CN107096041A - 使用腺病毒的治疗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过施用腺病毒而降低或减小患者中肿瘤大小或消除肿瘤或抑制、减少或降低患者中肿瘤内的新血管生成或血管发生的方法，所述腺病毒包含核酸构建体，该核酸构建体包含了可操作性连接到内皮细胞特异性启动子的FAS嵌合基因。本发明还提供了含有可操作性连接到内皮细胞特异性启动子的FAS嵌合基因的均一腺病毒群体及其用途。

Description

使用腺病毒的治疗方法
本申请是2013800622338的分案申请。
发明领域
本公开内容涉及癌症生物学、免疫学和药理学。更具体地，它涉 及通过施用表达Fas嵌合转基因产物的核酸构建体或所述核酸构建体 的均一群体治疗妇科癌症有关的疾病或紊乱的方法。
发明背景
妇科癌症在临床上具有侵袭性，通常在女性生殖道的组织中发 展，并与不良结果相关。这些癌症包括卵巢癌、子宫癌、输卵管癌和 宫颈癌，并且还包括恶性米勒管混合瘤(malignant mixed米勒管 tumors,MMMT)。在极少数情况下，MMMT也能够在女性腹膜(腹 壁内膜)中发展。
妇科癌症可能难于检测并往往在它们处于晚期时才得到诊断。卵 巢癌大约占女性癌症的百分之三。作为女性中第九位最常见的癌症， 卵巢癌是女性癌症相关死亡的第五大原因，并且是最致命的妇科癌症 (2012年)。卵巢癌以对基于铂和紫杉烷的疗法的高反应率而对化疗 敏感。但是，尽管在治疗的设计和递送中的进步，癌症复发和化疗抗 性仍然是治疗这些类型的癌症的障碍。尽管积极的主要治疗和高的初 始反应率，大多数患有晚期卵巢癌的女性会复发并发展抗性疾病。在 这些晚期疾病状态中，对后续化疗的反应率大大减少了，突出表明迫 切需要开发改进的治疗剂和策略。
发明概述
本发明涉及降低或减少患者中肿瘤的尺寸或者消除或减缓肿瘤 的生长的方法，该方法包括给所述患者施用有效量的核酸构建体，所 述核酸构建体包含被可操作地连接至内皮细胞特异性启动子的Fas嵌 合基因，其中在所述患者中，由所述核酸构建体编码的Fas嵌合基因 产物降低或减少所述肿瘤的尺寸或消除所述肿瘤，并且其中所述肿瘤 与女性妇科癌症或其转移有关。本发明还提供抑制、降低或减少肿瘤 中新生血管形成或血管发生的方法，该方法包括给患有所述肿瘤的患 者施用有效量的核酸构建体，所述核酸构建体包含被可操作地连接至 内皮细胞特异性启动子的Fas嵌合基因，其中由所述核酸构建体编码 的Fas嵌合基因产物抑制、降低或减少所述肿瘤中新生血管形成或血 管生成，并且其中所述肿瘤与女性妇科癌症或其转移有关。此外，本 发明包括治疗或预防患者中与以下癌症有关或源自以下癌症的肿瘤的 方法：米勒管癌症(Müllerian cancer)、卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌或 子宫乳头状浆液性癌，该方法包括施用有效量的核酸构建体，所述核 酸构建体包含被可操作地连接至内皮细胞特异性启动子的Fas嵌合基 因，其中由所述核酸构建体编码的Fas嵌合基因产物治疗或预防女性 妇科癌症或其转移。在一个实施方案中，所述肿瘤或其转移在所述施 用之后被降低尺寸或被消除或降低所述肿瘤的生长。在另一个实施方案中，所述肿瘤或其转移被降低，使得与所述施用之前所述肿瘤的最 大直径(LD)相比，其LD被降低至少大约10％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其它实施方案中，所述 女性妇科癌症与以下癌症有关或源自所述癌症：米勒管癌症、卵巢癌、 腹膜癌、输卵管癌、子宫乳头状浆液性癌、其任意组合或其转移。
在一些实施方案中，所述患者之前已经接受基于铂的疗法。在一 个实例中，所述患者患有复发性铂抗性癌症。在另一个实例中，患有 复发性铂抗性癌症或复发性紫杉烷抗性癌症的患者在完成或接受基于 铂的疗法或基于紫杉烷的疗法的六个月内具有进展性(progressive) 肿瘤。
在某些实施方案中，所述患者没有针对腺病毒的已有抗体或没有 发展针对腺病毒的抗体。
在其它实施方案中，本发明的方法还包括施用有效量的一种或更 多种化疗剂。所述一种或更多种化疗剂可以在施用所述核酸构建体之 前、同时或之后进行施用。在一个具体的实施方案中，所述化疗剂是 紫杉醇。
在某些实施方案中，用于本发明方法的核酸构建体是腺病毒。在 一个实例中，所述腺病毒表达Fas嵌合基因产物，所述Fas嵌合基因 产物包含融合至Fas多肽的跨膜结构域和胞内结构域的TNF受体1 (TNFR1)多肽的胞外结构域。编码Fas嵌合基因产物的多核苷酸被 可操作地连接至内皮细胞特异性启动子，例如PPE-1-3X启动子。在 一个具体的实施方案中，所述腺病毒包含与SEQ ID NO:19至少70％、 80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序 列。
本发明的一个方面包括包含SEQ ID NO:18的核酸构建体。在另 一个方面，所述核酸构建体还包含编码Fas嵌合蛋白的核苷酸序列。 在其它实施方案中，本发明是包含SEQID NO:19的载体。所述载体 可以是腺病毒。
本发明的一个方面包括包含SEQ ID NO:18的核酸构建体。在另 一个方面，所述核酸构建体还包含编码Fas嵌合蛋白的核苷酸序列。 在其它实施方案中，本发明是包含SEQID NO:19的载体。所述载体 可以是腺病毒。
本发明还包括在需要其的受试者的组织中抑制、降低或减少血管 发生或新生血管形成的方法，该方法包括向所述受试者施用所述核酸 构建体、所述载体、所述腺病毒或所述组合物。在一个实施方案中， 所述组织包含肿瘤。在另一个实施方案中，在所述施用之后肿瘤的尺 寸被减少或降低或者在所述施用之后所述肿瘤的生长被减缓。在其它 实施方案中，所述肿瘤源自以下癌症或与以下癌症有关：甲状腺癌、 神经内分泌癌、胶质母细胞瘤、女性妇科癌症、其任意组合或其转移。
附图简要说明
图1显示了在施用媒介物(vehicle)、VB111 1E9(109个病毒颗 粒(VP)的VB-111)、VB111 1E11(1011个VP的VB-111)、低 Com(ComLow)(20mg/kg卡铂+10mg/kg爱宁达(Alimta))、高Com (ComHigh)(50mg/kg卡铂+30mg/kg爱宁达)、VB111 1E9+低Com (VB-111109个VP+20mg/kg卡铂+10mg/kg爱宁达)、VB111 1E9+ 高Com(VB-111 109个VP+50mg/kg卡铂+30mg/kg爱宁达)、VB111 1E11+低Com(VB-111 1011个VP+20mg/kg卡铂+10mg/kg爱宁达) 和VB111 1E11+高Com(VB-111 1011个VP+50mg/kg卡铂+30mg/kg 爱宁达)(x轴)的Lewis肺癌小鼠中的平均肿瘤负荷(y轴)。
图2显示了在施用媒介物(1)、VB111 1E9(109个病毒颗粒(VP) 的VB-111)(2)、VB111 1E11(1011个VP的VB-111)(3)、低 Com(20mg/kg卡铂+10mg/kg爱宁达)(4)、高Com(50mg/kg卡 铂+30mg/kg爱宁达)(5)、VB111 1E9+低Com(VB-111 109个 VP+20mg/kg卡铂+10mg/kg爱宁达)(6)、VB111 1E9+高Com(VB-111 109个VP+50mg/kg卡铂+30mg/kg爱宁达)(7)、VB111 1E11+低 Com(VB-111 1011个VP+20mg/kg卡铂+10mg/kg爱宁达)(8)和 VB1111E11+高Com(VB-111 1011个VP+50mg/kg卡铂+30mg/kg爱 宁达)(9)(x轴)的Lewis肺癌小鼠中的平均肿瘤负荷(y轴)的 盒型图(box plot)。
图3显示了包含被可操作地连接至内皮细胞特异性启动子(例如 VB-111)的FAS嵌合基因的腺病毒和紫杉醇的组合治疗方案。每八 周施用大约3x1012个VP或1x1013个VP的VB-111，并且每周施用 紫杉醇一次。
发明详述
一、定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本发 明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在有冲突的 情况下，以本发明(包括定义)为准。除非上下文另有要求，否则单 数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。本文所提到的所有出版 物、专利和其它文献通过引用整体并入本文用于所有目的，如同每篇 出版物或专利申请被具体地且个别地指明通过引用并入本文一样。
虽然与本文所述的那些类似或等同的方法和材料能够被用于实 践或测试本发明，合适的方法和材料被描述如下。所述材料、方法和 实例仅仅是说明性的而非旨在限制。可以从详细的说明书和从权利要 求书容易地看到本发明的其它特征和优点。
为了进一步定义本发明，提供以下术语和定义。
在本文中所使用的“抗体”是指完整的免疫球蛋白或其抗原结合 片段。本发明的抗体可以是任何同种型(isotype)或类(例如M、D、 G、E和A)或任何亚类(例如G1-4、A1-2)，并且可以具有或者kappa (κ)或者lambda(λ)轻链。
在本文中所使用的术语“有效量”是指在剂量上和针对必需的时 间段有效实现所需结果的量。所需结果可以是例如体外或体内减少或 抑制新生血管形成或血管生成。有效量不需要是完全去除新生血管形 成或血管生成。
在本文中所使用的“治疗有效量”是指在剂量上和针对必需的时 间段有效实现所需治疗结果的量。治疗结果可以是例如症状减轻、在 放射成像中肿瘤尺寸的消退或稳定化、延长的存活期、改善的运动性 等。治疗结果不需要是“治愈”。
在本文中所使用的“预防有效量”是指在剂量上和针对必需的时 间段有效实现所需预防结果的量。典型地，由于预防剂量是在疾病的 很早期之前或在疾病的早期被用于受试者，所述预防有效量将小于所 述治疗有效量。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”涵盖单数核酸以及复数核酸，并且指 分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA (pDNA)。在某些实施方案中，多核苷酸包含常规磷酸二酯键或非 常规的键(例如酰胺键，如发现于肽核酸(PNA)中的键)。
在本文中所使用的“多核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”可以互换使用 并含有全长cDNA序列的核苷酸序列，包括非翻译5'和3'序列、编码 序列以及所述核酸序列的片段、表位、结构域和变体。所述多核苷酸 可以由任意多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰 的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由单 链和双链DNA、单链和双链区域混合的DNA、单链和双链RNA、单 链和双链区域混合的RNA、包含可以是单链或更典型地双链或单链和 双链区域混合的DNA和RNA的杂合分子组成。此外，所述多核苷酸 可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区域组成。多核 苷酸还可以含有一个或更多个修饰的碱基或因为稳定性或因为其它原 因被修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化碱 基和稀有碱基(如肌苷)。可以对DNA和RNA进行各种修饰；因此， “多核苷酸”包括化学、酶法或代谢修饰的形式。
在本发明中，多肽可以由通过肽键或修饰的肽键(即肽电子等排 物)互相结合的氨基酸组成，并可以含有除20种基因编码的氨基酸之 外的氨基酸(例如非天然存在的氨基酸)。本发明的多肽可以或者通 过天然的过程(如翻译后加工)或者通过本领域公知的化学修饰技术 进行修饰。这样的修饰被充分描述于基础教科书和更详细的专著以及 大量的研究文献中。修饰可以在多肽的任何地方发生，包括肽骨架、 氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解的是，相同类型的修饰可以 相同或不同的程度存在于给定多肽的几个位点。而且，给定多肽可以 含有许多类型的修饰。多肽可以是分支的，例如作为泛素化的结果， 并且它们可以是环状的，有或者没有分支。环状的、分支的和分支环 状多肽可以由翻译后天然过程导致或者可以由合成方法进行制备。修 饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血 红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂 质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键 形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的的 形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲 基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白质水解加工、磷酸化、异 戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导氨基酸添加到 蛋白质(如精氨酰化)和泛素化。(参见，例如Proteins-Structure And Molecular Properties,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)；Posttranslational CovalentModification of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,pgs.1-12(1983)；Seifter et al.,Meth Enzymol 182:626-646(1990)；Rattan et al., Ann NYAcad Sci 663:48-62(1992)。)
当涉及本发明的任意多肽或多核苷酸时，术语“片段”、“变体”、 “衍生物”和“类似物”包括保留至少一些活性(即作为所述多肽或多核 苷酸的任意天然存在的功能发挥作用的能力)的任意多肽或多核苷酸。 例如肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的“片段”、“变体”、“衍生物”和“类 似物”具有天然存在的全长TNFR1的一些活性，例如，结合TNFR1 配体(即TNF-α或淋巴毒素)的能力。在另一个实例中，FAS多肽的 “片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”具有天然存在的全长FAS多肽 的一些活性，例如，诱导细胞凋亡的能力。在其它实例中，内皮细胞 特异性启动子的“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”能够诱导被可 操作地连接至所述启动子的基因的内皮细胞特异性表达。TNFR1、FAS 多肽和内皮细胞特异性启动子的各种片段、变体、类似物或衍生物的 另外的非限制性的实例描述如下。
在本发明中，“多肽片段”或“蛋白质片段”是指多肽的短氨基酸序 列。蛋白质或多肽片段可以是“独立式的”，或包含于更大的多肽内， 其中所述片段形成区域的一部分。本发明的多肽片段的代表性实例包 括例如包含大约5个氨基酸、大约10个氨基酸、大约15个氨基酸、 大约20个氨基酸、大约30个氨基酸、大约40个氨基酸、大约50个 氨基酸、大约60个氨基酸、大约70个氨基酸、大约80个氨基酸、大 约90个氨基酸和大约100个氨基酸的片段。
“保守性氨基酸置换”是这样的，其中所述氨基酸残基被替换为具 有类似侧链的氨基酸残基。在本领域已经定义了具有类似侧链的氨基 酸残基的家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸 性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨 酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、 非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯 丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。 因此，如果多肽中的氨基酸被替换成来自相同侧链家族的另一氨基酸， 则该置换被认为是保守的。在另一个实施方案中，一串氨基酸可以被 保守替换成侧链家族成员的顺序和/或组成不同的结构类似的一串氨 基酸。
两个多核苷酸或多肽序列之间的术语“序列同一性百分比”是指， 考虑到针对这两个序列的最佳比对必须被引入的添加或缺失(即缺 口)，在比较窗口上由所述序列共有的相同匹配位置的数量。匹配位 置是靶序列和参考序列中均表现相同的核苷酸或氨基酸的任意位置。 不计算在靶序列中表现的缺口，因为缺口不是核苷酸或氨基酸。同样， 不计算在参考序列中表现的缺口，因为计算的是靶序列的核苷酸或氨 基酸，而不是来自参考序列的核苷酸或氨基酸。
通过以下方法计算序列同一性的百分比：确定在两个序列中均存 在相同的氨基酸残基或核酸碱基的位置的数量以得到匹配位置的数 量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数并将结果乘以100， 得到序列同一性的百分比。两个序列之间的序列比较和序列同一性百 分比的确定可以使用对于在线使用和下载均容易获得的软件来完成。 合适的软件程序可以从各种来源获得，并且可用于蛋白质和核苷酸序 列的比对。适于确定序列同一性百分比的一个程序是bl2seq，该程序 为可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站 (blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的部分。Bl2seq使 用或者BLASTN或者BLASTP算法进行两个序列之间的比较。 BLASTN是用于比较核酸序列，而BLASTP是用于比较氨基酸序列。 其它合适的程序有例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其为EMBOSS生物信息程序套件的部分，并且也可从欧洲生物信息研究所 (EBI)在www.ebi.ac.uk/Tools/psa获得。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列 内的不同区域可以各自具有它们自己的序列同一性百分比。应注意的 是，序列同一性百分比的值舍入至最接近的十分之一。例如，80.11、 80.12、80.13和80.14向下舍入至80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18 和80.19向上舍入至80.2。还应注意的是，长度的值将始终是整数。
本领域技术人员将理解的是，用于计算序列同一性百分比的序列 比对的产生并不仅仅局限于完全由原始序列数据所驱动的二元序列- 序列比较。序列比对可以源自多重序列比对。适于产生多个序列比对 的一个程序是ClustalW2，其可从www.clustal.org获得。另一个合适 的程序是MUSCLE，其可从www.drive5.com/muscle/获得。ClustalW2 和MUSCLE备选地可从例如EBI获得。
