CN111588710B - 一种针对egfr耐药突变c797s的联用药物及用途 - Google Patents

一种针对egfr耐药突变c797s的联用药物及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种针对EGFR耐药突变C797S的联用药物及用途，该联用药物包含：分子伴侣介导的自噬诱导剂，以及第三代或/和第四代EGFR‑TKI，该分子伴侣介导的自噬诱导剂包含：二甲双胍、FLT3抑制剂和MEK5抑制剂中的任意一种或两种以上。本发明的采用metformin和第三代或第四代EGFR‑TKI联合，能够杀伤三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞，降低了第三代或第四代EGFR‑TKI对肺癌细胞的EC50。

Description

一种针对EGFR耐药突变C797S的联用药物及用途
技术领域
本发明涉及一种联用药物组合物，具体涉及一种针对EGFR耐药突变C797S的联用药物及用途。
背景技术
分子伴侣介导自噬(chaperone mediated autophagy,CMA)是一种具有选择性的重要的溶酶体自噬相关蛋白质水解途径之一，分子伴侣介导自噬的分子机制以及其在肿瘤及疾病发展中所扮演的角色成为关注重点。因此，筛选分子伴侣介导自噬的安全有效的诱导剂可能是抑制肿瘤，缓解疾病的重要治疗策略。例如，奎扎替尼(Quizartinib，AC220)是第二代FLT3(Fms-like tyrosine kinase，FMS样的酪氨酸激酶3)抑制剂，FLT3属于III型受体酪氨酸激酶(receptortyrosine kinase III,RTK III)家族成员，奎扎替尼和spautin-1(自噬抑制剂)联用可以诱导分子伴侣介导自噬，但是由于对细胞有很大的毒性，并不能在临床中使用。
肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)约占所有肺癌病例的85％，而EGFR(epidermal growthfactorreceptor，表皮生长因子受体)突变在非小细胞肺癌中约占60％。因此，EGFR在非小细胞肺癌的发生和发展过程中起重要的作用，以EGFR为靶向的药物在特定的非小细胞肺癌患者中取得了显著的疗效。
现有的以EGFR为靶点的靶向药主要分为三代：
(1)第一代EGFR-TKI(表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂)，如erotinib(埃罗替尼)，拉开了治疗序幕。第一代EGFR-TKI是可逆性的酪氨酸激酶抑制剂，EGFR基因突变阳性的肺癌患者可以获得约10个月的中位生存期，但最终会发生获得性耐药，其耐药主要是由于发生在EGFR基因20号外显子的T790M突变，这一突变促使临床药物研发机构寻找更有效的EGFR-TKI药物；
(2)第二代EGFR-TKI，在克服T790M耐药性上的效果不尽如人意；
(3)第三代EGFR-TKI，以奥希替尼(AZD9291)为代表，可以高度选择性、有效对抗EGFR-TKI获得性T790M耐药，可解决大约60％的EGFR靶向药物耐药问题。
但是，随着第三代EGFR-TKI的使用，临床中的病人同样会产生耐药性，这一耐药性的产生主要是由于EGFR C797S突变，现有技术中有使用metformin(二甲双胍)与一代或二代EGFR-TKI联用的案例，无法克服C797S突变的耐药性。此外，三代EGFR抑制剂和PD-1抗体的联用案例，副作用很大，以失败告终。因此目前针对该突变还没有有效的解决办法。
发明内容
本发明的目的是提供一种针对EGFR耐药突变C797S的联用药物及用途，该联用药物解决了目前尚未有针对EGFR-TKI耐药性突变C797S药物的问题，能够对耐药性突变C797S、L858R和T790M的细胞均起到抑制生长的作用，能够作为治疗肿瘤的药物，尤其针对非小细胞肺癌。
为了达到上述目的，本发明提供了一种针对EGFR耐药突变C797S的联用药物，该联用药物包含：分子伴侣介导的自噬诱导剂，以及第三代或/和第四代EGFR-TKI，该分子伴侣介导的自噬诱导剂包含：二甲双胍、FLT3抑制剂和MEK5抑制剂中的任意一种或两种以上。
优选地，所述第三代EGFR-TKI包含：奥希替尼。
优选地，所述第四代EGFR-TKI包含：ES-072。
