ES2323991T3 - Formulacion de adenovirus para terapia genica. - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica acuosa de adenovirus que contiene un poliol en una cantidad defectiva para promover el mantenimiento de la infectividad adenoviral, en donde la composición incluye además Tween-20 o Tween- 80, en donde en el último caso la composición no es una composición que consista de 1 x 10 9 a 1 x 10 3 partículas/ml A/C/N 53, 0,5 a 10 mg/ml de fosfato de sodio monobásico, 0,5 a 10 mg/ml de trometamina, 5 a 25 mg/ml de sacarosa, 20 a 200 mg/ml de glicerol, 0,1 a 1 mg/ml de cloruro de magnesio, 0,03 a 0,3 mg/ml de polisorbato 80 y agua para inyección hasta alcanzar el volumen total.

Description

Formulación de adenovirus para terapia génica.
Antecedentes de la invención
La presente solicitud reivindica prioridad para los contenidos de la Solicitud Estadounidense Provisional de Patente con Serial No. 60/108.606, presentada el 16 de noviembre de 1998 y la Solicitud Estadounidense Provisional de Patente con Serial No. 60/133.116, presentada el 7 de mayo de 1999.
A. Campo de la invención
La presente invención se relaciona generalmente con los campos de la biología molecular, la producción de virus y la terapia génica. Más particularmente, se relaciona con métodos para la formulación de partículas de adenovirus, líquidas y liofilizadas, altamente purificadas, estables durante largos períodos de almacenamiento. Una modalidad importante de la presente invención es el uso de tales preparaciones de virus elaboradas para largos períodos de almacenamiento para tratamientos por terapia génica de enfermedades virales, enfermedades genéticas y neoplasias.
B. Descripción del estado del arte relacionado
Los virus son altamente eficientes en el suministro de ácido nucleico a tipos específicos de células mientras que a menudo evaden la detección por parte del sistema inmune de los huéspedes infectados. Estas características hacen que ciertos virus sean candidatos atractivos como vehículos para el suministro de genes para uso en terapias génicas (Robbins y Ghivizzani; 1998; Cristiano y colaboradores, 1998). Los retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), y virus del herpes simple son ejemplos de virus comúnmente utilizados en terapias génicas. Cada uno de los virus anteriormente mencionados tiene sus ventajas y limitaciones, y se debe seleccionar por lo tanto por su idoneidad para una terapia génica dada (Robbins y Ghivizzani; 1998).
Una cantidad de enfermedades genéticas y cancerosas están siendo tratadas actualmente por medio de terapia génica. La enfermedad cardiovascular (Morishita y colaboradores, 1998), el cáncer colorectal (Fujiwara y Tanaka, 1998), el cáncer de pulmón (Roth y colaboradores, 1998), tumores cerebrales (Badie y colaboradores, 1998), y carcinoma de tiroides (Braiden y colaboradores, 1998) son ejemplos de tratamientos por terapia génica actualmente bajo investigación. Además, el uso de vectores virales en combinación con otros tratamientos para el cáncer también es un camino de la investigación actual (Jounaidi y colaboradores, 1998).
Croyle, M. y colaboradores (1998) Pharmaceutical Development and Technology 383), 373-383 discute factores que influyen sobre la estabilidad de las preparaciones adenovirales, particularmente la escogencia de sistemas amortiguadores apropiados y de crioprotectores (por ejemplo manitol, sacarosa y trehalosa).
Las partículas virales deben mantener su integridad estructural para ser infecciosas y biológicamente activas. La integridad estructural de un vector viral está a menudo comprometida durante el proceso de formulación, excluyendo así su uso como vector para terapia génica. Los adenovirus para terapia génica tradicionalmente han sido formulados en amortiguadores que contienen 10% de glicerol. El adenovirus formulado se almacena a < -60ºC para garantizar una buena estabilidad del virus durante el almacenamiento. Este almacenamiento a temperatura ultra baja no solamente es muy costosa, sino que crea un inconveniente significativo para el almacenamiento, el transporte y el uso clínico. Existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas formulaciones para adenovirus que puedan ser almacenadas en condiciones refrigeradas.
Se ha utilizado ampliamente la liofilización para mejorar la estabilidad de diferentes vacunas virales y de productos de proteína recombinante. Se espera que se puede mejorar la estabilidad para el almacenamiento a largo plazo del adenovirus por medio de la reducción del contenido del agua residual (humedad) en el producto formulado a través de liofilización. Sin embargo, no se han reportado estudios sobre la liofilización del adenovirus vivo para terapia génica.
Generalmente se asume que el adenovirus no mantendrá su infectividad cuando se lo almacena en condición refrigerada en forma líquida durante períodos prolongados de tiempo. Como resultado, no se han reportado estudios sobre formulación y almacenamiento de adenovirus en condición refrigerada en forma líquida. Como resultado, no se han reportado estudios sobre formulación y almacenamiento de adenovirus en forma refrigerada en estado líquido. Por lo tanto, subsiste la necesidad de formulaciones estables almacenadas durante períodos prolongados de tiempo.
Resumen de la invención
Se discute aquí la necesidad de formulaciones virales mejoradas estables durante almacenamiento, y de métodos para la producción de las mismas, para uso en terapia génica. En modalidades particulares, una composición farmacéutica de adenovirus que incluye partículas de adenovirus y excipiente farmacéuticos, incluyendo los excipientes un agente de relleno y uno o más protectores, en donde los excipientes están incluidos en cantidades efectivas para proporcionar una composición de adenovirus que sea estable durante el almacenamiento. En modalidades preferidas, la composición de adenovirus tiene una infectividad entre el 60 y el 100% de la infectividad inicial, y una humedad residual aproximadamente menor al 5%, cuando se almacena durante seis meses a 4º centígrados.
Además se describe una composición de adenovirus que ha sido liofilizada. El agente de relleno en la composición liofilizada del adenovirus puede formar cristales durante la congelación, en donde el agente de relleno es manitol, inositol, lactitol, xilitol, isomaltol, sorbitol, gelatina, agar, pectina, caseína, leche descremada seca, leche entera seca, silicato, carboxipolimetileno, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa o metil celulosa.
El agente de relleno en la composición liofilizada de adenovirus puede ser manitol. En otras modalidades la composición se define adicionalmente como una composición acuosa que incluye manitol en una concentración aproximadamente desde 1% hasta aproximadamente 10% (p/v). En otra modalidad, la composición acuosa incluye al manitol en una concentración aproximadamente desde el 3% hasta el 8%. En una modalidad preferida, la composición acuosa incluye manitol en una concentración aproximadamente desde un 5% hasta un 7%.
La composición liofilizada se puede preparar a partir de una composición acuosa que contiene un agente de relleno en una concentración aproximadamente de 1% a 10% (p/v). La composición liofilizada se puede preparar a partir de una composición acuosa que contiene un agente de relleno en una concentración aproximadamente de 3% a 8%. La composición liofilizada se puede preparar a partir de una composición acuosa que contiene un agente de relleno en una concentración aproximadamente de 5% a 7%.
En modalidades particulares, los excipientes farmacéuticos sirven como protectores. En una modalidad, se define al protector como un crioprotector. En ciertas modalidades, el crioprotector es un azúcar no reductor. En modalidades particularmente definidas el azúcar no reductor es sacarosa o trehalosa. En modalidades preferidas, el azúcar no reductor es sacarosa.
En ciertas modalidades, se define adicionalmente la composición como una composición acuosa que contiene un azúcar no reductor en una concentración aproximadamente desde 2% hasta aproximadamente 10% (p/v). En otras modalidades, la composición acuosa contiene al azúcar en una concentración aproximadamente desde 4% hasta 8%. En aún otras modalidades, la composición acuosa incluye al azúcar en una concentración aproximadamente desde 5% hasta 6%.
La composición liofilizada se puede preparar a partir de una composición acuosa que contiene un azúcar no reductor en una concentración aproximadamente de 2% a 10% (p/v). La composición liofilizada se puede preparar a partir de una composición acuosa que contiene un azúcar reductor en una concentración aproximadamente de 4% a 8%. La composición liofilizada se puede preparar a partir de una composición acuosa que contiene un azúcar no reductor en una concentración aproximadamente de 5% a 6%.
En otra modalidad, los crioprotectores son niacinamida, creatinina, glutamato no sódico, dimetil sulfóxido o sólidos de suero dulce.
En ciertas modalidades, el protector incluye un lioprotector, en donde el lioprotector es albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, PEG, glicina, arginina, prolina, lisina, alanina, polivinil pirrolidina, polivinil alcohol, polidextrano, maltodextrinas, hidroxipropil-beta-ciclodextrina, almidones parcialmente hidrolizados, Tween-20 o Tween-80. En una modalidad preferida, el lioprotector es albúmina de suero humano.
En ciertas modalidades, se define además la composición como una composición acuosa que contiene al lioprotector en una concentración aproximadamente de 0,5% hasta aproximadamente 5% (p/v). En otra modalidad, la composición acuosa incluye al lioprotector en una concentración aproximadamente de 1% hasta aproximadamente 4%. En aún otra modalidad, la composición acuosa incluye al lioprotector en una concentración aproximadamente de 1% hasta aproximadamente 3%.
Se puede preparar la composición liofilizada a partir de una composición acuosa que contiene un lioprotector en una concentración aproximadamente de 0,5% hasta 5% (p/v). Se puede preparar la composición liofilizada a partir de una composición acuosa que contiene un lioprotector en una concentración aproximadamente de 1% hasta 4%. Se puede preparar la composición liofilizada a partir de una composición acuosa que contiene un lioprotector en una concentración aproximadamente de 1% hasta 3%.
En una modalidad, los excipientes farmacéuticos definidos como protectores, incluyen tanto a un lioprotector como a un crioprotector.
La presente invención se relaciona con una composición farmacéutica acuosa de adenovirus que contiene un poliol en una cantidad efectiva para promover el mantenimiento de la infectividad adenoviral en donde la composición incluye además Tween 20 o Tween 80, y en donde en el último caso la composición no es una composición que consista de 1 x 10^{9} a 1 x 10^{13} partículas/ml A/C/N/53, 0,5 a 10 mg/ml de fosfato de sodio monobásico, 0,5 a 10 mg/ml de trometamina, 5 a 25 mg/ml de sacarosa, 20 a 200 mg/ml de glicerol, 0,1 a 1 mg/ml de cloruro de magnesio, 0,03 a 0,3 mg/ml de polisorbato 80 y agua para inyección hasta alcanzar el volumen total. En una modalidad, la infectividad adenoviral de la composición de poliol adenoviral se define adicionalmente manteniendo una infectividad de aproximadamente 70% de PFU/mL hasta aproximadamente 99,9% de PFU/mL de la infectividad inicial cuando se almacena durante seis meses a 4º centígrados. En modalidades preferidas, la infectividad adenoviral es aproximadamente del 80% hasta 95% de PFU/mL de la infectividad inicial cuando se almacena durante seis meses a 4º centígrados.
En el contexto de la presente invención, se define un poliol como un alcohol polihídrico que contiene dos o más grupos hidroxilo. En ciertas modalidades, el poliol es glicerol, propilén glicol, polietilén glicol, sorbitol o manitol, donde la concentración de poliol es aproximadamente de 5% hasta aproximadamente 30% (p/v). En otras modalidades, la concentración de poliol es aproximadamente del 10% hasta aproximadamente 30%. En aún otras modalidades, la concentración de poliol es aproximadamente del 25%.
En una modalidad preferida, la composición farmacéutica acuosa de adenovirus incluye un poliol en una cantidad efectiva para promover el mantenimiento de infectividad adenoviral, donde el poliol es glicerol, inducida en una concentración aproximadamente desde 5% hasta aproximadamente 30% (p/v).
En otras modalidades, la composición farmacéutica acuosa de adenovirus contiene un poliol en una cantidad efectiva para promover el mantenimiento de la infectividad adenoviral que comprende además un excipiente además del poliol, en donde el excipiente es inositol, lactitol, xilitol, isomaltol, gelatina, agar, pectina, caseína, leche descremada seca, leche entera seca, silicato, carboxipolimetileno, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, sacarosa, dextrosa, lactosa, trehalosa, glucosa, maltosa, niacinamida, creatinina, glutamato monosódico, dimetil sulfóxido, sólidos de suero dulce, albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, PEG, glicina, arginina, prolina, lisina, alanina, polivinil pirrolidina, polivinil alcohol, polidextrano, maltodextrinas, hidroxipropil-beta-ciclodextrina, almidones parcialmente hidrolizados, Tween-20 o Tween-80.
En modalidades adicionales definidas, La composición farmacéutica acuosa de adenovirus incluye a un poliol que comprende además del poliol, al menos un primero y un segundo excipientes, en donde el segundo excipiente es diferente del primer excipiente, y el excipiente es inositol, lactitol, xilitol, isomaltol, gelatina, agar, pectina, caseína, leche descremada seca, leche entera seca, silicato, carboxipolimetileno, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, sacarosa, dextrosa, lactosa, trehalosa, glucosa, maltosa, niacinamida, creatinina, glutamato monosódico, dimetil sulfóxido, sólidos de suero dulce, albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, PEG, glicina, arginina, prolina, lisina, alanina, polivinil pirrolidina, polivinil alcohol, polidextrano, maltodextrinas, hidroxipropil-beta-ciclodextrina, almidones parcialmente hidrolizados, Tween-20 o Tween-80.
Adicionalmente se describe un método para la preparación de una formulación de adenovirus estable durante almacenamiento por un período de tiempo prolongado, que comprende las etapas de proporcionar adenovirus y combinar el adenovirus con una solución que contiene un amortiguador, un agente de relleno, un crioprotector y un lioprotector; y liofilizar la solución, por medio de lo cual, la liofilización de la solución produce una torta liofilizada de la formulación del adenovirus que retiene una alta infectividad y una baja humedad residual.
El agente de relleno utilizado para la preparación de la formulación liofilizada del adenovirus puede ser manitol, inositol, lactitol, xilitol, isomaltol, sorbitol, gelatina, agar, pectina, caseína, leche descremada seca, leche entera seca, silicato, carboxipolimetileno, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa o metilcelulosa. El agente de relleno puede ser manitol, en donde el manitol incluye aproximadamente 0,5% hasta aproximadamente 8% (p/v) de la formulación.
El crioprotector utilizado para preparar la formulación liofilizada de adenovirus puede ser sacarosa, dextrosa, lactosa, trehalosa, glucosa, maltosa, niacinamida, creatinina, glutamato monosódico, dimetil sulfóxido o sólidos de suero dulce. El crioprotector puede ser sacarosa, en donde la sacarosa incluye aproximadamente 2,5% hasta aproximadamente 10% (p/v) de dicha formulación.
El lioprotector utilizado para preparar la formulación liofilizada del adenovirus puede ser albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, PEG, glicina, arginina, prolina, lisina, alanina, polivinil pirrolidina, polivinil alcohol, polidextrano, maltodextrinas, hidroxipropil-beta-ciclodextrina, almidones parcialmente hidrolizados, Tween-20 o Tween-80. El lioprotector puede ser albúmina de suero humano.
El amortiguador utilizado para preparar la formulación liofilizada del adenovirus puede ser Tris-HCl, TES, HEPES, mono-Tris, tetrahidrato de brucina, EPPS, tricina, o histidina, en donde el amortiguador está presente en la formulación en una concentración aproximadamente desde 1 mM hasta 50 mM. El amortiguador utilizado para preparar la formulación liofilizada del adenovirus puede ser Tris-HCl, en donde el Tris-HCl esta incluido en una concentración aproximadamente desde 1 mM hasta aproximadamente 50 mM. El Tris-HCl puede ser incluido en una concentración aproximadamente desde 5 mM hasta aproximadamente 20 mM. La formulación liofilizada del adenovirus puede incluir además sal seleccionada del grupo que consiste de MgCl_{2}, MnCl_{2}, CaCl_{2}, ZnCl_{2}, NaCl y KCl.
La liofilización de la formulación de adenovirus se puede llevar a cabo en presencia de un gas inerte.
El método para preparar la formulación liofilizada del adenovirus, en donde la liofilización de la solución comprende las etapas de, congelar la solución, someter la solución a un vacio y someter la solución al menos a un primero y a un segundo ciclos de secado, donde el segundo ciclo de secado reduce el contenido de humedad residual de la torta liofilizada aproximadamente a menos del 2%.
En otra modalidad, un método para la preparación de una formulación líquida estable de adenovirus para almacenamiento durante un período prolongado de tiempo, comprende las etapas de suministrar adenovirus y combinar el adenovirus con una solución que contiene un amortiguador y un poliol, por medio del cual la formulación líquida del adenovirus retiene una alta infectividad.
Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debe entender sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades preferidas de la invención, tienen únicamente el propósito de ilustración, ya que diferentes modificaciones serán evidentes para aquellos capacitados en el arte a partir de esta descripción detallada.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente descripción y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede ser mejor entendida por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas aquí.
Fig. 1. Ciclo de Liofilización del Adenovirus.
