CN103405787B - 一种基于miR-141的分子靶向核酸纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于miR-141的分子靶向核酸纳米药物及其制备方法和应用。本发明应用miR-141首次调控CXCL12β作为IBD的分子治疗新靶点，采用聚乙烯亚胺作为核酸药物的载体制备了过表达miR-141的质粒或miR-141前体或miR-141模拟物的新型分子靶向核酸纳米药物，提高了核酸药物体内的稳定性，在核酸药物的转染效率和细胞靶向输送上取得重要突破。该核酸药物通过原位给药能直接上调小鼠结肠上皮细胞中miR-141水平，从而抑制免疫细胞的大量浸润，最终明显缓解小鼠肠炎症状，为IBD治疗提供一种全新的治疗药物。
Description
一、技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于miR-141的分子靶向核酸纳米药物及其制备方法和应用。
二、背景技术
炎症性肠炎（Inflammatory bowel disease,IBD）是胃肠道一种慢性、易复发的自身免疫性疾病。由于IBD的病因及发病机制尚未完全研究清楚，因此治疗药物也缺少特异性。现有的针对IBD的治疗药物主要包括三大类：氨基水杨酸类制剂、糖皮质类激素和免疫抑制剂，这些传统药物只能通过非特异性地抑制炎症来缓解肠道炎症反应，并不能从根本上来治愈肠道炎症。而IBD的反复发作和难以治愈会极大增加结肠癌变可能，严重威胁患者生命健康，因此亟待需要发展新型的IBD治疗药物。
近年来，微小RNA作为一类新的基因表达调控分子家族而受到广泛的关注，已有研究发现它们可作为重要的药物作用靶点和潜在的核酸药物应用于肝癌疾病的治疗，然而，微小RNA作为IBD治疗的分子核酸药物还没有被研制。本发明通过深入研究IBD的分子机制和生物学功能，发现微小RNA与IBD的发生和发展也密切相关。进一步研究发现一种重要的微小RNA---miR-141能够直接调控趋化因子CXCL12β的表达，影响结肠组织中免疫细胞的迁移从而调控IBD的病程。在此研究基础上，本发明通过miR-141首次调控的CXCL12β作为IBD的分子治疗新靶点，制备了基于miR-141的新型分子靶向核酸纳米药物，为IBD治疗提供一种全新的治疗策略。
三、发明内容
本发明需要解决的问题就是公开了一种有效治疗IBD的基于miR-141的分子靶向核酸纳米药物及其制备方法。
本发明所述一种基于miR-141的核酸纳米药物，是由基于miR-141的核酸药物和聚乙烯亚胺构成的纳米复合物，其中基于miR-141的核酸药物为过表达miR-141的质粒或miR-141前体或miR-141模拟物，聚乙烯亚胺可以为线性结构或分枝状结构，聚乙烯亚胺的分子量不受限制，本次实验中采用的核酸药物载体是分子量为25kDa的线性聚乙烯亚胺（polymine，PEI），但是不应视为对聚乙烯亚胺使用种类的限制。
本项发明中使用的基于miR-141的核酸药物包括：过表达miR-141的质粒或miR-141前体或miR-141模拟物（miR-141mimics）。本次实验中采用的基于miR-141的核酸药物为miR-141前体，但是不应视为对基于miR-141的核酸药物的使用种类的限制。
本发明中，miR-141前体/PEI核酸给药体系采取灌肠原位给药给予合适剂量。该试剂的 有效量是能导致炎症性肠病症状明显降低的剂量。
本发明通过动物体内实验对IBD疗效进行例证。此处的动物包括但是不限于：小鼠，大鼠，驯养动物包括但是不限于猫，狗，以及其它一些动物包括但是不限于牛，羊，猪，马，灵长类动物包括但是不限于猴子和人。小鼠IBD疾病模型是被广泛认可和接受的体内药物活性检测模型，同时也可以为其它生物包括但是不限于人提供参考。
下面的部分用以描述这项发明的内容，但是不应被视作对这项发明的功能范围的限定。
本发明所述的miR-141前体/PEI核酸纳米药物的制备方法：将PEI用生理盐水溶解制得PEI溶液，然后加入适量miR-141前体，搅拌混匀，室温静置，即可制得miR-141前体/PEI核酸纳米药物。
本发明所述的miR-141前体/PEI核酸纳米药物在TNBS肠炎模型治疗中的应用：
（1）BALB/C小鼠禁食24小时，灌肠给入TNBS溶液，
（2）TNBS小鼠模型建立12小时后，将预先制备好的miR-141前体/PEI核酸纳米药物通过灌肠给药方式注入小鼠结肠内，
（3）造模后每天称量小鼠体重，观察小鼠是否腹泻，便血，
（4）模型建立3天后处死小鼠，取结肠做H&E染色，并评分。
本发明所述的miR-141前体/PEI核酸纳米药物在IL-10敲除小鼠慢性肠炎模型治疗中的应用：
（1）IL-10敲除小鼠饲养于普通环境中，从12周到第20周期间每周灌肠给入miR-141前体/PEI复合物核酸纳米药物，
（2）给药后每周观察小鼠状态，粪便性状，小鼠饲养到模型建立第20周时，处死小鼠，眼眶取血，测量血清淀粉样蛋白A（SAA）浓度，作为炎症的衡量指标，同时取结肠切片做H&E染色，并进行评分。
