TWI503411B - Ｂ群腦膜炎球菌次單位疫苗之製造及純化 - Google Patents
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Description
本發明係關於B群腦膜炎球菌次單位疫苗之製備方法，特別是關於藉由大腸桿菌表現系統大量生產B群腦膜炎球菌重組Ag473脂化膜蛋白(rAg473)之製造及純化方法。
目前，細菌性腦膜炎對全球健康仍是一項嚴重威脅，全世界每年估計有170,000件死亡病例，尤其發生在嬰幼兒。奈瑟氏腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis
，NM)為能引起流行性疾病的細菌之一，此菌在引入b型嗜血性流感及肺炎鏈球菌疫苗後，會成為人類腦脊髓膜炎的主要病原體。自從1970年以來，市面上已發展出針對NM血清群(serogroup)A、C、Y與W-135群的傳統莢膜多醣疫苗。但是由於B群腦膜炎球菌的莢膜多醣組成與人類腦部的某些醣蛋白會產生免疫交叉反應，故在人體所引起的免疫力非常弱，而產生的抗體則可能造成自體免疫疾病，因此以類似策略來發展B群腦膜炎菌莢膜多醣疫苗，仍有無法克服的難題。世界上已有數種針對區域性流行之以蛋白質為主要組成的B群疫苗；然而，因為用於此等疫苗候選抗原之外膜蛋白在表現上變異非常大，故此類疫苗的適用範圍受到相當限制。
Ag473脂化膜蛋白為一種以抗B型腦膜炎雙球菌(NMB)單株抗體所發現的表面抗原。重組Ag473脂化膜蛋白經證實可在動物模式中引發免疫反應，而成為具有潛力的疫苗候選抗原。已有藉由將Ag473基因選殖至特定的大腸桿菌表現載體，並在含有肯那黴素(kanamycin)的特定培養條件下篩選出高表現量選殖株，而達到可於大腸桿菌大量生產rAg473，以供疫苗發展及相關使用的目標(參照，例如，中華民國專利I280247、美國US7357932、US20080118535及歐盟EP1612218)。由於rAg473為脂質化且會錨定於細菌的外膜，故LPS污染在傳統純化方法之安全性課題上會是一個很嚴重的問題。因此，本發明提供一種能在rAg473生產過程中，成功將LPS去除之層析技術。
本發明係基於發現，可藉由利用經修飾後之色層分析與超過濾技術，成功地純化出不含LPS污染的重組Ag473脂化膜蛋白。
於是，本發明之一方面特徵係在於，一種以大腸桿菌細胞製備重組脂化蛋白之方法，其中該脂化蛋白(例如)具有分子量大於10 kDa，且等電點(pI)係低於4.5。該方法包括下列五步驟：(1)於清潔劑存在下將表現奈瑟氏腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis
，NM) Ag473蛋白之大腸桿菌細胞的細胞膜打破而產生胞膜區分；(2)將所得之胞膜區分(例如)藉由通過孔徑為0.22 μm之濾膜過濾而產生濾液；(3)將該濾液藉由一純化程序進行純化而得一樣本，該純化程序包括混合相層析術、陽離子膜層析術與陰離子膜層析術(彼等進行之順序不限)；(4)將該樣本以濾洗膜(例如，具有10 kD之孔徑)進行濾洗(diafiltration)而產生一配製品；及(5)將該清潔劑(例如)藉由逆相層析術從該配製品中移除，而得到經純化的Ag473蛋白。於該逆相層析術，可使用之樹脂為例如GE’s SOURCE 30RPC樹脂等。可用含有40-60%(例如40%)乙腈之第一溶劑沖洗該樹脂(其中已加載有rAg473脂化蛋白)來去除殘留的清潔劑，然後再以含有60-90%(例如80%)乙腈之第二溶劑進行溶析，而回收得該蛋白質。
用於步驟(1)之清潔劑可為非離子系清潔劑(例如，Triton X-100、辛基-b-D-哌喃葡萄糖苷、NP-40、Triton X-114與Tween 20)、兩性離子系清潔劑(例如，CHAPS與CHAPSO)、或離子系清潔劑(SDS與肌胺酸)。該清潔劑之濃度範圍可介於0.01至2%，例如0.05至1%及0.1至0.5%。
