CN111356452A - 用于治疗神经病况的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开用于利用N‑甲基‑D‑天冬氨酸受体(NMDAR)的抑制剂治疗例如自闭症(ASD)、智力障碍或癫痫症的幼年发病神经病况的方法。所述抑制剂可以是硝基突触素或其衍生物。

Description

用于治疗神经病况的方法和组合物
交叉引用
本申请要求在2017年8月1日提交的美国临时专利申请第62/539,549号的权益，所述美国临时专利申请的全部内容通过引用的方式并入本文。
背景技术
在大脑中，肌细胞增强因子2(MEF2)转录对于神经元分化、突触形成和神经元存活至关重要。已经证明，在表达巢蛋白的神经祖细胞中Mef2c的条件性基因敲除使小鼠具有受损的电生理网络特性和行为缺陷，使人联想到瑞特(Rett)综合征，一种与ASD相关的神经病症。染色体5q14.3q15微缺失区域导致儿童具有被识别为MEF2C单倍剂量不足的神经缺陷表型。这些患者表现出的征象和症状包括ASD、智力和发育障碍(IDD)、不良的相互行为、缺乏言语、刻板和重复性行为，以及癫痫症。由MEF2C单倍剂量不足引起的病症统称为MEF2C单倍剂量不足综合征(MCHS)。另外，在具有共同世系的人类谱系中，多个MEF2靶基因已被识别为自闭症相关的基因。
发明内容
在一些方面，本文公开了利用N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受体(NMDAR)的抑制剂治疗对其有需要的受试者的幼年发病神经病况的方法。在一些情况下，NMDAR的抑制剂包含硝基突触素(NitroSynapsin)。在一些情况下，NMDAR的抑制剂是硝基突触素。在一些情况下，NMDAR的抑制剂是式I化合物或其医药学上可接受的盐：
Figure BDA0002433345300000011
其中
每个R1独立地选自-CH3和-CH2CH3；并且
R2选自氢和-ONO2。
在一些情况下，每个R1为-CH2CH3，并且R2为-ONO2。在一些情况下，NMDAR的抑制剂是式II化合物或其医药学上可接受的盐：
Figure BDA0002433345300000021
其中
每个R1独立地选自氢、C1-C6烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；
R2选自氢、C1-C6烷基和-ONO2；
R3和R4各自独立地选自氢和C1-C6烷基；
或R3和R4与它们所附接的氮原子一起形成杂环烷基。
在一些情况下，R3和R4各自为氢。在一些情况下，R2选自氢和-ONO2。在一些情况下，R2为-ONO2。在一些情况下，每个R1独立地为C1-C6烷基。在一些情况下，每个R1独立地选自甲基和乙基。在一些情况下，每个R1为乙基。在一些情况下，幼年发病神经病况是智力和发育障碍。在一些情况下，幼年发病神经病况是自闭症谱系病症(ASD)。在一些情况下，幼年发病神经病况包含癫痫症。在一些情况下，幼年发病神经病况是结节性硬化症。在一些情况下，幼年发病神经病况是自闭症。在一些情况下，幼年发病神经病况是瑞特综合征。在一些情况下，受试者是儿童。在一些情况下，受试者是MEF2C单倍剂量不足的，并且患有MEF2C单倍剂量不足综合征(MCHS)。在一些情况下，基于选自MEF2C、SLC32A1、SLC17A6、SYP和GAD65中的至少一种基因的表达水平来针对治疗选择受试者。在一些情况下，表达水平是受试者的细胞的表达水平。在一些情况下，表达水平是受试者的大脑中的细胞的表达水平。在一些情况下，表达水平是受试者的循环细胞的表达水平。在一些情况下，表达水平是mRNA表达水平。在一些情况下，表达水平是蛋白质表达水平。在一些情况下，受试者患有MEF2C单倍剂量不足。在一些情况下，基因是SLC32A1，并且表达水平相对于包含MEF2C基因的两个拷贝的普通受试者的表达水平显著降低。在一些情况下，基因是SLC17A6，并且表达水平相对于包含MEF2C基因的两个拷贝的普通受试者的表达水平显著增加。在一些情况下，基因是SYP，并且表达水平相对于包含MEF2C基因的两个拷贝的普通受试者的表达水平显著降低。在一些情况下，基因是GAD65，并且表达水平相对于包含MEF2C基因的两个拷贝的普通受试者的表达水平显著降低。
附图说明
图1示出Mef2c单倍剂量不足的概要图，所述Mef2c单倍剂量不足导致通过硝基突触素(也称为硝基美金刚YQW-036或NMI-6979)修复的E/I不平衡和MCHS样表型。
图2示出MEF2C蛋白质水平在MEF2C-het大脑中降低。与WT相比，前脑组织裂解物的免疫印迹法示出MEF2C在Mef2c-het小鼠中降低。蛋白质水平归一化为β-肌动蛋白(对照％)。在底部处示出代表性印迹。值为平均值+s.e.m.，n＝5；通过斯图登氏t检验，**P<0.01。
图3示出Mef2c-het小鼠显示MCHS样表型。图3A示出Mef2c-het小鼠过早死亡。与WT小鼠相比，Mef2c-het的数量在E18处几乎相等，但到成年(～3个月)时为WT的数量的～45％(通过卡方检验，*P<0.05)。图3B和图3C示出在训练期间(图3B)和关于随后的探针测试(图3C)，在Mef2c-het小鼠的巴恩斯迷宫中受损的空间学习和记忆。图3D和图3E示出在孔板探查中Mef2c-het小鼠的增加的爪子紧握(图3D)和重复的头浸入(图3E)。数据为平均值±s.e.m.；在图3B、图C和图E中，每个基因型n＝9-11个小鼠；n＝30(WT)和21(het)(以天为单位)；n.s.不显著，通过斯图登氏t检验(图3C-E)或方差分析(图3B)，*P<0.05，**P<0.01。
图4示出通过微阵列分析在Mef2c-het小鼠中神经性和突触基因的下调。图4A示出火山图，其示出产后30天(P)Mef2c-het和WT海马体中的RNA表达谱(红色＝向上，蓝色＝向下，通过绿色线指示，P<0.05)。[注意：在引用颜色的图4和后续图5-19中，彩色图像显现在我们的出版物中：Tu S,Lipton SA,Nakanishi N等人用于人类自闭症的小鼠MEF2C单倍剂量不足模型的硝基突触素疗法(NitroSynapsin therapy for the mouse MEF2Chaploinsufficiency model of human autism).《自然通讯(Nature Commun)》8,1488(2017)]。图4B示出使用NextBio和基因本体论(Gene-Ontology)(GO-术语)过滤，相对于WT，在Mef2c-het中具有显著改变的表达的所有基因的途径富集分析。图4C示出qPCR实验的图示，其示出以WT对照的百分比形式(对照％；每组n＝4)的Mef2c-het小鼠中mRNA的表达水平(相对于18S)。数据为平均值±s.e.m.；通过斯图登氏t检验，*P<0.05，**P<0.01。
图5示出Mef2c-het小鼠表现出异常的神经元特性。图5A示出免疫组织化学，其示出WT和Mef2c-het小鼠的齿状回(DG)中的NeuN+细胞。图5B呈现量化，其示出相对于WT，在Mef2c-het小鼠中海马体(hipp)和皮质(Ctx)中的NeuN+细胞计数降低。针对DG的分子层中的颗粒细胞获得海马体测量，并且针对额叶层IV和V获得皮质测量。图5C和图5D示出与Mef2c-het小鼠中的星形细胞增生相一致的GFAP+细胞的数量的增加。图5E示出通过WT和Mef2c-het小鼠的视觉皮质的V1(初级视觉皮质)、M2ML(次级视觉皮质中间外侧区域)和LPtA(外侧顶骨联络皮质)中的高尔基体染色可视化的代表性树突的neurolucida图。图5F和图5G示出Sholl分析的概要图，其示出Mef2c-het神经元中树突交叉点的累积数量(图5F)和树突长度(图5G)的减少。比例尺：50μm。数据为平均值±s.e.m.；每组n＝4。在图5A-D中通过斯图登氏t检验并且在图5F和图5G中通过方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
图6示出Mef2c-het小鼠表现出异常成年神经发生。图6A共聚焦图像示出在8周龄的WT和Mef2c-het小鼠中DG的颗粒下层(SGZ)中PCNA(绿色)和DCX(红色)双重染色。图6B和图6C示出PCNA+和DCX+细胞的量化揭示了Mef2c-het DG中增殖细胞(图6B)和发育中的神经元(图6C)的数量减少。图6D示出在8周龄的WT和Mef2c-het小鼠中注射BrdU后4周，BrdU(绿色)和NeuN(红色)双重染色揭示了新生的DG神经元(箭头：BrdU+/NeuN+)。图6E示出在Mef2c-het DG中BrdU+/NeuN+细胞的减少；在A-E图区中每个基因型n＝4个小鼠。图6F示出在成年Mef2c-het和WT小鼠中生出的神经元形态发育的实例。通过逆转录病毒介导的基因转导，用mCherry标记齿状回(DG)中的分裂细胞。4周后处死小鼠。图6G示出4周龄神经元的总树突长度的量化揭示了与WT小鼠(n＝12)相比，在Mef2c-het小鼠(n＝17)中树突长度减少。图6H示出量化，其示出与WT小鼠(n＝28)相比，在Mef2c-het小鼠(n＝71)中体细胞大小减小。图6I示出神经突数量的量化，其示出与WT大脑相比，在Mef2c-het中4周龄神经元的初级神经突(nWT＝25，nHet＝55)的数量正常，但是次级(nWT＝25，nHet＝55)、三级(nWT＝25，nHet＝55)、四级(nWT＝12，nHet＝17)和五级(nWT＝12，nHet＝17)神经突的数量减少。切片厚度：40μm。比例尺：50μm。值为平均值±s.e.m.，通过斯图登氏t检验，*P<0.05；***P<0.001。
图7示出Mef2c-het小鼠表现出在突触神经传递中改变的突触特性和兴奋性/抑制性(E/I)不平衡。图7A示出在WT和Mef2c-het海马体中突触体素(SYP)、VGLUT1和VGAT的免疫组织化学。比例尺：500μm(顶部图区)、50μm(中间和底部图区)。图7B示出在Mef2c-het海马体的齿状回(DG)和CA1区域中SYP的免疫反应性降低，但在皮质(Ctx)或纹状体(str，左侧)中却未降低。在分子层、锥体细胞层中的CA1、额叶皮质层IV和VI中的Ctx以及在伏核水平的硬膜中执行DG测量。在Mef2c-het海马体(右侧)中VGAT表达降低，但VGLUT1表达未降低。数据为平均值±s.e.m.，每组n＝4；通过斯图登氏t检验，*P<0.05，**P<0.01。图7C和图7D示出来自WT和Mef2c-het小鼠的DG神经元的切片记录的mIPSC(图7C)和微小兴奋性突触后电流(mEPSC)(图7D)的代表轨迹。图7E-H示出微小抑制性突触后电流(mIPSC)和mEPSC幅度以及事件间隔的累积图。每个基因型n＝7-9；通过两个样品柯尔莫哥罗夫-斯米尔诺夫检验，**P<0.01。
图8示出Mef2c-het小鼠表达在海马体中突触蛋白质的改变的水平。图8A示出突触体富集的海马体裂解物的免疫印迹，其示出在Mef2c-het小鼠中突触体素(SYP)和GAD65降低，但VGLUT1未降低。蛋白质水平归一化为α-微管蛋白(对照％)。在底部处示出代表性印迹。图8B示出VGLUT1与GAD65的比率。图8C示出突触体富集的海马体裂解物的免疫印迹，其示出在Mef2c-het小鼠中归一化为α-微管蛋白的VGLUT2增加。在底部处示出代表性印迹。数据为平均值+s.e.m.，每个基因型n＝4；*P<0.05，**P<0.01。统计显著性由斯图登氏t检验确定。
图9示出Mef2c-het小鼠在大脑切片记录中表现出海马体长期增强(LTP)和配对脉冲促进(PPF)受损。图9A和图9B示出Mef2c-het小鼠示出LTP受损(图9A)和PPF降低(图9B)。在图示下方示出代表性迹线。数据为平均值±s.e.m.，每个基因型n＝5-9。通过方差分析(图9A，*P<0.01)或符号检验(图9B，*P<0.05)确定统计显著性。
