CN106999607A

CN106999607A - 非编码rna malat‑1是调控学习和记忆的靶标

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Publication number: CN106999607A
Application number: CN201580060295.4A
Authority: CN
Inventors: T.P.迈克尔; S.莫特利
Original assignee: Aibis Biological Science Co Ltd
Current assignee: Aibis Biological Science Co Ltd; Ibis Biosciences Inc
Priority date: 2014-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2017-08-01
Also published as: US20170335321A1; EP3215194A4; CA2966624A1; EP3215194A1; WO2016073828A1

Abstract

本文提供了用于通过向对象的脑部施用组合物，而改善所述对象中的记忆或认知功能的方法，其中所述组合物包含：i)化合物，其增加MALAT‑1长非编码RNA的表达，ii)MALAT‑1长编码RNA核酸序列，或iii)至少一种源自MALAT‑1的piRNA核酸序列。本文还提供了针对其调节MALAT‑1长非编码RNA在脑细胞中的表达的能力而筛选候选化合物的方法。在某些实施方案中，还将如此鉴别出的增加表达的调节因子施用到实验室动物的脑部以测定此类调节因子对学习和记忆的影响。

Description

非编码RNA MALAT-1是调控学习和记忆的靶标

技术领域

本文提供了用于通过向对象的脑部施用组合物，而改善所述对象中的记忆或认知功能的方法，其中所述组合物包含：i) 化合物，其增加MALAT-1长非编码RNA的表达，ii)MALAT-1长编码RNA核酸序列，或iii) 至少一种源自MALAT-1的piRNA核酸序列。本文还提供了针对其调节MALAT-1长非编码RNA在脑细胞中的表达的能力而筛选候选化合物的方法。在某些实施方案中，还将如此鉴别出的增加表达的调节因子施用到实验室动物的脑部以测定此类调节因子对学习和记忆的影响。

背景技术

神经功能和病理学以及所导致的性质和表型(例如，行为、记忆、疾病等)是动物(例如，人类)生物学、健康和幸福的至关重要的方面。然而，对其基础的分子和细胞生物学知之甚少。有鉴于此，缺乏用于在分子水平并以特定方式改变这些性质和表型的药物或研究工具。

发明内容

本文提供了用于通过向对象的脑部施用组合物，而改善所述对象中的记忆或认知功能的方法，其中所述组合物包含：i) 化合物，其增加MALAT-1长非编码RNA的表达，ii)MALAT-1长编码RNA核酸序列，或iii) 至少一种源自MALAT-1的piRNA核酸序列(例如，SEQID NO:5-22或与SEQ ID NO:5-22具有90-99%序列同一性的序列中的一种或多种)。本文还提供了针对其调节MALAT-1长非编码RNA在脑细胞中的表达的能力而筛选候选化合物的方法。在某些实施方案中，还将如此鉴别出的增加表达的调节因子施用到实验室动物的脑部以测定此类调节因子对学习和记忆的影响。

在一些实施方案中，本文提供了用于改善对象中的记忆或认知功能的方法，包括：向所述对象(例如，人类对象)施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物增加转移相关肺腺癌转录物1 (MALAT-1)长非编码RNA在所述对象的神经系统细胞中的表达，其中所述施用颅内进行或其中所述施用在直接向所述对象脑部供血的血管中进行；其中所述组合物包含以下中的至少一种：i) 化合物(例如，通过本文所述的筛选方法鉴别的)，其增加MALAT-1长非编码RNA在细胞中的表达，ii) 第一核酸序列，其包含MALAT-1长编码RNA，或第一表达载体，其编码所述第一核酸序列；或iii) 第二核酸序列，其编码至少一种源自MALAT-1的piRNA序列(例如，SEQ ID NO:5-22中的一种或多种)，或第二表达载体，其编码所述第二核酸序列；并且其中所述记忆或认知功能的至少一项属性得到改善。

在某些实施方案中，所述对象患有其中以陈述性记忆减退为症状的疾病。在其它实施方案中，所述分子是KCl或DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂。在进一步的实施方案中，所述DNMT抑制剂包括RG108。在另外的实施方案中，所述第一和/或第二表达载体包括：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒或DNA质粒。在另外的实施方案中，所述组合物经由颅内接入装置通过颅内递送而向所述对象施用。在一些实施方案中，所述方法还包括步骤：在所述对象的脑部之外植入泵，其中所述泵与所述颅内接入装置的近端相连。在具体的实施方案中，所述颅内接入装置包括颅内导管。

在其它实施方案中，所述第一和/或第二核酸分子包含化学修饰，所述化学修饰改善以下中的一项或多项或全部：核酸酶稳定性、触发先天免疫应答的可能性降低、降低脱靶效应的发生率、以及相对于非修饰核酸的改善的药效学。在进一步的实施方案中，所述至少一种化学修饰选自：硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、4'-硫代-核糖、锁核酸、2'-O-(2'-甲氧基乙基)、2'-O-甲基、2'-氟代、2'-脱氧-2'-氟代-b-D-阿拉伯糖核酸、吗啉代核酸类似物和肽核酸类似物。在一些实施方案中，所述第一和/或第二核酸序列连接至纳米颗粒或位于其内部，所述纳米颗粒经配置以用于穿过血脑屏障。在某些实施方案中，所述纳米颗粒包括脂质体。在另外的实施方案中，所述组合物被递送至迈纳特(Meynert)基底核、大脑皮层或海马体。

在一些实施方案中，所述对象患有阿尔茨海默病和/或年龄相关的记忆减退。在进一步的实施方案中，所述对象患有记忆障碍。在另外的实施方案中，所述记忆障碍选自：毒物暴露、脑损伤、年龄相关的记忆障碍、轻度认知障碍、癫痫、精神发育迟缓和由于疾病导致的痴呆。在其它实施方案中，所述导致痴呆的疾病选自：帕金森病、阿尔茨海默病、AIDS、头部创伤、亨廷顿病、匹克氏病、克雅氏病、心脏手术后(疾病)、唐氏综合征、前交通动脉综合征和脑卒中症状。在具体的实施方案中，所述对象具有期望增强的正常的记忆功能。在一些实施方案中，所述施用在直接向所述对象脑部供血的血管中进行。

本公开提供了用于筛选和鉴别化合物的方法，所述化合物调节MALAT-1长非编码RNA在脑细胞中的表达，所述方法包括：a) 使脑细胞与候选试剂接触，并且b) 检测所述MALAT-1长非编码RNA(例如，SEQ ID NO:1的全部或一部分)和/或源自MALAT-1的piRNA (例如，SEQ ID NO:5-22中的一种或多种)的表达水平，其中所述表达水平的提高或降低表明所述候选试剂是MALAT-1长非编码RNA在脑细胞中的调节因子。在某些实施方案中，所述鉴别出的调节因子提高MALAT-1 RNA的表达水平，并且所述方法还包括：将所述鉴别出的MALAT-1长非编码RNA的调节因子施用至实验室动物的脑部，并且测定所述调节因子对所述实验室动物的记忆或学习的影响。在进一步的实施方案中，所述调节因子被鉴别为提高所述动物的记忆和/或学习。在具体的实施方案中，所述脑细胞是神经元或胶质细胞。

