 레트로바이러스 벡터를 시험하였다.
레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화를 평가하기 위해, 레트로바이러스 벡터를 상기 실시예 11에 기재된 바와 같이 혈청에 노출시키고 표적세포와 함께 인큐베이션하였다.
외인성 작용제를 수용해서 RFP 양성인 세포의 %를 계산하였다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %는 HEK293-HLA-G 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 레트로바이러스 벡터 샘플과, 상기 마우스로부터의 열 불활성화된 혈청과 함께 인큐베이션된 레트로바이러스 벡터 샘플 사이에서 상이하지 않을 것이며, 이는 레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화 또는 후천성 면역 반응이 존재하지 않음을 나타낸다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %는 HEK293-HLA-G 레트로바이러스 벡터로 1회, 2회, 3회, 5회 또는 10회 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 레트로바이러스 벡터 샘플 사이에서 상이하지 않을 것이며, 이는 레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화 또는 후천성 면역 반응이 존재하지 않음을 나타낸다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %는 비히클로 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 레트로바이러스 벡터 샘플과 HEK293-HLA-G 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 레트로바이러스 벡터 샘플 사이에서 상이하지 않을 것이며, 이는 레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화 또는 후천성 면역 반응이 존재하지 않음을 나타낸다. 일부 구현예에서, 외인성 작용제를 수용하는 세포의 %는 HEK293-HLA-G 레트로바이러스 벡터보다 HEK293에서 유도된 레트로바이러스 벡터의 경우 더 낮을 것이며, 이는 HEK293-HLA-G 레트로바이러스 벡터의 혈청 불활성화 또는 후천성 면역 반응이 존재하지 않음을 나타낸다.
실시예 13: 레트로바이러스 벡터에 대하여 반응성인 기존 IgG 및 IgM 항체 측정
본 실시예는 유세포분석을 사용하여 측정된 기존 항-레트로바이러스 벡터 항체 역가의 정량화를 설명한다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터에 대한 면역원성의 척도는 항체반응이다. 레트로바이러스 벡터를 인식하는 항체는 레트로바이러스 벡터 활성 또는 수명을 제한할 수 있는 방식으로 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 레트로바이러스 벡터 수용체 중 일부는 레트로바이러스 벡터에 결합하여 이를 인식하는 기존 항체를 가지고 있을 것이다.
본 실시예에서, 이종 원천세포를 사용하여 생성된 레트로바이러스 벡터를 사용하여 항-레트로바이러스 벡터 항체 역가를 시험하였다. 본 실시예에서, 레트로바이러스 벡터 나이브 마우스를 항-레트로바이러스 벡터 항체의 존재에 대해 평가하였다. 특히, 본원에 기재된 방법은 프로토콜을 최적화하여 인간, 래트, 원숭이에게 동일하게 적용 가능하다.
음성 대조군은 IgM 및 IgG가 고갈된 마우스 혈청이고, 양성 대조군은 이종 원천세포에서 생성된 레트로바이러스 벡터가 여러 번 주사된 마우스에서 유도된 혈청이다.
레트로바이러스 벡터에 결합하는 기존 항체의 존재를 평가하기 위해, 레트로바이러스 벡터 나이브 마우스의 혈청을 먼저 56℃로 30분 동안 가열하여 탈보체화한 후, 3% FCS 및 0.1% NaN3가 함유된 PBS 중에 33%로 희석하였다. 동일한 양의 혈청 및 레트로바이러스 벡터(1 mL당 1x102개 내지 1x108개의 레트로바이러스 벡터) 현탁액을 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 소 혈청 쿠션을 통해 PBS로 세척하였다.
레트로바이러스 벡터를 마우스 IgM(BD Bioscience)의 Fc 부분에 특이적인 PE-접합된 염소 항체와 함께 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하여, IgM 이종반응성 항체를 염색하였다. 특히, 항-마우스 IgG1 또는 IgG2 2차 항체를 또한 사용할 수 있다. 모든 군으로부터의 레트로바이러스 벡터를 2% FCS가 함유된 PBS로 2회 세척한 후, FACS 시스템(BD Biosciences)에서 분석하였다. 형광 데이터를 로그 증폭을 사용하여 수집하고, 평균 형광 강도로 표시하였다.
일 구현예에서, 음성 대조군 혈청은 무혈청 또는 2차 단독 대조군에 비교하여 무시할 만한 형광을 나타낼 것이다. 일 구현예에서, 양성 대조군은 음성 대조군, 및 무혈청 또는 2차 단독 대조군에 비해 더 큰 형광을 나타낼 것이다. 일 구현예에서, 면역원성이 발생하는 경우, 레트로바이러스 벡터 나이브 마우스로부터의 혈청은 음성 대조군보다 큰 형광을 나타낼 것이다. 일 구현예에서, 면역원성이 발생하지 않은 경우, 레트로바이러스 벡터 나이브 마우스로부터의 혈청은 음성 대조군과 비교하여 유사한 형광을 나타낼 것이다.
실시예 14: 레트로바이러스 벡터의 다회투여 후 IgG 및 IgM 항체반응의 측정
본 실시예는 변형된 레트로바이러스 벡터의 다회투여 후 변형된 레트로바이러스 벡터의 체액성 반응의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 변형된, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 변형된 레트로바이러스 벡터는, 변형된 레트로바이러스 벡터의 다회(예를 들어, 1회 초과, 예를 들어 2회 이상) 투여 후 감소된(예를 들어, 변형되지 않은 레트로바이러스 벡터의 투여와 비교하여 감소된) 체액성 반응을 나타낼 것이다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터에 대한 면역원성의 척도는 항체반응이다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터의 반복된 주사는 항-레트로바이러스 벡터 항체, 예를 들어 레트로바이러스 벡터를 인식하는 항체의 발달을 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터를 인식하는 항체는 레트로바이러스 벡터 활성 또는 수명을 제한할 수 있는 방식으로 결합할 수 있다.
본 실시예에서, 레트로바이러스 벡터의 1회 이상의 투여 후 항-레트로바이러스 벡터 항체 역가를 조사하였다. 레트로바이러스 벡터는 이전 실시예 중 어느 하나에 따라 생성하였다. 본 실시예에서, 레트로바이러스를 면역조절 단백질로 트랜스펙션되지 않은 세포(NMC), HLA-G 또는 HLA-E cDNA로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-HLA-G), 및 빈 벡터 대조군으로 트랜스펙션된 세포(이하 NMC-빈 벡터, 음성 대조군)로부터 생성하였다. 일부 구현예에서, 다른 면역조절 단백질을 발현하는 세포에서 레트로바이러스 벡터를 유도하였다.
혈청을 다음과 같은 상이한 코호트에서 추출하였다: 비히클(레트로바이러스 벡터 나이브 군), NMC 레트로바이러스 벡터, NMC-HLA-G 레트로바이러스 벡터 또는 NMC-빈 벡터 레트로바이러스 벡터를 1회, 2회, 3회, 5회, 10회 전신 및/또는 국소 주사한 마우스.
항-레트로바이러스 벡터 항체의 존재 및 풍부함을 평가하기 위해, 마우스의 혈청을 먼저 56℃로 30분 동안 가열하여 탈보체화한 후, 3% FCS 및 0.1% NaN3가 함유된 PBS 중에 33%로 희석하였다. 동일한 양의 혈청 및 레트로바이러스 벡터(1 mL당 1x102개 내지 1x108개의 레트로바이러스 벡터)를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 소 혈청 쿠션을 통해 PBS로 세척하였다.
레트로바이러스 벡터를 마우스 IgM(BD Bioscience)의 Fc 부분에 특이적인 PE-접합된 염소 항체와 함께 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하여, 레트로바이러스 벡터 반응성 IgM 항체를 염색하였다. 특히, 항-마우스 IgG1 또는 IgG2 2차 항체를 또한 사용할 수 있다. 모든 군으로부터의 레트로바이러스 벡터를 2% FCS가 함유된 PBS로 2회 세척한 후, FACS 시스템(BD Biosciences)에서 분석하였다. 형광 데이터를 로그 증폭을 사용하여 수집하고, 평균 형광 강도로 표시하였다.
일 구현예에서, NMC-HLA-G 레트로바이러스 벡터는 NMC 레트로바이러스 벡터 또는 NMC-빈 레트로바이러스 벡터와 비교하여, 주사 후 항-바이러스 IgM(또는 IgG1/2) 항체 역가(FACS에서 형광 강도로 측정 시)가 감소할 것이다.
실시예 15: 레트로바이러스 벡터 수용세포에 대한 IgG 및 IgM 항체반응의 역가 측정
본 실시예는 유세포분석을 사용한 수용세포(레트로바이러스 벡터와 융합된 세포)에 대한 항체 역가의 정량화를 설명한다. 일부 구현예에서, 수용세포의 면역원성의 척도는 항체반응이다. 수용세포를 인식하는 항체는 세포 활성 또는 수명을 제한할 수 있는 방식으로 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 수용세포는 항체반응에 의해 표적화되지 않거나, 항체반응이 참조 수준 미만일 것이다.
본 실시예에서, 대상(예를 들어, 인간, 래트 또는 원숭이)에서 항-수용세포 항체 역가를 시험하였다. 또한, 프로토콜은 적합한 표면 마커가 존재하는 임의의 세포 유형에 따라 조정될 수 있다. 본 실시예에서, 표적 수용세포는 CD3+ 세포이다.
마우스를 본 출원에 기재된 임의의 방법을 통해 생성된 레트로바이러스 벡터 또는 PBS(음성 대조군)로 5일 동안 매일 처리하였다. 최종 처리 28일 후, 레트로바이러스 벡터를 받은 마우스와 PBS 처리를 받은 마우스에서 말초혈액을 채취하였다. 5 μM EDTA가 함유된 1 ml PBS에 혈액을 채취하고, 응고를 방지하기 위해 즉시 혼합하였다. 튜브를 얼음에 보관하고, 염화암모늄(ACK) 완충 용액을 사용하여 적혈구를 제거하였다. 세포를 소 혈청 알부민으로 10분 동안 차단한 후, 쥣과 CD3-FITC 항체(Thermo Fisher 카탈로그 번호:11-0032-82)로 암실에서 4℃에서 30분 동안 염색하였다. PBS로 2회 세척한 후, 세포를 FACSDiva™ 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA)를 실행하여 488 nm 레이저 여기 및 530+/-30 nm에서 수집된 방출을 이용하여 LSR II(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 분석하였다. CD3+ 세포를 분류하였다.
이어서, 분류된 CD3+ 세포를 마우스 IgM(BD Bioscience)의 Fc 부분에 특이적인 PE-접합된 염소 항체와의 반응 혼합물로 4℃에서 45분 동안 인큐베이션하여, IgM 항체로 염색하였다. 특히, 항-마우스 IgG1 또는 IgG2 2차 항체를 또한 사용할 수 있다. 모든 군으로부터의 세포를 2% FCS가 함유된 PBS로 2회 세척한 후, FACS 시스템(BD Biosciences)에서 분석하였다. 형광 데이터를 로그 증폭을 사용하여 수집하고, 평균 형광 강도로 표시하였다. 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스 및 PBS로 처리된 마우스로부터 분류된 CD3 세포에 대하여 평균 형광 강도를 계산하였다.
낮은 평균 형광 강도는 수용세포에 대한 체액성 반응이 낮음을 나타낸다. PBS로 처리된 마우스는 평균 형광 강도가 낮을 것으로 예상된다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스와 PBS로 처리된 마우스로부터의 수용세포에 대한 평균 형광 강도는 유사할 것이다.
실시예 16: 레트로바이러스 벡터 수용세포에 대한 포식작용 반응의 측정
본 실시예는 포식작용 검정을 이용한 수용세포에 대한 대식세포 반응의 정량화를 설명한다.
일부 구현예에서, 수용세포의 면역원성의 척도는 대식세포 반응이다. 대식세포는 포식작용에 관여하여, 세포를 삼킴으로써, 박테리아 또는 사멸한 세포와 같은 외인성 침입자의 격리 및 파괴를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 대식세포에 의한 수용세포의 포식작용은 이의 활성을 감소시킬 수 있다.
일 구현예에서, 수용세포는 대식세포에 의해 표적화되지 않는다. 본 실시예에서, 대상에서 수용세포에 대한 대식세포 반응을 시험하였다. 또한, 프로토콜은 적합한 표면 마커가 존재하는 임의의 세포 유형에 따라 조정될 수 있다. 본 실시예에서, 표적 수용세포는 CD3+ 세포이다.
마우스를 본 출원에 기재된 임의의 방법을 통해 생성된 레트로바이러스 벡터 또는 PBS(음성 대조군)로 5일 동안 매일 처리하였다. 최종 처리 28일 후, 레트로바이러스 벡터를 받은 마우스와 PBS 처리를 받은 마우스에서 말초혈액을 채취하였다. 5 μM EDTA가 함유된 1 ml PBS에 혈액을 채취하고, 응고를 방지하기 위해 즉시 혼합하였다. 튜브를 얼음에 보관하고, 염화암모늄(ACK) 완충 용액을 사용하여 적혈구를 제거하였다.
세포를 소 혈청 알부민으로 10분 동안 차단한 후, 쥣과 CD3-FITC 항체(Thermo Fisher 카탈로그 번호:11-0032-82)로 암실에서 4℃에서 30분 동안 염색하였다. PBS로 2회 세척한 후, 세포를 FACSDiva™ 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA)를 실행하여 488 nm 레이저 여기 및 530+/-30 nm에서 수집된 방출을 이용하여 LSR II(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 분석하였다. 이어서, CD3+ 세포를 분류하였다.
대식세포 매개 면역제거를 평가하기 위해 다음 프로토콜에 따라 포식작용 검정을 실행하였다. 대식세포를 채취 직후 공초점 유리 바닥 접시에 플레이팅하였다. 대식세포를 DMEM+10%FBS+1%P/S에서 1시간 동안 인큐베이션하여 부착시켰다. 레트로바이러스 벡터 및 PBS를 받은 마우스에서 유도된, 적절한 수의 분류되고 FITC-염색된 CD3+ 세포를 프로토콜에 표시된 바와 같이 대식세포에 부가하고, 예를 들어 Vybrant™ Phagocytosis Assay Kit 제품 정보 설명서(Molecular Probes, 2001년 3월 18일 개정, tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf)에 기재된 바와 같이 2시간 동안 인큐베이션하였다.
2시간 후, 접시를 가볍게 세척하고, 세포내 형광을 조사하였다. 대식세포를 식별하기 위해서, 대식세포에서 풍부하게 발현되는 Fc 수용체에의 표지된 mAb의 결합을 차단하기 위해, 세포를 먼저 Fc-수용체 차단 항체(eBioscence 카탈로그 번호 14-0161-86, 클론 93)와 함께 15분 동안 인큐베이션하였다. 이러한 단계 후, 대식세포 표면 항원을 염색하기 위해, 항-F4/80-PE(ThermoFisher 카탈로그 번호 12-4801-82, 클론 BM8) 및 항-CD11b-PerCP-Cy5.5(BD Biosciences 카탈로그 번호 550993, 클론 M1/70) 접합된 항체를 부가하였다. 세포를 암실에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 원심분리하고 PBS로 세척하였다. 이어서, 세포를 PBS 중에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플의 유세포분석을 수행하고, 각각, 533 nm 및 647 nm 레이저 여기를 사용하여 F4/80-PE 및 CD11b-PerCP-Cy5.5에 대한 양성 형광 신호를 통해 대식세포를 식별하였다. 대식세포에 대한 게이팅 후, 포식된 수용세포에 의해 방출되는 세포내 형광을 488 nm 레이저 여기로 평가하였다. 포식작용 양성 대식세포의 수를 이미지화 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 데이터를 다음과 같이 표시하였다: 포식세포지수 = (포식된 세포의 총 수/계수된 대식세포의 총 수) × (포식된 세포를 함유하는 대식세포의 수/계수된 대식세포의 총 수) × 100.
낮은 포식세포지수는 대식세포에 의한 포식작용 및 표적화가 낮음을 나타낸다. PBS로 처리된 마우스는 포식세포지수가 낮을 것으로 예상된다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스와 PBS로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포에 대한 포식세포지수는 유사할 것이다.
실시예 17: 레트로바이러스 벡터 수용세포에 대한 PBMC 반응 측정
본 실시예는 세포 용해 검정을 이용한 수용세포에 대한 PBMC 반응의 정량화를 설명한다.
일부 구현예에서, 수용세포의 면역원성의 척도는 PBMC 반응이다. 일 구현예에서, PBMC에 의한 수용세포의 세포독성 매개 세포 용해는, 용해가 레트로바이러스 벡터의 활성을 감소, 예를 들어 저해하거나 중단시키기 때문에, 면역원성의 척도이다.
일 구현예에서, 수용세포는 PBMC 반응을 유도하지 않는다. 본 실시예에서, 대상에서 수용세포에 대한 PBMC 반응을 시험하였다.
또한, 프로토콜은 적합한 표면 마커가 존재하는 임의의 세포 유형에 따라 조정될 수 있다. 본 실시예에서, 표적 수용세포는 CD3+ 세포이다.
마우스를 본 출원에 기재된 임의의 방법을 통해 생성된 레트로바이러스 벡터 또는 PBS(음성 대조군)로 5일 동안 매일 처리하였다. 최종 처리 28일 후, 레트로바이러스 벡터를 받은 마우스와 PBS 처리를 받은 마우스에서 말초혈액을 채취하였다. 5 μM EDTA가 함유된 1 ml PBS에 혈액을 채취하고, 응고를 방지하기 위해 즉시 혼합하였다. 튜브를 얼음에 보관하고, 염화암모늄(ACK) 완충 용액을 사용하여 적혈구를 제거하였다. 세포를 세포 염색 완충액(Biolegend 카탈로그 번호: 420201) 중에서 10분 동안 Fc 차단한 후(Biolegend 카탈로그 번호: 101319), 쥣과 CD3:APC-Cy7 항체(Biolegend 카탈로그 번호: 100330) 또는 아이소타입 대조군인 APC-Cy7(IC:APC-Cy7) 항체(Biolegend 카탈로그 번호: 400230)로 암실에서 4℃에서 30분 동안 염색하였다. PBS로 2회 세척한 후, 아이소타입 대조군인 APC-Cy7 항체 표지된 세포를 사용하여 음성 게이트를 설정하기 위해, 세포를 FACSDiva™ 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA)를 실행하여 640 nm 레이저 여기 및 780 -/+ 60 nm에서 수집된 방출을 이용하여 FACS Aria(BD Biosciences, San Jose, CA.)에서 분석한 후, APC-Cy7 양성 세포를 분류하고 수집하였다. 이어서, 분류된 CD3+ 세포를 CellMask™ 녹색 원형질막 염료(CMG, ThermoFisher 카탈로그 번호: C37608) 또는 음성 대조군으로서 DMSO로 표지하였다.
레트로바이러스 벡터 또는 PBS로 처리된 마우스에서 CD3+ 세포의 단리 7일 전, 문헌[Crop et al. Cell transplantation (20):1547-1559; 2011]의 방법에 따라 PBMC를 레트로바이러스 벡터 또는 PBS로 처리된 마우스에서 단리하고, IL-2 재조합 마우스 단백질(R&D Systems 카탈로그 번호: 402-ML-020) 및 CD3/CD28 비드(ThermoFisher 카탈로그 번호: 11456D)의 존재 하에서 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 37℃에서 7일 동안 자극하였다. 7일차에, 자극된 PBMC를 CD3+/CMG+ 또는 CD3+/DMSO 대조군 세포와, 1000:1-1:1 내지 1:1.25-1:1000 범위의 PBMC:CD3+/CMG+ 또는 PBMC: CD3+/DMSO 대조군 세포의 비로 플레이팅하여, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 10시간, 15시간, 20시간, 24시간, 48시간 동안 함께 인큐베이션하였다. 음성 대조군으로서, 한 세트의 웰을 CD3+/CMG+ 및 CD3+/DMSO 대조군 세포만(PBMC 없음) 수용하게 하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 원심분리하고 처리하여, 상기와 같이 쥣과 CD3:APC-Cy7 항체 또는 IC:APC-Cy7 항체로 표지하였다. PBS로 2회 세척한 후, 세포를 PBS 중에 재현탁시키고, FACSDiva™ 소프트웨어(BD Biosciences, San Jose, CA)를 실행하여 FACS Aria(APC-Cy7: 640 nm 레이저 여기/780 -/+ 60 nm에서 수집된 방출, 및 CMG: 561 nm 레이저 여기/585 -/+ 16 nm에서 수집된 방출)에서 분석하였다. 이어서, FSC/SSC 사건 데이터를 초기에 "세포"로 표지된 사건에 대한 게이트를 설정하는 데 사용하였다. 이어서, 이러한 "세포" 게이트를 IC:APC-Cy7/DMSO로만 표지된 640 nm 및 561 nm 레이저 분석 샘플에 대한 PMT 전압을 설정하는 사건을 표시하는 데 사용하였다. 이러한 샘플은 또한 APC-Cy7 및 CMG 둘 모두에 대한 음성 세포의 게이트를 설정하는 데 사용할 수 있다. 이어서, 어떠한 PBMC도 수용하지 않은 CD3+/CMG+ 세포를 CD3+ 및 CMG+ 세포에 대한 양성 게이트를 설정하는 데 사용할 수 있다.
전체 세포 집단에서 CD3+/CMG+ 세포의 %를 검토하여 데이터를 분석하였다. 처리군을 비교할 때, PBMC:CD3+/CMG+ 세포의 임의의 주어진 검정 비에서 CD3+/CMG+ 세포의 상대적으로 낮은 %는 수용세포 용해를 나타낸다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스와 PBS로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포에 대한 CD3+/CMG+의 %는 유사할 것이다.
실시예 18: 레트로바이러스 벡터 수용세포에 대한 NK세포 반응의 측정
본 실시예는 세포 용해 검정을 이용한 수용세포에 대한 자연살해세포 반응의 정량화를 설명한다.
일부 구현예에서, 수용세포의 면역원성의 척도는 자연살해세포 반응이다. 일 구현예에서, 자연살해세포에 의한 수용세포의 세포독성 매개 세포 용해는, 용해가 레트로바이러스 벡터의 활성을 감소, 예를 들어 저해하거나 중단시키기 때문에, 면역원성의 척도이다.
일 구현예에서, 수용세포는 자연살해세포 반응을 유도하지 않는다. 본 실시예에서, 대상에서 수용세포에 대한 자연살해세포 반응을 시험하였다. 또한, 프로토콜은 적합한 표면 마커가 존재하는 임의의 세포 유형에 따라 조정될 수 있다. 본 실시예에서, 표적 수용세포는 CD3+ 세포이다.
마우스를 레트로바이러스 벡터로 처리하고, 혈액 샘플을 채취하고, CD3+ 세포를 상기 실시예 17에 기재된 바와 같이 분류하였다. NK세포를 단리하고, CD3+ 세포와 함께 배양하고, 실시예 17에 사용된 PBMC 세포 대신 NK세포를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 17에 기재된 프로토콜에 따라 FACS로 분석하였다.
전체 세포 집단에서 CD3+/CMG+ 세포의 %를 검토하여 데이터를 분석하였다. 처리군을 비교할 때, NK세포:CD3+/CMG+ 세포의 임의의 주어진 검정 비에서 CD3+/CMG+ 세포의 상대적으로 낮은 %는 수용세포 용해를 나타낸다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스와 PBS로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포에 대한 CD3+/CMG+의 %는 유사할 것이다.
실시예 19: 레트로바이러스 벡터 수용세포에 대한 CD8 T세포 반응의 측정
본 실시예는 세포 용해 검정을 이용한 수용세포(레트로바이러스 벡터와 융합된 세포)에 대한 CD8+ T세포 반응의 정량화를 설명한다.
일부 구현예에서, 수용세포의 면역원성의 척도는 CD8+ T세포 반응이다. 일 구현예에서, CD8+ T세포에 의한 수용세포의 세포독성 매개 세포 용해는, 용해가 레트로바이러스 벡터의 활성을 감소, 예를 들어 저해하거나 중단시키기 때문에, 면역원성의 척도이다.
일 구현예에서, 수용세포는 CD8+ T세포 반응을 유도하지 않는다. 본 실시예에서, 대상에서 수용세포에 대한 CD8+ T세포 반응을 시험하였다. 또한, 프로토콜은 적합한 표면 마커가 존재하는 임의의 세포 유형에 따라 조정될 수 있다. 본 실시예에서, 표적 수용세포는 CD3+ 세포이다.
마우스를 레트로바이러스 벡터로 처리하고, 혈액 샘플을 채취하고, CD3+ 세포를 상기 실시예 17에 기재된 바와 같이 분류하였다. CD8+ T세포를 단리하고, CD3+ 세포와 함께 배양하고, 실시예 17에 사용된 PBMC 세포 대신 CD8+ T세포를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 17에 기재된 프로토콜에 따라 FACS로 분석하였다.
전체 세포 집단에서 CD3+/CMG+ 세포의 %를 검토하여 데이터를 분석하였다. 처리군을 비교할 때, CD8+ 세포:CD3+/CMG+ 세포의 임의의 주어진 검정 비에서 CD3+/CMG+ 세포의 상대적으로 낮은 %는 수용세포 용해를 나타낸다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스와 PBS로 처리된 마우스에서 유도된 수용세포에 대한 CD3+/CMG+의 %는 유사할 것이다.
실시예 20: CNS세포 특이적 프로모터 활성 측정
본 실시예는 비표적세포와 비교하여 CNS세포에서 CNS세포 특이적 프로모터(양성 TCSRE)의 활성 측정을 설명한다.
두 가지 세포 유형을 별도로 배양하고, 본원에 기재된 바와 같이 생성된 레트로바이러스 벡터로 처리하였다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G로 위형화된 것으로, CNS세포 특이적 프로모터, 예를 들어 표 3의 CNS세포 특이적 프로모터의 제어 하에서 tdTomato 형광 단백질 리포터를 코딩한다.
형질도입 2일 후, 세포 내 유전자 발현을 유세포분석을 통해 측정하고, 세포 내 평균 벡터 카피 수를 정량적 PCR로 측정하였다. 세포 집단에서 세포당 tdTomato 유전자 발현의 중앙값을 집단 벡터 카피 수로 정규화하였다.
일부 구현예에서, CNS세포 집단은 tdTomato 발현 대 벡터 카피 수를 비표적세포 집단보다 더 큰 비로 가질 것이다. 이는, CNS세포 특이적 프로모터가 CNS세포에서 더 활성임을 보여준다.
실시예 21: 제한 마이크로RNA로부터의 발현 변화 측정
본 실시예는 비표적세포와 비교하여 CNS세포에서 비표적세포 제한 마이크로RNA(NTCSRE)의 활성 측정을 설명한다.
두 가지 세포 유형을 별도로 배양하고, 본원에 기재된 바와 같이 생성된 레트로바이러스 벡터로 처리하였다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G로 위형화된 것으로, 편재 활성 프로모터와 비표적세포 제한 마이크로RNA, 예를 들어 표 4의 마이크로RNA의 제어 하에서 tdTomato 형광 단백질 리포터를 코딩한다.
형질도입 2일 후, 세포 내 유전자 발현을 유세포분석을 통해 측정하고, 세포 내 평균 벡터 카피 수를 정량적 PCR로 측정하였다. 세포 집단에서 세포당 tdTomato 유전자 발현의 중앙값을 집단 벡터 카피 수로 정규화하였다.
일부 구현예에서, CNS세포 집단은 tdTomato 발현 대 벡터 카피 수를 비표적세포 집단보다 더 큰 비로 가질 것이다. 이는, 비표적세포 제한 마이크로RNA가 비표적세포에서 발현을 감소시킴을 보여준다.
실시예 22: 시험관내 VSV-G 위형을 이용한 프리드리히 운동실조증의 치료
본 실시예는, 시험관내 세포로의 치료용 전이유전자의 전달을 설명한다. 본 실시예에서, 치료용 전이유전자는 프라탁신(frataxin, fxn)이다.
뉴런을 YG8R 마우스의 뇌에서 배양하고, 본원에 기재된 바와 같이 생성된 레트로바이러스 벡터 또는 PBS(음성 대조군)로 형질도입하였다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G로 위형화된 것으로, 뉴런 특이적 프로모터(양성 TCSRE)와 미세아교세포 제한 마이크로RNA 서열(NTCSRE)의 제어 하에서 fxn 유전자를 운반한다.
Fxn 발현을 위한 충분한 시간 후, 이미지화를 위해 세포를 준비하였다. 세포를 고정시키고, 투과성으로 만들고, 차단하고, 항-Fxn 항체(예를 들어, abcam 카탈로그 번호 ab175402)로 면역염색하였다. 면역염색 후, 세포를 Alexa Fluor 488(예를 들어, abcam 카탈로그 번호 ab150077)에 접합된 2차 항체로 대조염색하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 유지시키면서, 63x 오일 침지 대물렌즈를 이용하여 Zeiss LSM 710 공초점 현미경 상에서 이미지화하였다. Alexa Fluor를 488 nm 레이저 여기 및 510±15 nm에서 포획된 방출에 적용하였다. 세포당 Alexa Flour 평균 강도를 계산하여, 세포당 Fxn 발현 수준을 결정하였다. 각 그룹에 대해, 적어도 30개 내지 40개의 세포를 이미지화하고, 분석하였다.
일부 구현예에서, 세포당 Fxn 발현 수준은 PBS로 처리된 뉴런보다 Fxn 유전자를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터로 처리된 뉴런에서 더 높을 것이다.
실시예 23: 생체내 VSV-G 위형화된 레트로바이러스를 이용한 프리드리히 운동실조증의 치료
본 실시예는, 생체내 세포로의 치료용 전이유전자의 전달을 설명한다. 본 실시예에서, 치료용 전이유전자는 프라탁신(fxn)이다.
VSV-G로 위형화되고, 뉴런 특이적 프로모터(양성 TCSRE)와 미세아교세포 제한 마이크로RNA 서열(NTCSRE)의 제어 하에서 fxn 유전자 작용제를 운반하는 레트로바이러스 벡터를, YG8R 마우스에게 뇌내로 주사하였다. 레트로바이러스 벡터는 본 출원에 기재된 임의의 방법을 통해 생성하였다. 음성 대조군 마우스는 PBS로 처리하였다.
처리 28일 후, 레트로바이러스 또는 PBS로 처리된 마우스에서 뇌 절편을 채취하고, 이전 실시예에 기재된 바와 같이 Fxn 발현을 위해 염색하였다. 일부 구현예에서, 세포당 Fxn 발현 수준은 PBS로 처리된 마우스의 뇌보다 Fxn 유전자를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터로 처리된 마우스의 뇌에서 더 높을 것이다.
마우스의 개별 그룹에서, 레트로바이러스 또는 PBS로의 처리 28일 후, 마우스를 문헌[Rocca et al., 2017, Sci. Transl. Med. 9(413), doi: 10.1126/scitranslmed.aaj2347]에 기재된 바와 같은 신경행동 검사에 적용하였다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스로 처리된 마우스는 PBS로 처리된 마우스와 비교하여 신경행동 검사에서 유의한 개선을 나타냈다.
실시예 24: 푸소좀의 전사 활성 결여
본 실시예는 푸소좀 생성에 사용되는 모세포, 예를 들어 원천세포와 비교하여 푸소좀에서의 전사 활성을 정량화한다. 일 구현예에서, 전사 활성은 모세포, 예를 들어 원천세포와 비교하여 푸소좀에서 낮거나 존재하지 않을 것이다.
푸소좀은 치료제의 전달을 위한 섀시(chassis)이다. 고효율로 세포 또는 국소 조직 환경에 전달될 수 있는 miRNA, mRNA, 단백질 및/또는 세포소기관과 같은 치료제는, 수용조직에서 병리학적으로 낮거나 높은 수준에서 정상적으로 활성 또는 활성이 아닌 경로를 조절하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 푸소좀이 전사할 수 없거나, 푸소좀이 모세포보다 낮은 전사 활성을 갖는다는 관찰은, 핵 물질의 제거가 충분히 일어났음을 입증한다.
푸소좀은 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조하였다. 이어서, 푸소좀을 생성하는 데 사용되는 충분한 수의 푸소좀과 모세포를, 6-웰 저부착 다중 웰 플레이트 내 20% 소태아혈청, 1x 페니실린/스트렙토마이신 및 형광 태그 가능한 알킨-뉴클레오시드 EU가 함유된 DMEM 중에 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 플레이팅하였다. 음성 대조군의 경우, 충분한 수의 푸소좀과 모세포를 또한 다중 웰 플레이트 내 20% 소태아혈청, 1x 페니실린/스트렙토마이신을 함유하지만 알킨-뉴클레오시드 EU는 함유하지 않는 DMEM 중에 플레이팅하였다.
