JPH11507231A

JPH11507231A - アデノ関連ウイルスベクターの経口送達

Info

Publication number: JPH11507231A
Application number: JP9502072A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ドゥーリン，マシュー
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 1999-06-29
Also published as: CA2222574A1; EP0832266A4; AU6168796A; WO1996040954A1; AU719950B2; US20050163756A1; EP0832266A1; IL122349A0

Abstract

(57)【要約】動物の腸で遺伝子産物を発現する方法であって、この方法は組換えＡＡＶベクターを動物の腸に投与することを包含し、ここで、このベクターはＡＡＶベクターゲノムに連結した目的の非ＡＡＶ遺伝子を含有する。

Description

【発明の詳細な説明】アデノ関連ウイルスベクターの経口送達謝辞本発明は、国立衛生研究所の助成ＮＳ２８２２７およびＮＳ０６２０８によって一部援助された。この援助の結果、米国政府が本発明の権利を有する。序論技術分野本発明は、遺伝子発現の分野であり、特に、動物の腸における遺伝子産物の発現に関する。背景アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、動物において遺伝子産物を発現させるベクターとして提案され、そして特許を得てきた。例えば、米国特許第5、19 3、941号（１９９２年８月１８日に発行、ＷＯ第９４１３７８８号）ならびに本発明者の研究所からの最も最近の出願である米国出願番号08/227、319を参照。多数の特許および他の刊行物が、多数のＡＡＶベクターおよびその使用を記載しており、その使用は、一般的に、インビトロ（通常は、組織培養）またはインビボ（米国特許出願第08/227、319号は、中枢神経系における発現に関連するが、通常は、ＡＡＶ感染の正常部位である肺または口腔粘膜において）のどちらか一方における、遺伝子産物の発現に関する。本発明者の研究所での研究により、驚いたことに、ＡＡＶベクターが、経口摂取後の動物の腸において、効果的な、長期間の発現系として作用し得ることが発見された。この発見により、ヒトを含む動物の腸において、所望の遺伝子産物および制御エレメントを発現する新規方法が提供される。発明の要旨従って、本発明の１つの目的は、他の目的のためにすでに開発されたＡＡＶベクターの新規使用法を提供することである。本発明のさらなる目的は、腸指向性遺伝子発現系を含む新しい組換えＡＡＶベクターを提供することである。本発明のこれらおよび他の目的は、動物の腸で、遺伝子産物を発現する方法を提供することによって達成されており、この方法は、組換えＡＡＶベクターを、動物の腸へ投与する工程を包含し、ここで、このベクターは、ＡＡＶベクターに連結された目的の非ＡＡＶ遺伝子を含む。図面の簡単な説明本発明は、明細書の一部を構成する図面と組み合わせて考慮される場合に、以下の発明の詳細な説明を参照することにより、よりよく理解される。図１は、急性のラクトース攻撃およびラクトースのみの食餌後の、血漿グルコースおよび動物の体重を示すグラフである。Ａ．一晩絶食したラットにおける、ラクトース摂取後の血漿グルコースの変化。ラットは、ＡＡＶｌａｃまたはＰＢＳ投与後１週間の間研究された。Ｂ．経口ラクトース攻撃は、１４日間のラクトース食餌の後に繰り返された。Ｃ．ベースライン、すなわち１４日間のラクトースおよび水の食餌の１週間後および２週間後のラットの体重。食餌は、経口ＡＡＶｌａｃまたはＰＢＳ処置の１週間後に開始した。図２。Ａ．一晩絶食したラットにおけるラクトース摂取後の血漿グルコースの変化であり、これらのラットは、ＡＡＶｌａｃまたはＰＢＳの１回の経口投薬後の１２０日間攻撃された。Ｂ．ベースライン、すなわち１４日間のラクトースおよび水の食餌の１週間後および２週間後のラットの体重。