BR112019014004A2

BR112019014004A2 - Método de fornecimento de transgene, comprimido ou cápsula, método de preparação de partículas virais e produto

Info

Publication number: BR112019014004A2
Application number: BR112019014004-2A
Authority: BR
Inventors: Drew Jeffrey
Original assignee: Stabilitech Biopharma Ltd
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2020-02-11
Also published as: IL267785A; AU2018206304A1; MX2019008105A; KR20190104051A; JP2020505335A; JP2023098938A; WO2018127702A1; US20190350846A1; CA3048313A1; EP3565591A1; CN110621350A

Abstract

a presente invenção encontra-se no campo de fornecimento de transgenes para células alvo utilizando vetores virais, particularmente no campo de terapia genética. foram identificadas composições que permitem a administração oral de partículas virais, particularmente partículas adenovirais.

Description

“MÉTODO DE FORNECIMENTO DE TRANSGENE, COMPRIMIDO OU CÁPSULA, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE PARTÍCULAS VIRAIS E PRODUTO”

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se à administração oral de partículas virais, particularmente partículas adenovirais, que carregam um transgene, tal como proteína terapêutica para terapia genética. A presente invenção refere-se particularmente a métodos de fornecimento de transgenes para células alvo por meio da administração oral de um produto que compreende partículas virais que carregam o transgene. A presente invenção também fornece cápsulas e comprimidos apropriados para fornecimento oral ao paciente, que tenham sido embalados com uma composição farmacêutica que compreende as partículas virais. A presente invenção fornece ainda um método de preparação das partículas virais para administração oral ao paciente.

Antecedentes da Invenção [002] Vetores virais são comumente utilizados para terapia genética e também como vacinas para expressar antígenos externos. Vetores adenovirais possuem uma série de vantagens sobre outros tipos de vetores virais. Adenovirus, por exemplo, são bem estudados, podem ser cultivados em estoques estáveis de alto título, são capazes de realizar transdução eficaz de células divisoras e não divisoras e são capazes de reter grandes segmentos de DNA. Grande quantidade de testes de terapia genética vem agora sendo conduzida utilizando-se vetores adenovirais, muitos dos quais referem-se ao tratamento de câncer. Outros estudos utilizaram adenovirus para expressar proteínas terapêuticas a fim de corrigir defeitos genéticos. Quase todos esses testes clínicos indicaram que vetores adenovirais são seguros e bem tolerados.

[003] Os vetores adenovirais, em sua maioria, são versões

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2/43 modificadas de Ad5 (sorotipo 5) e os vetores podem ser competentes para reprodução ou incompetentes para reprodução. Vetores incompetentes para reprodução possuem tipicamente os genes E1A e E1B essenciais excluídos e são substituídos por um conjunto de expressão com alta atividade promotora para dirigir a expressão de transgenes externos. Muitos vetores incompetentes para reprodução também não possuem as regiões E3 e E4. Outro tipo de vetor adenoviral incompetente para reprodução é o vetor “dependente de auxiliar” que possui a maior parte do seu genoma excluída, mas retém origens de reprodução, bem como cerca de 500 pares de bases que são necessários para embalagem em viriões. Estes vetores são construídos e propagados na presença de um adenovirus auxiliar competente para reprodução, que fornece as proteínas inicial e posterior necessárias. O adenovirus auxiliar possui tipicamente locais loxP laterais ao sinal de embalagem no genoma. As linhagens celulares utilizadas para produzir os vetores expressam condicionalmente Cre recombinase que extirpa o sinal de embalagem ladeado por loxP do genoma de adenovirus auxiliar, de forma a permitir embalagem preferencial do genoma adenoviral dependente auxiliar (vide, por exemplo, McConnell e Imperiale (2004), Human Gene Therapy, 1022-1033 e Vorburger e Hunt (2002), The Oncologist, 7, 46-59).

[004] Vetores adenovirais incompetentes para reprodução foram administrados, por exemplo, por via intranasal ou por meio de cateter intrabronquial ao expressar regulador de transmembrana de fibrose cística, por meio de injeção intramiocardial ou no músculo do esqueleto ao expressar fator de crescimento endotelial vascular e por meio de injeção intratumoral ao expressar citosina desaminase.

Descrição Resumida da Invenção [005] Os inventores do presente descobriram, surpreendentemente, que partículas adenovirais podem ser administradas

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3/43 oralmente. Particularmente, os inventores do presente demonstraram que partículas adenovirais que carregam insulina sob controle de um promotor de polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose foram capazes de reduzir os níveis de glicose em ratos diabéticos quando administrados oralmente. Não apenas as partículas adenovirais foram fornecidas com sucesso para o intestino, mas, surpreendentemente, as partículas entraram nas células e permitiram a expressão da proteína terapêutica. A proteína terapêutica foi considerada detectável na circulação periférica.

[006] A presente invenção fornece, portanto, um método de fornecimento de transgene(s) para células alvo em pacientes, em que o mencionado método compreende a administração oral de um produto que compreende partículas virais que carregam o transgene.

[007] A presente invenção também fornece uma pastilha ou cápsula para administração oral a pacientes, que compreende uma composição farmacêutica que compreende partículas virais que carregam um transgene.

[008] Além disso, a presente invenção fornece um método de preparação de partículas virais que carregam transgene para administração oral a pacientes, em que o mencionado método compreende:

a. cultivo e purificação de partículas virais que carregam o transgene;

b. formulação das partículas virais em composição farmacêutica;

c. secagem opcional da composição; e

d. embalagem da composição em pastilhas ou cápsulas para administração oral ao paciente.

Breve Descrição das Figuras [009] A Figura 1 exibe resultados da determinação in vivo de

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4/43 administração oral de construções adenovirais que compreendem um promotor de polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose que dirige a expressão de proinsulina ou a expressão de GFP. Os resultados apresentados são para determinação de glicose em amostra de plasma na veia sanguínea da cauda antes (-3 dias) ou após a dosagem (dia 3, 5, 8, 10 e 12, com a dosagem correspondente no dia 1). Os dados foram meios ajustados retrotransformados (n=5-6). Desvios padrão foram calculados a partir dos resíduos do modelo estatístico. Os dados foram analisados por um modelo linear geral com tratamento como fator e peso do corpo no Dia 1 e glicose no plasma em log(Dia -3) como covariações seguidas por teste de Dunnett. Diferenças significativas vs. veículo são fornecidas com **p<0,01.

[0010] A Figura 2 demonstra que foi detectada atividade enzimática de butirilcolinesterase in vitro positiva, substrato de iodeto de butiriltiocolina (BTC), em sobrenadantes em cultivo celular (HEK293) após a infecção de vetor Ad5- CMV- BChE e essencialmente ausentes com vetor Ad5CMV- GFP nulo (ambos não encapsulados).

[0011] A Figura 3 exibe a determinação in vivo das cápsulas formuladas com excipiente de adenovirus administradas oralmente a ratos marrons da Noruega com amostragem de sangue da veia da cauda (amostra de plasma) (dia de dosagem (dosagem prévia), 1 dia e 3 dias após a dosagem), com o nível de dosagem formulado com excipiente de adenovirus correspondente 2x10¹⁰ vp/cápsula determinado espectrofotometricamente (OD 260 nm). Os níveis de BCHe em amostras de plasma individuais, n=8 pacientes, foram medidos por meio do Kit de Atividade Fluorescente de Butirilcolinesterase DetectX® (K016-F1) e detectou-se nível elevado de atividade enzimática (P<0,01) três dias após a dosagem.

[0012] A Figura 4 exibe o percentual de perda de peso do corpo em camundongos ΙΡΝαβ ^Λ mediante desafio com vírus Zika até três dias após a

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5/43 infecção. Camundongos vacinados exibiram menor grau de perda de peso do corpo em comparação com camundongos que receberam administração de placebo (p = 0,0003).

[0013] A Figura 5 exibe a pressão intraocular em camundongos ΙΡΝαβ⁷’ mediante desafio com vírus Zika. Camundongos vacinados foram protegidos com relação a placebo (p = 0,016).

[0014] A Figura 6 exibe viremia em camundongos após desafio com vírus Zika. Observou-se redução da viremia após administração de três doses de vacina (VAC). Os resultados de placebo são apresentados como “PLA”.

[0015] A Figura 7 exibe a reação de camundongos competentes imunes à vacina (controle para a produção de anticorpos).

[0016] A Figura 8 exibe redução da viremia em Callithrix penicillata após desafio com vírus Zika infeccioso com administração anterior de duas doses de cápsulas orais de vetor.

[0017] A Figura 9 exibe o genoma do vírus Zika.

Descrição Detalhada da Invenção [0018] Deve-se compreender que diferentes aplicações dos produtos e métodos descritos podem ser adaptadas às necessidades específicas da técnica. Deve-se também compreender que a terminologia utilizada no presente destina-se somente a propósitos de descrição de realizações específicas da presente invenção e não se destina a ser limitadora.

[0019] Além disso, da forma utilizada no presente relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um”, “um” e “o/a” incluem referências ao plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Desta forma, por exemplo, referência a “sequência de aminoácidos” inclui duas ou mais dessas sequências e similares.

[0020] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente

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6/43 mencionados no presente, acima ou abaixo, são integralmente incorporados ao presente como referência.

Transgene [0021] A presente invenção fornece um método de fornecimento de transgenes a pacientes. Particularmente, a presente invenção fornece um método de fornecimento de transgenes a células alvo em pacientes. O método compreende a administração oral de partículas virais, particularmente partículas adenovirais, que carregam o transgene.

[0022] Um transgene (ou gene heterólogo), da forma utilizada no presente, destina-se a designar polinucleotídeo que tenha sido introduzido em células por meio de manipulação genética. O transgene poderá ser um gene que não é expresso naturalmente pela célula. O transgene poderá também ser um gene que não seria expresso naturalmente pela célula. O transgene poderá, por exemplo, suplementar a expressão natural de proteínas ou poderá corrigir deficiências na expressão de proteínas.

[0023] O transgene codifica tipicamente uma proteína terapêutica. Os métodos de acordo com a presente invenção são tipicamente métodos de terapia genética, em que os ácidos nucleicos são fornecidos terapeuticamente em células de pacientes, seguidos pela expressão da proteína terapêutica a fim de tratar a doença. Proteínas terapêuticas podem ser, por exemplo, hormônios ou enzimas.