图10示出在Mef2c-het小鼠中硝基突触素修复的MCHS样表型。图10A示出在莫里斯水迷宫中的训练环节期间发现隐藏平台的潜伏期。图10B示出探针测试的结果。媒剂治疗的Mef2c-het小鼠(Het/V)示出在目标和相对象限之间无偏好，表明记忆力受损。利用硝基突触素(N)进行治疗修复了此影响(Het/N)。在底部处示出代表性的游动图案。图10C和图10D示出开阔场地测试；Het/V小鼠表现出增加的中央时间，其通过用N治疗得以修复(图10C)。相比之下，Het/V小鼠显示出正常的总活性(图10D)。图10E示出Het/V小鼠显示出每个孔的头浸入增加，表明重复性行为。每种药物修复。图10F-1示出N治疗修复了Mef2c-het小鼠的异常社交能力。图10E示出三腔室社交能力测试中的小鼠移动的代表性轨迹。图10G-I示出Mef2c-het小鼠(Het/V)表现出在社交互动(所述社交互动通过在每个腔室中花费的时间来测量)(图10G)；访问E(空)或S1(陌生小鼠1)腔室的次数(图10H)和进行所述访问的持续时间(图10I)方面的异常。N治疗改善此缺陷(Het/N)。M：中间腔室。数据为平均值±s.e.m.，每组n＝7-9。通过方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
图11示出Mef2c杂合性和硝基突触素治疗都不改变小鼠在莫里斯水迷宫中的游动速度。在莫里斯水迷宫训练阶段期间小鼠逃离到隐藏平台的速度计算为距离除以潜伏期。与到平台的潜伏期不同(参见图10)，三组小鼠(WT/V、Het/V和Het/N)的速度没有显著差异。数据为平均值±s.e.m.，每组n＝7-9。
图12示出硝基突触素比美金刚在修复Mef2c-het小鼠的神经缺陷方面更有效。图12A呈现了概要图，其示出在三腔室社交互动测试中，用硝基突触素(N)治疗的Mef2c-het小鼠的社交访问次数明显大于经美金刚(M)治疗的小鼠的社交访问次数。社交访问构成了用陌生小鼠(S1)访问腔室的次数减去访问空腔室(E)的次数。数据为平均值+s.e.m.，每组n＝7-9；通过斯图登氏t检验，*P<0.05。图12B呈现概要图，其示出用硝基突触素(N)而非美金刚(M)治疗的Mef2c-het小鼠中海马体NeuN+细胞的数目显著大于经媒剂(V)治疗的小鼠中的海马体NeuN+细胞的数目。数据为平均值+s.e.m.，每组n＝4-5；通过方差分析，**P<0.01。
图13示出在三腔室测定中，硝基突触素(N)治疗未改变WT小鼠的社交行为。概要图示出在用媒剂(V)或硝基突触素(N)治疗3个月后WT小鼠在三个腔室中的时间(图13A)、访问的次数(图13B)和访问的持续时间(图13C)。硝基突触素治疗未显著改变WT小鼠的社交行为。数据为平均值+s.e.m.，对于WT/V和WT/N组分别为n＝10。E：空腔室；S1：陌生小鼠1腔室。通过方差分析或t检验，与E相比，*P<0.05并且**P<0.01。
图14示出除了未通过硝基突触素修复的爪子紧握之外，Mef2c-het小鼠未表现出异常运动行为。概要图示出用媒剂(V)或硝基突触素(N)治疗3个月后WT和Mef2c-het小鼠的运动行为。Mef2c-het小鼠在平衡木(图14A)、圆柱形棒(图14B)、牵引能力(图14C)、悬浮测试(图14D)或垂直杆测试(图14E)上未表现出明显改变的行为。在这些实验中，硝基突触素的治疗对WT或Mef2c-het小鼠的行为无明显影响。通过硝基突触素治疗未修复在Mef2c-het小鼠中观察到的异常的爪子紧握活性(图14F)。数据为平均值+s.e.m.，对于WT/V、WT/N、Het/V和Het/N组分别为n＝12、5、11和13。通过方差分析，与WT/V相比，*P<0.05。
图15示出硝基突触素修复Mef2c-het小鼠中的异常的神经元和突触特性。图15A示出用媒剂(V)或硝基突触素(N)治疗的WT和Mef2c-het小鼠的海马体齿状回(DG)的分子层(ML)中的NeuN、VGLUT1、VGAT和VGLUT2的免疫组织化学图像。比例尺：500μm(顶部图区)、25μm(中间图区)、40μm(底部图区)。图15B-F呈现了概要图，其示出在Mef2c-het小鼠的海马体中，通过硝基突触素修复了总NeuN+细胞计数的数目减少(图15B)，VGAT(图15D)和VGLUT2(图15F)的免疫反应性降低，以及VGLUT1/VGAT(e)与VGLUT2/VGAT(图15G)的比率增加。图15H示出通过硝基突触素还修复Mef2c-het小鼠中的LTP受损。数据为平均值±s.e.m.，在图15A-G中每组n＝4-5，并且在图15H中每组n＝7-9。通过方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
图16示出Mef2c-het小鼠在海马体中示出提高的半胱天冬酶-3活化和细胞凋亡。图16A示出在用媒剂(WT/V)或硝基突触素(WT/N)治疗的WT小鼠和在用媒剂(Het/V)或硝基突触素(Het/N)治疗的Mef2c-het小鼠的海马体CA3区域中，活化的半胱天冬酶-3(Act Casp3，顶部图区)和TUNEL染色(底部图区)的免疫组织化学。比例尺，25μm。图16B和图16C呈现直方图，其示出与对照WT/V小鼠相比，在Het/V小鼠中半胱天冬酶-3+(图16B)和TUNEL+神经元(图16C)显著增加。此外，在Het/N小鼠中这两种表型均得到改善。数据为平均值+s.e.m.，每组n＝4-5；通过方差分析，*P<0.05。
图17示出硝基突触素使Mef2c-het海马体中星形胶质细胞的数量正常化。图17A-C呈现代表性图像，其示出与WT相比(图17B与图17A)，Mef2c-het小鼠中具有星形胶质细胞形态的GFAP+细胞增加。通过用硝基突触素进行长期治疗，将GFAP+细胞的数量恢复至WT水平(图17C)。ML，齿状回(DG)的分子层。比例尺，25μm。(图17D)用媒剂(V)或硝基突触素(N)治疗的WT和Mef2c-het小鼠的海马体中的GFAP+细胞的量化。数据为平均值+s.e.m.，每组n＝4或5；通过方差分析，与WT/V相比，**P<0.01，并且与Het/V相比，#P<0.05。
图18示出Mef2c-het小鼠显示出小清蛋白+(PV+)抑制性突触和细胞的减少。图18A呈现了代表性图像，其示出用媒剂(WT/V)治疗的WT小鼠和用媒剂(Het/V)或硝基突触素(Het/N)治疗的Mef2c-het小鼠的海马体中PV+免疫反应性。PV+神经元(每个图区的左下方)或突触(每个图区的右下方)的放大倍数更高。比例尺，25μm。图18B呈现了直方图，其示出与WT/V小鼠相比，Het/V小鼠中PV-免疫反应性突触的减少。在硝基突触素治疗后，这种减少明显改善。图18C呈现了直方图，其示出与WT/V小鼠相比，在Het/V小鼠中PV-免疫反应性细胞的数量减少，但在Het/N小鼠中PV-免疫反应性细胞的数量未减少。数据为平均值+s.e.m.，每组n＝4-5；通过方差分析，*P<0.05，**P<0.01。
图19示出硝基突触素治疗修复Mef2c-het小鼠中LTP缺陷。在由WT/V-、Het/V-和Het/N治疗的小鼠制备的切片中，在诱导海马体LTP之前(左侧)和之后(右侧)的诱发电流的代表性轨迹。每组动物的fEPSP斜率呈现于文本中的图15H中。
图20A示出突触外N-甲基-D-天冬氨酸受体(eNMDAR)活性触发信号传导失活结节性硬化症2(TSC2)并且通过NMDAR拮抗剂硝基美金刚减弱(又称为硝基突触素，YQW-036，NMI-6979)，其减弱程度比美金刚更大。示意图示出，NMDA受体拮抗剂阻断了p38 MAPK级联的活化。硝基美金刚YQW-036(也称为硝基突触素)是比美金刚更有效的拮抗剂，并且因此发挥了更大的有益作用(因此，抑制剂符号更大)。图20B示出蛋白质印迹证据，即eNMDAR刺激增加了p38 MAPK/MAPKAPK2/TSC2/mTORC1/S6K1级联的磷酸化/活化。用eNMDAR拮抗剂美金刚(10μM)阻断eNMDAR减少了此信号传导。将此实验重复4次，具有类似的结果，并且在图20C中量化。图20C示出通过非配对t检验的免疫印迹的量化；平均值±s.e.m.，n＝4，*P<0.05(Mem，美金刚)。
图21示出美金刚(M)和硝基突触素(N，在图中标记的硝基美金刚)治疗对Tsc2+/-(het)小鼠的突触完整性的影响。图21A示出来自用媒剂、M或N治疗的三个月大的WT和Tsc2+/-转基因小鼠的大脑切片的代表性组织学图像。在海马体中示出SY38(突触体素)阳性突触末端(红色)的染色。图21B示出用媒剂、M或N治疗的WT和TSC2+/-转基因小鼠中突触体素的免疫反应性的量化。突触完整性被测量为免疫反应性SY38占据的面积％。用N治疗Tsc2+/-小鼠将突触信号提高到WT水平，并且显著大于经媒剂治疗的突触信号。值呈现为面积％+s.e.m.，通过t检验，*P<0.5，每个治疗组n＝3个小鼠。
图22示出Tsc2+/-(het)小鼠的异常CA1-LTP和利用硝基突触素得到的改善。图22A示出通过多电极阵列(MEA)从海马体切片记录的LTP(长期增强)。对于Tsc2+/+和Tsc2+/-(n＝7个切片，来自7个小鼠)，fEPSP斜率每30s进行绘制，并表示平均值±s.e.m.。图22B示出用媒剂对照与1-2μM美金刚或硝基突触素对Tsc+/-小鼠的治疗效果(n＝13个切片，来自13个小鼠，对于通过硝基突触素(而非美金刚)改善LTP，P<0.001，在诱导后55-65分钟监测)。
图23示出通过恐惧条件测试评定的用硝基突触素而非美金刚进行治疗对Tsc2+/-(het)小鼠的情境区分的有益效果。在恐惧条件试验中，用媒剂、美金刚或硝基突触素治疗的三个月大的WT和Tsc2+/-转基因小鼠的冷冻时间。测试的所有四组小鼠(WT-媒剂、Het-媒剂、Het-美金刚和Het-硝基突触素)示出在“训练情境”和“新情境+提示”中的冷冻，从而指示它们的条件恐惧响应不受基因型或药物的影响。另外，WT小鼠显示出训练和新型情境之间的情境区分(*P＝0.032)。相比之下，经媒剂或美金刚治疗的Tsc2+/-小鼠在这种行为上表现出缺陷，从而导致在训练与新情境之间缺乏区分(n.s.＝无明显差异)。硝基突触素(而非美金刚)治疗改善了此表型，使Tsc2+/-小鼠中情境区分正常化(**P＝0.023)。值为平均值+s.e.m.(每组n＝7-12个小鼠)。
图24示出通过用硝基突触素治疗改善了瑞特综合征的MeCP2基因敲除(KO)小鼠模型的转棒性能。将小鼠放置在固定圆筒上，并且然后将圆筒缓慢加速至10转/分钟。记录从圆筒掉下之前在10rpm下的总时间。V＝媒剂治疗(对于WT，n＝12，并且对于MeCP2 KO小鼠，n＝7；M＝美金刚治疗(对于WT，n＝16，并且对于MeCP2 KO，n＝13；N＝硝基突触素治疗(对于WT，n＝5，并且对于MeCP2 KO，n＝14)。值为+s.e.m.；*P<0.05。用N而非M治疗在此转棒测试中发挥了显著改善的运动性能。
具体实施方式
在大脑中，转录因子(肌细胞增强因子2(MEF2))对于神经元分化、突触形成和神经元存活至关重要。已经证明，在表达巢蛋白的神经祖细胞中Mef2c的条件性基因敲除使小鼠具有受损的电生理网络特性和行为缺陷，使人联想到瑞特综合征，一种与自闭症谱系病症(ASD)相关的神经病症。染色体5q14.3q15微缺失区域导致儿童具有被识别为MEF2C单倍剂量不足的神经缺陷表型。这些患者表现出的征象和症状包括ASD、智力和发育障碍(IDD)、不良的相互行为、缺乏言语、刻板和重复性行为，以及癫痫症。由MEF2C单倍剂量不足引起的病症统称为MEF2C单倍剂量不足综合征(MCHS)。另外，在具有共同世系的人类谱系中，多个MEF2靶基因已被识别为自闭症相关的基因。因此，所要求保护的用于MCHS的治疗方法也在有效治疗其它形式的ASD/IDD和癫痫症方面发现了实用性。
需要用于治疗ASD、IDD、癫痫症和相关病况的改善疗法。按照这些方式，最近基于突触外NMDA受体(eNMDAR)的主要双美金刚样作用和氧化还原(S-亚硝基化)为基础的抑制合成了一系列改善的药物。最初，这些化合物被称为‘硝基美金刚’，但最近的先导化合物YQW-036(或NMI-6979)由于其恢复多个损伤面的突触数量和功能的能力而被称为硝基突触素。方案1示出美金刚和硝基美金刚(又称为硝基突触素)的结构。
方案1.