还将理解的是，可以通过将序列数据与异质来源(如结构数据(例 如晶体学蛋白质结构)、功能数据(例如突变的位置)或系统发生数 据)整合来产生序列比对。整合异质数据以产生多重序列比对的合适 的程序是T-Coffee，其可从www.tcoffee.org获得，并且备选地可从例 如EBI获得。还将理解的是，用于计算序列同一性百分比的最终比对 可以被或者自动或者手工辅助。
在本文中所使用的术语“连接的”、“融合的(fused)”、“融合/ 融合体(fusion)”、“嵌合的”和“嵌合”可以互换使用。这些术语是指 两个或更多个的元件或成分以任何方式(包括化学缀合或重组方式) 连接在一起。“框内融合”是指两个或更多个开放阅读框(ORF)以保 持原始ORF的正确阅读框的方式连接而形成连续的更长ORF。因此， 所得到的重组融合体或嵌合蛋白质是含有对应于由原始ORF编码的 多肽的两个或更多个区段的单个蛋白质(所述区段在自然界中正常情 况下是不会这样连接的)。尽管由此所制得的阅读框在整个融合区段 上是连续的，但是这些区段可以由例如框内接头序列在物理上或空间 上分隔开。
术语“异源的”和“异源部分”是指源自与其要比较的实体不同的 实体的多核苷酸、多肽或其它部分。例如，异源多肽可以是合成的或 源自不同物种、个体的不同细胞类型或不同个体的相同或不同类型的 细胞。在一个方面，异源部分可以是被融合至另一个多肽以产生融合 多肽或蛋白质的多肽。在另一个方面，异源部分可以是被缀合至多肽 或蛋白质的非多肽(如PEG)。
在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是多肽中以从氨基到羧 基末端方向的氨基酸的顺序，其中所述序列中彼此相邻的残基在所述 多肽的一级结构中是连续的。
在本文中所使用的术语“表达”是指基因通过其产生生化产品(例 如RNA或多肽)的过程。所述过程包括细胞内所述基因的功能性存 在的任何表现，包括但不限于基因敲低以及瞬时表达和稳定表达。它 包括但不限于基因转录成信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产 物和这样的mRNA翻译成一个或多个多肽。如果最终所需产物是生化 产品，表达包括创造该生化产品和任何前体。
二、包含FAS嵌合基因和内皮细胞特异性启动子的核酸构建体
本发明涉及通过抑制、降低或减少肿瘤中血管生成或新生血管形 成来减少或降低女性妇科癌症中肿瘤的尺寸的方法，该方法包括施用 表达FAS嵌合蛋白的核酸构建体。编码FAS嵌合蛋白(或基因产物) 的基因在本发明中可被连接至指导所述FAS嵌合基因产物在内皮细 胞中表达的内皮细胞特异性启动子。这样的细胞毒性基因产物的表达 在不期望有过量的新生血管形成或血管生长的情况下(例如在肿瘤中) 是有用的。
本发明还提供包含被可操作地连接至内皮细胞特异性启动子的 FAS嵌合基因的核酸构建体的均质群体。
A.FAS嵌合
由本发明的核酸构建体表达的FAS嵌合蛋白包含至少两个“死亡 受体”多肽，所述多肽的每一个源自不同的蛋白质。FAS嵌合蛋白的 第一多肽包含肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)的配体结合结构域。FAS 嵌合蛋白的第二多肽包含FAS多肽的效应子结构域。
TNFR1的配体结合结构域可以是结合TNFR1配体的任何结构 域。在一个实施方案中，TNFR1配体是TNF-α。在另一个实施方案中， TNFR1配体是淋巴毒素-α。TNFR1的配体结合结构域可以是TNFR1 的胞外结构域或其任意片段、变体、衍生物或类似物。TNFR1配体结 合结构域的非限制性的实例描述如下。
可用于本发明的FAS多肽的效应子结构域包含形成死亡诱导性 信号传导复合物(death-inducing signaling complex，DISC)的任何 FAS结构域，从而诱导细胞凋亡。在一个实施方案中，FAS多肽的效 应子结构域包含胞内结构域、跨膜结构域或二者均包含。FAS多肽效 应子结构域的非限制性的实例描述如下。
TNFR1和FAS多肽可以通过肽键或通过接头进行连接。将 TNFR1配体结合结构域与FAS效应子结构域连接的接头可以是多肽 接头或非肽接头。例如，用于FAS嵌合蛋白的接头可以包含一个或更 多个甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸或其任意组合。在一个实施方案中，可 用于本发明的接头包含Ser-Leu。在另一个实施方案中，可用于本发 明的接头包含(GGGS)n，(Denise et al.J.Biol.Chem.277:35035-35043 (2002))，其中n可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更 大(SEQ ID NO:27)。
1.肿瘤坏死因子受体1
全长的人TNFR1多肽长455个氨基酸并且也被称为TNF-R1、I 型肿瘤坏死因子受体(TNFRI)、TNFR-I、TNFRSF1A、TNFAR、 p55、P60或CD120a。已知天然存在的人TNFR1多肽结合TNF-α或 同源三聚体淋巴毒素-α。TNF-α与胞外结构域的结合导致TNFR1的 同源三聚化，然后其与1型肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域蛋白 (TRADD)的死亡结构域发生特异性相互作用。各种TRADD相互作 用蛋白(如TNF受体相关因子(TRAFS)、受体相互作用性丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶1(RIPK1)和具有死亡结构域的Fas相关蛋白(FADD))通过它们与TRADD的缔合被募集至复合物。该复合物 活化至少两个不同的信号级联，细胞凋亡和NF-κ-B信号传导。
作为人TNFR1多肽序列报道的455个氨基酸的多肽序列在 UniProtKB数据库中具有识别号P19438-1。在本文中该人TNFR1多 肽序列被命名为同工型(isoform)A和SEQ IDNO:2。SEQ ID NO: 1是编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列。108aa的多肽序列被报道为人TNFR1多肽序列的同工型并且在UniProtKB数据库中具有识别号 P19438-2。该108aa的多肽对应于同工型A(SEQ ID NO:2)的第1 至108位氨基酸并且在本文中被命名为同工型B。具有232aa的人 TNFR1多肽的另一个变体被报道为在UniProtKB数据库中具有识别 号P19438-3。该232aa的多肽对应于同工型A(SEQ ID NO:2)的 第1至232位氨基酸并且在本文中被命名为同工型C。人TNFR1的 另外的天然变体包括但不限于包含选自由以下突变组成的组的一个或 更多个突变的同工型A、B和C的TNFR1多肽：H51Q、C59R、C59S、 C62G、C62Y、P75L、T79M、C81F、C99S、S115G、C117R、C117Y、 R121P、R121Q、P305T及其任意组合。其它已知TNFR1变体包括包 含L13LILPQ、K255E、S286G、R394L、412:缺失、GPAA443-446APP 或其任意组合的同工型A、B和C的TNFR1多肽。
表1显示了人野生型TNFR1氨基酸序列和编码所述野生型 TNFR1的核苷酸序列。
表1.TNFR1序列
本发明还报道了小鼠TNFR1多肽序列及其变体。454aa的小鼠 TNFR1多肽在UniProtKB数据库中具有识别号P25118。在其它动物 中已知的TNFR1多肽包括但不限于大鼠(例如UniProtKB数据库中 的P22934)、牛(例如UniProtKB数据库中的O19131)、猪(例如UniProtKB数据库中的P50555)或马(例如UniProtKB数据库中的 D1MH71)。
全长的TNFR1能够被裂解成两条链，(1)TNF受体超家族成 员1A、膜形式(即对应于全长TNFR1的第22至455位氨基酸)和 (2)TNF结合蛋白1(TBPI)(即对应于全长TNFR1的第41至291 位氨基酸)。全长的人TNFR1多肽由信号序列(SEQ ID NO:2的第 1至21位氨基酸)、胞外结构域(SEQ ID NO:2的第22至211位氨 基酸)、跨膜结构域(SEQ ID NO:2的第212至234位氨基酸)和胞 质结构域(SEQ ID NO:2的第235至455位氨基酸)组成。TNFR1 的胞外结构域包含四个半胱氨酸重复区域，TNFR-Cys1(对应于SEQ ID NO:2的第43至82位氨基酸)、TNFR-Cys2(对应于SEQ ID NO: 2的第83至125位氨基酸)、TNFR-Cys3(对应于SEQ ID NO:2的 第126至166位氨基酸)和TNFR-Cys4(对应于SEQ ID NO:2的第 167至196位氨基酸)。
如本领域技术人员将理解的，以上所列的结构域的开始和结束的 残基可以改变，这取决于所使用的计算机建模程序或用于确定该结构 域的方法。因此，TNFR1的各种功能结构域可以与上述定义的那些不 同。
在一个实施方案中，可用于FAS嵌合蛋白的TNFR1的配体结合 结构域包含、TNFR1的胞外结构域或其任何片段、变体、衍生物或类 似物基本上由其组成或者由其组成，其中所述TNFR1的胞外结构域 或其任何片段、变体、衍生物或类似物结合TNF-α。在另一个实施方 案中，TNFR1的配体结合结构域包含TNFR-Cys1；TNFR-Cys2； TNFR-Cys3；TNFR-Cys4；TNFR-Cys1和TNFR-Cys2；TNFR-Cys1和 TNFR-Cys3；TNFR-Cys1和TNFR-Cys4；TNFR-Cys2和TNFR-Cys3； TNFR-Cys2和TNFR-Cys4；TNFR-Cys3和TNFR-Cys4；TNFR-Cys1, TNFR-Cys2和TNFR-Cys3；TNFR-Cys1,TNFR-Cys2和TNFR-Cys4； TNFR-Cys2,TNFR-Cys3和TNFR-Cys4；或TNFR-Cys1,TNFR-Cys2, TNFR-Cys3和TNFR-Cys4。在其它实施方案中，FAS嵌合蛋白中的TNFR1配体结合结构域包含TNF结合蛋白I。在又一些其它实施方案 中，FAS嵌合蛋白的TNFR1配体结合结构域包含与SEQ ID NO:2 的第22至190位氨基酸、第22至191位氨基酸、第22至192位氨基 酸、第22至193位氨基酸、第22至194位氨基酸、第22至195位氨 基酸、第22至196位氨基酸、第22至197位氨基酸、第22至198 位氨基酸、第22至199位氨基酸、第22至200位氨基酸、第22至 201位氨基酸、第22至202位氨基酸、第22至203位氨基酸、第22 至204位氨基酸、第22至205位氨基酸、第22至206位氨基酸、第22至207位氨基酸、第22至208位氨基酸、第22至209位氨基酸、 第22至210位氨基酸或第22至211位氨基酸至少60％、70％、80％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、 基本上由其组成或者由其组成，其中所述配体结合结构域结合TNFR1 配体，例如TNF-α。
在其它实施方案中，所述TNFR1的配体结合结构域还包含信号 肽。合适的信号肽的一个实例是TNFR1的信号肽，例如SEQ ID NO: 2的第1至21位氨基酸。在又一些其它实施方案中，FAS嵌合基因产 物的配体结合结构域包含与SEQ ID NO:2的第1至190位氨基酸、第1至191位氨基酸、第1至192位氨基酸、第1至193位氨基酸、 第1至194位氨基酸、第1至195位氨基酸、第1至196位氨基酸、 第1至197位氨基酸、第1至198位氨基酸、第1至199位氨基酸、 第1至200位氨基酸、第1至201位氨基酸、第1至202位氨基酸、 第1至203位氨基酸、第1至204位氨基酸、第1至205位氨基酸、 第1至206位氨基酸、第1至207位氨基酸、第1至208位氨基酸、 第1至209位氨基酸、第1至210位氨基酸或第1至211位氨基酸至 少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％ 相同的氨基酸序列、基本上由其组成或者由其组成，其中所述配体结 合结构域结合TNFR1配体，例如TNF-α。在一个具体的实施方案中， FAS嵌合蛋白的TNFR1配体结合结构域包含与SEQ ID NO:4至少 60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相 同的氨基酸序列、基本上由其组成或者由其组成，其中所述配体结合 结构域结合TNFR1配体，例如TNF-α。
在又一些其它实施方案中，TNFR1的配体结合结构域由与SEQ ID NO:3至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％相同的核苷酸序列编码。
在又一些其它实施方案中，FAS嵌合蛋白的TNFR1配体结合结 构域包含与SEQ IDNO:2的第22至108位氨基酸(TNFR1同工型B)、 SEQ ID NO:2的第22至232位氨基酸(TNFR1同工型C)或SEQ ID NO:2的第44至291位氨基酸(TBP1)至少60％、70％、80％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、基本上 由其组成或者由其组成，其中所述配体结合结构域结合TNFR1配体， 例如TNF-α。
2.FAS多肽
全长的人FAS多肽长335个氨基酸，并且也被称为肿瘤坏死因 子受体超家族成员6、Apo-1抗原、细胞凋亡介导的表面抗原FAS、 FASLG受体或CD95。天然存在的FAS多肽是针对TNFSF6/FASLG 的受体。当FAS多肽结合FAS配体(FasL)时，FAS和FasL之间 的相互作用导致形成死亡诱导性信号传导复合物(DISC)，其含有 FADD、胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-10。在一些细胞类型(I型)中， 加工的胱天蛋白酶-8直接活化胱天蛋白酶家族的其它成员，并触发细 胞凋亡的执行。在其它细胞类型(II型)中，FAS-DISC启动反馈环 路，其螺旋形提高来自线粒体的促凋亡因子的释放和胱天蛋白酶-8的 放大的活化。FAS介导的细胞凋亡可能在外周耐受性的诱导中、在成 熟细胞的抗原刺激的自杀中或者二者中发挥作用。
作为人FAS多肽序列报道的335aa的多肽序列在UniProtKB数 据库中具有识别号P25445-1。该人FAS多肽序列被命名为SEQ ID NO: 6。SEQ ID NO:5是编码SEQ ID NO:6的核苷酸序列。编码FAS多 肽的核苷酸序列也被称为APT1、FAS1或TNFRSF6。全长FAS多肽 含有信号肽(对应于SEQ ID NO:6的第1至25位氨基酸)、胞外结 构域(对应于SEQ ID NO:6的第26至173位氨基酸)、跨膜结构域 (对应于SEQ ID NO:6的第174至190位氨基酸)和胞内(或胞质) 结构域(对应于SEQ ID NO:6的第191至335位氨基酸)。胞内结 构域含有死亡结构域(例如对应于SEQ ID NO:6的第230至314位 氨基酸)。
如本领域技术人员将理解的，以上所列的结构域的开始和结束的 残基可以因所使用的计算机建模程序或用于确定该结构域的方法而有 所变化。因此，FAS的各种功能结构域可以由上述定义那些而变化。 表2显示了野生型人FAS氨基酸序列和编码所述FAS的核苷酸序列。
表2.FAS序列
本发明还报道了小鼠FAS的多肽序列及其变体。327aa的小鼠 FAS多肽在UniProtKB数据库中具有识别号P25446。在其它动物中 已知的FAS多肽包括但不限于旧大陆猴(例如UniProtKB数据库中 的Q9BDN4)、恒河猴(例如UniProtKB数据库中的Q9BDP2)、大鼠(例如UniProtKB数据库中的Q63199)或牛(例如UniProtKB数 据库中的P51867)。
基于FAS多肽中的序列变化，本领域技术人员能够鉴定FAS多 肽的效应子结构域中的序列变化。例如，FAS效应子结构域的天然变 体可以包括C178R、L180F、P183L、I184V、T198I、Y232C、T241K、 T241P、V249L、R250P、R250Q、G253D、G253S、N255D、A257D、 I259R、D260G、D260V、D260Y、I262S、N264K、T270I、T270K、E272G、E272K、L278F、K299N、T305I、I310S或其任意组合的一 个或更多个置换或突变。
在一个实施方案中，可用于本发明的FAS多肽的效应子结构域 包含FAS多肽的死亡结构域。在另一个实施方案中，FAS多肽的效应 子结构域包含与SEQ ID NO:6的第230至314位氨基酸至少60％、 70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列、基本上由其组成或者由其组成。在其它实施方案中，FAS 多肽的效应子结构域包含FAS多肽的胞内结构域。在又一些其它实施 方案中，FAS多肽的效应子结构域包含与SEQID NO:6的第185至 335位氨基酸、第186至335位氨基酸、第187至335位氨基酸、第 188至335位氨基酸、第189至335位氨基酸、第190至335位氨基 酸、第191至335位氨基酸、第192至335位氨基酸、第193至335 位氨基酸、第194至335位氨基酸、第195至335位氨基酸、第196至335位氨基酸、第197至335位氨基酸、第198至335位氨基酸、 第199至335位氨基酸至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在又一些其它实施方案中，FAS多肽的效应子结构域还包含FAS 多肽的跨膜结构域。在又一些其它实施方案中，FAS多肽的效应子结 构域包含与SEQ ID NO:6的第174至335位氨基酸至少60％、70％、 80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序 列。在一些实施方案中，FAS多肽的效应子结构域还包含来自FAS 胞外结构域的C末端部分的大约十个、大约九个、大约八个、大约七 个、大约六个、大约五个、大约四个、大约三个、大约两个或大约一 个氨基酸。在某些实施方案中，FAS多肽的效应子结构域包含与SEQ IDNO:6的第179至335位氨基酸、第178至335位氨基酸、第177 至335位氨基酸、第176至335位氨基酸、第175至335位氨基酸、 第174至335位氨基酸、第173至335位氨基酸、第172至335位氨 基酸、第171至335位氨基酸、第170至335位氨基酸、第169至335 位氨基酸、第168至335位氨基酸、第167至335位氨基酸、第166 至335位氨基酸、第165至335位氨基酸、第164至335位氨基酸或 第163至335位氨基酸至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，其中所述效应子结构 域形成死亡诱导性信号传导复合物(DISC)、活化胱天蛋白酶8或 诱导细胞凋亡。
在一个实施方案中，FAS多肽的效应子结构域包含与SEQ ID NO: 8至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相 同的氨基酸序列、基本上由其组成或者由其组成，其中所述效应子结 构域形成死亡诱导性信号传导复合物(DISC)、活化胱天蛋白酶8 或诱导细胞凋亡。