Fig. 2. Humedad Residual del Adenovirus Liofilizado Después del Secado Secundario a 10ºC.
Fig. 3. Estabilidad del Adenovirus Liofilizado Después del Secado Secundario a 10ºC.
Fig. 4. Humedad Residual del Adenovirus Liofilizado Después del Secado Secundario a 30ºC.
Fig. 5. Estabilidad del Adenovirus Liofilizado Después del Secado Secundario a 30ºC.
Fig. 6. Análisis por HPLC del Adenovirus Liofilizado Almacenado a Temperatura Ambiente.
Fig. 7. Análisis por HPLC del Adenovirus Liofilizado Almacenado a 4ºC.
Fig. 8. Análisis por HPLC del Adenovirus Liofilizado Almacenado a -20ºC.
Fig. 9A y Fig. 9B. La adición de DMSO a la formulación para que un vector adenoviral incremente la eficiencia de la transducción. Se realizaron xenotransplantes de NSCLC humano sobre los flancos de ratones desnudos. Los animales recibieron una inyección intratumoral de 2 x 10^{10} partículas virales (vp) de Ad-\betagal formuladas ya sea en PBS + glicerol (Fig. 9A y Fig. 9B, paneles superiores) o en PBS + glicerol + DMSO al 5% (Fig. 9A y Fig. 9B, paneles inferiores). Se extirparon los tumores ya sea a las 24 horas (Fig. 9A) o a las 48 horas (Fig. 9B) después de la inyección y se los seccionó para análisis histoquímico de la expresión del gen reportero. Se realizó el análisis histoquímico sobre secciones múltiples del bloque del tumor para analizar la transducción y distribución del vector. Se ilustran dos secciones para cada formulación: una de la periferia del tumor (Fig. 9A y Fig. 9B, paneles izquierdos) y una del centro del tumor (Fig. 9A y Fig. 9B, paneles derechos). En cada sección, tanto la transducción (indicada por la intensidad de la coloración azul) como la distribución (indicada por el grado de la coloración azul) fueron mejoradas por medio de la adición de DMSO a la formulación.
Descripción de las Modalidades Ilustrativas
La necesidad de formulaciones estables de virus durante períodos prolongados de tiempo que pueden ser almacenadas a temperaturas de refrigeración o por encima de ellas sin pérdida de infectividad es muy deseable. Los métodos tradicionales de almacenamiento a temperaturas ultra bajas (\leq -60ºC) de preparaciones de virus a menudo limitan el almacenamiento, el transporte y las aplicaciones clínicas de los virus. Los inventores han desarrollado formulaciones óptimas de liofilización para liofilización del adenovirus en las cuales los productos liofilizados mantienen su estabilidad (esto es, infectividad del 60-100% de la infectividad inicial) y tienen una humedad residual aproximadamente menor al 5% cuando se almacenan durante 6 meses a 4ºC.
En otra modalidad, los inventores han desarrollado formulaciones estables de adenovirus durante largo tiempo para almacenar el adenovirus a 4ºC en una forma líquida que mantiene la estabilidad (esto es, infectividad del 60-100% de la infectividad inicial) durante al menos 6 meses.
A. Técnicas de Purificación
Un proceso a gran escala para la producción y purificación de adenovirus está descrita en la patente estadounidense con serial No. 08/975.519 presentada el 20 de noviembre de 1997 (específicamente incorporada aquí como referencia sin cláusula de exención de responsabilidad). Este proceso de producción no solamente ofrece escalabilidad y la posibilidad de validación sino también una pureza del virus comparable con aquella lograda utilizando ultracentrifugación por gradiente de CsCl. Este proceso involucra la preparación de partículas de adenovirus recombinante, donde el proceso incluye la preparación de un cultivo de células productoras por medio de la siembra de las células productoras en un medio de cultivo, infectando las células en el cultivo después del crecimiento en la fase media logarítmica con un adenovirus recombinante que incluye un gen recombinante seleccionado operativamente enlazado a un promotor, cosechando las partículas de adenovirus recombinante del cultivo celular y removiendo los ácidos nucleicos contaminantes. Un aspecto importante de este proceso es la remoción de ácidos nucleicos contaminantes utilizando nucleasas. Los ejemplos de nucleasas incluyen Benzonasa®, Pulmozyme®; o cualquier otra ADNasa o ARNasa comúnmente utilizados dentro del estado del arte.
Las enzimas tales como Benzonasa® degradan al ácido nucleico y no tienen actividad proteolítica. La habilidad de la Benzonasa® para hidrolizar rápidamente ácidos nucleicos hace a la enzima ideal para reducir la viscosidad del lisado celular. Se sabe bien que los ácidos nucleicos pueden adherirse a partículas derivadas de las células tales como los virus. La adhesión puede interferir con la separación debido a aglomeración, cambio en el tamaño de partícula o cambio en la carga de la partícula, dando como resultado, si acaso, una pequeña recuperación de producto con un esquema dado de purificación. Benzonasa® es adecuada para reducir la carga de ácido nucleico durante la purificación, eliminando así la interferencia y mejorando el rendimiento.
Como con todas las endonucleasas, la Benzonasa® hidroliza los enlaces fosfodiéster internos entre nucleótidos específicos.
Después de la digestión completa, todos los ácido nucleicos libres presentes en la solución se reducen hasta oligonucleótidos de 2 a 4 bases de longitud.
La presente invención emplea además, una cantidad de técnicas diferentes de purificación para purificar vectores virales de la presente invención. Tales técnicas incluyen a todas aquellas con base en sedimentación y cromatografía que se describen aquí con más detalle más adelante.
1. Centrifugación en Gradiente de Densidad
Existen dos métodos de centrifugación en gradiente de densidad, la técnica zonal de velocidad y la técnica isopícnica (igual densidad), y ambas pueden ser utilizadas cuando se requiere la separación cuantitativa de todos los componentes de una mezcla de partículas. Estos son también utilizados para la determinación de densidades por flotación y para la estimación de los coeficientes de sedimentación.
La separación de partículas por medio de la técnica zonal de velocidad se basa en las diferencias en tamaño o en las velocidades de sedimentación. La técnica involucra colocar cuidadosamente una capa de una solución de muestra en la parte superior de un gradiente realizado por densidad de líquidos, donde la densidad más alta excede aquella de las partículas más densas que van a ser separadas. Se centrifuga luego la muestra hasta obtener el grado deseado de separación, esto es, durante un tiempo suficiente para que las partículas viajen a través del gradiente para formar zonas discretas o bandas que están espaciadas de acuerdo con las velocidades relativas de las partículas. Ya que la técnica depende del tiempo, se debe terminar la centrifugación antes de que cualquiera de las zonas separadas precipite hasta el fondo del tubo. El método ha sido utilizado par la separación de enzimas, hormonas, híbridos de ADN-ARN, subunidades ribosomales, organelos subcelulares, para el análisis de distribución por tamaño de las muestras de polisomas y para las fracciones de lipoproteína.
Se coloca una capa de la muestra en la parte superior de un gradiente continuo de densidad que abarca todo el rango de las densidades de partícula que van a ser separadas. La densidad máxima del gradiente, por lo tanto, debe exceder siempre la densidad de la partícula más densa. Durante la centrifugación, ocurre la sedimentación de las partículas hasta que la densidad de flotación de la partícula y la densidad del gradiente son iguales (esto es, donde p_{p} = p_{m} en la ecuación 2.12). En este punto no ocurre más sedimentación, independientemente de cuento tiempo más dure la centrifugación, ya que las partículas están flotando sobre un cojín de material que tiene una densidad superior a la propia de las partículas.
La centrifugación isopícnica, al contrario de la técnica zonal de velocidad, es un método de equilibrio, las partículas forman bandas para formar zonas cada una con su propia característica de densidad de flotación. En los casos en los cuales, quizás, no se requieren todos los componentes en una mezcla de partículas, se puede seleccionar un rango de gradiente en el cual los componentes no deseados de la mezcla se sedimentarán hasta el fondo del tubo de centrífuga mientras que las partículas de interés sedimentan a sus respectivas posiciones isopícnicas. Tal técnica involucra una combinación tanto del enfoque zonal de velocidad como del enfoque isopícnico.
La centrifugación isopícnica depende únicamente de la densidad de flotación de la partícula y no de su forma o de su tamaño y es dependiente del tiempo. Ya que las proteína solubles, que tienen una densidad muy similar (por ejemplo, p = 1,3 g cm^{-3} en solución de sacarosa), usualmente no pueden ser separadas por este método, mientras que los organelos subcelulares (por ejemplo, el aparato de Golgi, p = 1,11 g cm^{-3}, la mitocondria, p = 1,19 g cm^{-3} y los peroxisomas, p = 1,23 g cm^{-3} en solución de sacarosa) pueden ser efectivamente separados.
Como alternativa a la colocación de una capa de la mezcla de partículas que van a ser separadas sobre un gradiente realizado, se mezcla inicialmente la muestra con el medio del gradiente para producir una solución de densidad uniforme, formándose "por si solo" el gradiente, por equilibrio de sedimentación, durante la centrifugación. En este método (denominado el método de equilibrio de isodensidad), se hace uso generalmente de las sales de metales pesados (por ejemplo, cesio o rubidio), sacarosa, sílice coloidal o Metrizamida.
La muestra (por ejemplo, ADN) se mezcla en forma homogénea, por ejemplo, con una solución concentrada de cloruro de cesio. La centrifugación de la solución concentrada de cloruro de cesio conduce a la sedimentación de las moléculas de CsCl para formar un gradiente de concentración y por lo tanto un gradiente de densidad. Las moléculas de la muestra (ADN), que inicialmente se distribuyen uniformemente a través del tubo ahora o bien suben o se sedimentan hasta que alcanzan una región donde la densidad de la solución es igual a su propia densidad de flotación, esto es, su posición isopícnica, donde ellas se agruparán para formar zonas. Este técnica sufre de la desventaja de que a menudo se requieren períodos de centrifugación muy largos (por ejemplo, 36 a 48 horas) para establecer el equilibrio. Sin embargo, es comúnmente utilizada en centrifugación analítica para determinar la densidad de flotación de una partícula, la composición básica del ADN bicatenario y para separar las formas lineales de las circulares
del ADN.
Muchas de las separaciones se pueden mejorar incrementando las diferencias de densidad entre las diferentes formas de ADN por medio de la incorporación de isótopos pesados (por ejemplo, ^{15}N) durante la biosíntesis, una técnica utilizada por Leselson y Stahl para elucidar el mecanismo de replicación del ADN en Escherichia coli, o por medio del enlazamiento de iones metálicos pesados o colorantes tales como bromuro de etidio. Se han utilizado también gradientes isopícnicos para separar y purificar virus y analizar lipoproteínas de plasma humano.
2. Cromatografía
Las técnicas de purificación son bien conocidas por aquellos capacitados en el arte. Estas técnicas tienden a involucrar el fraccionamiento del ambiente celular (por ejemplo centrifugación en gradiente de densidad) para separar las partículas de adenovirus de otros componentes de la mezcla. Habiendo separado las partículas adenovirales de los otros componentes, se puede purificar el adenovirus utilizando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr la purificación completa. Los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de una partícula adenoviral pura de la presente invención son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño y electroforesis en gel de poliacrilamida. Un método de purificación particularmente eficiente para ser empleado junto con la presente invención es HPLC.
Ciertos aspectos de la presente invención se relacionan con la purificación, y en modalidades particulares, con la purificación sustancial de una partícula adenoviral. El término "purificado" como se lo utiliza aquí, pretende hacer referencia a una composición, que puede ser aislada de otros componentes, en donde la partícula adenoviral es purificada en cualquier grado con relación a su forma obtenible en forma natural. Una partícula adenoviral purificada se refiere por lo tanto también a un componente adenoviral, libre del ambiente en el cual puede presentarse en forma
natural.
Generalmente, "purificado" se referirá a una partícula adenoviral que ha sido sometida a fraccionamiento para remover diferentes otros componentes, y cuya composición retiene sustancialmente su actividad biológica expresada. En donde se utiliza el término "sustancialmente purificado", esta designación se referirá a una composición en la cual la partícula, proteína o péptido forma el componente principal de la composición, tal como constituir aproximadamente un 50% o más de los constituyentes en la composición.
Aquellos capacitados en el arte conocerán diferentes métodos para cuantificar el grado de purificación de una proteína o péptido, a la luz de la presente descripción. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa, o evaluar la cantidad de polipéptidos dentro de una fracción por medio de análisis SDS/PAGE. Un método preferido para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, para compararla con la actividad específica del extracto inicial, y calcular así el grado de pureza, evaluado aquí por medio del "número de veces que se logró la purificación". Las unidades actuales utilizadas para representar la cantidad de actividad dependerán, desde luego, de la técnica particular del ensayo escogida para seguir la purificación y de si la proteína o el péptido expresados exhiben una actividad detectable.
No existe un requerimiento general de que el adenovirus sea suministrado en su estado más purificado. En realidad, se prevé que los productos sustancialmente menos purificados tendrán utilidad en ciertas modalidades. La purificación parcial se puede lograr por medio del uso de menos etapas de purificación en combinación, o por medio de la utilización, de diferentes formas del mismo esquema general de purificación. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC generalmente dará como resultado una mayor purificación que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía a baja presión. Los métodos que exhiben un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto proteínico, o en mantener la actividad de la proteína expresada.
Desde luego, se entiende que las técnicas cromatográficas y otras técnicas de purificación conocidas por aquellos capacitados en el arte pueden también ser empleadas para purificar proteínas expresadas por medio de los vectores adenovirales de la presente invención. La cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía líquida de alto rendimiento son ejemplos de técnicas de purificación empleadas en la purificación de partículas adenovirales y se las describe más detalladamente aquí más adelante.
a. Cromatografía de Intercambio Iónico
El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que la afinidad de una sustancia por el intercambiador depende tanto de las propiedades eléctricas del material como de la afinidad relativa de otras sustancias cargadas en el solvente. Por lo tanto, el material enlazado puede ser eluido cambiando el pH, alterando así la carga del material, o por medio de la adición de materiales que compiten, entre las cuales las sales son solamente un ejemplo. Debido a que sustancias diferentes tienen diferentes propiedades eléctricas, las condiciones para la liberación varían con cada especie molecular enlazada. En general, para obtener una buena separación, los métodos de escogencia son o bien una elución continua en gradiente de fuerza iónica o una elución por etapas. (Usualmente no es utiliza un gradiente de pH debido a que es difícil establecer un gradiente de pH sin incrementar simultáneamente la fuerza iónica). Para un intercambiador aniónico, se incrementan gradualmente tanto el pH como la fuerza iónica o solamente se incrementa la fuerza iónica. Para un intercambiador catiónico, se incrementan tanto el pH como la fuerza iónica. La escogencia actual del procedimiento de elución es usualmente el resultado de prueba y error y de consideraciones de estabilidad. Por ejemplo, para materiales inestables, es mejor mantener bastante constante el pH.
Un intercambiador iónico es un sólido que tiene grupos cargados enlazados químicamente a los cuales se enlazan iones electrostáticamente; puede intercambiar estos iones por iones en solución acuosa. Los intercambiadores iónicos se pueden utilizar en cromatografía de columna para separar moléculas de acuerdo con la carga; actualmente son usualmente importantes otras características de la molécula para que el comportamiento cromatográfico sea sensible a la densidad de la carga, a la distribución de carga, y el tamaño de la molécula.
El principio de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas cargadas sec adsorben a los intercambiadores iónicos en forma reversible de tal manera que las moléculas se puedan enlazar o ser eluidas cambiando el ambiente iónico. La separación sobre intercambiadores iónicos se logra usualmente en dos etapas: primero, las sustancias que van a ser separadas se enlazan al intercambiador, utilizando condiciones que permitan un enlace estable y firme; luego se eluye la columna con amortiguadores de diferente pH, fuerza iónica, o composición y los componentes del amortiguador compiten con el material enlazado por los sitios de enlazamiento.
Un intercambiador iónico es usualmente una red tridimensional o matriz que contiene grupos cargados covalentemente enlazados. Si un grupo está negativamente cargado, intercambiará iones positivos y es un intercambiador catiónico. Un grupo típico usado en intercambiadores catiónicos es el grupo sulfónico, SO_{3}^{-}. Si un H^{+} está enlazado al grupo, se dice que el intercambiador está en forma ácida; puede, por ejemplo, intercambiar un H^{+} por un Na^{+}, o dos H^{+} por un Ca^{2+}. El grupo de ácido sulfónico es llamado un intercambiador de cationes fuertemente ácido. Otros grupos comúnmente utilizados son el hidroxilo y el carboxilo fenólicos, ambos intercambiadores de cationes débilmente ácidos. Si el grupo cargado es positivo, por ejemplo, un grupo amino cuaternario, es un intercambiador aniónico fuertemente básico. Los intercambiadores aniónicos débilmente básicos más comunes son grupos amino aromáticos o alifáticos.