1시간 인큐베이션 후, 샘플을 이미지화 키트의 제조업체(ThermoFisher Scientific)의 설명서에 따라 처리하였다. 음성 대조군을 포함하는 세포와 푸소좀 샘플을 1xPBS 완충액으로 3회 세척하고, 1xPBS 완충액 중에 재현탁시키고, 여기용 488 nm 아르곤 레이저와 530+/-30 nm 방출을 사용하여 유세포분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로 분석하였다. 수집 및 분석을 위해 BD FACSDiva 소프트웨어를 사용하였다. 광산란 채널을 선형 증가로 설정하고, 최소 10,000개의 세포를 이용하여 로그 스케일로 형광 채널을 각각의 조건에서 분석하였다.
일 구현예에서, 음성 대조군에서 530+/-30 nm 방출로 측정된 전사 활성은 알킨-뉴클레오시드 EU의 누락으로 인해 무효가 될 것이다. 일부 구현예에서, 푸소좀은 모세포보다 약 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%(또는 그 이하) 더 적은 전사 활성을 가질 것이다.
또한, 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, Oct 14;105(41):15779-84](doi: 10.1073/pnas.0808480105. Epub 2008 Oct 7) 참조.
실시예 25: DNA 복제 또는 복제 활성의 결여
본 실시예는 푸소좀에서 DNA 복제를 정량화한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 세포와 비교하여 낮은 비율로 DNA를 복제할 것이다.
푸소좀은 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조하였다. 푸소좀과 모세포 DNA 복제 활성을 형광 태그 가능한 뉴클레오티드(ThermoFisher Scientific # C10632)의 혼입을 통해 평가하였다. 푸소좀과 동등한 수의 세포를, 디메틸설폭시드 중 EdU 스톡 용액의 제조 후, EdU와 함께 최종 농도 10 μM에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 3.7% PFA를 사용하여 15분 동안 고정시키고, 1xPBS 완충액(pH 7.4)으로 세척하고, 1xPBS 완충액(pH 7.4) 중 0.5% 세제 용액에서 15분 동안 투과성으로 만들었다.
투과화(permeabilization) 후, 0.5% 세제 함유 PBS 완충액 중 현탁액 중의 푸소좀과 세포를, 1xPBS 완충액(pH 7.4)으로 세척하고, 반응 칵테일, 1xPBS 완충액, CuSO4(구성요소 F), azide-fluor 488, 1x 반응 완충액 첨가제 중에서 21℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
푸소좀과 세포 DNA 복제 활성에 대한 음성 대조군을, 상기와 동일하지만 1x 반응 칵테일 중에 azide-fluor 488을 포함하지 않는 것으로 처리된 샘플로 제조하였다.
이어서, 세포와 푸소좀 샘플을 세척하고, 1xPBS 완충액 중에 재현탁시키고, 유세포분석으로 분석하였다. 488 nm 아르곤 레이저 여기를 이용하는 FACS 세포측정기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 유세포분석을 수행하고, 530+/-30 nm 방출 스펙트럼을 수집하였다. 수집 및 분석을 위해 FACS 분석 소프트웨어를 사용하였다. 광산란 채널을 선형 증가로 설정하고, 최소 10,000개의 세포를 이용하여 로그 스케일로 형광 채널을 각각의 조건에서 분석하였다. 각각의 샘플에서 azide-fluor 488의 강도 중앙값을 기준으로 상대 DNA 복제 활성을 계산하였다. 모든 사건을 전방 및 측방 분산 채널에서 포획하였다(대안적으로, 푸소좀 집단만 선택하도록 게이트를 적용할 수 있음). 푸소좀의 형광 강도 중앙값에서 각각의 음성 대조군 샘플의 형광 강도 중앙값을 빼서, 푸소좀에 대한 정규화된 형광 강도 값을 결정하였다. 이어서, 푸소좀 샘플에 대한 정규화된 상대 DNA 복제 활성을 각각의 유핵 세포에 대해 정규화하여, 샘플 DNA 복제 활성에 대한 정량적 측정을 생성하였다.
일 구현예에서, 푸소좀은 모세포보다 낮은 DNA 복제 활성을 갖는다.
또한, 문헌[Salic, 2415-2420](doi: 10.1073/pnas.0712168105) 참조.
실시예 26: 푸소겐 정량화
본 실시예는 푸소좀당 푸소겐 절대 수의 정량화를 설명한다.
GFP가 태그된 푸소겐(VSV-G)을 발현시키기 위해 이전 실시예에 기재된 바와 같이 조작한 것을 제외하고는, 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 푸소좀 조성물을 제조하였다. 또한, 음성 대조군 푸소좀은 푸소겐(VSV-G) 또는 GFP가 존재하지 않도록 조작하였다.
GFP 태그된 푸소겐과 음성 대조군(들)을 갖는 푸소좀을 하기와 같이 푸소겐 절대 수에 대해 검정하였다. 상업적으로 입수한 재조합 GFP를 순차적으로 희석하여, 단백질 농도의 검정 곡선을 생성하였다. 이어서, 검정 곡선과 양이 공지된 푸소좀 샘플의 GFP 형광을 GFP 광 큐브(469/35 여기 필터와 525/39 방출 필터)를 사용하여 형광계에서 측정하여, 푸소좀 제제 내 GFP 분자의 평균 몰농도를 계산하였다. 이어서, 몰농도를 GFP 분자의 수로 전환하고, 샘플당 푸소좀 수로 나누어, 푸소좀당 GFP 태그된 푸소겐 분자의 평균 수를 얻고, 푸소좀당 푸소겐의 수의 상대적 추정치를 제공하였다.
일 구현예에서, GFP 형광은 푸소겐 또는 GFP가 존재하지 않는 음성 대조군과 비교하여 GFP 태그를 포함하는 푸소좀에서 더 높을 것이다. 일 구현예에서, GFP 형광은 존재하는 푸소겐 분자의 수에 비례한다.
대안적으로, 개별 푸소좀을 제조업체의 설명서에 따라 단일 세포 제조 시스템(Fluidigm)을 사용하여 단리하고, 상업적으로 입수 가능한 프로브 세트(Taqman)와, Ct 값을 기준으로 푸소겐 또는 GFP cDNA 수준을 정량화하도록 설계된 마스터 믹스를 사용하여 qRT-PCR를 수행하였다. 푸소겐 유전자 또는 GFP 유전자의 클로닝된 단편과 동일한 서열의 RNA 표준을 합성(Amsbio)으로 생성한 후, 연속 희석으로 단일 세포 제조 시스템 qRT-PCR 실험 반응에 첨가하여, 푸소겐 또는 GFP RNA의 Ct vs 농도의 표준 곡선을 확립하였다.
푸소좀의 Ct 값을 표준 곡선과 비교하여, 푸소좀당 푸소겐 또는 GFP RNA의 양을 결정하였다.
일 구현예에서, 푸소겐과 GFP RNA는 푸소겐 또는 GFP가 존재하지 않는 음성 대조군과 비교하여 푸소겐을 발현시키도록 조작된 푸소좀에서 더 높을 것이다.
이전에 기재된 바와 같이 지질 이중층 구조를 분석하고, 본원의 다른 실시예에 기재된 바와 같이 LC-MS로 지질 이중층 내 푸소겐을 정량화하여, 푸소겐을 추가로 지질 이중층에서 정량화할 수 있다.
실시예 27: 푸소좀의 평균 크기 측정
본 실시예는 푸소좀의 평균 크기 측정을 설명한다.
푸소좀은 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조하였다. 평균 크기를 결정하기 위해 상업적으로 입수 가능한 시스템(iZON Science)을 사용하여 푸소좀을 측정하였다. 제조업체의 설명서에 따라 소프트웨어와, 40 nm 내지 10 μm 크기 범위 내 입자를 분석하기 위해 설계된 나노공극을 이용하여 시스템을 사용하였다. 푸소좀과 모세포를 포스페이트 완충 염수(PBS) 중에 1 mL당 단백질 0.01 μg 내지 0.1 μg 범위의 최종 농도로 재현탁시켰다. 다른 기기 설정은 하기 표에 지시된 바와 같이 조정하였다:
Figure pct00067
모든 푸소좀을 단리 2시간 내에 분석하였다. 일 구현예에서, 푸소좀은 모세포의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상) 이내의 크기를 가질 것이다.
실시예 28: 푸소좀의 평균 크기 분포 측정
본 실시예는 푸소좀의 크기 분포 측정을 설명한다.
푸소좀을 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조하고, 이전 실시예에 기재된 바와 같이, 상업적으로 입수 가능한 시스템을 사용하여 입자의 평균 크기를 결정하기 위해 시험하였다. 일 구현예에서, 중앙값을 중심으로 한 푸소좀의 10%, 50% 및 90%에 대한 크기 역치를 모세포와 비교하여, 푸소좀 크기 분포를 평가하였다.
일 구현예에서, 푸소좀은, 샘플의 10%, 50% 또는 90% 내에서, 모세포의 크기 분포 가변성의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%(또는 그 이하)미만을 가질 것이다.
실시예 29: 푸소좀의 평균 부피
본 실시예는 푸소좀의 평균 부피 측정을 설명한다. 이론에 구애됨 없이, 다양한 크기(예를 들어, 부피)의 푸소좀을 별개의 카고 로딩, 치료제 설계 또는 적용을 위해 다용도로 만들 수 있다.
푸소좀은 이전 실시예에 기재된 바와 같이 제조하였다. 양성 대조군은 HEK293 세포 또는 크기가 공지된 폴리스티렌 비드였다. 음성 대조군은 36게이지 바늘을 약 50회 통과시킨 HEK293 세포였다.
이전 실시예에 기재된 바와 같이 투과 전자 현미경을 이용한 분석을 사용하여, 푸소좀의 크기를 결정하였다. 푸소좀의 직경을 측정한 후, 부피를 계산하였다.
일 구현예에서, 푸소좀은 직경이 약 50 nm 이상인 평균 크기를 가질 것이다.
실시예 30: 푸소좀의 평균 밀도
푸소좀 밀도는 문헌[Thery et al., Curr Protoc Cell Biol. 2006 Apr; Chapter 3:Unit 3.22]에 기재된 바와 같이 연속 수크로오스 구배 원심분리 검정을 통해 측정하였다. 푸소좀은 이전 실시예에 기재된 바와 같이 수득하였다.
먼저, 수크로오스 구배를 준비하였다. 4 ml HEPES/수크로오스 스톡 용액과 1 ml HEPES 스톡 용액 또는 0.5 ml HEPES/수크로오스 스톡 용액과 4.5 ml HEPES 스톡 용액을 각각 혼합하여, 2 M 및 0.25 M 수크로오스 용액을 생성하였다. 이러한 2개의 분획을 모든 셔터가 닫힌 구배 메이커에 로딩하였는데, 2 M 수크로오스 용액을 자석 교반 바를 포함한 근위부에 0.25 M 수크로오스 용액을 원위부에 로딩하였다. 구배 메이커를 자석 교반 플레이트에 위치시키고, 근위부와 원위부 사이의 셔터를 열고 자석 교반 플레이트를 작동시켰다. HEPES 스톡 용액은 다음과 같이 제조하였다: 2.4 g N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES; 20 mM 최종), 300 H2O, 10 N NaOH를 이용하여 pH를 7.4로 조정하고, H2O를 이용하여 최종 부피를 500 ml로 조정함. HEPES/수크로오스 스톡 용액은 다음과 같이 제조하였다: 2.4 g 히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES; 20 mM 최종), 428 g 프로테아제 미함유 수크로오스(ICN; 2.5 M 최종), 150 ml H2O, 10 N NaOH를 이용하여 pH를 7.4로 조정하고, H2O를 이용하여 최종 부피를 500 ml로 조정함.
푸소좀을 HEPES/수크로오스 스톡 용액 2 ml 중에 재현탁시키고, SW 41 원심분리 튜브의 바닥에 부었다. 외부 도관을 2 ml의 푸소좀 바로 위 SW 41 튜브 내에 배치하였다. 외부 셔터를 개방하고, 2 M(하단)에서 0.25 M(상단)로의 연속 수크로오스 구배를 푸소좀의 상단에 서서히 부었다. 도관이 항상 액체의 상단보다 약간 위에 있도록, 구배가 부어질 때 SW 41 튜브를 낮추었다.
구배를 포함한 모든 튜브를 서로 또는 동일한 중량의 수크로오스 용액을 가진 다른 튜브와 균형을 맞추었다. 구배를 브레이크를 낮게 설정한 SW 41 스윙-버킷 로터에서 210,000 x g, 4℃에서 밤새(14시간 이상) 원심분리하였다.
마이크로피펫을 이용하여, 11개의 1 ml 분획(상단에서 하단으로)을 채취하고, TLA-100.3 로터용 3 ml 튜브에 넣었다. 샘플을 96-웰 플레이트의 별도의 웰에 따로 보관하고, 각 분획 50 μl를 사용하여 굴절률을 측정하였다. 플레이트를 접착 포일로 덮어 증발을 막고, 실온에서 1시간 이하 동안 보관하였다. 굴절계를 사용하여 96-웰 플레이트 내 저장된 재료의 각 분획 10 μl 내지 20 μl의 굴절률(따라서, 수크로오스 농도 및 밀도)을 측정하였다.
굴절률을 g/ml으로 전환시키기 위한 표는 Beckman 웹사이트에서 다운로드 가능한 초원심분리 카탈로그에서 입수 가능하다.
이어서, 단백질 함량 분석을 위해 각 분획을 준비하였다. 20 mM HEPES(pH 7.4) 2 밀리리터를 각각 1 ml 구배 분획에 첨가하고, 2회 내지 3회 위아래로 파이핑하여 혼합하였다. 각 튜브의 한쪽을 영구 마커로 마킹하고, 튜브를 TLA-100.3 로터에 마킹된 부분이 위로 오도록 배치하였다.
희석된 분획을 포함한 3 ml 튜브를 110,000 x g, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하였다. TLA-100.3 로터에는 6개의 튜브가 있으므로, 각 구배당 2회 원심분리를 수행하고, 다른 튜브는 원심분리될 때까지 4℃에서 보관하였다.
각각의 3 ml 튜브에서 상청액을 흡인하여, 펠릿의 상단에 액적을 남겼다. 펠릿은 대부분 보이지 않았지만, 튜브 상의 마커로부터 그 위치를 추론할 수 있었다. 보이지 않는 펠릿을 재현탁시키고, 미세원심분리 튜브로 옮겼다. 각각의 재현탁된 분획의 절반을 또 다른 실시예에 기재된 비신코닌산 검정을 이용한 단백질 함량 분석에 사용하였다. 이는, 푸소좀 제제의 다양한 구배 분획에 걸친 분포를 제공한다. 이러한 분포를 사용하여, 푸소좀의 평균 밀도를 결정하였다. 나머지 절반의 분획은 -80℃에서 보관하고, 단백질 분석으로 분획에 걸친 푸소좀 분포가 밝혀지면 다른 목적(예를 들어, 기능 분석, 또는 면역격리에 의한 추가 정제)을 위해 사용하였다.
일 구현예에서, 이러한 검정을 사용하여 측정 시, 푸소좀의 평균 밀도는 1.25 g/ml +/- 0.05 표준편차일 것이다. 일 구현예에서, 푸소좀의 평균 밀도는 1 내지 1.1, 1.05 내지 1.15, 1.1 내지 1.2, 1.15 내지 1.25, 1.2 내지 1.3, 또는 1.25 내지 1.35의 범위일 것이다. 일 구현예에서, 푸소좀의 평균 밀도는 1 미만 또는 1.35 초과일 것이다.
실시예 31: 핵 외피 함량 측정
본 실시예는 제핵된 푸소좀 내 핵 외피 함량의 측정을 설명한다. 핵 외피는 세포의 세포질에서 DNA를 단리한다.
일 구현예에서, 정제된 푸소좀 조성물은 포유류 세포, 예컨대 본원에 기재된 바와 같이 제핵된 HEK-293T(293 [HEK-293](ATCC® CRL-1573™)를 포함한다. 본 실시예는, 푸소좀 생성 후 남아있는 온전한 핵 막의 양을 측정하기 위한 대용물로서의 상이한 핵 막단백질의 정량화를 설명한다.
본 실시예에서, 10x106개의 HEK-293T와 10x106개의 HEK-293T에서 제조된 동등한 양의 푸소좀을 3.7% PFA를 사용하여 15분 동안 고정시키고, 1xPBS 완충액(pH 7.4)으로 세척하고, 동시에 투과성으로 만든 후, 1% 소 혈청 알부민 및 0.5% Triton® X-100(pH 7.4)이 함유된 1xPBS 완충액을 사용하여 15분 동안 차단하였다. 투과화 후, 푸소좀과 세포를 1% 소 혈청 알부민 및 0.5% Triton® X-100(pH 7.4)이 함유된 1xPBS 완충액 중에 희석된 제조업체 권장 농도로의 상이한 1차 항체, 예를 들어(항-RanGAP1 항체[EPR3295] (Abcam - ab92360), 항-NUP98 항체[EPR6678] - 핵 공극 마커(Abcam - ab124980), 항-핵 공극 복합체 단백질 항체[Mab414] - (Abcam- ab24609), 항-임포르틴 7 항체(Abcam - ab213670)와 함께 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 푸소좀과 세포를 1xPBS 완충액(pH 7.4)으로 세척하고, 1% 소 혈청 알부민과 0.5% 세제가 함유된 1xPBS 완충액(pH 7.4) 중에 희석된 제조업체 권장 농도로의 이전에 지정된 1차 항체를 검출하는 적절한 형광 2차 항체와 함께 21℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 푸소좀과 세포를 1xPBS 완충액으로 세척하고, 1 μg/ml Hoechst 33342가 함유된 1xPBS 완충액(pH 7.4) 300μL 중에 재현탁시키고, 20 μm FACS 튜브를 통해 여과하고, 유세포분석으로 분석하였다.
1차 항체를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 동일한 염색 절차를 사용하여 음성 대조군을 생성하였다. 488 nm 아르곤 레이저 여기를 이용하는 FACS 세포측정기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 유세포분석을 수행하고, 530+/-30 nm 방출 스펙트럼을 수집하였다. 수집 및 분석을 위해 FACS 수집 소프트웨어를 사용하였다. 광산란 채널을 선형 증가로 설정하고, 최소 10,000개의 세포를 이용하여 로그 스케일로 형광 채널을 각각의 조건에서 분석하였다. 각각의 샘플에서 형광 강도 중앙값을 기준으로 상대적인 온전한 핵막 함량을 계산하였다. 모든 사건을 전방 및 측방 분산 채널에서 포획하였다.
푸소좀의 형광 강도 중앙값에서 각각의 음성 대조군 샘플의 형광 강도 중앙값을 빼서, 푸소좀에 대한 정규화된 형광 강도 값을 결정하였다. 이어서, 푸소좀 샘플에 대한 정규화된 형광을 각각의 유핵 세포에 대해 정규화하여, 온전한 핵막 함량에 대한 정량적 측정을 생성하였다.
일 구현예에서, 제핵된 푸소좀은 유핵 모세포와 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만의 형광 강도 또는 핵 외피 함량을 포함할 것이다.
실시예 32: 크로마틴 수준 측정
본 실시예는 제핵된 푸소좀에서 크로마틴의 측정을 설명한다.
DNA는 크로마틴으로 응축되어 핵 내부에 들어갈 수 있게 된다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조된 정제된 푸소좀 조성물은 낮은 수준의 크로마틴을 포함할 것이다.
상기 기재된 임의의 방법으로 제조된 제핵된 푸소좀과 양성 대조군 세포(예를 들어, 모세포)를, 히스톤 단백질 H3 또는 히스톤 단백질 H4에 특이적인 항체와 함께 ELISA를 이용하여 크로마틴 함량에 대해 검정하였다. 히스톤은 크로마틴의 주요 단백질 구성요소이며, 여기서 H3 및 H4가 주요 히스톤 단백질이다.
상업용 키트(예를 들어 Abcam Histone Extraction Kit (ab113476)) 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 푸소좀 제제와 세포 제제에서 히스톤을 추출하였다. 이러한 분취액을 사용 시까지 -80℃에서 저장하였다. 정제된 히스톤 단백질(H3 또는 H4) 1 ng/μl 내지 50 ng/μl를 검정 완충액 용액 중에 희석하여, 표준물의 일련의 희석액을 제조하였다. 검정 완충액은 제조업체에서 공급된 키트(예를 들어 Abcam Histone H4 Total Quantification Kit (ab156909) 또는 Abcam Histone H3 Total Quantification Kit (ab115091))에서 유도할 수 있다. 검정 완충액을 48-웰 또는 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 이를 항-히스톤 H3 또는 항-H4 항체로 코팅하고, 샘플 또는 표준 대조군을 각각의 웰의 총 부피가 50 μl가 되도록 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 덮고, 37℃에서 90분 내지 120분 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 검출을 위해 플레이트에 부착된 항-히스톤 항체에 결합된 임의의 히스톤을 준비하였다. 상청액을 흡인하고, 플레이트를 세척 완충액 150 μl로 세척하였다. 이어서, 항-히스톤 H3 또는 항-H4 포획 항체를 포함한 포획 완충액을 부피 50 μl 및 농도 1 μg/mL로 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 오비탈 진탕기에서 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다.
다음으로, 플레이트를 흡인하고, 세척 완충액을 사용하여 6회 세척하였다. 이어서, 포획 항체에 의해 활성화 가능한 신호 리포터 분자를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 흡인하고, 세척 완충액을 사용하여 4회 세척하였다. 정지 용액을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트의 각각의 웰의 흡광도를 450 nm에서 판독하고, 각각의 샘플의 히스톤 농도를 표준 샘플의 히스톤 농도에 대해 450 nm에서의 흡광도 표준 곡선에 따라 계산하였다.
일 구현예에서, 푸소좀 샘플은 유핵 모세포의 히스톤 농도의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만을 차지할 것이다.
실시예 33: 푸소좀 내 miRNA 함량 측정
본 실시예는 푸소좀 내 마이크로RNA(miRNA)의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 miRNA를 포함한다.
miRNA는, 다른 활성 중에서, 메신저 RNA(mRNA)가 단백질로 번역되는 속도를 제어하는 조절 요소이다. 일 구현예에서, miRNA를 운반하는 푸소좀을 사용하여 miRNA를 표적 부위에 전달할 수 있다.
푸소좀은 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조하였다. 상기 기재된 바와 같이 푸소좀 또는 모세포에서 RNA를 제조하였다. Sanger Center miRNA 등록소(www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml)에서 적어도 하나의 miRNA 유전자를 선택하였다. miRNA는 문헌[Chen et al, Nucleic Acids Research, 33(20), 2005]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 모든 TaqMan miRNA 검정은 Thermo Fisher(A25576, Waltham, MA)를 통해 입수 가능하였다.
제조업체의 사양에 따라 miRNA cDNA에서 qPCR을 수행하고, 본원에 기재된 바와 같은 실시간 PCR 시스템을 사용하여 CT 값을 생성하고 분석하였다.
일 구현예에서, 푸소좀의 miRNA 함량은 이의 모세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)일 것이다.
실시예 34: 푸소좀 내 내인성 RNA 또는 합성 RNA의 발현 정량화
본 실시예는 발현이 변경된 내인성 RNA 또는 푸소좀에서 발현되는 합성 RNA의 수준의 정량화를 설명한다.
푸소좀에 대한 세포 기능을 매개하는 내인성 또는 합성 RNA의 발현을 변경시키기 위해 푸소좀 또는 모세포를 조작하였다.
트랜스포사아제 벡터(System Biosciences, Inc.)는 단백질 작용제의 클로닝된 단편의 오픈리딩프레임과 함께 푸로마이신 내성 유전자의 오픈리딩프레임을 포함한다. 벡터를 전기천공기(Amaxa)와 293T 세포주 특이적 핵 트랜스펙션 키트(Lonza)를 사용하여 293T로 전기천공하였다.
20% 소태아혈청 및 1x 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 DMEM 중에서 푸로마이신을 이용하여 3일 내지 5일 동안 선별한 후, 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 안정적으로 발현하는 세포주에서 푸소좀을 제조하였다.
개별 푸소좀을 단리하고, 푸소좀당 단백질 작용제 또는 RNA를 이전 실시예에 기재된 바와 같이 정량화하였다.
일 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀당 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 50개, 100개, 500개, 103개, 5.0 x 103개, 104개, 5.0 x 104개, 105개, 5.0 x 105개, 106개, 5.0 x 106개(또는 그 이상)의 RNA를 가질 것이다.
실시예 35: 푸소좀 내 프로테옴 조성의 측정
본 실시예는 푸소좀의 단백질 조성의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀의 단백질 조성은 이들이 유도된 세포와 유사할 것이다.
푸소좀은 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조하였다. 푸소좀을 용해 완충액(7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 50 mM Tris(pH 8.0) 중 4% (w/v) Chaps) 중에 재현탁시키고, 간헐적인 볼텍싱을 이용하여 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 혼합물을 아이스배쓰에서 5분 동안 초음파로 용해시키고, 13,000 RPM에서 5분 동안 회전시켰다. 비색 검정(Pierce)으로 단백질 함량을 결정하고, 각각의 샘플의 단백질을 새로운 튜브에 옮기고, 50 mM Tris(pH 8)를 이용하여 부피를 동일하게 만들었다.
단백질을 10 mM DTT를 이용하여 65℃에서 15분 동안 환원시키고, 암실에서 실온에서 30분 동안 15 mM 요오도아세트아미드로 알킬화하였다. 6부피의 냉각된(-20℃) 아세톤을 점진적으로 첨가하여 단백질을 침전시키고, -80℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 단백질 펠릿을 냉각된(-20℃) 메탄올로 3회 세척하였다. 단백질을 50 mM Tris(pH 8.3) 중에 재현탁시켰다.
다음으로, 37℃에서 교반 하의 소화 처음 4시간 동안 트립신/lysC를 첨가하였다. 샘플을 50 mM Tris(pH 8)로 희석하고, 37℃에서 교반 하의 밤새 소화 동안 추가의 트립신/lysC와 함께 0.1% 소듐 데옥시콜레이트를 첨가하였다. 소화를 중단시키고, 2% v/v 포름산을 첨가하여 소듐 데옥시콜레이트를 제거하였다. 샘플을 볼텍싱하고, 13,000 RPM에서 1분 동안 원심분리하여 맑게 만들었다. 펩타이드를 역상 고체상 추출(SPE)로 정제하고, 건조시켰다. 샘플을 물 중 3% DMSO, 0.2% 포름산 20 μl 중에서 재구성하고, LC-MS로 분석하였다.
정량적 측정을 위해, 단백질 표준물을 또한 기기에서 실행하였다. 표준 펩타이드(Pierce, equimolar, LC-MS grade, #88342)를 4 fmol/ul, 8 fmol/ul, 20 fmol/ul, 40 fmol/ul 및 100 fmol/ul로 희석하고, LC-MS/MS로 분석하였다. 단백질당 5개의 최상의 펩타이드(3 MS/MS 전이/펩타이드)의 평균 AUC(곡선 하 면적)를 각각의 농도에 대해 계산하여, 표준 곡선을 생성하였다.
25 μm iD 모세관을 갖는 전기분무 인터페이스가 장착되고, 미세-초고성능 액체 크로마토그래피(μUHPLC)(Eksigent, Redwood City, CA, USA)가 결합된 고해상도 질량 분광계(ABSciex, Foster City, CA, USA)를 이용하여 수집을 수행하였다. 기기를 제어하고, 데이터 처리 및 수집을 위해 분석 소프트웨어를 사용하였다. 전원 전압을 5.2 kV로 설정하고, 225℃에서 유지시켰으며, 커튼 가스는 27 psi로, 가스 1은 12 psi로, 가스 2는 10 psi로 설정하였다. 단백질 데이타베이스의 경우 정보 의존적 수집(IDA: Information Dependent Acquisition) 방식으로, 샘플의 경우 SWATH 수집 방식으로 수집을 수행하였다. 60℃에서 유지시킨 역상 컬럼(0.3 μm i.d., 2.7 μm 입자, 150 mm 길이)(Advance Materials Technology, Wilmington, DE)에서 분리를 수행하였다. 샘플을 루프 과충전으로 5μL 루프에 주입하였다. 120분 (샘플) LC 구배의 경우, 이동상은 다음을 포함하였다: 용매 A(물 중 0.2% v/v 포름산 및 3% DMSO v/v) 및 용매 B(EtOH 중 0.2% v/v 포름산 및 3% DMSO), 3 μL/min의 유량으로.
단백질의 절대 정량화의 경우, 단백질당 5개의 최상의 펩타이드(펩타이드당 3 MS/MS 이온)의 AUC의 합을 사용하여 표준 곡선(5개 지점, R2>0.99)을 생성하였다. 샘플의 분석을 위한 데이터베이스를 생성하기 위해, 12개 샘플 각각에 대해 DIAUmpire 알고리즘을 실행하고, 출력 MGF 파일을 하나의 데이터베이스로 통합하였다. 소프트웨어(ABSciex)와 함께 이러한 데이터베이스를 사용하여, 5 전이/펩타이드와 5 펩타이드/단백질 최대값을 사용하여 각각의 샘플의 단백질을 정량화하였다. 컴퓨터로 계산된 점수가 1.5를 넘거나 FDR이 1% 미만인 경우, 펩타이드를 적절하게 측정된 것으로 간주하였다. 적절하게 측정된 펩타이드 각각의 AUC의 합을 표준 곡선 상에 맵핑하고, fmol로 보고하였다.
이어서, 수득한 단백질 정량화 데이터를 분석하여, 다음과 같은 공지된 단백질 부류의 단백질 수준과 비율을 결정하였다: 효소를 효소 번호(EC: Enzyme Commission)로 주석이 달린 단백질로 식별하고; ER 관련 단백질을 미토콘드리아가 아닌 ER의 유전자 온톨로지(GO; http://www.geneontology.org) 세포 구획 분류를 갖는 단백질로 식별하고; 엑소좀 관련 단백질을 미토콘드리아가 아닌 엑소좀의 유전자 온톨로지 세포 구획 분류를 갖는 단백질로 식별하고; 미토콘드리아 단백질을 MitoCarta 데이터베이스(Calvo et al., NAR 2015l doi:10.1093/nar/gkv1003)에서 미토콘드리아로서 식별된 단백질로 식별함. 각 부류의 모든 단백질의 몰량의 합을 각 샘플에서 식별된 모든 단백질의 몰량의 합으로 나누어, 이러한 카테고리 각각의 몰비를 결정하였다.
푸소좀 프로테옴 조성을 모세포 프로테옴 조성과 비교하였다. 일 구현예에서, 식별된 단백질의 50% 초과가 푸소좀에 존재하고, 식별된 단백질 중에서 수준이 모세포에서 상응하는 단백질 수준의 25% 초과인 경우, 푸소좀과 모세포 사이의 유사한 프로테옴 조성을 관찰할 것이다.
실시예 36: 푸소좀 내 GAPDH의 측정
본 검정은 푸소좀 내 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나아제(GAPDH)의 수준과, 모세포와 비교한 푸소좀 내 GAPDH의 상대 수준의 정량화를 설명한다.
제조업체의 설명서에 따라 GAPDH에 대해 상업적으로 입수 가능한 표준 ELISA(ab176642, Abcam)를 사용하여 모세포와 푸소좀에서 GAPDH를 측정하였다.
총 단백질 수준은 GAPDH를 측정하는 데 사용된 동일한 부피의 샘플에서 상기 기재된 바와 같은 비신코닌산 검정을 통해 유사하게 측정하였다. 구현예에서, 본 검정을 사용하여 측정하면, 푸소좀 내 총 단백질당 GAPDH 수준은 총 단백질 1 μg당 100 ng 미만의 GAPDH일 것이다. 유사하게, 구현예에서, 모세포에서 푸소좀으로의 총 단백질에 대한 GAPDH 수준 감소는 10% 감소보다 클 것이다.
일 구현예에서, 제제 중 GAPDH 함량(총 단백질 1 μg당 GAPDH ng)은 500 미만, 250 미만, 100 미만, 50 미만, 20 미만, 10 미만, 5 미만 또는 1 미만일 것이다.
일 구현예에서, 모세포에서 제제로의 총 단백질당 GAPDH의 감소(ng/μg)는, 1% 초과, 2.5% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 15% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과 또는 90% 초과일 것이다.
실시예 37: 푸소좀 내 칼넥신 측정
본 검정은 푸소좀 내 칼넥신(CNX)의 수준과, 모세포와 비교한 푸소좀 내 CNX의 상대 수준의 정량화를 설명한다.
제조업체의 설명서에 따라 칼넥신에 대해 상업적으로 입수 가능한 표준 ELISA(MBS721668, MyBioSource)를 사용하여 출발세포와 제제에서 칼넥신을 측정하였다.
총 단백질 수준은 칼넥신을 측정하는 데 사용된 동일한 부피의 샘플에서 상기 기재된 바와 같은 비신코닌산 검정을 통해 유사하게 측정하였다. 구현예에서, 본 검정을 사용하여 측정하면, 푸소좀 내 총 단백질당 칼넥신 수준은 총 단백질 1 μg당 100 ng 미만의 칼넥신일 것이다. 유사하게, 구현예에서, 모세포에서 푸소좀으로의 총 단백질에 대한 칼넥신 수준 증가는 10% 증가보다 클 것이다.
일 구현예에서, 제제 중 칼넥신 함량(총 단백질 1 μg당 칼넥신 ng)은 500, 250, 100, 50, 20, 10, 5 또는 1 미만일 것이다.
