CN107158022A - 一种特异性抑制MIF的shRNA药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种特异性抑制巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的shRNA药物及其应用。本发明所述特异性抑制巨噬细胞移动抑制因子MIF的药物是由一种抑制MIF表达的核酸药物和阳离子聚合物聚乙烯亚胺PEI构成的纳米复合物。通过酶联免疫吸附(ELISA)和免疫组化(IHC)检测发现MIF在骨肉瘤患者血清和组织中显著升高。进一步研究发现，MIF在组织中的表达与骨肉瘤患者的生存率相关。可抑制MIF表达的shRNA表达质粒能显著抑制骨肉瘤细胞的增殖，同时，shRNA药物还能够明显抑制小鼠骨肉瘤模型中肿瘤的生长以及肿瘤的肺转移程度。本发明为骨肉瘤临床治疗提供了一种全新的治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种特异性抑制巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的shRNA药物及其应用。
背景技术
骨肉瘤是一种常见的原发性骨肿瘤，多发于青少年，主要表现为腿部肿块、疼痛及运动障碍。骨肉瘤发病率很低，但恶性程度高，易发生肺转移，严重危害青少年健康。初诊未转移的患者，5年生存率在40％至75％之间。20％的患者在初次诊断时就已发生肺转移，其5年生存率不及30％。
骨肉瘤的诊断方法主要包括断层扫描(CT)和核磁共振(MRI)放射性检查以及通过组织切片进行病理学评价。借助现有的方法做出诊断时，大部分骨肉瘤患者已出现微小转移灶，严重影响了患者的及时治疗。尽管临床上放化疗结合法的普遍采用提高了骨肉瘤患者的生存率，但是，放化疗法存在药物耐受和副作用大等缺点，骨肉瘤的复发和肺转移仍是导致骨肉瘤预后差的主要因素。为了解决现有骨肉瘤临床诊疗中的难题，探索便捷有效的关键生物分子用于骨肉瘤的早期诊断和精准治疗具有重要的临床意义。
RNAi(RNA interference，RNA干扰)是一种转录后基因沉默技术，可以在哺乳动物细胞中特异有效的抑制基因的表达。Brummelkamp等人发现将 shRNA的表达载体转染哺乳动物细胞中可以转录出shRNA并能够特异抑制目标基因的表达。合成RNA成本高，易降解，使用shRNA表达质粒来实现目的基因的沉默在抗肿瘤治疗和相关基因功能研究中得到了广泛的应用。近年来， RNA干扰在治疗一些肿瘤和病毒性感染疾病方面取得了进展，但是目前还没有发现有效的shRNA作为骨肉瘤的治疗药物。
作为一个多向性的细胞因子，巨噬细胞移动抑制因子(MIF)可由肿瘤细胞、免疫细胞、内分泌细胞和上皮细胞等分泌。MIF不仅是固有免疫的重要效应器，而且也能够促进肺癌、肝癌等肿瘤的发展和恶化。我们首次发现在骨肉瘤病人血清和组织中MIF具有显著差异表达变化，表明MIF可以作为骨肉瘤的治疗靶点。我们进一步研发了特异性干扰MIF的shRNA药物，发现其能够明显抑制骨肉瘤的生长和转移。上述结果表明以MIF为靶点的shRNA药物对于骨肉瘤的临床治疗具有重要的应用价值。
发明内容
本发明需要解决的问题是为骨肉瘤开发了一种疗效显著的shRNA药物，对骨肉瘤的临床治疗具有重要的应用价值，本发明公开了一种特异性干扰抑制 MIF表达，能够有效治疗骨肉瘤的shRNA药物。
下面部分描述了这项发明的内容，但是不应该被视作对这项发明的功能范围的限定。
本发明所述特异性抑制巨噬细胞移动抑制因子MIF的药物是由一种抑制 MIF表达的核酸药物和阳离子聚合物聚乙烯亚胺PEI构成的纳米复合物。本发明通过酶联免疫检测法检测骨肉瘤患者血清样本中MIF的表达水平，发现骨肉瘤患者血清样本中MIF的表达水平不仅显著高于健康志愿者，而且还与骨肉瘤患者的Enneking分期和肿瘤大小密切相关。此外，本发明采用免疫组化法检测骨肉瘤患者的组织样本，发现骨肉瘤患者组织样本中MIF的表达水平显著高于癌旁组织。通过骨肉瘤患者术后的3年随访，发现MIF高表达的骨肉瘤患者 (占总病例63.3％)，其3年生存率(68.42％)明显低于MIF低表达的骨肉瘤患者(95.45％)。本发明所述的MIF可作为治疗靶点应用于制备治疗骨肉瘤的药物。
本发明中使用的基于抑制MIF表达的核酸药物包括但是不限于：可抑制 MIF表达的shRNA表达质粒或可抑制MIF表达的shRNA病毒表达载体或化学合成的可抑制MIF表达的shRNA/siRNA片段或化学合成的反义寡聚核苷酸。本次实验中采用的核酸药物为一种特异性干扰抑制MIF表达的shRNA表达质粒，但是不应视为对MIF表达抑制的核酸药物使用种类的限制。