优选地，所述FLT3抑制剂包含：SGI-1776，Rebastinib和AC220中任意一种或两种以上；所述MEK5抑制剂包含：BIX 02189。
本发明还提供了一种联用药物的用途，该联用药物为所述的针对EGFR耐药突变C797S的联用药物，该联用药物用于作为治疗肿瘤的药物，该肿瘤包含EGFR耐药突变C797S的肿瘤。
优选地，所述的肿瘤包括：非小细胞肺癌。
优选地，所述的第三代和第四代EGFR-TKI均通过口服给药。
优选地，所述的二甲双胍通过口服给药。二甲双胍通过每天喝水的方式以口服给药。
本发明还提供了一种二甲双胍的用途，二甲双胍作为分子伴侣介导的自噬诱导剂。
本发明还提供了一种ES-072的用途，ES-072用于作为克服EGFR耐药突变C797S的药物。
本发明还提供了一种FLT3抑制剂的用途，FLT3抑制剂与第三代或第四代EGFR-TKI联用作为治疗肿瘤的药物，该肿瘤包含EGFR耐药突变C797S的肿瘤。
优选地，所述第三代EGFR-TKI包含：奥希替尼；所述第四代EGFR-TKI包含：ES-072。
优选地，所述FLT3抑制剂包含：SGI-1776，Rebastinib和AC220中任意一种或两种以上。
本发明还提供了一种MEK5抑制剂的用途，MEK5抑制剂与第三代或第四代EGFR-TKI联用作为治疗肿瘤的药物，该肿瘤包含EGFR耐药突变C797S的肿瘤，该MEK5抑制剂包含：BIX02189。
优选地，所述第三代EGFR-TKI包含：奥希替尼；所述第四代EGFR-TKI包含：ES-072。
本发明的针对EGFR耐药突变C797S的联用药物及用途，解决了目前尚未有针对EGFR-TKI耐药性突变C797S药物的问题，具有以下优点：
本发明的采用分子伴侣介导的自噬诱导剂和第三代或第四代EGFR-TKI联合，能够杀伤三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞，降低了第三代或第四代EGFR-TKI对肺癌细胞的EC50。ES072和metformin联用，对肺癌细胞杀伤与用药浓度有关，metformin的浓度为20mM，EC50为0.94μM，metformin的浓度为40mM，EC50为0.006966μM；AZD9291(奥希替尼)与metformin联用，metformin的浓度为20mM，EC50为0.49μM，metformin的浓度为40mM，EC50为0.012μM。
附图说明
图1为spautin-1和AC220联用对分子伴侣介导自噬影响的荧光图。
图2为spautin-1和AC220联用对分子伴侣介导自噬影响的统计图。
图3为spautin-1和AC220联用后流式细胞仪分析荧光通道荧光量图。
图4为spautin-1和AC220联用后流式细胞仪分析荧光统计图。
图5为metformin处理后Westernblotting图。
图6为20mM metformin不同处理时间下细胞的western blotting图(A1为对293THK细胞，A2为对H1975细胞，A3为对H4细胞)。
图7为metformin与MG132、E64D、氯化铵和Leupeptin处理细胞的Westernblotting图(B1为对H4细胞，B2为对H1975细胞)。
图8为metformin增加HSC70或lamp2a与HK2和PKM2相互作用的检测结果图(C为增加HSC70，D为增加lamp2a)。
图9为metformin处理H4细胞后的激光共聚焦图。
图10为metformin处理H4细胞后的荧光强度统计图(A为DMSO处理，B为metformin处理)。
图11为metformin与第三代和第四代EGFR-TKI联用对肿瘤的影响图。
图12为ES-072和20mM的metformin联用对肺癌细胞抑制结果图(A为曲线图，B为柱状图)。
图13为ES-072和40mM的metformin联用对肺癌细胞抑制结果图(A为曲线图，B为柱状图)。
图14为AZD9291和20mM的metformin联用对肺癌细胞抑制结果图(A为曲线图，B为柱状图)。
图15为AZD9291和40mM的metformin联用对肺癌细胞抑制结果图(A为曲线图，B为柱状图)。
图16为本发明ES-072与诱导剂联用的结果图。
图17为本发明AZD9291与诱导剂联用的结果图。
图18为本发明的ES-072和AZD9291对突变细胞株作用对比图。
