CN108795984A - 一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素的大鼠模型的方法。主要包括腺病毒载体的构建，腺病毒载体转染大鼠小肠的方法。本发明利用腺病毒载体携带大鼠反义mRNA胰岛素基因，通过灌胃大鼠，三个月可以造成大鼠小肠胰岛素降表达，而且能造成该大鼠胰岛素耐量和口服糖耐量降低。这种动物模型，对于进一步开发治疗糖尿病的药物，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于动物模型的建立方法，涉及慢性糖尿病的治疗与预防，更确切地说是一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法。
背景技术
糖尿病作为一种慢性进行性疾病，对人类健康造成巨大威胁，2015年国际糖尿病联合会公布，全世界糖尿病成年患者大约有4.15亿，糖耐量受损者约有3.18亿，其中中国糖尿病患者人数最多，已达到1.1亿。目前全世界面临糖尿病流行这一前所未有的难题，如果不采取相应积极的措施，预计到2040年糖尿病患者将超过6.42亿。然而控制饮食，注射胰岛素及口服降糖药物等传统的治疗方式，均不能有效的治疗。其发病机制不清是该病无法治愈的主要原因。我们利用小动物活体成像，发现除了胰腺部位以外，小肠部位也存在荧光信号，虽然其荧光强度远低于胰腺组织，但显著高于除胰腺外其他组织。我们采用免疫组化法，发现大鼠十二指肠存在胰岛素。我们采用荧光定量PCR的方法，对空腹大鼠肠道、胰腺、进行研究，发现小肠组织中有少量胰岛素mRNA表达，尽管其表达量低于胰腺表达水平，但显著高于心、肺、肝、脑、大肠等多种组织的表达水平。为了进一步研究大鼠小肠分泌胰岛素的生理作用，我们构建了小肠降表达胰岛素的大鼠动物模型。这种动物模型，对于进一步开发治疗糖尿病的药物，具有广泛的应用前景。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供一种建立小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法。本发明公开的技术内容如下：
一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法，其特征在于包括如下的步骤：
（1）腺病毒载体的构建：
大鼠小肠降表达胰岛素的腺病毒载体设计，共设计了两个含大鼠胰岛素反义mRNA载体；
Ins1 Primer:
Forward: cgGGATCCatggccctgttggtgcact
Reverse: cCGGAATTCTTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGctg
BamHI GGATCC
EcoRI GAATTC
Ins2 Primer:
Forward: CGGGATCCatggccctgtggatgcg
Reverse: CCGGAATTCctagttgcagtagttctccagc gaattccgg
BamHI GGATCC
EcoRI GAATTC
（2）腺病毒载体转染大鼠小肠的方法
1）T2DM大鼠模型的建立：
利用随机数字表法，在55只SPF级雄性SD大鼠中，随机取40只作为高脂组剩于15只为对照组；高脂组大鼠高脂喂养4周后，进行胰岛素耐量实验以确定是否诱导出胰岛素抵抗，当确定诱导出胰岛素抵抗之后尾静脉注射STZ（30mg/kg），3天后检测大鼠的随机血糖，随机血糖≥16.7mmol/L即为造模成功；
2）将降表达Ins1和Ins2腺病毒载体灌胃给正常SD大鼠：
从造模成功的大鼠中，挑选血糖、体重较为均一的大鼠进行实验，于注射STZ后第2周进行灌胃腺病毒操作，实验组灌胃抑制小肠分泌胰岛素的腺病毒载体，对照组灌胃空载体，将实验组与对照组灌胃后，以及实验组灌胃前后糖代谢状况进行比较分析；将降表达Ins1和Ins2腺病毒载体，给正常SD大鼠灌胃，同时加入抑制胃酸药物洛赛克，大鼠350g体重每次灌胃的药的剂量31ug，观察大鼠小肠胰岛素降表达模型的糖脂代谢变化。
本发明主要解决了糖尿病患者胰岛素抵抗和糖耐量降低的问题，重点考察了当前糖尿病患者，很难得到治愈的原因在于因自身免疫带来的胰岛素抵抗问题，主要的难点在于，如何能够将携带胰岛素反义mRNA的载体，转染进入小肠上皮细胞。为此先后考察了各种病毒载体等条件，最后确定的方案是，以能够转染动物消化道的腺病毒载体作为外源基因载体，并辅以加入抑制动物胃酸分泌的药物洛赛克同时灌胃，来保证载体不被动物胃酸破坏，顺利进入小肠，转染小肠粘膜上皮细胞。
本发明具有制作方便简单，成本相对便宜，重复性好的优点，模型成功可靠。所得的动物模型可用于进一步开发治疗糖尿病的药物，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为降表达腺病毒载体在细胞中降低表达程度的检测图；
图2为各组大鼠灌胃前后口服糖耐量的改变；
图3为各组大鼠灌胃前后胰岛素耐量的改变。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
1、大鼠小肠降表达胰岛素的腺病毒载体设计，共设计了两个含大鼠胰岛素反义mRNA载体；
Ins1 Primer:
Forward: cgGGATCCatggccctgttggtgcact SEQ ID NO:1
Reverse: cCGGAATTCTTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGctg SEQ ID NO:2
BamHI GGATCC
EcoRI GAATTC
Ins2 Primer:
Forward: CGGGATCCatggccctgtggatgcg SEQ ID NO:3
Reverse: CCGGAATTCctagttgcagtagttctccagc gaattccgg SEQ ID NO:4
BamHI GGATCC
EcoRI GAATTC
2、降表达腺病毒载体在细胞中降低表达程度的检测
在293A细胞中转染腺病毒载体，可以发现转染后1周，细胞出现空斑，释放出腺病毒，如图1所示。
3、T2DM大鼠模型的建立
利用随机数字表法，在55只SPF级雄性SD大鼠中，随机取40只作为高脂组（high-fatdiet group，HFD）剩于15只为对照组（Control group，CON)。高脂组大鼠高脂喂养4周后，进行胰岛素耐量实验以确定是否诱导出胰岛素抵抗，当确定诱导出胰岛素抵抗之后尾静脉注射STZ（30mg/kg）。3天后检测大鼠的随机血糖，随机血糖≥16.7mmol/L即为造模成功。
4、将降表达Ins1和Ins2腺病毒载体灌胃给正常SD大鼠
从造模成功的大鼠中，挑选血糖、体重较为均一的大鼠进行实验。按照随机数字法将其分为实验组和对照组组，每组15只，于注射STZ后第2周进行灌胃腺病毒等操作。实验组灌胃抑制小肠分泌胰岛素的腺病毒载体，对照组灌胃空载体。将实验组与对照组灌胃后，以及实验组灌胃前后糖代谢状况进行比较分析。