在某些实施方案中，本公开提供了用于治疗对象中酒精成瘾(alcoholism)的方法，包括：向所述对象施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物包含MALAT-1反义物(例如，SEQ ID NO: 2-4，或与SEQ ID NO:2-4具有90-99%同一性的序列)，其中所述施用颅内进行或其中所述施用在直接向该对象脑部供血的血管中进行；并且其中所述对象中的酒精成瘾的至少一项属性得到改善。

附图说明

图1显示了实施例1中所用的威胁识别行为测定的示意图。

图2显示了经受条件化恐惧训练(fear conditioning training)的小鼠，当被重新引入到训练环境中时，表现出增加的静止不动(freezing)。

图3显示了小鼠训练(环境 + 电击)后，MALAT1在2小时的表达相比对照(仅环境本身或未接受过实验)有显著提高，与基于行为的学习中的作用相一致。

图4显示了输注MALAT1反义寡核苷酸(ASO)导致在训练后24小时，条件化恐惧模型中的静止不动减少，这表明小鼠在没有MALAT1的情况下没有那样有效地巩固记忆。

图5显示了即刻早期基因(IEG)的基因表达在用MALAT1 ASO处理的小鼠与对照小鼠之间不存在显著改变。在此图中，M = 经malat1 ASO处理的，而P = PBS对照。

图6显示了在经MALAT1 ASO处理的小鼠中，小RNA的丰度有显著增加。

图7显示了相比对照，经MALAT1 ASO处理的小鼠中的DNA甲基化增加。

定义

如本文所用，术语“宿主”、“对象”和“患者”是指任何动物，包括但不限于所研究、分析、测试、诊断或治疗的人和非人动物(例如，狗、猫、牛、马、绵羊、禽类、鱼、甲壳动物等)。除非另外指明，如本文所用，术语“宿主”、“对象”和“患者”可互换使用。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现有益或期望结果的组合物(例如，合成的源自MALAT-1的piRNA)的量。有效量可以在一次或多次施用、应用或剂量中施用，并且并非旨在被限制于特定的制剂或施用途径。

如本文所用，术语“施用(administration)”和“施用(administering)”是指将药品、前药或其它试剂，或治疗性治疗(例如，本发明的组合物)给予对象(例如，对象或体内、体外或离体细胞、组织和器官)的行为。对人体的示例性施用途径可以是：经由脑或脊髓的蛛网膜下方的空间(鞘内)、眼睛(眼部)、嘴(口腔)、皮肤(局部或透皮)、鼻(鼻腔)、肺(吸入)、口腔粘膜(颊面)、耳、直肠、阴道，通过注射(例如，静脉内、皮下、瘤内、腹腔内等)等。

如本文所用，术语“共施用(co-administration)”和“共施用(co-administering)”是指向对象施用至少两种试剂(例如，多种合成的源自MALAT-1的piRNA，或piRNA或抗piRNA分子以及另一种治疗剂)或疗法。在一些实施方案中，两种或更多种试剂或疗法的共施用是同时发生的。在其它实施方案中，第一试剂/疗法先于第二试剂/疗法施用。本领域技术人员理解，所用的各种试剂或疗法的制剂和/或施用途径可有所差别。适用于共施用的剂量可以由本领域技术人员容易地确定。在一些实施方案中，当试剂或疗法被共施用时，试剂或疗法各自以低于适于其单独施用的剂量施用。因此，共施用在如下的实施方案中是特别期望的，其中试剂或疗法的共施用降低潜在有害(例如，有毒的)试剂的必需剂量，和/或，当共施用两种或更多种试剂导致对象对经由与其它试剂共施用的试剂之一的有益效果敏感化时。

如本文所用，术语“治疗”或语法上的等同形式涵盖对疾病(例如，神经退行性疾病)或病况的症状的改善和/或逆转。当用于本发明的筛选方法中时，造成与疾病相关的任何参数的改善的化合物，可由此被鉴别为治疗性化合物。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防预性措施二者。例如，可受益于使用本发明的组合物和方法的治疗的那些人包括已经患有疾病和/或障碍(例如，神经退行性疾病)的那些，以及其中要预防(例如，使用预防性治疗)疾病和/或障碍的那些。

术语“化合物”是指可以用于治疗或预防疾病、病症、病或身体功能障碍的任何化学物质、药物、药品等。化合物包括已知和潜在的治疗性化合物二者。可以通过使用筛选方法筛选来确定化合物是治疗性的。“已知的治疗性化合物”是指已经显示(例如，通过动物试验或对人体施用的先前经验)在此类治疗中有效的治疗性化合物。换言之，已知的治疗性化合物不限于在疾病(例如，神经退行性疾病)治疗中有效的化合物。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂(例如，源自MALAT-1的piRNA)与载体(惰性或活性)的组合，使得所述组合物特别适合于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。

如本文所用，术语“核酸分子”是指任何含有核酸的分子，包括但不限于：DNA或RNA(例如，源自MALAT-1的piRNA)。该术语涵盖包含DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，所述类似物包括但不限于：4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(queosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、氧丁核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。

如本文所用，术语“基因表达”和“表达”是指以下的过程：通过基因的“转录”(即，经由RNA聚合酶的酶促作用)，将基因中编码的遗传信息转换成RNA (例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，并对于编码蛋白质的基因，通过mRNA的“翻译”转换成蛋白质。可以在此过程中的多个阶段调控基因表达。“上调”或“活化”是指增加和/或提高基因表达产物(例如，RNA或蛋白质)的生产的调控，而“下调”或“抑制”是指减少生产的调控。

当术语“分离的”用于核酸相关时，如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中，是指从在其天然来源中，通常与之结合的至少一种组分或污染物中鉴别并分离出的核酸序列。分离的核酸以不同于其在天然所见的形式或设定存在。相比之下，非分离的核酸是处于其天然存在的状态的核酸如DNA和RNA。例如，给定DNA序列(例如，基因)见于宿主细胞染色体上相邻基因的附近；RNA序列，如编码特定蛋白质的特定的mRNA序列，与编码大量蛋白质的许多其它mRNA一起作为混合物而见于细胞中。然而，编码给定蛋白质的分离的核酸包括，譬如，在通常表达该给定蛋白质的细胞中的此核酸，其中该核酸位于不同于天然细胞的染色体位置，或其侧接不同于天然所见的核酸序列。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以单链或双链形式存在。

当术语“合成的”用于核酸分子(例如，piRNA)相关时，是指由人直接(例如，在实验室中)或间接(例如，通过在细胞中表达实验室中制得的构建体)制得的非天然分子。

发明详述

本文提供了用于通过向对象的脑部施用组合物，而改善所述对象中的记忆或认知功能的方法，其中所述组合物包含：i) 化合物，其增加MALAT-1长非编码RNA的表达，ii) MALAT-1长编码RNA核酸序列，或iii) 至少一种源自MALAT-1的piRNA核酸序列。本文还提供了针对其调节MALAT-1长非编码RNA在脑细胞中的表达的能力而筛选候选化合物的方法。在某些实施方案中，还将如此鉴别出的增加表达的调节因子施用到实验室动物的脑部以测定此类调节因子对学习和记忆的影响。