图19为本发明的ES-072和AZD9291在1μΜ浓度下对突变细胞株作用对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例1建立分子伴侣介导自噬的高通量筛选模型
原理如下：
HK2(人己糖激酶2)是分子伴侣介导自噬的底物蛋白，本发明构建了通过DOX(doxycycline，强力霉素)诱导表达的HK2-EGFP(绿色荧光蛋白)的单克隆细胞株293THK，利用spautin-1和AC220(奎扎替尼)联用作为阳性对照检测该体系的可用性，最终通过使用流式技术检测各种FDA药物处理条件下HK2-EGFP的荧光强度(采用异硫氰酸荧光素FITC荧光显色)来指征FDA药物的药效。
单克隆细胞株293THK的构建：构建HP138-HK2-EGFP-DOX的质粒，用该质粒转染293T细胞，在培养基中加入1μg/mL DOX，诱导EGFP绿色荧光表达，收集细胞后用流式细胞分选仪分选出单细胞，培养分化后形成单克隆细胞系293THK。
实验方法如下：
(1)cytationTM 3拍摄处理方法：
293THK细胞以2*105个/mL种于6孔板中，每孔种2mL，铺板的同时在培养基中添加NC siRNA(Negative siRNA control)，作为阴性对照，(购自艾博思)和HSC70siRNA(购自艾博思)，于37度，5％CO2培养条件下处理60h后，spautin-1+AC220处理12h后用细胞成像多功能检测系统cytationTM3拍摄(采用异硫氰酸荧光素FITC荧光显色)，放大倍数4倍，每孔拍摄9张照片，并利用仪器软件处理图像。
如图1所示，为spautin-1和AC220联用对分子伴侣介导自噬影响的荧光图，如图2所示，为spautin-1和AC220联用对分子伴侣介导自噬影响的统计图，从图1和2可以看出，在HSC70(heat shock cognate 70，热应激同源蛋白70)基因敲低的HSC70siRNA组中，spautin-1和AC220联用处理不能显著降低HK2的荧光水平，而NC siRNA组中，spautin-1和AC220联用显著降低HK2的荧光水平。而HSC70作为分子伴侣介导自噬中重要的分子伴侣蛋白，其蛋白含量的减少将会显著降低分子伴侣介导自噬(CMA)的水平。
(2)流式细胞仪分析方法：
293THK细胞以1*105个/mL种于96孔中，每孔种100μL，铺板的同时在培养基中添加NC siRNA和HSC70siRNA，于37度，5％CO2培养条件下处理60h后，spautin-1+AC220处理12h后用流式细胞仪分析绿色荧光通道荧光量，利用仪器软件处理图像。
如图3所示，为spautin-1和AC220联用后流式细胞仪分析荧光通道荧光量图(横坐标表示HK2-EGFP的荧光表达量，纵坐标表示加药情况以及该细胞是否使用HSC70siRNA进行knockdown)，如图4所示，为spautin-1和AC220联用后流式细胞仪分析荧光统计图(横坐标表示加药情况以及是否进行了HSC70knockdown，纵坐标表示荧光表达量)，从图3和4可以看出正常条件下，metformin处理可以显著降低HK2的荧光量，HSC70siRNA敲低表达HSC70后，metformin处理不能降低HK2荧光量。
(3)流式细胞仪分析结合graphpad处理数据方法：
293THK细胞以1*105个/mL种于96孔板中，每孔种100μL，24h后用安捷伦bravo自动化液体处理平台高通量加入FDA批准的药物，每孔加入10μM的药物，于37度，5％CO2培养条件下，处理24h后，直接用流式细胞仪分析HK2-EGFP的表达量，利用仪器软件处理图像，graphpad处理数据以热图展示。
通过用流式细胞仪对2000多个FDA批准的药物进行高通量筛选，发现metformin处理条件下相对于对照组的HK2-EGFP荧光表达量下降。
实验例2Westernblotting检测高通量筛选的metformin
293THK细胞以2*105个/mL种于6孔板中，每孔种2mL，铺板的同时在培养基中添加NC siRNA和HSC70siRNA，于37度，5％CO2培养条件下处理60h后，metformin处理12h后用250μL 2X SDS上样缓冲液(100mM Tris-HCl pH＝6.8，4％SDS，20％甘油，0.2％溴酚蓝)收样，100度加热10分钟，然后进行免疫杂交。
