BR112020016570A2 - Composições e métodos para liberação de proteína de membrana - Google Patents

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BR112020016570A2
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Geoffrey A. Von Maltzahn
John Miles Milwid
Jacob Rosenblum Rubens
Michael Travis Mee
Neal Francis Gordon
Jagesh Vijaykumar Shah
Kyle Marvin Trudeau
Brigham Jay Hartley
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Abstract

as composições e métodos de fusosoma são aqui descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM-
POSIÇÕES E MÉTODOS PARA LIBERAÇÃO DE PROTEÍNA DE MEMBRANA". PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade para a Patente Norte- americana No. Série 62/631.747 depositado em 17 de fevereiro de 2018, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi enviada eletronicamente em formato ASCII e é aqui incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 12 de fevereiro de 2019, é denominada V2050-7013WO_SL.txt e tem 14.911 bytes.
ANTECEDENTES
[003] A fusão célula-célula é necessária em processos biológicos tão diversos como fertilização, desenvolvimento, resposta imune e tu- morigênese.
SUMÁRIO
[004] A presente descrição fornece tecnologias relacionadas a fusosomas e seu uso para fornecer proteínas de membrana às célu- las-alvo. Em algumas modalidades, um fusosoma compreende uma bicamada lipídica, um lúmen rodeado pela bicamada lipídica, um fuso- gênio e uma carga que inclui um agente de carga útil de proteína de membrana. Em algumas modalidades, essa carga pode ser ou com- preender a própria proteína de membrana; em algumas modalidades, tal carga pode ser ou compreender um ácido nucleico que codifica (ou é complementar a um ácido nucleico que codifica) uma proteína de membrana.
[005] Em alguns aspectos, a descrição fornece um fusosoma que compreende:
(a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de lipídeos derivados de uma célula fonte; (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio que é exógeno ou superexpresso em rela- ção à célula fonte, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica; e (d) um agente de carga útil de proteína de membrana (por exemplo, que é exógeno ou superexpresso em relação à célula fonte) que compreende ou codifica um ou mais dentre: i) um receptor de antígeno quimérico; ii) uma carga útil de proteína de membrana integrina, por exemplo, escolhida da Tabela 5; iii) uma proteína de canal iônico escolhida da Tabela 6; iv) uma proteína formadora de poros, por exemplo, escolhi- da das Tabelas 7 e 8; v) um receptor Toll-Like, por exemplo, escolhido da Tabela 9; vi) uma carga útil do receptor de interleucina, por exemplo, escolhida da Tabela 10; vii) uma proteína de adesão celular escolhida das Tabelas 11-12; viii) uma proteína de transporte escolhida da Tabela 15; ix) uma sequência de sinal que é heteróloga em relação à proteína de membrana de ocorrência natural; ou x) uma sequência de sinal listada na Tabela 4; em que, opcionalmente, o fusosoma não compreende uma proteína do nucleocapsídeo ou uma proteína de matriz viral.
[006] Em alguns aspectos, a descrição fornece um fusosoma que compreende:
(a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de lipídeos derivados de uma célula fonte; (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio que é exógeno ou superexpresso em rela- ção à célula fonte, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica; e (d) um agente de carga útil de proteína de membrana (por exemplo, que é exógeno ou superexpresso em relação à célula fonte) que compreende ou codifica um receptor de célula T; em que, opcionalmente, o fusosoma não compreende uma proteína do nucleocapsídeo ou uma proteína de matriz viral.
[007] Em alguns aspectos, a descrição fornece um fusosoma que compreende: (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de lipídeos derivados de uma célula fonte; (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio que é exógeno ou superexpresso em rela- ção à célula fonte, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica; e (d) um agente de carga útil de proteína de membrana que é exógeno ou superexpresso em relação à célula fonte; e em que um ou mais dentre: i) o fusosoma compreende ou é composto por um citobioló- gico; ii) o fusogênio está presente em um número de cópias de pelo menos 1.000 cópias, por exemplo, conforme medido por um en- saio do Exemplo 29; iii) o fusosoma compreende um agente terapêutico em um número de cópias de pelo menos 1.000 cópias, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 43; iv) o fusosoma compreende um lipídeo em que um ou mais dentre CL, Cer, DAG, HexCer, LPA, LPC, LPE, LPG, LPI, LPS, PA, PC, PE, PG, PI, PS, CE, SM e TAG está dentro de 75 % do nível de lipídeo correspondente na célula fonte; v) o fusosoma compreende uma composição proteômica semelhante à da célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 42; vi) o fusosoma é capaz de transdução de sinal, por exem- plo, transmitir um sinal extracelular, por exemplo, fosforilação de AKT em resposta à insulina, ou captação de glicose (por exemplo, glicose marcada, por exemplo, 2-NBDG) em resposta à insulina, por exemplo, por pelo menos 10 % a mais do que um controle negativo, por exem- plo, um fusosoma de outra forma semelhante na ausência de insulina, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 63; vii) o fusosoma direciona-se a um tecido, por exemplo, fí- gado, pulmões, coração, baço, pâncreas, trato gastrointestinal, rim, testículos, ovários, cérebro, órgãos reprodutivos, sistema nervoso cen- tral, sistema nervoso periférico, músculo esquelético, endotélio, ouvido interno ou olho , quando administrado a um indivíduo, por exemplo, um camundongo, por exemplo, em que pelo menos 0,1 %, ou 10 %, dos fusosomas em uma população de fusosomas administrados estão pre- sentes no tecido alvo após 24 horas, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 87 ou 100; ou viii) a célula fonte é selecionada a partir de um neutrófilo, um granulócito, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco da medula óssea, uma célula-tronco pluripotente induzida, uma célula- tronco embrionária, um mieloblasto, um mioblasto , um hepatócito ou um neurônio, por exemplo, célula neuronal da retina.
[008] Em alguns aspectos, a descrição fornece um fusosoma que compreende: (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de lipídeos derivados de uma célula fonte; (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio que é exógeno ou superexpresso em rela- ção à célula fonte, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica; e (d) um agente de carga útil de proteína de membrana que: i) compreende DNA que codifica uma proteína de membra- na; ou ii) compreende RNA, por exemplo, mRNA, que codifica uma proteína de membrana que é exógena ou super-expressa em relação à célula fonte, em que, opcionalmente, o fusosoma não compreende uma proteína do nucleocapsídeo ou uma proteína de matriz viral.
[009] Em alguns aspectos, a descrição fornece um fusosoma que compreende: (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de lipídeos derivados de uma célula fonte; (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio não viral, por exemplo, mamífero, que é exógeno ou superexpresso em relação à célula fonte, em que o fuso- gênio de mamífero não é o peptídeo beta-amiloide de Alzheimer ou fertilina; e (d) um agente de carga útil de proteína de membrana que é exógeno ou superexpresso em relação à célula fonte, em que, opcionalmente, o fusosoma não compreende uma proteína do nucleocapsídeo ou uma proteína de matriz viral.
[0010] Em alguns aspectos, a descrição fornece um fusosoma que compreende: (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de lipídeos derivados de uma célula fonte; (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio que é exógeno ou superexpresso em rela- ção à célula fonte, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica; e (d) um agente de carga útil de proteína de membrana que é exógeno ou superexpresso em relação à célula fonte; em que o fusosoma compreende uma célula enucleada, e em que, opcionalmente, o fusosoma não compreende uma proteína do nucleocapsídeo ou uma proteína de matriz viral.
[0011] Em alguns aspectos, a descrição fornece um fusosoma que compreende: (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de lipídeos derivados de uma célula fonte; (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio que é exógeno ou superexpresso em rela- ção à célula fonte, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica; e (d) um agente de carga útil de proteína de membrana que é exógeno ou superexpresso em relação à célula fonte; e em que um ou mais dentre: i) o fusosoma compreende ou é composto por um citobioló- gico; ii) o fusosoma compreende uma célula enucleada;
iii) o fusosoma compreende um núcleo inativado; iv) o fusosoma se funde a uma taxa mais alta com uma cé- lula-alvo do que com uma célula não alvo, por exemplo, em pelo me- nos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; v) o fusosoma se funde a uma taxa mais alta com uma cé- lula-alvo do que fusosomas não alvo, por exemplo, em pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; vi) o fusosoma se funde com células-alvo a uma taxa tal que o agente de carga útil de proteína de membrana no fusosoma é liberado a pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, de células-alvo após 24, 48 ou 72 horas, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; vii) o fusogênio está presente em um número de cópias, por fusosoma, de pelo menos, ou não mais que, 10, 50, 100, 500, 1.000,
2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000,
1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000,
500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias, por exemplo, conforme me- dido por um ensaio do Exemplo 29; viii) o fusosoma compreende o agente de carga útil de pro- teína de membrana em um número de cópias, por fusosoma, de pelo menos, ou não mais que, 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000,
10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000,
5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000, 500.000.000 ou
1.000.000.000 de cópias, por exemplo, conforme medido por um en- saio do Exemplo 43; ix) a relação entre o número de cópias do fusogênio e o número de cópias do agente de carga útil da proteína de membrana está entre 1.000.000:1 e 100.000:1, 100.000:1 e 10.000:1, 10.000:1 e
1.000:1, 1.000:1 e 100:1, 100:1 e 50:1, 50:1 e 20:1, 20:1 e 10:1, 10:1 e 5:1, 5:1 e 2:1, 2:1 e 1:1, 1:1 e 1:2, 1:2 e 1:5, 1:5 e 1:10, 1:10 e 1:20, 1:20 e 1:50, 1:50 e 1:100, 1 : 100 e 1:1.000, 1:1.000 e 1:10.000, 1:10.000 e 1:100.000 ou 1:100.000 e 1:1.000.000; x) o fusosoma compreende uma composição lipídica subs- tancialmente semelhante à da célula fonte ou em que um ou mais den- tre CL, Cer, DAG, HexCer, LPA, LPC, LPE, LPG, LPI, LPS, PA, PC, PE, PG, PI, PS, CE, SM e TAG está dentro de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % ou 75 % do nível de lipídeo correspondente na célula fonte; xi) o fusosoma compreende uma composição proteômica semelhante à da célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 42; xii) o fusosoma compreende uma relação de lipídeos para proteínas que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da re- lação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 49; xiii) os fusosomas uma relação de proteínas para ácidos nucleicos (por exemplo, DNA) que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 50; xiv) o fusosoma compreende uma relação de lipídeos para ácidos nucleicos (por exemplo, DNA) que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio de Exemplo 51; xv) o fusosoma tem meia-vida em um indivíduo, por exem- plo, em um camundongo, que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % da meia-vida de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 75;
xvi) o fusosoma transporta glicose (por exemplo, glicose marcada, por exemplo, 2-NBDG) através de uma membrana, por exemplo, em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % mais do que um controle negativo, por exemplo, um fusosoma semelhante na ausência de gli- cose, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 64; xvii) o fusosoma compreende atividade de esterase no lú- men que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % daquela da atividade de esterase em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um fibroblasto embrionário de camundongo, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 66; xviii) o fusosoma compreende um nível de atividade meta- bólica (por exemplo, atividade de citrato sintase) que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % da atividade metabólica (por exemplo, atividade de citrato sintase) em uma célula de referência, por exemplo, a célula fon- te, por exemplo, como descrito no Exemplo 68; xix) o fusosoma compreende um nível de respiração (por exemplo, taxa de consumo de oxigênio) que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % do nível de respiração (por exemplo, taxa de consumo de oxigênio) em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 69; xx) o fusosoma compreende um nível de manchamento com Anexina-V de no máximo 18.000, 17.000, 16.000, 15.000, 14.000,
13.000, 12.000, 11.000 ou 10.000 MFI, por exemplo, usando um en- saio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compreende um nível de manchamento com Anexina-V pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40
% ou 50 % menor do que o nível de manchamento com Anexina-V de um fusosoma semelhante tratado com menadiona no ensaio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compreende um nível de man- chamento com Anexina-V pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % menor do que o nível de manchamento com Anexina-V de um macrófago tratado com menadiona no ensaio do Exemplo 70, xxi) o fusosoma tem um nível de teor de miRNA de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % , 90 %, ou maior do que a célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 39; xxii) o fusosoma tem uma relação de proteína solúvel:não solúvel que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que a célula fonte, por exemplo, dentro de 1 % - 2 %, 2 % - 3 %, 3 % - 4 %, 4 % - 5 %, 5 % - 10 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, 50 % - 60 %, 60 % - 70 %, 70 % - 80 % ou 80 % - 90 % daquele da célula fon- te, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 47; xxiii) o fusosoma tem um nível de LPS inferior a 5 %, 1 %, 0,5 %, 0,01 %, 0,005 %, 0,0001 %, 0,00001 % ou menos do teor de LPS da célula fonte, por exemplo, conforme medido por espectrome- tria de massa, conforme descrito no Exemplo 48; xxiv) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo, são capazes de transdução de sinal, por exemplo, transmitir um sinal extracelular, por exemplo, fosforilação de AKT em resposta à insulina ou captação de glicose (por exemplo, glicose marcada, por exemplo, 2-NBDG) em resposta à insulina, por exemplo, em pelo me- nos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % a mais do que um controle negativo, por exem- plo, um fusosoma de outra forma semelhante na ausência de insulina, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 63;
xxv) o fusosoma direciona-se a um tecido, por exemplo, fí- gado, pulmões, coração, baço, pâncreas, trato gastrointestinal, rim, testículos, ovários, cérebro, órgãos reprodutores, sistema nervoso cen- tral, sistema nervoso periférico, músculo esquelético, endotélio, ouvido interno ou olho, quando administrado a um indivíduo, por exemplo, um mamífero, por exemplo, um mamífero experimental (por exemplo, um camundongo), um animal domesticado (por exemplo, um animal de estimação ou animal de fazenda) ou um ser humano, em que pelo menos 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % dos fusosomas em uma população de fusosomas administrados estão presentes no tecido alvo após 24, 48 ou 72 horas, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 87 ou 100; xxvi) o fusosoma tem nível de sinalização de justácrina de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, ou 100 % maior do que o nível de sinalização de justácrina induzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula estromal da medula óssea (BMSC), por exemplo, por um ensaio do Exemplo 71; xxvii) o fusosoma tem nível de sinalização de parácrina de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % maior do que o nível de sinalização de parácrina induzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um macrófago, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 72; xxviii) o fusosoma polimeriza actina em um nível dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % em comparação com o nível de actina polimeri- zada em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula C2C12, por exemplo, pelo ensaio do Exemplo 73; xxix) o fusosoma tem um potencial de membrana dentro de cerca de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % do potencial de membrana de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula C2C12, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 74, ou em que o fusosoma tem um potencial de membrana de cerca de -20 a -150 mV, -20 a - 50 mV, -50 a -100 mV ou -100 a -150 mV; xxx) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo são capazes de extravasamento dos vasos sanguíneos, por exemplo, a uma taxa de pelo menos 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % da taxa de extravasamento de uma célula do mesmo tipo que a célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 57, por exemplo, em que a célula fonte é um neu- trófilo, linfócito, célula B, macrófago ou célula NK; xxxi) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo, são capazes de atravessar uma membrana celular, por exem- plo, uma membrana celular endotelial ou a barreira hematoencefálica, por exemplo, a uma taxa de pelo menos 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de uma célula do mes- mo tipo que a célula fonte; xxxii) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo, são capazes de secretar uma proteína, por exemplo, a uma taxa de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % , 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % maior do que a célula de referência, por exemplo, um fibroblasto embrionário de camundongo ou a célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 62; xxxiii) o fusosoma atende a um padrão de boas práticas de fabricação (GMP) ou farmacêutico; xxxiv) o fusosoma foi produzido de acordo com as boas práticas de fabricação (GMP); xxxv) uma preparação farmacêutica que compreende uma pluralidade de fusosomas, conforme aqui descrito, tem um nível de patógeno abaixo de um valor de referência predeterminado, por exem- plo, é substancialmente livre de patógenos; xxxvi) uma preparação farmacêutica que compreende uma pluralidade de fusosomas, conforme aqui descrito, tem um nível de contaminante abaixo de um valor de referência predeterminado, por exemplo, é substancialmente livre de contaminantes; xxxvii) uma preparação farmacêutica que compreende uma pluralidade de fusosomas, conforme aqui descrito, tem baixa imuno- genicidade, por exemplo, conforme aqui descrito; xxxviii) a célula fonte é selecionada a partir de um neutrófi- lo, um granulócito, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco da medula óssea, uma célula-tronco pluripotente induzida, uma célula- tronco embrionária, um mieloblasto, um mioblasto, um hepatócito ou um neurônio, por exemplo, célula neuronal retinal; ou xxxix) a célula fonte é diferente de uma célula 293, célula HEK, célula endotelial humana ou uma célula epitelial humana, monó- cito, macrófago, célula dendrítica ou célula-tronco.
[0012] Em algumas modalidades, uma proteína de membrana re- levante para a presente descrição é uma proteína de membrana inte- gral; em algumas modalidades, uma proteína de membrana é uma proteína de membrana periférica. Em outras modalidades, uma proteí- na de membrana está temporariamente associada a uma membrana. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana é uma proteína que está associada e/ou abrange total ou parcialmente (por exemplo, como uma proteína transmembrana) a membrana de uma célula-alvo. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana é uma proteína monotópica integral (ou seja, associada a apenas um lado de uma membrana). Em algumas modalidades, uma proteína de membrana está ou torna-se associada a (por exemplo, está parcial ou totalmente presente em) uma superfície externa da membrana de uma célula- alvo. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana está ou se torna associada a (por exemplo, está parcial ou totalmente presente em) uma superfície interna de uma membrana de célula-alvo.
[0013] Em algumas modalidades, uma proteína de membrana re- levante para a presente descrição é uma proteína de membrana tera- pêutica. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana rele- vante para a presente descrição é ou compreende um receptor (por exemplo, um receptor de superfície celular e/ou um receptor trans- membrana), um ligante de superfície celular, uma proteína de trans- porte de membrana (por exemplo, uma proteína de transporte ativa ou passiva tal como, por exemplo, uma proteína de canal iônico, uma pro- teína formadora de poros [por exemplo, uma proteína de toxina], etc), uma enzima de membrana e/ou uma proteína de adesão celular).
[0014] Em algumas modalidades, uma proteína de membrana re- levante para a presente descrição compreende uma sequência de uma proteína de membrana de ocorrência natural. Em algumas modalida- des, uma proteína de membrana relevante para a presente descrição é ou compreende uma variante ou versão modificada de uma proteína de membrana de ocorrência natural. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana relevante para a presente descrição é ou com- preende uma proteína de membrana modificada. Em algumas modali- dades, uma proteína de membrana relevante para a presente descri- ção é ou compreende uma proteína de fusão.
[0015] Em algumas modalidades, a presente descrição fornece e/ou utiliza preparações de fusosoma em que um agente de carga útil de proteína de membrana está parcial ou totalmente disposto em um lúmen de fusosoma. Em algumas modalidades, a presente descrição fornece preparações de fusosoma em que um agente de carga útil de proteína de membrana está associado a (por exemplo, parcialmente ou totalmente localizado dentro) uma bicamada lipídica de fusosoma. Em algumas modalidades, a proteína de membrana relevante está as- sociada e/ou parcialmente ou totalmente exibida na superfície externa do fusosoma.
[0016] A presente descrição fornece, em alguns aspectos, um fu- sosoma que compreende: (a) uma bicamada lipídica, (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio que é exógeno ou superexpresso em rela- ção à célula fonte, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica, (d) um agente de carga útil de proteína de membrana, por exemplo, uma proteína de membrana exógena à célula fonte, em que o fusosoma é derivado de uma célula fonte; e em que o fusosoma tem inativação nuclear parcial ou completa (por exemplo, falta um núcleo intacto como encontrado na célula fonte, re- moção/enucleação nuclear, núcleo não funcional, etc.).
[0017] A presente descrição fornece, em alguns aspectos, um fu- sosoma que compreende: (a) uma bicamada lipídica, (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio que é exógeno ou superexpresso em rela- ção à célula-alvo, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica (por exemplo, em que o fusogênio é endógeno ou exógeno à célula fonte), e (d) um agente de carga útil de proteína de membrana (por exemplo, que é exógeno ou superexpresso em relação à célula fonte) que:
xi) compreende ou codifica um receptor de antígeno quimé- rico; xii) compreende ou codifica uma carga útil de proteína de membrana integrina, por exemplo, escolhida da Tabela 5; xiii) compreende ou codifica uma proteína de canal iônico escolhida da Tabela 6; xiv) compreende ou codifica uma proteína formadora de poros, por exemplo, escolhida das Tabelas 7 e 8; xv) compreende ou codifica um receptor Toll-like, por exemplo, escolhido da Tabela 9; xvi) compreende ou codifica uma carga útil do receptor de interleucina, por exemplo, escolhida da Tabela 10; xvii) compreende ou codifica uma proteína de adesão celu- lar escolhida das Tabelas 11-12; xviii) compreende ou codifica uma proteína de transporte escolhida da Tabela 15; xix) compreende ou codifica uma sequência de sinal que é heteróloga em relação à proteína de membrana de ocorrência natural; xx) compreende ou codifica uma sequência de sinal listada na Tabela 4; em que o fusosoma não compreende capsídeo viral ou proteínas do envelope viral.
[0018] A presente descrição fornece, em alguns aspectos, um fu- sosoma que compreende: (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de lipídeos derivados de uma célula fonte; (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio que é exógeno ou superexpresso em rela- ção à célula fonte, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica; e (d) um agente de carga útil de proteína de membrana (por exemplo, que é exógeno ou superexpresso em relação à célula fonte) que compreende ou codifica um ou mais dentre: i) uma proteína ancorada em lipídeos; ii) uma proteína extracelular que se liga a uma proteína transmembrana; iii) uma proteína extracelular que não possui um domínio transmembrana; iv) uma proteína que atravessa parcialmente uma membra- na (por exemplo, uma membrana da célula-alvo ou o fusosoma) e não abrange completamente a membrana (por exemplo, a proteína com- preende uma hélice de membrana no plano, ou a proteína compreen- de uma alça hidrofóbica que não atravessa completamente a membra- na); ou v) a proteína não compreende um domínio transmembrana, em que a proteína interage com a superfície da membrana, por exem- plo, por meio de interações eletrostáticas ou iônicas; em que o fusosoma não compreende uma proteína estrutural viral, por exemplo, uma proteína do capsídeo viral ou uma proteína envelope viral.
[0019] Em algumas modalidades, um ou mais dos seguintes es- tá(ão) presente(s): xl) o fusosoma compreende ou é composto por um citobio- lógico; xli) o fusosoma compreende uma célula enucleada; xlii) o fusosoma compreende um núcleo inativado; xliii) o fusosoma se funde a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que com uma célula não alvo, por exemplo, em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %,
70 %, 80 %, 90 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; xliv) o fusosoma se funde a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que fusosomas não alvo, por exemplo, em pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, por exem- plo, em um ensaio do Exemplo 54; xlv) o fusosoma se funde com células-alvo a uma taxa tal que o agente de carga útil de proteína de membrana no fusosoma é liberado a pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, de células-alvo após 24, 48 ou 72 horas, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; xlvi) o fusogênio está presente em um número de cópias, por fusosoma, de pelo menos, ou não mais que, 10, 50, 100, 500,
1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000,
500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000,
500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias, por exemplo, conforme me- dido por um ensaio do Exemplo 29; xlvii) o fusosoma compreende o agente de carga útil de pro- teína de membrana em um número de cópias, por fusosoma, de pelo menos, ou não mais que, 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000,
10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000,
5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000, 500.000.000 ou
1.000.000.000 de cópias, por exemplo, conforme medido por um en- saio do Exemplo 43; xlviii) a relação do número de cópias do fusogênio para o número de cópias do agente de carga de proteína de membrana está entre 1.000.000:1 e 100.000:1, 100.000:1 e 10.000:1, 10.000:1 e
1.000:1, 1.000:1 e 100:1, 100:1 e 50:1, 50:1 e 20:1, 20:1 e 10:1, 10:1 e 5:1, 5:1 e 2:1, 2:1 e 1:1, 1:1 e 1:2, 1:2 e 1:5, 1:5 e 1:10, 1:10 e 1:20, 1:20 e 1:50, 1:50 e 1:100, 1:100 e 1:1.000, 1:1.000 e 1:10.000, 1:10.000 e 1:100.000, ou 1:100.000 e 1:1.000.000;
xlix) o fusosoma compreende uma composição lipídica substancialmente semelhante à da célula fonte ou em que um ou mais dentre CL, Cer, DAG, HexCer, LPA, LPC, LPE, LPG, LPI, LPS, PA, PC, PE, PG, PI, PS, CE, SM e TAG está dentro de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % ou 75 % do nível de lipídeo correspondente na célula fonte; l) o fusosoma compreende uma composição proteômica semelhante à da célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 42; li) o fusosoma compreende uma relação de lipídeos para proteínas que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da re- lação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 49; lii) o fusosoma compreende uma relação de proteínas para ácidos nucleicos (por exemplo, DNA) que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio de Exemplo 50; liii) o fusosoma compreende uma relação de lipídeos para ácidos nucleicos (por exemplo, DNA) que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio de Exemplo 51; liv) o fusosoma tem meia-vida em um indivíduo, por exem- plo, em um camundongo, que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % da meia-vida de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 75; lv) o fusosoma transporta glicose (por exemplo, glicose marcada, por exemplo, 2-NBDG) através de uma membrana, por exemplo, em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % mais do que um controle negativo, por exemplo, um fusosoma semelhante na ausência de gli- cose, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 64; lvi) o fusosoma compreende atividade de esterase no lú- men que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % daquela da atividade de esterase em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um fibroblasto embrionário de camundongo, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 66; lvii) o fusosoma compreende um nível de atividade metabó- lica (por exemplo, atividade de citrato sintase) que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % da atividade metabólica (por exemplo, atividade de ci- trato sintase) em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, como descrito no Exemplo 68; lviii) o fusosoma compreende um nível de respiração (por exemplo, taxa de consumo de oxigênio) que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % do nível de respiração (por exemplo, taxa de consumo de oxigênio) em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 69; lix) o fusosoma compreende um nível de manchamento com Anexina-V de no máximo 18.000, 17.000, 16.000, 15.000, 14.000,
13.000, 12.000, 11.000 ou 10.000 MFI, por exemplo, usando um en- saio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compreende um nível de manchamento com Anexina-V pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % menor do que o nível de manchamento com Anexina-V de um fusosoma semelhante tratado com menadiona no ensaio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compreende um nível de man- chamento com Anexina-V pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %
ou 50 % menor do que o nível de manchamento com Anexina-V de um macrófago tratado com menadiona no ensaio do Exemplo 70, lx) o fusosoma tem um nível de teor de miRNA de pelo me- nos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % , 90 %, ou maior do que a célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 39; lxi) o fusosoma tem uma relação de proteína solúvel: não solúvel que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que a célula fonte, por exemplo, dentro de 1 % - 2 %, 2 % - 3 %, 3 % - 4 %, 4 % - 5 %, 5 % - 10 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, 50 % - 60 %, 60 % - 70 %, 70 % - 80 % ou 80 % - 90 % daquele da célula fon- te, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 47; lxii) o fusosoma tem um nível de LPS inferior a 5 %, 1 %, 0,5 %, 0,01 %, 0,005 %, 0,0001 %, 0,00001 % ou menos do teor de LPS da célula fonte, por exemplo, conforme medido por espectrome- tria de massa, conforme descrito no Exemplo 48; lxiii) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo, são capazes de transdução de sinal, por exemplo, transmitir um sinal extracelular, por exemplo, fosforilação de AKT em resposta à insulina ou captação de glicose (por exemplo, glicose marcada, por exemplo, 2-NBDG) em resposta à insulina, por exemplo, em pelo me- nos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % a mais do que um controle negativo, por exem- plo, um fusosoma de outra forma semelhante na ausência de insulina, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 63; lxiv) o fusosoma direciona-se a um tecido, por exemplo, fí- gado, pulmões, coração, baço, pâncreas, trato gastrointestinal, rim, testículos, ovários, cérebro, órgãos reprodutores, sistema nervoso cen- tral, sistema nervoso periférico, músculo esquelético, endotélio, ouvido interno ou olho, quando administrado a um indivíduo, por exemplo, um mamífero, por exemplo, um mamífero experimental (por exemplo, um camundongo), um animal domesticado (por exemplo, um animal de estimação ou animal de fazenda) ou um ser humano, em que pelo menos 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 % , 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % dos fusosomas em uma população de fusosomas administrados estão presentes no tecido alvo após 24, 48 ou 72 horas, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 87 ou 100; lxv) o fusosoma tem nível de sinalização de justácrina de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, ou 100 % maior do que o nível de sinalização de justácrina induzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula estromal da medula óssea (BMSC), por exemplo, por um ensaio do Exemplo 71; lxvi) o fusosoma tem nível de sinalização de parácrina de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % maior do que o nível de sinalização de parácrina induzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um macrófago, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 72; lxvii) o fusosoma polimeriza actina a um nível dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, ou 100 % em comparação com o nível de actina polimeriza- da em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula C2C12, por exemplo, pelo ensaio do Exemplo 73; lxviii) o fusosoma tem um potencial de membrana dentro de cerca de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % do potencial de membrana de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula C2C12, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 74, ou em que o fusosoma tem um potencial de membrana de cerca de -20 a -150 mV, -20 a - 50 mV, -50 a -100 mV ou -100 a -150 mV; lxix) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo são capazes de extravasamento dos vasos sanguíneos, por exemplo, a uma taxa de pelo menos 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % da taxa de extravasamento da célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 57, por exemplo, em que a célula fonte é um neutrófilo, linfócito, célula B, ma- crófago ou célula NK; lxx) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo são capazes de atravessar uma membrana celular, por exem- plo, uma membrana celular endotelial ou a barreira hematoencefálica; lxxi) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo, são capazes de secretar uma proteína, por exemplo, a uma taxa de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % , 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % maior do que a célula de referência, por exemplo, um fibroblasto embrionário de camundongo ou a célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 62; lxxii) o fusosoma atende a um padrão de boas práticas de fabricação (GMP) ou farmacêutico; lxxiii) o fusosoma foi produzido de acordo com as boas prá- ticas de fabricação (GMP); lxxiv) uma preparação farmacêutica que compreende uma pluralidade de fusosomas, conforme aqui descrito, tem um nível de patógeno abaixo de um valor de referência predeterminado, por exem- plo, é substancialmente livre de patógenos; lxxv) uma preparação farmacêutica que compreende uma pluralidade de fusosomas, conforme aqui descrito, tem um nível de contaminante abaixo de um valor de referência predeterminado, por exemplo, é substancialmente livre de contaminantes;
lxxvi) uma preparação farmacêutica que compreende uma pluralidade de fusosomas, conforme aqui descrito, tem baixa imuno- genicidade, por exemplo, conforme aqui descrito; lxxvii) a célula fonte é selecionada a partir de um neutrófilo, um granulócito, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco da medula óssea, uma célula-tronco pluripotente induzida, uma célula- tronco embrionária, um mieloblasto, um mioblasto, um hepatócito ou um neurônio, por exemplo, célula neuronal retinal; ou lxxviii) a célula fonte é diferente de uma célula 293, célula HEK, célula endotelial humana ou uma célula epitelial humana, monó- cito, macrófago, célula dendrítica ou célula-tronco.
[0020] Em algumas modalidades, um ou mais dos seguintes es- tá(ão) presente(s): i) o fusosoma transporta glicose (por exemplo, glicose mar- cada, por exemplo, 2-NBDG) através de uma membrana, por exemplo, por pelo menos 10 % a mais do que um controle negativo, por exem- plo, um fusosoma semelhante na ausência de glicose, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 64; ii) o fusosoma compreende atividade de esterase no lúmen que está dentro de 90 % daquela da atividade de esterase em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um fibroblasto em- brionário de camundongo, por exemplo, usando um ensaio do Exem- plo 66; iii) o fusosoma compreende um nível de atividade metabóli- ca que está dentro de 90 % da atividade metabólica (por exemplo, ati- vidade de citrato sintase) em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 68; iv) o fusosoma compreende um nível de respiração (por exemplo, taxa de consumo de oxigênio) que está dentro de 90 % do nível de respiração em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 69; v) o fusosoma compreende um nível de manchamento com Anexina-V de no máximo 18.000, 17.000, 16.000, 15.000, 14.000,
13.000, 12.000, 11.000 ou 10.000 MFI, por exemplo, usando um en- saio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compreende um nível de manchamento com Anexina-V pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % menor do que o nível de manchamento com Anexina-V de um fusosoma semelhante tratado com menadiona no ensaio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compreende um nível de man- chamento com Anexina-V pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % menor do que o nível de manchamento com Anexina-V de um macrófago tratado com menadiona no ensaio do Exemplo 70; vi) o fusosoma tem um nível de LPS inferior a 5 % do teor de lipídeos dos fusosomas, por exemplo, conforme medido por um en- saio do Exemplo 48; vii) o fusosoma tem nível de sinalização de justácrina de pelo menos 5 % maior do que o nível de sinalização de justácrina in- duzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula estromal da medula óssea (BMSC), por exemplo, por um ensaio do Exemplo 71; viii) o fusosoma tem nível de sinalização de parácrina de pelo menos 5 % maior do que o nível de sinalização de parácrina in- duzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um macrófago, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 72; ix) o fusosoma polimeriza a actina a um nível de 5 % em comparação com o nível de actina polimerizada em uma célula de re- ferência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula C2C12, por exem- plo, pelo ensaio do Exemplo 73; ou x) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mes- mo, são capazes de secretar uma proteína, por exemplo, a uma taxa pelo menos 5 % maior do que uma célula de referência, por exemplo, um fibroblasto embrionário de camundongo, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 62.
[0021] Em algumas modalidades, um fusosoma fornecido compre- ende ainda uma organela, por exemplo, um número terapeuticamente eficaz de organelas, dispostas no lúmen.
[0022] Alternativamente ou adicionalmente, em algumas modali- dades, um ou mais dos seguintes está(ão) presente(s): i) a célula fonte é selecionada a partir de uma célula endo- telial, um macrófago, um neutrófilo, um granulócito, um leucócito, uma célula-tronco (por exemplo, uma célula-tronco mesenquimal, uma célu- la-tronco da medula óssea, uma célula-tronco pluripotente induzida, uma célula-tronco embrionária), um mieloblasto, um mioblasto, um he- patócito ou um neurônio, por exemplo, célula neuronal da retina; ii) o fusosoma compreende uma organela selecionada a partir de um aparelho de Golgi, lisossoma, retículo endoplasmático, vacúolo, endossoma, acrossoma, autofagossoma, centríolo, glicosso- ma, glioxissoma, hidrogenossoma, melanossoma, mitossoma, cnido- cisto, peroxissoma, proteassoma, vesícula, grânulo de estresse e um grânulo de combinação dos mesmos; iii) o fusosoma tem um diâmetro superior a 5 μm, 10 μm, 20 μm, 50 μm ou 100 μm; iv) uma preparação que compreende uma pluralidade de fusosomas tem uma densidade diferente de entre 1,08 g/mL e 1,12 g/mL, por exemplo, a preparação tem uma densidade de > 1,12 g/mL, por exemplo, 1,25 g/mL +/- 0,1, 1,25 g/mL +/- 0,05, por exemplo, con- forme medido por um ensaio do Exemplo 33; v) o fusosoma não é substancialmente capturado pelo sis- tema de eliminação em circulação ou por células de Kupffer no seio do fígado em um mamífero experimental ou em um humano;
vi) a célula fonte é diferente de uma célula 293; vii) a célula fonte não é transformada ou imortalizada; viii) a célula fonte é transformada ou imortalizada usando um método diferente da imortalização mediada por adenovírus, por exemplo, imortalizada por mutação espontânea ou expressão de telo- merase; ix) o fusogênio é diferente de VSVG, uma proteína SNARE ou uma proteína granular secretora; x) o fusosoma não compreende Cre ou GFP, por exemplo, EGFP; xi) o fusosoma compreende ainda uma proteína que é exó- gena em relação à célula fonte) diferente de Cre ou GFP, por exemplo, EGFP; xii) o fusosoma compreende ainda um ácido nucleico (por exemplo, RNA, por exemplo, mRNA, miRNA ou siRNA) que é exógeno em relação à célula fonte) ou uma proteína (por exemplo, um anticor- po) que é exógena à célula fonte, por exemplo, no lúmen; xiii) o fusosoma não compreende mitocôndrias ou está substancialmente livre de mitocôndrias; ou xiv) o fusosoma compreende ainda um ácido nucleico (por exemplo, um DNA, um gDNA, um cDNA, um RNA, um pré-mRNA, um mRNA, um miRNA ou um siRNA) ou proteína (por exemplo, um anti- corpo), em que o ácido nucleico ou a proteína é exógena à célula fon- te.
[0023] Alternativamente ou adicionalmente, em algumas modali- dades, um ou mais dos seguintes é(são) verdadeiro(s): i) o agente de carga útil de proteína de membrana é uma proteína de membrana ou um ácido nucleico (por exemplo, um DNA, um gDNA, um cDNA, um RNA, um pré-mRNA, um mRNA, etc.) que codifica ou é complementar a um que codifica, uma membrana proteí-
na, por exemplo, um receptor de antígeno quimérico (CAR); ii) a proteína de membrana é ou compreende um receptor, como um receptor de antígeno, que em algumas modalidades pode ser um receptor natural ou um receptor modificado, por exemplo, um CAR; iii) a proteína de membrana é ou compreende uma integri- na; iv) a proteína de membrana é ou compreende um receptor de células T; v) a proteína de membrana é ou compreende uma proteína de transporte de membrana, tal como uma proteína de canal iônico ou uma proteína formadora de poros (por exemplo, uma hemolisina ou colicina); vi) a proteína de membrana é ou compreende um receptor Toll-like; vii) a proteína de membrana é ou compreende um receptor de interleucina; viii) a proteína de membrana é ou compreende uma enzima de membrana; ix) a proteína de membrana é ou compreende uma proteína de adesão celular (por exemplo, proteína caderina, proteína selectina, proteína mucina, etc.).
[0024] A presente descrição fornece, em alguns aspectos, um fu- sosoma que compreende: (a) uma bicamada lipídica, (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica, (c) um fusogênio que é exógeno em relação à célula fonte ou um fusogênio superexpresso, por exemplo, em que o fusogênio es- tá disposto na bicamada lipídica,
(d) um agente de carga útil de proteína de membrana, e (e) um núcleo funcional, em que o fusosoma é derivado de uma célula fonte.
[0025] Em algumas modalidades, um ou mais dos seguintes es- tá(ão) presente(s): i) a célula fonte é diferente de uma célula dendrítica ou cé- lula tumoral, por exemplo, a célula fonte é selecionada a partir de uma célula endotelial, um macrófago, um neutrófilo, um granulócito, um leucócito, uma célula-tronco (por exemplo, uma célula-tronco mesen- quimal, uma célula-tronco da medula óssea, uma célula-tronco pluripo- tente induzida, uma célula-tronco embrionária), um mieloblasto, um mioblasto, um hepatócito ou um neurônio, por exemplo, célula neuro- nal retinal; ii) o fusogênio é diferente de uma glicoproteína fusogênica; iii) o fusogênio é uma proteína de mamífero diferente da fertilina-beta; iv) o fusosoma tem baixa imunogenicidade, por exemplo, conforme aqui descrito; v) o fusosoma atende a um padrão de boas práticas de fa- bricação (GMP) ou farmacêutico; vi) uma preparação farmacêutica que compreende uma plu- ralidade de fusosomas foi feita de acordo com boas práticas de fabri- cação (GMP); vii) uma preparação farmacêutica que compreende uma pluralidade de fusosomas tem um nível de patógeno abaixo de um va- lor de referência predeterminado, por exemplo, é substancialmente livre de patógenos; ou viii) uma preparação farmacêutica que compreende uma pluralidade de fusosomas tem um nível de contaminante abaixo de um valor de referência predeterminado, por exemplo, está substancial-
mente livre de contaminantes.
[0026] A presente descrição fornece, em alguns aspectos, uma preparação de fusosoma purificado congelado compreendendo uma pluralidade de fusosomas compreendendo um agente de carga útil de proteína de membrana aqui descrito, em que a preparação é congela- da a uma temperatura que é igual ou inferior a 4, 0, -4, -10, -12, -16, - 20, -80 ou -160 °C.
[0027] A presente descrição fornece, em alguns aspectos, uma preparação de fusosoma (por exemplo, uma preparação farmacêutica) compreendendo uma pluralidade de fusosomas aqui descritos.
[0028] A descrição também fornece, em alguns aspectos, uma composição de fusosoma compreendendo uma pluralidade de fuso- soma, em que pelo menos um fusosoma compreende: (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de lipídeos derivados de uma célula fonte; (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodea- do pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio que é exógeno ou superexpresso em rela- ção à célula fonte, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica; (d) um agente de carga útil de proteína de membrana, por exemplo, conforme aqui descrito.
[0029] A presente descrição fornece, em alguns aspectos, uma composição farmacêutica que compreende uma composição ou prepa- ração de fusosoma aqui descrita e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0030] Esta descrição fornece, em certos aspectos, um método de liberação de uma composição ou preparação de fusosoma compreen- dendo um agente de carga útil de proteína de membrana, conforme aqui descrito, para um indivíduo humano, um tecido alvo ou uma célu-
la, que compreende administrar ao indivíduo humano ou o contato do alvo tecido ou a célula com uma composição de fusosoma compreen- dendo uma pluralidade de fusosomas aqui descritos, uma composição de fusosomas aqui descrita ou uma composição farmacêutica aqui descrita, administrando desse modo a composição de fusosomas ao indivíduo.
[0031] Esta descrição fornece, em certos aspectos, um método de liberação de um agente de carga útil de proteína de membrana a um indivíduo, um tecido alvo ou uma célula, que compreende administrar ao indivíduo ou o contato do tecido alvo ou da célula com uma compo- sição ou preparação de fusosoma descrita aqui (por exemplo, uma composição farmacêutica aqui descrita), em que a composição ou preparação de fusosoma é administrada em uma quantidade e/ou tempo tal que o agente de carga útil da proteína de membrana seja liberado.
[0032] Esta descrição fornece, em certos aspectos, um método de modulação, por exemplo, realçando, uma função biológica em um indi- víduo, um tecido alvo ou uma célula, que compreende administrar ao indivíduo ou o contato do tecido alvo ou da célula com um fusosoma composição ou preparação compreendendo um agente de carga útil de proteína de membrana aqui descrito, por exemplo, uma composi- ção farmacêutica aqui descrita, modulando desse modo a função bio- lógica no indivíduo.
[0033] Esta descrição fornece, em certos aspectos, um método de liberação ou direcionamento de uma função de proteína de membrana a um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo de uma composição ou preparação de fusosoma aqui descrita que compreen- de um agente de carga útil de proteína de membrana, em que a com- posição ou preparação de fusosoma é administrada em uma quantida- de e/ou tempo tal que a função da proteína de membrana seja liberada ou direcionada ao indivíduo. Nas modalidades, o indivíduo tem um câncer, um distúrbio inflamatório, doença autoimune, uma doença crô- nica, inflamação, função de órgão danificado, uma doença infecciosa, um distúrbio degenerativo, uma doença genética ou uma lesão.
[0034] A descrição fornece, em alguns aspectos, um método de fabricação de uma composição de fusosoma, compreendendo: a) fornecer uma célula fonte compreendendo, por exemplo, expressar, um fusogênio; b) produzir um fusosoma a partir da célula fonte, em que o fusosoma compreende uma bicamada lipídica, um lúmen, um fusogê- nio e um agente de carga útil de proteína de membrana, formando desse modo um fusosoma; e c) formular o fusosoma, por exemplo, como uma composi- ção farmacêutica adequada para administração a um indivíduo.
[0035] Nas modalidades, um ou mais dos seguintes está(ão) pre- sente(s): i) a célula fonte é diferente de uma célula 293, célula endo- telial humana ou uma célula epitelial humana; ii) o fusogênio é diferente de uma proteína viral; iii) uma preparação compreendendo uma pluralidade de fusosomas tem uma densidade diferente de entre 1,08 g/mL e 1,12 g/mL; iv) uma preparação compreendendo uma pluralidade de fusosomas tem uma densidade de 1,25 g/mL +/- 0,05, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 33; v) o fusosoma não é substancialmente capturado pelo sis- tema de eliminação em circulação ou pelas células de Kupffer no seio do fígado; vi) o fusosoma não é substancialmente capturado pelo sis- tema retículo-endotelial (RES) em um indivíduo, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 76; vii) quando uma pluralidade de fusosomas é administrada a um indivíduo, menos de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % da pluralidade são capturados pelo RES após 24, 48 ou 72 horas, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 76; viii) o fusosoma tem um diâmetro maior que 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 10 μm, 20 μm, 50 μm, 100 μm, 150 μm ou 200 μm. ix) o fusosoma compreende um citobiológico; x) o fusosoma compreende uma célula enucleada; ou xi) o fusosoma compreende um núcleo inativado.
[0036] Em alguns aspectos, a presente descrição fornece um mé- todo de fabricação de uma composição de fusosoma, compreendendo: a) fornecer uma pluralidade de fusosomas aqui descritos ou uma composição de fusosomas aqui descrita; e b) formular os fusosomas, por exemplo, como uma compo- sição farmacêutica adequada para administração a um indivíduo.
[0037] Em alguns aspectos, a presente descrição fornece um mé- todo de fabricação de uma composição de fusosoma, compreendendo: a) fornecer, por exemplo, produzir uma pluralidade de fuso- somas ou uma preparação de fusosomas aqui descritos; e b) analisar uma amostra da pluralidade (por exemplo, da preparação) para determinar se um ou mais (por exemplo, 2, 3 ou mais) padrões são atendidos. Nas modalidades, o (s) padrão (ões) são escolhidos a partir de: i) fusosomas na amostra se fundem a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que com uma célula não alvo, por exemplo, em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54;
ii) fusosomas na amostra se fundem a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que outros fusosomas, por exemplo, em pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; iii) fusosomas na amostra se fundem com células-alvo a uma taxa tal que um agente de carga útil de proteína de membrana no fusosoma seja liberado a pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 %, das células-alvo após 24, 48 ou 72 horas, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; iv) o fusogênio está presente em um número de cópias, por fusosoma (por exemplo, em média na amostra), de pelo menos, ou não mais do que, 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000,
20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000,
10.000.000, 50.000.000, 100.000.000, 500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 29; v) o agente de carga útil de proteína de membrana é detec- tável em fusosomas da amostra (por exemplo, em média na amostra) em um número de cópias de pelo menos, ou não mais que, 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000,
200.000, 500.000 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000,
100.000.000, 500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 43; vi) a relação entre o número de cópias do fusogênio e o número de cópias do agente de carga útil da proteína de membrana está entre 1.000.000:1 e 100.000:1, 100.000:1 e 10.000:1, 10.000:1 e
1.000:1, 1.000:1 e 100:1, 100:1 e 50:1, 50:1 e 20:1, 20:1 e 10:1, 10:1 e 5:1, 5:1 e 2:1, 2:1 e 1:1 , 1:1 e 1:2, 1:2 e 1:5, 1:5 e 1:10, 1:10 e 1:20, 1:20 e 1:50, 1:50 e 1:100, 1 : 100 e 1:1.000, 1:1.000 e 1:10.000, 1:10.000 e 1:100.000 ou 1:100.000 e 1:1.000.000;
vii) os fusosomas da amostra são caracterizados por uma composição lipídica substancialmente semelhante à da célula fonte ou em que um ou mais dentre CL, Cer, DAG, HexCer, LPA, LPC, LPE, LPG, LPI, LPS, PA, PC, PE, PG, PI, PS, CE, SM e TAG está dentro de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 % ou 75 % do nível de lipídeo correspondente na célula fonte; viii) os fusosomas da amostra são caracterizados por uma composição proteômica semelhante à da célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 42; ix) os fusosomas da amostra são caracterizados por uma relação de lipídeos para proteínas que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 49; x) fusosomas da amostra são caracterizados por uma rela- ção de proteínas para ácidos nucleicos (por exemplo, DNA) que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 50; xi) fusosomas da amostra são caracterizados por uma rela- ção de lipídeos para ácidos nucleicos (por exemplo, DNA) que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 51; xii) os fusosomas da amostra são caracterizados por uma meia-vida em um indivíduo, por exemplo, em um animal experimental, como um camundongo, que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % da meia-vida de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 75; xiii) fusosomas da amostra são caracterizados por transpor-
tarem glicose (por exemplo, glicose marcada, por exemplo, 2-NBDG) através de uma membrana, por exemplo, em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % a mais do que um controle negativo, por exemplo, fusosomas de uma amostra semelhante na ausência de glicose, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 64; xiv) os fusosomas da amostra são caracterizados por ativi- dade de esterase no lúmen que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % daquela da atividade de esterase em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um fibroblasto embrionário de camundongo, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 66; xv) fusosomas da amostra são caracterizados por um nível de atividade metabólica (por exemplo, atividade de citrato sintase) que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % da atividade metabólica, por exemplo, atividade de citrato sintase, em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 68; xvi) fusosomas da amostra são caracterizados por um nível de respiração (por exemplo, taxa de consumo de oxigênio) que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % do nível de respiração em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, conforme des- crito no Exemplo 69; xvii) os fusosomas da amostra são caracterizados por um nível de manchamento com Anexina-V de no máximo 18.000, 17.000,
16.000, 15.000, 14.000, 13.000, 12.000, 11.000 ou 10.000 MFI, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compreende um nível de manchamento com Anexina-V pelo menos 5
%, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % menor do que o nível de man- chamento com Anexina-V de um fusosoma semelhante tratado com menadiona no ensaio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compre- ende um nível de manchamento com Anexina-V pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % menor do que o nível de manchamento com Anexina-V de um macrófago tratado com menadiona no ensaio do Exemplo 70, xviii) fusosomas da amostra são caracterizados por um ní- vel de teor de miRNA de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que a célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 39; xix) o fusosoma tem uma relação de proteína solúvel: não solúvel dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou maior do que a célula fonte, por exemplo, dentro de 1 % - 2 %, 2 % - 3 %, 3 % - 4 %, 4 % - 5 %, 5 % - 10 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, 50 % - 60 %, 60 % - 70 %, 70 % - 80 % ou 80 % - 90 % daquele da fonte célula, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 47; xx) fusosomas da amostra são caracterizados por um nível de LPS inferior a 5 %, 1 %, 0,5 %, 0,01 %, 0,005 %, 0,0001 %, 0,00001 % ou menos do teor de LPS da célula fonte ou uma célula de referência, por exemplo, como medido por um ensaio do Exemplo 48; xxi) fusosomas da amostra são capazes de transdução de sinal, por exemplo, transmitir um sinal extracelular, por exemplo, fosfo- rilação de AKT em resposta à insulina, ou captação de glicose (por exemplo, glicose marcada, por exemplo, 2-NBDG) em resposta à insu- lina, por exemplo, por pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % mais do que um controle negativo, por exemplo, um fusosoma de outra forma seme- lhante na ausência de insulina, por exemplo, usando um ensaio do
Exemplo 63; xxii) os fusosomas da amostra são caracterizados por um nível de sinalização de justácrina de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % maior do que o nível de sinalização de justácrina induzida por uma cé- lula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula estromal da medula óssea (BMSC), por exemplo, por um ensaio do Exemplo 71; xxiii) fusosomas da amostra são caracterizados por um ní- vel de sinalização de parácrina de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % maior do que o nível de sinalização de parácrina induzida por uma cé- lula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um macrófago, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 72; xxiv) fusosomas da amostra são caracterizados por polime- rizarem actina a um nível de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % em comparação com o nível de actina polimerizada em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula C2C12, por exemplo, pelo en- saio do Exemplo 73; xxv) fusosomas da amostra são caracterizados por um po- tencial de membrana dentro de cerca de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % do po- tencial de membrana de uma célula de referência, por exemplo, a célu- la fonte ou uma célula C2C12, por exemplo, por um ensaio do Exem- plo 74, ou em que o fusosoma tem um potencial de membrana de cer- ca de -20 a -150 mV, -20 a -50 mV, -50 a -100 mV ou -100 a -150 mV; xxvi) os fusosomas da amostra são capazes de secretar uma proteína, por exemplo, a uma taxa de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou
100 % maior do que uma célula de referência, por exemplo, um fi- broblasto embrionário de camundongo, por exemplo, usando um en- saio do Exemplo 62; ou xxvii) fusosomas da amostra são caracterizados por baixa imunogenicidade, por exemplo, conforme aqui descrito; e c) (opcionalmente) aprovar a pluralidade de fusosomas ou composição de fusosomas para liberação se um ou mais dos padrões for atendido (opcionalmente) formular a pluralidade de fusosomas ou a preparação de fusosomas como um produto de fármaco se um ou mais padrões forem atendidos.
[0038] A presente descrição também fornece, em alguns aspectos, um método de fabricação de uma composição de fusosoma, compre- endendo: a) fornecer, por exemplo, a produção de uma pluralidade de fusosomas aqui descritos ou uma composição ou preparação de fuso- somas aqui descritos; e b) analisar uma amostra da pluralidade ou preparação para determinar a presença ou nível de um ou mais dos seguintes fatores: i) uma molécula imunogênica, por exemplo, uma proteína imunogênica, por exemplo, como aqui descrito; ii) um patógeno, por exemplo, uma bactéria ou vírus; ou iii) um contaminante (por exemplo, uma estrutura ou com- ponente nuclear, como DNA nuclear); e c) (opcionalmente) aprovar a pluralidade de fusosomas ou preparação de fusosomas para liberação se um ou mais dos fatores se desviarem significativamente (por exemplo, por mais do que uma quantidade especificada) de um valor de referência ou (opcionalmente) formular a pluralidade de fusosomas ou a preparação de fusosoma como um produto de fármaco se um ou mais fatores não se desviarem significativamente (por exemplo, não se desviarem mais do que o es-
pecificado) do valor de referência.
[0039] A presente descrição também fornece, em alguns aspectos, um método de liberação de um agente de carga útil de proteína de membrana a um indivíduo, por exemplo, compreendendo: a) administrar ao indivíduo o primeiro fusogênio, sob condi- ções que permitem a disposição do primeiro fusogênio em uma ou mais células-alvo no indivíduo, em que um ou mais dos seguintes: i) administrar o primeiro fusogênio compreende administrar um ácido nucleico que codifica o primeiro fusogênio, sob condições que permitem a expressão do primeiro fusogênio em uma ou mais cé- lulas-alvo, ou ii) o primeiro fusogênio não compreende um motivo de anel espiralado, e b) administrar ao indivíduo humano uma composição ou preparação de fusosomas como aqui descrito, que compreende uma pluralidade de fusosomas compreendendo um segundo fusogênio e um agente de carga útil de proteína de membrana, em que o segundo fusogênio é compatível com o primeiro fusogênio, em que a pluralida- de de fusosomas compreende ainda uma membrana agente de carga útil de proteína (por exemplo, que é exógena ou super-expressa em relação à célula fonte), liberando desse modo o agente de carga útil da proteína de membrana ao indivíduo.
[0040] A presente descrição também fornece, em alguns aspectos, um método de modulação, por exemplo, realçando, uma função bioló- gica em um indivíduo, compreendendo: a) administrar ao indivíduo o primeiro fusogênio, sob condi- ções que permitem a disposição do primeiro fusogênio em uma ou mais células-alvo no indivíduo, em que um ou mais dos seguintes: i) administrar o primeiro fusogênio compreende administrar um ácido nucleico que codifica o primeiro fusogênio, sob condições que permitem a expressão do primeiro fusogênio em uma ou mais cé- lulas-alvo, ou ii) o primeiro fusogênio não compreende um motivo de anel espiralado, e b) administrar ao indivíduo humano uma composição ou preparação de fusosomas como aqui descrito, que compreende uma pluralidade de fusosomas compreendendo um segundo fusogênio, em que o segundo fusogênio é compatível com o primeiro fusogênio, em que a pluralidade de fusosomas compreende ainda um agente de car- ga útil de proteína de membrana (por exemplo, que é exógeno ou su- perexpresso em relação à célula fonte), modulando desse modo a função biológica no indivíduo.
[0041] Em alguns aspectos, um fusosoma compreende um con- drissoma e um fusogênio.
[0042] Em alguns aspectos, uma composição compreende uma pluralidade de fusosomas, em que pelo menos um fusosoma compre- ende um condrissoma e um fusogênio.
[0043] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de fabri- cação de uma composição de fusosoma, compreendendo: a) fornecer uma célula fonte compreendendo, por exemplo, expressar, um fusogênio; b) produzir um fusosoma a partir da célula fonte, em que o fusosoma compreende uma bicamada lipídica, um lúmen, um fusogê- nio e um agente de carga útil de proteína de membrana, formando desse modo um fusosoma; e c) formular o fusosoma, por exemplo, como uma composi- ção farmacêutica adequada para administração a um indivíduo, em que um ou mais dos seguintes: i) a célula fonte é outra que não uma célula 293, célula
HEK, célula endotelial humana ou uma célula epitelial humana; ii) o fusogênio é diferente de uma proteína viral; iii) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mes- mo tem uma densidade diferente de entre 1,08 g/mL e 1,12 g/mL, por exemplo, iv) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mes- mo tem uma densidade de 1,25 g/mL +/- 0,05, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 33; v) o fusosoma não é capturado pelo sistema de eliminação em circulação ou pelas células de Kupffer no seio do fígado; vi) o fusosoma não é capturado pelo sistema retículo- endotelial (RES) em um indivíduo, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 76; vii) quando uma pluralidade de fusosomas é administrada a um indivíduo, menos de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, da pluralidade não são captura- dos pelo RES após 24 horas, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 76; viii) o fusosoma tem um diâmetro de mais de 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 10 μm, 20 μm, 50 μm, 100 μm, 150 μm ou 200 μm. ix) o fusosoma compreende um citobiológico; x) o fusosoma compreende uma célula enucleada; ou xi) o fusosoma compreende um núcleo inativado.
[0044] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de fabri- cação de uma composição de fusosoma, compreendendo: i) fornecer uma pluralidade de fusosomas, uma composição de fusosomas ou uma composição farmacêutica como aqui descrito; e ii) formular a pluralidade de fusosomas, composição de fu- sosomas ou composição farmacêutica, por exemplo, como um produto de fármaco fusosoma adequado para administração a um indivíduo.
[0045] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de fabri- cação de uma composição de fusosoma, compreendendo: i) fornecer uma pluralidade de fusosomas, uma composição de fusosomas ou uma composição farmacêutica como aqui descrito; e b) analisar um ou mais fusosomas da pluralidade para de- terminar se um ou mais (por exemplo, 2, 3 ou todos) dos seguintes padrões são atendidos: i) o fusosoma se funde a uma taxa mais alta com uma célu- la-alvo do que com uma célula não alvo, por exemplo, em pelo menos 10 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; ii) o fusosoma se funde a uma taxa mais elevada com uma célula-alvo do que com outros fusosomas, por exemplo, em pelo me- nos 50 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; iii) o fusosoma se funde com células-alvo a uma taxa tal que um agente no fusosoma é liberado a pelo menos 10 % das célu- las-alvo após 24 horas, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; iv) o fusogênio está presente em um número de cópias de pelo menos 1.000 cópias, por exemplo, conforme medido por um en- saio do Exemplo 29; v) o fusosoma compreende uma carga útil de membrana de proteína em um número de cópias de pelo menos 1.000 cópias, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 43; vi) a relação do número de cópias do fusogênio para o nú- mero de cópias da carga útil da membrana da proteína está entre
1.000.000:1 e 100.000:1, 100.000:1 e 10.000:1, 10.000:1 e 1.000:1,
1.000:1 e 100:1, 100:1 e 50:1, 50:1 e 20:1, 20:1 e 10:1, 10:1 e 5:1, 5:1 e 2:1, 2:1 e 1:1, 1:1 e 1:2, 1:2 e 1:5, 1:5 e 1:10, 1:10 e 1:20, 1:20 e 1:50, 1:50 e 1:100, 1:100 e 1:1.000, 1:1.000 e 1:10.000, 1:10.000 e 1:100.000, ou 1:100.000 e 1:1.000.000; vii) o fusosoma compreende uma composição lipídica em que um ou mais dentre CL, Cer, DAG, HexCer, LPA, LPC, LPE, LPG, LPI, LPS, PA, PC, PE, PG, PI, PS, CE, SM e TAG estão dentro 75 % do nível de lipídeo correspondente na célula fonte; viii) o fusosoma compreende uma composição proteômica semelhante à da célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 42; ix) o fusosoma compreende uma relação de lipídeos para proteínas que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da re- lação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 49; x) o fusosoma compreende uma relação de proteínas para ácidos nucleicos (por exemplo, DNA) que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio de Exemplo 50; xi) o fusosoma compreende uma relação de lipídeos para ácidos nucleicos (por exemplo, DNA) que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio de Exemplo 51; xii) o fusosoma tem uma meia-vida em um indivíduo, por exemplo, em um camundongo, que está dentro de 90 % da meia-vida de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 75; xiii) o fusosoma transporta glicose (por exemplo, glicose marcada, por exemplo, 2-NBDG) através de uma membrana, por exemplo, por pelo menos 10 % a mais do que um controle negativo, por exemplo, um fusosoma semelhante na ausência de glicose, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 64; xiv) o fusosoma compreende atividade de esterase no lú- men que está dentro de 90 % daquela da atividade de esterase em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um fibroblasto embrionário de camundongo, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 66; xv) o fusosoma compreende um nível de atividade metabó- lica que está dentro de 90 % da atividade metabólica (por exemplo, atividade de citrato sintase) em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 68; xvi) o fusosoma compreende um nível de respiração (por exemplo, taxa de consumo de oxigênio) que está dentro de 90 % do nível de respiração em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 69; xvii) o fusosoma compreende um nível de manchamento com Anexina-V de no máximo 18.000, 17.000, 16.000, 15.000, 14.000,
13.000, 12.000, 11.000 ou 10.000 MFI, por exemplo, usando um en- saio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compreende um nível de manchamento com Anexina-V pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % menor do que o nível de manchamento com Anexina-V de um fusosoma semelhante tratado com menadiona no ensaio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compreende um nível de man- chamento com Anexina-V pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % menor do que o nível de manchamento com Anexina-V de um macrófago tratado com menadiona no ensaio do Exemplo 70; xviii) o fusosoma tem um nível de teor de miRNA de pelo menos 1 % do que aquele da célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 39; xix) o fusosoma tem uma relação de proteína solúvel: não solúvel dentro de 90 % daquela da célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 47; o fusosoma tem um nível de LPS inferior a 5 % do teor de lipídeos dos fusosomas, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 48; xx) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo, são capazes de transdução de sinal, por exemplo, transmitir um sinal extracelular, por exemplo, fosforilação de AKT em resposta à insulina ou captação de glicose (por exemplo, glicose marcada, por exemplo, 2-NBDG) em resposta à insulina, por exemplo, em pelo me- nos 10 % a mais do que um controle negativo, por exemplo, um fuso- soma de outra forma semelhante na ausência de insulina, por exem- plo, usando um ensaio do Exemplo 63; xxi) o fusosoma tem nível de sinalização de justácrina de pelo menos 5 % maior do que o nível de sinalização de justácrina in- duzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula estromal da medula óssea (BMSC), por exemplo, por um ensaio do Exemplo 71; xxii) o fusosoma tem nível de sinalização de parácrina de pelo menos 5 % maior do que o nível de sinalização de parácrina in- duzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um macrófago, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 72; xxiii) o fusosoma polimeriza a actina a um nível de 5 % em comparação com o nível de actina polimerizada em uma célula de re- ferência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula C2C12, por exem- plo, pelo ensaio do Exemplo 73; xxiv) o fusosoma tem um potencial de membrana dentro de cerca de 5 % do potencial de membrana de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula C2C12, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 74, ou em que o fusosoma tem um potencial de membrana de cerca de -20 a -150 mV, -20 a -50 mV, -50 a -100 mV ou -100 a -150 mV; xxv) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo são capazes de secretar uma proteína, por exemplo, a uma taxa pelo menos 5 % maior do que uma célula de referência, por exemplo, um fibroblasto embrionário de camundongo, por exemplo,
usando um ensaio do Exemplo 62; ou xxvi) o fusosoma tem baixa imunogenicidade, por exemplo, conforme aqui descrito; e c) (opcionalmente) aprovar a pluralidade de fusosomas ou composição de fusosomas para liberação se um ou mais dos padrões for atendido; fabricando desse modo uma composição de produto de fármaco fuso- soma
[0046] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de fabri- cação de uma composição de fusosoma, compreendendo: a) fornecer uma pluralidade de fusosomas, uma composi- ção de fusosomas ou uma composição farmacêutica como aqui des- crito; e b) analisar um ou mais fusosomas da pluralidade para de- terminar a presença ou nível de um ou mais dos seguintes fatores: i) uma molécula imunogênica, por exemplo, uma proteína imunogênica, por exemplo, como aqui descrito; ii) um patógeno, por exemplo, uma bactéria ou vírus; ou iii) um contaminante; c) (opcionalmente) aprovar a pluralidade de fusosomas ou composição de fusosomas para liberação se um ou mais dos fatores estiver abaixo de um valor de referência; fabricando desse modo uma composição de produto de fármaco fuso- soma.
[0047] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de admi- nistração de uma composição de fusosoma a um indivíduo, por exem- plo, um indivíduo humano, que compreende administrar ao indivíduo de uma composição de fusosoma compreendendo uma pluralidade de fusosomas, uma composição de fusosomas ou uma composição far- macêutica como aqui descrito, administrando desse modo a composi-
ção de fusosoma ao indivíduo.
[0048] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de libera- ção de uma carga útil de membrana de proteína a um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo de uma composição de fusoso- ma compreendendo uma pluralidade de fusosomas, uma composição de fusosomas ou uma composição farmacêutica como aqui descrito, em que a composição de fusosomas é administrada uma quantidade e/ou tempo em que a carga útil da membrana da proteína é liberada.
[0049] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de modu- lação, por exemplo, realçando, uma função biológica em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo de uma composição de fu- sosoma compreendendo uma pluralidade de fusosomas, uma compo- sição de fusosomas ou uma composição farmacêutica como aqui des- crito modulando desse modo a função biológica no indivíduo.
[0050] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de libera- ção ou direcionamento de uma função a um indivíduo, que compreen- de administrar ao indivíduo de uma composição de fusosoma compre- endendo uma pluralidade de fusosomas, uma composição de fusoso- mas ou uma composição farmacêutica como aqui descrito, em que a composição de fusosomas é administrada em uma quantidade e/ou tempo tal que a função no indivíduo seja liberada ou direcionada.
[0051] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de trata- mento de uma doença ou distúrbio em um paciente que compreende administrar ao indivíduo de uma composição de fusosoma compreen- dendo uma pluralidade de fusosomas, uma composição de fusosomas ou uma composição farmacêutica como aqui descrito, em que a com- posição de fusosomas é administrada em uma quantidade e/ou tempo tal que a doença ou distúrbio seja tratado.
[0052] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de admi- nistração de uma composição de fusosoma a um indivíduo humano,
compreendendo a) administrar ao indivíduo um primeiro fusogênio, sob con- dições que permitem a disposição do primeiro fusogênio em uma ou mais células-alvo no indivíduo, em que um ou mais dos seguintes: i) administrar o primeiro fusogênio compreende administrar de um ácido nucleico que codifica o primeiro fusogênio, sob condições que permitem a expressão do primeiro fusogênio em uma ou mais cé- lulas-alvo, ou ii) o primeiro fusogênio não compreende um motivo de anel espiralado, e b) administrar ao indivíduo humano uma composição de fusosoma compreendendo uma pluralidade de fusosomas compreen- dendo um segundo fusogênio, em que o segundo fusogênio é compa- tível com o primeiro fusogênio, em que a pluralidade de fusosomas compreende ainda um agente de carga útil de proteína de membrana (por exemplo, que é exógeno ou superexpresso em relação para a cé- lula fonte); administrando desse modo a composição de fusosoma ao indivíduo.
[0053] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de libera- ção de um agente de carga útil de proteína de membrana a um indiví- duo, compreendendo: a) administrar ao indivíduo o primeiro fusogênio, sob condi- ções que permitem a disposição do primeiro fusogênio em uma ou mais células-alvo no indivíduo, em que um ou mais dos seguintes: i) administrar o primeiro fusogênio compreende administrar um ácido nucleico que codifica o primeiro fusogênio, sob condições que permitem a expressão do primeiro fusogênio em uma ou mais cé- lulas-alvo, ou ii) o primeiro fusogênio não compreende um motivo de anel espiralado, e b) administrar ao indivíduo humano uma composição de fusosomas compreendendo uma pluralidade de fusosomas compreen- dendo um segundo fusogênio e um agente terapêutico, em que o se- gundo fusogênio é compatível com o primeiro fusogênio, em que a plu- ralidade de fusosomas compreende ainda um agente de carga útil de proteína de membrana; liberando desse modo o agente de carga útil da proteína de membrana ao indivíduo.
[0054] Em alguns aspectos, é fornecido aqui um método de modu- lação, por exemplo, realçando, uma função biológica em um indivíduo, compreendendo: a) administrar ao indivíduo o primeiro fusogênio, sob condi- ções que permitem a disposição do primeiro fusogênio em uma ou mais células-alvo no indivíduo, em que um ou mais dos seguintes: i) administrar o primeiro fusogênio compreende administrar um ácido nucleico que codifica o primeiro fusogênio, sob condições que permitem a expressão do primeiro fusogênio em uma ou mais cé- lulas-alvo, ou ii) o primeiro fusogênio não compreende um motivo de anel espiralado, e b) administrar ao indivíduo humano uma composição de fusosomas compreendendo uma pluralidade de fusosomas compreen- dendo um segundo fusogênio, em que o segundo fusogênio é compa- tível com o primeiro fusogênio, em que a pluralidade de fusosomas compreende ainda um agente de carga útil de proteína de membrana; modulando desse modo a função biológica no indivíduo.
[0055] Qualquer um dos aspectos aqui, por exemplo, os fusoso- mas, composições de fusosomas, preparações e métodos acima, po- dem ser combinados com uma ou mais das modalidades aqui, por exemplo, uma ou das modalidades aqui descritas.
[0056] Em algumas modalidades, a função biológica é selecionada a partir de: a) modular, por exemplo, aumentar ou diminuir, uma intera- ção entre duas células; b) modular, por exemplo, aumentar ou diminuir, uma res- posta imune; c) modular, por exemplo, aumentar ou diminuir o recruta- mento de células para um tecido-alvo; d) diminuindo a taxa de crescimento de um câncer; ou e) reduzir o número de células cancerosas no indivíduo.
[0057] Em algumas modalidades, uma pluralidade de fusosomas, quando em contato com uma população de células-alvo na presença de um inibidor de endocitose, e quando em contato com uma popula- ção de células-alvo de referência não tratada com o inibidor de endoci- tose, libera a carga a pelo menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % ou 80 % do número de células na população de células-alvo em comparação com a população de células-alvo de referência.
[0058] Em algumas modalidades, quando a pluralidade de fuso- somas é contatada com uma população de células que compreende células-alvo e células não alvo, a carga está presente em pelo menos 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, ou 100 vezes mais células-alvo do que células não alvo. Em algumas modalidades, os fusosomas da pluralidade se fundem a uma taxa mais elevada com uma célula-alvo do que com uma célula não alvo em pelo menos 50 %.
[0059] Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteí- na de membrana é diferente de, não compreende, não codifica ou não é complementar a uma sequência que codifica, uma conexina, CFTR, receptor de tireotropina, proteína zero de mielina, melacortina 4, prote- ína proteolipídica de mielina, receptor de lipoproteína de baixa densi-
dade, transportador ABC, CD81, mCAT-1, CXCR4, CD4, CCR5, prote- ínas ricas em ácido siálico, claudinas, CD21, receptores de células T, receptores de células B, TNFR1, CD63, GLUT4, VEGF ou ICAM . Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membra- na compreende ou codifica uma proteína quimérica que não se liga a um marcador de superfície celular ou porção de célula-alvo de uma célula-alvo e que não compreende uma proteína fluorescente.
[0060] Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteí- na de membrana compreende uma proteína terapêutica, por exemplo, uma proteína terapêutica aqui descrita. Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana compreende uma prote- ína de aparelho de Golgi, uma proteína secretada ou uma proteína de retículo endoplasmático ou uma combinação das mesmas. Em algu- mas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana não compreende um ou mais dentre: um dímero (por exemplo, um dí- mero que é exógeno à célula fonte), um heterodímero (por exemplo, um heterodímero que é exógeno à célula fonte), ou um domínio de di- merização (por exemplo, um domínio de dimerização em um polipeptí- deo que é exógeno à célula fonte). Em algumas modalidades, o agen- te de carga útil da proteína de membrana compreende um ácido nu- cleico (por exemplo, DNA ou RNA) que codifica uma proteína de membrana. Em algumas modalidades, o fusogênio é um fusogênio não viral, por exemplo, um fusogênio de mamífero. Em algumas moda- lidades, o fusogênio (por exemplo, fusogênio exógeno ou superex- presso) não promove a formação de vesículas a partir de uma célula fonte. Em algumas modalidades, o fusosoma compreende uma célula enucleada.
[0061] Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteí- na de membrana compreende ou codifica uma proteína de membrana que compreende um domínio transmembrana. Em algumas modalida-
des, o agente de carga útil da proteína de membrana compreende ou codifica uma proteína ancorada em lipídeos. Em algumas modalida- des, o agente de carga útil da proteína de membrana compreende ou codifica uma proteína que se liga a uma proteína transmembrana. Por exemplo, a proteína pode ser uma proteína extracelular que se liga a uma porção extracelular de uma proteína transmembrana, ou a proteí- na pode ser uma proteína intracelular que se liga a uma porção intra- celular de uma proteína transmembrana. Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana compreende ou codifica uma proteína que não possui um domínio transmembrana. Em algu- mas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana compreende ou codifica uma proteína que atravessa parcialmente uma membrana (por exemplo, uma membrana da célula-alvo ou o fusoso- ma) e não abrange completamente a membrana. Por exemplo, em al- gumas modalidades, a proteína compreende uma hélice de membrana no plano ou a proteína compreende uma alça hidrofóbica que não abrange completamente a membrana. Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana compreende ou codifica uma proteína que não compreende um domínio transmembrana, em que a proteína interage com uma superfície de membrana, por exem- plo, por meio de interações eletropstáticas ou iônicas)
[0062] Em algumas modalidades, um fusosoma que liberação um agente de carga útil de proteína de membrana à membrana de uma célula-alvo, conforme aqui descrito, é ainda capaz de liberar (por exemplo, liberação) um ou mais agentes, por exemplo, proteínas, áci- dos nucleicos (por exemplo, um DNA, um gDNA, um cDNA, um RNA, um pré-mRNA, um mRNA, etc.), organelas ou e/ou metabólitos para o citosol da célula-alvo. Assim, em algumas modalidades, um método fornecido aqui compreende a liberação de um agente ao citosol de uma célula-alvo; em algumas de tais modalidades, o agente liberado por citosol é uma proteína (ou um ácido nucleico que codifica, ou com- plementar a um que codifica, a proteína, por exemplo, um, por exem- plo, um DNA, um gDNA, um cDNA, um RNA, um pré-mRNA, um mRNA, etc. que codifica a proteína).
[0063] Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteí- na de membrana é ou compreende uma sequência de SEQ ID NOs: 8144-16131 da Publicação de Patente Norte-americana Nº 2016/0289674. Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana é ou compreende um fragmento, variante ou homólogo de uma sequência de SEQ ID NOs: 8144-16131 da Publica- ção de Patente Norte-americana Nº 2016/0289674. Em algumas mo- dalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana é ou com- preende um ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo uma sequência de SEQ ID NOs: 8144-16131 da Publicação de Paten- te Norte-americana Nº 2016/0289674. Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana é ou compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo um fragmen- to, variante ou homólogo de uma sequência de SEQ ID NOs: 8144- 16131 da Publicação de Patente Norte-americana Nº 2016/0289674.
[0064] Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteí- na de membrana é ou compreende uma proteína selecionada das Ta- belas 5-15. Em algumas modalidades, o agente de carga útil da prote- ína de membrana é ou compreende um fragmento, variante ou homó- logo de uma proteína selecionada das Tabelas 5-15. Em algumas mo- dalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana é ou com- preende um ácido nucleico que codifica uma proteína que é ou com- preende uma proteína selecionada das Tabelas 5-15. Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana é ou compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína compreen- dendo um fragmento, variante ou homólogo de uma proteína selecio-
nada das Tabelas 5-15.
[0065] Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteí- na de membrana é ou compreende um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende um domínio de ligação ao antígeno. Em algu- mas modalidades, o CAR é ou compreende um CAR de primeira gera- ção compreendendo um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização (por exemplo, um, dois ou três domínios de sinalização). Em algumas modalidades, o CAR é ou compreende um CAR de segunda geração que compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e dois domínios de sinalização. Em algumas modalidades, o CAR compreen- de um CAR de terceira geração que compreende um domínio de liga- ção ao antígeno, um domínio transmembrana e pelo menos três domí- nios de sinalização. Em algumas modalidades, um CAR de quarta ge- ração compreendendo um domínio de ligação ao antígeno, um domí- nio transmembrana, três ou quatro domínios de sinalização e um do- mínio que após a sinalização bem-sucedida do CAR induz a expres- são de um gene de citocina. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é ou compreende um scFv ou Fab.
[0066] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antíge- no direciona-se a uma célula neoplásica. Em algumas modalidades, a característica do antígeno de uma célula neoplásica é selecionada a partir de um receptor de superfície celular, um receptor ligado a um canal iônico, um receptor ligado a uma enzima, um receptor acoplado à proteína G, tirosina cinase receptora, receptor associado à tirosina cinase, tirosina fosfatase semelhante à receptora, serina/treonina ci- nase receptora, guanilil ciclase receptora, receptor associado à histidi- na cinase, receptores de Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR) (incluindo ErbB1/EGFR, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 e receptores de Fator de Crescimento ErbB4/HER4), (FGFR) (incluindo FGF1, FGF2,
FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF18 e FGF21) receptores de Fa- tor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGFR) (incluindo VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, e PIGF), o receptor RET e a família de receptores Eph (incluindo EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA9, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 e CphB6), CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CFTR, CIC-1, CIC-2, CIC- 4, CIC-5, CIC-7, CIC-Ka, CIC-Kb, Bestrofinas, TMEM16A, receptor GABA, receptor de glicina, transportadores ABC, NAV1.1, NAV1.2, NAV1.3, NAV1.4, NAV1.5, NAV1.6, NAV1 .7, NAV1.8, NAV1.9, recep- tor de esfingosina-1-fosfato (S1P1R), canal NMDA, proteína trans- membrana, proteína transmembrana multiamplitude, motivos de recep- tor de células T; cadeias alfa de células T; cadeias β de células T; ca- deias γ de células T; cadeias δ de células T; CCR7; CD3; CD4; CD5; CD7; CD8; CD11b; CD11c; CD16; CD19; CD20; CD21; CD22; CD25; CD28; CD34; CD35; CD40; CD45RA; CD45RO; CD52; CD56; CD62L; CD68; CD80; CD95; CD117; CD127; CD133; CD137 (4-1 BB); CD163; F4/80; IL-4Ra; Sca-1; CTLA-4; GITR; GARP; COLO; granzima B; LFA- 1; receptor de transferrina; NKp46, perforina, CD4+; Th1; Th2; Th17; Th40; Th22; Th9; Tfh, FoxP3+ Treg.
Canônica; Tr1; Th3; Treg17; TREG; CDCP1, NT5E, EpCAM, CEA, gpA33, Mucinas, TAG-72, anidra- se carbônica IX, PSMA, proteína de ligação ao folato, Gangliosídeos (por exemplo, CD2, CD3, GM2), Lewis-γ2, VEGF, VEGFR 1/2/3, αVβ3, α5β1, ErbB1/EGFR, ErbB1/HER2, ErB3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRA- IL-R1, TRAIL-R2, RANKL, FAP, Tenascina, PDL-1, BAFF, HDAC, ABL, FLT3, KIT, MET, RET, IL-1β, ALK, RANKL, mTOR, CTLA-4, IL-6, IL-6R, JAK3, BRAF, PTCH, Suavizado, PIGF, ANPEP, TIMP1, PLAUR, PTPRJ, LTBR ou ANTXR1, Receptor de folato alfa (FRa), ERBB2 (Her2/neu), EphA2, IL-13Ra2, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), Mesotelina, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30,
CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, MUC16 (CA125), L1CAM, LeY, MSLN, IL13Rα1, L1-CAM, Tn Ag, antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, receptor a da interleucina- 11 (IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-beta), SSEA- 4, CD20, MUC1, NCAM, Prostase, PAP, ELF2M, Efrina B2, receptor IGF-1, CAIX, LMP2, gplOO, bcr-abl, tirosinase, Fucosil GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetil-GD2, receptor de folato beta, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, ácido polissiálico, PLACl, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, legumaína, HPV E6, E7, ETV6-AML, proteína de esperma 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, antígeno relacio- nado a Fos 1, p53, mutante de p53, prosteína, survivina, telomerase, PCTA- 1/Galectina 8, MelanoA/MART1, mutante Ras, hTERT, pontos de ruptura de translocação de sarcoma, ML-IAP, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, receptor de andrógeno, Ciclina B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYPIB I, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, transcriptase reversa da telomerase humana, RU1, RU2, carboxil esterase intestinal, hsp70-2 mut, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, um neoantígeno, CD133, CD15, CD184, CD24, CD56, CD26, CD29, CD44, HLA-A, HLA-B, HLA-C, (HLA-A,B,C) CD49f, CD151 CD340, CD200, tkrA, trkB ou trkC, ou um fragmento antigênico ou porção antigênica dos mesmos.
[0067] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antíge- no direciona-se a uma característica do antígeno de uma célula T. Em algumas modalidades, a característica do antígeno de uma célula T é selecionada a partir de um receptor de superfície celular, uma proteína de transporte de membrana (por exemplo, uma proteína de transporte ativa ou passiva, como, por exemplo, uma proteína de canal iônico, uma proteína formadora de poros, etc.), um receptor transmembrana, uma enzima de membrana e/ou uma proteína de adesão celular carac- terística de uma célula T. Em algumas modalidades, uma característi- ca do antígeno de uma célula T pode ser um receptor acoplado à pro- teína G, tirosina cinase receptora, receptor associado à tirosina cinase, tirosina fosfatase semelhante ao receptor, serina/treonina cinase re- ceptora, guanilil ciclase receptora, receptor associado à histidina ci- nase, AKT1; AKT2; AKT3; ATF2; BCL10; CALM1; CD3D (CD3δ); CD3E (CD3ε); CD3G (CD3γ); CD4; CD8; CD28; CD45; CD80 (B7-1); CD86 (B7-2); CD247 (CD3ζ); CTLA4 (CD152); ELK1; ERK1 (MAPK3); ERK2; FOS; FYN; GRAP2 (GADS); GRB2; HLA-DRA; HLA-DRB1; HLA-DRB3; HLA-DRB4; HLA-DRB5; HRAS; IKBKA (CHUK); IKBKB; IKBKE; IKBKG (NEMO); IL2; ITPR1; ITK; JUN; KRAS2; LAT; LCK; MAP2K1 (MEK1); MAP2K2 (MEK2); MAP2K3 (MKK3); MAP2K4 (MKK4); MAP2K6 (MKK6); MAP2K7 (MKK7); MAP3K1 (MEKK1); MAP3K3; MAP3K4; MAP3K5; MAP3K8; MAP3K14 (NIK); MAPK8 (JNK1); MAPK9 (JNK2); MAPK10 (JNK3); MAPK11 (p38β); MAPK12 (p38γ); MAPK13 (p38δ); MAPK14 (p38α); NCK; NFAT1; NFAT2; NFKB1; NFKB2; NFKBIA; NRAS; PAK1; PAK2; PAK3; PAK4; PIK3C2B; PIK3C3 (VPS34); PIK3CA; PIK3CB; PIK3CD; PIK3R1; PKCA; PKCB; PKCM; PKCQ; PLCY1; PRF1 (Perforina); PTEN; RAC1; RAF1; RELA; SDF1; SHP2; SLP76; SOS; SRC; TBK1; TCRA; TEC; TRAF6; VAV1; VAV2; ou ZAP70.
[0068] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antíge- no direciona-se a uma característica do antígeno de um distúrbio au- toimune ou inflamatório. Em algumas modalidades, o distúrbio autoi- mune ou inflamatório é selecionado de doença do enxerto versus hos- pedeiro crônica (GVHD), lúpus, artrite, glomerulonefrite de complexo imune, goodpasture, uveíte, hepatite, esclerose sistêmica ou esclero- dermia, diabetes tipo I, esclerose múltipla, doença de crioaglutinina, Pênfigo vulgar, Doença de Grave, anemia hemolítica autoimune, He- mofilia A, Síndrome de Sjogren Primária, púrpura trombocitopênica trombótica, neuromielite óptica, síndrome de Evan, neuropatia media- da por IgM, ciroglobulinemia, dermatomiosite, trombocitopenia idiopáti- ca, espondilite anquilosante, penfigoide bolhosa, angioedema adquiri- do, urticariforme crônica, polineuropatia desmielinizante antifosfolipídi- ca e trombocitopenia autoimune ou neutropenia ou aplasia eritrocitária pura, enquanto exemplos não limitantes exemplares de doenças aloi- munes incluem alossensibilização (veja, por exemplo, Blazar et al., 2015, Am.
J.
Transplant, 15 (4): 931-41) ou xenossensibilização de transplante de órgãos hematopoéticos ou sólidos, transfusões de san- gue, gravidez com alossensibilização fetal, trombocitopenia neonatal aloimune, doença hemolítica do recém-nascido, sensibilização a antí- genos estranhos, como pode ocorrer com a substituição de distúrbios de deficiência herdados ou adquiridos tratados com terapia de reposi- ção enzimática ou proteica, produtos sanguíneos e terapia gênica.
Em algumas modalidades, a característica do antígeno de um distúrbio autoimune ou inflamatório é selecionada a partir de um receptor de superfície celular, um receptor ligado a um canal iônico, um receptor ligado a uma enzima, um receptor acoplado à proteína G, um tirosina cinase receptora, um receptor associado à tirosina cinase, tirosina fos- fatase semelhante ao receptor, serina/treonina cinase receptora, gua- nilil ciclase receptora ou receptor associado à histidina cinase.
Em al- gumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno de CAR se liga a um ligante expresso em células B, células plasmáticas, plasma- blastos, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD27, CD38, CD45R, CD138, CD319, BCMA, CD28, TNF, receptores de interferon, GM- CSF, ZAP-70, LFA-1, CD3 gama, CD5 ou CD2.
[0069] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antíge- no direciona-se a uma característica do antígeno de uma doença in- fecciosa. Em algumas modalidades, em que a doença infecciosa é se- lecionada de HIV, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus do herpes humano, vírus do herpes humano 8 (HHV-8, vírus do herpes associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV)), vírus linfotrófico T humano -1 (HTLV-1), poliomavírus de células Merkel (MCV), vírus Símio 40 (SV40), vírus Eptstein-Barr, CMV, vírus do papiloma humano. Em al- gumas modalidades, a característica do antígeno de uma doença in- fecciosa é selecionada a partir de um receptor de superfície celular, um receptor ligado a um canal iônico, um receptor ligado a uma enzi- ma, um receptor acoplado à proteína G, tirosina cinase receptora, re- ceptor associado à tirosina cinase, tirosina fosfatase semelhante à re- ceptora, serina/treonina cinase receptora, guanilil ciclase receptora, receptor associado à histidina cinase, HIV Env, gpl20 ou epítopo indu- zido por CD4 em HIV-1 Env.
[0070] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana CAR compreende pelo menos uma região transmembrana da cadeia alfa, beta ou zeta de um receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 ou variante funcional dos mesmos. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana compreende pelo menos uma (s) região (ões) transmembrana de CD8α, CD8β, 4- 1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD37, CD80, CD86, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS e FGFR2B, ou sua variante funcional.
[0071] Em algumas modalidades, o CAR compreende pelo menos um domínio de sinalização selecionado de um ou mais dentre B7- 1/CD80; B7-2/CD86; B7-H1/PD-L1; B7-H2; B7-H3; B7-H4; B7-H6; B7-
H7; BTLA/CD272; CD28; CTLA-4; Gi24/VISTA/B7-H5; ICOS/CD278; PD-1; PD-L2/B7-DC; PDCD6); 4-1BB/TNFSF9/CD137; Ligante 4- 1BB/TNFSF9; BAFF/BLyS/TNFSF13B; BAFF R/TNFRSF13C; CD27/TNFRSF7; CD27 Ligand/TNFSF7; CD30/TNFRSF8; Ligante CD30/TNFSF8; CD40/TNFRSF5; CD40/TNFSF5; Ligante CD40/TNFSF5; DR3/TNFRSF25; GITR/TNFRSF18; Ligante GITR/TNFSF18; HVEM/TNFRSF14; LIGHT/TNFSF14; Linfotoxina- alfa/TNF-beta; OX40/TNFRSF4; Ligante OX40/TNFSF4; RELT/TNFRSF19L; TACI/TNFRSF13B; TL1A/TNFSF15; TNF-alfa; TNF RII/TNFRSF1B); 2B4/CD244/SLAMF4; BLAME/SLAMF8; CD2; CD2F-10/SLAMF9; CD48/SLAMF2; CD58/LFA-3; CD84/SLAMF5; CD229/SLAMF3; CRACC/SLAMF7; NTB-A/SLAMF6; SLAM/CD150); CD2; CD7; CD53; CD82/Kai-1; CD90/Thy1; CD96; CD160; CD200; CD300a/LMIR1; HLA Classe I; HLA-DR; Ikaros; Integrina alfa 4/CD49d; Integrina alfa 4 beta 1; Integrina alfa 4 beta 7/LPAM-1; LAG- 3; TCL1A; TCL1B; CRTAM; DAP12; Dectina-1/CLEC7A; DPPIV/CD26; EphB6; TIM-1/KIM-1/HAVCR; TIM-4; TSLP; TSLP R; antígeno associ- ado à função linfocitária-1 (LFA-1); NKG2C, um domínio zeta CD3, um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM), CD27, CD28, 4-1BB, CD134/OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antíge- no associado à função linfocitária-1 (LFA- 1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligante que se liga especificamente ao CD83, ou fragmento funcional dos mesmos.
[0072] Em algumas modalidades, o CAR compreende (i) um do- mínio zeta CD3, ou um motivo de ativação baseado em tirosina imu- norreceptora (ITAM), ou variante funcional dos mesmos; (ii) um domí- nio CD28 ou variante funcional deste; e (iii) um domínio 4-1BB, ou um domínio CD134, ou variante funcional dos mesmos. Em algumas mo- dalidades, o CAR compreende um domínio zeta CD3 ou um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM), ou variante fun-
cional dos mesmos. Em algumas modalidades, o CAR compreende (i) um domínio zeta CD3 ou um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptora (ITAM), ou variante funcional dos mesmos; (ii) um domínio CD28, ou um domínio 4-1BB, ou variante funcional dos mes- mos, e/ou (iii) um domínio 4-1BB, ou um domínio CD134, ou variante funcional dos mesmos. Em algumas modalidades, o CAR compreende (i) um domínio zeta CD3, ou um motivo de ativação baseado em tirosi- na imunorreceptora (ITAM), ou variante funcional dos mesmos; (ii) um domínio CD28 ou variante funcional deste; (iii) um domínio 4-1BB, ou um domínio CD134, ou variante funcional dos mesmos; e (iv) uma ci- tocina ou transgene de ligante coestimulador.
[0073] Em algumas modalidades, o CAR compreende ainda um ou mais espaçadores, por exemplo, em que o espaçador é um primeiro espaçador entre o domínio de ligação ao antígeno e o domínio trans- membrana. Em algumas modalidades, o primeiro espaçador inclui pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina ou va- riante ou versão modificada da mesma. Em algumas modalidades, o espaçador é um segundo espaçador entre o domínio transmembrana e um domínio de sinalização. Em algumas modalidades, o segundo es- paçador é um oligopeptídeo, por exemplo, em que o oligopeptídeo compreende dupletos de glicina-serina.
[0074] Em algumas modalidades, o fusosoma se funde à célula- alvo na superfície da célula-alvo. Em algumas modalidades, o fusoso- ma promove a fusão a uma célula-alvo de uma maneira independente de lisossoma. Em algumas modalidades, o conteúdo do fusosoma e/ou fusosoma entra na célula-alvo por endocitose ou por meio de uma via não endocítica. Em algumas modalidades, o fusosoma entra na célula-alvo por endocitose, por exemplo, em que o nível de agente de carga útil de proteína de membrana liberado por meio de uma via en- docítica para um determinado fusosoma é 0,01-0,6, 0,01-0,1, 0,1-0,3 ou 0,3-0,6, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou maior que uma célula de refe- rência tratada com cloroquina, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 91. Em algumas modalidades, o fusosoma entra na célula- alvo por uma via não endocítica, por exemplo, em que o nível de agen- te de carga útil de proteína de membrana liberado por uma via não en- docítica para um dado fusosoma é 0,1-0,95, 0,1-0,2, 0,2-0,3, 0,3-0,4, 0,4-0,5, 0,5-0,6, 0,6-0,7, 0,7-0,8, 0,8-0,9, 0,9-0,95, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que uma célula de referência tratada com cloroquina, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 90.
[0075] Em algumas modalidades, a célula-alvo compreende uma proteína de membrana agregada ou deformada. Em algumas modali- dades, o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo são capazes de reduzir os níveis (por exemplo, reduz os níveis) da proteí- na agregada ou deformada na célula-alvo, ou um método aqui com- preende a redução dos níveis da proteína agregada ou deformada na célula-alvo.
[0076] Conforme aqui descrito, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de liberar (por exemplo, liberação) uma proteína de membrana à membrana celular de uma célula-alvo. Da mesma forma, em algumas modalidades, um método aqui compreende a liberação de uma proteína de membrana à membrana celular de uma célula-alvo. Em algumas modalidades, a liberação da proteína compreende a liberação de um ácido nucleico (por exemplo, um DNA, um gDNA, um cDNA, um RNA, um pré-mRNA, um mRNA, etc.) que codifica a proteína para a célula-alvo de modo que a célula-alvo produz a proteína e a localiza na membrana. Em al- gumas modalidades, o fusosoma compreende, ou o método compre- ende ainda a liberação, da proteína e a fusão do fusosoma com a célu-
la-alvo transfere a proteína para a membrana celular da célula-alvo. Em algumas modalidades, o agente compreende um ligante da super- fície celular ou um anticorpo que se liga a um receptor da superfície celular. Em algumas modalidades, o fusosoma compreende ainda, ou o método compreende ainda a liberação, de um segundo agente que compreende ou codifica um segundo ligante de superfície celular ou anticorpo que se liga a um receptor de superfície celular e, opcional- mente, compreende ou codifica ainda um ou mais ligantes de superfí- cie celular adicionais ou anticorpos que se ligam a um receptor de su- perfície celular (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 ou mais). Em al- gumas modalidades, o primeiro agente e o segundo agente formam um complexo, em que opcionalmente o complexo compreende ainda um ou mais ligantes de superfície celular adicionais. Em algumas mo- dalidades, o agente compreende ou codifica um receptor de superfície celular, por exemplo, uma superfície celular que é exógena ou super- expressa em relação à célula fonte. Em algumas modalidades, os fu- sosomas fornecidos compreendem ainda, ou o método compreende ainda a liberação, de um segundo agente que compreende ou codifica um segundo receptor de superfície celular e, opcionalmente, compre- ende ou codifica um ou mais receptores de superfície celular adicio- nais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 ou mais receptores de su- perfície celular).
[0077] Em algumas modalidades, o segundo agente, por exemplo, agente terapêutico, é selecionado de uma proteína, complexo de pro- teína (por exemplo, que compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 50 proteínas, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 50 proteí- nas diferentes) polipeptídeo, ácido nucleico (por exemplo, DNA, cro- mossoma ou RNA, por exemplo, mRNA, siRNA ou miRNA) ou molécu- la pequena.
[0078] Em algumas modalidades, o primeiro agente e o segundo agente formam um complexo, em que, opcionalmente, o complexo compreende ainda um ou mais receptores de superfície celular adicio- nais. Em algumas modalidades, o agente compreende ou codifica um antígeno ou uma proteína apresentadora de antígeno.
[0079] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de liberar (por exemplo, liberação) um agente secretado, por exemplo, uma proteína secretada a um sítio alvo (por exemplo, uma região extracelular), por exemplo, pela liberação de um ácido nucleico (por exemplo, um DNA, um gDNA, um cDNA, um RNA, um pré-mRNA, um mRNA, etc.) que codifica a proteína para a célula-alvo sob condições que permitem que a célula-alvo produza e secrete a proteína. Da mesma forma, em al- gumas modalidades, um método aqui compreende a liberação de um agente secretado como aqui descrito. Nas modalidades, a proteína secretada é endógena ou exógena em relação à célula fonte; em al- gumas modalidades, a proteína secretada é endógena ou exógena para a célula-alvo. Nas modalidades, a proteína secretada compreen- de uma proteína terapêutica, por exemplo, uma molécula de anticorpo, uma citocina ou uma enzima. Nas modalidades, a proteína secretada compreende uma molécula de sinalização autócrina ou uma molécula de sinalização de parácrina. Nas modalidades, o agente secretado compreende um grânulo de secreção.
[0080] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de liberar (por exemplo, liberação) uma proteína de membrana ou uma proteína se- cretada que é ou compreende um antígeno. Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mes- mos são capazes de liberar (por exemplo, liberação) uma proteína de membrana ou uma proteína secretada que é ou compreende uma pro- teína de apresentação de antígeno, opcionalmente em conjunto (por exemplo, como um complexo) com um antígeno.
[0081] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de doar (por exemplo, doação) um ou mais receptores de superfície celular para uma célula-alvo (por exemplo, uma célula imune). Da mesma forma, em algumas modalidades, um método aqui compreende a doação de um ou mais receptores de superfície celular.
[0082] Em algumas modalidades, uma célula-alvo é ou compreen- de uma célula tumoral. Em algumas modalidades, os fusosomas for- necidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de liberar (por exemplo, liberação) uma membrana ou proteína secre- tada que é ou compreende um ligante imunoestimulador, uma proteína que apresenta antígeno, uma proteína supressora de tumor, uma pro- teína apoptótica, ou um receptor ou parceiro de ligação para qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades, um fusosoma compre- ende um agente (por exemplo, um agente de carga de proteína de membrana e/ou pelo menos um segundo agente) que é imunomodula- dor, por exemplo, imunoestimulador.
[0083] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de fazer com que (por exemplo, causar) a célula-alvo apresente um antígeno. Da mesma forma, em algumas modalidades, um método aqui compreen- de a apresentação de um antígeno em uma célula-alvo.
[0084] Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de liberar (por exemplo, liberação) um ácido nucleico a uma célula-alvo, por exemplo, para modificar transitoriamente a expressão do gene na célula-alvo ou para modificar, por exemplo, por integração no genoma da célula-alvo, por exemplo, para causar a expressão de uma proteína de membrana (ou proteína secretada) como aqui descrito.
[0085] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de liberar (por exemplo, liberação) uma proteína (por exemplo, uma proteína de membrana, como uma proteína transportadora ou uma proteína secre- tada, como uma proteína imunossupressora) a um alvo célula de modo que uma deficiência de proteína da célula-alvo seja resgatada, pelo menos temporariamente.
[0086] Nas modalidades, a proteína de membrana fornecida por ou como um agente de carga útil de proteína de membrana, conforme aqui descrito, é ou compreende uma porção ou entidade de imunoglo- bulina (por exemplo, um anticorpo, um Fab, um scFV, um scFab, um sdAb, um duocorpo, um minicorpo, um nanocorpo, um diacorpo, um zicorpo, um anticorpo de camelídeo, um BiTE, um quadroma, um bsDb, etc). Em algumas modalidades, uma proteína de membrana po- de incluir um ou mais porções não peptídicas covalentemente associ- adas, tais como, por exemplo, uma ou mais porções de carboidratos, porções de lipídeos, porções de polietilenoglicol, moléculas pequenas, etc., e suas combinações.
[0087] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de fazer com que (por exemplo, causar) uma célula-alvo secrete uma proteína, por exemplo, uma proteína terapêutica. Da mesma forma, em algumas modalidades, um método aqui compreende fazer com que uma célula- alvo secrete uma proteína.
[0088] Nas modalidades, a proteína de membrana fornecida por ou como um agente de carga útil de proteína de membrana, conforme aqui descrito, é ou compreende um ou mais ligantes da superfície ce- lular (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 ou mais ligantes da superfí- cie celular). Da mesma forma, em algumas modalidades, um método aqui compreende a apresentação de um ou mais ligantes da superfície celular a uma célula-alvo. Em algumas modalidades, um fusosoma com um ligante de superfície celular é de uma célula fonte escolhida a partir de um neutrófilo (por exemplo, e a célula-alvo é um linfócito infil- trante de tumor), célula dendrítica (por exemplo, e a célula-alvo é uma célula T virgem), ou neutrófilos (por exemplo, e o alvo é uma célula tumoral ou célula infectada por vírus). Em algumas modalidades, tal fusosoma compreende um complexo de membrana, por exemplo, um complexo compreendendo pelo menos 2, 3, 4 ou 5 proteínas, por exemplo, um homodímero, heterodímero, homotrímero, heterotrímero, homotetrâmero ou heterotetrâmero. Em algumas modalidades, tal fu- sosoma compreende um anticorpo, por exemplo, um anticorpo tóxico, por exemplo, o fusosoma e/ou composições ou preparações do mes- mo, são capazes de liberar (por exemplo, liberação) o anticorpo ao sí- tio alvo, por exemplo, por direcionamento para um sítio alvo. Em algu- mas modalidades, a célula fonte é uma célula NK ou neutrófilo.