일 구현예에서, 모세포에서 제제로의 총 단백질당 칼넥신 감소(ng/μg)는, 1%, 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과일 것이다.
실시예 38: 가용성 대 불용성 단백질 질량 비교
본 실시예는 푸소좀 내 단백질 질량의 가용성:불용성 비의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀 내 단백질 질량의 가용성:불용성 비는 유핵 세포와 유사할 것이다.
푸소좀은 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조하였다. 표준 비신코닌산 검정(BCA)을 사용하여(예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 Pierce™ BCA Protein Assay Kit(Thermo Fischer product# 23225)를 사용하여) 푸소좀 제제를 시험하여, 가용성:불용성 단백질 비를 결정하였다. 제조된 푸소좀 또는 모세포를 PBS 중 1 mL당 1x10^7개의 세포 또는 푸소좀의 농도로 현탁시키고, 1600g에서 원심분리하여 푸소좀 또는 세포를 펠릿화하여, 가용성 단백질 샘플을 제조하였다. 상청액을 가용성 단백질 분획으로 채취하였다.
펠릿 내 푸소좀 또는 세포를 2% Triton-X-100이 함유된 PBS 중에서 격렬한 피펫팅 및 볼텍싱으로 용해시켰다. 용해된 분획은 불용성 단백질 분획을 나타낸다.
공급된 BSA(웰당 0 내지 20 μg의 BSA)(삼중으로)를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 측정된 양이 표준 범위 내에 있도록 푸소좀 또는 세포 제제를 희석하였다. 푸소좀 제제를 삼중으로 분석하고, 평균 값을 사용하였다. 가용성 단백질 농도를 불용성 단백질 농도로 나누어, 가용성:불용성 단백질 비를 산출하였다.
일 구현예에서, 푸소좀 가용성:불용성 단백질 비는 모세포와 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상) 이내일 것이다.
실시예 39: 푸소좀 내 LPS 측정
본 실시예는 모세포와 비교하여 푸소좀 내 지질다당류(LPS) 수준의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 모세포와 비교하여 LPS를 낮은 수준으로 가질 것이다.
LPS는 박테리아 막의 구성요소이며, 선천성 면역반응의 강력한 유도인자이다.
LPS 측정은 이전 실시예에 기재된 바와 같은 질량분석법을 기반으로 한다.
일 구현예에서, 푸소좀의 지질 함량의 5%, 1%, 0.5%, 0.01%, 0.005%, 0.0001%, 0.00001%(또는 그 이하) 미만이 LPS일 것이다.
실시예 40: 푸소좀 내 지질 대 단백질 비
본 실시예는 푸소좀 내 지질 질량 대 단백질 질량의 비의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 유핵 세포와 유사한 지질 질량 대 단백질 질량의 비를 가질 것이다.
총 지질 함량을 이전 실시예에 개괄된 리피도믹스(lipidomics) 데이터 세트로 식별된 모든 지질의 몰 함량의 합으로 계산하였다. 본원에 기재된 바와 같은 비신코닌산 검정을 통해 푸소좀의 총 단백질 함량을 측정하였다.
대안적으로, 지질 대 단백질 비를 특정 지질 종 대 특정 단백질의 비로 기재할 수 있다. 특정 지질 종은 이전 실시예에서 생성된 리피도믹스 데이터에서 선택하였다. 특정 단백질은 이전 실시예에서 생성된 프로테오믹스(proteomics) 데이터에서 선택하였다. 선택된 지질 종과 단백질의 상이한 조합을 사용하여, 특정 지질:단백질 비를 정의하였다.
실시예 41: 푸소좀 내 단백질 대 DNA 비
본 실시예는 푸소좀 내 단백질 질량 대 DNA 질량의 비의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 세포보다 훨씬 더 큰 단백질 질량 대 DNA 질량의 비를 가질 것이다.
이전 실시예에 기재된 바와 같이 푸소좀과 세포의 총 단백질 함량을 측정하였다. 이전 실시예에 기재된 바와 같이 푸소좀과 세포의 DNA 질량을 측정하였다. 이어서, 총 단백질 함량을 총 DNA 함량으로 나누어 전형적인 푸소좀 제제에 대해 주어진 범위 내 비를 산출하여, 단백질 대 총 핵산의 비를 결정하였다.
대안적으로, 핵산 수준을 반정량적 실시간 PCR(RT-PCR)을 사용하여, GAPDH와 같은 특정 하우스 키핑 유전자의 수준으로 정의하여, 단백질 대 핵산의 비를 결정하였다.
이어서, 총 단백질 함량을 총 GAPDH DNA 함량으로 나누어 전형적인 푸소좀 제제에 대한 단백질:핵산 비의 특정 범위를 정의하여, 단백질 대 GAPDH 핵산의 비를 결정하였다.
실시예 42: 표적세포와의 융합 측정
본 실시예는 비표적세포와 비교하여 표적세포와의 푸소좀 융합의 정량화를 설명한다.
일 구현예에서, 표적세포와의 푸소좀 융합은, 푸소좀의 내강 내 운반된 카고의 수용세포의 시토졸로의 세포 특이적 전달을 가능하게 한다. 본원에 기재된 방법에 따라 생성된 푸소좀을 다음과 같이 표적세포와의 융합율에 대해 검정하였다.
본 실시예에서, 푸소좀은 이의 원형질막에 미오메이커를 발현하는 HEK293T 세포를 포함한다. 또한, 푸소좀은 mTagBFP2 형광 단백질과 Cre 재조합효소를 발현한다. 표적세포는 미오메이커와 미오믹서를 모두 발현하는 근아세포이고, 비표적세포는 미오메이커도 미오믹서도 발현하지 않는 섬유아세포이다. 미오메이커 발현 푸소좀은 미오메이커와 미오믹서를 모두 발현하는 표적세포와 융합하지만, 비표적세포와는 융합하지 않을 것으로 예측된다(문헌[Quinn et al., 2017, Nature Communications, 8, 15665](doi.org/10.1038/ncomms15665))(문헌[Millay et al., 2013, Nature, 499(7458), 301-305](doi.org/10.1038/nature12343)). 표적세포와 비표적세포 유형 모두 마우스에서 단리된 것이고, CMV 프로모터 하에서 "LoxP-stop-Loxp-tdTomato" 카세트를 안정적으로 발현하여, Cre에 의한 재조합 시 tdTomato 발현을 활성화시키며, 이는 융합을 나타낸다.
표적 또는 비표적 수용세포를 흑색의 투명 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 표적세포와 비표적세포 모두 상이한 융합 군에 대해 플레이팅하였다. 다음으로, 수용세포 플레이팅 24시간 후, Cre 재조합효소 단백질과 미오믹서를 발현하는 푸소좀을 DMEM 배지 중 표적 또는 비표적 수용세포에 적용하였다. 푸소좀의 용량은 웰에 플레이팅된 수용세포의 수와 상관관계가 있었다. 푸소좀 적용 후, 푸소좀과 수용세포 사이의 접촉을 개시하는 것을 돕기 위해 세포 플레이트를 400g에서 5분 동안 원심분리하였다.
푸소좀 적용 4시간 후부터, 필드 또는 웰에서 RFP-양성 세포 대 GFP-양성 세포를 긍정적으로 식별할 수 있도록 세포 웰을 이미지화하였다.
본 실시예에서, 자동화 현미경을 사용하여 세포 플레이트를 이미지화하였다(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/). 먼저, DMEM 배지에서 10분 동안 Hoechst 33342로 세포를 염색하여 주어진 웰 내 총 세포 집단을 결정하였다. Hoechst 33342는 세포 핵을 DNA에 삽입하여 염색시키기 때문에, 개별 세포를 식별하는 데 사용된다. 염색 후, Hoechst 배지를 일반 DMEM 배지로 대체하였다.
405 nm LED 및 DAPI 필터 큐브를 사용하여 Hoechst를 이미지화하였다. GFP는 465 nm LED 및 GFP 필터 큐브를 사용하여 이미지화하고, RFP는 523 nm LED 및 RFP 필터 큐브를 사용하여 이미지화하였다. 먼저, 양성 대조군 웰; 즉, 푸소좀 대신 Cre 재조합효소를 코딩하는 아데노바이러스로 처리된 수용세포에서 LED 강도 및 통합 시간을 확립하여, 표적세포 및 비표적세포 웰의 이미지를 수집하였다.
RFP 및 GFP 강도가 최대 픽셀 강도 값에 있지만 포화되지 않도록, 수집 설정을 설정하였다. 이어서, 관심 웰을 확립된 설정을 사용하여 이미지화하였다. 웰을 4시간마다 이미지화하여, 융합 활성률에 대한 시간 경과 데이터를 수집하였다.
형광 현미경이 장착된 소프트웨어 또는 다른 소프트웨어를 이용하여 GFP 및 RFP-양성 웰의 분석을 수행하였다(Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2007).
롤링 볼(rolling ball) 배경 제거 알고리즘을 사용하여 60 μm 너비로 이미지를 사전 처리하였다. 총 세포 마스크를 Hoechst 양성 세포에 대해 설정하였다. 배경 강도를 유의하게 상회하는 Hoechst 강도를 갖는 세포에 대해 임계값을 설정하고, Hoechst 양성 세포가 되기에 너무 작거나 큰 영역은 제외시켰다.
총 세포 마스크 내에서, 배경을 유의하게 상회하는 세포에 대해 다시 임계값을 설정하고, 전체 세포 영역에 대한 Hoechst (핵) 마스크를 전체 GFP 및 RFP 세포 형광을 포함하도록 확장시켜 GFP 및 RFP 양성 세포를 식별하였다. 표적 또는 비표적 수용세포를 함유하는 대조군 웰에서 식별된 RFP 양성 세포 수를 푸소좀을 함유하는 웰 내 RFP 양성 세포 수에서 빼는 데 사용하였다(비특이적 Loxp 재조합에 대해 뺌). 이어서, RFP 양성 세포(융합된 수용세포)의 수를 각 시점에서 GFP 양성 세포(융합되지 않은 수용세포)와 RFP-양성 세포의 합으로 나누어, 수용세포 집단 내 푸소좀 융합율을 정량화하였다. 비율을 수용세포에 적용된 푸소좀의 주어진 용량으로 정규화하였다. 표적화된 융합(표적화된 세포에 대한 푸소좀 융합)율의 경우, 표적세포에 대한 융합율에서 비표적세포에 대한 융합율을 빼서, 표적화된 융합율을 정량화하였다.
일 구현예에서, 푸소좀과 표적세포의 평균 융합율은 표적세포 융합의 경우 시간당 0.01 내지 4.0 RFP/GFP 세포 범위이거나, 비표적 수용세포와 푸소좀의 융합율의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)일 것이다. 일 구현예에서, 푸소좀이 적용되지 않은 군은 시간당 <0.01 RFP/GFP 세포의 배경율을 보일 것이다.
실시예 43: 막단백질을 전달하기 위한 시험관내 융합
본 실시예는 시험관내 세포와의 푸소좀 융합을 설명한다. 일 구현예에서, 시험관내 세포와의 푸소좀 융합은, 수용세포로의 활성 막단백질의 전달을 유도한다.
본 실시예에서, 푸소좀은 센다이바이러스 HVJ-E 단백질을 발현하는 HEK293T 세포에서 생성하였다(문헌[Tanaka et al., 2015, Gene Therapy, 22(October 2014), 1-8](doi.org/10.1038/gt.2014.12)). 일 구현예에서, 근육 및 지방 조직에서 주로 발견되고, 글루코오스의 세포로의 인슐린 조절된 수송에 관여하는 막단백질인 GLUT4를 발현시켜 푸소좀을 생성하였다. 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 기재된 바와 같이 GLUT4를 포함하거나 포함하지 않는 푸소좀을 HEK293T 세포에서 제조하였다.
이어서, C2C12세포와 같은 근육세포를, GLUT4를 발현하는 푸소좀, GLUT4를 발현하지 않는 푸소좀, PBS(음성 대조군) 또는 인슐린(양성 대조군)으로 처리하였다. 형광 2-데옥시글루코오스 유사체인, 2-[N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디옥살-4-일)아미노]-2-데옥시글루코오스(2-NBDG)의 흡수로 C2C12세포에서의 GLUT4의 활성을 측정하였다. 이전 실시예에 기재된 방법을 사용하여 현미경을 통해 C2C12세포의 형광을 평가하였다.
일 구현예에서, GLUT4와 인슐린을 발현하는 푸소좀으로 처리된 C2C12세포는, PBS 또는 GLUT4를 발현하지 않는 푸소좀으로 처리된 C2C12세포와 비교하여 증가된 형광을 나타낼 것으로 예상되었다.
또한, 문헌[Yang et al., Advanced Materials 29, 1605604, 2017] 참조.
실시예 44: 혈관으로부터의 혈관외유출 측정
본 실시예는 시험관내 미세유체 시스템을 이용하여 시험된 내피 단층을 가로지르는 푸소좀 혈관외유출의 정량화를 설명한다(J.S Joen et al. 2013, journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0056910).
세포는 혈관계에서 주변 조직으로 유출된다. 이론에 구애됨 없이, 혈관외유출은 푸소좀이 혈관외 조직에 이르는 하나의 방식이다.
상기 시스템은 ECM 모방 겔을 주입할 수 있는 챔버에 의해 분리된 3개의 독립적으로 다룰 수 있는 매체 채널을 포함한다. 간략하게, 미세유체 시스템은 접근 포트에 구멍을 뚫고, 커버 유리에 결합시켜 미세유체 채널을 형성하여 PDMS(폴리디메틸 실록산; Silgard 184; Dow Chemical, MI)를 성형하였다. 채널 단면 치수는 1 mm(너비) x 120 μm(높이)였다. 매트릭스 접착을 증강시키기 위해, PDMS 채널을 PDL(폴리-D-리신 히드로브로마이드; 1 mg/ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 용액으로 코팅하였다.
다음으로, 콜라겐 유형 I(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 용액(2.0 mg/ml)을 포스페이트 완충 염수(PBS; Gibco) 및 NaOH와 함께 4개의 별개의 충전 포트를 통해 장치의 겔 영역에 주입하고, 30분 동안 인큐베이션하여, 히드로겔을 형성하였다. 겔이 중합되는 경우, 내피세포 배지(Lonza 또는 Sigma와 같은 공급업체에서 입수함)를 채널에 즉시 피펫팅하여, 겔의 수화를 막았다. 배지 흡인 시, 희석된 히드로겔(BD science) 용액(3.0 mg/ml)을 세포 채널에 도입하고, 과량의 히드로겔 용액을 냉각된 배지를 사용하여 세척해 내었다.
내피세포를 중간 채널에 도입하고, 내피가 형성되도록 정치시켰다. 내피세포 씨딩 2일 후, 푸소좀 또는 대식세포(양성 대조군)를 내피세포가 완전한 단층으로 형성된 동일한 채널에 도입하였다. 푸소좀을 도입하였고, 이는 단층에 부착되어, 단층을 가로질러 겔 영역으로 이동하였다. 배양물을 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 보관하였다. 형광 현미경을 통해 살아있는 세포 이미지화를 가능하게 하기 위해 푸소좀의 GFP 발현 버전을 사용하였다. 다음날, 세포를 고정하고, 챔버에서 DAPI 염색을 사용하여 핵을 염색하고, 공초점 현미경을 사용하여 관심 다중 영역을 이미지화하여, 내피 단층을 통과한 푸소좀의 수를 결정하였다.
일 구현예에서, DAPI 염색은, 푸소좀과 양성 대조군이 씨딩 후 내피 장벽을 통과할 수 있음을 나타낸다.
실시예 45: 화학주성 세포 이동성 측정
본 실시예는 푸소좀 화학주성의 정량화를 설명한다. 세포는 화학주성을 통해 화학 구배 쪽으로 가까워지거나 멀리 이동할 수 있다. 일 구현예에서, 화학주성은 푸소좀이 상처 부위로 돌아가게 하거나, 병원체를 추적할 수 있게 한다. 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조된 정제된 푸소좀 조성물을 하기와 같이 이의 화학주성 능력에 대해 검정하였다.
충분한 수의 푸소좀 또는 대식세포(양성 대조군)를 DMEM 배지에서 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 마이크로 슬라이드 웰에 로딩하였다(ibidi.com/img/cms/products/labware/channel_slides/S_8032X_Chemotaxis/IN_8032X_Chemotaxis.pdf ). 푸소좀을 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 부착시켰다. 세포 부착 후, DMEM(음성 대조군) 또는 MCP1 화학주성인자를 함유한 DMEM을 중간 채널의 인접 저장소에 로딩하고, Zeiss 도립 광시야 현미경을 사용하여 2시간 동안 연속으로 푸소좀을 이미지화하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하였다(Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2007). 각각 관찰된 푸소좀 또는 세포에 대한 이동 조정 데이터는 수동 추적 플러그인을 이용하여 수집하였다(Fabrice Cordelieres, Institut Curie, Orsay, France). Chemotaxis and Migration Tool(ibidi)을 이용하여 화학주성 플롯 및 이동 속도를 결정하였다.
일 구현예에서, 푸소좀의 평균 누적 거리 및 이동 속도는, 케모카인에 대한 양성 대조군 세포의 반응의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(또는 그 이상) 이내일 것이다. 케모카인에 대한 세포의 반응은, 예를 들어 문헌[Howard E. Gendelman et al., Journal of Neuroimmune Pharmacology, 4(1): 47-59, 2009]에 기재되어 있다.
실시예 46: 귀소 가능성 측정
본 실시예는 푸소좀의 상처 부위로의 귀소를 설명한다. 세포를 먼 부위에서 이동시키고/시키거나 특정 부위에 축적, 예를 들어 부위로 귀소시킬 수 있다. 전형적으로, 상기 부위는 상처 부위이다. 일 구현예에서, 푸소좀은 상처 부위로 귀소하거나, 예를 들어 상처 부위로 이동하거나 상처 부위에 축적될 것이다.
8주령 C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratories)의 우측 전경골(TA: tibialis anterior) 근육에, 30G 바늘을 사용하여, 멸균 식염수 중 노텍신(NTX:notexin)(Accurate Chemical & Scientific Corp), 미오톡신을 2 μg/mL 농도로 근육내(IM) 주사하였다. 전경골(TA) 근육 위 피부는 화학적 모발 제거기를 사용하여 45초 동안 해당 영역을 제모한 후, 물로 3회 헹구어 준비하였다. 이러한 농도는 근섬유의 최대 변성뿐 아니라, 이의 위성세포, 운동 축삭 및 혈관에의 최소 손상을 보장하기 위해 선택되었다.
NTX 주사 1일 후, 마우스에게 초파리 루시퍼라아제를 발현하는 푸소좀 또는 세포의 IV 주사를 투여하였다. 푸소좀은 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 초파리 루시퍼라아제를 안정적으로 발현하는 세포에서 제조하였다. 생물발광 이미지화 시스템(Perkin Elmer)을 사용하여, 주사 후 0일, 1일, 3일, 7일, 21일 및 28일차에 생물발광의 전체 동물 이미지를 얻었다.
이미지화 5분 후, 루시퍼라아제를 가시화하기 위해, 마우스에게 150 mg/kg 용량의 생물발광 기질(Perkin Elmer)을 복강내 주사하였다. 모든 장치 설정을 보완하기 위해 이미지화 시스템을 보정하였다. Radiance Photon을 사용하여 생물발광 신호를 측정하고, 총 플럭스를 측정된 값으로 사용하였다. 초당 광자 수의 단위로 값을 수득하기 위해 ROI의 신호를 둘러싸는 관심 영역(ROI)을 생성하였다. ROI를 NTX로 처리된 TA 근육과 반대쪽 TA 근육에서 평가하고, NTX 처리 및 NTX 미처리 TA 근육 사이의 초당 광자 수의 비를 NTX 처리된 근육으로의 귀소 측정치로 계산하였다.
일 구현예에서, 푸소좀 및 세포 내 NTX 처리 및 NTX 미처리 TA 근육 사이의 초당 광자 수의 비는, 1 초과일 것이며, 이는 상처에서 루시퍼라아제 발현 푸소좀의 부위 특이적 축적을 나타낸다.
예를 들어, 문헌[Plant et al., Muscle Nerve 34(5)L 577-85, 2006] 참조.
실시예 47: 탐식능(phagocytic activity) 측정
본 실시예는 푸소좀의 탐식능을 입증한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 탐식능을 가지며, 예를 들어 포식작용을 할 수 있다. 세포는 포식작용에 관여하여, 입자를 삼킴으로써, 박테리아 또는 사멸한 세포와 같은 외인성 침입자의 격리 및 파괴를 가능하게 한다.
부분적 또는 완전 핵 불활성화를 갖는 포유류 대식세포로부터의 푸소좀을 포함하는, 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조된 정제된 푸소좀 조성물은, 병원체 생체입자를 통한 검정 시 포식작용을 할 수 있었다. 이러한 추정은 하기 프로토콜에 따라 형광 포식작용 검정을 사용하여 이루어졌다.
대식세포(양성 대조군)와 푸소좀을 채취 직후 별개의 공초점 유리 바닥 디쉬에 플레이팅하였다. 대식세포와 푸소좀을 DMEM+10%FBS+1%P/S에서 1시간 동안 인큐베이션하여 부착시켰다. 플루오레세인 표지된 E. coli K12 및 비(非)플루오레세인 표지된 대장균(Escherichia coli) K-12(음성 대조군)을 제조업체의 프로토콜에 지시된 바와 같이 대식세포/푸소좀에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다(tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf). 2시간 후, 트립판 블루를 첨가하여 유리 형광 입자를 켄칭하였다. 포획된 입자에 의해 방출된 세포내 형광을 공초점 현미경으로 488 여기에서 이미지화하였다. 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 식작용 양성 푸소좀을 정량화하였다.
식작용 푸소좀의 평균 수는 생체입자 도입 2시간 후 적어도 30%였으며, 양성 대조군 대식세포에서는 30% 초과였다.
실시예 48: 단백질 분비 가능성 측정
본 실시예는 푸소좀에 의한 분비의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 분비, 예를 들어 단백질을 분비할 수 있을 것이다. 세포는 분비를 통해 물질을 배출하거나 처분할 수 있다. 일 구현예에서, 푸소좀은 분비를 통해 이의 환경과 화학적으로 상호작용 및 소통할 것이다.
주어진 속도로 단백질을 분비하는 푸소좀의 능력을 ThermoFisher Scientific 사의 Gaussia 루시퍼라아제 플래시 검정(카탈로그 #16158)을 사용하여 결정하였다. 마우스 배아 섬유아세포(양성 대조군) 또는 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 생성된 푸소좀을 성장 배지에서 인큐베이션하고, 푸소좀을 1600g에서 5분 동안 펠릿화한 후 상청액을 채취하여 배지 샘플을 15분마다 수집하였다. 채취된 샘플을 투명 바닥 96-웰 플레이트에 피펫팅하였다. 이어서, 검정 완충액의 작업 용액을 제조업체의 설명서에 따라 제조하였다.
간략하게, 콜렌테라진(colenterazine), 루시페린 또는 발광 분자를 플래시 검정 완충액과 혼합하고, 혼합물을 샘플을 함유하는 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 피펫팅하였다. 배경 Gaussia 루시퍼라아제 신호를 결정하기 위해, 세포 또는 푸소좀이 결여된 음성 대조군 웰에는 성장 배지 또는 검정 완충액을 포함시켰다. 또한, 발광 신호를 시간당 Gaussia 루시퍼라아제 분비 분자로 전환시키기 위해, 정제된 Gaussia 루시퍼라아제(Athena Enzyme Systems, 카탈로그 #0308)의 표준 곡선을 제조하였다.
500 msec 통합을 사용하여 플레이트를 발광에 대해 검정하였다. 모든 샘플에서 배경 Gaussia 루시퍼라아제 신호를 빼고, Gaussia 루시퍼라아제 표준 곡선에 대해 선형 최적 곡선을 계산하였다. 샘플 판독값이 표준 곡선 내에 핏팅되지 않는 경우, 이를 적절하게 희석하고 재검정하였다. 이러한 검정을 사용하여 측정 시, 주어진 범위 내 비율(분자/시간)로 Gaussia 루시퍼라아제를 분비하는 푸소좀의 능력을 결정하였다.
일 구현예에서, 푸소좀은 양성 대조군 세포의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(또는 그 이상)인 비율로 단백질을 분비할 수 있을 것이다.
실시예 49: 신호 전달 가능성 측정
본 실시예는 푸소좀에서의 신호 전달의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 신호 전달을 할 수 있다. 세포는 신호 전달로 공지된 과정에서 인산화와 같은 신호전달 캐스케이드를 통해 세포외 환경으로부터 분자 신호를 보내고 받을 수 있다. 부분적 또는 완전 핵 불활성화를 갖는 포유류 세포로부터의 푸소좀을 포함하는, 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조된 정제된 푸소좀 조성물은, 인슐린에 의해 유도된 신호 전달이 가능하다. AKT 인산화 수준, 인슐린 수용체 신호전달 캐스케이드에서의 핵심 경로, 및 인슐린에 대한 반응으로 글루코오스 흡수를 측정하여, 인슐린에 의해 유도된 신호 전달을 평가하였다.
AKT 인산화를 측정하기 위해, 세포, 예를 들어 마우스 배아 섬유아세포(MEF)(양성 대조군)와 푸소좀을 48-웰 플레이트에 플레이팅하고, 가습 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 정치시켰다. 세포 부착 후, 인슐린(예를 들어, 10 nM), 또는 인슐린 미포함 음성 대조군 용액을, 세포 또는 푸소좀 함유 웰에 30분 동안 첨가하였다. 30분 후, 단백질 용해물이 푸소좀 또는 세포에서 제조되었으며, 포스포-AKT 수준을 인슐린 자극된 및 인슐린 미자극된 대조군 샘플에서 웨스턴 블롯팅으로 측정하였다.
인슐린 또는 음성 대조군 용액에 대한 반응으로의 글루코오스 흡수를 표지된 글루코오스(2-NBDG)를 사용하여 글루코오스 흡수 섹션에 설명된 바와 같이 측정하였다. (문헌[S. Galic et al., Molecular Cell Biology 25(2): 819-829, 2005]).
일 구현예에서, 푸소좀은, 음성 대조군에 비해 인슐린에 대한 반응으로의 AKT 인산화 및 글루코오스 흡수를, 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(또는 그 이상) 증강시킬 것이다.
실시예 50: 세포막을 가로질러 글루코오스를 수송하는 능력 측정
본 실시예는 살아있는 세포에서 글루코오스 흡수를 모니터링함으로써, 지질 이중층을 가로지르는 능동 수송을 측정하는 데 사용될 수 있는 형광 글루코오스 유사체인 2-NBDG (2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-2-데옥시글루코오스) 수준의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀의 지질 이중층을 가로지르는 글루코오스 흡수 및 능동 수송의 수준을 측정하는 데 본 검정을 사용할 수 있다.
푸소좀 조성물은 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 생성하였다. 이어서, 충분한 수의 푸소좀을 글루코오스 미함유, 20% 소태아혈청 및 1x 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM에서 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간의 글루코오스 고갈 기간 후, 글루코오스 미함유 DMEM, 20% 소태아혈청, 1x 페니실린/스트렙토마이신 및 20 uM 2-NBDG(ThermoFisher)를 포함하도록 배지를 교환하고, 37℃ 및 5% CO2에서 추가 2시간 동안 인큐베이션하였다.
음성 대조군 푸소좀은, 2-NBDG 대신 동일한 양의 DMSO를 첨가한 것을 제외하고는, 동일하게 처리하였다.
이어서, 푸소좀을 1xPBS로 3회 세척하고, 적절한 완충액 중에 재현탁시키고, 96-웰 이미지화 플레이트로 옮겼다. 이어서, GFP 광 큐브(469/35 여기 필터 및 525/39 방출 필터)를 사용하여 형광계에서 2-NBDG 형광을 측정하여, 푸소좀 막을 가로질러 수송되고, 1시간 로딩 기간 동안 푸소좀에 축적된 2-NBDG의 양을 정량화하였다.
일 구현예에서, 2-NBDG 형광은 음성(DMSO) 대조군과 비교하여 2-NBDG 처리된 푸소좀에서 더 높을 것이다. 525/39 방출 필터를 이용한 형광 측정은 존재하는 2-NBDG 분자의 수와 상관관계가 있을 것이다.
실시예 51: 시토졸 내 에스테라아제 활성 측정
본 실시예는 푸소좀 내 대사 활성에 대한 대용물로서의 에스테라아제 활성의 정량화를 설명한다. 푸소좀 내 시토졸 에스테라아제 활성은 칼세인-AM 염색의 정량적 평가로 결정하였다(문헌[Bratosin et al., Cytometry 66(1): 78-84, 2005]).
막 투과성 염료인 칼세인-AM(Molecular Probes, Eugene OR USA)을, 디메틸설폭시드 중 10 mM 스톡 용액 및 PBS 완충액(pH 7.4) 중 100 mM 작업 용액으로 제조하였다. 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 생성된 푸소좀 또는 양성 대조군인 모 마우스 배아 섬유아세포를 PBS 완충액 중에 재현탁시키고, 칼세인-AM 작업 용액(칼세인-AM 최종 농도: 5 mM)과 함께 암실에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 칼세인 형광 보유의 즉각적인 유세포분석을 위해 PBS 완충액으로 희석하였다.
푸소좀과 대조군 모 마우스 배아 섬유아세포를, 문헌[Jacob et al., Cytometry 12(6): 550-558, 1991]에 기재된 바와 같이, 사포닌을 이용하여 제로(0) 에스테라아제 활성에 대한 음성 대조군으로서 실험적으로 투과성으로 만들었다. 푸소좀과 세포를 0.05% 소듐 아지드가 함유된 PBS 완충액(pH 7.4) 중 1% 사포닌 용액에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 원형질막 투과화의 가역적 특성으로 인해, 사포닌을 추가 염색 및 세척 단계에 사용되는 모든 완충액에 포함시켰다. 사포닌 투과화 후, 푸소좀과 세포를 0.1% 사포닌 및 0.05% 소듐 아지드가 함유된 PBS 완충액 중에 재현탁시키고, 최종 농도 5 mM까지 칼세인-AM과 함께 (암실에서 37℃에서 45분 동안) 인큐베이션하고, 0.1% 사포닌 및 0.05% 소듐 아지드가 함유된 동일한 PBS 완충액으로 3회 세척하고, 유세포분석으로 분석하였다. 488 nm 아르곤 레이저 여기를 이용하는 FACS 세포측정기(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 유세포분석을 수행하고, 530+/-30 nm에서 방출을 수집하였다. 수집 및 분석을 위해 FACS 소프트웨어를 사용하였다. 광산란 채널은 선형 증가로 설정하고, 형광 채널은 로그 스케일로 설정하고, 각각의 조건에서 최소 10,000개의 세포를 분석하였다. 각 샘플에서 칼세인-AM의 강도를 기준으로 상대 에스테라아제 활성을 계산하였다. 모든 사건을 전방 및 측방 분산 채널에서 포획하였다(대안적으로, 푸소좀 집단만 선택하도록 게이트를 적용할 수 있음). 각각의 음성 대조군인 사포닌 처리된 샘플의 형광 강도(FI) 값을 빼서 푸소좀에 대한 형광 강도(FI) 값을 결정하였다. 푸소좀 샘플에 대한 정규화된 에스테라아제 활성을 각각의 양성 대조군 세포 샘플에 대해 정규화하여, 시토졸 에스테라아제 활성에 대한 정량적 측정을 생성하였다.
일 구현예에서, 푸소좀 제제는 양성 대조군 세포와 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(또는 그 이상) 이내의 에스테라아제 활성을 가질 것이다.
또한, 문헌[Bratosin D, Mitrofan L, Palii C, Estaquier J, Montreuil J. Novel fluorescence assay using calcein-AM for the determination of human erythrocyte viability and aging. Cytometry A. 2005 Jul;66(1):78-84]; 및 문헌[Jacob BC, Favre M, Bensa JC. Membrane cell permeabilisation with saponin and multiparametric analysis by flow cytometry. Cytometry 1991;12:550-558] 참조.
실시예 52: 푸소좀 내 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정
아세틸콜린에스테라아제 활성은 이전에 기재된 절차(문헌[Ellman, et al., Biochem. Pharmacol. 7, 88, 1961]) 및 제조업체의 권장사항에 따라 키트(MAK119, SIGMA)를 사용하여 측정하였다.
간략하게, 푸소좀을 PBS(pH 8) 중 1.25 mM 아세틸티오콜린 중에 재현탁시키고, PBS(pH 7) 중 0.1 mM 5,5-디티오-비스(2-니트로벤조산)과 혼합하였다. 인큐베이션은 실온에서 수행하였지만, 푸소좀과 기질 용액은 광학 밀도 판독 시작 전 37℃에서 10분 동안 예비 가온시켰다.