免疫杂交：每个样品上样10μL，电泳90V，2h；转膜条件300mA，1h。5％脱脂牛奶封闭1h，抗体GFP(购自santa cruz，#sc-9996),HSC70(购自proteintech，#10654-1-AP)tubulin(购自华安生物，#M1305-2)以1：1000稀释，4度孵育过夜，PBST(磷酸盐缓冲液+0.1％Tween20)洗涤3遍，每次10min。二抗anti mouse IgG(购自thermo，#32430),anti rabbit IgG(购自thermo，#32460)以1：20000稀释，稀释液为PBST+5％脱脂奶粉，室温孵育1h，PBST洗涤3遍，每次10分钟，ECL(增强化学发光法)显色。
如图5所示，为metformin处理后Westernblotting图(siRNA#1,siRNA#2分别代表了HSC70siRNA的两种不同序列；Tubulin是指微管蛋白，作为内参)，正常条件下metformin处理可以显著降低HK2-EGFP的蛋白水平，HSC70敲低后metformin处理不能降低HK2-EGFP蛋白水平。
实验例3验证metformin诱导分子伴侣介导自噬
(1)metformin诱导分子伴侣介导自噬相关底物蛋白的降解
293T、H1975和H4细胞(购自ATCC)以2*105个/mL的密度种于6孔板中，每孔2mL，每个细胞种6个孔。分别在0h、2h、4h、8h、12h和24h加入metformin，终浓度为20mM。最后，统一用250μL 2X SDS上样缓冲液收样，100度加热10分钟，然后进行免疫杂交。
免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳90V，2h；转膜条件300mA，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1h，抗体tubulin(购自华安生物，#M1305-2)，HK2(购自proteintech，#22029-1-AP)，PKM2(购自CST，#4053)，IKBα(购自CST，#4814)，AMPKα(购自CST，#5832)，p-AMPKα(购自CST，#2535)以1：1000稀释，4度孵育过夜，PBST洗涤3遍，每次10分钟。二抗anti mouse IgG(购自thermo，#32430)，anti rabbit IgG(购自thermo，#32460)以1：20000稀释，稀释液为PBST+5％脱脂奶粉,室温孵育1h，PBST洗涤3遍每次10分钟，ECL显色。
如图6中所示，metformin处理293T、H1975、H4细胞，metformin在293T、H1975、H4细胞中以时间依赖的方式导致分子伴侣介导自噬底物蛋白HK2、PKM2、IKBα的降解。
(2)metformin通过溶酶体降解
H4和H1975细胞以2*105个/mL的密度种于6孔板中，每孔2mL，5个孔。24小时后，加入metformin，终浓度为20mM，处理24h，在收样前12小时分别加入MG132(蛋白酶体抑制剂，CAS号：133407-82-6)2μM(终浓度)，E64D(阿洛司他丁，蛋白酶体抑制剂，CAS号：88321-09-9)2μM(终浓度)和氯化铵20mM(终浓度)，Leupeptin(亮抑蛋白酶肽，CAS号：55123-66-5)50μM(终浓度)。在24h时，统一用250μl 2X SDS上样缓冲液收样，100度加热10min，然后进行免疫杂交。
免疫杂交：每个样品上样10μL，电泳90V，2h；转膜条件300mA，1h。5％脱脂牛奶封闭1h，抗体tubulin(购自华安生物，#M1305-2)，HK2(购自proteintech，#22029-1-AP)，PKM2(购自CST，#4053)，IKBα(购自CST，#4814)以1：1000稀释，4度孵育过夜，PBST洗涤3遍，每次10min。二抗anti mouse IgG(购自thermo，#32430)，anti rabbit IgG(购自thermo，#32460)以1：20000稀释，稀释液为PBST+5％脱脂奶粉,室温孵育1h，PBST洗涤3遍，每次10分钟，ECL显色。
如图7所示，从图7中B1和B2可以看出，metformin处理H1975和H4细胞导致的分子伴侣介导自噬底物蛋白主要通过溶酶体降解，加入溶酶体抑制剂后阻止了metformin诱导的分子伴侣介导自噬底物蛋白的降解，而蛋白酶体的抑制剂MG132并没有阻止。
