DE69921435T2

DE69921435T2 - Verfahren zur Inaktivierung vom umhüllten Viren in einem Viruspräparat mit Adenoviren

Info

Publication number: DE69921435T2
Application number: DE69921435T
Authority: DE
Inventors: David Gaillac; Michel Koehl
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1998-12-21
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2019-12-18
Also published as: JP2000201673A; CA2292922A1; DK1016711T3; ES2230820T3; US7378265B2; AU6535899A; EP1016711A1; CA2292922C; DE69921435D1; PT1016711E; JP4459353B2; US20060166345A1; FR2787465A1; AU769121B2; US7026154B1; EP1016711B1; ATE280823T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren, die in der Lage sind, ein Viruspräparat auf der Grundlage von nicht-umhüllten Viren zu kontaminieren. Die Erfindung hat gleichfalls ein Viruspräparat, das im Wesentlichen frei ist von umhüllten Viren, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein solches Viruspräparat umfasst, wie auch deren Verwendungsarten zu therapeutischen oder prophylaktischen Zwecken zum Gegenstand. Die Erfindung weist einen Nutzen insbesondere für Perspektiven einer Gentherapie, insbesondere beim Menschen, auf.
Die Gentherapie wird als Transfer von genetischer Information in eine Zelle oder einen Wirtsorganismus definiert. Das erste Protokoll, das auf den Menschen angewendet wurde, wurde in den Vereinigten Staaten im September 1990 an einem aufgrund einer Mutation, welche das Adenindesaminase (ADA) kodierende Gen betraf, genetisch bedingt immundefizienten Patienten begonnen. Es handelte sich darum, das fehlerhafte Gen, dessen Dysfunktion die Ursache einer genetisch bedingten Erkrankung darstellte, zu korrigieren oder zu ersetzen. Der relative Erfolg dieses ersten Experiments hat die Weiterentwicklung dieser Technik ermutigt, die seit damals auf die Behandlung von anderen Krankheiten, sowohl genetisch bedingten als auch erworbenen (Krebserkrankungen, Infektionskrankheiten, wie AIDS...) ausgedehnt worden ist mit dem Ziel, therapeutische Gene, die bei der Pathologie eine Besserung bringen, in situ abzugeben. Die meisten Strategien setzen Vektoren ein, um das therapeutische Gen in Richtung seiner Zielzelle zu transportieren. Zahlreiche Vektoren, ebenso virale wie auch synthetische, wurden während diesen letzten Jahren entwickelt und haben den Gegenstand von zahlreichen Veröffentlichungen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet zugänglich sind, gebildet.
An die Vorteile der Adenoviren als Vektoren bei der Gentherapie wurde bereits im Stand der Technik erinnert. Sie infizieren zahlreiche Zellarten, ebenso in Teilung befindliche wie auch ruhende Zellen, sind nicht integrativ und wenig pathogen. Außerdem weisen sie einen natürlichen Tropismus für die Atemwege auf. Diese besonderen Eigenschaften machen Adenoviren zu Vektoren der Wahl für zahlreiche therapeutische und sogar Impfanwendungen.
Der Infektionszyklus der Adenoviren läuft in 2 Schritten ab. Die frühe Phase geht der Initiation der Replikation voran und erlaubt, frühe Proteine zu produzieren, die die Replikation und die Transkription der viralen DNA regulieren. Der Replikation des Genoms folgt die späte Phase, während welcher die Strukturproteine, die die Viruspartikel bilden, synthetisiert werden. Der Zusammenbau der neuen Virionen findet im Kern statt. Zunächst finden sich die Virusproteine zusammen derart, dass leere Kapside von Ikosaederstruktur, in welchen das Genom verkapselt wird, gebildet werden. Die freigesetzten Adenoviren sind in der Lage, andere permissive Zellen zu infizieren.
Zur Unterrichtung wird ihr Genom aus einem linearen und doppelkettigen DNA-Molekül von ungefähr 36 kb gebildet, das ungefähr 30 Gene, die in den Viruszyklus eingreifen, trägt. Die frühen Gene (E1 bis E4; E für „early" im Englischen) sind in 4 in dem Genom verteilten Regionen verteilt. Die Regionen E1, E2 und E4 sind für die Virusreplikation essentiell, wohingegen die Region E3, die an der Modulation der anti-adenoviralen Immunantwort bei dem Wirt beteiligt ist, dies nicht ist. Die späten Gene (L1 bis L5; L für „late", was im Englischen spät bedeutet) kodieren hauptsächlich die Strukturproteine und überspannen teilweise die frühen Transkriptionseinheiten. Sie werden zumeist ausgehend von dem „Major Late"-Promotor MLP (für „Major Late Promoter" im Englischen) transkribiert. Außerdem trägt das adenovirale Genom an seinen Enden cis-wirkende, für die Verkapselung essentielle Regionen, die aus invertierten terminalen Sequenzen (ITR), die sich an den 5'- und 3'-Enden befinden, und einer Verkapselungsregion, die der 5'-ITR folgt, gebildet werden.
Den adenoviralen Vektoren, die gegenwärtig in Gentherapieprotokollen eingesetzt werden, fehlt der Hauptteil der Region E1, um deren Ausbreitung in der Umwelt und dem Wirtsorganismus zu vermeiden. Zusätzliche Deletionen in der Region E3 erlauben, das Klonierungsvermögen zu erhöhen. Es stehen gleichfalls sogenannte Vektoren der zweiten Generation zur Verfügung. Sie enthalten noch die cis-wirkenden Regionen (ITRs und Verkapselungssequenzen), die für die Verkapselung essentiell sind, umfassen aber zusätzliche genetische Modifikationen, die darauf abzielen, die in vivo-Expression von bestimmten viralen Genen, die die Persistenz der transduzierten Zellen und die stabile Expression des Transgens beeinträchtigen könnten, zu verringern (siehe beispielsweise die internationalen Anmeldungen WO94/28152 und WO97/04119). In dieser Hinsicht stellt ein Minimalvektor, dem die Gesamtheit der adenoviralen Funktionen fehlt, eine Alternative der Wahl dar.
Aus evidenten Sicherheitsgründen ist es wichtig, Viruspräparate zu erhalten, die frei von potentiell schädlichen Verunreinigungen sind. Die rekombinanten Adenoviren werden gewöhnlich in einer Zelllinie produziert, die die fehlerhaften/defekten Funktionen komplementiert. Nach der Kultivierung werden die infizierten Zellen geerntet, lysiert und die Viruspartikel werden ausgehend von dem Zelllysat gereinigt. Die Hauptanzahl der Gruppen, die auf diesem Gebiet arbeiten, ist daran interessiert, die molekularen Verunreinigungen (Proteine, DNA, anorganische Substanzen, Toxine ...) zu verringern, indem Ultrazentrifugationstechniken an einem Cäsiumchloridgradient oder chromatographische Techniken eingesetzt werden. Die potentielle Verunreinigung durch andere Arten von Viren bleibt jedoch bis zum heutigen Tag nicht gelöst. In dieser Hinsicht sind die pathologischen Risiken, die mit umhüllten Viren verbunden sind, nicht ohne Folgen, denn sie können zu Krebs, Hepatitiden, AIDS ... u.s.w. führen. Es ist folglich entscheidend, dass die Präparate von rekombinanten Viren, die für eine Verwendung beim Menschen bestimmt sind, frei von infektiösen umhüllten Viren sind.
Indessen sind die Verunreinigungsquellen während des gesamten Verfahrens, das zu dem Präparat der Viren von Interesse führt, zahlreich. Außer der unbeabsichtigten Verunreinigung können die für die Vermehrung der Viren von Interesse eingesetzten Zelllinien integriert in ihre Chromosomen eine bestimmte Anzahl von retroviralen Genomen (Proviren) umfassen. Diese können in Reaktion auf bestimmte Kulturbedingungen aktiviert werden, um infektiöse umhüllte Viren zu erzeugen. Außerdem enthalten die Kulturmedien häufig Serum tierischen Ursprungs, das eine Hauptquelle für umhüllte Viren ist. Außerdem können die Bedienungspersonen, die Umwelt, das mehrfach verwendete Material (Fermenter, Homogenisator, Chromatographiesäule...) gleichfalls zu der Verunreinigung beitragen. Diese Verunreinigungen werden als fremde Agentien bezeichnet und betreffen die umhüllten Viren, aber gleichfalls die Bakterien und die Zellen.
Für Proteinpräparate und Blutderivate (Plättchenkonzentrate, Kryopräzipitate, Fraktionierungsprodukte ....), wo die Verunreinigung durch die Hepatitis B-Viren ein Hauptproblem der öffentlichen Gesundheit bildet, ist bereits ein Verfahren zur Inaktivierung der umhüllten Viren durch eine Mischung von Tri(n-butyl)phosphat (TNBP) ausgeführt worden. Ein solches Verfahren ist noch nie auf ein Präparat von nicht-umhüllten Viren, wo die Verunreinigung durch die umhüllten Viren der Sicherheit der klinischen Chargen entgegensteht, angewendet worden.
Im Gegensatz zu dem Verfahren des Standes der Technik, welches auf Proteinzusammensetzungen anwendbar ist, stellt sich das besondere Problem der Coexistenz von zwei Arten von Viren in dem gleichen Präparat, einerseits der nicht-umhüllten Viren, die man zu bewahren wünscht, und der umhüllten Viren, die man zu inaktivieren sucht. Ein erfindungsgemäßes Verfahren muss diese beiden Vorfragen erfüllen. Allgemein weisen die Viren eine komplexe strukturelle Architektur auf und die Integrität des Viruspartikels ist für die Infektiosität und das Eindringen in die Wirtszellen essentiell. In dieser Hinsicht werden die Adenoviren aus einem DNA-Molekül gebildet, das mit Proteinen assoziiert ist und von einem ikosaedrischen Kapsid umhüllt wird. Das Kapsid wird aus Kapsomeren gebildet, die 720 Hexone und 60 Pentone umfassen, mit welchen Monomere der Polypeptide IIIa, VI und IX, die die Struktur stabilisieren, assoziiert sind. Gebunden an die Penton-Untereinheit und auf die Außenseite des Kapsids austretend befindet sich die trimere Faser, die die anfängliche Anheftung des Virus an seine Zielzelle erlaubt. Ein leicht verändertes adenovirales Kapsid könnte eine schädliche Auswirkung auf die virale Infektiosität haben. Man kann die Fragilität der Adenoviren veranschaulichen, indem die Tatsache erwähnt wird, dass eine länger andauernde Exposition gegenüber einer Temperatur über 37°C ausreicht, um das Infektionsvermögen oftmals um mehrere log zu verringern.
Es wurde jetzt ein Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren in einem rekombinante Adenoviren als wirksame Komponenten enthaltenden Präparat entwickelt, das das Lösemittel Tri-n-butyphosphat (TNBP) einsetzt. Außerdem wurde die Auswirkung von verschiedenen Variablen untersucht, um die experimentellen Bedingungen zu definieren, die am besten dazu geeignet sind, die Infektiosität der rekombinanten Adenoviren zu bewahren und um in ein globales Reinigungsverfahren integriert zu werden. Die folgenden Beispiele zeigen, dass die Wirkung von 0,1 bis 0,6% TNBP und von 1% bis 2% Tween 80 während 4 h bei Umgebungstemperatur es erlaubt, die Menge von umhüllten Viren auf signifikante Weise zu verringern (Verringerung um wenigstens einen Faktor von 4 log), wobei die Unversehrtheit der adenoviralen Partikel geschont wird (Ausbeute von wenigstens 80%, ja sogar über 100%). Es wurde gleichfalls die günstige Wirkung des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass die Aggregate, die sich spontan zwischen den Virionen bilden und die Infektiosität der Viren beeinträchtigen, verringert werden, nachgewiesen.
Aus diesem Grund hat die Erfindung ein Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren, die ein Viruspräprarat kontaminieren, das hauptsächlich Adenoviren enthält, zum Gegenstand, bei dem man:

– in das Viruspräparat eine ausreichende Menge des Lösemittels Tri-n-butylphosphat (TNBP) zwischen 0,05% und 1 % (Volumen/Volumen) einschließlich einführt,
– das TNBP bei einer Temperatur zwischen +4°C und +37°C einschließlich bei einem pH zwischen 6,5 und 8,5 einschließlich über eine ausreichend lange Zeit einwirken lässt, um signifikant die Menge an umhüllten Viren, die das Viruspräparat kontaminieren zu verringern.