플레이트 판독기 분광광도계(ELX808, BIO-TEK instruments, Winooski, VT, USA)를 이용하여 450 nm에서 10분 동안 흡광도 변화를 모니터링하였다. 별도로, 정규화를 위해 비신코닌산 검정을 통해 푸소좀의 단백질 함량을 결정하는 데 샘플을 사용하였다. 이러한 검정을 사용하여 측정 시, 푸소좀을 단백질 1 μg당 100 미만의 AChE 활성 단위를 갖는 것으로 결정하였다.
일 구현예에서, 단백질 1 μg당 AChE 활성 단위 값은 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 또는 1000 미만일 것이다.
실시예 53: 대사 활성 수준 측정
본 실시예는 푸소좀에서의 시트레이트 신타아제 활성 측정의 정량화를 설명한다.
시트레이트 신타아제는 옥살로아세테이트(OAA)와 아세틸-CoA 사이의 반응을 촉진시켜 시트레이트를 생성하는 트리카르복실산(TCA) 회로 내 효소이다. 아세틸-CoA의 가수분해 시, 티올기를 갖는 CoA(CoA-SH)가 방출된다. 티올기는 화학물질 시약인 5,5-디티오비스-(2-니트로벤조산)(DTNB)과 반응하여, 412 nm에서 분광광도계로 측정될 수 있는 황색 생성물인, 5-티오-2-니트로벤조산(TNB)을 형성한다(Green 2008). Abcam 인간 시트레이트 신타아제 활성 검정 키트(Human Citrate Synthase Activity Assay Kit)(Product #ab119692)와 같은 상업적으로 입수 가능한 키트는, 이러한 측정을 수행하는 데 필요한 모든 시약을 제공한다.
검정은 제조업체의 권장사항에 따라 수행하였다. 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조된 푸소좀을 채취하고, 이를 추출 완충액(Abcam) 중에 얼음 상에서 20분 동안 용해시켜, 푸소좀 샘플 용해물을 제조하였다. 원심분리 후 상청액을 채취하고, 단백질 함량을 비신코닌산 검정(BCA, ThermoFisher Scientific)으로 평가하고, 제제를 후속 정량화 프로토콜이 개시될 때까지 얼음 위에서 유지시켰다.
간략하게, 푸소좀 용해물 샘플을 제공된 마이크로플레이트 웰 내 1X 인큐베이션 완충액(Abcam)으로 희석하고, 한 세트의 웰에는 1X 인큐베이션 완충액만 넣었다. 플레이트를 밀봉하고, 300 rpm에서 진탕하면서 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 웰에서 완충액을 흡인하고, 1X 세척 완충액을 첨가하였다. 이러한 세척 단계를 1회 더 반복하였다. 이어서, 1X 활성 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기에서 30분 동안 20초마다 412 nm에서 흡광도를 측정하여(판독 사이에 진탕시킴) 플레이트를 분석하였다.
모든 웰에서 배경 값(1X 인큐베이션 완충액만 함유한 웰)을 빼고, 시트레이트 신타아제 활성을 로딩된 푸소좀 용해물 샘플 1 μg당 분당 흡광도 변화로 표현하였다(ΔmOD@412 nm/min/ug 단백질). 반응속도 측정의 100초에서 400초까지의 선형 부분만을 사용하여, 활성을 계산하였다.
일 구현예에서, 푸소좀 제제는 대조군 세포와 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(또는 그 이상) 이내의 신타아제 활성을 가질 것이다.
예를 들어, 문헌[Green HJ et al. Metabolic, enzymatic, and transporter response in human muscle during three consecutive days of exercise and recovery. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 295: R1238-R1250, 2008] 참조.
실시예 54: 호흡 수준 측정
본 실시예는 푸소좀의 호흡 수준 측정의 정량화를 설명한다. 세포의 호흡 수준은 대사를 일어나게 하는 산소 소비의 척도일 수 있다. 푸소좀 호흡은 Seahorse 세포외 플럭스 분석기(Agilent)(Zhang 2012)로 산소 소비율에 대해 측정하였다.
푸소좀을 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 생성하거나, 세포를 96-웰 Seahorse 마이크로플레이트(Agilent)에 씨딩하였다. 마이크로플레이트를 짧게 원심분리하여, 웰의 바닥에 푸소좀과 세포를 펠릿화하였다. 성장배지를 제거하고, 25 mM 글루코오스와 2 mM 글루타민이 함유된 저 완충 DMEM 최소 배지(Agilent)로 대체하고, 온도 및 pH 평형을 위해 마이크로플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하여, 산소 소비 검정을 개시하였다.
이어서, 부착된 푸소좀과 세포를 바로 둘러싸는 배지 중에서 세포외 산소 및 pH 변화를 측정하는 세포외 플럭스 분석기(Agilent)에서 마이크로플레이트를 검정하였다. 정상 상태 산소 소비(기초 호흡률) 및 세포외 산성화율을 수득한 후, ATP 신타아제를 저해하는 올리고마이신(5 μM)과, 미토콘드리아를 분리시키는 양성자 이오노포어인 FCCP(카르보닐 시아니드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존; 2 μM)를 마이크로플레이트 내 각각의 웰에 첨가하여, 최대 산소 소비율에 대한 값을 수득하였다.
최종적으로, 5 μM 안티마이신 A(미토콘드리아 복합체 III 저해제)를 첨가하여, 호흡 변화가 주로 미토콘드리아 호흡으로 인한 것임을 확인하였다. 모든 산소 소비 측정치에서 안티마이신 A 첨가 후 최소 산소 소비율을 빼서, 비(非)미토콘드리아 호흡 구성요소를 제거하였다. 올리고마이신(기저 값에서 산소 소비율 적어도 25% 감소) 또는 FCCP(올리고마이신 후 산소 소비율 적어도 50% 증가)에 대해 적절하게 반응하지 않는 세포 샘플을 분석에서 제외시켰다. 이어서, 푸소좀 호흡 수준을 pmol O2/min/1e4 푸소좀으로 측정하였다.
이어서, 이러한 호흡 수준을 각각의 세포 호흡 수준으로 정규화하였다. 일 구현예에서, 푸소좀은 각각의 세포 샘플과 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(또는 그 이상)의 호흡 수준을 가질 것이다.
예를 들어, 문헌[Zhang J, Nuebel E, Wisidagama DRR, et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature protocols. 2012;7(6):10.1038/nprot.2012.048. doi:10.1038/nprot.2012.048] 참조.
실시예 55: 푸소좀의 포스파티딜세린 수준 측정
본 실시예는 푸소좀 표면에의 아넥신-V 결합 수준의 정량화를 설명한다.
세포 사멸은 프로그래밍된 세포 사멸 경로에서 세포자멸사의 마커인 포스파티딜세린을 세포 표면 상에 표시할 수 있다. 아넥신-V는 포스파티딜세린에 결합하기 때문에, 아넥신-V 결합은 세포의 생존능에 대한 대용물이다.
푸소좀은 본원에 기재된 바와 같이 생성하였다. 세포자멸사 신호 검출을 위해, 푸소좀 또는 양성 대조군 세포를 5% 아넥신 V 플루오르 594(A13203, Thermo Fisher, Waltham, MA)로 염색하였다. 각각의 군(하기 표에 상세화됨)에는 세포자멸사 유도제인 메나디온으로 처리된 실험군이 포함되어 있었다. 메나디온을 100 μM 메나디온으로 4시간 동안 첨가하였다. 모든 샘플을 유세포분석기(Thermo Fisher, Waltham, MA)에서 실행시키고, 파장 561 nm의 YL1 레이저 및 585/16 nm의 방출 필터를 이용하여 형광 강도를 측정하였다. 모든 군의 아넥신 V의 형광 강도를 비교하여 세포외 포스파티딜세린의 존재를 정량화하였다.
음성 대조군인 염색되지 않은 푸소좀은 아넥신 V 염색에 대해 양성이 아니었다.
일 구현예에서, 푸소좀은 메나디온에 대한 반응으로 세포 표면 상의 포스파티딜세린 표시를 상향조절할 수 있으며, 이는 비(非)메나디온 자극된 푸소좀이 세포자멸사를 거치지 않음을 나타낸다. 일 구현예에서, 메나디온으로 자극된 양성 대조군 세포는 메나디온으로 자극되지 않은 푸소좀보다 더 높은 수준의 아넥신 V 염색을 나타냈다.
Figure pct00068
실시예 56: 적스타크린 신호전달 수준 측정
본 실시예는 푸소좀에서의 적스타크린 신호전달의 정량화를 설명한다.
세포는 적스타크린 신호전달을 통해 세포 접촉 독립적 신호전달을 형성할 수 있다. 일 구현예에서, 푸소좀에서 적스타크린 신호전달의 존재는, 푸소좀이 이의 바로 근처에 있는 세포를 자극하고, 억제하고, 일반적으로 이와 소통할 수 있음을 입증할 것이다.
부분적 또는 완전한 핵 불활성화를 갖는 포유류 골수간질세포(BMSC)에서 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 생성된 푸소좀은, 대식세포에서의 적스타크린 신호전달을 통해 IL-6 분비를 촉발시킨다. 1차 대식세포와 BMSC를 공동 배양하였다. 골수 유래 대식세포를 먼저 6-웰 플레이트에 씨딩하고, 24시간 동안 인큐베이션한 후, 1차 마우스 BMSC 유래 푸소좀 또는 BMSC 세포(양성 대조군 모세포)를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지 중 대식세포 상에 위치시켰다. 상청액을 상이한 시점(2시간, 4시간, 6시간, 24시간)에서 채취하고, ELISA 검정에 따라 IL-6 분비를 분석하였다. (Chang J. 등의 문헌(2015)).
일 구현예에서, BMSC 푸소좀에 의해 유도된 적스타크린 신호전달 수준을, 배지 중 대식세포 분비 IL-6 수준의 증가로 측정하였다. 일 구현예에서, 적스타크린 신호전달 수준은 양성 대조군인 골수간질세포(BMSC)에 의해 유도된 수준의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(또는 그 이상)일 것이다.
실시예 57: 파라크린 신호전달 수준 측정
본 실시예는 푸소좀에서의 파라크린 신호전달의 정량화를 설명한다.
세포는 파라크린 신호전달을 통해 국소 미세환경에서 다른 세포와 소통할 수 있다. 일 구현예에서, 푸소좀은 파라크린 신호전달이 가능하여, 예를 들어 이의 국소 환경에서 세포와 통신할 수 있다. 일 구현예에서, 하기 프로토콜을 갖는 파라크린 유도성 분비를 통해 내피세포에서 Ca2+ 신호전달을 촉발시키는 푸소좀의 능력은, 칼슘 지시계인 fluo-4 AM을 통해 Ca2+ 신호전달을 측정할 것이다.
실험 플레이트를 제조하기 위해, 쥣과 폐 미세혈관 내피세포(MPMVEC)를 0.2% 젤라틴 코팅된 25 mm 유리 바닥 공초점 디쉬에 플레이팅하였다(80% 컨플루언스(confluence)). MPMVEC를 2% BSA 및 0.003% 플루론산이 함유된 ECM에서 5 μM fluo-4 AM(Invitrogen) 최종 농도로 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여, fluo-4 AM의 로딩을 가능하게 하였다. 로딩 후, MPMVEC를 설핀피라존이 함유된 실험 이미지화 용액(0.25% BSA가 함유된 ECM)으로 세척하여, 염료 손실을 최소화하였다. fluo-4 로딩 후, 예비 가온된 실험 이미지화 용액 500μl를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 Zeiss 공초점 이미지화 시스템으로 이미지화하였다.
별도의 튜브에, 새로 단리된 쥣과 대식세포를 배양 배지(DMEM+10% FBS) 중 1μg/ml LPS로 처리하거나, LPS로 처리하지 않았다(음성 대조군). 자극 후, 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 대식세포에서 푸소좀을 생성하였다.
이어서, 푸소좀 또는 모 대식세포(양성 대조군)를 2% BSA와 0.003% 플루론산이 함유된 ECM 중의 cell tracker red CMTPX(Invitrogen)로 표지하였다. 이어서, 푸소좀과 대식세포를 세척하고, 실험 이미지화 용액 중에 재현탁시켰다. 표지된 푸소좀과 대식세포를 공초점 플레이트 내 fluo-4 AM 로딩된 MPMVEC 상에 첨가하였다.
fluo-4 AM와 cell tracker red 형광 각각에 대해, 녹색 및 적색 형광 신호를 488 nm 및 561 nm에서 여기되는 아르곤 이온 레이저 공급원을 포함하는 Zeiss 공초점 이미지화 시스템을 사용하여 10분 내지 20분 동안 3초마다 기록하였다. fluo-4 형광 강도 변화는 이미지화 소프트웨어를 사용하여 분석하였다(문헌[Mallilankaraman, K. et al., J Vis Exp. (58): 3511, 2011]). LPS 자극된 푸소좀 및 세포 군에서 측정된 fluo-4 강도 수준에서, 음성 대조군 푸소좀 및 세포 군에서 측정된 fluo-4 강도 수준을 뺐다.
일 구현예에서, 푸소좀, 예를 들어 활성화된 푸소좀은, 양성 대조군 세포 군의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(또는 그 이상)의 fluo-4 형광 강도의 증가를 유도할 것이다.
실시예 58: 이동성을 위한 액틴 중합 능력 측정
본 실시예는 푸소좀에서 액틴과 같은 세포골격 구성요소의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 액틴과 같은 세포골격 구성요소를 포함하며, 액틴을 중합할 수 있다.
세포는 운동성 및 다른 세포질 과정을 위한 세포골격 구성요소인 액틴을 사용한다. 세포골격은 운동성 구동력을 생성하고, 운동 과정을 조정하는 데 필수적이다.
C2C12세포는 본원에 기재된 바와 같이 핵을 제거하였다. 12.5% 내지 15% 피콜(Ficoll) 층에서 얻은 푸소좀은 풀링하여 '라이트(Light)'로 표지하였으며, 16% 내지 17% 층에서 얻은 푸소좀은 풀링하여 '미디엄(Medium)'으로 표지하였다. 푸소좀 또는 세포(모 C2C12세포, 양성 대조군)를DMEM + Glutamax + 10% 소태아혈청 (FBS)에 재현탁시키고, 24-웰 초저부착 플레이트(#3473, Corning Inc, Corning, NY)에 플레이팅하고, 37℃ + 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 샘플을 주기적으로(5.25시간, 8.75시간, 26.5시간) 취하고, 165 μM 로다민 팔로이딘(rhodamine phalloidin)으로 염색하고(음성 대조군은 염색하지 않음), FC 레이저 YL1(561 nm, 585/16 필터)가 장착된 유세포분석기(#A24858, Thermo Fisher, Waltham, MA)로 측정하여, F-액틴 세포골격 구성요소 함량을 측정하였다. 푸소좀 내 로다민 팔로이딘의 형광 강도를 염색되지 않은 푸소좀 및 염색된 모 C2C12세포와 함께 측정하였다.
푸소좀 형광 강도(도 1)는 모든 시점에서 음성 대조군보다 더 컸으며, 푸소좀은 모 C2C12세포와 유사한 비율로 액을 중합할 수 있었다.
하기 표에 열거된 바와 같은 추가의 세포골격 구성요소를, 상업적으로 입수 가능한 ELISA 시스템(Cell Signaling Technology and MyBioSource)을 통해 제조업체의 설명서에 따라 측정하였다.
Figure pct00069
이어서, 적절하게 희석된 용해물 100 uL를 마이크로웰 스트립의 적절한 웰에 첨가하였다. 마이크로웰을 테이프로 밀봉하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 밀봉 테이프를 제거하고, 내용물을 폐기하였다. 각각의 마이크로웰을 1X 세척 완충액 200 uL로 4회 세척하였다. 각각의 개별 세척 후, 플레이트를 흡수성이 있는 천 위에서 두드려, 잔류 세척 용액을 각각의 웰에서 제거하였다. 하지만, 웰은 실험 동안 어느 때라도 완전히 건조되지 않았다.
다음으로, 재구성된 검출 항체(녹색) 100 ul를 음성 대조군 웰을 제외한 각각의 개별 웰에 첨가하였다. 이어서, 웰을 밀봉하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 세척 과정을 반복하였다. 재구성된 HRP 결합 2차 항체(적색) 100 uL를 각각의 웰에 첨가하였다. 웰을 테이프로 밀봉하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 밀봉 테이프를 제거하고, 세척 절차를 반복하였다. 이어서, TMB 기질 100 uL를 각각의 웰에 첨가하였다. 웰을 테이프로 밀봉한 후, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 최종 인큐베이션이 완결된 후, 정지 용액 100 uL를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 몇 초 동안 가볍게 진탕시켰다.
정지 용액 첨가 후 30분 이내에 검정의 분광광도계 분석을 수행하였다. 웰의 밑면을 보풀이 일어나지 않는 티슈로 닦은 후, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 일 구현예에서, 검출 항체로 염색된 푸소좀 샘플은 음성 대조군 푸소좀 샘플보다 450 nm에서 더 많은 광을 흡수하고, 검출 항체로 염색된 세포 샘플보다 더 적은 광을 흡수할 것이다.
실시예 59: 평균 막 전위 측정
본 실시예는 푸소좀의 미토콘드리아 막 전위의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 미토콘드리아 막을 포함하는 푸소좀은 미토콘드리아 막 전위를 유지할 것이다.
미토콘드리아 대사 활성은 미토콘드리아 막 전위로 측정할 수 있다. 푸소좀 제제의 막 전위를 미토콘드리아 막 전위를 평가하는 상업적으로 입수 가능한 염료인 TMRE(TMRE: 테트라메틸 로다민, 에틸 에스테르, 퍼클로레이트, Abcam, Cat# T669)를 사용하여 정량화하였다.
푸소좀은 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 생성하였다. 푸소좀 또는 모세포를 성장 배지(10% 소태아혈청이 포함된 페놀-레드 미함유 DMEM)에 6개의 분취액(미처리군 및 FCCP 처리군, 3중으로)으로 희석하였다. 샘플 중 하나의 분취액을 미토콘드리아 막 전위를 제거하고, TMRE 염색을 방지하는 결합 해제제(uncoupler)인 FCCP와 함께 인큐베이션하였다. FCCP 처리된 샘플의 경우, 2 μM FCCP를 샘플에 첨가하고, 분석 전 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 푸소좀과 모세포를 30 nM TMRE로 염색하였다. 각각의 샘플에 대해, 염색되지 않은(TMRE 미함유) 샘플을 또한 함께 제조하였다. 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 유세포분석기에서 488 nm 아르곤 레이저로 분석하고, 여기 및 방출을 530+/-30 nm에서 수집하였다.
막 전위 값(밀리볼트, mV)을 TMRE의 강도를 기준으로 계산하였다. 모든 사건을 전방 및 측방 분산 채널에서 포획하였다(대안적으로, 작은 파편을 제외시키기 위해 게이트를 적용할 수 있음). 미처리된 및 FCCP 처리된 샘플의 기하 평균에서 염색되지 않은 샘플의 형광 강도의 기하 평균을 빼서, 미처리된 및 FCCP 처리된 샘플 모두에 대한 형광 강도(FI) 값을 정규화하였다. 각각의 제제에 대한 막 전위 상태는 TMRE 형광을 기반으로(TMRE는 네른스트 방식으로 미토콘드리아에 축적되기 때문에) 푸소좀 또는 세포의 미토콘드리아 막 전위를 결정하는 데 사용될 수 있는, 변형된 네른스트(Nernst) 방정식(하기 참조)으로 정규화된 형광 강도 값을 사용하여 계산하였다.
푸소좀 또는 세포막 전위는 하기 식으로 계산하였다: (mV) = -61.5 * log(FI미처리-정규화됨/FIFCCP-처리-정규화됨). 일 구현예에서, C2C12 마우스 근아세포의 푸소좀 제제에 대해 이러한 검정을 사용하면, 푸소좀 제제의 막 전위 상태는 모세포의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(또는 그 이상) 이내일 것이다. 일 구현예에서, 막 전위 범위는 약 -20 mV 내지 -150 mV였다.
실시예 60: 대상에서 지속성 반감기 측정
본 실시예는 푸소좀 반감기의 측정을 설명한다.
푸소좀을 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 생성된 Gaussia 루시퍼라아제를 발현하는 세포에서 유도하고, 순수한, 완충 용액 중의 1:2, 1:5 및 1:10 희석액을 제조하였다. 푸소좀이 결여된 완충 용액은 음성 대조군으로 사용하였다.
각각의 용량을 3마리의 8주령 수컷 C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratories)에게 정맥내 투여하였다. 푸소좀의 정맥내 투여 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 및 72시간 후 안와구 뒤 정맥에서 혈액을 채취하였다. 실험의 종료 시 CO2 흡입으로 동물을 희생시켰다.
혈액을 실온에서 20분 동안 원심분리하였다. 혈청 샘플은 생물분석 때까지 -80℃로 즉시 동결시켰다. 이어서, 각각의 혈액 샘플을 사용하여, 샘플을 Gaussia 루시퍼라아제 기질(Nanolight, Pinetop, AZ)과 혼합한 후, Gaussia 루시퍼라아제 활성 검정을 수행하였다. 간략하게, 콜렌테라진, 루시페린 또는 발광 분자를 플래시 검정 완충액과 혼합하고, 혼합물을 96-웰 플레이트 중 혈액 샘플을 함유하는 웰에 피펫팅하였다. 배경 Gaussia 루시퍼라아제 신호를 결정하기 위해, 혈액이 결여된 음성 대조군 웰에 검정 완충액을 포함시켰다.
또한, 발광 신호를 시간당 Gaussia 루시퍼라아제 분비 분자로 전환시키기 위해, 양성 대조군인 정제된 Gaussia 루시퍼라아제(Athena Enzyme Systems, 카탈로그 #0308)의 표준 곡선을 제조하였다. 500 msec 통합을 사용하여 플레이트를 발광에 대해 검정하였다. 모든 샘플에서 배경 Gaussia 루시퍼라아제 신호를 빼고, Gaussia 루시퍼라아제 표준 곡선에 대해 선형 최적 곡선을 계산하였다. 샘플 판독값이 표준 곡선 내에 핏팅되지 않는 경우, 이를 적절하게 희석하고 재검정하였다. 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 및 72시간에서 샘플에서 취한 루시퍼라아제 신호를 표준 곡선에 내삽하였다. 제거율 상수 ke(h-1)는 1-구획 모델의 하기 방정식을 사용하여 계산하였다: C(t) = C 0 x e -kext (여기서, C(t) (ng/mL)는 시간 t (h)에서의 푸소좀 농도이고, C 0 는 시간 = 0 (ng/mL)에서의 푸소좀 농도임). 제거 반감기 t 1/2,e (h)는 ln(2)/k e 로 계산하였다.
일 구현예에서, 푸소좀은 음성 대조군 세포의 반감기의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%(또는 그 이상)의 반감기를 가질 것이다.
실시예 61: 비세포내이입 경로를 통한 푸소좀 전달
본 실시예는 비세포내이입 경로를 통한 수용세포로의 Cre의 푸소좀 전달의 정량화를 설명한다.
일 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀 매개 비세포내이입 경로를 통해 작용제를 전달할 것이다. 이론에 구애됨 없이, 작용제, 예를 들어 푸소좀의 내강 내에서 운반되는 Cre의, 푸소좀의 세포내이입 매개 흡수에 대한 어떠한 요건 없이 수용세포의 시토졸로의 직접 전달은, 푸소좀 매개 비세포내이입 경로 전달을 통해 일어날 것이다.
본 실시예에서, 푸소좀은 이의 원형질막에 센다이바이러스 H 및 F 단백질을 발현하는 HEK293T 세포를 포함한다(문헌[Tanaka et al., 2015, Gene Therapy, 22(October 2014), 1-8](https://doi.org/10.1038/gt.2014.123)). 또한, 푸소좀은 mTagBFP2 형광 단백질과 Cre 재조합효소를 발현한다. 표적세포는 CMV 프로모터 하에서 "LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP" 카세트를 안정적으로 발현하는 RPMI8226 세포로서, 이는 Cre에 의한 재조합 시, GFP에서 RFP 발현으로 전환하여, 융합 및 Cre를 전달의 마커로서 나타낸다.
본원에 기재된 방법에 따라 생성된 푸소좀을 하기와 같이 비세포내이입 경로를 통한 Cre의 전달에 대해 검정하였다. 수용세포를 흑색의 투명 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음으로, 수용세포 플레이팅 24시간 후, Cre 재조합효소 단백질을 발현하고 특정 푸소겐 단백질을 보유하는 푸소좀을, DMEM 배지 중 수용세포에 적용하였다. 비세포내이입 경로를 통한 Cre 전달 수준을 결정하기 위해, 푸소좀을 수용하는 수용세포의 병용 군을 엔도좀 산성화 저해제인 클로로퀸(30 μg/mL)으로 처리하였다. 푸소좀의 용량은 웰에 플레이팅된 수용세포의 수와 상관관계가 있었다. 푸소좀 적용 후, 푸소좀과 수용세포 사이의 접촉을 개시하는 것을 돕기 위해 세포 플레이트를 400g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 세포를 16시간 동안 인큐베이션하고, 작용제 전달인 Cre를 이미지화를 통해 평가하였다.
필드 또는 웰에서 RFP-양성 세포 대 GFP-양성 세포를 긍정적으로 식별할 수 있도록 세포 웰을 이미지화하였다. 본 실시예에서, 자동화 형광 현미경을 사용하여 세포 플레이트를 이미지화하였다. 먼저, DMEM 배지에서 10분 동안 Hoechst 33342로 세포를 염색하여 주어진 웰 내 총 세포 집단을 결정하였다. Hoechst 33342는 세포 핵을 DNA에 삽입하여 염색시키기 때문에, 개별 세포를 식별하는 데 사용된다. 염색 후, Hoechst 배지를 일반 DMEM 배지로 대체하였다.
405 nm LED 및 DAPI 필터 큐브를 사용하여 Hoechst를 이미지화하였다. GFP는 465 nm LED 및 GFP 필터 큐브를 사용하여 이미지화하고, RFP는 523 nm LED 및 RFP 필터 큐브를 사용하여 이미지화하였다. 먼저, 양성 대조군 웰; 즉, 푸소좀 대신 Cre 재조합효소를 코딩하는 아데노바이러스로 처리된 수용세포에서 LED 강도 및 통합 시간을 확립하여, 상이한 세포 군의 이미지를 획득하였다.
RFP 및 GFP 강도가 최대 픽셀 강도 값에 있지만 포화되지 않도록, 수집 설정을 설정하였다. 이어서, 관심 웰을 확립된 설정을 사용하여 이미지화하였다.
형광 현미경이 장착된 소프트웨어 또는 다른 소프트웨어를 이용하여 GFP 및 RFP-양성 웰의 분석을 수행하였다(Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, 1997-2007). 롤링 볼 배경 제거 알고리즘을 사용하여 60 μm 너비로 이미지를 사전 처리하였다. 총 세포 마스크를 Hoechst 양성 세포에 대해 설정하였다. 배경 강도를 유의하게 상회하는 Hoechst 강도를 갖는 세포에 대해 임계값을 설정하는 데 사용하고, Hoechst 양성 세포가 되기에 너무 작거나 큰 영역은 제외시켰다.
총 세포 마스크 내에서, 배경을 유의하게 상회하는 세포에 대해 다시 임계값을 설정하고, 전체 세포 영역에 대한 Hoechst (핵) 마스크를 전체 GFP 및 RFP 세포 형광을 포함하도록 확장시켜 GFP 및 RFP 양성 세포를 식별하였다.
수용세포를 함유하는 대조군 웰에서 식별된 RFP 양성 세포의 수를, 푸소좀을 함유하는 웰 내 RFP 양성 세포의 수에서 빼는 데 사용하였다(비특이적 Loxp 재조합에 대해 뺌). 이어서, RFP 양성 세포(Cre를 수용한 수용세포)를 GFP-양성 세포(Cre를 수용하지 않은 수용세포)와 RFP-양성 세포의 합으로 나누어, 수용세포 집단에 전달된 푸소좀 Cre의 분획을 정량화하였다. 상기 수준을 수용세포에 적용된 푸소좀의 주어진 용량으로 정규화하였다. 비세포내이입 경로를 통해 전달된 푸소좀 Cre의 값을 계산하기 위해, 클로로퀸 존재 하의 푸소좀 Cre 전달 수준(FusL+CQ) 뿐 아니라, 클로로퀸 부재 하의 푸소좀 Cre 전달 수준(FusL-CQ)을 결정하였다. 비세포내이입 경로를 통해 전달된 푸소좀 Cre의 정규화된 값을 결정하기 위해, 하기 방정식을 사용하였다: [(FusL-CQ)-(FusL+CQ)]/(FusL-CQ).
일 구현예에서, 주어진 푸소좀에 대해 비세포내이입 경로를 통해 전달된 푸소좀 Cre의 평균 수준은, 0.1 내지 0.95 범위, 또는 클로로퀸 처리된 수용세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)일 것이다.
실시예 62: 세포내이입 경로를 통한 푸소좀 전달
본 실시예는 세포내이입 경로를 통한 수용세포로의 Cre의 푸소좀 전달을 설명한다.
일 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀 매개 세포내이입 경로를 통해 작용제를 전달할 것이다. 이론에 구애됨 없이, 작용제, 예를 들어 푸소좀의 내강에 운반된 카고의, 세포내이입 독립적인 흡수 경로로의 수용세포에의 전달은, 푸소좀 매개 세포내이입 경로 전달을 통해 일어날 것이다.
본 실시예에서, 푸소좀은 원형질막에서 푸소겐 단백질을 발현하는 HEK293T 세포를 2 μm 필터를 통해 압출시켜 생성한 미세소포를 포함한다(문헌[Lin et al., 2016, Biomedical Microdevices, 18(3)](doi.org/10.1007/s10544-016-0066-y), 문헌[Riedel, Kondor-Koch, & Garoff, 1984, The EMBO Journal, 3(7), 1477-83](www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6086326에서 검색됨)). 또한, 푸소좀은 mTagBFP2 형광 단백질과 Cre 재조합효소를 발현한다. 표적세포는 CMV 프로모터 하에서 "LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP" 카세트를 안정적으로 발현하는 PC3 세포로서, 이는 Cre에 의한 재조합 시, GFP에서 RFP 발현으로 전환하여, 융합 및 Cre를 전달의 마커로서 나타낸다.
본원에 기재된 방법에 따라 생성된 푸소좀을 하기와 같은 세포내이입 경로를 통한 전달에 대해 검정하였다. 수용세포를 사용하고자 하는 이미지화 시스템과 상용 가능한 세포 배양 다중 웰 플레이트에 플레이팅하였다(본 실시예에서, 세포를 흑색의 투명 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하였음). 다음으로, 수용세포 플레이팅 24시간 후, Cre 재조합효소 단백질을 발현하고 특정 푸소겐 단백질을 보유하는 푸소좀을, DMEM 배지 중 수용세포에 적용하였다. 세포내이입 경로를 통한 Cre 전달 수준을 결정하기 위해, 푸소좀을 수용하는 수용세포의 병용 군을 엔도좀 산성화 저해제인 클로로퀸(30 μg/mL)으로 처리하였다. 푸소좀의 용량은 웰에 플레이팅된 수용세포의 수와 상관관계가 있었다. 푸소좀 적용 후, 푸소좀과 수용세포 사이의 접촉을 개시하는 것을 돕기 위해 세포 플레이트를 400g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, 세포를 16시간 동안 인큐베이션하고, 작용제 전달인 Cre를 이미지화를 통해 평가하였다.
필드 또는 웰에서 RFP-양성 세포 대 GFP-양성 세포를 긍정적으로 식별할 수 있도록 세포 웰을 이미지화하였다. 본 실시예에서, 자동화 형광 현미경을 사용하여 세포 플레이트를 이미지화하였다. 먼저, DMEM 배지에서 10분 동안 Hoechst 33342로 세포를 염색하여 주어진 웰 내 총 세포 집단을 결정하였다. Hoechst 33342는 세포 핵을 DNA에 삽입하여 염색시키기 때문에, 개별 세포를 식별하는 데 사용된다. 염색 후, Hoechst 배지를 일반 DMEM 배지로 대체하였다.
405 nm LED 및 DAPI 필터 큐브를 사용하여 Hoechst를 이미지화하였다. GFP는 465 nm LED 및 GFP 필터 큐브를 사용하여 이미지화하고, RFP는 523 nm LED 및 RFP 필터 큐브를 사용하여 이미지화하였다. 먼저, 양성 대조군 웰; 즉, 푸소좀 대신 Cre 재조합효소를 코딩하는 아데노바이러스로 처리된 수용세포에서 LED 강도 및 통합 시간을 확립하여, 상이한 세포 군의 이미지를 획득하였다.
RFP 및 GFP 강도가 최대 픽셀 강도 값에 있지만 포화되지 않도록, 수집 설정을 설정하였다. 이어서, 관심 웰을 확립된 설정을 사용하여 이미지화하였다.