(3)metformin增加分子伴侣蛋白HSC70与分子伴侣介导自噬底物蛋白HK2和PKM2(pyruvate kinase M2，丙酮酸激酶M2，一种分子伴侣介导自噬底物蛋白)的相互作用。
通过PCDNA质粒载体在AvaΙ和BamHΙ位点酶切后插入HSC70-flag的氨基酸序列，构建PCDNA5-HSC70-flag质粒。
293T以2*105个/mL的密度种于6孔板中，每孔2mL，5个孔。24小时后，PCDNA5-HSC70-flag转染24小时，加入metformin，终浓度为20mM，处理8小时后用RIPA裂解液(20mMTris-HCl,150mM NaCl,0.5％NP-40,1mM NaF,1mM Na3VO4,1mM EDTA)裂解细胞30分钟后，将裂解液收集到1.5mL离心管中，4℃，12000rpm离心10min，收集上清；取出适量的flagbeads(购自selleck)到预冷的1.5ml离心管中，用RIPA裂解液重悬beads，4℃1000g离心1分钟，重复三次，将收集的上清吸取到flag beads中，4℃旋转结合过夜后用RIPA裂解液重悬beads，4℃1000g离心1分钟，并重复4次，吸干液体后加入适量的2X SDS上样缓冲液收样，100度加热10分钟，然后进行免疫杂交。
免疫杂交：每个样品上样10μL，电泳90V，2h；转膜条件300mA，1h。5％脱脂牛奶封闭1h，抗体Tubulin(购自华安生物，#M1305-2)，HK2(购自proteintech，#22029-1-AP)，PKM2(购自CST，#4053)，flag(购自华安生物，#M1403-2)以1：1000稀释，4度孵育过夜，PBST洗涤3遍，每次10min。二抗anti mouse IgG(购自thermo，#32430),anti rabbit IgG(购自thermo，#32460)以1：20000稀释，稀释液为PBST+5％脱脂奶粉,室温孵育1h，PBST洗涤3遍，每次10分钟，ECL显色。
如图8中C所示，为metformin增加HSC70与HK2和PKM2相互作用，分子伴侣介导自噬发生会引起分子伴侣蛋白HSC70与分子伴侣介导自噬底物蛋白的相互作用增强，metformin处理8小时后显著增加了分子伴侣蛋白HSC70与分子伴侣介导自噬底物蛋白HK2和PKM2的相互作用。
(4)metformin增加lamp2a(receptor lysosome-associated membrance protein2a，溶酶体相关膜蛋白2a)与分子伴侣介导自噬底物蛋白HK2和PKM2的相互作用
293T以2*105个/mL的密度种于6孔板中，每孔2mL，5个孔。24小时后，PCDNA5-lamp2a-flag转染24小时，加入metformin，终浓度为20mM，处理8小时后用RIPA裂解液裂解细胞30分钟后，将裂解液收集到1.5mL离心管中，4℃，12000rpm离心10分钟，收集上清；取出适量的flag beads到预冷的1.5mL离心管中，用RIPA裂解液重悬beads，4℃1000g离心1分钟，重复三次，将收集的上清吸取到flag beads中，4℃旋转结合过夜后用RIPA裂解液重悬beads，4℃1000g离心1分钟，并重复4次，吸干液体后加入适量的2X SDS上样缓冲液收样，100度加热10分钟，然后进行免疫杂交。
免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳90V，2h；转膜条件300mA，1h。5％脱脂牛奶封闭1h，抗体Tubulin(购自华安生物，#M1305-2)，HK2(购自proteintech，#22029-1-AP)，PKM2(购自CST,#4053)，flag(购自华安生物，#M1403-2)以1：1000稀释，4度孵育过夜，PBST洗涤3遍，每次10min。二抗anti mouse IgG(购自thermo，#32430),anti rabbit IgG(购自thermo，#32460)以1：20000稀释，稀释液为PBST+5％脱脂奶粉,室温孵育1h，PBST洗涤3遍，每次10分钟，ECL显色。