Figure BDA0002433345300000121
如本文实例中所体现的，通过在Mef2c+/-(Mef2c-het)小鼠中用硝基突触素(也称为硝基美金刚YQW-036/NMI-6979—参见结构1)治疗，神经行为缺陷、兴奋性/抑制性(E/I)不平衡和组织学破坏均得到改善。Mef2c-het小鼠被开发为ASD的人类MEF2C单倍剂量不足形式的模型。Mef2c-het小鼠显示出神经元和突触异常、在海马体中抑制性降低和兴奋性突触传递增加、长期增强(LTP)受遏制以及MCHS样行为表型。在用硝基突触素治疗之前，这些小鼠表现出减少的神经发生、增强的神经元凋亡、改变的E/I神经传递比率，以及行为缺陷表型，类似于患有自闭症谱系病症(ASD)、智力和发育障碍(IDD)和癫痫症的人类患者的那些。重要的是，通过用硝基突触素进行长期治疗，可修复或缓解几乎所有这些表型。此外，瑞特综合征和结节性硬化症的人类疾病的附加小鼠模型示出，硝基突触素在纠正与这些其它形式的ASD/IDD和癫痫症(与E/I不平衡相关联)相关联的表型方面同样有效。尽管有这种机制，但硝基突触素被示出为在ASD/IDD和癫痫症的多个小鼠模型中的有效治疗，并且因此应该对人类ASD/IDD和癫痫症有效。
令我们惊讶的是硝基突触素对MCHS和其它形式的ASD/IDD和癫痫症综合症具有功效，因为其它NMDAR拮抗剂(比如美金刚)为此目的在人体临床试验中失败(Fung LK,HardanAY.开发靶向自闭症中谷氨酸能功能障碍的药品：迄今为止的进展(Developingmedications targeting glutamatergic dysfunction in autism:Progress to date).《中枢神经系统药物(CNS Drugs)》29,453-463(2015)；Tu S,Lipton SA,Nakanishi N等人用于人类自闭症的小鼠MEF2C单倍剂量不足模型的硝基突触素疗法(NitroSynapsintherapy for the mouse MEF2C haploinsufficiency model of human autism).《自然通讯》8,1488(2017))。硝基突触素在这方面起作用是因为它显现出优越的功效，同时具有避免突触传递阻断和长期增强(LTP)的临床耐受特性。
图1示出Mef2c单倍剂量不足的概要图，所述Mef2c单倍剂量导致通过硝基突触素修复的E/I不平衡和MCHS样表型。Mef2c单倍剂量不足导致VGAT降低和VGLUT2蛋白质水平升高，从而导致E/I不平衡(过度兴奋)和突触功能障碍。Mef2c单倍剂量不足也导致神经元损失，尤其是PV+抑制性中间神经元数量减少。这些突触和细胞异常可能是在Mef2c-het小鼠中观察到的MCHS样行为表型的根本原因。用硝基突触素(NitroMem)长期治疗可改善组织学和行为表型，其改善程度明显大于FDA批准的药物美金刚(Mem)。
神经病况
在一些方面，本文提供治疗受试者的至少一种神经病况的方法。方法可包含将本文公开的化合物递送到受试者。方法可包含将本文公开的化合物的组合递送到受试者。神经病况可与E/I不平衡被相关联，如本领域中的技术人员知道如何评定。简言之，E/I可通过多种方法评定，例如，膜片钳电记录，以示出在抑制性传递中的过度兴奋或缺陷(Tu等人,2017同上)。如在Tu等人,2017(同上)中描述的兴奋性和抑制性突触的组织学评定也可部分地用于评定E/I不平衡。在可根据本文公开的方法治疗的人类或其它动物的神经病况包括但不限于任何形式的自闭症(ASD)、MEF2C单倍剂量不足综合征(MCHS)、智力和发育障碍(IDD)、癫痫症、瑞特综合征和结节性硬化症。
本文公开的治疗方法包含治疗幼年发病神经病况。幼年发病神经病况是在童年期间出现一种或多种神经或行为异常的病况。在一些情况下，童年的年龄被认为在0到18岁之间。在一些情况下，儿童的年龄在0到12岁之间。神经和行为异常的非限制性实例包括手紧握、缺乏眼神接触、头部生长缓慢、癫痫发作、重复性运动、语言减少或丧失、纽绞双手、拍手、轻拍、随机抓握和释放、呼吸不规则、社交互动的减少或丧失、沟通技巧的社交互动的减少或丧失、步态不稳、失用症、运动困难、肌肉无力、僵硬、痉挛、精神运动性迟缓、全身性张力减退、眼神接触不良、手口刻板、斜视和面部二态性。幼年发病神经病况的非限制性实例包括自闭症谱系病症(ASD)、智力和发育障碍(IDD)、癫痫症、MEF2C单倍剂量不足综合征(MCHS)和结节性硬化症。在一些情况下，IDD包含属于ASD的病况，包括自闭症本身。自闭症谱系病症包括但不限于自闭症、埃斯博格综合症(Asperger's Syndrome)和瑞特综合症。可考虑为幼年发病神经病况的附加病况包括注意缺陷病症、注意缺陷多动病症、普遍性发育病症和强迫症。在一些情况下，幼年发病神经病况是由于疾病/感染、头部创伤或毒性引起的大脑损伤。
本文公开的治疗方法可恢复突触可塑性以改善E/I不平衡。本文公开的治疗方法可预防神经元损失。本文公开的治疗方法可使突触标记物增加。本文公开的治疗方法可引起长期增强(LTP)。本文公开的治疗方法可使神经元数目增加。本文公开的治疗方法可纠正E/I不平衡。本文公开的治疗方法可改善自闭症/MCHS样行为缺陷。本文公开的治疗方法可增加抑制性中枢神经元/小白蛋白(PV)+突触。本文公开的治疗方法可使VGAT和/或VGLUT2水平正常化。本文所公开的治疗方法可使VGLUT1与VGAT的比率、VGLUT2与VGAT的比率或其组合正常化。本文公开的治疗方法可修复凋亡神经元。本文公开的治疗方法可减少在受试者的大脑中观察到的凋亡神经元的数量。本文公开的治疗方法可减少或预防认知缺陷。本文公开的治疗方法可减少或预防重复性行为。本文公开的治疗方法可减少或预防社交互动受损。本文公开的治疗方法可减少或预防焦虑症。本文公开的治疗方法可减少或预防异常运动行为。本文公开的治疗方法可导致减少或预防手紧握。本文公开的治疗方法可减少或预防异常社交行为。本文公开的治疗方法可改善记忆。本文公开的治疗方法可改善学习。
在一些情况下，本文公开的方法包含治疗患有自闭症谱系病症(ASD)的受试者。患有ASD的受试者包括经诊断患有自闭症、埃斯博格综合症和未另作指定的普遍性发育病症(PDD-NOS)和童年崩解性病症的受试者。这些受试者在社交沟通和互动方面表现出困难。它们还可表现出重复性行为。可基于最新的《精神病症诊断和统计手册(Diagnostic andStatistical Manual of Mental Disorders)》和/或《疾病和相关健康问题的国际统计分类(International Statistical Classification of Diseases and Related HealthProblems)(ICD)》中公布的标准执行ASD的诊断。从业人员可进行评定，如修订的自闭症诊断访谈(Autism Diagnostic Interview-Revised)和自闭症诊断观察时间表(AutismDiagnostic Observation Schedule)。其它病况(如癫痫症、结节性硬化症(非恶性肿瘤)、焦虑症、抑郁症、精神分裂症、注意缺陷多动病症(ADHD)和感官处理病症)通常与ASD共存。本文公开的方法可包含评定ASD的严重程度或与ASD共存的病况。方法可包含在将本文公开的化合物递送给受试者之前，评定ASD的一种或多种症状或与ASD共存的病况的存在和/或严重程度。方法可包含在将本文公开的化合物递送给受试者之后评定ASD的一种或多种症状或与ASD共存的病况的存在和/或严重程度。本文公开的方法可降低ASD的一种或多种症状或与ASD共存的病况的严重程度。在一些情况下，方法包含将本文公开的化合物递送给患有ASD的受试者，并向受试者提供行为疗法，如言语和语言疗法以及职业疗法。
在一些情况下，本文公开的方法包含治疗患有智力和发育障碍(IDD)的受试者。IDD是影响受试者的身体、认知和/或情感发展的病况。患有IDD的受试者可能难以学习、推理、解决问题和/或社交。患有IDD的受试者可表现出一种或多种行为病症、言语障碍、语言问题、癫痫发作和身体残疾。患有IDD的受试者的视力可受损。患有IDD的受试者的听力可受损。患有IDD的受试者可患有代谢病症。在一些情况下，这些问题会随着年龄的增长而恶化。IDD或与IDD相关联的病况的实例包括但不限于大脑性麻痹、唐氏综合症、脆性X综合征、自闭症谱系病症(ASD)、苯丙酮尿症(PKU)和先天性甲状腺功能减退。本文公开的方法可包含评定IDD或与IDD共存的病况的严重程度。方法可包含在将本文公开的化合物递送给受试者之前评定IDD的一种或多种症状的存在和/或严重程度。方法可包含在将本文公开的化合物递送给受试者之后评定IDD的一种或多种症状的存在和/或严重程度。本文公开的方法可降低IDD的一种或多种症状的严重程度。在一些情况下，方法包含将本文公开的化合物递送给受试者，并向患有IDD的受试者提供行为疗法，如言语和语言疗法以及职业疗法。
在一些情况下，本文公开的方法包含治疗患有癫痫症的受试者。癫痫症是描述以癫痫性发作为特征的多种神经病症的术语。这些癫痫发作被认为是由于大脑过度和/或异常活动引起的。在许多情况下，癫痫发作可通过药品、手术、神经刺激、饮食限制或其组合来控制。方法可包含与药品、手术、神经刺激、饮食限制或其组合相组合地将本文公开的一种或多种化合物递送给患有癫痫症的受试者。方法可包含在将本文公开的化合物递送给受试者之前评定受试者癫痫发作的存在和/或严重程度。方法可包含在将本文公开的化合物递送给受试者之后评定受试者癫痫发作的存在和/或严重程度。本文公开的方法可降低受试者癫痫发作的严重程度。本文公开的方法可减少受试者的癫痫发作的次数。本文公开的方法可减少受试者癫痫发作的频率。本文公开的方法可减少受试者癫痫发作的持续时间。
在一些情况下，本文公开的方法包含治疗患有瑞特综合征的受试者。瑞特综合症是一种神经病症，其特征在于语言和协调方面的挑战以及重复性运动。在一些情况下，患有瑞特综合征的受试者具有癫痫发作、脊柱侧凸和睡眠问题。其它症状包括头部生长下降(在4岁之前)、手控制能力降低或丧失、语言能力降低或丧失、纽绞双手、拍手、轻拍、随机抓握和释放、呼吸不规则、社交互动的减少或丧失、沟通技巧的社交互动的减少或丧失、步态不稳、失用症、运动困难、肌肉无力、僵硬和痉挛。方法可包含将本文公开的一种或多种化合物与用于治疗瑞特综合征的药品组合递送至患有瑞特综合征的受试者，所述药品包括但不限于助眠剂、选择性血清素再摄取抑制剂、抗精神病药和β-阻滞剂或其组合。方法可包含在将本文公开的化合物递送给患有瑞特综合征的受试者之前评定受试者症状的存在和/或严重程度。方法可包含在将本文公开的化合物递送给患有瑞特综合征的受试者之后评定受试者症状的存在和/或严重程度。本文公开的方法可降低受试者的瑞特综合征症状中的一个或多个的严重程度。本文公开的方法可减轻受试者的瑞特综合征症状中的一个或多个。
在一些情况下，本文公开的方法包含治疗患有结节性硬化症的受试者。结节性硬化症(TSC)是由TSC1或TSC2基因的杂合突变引起的常染色体显性病症。TSC通常与神经、认知和行为缺陷相关联。TSC患者可表现出具有焦虑症和情绪病症的共病。TSC相关的神经症状可伴有过度的谷氨酸能活性和突触脊柱结构改变。结节性硬化症是通常以良性肿瘤为特征的病况。这些肿瘤可出现在如大脑、心脏、肾脏、肝脏、眼睛、肺部和皮肤的器官中。症状包括但不限于以下征象：ASD、癫痫发作、认知障碍、行为异常(例如，攻击性、注意缺陷多动病症、强迫症、自我伤害)、皮肤病况、肺部疾病和肾脏疾病。这种病况的治疗选择方案很少，但是依维莫司已被批准用于治疗大脑和肾脏的肿瘤。方法可包含与依维莫司、神经外科干预或其组合相组合地将本文公开的一种或多种化合物递送至患有结节性硬化症的受试者。方法可包含在将本文公开的化合物递送至患有结节性硬化的受试者之前评定受试者症状的存在和/或严重程度。方法可包含在将本文公开的化合物递送至患有结节性硬化症的受试者之后评定受试者症状的存在和/或严重程度。本文公开的方法可降低受试者的结节性硬化症症状中的一个或多个的严重程度。本文公开的方法可减轻受试者的结节性硬化症症状中的一个或多个。
在一些情况下，本文公开的方法包含治疗患有MEF2C单倍剂量不足的受试者。MEF2C单倍剂量不足综合症(MCHS)是与智力障碍、自闭症特征、癫痫症和异常运动相关联的神经发育病症。症状包括但不限于精神运动迟缓、全身性张力低下、眼神接触不良、手口刻板、斜视和轻微的面部二态性。一些症状可以是由于大脑中正常电活动的兴奋性与抑制性比率(E/I比率)改变引起的。本文公开的方法可包含将E/I比率恢复到正常范围(例如，没有MEF2C单倍剂量不足的人员的E/I比率)和改善ASD的征象。方法可包含在将本文公开的化合物递送至患有MEF2C单倍剂量不足的受试者之前评定受试者症状的存在和/或严重程度。方法可包含在将本文公开的化合物递送至患有MEF2C单倍剂量不足的受试者之后评定受试者症状的存在和/或严重程度。本文公开的方法可降低受试者的MEF2C单倍剂量不足症状中的一个或多个的严重程度。本文公开的方法可减轻受试者的MEF2C单倍剂量不足症状中的一个或多个。