[0089] Em algumas modalidades, a proteína de membrana é sele- cionada a partir de um receptor de superfície celular, um receptor liga- do a um canal iônico, um receptor ligado a uma enzima, um receptor acoplado à proteína G, tirosina cinase receptora, receptor associado à tirosina cinase, tirosina fosfatase semelhante a receptor, seri- na/treonina cinase receptora, guanilil ciclase receptora, receptor asso- ciado à histidina cinase, receptores de fator de crescimento epidérmico (EGFR) (incluindo ErbB1/EGFR, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 e ErbB4/HER4), receptores de fator de crescimento de fibroblastos (in- cluindo FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF18 e FGF21) receptores de Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGFR) (incluindo VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e PIGF), Receptor RET e a família de receptores Eph (incluindo EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA9, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphB4 e EphB6), CXCR1, CXCR2, CXCR3,
CXCR4, CXCR6, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CFTR, CIC-1, CIC-2, CIC-4, CIC-5, CIC-7, CIC-Ka, CIC-Kb, Bestrofi- nas, TMEM16A, receptor GABA, receptor de glicina, transportadores ABC, NAV1.1, NAV1.2, NAV1.3, NAV1.4, NAV1.5, NAV1.6, NAV1.7, NAV1.8, NAV1.9, receptor de esfingosina-1-fosfato (S1P1R), canal NMDA, proteína transmembrana, proteína transmembrana multiampli- tude, motivos de receptor de célula T; cadeias alfa de células T; cadei- as β de células T; cadeias γ de células T; cadeias δ de células T; CCR7; CD3; CD4; CD5; CD7; CD8; CD11b; CD11c; CD16; CD19; CD20; CD21; CD22; CD25; CD28; CD34; CD35; CD40; CD45RA; CD45RO; CD52; CD56; CD62L; CD68; CD80; CD95; CD117; CD127; CD133; CD137 (4-1 BB); CD163; F4/80; IL-4Ra; Sca-1; CTLA-4; GITR; GARP; LAP; granzima B; LFA-1; receptor de transferrina; NKp46, per- forina, CD4+; Th1; Th2; Th17; Th40; Th22; Th9; Tfh, FoxP3+ Treg.
Canônica; Tr1; Th3; Treg17; TREG; CDCP1, NT5E, EpCAM, CEA, gpA33, Mucinas, TAG-72, Anidrase carbônica IX, PSMA, Proteína de ligação ao folato, Gangliosídeos (por exemplo, CD2, CD3, GM2), Le- wis-γ2, VEGF, VEGFR 1/2/3, αVβ3, α5β1, ErbB1/EGFR, ErbB1/HER2, ErB3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANKL, FAP, Te- nascina, PDL-1, BAFF, HDAC, ABL, FLT3, KIT, MET, RET, IL-1β, ALK, RANKL, mTOR, CTLA-4, IL-6, IL-6R, JAK3, BRAF, PTCH, Suavizado, PIGF, ANPEP, TIMP1, PLAUR, PTPRJ, LTBR, ou ANTXR1, Receptor alfa de folato (FRa), ERBB2 (Her2/neu), EphA2, IL-13Ra2, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), Mesotelina, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, MUC16 (CA125), L1CAM, LeY, MSLN, IL13RΑ1, L1- CAM, Tn Ag, antígeno membrana específico da próstata (PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, interleucina-11 receptor a (IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2, Le- wisY, CD24, receptor-beta do fator de crescimento derivado de plaque-
ta (PDGFR-beta), SSEA-4, CD20, MUC1, NCAM, Prostase, PAP, ELF2M, Efrina B2, receptor IGF-1, CAIX, LMP2, gplOO, bcr-abl, tirosi- nase, Fucosil GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetil-GD2, Recep- tor beta de folato, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, Ácido polisiálico, PLACl, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, legumain, HPV E6, E7, ETV6-AML, proteína de esperma 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD- CT-2, antígeno relacionado a Fos 1, p53, mutante de p53, prosteína, survivina, telomerase, PCTA-1/Galectina 8, MelanoA/MART1, mutante de Ras, hTERT, pontos de ruptura de translocação de sarcoma, ML- IAP, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, receptor de andrógeno, Ciclina B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYPIB I, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, transcriptase reversa da telomerase humana, RU1, RU2, carboxil esterase intestinal, hsp70-2 mut, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, um neoantigênio, CD133, CD15, CD184, CD24, CD56, CD26, CD29, CD44, HLA-A, HLA-B, HLA-C, (HLA-A,B,C) CD49f, CD151 CD340, CD200, tkrA, trkB ou trkC.
[0090] Em algumas modalidades, o fusosoma se associa a e/ou se liga a uma célula-alvo ou um recurso de superfície de uma célula-alvo.
[0091] Em algumas modalidades, um método aqui compreende causar a secreção de uma proteína de uma célula-alvo ou apresenta- ção de ligante na superfície de uma célula-alvo. Em algumas modali- dades, o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo são capazes de causar a morte celular da célula-alvo. Em algumas moda- lidades, o fusosoma é de uma célula fonte NK.
[0092] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos detectam e/ou respondem a uma ou mais características do ambiente local, como, por exemplo, metabólito, interleucina, antígeno, etc. ou combinações dos mesmos.
[0093] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são passíveis de quimiota- xia, extravasamento e/ou uma ou mais atividades metabólicas. Nas modalidades, a atividade metabólica é selecionada a partir de quineu- rinina, gliconeogênese, oxidação de ácidos graxos de prostaglandina, metabolismo de adenosina, ciclo de ureia e respiração termogênica. Em algumas modalidades, a célula fonte é um neutrófilo e o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo são capazes de se dirigir a um local de lesão. Em algumas modalidades, a célula fonte é um macrófago e o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo são capazes de fagocitose. Em algumas modalidades, a célula fonte é uma célula de tecido adiposo marrom e o fusosoma e/ou composições ou preparações do mesmo são capazes de lipólise.
[0094] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos compreendem (por exem- plo, são capazes de liberar à célula-alvo) uma pluralidade de agentes (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20 ou 50 agentes), em que pelo menos um agente é ou compreende uma carga útil de proteína de membrana; em algumas de tais modalidades, um ou mais dos agentes é ou compreende um ácido nucleico inibidor (por exemplo, siRNA ou miRNA) e/ou um mRNA.
[0095] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos que compreendem (por exemplo, são capazes de liberar à célula-alvo) um agente de carga de proteína de membrana são capazes de reprogramar ou transdiferenci- ar uma célula-alvo, por exemplo, o fusosoma (e/ou sua composição) compreende um ou mais agentes que induzem a reprogramação ou transdiferenciação de uma célula-alvo.
[0096] Em algumas modalidades, o fusosoma se funde a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que com uma célula não alvo, por exemplo, em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54. Em algumas modalidades, o fusosoma se funde a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que com uma não - célula-alvo em pelo menos 10 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54. Em algumas modalidades, o fusosoma se funde a uma taxa mais elevada com uma célula-alvo do que outros fusosomas, por exemplo, em pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54. Em algumas modalidades, o fusosoma se funde a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que outros fusosomas por pelo menos 50 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54. Em algumas modalidades, o fusosoma se funde com as células-alvo a uma taxa tal que um agente no fusosoma é liberado a pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, das células-alvo após 24, 48 ou 72 horas, por exemplo, em um en- saio do Exemplo 54. Em algumas modalidades, o fusosoma se funde com células-alvo a uma taxa tal que um agente no fusosoma é libera- do a pelo menos 10 % das células-alvo após 24 horas, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54.
[0097] Em algumas modalidades, o fusogênio está presente, por fusosoma, em um número de cópias de pelo menos, ou não mais que, 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000,
100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000,
50.000.000, 100.000.000, 500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 29. Em al- gumas modalidades, o fusogênio está presente em um número de có- pias de pelo menos 1.000 cópias, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 29. Em algumas modalidades, pelo menos 10
%, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % do fusogênio compreendido pelo fusosoma está dis- posto na membrana celular. Nas modalidades, o fusosoma também compreende fusogênio internamente, por exemplo, no citoplasma ou em uma organela.
[0098] Em algumas modalidades, o fusosoma compreende um agente terapêutico (por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana terapêutica) em um número de cópias por fusosoma de pelo menos, ou não mais que, 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000,
10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000,
5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000, 500.000.000 ou
1.000.000.000 de cópias, por exemplo, conforme medido por um en- saio do Exemplo 43. Em algumas modalidades, o fusosoma compre- ende um agente terapêutico de proteína em um número de cópias de pelo menos 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 20.000,
50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000,
50.000.000, 100.000.000, 500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias, por exemplo, medido por um ensaio do Exemplo 43. Em algumas mo- dalidades, o fusosoma compreende um agente terapêutico de ácido nucleico em um número de cópias de pelo menos 10, 50, 100, 500,
1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000,
500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000,
500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias. Em algumas modalidades, o fusosoma compreende um agente terapêutico de DNA em um número de cópias de pelo menos 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000,
10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000,
5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000, 500.000.000 ou
1.000.000.000 de cópias. Em algumas modalidades, o fusosoma com- preende um agente terapêutico de RNA em um número de cópias de pelo menos 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 20.000,
50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000,
50.000.000, 100.000.000, 500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias. Em algumas modalidades, o fusosoma compreende um agente tera- pêutico que é exógeno em relação à célula fonte em um número de cópias de pelo menos 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000,
20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000,
10.000.000, 50.000.000, 100.000.000, 500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias. Em algumas modalidades, o fusosoma compreende um agente terapêutico de proteína que é exógeno em relação à célula fon- te em um número de cópias de pelo menos 10, 50, 100, 500, 1.000,
2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000,
1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000,
500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias. Em algumas modalidades, o fusosoma compreende um agente terapêutico de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA) que é exógeno em relação à célula fonte em um número de cópias de pelo menos 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000,
5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000,
5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000, 500.000.000 ou
1.000.000.000 de cópias. Em algumas modalidades, a relação do nú- mero de cópias do fusogênio para o número de cópias do agente tera- pêutico está entre 1.000.000:1 e 100.000:1, 100.000:1 e 10.000:1,
10.000:1 e 1.000:1, 1.000:1 e 100:1, 100:1 e 50:1, 50:1 e 20:1, 20:1 e 10:1, 10:1 e 5:1, 5:1 e 2:1, 2:1 e 1 : 1, 1:1 e 1:2, 1:2 e 1:5, 1:5 e 1:10, 1:10 e 1:20, 1:20 e 1:50, 1:50 e 1:100, 1:100 e 1:1.000, 1:1.000 e 1:10.000, 1:10.000 e 1:100.000, ou 1:100.000 e 1:1.000.000. Em al- gumas modalidades, a relação do número de cópias do fusogênio para o número de cópias do agente de carga útil da proteína de membrana está entre 1.000.000:1 e 100.000:1, 100.000:1 e 10.000:1, 10.000:1 e
1.000:1, 1.000:1 e 100:1, 100:1 e 50:1, 50:1 e 20:1, 20:1 e 10:1, 10:1 e 5:1, 5:1 e 2:1, 2:1 e 1:1, 1:1 e 1:2, 1:2 e 1:5, 1:5 e 1:10, 1:10 e 1:20,
1:20 e 1:50, 1:50 e 1 : 100, 1:100 e 1:1.000, 1:1.000 e 1:10.000, 1:10.000 e 1:100.000, ou 1:100.000 e 1:1.000.000.
[0099] Em algumas modalidades, o fusosoma liberação a uma cé- lula-alvo pelo menos 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000,
20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000,
10.000.000, 50.000.000, 100.000.000, 500.000.000, ou 1.000.000.000 cópias de um agente terapêutico (por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana terapêutica). Em algumas modalidades, o fusosoma liberação a uma célula-alvo pelo menos 10, 50, 100, 500,
1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000,
500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000,
500.000.000, ou 1.000.000.000 de cópias de um agente terapêutico de proteína. Em algumas modalidades, o fusosoma liberação a uma célu- la-alvo pelo menos 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000,
20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000,
10.000.000, 50.000.000, 100.000.000, 500.000.000, ou 1.000.000.000 de cópias de um agente terapêutico de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o fusosoma liberação a uma célula-alvo pelo menos 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000,
200.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000,
100.000.000, 500.000.000, ou 1.000.000.000 de cópias de um agente terapêutico de RNA. Em algumas modalidades, o fusosoma liberação a uma célula-alvo pelo menos 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000,
10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000,
5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000, 500.000.000, ou
1.000.000.000 de cópias de um agente terapêutico de DNA.
[00100] Em algumas modalidades, o fusosoma liberação a uma cé- lula-alvo pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de um agente de carga útil de proteína de membrana (por exemplo, um agente terapêutico, por exemplo, um agente terapêutico que é endógeno ou exógeno em rela- ção à célula fonte) compreendido pelo fusosoma. Em algumas modali- dades, os fusosomas que se fundem com a (s) célula (s) alvo liberam à célula-alvo uma média de pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % do agente de carga de proteína de membrana (por exemplo, um agente de carga de proteína de membrana terapêutica, por exemplo, uma agente de carga útil de proteína de membrana terapêutica endógena ou um agente de carga útil de proteína de membrana terapêutica que é exógeno em relação à célula fonte) composto pelos fusosomas que se fundem com a (s) célula (s) alvo. Em algumas modalidades, a com- posição de fusosoma liberação a um tecido alvo pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % do agente de carga útil de proteína de membrana (por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana, por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana terapêuti- ca que é exógeno em relação à célula fonte) compreendido pela com- posição de fusosoma.
[00101] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos compreendem 0,00000001 mg de fusogênio a 1 mg de fusogênio por mg de proteína total em fu- sosoma, por exemplo, 0,00000001 - 0,0000001, 0,0000001 - 0,000001, 0,000001 - 0,00001, 0,00001 - 0,0001, 0,0001 - 0,001, 0,001 - 0,01, 0,01 - 0,1 ou 0,1 - 1 mg de fusogênio por mg de proteína total em fusosoma. Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos compreendem 0,00000001 mg de fusogênio a 5 mg de fusogênio por mg de lipídeo em fusosoma, por exemplo, 0,00000001 - 0,0000001, 0,0000001 - 0,000001, 0,000001 - 0,00001, 0,00001 - 0,0001, 0,0001 - 0,001, 0,001 - 0,01, 0,01 - 0,1, 0,1 - 1 ou 1-5 mg de fusogênio por mg de lipídeo em fusosoma.
[00102] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por uma composição lipídica substancialmente semelhante à da célula fon- te ou em que um ou mais dentre CL, Cer, DAG, HexCer, LPA, LPC, LPE, LPG, LPI, LPS, PA, PC, PE, PG, PI, PS, CE, SM e TAG está dentro de 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % ou 50 %, por exemplo, dentro de 75 %, do nível de lipídeo correspondente na célula fonte.
[00103] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por uma relação de cardiolipina : ceramida que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : ceramida no célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : diacilglicerol que está den- tro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : diacilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : he- xosilceramida que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : hexosilceramida na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : lisofosfatidato que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : lisofosfatidato na célu- la fonte; ou por uma relação de cardiolipina : liso-fosfatidilcolina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardio- lipina : liso-fosfatidilcolina na célula fonte; ou por uma relação de car- diolipina : liso-fosfatidiletanolamina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : liso-fosfatidiletanolamina na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : liso- fosfatidilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : liso-fosfatidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : liso-fosfatidilinositol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : liso-
fosfatidilinositol na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : liso-fosfatidilserina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : liso-fosfatidilserina na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : fosfatidato que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : fosfatidato na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : fosfatidilcolina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardio- lipina : fosfatidilcolina na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipi- na : fosfatidiletanolamina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : fosfatidiletanolamina na célula fon- te; ou por uma relação de cardiolipina : fosfatidilglicerol que está den- tro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : fosfatidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : fosfatidilinositol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : fosfatidilinositol na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : fosfatidilserina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : fosfatidilserina na cé- lula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : éster de colesterol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardio- lipina : éster de colesterol na célula fonte; ou por uma relação de car- diolipina : esfingomielina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : esfingomielina na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : triacilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : triacilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : ceramida que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfati- dilcolina : ceramida na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilco- lina : diacilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : hexosilceramida na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : hexosilceramida que está dentro de 10
%, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : hexosilce- ramida na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : lisofos- fatidato que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da rela- ção de fosfatidilcolina : lisofosfatidato na célula fonte; ou por uma rela- ção de fosfatidilcolina : liso-fosfatidilcolina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : liso- fosfatidilcolina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : liso-fosfatidiletanolamina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : liso-fosfatidiletanolamina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : liso- fosfatidilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : liso-fosfatidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : liso-fosfatidilinositol que está den- tro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : liso-fosfatidilinositol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilco- lina : liso-fosfatidilserina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : liso-fosfatidilserina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : fosfatidato que está den- tro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de cardiolipina : fosfatidato na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : fos- fatidiletanolamina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : fosfatidiletanolamina na célula fonte; ou por uma relação de cardiolipina : fosfatidilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : fosfa- tidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : fos- fatidilinositol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : fosfatidilinositol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : fosfatidilserina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : fosfatidilserina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : éster de coles-
terol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : éster de colesterol na célula fonte; ou por uma rela- ção de fosfatidilcolina : esfingomielina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilcolina : esfingomielina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilcolina : triacilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfati- dilcolina : triacilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidi- letanolamina : ceramida que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolamina : ceramida na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidiletanolamina : diacilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidileta- nolamina : diacilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de fosfati- diletanolamina : hexosilceramida que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolamina : hexosilceramida na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidiletanolamina : lisofosfa- tidato que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolamina : lisofosfatidato na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidiletanolamina : liso-fosfatidilcolina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolami- na : liso-fosfatidilcolina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidi- letanolamina : liso-fosfatidiletanolamina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolamina : liso- fosfatidiletanolamina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidile- tanolamina : liso-fosfatidilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolamina : liso-fosfatidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidiletanolamina : liso- fosfatidilinositol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolamina : liso-fosfatidilinositol na célula fon- te; ou por uma relação de fosfatidiletanolamina : liso-fosfatidilserina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolamina : liso-fosfatidilserina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidiletanolamina : fosfatidato que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolamina : fosfa- tidato na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidiletanolamina : fosfatidilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolamina : fosfatidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidiletanolamina : fosfatidilinositol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidileta- nolamina : fosfatidilinositol na célula fonte; ou por uma relação de fos- fatidiletanolamina : fosfatidilserina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolamina : fosfatidilserina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidiletanolamina : éster de colesterol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da re- lação de fosfatidiletanolamina : éster de colesterol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidiletanolamina : esfingomielina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidileta- nolamina : esfingomielina na célula fonte; ou por uma relação de fosfa- tidiletanolamina : triacilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidiletanolamina : triacilglicerol na cé- lula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : ceramida que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilse- rina : ceramida na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : diacilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilserina : diacilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : hexosilceramida que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilserina : hexosilce- ramida na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : lisofos- fatidato que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da rela- ção de fosfatidilserina : lisofosfatidato na célula fonte; ou por uma rela- ção de fosfatidilserina : liso-fosfatidilcolina que está dentro de 10 %, 20
%, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilserina : liso- fosfatidilcolina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : liso-fosfatidiletanolamina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilserina : liso-fosfatidiletanolamina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : liso- fosfatidilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilserina : liso-fosfatidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : liso-fosfatidilinositol que está den- tro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilserina : liso-fosfatidilinositol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilse- rina : liso-fosfatidilserina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilserina : liso-fosfatidilserina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : fosfatidato que está den- tro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilserina : fosfatidato na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : fos- fatidilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilserina : fosfatidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : fosfatidilinositol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilserina : fosfatidilino- sitol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : éster de colesterol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da re- lação de fosfatidilserina : éster de colesterol na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : esfingomielina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de fosfatidilserina : esfingo- mielina na célula fonte; ou por uma relação de fosfatidilserina : triacil- glicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da rela- ção de fosfatidilserina : triacilglicerol na célula fonte; ou por uma rela- ção de esfingomielina : ceramida que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomielina : ceramida na célula fonte; ou por uma relação de esfingomielina : diacilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomie- lina : diacilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de esfingomieli- na : hexosilceramida que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomielina : hexosilceramida na célula fonte; ou por uma relação de esfingomielina : lisofosfatidato que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomielina : li- sofosfatidato na célula fonte; ou por uma relação de esfingomielina : liso-fosfatidilcolina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomielina : liso-fosfatidilcolina na célula fonte; ou por uma relação de esfingomielina : liso-fosfatidiletanolamina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomie- lina : liso-fosfatidiletanolamina na célula fonte; ou por uma relação de esfingomielina : liso-fosfatidilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomielina : liso-fosfatidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de esfingomielina : liso- fosfatidilinositol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomielina : liso-fosfatidilinositol na célula fonte; ou por uma relação de esfingomielina : liso-fosfatidilserina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomielina : li- so-fosfatidilserina na célula fonte; ou por uma relação de esfingomieli- na : fosfatidato que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomielina : fosfatidato na célula fonte; ou por uma re- lação de esfingomielina glicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomielina : fosfatidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de esfingomielina : fosfatidilinositol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomie- lina : fosfatidilinositol na célula fonte; ou por uma relação de esfingo- mielina : éster de colesterol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomielina : éster de colesterol na célula fonte; ou por uma relação de esfingomielina : triacilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de esfingomie- lina : triacilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de éster de co- lesterol : ceramida que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : ceramida na célula fonte; ou por uma relação de éster de colesterol : diacilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : diacilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de éster de colesterol : hexosilceramida que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : hexosilceramida na célula fonte; ou por uma relação de éster de colesterol : lisofosfatidato que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : lisofosfatidato na célula fonte; ou por uma relação de éster de coleste- rol : liso-fosfatidilcolina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : liso-fosfatidilcolina na célula fonte; ou por uma relação de éster de colesterol : liso- fosfatidiletanolamina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : liso-fosfatidiletanolamina na célu- la fonte; ou por uma relação de éster de colesterol : liso- fosfatidilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : liso-fosfatidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de éster de colesterol : liso-fosfatidilinositol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : liso-fosfatidilinositol na célula fonte; ou por uma relação de éster de colesterol : liso-fosfatidilserina que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : liso- fosfatidilserina na célula fonte; ou por uma relação de éster de coleste- rol : fosfatidato que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : fosfatidato na célula fonte; ou por uma relação de éster de colesterol : fosfatidilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : fosfa-
tidilglicerol na célula fonte; ou por uma relação de éster de colesterol : fosfatidilinositol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : fosfatidilinositol na célula fonte; ou por uma relação de éster de colesterol : triacilglicerol que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação de éster de colesterol : triacilglicerol na célula fonte.
[00104] Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por uma composição proteômica semelhante à da célula fonte, por exem- plo, usando um ensaio do Exemplo 42. Em algumas modalidades, fu- sosomas fornecidos e/ou composições ou preparações destes, são caracterizados pela relação de lipídeos para proteínas que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação correspondente na cé- lula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 49. Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos, e/ou composições ou preparações dos mesmos, são caracterizados por uma relação de proteínas para ácidos nucleicos (por exemplo, DNA ou RNA) que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % do relação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usan- do um ensaio do Exemplo 50. Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos, e/ou composições ou preparações dos mesmos, são ca- racterizados por uma relação de proteínas para DNA que é maior do que a relação correspondente no célula fonte, por exemplo, pelo me- nos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % maior, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 50. Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por uma relação de lipí- deos para ácidos nucleicos (por exemplo, DNA) que está dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % da relação correspondente na célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo
51. Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composi- ções ou preparações dos mesmos são caracterizados por uma relação de lipídeos para ácidos nucleicos (por exemplo, DNA) que é maior do que a relação correspondente na célula fonte, por exemplo, pelo me- nos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % maior, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 51.
[00105] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por uma meia-vida em um indivíduo, por exemplo, em um camundongo, que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % da meia-vida de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 75. Em algumas modalidades, são fornecidos fusosomas e/ou composições ou Portanto, são caracterizados por uma meia-vida em um indivíduo, por exemplo, em um camundongo, que é de pelo menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 12 horas ou 24 horas, por exemplo, em um indivíduo humano ou em um camun- dongo, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 75. Em algumas mo- dalidades, fusosomas fornecidos, e/ou composições ou preparações dos mesmos, são capazes de liberar (por exemplo, liberação) um agente de carga útil de proteína de membrana (por exemplo, um agen- te terapêutico) que é caracterizado por uma meia-vida em um indiví- duo que é maior do que a meia-vida do fusosoma, por exemplo, por pelo menos 10 %, 20 %, 50 %, 2 vezes, 5 vezes ou 10- dobra. Por exemplo, o fusosoma pode liberar o agente terapêutico à célula-alvo e o agente pode estar presente após o fusosoma não estar mais presen- te ou detectável.
[00106] Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos transportam glicose (por exemplo, glicose marcada, por exemplo, 2-NBDG) através de uma membrana, por exemplo, em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % a mais do que um controle negativo, por exemplo, um fusosoma de outra forma semelhante na ausência de glicose, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 64. Em algumas modalidades, fusoso- mas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados pela atividade da esterase no lúmen que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % da atividade da esterase em uma célula de refe- rência, por exemplo, a célula fonte ou um fibroblasto embrionário de camundongo, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 66. Em al- gumas modalidades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou pre- parações dos mesmos são caracterizados por um nível de atividade metabólica (por exemplo, atividade de citrato sintase) que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % do nível de atividade metabólica em uma cé- lula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, como descrito no Exemplo 68. Em algumas modalidades, os fusosomas for- necidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracteri- zados por um nível de atividade metabólica (por exemplo, atividade de citrato sintase) que é pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % do nível de atividade metabólica em uma célula de referência, por exemplo, a cé- lula fonte, por exemplo, como descrito no Exemplo 68. Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por um nível de respiração (por exemplo, taxa de consumo de oxigênio) que está dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % do nível de respiração em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, como descrito no Exemplo 69.
Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por um nível de respi- ração (por exemplo, taxa de consumo de oxigênio) que é pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % do nível de respiração em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, conforme descrito no Exem- plo 69. Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos e/ou compo- sições ou preparações dos mesmos são caracterizados por um nível de manchamento com Anexina-V de no máximo 18.000, 17.000,
16.000, 15.000, 14.000, 13.000, 12.000, 11.000 ou 10.000 MFI, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compreende um nível de manchamento com Anexina-V de pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % mais baixo do que o nível de manchamento com Anexina-V de fusosomas semelhantes, ou uma composição ou preparação dos mesmos, tratada com menadiona no ensaio do Exemplo 70, ou em que o fusosoma compreende um nível de manchamento com Anexina-V pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % menor do que o de Anexina- Nível de manchamento V de um macrófago tra- tado com menadiona no ensaio do Exemplo 70.
[00107] Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por um nível de teor de miRNA de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou maior do que aquele da célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 39. Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos, são caracterizados por um nível de teor de miRNA de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do nível de teor de miRNA da célula fonte (por exemplo, até 100 % do nível de teor de miRNA da célula fonte), por exemplo, por um ensaio do Exemplo 39. Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos, são caracterizados por um nível de teor de RNA total de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do nível de teor de RNA total da célu- la fonte (por exemplo, até 100 % do nível de teor de RNA total da célu- la fonte), por exemplo, como medido por um ensaio do Exemplo 108. Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por uma relação de proteína solúvel: não solúvel dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou maior do que aquela da célula fonte, por exemplo, dentro de 1 % - 2 %, 2 % - 3 %, 3 % - 4 %, 4 % - 5 %, 5 % - 10 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, 50 % - 60 %, 60 % - 70 %, 70 % - 80 % ou 80 % - 90 % daquele da célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo
47. Em algumas modalidades, o fusosoma tem uma relação de proteí- na solúvel: não solúvel dentro de 90 % daquela da célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 47. Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos, e/ou composições ou preparações das mes- mas, são caracterizadas por um nível de LPS inferior a 5 %, 1 %, 0,5 %, 0,01 %, 0,005 %, 0,0001 %, 0,00001 % ou menos do teor de lipí- deos de fusosomas, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 48. Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de transdução de sinal, por exemplo, transmitir um sinal extracelular, por exemplo, fosforilação de AKT em resposta à captação de insulina ou glicose (por exemplo, glicose marcada, por exemplo, 2-NBDG) em resposta à insu- lina, por exemplo, em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 6 0 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % a mais do que um controle negativo, por exemplo, um fusosoma de outra forma se-
melhante na ausência de insulina, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 63. Em algumas modalidades, o fusosoma direciona-se a um tecido, por exemplo, fígado, pulmões, coração, baço, pâncreas, trato gastrointestinal, rim, testículos, ovários, cérebro, órgãos reprodutores, sistema nervoso central, sistema nervoso periférico, músculo esquelé- tico, endotélio, ouvido interno ou olho, quando administrado a um indi- víduo, por exemplo, um camundongo, por exemplo, em que pelo me- nos 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % dos fusosomas em uma população de fusosomas administrados estão pre- sentes no tecido alvo após 24, 48 ou 72 horas, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 87 ou 100. Em algumas modalidades, os fusoso- mas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por um nível de sinalização de justácrina de pelo me- nos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % maior que o nível de sinalização de justácrina induzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula estromal da medula óssea (BMSC), por exemplo, por um ensaio do Exemplo 71. Em algumas modalidades, fusosomas forneci- dos e/ou composições ou preparações dos mesmos, são caracteriza- dos por um nível de sinalização de justácrina de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % (por exemplo, até 100 %) do nível de sinalização de justácrina induzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula estromal da medula óssea (BMSC), por exemplo, por um ensaio do Exemplo 71. Em algumas modalidades, fornecidos fusoso- mas, e/ou composições ou preparações dos mesmos, são caracteriza- dos por um nível de sinalização de parácrina de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % maior do que o nível de sinalização de parácrina induzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um ma- crófago, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 72. Em algumas mo- dalidades, fornecidos fusosomas e/ou composições ou preparações dos mesmos, um re caracterizado por um nível de sinalização de pa- rácrina de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % (por exemplo, até 100 %) do nível de sinalização de parácrina induzida por uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou um macrófago, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 72. Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou suas preparações, são caracterizadas por polimerizar a actina a um nível dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % em comparação com o nível de actina polimerizada em uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula C2C12, por exemplo, pelo en- saio do Exemplo 73. Em algumas modalidades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações destes, são caracterizadas por um potencial de membrana dentro de cerca de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % do potencial de membrana de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula C2C12, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 74, ou em que fusosomas fornecidos, e/ou composições ou preparações dos mesmos, são caracterizados por um potencial de membrana de cerca de -20 a -150 mV, -20 a -50 mV, -50 a -100 mV ou -100 a -150 mV, ou em que o fusosoma tem um potencial de membra- na inferior a - 1mv, -5mv, -10 mv, -20 mv, -30 mv, -40 mv, -50 mv, -60 mv, -70 mv, -80 mv, -90 mv, -100 mv.
Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de extravasamento dos vasos sanguíneos, por exemplo, a uma taxa de pelo menos 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % da taxa de extravasamento da célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 57, por exemplo, em que a célula fonte é um neutrófilo, linfócito, célula B, macrófago, ou célula NK.
Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de quimiota- xia, por exemplo, de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % (por exemplo, até 100 %) em comparação com uma célula de referência, por exemplo, um macrófago, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 58. Em algu- mas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou pre- parações dos mesmos são capazes de fagocitose, por exemplo, pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % (por exemplo, até 100 %) em comparação com uma célula de referência, por exemplo, um macrófago, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 60. Em algumas modalidades, fusoso- mas fornecidos, e/ou composições ou preparações dos mesmos, são capazes de atravessar uma membrana celular, por exemplo, uma membrana celular endotelial ou a barreira hematoencefálica.
Em al- gumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são capazes de secretar uma proteína, por exemplo, a uma taxa de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % maior do que uma célula de referência, por exemplo, um fibroblasto embrionário de camundongo, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 62. Em algumas modalidades, desde que os fusosomas e/ou composições ou preparações dos mesmos sejam capazes de secretar uma proteína, por exemplo, a uma taxa de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % (por exemplo, até 100 %) em comparação com uma célula de referência, por exem- plo, um fibroblasto embrionário de camundongo, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 62.
[00108] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos não são capazes de trans- crição ou têm atividade transcricional inferior a 1 %, 2,5 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % da atividade de transcrição de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 19. Em algumas modali- dades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações des- tes, não são capazes de replicação de DNA nuclear ou tem replicação de DNA nuclear de menos de 1 %, 2,5 % 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % da replicação de DNA nuclear de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 20. Em algumas modalidades, fusoso- mas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos, falta de cromatina ou têm um teor de cromatina de menos de 1 %, 2,5 % 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % do teor de cromatina de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 37
[00109] Em algumas modalidades, uma característica de um fuso- soma fornecido e/ou de uma composição ou preparações do mesmo é descrita em comparação com uma célula de referência. Nas modalida- des, a célula de referência é a célula fonte. Nas modalidades, a célula de referência é uma célula HeLa, HEK293, HFF-1, MRC-5, WI-38, IMR 90, IMR 91, PER.C6, HT-1080 ou BJ. Em algumas modalidades, uma característica de uma população de fusosomas e/ou de uma composi- ção ou preparação dos mesmos é descrita por comparação com uma população de células de referência, por exemplo, uma população de células fonte ou uma população de células HeLa, HEK293, HFF-1, MRC-5, WI-38, IMR 90, IMR 91, PER.C6, HT-1080 ou BJ.
[00110] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos atendem a um padrão de práticas farmacêuticas ou de boas práticas de fabricação (GMP). Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos foram feitos de acordo com as boas práticas de fabricação (GMP). Em algumas modalidades, os fusosomas forne- cidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracteriza- dos por um nível de patógeno abaixo de um valor de referência prede- terminado, por exemplo, são substancialmente livres de patógenos. Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos, e/ou composi- ções ou preparações dos mesmos, têm um nível de contaminante (por exemplo, componente nuclear, como DNA nuclear) abaixo de um valor de referência predeterminado, por exemplo, estão substancialmente livres de um ou mais contaminantes especificados. Em algumas moda- lidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por baixa imunogenicidade, por exemplo, conforme aqui descrito.
[00111] Em algumas modalidades, a célula fonte ou célula-alvo é uma célula endotelial, um fibroblasto, uma célula sanguínea (por exemplo, um macrófago, um neutrófilo, um granulócito, um leucócito), uma célula-tronco (por exemplo, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco do cordão umbilical, célula-tronco da medula óssea, célu- la-tronco hematopoética, célula-tronco pluripotente induzida, por exemplo, célula-tronco pluripotente induzida derivada de células de um indivíduo), célula-tronco embrionária (por exemplo, célula-tronco do saco vitelino embrionário, placenta, cordão umbilical, pele fetal, pele de adolescente, sangue, medula óssea, tecido adiposo, tecido eritro- poiético, tecido hematopoético), um mioblasto, uma célula parenqui- matosa (por exemplo, hepatócito), uma célula alveolar, um neurônio (por exemplo, uma célula neuronal retinal) uma célula precursora (por exemplo, uma célula precursora da retina, um mieloblasto, células pre- cursoras mieloides, um timócito, um meiócito, um megacarioblasto, um promegacarioblasto, um melanoblasto, um linfoblasto, uma célula pre- cursora da medula óssea, um normoblasto ou um angioblasto), uma célula progenitora (por exemplo, uma célula progenitora cardíaca, uma célula satélite, uma célula gial radial, uma célula estromal da medula óssea, uma célula progenitora pancreática, uma célula progenitora en- dotelial, uma célula blástica) ou uma célula imortalizada (por exemplo, célula HeLa, HEK293, HFF-1, MRC-5, WI-38, IMR 90, IMR 91, PER.C6, HT-1080 ou BJ). Em algumas modalidades, a célula fonte é diferente de uma célula 293, célula HEK, célula endotelial humana ou uma célula epitelial humana, monócito, macrófago, célula dendrítica ou célula-tronco. Em algumas modalidades, a célula fonte ou célula-alvo é um glóbulo branco ou uma célula-tronco. Em algumas modalidades, a célula fonte ou célula-alvo é selecionada a partir de um neutrófilo, um linfócito (por exemplo, uma célula T, uma célula B, uma célula exter- minadora natural), um macrófago, um granulócito, uma célula-tronco mesenquimal, um célula-tronco da medula óssea, uma célula-tronco pluripotente induzida, uma célula-tronco embrionária ou um mieloblas- to.
[00112] Em algumas modalidades, a célula fonte é uma célula culti- vada sob condições aderentes ou de suspensão. Em algumas modali- dades, a célula fonte é uma célula primária, uma célula cultivada, uma célula imortalizada ou uma linhagem celular (por exemplo, linhagem celular mieloblástica, por exemplo, C2C12). Em algumas modalidades, a célula fonte é alogênica, por exemplo, obtida de um organismo dife- rente da mesma espécie que a célula-alvo. Em algumas modalidades, a célula fonte é autóloga, por exemplo, obtida do mesmo organismo que a célula-alvo. Em algumas modalidades, a célula fonte é heterólo- ga, por exemplo, obtida de um organismo de uma espécie diferente da célula-alvo.
[00113] Em algumas modalidades, a célula fonte compreende ainda um segundo agente que é exógeno à célula fonte, por exemplo, um agente terapêutico, por exemplo, uma proteína ou um ácido nucleico (por exemplo, um RNA, por exemplo, um mRNA ou miRNA). Em al- gumas modalidades, o segundo agente está presente pelo menos, ou não mais que, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000,
20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000 ou 1.000.000 de cópias compreendidas pelo fusosoma, ou está presente em um nível médio de pelo menos, ou não mais que, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1.000,
2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000 ou
1.000.000 de cópias por fusosoma.
[00114] Em algumas modalidades, o fusosoma tem um nível altera- do, por exemplo, aumentado ou diminuído de uma ou mais moléculas endógenas em comparação com a célula fonte, por exemplo, proteína ou ácido nucleico, por exemplo, devido ao tratamento da célula fonte, por exemplo, fonte de mamífero célula com um siRNA ou enzima de edição de gene. Em algumas modalidades, o fusosoma compreende pelo menos, ou não mais do que, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1.000,
2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000 ou
1.000.000 de cópias da molécula endógena ou está presente em um nível médio de pelo menos, ou não mais do que, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000,
500.000 ou 1.000.000 de cópias da molécula endógena por fusosoma. Em algumas modalidades, a molécula endógena (por exemplo, um RNA ou proteína) está presente no fusosoma a uma concentração de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 103, 5,0 x 103, 104, 5,0 x 104, 105, 5,0 x 105, 106, 5,0 x 106, 1,0 x 107, 5,0 x 107 ou 1,0 x 108 mai- or do que sua concentração na célula fonte. Em algumas modalidades, a molécula endógena (por exemplo, um RNA ou proteína) está presen- te no fusosoma a uma concentração de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 103, 5,0 x 103, 104, 5,0 x 104, 105, 5,0 x 105, 106, 5,0 x 106, 1,0 x 107, 5,0 x 107 ou 1,0 x 108 a menos do que sua concentra- ção na célula fonte.
[00115] Em algumas modalidades, um fusosoma compreende um agente de carga útil de proteína de membrana terapêutica, por exem- plo, um agente de carga útil de proteína de membrana terapêutica, por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana terapêuti- ca que é exógeno ou endógeno em relação à célula fonte. Em algu- mas modalidades, o agente de carga útil de proteína de membrana terapêutica é escolhido de um ou mais dentre uma proteína, por exemplo, uma proteína transmembrana, uma proteína da superfície celular, uma proteína secretada, um receptor, um anticorpo; um ácido nucleico, por exemplo, DNA, um cromossoma (por exemplo, um cro- mossoma artificial humano), RNA ou mRNA.
[00116] Em algumas modalidades, a célula-alvo está em um orga- nismo. Em algumas modalidades, a célula-alvo é uma célula primária isolada de um organismo. Em algumas modalidades, o domínio de di- recionamento interage com uma porção da célula-alvo na célula-alvo, por exemplo, uma característica da superfície celular. Em algumas modalidades, o fusosoma não compreende a referida porção de célu- la-alvo. Em algumas modalidades, o fusosoma compreende um fuso- gênio que interage com um parceiro de ligação do fusogênio na célula- alvo, permitindo desse modo que o fusosoma se ligue ou se funda à célula-alvo. Em algumas modalidades, o fusosoma não compreende o referido parceiro de ligação ao fusogênio. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento não faz parte do fusogênio. Em algumas modalidades, o fusogênio compreende o domínio de direcionamento. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação ao fusogênio é ou é uma porção de uma entidade diferente da fração da célula-alvo. Em algumas modalidades, o parceiro de ligação ao fusogênio é ou é uma porção da fração da célula-alvo.
[00117] Em algumas modalidades, um fusosoma entra na célula- alvo por endocitose, por exemplo, em que o nível de agente (por exemplo, agente de carga de proteína de membrana e/ou segundo agente) liberado por meio de uma via endocítica é 0,01-0,6, 0,01-0,1, 0,1-0,3, ou 0,3-0,6, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 8 0 %, 90 % ou mais do que uma célula de referência tratada com cloroquina em contato com fusoso- mas semelhantes, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 91. Em algumas modalidades, pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % dos fusosomas em uma composição ou preparação de fusosomas que entram em uma célula-alvo entram por uma via não endocítica, por exemplo, os fuso- somas entram a célula-alvo por fusão com a superfície da célula.
Em algumas modalidades, pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % dos fusosomas em uma composição ou preparação de fusosoma que entra em uma célu- la-alvo entra no citoplasma (por exemplo, não entra em um endosso- ma ou lisossoma). Em algumas modalidades, menos de 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % ou 1 % de fusosomas em uma composição ou preparação de fusosoma que entra em uma célula-alvo entra em um endossoma ou lisossoma.
Em algumas modalidades, o fusosoma entra na célula-alvo por uma via não endocítica, por exemplo, em que o nível de agente (por exemplo, agente de carga de proteína de membrana e/ou segundo agente) ad- ministrado é de pelo menos 90 %, 95 %, 98 %, ou 99 % de uma célula de referência tratada com cloroquina, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 91. Em algumas modalidades, um fusosoma liberação um agente (por exemplo, agente de carga útil de proteína de membrana e/ou segundo agente) a uma célula-alvo por meio de uma via mediada por dinamina.
Em algumas modalidades, o nível de agente (por exem-
plo, agente de carga útil de proteína de membrana e/ou segundo agente) liberado por meio de uma via mediada por dinamina está na faixa de 0,01-0,6, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que células- alvo tratadas com Dynasore em contato com fusosomas semelhantes, por exemplo, conforme medido em um ensaio de Exemplo 92. Em al- gumas modalidades, um fusosoma distribui um agente (por exemplo, agente de carga útil de proteína de membrana e/ou segundo agente) a uma célula-alvo por meio de macropinocitose. Em algumas modalida- des, o nível de agente (por exemplo, agente de carga útil de proteína de membrana e/ou segundo agente) liberado via macropinocitose está na faixa de 0,01-0,6, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que as cé- lulas-alvo tratadas com EIPA em contato com fusosomas semelhantes, por exemplo, conforme medido em um ensaio do Exemplo 92. Em al- gumas modalidades, um fusosoma distribui um agente (por exemplo, agente de carga útil de proteína de membrana e/ou segundo agente) a uma célula-alvo por meio de uma via mediada por actina. Em algumas modalidades, um nível de agente (por exemplo, agente de carga útil de proteína de membrana e/ou segundo agente) liberado por meio de uma via mediada por actina estará na faixa de 0,01-0,6, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que células-alvo tratadas com Latrunculina B em contato com fusosomas semelhantes, por exemplo, conforme me- dido em um ensaio do Exemplo 92.
[00118] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos têm densidade de <1, 1- 1,1, 1,05-1,15, 1,1-1,2, 1,15-1,25, 1,2-1,3, 1,25-1,35 ou> 1,35 g/mL, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 33.
[00119] Em algumas modalidades, são fornecidos fusosomas e/ou composições ou preparações dos mesmos, com menos de 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 4 %, 5 %, ou 10 % de células fonte por massa de proteína ou menos de 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 4 %, 5 % ou 10 % das célu- las têm um núcleo funcional. Em algumas modalidades, pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % dos fusosomas na composição ou preparação de fusosomas compre- endem uma organela, por exemplo, uma mitocôndria.
[00120] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos compreendem pelo menos 0,01 % - 0,05 %, 0,05 % - 0,1 %, 0,1 % - 0,5 %, 0,5 % - 1 %, 1 % - 2 %, 2 % - 3 %, 3 % - 4 %, 4 % - 5 %, 5 % - 10 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, 50 % - 60 %, 60 % - 70 %, 70 % - 80 % ou 80 % - 90 % de fusosomas em que: i) o fusogênio está presente em um número de cópias de pelo menos 1.000 cópias por fusosoma, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 29, ii) a re- lação do número de cópias do fusogênio para o número de cópias do agente de carga útil de proteína de membrana por fusosoma está en- tre 1.000.000:1 e 100.000:1, 100.000:1 e 10.000:1, 10.000:1 e 1.000:1,
1.000:1 e 100:1, 100:1 e 50:1, 50:1 e 20:1, 20:1 e 10:1, 10:1 e 5:1, 5:1 e 2:1, 2:1 e 1:1, 1:1 e 1:2, 1:2 e 1:5, 1:5 e 1:10, 1:10 e 1:20, 1:20 e 1:50, 1:50 e 1:100, 1:100 e 1:1.000, 1:1.000 e 1:10.000, 1:10.000 e 1:100.000, ou 1:100.000 e 1:1.000.000, ou iii) o agente de carga útil da proteína de membrana está presente em uma cópia número de pelo menos 1.000 cópias por fusosoma, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 43.
[00121] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos compreendem um agente terapêutico que é exógeno em relação à célula fonte. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é exógeno em relação à célula-
alvo. Em algumas modalidades, o agente terapêutico exógeno é esco- lhido de uma ou mais de uma proteína, por exemplo, uma proteína transmembrana, uma proteína da superfície celular, uma proteína se- cretada, um receptor, um anticorpo; um ácido nucleico, por exemplo, DNA, um cromossoma (por exemplo, um cromossoma artificial huma- no), RNA, mRNA, siRNA, miRNA ou uma molécula pequena.
[00122] Nas modalidades, um fusosoma fornecido entra na célula por endocitose ou uma via não endocítica.
[00123] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos não compreendem um nú- cleo. Em algumas modalidades, o fusosoma é substancialmente livre de DNA nuclear.
[00124] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são refrigerados ou conge- lados. Nas modalidades, os fusosomas fornecidos não compreendem um núcleo funcional e/ou as composições ou preparações de fusoso- mas fornecidos compreendem um ou mais fusosomas sem um núcleo funcional. Em algumas modalidades, são fornecidas composições ou preparações de fusosoma que não contêm 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 4 %, 5 % ou 10 % de células-fonte por massa de proteína ou menos de 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 4 %, 5 % ou 10 % das células têm um núcleo funcional. Nas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composi- ções ou preparações dos mesmos foram mantidos à referida tempera- tura por pelo menos 1, 2, 3, 6 ou 12 horas; 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias; 1, 2, 3 ou 4 semanas; 1, 2, 3 ou 6 meses; ou 1, 2, 3, 4 ou 5 anos. Nas mo- dalidades, fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por uma atividade de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % da atividade da população antes manutenção na referida temperatura, por exemplo, por um ou mais dentre: i) fundir a uma taxa mais elevada com uma célula-alvo do que com uma célula não alvo, por exemplo, em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; ii) fundir a uma taxa mais elevada com uma célula-alvo do que com outros fusosomas, por exemplo, por pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; iii) fundir com células-alvo a uma taxa tal que um agente no fusosoma é liberado a pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % das células-alvo após 24, 48 ou 72 horas, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; ou iv) nível de fusogênio em um número de cópias de pelo menos, ou não mais que, 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000,
10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000 ou 1.000.000 de cópias, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 29.
[00125] Nas modalidades, uma composição ou preparação de fuso- soma fornecida é estável a uma temperatura inferior a 4 C por pelo menos 1, 2, 3, 6 ou 12 horas; 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias; 1, 2, 3 ou 4 sema- nas; 1, 2, 3 ou 6 meses; ou 1, 2, 3, 4 ou 5 anos. Nas modalidades, a composição ou preparação de fusosoma é estável a uma temperatura inferior a -20 °C por pelo menos 1, 2, 3, 6 ou 12 horas; 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias; 1, 2, 3 ou 4 semanas; 1, 2, 3 ou 6 meses; ou 1, 2, 3, 4 ou 5 anos. Nas modalidades, a composição ou preparação de fusosoma é estável a uma temperatura inferior a -80 °C por pelo menos 1, 2, 3, 6 ou 12 horas; 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias; 1, 2, 3 ou 4 semanas; 1, 2, 3 ou 6 meses; ou 1, 2, 3, 4 ou 5 anos.
[00126] Nas modalidades, um ou mais dos seguintes são verdadei- ros para fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos: i) a célula fonte é diferente de uma célula 293; ii) a célula fonte não é transformada ou imortalizada; iii) a célula fonte é transformada ou imortalizada usando um método diferente de imortalização mediada por adenovírus, por exem- plo, imortalizada por mutação espontânea ou expressão de telomera- se; iv) o fusogênio é diferente de VSVG, uma proteína SNARE ou uma proteína granular secretora; v) o agente terapêutico é diferente de Cre ou GFP, por exemplo, EGFP; vi) o agente terapêutico é um ácido nucleico (por exemplo, RNA, por exemplo, mRNA, miRNA ou siRNA) ou uma proteína exóge- na à célula fonte (por exemplo, um anticorpo, por exemplo, um anti- corpo), por exemplo, no lúmen; ou vii) o fusosoma não compreende mitocôndrias.
[00127] Alternativamente ou adicionalmente, nas modalidades, um ou mais dos seguintes são verdadeiros para fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos: i) a célula fonte é diferente de uma célula 293 ou HEK; ii) a célula fonte não é transformada ou imortalizada; iii) a célula fonte é transformada ou imortalizada usando um método diferente de imortalização mediada por adenovírus, por exem- plo, imortalizada por mutação espontânea ou expressão de telomera- se; iv) o fusogênio não é um fusogênio viral; v) o fusosoma tem um diâmetro diferente de entre 40 e 150 nm, por exemplo, maior que 150 nm, 200 nm, 300 n, 400 nm ou 500 nm; ou vi) o fusosoma tem um diâmetro de pelo menos cerca de 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm ou 200 nm, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 32.
[00128] Alternativamente ou adicionalmente, nas modalidades, um ou mais dos seguintes são verdadeiros para fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos: i) a proteína de membrana é expressa pela célula fonte; ii) o fusogênio é diferente de TAT, TAT-HA2, HA-2, gp41, peptídeo beta-amiloide de Alzheimer, uma proteína do vírus Sendai ou peptídeo net-negativo anfipático (WAE 11); iii) o fusogênio é um fusogênio mamífero; iv) o fusosoma compreende em seu lúmen um polipeptídeo selecionado de uma enzima, anticorpo ou polipeptídeo antiviral; v) o fusosoma não compreende uma proteína transmem- brana terapêutica, por exemplo, uma proteína transmembrana terapêu- tica que é exógena em relação à célula fonte; ou vi) o fusosoma não compreende CD63 ou GLUT4.
[00129] Alternativamente ou adicionalmente, nas modalidades, um ou mais dos seguintes são verdadeiros para fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos: i) o fusogênio é diferente de uma proteína viral; ii) o fusogênio é diferente de uma glicoproteína fusogênica; iii) o fusogênio é uma proteína de mamífero diferente da fertilina-beta; iv) o fusogênio é diferente de VSVG, uma proteína SNARE ou uma proteína granular secretora; ou v) o fusogênio é diferente de TAT, TAT-HA2, HA-2, gp41, peptídeo beta-amiloide de Alzheimer, uma proteína do vírus Sendai ou peptídeo net-negativo anfipático (WAE 11).
[00130] Alternativamente ou adicionalmente, nas modalidades, um ou mais dos seguintes são verdadeiros para fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos: i) não contém um vírus, não é infeccioso ou não se propaga em uma célula hospedeira; ii) não é uma VLP (partícula semelhante a vírus); iii) não compreende uma proteína estrutural viral, por exemplo, uma proteína de capsídeo viral, por exemplo, uma proteína de nucleocapsídeo viral, ou em que a quantidade de proteína de cap- sídeo viral é inferior a 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 % ou 0,1 % da proteína total, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 53; iv) não compreende uma proteína de matriz viral; v) não compreende uma proteína não estrutural viral; vi) compreende menos de 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000,
5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000, 1.000.000,
5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000, 500.000.000,
1.000.000.000 cópias por vesícula de uma proteína estrutural viral; ou vii) o fusosoma não é um virossoma.
[00131] Alternativamente ou adicionalmente, nas modalidades, a relação entre o número de cópias do fusogênio e o número de cópias da proteína estrutural viral no fusosoma é de pelo menos 1.000.000:1,
100.000:1, 10.000:1, 1.000:1, 100:1, 50:1 1, 20:1, 10:1, 5:1 ou 1:1. Nas modalidades, a relação do número de cópias do fusogênio para o nú- mero de cópias da proteína de matriz viral no fusosoma é de pelo me- nos 1.000.000:1, 100.000:1, 10.000:1, 1.000:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1 ou 1:1.
[00132] Alternativamente ou adicionalmente, nas modalidades, um ou mais dos seguintes são verdadeiros para fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos: i) o fusosoma não compreende uma gotícula imiscível em água;
ii) o fusosoma compreende um lúmen aquoso e um exterior hidrofílico; iii) o fusogênio é uma proteína fusogênica.
[00133] Alternativamente ou adicionalmente, nas modalidades, um ou mais dos seguintes são verdadeiros para fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos: i) o fusogênio é um fusogênio de mamífero ou um fusogênio viral; ii) o fusosoma não foi feito carregando o fusosoma com uma substância terapêutica ou diagnóstica; iii) a célula fonte não estava carregada com uma substância terapêutica ou diagnóstica; iv) o fusosoma não compreende doxorrubicina, dexameta- sona, ciclodextrina; polietilenoglicol, um micro RNA, por exemplo, miR125, receptor VEGF, ICAM-1, E-selectina, óxido de ferro, uma pro- teína fluorescente, por exemplo, GFP ou RFP, uma nanopartícula ou um RNase, ou não compreende uma forma exógena de qualquer um dos o anterior que é exógeno à célula fonte; ou v) o fusosoma compreende ainda um agente terapêutico que é exógeno à célula fonte, tendo uma ou mais modificações pós- translação, por exemplo, glicosilação.
[00134] Alternativamente ou adicionalmente, nas modalidades, o fusosoma é unilamelar ou multilamelar.
[00135] Alternativamente ou adicionalmente, nas modalidades, fu- sosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos são caracterizados por um diâmetro dentro de cerca de 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % da célula fonte, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 30. Nas modalidades, o diâmetro isto é menos que cerca de 0,01 %, 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3
%, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % daquele da célula fonte, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 30. Nas modalidades, o diâmetro dentro de cerca de 0,01 % - 0,05 %, 0,05 % - 0,1 %, 0,1 % - 0,5 %, 0,5 % - 1 %, 1 % - 2 %, 2 % - 3 %, 3 % - 4 %, 4 % - 5 %, 5 % - 10 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, 50 % - 60 %, 60 % - 70 %, 70 % - 80 % ou 80 % - 90 % do diâmetro da célula fonte, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 30. Nas modalidades, o fusosoma tem um diâmetro que é inferior a cerca de 0,01 % - 0,05 %, 0,05 % - 0,1 %, 0,1 % - 0,5 %, 0,5 % - 1 %, 1 % - 2 %, 2 % - 3 %, 3 % - 4 %, 4 % - 5 %, 5 % - 10 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, 50 % - 60 %, 60 % - 70 %, 70 % - 80 % ou 80 % - 90 % do diâmetro da célula fonte, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 30. Nas modalidades, o diâmetro está em pelo menos cerca de 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm ou 250 nm, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 32. Nas modalidades, o diâmetro é de cerca de 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm ou 250 nm (por exemplo, ± 20 %), por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 32. Nas modalidades, o diâmetro é pelo menos cerca de 500 nm, 750 nm, 1.000 nm, 1.500 nm,
2.000 nm, 2.500 nm, 3.000 nm, 5.000 nm, 10.000 nm ou 20.000 nm, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 32. Nas modalidades, o diâmetro é cerca de 500 nm, 750 nm, 1.000 nm, 1.500 nm, 2.000 nm, 2.500 nm, 3.000 nm, 5.000 nm, 10.000 nm ou 20.000 nm (por exemplo, ± 20 %), por exemplo, conforme medido por um en- saio do Exemplo 32. Nas modalidades, o diâmetro é maior que 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 10 μm, 20 μm, 50 μm, 100 μm, 150 μm ou 200 μm.
[00136] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos têm um volume que é infe-
rior a cerca de 0,01 % - 0,05 %, 0,05 % - 0,1 %, 0,1 % - 0,5 %, 0,5 % - 1 %, 1 % - 2 %, 2 % - 3 %, 3 % - 4 %, 4 % - 5 %, 5 % - 10 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, 50 % - 60 %, 60 % - 70 %, 70 % - 80 % ou 80 % - 90 % do volume da célula fonte.
[00137] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos têm uma densidade dife- rente de 1,08 g/mL e 1,12 g/mL. Em algumas modalidades, a densida- de é de 1,25 g/mL +/- 0,05, por exemplo, conforme medido por um en- saio do Exemplo 33. Em algumas modalidades, a densidade é <1, 1- 1,1, 1,05-1,15, 1,1-1,2, 1,15 -1,25, 1,2-1,3, 1,25-1,35 ou> 1,35 g/mL, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 33.
[00138] Nas modalidades, um ou mais dos seguintes são verdadei- ros para fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos: i) o fusosoma não é um exossoma; ii) o fusosoma é uma microvesícula; iii) o fusosoma compreende um fusogênio não mamífero; iv) o fusosoma foi modificado para compreender ou incorpo- rar um fusogênio; v) o fusosoma compreende um fusogênio que é exógeno em relação à célula fonte ou um fusogênio superexpresso; vi) o fusosoma tem um diâmetro de pelo menos 80 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 1200 nm, 1400 nm ou 1500 nm, ou uma população ou pluralidade de fusosomas tem um diâmetro médio de pelo menos 80 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 1200 nm, 1400 nm ou 1500 nm; vii) o fusosoma compreende uma ou mais organelas, por exemplo, uma mitocôndria, aparelho de Golgi, lisossoma, retículo en- doplasmático, vacúolo, endossoma, acrossoma, autofagossoma, cen- tríolo, glicossoma, glioxissoma, hidrogenossoma, melanossoma, mi-
tossoma, cnidocisto, peroxissoma, proteassoma e grânulo de estresse; viii) o fusosoma compreende um citoesqueleto ou um com- ponente do mesmo, por exemplo, actina, Arp2/3, formina, coronina, distrofina, queratina, miosina ou tubulina; ix) uma preparação compreendendo uma pluralidade de fusosomas não tem uma densidade de flotação de 1,08-1,22 g/mL, ou tem uma densidade de pelo menos 1,18-1,25 g/mL, ou 1,05-1,12 g/mL, por exemplo, em um gradiente de sacarose ensaio de centrifugação, por exemplo, conforme descrito em Théry et al., "Isolation and charac- terization of exosomes from cell culture supernadants and biological fluids." Curr Protoc Cell Biol.
Abril de 2006; Capítulo 3: Unidade 3.22; x) a bicamada lipídica é enriquecida em ceramidas ou es- fingomielinas ou uma combinação das mesmas em comparação com a célula fonte, ou a bicamada lipídica não é enriquecida (por exemplo, está depletada) em glicolipídeos, ácidos graxos livres ou fosfatidilseri- na, ou uma combinação dos mesmos, em comparação com a célula fonte; xi) o fusosoma compreende Fosfatidilserina (PS) ou ligante de CD40 ou ambos de PS e ligante de CD40, por exemplo, quando medido em um ensaio do Exemplo 52; xii) o fusosoma é enriquecido para PS em comparação com a célula fonte, por exemplo, em uma população de fusosomas pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % são positi- vos para PS por um ensaio de Kanada M, et al. (2015) Differential fa- tes of biomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles.
Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433 – E1442; xiii) o fusosoma é substancialmente livre de acetilcolineste- rase (AChE) ou contém menos que 0,001, 0,002, 0,005, 0,01,0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, ou 1000 unidades de atividade de AChE/μg de proteína, por exemplo, por um ensaio do
Exemplo 67; xiv) o fusosoma é substancialmente livre de uma proteína da família da Tetraspanina (por exemplo, CD63, CD9 ou CD81), uma proteína relacionada a ESCRT (por exemplo, TSG101, CHMP4A-B ou VPS4B), Alix, TSG101, MHCI, MHCII, GP96, actinina-4, mitofilina, sin- tenina-1, TSG101, ADAM10, EHD4, sintenina-1, TSG101, EHD1, floti- lina-1, proteínas de choque térmico de 70 kDa (HSC70/HSP73, HSP70/HSP72), ou qualquer combinação destes, ou contém menos de 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 5 % ou 10 % de qual- quer proteína marcadora exossômica individual e/ou menos de 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % ou 25 % do total de proteínas marcadoras exossômicas de qualquer uma das refe- ridas proteínas, ou é enriquecido com qualquer uma ou mais dessas proteínas em comparação com a célula fonte, ou não é enriquecido para qualquer uma ou mais dessas proteínas, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 44; xv) o fusosoma compreende um nível de Gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase (GAPDH) que está abaixo de 500, 250, 100, 50, 20, 10, 5 ou 1 ng GAPDH/μg de proteína total ou abaixo do nível de GAPDH na célula fonte, por exemplo, menos de 1 %, 2,5 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, menos do que o nível de GAPDH por proteína total em ng/μg na célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 45; xvi) o fusosoma é enriquecido com uma ou mais proteínas do retículo endoplasmático (por exemplo, calnexina), uma ou mais pro- teínas de proteassoma, ou uma ou mais proteínas mitocondriais, ou qualquer combinação das mesmas, por exemplo, em que a quantidade de calnexina é inferior a 500, 250, 100, 50, 20, 10, 5 ou 1 ng de Calne- xina/μg de proteína total, ou em que o fusosoma compreende menos Calnexina por proteína total em ng/μg em comparação com a célula fonte em 1 %, 2,5 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 46; xvii) o fusosoma compreende um agente (por exemplo, pro- teína, mRNA ou siRNA) que é exógeno em relação à célula fonte, por exemplo, conforme medido usando um ensaio do Exemplo 39 ou 40; ou xviii) o fusosoma pode ser imobilizado em uma superfície de mica por microscopia de força atômica por pelo menos 30 min, por exemplo, por um ensaio de Kanada M, et al. (2015) Differential fates of biomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles. Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433 – E1442.
[00139] Nas modalidades, um ou mais dos seguintes: i) o fusosoma é um exossoma; ii) o fusosoma não é uma microvesícula; iii) o fusosoma tem um diâmetro inferior a 80 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 1200 nm, 1400 nm ou 1500 nm, ou uma população de fusosomas tem um diâmetro médio de pelo menos 80 nm, 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 1200 nm, 1400 nm ou 1500 nm; iv) o fusosoma não compreende uma organela; v) o fusosoma não compreende um citoesqueleto ou um componente do mesmo, por exemplo, actina, Arp2/3, formina, coroni- na, distrofina, queratina, miosina ou tubulina; vi) uma preparação compreendendo uma pluralidade de fusosomas tem uma densidade de flotação de 1,08-1,22 g/mL, por exemplo, em um ensaio de centrifugação de gradiente de sacarose, por exemplo, como descrito em Théry et al., "Isolation and characteri- zation of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids." Curr Protoc Cell Biol. Abril de 2006; Capítulo 3: Unidade 3.22; vii) a bicamada lipídica não é enriquecida (por exemplo, es-
tá depletada) para ceramidas ou esfingomielinas ou uma combinação das mesmas em comparação com a célula fonte, ou a bicamada lipídi- ca é enriquecida para glicolipídeos, ácidos graxos livres ou fosfatidilse- rina, ou uma combinação dos mesmos, em comparação com a célula fonte; viii) o fusosoma não compreende, ou está depletado em relação à célula fonte, Fosfatidilserina (PS) ou ligante CD40 ou ambos de PS e ligante CD40, por exemplo, quando medido em um ensaio do Exemplo 52; ix) o fusosoma não é enriquecido (por exemplo, está deple- tado) para PS em comparação com a célula fonte, por exemplo, em uma população de fusosomas inferior a 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % são positivos para PS por um ensaio de Ka- nada M, et al. (2015) Differential fates of biomolecules delivered to tar- get cells via extracellular vesicles.
Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433 – E1442; x) o fusosoma compreende acetilcolinesterase (AChE), por exemplo, pelo menos 0,001, 0,002, 0,005, 0,01,0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 ou 1000 unidades de atividade de AChE/μg de proteína, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 67; xi) o fusosoma compreende uma proteína da família da Te- traspanina (por exemplo, CD63, CD9 ou CD81), uma proteína relacio- nada a ESCRT (por exemplo, TSG101, CHMP4A-B ou VPS4B), Alix, TSG101, MHCI, MHCII, GP96, actinina-4, mitofilina, sintenina-1, TSG101, ADAM10, EHD4, sintenina-1, TSG101, EHD1, flotilina-1, pro- teínas de choque térmico de 70 kDa (HSC70/HSP73, HSP70/HSP72), ou qualquer combinação das mesmas, por exemplo, contém mais de 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 5 % ou 10 % de qual- quer proteína marcadora exossômica individual e/ou menos de 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 % ou 25 % do total de proteínas marcadoras exossômicas de qualquer uma das refe- ridas proteínas, ou é enriquecido com qualquer uma ou mais dessas proteínas em comparação com a célula fonte, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 44; xii) o fusosoma compreende um nível de Gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase (GAPDH) que está acima de 500, 250, 100, 50, 20, 10, 5 ou 1 ng GAPDH/μg de proteína total ou abaixo do nível de GAPDH na célula fonte, por exemplo, pelo menos 1 %, 2,5 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, maior que o nível de GAPDH por proteína total em ng/μg na célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 45; xiii) o fusosoma não é enriquecido (por exemplo, está de- pletado por) uma ou mais proteínas do retículo endoplasmático (por exemplo, calnexina), uma ou mais proteínas proteassoma, ou uma ou mais proteínas mitocondriais, ou qualquer combinação das mesmas, por exemplo, em que a quantidade de calnexina é inferior a 500, 250, 100, 50, 20, 10, 5 ou 1 ng Calnexina/μg de proteína total, ou em que o fusosoma compreende menos Calnexina por proteína total em ng/μg em comparação com a célula fonte em 1 %, 2,5 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 46; ou xiv) o fusosoma não pode ser imobilizado em uma superfí- cie de mica por microscopia de força atômica por pelo menos 30 min, por exemplo, por um ensaio de Kanada M, et al. (2015) Differential fa- tes of biomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles. Proc Natl Acad Sci USA 112:E1433 – E1442.
[00140] Nas modalidades, um ou mais dos seguintes: i) o fusosoma não compreende um VLP; ii) o fusosoma não contém um vírus; iii) o fusosoma não compreende um vírus competente para replicação; iv) o fusosoma não compreende uma proteína viral, por exemplo, proteína estrutural viral, por exemplo, uma proteína de cap- sídeo ou uma proteína de matriz viral; v) o fusosoma não compreende uma proteína do capsídeo de um vírus envelopado; vi) o fusosoma não compreende uma proteína do nucleoca- psídeo; ou vii) o fusogênio não é um fusogênio viral.
[00141] Nas modalidades, o fusosoma compreende citosol.
[00142] Nas modalidades, o fusosoma compreende ou é composto por um citobiológico.
[00143] Nas modalidades, o fusosoma compreende ou é composto por uma célula enucleada.
[00144] Nas modalidades, o fusosoma é ou compreende um con- drissoma.
[00145] Nas modalidades, um ou mais dos seguintes: i) o fusosoma ou a célula fonte não forma um teratoma quando implantado no indivíduo, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 102; ii) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mes- mo são capazes de quimiotaxia, por exemplo, a uma velocidade de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % em comparação com uma célula de referência, por exemplo, um macrófago, por exemplo, usando um en- saio do Exemplo 58; iii) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mes- mo, são capazes de se alojar, por exemplo, no sítio de uma lesão, em que o citobiológico é de uma célula humana, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 59, por exemplo, em que a célula fonte é um neu-
trófilo; ou iv) o fusosoma e/ou composições ou preparações do mes- mo, são capazes de fagocitose, por exemplo, em que a fagocitose pelo fusosoma é detectável dentro de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas usando um ensaio do Exemplo 60, por exemplo, em que a célula fonte é um macrófago.
[00146] Nas modalidades, o fusosoma ou composição de fusosoma retém um, dois, três, quatro, cinco, seis ou mais de qualquer uma das características por 5 dias ou menos, por exemplo, 4 dias ou menos, 3 dias ou menos, 2 dias ou menos, 1 dia ou menos, por exemplo, cerca de 12-72 horas, após a administração a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano.
[00147] Nas modalidades, o fusosoma tem uma ou mais das se- guintes características: a) compreende uma ou mais proteínas endógenas de uma célula fonte, por exemplo, proteínas de membrana ou proteínas citosó- licas; b) compreende pelo menos 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 ou 5000 proteínas diferentes; c) compreende pelo menos 1, 2, 5, 10, 20, 50 ou 100 glico- proteínas diferentes; d) pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % em massa das proteínas no fusosoma são proteínas de ocorrência natural; e) compreende pelo menos 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 ou 5000 RNAs diferentes; ou f) compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 10 ou 20 lipídeos dife- rentes, por exemplo, selecionados a partir de CL, Cer, DAG, HexCer, LPA, LPC, LPE, LPG, LPI, LPS, PA, PC, PE, PG, PI, PS, CE, SM e TAG.
[00148] Nas modalidades, o fusosoma foi manipulado para ter ou o fusosoma não é uma célula de ocorrência natural e tem, ou em que o núcleo não tem naturalmente uma, duas, três, quatro, cinco ou mais das seguintes propriedades: a) a inativação nuclear parcial resulta em uma redução de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na função nuclear, por exemplo, uma redução na transcrição ou replicação de DNA, ou ambos, por exemplo, em que a transcrição é medida por um ensaio do Exemplo 19 e a replicação do DNA é medida por um ensaio do Exem- plo 20; b) o fusosoma não é capaz de transcrição ou tem atividade transcricional inferior a 1 %, 2,5 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de o da atividade transcricional de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 19; c) o fusosoma não é capaz de replicação de DNA nuclear ou tem replicação de DNA nuclear inferior a 1 %, 2,5 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % da replicação do DNA nuclear de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 20; d) o fusosoma não tem cromatina ou tem um teor de croma- tina inferior a 1 %, 2,5 % 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % do teor de cromatina de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte, por exemplo, usando um ensaio do Exem- plo 37; e) o fusosoma não tem uma membrana nuclear ou tem me- nos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % ou 1 % da quantidade de membrana nuclear de uma célula de referência, por exemplo, a célula fonte ou uma célula de Jurkat, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 36;
f) o fusosoma não tem complexos de poros nucleares fun- cionais ou tem atividade de importação ou exportação nuclear reduzi- da, por exemplo, em pelo menos 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % ou 1 % por um ensaio do Exemplo 36, ou o fusosoma carece de uma ou mais de uma proteína de poro nuclear, por exemplo, NUP98 ou Importina 7. g) o fusosoma não compreende histonas ou tem níveis de histonas inferiores a 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % do nível de histona da célula fon- te (por exemplo, de H1, H2a, H2b, H3 ou H4), por exemplo, por um ensaio do Exemplo 37; h) o fusosoma compreende menos de 20, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 cromossoma; i) a função nuclear é eliminada; j) o fusosoma é uma célula de mamífero enucleada; k) o núcleo é removido ou inativado, por exemplo, extrusa- do por força mecânica, por radiação ou por ablação química; ou l) o fusosoma é de uma célula de mamífero com DNA que é completamente ou parcialmente removido, por exemplo, durante a in- terfase ou mitose.
[00149] Nas modalidades, o fusosoma compreende mtDNA ou DNA vetor. Nas modalidades, o fusosoma não compreende DNA, ou é substancialmente livre de DNA. Em algumas modalidades, o fusosoma não compreende um núcleo funcional. Em algumas modalidades, o fusosoma não compreende um núcleo. Em algumas modalidades, o fusosoma é substancialmente livre de DNA nuclear.
[00150] Nas modalidades, o fusosoma está substancialmente livre de uma ou mais das seguintes organelas: uma mitocôndria, aparelho de Golgi, lisossoma, retículo endoplasmático, vacúolo, endossoma, acrossoma, autofagossoma, centríolo, glicossoma, glioxissoma, hidro-
genossoma, melanossoma, mitossoma, cnidocisto, peroxissoma, pro- teassoma, vesícula e grânulos de estresse. Nas modalidades, o fuso- soma tem um número menor de uma organela em comparação com a célula fonte, onde a organela é selecionada a partir de: uma mitocôn- dria, aparelho de Golgi, lisossoma, retículo endoplasmático, vacúolo, endossoma, acrossoma, autofagossoma, centríolo, glicossoma, glioxissoma, hidrogenossoma, melanossoma, mitossoma, cnidocisto, peroxissoma, proteassoma, vesícula e grânulo de estresse.
[00151] Nas modalidades, a célula fonte é uma célula primária, cé- lula imortalizada ou uma linhagem celular (por exemplo, linhagem celu- lar mieloblástica, por exemplo, C2C12). Nas modalidades, o fusosoma é de uma célula fonte com um genoma modificado, por exemplo, tendo imunogenicidade reduzida (por exemplo, por edição do genoma, por exemplo, para remover uma proteína MHC, por exemplo, complexo MHC). Nas modalidades, a célula fonte é de uma cultura de células tratada com um agente imunossupressor. Nas modalidades, a célula fonte é substancialmente não imunogênica, por exemplo, usando um ensaio aqui descrito. Nas modalidades, a célula fonte compreende um agente exógeno, por exemplo, um agente terapêutico. Nas modalida- des, a célula fonte é uma célula recombinante.
[00152] Em algumas modalidades, a célula fonte é de uma cultura de células tratada com um sinal anti-inflamatório. Em algumas modali- dades, um método de preparação aqui descrito compreende ainda o contato da célula fonte com um sinal anti-inflamatório, por exemplo, antes ou depois de inativar o núcleo, por exemplo, enuclear a célula.
[00153] Nas modalidades, o fusosoma compreende ainda um agen- te que é exógeno em relação à célula fonte, por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana terapêutica, por exemplo, uma proteína ou um ácido nucleico (por exemplo, um DNA, um cromosso- ma (por exemplo, um cromossoma artificial humano), um RNA, por exemplo, um mRNA ou miRNA). Nas modalidades, o agente exógeno está presente pelo menos, ou não mais que, 10, 20, 50, 100, 200, 500,
1.000, 2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000,
500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000,
500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias. Nas modalidades, o fuso- soma tem um nível alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído de uma ou mais moléculas endógenas, por exemplo, proteína ou ácido nucleico (por exemplo, em algumas modalidades, endógeno em rela- ção à célula fonte, e em algumas modalidades, endógeno em relação à célula-alvo), por exemplo, devido ao tratamento da célula fonte, por exemplo, célula fonte de mamífero com um siRNA ou enzima de edi- ção de gene. Nas modalidades, a molécula endógena está presente pelo menos, ou não mais do que, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1.000,
2.000, 5.000, 10.000, 20.000, 50.000, 100.000, 200.000, 500.000,
1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000, 100.000.000,
500.000.000 ou 1.000.000.000 de cópias. Nas modalidades, a molécu- la endógena (por exemplo, um RNA ou proteína) está presente em uma concentração de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 103, 5,0 x 103, 104, 5,0 x 104, 105, 5,0 x 105, 106, 5,0 x 106, 1,0 x 107, 5,0 x 107 ou 1,0 x 108, maior do que sua concentração na célula fonte. Nas modalidades, a molécula endógena (por exemplo, um RNA ou proteína) está presente em uma concentração de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 103, 5,0 x 103, 104, 5,0 x 104, 105, 5,0 x 105, 106, 5,0 x 106, 1,0 x 107, 5,0 x 107 ou 1,0 x 108 menos do que sua con- centração na célula fonte.
[00154] Nas modalidades, o fusogênio é um fusogênio viral, por exemplo, HA, HIV-1 ENV, gp120 ou VSV-G. Nas modalidades, o fuso- gênio é um fusogênio de mamífero, por exemplo, um SNARE, uma Sincitina, miomarcador, miomisturador, miofusor ou FGFRL1. Nas mo- dalidades, o fusogênio é ativo a um pH de 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9 ou 9-
10. Nas modalidades, o fusogênio é ativo a um pH de 6-8 . Nas moda- lidades, o fusogênio não é ativo a um pH de 4-5, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9 ou 9-10. Nas modalidades, o fusosoma se funde a uma célula-alvo na su- perfície da célula-alvo. Nas modalidades, o fusogênio promove a fusão de uma maneira independente de lisossoma. Nas modalidades, o fu- sogênio é um fusogênio de proteína. Nas modalidades, o fusogênio é um fusogênio lipídico, por exemplo, ácido oleico, mono-oleato de glice- rol, um glicerídeo, diacilglicerol ou um ácido graxo insaturado modifi- cado. Nas modalidades, o fusogênio é um fusogênio químico, por exemplo, PEG. Nas modalidades, o fusogênio é um fusogênio de mo- lécula pequena, por exemplo, halotano, um NSAID, como meloxicam, piroxicam, tenoxicam e clorpromazina. Nas modalidades, o fusogênio é recombinante. Nas modalidades, o fusogênio é bioquimicamente in- corporado, por exemplo, o fusogênio é fornecido como uma proteína purificada e contatado com uma bicamada lipídica sob condições que permitem a associação do fusogênio com a bicamada lipídica. Nas modalidades, o fusogênio é biossinteticamente incorporado, por exemplo, expresso em uma célula fonte sob condições que permitem que o fusogênio se associe à bicamada lipídica.
[00155] Nas modalidades, o fusosoma se liga a uma célula-alvo. Nas modalidades, a célula-alvo é diferente de uma célula HeLa, ou a célula-alvo não é transformada ou imortalizada. Por exemplo, em al- gumas modalidades, uma célula que não é transformada exibe inibição de contato e/ou seu crescimento é dependente dos mesmos fatores de sobrevivência ou fatores de crescimento que uma célula normal do mesmo tipo. Em algumas modalidades, a célula-alvo é transformada ou imortalizada.
[00156] Em algumas modalidades que envolvem composições ou preparações de fusosomas, a pluralidade de fusosomas é a mesma. Em algumas modalidades, a pluralidade de fusosomas é diferente. Em algumas modalidades, a pluralidade de fusosomas é de um, dois ou mais tipos de células fonte.
Em algumas modalidades, a pluralidade de fusosomas é a mesma se pelo menos 0,01 % - 0,05 %, 0,05 % - 0,1 %, 0,1 % - 0,5 %, 0,5 % - 1 %, 1 % - 2 %, 2 % - 3 %, 3 % - 4 %, 4 % - 5 %, 5 % - 10 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, 50 % - 60 %, 60 % - 70 %, 70 % - 80 % ou 80 % - 90 % dos fusosomas na composição de fusosomas compartilham pelo menos uma proprie- dade selecionada a partir de: compreendem o mesmo fusogênio; pro- duzido usando o mesmo tipo de célula fonte; ou compreende o mesmo agente de carga útil de proteína de membrana.
Em algumas modalida- des, pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % dos fusosomas na pluralidade têm um diâmetro dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % do diâmetro médio dos fusosomas na composição ou preparação de fusosomas.
Em algumas modalidades, pelo menos 50 % dos fusosomas na pluralidade têm um diâmetro dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % do diâmetro médio dos fusosomas na com- posição de fusosomas.
Em algumas modalidades, a pluralidade de fu- sosomas tem um diâmetro médio de pelo menos cerca de 50 nm, cer- ca de 80 nm, cerca de 100 nm, cerca de 200 nm, cerca de 500 nm, cerca de 1000 nm, cerca de 1200 nm, cerca de 1400 nm ou cerca de 1500 nm.
Em algumas modalidades, a pluralidade de fusosomas com- preende fusosomas com um diâmetro dentro da faixa de cerca de 10 nm a cerca de 100 μm.
Em algumas modalidades, a pluralidade com- preende fusosomas com um tamanho dentro da faixa de cerca de 20 nm a cerca de 200 nm, cerca de 50 nm a cerca de 200 nm, cerca de 50 nm a cerca de 100 nm, cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, ou cer- ca de 100 nm a cerca de 150 nm.
Em algumas modalidades, pelo me- nos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % dos fusosomas na pluralidade têm um volume dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % do volume médio dos fusosomas na composição ou preparação de fusosomas.
Em algumas modalidades, pelo menos 50 % dos fusoso- mas na pluralidade têm um volume dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % do volume médio dos fusosomas na composição de fusoso- mas.
Em algumas modalidades, a pluralidade compreende fusosomas com um volume na faixa de cerca de 500 nm3 a cerca de 0,0006 mm3, ou cerca de 4.000 nm3 a cerca de 0,005 μm3, cerca de 65.000 nm3 a cerca de 0,005 μm3, cerca de 65.000 nm3 a cerca de 0,0006 μm3, cer- ca de 65.000 nm3 a cerca de 0,002 μm3, ou cerca de 0,0006 μm3 a cerca de 0,002 μm3. Em algumas modalidades, a composição ou pre- paração de fusosoma tem menos de cerca de 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, variabilidade na distribuição do diâmetro dentro de 10 %, 50 % ou 90 % da variabilidade da popula- ção de células fonte na distribuição do diâmetro, por exemplo, com ba- se no Exemplo 31. Em algumas modalidades, pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % dos fusosomas na pluralidade têm um número de cópias do fusogênio dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % do número médio de cópias fusogê- nicas nos fusosomas na composição ou preparação de fusosomas.
Em algumas modalidades, pelo menos 50 % dos fusosomas na plura- lidade têm um número de cópias do fusogênio dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % do número médio de cópias fusogênicas nos fu- sosomas na composição de fusosomas.
Em algumas modalidades, pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % dos fuso- somas na pluralidade têm um número de cópias do agente terapêutico dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % do número médio de cópias do agente terapêutico nos fusosomas na composição ou preparação de fusosomas.
Em algumas modalidades, pelo menos 50 % dos fusosomas na pluralidade têm um número de cópias da carga útil de proteína de membrana dentro de 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % do número de cópias de carga útil de membrana de proteína média nos fusosomas na composição de fusosomas. Em algumas modalidades, a composição ou preparação de fusosomas compreende pelo menos 105, 106, 107, 108, 109 ou 1010 ou fusosomas. Em algumas modalidades, a composição ou preparação de fusosoma está em um volume de pelo menos 1 μL, 2 μL, 5 μL, 10 μL, 20 μL, 50 μL, 100 μL, 200 μL, 500 μL, 1 mL, 2 mL, 5 mL ou 10 mL.
[00157] Em algumas modalidades, a pluralidade de fusosomas compreende pelo menos 0,01 % - 0,05 %, 0,05 % - 0,1 %, 0,1 % - 0,5 %, 0,5 % - 1 %, 1 % - 2 %, 2 % - 3 %, 3 % - 4 %, 4 % - 5 %, 5 % - 10 %, 10 % - 20 %, 20 % - 30 %, 30 % - 40 %, 40 % - 50 %, 50 % - 60 %, 60 % - 70 %, 70 % - 80 % ou 80 % - 90 % s que têm uma ou mais das seguintes características: (i) não compreendem um núcleo ou um núcleo funcional; (ii) são substancialmente livres de DNA nuclear; ou (iii) não compreendem mitocôndrias ou mitocôndrias funci- onais.
[00158] Nas modalidades, uma composição farmacêutica aqui des- crita tem uma ou mais das seguintes características: a) a composição farmacêutica atende a um padrão farma- cêutico ou de boas práticas de fabricação (GMP); b) a composição farmacêutica foi elaborada de acordo com as boas práticas de fabricação (GMP); c) a composição farmacêutica tem um nível de patógeno abaixo de um valor de referência predeterminado, por exemplo, está substancialmente livre de patógenos; d) a composição farmacêutica tem um nível de contaminan- te (por exemplo, DNA nuclear) abaixo de um valor de referência prede- terminado, por exemplo, está substancialmente livre de contaminantes; ou e) a composição farmacêutica tem baixa imunogenicidade,
por exemplo, como aqui descrito.
[00159] Nas modalidades, a função biológica é selecionada a partir de: a) modular, por exemplo, inibir ou estimular uma enzima; b) modular, por exemplo, aumentar ou diminuir os níveis de uma molécula (por exemplo, uma proteína, ácido nucleico ou metabóli- to, fármaco ou toxina) no indivíduo, por exemplo, por inibir ou estimular a síntese ou por inibir ou estimular a degradação do fator; c) modular, por exemplo, aumentar ou diminuir a viabilidade de uma célula ou tecido alvo; ou d) modulação de um estado de proteína, por exemplo, au- mentar ou diminuir a fosforilação da proteína ou modulando a confor- mação da proteína; e) promover a cura de uma lesão; f) modular, por exemplo, aumentar ou diminuir, uma intera- ção entre duas células; g) modular, por exemplo, promoção ou inibição da diferen- ciação celular; h) alterar a distribuição de um fator (por exemplo, uma pro- teína, ácido nucleico, metabólito, fármaco ou toxina) no indivíduo; i) modular, por exemplo, aumentar ou diminuir, uma respos- ta imune; ou j) modular, por exemplo, aumentar ou diminuir, o recruta- mento de células para um tecido alvo.
[00160] Em algumas modalidades dos métodos terapêuticos aqui, a pluralidade de fusosomas tem um efeito local. Em algumas modalida- des, a pluralidade de fusosomas tem um efeito distal. Em algumas modalidades, a pluralidade de fusosomas tem um efeito sistêmico.
[00161] Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer, um distúrbio inflamatório, doença autoimune, uma doença crônica, infla-
mação, função de órgão danificado, uma doença infecciosa, doença metabólica, distúrbio degenerativo, doença genética (por exemplo, uma deficiência genética ou um distúrbio genético dominante) ou uma lesão. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma doença infecci- osa e o fusosoma compreende um antígeno para a doença infecciosa. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma deficiência genética e o fusosoma compreende uma proteína para a qual o indivíduo é defici- ente ou um ácido nucleico (por exemplo, um DNA, um gDNA, um cDNA, um RNA, um pré-mRNA, um mRNA, etc.) que codifica a proteí- na, ou um DNA que codifica a proteína, ou um cromossoma que codi- fica a proteína, ou um núcleo que compreende um ácido nucleico que codifica a proteína. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um dis- túrbio genético dominante e o fusosoma compreende um inibidor de ácido nucleico (por exemplo, siRNA ou miRNA) do alelo mutante do- minante. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um distúrbio gené- tico dominante e o fusosoma compreende um inibidor de ácido nuclei- co (por exemplo, siRNA ou miRNA) do alelo mutante dominante, e o fusosoma também compreende um mRNA que codifica um alelo não mutado do gene mutado que não é direcionado pelo inibidor de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o indivíduo precisa de vacinação. Em algumas modalidades, o indivíduo precisa de regeneração, por exemplo, de um sítio lesado.
[00162] Em algumas modalidades, o fusosoma compreende um ácido nucleico que compreende ainda uma ou mais sequências que codificam uma ou mais sequências de sinal, por exemplo, em que uma célula-alvo transloca uma proteína compreendendo uma sequência de sinal para a membrana celular da célula-alvo.
[00163] Em algumas modalidades, a composição ou preparação de fusosoma é administrada ao indivíduo pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 ve- zes.
[00164] Em algumas modalidades, a composição ou preparação de fusosoma é administrada ao indivíduo sistemicamente (por exemplo, por via oral, parenteral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra- peritoneal) ou localmente. Em algumas modalidades, a composição ou preparação de fusosoma é administrada ao indivíduo de modo que a composição ou preparação de fusosoma atinja um tecido alvo selecio- nado de fígado, pulmões, coração, baço, pâncreas, trato gastrointesti- nal, rim, testículos, ovários, cérebro, órgãos reprodutores, sistema ner- voso central, sistema nervoso periférico, músculo esquelético, endoté- lio, ouvido interno ou olho. Em algumas modalidades (por exemplo, em que o indivíduo tem uma doença autoimune), a composição ou prepa- ração de fusosoma é coadministrada com um agente imunossupres- sor, por exemplo, um glicocorticoide, citostático, anticorpo ou modula- dor de imunofilina. Em algumas modalidades (por exemplo, em que o indivíduo tem um câncer ou uma doença infecciosa), a composição ou preparação de fusosoma é coadministrada com um agente imunoesti- mulador, por exemplo, um adjuvante, interleucina, citocina ou quimio- cina. Em algumas modalidades, a administração da composição ou preparação de fusosoma resulta em super-regulação ou subregulação de um gene em uma célula-alvo no indivíduo, por exemplo, em que o fusosoma compreende um ativador ou repressor transcricional, um ati- vador ou repressor translacional, ou um ativador epigenético ou re- pressor.
[00165] Em algumas modalidades dos métodos de fabricação aqui, fornecer uma célula fonte que expressa um fusogênio compreende a expressão de um fusogênio exógeno na célula fonte ou a expressão de super-regulação de um fusogênio endógeno na célula fonte. Em algumas modalidades, o método compreende a inativação do núcleo da célula fonte.
[00166] Em algumas modalidades, pelo menos um fusosoma da pluralidade de fusosomas é derivado de uma célula fonte.
[00167] Em algumas modalidades, um fusosoma está a uma tempe- ratura inferior a 4, 0, -4, -10, -12, -16, -20, -80 ou -160 °C.
[00168] Nas modalidades, uma preparação de fusosomas compre- ende pelo menos cerca de 103, 104,105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 ou 1015 fusosomas. Nas modalidades, a preparação de fusosoma compreende um volume de pelo menos 10 mL, 20 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 500 mL, 1 L, 2 L, 5 L, 10 L, 20 L ou 50 L. Nas modalidades, o método compreende a enucleação da célula fonte, por exemplo, uma célula de mamífero, por exemplo, por enucleação quí- mica, uso de força mecânica, por exemplo, uso de um filtro ou centrí- fuga, pelo menos ruptura parcial do citoesqueleto ou uma combinação dos mesmos. Nas modalidades, o método compreende a expressão de um fusogênio ou outra proteína de membrana na célula fonte. Nas modalidades, o método compreende um ou mais dentre: vesiculação, tratamento hipotônico, extrusão ou centrifugação. Nas modalidades, o método compreende expressar geneticamente um agente exógeno na célula fonte ou carregar o agente exógeno na célula fonte ou fusoso- ma. Nas modalidades, o método compreende o contato da célula fonte com o DNA que codifica um agente polipeptídico, por exemplo, antes de inativar o núcleo, por exemplo, enuclear a célula. Nas modalidades, o método compreende o contato da célula fonte com o RNA que codi- fica um agente polipeptídico, por exemplo, antes ou depois de inativar o núcleo, por exemplo, enuclear a célula. Nas modalidades, o método compreende a introdução de um agente terapêutico (por exemplo, um ácido nucleico ou proteína, por exemplo, um agente de carga de prote- ína de membrana) em um fusosoma, por exemplo, por eletroporação.
[00169] Nas modalidades, o fusosoma é de uma célula de mamífero com um genoma modificado, por exemplo, para reduzir a imunogenici- dade (por exemplo, por edição do genoma, por exemplo, para remover uma proteína MHC). Nas modalidades, o método compreende ainda o contato da célula fonte da etapa a) com um agente imunossupressor, por exemplo, antes ou depois de inativar o núcleo, por exemplo, enu- clear a célula.
[00170] Em algumas modalidades, se um nível detectável, por exemplo, um valor acima de um valor de referência, for determinado, uma amostra contendo a pluralidade de fusosomas ou composição ou preparação de fusosomas é descartada.
[00171] Em algumas modalidades, o primeiro fusogênio não é um lipopeptídeo.
[00172] Em algumas modalidades, os fusosomas fornecidos e/ou composições ou preparações dos mesmos têm inativação nuclear par- cial ou completa (por exemplo, remoção nuclear).
[00173] Em algumas modalidades, a célula fonte é uma célula culti- vada em condições aderentes ou de suspensão. Em algumas modali- dades, a célula fonte é uma célula primária, uma célula cultivada, uma célula imortalizada ou uma linhagem celular (por exemplo, linhagem celular mieloblástica, por exemplo, C2C12). Em algumas modalidades, a célula fonte é alogênica, por exemplo, obtida de um organismo dife- rente da mesma espécie que a célula-alvo. Em algumas modalidades, a célula fonte é autóloga, por exemplo, obtida do mesmo organismo que a célula-alvo. Em algumas modalidades, a célula fonte é heterólo- ga, por exemplo, obtida de um organismo de uma espécie diferente da célula-alvo.
[00174] Em algumas modalidades, o fusosoma não é capturado pe- lo sistema eliminador em circulação ou pelas células de Kupffer no seio do fígado. Em algumas modalidades, o fusosoma não é capturado pelo sistema retículo-endotelial (RES) em um indivíduo, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 76. Em algumas modalidades, quando uma pluralidade de fusosomas é administrada a um indivíduo, menos de 1
%, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, da pluralidade não são capturados pelo RES após 24 horas, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 76. Em algumas modalida- des, quando uma pluralidade de fusosomas é administrada a um indi- víduo menos de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, da pluralidade não são capturados pelo RES após 24 horas, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 76.
[00175] Em algumas modalidades, o fusosoma compreende uma proteína estrutural viral e/ou uma proteína de matriz viral.
[00176] Em algumas modalidades, o fusosoma está substancial- mente livre de, ou tem um número menor de uma ou mais das seguin- tes organelas: uma mitocôndria, aparelho de Golgi, lisossoma, retículo endoplasmático, vacúolo, endossoma, acrossoma, autofagossoma, centríolo, glicossoma, glioxissoma, hidrogenossoma, melanossoma alguns, cnidocisto, peroxissoma, proteassoma, vesícula e grânulo de estresse, por exemplo, em comparação com a célula fonte.
[00177] Em algumas modalidades, o fusosoma não compreende Cre ou GFP, por exemplo, EGFP.
[00178] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma ou composição farmacêutica foi mantida a uma temperatura predetermi- nada por pelo menos 1, 2, 3, 6 ou 12 horas; 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dias; 1, 2, 3 ou 4 semanas; 1, 2, 3 ou 6 meses; ou 1, 2, 3, 4 ou 5 anos. Em algu- mas modalidades, a temperatura predeterminada é selecionada de cerca de 4, 0, -4, -10, -12, -16, -20, -80 ou -160 °C.
[00179] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma ou composição farmacêutica tem uma atividade de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % da atividade da pluralidade antes da manutenção na referida temperatura, por exemplo, por um ou mais dentre: i) o fusosoma se funde a uma taxa mais elevada com uma célula-alvo do que com uma célula não alvo, por exemplo, em pelo menos 10 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; ii) o fusosoma se funde a uma taxa mais alta com uma célu- la-alvo do que com outros fusosomas, por exemplo, em pelo menos 50 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; iii) o fusosoma se funde com células-alvo a uma taxa tal que um agente no fusosoma é liberado a pelo menos 10 % das célu- las-alvo após 24 horas, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; ou iv) o fusogênio está presente em um número de cópias de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % do número de cópias fusogênio da pluralidade antes da manutenção na referida temperatura, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exem- plo 29.
[00180] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma ou composição farmacêutica é considerada estável se tiver uma atividade de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % da ativi- dade da pluralidade antes do armazenamento em a referida tempera- tura para o referido período de tempo, por exemplo, por um ou mais dentre: i) o fusosoma se funde a uma taxa mais elevada com uma célula-alvo do que com uma célula não alvo, por exemplo, em pelo menos 10 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; ii) o fusosoma se funde a uma taxa mais alta com uma célu- la-alvo do que com outros fusosomas, por exemplo, em pelo menos 50 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; iii) o fusosoma se funde com células-alvo a uma taxa tal que um agente no fusosoma é liberado a pelo menos 10 % das célu- las-alvo após 24 horas, por exemplo, em um ensaio do Exemplo 54; ou iv) o fusogênio está presente em um número de cópias de pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 99 % do número de cópias fusogênio da pluralidade antes da manutenção na referida temperatura, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exem- plo 29.
[00181] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é selecio- nado de câncer, distúrbio autoimune ou doença infecciosa. Em algu- mas modalidades, o indivíduo tem um câncer. Em algumas modalida- des, o fusosoma compreende um neoantígeno. Em algumas modali- dades, a composição de fusosoma é administrada ao indivíduo pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 vezes. Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é administrada ao indivíduo sistemicamente (por exem- plo, oralmente, parenteralmente, subcutaneamente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente) ou localmente. Em algumas modalidades, em que a composição de fusosoma é administrada ao indivíduo de modo que a composição de fusosoma alcance um tecido alvo selecionado de fígado, pulmões, coração, baço, pâncreas, trato gastrointestinal, rim, testículos, ovários, cérebro, órgãos reprodutores, sistema nervoso central sistema, sistema nervoso periférico, músculo esquelético, endotélio, ouvido interno ou olho. Em algumas modalida- des, a composição de fusosoma é coadministrada com um agente imunossupressor, por exemplo, um glicocorticoide, citostático, anticor- po ou modulador de imunofilina. Em algumas modalidades, a compo- sição de fusosoma é coadministrada com um agente imunoestimula- dor, por exemplo, um adjuvante, interleucina, citocina ou quimiocina.
[00182] Em algumas modalidades, a pluralidade de fusosomas tem um efeito local, distal ou sistêmico.
[00183] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos aqui descritos, compreende ainda uma etapa de monitoramento de um ou mais dentre progressão do câncer, recessão tumoral, volume do tu- mor, diminuição do número de células neoplásicas, quantidade de cé- lulas fundidas, quantidade de células fundidas compreendendo um agente de carga útil de proteína de membrana, quantidade de células fundidas que expressam uma carga útil de proteína de ácido nucleico e quantidade de proteína de membrana disposta na membrana de uma célula fundida.
[00184] Em algumas modalidades, qualquer um dos métodos aqui descritos compreende ainda uma etapa de monitoramento de eventos adversos no organismo. Em algumas modalidades, o evento adverso inclui um ou mais dentre síndrome de liberação de citocinas, febre, ta- quicardia, calafrios, anorexia, náuseas, vômitos, mialgia, dores de ca- beça, síndrome de vazamento capilar, hipotensão, edema pulmonar, coagulopatia, disfunção renal, lesão renal, síndrome de ativação de macrófago, linfo-histiocitose hemofagocítica, falência de órgãos, ede- ma cerebral, inflamação por ativação de células T, sintomas neurológi- cos, encefalopatia, confusão, alucinação, delírio, obtundação, afasia, convulsões, aplasia de células B, síndrome de lise tumoral e doença do enxerto versus hospedeiro.
[00185] Em algumas modalidades, o organismo é um humano. Em algumas modalidades, o humano tem uma doença, distúrbio ou condi- ção. Em algumas modalidades, a presença do agente de carga útil da proteína de membrana na bicamada lipídica da membrana celular da célula-alvo melhora um ou mais sintomas da doença, distúrbio ou con- dição.
[00186] Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e dos desenhos, e das reivindi- cações.
[00187] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comu- mente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e ou- tras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. Por exemplo, todas as sequências GenBank, Unigene e Entrez aqui referidas, por exemplo, em qualquer Tabela aqui, são incorporadas por referência. A menos que especificado de outra forma, os números de acesso de sequência aqui especificados, incluindo em qualquer Tabela aqui, referem-se às entradas do banco de dados atu- ais em 17 de fevereiro de 2018. Quando um gene ou proteína faz refe- rência a uma pluralidade de números de acesso de sequência, todas as variantes de sequência são englobadas. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00188] A seguinte descrição detalhada da invenção será melhor compreendida quando lida em conjunto com os desenhos anexos. Com o propósito de ilustrar a invenção, são mostradas nos desenhos aqui descritos certas modalidades, que são no momento exemplifica- das. Deve ser entendido, no entanto, que a invenção não está limitada ao arranjo preciso e instrumentalidades das modalidades mostradas nos desenhos.
[00189] A FIG. 1 quantifica o manchamento de fusosomas com um corante para retículo endoplasmático.
[00190] A FIG. 2 quantifica o manchamento de fusosomas com um corante para mitocôndrias.
[00191] A FIG. 3 quantifica o manchamento de fusosomas com um corante para lisossomas.
[00192] A FIG. 4 quantifica o manchamento de fusosomas com um corante para F-actina.
[00193] A FIG. 5 é um gráfico que mostra a recuperação de fluores- cência de GFP após fotobranqueamento de células em contato com fusogênios que expressam Cre e GFP.
[00194] A FIG. 6 é um gráfico que mostra a porcentagem de célu-
las-alvo que expressam RFP após o contato com fusosomas ou con- troles negativos.