La matriz se puede elaborar de diferentes materiales. Los materiales comúnmente utilizados son dextrano, celulosa, agarosa y copolímeros de estireno y de vinil benceno en los cuales el divinil benceno no solo entrelaza las cadenas de poliestireno sino que contiene los grupos cargados. La Tabla 1 muestra la composición de muchos intercambiadores iónicos.
La capacidad total de un intercambiador iónico mide su habilidad para fijar grupos intercambiables por miligramo de peso seco. Este número es suministrado por el fabricante y es importante ya que, si se excede la capacidad, los iones pasarán a través de la columna sin enlazarse.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
1 
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La capacidad disponible es la capacidad bajo condiciones experimentales particulares (esto es, pH, fuerza iónica). Por ejemplo, el grado en el cual un intercambiador iónico se carga depende del pH (el efecto del pH es menor con intercambiadores iónicos fuertes). Otro factor es la fuerza iónica ya que iones pequeños cerca de los grupos cargados compiten con la molécula de la muestra por estos grupos. Esta competición es muy efectiva si la muestra es una macromolécula ya que entre más alto el coeficiente de difusión del ion pequeño significa un mayor número de encuentros. Claramente, en la medida en que se incrementa la concentración del amortiguador, la competición se torna aguda.
La porosidad de la matriz es una característica importante ya que los grupos cargados están tanto dentro como fuera de la matriz y porque la matriz también actúa como tamiz molecular. Las moléculas grandes pueden ser incapaces de penetrar los poros; de modo que la capacidad disminuirá con el incremento de las dimensiones moleculares. La porosidad de las resinas con base en poliestireno está determinada por la cantidad de entrelazamiento por parte del divinil benceno (la porosidad disminuye con cantidades crecientes de divinil benceno). Con las series Dowex y AG, el porcentaje de divinil benceno se indica por medio de un número después de una X; por lo tanto, Dowex 50-X8 es 8% de divinil benceno.
Los intercambiadores iónicos vienen en una variedad de tamaños de partícula, llamados tamaño de malla. Malla fina significa una mayor proporción superficie a volumen y por lo tanto una mayor capacidad y un menor tiempo para que ocurra el intercambio para un volumen dado del intercambiador. Por otro lado, malla fina significa una menor velocidad de flujo, que puede aumentar la propagación de la difusión. El uso de partículas muy finas, aproximadamente 10 \mum de diámetro y alta presión para mantener un flujo adecuado es llamada cromatografía líquida de alto rendimiento o de alta presión, o simplemente HPLC. Tal variedad de intercambiadores que tienen propiedades tan diferentes, carga, capacidad, porosidad, malla, hace difícil la selección más apropiada para lograr una separación particular. A continuación se describe en los siguientes Ejemplos cómo decidir el tipo de material de la columna y las condiciones para el enlazamiento y la elución.
Existe una cantidad de posibilidades de escogencia cuando se emplea como técnica la cromatografía de intercambio iónico. La primera escogencia que debe hacerse es si el intercambiador es aniónico o es catiónico. Si los materiales que van a ser enlazados a la columna tienen una sola carga (esto es, más o menos), la escogencia es clara. Sin embargo, muchas sustancias (por ejemplo, proteínas, virus), trasportan tanto cargas negativas como positivas y la carga neta depende del pH. En tales casos, el factor primario es la estabilidad de la sustancia a diferentes valores de pH. La mayoría de las proteínas tiene un rango de pH de estabilidad (esto es, en el cual ellas no se desnaturalizan) en el cual ellas están cargadas tanto positivamente como negativamente. Por lo tanto, si una proteína es estable a valores de pH por encima del punto isoeléctrico, se debe utilizar un intercambiador aniónico; si es estable a valores por debajo del punto isoeléctrico, se requiere un intercambiador catiónico.
La escogencia entre intercambiadores fuertes y débiles se basa también en el efecto del pH sobre la carga y la estabilidad. Por ejemplo, si se cromatografía una sustancia débilmente ionizada que requiere de un pH muy bajo o muy alto para su ionización, se requiere un intercambiador iónico fuerte para que actúe sobre el rango completo de pH. Sin embargo, si la sustancia es lábil, se prefieren intercambiadores iónicos débiles debido a que los intercambiadores fuertes son a menudo capaces de distorsionar una molécula tanto que se desnaturaliza. El pH al cual es estable la sustancia debe, desde luego, ir acompañada por el rango estrecho de pH en el cual se carga el intercambiador débil particular. Los intercambiadores iónicos débiles son también excelentes para la separación de moléculas con una carga alta de aquellos con una carga pequeña, debido a que los iones débilmente cargados usualmente no se enlazan. Los intercambiadores débiles también muestran mayor resolución de sustancias si las diferencias de carga son muy pequeñas. Si una macromolécula tiene una carga muy fuerte, puede ser imposible eluirla de un intercambiador fuerte y nuevamente puede ser preferible un intercambiador débil. En general, los intercambiadores débiles son más útiles que los intercambiadores fuertes.
Los intercambiadores Sefadex y Bio-gel ofrecen una ventaja particular para macromoléculas que son inestables en fuerza iónica baja. Debido a que el entrelazamiento en estos materiales mantiene la insolubilidad de la matriz inclusive si la matriz es altamente polar, la densidad de los grupos ionizables puede hacerse varias veces superior de lo que es posible con los intercambiadores iónicos de celulosa. La mayor densidad de carga significa mayor afinidad de tal manera que se puede llevar a cabo la adsorción con fuerzas iónicas superiores. Por otro lado, estos intercambiadores retienen algo de sus propiedades como tamiz molecular de modo que algunas veces las diferencias de peso molecular anulan la distribución provocada por las diferencias de carga; el efecto como tamiz molecular puede mejorar también la separación.
Las moléculas pequeñas se separan mejor sobre matrices con tamaño de poro pequeño (alto grado de entrelazamiento) debido a que la capacidad disponible es grande, mientras que las macromoléculas necesitan tamaño de poro grande. Sin embargo, excepto por la matriz tipo Sefadex, la mayor parte de los intercambiadores iónicos no permiten la oportunidad para hacer corresponder la porosidad con el peso molecular.
Los intercambiadores iónicos de celulosa han probado ser los mejores para la purificación de grandes moléculas tales como proteínas y polinucleótidos. Esto es debido a que la matriz es fibrosa, y por lo tanto todos los grupos funcionales están sobre la superficie y disponibles incluso para las moléculas más grandes. En muchos casos sin embargo, las formas tipo cuentas como las de DEAE-Sefacel y DEAE-Biogel P son más útiles debido a que existe una mejor velocidad de flujo y el efecto del tamiz molecular ayuda en la separación.
La selección de un tamaño de malla es siempre difícil. El tamaño de malla pequeño mejora la resolución pero disminuye la velocidad de flujo, lo cual incrementa la propagación de zona y disminuye la resolución. Por lo tanto, el tamaño apropiado de malla se determina usualmente en forma empírica.
Debido a que los amortiguadores por si mismos consisten de iones, también pueden intercambiar, y el pH de equilibrio se puede afectar. Para evitar estos problemas, se adopta la regla de los amortiguadores: uso de amortiguadores catiónicos con intercambiadores aniónicos y de amortiguadores aniónicos con intercambiadores catiónicos. Debido a que la fuerza iónica es un factor en el enlazamiento, se debe escoger el amortiguador para que tenga una alta capacidad amortiguadora para que su fuerza iónica no requiera ser tan alta. Además, para una mejor resolución, se ha encontrado generalmente que las condiciones iónicas utilizadas para aplicar la muestra a la columna (las llamadas condiciones iniciales) deben ser cercanas a aquellas utilizadas para la elución de la columna.
b. Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento
La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se caracteriza por una separación muy rápida con una resolución extraordinaria de picos. Eso se logra por medio del uso de partículas muy finas y presión alta para mantener una velocidad de flujo adecuada. La separación se puede lograr en el término de minutos, o a lo sumo de una hora. Sin embargo, únicamente se requiere un volumen muy pequeño de la muestra ya que las partículas son tan pequeñas y están empacadas en forma tan estrecha que el volumen muerto es una fracción muy pequeña del volumen de lecho. También, la concentración de la muestra no necesita ser muy grande debido a que las bandas son tan estrechas que existe muy poca dilución de la muestra.
B. Formulación Viral
Los retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, y virus del herpes simple son los virus más comúnmente utilizados en terapia génica (Robbins y Ghivizzani; 1998). Se contempla en la presente invención que la preparación de vectores de adenovirus estables durante largos periodos de tiempo que se puedan almacenar a temperatura de refrigeración o por encima de la misma serían útiles como vectores para terapia génica. Las partículas virales deben mantener su integridad estructural para permanecer infectivas y biológicamente activas para uso como vectores en terapia génica. Las formulaciones actuales de virus no hacen fácilmente posible almacenar o transportar vectores virales a temperaturas de refrigeración o por encima de las mismas sin una pérdida significativa de infectividad viral.
La presente invención describe formulaciones de adenovirus estables durante largos períodos de tiempo que pueden ser almacenados a 4ºC durante períodos de tiempo hasta de 6 meses. Se describen preparaciones adicionales de adenovirus que pueden ser formuladas para liofilización y almacenamiento durante un largo período de tiempo a 4ºC como adenovirus liofilizado. El adenovirus se prepara como una formulación líquida que es estable durante un largo período de tiempo a 4ºC. Un aspecto importante tanto de las formulaciones liofilizadas como líquidas de adenovirus es la adición de al menos uno o más compuestos que mejoran la estabilidad en almacenamiento durante un largo período de tiempo del adenovirus.
El término "compuesto" en el contexto de la presente invención incluye portadores farmacéuticamente aceptables tales como agentes de relleno, crioprotectores, lioprotectores, preservantes, solventes y cualquier agente farmacéutico adicional conocido en el arte. Se pueden añadir simultáneamente también agentes amortiguadores y otro tipo de controles para el pH con el propósito de suministrar una capacidad máxima de amortiguación para la formulación del adenovirus. Por ejemplo, los cambios en el pH que se apartan de las condiciones fisiológicas a menudo resultan en agregación irreversible de proteínas (Wetzel, 1992) y en cápsides virales (Misselwitz y colaboradores, 1995) debido a desnaturalización completa o parcial de la proteína. Por lo tanto, los agentes amortiguadores son particularmente importantes para preparaciones virales, que se aglomeran o desnaturalizan en rangos de pH por debajo del óptimo.
1. Formulaciones Liofilizadas (para propósitos ilustrativos únicamente)
La formulación liofilizada de adenovirus estable en almacenamiento durante períodos prolongados de tiempo en la presente invención requiere de la presencia de uno o más excipientes. Más particularmente, para una óptima estabilidad durante un largo periodo de tiempo de las formulaciones liofilizadas de adenovirus, son deseables un agente de relleno y uno o más protectores. Se sabe bien en el arte que la pérdida en infectividad por parte del virus a menudo está directamente relacionada con desnaturalización, asociación y agregación de las partículas virales (Misselwitz y colaboradores, 1995; Vanlandschoot y colaboradores, 1998; Sagrera y colaboradores, 1998; Lu y colaboradores, 1998). En realidad, se ha observado que las proteínas GroELGroES de choque térmico de E. coli estabilizan a las partículas virales de la desnaturalización y la agregación durante condiciones celulares de alto estrés y facilitan la formación de la cápside durante condiciones celulares normales no estresadas (Polissi y colaboradores, 1995; Nakonechny y Teschke, 1998).
El uso de agentes de relleno, crioprotectores, lioprotectores y sales en la presente invención está incluido en la formulación de adenovirus liofilizado para mejorar la estabilidad durante largos períodos de tiempo (esto es, la infectividad) de los productos liofilizados del adenovirus. El efecto estabilizante de la sacarosa crioprotectora contra la desnaturalización y la agregación irreversibles ha sido descrita previamente como un efecto de volumen excluido (Hall y colaboradores, 1995). En forma similar, los agentes de relleno, crio y lioprotectores tales como los geles de poliacrilamida, los geles de agarosa, dextrano y polietilén glicol (PEG) han demostrado una mejor estabilidad de las proteínas y de los ácidos, en parte por los efectos del volumen excluido (Fried y Bromberg, 1997; Vossen y Fried, 1997). Los detalles exactos del mecanismo de efectos del volumen excluido aún no son claros. Una teoría actualmente aceptada es que muchos de estos compuestos dan como resultado la hidratación preferencial de moléculas de proteína (esto es, volumen de exclusión), que tiende a estabilizar la conformación nativa versus la conformación desnaturalizada de las proteínas, y por lo tanto evita la agregación. Además, la presencia de concentraciones bajas de cosolventes (por ejemplo, sales) resulta en selección de la carga de las proteínas y en recubrimientos de proteína viral que incrementan su solubilidad en agua.
Se ha estudiado y demostrado experimentalmente que el uso de agentes de relleno, crioprotectores, lioprotectores y sales en la presente invención mejora la estabilidad durante almacenamiento de productos liofilizados de adenovirus. En una modalidad, se combinan un agente de relleno y protectores con un amortiguador que incluye adenovirus.
Los agentes de relleno, crioprotectores y lioprotectores son bien conocidos en el arte (Lueckel y colaboradores, 1998; Merman y colaboradores, 1994; Croyle y colaboradores, 1998; Corveleyn y Remon, 1996). Los agentes de relleno considerados en la presente invención son manitol, inositol, lactitol, xilitol, isomaltol, sorbitol, gelatina, agar, pectina, caseína, leche descremada seca, leche entera seca, silicato, carboxipolimetileno, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, metil celulosa y otros agentes de relleno conocidos en el arte. Los crioprotectores considerados son sacarosa, dextrosa, lactosa, trehalosa, glucosa, maltosa, niacinamida, creatinina, glutamato monosódico, dimetil sulfóxido, sólidos de suero dulce, así como otros crioprotectores conocidos. Los lioprotectores contemplados para uso en la presente invención son albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, PEG, glicina, arginina, prolina, lisina, alanina, polivinil pirrolidina, polivinil alcohol, polidextrano, maltodextrinas, hidroxipropil-beta-ciclodextrina, almidones parcialmente hidrolizados, Tween-20 o Tween-80. Ciertos lioprotectores son también clasificados como crioprotectores y viceversa. Para los propósitos de la presente invención, los crioprotectores y lioprotectores se representan como clases independientes de compuestos. Sin embargo, esta clasificación es únicamente para claridad de la invención y no debe limitar a la persona capacitada en el arte del uso de cualquier excipiente que estabilice la formulación de adenovirus. En otras modalidades de la presente invención, el término excipiente abarca agentes de relleno, crio y lioprotectores. En ciertas modalidades, se incluyen sales en la formulación además e los excipientes anteriormente mencionados. Se considera el uso de las siguientes sales en la presente invención: MgCl_{2}, MnCl_{2}, CaCl_{2}, ZnCl_{2}, NaCl y KCl, pero no excluye el uso de otras sales que mejoren la estabilidad de la formulación del adenovirus.
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En otras modalidades de la invención, se seca la formulación liofilizada del adenovirus en presencia de un gas inerte o una combinación de gases inertes. La purga del recipiente de liofilización con un gas inerte o gases, la presencia del gas inerte o gases durante la liofilización de la solución del adenovirus y durante el sellado del vial de liofilización después de la etapa de secado, son para minimizar los efectos nocivos del O_{2}. Se sabe que el O_{2} residual conduce a la oxidación y degradación de las proteínas. Se contempla que la purga y el sellado del producto liofilizado del adenovirus mejore la estabilidad en almacenamiento durante un período prolongado de tiempo del producto del adenovirus. También se puede considerar el uso de antioxidantes tales como \beta-mercapto etanol, DTT, ácido cítrico y similares, en las formulaciones.
Un aspecto importante del proceso de liofilización es un segundo ciclo de secado. El segundo ciclo de secado es a una temperatura de 30ºC al menos durante 3,5 horas, que se demuestra que reduce la humedad residual del producto liofilizado del adenovirus a menos de un 2% de agua inmediatamente después del secado. Se contempla que la humedad residual reducida mejora la estabilidad durante el almacenamiento por un período prolongado de tiempo del producto liofilizado del adenovirus. Se contemplan por lo tanto períodos más largos de secado de hasta 20 horas para reducir más la humedad residual.
2. Formulaciones en Líquido
La formulación de adenovirus líquido estable durante el almacenamiento por períodos prolongados de tiempo en la presente invención requiere de la presencia de un poliol. Un poliol es un alcohol polihídrico que contiene dos o más grupos hidroxilo. Para una estabilidad óptima durante un período prolongado de tiempo de las formulaciones adenovirales líquidas en la presente invención, se utiliza glicerol. En modalidades particulares de la invención, la presencia de 20% de glicerol da como resultado la estabilidad del adenovirus (80% de PFU/mL) durante períodos de tiempo de al menos 6 meses cuando se almacena a 4ºC.