食事は、経口ＡＡＶｌａｃまたはＰＢＳ処置の１２０日後に開始した。特定の実施形態の説明本発明は非常に簡単であり、本発明に先行して組換えＡＡＶベクターは周知であり、そして多数の細胞および組織へ形質導入され得ることは公知であったが、動物の腸における遺伝子産物の発現において使用されていないし、その使用も示唆されていない。従って、本発明は、発現が望まれる遺伝子（ベクターに対して通常の様式で望まれるかまたは必要である場合、適切な制御エレメントをともなう）を含有する組換えＡＡＶベクターを、標的動物の腸に投与することを包含する。これまでに公知のＡＡＶベクターが、腸発現に十分に作用することが示されているので、新規ベクターは必要とされない。従って、本発明は、部分的には、ＡＡＶベクターの特別な適合が腸発現に必要とされないという発見であり、これは、ＡＡＶの再生産（すなわち、ヘルパーウイルスの存在）およびＡＡＶの肺および鼻腔通路との正常な結合のための厳密な要件の観点から驚異的である。多数の科学刊行物および特許刊行物が、ＡＡＶベクター分野における技術状態を記載する。先行技術のベクターの特別な適合性は、本発明の実施に必要とされないので、既に周知の技術状態を本明細書で長々と詳述する必要はない。しかし、以下の刊行物は、本明細書中の序論に示されている特許および特許出願（およびそれらの刊行された等価物）のように、本明細に参考として援用され、これらの資料は、ＡＡＶ分野でより経験の浅いものにとって有用であり得る：２つの最近の総説論文は、ＡＡＶウイルスを用いた遺伝子治療の近況の具体的で完全な概説を提供し、そして、この分野におけるさらに最近の科学刊行物の集積を包含する。本発明の目的のためのウイルスベクターの実際の送達は、腸へＡＡＶ組換えベクターを輸送する任意の物理的方法を用いて達成される。投与についての本発明の考察では、「ＡＡＶベクター」は、裸の組換えＡＡＶＤＮＡベクターまたはウイルスカプシドにパッケージされたＡＡＶベクターＤＮＡの両方を意味する。リン酸緩衝化生理食塩水にＡＡＶベクターを単に溶解することが、有用な腸発現にとって十分であることが実証され、そして（DNAを分解する組成物は、ベクターを用いる通常の様式では避けられるべきであるが）ベクターと共に同時投与され得るキャリアまたは他の成分に対する公知の制限は存在しない。薬学的組成物は、経口錠剤、カプセル、もしくは摂取可能液体または座薬として調製され得る。ベクターは、投与および取り扱いの簡便化のために、任意の薬学的に受容可能なキャリアと共に使用され得る。ＡＡＶベクターは、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用キャリアとともに経口的に投与され得るか、または硬いあるいは軟らかい外皮のゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得るか、または食事の食べ物に直接混ぜられ得る。経口治療投与に関しては、ＡＡＶベクターは、賦形剤と混合され、摂取可能な錠剤、舌下錠（buccal tablets）、トローチ、カプセル、霊薬、懸濁液、シロップ、およびオブラートのような形態で用いられ得る。このような組成物および調製物は、ＡＡＶベクターＤＮＡを少なくとも1μｇ、好ましくは１０〜１０００μｇ、または、体重１キログラム当たり、５×１０³〜５×１０⁶感染単位のＡＡＶベクターを含有すべきである。治療的に有用な組成物中のＡＡＶベクターの量は、治療的に有用なレベルで、遺伝子発現を生じるのに十分な量である。本発明による好適な組成物または調製物は、経口用量単位の形態が、約１０〜１０００μｇの間のＡＡＶベクターＤＮＡ、または１０⁴〜１０⁶感染単位のＡＡＶベクターを含有するように調製される。錠剤、トローチ、丸薬およびカプセルなどは、以下のものも含有し得る。ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム（gum tragacanth）、アカシア、ショ糖、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤、リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、および炭酸カルシウムのような賦形剤、コーンスターチ、バレイショデンプン、タピオカスターチ、特定のケイ酸複合体、およびアルギン酸のような崩壊剤、ラウリル硫酸ナトリウム、滑石およびステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、ラクトース、またはサッカリンのような甘味剤、または、ペパーミント、冬緑油もしくはチェリー香味料のような調味剤。類似のタイプの固体組成物は、軟らかく、および硬く充填されたゼラチンカプセルにおける充填剤としても用いられ、これに関連して好適な物質は、ラクトースまたは乳糖、ならびに、高分子量ポリエチレングリコールも含有する。用量単位形態がカプセルの場合、上記のタイプの物質に加え、液体キャリアを含有し得る。様々な他の物質が、コーティングとして、またはそうでなければ、用量単位の物理的形態を改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸薬、またはカプセルは、セラック、糖、またはその両方でコーティングされ得る。シロップまたは霊薬は、ＡＡＶベクター、甘味剤としてのショ糖、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、チェリーまたはオレンジフレーバーのような香味料、乳化剤および／または懸濁剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンのような希釈剤、および様々な同様のそれらの組み合わせを含有し得る。もちろん、任意の用量単位形態を調製するのに用いられる任意の物質は、薬学的に純粋で、用いられる量において実質的に非毒性であるべきである。さらに、ＡＡＶベクターは、徐放性調製物および処方物に取り入れられ得る。ＡＡＶは、過去において、広範な宿主範囲（肺発現に対して）を有していることが明らかにされており、現在、腸において作動可能であることが実証されたので、進化的に発達した小腸および大腸を有する動物、特に哺乳類、鳥類、魚類、および爬虫類、特に、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ニワトリ、および七面鳥などの家畜化された哺乳類および鳥類における発現が好ましいが、腸発現が発生し得る動物に関して公知の制限は無い。ヒトおよび獣医学での使用は共に、特に好ましい。発現されている遺伝子は、使用者が所望のいかなる制御エレメント（例えば、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位）を有するタンパク質をコードするＤＮＡセグメント、または、非コードＤＮＡセグメントのどちらか一方であり得、非コードＤＮＡセグメントの転写は、あるＲＮＡ含有分子または細胞内で機能するアンチセンス分子の全てまたは一部を生成する。本発明は、送達される物質というよりもむしろ、送達の経路およびベクターに関するので、ベクターによって送達される外来ＤＮＡ（非ＡＡＶＤＮＡ）に関する制限はない。腸発現に関係する遺伝子欠失の修正に関連する遺伝子の送達が好ましいが、腸における遺伝子発現は、体内中に発現産物を輸送する結果、他の場所での異常な遺伝子発現を修正する能力を有する。本発明者らは、腸におけるラクトース欠乏を修正することによって本発明を示した。本発明者らは、β−ガラクトシターゼ（ＡＡＶｌａｃ）を発現する組換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を用いて、ベクターを経口経路を用いて近位の腸に送達した。ＡＡＶｌａｃを受容するラクトースが欠乏したラットは、血漿グルコースの上昇によって実証されたように、急性のラクトース負荷を代謝し得た。それに対して、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で処置されたコントロールには、血漿グルコースへのラクトースの影響が全く見られないことが実証された。さらに、動物が、制限されたラクトースのみの食餌を強いられた場合、ＰＢＳ処置されたラットでは、２週間の試験食餌期間全体にわたって体重が低下し続けた。