CN110621350A - 病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用病毒载体将转基因递送至靶细胞的领域，特别是在基因治疗领域。已经鉴定出允许口服给药病毒颗粒，特别是腺病毒颗粒的组合物。

Description

病毒
技术领域
本发明涉及口服给药携带转基因(例如治疗性蛋白质)的病毒颗粒(特别是腺病毒颗粒)用于基因治疗。本发明特别涉及通过口服给药包含携带转基因的病毒颗粒的产品将所述转基因递送至靶细胞的方法。本发明还提供了适于对患者进行口服给药的胶囊和片剂，其已经包装了包含病毒颗粒的药物组合物。本发明进一步提供了制备用于对患者进行口服给药的病毒颗粒的方法。
背景技术
病毒载体通常用于基因治疗，也可用作疫苗以表达外源抗原。与其他类型的病毒载体相比，腺病毒载体具有许多优点。例如，腺病毒被很好地研究，可以生长成高滴度的稳定储液，能够有效地转导分裂和非分裂细胞并且能够保持大片段的DNA。现在已经使用腺病毒载体进行了大量基因治疗试验，其中许多涉及癌症的治疗。其他一些研究使用腺病毒表达治疗性蛋白质以纠正遗传缺陷。几乎所有这些临床试验都表明腺病毒载体是安全的并且耐受良好。
大多数腺病毒载体是修饰形式的Ad5(血清型5)，并且载体可以是复制型的或非复制型的。非复制型载体通常缺失必需的E1A和E1B基因，并被具有高启动子活性的表达盒取代，以驱动外源转基因的表达。许多非复制型载体也缺乏E3和E4区域。另一种非复制型腺病毒载体是“辅助依赖性”载体，其大部分基因组缺失但保留了复制起点以及用于包装成病毒所需的约500个碱基对。这些载体在复制型辅助腺病毒的存在下构建和繁殖，所述辅助腺病毒提供所需的早期和晚期蛋白质。辅助腺病毒通常在基因组中包装信号的侧翼有loxP位点。用于产生载体的细胞系有条件地表达Cre重组酶，其中所述Cre重组酶从辅助腺病毒基因组中切除包装信号侧翼的loxP，因此允许优先包装辅助依赖性腺病毒基因组(参见例如McConnell和Imperiale(2004)Human Gene Therapy,1022-1033，和Vorburger和Hunt(2002)The Oncologist,7,46-59)。
当表达囊性纤维化跨膜调控因子时，通过例如鼻内地或通过支气管内导管给药非复制型腺病毒载体，当表达血管内皮生长因子时，通过例如经心肌内或骨骼肌注射给药非复制型腺病毒载体，并且当表达胞嘧啶脱氨酶时，通过例如肿瘤内注射给药非复制型腺病毒载体。
发明内容
本发明人惊奇地发现，腺病毒颗粒可以口服给药。特别地，本发明人已经显示，在葡萄糖依赖性促胰岛素多肽启动子控制下，携带胰岛素的腺病毒颗粒能够在口服给药时降低糖尿病大鼠的葡萄糖水平。不仅腺病毒颗粒成功地递送到肠道，而且令人惊讶的是，颗粒进入细胞并允许治疗性蛋白质表达。发现治疗性蛋白质在外周循环中是可检测的。
因此，本发明提供了将转基因递送至患者体内靶细胞的方法，所述方法包括口服给药包含病毒颗粒的产品，所述病毒颗粒携带转基因。
本发明还提供用于对患者进行口服给药的片剂或胶囊，其包含药物组合物，所述药物组合物包含携带转基因的病毒颗粒。
此外，本发明提供了制备用于对患者进行口服给药的携带转基因的病毒颗粒的方法，所述方法包括：
(a)培养和纯化携带所述转基因的病毒颗粒；
(b)将所述病毒颗粒配制成药物组合物；
(c)可选的干燥所述药物组合物；和
(d)将所述药物组合物包装成片剂或胶囊，用于对患者进行口服给药。
附图说明
图1显示了口服给药腺病毒构建体的体内评估结果，所述腺病毒构建体包含驱动胰岛素原表达或GFP表达的葡萄糖依赖性促胰岛素多肽启动子。所呈现的结果为在给药前(-3天)或给药后(第3,5,8,10和12天，在第1天相应给药)的尾血静脉血浆样品葡萄糖评估。数据是回归调整的平均值(n＝5-6)。从统计模型的残差计算SEM。通过一般线性模型分析数据，其中治疗作为因子，第1天体重和log(第-3天)血浆葡萄糖作为协变量，然后进行Dunnett检验。与载体的显著差异以**p<0.01表示。
图2显示了在Ad5-CMV-BChE载体感染后的细胞培养物(HEK293)上清液中检测到阳性体外丁酰胆碱酯酶酶活性，丁酰硫代胆碱(BTC)碘化物底物，并且基本上不存在无效Ad5-CMV-GFP载体(均未包封)。
图3显示了用尾静脉血(血浆样品)取样(给药日(初始给药)，对给药后第1天和第3天)，对Brown Norway大鼠进行口服给药腺病毒赋形剂配制胶囊的体内评估，其中各自腺病毒赋形剂配制的剂量水平2x10^10vp/胶囊由分光光度法(OD260nm)确定，通过丁酰胆碱酯酶荧光活性试剂盒(K016-F1)测定单个血浆样品(n＝8个受试者)中的BCHe水平，并且在给药后第3天检测到升高的(P<0.01)酶活性水平。
图4显示了在用寨卡病毒攻击后直到感染后3天IFNαβ-/-小鼠体重损失的百分比。与施用安慰剂的小鼠相比，接种疫苗的小鼠显示出较小程度的体重损失(p＝0.0003)。
图5显示了用寨卡病毒攻击后的IFNαβ-/-小鼠的眼内压。相对于施用安慰剂的小鼠，接种疫苗的小鼠受到保护(p＝0.016)。
图6显示了用寨卡病毒攻击后的小鼠的病毒血症。在施用3剂疫苗(VAC)后观察到病毒血症减少。对于安慰剂的结果表示为“PLA”。
图7显示了免疫活性小鼠对疫苗的反应(控制抗体产生)。
图8显示了在先施用2剂量的口服载体胶囊后传染性寨卡病毒攻击的黑羽狨(Callithrix penicillata)的病毒血症减少。
图9显示了寨卡病毒基因组。
具体实施方式
应理解，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的特定需要而定制。还应理解，本文使用的术语仅用于描述本发明的特定实施方案的目的，而不是限制性的。
另外，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一”，“一个”和“所述”包括复数指示物，除非内容另有明确说明。因此，例如，提及“氨基酸序列”包括两个或更多个此类序列等。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论上文或下文，均通过引用整体并入本文。转基因
本发明提供了将转基因递送给患者的方法。特别地，本发明提供了将转基因递送至患者体内靶细胞的方法。该方法包括口服给药携带转基因的病毒颗粒，特别是腺病毒颗粒。
如本文所用，转基因(或异源基因)意指通过遗传操作引入细胞的多核苷酸。转基因可以不是由细胞天然表达的基因。转基因也可以是由细胞天然表达的基因。例如，转基因可以补充蛋白质的天然表达或者可以纠正蛋白质表达中的缺陷。
转基因通常编码治疗性蛋白质。本发明的方法通常是基因治疗方法，其中核酸治疗性地递送到患者的细胞中，然后表达治疗性蛋白质以治疗疾病。治疗性蛋白质可以例如是激素或酶。
使用蛋白质和肽的治疗方法可以基于功能和治疗应用进行分类(参见例如Leader等(2008)Nature Reviews Drug Discovery,7,21-39)。例如，治疗性蛋白质可具有酶活性或调节活性(第1组)。第1组中的治疗剂可以替代异常或缺乏的蛋白质(通常涉及内分泌或新陈代谢紊乱)，增强现有通路(例如血液学和内分泌通路和免疫应答)或提供新的功能或活性。此类蛋白质的实例包括白蛋白、胰岛素、因子VIII、因子IX和抗凝血酶III，酶如胰酶、乳糖酶、β-葡萄糖脑苷脂酶、阿糖苷酶-α拉罗尼酶、艾杜硫酶(idursulphase)、半乳硫酶(galsuphase)、腺苷脱氨酶，和其他蛋白质如促红细胞生成素、阿法达贝泊汀、G-CSF、GM-CSF、白细胞介素11、卵泡刺激素、人绒毛膜促性腺激素和各种干扰素。增强现有途径的治疗剂的实例包括角质形成细胞生长因子、血小板衍生生长因子和胰蛋白酶。提供新功能或活性的蛋白质的实例包括肉毒杆菌毒素、胶原酶、透明质酸酶、木瓜蛋白酶和链激酶。
第2组中的治疗性蛋白质/肽具有特异性靶向活性，并且可以干扰分子或生物体或递送其他化合物或蛋白质。例如，第2组中的蛋白质可以与分子结合并阻断它们的功能，靶向它们以破坏或刺激信号传导通路。实例包括基于药物和Fc融合蛋白的抗体。