在一些情况下，本文公开的方法包含治疗受试者，其中受试者是儿童。儿童可小于约14岁、小于约13岁、小于约12岁或小于约10岁。在一些情况下，受试者大于1岁、大于2岁、大于3岁、大于4岁或大于5岁。
本文公开的方法可包含选择进行治疗的受试者。在一些情况下，基于受试者中基因的表达选择受试者。在一些情况下，基于受试者中基因的序列选择受试者。在一些情况下，基于受试者中基因的突变来选择受试者。突变可以是缺失突变。缺失突变可以是单倍剂量不足(例如，MEF2C单倍剂量不足)。突变可以是移码突变。突变可以是单核苷酸多态性。在一些情况下，基于受试者对基因编码的蛋白质的表达来选择受试者。在一些情况下，基于由基因编码的蛋白质的活性来选择受试者。基因可以是MEF2C，其编码肌细胞增强因子2C(MEF2C)。基因可以是SLC32A1，其编码囊泡γ-氨基丁酸(GABA)转运体(VGAT)。基因可以是SLC17A6，其编码囊泡谷氨酸转运体2(VGLUT2)。基因可以是SYP，其编码蛋白质突触体素，也被称为主要突触小泡蛋白p38。基因可以是GAD65，其编码谷氨酸脱羧酶。
方法可包含获得本文公开的基因的表达水平。方法可包含获得本文公开的蛋白质的表达水平。方法可包含获得关于本文公开的蛋白质的活性的信息。方法可包含分析本文公开的基因的表达水平。方法可包含分析本文公开的蛋白质的表达水平。方法可包含分析关于本文公开的蛋白质的活性的信息。方法可包含量化本文公开的基因的表达水平。方法可包含量化本文公开的蛋白质的表达水平。方法可包含量化关于本文公开的蛋白质的活性的信息。分别量化和分析基因和蛋白质的表达和活性是本领域众所周知的。量化和分析基因表达的非限制性实例是q-PCR、微阵列、测序和Northern印迹。方法可包含分析等位基因特异性表达。量化和分析蛋白质表达和活性的非限制性实例是免疫组织化学、蛋白质印迹、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光和其组合。方法可包含对本文公开的基因进行测序。
方法可包含获得本文公开的基因的表达水平，其中表达水平是受试者的细胞的表达水平。方法可包含从受试者获得细胞。方法可包含从受试者中隔离细胞。细胞可以是大脑细胞。细胞可以是循环细胞。细胞可以是在脑脊髓液中循环的细胞。细胞可以是血细胞。细胞可以是皮肤细胞。细胞可以是上皮细胞。细胞可以是人类诱导多能干细胞，其源自患者皮肤活检，并分化为神经元或其它大脑细胞(例如，星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞)，且在二维(2D)培养系统中或3D脑类器官(体外产生的类似于大脑的小结构)中检定，并且因此能够模拟“盘中疾病”。
获得基因的表达水平可包含从受试者隔离无细胞核酸。无细胞核酸可包含RNA。无细胞核酸可包含信使RNA。无细胞核酸可基本上由信使RNA组成。无细胞核酸可包含DNA。DNA可以是甲基化的DNA。获得基因的表达水平可包含从受试者隔离无细胞核酸。无细胞核酸可以是循环无细胞核酸。方法可包含从受试者获得样品，其中样品包含无细胞核酸。这类样品的非限制性实例是全血、血浆、血清、尿液、脑脊液和唾液。
本文公开的方法可包含量化在受试者或其细胞或其生物流体中的SLC32A1的表达水平。受试者可患有MEF2C单倍剂量不足。受试者可未患有MEF2C单倍剂量不足。相对于具有MEF2C基因的两个拷贝的多个普通对照受试者的SLC32A1表达水平，受试者可具有显著降低的SLC32A1表达水平。相对于未表现出神经病症的征象或症状的多个普通对照受试者的SLC32A1表达水平，受试者可具有显著降低的SLC32A1表达水平。相对于未表现出本文公开的神经病症的征象或症状的多个普通对照受试者的SLC32A1表达水平，受试者可具有显著降低的SLC32A1表达水平。显著降低可以是降低至少约10％、降低至少约20％、降低至少约30％、降低至少约40％、降低至少约50％、降低至少约75％或降低约100％。
本文公开的方法可包含量化在受试者或其细胞或其生物流体中的SLC17A6的表达水平。受试者可患有MEF2C单倍剂量不足。受试者可未患有MEF2C单倍剂量不足。相对于具有MEF2C基因的两个拷贝的多个普通对照受试者的SLC17A6表达水平，受试者可具有显著增加的SLC17A6表达水平。相对于未表现出神经病症的征象或症状的多个普通对照受试者的SLC17A6表达水平，受试者可具有显著增加的SLC17A6表达水平。相对于未表现出本文公开的神经病症的征象或症状的多个普通对照受试者的SLC17A6表达水平，受试者可具有显著增加的SLC17A6表达水平。显著增加可以是增加至少约10％、增加至少约20％、增加至少约30％、增加至少约40％、增加至少约50％、增加至少约75％或增加约100％。
本文公开的方法可包含量化在受试者或其细胞或其生物流体中的突触体素(SYP)(一种突触前蛋白质)的表达水平。受试者可患有MEF2C单倍剂量不足。受试者可未患有MEF2C单倍剂量不足。相对于具有MEF2C基因的两个拷贝的多个普通对照受试者的SYP表达水平，受试者可具有显著降低的SYP表达水平。相对于未表现出神经病症的征象或症状的多个普通对照受试者的SYP表达水平，受试者可具有显著降低的SYP表达水平。相对于未表现出本文公开的神经病症的征象或症状的多个普通对照受试者的SYP表达水平，受试者可具有显著降低的SYP表达水平。显著降低可以是降低至少约10％、降低至少约20％、降低至少约30％、降低至少约40％、降低至少约50％、降低至少约75％或降低约100％。
本文公开的方法可包含量化在受试者或其细胞或其生物流体中的GAD65的表达水平。受试者可患有MEF2C单倍剂量不足。受试者可未患有MEF2C单倍剂量不足。相对于具有MEF2C基因的两个拷贝的多个普通对照受试者的GAD65表达水平，受试者可具有显著降低的SYP表达水平。相对于未表现出神经病症的征象或症状的多个普通对照受试者的GAD65表达水平，受试者可具有显著降低的GAD65表达水平。相对于未表现出本文公开的神经病症的征象或症状的多个普通对照受试者的GAD65表达水平，受试者可具有显著降低的GAD65表达水平。显著降低可以是降低至少约10％、降低至少约20％、降低至少约30％、降低至少约40％、降低至少约50％、降低至少约75％或降低约100％。
化合物
本文公开了一种用式I化合物或其医药学上可接受的盐治疗对其有需要的受试者的自闭症谱系病症(ASD)、智力和发育障碍(IDD)、癫痫症、瑞特综合征和/或结节性硬化症的方法：
Figure BDA0002433345300000221
其中
每个R1独立地选自-CH3和-CH2CH3；并且
R2选自氢和-ONO2。
在式I化合物或其医药学上可接受的盐的一些实施例中，R2为氢。在一些实施例中，R2为-ONO2。
在式I化合物或其医药学上可接受的盐的一些实施例中，每个R1不同。在一些实施例中，每个R1相同。在一些实施例中，每个R1为-CH3。在一些实施例中，每个R1为-CH2CH3。
在式I化合物或其医药学上可接受的盐的一些实施例中，每个R1为-CH2CH3且R2为-ONO2。
本文还公开了一种用式II化合物或其医药学上可接受的盐治疗对其有需要的受试者的其它形式的自闭症谱系病症(ASD)、智力和发育障碍(IDD)、癫痫症、瑞特综合征和/或结节性硬化症的方法：
Figure BDA0002433345300000222
其中
每个R1独立地选自氢、C1-C6烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；
R2选自氢、C1-C6烷基和-ONO2；
R3和R4各自独立地选自氢和C1-C6烷基；
或R3和R4与它们所附接的氮原子一起形成杂环烷基。
在式II化合物或其医药学上可接受的盐的一些实施例中，R3和R4独立地选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在一些实施例中，R3和R4独立地选自氢和甲基。在一些实施例中，R3和R4相同。在一些实施例中，R3和R4不同。在一些实施例中，R3和R4为氢。
在式II化合物或其医药学上可接受的盐的一些实施例中，R3和R4与它们所附接的氮原子一起形成杂环烷基。在一些实施例中，R3和R4与它们所附接的氮原子一起形成单环杂环烷基。
在式II化合物或其医药学上可接受的盐的一些实施例中，R2为氢。在一些实施例中，R2为C1-C6烷基。在一些实施例中，R2为-ONO2。在一些实施例中，R2为氢或-ONO2。
在一些实施例中，式II化合物或其医药学上可接受的盐是式III化合物或其医药学上可接受的盐：
Figure BDA0002433345300000231
在式II或式III化合物或其医药学上可接受的盐的一些实施例中，每个R1独立地选自氢、C1-C6烷基、环烷基、杂环烷基和芳基。在一些实施例中，每个R1独立地选自氢和C1-C6烷基。在一些实施例中，每个R1独立地选自C1-C6烷基。在一些实施例中，每个R1独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在一些实施例中，每个R1独立地选自甲基、乙基和正丙基。在一些实施例中，每个R1独立地选自甲基和乙基。在一些实施例中，每个R1相同。在一些实施例中，每个R1不同。在一些实施例中，每个R1为甲基。在一些实施例中，每个R1为乙基。在一些实施例中，每个R1为正丙基。
配方
方法可包含向受试者递送约1mg至约25mg剂量的本文公开的化合物。方法可包含向受试者递送约1mg至约20mg剂量的本文公开的化合物。方法可包含向受试者递送约1mg至约5mg剂量的本文公开的化合物。方法可包含向受试者递送约5mg至约10mg剂量的本文公开的化合物。方法可包含向受试者递送约10mg至约15mg剂量的本文公开的化合物。方法可包含向受试者递送约15mg至约20mg剂量的本文公开的化合物。方法可包含向受试者递送约1mg至约10mg剂量的本文公开的化合物。方法可包含向受试者递送约10mg至约20mg剂量的本文公开的化合物。对于儿童(小儿患者)，每天1至5mg剂量的化合物可为足够的。剂量可逐渐增加，因为每天分剂量耐受至多约20mg。剂量可在一个或多个星期内缓慢增加。
方法可包含每天一次递送一定剂量的本文公开的化合物。方法可包含每天一次递送本文公开的剂量。方法可包含每天两次递送本文公开的剂量。方法可包含在一天中的第一时间点递送第一剂量和在一天中的第二时间点递送第二剂量。第一剂量和第二剂量可相同。第一剂量和第二剂量可不同。
本文公开的方法可包含随时间增加本文公开的化合物的日剂量。举例来说，方法可包含在第一周以第一剂量递送本文公开的至少一种化合物，并在第二周以第二剂量递送至少一种化合物，其中第一剂量和第二剂量不同。在一些情况下，第二剂量大于第一剂量。在一些情况下，第二剂量小于第一剂量。
本文公开的方法可包含将本文公开的至少一种化合物口服递送至受试者。化合物可通过片剂或胶囊剂口服递送。化合物可作为液体溶液口服递送。可吞服液体溶液。液体溶液可通过滴管或移液管递送。替代地或另外，递送可包含注射化合物(肠胃外施用)、体表施用化合物、吸入化合物、经鼻向大脑施用化合物或其任何组合。
本文公开的方法可包含递送包含本文公开的至少一种化合物的医药组合物。医药组合物可包含医药学上可接受的稀释剂、赋形剂、媒剂或其组合。如本文所用的术语“医药学上可接受的”是指不消除本文所述的化合物的生物活性或特性的材料，并且相对无毒(即，材料的毒性显著胜过材料的益处)。在一些情况下，可将医药学上可接受的材料施用于个体，而不会引起明显的不期望的生物学作用或以有害的方式与包含所述材料的组合物的任何组分发生明显的相互作用。
本文的医药组合物可使用一种或多种生理上可接受的载体来配制，所述载体包括赋形剂和助剂，所述赋形剂和助剂有助于将活性试剂加工成医药学上使用的制剂。适当的配制物取决于所选的施用途径。医药组合物的概述可见于例如以下中：《雷明顿：制药科学和实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第十九版(宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.):Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,《雷明顿氏医药科学(Remington's Pharmaceutical Science)》,Mack Publishing Co.,宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pennsylvania)1975,Liberman,H.A.和Lachman,L.编,《医药剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)》,Marcel Decker,纽约州纽约(New York,N.Y.),1980；以及《医药剂型和药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems)》,第七版(Lippincott Williams&Wilkins,1999)。