Die „umhüllten Viren" und „nicht-umhüllten Viren" werden in den Grundlagenwerken der Virologie ausführlich definiert. Kurz zusammengefasst, weisen die umhüllten Viren an ihrer Oberfläche eine Hülle auf, die aus einer Lipidschicht oder -doppelschicht und damit assoziierten Proteinen gebildet wird. Ihre Zusammensetzung ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass sie sich während der Knospung der Viren durch die Zellmembran hindurch bildet. Der Aus druck Zellmembran umfasst die Plasmamembran und jene der anderen zellulären Organellen, wie des endoplasmatischen Retikulums, des Golgi-Apparats, des Kerns. Im Gegensatz dazu weist ein nicht-umhülltes Virus kein Lipid an seiner Oberfläche auf und wird von einem Proteinkapsid umgeben.
Ein „Viruspräparat" enthält hauptsächlich ein oder mehrere nicht-umhülltes) Virus bzw. Viren in einem wässrigen Medium (Kulturmedium, gepuffertes Medium, Formulierungslösung ...). Der Ausdruck „Virus" umfasst die Wildtyp-Viren, mutierten Viren und rekombinanten Viren (welche wenigstens ein Gen von Interesse umfassen). Ein Viruspräparat wird gewöhnlich durch Einführung der DNA des nicht-umhüllten Virus, die sich in einem oder mehreren Fragmenten befindet, in eine geeignete Zelllinie oder durch Infektion der Linie durch eine virale Prä-Stammlösung hergestellt. Dann wird die transfizierte infizierte Linie kultiviert und man erntet virale Partikel, die produziert worden sind, aus den Produzentenzellen und/oder aus dem Kulturüberstand.
Es wird angegeben, dass im Rahmen der Erfindung das Viruspräparat gleichfalls einem oder mehreren Reinigungsschritten, die darauf abzielen, Reinheitsniveaus zu erreichen, die mit der für das virale Produkt erforderlichen pharmazeutischen Qualität verträglich sind (wenigstens teilweise Beseitigung der Verunreinigungen vom Typ Proteine, Toxine, Nukleinsäure ...), unterworfen werden kann. Die Reinigung kann durch Zentrifugationstechniken auf einem Cäsiumchlorid-Gradienten oder Chromatographietechniken wie jene, die nachfolgend detailliert erläutert werden, ausgeführt werden.
Eine vorteilhafte Ausführungsweise der Erfindung besteht darin, ein replikationsdefektes Adenovirus einzusetzen, in welchem ein oder mehrere essentielle virale Funktionen durch Mutation (Addition, Deletion und/oder Substitution von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden oder nicht aufeinanderfolgenden Nukleotiden) funktionsunfähig gemacht sind.
Das erfindungsgemäße Inaktivierungsverfahren zielt darauf ab, die umhüllten Viren, die ein Viruspräparat, welches ein oder mehrere Adenoviren von Interesse enthält, kontaminieren können, zu verringern oder zu beseitigen.
Der Ausdruck „Inaktivierung" kann als eine signifikante oder vollständige Verringerung der Infektiosität des (oder der) umhüllten Virus bzw. Viren, das bzw. die das Viruspräparat von Interesse kontaminiert bzw. kontaminieren, definiert werden. Zu den Zwecken der Erfindung wird die Infektiosität um einen Faktor von wenigstens 2 log, vorteilhafterweise wenigstens 3 log, vorzugsweise wenigstens 4 log und ganz und gar bevorzugt um wenigstens 7 log verrin gert. Die Inaktivierung der umhüllten Viren kann gemäß den Techniken dieses Fachgebiets ausgewertet werden, beispielsweise durch Elektronenmikroskopie, HPLC, molekularbiologische Methoden (PCR), Methoden einer Titration des Virustiters, Fluoreszenz, immunologische Methoden (ELISA, RIA ...), immun-enzymatische Methoden, welche die Detektion von einem oder mehreren viralen Polypeptiden erlauben (Western...), Messung der reverse Transkriptase-Aktivität insbesondere bei den Retroviren...
Zu den Zwecken der Erfindung kann das Lösemittel dem Viruspräparat unmittelbar nach der Ernte der nicht-umhüllten Viren (nicht gereinigtes Viruspräparat) oder bei irgendeinem Schritt seiner Reinigung zugesetzt werden.
Im Rahmen der Erfindung bezeichnet der Ausdruck „Lösemittel" eine jegliche Substanz, Lösung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist, ein Lipid zu solubilisieren oder einen Bestandteil, der ein oder mehrere Lipide umfasst, zu dissoziieren. In dem vorliegenden Falle ist ein Lösemittel, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, insbesondere dazu bestimmt, eine Virushülle zu dissoziieren. Obgleich ein jegliches Lösemittel in Betracht gezogen werden kann, wird nichtsdestoweniger bevorzugt, Hecameg (Interchim, Referenz UP785480), Ether oder ferner ein Alkylphosphat, allein oder in Kombination, einzusetzen. Die Kombination kann Lösemittel der gleichen chemischen Familie (beispielsweise zwei Alkylphosphate) oder aus unterschiedlichen Familien (Ether und Alkylphosphat) zusammenbringen. Im Rahmen der Erfindung wird das Lösemittel insbesondere ausgewählt aus der Gruppe, die aus den Dialkylphosphaten und den Trialkylphosphaten gebildet wird. Vorteilhafterweise umfasst jede der Alkylgruppen des Dialkyl- oder Trialkylphosphats unabhängig voneinander 1 bis 10 Kohlenstoffatome. Es wird angegeben, dass die Alkylgruppe(n) in linearer oder verzweigter (Isoalkyl-) Form vorliegen können und gegebenenfalls substituiert sein können. Es handelt sich vorzugsweise um ein Trialkylphosphat, bei welchem jede der 3 Alkylgruppen unabhängig voneinander 2 bis 8 Kohlenstoffatome und ganz und gar bevorzugt 3 bis 5 umfasst. Rein zur Veranschaulichung kann man Tri-(n-butyl)phosphat (TNBP), Tri-(tert.-butyl)phosphat, Tri-(n-hexyl)phosphat, Tri-(2-ethylhexyl)phosphat, Tri-(n-decyl)phosphat aufführen. Ein besonders bevorzugtes Lösemittel ist Tri-n-butylphosphat.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzende Lösemittelmenge muss ausreichend sein, um die Infektiosität der umhüllten Viren, die das Viruspräparat von Interesse kontaminieren, signifikant zu verringern. Selbstverständlich kann diese Menge abhängig von bestimmten Parametern des erfindungsgemäßen Verfahrens variieren (Volumen des Viruspräparats, Verunreinigungsgrad, Art der umhüllten Viren, Reinigungszustand des Viruspräparats u.s.w....). Der Fachmann auf diesem Gebiet ist in der Lage, die erforderliche Lösemit telmenge an die genauen Versuchsbedingungen anzupassen. Das Lösemittel wird vorteilhafterweise in einer Endkonzentration zwischen 0,001 % und 10% einschließlich eingesetzt (wobei 1 % 1 ml einer Stammlösung des Lösemittels mit einer Reinheit über 99% oder 1 g reinem Lösemittel auf ein Gesamtvolumen von 100 ml entspricht). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise ist das dem Viruspräparat zugesetzte Lösemittel Tri-(n-butyl)phosphat und in einer Menge zwischen 0,05% und 1%, bevorzugt zwischen 0,1% und 0,6%, ganz und gar optimal von 0,3%.
Gemäß einer optionalen, aber gleichwohl vorteilhaften Ausführungsweise wird das Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren gemäß der Erfindung in Gegenwart eines Detergens, grenzflächenaktiven Mittels oder amphiphilen, vorzugsweise nicht-ionischen Moleküls ausgeführt. Diese nachfolgend unter der Bezeichnung Solubilisierungsmittel neu gruppierten Begriffe bezeichnen eine jegliche Substanz, Lösung oder Zusammensetzung, die die Löslichkeit einer anderen Substanz, Lösung oder Zusammensetzung in einem Medium, wo diese Letzere nicht oder wenig löslich ist, erleichtert oder ferner deren Zugänglichkeit zu den umhüllten Viren erleichtert. Gemäß den durch die Erfindung verfolgten Zielen ist das Solubilisierungsmittel dazu bestimmt, die Löslichkeit oder die Zugänglichkeit des Lösemittels gegenüber den umhüllten Viren, die in dem Viruspräparat von Interesse vorhanden sind, zu verbessern mit dem Ziel, die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erhöhen. Selbstverständlich können das Lösemittel und das Solubilisierungsmittel in das Viruspräparat individuell (das Solubilisierungsmittel vorab oder nach dem Lösemittel) oder ferner gleichzeitig eingeführt werden. Insbesondere wenn das erfindungsgemäße Inaktivierungsverfahren an einem Viruspräparat im Verlauf der Reinigung ausgeführt wird, kann es vorteilhaft sein, das Solubilisierungsmittel ab den ersten Reinigungsschritten zuzusetzen, dann das Lösemittel während des erfindungsgemäßen Verfahrens zuzugeben. Gegebenenfalls werden nachfolgende Reinigungsschrittte die Reinheit des Viruspräparats vervollkommnen, insbesondere indem von dem Endprodukt das Lösemittel und gegebenenfalls das Solubilisierungsmittel, die eingesetzt werden, entfernt wird.
Obgleich die Wahl des Solubilisierungsmittels nicht beschränkt ist, kann man insbesondere die polyoxyethylenierten Derivate von Fettsäuren oder von deren Estern aufführen. Die bevorzugten Solubilisierungsmittel umfassen Tween (insbesondere Tween 20 oder 80), Triton (insbesondere X-100), PEG (insbesondere PEG 400), Natriumcholat, Natriumdesoxycholat, Octyl-p-D-glucopyranosid und N-Dodecyl-N,N-dimethyl-2-ammonium-1-ethansulfonat. Tween 80 ist ganz und gar bevorzugt. Die Kombination von TNBP und Tween 80 ist im Rahmen der Erfindung bevorzugt.
In dem Falle, wo diese Ausführungsweise eingehalten wird, kann die Endkonzentration des einzusetzenden Solubilisierungsmittels in einem breiten Bereich variieren. Zur Unterrichtung kann sie zwischen 0,001 % und 10%, insbesondere zwischen 0,01 % und 5% und vorzugsweise zwischen 0,1 % und 2% liegen. Handelt es sich um Tween 80, liegt die optimale Konzentration zwischen 0,5% und 2%. Die Kombinationen von 0,6% TNBP und 2% Tween 80 wie auch 0,3% TNBP und 1 % Tween 80 sind besonders bevorzugt.
Außerdem kann das erfindungsgemäße Verfahren gleichfalls in Gegenwart von einer oder mehreren anderen Substanzen, die die Wirksamkeit des Lösemittels gegenüber den umhüllten Viren, dessen Stabilität oder dessen Löslichkeit verbessert bzw. verbessern oder interferierende Aktivitäten, die in der Lage sind, die Inaktivierung der umhüllten Viren und/oder die Infektiosität der nicht-umhüllten Viren zu beeinträchtigen, verringert bzw. verringern, ausgeführt werden. In dieser Hinsicht kann man insbesondere die Antiproteasen aufführen. Diese Ausführungsweise ist besonders geeignet für die Ausführung eines Verfahrens unter Verwendung von Hecameg als Lösemittel.
Die Temperatur, bei welcher das erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt wird, liegt zwischen –5 und +50°C. Um die Infektiosität der nicht-umhüllten Viren des Viruspräparats zu garantieren, bevorzugt man indessen eine Temperatur zwischen +4°C und +37°C und insbesondere zwischen +15°C und +25°C, wobei Umgebungstemperatur vollständig geeignet ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bei einem pH zwischen ungefähr 5 und ungefähr 9 ausgeführt. Man wird aber bevorzugen, bei einem pH zwischen 6,5 und 8,5 und vorzugsweise bei einem pH von 8,5 zu arbeiten. Der Fachmann ist in der Lage, den pH einzustellen durch Verwendung von Lösungen, gepufferten Lösungen oder durch Zugabe von Basen oder Säuren, um den pH gemäß dem Bedarf zu erhöhen oder zu verringern.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Reaktionszeit zwischen dem Lösemittel in etwaiger Gegenwart des Solubilisierungsmittels und dem Viruspräparat abhängig von verschiedenen Parametern (Volumen des Viruspräparats, Arten von umhüllten Viren, Reaktionstemperatur ...) variieren. Die bei den Versuchsbedingungen geeignete Reaktionszeit kann durch den Fachmann auf diesem Gebiet mit Hilfe von einfachen Vergleichsversuchen leicht bestimmt werden. Zur Unterrichtung liegt die Reaktionszeit zwischen 15 min und 24 h, vorteilhafterweise zwischen 30 min und 12 h und bevorzugt zwischen 1 h und 5 h. Die Verlängerung der Reaktionszeit kann bei besonders bedeutenden Viruspräparat-Volumen oder einer niedrigen Reaktionstemperatur in Betracht gezogen werden. Überdies ist in dem Falle, wo eine Verringerung der Reaktionszeit angestrebt wird, der Fachmann in der Lage, die geeignete Steigerung der Reaktionstemperatur festzulegen.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt unter Rühren ausgeführt. Tatsächlich wurde beobachtet, dass die Ausbeute an nicht-umhüllten Viren unter diesen Bedingungen erhöht ist. Obgleich die Wahl der Rührgeschwindigkeit in einem sehr breiten Bereich erfolgen kann, ist bevorzugt, bei einer Rührgeschwindigkeit zwischen ungefähr 50 und ungefähr 5000 Umdrehungen/min, vorteilhafterweise zwischen ungefähr 100 und ungefähr 2000 Umdrehungen/min und bevorzugt zwischen ungefähr 150 und ungefähr 500 Umdrehungen/min zu arbeiten. Man kann auf einen magnetischen Rührer oder ein jegliches anderes geeignetes Gerät (beispielsweise einen Behälter ausgerüstet mit einem Propeller- oder Schaufelrührwerk) zurückgreifen.
Schließlich ist bevorzugt, das erfindungsgemäße Verfahren unter Leitfähigkeitsbedingungen zwischen 5 und 500 mS/cm, vorteilhafterweise zwischen 10 und 200 mS/cm und vorzugsweise zwischen 10 und 100 mS/cm auszuführen. Diese Bedingungen sind vorteilhaft, um die Infektiosität der nicht-umhüllten Viren von Interesse zu bewahren.
Außerdem kann das erfindungsgemäße Verfahren eine oder mehrere Arten von umhüllten Viren, die aus verschiedenen Quellen stammen, wie beispielsweise dem Ausgangsmaterial, dem biologischen Material, der Umwelt oder von den Bedienungspersonen, die während der Herstellung und der Reinigung der nicht-umhüllten Viren von Interesse tätig werden, betrefffen. Das Verfahren der Erfindung ist besonders nützlich, um die für den Menschen pathogenen umhüllten Viren zu inaktivieren. Unter diesen kann man die Hepatitis-Viren, die Retroviren, das Epstein-Barr-Virus, die Zytomegalieviren, die Herpesviren, die Rhabdoviren, die Myxoviren, die Paramyxoviren, die Orthomyxoviren, die Arenaviren und die Coronaviren aufführen. Im Rahmen der Erfindung richtet sich das Verfahren der Erfindung insbesondere an die Retroviren und die Hepatitis-Viren. Die Validierung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann erfolgen, indem in ein Viruspräparat von Interesse eine bekannte Menge von gegenüber einer Inaktivierung besonders stabilen umhüllten Viren, wie beispielsweise das BVD (virale Rinder-Diarrhöe), das PRV (Pseudowut-Virus), das VSV (vesikuläres Stomatitis-Virus), die Retroviren oder HSV (Herpes simplex-Virus), eingeführt wird. Das Inaktivierungsverfahren der Erfindung ist validiert, wenn die Konzentration und/oder die Infektiosität der umhüllten „Test"-Viren auf signifikante Weise verringert wird, d.h. um wenigstens 4 log. Außerdem ist es in dem Maße, wo das Inaktivierungsverfahren der Erfindung in ein globales Verfahren zur Herstellung eines Viruspräparats integriert wird, gleichfalls möglich, eine globale Validierung vorzusehen, die erlaubt, die aus der Gesamtheit der Schritte des Herstel lungsverfahrens resultierende Inaktivierung zu quantifizieren. Ein Validierungsbeispiel des Inaktivierungsschritts wird nachfolgend aufgeführt.
Das erfindungsgemäße Inaktivierungsverfahren findet Anwendung auf ein Viruspräparat, das Adenoviren von Interesse umfasst. Das Verfahren der Erfindung ist ganz besonders geeignet für die Herstellung von replikationsdefekten rekombinanten Adenoviren. „Rekombinant" nimmt Bezug auf die Anwesenheit von einem oder mehreren Genen) von Interesse, das bzw. die unter die Kontrolle der geeigneten Elemente für dessen (deren) Expression in einer Wirtszelle gestellt ist bzw. sind. „Replikationsdefekt" bezeichnet unfähig zu autonomer Replikation in einer Wirtszelle (in Abwesenheit einer Komplementation).