在本发明的方法中，治疗性蛋白质可以在第1组或第2组中。换句话说，在本发明中，治疗性蛋白质可以替代异常或缺乏的蛋白质，增强现有通路或提供新的功能或活性。治疗性蛋白质还可具有特异性靶向活性，例如抗体或Fc融合蛋白。
第3组分子保护免受有害外来物质，治疗自身免疫疾病或治疗癌症(蛋白质疫苗)。通常，这些包含来自微生物的抗原成分，例如寨卡病毒或单纯疱疹病毒(Herpes SimplexVirus,HSV)(优选HSV2)，或来自肿瘤的抗原成分。在本发明的方法中，治疗性蛋白质也可以是第3组治疗剂。换句话说，治疗性蛋白质可以是抗原。
在一些情况下，转基因还可以编码诊断剂，例如可以通过外部扫描仪检测的荧光蛋白或蛋白质。
尽管病毒载体优选是基因治疗载体。病毒载体也可以是表达抗原的疫苗载体。
治疗剂，例如当用在基因治疗中时，通常是全长蛋白质。治疗剂还可以是功能变体，修饰形式或序列变体，其保留全长对应物的一种或多种活性(优选所有活性)。
在本发明中，治疗性蛋白质没有特别限制，只要患者能从编码它的核苷酸的口服给药受益，并包括激素和酶。这些蛋白质是本领域技术人员所熟知的，包括例如胰岛素、胰高血糖素拮抗剂、胰高血糖素样肽-1、抵抗素、瘦素、Acrp30，胆囊收缩素、凝血因子(例如因子VIII、IX或X)、生长因子(例如生长激素、胰岛素样生长因子1、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β等)和抗体(例如人的或人源化的)。
编码治疗性蛋白质的其他转基因包括细胞因子、干扰素(例如，干扰素(INF)，INF-α2b和2a，INF-αN1，INF-β1b，INF-γ)、白细胞介素(例如，IL-1至IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF-αTNF-β)、趋化因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、多肽激素、抗菌多肽(如抗菌的，抗真菌的，抗病毒的和/或抗寄生虫的多肽)、酶(例如腺苷脱氨酶)、促性腺激素、趋化素、脂质结合蛋白、非格司亭(filgastim)、血红蛋白、促红细胞生成素、促胰岛素、伊米苷酶、肌氨酸刺激素、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、链激酶、神经突生长因子(NGF)苯丙氨酸氨解酶、脑源神经突因子(BDNF)、神经突生长因子(NGF)、苯丙氨酸解氨酶、血小板生成素(TPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷脱酰胺酶、过氧化氢酶降钙素、内皮素(endothelian)、L-天冬酰胺酶胃蛋白酶、尿酸酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，弹性蛋白酶、羧基肽酶乳糖酶、蔗糖酶内因子、降钙素甲状旁腺激素(PTH)样、荷尔蒙、可溶性CD4，和抗体和/或其抗原结合片段(例如FAb)(例如orthocloneOKT-e(抗CD3),GPIIb/IIa单克隆抗体)。
如上所述，转基因不旨在限制本发明。技术人员可以容易地设想编码治疗性蛋白质的其他转基因。
靶细胞通常是肠道细胞。肠道是体内最大的内分泌器官，能够产生大量的蛋白质，并含有快速更新的组织，其中分裂细胞是可进入的。靶细胞，例如K细胞和干细胞，主要位于上肠中，其易于接受非侵入性基因治疗技术，如口服制剂。因此，以可调节形式分泌蛋白质，如胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、GLP-1、GLP-2、胃饥饿素、胆囊收缩素、生长激素、凝血因子、抗体等的所述肠道细胞(如K细胞)可作为一种在粘膜组织中产生蛋白质来治疗例如糖尿病、肥胖、生长缺陷和其他失调症的手段。
在本发明中，治疗性蛋白质优选为胰岛素。因此，本发明提供了一种治疗糖尿病的方法，包括给有需要的患者口服给药编码胰岛素的腺病毒颗粒。还可以治疗与糖尿病相关的其他继发性失调症或病症，包括肾管钙化、肝脏退化、眼损伤(糖尿病性视网膜病变)、糖尿病足、溃疡、出血过多、伤口愈合延迟、凝血延迟、增加风险的冠心病疾病、中风、血管疾病、血脂异常、高血压和肥胖。
本发明的方法可用于治疗和/或预防疾病或病症(换句话说，本发明的方法可以是治疗性或预防性的)。患者可能已经患有疾病/病症，或者可能有疾病/病症发展的风险。治疗通常导致减少或预防受试者的疾病/病症的严重性或症状。治疗可以防止疾病/病症的恶化或逆转病症/疾病。例如，胰岛素的递送可降低血糖、改善糖耐受性、提供正常的葡萄糖稳态或预防，改善或逆转如上述那些组织病理学变化。
胰岛素的序列可以是任何合适的治疗性胰岛素序列。例如，如果患者是人，则胰岛素可以是治疗性人胰岛素。转基因可以例如编码全长胰岛素的子序列，即具有其全长对应物的一种或多种活性的功能性子序列，所述子序列保留降低葡萄糖，提供正常的葡萄糖稳态或减少与慢性或急性高血糖相关的组织病理学病症的能力。此类序列在本领域中是熟知的。
适用于使用本发明方法给药的治疗性蛋白质的另一个实例是丁酰胆碱酯酶。再次，丁酰胆碱酯酶的序列不受限制，只要其适合于患者的治疗用途(即治疗丁酰胆碱酯酶缺乏症)。
本发明还可用于递送遗传有效载荷，例如基因编辑有效载荷(CRISPR)。
如上所述，在某些情况下，转基因/治疗性蛋白质是抗原(即设计用于刺激宿主中的免疫应答)。因此病毒载体可以是疫苗载体，其表达抗原并保护宿主免受(例如微生物)的攻击，其中抗原源自微生物。抗原不受限制，但通常可以源自病毒。能够刺激免疫应答的抗原是本领域已知的。
抗原可以源自寨卡病毒。如图9所示，寨卡病毒基因组编码各种蛋白质。本发明的疫苗载体可以表达这些蛋白质中的一种或多种。通常，疫苗载体表达包膜蛋白E和/或NS1。包膜蛋白E参与病毒颗粒的直接识别，并且NS1被认为在疾病发病机理中起重要作用。载体可以设计成表达全长抗原序列，或全长序列的抗原区(例如E蛋白的抗原区，或完整的E蛋白)。可以容易地确定这些抗原。在实施例中证明，这些抗原的表达可以在CMV启动子的控制下进行。技术人员可以容易地设计用于表达抗原的试剂盒。
抗原也可以源自单纯疱疹病毒(HSV)，优选源自HSV2。转基因可以编码能够刺激免疫应答的任何合适的HSV抗原。各种HSV抗原是本领域已知的。
例如，糖蛋白D(gD)在病毒表面上表达，并且已知其负责中和抗体活性。其他HSV糖蛋白包括糖蛋白C(gC)和糖蛋白E(gE)。转基因可以编码来自gD，gC和gE(或其组合)中的任何一种(或其组合)的抗原。再次，转基因可编码(即导致表达)(具有本领域技术人员确定的任何适当修饰)全长蛋白质或蛋白质的抗原区域。
转基因可以特别地编码来自gD，gC和gE的所有抗原(在一些情况下，转基因可以编码全部的gD，gC和gE)。例如，转基因可以表达多蛋白。
此类HSV抗原的表达可以在合适的启动子的控制下进行，并且可以包括其他合适的调节序列。由转基因表达的多蛋白可以是可分裂的(在一些情况下，多蛋白可以是可自分裂的)。技术人员可以容易地设计用于表达这种HSV抗原的合适的试剂盒。
病毒颗粒
如下文进一步讨论的，本发明通常使用腺病毒颗粒进行。然而，其他合适的病毒是腺相关病毒、慢病毒和溶瘤病毒，如HSV和牛痘病毒。具有治疗应用的病毒是本领域熟知的。
腺病毒颗粒
本发明的方法通常涉及对患者进行口服给药的腺病毒颗粒。腺病毒已被广泛研究作为感染制剂，作为基础研究的主题，和用于它们在基因治疗和疫苗中的潜在用途。已经鉴定了大量人腺病毒血清型，并且基于核酸比较、纤维蛋白特征和生物学特性将它们分类为六个亚属(A至F)。例如，组A包括血清型12和31，组B包括血清型3和7，组C包括血清型2和5，组D包括血清型8和30，组E包括血清型4，和组F包括血清型40和41。
就一般结构而言，迄今为止所检查的所有腺病毒都是无包膜的，直径约80纳米的正二十面体。腺病毒含有线性双链DNA，其与核心蛋白复合并被腺病毒衣壳包围。单个病毒体含有约11种不同的蛋白质，这些蛋白质由罗马数字(II-XII)表示，按SDS凝胶尺寸减小的顺序排列。