本文公开的医药组合物可包含医药学上可接受的稀释剂(一种或多种)、赋形剂(一种或多种)或载体(一种或多种)。医药组合物可包括其它药品或医药试剂、载体、佐剂，如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，医药组合物还含有其它治疗上有价值的物质。
本文公开的医药组合物可通过任何合适的施用途径施用到受试者，包括但不限于肠胃外(静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、血管内、鞘内、玻璃体内、输注或局部)、体表、口服或经鼻施用。
适用于肌肉内、皮下、肿瘤周围或静脉内注射的配制物可包括生理学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳剂，以及用于重建为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。合适的水性和非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒剂的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、克列莫佛(cremophor)等等)、其合适的混合物、植物油(如橄榄油)以及可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液情况下维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持适当流动性。适合于皮下注射的配制物还含有任选的添加剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分配剂。
对于静脉内注射，活性试剂可以任选地在水溶液中配制，优选地在生理学上相容的缓冲液，如汉克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水缓冲液中配制。
肠胃外注射可任选地涉及快速注射或连续输注。用于注射的配制物可任选地呈例如在安瓿或多剂量容器中的单位剂型，其中添加有防腐剂。本文所描述的医药组合物可以呈作为油性或水性媒剂中无菌悬浮液、溶液或乳液的适合于肠胃外注射的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。肠胃外施用的医药配制物包括呈水溶性形式的活性试剂的水溶液。另外，任选地将悬浮液制备为适当的油性注射悬浮液。
实例
以下说明性实例代表本文描述的软件应用程序、系统和方法的实施例，并且不意图以任何方式进行限制。
实例1：Mef2c-het小鼠显现出MCHS样行为并降低了生存能力
MEF2C蛋白质表达在Mef2c-het小鼠中比在野生型(WT)同窝仔小鼠中明显降低(P<0.01)(图2)，并且在Mef2c-het小鼠中观察到大量早期死亡(图3A)。计数了来自WT和Mef2c-het亲本之间的杂交的存活动物的数量。虽然WT和Mef2c-het后代的数量在胚胎第18天(E)大约相等(分别为28与23)，但是在出生后第21天(P)和第90天，存活的Mef2c-het与WT小鼠的比率分别为44％和40％。在E18处的存活率与成年的存活率之间存在显著差异(通过卡方检验，P<0.05)。除了生存能力降低外，存活至3个月大的Mef2c-het小鼠的体重也比其WT对应物减少(～14％)(WT的31.9±1.0gm与Mef2c-het的27.4±0.8gm；通过斯图登氏t检验，P<0.001)。
为了确定成年Mef2c-het小鼠是否显示出MCHS样表型，对雄性Mef2c-het小鼠及其WT同窝仔小鼠(≥3个月大)执行行为测试。与示出认知障碍的人类患者相似，Mef2c-het小鼠在巴恩斯迷宫(一种测量空间学习和记忆功能的测试)中的表现较差。Mef2c-het小鼠在训练期间花费了相当长的时间来找到逃离通道(图3B)。在随后的探针测试中，与相对的象限相比，WT小鼠而不是Mef2c-het小鼠表现出对目标象限的偏好(图3C)，表明Mef2c-het小鼠的空间记忆受损。对于孔板探查测试，Mef2c-het小鼠显现出刻板，包括异常的爪子紧握行为(图3D)和重复性头浸入(图2E)。综上所述，这些结果表明，Mef2c-het小鼠表现出多种模拟MCHS的MCHS样表型。
实例2在Mef2c-het小鼠中下调调节神经发生和突触功能的基因
为了识别MCHS发病机理的分子途径，通过微阵列检查了Mef2c-het小鼠与WT同窝仔小鼠的基因表达。识别出总共783个基因，其表达水平在海马体中显著改变，包括在Mef2c-het小鼠中394个下调和389个上调(图4A，绿色线上方)。利用这些数据，使用NextBio途径分析，识别在小鼠中由Mef2c单倍剂量不足下调的顶级神经元生物组，包括用于神经发生、神经元分化和突触功能的生物组(图4B)。同时，将用于调节神经元细胞死亡的生物组上调(图4B)。使用从3个月大的小鼠中提取的RNA，通过qPCR证实了微阵列结果(图4C)。与NextBio分析一致，囊泡γ-氨基丁酸(GABA)转运体VGAT(由Slc32a1编码)的mRNA水平(表示抑制性突触前标记物)在Mef2c-het小鼠中显著降低。还检查了表示兴奋性突触标记物的囊泡谷氨酸转运体1/2(VGLUT1/2)的mRNA水平，并且发现在Mef2c-het小鼠中VGLUT2而非VGLUT1的水平显著增加，这指示这些小鼠的兴奋性和抑制性神经传递的功能异常。
实例3.Mef2c-het小鼠的神经元减少和兴奋性/抑制性(E/I)突触传递受损
在使用光学解剖器作为无偏置立体计数方法的组织学实验中，与海马体中的WT相比，Mef2c-het小鼠的NeuN+细胞(即神经元)总数显著减少(WT对照值为69.5±1.6％，通过斯图登氏t检验，P<0.01)和额叶皮质(WT对照为79.8±5.1％，P<0.05)(图5A、图5B)。与NeuN+细胞相比之下，与WT相比，在海马体(WT对照为123.0±6.8％，P<0.01)和额叶皮质(WT对照为135.16±11.70％，P<0.05)中，Mef2c-het小鼠的神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)+细胞数量显著增加(图5C、图5D)。
对3D蒙太奇图像使用Neurolucida软件，在Mef2c-het和WT大脑中执行高尔基体染色，以确定脑皮质V层中锥体细胞的树突分支图案(图5E)。Sholl分析指示Mef2c-het神经元的树突复杂度显著降低，如通过降低的树突相互作用(图5F)和降低的总树突长度(图5G)所展现的。
为了进一步说明神经元数量的减少，除了已知的由MEF2C缺乏介导的胚胎神经发生的减少外，在2-3个月大的Mef2c-het小鼠的齿状回(DG)的颗粒下层(SGZ)中表征了成年神经发生，并且观察到增殖细胞(PCNA+，图6A、图6B)和发育中的神经元(DCX+，图6A、图6C)的数量减少。DG中BrdU标记的NeuN+细胞的数量也减少(图6D、图6E)。这些结果表明，Mef2c-het小鼠中成年神经发生的减少有助于神经元的减少。另外，通过逆转录病毒介导的mCherry基因转导可见的新形成的神经元的发育和复杂性在Mef2c-het DG中也降低，如体细胞大小和树突长度的减小所指示的(图6F-I)。因此，Mef2c单倍剂量不足导致小鼠神经元数量减少、成年神经发生受损和树突复杂性降低。
随后检查Mef2c-het小鼠的突触。与预测突触蛋白质改变的微阵列分析一致，量化共聚焦免疫组织化学示出在Mef2c-het小鼠的海马体中突触体素(SYP)(一种突触前标记物)的表达显著降低(图7A、图7B)。为了更好地定义突触缺陷，通过量化共聚焦免疫组织化学在海马体中检查主要的兴奋性突触蛋白质VGLUT1的表达水平和抑制性突触蛋白质VGAT的表达水平(图7A)。在Mef2c-het小鼠中VGAT的表达显著降低，而VGLUT1则没有(图7B)。另外，对海马体富含突触小体的裂解物执行免疫印迹实验，并且发现在Mef2c-het小鼠中SYP和GAD65(另一种抑制性神经元标记物)的水平而不是VGLUT1被下调(图8A)。在Mef2c-het小鼠中，VGLUT1(兴奋性神经元)与GAD65(抑制性神经元)的比率显著增加(图8B)，这是E/I不平衡的征象。此外，与VGLUT1相比之下并且与mRNA发现一致，通常在成年海马体中仅以非常低的水平表达的VGLUT2蛋白质相对于WT在Mef2c-het中显著上调(图8C)。综上所述，这些发现指示在Mef2c-het海马体中异常的兴奋性和抑制性突触蛋白质表达。
为了确定这些E/I标记物表达的变化是否伴有功能性突触传递异常，记录了来自Mef2c-het和WT小鼠海马体切片的自发微小兴奋性和抑制性突触后电流(mEPSC/mIPSC)。根据量化释放理论，微小频率的变化反映了突触前神经递质释放或突触数量的变化，而微小幅度的变化被认为表示突触后功能(例如，突触后受体的数量)的变化。Mef2c-het小鼠显示出降低的mIPSC频率(在图7C、图7G中显现为事件间间隔增加)，与突触前VGAT、树突和突触的总体减少一致。还观察到降低的mIPSC幅度(图7C、图7E)，这可能反映了已知MEF2水平与特异性GABA受体亚基的表达相关的事实。有趣的是，这些小鼠还示出mEPSC频率的增加(显现为事件间间隔的减小，图7D、图7F)，类似于先前在大脑特异性Mef2c-KO小鼠中mEPSC频率增加的报道。此结果也与在Mef2c-het海马体中突触前VGLUT2表达增加的发现相一致。mEPSC幅度的轻微降低(图7D、图7H)与MEF2在转录上正常上调谷氨酸受体表达的事实有关。预期mIPSC和mEPSC的总体变化会导致Mef2c-het小鼠的E/I比率升高。实际上，如mEPSC与mIPSC平均值的商所确定的，与WT小鼠相比，Mef2c-het小鼠显现出E/I频率比率提高116.2％，并且E/I幅度比提高25.7％，证实存在功能性E/I不平衡。
为了确定这些神经元和突触缺陷是否对突触可塑性和神经元回路具有有害作用，记录了海马体LTP。Mef2c-het小鼠在海马体CA1区域中表现出降低的LTP(图9A)。配对脉冲促进(PPF)表示突触前功能的短期增强，响应于第一次刺激后突触前末端中残留的Ca2+引起的两个配对刺激中的第二个。举例来说，降低的PPF与神经递质释放的可能性增加相关联。相对于WT小鼠，观察到Mef2c-het中PPF的统计学下降(图9B)，这与观察到的mEPSC频率的小幅增加相一致(图7D、图7F)。总的来说，这些结果表明，Mef2c-het小鼠显现出神经元数量减少、伴有突触缺陷、抑制性降低和兴奋性突触神经传递增加，从而导致E/I不平衡。
实例4：硝基突触素修复Mef2c-het小鼠的自闭症样行为
用硝基突触素或PBS媒剂治疗雄性Mef2c-het或WT小鼠3个月。然后执行行为、电生理和组织学分析以确定此药物的作用。重要的是，WT-小鼠的硝基突触素治疗表明对莫里斯水迷宫、EPSC或LTP没有影响。
使用神经行为测试来确定用硝基突触素治疗Mef2c-het小鼠是否可修复自闭症/MCHS样行为表型。首先执行莫里斯水迷宫以测试对空间学习和记忆的影响(图10A、图10B)。在隐藏平台训练环节期间，与经媒剂治疗的WT(WT/V)小鼠相比，经媒剂治疗的Mef2c-het(Het/V)小鼠由于花费更长的时间来寻找隐藏平台，在头两天示出空间学习受损(图10A)。然而，在这些测试期间，用硝基突触素(Het/N)治疗的Mef2c-het小鼠相对于媒剂表现出改善的性能。这种改善不能归因于游动速度本身的增加，Mef2c杂合性和硝基突触素治疗均不影响游动速度(图11)。在所有组的小鼠达到标准后二十四小时(找到隐藏平台的时间为20秒)执行探针测试以检查记忆保留。如图10B所示，WT/V小鼠通过在目标象限中花费明显更长的时间来显示出正常的记忆保留，所述目标象限是先前隐藏平台所定位的位置。相比之下，Het/V小鼠由于没有示出相对于相对象限对目标象限的偏好而显示出记忆受损。有趣的是，Het/N小鼠在目标象限中花费的时间明显多于相对象限，这表明硝基突触素治疗可使记忆功能正常化(图10A、图10B)。接下来执行一次开阔场地试验，即30分钟的试验，以测定总体运动能力。Het/V小鼠示出增强的中央活性(图10C)，但没有总活性(图10D)。通过长期使用硝基突触素治疗修复这种异常行为。药物还纠正了在孔板探查测试中Mef2c-het小鼠头部浸入增加的异常重复性行为(图10E)。另外，执行社交互动行为测试。与具有类似但空的笼子的腔室相比，WT/V小鼠在具有陌生小鼠1(S1)的腔室中花费的时间明显更长(图10E)。然而，Het/V小鼠对在任一腔室中花费的时间没有偏好(图10F、图10G)，这表明社交能力受损。另外，与WT/V小鼠相比，Het/V小鼠对S1的访问显著减小，并且每次访问的时间更短(图10H、图10I)。硝基突触素的治疗改善了这种异常的社交行为。重要的是，最初的可行性实验(其中头对头比较的Mef2chet小鼠用等摩尔的美金刚或硝基突触素治疗)展现了硝基突触素在这些行为范例中的优越性(图12A)。另外，硝基突触素治疗没有显著改变WT小鼠的社交行为(图13)。
