CN104161749A - 多甲氧基黄酮及其衍生物用于防治与sirt6水平低下相关疾病 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种如通式(Ⅰ)所示的基本结构为多甲氧基黄酮及其衍生物，用于制备预防和/或治疗SIRT6水平低下相关疾病的药品和用法。其代表药物为：五甲基槲皮素(化学名：3,5,7,3’,4’-五甲基槲皮素；英文名：Pentamethylquercetin)。本发明涉及五甲基槲皮素及相关多甲氧基黄酮类物质在SIRT6水平低下的动物模型和细胞模型，通过上调SIRT6水平，防治SIRT6水平低下相关的肥胖、代谢综合征、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病、血管内皮细胞功能失常、癌症。

Description

多甲氧基黄酮及其衍生物用于防治与SIRT6水平低下相关疾病

技术领域

本发明属于医药领域，涉及化合物之医药用途，具体涉及多甲氧基黄酮及其衍生物用于制备预防或治疗SIRT6水平低下相关疾病的药品和用法。

背景技术  物的沉默信息调节因子2(Silent information regulator Two proteins,Sir2)有7个亚型，分别为SIRT1-SIRT7，参与机体诸多重要机能的调节。SIRT6在骨骼肌、脑、心、肝、胸腺高表达，具脱乙酰酶活性和ADP-核糖转移酶活性。SIRT6在细胞核内以组织特异性方式调节转录，操控DNA稳定性和修复、能量平衡、糖脂代谢、炎症反应、自噬、衰老等。

近年的大量研究资料表明，SIRT6水平低下参与许多重大疾病的发生和发展，包括肥胖、代谢综合征、2型糖尿病、糖尿病性肾病、心血管病、非酒精性脂肪性肝病、慢性阻塞性肺病、恶性肿瘤，藉此，SIRT6被认为是极具潜力的治疗靶点(Beauharnois JM,et al.Sirtuin6:areview of biological effects and potential therapeutic properties.Mol BioSys2013；9:1789)。

提升SIRT6水平，包括上调其转录和/或翻译、增加其mRNA和蛋白质的稳定性、或直接增强其酶活性，都可能成为防治上述SIRT6水平低下相关疾病的有效途径，除罗格列酮外(PLoS ONE.2011；6(2):e17057，因不良反应已被被淘汰)，迄今尚无上调SIRT6水平、有效防治SIRT6水平低下相关疾病的药物问世。

黄酮类化合物广泛存在于蔬菜、水果和药用植物中，有数千种之多，以多羟基黄酮为主。对多羟基黄酮的生物活性进行了大量研究，但因其生物利用度低、效价低，均缺乏成药价值，至今鲜见突破。有趣的是，迄今所知多羟基黄酮在体外试验中都是SIRT6抑制剂(Sasuda M,et al.Anal.Chem.2011,83,7400-7407)，据认为其对SIRT6的抑制作用与多羟基黄酮分子中的3个供氢部位和1个受氢部位有关。

与多羟基黄酮比，多甲氧基黄酮具有显著的药效学及药物代谢动力学优势，如亲脂性更强，更易跨膜转运，生物利用度更高，靶点作用更清晰，药理活性更强等。但天然多甲氧基黄酮类化合物大多含量低，提取工艺繁杂、成本高、三废明显，这些都妨碍了对多甲氧基黄酮类化合物的研究和开发利用。

鉴于多羟基黄酮类化合物价廉易得、甲基化半合成工艺简单，我们合成了一系列的多甲氧基黄酮类化合物，对他们的作用靶点和生物活性进行了广泛研究。我们前期的研究证明，五甲基槲皮素(PMQ)可上调脂联素、PPARs(α/γ/δ)、PGC-1α、AMPK、Smad7等有利分子的表达；下调TNFα、IL-6、TGF-β、Smad2/3、IKKε/TBK1等有害分子的表达。鉴于SIRT6水平低下参与许多重大疾病的发生和发展，我们制备了SIRT6水平低下的动物模型和细胞模型，利用这些模型研究了多甲氧基黄酮类物质是否可上调SIRT6、对SIRT6水平低下相关疾病产生预防和治疗作用。