[00195] A FIG. 7 é uma imagem de uma liberação de organela posi- tiva por meio de fusão entre células HeLa doadoras e receptoras. As regiões intracelulares indicadas em branco indicam sobreposição entre as mitocôndrias doadoras e receptoras. As regiões intracelulares em cinza indicam onde as organelas doadoras e receptoras não se sobre- põem.
[00196] A FIG. 8 é uma imagem de uma liberação de organela posi- tiva por meio de fusão entre células HeLa doadoras e receptoras. As regiões intracelulares indicadas em branco indicam sobreposição entre as mitocôndrias doadoras e receptoras. As regiões intracelulares em cinza indicam onde as organelas doadoras e receptoras não se sobre- põem.
[00197] A FIG. 9 mostra imagens de microscopia dos tecidos indi- cados de camundongos injetados com fusosomas. O branco repre- senta células fluorescentes de RFP, indicando a liberação de uma car- ga de proteína para as células in vivo.
[00198] A FIG. 10 é uma série de imagens que mostra a liberação bem-sucedida de fusosomas para tecidos murinos in vivo pelas vias de administração indicadas, resultando na expressão de luciferase por células-alvo.
[00199] A FIG. 11 mostra imagens de microscopia de fluorescência tdTomato em tecido muscular murino, indicando a liberação de uma carga de protein para as células musculares por citobiológicos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00200] A invenção descreve fusosomas que incluem um agente de carga útil de proteína de membrana e métodos relacionados. Definições
[00201] Agente: Em geral, o termo "agente", como usado neste do-
cumento, pode ser usado para se referir a um composto ou entidade incluindo, por exemplo, um peptídeo, um polipeptídeo, um ácido nu- cleico (por exemplo, DNA, um cromossoma (por exemplo, um cromos- soma artificial humano), RNA, mRNA, siRNA, miRNA), um sacarídeo ou um polissacarídeo, um lipídeo, uma molécula pequena ou uma combinação ou complexo dos mesmos. O termo pode se referir a uma entidade que é ou compreende uma organela, ou uma fração, extrato ou componente da mesma.
[00202] Anticorpo: Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere- se a um polipeptídeo que inclui elementos de sequência de imunoglo- bulina canônica suficientes para conferir ligação específica a um antí- geno alvo particular. Para os propósitos da presente invenção, em cer- tas modalidades, qualquer polipeptídeo ou complexo de polipeptídeos que inclua sequências de domínio de imunoglobulina suficientes para conferir ligação específica a um antígeno pode ser referido e/ou usado como um "anticorpo", se tal polipeptídeo for produzido naturalmente (por exemplo, gerado por um organismo reagindo a um antígeno), ou produzido por modificação recombinante, síntese química ou outro sis- tema ou metodologia artificial. Em algumas modalidades, um anticorpo é policlonal; em algumas modalidades, um anticorpo é monoclonal. Em algumas modalidades, um anticorpo tem sequências de região cons- tante que são características de anticorpos de camundongo, coelho, primata ou humanos. Em algumas modalidades, os elementos da se- quência do anticorpo são humanizados, primatizados, quiméricos, etc. Nas modalidades, um anticorpo utilizado de acordo com a presente invenção está em um formato selecionador de, mas não limitado a, anticorpos IgA, IgG, IgE ou IgM intactos; anticorpos bi- ou multiespecí- ficos (por exemplo, Zybodies®, etc); fragmentos de anticorpo, tais co- mo fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd', fragmentos Fd e CDRs isoladas ou conjuntos dos mesmos; Fvs de cadeia única; fusões polipeptídeo-Fc; anticorpos de domínio único (por exemplo, anticorpos de domínio único de tubarão, tais como IgNAR ou fragmentos dos mesmos); anticorpos cameloides; anticorpos masca- rados (por exemplo, Probodies®); Imunofármacos modulares peque- nos ("SMIPsTM"); diacorpos de cadeia simples ou Tandem (TandAb®); VHHs; Anticalins®; Nanobodies®; minicorpos; BiTE®s; proteínas de repetição de ancirina ou DARPINs®; Avimers®; DARTs; Anticorpos do tipo TCR; Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; Tri- merX®; MicroProteínas; Fynomers®, Centyrins®; e KALBITOR®s. Em algumas modalidades, um anticorpo pode não ter uma modificação covalente (por exemplo, ligação de um glicano) que teria se fosse pro- duzido naturalmente. Em algumas modalidades, um anticorpo pode conter uma modificação covalente (por exemplo, o anexo de um glica- no, uma carga útil [por exemplo, uma porção detectável, uma porção terapêutica, uma porção catalítica, etc.], ou outro grupo pendente [por exemplo, polietilenoglicol, etc.]. Em algumas modalidades, um anticor- po de qualquer um dos formatos descritos acima compreende uma ou mais regiões de determinação de complemento, por exemplo, CDR1, CD2 e/ou CDR3.
[00203] Domínio de ligação ao antígeno: O termo "domínio de ligação ao antígeno", tal como aqui utilizado, refere-se àquela porção do anticorpo ou a um receptor de antígeno quimérico que se liga a um antígeno. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antíge- no liga-se a um antígeno de superfície celular de uma célula. Em al- gumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno liga-se a um antígeno característico de um câncer, por exemplo, um antígeno asso- ciado a um tumor em uma célula neoplásica. Em algumas modalida- des, um domínio de ligação ao antígeno liga-se a um antígeno caracte- rístico de uma doença infecciosa, por exemplo, um antígeno associado a vírus em uma célula infectada por vírus. Em algumas modalidades,
um domínio de ligação ao antígeno liga-se a uma característica do an- tígeno de uma célula visada pelo sistema imunológico de um indivíduo em uma doença autoimune, por exemplo, um autoantígeno. Em algu- mas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno é ou compreen- de um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo. Em al- gumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno é ou compre- ende um scFv ou Fab.
[00204] Associado com: Em algumas modalidades, duas ou mais entidades estão fisicamente "associadas" umas às outras se interagi- rem, direta ou indiretamente, de modo que estejam e/ou permaneçam em proximidade física uma da outra. Em algumas modalidades, duas ou mais entidades que estão fisicamente associadas uma à outra es- tão covalentemente ligadas uma à outra; em algumas modalidades, duas ou mais entidades que estão fisicamente associadas uma à outra não estão covalentemente ligadas uma à outra, mas estão associadas não covalentemente, por exemplo, por meio de ligações de hidrogênio, interação de van der Waals, interações hidrofóbicas, magnetismo e combinações dos mesmos.
[00205] Câncer: Os termos "câncer", "malignidade", "neoplasma", "tumor" e "carcinoma" são usados neste documento para se referir a células que apresentam crescimento relativamente anormal, descon- trolado e/ou autônomo, de modo que eles exibam um fenótipo de cres- cimento aberrante caracterizado por uma perda significativa de contro- le da proliferação celular. Em algumas modalidades, um tumor pode ser ou compreender células que são pré-cancerosas (por exemplo, benignas), malignas, pré-metastáticas, metastáticas e/ou não metastá- ticas. A presente divulgação identifica especificamente certos tipos de câncer para os quais seus ensinamentos podem ser particularmente relevantes. Em algumas modalidades, um câncer relevante pode ser caracterizado por um tumor sólido. Em algumas modalidades, um tu-
mor pode ser um tumor disperso ou um tumor líquido. Em algumas modalidades, um câncer relevante pode ser caracterizado por um tu- mor hematológico. Em geral, exemplos de diferentes tipos de cânceres conhecidos na técnica incluem, por exemplo, leucemias, linfomas (de Hodgkin e não Hodgkin), mielomas e distúrbios mieloproliferativos; sarcomas, melanomas, adenomas, carcinomas de tecido sólido, carci- nomas de células escamosas da boca, garganta, laringe e pulmão, câncer de fígado, cânceres geniturinários, tais como câncer da prósta- ta, cervical, bexiga, útero e endometrial e carcinomas de células re- nais, câncer ósseo, câncer pancreático, câncer de pele, melanoma cu- tâneo ou intraocular, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, cânceres gastrointestinais e câncer do sistema ner- voso, lesões benignas, tais como papilomas e similares.
[00206] Carga: Como usado neste documento, "carga" ou "carga útil" compreende um agente que pode ser liberado por uma fusosoma para uma célula-alvo. Em algumas modalidades, uma carga compre- ende um ou mais agentes terapêuticos, por exemplo, um agente tera- pêutico que é endógeno ou exógeno para a célula de origem. Em al- gumas modalidades, o agente terapêutico é escolhido de um ou mais dentre uma proteína, por exemplo, uma enzima, uma proteína de transmembrana, um receptor, um anticorpo; um ácido nucleico, por exemplo, DNA, um cromossoma (por exemplo, um cromossoma artifi- cial humano), RNA, mRNA, siRNA, miRNA ou uma molécula pequena. Em algumas modalidades, uma carga é ou compreende um agente de carga útil de proteína de membrana. Em algumas modalidades, uma carga é ou compreende uma organela.
[00207] CDR: Como aqui utilizado, "CDR" refere-se a uma região de determinação de complementaridade, por exemplo, que pode estar situada dentro de uma região variável de anticorpo. Existem três CDRs em cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia le- ve, que são designadas CDR1, CDR2 e CDR3, para cada uma das regiões variáveis. Um "conjunto de CDRs" ou "conjunto de CDR" refe- re-se a um grupo de três ou seis CDRs que ocorrem em uma única região variável capaz de se ligar ao antígeno ou às CDRs de regiões variáveis cognatas da cadeia pesada e leve capazes de se ligar ao an- tígeno. Certos sistemas foram estabelecidos na técnica para definir os limites de CDR (por exemplo, Kabat, Chothia, etc.); aqueles versados na técnica apreciam as diferenças entre e dentre esses sistemas e são capazes de entender os limites de CDR na medida requerida para en- tender e praticar a invenção reivindicada.
[00208] Membrana celular: Tal como aqui utilizado, uma "membra- na celular" refere-se a uma membrana derivada de uma célula, por exemplo, uma célula fonte ou uma célula-alvo.
[00209] Citobiológico: Tal como aqui utilizado, "citobiológico" se refere a uma porção de uma célula que compreende um lúmen e uma membrana celular, ou uma célula com inativação nuclear parcial ou completa. Em algumas modalidades, o citobiológico compreende um ou mais de um componente do citoesqueleto, uma organela e um ri- bossoma. Nas modalidades, o citobiológico é uma célula enucleada, uma microvesícula ou um fantasma celular.
[00210] Citosol: Como aqui utilizado, "citosol" refere-se ao compo- nente aquoso do citoplasma de uma célula. O citosol pode compreen- der proteínas, RNA, metabólitos e íons.
[00211] Endógeno: Como aqui utilizado, o termo "endógeno" refe- re-se a um agente, por exemplo, uma proteína ou lipídeo que é natu- ralmente encontrado em um sistema relevante (por exemplo, célula, tecido, organismo, célula fonte ou célula-alvo, etc.) Por exemplo, em algumas modalidades, pode-se dizer que uma fusosoma ou uma pre- paração fechada por membrana contém um ou mais lipídeos e/ou pro-
teínas "endógenos" quando os lipídeos e/ou proteínas relevantes são encontrados naturalmente em uma célula fonte da qual a fusosoma ou a preparação fechada por membrana é obtida ou derivada (por exem- plo, a célula fonte da fusosoma ou preparação fechada por membra- na). Em algumas modalidades, um agente endógeno é superexpresso em uma célula de origem.
[00212] Exógeno: Como aqui utilizado, o termo "exógeno" refere-se a um agente (por exemplo, uma proteína ou lipídeo) que não é encon- trado naturalmente em um sistema relevante (por exemplo, uma célu- la, um tecido, um organismo, uma célula fonte ou uma célula-alvo, etc.). Nas modalidades, o agente é modificado e/ou introduzido no sis- tema relevante. Por exemplo, em algumas modalidades, pode-se dizer que uma fusosoma ou uma preparação fechada por membrana con- tém um ou mais lipídeos e/ou proteínas "exógenos" quando os rele- vantes lipídeos e/ou proteínas não são encontrados naturalmente em uma célula fonte a partir da qual a fusosoma ou preparação fechada por membrana é obtido ou derivado (por exemplo, a célula fonte da fusosoma ou fechada por membrana. Em algumas modalidades, um agente exógeno é uma variante de um agente endógeno, tal como, por exemplo, uma variante de proteína que difere em um ou mais aspectos estruturais, tal como sequência de aminoácido, modificação pós- translacional, etc. de uma proteína endógena de referência, etc.).
[00213] Variante funcional: O termo "variante funcional" refere-se a um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido substanci- almente idêntica a uma sequência de aminoácido de referência, ou é codificada por uma sequência de nucleotídeo substancialmente idênti- ca e é capaz de ter uma ou mais atividades da sequência de aminoá- cido de referência.
[00214] Célula fundida: Tal como aqui utilizado, uma "célula fundi- da" refere-se a uma célula produzida pelo contato de um ou mais fuso-
somas com uma célula-alvo. Em algumas modalidades da célula fun- dida, pelo menos uma porção da bicamada lipídica de um ou mais fu- sosomas está associada a uma membrana da célula-alvo.
[00215] Fusogênio: Quando aqui usado, "fusogênio" se refere a um agente ou molécula que cria uma interação entre dois lúmens fe- chados por membrana. Nas modalidades, o fusogênio facilita a fusão das membranas. Em outras modalidades, o fusogênio cria uma cone- xão, por exemplo, um poro, entre dois lúmens (por exemplo, o lúmen da fusosoma e um citoplasma de uma célula-alvo). Em algumas moda- lidades, o fusogênio compreende um complexo de duas ou mais prote- ínas, por exemplo, em que nenhuma proteína tem atividade fusogênica apenas.
[00216] Parceiro de ligação a fusogênio: Quando aqui usado, "parceiro de ligação a fusogênio" refere-se a um agente ou molécula que interage com um fusogênio para facilitar a fusão entre duas mem- branas. Em algumas modalidades, um parceiro de ligação ao fusogê- nio pode ser ou compreender uma característica da superfície de uma célula.
[00217] Composição de fusosoma: Como usado neste documen- to, "composição de fusosoma" se refere a uma composição que com- preende uma ou mais fusosomas.
[00218] Agente de carga útil de proteína de membrana: Tal co- mo aqui utilizado, "agente de carga útil de proteína de membrana" re- fere-se a uma carga que é ou compreende uma proteína de membrana e/ou um ácido nucleico que codifica uma proteína de membrana, cuja carga pode ser incluída em uma fusosoma ou preparação fechada por membrana, como descrito neste documento (por exemplo, para libera- ção para uma célula-alvo). Uma proteína de membrana é uma proteína que se associa com (por exemplo, está localizada em e/ou sobre) ou é capaz de se associar a uma membrana celular. Em algumas modali-
dades, uma proteína de membrana é uma proteína de transmembrana. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana compreende um domínio que, pelo menos parcialmente (por exemplo, completa- mente) abrange uma membrana, por exemplo, membrana celular. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana está associada a uma porção interna (por exemplo, citosólica) de uma bicamada lipídica de membrana. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana está associada a uma porção externa de uma bicamada lipídica de membrana (por exemplo, com uma superfície celular ou com uma su- perfície de uma fusosoma ou uma preparação fechada por membrana, como aqui descrito). Em algumas modalidades, uma proteína de membrana que está associada a uma porção externa de uma bicama- da lipídica da membrana é uma proteína da superfície celular. Em al- gumas modalidades, uma proteína de membrana passa através de uma bicamada lipídica de membrana e é secretada. Em algumas mo- dalidades, uma proteína de membrana é uma proteína de ocorrência natural. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana é uma proteína modificada e/ou sintética (por exemplo, um receptor de antí- geno quimérico). Em algumas modalidades, uma proteína de membra- na é um agente terapêutico.
[00219] Composição farmacêutica: Tal como aqui utilizado, o ter- mo "composição farmacêutica" refere-se a um agente ativo, formulado em conjunto com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitá- veis. Em algumas modalidades, o agente ativo está presente em uma quantidade de dose unitária apropriada para administração em um re- gime terapêutico a um indivíduo relevante. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem ser especialmente formuladas para administração parenteral, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como, por exemplo, uma solu- ção ou suspensão estéril ou formulação de liberação prolongada.
[00220] Carreador farmaceuticamente aceitável: Conforme usado neste documento, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente acei- tável, tal como uma carga, diluente ou excipiente líquido ou sólido.
[00221] Purificado: Conforme usado neste documento, o termo "purificado" significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, uma célula ou fragmento cellular naturalmente presente em um animal vivo não é "purificado", mas a mesma célula ou fragmento celular parcial ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é "purificado". Uma composição de fusosoma purificada pode existir em forma substancialmente pura ou pode existir em um ambiente não nativo, tal como, por exemplo, um meio de cultu- ra, tal como um meio de cultura compreendendo células.
[00222] Célula fonte: Tal como aqui utilizado, uma "célula fonte" refere-se a uma célula a partir da qual uma fusosoma é derivada, por exemplo, obtida. Em algumas modalidades, derivada inclui a obtenção de uma preparação fechada por membrana a partir de uma célula de origem e a adição de um fusogênio.
[00223] Substancialmente idêntica: No contexto de uma sequên- cia de nucleotídeos, o termo "substancialmente idêntica" é usado neste documento para se referir a uma primeira sequência de ácido nucleico que contém um número suficiente ou mínimo de nucleotídeos que são idênticos aos nucleotídeos alinhados em uma segunda sequência de ácido nucleico de modo que a primeira e a segunda sequências de nu- cleotídeo codificam um polipeptídeo com atividade funcional comum ou codificam um domínio polipeptídico estrutural comum ou uma ativi- dade polipeptídica funcional comum, por exemplo, sequências de nu- cleotídeo tendo pelo menos cerca de 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com uma se- quência de referência, por exemplo, uma sequência aqui fornecida. As composições e métodos aqui abrangem polipeptídeos e ácidos nuclei- cos com as sequências especificadas, ou sequências substancialmen- te idênticas ou similares às mesmas, por exemplo, sequências pelo menos 85 %, 90 % ou 95 % idênticas ou superiores à sequência espe- cificada. No contexto de uma sequência de aminoácido, o termo "subs- tancialmente idêntica" é usado neste documento para se referir a uma primeira sequência de aminoácido que contém um número suficiente ou mínimo de resíduos de aminoácido que são i) idênticos a, ou ii) substituições conservativas de resíduos de aminoácido alinhados em uma segunda sequência de aminoácido de modo que a primeira e a segunda sequências de aminoácido possam ter um domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum, por exemplo, sequências de aminoácido que contêm um domínio estrutural comum com pelo me- nos cerca de 85 % , 90 %. 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com uma sequência de referência, por exemplo, uma sequência aqui fornecida.
[00224] Porção da célula-alvo: Como usado neste documento, o termo "porção da célula-alvo" é usado para se referir a uma caracterís- tica de uma célula (por exemplo, uma célula-alvo) que pode ser usada especificamente (em relação a pelo menos uma outra célula no siste- ma relevante) direcionar uma fusosoma para a célula. Em algumas modalidades, uma porção da célula-alvo é uma característica de su- perfície de uma célula-alvo. Em algumas modalidades, uma porção da célula-alvo é, ou é uma porção de uma proteína associada à membra- na celular de uma célula-alvo. Em algumas modalidades, uma porção da célula-alvo é, ou é uma porção de, um peptídeo ou proteína associ- ada com a membrana de uma célula-alvo. Em algumas modalidades, uma porção da célula-alvo é, ou é uma porção de um lipídeo associa- do com a membrana de uma célula-alvo. Em algumas modalidades, uma porção da célula-alvo é, ou é uma porção de um sacarídeo asso-
ciado com a membrana de uma célula-alvo.
[00225] Domínio alvo: Como usado neste documento, o termo "domínio alvo" é uma característica de uma fusosoma que se associa ou interage com uma porção da célula-alvo. Em algumas modalidades, um domínio alvo especificamente (sob condições de exposição) se as- socia ou interage com uma porção da célula-alvo. Em algumas moda- lidades, um domínio alvo se liga especificamente a uma porção da cé- lula-alvo presente em uma célula-alvo. Em algumas modalidades, um domínio alvo é ou compreende um domínio de um fusogênio, por exemplo, é covalentemente ligado a um fusogênio, por exemplo, é par- te de um polipeptídeo de fusogênio. Em algumas modalidades, um domínio alvo é uma entidade separada de qualquer fusogênio, por exemplo, não é covalentemente ligado a um fusogênio, por exemplo, não faz parte de um polipeptídeo de fusogênio.
[00226] Estável: O termo "estável", quando aplicado às composi- ções aqui, significa que as composições mantêm um ou mais aspectos de sua estrutura física e/ou atividade ao longo de um período de tem- po sob um conjunto designado de condições. Em algumas modalida- des, as condições designadas estão sob armazenamento refrigerado (por exemplo, a ou abaixo de cerca de 4 ºC, -20 ºC ou -80 ºC).
[00227] Célula-alvo: Tal como aqui utilizado, "célula-alvo" refere-se a uma célula à qual uma fusosoma se funde.
[00228] Domínio TCR: Tal como aqui utilizado, um "domínio TCR" refere-se a uma porção de um polipeptídeo receptor de células T, ou um fragmento funcional ou variante do mesmo, que pode causar a ati- vação do complexo TCR para pelo menos algum aspecto da via de sinalização de célula T. Em algumas modalidades, a ativação do com- plexo de TCR leva a um ou mais dentre proliferação, ativação, diferen- ciação, secreção de citocina ou atividade citolítica de células T.
[00229] Variante: O termo "variante" refere-se a um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido substancialmente idêntica a uma sequência de aminoácido de referência ou é codificado por uma sequência de nucleotídeo substancialmente idêntica. Em algumas mo- dalidades, a variante é uma variante funcional. Fusosomas
[00230] As composições e métodos de fusosoma aqui descritos compreendem (a) uma bicamada lipídica, (b) um lúmen (por exemplo, compreendendo citosol) rodeado pela bicamada lipídica; (c) um fuso- gênio que é exógeno ou superexpresso em relação à célula de origem, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica e (d) um agente de carga útil de proteína de membrana. Nas modalida- des, a fusosoma é derivada de uma célula não vegetal, por exemplo, uma célula mamífera, ou derivado da mesma (por exemplo, uma mito- côndria, um condrossoma, uma organela, uma vesícula ou uma célula enucleada) e compreende um fusogênio, por exemplo, proteína, lipí- deo ou fusogênio químico. Encapsulamento
[00231] Em algumas modalidades das composições e métodos aqui descritos incluem fusosomas, por exemplo, bicamadas naturalmente derivadas de lipídeos anfipáticos com um fusogênio. As fusosomas podem compreender vários tipos diferentes de lipídeos, por exemplo, lipídeos anfipáticos, tais como fosfolipídeos. As fusosomas podem compreender uma bicamada lipídica como a superfície externa. Tais composições podem ser surpreendentemente usadas nos métodos da invenção. Em alguns casos, as membranas podem assumir a forma de uma célula autóloga, alogênica, xenogênica ou modificada, como des- crito em Ahmad et al. 2014 Miro1 regula o transporte mitocondrial in- tercelular e realça a eficácia de resgate de células-tronco mesenqui- mais. EMBO Journal. 33 (9): 994-1010. Em algumas modalidades, as composições incluem membranas modificadas, como descrito em, por exemplo, em Orive. et al. 2015. Encapsulamento celular: avanços téc- nicos e clínicos. Trends in Pharmacology Sciences; 36 (8): 537-46; e em Mishra. 2016. Handbook of Encapsulation and Controlled Release. CRC Press. Em algumas modalidades, as composições incluem mem- branas de ocorrência natural (McBride et al. 2012. A Vesicular Trans- port Pathway Shuttles Cargo from mitochondria to lysosomes. Current Biology 22: 135-141).
[00232] Em algumas modalidades, uma composição aqui descrita inclui uma membrana naturalmente derivada, por exemplo, vesículas de membrana preparadas a partir de células ou tecidos. Em algumas modalidades, uma fusosoma é uma vesícula derivada de MSCs ou as- trócitos.
[00233] Em algumas modalidades, uma fusosoma é uma exosso- ma.
[00234] Exossomas exemplificativas e outros corpos fechados por membrana são descritos, por exemplo, em US2016137716, que é aqui incorporado por referência em sua íntegra. Em algumas modalidades, a fusosoma compreende uma vesícula que pode ser obtida, por exem- plo, de uma célula, por exemplo, uma microvesícula, uma exossoma, um corpo apoptótico (de células apoptóticas), uma micropartícula (que pode ser derivada de, por exemplo, plaquetas), uma ectossoma (deri- vável de, por exemplo, neutrófilos e monócitos no soro), uma prosta- tossoma (que pode ser obtida de células de câncer da próstata), uma cardiossoma (derivável de células cardíacas) e similares.
[00235] Exemplos de exossomas e outros corpos fechados por membrana também são descritos em WO/2017/161010, WO/2016/077639, US20160168572, US20150290343 e US20070298118, cada um dos quais é incorporado por referência nes- te documento em sua totalidade. Em algumas modalidades, a fusoso- ma compreende uma vesícula extracelular, nanovesícula ou exosso-
ma. Em algumas modalidades, uma fusosoma compreende uma vesí- cula extracelular, por exemplo, uma vesícula derivada de célula que compreende uma membrana que envolve um espaço interno e tem um diâmetro menor do que a célula da qual é derivada. Nas modalidades, a vesícula extracelular tem um diâmetro de 20 nm a 1000 nm. Nas modalidades, a fusosoma compreende um corpo apoptótico, um frag- mento de uma célula, uma vesícula derivada de uma célula por mani- pulação direta ou indireta, uma organela vesiculada e uma vesícula produzida por uma célula viva (por exemplo, por brotamento da mem- brana plasmática direto ou fusão da endossoma tardia com a mem- brana plasmática). Nas modalidades, a vesícula extracelular é deriva- da de um organismo vivo ou morto, tecidos ou órgãos explantados ou células cultivadas. Nas modalidades, a fusosoma compreende uma nanovesícula, por exemplo, uma pequena vesícula derivada de célula (por exemplo, entre 20-250 nm de diâmetro ou 30-150 nm de diâme- tro) que compreende uma membrana que envolve um espaço interno e que é gerada a partir da referida célula por manipulação direta ou indi- reta. A produção de nanovesículas pode, em alguns casos, resultar na destruição da célula de origem. A nanovesícula pode compreender um lipídeo ou ácido graxo e polipeptídeo. Nas modalidades, a fusosoma compreende uma exossoma. Nas modalidades, a exossoma é uma pequena vesícula derivada de célula (por exemplo, entre 20 e 300 nm de diâmetro ou 40 e 200 nm de diâmetro) que compreende uma mem- brana que envolve um espaço interno e que é gerada a partir da refe- rida célula por brotamento da membrana plasmática direto ou por fu- são da endossoma tardia com a membrana plasmática. Nas modalida- des, a produção de exossomas não resulta na destruição da célula fonte. Nas modalidades, a exossoma compreende lipídeo ou ácido graxo e polipeptídeo.
[00236] Exossomas exemplares e outros corpos fechados por membrana também são descritos na US 20160354313, que é aqui in- corporada por referência em sua íntegra. Nas modalidades, a fusoso- ma compreende um Módulo de Liberação Biocompatível, uma exos- soma (por exemplo, cerca de 30 nm a cerca de 200 nm de diâmetro), uma microvesícula (por exemplo, cerca de 100 nm a cerca de 2000 nm de diâmetro) um corpo apoptótico (por exemplo, cerca de 300 nm a cerca de 2000 nm de diâmetro), uma partícula de membrana, uma ve- sícula de membrana, uma vesícula semelhante a uma exossoma, uma vesícula semelhante a uma ectossoma, uma ectossoma ou uma exo- vesícula.
[00237] Em algumas modalidades, uma fusosoma é uma microve- sícula. Em algumas modalidades, uma fusosoma é um fantasma de célula. Em algumas modalidades, uma vesícula é uma vesícula de membrana plasmática, por exemplo, uma vesícula gigante da mem- brana plasmática.
[00238] Fusosomas podem ser feitas de vários tipos diferentes de lipídeos, por exemplo, lipídeos anfipáticos, tais como fosfolipídeos. A fusosoma pode compreender uma bicamada lipídica como a superfície externa. Esta bicamada pode ser composta por um ou mais lipídeos do mesmo ou diferente tipo. Os exemplos incluem, sem limitação, fosfoli- pídeos, tais como fosfocolinas e fosfoinositóis. Exemplos específicos incluem, sem limitação, DMPC, DOPC e DSPC. Fusogênios
[00239] Em algumas modalidades, a fusosoma aqui descrita (por exemplo, compreendendo uma vesícula ou uma porção de uma célula) inclui um ou mais fusogênios, por exemplo, para facilitar a fusão da fusosoma a uma membrana, por exemplo, uma membrana celular. Além disso, essas composições podem incluir modificações de super- fície feitas durante ou após a síntese para incluir um ou mais fusogê- nios. A modificação da superfície pode compreender uma modificação da membrana, por exemplo, a inserção de um lipídeo ou proteína na membrana.
[00240] Em algumas modalidades, as fusosomas compreendem um ou mais fusogênios em sua superfície externa (por exemplo, integra- dos na membrana celular) para alvejar uma um tipo de célula ou tecido específico (por exemplo, cardiomiócitos). As fusosomas podem com- preender um domínio alvo. Os fusogênios incluem, sem limitação, fu- sogênios com base em proteínas, lipídeos e produtos químicos. O fu- sogênio pode se ligar a um parceiro, por exemplo, uma característica na superfície de uma célula-alvo. Em algumas modalidades, o parceiro na superfície de uma célula-alvo é uma porção da célula-alvo. Em al- gumas modalidades, a fusosoma compreendendo o fusogênio integra- rá a membrana em uma bicamada lipídica de uma célula-alvo.
[00241] Em algumas modalidades, um ou mais dos fusogênios aqui descritos podem ser incluídos na fusosoma. Fusogênios de Proteína
[00242] Em algumas modalidades, o fusogênio é uma proteína fu- sogênica, por exemplo, uma proteína mamífera ou um homólogo de uma proteína mamífera (por exemplo, tendo 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % , 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou maior identidade), uma proteína não mamífera, tal como uma proteína viral ou um homólogo de uma proteína viral (por exemplo, tendo 50 %, 60 %, 70 %, 80 % , 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou maior identidade), uma proteína nativa ou um derivado de uma proteína nativa, uma proteína sintética, um fragmento da mesma, uma variante da mesma, uma fu- são de proteína compreendendo um ou mais dos fusogênios ou frag- mentos e qualquer combinação dos mesmos.
[00243] Em algumas modalidades, o fusogênio resulta na mistura entre lipídeos na fusosoma e lipídeos na célula-alvo. Em algumas mo- dalidades, o fusogênio resulta na formação de um ou mais poros entre o lúmen do fusosoma e o citosol da célula-alvo, por exemplo, a fuso- soma é, ou compreende, uma conexina como aqui descrito. (i) Proteínas Mamíferas
[00244] Em algumas modalidades, o fusogênio pode incluir uma proteína mamífera, veja a Tabela 1. Exemplos de fusogênios mamífe- ros podem incluir, mas não estão limitados a, uma proteína da família SNARE, tal como vSNAREs e tSNAREs, uma proteína sincitina, como Sincitina-1 (DOI: 10.1128/JVI.76.13.6442–6452.2002) e Sincitina-2, miomarcador (biorxiv.org/content/early/2017/04/02/123158, doi.org/10.1101/123158, doi: 10.1096/fj .201600945R, doi:
10.1038/nature12343), miomisturador (www.nature.com/nature/journal/v499/n7458/full/nature12343.html, doi:
10.1038/nature12343), miofusor (science.sciencemag.org/content/ ear- ly/2017/04/05/science.aam9361, DOI: 10.1126/science.aam9361), FGFRL1 (receptor de fator de crescimento de fibroblastos semelhante 1), Minion (doi.org/10.1101/122697), uma isoforma de gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH) (por exemplo, conforme divulgado na US 6.099.857A), uma proteína de junção de lacuna, como a conexina 43, conexina 40, conexina 45, conexina 32 ou conexina 37 (por exem- plo, como descrito na US 2007/0224176, Hap2, qualquer proteína ca- paz de induzir a formação de sincício entre células heterólogas (ver Tabela 2), qualquer proteína com propriedades de fusogênio (ver Ta- bela 3), um homólogo da mesma, um fragmento da mesma, uma vari- ante da mesma e uma fusão de proteína compreendendo uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades, o fusogênio é codificado por um elemento retroviral endógeno humano (hERV) encontrado no genoma humano. Fusogênios exemplares adi- cionais são descritos na US 6.099.857A e US 2007/0224176, a íntegra dos quais é pelo presente incorporada por referência.
Tabela 1: Exemplos não limitativos de fusogênios humanos e não humanos.
CLASSES DE FUSOGÊNIO HUMANO E NÃO HUMANO Classe de Fusogênio ID da Família de Pro- # de Sequências teína Uniprot EFF-AFF PF14884 191 SNARE PF05739 5977 DC-STAMP PF07782 633 ENV PF00429 312 Tabela 2: Genes que codificam proteínas com propriedades de fusogênio. Genes Humanos com a anotação de ontologia genética de: Formação de Sincítio por proteínas de fusão de membrana plas- mática ID Símbolo A0A024R0I0 DYRK1B A0A024R1N1 MYH9 A0A024R2D8 CAV3 A0A096LNV2 FER1L5 A0A096LPA8 FER1L5 A0A096LPB1 FER1L5 A0AVI2 FER1L5 A6NI61 TMEM8C (myomaker) B3KSL7 - B7ZLI3 FER1L5 H0YD14 MYOF O43184 ADAM12 O60242 ADGRB3 O60500 NPHS1 O95180 CACNA1H O95259 KCNH1 P04628 WNT1 P15172 MYOD1
Genes Humanos com a anotação de ontologia genética de: Formação de Sincítio por proteínas de fusão de membrana plas- mática ID Símbolo P17655 CAPN2 P29475 NOS1 P35579 MYH9 P56539 CAV3 Q2NNQ7 FER1L5 Q4KMG0 CDON Q53GL0 PLEKHO1 Q5TCZ1 SH3PXD2A Q6YHK3 CD109 Q86V25 VASH2 Q99697 PITX2 Q9C0D5 TANC1 Q9H295 DCSTAMP Q9NZM1 MYOF Q9Y463 DYRK1B Tabela 3: Candidatos de Fusogênio Humano Classe de Fusogênio ID do Gene SNARE O15400 Q16623 K7EQB1 Q86Y82 E9PN33 Q96NA8 H3BT82 Q9UNK0 P32856 Q13190 O14662 P61266
Classe de Fusogênio ID do Gene O43752 O60499 Q13277 B7ZBM8 A0AVG3 Q12846 DC-STAMP Q9H295 Q5T1A1 Q5T197 E9PJX3 Q9BR26 ENV Q9UQF0 Q9N2K0 P60507 P60608 B6SEH9 P60508 B6SEH8 P61550 P60509 Q9N2J8 Fusão Muscular (Myomaker) H0Y5B2 H7C1S0 Q9HCN3 A6NDV4 K4DI83 Fusão Muscular (Myomixer) NP_001302423.1 ACT64390.1 XP_018884517.1 XP_017826615.1 XP_020012665.1 XP_017402927.1
Classe de Fusogênio ID do Gene XP_019498363.1 ELW65617.1 ERE90100.1 XP_017813001.1 XP_017733785.1 XP_017531750.1 XP_020142594.1 XP_019649987.1 XP_019805280.1 NP_001170939.1 NP_001170941.1 XP_019590171.1 XP_019062106.1 EPQ04443.1 EPY76709.1 XP_017652630.1 XP_017459263.1 OBS58441.1 XP_017459262.1 XP_017894180.1 XP_020746447.1 ELK00259.1 XP_019312826.1 XP_017200354.1 BAH40091.1 HA P03452 Q9Q0U6 P03460 JUNÇÃO DE LACUNA P36382 P17302 P36383 P08034
Classe de Fusogênio ID do Gene P35212 Outro FGFRL1
GAPDH
[00245] Em algumas modalidades, a fusosoma compreende uma proteína geradora de curvatura, por exemplo, Epsina 1, dinamina ou uma proteína que compreende um domínio BAR. Veja, por exemplo, Kozlovet al, CurrOp StrucBio 2015, Zimmerberget al. Nat Rev 2006, Richard et al, Biochem J 2011. (ii) Proteínas não mamíferas Proteínas Virais
[00246] Em algumas modalidades, o fusogênio pode incluir uma proteína de não mamífera, por exemplo, uma proteína viral. Em algu- mas modalidades, um fusogênio viral é uma proteína de fusão de membrana viral de Classe I, uma proteína de fusão de membrana viral de Classe II, uma proteína de fusão de membrana viral de Classe III, uma glicoproteína de membrana viral ou outras proteínas de fusão vi- ral, ou um homólogo das mesmas, um fragmento das mesmas, uma variante das mesmas, ou uma fusão de proteína compreendendo uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas.
[00247] Em algumas modalidades, proteínas de fusão de membra- na viral de Classe I incluem, mas não estão limitadas a, proteína F de baculovírus, por exemplo, proteínas F do gênero nucleopoli-hedrovírus (NPV), por exemplo, Spodoptera exigua MNPV (SeMNPV) proteína F e Lymantria dispar MNPV (LdMNPV) e proteínas F do paramyxo vírus.
[00248] Em algumas modalidades, as proteínas de membrana viral de Classe II incluem, mas não estão limitadas a, encefalite óssea E do carrapato (TBEV E), Semliki Forest Virus E1/E2.
[00249] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão de mem- brana viral de Classe III incluem, mas não estão limitadas a, rabdoví- rus G (por exemplo, proteína G fusogênica do vírus da estomatite ve-
sicular (VSV-G)), glicoproteína B do herpesvírus (por exemplo, gB do vírus do Herpes Simples 1 (HSV-1)), glicoproteína B do vírus Epstein Barr (EBV gB), togotovírus G, gp64 do baculovírus (por exemplo, gp64 de Autographa California Multiple NPV (AcMNPV)), e glicoproteí- na (BDV G) do vírus da doença de Borna (BDV) .
[00250] Exemplos de outros fusogênios virais, por exemplo, glico- proteínas de membrana e proteínas virais de fusão, incluem, mas não estão limitados a: proteínas sinciciais virais, tais como hemaglutinina (HA) de influenza ou mutantes, ou proteínas de fusão das mesmas; proteína envelope do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1 ENV), gp120 de LFA-1 de ligação ao HIV para formar sincício de linfó- cito, gp41 de HIV, gp160 de HIV ou Trans-ativador de transcrição de HIV (TAT); glicoproteína viral VSV-G, glicoproteína viral do vírus da estomatite vesicular da família Rhabdoviridae; glicoproteínas gB e gH- gL do vírus varicela-zoster (VZV); vírus da leucemia de murino (MLV)- 10A1; Glicoproteína do vírus da leucemia do macaco gibão (GaLV); glicoproteínas tipo G em Raivas, Mokola, vírus da estomatite vesicular e Togaviroses; proteína de projeção de superfície JHM do vírus da he- patite de murino; glicoproteínas de membrana e pico de coronavírus respiratório suíno; glicoproteina de pico da bronquite infecciosa aviária e seu precursor; proteína de pico de coronavírus entérico bovino; os genes F e H, HN ou G do vírus do sarampo; vírus da cinomose canina, vírus da doença de Newcastle, vírus da parainfluenza humana 3, vírus símio 41, vírus Sendai e vírus sincicial respiratório humano; gH de herpesvírus 1 humano e vírus da varicela de símio, com a proteína chaperona gL; herpesvírus gB humano, bovino e cercopiticina; glico- proteínas envelope do vírus da leucemia de murino Friend e vírus do macaco Mason Pfizer; hemaglutinina neuraminidase do vírus da ca- xumba e glicoproteínas F1 e F2; glicoproteínas de membrana da ence- falomielite equina venezuelana; proteína F de paramixovírus; Proteína gp160 do SIV; Proteína G do vírus Ebola; ou proteína de fusão do ví- rus Sendai, ou um homólogo da mesma, um fragmento da mesma, uma variante da mesma, e uma proteína de fusão compreendendo uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas.
[00251] Fusogênios não mamíferos incluem fusogênios virais, ho- mólogos dos mesmos, fragmentos dos mesmos e proteínas de fusão compreendendo uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas. Fusogênios virais incluem fusogênios de classe I, fusogênios de classe II, fusogênios de classe III e fusogênios de classe IV. Nas modalida- des, os fusogênios de classe I, tal como a gp41 do vírus da imunodefi- ciência humana (HIV), têm uma conformação pós-fusão característica com um trímero de assinatura de grampos de cabelo α-helicoidais com uma estrutura de bobina espiral central. As proteínas de fusão virais de classe I incluem proteínas que têm um feixe central de seis hélices pós-fusão. Proteínas de fusão virais de classe I incluem HA de influen- za, parainfluenza F, HIV Env, Ebola GP, hemaglutininas de ortomixovi- roses, proteínas F de paramixoviroses (por exemplo, sarampo, (Katoh et al. BMC Biotechnology 2010, 10:37)), proteínas ENV de retroviro- ses, e fusogênios de filoviroses e coronaviroses. Nas modalidades, os fusogênios virais de classe II, tal como a glicoproteína E da dengue, têm uma assinatura estrutural de folhas β formando um ectodomínio alongado que se reduplica para resultar em um trímero de grampos de cabelo. Nas modalidades, o fusogênio viral de classe II não possui a bobina central em espiral. O fusogênio viral de classe II pode ser en- contrado em alfaviroses (por exemplo, proteína E1) e flaviviroses (por exemplo, glicoproteínas E). Os fusogênios virais de Classe II incluem fusogênios do vírus Semliki Forest, Sinbis, vírus da rubéola e vírus da dengue. Nas modalidades, os fusogênios virais de classe III, tal como a glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular, combinam assinatu- ras estruturais encontradas nas classes I e II. Nas modalidades, um fusogênio viral de classe III compreende hélices α (por exemplo, for- mando um feixe de seis hélices para novamente duplicar a proteína como com os fusogênios virais de classe I) e folhas β com um peptí- deo de fusão anfifílico em sua extremidade, reminiscente de fusogê- nios virais de classe II. Fusogênios virais de classe III podem ser en- contrados em rabdoviroses e herpesviroses. Nas modalidades, os fu- sogênios virais de classe IV são proteínas de transmembrana peque- nas (FAST) associadas à fusão (doi:10.1038/sj.emboj.7600767, Nes- bitt, Rae L., "Targeted Intracellular Therapeutic Delivery Using Liposo- mes Formulated with Multifunctional FAST protein" (2012). Eletronic Thesis and Dissertation Repository. Artigo 388), que são codificados por reoviroses não envelopadas. Nas modalidades, os fusogênios vi- rais de classe IV são suficientemente pequenos para não formarem grampos de cabelo (doi: 10.1146/annurev-cellbio-101512-122422, doi:10.1016/j.devcel.2007.12.008).
[00252] Em algumas modalidades, o fusogênio é um fusogênio de paramixovírus. Em algumas modalidades, o fusogênio é uma proteína F do vírus Nipah, uma proteína F do vírus do sarampo, uma proteína F do paramixovírus de tupaia, uma proteína F do paramixovírus, uma proteína F do vírus Hendra, uma proteína F do Henipavírus, uma pro- teína F do Morbilivírus, uma proteína F do respirovírus, uma proteína F do vírus Sendai, uma proteína F do rubulavírus ou uma proteína F do avulavírus.
[00253] Fusogênios exemplares adicionais são descritos na US
9.695.446, US 2004/0028687, US 6.416.997, US 7.329.807, US 2017/0112773, US 2009/0202622, WO 2006/027202 e US 2004/0009604, a íntegra das quais é aqui incorporada por referência. (iii) Outras proteínas
[00254] Em algumas modalidades, o fusogênio pode incluir uma proteína dependente do pH (por exemplo, como em casos de lesão isquêmica), um homólogo da mesma, um fragmento da mesma e uma fusão de proteína compreendendo uma ou mais proteínas ou fragmen- tos das mesmas. Os fusogênios podem mediar a fusão da membrana na superfície da célula ou em um endossoma ou em outro espaço li- gado à membrana da célula.
[00255] Em algumas modalidades, o fusogênio inclui um EFF-1, AFF-1, proteína de junção de lacuna, por exemplo, uma conexina (tal como Cn43, GAP43, CX43) (DOI: 10.1021/jacs.6b05191), outras pro- teínas de conexão tumoral, um homólogo das mesmas, um fragmento das mesmas, uma variante das mesmas, e uma fusão de proteína compreendendo uma ou mais proteínas ou fragmentos das mesmas. Modificações em fusogênios de proteína
[00256] Em algumas modalidades, os fusogênios de proteína po- dem ser alterados para reduzir a imunorreatividade. Por exemplo, pro- teínas fusogênicas podem ser decoradas com moléculas que reduzem interações imunológicas, tal como PEG (DOI: 10.1128/JVI.78.2.912–
921.2004). Desse modo, em algumas modalidades, o fusogênio com- preende PEG, por exemplo, é um polipeptídeo PEGilado. Os resíduos de aminoácidos no fusogênio que são direcionados pelo sistema imu- nológico podem ser alterados para não serem reconhecidos pelo sis- tema imunológico (doi:10.1016/j.virol.2014.01.027, doi:
10.1371/journal.pone.0046667). Em algumas modalidades, a sequên- cia de proteína do fusogênio é alterada para se assemelhar a sequên- cias de aminoácido encontradas em humanos (humanizadas). Em al- gumas modalidades, a sequência de proteína do fusogênio é alterada para uma sequência de proteína que se liga a complexos de MHC me- nos fortemente. Em algumas modalidades, os fusogênios de proteína são derivados de viroses ou organismos que não infectam humanos (e contra os quais os humanos não foram vacinados), aumentando a probabilidade de que o sistema imunológico de um paciente seja vir-
gem para os fusogênios de proteína (por exemplo, há um valor insigni- ficante de resposta imune adaptativa humoral ou mediada por células em relação ao fusogênio) (doi: 10.1006/mthe.2002.0550, doi:10.1371/journal.ppat.1005641, doi: 10.1038/gt.2011.209, DOI
10.1182/blood-2014-02-558163). Em algumas modalidades, a glicosi- lação do fusogênio pode ser mudada para alterar as interações imuno- lógicas ou reduzir a imunorreatividade. Sem desejar ser limitado pela teoria, em algumas modalidades, um fusogênio de proteína derivado de um vírus ou organismo que não infecta humanos não tem um alvo de fusão natural em pacientes e, desse modo tem alta especificidade. Fusogênios de Lipídeo
[00257] Em algumas modalidades, a fusosoma pode ser tratada com lipídeos fusogênicos, tal como ácidos graxos saturados. Em al- gumas modalidades, os ácidos graxos saturados têm entre 10 e 14 carbonos. Em algumas modalidades, os ácidos graxos saturados têm ácidos carboxílicos de cadeia mais longa. Em algumas modalidades, os ácidos graxos saturados são monoésteres.
[00258] Em algumas modalidades, a fusosoma pode ser tratada com ácidos graxos insaturados. Em algumas modalidades, os ácidos graxos insaturados têm entre C16 e C18 ácidos graxos insaturados. Em algumas modalidades, os ácidos graxos insaturados incluem ácido oleico, mono-oleato de glicerol, glicerídeos, diacilglicerol, ácidos gra- xos insaturados modificados e qualquer combinação dos mesmos.
[00259] Sem desejar ser limitado pela teoria, em algumas modali- dades, os lipídeos de curvatura negativa promovem a fusão da mem- brana. Em algumas modalidades, a fusosoma compreende um ou mais lipídeos de curvatura negativa, por exemplo, lipídeos de curvatu- ra negativa que são exógenos em relação à célula de origem, na membrana. Nas modalidades, o lipídeo de curvatura negativa ou um precursor do mesmo é adicionado ao meio compreendendo células-
fonte ou fusosomas. Nas modalidades, a célula fonte é modificada pa- ra expressar ou superexpressar um ou mais genes de síntese de lipí- deo. O lipídeo de curvatura negativa pode ser, por exemplo, diacilglice- rol (DAG), colesterol, ácido fosfatídico (PA), fosfatidiletanolamina (PE) ou ácido graxo (FA).
[00260] Sem desejar ser limitado pela teoria, em algumas modali- dades, os lipídeos de curvatura positiva inibem a fusão da membrana. Em algumas modalidades, a fusosoma compreende níveis reduzidos de um ou mais lipídeos de curvatura positiva, por exemplo, lipídeos de curvatura positiva exógenos, na membrana. Nas modalidades, os ní- veis são reduzidos pela inibição da síntese do lipídeo, por exemplo, por nocaute ou redução de um gene da síntese de lipídeos, na célula de origem. O lipídeo de curvatura positiva pode ser, por exemplo, liso- fosfatidilcolina (LPC), fosfatidilinositol (PtdIns), ácido lisofosfatídico (LPA), lisofosfatidiletanolamina (LPE) ou monoacilglicerol (MAG). Fusogênios Químicos
[00261] Em algumas modalidades, a fusosoma pode ser tratado com produtos químicos fusogênicos. Em algumas modalidades, o pro- duto químico fusogênico é polietilenoglicol (PEG) ou derivados dos mesmos.
[00262] Em algumas modalidades, o fusogênio químico induz uma desidratação local entre as duas membranas que leva a um empaco- tamento molecular desfavorável da bicamada. Em algumas modalida- des, o fusogênio químico induz a desidratação de uma área próxima à bicamada lipídica, causando o deslocamento de moléculas aquosas entre as células e permitindo a interação entre as duas membranas juntas.
[00263] Em algumas modalidades, o fusogênio químico é um cátion positivo. Alguns exemplos não limitativos de cátions positivos incluem Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, La3+, Sr3+ e H+.
[00264] Em algumas modalidades, o fusogênio químico liga-se à membrana alvo, modificando a polaridade da superfície, o que altera a repulsão intermembrana dependente da hidratação.
[00265] Em algumas modalidades, o fusogênio químico é um lipí- deo solúvel. Alguns exemplos não limitativos incluem oleoilglicerol, dio- leoilglicerol, trioleoilglicerol e variantes e derivados dos mesmos.
[00266] Em algumas modalidades, o fusogênio químico é um produ- to químico solúvel em água. Alguns exemplos não limitativos incluem polietilenoglicol, dimetilsulfóxido e variantes e derivados dos mesmos.
[00267] Em algumas modalidades, o fusogênio químico é uma pe- quena molécula orgânica. Um exemplo não limitativo inclui brometo de n-hexila.
[00268] Em algumas modalidades, o fusogênio químico não altera a constituição, a viabilidade celular ou as propriedades de transporte de íon do fusogênio ou membrana alvo.
[00269] Em algumas modalidades, o fusogênio químico é um hor- mônio ou uma vitamina. Alguns exemplos não limitativos incluem ácido abscísico, retinol (vitamina A1), um tocoferol (vitamina E) e variantes e derivados dos mesmos.
[00270] Em algumas modalidades, a fusosoma compreende actina e um agente que estabiliza a actina polimerizada. Sem desejar ser li- mitado pela teoria, a actina estabilizada em uma fusosoma pode pro- mover a fusão com uma célula-alvo. Nas modalidades, o agente que estabiliza a actina polimerizada é escolhido de actina, miosina, biotina- estreptavidina, ATP, proteína da síndrome de Wiskott-Aldrich neuronal (N-WASP) ou formina. Veja, por exemplo, Langmuir. 16 de agosto de 2011; 27(16): 10061-71 e Wen et al., Nat Commun. 31 de agosto de 2016;7. Nas modalidades, a fusosoma compreende actina que é exó- gena ou superexpressa em relação à célula de origem, por exemplo, actina de tipo selvagem ou actina compreendendo uma mutação que promove a polimerização. Nas modalidades, a fusosoma compreende ATP ou fosfocreatina, por exemplo, ATP exógeno ou fosfocreatina. Fusogênios de molécula pequena
[00271] Em algumas modalidades, a fusosoma pode ser tratada com pequenas moléculas fusogênicas. Alguns exemplos não limitati- vos incluem halotano, fármacos anti-inflamatórias não esteroidais (NSAIDs), como meloxicam, piroxicam, tenoxicam e clorpromazina.
[00272] Em algumas modalidades, o fusogênio de molécula peque- na pode estar presente em agregados semelhantes a micelas ou livre de agregados. Modificações de Fusogênio
[00273] Em algumas modalidades, o fusogênio está ligado a uma proteína clivável. Em alguns casos, uma proteína clivável pode ser cli- vada por exposição a uma protease. Uma proteína de fusão modifica- da pode ligar-se a qualquer domínio de uma proteína transmembrana. A proteína de fusão modificada pode ser ligada por um peptídeo de clivagem a um domínio de proteína localizado dentro do espaço inter- membrana. O peptídeo de clivagem pode ser clivado por uma ou uma combinação de proteases intermembrana (por exemplo, HTRA2/OMI que requer um aminoácido alifático não polar - valina, isoleucina ou metionina são preferidos - na posição P1, e resíduos hidrofílicos - argi- nina é preferida - nas posições P2 e P3).
[00274] Em algumas modalidades, o fusogênio está ligado a um marcador de afinidade. Em algumas modalidades, a etiqueta de afini- dade auxilia na separação e isolamento de fusosoma. Em algumas modalidades, o marcador de afinidade é clivável. Em algumas modali- dades, o marcador de afinidade está ligado de forma não covalente ao fusogênio. Em algumas modalidades, o marcador de afinidade está presente na fusosoma e separada do fusogênio.
[00275] Em algumas modalidades, as proteínas de fusogênio são modificadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica ou qualquer método aqui descrito para compreender uma sequência de degrada- ção proteolítica, por exemplo, uma sequência de degradação mitocon- drial ou citosólica. As proteínas fusogênicas podem ser modificadas para incluir, mas não se limitam a uma sequência de degradação pro- teolítica, por exemplo, uma sequência de proteína Caspase 2 (por exemplo, Val-Asp-Val-Ala-Asp-I- (SEQ ID NO: 1)) ou outro sequências proteolíticas (Veja, por exemplo, Gasteiger et al., The Proteomics Pro- tocols Handbook; 2005: 571-607), uma sequência de degradação pro- teolítica modificada que tem pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais identidade com a sequência de degradação proteolítica do tipo selvagem, uma sequência de degradação proteolítica citosólica, por exemplo, ubiquitina, ou uma sequência de degradação proteolítica citosólica modificada que tem pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou maior identidade com a sequência de degradação proteolítica do tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma composição compre- ende mitocôndrias em uma célula de origem ou condrissoma compre- endendo uma proteína modificada com uma sequência de degradação proteolítica, por exemplo, pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou maior identidade com a sequência de degradação proteolítica do tipo selvagem, uma sequência de degradação proteolítica citosólica, por exemplo, ubiquitina, ou uma sequência de degradação proteolítica citosólica modificada que tem pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou maior identidade com a sequência de degradação proteolítica do tipo selvagem.
[00276] Em algumas modalidades, o fusogênio pode ser modificado com um domínio de protease que reconhece proteínas específicas, por exemplo, superexpressão de uma protease, por exemplo, uma proteí- na de fusão modificada com atividade de protease. Por exemplo, uma protease ou domínio de protease de uma protease, como MMP, pepti-
dase de processamento mitocondrial, peptidase intermediária mito- condrial, peptidase de membrana interna.
[00277] Veja, Alfonzo, J.D. & Soll, D. Mitocondrial tRNA import - o desafio de entender apenas começou. Biological Chemistry 390: 717-
722. 2009; Langer, T. et al. Characterization of Peptides Released from Mitochondria. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. Vol. 280, No. 4. 2691–2699, 2005; Vliegh, P. et al. Synthetic therapeu- tic peptides: science nd mrket. Drug Discovery Today. 15(1/2). 2010; Quiros P.M.m et al., New roles for mitochondrial proteases in health, ageing and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. V16, 2015; Weber-Lotfi, F. et al. DNA import competence and mitochondrial genetics. Biopolymers and Cell. Vol. 30. N 1. 71–73, 2014. Entrada não Endocítica nas Células-alvo
[00278] Em algumas modalidades, uma fusosoma ou composição de fusosoma aqui descrita libera uma carga para uma célula-alvo por meio de uma via não endocítica. Sem desejar ser limitado pela teoria, uma via de liberação não endocítica pode melhorar a quantidade ou porcentagem de carga liberada para a célula, por exemplo, para o compartimento desejado da célula.
[00279] Por conseguinte, em algumas modalidades, uma pluralida- de de fusosomas aqui descritas, quando em contato com uma popula- ção de células-alvo na presença de um inibidor de endocitose, e quan- do em contato com uma população de células-alvo de referência não tratada com o inibidor de endocitose, libera a carga para pelo menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % ou 80 % do número de células na po- pulação de células-alvo em comparação com a população de células- alvo de referência.
[00280] Em algumas modalidades, menos de 10 % da carga entra na célula por endocitose.
[00281] Em algumas modalidades, o inibidor da endocitose é um inibidor da acidificação lisossômica, por exemplo, bafilomicina A1.
[00282] Em algumas modalidades, a carga liberada é determinada usando um ensaio de inibição de endocitose, por exemplo, um ensaio de Exemplo 135 do Pedido Internacional WO 2018/208728, que é aqui incorporado por referência em sua íntegra.
[00283] Em algumas modalidades, a carga entra na célula por uma via independente de dinamina ou uma via independente de acidifica- ção lisossômica, uma via independente de macropinocitose ou uma via independente de actina.
[00284] Em algumas modalidades (por exemplo, modalidades para ensaio de liberação não endocítica de carga), a liberação de carga é avaliada usando uma ou mais das (por exemplo, todas) as seguintes etapas: (a) colocação de 30.000 células-alvo HEK-293T em uma pri- meira cavidade de uma placa de 96 cavidades compreendendo 100 nM de bafilomicina A1, e colocação de um número similar de células semelhantes em uma segunda cavidade de uma placa de 96 cavida- des sem bafilomicina A1, (b) cultivo das células-alvo por quatro horas em meio DMEM em 37ºC e 5 % de CO2, (c) contato das células-alvo com 10 ug de fusosomas que compreendem carga, (d) incubação das células-alvo e fusosomas por 24 horas a 37ºC e 5 % de CO2, e (e) de- terminação da porcentagem de células na primeira cavidade e na se- gunda cavidade que compõem a carga. A etapa (e) pode compreender a detecção da carga usando microscopia, por exemplo, usando imuno- fluorescência. A etapa (e) pode compreender a detecção da carga indi- retamente, por exemplo, a detecção de um efeito a jusante da carga, por exemplo, a presença de uma proteína repórter. Em algumas moda- lidades, uma ou mais das etapas (a) - (e) acima mencionadas são rea- lizadas como descrito no Exemplo 135 do Pedido Internacional WO 2018/208728.
[00285] Em algumas modalidades, um inibidor da endocitose (por exemplo, cloroquina ou bafilomicina A1) inibe a acidificação endossô- mica. Em algumas modalidades, a liberação de carga é independente de acidificação lisossômica. Em algumas modalidades, um inibidor de endocitose (por exemplo, Dynasore) inibe a dinamina. Em algumas modalidades, a liberação de carga é independente da atividade da di- namina.
[00286] Em algumas modalidades, a fusosoma entra na célula-alvo por endocitose, por exemplo, em que o nível de agente terapêutico administrado por meio de uma via endocítica é de 0,01-0,6, 0,01-0,1, 0,1-0,3 ou 0,3-0,6, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais, do que uma célula de referência tratada com cloroquina contatada com fusosomas similares, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 91 aqui. Em algumas modalidades, pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % dos fusosomas em uma composição de fusosomas que entra em uma célula-alvo entra por meio de uma via não endocítica, por exemplo, as fusosomas en- tram na célula-alvo por meio da fusão com a superfície celular. Em al- gumas modalidades, o nível de um agente terapêutico liberado por meio de uma via não endocítica para uma determinada fusosoma é de 0,1-0,95, 0,1-0,2, 0,2-0,3, 0,3-0,4, 0,4-0,5, 0,5-0,6, 0,6-0,7, 0,7-0,8, 0,8-0,9, 0,9-0,95, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que uma célula de referência tratada com cloroquina, por exemplo, usando um ensaio de Exemplo 90 aqui mencionado. Em algumas modalidades, pelo me- nos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % dos fusosomas em uma composição de fusosoma que entra em uma célula-alvo entra no citoplasma (por exemplo, não entra em uma endossoma ou lisossoma). Em algumas modalidades, após o agente de carga útil de proteína da membrana entrar no citoplasma, o agente de carga útil da proteína da membrana ou polipeptídeo codifi- cado nele se localiza na membrana celular ou é secretado.
Em algu- mas modalidades, menos de 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % ou 1 % de fusosomas em uma composição de fusosoma que entra em uma célula-alvo entra em uma endossoma ou lisossoma.
Em algumas modalidades, a fusosoma en- tra na célula-alvo por uma via não endocítica, por exemplo, em que o nível de agente terapêutico administrado é de pelo menos 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % daquele de uma célula de referência tratada com cloro- quina, por exemplo, usando um ensaio de Exemplo 91 aqui menciona- do.
Em uma modalidade, uma fusosoma libera um agente para uma célula-alvo por meio de uma via mediada por dinamina.
Em uma mo- dalidade, o nível de agente liberado por meio de uma via mediada por dinamina está na faixa de 0,01-0,6, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que células-alvo tratadas com Dynasore em contato com fusoso- mas similares, por exemplo, como medido em um ensaio de Exemplo 92 neste documento.
Em uma modalidade, uma fusosoma libera um agente a uma célula-alvo por meio de macropinocitose.
Em uma mo- dalidade, o nível de agente liberado por meio de macropinocitose está na faixa de 0,01-0,6, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que células- alvo tratadas com EIPA em contato com fusosomas similares, por exemplo, como medido em um ensaio de Exemplo 92 neste documen- to.
Em uma modalidade, um fusosoma libera um agente a uma célula- alvo por meio de uma via mediada por actina.
Em uma modalidade, o nível de agente liberado por meio de uma via mediada por actina esta- rá na faixa de 0,01-0,6, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que as células-alvo tratadas com Latrunculina B em contato com fusosomas similares, por exemplo, como medido em um ensaio de Exemplo 92 neste documento.
[00287] Em algumas modalidades, a carga liberada para a célula- alvo é determinada usando um ensaio de inibição de endocitose, por exemplo, um ensaio do Exemplo 55, 90 ou 92 neste documento.
[00288] Em algumas modalidades, a carga entra na célula-alvo através de uma via independente de dinamina ou uma via independen- te de acidificação lisossômica, uma via independente de macropinoci- tose (por exemplo, em que o inibidor de endocitose é um inibidor de macropinocitose, por exemplo, 5-(N-etil-N-isopropil)amilorida (EIPA), por exemplo, a uma concentração de 25 µM), ou uma via independen- te de actina (por exemplo, em que o inibidor da endocitose é um inibi- dor da polimerização da actina é, por exemplo, Latrunculina B, por exemplo, a uma concentração de 6 µM).
[00289] Em algumas modalidades, o fusosoma, quando em contato com uma população de células-alvo, libera carga para uma localização da célula-alvo diferente de um endossoma ou lisossoma, por exemplo, para o citosol ou a membrana celular. Nas modalidades, menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 % ou 10 % da carga é liberada para um endossoma ou lisossoma. Liberação Específica para Células-alvo
[00290] Em algumas modalidades, uma composição de fusosoma aqui descrita libera carga preferencialmente a uma célula-alvo em comparação com uma célula não alvo. Por conseguinte, em certas modalidades, uma fusosoma aqui descrita tem uma ou ambas das se- guintes propriedades: (i) quando a pluralidade de fusosomas é conta- tada com uma população celular compreendendo células-alvo e célu- las não alvo, a carga está presente em pelo menos 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes mais células-alvo do que células não alvo, ou (ii) as fusosomas da pluralidade se fundem a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que com uma célula não alvo em pelo menos 50 %.
[00291] Em algumas modalidades, a presença de carga é medida por microscopia, por exemplo, usando um ensaio do Exemplo 124 do Pedido Internacional WO 2018/208728, que é aqui incorporado por referência em sua íntegra. Em algumas modalidades, a fusão é medi- da por microscopia, por exemplo, usando um ensaio de Exemplo 54 neste documento. Em algumas modalidades, a porção de direciona- mento é específica para um marcador de superfície celular na célula- alvo. Em algumas modalidades, o marcador de superfície celular é um marcador de superfície celular de uma célula da pele, cardiomiócito, hepatócito, célula intestinal (por exemplo, célula do intestine delgado), célula pancreática, célula cerebral, célula da próstata, célula do pul- mão, célula do cólon ou célula da medula óssea.
[00292] Em algumas modalidades (por exemplo, modalidades para liberação específica de carga a uma célula-alvo versus uma célula não alvo), a liberação de carga é avaliada usando uma ou mais das (por exemplo, todas) as seguintes etapas: (a) colocação de 30.000 células- alvo HEK-293T que superexpressam CD8a e CD8b em uma primeira cavidade de uma placa de 96 cavidades e colocação de 30.000 células HEK-293T não alvo que não superexpressam CD8a e CD8b em uma segunda cavidade de uma placa de 96 cavidades, (b) cultivo das célu- las por quatro horas em meio DMEM a 37ºC e 5 % de CO2, (c) contato das células-alvo com 10 ug de fusosomas que compreendem carga, (d) incubação das células-alvo e fusosomas por 24 horas a 37ºC e 5 % de CO2, e (e) determinação da percentagem de células na primeira cavidade e na segunda cavidade que compõem a carga. A etapa (e) pode compreender a detecção da carga usando microscopia, por exemplo, usando imunofluorescência. A etapa (e) pode compreender a detecção da carga indiretamente, por exemplo, a detecção de um efei-
to a jusante da carga, por exemplo, a presença de uma proteína repór- ter. Em algumas modalidades, uma ou mais das etapas (a) - (e) acima mencionadas são realizadas como descrito no Exemplo 124 do Pedido Internacional WO 2018/208728.
[00293] Em algumas modalidades, a fusosoma se funde a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que com uma célula não alvo, por exemplo, em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 % , 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 ve- zes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, ou 100 vezes, por exemplo, em um ensaio de Exemplo 54. Em algumas modalidades, a fusosoma se fun- de a uma taxa mais alta com uma célula-alvo do que com outras fuso- somas, por exemplo, em pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 % , 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, por exemplo, em um ensaio de Exemplo
54. Em algumas modalidades, a fusosoma se funde com células-alvo a uma taxa tal que um agente na fusosoma seja liberada em pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %, das célu- las-alvo após 24, 48 ou 72 horas, por exemplo, em um ensaio de Exemplo 54. Nas modalidades, a quantidade de fusão direcionada é de cerca de 30 % a 70 %, 35 % a 65 %, 40 % a 60 %, 45 % a 55 % ou 45 % a 50 %, por exemplo, cerca de 48,8 %, por exemplo, em um en- saio de Exemplo 54. Nas modalidades, a quantidade de fusão direcio- nada é de cerca de 20 % - 40 %, 25 % - 35 % ou 30 % - 35 %, por exemplo, cerca de 32,2 %, por exemplo, em um ensaio do Exemplo
55.
[00294] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma for- nece pelo menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % da carga para a população de células-alvo em comparação com a população de célu- las-alvo de referência ou para uma população de células não alvo. Em algumas modalidades, a composição de fusosoma fornece pelo menos
40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % a mais da carga para a população de células-alvo em comparação com a população de células-alvo de refe- rência ou para uma população de células não alvo. Geração de Fusosoma Fusosomas Gerados a partir de Células
[00295] As composições de fusosomas podem ser geradas a partir de células em cultura, por exemplo, células de mamíferos cultivadas, por exemplo, células humanas cultivadas. As células podem ser célu- las progenitoras ou células não progenitoras (por exemplo, diferencia- das). As células podem ser células primárias ou linhagens celulares (por exemplo, um mamífero, por exemplo, ser humano, linhagem celu- lar aqui descrita). Nas modalidades, as células cultivadas são células progenitoras, por exemplo, células do estroma da medula óssea, célu- las progenitoras adultas derivadas da medula (MAPCs), células proge- nitoras endoteliais (EPC), células blásticas, células progenitoras inter- mediárias formadas na zona subventricular, células-tronco neurais, músculo células-tronco, células-satélite, células-tronco do fígado, célu- las-tronco hematopoéticas, células do estroma da medula óssea, célu- las-tronco da epiderme, células-tronco embrionárias, células-tronco mesenquimais, células-tronco do cordão umbilical, células precurso- ras, células precursoras do músculo, mioblasto, cardiomioblasto, célu- las precursoras neurais, células precursoras gliais, células precursoras neuronais, hepatoblastos.
[00296] Em algumas modalidades, a célula fonte é uma célula en- dotelial, um fibroblasto, uma célula sanguínea (por exemplo, um ma- crófago, um neutrófilo, um granulócito, um leucócito), uma célula- tronco (por exemplo, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula- tronco do cordão umbilical, célula-tronco da medula óssea, uma célula- tronco hematopoética, uma célula-tronco pluripotente induzida, por exemplo, uma célula-tronco pluripotente induzida derivada de células de um indivíduo), uma célula-tronco embrionária (por exemplo, uma célula-tronco do saco vitelino embrionário, placenta, cordão umbilical, pele fetal, pele de adolescente, sangue, medula óssea, tecido adiposo, tecido eritropoiético, tecido hematopoético), um mioblasto, uma célula parenquimatosa (por exemplo, hepatócito), uma célula alveolar, um neurônio (por exemplo, uma célula neuronal da retina) uma célula pre- cursora (por exemplo, uma célula precursora da retina, um mieloblas- to, células precursoras mieloides, um timócito, um meiócito, um mega- carioblasto, um promegacarioblasto, um melanoblasto, um linfoblasto, uma célula precursora da medula óssea, um normoblasto ou um an- gioblasto), uma célula progenitora (por exemplo, uma célula progenito- ra cardíaca, uma célula satélite, uma célula gial radial, uma célula es- tromal da medula óssea, uma célula progenitora pancreática, uma cé- lula progenitora endotelial, uma célula blástica) ou uma célula imortali- zada (por exemplo, célula HeLa, HEK293, HFF-1, MRC-5, WI- 38, IMR 90, IMR 91, PER.C6, HT-1080 ou BJ).
[00297] As células cultivadas podem ser de tecido ou células epite- liais, conjuntivas, musculares ou nervosas e suas combinações. Fuso- soma pode ser gerado a partir de células cultivadas de qualquer sis- tema de órgão eucariótico (por exemplo, mamífero), por exemplo, a partir do sistema cardiovascular (coração, vasculatura); sistema diges- tivo (esôfago, estômago, fígado, vesícula biliar, pâncreas, intestinos, cólon, reto e ânus); sistema endócrino (hipotálamo, glândula pituitária, corpo pineal ou glândula pineal, tireoide, paratireoides, glândulas su- prarrenais); sistema excretor (rins, ureteres, bexiga); sistema linfático (linfa, nódulos linfáticos, vasos linfáticos, amígdalas, adenoides, timo, baço); sistema tegumentar (pele, cabelo, unhas); sistema muscular (por exemplo, músculo esquelético); sistema nervoso (cérebro, medula espinhal, nervos); sistema reprodutivo (ovários, útero, glândulas ma-
márias, testículos, vasos deferentes, vesículas seminais, próstata); sis- tema respiratório (faringe, laringe, traqueia, brônquios, pulmões, dia- fragma); sistema esquelético (osso, cartilagem) e suas combinações. Nas modalidades, as células são de um tecido altamente mitótico (por exemplo, um tecido saudável altamente mitótico, como epitélio, tecido embrionário, medula óssea, criptas intestinais). Nas modalidades, a amostra de tecido é um tecido altamente metabólico (por exemplo, te- cido esquelético, tecido neural, cardiomiócitos).
[00298] Em algumas modalidades, uma célula é uma célula em suspensão. Em algumas modalidades, uma célula é uma célula ade- rente.
[00299] Em algumas modalidades, as células são de um doador jovem, por exemplo, um doador de 25 anos, 20 anos, 18 anos, 16 anos, 12 anos, 10 anos, 8 anos de idade, 5 anos de idade, 1 ano de idade, ou menos. Em algumas modalidades, as células são de tecido fetal.
[00300] Em algumas modalidades, as células são derivadas de um indivíduo e administradas ao mesmo indivíduo ou a um indivíduo com uma assinatura genética semelhante (por exemplo, compatível com MHC).
[00301] Em certas modalidades, as células têm telômeros de tama- nho médio maior que 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 ou 10000 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, entre 4.000-10.000 nucleotídeos de comprimento, entre 6.000-10.000 nucleotídeos de comprimento)
[00302] Fusosomas podem ser gerados a partir de células geral- mente cultivadas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, as células podem ser cultivadas em 2 ou mais "fases", por exemplo, uma fase de crescimento, em que as células são cultivadas sob condições para multiplicar e aumentar a biomassa da cultura e uma fase de "produção", em que as células são cultivadas sob condições para alterar o fenótipo celular (por exemplo, para maxi- mizar o fenótipo mitocondrial, para aumentar o número ou diâmetro das mitocôndrias, para aumentar o estado de fosforilação oxidativa). Também pode haver uma fase de "expressão", em que as células são cultivadas sob condições para maximizar a expressão de proteínas fusogênicas ou agentes exógenos em relação à célula fonte, na mem- brana celular e para restringir a fusão indesejada em outras fases.
[00303] Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados a partir de células sincronizadas, por exemplo, durante uma fase de crescimento ou a fase de produção. Por exemplo, as células podem ser sincronizadas na fase G1 pela eliminação do soro do meio de cul- tura (por exemplo, por cerca de 12-24 horas) ou pelo uso no meio de cultura de inibidores da síntese de DNA, como timidina, aminopterina, hidroxiureia e citosina arabinosídeo. Métodos adicionais para sincroni- zação do ciclo celular de mamíferos são conhecidos e descritos, por exemplo, em Rosner et al. 2013. Nature Protocols 8: 602–626 (especi- ficamente Tabela 1 em Rosner).
[00304] Em algumas modalidades, as células podem ser avaliadas e opcionalmente enriquecidas para um fenótipo ou genótipo desejável para uso como uma fonte para a composição de fusosoma, como aqui descrito. Por exemplo, as células podem ser avaliadas e opcionalmen- te enriquecidas, por exemplo, antes da cultura, durante a cultura (por exemplo, durante uma fase de crescimento ou uma fase de produção) ou após a cultura, mas antes da produção de fusosoma, por exemplo, para um ou mais dentre: potencial de membrana (por exemplo, um po- tencial de membrana de -5 a -200 mV; teor de cardiolipina (por exem- plo, entre 1-20 % do lipídeo total); colesterol, fosfatidiletanolamina (PE), diglicerídeo (DAG), ácido fosfatídico (PA) ou ácido graxo (FA) conteúdo; qualidade genética > 80 %,> 85 %,> 90 %; expressão ou teor de fusogênio; expressão ou teor de carga.
[00305] Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados a partir de um clone celular identificado, escolhido ou selecionado com base em um fenótipo ou genótipo desejável para uso como uma fonte para a composição de fusosomas aqui descrita. Por exemplo, um clo- ne celular é identificado, escolhido ou selecionado com base na baixa carga de mutação mitocondrial, comprimento longo dos telômeros, es- tado de diferenciação ou uma assinatura genética particular (por exemplo, uma assinatura genética para corresponder a um receptor).
[00306] Uma composição de fusosomas aqui descrita pode ser composta por fusosomas de uma fonte celular ou de tecido, ou de uma combinação de fontes. Por exemplo, uma composição de fusosomas pode compreender fusosomas de fontes xenogênicas (por exemplo, animais, cultura de tecidos das células das espécies acima menciona- das), alogênicas, autólogas, de tecidos específicos, resultando em di- ferentes concentrações e distribuições de proteínas (fígado, esqueléti- co, neural, adiposo, etc.), a partir de células de diferentes estados me- tabólicos (por exemplo, glicolítico, respiração). Uma composição tam- bém pode compreender fusosomas em diferentes estados metabóli- cos, por exemplo, acoplado ou desacoplado, conforme descrito em outro lugar aqui.
[00307] Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados a partir de células fonte que expressam um fusogênio, por exemplo, um fusogênio aqui descrito. Em algumas modalidades, o fusogênio é dis- posto em uma membrana da célula fonte, por exemplo, uma membra- na de bicamada lipídica, por exemplo, uma membrana de superfície celular ou uma membrana subcelular (por exemplo, membrana lisos- sômica). Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados a partir de células fonte com um fusogênio disposto em uma membrana de superfície celular.
[00308] Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados indu- zindo brotamento de um exossoma, microvesícula, vesícula de mem- brana, vesícula de membrana extracelular, vesícula de membrana plasmática, vesícula de membrana plasmática gigante, corpo apoptóti- co, mitopartícula, pirenócito, lisossoma ou outra vesícula fechada por membrana.
[00309] Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados por indução da enucleação celular. A enucleação pode ser realizada usando ensaios como genético, químico (por exemplo, usando Acti- nomicina D, veja, Bayona-Bafaluy et al., "A chemical enucleation me- thod for the transfer of mitochondrial DNA to ρ° cells" Nucleic Acids Res. 2003 15 de agosto; 31 (16): e98), métodos mecânicos (por exemplo, compressão ou aspiração, veja, Lee et al., A comparative study on the efficiency of two enucleation methods in pig somatic cell nuclear transfer: effects of the squeezing and the aspiration methods." Anim Biotechnol. 2008; 19 (2): 71-9), ou combinações dos mesmos. A enucleação se refere não apenas à remoção completa do núcleo, mas também ao deslocamento do núcleo de sua localização típica, de mo- do que a célula contenha o núcleo, mas não seja funcional.
[00310] Nas modalidades, fazer um fusosoma compreende a pro- dução de fantasmas de células, vesículas de membrana plasmática gigante ou corpos apoptóticos. Nas modalidades, uma composição de fusosoma compreende um ou mais dos fantasmas celulares, vesículas de membrana plasmática gigante e corpos apoptóticos.
[00311] Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados indu- zindo a fragmentação celular. Em algumas modalidades, a fragmenta- ção celular pode ser realizada usando os seguintes métodos, incluin- do, mas não se limitando a: métodos químicos, métodos mecânicos (por exemplo, centrifugação (por exemplo, ultracentrifugação ou centri- fugação por densidade), congelamento-descongelamento ou sonica-
ção) ou combinações dos mesmos.
[00312] Em algumas modalidades, um fusosoma pode ser gerado a partir de uma célula fonte que expressa um fusogênio, por exemplo, como aqui descrito, por qualquer um, todos ou uma combinação dos seguintes métodos: i) induzir o brotamento de uma mitopartícula, exossoma ou outra vesícula fechada por membrana; ii) induzir a inativação nuclear, por exemplo, enucleação, por qualquer um dos seguintes métodos ou uma combinação dos mesmos: a) um método genético; b) um método químico, por exemplo, usando Actinomicina D; ou c) um método mecânico, por exemplo, compressão ou aspi- ração; ou iii) induzir a fragmentação celular, por exemplo, por qual- quer um dos seguintes métodos ou uma combinação dos mesmos: a) um método químico; b) um método mecânico, por exemplo, centrifugação (por exemplo, ultracentrifugação ou centrifugação por densidade); congelar - descongelar; ou sonicação.
[00313] Para evitar dúvidas, entende-se que, em muitos casos, a célula fonte realmente usada para fazer o fusosoma não estará dispo- nível para teste após a confecção do fusosoma. Assim, uma compara- ção entre uma célula fonte e um fusosoma não precisa testar a célula fonte que foi realmente modificada (por exemplo, enucleada) para fa- zer o fusosoma. Em vez disso, células de outra forma semelhantes à célula fonte, por exemplo, da mesma cultura, o mesmo genótipo, mesmo tipo de tecido, ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser testadas.
Modificações em Células Anteriores à Geração de Fusosoma
[00314] Em alguns aspectos, uma modificação é feita em uma célu- la, como a modificação de um indivíduo, tecido ou célula, antes da ge- ração de fusosoma. Tais modificações podem ser eficazes para, por exemplo, melhorar a fusão, expressão ou atividade de fusogênio, es- trutura ou função da carga, ou estrutura ou função da célula-alvo. (i) Modificações Físicas
[00315] Em algumas modalidades, uma célula é fisicamente modifi- cada antes de gerar o fusosoma. Por exemplo, conforme descrito em outro lugar aqui, um fusogênio pode ser ligado à superfície da célula.
[00316] Em algumas modalidades, uma célula é tratada com um agente químico antes de gerar o fusosoma. Por exemplo, a célula po- de ser tratada com um fusogênio químico ou lipídico, de modo que o fusogênio químico ou lipídico interaja não covalentemente ou covalen- temente com a superfície da célula ou incorpore-se na superfície da célula. Em algumas modalidades, a célula é tratada com um agente para aumentar as propriedades fusogênicas dos lipídeos na membra- na celular.
[00317] Em algumas modalidades, a célula é fisicamente modifica- da antes de gerar o fusosoma com um ou mais sítios de ligação cova- lentes ou não covalentes para pequenas moléculas ou lipídeos sintéti- cos ou endógenos na superfície da célula que realçam o direciona- mento do fusosoma para um órgão, tecidos ou tipo de célula.
[00318] Nas modalidades, um fusosoma compreende níveis aumen- tados ou diminuídos de uma molécula endógena. Por exemplo, o fuso- soma pode compreender uma molécula endógena que também ocorre naturalmente na célula fonte de ocorrência natural, mas em um nível superior ou inferior do que no fusosoma. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expresso a partir de um ácido nucleico exógeno na cé- lula fonte ou fusosoma. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é isolado de uma fonte e carregado ou conjugado a uma célula fonte ou fusosoma.
[00319] Em algumas modalidades, uma célula é tratada com um agente químico, por exemplo, molécula pequena, antes de gerar o fu- sosoma para aumentar a expressão ou atividade de um fusogênio en- dógeno na célula (por exemplo, em algumas modalidades, endógeno em relação à célula fonte, e em algumas modalidades, endógeno em relação à célula-alvo). Em algumas modalidades, uma molécula pe- quena pode aumentar a expressão ou atividade de um ativador trans- cricional do fusogênio endógeno. Em algumas modalidades, uma mo- lécula pequena pode diminuir a expressão ou atividade de um repres- sor transcricional do fusogênio endógeno. Em algumas modalidades, uma molécula pequena é um modificador epigenético que aumenta a expressão do fusogênio endógeno.
[00320] Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados a partir de células tratadas com compostos de interrupção de fusão, por exemplo, lisofosfatidilcolina. Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados a partir de células tratadas com reagentes de dissociação que não clivam fusogênios, por exemplo, Accutase.
[00321] Em algumas modalidades, uma célula fonte é fisicamente modificada com, por exemplo, ativadores CRISPR, antes de gerar um fusosoma para adicionar ou aumentar a concentração de fusogênios.
[00322] Em algumas modalidades, a célula é fisicamente modifica- da para aumentar ou diminuir a quantidade ou melhorar a estrutura ou função das organelas, por exemplo, mitocôndrias, aparelho de Golgi, retículo endoplasmático, vesículas intracelulares (como lisossomas, autofagossomas). (ii) Modificações Genéticas
[00323] Em algumas modalidades, uma célula é geneticamente modificada antes de gerar o fusosoma para aumentar a expressão de um fusogênio endógeno na célula (por exemplo, em algumas modali- dades, endógeno em relação à célula fonte, em algumas modalidades, endógeno em relação à célula-alvo. Em algumas modalidades, uma modificação genética pode aumentar a expressão ou atividade de um ativador transcricional do fusogênio endógeno. Em algumas modalida- des, uma modificação genética pode diminuir a expressão ou atividade de um repressor transcricional do fusogênio endógeno. Em algumas modalidades, o ativador ou repressor é um cas9 inativo de nuclease (dCas9) ligado a um ativador ou repressor transcricional que é direcio- nado ao fusogênio endógeno por um RNA guia. Em algumas modali- dades, uma modificação genética modifica epigeneticamente um gene de fusogênio endógeno para aumentar sua expressão. Em algumas modalidades, o ativador epigenético é um cas9 inativo de nuclease (dCas9) ligado a um modificador epigenético que é direcionado ao fu- sogênio endógeno por um RNA guia.
[00324] Em algumas modalidades, uma célula é geneticamente modificada antes de gerar o fusosoma para aumentar a expressão de um fusogênio exógeno na célula, por exemplo, liberação de um trans- gene. Em algumas modalidades, um ácido nucleico, por exemplo, DNA, mRNA ou siRNA, é transferido para a célula antes de gerar o fusosoma, por exemplo, para aumentar ou diminuir a expressão de uma molécula de superfície celular (proteína, glicano, lipídeo ou baixo peso molecular molécula) usada para o direcionamento de órgão, teci- do ou célula. Em algumas modalidades, o ácido nucleico direciona-se a um repressor de um fusogênio, por exemplo, um shRNA, construto de siRNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um ini- bidor de um repressor de fusogênio.
[00325] Em algumas modalidades, o método compreende a intro- dução de um ácido nucleico, que é exógeno em relação à célula fonte que codifica um fusogênio em uma célula fonte. O ácido nucleico exó-
geno pode ser, por exemplo, DNA ou RNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico exógeno pode ser, por exemplo, um DNA, um gDNA, um cDNA, um RNA, um pré-mRNA, um mRNA, um miRNA, um siRNA, etc. Em algumas modalidades, o DNA exógeno pode ser DNA linear, DNA circular ou um cromossoma artificial. Em algumas modalidades, o DNA é mantido epissomicamente. Em algumas modalidades, o DNA é integrado ao genoma. O RNA exógeno pode ser RNA quimicamente modificado, por exemplo, pode compreender uma ou mais modifica- ções de estrutura, modificações de açúcar, bases não canônicas ou tampas. As modificações da estrutura principal incluem, por exemplo, fosforotioato, N3’ fosforamidita, boranofosfato, fosfonoacetato, tio- PACE, morfolino fosforamiditas ou PNA. As modificações do açúcar incluem, por exemplo, 2′-O-Me, 2′F, 2′F-ANA, LNA, UNA e 2′-O-MOE. As bases não canônicas incluem, por exemplo, 5-bromo-U e 5-iodo-U, 2,6-diaminopurina, C-5 propinil pirimidina, difluorotolueno, difluoroben- zeno, diclorobenzeno, 2-tiouridina, pseudouridina e di-hidrouridina. Os limites incluem, por exemplo, ARCA. Modificações adicionais são dis- cutidas, por exemplo, em Deleavey et al., "Designing Chemically Modi- fied Oligonucleotides for Targeted Gene Silencing" Chemistry & Bio- logy Volume 19, Edição 8, 24 de agosto de 2012, Páginas 937-954, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[00326] Em algumas modalidades, uma célula é tratada com um agente químico, por exemplo, uma molécula pequena, antes de gerar o fusosoma para aumentar a expressão ou atividade de um fusogênio que é exógeno em relação à célula fonte na célula. Em algumas moda- lidades, uma molécula pequena pode aumentar a expressão ou ativi- dade de um ativador transcricional do fusogênio exógeno. Em algumas modalidades, uma molécula pequena pode diminuir a expressão ou atividade de um repressor transcricional do fusogênio exógeno. Em algumas modalidades, uma molécula pequena é um modificador epi-
genético que aumenta a expressão do fusogênio exógeno.
[00327] Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um fu- sogênio modificado. Por exemplo, um fusogênio que tem atividade fu- sogênica regulável, por exemplo, tipo específico de célula, tipo de teci- do ou atividade microambiental local. Tal atividade fusogênica regulá- vel pode incluir ativação e/ou iniciação da atividade fusogênica por baixo pH, alto pH, calor, luz infravermelha, atividade enzimática extra- celular (eucariótica ou procariótica) ou exposição de uma molécula pe- quena, uma proteína ou um lipídeo. Em algumas modalidades, a mo- lécula pequena, proteína ou lipídeo é exibido em uma célula-alvo.
[00328] Em algumas modalidades, uma célula é geneticamente modificada antes de gerar o fusosoma para alterar (ou seja, super- regular ou subregular) a expressão das vias de sinalização (por exem- plo, a via de Wnt/Beta-catenina). Em algumas modalidades, uma célu- la é geneticamente modificada antes de gerar o fusosoma para alterar (por exemplo, super-regular ou subregular) a expressão de um gene ou genes de interesse. Em algumas modalidades, uma célula é gene- ticamente modificada antes de gerar o fusosoma para alterar (por exemplo, super-regular ou subregular) a expressão de um ácido nu- cleico (por exemplo, um miRNA ou mRNA) ou ácidos nucleicos de in- teresse. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos, por exemplo, DNA, mRNA ou siRNA, são transferidos para a célula antes de gerar o fusosoma, por exemplo, para aumentar ou diminuir a expressão de vias de sinalização, genes ou ácidos nucleicos. Em algumas modali- dades, o ácido nucleico direciona-se a um repressor de uma via de sinalização, gene ou ácido nucleico, ou reprime uma via de sinaliza- ção, gene ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico codifica um fator de transcrição que super-regula ou sub-regula uma via de sinalização, gene ou ácido nucleico. Em algumas modali- dades, o ativador ou repressor é um cas9 inativo de nuclease (dCas9)
ligado a um ativador ou repressor transcricional que é direcionado para a via de sinalização, gene ou ácido nucleico por um RNA guia. Em al- gumas modalidades, uma modificação genética modifica epigenetica- mente uma via de sinalização endógena, gene ou ácido nucleico para sua expressão. Em algumas modalidades, o ativador epigenético é um cas9 inativo de nuclease (dCas9) ligado a um modificador epigenético que é direcionado para a via de sinalização, gene ou ácido nucleico por um RNA guia. Em algumas modalidades, o DNA de uma célula é editado antes de gerar o fusosoma para alterar (por exemplo, super- regular ou sub-regular) a expressão das vias de sinalização (por exemplo, a via de Wnt/Beta-catenina), gene ou ácido nucleico. Em al- gumas modalidades, o DNA é editado usando um RNA guia e CRISPR-Cas9/Cpf1 ou outra tecnologia de edição de gene.
[00329] Uma célula pode ser geneticamente modificada usando mé- todos recombinantes. Uma sequência de ácido nucleico que codifica um gene desejado pode ser obtida usando métodos recombinantes, tais como, por exemplo, rastreando bibliotecas de células que expres- sam o gene, derivando o gene de um vetor conhecido por incluir o mesmo, ou isolando diretamente de células e tecidos contendo o mesmo, usando técnicas padrão. Alternativamente, um gene de inte- resse pode ser produzido sinteticamente, em vez de clonado.
[00330] A expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos é tipicamente alcançada ligando operacionalmente um ácido nucleico que codifica o gene de interesse a um promotor e incorporando o construto em um vetor de expressão. Os vetores podem ser adequa- dos para replicação e integração em eucariotos. Os vetores de clona- gem típicos contêm terminadores de transcrição e translação, sequên- cias de iniciação e promotores úteis para a expressão da sequência de ácido nucleico desejada.
[00331] Em algumas modalidades, uma célula pode ser genetica-
mente modificada com uma ou mais regiões de expressão, por exem- plo, um gene.
Em algumas modalidades, a célula pode ser genetica- mente modificada com um gene exógeno (por exemplo, capaz de ex- pressar um produto de gene exógeno, como um RNA ou um produto polipeptídico) e/ou um ácido nucleico regulador exógeno.
Em algumas modalidades, a célula pode ser geneticamente modificada com uma sequência exógena que codifica um produto gênico que é endógeno a uma célula-alvo e/ou um ácido nucleico regulador exógeno capaz de modular a expressão de um gene endógeno.
Em algumas modalida- des, a célula pode ser geneticamente modificada com um gene exó- geno e/ou um ácido nucleico regulador que modula a expressão de um gene exógeno.
Em algumas modalidades, a célula pode ser genetica- mente modificada com um gene exógeno e/ou um ácido nucleico regu- lador que modula a expressão de um gene endógeno.
Será entendido por alguém versado na técnica que a célula aqui descrita pode ser ge- neticamente modificada para expressar uma variedade de genes exó- genos que codificam proteínas ou moléculas reguladoras, que podem, por exemplo, atuar sobre um produto gênico do genoma endógeno ou exógeno de uma célula-alvo.
Em algumas modalidades, tais genes conferem características ao fusosoma, por exemplo, modulam a fusão com uma célula-alvo.
Em algumas modalidades, a célula pode ser ge- neticamente modificada para expressar um gene endógeno e/ou ácido nucleico regulador.
Em algumas modalidades, o gene endógeno ou ácido nucleico regulador modula a expressão de outros genes endó- genos.
Em algumas modalidades, a célula pode ser geneticamente modificada para expressar um gene endógeno e/ou ácido nucleico re- gulador que é expresso de forma diferente (por exemplo, indutivelmen- te, especificamente de tecido, constitutivamente, ou em um nível supe- rior ou inferior) do que uma versão do endógeno gene e/ou ácido nu- cléico regulador em outros cromossomas.
[00332] Os elementos promotores, por exemplo, realçadores, regu- lam a frequência de iniciação da transcrição. Normalmente, estes es- tão localizados na região de 30-110 pb a montante do sítio de partida, embora vários promotores tenham recentemente demonstrado conter elementos funcionais a jusante do sítio de partida também. O espaça- mento entre os elementos do promotor frequentemente é flexível, de modo que a função do promotor é preservada quando os elementos são invertidos ou movidos em relação uns aos outros. No promotor da timidina cinase (tk), o espaçamento entre os elementos do promotor pode ser aumentado para 50 bp antes que a atividade comece a dimi- nuir. Dependendo do promotor, parece que os elementos individuais podem funcionar de forma cooperativa ou independente para ativar a transcrição.
[00333] Um exemplo de um promotor adequado é a sequência do promotor do citomegalovírus precoce imediato (CMV). Esta sequência promotora é uma sequência promotora constitutiva forte capaz de conduzir a níveis elevados de expressão de qualquer sequência poli- nucleotídica ligada operacionalmente a esta. Outro exemplo de um promotor adequado é Fator-1α de Crescimento de Alongamento (EF- 1α). No entanto, outras sequências promotoras constitutivas também podem ser utilizadas, incluindo, mas não se limitando ao promotor ini- cial do vírus símio 40 (SV40), vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus da imu- nodeficiência humana (HIV), promotor de MoMuLV, um promotor do vírus da leucemia aviária, um promotor precoce imediato do vírus Eps- tein-Barr, um promotor do vírus do sarcoma de Rous, bem como pro- motores do gene humano, tais como, mas não se limitando ao, promo- tor da actina, o promotor da miosina, o promotor da hemoglobina e o promotor da creatina cinase.
[00334] Além disso, a invenção não deve ser limitada ao uso de promotores constitutivos. Promotores indutíveis também são conside- rados como parte da invenção. A utilização de um promotor induzível proporciona uma mudança molecular capaz de ligar a expressão da sequência polinucleotídica à qual está operacionalmente ligada quan- do tal expressão é desejada, ou desligar a expressão quando a ex- pressão não é desejada. Exemplos de promotores indutíveis incluem, mas não estão limitados a um promotor específico de tecido, promotor de metalotionina, um promotor de glicocorticoide, um promotor de pro- gesterona e um promotor de tetraciclina. Em algumas modalidades, a expressão de um fusogênio é super-regulada antes dos fusosomas serem gerados, por exemplo, 3, 6, 9, 12, 24, 26, 48, 60 ou 72 horas antes dos fusosomas serem gerados.
[00335] O vetor de expressão a ser introduzido na fonte também pode conter um gene marcador selecionável ou um gene repórter ou ambos para facilitar a identificação e seleção de células que expres- sam a população de células que se pretende transfectar ou infectar através de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador selecioná- vel pode ser transportado em um pedaço separado de DNA e usado em um procedimento de cotransfecção. Ambos os marcadores seleci- onáveis e genes repórter podem ser flanqueados com sequências re- guladoras apropriadas para permitir a expressão nas células hospedei- ras. Os marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes de resistência a antibióticos, como neo e semelhantes.
[00336] Genes repórteres podem ser usados para identificar células potencialmente transfectadas e para avaliar a funcionalidade de se- quências reguladoras. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente ou é expresso pela fonte receptora e que codifica um polipeptídeo cuja expressão é manifestada por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A expressão do gene repórter é testada em um momento adequado após o DNA ter sido introduzido nas células receptoras. Genes repórter adequados podem incluir genes que codificam luciferase, beta-galactosidase, clo- ranfenicol acetil transferase, fosfatase alcalina segregada ou o gene da proteína fluorescente verde (por exemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Os sistemas de expressão adequados são bem conhecidos e podem ser preparados usando técnicas conhecidas ou obtidos comercialmente. Em geral, o construto com a região de flan- queamento 5' mínima mostrando o nível mais alto de expressão do gene repórter é identificado como o promotor. Tais regiões promotoras podem ser ligadas a um gene repórter e utilizadas para avaliar agentes quanto à capacidade de modular a transcrição dirigida por promotor.
[00337] Em algumas modalidades, uma célula pode ser genetica- mente modificada para alterar a expressão de uma ou mais proteínas. A expressão de uma ou mais proteínas pode ser modificada por um período de tempo específico, por exemplo, estado de desenvolvimento ou diferenciação da fonte. Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados a partir de uma fonte de células geneticamente modifica- das para alterar a expressão de uma ou mais proteínas, por exemplo, proteínas fusogênicas ou proteínas não fusogênicas que afetam a ati- vidade, estrutura ou função de fusão. A expressão de uma ou mais proteínas pode ser restrita a um local(is) específico(s) ou espalhada por toda a fonte.
[00338] Em algumas modalidades, a expressão de uma proteína fusogênica é modificada. Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados a partir de células com expressão modificada de uma proteína fusogênica, por exemplo, um aumento ou uma diminuição na expres- são de um fusogênio em pelo menos 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 % ou mais.
[00339] Em algumas modalidades, as células podem ser modifica- das para expressar uma enzima citosólica (por exemplo, proteases,
fosfatases, cinases, desmetilases, metiltransferases, acetilases) que direciona uma proteína fusogênica. Em algumas modalidades, a enzi- ma citosólica afeta um ou mais fusogênios, alterando as modificações pós-translação. Modificações de proteínas pós-translação de proteínas podem afetar a capacidade de resposta à disponibilidade de nutrientes e condições redox e interações proteína-proteína. Em algumas moda- lidades, um fusosoma compreende fusogênios com modificações pós- translacionais alteradas, por exemplo, um aumento ou uma diminuição nas modificações pós-translacionais em pelo menos 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 % ou mais.
[00340] Os métodos de introdução de uma modificação em uma célula incluem métodos físicos, biológicos e químicos. Veja, por exem- plo, Geng. & Lu, Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab on a Chip. 13(19):3803-21. 2013; Sharei, A. et al. A vec- tor-free microfluidic platform for intracellular delivery. PNAS vol. 110 no. 6. 2013; Yin, H. et al., Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15: 541–555. 2014. Métodos adequados para modificar uma célula para uso na geração de fusosomas aqui descritos incluem, por exemplo, difusão, osmose, pulsação osmótica, choque osmótico, lise hipotônica, diálise hipotônica, ionoforese, eletro- poração, sonicação, microinjeção, precipitação de cálcio, intercalação de membrana, transfecção mediada por lipídeos, tratamento com de- tergente, infecção viral, endocitose mediada por receptor, uso de do- mínios de transdução de proteína, disparo de partículas, fusão de membrana, congelamento-descongelamento, ruptura mecânica e fil- tração.
[00341] A confirmação da presença de uma modificação genética inclui uma variedade de ensaios. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de biologia molecular, tais como Southern e Northern blotting, RT-PCR e PCR; ensaios bioquímicos, como a detecção da presença ou ausência de um determinado peptídeo, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e Western blots) ou por ensaios aqui descritos. Modificações de Fusosoma
[00342] Em alguns aspectos, uma modificação é feita no fusosoma. Tais modificações podem ser eficazes para, por exemplo, melhorar o direcionamento, função ou estrutura.
[00343] Em algumas modalidades, o fusosoma é tratado com um fusogênio, por exemplo, um fusogênio químico aqui descrito, que pode se ligar de forma não covalente ou covalente à superfície da membra- na. Em algumas modalidades, o fusosoma é tratado com um fusogê- nio, por exemplo, uma proteína ou um fusogênio lipídico, que pode li- gar-se de forma não covalente ou covalente ou incorporar-se na mem- brana.
[00344] Em algumas modalidades, um ligante é conjugado à super- fície do fusosoma por meio de um grupo químico funcional (ácidos carboxílicos, aldeídos, aminas, sulfidrilas e hidroxilas) que está presen- te na superfície do fusosoma.
[00345] Esses grupos reativos incluem, sem limitação, grupos ma- leimida. Como um exemplo, os fusosomas podem ser sintetizados pa- ra incluir fosfolipídeos conjugados com maleimida, tais como, sem limi- tação, DSPE-MaL-PEG2000.
[00346] Em algumas modalidades, uma molécula pequena ou lipí- deo, sintético ou nativo, pode ser covalentemente ou não covalente ligada à superfície do fusosoma. Em algumas modalidades, um lipídeo de membrana no fusosoma pode ser modificado para promoVeja, in- duzir ou aumentar as propriedades fusogênicas.
[00347] Em algumas modalidades, o fusosoma é modificado carre- gando com proteínas modificadas (por exemplo, permitir nova funcio- nalidade, alterar modificações pós-translação, ligar-se à membrana mitocondrial e/ou proteínas da membrana mitocondrial, formar uma proteína clivável com uma função heteróloga, formar uma proteína destinados à degradação proteolítica, avaliar a localização e os níveis do agente ou administrar o agente como um veículo). Em algumas modalidades, um fusosoma é carregado com uma ou mais proteínas modificadas.