MALAT-l是非编码RNA，其已经表明是肺癌中转移的调控因子(Cancer Res.2013年2月1日;73(3):1180-9, 通过引用并入本文)，其在酒精成瘾者的脑中上调(Kryger, 等人,Alchol, 46, 629-634, 2012, 通过引用并入本文)并且提高肺腺癌细胞的运动性(Tano等人, FEBS Letters, 584:4575-4580, 2010, 通过引用并入本文)。在研发本公开的实施方案过程中所进行的工作表明，MALAT1 RNA在小鼠脑部的海马体中作为小RNA高度表达，所述小RNA通过对来自小鼠海马体细胞的培养物的RNA进行深度序列分析而鉴别出。在用KCI(针对神经元细胞培养物的模拟学习事件)和RG108 (DNMT抑制剂)处理后，表达增加，并且该效果是加成性的，使用KCI和RG108二者处理时观察到最高的表达水平。这与MALAT-l参与学习和记忆形成相符。当在存在或不存在RG108的情况下，用KCI刺激小鼠皮层神经元培养物时，诱导了MALAT-l表达。令人印象深刻的是，脑部CAl区中的MALAT-l表达在条件化恐惧/学习范式之后被诱导。此数据表明，MALAT-l明显参与学习和记忆过程。

在一些实施方案中，本文提供了合成的源自MALAT-1的piRNA分子(例如，SEQ IDNO: 5-22或与SEQ ID NO:5-22具有90-99%序列同一性的序列)。在一些实施方案中，所述piRNA分子包含化学修饰以改善核酸酶稳定性、降低触发先天免疫应答的可能性、降低脱靶效应的发生率、以及/或者相对于非修饰分子改善药效学，以便提高效力和特异性。在一些实施方案中，所述分子被加载到纳米颗粒上，以提供稳定效应(例如，免于核酸酶降解的保护)。这些效应对于旨在治疗脑部的核酸而言特别重要，其中递送困难限制了可到达靶细胞的活性核酸药物的量。可用于该技术的一些实施方案中的合成的piRNA分子中的示例性核苷酸化学修饰(例如，对糖类的修饰)包括以下：硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、4'-硫代-核糖、锁核酸、2'-O-(2'-甲氧基乙基)、2'-O-甲基、2'-氟代、2'-脱氧-2'-氟代-b-D-阿拉伯糖核酸、吗啉代核酸类似物和肽核酸类似物。可采用用于反义寡核苷酸的另外修饰(参见，例如，美国专利公布号2012/0202874和2012/0149755，通过引用以其全文并入本文)。

本文所述的核酸序列(例如，合成的源自MALAT-1的piRNA分子或MALAT-1反义寡核苷酸)的递送可通过任何期望的方法完成。在一些实施方案中，将分子通过鞘内、颅内或在直接通向脑部的血管中递送。在一些实施方案中，采用可植入的、电池供电的药物输注泵的美敦力(Medtronic)输液系统被用于将分子递送至纹状体(Dickinson等人，Neuro.Oncol.12:928-940 (2010)；Sah和Aronin, J. Clin.Invest.121: 500-507(2011))。在一些实施方案中，使用鼻内递送。在一些实施方案中，通过纳米颗粒递送核酸。例如，可使用包含由壳聚糖包被的氧化铁核的颗粒(参见，例如，Veiseh 等人，Adv.DrugDeliv.Rev., 8:582 (2011))。壳聚糖是能够穿过血脑屏障的转胞吞分子。在一些实施方案中，所述颗粒与细胞穿透肽结合以利于将核酸递送到细胞中。在一些实施方案中，内源性纳米颗粒(例如，高密度脂蛋白)被用于递送分子穿过血脑屏障。

在一些实施方案中，化合物和寡核苷酸被直接递送/施用至脑部，例如，通过鞘内注射(例如，在人中)、ICV (例如，在小鼠、大鼠和人中)、侧脑室内注射(进入脑部的脑室系统的注射类型)、或通过直接注射入待调查的特定脑区域。

在一些实施方案中，通过引入合成的寡核苷酸(例如，类似于piRNA或微RNA)上调Malat1表达，所述合成的寡核苷酸改变Malat1启动子的甲基化状态，因而增加转录。

在其它实施方案中，由于Malat1是长非编码RNA，并且它们已经显示对于基因表达具有类似增强子的功能，所以使用增强子以提高Malat1的实际表达(Ørom 等人，Cell.2010年10月1日;143(1):46-58.; 通过引用以其全文并入本文)。

在某些实施方案中，使用锌指重组酶融合蛋白的基因疗法被用于位点特异性地将Malat1的启动子与具有组成型或更高水平表达的启动子交换。在一些实施方案中，例如，使用Tet启动子，并在靶细胞中重组后，通过向对象提供四环素而启动该基因。此方法的一个示例性替代方案是将Malat1基因引入到具有所需表达水平的天然启动子之后。

在一些实施方案中，Malat1的负调控因子的表达被减少和/或抑制，从而增加Malat1的表达。类似地，在某些实施方案中，通过抑制降解途径而减少Malat1的降解。

在开发本文所述的实施方案的过程中所进行的实验已经证实，用KCl刺激细胞(其模拟学习事件)增加Malat1的表达。因此，在一些实施方案中，用强效学习事件刺激Malat1表达。在其它实施方案中，将已显示提高学习的深度脑部刺激(例如，通过植入电极或通过外部经颅直流电刺激)用于刺激Malat1的产生。

在一些实施方案中，施用(例如，外周注射)装载有Malat1 RNA的外来体，其携带外部标志物，所述标志物将外来体引导至期望的脑区(或任何器官)。

在其中组合物被递送穿过血脑屏障的某些实施方案中，所述组合物包含，例如，如例如美国专利号6,372,250 (Pardridge)中所述的脂质体，以及药学上可接受的载体。优选地，所述脂质体为受体特异性脂质体，其中所述受体特异性脂质体包括：具有外表面和内腔室的脂质体；位于所述脂质体的内腔室中的人工腺相关病毒(AAV)载体；一个或多个血脑屏障和脑细胞膜靶向剂；以及一个或多个缀合剂(例如，聚乙二醇(PEG)链)，其中各靶向剂均经由所述缀合剂中的至少一个而被连接至所述脂质体的外表面。在脂质体内腔室中包括人工腺相关病毒(AAV)载体的受体特异性脂质体可以通过美国专利号6,372,250(Pardridge)中所述的一般方法制备，不同之处在于，使用人工腺相关病毒(AAV)载体取代质粒DNA。

本公开提供了用于筛选和鉴别化合物的方法，所述化合物调节MALAT-1长非编码RNA在脑细胞中的表达，所述方法包括：a) 使脑细胞与候选试剂接触，和b) 检测所述MALAT-1长非编码RNA和/或源自MALAT-1的piRNA的表达水平，其中所述表达水平的提高或降低表明所述候选试剂是MALAT-1长非编码RNA在脑细胞中的调节因子。在某些实施方案中，所述鉴别出的调节因子提高MALAT-1 RNA的表达水平，并且所述方法还包括：将所述鉴别出的MALAT-1长非编码RNA的调节因子施用至实验室动物的脑部，并且测定所述调节因子对该实验室动物的记忆或学习的影响。在进一步的实施方案中，所述调节因子被鉴别为提高所述动物的记忆和/或学习。在具体的实施方案中，所述脑细胞是神经元或胶质细胞。