制备谷氨酸钠诱导的肥胖(Mono-sodium Glutamate Induced Obesity,MSGIO)小鼠模型，给新生CD-1小鼠皮下注射谷氨酸钠，成年后出现肥胖、代谢综合征、脂肪肝、2型糖尿病、血管内皮功能受损等病变。

在MSGIO小鼠肝脏和白色脂肪组织见Sirt6表达明显降低。肝脏和脂肪是研究代谢的主要靶器官，提示Sirt6水平低下参与了MSGIO小鼠的各种代谢异常及在此模型上所见的相关疾病，包括肥胖、代谢综合征、脂肪肝、2型糖尿病、血管内皮功能受损等。此结果表明，MSGIO小鼠可用作研究Sirt6水平低下及相关疾病的动物模型。

在正常小鼠和MSGIO小鼠腋下接种H22肝癌细胞，均见癌组织Sirt6表达水平明显降低，且降低程度与肿瘤生长呈正相关。此结果表明，此肿瘤模型可用于研究Sirt6水平低下相关肿瘤的代谢研究研究及药物干预试验。

用棕榈酸处理L02肝脏细胞系，见Sirt6水平下调并出现相应的代谢变化。此结果表明，此细胞模型可用于研究药物对Sirt6水平低下及代谢变化的影响。

在中国专利CN200710051693.7中记载了华中科技大学发明的“利用槲皮素制备3,5,7,3’,4’-五甲基槲皮素的方法”。其中，涉及一种制备3,5,7,3’,4’-五甲基槲皮素(PMQ)的改进方法。

在中国专利CN101269061A(公开号)中记载了金满文发明的“甲氧基黄酮类化合物作为防治代谢综合征的药物及用法”。其中，涉及了五甲基槲皮素作为防治代谢综合征的药物及用法。

发明内容

本发明的任务是提供一种用于预防和治疗与SIRT6水平低下相关疾病的药物。

实现本发明的技术方案是：本发明提供的用于预防和/或治疗与SIRT6水平低下相关疾病的药物是具有以下式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示结构的化合物，即本发明可表述为：具有以下式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示结构的化合物在制备用于预防和/或治疗与SIRT6水平低下相关疾病的药物中的应用。

在式(Ⅰ)中：

C₂-C₃为双键或单键；

R₁-R₁₀为甲氧基氢、羟基、硝基或糖苷，且R1-R10中至少有2个为甲氧基；

在式(Ⅱ)中：

C₂-C₃为双键或单键；

R₂-R₁₁为甲氧基氢、羟基、硝基或糖苷，且R₂-R₁₁中至少有2个为甲氧基。

本发明中所述的与SIRT6水平低下相关疾病包括肥胖、代谢综合征、2型糖尿病、糖尿病性肾病、糖尿病性认知功能障碍、非酒精性脂肪性肝病、恶性肿瘤。其机制是通过上调SIRT6表达，纠正因为SIRT6水平低下所致的各种代谢紊乱、预防和治疗相关疾病。

本发明发现如下：

1.在MSGIO小鼠，以五甲基槲皮素为代表的多甲氧基黄酮类药物剂量依赖性上调白色脂肪组织SIRT6的mRNA和蛋白质表达，其水平可完全恢复至正常动物水平。

2.在MSGIO小鼠，以五甲基槲皮素为代表的多甲氧基黄酮类药物剂量依赖性地上调肝脏SIRT6的mRNA和蛋白质表达，其水平可完全恢复至正常动物水平。

3.在MSGIO小鼠，以五甲基槲皮素为代表的多甲氧基黄酮类药物剂量依赖性地改善全部与SIRT6水平低下相关的代谢紊乱和疾病表现，包括减肥、降低血糖、改善糖耐量受损程度和胰岛素抵抗；降低血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇；有效改善肝脏脂肪变性，减轻肝脏损伤。即成功防治肥胖、代谢综合征、2型糖尿病、脂肪肝。