[00348] Em algumas modalidades, uma proteína exógena em rela- ção à célula fonte é ligada não covalentemente ao fusosoma. A proteí- na pode incluir um domínio clivável para liberação. Em algumas moda- lidades, a invenção inclui um fusosoma compreendendo uma proteína exógena com um domínio clivável.
[00349] Em algumas modalidades, o fusosoma é modificado com uma proteína destinada à degradação proteolítica. Uma variedade de proteases reconhece sequências de aminoácidos de proteínas especí- ficas e direciona as proteínas para degradação. Estas enzimas de de- gradação de proteínas podem ser utilizadas para degradar especifica- mente proteínas com uma sequência de degradação proteolítica. Em algumas modalidades, um fusosoma compreende níveis modulados de uma ou mais enzimas degradantes de proteínas, por exemplo, um aumento ou uma diminuição nas enzimas degradantes de proteínas em pelo menos 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 % ou mais.
[00350] Conforme aqui descrito, aditivos não fusogênicos podem ser adicionados ao fusosoma para modificar sua estrutura e/ou propri- edades. Por exemplo, colesterol ou esfingomielina podem ser adicio- nados à membrana para ajudar a estabilizar a estrutura e prevenir o vazamento da carga interna. Além disso, as membranas podem ser preparadas a partir de fosfatidilcolina de ovo hidrogenada ou fosfatidil- colina de ovo, colesterol e fosfato de dicetil. (veja, por exemplo, Spuch e Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Artigo ID 469679, 12 páginas, 2011. doi: 10.1155/2011/469679 para revisão).
[00351] Em algumas modalidades, o fusosoma compreende um ou mais grupos de direcionamento (por exemplo, uma proteína de direci- onamento) na superfície externa para direcionar uma célula específica ou tipo de tecido (por exemplo, cardiomiócitos). Esses grupos de dire- cionamento incluem, sem limitação, receptores, ligantes, anticorpos e semelhantes. Esses grupos de direcionamento ligam seu parceiro na superfície das células-alvo. Nas modalidades, a proteína de direcio- namento é específica para um marcador de superfície celular em uma célula-alvo aqui descrita, por exemplo, uma célula da pele, cardiomió- cito, hepatócito, célula intestinal (por exemplo, célula do intestino del- gado), célula pancreática, célula cerebral, célula da próstata, célula do pulmão, célula do cólon ou célula da medula óssea.
[00352] Em algumas modalidades, a proteína de direcionamento se liga a um marcador de superfície celular em uma célula-alvo. Nas mo- dalidades, o marcador da superfície celular compreende uma proteína, glicoproteína, receptor, ligante da superfície celular, proteína trans- membrana classe I, proteína transmembrana classe II ou proteína transmembrana classe III.
[00353] Em algumas modalidades, a porção de direcionamento é composta por um polipeptídeo que é um polipeptídeo separado do fu- sogênio. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreendendo uma porção de direcionamento compreende um domínio transmem- brana e um domínio de direcionamento extracelular. Nas modalidades, o domínio de direcionamento extracelular compreende um scFv, DARPin, nanocorpo, ligante de receptor ou antígeno. Em algumas mo- dalidades, o domínio de direcionamento extracelular compreende um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmentos Fv, fragmentos de anticorpo scFv, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1, anticorpos lineares, anticorpos de domínio único, como sdAb (tanto VL ou VH), ou domínios VHH de camelídeo), uma estrutura de fibronectina de ligação ao antígeno tipo III (Fn3), co- mo um minicorpo de polipeptídeo de fibronectina, um ligante, uma ci- tocina, uma quimiocina ou um receptor de células T (TCR).
[00354] Em algumas modalidades, o fusosoma aqui descrito é fun- cionalizado com um agente de diagnóstico. Exemplos de agentes de diagnóstico incluem, mas não estão limitados a, agentes de imagem comercialmente disponíveis usados em tomografia de emissão de pó- sitrons (PET), tomografia assistida por computador (CAT), tomografia computadorizada de emissão de fóton único, raio-x, fluoroscopia e imagem por ressonância magnética (MRI); e agentes de contraste. Exemplos de materiais adequados para uso como agentes de contras- te em MRI incluem quelatos de gadolínio, bem como ferro, magnésio, manganês, cobre e cromo.
[00355] Outro exemplo de introdução de grupos funcionais ao fuso- soma é durante a pós-preparação, por reticulação direta de fusosoma e ligantes com reticuladores homo ou heterobifuncionais. Este proce- dimento pode usar uma química adequada e uma classe de reticulado- res (CDI, EDAC, glutaraldeídos, etc. como discutido aqui) ou qualquer outro reticulador que acopla um ligante à superfície do fusosoma por meio de modificação química da superfície do fusosoma após a prepa- ração. Isso também inclui um processo pelo qual moléculas anfifílicas, como ácidos graxos, lipídeos ou estabilizadores funcionais, podem ser adsorvidos passivamente e aderidos à superfície do fusosoma, intro- duzindo, assim, grupos terminais funcionais para amarração aos ligan- tes. Carga
[00356] Em algumas modalidades, um fusosoma aqui descrito inclui uma carga que é ou compreende um agente de carga útil de proteína de membrana. Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana pode ser ou pode codificar uma proteína tera- pêutica. Um fusosoma pode incluir adicionalmente outra carga, por exemplo, em algumas modalidades, um fusosoma aqui descrito inclui uma carga que é ou compreende um agente terapêutico. Em algumas modalidades, um fusosoma aqui descrito inclui uma pluralidade de agentes de carga útil de membrana. Em algumas modalidades, um fusosoma aqui descrito inclui uma carga que é ou compreende uma pluralidade de agentes terapêuticos. Em algumas modalidades, um fusosoma compreende uma carga que compreende um ou mais agen- tes de carga útil de proteína de membrana e um ou mais agentes tera- pêuticos. Em algumas modalidades, uma carga pode ser um agente terapêutico que é exógeno ou endógeno em relação à célula fonte.
[00357] Em algumas modalidades, um fusosoma compreende uma carga associada à bicamada lipídica fusosoma. Em algumas modali- dades, um fusosoma compreende uma carga disposta dentro do lú- men do fusosoma. Em algumas modalidades, um fusosoma compre- ende uma carga associada à bicamada lipídica fusosoma e uma carga disposta dentro do lúmen do fusosoma.
[00358] Em algumas modalidades, uma carga não é expressa natu- ralmente em uma célula da qual o fusosoma é derivado. Em algumas modalidades, uma carga é expressa naturalmente na célula da qual um fusosoma é derivado. Em algumas modalidades, uma carga é um mutante de um ácido nucleico de tipo selvagem ou proteína expressa naturalmente em uma célula da qual o fusosoma é derivado ou é um tipo selvagem de um mutante expresso naturalmente em uma célula da qual um fusosoma é derivado.
[00359] Em algumas modalidades, uma carga é carregada em um fusosoma por meio da expressão em uma célula da qual o fusosoma é derivado (por exemplo, expressão de DNA introduzido por meio de transfecção, transdução ou eletroporação). Em algumas modalidades,
uma carga é expressa a partir de DNA integrado no genoma da célula da qual o fusosoma é derivado ou mantido episossoma na célula da qual o fusosoma é derivado. Em algumas modalidades, a expressão de uma carga é constitutiva na célula da qual o fusosoma é derivado. Em algumas modalidades, a expressão de uma carga na célula da qual o fusosoma é derivado é induzida. Em algumas modalidades, a expressão da carga é induzida na célula da qual o fusosoma é deriva- do imediatamente antes de gerar o fusosoma. Em algumas modalida- des, a expressão de uma carga na célula da qual o fusosoma é deri- vado é induzida ao mesmo tempo que a expressão do fusogênio na célula da qual o fusosoma é derivado.
[00360] Em algumas modalidades, uma carga é carregada eletropo- ração no próprio fusosoma ou em uma célula da qual o fusosoma é derivado. Em algumas modalidades, uma carga é carregada em um fusosoma via transfecção para o próprio fusosoma ou em uma célula da qual o fusosoma é derivado.
[00361] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma composição de fusosoma (por exemplo, uma composição farmacêutica) que com- preende: (i) um ou mais dentre um condrissoma (por exemplo, confor- me descrito no pedido internacional, PCT/US16/64251), uma mitocôn- dria, uma organela (por exemplo, mitocôndrias, lisossomas, núcleo, membrana celular, citoplasma, retículo endoplasmático, ribossomas, vacúolos, endossomas, espliceossomas, polimerases, capsídeos, acrossoma, autofagossoma, centríolo, glicossoma, glioxissoma, hidro- genossoma, melanossoma, mitossoma, miofibrila, cnidocisto, peroxis- soma, proteassoma, vesícula, grânulo de estresse e redes de organe- las), ou uma célula enucleada, por exemplo, uma célula enucleada compreendendo qualquer um dos anteriores, e (ii) um fusogênio, por exemplo, uma proteína miomarcadora.
[00362] Nas modalidades, o fusogênio está presente em uma bica-
mada lipídica externa à mitocôndria ou condrissoma. Nas modalida- des, o condrissoma tem uma ou mais das propriedades conforme des- crito, por exemplo, no pedido internacional, PCT/US16/64251, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, incluindo os Exem- plos e o Sumário da Invenção.
[00363] Em algumas modalidades, a carga pode incluir uma ou mais sequências de ácido nucleico, um ou mais polipeptídeos, uma combinação de sequências de ácido nucleico e/ou polipeptídeos, uma ou mais organelas e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a carga pode incluir um ou mais componentes celulares. Em algumas modalidades, a carga inclui um ou mais componentes ci- tosólicos e/ou nucleares.
[00364] Em algumas modalidades, a carga inclui um ácido nucleico, por exemplo, DNA, nDNA (DNA nuclear), mtDNA (DNA mitocondrial), DNA codificador de proteína, gene, óperon, cromossoma, genoma, transposon, retrotransposon, genoma viral, íntron, exon, DNA modifi- cado, mRNA (RNA mensageiro), tRNA (RNA de transferência), RNA modificado, microRNA, siRNA (pequeno RNA interferente), tmRNA (RNA mensageiro de transferência), rRNA (RNA ribossômico), mtRNA (RNA mitocondrial), snRNA (RNA nuclear pequeno), RNA nucleolar pequeno (snoRNA), SmY RNA (RNA de transligação de RNAm), gRNA (RNA guia), TERC (componente de RNA telomerase), aRNA (RNA antissentido), cis-NAT (transcrição antissentido Cis-natural), CRISPR RNA (crRNA), lncRNA (RNA não codificador longo), piRNA (RNA interagente com piwi), shRNA (RNA em formato de grampo de cabelo curto), tasiRNA (siRNA transativo), eRNA (RNA potenciador), RNA satélite, pcRNA (RNA codificador de proteína), dsRNA (RNA de fita dupla), RNAi (RNA interferente), circRNA (RNA circular), RNAs de reprogramação, aptâmeros e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a proteína é um ácido nucleico mutante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é uma fusão ou quimera de múltiplas sequências de ácido nucleico.
[00365] Em algumas modalidades, o DNA no fusosoma ou o DNA na célula da qual o fusosoma é derivado é editado para corrigir uma mutação genética usando uma tecnologia de edição de gene, por exemplo, um RNA guia e CRISPR-Cas9/Cpf1, ou usando uma endo- nuclease direcionada diferente (por exemplo, nucleases de ligador de zinco, nucleases semelhantes a ativadores de transcrição (TALENs)). Em algumas modalidades, a mutação genética está ligada a uma do- ença em um indivíduo. Exemplos de edições no DNA incluem peque- nas inserções/deleções, grandes deleções, correções de genes com DNA modelo ou grandes inserções de DNA. Em algumas modalida- des, a edição do gene é realizada com junção de extremidade não homóloga (NHEJ) ou reparo dirigido por homologia (HDR). Em algu- mas modalidades, a edição é um nocaute. Em algumas modalidades, a edição é um knock-in. Em algumas modalidades, ambos os alelos de DNA são editados. Em algumas modalidades, um único alelo é edita- do. Em algumas modalidades, várias edições são feitas. Em algumas modalidades, o fusosoma ou célula é derivado de um indivíduo, ou é geneticamente combinado com o indivíduo, ou é imunologicamente compatível com o indivíduo (por exemplo, tendo MHC semelhante).
[00366] Em algumas modalidades, a carga pode incluir um ácido nucleico. Por exemplo, a carga pode compreender RNA para aumentar a expressão de uma proteína endógena (por exemplo, em algumas modalidades, endógena em relação à célula fonte e, em algumas mo- dalidades, endógena em relação à célula-alvo), ou um siRNA ou miR- NA que inibe a proteína expressão de uma proteína endógena. Por exemplo, a proteína endógena pode modular a estrutura ou função nas células-alvo. Em algumas modalidades, a carga pode incluir um ácido nucleico que codifica uma proteína modificada que modula a estrutura ou função nas células-alvo. Em algumas modalidades, a carga é um ácido nucleico que direciona-se a um ativador transcricional que modu- la a estrutura ou função nas células-alvo.
[00367] Em algumas modalidades, a carga compreende um RNA autorreplicante, por exemplo, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante é RNA de fita simples e/ou RNA linear. Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante codifica um ou mais e proteínas, por exemplo, uma proteína aqui descrita, por exemplo, uma proteína de membrana ou uma proteína secretada. Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante compreende um genoma parcial ou completo de arterivírus ou alfavírus, ou uma variante dos mesmos.
[00368] Em algumas modalidades, a carga pode compreender um RNA que pode ser liberado a uma célula-alvo e o RNA é replicado dentro da célula-alvo. A replicação do RNA autorreplicante pode en- volver maquinário de replicação de RNA que é exógeno à célula hos- pedeira e/ou maquinário de replicação de RNA que é endógeno à célu- la hospedeira.
[00369] Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante compre- ende um genoma viral ou uma porção autorreplicante ou análogo des- te. Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante é de um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo. Em algumas modalidades, o RNA de autorreplicação compreende um genoma de arterivírus parcial ou completo, ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o arterivírus compreende vírus da arterite equina (EAV), vírus da sín- drome respiratória e reprodutiva suína (PRRSV), vírus da elevação da lactato desidrogenase (LDV) e vírus da febre hemorrágica símia (SHFV). Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante compreen- de um genoma de alfavírus parcial ou completo ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o alfavírus pertence ao grupo VE- EV/EEEV (por exemplo, vírus da encefalite equina venezuelana), o grupo SF ou o grupo SIN.
[00370] Em algumas modalidades, o fusosoma que compreende o RNA autorreplicante compreende ainda: (i) uma ou mais proteínas que promovem a replicação do RNA, ou (ii) um ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas que promovem a replicação do RNA, por exemplo, como parte do RNA autorreplicante ou em uma molécula de ácido nucleico separada.
[00371] Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante carece de pelo menos um gene funcional que codifica uma ou mais proteínas es- truturais virais em relação ao genoma de tipo selvagem corresponden- te. Por exemplo, em algumas modalidades, o RNA autorreplicante ca- rece totalmente de um ou mais genes para proteínas estruturais virais ou compreende um gene mutante não funcional para uma proteína es- trutural viral. Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante não compreende quaisquer genes para proteínas estruturais virais.
[00372] Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante compre- ende um realçador de capsídeo viral, por exemplo, conforme descrito no Pedido Internacional WO2018/106615, que é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o realçador de capsídeo viral é uma estrutura de RNA que aumenta a translação de uma sequência de codificação em cis, por exemplo, permitindo a translação independente de eIF2alfa da sequência de co- dificação. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira tem trans- lação prejudicada, por exemplo, devido à fosforilação mediada por PKR de eIF2alfa. Nas modalidades, o realçador do capsídeo viral compreende uma Alça a Jusante (DLP) de uma proteína do capsídeo viral ou uma variante da DLP. Em algumas modalidades, o realçador de capsídeo viral é de um vírus pertencente à família Togaviridae, por exemplo, o gênero Alphavirus da família Togaviridae. Em algumas modalidades, o realçador de capsídeo viral tem uma sequência de SEQ ID NO: 1 de WO2018/106615 (cuja sequência é aqui incorporada por referência em sua totalidade), ou uma sequência com pelo menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % de identidade com o mesmo. Em algumas modalidades, a sequência tem a mesma estrutura secun- dária mostrada na Fig. 1 do WO2018/106615.
[00373] Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante compre- ende uma ou mais sequências de arterivírus, por exemplo, conforme descrito no Pedido Internacional WO2017/180770, que é aqui incorpo- rado por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante compreende ORF7 (ou um fragmento funcional ou variante do mesmo) e/ou o RNA autorreplicante carece de um ORF2a funcional (por exemplo, carece totalmente de ORF2a, ou com- preende um mutante não funcional de ORF2a) de um arterivírus. Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante carece de um ORF2b funcional, ORF3, ORF4, ORF5a, ORF5 ou ORF6 ou qualquer combi- nação dos mesmos (por exemplo, carece totalmente da (s) sequência (s) ou compreende um mutante não funcional da (s) sequência (s)). Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante carece de uma por- ção de um ou mais dentre ORF2a, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5a, ORF5 ou ORF6. Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante compreende um ou mais promotores subgenômicos (sg), por exemplo, situados em um sítio não nativo. Em algumas modalidades, o promotor compreende o promotor 1 sg, o promotor 2 sg, o promotor 3 sg, o promotor 4 sg, o promotor 5 sg, o promotor 6 sg, o promotor 7 sg ou um fragmento funcional ou variante dos mesmos. Em algumas modali- dades, o RNA autorreplicante compreende um ou mais sinais de ter- minação da transcrição, por exemplo, sinais de terminação da transcri- ção T7, por exemplo, um sinal de terminação da transcrição T7 mutan-
te, por exemplo, um sinal de terminação da transcrição T7 mutante compreendendo um ou mais dentre (por exemplo, qualquer dois ou todos os) T9001G, T3185A ou G3188A.
[00374] Em algumas modalidades, o RNA autorreplicante compre- ende uma 5’ UTR, por exemplo, uma 5' UTR de alfavírus mutante, por exemplo, conforme descrito no Pedido Internacional WO2018/07 5235, que é incorporado por meio deste por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o 5’ UTR de alfavírus mutante compreende uma ou mais substituições de nucleotídeos na posição 1, 2, 4 ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a 5’ UTR de al- favírus mutante compreende uma substituição U -> G na posição 2.
[00375] Em algumas modalidades, a carga inclui um polipeptídeo, por exemplo, enzimas, polipeptídeos estruturais, polipeptídeos de sina- lização, polipeptídeos reguladores, polipeptídeos de transporte, poli- peptídeos sensoriais, polipeptídeos motores, polipeptídeos de defesa, polipeptídeos de armazenamento, fatores de transcrição, anticorpos, citocinas, hormônios, polipeptídeos catabólicos, polipeptídeos anabóli- cos, polipeptídeos proteolíticos, polipeptídeos metabólicos, cinases, transferases, hidrolases, liases, isomerases, ligases, polipeptídeos moduladores de enzima, polipeptídeos de ligação de proteínas, poli- peptídeos de ligação de lipídeos, polipeptídeos de fusão de membra- na, polipeptídeos de diferenciação celular, polipeptídeos de transporte nuclear epigenético, polipeptídeos, polipeptídeos de ligação de ácido nucleico, polipeptídeos de reprogramação, polipeptídeos de edição de DNA, polipeptídeos de reparo de DNA, polipeptídeos de recombinação de DNA, polipeptídeos de transposase, polipeptídeos de integração de DNA, endonucleases direcionadas (por exemplo, nucleases de ligador de zinco, nucleases semelhantes a ativadores de transcrição (TA- LENs), cas9 e homólogos dos mesmos), recombinases e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a proteína dire-
ciona uma proteína na célula para degradação. Em algumas modali- dades, a proteína direciona uma proteína na célula para degradação, localizando a proteína no proteassoma. Em algumas modalidades, a proteína é uma proteína de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a proteína é uma proteína mutante. Em algumas modalidades, a prote- ína é uma proteína de fusão ou quimérica.
[00376] Em algumas modalidades, a carga inclui uma molécula pe- quena, por exemplo, íons (por exemplo, Ca2+, Cl-, Fe2+), carboidratos, lipídeos, espécies reativas de oxigênio, espécies reativas de nitrogê- nio, isoprenoides, moléculas de sinalização, heme, cofatores polipeptí- dicos, compostos receptores de elétrons, compostos doadores de elé- trons, metabólitos, ligantes e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a molécula pequena é um produto farmacêutico que interage com um alvo na célula. Em algumas modalidades, a mo- lécula pequena direciona uma proteína na célula para degradação. Em algumas modalidades, a molécula pequena direciona uma proteína na célula para degradação, localizando a proteína no proteassoma. Em algumas modalidades, essa molécula pequena é uma molécula quimé- rica de proteólise (PROTAC).
[00377] Em algumas modalidades, a carga inclui uma mistura de proteínas, ácidos nucleicos ou metabólitos, por exemplo, polipeptídeos múltiplos, ácidos nucleicos múltiplos, moléculas pequenas múltiplas; combinações de ácidos nucleicos, polipeptídeos e pequenas molécu- las; complexos de ribonucleoproteína (por exemplo, complexo Cas9- gRNA); fatores de transcrição múltiplos, fatores epigenéticos múltiplos, fatores de reprogramação (por exemplo, Oct4, Sox2, cMyc e Klf4); RNAs reguladores múltiplos; e qualquer combinação dos mesmos.
[00378] Em algumas modalidades, a carga inclui uma ou mais or- ganelas, por exemplo, condrissomas, mitocôndrias, lisossomas, nú- cleo, membrana celular, citoplasma, retículo endoplasmático, ribosso-
mas, vacúolos, endossomas, espliceossomas, polimerases, capsí- deos, acrossoma, autofagossoma, centríolo, glicossoma, glioxissoma, hidrogenossoma, melanossoma, mitossoma, miofibrila, cnidocisto, pe- roxissoma, proteassoma, vesícula, grânulo de estresse, redes de or- ganelas e qualquer combinação dos mesmos.
[00379] Em algumas modalidades, a carga é enriquecida no fuso- soma ou membrana celular. Em algumas modalidades, a carga é enri- quecida por direcionamento para a membrana por meio de uma se- quência de sinal de peptídeo. Em algumas modalidades, a carga é en- riquecida pela ligação com uma proteína, lipídeo ou molécula pequena associada à membrana. Em algumas modalidades, a carga é enrique- cida por dimerização com uma proteína, lipídeo ou molécula pequena associada à membrana. Em algumas modalidades, a carga é quiméri- ca (por exemplo, uma proteína quimérica ou ácido nucleico) e compre- ende um domínio que media a ligação ou dimerização com uma prote- ína, lipídeo ou molécula pequena associada à membrana. Proteínas associadas à membrana de interesse incluem, mas não estão limita- das a, qualquer proteína tendo um domínio que se associa de forma estável, por exemplo, se liga a, integra, etc., uma membrana celular (ou seja, um domínio de associação de membrana), onde tais domí- nios pode incluir domínios miristoilados, domínios farnesilados, domí- nios transmembranas e semelhantes. Proteínas específicas associa- das à membrana de interesse incluem, mas não estão limitadas a: pro- teínas miristoiladas, por exemplo, p 60 v-src e semelhantes; proteínas farnesiladas, por exemplo, Ras, Rheb e CENP-E, F, proteínas que se ligam a componentes de bicamada lipídica específicos, por exemplo, AnexinaV, por ligação a fosfatidilserina, um componente lipídico da bicamada da membrana celular e semelhantes; proteínas âncora de membrana; proteínas transmembranas, por exemplo, receptores de transferrina e porções destes; e proteínas de fusão de membrana. Em algumas modalidades, a proteína associada à membrana contém um primeiro domínio de dimerização.
O primeiro domínio de dimerização pode ser, por exemplo, um domínio que se liga diretamente a um se- gundo domínio de dimerização de uma carga ou se liga a um segundo domínio de dimerização por meio de um mediador de dimerização.
Em algumas modalidades, a carga contém um segundo domínio de dime- rização.
O segundo domínio de dimerização pode ser, por exemplo, um domínio que dimeriza (por exemplo, estavelmente se associa com, tal como por interação de ligação não covalente, seja diretamente ou através de um mediador) com o primeiro domínio de dimerização da proteína associada à membrana, seja diretamente ou através um me- diador de dimerização.
Com relação aos domínios de dimerização, es- ses domínios são domínios que participam de um evento de ligação, seja diretamente ou por meio de um mediador de dimerização, onde o evento de ligação resulta na produção do multimérico desejado, por exemplo, dimérico, complexo da membrana associada e proteínas al- vo.
Os primeiro e o segundo domínios de dimerização podem ser ho- modiméricos, de modo que sejam feitos da mesma sequência de ami- noácidos, ou heterodiméricos, de modo que sejam feitos de diferentes sequências de aminoácidos.
Os domínios de dimerização podem vari- ar, onde os domínios de interesse incluem, mas não estão limitados a: ligantes de biomoléculas alvo, como ligantes que se ligam especifica- mente a proteínas específicas de interesse (por exemplo, proteína: domínios de interação de proteína), como domínios SH2, domínios Paz, Domínios RING, domínios ativadores transcricionais, domínios de ligação de DNA, domínios catalíticos de enzimas, domínios regulado- res de enzimas, subunidades de enzimas, domínios para localização em uma localização celular definida, domínios de reconhecimento para o domínio de localização, os domínios listados na URL: pawson- lab.mshri.on.ca/index.php?option=com_content&task=view&id=30&Ite mid=63/, etc. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de dimeri- zação se liga ao ácido nucleico (por exemplo, mRNA, miRNA, siRNA, DNA) e o segundo domínio de dimerização é uma sequência de ácido nucleico presente na carga (por exemplo, o primeiro domínio de dime- rização é MS2 e o segundo domínio de dimerização é a alça de liga- ção de alta afinidade do RNA de MS2). Qualquer composto convenien- te que funcione como um mediador de dimerização pode ser empre- gado. Uma grande variedade de compostos, incluindo substâncias na- turais e sintéticas, podem ser usados como mediadores de dimeriza- ção. Os critérios aplicáveis e prontamente observáveis ou mensuráveis para selecionar um mediador de dimerização incluem: (A) o ligante é fisiologicamente aceitável (isto é, não tem toxicidade indevida para a célula ou animal para o qual deve ser usado); (B) tem uma faixa de dosagem terapêutica razoável; (C) pode atravessar as membranas ce- lulares e outras, conforme necessário (onde em alguns casos pode ser capaz de mediar a dimerização de fora da célula), e (D) se liga aos domínios alvo das proteínas quiméricas para as quais é modificado com afinidade razoável para a aplicação desejada. Um primeiro critério desejável é que o composto seja relativamente fisiologicamente inerte, mas para sua atividade mediadora de dimerização. Em alguns casos, os ligantes serão não peptídicos e não nucleicos. Domínios de dimeri- zação adicionais são descritos, por exemplo, em US20170087087 e US20170130197, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Agentes de Carga Útil
[00380] Os métodos e composições aqui descritos podem ser usa- dos para direcionar os agentes de carga útil. Por exemplo, os agentes de carga útil podem ser direcionados para uma membrana celular, por exemplo, através do uso de um sinal de retículo endoplasmático (ER) cotranslacional. A membrana celular pode ser, por exemplo, uma membrana ER, uma membrana plasmática, membrana de vesículas secretadas e/ou secretoras ou membrana lisossômica. Em algumas modalidades, os agentes de carga útil são direcionados para a secre- ção. Em algumas modalidades, os métodos e composições aqui des- critos podem ser usados para direcionar cargas úteis para o lúmen de uma organela (por exemplo, um aparelho de Golgi, vesícula secretora ou lisossoma) após a translação no ER.
[00381] Um agente de carga de proteína (por exemplo, um agente de carga de proteína de membrana ou um agente de carga de proteína secretada) pode ser ou compreender, por exemplo, uma proteína ou um ácido nucleico que codifica uma proteína, selecionado a partir de: uma proteína transmembrana, uma proteína de superfície celular, uma proteína associada com o lado citosólico de uma membrana, uma pro- teína de retículo endoplasmático, uma proteína de lisossoma, uma pro- teína de aparelho de Golgi, uma proteína secretada, uma proteína de vesícula secretória ou uma proteína endossômica ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o agente de carga útil da pro- teína de membrana é uma versão exógena de uma proteína que está naturalmente presente ou direcionada para a membrana alvo. Em al- gumas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana não está naturalmente presente ou direcionado para a membrana alvo. Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteína (por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana ou um agente de carga útil de proteína secretada) pode ser ou compreender, por exemplo, uma proteína ou um ácido nucleico que codifica uma pro- teína, selecionado a partir de: uma proteína receptora de superfície celular, um transportador, um canal iônico, uma enzima associada à membrana, uma proteína de adesão celular, uma imunoglobulina, um receptor de células T, uma proteína de retículo endoplasmático, uma proteína de lisossoma, uma proteína secretada, uma proteína de vesí-
cula secretora, uma proteína endossômica. Um agente de carga útil de proteína de membrana pode ser, por exemplo, uma versão recombi- nante de uma proteína de membrana de ocorrência natural, ou uma proteína sintética, por exemplo, uma proteína com uma sequência não encontrada na natureza ou domínios não encontrados juntos na natu- reza, por exemplo, uma proteína de membrana quimérica, por exem- plo, uma proteína transmembrana tendo um domínio extracelular deri- vado de uma primeira proteína de ocorrência natural e um domínio transmembrana e/ou domínio intracelular derivado de uma segunda proteína de ocorrência natural, por exemplo, um receptor de antígeno quimérico.
[00382] Em algumas modalidades, um fusosoma compreende um agente de carga útil de proteína (por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana ou um agente de carga útil de proteína se- cretada). Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteí- na é uma proteína e/ou um ácido nucleico que o codifica. Em algumas modalidades, a proteína é expressa em uma linhagem celular e, em seguida, incorporada em um fusosoma. Uma pessoa com habilidade comum apreciará que na medida em que qualquer uma dessas proteí- nas é expressa pela linhagem celular, a linhagem celular é capaz de qualquer processamento pós-translação necessário para fazer a prote- ína. Em algumas modalidades, o processamento pós-translação com- preende um ou mais dentre ligação de proteínas, clivagem de proteí- nas, duplicação de proteínas, glicosilação de proteínas, dimerização, etc.
[00383] Em algumas modalidades, a proteína (por exemplo, proteí- na de membrana ou proteína secretada) é expressa pela célula fonte da qual um fusosoma é derivado. Uma pessoa versada apreciará que na medida em que qualquer uma dessas proteínas é expressa pela célula fonte, a célula fonte é capaz de qualquer processamento pós-
translação necessário para preparar a proteína. Em algumas modali- dades, o processamento pós-translação compreende um ou mais den- tre ligação de proteína, clivagem de proteína, duplicação de proteína, glicosilação de proteína, dimerização, etc. Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteína é um ácido nucleico. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica uma proteína da superfície ce- lular. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica uma proteína de retículo endoplasmático, uma proteína de lisossoma, uma proteína de aparelho de Golgi, uma proteína secretada, uma proteína de vesí- cula secretora ou uma proteína endossômica. Em algumas modalida- des, um agente de carga útil de proteína, por exemplo, agente de car- ga útil de proteína de membrana, é uma proteína ou ácido nucleico que codifica uma proteína selecionada a partir dos antígenos de super- fície celular aqui descritos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica uma proteína de superfície celular modificada. Em algumas modalidades, uma proteína de superfície celular modificada é um re- ceptor de antígeno quimérico.
[00384] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína (por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana ou um agente de carga útil de proteína secretada) compreende um ácido nucleico que é expresso pela célula-alvo fundida. Uma pessoa versada apreciará que na medida em que qualquer proteína produzida pela expressão de um agente de carga útil de membrana de proteína de ácido nucleico requeira processamento pós-translação, tal proces- samento pós-translação será realizado na célula-alvo fundida. Em al- gumas modalidades, a pós-translação pode compreender um ou mais dentre ligação de proteínas, clivagem de proteínas, duplicação de pro- teínas, glicosilação de proteínas, dimerização, etc. Em algumas moda- lidades, a modificação pós-translação é uma ligação covalente de um lipídeo, como um ácido graxo, isoprenoide, esterol, fosfolipídeo, glico-
silfosfatidil inositol (GPI), colesterol, farnesila, geranilgeranila, miristoí- la, palmitoíla, que em algumas modalidades direciona a proteína para a membrana plasmática.
[00385] Em algumas modalidades, o agente de carga útil de proteí- na (por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana ou um agente de carga útil de proteína secretada) compreende um ácido nucleico, por exemplo, RNA ou DNA. Em algumas modalidades, o áci- do nucleico é, compreende ou consiste em um ou mais resíduos de ácido nucleico naturais. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é, compreende ou consiste em um ou mais análogos de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o ácido nucleico tem uma sequência de nu- cleotídeos que codifica um produto gênico funcional, como um RNA ou proteína. Em algumas modalidades, o ácido nucleico inclui um ou mais íntrons. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são preparados por um ou mais dentre isolamento de uma fonte natural, síntese enzi- mática por polimerização com base em um modelo complementar (in vivo ou in vitro), reprodução em uma célula ou sistema recombinante e síntese química. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ou mais resíduos de comprimento. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é parcial ou totalmente de fita simples; em algumas modalidades, o ácido nucleico é parcial ou totalmente de fita dupla. Em algumas modalidades, o ácido nucleico tem uma sequência de nucleo- tídeos compreendendo pelo menos um elemento que codifica, ou é o complemento de uma sequência que codifica, um polipeptídeo. O áci- do nucleico pode incluir variantes, por exemplo, tendo uma identidade de sequência geral com um ácido nucleico de referência de pelo me-
nos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 %. Em algumas modalidades, um ácido nucleico variante não compartilha pelo menos um elemento de sequência ca- racterístico com um ácido nucleico de referência.
Em algumas modali- dades, um ácido nucleico variante compartilha uma ou mais das ativi- dades biológicas do ácido nucleico de referência.
Em algumas modali- dades, uma variante de ácido nucleico tem uma sequência de ácido nucleico que é idêntica à da referência, mas para um pequeno número de alterações de sequência em posições particulares.
Em algumas modalidades, menos de cerca de 20 %, cerca de 15 %, cerca de 10 %, cerca de 9 %, cerca de 8 %, cerca de 7 %, cerca de 6 %, cerca de 5 %, cerca de 4 %, cerca de 3 % ou cerca de 2 % dos resíduos em uma variante são substituídos, inseridos ou deletados, em comparação com a referência.
Em algumas modalidades, um ácido nucleico variante compreende cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2 ou cerca de 1 resíduo substituído em comparação com uma referência.
Em algumas modali- dades, um ácido nucleico variante compreende um número muito pe- queno (por exemplo, menos do que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2 ou cerca de 1) número de resíduos funcionais substituídos, inseridos ou deletados que participam de uma determinada atividade biológica em relação à referência.
Em algumas modalidades, um ácido nucleico variante compreende não mais do que cerca de 15, cerca de 12, cerca de 9, cerca de 3 ou cerca de 1 adição ou deleção e, em al- gumas modalidades, não compreende adições ou deleções, em com- paração com a referência.
Em algumas modalidades, um ácido nuclei- co variante compreende menos do que cerca de 27, cerca de 24, cer- ca de 21, cerca de 18, cerca de 15, cerca de 12, cerca de 9, cerca de 6, cerca de 3 ou menos do que cerca de 9, cerca de 6, cerca de 3, ou cerca de 2 adições ou deleções em comparação com a referência.
[00386] Em algumas modalidades, o agente de carga útil de proteí- na (por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana ou um agente de carga útil de proteína secretada) compreende uma pro- teína.
A proteína pode incluir porções diferentes de aminoácidos (por exemplo, pode ser glicoproteínas, proteoglicanos, etc.) e/ou pode ser processada ou modificada de outra forma.
A proteína pode às vezes incluir mais de uma cadeia polipeptídica, por exemplo, ligada por uma ou mais ligações dissulfeto ou associada por outros meios.
A proteína pode conter L-aminoácidos, D-aminoácidos ou ambos e pode conter qualquer uma de uma variedade de modificações de aminoácidos ou análogos.
Em algumas modalidades, as proteínas podem compreen- der aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais, aminoácidos sin- téticos e combinações dos mesmos.
Em algumas modalidades, as pro- teínas são anticorpos, fragmentos de anticorpos, porções biologica- mente ativas dos mesmos e/ou porções características dos mesmos.
Um polipeptídeo pode incluir suas variantes, por exemplo, tendo uma identidade de sequência geral com um polipeptídeo de referência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 %. Em algumas modalidades, um poli- peptídeo variante não compartilha pelo menos um elemento de se- quência característica com um polipeptídeo de referência.
Em algumas modalidades, um polipeptídeo variante compartilha uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de referência.
Em algumas mo- dalidades, uma variante de polipeptídeo tem uma sequência de ami- noácidos que é idêntica à da referência, mas para um pequeno núme- ro de alterações de sequência em posições particulares.
Em algumas modalidades, menos de cerca de 20 %, cerca de 15 %, cerca de 10 %, cerca de 9 %, cerca de 8 %, cerca de 7 %, cerca de 6 %, cerca de 5 %, cerca de 4 %, cerca de 3 % ou cerca de 2 % dos resíduos em uma variante são substituídos, inseridos ou deletados, em comparação com a referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo variante com- preende cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2 ou cerca de 1 resíduo substituído em comparação com uma referência. Em algumas modali- dades, um polipeptídeo variante compreende um número muito pe- queno (por exemplo, menos do que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2 ou cerca de 1) número de substituídos, inseridos ou deleta- dos, funcionais que participam de uma atividade biológica particular em relação à referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo variante compreende não mais do que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2 ou cerca de 1 adição ou deleção e, em algumas mo- dalidades, não compreende adições ou deleções, em comparação com a referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo variante compreende menos do que cerca de 25, cerca de 20, cerca de 19, cerca de 18, cerca de 17, cerca de 16, cerca de 15, cerca de 14, cerca de 13, cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, e comumente menos do que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2 adições ou deleções em comparação com a referência. Sequências de Sinal
[00387] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína (por exemplo, um agente de carga útil de proteína de membrana ou um agente de carga útil de proteína secretada) é uma proteína (ou ácido nucleico que a codifica) que inclui ou incluiu uma sequência de sinal que direciona a proteína para um determinado sítio ou local (por exemplo, para a superfície da célula). Aqueles versados na técnica apreciarão que, em certos casos, uma célula usa "sinais de classifica- ção" que são motivos de aminoácidos que são pelo menos temporari- amente parte de uma proteína (por exemplo, quando inicialmente pro- duzida), para direcionar a proteína para uma localização subcelular particular (por exemplo, para uma organela ou superfície específica membrana de uma célula-alvo). Em algumas modalidades, um sinal de classificação é uma sequência de sinal, um peptídeo de sinal ou uma sequência líder, que direciona uma proteína para uma organela cha- mada retículo endoplasmático (ER); em algumas dessas modalidades, a proteína é então liberada à membrana plasmática. Consulte US20160289674A1. Em algumas dessas modalidades, a proteína é então secretada. Em algumas dessas modalidades, a proteína é então trafegada para o lisossoma. Em algumas dessas modalidades, a prote- ína é então trafegada para o aparelho de Golgi. Em algumas dessas modalidades, a proteína é, então, trafegada para uma vesícula secre- tora e pode então ser secretada pela célula. Em algumas dessas mo- dalidades, a proteína é, então, trafegada para um endossoma.
[00388] Em algumas modalidades, o direcionamento da proteína para o ER é cotranslacional. Em algumas modalidades, a translocação de proteínas e a inserção na membrana são acopladas à síntese de proteínas. Em algumas modalidades, uma sequência de sinal pode ser hidrofóbica. Em algumas modalidades, uma sequência de sinal pode ser parcialmente hidrofóbica. Em algumas modalidades, uma sequên- cia de sinal é reconhecida por uma partícula de reconhecimento de sinal (SRP). Em algumas modalidades, a SRP reconhece uma se- quência de sinal conforme ela emerge de um ribossoma. Em algumas modalidades, um complexo nascente de cadeia de peptídeo- ribossoma é direcionado ao ER por ligação a um receptor de SRP. Em algumas modalidades, uma sequência de sinal interage com uma su- bunidade Sec61α de uma translocação e inicia a translocação de uma proteína de membrana ou cadeia parcial da referida proteína de mem- brana.
[00389] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana compreende uma fusão em estrutura de uma pro- teína de interesse para a sequência de codificação de uma proteína transmembrana, ou uma fusão em estrutura de uma proteína de inte- resse para o domínio transmembrana ou domínio de ancoragem à membrana de uma proteína (por exemplo, fusão com o domínio ânco- ra da membrana do receptor da transferrina). Veja, por exemplo, Winndard, P, et al. Development of novel chimeric transmembrane pro- teins for multimodality imaging of cancer cells, Cancer Biology & The- rapy. 12:1889-1899 (2007).
[00390] Em algumas modalidades, um sinal de classificação ou peptídeo de sinal é anexado ao terminal N ou C de uma proteína (por exemplo, proteína de membrana ou proteína secretada). Veja Goder, V. & Spiess, M., Topogenesis of membrane proteins: determinants and dynamics. FEBS Letters. 504 (3): 87-93 (2001). Em algumas modali- dades, a proteína é uma proteína natural. Em algumas modalidades, a proteína de membrana é uma proteína sintética.
[00391] Em algumas modalidades, um sinal emerge do ribossoma apenas depois que a translação de um transcrito atingiu um códon de interrupção. Em algumas modalidades, a inserção de uma proteína de membrana é pós-translação.
[00392] Em algumas modalidades, uma sequência de sinal é sele- cionada da Tabela 4. Em algumas modalidades, uma sequência de sinal compreende uma sequência selecionada da Tabela 4. Em algu- mas modalidades, uma sequência de sinal da Tabela 4 pode ser ane- xada ao terminal N de uma proteína, por exemplo, uma proteína de membrana ou proteína secretada. Em algumas modalidades, uma se- quência de sinal da Tabela 4 pode ser anexada ao terminal C de uma proteína, por exemplo, uma proteína de membrana ou proteína secre- tada. Alguém versado na técnica apreciará que as sequências de sinal abaixo não são limitadas para uso com suas respectivas proteínas na- turalmente associadas. Em algumas modalidades, o ácido nucleico inclui um ou mais elementos reguladores que direcionam a expressão de sequências que codificam a proteína de membrana pela célula- alvo. Tabela 4: Sequências de sinal exemplares. SEQ Sequência de Sinal Proteína Na- Proteína Associ- ID NO: turalmente ada à Localização Associada é Direcionada 2 MRVKEKYQHL HIV-1 gp41 Membrana de WRWGWKWGTM plasma
LLGILMICSA TE 3 CAAL p21ras Membrana de plasma 4 KKKKKK p21ras Membrana de plasma 5 RRRRR p21ras Membrana de plasma 6 MRLLLALLGV FGFR4 Membrana de LLSVPGPPVL S plasma 7 CSIMNLMCGS TC ROP7 GTPase Membrana de plasma 8 GHKSEEKREK RGS2 Membrana de MKRTLLKDWK plasma
TRLSYFLQNS
STPGKPKTGK KSKQQ 9 RSTLKLTTLQ CQYSTVMD LHR Membrana de plasma\superfície celular basolateral 10 RQGLHNMEDV YELIENSH TSHR Membrana de plasma\superfície celular basolateral 11 MDCRKMARFS TDGF1 Membrana de YSVIWIMAIS KVFELGLVAG plasma 12 MPAWGALFLL WATAEA (GP)IX Membrana de plasma 13 RDYR VPAC2 Membrana de plasma
SEQ Sequência de Sinal Proteína Na- Proteína Associ- ID NO: turalmente ada à Localização Associada é Direcionada 14 KMALRVALNN Toc159 Membrana de KQSGQITVKT plasma
SSSDHLSLAI AGLVPIALSI
YQKFKPGVSP SYSIY 15 MGSKIVQVFL Proteína ara- Membrana de MLALFATSAL A binogalactana plasma clássica 4 16 MNSKAMQALI Proteína ara- Membrana de FLGFLATSCL A binogalactana plasma clássica 2 17 MGAAASIQTT VN L1R Membrana de plasma SVM Proteína Rheb Membrana de de ligação a plasma
GTP 18 FALLGTHGAS G CD147 Membrana de plasma 19 RRRTFLK PlcH Membrana de plasma 20 MGGKWSKSSV Nef Membrana de plasma 21 DDPERE Nef Membrana de plasma 22 EEANTGENNS LLHPMS HIV-1 NA7 Membrana de plasma 23 SRRGLV DmsA Membrana de plasma 24 SRRRFL TorA/TorA- Membrana de MalE plasma 25 SRRQFI SufI Membrana de plasma\periplasma
SEQ Sequência de Sinal Proteína Na- Proteína Associ- ID NO: turalmente ada à Localização Associada é Direcionada 26 QRRDFL YacK Membrana de plasma\periplasma 27 MNKIYSIKYS AATGGLIAVS Pet (Auto- Membrana de ELAKKVICKT NRKISAALLS transportador plasma LAVISYTNII YA pet serina pro- tease) 28 MNPNQKIITI GSICMVIGIV Neuraminidase Membrana de SLMLQIGNII SIWVSHSIQT Influenza A plasma 29 LRCLACSCFR TPVWPR prRDH Membrana de plasma 30 MGCGCSSHPE Lck Membrana de plasma 31 MPFVNKQFN BoNT/A-LC Membrana de plasma 32 DEQNAKNAAQ Yck2p Membrana de DRNSNKSSKG FFSKLGCC plasma 33 MLCCMRRTKQ GAP-43 Membrana de plasma 34 VTNGSTYILV PLSH FSHR Membrana de plasma 35 AETENFV M3 mAChR Membrana de plasma 36 RARHRRNVDR VSIGSYRT pIgR Membrana de plasma 37 YEDQ RhBG Membrana de plasma 38 LLVTSLLLCELPHPAFL IP GM-CSF Re- Membrana de ceptor plasma (GM_CSFR) Agentes de Carga Útil de Proteínas de Membrana
[00393] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro-
teína de membrana é uma proteína (ou um ácido nucleico que a codifi- ca) que se encontra naturalmente na superfície da membrana de uma célula (por exemplo, na superfície de uma membrana plasmática).
[00394] Proteínas de membrana exemplares (e/ou ácidos nucleicos que as codificam) podem ser encontradas, por exemplo, na Publicação de Patente Norte-americana Nº 2016/0289674, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Em algumas modalidades, um agen- te de carga útil de proteína de membrana (e/ou um ácido nucleico que o codifica) tem uma sequência conforme mencionado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 8144-16131 da Publicação de Patente Norte- americana 2016/0289674, ou em um fragmento funcional destes. Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteína de mem- brana é uma proteína de membrana plasmática (ácido nucleico que a codifica), conforme mencionado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 8144-16131 da Publicação de Patente Norte-americana 2016/0289674, ou um fragmento, variante, ou homólogo desta (ou áci- do nucleico que o codifica) de uma proteína da membrana plasmática de.
[00395] Em algumas modalidades, uma proteína de membrana re- levante para a presente descrição é uma proteína de membrana tera- pêutica. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana rele- vante para a presente descrição é ou compreende um receptor de su- perfície celular, uma proteína de transporte de membrana (por exem- plo, uma proteína de transporte ativa ou passiva, tal como, por exem- plo, uma proteína de canal iônico, uma proteína formadora de poros [por exemplo, uma proteína de toxina], etc), uma enzima de membrana e/ou uma proteína de adesão celular).
[00396] Em algumas modalidades, uma proteína de membrana é uma proteína de membrana de abrangência única. Em algumas moda- lidades, uma proteína de membrana de abrangência única pode as-
sumir uma topologia final com um N- citoplasmático e um terminal C exoplasmático (Ncyt/Cexo) ou com a orientação oposta (Nexo/Ccyt).
[00397] Em algumas modalidades, uma proteína de membrana é uma proteína de membrana Tipo I compreendendo uma sequência de sinal clivável de terminal N e uma sequência de interrupção de transfe- rência (Nexo/Ccyt). Em algumas modalidades, um sinal está no terminal C. Em algumas modalidades, a sequência de sinal clivável de terminal N direciona o peptídeo nascente para o ER. Em algumas modalidades, uma sequência de sinal clivável de terminal N compreende um estira- mento hidrofóbico de tipicamente 7-15 resíduos predominantemente apolares. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana Tipo I compreende uma sequência de interrupção de transferência que inter- rompe a translocação adicional do polipeptídeo e atua como uma ân- cora transmembrana. Em algumas modalidades, uma sequência de interrupção de transferência compreende uma sequência de aminoáci- dos de cerca de 20 resíduos hidrofóbicos. Em algumas modalidades, o terminal N da proteína de membrana Tipo I é extracelular e o terminal C é citoplasmático. Em algumas modalidades, uma proteína de mem- brana Tipo I pode ser uma glicoforina ou um receptor de LDL.
[00398] Em algumas modalidades, uma proteína de membrana é uma proteína de membrana Tipo II que compreende uma sequência âncora de sinal (Ncyt/Cexo). Em algumas modalidades, um sinal está no terminal C. Em algumas modalidades, uma sequência âncora de sinal é responsável pela inserção e ancoragem de uma proteína de mem- brana Tipo II. Em algumas modalidades, uma sequência âncora de sinal compreende cerca de 18-25 resíduos predominantemente apola- res. Em algumas modalidades, uma sequência âncora de sinal carece de um local de clivagem de peptidase de sinal. Em algumas modalida- des, uma sequência âncora de sinal pode ser posicionada internamen- te dentro de uma cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, uma sequência âncora de sinal induz a translocação da extremidade termi- nal C de uma proteína através de uma membrana celular. Em algumas modalidades, o terminal C da proteína de membrana Tipo II é extrace- lular e o de terminal N é citoplasmático. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana Tipo II pode ser um receptor de transferri- na ou um receptor de galactosil transferase.
[00399] Em algumas modalidades, uma proteína de membrana é uma proteína de membrana Tipo III que compreende uma sequência reversa âncora de sinal (Nexo/Ccyt). Em algumas modalidades, um sinal está no terminal N. Em algumas modalidades, uma sequência reversa âncora de sinal é responsável pela inserção e ancoragem de uma pro- teína de membrana Tipo III. Em algumas modalidades, uma sequência âncora de sinal reverso compreende cerca de 18-25 resíduos predo- minantemente apolares. Em algumas modalidades, uma sequência âncora de sinal carece de um local de clivagem de peptidase de sinal. Em algumas modalidades, uma sequência âncora de sinal pode ser posicionada internamente dentro de uma cadeia polipeptídica. Em al- gumas modalidades, uma sequência âncora de sinal induz a translo- cação da extremidade de terminal N de uma proteína através de uma membrana celular. Em algumas modalidades, o terminal N da proteína de membrana Tipo III é extracelular e o terminal C é citoplasmático. Em algumas modalidades, uma proteína de membrana Tipo I pode ser uma sinaptogamina, neuregulina ou citocromo P-450.
[00400] Em algumas modalidades, proteínas de membrana Tipo I, Tipo II ou Tipo III são inseridas em uma membrana celular por meio de uma via celular compreendendo SRP, receptor de SRP e translocação de Sec61.
[00401] Em algumas modalidades, uma proteína de membrana é predominantemente exposta ao citosol e ancorada a uma membrana por uma sequência de sinal terminal C, mas que não interage com uma SRP. Em algumas modalidades, uma proteína é o citocromo b5 ou uma proteína SNARE (por exemplo, sinaptobrevina).
[00402] Em algumas modalidades, um agente de carga de proteína de membrana compreende uma sequência de sinal que localiza a pro- teína de carga de membrana na membrana celular. Em algumas mo- dalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana é um ácido nucleico em que o ácido nucleico codifica uma sequência de si- nal que localiza uma proteína de membrana de carga útil codificada pelo ácido nucleico na membrana celular. (i) Cargas Úteis de Proteína de Membrana de Integrina
[00403] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana é ou compromete uma integrina ou fragmento fun- cional, variante ou homólogo deste, ou um ácido nucleico que o codifi- ca. Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana é ou compromete uma integrina selecionada da Tabela 5, ou fragmento funcional, variante ou homólogo deste, ou um ácido nu- cleico que o codifica. Nas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana compreende uma proteína com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência polipeptídica de uma proteína da Tabela 5, ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Nas modalidades, o agente de carga útil de proteína de mem- brana compreende um ácido nucleico com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência de ácido nucleico de um gene da Tabela 5. Tabela 5: Proteínas integrinas exemplares ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene P05556 ITB1_HUMAN ITGB1 FNRB MDF2 MSK12 P05106 ITB3_HUMAN ITGB3 GP3A
ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene P06756 ITAV_HUMAN ITGAV MSK8 VNRA VTNR P05107 ITB2_HUMAN ITGB2 CD18 MFI7 P17301 ITA2_HUMAN ITGA2 CD49B P23229 ITA6_HUMAN ITGA6 P26006 ITA3_HUMAN ITGA3 MSK18 P16144 ITB4_HUMAN ITGB4 P08514 ITA2B_HUMAN ITGA2B GP2B ITGAB P08648 ITA5_HUMAN ITGA5 FNRA P13612 ITA4_HUMAN ITGA4 CD49D P20701 ITAL_HUMAN ITGAL CD11A P11215 ITAM_HUMAN ITGAM CD11B CR3A P26010 ITB7_HUMAN ITGB7 P20702 ITAX_HUMAN ITGAX CD11C P56199 ITA1_HUMAN ITGA1 Q9UKX5 ITA11_HUMAN ITGA11 MSTP018 P18084 ITB5_HUMAN ITGB5 Q13683 ITA7_HUMAN ITGA7 UNQ406/PRO768 P53708 ITA8_HUMAN ITGA8 P18564 ITB6_HUMAN ITGB6 P26012 ITB8_HUMAN ITGB8 P38570 ITAE_HUMAN ITGAE O75578 ITA10_HUMAN ITGA10 UNQ468/PRO827 Q13349 ITAD_HUMAN ITGAD Q13797 ITA9_HUMAN ITGA9 (ii) Proteínas do Canal Iônico
[00404] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana é ou compromete uma proteína de canal iônico ou fragmento funcional, variante ou homólogo deste, ou um ácido nuclei- co que o codifica. Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana é ou compromete uma proteína de canal iônico selecionada da Tabela 6, ou fragmento funcional, variante ou homólogo deste, ou um ácido nucleico que o codifica. Nas modalida-
des, um agente de carga útil de proteína de membrana compreende uma proteína com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência polipeptídica de uma proteína da Tabela 6, ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Nas modalidades, o agente de carga útil de proteína de membrana compreende um ácido nucleico com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à se- quência de ácido nucleico de um gene da Tabela 6. Tabela 6: Proteínas de canal de íons exemplares ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene P46098 5HT3A_HUMAN HTR3A 5HT3R HTR3 O95264 5HT3B_HUMAN HTR3B Q8WXA8 5HT3C_HUMAN HTR3C Q70Z44 5HT3D_HUMAN HTR3D A5X5Y0 5HT3E_HUMAN HTR3E P02708 ACHA_HUMAN CHRNA1 ACHRA CHNRA P11230 ACHB_HUMAN CHRNB1 ACHRB CHRNB Q07001 ACHD_HUMAN CHRND ACHRD Q04844 ACHE_HUMAN CHRNE ACHRE P07510 ACHG_HUMAN CHRNG ACHRG P78348 ASIC1_HUMAN ASIC1 ACCN2 BNAC2 Q16515 ASIC2_HUMAN ASIC2 ACCN ACCN1 BNAC1
MDEG Q9UHC3 ASIC3_HUMAN ASIC3 ACCN3 SLNAC1 TNAC1 Q96FT7 ASIC4_HUMAN ASIC4 ACCN4 Q9NY37 ASIC5_HUMAN ASIC5 ACCN5 HINAC P37088 SCNNA_HUMAN SCNN1A SCNN1 P51168 SCNNB_HUMAN SCNN1B P51172 SCNND_HUMAN SCNN1D DNACH P51170 SCNNG_HUMAN SCNN1G P48048 KCNJ1_HUMAN KCNJ1 ROMK1
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene P78508 KCJ10_HUMAN KCNJ10 Q14654 KCJ11_HUMAN KCNJ11 Q14500 KCJ12_HUMAN KCNJ12 IRK2 KCNJN1 Q9UNX9 KCJ14_HUMAN KCNJ14 IRK4 Q99712 KCJ15_HUMAN KCNJ15 KCNJ14 Q15842 KCNJ8_HUMAN KCNJ8 Q9UGQ2 FLOWR_HUMAN CACFD1 C9orf7 PSEC0107 PSEC0248 UNQ3071/PRO9903 Q12791 KCMA1_HUMAN KCNMA1 KCNMA SLO Q8NEC5 CTSR1_HUMAN CATSPER1 Q96P56 CTSR2_HUMAN CATSPER2 Q86XQ3 CTSR3_HUMAN CATSPER3 Q7RTX7 CTSR4_HUMAN CATSPER4 P29973 CNGA1_HUMAN CNGA1 CNCG CNCG1 Q96S66 CLCC1_HUMAN CLCC1 KIAA0761 MCLC P35523 CLCN1_HUMAN CLCN1 CLC1 P51788 CLCN2_HUMAN CLCN2 P51800 CLCKA_HUMAN CLCNKA P51801 CLCKB_HUMAN CLCNKB O00299 CLIC1_HUMAN CLIC1 G6 NCC27 O15247 CLIC2_HUMAN CLIC2 O95833 CLIC3_HUMAN CLIC3 Q9Y696 CLIC4_HUMAN CLIC4 Q9NZA1 CLIC5_HUMAN CLIC5 Q96NY7 CLIC6_HUMAN CLIC6 CLIC1L P51797 CLCN6_HUMAN CLCN6 KIAA0046 Q494W8 CRFM7_HUMAN CHRFAM7A Q16281 CNGA3_HUMAN CNGA3 CNCG3 Q8IV77 CNGA4_HUMAN CNGA4 Q14028 CNGB1_HUMAN CNGB1 CNCG2 CNCG3L CNCG4 RCNC2 Q9NQW8 CNGB3_HUMAN CNGB3
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene Q16280 CNGA2_HUMAN CNGA2 CNCA CNCA1 CNCG2 P48549 KCNJ3_HUMAN KCNJ3 GIRK1 P48051 KCNJ6_HUMAN KCNJ6 GIRK2 KATP2 KCNJ7 Q92806 KCNJ9_HUMAN KCNJ9 GIRK3 P48544 KCNJ5_HUMAN KCNJ5 GIRK4 P14867 GBRA1_HUMAN GABRA1 P47869 GBRA2_HUMAN GABRA2 P34903 GBRA3_HUMAN GABRA3 P48169 GBRA4_HUMAN GABRA4 P31644 GBRA5_HUMAN GABRA5 Q16445 GBRA6_HUMAN GABRA6 P18505 GBRB1_HUMAN GABRB1 P47870 GBRB2_HUMAN GABRB2 P28472 GBRB3_HUMAN GABRB3 O14764 GBRD_HUMAN GABRD P78334 GBRE_HUMAN GABRE Q8N1C3 GBRG1_HUMAN GABRG1 P18507 GBRG2_HUMAN GABRG2 Q99928 GBRG3_HUMAN GABRG3 O00591 GBRP_HUMAN GABRP P24046 GBRR1_HUMAN GABRR1 P28476 GBRR2_HUMAN GABRR2 A8MPY1 GBRR3_HUMAN GABRR3 Q9UN88 GBRT_HUMAN GABRQ P42261 GRIA1_HUMAN GRIA1 GLUH1 GLUR1 P42262 GRIA2_HUMAN GRIA2 GLUR2 P42263 GRIA3_HUMAN GRIA3 GLUR3 GLURC P48058 GRIA4_HUMAN GRIA4 GLUR4 Q9ULK0 GRID1_HUMAN GRID1 KIAA1220 O43424 GRID2_HUMAN GRID2 GLURD2 P39086 GRIK1_HUMAN GRIK1 GLUR5 Q13002 GRIK2_HUMAN GRIK2 GLUR6
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene Q13003 GRIK3_HUMAN GRIK3 GLUR7 Q16099 GRIK4_HUMAN GRIK4 GRIK Q16478 GRIK5_HUMAN GRIK5 GRIK2 Q05586 NMDZ1_HUMAN GRIN1 NMDAR1 Q12879 NMDE1_HUMAN GRIN2A NMDAR2A Q13224 NMDE2_HUMAN GRIN2B NMDAR2B Q14957 NMDE3_HUMAN GRIN2C NMDAR2C O15399 NMDE4_HUMAN GRIN2D GluN2D NMDAR2D Q8TCU5 NMD3A_HUMAN GRIN3A KIAA1973 O60391 NMD3B_HUMAN GRIN3B P23415 GLRA1_HUMAN GLRA1 P23416 GLRA2_HUMAN GLRA2 O75311 GLRA3_HUMAN GLRA3 Q5JXX5 GLRA4_HUMAN GLRA4 P48167 GLRB_HUMAN GLRB P51790 CLCN3_HUMAN CLCN3 P51793 CLCN4_HUMAN CLCN4 P51795 CLCN5_HUMAN CLCN5 CLCK2 P51798 CLCN7_HUMAN CLCN7 O15554 KCNN4_HUMAN KCNN4 IK1 IKCA1 KCA4 SK4 O60928 KCJ13_HUMAN KCNJ13 Q9NPI9 KCJ16_HUMAN KCNJ16 B7U540 KCJ18_HUMAN KCNJ18 P63252 KCNJ2_HUMAN KCNJ2 IRK1 P48050 KCNJ4_HUMAN KCNJ4 IRK3 Q9GZZ6 ACH10_HUMAN CHRNA10 NACHRA10 Q15822 ACHA2_HUMAN CHRNA2 P32297 ACHA3_HUMAN CHRNA3 NACHRA3 P43681 ACHA4_HUMAN CHRNA4 NACRA4 P30532 ACHA5_HUMAN CHRNA5 NACHRA5 Q15825 ACHA6_HUMAN CHRNA6 P36544 ACHA7_HUMAN CHRNA7 NACHRA7
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene Q9UGM1 ACHA9_HUMAN CHRNA9 NACHRA9 P17787 ACHB2_HUMAN CHRNB2 Q05901 ACHB3_HUMAN CHRNB3 P30926 ACHB4_HUMAN CHRNB4 O00180 KCNK1_HUMAN KCNK1 HOHO1 KCNO1 TWIK1 P57789 KCNKA_HUMAN KCNK10 TREK2 Q9HB15 KCNKC_HUMAN KCNK12 Q9HB14 KCNKD_HUMAN KCNK13 Q9H427 KCNKF_HUMAN KCNK15 TASK5 Q96T55 KCNKG_HUMAN KCNK16 TALK1 Q96T54 KCNKH_HUMAN KCNK17 TALK2 TASK4 UNQ5816/PRO19634 Q7Z418 KCNKI_HUMAN KCNK18 TRESK TRIK O95069 KCNK2_HUMAN KCNK2 TREK TREK1 O14649 KCNK3_HUMAN KCNK3 TASK TASK1 Q9NYG8 KCNK4_HUMAN KCNK4 TRAAK O95279 KCNK5_HUMAN KCNK5 TASK2 Q9Y257 KCNK6_HUMAN KCNK6 TOSS TWIK2 Q9Y2U2 KCNK7_HUMAN KCNK7 Q9NPC2 KCNK9_HUMAN KCNK9 TASK3 Q5JUK3 KCNT1_HUMAN KCNT1 KIAA1422 Q6UVM3 KCNT2_HUMAN KCNT2 SLICK A8MYU2 KCNU1_HUMAN KCNU1 KCNMA3 KCNMC1 SLO3 Q09470 KCNA1_HUMAN KCNA1 Q16322 KCA10_HUMAN KCNA10 P16389 KCNA2_HUMAN KCNA2 P22001 KCNA3_HUMAN KCNA3 HGK5 P22459 KCNA4_HUMAN KCNA4 KCNA4L P22460 KCNA5_HUMAN KCNA5 P17658 KCNA6_HUMAN KCNA6 Q96RP8 KCNA7_HUMAN KCNA7
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene Q14721 KCNB1_HUMAN KCNB1 Q92953 KCNB2_HUMAN KCNB2 P48547 KCNC1_HUMAN KCNC1 Q96PR1 KCNC2_HUMAN KCNC2 Q14003 KCNC3_HUMAN KCNC3 Q03721 KCNC4_HUMAN KCNC4 C1orf30 Q9NSA2 KCND1_HUMAN KCND1 Q9NZV8 KCND2_HUMAN KCND2 KIAA1044 Q9UK17 KCND3_HUMAN KCND3 P15382 KCNE1_HUMAN KCNE1 A0A087WTH KCE1B_HUMAN KCNE1B 5 Q9Y6J6 KCNE2_HUMAN KCNE2 Q9Y6H6 KCNE3_HUMAN KCNE3 Q8WWG9 KCNE4_HUMAN KCNE4 Q9UJ90 KCNE5_HUMAN KCNE5 AMMECR2 KCNE1L Q9H3M0 KCNF1_HUMAN KCNF1 Q9UIX4 KCNG1_HUMAN KCNG1 Q9UJ96 KCNG2_HUMAN KCNG2 KCNF2 Q8TAE7 KCNG3_HUMAN KCNG3 Q8TDN1 KCNG4_HUMAN KCNG4 KCNG3 O95259 KCNH1_HUMAN KCNH1 EAG EAG1 Q12809 KCNH2_HUMAN KCNH2 ERG ERG1 HERG Q9ULD8 KCNH3_HUMAN KCNH3 KIAA1282 Q9UQ05 KCNH4_HUMAN KCNH4 Q8NCM2 KCNH5_HUMAN KCNH5 EAG2 Q9H252 KCNH6_HUMAN KCNH6 ERG2 Q9NS40 KCNH7_HUMAN KCNH7 ERG3 Q96L42 KCNH8_HUMAN KCNH8 P51787 KCNQ1_HUMAN KCNQ1 KCNA8 KCNA9 KVLQT1 O43526 KCNQ2_HUMAN KCNQ2 O43525 KCNQ3_HUMAN KCNQ3
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene P56696 KCNQ4_HUMAN KCNQ4 Q9NR82 KCNQ5_HUMAN KCNQ5 Q96KK3 KCNS1_HUMAN KCNS1 Q9ULS6 KCNS2_HUMAN KCNS2 KIAA1144 Q9BQ31 KCNS3_HUMAN KCNS3 Q6PIU1 KCNV1_HUMAN KCNV1 Q8TDN2 KCNV2_HUMAN KCNV2 O60741 HCN1_HUMAN HCN1 BCNG1 Q9UL51 HCN2_HUMAN HCN2 BCNG2 Q9P1Z3 HCN3_HUMAN HCN3 KIAA1535 Q9Y3Q4 HCN4_HUMAN HCN4 Q92952 KCNN1_HUMAN KCNN1 SK Q9H2S1 KCNN2_HUMAN KCNN2 Q9UGI6 KCNN3_HUMAN KCNN3 K3 P35498 SCN1A_HUMAN SCN1A NAC1 SCN1 Q9Y5Y9 SCNAA_HUMAN SCN10A Q9UI33 SCNBA_HUMAN SCN11A SCN12A SNS2 Q99250 SCN2A_HUMAN SCN2A NAC2 SCN2A1 SCN2A2 Q9NY46 SCN3A_HUMAN SCN3A KIAA1356 NAC3 P35499 SCN4A_HUMAN SCN4A Q14524 SCN5A_HUMAN SCN5A Q01118 SCN7A_HUMAN SCN7A SCN6A Q9UQD0 SCN8A_HUMAN SCN8A MED Q15858 SCN9A_HUMAN SCN9A NENA Q07699 SCN1B_HUMAN SCN1B O60939 SCN2B_HUMAN SCN2B UNQ326/PRO386 Q9NY72 SCN3B_HUMAN SCN3B KIAA1158 Q8IWT1 SCN4B_HUMAN SCN4B Q8IZF0 NALCN_HUMAN NALCN VGCNL1 Q9ULQ1 TPC1_HUMAN TPCN1 KIAA1169 TPC1 Q8NHX9 TPC2_HUMAN TPCN2 TPC2
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene P54289 CA2D1_HUMAN CACNA2D1 CACNL2A CCHL2A MHS3 Q9NY47 CA2D2_HUMAN CACNA2D2 KIAA0558 Q8IZS8 CA2D3_HUMAN CACNA2D3 Q7Z3S7 CA2D4_HUMAN CACNA2D4 Q13936 CAC1C_HUMAN CACNA1C CACH2 CACN2 CACNL1A1 CCHL1A1 Q01668 CAC1D_HUMAN CACNA1D CACH3 CACN4 CACNL1A2 CCHL1A2 O60840 CAC1F_HUMAN CACNA1F CACNAF1 Q13698 CAC1S_HUMAN CACNA1S CACH1 CACN1 CACNL1A3 Q02641 CACB1_HUMAN CACNB1 CACNLB1 Q08289 CACB2_HUMAN CACNB2 CACNLB2 MYSB P54284 CACB3_HUMAN CACNB3 CACNLB3 O00305 CACB4_HUMAN CACNB4 CACNLB4 Q00975 CAC1B_HUMAN CACNA1B CACH5 CACNL1A5 O00555 CAC1A_HUMAN CACNA1A CACH4 CACN3 CACNL1A4 Q15878 CAC1E_HUMAN CACNA1E CACH6 CACNL1A6 O43497 CAC1G_HUMAN CACNA1G KIAA1123 O95180 CAC1H_HUMAN CACNA1H Q9P0X4 CAC1I_HUMAN CACNA1I KIAA1120 Q96D96 HVCN1_HUMAN HVCN1 VSOP UNQ578/PRO1140 Q14722 KCAB1_HUMAN KCNAB1 KCNA1B Q13303 KCAB2_HUMAN KCNAB2 KCNA2B KCNK2 O43448 KCAB3_HUMAN KCNAB3 KCNA3B Q5VU97 CAHD1_HUMAN CACHD1 KIAA1573 VWCD1 Q401N2 ZACN_HUMAN ZACN L2 LGICZ LGICZ1 ZAC (iii) Proteínas Formadoras de Poros
[00405] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana é ou compromete uma proteína formadora de po-
ros ou fragmento funcional, variante ou homólogo deste, ou um ácido nucleico que o codifica. Em algumas modalidades, uma proteína for- madora de poro pode ser uma hemolisina ou fragmento funcional, va- riante ou homólogo deste, ou um ácido nucleico que o codifica. Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteína de mem- brana é ou compromete uma hemolisina selecionada da Tabela 7, ou fragmento funcional, variante ou homólogo do mesmo, ou um ácido nucleico que o codifica. Em algumas modalidades, uma proteína for- madora de poros pode ser uma colicina ou fragmento funcional, vari- ante ou homólogo deste, ou um ácido nucleico que a codifica. Em al- gumas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membra- na é ou compromete uma colicina selecionada da Tabela 8, ou frag- mento funcional, variante ou homólogo do mesmo, ou um ácido nuclei- co que o codifica.
[00406] Nas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana compreende uma proteína com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência polipeptídica de uma proteína da Tabela 7, ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Nas modalidades, o agente de carga útil de proteína de membrana com- preende um ácido nucleico com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência de ácido nucleico de um gene da Tabela 7.
[00407] Nas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana compreende uma proteína com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência polipeptídica de uma proteína da Tabela 8, ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Nas modalidades, o agente de carga útil de proteína de membrana com-
preende um ácido nucleico com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência de ácido nucleico de um gene da Tabela 8. Tabela 7: Proteínas hemolisina exemplares ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene P19247 VVHA_VIBVU vvhA VV2_0404 P09545 HLYA_VIBCH hlyA VC_A0219 Q08677 HLY4_AERSA ash4 P55870 HLY1_AERHH ahh1 AHA_1512 Q4UK99 HLYC_RICFE tlyC RF_1185 Q68W10 HLYC_RICTY tlyC RT0725 O05961 HLYC_RICPR tlyC RP740 A8GTI4 HLYC_RICRS tlyC A1G_06280 Q92GI2 HLYC_RICCN tlyC RC1141 A8F2M1 HLYC_RICM5 tlyC RMA_1168 Q93RR6 HLYE_SALPA hlyE clyA sheA SPA1306 Q9REB3 HLYE_ECO57 hlyE clyA sheA Z1944 ECs1677 Q8Z727 HLYE_SALTI hlyE clyA sheA STY1498 t1477 P77335 HLYE_ECOLI hlyE clyA hpr sheA ycgD b1182 JW5181 P14711 HLYT_GRIHO A8GUH1 HLYC_RICB8 tlyC A1I_00305 A8EZU0 HLYC_RICCK tlyC A1E_04760 A8GPR9 HLYC_RICAH tlyC A1C_05795 Q1RGX2 HLYC_RICBR tlyC RBE_1311 Q9RCT3 HLYEL_SHIFL SF1171 S1259 Q8FI27 HLYEL_ECOL6 c1630 P28030 HLY_VIBMI tdh P28031 HLY1_GRIHO tdh P19249 HLY1_VIBPA tdh1 tdh VPA1378 P19250 HLY2_VIBPA tdh2 tdh trh VPA1314 P28029 HLY3_VIBPH tdh3 tdh/I tdhX
Tabela 8: Proteínas colicina exemplares ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene Q47500 CE05_ECOLX cfa Q47125 CE10_ECOLX cta P04480 CEA_CITFR caa Q47108 CEA_ECOLX caa P02978 CEA1_ECOLX cea P21178 CEA1_SHISO cea P04419 CEA2_ECOLX col ceaB P00646 CEA3_ECOLX ceaC P18000 CEA5_ECOLX col P17999 CEA6_ECOLX Q47112 CEA7_ECOLX colE7 cea P09882 CEA8_ECOLX col P09883 CEA9_ECOLX col cei P05819 CEAB_ECOLX cba P00645 CEAC_ECOLX ccl P17998 CEAD_ECOLX cda Q47502 CEAK_ECOLX cka P08083 CEAN_ECOLX cna P06716 CEIA_ECOLX cia P04479 CEIB_ECOLX cib P22520 CVAB_ECOLX cvaB Q06583 PYS1_PSEAI pys1 Q06584 PYS2_PSEAE pys2 PA1150 (iv) Receptores Toll-Like
[00408] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana é ou compromete um receptor toll-like (TLR) ou fragmento funcional, variante ou homólogo do mesmo, ou um ácido nucleico que o codifica. Em algumas modalidades, um agente de car- ga útil de proteína de membrana é ou compromete um receptor toll-like selecionado da Tabela 9, ou fragmento funcional, variante ou homólo- go deste, ou um ácido nucleico que o codifica. Nas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana compreende uma prote- ína com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência polipeptídica de uma proteína da Tabela 9, ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Nas modalidades, o agente de carga útil de proteína de membrana compreende um ácido nucleico com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência de ácido nucleico de um gene da Tabela 9. Tabela 9: Receptores Toll-like exemplificativos ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q86XR7 TCAM2_HUMAN TICAM2 Q9BXR5 TLR10_HUMAN TLR10 Q15399 TLR1_HUMAN TLR1 O60603 TLR2_HUMAN TLR2 O15455 TLR3_HUMAN TLR3 O00206 TLR4_HUMAN TLR4 O60602 TLR5_HUMAN TLR5 Q9Y2C9 TLR6_HUMAN TLR6 Q9NYK1 TLR7_HUMAN TLR7 Q9NR97 TLR8_HUMAN TLR8 Q9NR96 TLR9_HUMAN TLR9
[00409] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana é ou compromete um receptor de interleucina ou fragmento funcional, variante ou homólogo deste, ou um ácido nuclei- co que o codifica. Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana é ou compromete um receptor de interleuci- na selecionado da Tabela 10 ou fragmento funcional, variante ou ho- mólogo do mesmo, ou um ácido nucleico que o codifica. Nas modali- dades, um agente de carga útil de proteína de membrana compreende uma proteína com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %,
88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência polipeptídica de uma proteína da Tabela 10, ou um ácido nucleico que codifica a mesma.
Nas modalidades, o agente de carga útil de proteína de membrana compreende um ácido nucleico com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à se- quência de ácido nucleico de um gene da Tabela 10. (v) Cargas Úteis do Receptor de Interleucina Tabela 10: Receptores de interleucina exemplares ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q5EG05 CAR16_HUMAN CARD16 Q92851 CASPA_HUMAN CASP10 P25024 CXCR1_HUMAN CXCR1 P25025 CXCR2_HUMAN CXCR2 P31785 IL2RG_HUMAN IL2RG Q01167 FOXK2_HUMAN FOXK2 Q8IU57 INLR1_HUMAN IFNLR1 Q8IU54 IFNL1_HUMAN IFNL1 Q8IZJ0 IFNL2_HUMAN IFNL2 Q8IZI9 IFNL3_HUMAN IFNL3 Q12905 ILF2_HUMAN ILF2 Q12906 ILF3_HUMAN ILF3 P01583 IL1A_HUMAN IL1A P01584 IL1B_HUMAN IL1B Q8WWZ1 IL1FA_HUMAN IL1F10 Q9NPH3 IL1AP_HUMAN IL1RAP Q9NZN1 IRPL1_HUMAN IL1RAPL1 P18510 IL1RA_HUMAN IL1RN P14778 IL1R1_HUMAN IL1R1 P27930 IL1R2_HUMAN IL1R2 P51617 IRAK1_HUMAN IRAK1 Q5VVH5 IKBP1_HUMAN IRAK1BP1
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q9Y616 IRAK3_HUMAN IRAK3 Q9NWZ3 IRAK4_HUMAN IRAK4 O43187 IRAK2_HUMAN IRAK2 Q01638 ILRL1_HUMAN IL1RL1 Q9HB29 ILRL2_HUMAN IL1RL2 P22301 IL10_HUMAN IL10 Q13651 I10R1_HUMAN IL10RA Q08334 I10R2_HUMAN IL10RB P20809 IL11_HUMAN IL11 Q14626 I11RA_HUMAN IL11RA P42701 I12R1_HUMAN IL12RB1 Q99665 I12R2_HUMAN IL12RB2 P29459 IL12A_HUMAN IL12A P29460 IL12B_HUMAN IL12B P35225 IL13_HUMAN IL13 P78552 I13R1_HUMAN IL13RA1 Q14627 I13R2_HUMAN IL13RA2 P40933 IL15_HUMAN IL15 Q13261 I15RA_HUMAN IL15RA Q96F46 I17RA_HUMAN IL17RA Q9NRM6 I17RB_HUMAN IL17RB Q8NAC3 I17RC_HUMAN IL17RC Q8NFM7 I17RD_HUMAN IL17RD Q8NFR9 I17RE_HUMAN IL17RE Q16552 IL17_HUMAN IL17A Q9UHF5 IL17B_HUMAN IL17B Q9P0 m4 IL17C_HUMAN IL17C Q8TAD2 IL17D_HUMAN IL17D Q96PD4 IL17F_HUMAN IL17F Q13478 IL18R_HUMAN IL18R1 O95256 I18RA_HUMAN IL18RAP O95998 I18BP_HUMAN IL18BP
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene (primário) P60568 IL2_HUMAN IL2 P01589 IL2RA_HUMAN IL2RA P14784 IL2RB_HUMAN IL2RB Q9NYY1 IL20_HUMAN IL20 Q9UHF4 I20RA_HUMAN IL20RA Q6UXL0 I20RB_HUMAN IL20RB Q9HBE4 IL21_HUMAN IL21 Q9HBE5 IL21R_HUMAN IL21R Q9GZX6 IL22_HUMAN IL22 Q8N6P7 I22R1_HUMAN IL22RA1 Q969J5 I22R2_HUMAN IL22RA2 Q5VWK5 IL23R_HUMAN IL23R Q9NPF7 IL23A_HUMAN IL23A Q9H293 IL25_HUMAN IL25 Q9NPH9 IL26_HUMAN IL26 Q6UWB1 I27RA_HUMAN IL27RA Q8NEV9 IL27A_HUMAN IL27 Q14213 IL27B_HUMAN EBI3 P08700 IL3_HUMAN IL3 P26951 IL3RA_HUMAN IL3RA Q6EBC2 IL31_HUMAN IL31 Q8NI17 IL31R_HUMAN IL31RA O95760 IL33_HUMAN IL33 Q6ZMJ4 IL34_HUMAN IL34 Q9UHA7 IL36A_HUMAN IL36A Q9NZH7 IL36B_HUMAN IL36B Q9NZH8 IL36G_HUMAN IL36G Q9UBH0 I36RA_HUMAN IL36RN Q9NZH6 IL37_HUMAN IL37 P05112 IL4_HUMAN IL4 P24394 IL4RA_HUMAN IL4R P05113 IL5_HUMAN IL5
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q01344 IL5RA_HUMAN IL5RA P05231 IL6_HUMAN IL6 P08887 IL6RA_HUMAN IL6R P40189 IL6RB_HUMAN IL6ST P13232 IL7_HUMAN IL7 P16871 IL7RA_HUMAN IL7R P10145 IL8_HUMAN CXCL8 P15248 IL9_HUMAN IL9 Q01113 IL9R_HUMAN IL9R Q16649 NFIL3_HUMAN NFIL3 Q99650 OSMR_HUMAN OSMR Q8NDX1 PSD4_HUMAN PSD4 Q14005 IL16_HUMAN IL16 Q6ZVW7 I17EL_HUMAN IL17REL O43353 RIPK2_HUMAN RIPK2 Q6IA17 SIGIR_HUMAN SIGIRR Q8IUC6 TCAM1_HUMAN TICAM1 Q86XR7 TCAM2_HUMAN TICAM2 Q9Y4K3 TRAF6_HUMAN TRAF6 P58753 TIRAP_HUMAN TIRAP Q15399 TLR1_HUMAN TLR1 O60603 TLR2_HUMAN TLR2 O60602 TLR5_HUMAN TLR5 Q8TDR0 MIPT3_HUMAN TRAF3IP1 Q13445 TMED1_HUMAN TMED1 Q08881 ITK_HUMAN ITK Q9NP60 IRPL2_HUMAN IL1RAPL2 (vi) Cargas Úteis de Proteína de Adesão Celular
[00410] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana é ou compromete uma proteína de adesão celular ou fragmento funcional, variante ou homólogo deste, ou um ácido nu- cleico que o codifica. Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana é ou compromete uma proteína de ade- são celular selecionada da Tabela 11, ou fragmento funcional, variante ou homólogo do mesmo, ou um ácido nucleico que o codifica. Em al- gumas modalidades, uma proteína de adesão celular pode ser uma caderina ou fragmento funcional, variante ou homólogo do mesmo, ou um ácido nucleico que o codifica. Em algumas modalidades, um agen- te de carga útil de proteína de membrana é ou compromete uma cade- rina selecionada da Tabela 12, ou fragmento funcional, variante ou homólogo do mesmo, ou um ácido nucleico que o codifica. Em algu- mas modalidades, uma proteína de adesão celular pode ser uma se- lectina ou fragmento funcional, variante ou homólogo do mesmo, ou um ácido nucleico que o codifica. Em algumas modalidades, um agen- te de carga útil de proteína de membrana é ou compromete uma selec- tina selecionada da Tabela 13, ou fragmento funcional, variante ou homólogo do mesmo, ou um ácido nucleico que o codifica. Em algu- mas modalidades, uma proteína de adesão celular pode ser uma mu- cina ou fragmento funcional, variante ou homólogo do mesmo, ou um ácido nucleico que o codifica. Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana é ou compromete uma mucina se- lecionada da Tabela 14, ou fragmento funcional, variante ou homólogo deste, ou um ácido nucleico que o codifica.
[00411] Nas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana compreende uma proteína com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência polipeptídica de uma proteína da Tabela 11, ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Nas modalidades, o agente de carga útil de proteína de membrana compreende um ácido nucleico com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência de ácido nucleico de um gene da Tabela 11.
[00412] Nas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana compreende uma proteína com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência polipeptídica de uma proteína da Tabela 12, ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Nas modalidades, o agente de carga útil de proteína de membrana compreende um ácido nucleico com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência de ácido nucleico de um gene da Tabela 12.
[00413] Nas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana compreende uma proteína com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência polipeptídica de uma proteína da Tabela 13, ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Nas modalidades, o agente de carga útil de proteína de membrana compreende um ácido nucleico com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência de ácido nucleico de um gene da Tabela 13.
[00414] Nas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana compreende uma proteína com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência polipeptídica de uma proteína da Tabela 14, ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Nas modalidades, o agente de carga útil de proteína de membrana compreende um ácido nucleico com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à sequência de ácido nucleico de um gene da Tabela 14. Tabela 11: Proteínas de molécula de adesão intercelular exempla- res ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) P05362 ICAM1_HUMAN ICAM1 P13598 ICAM2_HUMAN ICAM2 P32942 ICAM3_HUMAN ICAM3 Q14773 ICAM4_HUMAN ICAM4 Q9UMF0 ICAM5_HUMAN ICAM5 Tabela 12: Proteínas caderina exemplares ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene (primário) P07949 RET_HUMAN RET P12830 CADH1_HUMAN CDH1 P55290 CAD13_HUMAN CDH13 Q9H251 CAD23_HUMAN CDH23 P19022 CADH2_HUMAN CDH2 O60716 CTND1_HUMAN CTNND1 P35221 CTNA1_HUMAN CTNNA1 P22223 CADH3_HUMAN CDH3 P33151 CADH5_HUMAN CDH5 Q9NYQ6 CELR1_HUMAN CELSR1 Q14126 DSG2_HUMAN DSG2 Q9HBB8 CDHR5_HUMAN CDHR5 Q96JQ0 PCD16_HUMAN DCHS1 O94985 CSTN1_HUMAN CLSTN1 Q02487 DSC2_HUMAN DSC2 Q6V0I7 FAT4_HUMAN FAT4 Q02413 DSG1_HUMAN DSG1 Q14517 FAT1_HUMAN FAT1 Q9BYE9 CDHR2_HUMAN CDHR2 P55291 CAD15_HUMAN CDH15 A7KAX9 RHG32_HUMAN ARHGAP32 Q12864 CAD17_HUMAN CDH17
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene (primário) P55287 CAD11_HUMAN CDH11 Q9NYQ7 CELR3_HUMAN CELSR3 Q14574 DSC3_HUMAN DSC3 Q9NYQ8 FAT2_HUMAN FAT2 P55283 CADH4_HUMAN CDH4 P55285 CADH6_HUMAN CDH6 P55286 CADH8_HUMAN CDH8 Q9Y6N8 CAD10_HUMAN CDH10 P55289 CAD12_HUMAN CDH12 Q13634 CAD18_HUMAN CDH18 Q9UJ99 CAD22_HUMAN CDH22 O75309 CAD16_HUMAN CDH16 Q9H159 CAD19_HUMAN CDH19 Q9HBT6 CAD20_HUMAN CDH20 Q8IXH8 CAD26_HUMAN CDH26 Q9ULB5 CADH7_HUMAN CDH7 Q9ULB4 CADH9_HUMAN CDH9 Q6ZTQ4 CDHR3_HUMAN CDHR3 Q9HCU4 CELR2_HUMAN CELSR2 Q86UP0 CAD24_HUMAN CDH24 Q96JP9 CDHR1_HUMAN CDHR1 A6H8M9 CDHR4_HUMAN CDHR4 Q9UI47 CTNA3_HUMAN CTNNA3 A4D0V7 CPED1_HUMAN CPED1 Q08554 DSC1_HUMAN DSC1 P32926 DSG3_HUMAN DSG3 Q86SJ6 DSG4_HUMAN DSG4 Q8TDW7 FAT3_HUMAN FAT3 Q9NPG4 PCD12_HUMAN PCDH12 O60330 PCDGC_HUMAN PCDHGA12 Q6V1P9 PCD23_HUMAN DCHS2 Q9UN71 PCDGG_HUMAN PCDHGB4
ID Uniprot Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q08174 PCDH1_HUMAN PCDH1 Tabela 13: Proteínas selectina exemplares ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) P16109 LYAM3_HUMAN SELP P16581 LYAM2_HUMAN SELE Q14242 SELPL_HUMAN SELPLG P14151 LYAM1_HUMAN SELL Tabela 14: Proteínas mucina exemplares ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) P15941 MUC1_HUMAN MUC1 Q99102 MUC4_HUMAN MUC4 Q8TDQ0 HAVR2_HUMAN HAVCR2 Q9HC84 MUC5B_HUMAN MUC5B P98088 MUC5A_HUMAN MUC5AC Q685J3 MUC17_HUMAN MUC17 Q9UJU6 DBNL_HUMAN DBNL Q9HBB8 CDHR5_HUMAN CDHR5 Q8WXI7 MUC16_HUMAN MUC16 Q9UHX3 AGRE2_HUMAN ADGRE2 Q02817 MUC2_HUMAN MUC2 Q8TAX7 MUC7_HUMAN MUC7 Q96D42 HAVR1_HUMAN HAVCR1 Q9H3R2 MUC13_HUMAN MUC13 Q8N307 MUC20_HUMAN MUC20 Q6W4X9 MUC6_HUMAN MUC6 Q02505 MUC3A_HUMAN MUC3A Q7L513 FCRLA_HUMAN FCRLA Q14246 AGRE1_HUMAN ADGRE1 Q86WA6 BPHL_HUMAN BPHL Q7Z5P9 MUC19_HUMAN MUC19 Q9UKN1 MUC12_HUMAN MUC12 Q5SSG8 MUC21_HUMAN MUC21
ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q9BY15 AGRE3_HUMAN ADGRE3 Q6UWI2 PARM1_HUMAN PARM1 O95395 GCNT3_HUMAN GCNT3 Q86SQ3 AGRE4_HUMAN ADGRE4P Q6BAA4 FCRLB_HUMAN FCRLB Q96DR8 MUCL1_HUMAN MUCL1 E2RYF6 MUC22_HUMAN MUC22 Q9H195 MUC3B_HUMAN MUC3B Q9ULC0 MUCEN_HUMAN EMCN Q8N387 MUC15_HUMAN MUC15 Q12889 OVGP1_HUMAN OVGP1 E2RYF7 PBMU2_HUMAN HCG22 Q96H15 TIMD4_HUMAN TIMD4 (vii) Cargas Úteis de Proteínas de Transporte
[00415] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana é ou compromete uma proteína de transporte ou fragmento funcional, variante ou homólogo deste, ou um ácido nuclei- co que o codifica. Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana é ou compromete uma proteína de transpor- te selecionada da Tabela 15, ou fragmento funcional, variante ou ho- mólogo deste, ou um ácido nucleico que o codifica. Nas modalidades, um agente de carga útil de proteína de membrana compreende uma proteína com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idên- tica à sequência polipeptídica de uma proteína da Tabela 15, ou um ácido nucleico que codifica a mesma. Nas modalidades, o agente de carga útil de proteína de membrana compreende um ácido nucleico com uma sequência de pelo menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à se- quência de ácido nucleico de um gene da Tabela 15.
Tabela 15: Proteínas de transporte exemplares ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q9NRA8 4ET_HUMAN EIF4ENIF1 Q9NS82 AAA1_HUMAN SLC7A10 Q15758 AAAT_HUMAN SLC1A5 O95477 ABCA1_HUMAN ABCA1 Q9BZC7 ABCA2_HUMAN ABCA2 Q99758 ABCA3_HUMAN ABCA3 P78363 ABCA4_HUMAN ABCA4 Q8IZY2 ABCA7_HUMAN ABCA7 Q86UK0 ABCAC_HUMAN ABCA12 Q9NP58 ABCB6_HUMAN ABCB6 O75027 ABCB7_HUMAN ABCB7 Q9NP78 ABCB9_HUMAN ABCB9 Q9NRK6 ABCBA_HUMAN ABCB10 Q9UG63 ABCF2_HUMAN ABCF2 P45844 ABCG1_HUMAN ABCG1 Q9UNQ0 ABCG2_HUMAN ABCG2 O00400 ACATN_HUMAN SLC33A1 P82251 BAT1_HUMAN SLC7A9 Q8N1D0 BWR1B_HUMAN SLC22A18AS Q12864 CAD17_HUMAN CDH17 Q53S99 CB083_HUMAN C2orf83 P51790 CLCN3_HUMAN CLCN3 P51793 CLCN4_HUMAN CLCN4 P51795 CLCN5_HUMAN CLCN5 P51798 CLCN7_HUMAN CLCN7 Q9NRU3 CNNM1_HUMAN CNNM1 Q9H8M5 CNNM2_HUMAN CNNM2 Q8NE01 CNNM3_HUMAN CNNM3 Q6P4Q7 CNNM4_HUMAN CNNM4 O15431 COPT1_HUMAN SLC31A1 O15432 COPT2_HUMAN SLC31A2
ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q8WWI5 CTL1_HUMAN SLC44A1 Q8IWA5 CTL2_HUMAN SLC44A2 Q8N4M1 CTL3_HUMAN SLC44A3 Q53GD3 CTL4_HUMAN SLC44A4 Q8NCS7 CTL5_HUMAN SLC44A5 P30825 CTR1_HUMAN SLC7A1 P52569 CTR2_HUMAN SLC7A2 Q8WY07 CTR3_HUMAN SLC7A3 O43246 CTR4_HUMAN SLC7A4 P43003 EAA1_HUMAN SLC1A3 P43004 EAA2_HUMAN SLC1A2 P43005 EAA3_HUMAN SLC1A1 P48664 EAA4_HUMAN SLC1A6 O00341 EAA5_HUMAN SLC1A7 P55899 FCGRN_HUMAN FCGRT Q9UPI3 FLVC2_HUMAN FLVCR2 Q96A29 FUCT1_HUMAN SLC35C1 O43826 G6PT1_HUMAN SLC37A4 O95528 GTR10_HUMAN SLC2A10 Q9BYW1 GTR11_HUMAN SLC2A11 Q8TD20 GTR12_HUMAN SLC2A12 Q8TDB8 GTR14_HUMAN SLC2A14 P11166 GTR1_HUMAN SLC2A1 P11168 GTR2_HUMAN SLC2A2 P11169 GTR3_HUMAN SLC2A3 P14672 GTR4_HUMAN SLC2A4 P22732 GTR5_HUMAN SLC2A5 Q9UGQ3 GTR6_HUMAN SLC2A6 Q6PXP3 GTR7_HUMAN SLC2A7 Q9NY64 GTR8_HUMAN SLC2A8 Q9NRM0 GTR9_HUMAN SLC2A9 Q9HCP6 HHATL_HUMAN HHATL
ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q6P1K1 HRG1_HUMAN SLC48A1 Q12756 KIF1A_HUMAN KIF1A Q6ZP29 LAAT1_HUMAN PQLC2 Q15012 LAP4A_HUMAN LAPTM4A Q01650 LAT1_HUMAN SLC7A5 Q9GIP4 LAT1L_HUMAN SLC7A5P2 Q8MH63 LAT1N_HUMAN SLC7A5P1 Q9UHI5 LAT2_HUMAN SLC7A8 O75387 LAT3_HUMAN SLC43A1 Q8N370 LAT4_HUMAN SLC43A2 Q9NUN5 LMBD1_HUMAN LMBRD1 Q9H0U3 MAGT1_HUMAN MAGT1 Q8N8R3 MCATL_HUMAN SLC25A29 Q96MC6 MF14A_HUMAN MFSD14A Q9NYZ2 MFRN1_HUMAN SLC25A37 Q96A46 MFRN2_HUMAN SLC25A28 Q14728 MFS10_HUMAN MFSD10 Q5TF39 MFS4B_HUMAN MFSD4B Q6N075 MFSD5_HUMAN MFSD5 Q9H2D1 MFTC_HUMAN SLC25A32 Q8N4V1 MMGT1_HUMAN MMGT1 Q8TF71 MOT10_HUMAN SLC16A10 Q8NCK7 MOT11_HUMAN SLC16A11 3 Q6ZSM MOT12_HUMAN SLC16A12 Q7RTY0 MOT13_HUMAN SLC16A13 Q7RTX9 MOT14_HUMAN SLC16A14 P53985 MOT1_HUMAN SLC16A1 O60669 MOT2_HUMAN SLC16A7 O95907 MOT3_HUMAN SLC16A8 O15427 MOT4_HUMAN SLC16A3 O15374 MOT5_HUMAN SLC16A4 O15375 MOT6_HUMAN SLC16A5
ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) O15403 MOT7_HUMAN SLC16A6 P36021 MOT8_HUMAN SLC16A2 Q7RTY1 MOT9_HUMAN SLC16A9 P33527 MRP1_HUMAN ABCC1 Q92887 MRP2_HUMAN ABCC2 O15438 MRP3_HUMAN ABCC3 O15439 MRP4_HUMAN ABCC4 O15440 MRP5_HUMAN ABCC5 O95255 MRP6_HUMAN ABCC6 Q9HD23 MRS2_HUMAN MRS2 Q7RTP0 NIPA1_HUMAN NIPA1 Q8N8Q9 NIPA2_HUMAN NIPA2 Q6NVV3 NIPA3_HUMAN NIPAL1 Q0D2K0 NIPA4_HUMAN NIPAL4 P49281 NRAM2_HUMAN SLC11A2 Q12908 NTCP2_HUMAN SLC10A2 Q9Y619 ORNT1_HUMAN SLC25A15 Q9BXI2 ORNT2_HUMAN SLC25A2 Q86UW1 OSTA_HUMAN SLC51A Q86UW2 OSTB_HUMAN SLC51B Q04671 P_HUMAN OCA2 Q96NT5 PCFT_HUMAN SLC46A1 O75915 PRAF3_HUMAN ARL6IP5 Q02094 RHAG_HUMAN RHAG Q9H310 RHBG_HUMAN RHBG Q9UBD6 RHCG_HUMAN RHCG Q92681 RSCA1_HUMAN RSC1A1 Q9BXP2 S12A9_HUMAN SLC12A9 Q8WWT9 S13A3_HUMAN SLC13A3 Q86YT5 S13A5_HUMAN SLC13A5 P46059 S15A1_HUMAN SLC15A1 Q16348 S15A2_HUMAN SLC15A2
ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q8IY34 S15A3_HUMAN SLC15A3 Q8N697 S15A4_HUMAN SLC15A4 Q6NT16 S18B1_HUMAN SLC18B1 P41440 S19A1_HUMAN SLC19A1 O60779 S19A2_HUMAN SLC19A2 Q9BZV2 S19A3_HUMAN SLC19A3 Q8WUM9 S20A1_HUMAN SLC20A1 Q08357 S20A2_HUMAN SLC20A2 O15245 S22A1_HUMAN SLC22A1 O15244 S22A2_HUMAN SLC22A2 O75751 S22A3_HUMAN SLC22A3 Q9H015 S22A4_HUMAN SLC22A4 O76082 S22A5_HUMAN SLC22A5 Q4U2R8 S22A6_HUMAN SLC22A6 Q9Y694 S22A7_HUMAN SLC22A7 Q8TCC7 S22A8_HUMAN SLC22A8 Q8IVM8 S22A9_HUMAN SLC22A9 Q63ZE4 S22AA_HUMAN SLC22A10 Q9NSA0 S22AB_HUMAN SLC22A11 Q96S37 S22AC_HUMAN SLC22A12 Q9Y226 S22AD_HUMAN SLC22A13 Q9Y267 S22AE_HUMAN SLC22A14 Q8IZD6 S22AF_HUMAN SLC22A15 Q86VW1 S22AG_HUMAN SLC22A16 Q8WUG5 S22AH_HUMAN SLC22A17 Q96BI1 S22AI_HUMAN SLC22A18 A6NK97 S22AK_HUMAN SLC22A20 Q6T423 S22AP_HUMAN SLC22A25 Q9UHI7 S23A1_HUMAN SLC23A1 Q9UGH3 S23A2_HUMAN SLC23A2 Q6PIS1 S23A3_HUMAN SLC23A3 Q86VD7 S2542_HUMAN SLC25A42
ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q86WA9 S2611_HUMAN SLC26A11 Q9H2B4 S26A1_HUMAN SLC26A1 P50443 S26A2_HUMAN SLC26A2 O43511 S26A4_HUMAN SLC26A4 Q9BXS9 S26A6_HUMAN SLC26A6 Q8TE54 S26A7_HUMAN SLC26A7 Q96RN1 S26A8_HUMAN SLC26A8 Q7LBE3 S26A9_HUMAN SLC26A9 O00337 S28A1_HUMAN SLC28A1 O43868 S28A2_HUMAN SLC28A2 Q99808 S29A1_HUMAN SLC29A1 Q14542 S29A2_HUMAN SLC29A2 Q9BZD2 S29A3_HUMAN SLC29A3 Q7RTT9 S29A4_HUMAN SLC29A4 P78382 S35A1_HUMAN SLC35A1 P78381 S35A2_HUMAN SLC35A2 Q9Y2D2 S35A3_HUMAN SLC35A3 Q96G79 S35A4_HUMAN SLC35A4 Q9BS91 S35A5_HUMAN SLC35A5 P78383 S35B1_HUMAN SLC35B1 Q8TB61 S35B2_HUMAN SLC35B2 Q9H1N7 S35B3_HUMAN SLC35B3 Q969S0 S35B4_HUMAN SLC35B4 Q9NTN3 S35D1_HUMAN SLC35D1 Q76EJ3 S35D2_HUMAN SLC35D2 Q8IY50 S35F3_HUMAN SLC35F3 Q7Z2H8 S36A1_HUMAN SLC36A1 Q495M3 S36A2_HUMAN SLC36A2 Q495N2 S36A3_HUMAN SLC36A3 Q6YBV0 S36A4_HUMAN SLC36A4 Q9H2H9 S38A1_HUMAN SLC38A1 Q96QD8 S38A2_HUMAN SLC38A2
ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q99624 S38A3_HUMAN SLC38A3 Q969I6 S38A4_HUMAN SLC38A4 Q8WUX1 S38A5_HUMAN SLC38A5 Q8IZM9 S38A6_HUMAN SLC38A6 Q9NVC3 S38A7_HUMAN SLC38A7 A6NNN8 S38A8_HUMAN SLC38A8 Q8NBW4 S38A9_HUMAN SLC38A9 Q9HBR0 S38AA_HUMAN SLC38A10 Q08AI6 S38AB_HUMAN SLC38A11 Q9NY26 S39A1_HUMAN SLC39A1 Q9NP94 S39A2_HUMAN SLC39A2 Q9BRY0 S39A3_HUMAN SLC39A3 Q6P5W5 S39A4_HUMAN SLC39A4 Q6ZMH5 S39A5_HUMAN SLC39A5 Q13433 S39A6_HUMAN SLC39A6 Q92504 S39A7_HUMAN SLC39A7 Q9C0K1 S39A8_HUMAN SLC39A8 Q9NUM3 S39A9_HUMAN SLC39A9 Q9ULF5 S39AA_HUMAN SLC39A10 Q8N1S5 S39AB_HUMAN SLC39A11 Q504Y0 S39AC_HUMAN SLC39A12 Q96H72 S39AD_HUMAN SLC39A13 Q15043 S39AE_HUMAN SLC39A14 Q9NP59 S40A1_HUMAN SLC40A1 Q9Y2W3 S45A1_HUMAN SLC45A1 Q9UMX9 S45A2_HUMAN SLC45A2 Q8NBS3 S4A11_HUMAN SLC4A11 Q9Y6M7 S4A7_HUMAN SLC4A7 Q9NWF4 S52A1_HUMAN SLC52A1 Q9HAB3 S52A2_HUMAN SLC52A2 Q9NQ40 S52A3_HUMAN SLC52A3 P48066 S6A11_HUMAN SLC6A11
ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) P48065 S6A12_HUMAN SLC6A12 Q9NSD5 S6A13_HUMAN SLC6A13 Q9UN76 S6A14_HUMAN SLC6A14 Q9H2J7 S6A15_HUMAN SLC6A15 Q9GZN6 S6A16_HUMAN SLC6A16 Q9H1V8 S6A17_HUMAN SLC6A17 Q96N87 S6A18_HUMAN SLC6A18 Q695T7 S6A19_HUMAN SLC6A19 Q9NP91 S6A20_HUMAN SLC6A20 Q8TCU3 S7A13_HUMAN SLC7A13 Q8TBB6 S7A14_HUMAN SLC7A14 Q70HW3 SAMC_HUMAN SLC25A26 P43007 SATT_HUMAN SLC1A4 P53794 SC5A3_HUMAN SLC5A3 Q9Y289 SC5A6_HUMAN SLC5A6 Q9GZV3 SC5A7_HUMAN SLC5A7 Q8N695 SC5A8_HUMAN SLC5A8 Q8WWX8 SC5AB_HUMAN SLC5A11 Q1EHB4 SC5AC_HUMAN SLC5A12 P30531 SC6A1_HUMAN SLC6A1 P23975 SC6A2_HUMAN SLC6A2 Q01959 SC6A3_HUMAN SLC6A3 P31645 SC6A4_HUMAN SLC6A4 Q9Y345 SC6A5_HUMAN SLC6A5 P31641 SC6A6_HUMAN SLC6A6 Q99884 SC6A7_HUMAN SLC6A7 P48029 SC6A8_HUMAN SLC6A8 P48067 SC6A9_HUMAN SLC6A9 P46721 SO1A2_HUMAN SLCO1A2 Q9Y6L6 SO1B1_HUMAN SLCO1B1 Q9NPD5 SO1B3_HUMAN SLCO1B3 G3V0H7 SO1B7_HUMAN SLCO1B7
ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q9NYB5 SO1C1_HUMAN SLCO1C1 Q92959 SO2A1_HUMAN SLCO2A1 O94956 SO2B1_HUMAN SLCO2B1 Q9UIG8 SO3A1_HUMAN SLCO3A1 Q96BD0 SO4A1_HUMAN SLCO4A1 Q6ZQN7 SO4C1_HUMAN SLCO4C1 Q9H2Y9 SO5A1_HUMAN SLCO5A1 Q86UG4 SO6A1_HUMAN SLCO6A1 Q3KNW5 SOAT_HUMAN SLC10A6 O95149 SPN1_HUMAN SNUPN Q8N434 SVOPL_HUMAN SVOPL Q9BRV3 SWET1_HUMAN SLC50A1 Q03518 TAP1_HUMAN TAP1 Q03519 TAP2_HUMAN TAP2 Q13454 TUSC3_HUMAN TUSC3 Q13336 UT1_HUMAN SLC14A1 Q15849 UT2_HUMAN SLC14A2 Q16572 VACHT_HUMAN SLC18A3 Q9P2U7 VGLU1_HUMAN SLC17A7 Q9P2U8 VGLU2_HUMAN SLC17A6 Q8NDX2 VGLU3_HUMAN SLC17A8 Q9H598 VIAAT_HUMAN SLC32A1 P54219 VMAT1_HUMAN SLC18A1 Q05940 VMAT2_HUMAN SLC18A2 Q9UPY5 XCT_HUMAN SLC7A11 Q9UM01 YLAT1_HUMAN SLC7A7 Q92536 YLAT2_HUMAN SLC7A6 Q6XR72 ZNT10_HUMAN SLC30A10 Q9Y6M5 ZNT1_HUMAN SLC30A1 Q9BRI3 ZNT2_HUMAN SLC30A2 Q99726 ZNT3_HUMAN SLC30A3 O14863 ZNT4_HUMAN SLC30A4
ID UniProt Nome de entrada Nomes de gene (primário) Q8TAD4 ZNT5_HUMAN SLC30A5 Q6NXT4 ZNT6_HUMAN SLC30A6 Q8NEW0 ZNT7_HUMAN SLC30A7 Q8IWU4 ZNT8_HUMAN SLC30A8 Q6PML9 ZNT9_HUMAN SLC30A9 (viii) Cargas Úteis do Receptor de Antígeno Quimérico
[00416] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana é ou compreende um CAR, por exemplo, um CAR de primeira geração ou um ácido nucleico que codifica um CAR de primeira geração. Em algumas modalidades, um CAR de primeira ge- ração compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização. Em algumas modalida- des, um domínio de sinalização media a sinalização a jusante durante a ativação de células T.