El glicerol (glicerina) es uno de los excipientes más antiguos y más ampliamente utilizados en productos farmacéuticos. Es un líquido claro, incoloro que es miscible con agua y alcohol. El glicerol es higroscópico, estable en ambientes ácidos y básicos suaves y se puede esterilizar a temperaturas hasta de 150ºC. Es bien conocido tanto para enmascarar el sabor y como agente crioprotector, así como un agente antimicrobiano. Tiene un buen poder solubilizante y es un solvente comúnmente utilizado en formulaciones parenterales. Es considerado uno de los excipientes más seguros utilizados ya que es metabolizado hasta glucosa, o hasta sustancias que están involucradas con la síntesis de triglicéridos o la glicólisis (Frank y colaboradores, 1981). Es un excipiente enlistado en GRAS y típicamente utilizado en niveles hasta del 50% en formulaciones parenterales.
Los efectos estabilizantes del glicerol sobre la estructura de la proteína son bien conocidos en el arte (Hase y colaboradores, 1998; Juranville y colaboradores, 1998). Varis estudios indican que el glicerol tiene un efecto similar en las partículas virales. Por ejemplo, cuando se expusieron bacterias competentes de Haemophilus influenza al fago purificado y se las sembró en placa para transfectantes, se observó un incremento de 100 veces en los transfectantes cuando estaba presente un 32% de glicerol en la solución (Stuy, 1986). En otro estudio, se demostró que el glicerol preserva la integridad del virus como vacuna (Slonin y Roslerova, 1969).
Otros polioles contemplados para uso en la presente invención son el polietilén glicol, propilén glicol, sorbitol, manitol, y similares. Los polietilén glicoles son polímeros de óxido de etileno con la fórmula general:
HO-CH_{2}-(CH_{2}-O-CH_{2})_{n}-CH_{2}OH
donde n representa el número de grupos oxietileno. Los PEG se designan por un valor numérico, que es indicativo del peso molecular promedio para un grado dado. Los pesos moleculares por debajo de 600 son líquidos, y los pesos moleculares por encima de 1000 son sólidos a temperatura ambiente. Estos polímeros son fácilmente solubles en agua, lo que los hace bastante útiles para formas de dosificación parenterales. Únicamente PEG 400 y PEG 300 se utilizan en productos parenterales, típicamente en concentraciones hasta del 30% v/v. estos polímeros son generalmente considerados como no tóxicos y no irritantes. Existen numerosas revisiones relacionadas con las características farmacéuticas y toxicológicas de estos polioles (Smyth y colaboradores, 1950; Rowe y Wolf, 1982, Swarbrick y Boylan, 1990).
El propilén glicol, un dihidroxi alcohol, es uno de los solventes más comunes encontrados en las formulaciones de cosolventes farmacéuticos, tanto para formas de dosificación parenterales como no parenterales. PG es considerado generalmente como no tóxico. Es más higroscópico que la glicerina, y tiene excelente poder de solubilización para una gran variedad de compuestos. Además, tiene excelentes propiedades bactericidas y como preservante (Heine y colaboradores, 1950). PG se metaboliza hasta dióxido de carbono y agua a través de los intermediarios ácido láctico y ácido pirúvico y, por lo tanto, no propenso a toxicidades severas.
El sorbitol y el manitol son alcoholes hexahídricos, que consisten de polvos cristalinos de color blanco, que son solubles en agua. Ambos son excipientes comúnmente utilizados en productos farmacéuticos con poca o ninguna toxicidad asociada, como los aprobados por la FDA para uso alimentario. Los mecanismos de la proteína sorbitol y manitol y la estabilización viral no están completamente entendidos aún. Las teorías actuales sugieren que al menos parte del efecto es diurético osmótico (Vanholder y colaboradores, 1984; de Rizzo y colaboradores, 1988). El uso de los polioles descritos anteriormente se considera un ejemplo, y no debe limitar a la persona capacitada en el arte para seleccionar otros polioles que confieran estabilidad viral para las formulaciones líquidas. La formulación líquida contiene además Tween-20 o Tween-80.
También se contempla, además de un poliol en la formulación líquida, que puedan ser incluidos también uno o posiblemente dos excipientes. Los excipientes considerados para uso en la presente invención son inositol, lactitol, xilitol, isomaltol, gelatina, agar, pectina, caseína, leche descremada seca, leche entera seca, silicato, carboxipolimetileno, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, sacarosa, dextrosa, lactosa, trehalosa, glucosa, maltosa, niacinamida, creatinina, glutamato monosódico, dimetil sulfóxido, sólidos de suero dulce, albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, glicina, arginina, prolina, lisina, alanina, polivinil pirrolidina, polivinil alcohol, polidextrano, maltodextrinas, hidroxipropil-beta-ciclodextrina y almidones parcialmente hidrolizados. La escogencia de un excipiente particular depende en algunos casos de las propiedades deseadas de la formulación viral.
En modalidades particulares, se contempla al dimetil sulfóxido (DMSO) para uso en la presente invención. Se ha demostrado que el DMSO mejora la infectividad de las preparaciones de adenovirus incrementando la eficiencia de la transferencia génica (Chikada y Jones, 1999). Por ejemplo, la infectividad del ADN del adenovirus tipo 2 en células 293 se incremento hasta en cinco veces por medio de un tratamiento breve de monocapas de células con DMSO al 25% (Chinnadurai y colaboradores, 1978). También se ha reportado la estabilización de las partículas virales a través de DMSO (Wallis y Melnick, 1968). Los presentes inventores demuestran que la administración intratumoral de Ad-p53 se mejora cuando se añade DMSO en un 5 o un 10% (ver Fig. 9). Los estudios de adenovirus a través de administración intravesical indican que un vector adenoviral puede ser estable hasta en un 50% de DMSO (WO 98/35554). En otras modalidades, un poliol contemplado para uso en la presente invención como reforzador de la transcripción del gen del adenovirus es un polioxialqueno (patente estadounidense No. 5.552.309, incorporada aquí específicamente como referencia en su totalidad).
Por lo tanto, en modalidades particulares, una formulación adenoviral de acuerdo con la presente invención puede contener también DMSO. La concentración para administración intratumoral puede contener aproximadamente desde 2% hasta 67% de DMSO, preferiblemente aproximadamente desde 5% hasta 20%. La concentración para administración intravesical puede contener aproximadamente desde 2% hasta 67% de DMSO, preferiblemente aproximadamente desde 20% hasta 50%. La concentración para administración tópica puede contener aproximadamente desde 2% hasta 67% de DMSO, preferiblemente aproximadamente desde 10% hasta 40%. La concentración para administración intraarticular puede contener aproximadamente desde 2% hasta 67% de DMSO, preferiblemente aproximadamente desde 5% hasta 40%. La concentración para administración sistémica puede contener aproximadamente desde 2% hasta 75% de DMSO, preferiblemente aproximadamente desde 50% hasta 67%.
Las formulaciones de poliol adenovirus de la invención pueden incluir además un polioxámero, tal como el Polioxámero 407, en concentraciones aproximadamente desde 0,5% hasta 20%, preferiblemente aproximadamente desde 10% hasta 20%. La formulación estable durante almacenamiento del adenovirus puede contener también aproximadamente desde 5% hasta 40% de dimetilacetamida, preferiblemente aproximadamente desde 10% hasta 25%. O puede contener aproximadamente desde 10% hasta 50% de un polietilén glicol, tal como el polietilén glicol 400, preferiblemente aproximadamente desde 15% hasta 50%. Desde luego, la formulación de dicho adenovirus también puede contener combinaciones de los componentes anteriores.
C. Transformación Viral
La presente invención emplea, en un ejemplo, infección adenoviral de células con el propósito de generar vectores terapéuticamente significativos. Típicamente, se expondrá simplemente el virus a la célula huésped apropiada bajo condiciones fisiológicas, permitiendo la admisión del virus. Aunque el adenovirus es un ejemplo, los métodos presentes pueden ser convenientemente empleados con otros vectores virales, como se discute más adelante.
1. Infección Viral a. Adenovirus
Un método para suministrar el ADN recombinante involucra el uso de un vector de expresión del adenovirus. Aunque los vectores de adenovirus se sabe que tienen una baja capacidad para integración dentro del ADN genómico, esta característica es contrarrestada por la alta eficiencia de la transferencia génica aportada por estos vectores. "Vector de expresión de adenovirus" significa que incluye a aquellas construcciones que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) soportar el empaquetamiento de la construcción y (b) para expresar en última estancia una construcción génica recombinante que ha sido clonada allí dentro.
El vector incluye una forma genéticamente modificada del adenovirus. El conocimiento de la organización genética o del adenovirus, un virus de ADN bicatenario de 36 kb, permite la sustitución de grandes pedazos del ADN adenoviral con secuencias foráneas hasta de 7 kb (Grunhouse y Horwitz, 1992). En contraste con el retrovirus, la infección adenoviral de células huésped no resulta en integración cromosómica debido a que el ADN adenoviral puede replicarse en una forma episomal sin genotoxicidad potencial. También, los adenovirus son estructuralmente estables, y no se ha detectado un reordenamiento del genoma después de una amplificación extendida.
El adenovirus es particularmente adecuado para uso como vector de transferencia génica debido a su genoma de tamaño medio, de fácil manipulación, título alto, amplio rango de células objetivo y alta infectividad. Ambos extremos del genoma viral contienen 100-200 repeticiones invertidas de pares de bases (ITR), que son elementos cis necesarios para la replicación y empaquetamiento del ADN viral. Las regiones temprana (E) y tardía (L) del genoma contienen diferentes unidades de transcripción que están divididas por el inicio de la replicación del ADN viral. La región E1 (E1A y E1B) codifica proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral y de unos pocos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) resulta en la síntesis de las proteínas para replicación del ADN viral. Estas proteínas están involucradas en la replicación del ADN, la expresión tardía del gen y la desconexión de la célula huésped (Renan, 1990). Los productos de los genes tardíos, incluidas la mayoría de las proteínas de la cápside viral, se expresan únicamente después de un procesamiento significativo de una única transcripción primaria emitida por el promotor tardío principal (MLP). El MLP, (localizado en 16,8 m. u.) es particularmente eficiente durante la fase tardía de la infección, y todos los ARNm emitidos por este promotor poseen una secuencia líder tripartita 5' (TLP) que hace a los ARNm preferidos para la traducción.
En un sistema actual, el adenovirus recombinante se genera a partir de recombinación homóloga entre un vector lanzadera y un vector provirus. Debido a la posible recombinación entre dos vectores provirales, se puede generar el adenovirus de tipo silvestre a partir de este proceso. Por lo tanto, es crítico aislar un clon único del virus de una placa individual y examinar su estructura genómica.
La generación y propagación de los vectores actuales de adenovirus, que son deficientes en replicación, dependen de una única línea celular auxiliar, denominada 293, que fue transformada a partir de células de riñón embrionario humano por medio de fragmentos de ADN de Ad5 y que expresan constitutivamente proteínas E1 (Graham y colaboradores, 1977). Ya que se puede eliminar la región E3 del genoma del adenovirus (Jones y Shenk, 1978), los vectores adenovirales actuales, con ayuda de las células 293, trasportan ADN foráneo en cualquiera de las regiones E1, D3 o en ambas (Graham y Prevec, 1991). En la naturaleza, un adenovirus puede empacar aproximadamente 105% del genoma de tipo silvestre (Ghosh-Choudhury y colaboradores, 1987), proporcionando capacidad aproximadamente para 2 kb extra de ADN. Combinado con los aproximadamente 5,5 kb del ADN que es reemplazable en las regiones E1 y E3, la capacidad máxima del vector adenoviral actual está por debajo de los 7,5 kb, o aproximadamente 15% de la longitud total del vector. Más del 80% del genoma viral del adenovirus permanece en la columna vertebral del vector.
Se pueden derivar líneas celulares auxiliares de células humanas tales como células de riñón embrionario humano, células musculares, células hematopoyéticas u otras células epiteliales o mesenquimales embrionarias humanas. Alternativamente, las células auxiliares se pueden derivar de las células de otras especies de mamíferos que son permisivas para adenovirus humano. Tales células incluyen, por ejemplo células Vero u otras células epiteliales o mesenquimales embrionarias de mono. Como se estableció anteriormente, la línea celular auxiliar preferida es la 293.
Racher y colaboradores (1995) han divulgado métodos mejorados para el cultivo de células 293 y propagación del adenovirus. En un formato, se cultivan los agregados celulares naturales por medio de la inoculación de células individuales en matraces de agitación siliconados de 1 litro (Techne, Cambridge, RU) que contienen 100-200 ml de medio. Después de agitar a 40 rpm, se estima la viabilidad de las células con tripan azul. En otro formato, se emplean microportadores Fibra-Cel (Bibby Sterlin, Stone, RU) (5 g/l) de la siguiente manera. Se añade un inóculo celular, resuspendido en 5 ml de medio, al portador (50 ml) en un matraz Erlenmeyer y se lo deja quieto, con agitación ocasional, durante 1 a 4 h. Se reemplaza luego el medio con 50 ml de medio fresco y se inicia la agitación. Para la producción de virus, se le permite a las células crecer hasta aproximadamente un 80% de confluencia, después de lo cual se reemplaza el medio (hasta un 25% del volumen final) y se añade el adenovirus a una MOI de 0,05. Se dejan quietos los cultivos durante la noche, después de lo cual se incrementa el volumen hasta un 100% y se comienza la agitación durante otras 72 horas.
Aparte del requisito de que el vector de adenovirus sea deficiente en la replicación, o al menos condicionalmente deficiente, no se cree que la naturaleza del vector de adenovirus sea crucial para la práctica exitosa de la invención. El adenovirus puede ser de cualquiera de 42 serotipos diferentes conocidos o subgrupos A-F. El adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el material de partida preferido con el propósito de obtener el vector de adenovirus deficiente en replicación condicional para uso en la presente invención. Esto es debido a que el Adenovirus tipo 5 es un adenovirus humano alrededor del cual se conoce mucha de la información bioquímica y genética, y se lo ha utilizado históricamente para la mayoría de las construcciones que emplean adenovirus como vector.
Como se estableció anteriormente, el vector típico de acuerdo con la presente invención es deficiente en replicación y no tendrá una región E1 de adenovirus. En consecuencia, será más conveniente introducir la construcción de transformación en la posición en la cual las secuencias de codificación de E1 han sido removidas. Sin embargo, la posición de inserción de la construcción dentro de las secuencias del adenovirus no es crítica para la invención. El polinucleótido que codifica al gen de interés puede ser también insertado en vez de la región suprimida E3 en vectores de reemplazo de E3 como lo describen Karlsson y colaboradores (1986) o en la región E4 donde la línea celular auxiliar o el virus auxiliar complementan el defecto de E4.
El crecimiento y la manipulación del adenovirus son conocidos por aquellos capacitados en el arte, y exhibe un amplio tango de huéspedes in vitro e in vivo. Este grupo se virus se puede obtener en títulos altos, por ejemplo, 10^{9}-10^{11} unidades formadoras de placa por ml, y son altamente infectivos. El ciclo de vida del adenovirus no requiere de la integración dentro del genoma de la célula huésped. Los genes foráneos suministrados por los vectores de adenovirus son episomales y, por lo tanto, tiene baja genotoxicidad para las células huésped. No se han reportado efectos secundarios en estudios de vacunación con adenovirus de tipo silvestre (Couch y colaboradores, 1963; Top y colaboradores, 1971), demostrando su seguridad y potencial terapéutico como vectores de transferencia de genes in vivo.
Los vectores de adenovirus han sido utilizados en expresión de genes en eucariotas (Levrero y colaboradores, 1991; Gomez-Foix y colaboradores, 1992) y en desarrollo de vacunas (Grunhaus y Horwitz, 1992; Graham y Prevec, 1992). También se han descrito vectores adenovirales para el tratamiento de ciertos tipos de cánceres (patente estadounidense No. 5.789.244, incorporada aquí específicamente como referencia en su totalidad). Los estudios en animales han sugerido que el adenovirus recombinante podría ser utilizado para terapia génica (Stratford-Perricaudet y Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet y colaboradores, 1990; Rich y colaboradores, 1993). Los estudios en administración de adenovirus recombinante para diferentes tejidos incluyen instilación en la tráquea (Rosenfeld y colaboradores, 1991; Rosenfeld y colaboradores, 1992), inyección muscular (Ragot y colaboradores, 1993), inyecciones intravenosas periféricas (Herz y Gerard, 1993) e inoculación estereotáctica en el cerebro (Le Gal La Salle y colaboradores, 1993).
b. Retrovirus (para propósitos ilustrativos únicamente)
Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenario caracterizado por una habilidad para convertir su ARN en ADN bicatenario en células infectadas por medio de un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). El ADN resultante se integra luego en forma estable dentro de los cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración resulta en la retención de las secuencias de los genes del virus en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol, y env que codifican para las proteínas de la cápside, la enzima polimerasa, y los componentes de la envoltura, respectivamente. Una secuencia encontrada secuencia arriba del gen gap contiene una señal para el empaquetamiento del genoma en viriones. Dos secuencias de repeticiones terminales largas (LTR) están presentes en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Estas contienen un promotor fuerte y secuencias reforzadoras y son requeridas también para la integración en el genoma de la célula huésped (Coffin, 1990).