在其它实施方案中，FAS多肽的效应子结构域由与SEQ ID NO: 7至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或 100％相同的核苷酸序列编码。
在一个实施方案中，用于本发明的FAS嵌合基因产物包含与SEQ ID NO:10至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％ 或100％相同的氨基酸序列、基本上由其组成或者由其组成，其中所 述FAS嵌合基因产物诱导细胞凋亡。在另一个实施方案中，所述FAS 嵌合基因产物由与SEQ ID NO:9至少60％、70％、80％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列编码，其中所述 FAS嵌合基因产物诱导细胞凋亡。
B.内皮细胞特异性启动子
包含FAS嵌合基因的核酸构建体还包含一个或更多个可用于调 控可操作地连接的FAS嵌合基因的表达的表达控制元件。所述表达控 制元件包括但不限于启动子、分泌信号和其它调控元件。
可用于本发明的核酸构建体利用内皮细胞特异性启动子指导 FAS嵌合蛋白在内皮细胞中表达，从而诱导所述内皮细胞的细胞凋亡。
为了本发明的目的，内皮细胞特异性启动子可含有一个或更多个 顺式调控元件，其与不具有所述顺式调控元件的启动子相比改善启动 子的内皮细胞特异性。在一个实例中，所述顺式调控元件包含增强子。 在另一个方面，所述顺式调控元件包含缺氧反应元件。在其它实例中， 所述顺式调控元件既包含增强子又包含缺氧反应元件。
在一个实施方案中，可用于本发明的增强子包含与SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO:12(SEQ ID NO:11的互补序列)至少60％、70％、 80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序 列，其中，与不具有所述增强子的启动子相比，所述增强子改善启动子的内皮细胞特异性。所述增强子还可以包含与SEQ ID NO:13或 SEQ ID NO:14(SEQ IDNO:13的互补序列)至少60％、70％、80％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的另外的核苷酸 序列。
在另一个实施方案中，用于本发明的增强子包含与SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO:14(SEQ ID NO:13的互补序列)至少60％、70％、 80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序 列，其中，与不具有所述增强子的启动子相比，所述增强子改善启动子的内皮细胞特异性。所述增强子还可以包含与SEQ ID NO:11或 SEQ ID NO:12(SEQ IDNO:11的互补序列)至少60％、70％、80％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的另外的核苷酸 序列。
在其它实施方案中，用于本发明的增强子包含与SEQ ID NO:15 或SEQ ID NO:16(SEQ ID NO:15互补序列)至少60％、70％、80％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列， 其中，与不具有所述增强子的启动子相比，所述增强子改善启动子的 内皮细胞特异性。在又一些其它实施方案中，用于所述核酸构建体的 增强子包含SEQID NO:15或SEQ ID NO:16或其任何片段、变体、 衍生物或类似物，其中，与不具有所述增强子的启动子相比，所述片 段、变体、衍生物或类似物改善启动子的内皮细胞特异性。
在一些实施方案中，用于本发明的增强子包含与SEQ ID NO:22 或SEQ ID NO:23至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％相同的核苷酸序列，其中，与不具有所述增强子 的启动子相比，所述增强子改善启动子的内皮细胞特异性。在又一些 其它实施方案中，用于所述核酸构建体的增强子包含SEQ ID NO:22 或SEQ ID NO:23或其任何片段、变体、衍生物或类似物，其中，与 不具有所述增强子的启动子相比，所述片段、变体、衍生物或类似物 改善启动子的内皮细胞特异性。
在其它实施方案中，用于本发明的增强子包含与SEQ ID NO:24 或SEQ ID NO:25至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％相同的核苷酸序列，其中，与不具有所述增强子 的启动子相比，所述增强子改善启动子的内皮细胞特异性。在又一些 其它实施方案中，用于所述核酸构建体的增强子包含SEQ ID NO:24 或SEQ ID NO:25或其任何片段、变体、衍生物或类似物，其中，与 不具有所述增强子的启动子相比，所述片段、变体、衍生物或类似物 改善启动子的内皮细胞特异性。
表3显示了可用于本发明的各种增强子序列。
表3.内皮细胞特异性增强子元件和启动子
用于本发明的增强子可以被连接至启动子上游或启动子下游或 插入启动子中的两个核苷酸之间。用于本发明的内皮细胞特异性启动 子可以利用现有技术已知的任何启动子。例如，能够用于本发明的合 适的启动子包括内皮特异性启动子：前内皮素原-1(preproendothelin-1，PPE-1启动子)(US 2010/0282634，公开于 2010年11月11日；和WO2011/083464，公开于2011年7月14日)； PPE-1-3X启动子(美国专利号7,579,327，美国专利号8,071,740，US 8,039,261，US2010/0282634，US 2007/0286845，WO 2011/083464和WO2011/083466)；TIE-1(S79347，S79346)和TIE-2(U53603) 启动子[Sato TN,Proc NatlAcad Sci U S A 1993 Oct 15；90(20):9355-8]，内皮糖蛋白(Endoglin)启动子[Y11653；Rius C, Blood 1998 Dec 15；92(12):4677-90]，von Willerbrand因子[AF152417；Collins CJ Proc Natl Acad Sci U S A 1987 Jul；84(13):4393-7]， KDR/flk-1启动子[X89777，X89776；Ronicke V,Circ Res 1996 Aug；79(2):277-85]，FLT-1启动子[D64016AJ224863；Morishita K,:J Biol Chem 1995 Nov 17；270(46):27948-53]，Egr-1启动子[AJ245926； Sukhatme VP,Oncogene Res 1987 Sep-Oct；l(4):343-55]，E-选择素启 动子[Y12462；Collins T J Biol Chem 1991 Feb 5；266(4):2466-73]，内 皮粘附分子启动子：ICAM-1[X84737；Horley KJ EMBO J 1989 Oct；8(10):2889-96]、VCAM-1[M92431；Iademarco MF,J Biol Chem 1992 Aug 15；267(23):16323-9]、PECAM-1[AJ313330X96849；CD31， Newman PJ,Science 1990 Mar 9；247(4947):1219-22]，血管平滑肌特 异性元件：CArG盒X53154和主动脉羧肽酶样蛋白(ACLP)启动 子[AF332596；Layne MD,CircRes.2002；90:728-736]和主动脉优先 表达基因-1[Yen-Hsu Chen J.Biol.Chem,Vol.276,Issue 50, 47658-47663,December 14,2001]，其全部内容通过引用整体并入本 文。
在一个实施方案中，被连接至内皮细胞特异性增强子的启动子包 含SEQ ID NO:17的至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％的核苷酸序列，其中所述被连接至增强子的启动 子诱导被可操作地连接至所述启动子的基因的内皮细胞特异性。在另 一个实施方案中，被连接至内皮细胞特异性增强子的启动子包含野生 型PPE-1启动子的片段、变体、衍生物或类似物，其中其所述片段、 变体、衍生物或类似物诱导被可操作地连接至所述启动子的基因的内 皮细胞特异性。在一个实例中，该内皮细胞特异性增强子能够被插入 对应于SEQ ID NO:17的第442位和第449位核苷酸残基之间。
在进一步的实施方案中，内皮细胞特异性启动子包含缺氧反应元 件。缺氧反应元件(HRE)位于内皮素(endothelin)-1启动子的反 义链上。该元件是缺氧诱导性因子-1的结合位点，该位点是缺氧对(人、 大鼠和小鼠基因的)内皮素-1启动子的正向调控所必需的。缺氧是强 效信号，其诱导几种基因的表达，包括促红细胞生成素(Epo)、VEGF 和各种糖酵解酶。在所有基因中响应缺氧条件的核心序列(8个碱基 对)是保守的，侧翼区与其它基因不同。ET-I缺氧反应元件位于GAT A-2和AP-1结合位点之间。在一个实例中，缺氧反应元件包含SEQ ID NO:26、其片段、变体、衍生物或类似物。
在其它实施方案中，可用于本发明的内皮细胞特异性启动子包含 SEQ ID NO:18的至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或100％的核苷酸序列、基本上由其组成或者由其组成， 其中被连接至增强子的启动子诱导被可操作地连接至所述启动子的基 因的内皮细胞特异性。在另一个实施方案中，内皮细胞特异性启动子 包含SEQ IDNO:18的片段、变体、衍生物或类似物，其中所述片段、 变体、衍生物或类似物诱导被可操作地连接至所述启动子的基因的内 皮细胞特异性。
内皮细胞特异性启动子的另外的变化可以被发现于 WO2011/083464、WO2011/083466和WO2012/052423，其通过引用整 体并入本文。
本发明还提供包含核苷酸序列SEQ ID NO:17的新的启动子序 列。在一个实例中，所述启动子还包含内皮细胞特异性增强子。在一 个实例中，所述内皮细胞特异性增强子包含SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26或其任意片段、变体、衍生物或类似物，其中， 与不具有所述增强子的启动子相比，所述片段、变体、衍生物或类似 物改善启动子的内皮细胞特异性。在另一个实例中，所述启动子包含 SEQ IDNO:18的核苷酸序列。本发明包括包含该新的启动子和异源 核苷酸序列的核酸构建体。在一个实施方案中，所述异源核酸序列包 含编码本文所述的FAS嵌合蛋白的核苷酸序列。在另一个实施方案 中，所述异源核酸序列包含腺病毒序列。
C.载体
本发明还提供包含所述核酸构建体的载体，其包含被可操作地连 接至内皮细胞特异性启动子的FAS嵌合基因。为了本发明的目的，可 以采用众多载体系统。例如，可以用于本发明该方面的实施的各种病 毒基因递送系统包括但不限于腺病毒载体、α病毒载体、肠病毒载体、 瘟病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、EB病毒 载体、乳多空病毒载体、痘病毒载体、痘苗病毒载体、腺相关病毒载 体和单纯疱疹病毒载体。
在另一个实施方案中，包含被可操作地连接至内皮细胞特异性启 动子的FAS嵌合基因的载体是腺病毒。例如，所述腺病毒可以是人腺 病毒A种(血清型12、18和31)、B种(血清型3、7、11、14、16、 21、34、35、50和55)、C种(血清型1、2、5、6和57)、D种(血 清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39、42-49、 51、53、54和56)、E种(血清型4)、F种(血清型40和41)或 G种(血清型52)中的任意一个或更多个。在一个具体的实施方案中， 用于本发明的腺病毒是人腺病毒血清型5。在一些实施方案中，可用 于基因疗法的腺病毒是重组非复制型腺病毒，其不含有E1区域和E3 区域。在某些实施方案中，用于本发明的腺病毒是条件复制型腺病毒， 其不含有E3区域，但是含有E1区域。
D.生物保藏
根据布达佩斯条约并根据37C.F.R.§1.808由位于Health Protection AgencyCulture Collections,Health Protection Agency, Microbiology Services,PortonDown,Salisbury,SP4 0JG,英国的欧 洲动物细胞保藏中心(ECACC)进行生物保藏。一旦授予专利权，保 藏材料的样品将成为公众可以获得的样品。因为所保藏的实施方案仅 仅旨在举例说明本发明，所以在本文中所述和所要求保护的发明并不 限于所保藏的株的范围。
株 ECACC登录号 保藏日期
VB-111 13021201 2013年2月12日
三、使用表达FAS嵌合蛋白的腺病毒的治疗方法
本发明的一个实施方案提供用于使用表达FAS嵌合蛋白的核酸 构建体或包含所述核酸构建体的腺病毒的方法。在一个方面，表达FAS 嵌合蛋白的核酸构建体或包含所述核酸构建体的腺病毒可用于在受试 者中减少或降低肿瘤的尺寸或消除肿瘤，其中由所述核酸构建体编码 的FAS嵌合蛋白在所述受试者中减少或降低所述肿瘤的尺寸或减缓 肿瘤生长速率或防止出现新的肿瘤转移灶或消除所述肿瘤，并且其中 所述肿瘤与女性妇科癌症或其转移有关或源自所述女性妇科癌症或其 转移。可以基于放射诊断测试(如CT扫描)和/或肿瘤标志物(如 CA-125的血液水平)来评估这些效果。在另一个方面，表达FAS嵌 合蛋白的核酸构建体或包含所述核酸构建体的腺病毒可用于抑制、降 低或减少肿瘤中新生血管形成或血管生成，其中由所述核酸构建体编 码的FAS嵌合蛋白抑制、降低或减少肿瘤中新生血管形成或血管生 成，并且其中所述肿瘤与女性妇科癌症或其转移有关或源自所述女性 妇科癌症或其转移。在其它方面，表达FAS嵌合蛋白的核酸构建体或 包含所述构建体的腺病毒能够治疗或预防受试者中与女性妇科癌症或 其转移有关或源自所述女性妇科癌症或其转移的肿瘤，其中由所述核 酸构建体编码的FAS嵌合蛋白治疗或预防所述受试者中的女性妇科 癌症或其转移。
因此，在一个方面，本发明提供在受试者中减少或降低肿瘤或其 转移的尺寸、消除肿瘤或其转移或者减缓肿瘤或其转移的生长的方法， 该方法包括给患者施用有效量的核酸构建体(其包含被可操作地连接 至内皮细胞特异性启动子的Fas嵌合蛋白)或包含所述核酸构建体的 腺病毒，其中由所述核酸构建体编码的Fas嵌合基因产物在受试者中 减少或降低所述肿瘤或其转移的尺寸或者消除所述肿瘤或其转移，并 且其中所述肿瘤或其转移与女性妇科癌症有关或源自所述女性妇科癌 症。在另一个方面，本发明提供抑制、降低或减少肿瘤或其转移中新 生血管形成或血管生成的方法，该方法包括给患有所述肿瘤或其转移 的受试者施用有效量的核酸构建体或包含所述核酸构建体的腺病毒， 其包含被可操作地连接至内皮细胞特异性启动子的Fas嵌合基因，其 中由所述核酸构建体编码的Fas嵌合基因产物抑制、减少或降低所述 肿瘤或其转移中新生血管形成或血管生成，并且其中所述肿瘤或其转 移与女性妇科癌症有关或源自所述女性妇科癌症。在其它方面，本发明提供治疗或预防受试者中与女性妇科癌症有关或源自所述女性妇科 癌症的肿瘤或其转移的方法，该方法包括施用有效量的核酸构建体， 其包含被可操作地连接至内皮细胞特异性启动子的Fas嵌合基因，其 中由所述核酸构建体编码的Fas嵌合基因产物治疗或预防患者中的女 性妇科癌症。仍在一些其它实施方案中，所述女性妇科癌症或其转移 的肿瘤在所述施用之后被降低尺寸或被消除。在某些实施方案中，所 述肿瘤或其转移的尺寸被降低，从而与所述施用之前所述肿瘤的最大 直径(LD)相比，所述LD被降低至少大约10％、20％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施方案中，本发 明包括稳定与女性妇科癌症有关的疾病或紊乱的方法。例如，本发明 包括阻止或减缓与女性妇科癌症有关的肿瘤的进一步生长的方法。在 进一步的实施方案中，本发明减少恶性腹膜液(例如腹水)的体积、 减少受试者的疼痛、延长受试者的存活期或其任意组合。在其它实施方案中，本发明的腺病毒当被施用给受试者时延长该受试者的总体存 活期。在进一步的实施方案中，本发明的腺病毒当被施用给受试者时 延长该受试者的无进展存活期。
在一个实施方案中，所述女性妇科癌症可以是米勒管癌、卵巢癌、 腹膜癌、输卵管癌、子宫乳头状浆液性癌、或其转移、或其任意组合。 在另一个实施方案中，所述女性妇科癌症可以是子宫颈癌、子宫内膜 癌、妊娠滋养细胞疾病、子宫癌、外阴癌、或其转移、或其任意组合。 在其它实施方案中，所述女性妇科癌症包括从妇科组织(子宫、卵巢、 输卵管、子宫颈、卵细胞、支持细胞或其任意组合)所产生的任何癌 性生长。在某些实施方案中，所述与女性妇科癌症有关或源自所述女 性妇科癌症的肿瘤可以选自由以下组成的组：表面上皮间质瘤(腺癌)、 乳头状浆液性囊腺癌、子宫内膜样瘤、浆液性囊腺癌、乳头状瘤、粘 液性囊腺癌、透明细胞卵巢瘤、粘液腺癌、囊腺癌、癌、性索间质瘤、 生殖细胞瘤、畸胎瘤、无性细胞瘤、表皮样瘤(鳞状细胞癌)、布莱 纳瘤、或其转移或其任意组合。
用于本发明的目的的米勒管癌症包括恶性米勒管混合瘤，也被称 为恶性混合性中胚叶肿瘤、MMMT和癌肉瘤。MMMT是发现于子宫、 卵巢、输卵管以及身体其它部位的恶性肿瘤，其含有癌性(上皮组织) 和肉瘤性(结缔组织)成分。它被分成两种类型，同源的(其中肉瘤 性成分由发现于子宫中的组织(如子宫内膜、纤维和/或平滑肌组织) 组成)和异源的类型(由不在子宫发现的组织(如软骨、骨骼肌和/ 或骨)组成)。MMMT占源自子宫体的所有肿瘤的百分之二至五之 间，并且主要发现于平均年龄66岁的绝经后女性。
卵巢癌包含从卵巢所产生的任何癌性生长。大多数(超过90％) 卵巢癌被分类为“上皮”并且被认为从卵巢的表面产生。但是，输卵 管也可以是一些卵巢癌的来源。由于卵巢和输卵管彼此密切相关，据 认为这些输卵管癌细胞能够模仿卵巢癌。其它类型可以从卵细胞(生 殖细胞瘤)或支持细胞产生。在一些实施方案汇总，卵巢癌是继发性 癌症，其为体内其它地方的原发癌症转移的结果。大约7％的卵巢癌 是由于转移，而其余的都是原发癌症。常见的原发癌症是乳腺癌和胃 肠癌。
腹膜癌(cancer)或癌(carcinoma)也被称为：浆液性表面乳 头状癌、原发腹膜癌、卵巢外浆液性癌、原发浆液性乳头状癌或沙样 癌。它在历史上被分类至“不明原发癌”(CUP)之下。原发腹膜癌 (PPC或PPCa)是腹膜或腹腔内膜细胞的癌。组织学和分子生物学特征表明浆液性癌(其包括卵巢浆液性癌、子宫浆液性癌、输卵管浆 液性癌、宫颈浆液性癌和原发腹膜浆液性癌)事实上代表一个实体。
原发输卵管癌(PFTC)(往往只是输卵管癌)是起源于输卵管 的恶性肿瘤。输卵管癌被认为是女性中占所有妇科癌症的1至2％的 相对罕见的原发癌症。
子宫浆液性癌(USC)(也被称为子宫乳头状浆液性癌(UPSC) 和子宫浆液性腺癌)是不常见的子宫内膜癌，其通常发生于绝经后女 性。它通常在由绝经后出血提示的子宫内膜活检中被诊断出。不同于 更常见的低级子宫内膜样子宫内膜腺癌，USC不会从子宫内膜增生发 展并且不是激素敏感性的。它产生于子宫内膜萎缩的情况下并且被分 类为II型子宫内膜癌。