それに対して、ＡＡＶｌａｃ処置された動物は、第２週目の間、体重の低下は見られなかった。ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ、そして従来の分析により、ウイルスＤＮＡの腸内残留性および動物の生命のためのベクターにコードされたβ−ガラクトシダーゼの発現が確認された（６ヶ月にわたる）。さらに、動物が、１回のＡＡＶｌａｃまたはＰＢＳ処置後３ヶ月に、ラクトース負荷で再攻撃された場合、ＡＡＶｌａｃ動物は、ラクトースを代謝する能力を保持しており、ラクトース食餌において体重を維持していた。これらのデータは、ＡＡＶベクターの経口送達により、ラクトース欠乏の、長く続く表現型の修正が生じ得ることを示す。この実証システムは、本発明の原理を証明し、かつ、治療的に有用な形態で本発明を実証するために選択された。成人型低ラクトース分解症（hypolactasis）は、常染色体劣性遺伝子によって遺伝的に決定される（Sahiら、Lancet、1973、 2:823〜828）。これは、世界で最も一般的な遺伝障害で、ある東南アジアの人口の１００％、そしてある北ヨーロッパの国々では５％以下の範囲である、世界人口の５０％以上を苦しめている（Flatz Human Genet．1984、36:306〜310）。ラクトース不耐性に関連する症状は、比較的軽く、ラクトースを含有する食べ物を除外することにより簡単に制御されるが、ラクトース不耐性に典型的に付随する食事制限の潜在的な臨床的有意性に関してある論議がある。具体的には、ラクトースを含まない食餌に従うことに関連するカルシウム摂取の低下により、高齢者における骨質量の減少の加速につながり得（Flatz、1987、Advances in Human G enet.、16:1〜77、NY Plenum Press）、青年期および若年成人においては、骨ミネラル量が減少し得る（Mobassalehら、Pediatrics、75:160〜166、1985）。本発明者らは、胃腸遺伝病のモデルとして、ラットにおけるラクトースの欠乏を研究することを選んだ。本発明者らは、特に、経口的に送達されたウイルスベクターを用いて表現型を修正し得るか否かを決定することに興味があった。本発明者らは、ＡＡＶベクターにより、インビボの投与後の末端分化型細胞において長期導入遺伝子発現が生じ得ることを以前に示した（Birgeら、NEJM、1967、276 :445〜448）。ＡＡＶは、ＡＡＶを遺伝子治療にとって特に魅力的にする幾つかの特徴を有する。ＡＡＶは、欠陥のある、ヘルパー依存性ウイルスであり、その野生型は、非病原性である。ヘルパーウイルスを全く有さないベクターが生成され得る（Baylessら、1975、NEJM、292:1156〜1159）。さらに、ある組換えＡＡＶベクターは、コード配列全体を取り除いた、ちょうど１４５塩基ベース末端繰り返しを保持する。他のＡＡＶベクターにおいては、非ＡＡＶＤＮＡは、両末端でＤセグメントを有する内部末端繰り返しを含む１６５の塩基対から構成される二重−ＤＡＡＶゲノムセグメントを含有するベクターに作動可能に連結する。従って、これらのベクターは、あらゆるウイルス遺伝子を持たず、任意の組換えの可能性およびウイルス遺伝子発現を最小限に抑える。さらに、アデノウイルスとは違い、これらのベクターは、どのような免疫応答も誘発するようには思われない。経口に基づくベクター（orally based vector）に対してＡＡＶ（ｉｔ）を潜在的に適切とさせるＡＡＶの他の特徴は、耐久力の特徴であり、ＡＡＶは、温度、ｐＨ極値および溶媒に対して耐性がある（Sandlerら、Am．J．Clin．Nu tr.、1985、42:270〜274）。さらに、ヒトにおける能動的感染の間、野生型ＡＡＶは、典型的には、気道および胃腸分泌物の両方に見られ、その結果、腸は、ウイルスにとって通常の宿主組織である。ラクトース不耐性は、最も一般的に、腸のラクターゼ活性の低下に関連する。ラクトースの消化は、酵素、ラクターゼ−フロリジンヒドロラーゼ（ＬＰＨ）、ガラクトシダーゼ活性およびグリコシル−Ｎ−アシルスフィンゴシングルコヒドロラーゼ活性の両方を有する微絨毛タンパク質に依存する。