Con el propósito de construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico que codifica un gen de interés dentro del genoma viral en lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es deficiente en replicación. Con el propósito de producir viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que contiene a los genes gag, pol, y env pero sin la LTR y los componentes de empaquetamiento (Mann y colaboradores, 1983). Cuando se introduce un plásmido recombinante que contiene un ADNc, junto con la LTR retroviral y las secuencias de empaquetamiento en esta línea celular (por ejemplo, por medio de precipitación en fosfato de calcio), la secuencia de empaquetamiento permite que la transcripción de ARN del plásmido recombinante que va a ser empacada en partículas virales, que son luego secretadas dentro del medio de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann y colaboradores, 1983). Se recolecta luego el medio que contiene a los retrovirus recombinantes, opcionalmente se lo concentra, y se lo utiliza para transferencia génica. Los vectores retrovirales son capaces de infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y expresión estable requiere de la división de células huésped (Paskind y colaboradores, 1975).
Relacionado con el uso de vectores defectuosos de retrovirus está la aparición potencial del virus competente para replicación de tipo silvestre en las células de empaquetamiento. Esto puede ser el resultado de eventos de recombinación en los cuales la secuencia intacta del virus recombinante se inserta secuencia arriba de la secuencia de gag, pol, env integrada en el genoma de la célula huésped. Sin embargo, ahora se encuentran disponibles nuevas líneas celulares de empaquetamiento que deben disminuir grandemente la probabilidad de recombinación (Markowitz y colaboradores, 1988; Hersdorffer y colaboradores, 1990).
c. Virus Adeno-Asociado (para propósitos de ilustración únicamente)
El virus adeno-asociado (AAV) es un sistema vector atractivo para ser utilizado en la presente invención ya que tiene una alta frecuencia de integración y puede infectar células que no se dividen, haciéndolas por lo tanto útiles para el suministro de genes en células de mamífero en cultivo de tejido (Muzyczka, 1992). El AAV tiene un amplio rango de huéspedes para infectividad (Tratschin, y colaboradores, 1984; Laughlin, y colaboradores, 1986; Lebkowski, y colaboradores, 1988; McLaughlin, y colaboradores, 1988), lo cual significa que es aplicable para uso con la presente invención. Los detalles concernientes a la generación y el uso de vectores rAAV están descritos en la patente estadounidense No. 5.139.941 y en la patente estadounidense No. 4.797.368, cada una incorporada aquí como referencia.
Los estudios que demuestran el uso de AAV en el suministro de genes incluyen a LaFace y colaboradores (1988); Zhou y colaboradores (1993); Flotte y colaboradores (1993); y Walsh y colaboradores (1994). Los vectores recombinantes del AAV han sido utilizados exitosamente para transducción in vitro e in vivo de genes marcadores (Kaplitt y colaboradores, 1994; Lebkowski y colaboradores, 1988; Samulski y colaboradores, 1989; Shelling y Smith, 1994; Yoder y colaboradores, 1994; Zhou y colaboradores, 1994; Hermonat y Muzyczka 1984; Tratschin y colaboradores, 1985; McLaughlin y colaboradores, 1988) y los gens involucrados en enfermedades humanas (Flotte y colaboradores, 1992: Luo y colaboradores, 1994; Ohi y colaboradores, 1990; Walsh y colaboradores, 1994; Wei y colaboradores, 1994). Recientemente, un vector de AAV vector ha sido aprobado para la fase I de ensayos en humanos para el tratamiento de la fibrosis cística.
AAV es un parvovirus dependiente ya que requiere de la coinfección con otro virus (ya sea un adenovirus o un miembro de la familia del virus del herpes) para sufrir una infección productiva en células cultivadas (Muzyczka, 1992). En ausencia de coinfección con un virus auxiliar, el genoma del AAV de tipo silvestre se integra a través de sus extremos dentro del cromosoma humano 19 donde reside en estado latente como un provirus (Kotin y colaboradores, 1990; Samulski y colaboradores, 1991). Sin embargo, rAAV no está restringido al cromosoma 19 para la integración a menos que la proteína Rep del AAV sea expresada también (Shelling y Smith, 1994). Cuando una célula que transporta a un provirus del AAV es superinfectado con un virus auxiliar, se "rescata" al genoma del AAV del cromosoma o de un plásmido recombinante, y se establece una infección productiva normal (Samulski y colaboradores, 1989; McLaughlin y colaboradores, 1988; Kotin y colaboradores, 1990; Muzyczka, 1992).
Típicamente, un virus recombinante del AAV (rAAV) se elabora por medio de cotransfección de un plásmido que contiene al gen de interés flanqueado por las dos repeticiones terminales del AAV (McLaughlin y colaboradores, 1988; Samulski y colaboradores, 1989; cada una incorporada aquí como referencia) y un plásmido de expresión que contiene a las secuencias de codificación del AAV de tipo silvestre sin las repeticiones terminales, por ejemplo pIM45 (McCarty y colaboradores, 1991; incorporadas aquí como referencia). Las células son también infectadas o transfectadas con adenovirus o plásmidos que transportan a los genes del adenovirus requeridos para la función auxiliar del AAV. Las estirpes del virus del rAAV elaboradas de esa manera son contaminadas con adenovirus que debe ser físicamente separado de las partículas del rAAV (por ejemplo, por medio de centrifugación por densidad en cloruro de cesio). Alternativamente, se podrían utilizar los vectores del adenovirus que contienen a las regiones que codifican al AAV o a las líneas celulares que contienen a las regiones que codifican al AAV y algunos o todos los genes auxiliares del adenovirus (Yang y colaboradores, 1994a; Clark y colaboradores, 1995). Se pueden utilizar también las líneas celulares que transportan al ADN del rAAV como un provirus integrado (Flotte y colaboradores, 1995).
d. Otros Vectores Virales (para propósitos ilustrativos únicamente)
Se pueden emplear otros vectores virales como construcciones en la presente invención. Se pueden emplear vectores derivados de virus tales como el virus vacuna (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar y colaboradores, 1988) y virus del herpes. Ellos ofrecen varias características atractivas para diferentes células de mamífero (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar y colaboradores, 1988; Horwich y colaboradores, 1990).
Con el reciente reconocimiento de los virus defectuosos de la hepatitis B, se ganó una nueva comprensión en la relación función-estructura de diferentes secuencias virales. Los estudios in vitro mostraron que el virus podría retener la habilidad para el empaquetamiento dependiente de un auxiliar y la transcripción inversa a pesar de la supresión hasta del 80% de su genoma (Horwich y colaboradores, 1990). Esto sugirió que grandes porciones del genoma podrían ser reemplazadas con material genético foráneo. Chang y colaboradores introdujeron recientemente el gen de la cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) dentro del genoma del virus de la hepatitis B de pato en lugar de las secuencias que codifican a la superficie y presuperficie de la polimerasa. Se cotransfectó con virus tipo silvestre en una línea celular de hepatoma aviar. Se utilizaron medios de cultivo que contenían títulos altos del virus recombinante para infectar hepatocitos primarios de patos pequeños. Se detectó la expresión estable del gen CAT durante al menos 24 días después de la transfección (Chang y colaboradores, 1991).
También se contempla el uso en la presente invención de una clase completamente nueva de virus llamados virus oncolíticos (Pennisi, 1998). Algunos de los virus incluidos en este grupo son retrovirus, el adenovirus genéticamente modificado OYNX-015 y CN706. Estos virus oncolíticos, que no han sido genéticamente alterados para evitar su replicación, destruyen ciertos tipos de células cancerosas por multiplicación y difusión, matando únicamente a las células cancerosas. Cada uno de los virus oncolíticos anteriores es propuesto para operar a través de diferentes rutas involucradas en los cánceres.
Por ejemplo, los reovirus humanos requieren de una ruta de señalización Ras activada para la infección de células cultivadas. De este modo, en ciertos tumores con un gen ras hiperactivo, los retrovirus se replican fácilmente. En un estudio sobre reovirus se trataron ratones severamente inmunodeficientes combinados que soportaban tumores establecidos a partir de células 3T3 NIH de múrido transformadas con v-erbB o células de glioblastoma U87 humano con el virus. Una inyección intratumoral única del virus resultó en regresión de los tumores en 65% a 80% de los ratones. El tratamiento de los ratones C3H inmunocompetentes que soportan tumores establecidos a partir de células C3H-10T1/2 transformadas con ras también resultó en regresión tumoral, aunque se requirió de algunas inyecciones (Coffey y colaboradores, 1998).
2. Vectores y Señales Reguladoras
Los vectores de la presente invención son diseñados, principalmente, para transformar células con un gen bajo el control de promotores eucariotas regulados (esto es, inducibles, reprimibles, específicos del tejido). También, los vectores usualmente contendrán un marcador seleccionable, si no existe ninguna otra razón, para facilitar su producción in vitro. Sin embargo, los marcadores seleccionables pueden jugar un papel importante en la producción de células recombinantes y por lo tanto es útil aquí una discusión de promotores. La Tabla 2 y la Tabla 3 a continuación, enlistan elementos promotores inducibles y elementos reforzadores, respectivamente.
TABLA 2 Elementos Inducibles
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TABLA 3 Otros Elemnetos Promotores/Reforzadores
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(Continuación)
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(Continuación)
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Otra señal que puede resultar ser útil es una señal de poliadenilación (hGH, BGH, SV40).
El uso de elementos internos de sitios de enlazamiento de ribosoma (IRES) es utilizado para crear mensajes multigén o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de evitar el modelo de escaneado del ribosoma de la traducción que depende de la cubierta 5' metilada e iniciar la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Los elementos IRES de dos miembros de la familia del picornavirus (polio y encefalomiocarditis) han sido descritos (Pelletier y Sonenberg, 1988), así como un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991). Los elementos IRES se pueden enlazar a marcos heterólogos de lectura abierta. Múltiples marcos de lectura abierta se pueden transcribir juntos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierta está accesible a los ribosomas para una traducción eficiente. Se pueden expresar eficientemente múltiples genes utilizando un promotor/reforzador único para transcribir un solo mensaje.
Como se discutió anteriormente, en ciertas modalidades de la invención, se puede identificar una célula y seleccionar in vitro o in vivo incluyendo un marcador en la construcción de expresión. Tales marcadores confieren un cambio identificable a la célula permitiendo una fácil identificación de las células que contienen a la construcción de expresión. Usualmente, la inclusión de un marcador para selección de un fármaco ayuda en la clonación y en la selección de transformantes, por ejemplo, genes que confieren resistencia a la neomicina, la puromicina, la higromicina, DHFR, GPT, Zeocina, tetraciclina e histidinol son marcadores seleccionables útiles. Alternativamente, se pueden emplear enzimas tales como la timidina quinasa (tk) del virus del herpes simple o la cloramfenicol acetiltransferasa (CAT).
Los promotores y los reforzadores que controlan la transcripción de los genes que codifican proteína en células eucariotas están compuestos de múltiples elementos genéticos. La maquinaria celular es capaz de reunir e integrar la información reguladora transportada por cada elemento, permitiendo que diferentes genes desarrollen patrones distintos a menudo complejos de regulación transcripcional.
El término promotor será utilizado aquí para referirse a un grupo de módulos de control transcripcional que se aglutinan alrededor del sitio de iniciación para la ARN polimerasa II. Mucho de lo que piensa acerca de cómo los promotores se organizan se deriva del análisis de diferentes promotores virales, incluidos aquellos para la timidina quinasa (tk) de HSV y las unidades de transcripción temprana de SV40. Esos estudios, junto con trabajos más recientes, han mostrado que los promotores están compuestos de módulos funcionales discretos, consistiendo cada uno de aproximadamente 7-20 pb de ADN, y conteniendo uno o más sitios de reconocimiento para las proteínas activadoras transcripcionales.
Al menos un módulo en cada promotor funciona para posicionar el sitio de inicio para la síntesis del ARN. El ejemplo más conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de una caja TATA, tal como el promotor para el gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y el promotor para los genes tardíos de SV40, un elemento discreto que se superpone al sitio mismo de inicio ayuda a fijar el lugar de iniciación.
Elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de la iniciación transcripcional. Típicamente, estos se localizan en la región de 30-110 pb secuencia arriba del sitio de inicio, aunque se ha mostrado recientemente que una cantidad de promotores contienen también elementos funcionales secuencia abajo del sitio de inicio. El espaciado entre elementos es flexible, para que se preserve la función del promotor cuando se invierten los elementos o se mueven relativamente entre sí. En el promotor tk, el espaciado entre elementos se puede incrementar hasta 50 pb antes de que la actividad comience a declinar. Dependiendo del promotor, parece que elementos individuales pueden funcionar ya sea cooperativamente o independientemente para activar la transcripción.
Se detectaron originalmente los reforzadores como elementos genéticos que incrementaron la transcripción de un promotor localizado en una posición distante sobre la misma molécula de ADN. Esta habilidad para actuar sobre una distancia grande tuvo poco precedente en estudios clásicos de regulación transcripcional procariota. Un trabajo posterior mostró que regiones de ADN con actividad reforzadora se organizan como promotoras. Esto es, que están compuestas de muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se enlaza a una o más proteínas transcripcionales.
La distinción básica entre reforzadores y promotores es operacional. Una región reforzadora como tal debe ser capaz de estimular la transcripción a distancia; esto no necesita ser cierto para un región promotora o sus elementos componentes. Por otro lado, un promotor debe tener uno o más elementos que dirijan la iniciación de la síntesis del ARN en un sitio particular y en una orientación particular, mientras que los reforzadores carecen de estas especificidades. A parte de esta distinción operacional, los reforzadores y los promotores son entidades muy similares.
Los promotores y los reforzadores tienen la misma función general de activar la transcripción en la célula. Ellos a menudo están superpuestos y contiguos, pareciendo a menudo que tienen una organización modular muy similar. Tomadas juntas, estas consideraciones sugieren que los reforzadores y los promotores son entidades homólogas y que las proteínas activadoras transcripcionales enlazadas a estas secuencias pueden interactuar con la maquinaria transcripcional celular fundamentalmente en la misma forma.
En cualquier caso, se entenderá que los promotores son elementos de ADN que cuando se posicionan funcionalmente secuencia arriba de un gen conducen a la expresión de ese gen. La mayoría de las construcciones transgénicas de la presente invención se posicionan funcionalmente secuencia abajo de un elemento promotor.
D. Modificación Genética de Vectores Virales
En ciertas modalidades, la presente invención involucra además la manipulación de vectores virales. Tales métodos involucran el uso de una construcción de un vector que contiene, por ejemplo, un ADN heterólogo que codifica a un gen de interés y un medio para su expresión, replicando al vector en una célula auxiliar apropiada, obteniendo partículas virales producidas a partir de allí, e infectando células con las partículas del virus recombinante. El gen podría simplemente codificar una proteína para lo cual se desean grandes cantidades de la proteína, esto es, métodos de producción in vitro a gran escala. Alternativamente, el gen podría ser un gen terapéutico, por ejemplo para tratar células cancerosas, para expresar genes inmunomoduladores para combatir infecciones virales, o para remplazar una función del gen como resultado de un defecto genético. En el contexto del vector para terapia génica, el gen será un ADN heterólogo, destinado a incluir ADN derivado de una fuente diferente al genoma viral que proporciona la columna vertebral del vector. Finalmente, el virus puede actuar como una vacuna viral viva y expresar un antígeno de interés para la producción de anticuerpos que están en contra. El gen se puede derivar de una fuente procariota o eucariota tal como una bacteria, un virus, una levadura, un parásito, una planta, o incluso un animal. El ADN heterólogo también se puede derivar de más de una fuente, esto es, una construcción multigén o una proteína de fusión. El ADN heterólogo puede incluir también una secuencia reguladora que se puede derivar de una fuente y el gen de una fuente diferente.
1. Genes Terapéuticos
Se reconoce actualmente a p53 como a un gen supresor de tumores (Montenarh, 1992). Se han encontrado niveles altos de p53 mutante en muchas células transformadas por carcinogénesis química, radiación ultravioleta, y diferentes virus, incluyendo SV40. El gen p53 es un objetivo frecuente de inactivación mutacional en una gran variedad de tumores humanos y ya se ha documentado que es el gen más frecuentemente mutado en cánceres humanos comunes (Mercer, 1992). Está mutado en más del 50% de NSCLC humano (Hollestein y colaboradores, 1991) y en un amplio espectro de otros tumores.