[0024] Terapias utilizando proteínas e peptídeos podem ser classificadas com base na função e aplicação terapêutica (vide, por exemplo, Leader et al (2008), Nature Reviews Drug Discovery, 7, 21-39). Proteínas terapêuticas podem possuir, por exemplo, atividade enzimática ou regulatória (Grupo 1). Produtos terapêuticos no grupo 1 podem substituir uma proteína que é anormal ou deficiente (frequentemente envolvida em distúrbios metabólicos ou endócrinos), ampliar um processo existente (por exemplo, processos

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7/43 hematológicos e endócrinos e reações imunológicos) ou fornecer função ou atividade inovadora. Exemplos de proteínas nesta categoria incluem albumina, insulina, Fator VIII, Fator IX e antitrombina III, enzimas tais como enzimas pancreáticas, lactase, β-glucocerebrosidase, alglicosidase-α laronidase, idursulfase, galsufase, adenosina desaminase e outras proteínas tais como eritropoietina, darbepoetina-α, G-CSF, GM-CSF, interleucina 11, hormônio estimulante dos folículos, gonadotropina coriônica humana e diversas interferonas. Exemplos de produtos terapêuticos que ampliam processos existentes incluem fator de crescimento de queratinócitos, fator de crescimento derivado de plaquetas e tripsina. Exemplos de proteínas que fornecem função ou atividade inovadora incluem toxina botulínica, colagenase, hialuronidase, papaína e estreptoquinase.

[0025] Proteínas/peptídeos terapêuticos no grupo 2 possuem atividade direcionadora específica e podem interferir com uma molécula ou organismo ou fornecer outros compostos ou proteínas. Proteínas do grupo 2, por exemplo, podem ligar-se a moléculas e bloquear sua função, dirigir-se a elas para destruição ou estimular processos de sinalização. Exemplos incluem drogas com base em anticorpos e proteínas de fusão Fc.

[0026] Nos métodos de acordo com a presente invenção, proteínas terapêuticas podem estar no grupo 1 ou no grupo 2. Em outras palavras, na presente invenção, a proteína terapêutica pode substituir uma proteína que é anormal ou deficiente, ampliar um processo existente ou fornecer função ou atividade inovadora. A proteína terapêutica pode também ter atividade direcionadora específica, tal como um anticorpo ou proteína de fusão Fc.

[0027] Moléculas do grupo 3 protegem contra agentes externos prejudiciais, tratam doenças autoimunes ou tratam câncer (vacinas de proteína). Tipicamente, elas compreendem um componente antigênico de

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8/43 micro-organismo, tal como vírus Zika ou Virus Simplex da Herpes (HSV) (preferencialmente, HSV2), ou de tumores. Nos métodos de acordo com a presente invenção, proteínas terapêuticas podem também ser terapias do grupo 3. Em outras palavras, a proteína terapêutica pode ser um antígeno.

[0028] Em alguns casos, o transgene pode também codificar um agente de diagnóstico, tal como proteína fluorescente ou proteína que pode ser detectada por scanners externos.

[0029] O vetor viral é preferencialmente, entretanto, um vetor de terapia genética. O vetor viral pode também ser um vetor de vacina que expressa um antígeno.

[0030] O produto terapêutico, por exemplo, quando utilizado em terapia genética, é tipicamente uma proteína com comprimento total. O produto terapêutico pode também ser uma variante funcional, forma modificada ou variante de sequência que retém uma ou mais atividades (preferencialmente, todas as atividades) do correspondente com comprimento total.

[0031] Na presente invenção, a proteína terapêutica não é particularmente limitada, já que ela se beneficiaria da administração oral do ácido nucleico que a codifica para um paciente e inclui hormônios e enzimas. Essas proteínas seriam bem conhecidas por meio do conhecimento geral comum dos técnicos no assunto e incluem, por exemplo, insulina, um antagonista de glucagon, peptídeo 1 similar a glucagon, resistina, leptina, Acrp30, colecistoquinina, fatores de coagulação (por exemplo, Fator VIII, IX ou X), fatores de crescimento (por exemplo, hormônio do crescimento, fator de crescimento similar a insulina 1, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento epidérmico, fatores de crescimento de fibroblastas ácido e básico, fator de crescimento de transformação β etc.) e anticorpos (por exemplo, humanos ou humanizados).

[0032] Transgenes adicionais que codificam uma proteína

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9/43 terapêutica incluem citoquinas, interferonas (por exemplo, interferona (INF), INF-a 2b e 2a, INF-a N1, INF-β 1b, INF-gama), interleucinas (por exemplo, IL-1 a IL-10), fator de necrose de tumores (TNF-a TNF-β), quemoquinas, fator estimulante de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF), hormônios de polipeptídeos, polipeptídeos antimicrobianos (por exemplo, polipeptídeos antibacterianos, antifúngicos, antivirais e/ou antiparasíticos), enzimas (por exemplo, adenosina desaminase), gonadotrofinas, quemotactinas, proteínas de ligação de lipídios, filgastim, hemoglobina, eritropoietina, insulinotropina, imiglucerase, sarbramostim, ativador da plasminogene de tecidos (tPA), uroquinase, estreptoquinase, fator de crescimento de neurites (NGF), fenilalanina amônia liase, fator de neurite derivada do cérebro (BDNF), fator de crescimento de neurite (NGF), fenilalanina amônia liase, trombopoietina (TPO), superóxido dismutase (SOD), adenosina desamidase, catalase calcitonina, endotelian, L-asparaginase pepsina, uricase tripsina, quimotripsina elastase, carboxipeptidase lactase, fator intrínseco de sucrase, hormônio similar a hormônio paratireoide calcitonina (PTH), CD4 solúvel e anticorpos e/ou seus fragmentos de ligação de antígenos (por exemplo, FAbs) (por exemplo, ortoclone OKT-e (anti-CD3) e anticorpo monoclonal GPIIb/lla).

[0033] Conforme mencionado acima, os transgenes não se destinam a limitar a presente invenção. Os técnicos no assunto poderão idealizar facilmente transgenes adicionais que codificam proteínas terapêuticas.

[0034] As células alvo são tipicamente células do intestino. O intestino é o maior órgão endócrino do corpo, capaz de produzir vastas quantidades de proteínas e contém tecido de rápida renovação no qual as células divisoras são acessíveis. Células alvo, tais como células K e células tronco, encontram-se predominantemente localizadas no intestino superior, que é facilmente acessível para métodos de terapia genética não invasiva, como formulações orais. Células do intestino, tais como células K, que secretam uma

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10/43 proteína, tal como insulina, leptina, antagonista de glucagon, GLP-1, GLP-2, grelina, colecistoquinina, hormônio do crescimento, fatores de coagulação, anticorpo e outros, em forma regulável, portanto, são um meio com o qual se tratam, por exemplo, diabete, obesidade, deficiência do crescimento e outros distúrbios tratáveis por meio da produção de proteínas em tecido da mucosa.

[0035] Na presente invenção, a proteína terapêutica é preferencialmente insulina. Consequentemente, a presente invenção fornece um método de tratamento de diabete que compreende a administração oral de partículas adenovirais que codificam insulina para pacientes delas necessitados. Outros distúrbios ou condições secundárias associadas à diabete podem também ser tratados, incluindo calcificação dos tubos renais, degeneração do fígado, lesões oculares (retinopatia diabética), pé diabético, ulcerações, sangramento em excesso, cura de feridas retardada, coagulação retardada, aumento do risco de parada cardíaca coronariana, derrame, doença vascular, dislipidemia, hipertensão e obesidade.

[0036] Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para o tratamento e/ou prevenção de doenças ou condições (em outras palavras, os métodos de acordo com a presente invenção podem ser terapêuticos ou profiláticos). Os pacientes podem já possuir doença/condição ou podem encontrar-se em risco de desenvolver doença/condição. O tratamento normalmente resulta na redução ou prevenção da severidade ou sintomas da doença/condição no paciente. O tratamento pode evitar a piora da doença/condição ou reverter a condição/doença. O fornecimento de insulina pode, por exemplo, reduzir a glicose do sangue, aumentar a tolerância à glicose, fornecer homeostase de glicose normal ou evitar, aumentar ou reverter alterações histopatológicas tais como as mencionadas acima.

[0037] A sequência da insulina pode ser qualquer sequência de insulina terapêutica apropriada. Caso o paciente seja ser humano, por

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11/43 exemplo, a insulina poderá ser insulina humana terapêutica. O transgene poderá, por exemplo, codificar uma subsequência de insulina com comprimento total que mantém a capacidade de reduzir a glicose, fornece homeostase de glicose normal ou reduz as condições histopatológicas associadas à hiperglicemia crônica ou aguda, ou seja, uma subsequência funcional que possui uma ou mais atividades do seu correspondente com comprimento total. Essas sequências são bem conhecidas na técnica.

[0038] Outro exemplo de proteína terapêutica apropriada para administração utilizando os métodos de acordo com a presente invenção é butirilcolinesterase. Uma vez mais, a sequência de butirilcolinesterase não é limitada, desde que seja apropriada para uso terapêutico no paciente (ou seja, para o tratamento de deficiência de butirilcolinesterase).

[0039] A presente invenção poderá ser também utilizada para o fornecimento de cargas genéticas, tais como cargas de edição de genes (CRISPR).

[0040] Conforme mencionado acima, em alguns casos, a proteína terapêutica/transgene é um antígeno (ou seja, projetado para estimula reação imunológica no hospedeiro). O vetor viral pode ser, portanto, um vetor de vacina que expressa um antígeno e protege o hospedeiro contra desafio (por exemplo, com o micro-organismo) do qual o antígeno é derivado. O antígeno não é limitado, mas pode ser tipicamente derivado de vírus. Os antígenos capazes de estimular reação imunológica são conhecidos na técnica.

[0041] O antígeno pode ser derivado de vírus Zika. Conforme exibido na Figura 9, o genoma do vírus Zika codifica diversas proteínas. Um vetor de vacina de acordo com a presente invenção pode expressar uma ou mais dessas proteínas. Tipicamente, o vetor de vacina expressa a proteína de envelope E e/ou NS1. A proteína de envelope E é envolvida no reconhecimento direto de partículas virais e acredita-se que NS1 desempenhe papel

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12/43 significativo na patogênese de doenças. O vetor pode ser projetado para expressar uma sequência antigênica com comprimento total ou uma região antigênica da sequência com comprimento total (por exemplo, uma região antigênica da proteína E ou a proteína E completa). Esses antígenos poderão ser facilmente determinados. Conforme demonstrado nos Exemplos, a expressão desses antígenos pode estar sob o controle de um promotor de CMV. Os técnicos no assunto poderão projetar facilmente conjuntos de expressão de antígenos.

[0042] O antígeno pode ser também derivado de Vírus Simplex da Herpes (HSV), preferencialmente de HSV2. O transgene pode codificar qualquer antígeno de HSV apropriado, capaz de estimular reação imunológica. Diversos antígenos de HSV são conhecidos na técnica.