しかし、酵母または細菌性β−ガラクトシダーゼの食餌的投与は、ラクトースを代謝させる能力を与えるのに十分である（Kaplittら、Nature Genet.、1994、8:148〜154）。ほとんどの哺乳類の種類は、離乳後、比較的ラクトースが欠乏しているが、ＬＰＨ発現におけるこの発育上の変化は、単純に遺伝子転写の低下であるとは思われない。ヒトおよひラットの両方において、離乳後、ＬＰＨｍＲＮＡは減少するが、成人期の間に再び現れる。しかし、ｍＲＮＡのこの増加は、翻訳の増加に関連するものではなく、刷子縁内の成人の酵素レベルは低いままである。あるＬＰＨタンパク質が発現されるようだが、酵素は、ゴルジ領域内に蓄積され、刷子縁には運ばれない。この情報に基づいて、本発明者らは、以下の実施例を実施して本発明を説明した。これらの実施例は、そのように記載されない限り、本発明を限定することを意図しない。実施例本発明者らは、ウイルスベクターを用いてβ−ガラクトシダーゼの腸細胞発現の増加を実証し、動物モデルにおいて表現型の修正につながる酵素活性の刷子縁の増加を得ることを決定した。本発明者らは、成人発症低ラクトース分解症(hyp olactasia)の遺伝的モデルとして、成人したラットを研究することを選んだ。しかし、成人（＞４ヶ月齢）のSprague-DawleyおよびFisherラットをスクリーニングした際、かなりの数（少なくとも７０％）が、経口ラクトース攻撃テスト後の血漿グルコースの上昇によって決定されるような、持続的なラクターゼ活性を有していた。従って、本発明者らは、ラクトースを与えられた後、平らな血漿グルコース曲線を有していた動物のみを選択した。ラットに無作為にＡＡＶｌａｃまたはビヒクルを受容させた。ベクター（またはＰＢＳビヒクル）は、軽く麻酔をかけられた絶食させたラットにおいて、口と胃をつなぐチューブ（oro-gastric tube）を用いて送達された。動物は、回復を許可され、通常のラットの固形飼料食餌の状況に置かれた。ＡＡＶｌａｃ投与後の様々な時点で、動物は、測量されたラクトースおよび血漿グルコース試料で攻撃された。さらに、ＡＡＶ後の１週間目および１２０日後に再び、動物は、ラクトースのみの食餌の状況に置かれた。動物の体重がモニターされ、ラクトース攻撃が繰り返された。ＡＡＶｌａｃＤＮＡの持続性および発現は、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュＲＴ−ＰＣＲおよびＸ-gal免疫組織化学を用いて決定された。（Ｘ-g al染色を用いて決定されるような）β−ガラクトシダーゼ発現は、初めの３時間以内に観察された。しかし、６時間後には、澄んだ青い（Ｘ-gal陽性）細胞が特性分布において見られた。さらに、この発現は、発現の損失が観測されることなしに、動物の生涯を通じて持続した。ラクターゼを加えられた動物における、絨毛の先端部および刷子緑における内因性酵素活性とは対照的に、発現の大多数は、経口投与の６時間後でさえ、固有層内にあった。しかし、高倍率の拡大率では、酵素のいくらかは拡散した、または、腸の刷子縁に輸送されたようであった。ＡＡＶｌａｃの投与は、通常のラット固形飼料を与えられた任意のラットの体重増加または行動に影響を及ぼさなかった。しかし、ラクトースのみの食事に変えた際に、ＡＡＶｌａｃ処置を受けたラットおよびＰＢＳ処置を受けたラットは共に体重が低下した。第１週目は、この体重の減少は、両方のグループにおいて同一であり、食品摂取の低下およびラクトースを摂取する興味の欠如が主に反映されていた。しかし、第２週目においては、両方のグループがラクトースを摂取した。興味深いことに、ＡＡＶｌａｃ動物には、さらなる体重の減少がなかった。その一方で、ＰＢＳ処置された動物は、第１週目と同じ速度で体重の減少を続けた。さらに、ラクトースの攻撃の後、ＡＡＶｌａｃ動物には、血漿グルコースの大幅な上昇があったが、ＰＢＳ処置された動物の血漿グルコースレベルは、平らなままであった（図１）。動物のグループは、ベクターの１回の経口投与の後４ヶ月間追跡された。１２０日目に、これらのラットは、ラクトース負荷で再攻撃され、その後、ラクトースのみの食餌を再開した。