El gen p53 codifica a una fosfoproteína de 393 aminoácidos que puede formar complejos con proteínas huésped tales como el antígeno T grande y E1B. La proteína se encuentra en tejidos y células normales, pero en concentraciones que son generalmente pequeñas en comparación con células transformadas o tejido tumoral. En forma muy interesante, p53 de tipo silvestre parece ser importante en la regulación del crecimiento y división de la célula. Se ha mostrado que la sobreexpresión de p53 de tipo silvestre en algunos casos es antiproliferativa en líneas de células tumorales humanas. De este modo, p53 puede actuar como un regulador negativo del crecimiento celular (Weinberg, 1991) y puede suprimir directamente el crecimiento celular incontrolado o directa o indirectamente activar genes que suprimen este crecimiento. De este modo, la ausencia o la inactivación de p53 de tipo silvestre pueden contribuir a la transformación. Sin embargo, algunos estudios indican que la presencia de p53 mutante puede ser necesaria para una expresión completa del potencial transformador del gen.
p53 de tipo silvestre es reconocido como un importante regulador del crecimiento en muchos tipos de células. Las mutaciones de sentido erróneo son comunes para el gen p53 y se sabe que se presentan en al menso 30 codones distintos, creando a menudo alelos dominantes que producen cambios en el fenotipo celular sin una reducción hasta homocigocidad. Adicionalmente, muchos de estos alelos negativos dominantes parecen ser tolerados en el organismo y son pasados a la línea germinal. Diferentes alelos mutantes aparecen en el rango desde alelos negativos dominantes mínimamente disfuncionales hasta fuertemente penetrantes (Weinberg, 1991).
Casey y colegas han reportado que la transfección del ADN que codifica a p53 de tipo silvestre dentro de dos líneas celulares de cáncer de seno humano restablece el control de supresión del crecimiento en tales células (Casey y colaboradores, 1991). Un efecto similar ha sido demostrado también sobre la transfección de p53 silvestre, pero no mutante, en líneas celulares de cáncer de pulmón humano (Takahasi y colaboradores, 1992). p53 parece dominante sobre el gen mutante y seleccionara contra la proliferación cuando se lo transfecta en células con el gen mutante. La expresión normal del p53 transfectado o es nocivo para las células normales con p53 endógeno de tipo silvestre. De este modo, tales construcciones pueden ser tomadas como células normales sin efectos adversos. Se propone por lo tanto que el tratamiento de cánceres asociados con p53 con las construcciones de expresión de p53 de tipo silvestre reducirá el número de células malignas o su tasa de crecimiento. Además, estudios recientes sugieren que algunos tumores de tipo silvestre de p53 son también sensibles a los efectos de la expresión exógena de p53.
Las transiciones principales del ciclo celular eucariota se activan por medio de las quinasas que dependen de la ciclina, o de CDK. Una CDK, quinasa 4 que depende de ciclina (CDK4), regula el progreso a través de la fase G_{1}. La actividad de esta enzima puede ser para fosforilar Rb en G_{1} tardío. La actividad de CDK4 se controla por medio de una subunidad activadora, ciclina tipo D, y por medio de una subunidad inhibidora, por ejemplo, p16^{INK4}, que ha sido bioquímicamente caracterizada como una proteína que se enlaza específicamente e inhibe a CDK4, y por lo tanto puede regular la fosforilación de Rb (Serrano y colaboradores, 1993; Serrano y colaboradores, 1995). Ya que la proteína p16^{INK4} es un inhibidor de CDK4 (Serrano, 1993), la supresión de este gen puede incrementar la actividad de CDK4, resultando en una hiperfosforilación de la proteína Rb. p16 también es conocida por regular la función de CDK6.
p16^{INK4} pertenece a una clase recientemente descrita de proteínas inhibidoras de CDK que también incluyen a p16^{B}, p21^{WAF1.CIP1.SDI1}, y p27^{KIP1}. El gen p16^{INK4} mapea a 9p21, una región del cromosoma frecuentemente suprimida en muchos tipos de tumores. Las supresiones y mutaciones homocigotas del gen p16^{INK4} son frecuentes en líneas celulares de tumores humanos. Esta evidencia sugiere que el gen p16^{INK4}, es un gen supresor de tumores. Esta interpretación ha sido retada, sin embargo, por la observación de que la frecuencia de las alteraciones del gen p16^{INK4} es mucho menor en tumores primarios no cultivados que en líneas celulares cultivadas (Caldas y colaboradores, 1994; Cheng y colaboradores, 1994; Hussussian y colaboradores, 1994; Kamb y colaboradores, 1994a; Kamb y colaboradores, 1994b; Mori y colaboradores, 1994; Okamoto y colaboradores, 1994; Nobori y colaboradores, 1995; Orlow y colaboradores, 1994; Arap y colaboradores, 1995). La restauración de la function de p16^{INK4} de tipo silvestre por medio de transfección con un vector de expresión de plásmido reduce la formación de colonias por medio de algunas líneas celulares de cáncer humano (Okamoto, 1994; Arap, 1995).
C-CAM se expresa virtualmente en todas las células epiteliales (Odin y Obrink, 1987). C-CAM, con un peso molecular aparente de 105 kD, fue aislado originalmente de la membrana plasmática del hepatocito de rata por su reacción con anticuerpos específicos que neutralizan la agregación celular (Obrink, 1991). Estudios recientes indican que, estructuralmente, C-CAM pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig) y su secuencia es altamente homóloga con al antígeno carcinoembrionario (CEA) (Lin y Guidotti, 1989). Utilizando sistemas de expresión de baculovirus, Cheung y colaboradores (1993a; 1993b y 1993c) demostraron que el primer dominio de Ig de C-CAM es crítico para la actividad de adhesión celular.
Las moléculas de adhesión celular o las CAM se sabe que están involucradas en una red compleja de interacciones moleculares que regulan el desarrollo de órganos y la diferenciación celular (Edelman, 1985). Datos recientes indican que la expresión aberrante de las CAM puede estar involucrada en la tumorogénesis de diferentes neoplasmas; por ejemplo, la menos expresión de E-cadherina, que se expresa predominantemente en células epiteliales, está asociada con el progreso de varios tipos de neoplasmas (Edelman y Crossin, 1991; Frixen y colaboradores, 1991; Bussemakers y colaboradores, 1992; Matsura y colaboradores, 1992; Umbas y colaboradores, 1992). También, Giancotti y Ruoslahti (1990) demostraron que la mayor expresión de la \alpha_{5}\beta_{1} integrina por transferencia génica puede reducir la tumorogenicidad de las células de ovario de hámster chino in vivo. Se ha mostrado ahora que C-CAM suprime el crecimiento del tumor in vitro e in vivo.
Otros supresores tumorales que pueden ser empleados de acuerdo con la presente invención incluyen RB, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-1, MEN-II, zac1, p73, BRCA1, VHL, FCC, MMAC1, MCC, p16, p21, p57, C-CAM, p27 y BRCA2. Los inductores de apoptosis, tales como las proteasas Bax, Bak, Bcl-X_{5}, Bik, Bid, Harakiri, Ad E1B, Bad e ICE-CED3, podrían encontrar uso similarmente de acuerdo con la presente invención.
Diferentes genes para enzimas son de interés de acuerdo con la presente invención. Tales enzimas incluyen a la citosina desaminasa, a la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa, a la galactosa-1-fosfato uridiltransferasa, a la fenilalanina hidroxilasa, a la glucocerbrosidasa, a la esfingomielinasa, a la \alpha-L-iduronidasa, a la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, a la HSV timidina quinasa y a la timidina quinasa humana.
Las hormonas son otro grupo del gen que pueden ser utilizadas en los vectores descritos aquí. Se incluyen la hormona de crecimiento, la prolactina, el lactógeno placentario, la hormona luteinizante, la hormona estimuladora de folículos, la gonadotropina coriónica, la hormona estimuladora de la tiroides, la leptina, la adrenocorticotropina (ACTH), la angiotensina I y II, la endorfina \beta, la hormona estimuladora del Melanocito \beta (\beta-MSH), la colecistoquinina, la endotelina I, la galanina, el péptido inhibidor gástrico (GIP), el glucagón, la insulina, las lipotropinas, las neurofisinas, somatostatina, calcitonina, el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), el péptido relacionado con el gen de la calcitonina \beta, la hipercalcemia del factor de malignidad (1-40), la proteína relacionada con la hormona paratiroidea (107-139) (PT-rP), la proteína relacionada con la hormona paratiroidea (107-111) (PT-rP), el péptido tipo glucagón (GLP-1), la pancreastatina, el péptido pancreático, el péptido YY, PHM, la secretina, el péptido intestinal vasoactivo (VIP), la oxitocina, la vasopresina (AVP), la vasotocina, el enquefalinamida, la metorfinamida, la hormona estimuladora del Melanocito alfa (MSH alfa), el factor natriurético atrial (5-28) (ANF), la amilina, el componente amiloide P (SAP-1), la hormona liberadora de corticotropina (CRH), el factor liberador de hormona del crecimiento (GHRH), la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH), el neuropéptido Y, la sustancia K (neuroquinina A), la sustancia P y la hormona liberadora de tirotropina (TRH).
Otras clases de genes que son contemplados para ser insertados en los vectores de la presente invención incluyen interleuquinas y citoquinas. Interleuquina 1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 IL-12, GM-CSF y G-CSF.
Los ejemplos de enfermedades para las cuales el presente vector viral sería útil incluyen, pero no se limitan a deficiencia de adenosina desaminasa, deficiencia del factor IX de coagulación de sangre humana en la hemofilia B, y fibrosis cística, que involucrarían el reemplazo del gen receptor transmembrana de la fibrosis cística. Los vectores abarcados en la presente invención podrían ser utilizados también para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos tales como la artritis reumatoide o la restenosis por transferencia de los genes que codifican a los inhibidores de angiogénesis o a los inhibidores del ciclo celular. La transferencia de activadores de prodroga tales como el gen para HSV-TK pueden ser utilizados también en el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, incluido el cáncer.
2. Construcciones Antisentido
Oncogenes tales como ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl y abl también son objetivos adecuados. Sin embargo, para beneficio terapéutico, estos oncogenes se expresarían como un ácido nucleico antisentido, a fin de inhibir la expresión del oncogén. El término "ácido nucleico antisentido" se refiere a los oligonucleótidos complementarios a las secuencias base de ADN y ARN que codifican al oncogén. Los oligonucleótidos antisentido, cuando se los introduce en una célula objetivo, se enlazan específicamente a su ácido nucleico objetivo e interfieren con la transcripción, el procesamiento del ARN, el transporte y/o la traducción. El ADN bicatenario (ds) objetivo con oligonucleótido conduce a la formación de una triple hélice; el ARN objetivo conducirá a la formación de una doble hélice.
Las construcciones antisentido pueden ser diseñadas para enlazarse con el promotor y otras regiones de control, exones, intrones o incluso los límites exón-intrón de un gen. Las construcciones de ARN antisentido, o de ADN que codifican a tales ARN antisentido, pueden ser empleadas para inhibir la transcripción génica o la traducción o ambas dentro de una célula huésped, ya sea in vitro o in vivo, tal como dentro de un animal huésped, incluido un individuo humano. Las secuencias de ácido nucleico que incluyen "nucleótidos complementarios" son aquellos que son capaces del apareamiento de bases de acuerdo con las reglas estándar de complementariedad de Watson-Crick. Esto es, que las purinas mayores formarán una pareja de bases con las pirimidinas más pequeñas para formar únicamente combinaciones de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada ya sea con timina (A:T), en el caso del ADN, o adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso del ARN.
Como se los utiliza aquí, los términos "complementario" o "secuencias antisentido" significan secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente complementarias en toda su longitud y tienen muy pocas incongruencias de bases. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico de quince bases de longitud se pueden llamar complementarias cuando ellas tienen un nucleótido complementario en las posiciones trece o catorce con únicamente incongruencias dobles o sencillas. Naturalmente, las secuencias de ácido nucleico que son "completamente complementarias" serán secuencias de ácido nucleico que son completamente complementarias a lo lago de toda su longitud y no tienen incongruencias de bases.
Aunque todo o parte de la secuencia de genes puede ser empleada en el contexto de la construcción antisentido, estadísticamente, cualquier secuencia de 17 bases de longitud se presentaría únicamente una vez en el genoma humano y, por lo tanto, basta para especificar una única secuencia objetivo. Aunque los oligómeros más cortos son más fáciles de elaborar e incrementan la accesibilidad in vivo, están involucrados numerosos otros factores en la determinación de la especificidad de la hibridación. Tanto la afinidad de enlazamiento como la especificidad de la secuencia de un oligonucleótido con su objetivo complementario se incrementan con el incremento de la longitud. Se contempla que se utilizarán oligonucleótidos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó más pares de bases. Uno puede fácilmente determinar si un ácido nucleico antisentido dado es efectivo como objetivo del correspondiente gen de la célula huésped analizando simplemente las construcciones in vitro para determinar si la función del gen endógeno es afectada o si se afecta la expresión de los genes relacionados que tienen secuencias complementarias.
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En ciertas modalidades, uno puede desear emplear construcciones antisentido que incluyan otros elementos, por ejemplo, aquellas que incluyen pirimidinas propino C-5. Los oligonucleótidos que contienen análogos propino C-5 de uridina y citidina han mostrado que enlazan ARN con alta afinidad y que son potentes inhibidores antisentido de expresión génica (Wagner y colaboradores, 1993).
Como una alternativa al suministro antisentido dirigido, se pueden utilizar ribozimas dirigidas. El término "ribozima" se refiere a una enzima con base en ARN capaz de dirigir y cortar secuencias particulares de bases en el ADN o ARN del oncogén. También se pueden dirigir ribozimas directamente a las células, en la forma de oligonucleótidos de ARN que incorporan secuencias de ribozima, o introducirlas en las células como una construcción de expresión que codifica al ARN ribosimal deseado. Los ribozimas se pueden utilizar y aplicar de la misma manera como se describió para los ácidos nucleicos antisentido.
3. Antígenos para Vacunas
Otros genes terapéuticos podrían incluir genes que codifican antígenos tales como antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos de hongos o antígenos parasitarios. Los virus incluyen picornavirus, coronavirus, togavirus, flavivirus, rabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, bunyavirus, arenavirus, reovirus, retrovirus, papovavirus, parvovirus, virus del herpes, virus de la viruela, hepadnavirus, y virus espongiforme. Los objetivos virales incluyen influenza, virus 1 y 2 del herpes simple, sarampión, viruela, polio o HTV. Los patógenos incluyen tripanosomas, lombriz solitaria, ascárides, helmintos. También, se pueden dirigir los marcadores tumorales, tal como el antígeno fetal o el antígeno prostático específico. Los ejemplos preferidos incluyen a las proteínas de env del VIH y al antígeno de superficie de la hepatitis B. La administración de un vector de acuerdo con la presente invención para propósitos de vacunación requeriría que los antígenos asociados al vector sean suficientemente no inmunogénicos para permitir la expresión a largo plazo del transgén, para lo cual sería deseable una respuesta inmune fuerte. Preferiblemente, la vacunación de un individuo solo sería necesaria con poca frecuencia, tal como cada año o cada dos años, y proporciona una protección inmunológica contra el agente infeccioso.
4. Regiones de Control
Con el propósito de que el vector viral efectúe la expresión de un transcripto que codifique un gen terapéutico, el polinucleótido que codifica al gen terapéutico estará bajo el control transcripcional de un promotor y una señal de poliadenilación. Un "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula huésped, o la maquinaria sintética introducida, que se requiere para iniciar la transcripción específica de un gen. Una señal de poliadenilación se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula huésped, o la maquinaria sintética introducida, que es requerida para dirigir la adición de una serie de nucleótidos sobre el extremo del transcripto de ARNm para el procesamiento adecuado y tráfico del transcripto fuera del núcleo dentro del citoplasma para la traducción. La frase "bajo control transcripcional" significa que el promotor está en la ubicación correcta en relación con el polinucleótido para controlar la iniciación de la ARN polimerasa y la expresión del polinucleótido.
El término promotor será utilizado aquí para referirse a un grupo de módulos de control transcripcional que se aglomeran alrededor del sitio de iniciación para la ARN polimerasa II. Mucha de la reflexión acerca de cómo se organizan los promotores se deriva del análisis de varios promotores virales, incluidos aquellos para la timidina quinasa (tk) de HSV y las unidades de transcripción temprana de SV40. Esos estudios, junto con trabajos más recientes, han mostrado que los promotores están compuestos de módulos funcionales discretos, consistiendo cada uno de aproximadamente 7-20 pb de ADN, y conteniendo uno o más sitios de reconocimiento para las proteínas activadoras o represoras transcripcionales.
Al menos un módulo en cada promotor funciona para posicionar el sitio de inicio para la síntesis del ARN. El ejemplo más conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de una caja TATA, tal como el promotor para el gen de la desoxinucleotidil transferasa terminal de mamífero y el promotor para los genes tardíos de SV40, un elemento discreto que se superpone al sitio mismo de inicio ayuda a fijar el lugar de iniciación.
Elementos promotores adicionales regulan la frecuencia de la iniciación transcripcional. Típicamente, estos se localizan en la región de 30-110 pb secuencia arriba del sitio de inicio, aunque se ha mostrado recientemente que una cantidad de promotores contienen también elementos funcionales secuencia abajo del sitio de inicio. El espaciado entre elementos es flexible, para que se preserve la función del promotor cuando se invierten los elementos o se mueven relativamente entre sí. En el promotor tk, el espaciado entre elementos se puede incrementar hasta 50 pb antes de que la actividad comience a declinar. Dependiendo del promotor, parece que elementos individuales pueden funcionar ya sea cooperativamente o independientemente para activar la transcripción.