[00417] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana é ou compreende um CAR de segunda geração ou um ácido nucleico que codifica um CAR de segunda geração. Em al- gumas modalidades, um CAR de segunda geração compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e dois domínios de sinalização. Em algumas modalidades, um domínio de sinalização media a sinalização a jusante durante a ativação de célu- las T. Em algumas modalidades, um domínio de sinalização é um do- mínio coestimulador. Em algumas modalidades, um domínio coestimu- lador aumenta a produção de citocinas, proliferação de células T de CAR e/ou persistência de células T de CAR durante a ativação de cé- lulas T.
[00418] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana é ou compreende um CAR de terceira geração ou um ácido nucleico que codifica um CAR de terceira geração. Em al- gumas modalidades, um CAR de terceira geração compreende um domínio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e pelo menos três domínios de sinalização. Em algumas modalidades, um domínio de sinalização media a sinalização a jusante durante a ativa- ção de células T. Em algumas modalidades, um domínio de sinaliza- ção é um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, um domí- nio coestimulador aumenta a produção de citocinas, proliferação de células T de CAR e/ou persistência de células T de CAR durante a ati- vação de células T. Em algumas modalidades, um CAR de terceira geração compreende pelo menos dois domínios coestimuladores. Em algumas modalidades, os pelo menos dois domínios coestimuladores não são iguais.
[00419] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana é ou compreende um CAR de quarta geração ou um ácido nucleico que codifica um CAR de quarta geração. Em algu- mas modalidades, um CAR de quarta geração compreende um domí- nio de ligação ao antígeno, um domínio transmembrana e pelo menos dois, três ou quatro domínios de sinalização. Em algumas modalida- des, um domínio de sinalização media a sinalização a jusante durante a ativação de células T. Em algumas modalidades, um domínio de si- nalização é um domínio coestimulador. Em algumas modalidades, um domínio coestimulador aumenta a produção de citocinas, proliferação de células T de CAR e/ou persistência de células T de CAR durante a ativação de células T.
[00420] Em algumas modalidades, um CAR de primeira, segunda, terceira ou quarta geração compreende ainda um domínio que após a sinalização bem-sucedida do CAR induz a expressão de um gene de citocina. Em algumas modalidades, um gene de citocina é endógeno ou exógeno a uma célula-alvo compreendendo um CAR que compre- ende um domínio que após a sinalização bem-sucedida do CAR induz a expressão de um gene de citocina. Em algumas modalidades, um gene de citocina codifica uma citocina pró-inflamatória. Em algumas modalidades, um gene de citocina codifica IL-1, IL-2, IL-9, IL-12, IL-18, TNF ou IFN-gama, ou fragmento funcional dos mesmos. Em algumas modalidades, um domínio que após a sinalização bem-sucedida do CAR induz a expressão de um gene de citocina é ou compreende um fator de transcrição ou domínio funcional ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, um domínio que após a sinalização bem- sucedida do CAR induz a expressão de um gene de citocina é ou compreende um fator de transcrição ou domínio funcional ou fragmen- to do mesmo. Em algumas modalidades, um fator de transcrição ou domínio funcional ou fragmento do mesmo é ou compreende um fator nuclear de células T ativadas (NFAT), um NF-kB ou domínio funcional ou fragmento do mesmo. Veja, por exemplo, Zhang. C. et al., Enginee- ring CAR-T cells. Biomarker Research. 5:22 (2017); WO 2016126608; Sha, H. et al. Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumour immunotherapy. Bioscience Reports, 27 de janeiro de 2017, 37 (1). (a) Domínios de Ligação do Antígeno de CAR
[00421] Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antí- geno de CAR é ou compreende um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno de CAR é ou compreende um scFv ou Fab. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno de CAR compreende um scFv ou fragmento Fab de um anticorpo de cadeia alfa de célula T; anticorpo de cadeia β de célula T; anticorpo de cadeia γ de célula T; anticorpo de cadeia δ de célula T; anticorpo CCR7; anticorpo CD3; an- ticorpo CD4; anticorpo CD5; anticorpo CD7; anticorpo CD8; anticorpo CD11b; anticorpo CD11c; anticorpo CD16; anticorpo CD19; anticorpo CD20; anticorpo CD21; anticorpo CD22; anticorpo CD25; anticorpo CD28; anticorpo CD34; anticorpo CD35; anticorpo CD40; anticorpo CD45RA; anticorpo CD45RO; anticorpo CD52; anticorpo CD56; anti-
corpo CD62L; anticorpo CD68; anticorpo CD80; anticorpo CD95; anti- corpo CD117; anticorpo CD127; anticorpo CD133; anticorpo CD137 (4- 1 BB); anticorpo CD163; anticorpo F4/80; anticorpo IL-4Ra; anticorpo Sca-1; anticorpo CTLA-4; anticorpo GITR; anticorpo GARP; anticorpo LAP; anticorpo granzima B; anticorpo LFA-1; ou anticorpo receptor de transferrina.
[00422] Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antí- geno se liga a um antígeno de superfície celular de uma célula. Em algumas modalidades, um antígeno de superfície celular é característi- co de um tipo de célula. Em algumas modalidades, um antígeno de superfície celular é característico de mais de um tipo de célula.
[00423] Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antí- geno de CAR se liga a um antígeno de superfície celular característico de uma célula T. Em algumas modalidades, uma característica de an- tígeno de uma célula T pode ser um receptor de superfície celular, uma proteína de transporte de membrana (por exemplo, uma proteína de transporte ativa ou passiva, como, por exemplo, uma proteína de canal iônico, uma proteína formadora de poros, etc.), um receptor transmembrana, uma enzima de membrana e/ou uma proteína de adesão celular característica de uma célula T. Em algumas modalida- des, uma característica do antígeno de uma célula T pode ser um re- ceptor acoplado à proteína G, tirosina cinase receptora, receptor asso- ciado à tirosina cinase, tirosina fosfatase semelhante ao receptor, seri- na/treonina cinase receptora, guanilil ciclase receptora ou receptor as- sociado à histidina cinase.
[00424] Em algumas modalidades, uma característica de antígeno de uma célula T pode ser um receptor de célula T. Em algumas moda- lidades, um receptor de células T pode ser AKT1; AKT2; AKT3; ATF2; BCL10; CALM1; CD3D (CD3δ); CD3E (CD3ε); CD3G (CD3γ); CD4; CD8; CD28; CD45; CD80 (B7-1); CD86 (B7-2); CD247 (CD3ζ); CTLA4
(CD152); ELK1; ERK1 (MAPK3); ERK2; FOS; FYN; GRAP2 (GADS); GRB2; HLA-DRA; HLA-DRB1; HLA-DRB3; HLA-DRB4; HLA-DRB5; HRAS; IKBKA (CHUK); IKBKB; IKBKE; IKBKG (NEMO); IL2; ITPR1; ITK; JUN; KRAS2; LAT; LCK; MAP2K1 (MEK1); MAP2K2 (MEK2); MAP2K3 (MKK3); MAP2K4 (MKK4); MAP2K6 (MKK6); MAP2K7 (MKK7); MAP3K1 (MEKK1); MAP3K3; MAP3K4; MAP3K5; MAP3K8; MAP3K14 (NIK); MAPK8 (JNK1); MAPK9 (JNK2); MAPK10 (JNK3); MAPK11 (p38β); MAPK12 (p38γ); MAPK13 (p38δ); MAPK14 (p38α); NCK; NFAT1; NFAT2; NFKB1; NFKB2; NFKBIA; NRAS; PAK1; PAK2; PAK3; PAK4; PIK3C2B; PIK3C3 (VPS34); PIK3CA; PIK3CB; PIK3CD; PIK3R1; PKCA; PKCB; PKCM; PKCQ; PLCY1; PRF1 (Perforina); PTEN; RAC1; RAF1; RELA; SDF1; SHP2; SLP76; SOS; SRC; TBK1; TCRA; TEC; TRAF6; VAV1; VAV2; ou ZAP70.
[00425] Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antí- geno de CAR se liga a uma característica do antígeno de um câncer. Em algumas modalidades, uma característica de antígeno de um cân- cer é selecionada a partir de um receptor de superfície celular, um re- ceptor ligado a um canal iônico, um receptor ligado a uma enzima, um receptor acoplado à proteína G, tirosina cinase receptora, receptor as- sociado à tirosina cinase, tirosina fosfatase semelhante ao receptor, serina/treonina cinase receptora, guanilil ciclase receptora, receptor associado à histidina cinase, receptores de Fator de Crescimento Epi- dérmico (EGFR) (incluindo ErbB1/EGFR, ErbB2/HER2, ErbB3/HER3 e receptores de Fator de Crescimento ErbB4/HER4), Fibroblastos recep- tores de Fator de Crescimento) (incluindo FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF18 e FGF21) receptores de Fator de Cresci- mento Endotelial Vascular (VEGFR) (incluindo VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e PIGF), Receptor RET e família de receptores Eph (incluindo EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5, EphA6, EphA7, EphA8, EphA9, EphA10, EphB1, EphB2, EphB3, EphBCR4, e EphB6,
CXCR4, CXC3, CX2, CX2, CX2, CX2, CXCR4, CXCR6, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CFTR, CIC-1, CIC-2, CIC-4, CIC- 5, CIC-7, CIC-Ka, CIC-Kb, Bestrofinas, TMEM16A, receptor GABA, receptor de glicina, transportadores ABC, NAV1.1, NAV1.2, NAV1.3, NAV1.4, NAV1.5, NAV1.6, NAV1.7, NAV1.8, NAV1.9, receptor de es- fingosina-1-fosfato (S1P1R), canal NMDA, proteína transmembrana, proteína transmembrana multiamplitude, motivos de receptor de célula T; cadeias alfa de células T; cadeias β de células T; cadeias γ de célu- las T; cadeias δ de células T; CCR7; CD3; CD4; CD5; CD7; CD8; CD11b; CD11c; CD16; CD19; CD20; CD21; CD22; CD25; CD28; CD34; CD35; CD40; CD45RA; CD45RO; CD52; CD56; CD62L; CD68; CD80; CD95; CD117; CD127; CD133; CD137 (4-1 BB); CD163; F4/80; IL-4Ra; Sca-1; CTLA-4; GITR; GARP; LAP; granzima B; LFA-1; recep- tor de transferrina; NKp46, perforina, CD4+; Th1; Th2; Th17; Th40; Th22; Th9; Tfh, FoxP3+ Treg.
Canônica; Tr1; Th3; Treg17; TREG; CDCP1, NT5E, EpCAM, CEA, gpA33, Mucinas, TAG-72, Anidrase carbônica IX, PSMA, Proteína de ligação ao folato, Gangliosídeos (por exemplo, CD2, CD3, GM2), Lewis-γ2, VEGF, VEGFR 1/2/3, αVβ3, α5β1, ErbB1/EGFR, ErbB1/HER2, ErB3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRA- IL-R1, TRAIL-R2, RANKL, FAP, Tenascina, PDL-1, BAFF, HDAC, ABL, FLT3, KIT, MET, RET, IL-1β, ALK, RANKL, mTOR, CTLA-4, IL-6, IL-6R, JAK3, BRAF, PTCH, Suavizado, PIGF, ANPEP, TIMP1, PLAUR, PTPRJ, LTBR, ou ANTXR1, Receptor alfa de folato (FRa), ERBB2 (Her2/neu), EphA2, IL-13Ra2, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), Mesotelina, TSHR, CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, CLL-1, CD33, EGFRvIII, GD2, GD3, BCMA, MUC16 (CA125), L1CAM, LeY, MSLN, IL13RΑ1, L1-CAM, Tn Ag, antígeno membrana específico da próstata (PSMA), ROR1, FLT3, FAP, TAG72, CD38, CD44v6, CEA, EPCAM, B7H3, KIT, interleucina-11 receptor a (IL-11Ra), PSCA, PRSS21, VEGFR2, LewisY, CD24, receptor-beta do fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR-beta), SSEA-4, CD20, MUC1, NCAM, Prostase, PAP, ELF2M, Efrina B2, receptor IGF- 1, CAIX, LMP2, gplOO, bcr-abl, tirosinase, Fucosil GM1, sLe, GM3, TGS5, HMWMAA, o-acetil-GD2, Receptor beta de folato, TEM1/CD248, TEM7R, CLDN6, GPRC5D, CXORF61, CD97, CD179a, ALK, Ácido polisiálico, PLACl, GloboH, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, GPR20, LY6K, OR51E2, TARP, WT1, NY-ESO-1, LAGE-la, MAGE-A1, legumain, HPV E6, E7, ETV6-AML, proteína de esperma 17, XAGE1, Tie 2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, Antígeno relacio- nado a Fos 1, p53, mutante de p53, prosteína, survivina, telomerase, PCTA-1/Galectina 8, MelanoA/MART1, mutante de Ras, hTERT, pon- tos de ruptura de translocação de sarcoma, ML-IAP, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, receptor de andrógeno, Ciclina B1, MYCN, RhoC, TRP-2, CYPIB I, BORIS, SART3, PAX5, OY-TES1, LCK, AKAP-4, SSX2, RAGE-1, transcriptase reversa da telomerase humana, RU1, RU2, carboxil esterase intestinal, hsp70-2 mut, CD79a, CD79b, CD72, LAIR1, FCAR, LILRA2, CD300LF, CLEC12A, BST2, EMR2, LY75, GPC3, FCRL5, IGLL1, um neoantigênio, CD133, CD15, CD184, CD24, CD56, CD26, CD29, CD44, HLA-A, HLA-B, HLA-C, (HLA-A,B,C) CD49f, CD151 CD340, CD200, tkrA, trkB, ou trkC, ou um fragmento antigênico ou porção antigênica dos mesmos.
[00426] Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antí- geno de CAR se liga a uma característica do antígeno de uma doença infecciosa (por exemplo, uma infecção viral ou uma infecção bacteria- na). Em algumas modalidades, um antígeno é característico de uma doença infecciosa selecionada de HIV, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus do herpes humano, vírus do herpes humano 8 (HHV- 8, vírus do herpes associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV)), vírus linfotrófico T humano-1 (HTLV-1), poliomavírus de células Merkel (MCV), vírus Símio 40 (SV40), vírus Eptstein-Barr, CMV, vírus do papi-
loma humano. Em algumas modalidades, uma característica de antí- geno de uma doença infecciosa é selecionada a partir de um receptor de superfície celular, um receptor ligado a um canal iônico, um recep- tor ligado a uma enzima, um receptor acoplado à proteína G, um tiro- sina cinase receptora, um receptor associado à tirosina cinase, um re- ceptor semelhante à tirosina fosfatase, serina/treonina cinase recepto- ra, guanilil ciclase receptora ou receptor associado à histidina cinase. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno de CAR se liga a um antígeno característico de uma doença infecciosa, em que o antígeno é selecionado a partir de Env de HIV, gpl20 ou epítopo in- duzido por CD4 em Env de HIV-1. Veja, por exemplo, WO2015/077789, cujos conteúdos são aqui incorporados por referên- cia. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno de CAR compreende CD4 ou um fragmento de ligação ao HIV do mesmo.
[00427] Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antí- geno de CAR se liga a uma característica do antígeno de um distúrbio autoimune ou inflamatório. Em algumas modalidades, o antígeno é ca- racterístico de um distúrbio autoimune ou inflamatório selecionado de doença do enxerto versus hospedeiro crônica (GVHD), lúpus, artrite, glomerulonefrite de complexo imunológico, goodpasture, uveíte, hepa- tite, esclerose sistêmica ou esclerodermia, diabetes tipo I, esclerose, doença da aglutinina fria, Pênfigo vulgar, Doença de Grave, anemia hemolítica autoimune, Hemofilia A, Síndrome de Sjogren Primária, púrpura trombocitopênica trombótica, neuromielite óptica, síndrome de Evan, neuropatia mediada por IgM, ciroglobulinemia, dermatomiosite, trombocitopenia idiopática, espondilite anquilosante, penfingoide bo- lhosa, angioedema adquirido, urticária crônica, polineuropatia desmie- linizante antifosfolipídica e trombocitopenia autoimune ou neutropenia ou aplasias eritrocitárias puras, enquanto exemplos não limitantes exemplares de doenças aloimunes incluem alossensibilização (veja,
por exemplo, Blazar et al., 2015, Am. J. Transplant, 15 (4): 931-41) ou xenossensibilização de transplante de órgãos hematopoéticos ou sóli- dos, transfusões de sangue, gravidez com alossensibilização fetal, trombocitopenia neonatal aloimune, doença hemolítica do recém- nascido, sensibilização a antígenos estranhos, como pode ocorrer com a substituição de distúrbios de deficiência herdados ou adquiridos tra- tados com terapia de reposição enzimática ou proteica, produtos san- guíneos e terapia gênica. Em algumas modalidades, um antígeno ca- racterístico de um distúrbio autoimune ou inflamatório é selecionado a partir de um receptor de superfície celular, um receptor ligado a um canal iônico, um receptor ligado a uma enzima, um receptor acoplado a proteína G, tirosina cinase receptora, receptor associado à tirosina cinase, tirosina fosfatase semelhante ao receptor, serina/treonina ci- nase receptora, guanilil ciclase receptora ou receptor associado à his- tidina cinase. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao an- tígeno de CAR se liga a um ligante expresso em células B, células plasmáticas ou plasmablastos. Em algumas modalidades, um domínio de ligação ao antígeno de CAR se liga a uma característica do antíge- no de um distúrbio autoimune ou inflamatório, em que o antígeno é selecionado a partir de CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD27, CD38, CD45R, CD138, CD319, BCMA, CD28, TNF, receptores de in- terferon, GM-CSF, ZAP-70, LFA-1, CD3 gama, CD5 ou CD2. Veja US 2003/0077249; WO 2017/058753; WO 2017/058850, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. (b) Domínios Transmembrana CAR
[00428] Em algumas modalidades, um CAR compreende um domí- nio transmembrana. Em algumas modalidades, um CAR compreende pelo menos uma região transmembrana da cadeia alfa, beta ou zeta de um receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134,
CD137, CD154 ou sua variante funcional. Em algumas modalidades, um CAR compreende pelo menos uma região transmembrana de CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD37, CD80, CD86, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS e FGFR2B, ou sua variante funcional. (c) Domínios de Sinalização CAR
[00429] Em algumas modalidades, um CAR compreende um domí- nio de sinalização de um ou mais dentre B7-1/CD80; B7-2/CD86; B7- H1/PD-L1; B7-H2; B7-H3; B7-H4; B7-H6; B7-H7; BTLA/CD272; CD28; CTLA-4; Gi24/VISTA/B7-H5; ICOS/CD278; PD-1; PD-L2/B7-DC; PDCD6); 4-1BB/TNFSF9/CD137; Ligante 4-1BB/TNFSF9; BAFF/BLyS/TNFSF13B; BAFF R/TNFRSF13C; CD27/TNFRSF7; CD27 Ligante/TNFSF7; CD30/TNFRSF8; Ligante CD30/TNFSF8; CD40/TNFRSF5; CD40/TNFSF5; Ligante CD40/TNFSF5; DR3/TNFRSF25; GITR/TNFRSF18; Ligante GITR/TNFSF18; HVEM/TNFRSF14; LIGHT/TNFSF14; Linfotoxina-alfa/TNF-beta; OX40/TNFRSF4; Ligante OX40/TNFSF4; RELT/TNFRSF19L; TA- CI/TNFRSF13B; TL1A/TNFSF15; TNF-alfa; TNF RII/TNFRSF1B); 2B4/CD244/SLAMF4; BLAME/SLAMF8; CD2; CD2F-10/SLAMF9; CD48/SLAMF2; CD58/LFA-3; CD84/SLAMF5; CD229/SLAMF3; CRACC/SLAMF7; NTB-A/SLAMF6; SLAM/CD150); CD2; CD7; CD53; CD82/Kai-1; CD90/Thy1; CD96; CD160; CD200; CD300a/LMIR1; HLA Classe I; HLA-DR; Ikaros; Integrina alfa 4/CD49d; Integrina alfa 4 beta 1; Integrina alfa 4 beta 7/LPAM-1; LAG-3; TCL1A; TCL1B; CRTAM; DAP12; Dectina-1/CLEC7A; DPPIV/CD26; EphB6; TIM-1/KIM- 1/HAVCR; TIM-4; TSLP; TSLP R; antígeno associado à função linfoci- tária-1 (LFA-1); NKG2C, um domínio zeta CD3, um motivo de ativação à base de tirosina imunorreceptora (ITAM) ou variante funcional dos mesmos.
[00430] Em algumas modalidades, um CAR compreende um domí- nio de sinalização que é um domínio coestimulador. Em algumas mo- dalidades, um CAR compreende um segundo domínio coestimulador. Em algumas modalidades, um CAR compreende pelo menos dois do- mínios coestimuladores. Em algumas modalidades, um CAR compre- ende pelo menos três domínios coestimuladores. Em algumas modali- dades, um CAR compreende um domínio coestimulador selecionado de um ou mais dentre CD27, CD28, 4-1BB, CD134/OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno associado à função linfocitária-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligante que se liga especifica- mente ao CD83.
[00431] Em algumas modalidades, um CAR compreende um domí- nio zeta CD3 ou um motivo de ativação à base de tirosina imunorre- ceptora (ITAM), ou uma variante funcional dos mesmos. Em algumas modalidades, um CAR compreende (i) um domínio zeta de CD3, ou um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM), ou variante funcional dos mesmos; e (ii) um domínio CD28, ou um do- mínio 4-1BB, ou variante funcional dos mesmos. Em algumas modali- dades, um CAR compreende (i) um domínio zeta de CD3, ou um moti- vo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM), ou vari- ante funcional dos mesmos; (ii) um domínio CD28 ou variante funcio- nal deste; e (iii) um domínio 4-1BB, ou um domínio CD134, ou variante funcional dos mesmos. Em algumas modalidades, um CAR compre- ende (i) um domínio zeta de CD3, ou um motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM), ou variante funcional dos mes- mos; (ii) um domínio CD28 ou variante funcional deste; (iii) um domínio 4-1BB, ou um domínio CD134, ou variante funcional dos mesmos; e (iv) uma citocina ou transgene de ligante coestimulador. (d) Espaçadores CAR
[00432] Em algumas modalidades, um CAR compreende um ou mais espaçadores. Em algumas modalidades, um CAR compreende um espaçador entre o domínio de ligação ao antígeno e o domínio transmembrana. Em algumas modalidades, um CAR compreende um espaçador entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização intracelular. (e) Agentes de Carga Útil de Proteína de Membrana CAR
[00433] Além dos CARs aqui descritos, vários receptores de antí- genos quiméricos e sequências de nucleotídeos que os codificam são conhecidos na técnica e seriam adequados para distribuição fusoso- mal e reprogramação de células-alvo in vivo e in vitro, conforme aqui descrito. Veja, por exemplo, WO2013040557; WO2012079000; WO2016030414; Smith T, et al., Nature Nanotechnology. 2017. DOI:
10.1038/NNANO.2017.57, cujas descrições são aqui incorporadas por referência.
[00434] Em algumas modalidades, um fusosoma compreendendo um agente de carga de proteína de membrana que é ou compreende um CAR ou um ácido nucleico que codifica um CAR (por exemplo, um DNA, um gDNA, um cDNA, um RNA, um pré-MRNA, um mRNA, um miRNA, um siRNA, etc.) é liberado a uma célula-alvo. Em algumas modalidades, a célula-alvo é uma célula efetora, por exemplo, uma célula do sistema imunológico que expressa um ou mais receptores Fc e media uma ou mais funções efetoras. Em algumas modalidades, uma célula-alvo pode incluir, mas não pode estar limitada a, um ou mais dentre um monócito, macrófago, neutrófilo, célula dendrítica, eo- sinófilo, mastócito, plaqueta, linfócito granular grande, célula de Lange- rhans, célula exterminadora natural (NK), linfócito T (por exemplo, cé- lula T), uma célula T gama delta, linfócito B (por exemplo, célula B) e pode ser de qualquer organismo, incluindo, mas não se limitando a humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. (ix) Cargas Úteis do Receptor de Células T
[00435] Em algumas modalidades, um agente de carga útil de pro- teína de membrana aqui descrito compreende ou codifica um polipep- tídeo compreendendo um receptor de células T, por exemplo, uma proteína de fusão receptora de células T (TFP). Em algumas modali- dades, a TFP compreende um polipeptídeo recombinante derivado dos vários polipeptídeos compreendendo o TCR que é geralmente capaz de i) se ligar a um antígeno de superfície nas células-alvo e ii) interagir com outros componentes polipeptídicos do complexo de TCR intacto, tipicamente quando colocalizado em ou sobre a superfície de uma cé- lula T. Em algumas modalidades, a TFP incorpora em um TCR quando expressa em uma célula T. Em algumas modalidades, o agente de carga útil da proteína de membrana compreende ou codifica (i) um domínio de ligação ao antígeno operativamente ligado a (ii) um domí- nio TCR.
[00436] O domínio de ligação ao antígeno pode compreender, por exemplo, um scFv, por exemplo, um scFv que se liga a um antígeno compreendido por uma célula cancerosa, por exemplo, um antígeno na superfície de uma célula cancerosa. O domínio de ligação ao antí- geno pode ser humano ou humanizado. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno aqui descrito, por exemplo, na seção intitulada "Domínios de ligação ao antígeno CAR".
[00437] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antíge- no se liga a um domínio Fc de um anticorpo. Em algumas modalida- des, o domínio de ligação ao antígeno se liga seletivamente a um anti- corpo IgGl. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antíge- no se liga a um antígeno de superfície celular, por exemplo, um antí- geno de superfície celular na superfície de uma célula tumoral. Em al- gumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um monômero, um dímero, um trímero, um tetrâmero, um pentâmero,
um hexâmero, um heptâmero, um octômero, um nonâmero, ou um de- câmero. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno não compreende um anticorpo ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um poli- peptídeo CD16 ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um polipeptídeo de liga- ção a CD16.
[00438] Em algumas modalidades, a TFP inclui um domínio extra- celular de uma subunidade TCR que compreende um domínio extrace- lular ou porção do mesmo de uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste na cadeia alfa ou beta do receptor de células T, CD3 delta, CD3 épsilon ou CD3 gama, ou um fragmento funcional ou variante do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio TCR inclui um domínio transmembrana, por exemplo, pelo menos uma região transmembrana de um domínio transmembrana de uma cadeia TCR alfa, uma cadeia TCR beta, uma subunidade TCR CD3 épsilon, uma subunidade TCR CD3 gama, uma subunidade TCR CD3 delta, ou uma subunidade TCR CD3 zeta, ou um fragmento funcional ou variante do mesmo.
[00439] Em outras modalidades, o domínio TCR compreende um domínio intracelular de TCR que compreende um domínio estimulador selecionado a partir de um domínio de sinalização intracelular de CD3 épsilon, CD3 gama ou CD3 delta, ou uma variante dos mesmos.
[00440] Em outras modalidades, o domínio TCR compreende (i) um domínio extracelular TCR, (ii) um domínio transmembrana TCR, e (iii) um domínio intracelular TCR, em que pelo menos dois ou todos os três de (i), (ii), e (iii) são da mesma subunidade TCR.
[00441] Em algumas modalidades, o domínio TCR compreende CD3ε ou um fragmento funcional ou variante do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio TCR (por exemplo, domínio TCR baseado em
CD3ε) se liga a CD3ζ endógeno. Em algumas modalidades, o domínio TCR (por exemplo, domínio TCR baseado em CD3ε) se liga a CD3γ endógeno e/ou CD3δ endógeno. Em algumas modalidades, o domínio TCR compreende CD3α ou um fragmento funcional ou variante do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio TCR compreende CD3β ou um fragmento funcional ou variante do mesmo. Em algumas moda- lidades, o domínio TCR (por exemplo, domínio TCR baseado em CD3α ou baseado em CD3β) se liga a CD3ζ endógeno. Em algumas modalidades, o domínio TCR (por exemplo, domínio TCR baseado em CD3α) se liga a CD3β endógeno. Em algumas modalidades, o domínio TCR (por exemplo, domínio TCR baseado em CD3β) se liga a CD3α endógeno. Em algumas modalidades, o domínio TCR (por exemplo, domínio TCR baseado em CD3α ou baseado em CD3β) se liga a CD3δ endógeno.
[00442] Em algumas modalidades, uma TFP compreende uma su- bunidade de TCR compreendendo pelo menos uma porção de um domínio extracelular de TCR e um domínio intracelular de TCR com- preendendo um domínio estimulador de um domínio de sinalização intracelular de CD3 (por exemplo, CD3 épsilon, CD3 gama, CD3 delta, TCR alfa ou TCR beta); e um domínio de ligação ao antígeno humano ou humanizado, em que a subunidade TCR e o domínio de ligação ao antígeno estão operativamente ligados, e em que a TFP se incorpora em um TCR quando expresso em uma célula T. Em algumas modali- dades, uma TFP compreende uma subunidade de TCR e um domínio de anticorpo humano ou humanizado compreendendo um domínio de ligação ao antígeno que é um domínio de ligação anti-CD19 ou um domínio de ligação ao antígeno de maturação de células B (BCMA).
[00443] TFPs exemplares são descritas, por exemplo, em WO2016187349, WO2018026953, WO2018067993, WO2018098365, WO2018119298 e WO2018232020, cada um dos quais é aqui incorpo-
rado por referência na sua totalidade. Agentes de Carga Útil Secretados, por exemplo, Agentes de Carga Útil de Proteína Secretada
[00444] Agentes de carga útil, por exemplo, agentes de carga útil de proteína, também podem ser direcionados para secreção. Em algumas modalidades, os métodos e composições aqui descritos podem ser usados para direcionar cargas úteis para o lúmen de uma organela (por exemplo, um aparelho de Golgi, vesícula secretora) após a trans- lação no ER. Em algumas modalidades, um agente de carga útil de proteína secretada compreende uma proteína secretada ou um ácido nucleico que a codifica. Condrissomas
[00445] Em algumas modalidades, um fusosoma ou composição de fusosoma compreende ainda um condrissoma ou preparação de con- drissoma. Em algumas modalidades, um fusosoma ou composição de fusosoma compreende uma preparação de condrissoma modificada derivada de uma fonte celular de mitocôndria. Em algumas modalida- des, um fusosoma ou composição de fusosoma compreende uma pre- paração de condrissoma que expressa uma proteína exógena. Em al- gumas modalidades, a proteína exógena é exógena à referida mito- côndria. Em algumas modalidades, a proteína exógena é exógena à referida fonte celular de mitocôndrias. Características e modalidades adicionais, incluindo condrissomas, preparações de condrissomas, métodos e usos, são considerados pela invenção, por exemplo, con- forme descrito no pedido internacional PCT/US16/64251. Imunogenicidade
[00446] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, a composição de fusosoma é substancialmente não imunogênica. A imunogenicidade pode ser quantificada, por exemplo, conforme aqui descrito.
[00447] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem simetria de membrana de uma célula que é, ou é conhecida por ser, substancialmente não imunogênica, por exemplo, uma célula-tronco, célula-tronco mesenquimal, célula-tronco pluripotente induzida, célula- tronco embrionária, célula de Sertoli ou célula epitelial pigmentar da retina. Em algumas modalidades, o fusosoma tem uma imunogenici- dade não superior a 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % maior do que a imunogenicidade de uma célula-tronco, célula-tronco mesen- quimal, célula-tronco pluripotente induzida, célula-tronco embrionária, célula de Sertoli ou célula epitelial de pigmento retinal conforme medi- do por um ensaio aqui descrito.
[00448] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma compreende níveis elevados de um agente imunossupressor em com- paração com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte ou uma célula de Jurkat. Em algumas modalidades, o nível elevado é de pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes. Em algu- mas modalidades, a composição de fusosoma compreende um agente imunossupressor que está ausente da célula de referência. Em algu- mas modalidades, a composição de fusosoma compreende níveis re- duzidos de um agente de ativação imune em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte ou uma célula de Jurkat. Em algumas modalidades, o nível reduzido é de pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % em comparação para a célula de referência. Em algumas modalidades, o agente de ativação imune está substancialmente ausente do fusoso- ma.
[00449] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma compreende uma membrana com composição substancialmente se- melhante, por exemplo, conforme medido por proteômica, àquela de uma célula fonte, por exemplo, uma célula fonte substancialmente não imunogênica. Em algumas modalidades, a composição do fusosoma compreende uma membrana que compreende pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou 100 % das proteínas de membrana da célula fonte. Em algumas modalidades, a composição do fusosoma compreende uma membrana compreendendo proteínas de membrana expressas em, pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou 100 % do nível de expressão das proteínas de membrana em uma membrana da célula fonte.
[00450] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma, ou a célula fonte da qual a composição de fusosoma é derivada, tem um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais das seguintes características: a. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de MHC classe I ou MHC classe II, em compara- ção com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modi- ficada de outra forma semelhante ao célula fonte, ou uma célula HeLa; b. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de uma ou mais proteínas coestimuladoras inclu- indo, mas não se limitando a: LAG3, ICOS-L, ICOS, OX40L, OX40, CD28, B7, CD30, CD30L 4-1BB, 4-1BBL, SLAM, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, B7-H3 ou B7-H4, em comparação com uma célula de referên- cia, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhan- te à célula fonte, ou uma célula de referência aqui descrita; c. expressão de proteínas de superfície que suprimem o envolvimento de macrófagos, por exemplo, CD47, por exemplo, ex- pressão detectável por um método aqui descrito, por exemplo, mais de
1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, ou mais ex- pressão da proteína de superfície que suprime o envolvimento de ma- crófagos, por exemplo, CD47, em comparação com uma célula de re- ferência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma se- melhante à célula fonte, ou uma célula de Jurkat; d. expressão de citocinas imunossupressoras solúveis, por exemplo, IL-10, por exemplo, expressão detectável por um método aqui descrito, por exemplo, mais de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 ve- zes, 5 vezes, 10 vezes, ou mais expressão de citocinas imunossu- pressoras solúveis, por exemplo, IL-10, em comparação com uma cé- lula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula de Jurkat; e. expressão de proteínas imunossupressoras solúveis, por exemplo, PD-L1, por exemplo, expressão detectável por um método aqui descrito, por exemplo, mais de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 ve- zes, 5 vezes, 10 vezes, ou mais expressão de proteínas imunossu- pressoras solúveis, por exemplo, PD-L1, em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula de Jurkat; f. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de citocinas estimulantes da imunidade solúvel, por exemplo, IFN-gama ou TNF-a, em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula U-266; g. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de antígeno imunoestimulante endógeno, por exemplo, Zg16 ou Hormad1, em comparação com uma célula de refe- rência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma seme- lhante à célula fonte, ou uma célula A549 ou uma célula SK-BR-3; h. expressão de, por exemplo, expressão detectável por um método aqui descrito, HLA-E ou HLA-G, em comparação com uma cé- lula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula de Jurkat; i. perfil de glicosilação de superfície, por exemplo, contendo ácido siálico, que atua para, por exemplo, suprimir a ativação de célu- las NK; j. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de TCRα/β, em comparação com uma célula de re- ferência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma se- melhante à célula fonte, ou um Célula Jurkat; k. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de grupos sanguíneos ABO, em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modifica- da de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula HeLa; l. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de Antígeno de Histocompatibilidade Menor (MHA), em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célu- la não modificada de outra forma semelhante à fonte célula, ou uma célula de Jurkat; ou m. tem menos de 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % ou menos, de MHAs mitocondriais, em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula de Jurkat, ou não tem MHAs mitocondriais detectáveis.
[00451] Nas modalidades, a proteína coestimuladora é 4-1BB, B7, SLAM, LAG3, HVEM ou LIGHT, e a célula ref é HDLM-2. Em algumas modalidades, a proteína coestimuladora é BY-H3 e a célula de refe- rência é HeLa. Em algumas modalidades, a proteína coestimuladora é ICOSL ou B7-H4, e a célula de referência é SK-BR-3. Em algumas modalidades, a proteína coestimuladora é ICOS ou OX40 e a célula de referência é MOLT-4. Em algumas modalidades, a proteína coestimu- ladora é CD28 e a célula de referência é U-266. Em algumas modali- dades, a proteína coestimuladora é CD30L ou CD27 e a célula de refe- rência é Daudi.
[00452] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma não elicia substancialmente uma resposta imunogênica pelo sistema imu- nológico, por exemplo, sistema imunológico inato. Nas modalidades, uma resposta imunogênica pode ser quantificada, por exemplo, con- forme aqui descrito. Em algumas modalidades, a resposta imunogêni- ca pelo sistema imune inato compreende uma resposta de células imunes inatas incluindo, mas não se limitando a células NK, macrófa- gos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, células dendríticas, mastócitos ou células T gama/delta. Em algumas modalidades, uma resposta imunogênica do sistema imunológico inato compreende uma resposta do sistema complemento que inclui componentes solúveis do sangue e componentes ligados à membrana.
[00453] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma não elicia substancialmente uma resposta imunogênica pelo sistema imu- nológico, por exemplo, sistema imunológico adaptativo. Nas modalida- des, uma resposta imunogênica pode ser quantificada, por exemplo, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, uma resposta imu- nogênica pelo sistema imune adaptativo compreende uma resposta imunogênica por uma célula imune adaptativa incluindo, mas não se limitando a uma mudança, por exemplo, aumento, no número ou ativi- dade de linfócitos T (por exemplo, células T CD4, T CD8 células, e ou células T gama-delta), ou linfócitos B. Em algumas modalidades, uma resposta imunogênica pelo sistema imune adaptativo inclui níveis au- mentados de componentes do sangue solúveis, incluindo, mas não se limitando a uma mudança, por exemplo, aumento, no número ou ativi- dade de citocinas ou anticorpos (por exemplo, IgG, IgM, IgE, IgA ou
IgD).
[00454] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é modificada para ter imunogenicidade reduzida. A imunogenicidade po- de ser quantificada, por exemplo, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem uma imunogenicidade menor que 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % menor que a imuno- genicidade de uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte ou uma célula de Jurkat.
[00455] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, a composição de fusosoma é derivada de uma célula fonte, por exemplo, uma célula de mamífero, com um genoma modifi- cado, por exemplo, modificado usando um método aqui descrito, para reduzir, por exemplo, diminuir a imunogenicidade. A imunogenicidade pode ser quantificada, por exemplo, conforme aqui descrito.
[00456] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é derivada de uma célula de mamífero depletada de, por exemplo, com um nocaute de, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais dos seguintes: a. MHC classe I, MHC classe II ou MHA; b. uma ou mais proteínas coestimuladoras incluindo, mas não se limitando a: LAG3, ICOS-L, ICOS, OX40L, OX40, CD28, B7, CD30, CD30L 4-1BB, 4-1BBL, SLAM, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, B7-H3 ou B7-H4; c. citocinas de estimulação imunológica solúveis, por exemplo, IFN-gama ou TNF-a; d. antígeno imunoestimulante endógeno, por exemplo, Zg16 ou Hormad1; e. receptores de células T (TCR); f. Os genes que codificam grupos sanguíneos ABO, por exemplo, gene ABO; g. fatores de transcrição que conduzem a ativação imune, por exemplo, NFkB; h. fatores de transcrição que controlam a expressão de MHC, por exemplo, transativador de classe II (CIITA), fator regulador do Xbox 5 (RFX5), proteína associada a RFX (RFXAP) ou repetições de anquirina de RFX (RFXANK; também conhecido como RFXB); ou i. proteínas TAP, por exemplo, TAP2, TAP1 ou TAPBP, que reduzem a expressão de MHC de classe I.
[00457] Em algumas modalidades, o fusosoma é derivado de uma célula fonte com uma modificação genética que resulta em expressão aumentada de um agente imunossupressor, por exemplo, um, dois, três ou mais dos seguintes (por exemplo, em que antes da modifica- ção genética a célula não expressar o fator): a. proteínas de superfície que suprimem o envolvimento de macrófagos, por exemplo, CD47; por exemplo, expressão aumentada de CD47 em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula de Jurkat; b. citocinas imunossupressoras solúveis, por exemplo, IL- 10, por exemplo, expressão aumentada de IL-10 em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula de Jurkat; c. proteínas imunossupressoras solúveis, por exemplo, PD- 1, PD-L1, CTLA4 ou BTLA; por exemplo, expressão aumentada de proteínas imunossupressoras em comparação com uma célula de refe- rência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma seme- lhante à fonte de célula, ou uma célula de Jurkat; ou d. uma proteína tolerogênica, por exemplo, um agonista de ILT-2 ou ILT-4, por exemplo, HLA-E ou HLA-G ou qualquer outro ago-
nista de ILT-2 ou ILT-4 endógeno, por exemplo, expressão aumentada de HLA-E, HLA-G, ILT-2 ou ILT-4 em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula de Jurkat.
[00458] Em algumas modalidades, o nível de expressão aumentado é de pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes ou 100 vezes maior em comparação com uma célula de referência.
[00459] Em algumas modalidades, o fusosoma é derivado de uma célula fonte modificada para ter expressão diminuída de um agente de ativação imunológica, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais dos seguintes: a. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de MHC classe I ou MHC classe II, em compara- ção com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modi- ficada de outra forma semelhante ao célula fonte, ou uma célula HeLa; b. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de uma ou mais proteínas coestimuladoras inclu- indo, mas não se limitando a: LAG3, ICOS-L, ICOS, OX40L, OX40, CD28, B7, CD30, CD30L 4-1BB, 4-1BBL, SLAM, CD27, CD70, HVEM, LIGHT, B7-H3 ou B7-H4, em comparação com uma célula de referên- cia, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhan- te à célula fonte, ou uma célula de referência aqui descrita; c. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de citocinas estimulantes da imunidade solúvel, por exemplo, IFN-gama ou TNF-a, em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula U-266; d. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de antígeno imunoestimulante endógeno, por exemplo, Zg16 ou Hormad1, em comparação com uma célula de refe- rência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma seme- lhante à célula fonte, ou uma célula A549 ou uma célula SK-BR-3; e. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de receptores de células T (TCR) em compara- ção com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modi- ficada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula de Jur- kat; f. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de grupos sanguíneos ABO, em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modifica- da de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula HeLa; g. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de fatores de transcrição que conduzem a ativa- ção imune, por exemplo, NFkB; em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula de Jurkat h. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de fatores de transcrição que controlam a ex- pressão de MHC, por exemplo, transativador de classe II (CIITA), fator regulador do Xbox 5 (RFX5), proteína associada a RFX (RFXAP) ou repetições de anquirina de RFX (RFXANK; também conhecido como RFXB) em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula de Jurkat; ou i. menos de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 % ou 5 % ou menos expressão de proteínas TAP, por exemplo, TAP2, TAP1 ou TAPBP, que reduzem a expressão de MHC classe I em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modifica- da de outra forma semelhante à célula fonte, ou uma célula HeLa.
[00460] Em algumas modalidades, uma composição de fusosoma derivada de uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula-tronco mesenquimal, modificada usando shRNA que expressa lentivírus para diminuir a expressão de MHC Classe I, tem menor expressão de MHC Classe I em comparação com uma célula não modificada, por exem- plo, uma haste mesenquimal célula que não foi modificada. Em algu- mas modalidades, uma composição de fusosoma derivada de uma cé- lula de mamífero, por exemplo, uma célula-tronco mesenquimal, modi- ficada usando lentivírus que expressa HLA-G para aumentar a expres- são de HLA-G, aumentou a expressão de HLA-G em comparação com uma célula não modificada, por exemplo, uma célula-tronco mesen- quimal que não foi modificada.
[00461] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é derivada de uma célula fonte, por exemplo, uma célula de mamífero, que não é substancialmente imunogênica, em que as células fonte es- timulam, por exemplo, induzem a secreção de IFN-gama de células T, a um nível de 0 pg/mL a > 0 pg/mL, por exemplo, como testado in vitro, pelo ensaio ELISPOT de IFN-gama.
[00462] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é derivada de uma célula fonte, por exemplo, uma célula de mamífero, em que a célula de mamífero é de uma cultura de células tratada com um agente imunossupressor, por exemplo, um glicocorticoide (por exemplo, dexametasona), citostático (por exemplo, metotrexato), anti- corpo (por exemplo, Muromonabe-CD3) ou modulador de imunofilina (por exemplo, Ciclosporina ou rapamicina).
[00463] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é derivada de uma célula fonte, por exemplo, uma célula de mamífero, em que a célula de mamífero compreende um agente exógeno, por exemplo, um agente terapêutico.
[00464] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é derivada de uma célula fonte, por exemplo, célula de mamífero, em que a célula de mamífero é uma célula recombinante.
[00465] Em algumas modalidades, o fusosoma é derivado de uma célula de mamífero geneticamente modificada para expressar imunoe- vasinas virais, por exemplo, hCMV US2 ou US11.
[00466] Em algumas modalidades, a superfície do fusosoma, ou a superfície da célula de mamífero da qual o fusosoma é derivado, é co- valentemente ou não covalentemente modificada com um polímero, por exemplo, um polímero biocompatível que reduz a imunogenicidade e a depuração imunomediada, por exemplo, PEG.
[00467] Em algumas modalidades, a superfície do fusosoma ou a superfície da célula de mamífero da qual o fusosoma é derivado é co- valentemente ou não covalentemente modificada com um ácido siáli- co, por exemplo, um ácido siálico compreendendo glicopolímeros, que contêm epítopos de glicano supressores de NK.
[00468] Em algumas modalidades, a superfície do fusosoma ou a superfície da célula de mamífero da qual o fusosoma é derivado é tra- tada enzimaticamente, por exemplo, com enzimas glicosidase, por exemplo, α-N-acetilgalactosaminidases, para remover grupos sanguí- neos ABO
[00469] Em algumas modalidades, a superfície do fusosoma ou a superfície da célula de mamífero da qual o fusosoma é derivado é tra- tada enzimaticamente, para dar origem a, por exemplo, induzir a ex- pressão de grupos sanguíneos ABO que correspondem ao tipo de sangue do receptor. Parâmetros para avaliar a imunogenicidade
[00470] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é derivada de uma célula fonte, por exemplo, uma célula de mamífero que não é substancialmente imunogênica, ou modificada, por exemplo, modificada usando um método aqui descrito, para ter uma redução na imunogenicidade. A imunogenicidade da célula fonte e da composição de fusosoma pode ser determinada por qualquer um dos ensaios aqui descritos.
[00471] Em algumas modalidades, a composição do fusosoma tem um aumento, por exemplo, um aumento de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais, na sobrevivência do enxerto in vivo em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à cé- lula fonte. Em algumas modalidades, a sobrevivência do enxerto é de- terminada por um ensaio que mede a sobrevivência do enxerto in vivo como aqui descrito, em um modelo animal apropriado, por exemplo, um modelo animal aqui descrito.
[00472] Em algumas modalidades, a composição do fusosoma tem um aumento, por exemplo, um aumento de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na formação de tera- toma em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte. Em algumas modalidades, a formação do teratoma é determinada por um ensaio que mede a formação do teratoma como aqui descrito, em um modelo animal apropriado, por exemplo, em um modelo animal aqui descrito.
[00473] Em algumas modalidades, a composição do fusosoma tem um aumento, por exemplo, um aumento de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na sobrevivência do teratoma em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte. Em algumas modalidades, a composição de fusosoma sobrevive por um ou mais dias em um ensaio de sobrevivência de teratoma. Em al- gumas modalidades, a sobrevivência do teratoma é determinada por um ensaio que mede a sobrevivência do teratoma como aqui descrito,
em um modelo animal apropriado, por exemplo, em um modelo animal aqui descrito. Em uma modalidade, a formação de teratoma é medida por análise de imagem, por exemplo, manchamento IHC, manchamen- to fluorescente ou H&E, de tecido fixo, por exemplo, congelado ou fi- xado com formalina, conforme descrito nos Exemplos. Em algumas modalidades, o tecido fixo pode ser corado com qualquer um ou todos os seguintes anticorpos: CD3 anti-humano, CD4 anti-humano ou CD8 anti-humano.
[00474] Em algumas modalidades, a composição do fusosoma tem uma redução, por exemplo, uma redução de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na infiltração de célu- las T CD8+ em um enxerto ou teratoma em comparação com uma cé- lula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte. Em algumas modalidades, a infiltra- ção de células T CD8 é determinada por um ensaio que mede a infil- tração de células T CD8+ como aqui descrito, por exemplo, análise histológica, em um modelo animal apropriado, por exemplo, um mode- lo animal aqui descrito. Em algumas modalidades, os teratomas deri- vados da composição de fusosoma têm infiltração de células T CD8+ em 0 %, 0,1 %, 1 % 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % dos campos de imagem 50x de uma seção de tecido de histologia.
[00475] Em algumas modalidades, uma composição de fusosoma tem uma redução, por exemplo, uma redução de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na infiltração de células T CD4+ em um enxerto ou teratoma em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte. Em algumas modalidades, a infiltração de células T CD4 é determinada por um ensaio que mede a infiltração de células T CD4+ como aqui descrito, por exemplo, análise histológica, em um modelo animal apropriado, por exemplo, um mode- lo animal aqui descrito. Em algumas modalidades, os teratomas deri- vados da composição de fusosoma têm infiltração de células T CD4+ em 0 %, 0,1 %, 1 % 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % dos campos de imagem 50x de uma seção de tecido de histologia.
[00476] Em algumas modalidades, uma composição de fusosoma tem uma redução, por exemplo, uma redução de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na infiltração de células NK CD3+ em um enxerto ou teratoma em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte. Em algumas modalidades, a infiltração de células NK CD3+ é determinada por um ensaio que mede a infiltração de células NK CD3+ como aqui descrito, por exemplo, análise histológica, em um modelo animal apropriado, por exemplo, um modelo animal aqui descrito. Em algumas modalidades, os terato- mas derivados da composição do fusosoma têm infiltração de células T NK CD3+ em 0 %, 0,1 %, 1 % 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou100 % dos campos de imagem 50x de uma seção de tecido de histologia.
[00477] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem uma redução na imunogenicidade medida por uma redução na respos- ta humoral após uma ou mais implantações do fusosoma derivado em um modelo animal apropriado, por exemplo, um modelo animal aqui descrito, em comparação com uma resposta humoral após um ou mais implantação de uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, em um modelo animal apropriado, por exemplo, um modelo animal aqui descrito. Em algumas modalidades, a redução na resposta humoral é medida em uma amostra de soro por um título de anticorpo anticélula, por exem-
plo, título de anticorpo antifusosoma, por exemplo, por ELISA. Em al- gumas modalidades, a amostra de soro de animais administrados com a composição de fusosoma tem uma redução de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, ou mais de um título de anticorpo anticélula em comparação com a amostra de soro de animais administrados com uma célula não modificada. Em algumas modalidades, a amostra de soro de animais aos quais foi administrada a composição de fusosoma tem um título de anticorpo anticélula au- mentado, por exemplo, aumentado em 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 % ou 0,40 % da linha de base, por exemplo, em que a linha de base se refere a uma amostra de soro dos mesmos animais antes da admi- nistração da composição de fusosoma.
[00478] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem uma redução na fagocitose de macrófagos, por exemplo, uma redução de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, ou mais na fagocitose de macrófagos em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, em que a redução na fagocitose de macró- fagos é determinada pela análise do índice de fagocitose in vitro, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 82. Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem um índice de fagocitose de 0, 1, 10, 100 ou mais, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exem- plo 82, quando incubado com macrófagos em um ensaio in vitro de fagocitose de macrófagos.
[00479] Em algumas modalidades, a célula fonte tem uma redução na lise celular mediada por citotoxicidade por PBMCs, por exemplo, uma redução de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na lise celular em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte ou células-tronco mesenquimais, por exem-
plo, usando um ensaio do Exemplo 83. Nas modalidades, a célula fon- te expressa HLA-G exógeno.
[00480] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem uma redução na lise celular mediada por NK, por exemplo, uma redu- ção de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na lise celular mediada por NK em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, em que a lise celular mediada por NK é avaliada in vitro, por um ensaio de liberação de cromo ou en- saio de liberação de európio.
[00481] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem uma redução na lise de células mediada por células T CD8+, por exemplo, uma redução de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na lise de células mediada por célu- las T CD8 em comparação com uma célula de referência, por exem- plo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, em que a lise de células mediada por células T CD8 é avaliada in vitro, por uma liberação de cromo ensaio ou ensaio de liberação de európio. Nas modalidades, a ativação e/ou proliferação é medida con- forme descrito no Exemplo 85.
[00482] Em algumas modalidades, a composição do fusosoma tem uma redução na proliferação e/ou ativação de células T CD4+, por exemplo, uma redução de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, em que a proliferação de células T CD4 é avaliada in vitro (por exemplo, ensaio de cocultura de célula fonte de mamífero modificada ou não modificada e células T CD4+ com CD3/CD28 Dynabeads), por exemplo, como descrito no Exemplo 86.
[00483] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem uma redução na secreção de IFN-gama de células T, por exemplo, uma redução de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na secreção de IFN-gama de células T em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, em que a secreção de IFN-gama de células T é testada in vitro, por exemplo, por IFN-gama ELISPOT.
[00484] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem uma redução na secreção de citocinas imunogênicas, por exemplo, uma redução de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na secreção de citocinas imunogênicas em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, em que a secreção de citocinas imunogênicas é avaliada in vitro usando ELISA ou ELISPOT.
[00485] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma re- sulta em secreção aumentada de uma citocina imunossupressora, por exemplo, um aumento de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na secreção de uma citocina imunossu- pressora em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, em que a secreção da citocina imunossupressora é avaliada in vitro usando ELISA ou ELISPOT.
[00486] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem um aumento na expressão de HLA-G ou HLA-E, por exemplo, um au- mento na expressão de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais de HLA-G ou HLA-E, em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modifica- da de outra forma semelhante à célula fonte, em que a expressão de HLA-G ou HLA-E é testado in vitro usando citometria de fluxo, por exemplo, FACS. Em algumas modalidades, a composição do fusoso- ma é derivada de uma célula fonte que é modificada para ter uma ex- pressão aumentada de HLA-G ou HLA-E, por exemplo, em compara- ção com uma célula não modificada, por exemplo, uma expressão aumentada de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais de HLA-G ou HLA-E, em que a expressão de HLA-G ou HLA-E é testada in vitro usando citometria de fluxo, por exemplo, FACS. Em algumas modalidades, a composição de fusoso- ma derivada de uma célula modificada com expressão aumentada de HLA-G demonstra imunogenicidade reduzida, por exemplo, conforme medido por infiltração de célula imune reduzida, em um ensaio de for- mação de teratoma, por exemplo, um ensaio de formação de teratoma como aqui descrito.
[00487] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem um aumento na expressão de ligantes inibidores de células T (por exemplo, CTLA4, PD1, PD-L1), por exemplo, um aumento na expres- são de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais de ligantes inibidores de células T em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, em que a expressão dos ligan- tes de inibidor de células T é testada in vitro usando citometria de flu- xo, por exemplo, FACS.
[00488] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem uma diminuição na expressão de ligantes coestimuladores, por exem- plo, uma diminuição de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais na expressão de ligantes coestimulado- res em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à célula fonte, em que a expressão de ligantes coestimuladores é testada in vitro usando citometria de fluxo, por exemplo, FACS.
[00489] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma tem uma diminuição na expressão de MHC classe I ou MHC classe II, por exemplo, uma diminuição na expressão de 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais de MHC Classe I ou MHC Classe II em comparação com uma célula de referência, por exemplo, uma célula não modificada de outra forma semelhante à cé- lula fonte ou uma célula HeLa, em que a expressão de MHC Classe I ou II é testada in vitro usando citometria de fluxo, por exemplo, FACS.
[00490] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é derivada de uma fonte de células, por exemplo, uma fonte de células de mamíferos, que é substancialmente não imunogênica. Em algumas modalidades, a imunogenicidade pode ser quantificada, por exemplo, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, a fonte de células de mamífero compreende qualquer um, todos ou uma combinação dos seguintes recursos: a. em que a célula fonte é obtida a partir de uma fonte de células autólogas; por exemplo, uma célula obtida de um receptor que receberá, por exemplo, administrado, a composição de fusosoma; b. em que a célula fonte é obtida a partir de uma fonte de célula alogênica que é de gênero compatível, por exemplo, semelhan- te a um receptor, por exemplo, um receptor aqui descrito que estará recebendo, por exemplo, administrado; a composição de fusosoma; c. em que a célula fonte é obtida a partir de uma fonte celu- lar alogênica que é HLA combinado com um HLA do receptor, por exemplo, em um ou mais alelos; d. em que a célula fonte é obtida de uma fonte celular alo- gênica que é um homozigoto HLA; e. em que a célula fonte é obtida de uma fonte de células alogênicas que não possui (ou tem níveis reduzidos em comparação com uma célula de referência) MHC de classe I e II; ou f. em que a célula fonte é obtida a partir de uma fonte celu- lar que é conhecida por ser substancialmente não imunogênica inclu- indo, mas não se limitando a uma célula-tronco, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco pluripotente induzida, uma célula- tronco embrionária, uma célula de Sertoli ou uma célula epitelial pig- mentar da retina.
[00491] Em algumas modalidades, o indivíduo a ser administrado com a composição de fusosoma tem, ou é conhecido por ter, ou é tes- tado para, um anticorpo pré-existente (por exemplo, IgG ou IgM) reati- vo com um fusosoma. Em algumas modalidades, o indivíduo a ser administrado com a composição de fusosoma não tem níveis detectá- veis de um anticorpo pré-existente reativo com o fusosoma. Os testes para o anticorpo são descritos, por exemplo, no Exemplo 78.
[00492] Em algumas modalidades, um indivíduo que recebeu a composição de fusosoma tem, ou é conhecido por ter, ou é testado para, um anticorpo (por exemplo, IgG ou IgM) reativo com um fusoso- ma. Em algumas modalidades, o indivíduo que recebeu a composição de fusosoma (por exemplo, pelo menos uma, duas, três vezes, quatro vezes, cinco vezes ou mais) não tem níveis detectáveis de anticorpo reativo com o fusosoma. Nas modalidades, os níveis de anticorpo não aumentam mais do que 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 % ou 50 % entre dois pontos de tempo, o primeiro ponto de tempo sendo antes da primeira administração do fusosoma, e o segundo ponto de tempo sendo após uma ou mais administrações do fusosoma. Os testes para o anticorpo são descritos, por exemplo, no Exemplo 79. Agentes terapêuticos adicionais
[00493] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é coadministrada com um agente adicional, por exemplo, um agente te- rapêutico, a um indivíduo, por exemplo, um receptor, por exemplo, um receptor aqui descrito. Em algumas modalidades, o agente terapêutico coadministrado é um agente imunossupressor, por exemplo, um glico- corticoide (por exemplo, dexametasona), citostático (por exemplo, me- totrexato), anticorpo (por exemplo, Muromonabe-CD3) ou modulador de imunofilina (por exemplo, Ciclosporina ou rapamicina) Nas modali- dades, o agente imunossupressor diminui a depuração mediada por imunidade de fusosomas. Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é coadministrada com um agente imunoestimulador, por exemplo, um adjuvante, uma interleucina, uma citocina ou uma quimi- ocina.
[00494] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma e o agente imunossupressor são administrados ao mesmo tempo, por exemplo, administrados contemporaneamente. Em algumas modalida- des, a composição de fusosoma é administrada antes da administra- ção do agente imunossupressor. Em algumas modalidades, a compo- sição de fusosoma é administrada após a administração do agente imunossupressor.
[00495] Em algumas modalidades, o agente imunossupressor é uma molécula pequena, como ibuprofeno, acetaminofeno, ciclospori- na, tacrolimo, rapamicina, micofenolato, ciclofosfamida, glicocorticoi- des, sirolimo, azatriopina ou metotrexato.
[00496] Em algumas modalidades, o agente imunossupressor é uma molécula de anticorpo, incluindo, mas não se limitando a: muro- nomabe (anti-CD3), Daclizumabe (anti-IL12), Basiliximabe, Infliximabe (Anti-TNFa) ou rituximabe (Anti-CD20).
[00497] Em algumas modalidades, a coadministração da composi- ção de fusosoma com o agente imunossupressor resulta em persis- tência realçada da composição de fusosoma no indivíduo em compa- ração com a administração da composição de fusosoma sozinha. Em algumas modalidades, a persistência realçada da composição de fu- sosoma na coadministração é de pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %,
50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais, em comparação com persis- tência da composição de fusosoma quando administrado sozinho. Em algumas modalidades, a persistência aumentada da composição de fusosoma na coadministração é de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, 25 ou 30 dias ou mais, em comparação com a sobrevivência da composição de fusosoma quando administrado sozinho. Liberação
[00498] Em algumas modalidades, um fusogênio (por exemplo, pro- teína, lipídeo ou fusogênio químico) ou um parceiro de ligação de fu- sogênio é liberado a uma célula ou tecido alvo antes, ao mesmo tempo ou após a liberação de um fusosoma.
[00499] Em algumas modalidades, um fusogênio (por exemplo, pro- teína, lipídeo ou fusogênio químico) ou um parceiro de ligação de fu- sogênio é liberado a uma célula ou tecido não alvo antes, ao mesmo tempo ou após a liberação de um fusosoma.
[00500] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um fusogênio (por exemplo, proteína ou fusogênio lipídico) ou um par- ceiro de ligação de fusogênio é liberado a uma célula ou tecido alvo antes, ao mesmo tempo ou após a liberação de um fusosoma.
[00501] Em algumas modalidades, um polipeptídeo, ácido nucleico, ribonucleoproteína ou molécula pequena que super-regula ou subregu- la a expressão de um fusogênio (por exemplo, proteína, lipídeo ou fu- sogênio químico) ou um parceiro de ligação de fusogênio é liberado a uma célula ou tecido alvo antes de, ao mesmo tempo, ou após a libe- ração de um fusosoma.
[00502] Em algumas modalidades, um polipeptídeo, ácido nucleico, ribonucleoproteína ou molécula pequena que super-regula ou subregu- la a expressão de um fusogênio (por exemplo, proteína, lipídeo ou fu- sogênio químico) ou um parceiro de ligação a fusogênio é liberado a uma célula ou tecido não alvo antes, ao mesmo tempo ou após a libe-
ração de um fusosoma.
[00503] Em algumas modalidades, a célula ou tecido alvo é modifi- cado (por exemplo, induzindo estresse ou divisão celular) para aumen- tar a taxa de fusão antes, ao mesmo tempo ou após a liberação de um fusosoma. Alguns exemplos não limitativos incluem indução de isque- mia, tratamento com quimioterapia, antibiótico, irradiação, toxina, in- flamação, moléculas inflamatórias, moléculas antiinflamatórias, lesão por ácido, lesão básica, queimadura, polietilenoglicol, neurotransmis- sores, fármacos mielotóxicos, fatores de crescimento ou hormônios, ressecção de tecido, inanição e/ou exercício.
[00504] Em algumas modalidades, a célula ou tecido alvo é tratado com um vasodilatador (por exemplo, óxido nítrico (NO), monóxido de carbono, prostaciclina (PGI2), nitroglicerina, fentolamina) ou vasocons- tritores (por exemplo, angiotensina (AGT), endotelina (EDN), norepine- frina)) para aumentar a taxa de transporte de fusosoma para o tecido alvo.
[00505] Em algumas modalidades, a célula ou tecido alvo é tratado com um agente químico, por exemplo, um quimioterápico. Em tais mo- dalidades, o quimioterápico induz danos à célula ou tecido alvo que aumenta a atividade fusogênica de células ou tecido alvo.
[00506] Em algumas modalidades, a célula ou tecido alvo é tratado com um estresse físico, por exemplo, eletrofusão. Em tais modalida- des, o estresse físico desestabiliza as membranas da célula ou tecido alvo para aumentar a atividade fusogênica das células ou tecido alvo.
[00507] Em algumas modalidades, a célula ou tecido alvo pode ser tratado com um agente para aumentar a fusão com um fusosoma. Por exemplo, receptores neuronais específicos podem ser estimulados com um antidepressivo para aumentar as propriedades fusogênicas.
[00508] As composições que compreendem os fusosomas aqui descritos podem ser administradas ou direcionadas ao sistema circula-
tório, sistema hepático, sistema renal, sistema cardiopulmonar, siste- ma nervoso central, sistema nervoso periférico, sistema músculo- esquelético, sistema linfático, sistema imunológico, sistema nervoso sensorial (visão, audição, olfato, tato, paladar), sistema digestivo, sis- tema endócrino (incluindo regulação metabólica do tecido adiposo) e sistema reprodutivo.
[00509] Nas modalidades, uma composição de fusosoma aqui des- crita é liberado ex vivo a uma célula ou tecido, por exemplo, uma célu- la ou tecido humano. Em algumas modalidades, a composição é libe- rada a um tecido ex vivo que está em um estado ferido (por exemplo, de trauma, doença, hipoxia, isquemia ou outro dano).
[00510] Em algumas modalidades, a composição do fusosoma é liberado a um transplante ex vivo (por exemplo, um explante de tecido ou tecido para transplante, por exemplo, uma veia humana, um enxer- to músculo-esquelético, como osso ou tendão, córnea, pele, válvulas cardíacas, nervos; ou um órgão isolado ou cultivado, por exemplo, um órgão a ser transplantado em um ser humano, por exemplo, um cora- ção humano, fígado, pulmão, rim, pâncreas, intestino, timo, olho). A composição melhora a viabilidade, respiração ou outra função do transplante. A composição pode ser liberada ao tecido ou órgão antes, durante e/ou após o transplante.
[00511] Em algumas modalidades, uma composição de fusosoma aqui descrita é liberada ex vivo a uma célula ou tecido derivado de um indivíduo. Em algumas modalidades, a célula ou tecido é readministra- do ao indivíduo (isto é, a célula ou tecido é autólogo).
[00512] Os fusosomas podem se fundir com uma célula de qualquer tecido de mamífero (por exemplo, humano), por exemplo, de tecido ou células epiteliais, conectivas, musculares ou nervosas e suas combi- nações. Os fusosomas podem ser administrados a qualquer sistema de órgão eucariótico (por exemplo, mamífero), por exemplo, a partir do sistema cardiovascular (coração, vasculatura); sistema digestivo (esô- fago, estômago, fígado, vesícula biliar, pâncreas, intestinos, cólon, reto e ânus); sistema endócrino (hipotálamo, glândula pituitária, corpo pi- neal ou glândula pineal, tireoide, paratireoides, glândulas suprarre- nais); sistema excretor (rins, ureteres, bexiga); sistema linfático (linfa, nódulos linfáticos, vasos linfáticos, amígdalas, adenoides, timo, baço); sistema tegumentar (pele, cabelo, unhas); sistema muscular (por exemplo, músculo esquelético); sistema nervoso (cérebro, medula es- pinhal, nervos); sistema reprodutivo (ovários, útero, glândulas mamá- rias, testículos, vasos deferentes, vesículas seminais, próstata); siste- ma respiratório (faringe, laringe, traqueia, brônquios, pulmões, dia- fragma); sistema esquelético (osso, cartilagem) e suas combinações.
[00513] Nas modalidades, o fusosoma direciona-se a um tecido, por exemplo, fígado, pulmões, coração, baço, pâncreas, trato gastrointes- tinal, rim, testículos, ovários, cérebro, órgãos reprodutores, sistema nervoso central, sistema nervoso periférico, músculo esquelético, en- dotélio, ouvido interno, tecido adiposo (por exemplo, tecido adiposo marrom ou tecido adiposo branco) ou olho, quando administrado a um indivíduo, por exemplo, em que pelo menos 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % dos fusosomas em uma população de fusosomas administrados estão presentes no tecido alvo após 24, 48 ou 72 horas, por exemplo, por um ensaio do Exemplo 87 ou 100.
[00514] Nas modalidades, os fusosomas podem se fundir com uma célula de uma fonte de células-tronco ou células progenitoras, por exemplo, células do estroma da medula óssea, células progenitoras adultas derivadas da medula (MAPCs), células progenitoras endoteli- ais (EPC), células blásticas, células progenitoras intermediárias forma- da na zona subventricular, células-tronco neurais, células-tronco mus- culares, células satélite, células-tronco hepáticas, células-tronco hema-
topoéticas, células do estroma da medula óssea, células-tronco epi- dérmicas, células-tronco embrionárias, células-tronco mesenquimais, células-tronco do cordão umbilical, células precursoras, células pre- cursoras musculares, mioblastos, cardiomioblastos, células precurso- ras neurais, células precursoras gliais, células precursoras neuronais, hepatoblastos. Parceiros de Ligação de Fusogênio, por exemplo, para modalida- des de plataforma de aterrissagem
[00515] Em certos aspectos, a descrição fornece um método de li- beração de um fusosoma a uma célula-alvo em um indivíduo. Em al- gumas modalidades, o método compreende administrar a um indivíduo um fusosoma compreendendo um ácido nucleico que codifica um fu- sogênio, por exemplo, uma proteína miomarcadora, em que o ácido nucleico não está presente ou não é expresso (por exemplo, está pre- sente, mas não é transcrito ou transladado) dentro de uma célula, sob condições que permitem que o fusogênio seja expresso na superfície o fusosoma no indivíduo. Em algumas modalidades, o método compre- ende ainda a administração ao indivíduo de uma composição compre- endendo um agente, por exemplo, um agente terapêutico e um parcei- ro de ligação de fusogênio, opcionalmente, que compreende um veícu- lo, por exemplo, uma membrana, sob condições que permitem a fusão do fusogênio em o fusosoma e o parceiro de ligação do fusogênio. Em algumas modalidades, o veículo compreende uma membrana, por exemplo, uma bicamada lipídica, por exemplo, o agente é disposto dentro de uma bicamada lipídica. Em algumas modalidades, a bica- mada lipídica se funde com a célula-alvo, liberando desse modo o agente à célula-alvo no indivíduo.
[00516] Em algumas modalidades, um parceiro de ligação ao fuso- gênio é uma porção, por exemplo, uma molécula de proteína, disposta em uma membrana (por exemplo, uma bicamada lipídica), de uma cé-
lula-alvo, por exemplo, uma célula-alvo aqui descrita. Em algumas modalidades, a membrana pode ser uma membrana da superfície ce- lular ou uma membrana subcelular de uma organela, por exemplo, uma mitocôndria, lisossoma ou aparelho de Golgi. Em algumas moda- lidades, um parceiro de ligação ao fusogênio pode ser expresso endo- genamente, superexpresso ou expresso exogenamente (por exemplo, por um método aqui descrito). Em algumas modalidades, o parceiro de ligação ao fusogênio pode se agrupar com outros parceiros de ligação ao fusogênio na membrana.
[00517] Em algumas modalidades, a presença de um parceiro de ligação de fusogênio, ou uma pluralidade de parceiros de ligação de fusogênio, em uma membrana de uma célula-alvo, cria uma interface que pode facilitar a interação, por exemplo, ligação, entre um parceiro de ligação de fusogênio em uma célula-alvo (por exemplo, uma célula aqui descrita), e um fusogênio em um fusosoma (por exemplo, um fu- sosoma aqui descrito). Em algumas modalidades, o fusogênio em um fusosoma interage com, por exemplo, se liga a um parceiro de ligação de fusogênio na célula-alvo, por exemplo, na membrana (por exemplo, bicamada lipídica), de uma célula-alvo, para induzir a fusão do fuso- soma com o membrana alvo. Em algumas modalidades, o fusogênio interage com, por exemplo, se liga a um parceiro de ligação ao fuso- gênio em uma plataforma de aterrissagem em uma organela subcelu- lar, incluindo uma mitocôndria, para induzir a fusão do fusosoma com a organela subcelular.
[00518] Um parceiro de ligação de fusogênio pode ser introduzido em uma célula-alvo, por exemplo, uma célula-alvo descrita aqui, por qualquer um dos métodos discutidos abaixo.
[00519] Em algumas modalidades, um método de introdução de um parceiro de ligação de fusogênio a uma célula-alvo compreende a re- moção, por exemplo, extração, de uma célula-alvo (por exemplo, via aférese ou biópsia), de um indivíduo (por exemplo, um indivíduo aqui descrito) e administração de, por exemplo, exposição a um parceiro de ligação ao fusogênio sob condições que permitem que o parceiro de ligação ao fusogênio seja expresso em uma membrana da célula-alvo. Em algumas modalidades, um método compreende o contato da célu- la-alvo que expressa um parceiro de ligação ao fusogênio ex vivo com um fusosoma compreendendo um fusogênio para induzir a fusão do fusosoma com a membrana da célula-alvo. Em algumas modalidades, uma célula-alvo fundida ao fusosoma é reintroduzida no indivíduo, por exemplo, por via intravenosa.
[00520] Em algumas modalidades, uma célula-alvo que expressa um parceiro de ligação ao fusogênio é reintroduzida no indivíduo, por exemplo, por via intravenosa. Em algumas modalidades, um método compreende a administração ao indivíduo de um fusosoma compreen- dendo um fusogênio para permitir a interação, por exemplo, a ligação, do fusogênio no fusosoma com o parceiro de ligação do fusogênio na célula-alvo e a fusão do fusosoma com a membrana da célula-alvo .
[00521] Em algumas modalidades, as células-alvo são tratadas com um modificador epigenético, por exemplo, um modificador epigenético de molécula pequena, para aumentar ou diminuir a expressão de uma molécula de superfície celular endógena (por exemplo, em algumas modalidades, endógena em relação à célula-alvo), por exemplo, um parceiro de ligação a fusogênio, por exemplo, um órgão, tecido ou mo- lécula de alvo celular, onde a molécula de superfície celular é uma pro- teína, glicano, lipídeo ou molécula de baixo peso molecular. Em algu- mas modalidades, uma célula-alvo é geneticamente modificada para aumentar a expressão de uma molécula de superfície celular endóge- na, por exemplo, um parceiro de ligação a fusogênio, por exemplo, um órgão, tecido ou molécula de alvo celular, onde a molécula de superfí- cie celular é uma proteína, glicano, lipídeo ou molécula de baixo peso molecular. Em algumas modalidades, uma modificação genética pode diminuir a expressão de um ativador transcricional da molécula de su- perfície celular endógena, por exemplo, um parceiro de ligação a fuso- gênio.
[00522] Em algumas modalidades, uma célula-alvo é geneticamen- te modificada para expressar, por exemplo, super-expressar, uma mo- lécula de superfície celular exógena, por exemplo, um parceiro de liga- ção a fusogênio, onde a molécula de superfície celular é uma proteína, glicano, lipídeo ou molécula de baixo peso molecular.
[00523] Em algumas modalidades, a célula-alvo é geneticamente modificada para aumentar a expressão de um fusogênio exógeno na célula, por exemplo, a liberação de um transgene. Em algumas moda- lidades, um ácido nucleico, por exemplo, DNA, mRNA ou siRNA trans- feridos para a célula-alvo, por exemplo, para aumentar ou diminuir a expressão de uma molécula de superfície celular (proteína, glicano, lipídeo ou molécula de baixo peso molecular). Em algumas modalida- des, o ácido nucleico direciona-se a um repressor de um parceiro de ligação de fusogênio, por exemplo, um shRNA ou construto de siRNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica um inibidor de um repressor de parceiro de ligação a fusogênio. Métodos de Uso
[00524] A administração de uma composição farmacêutica aqui descrita pode ser por meio de administração oral, inalada, transdérmi- ca ou parenteral (incluindo intravenosa, intratumoral, intraperitoneal, intramuscular, intracavidade e subcutânea). Os fusosomas podem ser administrados sozinhos ou formulados como uma composição farma- cêutica.
[00525] Os fusosomas podem ser administrados na forma de uma composição de dose unitária, tal como uma composição de dose unitá- ria oral, parenteral, transdérmica ou inalada. Essas composições são preparadas por mistura e são adequadamente adaptadas para admi- nistração oral, inalada, transdérmica ou parenteral e, como tal, podem estar na forma de comprimidos, cápsulas, preparações líquidas orais, pós, grânulos, pastilhas, pós reconstituíveis, soluções injetáveis e infu- síveis ou suspensões ou supositórios ou aerossóis.
[00526] Em algumas modalidades, a liberação de um agente de carga útil de proteína de membrana por meio de uma composição de fusosoma aqui descrita pode induzir ou bloquear a diferenciação, des- diferenciação ou transdiferenciação celular. A célula-alvo de mamífero pode ser uma célula precursora. Alternativamente, a célula-alvo de mamífero pode ser uma célula diferenciada e a alteração do destino da célula inclui direcionar a desdiferenciação em uma célula precursora pluripotente ou bloquear essa desdiferenciação. Em situações em que uma mudança no destino da célula é desejada, quantidades eficazes de um fusosoma aqui descrito que codifica uma molécula indutora do destino da célula ou sinal é introduzida em uma célula-alvo sob condi- ções tais que uma alteração no destino da célula é induzida. Em algu- mas modalidades, um fusosoma aqui descrito é útil para reprogramar uma subpopulação de células de um primeiro fenótipo para um segun- do fenótipo. Essa reprogramação pode ser temporária ou permanente. Opcionalmente, a reprogramação induz uma célula-alvo a adotar um fenótipo intermediário.
[00527] Também são fornecidos métodos de redução da diferencia- ção celular em uma população de células-alvo. Por exemplo, uma po- pulação de células-alvo contendo um ou mais tipos de células precur- soras é colocada em contato com uma composição de fusosoma aqui descrita, sob condições tais que a composição reduza a diferenciação da célula precursora. Em certas modalidades, a população de células- alvo contém tecido lesado em um indivíduo mamífero ou tecido afeta- do por um procedimento cirúrgico. A célula precursora é, por exemplo,
uma célula precursora do estroma, uma célula precursora neural ou uma célula precursora mesenquimal.
[00528] Uma composição de fusosoma aqui descrita, que compre- ende um agente de carga útil de proteína de membrana pode ser usa- da para liberar tal agente a um tecido celular ou indivíduo. A liberação de um agente de carga útil de proteína de membrana pela administra- ção de uma composição de fusosoma aqui descrita pode modificar os níveis de expressão de proteína celular. Em certas modalidades, a composição administrada direciona a super-regulação de (via expres- são na célula, liberação na célula ou indução dentro da célula) de um ou mais agentes de carga útil de proteína de membrana (por exemplo, um polipeptídeo ou ácido nucleico) que fornecem uma atividade funci- onal que está substancialmente ausente ou reduzida na célula na qual o agente de carga útil da proteína de membrana é liberado. Por exem- plo, a atividade funcional ausente pode ser de natureza enzimática, estrutural, de sinalização ou reguladora. Em modalidades relaciona- das, a composição administrada direciona a super-regulação de um ou mais agentes de carga útil de proteína de membrana que aumenta (por exemplo, sinergicamente) uma atividade funcional que está pre- sente, mas substancialmente deficiente na célula em que o agente de carga útil de proteína de membrana é super-regulado. Em modalida- des relacionadas, a composição administrada direciona a subregula- ção de um ou mais polipeptídeos que diminui (por exemplo, sinergica- mente) uma atividade funcional que está presente ou super-regulada na célula em que o polipeptídeo é subregulado. Em certas modalida- des, a composição administrada direciona a super-regulação de certas atividades funcionais e a subregulação de outras atividades funcionais.
[00529] Nas modalidades, a composição de fusosoma media um efeito em uma célula-alvo e o efeito dura pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, 2, 3 ou 4 semanas, ou 1, 2, 3, 6 ou 12 meses. Em algumas modalidades (por exemplo, em que a composição de fusosoma com- preende uma proteína exógena), o efeito dura menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, 2, 3 ou 4 semanas, ou 1, 2, 3, 6 ou 12 meses. Aplicações Ex vivo
[00530] Nas modalidades, a composição de fusosoma aqui descrita é liberada ex vivo a uma célula ou tecido, por exemplo, uma célula ou tecido humano. Nas modalidades, a composição melhora a função de uma célula ou tecido ex vivo, por exemplo, melhora a viabilidade celu- lar, sinalização, respiração ou outra função (por exemplo, outra função aqui descrita).
[00531] Em algumas modalidades, a composição é liberada a um tecido ex vivo que está em um estado ferido (por exemplo, de trauma, doença, hipoxia, isquemia ou outro dano).
[00532] Em algumas modalidades, a composição é liberada a um transplante ex vivo (por exemplo, um explante de tecido ou tecido para transplante, por exemplo, uma veia humana, um enxerto músculo- esquelético, como osso ou tendão, córnea, pele, válvulas cardíacas, nervos; ou um órgão isolado ou cultivado, por exemplo, um órgão a ser transplantado em um ser humano, por exemplo, um coração humano, fígado, pulmão, rim, pâncreas, intestino, timo, olho). A composição po- de ser liberada ao tecido ou órgão antes, durante e/ou após o trans- plante.
[00533] Em algumas modalidades, a composição é liberada, admi- nistrada ou posta em contato com uma célula, por exemplo, uma pre- paração de célula. A preparação de células pode ser uma preparação de terapia celular (uma preparação de células destinada à administra- ção a um indivíduo humano). Nas modalidades, a preparação de célu- las compreende células que expressam um receptor de antígeno qui- mérico (CAR), por exemplo, expressando um CAR recombinante. As células que expressam o CAR podem ser, por exemplo, células T, cé-
lulas Exterminadoras Naturais (NK), linfócitos T citotóxicos (CTL), célu- las T reguladoras. Nas modalidades, a preparação de células é uma preparação de células-tronco neurais. Nas modalidades, a preparação de células é uma preparação de células-tronco mesenquimais (MSC). Nas modalidades, a preparação de células é uma preparação de célu- las-tronco hematopoéticas (HSC). Nas modalidades, a preparação de células é uma preparação de células da ilhota. Usos In Vivo
[00534] As composições de fusosoma aqui descritas podem ser administradas a um indivíduo, por exemplo, um mamífero, por exem- plo, um humano. Em tais modalidades, o indivíduo pode estar em risco de, pode ter um sintoma de, ou pode ser diagnosticado ou identificado como tendo, uma doença ou condição específica (por exemplo, uma doença ou condição aqui descrita). Em uma modalidade, o indivíduo tem câncer. Em uma modalidade, o indivíduo tem uma doença infecci- osa.
[00535] Em algumas modalidades, a fonte de fusosomas é do mesmo indivíduo que recebe uma composição de fusosomas. Em ou- tras modalidades, eles são diferentes. Por exemplo, a fonte de fuso- somas e tecido receptor pode ser autóloga (do mesmo indivíduo) ou heteróloga (de diferentes indivíduos). Em ambos os casos, o tecido doador para composições de fusosoma aqui descritas pode ser um tipo de tecido diferente do tecido receptor. Por exemplo, o tecido doa- dor pode ser tecido muscular e o tecido receptor pode ser tecido con- juntivo (por exemplo, tecido adiposo). Em outras modalidades, o tecido doador e o tecido receptor podem ser do mesmo tipo ou de tipo dife- rente, mas de sistemas de órgãos diferentes.
[00536] Uma composição de fusosoma aqui descrita pode ser ad- ministrada a um indivíduo com um câncer, uma doença autoimune, uma doença infecciosa, uma doença metabólica, uma doença neuro-
degenerativa ou uma doença genética (por exemplo, deficiência de enzima). Em algumas modalidades, um tecido do indivíduo precisa de regeneração.
[00537] Em algumas modalidades, uma quantidade terapeutica- mente eficaz de uma composição de fusosoma aqui descrita é admi- nistrada a um indivíduo. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma substância é uma quantidade que é suficiente, quando administrada a um indivíduo que tem ou é suscetí- vel a uma doença, distúrbio e/ou condição, para tratar e/ou atrasar o início da doença, distúrbio e/ou condição. Por exemplo, nas modalida- des, a quantidade eficaz de um fusosoma em uma formulação para tratar uma doença, distúrbio e/ou condição é a quantidade que alivia, melhora, mitiga, inibe, retarda o início, reduz a gravidade e/ou reduz a incidência de um ou mais sintomas ou características da doença, dis- túrbio e/ou condição.
[00538] Em algumas modalidades, um indivíduo é tratado com uma composição de fusosoma. Em algumas modalidades, o tratamento parcialmente ou completamente alivia, melhora, mitiga, inibe, retarda o início, reduz a gravidade e/ou reduz a incidência de um ou mais sinto- mas, características e/ou causas de uma doença, distúrbio e/ou condi- ção. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser de um indivíduo que foi diagnosticado como sofrendo da doença, distúrbio e/ou condi- ção relevante. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser de um indivíduo conhecido por ter um ou mais fatores de suscetibilidade que são estatisticamente correlacionados com o aumento do risco de de- senvolvimento da doença, distúrbio e/ou condição relevante. Em al- gumas modalidades, o tratamento melhora parcial ou completamente a causa raiz da doença, distúrbio e/ou condição relevante.
[00539] Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é eficaz para tratar a doença, por exemplo, câncer. Em algumas modali-
dades, a composição de fusosoma é eficaz para reduzir o número de células cancerosas no indivíduo em comparação com o número de cé- lulas cancerosas no indivíduo antes da administração. Em algumas modalidades, a composição de fusosoma é eficaz para reduzir o nú- mero de células cancerosas no indivíduo em comparação com o curso esperado da doença sem tratamento. Em algumas modalidades, o in- divíduo experimenta uma resposta completa ou resposta parcial após a administração da composição de fusosoma.
[00540] Em algumas modalidades, o fusosoma é coadministrado com um inibidor de uma proteína que inibe a fusão da membrana. Por exemplo, Suppressina é uma proteína humana que inibe a fusão célu- la-célula (Sugimoto et al., "A novel human endogenous retroviral pro- tein inhibits cell-cell fusion" Scientific Reports 3: 1462 DOI:
10.1038/srep01462). Assim, em algumas modalidades, o fusosoma é coadministrado com um inibidor de sipressina, por exemplo, um siRNA ou anticorpo inibidor. Aplicativos não Humanos
[00541] As composições aqui descritas também podem ser usadas para modular de forma semelhante à função da célula ou tecido ou fi- siologia de uma variedade de outros organismos, incluindo, mas não se limitando a: animais de fazenda ou de trabalho (cavalos, vacas, porcos, galinhas, etc.), animais de estimação ou de zoológico (gatos, cachorros, lagartos, pássaros, leões, tigres e ursos etc.), animais da aquicultura (peixes, caranguejos, camarões, ostras etc.), espécies de plantas (árvores, plantações, flores ornamentais etc.), espécies de fermentação (saccharomyces etc.). As composições de Fusosoma aqui descritas podem ser feitas a partir de fontes não humanas e ad- ministradas a uma célula ou tecido alvo não humano ou indivíduo.
[00542] As composições de fusosoma podem ser autólogas, alogê- nicas ou xenogênicas para o alvo.
[00543] Todas as referências e publicações citadas aqui são incor- poradas por meio deste por referência.
[00544] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar ainda mais algumas modalidades da presente invenção, porém, não se des- tinam a limitar o escopo da invenção; será entendido por sua natureza exemplar que outros procedimentos, metodologias ou técnicas conhe- cidas pelos versados na técnica podem ser usados alternativamente.
EXEMPLOS Exemplo 1. Geração de células fusogênicas enucleadas por meio de tratamento químico (PEG)
[00545] Células HeLa doadoras de expressão de Mito-DsRed (um corante direcionado específico mitocondrial) foram tripsinizadas com 0,25 % de tripsina, coletadas, centrifugadas em 500xg por 5min, lava- das uma vez em PBS e contadas. 10x106 células foram subsequente- mente ressuspensas em 3ml de 12,5 % de ficoll em MEM-alfa comple- to (+10 % de FBS, + 1 % de penicilina/estreptomicina, + glutamina) suplementadas com 10ug/ml de citocalasina-B por 15 min. Para enu- clear as células, elas foram transferidas para um gradiente ficoll des- contínuo que consiste nas seguintes frações de ficoll (de cima para baixo): 2 mL de ficoll 12,5 %, 0,5 mL de ficoll 15 %, 0,5 mL de ficoll 16 %, 2 mL gradiente de ficoll 17 %, 2 mL de ficoll 25 %. Todas as frações do gradiente de ficoll foram feitas em DMEM completo suplementado com citocalasina-B 10ug/mL. Os gradientes foram centrifugados em uma ultracentrífuga Beckman SW-40, rotor Ti-70 em 107971xg por 1h a 37 °C. Após a centrifugação, as células HeLa enucleadas foram co- letadas a partir de 12,5 %, 15 %, 16 % e 1/2 das frações de ficoll 17 % e ressuspensas em DMEM completo (+10 % de FBS, + 1 % de penici- lina/estreptomicina, + glutamina), e centrifugadas em 500xg por 5 min para o pélete. As células doadoras Mito-DsRed enucleadas foram la- vadas 2x em DMEM. Simultaneamente, as células HeLa receptoras de expressão de Mito-GFP (um corante direcionado específico mitocon- drial) foram tripsinizadas, contadas e preparadas para fusão.
[00546] Para a fusão, as células HeLa doadoras Mito-DsRed enu- cleadas foram combinadas a uma relação de 1:1 com células HeLa receptoras Mito-GFP (200.000 cada) em uma solução de polietileno glicol a 50 % (PEG de 50 % em p/v preparada em DMEM completo w/10 % de DMSO) durante 1 minuto a 37 °C. As células foram subse- quentemente lavadas 3x em 10 mL de DMEM completo e semeadas em placas de imageamento de quadrante com fundo de vidro de 35 mm a uma densidade de 50k células/quadrante, com cada quadrante tendo uma área de 1,9 cm2. Exemplo 2. Geração de células fusogênicas nucleadas por meio de tratamento químico (PEG)
[00547] Células HeLa doadoras de expressão de Mito-DsRed (um corante direcionado específico mitocondrial) foram tripsinizadas com 0,25 % de tripsina, coletadas, centrifugadas em 500xg por 5min, lava- das uma vez em PBS e contadas. 2x106 células foram subsequente- mente ressuspensas em DMEM completo (+10 % de FBS, + 1 % de penicilina/estreptomicina, + glutamina), contadas e preparadas para fusão.
[00548] Células doadoras Mito-DsRed foram lavadas 3x em DMEM. Simultaneamente, as células HeLa receptoras de expressão de Mito- GFP (um corante direcionado específico mitocondrial) foram tripsiniza- das, contadas e preparadas para fusão.
[00549] Para a fusão, as células HeLa doadoras Mito-DsRed foram combinadas a uma relação de 1:1 com células HeLa receptoras Mito- GFP (200.000 cada) em uma solução de polietileno glicol a 50 % (PEG a 50 % em p/v preparado em DMEM completo w/10 % de DMSO) du- rante 1 minuto a 37 °C. As células foram subsequentemente lavadas 3X em 10 mL de DMEM completo e semeadas em placas de imagea-
mento de quadrante com fundo de vidro de 35 mm a uma densidade de 50k células/quadrante, com cada quadrante tendo uma área de 1,9 cm2. Exemplo 3. Criação de células HeLa expressando fusogênios exógenos
[00550] Este Exemplo descreve a criação de células de cultura de tecidos que expressam um fusogênio exógeno. O exemplo a seguir é igualmente aplicável a qualquer fusogênio à base de proteína e é igualmente aplicável à produção em células primárias (em suspensão ou aderentes) e tecido. Em certos casos, um par de fusogênio pode ser usado para induzir a fusão (delineada como fusogênio um par de ligação ao fusogênio).
[00551] O gene de fusogênio, falha de fusão 1 (EFF-1), é clonado no vetor pIRES2-AcGFP1 (Clontech), e este construto é, então, trans- fectado em células HeLa (CCL-2TM, ATCC) usando o reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (Invitrogen). O gene de par de ligação ao fusogênio, falha de fusão da célula âncora 1 (AFF-1), é clonado no vetor pIRES2 DsRed-Express 2 (Clontech), e este construto é, então, transfectado em células HeLa (CCL-2TM, ATCC) usando o reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As células HeLa transfec- tadas são mantidas a 37 °C, CO2 5 % em Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com GlutaMAX (GIBCO), 10 % de soro de bezerro fetal (GIBCO) e 500 mg/mL de zeocina. As células de expressão de EFF-1 são isoladas por classificação de células ativadas fluorescentes (FACS) para obter uma população pura de células GFP+ Hela que expressam fusogênio EFF-1. As células de expressão de AFF-1 são isoladas por classificação de células ativadas fluorescentes (FACS) para obter uma população pura de células DSRED+ Hela que expressam o par de ligação ao fusogênio AFF-1. Exemplo 4. Liberação de organela por meio de células enucleadas fusogênicas quimicamente realçadas
[00552] Células fusogênicas (células enucleadas doadoras Mito- DsRed e células HeLa receptoras Mito-GFP) produzidas e fundidas como descrito no Exemplo 1 foram imageadas em um microscópio confocal invertido Zeiss LSM 780 com ampliação de 63X 24h após a deposição na placa de imagem. As células que expressam apenas Mi- to-DsRed isoladamente e Mito-GFP isoladamente foram imageadas separadamente para configurar os parâmetros de aquisição de modo a garantir que não haja sobreposição de sinal entre os dois canais em condições em que Mito-DsRed e Mito-GFP estavam ambas presentes e adquiridos simultaneamente . Dez regiões de interesse foram esco- lhidas de uma maneira completamente imparcial, com o único critério sendo que um mínimo de 10 células estejam contidas em cada ROI, de modo que um mínimo de 100 células estejam disponíveis para aná- lise a jusante. Um determinado pixel nessas imagens foi determinado como positivo para mitocôndrias se sua intensidade para qualquer um dos canais (mito-DsRed e mito-GFP) fosse maior que 10 % do valor de intensidade máxima para cada canal respectivo em todas as três ROIs.
[00553] Os eventos de fusão com liberação de organela foram iden- tificados com base no critério de que > 50 % das mitocôndrias (identifi- cadas por todos os pixels que são mito-GFP+ ou mito-Ds-Red+) em uma célula eram positivas para ambos mitoDs-Red e mito-GFP com base no limite indicado acima, indicando que organelas (neste caso, mitocôndrias) contendo essas proteínas foram liberadas, fundidas e seus conteúdos misturados. No ponto de tempo de 24 horas, várias células exibiram liberação de organela positiva por meio de fusão, con- forme indicado na Figura 7. Esta é a imagem de uma liberação de or- ganela positiva por meio de fusão entre as células HeLa doadoras e receptoras. As áreas intracelulares indicadas em branco indicam so-
breposição entre as mitocôndrias doadoras e receptoras. As regiões intracelulares em cinza indicam onde as organelas doadoras e recep- toras não se sobrepõem. Exemplo 5. Liberação de organela por meio de células nucleadas fusogênicas quimicamente realçadas
[00554] Células fusogênicas (células doadoras Mito-DsRed e célu- las HeLa receptoras Mito-GFP) produzidas e combinadas como des- crito no exemplo 2 foram imageadas em um microscópio confocal in- vertido Zeiss LSM 780 com ampliação de 63X 24h após a deposição na placa de imagem. As células que expressam apenas Mito-DsRed isoladamente e Mito-GFP isoladamente foram geradas separadamente para configurar os parâmetros de aquisição de modo a garantir que não haja sobreposição de sinal entre os dois canais em condições em que Mito-DsRed e Mito-GFP estavam ambas presentes e adquiridas simultaneamente. Dez regiões de interesse foram escolhidas de uma maneira completamente imparcial, com o único critério sendo que um mínimo de 10 células estejam contidas em cada ROI, de modo que um mínimo de 100 células estejam disponíveis para análise a jusante. Um determinado pixel nessas imagens foi determinado como positivo para mitocôndrias se sua intensidade para qualquer um dos canais (mito- DsRed e mito-GFP) fosse maior que 20 % do valor de intensidade má- xima para cada respectivo canal em todas as três ROIs.