형광 현미경이 장착된 소프트웨어 또는 다른 소프트웨어를 이용하여 GFP 및 RFP-양성 웰의 분석을 수행하였다(Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, 1997-2007). 롤링 볼 배경 제거 알고리즘을 사용하여 60 μm 너비로 이미지를 사전 처리하였다. 총 세포 마스크를 Hoechst 양성 세포에 대해 설정하였다. 배경 강도를 유의하게 상회하는 Hoechst 강도를 갖는 세포에 대해 임계값을 설정하고, Hoechst 양성 세포가 되기에 너무 작거나 큰 영역은 제외시켰다.
총 세포 마스크 내에서, 배경을 유의하게 상회하는 세포에 대해 다시 임계값을 설정하고, 전체 세포 영역에 대한 Hoechst (핵) 마스크를 전체 GFP 및 RFP 세포 형광을 포함하도록 확장시켜 GFP 및 RFP 양성 세포를 식별하였다.
수용세포를 함유하는 대조군 웰에서 식별된 RFP 양성 세포의 수를, 푸소좀을 함유하는 웰 내 RFP 양성 세포의 수에서 빼는 데 사용하였다(비특이적 Loxp 재조합에 대해 뺌). 이어서, RFP 양성 세포(Cre를 수용한 수용세포)를 GFP-양성 세포(Cre를 수용하지 않은 수용세포)와 RFP-양성 세포의 합으로 나누어, 수용세포 집단에 전달된 푸소좀 Cre의 분획을 정량화하였다. 상기 수준을 수용세포에 적용된 푸소좀의 주어진 용량으로 정규화하였다. 세포내이입 경로를 통해 전달된 푸소좀 Cre의 값을 계산하기 위해, 클로로퀸 존재 하의 푸소좀 Cre 전달 수준(FusL+CQ) 뿐 아니라, 클로로퀸 부재 하의 푸소좀 Cre 전달 수준(FusL-CQ)을 결정하였다. 세포내이입 경로를 통해 전달된 푸소좀 Cre의 정규화된 값을 결정하기 위해, 하기 방정식을 사용하였다: (FusL+CQ)/(FusL-CQ).
일 구현예에서, 주어진 푸소좀에 대해 세포내이입 경로를 통해 전달된 푸소좀 Cre의 평균 수준은, 0.01 내지 0.6 범위, 또는 클로로퀸 처리된 수용세포의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%(또는 그 이상)일 것이다.
실시예 63: 디나민 매개 경로, 거대음작용 경로 또는 액틴 매개 경로를 통한 푸소좀 전달
본 실시예는 디나민 매개 경로를 통한 수용세포로의 Cre의 푸소좀 전달을 설명한다. 미세소포를 포함하는 푸소좀은 이전 실시예에 기재된 바와 같이 생성할 수 있다. 푸소좀을 수용하는 수용세포의 군을 디나민 저해제인 Dynasore(120 μM)로 처리한 것을 제외하고는, 이전 실시예에 따라, 디나민 매개 경로를 통한 Cre의 전달에 대해 푸소좀을 검정하였다. 디나민 매개 경로를 통해 전달된 푸소좀 Cre의 값을 계산하기 위해, Dynasore 존재 하의 푸소좀 전달 수준(FusL+DS) 뿐 아니라, Dynasore 부재 하의 푸소좀 전달 수준(FusL-DS)을 결정하였다. 전달된 푸소좀 Cre의 정규화된 값은 이전 실시예에 기재된 바와 같이 계산할 수 있다.
본 실시예는 또한 거대음작용을 통한 수용세포로의 Cre의 전달을 설명한다. 미세소포를 포함하는 푸소좀은 이전 실시예에 기재된 바와 같이 생성할 수 있다. 푸소좀을 수용하는 수용세포의 군을 거대음작용 저해제인 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로리드(EIPA)(25 μM)로 처리한 것을 제외하고는, 이전 실시예에 따라, 거대음작용을 통한 Cre의 전달에 대해 푸소좀을 검정하였다. 거대음작용을 통해 전달된 푸소좀 Cre의 값을 계산하기 위해, EIPA 존재 하의 푸소좀 전달 수준(FusL+EPIA) 뿐 아니라, EIPA 부재 하의 푸소좀 전달 수준(FusL-EIPA)을 결정하였다. 전달된 푸소좀 Cre의 정규화된 값은 이전 실시예에 기재된 바와 같이 계산할 수 있다.
본 실시예는 또한 액틴 매개 경로를 통한 수용세포로의 Cre의 푸소좀 전달을 설명한다. 미세소포를 포함하는 푸소좀은 이전 실시예에 기재된 바와 같이 생성할 수 있다. 푸소좀을 수용하는 수용세포의 군을 액틴 중합 저해제인 라트룬쿨린 B(6 μM)로 처리한 것을 제외하고는, 이전 실시예에 따라, 거대음작용을 통한 Cre의 전달에 대해 푸소좀을 검정하였다. 액틴 매개 경로를 통해 전달된 푸소좀 Cre의 값을 계산하기 위해, 라트룬쿨린 B 존재 하의 푸소좀 Cre 전달 수준(FusL+ LatB) 뿐 아니라, 라트룬쿨린 B 부재 하의 푸소좀 Cre 전달 수준(FusL - LatB)을 결정하였다. 전달된 푸소좀 Cre의 정규화된 값은 이전 실시예에 기재된 바와 같이 계산할 수 있다.
실시예 64: 단백질의 생체내 전달
본 실시예는 푸소좀에 의한 눈으로의 치료제의 전달을 설명한다.
푸소좀을 이전 실시예에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여 조혈줄기세포 및 전구세포에서 유도하고, 마우스 녹아웃이 결핍된 단백질을 로딩하였다.
푸소좀을 단백질이 결핍된 마우스의 우측 눈에 망막하 주사하고, 비히클을 마우스의 좌측 눈에 주사하였다. 마우스가 2개월령이 되면, 마우스의 서브세트를 안락사시켰다.
마우스의 각각의 망막에서 얻은 세포의 수를 계수하여, 채취한 망막조직의 조직학 및 H&E 염색을 수행하였다(문헌[Sanges et al., The Journal of Clinical Investigation, 126(8): 3104-3116, 2016]에 기재됨).
2개월령에 안락사시킨 마우스에서 채취한 망막에서 PDE6B 단백질에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 통해 주사된 단백질 수준을 측정하였다.
일 구현예에서, 푸소좀이 투여된 마우스의 좌측 눈은 비히클이 투여된 마우스의 우측 눈과 비교하여 망막의 외부 핵 수준에 존재하는 핵의 수가 증가할 것이다. 증가된 단백질은 돌연변이된 PBE6B 단백질의 상보성을 시사한다.
실시예 65: 푸소좀 투여 후 기형종 형성의 평가
본 실시예는 푸소좀을 이용한 기형종 형성의 부재를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 대상에게 투여될 때 기형종 형성을 유도하지 않을 것이다.
푸소좀을 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 생성하였다. 푸소좀, 종양 세포(양성 대조군) 또는 비히클(음성 대조군)을 마우스(12주령 내지 20주령)의 좌측 옆구리에 PBS로 피하 주사하였다. 기형종, 예를 들어 종양 성장은, 푸소좀, 종양 세포 또는 비히클 주사 8주 후, 캘리퍼 측정으로 종양 부피를 주 2회 내지 3회 결정하여 분석하였다.
일 구현예에서, 푸소좀 또는 비히클이 투여된 마우스는, 캘리퍼 측정을 통해 측정 시, 측정 가능한 종양 형성, 예를 들어 기형종을 갖지 않을 것이다. 일 구현예에서, 종양 세포로 처리된 양성 대조군 동물은, 8주의 관찰에 걸쳐 캘리퍼로 측정 시, 인식 가능한 종양, 예를 들어 기형종의 크기를 나타낼 것이다.
실시예 66: 푸소좀 및 원천세포 내 총 RNA 측정
본 실시예는 원천세포와 비교하여 푸소좀에서 RNA의 양을 정량화하는 방법을 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 원천세포와 유사한 RNA 수준을 가질 것이다. 본 검정에서, RNA 수준은 총 RNA 측정으로 결정하였다.
푸소좀은 이전 실시예에 기재된 방법 중 어느 하나에 따라 제조하였다. 푸소좀 및 원천세포의 단백질로 측정된 것과 동일한 질량의 제제를 사용하여(예를 들어, Qiagen RNeasy catalog #74104와 같은 키트를 사용하여) 총 RNA를 단리한 후, RNA에 의한 광 흡광도를 평가하는 표준 분광법을 사용하여(예를 들어, Thermo Scientific NanoDrop를 이용하여) RNA 농도를 결정하였다.
일 구현예에서, 푸소좀 내 RNA 농도는 단백질 질량당 원천세포의 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%일 것이다.
실시예 67: 세포에서 자유롭게 방출된 융합성 미세소포의 단리
본 실시예는 세포에서 자유롭게 방출된 융합성 미세소포의 단리를 설명한다. 융합성 미세소포를 하기와 같이 단리하였다. 9.2 x 106개의 HEK-293T(ATCC, Cat# CRL-3216)를, 100 mm 콜라겐 코팅된 디쉬(Corning) 내 완전 배지(GlutaMAX (ThermoFisher), 10% 소태아혈청(ThermoFisher) 및 페니실린/스트렙토마이신 항생제(ThermoFisher)가 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)) 7.5 mL 중의 VSVg에 대한 오픈리딩프레임을 함유하는 pcDNA3.1 발현 플라스미드 10 μg과, SV40 핵 국소화 서열을 갖는 박테리오파지 P1 Cre 재조합효소에 대한 오픈리딩프레임을 함유하는 pcDNA3.1 발현 플라스미드 15 ug을 갖는 Xfect 트랜스펙션 시약(Takara, Cat# 631317)을 사용하여 역트렌트펙션시켰다. 씨딩 12시간 후, 추가의 완전 배지 7.5 mL를 주의하여 첨가하였다. 200 x g에서 10분 동안 원심분리하여 배양 배지에서 세포를 분리하였다. 상청액을 채취하고, 500 x g에서 10분 2회, 2,000 x g에서 15분 1회, 10,000 x g에서 30분 1회 및 70,000 x g에서 60분 1회 순차적으로 원심분리하였다. 최종 원심분리 단계 동안 자유롭게 방출된 푸소좀을 펠릿화하고, PBS 중에 재현탁시키고, 70,000 x g에서 재펠릿화하였다. 최종 펠릿을 PBS 중에 재현탁시켰다.
또한, 문헌[Wubbolts R et al. Proteomic and Biochemical Analyses of Human B Cell-derived Exosomes: Potential Implications for their Function and Multivesicular Body Formation. J. Biol. Chem. 278:10963-10972 2003] 참조.
실시예 68: 푸소좀의 평균 크기 분포 측정
본 실시예는 푸소좀의 크기 분포 측정을 설명한다.
푸소좀은 HEK293T의 VSV-G로의 일시적 트랜스펙션, 제핵 및 Ficoll을 이용한 후속 분획화를 통해, 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 푸소좀을 도 3에 제시된 바와 같은 실시예 27의 방법을 사용하여 측정하여, 크기 분포를 결정하였다. 푸소좀은 샘플의 90% 내에서, 모세포의 크기 분포 가변성의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%(또는 그 이하) 미만을 가질 것으로 고려된다. 푸소좀은 샘플의 90% 내에서, 58% 더 적은 모세포의 크기 분포 가변성을 가질 수 있다고 고려된다.
실시예 69: 푸소좀의 평균 부피
본 실시예는 푸소좀의 평균 부피 측정을 설명한다. 다양한 크기(예를 들어, 부피)의 푸소좀을 별개의 카고 로딩, 치료제 설계 또는 적용을 위해 다용도로 만들 수 있다.
푸소좀은 HEK293T의 VSV-G로의 일시적 트랜스펙션, 제핵 및 Ficoll을 이용한 후속 분획화를 통해, 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 양성 대조군은 HEK293T 세포였다.
실시예 27에 기재된 바와 같이 NTA와 공초점 현미경의 조합을 이용한 분석을 사용하여, 푸소좀의 크기를 결정하였다. 도 4에 제시된 바와 같이, 푸소좀의 직경을 측정하고, 부피를 계산하였다. 푸소좀의 평균 직경 크기가 50 nm 초과일 수 있다고 고려된다. 푸소좀의 평균 직경 크기가 129 nm일 수 있다고 고려된다.
실시예 70: 가용성 대 불용성 단백질 질량 비교
본 실시예는 푸소좀 내 단백질 질량의 가용성:불용성 비의 정량화를 설명한다. 푸소좀 내 단백질 질량의 가용성:불용성 비는, 일부 경우에, 유핵 세포와 유사할 수 있다.
푸소좀은 HEK293T의 VSV-G로의 일시적 트랜스펙션, 제핵 및 Ficoll을 이용한 후속 분획화를 통해, 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 표준 비신코닌산 검정(BCA)(Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo Fischer product# 23225)을 사용하여 푸소좀 제제를 시험하여, 가용성:불용성 단백질 비를 결정하였다. 제조된 푸소좀 또는 모세포를 PBS 중 총 푸소좀 1 mL당 1x107개의 세포 또는 약 1 mg의 농도로 현탁시키고, 1,500 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하거나 16,000 x g에서 원심분리하여 푸소좀을 펠릿화하여, 가용성 단백질 샘플을 제조하였다. 상청액을 가용성 단백질 분획으로 수집하였다.
이어서, 푸소좀 또는 세포를 PBS 중에 재현탁시켰다. 이러한 현탁액은 불용성 단백질 분획을 나타낸다.
공급된 BSA(웰당 0 내지 15 μg의 BSA)(이중으로)를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 측정된 양이 표준 범위 내에 있도록 푸소좀 또는 세포 제제를 희석하였다. 푸소좀 제제를 이중으로 분석하고, 평균 값을 사용하였다. 가용성 단백질 농도를 불용성 단백질 농도로 나누어, 가용성:불용성 단백질 비를 산출하였다(도 5).
실시예 71: 표적세포와의 융합 측정
홍역바이러스(MvH)의 조작된 헤마글루티닌 당단백질 및 세포 표면 상의 융합 단백질(F)을 발현하고, Cre 재조합효소 단백질을 함유하는 HEK-293T 세포에서 유도된 푸소좀을, 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 천연 수용체 결합이 제거되고, 세포 표면 항원을 인식하는 단일 사슬 항체(scFv)를 통해 표적세포 특이성이 제공되도록 MvH를 조작하였으며, 이러한 경우 scFv는 T세포 수용체에 대한 공동 수용체인 CD8을 표적화하도록 설계되었다. 표면에서 푸소겐 VSV-G를 발현하고, Cre 재조합효소 단백질을 함유하는 HEK-293T 세포에서 유도된 것을 대조군 푸소좀으로 사용하였다. 표적세포는, CMV 프로모터 하에서 "Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP" 카세트를 발현하도록 조작되고, 또한 CD8a와 CD8b의 공동 수용체를 과발현하도록 조작된 HEK-293T 세포였다. 비표적세포는, "Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP" 카세트를 발현하지만, CD8a/b를 과발현하지 않는 동일한 HEK-293T 세포였다. 표적 또는 비표적 수용세포를 흑색의 투명 바닥 96-웰 플레이트에 웰당 30,000개 세포로 플레이팅하고, 10% 소태아혈청이 함유된 DMEM 배지에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 수용세포 플레이팅 4시간 내지 6시간 후, Cre 재조합효소 단백질과 MvH+F를 발현하는 푸소좀을 DMEM 배지 중 표적 또는 비표적 수용세포에 적용하였다. 수용세포를 푸소좀 10 μg로 처리하고, 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
자동화 현미경을 사용하여 세포 플레이트를 이미지화하였다(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/). DMEM 배지에서 10분 동안 Hoechst 33342로 세포를 염색하여 주어진 웰 내 총 세포 집단을 결정하였다. Hoechst 33342는 세포 핵을 DNA에 삽입하여 염색시키기 때문에, 개별 세포를 식별하는 데 사용된다. 405 nm LED 및 DAPI 필터 큐브를 사용하여 Hoechst를 이미지화하였다. GFP는 465 nm LED 및 GFP 필터 큐브를 사용하여 이미지화하고, RFP는 523 nm LED 및 RFP 필터 큐브를 사용하여 이미지화하였다. 먼저, 양성 대조군 웰; 즉, 푸소좀 대신 Cre 재조합효소를 코딩하는 아데노바이러스로 처리된 수용세포에서 LED 강도 및 통합 시간을 확립하여, 표적세포 및 비표적세포 웰의 이미지를 수집하였다.
Hoescht, RFP 및 GFP 강도가 최대 픽셀 강도 값에 있지만 포화되지 않도록, 수집 설정을 설정하였다. 이어서, 관심 웰을 확립된 설정을 사용하여 이미지화하였다. Hoescht 채널에서 자동으로 초점을 맞춘 후, GFP 및 RFP 채널에 대해 확립된 초점면을 사용하여 각각의 웰에 대해 초점을 설정하였다. 자동화 형광 현미경이 장착된 Gen5 소프트웨어를 이용하여 GFP 및 RFP 양성 세포를 분석하였다(https://www.biotek.com/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/).
롤링 볼 배경 제거 알고리즘을 사용하여 60 μm 너비로 이미지를 사전 처리하였다. 배경 강도를 유의하게 상회하는 GFP 강도를 갖는 세포에 대해 임계값을 설정하고, GFP 양성 세포가 되기에 너무 작거나 큰 영역은 제외시켰다. RFP 채널에 동일한 분석 단계를 적용하였다. 이어서, RFP 양성 세포(Cre를 수용하는 수용세포)의 수를 GFP 양성 세포(전달을 나타내지 않은 수용세포)와 RFP 양성 세포의 합으로 나누어, 표적 및 비표적 수용세포 집단 내 푸소좀 융합의 양을 설명하는 RFP 전환%를 정량화하였다. 표적화된 융합(표적화된 수용세포에 대한 푸소좀 융합)의 양의 경우, 피코에리트린(PE)에 접합된 항-CD8 항체를 이용한 염색으로 평가하고, 유세포분석으로 분석한 표적 수용세포(즉, CD8 발현)인 수용세포의 백분율로 RFP 전환 값%를 정규화하였다. 최종적으로, 표적세포 융합 양에서 비표적세포 융합 양을 빼서 표적화된 융합의 절대량을 결정하였다(0 미만의 임의의 값은 0으로 간주하였음).
본 검정에 따르면, 표면에서 조작된 MvH(CD8)+F를 발현하고, Cre 재조합효소 단백질을 함유하는 HEK-293T 세포에서 유도된 푸소좀은, 수용세포가 "Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP" 카세트를 발현하는 표적 HEK-293T 세포이고, 이러한 수용세포의 51.1%가 CD8 양성인 것으로 관찰된 경우, 25.2 +/- 6.4%의 RFP 전환율을 나타냈다. 이러한 결과로부터, 정규화된 RFP 전환율 또는 표적화된 융합 양은 표적화된 융합에 대해 49.3 +/- 12.7%인 것으로 결정되었다. 수용체가 "Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP"를 발현하지만, CD8은 발현하지 않는 비표적 HEK-293T 세포인 경우, 동일한 푸소좀은 0.5 +/- 0.1%의 RFP 전환율을 나타냈다. 상기를 기반으로, MvH(CD8)+F 푸소좀에 대한 표적화된 융합의 절대량은 48.8%인 것으로 결정되었고, 대조군 VSV-G 푸소좀에 대한 표적화된 융합의 절대량은 0%인 것으로 결정되었다(도 6).
실시예 72: 세포막을 가로질러 글루코오스를 수송하는 능력 측정
세포 표면에서 수포성 구내염바이러스의 외피 당단백질 G(VSV-G)를 발현하고, Cre 재조합효소 단백질을 발현하는 HEK-293T 세포의 푸소좀을, Ficoll 구배를 통한 초원심분리 표준 절차에 따라 생성하여, 본원에 기재된 바와 같은 소입자 푸소좀을 수득하였다. 세포막을 가로질러 글루코오스를 수송하는 푸소좀의 능력을 측정하기 위해, 지질 이중층을 가로지르는 능동 수송을 측정하는 데 사용될 수 있는 형광 글루코오스 유사체인 2-NBDG (2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-2-데옥시글루코오스) 수준을 정량화하여, 지질 이중층을 가로지르는 능동 수송을 평가하였다. 검정을 위해 Biovision Inc. 사의 상업적으로 입수 가능한 키트(Cat #K682)를 제조업체의 설명서에 따라 사용하였다.
간략하게, 푸소좀 샘플을 비신코닌산 검정(BCA, ThermoFisher, Cat #23225)으로 제조업체의 설명서에 따라 총 단백질 함량에 대해 측정하였다. 다음으로, 푸소좀 총 단백질 40 ug을 테이블용 원심분리기에서 3000g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화한 후, 0.5% 소태아혈청이 보충된 DMEM 400 uL 중에 재현탁시켰다. 이를 각각의 샘플에 대해 이중으로 수행하고, 이중 시험 중 하나를, 글루코오스 흡수 저해에 대한 대조군으로서, 글루코오스 흡수를 저해하는 천연 페놀인 플로레틴(phloretin)(키트에 제공됨) 4 uL으로 처리하였다. 이어서, 샘플을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 푸소좀 샘플을 펠릿화하고, 사전 제조된 글루코오스 흡수 믹스 400 uL 중에 재현탁시켰다(제형에 대해서는 하기 표 10 참조). 플로레틴으로 전처리된 샘플을 플로레틴 함유 글루코오스 흡수 믹스에 재현탁시키고, 전처리되지 않은 샘플을 플로레틴 대신 PBS 20 uL가 함유된 글루코오스 흡수 믹스에 재현탁시켰다. 또한, 푸소좀 샘플의 병용 세트를, 유세포분석을 위한 음성 대조군으로서, 0.5% FBS만 함유된 DMEM 배지에 재현탁시켰다.
Figure pct00070
이어서, 샘플을 37℃ 및 5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 펠릿화하고, 1X 분석 완충액(키트에 제공됨) 1 mL로 1회 세척하고, 다시 펠릿화하고, 1X 분석 완충액 400 uL 중에 재현탁시켰다.
이어서, 샘플을 Invitrogen Attune NxT 음향 집속 세포계수기를 사용하여 유세포분석으로 2-NBDG 흡수에 대해 측정하였다. 2-NBDG를 488 nm 레이저로 여기시키고, 513±26 nm에서 방출을 포획하였다. 전방 및 측방 산란 게이팅을 초기에 사용하여, 푸소좀 크기 사건을 포획하고 작은 파편을 제거하였다. 2-NBDG에 대해 양성인 사건은, 2-NBDG 음성 대조군 샘플이 2-NBDG 염색에 대해 양성인 사건의 0.5% 미만을 나타내는 최소 수준에서 게이팅하여 결정하였다. 이어서, 2-NBDG 형광에 대해 양성인 게이팅된 세포를 2-NBDG의 평균 형광 강도(F.I.)에 대해 평가하여, 플로레틴 처리 유무 하의 푸소좀에 대한 글루코오스 흡수 값을 계산하였다.
이러한 검정에 따르면, VSV-G 및 Cre를 발현하는 HEK-293T 세포에서 유도된 푸소좀은, 플로레틴 처리되지 않은 경우 2-NBDG 평균 F.I. 631.0 +/- 1.4 및 플로레틴 처리된 경우 평균 F.I. 565.5 +/- 4.9를 나타냈다(도 7).
실시예 73: 시토졸 내 에스테라아제 활성 측정
C2C12세포 유래 푸소좀을 Ficoll 구배를 통한 초원심분리 표준 절차에 따라 생성하여, 본원에 기재된 바와 같은 소입자 푸소좀을 수득하였다. 푸소좀의 시토졸에서 에스테라아제 활성을 측정하기 위해, 샘플을 칼세인 AM(BD Pharmigen, Cat #564061), 플루오레세인 유도체, 및 생존 가능한 세포의 세포막을 수동적으로 가로지르고 시토졸 에스테라아제에 의해 녹색 형광 칼세인으로 전환되는 비(非)형광 필수 염료(이는 온전한 막과 불활성 다중약물내성 단백질을 갖는 세포에 의해 유지됨)로 염색하였다.
간략하게, 푸소좀 샘플을 비신코닌산 검정(BCA, ThermoFisher, Cat #23225)으로 제조업체의 설명서에 따라 총 단백질 함량에 대해 측정하였다. 다음으로, 푸소좀 총 단백질 20 ug을 테이블용 원심분리기에서 3000g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화한 후, 0.5% 소태아혈청이 보충된 DMEM 400 uL 중에 재현탁시켰다. 막 투과성 염료인 칼세인-AM을, 디메틸설폭시드 중 10 mM 스톡 용액 및 PBS 완충액(pH 7.4) 중 1 mM 작업 용액으로 제조하였다. VSV-G 푸소좀을 DMEM 배지에 희석된 1 μM 칼세인-AM 용액으로 염색하였다. 샘플을 암실에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 원심분리를 통해 펠릿화하였다. PBS 완충액으로 2회 세척 후, 푸소좀을 PBS 중에 재현탁시키고, 유세포분석으로 분석하였다.
샘플을 Invitrogen Attune NxT 음향 집속 세포계수기를 사용하여 칼세인 형광 보유에 대해 측정하였다. Calcein AM을 488 nm 레이저로 여기시키고, 513±26 nm에서 방출을 포획하였다. 전방 및 측방 산란 게이팅을 초기에 사용하여, 푸소좀 크기 사건을 포획하고 작은 파편을 제거하였다. 칼세인에 대해 양성인 사건은, 칼세인 음성 대조군 샘플이 칼세인 염색에 대해 양성인 사건의 0.5% 미만을 나타내는 최소 수준에서 게이팅하여 결정하였다. 이어서, 칼세인 형광에 대해 양성인 게이팅된 세포를 칼세인의 평균 형광 강도(F.I.)에 대해 평가하여, 푸소좀의 시토졸 내 에스테라아제 활성 값을 계산하였다.
이러한 검정에 따르면, C2C12세포에서 유도된 푸소좀은, 631.0 +/- 1.4 의 에스테라아제 활성(평균 칼세인 F.I.)을 나타냈다(도 8).
실시예 74: 푸소좀 내 아세틸콜린에스테라아제 활성 측정
세포 표면에서 태반세포-세포 융합 단백질 신시틴-1(Syn1)을 발현하고, Cre 재조합효소 단백질을 발현하는 HEK-293T 세포 유래 푸소좀을, 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 아세틸콜린에스테라아제 활성을 FluoroCet Quantitation Kit(System Biosciences, Cat #FCET96A-1)를 사용하여 제조업체의 권장사항에 따라 측정하였다.
간략하게, 푸소좀을 120,000 g에서 90분 동안 초원심분리를 통해 펠릿화하고, 포스페이트 완충 염수(PBS) 중에 주의하여 재현탁시켰다. 다음으로, 푸소좀 샘플을 비신코닌산 검정(BCA, ThermoFisher, Cat #23225)으로 제조업체의 설명서에 따라 총 단백질 함량에 대해 정량화하였다. 단백질 농도의 BCA 정량화 후, 총 푸소좀 단백질 1000 ng을 PBS로 60 uL 부피까지 희석한 후, 용해 완충액 60 uL를 첨가하여 입자를 용해시켰다. 얼음 위에서의 30분 인큐베이션 후, 샘플은 FluoroCet 검정을 실행할 준비가 되었다.
96-웰 플레이트의 이중 웰에, 용해된 푸소좀 샘플 50 uL를 완충액 A의 작업 스톡 50 uL 및 완충액 B의 작업 스톡 50 uL와 혼합하였다. 동시에, 1X 반응 완충액 126 uL 중에 제공된 표준물 2 uL를 피펫팅하여 표준 곡선을 제조하였다. 이어서, 이러한 표준 용액을 5배로 순차적으로 희석하여, 2.0E+08, 1.0E+08, 5.0E+07, 2.5E+07, 1.25E+07 및 6.25E+06의 아세틸콜린에스테라아제 활성의 엑소좀 당량으로 이루어진 6점 표준 곡선을 생성하였다. 이어서, 96-웰 플레이트의 이중 웰에, 각각의 표준물 50 uL를 완충액 A의 작업 스톡 50 uL 및 완충액 B의 작업 스톡 50 uL와 혼합하였다. 1X 반응 완충액 50 uL를 블랭크로 사용하였다. 플레이트를 측면을 두드려 혼합한 후, 암실에서 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 즉시 여기: 530 내지 570 nm 및 방출: 590 내지 600 nm로 설정된 형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 플레이트를 판독 전 30초 동안 진탕하였다.
이어서, 블랭크 웰에서 RFU 값을 뺀 후, 상대 형광 단위(RFU)를 공지된 아세틸콜린에스테라아제 활성의 엑소좀 당량에 대해 플롯팅하였다. 이어서, 선형 회귀선을 계산하고, 방정식을 사용하여, 측정된 RFU 값에서 푸소좀 샘플에 대한 아세틸콜린에스테라아제 활성(엑소좀 당량으로)을 결정하였다. Syn1 푸소좀에 대해 측정된 아세틸콜린에스테라아제 활성은 표 11에 제시되어 있다:
Figure pct00071
실시예 75: 대사 활성 수준 측정
세포 표면에서 수포성 구내염바이러스의 외피 당단백질 G(VSV-G)를 발현하고, Cre 재조합효소 단백질을 발현하는 HEK-293T 세포의 푸소좀을, 본원에 기재된 바와 같이 생성하였다. 푸소좀 제제의 대사 활성 수준을 결정하기 위해, 시트레이트 신타아제 활성을 Sigma 사의 상업적으로 입수 가능한 키트(Cat #CS0720)(이는 모든 필수 시약을 제공함)를 사용하여 평가하였다. 시트레이트 신타아제는 옥살로아세테이트(OAA)와 아세틸-CoA 사이의 반응을 촉진시켜 시트레이트를 생성하는 트리카르복실산(TCA) 회로 내 효소이다. 아세틸-CoA의 가수분해 시, 티올기를 갖는 CoA(CoA-SH)가 방출된다. 티올기는 화학물질 시약인 5,5-디티오비스-(2-니트로벤조산)(DTNB)과 반응하여, 412 nm에서 분광광도계로 측정될 수 있는 황색 생성물인, 5-티오-2-니트로벤조산(TNB)을 형성한다.
검정은 제조업체의 권장사항에 따라 수행하였다. 간략하게, 푸소좀 샘플을 비신코닌산 검정(BCA, ThermoFisher, Cat #23225)으로 제조업체의 설명서에 따라 총 단백질 함량에 대해 측정하였다. 다음으로, 푸소좀 총 단백질 400 ug을 테이블용 원심분리기에서 3000g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하였다. 푸소좀을 다시 펠릿화하고, 얼음 냉각된 PBS 중에 재현탁시켜 1회 세척하였다. 푸소좀을 다시 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 펠릿을 1X 프로테아제 저해제가 함유된 CellLytic M 완충액 100 uL에 용해시켰다. 피펫팅에 의한 혼합 후, 용해된 샘플을 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여, 완전히 용해시켰다. 이어서, 샘플을 12,000g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 새로운 미세원심분리 튜브에 옮기고, 후속 검정을 수행할 때까지 -80℃에서 보관하였다.
시트레이트 신타아제 활성 검정을 개시하기 위해, 모든 검정 용액을 사용 전 실온까지 가온시켰다. 용해된 푸소좀 샘플을 하기 표 12에 따른 검정 용액과 혼합하였다:
Figure pct00072
표 12의 부피는 96-웰 플레이트의 단일 웰에 대한 부피를 나타낸다. 샘플을 이중으로 측정하였다. 반응의 모든 구성요소를 혼합하고, 96-웰 플레이트의 단일 웰에 피펫팅하였다. 이어서, 412 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기에서 1.5분 동안 분석하여, 기준 반응을 측정하였다. 다음으로, 10 mM OAA 용액 10 uL를 웰에 첨가하여 반응을 개시하였다. 플레이트를 마이크로플레이트 판독기에서 10초 동안 진탕시킨 후, 1.5분 동안 412 nm에서 10초마다 흡광도를 측정하였다.
시트레이트 신타아제 활성을 계산하기 위해, 412 nm에서의 흡광도를 각각의 반응에 대해 플롯팅하였다. OAA 첨가 전(내인성 활성) 및 후(총 활성)에 대한 플롯의 선형 범위에 대한 분당 흡광도 변화를 계산하였다. 이어서, 샘플에 대한 총 활성에서 내인성 활성을 빼서 순 시트레이트 신타아제 활성을 계산하였다. 이어서, 이러한 값을 사용하여 제조업체가 제공한 방정식 및 상수 값을 기반으로 시트레이트 신타아제 활성을 계산하였다. VSV-G 푸소좀에 대해 측정된 시트레이트 신타아제 활성은 분당 푸소좀 1 ug당 1.57E-02 +/- 1.86E-03 umol이었다.
실시예 76: 호흡 수준 측정
세포 표면에서 수포성 구내염바이러스의 외피 당단백질 G(VSV-G)를 발현하는 HEK-293T 세포의 푸소좀을, Ficoll 구배를 통한 초원심분리 표준 절차에 따라 생성하여, 본원에 기재된 바와 같은 소입자 푸소좀을 수득하였다. 푸소좀 제제의 호흡 수준은, Seahorse 세포외 플럭스 분석기(Agilent)로 미토콘드리아 산소 소비율을 측정하여 결정하였다.