衣壳由七种结构蛋白组成：II(六邻体)、III(五邻体)、IIIa、IV(纤维)、VI、VII和IX。衣壳包含252个壳粒，其中240个是六邻体壳粒，12个是五邻体壳粒。六邻体壳粒是六邻体蛋白的三聚体，占衣壳蛋白的约75％。五邻体壳粒是五邻体蛋白的五聚体，位于病毒粒子的12个顶点的每一个。每个五邻体壳粒与六个相邻的六邻体壳粒和纤维结合。纤维通常是纤维蛋白的三聚体，从五邻体壳粒突出。六邻体蛋白和在较小程度上的纤维蛋白包含腺病毒的主要抗原决定簇，并且还确定血清型特异性。
研究人员已经检查并比较了不同腺病毒血清型的衣壳蛋白(特别是六邻体蛋白)的结构，以努力确定针对引发中和抗体的蛋白质区域。针对中和抗体的六邻体蛋白中的主要区域似乎在环1和2(即分别为L1或l1，和LII或l2)中，其从六邻体壳粒的碱基向外突出。对来自不同腺病毒六邻体蛋白的环1和环2的分析揭示了七个离散的高变区域(HVR1至HVR7)的存在，所述七个离散的高变区域对应于六邻体蛋白在血清型之间显著不同的位置。
腺病毒粒子的核心包含线性双链DNA基因组和相关蛋白V，VII，X(μ)，IVa2和末端蛋白(TP)。不同腺病毒的基因组组织是保守的，并且已经提出具有定时功能(timingfunction)，其中基因组的末端首先被转录(即刻早期基因E1和E4位于线性基因组的相对末端)。E1和E4的早期转录导致基因组中心区域的开放，允许中心区域的转录。
腺病毒基因组通常包含8个RNA聚合酶II转录单元：5个早期单元，E1A，E1B，E2A-E2B，E3和E4；两个延迟的早期单元，IX和IVa2；和主要的晚期转录单元。基于使用可变剪接位点，主要晚期转录单元进一步细分为L1-L5区域。转录单元通常表达具有相似功能的蛋白质。例如，E1A单元编码两种负责在细胞感染时激活转录和诱导S期的蛋白质；E1B转录单元编码两种抑制细胞凋亡的蛋白质；E3转录单元参与逃避免疫反应；和主要的晚期转录单元编码组装衣壳所需的结构蛋白。
为了基因治疗和疫苗接种的目的，已经设计了重组腺病毒载体以编码和表达异源基因和抗原。在这种情况下，Ad2和Ad5血清型已被广泛使用。异源序列已被插入腺病毒基因组中，其包括在早期转录单元中和各种结构蛋白(如六邻体、五邻体和纤维)的编码区中。在许多情况下，腺病毒基因组中(例如，在E1区域中)的缺失已被用于产生复制缺陷型腺病毒载体，其通常被认为对人类受试者给药更安全。
在本发明中，腺病毒可以是适于将转基因递送至靶细胞的任何腺病毒。例如，腺病毒可以是任何血清型，但通常是Ad5。术语“腺病毒载体”是指野生型，突变体和/或重组腺病毒基因组，以及包含这种基因组的腺病毒。腺病毒载体可包含任何腺病毒血清型的全部或部分基因组，以及其组合(即杂合基因组)。
用于本发明的腺病毒载体可以复制型的或非复制型的。这些载体是众所周知的。例如，在非复制型载体中，可以缺失E1区域并用具有驱动异源转基因表达的外源启动子的表达盒替换。通常，E3区域也缺失。缺失E3允许较大插入物插入到E1区域。此类载体可以在合适的细胞系(例如保留和表达E1A和E1B蛋白的HEK 293细胞)中繁殖。后代载体也缺少E4区域，并且一些载体进一步缺少E2区域。E2和E4载体必须在补充E1，E4和E2缺失的细胞系中生长。
载体也可以是辅助依赖性载体，其缺少大部分或全部腺病毒基因但保留顺式作用序列，例如反向末端重复序列以及包装和复制基因组所需的包装序列。这些载体在辅助腺病毒存在下繁殖，其必须从载体储液中除去。再一次，这种系统是本领域众所周知的。
在本发明中，载体通常是非复制型载体(如实施例中所用的E1/E3缺失载体)，但载体也可以是辅助依赖性的或复制型的。复制型载体是众所周知的。技术人员将能够容易地根据预期的应用选择合适的载体系统。
转基因的表达可以通过与适当启动子的可操作连接来驱动。用于本发明的载体可以使用其他合适的表达控制元件，例如增强子和调控因子。增强子广义地定义为顺式作用剂，当其与启动子/基因序列可操作地连接时，将增加该基因序列的转录。增强子可以从比其他表达控制元件(例如启动子)更远离感兴趣序列的位置起作用，并且可以在相对于感兴趣序列定位在任一方向时操作。已经从许多病毒来源(包括腺病毒)鉴定了增强子。
腺病毒载体可以使用高活性启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40大T抗原启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(MLP)、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子或SV40早期启动子。
当需要时，载体也可以使用适当的启动子来启动例如在靶细胞(组织特异性启动子或诱导型启动子)中的转基因的表达。可以选择启动子与设计表达的靶细胞相容。
组织特异性启动子通常在特定细胞类型中是活性的，因为它们被转录激活蛋白或转录的其他调控因子识别，所述转录激活蛋白或转录的其他调节因子对该细胞类型是特异性的。例如，在本发明中，启动子可能能够将转基因的表达靶向肠内的内分泌细胞(“肠内分泌细胞特异性启动子”)。
启动子可响应于从转基因产物的活性产生的刺激而维持转基因产物的转录稳态。
优选通过与葡萄糖依赖性促胰岛素多肽启动子(GIP)的可操作连接来控制转基因的表达，GIP是肠内分泌细胞启动子的具体实例。当将该构建体引入内分泌细胞时，编码的蛋白质将以受调节的方式表达和分泌。先前已经显示GIP启动子靶向胃肠道K细胞中人胰岛素的表达和分泌。最优选地，GIP启动子用于控制胰岛素的表达。
本申请的实施例使用如Biol.Res.(2011)44,301-305中所述的1.2kb大鼠GIP插入物。然而技术人员可以根据应用容易地选择合适的启动子。
用于靶向蛋白质至肠内的内分泌细胞的表达的组织特异性启动子和增强子的其他实例是葡萄糖激酶、嗜铬粒蛋白A和B、胆囊收缩素、胰高血糖素原、腺苷脱氨酶、促胰液素、胃泌素、生长抑素、胃动素和胃饥饿素。组织特异性表达控制元件可以在其他组织中是活性的，但程度远低于在靶组织中。启动子还可以响应营养物或响应撤回营养物而增加或减少可操作连接的核酸的表达。这种营养调节元件也是众所周知的。其他表达控制元件可以是结构型活性的，或者可以在细胞周期的特定阶段赋予表达。
如本文所用，术语“可操作的连接”或其语法变体是指如此描述的组件的物理或功能并置，以允许它们以其预期的方式起作用。在与核酸可操作连接的表达控制元件的实例中，该关系为使得控制元件调节核酸的表达。
包含病毒颗粒的制剂
用赋形剂配制病毒颗粒，赋形剂提供热稳定性。
WO2011/121306公开了能够稳定病毒颗粒以防止由于冷冻、冷冻干燥和解冻引起的损伤的制剂。在长期稳定性测试期间也保留了病毒活性。
在本发明中，病毒颗粒可以配制成组合物，该组合物包含式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯，和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯。可选的包含一种、两种或更多种的糖。通常使病毒颗粒与式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和可选的一种或多种糖在水溶液中接触。然后干燥其中存在病毒颗粒的所得溶液，以形成掺入病毒颗粒的组合物。
因此，病毒颗粒可以与式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和可选的一种或多种糖的水溶液混合。然后干燥所得溶液以形成掺入病毒颗粒的组合物。干燥的组合物可以是块或粉末的形式。如果需要，可以将块研磨成粉末。
在干燥步骤之前将病毒颗粒保存在水溶液中。这允许水溶液在制备后储存，直到可以进行干燥步骤，而不会过度损失病毒活性。
式(I)和(II)化合物可以其生理学上可接受的盐或酯存在。
盐通常是具有生理学上可接受的酸的盐，因此包括与无机酸(如盐酸或硫酸)或有机酸(如柠檬酸、酒石酸、苹果酸、马来酸、扁桃酸、富马酸或甲磺酸)形成的盐。盐酸盐是优选的。
酯通常是C1-6烷基酯，优选C1-4烷基酯。因此，酯可以选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基酯。乙基酯是优选的。
如本文所用，C1-6烷基优选为C1-4烷基。优选的烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。特别优选甲基和乙基。