本公开的候选试剂(即，测试化合物)可以，例如，使用本领域已知的组合文库方法中众多方法中的任一种获得，包括：生物文库；类肽(peptoid)文库(具有肽的功能性，但具有新的非肽骨架的分子的文库，所述分子具有酶降解抗性，但依然保持生物活性；参见，例如，Zuckennann 等人，J. Med.Chem.37: 2678-85 (1994))；空间可寻址平行固相或溶液相文库；需要去卷积的合成文库方法；‘一珠一化合物’的文库方法；以及使用亲和层析选择的合成文库方法。一般优选生物文库和类肽文库方法与肽文库一起使用，而其它四种方法适用于化合物的肽、非肽低聚物或小分子文库(Lam (1997) Anticancer Drug Des.12:145)。

用于合成分子文库的方法的实例可见于本领域，例如，在以下中：DeWitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909 (1993)；Erb等人，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 91:11422 (1994); Zuckermann等人，J. Med.Chem.37:2678 (1994)；Cho等人，Science 261:1303 (1993)；Carrell等人，Angew.Chem.Int. Ed.Engl. 33.2059 (1994)；Carell等人，Angew.Chem.Int. Ed.Engl. 33:2061 (1994)；以及Gallop等人，J. Med.Chem.37:1233(1994)。化合物文库可存在于溶液中(例如，Houghten, Biotechniques 13:412-421(1992))，或在珠(Lam, Nature 354:82-84 (1991))、芯片(Fodor, Nature 364:555-556(1993))、细菌或孢子(美国专利号5,223,409; 通过引用并入本文)、质粒(Cull等人，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 89:18651869 (1992))上，或在噬菌体上(Scott和Smith,Science 249:386-390 (1990)；Devlin Science 249:404-406 (1990)；Cwirla等人，Proc.NatI.Acad.Sci.87:6378-6382 (1990)；Felici, J. Mol.Biol.222:301 (1991))。

用于筛选MALAT1靶向化合物的方法可通过基于细胞的测定或无细胞测定进行。

在一些实施方案中，对于无细胞测定，将全长Malat1 RNA连同PIWI蛋白、合成的piRNA以及携带待调查序列的质粒DNA一起提供。在温育后，通过直接测序测定质粒DNA上的甲基化水平，或者如果使用了表达构建体，则通过与相关的RNA聚合酶一起温育并监测RNA转录水平，以测定来自启动子的体外表达水平。

在一些实施方案中，对于基于细胞的测定，使用来自皮质或海马体的原代细胞，或转化的神经元细胞系，来鉴别对于学习和记忆重要的区域。根据需要，使用来自适当组织的其它细胞系来研究表现和效果。细胞铺板并生长至接近汇合。然后，用合成的寡核苷酸(oligos)转染细胞。在一段时间后(例如，2小时-2周)，收获细胞，提取RNA和DNA。将RNA用于，例如，RNA测序实验以鉴别基因表达以及小RNA生产中的变化。DNA被用于以甲基化DNA-测序鉴别DNA甲基化中的变化(例如，现有技术是：用亚硫酸氢盐化学转化DNA，然后在Illumina HiSeq 2500上进行单核苷酸测序)。可选地，使用直接鉴别特定碱基的甲基化的Pacific Biosciences DNA测序技术或类似技术，来直接鉴别DNA甲基化。

实施例

实施例1：MALAT-1参与对学习和记忆的调控

本实施例描述了将非编码RNA MALAT-1鉴别并表征为参与对学习和记忆的调控。

将约9-12周龄的雄性C57BL/6J小鼠(Jackson Laboratories)用于实验。动物在抵达后成对居住并随意饮食。在纳入实验前，给动物至少一周时间适应环境。所有方案均遵守国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南，并且得到阿拉巴马大学伯明翰分校动物护理委员会的批准。在威胁识别学习前，所有动物均经过4天的管理。

将小鼠置于训练室中并给2分钟以探索新环境。2分钟后，小鼠接受以1分钟间隔施用的3次足底电击(0.7 mA, 2秒)，并在移出训练室前允许另外的一分钟用于探索。在训练后1小时，通过快速断头将动物安乐死。在快速断头后立刻以及在海马体、皮质和小脑的大体解剖过程中，将脑部浸没在富氧的(95%/5% O₂/CO₂)冰冷切削液(125 mM NaCl、3 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄、25 mM NaHCO₃、0.5 mM CaCl₂、7 mM MgCl₂、10 mM葡萄糖、0.6mM抗坏血酸盐)中。

静止不动百分比是对动物对于其在特定环境中所接受的经历 (轻度足底电击)的记忆程度的测量。将未接受过实验的动物置于新“环境”中并经历一系列3次的足底电击(1s, 0.5mA)，电击之间间隔2m。24小时后，使动物回到此环境中并测量其保持静止不动的时间量。在这种情况下，相比仅环境，环境加上电击造成静止不动显著增加。在图1示出了威胁识别行为测定的示意图。

使年轻雄性C57B6小鼠经受标准恐惧识别训练方案。这包括将小鼠置于新环境中2m，然后以2分钟的间隔进行3次足底电击(12, 0.5mA)。对照小鼠也被置于该新环境中，但不接受足底电击。然后，使所有的小鼠回到其饲养笼中，待上24小时。然后，将小鼠再次置于所述新环境中，并测量静止不动百分比。静止不动是相比于仅经历环境处理的动物，动物对于诱导恐惧的经历(足底电击)的记忆程度的测量。

如图2中所示，经受条件化恐惧训练的小鼠，当被重新引入到训练环境中时，表现出增加的静止不动。值得注意的是，短语“威胁识别行为训练”的使用等同于“条件化恐惧训练”。“条件化恐惧”是在科学文献中最常使用的术语，而“威胁识别”则是用在军事背景中。

在另外的工作中，使动物经受如上所述相同的训练方案，不同的是，在训练后的不同时间点(30m、2h和24h)处死动物。使用富氧的切削液(高Mg²⁺并且低Ca²⁺以防止兴奋性毒性)，将海马体解剖。随后，从海马体中提取RNA (使用Qiagen miRNeasy试剂盒)。将RNA的等分试样用于内部qPCR以验证Malat-1表达。

图3显示在训练(环境 + 电击)后，MALAT1在2小时的表达相比对照(仅环境或未接受过实验)有显著提高，与基于行为的学习中的作用相一致。训练后24小时，MALAT1表达回到对照的水平。这些结果共同显示，基于活动的学习事件导致MALAT1的时间依赖性增加，与学习和记忆巩固中的作用相一致。

在进一步的工作中，进行了用于反义寡核苷酸(ASO)递送的立体定位手术。将小鼠用异氟烷麻醉并固定在Kopf立体定位装置上。使用以下坐标：(AP -0.2; ML -1.0; DV -2.4)，以1 ul/min的速率将ASO (300ug，以60ug/ul)递送到ICV中，并允许恢复2周。

MALAT1 ASO #1 (SEQ ID NO: 2)通过侧脑室内推(ICVB)注(300ug、180ug或PBS对照)进行注射。在2周的术后恢复后，使动物经受如上所述的条件化恐惧训练，并在24小时后测试恐惧反应。