[00555] Os eventos de fusão com liberação de organela foram iden- tificados com base no critério de que > 50 % das mitocôndrias (identifi- cadas por todos os pixels que são mito-GFP+ ou mito-Ds-Red+) em uma célula eram positivas para ambos mitoDs-Red e mito-GFP com base no limite indicado acima, indicando que organelas (neste caso, mitocôndrias) contendo essas proteínas foram liberadas, fundidas e seus conteúdos misturados. No ponto de tempo de 24 horas, várias células exibiram liberação de organela positiva por meio de fusão, con-
forme indicado na Figura 8. Esta é a imagem de uma liberação de or- ganela positiva por meio de fusão entre as células HeLa doadoras e receptoras. As áreas intracelulares indicadas em branco indicam so- breposição entre as mitocôndrias doadoras e receptoras. As regiões intracelulares em cinza indicam onde as organelas doadoras e recep- toras não se sobrepõem. Exemplo 6. Liberação de mitocôndrias por meio de células enu- cleadas fusogênicas realçadas por proteína
[00556] As células fusogênicas produzidas e combinadas conforme descrito no Exemplo 3 são imageadas em um microscópio confocal invertido Zeiss LSM 780 com ampliação de 63X 24h após a deposição na placa de imagem. As células que expressam apenas Mito-DsRed isoladamente e Mito-GFP isoladamente são geradas separadamente para configurar os parâmetros de aquisição de modo a garantir que não haja sobreposição de sinal entre os dois canais em condições on- de Mito-DsRed e Mito-GFP estão presentes e adquiridos simultanea- mente. Dez regiões de interesse são escolhidas de uma maneira com- pletamente imparcial, com o único critério sendo que um mínimo de 10 células estejam contidas em cada ROI, de modo que um número mí- nimo de células esteja disponível para análise a jusante. Um determi- nado pixel nessas imagens é determinado como positivo para mito- côndrias se a sua intensidade de qualquer um dos canais (mito-DsRed e mito-GFP) for maior que 10 % do valor de intensidade máxima para cada respectivo canal em todas as três ROIs.
[00557] Eventos de fusão com liberação de organela serão identifi- cados com base no critério de que > 50 % das mitocôndrias (identifi- cados por todos os pixels que são mito-GFP+ ou mito-Ds-Red+) em uma célula são positivos para ambos mitoDs-Red e mito-GFP com ba- se no limite indicado acima, o que indicará que organelas (neste caso, mitocôndrias) contendo essas proteínas são liberadas, fundidas e seus conteúdos misturados. No ponto de tempo de 24 horas, espera-se que várias células exibam liberação de organela positiva por meio de fu- são. Exemplo 7: Geração de fusosomas por meio de eletroporação de ácido nucleico
[00558] Este Exemplo descreve a geração de fusosoma por meio de eletroporação de células ou vesículas com ácidos nucleicos (por exemplo, mRNA ou DNA) que codificam um fusogênio.
[00559] Os vetores de transposase (System Biosciences, Inc.) que incluem a estrutura de leitura aberta do gene de resistência à Puromi- cina juntamente com uma estrutura de leitura aberta de um fragmento clonado (por exemplo, Glicoproteína do vírus da estomatite Vesicular [VSV-G], Oxford Genetics # OG592) são eletroporados em 293Ts usando um eletroporador (Amaxa) e um kit de transfecção nuclear es- pecífico de linhagem celular 293T (Lonza).
[00560] Após a seleção com 1 µg/µL de puromicina por 3-5 dias em DMEM contendo Soro Bovino Fetal 20 % e 1x de Penicili- na/Estreptomicina, as células são, então, lavadas com 1xPBS, tampão de lise gelado (NaCl 150 mM, Triton X-100 0,1 %, desoxicolato de só- dio 0,5 %, SDS 0,1 %, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 e coquetel de inibidor de protease (Abcam, ab201117)), sonicadas 3 vezes, 10-15 segundos por vez e centrifugadas em 16.000 x g por 20 min. Um western blot é conduzido na fração de sobrenadante recuperada com uma sonda es- pecífica para VSV-G para determinar a concentração não específica de membrana de VSV-G a partir de fusosomas preparados a partir de células transfectadas de forma estável ou células de controle e em comparação com a proteína VSV-G padrão.
[00561] Em modalidades, os fusosomas de células transfectadas de forma estável terão mais VSV-G do que fusosomas gerados a partir de células que não foram transfectadas de forma estável.
Exemplo 8: Geração de fusosomas por meio de eletroporação de proteínas
[00562] Este Exemplo descreve a eletroporação de fusogênios para gerar fusosomas.
[00563] Aproximadamente 5 × 106 células ou vesículas são usadas para eletroporação usando um sistema de transfecção de eletropora- ção (Thermo Fisher Scientific). Para configurar uma mistura principal, 24 µg de fusogênios de proteína purificada são adicionados ao tampão de ressuspensão (fornecido no kit). A mistura é incubada à temperatu- ra ambiente durante 10 min. Enquanto isso, as células ou vesículas são transferidas para um tubo de ensaio estéril e centrifugadas em 500 × g por 5 min. O sobrenadante é aspirado e o pélete é ressuspenso em 1 mL de PBS sem Ca2+ e Mg2+. O tampão com os fusogênios é, então, usado para ressuspender o pélete de células ou vesículas. Uma suspensão de células ou vesículas também é usada para condições de otimização, que variam em voltagem de pulso, largura de pulso e número de pulsos. Após a eletroporação, as células eletroporadas ou vesículas com fusogênios são lavadas com PBS, ressuspensas em PBS e mantidas em gelo.
[00564] Veja, por exemplo, Liang et al., Rapid and highly efficiency mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection, Journal of Biotechnology 208: 44-53, 2015. Exemplo 9: Geração e isolamento de fusosomas através da for- mação de vesículas e centrifugação
[00565] Este Exemplo descreve a geração e isolamento de fusoso- ma por meio de vesiculação e centrifugação. Este é um dos métodos pelos quais os fusosomas podem ser isolados.
[00566] Os fusosomas são preparados da seguinte forma. Aproxi- madamente 4 x 106 células HEK-293T são semeadas em uma placa de 10 cm em meio completo (DMEM + FBS 10 % + Pen/Estrep). Um dia após a semeadura, 15 µg de plasmídeo ou vírus de expressão de fusogênio são liberados às células. Após um período de tempo sufici- ente para a expressão do fusogênio, o meio é cuidadosamente substi- tuído por meio fresco suplementado com 100 µM de ATP. Os sobre- nadantes são colhidos 48-72 horas após a expressão do fusogênio, clarificados por filtração através de um filtro de 0,45 µm e ultracentrifu- gados em 150.000 x g por 1 h. O material precipitado é ressuspenso durante a noite em PBS gelada. Fusosomas são ressuspensos no tampão desejado para experimentação.
[00567] Veja, por exemplo, Mangeot et al., Molecular Therapy, vol. 19 no. 9, 1656–1666, Sept. 2011 Exemplo 10: Geração e isolamento de fusosomas de membrana plasmática gigante
[00568] Este Exemplo descreve a geração e isolamento de fusoso- ma via vesiculação e centrifugação. Este é um dos métodos pelos quais os fusosomas podem ser isolados. Os fusosomas são prepara- dos da seguinte forma.
[00569] Resumidamente, as células HeLa que expressam um fuso- gênio são lavadas duas vezes em tampão (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, pH 7,4), ressuspensas em uma solução (DTT 1 mM, Paraformaldeído 12,5 mM e N-etilmaleimida 1 mM em Tampão GPMV), e incubadas a 37 °C por 1 h. Os fusosomas são clarificados a partir das células, removendo primeiro as células por centrifugação em 100 x g por 10 minutos e, em seguida, colhendo os fusosomas em
20.000 x g por 1 h a 4 °C. Os fusosomas são ressuspensos no tampão desejado para experimentação.
[00570] Veja, por exemplo, Sezgin E et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant membrane plasma vesicles. Nat. Protocols. 7(6):1042-51 2012. Exemplo 11: Geração e isolando fantasmas de fusosoma
[00571] Este Exemplo descreve a geração e o isolamento de fuso- somas por meio de tratamento hipotônico e centrifugação. Este é um dos métodos pelos quais os fusosomas podem ser produzidos.
[00572] Em primeiro lugar, os fusosomas são isolados das células- tronco mesenquimais que expressam fusogênios (109 células) princi- palmente usando o tratamento hipotônico de modo que as rupturas celulares e fusosomas sejam formados. As células são ressuspensas em solução hipotônica, tampão Tris-magnésio (TM, por exemplo, pH 7,4 ou pH 8,6 a 4 °C, ajuste de pH feito com HCl). A dilatação das cé- lulas é monitorada por microscopia de contraste de fase. Uma vez que as células dilatam e os fusosomas são formados, a suspensão é colo- cada em um homogeneizador. Normalmente, a ruptura de cerca de 95 % das células é suficiente, conforme medido através da contagem de células e coloração AOPI padrão. As membranas/fusosomas são, en- tão, colocadas em sacarose (0,25 M ou superior) para preservação. Alternativamente, os fusosomas podem ser formados por outras abor- dagens conhecidas na técnica para lisar as células, como sonicação leve (Arkhiv anatomii, gistologii i embriologii; 1979, Aug, 77(8) 5-13; PMID: 496657), congelamento-descongelamento (Nature. 1999, Dec 2; 402 (6761):551-5; PMID:10591218), French-press (Methods in Enzymology, Volume 541, 2014, Pages 169-176; PMID: 24423265), passagem de agulha (www.sigmaaldrich.com/technical- documents/protocols/biology/nuclear-protein-extraction.html) ou solu- blização em soluções contendo detergentes (www.thermofisher.com/order/catalog/product/89900).
[00573] Para evitar aderência, os fusosomas são colocados em tu- bos plásticos e centrifugados. Um pélete laminado é produzido em que a lâmina cinza superior mais clara inclui principalmente os fusosomas. No entanto, todo o pélete é processado, para aumentar os rendimen- tos. A centrifugação (por exemplo, 3.000 rpm por 15 min a 4 °C) e a lavagem (por exemplo, 20 volumes de Tris magnésio/TM-sacarose pH 7,4) podem ser repetidas.
[00574] Na próxima etapa, a fração do fusosoma é separada por flutuação em um gradiente de densidade de sacarose descontínuo. Um pequeno excesso de sobrenadante é deixado remanescente com o pélete lavado, que agora inclui fusosomas, núcleos e células inteiras incompletamente rompidas. Um adicional de 60 % em p/p de sacarose em TM, pH 8,6, é adicionado à suspensão para dar uma leitura de 45 % de sacarose em um refratômetro. Após esta etapa, todas as solu- ções são TM pH 8,6. 15 mL da suspensão são colocados em tubos de nitrato de celulose SW-25.2 e um gradiente descontínuo é formado sobre a suspensão adicionando camadas de 15 mL, respectivamente, de 40 % e 35 % em p/p de sacarose e, em seguida, adicionando 5 mL de TM-sacarose (0,25 M). As amostras são, então, centrifugadas em
20.000 rpm durante 10 min, 4 °C. Os sedimentos de núcleos formam um pélete, as células inteiras incompletamente rompidas são coleta- das na interface de 40 %-45 % e os fusosomas são coletados na inter- face de 35 %-40 %. Os fusosomas de vários tubos são coletados e agrupados. Veja, por exemplo, a publicação de patente Internacional, WO2011024172A2. Exemplo 12: Geração de fusosomas através de extrusão
[00575] Este Exemplo descreve a fabricação de fusosoma por ex- trusão através de uma membrana.
[00576] Resumidamente, as células-tronco hematopoéticas que ex- pressam fusogênios estão em uma suspensão a 37 °C a uma densi- dade de 1 x 106 células/mL em meio sem soro contendo coquetel de inibidor de protease (Set V, Calbiochem 539137-1ML). As células são aspiradas com uma seringa luer lock e passadas uma vez através de um filtro de seringa descartável de 5 mm para um tubo limpo. Se a membrana entope e fica obstruída, ela é colocada de lado e um novo filtro é colocado. Depois que toda a suspensão de células passou pelo filtro, 5 mL de meio sem soro são passados através de todos os filtros usados no processo para lavar qualquer material restante através do(s) filtro(s). A solução é, então, combinada com os fusosomas extru- sados no filtrado.
[00577] Fusosomas podem ser ainda mais reduzidos em diâmetro por extrusão contínua seguindo o mesmo método com tamanhos de poros de filtro cada vez menores, variando de 5 mm a 0,2 mm. Quan- do a extrusão final está completa, as suspensões são precipitadas por centrifugação (o tempo e a velocidade exigidos variam de acordo com o tamanho) e ressuspensas em meios.
[00578] Além disso, este processo pode ser suplementado com o uso de um inibidor do citoesqueleto de actina para diminuir a influência da estrutura citoesquelética existente na extrusão. Resumidamente, uma suspensão de 1 x 106 células/mL é incubada em meio sem soro com 500 nM de Latrunculina B (ab144291, Abcam, Cambridge, MA) e incubada por 30 minutos a 37 °C na presença de CO2 5 %. Após a in- cubação, o coquetel de inibidores de protease é adicionado e as célu- las são aspiradas para uma seringa Luer Lock, com a extrusão reali- zada conforme descrito anteriormente.
[00579] Os fusosomas são precipitados e lavados uma vez em PBS para remover o inibidor do citoesqueleto antes de serem ressuspensos nos meios. Exemplo 13: Geração de fusosomas através do tratamento quími- co com proteína
[00580] Este Exemplo descreve a liberação mediada por produtos químicos de fusogênios para gerar fusosomas. Aproximadamente 5 × 106 células ou vesículas são usadas para liberação de fusogênios me- diada por produtos químicos. As células ou vesículas são suspensas em 50 µL de meio Opti-MEM. Para configurar uma mistura principal,
24 µg de fusogênios de proteína purificada são misturados com 25 µL de meio Opti-MEM, seguido pela adição de 25 µL de Opti-MEM con- tendo 2 µL de reagente de transfecção de lipídeo 3000. As células ou vesículas e as soluções de fusogênio são misturadas agitando suave- mente a placa e incubando a 37 °C por 6 horas, de modo que o fuso- gênio seja incorporado na célula ou membrana da vesícula. Fusoso- mas são, então, lavados com PBS, ressuspensos em PBS e mantidos em gelo.
[00581] Veja, também, Liang et al., Rapid and highly efficiency mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection, Journal of Biotechnology 208: 44-53, 2015. Exemplo 14: Geração de fusosomas através do tratamento com lipossomas contendo fusogênio
[00582] Este Exemplo descreve a liberação mediada por liposso- mas de fusogênios a uma célula fonte para gerar fusosomas. Aproxi- madamente 5 × 106 células ou vesículas são usadas para liberação mediada por lipossomas de fusogênios. As células ou vesículas são suspensas em 50 µL de meio Opti-MEM. A proteína fusogênica é puri- ficada de células na presença de n-octil b-D-glicopiranosídeo. O n-octil b-D-glicopiranosídeo é um detergente suave usado para solubilizar proteínas integrais da membrana. A proteína fusogênica é, então, re- constituída em grandes vesículas unilamelares (LUVs) (400 nm de di- âmetro) misturando a proteína suspensa de n-octil bD-glicopiranosídeo com LUVs pré-saturadas com n-octil bD-glicopiranosídeo, seguido pela remoção de n-octil bD-glicopiranosídeo, como descrito em Top et al., EMBO 24: 2980-2988, 2005. Para configurar uma mistura principal, uma massa de lipossomas que contém 24 µg de proteína fusogênica total é misturada com 50 µL de meio Opti-MEM. As soluções de lipos- somas e células fonte ou vesículas são, então, combinadas e toda a solução é misturada agitando suavemente a placa e incubando a 37
°C por 6 horas sob condições que permitem a fusão dos lipossomas contendo fusogênio e as células fonte ou vesículas, de modo que a proteína fusogênica seja incorporada na célula fonte ou na membrana da vesícula. Os fusosomas são, então, lavados com PBS, ressuspen- sos em PBS e mantidos em gelo. Veja, também, Liang et al., Rapid and highly efficiency mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection, Journal of Biotechnology 208: 44-53, 2015. Exemplo 15: Isolamento de microvesículas fusogênicas livremen- te liberadas de células
[00583] Este Exemplo descreve o isolamento de fusosomas por meio de centrifugação. Este é um dos métodos pelos quais os fuso- somas podem ser isolados.
[00584] Fusosomas são isolados de células que expressam fuso- gênios por centrifugação diferencial. O meio de cultura (DMEM + Soro Bovino Fetal 10 %) é primeiro clarificado de pequenas partículas por ultracentrifugação em >100.000 x g por 1 h. Os meios de cultura clari- ficados são, então, usados para cultivar Fibroblastos Embrionários de Camundongo que expressam fusogênios. As células são separadas do meio de cultura por centrifugação em 200 x g durante 10 minutos. Os sobrenadantes são recolhidos e centrifugados sequencialmente duas vezes em 500 x g durante 10 minutos, uma vez em 2.000 x g durante 15 minutos, uma vez em 10.000 x g durante 30 minutos e uma vez em
70.000 x g durante 60 minutos. Os fusosomas liberados livremente são precipitados durante a etapa final de centrifugação, ressuspensos em PBS e novamente precipitados em 70.000 x g. O pélete final é ressus- penso em PBS.
[00585] Veja, também, Wubbolts R et al. Proteomic and Biochemi- cal Analyses of Human B Cell-derived Exosomes: Potential Implica- tions for their Function and Multivesicular Body Formation. J. Biol. Chem. 278:10963-10972 2003..
Exemplo 16: Enucleação física de fusosomas
[00586] Este Exemplo descreve a enucleação de fusosomas por meio de inativação citoesquelética e centrifugação. Este é um dos mé- todos pelos quais os fusosomas podem ser modificados.
[00587] Os fusosomas são isolados de linhagens celulares primá- rias ou imortalizadas de mamíferos que expressam um fusogênio. As células são enucleadas por tratamento com um inibidor de esqueleto de actina e ultracentrifugação. Resumidamente, as células C2C12 são coletadas, precipitadas e ressuspensas em DMEM contendo Ficoll 400 12,5 % (F2637, Sigma, St. Louis MO) e 500 nM de Latrunculina B (ab144291, Abcam, Cambridge, MA) e incubadas por 30 minutos a 37 °C + CO2 5 %. As suspensões são cuidadosamente colocadas em ca- madas em ultracentrífugas contendo concentrações crescentes de Fi- coll 400 dissolvido em DMEM (15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 3 mL por camada) que foram equilibradas durante a noite a 37 °C na presença de CO2 5 %. Gradientes de Ficoll são centrifugados em um rotor Ti-70 (Beckman-Coulter, Brea, CA) em 32.300 RPM por 60 minu- tos a 37 oC. Após ultracentrifugação, os fusosomas encontrados entre Ficoll 16 - 18 % são removidos, lavados com DMEM e ressuspensos em DMEM.
[00588] O manchamento do teor nuclear com Hoechst 33342, con- forme descrito no Exemplo 35, seguido pelo uso de citometria de fluxo e/ou imageamento, será realizado para confirmar a ejeção do núcleo. Exemplo 17: Modificação de fusosomas por meio de irradiação
[00589] O exemplo a seguir descreve a modificação de fusosomas com irradiação gama. Sem estar limitado pela teoria, a irradiação ga- ma pode causar quebras de fita dupla no DNA e levar as células à apoptose.
[00590] Em primeiro lugar, as células que expressam fusogênios são cultivadas em uma monocamada em frascos ou placas de cultura de tecidos abaixo de uma densidade confluente (por exemplo, por cul- tura ou semeadura de células). Em seguida, o meio é removido dos frascos confluentes, as células são enxaguadas com HBSS livre de Ca2+ e Mg2+ e tripsinizadas para remover as células da matriz de cul- tura. O pélete celular é, então, ressuspenso em 10ml de meio de cultu- ra de tecidos sem penicilina/estreptomicina e transferido para uma pla- ca de Petri de 100 mm. O número de células no pélete deve ser equi- valente ao que seria obtido de 10-15 culturas de MEF confluentes em frascos de 150 cm2. As células são, então, expostas a 4000 rads de uma fonte de radiação γ para gerar fusosomas. Os fusosomas são, então, lavados e ressuspensos no tampão final ou meio a ser usado. Exemplo 18: Modificação de fusosomas por meio do tratamento químico
[00591] O exemplo a seguir descreve a modificação de fusosomas com tratamento com mitomicina C. Sem estar limitado por nenhuma teoria particular, o tratamento com mitomicina C modifica os fusoso- mas ao inativar o ciclo celular.
[00592] Em primeiro lugar, as células que expressam fusogênios são cultivadas a partir de uma monocamada em frascos ou placas de cultura de tecidos a uma densidade confluente (por exemplo, por cultu- ra ou semeadura de células). Uma solução mãe de mitomicina C em mg/mL é adicionada ao meio para uma concentração final de 10 μg/mL. As placas são, então, devolvidas à incubadora por 2 a 3 horas. Em seguida, o meio é removido dos frascos confluentes, as células são enxaguadas com HBSS livre de Ca2+ e Mg2+ e tripsinizadas para remover as células da matriz de cultura. As células são, então, lavadas e ressuspensas no tampão final ou meio a ser usado.
[00593] Veja, por exemplo, camundongo Embryo Fibroblast (MEF) Feeder Cell Preparation, Current Protocols in Molecular Biology. David A. Conner 2001.
Exemplo 19: Falta de atividade transcricional em fusosomas
[00594] Este exemplo quantifica a atividade transcricional em fuso- somas em comparação com células origem, por exemplo, células fon- te, usadas para geração de fusosomas. Em algumas modalidades, a atividade transcricional será baixa ou ausente nos fusosomas em comparação com as células origem, por exemplo, células fonte.
[00595] Os fusosomas são um chassi para a liberação do agente terapêutico. Os agentes terapêuticos, como miRNA, mRNAs, proteínas e/ou organelas que podem ser liberados às células ou ambientes de tecido local com alta eficiência, podem ser usados para modular as vias que não são normalmente ativas ou ativas em níveis patológicos baixos ou altos no tecido receptor. Em algumas modalidades, a obser- vação de que os fusosomas não são capazes de transcrição, ou que os fusosomas têm atividade transcricional menor do que sua célula origem, demonstrará que a remoção do material nuclear ocorreu de forma suficiente.
[00596] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos nos Exemplos anteriores. Um número suficiente de fuso- somas e células origem usadas para gerar os fusosomas são, então, semeados em uma placa de múltiplas cavidades de baixa fixação de 6 cavidades em DMEM contendo Soro Bovino Fetal 20 %, 1x de Penici- lina/Estreptomicina e o alquino-nucleosídeo fluorescente marcável EU por 1 hora em 37 °C e CO2 5 %. Para controles negativos, um número suficiente de fusosomas e células origem também são semeados em placa de múltiplas cavidades em DMEM contendo Soro Bovino Fetal 20 %, 1x de Penicilina/Estreptomicina, porém, sem alquino- nucleosídeo EU.
[00597] Após a incubação de 1 hora, as amostras são processadas seguindo as instruções do fabricante para um kit de imagem (Thermo- Fisher Scientific). As amostras de células e fusosomas, incluindo os controles negativos, são lavadas três vezes com tampão 1xPBS e res- suspensas em tampão 1xPBS e analisadas por citometria de fluxo (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) usando um laser de argônio de 488nm para excitação e a emissão de 530+/-30nm. O software BD FACSDiva foi usado para aquisição e análise. Os canais de dispersão de luz são definidos em ganhos lineares e os canais de fluorescência em uma escala logarítmica, com um mínimo de 10.000 células anali- sadas em cada condição.
[00598] Em algumas modalidades, a atividade transcricional medida pela emissão de 530+/- 30nm nos controles negativos será nula devido à omissão do alquino-nucleosídeo EU. Em algumas modalidades, os fusosomas terão menos de cerca de 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %2 %, 1 % ou menos atividade transcricional do que as célu- las origem.
[00599] Veja, também, Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, Oct 14; 105(41):15779-84. doi: 10.1073/pnas.0808480105. Epub 2008 Oct 7. Exemplo 20: Falta de replicação de DNA ou atividade de replica- ção
[00600] Este Exemplo quantifica a replicação de DNA em fusoso- mas. Em algumas modalidades, os fusosomas irão replicar DNA a uma taxa baixa em comparação com as células.
[00601] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos nos Exemplos anteriores. A atividade de replicação de DNA da célula origem e do fusosoma é avaliada pela incorporação de um nucleotídeo marcável fluorescente (ThermoFisher Scientific # C10632). Fusosomas e um número equivalente de células são incuba- dos com EdU a uma concentração final de 10 µM por 2 h, após a pre- paração de uma solução mãe de EdU com dimetilsulfóxido. As amos- tras são, então, fixadas por 15 min usando PFA 3,7 %, lavadas com tampão 1xPBS, pH 7,4 e permeabilizadas por 15 min em solução de detergente 0,5 % em tampão 1xPBS, pH 7,4.
[00602] Após a permeabilização, fusosomas e células em suspen- são em tampão de PBS contendo detergente 0,5 % são lavados com tampão 1xPBS, pH 7,4 e incubados por 30 min a 21 °C em coquetel de reação, tampão 1xPBS, CuSO4 (Componente F), azida-flúor 488, adi- tivo de tampão de reação 1x.
[00603] Um controle negativo para fusosoma e atividade de replica- ção de DNA celular é feito com amostras tratadas da mesma forma que acima, porém, sem azida-flúor 488 no coquetel de reação 1x.
[00604] As amostras de células e fusosoma são, então, lavadas e ressuspensas em tampão 1xPBS e analisadas por citometria de fluxo. A citometria de fluxo é feita com um citômetro de FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) com excitação a laser de argônio 488nm e um espectro de emissão de 530+/-30nm é coletado. O sof- tware de análise FACS é usado para aquisição e análise. Os canais de dispersão de luz são definidos em ganhos lineares e os canais de fluo- rescência em escala logarítmica, com um mínimo de 10.000 células analisadas em cada condição. A atividade de replicação relativa do DNA é calculada com base na intensidade média de azida-flúor 488 em cada amostra. Todos os eventos são capturados nos canais de dispersão anterógrada e lateral (alternativamente, um canal pode ser aplicado para selecionar apenas a população de fusosoma). O valor de intensidade de fluorescência normalizado para os fusosomas é de- terminado subtraindo do valor de intensidade de fluorescência media- na do fusosoma, o valor de intensidade de fluorescência mediana da respectiva amostra de controle negativo. Em seguida, a atividade de replicação de DNA relativa normalizada para as amostras de fusoso- mas é normalizada para as respectivas amostras de células nuclea- das, a fim de gerar medições quantitativas para a atividade de replica- ção de DNA.
[00605] Em algumas modalidades, os fusosomas têm menos ativi- dade de replicação de DNA do que as células origem.
[00606] Veja, também, Salic, 2415–2420, doi:
10.1073/pnas.0712168105. Exemplo 21: Eletroporação para modificar fusosoma com carga de ácido nucleico
[00607] Este Exemplo descreve a eletroporação de fusosomas com carga de ácido nucleico.
[00608] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos em um Exemplo anterior. Aproximadamente 109 fusoso- mas e 1 µg de ácidos nucleicos, por exemplo, RNA, são misturados em tampão de eletroporação (fosfato de potássio 1,15 mM pH 7,2, clo- reto de potássio 25 mM, iodixanol 60 % em p/v em água). Os fusoso- mas são eletroporados usando uma única cubeta de 4 mm usando um sistema de eletroporação (BioRad, 165-2081). Os fusosomas e ácidos nucleicos são eletroporados em 400 V, 125 μF e ∞ ohms, e a cubeta é imediatamente transferida para o gelo. Após a eletroporação, os fuso- somas são lavados com PBS, ressuspensos em PBS e mantidos em gelo.
[00609] Veja, por exemplo, Kamerkar et al., Exosomes facilitate the- rapeutic targeting of oncogenic KRAS in pancreatic cancer, Nature, 2017 Exemplo 22: Eletroporação para modificar fusosoma com a carga de proteína
[00610] Este Exemplo descreve a eletroporação de fusosomas com a carga de proteína.
[00611] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos em um Exemplo anterior. Aproximadamente 5 × 106 fu- sosomas são usados para eletroporação usando um sistema de trans- fecção de eletroporação (Thermo Fisher Scientific). Para configurar uma mistura principal, 24 µg de carga de proteína purificada são adici- onados ao tampão de ressuspensão (fornecido no kit). A mistura é in- cubada à temperatura ambiente durante 10 min. Enquanto isso, os fu- sosomas são transferidos para um tubo de ensaio estéril e centrifuga- dos em 500 × g por 5 min. O sobrenadante é aspirado e o pélete é ressuspenso em 1 mL de PBS sem Ca2+ e Mg2+. O tampão com a car- ga de proteína é, então, usado para ressuspender o pélete de fusoso- mas. Uma suspensão de fusosoma é, então, usada para condições de otimização, que variam em voltagem de pulso, largura de pulso e o número de pulsos. Após a eletroporação, os fusosomas são lavados com PBS, ressuspensos em PBS e mantidos em gelo.
[00612] Veja, por exemplo, Liang et al., Rapid and highly efficiency mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection, Journal of Biotechnology 208: 44-53, 2015.. Exemplo 23: Tratamento químico de fusosomas para modificar com a carga de ácido nucleico
[00613] Este Exemplo descreve o carregamento de carga de ácido nucleico em um fusosoma por meio de tratamentos químicos.
[00614] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos nos Exemplos anteriores. Aproximadamente 106 fuso- somas são precipitados por centrifugação em 10.000g por 5min a 4 °C. Os fusosomas precipitados são, então, ressuspensos em tampão TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 0,1 mM) com 20 µg de DNA. A solu- ção de fusosoma:DNA é tratada com um detergente neutro para au- mentar a permeabilidade do DNA através da membrana do fusosoma (Reagente B, Cosmo Bio Co., LTD, Cat# ISK-GN-001-EX). A solução é centrifugada novamente e o pélete é ressuspenso em tampão com um peptídeo carregado positivamente, como sulfato de protamina, para aumentar a afinidade entre os fusosomas carregados de DNA e as cé- lulas receptoras alvo (Reagente C, Cosmo Bio Co., LTD, Cat# ISK-GN-
001-EX). Após o carregamento de DNA, os fusosomas carregados são mantidos no gelo antes do uso.
[00615] Veja, também, Kaneda, Y., et al., New vector innovation for drug delivery: development of fusigenic non-viral letters. Curr. Drug Targets, 2003 Exemplo 24: Tratamento químico de fusosomas para modificar com a carga de proteína
[00616] Este Exemplo descreve o carregamento de carga de prote- ína em um fusosoma por meio de tratamentos químicos.
[00617] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos nos Exemplos anteriores. Aproximadamente 106 fuso- somas são precipitados por centrifugação em 10.000g por 5min a 4 °C. Os fusosomas precipitados são, então, ressuspensos em tampão com peptídeos carregados positivamente, como sulfato de protamina, para aumentar a afinidade entre os fusosomas e as proteínas de carga (Reagente A, Cosmo Bio Co., LTD, Cat# ISK-GN-001-EX). Em segui- da, 10 µg de proteína de carga são adicionados à solução de fusoso- ma seguido pela adição de um detergente neutro para aumentar a permeabilidade da proteína através da membrana do fusosoma (Rea- gente B, Cosmo Bio Co., LTD, Cat# ISK-GN-001-EX). A solução é cen- trifugada novamente e o pélete é ressuspenso em tampão com o pep- tídeo carregado positivamente, tal como sulfato de protamina, para aumentar a afinidade entre os fusosomas carregados de proteína e as células receptoras alvo (Reagente C, Cosmo Bio Co., LTD, Cat# ISK- GN-001-EX). Após o carregamento de proteína, os fusosomas carre- gados são mantidos em gelo antes do uso.
[00618] Veja, também, Yasouka, E., et al., Needleless intranasal Administration of HVJ-E containing allergen attenuates experimental allergic rhinitis. J. Mol. Med., 2007 Exemplo 25: Transfecção de fusosomas para modificar com a carga de ácido nucleico
[00619] Este Exemplo descreve a transfecção de carga de ácido nucleico em um fusosoma. Os fusosomas são preparados por qual- quer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores.
[00620] 5 × 106 fusosomas são mantidos em Opti-Mem. 0,5 µg de ácido nucleico é misturado com 25 µL de meio Opti-MEM, seguido pe- la adição de 25 µL de Opti-MEM contendo 2 µL de reagente de trans- fecção de lipídeo 2000. A mistura de ácidos nucleicos, Opti-MEM e reagente de transfecção de lipídeo é mantida à temperatura ambiente durante 15 minutos, depois é adicionada aos fusosomas. Toda a solu- ção é misturada agitando suavemente a placa e incubando a 37 °C durante 6 horas. Os fusosomas são, então, lavados com PBS, ressus- pensos em PBS e mantidos em gelo.
[00621] Veja, também, Liang et al., Rapid and highly efficiency mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection, Journal of Biotechnology 208: 44-53, 2015. Exemplo 26: Transfecção de fusosomas para modificar com a carga de proteína
[00622] Este Exemplo descreve a transfecção da carga de proteína em um fusosoma.
[00623] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos nos Exemplos anteriores. 5 × 106 fusosomas são manti- dos em Opti-Mem. 0,5 µg de proteína purificada é misturada com 25 µL de meio Opti-MEM, seguido pela adição de 25 µL de Opti-MEM contendo 2 µL de reagente de transfecção de lipídeo 3000. A mistura de proteína, Opti-MEM e reagente de transfecção de lipídeo é mantida à temperatura ambiente durante 15 minutos, depois é adicionada aos fusosomas. Toda a solução é misturada agitando suavemente a placa e incubando a 37 °C durante 6 horas. Os fusosomas são, então, lava- dos com PBS, ressuspensos em PBS e mantidos em gelo.
[00624] Veja, também, Liang et al., Rapid and highly efficiency mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection, Journal of Biotechnology 208: 44-53, 2015. Exemplo 27: Fusosomas com estrutura de bicamada de lipídeo
[00625] Este Exemplo descreve a composição dos fusosomas. Em algumas modalidades, uma composição de fusosoma compreenderá uma estrutura de bicamada de lipídeo, com um lúmen no centro.
[00626] Sem desejar estar limitado pela teoria, a estrutura de bica- mada de lipídeo de um fusosoma promove a fusão com uma célula- alvo e permite que os fusosomas carreguem diferentes terapêuticas.
[00627] Os fusosomas são recentemente preparados usando os métodos descritos nos Exemplos anteriores. O controle positivo é a linhagem celular nativa (HEK293), e o controle negativo é DPBS fria e prep. de células HEK293 com ruptura de membrana, que foi passada através de agulhas de calibre 36 por 50 vezes.
[00628] As amostras são centrifugadas no tubo Eppendorf e o so- brenadante é cuidadosamente removido. Em seguida, uma solução fixadora pré-aquecida (glutaraldeído 2,5 % em tampão cacodilato 0,05 M com NaCl 0,1 M, pH 7,5; manutenção a 37 °C por 30 min antes do uso) é adicionada ao pélete de amostra e mantida em temperatura ambiente por 20 minutos. As amostras são lavadas duas vezes com PBS após a fixação. A solução de tetróxido de ósmio é adicionada ao pélete da amostra e incubada por 30 minutos. Depois de enxaguar uma vez com PBS, hexileno glicol 30 %, 50 %, 70 % e 90 % é adicio- nado e lavado com agitação, 15 minutos cada. Em seguida, hexileno glicol 100 % é adicionado com agitação, 3 vezes, 10 minutos cada.
[00629] A resina é combinada com hexileno glicol na relação de 1:2 e, em seguida, adicionada às amostras e incubada em temperatura ambiente por 2 horas. Após a incubação, a solução é substituída por resina 100 % e incubada por 4-6 horas. Esta etapa é repetida mais uma vez com resina fresca 100 %. Em seguida, ela é substituída por resina fresca 100 %, o nível é ajustado para ~ 1-2 mm de profundida- de, e cozida por 8-12 horas. O tubo Eppendorf é cortado e pedaços de epóxi fundidos com a amostra são cozidos por mais 16-24 horas. O molde de epóxi é, então, cortado em pequenos pedaços, anotando-se o lado com as células. Os pedaços são colados em blocos para corte, usando cola epóxi comercial de 5 minutos. Um microscópio eletrônico de transmissão (JOEL, USA) é usado para imagear as amostras a uma voltagem de 80 kV.
[00630] Em algumas modalidades, os fusosomas mostrarão uma estrutura de bicamada de lipídeo semelhante ao controle positivo (cé- lulas HEK293) e nenhuma estrutura óbvia é observada no controle de DPBS. Em algumas modalidades, nenhuma estrutura luminal será ob- servada na preparação de células interrompidas. Exemplo 28: Detecção da expressão de fusogênio
[00631] Este exemplo quantifica a expressão de fusogênio em fuso- somas.
[00632] Os vetores de transposase (System Biosciences, Inc.) que incluem a estrutura de leitura aberta do gene de resistência à Puromi- cina juntamente com uma estrutura de leitura aberta de um fragmento clonado (por exemplo, Glicoproteína do vírus da estomatite Vesicular [VSV-G], Oxford Genetics # OG592) são eletroporados em 293Ts usando um eletroporador (Amaxa) e um kit de transfecção nuclear es- pecífico de linhagem celular 293T (Lonza).
[00633] Após a seleção com 1 µg/µL de puromicina por 3-5 dias em DMEM contendo Soro Bovino Fetal 20 % e 1x de Penicili- na/Estreptomicina, os fusosomas são preparados a partir da linhagem celular de expressão estável ou a partir de células de controle por qualquer um dos métodos descritos em Exemplos anteriores.
[00634] Os fusosomas são, então, lavados com 1xPBS, tampão de lise gelado (NaCl 150 mM, Triton X-100 0,1 %, desoxicolato de sódio 0,5 %, SDS 0,1 %, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 e Coquetel Inibidor de Pro- tease III (Abcam, ab201117)), sonicados 3 vezes, 10-15 segundos de cada vez e centrifugados em 16.000 xg por 20 min. Um western blot é conduzido na fração de sobrenadante recuperada com uma sonda es- pecífica para VSV-G para determinar a concentração não específica de membrana de VSV-G a partir dos fusosomas preparados a partir de células transfectadas de forma estável ou células de controle e em comparação com a proteína VSV-G padrão.
[00635] Em algumas modalidades, os fusosomas de células trans- fectadas de forma estável terão mais VSV-G do que os fusosomas ge- rados a partir de células que não foram transfectadas de forma está- vel. Exemplo 29: Quantificação de fusogênios
[00636] Este Exemplo descreve a quantificação do número absoluto de fusogênios por fusosoma.
[00637] Uma composição de fusosoma é produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores, exceto o fusoso- ma que é modificado conforme descrito em um Exemplo anterior para expressar um fusogênio (VSV-G) marcado com GFP. Além disso, um fusosoma de controle negativo é projetado sem fusogênio (VSV-G) ou GFP presente.
[00638] Os fusosomas com o fusogênio marcado com GFP e o(s) controle(s) negativo(s) são, então, testados para o número absoluto de fusogênios como se segue. GFP recombinante adquirido comercial- mente é diluído em série para gerar uma curva de calibração de con- centração de proteína. A fluorescência de GFP da curva de calibração e uma amostra de fusosomas de quantidade conhecida é, então, me- dida em um fluorímetro usando um cubo de luz de GFP (filtro de exci- tação de 469/35 e um filtro de emissão de 525/39) para calcular a con-
centração molar média de moléculas de GFP na preparação de fuso- soma. A concentração molar é, então, convertida para o número de moléculas de GFP e dividida pelo número de fusosomas por amostra para atingir um número médio de moléculas de fusogênio marcadas com GFP por fusosoma e, assim, fornece uma estimativa relativa do número de fusogênios por fusosoma.
[00639] Em algumas modalidades, a fluorescência de GFP será maior nos fusosomas com marcador de GFP em comparação com os controles negativos, onde nenhum fusogênio ou GFP está presente. Em algumas modalidades, a fluorescência de GFP é relativa ao núme- ro de moléculas de fusogênio presentes.
[00640] Alternativamente, fusosomas individuais são isolados usan- do um sistema de preparação de célula única (Fluidigm) por instruções do fabricante, e qRT-PCR é realizada usando um conjunto de sondas disponível comercialmente (Taqman) e mistura principal projetada para quantificar os níveis de cDNA de fusogênio ou GFP com base no valor Ct. Um padrão de RNA da mesma sequência do fragmento clonado do gene de fusogênio ou do gene GFP é gerado por síntese (Amsbio) e, em seguida, adicionado à reação experimental de qRT-PCR do siste- ma de preparação de célula única em diluições em série para estabe- lecer uma curva padrão de Ct vs concentração de fusogênio ou RNA de GFP.
[00641] O valor Ct de fusosomas é comparado à curva padrão para determinar a quantidade de fusogênio ou RNA de GFP por fusosoma.
[00642] Em algumas modalidades, o fusogênio e o RNA de GFP serão maiores nos fusosomas com modificação para expressar os fu- sogênios em comparação com os controles negativos, onde nenhum fusogênio ou GFP está presente.
[00643] Os fusogênios podem ainda ser quantificados na bicamada de lipídeo analisando a estrutura da bicamada de lipídeo como des-
crito anteriormente e quantificando os fusogênios na bicamada de lipí- deo por LC-MS como descrito em outros Exemplos aqui. Exemplo 30: Medição do diâmetro médio de fusosomas
[00644] Este Exemplo descreve a medição do diâmetro médio de fusosomas.
[00645] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos nos Exemplos anteriores. Os fusosomas medidos para determinar o diâmetro médio usando sistemas disponíveis comercial- mente (iZON Science). O sistema é usado com software de acordo com as instruções do fabricante e um nanoporo projetado para anali- sar partículas dentro da faixa de diâmetro de 40 nm a 10 µm. Os fuso- somas e células origem são ressuspensos em solução salina tampo- nada com fosfato (PBS) para uma faixa de concentração final de 0,01- 0,1 µg de proteína/mL. Outras configurações do instrumento são ajus- tadas conforme indicado na tabela a seguir: Tabela 16: Parâmetros de medição e configurações de fusosoma Parâmetro de Medição Configuração Pressão 6 Tipo de nanoporo NP300 Amostra de Calibração CPC400_6P Análise padrão ouro não Assistente de captura nenhum
[00646] Todos os fusosomas são analisados dentro de 2 horas de isolamento. Em algumas modalidades, os fusosomas terão um diâme- tro dentro de cerca de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que as células fonte de origem. Exemplo 31: Medição da distribuição de diâmetro médio de fuso- somas
[00647] Este Exemplo descreve a medição da distribuição de diâ- metro de fusosomas.
[00648] Os fusosomas são gerados por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores e são testados para determinar o diâmetro médio das partículas usando um sistema disponível comerci- almente, tal como descrito em um Exemplo anterior. Em algumas mo- dalidades, os limites de diâmetro para 10 %, 50 % e 90 % dos fusoso- mas centrados em torno da mediana são comparados às células de origem para avaliar a distribuição do diâmetro dos fusosomas.
[00649] Em algumas modalidades, os fusosomas terão menos que cerca de 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % ou menos da variabilidade das células de origem na distribuição do diâmetro dentro de 10 %, 50 % ou 90 % da amostra. Exemplo 32: Volume médio de fusosomas
[00650] Este Exemplo descreve a medição do volume médio de fu- sosomas. Sem desejar estar limitado pela teoria, a variação do tama- nho (por exemplo, diâmetro, volume, área de superfície, etc.) dos fu- sosomas pode torná-los versáteis para o carregamento de carga dis- tinto, projeto terapêutico ou aplicação.
[00651] Os fusosomas são preparados conforme descrito nos Exemplos anteriores. O controle positivo é células HEK293 ou contas de poliestireno de tamanho conhecido. O controle negativo é células HEK293 que são passadas por uma agulha de calibre 36 aproxima- damente 50 vezes.
[00652] A análise com um microscópio eletrônico de transmissão, conforme descrito em um Exemplo anterior, é usada para determinar o tamanho dos fusosomas. O diâmetro do fusosoma é medido e o volu- me é calculado.
[00653] Em algumas modalidades, os fusosomas terão um tamanho médio de aproximadamente 50 nm ou mais de diâmetro. Exemplo 33: Densidade média de fusosomas
[00654] A densidade de fusosoma é medida por meio de um ensaio de centrifugação de gradiente de sacarose contínuo, conforme descrito em Théry et al., Curr Protoc Cell Biol. Abril de 2006; Chapter 3: Unit
3.22. Os fusosomas são obtidos conforme descrito nos exemplos ante- riores.
[00655] Primeiro, um gradiente de sacarose é preparado. Uma so- lução de sacarose 2 M e uma de 0,25 é gerada pela mistura de 4 mL de HEPES/solução mãe de sacarose e 1 mL de solução mãe de HEPES ou 0,5 mL de HEPES/solução mãe de sacarose e 4,5 mL de solução mãe de HEPES, respectivamente. Essas duas frações são carregadas no gradiente com todos os obturadores fechados, a solu- ção de sacarose 2 M no compartimento proximal com uma barra de agitação magnética e a solução de sacarose 0,25 M no compartimento distal. O fabricante de gradiente é colocado em uma placa de agitação magnética, o obturador entre os compartimentos proximais e distais é aberto e a placa de agitação magnética é ligada. A solução mãe de HEPES é feita da seguinte forma: 2,4 g de ácido N-2- hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES; 20mM final), 300 H2O, ajustar o pH para 7,4 com NaOH 10 N e finalmente ajustar o vo- lume para 500 mL com H2O. A HEPES/solução mãe de sacarose é feita da seguinte forma: 2,4 g de ácido hidroxietilpiperazina-N'-2- etanossulfônico (HEPES; 20 mM final), 428 g de sacarose livre de pro- tease (ICN; 2,5 M final), 150 mL de H2O, ajustar o pH para 7,4 com NaOH 10 N e finalmente ajustar o volume para 500 mL com H2O.
[00656] Os fusosomas são ressuspensos em 2 mL de HEPES/solução mãe de sacarose e são despejados no fundo de um tubo de centrífuga SW 41. O tubo externo é colocado no tubo SW 41, logo acima dos 2 mL de fusosomas. O obturador externo é aberto, e um gradiente contínuo de sacarose de 2 M (base) a 0,25 M (topo) é lentamente derramado no topo dos fusosomas. O tubo SW 41 é baixa- do à medida que o gradiente é derramado, de modo que o tubo esteja sempre ligeiramente acima do topo do líquido.
[00657] Todos os tubos com gradientes são equilibrados entre si ou com outros tubos com o mesmo peso de soluções de sacarose. Os gradientes são centrifugados durante a noite (≥14 horas) em 210.000 x g, 4 °C, no rotor de balde oscilante SW 41 com o freio ajustado no bai- xo.
[00658] Com uma micropipeta, onze frações de 1 mL, do topo para base, são coletadas e colocadas em um tubo de 3 mL para o rotor TLA-100.3. As amostras são postas de lado e, em cavidades separa- das de uma placa de 96 cavidades, 50 μl de cada fração são usados para medir o índice de refração. A placa é coberta com folha adesiva para evitar a evaporação e armazenada por não mais de 1 hora em temperatura ambiente. Um refratômetro é usado para medir o índice de refração (consequentemente a concentração de sacarose, e a den- sidade) de 10 a 20 μl de cada fração do material armazenado na placa de 96 cavidades.
[00659] Uma tabela para converter o índice de refração em g/mL está disponível no catálogo de ultracentrifugação para download no site de Beckman.
[00660] Cada fração é, então, preparada para análise de teor de proteína. Dois mililitros de HEPES 20 mM, pH 7,4, são adicionados a cada fração de gradiente de 1 mL e misturados por pipetagem para cima e para baixo duas a três vezes. Um lado de cada tubo é marcado com um marcador permanente e os tubos são colocados com o lado marcado para cima em um rotor TLA-100.3.
[00661] Os tubos de 3 mL com frações diluídas são centrifugados durante 1 hora em 110.000 x g, 4 °C. O rotor TLA-100.3 comporta seis tubos, então duas centrifugações para cada gradiente são realizadas com os outros tubos mantidos a 4 °C até que possam ser centrifuga- dos.
[00662] O sobrenadante é aspirado de cada um dos tubos de 3 mL, deixando uma gota no topo do pélete. O pélete provavelmente não é visível, porém, sua localização pode ser inferida a partir da marca no tubo. O pélete invisível é ressuspenso e transferido para tubos de mi- crocentrífuga. Metade de cada fração ressuspensa é usada para análi- se de teor de proteína por ensaio de ácido bicinconínico, descrito em outro exemplo. Isso fornece uma distribuição entre as várias frações de gradiente da preparação de fusosoma. Esta distribuição é usada para determinar a densidade média dos fusosomas. A segunda meta- de do volume da fração é armazenada a -80 °C e usada para outros fins (por exemplo, análise funcional ou purificação adicional por imu- noisolamento), uma vez que a análise de proteína revelou a distribui- ção de fusosoma entre as frações.
[00663] Em algumas modalidades, usando este ensaio ou um equi- valente, a densidade média da preparação compreendendo uma plura- lidade de fusosomas será de 1,25 g/mL +/- 0,05 de desvio-padrão. Em algumas modalidades, a densidade média da preparação estará na faixa de 1-1,1, 1,05-1,15, 1,1-1,2, 1,15-1,25, 1,2-1,3 ou 1,25-1,35 g/mL. Em algumas modalidades, a densidade média da preparação será menor que 1 ou maior que 1,35. Exemplo 34: Medição do teor de organela em fusosomas
[00664] Este Exemplo descreve a detecção de organelas em fuso- somas.
[00665] Os fusosomas foram preparados conforme descrito aqui. Para a detecção de retículo endoplasmático (ER) e mitocôndrias, fuso- somas ou células C2C12 foram corados com coloração 1 µM de ER (E34251, Thermo Fisher, Waltham, MA) e 1 µM de mancha de mito- côndria (M22426, Thermo Fisher Waltham, MA). Para a detecção de lisossomos, fusosomas ou células foram corados com 50 nM de man- cha de lisossoma (L7526, Thermo Fisher, Waltham, MA).
[00666] Fusosomos corados foram executados em um citômetro de fluxo (Thermo Fisher, Waltham, MA) e a intensidade de fluorescência foi medida para cada corante de acordo com a tabela abaixo. A valida- ção para a presença de organelas foi feita comparando a intensidade de fluorescência de fusosomas corados para fusosomas não corados (controle negativo) e células coradas (controle positivo).
[00667] Fusosomos corados positivos para retículo endoplasmático (Figura 1), mitocôndrias (Figura 2) e lisossomos (Figura 3) 5 horas após a enucleação. Tabela 17: Manchas de fusosoma Mancha Laser/Filtro Comprimento Filtro de Attune de onda do Emissão Laser (nm) Hoechst 33342 VL1 405 450/40 ER-Tracker Green BL1 488 530/30 MitoTracker Deep Red FM RL1 638 670/14 LysoTracker Green BL1 488 530/30 Exemplo 35: Medição do conteúdo nuclear em fusosomas
[00668] Este Exemplo descreve a medição do teor nuclear em um fusosoma. Para validar que os fusosomas não contêm núcleos, os fu- sosomas são corados com 1 µg.mL-1 de Hoechst 33342 e 1 µM de CalceinAM (C3100MP, Thermo Fisher, Waltham, MA) e os fusosomas corados são executados em um Citômetro de Fluxo Attune NXT (Thermo Fisher, Waltham, MA) para determinar a intensidade de fluo- rescência de cada corante de acordo com a tabela abaixo. Em algu- mas modalidades, a validação para a presença de citosol (CalceinAM) e a ausência de um núcleo (Hoechst 33342) será feita comparando a intensidade média de fluorescência de fusosomas corados para fuso- somas não corados e células coradas.
Tabela 18: Configurações do citômetro de fluxo mancha Laser/Filtro Comprimento de Filtro de Emis- Attune onda do Laser são (nm) Hoechst 33342 VL1 405 450/40 Calcein AM BL1 488 530/30 Exemplo 36: Medição do teor do envelope nuclear
[00669] Este Exemplo descreve uma medição do teor do envelope nuclear em fusosomas enucleados. O envelope nuclear isola o DNA do citoplasma da célula.
[00670] Em algumas modalidades, uma composição de fusosoma purificada compreende uma célula de mamífero, tal como HEK-293Ts (293 [HEK-293] (ATCC® CRL-1573™), que foi enucleada conforme descrito aqui. Este Exemplo descreve a quantificação de diferentes proteínas de membrana nuclear como um substituto para medir a quantidade de membrana nuclear intacta que permanece após a gera- ção de fusosoma.
[00671] Neste exemplo, 10x106 HEK-293Ts e a quantidade equiva- lente de fusosomas preparados a partir de 10x106 HEK-293Ts são fi- xados por 15 min usando 3,7 % de PFA, lavados com tampão 1xPBS, pH 7,4 e permeabilizados simultaneamente e, em seguida, bloqueados por 15 min usando tampão 1xPBS contendo 1 % de Albumina de Soro Bovino e 0,5 % de Triton® X-100, pH 7,4. Após permeabilização, fuso- somas e células são incubados por 12 horas a 4 °C com diferentes an- ticorpos primários, por exemplo, (anticorpo anti-RanGAP1 [EPR3295] (Abcam - ab92360), anticorpo anti-NUP98 [EPR6678] - marcador de poro nuclear (Abcam - ab124980), anticorpo de proteínas do complexo de poro antinuclear [Mab414] - (Abcam- ab24609), anticorpo anti- importina 7 (Abcam - ab213670), em concentrações sugeridas pelo fabricante diluídas em tampão 1xPBS contendo 1 % de albumina de soro bovino e 0,5 % de Triton® X-100, pH 7,4. Os fusosomas e células são, então, lavados com tampão 1xPBS, pH 7,4, e incubados por 2 h a
21°C com um anticorpo secundário fluorescente apropriado que detec- ta o anticorpo primário especificado anterior em concentrações sugeri- das pelo fabricante diluídas em tampão 1xPBS contendo 1 % de albu- mina de soro bovino e detergente 0,5 %, pH 7,4. Os fusosomas e célu- las são, então, lavados com tampão 1xPBS, ressuspensos em 300 µL de tampão 1xPBS, pH 7,4 contendo 1 μg/mL de Hoechst 33342, filtra- dos através de um tubo FACS de 20 μm e analisados por citometria de fluxo.
[00672] Os controles negativos são gerados usando o mesmo pro- cedimento de manchamento, porém, sem adição de anticorpo primá- rio. A citometria de fluxo é realizada em um citômetro de FACS (Bec- ton Dickinson, San Jose, CA, USA) com excitação com laser de argô- nio de 488 nm, e um espectro de emissão de 530+/-30 nm é coletado. O software de aquisição FACS é usado para aquisição e análise. Os canais de dispersão de luz são definidos em ganhos lineares e os ca- nais de fluorescência em uma escala logarítmica, com um mínimo de
10.000 células analisadas em cada condição. O teor relativo da mem- brana nuclear intacta é calculado com base na intensidade média de fluorescência em cada amostra. Todos os eventos são capturados nos canais de dispersão anterógrada e lateral.
[00673] O valor de intensidade de fluorescência normalizado para os fusosomas é determinado subtraindo-se do valor de intensidade de fluorescência mediana do fusosoma, o valor de intensidade de fluores- cência mediana da respectiva amostra de controle negativo. Em se- guida, a fluorescência normalizada para as amostras de fusosomas é normalizada para as respectivas amostras de células nucleadas, a fim de gerar medições quantitativas do conteúdo da membrana nuclear intacta.
[00674] Em algumas modalidades, os fusosomas enucleados com- preenderão menos de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40
%, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % da intensidade de fluorescência ou teor do envelope nuclear em comparação com as células de origem nucleadas. Exemplo 37: Medição dos níveis de cromatina
[00675] Este Exemplo descreve a medição da cromatina em fuso- somas enucleados.
[00676] O DNA pode ser condensado em cromatina para permitir que ele se encaixe dentro do núcleo. Em algumas modalidades, uma composição de fusosoma purificada produzida por qualquer um dos métodos aqui descritos compreenderá baixos níveis de cromatina.
[00677] Fusosomas enucleados preparados por qualquer um dos métodos descritos anteriormente e células de controle positivo (por exemplo, células de origem) são testados quanto ao teor de cromatina usando um ELISA com anticorpos que são específicos para a proteína histona H3 ou proteína histona H4. As histonas são o principal compo- nente proteico da cromatina, sendo H3 e H4 as proteínas histonas predominantes.
[00678] As histonas são extraídas da preparação de fusosoma e da preparação de células usando um kit comercial (por exemplo, Abcam Histone Extraction Kit (ab113476)) ou outros métodos conhecidos na técnica. Essas alíquotas são armazenadas a -80 °C até o uso. Uma diluição em série do padrão é preparada pela diluição da proteína his- tona purificada (H3 ou H4) de 1 a 50 ng/µL em uma solução do tampão de ensaio. O tampão de ensaio pode ser derivado de um kit fornecido por um fabricante (por exemplo, Abcam Histone H4 Quantification Kit (ab156909) ou Abcam Histone H3 Quantification Kit (ab115091)). O tampão de ensaio é adicionado a cada cavidade de uma placa de 48 ou 96 cavidades, que é revestida com um anticorpo anti-histona H3 ou anti-H4 e amostra ou controle padrão é adicionado à cavidade para trazer o volume total de cada cavidade para 50 µL. A placa é, então,
coberta e incubada a 37 graus por 90 a 120 minutos.
[00679] Após a incubação, qualquer histona ligada ao anticorpo an- ti-histona ligado à placa é preparada para detecção. O sobrenadante é aspirado e a placa é lavada com 150 µL de tampão de lavagem. O tampão de captura, que inclui um anticorpo de captura anti-histona H3 ou anti-H4, é, então, adicionado à placa em um volume de 50 µL e a uma concentração de 1 µg/mL. A placa é, então, incubada à tempera- tura ambiente em um agitador orbital por 60 minutos.
[00680] Em seguida, a placa é aspirada e lavada 6 vezes usando tampão de lavagem. A molécula repórter de sinal ativável pelo anticor- po de captura é, então, adicionada a cada cavidade. A placa é coberta e incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos. A placa é, en- tão, aspirada e lavada 4 vezes usando tampão de lavagem. A reação é interrompida pela adição de solução de interrupção. A absorvência de cada cavidade na placa é lida a 450 nm e a concentração de histonas em cada amostra é calculada de acordo com a curva padrão de absor- vência a 450 nm vs. concentração de histona em amostras padrão.
[00681] Em algumas modalidades, as amostras de fusosoma com- preenderão menos de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % a concentração de histonas das células de origem nucleadas. Exemplo 38: Medição do teor de DNA em fusosomas
[00682] Este Exemplo descreve a quantificação da quantidade de DNA em um fusosoma em relação a contrapartes nucleadas. Em al- gumas modalidades, os fusosomas terão menos DNA do que as con- trapartes nucleadas. Os níveis de ácido nucléico são determinados medindo o DNA total ou o nível de um gene de manutenção específi- co. Em algumas modalidades, os fusosomas tendo teor de DNA redu- zido ou com falta substancial de DNA serão incapazes de replicar, di- ferenciar ou transcrever genes, garantindo que sua dose e função não sejam alteradas quando administradas a um indivíduo.
[00683] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos nos Exemplos anteriores. As preparações da mesma massa medida pela proteína de fusosomas e células fonte são usadas para isolar o DNA total (por exemplo, usando um kit como o catálogo Qiagen DNeasy #69504), seguido pela determinação da concentração de DNA usando métodos espectroscópicos padrão para avaliar a ab- sorvência de luz pelo DNA (por exemplo, com Thermo Scientific Na- noDrop).
[00684] Em algumas modalidades, a concentração de DNA em fu- sosomas enucleados será inferior a cerca de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % ou menos do que nas células de ori- gem.
[00685] Alternativamente, a concentração de um gene de manuten- ção específico, como GAPDH, pode ser comparada entre as células nucleadas e fusosomas com PCR em tempo real semiquantitativa (RT- PCR). O DNA total é isolado das células de origem e fusosoma e a concentração de DNA é medida como aqui descrito. A RT-PCR é rea- lizada com um kit de PCR (Applied Biosystems, catálogo #4309155) usando o seguinte modelo de reação: Mistura Principal SYBR Green: 10 µL Iniciador Dianteiro 0,45 µM: 1 µL Iniciador Reverso 0,45 µM: 1 µL Padrão de DNA: 10 ng Água em Grau de PCR: Variável
[00686] Os iniciadores dianteiro e reversos são adquiridos da Inte- grated DNA Technologies. A tabela abaixo detalha os pares de inicia- dores e suas sequências associadas:
Tabela 19: Sequências de iniciador Alvo Sequência de Iniciador Sequência de Iniciador Dianteiro (5’→3’) Reverso (5’→3’) nDNA Hu- GGAGTCCACTGGCG- GAGGCATTG- mano (GA- TCTTCAC (SEQ ID NO: CTGATGATCTTGAGG PDH) 39) (SEQ ID NO: 40)
[00687] Um sistema de PCR em tempo real (Applied Biosystems) é usado para realizar a amplificação e detecção com o seguinte protoco- lo: Desnaturação, 94 °C 2 min 40 ciclos da seguinte sequência: Desnaturação, 94 °C 15 s Recozimento, Extensão, 60 °C 1 min
[00688] Uma curva padrão da concentração de Ct vs. DNA é prepa- rada com diluições em série de DNA de GAPDH e usada para norma- lizar o valor nuclear de Ct dos resultados de PCR de fusosoma para uma quantidade específica (ng) de DNA.
[00689] Em algumas modalidades, a concentração de DNA de GA- PDH em fusosomas enucleados será inferior a cerca de 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % ou menos do que nas cé- lulas de origem. Exemplo 39: Medição dp teor de miRNA em fusosomas
[00690] Este Exemplo descreve a quantificação de microRNAs (miRNAs) em fusosomas. Em algumas modalidades, um fusosoma compreende miRNAs.
[00691] MiRNAs são elementos reguladores que, entre outras ativi- dades, controlam a taxa pela qual os RNAs mensageiros (mRNAs) são transladados em proteínas. Em algumas modalidades, fusosomas car- regando miRNA podem ser usados para liberar o miRNA aos sítios alvo.
[00692] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto-
dos descritos nos Exemplos anteriores. O RNA de fusosomas ou célu- las de origem é preparado conforme descrito anteriormente. Pelo me- nos um gene de miRNA é selecionado do Sanger Center miRNA Re- gistry em www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml. O miRNA é preparado conforme descrito em Chen et al, Nucleic Acids Research, 33 (20), 2005. Todos os ensaios de miRNA de TaqMan es- tão disponíveis através da Thermo Fisher (A25576, Waltham, MA).
[00693] qPCR é realizada de acordo com as especificações do fa- bricante no cDNA de miRNA, e os valores de CT são gerados e anali- sados usando um sistema de PCR em tempo real, conforme descrito aqui.
[00694] Em algumas modalidades, o teor de miRNA de fusosomas será de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % , 90 % ou mais do que as células de origem. Exemplo 40: Quantificação da expressão de um RNA endógeno ou RNA sintético em fusosomas
[00695] Este Exemplo descreve a quantificação dos níveis de RNA endógeno com expressão alterada, ou um RNA sintético que é ex- presso em um fusosoma.
[00696] O fusosoma ou célula de origem é projetado para alterar a expressão de um RNA endógeno ou sintético que media uma função celular para os fusosomas.
[00697] Os vetores de transposase (System Biosciences, Inc.) in- cluem a estrutura de leitura aberta do gene de resistência à Puromici- na juntamente com uma estrutura de leitura aberta de um fragmento clonado de um agente proteico. Os vetores são eletroporados em 293Ts usando um eletroporador (Amaxa) e um kit de transfecção nu- clear específico de linhagem celular 293T (Lonza).
[00698] Após a seleção com puromicina por 3-5 dias em DMEM contendo Soro Bovino Fetal 20 % e 1x de Penicilina/Estreptomicina, os fusosomas são preparados a partir da linhagem celular de expressão estável por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anterio- res.
[00699] Os fusosomas individuais são isolados e o agente de prote- ína ou RNA por fusosoma é quantificado conforme descrito em um Exemplo anterior.
[00700] Em algumas modalidades, os fusosomas terão pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 103, 5,0 x 103, 104, 105, 5,0 x 105, 106, 5,0 x 106, ou mais do RNA por fusosoma. Exemplo 41: Medição da composição de lipídieo em fusosomas
[00701] Este Exemplo descreve a quantificação da composição de lipídeo de fusosomas. Em algumas modalidades, a composição de li- pídeo dos fusosomas é semelhante às células das quais eles são deri- vados. A composição de lipídeo afeta parâmetros biofísicos importan- tes de fusosomas e células, como tamanho, interações eletrostáticas e comportamento coloidal.
[00702] As medições de lipídeos são baseadas em espectrometria de massa. Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos nos Exemplos anteriores.
[00703] A análise de lipídeo baseada em espectrometria de massa é realizada em um serviço de análise de lipídeos (Dresden, Germany) conforme descrito (Sampaio, et al., Proc Natl Acad Sci, 2011, Feb 1; 108(5): 1903–7). Os lipídeos são extraídos usando um procedimento de clorofórmio/metanol em duas etapas (Ejsing, et al., Proc Natl Acad Sei, 2009, Mar 17; 106(7):2136-41). As amostras são enriquecidas com uma mistura padrão de lipídeo interna de: cardiolipina 16:1/15:0/15:0/15:0 (CL), ceramida 18:1; 2/17:0 (Cer), diacilglicerol 17:0/17:0 (DAG), hexosilceramida 18:1; 2/12:0 (HexCer), liso- fosfatidato 17:0 (LPA), liso-fosfatidilcolina 12:0 (LPC), liso- fosfatidiletanolamina 17:1 (LPE), liso-fosfatidilglicerol 17:1 (LPG), liso-
fosfatidilinositol 17:1 (LPI), liso-fosfatidilserina 17:1 (LPS), fosfatidato 17:0/17:0 (PA), fosfatidilcolina 17:0/17:0 (PC), fosfatidiletanolamina 17:0/17:0 (PE), fosfatidilglicerol 17:0/17:0 (PG), fosfatidilinositol 16:0/16:0 (PI), fosfatidilserina 17:0/17:0 (PS) , éster de colesterol 20:0 (CE), esfingomielina 18:1; 2/12 0; 0 (SM) e triacilglicerol 17:0/17:0/17:0 (TAG).
[00704] Após a extração, a fase orgânica é transferida para uma placa de infusão e seca em um concentrador de vácuo rápido. O extra- to seco da primeira etapa é ressuspenso em acetato de amônio 7,5 mM em clorofórmio/metanol/propanol (1:2:4, V:V:V) e o extrato seco da segunda etapa é ressuspenso em solução de etanol 33 % de meti- lamina em clorofórmio/metanol (0,003:5:1; V:V:V). Todas as etapas de manuseio de líquidos são realizadas usando uma plataforma robótica para solvente orgânico com um recurso de controle antigotas (Hamil- ton Robotics) para pipetagem.
[00705] As amostras são analisadas por infusão direta em um es- pectrômetro de massa (Thermo Scientific) equipado com uma fonte de íons (Advion Biosciences). As amostras são analisadas em ambos os modos de íon positivo e negativo com uma resolução de Rm/z=200=280000 para MS e Rm/z=200=17.500 para experimentos de MS/MS em tandem, em uma única aquisição. MS/MS é desenca- deada por uma lista de inclusão que abrange as faixas de massa de MS correspondentes digitalizadas em incrementos de 1 Da (Surma, et al., Eur J lipid Sci Technol, 2015, Oct; 117(10):1540–9). Os dados de MS e MS/MS são combinados para monitorar íons de CE, DAG e TAG como aduzidos de amônio; PC, PC O-, como aduzidos de acetato; e CL, PA, PE, PE O-, PG, PI e PS como ânions desprotonados. MS é usada apenas para monitorar LPA, LPE, LPE O-, LPI e LPS como ânions desprotonados; Cer, HexCer, SM, LPC e LPC O- como acetato.
[00706] Os dados são analisados com software de identificação de lipídeos desenvolvido local, conforme descrito nas seguintes referên- cias (Herzog, et al., Genome Biol, 2011, Jan 19; 12(1):R8; Herzog, et al., PLoS One, 2012, Jan; 7(1):e29851). Apenas as identificações de lipídeos com uma relação sinal para ruído > 5, e uma intensidade de sinal 5 vezes maior do que nas amostras em branco correspondentes são consideradas para análise de dados posterior.
[00707] A composição de lipídeo de fusosoma é comparada à com- posição de lipídeo das células de origem. Em algumas modalidades, os fusosomas e células de origem terão uma composição de lipídeo semelhante se > 50 % dos lipídeos identificados nas células de origem estiverem presentes nos fusosomas, e desses lipídeos identificados, o nível no fusosoma será > 25 % do nível de lipídeo correspondente na células de origem. Exemplo 42: Medição da composição proteômica em fusosomas
[00708] Este Exemplo descreve a quantificação da composição de proteína de fusosomas. Em algumas modalidades, a composição de proteína de fusosomas será semelhante às células das quais eles são derivados.
[00709] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos nos Exemplos anteriores. Os fusosomas são ressuspen- sos em tampão de lise (Ureia 7M, Tioureia 2M, 4 % (p/v) de Chaps em Tris 50 mM pH 8,0) e incubados por 15 minutos à temperatura ambien- te com vórtice ocasional. As misturas são, então, lisadas por sonica- ção por 5 minutos em um banho de gelo e centrifugadas por 5 minutos em 13.000 RPM. O teor de proteína é determinado por um ensaio co- lorimétrico (Pierce) e a proteína de cada amostra é transferida para um novo tubo e o volume é equalizado com Tris 50 mM pH 8.
[00710] As proteínas são reduzidas durante 15 minutos em 65 Cel- sius com DTT 10 mM e alquiladas com iodoacetamida 15 mM durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. As proteínas são preci-
pitadas com adição gradual de 6 volumes de acetona fria (-20 °Celsius) e incubadas durante a noite a -80 °C. Os peletes de proteína são lavados 3 vezes com metanol frio (-20 °Celsius). As proteínas são ressuspensas em Tris 50 mM pH 8,3.
[00711] A seguir, a tripsina/lysC é adicionada às proteínas durante as primeiras 4 horas de digestão a 37 Celsius com agitação. As amos- tras são diluídas com Tris 50 mM pH 8 e desoxicolato de sódio 0,1 % é adicionado com mais tripsina/lysC para digestão durante a noite a 37 Celsius com agitação. A digestão é interrompida e o desoxicolato de sódio é removido pela adição de ácido fórmico a 2 % em v/v. As amos- tras são submetidas a vórtice e eliminadas por centrifugação durante 1 minuto em 13.000 RPM. Os peptídeos são purificados por extração em fase sólida de fase reversa (SPE) e secos. As amostras são reconstitu- ídas em 20 μl de DMSO 3 %, ácido fórmico 0,2 % em água e analisa- das por LC-MS.
[00712] Para ter medições quantitativas, um padrão de proteína também é executado no instrumento. Peptídeos padrão (Pierce, equi- molar, grau LC-MS, #88342) são diluídos para 4, 8, 20, 40 e 100 fmol/μL e são analisados por LC-MS/MS. A AUC média (área sob a curva) dos 5 melhores peptídeos por proteína (3 MS/MS transi- ção/peptídeo) é calculada para cada concentração para gerar uma curva padrão.
[00713] A aquisição é realizada com um espectrômetro de massa de alta resolução (ABSciex, Foster City, CA, USA) equipado com uma interface de eletrospray com um capilar iD de 25 μm e acoplado com cromatografia líquida de microultraalto desempenho (μUHPLC) (Eksi- gent, Redwood City, CA, USA). O software de análise é usado para controlar o instrumento e para processamento e aquisição de dados. A voltagem da fonte é ajustada para 5,2 kV e mantida a 225 °C, o gás de cortina é ajustado para 1,48 Kg/cm2 (27 psi), o gás um para 0,84
Kg/cm2 (12 psi) e o gás dois para 0,70 Kg/cm2 (10 psi). A aquisição é realizada no modo de Aquisição Dependente de Informação (IDA) para o banco de dados de proteínas e no modo de aquisição SWATH para as amostras. A separação é realizada em uma coluna de fase reversa de 0,3 μm i.d., partículas de 2,7 μm, 150 mm de comprimento (Advan- ce Materials Technology, Wilmington, DE) que é mantida a 60 °C. As amostras são injetadas por overfilling de alça em uma alça de 5μL. Pa- ra o gradiente de LC de 120 minutos (amostras), a fase móvel inclui o seguinte: solvente A (0,2 % em v/v de ácido fórmico e 3 % de DMSO em v/v em água) e solvente B (0,2 % em v/v de ácido fórmico e 3 % de DMSO em EtOH) em uma taxa de fluxo de 3 µL/min.
[00714] Para a quantificação absoluta das proteínas, uma curva pa- drão (5 pontos, R2>0,99) é gerada usando a soma da AUC dos 5 me- lhores peptídeos (3 íons de MS/MS por peptídeo) por proteína. Para gerar um banco de dados para a análise das amostras, o algoritmo DIAUmpire é executado em cada uma das 12 amostras e combinado com os arquivos MGF de saída em um banco de dados. Este banco de dados é utilizado com software (ABSciex) para quantificar as proteínas em cada uma das amostras, utilizando 5 transições/peptídeo e 5 pep- tídeos/proteínas no máximo. Um peptídeo é considerado adequada- mente medido se a pontuação calculada for superior a 1,5 ou se tiver um FDR < 1 %. A soma da AUC de cada um dos peptídeos medidos adequadamente é mapeada na curva padrão, e é relatada como fmol.
[00715] Os dados de quantificação de proteína resultantes são, en- tão, analisados para determinar os níveis de proteína e proporções de classes conhecidas de proteínas como segue: as enzimas são identifi- cadas como proteínas que são anotadas com um número da Comis- são de Enzima (EC); as proteínas associadas ao ER são identificadas como proteínas que tiveram uma classificação de compartimento celu- lar de Gene Ontology (GO; http://www.geneontology.org) de ER e não mitocôndria; proteínas associadas a exossomos são identificadas co- mo proteínas que têm uma classificação de compartimento celular de Gene Oncology de exossomas e não mitocôndrias; e as proteínas mi- tocondriais são identificadas como proteínas que são identificadas co- mo mitocondriais no banco de dados MitoCarta (Calvo et al., NAR 2015l doi:10.1093/nar/gkv1003). As relações molares de cada uma dessas categorias são determinadas como a soma das quantidades molares de todas as proteínas em cada classe dividida pela soma das quantidades molares de todas as proteínas identificadas em cada amostra.
[00716] A composição proteômica de fusosoma é comparada à composição proteômica da célula de origem. Em algumas modalida- des, as composições proteômicas semelhantes entre fusosomas e cé- lulas parentais serão observadas quando > 50 % das proteínas identi- ficadas estão presentes no fusosoma, e dessas proteínas identificadas o nível é >25 % do nível de proteína correspondente na célula de ori- gem. Exemplo 43: Quantificação de um nível de proteína endógena ou sintética por fusosoma
[00717] Este Exemplo descreve a quantificação de uma carga de proteína endógena ou sintética em fusosomas. Em algumas modalida- des, os fusosomas compreendem uma carga de proteína endógena ou sintética.
[00718] O fusosoma ou célula de origem é projetado para alterar a expressão de uma proteína endógena ou expressar uma carga sintéti- ca que media uma função celular nova ou terapêutica.
[00719] Os vetores de transposase (System Biosciences, Inc.) que incluem a estrutura de leitura aberta do gene de resistência à puromi- cina juntamente com uma estrutura de leitura aberta de um fragmento clonado de um agente de proteína, opcionalmente fundido de forma traducional à estrutura de leitura aberta de uma proteína fluorescente verde (GFP). Os vetores são eletroporados em 293Ts usando um ele- troporador (Amaxa) e um kit de transfecção nuclear específico de li- nhagem celular 293T (Lonza).
[00720] Após a seleção com puromicina por 3-5 dias em DMEM contendo 20 % de soro fetal bovino e 1x de penicilina/estreptomicina, os fusosomas são preparados a partir da linhagem celular de expres- são estável por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos an- teriores.
[00721] Os níveis de expressão alterados de uma proteína endóge- na ou os níveis de expressão de uma proteína sintética que não são fundidos para GFP são quantificados por espectrometria de massa, conforme descrito acima. Em algumas modalidades, os fusosomes te- rão pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 103, 5,0 x 103, 104, 5,0 x 104, 105, 5,0 x 105, 106, 5,0 x 106, ou mais moléculas de agente de proteína por fusosoma.
[00722] Alternativamente, o GFP purificado é diluído em série em DMEM contendo 20 % de soro fetal bovino e 1x de Penicili- na/Estreptomicina para gerar uma curva padrão de concentração de proteína. A fluorescência de GFP da curva padrão e uma amostra de fusosomas é medida em um fluorímetro (BioTek) usando um cubo de luz de GFP (filtro de excitação de 469/35 e um filtro de emissão de 525/39) para calcular a concentração molar média de moléculas de GFP nos fusosomas. A concentração molar é, então, convertida em número de moléculas de GFP e dividida pelo número de fusosomas por amostra para atingir um número médio de moléculas de agente de proteína por fusosoma.
[00723] Em algumas modalidades, os fusosomas terão pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 103, 5,0 x 103, 104, 5,0 x 104, 105, 5,0 x 105, 106, 5,0 x 106 ou mais moléculas de agente de proteína por fu-
sosoma. Exemplo 44: Medição de marcadores de proteínas exossômicas em fusosomas
[00724] Este ensaio descreve a quantificação da composição pro- teômica da preparação da amostra e quantifica a proporção de proteí- nas que são conhecidas por serem marcadores específicos de exos- somas.
[00725] Fusosomas são precipitados e enviados congelados para o centro de análise de proteômica por procedimentos de manipulação de amostra biológica padrão.
[00726] Os fusosomas são descongelados para extração e análise de proteínas. Em primeiro lugar, eles são ressuspensos em tampão de lise (ureia 7M, tioureia 2M, 4 % (p/v) de chaps em Tris 50 mM pH 8,0) e incubados por 15 minutos em temperatura ambiente com vórtice ocasional. As misturas são, então, lisadas por sonicação por 5 minutos em um banho de gelo e centrifugadas por 5 minutos em 13.000 RPM. O teor de proteína total é determinado por um ensaio colorimétrico (Pi- erce) e 100 µg de proteína de cada amostra são transferidos para um novo tubo e o volume é ajustado com Tris 50 mM pH 8.
[00727] As proteínas são reduzidas durante 15 minutos a 65 ° Cel- sius com DTT 10 mM e alquiladas com iodoacetamida 15 mM por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. As proteínas são, então, precipitadas com adição gradual de 6 volumes de acetona fria (-20 ° Celsius) e incubadas durante a noite a -80 ° Celsius.
[00728] As proteínas são precipitadas, lavadas 3 vezes com meta- nol frio (-20 ° Celsius) e ressuspensas em Tris 50 mM pH 8. 3,33 µg de tripsina/lysC são adicionados às proteínas para as primeiras 4 horas de digestão a 37 ° Celsius com agitação. As amostras são diluídas com Tris 50 mM pH 8 e desoxicolato de sódio 0,1 % é adicionado a mais 3,3 µg de tripsina/lysC para digestão durante a noite a 37 ° Cel-
sius com agitação. A digestão é interrompida e o desoxicolato de sódio é removido pela adição de ácido fórmico a 2 % em v/v. As amostras são submetidas a vórtice e eliminadas por centrifugação durante 1 mi- nuto em 13.000 RPM.
[00729] As proteínas são purificadas por extração em fase sólida de fase reversa (SPE) e secas. As amostras são reconstituídas em DMSO a 3 %, ácido fórmico a 0,2 % em água e analisadas por LC-MS conforme descrito anteriormente.
[00730] Os dados de quantificação de proteína resultantes são ana- lisados para determinar os níveis de proteína e as proporções de pro- teínas marcadoras exossômicas conhecidas. Especificamente: proteí- nas da família de tetraspanina (CD63, CD9 ou CD81), proteínas rela- cionadas a ESCRT (TSG101, CHMP4A-B ou VPS4B), Alix, TSG101, MHCI, MHCII, GP96, actinina-4, mitofilina, sintenina-1, TSG101, ADAM10, EHD4, sintenina-1, TSG101, EHD1, flotilina-1, proteínas de choque térmico de 70 kDa (HSC70/HSP73, HSP70/HSP72). A relação molar dessas proteínas marcadoras exossômicas em relação a todas as proteínas medidas é determinada como a quantidade molar de ca- da proteína marcadora exossômica específica listada acima dividida pela soma das quantidades molares de todas as proteínas identifica- das em cada amostra e expressa como um percentual.
[00731] Da mesma forma, a relação molar para todas as proteínas marcadoras exossômicas em relação a todas as proteínas medidas é determinada como a soma da quantidade molar de todas as proteínas marcadoras exossômicas específicas listadas acima dividida pela so- ma das quantidades molares de todas as proteínas identificadas em cada amostra e expressas como uma porcentagem do total.
[00732] Em algumas modalidades, uma amostra compreenderá menos de 5 % de qualquer proteína marcadora exossômica individual e menos de 15 % do total de proteínas marcadoras exossômicas.
[00733] Em algumas modalidades, uma proteína marcadora exos- sômica individual estará presente em menos de 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 % ou 10 %.
[00734] Em algumas modalidades, a soma de todas as proteínas marcadoras exossômicas será inferior a 0,05 %, 0,1 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, ou 25 %. Exemplo 45: Medição de GAPDH em fusosomas
[00735] Este ensaio descreve a quantificação do nível de gliceralde- ído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) nos fusosomas e o nível relativo de GAPDH nos fusosomas em comparação com as células de origem.
[00736] GAPDH é medido nas células de origem e nos fusosomas usando um ELISA padrão comercialmente disponível para GAPDH (ab176642, Abcam) de acordo com as instruções do fabricante.
[00737] Os níveis de proteína total são medidos de forma seme- lhante por meio do ensaio de ácido bicinconínico, conforme descrito anteriormente no mesmo volume de amostra usado para medir GA- PDH. Em modalidades, usando este ensaio, o nível de GAPDH por proteína total nos fusosomas será <100ng de GAPDH/µg de proteína total. Da mesma forma, nas modalidades, a diminuição nos níveis de GAPDH em relação à proteína total das células de origem para os fu- sosomas será maior do que uma diminuição de 10 %.
[00738] Em algumas modalidades, o teor de GAPDH na preparação em ng de GAPDH/µg de proteína total será menor que 500, menor que 250, menor que 100, menor que 50, menor que 20, menor que 10, menor que 5 ou menor que 1.
[00739] Em algumas modalidades, uma diminuição em GAPDH por proteína total em ng/µg da células de origem para a preparação será mais de 1 %, mais de 2,5 %, mais de 5 %, mais de 10 %, mais de 15 %, mais de 20 %, mais de 30 %, mais de 40 %, mais de 50 %, mais de 60 %, mais de 70 %, mais de 80 % ou mais de 90 %.
Exemplo 46: Medição de calnexina em fusosomas
[00740] Este ensaio descreve a quantificação do nível de calnexina (CNX) nos fusosomas e o nível relativo de CNX nos fusosomas em comparação com as células de origem.
[00741] A calnexina é medida nas células de partida e na prepara- ção usando um ELISA padrão comercialmente disponível para calne- xina (MBS721668, MyBioSource) de acordo com as instruções do fa- bricante.
[00742] Os níveis de proteína total são medidos de forma seme- lhante através do ensaio de ácido bicinconínico, conforme descrito an- teriormente no mesmo volume de amostra usado para medir a calne- xina. Em modalidades, usando este ensaio, o nível de calnexina por proteína total nos fusosomas será <100ng de calnexina/µg de proteína total. Da mesma forma, nas modalidades, o aumento nos níveis de calnexina em relação à proteína total das células de origem para os fusosomas será maior do que um aumento de 10 %.
[00743] Em algumas modalidades, o teor de calnexina na prepara- ção em ng de calnexina/µg de proteína total será inferior a 500, 250, 100, 50, 20, 10, 5 ou 1.
[00744] Em algumas modalidades, uma diminuição na calnexina por proteína total em ng/µg das células de origem para a preparação será superior a 1 %, 2,5 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 %. Exemplo 47: Comparação da massa de proteína solúvel para inso- lúvel
[00745] Este Exemplo descreve a quantificação da relação solú- vel:insolúvel de massa de proteína em fusosomas. Em algumas moda- lidades, uma relação solúvel:insolúvel de massa de proteína em fuso- somas será semelhante a células nucleadas.
[00746] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto-
dos descritos nos Exemplos anteriores. A preparação de fusosoma é testada para determinar a relação de proteína solúvel:insolúvel usando um ensaio de ácido bicinconínico padrão (BCA) (por exemplo, usando o Kit de Ensaio de Proteína Pierce™ BCA comercialmente disponível, Thermo Fischer produto# 23225). As amostras de proteínas solúveis são preparadas suspendendo-se os fusosomas preparados ou células de origem a uma concentração de 1x107 células ou fusosomas/mL em PBS e centrifugando-se em 1600g para precipitar os fusosomas ou células. O sobrenadante é coletado como a fração de proteína solúvel.
[00747] Os fusosomas ou células no pélete são lisados por pipeta- gem vigorosa e vórtice em PBS com Triton-X-100 a 2 %. A fração lisa- da representa a fração de proteína insolúvel.
[00748] Uma curva padrão é gerada usando o BSA fornecido, de 0 a 20 µg de BSA por cavidade (em triplicado). O fusosoma ou prepara- ção celular é diluído de modo que a quantidade medida esteja dentro da faixa dos padrões. A preparação de fusosoma é analisada em tripli- cado e o valor médio é usado. A concentração de proteína solúvel é dividida pela concentração de proteína insolúvel para produzir a rela- ção de proteína solúvel:insolúvel.
[00749] Em algumas modalidades, uma relação de proteína solú- vel:insolúvel de fusosoma estará dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais em comparação com as células de origem. Exemplo 48: Medição de LPS em fusosomas
[00750] Este Exemplo descreve a quantificação dos níveis de lipo- polissacarídeos (LPS) em fusosomas em comparação com as células de origem. Em algumas modalidades, os fusosomas terão níveis mais baixos de LPS em comparação com as células de origem.
[00751] Os LPS são um componente das membranas bacterianas e um potente indutor de respostas imunes inatas.
[00752] As medições de LPS são baseadas em espectrometria de massa, conforme descrito nos exemplos anteriores.
[00753] Em algumas modalidades, menos de 5 %, 1 %, 0,5 %, 0,01 %, 0,005 %, 0,0001 %, 0,00001 % ou menos do teor de lipídeos dos fusosomas será LPS. Exemplo 49: Relação de lipídeos para proteínas em fusosomas
[00754] Este Exemplo descreve a quantificação da relação de mas- sa de lipídeos para massa de proteína em fusosomas. Em algumas modalidades, os fusosomas terão uma relação de massa de lipídeos para massa de proteína que é semelhante às células nucleadas.
[00755] O teor total de lipídeos é calculado como a soma do teor molar de todos os lipídeos identificados nos dados lipidômicos defini- dos em um Exemplo anterior. O teor de proteína total dos fusosomas é medido por meio de ensaio de ácido bicinconínico, conforme descrito aqui.
[00756] Alternativamente, a relação de lipídeos para proteínas pode ser descrita como uma relação de uma espécie de lipídeo particular para uma proteína específica. A espécie de lipídeo particular é seleci- onada a partir dos dados lipidômicos produzidos em um Exemplo ante- rior. A proteína específica é selecionada a partir dos dados proteômi- cos produzidos em um Exemplo anterior. Diferentes combinações de espécies de lipídeos e proteínas selecionadas são usadas para definir relações específicas de lipídeo:proteína. Exemplo 50: Relação de proteínas para DNA em fusosomas
[00757] Este Exemplo descreve a quantificação da relação de mas- sa de proteína para massa de DNA em fusosomas. Em algumas mo- dalidades, os fusosomas terão uma relação de massa de proteína para massa de DNA que é muito maior do que as células.
[00758] O teor de proteína total dos fusosomas e células é medido conforme descrito em um Exemplo anterior. A massa de DNA de fuso-
somas e células é medida conforme descrito em um Exemplo anterior. A relação de proteínas para ácidos nucleicos totais é, então, determi- nada dividindo o teor de proteína total pelo teor de DNA total para pro- duzir uma relação dentro de uma determinada faixa para uma prepa- ração de fusosoma típica.
[00759] Alternativamente, a relação de proteínas para ácidos nu- cleicos é determinada definindo os níveis de ácido nucleico como o nível de um gene de manutenção específico, como GAPDH, usando PCR em tempo real semiquantitativa (RT-PCR).
[00760] A relação de proteínas para ácidos nucleicos de GAPDH é, então, determinada dividindo o teor de proteína total pelo teor de DNA de GAPDH total para definir uma faixa específica da relação de proteí- na:ácido nucleico para uma preparação de fusosoma típica. Exemplo 51: Relação de lipídeos para DNA em fusosomas
[00761] Este Exemplo descreve a quantificação da relação de lipí- deos para DNA em fusosomas em comparação com as células de ori- gem. Em algumas modalidades, os fusosomas terão uma relação mai- or de lipídeos para DNA em comparação com as células de origem.
[00762] Esta relação é definida como teor total de lipídeos (descrito em um Exemplo acima) ou uma espécie de lipídeo particular. No caso de uma espécie de lipídeo particular, a faixa depende da espécie de lipídio particular selecionada. A espécie de lipídeo particular é selecio- nada a partir dos dados lipidômicos produzidos no Exemplo descrito anteriormente. O teor de ácido nucleico é determinado conforme des- crito no Exemplo descrito anteriormente.
[00763] Diferentes combinações de espécies de lipídeos seleciona- das normalizadas para o teor de ácido nucleico são usadas para defi- nir relações específicas de lipídio:ácido nucleico que são característi- cas de uma preparação de fusosoma particular. Exemplo 52: Análise de marcadores de superfície em fusosomas
[00764] Este ensaio descreve a identificação de marcadores de su- perfície nos fusosomas.
[00765] Os fusosomas são precipitados e enviados congelados pa- ra o centro de análise proteômica de acordo com os procedimentos de manipulação de amostra biológica padrão.
[00766] Para identificar a presença ou ausência de marcador de superfície nos fusosomas, eles são corados com marcadores contra fosfatidil serina e ligante de CD40 e analisados por citometria de fluxo usando um sistema FACS (Becton Dickinson). Para a detecção de fos- fatidilserina de superfície, o produto é analisado com um ensaio de anexina V (556547, BD Biosciences), conforme descrito pelo fabrican- te.
[00767] Resumidamente, os fusosomas são lavados duas vezes com PBS fria e, em seguida, ressuspensos em tampão de ligação 1X a uma concentração de 1 x 106 fusosomas/mL. 10 % da ressuspensão é transferida para um tubo de cultura de 5 mL e 5 μl de anexina V de FITC são adicionados. As células são suavemente agitadas com vórti- ce e incubadas por 15 min em temperatura ambiente (25 °C) no escu- ro.
[00768] Em paralelo, 10 % separados da ressuspensão são transfe- ridos para um tubo diferente para atuar como um controle não corado. Tampão de ligação 1X é adicionado a cada tubo. As amostras são analisadas por citometria de fluxo dentro de 1 hora.
[00769] Em algumas modalidades, usando este ensaio, a média da população dos fusosomas corados será determinada como estando acima da média das células não coradas, indicando que os fusosomas compreendem fosfatidil serina.
[00770] Da mesma forma, para o ligante de CD40, o seguinte anti- corpo monoclonal é adicionado a outros 10 % dos fusosomas lavados: clone de CD154 anti-humano de camundongo PE-CF594 TRAP1
(563589, BD Pharmigen) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, quantidades saturantes do anticorpo são usadas. Em paralelo, 10 % separados dos fusosomas são transferidos para um tu- bo diferente para atuar como um controle não corado. Os tubos são centrifugados por 5 min em 400 × g, à temperatura ambiente. O sobre- nadante é decantado e o pélete é lavado duas vezes com solução de lavagem de citometria de fluxo. 0,5 mL de fixador de paraformaldeído a 1 % é adicionado a cada tubo. Cada um é brevemente agitado em vórtice e armazenado a 4 °C até a análise no citômetro de fluxo.
[00771] Em algumas modalidades, usando este ensaio ou equiva- lente, a média da população dos fusosomas corados estará acima da média das células não coradas, indicando que os fusosomas compre- endem ligante de CD40. Exemplo 53: Análise de proteínas do capsídeo viral em fusoso- mas
[00772] Este ensaio descreve a análise da composição da prepara- ção da amostra e avalia a proporção de proteínas que são derivadas de fontes de capsídeo viral.
[00773] Os fusosomas são precipitados e enviados congelados pa- ra um centro de análise proteômica de acordo com os procedimentos de manipulação de amostra biológica padrão.
[00774] Os fusosomas são descongelados para extração e análise de proteínas. Primeiro, eles são ressuspensos em tampão de lise (ureia 7 M, tioureia 2 M, 4 % (p/v) de chaps em Tris 50 mM pH 8,0) e incubados por 15 minutos à temperatura ambiente com vórtice ocasio- nal. As misturas são, então, lisadas por sonicação por 5 minutos em um banho de gelo e centrifugadas por 5 minutos em 13.000 RPM. O teor de proteína total é determinado por um ensaio colorimétrico (Pier- ce) e 100 µg de proteína de cada amostra são transferidos para um novo tubo e o volume é ajustado com Tris 50 mM pH 8.
[00775] As proteínas são reduzidas durante 15 minutos a 65 °Celsius com DTT 10 mM e alquiladas com iodoacetamida 15 mM du- rante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. As proteínas são, então, precipitadas com adição gradual de 6 volumes de acetona fria (- 20 °Celsius) e incubadas durante a noite a -80 °Celsius.
[00776] As proteínas são precipitadas, lavadas 3 vezes com meta- nol frio (-20 °Celsius) e ressuspensas em Tris 50 mM pH 8. 3,33 µg de tripsina/lysC são adicionados às proteínas durante as primeiras 4 ho- ras de digestão a 37 °Celsius com agitação. As amostras são diluídas com Tris 50 mM pH 8 e desoxicolato de sódio 0,1 % é adicionado a mais 3,3 µg de tripsina/lysC para digestão durante a noite a 37 °Celsius com agitação. A digestão é interrompida e o desoxicolato de sódio é removido pela adição de ácido fórmico a 2 % em v/v. As amos- tras são submetidas a vórtice e eliminadas por centrifugação durante 1 minuto a 13.000 RPM.
[00777] As proteínas são purificadas por extração em fase sólida de fase reversa (SPE) e secas. As amostras são reconstituídas em DMSO 3 %, ácido fórmico 0,2 % em água e analisadas por LC-MS conforme descrito anteriormente.
[00778] A relação molar das proteínas do capsídeo viral em relação a todas as proteínas medidas é determinada como a quantidade molar de todas as proteínas do capsídeo viral dividida pela soma das quanti- dades molares de todas as proteínas identificadas em cada amostra e expressa como uma porcentagem.
[00779] Em algumas modalidades, usando esta abordagem ou um equivalente, a amostra compreenderá menos de 10 % da proteína do capsídeo viral. Em algumas modalidades, uma amostra compreenderá menos de 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % da proteína do capsídeo viral.
Exemplo 54: Medição da fusão com uma célula-alvo
[00780] Este Exemplo descreve a quantificação da fusão de fuso- soma com uma célula-alvo em comparação com uma célula não alvo.
[00781] Em algumas modalidades, a fusão de fusosoma com uma célula-alvo permite a liberação específica da célula de uma carga, transportada dentro do lúmen do fusosoma, para o citosol da célula receptora. Os fusosomas produzidos pelos métodos aqui descritos são analisados quanto à taxa de fusão com uma célula-alvo como se se- gue.
[00782] Neste exemplo, o fusosoma compreende uma célula HEK293T que expressa Myomaker em sua membrana plasmática. Além disso, o fusosoma expressa a proteína fluorescente mTagBFP2 e a Cre recombinase. A célula-alvo é uma célula mioblástica, que ex- pressa igualmente Myomaker e Myomixer, e a célula não alvo é uma célula de fibroblasto, que não expressa nem Myomaker nem Myomi- xer. Um fusosoma de expressão de Myomaker está previsto para se fundir com a célula-alvo que expressa igualmente Myomaker e Myomi- xer, porém, não a célula não alvo (Quinn et al., 2017, Nature Commu- nications, 8, 15665. doi.org/10.1038/ncomms15665) (Millay et al., 2013, Nature, 499(7458), 301–305. doi.org/10.1038/nature12343). Ambos os tipos de células-alvo e não alvo são isolados de camundon- gos e expressam de forma estável o cassete "LoxP-stop-Loxp- tdTomato" sob um promotor de CMV, que após a recombinação por Cre ativa a expressão de tdTomato, indicando fusão.
[00783] As células receptoras alvo ou não alvo são colocadas em uma placa de 96 cavidades com fundo claro, preta. Ambas as células- alvo e não alvo são semeadas para os diferentes grupos de fusão. Em seguida, 24 horas após a semeadura das células receptoras, os fuso- somas que expressam a proteína Cre recombinase e Myomaker são aplicados às células receptoras alvo ou não alvo em meio DMEM. A dose de fusosomas está correlacionada ao número de células recepto- ras semeadas na cavidade. Após a aplicação dos fusosomas, a placa de células é centrifugada em 400g por 5 minutos para ajudar a iniciar o contato entre os fusosomas e as células receptoras.
[00784] Começando em quatro horas após a aplicação de fusoso- ma, as cavidades das células são imageadas para identificar positiva- mente células positivas para RFP versus células positivas para GFP no campo ou cavidade.
[00785] Neste exemplo, as placas de células são imageadas usan- do um microscópio automatizado (www.biotek.com/products/imaging- microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell- imager/). A população total de células em uma dada cavidade é de- terminada manchando-se primeiro as células com Hoechst 33342 em meio DMEM por 10 minutos. Hoechst 33342 cora os núcleos de célu- las intercalando em DNA e, portanto, é usado para identificar células individuais. Após o manchamento, o meio Hoechst é substituído por meio DMEM regular.
[00786] Hoechst é imageado usando LED de 405 nm e cubo de fil- tro de DAPI. GFP é imageado usando LED de 465 nm e cubo de filtro de GFP, enquanto RFP é imageado usando LED de 523 nm e cubo de filtro de RFP. As imagens de cavidades de células-alvo e não alvo são adquiridas estabelecendo primeiro a intensidade do LED e os tempos de integração em uma cavidade de controle positivo; isto é, células receptoras tratadas com adenovírus que codificam para Cre recombi- nase em vez de fusosomas.
[00787] As configurações de aquisição são definidas de forma que as intensidades de RFP e GFP estejam nos valores máximos de inten- sidade de pixel, porém, não saturadas. As cavidades de interesse são, então, imageadas usando as configurações estabelecidas. As cavida- des são imageadas a cada 4 horas para adquirir os dados de curso de tempo para taxas de atividade de fusão.
[00788] A análise de cavidades positivas para GFP e RFP é reali- zada com o software fornecido com o microscópio fluorescente ou ou- tro software (Rasband, WS, ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2007).
[00789] As imagens são pré-processadas usando um algoritmo de subtração antecedente rolling ball com uma largura de 60 µm. A más- cara de célula total é definida nas células positivas para Hoechst. As células com intensidade de Hoechst significativamente acima das in- tensidades antecedentes são limiarizadas e áreas muito pequenas ou grandes para serem células positivas para Hoechst são excluídas.
[00790] Dentro da máscara de célula total, as células positivas para GFP e RFP são identificadas novamente pelo limiar para células signi- ficativamente acima do antecedente e estendendo as máscaras de Hoechst (núcleos) para toda a área celular para incluir toda a fluores- cência celular de GFP e RFP. O número de células positivas para RFP identificadas em cavidades de controle contendo células receptoras alvo ou não alvo é usado para subtrair do número de células positivas para RFP nas cavidades contendo fusosoma (subtrair para recombi- nação de Loxp não específica). O número de células positivas para RFP (células receptoras fundidas) é, então, dividido pela soma das células positivas para GFP (células receptoras que não se fundiram) e células positivas para RFP em cada ponto de tempo para quantificar a taxa de fusão de fusosoma dentro da população de células receptoras. A taxa é normalizada para a determinada dose de fusosoma aplicado às células receptoras. Para taxas de fusão direcionada (fusão de fuso- soma para células direcionadas), a taxa de fusão para a célula não alvo é subtraída da taxa de fusão à célula-alvo a fim de quantificar as taxas de fusão direcionada.