간략하게, 푸소좀 샘플을 비신코닌산 검정(BCA, ThermoFisher, Cat #23225)으로 제조업체의 설명서에 따라 총 단백질 함량에 대해 측정하였다. 다음으로, 푸소좀 총 단백질 20 μg을 테이블용 원심분리기에서 3000g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화한 후, 25 mM 글루코오스와 2 mM 글루타민이 보충된 XF 검정 배지(Agilent Cat # 103575-100)(pH 7.4) 150 μL 중에 재현탁시켰다(사중으로). 이어서, 재현탁된 샘플을 96-웰 Seahorse 플레이트(Agilent)의 하나의 웰에 첨가하였다.
96-웰 Seahorse 플레이트를 샘플과 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하여 온도 및 pH가 평형에 이르도록 하여, 산소 소비 검정을 개시하였다. 이어서, 마이크로플레이트를 XF96 세포외 플럭스 분석기(Agilent)에서 검정하여, 푸소좀을 바로 둘러싸는 배지 중 산소 및 pH의 세포외 플럭스 변화를 측정하였다. 정상 상태 산소 소비 및 세포외 산성화율을 수득한 후, ATP 신타아제를 저해하는 올리고마이신(5 μM)과, 미토콘드리아를 분리시키는 양성자 이오노포어인 FCCP(카르보닐 시아니드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존; 2 μM)를 마이크로플레이트 내 각각의 웰에 대한 시약 전달 챔버를 통해 순차적으로 주입하여, 최대 산소 소비율에 대한 값을 수득하였다. 최종적으로, 5 μM 안티마이신 A(미토콘드리아 복합체 III 저해제)를 주입하여, 호흡 변화가 주로 미토콘드리아 호흡으로 인한 것임을 확인하였다. 다른 세 개의 호흡률에서 안티마이신 A 호흡률을 빼서, 기초, 비결합(올리고마이신 내성) 및 최대(FCCP 유도성) 미토콘드리아 호흡률을 결정하였다.
이러한 검정을 사용하여 측정 시, 공여체 VSV-G 푸소좀이 하기 표 13에 따른 기초, 비결합 및 최대 산소 소비(호흡)율을 나타내는 것으로 결정되었다.
Figure pct00073
실시예 77: 푸소좀의 포스파티딜세린 수준 측정
세포 표면에서 수포성 구내염바이러스의 외피 당단백질 G(VSV-G)를 발현하고, Cre 재조합효소 단백질을 발현하는 HEK-293T 세포의 푸소좀을, Ficoll 구배를 통한 초원심분리 표준 절차에 따라 생성하여, 본원에 기재된 바와 같은 소입자 푸소좀을 수득하였다. 푸소좀의 포스파티딜세린 수준을 측정하기 위해, 상업적으로 입수 가능한 Alexa Fluor 647 염료와 접합된 아넥신 V(Cat #A23204)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 아넥신 V 염색을 수행하였다. 아넥신 V는 원형질막의 외부 소엽에 노출될 때 포스파티딜세린에 결합할 수 있는 세포 단백질이기 때문에; 샘플에의 아넥신 V 결합의 판독값은 샘플 내 포스파티딜세린 수준의 평가를 제공할 수 있다.
간략하게, 푸소좀 샘플을 비신코닌산 검정(BCA, ThermoFisher, Cat #23225)으로 제조업체의 설명서에 따라 총 단백질 함량에 대해 측정하였다. 다음으로, 푸소좀 총 단백질 40 μg을 테이블용 원심분리기에서 3000g에서 5분 동안 원심분리하여(샘플에서 삼중으로) 펠릿화한 후, 2% 소태아혈청이 보충된 DMEM 400 uL 중에 재현탁시켰다. 하나의 샘플을 40 μM 안티마이신 A로 처리하였다. 이어서, 샘플을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 다시 원심분리하여 펠릿화하고, 100 μL 아넥신 결합 완충액(ABB; 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, pH 7.4) 중에 재현탁시켰다. 다음으로, Alexa Fluor 647와 접합된 아넥신 V 5 μL를 각각의 샘플에 첨가하였다(아넥신 V 염색 미포함 음성 대조군 제외). 샘플을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, ABB 400 μL를 첨가하였다.
이어서, 샘플을 Invitrogen Attune NxT 음향 집속 세포계수기를 사용하여 유세포분석으로 아넥신 V 염색에 대해 측정하였다. Alexa Fluor 647과 접합된 아넥신 V를 638 nm 레이저로 여기시키고, 670 ± 14 nm에서 방출을 포획하였다. 전방 및 측방 산란 게이팅을 초기에 사용하여, 푸소좀 크기 사건을 포획하고 작은 파편을 제거하였다. Alexa Fluor 647(아넥신 V) 염색에 대해 양성인 사건은, 염색되지 않은 아넥신 V 음성 대조군 샘플이 Alexa Fluor 647 염색에 대해 양성인 사건의 0.5% 미만을 나타내는 최소 수준에서 게이팅하여 결정하였다. 이어서, Alexa Fluor 647 염색에 대해 양성으로 게이팅된 사건을 총 모 집단의 아넥신 V 양성 사건(전방/측방 산란 게이팅에서 푸소좀 크기 사건)의 백분율에 대해 평가하고, 이러한 값을 푸소좀 샘플 내 포스파티딜세린 수준의 정량화로 사용하였다.
이러한 검정에 따르면, VSV-G 및 Cre를 발현하는 HEK-293T 세포에서 유도된 푸소좀은, 안티마이신 A 처리되지 않은 경우 63.3 ± 2.3%의 아넥신 V 양성 푸소좀의 % 및 안티마이신 A 처리된 경우 67.6 ± 5.7%의 아넥신 V 양성 푸소좀의 %를 나타냈다.
실시예 78: 평균 미토콘드리아 막 전위 측정
세포 표면에서 수포성 구내염바이러스의 외피 당단백질 G(VSV-G)를 발현하고, Cre 재조합효소 단백질을 발현하는 HEK-293T 세포의 푸소좀을, Ficoll 구배를 통한 초원심분리 표준 절차에 따라 생성하여, 본원에 기재된 바와 같은 소입자 푸소좀을 수득하였다. 푸소좀의 평균 미토콘드리아 막 전위 수준을 측정하기 위해, 상업적으로 입수 가능한 미토콘드리아 막 전위 민감성 염료인, 테트라메틸 로다민, 에틸 에스테르, 퍼클로레이트(TMRE; Abcam, Cat# T669)를 사용하여 미토콘드리아 막 전위를 평가하였다. TMRE 형광 강도(FI)를 샘플 내 미토콘드리아 양에 대해 정규화하기 위해, TMRE FI를 MTG FI로, 따라서 샘플 내 미토콘드리아의 양으로 정규화하기 위해, MitoTracker Green FM 염료(MTG; ThermoFisher, Cat #M7514)를 사용하여 샘플을 동시 염색하였다. 또한, 미토콘드리아 막 전위를 완전히 탈분극화하여, 미토콘드리아 막 전위를 TMRE FI의 감소를 기반으로 밀리볼트로 정량화하기 위해, 카르보닐 시아니드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존(FCCP; Sigma Cat #C2920)을 사용하여 샘플의 병용 세트를 처리하였다.
간략하게, 푸소좀 샘플을 비신코닌산 검정(BCA, ThermoFisher, Cat #23225)으로 제조업체의 설명서에 따라 총 단백질 함량에 대해 측정하였다. 다음으로, 푸소좀 총 단백질 40 ug을 테이블용 원심분리기에서 3000g에서 5분 동안 원심분리하여(미처리군 및 FCCP 처리군 샘플에 대해 사중으로) 펠릿화한 후, 2% 소태아혈청이 보충되고 TMRE 및 MTG 염료가 함유된 DMEM 100 uL 중에, 각각, 최종 농도 30 nM 및 200 nM로 재현탁시켰다. 푸소좀 샘플의 병용 세트를 음성 대조군으로 염색되지 않은 채로 두었다. 샘플을 37℃에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 원심분리로 펠릿화하고, 30 nM TMRE가 함유된 페놀 레드 미함유 DMEM 400 μL 중에 재현탁시켰다. 이중 샘플 중 한 세트를 유세포분석으로의 평가 전 20 μM FCCP로 5분 동안 처리하였다.
이어서, 샘플을 Invitrogen Attune NxT 음향 집속 세포계수기를 사용하여 유세포분석으로 아넥신 V 염색에 대해 측정하였다. MTG를 488 nm 레이저로 여기시키고, 530 ± 30 nm에서 방출을 포획하였다. TMRE를 561 nm 레이저로 여기시키고, 585 ± 16 nm에서 방출을 포획하였다. 전방 및 측방 산란 게이팅을 초기에 사용하여, 푸소좀 크기 사건을 포획하고 작은 파편을 제거하였다. MTG 및 TMRE 염색에 대해 양성인 사건은, 염색되지 않은 음성 대조군 샘플이 MTG 또는 TMRE 염색에 대해 양성인 사건의 0.5% 미만을 나타내는 최소 수준에서 게이팅하여 결정하였다. 이어서, MTG 및 TMRE 염색에 대해 양성으로 게이팅된 사건을 MTG 및 TMRE의 평균 FI에 대해 평가하였다.
TMRE FI 값을 MTG FI 값으로 정규화한 후, 막 전위 값(밀리볼트, mV)을 TMRE의 강도를 기준으로 계산하였다. 이러한 TMRE/MTG 비 값은, TMRE 강도의 샘플 내 미토콘드리아의 양으로의 정규화를 가능하게 한다. 미처리 및 FCCP 처리된 샘플 모두에 대한 TMRE/MTG 비 값을 계산하고, 이를 TMRE 형광을 기반으로 미토콘드리아 막 전위를 결정할 수 있는 변형된 네른스트 방정식(하기 참조)을 사용하여(TMRE는 네른스트 방식으로 미토콘드리아에 축적되기 때문에) 막 전위를 밀리볼트로 결정하는 데 사용하였다. 푸소좀 막 전위는 하기 식으로 계산하였다: (mV) = -61.5 * log(FI(미처리군)/FI(FCCP 처리군)). 이러한 방정식을 사용하여, VSV-G 푸소좀 샘플의 계산된 미토콘드리아 막 전위는 -29.6 ± 1.5 밀리볼트였다.
실시예 79: 대상에서 표적화 가능성의 측정(BiVs- Cre Gesicles)
본 실시예는 특정 신체 부위를 표적으로 하는 푸소좀의 능력을 평가한다. 푸소좀을 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 유도하고, Cre-재조합효소 단백질을 로딩하였다.
2가지 용량의 푸소좀(1x 및 3x)을 Loxp 루시퍼라아제(Jackson Laboratory, 005125)에 전달하고, 마우스에게 꼬리 정맥을 통해 정맥내(I.V.) 주사하였다. 마우스를 가열 램프(250W(적외선) 가열 램프 전구 사용) 아래 약 5분 동안(또는 마우스가 이의 수염을 과도하게 다듬기 시작할 때까지) 위치시켜, 꼬리 정맥을 팽창시켰다. 마우스를 제어장치에 위치시키고, 꼬리를 70% 에탄올로 닦아 정맥이 더 잘 보이게 하였다.
투베르쿨린 시린지를 사용하여 푸소좀 1x 용액(1 μl당 8.5e8±1.4e8개의 입자, 평균(SEM)) 또는 3x 용액(1 μL당 2.55e9±1.4e8개의 입자, 평균(SEM)) 200 μL를 IV 주사하였다. 주사의 완결 시, 시린지를 제거하고, 주사 부위에 압력을 가하였다.
융합 후, CRE 단백질은 핵으로 전위되어 재조합을 수행하였으며, 이는 루시퍼라아제의 구성적 발현을 유도하였다. 처리 3일 후, 대상의 복부 영역을 제모하여 준비하였다(Nair 모발 제거 크림으로 45초 동안, 이후 70% 에탄올로 해당 영역을 세척함). 이어서, 대상을 복강내 주사를 통해 D-루시페린(Perkin Elmer, 150 mg/kg)으로 처리하였다. 이는, 생체내 생물발광 이미지화를 통한 루시퍼라아제 발현의 검출을 가능하게 하였다. 동물을 동물의 움직임을 막기 위해 원뿔형 마취제(이소플루란)을 포함시킨 생체내 생물발광 이미지화 챔버(Perkin Elmer)에 위치시켰다. D-루시페린 약동학적 제거로 인한 최대 생물발광 신호를 관찰하기 위해 주사 후 3분 내지 15분 사이에 광자 수집을 수행하였다. 최대 발광은 광자 수/초/cm2/라디안으로 기록하였다. 해당 영역에 걸친 발광을 통합한 총 플럭스를 Living Image Software(Perkin Elmer) 내 관심 영역(ROI) 도구를 사용하여 정량화하고, 초당 광자수로 보고하였다.
푸소좀에 의한 단백질 전달의 증거(Cre 재조합효소)를 도 9a 및 도 9b에 제시된 바와 같이 동물의 수용조직에서 생물발광 이미지화로 검출하였다. 신호는 주로 비장 및 간에서 확인되었으며, 3x 군에서 최고 신호를 나타냈다.
전신 이미지화 후, 마우스를 자궁경부를 통해 탈구시키고, 간, 심장, 폐, 신장, 소장, 췌장 및 비장을 채취하고, 안락사 5분 이내에 이미지화하였다. 푸소좀에 의한 간 및 비장으로의 단백질 전달의 증거(Cre 재조합효소)를 동물의 추출된 수용조직에서 생물발광 이미지화로 검출하였다. 이는 도 10a 및 도 10b에서 확인할 수 있다. 신호는 비장에서 최고였고, 심장에서 최저였으며, 3x 군에서 최고 유의 신호를 나타냈다(심장과 비교 시 p=0.0004).
실시예 80: 리소좀 산성화와 독립적인 경로를 통한 푸소좀의 전달
종종, 복합 생물학적 카고의 표적세포에의 진입은 세포내이입을 통해 달성된다. 세포내이입은, 카고가 엔도좀으로 들어가 산성화된 리소좀으로 성숙되는 것을 필요로 한다. 불리하게도, 세포내이입을 통해 세포에 들어가는 카고는 엔도좀 또는 리소좀에 포획되어, 세포질에 도달하지 못할 수 있다. 카고는 또는 리소좀 내 산성 조건 하에서 손상될 수 있다. 일부 바이러스는 표적세포에의 비세포내이입성 진입이 가능하지만, 이러한 과정은 완전히 이해되지 않았다. 본 실시예는, 바이러스 푸소겐이 나머지 바이러스에서 단리될 수 있으며, 다른 바이러스 단백질이 결여된 푸소좀에 비세포내이입성 진입을 부여할 수 있음을 입증한다.
세포 표면에서 니파바이러스 수용체 결합 G 단백질 및 융합 F 단백질(NivG+F)을 발현하고, Cre 재조합효소 단백질을 발현하는 HEK-293T 세포의 푸소좀을, Ficoll 구배를 통한 초원심분리 표준 절차에 따라 생성하여, 본원에 기재된 바와 같은 소입자 푸소좀을 수득하였다. 비세포내이입 경로를 통한 수용세포에의 푸소좀의 전달을 입증하기 위해, NivG+F 푸소좀을 CMV 프로모터 하에서"Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP" 카세트를 발현하도록 조작된 수용 HEK-293T 세포로 처리하였다. NivF 단백질은, 활성화 및 후속 융합 활성을 위해 주변 산성화를 필요로 하지 않는 것으로 확인된 pH 독립적 외피 당단백질이다(Tamin, 2002).
수용세포를 흑색의 투명 바닥 96-웰 플레이트에 웰당 30,000개의 세포로 플레이팅하였다. 수용세포 플레이팅 4시간 내지 6시간 후, Cre 재조합효소 단백질을 발현하는 NivG+F 푸소좀을 DMEM 배지 중 표적 또는 비표적 수용세포에 적용하였다. 먼저, 푸소좀 샘플을 비신코닌산 검정(BCA, ThermoFisher, Cat #23225)으로 제조업체의 설명서에 따라 총 단백질 함량에 대해 측정하였다. 수용세포를 푸소좀 10 μg로 처리하고, 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. NivG+F 푸소좀을 통한 Cre 전달이 비세포내이입 경로를 통해 이루어진다는 것을 입증하기 위해, NivG+F 푸소좀 처리를 받는 수용세포의 병용 웰을 엔도좀/리소좀 산성화 저해제인 바필로마이신 A1(Baf; 100 nM; Sigma, Cat #B1793)로 동시 처리하였다.
자동화 현미경을 사용하여 세포 플레이트를 이미지화하였다(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/). DMEM 배지에서 10분 동안 Hoechst 33342로 세포를 염색하여 주어진 웰 내 총 세포 집단을 결정하였다. Hoechst 33342는 세포 핵을 DNA에 삽입하여 염색시키기 때문에, 개별 세포를 식별하는 데 사용된다. 405 nm LED 및 DAPI 필터 큐브를 사용하여 Hoechst 염색을 이미지화하였다. GFP는 465 nm LED 및 GFP 필터 큐브를 사용하여 이미지화하고, RFP는 523 nm LED 및 RFP 필터 큐브를 사용하여 이미지화하였다. 먼저, 푸소좀 대신 Cre 재조합효소를 코딩하는 아데노바이러스로 처리된 수용세포를 함유하는 양성 대조군 웰에서 LED 강도 및 통합 시간을 확립하여, 표적세포 및 비표적세포 웰의 이미지를 수집하였다.
Hoescht, RFP 및 GFP 강도가 최대 픽셀 강도 값에 있지만 포화되지 않도록, 수집 설정을 설정하였다. 이어서, 관심 웰을 확립된 설정을 사용하여 이미지화하였다. Hoescht 채널에서 자동으로 초점을 맞춘 후, GFP 및 RFP 채널에 대해 확립된 초점면을 사용하여 각각의 웰에 대해 초점을 설정하였다. 자동화 형광 현미경이 장착된 Gen5 소프트웨어를 이용하여 GFP 및 RFP 양성 세포를 분석하였다(https://www.biotek.com/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/).
롤링 볼 배경 제거 알고리즘을 사용하여 60 μm 너비로 이미지를 사전 처리하였다. 배경 강도를 유의하게 상회하는 GFP 강도를 갖는 세포에 대해 임계값을 설정하고, GFP 양성 세포가 되기에 너무 작거나 큰 영역은 제외시켰다. RFP 채널에 동일한 분석 단계를 적용하였다. 이어서, RFP 양성 세포(Cre를 수용하는 수용세포)의 수를 GFP 양성 세포(전달을 나타내지 않은 수용세포)와 RFP 양성 세포의 합으로 나누어, 수용세포 내 푸소좀 융합의 양을 설명하는 RFP 전환 백분율을 정량화하였다.
이러한 검정에 따르면, 표면에서 NivG+F를 발현하고 Cre 재조합효소 단백질을 함유하는 HEK-293T 세포에서 유도된 푸소좀은, 리소좀 독립적 경로를 통한 유의한 전달을 나타냈으며, 이는 수용세포가 세포내이입 매개 흡수를 저해하기 위해 Baf로 동시 처리되었던 경우에도 NivG+F 푸소좀에 의한 Cre 카고의 유의한 전달에 의해 입증된 바와 같이, 비세포내이입 경로를 통한 진입과 일치하였다(도 11). 이러한 경우, Baf 동시 처리에 의한 카고 전달의 저해는 23.4%였다.
실시예 81: 이동성을 위한 액틴 중합 능력 측정
푸소좀은, 본원에 기재된 바와 같이, 세포 표면에서 수포성 구내염바이러스의 외피 당단백질 G(VSV-G)를 발현하는 HEK-293T 세포에서 생성된 푸소좀을 채취하고 제조하는 표준 절차에 따라 생성하였다. 대조군 입자(비융합성 푸소좀)는 pcDNA3.1 빈 벡터로 일시적으로 역트랜스펙션된 HEK-293T 세포에서 생성하였다. 이어서, 푸소좀과 모세포를 로다민 팔로이딘-유세포분석 검정 및 튜불린 ELISA를 사용하여 (시간 경과에 따른) 액틴 중합 능력에 대해 검정하였다. 간략하게, 표준 VSV-G 푸소좀 제제 60 μL에 상응하는 대략 1x106개의 푸소좀과, 푸소좀을 생성하는 데 사용된 1x105개의 모세포를, 96-웰 저부착 다중 웰 플레이트 내 완전 배지 1 mL에 플레이팅하고, 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 샘플을 플레이팅 3시간, 5시간 및 24시간 후에 주기적으로 취하였다. 샘플을 21,000xg에서 10분 동안 원심분리하고, 포스페이트 완충 염수 중 4%(v/v) PFA 200 uL 중에 10분 동안 재현탁시키고, 포스페이트 완충 염수 1 mL로 세척하고, 21,000xg에서 10분 동안 원심분리하고, 다시 세척하고, 추가 사용 시까지 4℃에서 보관하였다.
로다민-팔로이딘 염색의 경우, 샘플을 21,000xg에서 10분 동안 원심분리하고, 포스페이트 완충 염수 중 0.1%(v/v) Triton X-100 100 uL 중에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 20분 인큐베이션 후, 165 μM 로다민-팔로이딘이 함유된 포스페이트 완충 염수 중 0.1%(v/v) Triton X-100 추가 100 uL를 샘플에 첨가하고, 피펫으로 혼합하고, 음성 대조군에는 포스페이트 완충 염수 중 0.1%(v/v) Triton X-100 100 uL만 첨가하였다. 샘플을 포스페이트 완충 염수 1 mL로 세척하기 전 45분 동안 인큐베이션하고, 21,000xg에서 10분 동안 원심분리하고, 다시 세척하고, 포스페이트 완충 염수 300 uL 중에 재현탁시키고, 여기용 561 nm 레이저 및 585 +/- 16 nm 필터 방출을 사용하여, 하기 표에 제시된 바와 같이 유세포분석기(Attune, ThermoFisher)로 분석하였다:
Figure pct00074
Attune NxT 소프트웨어를 수집에 사용하고, FlowJo를 분석에 사용하였다. 데이터 수집을 위해, FSC 및 SSC 채널을 선형 축에 설정하여, 세포 또는 푸소좀을 대표하는 집단을 결정하였다. 이어서, 이러한 집단을 게이팅하고, 이러한 게이트 내에 있는 사건만 사용하여 585 +/- 16 nm 방출 채널에서 로그 스케일로 사건을 표시하였다. 각각의 조건에서 세포 또는 푸소좀 게이트 내 최소 10,000개의 사건을 수집하였다. 데이터 분석을 위해, FSC 및 SSC 채널을 선형 축에 설정하여, 세포 또는 푸소좀을 대표하는 집단을 결정하였다. 이어서, 이러한 집단을 게이팅하고, 이러한 게이트 내에 있는 사건만 사용하여 585 +/- 16 nm 방출 채널에서 로그 스케일로 사건을 표시하였다. 음성 대조군 585 +/- 16 nm 방출을 사용하여, 게이트가 1% 미만의 양성을 포함하는 것보다 더 적도록, 히스토그램에서 게이트를 배치할 위치를 결정하였다. 상기 열거된 분석 기준을 사용하면, 모세포는, 3시간, 5시간 및 24시간 시점에서, 각각, 19.9%, 24.8% 및 82.5%의 로다민-팔로이딘 양성 사건을 나타냈다. 푸소좀은 3시간, 5시간 및 24시간 시점에서, 각각, 44.6%, 41.9% 및 34.9%의 로다민-팔로이딘 양성이었다(도 2). 본 실시예는, 푸소좀은 시간의 경과에 따라 액틴의 양을 증가시키지 않지만, 모세포는 액틴의 양을 증가시킴을 나타낸다.
실시예 82: 푸소좀 내 GAPDH의 측정
본 실시예는 푸소좀 내 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나아제(GAPDH)의 수준과, 모세포와 비교한 푸소좀 내 GAPDH의 상대 수준의 정량화를 설명한다. 푸소좀은 실시예 67 및 실시예 86에 기재된 바와 같이 제조하였다.
제조업체의 설명서에 따라 GAPDH에 대해 상업적으로 입수 가능한 표준 ELISA(ab176642, Abcam)를 사용하여 모세포와 푸소좀에서 GAPDH를 측정하였다. 총 단백질 수준은 비신코닌산 검정을 통해 유사하게 측정하였다. 측정된 GAPDH 및 단백질 수준은 하기 표에 제시되어 있다:
Figure pct00075
GAPDH:총 단백질 비 또한 도 12에 제시되어 있다.
실시예 83: 푸소좀 내 지질 대 단백질 비
본 실시예는 푸소좀 내 지질 질량 대 단백질 질량의 비의 정량화를 설명한다. 푸소좀은 유핵 세포와 유사한 지질 질량 대 단백질 질량의 비를 가질 수 있다고 고려된다. 푸소좀과 모세포는 실시예 67 및 실시예 86에 기재된 바와 같이 제조하였다.
지질 함량은 총 지질의 서브세트로서 콜린 함유 인지질을 사용하여, 상업적으로 입수 가능한 인지질 검정 키트(MAK122 Sigma St. Louis, MO)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 계산하였다. 본원에 기재된 바와 같은 비신코닌산 검정을 통해 푸소좀의 총 단백질 함량을 측정하였다. 측정된 인지질 수준, 단백질 수준 및 인지질 대 단백질 비는 도 13 및 하기 표에 제시되어 있다:
Figure pct00076
실시예 84: 푸소좀 내 단백질 대 DNA 비
본 실시예는 푸소좀 내 단백질 질량 대 DNA 질량의 비의 정량화를 설명한다. 푸소좀은 세포보다 훨씬 큰 단백질 질량 대 DNA 질량의 비를 가질 수 있다고 고려된다. 푸소좀은 실시예 67 및 실시예 86에 기재된 바와 같이 제조하였다.
본원에 기재된 바와 같은 비신코닌산 검정을 통해 푸소좀 및 세포의 총 단백질 함량을 측정하였다. 푸소좀 및 세포의 DNA 질량은 상업적으로 입수 가능한 단리 키트(#69504 Qiagen Hilden, Germany)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라, 총 DNA의 추출 후 280 nm에서의 흡광도로 측정하였다. 총 단백질 함량을 총 DNA 함량으로 나누어 전형적인 푸소좀 제제에 대해 주어진 범위 내 비를 산출하여, 단백질 대 총 핵산의 비를 결정하였다. 측정된 단백질 수준, DNA 수준 및 단백질 대 DNA의 비는 도 14 및 하기 표에 제시되어 있다:
Figure pct00077
실시예 85: 푸소좀 내 지질 대 DNA 비
본 실시예는 모세포와 비교하여 푸소좀 내 지질 대 DNA의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 모세포와 비교하여 더 큰 지질 대 DNA의 비를 가질 것이다. 푸소좀은 실시예 67 및 실시예 86에 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
이러한 비는 실시예 40에 개괄된 지질 함량으로 정의되고, 핵산 함량은 실시예 41에 기재된 바와 같이 결정하였다. 측정된 지질 수준, DNA 수준 및 지질 대 DNA의 비는 도 15 및 하기 표에 제시되어 있다:
Figure pct00078
실시예 86: 푸소좀 내 지질 조성 측정
본 실시예는 푸소좀의 지질 조성의 정량화를 설명한다. 푸소좀의 지질 조성은 이들이 유도된 세포와 유사할 수 있다고 고려된다. 지질 조성은 크기, 정전기 상호작용 및 콜로이드 거동과 같은 푸소좀과 세포의 중요한 생물리학적 매개변수에 영향을 미친다.
지질 측정은 질량분석법을 기반으로 하였다. 10 cm 디쉬에서 VSV-G와 GFP의 일시적 트랜스펙션 후, 트랜스펙션 48시간 후 조건화된 배지의 여과 및 초원심분리를 통해 푸소좀을 수득하여, 본원에 기재된 바와 같이 푸소좀을 제조하였다. 트랜스펙션된 세포를 조건화된 배지와 동시에 채취하고, 분석을 위해 제공하였다. 엑소좀은 VSV-G 또는 GFP로 트랜스펙션되지 않은 세포에서도 채취하였다.
질량분석법 기반 지질 분석은 (Sampaio 등의 문헌(2011))에 기재된 바와 같이 Lipotype GmbH (Dresden, Germany)으로 수행하였다. 지질은 2단계 클로로포름/메탄올 절차를 사용하여 추출하였다(Ejsing 등의 문헌 (2009)). 샘플을 다음을 함유하는 내부 지질 표준 혼합물과 혼합하였다: 카르디오리핀 16:1/15:0/15:0/15:0(CL), 세라미드 18:1;2/17:0(Cer), 디아실글리세롤 17:0/17:0(DAG), 헥소실세라미드 18:1;2/12:0(HexCer), 리소포스파티데이트 17:0 (LPA), 리소포스파티딜콜린 12:0(LPC), 리소포스파티딜에탄올아민 17:1(LPE), 리소포스파티딜글리세롤 17:1(LPG), 리소포스파티딜이노시톨 17:1(LPI), 리소포스파티딜세린 17:1(LPS), 포스파티데이트 17:0/17:0 (PA), 포스파티딜콜린 17:0/17:0(PC), 포스파티딜에탄올아민 17:0/17:0(PE), 포스파티딜글리세롤 17:0/17:0(PG), 포스파티딜이노시톨 16:0/16:0 (PI), 포스파티딜세린 17:0/17:0(PS), 콜레스테롤 에스테르 20:0(CE), 스핑고미엘린 18:1;2/12:0;0(SM), 트리아실글리세롤 17:0/17:0/17:0(TAG) 및 콜레스테롤 D6(Chol).
추출 후, 유기상을 융합 플레이트로 옮기고, 고속 진공 농축기에서 건조시켰다. 제1 단계 건조 추출물을 클로로포름/메탄올/프로판올(1:2:4, V:V:V) 중 7.5 mM 암모늄 아세테이트 중에 재현탁시키고, 제2 단계 건조 추출물을 클로로포름/메탄올(0.003:5:1; V:V:V) 중 메틸아민의 33% 에탄올 용액 중에 재현탁시켰다. 모든 액체 취급 단계는 유기 용매 피펫팅을 위한 Anti Droplet Control 기능이 있는 Hamilton Robotics STARlet 로봇 플랫폼을 사용하여 수행하였다.
샘플을 TriVersa NanoMate 이온 공급원(Advion Biosciences)이 장착된 QExactive 질량분석기(Thermo Scientific)에 직접 주입하여 분석하였다. 단일 수집에서, MS의 경우 Rm/z=200=280000 및 MSMS 실험의 경우 Rm/z=200=17500의 해상도로 양성 및 음성 이온 방식 둘 모두로 샘플을 분석하였다. MSMS는 1 Da 증분으로 스캐닝된 상응하는 MS 질량 범위를 포함하는 포함 목록에 의해 촉발되었다(Surma 등의 문헌(2015)). MS 및 MSMS 데이터를 조합하여, 암모늄 부가물로서 CE, DAG 및 TAG 이온; 아세테이트 부가물로서 PC, PC O-; 및 탈양성자화된 음이온으로서 CL, PA, PE, PE O-, PG, PI 및 PS를 모니터링하였다. MS만 사용하여, 탈양성자화된 음이온으로서 LPA, LPE, LPE O-, LPI 및 LPS; 아세테이트 부가물로서 Cer, HexCer, SM, LPC 및 LPC O-; 및 아세틸화된 유도체의 부가물로서 콜레스테롤을 모니터링하였다(Liebisch 등의 문헌(2006)).
데이터를 LipidXplorer를 기반으로 하는 자체 개발된 지질 확인 소프트웨어로 분석하였다(Herzog 등의 문헌(2011);등의 문헌(2012)). 데이터 후처리 및 정규화는 자체 개발된 데이터 관리 시스템을 사용하여 수행하였다. 신호-대-노이즈 비가 5초과이고, 상응하는 블랭크 샘플보다 5배 더 높은 신호 강도를 갖는 지질 확인치만, 추가 데이터 분석에 고려하였다.
푸소좀 지질 조성을 모세포의 지질 조성과 비교하고, 검출되지 않은 지질 종은 0의 값으로 지정하였다. 푸소좀 및 모세포에서 확인된 지질 종은 하기 표에 제시되어 있다:
Figure pct00079
모세포의 임의의 복제 샘플에서 확인된 지질 종의 70% 이상이 푸소좀의 임의의 복제 샘플에 존재하고, 확인된 지질 중에서, 푸소좀에서의 평균 수준이 모세포에서 상응하는 평균 지질 종 수준의 25% 초과일 수 있는 경우, 푸소좀과 모세포는 유사한 지질 조성을 가질 수 있다고 고려된다.
실시예 87: 푸소좀 내 프로테옴 조성의 측정
본 실시예는 푸소좀의 단백질 조성의 정량화를 설명한다. 푸소좀의 단백질 조성은 이들이 유도된 모세포와 유사할 수 있다고 고려된다.
푸소좀과 모세포는 실시예 67 및 실시예 86의 방법에 따라 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다.