[0043] Glicoproteína D (gD), por exemplo, é expressa sobre a superfície viral e é sabidamente responsável pela neutralização da atividade de anticorpos. Outras glicoproteínas de HSV incluem glicoproteína C (gC) e glicoproteína E (gE). O transgene pode codificar um antígeno de qualquer um dentre gD, gC e gE (ou suas combinações). Novamente, o transgene pode codificar a proteína com comprimento total (ou seja, resultar na sua expressão) ou uma região antigênica da proteína (com quaisquer modificações apropriadas que sejam determinadas pelos técnicos no assunto).

[0044] O transgene pode codificar particularmente antígenos de todos dentre gD, gC e gE (em alguns casos, o transgene pode codificar todos dentre gD, gC e gE). O transgene pode, por exemplo, expressar uma poliproteína.

[0045] A expressão desses antígenos de HSV pode estar sob o controle de promotores apropriados e pode incluir outras sequências reguladoras apropriadas. Poliproteínas expressas pelo transgene podem ser divisíveis (em alguns casos, a poliproteína pode ser autodivisível). Os técnicos

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13/43 no assunto poderão projetar facilmente conjuntos apropriados de expressão desses antígenos de HSV.

Partículas virais [0046] Conforme discutido adicionalmente abaixo, a presente invenção é tipicamente realizada utilizando partículas adenovirais. Outros vírus apropriados, entretanto, são vírus adenoassociados, lentivírus e vírus oncolíticos, tais como HSV e vírus Vaccinia. Vírus com aplicações terapêuticas são bem conhecidos na técnica.

Partículas adenovirais [0047] Os métodos de acordo com a presente invenção envolvem tipicamente a administração oral de partículas adenovirais a pacientes. Adenovirus vêm sendo amplamente estudados como agentes infecciosos, como objetos de pesquisa básica e para determinar seu uso potencial em terapia genética e vacinas. Grande quantidade de sorotipos adenovirais humanos foi identificada e eles são classificados em seis subgêneros (A até F) com base em comparações de ácidos nucleicos, características de proteínas de fibras e propriedades biológicas. O grupo A, por exemplo, inclui sorotipos 12 e 31, o grupo B inclui sorotipos 3 e 7, o grupo C inclui sorotipos 2 e 5, o grupo D inclui sorotipos 8 e 30, o grupo E inclui sorotipo 4 e o grupo F inclui sorotipos 40e41.

[0048] Em termos de estrutura geral, todos os adenovirus examinados até hoje são icosaedros regulares não encapsulados com cerca de 80 nanômetros de diâmetro. Adenovirus contêm DNA linear com fita dupla que forma complexo com proteínas centrais e é rodeado pelo capsídeo adenoviral. Viriões individuais contêm cerca de 11 proteínas diferentes designadas por algarismos romanos (ll-XII), em ordem decrescente de tamanho sobre géis de SDS.

[0049] O capsídeo é composto de sete proteínas estruturais: II

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14/43 (hexon), III (penton), Illa, IV (fibra), VI, VII e IX. O capsídeo compreende 252 capsômeros, dos quais 240 são capsômeros de hexon e 12 são capsômeros de penton. Capsômeros de hexon, que são trímeros da proteína hexon, compõem cerca de 75% da proteína do capsídeo. Capsômeros de penton, que são pentâmeros da proteína de penton, estão situados em cada um dos 12 vértices do virião. Cada capsômero de penton é ligado a seis capsômeros de hexon adjacentes e uma fibra. A fibra, que normalmente é um trímero da proteína de fibra, projeta-se a partir do capsômero de penton. A proteína de hexon e, até certo ponto, a proteína de fibra compreendem os principais determinantes antigênicos de um adenovirus e também determinam a especificidade de sorotipos.

[0050] Os pesquisadores examinaram e compararam a estrutura das proteínas de capsídeo de diferentes sorotipos adenovirais, particularmente proteínas de hexon, em um esforço para definir as regiões das proteínas contra as quais são obtidos anticorpos neutralizantes. As regiões predominantes em proteína de hexon contra as quais são dirigidos anticorpos neutralizantes encontram-se aparentemente nos circuitos 1 e 2 (ou seja, L1 ou 11 e Lll ou I2, respectivamente), que se projetam para fora a partir da base do capsômero de hexon. Análises de circuitos 1 e 2 de diferentes proteínas de hexon de adenovirus diferentes revelaram a presença de sete regiões hipervariáveis discretas (HVR1 a HVR7) correspondentes a locais em que as proteínas de hexon diferem consideravelmente entre os sorotipos.

[0051] O núcleo de um virião de adenovirus contém o genoma de DNA de fita dupla linear e proteínas associadas V, VII, X (mu), IVa2 e proteína terminal (TP). A organização de genoma de diferentes adenovirus é conservada e propôs-se que possuísse função de temporização, em que as extremidades do genoma são transcritas em primeiro lugar (os genes iniciais imediatos E1 e E4 estão localizados em extremidades opostas do genoma

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15/43 linear). A transcrição precoce de E1 e E4 gera a abertura da região central do genoma, o que permite a transcrição da região central.

[0052] Genomas adenovirais compreendem tipicamente oito unidades de transcrição de RNA polimerase II: cinco unidades iniciais, E1A, E1B, E2A-E2B, E3 e E4; duas unidades iniciais retardadas, IX e IVa2; e a unidade de transcrição Posterior Principal. A unidade de transcrição Posterior Principal é adicionalmente subdividida em regiões L1-L5 com base no uso de locais de divisão alternativos. As unidades de transcrição frequentemente expressam proteínas com função similar. A unidade E1A, por exemplo, codifica duas proteínas responsáveis pela ativação de transcrição e indução de fase S mediante infecção celular; a unidade de transcrição E1B codifica duas proteínas que inibem a apoptose celular; a unidade de transcrição E3 está envolvida na evasão da reação imunológica; e a unidade de transcrição Posterior Principal codifica proteínas estruturais necessárias para montagem do capsídeo.

[0053] Para o propósito de terapia genética e vacinação, vetores adenovirais recombinantes foram projetados para codificar e expressar genes e antígenos heterólogos. Os sorotipos Ad2 e Ad5 foram utilizados mais extensamente neste contexto. Sequências heterólogas foram inseridas nos genomas adenovirais, incluindo nas unidades de transcrição iniciais e nas regiões de codificação de diversas proteínas estruturais, tais como hexon, penton e fibra. Em muitos casos, exclusões no genoma adenoviral (por exemplo, nas regiões E1) foram utilizadas para criar vetores adenovirais com defeito de reprodução, que foram geralmente considerados mais seguros para administração a pacientes humanos.

[0054] Na presente invenção, o adenovirus pode ser qualquer adenovirus apropriado para fornecimento do transgene para células alvo. O adenovirus pode ser, por exemplo, qualquer sorotipo, mas é tipicamente Ad5. A

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16/43 expressão “vetor adenoviral” designa um genoma adenoviral do tipo selvagem, mutante e/ou recombinante, bem como adenovirus que compreendem esse genoma. Vetores adenovirais podem compreender, no todo ou em parte, o genoma de qualquer sorotipo adenoviral, bem como suas combinações (ou seja, genomas híbridos).

[0055] O vetor adenoviral utilizado na presente invenção pode ser competente para reprodução ou incompetente para reprodução. Esses vetores são bem conhecidos. Em um vetor incompetente para reprodução, por exemplo, a região E1 pode ser excluída e substituída por um conjunto de expressão com um promotor exógeno que dirige a expressão do transgene heterólogo. Normalmente, a região E3 também é excluída. A exclusão de E3 permite insertos maiores na região E1. Esses vetores podem ser propagados em linhagens celulares apropriadas, tais como células HEK 293, que retêm e expressam as proteínas E1A e E1B. Vetores de última geração também não possuem a região E4 e alguns vetores não possuem também a região E2. Os vetores E2 e E4 devem ser cultivados em linhagens celulares que complementam as exclusões E1, E4 e E2.

[0056] Os vetores podem também ser vetores dependentes auxiliares, que não possuem os genes adenovirais, no todo ou em sua maior parte, mas retêm sequências de ação cis como as repetições terminais invertidas, bem como sequências de embalagem que são necessárias para que o genoma seja embalado e reproduzido. Esses vetores são propagados na presença de adenovirus auxiliares, que devem ser eliminados dos estoques de vetores. Novamente, esses sistemas são bem conhecidos na técnica.

[0057] Na presente invenção, o vetor é tipicamente um vetor incompetente para reprodução (tal como um vetor de exclusão E1/E3 conforme utilizado nos Exemplos), mas o vetor poderá também ser dependente de auxiliar ou competente para reprodução. Vetores competentes para reprodução

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17/43 são bem conhecidos. Os técnicos no assunto seriam facilmente capazes de selecionar um sistema de vetor apropriado, dependendo da aplicação pretendida.

[0058] A expressão do transgene pode ser dirigida por meio de ligação operativa a um promotor apropriado. Os vetores utilizados na presente invenção podem empregar outros elementos de controle de expressão apropriados, tais como amplificadores e reguladores. Os amplificadores são definidos amplamente como agentes de ação cis que, quando ligados operativamente a uma sequência genética/promotora, aumentarão a transcrição daquela sequência genética. Os amplificadores podem funcionar a partir de posições que são muito mais distantes de uma sequência de interesse que outros elementos de controle de expressão (por exemplo, promotores) e podem operar quando posicionados em qualquer orientação com relação à sequência de interesse. Amplificadores foram identificados a partir de uma série de fontes virais, incluindo adenovirus.

[0059] Vetores adenovirais podem utilizar promotores de alta atividade, tais como o promotor de citomegalovírus (CMV), promotor de antígeno T grande SV40, promotor LTR de vírus de tumor mamário de camundongos, promotor posterior principal (MLP) de adenovirus, o promotor LTR de vírus de tumor mamário de camundongo ou o promotor inicial SV40.

[0060] Os vetores podem também utilizar um promotor apropriado para ligar a expressão do transgene quando necessário, por exemplo, em células alvo (promotores específicos de tecidos ou promotores indutíveis). Podem ser selecionados promotores que sejam compatíveis com a célula alvo para a qual a expressão é projetada.

[0061] Promotores específicos de tecidos são tipicamente ativos em um tipo de célula específico, pois são reconhecidos por proteínas ativadoras da transcrição ou outros reguladores da transcrição, que são

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18/43 específicos para aquele tipo de célula. Na presente invenção, por exemplo, o promotor pode ser capaz de dirigir a expressão do transgene para as células endócrinas no intestino (“promotor específico de células endócrinas do intestino”).

[0062] O promotor pode manter a homeostase de transcrição do produto de transgene em resposta a estímulos gerados pela atividade do produto de transgene.