E. Composiciones Farmacéuticas
En ciertas modalidades, la presente invención también se relaciona con formulaciones de una composición viral para administración a un mamífero. Se entenderá también que, si se desea, las composiciones virales divulgadas aquí se pueden administrar también en combinación con otros agentes, tales como, por ejemplo, diferentes agentes farmacéuticamente activos. Siempre y cuando la composición no cause un efecto significativo adverso por contacto con las células objetivo o los tejidos huésped, no existe virtualmente límite para otros componentes que pueden ser incluidos también.
La formulación de excipientes farmacéuticamente aceptables y de soluciones portadoras es bien conocida por aquellos capacitados en el arte, así como el desarrollo de dosis adecuadas y regímenes de tratamiento para uso de las composiciones particulares descritas aquí en una variedad de regímenes de tratamiento, incluidos, por ejemplo, formulación y administración oral, parenteral, intravenosa, intranasal, e intramuscular.
1. Composiciones Inyectables y Suministro
Las composiciones farmacéuticas divulgadas aquí se pueden administrar en forma parenteral, intravenosa, intramuscular, o incluso intraperitoneal como se describe en la patente estadounidense No. 5.543.158, en la patente estadounidense No. 5.641.515 y la en la patente estadounidense No. 5.399.363. Se pueden preparar soluciones de los compuestos activos como bases libres o como sales farmacológicamente aceptables en agua convenientemente mezclados con un tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Se pueden preparar también dispersiones en glicerol, glicoles de polietileno líquido, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones normales de uso y almacenamiento, estas preparaciones contienen un preservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Típicamente, estas formulaciones pueden contener aproximadamente al menos 0,1% del compuesto activo o más, aunque el porcentaje del(los) ingrediente(s) activo(s) se puede variar desde luego, y puede estar convenientemente aproximadamente entre 1 ó 2% y aproximadamente 60% ó 70% o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de compuesto(s) activo(s) en cada composición terapéuticamente útil se puede preparar de tal manera que se obtendrá una dosis adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Factores tales como la solubilidad, la biodisponibilidad, la vida media biológica, la vía de administración, la vida útil del producto, así como otras consideraciones farmacológicas serán tenidas en cuenta por la persona capacitada en el arte en la preparación de tales formulaciones farmacéuticas, y como tal, pueden ser deseables una variedad de regímenes de tratamiento y de dosis.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones (patente estadounidense No. 5. 466.468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto en que pueda inyectarse fácilmente. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y deben ser preservadas contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un medio solvente o dispersante que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilén glicol, y polietilén glicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, por medio del uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por medio del mantenimiento de un tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y por medio del uso de tensoactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr por medio de diferentes agentes antibacteriales y antihongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse por medio del uso en las composiciones de agentes que demoran la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser adecuadamente amortiguada si es necesario y el diluyente líquido se debe volver primero isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este sentido, el medio acuoso estéril que se puede emplear será conocido por aquellos capacitados en el arte a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosis se puede disolver en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirla ya sea a 1000 ml de un fluido de hipodermoclisis o inyectada en el sitio propuesto para la infusión, (ver por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ava Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Se presentará necesariamente alguna variación en la dosis dependiendo de la condición del individuo que está siendo tratado. La persona responsable de la administración determinará en cualquier caso, la dosis apropiada para el individuo en particular. Además, para administración en humanos, las preparaciones deben reunir las condiciones de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza estándares requeridas por los estándares de la Oficina de Biológicos de la FDA.
Las soluciones estériles inyectables se preparan por medio de la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por filtración esterilizante. Generalmente, las dispersiones se preparan por medio de la incorporación de los diferentes ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio básico de dispersión y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y de liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada en forma estéril del mismo.
Las composiciones descritas aquí se pueden formular en una forma neutra o de una sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen a las sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres se pueden derivar también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, de sodio, de potasio, de amonio, de calcio, o de hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Después de la formulación, se administrarán las soluciones en una forma compatible con la formulación de la dosis y en una cantidad tal que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas para liberación del fármaco y similares.
Como se lo utiliza aquí, "portador" incluye a cualquiera y a todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacteriales y agentes antihongos, agentes isotónicos y agentes que demoran la absorción, amortiguadores, soluciones portadoras, suspensiones, coloides, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en el arte. Excepto en la medida en que cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en la composición terapéutica. Se pueden incorporar también ingredientes activos suplementarios dentro de las composiciones.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y a composiciones que no producen una reacción alérgica o adversa similar cuando se la administra a un humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como ingrediente activo está bien entendida en el arte. Típicamente, tales composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o como suspensiones; también se pueden preparar las formas sólidas adecuadas para solución en líquido o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar.
2. Composiciones Orales y Suministro
Alternativamente, las composiciones farmacéuticas divulgadas aquí se pueden suministrar por medio de administración oral a un animal, y como tal, estas composiciones se pueden formular con un diluyente inerte o con un portador asimilable comestible, o se las puede incluir en cápsulas de gelatina de caparazón dura o blanda o se las puede comprimir en tabletas, o se las puede incorporar directamente con el alimento de la dieta.
Los compuestos activos se pueden incorporar incluso con excipientes y utilizarlos en la forma de tabletas que se pueden ingerir, tabletas bucales, comprimidos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares (Mathiowitz y colaboradores, 1997; Hwang y colaboradores, 1998; patente estadounidense No. 5.641.515; patente estadounidense No. 5.580.579 y patente estadounidense No. 5.792.451). Las tabletas, comprimidos, píldoras, cápsulas y similares pueden contener también lo siguiente: un aglomerante, como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz, o gelatina; excipientes, tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrante, tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio, y se puede añadir un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente saborizante, tal como menta, aceite de gaulteria o saborizante de cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido. Varios otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar la forma física de la dosis unitaria. Por ejemplo, las tabletas, píldoras o cápsulas se pueden recubrir con laca, azúcar o con ambos. Un jarabe de elixir puede contener a los compuestos activos de sacarosa como agente edulcorante, metil y de propilparabenos como preservantes, un colorante y un saborizante, tales como sabor a cereza o a naranja. Desde luego, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación deben ser farmacéuticamente puros y sustancialmente no tóxicos en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos se pueden incorporar en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.
Para administración oral, se pueden incorporar alternativamente las composiciones de la presente invención con uno o más excipientes en la forma de un enjuague bucal, dentífrico, tableta bucal, atomizador oral, o formulación administrada oralmente en forma sublingual. Por ejemplo, un enjuague bucal se puede preparar incorporando al ingrediente activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado, tal como una solución de borato sódico (Solución de Dobell). Alternativamente, el ingrediente activo se puede incorporar en una solución oral tal como aquellas que contienen borato sódico, glicerina y bicarbonato de potasio, o dispersadas en un dentífrico, incluyendo: geles, pastas, polvos y suspensiones, o añadido en una cantidad terapéuticamente efectiva a una pasta dentífrica que puede incluir agua, aglomerantes, abrasivos, agentes saborizantes, agentes espumantes, y humectantes, o alternativamente confeccionado en forma de una tableta o de una solución que puede ser colocada bajo la lengua o bien disuelta en la boca.
3. Suministro Nasal
Se considera también la administración de composiciones farmacéuticas agonistas por medio de atomizadores intranasales, inhalación, y/o otros vehículos para suministro en aerosol. Los métodos para el suministro de genes, ácidos nucleicos y composiciones de péptidos directamente en los pulmones a través de atomizadores nasales en aerosol han sido descritos por ejemplo, en la patente estadounidense No. 5.756.353 y en la patente estadounidense No. 5.804.212, y el suministro de fármacos utilizando resinas intranasales en micropartículas (Takenaga y colaboradores, 1998) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (patente estadounidense No. 5.725.871, específicamente incorporada aquí como referencia en su totalidad) son también conocidos en las artes farmacéuticas. Igualmente, el suministro transmucosal de fármacos en la forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno es descrita en la patente estadounidense No. 5.780.045.
F. Ejemplos
Se incluyen los siguientes ejemplos para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Aquellos capacitados en el arte apreciarán que las técnicas divulgadas en los ejemplos que vienen a continuación representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, y por lo tanto pueden ser consideradas como constitutivas de las formas preferidas para su práctica. Sin embargo, aquellos capacitados en el arte deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que son descritas y aún obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Materiales y Métodos Liofilizador
Se utilizó un liofilizador Dura-Stop \mup (FrSsystems) con recuperación de la muestra en proceso. Se equipó el liofilizador tanto con un vacuómetro con termocupla como con un manómetro de capacitancia para medición del vacío. Se programa la temperatura del condensador hasta alcanzar los-80ºC. Se taparon los viales al final de cada corrimiento con un dispositivo mecánico incorporado de tapado.
Medición de la Humedad Residual
Se analizó la humedad residual en un producto liofilizado por medio de un coulómetro tipo Karl-Fisher (coulómetro KF marca Mettler DL37).
Análisis por HPLC
El análisis por medio de HPLC de las muestras se realizó sobre un sistema de HPLC marca Beckman Gold.
Viales y Tapones
Se utilizaron viales lyo en vidrio borosilicato de 3 ml de capacidad con aberturas de 13 mm y sus correspondientes tapones de caucho de butilo (ambos de Wheaton) tanto para la liofilización como para el desarrollo de la formulación líquida. Los viales con sus tapas fueron recubiertos con tapas de aluminio tipo Flip-off utilizando un dispositivo de tapado (LW312 Westcapper, The West Company).
Ejemplo 2
(Para propósitos ilustrativos únicamente)
Liofilización: Ciclo Inicial y Desarrollo de la Formulación
Existen tres procesos principales variables que se pueden programar para lograr una liofilización óptima. Estos son temperatura en el estante, presión de la cámara, y tiempo de duración de la etapa de liofilización. Para evitar el colapso de la torta, se debe programar la temperatura en el estante entre 2-3ºC por debajo de la temperatura de transición del vidrio o temperatura eutéctica de la formulación congelada. Tanto la temperatura de transición del vidrio como la temperatura eutéctica de una formulación se pueden determinar por medio de análisis por calorimetría diferencial de barrido (DSC). La presión de la cámara generalmente se programa por debajo de la presión de vapor del hielo de la formulación congelada. La presión de vapor del hielo depende de la temperatura en el estante y de la presión de la cámara. Una presión muy alta de la cámara reducirá la tasa de secado reduciendo la presión diferencial entre el hielo y el medio circundante, mientras que una presión muy baja disminuirá también la tasa de secado reduciendo la tasa de transferencia de calor desde el estante hacia los viales. El desarrollo del ciclo de liofilización está muy relacionado con la formulación y los viales escogidos para la liofilización. El éxito en esta etapa fue desarrollar un ciclo algo conservador capaz de liofilizar exitosamente una cantidad de formulaciones diferentes. Los ciclos desarrollados y las formulaciones se optimizarán adicionalmente cuando se formulan los virus en las formulaciones. La selección del excipiente de la formulación se basó en los excipientes clásicos encontrados en la mayoría de los productos farmacéuticos liofilizados. Los excipientes en una formulación liofilizada deben proveer las funciones de relleno, crioprotección, y lioprotección. Los excipientes escogidos fueron manitol (agente de relleno), sacarosa (crio y lioprotector), y albumina de suero humano (HSA, lioprotector). Estos excipientes se formularon en tris 10 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50 en diferentes porcentajes y se los colocó en viales de 3 ml con un volumen total de 1 ml. Para iniciar se programó un ciclo preliminar para seleccionar una variedad de formulaciones con base en el criterio de la humedad residual y la apariencia física después del secado. El ciclo utilizado está graficado en la Fig. 1. Se llevó a cabo una amplia selección por medio de la variación de los porcentajes de los excipientes individuales. La Tabla 4 muestra brevemente algunos de los resultados.
TABLA 4 Evaluación de Diferentes Formulaciones Bajo el Mismo Ciclo
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Los resultados sugieren que se requiere una cantidad mínima de 3% de manitol en la formulación con el propósito de lograr una torta farmacéuticamente elegante. Se examinaron también los porcentajes de sacarosa en la formulación. No se observó un efecto significativo sobre la liofilización con concentraciones de sacarosa de \leq 10%. Se mantuvo constante la concentración de HSA en 0,5% durante la etapa inicial de selección.
Después de la evaluación de las formulaciones, se optimizó el ciclo de liofilizado cambiando la temperatura del estante, el vacío de la cámara y la duración de cada etapa del ciclo. Con base en la optimización del ciclo extendido, se utilizó el siguiente ciclo (ciclo # 14) para el desarrollo adicional de la liofilización del virus.
1.
Cargar la muestra a temperatura ambiente en un estante.
2.
Programar la temperatura en el estante a -45ºC y congelar la muestra. Intervalo de tiempo 2 h.
3.
Programar la temperatura en el estante a -45ºC, encender la bomba de vacío y programar el vacío a 400 mT. Intervalo de tiempo 5 h.
4.
Programar la temperatura en el estante a -35ºC, programar el vacío a 200 mT. Intervalo de tiempo 13 h.
5.
Programar la temperatura en el estante a -22ºC, programar el vacío a 100 mT. Intervalo de tiempo 15 h.
6.
Programar la temperatura en el estante a -10ºC, programar el vacío a 100 mT. Intervalo de tiempo 5 h.
7.
Programar la temperatura en el estante a 10ºC, programar el vacío a 100 mT. Intervalo de tiempo 4 h.
8.
Tapar el vial al vacío.
Ejemplo 3
(Para propósitos ilustrativos únicamente)
Desarrollo del Ciclo y las Formulaciones con Virus en las Formulaciones
Efecto de la Concentración de Sacarosa en las Formulaciones. Se optimizaron adicionalmente el ciclo y la formulación de acuerdo con la recuperación del virus después de analizada la liofilización tanto por medio del ensayo por HPLC como por el ensayo de la unidad formadora de placa (PFU). La Tabla 5 muestra las recuperaciones de virus inmediatamente después del secado en diferentes formulaciones utilizando el ciclo anterior de secado. La variación del porcentaje de sacarosa en la formulación tuvo un efecto significativo sobre las recuperaciones del virus.
TABLA 5 Recuperaciones de Virus Después de la Liofilización
9
Se incrementó la humedad residual en el producto liofilizado en la medida en que se incrementó el porcentaje de sacarosa. Se requiere una concentración mínima de sacarosa de 5% en la formulación para mantener una buena recuperación de virus después de la liofilización. Se observaron efectos similares de la sacarosa en la formulación que tenía 5% en vez de 6% de manitol. Sin embargo, una buena recuperación de virus inmediatamente después del secado no necesariamente conlleva una buena estabilidad en almacenamiento durante un largo periodo de tiempo. Como resultado, se incorporaron las formulaciones que tienen 4 concentraciones diferentes de sacarosa de 6, 7, 8 y 9%, para una evaluación adicional.
Efecto de la HSA en la Formulación. La contribución de las concentraciones de HSA en la formulación sobre la recuperación del virus después del secado fue examinada utilizando el mismo ciclo de liofilización. La Tabla 6 muestra los resultados.
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TABLA 6 Efectos de la Concentración de la HSA sobre la Liofilización
10
Los resultados indican que la inclusión de la HSA en la formulación tuvo un efecto positivo sobre la recuperación del virus después del secado. Concentraciones superiores al 0,5% no mejoraron adicionalmente la recuperación del virus después del secado. Como resultado, se formuló 0,5% de HSA en todas las formulaciones de liofilización.
Optimización del Ciclo. Como se indica en la Tabla 5, estaban presentes humedades residuales relativamente altas en el producto seco. Aunque no se conoce una humedad residual óptima para los virus liofilizados, puede ser beneficioso para la estabilidad en almacenamiento durante un largo periodo de tiempo, reducir adicionalmente la humedad residual en el producto seco. Después de revisar el ciclo de secado, se decidió incrementar la temperatura del secado secundario de 10ºC a 30ºC sin incrementar el tiempo total del ciclo. Como se indica en la Tabla 7, se había logrado una significativa reducción en la humedad relativa en todas las formulaciones sin efectos negativos sobre la recuperación del virus. Con el ciclo mejorado de secado, la humedad residual fue menor al 2% en todas las formulaciones inmediatamente después del secado. Se espera que la humedad residual reducida mejore la estabilidad en almacenamiento durante un periodo prolongado de tiempo del producto seco.
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TABLA 7 Efectos de la Temperatura del Secado Secundario sobre la Liofilización
11
Relleno de N_{2} (Esparcimiento). La liofilización se hizo en forma similar al proceso anterior excepto porque se utilizó N_{2} seco para la purga del gas para control de la presión durante el secado y relleno al final del ciclo. Al final de un proceso de secado, se relleno la cámara con N_{2} seco hasta aproximadamente 80% de la presión atmosférica. Posteriormente, se taparon los viales. No se observó diferencia entre los corrimientos con relleno de N_{2} y al aire inmediatamente después del secado. Sin embargo, si el oxígeno presente en el vial durante el relleno con aire causa efectos nocivos (oxidación) sobre el virus o los excipientes utilizados durante almacenamiento por un largo periodo de tiempo, el relleno con N_{2} seco probablemente disminuya los efectos nocivos y mejore la estabilidad durante el almacenamiento por un largo periodo de tiempo del virus.