本发明中特异性干扰抑制MIF的shRNA表达质粒药物采用瘤内给药的方式给予合适剂量。该试剂的有效量是能导致骨肉瘤症状明显缓解的剂量。
本发明通过将特异性干扰抑制MIF的shRNA表达质粒与聚乙烯亚胺阳离子聚合物(PEI)制备成核酸药物制剂进行瘤内给药，但是不应视为对干扰MIF 的shRNA药物的载体种类的限制，其中涉及的PEI的结构和分子量不受限制。
本发明所述的特异性干扰抑制MIF的shRNA表达质粒和聚乙烯亚胺(PEI) 进行核酸药物制剂的制备方法是：将浓度为2mg/ml的shRNA表达质粒溶液与等体积的4mg/ml PEI生理盐水溶液混匀，室温静置30分钟即可制得shRNA表达质粒/PEI核酸药物制剂。
本发明通过动物体内实验对骨肉瘤疗效进行例证。此处的动物包括但是不限于：小鼠，大鼠，驯养动物包括但是不限于猫，狗，以及其它一些动物包括但是不限于牛，羊，猪，马，灵长类动物包括但是不限于猴子和人。裸鼠腋下植瘤的肿瘤模型是被广泛认可和接受的体内药物活性检测模型，同时也可以为其它生物包括但是不局限人提供参考。
本发明的有益效果是：首次发现了骨肉瘤患者中巨噬细胞移动抑制因子 (MIF)的高表达与骨肉瘤患者的发病程度及其术后生存率密切相关，为骨肉瘤的治疗提供了一种新的作用靶点。我们进一步设计和制备特异性干扰抑制 MIF的shRNA药物，该药物通过瘤内给药的方式能直接下调裸鼠骨肉瘤中MIF 的水平，明显缓解小鼠骨肉瘤的生长和肺转移症状。本发明为骨肉瘤开发了一种疗效显著的shRNA药物，对骨肉瘤的临床治疗具有重要的应用价值。
附图说明
图1Kaplan-Meier法分析骨肉瘤患者组织中MIF表达水平与患者生存率的关系
图2特异性干扰抑制MIF的shRNA(shRNA-MIF组)对骨肉瘤细胞生长有明显的抑制作用
图3特异性干扰抑制MIF的shRNA药物(shRNA-MIF组)明显地抑制小鼠骨肉瘤的生长
图4为小鼠骨肉瘤模型中肺组织HE染色照片，shRNA-MIF组能显著地抑制肿瘤向肺组织的转移
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1.样本和材料来源
收集南京军区南京总医院2008年至2012年的术中骨肉瘤组织样本和相应癌旁组织样本各60例。其中男性40例，女性20例。骨肉瘤临床分期参照Enneking分期法：ⅡB期58例、Ⅲ期2例；组织学分型参照Dahlin标准：成骨型36例，其他24例。选取距肿瘤组织边缘大于5厘米的相应的癌旁组织作为对照。术后随访率为100％，随访时间为10-36个月。入院即存在肺转移者4例，治疗期间发生肺转移者14例，死亡13例，死亡原因均为肺部多发转移导致呼吸循环衰竭。
35例血清样本取自上述60例骨肉瘤患者首次入院治疗前的血样。其中，男性23例，女性12例，其他相关临床病理参数见表1。35名志愿者来源于 2010年至2012年献血的健康志愿者。所有血样经离心后保留血清，在检测前保存于-70℃度冰箱。
BALB/c裸鼠(16-18g)，购自北京军事医学院动物中心。人骨肉瘤细胞系143B购自上海细胞研究院细胞资源中心。细胞培养试剂和转染试剂以及shRNA的表达质粒等相关试剂均购自美国Life Technology公司；酶联免疫检测和免疫组化相关试剂购自Abcam公司；聚乙烯亚胺(PEI)购自 Sigma-Aldrich有限公司；CCK8试剂盒购自日本Dojindo公司。
2.酶联免疫吸附法(ELISA)检测骨肉瘤患者血清中MIF水平
使用酶联免疫检测方法(ELISA)检测35例骨肉瘤患者和35例健康人群血清中的MIF水平，结果显示35例骨肉瘤患者首次入院时血清MIF水平为1.521±0.520ng/mL,明显高于35例健康对照人群组的1.149±0.284ng/mL (p<0.05)。使用χ2检验分析发现血清中MIF的表达水平与骨肉瘤患者的Enneking分期和肿瘤的大小密切相关(见表一)。
3.免疫组化法(IHC)检测骨肉瘤患者组织中MIF的水平及其与骨肉瘤患者预后的关系