[0063] A expressão do transgene é preferencialmente controlada por meio de ligação operativa ao promotor de polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP), que é um exemplo específico de promotor de células endócrinas do intestino. Quando essa construção for introduzida em células endócrinas, a proteína codificada será expressa e secretada de forma regulada. Demonstrou-se anteriormente que o promotor de GIP dirige a expressão e a secreção de insulina humana em células K do trato gastrointestinal. De preferência superior, o promotor de GIP é utilizado para controlar a expressão de insulina.

[0064] Os Exemplos do presente pedido utilizam um inserto de GIP de rato de 1,2 kb conforme descrito em Biol. Res. (2011) 44, 301-305. Os técnicos no assunto seriam facilmente capazes de selecionar um promotor apropriado, dependendo da aplicação.

[0065] Outros exemplos de promotores específicos de tecidos e amplificadores para dirigir a expressão de proteínas para células endócrinas no intestino são glicoquinase, cromogranina A e B, colecistoquinina, proglucagon, adenosina desaminase, secretina, gastrina, somatostatina, motilina e grelina. Elementos de controle da expressão específicos de tecidos podem ser ativos em outros tecidos, mas até ponto muito menor que no tecido alvo. Promotores podem também aumentar ou reduzir a expressão de um ácido nucleico ligado operativamente em resposta à retirada de um nutriente. Esses elementos

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19/43 reguláveis por nutrientes também são amplamente conhecidos. Outros elementos de controle da expressão podem ser constitutivamente ativos ou podem conferir expressão em um estágio específico do ciclo celular.

[0066] Da forma utilizada no presente, a expressão “ligação operativa” ou suas variações gramaticais designa justaposição física ou funcional dos componentes descritos, de forma a permitir seu funcionamento conforme pretendido. No exemplo de elemento de controle da expressão em ligação operativa com um ácido nucleico, a relação é tal que o elemento de controle modula a expressão do ácido nucleico.

Formulações que compreendem as partículas virais [0067] As partículas virais são formuladas com excipientes que fornecem estabilidade térmica.

[0068] WO 2011/121306 descreve formulações que foram capazes de estabilizar partículas virais contra lesões causadas pelo congelamento, secagem por congelamento e descongelamento. A atividade de vírus também foi preservada durante testes de estabilidade a longo prazo.

[0069] Na presente invenção, as partículas virais podem ser formuladas em uma composição que compreende um composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e, opcionalmente, um, dois ou mais açúcares. As partículas virais são tipicamente colocadas em contato com o composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e/ou composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e, opcionalmente, um ou mais açúcares em solução aquosa e a solução resultante na qual as partículas virais estão presentes é seca em seguida para formar uma composição que incorpora as partículas virais.

[0070] As partículas virais podem, portanto, ser misturadas com

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20/43 uma solução aquosa do composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e, opcionalmente, um ou mais açúcares. A solução resultante é seca em seguida para formar uma composição que incorpora as partículas virais. A composição seca pode assumir a forma de aglomerado ou pó. O aglomerado pode ser moído até tornar-se pó, se necessário.

[0071] As partículas virais são preservadas na solução aquosa antes da etapa de secagem. Isso permite que a solução aquosa seja armazenada após a preparação, até o momento em que a etapa de secagem possa ser conduzida, sem perda indevida da atividade viral.

[0072] Os compostos das fórmulas (I) e (II) podem estar presentes na forma de um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis.

[0073] O sal é tipicamente um sal com ácido fisiologicamente aceitável e, portanto, inclui os formados com um ácido inorgânico, tal como ácido clorídrico ou sulfúrico, ou ácido orgânico, tal como ácido cítrico, tartárico, málico, maleico, mandélico, fumárico ou metanossulfônico. É preferido o sal de cloridrato.

[0074] O éster é tipicamente éster alquila C1-6, preferencialmente éster alquila Ci-4. O éster pode ser, portanto, metil, etil, propil, isopropil, butil, isobutil ou terc-butil éster. Etil éster é preferido.

[0075] Da forma utilizada no presente, grupo alquila C1-6 é preferencialmente um grupo alquila Ci-4. Grupos alquila preferidos são selecionados a partir de metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila e tercbutila. Metila e etila são particularmente preferidos.

[0076] Para evitar dúvidas, as definições de compostos da fórmula (I) e da fórmula (II) também incluem compostos nos quais o ânion de carboxilato é protonado para gerar -COOH e o cátion de amônio ou sulfônio é

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21/43 associado a um ânion farmaceuticamente aceitável. Além disso, para evitar dúvidas, os compostos definidos acima podem ser utilizados em qualquer forma tautomérica ou enantiomérica.

Compostos da Fórmula (I) [0077] Tipicamente, Ri representa hidrogênio ou alquila C1-6 e R4 representa hidrogênio. Tipicamente, R2 representa hidrogênio ou alquila C1-6. Preferencialmente, R1 representa hidrogênio ou alquila C1-6, R4 representa hidrogênio e R2 representa hidrogênio ou alquila C1-6. De maior preferência, R1 representa hidrogênio ou alquila C1-6, R4 representa hidrogênio e R2 representa alquila C1-6.

[0078] Preferencialmente, 0 composto da fórmula (I) é N-alquila C1-6, N,N-di(alquila C1-6)- ou N,N,N-tri(alquil Ci-6)-glicina ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e, de maior preferência, N,N-di(alquila C1-6) ou N,N,N-tri(alquil C1-6)-glicina ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis. O grupo alquila é tipicamente um grupo alquila C1-4. Grupos alquila preferidos são selecionados a partir de metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila e terc-butila. Metila e etila são particularmente preferidos.

[0079] Compostos preferidos da fórmula (I) são N-metilglicina, N,N-dimetilglicina, Ν,Ν,Ν-trimetilglicina, seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis. N-Metilglicina é também denominada sarcosina. Ν,Ν-Dimetilglicina é também denominada dimetilglicina (DMG) ou ácido 2-(dimetilamino)-acético. Ν,Ν,Ν-trimetilglicina é denominada trimetilglicina (TMG). O composto da fórmula (I) de preferência superior é DMG.

[0080] Alternativamente, 0 composto da fórmula (I) é tipicamente um derivado de glicina da fórmula (IA) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis:

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R(5 I θ r₇ o (IA) em que Rs e Re representam independentemente alquila C1-6, tai como alquila C1-4 como metila ou etila; e R? representa alquila C1-6, tai como alquila C1-4 como metila ou etila, ou -(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-isCH3. Compostos preferidos da fórmula (IA) são trimetilglicina (TMG) e cocamidopropill betaína (CAPB) ou seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis. Trimetilglicina é preferida.

[0081] Alternativamente, 0 composto da fórmula (I) é tipicamente um derivado de prolina da fórmula (IB) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis:

(IB) em que Rs e R9 representam independentemente alquila C1-6, tal como alquila C1-4 como metila ou etila. Preferencialmente, 0 composto da fórmula (IB) é um derivado de S-prolina. Preferencialmente, ambos, Rs e R9, representam metila; este composto é conhecido como prolina betaína. Sprolina betaína ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis é particularmente preferido:

[0082] Os compostos da fórmula (IA), seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis são preferidos.

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23/43 [0083] Preferencialmente, o composto da fórmula (I) é Ν,Νdimetilglicina, Ν,Ν,Ν-trimetilglicina ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis. De preferência superior, o composto da fórmula (I) é N,N-dimetilglicina ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis.

Compostos da Fórmula (II) [0084] Tipicamente, os substituintes de carboxilato e amina de R_csão ligados ao mesmo átomo de carbono da porção alquila R_c. Tipicamente, R_cé uma porção alquila C2-4OU C2-3.

[0085] O composto da fórmula (II) é tipicamente um composto de sulfona da fórmula (HA) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis:

(HA) em que Rc e Rd representam independentemente alquila C1-6, tal como alquila C1-4. Grupos alquila preferidos são selecionados a partir de metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila e terc-butila. Metila e etila são particularmente preferidos. O composto de sulfona de preferência superior é metilsulfonilmetano (MSM), que também é conhecido como dimetilsulfona (DMSO2).

[0086] O composto da fórmula (II) pode ser um composto da fórmula (IIB) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis:

Re

Rf Rg (IIB) em que R_e e Rf representam independentemente alquila C1-6, tal como alquila C1-4 como metila ou etila, e R_g representa alquila C1-6, tal como

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24/43 alquila C1-4 como metila ou etila, substituído por um ânion de carboxilato e uma porção amina (-NH2). Preferencialmente, os substituintes amina e carboxilato são ligados ao mesmo átomo de carbono. Um composto preferido da fórmula (IIB) é S-metil-L-metionina (SMM) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis.

[0087] Na presente invenção, é de preferência superior que 0 composto da fórmula (I) seja DMG ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e 0 composto da fórmula (II) seja MSM ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis.

Açúcares [0088] Açúcares apropriados para uso na presente invenção incluem açúcares redutores, tais como glicose, frutose, gliceraldeídos, lactose, arabinose e maltose; e, preferencialmente, açúcares não redutores, tais como sacarose e rafinose, de maior preferência sacarose. O açúcar pode ser um monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo ou outros oligossacarídeos. O termo “açúcar” inclui álcoois de açúcar. Em uma realização, portanto, preferese 0 uso de açúcar não redutor ou álcool de açúcar.

[0089] São idealizados monossacarídeos, tais como galactose e manose; dissacarídeos, tais como sacarose, lactose e maltose; trissacarídeos, tais como rafinose; e tetrassacarídeos, tais como estaquiose. Tre-halose, umbeliferose, verbascose, isomaltose, celobiose, maltulose, turanose, melezitose e melibiose também são apropriadas para uso na presente invenção. Um álcool de açúcar apropriado é manitol. Ao utilizar-se manitol, podem ser obtidos aglomerados com aparência aprimorada mediante secagem por congelamento.

[0090] A presença de açúcar pode agir para aumentar a estabilidade. A adição de açúcar pode também fornecer outros benefícios tais como aglomerado de liofilização alterado e solubilidade aprimorada para

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25/43 reconstituição mais rápida. Geralmente, um ou mais açúcares estão presente ao utilizar-se secagem por congelamento. Ao utilizar-se um açúcar, o açúcar é preferencialmente sacarose ou manitol.

[0091] A preservação da atividade viral é particularmente eficaz quando dois ou mais açúcares são utilizados na mistura de preservação. Podem ser utilizados dois, três ou quatro açúcares. Preferencialmente, a solução aquosa é uma solução de sacarose e rafinose. Sacarose é um dissacarídeo de glicose e frutose. Rafinose é trissacarídeo composto de galactose, frutose e glicose.

[0092] Na presente invenção, o composto da fórmula (I) é preferencialmente DMG ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e o composto da fórmula (II) é preferencialmente MSM ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis. A composição também compreende preferencialmente sacarose.