[00791] Em algumas modalidades, a taxa média de fusão para os fusosomas com as células-alvo estará na faixa de 0,01-4,0 células RFP/GFP por hora para fusão de células-alvo ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que células receptoras não alvo com fusosomas. Em algumas modalidades, os grupos sem fusosoma aplicado mostrarão uma taxa antecedente de <0,01 células RFP/GFP por hora. Exemplo 55: Fusão in vitro para liberar uma proteína de membra- na
[00792] Este Exemplo descreve a fusão de fusosoma com uma cé- lula in vitro. Em algumas modalidades, a fusão de fusosoma com uma célula in vitro resulta na liberação de uma proteína de membrana ativa à célula receptora.
[00793] Neste exemplo, os fusosomas são gerados a partir de uma célula HEK293T que expressa a proteína HVJ-E do vírus Sendai (Ta- naka et al., 2015, Gene Therapy, 22(October 2014), 1-8. doi.org/10.1038/gt.2014.12) Em algumas modalidades, os fusosomas são gerados para expressar a proteína de membrana, GLUT4, que é encontrada principalmente nos tecidos musculares e adiposos e é res- ponsável pelo transporte regulado por insulina de glicose em células. Os fusosomas com e sem GLUT4 são preparados a partir de células HEK293T conforme descrito por qualquer um dos métodos descritos em um Exemplo anterior.
[00794] As células musculares, como as células C2C12, são, então, tratadas com fusosomas que expressam GLUT4, fusosomas que não expressam GLUT4, PBS (controle negativo) ou insulina (controle posi- tivo). A atividade de GLUT4 nas células C2C12 é medida pela absor- ção do análogo 2-desoxiglicose fluorescente, 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa- 1,3-diaxol-4-il)amino]-2-desoxiglicose (2-NBDG). A fluorescência de células C2C12 é avaliada por meio de microscopia usando métodos descritos nos Exemplos anteriores.
[00795] Em algumas modalidades, as células C2C12 que são trata- das com fusosomas que expressam GLUT4 e insulina devem demons- trar fluorescência aumentada em comparação com células C2C12 tra- tadas com PBS ou fusosomas que não expressam GLUT4. Veja, tam- bém, Yang et al., Advanced Materials 29, 1605604, 2017. Exemplo 56: Liberação in vivo de proteína de membrana
[00796] Este Exemplo descreve a fusão de fusosoma com uma cé- lula in vivo. Em algumas modalidades, a fusão de fusosoma com uma célula in vivo resulta na liberação de uma proteína de membrana ativa à célula receptora.
[00797] Neste exemplo, os fusosomas são gerados a partir de uma célula HEK293T que expressa a proteína HVJ-E do vírus Sendai como no Exemplo anterior. Em algumas modalidades, os fusosomas são ge- rados para expressar a proteína de membrana, GLUT4. Os fusosomas com e sem GLUT4 são preparados a partir de células HEK293T con- forme descrito por qualquer um dos métodos descritos em um Exem- plo anterior.
[00798] Camundongos BALB/c-nu são administrados com fusoso- mas que expressam GLUT4, fusosomas que não expressam GLUT4 ou PBS (controle negativo). Os camundongos são injetados intramus- cularmente no músculo tibial anterior com fusosomas ou PBS. Imedia- tamente antes da administração do fusosoma, os camundongos são mantidos em jejum por 12 horas e injetados com [18F] 2-fluoro-2 de- sóxi-d-glicose (18F-FDG), que é um análogo da glicose que permite a tomografia por emissão de pósitrons (imagem por PET). Os camun- dongos são injetados com 18F-FDG através da veia da cauda sob anestesia (isoflurano 2 %). A imagem por PET é realizada usando um sistema de imageamento em nanoescala (1T, Mediso, Hungary). A imagem é realizada 4 horas após a administração de fusosomas. Ime- diatamente após a imagem, os camundongos são sacrificados e o músculo tibial anterior é pesado. As imagens por PET são reconstruí- das usando um sistema de imageamento 3D no modo detector com- pleto, com todas as correções em, alta regularização e oito iterações. A análise tridimensional do volume de interesse (VOI) das imagens reconstruídas é realizada usando o pacote de software de imageamen- to (Mediso, Hungary) e aplicando a análise do valor de captação pa- drão (SUV). O VOI fixado com um diâmetro de esfera de 2 mm, é re- presentado para o sítio do músculo tibial anterior. O SUV de cada sítio de VOI é calculado usando a seguinte fórmula: SUV = (radioatividade no volume de interesse, medida como Bq/cc × peso corpo- ral)/radioatividade injetada.
[00799] Em algumas modalidades, é esperado que camundongos aos quais são administrados fusosomas que expressam GLUT4 de- monstrem um sinal radioativo aumentado em VOI em comparação com camundongos administrados com PBS ou fusosomas que não expressam GLUT4. Veja, também, Yang et al., Advanced Materials 29, 1605604, 2017. Exemplo 57: Medição do extravasamento dos vasos sanguíneos
[00800] Este Exemplo descreve a quantificação de extravasamento de fusosoma através de uma monocamada endotelial, conforme testa- do com um sistema microfluídico in vitro (J.S Joen et al. 2013, jour- nals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0056910).
[00801] As células extravasam da vasculatura no tecido circundan- te. Sem desejar ser limitado pela teoria, o extravasamento é uma for- ma dos fusosomas atingirem os tecidos extravasculares.
[00802] O sistema inclui três canais de mídia endereçáveis independentemente, separados por câmaras em que um gel que imita ECM pode ser injetado. Em resumo, o sistema microfluídico moldou PDMS (poli-dimetil siloxano; Silgard 184; Dow Chemical, MI) através do qual as portas de acesso são perfuradas e ligadas a uma tampa de vidro para formar canais microfluídicos. As dimensões da seção trans- versal do canal são 1 mm (largura) por 120 µm (altura). Para realçar a adesão à matriz, os canais de PDMS são revestidos com uma solução de PDL (bromidrato de poli-D-lisina; 1 mg/mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
[00803] Em seguida, a solução de colágeno tipo I (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) (2,0 mg/mL) com solução salina tamponada com fosfato (PBS; Gibco) e NaOH é injetada nas regiões de gel do disposi- tivo por meio de quatro portas de enchimento separadas e incubada por 30 min para formar um hidrogel. Quando o gel é polimerizado, o meio de células endoteliais (adquirido de fornecedores como Lonza ou Sigma) é imediatamente pipetado nos canais para evitar a desidrata- ção do gel. Após a aspiração do meio, a solução diluída de hidrogel (BD science) (3,0 mg/mL) é introduzida no canal celular e o excesso da solução de hidrogel é lavado com meio frio.
[00804] As células endoteliais são introduzidas no canal do meio e podem se assentar para formar um endotélio. Dois dias após a seme- adura das células endoteliais, fusosomas ou células de macrófagos (controle positivo) são introduzidos no mesmo canal onde as células endoteliais formaram uma monocamada completa. Os fusosomas são introduzidos de forma que aderem e transmigram através da monoca- mada para a região de gel. As culturas são mantidas em uma incuba- dora umidificada a 37 °C e CO2 5 %. Uma versão de expressão de GFP do fusosoma é usada para permitir o imageamento das células vivas por meio de microscopia fluorescente. No dia seguinte, as célu- las são fixadas e coradas para núcleos usando manchamento de DAPI na câmara, e várias regiões de interesse são imageadas usando mi- croscópio confocal para determinar quantos fusosomas passaram através da monocamada endotelial.
[00805] Em algumas modalidades, a manchamento de DAPI indica-
rá que os fusosomas e as células de controle positivo são capazes de passar pela barreira endotelial após a semeadura. Exemplo 58: Medição da mobilidade celular quimiotática
[00806] Este Exemplo descreve a quantificação da quimiotaxia de fusosoma. As células podem mover-se para perto ou para longe de um gradiente químico por meio de quimiotaxia. Em algumas modalidades, a quimiotaxia permitirá que os fusosomas se alojem em um sítio da lesão ou rastreiem um patógeno. Uma composição de fusosoma purifi- cada, conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores, é testada quanto às suas capacidades quimiotá- ticas como segue.
[00807] Um número suficiente de fusosomas ou células de macró- fagos (controle positivo) é carregado em uma cavidade de microlâmina de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante em meio DMEM (ibi- di.com/img/cms/products/labware/channel_slides/S_8032X_Chemotaxi s/IN_8032X_Chemotaxis.pdf). Os fusosomas são deixados a 37 °C e CO2 5 % por 1h para ligar. Após a ligação da célula, DMEM (controle negativo) ou DMEM contendo quimioatrativo MCP1 é carregado em reservatórios adjacentes do canal central e os fusosomas são imagea- dos continuamente por 2 horas usando um microscópio de campo am- plo invertido Zeiss. As imagens são analisadas usando o software ImageJ (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2007). Os dados de coordenação da migração para cada fusosoma ou célula ob- servada são adquiridos com o plugin de rastreamento manual (Fabrice Cordelières, Institut Curie, Orsay, France). As plotagens de quimiotaxia e as velocidades de migração são determinadas com a Ferramenta de Quimiotaxia e Migração (ibidi).
[00808] Em algumas modalidades, uma distância média acumulada e velocidade de migração de fusosomas estarão dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou mais do que a resposta das células de controle positivo à quimiocina. A resposta das células a uma quimiocina é descrita, por exemplo, em Howard E. Gendelman et al., Journal of Neuroimmune Pharmacology, 4(1): 47-59, 2009. Exemplo 59: Medição do potencial de orientação automática
[00809] Este Exemplo descreve a orientação automática dos fuso- somas para um sítio da lesão. As células podem migrar de um sítio distal e/ou acumular-se em um sítio específico, por exemplo, abrigo para um sítio. Normalmente, o sítio é um sítio de lesão. Em algumas modalidades, os fusosomas irão se abrigar, por exemplo, migrar para ou se acumular em um sítio de lesão.
[00810] Camundongos C57BL/6J de oito semanas de idade (Jack- son Laboratories) são dosados com notexina (NTX) (Accurate Chemi- cal & Scientific Corp), uma miotoxina, em solução salina estéril por in- jeção intramuscular (IM) usando uma agulha 30G no músculo tibial an- terior direito (TA) em uma concentração de 2 µg/mL. A pele sobre o músculo tibial anterior (TA) é preparada depilando a área usando um removedor químico de pelos por 45 segundos, seguido de 3 enxágues com água. Essa concentração é escolhida para garantir a degenera- ção máxima das miofibras, bem como dano mínimo às células satéli- tes, aos axônios motores e aos vasos sanguíneos.
[00811] No dia 1 após a injeção de NTX, os camundongos recebem uma injeção IV de fusosomas ou células que expressam a vaga-lume luciferase. Os fusosomas são produzidos a partir de células que ex- pressam estavelmente a vaga-lume luciferase por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores. Um sistema de imagea- mento bioluminescente (Perkin Elmer) é usado para obter imagens de bioluminescência de animais inteiros em 0, 1, 3, 7, 21 e 28 após a in-
jeção.
[00812] Cinco minutos antes do imageamento, os camundongos recebem uma injeção intraperitoneal de substrato bioluminescente (Perkin Elmer) a uma dose de 150 mg/kg, a fim de visualizar a lucife- rase. O sistema de imageamento é calibrado para compensar todas as configurações do dispositivo. O sinal bioluminescente é medido usan- do Radiance Photons, com Fluxo Total usado como um valor medido. A região de interesse (ROI) é gerada circundando o sinal da ROI para fornecer um valor em fótons/segundo. Uma ROI é avaliada em ambos os músculos TA tratados com NTX e no músculo TA contralateral, e a relação de fótons/segundo entre os músculos TA tratados com NTX e não tratados com NTX é calculada como uma medida de orientação automática ao músculo tratado com NTX.
[00813] Em algumas modalidades, uma relação de fótons/segundo entre os músculos TA tratados com NTX e não tratados com NTX em fusosomas e células será maior do que 1, indicando o acúmulo especí- fico de local de fusosomas de expressão de luciferase na lesão.
[00814] Veja, por exemplo, Plant et al., Muscle Nerve 34 (5)L 577- 85, 2006. Exemplo 60: Medição da atividade fagocítica
[00815] Este exemplo demonstra a atividade fagocítica de fusoso- mas. Em algumas modalidades, os fusosomas têm atividade fagocíti- ca, por exemplo, são capazes de fagocitose. As células se envolvem em fagocitose, submergindo partículas, permitindo o sequestro e des- truição de invasores estranhos, como bactérias ou células mortas.
[00816] Uma composição de fusosoma purificada como produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores com- preendendo um fusosoma de um macrófago de mamífero tendo inati- vação nuclear parcial ou completa foi capaz de fagocitose analisada por meio de biopartículas de patógenos. Esta estimativa foi feita usan-
do um ensaio de fagocitose fluorescente de acordo com o seguinte protocolo.
[00817] Macrófagos (controle positivo) e fusosomas foram semea- dos imediatamente após a colheita em placas de fundo de vidro confo- cais separados. Os macrófagos e fusosomas foram incubados em DMEM+10 %FBS+1 %P/S por 1h para ligar. E. coli K12 marcada com fluoresceína e Escherichia coli K-12 não marcada com fluoresceína (controle negativo) foram adicionados aos macrófagos/fusosomas con- forme indicado no protocolo do fabricante, e foram incubados por 2h, tools.thermofisher.com/content/sfs/manuais/mp06694.pdf. Após 2h, as partículas fluorescentes livres foram extintas adicionando azul de Tri- pano. A fluorescência intracelular emitida por partículas submersas foi imageada por microscopia confocal em 488 de excitação. O número de fusosomas fagocitóticos positivos foram quantificados usando o sof- tware de imageamento J.
[00818] O número médio de fusosomas fagocitóticos foi de pelo menos 30 % 2h após a introdução da biopartícula, e foi maior que 30 % nos macrófagos de controle positivo. Exemplo 61: Medição da capacidade de cruzar uma membrana celular ou a barreira hematoencefálica
[00819] Este Exemplo descreve a quantificação de fusosomas que cruzam a barreira hematoencefálica. Em algumas modalidades, os fu- sosomas irão cruzar, por exemplo, entrar e sair, a barreira hematoen- cefálica, por exemplo, para liberação ao sistema nervoso central.
[00820] Camundongos C57BL/6J de oito semanas de idade (Jack- son Laboratories) são injetados por via intravenosa com fusosomas ou leucócitos (controle positivo) que expressam a vaga-lume luciferase. Os fusosomas são produzidos a partir de células que expressam de forma estável a vaga-lume luciferase ou células que não expressam luciferase (controle negativo) por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores. Um sistema de imageamento bioluminescen- te (Perkin Elmer) é usado para obter imagens de bioluminescência de todo o animal em uma, duas, três, quatro, cinco, seis, oito, doze e vinte e quatro horas após o fusosoma ou injeção de células.
[00821] Cinco minutos antes da imagem, os camundongos recebem uma injeção intraperitoneal de substrato bioluminescente (Perkin El- mer) a uma dose de 150 mg/kg, a fim de visualizar a luciferase. O sis- tema de imageamento é calibrado para compensar todas as configura- ções do dispositivo. O sinal bioluminescente é medido, com o fluxo to- tal usado como um valor medido. A região de interesse (ROI) é gerada circundando o sinal da ROI para fornecer um valor em fótons/segundo. A ROI selecionada é a cabeça do camundongo em torno da área que inclui o cérebro.
[00822] Em algumas modalidades, os fótons/segundo na ROI serão maiores nos animais injetados com células ou fusosomas de expres- são de luciferase do que os fusosomas de controle negativo que não expressam luciferase, indicando acúmulo de fusosomas de expressão de luciferase dentro ou ao redor do cérebro. Exemplo 62: Medição do potencial de secreção de proteína
[00823] Este Exemplo descreve a quantificação da secreção por fusosomas. Em algumas modalidades, os fusosomas serão capazes de secreção, por exemplo, secreção de proteína. As células podem descartar ou descarregar material por meio de secreção. Em algumas modalidades, os fusosomas irão interagir quimicamente e se comuni- car em seu ambiente por meio de secreção.
[00824] A capacidade dos fusosomas de secretar uma proteína a uma determinada taxa é determinada usando o ensaio rápido de Gau- ssia luciferase ThermoFisher Scientific (catálogo #16158). As células de Fibroblastos Embrionários de Camundongo (controle positivo) ou fusosomas produzidos por qualquer um dos métodos descritos nos
Exemplos anteriores são incubados em meio de crescimento e amos- tras dos meios são coletadas a cada 15 minutos precipitando primeiro os fusosomas em 1600g por 5min e, em seguida, coletando o sobre- nadante. As amostras coletadas são pipetadas em uma placa de 96 cavidades com fundo claro. Uma solução de trabalho de tampão de ensaio é, então, preparada de acordo com as instruções do fabricante.
[00825] Resumidamente, colenterazina, uma luciferina ou molécula emissora de luz, é misturada com tampão de ensaio rápido e a mistura é pipetada em cada cavidade da placa de 96 cavidades contendo as amostras. As cavidades de controle negativo que não possuem células ou fusosomas incluem meio de crescimento ou tampão de ensaio para determinar o sinal de Gaussia luciferase antecedente. Além disso, uma curva padrão de Gaussia luciferase purificada (Athena Enzyme Sys- tems, catálogo #0308) é preparada a fim de converter o sinal de lumi- nescência em moléculas de secreção de Gaussia luciferase por hora.
[00826] A placa é analisada para luminescência, usando integração de 500 mseg. O sinal de Gaussia luciferase antecedente é subtraído de todas as amostras e, em seguida, uma curva linear de melhor ajus- te é calculada para a curva padrão da Gaussia luciferase. Se as leitu- ras da amostra não se encaixarem na curva padrão, elas serão diluí- das de forma adequada e analisadas novamente. Usando este ensaio, a capacidade dos fusosomas secretarem a Gaussia luciferase a uma taxa (moléculas/hora) dentro de uma determinada faixa é determinada.
[00827] Em algumas modalidades, os fusosomas serão capazes de secretar proteínas a uma taxa que é 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou mais do que as células de controle positivo. Exemplo 63: Medição do potencial de transdução de sinal
[00828] Este Exemplo descreve a quantificação da transdução de sinal em fusosomas. Em algumas modalidades, fusosomas são capa-
zes de transdução de sinal. As células podem enviar e receber sinais moleculares do ambiente extracelular por meio de cascatas de sinali- zação, como a fosforilação, em um processo conhecido como transdu- ção de sinal. Uma composição de fusosoma purificado como produzi- da por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores compreendendo um fusosoma de uma célula de mamífero com inati- vação nuclear parcial ou completa é capaz de transdução de sinal in- duzida pela insulina. A transdução de sinal induzida pela insulina é avaliada medindo os níveis de fosforilação de AKT, uma via chave na cascata de sinalização do receptor de insulina e captação de glicose em resposta à insulina.
[00829] Para medir a fosforilação de AKT, as células, por exemplo, Fibroblastos Embrionários de Camundongo (MEFs) (controle positivo) e fusosomas são semeados em placas de 48 cavidades e deixados por 2 horas em uma incubadora umidificada a 37 °C e CO2 5 %. Após a aderência das células, a insulina (por exemplo, em 10 nM), ou uma solução de controle negativo sem insulina, é adicionada à cavidade contendo células ou fusosomas por 30 min. Após 30 minutos, o lisado de proteína é feito a partir dos fusosomas ou células, e os níveis de fosfo-AKT são medidos por western blotting em amostras estimuladas com insulina e não estimuladas por controle.
[00830] A captação de glicose em resposta à insulina ou solução de controle negativo é medida conforme explicado na seção de captação de glicose usando glicose marcada (2-NBDG). (S. Galic et al., Molecu- lar Cell Biology 25(2): 819-829, 2005).
[00831] Em algumas modalidades, os fusosomas realçarão a fosfo- rilação de AKT e a captação de glicose em resposta à insulina em re- lação aos controles negativos em pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou mais.
Exemplo 64: Medição da capacidade de transportar glicose atra- vés da membrana celular
[00832] Este Exemplo descreve a quantificação dos níveis de um 2- NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)Amino)-2- Desoxiglicose) um análogo de glicose fluorescente que pode ser usa- do para monitorar a captação de glicose em células vivas e, assim, medir o transporte ativo através da bicamada de lipídeo. Em algumas modalidades, este ensaio ou um equivalente pode ser usado para me- dir o nível de captação de glicose e transporte ativo através da bica- mada de lipídeo do fusosoma.
[00833] Uma composição de fusosoma é produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores. Um número sufi- ciente de fusosomas é, então, incubado em DMEM sem glicose, Soro Bovino Fetal 20 % e 1x de Penicilina/Estreptomicina por 2 horas a 37 °C e CO2 5 %. Após um período de privação de glicose de 2 horas, o meio é trocado de modo a incluir DMEM sem glicose, Soro Bovino Fe- tal 20 %, 1x de Penicilina/Estreptomicina e 20 μM de 2-NBDG (Ther- moFisher) e incubado por mais 2 horas a 37 °C e CO2 5 %.
[00834] Os fusosomas de controle negativo são tratados da mesma forma, exceto que uma quantidade igual de DMSO é adicionada no lugar de 2-NBDG.
[00835] Os fusosomas são, então, lavados três vezes com 1xPBS e ressuspensos em um tampão apropriado e transferidos para uma pla- ca de imageamento de 96 cavidades. A fluorescência de 2-NBDG é, então, medida em um fluorímetro usando um cubo de luz de GFP (filtro de excitação 469/35 e um filtro de emissão 525/39) para quantificar a quantidade de 2-NBDG que foi transportada através da membrana de fusosoma e acumulada no fusosoma no período de carregamento de 1 h.
[00836] Em algumas modalidades, a fluorescência de 2-NBDG será maior no fusosoma com tratamento de 2-NBDG em comparação com o controle negativo (DMSO). A medida de fluorescência com um filtro de emissão 525/39 se correlacionará com o número de moléculas de 2-NBDG presentes. Exemplo 65: Lúmen de fusosomas são miscíveis com soluções aquosas
[00837] Este exemplo avalia a miscibilidade de um lúmen de fuso- soma com soluções aquosas, como água.
[00838] Os fusosomas são preparados conforme descrito nos exemplos anteriores. Os controles são membranas de diálise com so- lução hipotônica, solução hiperosmótica ou soluções osmóticas nor- mais.
[00839] Fusosomas, controle positivo (solução osmótica normal) e controle negativo (solução hipotônica) são incubados com solução hi- potônica (150 mOsmol). O tamanho da célula é medido sob um mi- croscópio após a exposição de cada amostra à solução aquosa. Em algumas modalidades, o fusosoma e os tamanhos de controle positivo na solução hipotônica aumentam em comparação com um controle negativo.
[00840] Fusosomas, controle positivo (solução osmótica normal) e controle negativo (solução hiperosmótica) são incubados com solução hiperosmótica (400 mOsmol). O tamanho da célula é medido sob um microscópio após a exposição de cada amostra à solução aquosa. Em algumas modalidades, o fusosoma e tamanhos de controle positivo em uma solução hiperosmótica diminuirão em comparação com o controle negativo.
[00841] Fusosomas, controle positivo (solução hipotônica ou hipe- rosmótica) e controle negativo (osmótico normal) são incubados com solução osmótica normal (290 mOsmol). O tamanho da célula é medi- do ao microscópio após a exposição de cada amostra à solução aquo-
sa. Em algumas modalidades, o fusosoma e os tamanhos de controle positivo em uma solução osmótica normal permanecerão substancial- mente os mesmos em comparação com o controle negativo. Exemplo 66: Medição da atividade de esterase no citosol
[00842] Este Exemplo descreve a quantificação da atividade de es- terase, como um substituto para a atividade metabólica, em fusoso- mas. A atividade de esterase citosólica em fusosomas é determinada por avaliação quantitativa do manchamento com calceína-AM (Brato- sin et al., Cytometry 66(1): 78-84, 2005).
[00843] O corante permeável à membrana, calceína-AM (Molecular Probes, Eugene OR USA), é preparado como uma solução mãe de 10 mM em dimetilsulfóxido e como uma solução de trabalho de 100 mM em tampão de PBS, pH 7,4. Os fusosomas produzidos por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores ou células de Fi- broblastos Embrionários de Camundongos de origem de controle posi- tivo são suspensos em tampão de PBS e incubados por 30 minutos com solução de trabalho de calceína-AM (concentração final em calce- ína-AM: 5 mM) a 37 °C no escuro e, em seguida, diluídos em tampão de PBS para análise citométrica de fluxo imediata de retenção de fluo- rescência de calceína.
[00844] Os fusosomas e células de Fibroblastos Embrionários de Camundongo de origem de controle são permeabilizadas experimen- tais como um controle negativo para atividade zero esterase com sa- ponina, conforme descrito em (Jacob et al., Cytometry 12(6): 550-558, 1991). Os fusosomas e células são incubados por 15 min em solução de saponina a 1 % em tampão de PBS, pH 7,4, contendo azida de só- dio 0,05 %. Devido à natureza reversível da permeabilização da mem- brana plasmática, a saponina é incluída em todos os tampões usados para outras etapas de manchamento e lavagem. Após a permeabiliza- ção da saponina, os fusosomas e as células são suspensos em tam-
pão de PBS contendo saponina 0,1 % e azida de sódio 0,05 % e incu- bados (37 °C no escuro por 45 min) com calceína-AM até uma concen- tração final de 5 mM, lavados três vezes com o mesmo tampão de PBS contendo saponina 0,1 % e azida de sódio 0,05 %, e analisados por citometria de fluxo. As análises de citometria de fluxo são realiza- das em um citômetro de FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) com excitação com laser de argônio 488nm e a emissão é cole- tada em 530+/-30nm. O software FACS é usado para aquisição e aná- lise. Os canais de dispersão de luz são definidos em ganhos lineares e os canais de fluorescência são definidos em uma escala logarítmica, com um mínimo de 10.000 células analisadas em cada condição. As atividades de esterase relativas são calculadas com base na intensi- dade da calceína-AM em cada amostra. Todos os eventos são captu- rados nos canais de dispersão anterógrada e lateral (alternativamente, um canal pode ser aplicado para selecionar apenas a população de fusosoma). O valor de intensidade de fluorescência (FI) para os fuso- somas é determinado subtraindo o valor de FI da respectiva amostra tratada com saponina de controle negativo. A atividade de esterase normalizada para as amostras de fusosomas é normalizada para as respectivas amostras de células de controle positivo, a fim de gerar medições quantitativas para atividades de esterase citosólica.
[00845] Em algumas modalidades, uma preparação de fusosoma terá dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou mais atividade de esterase em comparação com a célula de controle positivo.
[00846] Veja, também, Bratosin D, Mitrofan L, Palii C, Estaquier J, Montreuil J. Novel fluorescence assay using calcein-AM for the deter- mination of human erythrocyte viability and aging. Cytometry A. 2005 Jul;66(1):78-84; and Jacob BC, Favre M, Bensa JC. Membrane cell permeabilisation with saponin and multiparametric analysis by flow cytometry. Cytometry 1991;12:550–558. Exemplo 67: Medição da atividade da acetilcolinesterase em fuso- somas
[00847] A atividade da acetilcolinesterase é medida usando um kit (MAK119, SIGMA) que segue um procedimento descrito anteriormente (Ellman, et al., Biochem. Pharmacol. 7, 88, 1961) e seguindo as reco- mendações do fabricante.
[00848] Resumidamente, os fusosomas são suspensos em acetilti- ocolina 1,25 mM em PBS, pH 8, misturado com 5,5-ditio-bis(ácido 2- nitrobenzoico) 0,1 mM em PBS, pH 7. A incubação é realizada à tem- peratura ambiente, porém, os fusosomas e a solução de substrato são pré-aquecidos a 37 °C por 10 min antes de iniciar as leituras de densi- dade ótica.
[00849] As alterações na absorção são monitoradas em 450 nm por 10 min com um espectrofotômetro de leitor de placas (ELX808, BIO- TEK Instruments, Winooski, VT, USA). Separadamente, uma amostra é usada para determinar o teor de proteína dos fusosomas por meio de ensaio de ácido bicinconínico para normalização. Usando este en- saio, os fusosomas são determinados para ter <100 unidades de ativi- dade de AChE/µg de proteína.
[00850] Em algumas modalidades, as unidades de atividade de AChE/µg de valores de proteína serão inferiores a 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 ou 1000. Exemplo 68: Medição do nível de atividade metabólica
[00851] Este Exemplo descreve a quantificação da medição da ati- vidade de citrato sintase em fusosomas.
[00852] A citrato sintase é uma enzima dentro do ciclo do ácido tri- carboxílico (TCA) que catalisa a reação entre o oxaloacetato (OAA) e o acetil-CoA para gerar o citrato. Na hidrólise de acetil-CoA, há liberação de CoA com um grupo tiol (CoA-SH). O grupo tiol reage com um rea-
gente químico, 5,5-Ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), para for- mar ácido 5-tio-2-nitrobenzoico (TNB), que é um produto amarelo que pode ser medido espectrofotometricamente em 412 nm (Green 2008). Kits comercialmente disponíveis, como o Kit de Ensaio de Atividade de Citrato Sintase Humano Abcam (Produto #ab119692) fornecem todos os reagentes necessários para realizar esta medição.
[00853] O ensaio é realizado de acordo com as recomendações do fabricante. Os lisados de amostra de fusosomas são preparados pela coleta dos fusosomas conforme produzidos por qualquer um dos mé- todos descritos nos Exemplos anteriores e solubilizando-os em Tam- pão de Extração (Abcam) por 20 minutos em gelo. Os sobrenadantes são coletados após a centrifugação e o teor de proteína é avaliado por ensaio de ácido bicinconínico (BCA, ThermoFisher Scientific) e a pre- paração permanece em gelo até o seguinte protocolo de quantificação ser iniciado.
[00854] Resumidamente, as amostras de lisado de fusosoma são diluídas em tampão de Incubação 1X (Abcam) nas cavidades da mi- croplaca fornecidas, com um conjunto de cavidades recebendo apenas tampão de Incubação 1X. A placa é selada e incubada por 4 horas à temperatura ambiente com agitação em 300 rpm. O tampão é, então, aspirado das cavidades e tampão de Lavagem 1X é adicionado. Esta etapa de lavagem é repetida mais uma vez. Em seguida, a solução de Atividade 1X é adicionada a cada cavidade, e a placa é analisada em um leitor de microplaca medindo a absorvência em 412 nm a cada 20 segundos por 30 minutos, com agitação entre as leituras.
[00855] Os valores antecedentes (cavidades com apenas tampão de Incubação 1X) são subtraídos de todas as cavidades, e a atividade da citrato sintase é expressa como a mudança na absorvência por mi- nuto por µg de amostra de lisado de fusosoma carregada (ΔmOD@ 412nm/min/µg de proteína). Apenas a parte linear de 100-400 segun-
dos da medição cinética é usada para calcular a atividade.
[00856] Em algumas modalidades, uma preparação de fusosoma terá dentro de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou mais atividade da sintase em comparação com a célula de controle.
[00857] Veja, por exemplo, Green HJ et al. Metabolic, enzymatic, and transporter response in human muscle during three consecutive days of exercise and recovery. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 295: R1238-R1250, 2008. Exemplo 69: Medição dos níveis de respiração
[00858] Este Exemplo descreve a quantificação da medição do ní- vel de respiração em fusosomas. O nível de respiração nas células pode ser uma medida do consumo de oxigênio, que estimula o meta- bolismo. A respiração fusosoma é medida para taxas de consumo de oxigênio por um analisador de fluxo extracelular Seahorse (Agilent) (Zhang 2012).
[00859] Os fusosomas produzidos por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores ou células são semeados em uma microplaca Seahorse de 96 cavidades (Agilent). A microplaca é centri- fugada brevemente para sedimentar os fusosomas e as células no fundo dos cavidades. Os ensaios de consumo de oxigênio são inicia- dos removendo o meio de crescimento, substituindo por um meio mí- nimo DMEM tamponado baixo contendo glicose 25 mM e glutamina 2 mM (Agilent) e incubando a microplaca a 37 °C por 60 minutos para permitir o equilíbrio de temperatura e pH.
[00860] A microplaca é, então, analisada em um analisador de fluxo extracelular (Agilent) que mede as mudanças no oxigênio extracelular e no pH nos meios imediatamente que circundante os fusosomas e células aderentes. Após obter o consumo de oxigênio em estado esta- cionário (taxa de respiração basal) e as taxas de acidificação extrace-
lular, oligomicina (5 µM), que inibe a ATP sintase, e ionóforo de pró- tons FCCP (4-(trifluorometoxi)fenil-hidrazona de cianeto de carbonila; 2 µM), que desacopla mitocôndrias, são adicionados a cada cavidade da microplaca para obter os valores das taxas máximas de consumo de oxigênio.
[00861] Finalmente, 5 µM de antimicina A (inibidor do complexo da mitocôndria III) são adicionados para confirmar que as alterações na respiração são devido principalmente à respiração mitocondrial. A taxa mínima de consumo de oxigênio após a adição de antimicina A é sub- traída de todas as medições de consumo de oxigênio para remover o componente de respiração não mitocondrial. As amostras de células que não respondem adequadamente à oligomicina (pelo menos uma redução de 25 % na taxa de consumo de oxigênio do basal) ou FCCP (pelo menos um aumento de 50 % na taxa de consumo de oxigênio após a oligomicina) são excluídas da análise. O nível de respiração dos fusosomas é, então, medido como pmol de fusosomas O2/min/1e4.
[00862] Este nível de respiração é, então, normalizado para o res- pectivo nível de respiração celular. Em algumas modalidades, os fuso- somas terão pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou superior ao nível de respiração em comparação com as respectivas amostras de células respectivas.
[00863] Veja, por exemplo, Zhang J, Nuebel E, Wisidagama DRR, et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nature protocols. 2012;7(6):10.1038/nprot.2012.048. doi:10.1038/nprot.2012.048. Exemplo 70: Medição de níveis de fosfatidilserina de fusosomas
[00864] Este Exemplo descreve a quantificação do nível de ligação da anexina-V à superfície dos fusosomas.
[00865] As células que estão morrendo podem exibir fosfatidilserina na superfície celular, que é um marcador de apoptose na via de morte celular programada. A anexina-V liga-se à fosfatidilserina e, portanto, a ligação da anexina-V é um substituto para a viabilidade nas células.
[00866] Os fusosomas foram produzidos conforme descrito aqui. Para a detecção de sinais de apoptose, fusosomas ou células de con- trole positivo foram corados com 5 % de anexina V flúor 594 (A13203, Thermo Fisher, Waltham, MA). Cada grupo (detalhado na tabela abai- xo) incluiu uma subdivisão experimental que foi tratada com um indutor de apoptose, menadiona. A menadiona foi adicionada a 100 µM de menadiona durante 4 h. Todas as amostras foram analisadas em citô- metro de fluxo (Thermo Fisher, Waltham, MA) e a intensidade de fluo- rescência foi medida com o laser YL1 em um comprimento de onda de 561 nm e um filtro de emissão de 585/16 nm. A presença de fosfatidil serina extracelular foi quantificada pela comparação da intensidade de fluorescência da anexina V em todos os grupos.
[00867] Os fusosomas não corados de controle negativo não foram positivos para manchamento com anexina V.
[00868] Em algumas modalidades, os fusosomas foram capazes de super-regular a exibição de fosfatidilserina na superfície celular em resposta à menadiona, indicando que os fusosomas não estimulados por menadiona não estão passando por apoptose. Em algumas moda- lidades, as células de controle positivo que foram estimuladas com menadiona demonstraram níveis mais elevados de manchamento com anexina V do que fusosomas não estimulados com menadiona. Tabela 20: Parâmetro de manchamento com Anexina V Subdivisão Experimental Intensidade de Fluorescência Média de Sinal de Anexina V (e desvio padrão) Fusosomas Não corados (controle 941 (937) negativo)
Subdivisão Experimental Intensidade de Fluorescência Média de Sinal de Anexina V (e desvio padrão) Fusosomas Corados 11257 (15826) Fusosomas Corados + Menadiona 18733 (17146) Macrófagos Coradps + Menadiona 14301 (18142) (controle positivo) Exemplo 71: Medição dos níveis de sinalização justácrina
[00869] Este Exemplo descreve a quantificação da sinalização jus- tácrina em fusosomas.
[00870] As células podem formar sinalização dependente do conta- to celular por meio de sinalização justácrina. Em algumas modalida- des, a presença de sinalização justácrina em fusosomas demonstrará que os fusosomas podem estimular, reprimir e geralmente se comuni- car com as células em sua vizinhança imediata.
[00871] Os fusosomas produzidos por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores de células estromais da medula ós- sea de mamíferos (BMSCs) tendo a inativação nuclear parcial ou completa desencadeiam a secreção de IL-6 por meio da sinalização justácrina em macrófagos. Macrófagos primários e BMSCs são cocul- tivados. Macrófagos derivados de medula óssea são semeados primei- ro em placas de 6 cavidades e incubados por 24h, então fusosomas derivados de BMSC de camundongo primário ou células BMSC (célu- las de origem de controle positivo) são colocados nos macrófagos em um meio DMEM com FBS 10 %. O sobrenadante é coletado em dife- rentes pontos de tempo (2, 4, 6, 24 horas) e analisado quanto à secre- ção de IL-6 por ensaio ELISA. (Chang J. et al., 2015).
[00872] Em algumas modalidades, um nível de sinalização justácri- na induzida por fusosomas de BMSC é medido por um aumento nos níveis de IL-6 secretada por macrófagos nos meios. Em algumas mo- dalidades, um nível de sinalização justácrina será de pelo menos 1 %,
2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou mais do que os níveis induzidos pelas células estro- mais da medula óssea de controle positivo (BMSCs). Exemplo 72: Medição dos níveis de sinalização parácrina
[00873] Este Exemplo descreve a quantificação da sinalização pa- rácrina em fusosomas.
[00874] As células podem se comunicar com outras células no mi- croambiente local por meio da sinalização parácrina. Em algumas mo- dalidades, os fusosomas serão capazes de sinalização parácrina, por exemplo, para se comunicar com as células em seu ambiente local. Em algumas modalidades, a capacidade dos fusosomas de desenca- dear a sinalização de Ca2+ em células endoteliais por meio da secre- ção derivada de parácrina com o seguinte protocolo medirá a sinaliza- ção de Ca2+ por meio do indicador de cálcio, fluo-4 AM.
[00875] Para preparar a placa experimental, as células endoteliais microvasculares pulmonares de murino (MPMVECs) são semeadas em uma placa confocal com fundo de vidro de 25 mm revestida com gelatina a 0,2 % (80 % de confluência). As MPMVECs são incubadas em temperatura ambiente por 30 min em ECM contendo BSA 2 % e ácido plurônico 0,003 % com 5 μM de fluo-4 AM (Invitrogen) concen- tração final para permitir o carregamento de fluo-4 AM. Após o carre- gamento, as MPMVECs são lavadas com solução de imageamento experimental (ECM contendo BSA 0,25 %) contendo sulfinpirazona para minimizar a perda de corante. Depois de carregar fluo-4, 500 μl de solução de imageamento experimental pré-aquecida são adiciona- dos à placa, e a placa é imageada por um sistema de imageamento confocal Zeiss.
[00876] Em um tubo separado, macrófagos de murino isolados re- centemente são tratados com 1μg/mL de LPS em meios de cultura (DMEM+FBS a 10 %) ou não tratados com LPS (controle negativo).
Após a estimulação, os fusosomas são gerados a partir de macrófagos por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores.
[00877] Os fusosomas ou macrófagos de origem (controle positivo) são, então, rotulados com vermelho rastreador de células, CMTPX (In- vitrogen), em ECM contendo BSA 2 % e ácido plurônico 0,003 %. Os fusosomas e macrófagos são, então, lavados e ressuspensos em so- lução de imagemento experimental. Os fusosomas e macrófagos mar- cados são adicionados às MPMVECs carregadas com fluo-4 AM na placa confocal.
[00878] O sinal de fluorescência verde e vermelho é registrado a cada 3s por 10-20 min usando o sistema de imageamento confocal Zeiss com fonte de laser de íon de argônio com excitação em 488 e 561 nm para fluo-4 AM e fluorescência vermelha do rastreador de cé- lulas, respectivamente. As alterações de intensidade de fluorescência de Fluo-4 são analisadas usando software de imageamento (Mallilan- karaman, K. et al., J Vis Exp. (58): 3511, 2011). O nível de intensidade de Fluo-4 medido em fusosoma de controle negativo e grupos de célu- las é subtraído de fusosoma e grupos de células estimulados por LPS.
[00879] Em algumas modalidades, fusosomas, por exemplo, fuso- somas ativados, irão induzir um aumento na intensidade de fluores- cência Fluo-4 que é de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou mais do que os grupos de células de controle positivo. Exemplo 73: Medição da capacidade de polimerizar actina para mobilidade
[00880] Este Exemplo descreve a quantificação de componentes do citoesqueleto, como a actina, em fusosomas. Em algumas modalida- des, os fusosomas compreendem componentes do citoesqueleto, co- mo actina, e são capazes de polimerização de actina.
[00881] As células usam actina, que é um componente do citoes-
queleto, para a motilidade e outros processos citoplasmáticos. O citoe- squeleto é essencial para criar forças impulsionadas pela motilidade e coordenar o processo de movimento
[00882] As células C2C12 foram enucleadas como aqui descrito. Os fusosomas obtidos das camadas Ficoll de 12,5 % e 15 % foram agru- pados e marcados como 'Leve', enquanto os fusosomas das camadas de 16-17 % foram agrupados e rotulados como 'Médio'. Os fusosomas ou células (células C2C12 de origem, controle positivo) foram ressus- pensos em DMEM + Glutamax + Soro Bovino Fetal 10 % (FBS), se- meados em placas de fixação ultrabaixa de 24 cavidades (#3473, Cor- ning Inc, Corning, NY) e incubados a 37°C + CO2 5 %. As amostras foram coletadas periodicamente (5,25 horas, 8,75 horas, 26,5 horas) e coradas com 165 µM de rodamina faloidina (controle negativo não foi corado) e medidas em um citômetro de fluxo (# A24858, Thermo Fis- her, Waltham, MA) com um laser de FC YL1 (561 nm com filtro de 585/16) para medir o teor do citoesqueleto de F-actina. A intensidade de fluorescência da rodamina faloidina em fusosomas foi medida junto com fusosomas não corados e células C2C12 de origem coradas.
[00883] A intensidade de fluorescência dos fusosomas foi maior (Figura 4) do que o controle negativo em todos os pontos de tempo, e os fusosomas foram capazes de polimerizar actina a uma taxa seme- lhante às células C2C12 de origem.
[00884] Componentes do citoesqueleto adicionais, como aqueles listados na tabela abaixo, são medidos por meio de sistemas ELISA disponíveis comercialmente (Cell Signaling Technology and MyBio- Source), de acordo com as instruções do fabricante.
Tabela 21: Componentes do citoesqueleto Proteína do citoe- Tipo do Kit Comercial ID do Kit squeleto medida Actina Kit ELISA Sanduíche de Cell Signaling, 7880 B-Actina Total de Path Scan Arp2/3 Subunidade do complexo MyBioSource, da proteína Relacionada à MBS7224740 Actina Humana 2/3 (APRC2)
KIT ELISA Formina Proteína de Ligação à MyBioSource, Formina 1 (FNBP1), MBS9308864 Kit ELISA Coronina Coronina Humana 1A MyBioSource, Kit ELISA MBS073640 Distrofina Distrofina humana MyBioSource Kit ELISA MBS722223 Queratina Queratina Humana 5 MyBioSource, Kit ELISA MBS081200 Miosina IG de Miosina Humana MyBioSource, (MYO1G) MBS9312965 Kit ELISA Tubulina Tubulina Beta 3 Humana MyBioSource, Kit ELISA MBS097321
[00885] Em seguida, 100 μL de lisado diluído apropriadamente são adicionados à cavidade apropriada das tiras de microcavidades. As microcavidades são seladas com fita e incubadas durante 2 horas a 37 °C. Após a incubação, a fita adesiva é removida e o teor descartado. Cada microcavidade é lavada quatro vezes com 200 μL de Tampão de Lavagem 1X. Após cada lavagem individual, as placas são batidas em um pano absorvente para que a solução de lavagem residual seja re- movida de cada cavidade. No entanto, as cavidades não ficam com- pletamente secas em nenhum momento durante o experimento.
[00886] Em seguida, 100 μL do Anticorpo de Detecção reconstituído (verde) são adicionados a cada cavidade individual, exceto para as cavidades de controle negativo. Em seguida, as cavidades são sela- das e incubadas por 1 hora a 37 oC. O procedimento de lavagem é re- petido após a incubação estar completa. 100 μL de anticorpo secundá- rio Ligado à HRP reconstituída (vermelho) são adicionados a cada uma das cavidades. As cavidades são lacrados com fita adesiva e in- cubadas por 30 minutos a 37 oC. A fita adesiva é, então, removida e o procedimento de lavagem é repetido. 100 μL de substrato TMB são, então, adicionados a cada cavidade. As cavidades são seladas com fita adesiva e incubadas por 10 minutos a 37 oC. Assim que a incuba- ção final estiver concluída, 100 μL de solução de INTERRUPÇÃO são adicionados a cada uma das cavidades e a placa é agitada suavemen- te por vários segundos.
[00887] A análise espectrofotométrica do ensaio é realizada 30 mi- nutos após a adição da solução de INTERRUPÇÃO. A parte inferior dAs cavidades é limpa com um tecido sem fiapos e, em seguida, a ab- sorvência é lida em 450 nm. Em algumas modalidades, as amostras de fusosoma que foram coradas com o anticorpo de detecção irão ab- sorver mais luz em 450 nm que as amostras de fusosoma de controle negativo e absorverão menos luz do que as amostras de células que foram coradas com o anticorpo de detecção. Exemplo 74: Medição do potencial de membrana médio
[00888] Este Exemplo descreve a quantificação do potencial de membrana mitocondrial de fusosomas. Em algumas modalidades, os fusosomas que compreendem uma membrana mitocondrial manterão o potencial da membrana mitocondrial.
[00889] A atividade metabólica mitocondrial pode ser medida pelo potencial de membrana mitocondrial. O potencial de membrana da preparação de fusosoma é quantificado usando um corante disponível comercialmente, TMRE, para avaliar o potencial de membrana mito- condrial (TMRE: tetrametil rodamina, etil éster, perclorato, Abcam, Cat # T669).
[00890] Os fusosomas são gerados por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores. Os fusosomas ou células de ori- gem são diluídos em meio de crescimento (DMEM livre de vermelho de fenol com Soro Bovino Fetal 10 %) em 6 alíquotas (triplicatas não tratadas e tratadas com FCCP). Uma alíquota das amostras é incuba- da com FCCP, um desacoplador que elimina o potencial da membrana mitocondrial e evita o manchamento com TMRE. Para amostras trata- das com FCCP, 2 µM de FCCP são adicionados às amostras e incu- bados por 5 minutos antes da análise. Os fusosomas e células de ori- gem são, então, corados com TMRE 30nM. Para cada amostra, uma amostra não corada (sem TMRE) também é preparada em paralelo. As amostras são incubadas a 37 °C durante 30 minutos. As amostras são, então, analisadas em um citômetro de fluxo com laser de argônio de 488 nm, e a excitação e a emissão são coletadas em 530+/-30 nm.
[00891] Os valores do potencial da membrana (em milivolts, mV) são calculados com base na intensidade de TMRE. Todos os eventos são capturados nos canais de dispersão anterógrada e lateral (alterna- tivamente, um canal pode ser aplicado para excluir pequenos detritos). O valor de intensidade de fluorescência (FI) para as amostras não tra- tadas e tratadas com FCCP são normalizados subtraindo a média ge- ométrica da intensidade de fluorescência da amostra não corada da média geométrica da amostra não tratada e tratada com FCCP. O es- tado do potencial de membrana para cada preparação é calculado usando os valores de intensidade fluorescente normalizados com uma equação de Nernst modificada (veja abaixo) que pode ser usada para determinar o potencial de membrana mitocondrial dos fusosomas ou células com base na fluorescência de TMRE (como TMRE se acumula nas mitocôndrias em um maneira Nernstiana).
[00892] Fusosoma ou potencial de membrana celular é calculado com a seguinte fórmula: (mV) = -61,5 * log (FI não tratado- normalizado/FIFCCP-tratado-normalizado). Em algumas modalidades, usando este ensaio ou um equivalente em preparações de fusosoma de células de mioblasto de camundongo C2C12, o estado potencial de membrana da preparação de fusosoma estará dentro de cerca de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou mais do que as células de origem. Em algumas moda- lidades, a faixa de potencial de membrana é de cerca de -20 a - 150mV. Exemplo 75: Medição da meia-vida de persistência em um indiví- duo
[00893] Este Exemplo descreve a medição da meia-vida de fuso- soma.
[00894] Os fusosomas são derivados de células que expressam gaussia-luciferase produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores, e diluições puras de 1:2, 1:5 e 1:10 em solu- ção tamponada são feitas. Uma solução tamponada sem fusosomas é usada como um controle negativo.
[00895] Cada dose é administrada a três camundongos C57BL/6J machos com oito semanas de idade (Jackson Laboratories) por via intravenosa. O sangue é coletado da veia retro-orbital em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24, 48 e 72 horas após a administração intravenosa dos fuso- somas. Os animais são sacrificados no final do experimento por inala- ção de CO2.
[00896] O sangue é centrifugado por 20 min em temperatura ambi- ente. As amostras de soro são imediatamente congeladas a −80 °C até a bioanálise. Em seguida, cada amostra de sangue é usada para realizar um ensaio de atividade de Gaussia-luciferase após misturar as amostras com substrato de Gaussia-luciferase (Nanolight, Pinetop, AZ). Resumidamente, a colenterazina, uma luciferina ou molécula emissora de luz, é misturada com tampão de ensaio rápido e a mistura é pipetada em cavidades contendo amostras de sangue em uma placa de 96 cavidades. As cavidades de controle negativo sem sangue con- têm tampão de ensaio para determinar o sinal de Gaussia luciferase antecedente.
[00897] Além disso, uma curva padrão de Gaussia luciferase purifi- cada de controle positivo (Athena Enzyme Systems, catálogo #0308) é preparada a fim de converter o sinal de luminescência em moléculas de secreção de Gaussia luciferase por hora. A placa é analisada para luminescência, usando integração de 500 mseg. O sinal da Gaussia luciferase antecedente é subtraído de todas as amostras e, em segui- da, uma curva linear de melhor ajuste é calculada para a curva padrão da Gaussia luciferase. Se as leituras da amostra não se encaixarem na curva-padrão, elas serão diluídas de forma adequada e testadas novamente. O sinal de luciferase de amostras retiradas em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24, 48 e 72 horas é interpolado para a curva padrão. A cons- tante de taxa de eliminação ke (h-1) é calculada usando a seguinte equação de um modelo de um compartimento: C(t) = C0 x e-kext, em que C(t) (ng/mL) é a concentração de fusosomas no tempo t (h) e C0 a concentração de fusosomas no tempo = 0 (ng/mL). A meia-vida de eliminação t1/2,e (h) é calculada como ln(2)/ke.
[00898] Em algumas modalidades, os fusosomas terão uma meia- vida de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % ou mais do que as células de controle negativo. Exemplo 76: Medição da retenção de fusosomas em circulação
[00899] Este Exemplo descreve a quantificação da liberação de fu- sosoma na circulação e retenção nos órgãos. Em algumas modalida-
des, os fusosomas são liberadas na circulação e não são capturados e retidos em sítios de órgãos.
[00900] Em algumas modalidades, os fusosomas liberados na circu- lação periférica evitam a captura e retenção pelo sistema retículoendo- telial (RES), a fim de atingir os sítios alvo com alta eficiência. O RES compreende um sistema de células, principalmente macrófagos, que residem em órgãos sólidos como o baço, os linfonodos e o fígado. Es- sas células geralmente têm a tarefa de remover células "velhas", como os glóbulos vermelhos.
[00901] Os fusosomas são derivados de células que expressam a CRE recombinase (agente) ou células que não expressam CRE (con- trole negativo). Estes fusosomas são preparados para injeção in vivo como no Exemplo 62.
[00902] Os camundongos receptores abrigam um locus de DNA genômico de loxp-luciferase que é modificado pela proteína CRE feita a partir de mRNA liberado pelos fusosomas para desbloquear a ex- pressão da luciferase (JAX#005125). A luciferase pode ser detectada por imageamento bioluminescente em um animal vivo. O controle posi- tivo para este exemplo são descendentes de camundongos receptores acasalados com uma cepa de camundongo que expressa a mesma proteína exclusivamente em macrófagos e células de monócitos de seu próprio genoma (Cx3cr1-CRE JAX#025524). A prole deste acasa- lamento abriga um de cada alelo (loxp-luciferase, Cx3cr1-CRE).
[00903] Os fusosomas são injetados na circulação periférica por meio da injeção na veia da cauda (IV, Exemplo #48) em camundongos que abrigam um locus genético que, quando atuado pela proteína CRE, resulta na expressão da luciferase. O mecanismo de captura não específico de RES é de natureza fagocítica, liberando uma proporção da proteína CRE do fusosoma no macrófago, resultando na recombi- nação genômica. As medições IVIS (conforme descrito no Exemplo
62) identificam onde os controles sem fusogênio se acumulam e se fundem. O acúmulo no baço, linfonodos e fígado será indicativo de captura não específica mediada por RES do fusosoma. IVIS é realiza- do em 24, 48 e 96 horas após a injeção de fusosomas.
[00904] Os camundongos são sacrificados e o baço, o fígado e a cadeia linfática principal no intestino são colhidos.
[00905] O DNA genômico é isolado desses órgãos e submetido à reação em cadeia da polimerase quantitativa contra o remanescente de DNA genômico recombinado. Um locus genômico alternativo (não direcionado por CRE) também é quantificado para fornecer uma medi- da do número de células na amostra.
[00906] Em modalidades, sinais bioluminescentes baixos serão ob- servados tanto para o agente quanto para o controle negativo em todo o animal e especificamente no fígado e nos sítios esplênicos. Em mo- dalidades, o controle positivo mostrará sinal aumentado no fígado (em controle negativo e agente) e sinais elevados no baço e uma distribui- ção consistente com os linfonodos.
[00907] Em algumas modalidades, a quantificação de PCR genômi- ca desses tecidos indicará uma alta proporção dos sinais de recombi- nação sobre o locus alternativo no controle positivo em todos os teci- dos examinados, enquanto para ou agente e controles negativos, o nível de recombinação será insignificante em todos os tecidos.
[00908] Em algumas modalidades, o resultado deste Exemplo indi- cará que os controles não fusogênicos não são retidos pelo RES e se- rão capazes de atingir ampla distribuição e exibir alta biodisponibilida- de. Exemplo 77: Longevidade de fusosoma com imunossupressão
[00909] Este Exemplo descreve a quantificação da imunogenicida- de de uma composição de fusosoma quando é coadministrada com um fármaco imunossupressor.
[00910] As terapias que estimulam uma resposta imune podem, às vezes, reduzir a eficácia terapêutica ou causar a toxicidade ao recep- tor. Em algumas modalidades, os fusosomas serão substancialmente não imunogênicos.
[00911] Uma composição purificada de fusosomas conforme produ- zida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores é coadministrada com um fármaco imunossupressor e as propriedades imunogênicas são analisadas pela longevidade do fusosoma in vivo. Um número suficiente de fusosomas, marcados com luciferase, é inje- tado localmente no músculo gastrocnêmio de um camundongo normal com tacrolimus (TAC, 4mg/kg/dia; Sigma Aldrich), ou veículo (controle negativo), ou sem qualquer agente adicional (controle positivo). Os camundongos são, então, submetidos a imageamento in vivo em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 24, 48 e 72 horas após a injeção.
[00912] Resumidamente, os camundongos são anestesiados com isoflurano e D-luciferina é administrada por via intraperitoneal em uma dose de 375 mg por quilograma de peso corporal. No momento do imageamento, os animais são colocados em uma câmara à prova de luz e os fótons emitidos pela luciferase expressando fusosomas trans- plantados para os animais são coletados com tempos de integração de 5 segundos a 5 minutos, dependendo da intensidade da emissão de bioluminescência. O mesmo camundongo é varrido repetidamente nos vários pontos de tempo definidos acima. O sinal BLI é quantificado em unidades de fótons por segundo (fluxo total) e apresentado como log [fótons por segundo]. Os dados são analisados comparando a intensi- dade e a injeção de fusosoma com e sem TAC.
[00913] Em modalidades, o ensaio mostrará um aumento na longe- vidade dos fusosomas no grupo coadministrado com TAC em relação ao fusosoma sozinho e grupos veículo no ponto de tempo final. Além do aumento na longevidade do fusosoma, em algumas modalidades,
um aumento no sinal BLI do fusosoma mais a subdivisão de TAC ver- sus o fusosoma mais veículo ou fusosomas sozinho em cada um dos pontos de tempo será observado. Exemplo 78: Medição de anticorpos IgG e IgM pré-existentes rea- tivos contra fusosomas
[00914] Este Exemplo descreve a quantificação de títulos de anti- corpos anti-fusosoma pré-existentes medidos usando citometria de fluxo.
[00915] Uma medida de imunogenicidade para fusosomas são as respostas de anticorpos. Os anticorpos que reconhecem fusosomas podem se ligar de uma maneira que pode limitar a atividade ou longe- vidade do fusosoma. Em algumas modalidades, alguns receptores de um fusosoma aqui descrito terão anticorpos pré-existentes que se li- gam a e reconhecem fusosomas.
[00916] Neste Exemplo, os títulos de anticorpos antifusosoma são testados usando fusosomas produzidos usando uma célula fonte xe- nogênica por qualquer um dos métodos descritos em um Exemplo an- terior. Neste exemplo, um camundongo naive de fusosoma é avaliado quanto à presença de anticorpos antifusosoma. Notavelmente, os mé- todos descritos aqui podem ser igualmente aplicáveis a humanos, ra- tos, macacos com otimização do protocolo.
[00917] O controle negativo é soro de camundongo que foi depleta- do de IgM e IgG, e o controle positivo é soro derivado de um camun- dongo que recebeu múltiplas injeções de fusosomas gerados a partir de uma célula fonte xenogênica.
[00918] Para avaliar a presença de anticorpos pré-existentes que se ligam a fusosomas, o soro de camundongos naive de fusosoma é pri- meiro descomplementado por aquecimento a 56 °C por 30 min e, pos- teriormente, diluído em 33 % em PBS contendo FCS 3 % e NaN3 0,1 %. Quantidades iguais de suspensões de soro e fusosomas (1x102 -
1x108 fusosomas por mL) são incubadas por 30 min a 4 °C e lavadas com PBS através de um coxim de soro de bezerro.
[00919] Os anticorpos xenorreativos de IgM são corados por incu- bação das células com anticorpos de cabra conjugados com PE espe- cíficos para a porção Fc de IgM de camundongo (BD Bioscience) a 4 °C por 45 min. Notavelmente, anticorpos secundários IgG1 ou IgG2 anticamundongo também podem ser usados. As células de todos os grupos são lavadas duas vezes com PBS contendo FCS 2 % e então analisadas em um sistema FACS (BD Biosciences). Os dados de fluo- rescência são coletados por meio de amplificação logarítmica e ex- pressos como intensidade fluorescente média. Em algumas modalida- des, o soro de controle negativo mostrará fluorescência insignificante comparável a nenhum soro ou controles secundários isolados. Em uma modalidade, o controle positivo mostrará mais fluorescência do que o controle negativo e mais do que os controles sem soro ou se- cundários isolados. Em uma modalidade, nos casos onde ocorre imu- nogenicidade, o soro de camundongos naive de fusosoma irá mostrar mais fluorescência do que o controle negativo. Em uma modalidade, nos casos onde a imunogenicidade não ocorre, o soro de camundon- gos naive de fusosoma apresentará fluorescência semelhante em comparação ao controle negativo. Exemplo 79: Medição de respostas de anticorpos IgG e IgM após múltiplas administrações de fusosomas
[00920] Este Exemplo descreve a quantificação da resposta humo- ral de um fusosoma modificado após múltiplas administrações do fu- sosoma modificado. Em algumas modalidades, um fusosoma modifi- cado, por exemplo, modificado por um método aqui descrito, terá uma resposta humoral reduzida (por exemplo, reduzida em comparação com a administração de um fusosoma não modificado) após múltiplas (por exemplo, mais de um, por exemplo, 2 ou mais), administrações do fusosoma modificado.
[00921] Uma medida de imunogenicidade para fusosomas é as res- postas de anticorpos. Em algumas modalidades, as injeções repetidas de um fusosoma podem levar ao desenvolvimento de anticorpos anti- fusosoma, por exemplo, anticorpos que reconhecem fusosomas. Em algumas modalidades, os anticorpos que reconhecem fusosomas po- dem se ligar de uma maneira que pode limitar a atividade ou longevi- dade dos fusosomas.
[00922] Neste Exemplo, os títulos de anticorpos antifusosomas são examinados após uma ou mais administrações de fusosomas. Os fu- sosomas são produzidos por qualquer um dos Exemplos anteriores. Os fusosomas são gerados a partir de: células-tronco mesenquimais não modificadas (a seguir, MSCs), células-tronco mesenquimais modi- ficadas com uma expressão mediada por lentivírus de HLA-G (a se- guir, MSC-HLA-G), e células-tronco mesenquimais modificadas com uma expressão mediada por lentivírus de um vetor vazio (a seguir, ve- tor de MSC-vazia). O soro é extraído de coortes diferentes: camun- dongos injetados sistemicamente e/ou localmente com 1, 2, 3, 5, 10 injeções de veículo (grupo naive de Fusosoma), fusosomas de MSC, fusosomas de MSC-HLA-G ou fusosomas de vetores vazios de MSC .
[00923] Para avaliar a presença e abundância de anticorpos antifu- sosomas, o soro dos camundongos é primeiro descomplementado por aquecimento a 56 °C por 30 min e subsequentemente diluído em 33 % em PBS com FCS 3 % e NaN3 0,1 %. Quantidades iguais de soro e fusosomas (1x102 - 1x108 fusosomas por mL) são incubadas por 30 min a 4 °C e lavadas com PBS através de um coxim de soro de bezer- ro.
[00924] Os anticorpos IgM reativos a fusosoma são corados por in- cubação das células com anticorpos de cabra conjugados com PE es- pecíficos para a porção Fc de IgM de camundongo (BD Bioscience) a
4 °C por 45 min. Notavelmente, os anticorpos secundários IgG1 ou IgG2 anticamundongo também podem ser usados. As células de todos os grupos são lavadas duas vezes com PBS contendo FCS 2 % e en- tão analisadas em um sistema FACS (BD Biosciences). Os dados de fluorescência são coletados por uso de amplificação logarítmica e ex- pressos como intensidade fluorescente média.
[00925] Em algumas modalidades, os fusosomas de MSC-HLA-G terão títulos de anticorpos IgM (ou IgG1/2) antifusosoma diminuídos (conforme medido pela intensidade de fluorescência em FACS) após as injeções, em comparação com fusosomas de MSC ou fusosomas de vetor de MSC-vazia. Exemplo 80: Modificação de células fonte de fusosoma para ex- pressar proteína tolerogênica para reduzir a imunogenicidade
[00926] Este Exemplo descreve a quantificação da imunogenicida- de em fusosomas derivados de uma fonte de células modificadas. Em algumas modalidades, os fusosomas derivados de uma fonte de célu- las modificadas têm imunogenicidade reduzida em comparação com os fusosomas derivados de uma fonte de células não modificadas.
[00927] As terapias que estimulam uma resposta imune podem, às vezes, reduzir a eficácia terapêutica ou causar toxicidade ao receptor. Em algumas modalidades, fusosomas substancialmente não imunogê- nicos são administrados a um indivíduo. Em algumas modalidades, a imunogenicidade da fonte de células pode ser analisada como um substituto para a imunogenicidade de fusosoma.
[00928] As células iPS modificadas usando expressão mediada por lentivírus de HLA-G ou expressando um vetor vazio (controle negativo) são analisadas quanto às propriedades imunogênicas como segue. Um número suficiente de células iPS, como uma fonte de célula de fusosoma potencial, é injetado em camundongos C57/B6, por via sub- cutânea no flanco traseiro e recebem uma quantidade apropriada de tempo para permitir que teratomas se formem.
[00929] Uma vez que os teratomas são formados, os tecidos são coletados. Tecidos preparados para manchamento fluorescente são congelados em OCT, e aqueles preparados para o manchamento imu- no-histoquímica e H&E são fixados em formalina tamponada 10 % e embebidos em parafina. As seções de tecido são coradas com anti- corpos, anticorpo CD3 anti-humano de coelho policlonal (DAKO), mAb CD4 anti-humano de camundongo (RPA-T4, BD PharMingen), mAb CD8 anti-humano de camundongo (RPA-T8, BD PharMingen), de acordo com os protocolos gerais de imuno-histoquímica. Estes são detectados usando um reagente de detecção apropriado, nomeada- mente uma HRP secundária anticamundongo (Thermofisher) ou HRP secundária anticoelho (Thermofisher).
[00930] A detecção é obtida usando sistemas de visualização ba- seados em peroxidase (Agilent). Os dados são analisados tomando o número médio de células T CD4+ infiltrantes, células T CD8+, células NK CD3+ presentes em 25, 50 ou 100 cortes de tecido examinados em um campo 20x usando um microscópio ótico. Em modalidades, iPSCs que não são modificados ou iPSCs que expressam um vetor vazio terão um maior número de células T CD4+ infiltrantes, células T CD8+, células NK CD3+ presentes nos campos examinados em com- paração com iPSCs que expressam HLA-G.
[00931] Em algumas modalidades, propriedades imunogênicas de fusosoma serão substancialmente equivalentes às da célula fonte. Em algumas modalidades, os fusosomas derivados de células iPS modifi- cadas com HLA-G terão infiltração de células imunes reduzida em re- lação às suas contrapartes não modificadas. Exemplo 81: Modificação de células fonte de fusosoma para pro- teína imunogênica nocaute para reduzir a imunogenicidade
[00932] Este Exemplo descreve a quantificação da geração de uma composição de fusosoma derivada de uma fonte de célula, que foi modificada para reduzir a expressão de uma molécula que é imunogê- nica. Em algumas modalidades, um fusosoma pode ser derivado de uma fonte de célula, que foi modificada para reduzir a expressão de uma molécula que é imunogênica.
[00933] As terapias que estimulam uma resposta imune podem re- duzir a eficácia terapêutica ou causar toxicidade ao receptor. Assim, a imunogenicidade é uma propriedade importante para um fusosoma terapêutico seguro e eficaz. A expressão de certos agentes de ativa- ção imune pode criar uma resposta imune. MHC classe I representa um exemplo de um agente de ativação imune.
[00934] Neste exemplo, os fusosomas são gerados por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores. Fusosomas são gerados a partir de: células-tronco mesenquimais não modificadas (a seguir, MSCs, controle positivo), células-tronco mesenquimais modifi- cadas com uma expressão mediada por lentivírus de um shRNA dire- cionado a MHC classe I (a seguir, MSC-shMHC classe I) e células- tronco mesenquimais modificadas com uma expressão mediada por lentivírus de um shRNA misturado não direcionado (a seguir, MSC misturado, controle negativo).
[00935] Os fusosomas são analisados quanto à expressão de MHC classe I usando citometria de fluxo. Um número apropriado de fuso- somas é lavado e ressuspenso em PBS, mantido em gelo por 30 minu- tos com diluição de 1: 10-1: 4000 de anticorpos monoclonais conjuga- dos por fluorescência contra MHC classe I (Harlan Sera-Lab, Belton, UK). Os fusosomas são lavados três vezes em PBS e ressuspensos em PBS. A fluorescência inespecífica é determinada, usando alíquotas iguais de preparação de fusosomas incubadas com um anticorpo de controle de isótipo conjugado por fluorescência apropriado em dilui- ções equivalentes. Os fusosomas são analisados em um citômetro de fluxo (FACSort, Becton-Dickinson) e os dados são analisados com sof- tware de análise de fluxo (Becton-Dickinson).
[00936] Os dados de fluorescência média dos fusosomas derivados de MSCs, MSCs-shMHC classe I, MSC misturado, são comparados. Em algumas modalidades, fusosomas derivados de MSCs-shMHC classe I terão menor expressão de MHC classe I em comparação com MSCs e MSC misturados. Exemplo 82: Modificação de células fonte de fusosoma para evitar a fagocitose de macrófagos
[00937] Este Exemplo descreve a quantificação da evasão da fago- citose por fusosomas modificados. Em algumas modalidades, os fuso- somas modificados evitarão a fagocitose por macrófagos.
[00938] As células se envolvem em fagocitose, submergindo partí- culas, permitindo o sequestro e destruição de invasores estranhos, como bactérias ou células mortas. Em algumas modalidades, a fagoci- tose de fusosomas por macrófagos reduziria sua atividade.
[00939] Os fusosomas são gerados por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores. Os fusosomas são criados a partir de: células de mamífero marcadas com CSFE que carecem de CD47 (a seguir, NMC, controle positivo), células marcadas com CSFE que são projetadas para expressar CD47 usando expressão mediada por lentivírus de um cDNA de CD47 (a seguir, NMC-CD47) e células mar- cadas com CSFE modificadas usando a expressão mediada por lenti- vírus de um controle de vetor vazio (a seguir, vetor vazio de NMC, con- trole negativo).
[00940] A redução da depuração imune mediada por macrófagos é determinada com um ensaio de fagocitose de acordo com o seguinte protocolo. Os macrófagos são semeados imediatamente após a colheita em placas de fundo de vidro confocais. Os macrófagos são incubados em DMEM+10 %FBS+1 %P/S por 1h para ligar. Um número apropriado de fusosomas derivados de NMC, NMC-CD47, vetor vazio de NMC é adicionado aos macrófagos conforme indicado no protocolo, e são incubados por 2h, tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf.
[00941] Após 2h, a placa é cuidadosamente lavada e a fluorescên- cia intracelular é examinada. A fluorescência intracelular emitida por partículas submersas é imageada por microscopia confocal em 488 de excitação. O número de macrófago positivo fagocitótico é quantificado usando software de imageamento. Os dados são expressos como o índice fagocítico = (número total de células submersas/número total de macrófagos contados) × (número de macrófagos contendo células submersas/número total de macrófagos contados) × 100.
[00942] Em algumas modalidades, um índice fagocítico será redu- zido quando os macrófagos são incubados com fusosomas derivados de NMC-CD47, versus aqueles derivados de NMC, ou vetor vazio de NMC. Exemplo 83: Modificação de células fonte de fusosoma para cito- toxicidade diminuída mediada por lise de células PBMC
[00943] Este Exemplo descreveu a geração de fusosomas deriva- dos de células modificadas para ter citotoxicidade diminuída devido à lise celular por PBMCs.
[00944] Em algumas modalidades, a lise celular mediada por citoto- xicidade de células fonte ou fusosomas por PBMCs é uma medida de imunogenicidade para fusosomas, como lise reduzirá, por exemplo, inibirá ou interromperá a atividade de um fusosoma.
[00945] Neste exemplo, fusosomas são gerados por qualquer um dos métodos descritos em um Exemplo anterior. Os fusosomas são criados a partir de: células-tronco mesenquimais não modificadas (a seguir, MSCs, controle positivo), células-tronco mesenquimais modifi- cadas com uma expressão mediada por lentivírus de HLA-G (a seguir,
MSC-HLA-G) e células-tronco mesenquimais modificadas com uma expressão mediada por lentivírus de um vetor vazio (a seguir, vetor de MSC-vazia, controle negativo).
[00946] A lise mediada por PMBC de um fusosoma é determinada por ensaios de liberação de európio, conforme descrito em Bouma, et al. Murmurar. Immunol. 35(2):85-92; 1992 & van Besouw et al. Trans- plantation 70(1):136-143; 2000. PBMCs (a seguir, células efetoras) são isolados de um doador apropriado e estimulados com PMBCs irradia- dos com gama alogênica e 200 UI/mL de IL-2 (proleucina, Chiron BV Amsterdam, The Netherlands) em uma placa de 96 cavidades de fun- do redondo por 7 dias a 37 °C. Os fusosomas são marcados com európio-dietilenotriaminopenta-acetato (DTPA) (sigma, St. Louis, MO, USA).
[00947] No dia 7, os ensaios de lise mediados por citotoxicidade 63 são realizados incubando fusosomas marcados com Eu com células efetoras em uma placa de 96 cavidades para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 24, 48 horas após a semeadura em relações efetor/alvo variando de 1000:1-1:1 e 1:1,25-1:1000. Após a incubação, as placas são cen- trifugadas e uma amostra do sobrenadante é transferida para placas de 96 cavidades com baixa fluorescência antecedente (fluoroimmuno- plates, Nunc, Roskilde, Denmark).
[00948] Posteriormente, a solução de realce (PerkinElmer, Gronin- gen, The Netherlands) é adicionada a cada cavidade. O európio libe- rado é medido em um fluorômetro resolvido com o tempo (contador de múltiplos rótulos Victor 1420, LKB-Wallac, Finland). A fluorescência é expressa em contagens por segundo (CPS). A liberação percentual máxima de európio por um fusosoma alvo é determinada incubando um número apropriado (1x 102 -1x 108) de fusosomas com triton 1 % (sigma-aldrich) por um período de tempo apropriado. A liberação es- pontânea de európio por fusosomas alvo é medida por incubação de fusosomas alvo marcados sem células efetoras. A porcentagem de vazamento é, então, calculada como: (liberação espontânea/liberação máxima) x100 %. Finalmente, a porcentagem de lise mediada por cito- toxicidade é calculada como % de lise = [(lise medida - lise espontânea - liberação espontânea)/(liberação máxima - liberação espontâ- nea)]x100 %. Os dados são analisados observando-se a porcentagem de lise como uma função de diferentes relações alvo efetoras.
[00949] Em algumas modalidades, os fusosomas gerados a partir de células MSC-HLA-G terão uma porcentagem diminuída de lise por células-alvo, em pontos de tempo específicos em comparação com MSCs ou fusosomas gerados por MSC misturada. Exemplo 84: Modificação de células fonte de fusosoma para ativi- dade de lise de NK diminuída
[00950] Este Exemplo descreve a geração de uma composição de fusosoma derivada de uma fonte de célula, que foi modificada para diminuir a lise celular mediada por citotoxicidade por células NK. Em algumas modalidades, a lise celular mediada por citotoxicidade de cé- lulas fonte ou fusosomas por células NK é uma medida de imunogeni- cidade para fusosomas.
[00951] Neste exemplo, fusosomas são gerados por qualquer um dos métodos descritos em um Exemplo anterior. Os fusosomas são criados a partir de: células-tronco mesenquimais não modificadas (a seguir, MSCs, controle positivo), células-tronco mesenquimais modifi- cadas com uma expressão mediada por lentivírus de HLA-G (a seguir, MSC-HLA-G) e células-tronco mesenquimais modificadas com uma expressão mediada por lentivírus de um vetor vazio (a seguir, vetor de MSC-vazia, controle negativo).
[00952] A lise mediada por células NK de um fusosoma é determi- nada por ensaios de liberação de európio, conforme descrito em Bou- ma, et al. Hum. Immunol. 35(2):85-92; 1992 & van Besouw et al.
Transplantation 70(1):136-143; 2000. As células NK (a seguir, células efetoras) são isoladas de um doador apropriado de acordo com os mé- todos em Crop et al. Cell transplantation (20):1547-1559; 2011, e esti- muladas com PMBCs irradiadas com gama alogênicas e 200UI/mL de IL-2 (proleucina, Chiron BV Amsterdam, The Netherlands) em uma placa de 96 cavidades de fundo redondo por 7 dias a 37 °C. Os fuso- somas são marcados com európio-dietilenotriaminopenta-acetato (DTPA) (sigma, St. Louis, MO, USA).
[00953] No dia 7, os ensaios de lise mediados por citotoxicidade 63 são realizados incubando fusosomas marcados com Eu com células efetoras em uma placa de 96 cavidades por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 24, 48 horas após a semeadura em relações efetor/alvo variando de 1000:1-1:1 e 1:1,25-1:1000. Após a incubação, as placas são cen- trifugadas e uma amostra do sobrenadante é transferida para placas de 96 cavidades com baixa fluorescência antecedente (fluoroimmuno- plates, Nunc, Roskilde, Denmark).
[00954] Posteriormente, a solução de realce (PerkinElmer, Gronin- gen, The Netherlands) é adicionada a cada cavidade. O európio libe- rado é medido em um fluorômetro resolvido com o tempo (contador de mútiplos rótulos Victor 1420, LKB-Wallac, Finland). A fluorescência é expressa em contagens por segundo (CPS). A liberação percentual máxima de európio por um fusosoma alvo é determinada incubando um número apropriado (1x 102 -1x 108) de fusosomas com triton 1 % (Sigma-Aldrich) por um período de tempo apropriado. A liberação es- pontânea de európio por fusosomas alvo é medida por incubação de fusosomas alvo marcados sem células efetoras. A porcentagem de vazamento é, então, calculada como: (liberação espontânea/liberação máxima) x100 %. Finalmente, a porcentagem de lise mediada por cito- toxicidade é calculada como % de lise = [(lise medida - lise espontânea - liberação espontânea)/(liberação máxima - liberação espontânea)]
x100 %. Os dados são analisados observando-se a porcentagem de lise como uma função de diferentes relações efetor alvo.
[00955] Em algumas modalidades, os fusosomas gerados a partir de células MSC-HLA-G terão uma porcentagem diminuída de lise em pontos de tempo apropriados em comparação com MSCs ou fusoso- mas gerados por MSC misturado. Exemplo 85: Modificação de células fonte de fusosoma para lise de células T Exterminadoras CD8 diminuída
[00956] Este Exemplo descreve a geração de uma composição de fusosoma derivada de uma fonte de células, que foi modificada para diminuir a lise celular mediada por citotoxicidade por células T CD8+. Em algumas modalidades, a lise celular mediada por citotoxicidade de células fonte ou fusosomas por células T CD8+ é uma medida de imu- nogenicidade para fusosomas.
[00957] Neste exemplo, fusosomas são gerados por qualquer um dos métodos descritos em um Exemplo anterior. Os fusosomas são criados a partir de: células-tronco mesenquimais não modificadas (a seguir, MSCs, controle positivo), células-tronco mesenquimais modifi- cadas com uma expressão mediada por lentivírus de HLA-G (a seguir, MSC-HLA-G) e células-tronco mesenquimais modificadas com uma expressão mediada por lentivírus de um vetor vazio (a seguir, vetor de MSC-vazia, controle negativo).
[00958] A lise mediada por células T CD8+ de um fusosoma é de- terminada por ensaios de liberação de európio, conforme descrito em Bouma, et al. Hum. Immunol. 35(2):85-92; 1992 & van Besouw et al. Transplantation 70(1):136-143; 2000. As células T CD8+ (a seguir, cé- lulas efetoras) são isoladas de um doador apropriado de acordo com os métodos em Crop et al. Cell transplantation (20):1547-1559; 2011, e estimuladas com PMBCs irradiadas com gama alogênicas e 200UI/mL de IL-2 (proleucina, Chiron BV Amsterdam, The Netherlands) em uma placa de 96 cavidades de fundo redondo por 7 dias a 37 °C. Os fuso- somas são marcados com európio-dietilenotriaminopenta-acetato (DTPA) (sigma, St. Louis, MO, USA).
[00959] No dia 7, os ensaios de lise mediada por citotoxicidade são 63 realizados incubando fusosomas marcados com Eu com células efe- toras em uma placa de 96 cavidades para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 24, 48 horas após a semeadura em relações efetor/alvo variando de 1000:1-1:1 e 1:1,25-1:1000. Após a incubação, as placas são centrifu- gadas e 20 μL do sobrenadante são transferidos para placas de 96 cavidades com baixa fluorescência antecedente (fluoroimmunoplates, Nunc, Roskilde, Denmark).
[00960] Posteriormente, a solução de realce (PerkinElmer, Gronin- gen, The Netherlands) é adicionada a cada cavidade. O európio libe- rado é medido em um fluorômetro resolvido com o tempo (contador de mútiplos rótulos Victor 1420, LKB-Wallac, Finland). A fluorescência é expressa em contagens por segundo (CPS). A liberação percentual máxima de európio por um fusosoma alvo é determinada incubando um número apropriado (1x 102 -1x 108) de fusosomas com triton 1 % (sigma-aldrich) por um período de tempo apropriado. A liberação es- pontânea de európio por fusosomas alvo é medida por incubação de fusosomas alvo marcados sem células efetoras. A porcentagem de vazamento é, então, calculada como: (liberação espontânea/liberação máxima) x100 %. Finalmente, a porcentagem de lise mediada por cito- toxicidade é calculada como % de lise = [(lise medida - lise espontânea - liberação espontânea)/(liberação máxima - liberação espontânea)] x100 %. Os dados são analisados observando-se a porcentagem de lise como uma função de diferentes relações efetor alvo.
[00961] Em algumas modalidades, os fusosomas gerados a partir de células MSC-HLA-G terão uma porcentagem diminuída de lise em pontos de tempo apropriados em comparação com os fusosomas ge-
rados por MSCs ou MSC misturada. Exemplo 86: Modificação de células fonte de fusosoma para ati- vação de células T diminuída
[00962] Este Exemplo descreve a geração de fusosomas modifica- dos que terão ativação e proliferação de células T reduzidas conforme avaliado por uma reação de linfócitos mistos (MLR).
[00963] A proliferação e ativação de células T são medidas de imu- nogenicidade para fusosomas. A estimulação da proliferação de célu- las T em uma reação de MLR por uma composição de fusosoma pode- ria sugerir uma estimulação da proliferação de células T in vivo.
[00964] Em algumas modalidades, os fusosomas gerados a partir de células fonte modificadas têm ativação e proliferação de células T reduzidas conforme avaliado por uma reação de linfócitos mistos (MLR). Em algumas modalidades, os fusosomas gerados a partir de células fonte modificadas não geram uma resposta imune in vivo, man- tendo assim a eficácia da composição de fusosomas.
[00965] Neste exemplo, fusosomas são gerados por qualquer um dos métodos descritos em um Exemplo anterior. Os fusosomas são gerados a partir de: células-tronco mesenquimais não modificadas (a seguir, MSCs, controle positivo), células-tronco mesenquimais modifi- cadas com uma expressão de IL-10 mediada por lentivírus (a seguir, MSC-IL-10) e células-tronco mesenquimais modificadas com uma ex- pressão mediada por lentivírus de um vetor vazio (a seguir, vetor de MSC-vazia, controle negativo).
[00966] Os esplenócitos de BALB/ce C57BL/6 são usados como células estimuladoras ou respondedoras. Notavelmente, a fonte des- sas células pode ser trocada por células estimuladoras/respondedoras derivadas de humanos comumente usadas. Além disso, qualquer po- pulação de células T CD4+ alogênicas purificadas de mamífero, popu- lação de células T CD8+ ou CD4-/CD8- pode ser usada como popula-
ção respondedora.
[00967] Os esplenócitos de camundongo são isolados por dissocia- ção mecânica usando lâminas totalmente congeladas, seguido por lise de glóbulos vermelhos com tampão de lise (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO). Antes do experimento, as células estimuladoras são irradiadas com 20 Gy de raio γ para evitar que reajam contra as células respon- dedoras. Uma cocultura é, então, feita adicionando números iguais de células estimuladoras e respondedoras (ou concentrações alternativas, mantendo uma relação de 1:1) a uma placa de fundo redondo de 96 cavidades em meio DMEM-10 completo. Um número apropriado de fusosomas (em várias concentrações de uma faixa de 1x101-1x108) é adicionado à cocultura em diferentes intervalos de tempo, t = 0, 6, 12, 24, 36, 48h.
[00968] A proliferação é avaliada pela adição de 1 µCi de [3H]- timi- dina (Amersham, Buckinghamshire, UK) para permitir a incorporação. [3H]- timidina é adicionada ao MLR em t = 2, 6, 12, 24, 36, 48, 72h, e as células são colhidas em filtros de fibra de vidro usando um coletor de células de 96 cavidades (Inoteck, Bertold, Japan) após 2, 6, 12, 18, 24, 36 e 48h de cultura estendida. Todas as experiências de prolifera- ção de células T são feitas em triplicado. A incorporação de [3H]- timi- dina é medida usando um contador de Luminescência microbeta (Per- kin Elmer, Wellesley, MA). Os resultados podem ser representados como contagens por minuto (cpm).
[00969] Em algumas modalidades, os fusosomas de MSC-IL10 mostrarão uma diminuição na proliferação de células T em compara- ção com o vetor MSC-Vazio ou os controles de fusosomas não modifi- cados de MSC. Exemplo 87: Medição do potencial de direcionamento em um indi- víduo
[00970] Este Exemplo avalia a capacidade de um fusosoma de atingir um sítio específico do corpo. Em algumas modalidades, um fu- sosoma pode direcionar um sítio do corpo específico. O direcionamen- to é uma forma de restringir a atividade de um agente terapêutico a um ou mais sítios terapêuticos relevantes.
[00971] Camundongos C57BL/6J de oito semanas de idade (Jack- son Laboratories) são injetados por via intravenosa com fusosomas ou células que expressam a vaga-lume luciferase. Os fusosomas são produzidos a partir de células que expressam de forma estável a vaga- lume luciferase ou células que não expressam luciferase (controle ne- gativo) por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anterio- res. Grupos de camundongos são sacrificados em uma, duas, três, quatro, cinco, seis, oito, doze e vinte e quatro horas após o fusosoma ou injeção de células.
[00972] Cinco minutos antes da eutanásia, os camundongos rece- bem uma injeção IP de substrato bioluminescente (Perkin Elmer) em uma dose de 150mg/kg para visualizar a luciferase. O sistema de ima- geamento bioluminescente é calibrado para compensar todas as con- figurações do dispositivo. Os camundongos são, então, sacrificados e o fígado, pulmões, coração, baço, pâncreas, GI e rins são coletados. O sistema de imageamento (Perkin Elmer) é usado para obter imagens de bioluminescência desses órgãos ex vivo. O sinal bioluminescente é medido usando Radiance Photons, com Fluxo Total usado como um valor medido. A região de interesse (ROI) é gerada circundando o ór- gão ex vivo para fornecer um valor em fótons/segundo. A relação de fótons/segundo entre órgãos alvo (por exemplo, fígado) e órgãos não alvo (por exemplo, a soma de fótons/segundo de pulmões, coração, baço, pâncreas, GI e rim) é calculada como uma medida de direcio- namento para o fígado.
[00973] Em algumas modalidades, em ambos os fusosomas e célu- las, a relação de fótons/segundo entre o fígado e os outros órgãos se-
rá maior do que 1, o que indicaria que os fusosomas se direcionam ao fígado. Em algumas modalidades, os animais de controle negativo exi- birão fótons/segundo muito mais baixos em todos os órgãos. Exemplo 88: Medição da liberação de um agente exógeno em um indivíduo
[00974] Este Exemplo descreve a quantificação da liberação de fu- sosomas compreendendo um agente exógeno em um indivíduo. Os fusosomas são preparados a partir de células que expressam Gaus- sia-luciferase ou de células que não expressam luciferase (controle negativo) por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos ante- riores.
[00975] Células de controle positivo ou fusosomas são injetados por via intravenosa em camundongos. Os fusosomas ou células são libe- rados em 5–8 segundos usando uma agulha de seringa de insulina de calibre 26. O imageamento bioluminescente in vivo é realizado em camundongos 1, 2 ou 3 dias após a injeção usando um sistema de imageamento in vivo (Xenogen Corporation, Alameda, CA).
[00976] Imediatamente antes do uso, a coelenterazina, uma lucife- rina ou molécula emissora de luz (5 mg/mL), é preparada em metanol acidificado e injetada imediatamente na veia da cauda dos camundon- gos. Os camundongos estão sob anestesia contínua em um estágio aquecido usando o Sistema de Anestesia com Gás XGI-8.
[00977] O imageamento por bioluminescência é obtido através da aquisição de contagens de fótons ao longo de 5 min imediatamente após a injeção na veia da cauda intravenosa de coelenterazina (4 µg/g de peso corporal). Os dados adquiridos são analisados usando softwa- re (Xenogen) com a sobreposição na imagem com visão clara. Regi- ões de interesse (ROI) são criadas usando uma ferramenta de contor- no de intensidade de sinal automática e normalizada com subtração antecedente do mesmo animal. Uma aquisição de dados seqüencial usando três filtros nos comprimentos de onda de 580, 600 e 620 nm com tempo de exposição de 3 a 10 minutos é conduzida para localizar fontes de luz bioluminescente dentro de um camundongo.
[00978] Além disso, em cada ponto de tempo, as amostras de urina são coletadas por palpação abdominal.
[00979] Amostras de sangue (50 µL) são obtidas da veia da cauda de cada camundongo em tubos heparinizados ou EDTA. Para o isola- mento do plasma, as amostras de sangue são centrifugadas durante 25 min em 1,3 × g a 4 °C.
[00980] Então, 5 µL de amostra de sangue, plasma ou urina são usados para realizar um ensaio de atividade de Gaussia-luciferase após misturar as amostras com 50 µM de substrato de Gaussia- luciferase (Nanolight, Pinetop, AZ).
[00981] Em algumas modalidades, uma amostra de controle negati- vo será negativa para luciferase e uma amostra de controle positivo será de células administradas a animais. Em algumas modalidades, as amostras de animais administrados com fusosomas que expressam Gaussia-luciferase serão positivas para luciferase em cada amostra.
[00982] Veja, por exemplo, El-Amouri SS et al., Molecular bio- technology 53(1): 63-73, 2013. Exemplo 89: Transporte ativo através de uma bicamada de lipídeo de um fusosoma
[00983] Este Exemplo descreve a quantificação do nível de 2- NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)Amino)-2- Desoxiglicose), um análogo de glicose fluorescente que pode ser usa- do para monitorar a captação de glicose em células vivas e, portanto, o transporte ativo através da bicamada de lipídeo. Em algumas moda- lidades, este ensaio ou um equivalente pode ser usado para medir o nível de captação de glicose e transporte ativo através da bicamada de lipídeo do fusosoma.
[00984] Uma composição de fusosoma conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores. Um nú- mero suficiente de fusosomas é, então, incubado em DMEM sem gli- cose, Soro Bovino Fetal 20 % e 1x de Penicilina/Estreptomicina por 2 horas a 37 °C e CO2 5 %. Após o período de privação de glicose de 2 horas, o meio é trocado de modo que inclua DMEM sem glicose, Soro Bovino Fetal 20 %, 1x de Penicilina/Estreptomicina e 20 μM de 2- NBDG (ThermoFisher) e incubado por 2 horas a 37 °C e CO2 5 %. Fu- sosomas de controle negativo são tratados da mesma forma, exceto uma quantidade igual de DMSO, o veículo para 2-NBDG é adicionado no lugar de 2-NBDG.
[00985] Os fusosomas são, então, lavados três vezes com 1xPBS e ressuspensos em um tampão apropriado e transferidos para uma pla- ca de imageamento de 96 cavidades. A fluorescência de 2-NBDG é, então, medida em um fluorímetro usando um cubo de luz de GFP (filtro de excitação 469/35 e um filtro de emissão 525/39) para quantificar a quantidade de 2-NBDG que foi transportado através da membrana do fusosoma e acumulado no fusosoma em o período de carregamento de 1 hora.
[00986] Em algumas modalidades, a fluorescência de 2-NBDG será maior nos fusosomas com tratamento de 2-NBDG em comparação com o controle negativo (DMSO). A medida de fluorescência com um filtro de emissão 525/39 será relativamente ao número de moléculas de 2-NBDG presentes. Exemplo 90: Liberação de fusosomas por meio da via não endocí- tica
[00987] Este Exemplo descreve a quantificação da liberação de fu- sosoma de Cre a uma célula receptora por meio de uma via não endo- cítica.
[00988] Em algumas modalidades, os fusosomas liberarão agentes por meio de uma via não endocítica mediada por fusosomas. Sem de- sejar estar limitado pela teoria, a liberação de um agente, por exemplo, Cre, que é transportado dentro do lúmen dos fusosomas, diretamente para o citosol das células receptoras, sem qualquer exigência para captação mediada por endocitose dos fusosomas, ocorrerá através uma liberação da via não endocítica mediada por fusosoma.
[00989] Neste exemplo, o fusosoma compreende uma célula HEK293T que expressa a proteína H e F do vírus Sendai em sua membrana plasmática (Tanaka et al., 2015, Gene Therapy, 22 (Octo- ber 2014), 1-8. https://doi.org/10.1038/gt.2014.123). Além disso, o fu- sosoma expressa a proteína fluorescente mTagBFP2 e a Cre recom- binase. A célula-alvo é uma célula RPMI8226 que expressa de forma estável o cassete "LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP" sob um promotor de CMV, que na recombinação por Cre muda de expressão de GFP para RFP, indicando fusão e Cre, como um liberação de marcador.
[00990] Os fusosomas produzidos pelos métodos aqui descritos são analisados para liberação de Cre por meio de uma via não endocítica como se segue. As células receptoras são semeadas em uma placa de 96 cavidades com fundo claro, preta. Em seguida, 24 horas após a semeadura das células receptoras, os fusosomas que expressam a proteína Cre recombinase e que possuem a proteína fusogênica parti- cular são aplicados às células receptoras em meio DMEM. Para de- terminar o nível de liberação de Cre por meio de uma via não endocíti- ca, um grupo paralelo de células receptoras que recebem fusosomas é tratado com um inibidor de acidificação endossômica, cloroquina (30 µg/mL). A dose de fusosomas está correlacionada ao número de célu- las receptoras semeadas na cavidade. Após a aplicação dos fusoso- mas, a placa de células é centrifugada em 400g por 5 minutos para ajudar a iniciar o contato entre os fusosomas e as células receptoras. As células são, então, incubadas por 16 horas e a liberação do agente,
Cre, é avaliada por meio de imageamento.
[00991] As células são imageadas para identificar positivamente as células positivas para RFP versus células positivas para GFP no cam- po ou cavidade. Neste exemplo, as placas de células são imageadas usando um microscópio de fluorescência automatizado. A população total de células em uma dada cavidade é determinada manchando-se primeiro as células com Hoechst 33342 em meio DMEM por 10 minu- tos. Hoechst 33342 cora os núcleos de células intercalando em DNA e, portanto, é usado para identificar as células individuais. Após o man- chamento, o meio Hoechst é substituído por meio DMEM regular.
[00992] Hoechst é imageado usando LED de 405 nm e cubo de fil- tro de DAPI. GFP é imageado usando LED de 465 nm e cubo de filtro de GFP, enquanto RFP é imageado usando LED de 523 nm e cubo de filtro de RFP. As imagens dos diferentes grupos de células são adqui- ridas estabelecendo-se primeiro a intensidade do LED e os tempos de integração em uma cavidade de controle positivo; isto é, células recep- toras tratadas com adenovírus que codificam para Cre recombinase em vez de fusosomas.
[00993] As configurações de aquisição são definidas de forma que as intensidades de RFP e GFP estejam nos valores máximos de inten- sidade de pixel, porém, não saturadas. As cavidades de interesse são, então, imageadas usando as configurações estabelecidas.
[00994] A análise de cavidades positivas para GFP e RFP é reali- zada com software fornecido com o microscópio de fluorescência ou outro software (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, 1997–2007). As imagens são pré- processadas usando um algoritmo de subtração antecedente rolling ball com uma largura de 60 µm. A máscara de célula total é definida nas células positivas para Hoechst. As células com intensidade de Ho- echst significativamente acima das intensidades antecedentes são usadas para definir um limite e áreas muito pequenas ou grandes para serem células positivas para Hoechst são excluídas.
[00995] Dentro da máscara de célula total, células positivas para GFP e RFP são identificadas definindo novamente um limite para célu- las significativamente acima do antecedente e estendendo as másca- ras de Hoechst (núcleos) para toda a área celular para incluir toda a fluorescência celular de GFP e RFP.
[00996] O número de células positivas para RFP identificadas em cavidades de controle contendo células receptoras é usado para sub- trair do número de células positivas para RFP nas cavidades contendo fusosomas (subtrair para a recombinação Loxp não específica). O nú- mero de células positivas para RFP (células receptoras que receberam Cre) é, então, dividido pela soma de células positivas para GFP (célu- las receptoras que não receberam Cre) e células positivas para RFP para quantificar a fração de Cre de fusosoma liberada à população de células receptora. O nível é normalizado para a determinada dose de fusosomas aplicada às células receptoras. Para calcular o valor de Cre de fusosoma liberada através de uma via não endocítica, o nível de liberação de Cre de fusosoma na presença de cloroquina (FusL+CQ) é determinado, bem como o nível de liberação de Cre de fusosoma na ausência de cloroquina (FusL- CQ). Para determinar o valor normali- zado de Cre de fusosoma liberado através de uma via não endocítica, a seguinte equação é usada: [(FusL-CQ)-(FusL+CQ)]/(FusL-CQ).
[00997] Em algumas modalidades, um nível médio de Cre de fuso- soma liberado através de uma via não endocítica para um determinado fusosoma estará na faixa de 0,1-0,95, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que as células receptoras tratadas com cloroquina. Exemplo 91: Liberação de fusosomas por meio da via endocítica
[00998] Este Exemplo descreve a liberação de fusosoma de Cre a uma célula receptora por meio de uma via endocítica.
[00999] Em algumas modalidades, os fusosomas liberarão agentes por meio de uma via endocítica mediada por fusosomas. Sem desejar estar limitado pela teoria, a liberação de um agente, por exemplo, uma carga, transportada no lúmen dos fusosomas, para as células recepto- ras com a rotina de captação sendo dependente de endocitose ocorre- rá através de uma liberação de via endocítica, mediada por fusosoma.
[001000] Neste exemplo, o fusosoma compreende microvesículas que foram produzidas pela extrusão de uma célula HEK293T que ex- pressa uma proteína fusogênica em sua membrana plasmática através de um filtro de 2 µm (Lin et al., 2016, Biomedical Microdevices, 18(3). doi.org/10.1007/s10544-016-0066-y)(Riedel, Kondor-Koch, & Garoff, 1984, The EMBO Journal, 3(7), 1477-83. Obtido de www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6086326). Além disso, o fusosoma ex- pressa a proteína fluorescente mTagBFP2 e a Cre recombinase. A cé- lula-alvo é uma célula PC3 que expressa de forma estável o cassete "LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP" sob um promotor de CMV, que na recom- binação por Cre muda de expressão de GFP para RFP, indicando fu- são e Cre, como um liberação de marcador.
[001001] Os fusosomas produzidos pelos métodos aqui descritos são analisados para liberação de Cre por meio de uma via endocítica como se segue. As células receptoras são semeadas em uma placa de cul- tura de células de múltiplas cavidades compatível com o sistema de imageamento a ser usado (neste exemplo, as células são semeadas em uma placa de 96 cavidades com fundo claro, preta). Em seguida, 24 horas após a semeadura das células receptoras, os fusosomas que expressam a proteína Cre recombinase e que possuem a proteína fu- sogênica particular são aplicados às células receptoras em meio DMEM. Para determinar o nível de liberação de Cre por meio de uma via endocítica, um grupo paralelo de células receptoras recebendo fu-
sosomas é tratado com um inibidor de acidificação endossomal, cloro- quina (30 µg/mL). A dose de fusosomas está correlacionada ao núme- ro de células receptoras semeadas na cavidade. Após a aplicação dos fusosomas, a placa de células é centrifugada em 400g por 5 minutos para ajudar a iniciar o contato entre os fusosomas e as células recep- toras. As células são, então, incubadas por 16 horas e a liberação do agente, Cre, é avaliada por meio de imageamento.
[001002] As células são imageadas para identificar positivamente as células positivas para RFP versus células positivas para GFP no cam- po ou cavidade. Neste exemplo, as placas de células são imageadas usando um microscópio fluorescente automatizado. A população total de células em uma dada cavidade é determinada manchando-se pri- meiro as células com Hoechst 33342 em meio DMEM por 10 minutos. Hoechst 33342 cora os núcleos de células intercalando em DNA e, portanto, é usado para identificar células individuais. Após o mancha- mento, o meio Hoechst é substituído por meio DMEM regular.
[001003] Hoechst é imageado usando LED de 405 nm e cubo de fil- tro de DAPI. GFP é imageado usando LED de 465 nm e cubo de filtro de GFP, enquanto RFP é imageado usando LED de 523 nm e cubo de filtro de RFP. As imagens dos diferentes grupos de células são adqui- ridas estabelecendo-se primeiro a intensidade do LED e os tempos de integração em uma cavidade de controle positivo; isto é, células recep- toras tratadas com adenovírus que codificam para Cre recombinase em vez de fusosomas.
[001004] As configurações de aquisição são definidas de forma que as intensidades de RFP e GFP estejam nos valores máximos de inten- sidade de pixel, porém, não saturadas. As cavidades de interesse são, então, imageadas usando as configurações estabelecidas.
[001005] A análise de cavidades positivas para GFP e RFP é reali- zada com software fornecido com o microscópio fluorescente ou outro software (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, 1997–2007). As imagens são pré- processadas usando um algoritmo de subtração antecedente rolling ball com uma largura de 60 µm. A máscara de célula total é definida nas células positivas para Hoechst. As células com intensidade de Ho- echst significativamente acima das intensidades antecedentes são li- miarizadas e áreas muito pequenas ou grandes para serem células positivas para Hoechst são excluídas.