關於步驟(3)，該純化程序可包括(i)將該濾液通過一混合相層析術樹脂得到第一溶析液，而該樹脂為經由矽烷加以修飾且經醋酸活化的二氧化矽樹脂；(ii)將所得之第一溶析液進行陽離子膜層析術而得第二溶析液；及(iii)將該第二溶析液進行陰離子膜層析術而獲得該樣本。可藉由將二氧化矽樹脂與矽烷，以範圍介於2.0至3.5(例如，2.5至3，以乾重計)之比例進行矽烷-修飾反應，而得到該二氧化矽樹脂。該混合相層析術可包括，以含有濃度範圍介於0.25至1 M(例如，0.5至0.75 M)之NaCl的溶劑對該樹脂進行溶析。可將欲施用於該陽離子膜層析術的第一溶析液，藉由添加含有醋酸之溶液預先酸化，而得到範圍從2.5至5.0之pH值。而施用於該陰離子膜層析術之第二溶析液，可藉由添加NaOH溶液預先鹼化，而使其pH值範圍介於5.0至7.5。該陽離子膜層析術可利用PALL’s 0.8 μm Mustang S膜來完成。而該陰離子膜層析術可以PALL’s 0.22 μm Mustang E膜來完成。該步驟(ii)可於具有pH值範圍介於3.0至4.0之磷酸鹽緩衝液系統中進行。該步驟(iii)可於其pH值高於5之醋酸/磷酸鹽緩衝液系統中進行。
本發明之另一方面特徵係在於，一種經由矽烷加以修飾之二氧化矽樹脂，其係藉由一種包括：將二氧化矽樹脂與矽烷混合於一溶劑中，該二氧化矽樹脂對該矽烷之比例為2.0至3.5(以乾重計)；將該混合物靜置反應以使該二氧化矽樹脂與矽烷進行反應而形成一種經矽烷修飾之二氧化矽樹脂；及將該溶劑去除而得到乾燥的經矽烷修飾之二氧化矽樹脂的製程所製備得。該溶劑可為醇類，例如乙醇及甲醇。該反應時間代表性地係持續12小時。在經反應後，可將該經矽烷修飾之二氧化矽樹脂使用現配的溶劑清洗數次，以去除殘餘的矽烷。前述之製程可進一步包括，將該經矽烷修飾之二氧化矽樹脂藉由以醋酸溶液(例如，0.1至1%醋酸)進行清洗而使其活化、將該醋酸溶液去除、以及將該經活化之矽烷-修飾二氧化矽樹脂以緩衝液清洗的步驟。
以下所描述之實施方式及相關圖式，進一步詳細說明本發明之一或多項較佳實施例。本發明之其他特色、標的及優點將自該等所載之說明與圖式，以及申請專利範圍而顯現出來。
本發明係關於B群腦膜炎球菌次單位疫苗之製備方法，特別是關於藉由大腸桿菌表現系統大量製造及純化B群腦膜炎球菌之重組Ag473脂化膜蛋白(rAg473)。
因此，於一方面，本發明之特徵為一種於大規模大腸桿菌表現系統純化B群腦膜炎球菌之重組Ag473脂化膜蛋白的方法，其包括下列步驟：(a)使用特定濃度之清潔劑自被誘導大量表現該脂化膜蛋白之大腸桿菌細胞獲得澄清上清液，該清潔劑只會從細胞膜充分萃取出rAg473脂化膜蛋白，而不會破壞整體細胞結構(亦即，細胞的其他組成例如細胞壁、細胞質與基因組等並未被破壞，且實質上仍保持完整)；(b)將rAg473脂化膜蛋白萃取液於一經由特定比例之修飾劑(矽烷)製得，呈現良好純化應用性的二氧化矽樹脂中進行混合相層析術，其特徵在於包括以醋酸活化，以及藉由添加濃度大於0.25 M之NaCl鹽將標的蛋白質溶析出的程序；(c)進行陽離子膜層析術，其特徵在於藉由將醋酸加入該系統使該萃取液酸化，以選擇性地與雜質結合；(d)進行陰離子膜層析術，其pH值係藉由將NaOH溶液加入醋酸/磷酸鹽緩衝液系統而經調整至5以上，以去除LPS污染；(e)使用具有不同截斷值範圍介於10至100 kDa之孔徑的膜進行濾洗(diafiltration)；及視需要地，(f)進行逆相層析術以去除殘餘的清潔劑。
於本發明之一項具體實施例，該用於澄清化步驟之清潔劑為濃度0.05至1%之Triton X-100。於另一項具體實施例，係使用經活化的二氧化矽凝膠，及以0.25至1 M NaCl/0.1% Triton X-100/1X PBS(pH7.4)緩衝液做為溶析劑，來完成該混合相層析術程序。
進而，本發明係提供一種大量製造B群腦膜炎球菌次單位疫苗之方法。該方法包括將大腸桿菌宿主細胞(例如)於生物反應器中，使用無動物組成的培養基進行發酵，以誘導rAg473脂化膜蛋白之表現；使用濃度1%之清潔劑Triton X-100從細胞膜萃取出rAg473脂化膜蛋白；將rAg473脂化膜蛋白萃取液於一經由矽烷修飾之二氧化矽樹脂(已使用醋酸預先活化)中進行混合相層析術；及藉由添加濃度大於0.5 N之NaCl將蛋白質溶析出；於一其pH值範圍介於3.0至4.0之醋酸/磷酸鹽緩衝液系統中進行陽離子膜(例如PALL’s 0.8 mm Mustang S)層析術；於一具有pH值範圍高於5之緩衝液系統中進行陰離子膜(例如PALL’s 0.22 mm Mustang E)層析術；使用具有孔徑為10 kDa之膜進行濾洗；以及使用一種含有40至60%乙腈之溶劑來去除殘留的清潔劑，與使用另一種用以將經純化的蛋白溶析出之含有60至90%乙腈的溶劑進行逆相層析術。