4.在棕榈酸处理的人肝细胞系L02，SIRT6水平明显降低，出现内质网应激、IKKε/TBK1激活等与SIRT6水平低下相关的病理变化。以五甲基槲皮素为代表的多甲氧基黄酮类药物剂量依赖性地上调被棕榈酸降低的SIRT6水平，成功矫正相关病理变化。此结果提示五甲基槲皮素为代表的多甲氧基黄酮类药物对肝脏细胞的直接保护作用。

5.在接种的小鼠H22肝脏肿瘤，以五甲基槲皮素为代表的多甲氧基黄酮类药物剂量依赖性地上调SIRT6水平，明显抑制肿瘤生长速度，降低肿瘤体积和重量。

6.在棕榈酸处理的L02细胞模型，三甲基芹菜素、3,5,7,3’,4’-四甲基槲皮素、5-O-去甲蜜桔黄素、三甲基金雀异黄素对SIRT6mRNA表达有不同成度的上调作用，但作用强度都不及五甲基槲皮素。这并不排除在多甲氧基黄酮类化合物及衍生物中可寻找到明显提升SIRT6水平或活性、具有药用价值的新物质。

附图说明

图1.五甲基槲皮素(PMQ5,10,20mg/kg)上调MSGIO小鼠白色脂肪组织SIRT6mRNA(A)和蛋白质(B)表达。#P<0.05vs正常组(Control)，*P<0.05vs MSGIO模型溶剂对照组(Vehicle)。

图2.五甲基槲皮素(PMQ)降低MSGIO小鼠体重(A,B)、腰围(B)、体重指数(C)、脂肪重量(D)。###P<0.001vs正常组(CTL)，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs MSGIO溶剂对照组(Veh)。

图3.五甲基槲皮素(PMQ)降低MSGIO小鼠血糖(A)、改善糖耐量(B，OGTT)、降低OGTT曲线下面积(C)、降低血清胰岛素(D)和胰岛素抵抗指数HOMA-IR(E)。###P<0.001vs正常组(CTL)，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs MSGIO模型溶剂对照组(Veh)。

图4.五甲基槲皮素(PMQ)明显降低MSGIO小鼠血清甘油三酯(A)、总胆固醇(B)、低密度脂蛋白胆固醇(C)，对高密度脂蛋白胆固醇也有轻度降低作用(D)。###P<0.001vs正常组(CTL)；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs MSGIO溶剂对照组(Veh)。

图5.五甲基槲皮素(PMQ)上调MSGIO小鼠肝脏SIRT6mRNA(A)和SIRT6蛋白质表达(B)。#P<0.05,##P<0.01vs正常组(CTL)；*P<0.05,**P<0.01vs MSGIO溶剂对照组(Veh)。

图6.五甲基槲皮素(PMQ)明显减轻MSGIO小鼠的非酒精性脂肪肝病变(A，肝脏、油红染色、HE染色)、肝脏重量(B)、肝脏器官指数(C)、肝脏甘油三酯含量(D,TG)、肝脏总胆固醇含量(E,TC)、血清AST(F)和ALT(G)。###P<0.001vs正常组(CTL)；**P<0.01,***P<0.001vs MSGIO溶剂对照组(Veh)。

图7.五甲基槲皮素(PMQ)对培养的人L02肝细胞系SIRT6表达的影响。棕榈酸处理明显降低L02细胞的SIRT6表达，五甲基槲皮素(PMQ)恢复SIRT6水平(A)，同时改善棕榈酸诱导的葡萄糖利用降低(B)，降低内质网应激指标GRP78(C)和CHOP(D)。#P<0.05,##P<0.01vs正常组(Control)；*P<0.05,**P<0.01vs MSGIO溶剂对照组(Vehicle or DMSO)。

图8.五甲基槲皮素(PMQ)上调H22肿瘤组织SIRT6的mRNA表达水平(A)和蛋白质含量(B)，明显抑制肿瘤生长速度、肿瘤体积(C)和重量(D)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs溶剂对照组(Veh)。