术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物” 是指任何受试者，特别是哺乳动物受试者，其患有或者预计发展与腹 膜癌或女性妇科癌症有关或源自腹膜癌或女性妇科癌症的至少一种肿 瘤。在一个实施方案中，所述受试者是人。在另一个实施方案中，所 述受试者是癌症患者。
在本发明的一个实施方案中，所述受试者是之前已经接受基于铂 的疗法的患者。这样的之前基于铂的疗法包括但不限于顺铂、卡铂、 奥沙利铂、奈达铂、沙铂、吡铂、四硝酸三铂或aroplatin。基于铂的 抗肿瘤剂引起DNA的交联如monadduct、链间交联、链内交联或DNA 蛋白质交联。多数情况下，它们作用于相邻的鸟嘌呤的N-7位置，形 成1,2链内交联。所得到的交联抑制癌细胞中的DNA修复和/或DNA 合成。由于与烷基化抗肿瘤剂类似的效果，尽管它们不具有烷基基团， 但是基于铂的抗肿瘤剂有时被描述为“烷基化样”。在某些实施方案 中，之前的基于铂的疗法是使用顺铂(cisplatin)(其也被称为顺铂 (cisplatinum)或顺-二胺二氯络铂(II)(CDDP)(由Cadila Healthcare 根据FDA橙皮书销售的商品名Cisplatin、商标名Platin))的疗法。 顺铂作为短期输注以生理盐水的形式进行静脉内施用用于治疗实体恶 性肿瘤。它被用于治疗各种类型的癌症，包括肉瘤、一些癌(例如小 细胞肺癌和卵巢癌)、淋巴瘤和生殖细胞瘤。
在其它实施方案中，所述受试者之前已经接受基于紫杉烷类的疗 法。紫杉烷类是由紫杉属(紫杉)的植物产生的双萜，并且被广泛地 用作化疗剂。紫杉烷现在能够人工合成。紫杉烷剂包括但不限于紫杉 醇和多西他赛
在一个方面，紫杉烷能够被融合至或结合至异源部分。这样的异 源部分能够改善紫杉烷制剂的溶解性或减少紫杉烷的毒性。例如，紫 杉烷能够被融合至或结合至白蛋白：白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane， 也被称为nab-paclitaxel)是备选的制剂，其中紫杉醇结合至白蛋白纳 米颗粒。
紫杉醇生产的合成方法导致多西他赛的开发。多西他赛与紫杉醇 具有一套类似的临床用途并且以的名称进行销售。
在另一个方面，可用于本发明的紫杉烷包括但不限于榛植物的壳 和叶中的紫杉醇、10-脱乙酰基巴苦亭III、巴苦亭III、紫杉醇C和7-表紫杉醇。
在其它实施方案中，所述受试者之前已经接受高达三、高达二或 高达一线的化疗。前一线的化疗可以是基于铂的疗法或基于紫杉烷的 疗法。在又一些其它实施方案中，所述受试者之前没有接受超过3线 的针对复发癌症的化疗。
在某些实施方案中，所述受试者是患有复发性铂抗性癌症或对铂 无效(platinumrefractory)的疾病的患者。在一些实施方案中，所述 受试者是患有复发性紫杉烷抗性癌症的患者。在一个方面，复发性铂 抗性癌症或复发性紫杉烷抗性癌症在铂或紫杉烷治疗期间，在完成或 接受基于铂的疗法或基于紫杉烷的疗法的大约一个月内、大约两个月 内、大约三个月、大约四个月、大约五个月、大约六个月、大约七个 月、大约八个月、大约九个月、大约十个月、大约11个月或大约12 个月内具有进展性肿瘤。在一个具体的实施方案中，所述复发性铂抗 性癌症或所述复发性紫杉烷抗性癌症在完成或接受基于铂的疗法或基 于紫杉烷的疗法的大约六个月内具有进展性肿瘤。所述复发性铂抗性 癌症或所述复发性紫杉烷抗性癌症可以由实体瘤响应评价标准 (RECIST)、一个或更多个肿瘤标志物(例如CA-125)的测定、体 检、重新评估或二探剖腹检查和/或一种或更多种成像研究(例如X射 线、CT或MRI)来确定。
RECIST是一套出版的规则，其定义在治疗期间什么时候癌症患 者改善(“响应”)、保持相同(“稳定”)或恶化(“进展”)。 最初标准由包括欧洲癌症研究与治疗组织(EORTC)、美国国家癌症 研究所(NCI)和加拿大临床试验组的国家癌症研究所的国际合作组 织于2000年2月出版。于2009年1月出版的RECIST 1.1是最初标 准的更新版。大多数评估癌症治疗在实体瘤中的目标响应的临床试验 正在使用RECIST。
在一些实施方案中，受试者能够表现出肿瘤标志物，例如 CA-125。在一个方面，与施用之前的CA-125水平相比，施用之后所 述受试者中CA-125的表达水平被减少至少大约10％、至少大约20％、 至少大约30％、至少大约40％、至少大约50％、至少大约55％、至 少大约60％、至少大约65％、至少大约70％、至少大约75％、至少 大约80％、至少大约85％、至少大约90％或至少大约100％。
在一些实施方案中，受试者仅已经接受过一次针对复发性铂敏感 性疾病的基于铂的治疗，后续无铂间隔不到六个月。
在其它实施方案中，受试者具有美国东部肿瘤协作组(ECOG) 体能状况(performance status)0-1级。ECOG是用于评估患者的疾 病进展、在患者的日常生活中疾病的作用和确定合适的治疗和预后的 量表或标准。表4显示ECOG体能状况：
*如在Am.J.Clin.Oncol.:Oken,M.M.,Creech,R.H.,Tormey, D.C.,Horton,J.,Davis,T.E.,McFadden,E.T.,Carbone,P.P.:Toxicity And Response Criteria Of TheEastern Cooperative Oncology Group. Am J ClinOncol 5:649-655,1982中所出版的。
在一些实施方案中，受试者具有与未患癌症的受试者可比的骨髓 功能。与未患癌症的受试者可比的骨髓功能包括但不限于其作为主要 造血器官和初级淋巴组织并且负责产生血细胞(例如红细胞、粒细胞、 单核细胞、淋巴细胞和血小板)的作用。骨髓结构和功能的详细描述 见于Jain,C.,1986b,Schalm’s Veterinary Hematology,The hematopoieticsystem(Lea and Febiger,Philadelphia,PA),4,pp 350–387；Weiss and Geduldig,1991,Blood 78:975–90； Wickramasinghe,1992,in Histology for Pathologists,Bonemarrow,ed Sternberg SS(Raven Press,New York),pp 1–31；Picker and Siegelman,1999,in Fundamental Immunology,Lymphoid tissues and organs,ed Paul WE(Lippincott-Raven,Philadelphia,PA),4,pp 479–531；Hoffman et al.,2000,Hematology Basic Principals and Practice(Churchill Livingstone,New York),3；Abboud and Lichtman, 2001,in Williams’Hematology,Structure of the marrow andthe hematopoietic microenvironment,edsBeutler E,Lichtman MA,Coller BS,KippsTJ,Seligsohn U(McGraw-Hill,New York),6,pp 29–58，其 每一篇通过引用整体并入本文。
在进一步的实施方案中，受试者具有与未患癌症的受试者可比的 血液学功能，其中血液学功能的指标选自由以下组成的组：
a.中性粒细胞绝对计数(ANC)等于或高于1000/mm3；
b.血小板(PLT)计数等于或高于100,000个/mm3；
c.凝血酶原时间(PT)小于1.2x正常上限(ULN)秒；
d.凝血活酶时间(PTT)小于1.2x ULN秒，其中如果PTT高 于ULN，则该患者狼疮性抗凝集物质(LAC)为阴性；以及
e.其任意组合。
在其它实施方案中，受试者具有与未患癌症的受试者可比的器官 功能，其中所述器官功能使用常见毒性标准进行分析，所述标准选自 由以下组成的组：
a.小于或等于1级常见毒性标准(CTC)的神经病；
b.之前不超过30％的含有骨髓的主要区域已经接受过放射；
c.小于2.5x正常上限(ULN)或小于5x ULN的血清谷草转氨 酶(SGOT)、血清谷丙转氨酶(SGPT)或碱性磷酸酶；
d.小于或等于1.5x ULN水平的胆红素；
e.小于或等于1.5x ULN水平的肌酐；
f.在筛选时蛋白尿试纸小于2+或尿蛋白肌酐的比小于1.0；以 及
g.其任意组合。
在又一些其它实施方案中，受试者已经从来自之前的治疗(例如 任何化疗、放疗或生物疗法)的急性毒性中恢复。但是，所述受试者 可能需要从1级神经病理、任意级的贫血或脱发中恢复。
在某些实施方案中，受试者之前已经接受过抗血管生成剂。在一 些实施方案中，所述受试者之前没有胃肠(GI)穿孔、GI梗阻或参 与肠影像学研究。在又一些其它实施方案中，所述受试者没有需要治 疗的活动的、未经治疗的精神疾病或神经学症状(允许有I级感觉性 神经病理)，不存在未经治疗的中枢神经系统或脑转移，没有任何会 阻止理解和/或给予知情同意的痴呆或显著改变的精神状况，没有任何 已知对聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)的超敏反应，没有不受控制 的细菌、病毒或真菌感染的迹象，或其任意组合。在又一些其它实施 方案中，如果所述受试者之前已经有紫杉醇反应，但随后在重新攻击 时耐受该药物，那么所述受试者是适合本发明的。
适合于本发明的受试者可以通过针对抗血管生成疗法的血浆生 物标志物或细胞表面生物标志物的测定进行鉴定。在一个实施方案中， 适合于本发明的受试者表现出血浆生物标志物，其包括但不限于血管 内皮生长因子(VEGF)、磷脂酰肌醇聚糖生物合成F类蛋白(PIGF)、 可溶性血管内皮生长因子受体-1(sVEGFR-1)、sVEGFR-2、 sVEGFR-3、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素-1β(IL-1 β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、von Willerbrand因子(vWF)、可溶性c-kit(c-kit)、 基质衍生因子1α(SDF1α)、甲胎蛋白(AFP)及其任意组合。在另 一个实施方案中，适合于本发明的受试者表现出细胞表面生物标志物， 其包括但不限于CD31、CD34、CD45、CD133、血管内皮生长因子受 体-1(VEGFR)、VEGFR-2或其任意组合。
已知中和抗体的存在或形成在病毒的二次施用时可以阻碍有效 基因转移。在一个实施方案中，受试者没有针对腺病毒的预先存在的 抗体应答。在另一个实施方案中，在施用腺病毒时受试者没有发展针 对腺病毒的抗体应答。
在本发明的一些方面，受试者没有表现出狼疮细胞抗凝集物质 (LAC，也被称为狼疮细胞抗体、LA或狼疮细胞抑制剂)。LAC的 存在能够通过任何已知的方法确定，例如通过由LAC测试或APLA 测试测定所述LAC。LAC是结合与细胞膜有关的磷脂和蛋白质的免 疫球蛋白。Joussen,J.,et al.,in DocumentaOphthalmologica,2008, Volume 117,Number 3,Pages 263-265,Retinal Vascular Disease,S.J. Ryan(eds),Springer,2007,780 p,1040,ISBN:978-3-540-29541-9。 LAC是促血栓形成剂；即，体内LAC抗体的存在沉淀血栓的形成。 在实验室试验中这些抗体的存在引起aPTT的提高。据推测，所述抗 体的存在干扰了用来诱导体外凝聚的磷脂。据认为，体内与血小板膜 磷脂发生相互作用，增加血小板的粘附和聚集；从而发挥其体内促血 栓形成特征。因此，LAC在体内充当凝血剂。
四、表达FAS嵌合的腺病毒的均质群体
本发明还提供包含SEQ ID NO:19的腺病毒或具有ECACC保藏 号13021201的腺病毒的均质群体。在本文中所使用的术语“均质”是 指没有污染具有不同序列的异源腺病毒的腺病毒单个群体。异源腺病 毒的实例包括但不限于包含含有SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21的 核苷酸序列的腺病毒。
包含含有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的腺病毒和包含含有 SEQ ID NO:21的核苷酸序列的腺病毒之前被公开于国际申请号 PCT/IL2011/00007和PCT/IL2011/00009，其于2011年7月14日分 别作为WO2011/083464和WO2011/083466出版，其通过引用整体并 入本文。
本发明提供包含SEQ ID NO:19(35207bp)的腺病毒，其包括 不同于SEQ ID NO:20(35203bp)和SEQ ID NO:21的两个核苷酸 残基。在SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21中的这两个错配(即 Gly→Ala)位于核苷酸残基第501位和第1255位。此外，SEQ ID NO: 19在3'端含有四个额外的碱基对。另外，SEQ ID NO:21含有编码额 外的E1区域的氨基酸。
SEQ ID NO:19包含在核苷酸残基第458至1444位对应于SEQ ID NO:18的内皮细胞特异性启动子(即PPE-1-3x启动子)的核苷酸 序列，和在核苷酸残基第1469至2569位对应于SEQ ID NO:9的编 码FAS嵌合蛋白的核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明是包含腺病毒的组合物，所述腺病毒 包含被可操作地连接至内皮细胞特异性启动子的FAS嵌合基因，其中 所述腺病毒不含有SEQ ID NO:20并且不含有SEQ ID NO:21。在另 一个实施方案中，本发明是包含含有SEQ ID NO:19的腺病毒或具有 ECACC保藏号13021201的腺病毒的组合物，其中所述组合物不含有 包含SEQ ID NO:20的腺病毒并且不含有包含SEQ ID NO:21的腺病 毒。
在另一个实施方案中，组合物包含含有SEQ ID NO:19的第458 至2569位核苷酸残基的腺病毒，其中所述组合物不包含含有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的第458至2569位核苷酸残基的腺病毒。
在其它实施方案中，本发明的组合物包含腺病毒，所述腺病毒包 含与SEQ ID NO:19至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％相同的核酸序列，其中所述核酸序列不是SEQ ID NO:20 并且不是SEQ ID NO:21，并且其中所述组合物不含有包含SEQID NO:20的腺病毒并且不含有包含SEQ ID NO:21的腺病毒。
仍在一些其它实施方案中，本发明的组合物包含含有SEQ ID NO: 19的腺病毒或具有ECACC保藏号13021201的腺病毒，其中所述腺 病毒是至少大约51％纯的、至少55％纯的、至少大约60％纯的、至 少大约70％纯的、至少大约80％纯的、至少大约90％纯的、至少大 约95％纯的、至少大约96％纯的、至少大约97％纯的、至少大约98％ 纯的、至少大约99％纯的或大约100％纯的。在本文中所使用的术语 “纯”是指均质性的程度，即没有异源腺病毒。例如，包括包含SEQ ID NO:19的腺病毒的大约51％纯的组合物含有大约51％的包含SEQ ID NO:19的腺病毒和大约49％的包含异源序列(例如SEQ ID NO:20 或SEQ ID NO:21)的腺病毒。本发明的组合物可以含有其它成分， 包括但不限于药学可接受的载体、赋形剂、张力改性剂或用于制剂的 任何必要成分。
在一些实施方案中，本发明包括分离或纯化所述核酸构建体的均 质群体的方法。在其它实施方案中，本发明提供从包括包含SEQ ID NO:19的腺病毒或具有ECACC保藏号13021201的组合物中去除腺 病毒的异质群体(例如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21)的方法。
本发明还提供了在受试者中减少或降低肿瘤的尺寸或减缓肿瘤 生长的速率、消除肿瘤的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量 的腺病毒的均质群体或包含腺病毒的均质群体的组合物。本发明还包 括抑制、降低或减少肿瘤中新生血管形成或血管生成的方法，该方法 包括向患有所述肿瘤的受试者施用有效量的腺病毒的均质群体或包含 腺病毒的均质群体的组合物。另外，本发明包括在受试者中治疗或预 防与癌症有关或源自癌症的肿瘤的方法，该方法包括施用有效量的腺 病毒的均质群体或包含腺病毒的均质群体的组合物。
本发明还包括在受试者中减少或降低肿瘤的尺寸或减缓肿瘤生 长的速率、消除肿瘤的方法，该方法包括向所述受试者重复施用有效 量的腺病毒的均质群体或包含腺病毒的均质群体的组合物而不施用包 含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的腺病毒的异质群体或包含腺病 毒的异质群体的组合物。本发明还包括抑制、降低或减少肿瘤中新生 血管形成或血管生成的方法，该方法包括向患有所述肿瘤的受试者重 复施用有效量的腺病毒的均质群体或包含腺病毒的均质群体的组合物 而不施用包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的腺病毒的异质群体 或包含腺病毒的异质群体的组合物。此外，本发明包括在受试者中治疗或预防与癌症有关或源自癌症的肿瘤的方法，该方法包括重复施用 有效量的腺病毒的均质群体或包含腺病毒的均质群体的组合物而不施 用包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的腺病毒的异质群体或包含 腺病毒的异质群体的组合物。
可以被用腺病毒的均质群体或组合物减少、抑制或治疗的肿瘤可 以是实体瘤、原发瘤或转移。术语“转移的”或“转移”是指能够在 另一部位或器官建立继发性肿瘤病灶的肿瘤细胞。
在其它实施方案中，本发明的均质群体当被施用给需要其的受试 者时延长该受试者的总体存活期。在进一步的实施方案中，本发明的 均质群体当被施用给需要其的受试者时延长该受试者的无进展存活 期。
“实体瘤”包括但不限于肉瘤、黑色素瘤、癌或其它实体瘤癌症。 “肉瘤”是指由像胚胎结缔组织的物质组成并且通常由包埋于纤维状 或同源物质中的紧密堆积的细胞组成的肿瘤。肉瘤包括但不限于软骨 肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑色素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy's 肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、肺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄 状肉瘤、绿色瘤肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、维尔姆斯瘤肉瘤、子 宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨 细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性 肉瘤、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、 Jensen's肉瘤、卡波西肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白色肉瘤、 恶性间质瘤肉瘤、骨旁肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤、浆液囊性肉 瘤、滑膜肉瘤和毛细管扩张性肉瘤。