综上所述，这些结果表明，用硝基突触素长期治疗Mef2c-het小鼠可显著改善认知缺陷、重复性行为、社交互动受损以及可能改变的焦虑症。值得注意的是，Mef2c-het小鼠除了爪子紧握外没有表现出异常的运动行为(图14A-E)。然而，硝基突触素治疗未改善爪子紧握表型(图14F)。
实例5：硝基突触素对Mef2c-het小鼠中神经元细胞损失、E/I标记物改变和LTP受 损的有益作用
执行免疫组织化学以确定药物治疗对Mef2c-het小鼠海马体中神经元损失和VGAT或VGLUT2表达改变的影响(图15A-G)。具体地，通过立体地使用光学解剖器方法监测，Het/N小鼠海马体中NeuN+细胞的总数显著大于Het/V小鼠中的NeuN+细胞的总数(图15B)，这与先前行为实验中硝基突触素的功效一致。另外，在最初的可行性实验中，观察到硝基突触素比美金刚对NeuN+细胞计数具有明显更大的作用(图12B)。
Mef2c-het小鼠中NeuN+细胞的减少至少可部分由凋亡性细胞丢失引起，因为在海马体的CA3区域中活性半胱天冬酶-3和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)的神经元染色的数量与WT相比，在Mef2c-het小鼠中显著增加(P<0.012，图16)。此外，尽管在Het/V中活化的半胱天冬酶3-阳性和TUNEL-阳性细胞的数目增加，但是在Het/N小鼠中其减少回到正常水平(图16)。此结果与以下观点相一致：在Mef2c-het小鼠中观察到的凋亡神经元通过硝基突触素显著修复。此外，在Mef2c-het小鼠中，用硝基突触素治疗还使具有星形细胞形态的GFAP+细胞的数量正常化(图17)。
通过量化共聚焦免疫组织化学确定硝基突触素对Mef2c-het小鼠中E/I标记物表达改变的影响。虽然VGLUT1免疫反应性的水平不由硝基突触素治疗而改变，但是VGAT和VGLUT2水平以及VGLUT1/VGAT或VGLUT2/VGAT的比率通过在Mef2c-het小鼠中由硝基突触素治疗正常化(图15C-G)。在Mef2c-het小鼠中表达小白蛋白(PV)的篮子中间神经元和PV阳性突触的数目均显著降低(图18)，而硝基突触素显著增加PV+突触(面积％)(图18)。这些结果表明，硝基突触素恢复Mef2c-het小鼠的E/I平衡。最后，用硝基突触素进行的长期治疗还明显修复Mef2c-het小鼠的海马体LTP受损(图15H、图19)。
如图1中总结的，Mef2c-het小鼠显示出MCHS样行为缺陷，并且因此代表了研究疾病病理生理学的模型。Mef2c-het小鼠的生存能力下降，其原因目前未知。存活到成年期的Mef2c-het小鼠表现出减少的神经元数量和突触损伤，特别是由抑制性降低和兴奋性神经传递增强引起的E/I不平衡。值得注意的是，用新型改善的NMDAR拮抗剂硝基突触素治疗Mef2c-het小鼠不仅纠正了E/I不平衡，而且改善了自闭症/MCHS样行为缺陷，从而提供了目标验证和潜在的疾病治疗。
本文提供的结果表明，在Mef2c-het小鼠海马体中VGAT显著降低。根据这一发现，功能抑制性突触传递减少，如自发性mIPSC的记录所展现的。另外，VGLUT2异常上调，与mEPSC频率增加所证明的兴奋性神经传递增加有关。因此，功能异常的抑制性和兴奋性神经传递促进了Mef2c-het小鼠海马体中的E/I不平衡。值得注意的是，硝基突触素显著改善了Mef2c-het小鼠的所有三个参数，其中增加突触标记物、LTP和神经元数量。最重要的是，硝基突触素显著改善了Mef2c-het小鼠的自闭症/MCHS样行为。
实例6：硝基突触素在结节性硬化症的TSC+/-小鼠模型中的有益作用
结节性硬化症(TSC)是常染色体显性病况，其显现为智力障碍、癫痫症/电生理缺陷和神经行为异常，通常会产生自闭症谱系病症(ASD)的特征。所述病症是由使两个基因Tsc1或Tsc2中的一个失活的杂合突变引起的。TSC蛋白质形成TSC1/2复合物，所述TSC1/2复合物抑制Rheb(一种活化雷帕霉素复合物1(mTORC1)的哺乳动物靶标的GTP酶)。mTORC1刺激mRNA翻译和细胞生长；由于失活的TSC1/2复合物，此途径的过度活化可导致TSC病理特征，如各种神经元类型的突触处的异常信号传导和AMPA受体的异常亚基组成。一种重要的病因学途径涉及mTOR的过度刺激。TSC中mTOR的过度活化导致大自噬的抑制，随后具有突触棘突的丧失和行为异常；雷帕霉素对mTOR的抑制可修复这些表型。
在此实例中，发现优先阻断eNMDAR处的强直活性的拮抗剂，尤其是新药硝基突触素，提供在Tsc2+/-(het)小鼠表型方面的生物学上和统计学上的显著改善。在这些研究中，使用了结节性硬化症的Tsc2+/-小鼠模型。伴随此改善的是p38 MAPK-TSC-Rheb-mTORC1-S6K1途径中活性的纠正(图20)。在Tsc2+/-小鼠中海马体长期增强(LTP)缺陷、突触的组织损失和行为恐惧条件在用硝基突触素治疗后均得到改善。综上所述，这些结果表明，通过限制过度的eNMDAR活性来改善兴奋性/抑制性(E/I)不平衡可表示用于TSC的一种新型治疗方法。
硝基突触素逆转Tsc2杂合小鼠中长期海马体可塑性的缺陷
检查长期增强(LTP)，其是一种响应于兴奋性输入而引起并且被认为代表海马体中学习与记忆的电相关性的突触可塑性的形式。使用海马体切片CA1区域的现场记录来研究Tsc2突变对这种形式的突触可塑性的影响。为此，准备了一个月大小鼠的急性海马体切片，并在灌注有人工脑脊髓液(ACSF)的微电极阵列(MEA)腔室中执行现场记录。在通过刺激Schaffer侧支诱发LTP后(在100Hz脉冲的四个重复中，每个重复一秒)，在CA1区域中记录fEPSP(场兴奋性突触后电位)。分析fEPSP的初始斜率以评定LTP。然而，在此处使用更强的诱导方案后，我们观察到诱导后60分钟监测到的LTP降低。令人惊讶的是，我们发现，与媒剂对照治疗相比，用1-2μM的更有效的eNMDAR拮抗剂硝基突触素(而不是美金刚)进行4小时治疗改善了Tsc2+'-小鼠的LTP(55-65分钟时P<0.001)。如图21-23所示，硝基突触素(又称为硝基美金刚)保护ADD/IDD的结节性硬化症(TSC)het模型中的突触、长期增强(LTP)和神经行为，其程度明显优于美金刚。
硝基突触素治疗Tsc2杂合小鼠减少突触损失
为了确定eNMDAR拮抗剂对Tsc2+/-小鼠的大脑组织学的影响，使用量化共聚焦免疫组织化学分析来自用媒剂、美金刚或硝基突触素治疗两天半的3个月大的野生型(WT)和Tsc2+/-小鼠的冠状脑切片。在C57Bl/6J背景下的Tsc2+/-小鼠通过腹膜内途径接纳媒剂或负载剂量为92μmol/kg的美金刚或硝基突触素，然后每天两次接纳4.6μmol/kg的药物，其中最后一次剂量在行为训练环节之前3个小时(总共注射5次药物)。这种投予方案可在大脑中NMDAR处产生1-10μM的有效药物浓度。
TSC的关键特征被认为涉及突触的损失。重要的是，用硝基突触素(硝基美金刚)治疗的Tsc2+/-小鼠显现出海马体中突触前标记物突触体素(SY38)的染色明显多于未治疗的杂合同窝仔小鼠，而美金刚的作用在统计学上不显著(参见图21A和图21B)。
附加标记物分析包括神经胶质纤维酸性蛋白质(GFAP，在这些情况下为星形细胞标记物)、NeuN(神经元核和细胞体标记物)和微管相关蛋白质2(MAP2，标记神经元树突棘)。海马体的共聚焦免疫组织化学图像揭示在WT与Tsc2+/-小鼠的NeuN、MAP2或GFAP之间的表达没有差异。总的来说，这些组织学结果指示，在疾病的这一阶段，海马体中没有明显的神经元/神经纤维损失或反应性星形细胞增多，这与突触的损失不同。
硝基突触素改善Tsc2杂合小鼠的神经行为表型
对三个月大的Tsc2+/+和Tsc2+/-小鼠执行恐惧条件测试，以探查eNMDAR拮抗剂对Tsc2+/-小鼠的焦虑症以及学习和记忆缺陷的影响。施用媒剂、美金刚或硝基突触素持续两天半，其中最后一次药物的剂量在第一次训练环节之前3小时发生。在恐惧条件测试中(参见图23)，WT同窝仔小鼠在训练情境中表现出比新情境显著增加的冷冻时间量(P＝0.032)，这指示这些动物可在两种条件之间进行区分。图23示出通过恐惧条件测试评定的美金刚或硝基突触素治疗对Tsc2+/-小鼠的情境区分的影响。在恐惧条件试验中，用媒剂、美金刚或硝基突触素治疗的三个月大的WT和Tsc2+/-转基因小鼠的冷冻时间。测试的所有四组小鼠(WT-媒剂、Het-媒剂、Het-美金刚和Het-硝基突触素)示出在“训练情境”和“新情境+提示”中冷冻，这指示它们的条件恐惧响应不受基因型或药物的影响。另外，WT小鼠显示出训练和新型情境之间的情境区分(*P＝0.032)。相比之下，经媒剂或美金刚治疗的Tsc2+/-小鼠在这种行为上表现出缺陷，从而导致训练与新情境之间缺乏区分(n.s.＝无明显差异)。硝基突触素治疗改善了此表型，使Tsc2+/-小鼠的情境区分正常化(**P＝0.023)。值为平均值+s.e.m.(每组n＝7-12个小鼠)。缩写：训练情境＝训练环境，其中小鼠先受到冲击，然后声音提示的训练。新情境＝测试腔室内的新地板和墙壁。新情境+提示＝带有声音提示的新情境。
相比之下，Tsc2+/-(het)小鼠缺乏这种形式的情境区分。值得注意的是，虽然美金刚未能减轻这种缺陷，但是硝基突触素改善了Tsc2+/-小鼠将情境区分到正常WT水平的能力(P＝0.023)。作为对照，测试的所有四组小鼠(WT-媒剂、Het-媒剂、Het-美金刚和Het-硝基突触素)在新情境下均显示出对条件提示的冷冻，这指示基因型或药物不影响海马体独立性恐惧响应。
总之，如在CA1海马体中诱导LTP大约一小时后监测到的，新改善的药物硝基突触素的短期(4小时)施加(而非美金刚)能够逆转突触可塑性的缺陷。重要的是，用硝基突触素进行两天半的治疗逆转通过突触体素染色监测的Tsc2+/-小鼠海马体中观察到的突触损失。用硝基突触素进行短短两天半的治疗(但不使用美金刚)可使Tsc2+/-小鼠中的情境区分正常化。在突触可塑性的电生理学读取、突触的神经组织学分析以及焦虑症和记忆的神经行为评定方面，硝基突触素优于美金刚。这些结果表明，应将硝基突触素测试作为TSC的神经方面的潜在疗法，以改善生活质量。
实例7：硝基突触素在瑞特综合征的MeCP2无效小鼠模型中的有益作用
如图24所示，在瑞特综合征(另一种类型的ADD/IDD)的MeCP2基因敲除(KO)小鼠模型中，硝基突触素改善了运动行为(对于转棒测试，其为本领域技术人员所熟知)。
本申请展现了Mef2c-het小鼠是人类MCHS的有用模型；E/I不平衡可在MCHS的发病机制中起作用。用适当NMDAR拮抗剂恢复突触可塑性和预防神经元损失修复或改善在MEF2C-Het小鼠中的自闭症/MCHS样表型。本文的结果描述了通过施用硝基突触素(也称为硝基美金刚YQW-036或NMI-6979，参见结构1)治疗人类MCHS和其它形式的ASD、IDD和癫痫症(例如，此处示出的TSC和瑞特综合征)。
实例8.方法
实例1-7采用了如下所述的方法。本领域技术人员理解以下描述是实例性的，并且在获得与实例1-7中相同或相似的结果时可进行不重要的变化。
小鼠、药物治疗和行为测试
通过将携带常规外显子2-缺失等位基因的Mef2c(Mef2cΔ2)与其WT同窝仔小鼠杂交形成Mef2c杂合基因敲除(Mef2c-het)小鼠。在Sanford Burnham Prebys医学发现研究所的机构动物护理及使用委员会(IACUC)批准了所有用于维持和使用这些小鼠的程序。在这项研究中，仅雄性小鼠用于行为测定以确保均匀性(无论是否接受药物治疗)。用美金刚、硝基突触素(均为4.6μmol/kg体重)或媒剂(PBS)的长期治疗通过腹膜内注射施用，每天两次，持续至少3个月，开始于约2.5周龄。之所以选择这个年龄是因为小鼠仍处于幼年状态，因此可在人类的等效阶段开始治疗。药物治疗的剂量和持续时间是根据以前的研究选择的，其中硝基突触素对神经元和突触具有明显的保护作用。
在对小鼠执行基因分型之前，将其随机分配至美金刚、硝基突触素或媒剂组。执行腹膜内注射和行为测试的实验室工作人员对基因型不了解。在行为测试后，将小鼠用于免疫组织化学或电生理学研究，如下所述并以盲法进行研究。
运动活性
在放置在框架(25.5x47cm)中的聚碳酸酯笼子(42x22x20cm)中测量运动活性，所述框架在笼子底部上方2和7cm处安装有两个水平的光电管光束(San Diego Instruments,SanDiego,CA)。这两组光束允许记录水平(运动)和垂直(竖起)行为。将薄层的床上用品施加在笼子的底部。根据确切的测试将小鼠测试30或120分钟。
爪子紧握
为了进行爪子握紧测试，拾取小鼠的尾巴末端三分之一，并且观察10秒。基于对前爪和/或后爪的紧握，对基因型进行了盲法评分：0-不爪子紧握；1-偶尔前爪紧握；3-前爪的持续紧握并且后爪的偶尔握紧。
巴恩斯迷宫