将降表达Ins1和Ins2腺病毒载体，给正常SD大鼠灌胃，同时加入抑制胃酸药物洛赛克，用药的剂量：人的剂量是20mg，用PBS配成工作液20mg/ml，按大鼠的体重换算之后，大鼠350g体重每次灌胃的药的剂量31ug。大鼠小肠胰岛素表达量比对照组显著上升。
5、大鼠小肠胰岛素降表达模型的糖脂代谢变化。
结果发现空腹血糖和随机血糖均没有发生显著改变，但胰岛素耐量和口服糖耐量降低，降低了胰岛素抵抗的可能。对血脂总胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸检测发现，仅油脂脂肪酸的水平，较对照组有显著升高。
各组大鼠灌胃前后口服糖耐量的改变（见图2）
各组大鼠灌胃前后胰岛素耐量的改变（见图3）
结论：
利用腺病毒载体携带大鼠反义mRNA胰岛素基因，通过灌胃大鼠，三个月可以造成大鼠小肠胰岛素降表达，而且能造成该大鼠胰岛素耐量和口服糖耐量降低。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津医科大学
<120> 一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgggatccat ggccctgttg gtgcact 27
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccggaattct tagttgcagt agttctccag ctg 33
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgggatccat ggccctgtgg atgcg 25
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccggaattcc tagttgcagt agttctccag cgaattccgg 40
Claims (1)
1.一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法，其特征在于包括如下的步骤:
（1）腺病毒载体的构建：
大鼠小肠降表达胰岛素的腺病毒载体设计，共设计了两个含大鼠胰岛素反义mRNA载体；
Ins1 Primer:
Forward: cgGGATCCatggccctgttggtgcact
Reverse: cCGGAATTCTTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGctg
BamHI GGATCC
EcoRI GAATTC
Ins2 Primer:
Forward: CGGGATCCatggccctgtggatgcg
Reverse: CCGGAATTCctagttgcagtagttctccagc gaattccgg
BamHI GGATCC
EcoRI GAATTC
（2）腺病毒载体转染大鼠小肠的方法
1）T2DM大鼠模型的建立：
利用随机数字表法，在55只SPF级雄性SD大鼠中，随机取40只作为高脂组剩于15只为对照组；高脂组大鼠高脂喂养4周后，进行胰岛素耐量实验以确定是否诱导出胰岛素抵抗，当确定诱导出胰岛素抵抗之后尾静脉注射STZ（30mg/kg），3天后检测大鼠的随机血糖，随机血糖≥16.7mmol/L即为造模成功；
2）将降表达Ins1和Ins2腺病毒载体灌胃给正常SD大鼠：
从造模成功的大鼠中，挑选血糖、体重较为均一的大鼠进行实验，于注射STZ后第2周进行灌胃腺病毒操作，实验组灌胃抑制小肠分泌胰岛素的腺病毒载体，对照组灌胃空载体，将实验组与对照组灌胃后，以及实验组灌胃前后糖代谢状况进行比较分析；将降表达Ins1和Ins2腺病毒载体，给正常SD大鼠灌胃，同时加入抑制胃酸药物洛赛克，大鼠350g体重每次灌胃的药的剂量31ug，观察大鼠小肠胰岛素降表达模型的糖脂代谢变化。
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| CN201810727184.XA CN108795984A (zh) | 2018-07-05 | 2018-07-05 | 一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法 |
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|---|---|---|---|
| CN201810727184.XA CN108795984A (zh) | 2018-07-05 | 2018-07-05 | 一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法 |
Publications (1)
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|---|---|
| CN108795984A true CN108795984A (zh) | 2018-11-13 |
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| CN201810727184.XA Pending CN108795984A (zh) | 2018-07-05 | 2018-07-05 | 一种利用腺病毒载体构建小肠降表达胰岛素大鼠模型的方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN108795984A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110621350A (zh) * | 2017-01-06 | 2019-12-27 | 稳定技术生物制药有限公司 | 病毒 |
-
2018
- 2018-07-05 CN CN201810727184.XA patent/CN108795984A/zh active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MELIS KARACA等: "Transgenic expression of human INS gene in Ins1/Ins2 double knockout mice leads to insulin underproduction and diabetes in some male mice", 《FRONTIERS IN BIOSCIENCE》 * |
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| 甘文学等: "大鼠小肠分泌胰岛素基因水平研究", 《天津医科大学学报》 * |
| 马林: "双调蛋白反义重组腺病毒治疗乳腺癌的实验研究", 《中国肿瘤临床》 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN110621350A (zh) * | 2017-01-06 | 2019-12-27 | 稳定技术生物制药有限公司 | 病毒 |
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