术语“黑色素瘤”是指由皮肤和其它器官的黑色素细胞系统产生 的肿瘤。黑色素瘤包括例如肢端雀斑状黑色素瘤、无黑色素性黑色素 瘤、良性青少年性黑色素瘤、Cloudman's黑色素瘤、S91黑色素瘤、 Harding-Passey黑色素瘤、青少年性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素 瘤、转移性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、甲下黑色素瘤(subungalmelanoma)和浅表扩散性黑色素瘤。
术语“癌(carcinoma)”是指由倾向于渗透周围组织且引起转 移的上皮细胞构成的恶性新生长。示例性的癌包括例如腺泡癌、腺泡 状癌、腺囊癌、腺样囊性癌、癌性腺瘤(carcinoma adenomatosum)、 肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basalcell carcinoma)、基底细胞性癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、 基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、支气管 源性癌、脑形癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉剌癌、子宫体 癌、筛状癌、en cuirasse癌、皮肤癌、圆柱细胞癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cell carcinoma)、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌(encephaloid carcinoma)、表皮样癌(epiermoid carcinoma)、腺样上皮细胞癌、外植癌、ex ulcere癌、纤维癌、胶状 癌(gelatiniform carcinoma)、胶质癌(gelatinous carcinoma)、巨大 细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinomagigantocellulare)、 腺癌、粒层细胞癌、发基质癌(hair-matrix carcinoma)、血样癌、肝细胞癌、Hurthle细胞癌、胶样癌(hyaline carcinoma)、hypemephroid 癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher's 癌、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、 豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤样癌、淋巴上皮癌、髓样癌 (carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、 软癌(carcinoma molle)、粘液性癌(mucinous carcinoma)、粘液癌 (carcinoma muciparum)、粘液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、 粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌(carcinomaossificans)、骨样癌(osteoid carcinoma)、乳头状癌、门脉周癌、浸润 前癌(preinvasivecarcinoma)、棘细胞癌、软糊状癌(pultaceous carcinoma)、肾脏的肾细胞癌、备细胞癌(reserve cell carcinoma)、 肉瘤样癌、schneiderian癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、 印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细 胞癌、软癌(carcinomas pongiosum)、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、 血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、血管扩张性癌 (carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌和viflosum 癌。
可被抑制或治疗的另外的癌(cancer)包括例如白血病、霍奇金 病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢 癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、 小细胞肺肿瘤、原发性脑瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性 类癌、膀胱癌、恶变前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、乳头 状甲状腺癌、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、食管癌、泌尿生殖道癌、 恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、前列腺癌、米 勒管癌、卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌或子宫乳头状浆液性癌。
五、药物组合物
本发明中还提供了药物组合物，其包含表达在本发明的方法中所 使用的FAS嵌合体蛋白的核酸构建体，还提供了包含所述核酸构建体 的腺病毒或所述腺病毒的均质群体。可以配制所述药物组合物用于施 用给哺乳动物，包括人类。在本发明的方法中所使用的药物组合物包 含药学可接受的载体，包括例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵 磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨 酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐 或电解质、如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、 胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚 乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段 聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。在一个实施方案中，所述组合物通过加 入盐水进行配制。
本发明的组合物可以通过任何合适的方法进行施用，例如肠胃外 (例如包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、 肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)、心室内、口服、通过喷雾吸 入、局部地、经直肠地、经鼻地、经颊地、经阴道地或经植入的贮库。如之前所述，包括包含FAS嵌合体基因的核酸构建体或所述腺病毒的 均质群体的组合物在内皮细胞中表达FAS嵌合体基因产物，并从而诱 导该内皮细胞的细胞凋亡。因此，所述组合物能够通过抑制肿瘤内皮 细胞的新生血管形成和/或血管生成而抑制、减少或降低肿瘤或其转移 的尺寸。因此，在一个实施方案中，全身或局部递送所述组合物。为 了全身或局部递送，含有所述核酸构建体、腺病毒或腺病毒的均质群 体的药物组合物可以利用机械装置，如针、套管或手术器械。
在本发明的方法中所使用的无菌可注射形式的组合物可以是水 性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的 分散剂或湿润剂和悬浮剂进行配制。该无菌可注射制剂还可以是在无 毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如 在1,3-丁二醇中的悬浮液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液和等张氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常用作溶 剂或悬浮介质。为了这个目的，任何温和的不挥发性油都可以使用， 包括合成的甘油单酸酯或甘油二酸酯。脂肪酸(如油酸及其甘油酯衍 生物)可用于注射剂的制备，天然的药学可接受的油如橄榄油或蓖麻 油(尤其是它们的聚氧乙烯化的形式)也可以。这些油溶液或悬浮液 也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或在配制药学可 接受的剂型(包括乳剂和悬浮液)中常用的类似的分散剂。其它常用 表面活性剂(如吐温、司盘和在制备药物可接受的固体、液体或其它 剂型中常用的其它乳化剂或生物利用度增强剂)也可以用于配制的目 的。
肠胃外制剂可以是单次大丸药剂量、输注或负荷丸药剂量接着维 持剂量。这些组合物可以特定的固定或可变的时间间隔进行施用，例 如每天一次或“按需”施用。
在本发明的方法中所使用的某些药物组合物可以可接受的剂型 (例如胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液)进行口服施用。某些药物组 合物还可通过鼻气雾剂或吸入进行施用。这样的组合物可以制备成在 盐水中的溶液，其中使用苄醇或其它合适的防腐剂、提高生物利用度 的吸收促进剂和/或其它常规增溶剂或分散剂。
可与载体材料组合以生产单个剂型的表达FAS嵌合体蛋白的核 酸构建体、包含所述核酸构建体的腺病毒或所述腺病毒的均质群体的 量将根据所治疗的宿主、所使用的多肽类型和具体的施用模式而变化。 组合物可以作为单个剂量、多个剂量或在所确立的时间段以输注的形 式进行施用。还可以调整剂量方案以提供所需最佳应答(例如治疗性 或预防性应答)。
在一个实施方案中，包含表达FAS嵌合体蛋白的核酸构建体、 腺病毒或所述腺病毒的均质群体的组合物在第1天进行输注(即第一 次剂量)，并且接着一次或更多次后续剂量，例如，每一周的周期、 每两周的周期、每三周的周期、每四周的周期、每五周的周期、每六 周的周期、每七周的周期、每八周的周期、每九周的周期、每十周的 周期、每11周的周期或每12周的周期。在另一个实施方案中，包含 表达FAS嵌合体蛋白的核酸构建体、腺病毒或所述腺病毒的均质群体 的组合物在第1天进行输注(即第一次剂量)，并且接着一次或更多次后续剂量，例如，每两周的周期、每个月的周期、每两个月的周期、 每三个月的周期、每四个月的周期、每五个月的周期或每六个月的周 期。
本发明的方法使用“有效量”或“治疗有效量”的包含表达FAS 嵌合体蛋白的核酸构建体、包含所述核酸构建体的腺病毒或所述腺病 毒的均质群体的组合物。这样的有效量或治疗有效量可以根据如个体 的疾病状态、年龄、性别和体重的因素而变化。有效量或治疗有效量 可以是这样的：其中治疗有益效果胜过任何有毒或有害作用。
针对任何具体患者的特定剂量和治疗方案将取决于各种因素，包 括所使用的具体组合物、所述患者的年龄、体重、一般健康状况、性 别和饮食、以及施用时间、排泄速率、药物组合和要治疗的具体疾病 的严重程度。医疗护理人员对这样的因素的判断是在本领域普通技术 范围内的。量也将取决于要治疗的个体、施用途径、制剂类型、所使 用的化合物的特征、疾病的严重程度和所需效果。所用的量可通过本 领域中公知的药理学和药代动力学原理来确定。
包含编码FAS嵌合体的核酸构建体的腺病毒或包含所述编码 FAS嵌合体的核酸构建体的腺病毒的均质群体的有效量可以是任何合 适的剂量。在一个实施方案中，所述腺病毒或所述腺病毒均质群体的 有效量是每个受试者至少大约109个VP、至少大约1010个VP、大约 1011个VP、至少大约1012个VP或至少大约1013个VP。在另一个实 施方案中，所述腺病毒或所述腺病毒均质群体的有效量是每个受试者 至少大约1x1012个VP、至少大约2x1012个VP、大约3x1012个VP、 至少大约4x1012个VP、至少大约5x1012个VP、至少大约6x1012个VP、大约7x1012个VP、至少大约8x1012个VP、至少大约9x1012个VP或至少大约1013个VP。在其它实施方案中，所述腺病毒或所述 腺病毒均质群体的有效量是每个受试者大约109至大约1015个VP、大 约1010至大约1014个VP、大约1011至大约1013个VP或大约1012至 大约1013个VP或大约3x1012至大约1013个VP。
在其它方面，如果第一次剂量没有诱导任何毒性，则升高表达 FAS嵌合体蛋白的腺病毒或所述腺病毒的均质群体的有效量。例如， 所述表达FAS嵌合体蛋白的腺病毒或所述腺病毒的均质群体的第一 次剂量可以是每个受试者至少大约1x109、大约1x1010个VP、至少 大约1x1011个VP、至少大约1x1012个VP、至少大约2x1012个VP、 至少大约3x1012个VP、至少大约4x1012个VP、至少大约5x1012个VP、至少大约6x1012个VP、至少大约7x1012个VP、至少大约8x1012个VP或至少大约9x1012个VP，并且所述表达FAS嵌合体 蛋白的腺病毒的第二次剂量或后续剂量可以是每个受试者至少大约5 x1012个VP、至少大约6x1012个VP、至少大约7x1012个VP、至少 大约8x1012个VP或至少大约9x1012个VP、至少大约1x1013个VP、 至少大约2x1013个VP、至少大约3x1013个VP、至少大约4x1013个VP、至少大约5x1013个VP、至少大约6x1013个VP、至少大约 7x1013个VP、至少大约8x1013个VP、至少大约9x1013个VP、至 少大约1x1014个VP。在一个具体的实例中，所述表达FAS嵌合体蛋 白的腺病毒或所述腺病毒的均质群体的第一次剂量是每个受试者大约 3x1012个VP，并且所述表达FAS嵌合体蛋白的腺病毒的第二次剂量 是每个受试者大约1x1013个VP。但是，如果一个特定的剂量诱导了 剂量限制性毒性，则可以减少所述表达FAS嵌合体蛋白的腺病毒或所 述腺病毒的均质群体的有效量。
包含所述腺病毒或所述腺病毒的均质群体的组合物可以向所述 受试者输注大约10分钟、大约20分钟、大约30分钟、大约40分钟、 大约50分钟、大约60分钟、大约70分钟、大约80分钟、大约90 分钟、大约100分钟、大约110分钟或大约120分钟。在一个实施方 案中，本发明的所述核酸构建体被静脉内输注不超过60分钟。在另一 个实施方案中，包含所述腺病毒或所述腺病毒的均质群体的组合物以 1mL/分钟的速率、剂量为等于或小于3x1012个VP/受试者进行输注。 如果剂量大于3x1012个VP/受试者，则包含所述腺病毒或所述腺病毒的均质群体的组合物以1mL/分钟的速率输注第一个10mL，然后以3 mL/分钟的速率输注剩余的组合物。
还可以将补充的活性化合物掺入本发明的方法中所使用的组合 物。例如，编码FAS嵌合体基因产物的核酸构建体或所述核酸构建体 的均质群体可以与一种或更多种另外的治疗剂共同配制和/或共同施 用。
本发明包括用于将编码FAS嵌合体基因产物的核酸构建体或所 述核酸构建体的均质群体递送至选定靶组织的任何合适的递送方法， 包括推注水性溶液或植入控释系统。控释植入物的使用减少了重复注 射的需要。
编码FAS嵌合体基因产物的核酸构建体、包含所述核酸构建体 的腺病毒或所述腺病毒的均质群体可以被直接输注进入肿瘤。用于化 合物的直接肿瘤输注的各种植入物是已知的，并且在治疗化合物向患 有女性妇科癌症的人类患者的递送中是有效的。
组合物还可以包含分散于作为化合物的合适递送或支持系统起 作用的生物相容性载体材料中的编码FAS嵌合体基因产物的核酸构 建体、包含所述核酸构建体的腺病毒或所述腺病毒的均质群体。缓释 载体的合适的实例包括成型颗粒形式(如栓剂或胶囊)的半透聚合物 基质。可植入的或微胶囊的缓释基质包括聚丙交酯(美国专利号 3,773,319；EP58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物 (Sidmanet al.,Biopolymers 22:547-56(1985))；聚(2-羟乙基-甲基丙 烯酸酯)、乙烯-乙酸乙烯酯(Langer et al.,J.Biomed.Mater.Res. 15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.12:98-105(1982))或聚-D-(-)-3羟基丁酸(EP 133,988)。
根据本发明的方法，所述核酸构建体、所述腺病毒或所述腺病毒 的均质群体的施用可以与一种或更多种化疗剂的施用组合进行。该化 疗剂可以在表达FAS嵌合体蛋白的腺病毒或所述腺病毒的均质群体 的施用之前、同时或之后进行施用。