如图8中D所示，为metformin增加lamp2a与HK2和PKM2相互作用，分子伴侣介导自噬发生会引起溶酶体膜蛋白lamp2a与分子伴侣介导自噬底物蛋白的相互作用增强，metformin处理8小时后显著增加了lamp2a与分子伴侣介导自噬底物蛋白HK2和PKM2的相互作用。
(5)metformin对PKM2和溶酶体共定位的影响
H4细胞接种在铺放盖玻片的12孔培养板中，待细胞融合度达到70％～80％加metformin，终浓度为20mM。8小时后，去掉培养基，PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤2次，每次5min。之后，用4％多聚甲醛室温固定20min，PBS轻柔漂洗细胞3次，每次3min；用5％FBS(fetalbovine serum，胎儿牛血清)/PBS/0.1％Triton 100室温封闭1h，封闭液(5％FBS/PBS)按1:50-1:100的稀释度配置PKM2(购自CST，#4053)及Lamp2(购自santa cruz)一抗，4℃孵育过夜。PBS轻柔漂洗细胞，每次3min，重复3次。将盖玻片的细胞面扣于滴有封片剂的载玻片上，避免产生气泡，指甲油封边，防止水分蒸发。
图像采集使用Zeiss LSM 510和Zeiss LSM 800激光共聚焦成像系统，选用60×油镜，488nm和561nm的激光器，根据样品荧光强度调整参数，获得较高分辨率的图像。使用图像分析软件Image J统计荧光强度和溶酶体等点状结构的数量，然后用制图软件GraphPadPrism 5统计数据并制图。
如图9所示，为metformin处理H4细胞后的激光共聚焦图(PKM2，586nm激发荧光，为分子伴侣介导自噬的底物蛋白；488nm激发荧光代表溶酶体)，如图10所示，为metformin处理H4细胞后的荧光强度统计图(曲线1代表PKM2的荧光强度，曲线2代表lamp2的荧光强度，横坐标表示放大倍数，纵坐标表示荧光强度)，H4细胞用metformin处理后拍摄激光共聚焦图片观察分子伴侣介导自噬底物蛋白PKM2和溶酶体共定位，可以看到加入metformin处理后黄色荧光增强，表明metformin处理后PKM2与溶酶体共定位增强。
实验例4metformin与第三代和第四代EGFR-TKI联用显著降低小鼠肿瘤体积和相对肿瘤大小
metformin能够显著降低HK2的蛋白含量，HK2在肿瘤的生存和发展过程中起着至关重要的作用，因此将metformin与EGFR-TKI联用可能会对肿瘤的生存和繁殖起到一定的抑制作用。
具体实验步骤如下：
培养H1975细胞并收集细胞，最终用PBS稀释细胞，使细胞密度达到5×107个每毫升，取30只裸鼠每只裸鼠腋下接种100μL PBS稀释的H1975细胞，使每只裸鼠接种的细胞个数为5×106。
待肿瘤生成后，给裸鼠喂药，AZD9291(奥希替尼，第三代EGFR-TKI)和ES-072(浙江博生医药有限公司研发的首个第四代EGFR抑制剂)采用灌胃的给药方式，metformin溶于水，给药方式是将metformin放入水中，通过每天喝水的方式给药。其中，metformin给药的浓度为20mM，AZD9291给药剂量为2.5mg/kg，ES-072给药剂量为30mg/kg，联合用药给药方式是AZD9291和ES-072灌胃给药，同时metformin以给水的方式给药。分别在给药后2天、4天、6天、8天、10天、12天和14天测量肿瘤体积，如图11所示，为metformin与第三代和第四代EGFR-TKI联用对肿瘤的影响图(横坐标代表了给药时间，纵坐标代表肿瘤体积)。
上述通过将H1975细胞接种于裸鼠腋下，待其肿瘤生成后开始对其进行ES-072、AZD9291，以及ES-072和AZD9291分别与metformin的联用，发现随着给药时间的延长AZD9291与metformin联用较AZD9291可以降低肿瘤体积，ES-072与metformin联用较ES-072可以显著降低肿瘤体积。
如图11所示，通过将H1975细胞接种于裸鼠腋下，待其肿瘤生成后开始对其进行ES072、AZD9291及ES072和AZD9291与metformin的联用，发现随着给药时间的延长AZD9291与metformin联用较AZD9291可以降低肿瘤体积，ES-072与metformin联用较ES-072可以显著降低肿瘤体积。
实验例5metformin与第三代和第四代EGFR-TKI联用降低EGFR-TKI的EC50