如图4中所示，MALAT1 ASO的输注导致在训练后24小时，条件化恐惧模型中静止不动减少，这表明小鼠在没有MALAT1的情况下没有那样有效地巩固记忆。小鼠在没有MALAT1的情况下也没有习得电击，这一事实与训练后2小时MALAT1表达增加相符。本实验已经重复三次(在图中以批次标记)；仅示出了批次一、二以及合并的结果。此结果非常显著，因为MALAT1丧失显示了对学习的明显影响。还存在剂量反应，其中300ug导致强于180ug剂量的反应。MALAT1转录物的分子敲低(molecular knockdown) (qPCR)在图4的右下图(300ug 剂量)中得到确认。

在另外的工作中，监测了使用MALAT1 ASO处理的小鼠中的即刻早期基因(IEG)的表达。MALAT1 ASO #1 (SEQ ID NO: 2)通过侧脑室内推(ICVB)注(300ug对比PBS对照)进行注射。在2周的术后恢复后，使动物经受如上所述的条件化恐惧训练。训练后一小时，处死动物，取出海马体，提取RNA并用于经qPCR的基因表达的定量。

RNA提取和qRT-PCR如下进行。使用miRNeasy mini试剂盒(Qiagen)，按照制造商的准则，提取总RNA，并进行额外的无RNase DNase (Qiagen)处理步骤，并洗脱在104 uL无RNase的水中。对于体内研究而言，处理右侧海马体。对于体外研究而言，将纯化的RNA穿过12孔平板的三个孔汇集，以提高测序所需RNA的产量。使用NanoDrop 200c (ThermoScientific)，以分光光度法测定RNA浓度。然后，通过使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)中的寡聚-(dT)和随机六聚体引物，将300 ng的RNA逆转录成cDNA。使用CFX96 Touch实时PCR检测系统(Bio-Rad)，用SSO Advanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)和500 nM跨内含子的引物(表1)，或Taqman Fast Advanced Master Mix和Taqman基因表达测定(Life Technologies)(表2)，进行定量逆转录酶PCR (qRT-PCR)。

表1：所使用的引物。

基因	正义引物 (5’-> 3’)	反义引物 (5’-> 3’)
			Hprt	GGAGTCCTGTTGATGTTGCCAGTA (SEQ ID NO:23)	GGGACGCAGCAACTGACATTTCTA (SEQ ID NO:24)
Fos	AATGGTGAAGACCGTGTCAGGA (SEQ ID NO:25)	TTGATCTGTCTCCGCTTGGAGTGT (SEQ ID NO:26)
			Arc	ACGATCTGGCTTCCTCATTCTGCT (SEQ ID NO:27)	AGGTTCCCTCAGCATCTCTGCTTT (SEQ ID NO:28)
Egr1	AGCGCCTTCAATCCTCAAG (SEQ ID NO:29)	TTTGGCTGGGATAACTCGTC (SEQ ID NO:30)

表2：所使用的Taqman基因表达测定。

基因	产物大小	目录号
			Hprt	65 bp	Mm00446968_m1
Malat-1	124 bp	Mm03958568_s1

使用以下循环条件一式三份进行PCR扩增：95℃ 30秒，然后95℃ 10秒和60℃ 30秒的40个循环，然后进行实时熔融分析以验证产物特异性(SYBR)，或者是50℃ 2分钟，然后是95℃ 20秒，然后95℃ 3秒和60℃ 30秒的40个循环(Taqman)。样品间的差异基因表达通过比较Ct (ΔΔCt)方法测定，使用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hprt)作为内部对照。

已经显示即刻早期基因(IEG)的表达在学习事件后增加。本实施例就其在用MALAT1 ASO处理的小鼠中的表达，监测了典型IEG Arc、Btg2、Dusp1、Egr1、Egr2、Fos、Fosb、Gadd45g、ler2、Junb、Npas4、Nr4a1和Nr4a2的表达。如图5中所示，发现这些IEG的基因表达在用MALAT1 ASO处理的小鼠与对照小鼠之间不存在显著改变。因此，在经MALAT1 ASO处理的小鼠中观察到的学习减少并非由于IEG基因的表达改变所造成。这些结果表明，MALAT1通过尚未在文献中描述的新机制起到提高学习的作用。

在进一步的工作中，在经MALAT1反义寡核苷酸(ASO)处理的小鼠中检查了小RNA的表达水平。在表3中提供了来自MALAT1 (SEQ ID NO:1)的示例性ASO (SEQ ID NO:2-4)。

表3：示例性反义寡核苷酸

分离了来自经MALAT1 ASO处理的小鼠以及对照小鼠的RNA，并对其进行RNA-测序和小RNA测序。针对衔接子污染和低质量序列调整配对末端mRNA读出序列。然后，用Tophat2，将这些与小鼠基因组GRCm38.p2比对，使用经注释的转录物组以指导已知剪接位点间的比对。然后，用Cufflinks处理这些比对，以检测表达的转录物。用cuffmerge，将全部所得GTF文件和参考注释汇集在一起，以构建共有转录物组件，并计算其丰度。小RNA样品得到1x67bp读取项，针对衔接子序列和质量进行调整，并弃去短于15bp的经调整的读出序列。使用Bowtie2，以默认参数，将经调整的读出序列与参照基因组比对。使用ncRNA基因组注释以鉴别已知的小RNA，如miRNA、tRNA、snoRNA等。在剩余的读出序列上进行新的小RNA基因座的检测。miRNA检测使用miRDeep2进行，其使用热力学以鉴别稳定的miRNA发夹结构。其它小RNA和piRNA簇(例如，SEQ ID NO:5-22)的从头检测通过内部脚本进行，所述脚本首先通过计算在相同区域中偶然得到所观察到的读出序列分布的可能性而鉴别转录物。新的和已知基因座一起形成转录物组件，计算其丰度，并鉴别出差异表达的基因座，这使用具有无长度校正标志的cufflinks完成。

如图6中所示，发现在经MALAT1 ASO处理的小鼠中，小RNA的丰度有显著增加。另外，相比对照小鼠，与所表达蛋白的编码基因座具有序列互补性的许多小RNA在Malat1 ASO小鼠中表现出扩增。这些结果与MALAT1通过诱导小RNA (其可以在小RNA的同源编码基因座起到调控作用)或通过序列特异性DNA甲基化而影响学习和记忆巩固相符。

在进一步的工作中，检查了经MALAT1 ASO处理的小鼠中的DNA甲基化水平。MALAT1ASO #1 (SEQ ID NO: 2)通过侧脑室内推(ICVB)注(300ug对比PBS对照)进行注射。2周后，取出海马体，并用Qigen DNA纯化试剂盒纯化DNA。然后，使用来自Epicentre的Epi-Gnome试剂盒(EpiGnome™ Methyl-Seq试剂盒)，对DNA进行亚硫酸氢盐转化。用Illumina测序，通过合成技术对转化的DNA进行测序。针对衔接子污染调整读出序列，连接，并最终针对低质量碱基进行调整。使用Bismark以默认设定进行甲基化调用，其中使读出序列与转化形式的基因组比对，并通过鉴别错配来推断读出序列中甲基化的碱基。然后，从所调用的读出序列中提取甲基化调用，以生成基因组的单bp分辨率甲基化图谱。通过计算与λ对照序列比对的读出序列中甲基化碱基的数量，来估计亚硫酸氢盐转化误差率。此误差率被用作最大似然估计(MLE)模型中的参数，该模型测定具有序列覆盖的基因组中各个胞嘧啶处的甲基化比率。将所有生物复制品的数据汇集，假设具有随机采样的正态分布，测定各位点处的群体甲基化比率。使用配对t检验以鉴别差异甲基化基因，其中各条件之间平均甲基化比率的差异在统计上不同于零。在基因体和侧翼区上计算甲基化概况，使用1kb滑动窗口以使数据足够平滑用于作图。