为避免疑义，式(I)和式(II)化合物的定义还包括化合物，其中羧酸根阴离子被质子化以得到-COOH且铵或锍阳离子与药学上可接受的阴离子缔合。此外，为避免疑义，上述定义的化合物可以以任何互变异构或对映异构形式使用。
式(I)化合物
通常，R1代表氢或C1-6烷基，R4表示氢。通常，R2代表氢或C1-6烷基。优选地，R1代表氢或C1-6烷基，R4代表氢，R2代表氢或C1-6烷基。更优选R1代表氢或C1-6烷基，R4代表氢，R2代表C1-6烷基。
优选地，式(I)化合物是N-C1-6烷基-，N,N-二(C1-6烷基)-或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其生理学上可接受的盐或酯，更优选N,N-二(C1-6烷基)-或N,N,N-三(C1-6烷基)-甘氨酸或其生理学上可接受的盐或酯。烷基通常是C1-4烷基。优选的烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。特别优选甲基和乙基。
优选的式(I)化合物是N-甲基甘氨酸，N,N-二甲基甘氨酸或N,N,N-三甲基甘氨酸或其生理学上可接受的盐或酯。N-甲基-甘氨酸也称为肌氨酸。N,N-二甲基甘氨酸也称为二甲基甘氨酸(DMG)或2-(二甲基氨基)-乙酸。N,N,N-三甲基甘氨酸被称为三甲基甘氨酸(TMG)。最优选的式(I)化合物是DMG。
或者，式(I)化合物通常是式(IA)的甘氨酸衍生物或其生理学上可接受的盐或酯：
其中R5和R6独立地代表C1-6烷基，例如C1-4烷基，如甲基或乙基；R7表示C1-6烷基，例如C1-4烷基，如甲基或乙基，或-(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3。优选的式(IA)化合物是三甲基甘氨酸(TMG)和椰油酰胺丙基甜菜碱(CAPB)或其生理学上可接受的盐或酯。三甲基甘氨酸是优选的。
或者，式(I)化合物通常是式(IB)的脯氨酸衍生物或其生理学上可接受的盐或酯：
其中R8和R9独立地代表C1-6烷基，例如C1-4烷基，如甲基或乙基。优选地，式(IB)化合物是S-脯氨酸衍生物。优选R8和R9均代表甲基；这种化合物被称为脯氨酸甜菜碱。特别优选S-脯氨酸甜菜碱或其生理学上可接受的盐或酯：
式(IA)化合物或其生理学上可接受的盐或酯是优选的。
优选地，式(I)化合物是N,N-二甲基甘氨酸或N,N,N-三甲基甘氨酸或其生理学上可接受的盐或酯。最优选地，式(I)化合物是N,N-二甲基甘氨酸或其生理学上可接受的盐或酯。
式(II)化合物
通常，Rc的羧酸盐取代基和胺取代基与Rc烷基部分的相同碳原子连接。通常Rc是C2-4或C2-3烷基部分。
式(II)化合物通常是式(IIA)的砜化合物或其生理学上可接受的盐或酯：
其中Rc和Rd独立地代表C1-6烷基，例如C1-4烷基。优选的烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔丁基。特别优选甲基和乙基。最优选的砜化合物是甲基磺酰甲烷(MSM)，也称为二甲基砜(DMSO2)。
式(II)化合物可以是式(IIB)化合物或其生理学上可接受的盐或酯：
其中Re和Rf独立地代表C1-6烷基，例如C1-4烷基如甲基或乙基，Rg代表C1-6烷基，例如C1-4烷基如甲基或乙基，被羧酸根阴离子和胺基(-NH2)部分取代。优选羧酸盐取代基和胺取代基与相同的碳原子连接。优选的式(IIB)化合物是S-甲基-L-甲硫氨酸(SMM)或其生理学上可接受的盐或酯。
在本发明中，最优选，式(I)化合物是DMG或其生理学上可接受的盐或酯，和式(II)化合物是MSM或其生理学上可接受的盐或酯。
糖
适用于本发明的糖包括还原糖，如葡萄糖、果糖、甘油醛、乳糖、阿拉伯糖和麦芽糖；并且优选非还原糖，例如蔗糖和棉子糖，更优选蔗糖。糖可以是单糖、二糖、三糖或其他寡糖。术语“糖”包括糖醇。因此，在一个实施方案中，优选使用非还原糖或糖醇。
设想单糖如半乳糖和甘露糖；二糖如蔗糖、乳糖和麦芽糖；三糖如棉子糖；四糖如水苏糖。海藻糖、伞形糖、毛蕊花糖、异麦芽糖、纤维二糖、麦芽酮糖、松二糖、松三糖和蜜二糖也适用于本发明。合适的糖醇是甘露糖醇。当使用甘露糖醇时，可以在冷冻干燥时获得改善外观的块。
糖的存在可以起到改善稳定性的作用。添加糖还可以提供其他益处，例如改变冷冻干燥的块和改善溶解性以更快地重构。通常，当使用冷冻干燥时，存在一种或多种糖。当使用一种糖时，糖优选是蔗糖或甘露糖醇。
当在保存混合物中使用两种或更多种糖时，保持病毒活性特别有效。可以使用两种，三种或四种糖。优选地，水溶液是蔗糖和棉子糖的溶液。蔗糖是葡萄糖和果糖的二糖。棉子糖是由半乳糖、果糖和葡萄糖组成的三糖。
在本发明中，式(I)化合物优选为DMG或其生理学上可接受的盐或酯，式(II)化合物优选为MSM或其生理学上可接受的盐或酯。该组合物优选还包含蔗糖。
含水组合物的其他组分
在本发明中，包含病毒颗粒，可选的一种或多种糖和式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯的水溶液，通常进行干燥。可以使用任何合适的水溶液。溶液可以是缓冲的。溶液可以是HEPES，磷酸盐缓冲的，三羟甲基氨基甲烷缓冲的(Tris-buffered)或纯水溶液。
溶液的pH可以为2至约12，并且可以是缓冲的。溶液可以用HEPES缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷缓冲剂、柠檬酸钠缓冲剂、N-二甘氨酸缓冲剂(即N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲剂)或MOPS缓冲剂(即3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲剂)进行缓冲。溶液可含有或不含NaCl。因此该溶液可以是盐水柠檬酸钠(SSC)缓冲溶液。
通常，病毒颗粒的制剂将与保存混合物混合，即与式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和可选的一种、两种或更多种糖混合。保存混合物本身可以是缓冲的。它可以是HEPES，磷酸盐缓冲的，三羟甲基氨基甲烷缓冲的或纯水溶液。
或者，水溶液通常可由或基本上由病毒颗粒、式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和可选的一种或多种糖组成。
式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和各可选糖的浓度可通过常规实验确定。因此可以选择导致最佳稳定性的优化浓度。式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯可协同作用以改善稳定性。
当糖存在于干燥的水溶液中时，其浓度为至少0.01M，通常达到饱和。通常糖存在时其浓度为至少0.1M，至少0.2M或至少0.5M直至饱和，例如在室温下饱和或达到3M，2.5M或2M。因此糖浓度范围可以为例如0.1M至3M或0.2M至2M。优选存在糖。或者，糖浓度或总糖浓度(如果存在多于一种糖)因此可以为0.08M至3M，0.15M至2M或0.2M至1M。合适的范围为0.05至1M。
当多于一种糖存在时，优选这些糖中的一种是蔗糖。蔗糖可以以0.05M，0.1M，0.25M或0.5M的浓度存在直至饱和，例如，在室温下饱和或达到3M，2.5M或2M。
蔗糖的摩尔浓度相对于其他糖的摩尔浓度的比率通常为1：1至20：1，例如5：1至15：1。在存在两种糖的情况下，特别是当蔗糖和棉子糖存在时，因此蔗糖的摩尔浓度比率通常为1：1至20：1，例如5：1至15：1，优选约10：1。
在用于干燥的水溶液中式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯每种的浓度通常为0.001M至2.5M，并且更特别是从0.01M到2.5M。例如，浓度范围可以为0.1M至2.5M。