Outros componentes da composição aquosa [0093] Na presente invenção, uma solução aquosa que compreende as partículas virais, opcionalmente um ou mais açúcares e um composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis é tipicamente seca. Pode-se utilizar qualquer solução aquosa apropriada. A solução pode ser tamponada. A solução pode ser solução de HEPES, tamponada com fosfato, tamponada com Tris ou de água pura.

[0094] A solução pode ter pH de 2 a cerca de 12 e pode ser tamponada. A solução pode ser tamponada com tampão HEPES, tampão de fosfato, tampão de Tris, tampão de citrato de sódio, tampão de bicina (ou seja, tampão de N,N-bis(2-hidroxietil)glicina) ou tampão de MOPS (ou seja, tampão de ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico). A solução pode ou não conter

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NaCI. A solução pode ser, portanto, uma solução tamponada de citrato de sódio salina (SSC).

[0095] Geralmente, uma preparação das partículas virais é misturada com a mistura de preservação, ou seja, com uma solução aquosa de composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e, opcionalmente, um, dois ou mais açúcares. A própria mistura de preservação pode ser tamponada. Ela pode ser solução de HEPES, tamponada com fosfato, tamponada com Tris ou de água pura.

[0096] Alternativamente, a solução aquosa pode consistir tipicamente ou consistir essencialmente de partículas virais, um composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e, opcionalmente, um ou mais açúcares.

[0097] As concentrações do composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e cada açúcar opcional podem ser determinadas por meio de experimentação rotineira. Podem ser selecionadas, portanto, concentrações otimizadas que resultam em melhor estabilidade. O composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis podem agir de forma sinérgica para aumentar a estabilidade.

[0098] A concentração de açúcar, quando presente na solução aquosa para secagem, é de pelo menos 0,01 M, tipicamente até a saturação. Geralmente, a concentração de açúcar, quando presente, é de pelo menos 0,1 M, pelo menos 0,2 M ou pelo menos 0,5 M até a saturação, tal como saturação à temperatura ambiente ou até 3 M, 2,5 M ou 2 Μ. A concentração de açúcar

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27/43 pode variar, portanto, de, por exemplo, 0,1 M a 3 M ou 0,2 M a 2 M. Preferencialmente, um açúcar está presente. Alternativamente, a concentração de açúcar ou a concentração total de açúcar, caso esteja presente mais de um açúcar, pode variar, portanto, de 0,08 M a 3 M, 0,15 M a 2 M ou de 0,2 M a 1 M. Uma faixa apropriada é de 0,05 a 1 M.

[0099] Quando mais de um açúcar estiver presente, um desses açúcares é preferencialmente sacarose. A sacarose pode estar presente em concentração de 0,05 M, 0,1 M, 0,25 M ou 0,5 M até a saturação, tal como saturação à temperatura ambiente ou até 3 M, 2,5 M ou 2 M.

[00100] A razão da concentração molar de sacarose com relação à concentração molar do(s) outro(s) açúcar(es) é tipicamente de 1:1 a 20:1, tal como de 5:1 a 15:1. Caso dois açúcares estejam presentes e, particularmente, na presença de sacarose e rafinose, portanto, a razão de concentrações molares de sacarose é tipicamente de 1:1 a 20:1, tal como de 5:1 a 15:1 e, preferencialmente, cerca de 10:1.

[00101] A concentração de cada composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis, ou composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis na solução aquosa para secagem encontra-se geralmente na faixa de 0,001 M a 2,5 M e, mais especialmente, de 0,01 M a 2,5 Μ. A faixa de concentração pode ser, por exemplo, de 0,1 M a 2,5 M.

[00102] Alternativamente, por exemplo, quando o composto da fórmula (I) for DMG ou um de seus sais ou ésteres, a concentração de cada composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis, ou composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis na solução aquosa para secagem encontra-se geralmente na faixa de 0,1 mM a 3 M ou de 1 mM a 2 Μ. A faixa de concentração pode ser de 1 mM a 1,5 M, 5 mM a 1 M ou de 0,07 M a 0,7 M. As

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28/43 concentrações preferidas são de 7 mM a 1,5 mM ou de 0,07 M a 1,2 M. Outra faixa preferida adicional é de 0,5 a 1,5 M, particularmente quando o composto da fórmula (I) for um derivado de glicina N-alquilado, tal como DMG.

[00103] A concentração específica de composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis ou composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis que é empregada dependerá de diversos fatores, incluindo o tipo de partícula viral a ser preservado; o composto específico sendo utilizado; se um, dois ou mais açúcares estão presentes e da identidade do(s) açúcar(es); e do procedimento e condições de secagem. Portanto:

a concentração de composto da fórmula (II) no qual X representa -S(O)2- ou um composto da fórmula (IIA), tal como MSM, ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis é preferencialmente de 0,2 mM a 1 M, tal como de 0,35 mM a 1 M, 3,5 mM a 0,5 M, 0,035 M a 0,5 M ou de 0,035 M a 0,25 M;

a concentração de composto da fórmula (I) ou composto da fórmula (IA) ou fórmula (IB), tal como TMG, ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis é preferencialmente utilizada em concentração de 0,01 M a 2 M, tal como de 0,07 M a 2 M, 0,2 M a 1,5 M, 0,23 M a 1,5 M ou de 0,07 M a 0,7 M;

a concentração de composto da fórmula (II) no qual X representa -S⁺(R_C)- ou um composto da fórmula (IIB), tal como S-metil-Lmetionina, ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis é preferencialmente de 0,005 M a 2 M, tal como de 0,007 M a 2 M, 0,02 M a 2 M, 0,023 M a 1,5 M ou de 0,07 M a 1 M;

a concentração de composto da fórmula (I), tal como Ν,Ν-dimetilglicina (DMG) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis, quando não houver presença de açúcar, é de 5 mM a 1,5 M, 70

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29/43 mM a 1,5 M ou até 1,2 M, ou de 7 mM a 1 M. Concentrações de maior preferência são de 0,023 M a 0,7 M ou 1 M, ou de 0,07 M a 0,7 M ou 1 M, tal como cerca de 0,7 M;

a concentração de composto da fórmula (I), tal como Ν,Ν-dimetilglicina (DMG) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis, quando um ou mais açúcares estiverem presentes, geralmente é mais faixa e encontra-se na faixa de 1 mM a 1 M ou 1,5 M, ou de 5 mM a 1 M. Concentrações de maior preferência são de 0,007 M a 0,7 M ou 1 M, tal como cerca de 0,007 M. Uma faixa particularmente preferida é de 0,5 M a 1,5 M.

[00104] Quando um composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis estiverem presentes e, preferencialmente, na presença de um derivado de glicina N-alquilado ou um de seus sais ou ésteres e um composto de sulfona da fórmula (HA) ou (IIC), os compostos podem estar presentes em quantidades que resultem em sinergia. Por exemplo:

A concentração do derivado de glicina N-alquilado, seu sal ou éster na solução aquosa para secagem encontra-se geralmente na faixa de 0,1 mM a 3 M ou de 1 mM a 2 Μ. A concentração pode ser, por exemplo, de 1 mM a 1,5 M ou de 5 mM a 1 M. As concentrações preferidas são de 0,1 M a 1,5 M ou de 0,5 M a 1,25 M;

A concentração do composto de sulfona da fórmula (HA) ou (IIC) na solução aquosa para secagem encontra-se geralmente na faixa de 0,1 mM a 3 M, 1 mM a 2 M ou de 0,2 mM a 1 Μ. A concentração pode ser de 0,1 M a 1,5 M ou de 0,5 M a 1,25 M.

[00105] A composição pode também compreender outros conservantes, tais como antioxidantes, lubrificantes e aglutinantes bem

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30/43 conhecidos na técnica.

Comprimidos e cápsulas [00106] As composições farmacêuticas descritas no presente podem ser administradas na forma de solução ou suspensão aquosa ou de pastilhas, mas são tipicamente administradas na forma de comprimidos ou cápsulas. As composições podem ser também administradas na forma de wafers de gelatina. Os comprimidos podem ser revestidos ou não revestidos. Preferencialmente, a composição é incorporada em cápsulas, tais como cápsulas de gelatina.

[00107] Agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos em formulações orais. Os comprimidos, cápsulas, pastilhas e similares podem conter qualquer um dos ingredientes a seguir ou compostos de natureza similar: um aglutinante tal como celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; excipiente tal como amido ou lactose, agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel ou amido de milho; lubrificante tal como estearato de magnésio ou Sterotes; lubrificante tal como dióxido de silício coloidal; agente adoçante tal como sacarose ou sacarina; ou agente aromatizante tal como menta, salicilato de metila ou aromatizante.

[00108] Cápsulas e comprimidos são tipicamente revestidos entericamente. Os técnicos no assunto seriam facilmente capazes de selecionar e aplicar revestimento entérico apropriado, dependendo do transgene a ser fornecido utilizando métodos conhecidos na técnica. O revestimento entérico pode, por exemplo, dirigir o fornecimento ao duodeno. Um exemplo desse revestimento é copolímero de pólifácido metacrílico-co-acrilato de etila) 1:1 conforme utilizado no Exemplo. O revestimento entérico pode possuir limite de pH 5,8-6,8.

Fornecimento de partículas virais a pacientes [00109] O paciente é tipicamente ser humano, mas poderá

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31/43 também ser animal, como animal doméstico, de companhia (tal como cães ou gatos) ou de criação (carneiros, porcos e vacas).

[00110] A administração das partículas virais pode destinarse a propósitos profiláticos ou terapêuticos. As doses ou “quantidade eficaz” para tratamento de pacientes são preferencialmente suficientes para melhorar um, vários ou todos os sintomas da condição, até um ponto mensurável ou detectável, embora a prevenção ou inibição da progressão ou piora do distúrbio, condição ou sintoma, seja um resultado satisfatório. As doses e frequência de dosagem dependerão da condição a ser tratada, do resultado desejado e podem ser facilmente determinadas pelos técnicos no assunto. As quantidades apropriadas dependerão do efeito terapêutico desejado, bem como do paciente individual (por exemplo, a biodisponibilidade no paciente, gênero, idade etc.). Restauração parcial da homeostase de glicose normal em pacientes pode, por exemplo, reduzir a frequência de injeção de insulina, muito embora não tenha resultado liberdade completa da injeção de insulina.

[00111] Quantidades eficazes podem ser determinadas por meio de medição dos efeitos fisiológicos relevantes. No caso de diabete ou outra condição hiperglicêmica, por exemplo, redução da glicose do sangue ou melhoria no teste de tolerância à glicose podem ser utilizadas para determinar se a quantidade de insulina é eficaz para tratar a condição hiperglicêmica. No caso de hemofilia, quantidade eficaz é uma quantidade que reduz o tempo de coagulação, a frequência ou a duração de episódios de sangramento em pacientes.