如图7中所示，发现相比对照，经MALAT1 ASO处理的小鼠中的DNA甲基化增加。相对于对照(P)，MALAT1 ASO小鼠(M)中差异甲基化基因的3'端在CHG和CHH背景中具有增加的甲基化(p=4.686e-09)。这些结果表明，MALAT1在学习过程中的主要作用是在特定基因的基因座增加小RNA并且减少DNA甲基化。小RNA丰度和DNA甲基化的变化负责在条件化恐惧中编码学习和记忆事件。MALAT1可在通过小RNA指令序列特异性DNA甲基化调控记忆的表观编码中起到直接作用。

本申请中提及的所有出版物和专利均通过引用并入本文。本发明所述的方法和组合物的各种修改形式和变型对于本领域技术人员将是显而易见的，并且不脱离本发明的范围和精神。尽管已经结合特定优选实施方案描述了本发明，但应当理解，所要求保护的本发明不应不适当地受限于此类特定实施方案。事实上，所述用于实施本发明的模式的对于相关领域技术人员而言显而易见的各种修改形式均旨在落入以下权利要求书的范围内。

序列表

<110> 艾比斯生物科学公司

Michael, Todd P.

Motley, Stanley T.

<120> 非编码RNA MALAT-1是调控学习和记忆的靶标

<130> ISIS-33961/US-1/PRO

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6982

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

aggcattcag gcagcgagag cagagcagcg tagagcagca cagctgagct cgtgaggcag 60

gagactcagc ccgaggaaat cgcagataag tttttaatta aaaagattga gcagtaaaaa 120

gaattagaac tctaaactta agctaataga gtagcttatc gaaatattac ttagtcttaa 180

taatctaaga agatcttaag agataacatg aaggcttatt taaacagttt gaaaaaggaa 240

atgaggagaa aagtatttgt actgtataat ggaggctgac cagagcagtt taggagattg 300

taaagggagg ttttgtgaag ttctaaaagg ttctagtttg aaggtcggcc ttgtagatta 360

aaacgaaggt tacctaaata gaatctaagt ggcatttaaa acagtaaagt tgtagagaat 420

agtttgaaaa tgaggtgtag ttttaaaaga ttgagaaaag taggttaagt tgacggccgt 480

tataaaaatc cttcgactgg cgcatgtacg tttgaaggca tgagttggaa acagggaaga 540

tggaagtgtt aggctagccg ggcgatggtg gcgcacgcct ttaatcctag cacttgggag 600

gcagaggcag gcggatttct gagttcgagg ccagcctggt ctacagagtg agttccagga 660

cagccagggc tacacagaga aaccctgtct tgaaaaaaca aaaaggttag gctagtattt 720

ggagaaagaa gattagaaaa tggaagtgaa agacgaagaa gacatacagg aaggtgaaga 780

aaaagctgtt agagaagata ggaaaataga agacaaagca tctttagaag acagaaaagg 840

tacttaaagg cacaggtagt aggaagccga agaatagaag atagaaagaa gcaagataga 900

aaaacaaaat ggaagttaag acaactttgg atgccagcat tcaagatagg caaagaagat 960

aagattgagg ccaaaaggtt ggataagata taaagtcaga aggaaattat ctttaaagcc 1020

ataagttcaa atttctgatg gagcgagcag tttagaagag tctttagaca gccacataca 1080

agattgaagc tagcaatcaa agctactagg actgaagtaa aaagttaagg cagaatgcct 1140

ttgaagagtt agaagaatat taaaagcctt aacttgtagc ttaattttgc ttgatgacaa 1200

aaggactttt gataacagtt tcaagattgt cagcattttg cattggactt gagctgaggt 1260

gcttttaaaa tcctaacgac tagcattggc agctgaccca ggtctacaca gaagtgcatt 1320

cagtgaacta ggaagacagg agcggcagac aggagtcccg aagccagttt ggtgaagcta 1380

ggaaggactg aggagccagc agcagcagtg catggtgaag atagcccagg aaagagtgcg 1440

gttcggtgga ggaagctagg aagaaggagc catacggatg tggtggtgaa gctgggaaag 1500

ggttccagga tggtggagcg agagcgagtt ggtgatgaag ctagctggcg gcttggcttg 1560

tcaactgcgc ggaggaggcg agcaggcatt gtggagagga tagatagcgg ctcctagacc 1620

agcatgccag tgtgcaagaa aggctgcagg gagagcatgc ggtgcggtaa cattccttga 1680

ggtcggcaac atggtggtgg ttttctgtaa cttggatggt aacttgttta ctttgtctta 1740

atagttatgg gggagttgta ggcttctgtg taaagagata tatctggggc tgtatgtagg 1800

cctttgcggg tgttgtaggt ttttcttttt cagggttatg tcctcttgca tcttgtcaga 1860

agcttttgag ggctgactgc caaggcccag aaagaagaat ggtagatggc aagttgtctt 1920

taaccgctca gaggggaatg aatggtagag ccagcacaac ctcccagttt tgtaagacgt 1980

tgtagtttga acagatgacc taccacaagc ctcactcctg tgtaggggag gtaattgggc 2040

aaagtgcttt tgggggaatg ggggcaaaat atattttgag ttcttttccc cttaggtctg 2100

tctagaatcc taaaggcaga tgactcaagg gaaccagaaa aaaggaaatc cactctcagg 2160

ataagcagag ctcgccaggt ttacagtttg taggaagtag aggatggatg ctagctttca 2220

cactgagtgt ggaggagctg gccatggcgg aattgctggt agtttactct ttccccctcc 2280

cttaatgaga tttgtaaaat cctaaacact tttacttgaa atatttggga gtggtcttaa 2340

cagggaggag tgggtggggg aaacgttttt tttctaagat tttccacaga tgctatagtt 2400

gtgttgacac actgggttag agaaggcgtg tactgctatg ctgttggcac gacaccttca 2460

gggactggag ctgccttttg tccttggaag agttttccca gttgccgctg aagtcagcac 2520

agtgcggctt tggttcacag tcacctcagg agaacctcag gagcttggct aggccagagg 2580

ttgaagttaa gttttacagc accgtgattt aaaatatttc attaaagggg aggggtaaaa 2640

cttagttggc tgtggccttg tgtttgggtg ggtgggggtg ttaggtaatt gtttagttta 2700

tgatttcaga taatcatacc agagaactta aatatttgga aaaacaggaa atctcagctt 2760

tcaagttggc aagtaactcc caatccagtt tttgcttctt ttttcctttt tctttttttg 2820

aggcgggcag ctaaggaagg ttggttcctc tgccggtccc tcgaaagcgt agggcttggg 2880

ggttggtctg gtccactggg atgatgtgat gctacagtgg ggactcttct gaagctgttg 2940

gatgaatata gattgtagtg tgtggttctc ttttgaaatt tttttcaggt gacttaatgt 3000

atcttaataa ctactatagg aacaaaggaa gtggctttaa tgaccctgaa ggaatttctt 3060

ctggtgatag cttttatatt atcaagtaag agatactatc tcagttttgt ataagcaagt 3120

ctttttccta gtgtaggaga aatgattttc cttgtgacta aacaagatgt aaaggtatgc 3180

tttttttctt cttgtgcatt gtatacttgt gtttatttgt aacttataat ttaagaatta 3240

tgataattca gcctgaatgt cttttagagg gtgggctttt gttgatgagg gaggggaaac 3300

cttttttttt ctgtagacct ttttcagata acaccatctg agtcataacc agcctggcag 3360