或者，例如当式(I)化合物是DMG或盐或酯时，在用于干燥的水溶液中式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯或式(II)化合物或生理学上可接受的盐或酯每种的浓度范围通常为0.1mM至3M或1mM至2M。浓度可以为1mM至1.5M或5mM至1M或0.07M至0.7M。优选的浓度为7mM至1.5M或0.07M至1.2M。另一个进一步优选的范围为0.5至1.5M，特别是当式(I)化合物是N-烷基化甘氨酸衍生物如DMG时。
所用的式(Ⅰ)化合物或其生理学上可接受的盐或酯或式(Ⅱ)化合物或其生理学上可接受的盐或酯的特定浓度取决于几个因素，包括待保存的病毒颗粒的类型；使用的特定化合物；是否存在一种、两种以上的糖和糖的特性；和干燥程序和条件。从而：
-式(II)化合物或式(IIA)化合物(如MSM)或其生理学上可接受的盐或酯的浓度优选为0.2mM至1M，例如0.35mM至1M，3.5mM至0.5M，0.035M至0.5M或0.035M至0.25M，其中所述式(II)化合物中X代表-S(O)2-。
-式(I)化合物或式(IA)或式(IB)化合物(如TMG)或其生理学上可接受的盐或酯的使用浓度优选为0.01M至2M，例如从0.07M到2M，从0.2M到1.5M，从0.23M到1.5M或从0.07M到0.7M。
式(II)化合物或式(IIB)化合物(如S-甲基-L-甲硫氨酸)或其生理学上可接受的盐或酯的浓度优选为0.005M至2M，例如0.007M至2M，0.02M至2M，0.023M至1.5M或0.07M至1M，其中式(II)化合物中X代表-S+(Rc)-。
-当不存在糖时，式(I)化合物(例如N,N-二甲基甘氨酸(DMG))或其生理学上可接受的盐或酯的浓度为5mM至1.5M，或70mM至1.5M或至1.2M，或7mM至1M。更优选的浓度为0.023M至0.7M或1M，或0.07M至0.7M或1M，例如约0.7M
-当存在一种或多种糖时，式(I)化合物(例如N,N-二甲基甘氨酸(DMG))或其生理学上可接受的盐或酯的浓度通常较低且范围为1mM至1M或1.5M，或5mM至1M。更优选的浓度为0.007M至0.7M或1M，例如约0.007M。特别优选的范围是0.5至1.5M。
当存在式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯时，并且优选当存在N-烷基化甘氨酸衍生物或其盐或酯和式(IIA)或(IIC)的砜化合物时，化合物可以以产生协同作用的量存在。例如：
-在用于干燥的水溶液中N-烷基化甘氨酸衍生物或其盐或酯的浓度通常为0.1mM至3M或1mM至2M。浓度可以是1mM至1.5M或5mM至1M。优选的浓度为0.1M至1.5M或0.5M至1.25M。
-在用于干燥的水溶液中的式(IIA)或(IIC)的砜化合物的浓度通常为0.1mM至3M，1mM至2M或0.2mM至1M。浓度可以为0.1M至1.5M或0.5M至1.25M。
该组合物还可包含其他防腐剂，例如本领域熟知的抗氧化剂、润滑剂和粘合剂。
片剂和胶囊
本文所述的药物组合物可以以水性悬浮液或溶液或锭剂的形式给药，但通常以片剂或胶囊形式给药。该组合物也可以作为明胶片给药。片剂可以是包衣的或未包衣的。优选地，将组合物掺入胶囊中，例如明胶胶囊。
药学上相容的粘合剂和/或辅料可以包括在口服制剂中。片剂、胶囊、锭剂等可含有下列任何成分或类似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素，黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如海藻酸，凝胶或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或香料。
胶囊和片剂通常是肠溶衣包衣的。本领域技术人员将能够容易地选择和应用适当的肠溶衣，这取决于使用本领域已知的方法递送的转基因。例如，肠溶衣可以靶向递送至十二指肠。这种包衣的一个实例是实施例中使用的聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸甲酯)1：1共聚物。肠溶衣可具有pH 5.8-6.8的阈值。
将病毒颗粒递送给患者
患者通常是人，但也可以是动物，例如家养的伴侣(例如狗或猫)或家畜(羊、猪、牛)。
施用病毒颗粒可以用于预防或治疗目的。用于治疗受试者的剂量或“有效量”优选是足够将病症的一种、几种或所有症状改善到可测量或可检测的程度，即使预防或抑制疾病或病症，或症状的进展或恶化，是令人满意的结果。给药的剂量和频率将取决于待治疗的病症和所需的结果，并且可由技术人员容易地确定。适当的量将取决于期望的治疗效果，以及个体受试者(例如，受试者的生物利用度、性别、年龄等)。例如，即使完全没有胰岛素注射发生的情况下，受试者中正常葡萄糖稳态的部分恢复可以降低胰岛素注射的频率。
通过测量相关的生理效应可以确定有效量。例如，在糖尿病或其他高血糖症的情况下，可以使用血糖降低或葡萄糖耐量试验的改善来确定胰岛素的量是否对于治疗高血糖症是有效的。在血友病的情况下，有效量是减少受试者的凝血时间或出血发作的频率或持续时间的量。
用于治疗受试者的本发明方法还可以补充其他形式的治疗。补充治疗方法包括药物治疗、饮食改变(低糖，脂肪等)、手术切除、移植，放射治疗方法等。例如，用于治疗高血糖症的本发明方法可以与药物或其他药物制剂组合使用，所述药物或其他药物制剂增加受试者的胰岛素或降低受试者的葡萄糖。用于治疗糖尿病的药物包括例如双胍类和磺酰脲类(例如甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、乙酰己酰胺、妥拉磺胺、格列本脲和格列吡嗪)。食欲抑制药物也是众所周知的，可以与本发明的方法组合使用。补充治疗方法可以在本发明的治疗方法之前，同时或之后施用。技术人员可以容易地确定可以与本发明的治疗方法组合使用在方案中的治疗方法。
本发明还提供了使用本发明的病毒颗粒预防和/或治疗寨卡病毒感染的方法。特别地，病毒颗粒可以用作预防和/或治疗寨卡病毒感染的疫苗。如上所述，此处病毒载体可表达寨卡病毒抗原，所述寨卡病毒抗原优选衍生自包膜蛋白E和/或NS1。
本领域技术人员可以容易地确定寨卡病毒疫苗的剂量和剂量方案。例如，可以以适当的间隔多次(例如两次或三次)施用预防疫苗。这样的间隔可以是每周一次，或者每两周一次。例如，预防性疫苗可以大约每两周(大约14天间隔)施用两次或三次。
制备病毒颗粒的方法
本发明还提供了制备用于对患者进行口服给药的病毒颗粒的方法。该方法通常包括培养和纯化病毒颗粒，将颗粒配制成组合物，可选的干燥组合物，和将组合物包装成胶囊片剂，用于对患者口服给药。
携带转基因的病毒颗粒可使用本领域技术人员熟知的标准技术制备。例如，标准分子生物学技术可用于产生用于表达转基因的遗传构建体。
可以通过用待使用的病毒株感染培养的宿主细胞来制备病毒，使感染进展，使得病毒在培养的细胞中复制并且可以通过本领域已知的用于收获和纯化病毒的标准方法释放。合适的细胞包括人胚肾(HEK)293细胞或HEK 293衍生的细胞克隆体，其适合于所使用的腺病毒类型。可以在导致病毒颗粒产生的任何适当条件下培养细胞。
例如，本申请的实施例使用在HEK293细胞中的病毒培养物，随后通过双氯化铯密度梯度离心纯化，然后柱脱盐(例如PD-10)纯化到赋形剂制剂中。所述赋形剂制剂如上所述。
通常，通过冷冻干燥、真空干燥、流化床干燥或喷雾干燥来实现干燥。冷冻干燥是优选的。通过减少材料中的水并将材料密封在小瓶中，材料可以容易地储存、运输并随后重建成其原始形式。干燥条件可以通过常规实验适当地优化。
在干燥时，形成掺入病毒颗粒的组合物。产生掺入病毒颗粒的基质。该组合物通常是无定形固体。因此通常形成固体基质(通常是无定形固体基质)。“无定形”是指非结构化的并且没有可观察到的规则或重复的分子组织(即非结晶的)。
当糖或多种糖存在时，所述糖或多种糖提供干燥组合物中的无定形基质。式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯分散在糖基质中。因此，式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯被掺入糖基质中。病毒颗粒也掺入糖基质中。因此，干燥过程可以例如通过冷冻干燥实现，以形成无定形块，其中掺入病毒颗粒。