각각의 샘플을 용해 완충액(6 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% CHAPS, 50 mM Tris pH 8.0) 중에 재현탁시키고, 얼음 배쓰 상에서 초음파 처리하고, 작은 게이지의 시린지를 통해 실행하였다. 단백질을 10 mM DTT를 이용하여 65℃에서 15분 동안 환원시키고, 암실에서 실온에서 30분 동안 15 mM 요오도아세트아미드(IAA)로 알킬화하였다. 과량의 IAA를 추가의 10 mM DTT를 이용하여 켄칭하였다. 이어서, 단백질을 8부피의 얼음 냉각된 아세톤 + 1부피의 얼음 냉각된 메탄올을 첨가하여 침전시키고, -80℃에서 밤새 정치시켰다. 침전된 단백질을 원심분리로 펠릿화하였다. 남은 용해 완충액을 얼음 냉각된 메탄올 200 μl로 3회 세척하였다. 단백질을 0.75 M 우레아 + 50 mM Tris(pH 8.0) + 1 μg 트립신/LysC 중에 재현탁시키고, 37℃에서 4시간 동안 교반 하에서 사전 소화시켰다. 추가의 트립신/LysC 1 μg을 단백질에 첨가하고, 밤새 소화를 지속시켰다. 펩타이드를 역상 SPE로 정제하고, LC-MS로 분석하였다.
각각의 조건에 대한 복제 샘플을 용해시키고, 하나의 튜브에 통합하였다. 이어서, 이러한 풀을 샘플과 동일한 제조 프로토콜에 적용시키고, 정보 의존적 수집으로 LC-MS로 분석하거나, 하기 기재된 바와 같이 겔 상에서 분리하였다.
풀링된 단백질 총 100 μg을 2x Laemmli 로딩 완충액에 위치시키고, 12.5% SDS PAGE에서 분리하였다. 단백질을 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 간단히 염색하고, 단백질 레인을 12개의 분획으로 분리하였다. 이어서, 각각의 분획을 50% 아세토니트릴로 탈수시키고, 환원을 위해 10 mM DTT로 재수화시켰다. 겔 조각을 65℃에서 15분 동안 위치시키고, 암실에서 실온에서 30분 동안 15 mM IAA로 알킬화하였다. 겔을 추가로 50% 아세토니트릴로 탈수시키고, 트립신/LysC 1 μg이 함유된 50 mM Tris(pH 8)에서 37℃에서 재수화시켰다. 펩타이드를 탈수 및 초음파 처리를 통해 겔에서 추출하였다. 펩타이드를 역상 SPE로 정제하고, LC-MS/MS(분획당 1xIDA)로 분석하였다.
25 μm iD 모세관을 갖는 전기분무 인터페이스가 장착되고, Eksigent μUHPLC(Eksigent, Redwood City, CA, USA)가 결합된 ABSciex TripleTOF 5600(ABSciex, Foster City, CA, USA)를 이용하여 수집을 수행하였다. 기기를 제어하고, 데이터 처리 및 수집을 위해 Analyst TF 1.7 소프트웨어를 사용하였다. 겔의 12개의 분획 또는 미분획된 풀에 대해 정보 독립적 수집(IDA) 방식으로 수집을 수행하였다. 샘플을 SWATH 수집 방식으로 분석하였다. IDA 방식의 경우, 공급 전압을 5.2 kV로 설정하고, 225℃에서 유지시키고, 커튼 가스를 27 psi로 설정하고, 가스 1은 12 psi로 및 가스 2는 10 psi로 설정하였다. SWATH 방식의 경우, 공급 전압을 5.5 kV로 설정하고, 225℃에서 유지시키고, 커튼 가스를 25 psi로 설정하고, 가스 1은 16 psi로 및 가스 2는 15 psi로 설정하였다. 60℃에서 유지시킨 역상 HALO C18-ES 컬럼(0.3 mm i.d., 2.7 μm 입자, 150 mm 길이)(Advance Materials Technology, Wilmington, DE)에서 분리를 수행하였다. 샘플을 루프 과충전으로 5 μL 루프에 주입하였다. 60분 LC 구배의 경우, 이동상은 하기로 이루어져 있었다: 용매 A(물 중 0.2% v/v 포름산 및 3% DMSO v/v) 및 용매 B(EtOH 중 0.2% v/v 포름산 및 3% DMSO), 3 μL/min의 유량으로.
샘플 분석을 위한 이온 라이브러리를 생성하기 위해, ProteinPilot 소프트웨어를 IDA 실행에 의해 생성된 위프(wiff) 파일에서 실행시켰다. Peakview 소프트웨어(ABSciex)와 함께 이러한 데이터베이스를 사용하여, 3 전이/펩타이드와 15 펩타이드/단백질을 사용하여 각각의 샘플에서 단백질을 정량화하였다. 정량화된 단백질의 수를 최대화하기 위해, 샘플을 동일한 매개변수를 사용하여 공개적으로 입수 가능한 인간 SWATH 데이터베이스(Atlas)에서 정량화하였다. Peakview에 의해 계산된 점수가 1.5를 넘거나 FDR이 1% 미만인 경우, 펩타이드를 적절하게 측정된 것으로 간주하였다. 두 가지 데이터베이스로부터의 단백질 명칭을 사용하여 각각의 데이터베이스로부터의 정량화를 하나의 최종 정량화로 통합하였다. 모든 샘플에 대한 총 신호의 평균과 비교할 때, 샘플 내 모든 단백질의 총 신호를 고려하여 모든 샘플에 대해 보정 계수를 계산하였다.
푸소좀 프로테옴 조성을 모세포 프로테옴 조성과 비교하였다. 하기 표에 제시된 바와 같이, 확인된 단백질의 33% 초과가 푸소좀에 존재하고, 확인된 단백질 중에서, 수준이 모세포에서 상응하는 단백질 수준의 25% 초과인 경우, 푸소좀과 모세포 사이의 유사한 프로테옴 조성이 관찰되었다.
Figure pct00080
실시예 88: 푸소좀당 내인성 또는 합성 단백질 수준의 정량화
본 실시예는 푸소좀당 내인성 또는 합성 단백질 카고의 정량화를 설명한다. 푸소좀은, 일부 예에서, 내인성 또는 합성 단백질 카고를 포함한다. 본 실시예에 기재된 푸소좀 또는 모세포를, 내인성 단백질의 발현을 변경시키거나, 치료적 또는 신규한 세포 기능을 매개하는 합성 카고를 발현하도록 조작하였다.
GFP를 발현하는 푸소좀과 모세포는 실시예 67 및 실시예 86의 방법에 따라 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 푸소좀 내 GFP의 정량화는 상업적으로 입수 가능한 ELISA 키트(ab171581 Abcam Cambridge, United Kingdom)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 달성하였다. 푸소좀 정량화는 NanoSight NS300(Malvern Instruments, Malvern, Worcestershire, United Kingdom)을 사용하여 나노입자 추적 분석(Nanoparticle Tracking Analysis)에 따라 수행하였다. 결과는 하기 표에 제시되어 있다.
Figure pct00081
푸소좀은 푸소좀당 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 50개, 100개(또는 그 이상)의 단백질 작용제 분자를 가질 수 있다고 고려된다. 일 구현예에서, 푸소좀은 푸소좀당 166개의 단백질 작용제 분자를 가질 것이다.
실시예 89: 푸소좀 내 엑소좀 단백질 마커의 측정
본 검정은 엑소좀의 특정 마커로 공지된 단백질 비율의 정량화를 설명한다.
푸소좀은 실시예 67 및 실시예 86의 방법에 따라 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 엑소좀은, 모세포를 VSV-G 또는 GFP로 트랜스펙션시키지 않은 것을 제외하고는, 실시예 67 및 실시예 86의 방법에 따라 푸소좀에 대해 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 푸소좀 및 엑소좀에 대한 질량분석법에 의한 단백질 정량화는 실시예 35에 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다.
수득된 단백질 정량화 데이터를 분석하여, 공지된 엑소좀 마커 CD63의 단백질 수준과 비율을 결정하였다. 질량분석법으로 얻은 강도 값에 1을 더하고, log10으로 변환시키고, 반복에 걸친 평균을 계산하여, 군당 평균 로그 강도를 계산하였다. 결과는 도 16에 제시되어 있다.
실시예 90: 푸소좀 내 칼넥신 측정
본 검정은 푸소좀 내 칼넥신(CNX)의 수준과, 모세포와 비교한 푸소좀 내 CNX의 상대 수준의 정량화를 설명한다.
푸소좀과 모세포는 실시예 67 및 실시예 86에 기재된 바와 같이 제조하였다. 실시예 35의 방법에 따라 수행되는 질량분석법을 사용하여 칼넥신과 총 단백질을 측정하였다. 모세포 및 푸소좀에 대해 결정된 칼넥신 신호 강도는 도 17에 제시되어 있다.
구현예에서, 이러한 검정을 사용하면, 푸소좀 CNX의 평균 분획 함량(실시예 35에 본원에 기재된 바와 같이 측정됨)은 2.43 x 10-4 미만일 것이다.
일 구현예에서, 모세포에서 제제로의 총 단백질당 칼넥신의 감소(ng/μg)는 88% 초과일 것이다.
실시예 91: 푸소좀 내 지질 대 DNA 비
본 실시예는 모세포와 비교하여 푸소좀 내 지질 대 DNA의 정량화를 설명한다. 일 구현예에서, 푸소좀은 모세포와 비교하여 더 큰 지질 대 DNA의 비를 가질 것이다. 푸소좀은 실시예 67 및 실시예 86에 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
이러한 비는 실시예 40에 개괄된 지질 함량으로 정의되고, 핵산 함량은 실시예 41에 기재된 바와 같이 결정하였다. 도 18 및 하기 표에 제시된 바와 같이, 푸소좀은 모세포보다 더 큰 지질:DNA 비를 나타내는 것으로 확인되었다.
Figure pct00082
실시예 92: 푸소좀 상의 표면 마커 분석
본 검정은 푸소좀 상의 표면 마커 식별을 설명한다.
푸소좀은 실시예 67 및 실시예 86에 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 실시예 67 및 실시예 86에 본원에 기재된 바와 같이 질량분석법에 따라 포스파티딜세린을 측정하였다. 푸소좀 내 총 지질에 대한 포스파티딜세린의 양은, 하기 표에 제시된 바와 같이, 모세포 내 총 지질에 대한 포스파티딜세린의 양보다 121% 더 큰 것으로 결정되었다.
Figure pct00083
실시예 93: 푸소좀 내 바이러스 캡시드 단백질의 분석
본 실시예에서, 샘플 제제의 구성을 분석하고, 바이러스 캡시드 공급원에서 유도된 단백질의 비율을 평가하였다.
푸소좀은 실시예 67 및 실시예 86의 방법에 따라 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 푸소좀에 대한 질량분석법에 의한 단백질 정량화는 실시예 35에 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다. 바이러스 캡시드 단백질의 분획 함량을 실시예 35에 본원에 기재된 바와 같이 계산하고, 푸소좀 샘플에 걸쳐 평균을 내고, %로 표현하였다.
이러한 접근법을 사용하여, 하기 표에 제시된 바와 같이, 샘플이 바이러스 캡시드 단백질을 0.05% 함유하는 것으로 확인되었다. 검출된 유일한 바이러스 캡시드 단백질은 토끼 내인성 렌티바이러스(RELIK) 캡시드와 시클로필린 A의 복합체(PDB 2XGY|B)였다.
Figure pct00084
실시예 94: 푸소좀 내 푸소겐성 단백질 비의 정량화
본 실시예는 푸소겐 단백질 대 총 단백질 또는 푸소좀 내 다른 관심 단백질의 비의 정량화를 설명한다. 다른 관심 단백질에는, 비제한적으로, EGFP, CD63, ARRDC1, GAPDH, 칼넥신(CNX) 및 TSG101이 포함된다. 푸소좀은 실시예 67 및 실시예 86의 방법에 따라 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 푸소좀에 대한 질량분석법에 의한 단백질 정량화는 실시예 35에 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다. 모든 단백질의 정량화를 실시예 35에 본원에 기재된 바와 같이 계산하고, 푸소좀 샘플에 걸쳐 평균을 내고, 분율로 표현하였다.
하기 표에 제시된 바와 같이, 푸소겐은 EGFP에 대한 비 156.9, CD63에 대한 비 2912.0, ARRDC1에 대한 비 664.9, GAPDH에 대한 비 69.0, CNX에 대한 비 558.4, 및 TSG101에 대한 비 3064.1을 갖는 것으로 확인되었다.
Figure pct00085
실시예 95: 푸소좀 내 내인성 및 합성 단백질 비의 정량화
본 실시예는 총 단백질 또는 푸소좀 내 다른 관심 단백질에 대한 내인성 또는 합성 단백질 카고의 정량화를 설명한다. 다른 관심 단백질에는, 비제한적으로, VSV-G, CD63, ARRDC1, GAPDH, 칼넥신(CNX) 또는 TSG101이 포함된다. 푸소좀은 실시예 67 및 실시예 86의 방법에 따라 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 푸소좀에 대한 질량분석법에 의한 단백질 정량화는 실시예 35에 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다. 모든 단백질의 정량화를 실시예 35에 본원에 기재된 바와 같이 계산하고, 푸소좀 샘플에 걸쳐 평균을 내고, 분율로 표현하였다.
하기 표에 제시된 바와 같이, 합성 단백질 카고는 VSV-G에 대한 비 6.37 x 10-3, CD63에 대한 비 18.6, ARRDC1에 대한 비 4.24, GAPDH에 대한 비 0.44, CNX에 대한 비 3.56, 및 TSG101에 대한 비 19.52를 갖는 것으로 확인되었다.
Figure pct00086
실시예 96: 푸소좀 내 강화된 지질 조성
본 실시예는 푸소좀, 모세포 및 엑소좀의 지질 조성의 정량화를 설명한다. 푸소좀의 지질 조성은 이들이 유도된 세포에 비해 특정 지질이 강화 및/또는 고갈될 수 있다고 고려된다. 지질 조성은 크기, 정전기 상호작용 및 콜로이드 거동과 같은 푸소좀과 세포의 중요한 생물리학적 매개변수에 영향을 미친다.
지질 조성은 실시예 67 및 실시예 86에 기재된 바와 같이 측정하였다. 10 cm 디쉬에서 VSV-G와 GFP의 일시적 트랜스펙션 후, 트랜스펙션 48시간 후 조건화된 배지의 여과 및 초원심분리를 통해 푸소좀을 수득하여, 본원에 기재된 바와 같이 푸소좀을 제조하였다. 트랜스펙션된 세포를 조건화된 배지와 동시에 채취하고, 분석을 위해 제공하였다. 엑소좀은, 모세포를 VSV-G 또는 GFP로 트랜스펙션시키지 않은 것을 제외하고는, 푸소좀에 대해 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다.
푸소좀, 엑소좀 및 모세포에 대한 지질 조성은 도 19a 및 도 19b에 제시되어 있다. 모세포와 비교하여, 푸소좀은 콜레스테릴 에스테르, 유리 콜레스테롤, 에테르 결합된 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜세린, 포스파티데이트, 에테르 결합된 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 및 스핑고미엘린이 강화되었다. 모세포와 비교하여, 푸소좀은 세라미드, 카르디오리핀, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜글리세롤, 리소포스파티딜이노시톨, 에테르 결합된 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 및 트리아실글리세롤이 고갈되었다. 엑소좀과 비교하여, 푸소좀은 콜레스테릴 에스테르, 세라미드, 디아실글리세롤, 리소포스파티데이트 및 포스파티딜에탄올아민, 트리아실글리세롤이 강화되었다. 엑소좀과 비교하여, 푸소좀은 유리 콜레스테롤, 헥소실세라미드, 리소포스파티딜콜린, 에테르 결합된 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 에테르 결합된 리소포스파티딜에탄올아민 및 리소포스파티딜세린이 고갈되었다.
실시예 97: 푸소좀의 구획 특이적 프로테옴 함량 측정
본 실시예는 푸소좀, 푸소좀 모세포 및 엑소좀 내 특정 세포 구획에서 유도된 것으로 공지된 단백질 비율의 정량화를 설명한다.
푸소좀과 모세포는 실시예 67 및 실시예 86의 방법에 따라 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 엑소좀은, 모세포를 VSV-G 또는 GFP로 트랜스펙션시키지 않은 것을 제외하고는, 실시예 67 및 실시예 86의 방법에 따라 푸소좀에 대해 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 푸소좀 및 엑소좀에 대한 질량분석법에 의한 단백질 정량화는 실시예 35에 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다. 수득된 단백질 정량화 데이터를 분석하여, 증거 코드 IDA(직접 검정에 의해 추론됨)와 함께 유전자 온톨로지 세포 구획(Gene Ontology Cellular Compartment) 주석 용어(엑소좀: GO:0070062, 소포체: GO:0005783, ribosome: GO:0005840, GO:0022625, GO:0022626, GO:0022627, GO:0044391, GO:0042788, GO:0000313)로 주석이 달린 바와 같이 공지된 엑소좀, 소포체, 리보솜, 핵 및 미토콘드리아 단백질의 단백질 수준 및 비율을 결정하였다. 푸소좀 샘플, 엑소좀 샘플 및 모세포에 대해, 각각의 샘플 내 총 단백질에 대한 구획 특이적 단백질의 분율을 결정하였다.
도 20에 제시된 바와 같이, 푸소좀은 모세포 및 엑소좀과 비교하여 소포체 단백질이 고갈된 것으로 확인되었다. 푸소좀은 또한 엑소좀과 비교하여 엑소좀 단백질이 고갈된 것으로 확인되었다. 푸소좀은 모세포와 비교하여 미토콘드리아 단백질이 고갈되었다. 푸소좀은 모세포와 비교하여 핵 단백질이 강화되었다. 푸소좀은 모세포 및 엑소좀과 비교하여 리보솜 단백질이 강화되었다.
실시예 98: 푸소좀 내 TSG101 및 ARRDC1 함량 측정
본 실시예는 세포에서 방출된 푸소좀에서 중요한 것으로 공지된 단백질 비율의 정량화를 설명한다.
푸소좀과 모세포는 실시예 67 및 실시예 86의 방법에 따라 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 엑소좀은, 모세포를 VSV-G 또는 GFP로 트랜스펙션시키지 않은 것을 제외하고는, 실시예 67 및 실시예 86의 방법에 따라 푸소좀에 대해 본원에 기재된 바와 같이 제조하였다. 푸소좀 및 엑소좀에 대한 질량분석법에 의한 단백질 정량화는 실시예 35에 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다. 수득된 단백질 정량화 데이터를 분석하여, 단백질 TSG101 및 ARRDC1의 단백질 수준과 비율을 결정하였다. 질량분석법으로 얻은 강도 값에 1을 더하고, log10으로 변환시키고, 반복에 걸친 평균을 계산하여, 군당 평균 로그 강도를 계산하였다. 엑소좀 또는 모세포에 대한 푸소좀 TSG101 또는 ARRDC1의 총 단백질 함량의 백분율을, 각각의 샘플에 대한 TSG101 또는 ARRDC1의 평균 로그 강도로 결정하고, 동일한 샘플 내 모든 단백질의 강도의 합으로 나누고, 반복에 대해 평균을 내고, %로 표현하였다.
도 21에 제시된 바와 같이, ARRDC1은 푸소좀 내 총 단백질 함량의 백분율을 모세포 또는 엑소좀에 비해 더 큰 수준으로 나타내는 것으로 확인되었다. 총 단백질 함량의 백분율로서의 ARRDC1의 수준은 푸소좀에서 적어도 0.02%였다. TSG101은 푸소좀 내 총 단백질 함량의 백분율을 모세포 또는 엑소좀보다 더 큰 수준으로 나타내는 것으로 확인되었다. 총 단백질 함량의 백분율로서의 TSG101의 수준은 푸소좀에서 적어도 0.004%였다.
실시예 99: 다회투여 후 푸소좀의 혈청 불활성화 측정
본 실시예는 푸소좀의 다회투여 후 시험관내 전달 검정을 사용한 푸소좀의 혈청 불활성화의 정량화를 설명한다. 변형된, 예를 들어 본원에 기재된 방법에 의해 변형된 푸소좀은, 변형된 푸소좀의 다회(예를 들어, 1회 초과, 예를 들어 2회 이상) 투여 후 감소된(예를 들어, 변형되지 않은 푸소좀의 투여와 비교하여 감소된) 혈청 불활성화를 나타낼 수 있다고 고려된다. 일부 예에서, 본원에 기재된 푸소좀은 다회투여 후 혈청에 의해 불활성화되지 않을 것이다.
푸소좀에 대한 면역원성의 척도는 혈청 불활성화이다. 일 구현예에서, 푸소좀의 반복된 주사는 항-푸소좀 항체, 예를 들어 푸소좀을 인식하는 항체의 발달을 유도할 수 있다. 일 구현예에서, 푸소좀을 인식하는 항체는 푸소좀 활성 또는 수명을 제한하고, 보체 분해를 매개할 수 있는 방식으로 결합할 수 있다.
본 실시예에서, 푸소좀의 1회 이상의 투여 후 혈청 불활성화를 조사하였다. 푸소좀은 이전 실시예 중 어느 하나에 따라 생성하였다. 본 실시예에서, HLA-G의 렌티바이러스 매개 발현으로 변형된 HEK293 세포(이하 HEK293-HLA-G), 및 빈 벡터의 렌티바이러스 매개 발현으로 변형된 HEK293 세포(이하 HEK293)에서 푸소좀을 생성하였다. 일부 구현예에서, 다른 면역조절 단백질을 발현하는 세포에서 푸소좀을 유도하였다.
혈청을 다음과 같은 상이한 코호트에서 추출하였다: 비히클( 푸소좀 나이브 군), HEK293-HLA-G 푸소좀 또는 HEK293을 1회, 2회, 3회, 5회, 10회 전신 및/또는 국소 주사한 마우스. 마우스에서 신선한 전혈을 채취하고, 수 시간 동안 완전히 응고시켜, 혈청을 채취하였다. 혈전을 원심분리로 펠릿화하고, 혈청 상청액을 제거하였다. 음성 대조군은 열 불활성화 마우스 혈청이었다. 음성 대조군 샘플을 56℃에서 1시간 동안 가열하였다. 혈청은 분취량으로 동결시킬 수 있다.
수용체 집단의 세포의 50%가 푸소좀 내 페이로드를 수용하는 용량에 대해 푸소좀을 시험하였다. 푸소좀은 본원에 기재된 임의의 다른 실시예를 통해 생성할 수 있으며, 본원에 기재된 임의의 페이로드를 함유할 수 있다. 수용세포로의 페이로드의 푸소좀 전달을 검정하기 위한 다수의 방법이 또한 본원에 기재되어 있다. 이러한 특정 실시예에서, 페이로드는 Cre 단백질이고, 수용세포는 CMV 프로모터 하에서 "LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP" 카세트를 안정적으로 발현하는 RPMI8226 세포이며, 이는 Cre에 의한 재조합 시, GFP에서 RFP 발현으로 전환하여, 융합 및 Cre를 전달의 마커로서 나타낸다. 수용세포의 50%가 RFP 양성으로 확인된 용량을 추가 실험에 사용하였다. 다른 구현예에서, 수용세포의 50%가 페이로드를 수용하는 것으로 확인된 용량을 추가 시험에 사용하였다.
푸소좀의 혈청 불활성화를 평가하기 위해, 푸소좀을 정상 또는 열 불활성화된 혈청(또는 무혈청 대조군과 같이 10% 열 불활성화된 FBS가 함유된 배지)으로 1:5로 희석하고, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 추가의 1:5 희석을 위해 반응액에 배지를 첨가한 후, 1:10 비로 2회 연속 희석하였다. 이러한 단계 후, 푸소좀은 수용세포의 50%가 페이로드를 수용한(예를 들어, RFP 양성인) 이전에 확인된 용량으로 존재해야 한다. 수용세포의 50%가 페이로드를 수용하는 것으로 확인된 용량은 푸소좀에 걸쳐 유사할 수 있다고 고려된다.
이어서, 혈청에 노출된 푸소좀을 수용세포와 함께 인큐베이션하였다. 페이로드를 수용해서 RFP 양성인 세포의 %를 계산하였다. 페이로드를 수용하는 세포의 %는 HEK293-HLA-G 푸소좀으로 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플과, 상기 마우스로부터의 열 불활성화된 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플 사이에서 상이하지 않을 것이며, 이는 푸소좀의 혈청 불활성화 또는 후천성 면역 반응이 존재하지 않음을 나타낸다. 페이로드를 수용하는 세포의 %는 HEK293-HLA-G 푸소좀으로 1회, 2회, 3회, 5회 또는 10회 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플 사이에서 상이하지 않을 것이며, 이는 푸소좀의 혈청 불활성화 또는 후천성 면역 반응이 존재하지 않음을 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 페이로드를 수용하는 세포의 %는 비히클로 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플과, HEK293-HLA-G 푸소좀으로 처리된 마우스로부터의 혈청과 함께 인큐베이션된 푸소좀 샘플 사이에서 상이하지 않을 것이며, 이는 푸소좀의 혈청 불활성화 또는 후천성 면역 반응이 존재하지 않음을 나타낸다. 일부 예에서, 페이로드를 수용하는 세포의 %는 HEK293-HLA-G 푸소좀보다 HEK293에서 유도된 푸소좀의 경우 더 적으며, 이는 HEK293-HLA-G 푸소좀의 혈청 불활성화 또는 후천성 면역 반응이 존재하지 않음을 나타낸다.
실시예 100: 푸소좀의 보체 표적화 측정
본 실시예는 시험관내 검정을 사용한 푸소좀에 대한 보체 활성의 정량화를 설명한다. 본원에 기재된 변형된 푸소좀은 상응하는 변형되지 않은 푸소좀과 비교하여 감소된 보체 활성을 유도할 수 있다고 고려된다.
본 실시예에서, 마우스의 혈청을 푸소좀에 대한 보체 활성에 대해 평가하였다. 본 실시예에서는 모든 보체 경로의 중심 노드인 보체 C3a의 수준을 측정하였다. 특히, 본원에 기재된 방법은 프로토콜을 최적화하여 인간, 래트, 원숭이에게 동일하게 적용 가능하다.
본 실시예에서, 푸소좀은 이전 실시예 중 어느 하나에 따라 생성하였다. 보체 조절 단백질 DAF의 렌티바이러스 매개 발현으로 변형된 HEK293 세포(HEK293-DAF 푸소좀) 또는 상보적 조절 단백질을 발현하지 않는 HEK293 세포(HEK293 푸소좀)에서 푸소좀을 생성하였다. 붕괴촉진인자(DAF, CD55)에 결합하는 단백질, 예를 들어 인자 H(FH) 유사 단백질-1(FHL-1), 예를 들어 C4b-결합 단백질(C4BP), 예를 들어 보체 수용체 1(CD35), 예를 들어 막 보조인자 단백질(MCP, CD46), 예를 들어 프로텍틴(CD59), 예를 들어 전형적 및 대안적 보체 경로 CD/C5 전환효소를 저해하는 단백질, 예를 들어 MAC 어셈블리를 조절하는 단백질과 같은 다른 보체 조절 단백질을 또한 사용할 수 있다.
나이브 마우스, HEK293-DAF 푸소좀을 투여한 마우스 또는 HEK293 푸소좀을 투여한 마우스에서 혈청을 회수하였다. 마우스에서 신선한 전혈을 채취하고, 수 시간 동안 완전히 응고시켜, 혈청을 채취하였다. 혈전을 원심분리로 펠릿화하고, 혈청 상청액을 제거하였다. 음성 대조군은 열 불활성화 마우스 혈청이었다. 음성 대조군 샘플을 56℃에서 1시간 동안 가열하였다. 혈청은 분취량으로 동결시킬 수 있다.
수용체 집단의 세포의 50%가 푸소좀 내 페이로드를 수용하는 용량에 대해 상이한 푸소좀을 시험하였다. 푸소좀은 본원에 기재된 임의의 다른 실시예를 통해 생성할 수 있으며, 본원에 기재된 임의의 페이로드를 함유할 수 있다. 수용세포로의 페이로드의 푸소좀 전달을 검정하기 위한 다수의 방법이 또한 본원에 기재되어 있다. 이러한 특정 실시예에서, 페이로드는 Cre 단백질이고, 수용세포는 CMV 프로모터 하에서 "LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP" 카세트를 안정적으로 발현하는 RPMI8226 세포이며, 이는 Cre에 의한 재조합 시, GFP에서 RFP 발현으로 전환하여, 융합 및 Cre를 전달의 마커로서 나타낸다. 수용세포의 50%가 RFP 양성으로 확인된 용량을 추가 실험에 사용하였다. 다른 구현예에서, 수용세포의 50%가 페이로드를 수용하는 것으로 확인된 용량을 추가 시험에 사용하였다. 바람직한 구현예에서, 수용세포의 50%가 페이로드를 수용하는 것으로 확인된 용량은 푸소좀에 걸쳐 유사하다.
수용세포의 50%가 포스페이트 완충 염수(PBS, pH 7.4) 중의 페이로드를 수용하는 푸소좀의 용량에서 시작하여, 푸소좀의 2배 희석액을, 동일한 푸소좀으로 처리한 마우스 또는 나이브 마우스의 혈청과 1:10 희석으로 혼합하고(검정 부피, 20 μl), 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 1:500로 추가로 희석하고, C3a에 대하여 특이적인 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 사용하였다. ELISA는 LifeSpan BioSciences Inc 사에서 시판되는 마우스 보체 C3a ELISA 키트 제품 LS-F4210으로, 이는 샘플에서 C3a의 농도를 측정한다. 200 pg/ml의 C3a가 존재하는 푸소좀의 용량을 마우스로부터 단리된 혈청에 걸쳐 비교하였다.