可以与本发明的所述腺病毒共同施用的一种或更多种化疗剂包 括但不限于阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、阿霉素、 阿多来新、阿地白介素、爱宁达、六甲蜜胺、安波霉素、醋酸阿美蒽 醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、安特拉霉素、天冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴马司他、苯佐替派、比卡 鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、贝伐单抗、比折来新、硫酸 博来霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素C、卡鲁睾酮、 卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、卡莫司汀、盐酸卡柔比星、卡折来新、西 地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗霉素、顺铂、克拉屈平、甲磺酸克立那托、 环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西 他滨、右奥马铂、地扎呱宁、甲磺酸地扎呱宁、地吖醌、多西他赛、 多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、丙酸甲雄烷 酮、达佐霉素、依达曲沙、盐酸依氟鸟氨酸、依沙芦星、恩洛铂、恩 普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌莫 司汀、雌莫司汀磷酸钠、依他硝唑、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氯苯 乙嘧胺、盐酸法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、 氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、磷曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、 羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、干扰素α-2a、干扰 素α-2b、干扰素α-nl、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、羟丙 氨铂、盐酸伊立替康、醋酸兰瑞肽、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、盐酸利 阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索蒽醌、马索丙考、美登素、 盐酸氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、巯嘌 呤、甲氨喋呤、甲氨喋呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米托 凯星、丝裂红素、米托菌素、米托马星、丝裂霉素、米托司培、米托 坦、盐酸米托蒽醌、麦考酚酸、诺考达唑、诺拉霉素、奥马铂、奥昔 舒仑、帕唑帕尼(pazotinib)、紫杉醇、培门冬酶、培利霉素、溴新 斯的明、硫酸培洛霉素、过磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗 蒽醌、普卡霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、泊非霉素、泼尼莫司汀、盐 酸丙卡巴肼、嘌罗霉素、盐酸嘌罗霉素、吡唑呋林、利波腺苷、罗谷 亚胺、沙芬戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、索拉非尼(Sorafinib)、司巴膦酸钠、司帕霉素、盐酸锗螺胺、螺莫斯汀、螺铂、绛色霉素、 链佐星、磺氯苯脲、舒尼替尼(Sunitinib)、他利霉索、紫杉酚、替 可加兰钠(tecogalan sodium)、替加氟、盐酸替洛蒽醌、替莫泊芬、 替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酯、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、噻替派、噻唑 呋林(Tiazofuirin)、替拉扎明、盐酸拓扑替康、柠檬酸托瑞米芬、 醋酸曲托龙、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、三甲曲沙葡萄糖醛酯、曲普 瑞林、盐酸妥布氯唑、尿嘧啶氮芥、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、 硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹 定、硫酸长春甘酯、硫酸环氧长春碱、长春瑞滨、硫酸异长春碱、硫 酸长春利定、伏氯唑、折尼铂(Zeniplatin)、净司他丁或盐酸佐柔比 星。另外的抗肿瘤剂包括在抗肿瘤剂(PaulCalabresi和Bruce A. Chabner)第52章及其引言、Goodman和Gilman的"ThePharmacological Basis of Therapeutics",Eighth Edition,1990, McGraw-Hill,Inc.的第1202-1263页中所公开的那些。
在一些实施方案中，施用表达FAS嵌合体蛋白的腺病毒或所述 腺病毒的均质群体的受试者同时进行放疗治疗。在其它实施方案中， 施用表达FAS嵌合体蛋白的腺病毒或所述腺病毒的均质群体的受试 者用两种或更多种化疗剂同时进行治疗。在某些实施方案中，施用表 达FAS嵌合体蛋白的腺病毒或所述腺病毒的均质群体的受试者同时 用化疗剂和放疗进行治疗。
在本发明的组合疗法方面，化疗剂可以是紫杉醇。在一个方面， 表达FAS嵌合体蛋白的腺病毒或所述腺病毒的均质群体可以与紫杉 醇同时施用。在另一个方面，表达FAS嵌合体蛋白的腺病毒或所述腺 病毒的均质群体可以在紫杉醇的施用之前或之后施用。在其它实施方 案中，紫杉醇在施用表达FAS嵌合体蛋白的腺病毒或所述腺病毒的均 质群体之前至少30分钟、至少大约一小时、至少大约两小时、至少大 约三小时、至少大约四小时、至少大约五小时、至少大约六小时、至 少大约七小时、至少大约八小时、至少大约九小时、至少大约十小时、 至少大约11小时、至少大约12小时、至少大约13小时、至少大约 14小时、至少大约19小时、至少大约20小时、至少大约21小时、 至少大约22小时、至少大约23小时、至少大约24小时、至少大约一 天、至少大约36小时、至少大约2天、至少大约60小时或至少大约 3天进行施用。
化疗剂还可以任何合适的方法进行施用，例如胃肠外、心室内、 口服、通过吸入喷雾、局部地、经直肠地、经鼻地、经颊地、经阴道 地或经植入的贮库。在本文中所使用的术语“肠胃外”包括皮下、静 脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、腹膜 内、颅内注射或输注技术。
化疗剂的有效量可由本领域获得。在一个方面，例如，紫杉醇的 有效量可以是至少大约10mg/m2、至少大约20mg/m2、至少大约30 mg/m2、至少大约40mg/m2、大约50mg/m2、至少大约60mg/m2、至 少大约70mg/m2、至少大约80mg/m2、大约90mg/m2、至少大约100 mg/m2或至少大约110mg/m2。在另一个方面，紫杉醇的有效量是从 大约10mg/m2至大约200mg/m2、从大约20mg/m2至大约150mg/m2、 从大约30mg/m2至大约100mg/m2或从大约40mg/m2至大约80 mg/m2。在其它方面，紫杉醇的有效量是大约10mg/m2、大约20mg/m2、 大约30mg/m2、大约40mg/m2、大约50mg/m2、大约60mg/m2、大 约70mg/m2、大约80mg/m2、大约90mg/m2或大约100mg/m2。
在紫杉醇施用的某些方面，紫杉醇被输注至少10分钟、至少20 分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少60分钟、至 少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110 分钟、至少120分钟、至少150分钟、至少180分钟、至少210分钟、 至少240分钟、至少270分钟或至少300分钟。在特定的实例中，紫 杉醇至少进行一小时输注。可以使用本领域已知的任何方法用于紫杉 醇的输注方法。例如，可以通过具有不大于0.22微米的微孔膜的管线 滤器(inline filter)施用紫杉醇超过三小时。
在一些方面，紫杉醇在第1天(施用表达FAS嵌合体蛋白的腺 病毒或所述腺病毒的均质群体的同一天)进行输注(即第一次剂量)， 并且接着一次或更多次后续剂量，例如，每三天、每四天、每五天、 每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每11天、每12天、每 13天或每14天输注。在一个特定的实例中，在每一个28天中，紫杉 醇在第1天施用(即第一次剂量)并且接着在第8天(即第二次剂量)、 第15天(即第三次剂量)和第22天(即第四次剂量)施用。
在又一些其它方面，如果第一次剂量没有诱导任何毒性，则升高 要与表达FAS嵌合体蛋白的腺病毒或所述腺病毒的均质群体共同施 用的化疗剂的有效量。例如，紫杉醇的第一次剂量可以是大约10至大 约70mg/m2、大约20至大约60mg/m2、大约30至大约50mg/m2或大约40mg/m2，并且第二次剂量或任何后续剂量可以提高大约10 mg/m2、大约20mg/m2、大约30mg/m2、大约40mg/m2、大约50mg/m2、 大约60mg/m2、大约70mg/m2或大约80mg/m2。在一个实施方案中， 紫杉醇的第一次剂量是大约40mg/m2，紫杉醇的第二次剂量是大约80 mg/m2。在另一个实施方案中，紫杉醇的第一次剂量是大约40mg/m2， 紫杉醇的第二次剂量是大约80mg/m2，紫杉醇的第三次剂量是大约80 mg/m2。在其它实施方案中，紫杉醇的第一次剂量是大约40mg/m2， 紫杉醇的第二次剂量是大约80mg/m2，紫杉醇的第三次剂量是大约80 mg/m2，紫杉醇的第四次剂量是大约80mg/m2。
但是，如果第一次剂量对受试者诱导剂量限制性毒性，则可以减 少紫杉醇的有效量。可以通过任何已知方法确定该剂量限制性毒性： 例如，(1)中性粒细胞绝对计数(ANC)<0.5x109/L持续≥4天或 者中性粒细胞绝对计数<0.5x109/L伴有败血症，或不易用解热药控制的3-4级发烧(>100.2°F)；(2)持续任意时间的血小板计数<10x 109/L；(3)任何其它药物有关的非肝和非血液学≥3级的毒性，或其 任意组合。这不包括可被医学控制的≥3级的恶心或呕吐(如果恶心和 /或呕吐不能被医学控制并且在第一周期期间发生，这将被认为是DLT)或≥3级的低钾血症、低钠血症、低磷血症、低镁血症、低钙血 症，如果能被很容易地校正，在临床上是无症状的，并且没有伴随医 学显著并发症(例如EGC变化)。
在一个实施方案中，在第1天的紫杉醇的第一次剂量是40 mg/m2，且如果受试者没有表现出剂量限制性毒性，则第8天的第二 次剂量和后续第15天、第22天和第28天的剂量提升至80mg/m2。 在另一个实施方案中，如果受试者中ANC/药物≥1,000/mm3，则对所 述受试者施用完全剂量的紫杉醇，例如80mg/m2。如果受试者中ANC/ 药物<1,000/mm3，则停止紫杉醇的施用。如果进一步发生ANC< 1,000/mm3，则紫杉醇的剂量可以减少至60mg/m2。在其它实施方案 中，如果受试者具有血小板/药物≥100,000/mm3或第一次发生 <100,000/mm3和>75,000/mm3，则所述受试者施用完全剂量的紫杉 醇，例如80mg/m2。如果受试者显示<75,000/mm3的血小板/药物，则 停止紫杉醇的施用。如果受试者显示重复发生血小板/药物 <100,000/mm3并且>75,000/mm3，则紫杉醇的剂量降至69mg/m2。在 一些实施方式中，如果受试者表现出第一次发生神经病等级>2，则紫 杉醇的剂量从全剂量(例如大约80mg/m2)减少至大约60mg/m2。如 果受试者表现出第二次发生神经病等级>2(或尽管剂量减少仍显示该病顽固存在)，则紫杉醇剂量减少至40mg/m2。如果受试者表现出第 三次发生(或尽管剂量减少但该病仍保持)，则中止施用紫杉醇。
尚不清楚紫杉醇会引起肝毒性；但是，它在具有严重肝功能障碍 的患者中的清除被延迟。因此，具有肝功能障碍的受试者中的紫杉醇 剂量可以根据下表进行修改。
表5.针对具有肝功能障碍的受试者的紫杉醇剂量修改
血清AST或ALT 紫杉醇
<3x ULN 80mg/m2
≥3x ULN 60mg/m2
≥5x ULN 保持用药(hold drug)
具有升高的胆红素>1.5mg/dl的受试者直到该异常实验室值改 善至≤1级才可以接受紫杉醇。按照以上表格，在恢复后治疗可以重新 开始，紫杉醇为低于一个剂量水平。表现出紫杉醇毒性持续超过2周 的受试者可以中止该药物。
在某些实施方案中，受试者在施用一种或更多种化疗剂(例如紫 杉醇)之前、同时或之后施用免疫抑制剂。在一个实施方案中，可用 于施用给受试者的免疫抑制剂选自由以下组成的组：H2-受体拮抗剂、 西咪替丁、雷尼替丁、法莫替丁、皮质类固醇、地塞米松、环孢霉素、 苯海拉明及其任意组合。
在进一步的实施方案中，本发明的方法还包括在施用表达FAS 嵌合体蛋白的核酸构建体之前、同时或之后施用一种或更多种抗血管 生成剂。
在一些实施方案中，本发明的受试者被施用止吐剂。合适的止吐 剂的实例包括但不限于5-HT3受体拮抗剂(例如多拉司琼、格拉司琼、 昂丹司琼、托烷司琼、帕洛诺司琼或米塔扎平)、多巴胺拮抗剂(例 如多潘立酮、奥氮平、氟哌啶、氟哌啶醇、氯丙嗪、异丙嗪、丙氯拉 嗪、甲氧氯普胺、阿立必利或丙氯拉嗪(compazine、stemzine、buccastem、stemetil或phenotil)、NK1受体拮抗剂(例如阿瑞吡坦 (aprepitant)或卡索吡坦(casopitant))、抗组胺剂(H1组胺受体 拮抗剂)(例如赛克利嗪、苯海拉明、茶苯海明、多西拉敏、美克洛 嗪、异丙嗪或羟嗪)、大麻类物质(例如大麻、屈大麻酚、大麻隆、 JWH系列或四氢大麻酚(Sativex))、苯二氮类(例如咪达唑仑或 劳拉西泮)、抗胆碱药(例如东莨菪碱)、类固醇(例如地塞米松)、 曲美苄胺、姜、愈吐宁锭(emetrol)、异丙酚、薄荷、蝇蕈醇或ajwain、 或其任意组合。在其它实施方案中，合适的止吐剂是地塞米松、PRN 劳拉西泮(Ativan)、格拉司琼(kytril)、丙氯拉嗪(compazine)、 奋乃静、昂丹司琼(zofran)、奋乃静或其任意组合。
在其它实施方案中，在施用编码FAS嵌合体蛋白的核酸构建体 之前、同时或之后施用解热药。解热药的实例包括但不限于NSAIDs (例如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、阿司匹林、对乙酰氨 基酚、安乃近、萘丁美酮、安替比林、奎宁或其任意组合。
本发明的方法还包括在接受表达FAS嵌合体蛋白的核酸构建体或 所述化疗剂之前或之后确定受试者中的疾病进展。在一个实施方案中， 通过测定肿瘤的尺寸确定疾病进展。在另一个实施方案中，通过测定 肿瘤抗原(例如CA-125)的表达确定疾病进展。为了确定所述疾病进 展，在表达FAS嵌合体基因产物的核酸构建体的输注之前、在所述输 注结束时、所述输注之后大约三小时和/或所述输注之后大约六小时收 集受试者的血液和尿液。在其它实施方案中，在0分钟-15分钟(就 在给药之前)、给药开始之后30分钟±15分钟、给药开始之后60分 钟±15分钟、给药开始之后四小时±15分钟、给药开始之后六小时±15分钟和/或在任何不良事件发生时记录受试者的生命体征。要测定的生 命体征包括但不限于收缩和舒张压、外周心率、体温、呼吸率或其任 意组合。在又一些其它实施方案中，测定受试者的血液学(例如全血 细胞分类计数、INR和活化的PTT)、凝固(例如PTT水平)、表 达FAS嵌合体的核酸构建体的生物分布、血管生成性和炎症性生物标 志物的表达(例如VEGF、PlGF、sVEGFR1、bFGF、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、sVEGFR2、SDF1α、CD31、CD34、VEGFR2、vWF、其任意组合)、肿瘤标志物(例如CA-125)的表达或其任意组合。
对于发热和嗜中性粒细胞减少症，以常规方式管理适合于本发明 方法的受试者。在重新开始疗法之前，受试者需要从发热和活跃性感 染问题中恢复。在一些实施方式中，不使用生长因子的受试者在其下 一个周期中将添加Neupogen或Neulasta。接受Neupogen5μg/kg/天 的受试者可以在同一方案内将他们的剂量升高至10μg/kg。
实施例
实施例1
病毒载体的构建和克隆
所述载体使用含有大部分5型腺病毒基因组的骨架构建，并与衔 接质粒部分同源，从而能够进行重组。
从骨架质粒上去除E1早期转录单位，并且缺失pWE25和Amp 抗性选择标记位点而对其进一步修饰。
衔接质粒(含有Ad5、CMV启动子、MCS和SV40 polyA序列) 通过限制性消化去除其中的CMV启动子，并插入PPE-1启动子和 Fas-c片段对其进行修饰。修饰的PPE-1启动子(PPE-1-3X,SEQ ID NO:18)和Fas嵌合转基因(Fas-c,SEQ ID NO:9)被用来构建腺病毒 载体。PPE-1-(3X)-Fas-c元件(2115bp)由PPE-1-(3X)-luc元件构建 而来。该元件含有1.4kb的小鼠前内皮素原PPE-1-(3X)启动子、荧 光素酶基因、SV40polyA位点和小鼠ET-1基因的第一个内含子，其 来自Harats等人使用的pEL8质粒(8848bp)(Harats D.等，JCI, 1995)(Harats D.et al.,JCI,1995)。使用BamHI限制性酶从pEL8质 粒中获取PPE-3-Luc盒。荧光素酶基因被Fas-c基因[由人TNF-R1 (肿瘤坏死因子受体1，SEQ ID NO:4)的胞外和膜内结构域以及Fas (p55)胞内结构域(SEQ ID NO:8)组成(Boldin等,JBC,1995)]取 代而获得PPE-l-3x-Fas-c盒。
PPE-1(3x)-Fas-c质粒–所述盒通过限制性消化被进一步引入 到骨架质粒中，得到PPE-1(3x)-Fas-c质粒。
衔接子-PPE-l(3x)-Fas-c质粒–从第一代构建体PPE-1-3x-Fas-c 质粒中提取PPE-l-3x-Fas-c元件，并使用选定的PCR引物进行扩增， 分别在5’-和3’-末端引入SnaB1和EcoR1限制性位点。利用这些位点 将PPE-Fas-c片段克隆进经SnaB1和EcoR1消化的衔接质粒，获得 衔接子-PPE-l-3x-Fas-c质粒，用于宿主细胞的转染(例如，PER.C6 细胞)。
实施例2
VB-111在具有转移性Lewis肺癌(LLC)的小鼠中的效力和安全 性
总结
在本研究中，使用VB-111(109或1011个病毒颗粒(VPs))、卡铂 (Carboplatin)(20或50mg/kg)和爱宁达(Alimta)(10或30mg/kg) 或这些小分子和腺病毒载体的组合处理LLC模型小鼠。
使用两个剂量的VB-111的处理都获得了100％存活。施用低剂量 的化疗剂获得轻微降低的存活率(94.1％)，其与施用媒介物看到的 相似(93.8％)。但是，施用高剂量的化疗剂导致最低的存活百分比 (50％)。与单独施用VB-111相比，组合治疗降低了存活率(64％ －93％)。
在不同组中器官重量(心脏、肾脏和脑)基本相同。不同组之间 在肝、脾和睾丸重量上发现一些不同，主要是单独高剂量VB-111或 与该剂量的任何组合的重量较高。
与媒介物处理相比，在肝功能上没有发现显著差异。通常，组合 疗法没有比组成其的单一疗法引起更高的毒性。
VB-111 109+高化疗剂的组合比单独的高化疗剂处理明显更有效。 另外，组合处理提高了VB-111 109单独处理的平均和中值肿瘤负荷 (分别是1.5倍平均值和5倍的中值)，虽然统计学上不显著。如果 在更大组上应用该处理，这种效果可能会呈现统计学上的显著性。
VB-111 109+高化疗剂的组合获得了与VB-111 1011类似的高肿瘤 负荷减轻，因为在这两组之间没有明显的差异。单独VB-111 109的处 理没有获得这种与VB-111 1011的明显相似性。
VB111 109+高化疗剂组合疗法可能会降低VB-111的剂量，却保持 其高效力，并改善卡铂和爱宁达单独化疗的低效力。
介绍
Lewis肺癌(LLC)是一种广泛应用于转移的小鼠模型 (Varda-Bloom等,2001)。本研究将要确定VB-111与已经明确的化疗 法(例如卡铂和爱宁达)组合治疗时的可能的协同性：评价单一剂量 VB-111(109或1011VPs/小鼠)在单独处理或与卡铂(20或50mg/kg) 和爱宁达(10或30mg/kg)重复腹膜内处理组合时的效力，并评价和 鉴定VB-111单独处理和与上述的化疗剂组合时的安全性和耐受性。
表6显示了本研究设计。
表6.研究设计
材料和方法
测试和参考材料
名称:VB-111(PPE-fas).