干燥步骤通常在水溶液一制备好就进行或在水溶液制备好之后不久进行。或者，通常在干燥步骤之前储存水溶液。在储存期间水溶液中的病毒颗粒由式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯和可选的一种或多种糖保存。
水溶液或散装中间体溶液通常储存长达5年，例如长达4年、3年、2年或1年。优选地，溶液储存最多6个月，更优选地最多3个月或最多2个月，例如1天至1个月或1天至1周。在干燥之前，通常将溶液储存在冰箱或冷库中。冰箱的温度通常为2至8℃，优选4至6℃，或例如约4℃。冷库的温度通常为-10至-80℃，优选-10至-30℃，例如约-20℃。
溶液通常储存在密封容器中，优选密封的惰性塑料容器，例如袋子或瓶子。容器通常是无菌的。散装中间体溶液的体积通常为0.1至100公升，优选0.5至100公升，例如0.5至50公升，1至20公升或5至10公升。容器的体积通常为0.1至100公升，优选0.5至100公升，例如0.5至50公升，1至20公升或5至10公升。
如果要将储存的散装中间体溶液冷冻干燥，则通常在干燥步骤之前将其倒入冷冻干燥盘中。
冷冻干燥有三个主要阶段，即冷冻、初级干燥和二次干燥。通常使用冷冻干燥机进行冷冻。在该步骤中，重要的是，在简单结晶产物的情况下将生物材料冷却至低于其共晶点(Teu)，或在无定形产物的情况下将生物材料冷却至低于其玻璃化转变温度(Tg')，即低于材料的固相和液相可以共存的最低温度。这确保了在随后的初级干燥阶段中将发生升华而不是熔化。
在初级干燥期间，通过应用适当水平的真空同时供应足够的热量以使水升华来控制压力。在该阶段，材料中至少50％，通常为60-70％的水升华。初级干燥可能是缓慢的，因为太多的热量会使生物材料降解或改变生物材料的结构。冷凝器室和/或冷凝器板提供表面，在所述表面上通过再凝固捕获水蒸气。
在二次干燥过程中，通过进一步加热除去水合作用的水。通常，还降低压力以促进进一步干燥。在完成冷冻干燥过程之后，可以在密封之前用惰性气体如氮气破坏真空，或者可以在真空下密封材料。
在某些实施方案中，使用约1300Pa的真空干燥进行真空干燥。然而，真空干燥对于本发明不是必需的，并且在其他实施方案中，与病毒颗粒接触的保存混合物是旋转的(即旋转干燥)或冷冻干燥。有利地，本发明的方法还包括使含有病毒颗粒的保存混合物经受真空。方便地，在20,000Pa或更低，优选10,000Pa或更低的压力下施加真空。有利地，施加真空至少10小时，优选16小时或更长。如本领域技术人员所知，真空应用的时期将取决于样品的大小、所用的机器和其他参数。
在另一个实施方案中，通过喷雾干燥或喷雾冷冻干燥与本发明的保存混合物混合的病毒颗粒来实现干燥。这些技术对于本领域技术人员来说是公知的，并且涉及通过气体(例如空气、无氧气体或氮气)或在喷雾冷冻干燥的情况下通过液氮干燥液体进料的方法。液体进料雾化成液滴喷雾。然后通过在干燥室中与气体接触或用液氮干燥液滴。
在另一个实施方案中，通过流化床干燥与保存混合物混合的病毒颗粒来实现干燥。该技术对于本领域技术人员来说是公知的，并且通常涉及在受控速度条件下使气体(例如空气)通过产品层以产生流化状态。该技术可涉及颗粒产品材料的干燥、冷却、聚集、造粒和包衣的阶段。可以通过流化气体和/或通过浸没在流化层中的其他加热表面(例如板或管)来提供热量。使用浸入流化层中的冷却气体和/或冷却表面实现冷却。聚集和造粒的步骤是本领域技术人员公知的，并且可以根据要实现的产品性质以各种方式进行。通过在受控条件下将液体喷洒在流化颗粒上，可以实现颗粒产品如粉末，颗粒或片剂的包衣。
因此可以获得具有低残余水分含量的组合物。获得一定水平的残余水分含量，其可在高于冷藏温度，例如在40℃至56℃或更高的温度范围内提供长期保存，或在低于冷藏温度，例如在0至-70℃或更低的范围内提供长期保存。因此，干燥组合物可具有按重量计10％或更低、5％或更低、2％或更低或1％或更低的残余水分含量。残余水分含量优选为0.5％或更多1％或更多。通常干燥组合物具有按重量计0.5至10％，优选1至5％的残余水分含量。
该组合物可以干粉形式获得。由冷冻干燥所得的块可以研磨成粉末形式。因此根据本发明的固体组合物可以采用自由流动颗粒的形式。
在本发明中，粉末可以压缩成片剂形式。片剂如上所述。粉末也可以填充到胶囊中。再次地，胶囊如上所述。
以下实施例说明了本发明。
实施例
实施例1
通过标准分子生物学技术制备两种腺病毒(人腺病毒5型(dE1/E3))构建体。第一种腺病毒携带驱动INS(胰岛素原)表达的GIP(葡萄糖依赖性促胰岛素多肽)启动子(命名为GIP-INS)。使用的序列是如Biol Res 44:301-305,2011和NCBI参考序列(胰岛素原)NM_019129.2/3中所述的1.2kb大鼠GIP插入物。第二种腺病毒携带“无效”eGFP(720bp,Gene.1996；173(1序列号):33-8)构建体(特指GIP-GFP)，其表达增强的绿色荧光蛋白。使用与胰岛素盒相同的启动子系统控制GFP的表达。
通过在HEK293细胞中的病毒培养物制备高滴度腺病毒储液，随后通过双氯化铯密度梯度离心进行纯化，然后柱脱盐(例如PD-10)纯化为以下赋形剂制剂：
-N,N-二甲基甘氨酸(DMG)(0.2M)；
-甲基磺酰甲烷(MSM)(0.2M)；和
-蔗糖(0.4M)。
将最终的赋形剂配制的腺病毒冷冻干燥，将得到的块(cake)用刮刀粉末化，然后装入尺寸为9的猪明胶胶囊(Torpac Inc.NJ,07006)。最后，通过本领域技术人员已知的肠溶衣方法将胶囊包衣，用于靶向递送至十二指肠(聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1：1共聚物)。
口服给药(通过口服强饲)腺病毒赋形剂配制胶囊的体内评估在STZ(35mg/Kg)诱导的高脂肪饲养糖尿病大鼠(Cardiovascular Diabetology 2013 12:136)中进行，在给药前(-3天)和给药后(第3,5,8,10和15天)进行尾静脉血(血浆样品)葡萄糖评估，在第1天给予相应的剂量。结果如图1所示。各自口服给药的腺病毒赋形剂配制的剂量通过HEK293细胞中的TCID50，CPE测定滴定，以量化口服给药的活病毒剂量。这些是：9.6E+07TCID剂量的GIP-INS和1.6+07TCID剂量的GIP-GFP。在图1中，给药的所有大鼠的糖尿病状态通过在约x4正常水平(～7mM)的给药前(-3天)血糖水平来指示。
数据是回归调整的平均值(n＝5-6)。从统计模型的残差计算SEM。通过一般线性模型分析数据，其中治疗作为因子，第1天体重和log(第-3天)血浆葡萄糖作为协变量，然后进行Dunnett检验。与载体的显著差异以**p<0.01表示。
实施例2
通过标准分子生物学技术制备腺病毒(人腺病毒5型(dE1/E3))构建体，其由驱动BChE(丁酰胆碱酯酶)表达的CMV(巨细胞病毒)启动子组成，命名为Ad5-CMV-BChE。NCBI参考序列：-使用丁酰胆碱酯酶NM_022942.1，大鼠物种。
随后，通过在HEK 293细胞中的病毒培养物制备高滴度腺病毒储液，随后通过腺病毒色谱法纯化，最终浓缩成为DMG(0.2M)/MSM(0.2M)/蔗糖(0.4M)赋形剂制剂。将最终赋形剂配制的腺病毒冷冻干燥，将所得块粉末化，然后手工填充到尺寸为9的猪明胶胶囊(Torpac Inc.NJ，07006)中。最后，通过肠溶衣(聚(甲基丙烯酸-共-丙烯酸乙酯)1：1共聚物)将胶囊包衣，用于靶向递送至十二指肠。
在Ad5-CMV-BChE载体感染后的细胞培养物(HEK293)上清液中检测到阳性体外丁酰胆碱酯酶酶活性，丁酰基硫代胆碱(BTC)碘化物底物，并且基本上不存在无效Ad5-CMV-GFP载体(均未包封)。结果如图2所示。
用尾静脉血液(血浆样品)取样(给药日(初始剂量)，给药后第1天和第3天)，对Brown Norway大鼠口服给药腺病毒赋形剂配制胶囊进行体内评估，各腺病毒赋形剂配制剂量水平2×10^10vp/胶囊由分光光度法测定(OD260nm)