[00112] Os métodos de acordo com a presente invenção para tratamento de pacientes podem também ser suplementados com outras formas de terapia. Terapias suplementares incluem tratamento com drogas, alteração da alimentação (baixo teor de açúcar, gorduras etc.), ressecção cirúrgica, transplante, radioterapia etc. Um método de acordo com a presente

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32/43 invenção para tratamento de condições hiperglicêmicas pode ser utilizado, por exemplo, em combinação com drogas ou outras formulações farmacêuticas que aumentam a insulina ou reduzem a glicose em pacientes. Drogas para tratamento de diabete incluem, por exemplo, biguanidas e sulfonilureias (por exemplo, tolbutamida, clorpropamida, aceto-hexamida, tolazamida, glibenclamida e glipizida). Drogas de supressão do apetite também são bem conhecidas e podem ser utilizadas em combinação com os métodos de acordo com a presente invenção. Terapias suplementares podem ser administradas antes, simultaneamente ou depois dos métodos de tratamento de acordo com a presente invenção. Os técnicos no assunto poderão determinar facilmente terapias que podem ser utilizadas em um regime em combinação com os métodos de tratamento de acordo com a presente invenção.

[00113] A presente invenção também fornece métodos de prevenção e/ou tratamento de infecções por vírus Zika utilizando as partículas virais de acordo com a presente invenção. Particularmente, as partículas virais podem ser utilizadas como vacina para evitar e/ou tratar infecções por vírus Zika. Conforme discutido acima, neste ponto, o vetor viral pode expressar antígenos do vírus Zika, preferencialmente derivados de proteína de envelope E e/ou NS1.

[00114] Dosagens e regimes de dosagem de vacina de vírus Zika poderão ser facilmente determinados pelos técnicos no assunto. Vacinas profiláticas, por exemplo, podem ser administradas diversas vezes (por exemplo, duas ou três vezes) em intervalos apropriados. Esses intervalos podem ser uma vez por semana ou uma vez a cada duas semanas. Vacinas profiláticas poderão ser administradas, por exemplo, duas ou três vezes, aproximadamente uma vez a cada duas semanas (em intervalos aproximados de 14 dias).

Método de preparação de partículas virais [00115] A presente invenção também fornece um método de preparação das partículas virais para administração oral a pacientes. O método

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33/43 compreende tipicamente cultivo e purificação das partículas virais, formulação das partículas em uma composição, secagem opcional da composição e embalagem da composição em comprimidos ou cápsulas para administração oral ao paciente.

[00116] Partículas virais que carregam um transgene podem ser preparadas utilizando métodos padrão bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Métodos de biologia molecular padrão podem ser utilizados, por exemplo, para criar as construções genéticas para expressão do transgene.

[00117] Pode-se preparar um vírus por meio de infecção de células hospedeiras cultivadas com a linhagem de vírus que deve ser utilizada, permitindo o progresso da infecção de forma que o vírus se reproduza nas células cultivadas e possa ser liberado por meio de métodos padrão conhecidos na técnica para coleta e purificação de vírus. Células apropriadas incluem células de Rim Embriônico Humano (HEK) 293 ou clones de células derivadas de HEK 293, que são apropriados para o tipo de adenovirus sendo utilizado. As células podem ser cultivadas sob quaisquer condições apropriadas que resultem na produção de partículas de vírus.

[00118] O Exemplo de acordo com o presente pedido utiliza, por exemplo, o cultivo de vírus em células HEK 293 e purificação subsequente por meio de centrifugação de gradiente de densidade de cloreto de césio dupla, seguida por dessalinização de coluna (por exemplo, PD-10) na formulação excipiente. Formulações excipientes são descritas acima.

[00119] Tipicamente, atinge-se secagem por meio de secagem por congelamento, secagem a vácuo, secagem de leito de fluido ou secagem por pulverização. Prefere-se secagem por congelamento. Reduzindose a água no material e vedando-se o material em ampola, o material pode ser facilmente armazenado, embarcado e posteriormente reconstituído na sua forma original. As condições de secagem podem ser adequadamente

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34/43 otimizadas por meio de experimentação rotineira.

[00120] Durante a secagem, forma-se uma composição que incorpora as partículas virais. É produzida uma matriz que incorpora as partículas virais. A composição é tipicamente um sólido amorfo. É geralmente formada, portanto, uma matriz sólida, geralmente uma matriz sólida amorfa. “Amorfo” indica não estruturado e que não possui organização regular ou repetida de moléculas observável (ou seja, não cristalina).

[00121] O(s) açúcar(es), quando presente(s), fornece(m) a matriz amorfa na composição seca. O composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis é disperso na matriz de açúcar. O composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis é, portanto, incorporado à matriz de açúcar. As partículas virais são também incorporadas à matriz de açúcar. O procedimento de secagem pode, portanto, ser realizado, por exemplo, por meio de secagem por congelamento para formar um aglomerado amorfo ao qual são incorporadas as partículas virais.

[00122] A etapa de secagem é geralmente realizada assim que a solução aquosa tenha sido preparada ou pouco depois. Alternativamente, a solução aquosa é tipicamente armazenada antes da etapa de secagem. A partícula viral na solução aquosa é preservada pelo composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis e, opcionalmente, um ou mais açúcares durante a armazenagem.

[00123] A solução aquosa ou solução intermediária a granel é geralmente armazenada por até cinco anos, por exemplo até quatro anos, três anos, dois anos ou um ano. Preferencialmente, a solução é armazenada

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35/43 por até seis meses, de maior preferência até três meses ou até dois meses, por exemplo um dia a um mês ou um dia a uma semana. Antes da secagem, a solução é tipicamente armazenada em refrigerador ou congelador. A temperatura do refrigerador é tipicamente de 2 a 8 ^SC, preferencialmente 4 a 6 ^SC ou, por exemplo, cerca de 4 ^SC. A temperatura do congelador é tipicamente de -10 a -80 ^SC, preferencialmente -10 a -30 ^SC ou, por exemplo, cerca de -20 ^eC.

[00124] A solução é tipicamente armazenada em recipientes vedados, preferencialmente recipientes plásticos inertes vedados, tais como sacos ou garrafas. O recipiente é tipicamente estéril. O volume da solução intermediária a granel é tipicamente de 0,1 a 100 litros, preferencialmente 0,5 a 100 litros, por exemplo 0,5 a 50 litros, 1 a 20 litros ou 5 a 10 litros. O recipiente possui tipicamente volume de 0,1 a 100 litros, preferencialmente 0,5 a 100 litros, por exemplo 0,5 a 50 litros, 1 a 20 litros ou 5 a 10 litros.

[00125] Caso a solução intermediária a granel armazenada deva ser seca por congelamento, ela é tipicamente despejada em uma bandeja de secagem por congelamento antes da etapa de secagem.

[00126] Existem três etapas principais de secagem por congelamento, a saber, congelamento, secagem primária e secagem secundária. Realiza-se tipicamente congelamento utilizando uma máquina de secagem por congelamento. Nesta etapa, é importante resfriar o material biológico abaixo do seu ponto eutético (Teu), no caso de produtos cristalinos simples, ou temperatura de transição em vidro (Tg’), no caso de produtos amorfos, ou seja, abaixo da temperatura mais baixa à qual as fases líquida e sólida do material podem coexistir. Isso garante que ocorra sublimação e não fusão na etapa de secagem primária a seguir.

[00127] Durante a secagem primária, a pressão é controlada por meio da aplicação de níveis apropriados de vácuo, enquanto calor

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36/43 suficiente é fornecido para permitir a sublimação da água. Pelo menos 50%, tipicamente 60 a 70% da água do material são sublimados nesta etapa. A secagem primária pode ser lenta, pois calor excessivo poderá degradar ou alterar a estrutura do material biológico. Uma câmara condensadora fria e/ou placas condensadoras fornecem superfícies sobre as quais o vapor d’água é capturado por meio de ressolidificação.

[00128] No processo de secagem secundário, a água da hidratação é removida por meio de aplicação adicional de calor. Tipicamente, a pressão também é reduzida para incentivar secagem adicional. Após o término do processo de secagem por congelamento, o vácuo pode ser rompido com um gás inerte como nitrogênio antes da vedação ou o material pode ser vedado a vácuo.

[00129] Em certas realizações, secagem a vácuo é conduzida utilizando dissecação a vácuo a cerca de 1300 Pa. Dissecação a vácuo, entretanto, não é essencial para a presente invenção e, em outras realizações, a mistura de preservação colocada em contato com a partícula viral é centrifugada (ou seja, dissecação giratória) ou seca por congelamento. Convenientemente, o método de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente a submissão a vácuo da mistura de preservação que contém a partícula viral. Convenientemente, aplica-se vácuo sob pressão de 20.000 Pa ou menos, preferencialmente 10.000 Pa ou menos. Convenientemente, aplicase vácuo por um período de pelo menos 10 horas, preferencialmente 16 horas ou mais. Como sabem os técnicos no assunto, o período de aplicação de vácuo dependerá do tamanho da amostra, da maquinaria utilizada e outros parâmetros.

[00130] Em outra realização, atinge-se secagem por meio de secagem por pulverização ou secagem por congelamento por pulverização das partículas virais misturadas com a mistura de preservação de acordo com

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37/43 a presente invenção. Estes métodos são bem conhecidos pelos técnicos no assunto e envolvem um método de secagem de alimentação líquida por meio de um gás, tal como ar, gás livre de oxigênio ou nitrogênio, ou, no caso de secagem por congelamento de pulverização, nitrogênio líquido. A alimentação líquida é atomizada em pulverização de gotículas. As gotículas são secas em seguida por meio de contato com o gás em uma câmara de secagem ou com o nitrogênio líquido.

[00131] Em realização adicional, atinge-se secagem por meio de secagem por leito fluido das partículas virais misturadas com a mistura de preservação. Este método é bem conhecido pelos técnicos no assunto e envolve tipicamente a passagem de um gás (por exemplo, ar) através de uma camada de produto sob condições de velocidade controladas para criar um estado fluidificado. O método pode envolver as etapas de secagem, resfriamento, aglomeração, granulação e revestimento de materiais de produto particulados. Pode-se fornecer calor por meio do gás de fluidificação e/ou outras superfícies de aquecimento (por exemplo, painéis ou tubos) imersas na camada fluidificada. Pode-se atingir resfriamento utilizando um gás frio e/ou superfícies de resfriamento imersas na camada fluidificada. As etapas de aglomeração e granulação são bem conhecidas pelos técnicos no assunto e podem ser realizadas de várias formas, dependendo das propriedades de produto a serem atingidas. O revestimento de produtos particulados, tais como pós, grânulos ou pastilhas, pode ser atingido por meio de pulverização de líquido sobre as partículas fluidificadas sob condições controladas.