图9和图10为本发明用于预防和治疗与SIRT6水平低下相关疾病的药物结构通式。

术语和简称

PMQ:Pentamethylquercetin,五甲基槲皮素

MSGIO:Monosodium Glutamate Induced Obesity,谷氨酸钠诱导的肥胖；

CTL:Control,正常对照；

Veh:Vehicle,溶剂；

TG:Treglyceride,甘油三酯

TC:Total Cholesterol,总胆固醇

LDL-C,Low dencity Lipoprotein-Cholesterol,低密度脂蛋白胆固醇

HDL-C,High dencity Lipoprotein-Cholesterol,高密度脂蛋白胆固醇

PA:Palmitinic Acid,棕榈酸

具体实施方式

下述实施例具体显示本发明的应用。但本实施例不限定本发明的使用范围。

实施例1、制备SIRT6水平低下并出现相关疾病的动物模型：MSGIO小鼠健康CD-1小鼠(10周龄)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。适应性饲养2周，至12周龄时，按照雄雌1:3比例进行配种。保持饲养间温度22±2℃，湿度55±5％及12h光照周期。雄性乳鼠于出生后2-8天皮下注射谷氨酸钠(MSG,3mg/g/d,生理盐水(Saline)溶解)制备谷氨酸钠诱导的肥胖模型(Monosodium Glutamate Induced Obesity，MSGIO)或Saline(对照组，Control,CTL)。21日龄时断乳分笼，MSGIO小鼠分为溶剂对照组(Vehicle,Veh)，五甲基槲皮素低、中、高剂量组(分别为5、10、20mg/kg/d)，各组n＝15。每周监测各组小鼠的体重及摄食量。

16周龄时，鼠尾微创、微量取血法进行经典的口服糖耐量试验(OGTT)。

饲养至18周龄时，记录小鼠体重、腰围、体长，取禁食血液分离血清，检测各组小鼠的血清血糖、甘油三脂、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HLD-C)、胰岛素水平。后宰杀，分离相应组织器官，称重、记录，冻存备测。

计算体重指数、胰岛素抵抗指数、脂肪重量和脂肪器官指数(脂肪/体重)，结合各项血生化指标，评价PMQ对肥胖、代谢综合征、2型糖尿病的防治作用。

检测肝脏重量、肝脏器官指数(肝重/体重)、肝脏的颜色、组织切片的HE和油红染色、肝脏的甘油三酯(TG)和总胆固醇含量(TC)、血清AST和ALT等，评价PMQ对脂肪肝的改善作用。

脂肪和肝脏参与代谢性疾病的发生和发展、是最具代表性的重要器官。用RT-PCR和Western blot检测MSGIO小鼠脂肪和肝脏组织中Sirt6m RNA和蛋白水平。结果显示，与正常动物比，MSGIO小鼠脂肪和肝脏组织中Sirt6mRNA和蛋白水平均明显降低，提示在MSGIO小鼠出现的肥胖、代谢综合征、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝与SIRT6水平低下相关。

实施例2、PMQ对MSGIO小鼠SIRT6水平低下的矫正作用和对SIRT6水平低下相关疾病的防治效果。

PMQ:Pentamethylquercetin,五甲基槲皮素的结构式为：

PMQ剂量依赖性地上调MSGIO小鼠脂肪组织和肝脏中的SIRT6mRNA表达和蛋白质含量，几乎可完全恢复至正常动物水平。见图1、图5

PMQ剂量依赖性地减慢MSGIO小鼠的体重增长、减少腰围、降低体重指数，减少脂肪总量脂肪器官指数，减肥作用明显，见图2。PMQ降低MSGIO小鼠空腹血糖、改善糖耐量、改善高胰岛素血症、降低胰岛素抵抗指数，见图3。PMQ改善MSGIO小鼠的脂代谢紊乱，表现为降低血清甘油三酯、总胆固醇、LDL-C，见图4。PMQ改善MSGIO小鼠的肝脏脂肪变性程度，表现为减轻肝脏重量、病理切片见脂肪空泡明显减少、明显降低肝脏的甘油三酯(TG)和总胆固醇含量(TC)、血清AST和ALT明显降低，见图6。

结论：MSGIO小鼠表现为SIRT6水平低下、并出现与SIRT6水平低下相关的肥胖，代谢综合征、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等疾病的病理特征。PMQ提升MSGIO小鼠SIRT6水平、并改善相应病变。PMQ提升SIRT6水平的作用与改善MSGIO小鼠SIRT6水平低下相关病变呈明显相关。