Vorteilhafterweise kodiert das Gen von Interesse eine Antisinn-RNA, ein Ribozym oder ferner ein Polypeptid von Interesse. Es kann aus einem eukaryotischen Organismus, einem Prokaryoten, einem Parasiten oder einem anderen Virus als einem Adenovirus stammen. Es kann durch eine jegliche auf diesem Fachgebiet herkömmliche Technik (durch Klonierung, PCR, chemische Synthese ...) isoliert werden. Es kann vom genomischen Typ (welcher die Gesamtheit oder einen Teil der Gesamtheit der Introns umfasst), vom Typ komplementäre DNA (cDNA, frei von Introns) oder vom gemischten Typ (Minigen) sein. Außerdem kann das Polypeptid, das es kodiert, (i) intrazellulär sein, (ii) in die Membran der Wirtszelle eingebaut oder (iii) sekretiert werden. Es kann sich um ein Polypeptid, wie es in der Natur gefunden wird (nativ), einen Abschnitt von diesem (verkürzt), eine Mutante, die insbesondere verbesserte oder modifizierte biologische Eigenschaften aufweist, oder ferner um ein chimäres Polypeptid, das aus der Fusion von Sequenzen unterschiedlicher Herkunft hervorgeht, handeln.
Unter den Polypeptiden von Interesse, die einsetzbar sind, kann man insbesondere die Chemokine (MIP-1α, MIP-1β, RANTES, DC-CK1, MDC, MCP1 (Proteine der Chemoattraktion der Monozyten), IP10...), die Zytokine (Interferon α, β oder γ, Interleukin (IL), insbesondere IL-2, IL-6, IL-10 oder ferner IL-12, kolonie-stimulierende Faktoren (GM-CSF, C-CSF, M-CSF)...), die zellulären Rezeptoren (die insbesondere durch das HIV-Virus erkannt werden), die Rezeptor-Liganden, die Gerinnungsfaktoren (Faktor VIII, Faktor IX, Thrombin, Protein C), die Wachstumsfaktoren, die proangiogenen Faktoren (FGF für „Fibroblast Growth Factor" (Fibroblastenwachstumsfaktor), VEGF für „Vascular Endothelial Growth Factor" (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor), SH/HGF für „Scatter factor/Hepatocyte growth factor" (Streu- (Scatter)-Faktor/Hepatozyten-Wachstumsfaktor), TGF für „Transforming Growth Factor" (transformierender Wachstumsfaktor), TNF für Tumornekrosefaktor, Angiopoetin), die Enzyme (Urease, Renin, Metalloprotease, Stickoxid-Synthetase NOS, SOD, Katalase, Lecithin-Cholesterol-Acyltransferase LCAT...), die Enzyminhibitoren (α1-Antitrypsin, Antithrombin III, Inhibitoren von viralen Proteasen, PAI-1 für Plasminogenaktivatorinhibitor), die Antigene des Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse I oder II oder Polypeptide, die auf die Expression der entsprechenden Gene einwirken, die Antigene (oder antigenen Peptide), die in der Lage sind, eine Immunantwort zu erzeugen, die Polypeptide, die in der Lage sind, eine Virusinfektion, bakterielle oder parasitäre Infektion oder ihre Entwicklung zu hemmen, die Polypeptide mit Antitumor-Wirkung (Expressionsprodukte der Tumorsuppressorgene, mit Tumoren assoziierte Antigene, ...), die Polypeptide, die positiv oder negativ auf die Apoptose einwirken (Bax, Bcl2, BclX...), die zytostatischen Mittel (p21, p16, Rb), die Immunglobuline in ihrer Gesamtheit oder zu einem Teil (Fab, ScFv...), die Toxine, die Immuntoxine, die Apolipoproteine (ApoAl, ApoAlV, ApoE...), die zytotoxischen Produkte, die anti-angiogenen Faktoren (Angiostatin, Endostatin, PF-4...), die Marker (p-Galactosidase, Luciferase, „Green Fluorescent Protein") oder ein jegliches anderes Polypeptid mit einer therapeutischen Wirkung für die Zielerkrankung aufführen.
Genauer wird man mit dem Ziel, eine vererbte Dysfunktion zu behandeln, eine funktionsfähige Kopie des defekten Gens einsetzen, beispielsweise ein Gen, welches den Faktor VIII oder IX kodiert, im Rahmen der Hämophilie A oder B, Dystrophin (oder Minidystrophin) im Rahmen der Duchenne- und Becker-Muskeldystrophien, Insulin im Rahmen von Diabetes, das Protein CFTR („Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) im Rahmen von Mukoviszidose. Handelt es sich darum, die Initiation oder das Fortschreiten von Tumoren oder Krebserkrankungen zu hemmen, wird man vorzugsweise ein Gen von Interesse einsetzen, das eine Antisinn-RNA, ein Ribozym, ein zytotoxisches Produkt (Thymidinkinase des Herpes simplex-Virus 1 (TK-HSV-1), Ricin, Choleratoxin, Diphtherietoxin, ein Produkt der Hefe-Gene FCY1 und FUR1, die Uracylphosphoribosyltransferase und Cytosindesaminase kodieren, ...), ein Immunglobulin, einen Inhibitor der Zellteilung oder der Translationssignale, ein Expressionsprodukt eines Tumorsuppressorgens (p53, Rb, p73, DCC...), ein Polypeptid, das das Immunsystem stimuliert, ein mit einem Tumor assoziiertes Antigen (MUC-1, BRCA-1, frühe oder späte Antigene eines Papilloma-Virus), kodiert. gegebenenfalls in Kombination mit einem Zytokin-Gen. Schließlich kann man im Rahmen einer anti-HIV-Therapie auf ein Gen zurückgreifen, das ein immunschützendes Polypeptid, ein antigenes Epitop, einen Antikörper (2F5; Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 191–195), die extrazelluläre Domäne des CD4-Rezeptors (sCD4; Traunecker et al., 1988, Nature 331, 84–86), ein Immunadhäsin (beispielsweise ein CD4-Immunglobulin IgG-Hybrid; Capon et al., 1989, Nature 337, 525–531; Bym et al., 1990, Nature 344, 667–670), ein Immunotoxin (beispielsweise eine Fusion des Antikörpers 2F5 oder des Immunadhäsins CD-4-2F5 mit Angiogenin; Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5494–5499), eine transdominante Variante ( EP 0614980 , WO 95/16780), ein zytotoxisches Produkt, wie eines von jenen, die oben erwähnt wurden, oder ferner IFNα oder β kodiert.
Eines der Gene von Interesse kann gleichfalls ein der Selektion dienendes Gen sein, welches erlaubt, die transfizierten oder transduzierten Zellen auszuwählen oder zu identifizieren. Man kann die neo-Gene (welche Neomycinphosphotransferase kodieren), welche eine Resistenz gegen das Antibiotikum G418 verleihen, dhfr (Dihydrofolatreductase), CAT (Chloramphenicolacetyltransferase), pac (Puromycinacetyltransferase) oder ferner gpt (Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase) aufführen. Allgemein sind die der Selektion dienenden Gene den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt.
Im Allgemeinen sind das oder die Gene von Interesse unter die Kontrolle der Regulationselemente, die deren Expression in der Wirtszelle oder dem Wirtsorganismus erlauben, gestellt. Es handelt sich um die Gesamtheit der genetischen Elemente, welche die Transkription eines Gens von Interesse in RNA und die Translation einer mRNA in ein Polypeptid erlauben. Unter jenen kommt dem Promotor eine besondere Bedeutung zu. Er kann aus irgendeinem Gen eukaryotischen oder sogar viralen Ursprungs isoliert werden und kann konstitutiv oder regulierbar sein. Alternativ kann es sich um den natürlichen Promotor des fraglichen Gens handeln. Überdies kann er modifiziert sein derart, dass die Promotoraktivität erhöht wird, eine die Transkription hemmende Region supprimiert ist, ein konstitutiver Promotor regulierbar gemacht wird oder umgekehrt, eine Restriktionsstelle eingeführt wird ... Man kann als Beispiele die eukaryotischen Promotoren der Gene PGK (Phosphoglyceratkinase), MT (Metallothionein; Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838–848), SRα (Takebe et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 466–472), den frühen Promotor des SV40-Virus (Simian Virus), die LTR des RSV (Rous-Sarkom-Virus), den Promotor TK-HSV-1, den frühen Promotor des CMV-Virus (Zytomegalievirus) und die adenoviralen Promotoren E1A und MLP erwähnen.
Ein Promotor, der im Rahmen der Erfindung Verwendung findet, kann gleichfalls die Expression in einer Tumorzelle oder Krebszelle stimulieren. Man kann insbesondere die Promotoren der Gene MUC-1, die bei Brust- und Prostatakrebserkrankungen überexprimiert werden (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775–2782), CEA (für „carcinoma embryonic antigen"), welches bei den Kolonkrebserkrankungen überexprimiert wird (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738–2748), Tyrosinose, die bei Melanomen überexprimiert wird (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860–3864), ERB-2, das bei den Brust- und Pankreaskrebserkrankungen überexprimiert wird (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170–175) und α-Fetoprotein, welches bei Leberkrebserkrankungen überexprimiert wird (Kanal et al., 1997, Cancer Res. 57, 461–465) aufführen. Ein durch hormonale oder exogene Substanzen (Steroid hormone, Tetracycline ... u.s.w.) regulierbarer Promotor ist gleichfalls denkbar (Saez et al., 1997, Current Opinion in Biotechnology 8, 608–616).
Man kann auch auf einen gewebespezifischen Promotor zurückgreifen. Rein zur Veranschaulichung kann man die leberspezifischen Promotoren (der Gene α-1-Antitrypsin, Albumin, FIX, ApoAl...), lungenspezifischen Promotoren (der Gene CFTR, Surfactant), Lymphozyten-spezifischen (Immunglobulin) und muskelspezifischen (β-Actin, Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 426–436; SM22; Moessler et al., 1996, Development 122, 2415–2425, und Desmin, Li et al., 1989, Gene 78, 243–254) Promotoren aufführen.
Überdies können die Regulationselemente außerdem zusätzliche Elemente umfassen, die die Expression oder die Aufrechterhaltung des Gens von Interesse in der Wirtszelle verbessern (Replikationsstartpunkt, Elemente für die Integration in das zelluläre Genom, Intronsequenzen, poly A-Transkriptionsterminationssequenzen, dreiteilige Leadersequenzen...). Diese Elemente sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Außerdem kann das Gen von Interesse gleichfalls strangaufwärts von der kodierenden Region eine Sequenz umfassen, die ein Signalpeptid kodiert, welches dessen Sekretion aus der Wirtszelle erlaubt. Das Signalpeptid kann jenes des fraglichen Gens oder heterolog (Abstammung von irgendeinem sekretierten oder synthetischen Gen) sein.
Das Gen von Interesse kann an irgendeinem Ort des Genoms des nicht-umhüllten Virus, vorteilhafterweise unter Ersetzung der Region E1 oder E3, wenn es sich um ein Adenovirus handelt, inseriert werden. Wenn der rekombinante adenovirale Vektor mehrere Gene von Interesse umfasst, können jene unter die Kontrolle der gleichen genetischen Elemente (polycistronische Kassette, die eine interne Translationsinitiationsstelle vom IRES-Typ für die Reinitiierung der Translation des zweiten Cistrons nutzt) oder von unabhängigen Elementen gestellt werden. In diesem Falle können sie in ein und dieselbe virale Region (beispielsweise unter Ersetzen von E1) oder in unterschiedliche Regionen (beispielsweise unter Ersetzen von E1 und einer anderen deletierten Region) inseriert werden.
Ein defektes Virus kann durch nicht-funktionale Mutation oder durch vollständige oder teilweise Deletion einer für die Virusreplikation essentiellen Region erhalten werden. Man wird vorzugsweise auf einen adenoviralen Vektor zurückgreifen, dem die Gesamtheit oder ein Teil von wenigstens einer für die Replikation essentiellen Region, ausgewählt aus den Regionen E1, E2, E4 und L1 bis L5, fehlt, um dessen Vermehrung innerhalb des Wirtsorganismus oder der Umwelt zu verhindern. Eine Deletion des Hauptteils der E1-Region ist bevorzugt. Sie erstreckt sich vorzugsweise von den Nukleotiden (nt) 454 bis 3328, kann aber gleichfalls zusätzliche Sequenzen 5' und/oder 3' mit umfassen mit der Maßgabe, dass dies nicht mit der Verkapselungsfunktion interferiert. Vorzugsweise ist das Gen plX nicht in der Deletion von E1 enthalten. Eine Deletion, die sich bis zu nt 3510 erstreckt, entspricht diesen Kriterien.
Außerdem kann die Deletion von E1 mit einer oder mehreren anderen Modifikation(en), welche insbesondere die Regionen E2, E4, L1, L2, L3, L4 und/L5 betrifft bzw. betreffen, kombiniert werden mit der Maßgabe, dass die defekten essentiellen Funktionen in trans mittels einer Komplementationslinie und/oder eines Hilfsvirus komplementiert werden. In dieser Hinsicht kann man auf die Vektoren der zweiten Generation, welche hinsichtlich der Funktionen E1 und E4 oder E1 und E2 defekt sind, zurückgreifen (siehe beispielsweise die Internationalen Anmeldungen WO 94/28152 und WO 97/04119). Um diese Ausführungsweise zu veranschaulichen, kann man einen Vektor aufführen, der eine Deletion innerhalb der E1-Region und eine wärmeempfindliche Mutation, welche das Gen DBP (für „DNA Binding Protein" im Englischen) der Region E2A betrifft, (Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328–339), oder eine Deletion von diesem Letzteren kombiniert. Was die Region E4 betrifft, kann sie vollständig oder teilweise deletiert werden. Eine partielle Deletion der Region E4 mit Ausnahme der die offenen Leseraster (ORF) 3 und/oder 6/7 kodierenden Sequenzen ist vorteilhaft mit der Maßgabe, dass sie keine Komplementation der E4-Funktion erforderlich macht (Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037–3048). Eine andere Alternative besteht darin, in dem adenoviralen Gerüst die E4-Sequenzen, die die ORFs 3 und 4 oder die ORFS 3, 6 und 7, die eine günstige Wirkung auf die Expression des Gens von Interesse haben, kodieren, beizubehalten.
Mit dem Ziel, das Klonierungsvermögen zu erhöhen, kann der rekombinante adenovirale Vektor außerdem frei von der Gesamtheit oder einem Teil der nicht-essentiellen E3-Region sein. Gemäß dieser Alternative kann es interessant sein, gleichwohl die E3-Sequenzen zu bewahren, die die Polypeptide, welche es erlauben, dem Immunsystem des Wirts zu entkommen, insbesondere das Glycoprotein gp19k kodieren (Gooding et al., 1990, Crirical Review of Immunology 10, 53–71). Gemäß einer anderen Alternative kann man einen adenoviralen Minimalvektor einsetzen, der im wesentlichen die ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5' und 3' und die Verkapselungsregion beibehält und hinsichtlich der Gesamtheit der viralen Funktionen defekt ist.
Überdies kann die Herkunft des adenoviralen Vektors sowohl aus Sicht der Spezies als auch des Serotyps variiert werden. Er kann sich von dem Genom eines humanen oder tierischen Adenovirus (Hund, Vogel, Rind, Maus, Schaf, Schwein, Affe...) oder ferner einem Hybrid, welches Fragmente von adenoviralen Genomen von wenigstens zwei unterschiedlichen Her künften umfasst, ableiten. Man kann insbesondere die Hunde-Adenoviren CAV-1 und CAV-2, Vogel-DAV oder ferner Rinder-Bad (insbesondere vom Typ 3) aufführen (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128: 171–176; Spibey und Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70:165–172; Jouvenne et al., Gene, 1987, 60:21–28 ; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76:93–102). Indessen wird man einen adenoviralen Vektor humanen Ursprungs, welcher sich von einem Adenovirus vom Serotyp C ableitet, insbesondere vom Typ 2 oder 5 bevorzugen.
Die Erfindung hat gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Viruspräparats, das hauptsächlich nicht-umhüllte Viren enthält, zum Gegenstand, wobei das Verfahren mindestens einen Schritt der Inaktivierung von umhüllten Viren gemäß dem Verfahren der Erfindung umfasst.
Das Verfahren zur Herstellung gemäß der Erfindung umfasst wenigstens:

(a) einen Schritt der Produktion des Viruspräparats in einer geeigneten Zelllinie,
(b) einen Schritt der Ernte des Viruspräparats, das in Schritt (a) produziert wurde, ausgehend von der Produzenten-Zelllinie und/oder dem Kulturüberstand und
(c) gegebenenfalls einen Schritt des Aufbrechens der Zellen der Produzenten-Zelllinie,
(d) gegebenenfalls einen Klärungsschritt,
(e) einen Schritt der Inaktivierung von umhüllten Viren, wie zuvor beschrieben, und
(f) gegebenenfalls einen Reinigungsschritt.

Selbstverständlich kann die Reihenfolge der Schritte variieren, insbesondere was den Inaktivierungsschritt (e) angeht, der unmittelbar nach der Ernte der Viren (Schritt b), nach den optionalen Schritten c) oder d) liegen kann oder ferner in den Reinigungsschritt (f) aufgenommen werden kann.
Wie zuvor angegeben, kann der Schritt (a) aus der Transfektion einer geeigneten Zelllinie mit dem Genom des nicht-umhüllten Virus von Interesse resultieren. Die eingeschleuste virale DNA kann das virale Genom, gegebenenfalls konstruiert in einem Bakterium (WO 96/17070), in einer Hefe (WO 95/03400) oder in einer Zelle, sein. Die Konstruktion erfolgt durch in diesem Fachgebiet klassische Techniken der Molekularbiologie oder der intermolekularen homologen Rekombination. Die DNA kann in die Zelllinie gleichfalls in Form von Fragmenten eingeschleust werden, die einen Teil des Virusgenoms umfassen und eine Region mit Homologie aufweisen, welche erlaubt, das vollständige Genom durch Rekombination zwischen den homologen Sequenzen, die in jedem der Fragmente enthalten sind, zu rekonstituieren (Graham und Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Band 7, S. 109–128; Hrsg. Murey, The Human Press Inc.). Eine andere Alternative besteht darin, die Zelllinie durch eine Virus-Prä-Stammlösung zu infizieren. Die Infektionsbedingungen können durch Virus-Prä-Stammlösung zu infizieren. Die Infektionsbedingungen können durch die Fachleute auf diesem Gebiet definiert werden. Zur Veranschaulichung werden die Zellen mit dem nicht-umhüllten Virus mit einer definierten Infektionsmultiplizität (MOI) (ungefähr 1 bis 20, wenn es sich um ein defektes Adenovirus handelt) infiziert.
Nach Transfektion oder Infektion wird die Kultur vorzugsweise bei 37°C während einer ausreichend langen Zeit, um die Amplifizierung der Viren zu ermöglichen, weitergeführt. Je nach der zu produzierenden Menge Virus wird dieser Schritt in Kulturflaschen, in einem Fermenter oder in einem jeglichen anderen geeigneten Kultursystem ausgeführt. Im Allgemeinen erfolgt die Ernte der nicht-umhüllten Viren zwischen 24 h und 1 Woche nach der Infektion oder Transfektion. Der Zeitpunkt der Ernte kann anhand von mehreren Kriterien bestimmt werden: optimaler Virustiter, Beobachtung einer Zytopathie (Abrundung der Produzentenzellen) und/oder Verringerung des Sauerstoffverbrauchs. Eine Ernte nach 48 h oder 72 h ist bevorzugt. Die Viren werden entweder ausgehend von den Produzentenzellen oder ausgehend von dem Kulturüberstand oder ferner ausgehend von der Gesamtheit aus Zellen und Kulturüberstand gewonnen.
In dem erstgenannten Fall werden die Produzentenzellen geerntet. Es ist bevorzugt, einen Schritt des Aufbrechens der Zellen, im allgemeinen nach Resuspendierung der zellulären Biomasse, auszuführen, um die intrazellulär produzierten Viren freizusetzen. Im Rahmen der Erfindung können alle klassischen Mittel, insbesondere die chemischen und/oder mechanischen Mittel eingesetzt werden. Man kann beispielsweise Einfrier-Auftau-Zyklen, die die Zellmembranen brüchig machen, eine enzymatische Lyse (Einsatz von Enzymen, die die Zellmembranen abbauen) oder chemische Lyse (Einsatz von Detergentien, pH-Schock, osmotischer Schock...) ausführen. Die mechanischen Mittel können aus Ultraschall (Beschallung), Reibung (Glaskugeln DynoMill, BeadMill), Druck- und Scherkräften (Hochdruckhomogenisator French Press), Mikrofluiden (Microfluidics, Newton, MA) oder ferner aus der mechanischen Wirkung von zwei Zylindern, die hydraulische und mechanische Scherkräfte erzeugen (Silverson-Homogenisator) resultieren.
Wenn das Viruspräparat direkt aus dem Kulturmedium geerntet wird, ist es nicht erforderlich, den Schritt des Aufbrechens auszuführen, da der Kulturüberstand direkt geklärt werden kann, um die Zellrückstände zu beseitigen, beispielsweise durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit oder Kaskadenfiltration. In diesem Falle kann die Kultur während einer längeren Dauer weitergeführt werden, um eine maximale Virusausbeute zu garantieren.
Gemäß einer dritten Option kann man den Überstand und die Zellen ernten. In diesem Falle empfiehlt es sich, den Schritt des Aufbrechens, um die intrazellulären Viren freizusetzen, und den Klärungsschritt auszuführen.
Der Klärungsschritt hat zum Ziel, die unlöslichen Anteile (Zellrückstände, Ausflockungen von Makromolekülen ... u.s.w.) zu entfernen. Er kann durch eine jegliche herkömmliche Filtrations- (Tiefenfiltration, tangentiale Mikrofiltration) oder Zentrifugationstechnik (kontinuierlich ....) ausgeführt werden. Es kann klug sein, insbesondere wenn das Viruspräparat sehr konzentriert ist, den Hauptteil der unlöslichen Substanzen zuerst durch Zentrifugation zu entfernen, dann die Klärung durch Tiefenfiltration vorzunehmen. Im Rahmen der Erfindung können zahlreiche Filter eingesetzt werden mit der Maßgabe gleichwohl, dass sie eine Porosität haben, die es erlaubt, das nicht-umhüllte Virus von Interesse passieren zu lassen und die unlöslichen Anteile zurückzuhalten. Es wird angegeben, dass das Adenovirus eine Größe von ungefähr 0,07 bis 0,1 μm aufweist, was die Verwendung von Filtern mit einer höheren Porosität erforderlich macht. Überdies können die Filter aus synthetischem Material (Nylon), organischem Material (Cellulose) oder nicht-organischem Material (Zirconium) bestehen. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsweise führt man aufeinanderfolgende Filtrationen auf Filtern mit abnehmender Porosität aus, beispielsweise zuerst auf einem Filter mit der Porosität 8 μm (Sartorius 5591301P5-00), dann auf einem Filter mit der Porosität 5 μm (Sartorius 5591342P5-00), dann auf einem Filter mit einer Porosität zwischen 3 und 0, 8 μm (Sartorius, Sartoclean CA Kapsel 5621304E9-00-A), dann auf einem Filter mit einer Porosität zwischen 0,8 und 0,65 μm (Sartorius, Sartoclean CA Kapsel 5621305G9-00-A). Gemäß einer anderen Variante kann die Filtration durch tangentiale Mikrofiltration auf ebenen oder Hohlfaser-Membranen mit einer Porosität über der Größe des Adenovirus ausgeführt werden. In dieser Hinsicht können die Membranen Durapore (Millipore) und Omega (Pall) eingesetzt werden.
Der Reinigungsschritt kann durch klassische Techniken des Standes der Technik, beispielsweise durch Ultrazentrifugation (mittels eines Cäsiumchlorid-Gradienten oder andersartigen Gradienten) oder Chromatographie, ausgeführt werden.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsweise umfasst der Reinigungsschritt des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens einen Chromatographieschritt, insbesondere durch Ionenaustausch. Gegebenenfalls kann dieser mit einer Chromatographie einer anderen Art kombiniert werden, insbesondere durch Gelfiltration, um die Reinigung der nicht-umhüllten Viren zu vervollkommnen. Die beiden Chromatographien können in einer beliebigen Reihenfolge ausgeführt werden, man bevorzugt aber gleichwohl, an erster Stelle die Ionenaustausch-Chromatographie, dann die Gelfiltrationschromatographie auszuführen.
Für die Ionenaustauschchromatographie können verschiedene Arten von Trägern eingesetzt werden, wie die Träger auf der Grundlage von Cellulose, von Agarose (Sepharose- oder Macro-Prep-Gele), von Dextran (Sephadex-Gele), von Acrylamid (Sephacryl-, Trisacryl-Gele), von Siliciumdioxid (TSK-, SW-Gele), von Polystyrol-divinylbenzol) (Source- oder Poros-Gele), von Ethylenglycol-Methacrylat-Copolymeren (Toyopearl HW-, TSK-, PW-, Fractogel EMD-Gele) oder von Mischungen, insbesondere von Agarose und von Dextran (Superdex-Gel). Man wird insbesondere die durch die zuständigen amerikanischen Behörden (FDA für „Food and Drug Administration") oder durch die Ämter der Europäischen Union für eine Verwendung beim Menschen oder für eine veterinärmedizinische Verwendung zugelassenen Träger heranziehen. Außerdem muss der herangezogene Träger, vorzugsweise durch kovalente Bindung, mit einer oder mehreren Arten von Gruppen, die in der Lage sind, mit dem zu reinigenden nicht-umhüllten Virus zu interagieren, verknüpft sein (sogenannter funktionalisierter Träger). Es wird eine Gruppe bevorzugt werden, die einen Ionenaustausch erlaubt, welche insbesondere aus einem tertiären oder quartären Amin gebildet wird. Unter den durch tertiäre Amine funktionalisierten Trägem kann man die Fractogel-DEAE (Diethylaminoethyl)-, Fractogel-DMAE (Dimethylaminoethyl)- und die Toyopearl-DEAE-Harze aufführen. Unter den durch quartäre Amine funktionalisierten Trägern kann man die Harze Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ und QE, Streamline QXL (französische Anmeldung 99 02167), die Harze vom Typ Fractogel TMAE und Toyopearl super Q aufführen. Das Harz Poros PI ist ein geeignetes Beispiel für einen mit Polyethylenimin funktionalisierten Träger. Der Träger Fractogel-DEAE wird im Rahmen der Erfindung bevorzugt. Die Säule wird anfänglich unter Salzbedingungen, die die Anheftung der nicht-umhüllten Viren von Interesse an die positiv geladenen funktionellen Gruppen erlauben, äquilibriert. Man setzt vorteilhafterweise einen Puffer ein, der NaCl in einer Endkonzentration von ungefähr 250 mM enthält. Selbstverständlich können die Chromatographiebedingungen aber abhängig von verschiedenen Parametern, insbesondere dem Volumen der Säule, dem gewählten Träger, dem gewählten Virus und der Viruskonzentration, angepasst werden. Die Elution des an den Amingruppen zurückgehaltenen Virus erfolgt, indem die Salzkonzentration zunehmend erhöht wird, vorzugsweise bis auf eine Endkonzentration von 300 bis 400 mM NaCl und ganz und gar bevorzugt zwischen 300 und 350 mM NaCl, und die Fraktionen, die das nicht-umhüllte Virus von Interesse enthalten, können durch jegliche technische Mittel oder Maßnahmen dieses Fachgebiets (spektrophotometrische Messung der Absorption bei 260 und 280 nm, Sichtbarmachung der Peptide oder Virusgenome...) bestimmt werden. Es ist gleichfalls möglich, die Säule mit einem Detektor, der mit einem Filter für die Detektion der Virusfraktionen in Reihe ausgerüstet ist, zu verbinden. Es wird angegeben, dass die Virusfraktion (welche aus DNA und Proteinen gebildet wird) eine charakteristische Absorption bei 260 und 280 nm aufweist, wohingegen die proteinartigen Verunreinigungen lediglich bei 280 nm und die freien Nukleinsäuren bei 260 nm detektiert werden.
Was die Gelfiltrationschromatographie angeht, wird das Virus an einem Träger gereinigt, der einen Durchmesser der Kugeln zwischen 3 und 160 μm, vorteilhafterweise zwischen 5 und 105 μm und vorzugsweise zwischen 10 und 80 μm aufweist. Der Träger hat vorzugsweise eine Porosität nahe der Größe des Virus, damit jenes nicht in die Kugeln eindringt. Im Gegensatz dazu werden alle Moleküle von kleinerer Größe in die Kugeln eindringen und verzögert werden. Es können verschiedene Arten von Trägem verwendet werden, wie die Matrices auf der Grundlage von Agarose (Sepharose), von Dextran (Sephadex-Gel), von Acrylamid (Sephacryl- und Trisacryl-Gele), von Siliciumdioxid (TSK- und SW-Gele), von Ethylenglycol-Methacrylat-Copolymeren (Toyopearl HW-, TSK- und PW-Gele) und von Mischungen, insbesondere von Agarose und von Dextran (Superdex-Gel). Die erwähnten Träger werden vorzugsweise ohne Funktionalisierungsgruppen eingesetzt. Die für die Ausführung des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens besonders geeigneten Träger sind die folgenden:

– Allyldextran-Methylenbisacrylamid-Matrices (Sephacryl S300 HR mit einem Kugeldurchmesser zwischen 25 und 75 μm, Sephacryl S400 HR mit einem Kugeldurchmesser zwischen 25 und 75 μm, Sephacryl S500 HR mit einem Kugeldurchmesser zwischen 25 und 75 μm und Sephacryl S1000 SF mit einem Kugeldurchmesser zwischen 40 und 105 μm; Pharmacia),
– Ethylenglycol-Methacrylat-Matrices (Toyopearl HW 55, Toyopearl HW 65 und Toyopearl HW 75 mit einem Kugeldurchmesser, der von 20 bis 60 μm variiert; Tosohaas),
– N-Acrylaminhydroxylpropandiol-Matrices (Trisacryl mit einem Kugeldurchmesser zwischen 80 und 160 μm; Biosepra) und
– Agarose-Matrices (Macro-Prep SE mit einem Kugeldurchmesser zwischen 20 und 80 μm; Biorad).

Zur Unterrichtung ist der Träger vom Typ Toyopearl HW65F oder HW65S (Porosität 1000 Å) oder Sephacryl S400HR bevorzugt. Die Säule wird in einem Puffer, der Salzbedingungen und einen pH, der die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen dem Träger und dem Virus begrenzt, aufweist, äquilibriert. Man setzt vorteilhafterweise einen 50 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl₂, 2% Saccharose-Puffer mit pH 8,5 ein. Die nicht-umhüllten Viren von Interesse strömen an den Kugeln vorbei, ohne zurückgehalten zu werden, und treten vor den Verunreinigungen mit geringeren Molekulargewichten aus. Die Fraktionen, die diese enthalten, können durch die üblichen Techniken bestimmt werden (Absorption bei 260 und 280 nm, Elektrophoresetechniken, PCR-Techniken...). Es wird festgehalten, dass ein Vorteil des erfindungsge mäßen Herstellungsverfahrens in der Entfernung des Lösemittels und des Solubilisierungsmittels, die in dem erfindungsgemäßen Inaktivierungsverfahren eingesetzt werden, während dieses Schritts (f) besteht. Gemäß einer optionalen Ausführungsweise können die nach dem Reinigungsschritt erhaltenen Virusfraktionen vereinigt und gegebenenfalls gemäß den üblichen Techniken aufkonzentriert werden. Man kann die tangentiale Ultrafiltration und die Diafiltration aufführen. Die Kassetten BioMax PES (Millipore, Referenz PXB300050 oder PXB01MC50) und PLCMK (Millipore, Referenz PXC300050) sind ganz besonders geeignet.
Außerdem kann das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren ergänzende Schritte und insbesondere einen Schritt des Abbaus der Nukleinsäuren (hauptsächlich von zellulärem Ursprung), die in bedeutenden Mengen nach dem Aufbrechen der Zellen vorhanden sind, umfassen. Zu diesem Zweck können alle nicht-spezifischen Restriktionsenzyme vom Typ Endo- oder Exonukleasen eingesetzt werden. Die bevorzugte Methode besteht aber in einer Behandlung mit Benzonase. Zur Unterrichtung setzt man ungefähr 5 bis 50 U/ml Benzonase ein, die optimalen Bedingungen können jedoch durch den Fachmann auf diesem Gebiet je nach dem zu behandelnden Volumen und der Viskosität des Viruspräparats angepasst werden. Die Wirkung der Benzonase kann durch die Verringerung der Konzentration an Nukleinsäuren beurteilt werden, indem eine jegliche in der Literatur offenbarte Methodik angewendet wird. Obgleich die Schritte umgestellt werden können, wird bevorzugt, den Schritt der Behandlung mit Benzonase zwischen den Schritten des Aufbrechens (c) und der Klärung (d) des Herstellungsverfahrens auszuführen. Eine andere Alternative besteht darin, den Behandlungsschritt mit Benzonase und den Inaktivierungsschritt gleichzeitig nach den Schritten des Aufbrechens und der Klärung auszuführen. Außerdem kann die Benzonase gegebenenfalls in Gegenwart von β-Cyclodextrin eingesetzt werden. Dieses Letztere trägt dazu bei, die Lipide auszufällen und kann zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 10% und insbesondere von 1,5% zugesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren kann gleichfalls einen sterilisierenden Filtrationsschritt umfassen, wobei der sterilisierende Filtrationsschritt vorzugsweise nach dem Schritt (f) des Herstellungsverfahrens ausgeführt wird. Man wird vorteilhafterweise auf Filter von 0,22 μm mit einer für das zu behandelnde Volumen angepassten Oberfläche zurückgreifen. Man kann beispielsweise die Filtrationseinheiten vom Typ Minisart (Sartorius, Referenz SM 16534), Sartolab P20 (Sartorius, Referenz 18053D), Millex GF (Millipore, Referenz SLGS025BS), Millex GV (Millipore, Referenz SLGV025BS), Millex GP (Millipore, Referenz SLGPR25LS) oder ferner Spirale Cap (Version Super CQS 92 HS oder HP; Gelman Sciences), Criticap 50 (12995, Gelman Sciences) oder Millipak (Millipore Ref. MPGL04SK2 oder MPGL02SH2) aufführen. Dann kann das Filtrat in eingestellten Dosen bei einer gegebenen Konzentration konditioniert oder abgepackt werden.
Die Qualität, d.h. der Reinheitsgrad des Viruspräparats kann während des gesamten erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens verfolgt werden, indem die restliche Konzentration der Verunreinigungen und die Funktionalität des nicht-umhüllten Virus von Interesse bestimmt werden. In dem ersten Falle und wobei es sich um die bevorzugte Ausführungsweise handelt, kann das Verschwinden des Tween 80 (oder Polysorbat 80) nach dem Schritt (f) anhand der im Europäischen Arzneibuch (1997, S. 1372–1373) empfohlenen Methode mit Hilfe von Kaliumthiocyanat und Chloroform beurteilt werden. Die Menge von TNBP, die in dem Viruspräparat vorhanden ist, kann durch die Gasphasenchromatographietechnik titriert werden, wie in Horowitz et al. (1985, Transfusion 25, 516–522) offenbart. Die restliche Konzentration durch Proteine kann durch eine jegliche Technik zur quantitativen Bestimmung von Proteinen gemessen werden. Eine adäquate Technik ist jene der BCA (Bicinchoninsäure) (Kit Micro BCA Protein Assay Reagent Kit; Pierce, Ref. 23235). Was die aktive virale Komponente angeht, wird die Anzahl von gesamten Partikeln durch Spektrometrie bei einer Wellenlänge von 260 nm in Gegenwart von SDS bestimmt (siehe Shabram et al., 1997, Human Gene Therapy 8, 453–465). Die Funktionsfähigkeit des nicht-umhüllten Virus wird allgemein durch dessen Infektionsvermögen bestimmt, beispielsweise durch Titration der Anzahl von infektiösen Einheiten (siehe Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022–2032). Wenn es sich um ein rekombinantes Virus handelt, kann man gleichfalls die Expression des rekombinanten Gens nach Infektion einer Zielzelle durch Fluoreszenz, immunologische Methoden (ELISA, RIA...), immun-enzymatische Methoden (Western...), Färbungs- oder Lumineszenztechniken ... u.s.w. auswerten.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren richtet sich an Adenoviren. Diese weisen bevorzugt die nachfolgend definierten Eigenschaften auf.
Die Wahl der verschiedenen, für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Zelllinien liegt ohne Weiteres im Vermögen der Fachleute auf diesem Gebiet. Man wird eine Linie auswählen, die für das zurückzuhaltende nicht-umhüllte Virus angepasst ist. Handelt es sich um die bevorzugte Ausführungsweise (replikationsdefektes rekombinantes Adenovirus), wird man eine Komplementationslinie einsetzen, die an die Defekte des Adenovirus, wie sie in der Literatur beschrieben wurden, angepasst ist. Es handelt sich vorzugsweise um eine Linie, die die Funktion E1 komplementiert, wie beispielsweise die Linie 293, die von humanen embryonalen Nierenzellen abstammt und die integriert in ihr Genom das 5'-Ende des Genoms von Ad5 umfasst (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59–72). Es stehen gleichfalls andere Linien, die E1 komplementieren, zur Verfügung (Imler et al., 1996, Gene Therapy 3, 75–84; Fallaux et al., 1996, Human Gene Therapy 7, 215–222; Fallaux et al., 1998, Human Gene Therapy 9, 1909–1917). Wenn die Defekte des Virus gleichfalls die Regionen E2 oder E4 betreffen, kann man auf die Komplementationslinien zurückgreifen, die in Brough et al. (1992, Virology 190, 624), Wang et al. (1995, Gene Therapy 2, 775–783), Yeh et al. (1996, J. Virol. 70, 559–565), Kougliak und Graham (1996, Human Gene Therapy 6, 1575–1586) und Lusky et al. (1998, J. Virol. 72, 2022–2032) und in den internationalen Anmeldungen WO 94/28152 und WO 97/04119 beschrieben sind. Eine andere Alternative beruht auf dem Einsatz eines ergänzenden viralen Elements, welches als „Hilfsvirus" bezeichnet wird, um die defekten Funktionen des nicht-umhüllten Virus von Interesse wenigstens teilweise zu komplementieren. Die Hilfsviren des Standes der Technik bestehen aus einem viralen Genom, bei welchem gegebenenfalls eine essentielle Region, für welche das Virus von Interesse keine Komplementation benötigt oder die durch die Linie bereitgestellt wird, deletiert ist. Eine Komplementationslinie kann allgemein durch Transfektion mit viralen Sequenzen, die die defekte(n) Funktionen) des Virus wiederherstellen, die unter die Kontrolle der für deren Expression in einer geeigneten Zelllinie erforderlichen Elemente gestellt sind, erzeugt werden. In dieser Hinsicht kann diese von einer etablierten Zelllinie von humanem oder tierischem Ursprung, und welche vorzugsweise von einem pharmazeutischen Gesichtspunkt aus annehmbar ist (verwendbar für die in industriellem Maßstab erfolgende Produktion von Produkten, die für eine Verwendung beim Menschen bestimmt sind und die keinen bekannten pathogenen Charakter haben), abstammen. Man kann unter anderem die KB-, HeLa-, Vero- (ATCC CCL-81), BHK- (ATCC CCL-10), A 549- (ATCC CCL-185), MRC5-(ATCC CCL-171), WI-38- (ATCC CCL-75), CHO-, MDCK- und MDBK-Zellen aufführen. Eine im Rahmen der Erfindung geeignete Linie kann sich gleichfalls von einer primären Zelle und insbesondere von Retina- oder Nierenzellen, die einem humanen Embryo entnommen worden sind, ableiten. Man greift bevorzugt auf eine Linie zurück, die sich von einer humanen embryonalen Nierenzelle, einer Retinazelle (insbesondere von humaner embryonaler Retina, HER) oder einem humanen Karzinom (A 549) ableitet.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Viruspräparat, das gemäß dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren erhalten wird, wie auch eine eukaryotische Zelle, die durch ein erfindungsgemäßes Viruspräparat infiziert ist. Es handelt sich vorzugsweise um eine Säugetierzelle und insbesondere humane Zelle. Sie kann primär oder eine Tumorzelle und von beliebigem Ursprung, insbesondere hämopoetisch (totipotente Stammzelle, Leukozyt, Lymphozyt, Monozyt oder Makrophage...), muskulär (Satellitenzelle, Myozyt, Myoblast, glatter Muskel...), kardial, pulmonal, tracheal, hepatisch, epithelial oder ein Fibroblast sein. Es wird angegeben, dass das Präparat der Erfindung sich von jenen des Standes der Technik darin unterscheidet, dass es im wesentlichen frei von infektiösen umhüllten Viren ist.