ＡＡＶｌａｃ投与後の第１週目の間の攻撃と類似して、ベクター処置された動物は、血漿グルコースを上昇させたが、コントロールは反応を示さなかった。さらに、ＰＢＳ処置された動物には、ラクトース食の状態で、持続的な体重の減少があったが、ＡＡＶｌａｃ処置された動物は、第２週目の間、体重を維持することができた（図２）。実験の詳細成体（年齢＞４ヶ月）のオスのFisher334ラットが、経口ラクトース攻撃を用いてスクリーニングされた。ラットは、一晩絶食させられた。テストの朝、ベースライン、すなわち、絶食している時の血漿グルコースレベルが、尾静脈から採取された血液から取られた。その後、動物は、２ｇｒのラクトースを投与され、血漿グルコースが、３０分後に、尾静脈試料で再び測定された。血漿グルコースは、以前に記載されたような（During MJら、J．Clin Invest、1995、95:2403〜 2408）Beckman Glucose Analyzer IIを用いて測定された。５ｍｇ／ｄｌを超える血漿グルコースの上昇を有したラットは、さらなる研究から除外された。平らな血漿グルコースの上昇（Δ＜５ｍｇ／ｄｌ）を有していたラットが、２つのグループ、すなわち、Ａ）ＡＡＶｌａｃおよびＢ）ＰＢＳに無作為化された。ＡＡＶｌａｃに無作為化されたラットは、ケタミン／キシラジン（8/80 mg/kg i.p. ）を用いて軽く麻酔され、口と胃をつなぐチューブが挿入された。１０マイクロリットルのＡＡＶｌａｃ（キャリア溶液において滴定濃度５×１０⁶／ｍｌ）または０．５ｍｌのＰＢＳまたはＰＢＳのみが注入された。ラットは、回復を許可され、任意に水およびラットの固形飼料を得られる状態に戻された。ＡＡＶｌａｃは、記載されたように、ｐＡＢ１１から調製された組換えＡＡＶベクターである（Goodmanら、Blood、1994、84:1492〜1500）。ラットを、一晩絶食し、尾静脈を傷つけることにより血液を採取した。ラットは、次に、ホームケージ（home cage）の中で、２グラムのラクトースにアクセスする機会を３０分間与えられた（Sigma．St．Louis）。ラクトースの食餌の中間時点から３０分で、第２の尾静脈試料が採取された。血液は、採取された際に直ちに遠心分離され、血漿が、グルコースに関して、Beckman Glucose Analyze rを用いて分析された。先行の研究において、本発明者らは、口と胃または他の強制投与を用いたラクトースの強制的経口投薬により、高度に可変であるストレス（stres）高血糖性応答が生じたことを確定した。さらに、食の習性それ自体は、血漿グルコースを上昇させるのに不十分であった。ラットの固形飼料は、ハウジングケージから取り除かれ、１００％のラクトースと交換された（Sigma、St．Louis）。任意の水へのアクセスは、常に継続された。動物は、初めに体重を計られ、ラクトース食開始後７日目と１４日目に体重を計られた。１４日目の最後には、ラクトースは取り除かれ、ラットは通常のラット固形飼料を与えられた。これらの研究により、長期の遺伝子発現を得るためのＡＡＶベクターの経口投与の実現可能性が実証された。さらに、６ヶ月間にわたって発現の損失の形跡が見られず、表現型の修正は、少なくとも４ヶ月間に及んだ。正常なラットにおいては、ＬＰＨ発現は、刷子縁に輸送されたタンパク質を有する腸細胞内で観測された。本発明者らの研究におけるβ−ガラクトシダーゼ発現は、発現が固有層において最も明らかで、腸細胞では、ほとんど発現がないという点で幾分非定型的である。腸細胞の代謝回転が、３〜５日ごとに起こるので、４日または５日後に発現が細胞のこの集団の中に見られないことが予測され得る。あるいは、本発明者らは、絨毛の両先端における腸細胞において、またはクリプト（crypt）の深さで、いかなる持続性の遺伝子発現も観測しなかったが、クリプト内の少数の前駆細胞は、形質導入され得たかもしれない。それに対して、ＡＡＶｌａｃ投与の後、早くも６時間で発現が固有層内で観測された。この発見は、腸内のＭ細胞の機能と一致している。Ｍ細胞は、腸中に散乱している固有の腸上皮細胞であるが、バイエル板および免疫細胞の集団の上に最も集中して見られる。