化学名称:未说明
活性组分:5型腺病毒，E1缺失，E3部分缺失，具有 PPE-1(3x)启动子，含有fas嵌合转基因
媒介物:PBS和甘油
提供:VBL
物理状态:液体
保存条件:≤-65℃,低温瓶中
物品准备:处理当天融化药瓶并颠倒混合
名称:卡铂
化学名称:Ebewe
媒介物:注射用水
提供:Ebewe
物理状态:液体(450mg/45ml)
保存条件:RT
名称:爱宁达
化学名称:Pemetrexed
媒介物:注射用水
提供:Lilly
物理状态:粉末
保存条件:RT
对照品:
名称:PBS 10％甘油
提供:VBL
物理状态:液体
保存条件:≤-65℃,低温瓶中.
物品准备:处理当天融化药瓶并置于冰上不超过30分钟。
融化D122Lewis肺癌细胞。在细胞注射的第一天，收集细胞并悬 浮至终浓度5x105/50μl，注射至左足垫。在注射后5天用卡尺测量肿 瘤的直径。接下来每周测量直至其达到5mm，然后每天测量直至7mm 时切除(定义为第－5天)。处死后，收集脑、心脏、肝脏、脾脏、 肾脏和睾丸，称重并根据下列参数评估：整个器官的颜色和质地结构、 病灶的存在或器官内转移的任何证据(切片后)。肝功能实验室分析(血液中GOT和GPT水平)包括在第5±1天和研究结束时(第16 天)取自每组5只小鼠的样品。
所有的动物程序都经过Tel-Hashomer的Sheba医学中心的“动 物护理与使用委员会”(“Animal Care and Use Committee”of Sheba Medical Center,Tel-Hashomer)的批准。本研究为有安慰剂对照的盲 研究。C57Bl6小鼠通过左足垫皮下注射接受Lewis肺癌细胞(D122)。 当肿瘤组织达到直径7mm时(大约细胞注射后3周)，在麻醉下将 具有原发肿瘤的足垫切除。将这一天定义为第-5天。原发肿瘤切除后 5天、第一次施用日为第0天。在第0天将小鼠随机分为如下表所述 的不同处理组。将测试的腺病毒载体或对照物质进行尾静脉注射，每 只小鼠的总体积为100μl。IP施用卡铂和爱宁达，每只小鼠每天剂量 为总体积100μl。
在整个研究过程中直至处死时，针对安全性和效力对动物进行跟 踪(如下面评估规划表所列)。记录研究中每只动物的死亡，并试图 确定死亡原因。对每只动物的处死日设定如下：当第5只对照小鼠(PBS 10％甘油–组9)死于转移时，确定从第0天(对该小鼠第一次IV 施用媒介物)开始经过的天数。该天数设定为所有仍存活小鼠的处死 日(即如果第5只对照小鼠在其第16天死亡，那么每只小鼠都在到达 其自己的第16天时被处死)。
效力评估规划示于表7中。
表7.评估规划
*皮肤、皮毛、眼睛、粘膜、呼吸、神经控制、震颤、流涎、腹 泻、活动、昏睡、抽搐、异常行为模式、睡眠、昏迷。
**来自每组5只小鼠
结果
在单独用109和1011VPs VB-111处理的小鼠组中，至第16天时 所有动物都存活。组合治疗的存活率降低，而最低的存活率见于用高 剂量的化疗剂处理的小鼠中，如表8所示。
表8.第16天的死亡率。
为了评估效力，在处死日称重肺。正常肺质量为～0.2g。肿瘤负荷 定义为肺质量减去0.2g。平均和中值肿瘤负荷示于表9中。
表9.平均和中值肿瘤负荷
与媒介物处理相比导致降低的肿瘤负荷的所有处理示于图1中。 图1显示，使用E11、E9+高化疗剂和E11+高化疗剂的处理比其它处 理组显示更低的平均肿瘤负荷。
对效力进行了几种统计学比较。当使用单因素方差分析时，媒介 物处理比除了VBE9+低化疗剂组合外的所有其它处理具有更高的肿 瘤负荷，这具有统计学上的显著性(p＝<0.001)。与两种化疗剂处理 和两种具有低化疗剂的组合处理相比，VB-111 1E11处理的肿瘤负荷 明显更低。当使用Mann-Whitney两组之间的单独比较时，VB-111 E11中的肿瘤负荷明显低于除了E9+高化疗剂之外的所有组。E9+高 化疗剂明显低于除了E11、E9和E11+高化疗剂之外的所有组。图2 显示了数据的盒型图。
结论
两种剂量的VB-111处理都得到了100％的存活率。施用低剂量的 化疗剂产生了稍微降低的存活率(94.1％)，其与施用媒介物看到的 存活率相似(93.8％)。但是施用高剂量的化疗剂导致了最低的存活百 分比(50％)。与单独施用VB-111相比，组合处理降低了存活率 (64％-93％)。
在不同组间器官重量(心脏、肾脏和脑)基本上没有不同。不同 组之间在肝脏、脾脏和睾丸重量上存在一些差异，主要是单独VB-111 高剂量或与此剂量的组合组中的重量较高。
与媒介物处理相比在肝功能上没有观察到明显的差异。一般来讲， 组合疗法没有导致比组成该疗法的单一疗法更高的毒性。
与高化疗剂单独处理相比，VB111 109+高化疗剂组合处理明显改 善了效果。另外，与VB111 109单独处理相比，其也改善了平均和中 值肿瘤负荷(分别为1.5倍平均值和5倍中值)，尽管没有统计学显 著性。如果对较大的组应用该处理，这种效果可能会呈现出统计学显 著性。
VB111 109+高化疗剂组合处理得到了与E11类似的肿瘤负荷降低 效果，因为在这两组中没有明显的差异(参见盒式图和Mann-Whitney 统计学比较)。VB111 109单独处理没有得到与VB111 1011明显的相 似性。
VB111 109+高化疗剂组合疗法可能会降低VB-111的剂量而保持 其高效力，并改善卡铂和爱宁达单独化疗时的低效力。
VB111 109+高化疗剂处理组的存活率和重量减少都比高化疗剂单 独处理要好：分别为存活率–64％和50％，重量减少–9.7％和 11.6％。对于任何所检测的器官重量在这两组之间没有发现差异。
实施例3
Ad5PPE-l-3X-Fas嵌合体与紫杉醇组合施用
这将是一个前瞻性、开放性、剂量逐步升高的、多中心(两个中 心)、阶段I/II的研究，来确定AD5PPE-1-3X-Fas-嵌合(VB-111)在 临床使用情况下的安全性和效力，将要监测具有实体原发性和转移肿 瘤(比如复发性卵巢上皮癌、输卵管癌、原发腹膜癌、MMMT和乳头状浆液米勒管肿瘤)的受试者接受静脉内输注一定剂量范围的 Ad5PPE-l-3X-Fas嵌合腺病毒载体与紫杉醇组合后的结果，比如毒 性、副作用、抗体效价、生物学分布、疾病进展和疾病复发以及存活。
VB-111对形成针对腺病毒载体的抗体、肿瘤应答和血管生成生物 标志物的效果也将得到评估。
材料和实验方法
研究目的
本研究假设VB-111加上每周的紫杉醇将产生可接受的毒性和应 答率或足以确保将来评价的临床效益。
主要目的
1.明确有限数量的VB-111和每周紫杉醇组合的剂量的毒性，跨 越预期有效剂量。
2.探索在扩大的组群中最佳耐受剂量的VB-111和每周的紫杉醇 组合的效力(RECIST应答、CA-125应答和无进展存活(PFS))。
次要目的
探索毒性和应答的预测性标志物
研究设计和评价的概述
该开放性、单中心、I/II期试验将VB-111与每周一次的紫杉醇组 合，用以确定与这个预处理群体中的历史对照比较，这种组合是否能 改善应答率，其中VB-111在每第二个28天周期的第一天输注，而每 周一次的紫杉醇在每28天的第1、8、15和22天输注紫杉醇40-80 mg/m2用时超过1小时。患者可继续有益处和改变的治疗，并且紫杉 醇施用有计划的间断，以避免过度的神经病，但不中断VB-111的输 注。该试验设计为2－步骤(2－stage)Simon’s设计，基于10个患 者中≥2个应答，并将继续加入。
受试者群:
将列入具有复发性卵巢上皮癌、输卵管癌、原发腹膜癌、MMMT 和乳头状浆液性米勒管肿瘤的受试者。
计划列入的患者数
基于研究设计，估计需要2到42名具有晚期癌症的患者(在剂量 升高过程中每个群组最多6名(＝18名患者)，在MTD剂量水平最 多29名患者，从而能够进行相关性/特异性研究的评价以及确保安全 性。
患者的选择
I/II期设计为了评价RECIST标准和CA-125限定的应答率 (GynecologicalCancer Intergroup(GCIG)标准)以及为了描述安全 性和表征不良事件以及毒性的特点。阶段I研究将加入3+3设计至3 个剂量水平。阶段II研究在第一阶段将列入多至10名患者，包括接 受全剂量化疗的剂量水平2和3的参与者。如果有至少2名应答，在 扩展群组中将继续列入另外19名患者至最多29名参与者。效力分析 将用来估计应答率。将进行持续的安全性审查，如果在第一阶段有2 或多名等级≥3的GI穿孔或在任何时候有3名，研究则终止。
受试者列入处理组的标准是：
1.患者年龄>18.
2.组织学上确定的卵巢上皮、腹膜或输卵管癌症，以及子宫乳头 状浆液性癌(UPSC)和妇科MMMT。
3.允许多达3条以前的转移性疾病化疗线。
4.患者必须之前进行过铂或基于铂的化疗。
5.Eastern Cooperative Oncology Group(ECOG)状态0-1.
6.在完成或正在接受含有铂和紫杉烷的疗法的6个内，根据成像 或CA-125定义铂抗性或难治疗性疾病为进展性疾病(原发或继发－ 即对于复发性铂敏感性疾病，患者可能只接受一次基于铂的治疗，接 下来无铂间隔<6个月)。
7.需要使用RECIST或CA-125可测量的或可评估的疾病(对于标 准化资格，如果一些患者根据RECIST和CA-125都符合，则RECIST 优先)。
8.适当的骨髓功能。
9.适当的血液学功能：
i.ANC≥1000/mm3
ii.PLT≥100,000/mm3
iii.PT和PTT(秒数)<1.2X ULN(PTT>ULN的受试者必须具 有阴性的LAC)
10.适当的器官功能：
a.CTC神经病学低于或等于1级。
b.之前的放射必须没有包括≥30％的含有主要骨髓的区域(骨 盆、腰椎)
c.SGOT/SGPT/碱性磷酸酶≤2.5x ULN或<5x ULN(对于记载 的肝转移)
d.胆红素≤1.5x ULN
e.肌酸酐≤1.5x ULN
f.筛选时浸棒的蛋白尿<2+或UPC(尿蛋白肌酸酐比<1.0).
11.必须已经从之前治疗的急性毒性中恢复，所述治疗包括放疗、 化疗、生物疗法，其中1级的神经病或任何等级的贫血症和秃头症除 外。
12.事先经过抗血管生成剂治疗不是排除标准。
13.之前没有GI穿孔或GI梗阻或成像时肠的参与。
14.没有活跃的、未治疗的精神疾病或需要治疗的神经病症状(允 许I级的感觉神经病)。不存在未经治疗的中枢神经系统或脑转移。 没有痴呆症或精神状态的显著改变，其会阻止理解和/或给予知情同 意。
15.没有患者对EL具有已知的过敏性。但是如果参 与者之前具有紫杉醇反应性，而接下来对药物的再刺激耐受，那么他 们是合格的。
16.没有不可控的细菌、病毒或真菌感染的迹象。
17.没有患者在施用前过去的30天接受其它的研究性疗法
18.必须有能力给予知情同意。
受试者从处理组排除的标准将为：
1.对复发性癌症有超过3条之前的化疗线。
2.在过去的2年内，除了浅表基底细胞和浅表鳞状细胞外，没有 活跃的恶性肿瘤或宫颈原位癌。诊断为共存的米勒管肿瘤(通常是子 宫内膜癌)的患者不被排除。在2年内诊断出并经治疗意图的处理的 具有低危险性(局部的非炎性)的乳腺癌患者不被排除。
3.不能遵守研究和/或后续程序。
4.预期寿命少于3个月。
5.常见毒性标准(CTC)等级1或更高的神经病(运动或感觉)， 其来自除了事先的紫杉烷接触外的共病，比如糖尿病。
6.尽管很少适用，具有生育能力的性活跃妇女在研究过程中必须 使用有效的生育控制方法，以将失败的风险最小化。在研究招收前， 具有生育能力的妇女必需被告知在试验参与过程中避免怀孕的重要 性，以及非故意怀孕的潜在危险因素。在接受研究产物前的14天内所 有具有生育能力的妇女必须是怀孕测试阴性。如果怀孕检查阳性，患 者一定不能接受研究产物，并不能被列入到本研究中。
7.不适当控制的高血压。
8.之前的高血压危象或高血压脑病的病史。
9.纽约心脏协会(NYHA)等级II或更高等级的充血性心脏衰 竭。
10.研究第一天前6个月内心肌梗死或不稳定型心绞痛的病史。
11.研究第一天前6个月内中风或短暂性脑缺血发作的病史。
12.已知的CNS疾病，除了治疗过的脑转移：治疗过的脑转移定 义为通过在筛选期间临床检验和脑部成像(MRI或CT)，确定治疗 后没有发展或出血的迹象并对地塞米松无持续需求。允许抗痉挛剂(稳 定剂量)。脑转移的治疗可包括全脑放疗(WBRT)、放射外科(RS：仂吗刀、LINAC或等同法)或治疗医生认为合适的组合。具有CNS 转移的患者中，若经过神经外科切除治疗或在第一天之前的3个月内 进行过脑部活检的将被排除。
13.在第一天前的6个月内有明显的血管疾病(例如主动脉瘤、 需要手术修复或近期外周动脉血栓)。
14.在第一天之前的一个月内的咳血病史(每次发作>1/2茶勺的 鲜红的血)。
15.出血素质或凝血功能明显异常的迹象(没有抗凝治疗)。
16.在第一天前的28天内有大的手术操作、开放性活检或重大创 伤性病变，或者预计在研究过程中需要大的手术操作。
17.在第一天之前的7天内进行了中心活检或其它小的外科手术 操作，不包括放置血管通路装置。
18.在第一天前的6个月内腹壁瘘或胃肠穿孔病史。
19.当前的肠梗阻指征和症状。
20.当前的对IV水合或肠道外全营养(TPN)的依赖性。
21.严重的不愈合的伤口、活跃的溃疡或未治疗的骨折。
22.对于TKI在前面4周内或对于抗体或基于肽抗体(peptibody) 的治疗6周内接受抗血管生成治疗的患者。
23.持续需要免疫抑制治疗的患者，包括使用环孢菌素，或具有 在列入前最后4周内长期使用任何此类药物的历史的患者。允许稳定 剂量的皮质类固醇(例如在施用前至少2周开始的)。
组成：AD5-PPE-L-3X-FAS-嵌合体
Ad5-PPE-l-3X-fas-嵌合体(SEQ ID NO:19)是一种血管破坏性 基因治疗剂，由含有修饰的小鼠前内皮素原启动子(PPE-l-3x,SEQ ID NO:18)和fas－嵌合转基因[Fas和人肿瘤坏死因子(TNF)受体](SEQ ID NO:9)的非复制性腺病毒载体(Ad5，E1缺失的)组成。其配制 成无菌载体溶液，并在一次性使用的小瓶中以冷冻形式提供(低于 -65℃)。每个小瓶含有1.1mL的具有特定病毒滴度的载体溶液。
效力和药效学研究目的:
治疗计划
用Ad5-PPE-l-3X-fas-嵌合体与每周一次的紫杉醇组合处理患者。 周期长度为28天。患者将每周(第1、8、15和22天)接受60分钟IV 输注的紫杉醇。在周期1开始的奇数周期的第一天经IV输注施用 Ad5-PPE-l-3X-fas-嵌合体，之后每两个周期进行一次。处理计划示于 图3。阶段I的剂量水平示于下列表10。
表10:阶段I1部分的剂量水平：
脚注:
1.在确定最大耐受剂量(MTD)之后或剂量水平3已经完成后 转换到阶段II。
2.请注意，对于<50kg的受试者，在各个剂量水平时总VB-111 病毒颗粒剂量与所示的不同。
3.对于剂量水平1计划在受试者内进行剂量逐渐升高。在周期2 第一天，对列入到剂量水平1的参与者，紫杉醇的剂量可能被升高至 80mg/m2，考虑到这是临床使用的标准剂量。如果两名参与者在剂量 水平1经历剂量限制性毒性(DLT)，则终止该研究，不确定MTD。
4.这些数字可反应包括有：(a)直接列入到剂量水平2的参与 者，以及(b)剂量水平1参与者，其已在周期2的第一天升高剂量至 剂量水平2，用于评价周期3过程中的DLT。
阶段I组群的参与者将因此通过修饰的3+3设计被列入，如表11 所示和如下所述。
从剂量水平1升高剂量至剂量水平2：如果2名参与者在剂量水 平1经历DLT，研究将终止，不确定MTD。在剂量水平1中，计划 在周期2的第一天，在受试者内将参与者剂量升高至80mg/m2的紫 杉醇，然后这些参与者可以被算作评价列入剂量水平2的参与者，尽 管VB-111和紫杉醇同时施用发生在剂量水平1的周期3(即列入剂量 水平2的参与者和具有紫杉醇的剂量升高至80mg/m2的周期3剂量水 平1的参与者都将被评价，所以在剂量水平2可有2－12名参与者， 其中多至6名起始列入剂量水平1，然后剂量被升高)。如果在评价 了3名受试者后在剂量水平2没有DLT(或者作为剂量水平2的新 参与者或者由于剂量水平1中的紫杉醇剂量升高)，该研究将列入剂 量水平3。该计划只适用于在受试者内紫杉醇的剂量升高(以使进行 40mg/m2剂量的参与者数最小化)，没有VB-111的受试者内剂量升 高。