일부 예에서, 200 pg/ml의 C3a가 존재하는 푸소좀의 용량은 HEK293 마우스 혈청과 함께 인큐베이션된 HEK293 푸소좀보다 HEK293 DAF 마우스 혈청과 함께 인큐베이션된 HEK293-DAF 푸소좀에서 더 크며, 이는 보체 활성 표적화 푸소좀이 HEK293-DAF 푸소좀보다 HEK293 푸소좀으로 처리된 마우스에 더 많다는 것을 나타낸다. 일부 예에서, 200 pg/ml의 C3a가 존재하는 푸소좀의 용량은 나이브 마우스 혈청과 함께 인큐베이션된 HEK293 푸소좀보다 나이브 마우스 혈청과 함께 인큐베이션된 HEK293-DAF 푸소좀에서 더 크며, 이는 보체 활성 표적화 푸소좀이 HEK293-DAF 푸소좀보다 HEK293 푸소좀으로 처리된 마우스에 더 많다는 것을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS V, INC. <120> FUSOSOME COMPOSITIONS FOR CNS DELIVERY <130> V2050-7029WO_VL39023-03 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> 62/767,358 <151> 2018-11-14 <150> 62/900,064 <151> 2019-09-13 <160> 162 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 589 <212> PRT <213> human respiratory syncytal virus <220> <221> MISC_FEATURE <223> fusion glycoprotein <400> 1 Met Ile Pro Gln Ala Arg Thr Glu Leu Asn Leu Gly Gln Ile Thr Met 1 5 10 15 Glu Leu Leu Ile His Arg Ser Ser Ala Ile Phe Leu Thr Leu Ala Ile 20 25 30 Asn Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr 35 40 45 Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Arg Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg 50 55 60 Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys 65 70 75 80 Glu Thr Lys Cys Asn Gly Thr Asp Thr Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln 85 90 95 Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met 100 105 110 Gln Asn Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Ala Pro 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fusion glycoprotein precursor <400> 20 Met Ile Pro Gly Arg Ile Phe Leu Val Leu Leu Val Ile Phe Asn Thr 1 5 10 15 Lys Pro Ile His Pro Asn Thr Leu Thr Glu Lys Phe Tyr Glu Ser Thr 20 25 30 Cys Ser Val Glu Thr Ala Gly Tyr Lys Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp 35 40 45 His Met Thr Val Met Ser Ile Lys Leu Ser Gln Ile Asn Ile Glu Ser 50 55 60 Cys Lys Ser Ser Asn Ser Leu Leu Ala His Glu Leu Ala Ile Tyr Ser 65 70 75 80 Ser Ala Val Asp Glu Leu Arg Thr Leu Ser Ser Asn Ala Leu Lys Ser 85 90 95 Lys Arg Lys Lys Arg Phe Leu Gly Leu Ile Leu Gly Leu Gly Ala Ala 100 105 110 Val Thr Ala Gly Val Ala Leu Ala Lys Thr Val Gln Leu Glu Ser Glu 115 120 125 Ile Ala Leu Ile Arg Asp Ala Val Arg Asn Thr Asn Glu Ala Val Val 130 135 140 Ser Leu Thr Asn Gly Met Ser Val Leu Ala Lys Val Val Asp Asp Leu 145 150 155 160 Lys Asn Phe Ile Ser Lys Glu Leu Leu Pro Lys Ile Asn Arg Val Ser 165 170 175 Cys Asp Val His Asp Ile Thr Ala Val Ile Arg Phe Gln Gln Leu Asn 180 185 190 Lys Arg Leu Leu Glu Val Ser Arg Glu Phe Ser Ser Asn Ala Gly 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<213> Avian paramyxovirus 8 <220> <221> MISC_FEATURE <223> fusion protein <400> 23 Met Gly Gln Ile Ser Val Tyr Leu Ile Asn Ser Val Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Tyr Pro Val Asn Ser Ile Asp Asn Thr Leu Ile Ala Pro Ile Gly 20 25 30 Val Ala Ser Ala Asn Glu Trp Gln Leu Ala Ala Tyr Thr Thr Ser Leu 35 40 45 Ser Gly Thr Ile Ala Val Arg Phe Leu Pro Val Leu Pro Asp Asn Met 50 55 60 Thr Thr Cys Leu Arg Glu Thr Ile Thr Thr Tyr Asn Asn Thr Val Asn 65 70 75 80 Asn Ile Leu Gly Pro Leu Lys Ser Asn Leu Asp Ala Leu Leu Ser Ser 85 90 95 Glu Thr Tyr Pro Gln Thr Arg Leu Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Ile 100 105 110 Ala Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile Thr Ala Ala Val Ala Leu 115 120 125 Lys Gln Ala Gln Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Ala Leu Lys Glu Ala 130 135 140 Leu Ser Lys Thr Asn Glu Ala Val Lys Glu Leu Ser Ser Gly Leu Gln 145 150 155 160 Gln Thr Ala Ile Ala Leu Gly Lys Ile Gln Ser Phe Val Asn Glu Glu 165 170 175 Ile Leu Pro Ser Ile Asn Gln Leu Ser Cys Glu Val Thr Ala Asn Lys 180 185 190 Leu Gly Val Tyr 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14 <220> <221> MISC_FEATURE <223> fusion protein <400> 54 Met Glu Lys Gly Thr Val Leu Phe Leu Ala Ala Leu Thr Leu Tyr Asn 1 5 10 15 Val Lys Ala Leu Asp Asn Thr Lys Leu Leu Gly Ala Gly Ile Ala Ser 20 25 30 Gly Lys Glu His Glu Leu Lys Ile Tyr Gln Ser Ser Val Asn Gly Tyr 35 40 45 Ile Ala Val Lys Leu Ile Pro Phe Leu Pro Ser Thr Lys Arg Glu Cys 50 55 60 Tyr Asn Glu Gln Leu Lys Asn Tyr Asn Ala Thr Ile Asn Arg Leu Met 65 70 75 80 Gly Pro Ile Asn Asp Asn Ile Lys Leu Val Leu Ser Gly Val Lys Thr 85 90 95 Arg Thr Arg Glu Gly Lys Leu Ile Gly Ala Ile Ile Gly Thr Ala Ala 100 105 110 Leu Gly Leu Ala Thr Ala Ala Gln Val Thr Ala Ala Ile Ala Leu Glu 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Asn Ala Arg Ala Ile Leu Thr Leu Lys Glu Ser Ile 130 135 140 Arg Asn Thr Asn Asn Ala Val Ser Glu Leu Lys Thr Gly Leu Ser Glu 145 150 155 160 Val Ser Ile Ala Leu Ser Lys Thr Gln Asp Tyr Ile Asn Thr Gln Ile 165 170 175 Met Pro Ala Leu Ser Asn Leu Ser Cys Glu Ile Val Gly Leu Lys Ile 180 185 190 Gly Ile Gln Leu Ser Gln Tyr Leu Thr Glu 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metapneumovirus <220> <221> MISC_FEATURE <223> attachment glycoprotein G <400> 69 Met Glu Val Arg Val Glu Asn Ile Arg Ala Ile Asp Met Phe Lys Ala 1 5 10 15 Lys Met Lys Asn Arg Ile Arg Ser Ser Lys Cys Tyr Arg Asn Ala Thr 20 25 30 Leu Ile Leu Ile Gly Leu Thr Ala Leu Ser Met Ala Leu Asn Ile Phe 35 40 45 Leu Ile Ile Asp Tyr Ala Thr Leu Lys Asn Met Thr Lys Val Glu His 50 55 60 Cys Val Asn Met Pro Pro Val Glu Pro Ser Lys Lys Ser Pro Met Thr 65 70 75 80 Ser Ala Ala Asp Leu Asn Thr Lys Leu Asn Pro Gln Gln Ala Thr Gln 85 90 95 Leu Thr Thr Glu Asp Ser Thr Ser Leu Ala Ala Thr Ser Glu Asn His 100 105 110 Leu His Thr Glu Thr Thr Pro Thr Ser Asp Ala Thr Ile Ser Gln Gln 115 120 125 Ala Thr Asp Glu His Thr Thr Leu Leu Arg Pro Ile Asn Arg Gln Thr 130 135 140 Thr Gln Thr Thr Thr Glu Lys Lys Pro Thr Gly Ala Thr Thr Lys Lys 145 150 155 160 Asp Lys Glu Lys Glu Thr Thr Thr Arg Thr Thr Ser Thr Ala Ala Thr 165 170 175 Gln Thr Leu Asn Thr Thr Asn Gln Thr Ser Asn Gly Arg Glu Ala Thr 180 185 190 Thr Thr Ser Ala 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945 950 955 960 Ile Asp Arg Ile Val Met Gln Glu Leu Gln Asp Met Phe Pro Glu Glu 965 970 975 Phe Asp Lys Thr Ser Phe His Lys Val Arg His Ser Glu Asp Met Gln 980 985 990 Phe Ala Phe Ser Tyr Phe Tyr Tyr Leu Met Ser Ala Val Gln Pro Leu 995 1000 1005 Asn Ile Ser Gln Val Phe Asp Glu Val Asp Thr Asp Gln Ser Gly 1010 1015 1020 Val Leu Ser Asp Arg Glu Ile Arg Thr Leu Ala Thr Arg Ile His 1025 1030 1035 Glu Leu Pro Leu Ser Leu Gln Asp Leu Thr Gly Leu Glu His Met 1040 1045 1050 Leu Ile Asn Cys Ser Lys Met Leu Pro Ala Asp Ile Thr Gln Leu 1055 1060 1065 Asn Asn Ile Pro Pro Thr Gln Glu Ser Tyr Tyr Asp Pro Asn Leu 1070 1075 1080 Pro Pro Val Thr Lys Ser Leu Val Thr Asn Cys Lys Pro Val Thr 1085 1090 1095 Asp Lys Ile His Lys Ala Tyr Lys Asp Lys Asn Lys Tyr Arg Phe 1100 1105 1110 Glu Ile Met Gly Glu Glu Glu Ile Ala Phe Lys Met Ile Arg Thr 1115 1120 1125 Asn Val Ser His Val Val Gly Gln Leu Asp Asp Ile Arg Lys Asn 1130 1135 1140 Pro Arg Lys Phe Val Cys Leu Asn Asp Asn Ile Asp His Asn His 1145 1150 1155 Lys Asp Ala Gln Thr Val Lys Ala Val Leu Arg Asp Phe Tyr Glu 1160 1165 1170 Ser Met Phe Pro Ile Pro Ser Gln Phe Glu Leu Pro Arg Glu Tyr 1175 1180 1185 Arg Asn Arg Phe Leu His Met His Glu Leu Gln Glu Trp Arg Ala 1190 1195 1200 Tyr Arg Asp Lys Leu Lys Phe Trp Thr His Cys Val Leu Ala Thr 1205 1210 1215 Leu Ile Met Phe Thr Ile Phe Ser Phe Phe Ala Glu Gln Leu Ile 1220 1225 1230 Ala Leu Lys Arg Lys Ile Phe Pro Arg Arg Arg Ile His Lys Glu 1235 1240 1245 Ala Ser Pro Asn Arg Ile Arg Val 1250 1255 <210> 154 <211> 580 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> MCOLN1 <400> 154 Met Thr Ala Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ser Glu Thr Glu Arg Leu Leu 1 5 10 15 Thr Pro Asn Pro Gly Tyr Gly Thr Gln Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro 20 25 30 Pro Thr Pro Pro Glu Glu Glu Asp Leu Arg Arg Arg Leu Lys Tyr Phe 35 40 45 Phe Met Ser Pro Cys Asp Lys Phe Arg Ala Lys Gly Arg Lys Pro Cys 50 55 60 Lys Leu Met Leu Gln Val Val Lys Ile Leu Val Val Thr Val Gln Leu 65 70 75 80 Ile Leu Phe Gly Leu Ser Asn Gln Leu Ala Val Thr Phe Arg Glu Glu 85 90 95 Asn Thr Ile Ala Phe Arg His Leu Phe Leu Leu Gly Tyr Ser Asp Gly 100 105 110 Ala Asp Asp Thr Phe Ala Ala Tyr Thr Arg Glu Gln Leu Tyr Gln Ala 115 120 125 Ile Phe His Ala Val Asp Gln Tyr Leu Ala Leu Pro Asp Val Ser Leu 130 135 140 Gly Arg Tyr Ala Tyr Val Arg Gly Gly Gly Asp Pro Trp Thr Asn Gly 145 150 155 160 Ser Gly Leu Ala Leu Cys Gln Arg Tyr Tyr His Arg Gly His Val Asp 165 170 175 Pro Ala Asn Asp Thr Phe Asp Ile Asp Pro Met Val Val Thr Asp Cys 180 185 190 Ile Gln Val Asp Pro Pro Glu Arg Pro Pro Pro Pro Pro Ser Asp Asp 195 200 205 Leu Thr Leu Leu Glu Ser Ser Ser Ser Tyr Lys Asn Leu Thr Leu Lys 210 215 220 Phe His Lys Leu Val Asn Val Thr Ile His Phe Arg Leu Lys Thr Ile 225 230 235 240 Asn Leu Gln Ser Leu Ile Asn Asn Glu Ile Pro Asp Cys Tyr Thr Phe 245 250 255 Ser Val Leu Ile Thr Phe Asp Asn Lys Ala His Ser Gly Arg Ile Pro 260 265 270 Ile Ser Leu Glu Thr Gln Ala His Ile Gln Glu Cys Lys His Pro Ser 275 280 285 Val Phe Gln His Gly Asp Asn Ser Phe Arg Leu Leu Phe Asp Val Val 290 295 300 Val Ile Leu Thr Cys Ser Leu Ser Phe Leu Leu Cys Ala Arg Ser Leu 305 310 315 320 Leu Arg Gly Phe Leu Leu Gln Asn Glu Phe Val Gly Phe Met Trp Arg 325 330 335 Gln Arg Gly Arg Val Ile Ser Leu Trp Glu Arg Leu Glu Phe Val Asn 340 345 350 Gly Trp Tyr Ile Leu Leu Val Thr Ser Asp Val Leu Thr Ile Ser Gly 355 360 365 Thr Ile Met Lys Ile Gly Ile Glu Ala Lys Asn Leu Ala Ser Tyr Asp 370 375 380 Val Cys Ser Ile Leu Leu Gly Thr Ser Thr Leu Leu Val Trp Val Gly 385 390 395 400 Val Ile Arg Tyr Leu Thr Phe Phe His Asn Tyr Asn Ile Leu Ile Ala 405 410 415 Thr Leu Arg Val Ala Leu Pro Ser Val Met Arg Phe Cys Cys Cys Val 420 425 430 Ala Val Ile Tyr Leu Gly Tyr Cys Phe Cys Gly Trp Ile Val Leu Gly 435 440 445 Pro Tyr His Val Lys Phe Arg Ser Leu Ser Met Val Ser Glu Cys Leu 450 455 460 Phe Ser Leu Ile Asn Gly Asp Asp Met Phe Val Thr Phe Ala Ala Met 465 470 475 480 Gln Ala Gln Gln Gly Arg Ser Ser Leu Val Trp Leu Phe Ser Gln Leu 485 490 495 Tyr Leu Tyr Ser Phe Ile Ser Leu Phe Ile Tyr Met Val Leu Ser Leu 500 505 510 Phe Ile Ala Leu Ile Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Lys His Pro Gly 515 520 525 Gly Ala Gly Ala Glu Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Ile Ala Gln Cys 530 535 540 Gln Asp Ser Pro Thr Ser Gly Lys Phe Arg Arg Gly Ser Gly Ser Ala 545 550 555 560 Cys Ser Leu Leu Cys Cys Cys Gly Arg Asp Pro Ser Glu Glu His Ser 565 570 575 Leu Leu Val Asn 580 <210> 155 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Caspase 2 protein sequence <400> 155 Val Asp Val Ala Asp 1 5 <210> 156 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> miR-338-3p <400> 156 uccagcauca gugauuuugu ug 22 <210> 157 <211> 23 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> miR-9-5p <400> 157 ucuuugguua ucuagcugua uga 23 <210> 158 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> miR-9-3p <400> 158 auaaagcuag auaaccgaaa gu 22 <210> 159 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> miR-125b-5p <400> 159 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 160 <211> 23 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> miR-342-3p <400> 160 ucucacacag aaaucgcacc cgu 23 <210> 161 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> miR-124-3p <400> 161 uaaggcacgc ggugaaugcc aa 22 <210> 162 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> miR-124-5p <400> 162 cguguucaca gcggaccuug au 22

Claims (62)

  1. 푸소좀(fusosome)으로서,
    a) 푸소겐(fusogen)을 포함하는 지질 이중층; 및
    b) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 핵산을 포함하는, 푸소좀:
    (i) 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자(payload gene); 및
    (ii) 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된(operatively linked) 양성 표적세포 특이적 조절 요소로서, 양성 표적세포 특이적 조절 요소가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 표적세포에서 페이로드 유전자의 발현을 증가시키며, 여기서 표적세포는 CNS세포인, 양성 표적세포 특이적 조절 요소.
  2. 제1항에 있어서, 핵산이 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 비(非)표적세포 특이적 조절 요소(NTCSRE)를 추가로 포함하고, 여기서 NTCSRE는 NTCSRE가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 비표적세포에서 페이로드 유전자의 발현을 감소시키고, 여기서 표적세포는 첫 번째 유형의 CNS세포이고, 비표적세포는 두 번째 상이한 유형의 CNS세포 또는 비(非)CNS세포이며, 선택적으로 여기서
    표적세포는 뉴런이고, 비표적세포는 아교세포이며, 선택적으로 여기서 아교세포는 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포이거나,
    표적세포는 아교세포이며, 선택적으로 여기서 아교세포는 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포이고, 비표적세포는 뉴런인, 푸소좀.
  3. 푸소좀으로서,
    a) 푸소겐을 포함하는 지질 이중층; 및
    b) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 핵산을 포함하는, 푸소좀:
    (i) 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자; 및
    (ii) 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터로서, SYN, NSE, CaMKII, α튜불린, PDGF, fSST, fNPY, GAD67, DLX5/6, VGLUT1, Dock10, ChAT, VAChT, Drd1a, TPH-2, GFAP, EAAT1, GS, CX3CR1, TMEM119, MBP, CNP 또는 CRFR2β 프로모터에서 선택되는, 프로모터.
  4. 푸소좀으로서,
    a) 푸소겐을 포함하는 지질 이중층; 및
    b) 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 핵산을 포함하는, 푸소좀:
    (i) 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자; 및
    (ii) 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 비표적세포 특이적 조절 요소(NTCSRE)로서, 여기서
    NTCSRE는 NTCSRE가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 비표적세포 또는 비표적조직에서 페이로드 유전자의 발현을 감소시키고, 여기서 표적세포는 첫 번째 유형의 CNS세포이고, 비표적세포는 두 번째 상이한 유형의 CNS세포 또는 비CNS세포이며,
    NTCSRE는 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열, 비표적세포 특이적 프로테아제 인식 부위, 비표적세포 특이적 유비퀴틴 리가아제 부위, 비표적세포 특이적 전사 억제 부위 또는 비표적세포 특이적 후성적 억제 부위를 포함하는, NTCSRE.
  5. 제4항에 있어서, 핵산이 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 양성 표적세포 특이적 조절 요소를 추가로 포함하고, 여기서 양성 표적세포 특이적 조절 요소는 양성 표적세포 특이적 조절 요소가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 표적세포에서 페이로드 유전자의 발현을 증가시키며, 여기서 표적세포는 CNS세포인, 푸소좀.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 (i) 또는 (ii) 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함하는, 푸소좀:
    (i) 지질 이중층 상의 제1 외인성 또는 과발현된 면역억제 단백질; 또는
    (ii) 존재하지 않거나 감소된 수준으로 존재하는 제1 면역자극 단백질(선택적으로 여기서 감소된 수준은 다른 유사한 변형되지 않은 원천세포에서 생성된 푸소좀과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된 수준임).
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드 유전자가 리소좀 축적 질환 또는 장애, 또는 CNS 질환 또는 장애를 치료하는 유전자이고, 선택적으로 여기서 상기 질환 또는 장애는 유전자 결핍인, 푸소좀.
  8. 푸소좀으로서,
    a) 푸소겐을 포함하는 지질 이중층;
    b) 리소좀 축적 질환 또는 장애, 또는 CNS 질환 또는 장애를 치료하기 위한 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자를 포함하는 핵산; 및
    c) 하기 (i) 또는 (ii) 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 푸소좀:
    (i) 지질 이중층 상의 제1 외인성 또는 과발현된 면역억제 단백질; 또는
    (ii) 존재하지 않거나, 다른 유사한 변형되지 않은 원천세포에서 생성된 푸소좀과 비교하여 감소된 수준으로(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된 수준으로) 존재하는 제1 면역자극 단백질.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, (i)과 (ii)를 포함하는, 푸소좀.
  10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, (i)을 포함하고, 지질 이중층 상의 제2 외인성 또는 과발현된 면역억제 단백질을 추가로 포함하는, 푸소좀.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, (ii)를 포함하고, 존재하지 않거나 감소된 수준으로 존재하는 제2 면역자극 단백질(선택적으로 여기서 감소된 수준은 다른 유사한 변형되지 않은 원천세포에서 생성된 푸소좀과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소된 수준임)을 추가로 포함하는, 푸소좀.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 양성 표적세포 특이적 조절 요소를 추가로 포함하고, 여기서 양성 표적세포 특이적 조절 요소는 양성 표적세포 특이적 조절 요소가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 표적세포에서 페이로드 유전자의 발현을 증가시키며, 여기서 표적세포는 CNS세포인, 푸소좀.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 페이로드 유전자에 작동적으로 연결된 비표적세포 특이적 조절 요소(NTCSRE)를 추가로 포함하고, 여기서 NTCSRE는 NTCSRE가 결여된 다른 유사한 푸소좀에 비해 비표적세포 또는 비표적조직에서 페이로드 유전자의 발현을 감소시키고, 여기서 표적세포는 첫 번째 유형의 CNS세포이고, 비표적세포는 두 번째 상이한 유형의 CNS세포 또는 비CNS세포이며, 선택적으로 여기서
    표적세포는 뉴런이고, 비표적세포는 아교세포이며, 선택적으로 여기서 아교세포는 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포이거나,
    표적세포는 아교세포이며, 선택적으로 여기서 아교세포는 회소돌기아교세포, 별아교세포 또는 미세아교세포이고, 비표적세포는 뉴런인, 푸소좀.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에게 투여될 때, 하기 i) 내지 vi) 중 하나 이상을 특징으로 하는, 푸소좀:
    i) 푸소좀이 검출 가능한 항체반응을 생성하지 않거나, 또는 배경 수준보다 높은 푸소좀에 대한 항체가 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 수준으로 존재함;
    ii) 푸소좀이 검출 가능한 세포성 면역반응을 생성하지 않거나, 또는 배경 수준보다 높은 푸소좀에 대한 세포성 면역반응이 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 수준으로 존재함;
    iii) 푸소좀이 검출 가능한 선천성 면역반응을 생성하지 않거나, 또는 배경 수준보다 높은 푸소좀에 대한 선천성 면역반응이 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 수준으로 존재함;
    iv) 푸소좀의 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이 혈청에 의해 불활성화됨;
    v) 푸소좀으로부터 외인성 작용제를 받은 표적세포가 검출 가능한 항체반응을 생성하지 않거나, 또는 배경 수준보다 높은 표적세포에 대한 항체가 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 수준으로 존재함; 또는
    vi) 푸소좀으로부터 외인성 작용제를 받은 표적세포가 검출 가능한 세포성 면역반응을 생성하지 않거나, 또는 배경 수준보다 높은 표적세포에 대한 세포성 면역반응이 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 수준으로 존재함.
  15. 제14항에 있어서, 배경 수준이 푸소좀의 투여 전 동일한 대상에서의 상응하는 수준인, 푸소좀.
  16. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제 단백질이 보체 조절 단백질 또는 CD47인, 푸소좀.
  17. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 면역자극 단백질이 MHC I 또는 MHC II 단백질인, 푸소좀.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 i) 내지 vi) 중 하나 이상을 특징으로 하는, 푸소좀:
    i) 푸소좀은 비표적세포보다 CNS 표적세포와 더 높은 비율로 융합하고, 선택적으로 여기서 더 높은 비율은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배임;
    ii) 푸소좀은 또 다른 푸소좀보다 CNS 표적세포와 더 높은 비율로 융합하고, 선택적으로 여기서 더 높은 비율은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배임;
    iii) 푸소좀은, 푸소좀 내 외인성 작용제가 24시간, 48시간 또는 72시간 후 CNS 표적세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%에 전달되도록 하는 비율로 CNS 표적세포와 융합함;
    iv) 푸소좀은 비표적세포보다 더 높은 비율로 CNS 표적세포에 핵산을 전달하고, 선택적으로 여기서 더 높은 비율은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배임;
    v) 푸소좀은 또 다른 푸소좀보다 더 높은 비율로 CNS 표적세포에 핵산을 전달하고, 선택적으로 여기서 더 높은 비율은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배임; 또는
    vi) 푸소좀은, 푸소좀 내 외인성 작용제가 24시간, 48시간 또는 72시간 후 CNS 표적세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%에 전달되도록 하는 비율로 CNS 표적세포에 핵산을 전달함.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 작용제가 SYNE1, SETX, FMR1, SLC6A8, UBE3A, SOD1, TDP43, C9orf72, FXN, MECP2, ASPA 또는 ALDH7A1에서 선택되거나; TPP1, FUCA1, GALC, HEXA, HEXB, MANBA, ARSA, GNPTAB 또는 MCOLN1에서 선택되는, 푸소좀.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드 유전자가 SYNE1, SETX, FMR1, SLC6A8, UBE3A, SOD1, TDP43, C9orf72, FXN, MECP2, ASPA 및 ALDH7A1 중에서 선택되는, 푸소좀.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드 유전자가 서열번호 134 내지 145 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 외인성 작용제, 이의 기능성 단편, 또는 서열번호 134 내지 145 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 기능성 변이체를 인코딩하는, 푸소좀.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드 유전자가 TPP1, FUCA1, GALC, HEXA, HEXB, MANBA, ARSA, GNPTAB 및 MCOLN1에서 선택되는, 푸소좀.
  23. 제1항 내지 제19항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드 유전자가 서열번호 146 내지 154 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 외인성 작용제, 이의 기능성 단편, 또는 서열번호 146 내지 154 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이의 기능성 변이체를 인코딩하는, 푸소좀.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 푸소겐이 CNS세포를 표적으로 하고, 선택적으로 여기서 CNS세포는 뉴런 또는 아교세포이며, 선택적으로 여기서 CNS세포는 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포(choroid plexus cell)인, 푸소좀.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 푸소겐이 바이러스 외피 단백질인, 푸소좀.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 푸소겐이 VSV-G를 포함하는, 푸소좀.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 푸소겐이 니파바이러스(Nipah virus) F 및 G 단백질, 홍역바이러스 F 및 H 단백질, 투파이아(Tupaia) 파라믹소바이러스 F 및 H 단백질, 파라믹소바이러스 F 및 G 단백질 또는 F 및 H 단백질 또는 F 및 HN 단백질, 헨드라바이러스(Hendra virus) F 및 G 단백질, 헤니파바이러스(Henipavirus) F 및 G 단백질, 모빌리바이러스(Morbilivirus) F 및 H 단백질, 레스피로바이러스(Respirovirus) F 및 HN 단백질, 센다이바이러스(Sendai virus) F 및 HN 단백질, 루불라바이러스(Rubulavirus) F 및 HN 단백질, 또는 아불라바이러스(Avulavirus) F 및 HN 단백질, 또는 이들의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 서열을 포함하는, 푸소좀.
  28. 제1항 내지 제24항 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 푸소겐이 야생형 파라믹소바이러스 푸소겐과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 100개 아미노산 길이의 도메인을 포함하고, 선택적으로 여기서 야생형 파라믹소바이러스 푸소겐은 서열번호 1 내지 133 중 어느 하나에 제시된 것인, 푸소좀.
  29. 제27항에 있어서, 야생형 파라믹소바이러스가 니파바이러스이고, 선택적으로 여기서 니파바이러스는 헤니파바이러스인, 푸소좀.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 푸소겐이 CNS세포로의 전달을 위해 재표적화되고, 선택적으로 여기서 CNS세포는 뉴런 또는 아교세포이며, 선택적으로 여기서 CNS세포는 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포인, 푸소좀.
  31. 제1항, 제2항, 제5항, 제6항, 제7항 및 제12항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 양성 표적세포 특이적 조절 요소가 CNS세포 특이적 프로모터, CNS세포 특이적 인핸서, CNS세포 특이적 스플라이스 부위, RNA 또는 단백질의 반감기를 연장시키는 CNS세포 특이적 부위, CNS세포 특이적 mRNA 핵 방출 촉진 부위, CNS세포 특이적 번역 증강 부위 또는 CNS세포 특이적 번역 후 변형 부위를 포함하는, 푸소좀.
  32. 제1항, 제2항, 제5항, 제6항, 제7항 및 제12항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 양성 표적세포 특이적 조절 요소가 CNS세포 특이적 프로모터를 포함하는, 푸소좀.
  33. 제32항에 있어서, 양성 CNS세포 특이적 조절 요소가 SYN, NSE, CaMKII, α튜불린, PDGF, fSST, fNPY, GAD67, DLX5/6, VGLUT1, Dock10, ChAT, VAChT, Drd1a, TPH-2, GFAP, EAAT1, GS, CX3CR1, TMEM119, MBP, CNP 또는 CRFR2β 프로모터에서 선택되는 프로모터를 포함하는, 푸소좀.
  34. 제2항, 제4항 내지 제7항 및 제13항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, NTCSRE가 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열, 비표적세포 특이적 프로테아제 인식 부위, 비표적세포 특이적 유비퀴틴 리가아제 부위, 비표적세포 특이적 전사 억제 부위 또는 비표적세포 특이적 후성적 억제 부위를 포함하는, 푸소좀.
  35. 제2항, 제4항 내지 제7항 및 제13항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, NTCSRE가 조직 특이적 miRNA 인식 서열, 조직 특이적 프로테아제 인식 부위, 조직 특이적 유비퀴틴 리가아제 부위, 조직 특이적 전사 억제 부위 또는 조직 특이적 후성적 억제 부위를 포함하는, 푸소좀.
  36. 제2항, 제4항 내지 제7항 및 제13항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, NTCSRE가 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열, 비표적세포 특이적 프로테아제 인식 부위, 비표적세포 특이적 유비퀴틴 리가아제 부위, 비표적세포 특이적 전사 억제 부위 또는 비표적세포 특이적 후성적 억제 부위를 포함하는, 푸소좀.
  37. 제2항, 제4항 내지 제7항 및 제13항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, NTCSRE가 비표적세포 특이적 miRNA 인식 서열을 포함하고, 상기 miRNA 인식 서열이 miR-338-3p, miR-9, miR-125b-5p, miR-342-3p 또는 miR-124 중 하나 이상에 의해 결합될 수 있으며; 선택적으로 여기서 miRNA는 서열번호 156 내지 162 중 어느 하나에 제시된 서열이거나 이를 포함하는, 푸소좀.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, NTCSRE가 외인성 작용제를 인코딩하는 전사된 영역 내에 위치하거나 인코딩되고, 선택적으로 여기서 전사된 영역에 의해 생성된 RNA는 UTR 또는 코딩 영역 내에 miRNA 인식 서열을 포함하는, 푸소좀.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 하나 이상의 절연인자(insulator) 요소를 포함하는, 푸소좀.
  40. 제39항에 있어서, 핵산이 2개의 절연인자 요소를 포함하고, 선택적으로 여기서 2개의 절연인자 요소는 페이로드 유전자의 업스트림에 있는 제1 절연인자 요소 및 페이로드 유전자의 다운스트림에 있는 제2 절연인자 요소를 포함하고, 선택적으로 여기서 제1 절연인자 요소와 제2 절연인자 요소는 동일하거나 상이한 서열을 포함하는, 푸소좀.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 푸소좀이 레트로바이러스 벡터 입자인, 푸소좀.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 CNS세포의 게놈에 통합될 수 있는, 푸소좀.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 표적세포가 CNS세포에서 선택되고, 선택적으로 여기서 CNS세포는 뉴런 또는 아교세포이며, 선택적으로 여기서 CNS세포는 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포인, 푸소좀.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 푸소좀과, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 푸소좀 또는 제44항의 약학적 조성물을 대상에게 투여하여, 외인성 작용제를 대상에게 전달하는 것을 포함하는, 외인성 작용제를 대상에게 전달하는 방법.
  46. 대상의 CNS조직 또는 CNS세포를 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 푸소좀 또는 제45항의 약학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 대상, CNS조직 또는 CNS세포에서 기능을 조절하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, CNS세포가 뉴런 또는 아교세포이고, 선택적으로 여기서 CNS세포는 범뉴런세포, GABA성 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, 콜린성 뉴런, 도파민성 뉴런, 세로토닌성 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 미세아교세포, 회소돌기아교세포 또는 맥락얼기세포인, 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, CNS조직 또는 CNS세포가 대상에 존재하는, 방법.
  49. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 푸소좀 또는 제44항의 약학적 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, CNS 질환 또는 장애, 또는 리소좀 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, CNS 질환 또는 장애, 또는 리소좀 질환 또는 장애가 유전자 결핍에 의해 유발된 것인, 방법.
  51. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 푸소좀 또는 제44항의 약학적 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 유전자 결핍을 치료하는 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 유전자 결핍이 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자에 의해 치료될 수 있는 유전자 결핍인, 방법.
  53. 제49항, 제50항 또는 제52항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 척수소뇌성 운동실조증; 상염색체 열성 1형; 안구운동실행증 동반 운동실조증 2형; 취약X증후군; 뇌크레아틴결핍증후군 1; 엔젤만증후군(Angelman Syndrome); 근위축성 측삭경화증; 프리드리히 운동실조증(Friedreich's Ataxia); 레트증후군(Rett Syndrome); 카나반병(Canavan Disease); 피리독신 의존성 발작; 바텐병(Batten Disease), 푸코시드축적증; 크라베병(Krabbe Disease); 테이-삭스병(Tay Sachs Disease); 샌드호프병(Sandhoff Disease); 베타-만노스축적증; 이염성 백질디스트로피; 뮤코리피드증 IIIa형; 뮤코리피드증 IIIb형 또는 뮤코리피드증 IV형에서 선택되는, 방법.
  54. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 인간 대상인, 방법.
  55. 제1항 내지 제43항 또는 제44항 중 어느 한 항에 있어서, CNS 질환 또는 장애, 또는 리소좀 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상을 치료하는 데 사용하기 위한, 푸소좀 또는 약학적 조성물.
  56. CNS 질환 또는 장애, 또는 리소좀 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상을 치료하는 데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 푸소좀 또는 제44항의 약학적 조성물의 용도.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, CNS 질환 또는 장애, 또는 리소좀 질환 또는 장애가 유전자 결핍에 의해 유발된 것인, 푸소좀 또는 약학적 조성물, 또는 용도.
  58. 제55항, 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 척수소뇌성 운동실조증; 상염색체 열성 1형; 안구운동실행증 동반 운동실조증 2형; 취약X증후군; 뇌크레아틴결핍증후군 1; 엔젤만증후군; 근위축성 측삭경화증; 프리드리히 운동실조증; 레트증후군; 카나반병; 피리독신 의존성 발작; 바텐병, 푸코시드축적증; 크라베병; 테이-삭스병; 샌드호프병; 베타-만노스축적증; 이염성 백질디스트로피; 뮤코리피드증 IIIa형; 뮤코리피드증 IIIb형 또는 뮤코리피드증 IV형에서 선택되는, 푸소좀 또는 약학적 조성물, 또는 용도.
  59. 제1항 내지 제43항 또는 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 결핍을 치료하는 데 사용하기 위한, 푸소좀 또는 약학적 조성물.
  60. 유전자 결핍을 치료하는 데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 푸소좀 또는 제44항의 약학적 조성물의 용도.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 결핍이 외인성 작용제를 인코딩하는 페이로드 유전자에 의해 치료될 수 있는 유전자 결핍인, 푸소좀 또는 약학적 조성물, 또는 용도.
  62. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 푸소좀을 제조하는 방법으로서,
    a) 핵산과 푸소좀을 포함하는 세포를 제공하는 단계;
    b) 푸소좀의 생성을 가능하게 하는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계; 및
    c) 세포로부터 푸소좀을 분리, 농축 또는 정제하여 푸소좀을 제조하는 단계를 포함하는, 푸소좀을 제조하는 방법.
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