Ｍ細胞は、本質的に、異質タンパク質、ウイルスおよびバクテリアを除去し、これらの異質物質を、固有層内の免疫細胞へと迅速（３時間以内）に輸送する。固有層内のベクターにコードされたβ-ガラクトシダーゼの初期の発現は、この経路に一致している。高倍率の部分において、本発明者らは、刷子縁へと腸細胞を通って下へと広がり、その結果、このモデルにおいて本発明者らが観測した表現型修正に寄与する酵素活性（Ｘ-gal染色によって実証されるような）を観察することができた。しかし、最大の発現は固有層内にあった。腸の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、全身免疫応答を発生させるのに１番よい細胞であり得、ワクチンの開発の標的である（Bernsら、Adv．Virus Res.、1979、25:407〜409）。従って、経口ＡＡＶベクターは、免疫化にとって非常に魅力的な選択であり得る。血管固有層内の持続性発現は、特に門脈循環への放出が望ましい場所で、この経路がタンパク質の置換に適用可能であり得ることも示唆している。例えばこのアプローチは、糖尿病における門脈インシュリン放出の修復に有用であり得る。胃腸免疫系内の導入遺伝子の安定した発現は、経口抗原アプローチに類似した免疫寛容を生成するのにも有用であり得る（Scrimshawら、Am．J．Clin．Nutr.、1988、48: 1129〜1136）。要約すれば、本発明者らは、ＡＡＶベクターの１回の経口投与により、持続性発現および長く続く表現型の修正が生じ得ることを実証した。本発明者らのデータは、ＡＡＶベクターを用いた「錠剤中の遺伝子」方法が、広範囲の状況において有用であろうことを示す。さらに、このアプローチの毒性および非侵襲性の欠如は、現在の薬理学的処置と比較して、経口ＡＡＶベクターを好ましい選択とする。本明細書に掲載されている全刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願が、詳細且つ個別に参考として援用されていることが示されるかのように、同じ程度に、本明細書に参考として援用されている。ここで、本発明は完全に記載され、多くの変化および改変が、添付の請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、実施され得ることは、当業者には、明白である。

Claims

【特許請求の範囲】１．動物の腸において遺伝子産物を発現する方法であって、該方法は組換えＡＡＶベクターを該動物の腸へ投与する工程を包含し、ここで、該ベクターはＡＡＶベクターに連結した目的の非ＡＡＶ遺伝子を含有する、方法。２．前記ベクターが液体の薬学的に受容可能なキャリア中に溶解または懸濁されて投与される、請求項１に記載の方法。３．前記液体キャリアが水溶液を含む、請求項２に記載の方法。４．前記ベクターが固体の薬学的キャリアで投与される、請求項１に記載の方法。５．前記遺伝子が、前記腸において作動可能なプロモーターに作動可能に連結した、タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含有する、請求項１に記載の方法。６．前記投与が経口摂取によって行われる、請求項１に記載の方法。７．前記投与が座薬によって行われる、請求項１に記載の方法。８．前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶゲノムの最初および最後の145塩基対を除くＡＡＶＤＮＡ配列のかわりにもしくはそれに付加されて該ＡＡＶゲノムに連結された非ＡＡＶＤＮＡ、または、両末端にＤセグメントを有する内部末端繰り返しを含む165塩基対からなる二重-ＤＡＡＶゲノムセグメントを含有するベクターに作動可能に連結された非ＡＡＶＤＮＡを含有する、請求項１に記載の方法。９．前記遺伝子が、アンチセンスＲＮＡ分子または遺伝制御エレメントをコードするＤＮＡセグメントを含有する、請求項１に記載の方法。１０．前記動物が鳥類または哺乳動物である、請求項１に記載の方法。１１．前記動物がヒトである、請求項１に記載の方法。１２．前記ＤＮＡセグメントがβ−ガラクトシダーゼ遺伝子およびプロモーター系を含有する、請求項１に記載の方法。