巴恩斯迷宫由直径75cm的通过三脚架高出地面58cm的不透明有机玻璃圆盘组成。直径为5cm的20个孔位于距离周长5cm处，并且在孔中的一个的下方放置黑色有机玻璃逃离盒(19x8x7cm)。明显的空间提示位于整个迷宫周围，并且在整个研究过程中保持不变。在测试的第一天，执行训练环节，所述训练环节由将小鼠放置在逃离盒中并使其在此停留1分钟组成。在一分钟后，开始第一环节。在每个环节开始时，将小鼠放置在10cm高的圆柱形黑色起始腔室中的迷宫的中间。在10s后，移除起始腔室，打开蜂鸣器(80dB)和灯具(400lux)，并让小鼠自由探查迷宫。当小鼠进入逃离通道或在经历3分钟后，环节结束。当小鼠进入逃离通道时，关闭蜂鸣器，并且使小鼠保持在黑暗中一分钟。当小鼠本身没有进入通道时，将其轻轻放入逃离盒中1分钟。通道始终位于为每个小鼠随机确定的同一孔(在空间环境内稳定)的下方。每天对小鼠进行一次测试，持续12天，用于研究的采集部分。应注意，一般来说，在小鼠中，巴恩斯迷宫通常比莫里斯水迷宫更受青睐，因为其压力较小。然而，由于使用莫里斯水迷宫用硝基突触素针对其它指示对啮齿类动物进行测试，因此在这里也将其用于药物测试以进行比较。
莫里斯水迷宫
我们使用常规莫里斯水迷宫测试了空间参考学习和记忆。训练小鼠游动至直径为14cm的平台，并淹没在水面以下1.5cm处。游动时小鼠不可见平台。如果小鼠在60s内未能找到平台，则将其手动引导至平台并使其停留10s。每天对小鼠进行4次试验，持续达到标准(<20s平均逃离潜伏期)的时间。在最后一次训练试验后24h评定空间训练的保留时间。两次探针试验都由以下组成：在没有平台的情况下在游泳池中自由游动60s。使用ANY-迷宫视频跟踪系统(Stoelting Co.)对所有试验进行录像以进行自动分析。
三腔室社交互动
此测试最初由Crawley集团开发，用于自闭症动物模型。自闭症个体表现出异常的双向社交互动，包括低水平的社交方式和不寻常的互动模式。使用社交互动设备，所述设备由矩形的三腔室有机玻璃盒组成，其中每个腔室的尺寸为20cm(长)x40.5cm(宽)x22cm(高)。分隔腔室的墙壁是干净的，其带有小的半圆形开口(半径为3.5cm)，从而允许进入每个腔室。中间腔室是空的，并且两个外部腔室容纳有小的圆形金属丝笼(Galaxy Cup,Spectrum Diversified Designs,Inc.,Streetsboro,OH)。使小鼠习惯于整个设备，持续5分钟。为了评定社交互动，将小鼠返回到中间腔室，这次是用陌生小鼠(同性的C57BL/6J拴在铁丝笼中)。持续5分钟记录下用陌生小鼠在腔室中所花费的时间和在容纳有空金属丝笼的腔室中所花费的时间，如进入每个腔室的次数那样。对实验小鼠进行一次测试，并且将陌生的C57BL/6J小鼠用于最多6项测试。
孔板探查
设备由有机玻璃笼子(32x32x30cm)组成，所述笼子具有格式为4x4(每个直径为3cm)的在升高的地板上等距间隔开的16个孔。在5分钟内测量包括头浸入的次数和头浸入花费的时间的探查性活动。
海马体切片制备和电生理
用过量的异氟烷麻醉1至6个月大的小鼠并将其断头。将大脑快速解剖，并且将海马体切片(350μm厚)收集在冰冷解剖缓冲液中，所述冰冷解剖缓冲液含有以下(以mM为单位)：212蔗糖、3KCl、5MgCl2、0.5CaCl2、1NaH2PO4、26NaHCO3和10葡萄糖(pH 7.4)。切割CA3区域以避免癫痫症样活动。在30℃下在人工脑脊液(ACSF)中放置切片，所述人工脑脊液(ACSF)含有以下(以mM为单位)：124NaCl、5KCl、26NaHCO3、1.25NaH2PO4、2CaCl2、1MgCl2和10葡萄糖(pH 7.4)。向ACSF和解剖缓冲液中注入95％O2/5％CO2。在记录之前，将切片放置于浸没式记录腔室中，维持在30℃下，并用ACSF灌注≥1h。
对于胞外场记录，使用同心、双极钨电极活化在海马CA1区的Schaffer侧支/连合(SC)纤维。将充满ACSF(电阻为约1-3MΩ)的胞外玻璃微电极置于放射状层中，以测量场兴奋性突触后电位(fEPSP)。对于基线记录，以0.033Hz的频率刺激切片20分钟，其刺激强度是用来引起最大的测量fEPSP幅度的那些刺激强度的30-40％。通过施加由三个100Hz脉冲组成的高频刺激(HFS)来诱导长期增强(LTP)(持续时间：1s，间隔：20s)。通过施加两个脉冲间隔(ISI)为20到200ms的脉冲来测试配对脉冲促进(PPF)。使用Multiclamp 700B放大器(分子设备)进行实验。数据以5kHz采样并使用Clampfit10程序(Molecular Devices)进行分析。
使用全细胞电压钳技术从齿状回(DG)颗粒神经元记录突触活性。使用Multiclamp700B放大器和Clampex 10.2软件(Molecular Devices)获取数据。记录以200μs采样并以2kHz过滤。ACSF用作外部浴液，含有50μM微小毒素和1μM河豚毒素(TTX)来分离自发的微型兴奋性突触后电流(mEPSC)或10μM 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)、50μM(2R)-氨基-5-膦酸戊酸酯(AP5)和1μM TTX来分离自发的微型抑制突触后电流(mIPSC)。在开始记录之前，让所有溶液平衡至少20分钟。用于电压钳实验的移液管的内部溶液含有以下(以mM计)：120葡萄糖酸钾、15KCl、1MgCl2、5HEPES、5EGTA、2Mg-ATP、pH 7.4(300mOsm)。通常将mEPSC和mIPSC记录至少3-5分钟，并使用Mini Analysis Program6.0.3版(Synaptosoft)进行分析。
免疫组织化学和无偏好的体细胞计数
用PBS缓冲液灌注小鼠，然后用PBS(PFA)中的2％多聚甲醛灌注。灌注后，取出大脑，放置在2％PFA中过夜以进行后固定，然后在冷冻前沉入PBS中的30％蔗糖中。将低温恒温器切片切成15μm的厚度。将切片浸入抗原解掩蔽溶液(媒剂)中并微波治疗30s，然后用0.25％Triton X-100的PBS渗透15分钟。一抗在4℃孵育16小时，荧光偶联的二抗在25℃孵育2小时。每个视野中许多未染色的细胞用作染色特异性的内部对照。一抗包括：NeuN(小鼠，EMD密理博)，活化的半胱天冬酶-3(兔，细胞信号转导)，VGLUT1(豚鼠，SYSY)、VGLUT2(兔，SYSY)、VGAT(小鼠，SYSY)、突触素(小鼠，Sigma)、GFAP(小鼠，Sigma)、PCNA(小鼠，SantaCruz)、DCX(山羊，Santa Cruz)。根据供应商的指示，使用罗氏原位细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL分析以评定细胞凋亡。如前所述，使用光解剖仪在特定的大脑区域对被NeuN、活化的半胱天冬酶-3、TUNEL、GFAP、PCNA或DCX占据的阳性或百分比细胞数量进行计数，或者通过量化共聚焦免疫组织化学或光学密度进行估计，如前所述。
脑裂解物的制备和蛋白质印迹
将脑组织在10体积的冷蔗糖缓冲液(0.32M蔗糖，25mM Hepes，pH 7.4)中匀浆。在4℃下以3,000g短暂离心5分钟后，收集上清液，并在4℃下以10,000g离心12分钟。收集沉淀的外部3/4，并通过缓慢移液用相同的蔗糖缓冲液重悬，同时避免了含有线粒体的深色中心。在10,000g在4℃下进行12分钟的第二次离心后，将没有深色中心的沉淀物收集在冷HBS(25mM Hepes，pH 7.4，150mM NaCl)中，作为富含突触体的脑裂解液，并用于蛋白质印迹实验。免疫印迹的一抗包括：VGLUT1(豚鼠，SYSY)、VGLUT2(兔子，SYSY)、GAD 65(兔子，Millipore)、突触素(小鼠，Millipore)、MEF2C(兔子，Proteintech)、α-微管蛋白(小鼠，Sigma)、β-肌动蛋白(小鼠，Sigma)，然后加上适当的二抗。请注意，GAD65代替了VGAT进行了免疫印迹，因为前一种抗体被证明对蛋白质印迹具有优越性。免疫信号在柯达X射线胶片上捕获，并使用ImageJ版本1.45s量化。
高尔基体染色和肖尔分析
根据制造商的说明，使用FDR apid GolgiStain试剂盒(FDNeuro Technologies，Inc.)用WT和Mef2c-het大脑进行标准的Golgi-Cox浸渍。通过反卷积显微镜以40倍的分辨率拍摄整个细胞的3D蒙太奇并用SlideBook5.0软件(Intelligent Imaging Innovations)重建后，使用Neurolucida神经元示踪软件(MBF Bioscience)描绘整个细胞的轮廓并进行Sholl分析，在其它地方详细描述。分析了累积的树突交叉点和树突长度。
成人神经发生
为了研究成年神经发生，对8周大的小鼠每天两次连续5天腹腔注射BrdU(50mg/kg体重)，并在最后一次注射后4周注入4％PFA。然后将脑解剖并在4％PFA中固定过夜，冲洗，冷冻保护并冷冻在液体N2。将冷冻切片(厚度为30或40μm)在低温恒温器上切片。标准的免疫染色程序用于一抗与适当的偶联二抗。对于BrdU免疫染色，将切片在2NHCl中预治疗30分钟。通过Mef2c-het和WT小鼠的海马DG在连续切片中分析了PCNA、DCX、BrdU、NeuN或mCherry阳性的细胞。使用SlideBook软件在63x目标下对阳性细胞进行计数。使用光学解剖器技术对细胞总数进行计数。在相同的曝光时间和对比度/亮度参数下拍摄照片。使用ImageJ软件确定特定标记的平均强度，并将其标准化为DG颗粒神经元的平均强度。每个标记至少分析6张图片，其中至少包含40个细胞。
运动行为测试
在四项20秒的试验中，通过落下升高(40cm)的水平棒(长50cm)的潜伏期来测量平衡。在试验1-2中使用扁木棒(9mm宽)，并且在试验3-4中使用圆柱形铝棒(直径为1cm)。在每个试验中，将动物放在升高的棒上的标记的中央区域(10cm)中。如果动物在20s内落入，则得分为0；如果在中央区域停留20s，则得分为1；离开中央区域时得分为2；并且到达杆末端中的一个时得分为3。在三个5s试验中测量了牵引能力，作为动物抬高后肢，同时通过保持被举起的水平杆(直径2mm)抓住的前脚悬吊的能力。如果动物没有举起四肢，则得分为0；如果一只动物举起了一只腿，则得分为0；而两只动物的举起了两个得分。通过一项60年代的试验来确定肌肉强度，在该试验中，将小鼠以颠倒的姿势放在单杠的中间，并测量了直至摔倒的潜伏期。对于垂直杆测试，将小鼠的头朝上放在用布胶带覆盖的垂直木杆上(直径1cm；高度：试验1中为75cm，试验2-3中为55cm)。记录了在3次试验中下降的等待时间和下降的总时间。如果小鼠没有向下转动，掉落或下滑，则记录为60s的默认值。
微阵列和NextBio基因网络分析
使用Qiagen miRNA试剂盒，从产后第30天的WT和Mef2c-het小鼠的海马体制备的冷冻组织中提取总RNA。使用Nanodrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific)确定RNA浓度，并使用安捷伦生物分析仪评定RNA质量。表达分析中包括的所有RNA样品的RNA完整性数(RIN)>8。MouseRef-8v2表达珠芯片(Illumina)用于基因表达微阵列。使用R软件和Bioconductor软件包执行微阵列数据分析。原始表达数据经过log2转换并通过分位数归一化进行归一化。数据质量控制标准包括高阵列间相关性(Pearson相关系数>0.85)以及基于平均阵列间相关性和层次聚类的异常值阵列检测。
对于途径富集分析，使用NextBio(Illumina公司)的途径富集应用程序针对GO-术语将在Mef2c-het小鼠中的所有基因(其的表达有统计学改变(P<0.05))相对于WT小鼠聚类。所用基因的背景设置是整个人类基因组。NextBio基于先前描述的方法分配等级得分。聚类到与神经元发育有关的GO术语的基因被优先用于验证基因表达的变化。
统计分析
将数据报告为平均值±s.e.m.。每个实验的统计测试在此处、图例或文本中列出。使用Prism 6程序(GraphPad Software公司)分析所有数据。对于正态分布的数据，通过斯图登氏t检验进行配对比较确定统计学显著性。使用具有Tukey's、Dunnett's或Newman-Keuls事后分析的方差分析进行多重比较。对于分类数据，采用在2x2列联表上的卡方检验或Fisher精确检验。对于不符合正态分布的数据，使用非参数检验。P<0.05被认为是统计显著的。

Claims (31)

1.一种利用N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受体(NMDAR)的抑制剂治疗对其有需要的受试者的幼年发病神经病况的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述NMDAR的抑制剂包含硝基突触素。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述NMDAR的抑制剂是硝基突触素。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述NMDAR的抑制剂是式I化合物或其医药学上可接受的盐：
Figure FDA0002433345290000011
其中
每个R1独立地选自-CH3和-CH2CH3；并且
R2选自氢和-ONO2。