[00132] Pode ser obtida, portanto, uma composição que contém baixo teor de umidade residual. Atinge-se nível de teor de umidade residual que oferece preservação a longo prazo sob temperaturas superiores às de refrigeração, por exemplo, dentro da faixa de 40 °C a 56 °C ou mais, ou abaixo das temperaturas de refrigeração, tais como dentro da faixa de 0 a -70

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38/43 °C ou menos. A composição seca pode, portanto, conter teor de umidade residual de 10% ou menos, 5% ou menos, 2% ou menos ou 1% ou menos em peso. Preferencialmente, o teor de umidade residual é de 0,5% ou mais a 1% ou mais. Tipicamente, uma composição seca contém teor de umidade residual de 0,5% a 10% em peso, preferencialmente de 1 a 5% em peso.

[00133] A composição pode ser obtida em forma de pó seco. Aglomerados resultantes, por exemplo, da secagem por congelamento podem ser moídos em forma de pó. Uma composição sólida de acordo com a presente invenção pode, portanto, assumir a forma de partículas em livre fluxo.

[00134] Na presente invenção, pó pode ser compactado na forma de comprimidos. Os comprimidos são descritos acima. O pó pode também ser colocado em cápsulas. Novamente, as cápsulas são descritas acima.

[00135] Os Exemplos a seguir ilustram a presente invenção.

Exemplos Exemplo 1 [00136] Duas construções de adenovirus (Adenovirus humano do Tipo 5 (dE1/E3)) foram preparadas por meio de métodos biológicos moleculares padrão. O primeiro adenovirus carregou um promotor GIP (polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose) que dirige a expressão de INS (proinsulina) (denominado GIP-INS). As sequências utilizadas foram um inserto de GIP de rato de 1,2 kb conforme descrito em Biol. Res. 44: 301-305, 2011 e as Sequências de Referência NCBI (proinsulina) NM_019129.2/3. O segundo adenovirus carregou uma construção eGFP “nula” (720 bp, Gene 1996; 173 (1 Espec. n°): 33-8) (denominada GIP-GFP), que expressa proteína fluorescente verde aprimorada. A expressão de GFP foi controlada utilizando o mesmo sistema promotor do conjunto de insulina.

[00137] Estoques adenovirais com alto título foram

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39/43 preparados por meio de cultivo de vírus em células HEK 293 e purificação subsequente por meio de centrifugação de gradiente de densidade de cloreto de césio dupla, seguida por dessalinização de colunas (por exemplo, PD-10), na formulação de excipiente a seguir:

Ν,Ν-dimetiglicina (DMG) (0,2 M); metilsulfonilmetano (MSM) (0,2 M); e sacarose (0,4 M).

[00138] O adenovirus formulado com excipiente final foi seco por congelamento e o aglomerado resultante foi pulverizado com espátula e preenchido em seguida em cápsulas de gelatina suína com tamanho 9 (Torpac, Inc., NJ, 07006). Por fim, as cápsulas foram revestidas por meio de métodos de revestimento entérico conhecidos pelos técnicos no assunto para fornecimento dirigido ao duodeno (copolímero 1:1 de póli (ácido metacrílico-coacrilato de etila)).

[00139] Realizou-se determinação in vivo das cápsulas formuladas com excipiente de adenovirus administradas oralmente (por meio de alimentação forçada) em STZ (35 mg/kg), que induziu ratos diabéticos com alimentação com alto teor de gordura (Cardiovascular Diabetology 2013 12: 136) com determinação da glicose no sangue da veia da cauda (amostra de plasma) antes (-3) e depois da dosagem (dia 3, 5, 8, 10, 12 e 15) com a dosagem correspondente no dia 1. Os resultados são apresentados na Figura 1. As doses formuladas com excipiente de adenovirus em dose oral correspondentes foram tituladas por meio de TCID50, teste de CPE em células HEK293, para quantificar a dose de vírus vivo administrada por via oral. Estas foram: GIP-INS em dose TCID de 9,6E+07 e GIP-GFP em dose TCID de 1,6+07. Na Figura 1, a situação diabética de todos os ratos dosados é indicada pelos níveis de glicose no sangue antes da dosagem (-3 dias) em níveis de cerca de 4 vezes o normal (cerca de 7 mM).

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40/43 [00140] Os dados foram meios ajustados retrotransformados (n=5-6). Desvios padrão foram calculados a partir dos resíduos do modelo estatístico. Os dados foram analisados por um modelo linear geral com tratamento como fator e peso do corpo no Dia 1 e glicose no plasma em log(Dia -3) como covariações seguidas por teste de Dunnett. Diferenças significativas vs. veículo são fornecidas com **p<0,01.

Exemplo 2 [00141] Preparou-se uma construção de Adenovirus (Adenovirus humano Tipo 5 (dE1/E3)) por meio de métodos biológicos moleculares padrão, composta do promotor de CMV (citomegalovírus) que dirige a expressão de BChE (Butirilcolinesterase) denominada Ad5- CMVBChE. Sequências de referência NCBI: utilizou-se Butirilcolinesterase NM_022942.1, espécie de rato.

[00142] Em seguida, foram preparados estoques adenovirais com alto título por meio de cultivo de vírus em células HEK 293 e purificação subsequente por meio de adenovirus cromatograficamente com concentração final na formulação excipiente de DMG (0,2 M)/MSM (0,2 M)/sacarose (0,4 Μ). O adenovirus formulado com excipiente final foi seco por congelamento e o aglomerado resultante foi pulverizado e preenchido a mão em seguida em cápsulas de gelatina suína com tamanho 9 (Torpac, Inc., NJ, 07006). Por fim, as cápsulas foram revestidas por meio de revestimento entérico (copolímero 1:1 de póli (ácido metacrílico-co-acrilato de etila)) para fornecimento dirigido ao duodeno.

[00143] Detectou-se atividade enzimática de butirilcolinesterase in vitro positiva, substrato de iodeto de butiriltiocolina (BTC) em sobrenadantes de cultivo celular (HEK293) após a infecção de vetor Ad5CMV- BChE e essencialmente ausentes com vetor Ad5- CMV- GFP nulo (ambos não encapsulados). Os resultados são exibidos na Figura 2.

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41/43 [00144] Realizou-se determinação in vivo das cápsulas formuladas com excipiente adenovirus administradas oralmente em ratos marrons da Noruega com amostragem de sangue da veia da cauda (amostra de plasma) (dia de dosagem (antes da dosagem), 1 dia e 3 dias após a dosagem), com o nível de dose formulada de excipiente de adenovirus correspondente 2x10¹⁰ vp/cápsula determinado espectrofotometricamente (OD 260 nm).

[00145] Os níveis de BCHe em amostras de plasma individuais, n=8 pacientes, foram medidos por meio do Kit de Atividade Fluroescente de Butirilcolinesterase DetectX® (K016-F1) e detectou-se nível elevado de atividade enzimática (P<0,01) três dias após a dosagem. Os resultados são apresentados na Figura 3.

Exemplo 3 [00146] Foi preparada uma construção de adenovirus (sorotipo 5) (dE1/E3)) composta de um promotor de CMV que dirige a expressão de antígeno Zika (E e NS1), denominada Ad5_FP (E/NS1)_GW. Estoques de vírus com alto título foram preparados por meio de cultivo de vírus em células HEK 293, seguidos por formulação com excipientes (0,4 M de sacarose, 0,2 M de DMG e 0,2 MSM) e secagem por pulverização. O aglomerado resultante em pó foi preenchido em cápsulas de gelatina suína, seguido por revestimento entérico para ampliar o fornecimento gastrointestinal inferior.

[00147] Este produto foi testado em um estudo com 12 camundongos ΙΡΝαβ⁷’ (6 camundongos foram tratados com vacina e 6 foram tratados com placebo). Camundongos SV129 foram também conduzidos como controle competente imune para a produção de anticorpos.

[00148] Os camundongos receberam dosagem por meio de alimentação oral formada nos dias 0, 14 e 28, seguida por desafio com vírus

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Zika (isolado HS-2015-BA-01,4x10⁵ PFU administradas por via intravenosa na veia da cauda no dia 42). Foram medidos o peso do corpo, a pressão intraocular e viremia cerebral.

[00149] A Figura 4 exibe o percentual de perda de peso do corpo em camundongos que receberam administração da vacina e camundongos que receberam administração de placebo por três dias após desafio viral (sabe-se que camundongos ΙΡΝαβ⁷’ perdem peso do corpo mediante desafio com vírus Zika). A vacina gerou proteção (p = 0,0003).

[00150] A Figura 5 exibe os efeitos de desafio viral sobre a pressão intraocular para camundongos vacinados e camundongos que receberam administração de placebo. Novamente, a vacinação gerou proteção (p = 0,016).

[00151] A Figura 6 exibe em seguida viremia dos testículos, nervos ópticos e cérebro (registrada no dia 49). Observou-se eficácia protetora por meio de redução da carga de viremia com relação ao controle de placebo.

Exemplo 4 [00152] Vacina contra a Zika oral foi testada em Callithrix penicillata (2 controles pré-imunes, 2 placebos e 2 vacinados). A formulação de vacina foi preparada conforme acima e preenchida em cápsulas revestidas entericamente (2,1x10⁸ vacina TCIDso e 2,5x10⁸ placebo TCIDso por dose). Cápsulas foram armazenadas à temperatura ambiente por cerca de um mês após a fabricação. As cápsulas foram administradas duas vezes, nos dias 0 e 13.

[00153] Os animais receberam desafio com o isolado clínico de vírus Zika HS-2015-BA-01 (5x10⁵ PFU, administrado por via subcutânea no dia 27 (14 dias após a última dose de vacina)). Conduziu-se coleta de sangue após o desafio nos dias 1,3, 6, 9 e 12 e coleta de saliva e urina nos dias 3, 6, 9 e 12.

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43/43 [00154] A Figura 8 exibe carga viral relativa até 5 dias após o desafio. A vacina conferiu imunidade equivalente à exposição anterior ao vírus Zika. Não foi detectado vírus Zika nos grupos vacinados ou pré-imunes (LOD = 4). A vacina foi eficaz, portanto, após um mês em armazenagem ambiente.

Claims

Reivindicações

1. MÉTODO DE FORNECIMENTO DE TRANSGENE(S) para células alvo em pacientes, em que o mencionado método compreende a administração oral de um produto caracterizado pelo fato de que compreende partículas virais que carregam o transgene.
2. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as partículas virais são partículas adenovirais.
3. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou

2, caracterizado pelo fato de que o produto compreende adicionalmente revestimento entérico.
4. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a

3, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica uma proteína terapêutica.
5. MÉTODO de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é insulina ou butirilcolinesterase.
6. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a

4, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos.
7. MÉTODO de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos do vírus Zika.
8. MÉTODO de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o(s) antígeno(s) do vírus Zika é(são) derivado(s) da proteína envelope (E) e/ou NS1.
9. MÉTODO de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos do Vírus Simplex da Herpes (HSV), opcionalmente HSV2.
10. MÉTODO de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o(s) antígeno(s) de HSV é(são) derivado(s) de glicoproteína C (gC), glicoproteína D (gD) e/ou glicoproteína E (gE).