通过丁酰胆碱酯酶荧光活性试剂盒(K016-F1)测定单个血浆样品(n＝8个受试者)中的BCHe水平，并且在给药后3天检测到升高的(P<0.01)酶活性水平。结果如图3所示。
实施例3
制备腺病毒(血清型5)构建体(dE1/E3))，其由驱动寨卡抗原(E和NS1)表达的CMV启动子组成，命名为Ad5_FP(E/NS1)_GW。通过在HEK 293细胞中的病毒物培养制备高滴度病毒储液，然后用赋形剂(0.4M蔗糖、0.2M DMG、0.2MSM)配制并冷冻干燥。将得到的块，粉末填充到猪明胶胶囊中，然后进行肠溶衣包衣以增提高降低的GI递送。
在12个IFNαβ-/-小鼠研究中测试该产品(6只小鼠用疫苗处理，6只小鼠用安慰剂处理)。SV129小鼠也作为抗体产生的免疫型对照进行。
在第0,14和28天通过口服强饲对小鼠给药，然后用寨卡病毒(HS-2015-BA-01分离物；第42天在尾静脉内静脉给药4×10 5PFU)进行攻击。测量体重、眼压和脑病毒血症。
图4显示了在病毒攻击后3天施用疫苗和施用安慰剂的小鼠体重损失的百分比(已知IFNαβ-/-小鼠在用寨卡病毒攻击时损失体重)。疫苗提供保护(p＝0.0003)。
图5显示了疫苗接种的小鼠和施用安慰剂的小鼠的病毒攻击对眼内压的影响。疫苗再次提供保护(p＝0.016)
然后，图6显示了脑、视神经和睾丸病毒血症(在第49天记录)。相对于安慰剂对照，通过降低的病毒血症负荷观察到保护效果。
实施例4
在黑装缨球耳朵小猿(Callithrix penicillata)中测试口服寨卡疫苗(2个免疫前对照，2个安慰剂和2个接种疫苗的)。如上制备疫苗制剂并填充到肠溶衣的胶囊中(每剂量2.1×108TCID50疫苗和2.5×108TCID50安慰剂)。在制造后将胶囊在环境温度下储存约1个月。在第0天和第13天胶囊给药两次。
然后用Zika病毒HS-2015-BA-01临床分离物(5x105PFU，在第27天皮下给药(最后一剂疫苗后14天)攻击动物。攻击后在第1,3,6,9,12天进行血液收集和第6,9,12天进行唾液和尿液收集。
图8显示了直至攻击后5天的相对病毒载量。该疫苗赋予相当于先前暴露于寨卡病毒的免疫力。在接种疫苗组或免疫前组中未检测到寨卡病毒(LOD＝4)。因此疫苗在环境储存1个月后是有效的。

Claims (72)

1.一种将转基因递送至患者体内靶细胞的方法，所述方法包括口服给药包含病毒颗粒的产品，所述病毒颗粒携带所述转基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒颗粒是腺病毒颗粒。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述产品还包含肠溶衣。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述转基因编码治疗性蛋白质。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是胰岛素或丁酰胆碱酯酶。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述转基因编码一种或多种抗原。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述转基因编码一种或多种寨卡病毒抗原。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述寨卡病毒抗原衍生自包膜蛋白质(E)和/或NS1。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述转基因编码一种或多种单纯疱疹病毒(HSV)抗原，可选的HSV2抗原。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述HSV抗原衍生自糖蛋白C(gC)，糖蛋白D(gD)和/或糖蛋白E(gE)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转基因的表达由组织特异性启动子控制。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述启动子是葡萄糖依赖性促胰岛素多肽启动子。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是胰岛素，并且所述胰岛素的表达由所述葡萄糖依赖性促胰岛素多肽启动子控制。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述腺病毒颗粒配制成药物组合物，所述药物组合物包含：
(a)病毒颗粒；
(b)可选的一种或多种糖；和
(b)式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯
其中：
R1代表氢或C1-6烷基；和
R4代表氢；或者
R1和R4与它们所连接的原子一起形成吡咯烷环；
R2代表氢，C1-6烷基或-(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3；和
R3代表C1-6烷基；
和/或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯
其中：
X代表–S(O)2-或–S+(Rc)-；
Ra和Rb独立地代表C1-6烷基；和
Rc代表被羧酸根阴离子和胺基(-NH2)部分取代的C1-6烷基。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述水溶液包含式(I)化合物或其生理学上可接受的盐，或式(II)化合物或其生理学上可接受的盐。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中式(I)化合物是N,N-二(C1-6烷基)-，N,N,N-三(C1-6烷基)-，或N-C1-6烷基-甘氨酸或其生理学上可接受的盐或酯。
17.根据权利要求16所述的方法，其中式(I)化合物是(a)N,N-二甲基甘氨酸，N,N,N-三甲基甘氨酸或N-甲基甘氨酸或其生理学上可接受的盐或酯，或(b)N-甲基甘氨酸，N,N-二甲基甘氨酸或N,N,N-三甲基甘氨酸或其盐酸盐。
18.根据权利要求17所述的方法，其中式(I)化合物是N,N-二甲基甘氨酸或其生理学上可接受的盐或酯。
19.根据权利要求14或15所述的方法，其中
式(I)化合物是式(IA)化合物或其生理学上可接受的盐或酯
其中R5和R6独立地代表C1-4烷基，R7代表C1-4烷基或(CH2)2-5NHC(O)(CH2)5-15CH3；
式(I)化合物是式(IB)化合物或其生理学上可接受的盐或酯：
其中R8和R9独立地代表C1-4烷基；
式(II)化合物是式(IIA)化合物或其生理学上可接受的盐或酯：
其中Rc和Rd独立地代表C1-4烷基；或者
式(II)化合物是式(IIB)化合物或其生理学上可接受的盐或酯：
其中Re和Rf独立地代表C1-4；和Rg代表被羧酸根阴离子和胺基部分取代的C1-4烷基。
20.根据权利要求14,15或19中任一项所述的方法，其中式(I)或(II)化合物是二甲基砜，三甲基甘氨酸，椰油酰胺丙基甜菜碱，脯氨酸甜菜碱或S-甲基-L-甲硫氨酸或其生理学上可接受的盐或酯。
21.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中：(a)所述水溶液包含一种或多种糖，式(I)或(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯的浓度为0.1mM至2.5M并且糖浓度或者，如果存在多于一种糖，总糖浓度为至少0.01M，或者(b)式(I)或(II)化合物或其生理学上可接受的盐或酯的浓度为0.1mM至3M。
22.根据权利要求15-20中任一项所述的方法，其中式(I)或(II)化合物或生理学上可接受的盐或酯的浓度为(a)0.001M至2.5M，0.01M至2.5M或0.1M至2M，或(b)7mM至1.5M或0.07M至0.7M，或(c)7mM至1.5M或0.07M至1M，或(d)0.05M至2M，0.02M至2M或0.07M至1M.