Die Erfindung betrifft gleichfalls eine Zusammensetzung, die ein Viruspräparat oder eine Wirtszelle gemäß der Erfindung umfasst. Als Wiederholung kann das Viruspräparat ein oder mehrere nicht-umhüllte Viren von Interesse, das bzw. die gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt wird bzw. werden, umfassen. Jene können zu der gleichen Familie gehören (Adenoviren, die ein unterschiedliches rekombinantes Gen tragen) oder nicht. Die Zusammensetzung ist vorzugsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, die wenigstens einen aus pharmazeutischer Sicht annehmbaren Träger enthält.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auf herkömmliche Weise in Hinblick auf eine Verabreichung auf lokalem, parenteralem oder über den Verdauungstrakt erfolgendem Wege hergestellt werden. Die in Betracht zu ziehenden Verabreichungswege sind zahlreich. Man kann beispielsweise den intragastrischen, subkutanen, intrakardialen, intramuskulären, intravenösen, intraarteriellen, intravaskulären, intraperitonealen, intratumoralen, intranasalen, intrapulmonalen oder intratrachealen Weg aufführen. Für diese drei letztgenannten Ausführungsweisen ist eine Verabreichung durch ein Aerosol oder eine Instillation vorteilhaft. Die Verabreichung kann in einer einzigen Dosis oder mittels ein- oder mehrmals nach einem bestimmten Zeitintervall wiederholter Dosen erfolgen. Der Verabreichungsweg und die Virus-Dosen, die geeignet sind, variieren abhängig von verschiedenen Parametern, beispielsweise dem Individuum, der Pathologie, dem zu transferierenden Gen von Interesse, dem Verabreichungsweg. Zur Unterrichtung können die Präparate auf der Basis von adenoviralen Partikeln in Form von Dosen zwischen 10⁴ und 10¹⁴ pfu (Plaque bildende Einheiten), vorteilhafterweise 10⁵ und 10¹³ pfu und vorzugsweise 10⁶ und 10¹² pfu formuliert werden.
Die Formulierung kann gleichfalls ein Verdünnungsmittel, ein Adjuvans oder ein Exzipiens bzw. Vehikel, das aus pharmazeutischer Sicht annehmbar ist, ebenso wie Solubilisierungs-, Stabilisierungs-, Konservierungsmittel umfassen. Eine bevorzugte Zusammensetzung liegt in injizierbarer Form vor. Sie kann in wässriger Lösung, Salzlösung (Phosphat, Mononatrium, Dinatrium, Magnesium, Kalium...) oder isotonischer Lösung formuliert werden. Der in der Internationalen Anmeldung WO 98/02522 beschriebene Formulierungspuffer ist ganz besonders geeignet. Sie kann in einer Einheitsdosis oder in einer Mehrzahl von Dosen in flüssiger oder trockener Form (Pulver, Lyophilisat), die unmittelbar zuvor durch ein geeignetes Verdünnungsmittel rekonstituiert werden können, präsentiert werden.
Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung ist insbesondere für die präventive oder kurative Behandlung von Krankheiten durch Gentherapie (einschließlich einer Immuntherapie) bestimmt und richtet sich insbesondere an die proliferativen Krankheiten (Krebs, Tumore, Dysplasien ... u.s.w.), die Infektionskrankheiten und insbesondere durch Viren verursachte Krankheiten (die durch die Hepatitis B- oder C-Viren, HIV-Viren, Herpes-Viren, Retroviren ... u.s.w. induziert werden), an die genetisch bedingten Krankheiten (Mukoviszidose, Dystrophie, Hämophilie, Diabetes...) und an die Herz-Kreislauf-Erkrankungen (Restenose, Ischämie, Dislipidämie...).
Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf die therapeutische oder prophylaktische Verwendung eines Viruspräparats, einer Wirtszelle, einer Zusammensetzung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels, das für den Transfer und die Expression eines Gens von Interesse in einer) Wirtszelle oder einen bzw. einem Wirtsorganismus bestimmt ist. Das Arzneimittel ist ganz besonders für die Behandlung von Krankheiten durch Gentherapie bestimmt. Gemäß einer ersten Möglichkeit kann es direkt in vivo verabreicht werden (z.B. durch intravenöse Injektion in einen zugänglichen Tumor, in die Lungen durch Aerosol, in das Kreislaufsystem mittels einer geeigneten Sonde). Man kann gleichfalls den ex vivo-Ansatz heranziehen, der darin besteht, dem Patienten Zellen zu entnehmen (Stammzellen des Knochenmarks, Lymphozyten des peripheren Bluts, Muskelzellen...), diese in vitro gemäß den Techniken dieses Fachgebiets zu transfizieren oder zu infizieren und diese dem Patienten nach einem etwaigen Amplifizierungsschritt erneut zu verabreichen. Es kann die Verhütung und die Behandlung von zahlreichen Pathologien in Betracht gezogen werden. Eine bevorzugte Verwendung besteht darin, Krebserkrankungen, Tumore und Krankheiten, die aus einer nicht gewünschten Zellproliferation resultieren, zu behandeln oder zu verhüten. Unter den in Betracht zu ziehenden Anwendungen kann man die Krebserkrankungen der Brust, des Uterus (insbesondere jene, die durch die Papillomaviren induziert werden), der Prostata, der Lunge, der Blase, der Leber, des Kolons, des Pankreas, des Magens, der Speiseröhre, des Kehlkopfs, des Zentralnervensystems und des Bluts (Lymphome, Leukämie u.s.w....) aufführen. Sie ist gleichfalls im Rahmen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen nützlich, beispielsweise für die Hemmung oder Verzögerung der Proliferation der Zellen der glatten Muskulatur der Gefäßwand (Restenose). Was die Infektionskrankheiten betrifft, kann schließlich die Anwendung bei AIDS in Betracht gezogen werden.
Die Erfindung erstreckt sich gleichfalls auf ein Verfahren zur Behandlung von Krankheiten durch Gentherapie, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einem Organismus oder ei ner Wirtszelle, der bzw. die einer solchen Behandlung bedarf, ein Viruspräparat, eine Wirtszelle oder eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung verabreicht.
BEISPIELE
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, ohne deswegen beschränkt zu werden.
Die rekombinanten Adenoviren werden durch die Technik der homologen Rekombination, die in Chartier et al. (1996, J. Virol. 70, 4805–4810) beschrieben wird, konstruiert. Die ausgeführten Konstruktionen erfolgten gemäß den allgemeinen Techniken der Gentechnologie und der molekularen Klonierung, die detailliert in Maniatis et al. (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, oder eine neuere Auflage) beschrieben sind, oder gemäß den Empfehlungen des Herstellers, wenn man einen kommerziellen Kit verwendet. Die Klonierungsschritte setzen den Stamm E. coli 5K (hsdR, mcrA, DH5α[(recA1, endA1, hodR17 (r-m-), supE44 thi-1, gyrA(nalr)] oder NM522 (supE, thi, Δ(lac-proAB), hsd5, (r-m-), (F=proAB, lacl^q, ZΔM15) und jene der homologen Rekombination den Stamm E. coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557–580) ein. Handelt es sich um die Reparatur von Restriktionsstellen besteht die eingesetzte Technik in einem Auffüllen der überhängenden 5'-Enden mit Hilfe des großen Fragments der DNA-Polymerase von E. coli (Klenow, Boehringer Mannheim). Die DNA-Fragmente werden mit Hilfe des DNA-Reinigungskits GeneCleanII^R (Bio101Inc.) gereinigt. Außerdem werden die bei den verschiedenen Konstruktionen eingesetzten Fragmente des adenoviralen Genoms genau gemäß ihrer Position in der Nukleotidsequenz des Genoms von Ad5, wie sie in der Datenbank Genebank unter der Referenz M73260 offenbart wird, angegeben.
Was die Zellbiologie betrifft, werden die Zellen transfiziert oder transduziert und kultiviert gemäß den Standardtechniken, die den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sind. Man greift auf die Zelllinien 293 (ATCC CRL-1573), A549 E1+ (WO 94/28152) und 293-E4ORF6+7 (Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022–2032) zurück. Es versteht sich, dass andere Zelllinien eingesetzt werden können. Die Zellen werden bei 37°C in mit 5% CO₂ angereicherter feuchter Atmosphäre in DMEM-Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco, BRL), ergänzt mit 1 mM Glutamin, 1 % Aminosäuren (Gibco BRL), 40 μg/ml Gentamycin und 10% fötalem Kälberserum (SVF, Gibco BRL) in Kultur gehalten. Die Zellen können gleichfalls in einem Zellkulturreaktor produziert werden. Die Zellen werden gemäß den Techniken dieses Fachgebiets transfiziert (Calciumphosphat-Präzipitation...). Der Titer an infektiösen Einheiten (ie) oder gesamten Viruspartikeln wird gemäß den Techniken dieses Fachgebiets (Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022–2032) bestimmt.
Die folgenden Beispiele wurden mit Hilfe von rekombinanten Adenoviren, die ein Markergen oder ein therapeutisches Gen exprimieren, ausgeführt. Sie leiten sich vom Serotyp Ad5 ab und haben die folgende Struktur:

– AdTG6297 ist ein adenoviraler Vektor der ersten Generation, der hinsichtlich der Funktionen E1 (Deletion der nt 459 bis 3328) und E3 (Deletion des Xbal-Fragments, welches sich von nt 28592 bis 30470 erstreckt) defekt ist, in dessen Genom unter Ersatz der E1-Region eine Expressionskassette des Markergens, welches das GFP-Protein (für „Green Fluorescent Protein") kodiert, inseriert ist. Jenes reagiert bei Anregung durch Licht (485 nm) durch die Emission eines fluoreszierenden Lichts, dessen Intensität man mittels eines Filters (535 nm) misst. Genauer wird die Kassette aus dem CMV-Promotor, gefolgt von einem chimären Intron, von der das GFP-Protein kodierenden Sequenz und der polyA-Sequenz des SV40-Virus gebildet. Die Intronsequenzen werden aus dem Plasmid pCl (Promega Corp., pCl Säugetierexpressionsvektor E1731) isoliert und umfassen die Spleißdonorstelle des Introns 1 des humanen β-Globingens wie auch die Verzweigungsstelle und die Spleißakzeptorstelle des Gens eines Mäuse-Immunglobulins. Die Viruspartikel werden durch Transfektion einer E1-Komplementationslinie (293 oder A549 E1+) mit dem Vektor AdTG6297 produziert und durch aufeinanderfolgende Passagen auf einer permissiven Linie (welche E1 komplementiert) amplifiziert.
– Der Vektor AdTG5643 ist ein Vektor der zweiten Generation, bei dem die Regionen E1 (nt 459 bis 3328), E3 (nt 28592 bis 30470) und E4 (nt 32994 bis 34998) deletiert sind und der das therapeutische humane CFTR-Gen exprimiert. Die Expressionskassette wird aus dem frühen CMV-Promotor, der CFTR-cDNA und der polyA-Sequenz des p-Globingens aus Kaninchen gebildet und wird anstelle der deletierten E1-Sequenzen inseriert. Die Viruspartikel werden durch Transfektion einer E1- und E4-Komplementationslinie (293-E4ORF6+7) mit dem Vektor AdTG5643 produziert und eine Virusstammlösung durch aufeinanderfolgende Passagen auf einer permissiven Linie (welche E1 und E4 komplementiert) gebildet.
– Der Vektor AdTG13383 ist ein Vektor, bei dem die Regionen E1 (nt 459 bis 3511) und E3 (nt 28539 bis 30470) deletiert sind und der das therapeutische humane IL2-Gen exprimiert. Die anstelle der E1-Sequenzen inserierte Expressionskassette wird aus dem frühen CMV-Promotor, dem aus dem Plasmid pCl isolierten synthetischen Intron, der humanes IL-2 kodierenden cDNA und aus der poly A-Sequenz von SV40 gebildet. Die Viruspartikel werden durch Transfektion einer E1-Komplementationslinie mit dem Vektor pTG13383 produziert und eine Virusstammlösung durch aufeinanderfolgende Passagen auf einer permissiven Linie (welche E1 komplementiert) gebildet.

BEISPIEL 1: Herstellung von Viren ausgehend von Komplementationszellen
Die A549-E1+-Zellen werden in Kulturflaschen kultiviert, bis eine Zelldichte von 2,5·10⁵ Zellen/cm² erreicht wird, und werden dann mit einer AdTG6297-Prä-Stammlösung („prestock") mit einer MOI von ungefähr 3 infiziert. Die infizierten Zellen werden 72 h nach der Infektion geerntet und bei geringer Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Bodensatz wird in ungefähr 600 ml Kulturmedium ohne Serum wieder aufgenommen. Das so erhaltene Viruspräparat entspricht einem Volumen von ungefähr 20 l.
Das intrazelluläre Virus wird nach Aufbrechen der Zellen, die 7 bis 10 min einer mechanischen Wirkung eines Silverson-Homogenisators (L4R-Silverson), welcher auf eine Rotationsgeschwindigkeit von 4200 Umdrehungen/min eingestellt wird, unterworfen werden, freigesetzt.
In diesem Stadium ist das Viruspräparat sehr viskos aufgrund der Freisetzung von genomischer DNA infolge des Aufbrechens der Zellen. Man setzt zu dem Viruspräparat ein Volumen eines Puffers zu, welcher eine optimale Wirkung der Benzonase erlaubt und aus 100 mM Tris, 4 mM MgCl₂, 4% Saccharose, pH 8,5, zu welchen man das Solubilisierungsmittel Tween 80 (Merck, Referenz 8-22187-1000) bis zu einer Konzentration von 2% hinzugesetzt hat, gebildet wird. Die Mischung wird bei Umgebungstemperatur unter Bewegung gesetzt, bevor die Benzonase in einer Konzentration von 50 U/ml (Merck, Referenz 101697) hinzugesetzt wird, und man lässt die Reaktion 1 bis 2 h bei Umgebungstemperatur und unter Bewegung ablaufen.
Das so behandelte Viruspräparat wird dann durch Tiefenfiltration in vier aufeinanderfolgenden Schritten geklärt. Die erste Filtration erfolgt durch 8 μm-Filter (Sartorius 5591301P5-00) hindurch, dann auf 5 μm-Filtern (Sartorius 5591342P5-00), dann auf 3 bis 0,8 μm-Filtem (Sartoclean CA Kapsel 5621304E9-00-A) und gefolgt von einer vierten Filtration durch 0,8 bis 0,65 μm-Filter (Sartoclean CA Kapsel 5621305G9-00-A) hindurch.
Der Schritt der Inaktivierung der umhüllten Viren erfolgt durch Einwirkung von TNBP in einer Endkonzentration von 0,3%. Um dies zu tun, wird das Filtrat Volumen auf Volumen in einer Pufferlösung aus 50 mM Tris, 2 mM MgCl₂, 2% Saccharose, 350 mM NaCl und 0,6% TNBP (Aldrich 24-049-4), pH 8,5, verdünnt. Es ist gleichfalls möglich, zu dem filtrierten Viruspräparat 9 Volumen eines konzentrierteren Puffers (50 mM Tris, 2 mM MgCl₂, 2% Saccharose, 1,82 M NaCl und 3% TNBP, pH 8,5) hinzuzusetzen. Es ist anzumerken, dass die eingesetzten Salzbedingungen (250 mM NaCl Endkonzentration) den Äquilibrierungsbedingungen der Ionenaustauschchromatographie entsprechen. Man lässt die Wirkung des TNBP/Tween 80 unter Bewegung (500 Upm) bei Umgebungstemperatur 3 h oder bei 4°C 4 h andauern.
Für den Chromatographieschritt durch Ionenaustausch wird das inaktivierte Viruspräparat auf eine Säule, die Fractogel EMD DEAE (Merck, Referenz 1,16883), welches vorab mit dem Puffer 50 mM Tris, 2 mM MgCl₂, 2% Saccharose, 250 mM NaCl, pH 8,5, äquilibriert worden ist, enthält, aufgetragen. Nach Spülen mit dem Äquilibrierungspuffer werden die an dem Träger absorbierten Bestandteile mit dem vorangegangenen Puffer in Gegenwart von steigenden Salzkonzentrationen (NaCl 300 mM, 350 mM, 400 mM.... u.s.w.) eluiert. Es wird eine Fördermenge von 30 bis 100 cm/h und vorzugsweise 50 cm/h angewendet. Die verschiedenen eluierten Fraktionen werden durch Messung der Absorption bei 260 und 280 nm sichtbar gemacht. Im Allgemeinen werden die Proteine (detektiert allein bei 280 nm) durch den Puffer, welcher 300 mM NaCl enthält, eluiert. Der zweite Elutionspeak (detektiert bei 260 und 280 nm) enthält die Adenoviren von Interesse, die bei einer Salzkonzentration von 350 mM eluiert werden. Die Säule wird in Gegenwart von 1,5 M NaCl regeneriert. Das Fractogel wird regelmäßig durch Hindurchleiten von 0,5 N NaOH sterilisiert.
Die Virusfraktion wird dann auf eine Säule, die Toyopearl HW-65F-Gel (Tosohaas, Referenz 43304 oder 07465) oder 65S-Gel (Tosohaas, Referenz 43354 oder 07467) oder Sephacryl S400HR-Gel (Pharmacia, Referenz 17-0609-10) enthält, die vorab mit dem Puffer 25 mM Tris, 2 mM MgCl₂, 2% Saccharose, pH 8,5, äquilibriert worden ist, aufgetragen. Im Allgemeinen entspricht das injizierte Volumen von Viruspräparat 5 bis 20% des Volumens der Gelfiltrationssäule und die angewandte Fördermenge variiert von 5 bis 100 cm/h mit einer Präferenz für 10 bis 50 cm/h. Das durch die Messung der Absorption bei 280 nm verfolgte Elutionsprofil zeigt, dass der Peak der Adenoviren der erste Peak ist, der beim Austreten aus der Säule erhalten wird.
Der folgende Schritt besteht darin, das Viruspräparat einer Diafiltration zu unterziehen, um dieses in dem Formulierungspuffer konditionieren zu können. Zu diesem Zweck werden die Virusfraktionen vereinigt und man misst den Titer an gesamten Viruspartikeln und an infektiösen Einheiten an einem Aliquot. Wenn der Virustiter ausreichend ist, werden die Viren in dem Formulierungspuffer verdünnt, einer sterilisierenden Filtration auf einem 0,22 μm-Filter (Sartolab P20, Sartorius, Referenz 18053D) unterworfen und in Dosen aufgeteilt. Wenn der Titer zu gering ist, kann das Viruspräparat vorab durch tangentiale Ultrafiltration und/oder Diafiltration mit Hilfe beispielsweise der Kassetten BioMax PES (Millipore, Referenz PXB300050) und PLCMK (Millipore, Referenz PXC300050) aufkonzentriert werden.
In einem repräsentativen Experiment, das ausgehend von einem Viruspräparat von AdTG6297, welches den Marker GFP exprimiert, ausgeführt wurde, ist das Endergebnis hinsichtlich des Virustiters das folgende:

– ie repräsentiert die Anzahl von infektiösen Einheiten
– der Durchfluss repräsentiert das Material, das auf der Säule nicht zurückgehalten wird und das folglich direkt eluiert wird.