所有骨肉瘤患者组织和癌旁组织经过HE染色分析后，进一步使用免疫组化方法(IHC)检测骨肉瘤患者中MIF的表达水平。采用双盲法进行MIF 抗体染色分析。在400倍光镜下随机选择5-10个视野，计数100-200个癌细胞，计算细胞中MIF抗体染色的阳性率。阳性细胞占比少于20％的组织为 MIF低表达，多于20％的为MIF高表达。实验结果显示，60例骨肉瘤组织中38例(63.3％)MIF呈高表达，22例(36.7％)呈低表达，组间差异具有统计学意义(p<0.01)。使用χ2检验分析发现骨肉瘤患者组织中MIF的表达水平与其肿瘤大小密切相关。使用Kaplan-Meier法分析骨肉瘤患者组织中 MIF表达水平与其生存率有关。如图1所示，MIF高表达的骨肉瘤患者3年生存率为68.42％，明显少于MIF低表达的骨肉瘤患者95.45％的3年生存率。
4.抑制MIF的shRNA表达质粒影响骨肉瘤细胞的增殖
我们将特异性干扰抑制MIF的shRNA序列5’-CAGCUUGCUGUAGGAGCGGGUUUUGGCCACUGACUGACCCGCUCCU ACAGCAAGCUG-3’构建到shRNA的表达质粒载体中。将该shRNA的表达质粒500ng与5μl Lipofectamine 2000混匀，在室温静置20分钟后，对6 孔板中的143B骨肉瘤细胞进行转染，6小时后换正常培养液培养。将5000 个经过转染处理的细胞接种到96孔板中，分别在12,24,36,48,60和72小时使用CCK8试剂检测细胞的增殖水平。如图2所示，相比于空载表达质粒 (shRNA-NC)，转染了干扰抑制MIF的shRNA表达质粒后(shRNA- MIF)，骨肉瘤细胞的增殖速度显著下降。
5.抑制MIF的shRNA药物制剂对于裸鼠骨肉瘤的治疗作用
按照文献报道方法建立裸鼠的骨肉瘤异位模型，即取BALB/c裸鼠20只，将培养的人骨肉瘤细胞143B用胰酶消化计数，接种于裸鼠左前肢腋下，每只裸鼠接种细胞量为107个(100μl)，在细胞接种至9天后，将20只小鼠随机分为2组进行治疗实验。分别将浓度为2mg/ml的shRNA表达质粒与等体积的4 mg/ml PEI溶液混匀，在室温静置30分钟后每只裸鼠瘤内注射100μl，每隔3天给药，给药5次后，处死小鼠，分离肿瘤进行拍照，结果如图3所示，相比于空载质粒组(shRNA-NC)，药物治疗组(shRNA-MIF)的瘤内给药能明显抑制肿瘤的生长。此外，我们进一步按照文献报道方法建立裸鼠骨肉瘤原位模型，即取BALB/c裸鼠20只，使用腹腔注射戊巴比妥钠的方法麻醉裸鼠后，在外科手术显微镜下进行手术操作。用手术剪在裸鼠右后肢胫骨上端做0.5厘米左右的纵切口，剪开皮肤和筋膜，充分暴露胫骨上端。用微量注射器针头插入裸鼠胫骨腔内，吸出少量骨髓液以减少髓腔压力，将50μl细胞悬液(约5×106个细胞/只)缓慢注入裸鼠胫骨腔，之后使用骨蜡密封切口，最后缝合皮肤，涂抹红霉素软膏，整个操作过程均在超净工作台中完成。在细胞接种至9天后，将20 只小鼠随机分为2组进行治疗实验。分别将浓度为2mg/ml的shRNA的表达质粒等体积的4mg/ml PEI溶液混匀，在室温静置30分钟后每只裸鼠瘤内注射 100μl，每隔5天给药，给药5次后，处死小鼠，分离肿瘤进行拍照，取肺组织进行组织切片和HE染色分析。如图4所示，相比于空载质粒组(shRNA-NC)，药物治疗组(shRNA-MIF)通过瘤内给药能明显抑制骨肉瘤的肺部转移程度。上述结果表明我们设计制备的特异性干扰抑制MIF的shRNA药物具有显著的骨肉瘤治疗效果。
表1 MIF在血清和组织中的表达水平及其与骨肉瘤患者相关病理参数的关系
。
Claims (5)
1.一种特异性抑制巨噬细胞移动抑制因子MIF的药物，其特征是由一种抑制MIF表达的核酸药物和阳离子聚合物聚乙烯亚胺PEI构成的纳米复合物。
2.根据权利要求1所述特异性抑制巨噬细胞移动抑制因子的药物，其特征是抑制MIF表达的核酸药物为可抑制MIF表达的shRNA表达质粒或shRNA病毒载体或化学合成的shRNA/siRNA片段或化学合成的反义寡聚核苷酸。
3.根据权利要求1所述特异性抑制巨噬细胞移动抑制因子的药物，其特征是将特异性抑制MIF的核酸药物与聚乙烯亚胺PEI作为载体制备成为核酸药物制剂，但是不应视为对抑制MIF的核酸药物的载体种类的限制，其中涉及的PEI的结构和分子量不受限制。
4.根据权利要求1所述特异性抑制巨噬细胞移动抑制因子的药物的制备方法，其特征是将浓度为2mg/ml的shRNA表达质粒溶液与等体积的4mg/mlPEI生理盐水溶液混匀，室温静置30分钟即可制得shRNA表达质粒/PEI核酸药物制剂。
5.根据权利要求1所述特异性抑制巨噬细胞移动抑制因子在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。
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