23.根据权利要求14所述的方法，其中所述水溶液包含式(I)化合物或其生理学上可接受的盐和式(II)化合物或其生理学上可接受的盐。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述水溶液包含如权利要求13-15中任一项所定义的式(I)化合物或其生理学上可接受的盐和式(II)化合物，所述式(II)化合物是式(IIC)的砜化合物：
其中Ra和Rb独立地代表C1-6烷基。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述水溶液中式(I)化合物或其生理学上可接受的盐的浓度为0.1-1.5M。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中式(IIC)的砜化合物是甲基磺酰甲烷。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述水溶液中式(IIC)的砜化合物的浓度为0.1-1.5M。
28.根据权利要求14-27中任一项所述的方法，其中(a)糖浓度或总糖浓度为0.1M至3M或0.2M至2M，(b)所述溶液包含一种或多种糖，糖浓度，如果存在多于一种糖，或者总糖浓度为至少0.1M，或(c)所述水溶液的糖浓度为0.05至1M。
29.根据权利要求14-28中任一项所述的方法，其中所述组合物包含非还原糖或糖醇。
30.根据权利要求14-29中任一项所述的方法，其中使用两种或更多种糖，并且所述糖中的一种是蔗糖。
31.根据权利要求30所述的方法，其中蔗糖浓度相对于其他糖的比例为1：1至20：1。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中另一种糖是棉子糖。
33.根据权利要求14-31中任一项所述的方法，其中所述组合物包含甘露糖醇。
34.根据权利要求14-29中任一项所述的方法，其中存在一种糖，其为甘露糖醇，或存在两种糖，其为蔗糖和棉子糖。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述水溶液包含蔗糖或甘露糖醇。
36.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物包含0.2M N,N-二甲基甘氨酸，0.2M二甲基砜和0.4M蔗糖。
37.根据权利要求14至36中任一项所述的方法，其中所述组合物是干粉。
38.根据权利要求14至37中任一项所述的方法，其中所述组合物以片剂或胶囊的形式对患者进行给药。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述片剂或胶囊是肠溶衣包衣的。
40.一种用于对患者进行口服给药的片剂或胶囊，包含药物组合物，所述药物组合物包含携带转基因的病毒颗粒。
41.根据权利要求40所述的片剂或胶囊，其中所述病毒是腺病毒。
42.根据权利要求40或41所述的片剂或胶囊，其中所述组合物包含如权利要求14或16至25中任一项所定义的式(I)化合物或其生理学上可接受的盐或酯，和/或如权利要求14,19-24,26或27中任一项所定义的式(II)或其生理学上可接受的盐或酯，和可选的一种或多种糖，优选蔗糖。
43.根据权利要求42所述的片剂或胶囊，其中所述糖是如权利要求28-35中任一项所定义的。
44.根据权利要求40或41所述的片剂或胶囊，其中所述组合物包含0.2M N,N-二甲基甘氨酸，0.2M二甲基砜和0.4M蔗糖。
45.根据权利要求40至44中任一项所述的片剂或胶囊，其中所述转基因编码治疗性蛋白质。
46.根据权利要求45所述的片剂或胶囊，其中所述治疗性蛋白质是胰岛素或丁酰胆碱酯酶。
47.根据权利要求40-45中任一项所述的片剂或胶囊，其中所述转基因编码一种或多种抗原。
48.根据权利要求47所述的片剂或胶囊，其中所述转基因编码一种或多种寨卡病毒抗原。
49.根据权利要求48所述的片剂或胶囊，其中所述转基因编码源自包膜蛋白(E)和/或NS1的一种或多种寨卡病毒抗原。
50.根据权利要求47所述的片剂或胶囊，其中所述转基因编码一种或多种HSV抗原，可选的HSV2抗原。
51.根据权利要求50所述的片剂或胶囊，其中所述转基因编码衍生自糖蛋白C(gC)，糖蛋白D(gD)和/或糖蛋白E(gE)的一种或多种HSV抗原。
52.根据权利要求40至51中任一项所述的片剂或胶囊，其中所述转基因的表达由组织特异性启动子控制。
53.根据权利要求52所述的片剂或胶囊，其中所述启动子是葡萄糖依赖性促胰岛素多肽启动子。
54.根据权利要求53所述的片剂或胶囊，其中所述治疗性蛋白质是胰岛素，并且所述胰岛素的表达由所述葡萄糖依赖性促胰岛素多肽启动子控制。
55.根据权利要求40至54中任一项所述的片剂或胶囊，其中在包装成所述片剂或胶囊之前干燥所述组合物。
56.根据权利要求40-55中任一项所述的片剂或胶囊，其用肠溶衣包衣。
57.一种制备用于对患者进行口服给药的携带转基因的病毒颗粒的方法，所述方法包括：
(a)培养和纯化携带所述转基因的病毒颗粒；
(b)将所述病毒颗粒配制成药物组合物；
(c)可选的干燥所述药物组合物；和
(d)将所述药物组合物包装成片剂或胶囊，用于对患者进行口服给药。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述病毒颗粒是腺病毒颗粒。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中将所述病毒颗粒配制在根据权利要求14-36中任一项所述的组合物中。
60.根据权利要求57,58或59所述的方法，其中所述转基因编码治疗性蛋白质。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是胰岛素或丁酰胆碱酯酶。
62.根据权利要求57-60中任一项所述的方法，其中所述转基因编码一种或多种抗原。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述转基因编码一种或多种寨卡病毒抗原。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述转基因编码源自包膜蛋白(E)和/或NS1的一种或多种寨卡病毒抗原。
65.根据权利要求62所述的方法，其中转基因编码一种或多种HSV抗原，可选的HSV2抗原。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述转基因编码衍生自糖蛋白C(gC)，糖蛋白D(gD)和/或糖蛋白E(gE)的一种或多种HSV抗原。
67.根据权利要求57至66中任一项所述的方法，其中所述转基因的表达由组织特异性启动子控制。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述启动子是葡萄糖依赖性促胰岛素多肽启动子。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是胰岛素，所述胰岛素的表达由所述葡萄糖依赖性促胰岛素多肽启动子控制。
70.根据权利要求57-69中任一项所述的方法，其中所述片剂或胶囊用肠溶衣包衣。
71.一种用于将转基因递送至患者体内靶细胞的方法的包含病毒颗粒的产品，所述方法包括口服给药携带转基因的病毒颗粒。
72.根据权利要求71所述的供使用的产品，其中所述病毒颗粒是腺病毒颗粒。
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