Die Erhöhung der Adenovirus-Titer um einen Faktor 3 bis 4 während des Inaktivierungsschritts kann durch eine Auflösung von Aggregaten der Viren in Gegenwart des Lösemittels erklärt werden.
BEISPIEL 2: Herstellung von Viren ausgehend von Zellkultur
Das Beispiel 1 wird wiederholt mit dem Unterschied, dass man 72 h nach der Infektion die Zellen und den Kulturüberstand (Volumen von ungefähr 20 l) erntet und das Ganze direkt dem Schritt des Aufbreches unterworfen wird.
BEISPIEL 3: Inaktivierung von umhüllten Viren
3.1 Validierung an einem Retrovirus-Präparat
Die Wirksamkeit des im Rahmen der Erfindung vorgeschlagenen Inaktivierungsverfahren wird an rekombinanten Retroviren, die das Markergen LacZ, das das Enzym p-Galactosidase kodiert, exprimieren, ausgewertet. Es wird eine Kultur von 20 F500 293-Zellen hergestellt. Nach achtminütiger Zentrifugation bei 3000 Upm werden die Zellen in Medium ohne Serum wieder aufgenommen. Die Präparation enthält 3 × 10⁷ Zellen/ml in einem Volumen von 25 ml. Die Zellen werden mittels des Silverson-Apparats aufgebrochen, dann 10 min bei 3500 Upm zentrifugiert, um die Rückstände zu entfernen. Die Präparation wird dann in zwei Teile geteilt, wobei eine erste Hälfte Volumen auf Volumen in dem Benzonase-Puffer (100 mM Tris, 4 mM MgCl₂, 4% Saccharose, pH 8,5) in Abwesenheit von β-Cyclodextrin verdünnt wird, wohingegen die zweite Hälfte auf gleiche Weise, aber in Anwesenheit von 3% β-Cyclodextrin (1,5% Endkonzentration) behandelt wird. Die Proben werden durch Kaskaden-Filtration auf Minisart (Sartorius)-Filtern von 5 μm (Referenz 17594Q), von 1,2 μm (Referenz 17593Q) und von 0,8 μm (Referenz 17592Q) geklärt. Jede Probe wird dann mit einem Volumen 50 mM Tris, 2 mM MgCl₂, 2% Saccharose, 450 mM NaCl, 0,6% TNBP und 2% Tween 80, pH 8,5, behandelt. Man gibt die retroviralen Partikel bis zu einer Endkonzentration von 1,5 × 10⁶ infektiöse Partikel/ml zu. Der Titer an retroviralen Partikeln wird nach 15 s, 20 min, 1 h, 2 h und 4 h Inkubation entweder bei 4°C oder bei Umgebungstemperatur bestimmt. Die Titration erfolgt durch Zählung der blauen Zellen gemäß der Standardmethodik (siehe beispielsweise US 5,747,323 ).
Die Ergebnisse werden nachfolgend zusammengefasst:
vor der Behandlung: 1,5 × 10⁶ Retrovirus-Partikel/ml
Umgebungstemperatur + β-Cyclodextrin, 15 s Inkubation: <1 × 10³/ml
Umgebungstemperatur- β-Cyclodextrin, 15 s Inkubation: 1 × 10⁴/ml
4°C + β-Cyclodextrin, 15 s Inkubation: < 1 × 10³/ml
Jenseits von 15 s Inkubation liegen die Titer von retroviralen Partikeln unter dem Nachweisschwellenwert (10³ infektiöse Partikel/ml). Die Ergebnisse zeigen, dass das Inaktivierungsverfahren der Erfindung eine Verringerung der Infektiosität der Retroviren um 2 log in 15 s erlaubt. Die Anwesenheit von β-Cyclodextrin ist vorteilhaft, denn dieses verbessert die Inaktivierung der Retroviren um einen zusätzlichen Faktor von 10.
3.2 Validierung eines Adenovirus-Präparats, das mit dem Virus BVD kontaminiert ist.
Man stellt ein Adenovirus-Präparat in kleinem Maßstab (18 ml) gemäß dem in Beispiel 1 eingesetzten Protokoll her. Nach Klärung durch Tiefenfiltration in 4 aufeinanderfolgenden Schritten gibt man 2 ml einer Lösung von BVD-Partikeln zu. Dann führt man den Inaktivierungsschritt in Gegenwart einer Endkonzentration von 0,3% TNBP und 1 % Tween 80 aus. Der Titer von infektösen BVD-Partikeln und adenoviralen Partikeln wird nach 0 min, 15 min, 60 min und 120 min Inkubation bei Umgebungstemperatur bestimmt.
Wir erhalten so eine Inaktivierungskinetik des BVD-Virus:
Dies entspricht einer Verringerung um 4,7 log₁₀ nach 2 h Inaktivierung.
BEISPIEL 4: Herstellung von Viren ausgehend von Komplementationszellen
Die Komplementationszellen für die adenovirale E1-Funktion werden in einem Bioreaktor in Excell 525 (JRH Biosciences)-Medium kultiviert, bis eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml erreicht ist, und werden dann mit einem äquivalenten Volumen einer Prä-Stammlösung von AdTG13383 mit einer MOI von ungefähr 10 infiziert. Die infizierten Zellen werden 72 h nach der Infektion geerntet. Der Kulturüberstand (Volumen ungefähr 20 l) und das Ganze wird direkt dem Schritt des Aufbrechens unterworfen, um das rohe, aufzureinigende Viruspräparat zu erhalten.
Die intrazellulären Viruspartikel werden nach Aufbrechen der Zellen, die 7 bis 10 min der mechanischen Wirkung eines Silverson-Homogenisators (275 UHLS), welcher auf eine Rotationsgeschwindigkeit von 50 Hz (Geschwindigkeit 8,1) eingestellt wird, unterworfen werden, freigesetzt.
Der Klärungsschritt erfolgt durch aufeinanderfolgende Filtrationen auf Filtern mit abnehmender Porosität, an erster Stelle auf einem Filter mit einer Porosität von 8 μm (Sartopure 300PP2 5592501), dann auf einem Filter mit einer Porosität von 5 μm (Sartopure 300 PP3 5592542), schließlich auf einem Filter mit einer Porosität zwischen 3 und 0,8 μm (Sartorius, Sartoclean CA Kapsel 5621304E9-00-A).
Man setzt zu dem geklärten Viruspräparat ein Volumen eines Puffers, der eine optimale Wirkung der Benzonase erlaubt und aus 100 mM Tris, 4 mM MgCl₂, 4% Saccharose, pH 8,5, der darüber hinaus Tween 80 (Merck, Referenz 8-22187-1000) in einer Konzentration von 2% enthält, gebildet wird, hinzu. Die Mischung wird bei Umgebungstemperatur unter Bewe gung gesetzt, bevor die Benzonase in einer Menge von 10 U/ml (Merck, Referenz 101697) hinzugesetzt wird, und man lässt die Reaktion 2 h bei Umgebungstemperatur und unter Bewegung (500 Umdrehg./min) ablaufen. Man kann das geklärte Viruspräparat gleichfalls der gleichzeitigen Einwirkung der Benzonase (Abbauschritt der DNA) und des TNBP/Tween 80 (Inaktivierung der umhüllten Viren) unterwerfen. Dafür wird das TNBP (Aldrich 24-049-40) bis zu einer Endkonzentration von 0,3% zu dem vorangehenden Präparat hinzugesetzt. Die Wirkung des TNBP/Tween 80 erfolgt unter Bewegung (500 Umdrehg./min) während 2 h bei Umgebungstemperatur. Der Titer an infektiösen Einheiten, der nach jedem bedeutenderen Schritt des Verfahrens bestimmt wird, wird in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
Die Zunahme der Adenovirus-Titer um einen Faktor 1,3 während des Inaktivierungsschritts kann durch eine Auflösung von Aggregaten der Viren in Gegenwart des Lösemittels erklärt werden.
BEISPIEL 5: Validierung eines Adenovirus-Präparats, das durch das VSV-Virus verunreinigt ist.
Man stellt ein Adenovirus-Präparat in kleinem Maßstab gemäß dem in Beispiel 4 eingesetzten Protokoll her. Nach Aufbrechen und Klärung durch Tiefenfiltration setzt man zu dem Adenovirus-Präparat (2,5 × 10¹⁰ ie) eine Lösung von VSV-Partikeln (ATCC VR-158, 9,9 log₁₀ TCTID50) zu. Dann führt man den Inaktivierungsschritt in Gegenwart einer Endkonzentration von 0,3% TNBP und von 1 % Tween 80 zu der gleichen Zeit wie den Abbauschritt der Nukleinsäuren in Gegenwart von 10 U/ml Benzonase (Merck, Referenz 101697) aus. Der Titer von infektiösen VSV-Partikeln wird an VERO-Zellen gemäß den Techniken dieses Fachgebiets (Virology Methods Manual 1996, S. 35–40, Hrsg. Mahy und Kangro, Academic Press Ltd. London) nach 0 min, 30 min, 60 min und 120 min Inkubation bei Umgebungstemperatur bestimmt.
Dies entspricht einer Verringerung um 7,5 log₁₀ nach 2 h Inaktivierung.
In ihrer Gesamtheit zeigen die Daten, dass das Verfahren der Erfindung erlaubt, die umhüllten Viren eines Präparats von rekombinanten Adenoviren zu inaktivieren, ohne deren Infektiosität zu beeinträchtigen, und mit einer Gesamtausbeute, die über 100% liegt.

Claims

Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren, die ein Viruspräparat kontaminieren, das hauptsächlich Adenoviren enthält, bei dem man: – in das Viruspräparat eine ausreichende Menge des Lösungsmittels Tri-n-butylphosphat (TNBP) zwischen 0,05 % und 1,0 % (Volumen/Volumen) einschließlich einführt, – das TNBP bei einer Temperatur zwischen + 4 °C und + 37 °C einschließlich bei einem pH zwischen 6,5 und 8,5 einschließlich über eine ausreichend lange Zeit einwirken lässt, um signifikant die Menge an umhüllten Viren, die das Viruspräparat kontaminieren, zu verringern, wobei das Verfahren zur Inaktivierung das Infektionsvermögen der Adenoviren bewahrt.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach Anspruch 1, in dem die Menge an TNBP, die in das Viruspräparat eingeführt wird, zwischen 0,1 und 0,6 % (Volumen/Volumen) einschließlich liegt.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach Anspruch 2, in dem das TNBP in das Viruspräparat in einer Menge von 0,3 % (Volumen/Volumen) eingeführt wird.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das in Anwesenheit eines Solubilisierungsmittels durchgeführt wird, wobei das Solubilisierungsmittel ein Detergens bei einer Konzentration zwischen 0,01 % und 5 % (Volumen/Volumen) einschließlich ist.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach Anspruch 4, in dem das Detergens ein nichtionisches Detergens ist.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach Anspruch 5, in dem das nichtionische Detergens ein Tween ist.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach Anspruch 6, in dem das Tween Tween 80 ist.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, in dem die Detergensmenge, die in das Viruspräparat eingeführt wird, zwischen 0,1 und 2 % (Volumen/Volumen) einschließlich liegt.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, in dem man das TNBP gegebenenfalls in Anwesenheit des Detergens bei einer Temperatur zwischen + 15 °C und + 25 °C einschließlich einwirken lässt.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, in dem man das TNBP gegebenenfalls in Anwesenheit des Detergens bei einem pH von 8,5 einwirken lässt.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, in dem man das TNBP gegebenenfalls in Anwesenheit des Detergens über eine Zeit zwischen 1 h und 5 h einschließlich einwirken lässt.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, das unter Rühren durchgeführt wird.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, in dem man: – in das Viruspräparat TNBP mit einer Endkonzentration zwischen 0,1 und 0,6 % (Volumen/Volumen) einschließlich und Tween 80 mit einer Endkonzentration zwischen 0,5 % und 2 % (Volumen/Volumen) einschließlich einführt, – das TNBP und das Tween 80 bei Umgebungstemperatur – bei einem pH von 8,5 und – über eine Zeit zwischen 1 Stunde und 5 Stunden einschließlich einwirken lässt.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, das unter Leitfähigkeitsbedingungen zwischen 5 und 500 mS/cm einschließlich durchgeführt wird.
Verfahren zur Inaktivierung von umhüllten Viren nach Anspruch 14, in dem die Leitfähigkeitsbedingungen zwischen 10 und 100 mS/cm einschließlich liegen.
Verfahren zur Inaktivierung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, in dem das Adenovirus rekombinant ist.
Verfahren zur Inaktivierung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, in dem das Adenovirus replikationsdefekt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Viruspräparats, das hauptsächlich Adenoviren enthält, welches mindestens einen Schritt der Inaktivierung von umhüllten Viren gemäß einem Verfahren umfasst, das in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 17 definiert ist.
Verfahren zur Herstellung nach Anspruch 18, mindestens umfassend: (a) einen Schritt der Produktion des Viruspräparats in einer geeigneten Zelllinie, (b) einen Schritt der Ernte des Viruspräparats, das im Schritt (a) produziert wurde, ausgehend von der Produzenten-Zelllinie und/oder dem Kulturüberstand und (c) gegebenenfalls einen Schritt des Aufbrechens der Zellen der erzeugenden Zelllinie.
Verfahren zur Herstellung nach Anspruch 19, mindestens umfassend: (a) einen Schritt der Produktion des Viruspräparats in einer geeigneten Zelllinie, (b) einen Schritt der Ernte des Viruspräparats, das im Schritt (a) produziert wurde, ausgehend von der Produzenten-Zelllinie und/oder dem Kulturüberstand, (c) gegebenenfalls einen Schritt des Aufbrechens der Zellen der erzeugenden Zelllinie, (d) gegebenenfalls einen Klärungsschritt, (e) einen Schritt der Inaktivierung von umhüllten Viren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und (f) gegebenenfalls einen Reinigungsschritt.
Verfahren zur Herstellung nach Anspruch 20, in dem der Reinigungsschritt einen Chromatographieschritt umfasst.
Verfahren zur Herstellung nach Anspruch 21, in dem der Chromatographieschritt eine Ionenaustausch-Chromatographie, dann eine Gelfiltrations-Chromatographie umfasst.