以下的特別實施例僅為例舉說明而設，且無意於以任何方式限制本發明揭示的其他部份。無需進一步詳細敘述，據相信熟悉該項技藝具有通常知識者可基於本說明書之敘述，而將本發明利用至其最完善程度。所有於本文中引述的公開文獻，皆係完整地以引用方式納入本文作為參考。又，以下有任何作用機制提出之步驟亦無意於限制本發明所請的範圍。
將粒徑分布介於75至200 μm之製藥級二氧化矽PharmPrep60 CC(Merck KGaA，德國，Cat. No. 1.09373.1000)以相當量的矽烷(二乙胺基丙基三甲氧基矽烷，CAS No. 41051-80-3)加以修飾。於二氧化矽對矽烷之比例大於2.5之條件下，於乙醇中進行代表性的無水反應。此反應係由二氧化矽顆粒(250 g溶於10升乙醇(95%))與100 ml其密度為大約0.934 g/ml之矽烷所組成。將所成之混合物於室溫(RT)下靜置反應12小時，然後置換以現配之乙醇，並伴隨攪拌再反應12小時。重複此程序兩次後，將所得經修飾之二氧化矽於設定為120及2 kgf/cm2
之高壓釜中進行乾燥20分鐘。
對於測驗規模，係將0.05 g前述經修飾的二氧化矽凝膠裝填於Ultrafree-MC管(Millipore Corp.USA,Cat.No:UFC30HV)中，以400 μl之dH2
O清洗，於12,000 rpm於室溫下離心1分鐘。將流通液(flow through liquid)丟棄，並重複進行該清洗與離心步驟一次。然後將二氧化矽凝膠以200 μl之1%醋酸清洗，以轉速12,000 rpm於室溫下離心1分鐘，並將流通液丟棄。其後，將二氧化矽凝膠以400 μl之0.1% Triton X-100/1X PBS,pH7.4平衡，以轉速12,000 rpm於室溫下離心1分鐘，並將流通液丟棄。重覆該預處理(平衡)步驟兩次。對於大量生產規模(1,000克或以上)，係將該二氧化矽凝膠倒入層析管柱AxiChrom(GE Healthcare Bio-Sciences Corp. USA)中，該管柱裝備有一用以進行緩衝液交換之幫浦系統。
將經選殖於質體pET9a中之Ag473基因轉形的大腸桿菌C43(DE3)，使用無動物組成的培養基進行5公升-規模發酵，以生產用於臨床前研究之rAg473蛋白。此脂化膜蛋白係由105個胺基酸殘基所組成，且其N-端胺基酸為N-醯基-S-二醯基甘油基-Cys。其胺基酸序列如下所示：CSQEAKQEVKEAVQAVESDVKDTAASAAESAASAVEEAKDQVKDAAADAKASAEEAVTEAKEAVTEAKEAVTEAKEAVTEAAKDTLNKAADATQEAADKMKDAAK(SEQ ID NO: 1)。
該發酵係於補充以酵母抽出物之M9合成培養基中進行。使細菌培養物於5-L發酵槽中生長至其OD 600值達到8。以乳糖(終濃度為1%)誘導標的蛋白質表現。待收取細胞並以清潔劑打破細胞膜後，經由於5,000 rpm、4℃下離心10分鐘而得到上清液，將其通過孔徑為0.22 μm之膜過濾，並進行如下所述之5-步驟純化方法。於該等五步驟中，步驟(2)、(3)與(4)可依任意順序進行。
圖1列示5-步驟之純化方法。更特別地，該方法包括下列步驟：(1)以特定濃度(較佳地例如1%)之清潔劑(本實驗係使用Triton X-100)破壞大腸桿菌細胞膜萃取出rAg473脂化膜蛋白，並藉由通過一膜進行微過濾而將該萃取液澄清化；(2)將該rAg473脂化膜蛋白萃取液，於一經由前述實施例1所載方法製備得之二氧化矽樹脂中，使用0.5M NaCl/0.1% Triton X-100/1X PBS,pH7.4做為溶析溶劑進行混合相層析術；(3)使用預先以醋酸/0.1% Triton X-100/1X PBS緩衝液前處理之PALL’s 0.8 mm Mustang S膜進行陽離子膜層析術；(4)使用預先以0.1% Triton X-100/1X PBS,pH7.4緩衝液前處理之PALL’s 0.22 μm Mustang E膜進行陰離子膜層析術；及(5)通過具有孔徑為10 kDa之濃縮膜進行濾洗。