[001006] Dentro da máscara de célula total, as células positivas para GFP e RFP são identificadas novamente pelo limiar para células signi- ficativamente acima do antecedente e estendendo as máscaras de Hoechst (núcleos) para toda a área celular para incluir toda a fluores- cência celular de GFP e RFP.
[001007] O número de células positivas para RFP identificadas em cavidades de controle contendo células receptoras é usado para sub- trair do número de células positivas para RFP nas cavidades contendo fusosomas (subtrair para recombinação de Loxp não específica). O número de células positivas para RFP (células receptoras que recebe- ram Cre) é, então, dividido pela soma das células positivas para GFP (células receptoras que não receberam Cre) e células positivas para RFP para quantificar a fração de Cre de fusosoma liberada à popula- ção de células receptoras. O nível é normalizado para a determinada dose de fusosomas aplicada às células receptoras. Para calcular o va- lor de Cre de fusosoma liberado através de uma via endocítica, o nível de liberação de Cre de fusosoma na presença de cloroquina (FusL+CQ) é determinado, bem como o nível de liberação de Cre de fusosoma na ausência de cloroquina (FusL-CQ). Para determinar o valor normalizado de Cre de fusosoma liberado por uma via endocíti- ca, a seguinte equação é usada: (FusL+CQ)/(FusL-CQ).
[001008] Em algumas modalidades, um nível médio de Cre de fuso-
soma liberado por meio de uma via endocítica para um determinado fusosoma estará na faixa de 0,01-0,6, ou pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou mais do que as células receptoras tratadas com cloroquina. Exemplo 92: Liberação de fusosomas por meio de uma via medi- ada por dinamina, uma via de macropinocitose, ou uma via medi- ada por actina
[001009] Este Exemplo descreve a liberação de fusosoma de Cre a uma célula receptora por meio de uma via mediada por dinamina. Um fusosoma compreendendo uma microvesícula pode ser produzido con- forme descrito no exemplo anterior. Os fusosomas são analisados pa- ra liberação de Cre através de uma via mediada por dinamina de acor- do com o exemplo anterior, exceto que um grupo de células receptoras recebendo fusosomas é tratado com um inibidor de dinamina, Dynaso- re (120 µM). Para calcular o valor de Cre de fusosoma liberado por meio de uma via mediada por dinamina, o nível de liberação de Cre de fusosoma na presença de Dynasore (FusL+DS) é determinado, bem como o nível de liberação de Cre de fusosoma na ausência de Dyna- sore (FusL-DS). O valor normalizado de Cre de fusosoma liberado po- de ser calculado conforme descrito no exemplo anterior.
[001010] Este exemplo também descreve a liberação de Cre a uma célula receptora por meio de macropinocitose. Um fusosoma compre- endendo uma microvesícula pode ser produzido conforme descrito no exemplo anterior. Os fusosomas são analisados para liberação de Cre por meio de macropinocitose de acordo com o exemplo anterior, exce- to que um grupo de células receptoras que recebem fusosomas é tra- tado com um inibidor de macropinocitose, 5-(N-etil-N- isopropil)amilorida (EIPA) (25 µM). Para calcular o valor de Cre de fu- sosoma liberado por meio de macropinocitose, o nível de liberação de Cre de fusosoma na presença de EIPA (FusL+EPIA) é determinado,
bem como o nível de liberação de Cre de fusosoma na ausência de EPIA (FusL-EIPA). O valor normalizado de Cre de fusosoma liberado pode ser calculado conforme descrito no exemplo anterior.
[001011] Este exemplo também descreve a liberação de fusosoma de Cre a uma célula receptora por meio de uma via mediada por acti- na. Um fusosoma compreendendo uma microvesícula pode ser produ- zido conforme descrito no exemplo anterior. Os fusosomas são anali- sados para liberação de Cre por meio de macropinocitose de acordo com o exemplo anterior, exceto que um grupo de células receptoras que recebem fusosomas é tratado com um inibidor de polimerização de actina, Latrunculina B (6 µM). Para calcular o valor de Cre de fuso- soma liberado por meio de uma via mediada por actina, o nível de libe- ração de Cre de fusosoma na presença de Latrunculina B (FusL+LatB) é determinado, bem como o nível de liberação de Cre de fusosoma na ausência de Latrunculina B (FusL-LatB). O valor normalizado de Cre de fusosoma liberado pode ser calculado conforme descrito no exem- plo anterior. Exemplo 93: Liberação de organelas
[001012] Este Exemplo descreve a fusão de fusosoma com uma cé- lula in vitro. Em algumas modalidades, a fusão de fusosoma com uma célula in vitro pode resultar na liberação de carga mitocondrial fusoso- mal para a célula receptora.
[001013] Um fusosoma produzido pelos métodos descritos aqui foi testado quanto à sua capacidade de liberar suas mitocôndrias à célula receptora como segue.
[001014] Neste exemplo particular, o fusosoma era uma célula HEK293T que expressa uma proteína fusogênica em sua membrana, bem como a proteína DsRED direcionada à mitocôndria (mito-DsRED) para marcar as mitocôndrias. As células receptoras foram semeadas em uma placa de múltiplas cavidades de cultura de células compatível com o sistema de imageamento a ser usado (neste exemplo, as célu- las foram semeadas em uma placa de imageamento com fundo de vi- dro). As células receptoras expressaram GFP citosólica de forma está- vel.
[001015] Em seguida, 24 horas após a semeadura das células recep- toras, o fusosoma que expressa mito-DsRED e que possui a proteína fusogênica particular foi aplicado às células receptoras em meio DMEM. A dose de fusosomas foi correlacionada ao número de células receptoras semeadas na cavidade. Após a aplicação dos fusosomas, a placa de células foi centrifugada em 400g por 5 minutos para ajudar a iniciar o contato entre os fusosomas e as células receptoras. As célu- las foram, então, incubadas durante 4 horas e a fusão mediada por VSVG foi induzida por um minuto de exposição à solução salina tam- ponada com fosfato de pH 6,0 (ou as células de controle são expostas à solução salina tamponada com fosfato de pH 7,4). Após a indução da fusão, as células foram incubadas por mais 16 horas e a liberação de mitocôndrias foi avaliada por meio de imageamento.
[001016] Neste exemplo, as células foram imageadas em um mi- croscópio confocal Zeiss LSM 710 com uma objetiva de imersão em óleo de 63x enquanto mantidas a 37 °C e CO2 5 %. A GFP foi subme- tida à excitação a laser de 488 nm e a emissão foi registrada por meio de um filtro de passagem de banda de 495-530 nm. DsRED foi subme- tida à excitação de laser de 543 nm e a emissão foi registrada através de um filtro de passagem de banda de 560 a 610 nm. As células foram digitalizadas para identificar positivamente as células positivas para fluorescência de GFP citosólica e fluorescência de mito-DsRED.
[001017] A presença de ambas GFP citosólica e mitocôndrias de mi- to-DsRED foi encontrada na mesma célula, indicando que a célula so- freu fusão mediada por VSVG e, assim, as mitocôndrias foram libera- das a partir do fusosoma para a célula receptora.
Exemplo 94: Liberação in vitro de DNA
[001018] Este Exemplo descreve a liberação de DNA usando fuso- somas para células in vitro. Este exemplo quantifica a capacidade dos fusosomas de liberar o DNA usando um plasmídeo que codifica um gene exógeno, GFP, uma carga terapêutica substituta.
[001019] Uma composição de fusosoma, resultante de vesículas de- rivadas de células ou citobiológicos derivados de células, conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos ante- riores, exceto que o fusosoma é projetado de modo que o fusogênio está na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre. Após a pro- dução do fusosoma, ele é adicionalmente nucleofectado com um plasmídeo tendo uma sequência que codifica para GFP (System Bios- ciences, Inc.).
[001020] Veja, por exemplo, Chen X, et al., Genes Dis. 2015 Mar; 2(1):96-105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001.
[001021] Como um controle negativo, os fusosomas são nucleofec- tados com um plasmídeo tendo uma sequência que codifica para beta- actina.
[001022] Um número suficiente de fusosomas é, então, incubado a 37 °C e CO2 5 % em conjunto com uma linhagem celular de fibroblas- tos NIH/3T3 receptora que tem um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato por um período de 48h em DMEM contendo Soro Bovino Fetal 20 % e 1x de Penicilina/Estreptomicina. Após a incubação de 48 horas, as cé- lulas positivas para tdTomato são, então, isoladas por meio de FACS, usando um citômetro de FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) com excitação a laser de 561 nm e a emissão é coletada em 590+/-20nm. O DNA total é, então, isolado usando uma solução de extração de DNA (epicentro) e PCR é realizada usando iniciadores es- pecíficos para GFP (veja Tabela 222) que amplificam um fragmento de 600 pb. Um fragmento de 600 pb presente em um gel após eletrofore-
se em gel, em seguida, substanciaria o presente da liberação de DNA à célula receptora. Tabela 22. Sequências de Iniciadores de GFP que amplificam um fragmento de 500 pb Iniciador SEQ ID NO: Sequência GFP-F 41 ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC GFP-R 42 GTCCTTTTACCAGACAACCATTAC
[001023] Em algumas modalidades, a liberação de carga de ácido nucleico com fusosomas in vitro é maior em fusosomas com plasmí- deo de GFP em comparação com o controle negativo. A fluorescência de GFP insignificante é detectada no controle negativo. Exemplo 95: Liberação in vivo de DNA
[001024] Este Exemplo descreve a liberação de DNA às células in vivo por meio de fusosomas. A liberação de DNA às células in vivo re- sulta na expressão de proteínas dentro da célula receptora.
[001025] A liberação de DNA de fusosoma in vivo demonstrará a li- beração de DNA e expressão de proteínas em células receptoras den- tro de um organismo (camundongo).
[001026] Os fusosomas que expressam um fusogênio direcionado ao fígado são preparados conforme descrito aqui. Após a produção do fusosoma, ele é adicionalmente nucleofectado com um plasmídeo com uma sequência que codifica para a Cre recombinase.
[001027] Os fusosomas são preparados para liberação in vivo. As suspensões de fusosoma são submetidas à centrifugação. Os peletes dos fusosomas são ressuspensos em solução salina tamponada com fosfato estéril para injeção.
[001028] Os fusosomas são verificados para conter DNA usando um método de detecção de ácido nucleico, por exemplo, PCR.
[001029] Os camundongos receptores abrigam um locus de DNA genômico de loxp-luciferase que é modificado pela proteína CRE feita a partir de DNA liberado pelos fusosomas para desbloquear a expres-
são da luciferase (JAX#005125). O controle positivo para este exemplo são descendentes de camundongos receptores acasalados com uma cepa de camundongo que expressa a mesma proteína exclusivamente no fígado de seu próprio genoma (albumina-CRE JAX#003574). A descendência deste acasalamento abriga um de cada alelo (loxp- luciferase, albumina-CRE). Os controles negativos são realizados por injeção de camundongos receptores com fusosomas que não expres- sam fusogênios ou fusosomas com fusogênios, porém, não contendo DNA de Cre.
[001030] Os fusosomas são liberados em camundongos por adminis- tração intravenosa (IV) na veia da cauda. Os camundongos são colo- cados em um limitador de camundongos disponível comercialmente (Harvard Apparatus). Antes da restrição, os animais são aquecidos colocando sua gaiola em um banho de água circulante. Uma vez den- tro da restrição, os animais podem se aclimatar. Um cateter IV que consiste em uma ponta de agulha de 30G, um comprimento de 3" do tubo PE-10 e uma agulha de 28G é preparado e estimulado com solu- ção salina heparinizada. A cauda é limpa com uma compressa prep. com álcool 70 %. Em seguida, a agulha do cateter é mantida com fór- ceps e introduzida lentamente na veia da cauda lateral até que o san- gue se torne visível no tubo. A solução de fusosoma (fusosomas de ~500K-5M) é aspirada para uma seringa de tuberculina de 1 cc e co- nectada a uma bomba de infusão. A solução de fusosoma é liberada em uma taxa de 20 μL por minuto por 30 segundos a 5 minutos, de- pendendo da dose. Após a conclusão da infusão, o cateter é removido e a pressão é aplicada ao sítio da injeção até a cessação de qualquer sangramento. Os camundongos são devolvidos às suas gaiolas e permitos se recuperar.
[001031] Após a fusão, o DNA será transcrito e transladado na prote- ína CRE que, então, se transloca para o núcleo para realizar a recom-
binação resultando na expressão constitutiva da luciferase. A adminis- tração intraperitoneal de D-luciferina (Perkin Elmer, 150 mg/kg) permi- te a detecção da expressão da luciferase por meio da produção de bio- luminescência. O animal é colocado em uma câmara de imagem bio- luminescente in vivo (Perkin Elmer) que abriga um anestesiante (isoflu- rano) no cone para evitar o movimento do animal. A coleta de fótons é realizada entre 8-20 minutos após a injeção para observar o máximo na bioluminescência devido à depuração farmacocinética da D- luciferina. Uma região específica do fígado é criada no software e o tempo de exposição da coleção definido para que as taxas de conta- gem fiquem acima de 600 (nesta região) para produzir medições de radiância interpretáveis (fótons/seg/cm2/esteradianos). O valor máximo da radiância bioluminescente é registrado como a imagem da distribui- ção da bioluminescência. O tecido do fígado é monitorado especifica- mente para medições de radiação acima do antecedente (animais não tratados) e dos controles negativos. As medições são realizadas 24 horas após a injeção para observar a atividade da luciferase. Os ca- mundongos são, então, sacrificados e os fígados são colhidos.
[001032] O tecido recentemente colhido é submetido à fixação e in- crustação por imersão em paraformaldeído 4 %/tampão de fosfato só- dico 0,1 M pH 7,4 a 4 °C por 1-3 horas. O tecido é, então, submerso em sacarose 15 % estéril/1xPBS (3 horas durante a noite) a 4 °C. O tecido é, então, incrustado em O.C.T. (Baxter No. M7148-4). O tecido é orientado no bloco apropriadamente para o secionamento (seção transversal). O tecido é, então, congelado em nitrogênio líquido usan- do o seguinte método: colocar a terceira base do bloco no nitrogênio líquido, deixar congelar até que todo, exceto o centro de O.C.T. esteja congelado, e permitir o congelamento concluir em gelo seco. Os blo- cos são secionados por criostato em seções de 5-7 mícrons colocadas em lâminas e recongelados para o manchamento.
[001033] A hibridização in situ é realizada (usando métodos padrão) em seções de tecido usando sondas de ácido nucleico marcadas com digoxigenina (para DNA de CRE e detecção de mRNA de luciferase), marcadas por anticorpos fluorescentes antidigoxigenina e observadas por microscopia confocal.
[001034] Em algumas modalidades, os animais de controle positivo (recombinação por meio da reprodução sem injeção de fusosoma) mostrarão intensidade de bioluminescência no fígado em comparação com animais não tratados (sem CRE e sem fusosomas) e controles negativos, enquanto os animais injetados com agente mostrarão bio- luminescência no fígado em comparação com os controles negativos (fusosomas sem fusogênio) e animais não tratados.
[001035] Em modalidades, a detecção de ácido nucleico em seções de tecido em animais injetados com agente revelará a detecção de CRE recombinase e mRNA de luciferase em comparação com contro- les negativos e animais não tratados em células no tecido, enquanto os controles positivos mostrarão níveis de mRNA de luciferase e DNA de CRE recombinase em todo o tecido.
[001036] A evidência de liberação de DNA por fusosomas será de- tectada por detecção baseada em hibridização in situ do DNA e sua colocalização no tecido receptor do animal. A atividade da proteína expressa a partir do DNA será detectada por imagem bioluminescente. Em modalidades, os fusosomas irão liberar o DNA que resultará na produção e atividade de proteínas. Exemplo 96: Liberação in vitro de mRNA
[001037] Este Exemplo descreve a fusão de fusosoma com uma cé- lula in vitro. Em algumas modalidades, a fusão de fusosoma com uma célula in vitro resulta na liberação de um mRNA especificado para a célula receptora.
[001038] Um fusosoma produzido pelos métodos descritos aqui foi testado quanto à sua capacidade de liberar um mRNA especificado à célula receptora como segue. Neste exemplo específico, o fusosoma era um citobiológico (sem núcleo), que foi gerado a partir de uma célu- la de fibroblasto de camundongo 3T3 que expressa Cre e GFP. O cito- biológico foi, então, tratado com proteína fusogênica HVJ-E para pro- duzir o fusosoma.
[001039] As células de macrófago de camundongo receptoras foram semeadas em uma placa de múltiplas cavidades de cultura de células compatível com o sistema de imageamento a ser usado (neste exem- plo, as células são semeadas em uma placa de imageamento com fundo de vidro). As células receptoras expressam estavelmente o cas- sete "LoxP-stop-LoxP-tdTomato" sob o promotor de CMV, que na re- combinação por Cre induz a expressão de tdTomato, indicando a libe- ração da proteína Cre à célula receptora.
[001040] Em seguida, 24 horas após a semeadura das células recep- toras, o fusosoma expressando a proteína Cre recombinase e pos- suindo a proteína fusogênica particular foi aplicado às células recepto- ras em meio DMEM. A dose de fusosomas foi correlacionada ao nú- mero de células receptoras semeadas na cavidade. Após a aplicação dos fusosomas, a placa de células foi centrifugada em 400g por 5 mi- nutos para ajudar a iniciar o contato entre os fusosomas e as células receptoras. As células foram, então, incubadas por 16 horas e a libe- ração de mRNA foi avaliada por meio de imageamento.
[001041] As células foram coradas com 1 µg/mL de Hoechst 33342 em meio DMEM por 10 minutos antes do imageamento. Neste exem- plo, as células foram imageadas em um microscópio confocal Zeiss LSM 710 com uma objetiva de imersão em óleo de 63x enquanto man- tidas a 37 °C e CO2 5 %. Hoechst foi submetido à excitação a laser de 405 nm e a emissão foi registrada através de um filtro de passagem de banda de 430-460 nm. A GFP foi submetida à excitação a laser de 488 nm e a emissão foi registrada por meio de um filtro de passagem de banda de 495-530 nm. O tdTomato foi submetido à excitação a laser de 543 nm e a emissão foi registrada através de um filtro de passagem de banda de 560 a 610 nm.
[001042] Primeiro, as células foram escaneadas para identificar posi- tivamente as células positivas para tdTomato de nucleação única. A presença de uma célula positiva para tdTomato indicava uma célula que sofreu fusão, e o núcleo único indicava que a fusão foi por um do- ador de fusosoma citobiológico. Estas células identificadas foram pri- meiro imageadas e, em seguida, fotobranqueadas usando um laser de 488 nm para extinguir parcialmente a fluorescência de GFP. As células foram, então, imageadas ao longo do tempo para avaliar a recupera- ção da fluorescência de GFP, o que demonstraria a translação da no- va proteína GFP e, portanto, a presença de mRNA de GFP liberado pelo fusosoma doador.
[001043] A análise de Hoechst, GFP e fluorescência de tdTomato nas células de interesse foi realizada usando o software ImageJ (Ras- band, WS, ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 –2007). Primeiro, as imagens foram pré-processadas usando um algoritmo de subtração anteceden- te rolling ball com uma largura de 60 µm. Dentro de uma célula foto- branqueada, a fluorescência de GFP foi limitada para remover a base. Em seguida, a intensidade de fluorescência média de GFP para a cé- lula fotobranqueada foi analisada em tempos diferentes antes e depois do fotobranqueamento.
[001044] Dentro deste Exemplo particular, citobiológicos de fibroblas- tos de camundongo 3T3 expressando Cre e GFP e possuindo o fuso- gênio aplicado HVJ-E (+fusogênio) foram aplicados a células de ma- crófagos de camundongos receptores expressando o cassete "LoxP- stop-LoxP-tdTomato". Imagens e dados representativos são mostrados na FIG. 5. Para este exemplo específico, a intensidade de fluorescên- cia GFP recuperou até 25 % da intensidade original 10 horas após o fotobranqueamento, indicando a liberação de mRNA transladado ati- vamente na célula receptora. Exemplo 97: Liberação in vitro de siRNA
[001045] Este exemplo de descrever RNA interferente curto (siRNA) para a célula in vitro via fusosomas. A liberação de siRNA às células in vitro resulta na supressão da expressão de proteínas dentro da célula receptora. Isto pode ser usado para inibir a atividade de uma proteína cuja expressão é prejudicial à célula, permitindo assim que a célula se comporte normalmente.
[001046] Um fusosoma produzido pelos métodos aqui descritos é testado quanto à sua capacidade de liberar um siRNA especificado à célula receptora como segue. Os fusosomas são preparados conforme descrito aqui. Após a produção do fusosoma, ele é adicionalmente ele- troporado com um siRNA tendo uma sequência que inibe especifica- mente GFP. A sequência do siRNA de fita dupla direcionado contra GFP é 5' GACGUAAACGGCCACAAGUUC 3' (SEQ ID NO: 43) e seu complemento 3' CGCUGCAUUUGCCGGUGUUCA 5' (SEQ ID NO: 44) (observe que há saliências, 2 pares de base no comprimento nas ex- tremidades 3' da sequência de siRNA). Como um controle negativo, fusosomas são eletroporados com um siRNA tendo uma sequência que inibe especificamente a luciferase. A sequência do siRNA de fita dupla direcionado contra a luciferase é 5' CUUACGCUGAGUA- CUUCGATT 3' (SEQ ID NO: 45) e seu complemento 3' TTGAAUG- CGACUCAUGAAGCU 5' (SEQ ID NO: 46) (observe que há saliências, 2 pares de base no comprimento nas extremidades 3' da sequência de siRNA).
[001047] Os fusosomas são, então, aplicados às células receptoras que expressam GFP constitutivamente. As células receptoras são se-
meadas em uma placa de 96 cavidades com fundo claro, preta. Em seguida, 24 horas após a semeadura das células receptoras, os fuso- somas expressos são aplicados às células receptoras em meio DMEM. A dose de fusosomas está correlacionada ao número de célu- las receptoras semeadas na cavidade. Após a aplicação dos fusoso- mas, a placa de células é centrifugada em 400g por 5 minutos para ajudar a iniciar o contato entre os fusosomas e as células receptoras. As células são, então, incubadas por 16 horas e a liberação do agente, siRNA, é avaliada por meio de imageamento.
[001048] As células são imageadas para identificar positivamente as células positivas para GFP no campo ou cavidade. Neste exemplo, as placas de células são imageadas usando um microscópio de fluores- cência automatizado (www.biotek.com/products/imaging-microscopy- automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/). A po- pulação de célula total em uma dada cavidade é determinada man- chando-se primeiro as células com Hoechst 33342 em meio DMEM por 10 minutos. Hoechst 33342 cora os núcleos de células intercalan- do em DNA e, portanto, é usado para identificar células individuais. Após o manchamento, o meio Hoechst é substituído por meio DMEM regular.
[001049] Hoechst é imageado usando LED de 405 nm e cubo de fil- tro de DAPI. GFP é imageado usando o LED de 465 nm e o cubo de filtro de GFP. As imagens dos diferentes grupos de células são adqui- ridas estabelecendo-se primeiro a intensidade do LED e os tempos de integração em uma cavidade não tratada; isto é, células receptoras que não foram tratadas com quaisquer fusosomas.
[001050] As configurações de aquisição são definidas de forma que as intensidades de GFP estejam nos valores máximos de intensidade de pixel, porém, não saturadas. As cavidades de interesse são, então, imageadas usando as configurações estabelecidas.
[001051] A análise de cavidades positivas para GFP é realizada com o software fornecido com o microscópio de fluorescência ou outro sof- tware (Rasband, WS, ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2007). As imagens são pré-processadas usando um algoritmo de subtração an- tecedente rolling ball com uma largura de 60 µm. A máscara de célula total é definida nas células positivas para Hoechst. As células com in- tensidade de Hoechst significativamente acima das intensidades ante- cedentes são limiarizadas e áreas muito pequenas ou grandes para serem células positivas para Hoechst são excluídas.
[001052] Dentro da máscara de célula total, as células positivas para GFP são identificadas novamente pelo limiar para células significati- vamente acima do antecedente e estendendo as máscaras de Hoechst (núcleos) para toda a área celular para incluir toda a fluorescência ce- lular de GFP. A porcentagem de células positivas para GFP fora do total de células é calculada.
[001053] Em modalidades, a porcentagem de células positivas para GFP em cavidades tratadas com fusosomas contendo um siRNA con- tra GFP será de pelo menos 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % menos do que a porcentagem de células positivas para GFP em cavidades tratadas com fusosomas contendo um siRNA contra luciferase. Exemplo 98: Liberação in vivo de mRNA
[001054] Este Exemplo descreve a liberação de RNA mensageiro (mRNA) às células in vivo por meio de fusosomas. Em algumas moda- lidades, a liberação de mRNA às células in vivo resulta na expressão de proteínas dentro da célula receptora. Em algumas modalidades, este método de liberação pode ser usado para suplementar uma prote- ína não presente devido a uma mutação genética, permitindo que a célula se comporte normalmente, ou redirecione a atividade de uma célula para realizar uma função, por exemplo, uma função terapêutica.
[001055] Em algumas modalidades, a liberação de mRNA de fuso- soma in vivo demonstra a liberação de RNA mensageiro e expressão de proteína em células receptoras dentro de um organismo (por exem- plo, um camundongo).
[001056] Em algumas modalidades, os fusosomas que expressam um fusogênio direcionado ao fígado e produzem mRNA que expressa Cre são preparados para liberação in vivo.
[001057] Os fusosomas são preparados conforme descrito aqui. As suspensões de fusosoma são submetidas à centrifugação. Os peletes dos fusosomas são ressuspensos em solução salina tamponada com fosfato estéril para injeção.
[001058] Os fusosomas são verificados para expressar o mRNA usando um método de detecção de ácido nucleico, por exemplo, PCR.
[001059] Os camundongos receptores abrigam um locus de DNA genômico de loxp-luciferase que é modificado pela proteína CRE feita a partir de mRNA liberado pelos fusosomas para desbloquear a ex- pressão da luciferase (JAX # 005125). Os controles positivos para este exemplo são descendentes de camundongos receptores acasalados com uma cepa de camundongo que expressa a mesma proteína ex- clusivamente no fígado de seu próprio genoma (albumina-CRE JAX#003574). A descendência deste acasalamento abriga um de cada alelo (loxp-luciferase, albumina-CRE). Os controles negativos são rea- lizados por injeção de camundongos receptores com fusosomas que não expressam fusogênios ou fusosomas com fusogênios, porém, não expressam mRNA de Cre.
[001060] Os fusosomas são liberadas em camundongos por adminis- tração intravenosa (IV) na veia da cauda. Os camundongos são colo- cados em um limitador de camundongos disponível comercialmente (Harvard Apparatus). Antes da restrição, os animais são aquecidos colocando sua gaiola em um banho de água circulante. Logo que den- tro do limitador, os animais podem se aclimatar. Um cateter IV que consiste em uma ponta de agulha de 30G, um comprimento de 3" do tubo PE-10 e uma agulha de 28G é preparado e lavado com solução salina heparinizada. A cauda é limpa com uma compressa prep. com álcool 70 %. Em seguida, a agulha do cateter é mantida com fórceps e introduzida lentamente na veia da cauda lateral até que o sangue se torne visível no tubo. A solução de fusosoma (fusosomas de ~500K- 5M) é aspirada para uma seringa de tuberculina de 1 cc e conectada a uma bomba de infusão. A solução de fusosoma é administrada em uma taxa de 20 μL por minuto por 30 segundos a 5 minutos, depen- dendo da dose. Após a conclusão da infusão, o cateter é removido e a pressão é aplicada no sítio da injeção até a cessação de qualquer sangramento. Os camundongos são devolvidos às suas gaiolas e permitidos se recuperar.
[001061] Após a fusão, o mRNA é transladado no citoplasma do re- ceptor em proteína CRE que, então, se transloca para o núcleo para realizar a recombinação resultando na expressão constitutiva da lucife- rase. A administração intraperitoneal de D-luciferina (Perkin Elmer, 150 mg/kg) permite a detecção da expressão da luciferase por meio da produção de bioluminescência. O animal é colocado em uma câmara de imagem bioluminescente in vivo (Perkin Elmer) que abriga um anestesiante (isoflurano) no cone para evitar o movimento do animal. A coleta de fótons é realizada entre 8-20 minutos após a injeção para observar o máximo na bioluminescência devido à depuração farmaco- cinética da D-luciferina. Uma região específica do fígado é criada no software e o tempo de exposição da coleção definido para que as ta- xas de contagem fiquem acima de 600 (nesta região) para produzir medições de radiância interpretáveis (fótons/seg/cm2/esteradianos). O valor máximo da radiância bioluminescente é registrado como a ima-
gem da distribuição da bioluminescência. O tecido do fígado é monito- rado especificamente para medições de radiação acima do anteceden- te (animais não tratados) e dos controles negativos. As medições são realizadas 24 horas após a injeção para observar a atividade da lucife- rase. Os camundongos são, então, sacrificados e os fígados são co- lhidos.
[001062] O tecido recentemente colhido é submetido à fixação e in- crustação por meio de imersão em paraformaldeído 4 %/tampão de fosfato sódico 0,1 M pH 7,4 em 4 °C por 1-3 horas. O tecido é, então, submerso em sacarose 15 % estéril/1xPBS (3 horas a durante a noite) a 4 °C. O tecido é, então, incrustado em O.C.T. (Baxter No. M7148-4). O tecido é orientado no bloco apropriadamente para o secionamento (seção transversal). O tecido é, então, congelado em nitrogênio líquido usando o seguinte método: colocar a terceira base do bloco no nitro- gênio líquido, deixe congelar até que todo, exceto o centro de O.C.T. esteja congelado, e permitir o congelamento concluir em gelo seco. Os blocos são seccionados por criostato em seções de 5-7 mícrons colo- cadas em lâminas e recongelados para o manchamento.
[001063] A hibridização in situ é realizada (usando métodos padrão) em seções de tecido usando sondas de RNA marcadas com digoxige- nina (para mRNA de CRE e detecção de mRNA de luciferase), marca- das por anticorpos fluorescentes anti-digoxigenina e observadas por microscopia confocal.
[001064] Em algumas modalidades, os animais de controle positivo (por exemplo, recombinação por meio de reprodução sem injeção de fusosoma), mostrarão intensidade de bioluminescência no fígado em comparação com animais não tratados (por exemplo, sem CRE ou fu- sosomas) e controles negativos. Em algumas modalidades, os animais injetados com fusosoma mostrarão bioluminescência no fígado em comparação com controles negativos (por exemplo, fusosomas sem fusogênio) e animais não tratados.
[001065] Em algumas modalidades, a detecção de mRNA em seções de tecido em animais administrados com fusosomas irá revelar a de- tecção de CRE recombinase e mRNA de luciferase em comparação com controles negativos e animais não tratados em células no tecido. Em algumas modalidades, os controles positivos mostrarão níveis igualmente de mRNA de luciferase e mRNA de CRE recombinase em todo o tecido.
[001066] Em algumas modalidades, a evidência de liberação de mRNA por fusosomas será detectada por detecção baseada em hibri- dização in situ do mRNA e sua colocalização no tecido receptor do animal. Em algumas modalidades, a atividade da proteína expressa a partir do mRNA liberado pelo fusosoma é detectada por imagem bio- luminescente. Em algumas modalidades, os fusosomas liberam mRNA que resultará na produção e atividade de proteínas. Exemplo 99: Liberação in vitro de proteína
[001067] Este exemplo demonstra a fusão de fusosoma com uma célula in vitro. Neste exemplo, a fusão de fusosoma com uma célula in vitro resulta na liberação da proteína Cre para a célula receptora.
[001068] Neste exemplo, os fusosomas foram gerados a partir de uma célula de fibroblasto de camundongo 3T3 possuindo a proteína HVJ-E do vírus Sendai (Tanaka et al., 2015, Gene Therapy, 22(October 2014), 1-8. doi.org/10.1038/gt.2014.12). Além disso, os fusosomas expressaram a Cre recombinase. A célula-alvo era uma célula HEK293T primária que expressou estavelmente o cassete "LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP" sob um promotor de CMV, que na recom- binação por Cre muda de expressão de GFP para RFP, indicando fu- são e Cre, como uma liberação de marcador.
[001069] Os fusosomas produzidos pelos métodos aqui descritos fo- ram analisados quanto à capacidade de liberar a proteína Cre às célu-
las receptoras como segue. As células receptoras foram semeadas em uma placa de cultura de células de múltiplas cavidades compatível com o sistema de imageamento a ser usado (neste exemplo, as célu- las foram semeadas em uma placa de 96 cavidades com fundo claro, preta). Em seguida, 24 horas após a semeadura das células recepto- ras, o fusosoma expressando a proteína Cre recombinase e possuindo a proteína fusogênica particular foi aplicado às células receptoras em meio DMEM. A dose de fusosomas foi correlacionada ao número de células receptoras semeadas na cavidade. Após a aplicação dos fuso- somas, a placa de células foi centrifugada em 400g por 5 minutos para ajudar a iniciar o contato entre os fusosomas e as células receptoras. As células foram, então, incubadas por 16 horas e a liberação da pro- teína foi avaliada por meio de imageamento.
[001070] As células foram imageadas para identificar positivamente células positivas para RFP versus células positivas para GFP no cam- po ou cavidade. Neste exemplo, as placas de células foram imageadas usando um microscópio automatizado. A população total de células em uma dada cavidade foi determinada manchando-se primeiro as células com 1 µg/mL de Hoechst 33342 em meio DMEM por 10 minutos. Hoe- chst 33342 cora os núcleos de células intercalando em DNA e, portan- to, é usado para identificar as células individuais. Após o manchamen- to, o meio Hoechst foi substituído por meio DMEM regular. Hoechst foi imageado usando LED de 405 nm e cubo de filtro de DAPI. GFP foi imageada usando o LED de 465 nm e cubo de filtro de GFP, enquanto RFP foi imageada usando LED de 523 nm e cubo de filtro de RFP. Imagens dos diferentes grupos de células foram adquiridas estabele- cendo primeiro a intensidade do LED e os tempos de integração em uma cavidade de controle positivo; isto é, células tratadas com adeno- vírus que codificam para Cre recombinase. As configurações de aqui- sição foram definidas para que as intensidades de RFP e GFP estejam nos valores de intensidade máxima de pixel, porém, não saturadas. As cavidades de interesse foram, então, imageadas usando as configura- ções estabelecidas.
[001071] A análise de Hoechst, GFP e cavidades positivas para RFP foi realizada no software Gen5 fornecido com o LionHeart FX ou pelo software ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997– 2007). Primeiro, as imagens foram pré-processadas usando um algo- ritmo de subtração antecedente rolling ball com uma largura de 60 µm. Em seguida, a máscara de célula total foi colocada nas células positi- vas para Hoechst. As células com intensidade de Hoechst significati- vamente acima das intensidades antecedentes foram limiarizadas e as áreas muito pequenas ou grandes para serem células positivas para Hoechst foram excluídas. Dentro da máscara de célula total, as células positivas para GFP e RFP foram identificadas novamente pelo limiar para células significativamente acima do antecedente e estendendo as máscaras de Hoechst (núcleos) para toda a área celular para incluir toda a fluorescência celular de GFP e RFP.
[001072] O número de células positivas para RFP identificadas em cavidades de controle contendo apenas células receptoras foi usado para subtrair do número de células positivas para RFP nas cavidades contendo fusosoma (subtrair para recombinação de Loxp não específi- ca). O número de células positivas para RFP (células receptoras que receberam o agente) foi, então, dividido pela soma das células positi- vas para GFP (células receptoras que não receberam o agente) e cé- lulas positivas para RFP para quantificar a fração de liberação do agente de fusosoma dentro da população de células receptoras.
[001073] Dentro deste exemplo particular, células de fibroblastos de camundongo 3T3 expressando Cre e possuindo o fusogênio aplicado HVJ-E (+fusogênio) ou não (-fusogênio) foram aplicadas a células
293T receptoras expressando o cassete "LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP". A liberação da proteína Cre é avaliada pela indução da expressão de RFP nas células receptoras. O gráfico na Figura 6 mostra a quantifica- ção das células positivas para RFP (barra mais à direita de cada par) do total de células coradas positivas para Hoechst (mais à esquerda de cada par). Para este Exemplo particular, a fração de liberação de fusosoma às células receptoras é de 0,44 para células Cre 3T3 pos- suindo fusogênio HVJ-E. Exemplo 100: Liberação in vivo de proteína
[001074] Este Exemplo descreve a liberação de agentes terapêuticos ao olho por fusosomas.
[001075] Os fusosomas são derivados de células-tronco hematopoé- ticas e células progenitoras usando qualquer um dos métodos descri- tos nos Exemplos anteriores e são carregadas com uma proteína que é deficiente em um camundongo nocaute.
[001076] Os fusosomas são injetados subretinalmente no olho direito de um camundongo que é deficiente para a proteína e o controle do veículo é injetado no olho esquerdo dos camundongos. Um subconjun- to dos camundongos é sacrificado quando atingem 2 meses de idade.
[001077] A histologia e manchamento de H&E do tecido retinal colhi- do são conduzidos para contar o número de células resgatadas em cada retina dos camundongos (descrito em Sanges et al., The Journal of Clinical Investigation, 126(8):3104-3116, 2016).
[001078] O nível da proteína injetada é medido em retinas colhidas de camundongos sacrificados aos 2 meses de idade por meio de um Western blot com um anticorpo específico para a proteína PDE6B.
[001079] Em algumas modalidades, os olhos esquerdos de camun- dongos, aos quais são administrados fusosomas, terão um número aumentado de núcleos presentes no nível nuclear externo da retina em comparação com os olhos direitos de camundongos, que são tratados com veículo. O aumento da proteína é sugestivo de complementação da proteína PBE6B mutada. Exemplo 101: Liberação para editar o DNA receptor
[001080] Este Exemplo descreve fusosomas para liberação de ma- quinário de edição do genoma CRISPR-Cas9 a uma célula in vitro. Em algumas modalidades, a liberação de maquinário de edição do geno- ma CRISPR-Cas9 a uma célula in vitro por meio de um fusosoma re- sulta em uma perda de função de uma proteína específica em uma célula receptora. A maquinaria de edição de genoma referida, neste exemplo, é a proteína Cas9 de S. pyogenes complexada com um RNA guia (gRNA) específico para GFP.
[001081] Em algumas modalidades, os fusosomas são um chassi para a liberação de agentes terapêuticos. Em algumas modalidades, agentes terapêuticos, como maquinaria de edição de genoma que po- dem ser liberadas às células com alta especificidade e eficiência, po- dem ser usados para inativar genes e, portanto, produtos gênicos sub- sequentes (por exemplo, proteínas) que quando expressos em níveis elevados ou na célula errada o tipo se torna patológico.
[001082] Uma composição de fusosoma como produzida por qual- quer um dos métodos descritos nos Exemplos anteriores, exceto o fu- sosoma é modificado de modo que o fusosoma também inclua a prote- ína Cas9 de S. pyogenes complexada com uma sequência de RNA guia (gRNA) que é específica para a sequência de EGFP de A. Victo- ria. Isto é conseguido por conucleofectação de um vetor PiggyBac que tem a estrutura de leitura aberta do gene de resistência à Neomicina que é uma fusão na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cas9 de S. pyogenes, separado por uma sequência de clivagem P2A. O vetor PiggyBac conucleofectado adicional também inclui a sequên- cia de gRNA (GAAGTTCGAGGGCGACACCC (SEQ ID NO: 47)) con- duzida pelo promotor U6. Como um controle negativo, um fusosoma é projetado de modo que o fusosoma inclua a proteína Cas9 de S. pyo- genes complexada com uma sequência de gRNA misturada (GCAC- TACCAGAGCTAACTCA (SEQ ID NO: 48)) que não é específica para qualquer alvo no genoma do camundongo.
[001083] Um número suficiente de fusosomas é incubado a 37 °C e CO2 5 % em conjunto com células NIH/3T3 GFP+ por um período de 48h em DMEM contendo Soro Bovino Fetal 20 % e 1x de Penicili- na/Estreptomicina. Após a incubação de 48 horas, o DNA genômico é preparado e usado como um padrão com iniciadores específicos para a região dentro de 500 bp do sítio de clivagem de gRNA previsto no gene de GFP (veja Tabela 23). Tabela 23. Sequências de iniciadores de GFP que amplificam um fragmento de 500 pb para análise de TIDE Iniciador SEQ ID NO: Sequência GFP-F 41 ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC GFP-R 42 GTCCTTTTACCAGACAACCATTAC
[001084] O amplicon de PCR é, então, purificado, sequenciado por sequenciamento capilar e, em seguida, carregado para o Tide Calcula- tor, uma ferramenta da web que avalia rapidamente a edição do ge- noma por CRISPR-Cas9 de um locus alvo determinado por um RNA guia. Com base nos dados de rastreamento de sequência quantitativa de duas reações de sequenciamento capilar padrão, o software quanti- fica a eficácia da edição. Uma indel (inserção ou deleção) no sítio de clivagem de gRNA previsto com o locus de GFP resulta na perda de expressão de GFP nas células e é quantificada por meio de FACS usando uma análise de FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) com excitação e emissão a laser de argônio de 488nm coletadas em 530+/-30nm. O software FACS é usado para aquisição e análise. Os canais de dispersão de luz são definidos em ganhos lineares, e os ca- nais de fluorescência em uma escala logarítmica, com um mínimo de
10.000 células analisadas em cada condição. A indel e a perda subse-
quente da função de GFP são calculadas com base na intensidade do sinal de GFP em cada amostra.
[001085] Em algumas modalidades, um indel (inserção ou deleção) no sítio de clivagem de gRNA previsto com o locus de GFP e perda de fluorescência GFP na célula, em comparação com o controle negativo, indicará a capacidade de um fusosoma de editar o DNA e resultar em uma perda da função da proteína in vitro. Em algumas modalidades, os fusosomas com a sequência de gRNA misturada não demonstrarão indels ou perda subsequente da função da proteína. Exemplo 102: Avaliação da formação de teratoma após adminis- tração de fusosoma
[001086] Este Exemplo descreve a ausência de formação de terato- ma com um fusosoma. Em algumas modalidades, um fusosoma não resultará na formação de teratoma quando administrado a um indiví- duo.
[001087] Os fusosomas são produzidos por qualquer um dos méto- dos descritos em um Exemplo anterior. Fusosomas, células tumorais (controle positivo) ou veículo (controle negativo) são injetados por via subcutânea em PBS no flanco esquerdo dos camundongos (12-20 semanas de idade). O teratoma, por exemplo, tumor, o crescimento é analisado 2-3 vezes por semana por determinação do volume do tu- mor por medições do calibrador durante oito semanas após fusosoma, célula tumoral ou injeção de veículo.
[001088] Em algumas modalidades, os camundongos administrados com fusosomas ou veículo não terão uma formação tumoral mensurá- vel, por exemplo, teratoma, por meio de medições do calibrador. Em algumas modalidades, os animais de controle positivo tratados com células tumorais irão demonstrar um tumor apreciável, por exemplo, teratoma, tamanho medido por calibradores ao longo das oito sema- nas de observação.
Exemplo 103: Fusosomas liberam proteína ativa para células re- ceptoras de um indivíduo in vivo
[001089] Este Exemplo demonstra que os fusosomas podem liberar uma proteína a um indivíduo in vivo. Isto é exemplificado pela libera- ção da proteína de edição nuclear Cre. Uma vez dentro de uma célula, Cre se transloca para o núcleo, onde se recombina e extirpa o DNA entre dois sítios LoxP. A recombinação mediada por Cre pode ser me- dida microscopicamente quando o DNA entre os dois sítios de LoxP é um códon de interrupção e está a montante de uma proteína fluores- cente distal, como a proteína fluorescente vermelha tdTomato.
[001090] Os fusosomas que contêm CRE e o fusogênio VSV-G, ad- quiridos de Takara (Cre Recombinase Gesicles, Takara product 631449), foram injetados em camundongos B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze /J (cepa 007909 de Jackson Laboratories). Os animais foram injetados nos sítios anatômicos, volumes de injeção e sítios de injeção conforme descrito na Tabela 24. Os camundongos que não têm tdTomato (FVB.129S6(B6)-GT(ROSA)26Sortm1(Luc)Kael/J, cepa 005125 de Jackson Laboratories) e foram injetados com fusosomas e camundongos B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14 (CAG-tdTomato)Hze /J que não fo- ram injetados com fusosomas foram usados como controles negativos. Tabela 24: Parâmetros de injeção Sítio Anatômico Volume de Injeção Sítio(s) de Injeção Cérebro 10 μL eixo posterior anterior: -2 Eixo lateral/medial: 1,8 ventral: 1.5 lateral: direiro Olho 1 μL Intravítreo Fígado 25 μL centro do lobo frontal Baço 10 μL aproximadamente no centro, tanto no sentido do compri- mento quanto da largura
Sítio Anatômico Volume de Injeção Sítio(s) de Injeção Rim 20 μL centro do rim esquerdo Revestimento do 10 μL alça do intestino delgado mais intestino delgado próxima da parede peritoneal foi isolada fora do peritônio e injetada no revestimento. Coração 5 μL perto do ápice White Adipose 25 μL esquerda, topo e central (Coxim gorduroro epididimal) Adiposo marrom 25 μL lobo esquerdo, o mais central (intraescapular) possível Pulmão 10 μL lobo inferior do pulmão direito Testículo 10 μL testículo esquerdo, o mais central possível Ovário 1 μL ovário esquerdo, o mais cen- tral possível
[001091] Dois dias após as injeções, os animais foram sacrificados e as amostras foram coletadas. As amostras foram fixadas por 8 horas em PFA 2 %, fixadas durante a noite em sacarose 30 % e enviadas para incrustação imediata em OCT e corte em lâminas. As lâminas fo- ram coradas para núcleos com DAPI. A fluorescência de DAPI e tdTomato foi imageada microscopicamente.
[001092] Todos os sítios anatômicos listados na Tabela 24 demons- traram fluorescência de tdTomato (Figura 9). Além disso, a liberação ao tecido muscular foi confirmada usando microscopia de fluorescên- cia para tdTomato (Figura 11). Os camundongos de controle negativo não tinham tecidos com fluorescência de tdTomato. Este resultado demonstra que os fusosomas são capazes de ativar a fluorescência de tdTomato nas células de um camundongo em vários sítios anatômicos, e que isso não ocorre se os camundongos não forem tratados com fu- sosomas ou se os camundongos não tiverem tdTomato em seu geno- ma. Assim, os fusosomas liberam a Cre recombinase ativa ao núcleo das células de camundongo in vivo.
[001093] Também foi demonstrado que diferentes rotinas de admi- nistração podem liberar fusosomas ao tecido in vivo. Os fusosomas que contêm CRE e o fusogênio VSV-G, adquirido da Takara (Cre Re- combinase Gesicles, Takara product 631449), foram injetados em FVB.129S6(B6)-GT(ROSA)26Sortm1(Luc)Kael/J (cepa 005125 de Jackson Laboratories) intramuscularmente (em 50 μL para o músculo anterior tibial direito), intraperitonealmente (em 50 μL para a cavidade perito- neal) e subcutânea (em 50 μL sob a pele dorsal).
[001094] As pernas, lado ventral e pele dorsal foram preparados para injeção intramuscular, intraperitoneal e subcutânea, respectivamente, depilando a área usando um removedor de pelos químicos por 45 se- gundos, seguido por 3 enxágues com água.
[001095] No dia 3 após a injeção, um sistema de imageamento in vivo (Perkin Elmer) foi usado para obter imagens de animais inteiros de bioluminescência. Cinco minutos antes da imagem, os camundon- gos receberam uma injeção intraperitoneal de substrato biolumines- cente (Perkin Elmer) em uma dose de 150 mg/kg, a fim de visualizar a luciferase. O sistema de imageamento foi calibrado para compensar todas as configurações do dispositivo.
[001096] A administração por todas as três rotinas resultou em lumi- nescência (Figura 10) indicando liberação bem-sucedida de Cre re- combinase ativa para células de camundongo in vivo.
[001097] Em conclusão, os fusosomas são capazes de liberar prote- ína ativa às células de um indivíduo in vivo. Exemplo 104: Carregamento mediado por sonicação de ácido nu- cleico em fusosomas
[001098] Este Exemplo descreve o carregamento de cargas úteis de ácido nucleico em um fusosoma por meio de sonicação. Os métodos de sonicação são descritos, por exemplo, em Lamichhane, TN, et al.,
Oncogene Knockdown via Active Loading of Small RNAs into Extra- cellular Vesicles by Sonication. Cell Mol Bioeng, (2016), cujos conteú- dos inteiros estão aqui incorporados por referência.
[001099] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos em um Exemplo anterior. Aproximadamente 106 fusoso- mas são misturados com 5-20 µg de ácido nucleico e incubados à temperatura ambiente por 30 minutos. A mistura de fusosomo/ácido nucleico é, então, sonicada por 30 segundos à temperatura ambiente usando um sonicador de banho de água (modelo Brason #1510R- DTH) operado em 40 kHz. A mistura é, então, colocada em gelo por um minuto seguido por uma segunda rodada de sonicação em 40 kHz por 30 segundos. A mistura é, então, centrifugada em 16.000g por 5 minutos a 4ºC para precipitar os fusosomas contendo ácido nucleico. O sobrenadante contendo ácido nucleico não incorporado é removido e o pélete é ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato. Após o carregamento do DNA, os fusosomas são mantidos no gelo antes do uso. Exemplo 105: Carregamento mediado por sonicação de proteína em fusosomas
[001100] Este Exemplo descreve o carregamento de cargas úteis de proteína em um fusosoma por meio de sonicação. Os métodos de so- nicação são divulgados, por exemplo, em Lamichhane, TN, et al., On- cogene Knockdown via Active Loading of Small RNAs into Extracellular Vesicles by Sonication. Cell Mol Bioeng, (2016), cujos conteúdos intei- ros estão aqui incorporados por referência..
[001101] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos em um Exemplo anterior. Aproximadamente 106 fusoso- mas são misturados com 5-20 µg de proteína e incubados à tempera- tura ambiente por 30 minutos. A mistura de fusosoma/proteína é, en- tão, sonicada por 30 segundos à temperatura ambiente usando um sonicador de banho de água (Brason modelo #1510R-DTH) operado em 40 kHz. A mistura é, então, colocada em gelo por um minuto se- guido por uma segunda rodada de sonicação em 40 kHz por 30 se- gundos. A mistura é, então, centrifugada em 16.000g por 5 minutos a 4 °C para precipitar os fusosomas contendo proteína. O sobrenadante contendo proteína não incorporada é removido e o pélete é ressus- penso em solução salina tamponada com fosfato. Após o carregamen- to da proteína, os fusosomas são mantidos no gelo antes do uso. Exemplo 106: Carregamento mediado por transportador hidrofó- bico de ácido nucleico em fusosomas
[001102] Este Exemplo descreve o carregamento de cargas úteis de ácido nucleico em um fusosoma por meio de transportadores hidrofó- bicos. Métodos exemplares de carregamento hidrofóbico são descri- tos, por exemplo, em Didiot et al., Exosome-mediated Delivery of Hydrophobically Modified siRNA for Huntingtin mRNA Silencing, Mole- cular Therapy 24(10): 1836–1847, (2016), cujos conteúdos inteiros es- tão aqui incorporados por referência.
[001103] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos em um Exemplo anterior. A extremidade 3' de uma mo- lécula de RNA é conjugada a um conjugado hidrofóbico bioativo (trieti- leno glicol-colesterol). Aproximadamente 106 fusosomas são mistura- dos em 1 mL com 10 μmol/l de conjugado de siRNA em PBS por incu- bação a 37°C por 90 minutos com agitação em 500 rpm. O transporta- dor hidrofóbico media a associação do RNA com a membrana do fu- sosoma. Em algumas modalidades, algumas moléculas de RNA são incorporadas ao lúmen do fusosoma e algumas estão presentes na superfície do fusosoma. Os fusosomas descarregados são separados dos fusosomas carregados com RNA por ultracentrifugação por 1 hora em 100.000g, 4°C em uma ultracentrífuga de mesa usando um rotor TLA-110. Os fusosomas descarregados permanecem no sobrenadante e os fusosomas carregados de RNA formam um pélete. Os fusosomas carregados com RNA são ressuspensos em 1 mL de PBS e mantidos em gelo antes do uso. Exemplo 107: Processamento de fusosomas
[001104] Este exemplo descreve o processamento de fusosomas. Os fusosomas produzidos por meio de qualquer um dos métodos descri- tos nos Exemplos anteriores podem ser posteriormente processados.
[001105] Em algumas modalidades, os fusosomas são primeiro ho- mogeneizados, por exemplo, por sonicação. Por exemplo, o protocolo de sonicação inclui uma sonicação de 5 segundos usando um sonica- dor de MSE com microssonda em uma configuração de amplitude de 8 (Instrumentation Associates, N.Y.). Em algumas modalidades, este curto período de sonicação é suficiente para fazer com que a mem- brana plasmática dos fusosomas se quebre em fusosomas de tama- nho homogêneo. Nessas condições, as membranas das organelas não são rompidas e são removidas por centrifugação (3.000 rpm, 15 min 4 °C). Os fusosomas são, então, purificados por centrifugação diferenci- al, conforme descrito no Exemplo 16.
[001106] A extrusão de fusosomas através de uma membrana de policarbonato disponível comercialmente (por exemplo, de Sterlitech, Washington) ou uma membrana de cerâmica assimétrica (por exem- plo, Membralox), comercialmente disponível de Pall Execia, France, é um método eficaz para reduzir os tamanhos do fusosoma a uma distri- buição de tamanho relativamente bem definido. Normalmente, a sus- pensão é submetida a ciclos através da membrana uma ou mais vezes até que a distribuição de tamanho de fusosoma desejada seja alcan- çada. Os fusosomas podem ser extrusados através de membranas de poros sucessivamente menores (por exemplo, tamanho de poro de 400 nm, 100 nm e/ou 50 nm) para atingir uma redução gradual no ta- manho e distribuição uniforme.
[001107] Em algumas modalidades, em qualquer etapa da produção de fusosoma, embora normalmente antes das etapas de homogenei- zação, sonicação e/ou extrusão, um agente farmacêutico (tal como um terapêutico) pode ser adicionado à mistura de reação de modo que o fusosoma resultante encapsule o agente farmacêutico. Exemplo 108: Medição de RNA total em um fusosoma e célula fon- te
[001108] Este Exemplo descreve um método para quantificar a quan- tidade de RNA em um fusosoma em relação a uma célula fonte. Em algumas modalidades, um fusosoma terá níveis de RNA semelhantes aos da célula fonte. Neste ensaio, os níveis de RNA são determinados medindo o RNA total.
[001109] Os fusosomas são preparados por qualquer um dos méto- dos descritos nos Exemplos anteriores. As preparações da mesma massa medida pela proteína de fusosomas e células fonte são usadas para isolar o RNA total (por exemplo, usando um kit como o Qiagen RNeasy catálogo #74104), seguido pela determinação da concentra- ção de RNA usando métodos espectroscópicos padrão para avaliar a absorvência de luz por RNA (por exemplo, com Thermo Scientific Na- noDrop).
[001110] Em algumas modalidades, a concentração de RNA em fu- sosomas será 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % daquela das células fonte por massa de proteína. Exemplo 109: Fusão de Fusosoma para célula T In Vitro a. Carga Útil de DNA
[001111] Este Exemplo descreve a liberação de DNA usando fuso- somas para células T CD3+ in vitro. Este exemplo quantifica a capaci- dade dos fusosomas de liberar DNA usando um plasmídeo que codifi- ca um gene exógeno, um receptor de antígeno quimérico direcionado contra CD19, que é uma carga terapêutica.
[001112] Uma composição de fusosoma, resultante de vesículas de- rivadas de células ou citobiológicos derivados de células, conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos ante- riores, exceto que o fusosoma é modificado de modo que o fusogênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre, porém, separado por uma sequência de peptídeo autoclivável P2A. Após a produção do fusosoma, ele é adicionalmente nucleofectado com um plasmídeo tendo uma sequência que codifica o CAR.
[001113] Veja, por exemplo, Chen X, et al., Genes Dis. 2015 Mar; 2(1):96-105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001.
[001114] Como controle negativo, os fusosomas são nucleofectados com um plasmídeo que codifica para GFP.
[001115] Um número suficiente de fusosomas é, então, incubado a 37 °C e CO2 5 % em conjunto com células T CD3+ receptoras que têm um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato por um período de 48h em meio de células T compreendendo meio X-VIVO 15 (Lonza, Basel, CH, Switzerland) suplementado com Soro Bovino Fetal 5 % (FBS) (Gibco, LAX, CA, USA), 100 U mL - 1 penicilina, 100 μg mL – 1 estreptomicina, 1,25 μg mL - 1 anfotericina B, L-glutamina 2 mM (Gibco) e 100 U mL - 1 hIL-2 (PerproTech, Rocky Hill, CT, USA). A fusão de fusosoma com as células T CD3+ que têm um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato re- sulta na expressão de tdTomato devido à excisão da Cre recombinase do DNA do códon de interrupção que bloqueia a expressão de tdTo- mato. Após a incubação de 48 horas, as células positivas para tdTo- mato são, então, isoladas por meio de FACS, usando um citômetro de FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) com excitação a laser de 561 nm e a emissão é coletada em 590+/-20nm. O DNA total é, en- tão, isolado usando uma solução de extração de DNA (Epicentro). A PCR em tempo real quantitativa é realizada usando um Sistema de PCR em Tempo real QuantStudio3 (ThermoFisher Scientific) com
TaqMan® Fast Advanced Master Mix (ThermoFisher Scientific), 100 ng de padrão de DNA, um iniciador e conjunto de sondas que são especí- ficos para as regiões variáveis do CAR anti-CD19 (projetado usando o iniciador online Taqman e o programa de projeto de sonda). A curva padrão cA é preparada para quantificação absoluta de cópias de DNA do transgene de CAR anti-CD19 fazendo diluições em série do plas- mídeo que codifica o CAR. Um conjunto de iniciador e sonda específi- co para beta-lactamase (gene AMPr) foi usado para normalizar a quan- tidade de DNA. O valor Ct é usado para comparar a quantidade de DNA de CAR nas células T CD3+ tratadas com fusosomas com plas- mídeo de CAR ou com controle negativo.
[001116] Em algumas modalidades, a liberação de carga de DNA com fusosomas in vitro é maior em fusosomas com plasmídeo de CAR em comparação com o controle negativo. b. Carga Útil de mRNA
[001117] Este Exemplo descreve a liberação de mRNA usando fuso- somas para células T CD3+ in vitro. Este exemplo quantifica a capaci- dade de fusosomas para liberar mRNA que codifica um gene exógeno, um receptor de antígeno quimérico direcionado contra CD19, que é uma carga terapêutica.
[001118] Uma composição de fusosoma, resultante de vesículas de- rivadas de células ou citobiológicos derivados de células, conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos ante- riores, exceto que o fusosoma é modificado de modo que o fusogênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre, porém, separado por uma sequência de peptídeo autoclivável P2A. Após a produção do fusosomo, ele é adicionalmente nucleofectado com um mRNA tendo uma sequência que codifica para o CAR. Veja, por exemplo, Chen X, et al., Genes Dis. 2015 Mar; 2(1):96-
105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001.
[001119] Como um controle negativo, fusosomas são nucleofectados com um mRNA que codifica para GFP.
[001120] Um número suficiente de fusosomas é, então, incubado a 37 °C e CO2 5 % em conjunto com células T CD3+ receptoras que têm um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato por um período de 48h em meio de células T compreendendo meio X-VIVO 15 (Lonza, Basel, CH, Switzerland) suplementado com Soro Bovino Fetal 5 % (FBS) (Gibco, LAX, CA, USA), 100 U mL− 1 penicilina, 100 μg mL - 1 estreptomicina, 1,25 μg mL - 1 anfotericina B, L-glutamina 2 mM (Gibco) e 100 U mL - 1 hIL-2 (PerproTech, Rocky Hill, CT, USA). A fusão de fusosoma com as células T CD3+ que têm um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato re- sulta na expressão de tdTomato devido à excisão de Cre recombinase do DNA do códon de interrupção que bloqueia a expressão de tdTo- mato. Após a incubação de 48 horas, as células positivas para tdTo- mato são, então, isoladas por meio de FACS, usando um citômetro de FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) com excitação a laser de 561 nm e a emissão é coletada a 590+/-20nm.
[001121] O RNA total é isolado (por exemplo, usando um kit como o Qiagen RNeasy catálogo #74104), seguido pela determinação da con- centração de RNA usando métodos espectroscópicos padrão para avaliar a absorvência de luz por RNA (por exemplo, com Thermo Sci- entific NanoDrop). A transcrição reversa é realizada usando a super- mistura Superscript III First-Strand Synthesis para RT-PCR (Thermo Fisher Scientific), e o RNA (100 ng) é reversamente transcrito em cDNA. A PCR em Tempo Real quantitativa é realizada usando um sis- tema de PCR em Tempo Real QuantStudio3 (ThermoFisher Scientific) com TaqMan® Fast Advanced Master Mix (ThermoFisher Scientific), 100 ng de padrão de cDNA, um iniciador e conjunto de sondas que são específicos para as regiões variáveis do CAR anti-CD19 (projeta- do usando o iniciador online Taqman e o programa de projeto de son-
da) e conjunto de sonda de iniciador designado para amplificar a β- actina como um controle de carregamento endógeno. O valor Ct é usado para comparar a quantidade de cDNA do CAR na reação qRT- PCR entre células T CD3+ tratadas com fusosomas contendo o mRNA do CAR e tratadas com fusosomas contendo controle negativo. A ex- pressão relativa é calculada usando o método ΔΔCt. Um nível de ex- pressão relativa mais alto de CAR é devido a um nível mais alto de mRNA do CAR que é purificado a partir das células T CD3+ classifica- das.
[001122] Em algumas modalidades, a liberação de carga de mRNA com fusosomas in vitro é maior em fusosomas contendo mRNA de CAR em comparação com fusosomas de controle negativo. c. Carga útil de Proteína/mRNA, em que a carga útil é expressa pela célula doadora
[001123] Este Exemplo descreve a fusão de fusosoma com uma cé- lula in vitro. Em algumas modalidades, a fusão de fusosoma com uma célula T CD3+ in vitro resulta na liberação de uma proteína do receptor de antígeno quimérico para a membrana da célula T CD3+.
[001124] Uma composição de fusosoma, resultante de vesículas de- rivadas de células ou citobiológicos derivados de células, conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos ante- riores, exceto que o fusosoma é modificado de modo que o fusogênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre e com a estrutura de leitura aberta de um CAR que se direciona à CD19, sepa- rado por uma sequência de peptídeo autoclivável P2A e T2A, respecti- vamente. Um fusosoma de controle negativo é modificado de modo que o fusogênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre e com a estrutura de leitura aberta da proteína fluorescente azul mTagBFP2, cada qual separado por uma sequência de peptídeo autoclivável P2A. Veja, por exemplo, Chen X, et al., Genes Dis. 2015
Mar; 2(1):96-105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001.
[001125] Um número suficiente de fusosomas é, então, incubado a 37 °C e CO2 5 % em conjunto com células T CD3+ receptoras que têm um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato por um período de 48h em meio de células T compreendendo meio X-VIVO 15 (Lonza, Basel, CH, Switzerland) suplementado com Soro Bovino Fetal 5 % (FBS) (Gibco, LAX, CA, USA), 100 U mL− 1 penicilina, 100 μg mL - 1 estreptomicina, 1,25 μg mL - 1 anfotericina B, L-glutamina 2 mM (Gibco) e 100 U mL - 1 hIL-2 (PerproTech, Rocky Hill, CT, USA). Fusão de fusosoma com as células T CD3+ que têm um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato re- sulta na expressão de tdTomato devido à excisão de Cre recombinase do DNA do códon de interrupção que bloqueia a expressão de tdTo- mato. Após a incubação de 48 horas, as células positivas para tdTo- mato são, então, isoladas por meio de FACS, usando um citômetro de FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) com excitação a laser de 561 nm e a emissão é coletada em 590+/-20nm.
[001126] A liberação de mRNA às células T classificadas é analisa- da. O RNA total é isolado (por exemplo, usando um kit como o Qiagen RNeasy catálogo #74104), seguido pela determinação da concentra- ção de RNA usando métodos espectroscópicos padrão para avaliar a absorvência de luz por RNA (por exemplo, com Thermo Scientific Na- noDrop). A transcrição reversa é realizada usando a supermistura Su- perscript III First-Strand Synthesis para RT-PCR (Thermo Fisher Scien- tific), e o RNA (100 ng) é reversamente transcrito em cDNA. A PCR em Tempo Real quantitativa é realizada usando um Sistema de PCR em Tempo Real QuantStudio3 (ThermoFisher Scientific) com TaqMan® Fast Advanced Master Mix (ThermoFisher Scientific), 100 ng de padrão de cDNA, um iniciador e conjunto de sondas que são espe- cíficos para as regiões variáveis do CAR anti-CD19 (projetado usando o iniciador online Taqman e o programa de projeto de sonda) e conjun-
to de sonda de iniciador projetado para amplificar a β-actina como um controle de carregamento endógeno. O valor Ct é usado para compa- rar a quantidade de cDNA do CAR na reação qRT-PCR entre células T CD3+ tratadas com fusosomas contendo o mRNA do CAR e tratadas com fusosomas contendo controle negativo. A expressão relativa é calculada usando o método ΔΔCt. Um nível de expressão relativa mais alto de CAR é devido a um nível mais alto de mRNA do CAR que é purificado a partir das células T CD3+ classificadas.
[001127] Em algumas modalidades, a liberação da carga de mRNA do CAR com fusosomas in vitro é maior em fusosomas derivados de células que expressam o CAR em comparação com os fusosomas de controle negativo derivados de células que expressam CFP.
[001128] A expressão de CAR na superfície das células classificadas é analisada. As células CD3+ de tdTomato+ classificadas são incuba- das com CD19sIg1-4 conjugado para Alexa Fluor 488 (CD19sIg1- 4:AF488), conforme descrito em De Oliveira et al., J Transl Med 11:23,
2013. CD19sIg1-4:AF488 marca células que expressam CD19 CAR. 2 × 105 células são incubadas com 450 ng de CD19sIg1-4:AF488 a 4 °C por 30 minutos no escuro, após serem bloqueadas por soro humano de plasma AB (Sigma-Aldrich) por 10 minutos. Depois de serem lava- das duas vezes com PBS, as células são analisadas em uma máquina LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA.) executando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA.). As células CD3+ de tdTomato+ que foram incubadas com o fusogênio de controle negativo são usadas para configurar o canal negativo para o sinal CD19sIg1- 4:AF488. O canal é escolhido de modo que o % de eventos positivos para CD19sIg1-4:AF488 seja igual a 0,0 %. A porcentagem de eventos que são positivos para CD19sIg1-4:AF488 é medida em células classi- ficadas que foram tratadas com fusosomas derivados de células que expressam o CAR .
[001129] Em algumas modalidades, a porcentagem de células classi- ficadas com expressão de CAR de superfície é maior em células trata- das com fusosomas derivados de células que expressam o CAR em comparação com os fusosomas de controle negativo derivados de cé- lulas que expressam mTagBFP2. Exemplo 110: Fusão do Fusosoma Específico de Célula T para célula T In Vitro
[001130] Este Exemplo descreve a fusão de fusosoma que é prefe- rencial para uma célula T CD3+ in vitro. Em algumas modalidades, o fusosoma liberação sua carga útil a uma célula T CD3+ em uma efici- ência maior do que um tipo de célula alternativo.
[001131] Uma composição de fusosoma, resultante de vesículas de- rivadas de células ou citobiológicos derivados de células, conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos ante- riores, exceto que o fusosoma é modificado de modo que o fusogênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre, porém, separado por uma sequência de peptídeo autoclivável P2A.
[001132] Um número suficiente de fusosomas é, então, incubado a 37 °C e CO2 5 % em conjunto com células T CD3+ receptoras que têm um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato por um período de 48h em meio de células T compreendendo meio X-VIVO 15 (Lonza, Basel, CH, Switzerland) suplementado com Soro Bovino Fetal 5 % (FBS) (Gibco, LAX, CA, USA), 100 U mL− 1 penicilina, 100 μg mL - 1 estreptomicina, 1,25 μg mL - 1 anfotericina B, L-glutamina 2 mM (Gibco) e 100 U mL - 1 hIL-2 (PerproTech, Rocky Hill, CT, USA). A fusão do fusosoma com células T CD3+ que têm um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato resulta na expressão de tdTomato devido à excisão da Cre recombinase do DNA do códon de interrupção que bloqueia a expressão de tdTomato.
[001133] Em um experimento separado, o mesmo número de fuso- somas são incubados a 37 °C e CO2 5 % em conjunto com uma linha-
gem celular de fibroblastos NIH/3T3 receptora que tem um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato por um período de 48h em DMEM conten- do Soro Bovino Fetal 20 % e 1x de Penicilina/Estreptomicina. A fusão do fusosoma com os fibroblastos NIH/3T3 que têm um repórter loxP- STOP-loxP-tdTomato resulta na expressão de tdTomato devido à ex- cisão da Cre recombinase do DNA do códon de interrupção que blo- queia a expressão de tdTomato.
[001134] Após as incubações de 48 horas, as células são analisadas em um citômetro de FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) com excitação a laser de 561 nm e emissão coletada em 590+/-20nm. Um canal é configurado para medir a expressão de tdTomato positiva. O canal é escolhido de modo que as células T CD3+ e os fibroblastos NIH/3T3 que não foram contatados com os fusosomas sejam todas negativas. A porcentagem de células que são positivas para a expres- são de tdTomato é medida em células T CD3+ e fibroblastos NIH/3T3 que foram contatados por fusosomas.
[001135] Em algumas modalidades, uma porcentagem de células que são positivas para a expressão de tdTomato é maior em células CD3+ em contato com fusosomas do que em fibroblastos NIH/3T3 em contato com fusosomas, o que demonstra que os fusosomas se fun- dem preferencialmente com as células CD3+ alvo. Exemplo 111: Fusão do Fusosoma Específico de célula T para cé- lula T In Vivo
[001136] Este Exemplo descreve a fusão de fusosoma que é prefe- rencial para uma célula T CD3+ in vivo. Em algumas modalidades, um fusosoma liberação sua carga útil a uma célula T CD3+ com uma efici- ência maior do que qualquer tipo de célula alternativo.
[001137] Uma composição de fusosoma, resultante de vesículas de- rivadas de células ou citobiológicos derivados de células, conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos ante-
riores, exceto que o fusosoma é modificado de modo que o fusogênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre, porém, separado por uma sequência de peptídeo autoclivável P2A.
[001138] 3 x 1011 fusosomas ou PBS são, então, administrados len- tamente ao longo de 20 min através de um cateter na veia da cauda do roedor usando uma bomba de infusão BS-300 programável (ambos Braintree Scientific Inc.) diariamente por 5 dias para camundongos B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J (cepa 007909 de Jackson Laboratories). Três dias após o tratamento final, o sangue periférico é coletado de camundongos tratados com fusosoma e de camundongos que receberam tratamento com PBS. O sangue é coletado em 1ml de PBS contendo 5 μM de EDTA e misturado imediatamente para evitar a coagulação. Os tubos são mantidos em gelo e os glóbulos vermelhos são removidos usando uma solução tamponada de cloreto de amônio (ACK). As células são coradas com um anticorpo CD3-FITC de murino (Thermo Fisher Catálogo #: 11-0032-82), a 4 °C por 30 minutos no escuro, após serem bloqueadas com albumina de soro bovino por 10 minutos. Após serem lavadas duas vezes com PBS, as células são analisadas em um LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA.) com exci- tação a laser de 488nm e a emissão coletada em 530+/-30nm anali- sando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA.). As células não coradas de camundongos que receberam tratamento com PBS são usadas para estabelecer um canal para FITC negativa e fluo- rescência de tdTomato negativa.
[001139] Em algumas modalidades, uma porcentagem de células que são positivas para fluorescência de tdTomato é maior em camun- dongos tratados com fusosomas do que em camundongos tratados com PBS. Em algumas modalidades, uma porcentagem de células po- sitivas para tdTomato que coram positivamente para FITC é maior do que aquelas que coram negativamente para FITC em camundongos tratados com fusosomas. Isso demonstra que os fusosomas direciona- dos às células CD3+ se fundem especificamente com as células CD3+ in vivo. Exemplo 112: Células T modificadas in vitro lisam as células as- sociadas a um antígeno alvo in vitro
[001140] Este exemplo demonstra que as células T CD3+ que ex- pressam um CAR após serem contatadas por um fusosomo, conforme descrito em qualquer um dos métodos nos Exemplos anteriores, são capazes de lisar células associadas a um antígeno alvo, por exemplo, CD19, in vitro.
[001141] As células T CD3+ que expressam um CAR direcionado à CD19 são incubadas com células de leucemia CD19+ Eμ-ALL01 (alvo) ou células tumorais de melanoma CD19- B16F10 (controle). Antes da incubação, as células T CD3+ são ativadas usando contas magnéticas específicas de CD3 e CD28 em três contas/célula (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA e as células de leucemia Eμ-ALL01 e células tumorais de melanoma B16F10 são marcadas com corante de membrana PKH-26 (Sigma-Aldrich), lavadas com RPMI contendo 10 % de soro de bezerro fetal, e ressuspensas no mesmo meio a uma concentração de 1x105 células tumorais por mL. As células T são, en- tão, adicionadas à suspensão em várias relações de células T para células tumorais, variando de 0 célula T : 1 célula tumoral em 100 célu- las T : 1 célula tumoral, em placas de 96 cavidades (volume final, 200 μl), e incubadas durante 3 h a 37 °C. Em seguida, as células são trans- feridas para placas de 96 cavidades com fundo em V e coradas com Anexina V-Violeta Brilhante 421 (BioLegend). Após uma lavagem em PBS, as células são analisadas por citometria de fluxo em uma máqui- na LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA.) executando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA.). As células da incuba- ção de 0 célula T : 1 célula tumoral e uma batelada separada de célu-
las T são primeiro analisadas no citômetro de fluxo. Um canal é primei- ro representado para distinguir células T e células tumorais com base na fluorescência de PKH-26. O canal é representado de modo que as células T sejam negativas e as células tumorais que foram incubadas com PKH-26 sejam positivas. Em seguida, um canal é representado para medir o manchamento com Anexina V-Violeta Brilhante 421. O canal é representado de modo que as células da incubação de 0 célula T: 1 célula tumoral sejam todas negativas para Anexina V-Violeta Bri- lhante 421. Usando esses dois canais, as células de cada uma das incubações de várias relações de células T para células tumorais são analisadas no citômetro de fluxo.
[001142] Em algumas modalidades, a porcentagem de células que são positivas para PKH-26 e Anexina V-Violeta Brilhante 421 aumenta com as relações crescentes de células T para células tumorais para as células de leucemia Eμ-ALL01 e a porcentagem de células que são positivas para PKH -26 e Anexina V-Violeta Brilhante 421 não aumenta com relações crescentes de células T para células tumorais para as células tumorais de melanoma B16F10. Isso demonstra que as células T que expressam um CAR direcionado à CD19 após serem contatadas por fusomas são capazes de lisar especificamente as células que são CD19-positivas.
[001143] Veja, por exemplo, Smith T, et al., Nature Nanotechnology.
2017. DOI:10.1038/NNANO.2017.57 Exemplo 113: Células T modificadas in vivo lisam as células as- sociadas com um antígeno alvo in vitro
[001144] Este exemplo demonstra que as células T CD3+ modifica- das para expressar um CAR após serem contatadas por fusosomas in vivo são capazes de lisar as células associadas a um antígeno alvo in vitro.
[001145] Uma composição de fusosoma, resultante de vesículas de-
rivadas de células ou citobiológicos derivados de células, conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos ante- riores, exceto que o fusosoma é modificado de modo que o fusogênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre, porém, separado por uma sequência de peptídeo autoclivável P2A. Além dis- so, o fusosoma é modificado para liberar um CAR direcionado à CD-19 a uma célula-alvo, conforme descrito nos Exemplos anteriores.
[001146] 3 x 1011 fusosomas ou PBS são, então, administrados len- tamente durante 20 min através de um cateter na veia da cauda de roedor usando uma bomba de infusão BS-300 programável (ambos Braintree Scientific Inc.) diariamente por 5 dias para camundongos B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J (cepa 007909 de Jackson Laboratories). Três dias após o tratamento final, o sangue periférico é coletado de camundongos tratados com fusosoma e os camundongos receberam tratamento com PBS. O sangue é coletado em 1ml de PBS contendo 5 μM de EDTA e misturado imediatamente para evitar a coa- gulação. Os tubos são mantidos em gelo e os glóbulos vermelhos são removidos usando uma solução tamponada de cloreto de amônio (ACK). As células são coradas com um anticorpo CD3-FITC de murino (Thermo Fisher Catálogo #: 11-0032-82), a 4 °C por 30 minutos no escuro, após serem bloqueadas com Albumina de Soro Bovino por 10 minutos. Depois de serem lavadas duas vezes com PBS, as células são analisadas em um LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA.) com excitação a laser de 488nm e a emissão coletada em 530+/-30nm executando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA.). As células classificadas de camundongos tratados com fusosomas ou PBS são, então, incubadas com células de leucemia CD19+ Eμ- ALL01. Antes da incubação, as células de leucemia Eμ-ALL01 são marcadas com corante de membrana PKH-26 (Sigma-Aldrich), lavadas com RPMI contendo 10 % de soro de bezerro fetal e ressuspensas no mesmo meio a uma concentração de 1x105 células tumorais por mL. As células T são, então, adicionadas à suspensão em várias relações de células T para células tumorais, variando de 0 célula T: 1 célula tu- moral para 100 células T : 1 célula tumoral, em placas de 96 cavidades (volume final, 200 μl), e incubadas durante 3 h a 37 °C. Em seguida, as células são transferidas para placas de 96 cavidades com fundo em V e coradas com Anexina V-Violeta Brilhante 421 (BioLegend). Após uma lavagem em PBS, as células são analisadas por citometria de flu- xo em uma máquina LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA.) execu- tando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA.). As células da incubação de 0 célula T : 1 célula tumoral e uma batelada separada de células T classificadas são primeiro executadas no citô- metro de fluxo. Um primeiro canal é primeiro representado para distin- guir as células T e células tumorais com base na fluorescência de PKH-26. O canal é representado de modo que as células T sejam ne- gativas e as células tumorais que foram incubadas com PKH-26 sejam positivas. Em seguida, um canal é representado para medir o man- chamento com Anexina V-Violeta Brilhante 421. O canal é representa- do de modo que as células da incubação de 0 célula T : 1 célula tumo- ral sejam todas negativas para Anexina V-Violeta Brilhante 421. Usan- do esses dois canais, as células de cada uma das incubações de vá- rias relações de células T para células tumorais são analisadas no flu- xo citômetro.
[001147] Em algumas modalidades, uma porcentagem de células que são positivas para PKH-26 e Anexina V-Violeta Brilhante 421 au- menta com as relações crescentes de células T para células de leu- cemia Eμ-ALL01 de camundongos tratados com fusosomas e a por- centagem de células que são positivas para PKH-26 e Anexina V- Violeta Brilhante 421 não aumenta com as relações crescentes de cé- lulas T para células de leucemia Eμ-ALL01 de camundongos tratados com PBS. Isso demonstra que as células T modificadas para expres- sar um CAR que se direciona à CD19 após o tratamento com fusoso- mas são capazes de lisar células associadas com CD19. Veja, por exemplo, Smith T, et al., Nature Nanotechnology. 2017. DOI:10.1038/NNANO.2017.57 Exemplo 114: Células T modificadas in vivo lisam as células tu- morais associadas a um antígeno alvo in vivo
[001148] Este exemplo demonstra que as células T CD3+ modifica- das para expressar um CAR após serem contatadas por fusosomas in vivo são capazes de tratar um tumor in vivo.
[001149] Uma composição de fusosoma, resultante de vesículas de- rivadas de células ou citobiológicos derivados de células, conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos ante- riores, exceto que o fusosoma é modificado de modo que o fusogênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre, porém, separado por uma sequência de peptídeo autoclivável P2A. Além dis- so, o fusosoma é modificado para liberar um CAR que se direciona à CD-19, conforme descrito nos Exemplos anteriores.
[001150] Um modelo de leucemia é estabelecido injetando-se siste- micamente as células de leucemia Eμ-ALL01 de expressão de lucife- rase em camundongos B6 albinos fêmeas de 4–6 semanas de idade (C57BL/6J-Tyr < c-2J>) (Jackson Laboratories) e permitindo que eles se desenvolvam por 1 semana. Os camundongos são, então, designa- dos randomizadamente a coortes experimentais. 3 x 1011 fusosomas ou PBS são, então, administrados lentamente durante 20 min através de um cateter na veia da cauda de roedor usando uma bomba de infu- são BS-300 programável (ambos Braintree Scientific Inc.) diariamente durante 5 dias.
[001151] A luminescência como um substituto para o número de cé- lulas de leucemia vivas é, então, medida diariamente. D-luciferina (Xe-
nogen) em PBS (15 mg mL – 1) é usado como um substrato para F-luc expresso pelas células de leucemia. As imagens de bioluminescência são coletadas com um Xenogen IVIS Spectrum Imaging System (Xe- nogen). O software Living Image versão 4.3.1 (Xenogen) é usado para adquirir (e posteriormente quantificar) os dados obtidos ao longo de uma faixa de 10-35 min após a injeção intraperitoneal de D-luciferina em animais anestesiados com 150 mg kg – 1 de isoflurano 2 % (Fora- ne, Baxter Healthcare). Os tempos de aquisição variam de 10 s a 5 min. Para corrigir a bioluminescência antecedente, os sinais adquiridos de camundongos sem tumor (injetados com D-luciferina) são subtraí- dos da região de medição de interesse (ROI).
[001152] Em modalidades, o sinal de luciferase aumenta ao longo de 21 dias em camundongos tratados com PBS e o sinal de luciferase diminui ao longo de 21 dias em camundongos tratados com fusoso- mas.
[001153] A sobrevivência de camundongos que receberam PBS ou fusosomas também é rastreada. Em modalidades, os camundongos que receberam PBS têm uma sobrevida média que é menor do que os camundongos tratados com fusosomas.
[001154] Isso demonstra que os fusosomas são capazes de modifi- car células T para direcionar as células tumorais in vivo. Veja, por exemplo, Smith T, et al., Nature Nanotechnology. 2017. DOI:10.1038/NNANO.2017.57 Exemplo 115: Fusosomas liberam uma proteína transmembrana às células receptoras
[001155] Este Exemplo descreve a fusão de fusosoma com uma cé- lula in vitro. Em algumas modalidades, a fusão de fusosoma resulta na liberação de uma proteína transmembrana a uma célula receptora.
[001156] Uma composição de fusosoma, resultante de vesículas de- rivadas de células ou citobiológicos derivados de células, conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos ante- riores, exceto que o fusosoma é modificado de modo que o fusogênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre e com a estrutura de leitura aberta do receptor de insulina humana, separado por uma sequência de peptídeo autoclivável P2A e T2A, respectiva- mente. Um fusosoma de controle negativo é modificado de modo que o fusogênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre e com a estrutura de leitura aberta da proteína fluorescente azul mTagBFP2, cada qual separado por uma sequência de peptídeo auto- clivável P2A. Veja, por exemplo, Chen X, et al., Genes Dis. 2015 Mar; 2(1):96-105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001.
[001157] Um número suficiente de fusosomas é, então, incubado a 37 °C e CO2 5 % em conjunto com células HEK293 receptoras que têm um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato por um período de 48h em meio completo (DMEM +FBS 10 % + Pen/Estrep). A fusão de fusoso- ma com as células HEK293 que têm um repórter loxP-STOP-loxP- tdTomato resulta na expressão de tdTomato devido à excisão da Cre recombinase do DNA do códon de interrupção que bloqueia a expres- são de tdTomato. Após a incubação de 48 horas, as células positivas para tdTomato são, então, isoladas por meio de FACS, usando um ci- tômetro de FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) com a exci- tação a laser de 561nm e a emissão é coletada em 590+/-20 nm.
[001158] A liberação de mRNA às células HEK293 classificadas é testada. O RNA total é isolado (por exemplo, usando um kit como Qia- gen RNeasy catálogo #74104), seguido pela determinação da concen- tração de RNA usando métodos espectroscópicos padrão para avaliar a absorvência de luz por RNA (por exemplo, com Thermo Scientific NanoDrop). A transcrição reversa é realizada usando a supermistura Superscript III First-Strand Synthesis para RT-PCR (Thermo Fisher Scientific), e o RNA (100 ng) é reversamente transcrito em cDNA. A
PCR em Tempo Real quantitativa é realizada usando um Sistema de PCR em Tempo Real QuantStudio3 (ThermoFisher Scientific) com TaqMan® Fast Advanced Master Mix (ThermoFisher Scientific), 100 ng de padrão de cDNA, um iniciador e conjunto de sonda que são especí- ficos para as regiões variáveis do Receptor de Insulina Humana (proje- tado usando o iniciador online Taqman e o programa de projeto de sonda) e conjunto de sonda de iniciador projetado para amplificar a β- actina como um controle de carregamento endógeno. O valor Ct é usado para comparar a quantidade de cDNA do Receptor de Insulina na reação qRT-PCR entre as células HEK293 tratadas com fusosomas contendo o mRNA do Receptor de Insulina e tratadas com fusosomas contendo controle negativo. A expressão relativa é calculada usando o método ΔΔCt. Um nível de expressão relativa mais alto do receptor de insulina é devido a um nível mais alto de mRNA do receptor de insuli- na que é purificado a partir das células T HEK293 classificadas.
[001159] Em algumas modalidades, a liberação da carga de mRNA do Receptor de Insulina com fusosomas in vitro é maior em fusosomas derivados de células que expressam o Receptor de Insulina em com- paração com os fusosomas de controle negativo derivados de células que expressam CFP.
[001160] A expressão do Receptor de Insulina na superfície das cé- lulas classificadas é testada. As células HEK293 de tdTomato+ classi- ficadas são incubadas com Anticorpo Alfa do Receptor de Insulina conjugado com Alexa Fluor 488 (Bioss Antibodies, catálogo número bs-0260R-A488). O anticorpo marca células que expressam o Recep- tor de Insulina proporcional à quantidade de expressão do Receptor de Insulina. 2 × 105 células são incubadas com 450 ng do Anticorpo Alfa do Receptor de Insulina conjugado com Alexa Fluor 488 a 4 °C por 30 minutos no escuro, após serem bloqueadas por soro humano de plas- ma AB (Sigma-Aldrich) por 10 minutos. Depois de serem lavadas duas vezes com PBS, as células são analisadas em uma máquina LSR II (BD Biosciences, San Jose, CA.) executando o software FACSDiva™ (BD Biosciences, San Jose, CA.). As células HEK293 de tdTomato+ que foram incubadas com o fusogênio de controle negativo são usa- das para configurar o canal negativo para o Anticorpo Alfa do Receptor de Insulina conjugado para o sinal Alexa Fluor 488. O canal é escolhi- do de modo que a porcentagem de eventos positivos para o Anticorpo Alfa do Receptor de Insulina conjugado para Alexa Fluor 488 seja igual a 0,0 %. A porcentagem de eventos que são positivos para o Anticorpo Alfa do Receptor de Insulina conjugado para Alexa Fluor 488 é medida em células classificadas que foram tratadas com fusosomas derivados de células que expressam o Receptor de Insulina.
[001161] Em algumas modalidades, a porcentagem de células classi- ficadas com expressão do Receptor de Insulina de superfície é maior em células tratadas com fusosomas derivados de células que expres- sam o Receptor de Insulina em comparação com os fusosomas de controle negativo derivados de células que expressam mTagBFP2. Exemplo 116: Fusosomas liberam uma proteína transmembrana direcionada ao peptídeo sinal, heteróloga para células receptoras
[001162] Este Exemplo descreve a fusão de fusosoma com uma cé- lula in vitro. Em algumas modalidades, a fusão de fusosoma com uma célula receptora resulta na liberação de uma carga útil de proteína de membrana heteróloga à membrana plasmática da célula receptora.
[001163] Uma composição de fusosoma, resultante de vesículas de- rivadas de células ou citobiológicos derivados de células, conforme produzida por qualquer um dos métodos descritos nos Exemplos ante- riores, exceto que o fusosoma é modificado de modo que o fusogênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre e com a estrutura de leitura aberta de uma GFP direcionada à membrana, se- parada por uma sequência de peptídeo autoclivável P2A e T2A, res-
pectivamente. A GFP direcionada à membrana é gerada pela fusão do terminal N da sequência de codificação de GFP aos primeiros vinte e seis aminoácidos de LCK, uma tirosina cinase da família Src contendo dois domínios de palmitoilação e um único domínio de miristoilação. Um fusosoma de controle negativo é modificado de modo que o fuso- gênio esteja na estrutura com a estrutura de leitura aberta de Cre e com a estrutura de leitura aberta de GFP citosólica (a sequência de codificação de GFP sem quaisquer sequências de peptídeo de direci- onamento adicionais), cada qual separado por uma sequência de pep- tídeo autoclivável P2A. Veja, por exemplo, Chen X, et al., Genes Dis. 2015 Mar; 2(1):96 105.DOI:10.1016/j.gendis.2014.12.001, e Bene- diktsson A, et al, Journal of Neuroscience Methods 2005 141, 41-53.
[001164] Um número suficiente de fusosomas é, então, incubado a 37 °C e CO2 5 % em conjunto com células HEK293 receptoras que têm um repórter loxP-STOP-loxP-tdTomato por um período de 48h em meio completo (DMEM + FBS 10 % + Pen/Estrep). A fusão do fusos- somo com as células HEK293 que têm um repórter loxP-STOP-loxP- tdTomato resulta na expressão de tdTomato devido à excisão de Cre recombinase do DNA do códon de interrupção que bloqueia a expres- são de tdTomato. Após a incubação de 48 horas, as células positivas para tdTomato são, então, isoladas por meio de FACS, usando um ci- tômetro de FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) com excita- ção a laser de 561 nm e a emissão é coletada em 590+/-20nm.
[001165] A localização da membrana de GFP na membrana plasmá- tica das células HEK293 classificadas é analisada por meio de micros- copia confocal. Antes da microscopia confônica, as células HEK293 classificadas são coradas com um reagente que marca a membrana plasmática (por exemplo, CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain, Invitrogen, Catálogo número C10046). Os experimentos de ima- gem são realizados com um microscópio invertido Zeiss LSM 710 usando uma objetiva de óleo de abertura numérica Plan Apochromat 63 x 1,4. Um laser de argônio de 488 nm é usado para excitar GFP/EGFP e um laser de Hélio-Neon de 632 nm é usado para excitar a mancha da membrana plasmática. Um script MATLAB é escrito para determinar a intensidade média de GFP da membrana plasmática e do citosol para cada célula. No script, a intensidade média na membrana plasmática (definida por 6 pixels em cada lado da membrana plasmáti- ca conforme definido pela mancha da membrana plasmática) e o cito- sol (região dentro da região da membrana plasmática) são calculados. Os valores para membrana plasmática e intensidade do citosol para cada célula são, então, usados para calcular o % de localização da membrana plasmática. O % de localização da membrana plasmática é calculado com a seguinte equação: intensidade da membrana plasmá- tica sobre a intensidade total (membrana plasmática + citosol) x 100 %. Veja, por exemplo, Johnson A, et al., Scientific Reports 6: 19125 (2015).
[001166] Em algumas modalidades, as células classificadas tratadas com fusosomas contendo GFP localizada na membrana plasmática têm maior % de localização na membrana plasmática de GFP do que as células classificadas tratadas com fusosomas contendo GFP citosó- lica.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES
1. Fusosoma caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma bicamada lipídica compreendendo uma pluralidade de lipídeos derivados de uma célula fonte; (b) um lúmen (por exemplo, que compreende citosol) rode- ado pela bicamada lipídica; (c) um fusogênio que é exógeno ou superexpresso em rela- ção à célula fonte, por exemplo, em que o fusogênio está disposto na bicamada lipídica; e (d) um agente de carga útil de proteína de membrana (por exemplo, que é exógeno ou superexpresso em relação à célula fonte) que compreende ou codifica um ou mais dentre: i) um receptor de antígeno quimérico; ii) uma carga útil de proteína de membrana integrina, por exemplo, escolhida da Tabela 5; iii) uma proteína de canal iônico escolhida da Tabela 6; iv) uma proteína formadora de poros, por exemplo, escolhi- da das Tabelas 7 e 8; v) um receptor tipo Toll, por exemplo, escolhido da Tabela 9; vi) uma carga útil do receptor de interleucina, por exemplo, escolhida da Tabela 10; vii) uma proteína de adesão celular escolhida das Tabelas 11-12; viii) uma proteína de transporte escolhida da Tabela 15; ix) uma sequência de sinal que é heteróloga em relação à proteína de membrana de ocorrência natural; ou x) uma sequência de sinal listada na Tabela 4; em que o fusosoma não compreende uma proteína do nucleocapsídeo ou uma proteína de matriz viral.
2. Fusosoma, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que a célula fonte é uma célula primária, uma célula cultivada, uma célula imortalizada ou uma linhagem celular (por exem- plo, linhagem celular mieloblástica, por exemplo, C2C12).
3. Fusosoma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que a célula fonte é uma célula endotelial, um fi- broblasto, uma célula sanguínea (por exemplo, um macrófago, um neutrófilo, um granulócito, um leucócito), uma célula-tronco (por exem- plo, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco do cordão um- bilical, uma célula-tronco da medula óssea, uma célula-tronco hemato- poética, uma célula-tronco pluripotente induzida, por exemplo, uma célula-tronco pluripotente induzida derivada de células de um indiví- duo), uma célula-tronco embrionária (por exemplo, uma célula-tronco do saco vitelino embrionário, placenta, cordão umbilical, pele fetal, pe- le de adolescente, sangue, medula óssea, tecido adiposo, tecido eri- tropoiético, tecido hematopoético), um mioblasto, uma célula paren- quimatosa (por exemplo, hepatócito), uma célula alveolar, um neurônio (por exemplo, uma célula neuronal retinal) uma célula precursora (por exemplo, uma célula precursora da retina, um mieloblasto, células pre- cursoras mieloides, um timócito, um meiócito, um megacarioblasto, um promegacarioblasto, um melanoblasto, um linfoblasto, uma célula pre- cursora da medula óssea, um normoblasto ou um angioblasto), uma célula progenitora (por exemplo, uma célula progenitora cardíaca, uma célula satélite, uma célula gial radial, uma célula estromal da medula óssea, uma célula progenitora pancreática, uma célula progenitora en- dotelial, uma célula blástica) ou uma célula imortalizada (por exemplo, HeLa, HEK293, HFF-1, MRC- 5, WI-38, IMR 90, IMR 91, PER.C6, HT- 1080 ou célula BJ).
4. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula fonte é alogê-
nica, por exemplo, obtida de um organismo diferente da mesma espé- cie que a célula-alvo.
5. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula fonte é autólo- ga, por exemplo, obtida do mesmo organismo que a célula-alvo.
6. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula fonte é seleci- onada a partir de um glóbulo branco ou uma célula-tronco.
7. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula fonte é seleci- onada a partir de um neutrófilo, um linfócito (por exemplo, uma célula T, uma célula B, uma célula exterminadora natural), um macrófago, um granulócito, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco da medula óssea, uma célula-tronco pluripotente induzida, uma célula- tronco embrionária ou um mieloblasto.
8. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que o fusosoma é de uma célula fonte com um genoma modificado, por exemplo, tendo imuno- genicidade reduzida (por exemplo, por edição do genoma para remo- ver complexos de MHC).
9. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de que o fusosoma tem um diâmetro que é inferior a cerca de 0,01 % ou 1 % daquele da célula fonte, por exemplo, conforme medido por um ensaio do Exemplo 30.
10. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que o fusogênio é um fusogênio de mamífero ou um fusogênio viral.
11. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que o fusogênio é ativo a um pH de 6-8.
12. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que o fusosoma compre- ende um agente de carga útil de proteína de membrana em um núme- ro de cópias de pelo menos 1.000 cópias, por exemplo, conforme me- dido por um ensaio do Exemplo 43.
13. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que: i) o fusosoma atende a um padrão de boas práticas de fa- bricação (GMP) ou farmacêutico; ii) o fusosoma foi produzido de acordo com as boas práticas de fabricação (GMP); iii) o fusosoma tem um nível de patógeno abaixo de um va- lor de referência predeterminado, por exemplo, está substancialmente livre de patógenos; ou iv) o fusosoma tem um nível de contaminante abaixo de um valor de referência predeterminado, por exemplo, está substancial- mente livre de contaminantes.
14. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que o agente de carga útil de proteína de membrana é uma proteína de membrana disposta na bicamada lipídica de fusosoma.
15. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o agente de carga útil da proteína de membrana é um ácido nucleico, disposto no lúmen do fu- sosoma, que codifica uma proteína de membrana.
16. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que o agente de carga útil da proteína de membrana é ou compreende um receptor de antí- geno quimérico (CAR) que compreende um domínio de ligação ao an- tígeno.
17. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo está em um organismo.
18. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é uma cé- lula primária isolada de um organismo.
19. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é sele- cionada a partir de uma célula endotelial, um fibroblasto, uma célula do sangue (por exemplo, um macrófago, um neutrófilo, um granulócito, um leucócito), uma célula-tronco (por exemplo, uma célula-tronco me- senquimal, uma célula-tronco do cordão umbilical, célula-tronco da medula óssea, uma célula-tronco hematopoética, uma célula-tronco pluripotente induzida, por exemplo, uma célula-tronco pluripotente in- duzida derivada de células de um indivíduo), uma célula-tronco embri- onária (por exemplo, uma célula-tronco do saco vitelino embrionário, placenta, cordão umbilical, pele fetal, pele de adolescente, sangue, medula óssea, tecido adiposo, tecido eritropoiético, tecido hematopoé- tico), um mioblasto, uma célula parenquimatosa (por exemplo, hepató- cito), uma célula alveolar, um neurônio (por exemplo, uma célula neu- ronal da retina) uma célula precursora (por exemplo, uma célula pre- cursora da retina, um mieloblasto, células precursoras mieloides, um timócito, um meiócito, um megacarioblasto, um promegacarioblasto, um melanoblasto, um linfoblasto, uma célula precursora da medula óssea, um normoblasto, ou um angioblasto), uma célula progenitora (por exemplo, uma célula progenitora cardíaca, uma célula satélite, uma célula gial radial, uma célula estromal da medula óssea, uma cé- lula progenitora pancreática, uma célula progenitora endotelial, uma célula blástica) ou uma célula imortalizada (por exemplo, HeLa, HEK293, HFF-1, MRC-5, WI-38, IMR 90, IMR 91, PER.C6, HT-1080 ou célula BJ).
20. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que a célula-alvo é sele- cionada a partir de um neutrófilo, um linfócito (por exemplo, uma célula T, uma célula B, uma célula exterminadora natural), um macrófago, um granulócito, uma célula-tronco mesenquimal, uma célula-tronco da medula óssea, uma célula-tronco pluripotente induzida, uma célula- tronco embrionária ou um mieloblasto.
21. Fusosoma, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações anteriores, caracterizado pelo fato de que o fusosoma com- preende um domínio de direcionamento que localiza o fusosoma em uma célula-alvo.
22. Fusosoma, de acordo com a reivindicação 21, caracte- rizado pelo fato de que o domínio de direcionamento interage com uma porção de célula-alvo na célula-alvo.
23. Método de fabricação de uma composição de fusoso- ma, caracterizado pelo fato de que compreende: i) fornecer uma pluralidade de fusosomas como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 22; e ii) formular a pluralidade de fusosomas, composição de fu- sosomas ou composição farmacêutica, por exemplo, como um produto de fármaco fusosoma adequado para administração a um indivíduo.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracteri- zado pelo fato de que o fusosoma é de uma célula de mamífero com um genoma modificado, por exemplo, tendo imunogenicidade reduzida (por exemplo, por edição do genoma para remover complexos de MHC).
25. Método de fabricação de uma composição de produto de fármaco fusosoma, caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer, por exemplo, produzir, fornecer uma pluralidade de fusosomas como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 22; e b) analisar um ou mais fusosomas da pluralidade para de- terminar a presença ou nível de um ou mais dos seguintes fatores: i) uma molécula imunogênica, por exemplo, uma proteína imunogênica, por exemplo, como aqui descrito; ii) um patógeno, por exemplo, uma bactéria ou vírus; ou iii) um contaminante; c) (opcionalmente) aprovar a pluralidade de fusosomas ou composição de fusosomas para liberação se um ou mais dos fatores estiver abaixo de um valor de referência; fabricando desse modo uma composição de produto de fármaco fuso- soma.
26. Método de administração de uma composição de fuso- soma a um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, caracteriza- do pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo de uma composição de fusosoma que compreende uma pluralidade de fuso- somas, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1-22, ad- ministrando desse modo a composição de fusosoma ao indivíduo.
27. Método de liberação de uma carga útil de membrana de proteína a um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo de uma composição de fusosoma compreen- dendo uma pluralidade de fusosomas, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, em que a composição de fusosoma é administrada em uma quantidade e/ou tempo tal que a carga útil da membrana de proteína é liberada.
28. Método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo de uma pluralidade de fusosomas, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, em que a composição de fu-
sosoma é administrada em uma quantidade e/ou tempo tal que a do- ença ou distúrbio é tratado.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio é selecionado a partir de câncer, distúrbio autoimune ou doença infecciosa.
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