H1975-三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞株，其购于康源博创生物科技(北京)有限公司，该细胞培养条件：培养基为RPMI-1640培养基(购自Hyclone,#SH30809.01B)+青霉素，链霉素双抗(购自Gibco，#15140-122)，37摄氏度，5％CO2加湿无菌培养。
(1)ES-072和metformin联用降低EGFR-TKI的EC50
待H1975-三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞株培养至状态良好后，取对数生长期细胞用胰酶(购自Gibco)进行消化计数，细胞密度按照3*104个每孔接种于384孔板，每孔体积40μL，保证细胞分布均匀。
在24小时以后，加入药物ES-072(加入ES-072的浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40μM)，同时加入metformin(加入metformin的浓度分别为20mM和40mM)作为联合用药组，不加metformin组作为对照组，每个孔40μL，每个浓度3个重复，药物处理48h。
药物孵育后，每孔加入13μLATP，37摄氏度避光孵育10min，用酶标仪Cytation 3检测荧光素酶的活力。根据活力值计算药物单独用药和联合用药的半抑制浓度EC50，并统计EC50附近浓度的给药对细胞的杀伤。
如图12所示，为ES-072和20mM的metformin联用对肺癌细胞抑制结果图，如图13所示，为ES-072和40mM的metformin联用对肺癌细胞抑制结果图，在H1975-三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞株上，EGFR三代药物ES-072和metformin联用后，降低了ES-072对肺癌细胞的EC50，增强了ES-072杀伤肿瘤细胞的能力。
(2)AZD9291和metformin联用降低EGFR-TKI的EC50
待H1975-三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞株培养至状态良好后，取对数生长期细胞用胰酶(Gibco)进行消化计数，细胞密度按照3*104个每孔接种于384孔板，每孔体积40μL，保证细胞分布均匀。24小时以后加入药物，AZD9291(加入AZD9291的浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20、40μM)，同时加入metformin(加入metformin的浓度分别为20mM、40mM)作为联合用药组，不加metformin组作为对照组，每个孔40μL，每个浓度3个重复，药物处理48h。
药物孵育后，每孔加入13μLATP，37摄氏度避光孵育10min，用酶标仪Cytation 3检测荧光素酶的活力。根据活力值计算药物单独用药和联合用药的半抑制浓度EC50，并统计EC50附近浓度的给药对细胞的杀伤。
如图14所示，为AZD9291和20mM的metformin联用对肺癌细胞抑制结果图，如图15所示，为AZD9291和40mM的metformin联用对肺癌细胞抑制结果图，在H1975-三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞株上，EGFR三代药物奥西替尼(AZD9291)和metformin联用后，降低了AZD9291对肺癌细胞的EC50，增强了AZD9291杀伤肿瘤细胞的能力。
实验例6第三代EGFR-TKI与CMA诱导剂联用
CMA诱导剂包括：FLT3抑制剂、MEK5抑制剂，其中，FLT3抑制剂包括：SGI-1776，Rebastinib和AC220，MEK5抑制剂包括：BIX 02189。
H1975-三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞株购于康源博创生物科技(北京)有限公司，该细胞培养条件：培养基，RPMI-1640(Hyclone)+青霉素和链霉素(Gibco)，37摄氏度，加湿无菌培养。