tgtgatgacg tagatgcaga gggagcagct ccttggtgaa tgagtgataa gtaaaggcag 3420

aaaaaataat gtcatgtctc catggggaat gagcatgagc cagagattgt tcctactgat 3480

gaaaagctgc atatgcaaaa atttaagcaa atgaaagcaa ccagtataaa gttatggcaa 3540

tacctttaaa agttatggct tatctaccaa gctttatcca caaaagtaaa gaattgatga 3600

aaaacagtga agatcaaatg ttcatctcaa aactgctttt acaaaagcag aatagaaatg 3660

aagtgaaaat gctgcattaa gcctggagta aaaagaagct gagcttgttg agatgagtgg 3720

gatcgagcgg ctgcgaggcg gtgcagtgtg ccaatgtttc gtttgcctca gacaggtttc 3780

tcttcataag cagaagagtt gcttcattcc atctcggagc aggaaacagc agactgctgt 3840

tgacagataa gtgtaacttg gatctgcagt attgcatgtt agggatagat aagtgccttt 3900

tttctctttt tccaaaaaga cctgtagagc tgttgaatgt ttgcagctgg cccctcttag 3960

gcagttcaga attttgagta gttttcccat ccagcctctt aaaaattcct aagccttgca 4020

ccgatgggct ttcatgatgg gatagctaat aggcttttgc atcgtaaact tcaacacaaa 4080

agcctacatg attaatgcct actttaatta cattgcttac aagattaagg aatctttatc 4140

ttgaagaccc catgaaaggg atcattatgt gctgaaaatt agatgttcat attgctaaaa 4200

tttaaatgtg ctccaatgta cttgtgctta aaatcattaa attatacaaa ttaataaaat 4260

acttcactag agaatgtatg tatttagaag gctgtctcct tatttaaata aagtcttgtt 4320

tgttgtctgt agttagtgtg ggcaattttg gggggatgtt cttctctaat cttttcagaa 4380

acttgacttc gaacacttaa gtggaccaga tcaggatttg agccagaaga ccgaaattaa 4440

ctttaaggca ggaaagacaa attttattct ccatgcagtg atgagcattt aataattgca 4500

ggcctggcat agaggccgtc taactaagga ctaagtacct taggcaggtg ggagatgatg 4560

gtcagagtaa aaggtaacta catattttgt ttccagaaag tcaggggtct aatttgacca 4620

tggctaaaca tctagggtaa gacacttttc ccccacattt ccaaatatgc atgttgagtt 4680

taaatgctta cgatcatctc atccacttta gccttttgtc acctcacttg agccacgagt 4740

ggggtcaggc atgtgggttt aaagagtttt cctttgcaga gcctcatttc atccttcatg 4800

gagctgctca ggactttgca tataagcgct tgcctctgtc ttctgttctg ctagtgagtg 4860

tgtgatgtga gaccttgcag tgagtttgtt tttcctggaa tgtggaggga gggggggatg 4920

gggcttactt gttctagctt tttttttaca gaccacacag aatgcaggtg tcttgacttc 4980

aggtcatgtc tgttctttgg caagtaatat gtgcagtact gttccaatct gctgctatta 5040

gaatgcattg tgacgcgact ggagtatgat taaagaaagt tgtgtttccc caagtgtttg 5100

gagtagtggt tgttggagga aaagccatga gtaacaggct gagtgttgag gaaatggctc 5160

tctgcagctt taagtaaccc gtgtttgtga ttggagccga gtccctttgc tgtgctgcct 5220

taggtaaatg tttttgttca tttctggtga ggggggttgg gagcactgaa gcctttagtc 5280

tcttccagat tcaacttaaa atctgacaag aaataaatca gacaagcaac attcttgaag 5340

aaattttaac tggcaagtgg aaatgttttg aacagttccg tggtctttag tgcattatct 5400

ttgtgtaggt gttctctctc ccctcccttg gtcttaattc ttacatgcag gaacattgac 5460

aacagcagac atctatctat tcaaggggcc agagaatcca gacccagtaa ggaaaaatag 5520

cccatttact ttaaatcgat aagtgaagca gacatgccat tttcagtgtg gggattggga 5580

agccctagtt ctttcagatg tacttcagac tgtagaagga gcttccagtt gaattgaaat 5640

tcaccagtgg acaaaatgag gacaacaggt gaacgagcct tttcttgttt aagattagct 5700

actggtaatc tagtgttgaa tcctctccag cttcatgctg gagcagctag catgtgatgt 5760

aatgttggcc ttggggtgga ggggtgaggt gggcgctaag ccttttttta agatttttca 5820

ggtacccctc actaaaggca ctgaaggctt aatgtaggac agcggagcct tcctgtgtgg 5880

caagaatcaa gcaagcagta ttgtatcgag accaaagtgg tatcatggtc ggttttgatt 5940

agcagtgggg actaccctac cgtaacacct tgttggaatt gaagcatcca aagaaaatac 6000

ttgagaggcc ctgggcttgt tttaacatct ggaaaaaagg ctgtttttat agcagcggtt 6060

accagcccaa acctcaagtt gtgcttgcag gggagggaaa agggggaaag cgggcaacca 6120

gtttccccag cttttccaga atcctgttac aaggtctccc cacaagtgat ttctctgcca 6180

catcgccacc atgggccttt ggcctaatca cagacccttc acccctcacc ttgatgcagc 6240

cagtagctgg atccttgagg tcacgttgca tatcggtttc aaggtaacca tggtgccaag 6300

gtcctgtggg ttgcaccaga aaaggccatc aattttcccc ttgcctgtaa tttaacatta 6360

aaaccatagc taagatgttt tatacatagc acctatgcag agtaaacaaa ccagtatggg 6420

tatagtatgt ttgataccag tgctgggtgg gaatgtagga agtcggatga aaagcaagcc 6480

tttgtaggaa gttgttgggg tgggattgca aaaattctct gctaagactt tttcaggtgg 6540

acataacaga cttggccaag ctagcatctt agtggaagca gattcgtcag tagggttgta 6600

aaggtttttc ttttcctgag aaaacaacct tttgttttct caggttttgc tttttggcct 6660

ttccctagct ttaaaaaaaa aaaagcaaaa gacgctggtg gctggcactc ctggtttcca 6720

ggacggggtt caagtccctg cggtgtcttt gcttgactct tatatcatga ggccattaca 6780

tttttcttgg agggttctaa aggctctggg tatggtagct gatatcactg gaacactccc 6840

cagcctcagt gttgaactct tgataattaa ctgcattgtc tttcaggtta tgcccaattc 6900

gtcttattac ctctgagtcg acacacctcc tactatttat tgaatacttt gattttatga 6960

aataaaaact aaatatctct ca 6982

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

gccaggctgg ttatgactca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

cggtgcaagg cttaggaatt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

gggtcagctg ccaatgctag 20

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

tgaaccccgt cctggaaacc aggagtgcca gccacca 37

<210> 6

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