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11. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a expressão do transgene é controlada por um promotor específico de tecidos.
12. MÉTODO de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o promotor é o promotor de polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose.
13. MÉTODO de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é insulina e a expressão da insulina é controlada pelo promotor de polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose.
14. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as partículas adenovirais são formuladas em composição farmacêutica que compreende:

a. as partículas virais;

b. opcionalmente, um ou mais açúcares; e

c. um composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis:

em que:

Ri representa hidrogênio ou alquila Ci-e; e

R4 representa hidrogênio; ou

Ri e R4, em conjunto com os átomos aos quais são ligados, formam um anel de pirrolidina;

R2 representa hidrogênio, alquila C1-6 ou -(CH2)2Petição 870190063088, de 05/07/2019, pág. 115/132

3/11 ₅NHC(O)(CH2)5-15CH₃; e

R3 representa alquila Ci-β; e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis:

em que:

X representa -S(O)2- ou -S⁺(R_C)-;

Ra e Rb representam independentemente alquila Ci-β; e

Rc representa alquila C1-6 substituído por um ânion de carboxilato e uma porção amina (-NH2).
15. MÉTODO de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreende um composto da fórmula (I), um de seus sais fisiologicamente aceitáveis ou um composto da fórmula (II), ou um de seus sais fisiologicamente aceitáveis.
16. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que 0 composto da fórmula (I) é N,N-di(alquil C1-6)-, N,N,N-tri(alquil C1-6)-, N-alquil C1-6 glicina ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis.
17. MÉTODO de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que 0 composto da fórmula (I) é (a) Ν,Ν-dimetilglicina, Ν,Ν,Νtrimetilglicina, N-metilglicina ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis ou (b) N-metilglicina, Ν,Ν-dimetilglicina, Ν,Ν,Ν-trimetilglicina ou um de seus sais de cloridrato.
18. MÉTODO de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que 0 composto da fórmula (I) é Ν,Ν-dimetilglicina ou um de seus

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4/11 sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis.
19. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que:

o composto da fórmula (I) é um composto da fórmula (IA) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis:

(IA) em que Rs e Re representam independentemente alquila Ci-4 e R? representa alquila Ci-4 ou -(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-isCH3;

o composto da fórmula (I) é um composto da fórmula (IB) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis:

(IB) em que Rs e Rg representam independentemente alquila C1-4;

0 composto da fórmula (II) é um composto da fórmula (HA) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis:

Rc Rd (HA) em que Rc e Rd representam independentemente alquila C1-4; ou

0 composto da fórmula (II) é um composto da fórmula (HB) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis:

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5/11

(IIB) em que Re e Rf representam independentemente alquila C1-4; e R_grepresenta alquila C1-4 substituído por um ânion de carboxilato e por uma porção amina.
20. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 14, 15 ou 19, caracterizado pelo fato de que 0 composto da fórmula (I) ou (II) é dimetilsulfona, trimetilglicina, cocamidopropil betaína, prolina betaína, S-metil-Lmetionina ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis.
21. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que: (a) as soluções aquosas compreendem um ou mais açúcares, a concentração do compostos da fórmula (I) ou (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis é de 0,1 mM a 2,5 M e a concentração de açúcar ou, caso mais de um açúcar esteja presente, a concentração total de açúcares é de pelo menos 0,01 M; ou (b) a concentração do composto da fórmula (I) ou (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis é de 0,1 mM a 3 M.
22. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que a concentração do composto da fórmula (I) ou (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis é (a) 0,001 M a 2,5 M, 0,01 M a 2,5 M ou 0,1 M a 2 M; (b) 7 mM a 1,5 M ou 0,07 M a 0,7 M; (c) 7 mM a 1,5 M ou 0,07 M a 1 M; ou (d) 0,05 M a 2 M, 0,02 M a 2 M ou 0,07 M a 1 M.
23. MÉTODO de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreende um composto da fórmula (I) ou um de seus sais fisiologicamente aceitáveis e um composto da fórmula (II) ou

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6/11 um de seus sais fisiologicamente aceitáveis.
24. MÉTODO de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreende um composto da fórmula (I) ou um de seus sais fisiologicamente aceitáveis conforme definido em qualquer das reivindicações 13 a 15 e um composto da fórmula (II) que é um composto de sulfona da fórmula (IIC):

O_x ,O ¥

Ra Rb (IIC) em que Ra e Rb representam independentemente alquila C1-6.
25. MÉTODO de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a concentração do composto da fórmula (I) ou um de seus sais fisiologicamente aceitáveis na mencionada solução aquosa é de 0,1 a 1,5 M.
26. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o composto de sulfona da fórmula (IIC) é metilsulfonilmetano.
27. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 24 a

26, caracterizado pelo fato de que a concentração do composto de sulfona da fórmula (IIC) na mencionada solução aquosa é de 0,1 a 1,5 M.
28. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 14 a

27, caracterizado pelo fato de que (a) a concentração de açúcar, ou a concentração total de açúcares, é de 0,1 M a 3 M ou 0,2 M a 2 M; (b) a solução compreende um ou mais açúcares em concentração, ou concentração total de açúcares caso mais de um açúcar esteja presente, de pelo menos 0,1 M; ou (c) a concentração de açúcar da solução aquosa é de 0,05 a 1 M.
29. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 14 a

28, caracterizado pelo fato de que a composição compreende um açúcar não

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7/11 redutor ou álcool de açúcar.
30. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 14 a

29, caracterizado pelo fato de que dois ou mais açúcares são utilizados e um dos açúcares é sacarose.
31. MÉTODO de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a razão da concentração de sacarose com relação ao(s) outro(s) açúcar(es) é de 1:1 a 20:1.
32. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que o outro açúcar é rafinose.
33. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 14 a

31, caracterizado pelo fato de que a composição compreende manitol.
34. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 14 a

29, caracterizado pelo fato de que está presente um açúcar, que é manitol, ou estão presentes dois açúcares, que são sacarose e rafinose.
35. MÉTODO de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa compreende sacarose ou manitol.
36. MÉTODO de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a composição compreende 0,2 M de N,N-dimetilglicina, 0,2 M de dimetilsulfona e 0,4 M de sacarose.
37. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 14 a

36, caracterizado pelo fato de que a composição é um pó seco.
38. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 14 a

37, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada ao paciente na forma de comprimido ou cápsula.
39. MÉTODO de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o comprimido ou cápsula é revestido entericamente.
40. COMPRIMIDO OU CÁPSULA para administração oral a pacientes, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição

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8/11 farmacêutica que compreende partículas virais que carregam um transgene.
41. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o vírus é um adenovirus.
42. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com qualquer das reivindicações 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que a composição compreende um composto da fórmula (I) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis conforme definido em qualquer das reivindicações 14 ou 16 a 25 e/ou um composto da fórmula (II) ou um de seus sais ou ésteres fisiologicamente aceitáveis, conforme definido em qualquer das reivindicações 14, 19 a 24, 26 ou 27 e, opcionalmente, um ou mais açúcares, preferencialmente sacarose.
43. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o açúcar é conforme definido em qualquer das reivindicações 28 a 35.
44. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com qualquer das reivindicações 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que a composição compreende 0,2 M de N,N-dimetilglicina, 0,2 M de dimetilsulfona e 0,4 M de sacarose.
45. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com qualquer das reivindicações 40 a 44, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica uma proteína terapêutica.
46. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é insulina ou butirilcolinesterase.
47. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com qualquer das reivindicações 40 a 45, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos.
48. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com a

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9/11 reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos do vírus Zika.
49. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos do vírus Zika derivados da proteína de envelope (E) e/ou NS1.
50. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos de HSV, opcíonalmente HSV2.
51. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos de HSV derivados de glicoproteína C (gC), glicoproteína D (gD) e/ou glicoproteína E (gE).
52. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com qualquer das reivindicações 40 a 51, caracterizado pelo fato de que a expressão do transgene é controlada por um promotor específico de tecidos.
53. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o promotor é o promotor de polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose.
54. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é insulina e a expressão da insulina é controlada pelo promotor de polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose.
55. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com qualquer das reivindicações 40 a 54, caracterizado pelo fato de que a composição é seca antes da embalagem em comprimidos ou cápsulas.
56. COMPRIMIDO OU CÁPSULA de acordo com qualquer das reivindicações 40 a 55, caracterizado pelo fato de que é revestido com revestimento entérico.

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10/11
57. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE PARTÍCULAS VIRAIS que carregam transgene para administração oral a pacientes, caracterizado pelo fato de que o mencionado método compreende:

a. cultivo e purificação de partículas virais que carregam o transgene;

b. formulação das partículas virais em composição farmacêutica;

c. secagem opcional da composição; e

d. embalagem da composição em comprimidos ou cápsulas para administração oral ao paciente.
58. MÉTODO de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que as partículas virais são partículas adenovirais.
59. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 57 ou 58, caracterizado pelo fato de que as partículas virais são formuladas em uma composição conforme definido em qualquer das reivindicações 14 a 36.
60. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 57,

58 ou 59, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica uma proteína terapêutica.
61. MÉTODO de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é insulina ou butirilcolinesterase.
62. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 57 a

60, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos.
63. MÉTODO de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos do vírus Zika.
64. MÉTODO de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos do vírus Zika derivados da proteína de envelope (E) e/ou NS1.
65. MÉTODO de acordo com a reivindicação 62, caracterizado

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11/11 pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos de HSV, opcionalmente HSV2.
66. MÉTODO de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica um ou mais antígenos de HSV derivados de glicoproteína C (gC), glicoproteína D (gD) e/ou glicoproteína E (gE).
67. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 57 a

66, caracterizado pelo fato de que a expressão do transgene é controlada por um promotor específico de tecidos.
68. MÉTODO de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o promotor é o promotor de polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose.
69. MÉTODO de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é insulina e a expressão da insulina é controlada pelo promotor de polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose.
70. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 57 a 69, caracterizado pelo fato de que os comprimidos ou cápsulas são revestidos com revestimento entérico.
71. PRODUTO caracterizado pelo fato de que compreende partículas virais para uso em um método de fornecimento de transgenes para células alvo em pacientes, em que o mencionado método compreende a administração oral das partículas virais que carregam o transgene.
72. PRODUTO para uso de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que as partículas virais são partículas adenovirais.