实施例3、制备SIRT6水平低下并出现相关代谢紊乱的细胞模型，在细胞水平观察PMQ对SIRT6蛋白水平和相关代谢的影响。用棕榈酸(PA)处理人肝细胞系L02细胞，在预实验的基础上，确定PA用量为100μM。试验分为正常对照(Control)，单给PA组(PA alone)，PA+PMQ0.1、0.3、1、3、10μM。检测各组葡萄糖利用率、内质网应激的重要分子GRP78和CHOP、参与炎症因子NF-κB激活的重要分子IKKε和TBK1。

PA处理的L02细胞出现SIRT6水平降低，伴葡萄糖利用障碍、内质网应激、IKKε/TBK1升高等。此结果证明PA-L02细胞，可作为细胞模型，用于研究药物对SIRT6水平低下及相关代谢紊乱的防治作用。

PMQ浓度依赖性地提升PA-L02细胞的SIRT6水平，见图7A；并改善葡萄糖利用率，见图7B；降低反映内质网应激的GRP78和CHOP，见图7C、7D；降低参与炎症因子NF-κB激活的重要分子IKKε和TBK1，见图7E、7F。

结论：在SIRT6低下的PA-L02细胞模型，PMQ能提升SIRT6水平，改善相应的代谢紊乱。

实施例4、制备H22肝癌荷瘤小鼠模型，检测H22肿瘤的生长速度、肿瘤体积和重量、SIRT6mRNA和蛋白水平。

成年雄性CD-1小鼠，腋下接种H22细胞

试验分组：与接种H22细胞前1周开始灌胃给予PMQ5、10、20mg/kg/d。

PMQ剂量依赖性地提升H22肿瘤组织的SIRT6的mRNA表达水平和蛋白含量。明显减慢肿瘤生长速度，减小肿瘤体积和重量。

结论：H22肿瘤出现SIRT6水平低下，PMQ能提升SIRT6水平，产生抗肿瘤作用，见图8。

Claims (6)

1.具有以下式(Ⅰ)或式(Ⅱ)所示结构的化合物在制备用于预防和/或治疗与SIRT6水平低下相关疾病的药物中的应用，

在式(Ⅰ)中：

C₂-C₃为双键或单键；

R₁-R₁₀为甲氧基氢、羟基、硝基或糖苷，且R₁-R₁₀中至少有2个为甲氧基；

在式(Ⅱ)中：

C₂-C₃为双键或单键；

R₂-R₁₁为甲氧基氢、羟基、硝基或糖苷，且R₂-R₁₁中至少有2个为甲氧基。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的与SIRT6水平低下相关疾病是指肥胖、代谢综合征、2型糖尿病、糖尿病性肾病、糖尿病性认知功能障碍、非酒精性脂肪性肝病和/或恶性肿瘤。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的用于预防与SIRT6水平低下相关疾病是指对有SIRT6水平低下趋势及相关疾病的高危人群进行药物干预，旨在预防和延缓SIRT6水平低下及相关疾病的发生。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于治疗与SIRT6水平低下相关疾病是指对已被确诊SIRT6水平低下相关疾病患者，本着剂量个体化的原则，选用适当剂量的甲氧基黄酮类化合物或含有该类化合物的复方制剂，通过提升SIRT6水平，减轻相关疾病的病情、或/和延缓病程、或/和治愈疾病。

5.权利要求1中所述的式(Ⅰ)或式(Ⅱ)的甲氧基黄酮类化合物用于预防和/或治疗SIRT6水平低下相关疾病，其特征在于：单用天然的、半合成或全合成的式(Ⅰ)或式(Ⅱ)中的一种甲氧基黄酮类化合物；或用含式(Ⅰ)或式(Ⅱ)甲氧基黄酮类化合物的混合物；或用由式(Ⅰ)或式(Ⅱ)甲氧基黄酮类化合物与其他改善SIRT6水平低下相关疾病的药物组成复方制剂。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的式(Ⅰ)或式(Ⅱ)甲氧基黄酮类化合物是从植物中提取的天然产物或半合成得到的产物或全合成得到的产物。