Remoción del Glicerol de la Formulación. Durante la preparación de las formulaciones que contienen el virus, se añadió una solución patrón del virus a las formulaciones previamente formuladas con un factor de dilución de 10. Debido a la presencia de 10% de glicerol en la solución patrón del virus, se introdujo 1% de glicerol en las formulaciones. Para examinar cualquier posible efecto de la presencia de 1% de glicerol sobre la liofilización, se llevó a cabo un procedimiento de liofilizado utilizando virus diafiltrado dentro de la formulación de 5% (M)/7% (S)/ 0,5% (HSA). Se realizó la diafiltración con 5 volúmenes de amortiguador de intercambio utilizando una forma de volumen constante de amortiguador de intercambio para garantizar la remoción adecuada del glicerol residual (remoción del 99%). Después de la diafiltración, se colocó la solución del virus en los viales y se liofilizó luego en forma similar. La Tabla 8 muestra los resultados de la liofilización.
TABLA 8 Liofilización sin Glicerol
12
No se observó una diferencia significativa después de la liofilización entre las formulaciones con y sin 1% de glicerol. Se evaluarán las posibles implicaciones de este cambio sobre el almacenamiento durante un largo periodo de tiempo.
Ejemplo 4
(Para propósitos ilustrativos únicamente)
Estudio de Estabilidad Durante el Almacenamiento por Largos Periodos de Tiempo
Se colocó el virus Adp53 liofilizado bajo diferentes formulaciones y diferentes ciclos a -20ºC, 4ºC y temperatura ambiente (RT) en la oscuridad para evaluar la estabilidad durante el almacenamiento por largos periodos de tiempo. Los parámetros medidos durante el estudio de estabilidad fueron PFU, partículas virales por HPLC, humedad residual, y el vacío dentro del vial. El plan es poder evaluar la estabilidad del virus a diferentes condiciones hasta por un año de almacenamiento. La Tabla 6 muestra los datos después de un periodo de almacenamiento de 12 meses con secado secundario a 10ºC sin relleno de N_{2}. El virus liofilizado es estable tanto a -20ºC como a 4ºC durante almacenamiento hasta por 12 meses. Sin embargo, el virus no fue estable durante el almacenamiento a temperatura ambiente. Se observó una pérdida de infectividad de más del 50% a RT después de un mes de almacenamiento. La razón de la rápida pérdida de infectividad a RT no es clara. Sin embargo, es probable que la RT este por encima de la temperatura de transformación del vidrio de la formulación seca dando como resultado una degradación acelerada del virus. Un análisis por calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la formulación podría suministrar información muy útil. No se detectó cambio de presión dentro de los viales durante el almacenamiento, lo cual indica que los viales mantuvieron su integridad. El ligero incremento en humedad residual durante el almacenamiento se puede atribuir a la liberación de humedad por parte de la tapa de caucho dentro del producto seco.
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TABLA 12 Formulación Acuosa Serie #1
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TABLA 13 Formulación Acuosa Serie # 2
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Las formulaciones están en amortiguador tris 10 mM (pH = 7,5) que consiste de 1% de glicerol y MgCl_{2} 1 mM.
Las formulaciones están almacenadas a 4ºC y a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno.
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TABLA 14 Formulación Acuosa Serie #3
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TABLA 15 Formulación líquida serie #4
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(Continuación)
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La Tabla 10 y la Tabla 11 muestran los datos de estabilidad durante el almacenamiento con secado secundario a 30ºC sin y con relleno de N_{2}, respectivamente. Debido a la estabilidad casi idéntica observada en condiciones de almacenamiento a -20ºC y a 4ºC, y para reducir el consumo de virus, no se incluyó -20ºC en el estudio de estabilidad para el almacenamiento durante un largo periodo de tiempo. En forma similar a las muestras secadas con secado secundario a 10ºC, el virus es estable a 4ºC pero no es estable a RT. Sin embargo, se observó una mejor estabilidad relativa para el almacenamiento a RT que aquellas secadas con secado secundario a 10ºC. Este es probablemente el resultado de la menor humedad residual alcanzada con un secado secundario a 30ºC. Este resultado sugiere que la humedad residual es un parámetro importante que afecta la estabilidad del almacenamiento durante un almacenamiento por un largo periodo de tiempo.
Las recuperaciones de partículas virales por HPLC son consistentemente menores que las recuperaciones de virus calculadas a partir del ensayo de PFU inmediatamente después del secado. La razón de la discrepancia no está clara. Sin embargo, probablemente está relacionada con una posible agregación de los virus durante la liofilización. La evaluación por microscopía electrónica se lleva a cabo para examinar una posible agregación de los virus de la liofilización. Durante el almacenamiento, el análisis por HPLC indica que el virus es estable durante el almacenamiento tanto a -20ºC como a 4ºC y no es estable a RT, lo cual es consistente con los resultados del ensayo de PFU.
Ejemplo 5 Alternativas a la HSA
La presencia de HSA en las formulaciones podría ser una potencial preocupación regulatoria. Como resultado, se han evaluado una variedad de excipientes para sustituir HSA en la formulación. Los sustituyentes examinados incluyen PEG, aminoácidos (glicina, arginina), polímeros (polivinil pirrolidona), y tensoactivos (Tween-20 y Tween-80). Estos sustituyentes de HSA están, sin embargo, por debajo del óptimo con relación a HSA. El esfuerzo de un desarrollo adicional fue mínimo.
Ejemplo 6 Formulación Líquida
Concurrente con el desarrollo de la liofilización del producto Adp53, se llevó a cabo una experimentación para examinar la posibilidad de desarrollar una formulación líquida para el producto Adp53. El éxito estuvo en desarrollar una formulación que puede suministrar suficiente estabilidad al virus cuando se lo almacena a temperaturas por encima de la congelación. Se han evaluado cuatro series de formulaciones líquidas. En la primera serie de formulaciones, la formulación actual con 10% de glicerol fue comparada con formulaciones que contenían HSA y PEG. En la segunda serie de formulaciones, se examinaron diferentes aminoácidos para la formulación de Adp53. En la tercera serie de formulaciones, se utilizó la formulación óptima desarrollada para la liofilización para formular Adp53 en una forma líquida. En la cuarta serie de formulaciones, se evaluaron detergentes para la formulación de Adp53. Los virus formulados con todas aquellas diferentes formulaciones están siendo analizadas para la estabilidad durante el almacenamiento por largos periodos de tiempo a -20ºC, 4ºC y RT.
Formulación Líquida Serie # 1
Se comparó la formulación que contenía HSA (5% de sacarosa + 5% de HSA en amortiguador Tris 10 mM, NaCl 150 mM, y MgCl_{2} 1 mM, amortiguador de pH = 8,20) con formulaciones de 10% de glicerol en amortiguador DPBS y sacarosa/PEG y Trehalosa/PEG. Se ha recomendado PEG como un buen agente de exclusión preferencial en formulaciones (Wong y Parasrampurita, 1997). Está incluida en esta serie de formulaciones examinar si pueden proporcionar un efecto de estabilización sobre Adp53. Se colocaron las formulaciones en viales lyo de 3 ml hasta un volumen de 0,5 ml. Se taparon los viales ya sea bajo condiciones atmosféricas o con relleno de N_{2} para examinar los posibles efectos que el relleno de N_{2} puede tener sobre la estabilidad del almacenamiento durante un largo periodo de tiempo de Adp53. Para garantizar una adecuada desgasificación de la formulación y el posterior relleno con N_{2}, se taparon parcialmente los viales llenos con tapones lyo y se los colocó sobre el estante del liofilizador bajo condiciones de RT. Se cerró la cámara del liofilizador y se hizo vacío prendiendo la bomba de vacio. Se evacuó la cámara hasta 25 mm de Hg. Luego se purgó la cámara completamente con N_{2} seco. Se repitió la evacuación y la gasificación dos veces para garantizar el relleno con N_{2}. Los viales rellenados con N_{2} fueron colocados con los viales que no fueron rellenados con N_{2} a diferentes condiciones de almacenamiento para evaluar la estabilidad durante el almacenamiento. La Tabla 12 muestra los datos del análisis para un almacenamiento hasta de 18 meses a 4ºC y RT.
Se observaron caídas estadísticamente significativas en el virus de PFU y en las partículas virales por HPLC para formulaciones con 10% de glicerol después de 3 meses de almacenamiento tanto a 4ºC como a RT. No se observó una degradación estadísticamente significativa del virus para todas las otras formulaciones almacenadas a 4ºC. Sin embargo, se observó una disminución en la infectividad del virus cuando se almacenó a RT.
Formulación Líquida Serie # 2
Se evaluaron diferentes combinaciones de aminoácidos, azúcares, PEG y urea para la estabilización de Adp53 durante periodos de almacenamiento largos. La Tabla 13 muestra los datos de estabilidad para 12 meses. Los resultados indican que la combinación de 5% de manitol y 5% de sacarosa con otros excipientes produjo una mejor estabilidad durante el almacenamiento a RT durante un mes. Adp53 es más estable en la formulación que tiene todos los excipientes. En esta serie de formulaciones, no se incluyeron excipientes derivados de humanos o de animales. Nuestra expectativa es desarrollar una formulación líquida sin incluir a ninguna de las proteínas derivadas ya sea de origen humano o animal.
Formulación Líquida Serie # 3
Se evaluaron las formulaciones óptimas desarrolladas para la liofilización para formular Adp53 en una forma líquida. Este enfoque sería un buen puente entre una formulación líquida y la liofilización si se puede lograr una estabilidad satisfactoria de Adp53 utilizando una formulación de liofilización para relleno líquido. Las muestras rellenadas fueron almacenadas a -20ºC y 4ºC para un estudio de estabilidad. La Tabla 14 muestra los datos de estabilidad para 3 meses. El virus es estable tanto a -20ºC como a 4ºC para las cuatro formulaciones diferentes. Este está de acuerdo con los resultados de la formulación serie # 2, lo cual sugiere que se espera la mejor estabilidad del virus con la presencia tanto de manitol como de sacarosa en la formulación. Se está acumulando datos de estabilidad para almacenamiento durante periodos de tiempo más largos.
Formulación Líquida Serie # 4
Se han utilizado detergentes en las formulaciones para una variedad de proteínas recombinantes. En esta serie de formulaciones, se examinaron diferentes concentraciones de detergentes para la formulación de Adp53. Los detergentes utilizados fueron no iónicos (Tween-80) y zwitteriónicos (Chap). La Tabla 15 muestra los datos de estabilidad para 12 meses. El virus es estable durante almacenamiento a 4ºC. No se observó una diferencia significativa en la estabilidad del virus a 4ºC entre las formulaciones analizadas. En forma similar a las formulaciones serie # 2, no se incluyó una proteína exógena en esta serie de formulaciones.
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Todas las composiciones y métodos divulgados y reivindicados aquí se pueden elaborar y llevar a cabo sin la debida experimentación a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y los métodos de esta invención han sido descritos en términos de modalidades preferidas, será evidente para aquellos capacitados en el arte que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y los métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito aquí. Más específicamente, será evidente que se pueden sustituir ciertos agentes que están relacionados tanto química como fisiológicamente por los agentes descritos aquí en tanto que se puedan lograr los mismos resultados o resultados similares.
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Claims (26)

1. Una composición farmacéutica acuosa de adenovirus que contiene un poliol en una cantidad defectiva para promover el mantenimiento de la infectividad adenoviral, en donde la composición incluye además Tween-20 o Tween-80, en donde en el último caso la composición no es una composición que consista de 1 x 10^{9} a 1 x 10^{3} partículas/ml A/C/N 53, 0,5 a 10 mg/ml de fosfato de sodio monobásico, 0,5 a 10 mg/ml de trometamina, 5 a 25 mg/ml de sacarosa, 20 a 200 mg/ml de glicerol, 0,1 a 1 mg/ml de cloruro de magnesio, 0,03 a 0,3 mg/ml de polisorbato 80 y agua para inyección hasta alcanzar el volumen total.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición incluye Tween-80.
3. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, definida además para mantener una infectividad de aproximadamente 70% de PFU/mL, hasta aproximadamente 99,9% de PFU/mL de la infectividad inicial cuando se almacena durante seis meses a 4º centígrados.
4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, definida además para mantener una infectividad de aproximadamente 80% a 95% de PFU/mL de la infectividad inicial cuando se almacena durante seis meses a 4º centígrados.
5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho poliol es glicerol, polietilén glicol, sorbitol o manitol, preferiblemente polietilén glicol.
6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha concentración de poliol es aproximadamente de 5% hasta aproximadamente 30% (p/v).
7. La composición de la reivindicación 6, en donde dicha concentración de poliol es aproximadamente de 10% hasta aproximadamente 30%.
8. La composición de la reivindicación 1, en donde dicho poliol es glicerol, incluido en una concentración aproximadamente desde 10% hasta aproximadamente 30% (p/v).
9. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha composición incluye además un excipiente además de dicho poliol, en donde dicho excipiente es inositol, lactitol, xilitol, isomaltol, gelatina, agar, pectina, caseína, leche descremada seca, leche entera seca, silicato, carboxipolimetileno, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, sacarosa, dextrosa, lactosa, trehalosa, glucosa, maltosa, niacinamida, creatinina, glutamato monosódico, dimetil sulfóxido, sólidos de suero dulce, albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, PEG, glicina, arginina, prolina, lisina, alanina, polivinil pirrolidina, polivinil alcohol, polidextrano, maltodextrinas, hidroxipropil-beta-ciclodextrina o almidones parcialmente hidrolizados.
10. La composición de la reivindicación 9, en donde dicha composición incluye además al menos un primer y un segundo excipientes, dicho segundo excipiente diferente de dicho primer excipiente.
11. La composición de la reivindicación 1, en donde el poliol es polietilén glicol.
12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además un amortiguador.
13. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la composición es estéril.
14. Un método para la preparación de una formulación líquida de adenovirus, estable durante almacenamiento durante un largo período de tiempo, que comprende las etapas de
-
suministrar un adenovirus y combinar dicho adenovirus con una solución que incluye un poliol y Tween-20 o Tween-80, por medio de lo cual dicha formulación líquida de adenovirus retiene alta infectividad, y
-
en donde en el último caso la formulación resultante no consiste de 1 x 10^{9} a 1 x 10^{3} partículas/ml A/C/N 53, 0,5 a 10 mg/ml de fosfato de sodio monobásico, 0,5 a 10 mg/ml de trometamina, 5 a 25 mg/ml de sacarosa, 20 a 200 mg/ml de glicerol, 0,1 a 1 mg/ml de cloruro de magnesio, 0,03 a 0,3 mg/ml de polisorbato 80 y agua para inyección hasta alcanzar el volumen total.
15. El método de la reivindicación 14, en donde dicha solución incluye Tween-80.
16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, definido además para mantener una infectividad de aproximadamente 70% de PFU/mL hasta aproximadamente 99,9% de PFU/mL de la infectividad inicial cuando se almacena durante seis meses a 4º centígrados.
\newpage
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, definido además para mantener una infectividad de aproximadamente 80% a 95% de PFU/mL de la infectividad inicial cuando se almacena durante seis meses a 4º centígrados.
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde dicho poliol es glicerol, polietilén glicol, sorbitol o manitol, preferiblemente polietilén glicol.
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en donde dicha concentración de poliol es aproximadamente desde 10% hasta aproximadamente 30% (p/v).
20. El método de la reivindicación 29, en donde dicha concentración de poliol es aproximadamente desde 10% hasta aproximadamente 30%.
21. El método de la reivindicación 14, en donde dicho poliol es glicerol, incluido en una concentración de aproximadamente desde 10% hasta aproximadamente 30% (p/v).
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, en donde dicha formulación incluye además un excipiente además de dicho poliol, en donde dicho excipiente es inositol, lactitol, xilitol, isomaltol, gelatina, agar, pectina, caseína, leche descremada seca, leche entera seca, silicato, carboxipolimetileno, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, sacarosa, dextrosa, lactosa, trehalosa, glucosa, maltosa, niacinamida, creatinina, glutamato monosódico, dimetil sulfóxido, sólidos de suero dulce, albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, PEG, glicina, arginina, prolina, lisina, alanina, polivinil pirrolidina, polivinil alcohol, polidextrano, maltodextrinas, hidroxipropil-beta-ciclodextrina o almidones parcialmente hidrolizados.
23. El método de la reivindicación 22, en donde dicha formulación incluye además al menos un primer y un segundo de dichos excipientes, dicho segundo excipiente diferente de dicho primer excipiente.
24. El método de la reivindicación 23, en donde el poliol es polietilén glicol.
25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 24, en donde dicha solución incluye además un amortiguador.
26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, que comprende además la etapa de esterilizar la solución por medio de esterilización por filtración.
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