將經過各步驟處理後的純化流份，於SDS-PAGE凝膠上進行分析。結果顯示，經由步驟(2)已顯著純化出rAg473脂化膜蛋白，而步驟(3)-(5)則進一步將其純化達到純質。已發現，在經過二氧化矽凝膠層析術後之溶析液中的內毒素含量，從1000,000 EU/ml以上減低至少於200,000 EU/ml，表示大多數內毒素已經由該二氧化矽凝膠層析術去除。
本實例係針對以不同劑量(0、5、10、30及50 μg/ml)之經純化rAg473脂化膜蛋白免疫的小鼠中，Ag473-專一性抗體反應之量進行分析，來評估經純化rAg473脂化膜蛋白於活體內的免疫原性。更特別地，係將各組8-12-週齡BALB/c小鼠(n
=5)起初以0、5、10、30或50 μg/ml調配於PBS，或與ALPO4
佐劑調配之經純化rAg473脂化膜蛋白經皮下進行免疫。於初劑量後第14天，使用相同的抗原調合物與劑量以皮下注射對小鼠進行追加免疫。於追加免疫後第2、3、4及6週，經由尾部靜脈採血收集免疫血清。藉由ELISA測定抗-Ag473抗體力價。其步驟簡述如下，將微量滴定平盤每孔塗布以50 μl之rAg473溶液(2 μg/mL)。使用連接有辣根過氧化酶之山羊抗-小鼠IgG Fc偵測已結合的IgG。添加3,3,5,5-四甲基聯苯胺進行呈色反應，並於ELISA讀取機中，於波長450 nm下測量吸光值。終點力價(End-point titer)係定義為，可產生吸光值0.2之血清稀釋度。
以溶於PBS或與ALPO4
佐劑調配之經純化rAg473脂化膜蛋白免疫的小鼠，當與單獨以PBS或與ALPO4
佐劑免疫之動物(即，施予0 μg/ml rAg473之動物組)進行比較時，顯示已引發可偵測量的抗-Ag473 IgG抗體反應。而且，以與ALPO4
佐劑調配之經純化rAg473脂化膜蛋白免疫的小鼠，當與以溶於PBS之經純化rAg473脂化膜蛋白免疫之小鼠進行比較時，顯示可產生高出甚多的抗-Ag473抗體。
本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。
從前述之說明，習於該項技藝人士可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。
<110> 財團法人國家衛生研究院
<120> B群腦膜炎球菌次單位疫苗之製造及純化
<160> 1
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 105
<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌Neisseria meningitidis
<400> 1
圖1為一種用於純化重組Ag473脂化膜蛋白(rAg473)之5-步驟製程的流程圖。
Claims (19)
- 一種純化以大腸桿菌細胞製備之B群腦膜炎球菌(NM)重組Ag473脂化膜蛋白之方法，其包含：於濃度範圍從0.05至1%之不會破壞整體細胞結構之清潔劑存在下將表現奈瑟氏腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis ，NM)Ag473蛋白之大腸桿菌細胞的細胞膜打破而產生胞膜區分；將所得之胞膜區分進行微過濾而產生澄清化濾液；將該濾液藉由純化程序進行純化而得一樣本，該純化程序包括於經由矽烷修飾之二氧化矽樹脂中進行之混合相層析術、陽離子膜層析術與陰離子膜層析術(彼等進行之順序不限)；將該樣本以濾洗膜進行濾洗而產生一配製品；及使用含有乙腈之溶劑將該清潔劑從該配製品中去除而得到經純化的重組Ag473蛋白，其中該經由矽烷修飾之二氧化矽樹脂係由包含下列步驟的製程所製備得：將二氧化矽樹脂與矽烷以二氧化矽樹脂對該矽烷為2.5至3.5(以乾重計)之比例混合於一無水溶劑中；將該混合物靜置及應以使該二氧化矽樹脂與矽烷進行反應而形成一種經矽烷修飾之二氧化矽樹脂；及將該溶劑去除而得到乾燥的經矽烷修飾之二氧化矽樹脂。