本发明具的有益效果：我们应用聚乙烯亚胺作为核酸药物载体，发展了过表达miR-141的质粒或miR-141前体或miR-141模拟物的核酸药物输送系统，大大提高了核酸药物在体内的稳定性；本发明应用结肠原位核酸输送技术，在核酸的转染效率和结肠上皮细胞的靶向输送上取得重要突破；该核酸纳米药物通过原位给药能直接上调小鼠结肠上皮细胞中miR-141水平，通过特异性的分子靶向对趋化因子CXCL12β的表达进行调控，抑制了免疫细胞的大量浸润，最终明显缓解小鼠肠炎症状。本发明为炎症性肠病开发了一种疗效显著的新药。
四、具体实施方式
1.miR-141前体/PEI核酸纳米药物的制备方法
miR-141前体/PEI核酸纳米药物通过等体积混合4mg/ml的PEI生理盐水溶液和2mg/ml 的miR-141前体生理盐水溶液而制备得到。
2.miR-141前体/PEI核酸纳米药物对TNBS肠炎的治疗作用
按照文献报道方法建立小鼠TNBS肠炎模型，即取雌性BALB/C小鼠50只，体重16-18g，将小鼠随机分为5组，正常对照组，TNBS模型组，miR-141前体/PEI复合物组，错配miR-141前体/PEI复合物组，PEI组；BALB/C小鼠禁食24小时，使用乙醚麻醉，缓慢注入总体积为100μl的TNBS溶液，其中TNBS溶液是用3mg的TNBS溶于1ml的50%的乙醇溶液，正常对照小鼠灌入100μl的50%乙醇溶液；模型建立12小时后，miR-141前体/PEI复合物组的小鼠原位灌肠miR-141前体/PEI复合物，给药体积为100μl（含有100μg miR-141前体）。错配miR-141前体/PEI复合物组的小鼠给入等量的错配miR-141前体，PEI组的给入等量的PEI，模型组不做任何处理。
（1）疾病活动度（DAI）评分
给药后每天观察小鼠毛发状况，粪便性状，称量小鼠体重，并详细记录，共计三天，DAI评分标准如下表。
表1DAI积分计分法
DAI评分=（体重丢失积分+粪便连续积分+隐血肉眼血积分）/3
（2）结肠HE病理切片评分
模型建立后3天处死动物，取小鼠结肠，4％甲醛固定12时，包埋切片，H&E染色，显微镜观察其病理变化，并进行评分，评分标准如下。
表2小鼠结肠HE病理切片评分标准：
TNBS灌肠造模后，小鼠出现明显腹泻，体重降低，便血等症状，DAI评分可以综合上述指标评价小鼠结肠炎的疾病严重程度，如表3所示，TNBS模型小鼠的DAI评分远高于正常健康小鼠，而miR-141前体/PEI复合物治疗能有效缓解肠炎症状，降低DAI评分，此外PEI和错配miR-141前体/PEI复合物处理对DAI评分没有影响，如表3所示，通过组织学评分可以发现miR-141前体/PEI复合物治疗组中的组织学评分显著低于TNBS模型组，而PEI或错配miR-141前体/PEI复合物单独处理对结肠的病理学评分并无影响，由此可见miR-141前体/PEI复合物治疗可以有效缓解TNBS诱导的肠道炎症。
表3miR-141前体/PEI复合物治疗TNBS肠炎模型小鼠疗效
数据均以平均值±标准差的形式加以显示，显著性差异通过ANOVA检验加以确定。
*代表P≤0.05
3.miR-141前体/PEI核酸纳米药物在IL-10敲除小鼠慢性肠炎中应用
按照文献报道方法建立IL-10敲除小鼠肠炎模型，即取雌性C3He野生型小鼠作为正常对照组，取雌性C3He背景IL-10敲除小鼠40只，体重16-18g，将小鼠随机分为4组，分别为模型组，miR-141前体/PEI复合物组，错配miR-141前体/PEI复合物组，PEI组；IL-10敲除小鼠从12周到第20周期间给药，每周给药一次，miR-141前体/PEI复合物组灌肠给入miR-141 前体/PEI复合物，给药体积为100μl（含有100μg miR-141前体）；错配miR-141前体/PEI复合物组给入等量的错配miR-141前体，PEI组给入等量的PEI，模型组不做处理。
给药后每周观察小鼠状态，粪便性状，小鼠饲养到模型建立第20周时，处死小鼠，眼眶取血，测量血清淀粉样蛋白A浓度（SAA），作为炎症的衡量指标；同时取小鼠结肠，4％甲醛固定12小时，包埋切片，H&E染色，显微镜观察其病理变化，并进行评分，评分标准同实施例2中的表2。
表4miR-141前体/PEI复合物治疗IL-10敲除小鼠肠炎疗效
数据均以平均值±标准差的形式加以显示，显著性差异通过ANOVA检验加以确定。
*代表P≤0.05
本发明分别测定了各组小鼠血清中的SAA的含量，如表4所示，IL-10敲除小鼠血清中的SAA含量相对于正常健康小鼠显著升高，说明IL-10敲除小鼠体内存在较严重的炎症，而miR-141前体/PEI复合物治疗显著降低了SAA浓度，表明复合物治疗可以有效抑制了IL-10敲除小鼠体内的炎症发作，而PEI或者PEI+错配的miR-141前体处理对血清中SAA的浓度并无影响，结肠病理学评分同样证实miR-141前体/PEI复合物可以显著降低IL-10敲除小鼠结肠组织的病理程度。
Claims (1)
1.一种基于miR-141和聚乙烯亚胺的分子靶向核酸纳米药物在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。
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