aagatgctag cttggccaag tctgttatgt ccacctgaaa aagtcttagc agagaatttt 60

tgcaatccca ccccaacaac ttcctacaaa 90

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

catccgactt cctacattcc cacccagcac t 31

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

cagccttttt tccagatgtt aaaacaagcc cagggcctct caagtatt 48

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

cacatcacac actcactagc agaacagaag acagaggca 39

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

gacaaaaggc taaagtggat gagatgatcg taagc 35

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

tcggtcttct ggctcaaatc ctgatctggt ccac 34

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

tgcccacact aactacagac aacaaacaa 29

<210> 13

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

aagaggctgg atgggaaaac tactcaaaat tctgaactgc ctaagagggg ccagctgcaa 60

acattcaaca gctctacagg tctt 84

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

catcagtagg aacaatctct ggctcatgct cattccccat 40

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

caccaaggag ctgctccctc tgcatctacg tcatcacact gccaggct 48

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

aaggcagctc cagtccctga aggtgtcgtg ccaacagcat 40

<210> 17

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

catcctctac ttcctacaaa ctgtaaacct ggcgagctct gcttatcctg agagtggatt 60

tccttttttc tggttccctt gagtcat 87

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

acacagaagc ctacaactcc cccataacta tta 33

<210> 19

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

cactgctgct gctggctcct cagtccttcc tagcttcacc aaactggctt cgggactcct 60

gtctgccgct cctgtcttcc tagtt 85

<210> 20

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

tgtcttctat tttcctatct tctctaacag ctttttcttc accttcctgt atgtcttctt 60

cgtctttcac ttccattttc taatcttctt tctccaaata ctagcctaac cttt 114

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

tccctgtttc caactcatgc cttcaaacgt acatgcgcca gtcgaa 46

<210> 22

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 22

agtctcctgc ctcacgagct cagctgtgct gctctacgct gctctgctct cgctgcctga 60

a 61

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 23

ggagtcctgt tgatgttgcc agta 24

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 24

gggacgcagc aactgacatt tcta 24

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

aatggtgaag accgtgtcag ga 22

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 26

ttgatctgtc tccgcttgga gtgt 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 27

acgatctggc ttcctcattc tgct 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 28

aggttccctc agcatctctg cttt 24

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 29

agcgccttca atcctcaag 19

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 30

tttggctggg ataactcgtc 20

Claims

1.用于改善对象中的记忆或认知功能的方法，包括：

向所述对象施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物增加转移相关肺腺癌转录物1(MALAT-1)长非编码RNA在所述对象的神经系统细胞中的表达，

其中所述施用颅内进行，或其中所述施用在直接向所述对象脑部供血的血管中进行；

其中所述组合物包含以下的至少一种：

i) 化合物，其增加MALAT-1长非编码RNA在所述细胞中的表达，

ii) 第一核酸序列，其包含所述MALAT-1长编码RNA，或第一表达载体，其编码所述第一核酸序列；或

iii) 第二核酸序列，其编码至少一种源自MALAT-1的piRNA序列，或第二表达载体，其编码所述第二核酸序列；并且

其中所述记忆或认知功能的至少一项属性得到改善。

2.权利要求1的方法，其中所述对象患有其中以陈述性记忆减退为症状的疾病。

3.权利要求1的方法，其中所述分子为KCl或DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂。

4.权利要求3的方法，其中所述DNMT抑制剂包括RG108。

5.权利要求1的方法，其中所述第一和/或第二表达载体包括：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒或DNA质粒。

6.权利要求1的方法，其中所述组合物经由颅内接入装置通过颅内递送而向所述对象施用。

7.权利要求6的方法，还包括步骤：在所述对象的脑部之外植入泵，其中所述泵与所述颅内接入装置的近端相连。

8.权利要求6的方法，其中所述颅内接入装置包括颅内导管。

9.权利要求1的方法，其中所述第一和/或第二核酸分子包含化学修饰，所述化学修饰改善以下中的一项或多项或全部：核酸酶稳定性、触发先天免疫应答的可能性降低、降低脱靶效应的发生率、以及相对于非修饰核酸的改善的药效学。

10.权利要求9的方法，其中所述至少一种化学修饰选自：硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯、4'-硫代-核糖、锁核酸、2'-O-(2'-甲氧基乙基)、2'-O-甲基、2'-氟代、2'-脱氧-2'-氟代-b-D-阿拉伯糖核酸、吗啉代核酸类似物和肽核酸类似物。

11.权利要求1的方法，其中所述第一和/或第二核酸序列连接至纳米颗粒或位于其内部，所述纳米颗粒经配置以用于穿过血脑屏障。

12.权利要求1的方法，其中所述纳米颗粒包括脂质体。

13.权利要求1的方法，其中所述组合物被递送至迈纳特基底核、大脑皮层或海马体。

14.权利要求1的方法，其中所述对象患有阿尔茨海默病和/或年龄相关的记忆减退。

15.权利要求1的方法，其中所述对象患有记忆障碍。

16.权利要求15的方法，其中所述记忆障碍选自：毒物暴露、脑损伤、年龄相关的记忆障碍、轻度认知障碍、癫痫、精神发育迟缓和由于疾病导致的痴呆。

17.权利要求16的方法，其中所述导致痴呆的疾病选自：帕金森病、阿尔茨海默病、AIDS、头部创伤、亨廷顿病、匹克氏病、克雅氏病、心脏手术后疾病、唐氏综合征、前交通动脉综合征和脑卒中症状。

18.权利要求1的方法，其中所述对象具有期望增强的正常的记忆功能。

19.权利要求1的方法，其中所述施用在直接向所述对象脑部供血的血管中进行。

20.鉴别在脑细胞中调节MALAT-1长非编码RNA的化合物的方法，包括：

a) 使脑细胞与候选试剂接触，并且

b) 检测所述MALAT-1长非编码RNA和/或源自MALAT-1的piRNA的表达水平，

其中所述表达水平的提高或降低表明所述候选试剂是MALAT-1长非编码RNA在脑细胞中的调节因子。

21.权利要求20的方法，其中所述调节因子提高所述表达水平，并且其中所述方法还包括：将MALAT-1长非编码RNA的所述调节因子施用至实验室动物的脑部，并且测定所述调节因子对所述实验室动物的记忆或学习的影响。

22.权利要求21的方法，其中所述调节因子被鉴别为提高所述动物的记忆和/或学习。

23.权利要求20的方法，其中所述脑细胞是神经元或胶质细胞。

24.用于治疗对象中的酒精成瘾的方法，包括：

向所述对象施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物包含MALAT-1反义物，

其中所述施用颅内进行，或其中所述施用在直接向所述对象脑部供血的血管中进行；并且

其中所述对象中的酒精成瘾的至少一项属性得到改善。