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該脂化蛋白具有分子 量大於10kDa且等電點(pI)低於4.5。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該清潔劑係選自Triton X-100、辛基-b-D-哌喃葡萄糖苷、NP-40、Triton X-114、Tween 20、CHAPS、CHAPSO、SDS及肌胺酸。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該過濾步驟係藉由通過孔徑為0.22μm之過濾膜來進行。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該陽離子膜層析術係使用PALL’s 0.8μm Mustang S膜完成。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該陰離子膜層析術係使用PALL’s 0.22μm Mustang E膜完成。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該純化步驟係經由下列步驟完成：(i)將該濾液通過一混合相層析術樹脂得到第一溶析液，其中該樹脂為經由矽烷加以修飾且經醋酸活化的二氧化矽樹脂；(ii)將所得之第一溶析液於酸化條件下進行陽離子膜層析術而得第二溶析液；及(iii)將該第二溶析液預先鹼化並於具有pH值範圍高於5之緩衝液系統中進行陰離子膜層析術而獲得該樣本。
- 根據申請專利範圍第7項之方法，其中該步驟(i)中之混合相層析術包括以含有濃度範圍介於0.25至1M之NaCl的溶劑對該樹脂進行溶析。
- 根據申請專利範圍第7項之方法，其中該步驟(i)中之二氧化矽 樹脂係藉由將二氧化矽樹脂與矽烷，以範圍介於2.0至3.5之比例進行矽烷-修飾反應而製得。
- 根據申請專利範圍第7項之方法，其中該步驟(ii)係於具有pH值範圍介於3.0至4.0之磷酸鹽緩衝液系統中進行。
- 根據申請專利範圍第7項之方法，其中欲施用於該步驟(ii)陽離子膜層析術的第一溶析液係藉由添加含有醋酸之溶液預先酸化而得到pH值為2.5至5.0。
- 根據申請專利範圍第7項之方法，其中該步驟(iii)係於具有pH值高於5之醋酸/磷酸鹽緩衝液系統中進行。
- 根據申請專利範圍第7項之方法，其中欲加至該步驟(iii)陰離子膜層析術的第二溶析液係藉由添加NaOH溶液預先鹼化而得到pH值為5.0至7.5。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該濾洗膜具有孔徑為10kDa。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該清潔劑去除步驟係藉由使用含有40至60%乙腈之第一溶劑將清潔劑洗出，及使用含有60至90%乙腈的第二溶劑將蛋白質回收所進行的逆相層析術來完成。
- 根據申請專利範圍第15項之方法，其中該逆相層析術係使用GE’s SOURCE 30RPC樹脂來進行。
- 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該清潔劑去除步驟係藉由包含下列程序之逆相層析術來完成： 使用含有40%乙腈之溶劑沖洗以去除殘留的清潔劑，及使用含有80%乙腈的溶劑溶析以回收得rAg473蛋白。
- 一種製備用於根據申請專利範圍第1項之純化脂化膜蛋白之方法的經由矽烷修飾之二氧化矽樹脂的方法，其包含下列步驟：(1)將二氧化矽樹脂與矽烷以二氧化矽樹脂對該矽烷為2.5至3.5(以乾重計)之比例混合於一無水溶劑中；(2)將該混合物靜置反應以使該二氧化矽樹脂與矽烷進行反應而形成一種經矽烷修飾之二氧化矽樹脂；及(3)將該溶劑去除而得到乾燥的經矽烷修飾之二氧化矽樹脂。
- 根據申請專利範圍第18項之製備方法，其中該方法(於該溶劑去除步驟後)進一步包含：(4)將該經矽烷修飾之二氧化矽樹脂以醋酸溶液清洗而使其活化；(5)將該醋酸溶液去除；及(6)將該經活化之矽烷-修飾二氧化矽樹脂以緩衝液清洗。
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