5.根据权利要求4所述的方法，其中每个R1为-CH2CH3，并且R2为-ONO2。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述NMDAR的抑制剂是式II化合物或其医药学上可接受的盐：
Figure FDA0002433345290000012
其中
每个R1独立地选自氢、C1-C6烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基；
R2选自氢、C1-C6烷基和-ONO2；
R3和R4各自独立地选自氢和C1-C6烷基；
或R3和R4与它们所附接的氮原子一起形成杂环烷基。
7.根据权利要求6所述的方法，其中R3和R4各自为氢。
8.根据权利要求6所述的方法，其中R2选自氢和-ONO2。
9.根据权利要求8所述的方法，其中R2为-ONO2。
10.根据权利要求6所述的方法，其中每个R1独立地为C1-C6烷基。
11.根据权利要求6所述的方法，其中每个R1独立地选自甲基和乙基。
12.根据权利要求11所述的方法，其中每个R1为乙基。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述幼年发病神经病况是智力和发育障碍。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述幼年发病神经病况是自闭症谱系病症(ASD)。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述幼年发病神经病况包含癫痫病。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述幼年发病神经病况是结节性硬化症。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述幼年发病神经病况是自闭症。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述幼年发病神经病况是瑞特综合征(Rettsyndrome)。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是儿童。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是MEF2C单倍剂量不足的，并且患有MEF2C单倍剂量不足综合征(MCHS)。
21.根据权利要求1所述的方法，包含基于选自MEF2C、SLC32A1、SLC17A6、SYP和GAD65中的至少一种基因的表达水平选择进行治疗的受试者。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述表达水平是所述受试者的细胞的表达水平。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述表达水平是所述受试者的大脑中的细胞的表达水平。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述表达水平是所述受试者的循环细胞的表达水平。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述表达水平是mRNA表达水平。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述表达水平是蛋白质表达水平。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者患有MEF2C单倍剂量不足。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述基因是SLC32A1，并且相对于包含MEF2C基因的两个拷贝的普通受试者的表达水平，所述表达水平显著降低。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述基因是SLC17A6，并且相对于包含MEF2C基因的两个拷贝的普通受试者的表达水平，所述表达水平显著增加。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述基因是SYP，并且相对于包含MEF2C基因的两个拷贝的普通受试者的表达水平，所述表达水平显著降低。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述基因是GAD65，并且相对于包含MEF2C基因的两个拷贝的普通受试者的表达水平，所述表达水平显著降低。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023159238A1 (en) * 2022-02-21 2023-08-24 The Scripps Research Institute Mef2 transcriptional activators to treat neurologic conditions

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1852113A2 (en) * 2000-12-07 2007-11-07 Neuromolecular Inc. Methods for treating neuropsychiatric disorders with NMDA receptors antagonists
CN101374525A (zh) * 2004-09-23 2009-02-25 莫茨药物股份两合公司 美金刚治疗儿童行为障碍
US20110171291A1 (en) * 2010-01-07 2011-07-14 Sanford-Burnham Medical Research Institute Pathologically-activated therapeutics
US20140088083A1 (en) * 2004-09-20 2014-03-27 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Use of memantine (namenda) to treat autism, compulsivity, and impulsivity
US20150359759A1 (en) * 2013-01-25 2015-12-17 Case Western Reserve University Compositions and methods for the treatment of pervasive development disorders
WO2016083458A1 (en) * 2014-11-26 2016-06-02 Ieo - Istituto Europeo Di Oncologia S.R.L. Reprogramming-based models of neurodevelopmental disorders and uses thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4994467A (en) * 1989-05-31 1991-02-19 Zimmerman Andrew W Treating autism and other developmental disorders in children with NMDA receptor antagonists
US6444702B1 (en) 2000-02-22 2002-09-03 Neuromolecular, Inc. Aminoadamantane derivatives as therapeutic agents
US20040122090A1 (en) * 2001-12-07 2004-06-24 Lipton Stuart A. Methods for treating neuropsychiatric disorders with nmda receptor antagonists
CN1486180A (zh) 2000-12-07 2004-03-31 纽热莫勒丘乐有限公司 用nmda受体拮抗物治疗神经精神病紊乱的方法
WO2014015047A1 (en) 2012-07-17 2014-01-23 The General Hospital Corporation Compositions and methods to treat neurodegenerative diseases
FR3007983B1 (fr) 2013-07-08 2015-06-26 Air Liquide Association de xenon et d'un antagoniste des recepteurs nmda pour lutter contre une maladie neurodegenerative

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1852113A2 (en) * 2000-12-07 2007-11-07 Neuromolecular Inc. Methods for treating neuropsychiatric disorders with NMDA receptors antagonists
US20140088083A1 (en) * 2004-09-20 2014-03-27 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Use of memantine (namenda) to treat autism, compulsivity, and impulsivity
CN101374525A (zh) * 2004-09-23 2009-02-25 莫茨药物股份两合公司 美金刚治疗儿童行为障碍
US20110171291A1 (en) * 2010-01-07 2011-07-14 Sanford-Burnham Medical Research Institute Pathologically-activated therapeutics
US20150359759A1 (en) * 2013-01-25 2015-12-17 Case Western Reserve University Compositions and methods for the treatment of pervasive development disorders
WO2016083458A1 (en) * 2014-11-26 2016-06-02 Ieo - Istituto Europeo Di Oncologia S.R.L. Reprogramming-based models of neurodevelopmental disorders and uses thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CRAIG ERICKSON等: "A retrospective study of memantine in children and adolescents with pervasive developmental disorders", 《PSYCHOPHARMACOLOGY》 *
HIROTO TAKAHASHI等: "Pharmacologically targeted NMDA receptor antagonism by NitroMemantine for cerebrovascular disease", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
HIROTO TAKAHASHI等: "Pharmacologically targeted NMDA receptor antagonism by NitroMemantine for cerebrovascular disease", SCIENTIFIC REPORTS *
S. LIPTON: "Application of FDA-Approved Memantine and Newer NitroMemantine Derivatives to Treat Neurological Manifestations in Rodent Models of Tuberous Sclerosis Complex", 《BIOLOGY，PSYCHOLOGY》 *
S. LIPTON: "Application of FDA-Approved Memantine and Newer NitroMemantine Derivatives to Treat Neurological Manifestations in Rodent Models of Tuberous Sclerosis Complex", BIOLOGY，PSYCHOLOGY *

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