细胞株培养至状态良好后，取对数生长期细胞用胰酶(Gibco)进行消化计数，细胞密度按照3*104个每孔接种与384孔板，每孔体积40μL，保证细胞分布均匀。24小时以后加入药物，ES-072或AZD9291(0、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、40μM)，同时加入各诱导剂(2.5μM、5μM、10μM)作为联合用药组，不加CMA诱导剂组作为对照组，每个孔40μL，每个浓度3个重复，药物处理48小时。药物孵育后，每孔加入13μLATP，37摄氏度避光孵育10分钟，用酶标仪Cytation 3检测荧光素酶的活力。根据活力值计算药物单独用药和联合用药的半抑制浓度EC50，并统计EC50附近浓度的给药对细胞的杀伤。其中，诱导剂包含：SGI-1776、Rebastinib、BIX 02189、AC220。
如图16所示，为本发明ES-072与诱导剂联用的结果图，如图17所示，为本发明AZD9291与诱导剂联用的结果图，AC220与ES-072和AZD9291联用明显肺癌细胞活性显著降低。
实验例7ES-072对具有EGFR耐药突变C797S的细胞株的作用
(1)将H1975-三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞株培养至状态良好后，取对数生长期细胞用胰酶(Gibco)进行消化计数，细胞密度按照3*104个每孔接种与384孔板，每孔体积40μL，保证细胞分布均匀。24小时以后加入药物ES-072和AZD9291，每个孔40μL，每个浓度3个重复，药物处理48小时。药物孵育后，每孔加入13μLATP，37摄氏度避光孵育10分钟，用酶标仪Cytation 3检测荧光素酶的活力。根据活力值计算药物单独对细胞的杀伤。
如图18所示，为本发明的ES-072和AZD9291对突变细胞株作用对比图，从图中可以看出：ES-072相较于AZD9291，其对H1975-三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞杀伤更强，ES-072的EC50值小于AZD9291。
(2)将H1975-三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞株培养至状态良好后，取对数生长期细胞用胰酶(Gibco)进行消化计数，细胞密度按照3*104个每孔接种与384孔板，每孔体积40μL，保证细胞分布均匀。24小时以后加入药物ES-072(1μΜ)和AZD9291(1μΜ)，每个孔40μL，每个浓度3个重复，药物处理48小时。药物孵育后，每孔加入13μLATP，37摄氏度避光孵育10分钟，用酶标仪Cytation 3检测荧光素酶的活力。根据活力值计算药物单独对细胞的杀伤。
如图19所示，为本发明的ES-072和AZD9291在1μΜ浓度下对突变细胞株作用对比图，从图中可以看出：1μΜES-072对H1975-三突变EGFR(L858R/T790M/C797S)的肺癌细胞杀伤大于AZD9291。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (1)

1.一种针对EGFR耐药突变C797S的联用药物在制备治疗肿瘤药物中的用途，其特征在于，该联用药物包含：分子伴侣介导的自噬诱导剂，以及第三代或/和第四代EGFR-TKI，该分子伴侣介导的自噬诱导剂选自二甲双胍、FLT3抑制剂和MEK5抑制剂中的任意一种或两种以上；
该肿瘤为包含EGFR耐药突变C797S的肿瘤；所述的肿瘤为非小细胞肺癌；
所述第三代EGFR-TKI为奥希替尼；
所述第四代EGFR-TKI为ES-072；
所述FLT3抑制剂选自SGI-1776，Rebastinib和AC220中任意一种或两种以上；所述MEK5抑制剂为BIX 02189。
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Osimertinib 联合二甲双胍对非小细胞肺癌PC 9/GR 细胞的协同效应;彭佳等;《安徽医科大学学报》;20170731;第52卷(第7期);第957-962页 *
彭佳等.Osimertinib 联合二甲双胍对非小细胞肺癌PC 9/GR 细胞的协同效应.《安徽医科大学学报》.2017,第52卷(第7期),第957-962页. *

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