从剂量水平2到剂量水平3的剂量升高：一旦3名受试者列入剂 量水平2，在起始施用VB-111后观察14天，没有DLT，则受试者可 列入剂量水平3(1x1013VPs)，因为至少6名参与者将已经在剂量水平1 和2被施用3x1012VPs。只有当至少2名患者接受一剂施用3x1012VPs而没有DLT，才可在剂量水平3第二次施用VB-111。另外，将在平 行的VB-111I/II期研究的同时进行DLT监测。从这些研究得到的安 全性发现将在该团队中分享。如果在剂量水平3发生任何DLT，参与 者可继续研究，并将接受进一步施用剂量水平2的VB-111(3x1012 VPs)。
表11:剂量升高决定规则
鉴于药物的新颖性，将在开始研究的每名新人之间至少间隔2天 按顺序列入新参与者。多个新研究的参与者不会在同一天施用。一个 28天的处理周期的完成将作为确定每一施用组群的MTD和DLT的 基础。将根据Common Terminology Criteria for AdverseEvents (CTCAE)第4版(在国际互联网：http://ctep.info.nih.gov有可下载文 件)来评价毒性等级。
定义剂量限制性毒性(DLT)
对于DL1参与者，将在第一周期(周期1)和第三周期评估潜在 的DLT。
将通过CTCAE 4.0版来评估毒性。剂量限制性毒性定义如下：
1.中性粒细胞绝对计数<0.5x109/L持续≥4天，或者中性粒 细胞绝对计数<0.5x109/L伴有败血症，或等级3-4的发热 (>100.2°F)，其不容易用解热药控制。
2.血小板计数<10x109/L持续任何时间。
3.任何其它药物有关的非肝和非血液系统等级≥3的毒性。这不 包括等级≥3的可以被药物控制的恶心或呕吐(如果恶心和/或呕吐不 能被药物控制并发生在第一周期，它将被认为DLT)或等级≥3的可 以被容易矫正的、临床无症状的、并不伴有医学上严重并发症(例如 ECG改变)的低钾血症、低钠血症、低磷血症、低镁血症和低钙血症。
发生在施用VB-111后24小时内的等级3－4的发热事件，如果他 们对有症状的治疗有反应，则不被认为是DLT。在任何时间点，如 果患者有不可接受的毒性和/或进展，其将被移出研究。
研究过程
预处理评估：
临床医师(MD或NP)将评估患者是否满足合格标准。在开始第 一个处理周期处理之前的14天内将进行病史、身体检查，并记录重量 和生命指征以及记录ECG。建立基线测量值的调查(如果适用)应该 在开始第一个处理周期前28内完成。
在任何研究施用前，在每一周期的第一天，必须重新确定受试者 的合格性。
下列评估应该在D1的3天内完成(除了周期1，血液检验可以在 第一天的14天内检查)：
1.临床评估：医学史、身体检查、生命指征(VS)，并检查出血 的风险。在其它时候可以按护理的机构标准进行VS评估。
2.血液学：全血计数及分类、INR和活化的PTT。
3.凝血：如果部分凝血酶原时间(PTT)延长超过正常上限 (ULN)，需要抽血检查狼疮抗凝物(lupus anticoagulant，LAC)。 具有延长的aPTT的患者不应该接受VB-111，直至aPTT正常。在检 查狼疮抗凝物(LAC)阳性的患者中，在重复施用VB-111之前需要 阴性测试。对于一直阳性的LAC或抗磷脂抗体(APLA)检验，必须 在初始阳性检验开始的12周内重复所述的检验。
4.综合代谢方面：包括电解质、肝功能检验(LETS)、血尿氮 (BUN)/肌酸酐(Cr)、钙和镁。
5.尿：收集用于常规分析。
6.VB-111特异实验室:抽血用于：
(i)生物学分布：VB-111腺病毒DNA水平和转基因表达定量。
(ii)生物标志物：将检验所有列入本研究的患者的外周血样品中 抗血管生成疗法的生物标志物。分析血浆中循环血管生成性和炎症性 生物标志物：VEGF、PlGF、sVEGFR1、bFGF、IL-1β、IL-6、 IL-8、和TNF-α(使用Meso-Scale Discovery的多重ELISA平板)以 及sVEGFR2和SDF1α(使用R&D Systems试剂盒)。将使用标准流 式细胞术计数新鲜样品中的血液循环细胞。对存档的组织评估 CD31、CD34、VEGFR2和vWF。
(iii)肿瘤标志物：CA-125
(iv)抗体：针对AD-5病毒的抗体水平(包括中和抗体)。
研究处理输注：
在研究处理输注前ANC必须≥1,000/mm3并且血小板计数≥ 100,000/mm3。
紫杉醇输注：
抗呕吐疗法：抗呕吐疗法可包括地塞米松10mg i.v.prn、氯羟安 定(Ativan)0.5-2.0mg i.v.、和/或康帕嗪10mg p.o.或羟哌氯丙嗪4mg p.o.，基于学院标准。
施用顺序是紫杉醇然后VB-111。
经过具有不大于0.22微米的微孔膜的管路过滤器，以起始剂量 40–80mg/m2每周施用紫杉醇，用时超过60分钟。
所有患者在施用紫杉醇之前必须接受术前治疗(premedication) 以防止严重的过敏性反应。患者将口服地塞米松，在处理前一天晚上 20mg，在第一次施用处理的早晨20mg，然后如果紫杉醇耐受，则第 二周不用口服，只是IV术前治疗，剂量逐渐减少，第三周后不再使 用。典型的术前治疗方案组成如下：在紫杉醇之前30－60分钟给予 10-20mg静脉内(IV)地塞米松、50mg IV苯海拉明(或其等价物)， 以及300mg西咪替丁或50mg IV雷尼替丁。根据当地处方，法莫替 丁20mg IV可以作为替代物。如果在施用紫杉醇时患者发生了过敏 反应，研究人员可以自行决定提高地塞米松剂量。
奇数周期的第一天：
除了上述操作，将在奇数周期的第一天进行下列程序。
肿瘤测量：
在周期1的第一天之前(允许长达一个月之前)以及在每个奇数 周期(例如周期1、3、5等＝每8周)直至病情发展，利用CT进行胸 部、腹部和骨盆的肿瘤测量。在施用前、长达施用前3天，进行评估。
研究处理输注：VB-111
将在每个奇数周期的第一天施用VB-111直至病情发展。
应该在紫杉醇之后施用VB-111。这是基于以下考虑，作为安全防 范，研究性药剂应该在最后施用。没有预期两种药剂会有顺序依赖的 药理学改变。虽然预料这会在紫杉醇之后立即施用(1小时之内)的 情况下发生，如果有临床指示，可以晚些施用(24小时内)。
具有延长的aPTT的患者不应该接受VB-111直至aPTT正常。 LAC和/或APLA检验阳性的患者，需要在重复施用VB-111之前进行 阴性检验。如果检验仍然阳性，则不应该进一步施用VB-111。对于一 直阳性的LAC或APLA检验，从最初检验阳性起12周内必须重复检验。
退热治疗：施用VB-111之前应该施用1000mg的醋氨酚，VB-111 之后施用PRN醋氨酚。对于发展了3级发热的患者或者根据研究人员 的自行判断，可以在接下来施用VB-111之前10分钟i.v.施用10mg 地塞米松。
VB-111的准备和输注：完成紫杉醇输注后，将对正在禁食或只进 食了清淡饮食的患者施用单剂量VB-111 3x1012VPs(剂量水平1-2) 或1x1013VPs(剂量水平3)。请注意：如果患者具有明显的发冷，而 不是通常的低级和自限性发热，则建议禁食以避免呕吐。这不是绝对 要求。施用的最终溶液应该在制备后不超过60分钟内施用。施用后 0.5小时允许正常饮食。必须以下列速度施用稀释的VB-111单一静脉 内输注：
1.对于剂量3x1012VPs:1mL/分钟
2.对于剂量1x1013VPs:最初的10mL为1mL/分钟，然后剩余 的输注为3mL/分钟。
VB-111施用后的观察
在第一次施用研究药物后的最初8小时，研究参与者应该在门诊 部或输注区进行观察，接下来根据临床指示而定。
VB-111分布实验
在下列时间点收集血液和尿液样品用于VB-111腺病毒DNA表达 水平定量：
血液:
1. 0(施用前)
2.输注结束时
3. 3±0.5小时
4. 6±0.5小时
生命指征:
记录生命指征(收缩压和舒张压、外周心率、体温、呼吸率)：
1. 0分钟(就在施用前)(-15分钟的范围)
2.开始施用后30分钟(+/-15分钟的范围)
3.开始施用后60分钟(+/-15分钟的范围)
4.开始施用后4小时(+/-15分钟的范围)
5.开始施用后6小时(+/-15分钟的范围)
6.在任何不良事件发生的时候
每个周期的第8、15和22天
每名患者被要求在禁食状态下回到门诊部，进行下列评估：
1.生命指征：收缩压和舒张压、外周心率、体温、呼吸率。
2.血液学：全血计数并分类、INR和活化的PTT。
3.凝血：如果需要，跟踪异常PTT水平。
4.尿液：收集用于常规分析
血液实验将在周期1－6的第8天抽血。抽血用于：
1.生物学分布：VB-111腺病毒DNA水平以及转基因表达定量 (VB-111输注后的每个第二周期)
2.生物标志物：分析血浆中循环性血管生成性和炎症性生物标志 物VEGF、PlGF、sVEGFR1、bFGF、IL-1β、IL-6、IL-8、和TNF-α (使用Meso-Scale Discovery的多重ELISA平板)以及sVEGFR2和 SDF1α(使用R&D Systems试剂盒)。将使用标准流式细胞术计数新 鲜样品中的血液循环细胞。对存档的组织评价CD31、CD34、VEGFR2 和vWF。
3.肿瘤标志物:CA-125
4.抗体:针对病毒的抗体水平(包括中和抗体)
注意：综合代谢方面包括电解质、LETS、BUN/Cr、钙和镁分析 只需要在第一天进行，以及只需要在第1、8、15、22天进行LFTs。
如上详述施用紫杉醇。ANC必须>1,000/mm3并且血小板计数> 100,000/mm3
抗呕吐疗法：抗呕吐疗法包括凯特瑞(Kytril)750μg i.v.或1mg p.o或枢复宁(Zofran)10mg i.v.或8mg p.o.，和地塞米松10mg i.v.， 以及prn氯羟安定(Ativan)0.5-2.0mg i.v.，和/或甲哌氯丙嗪 (Compazine)10mg p.o.或奋乃静(Perphenazine)4mgp.o.，遵照 学院标准。
研究完成回访
受试者将按上述周期规划给予组合疗法(紫杉醇和VB-111)直至 疾病发展。
最后一次施用VB-111后，要求每名患者回到门诊进行最后的跟踪 访问，进行相同的临床评估和常规实验室样品采集，对于临床重要事 件，其将被记录作为未规划的实验室评估。不良事件以及相关治疗应 以在前的研究相同的方式记录。治疗医师(MD或NP)将对受试者进 行体检。将进行ECG。
将对没能继续研究或发生疾病发展的患者，进行临床跟踪或电话 联系以评估存活。但是疾病发展后，描述CA125和RECIST的数据 将被保存在临床研究文件中。
另外的程序
不良事件
对于具有任何不良事件的患者应进行完全的支持性措施。在施用 后发生的所有不良事件将以病历报告形式(CRF)被记录，并记录强 度、应用的治疗措施、结果和与研究药物相关性的评价。对相关的不 良事件进行跟踪，直至消退。对不相关的不良事件进行跟踪，直至消 退或研究结束时。
常见副作用包括恶心、呕吐以及食欲减退。患者也可能会遇到 便秘、拉肚子和腹泻。如果发生腹泻，增加液体摄入非常重要。如果 症状变得严重，患者可能需要住院治疗和接受静脉输液。施用任何研 究性产品都涉及一般的副作用风险。因为VB-111是研究性产品，并 不知道其所有的在人体中的潜在副作用。VB-111可能会引起下列副作 用的全部、一些或不引起这些副作用。副作用是指你在一项研究中可 能发生的不良医学状况或预先存在的医学状况的恶化。除了下列可能 的不良反应，不可预见的或不常见的副作用(可能会比较严重或威胁 生命)可能会在VB-111单独给予或与其它治疗组合时发生。本研究 目的之一是研究VB-111可能的副作用。在该研究过程中，研究医生 会密切监测患者，并与患者讨论有关风险、不适和不良反应的任何问 题。
与VB-111相关的危险
很可能的(高于50％的机率会发生)
·流感样症状，比如发热、肌肉疼痛、疲劳、发冷，
·恶心
·呕吐
偶尔的(1-10％的机率会发生)
·便秘
·肝脏产生了异常高水平的酶，意味着你的肝脏功能不正常，并 有可能引起疲劳和黄疸(皮肤和眼睛颜色发黄)。尽管这通常比较轻 微而且可逆，但是这也可能严重或威胁生命。
·脾脏大小的增加通常不引起任何症状，但是如果脾脏破裂，则 可能引起胃痛，并可能威胁生命。
·骨髓中新血细胞生成的增加，可能导致增加的血细胞数目，但 是白血病风险不会增加。
·在给予注射位置的过敏反应，其可能引起一些红肿。
·出血
·异常延长的凝血检验(PTT)和某些类型的抗体的产生(抗磷 脂抗体)，其可能干扰正常血液凝固。这可能引起血栓(血凝块)或 出血，其可能需要治疗，并可能比较严重或威胁生命。
·你的伤口愈合能力可能会受到影响。这可以导致感染，并可能 需要住院治疗。
·高血压
·尿中过多的蛋白。这通常是无症状的实验室发现，但是，如果 过多，可能会引起体液滞留，如腿肿。
·头痛
·食欲减退和体重减轻(厌食)
·血液中钠水平降低，其可以引起混乱、癫痫、疲劳和低水平意 识。
·血液中过多的糖分，如果严重，则可能需要住院治疗以及紧急 治疗。
·出汗增加(多汗症)
罕见的(低于1％的机率会发生)
·红细胞数量低，可引起疲劳和呼吸急促。这有可能需要输血。
·血小板数量低，这可能引起出血和淤青。出血可能会很严重或 威胁生命，并有可能需要输血。
·白细胞数量轻微升高(可能增加感染危险)
·严重出血
·肾功能可能恶化(急性肾衰竭)，这可能需要治疗，并且可能很严 重或威胁生命
·在具有涉及脑部的肿瘤的患者中，可能产生脑水肿(例如脑转 移)
·腹泻
·心血管并发症：心脏病、心绞痛(胸痛)或血凝块(血栓)， 其可能堵塞重要器官的血液供应，并引起中风或对其它器官的病变。
·充血性心力衰竭－心脏不能正常泵血，其可导致虚弱和疲劳、 流体滞留和流体集于肺中，这可能导致呼吸急促。可能很严重或威胁 生命。
与紫杉醇相关的危险
很可能的(高于50％的机率会发生)
·轻微至严重的过敏反应，可能威胁生命
·手足麻木和疼痛，有时恶化需要另外的治疗，并且在停药后可能 不会消失
·脱发
·肌肉和关节疼痛
·疲劳
经常(10-50％的机率会发生)
·恶心和/或呕吐
·腹泻
·口或喉酸痛
·头昏目眩
·头痛
·肝病变
·如果药物从注射的静脉泄漏到其周围的皮肤中，则有皮肤刺激和 肿胀。
·味觉改变
·先前的放射位点处的皮肤刺激
·皮疹
偶尔的(1-10％的机率会发生)
·结肠炎症，可能会引起你的肠部运动改变
·胰腺炎症，可能会引起短时的腹部疼痛
·闪烁的灯光或斑点的感觉
·肾脏病变
·一种叫作甘油三酯的脂肪形式在血液中水平升高(高甘油三酯 血症)
·心率减慢
·心跳不规则
罕见(低于1％的机率会发生)
·肝衰竭
·癫痫
·混乱；情绪变化
与活检相关的危险:
活检通常在成像技术的指导下进行。每个操作在活检前需要独立 的同意书。该危险可能包括：
·疼痛和不舒服。疼痛和不舒服的程度会不同，取决于活检位点的 位置。可以和研究医生讨论这些风险。
·在活检位点少量出血。
·在活检位点触痛。
·在活检位点结疤。
·罕见的在活检位点的感染。
非常少见地，活检引起的并发症可以威胁生命。对于任何介入性 操作，可能发生其它由于出血或器官病变导致的潜在的严重并发症。 这些可能需要进一步的外科干预。
与放射扫描和X－射线相关的危险：
可能会应用CT扫描评估该研究中患者的疾病。这些检验的频率 是标准治疗。从长期来看，经过很多年，由于对癌症的放射学评估和 治疗导致形成新的癌症的风险非常低。某些类型的药物或这些药物与 放射治疗的组合，可能会进一步轻微增加形成新癌症的风险。
在扫描过程中注射到血管中的造影剂的使用存在很小的风险。它 可能使肾功能已经降低的人的肾功能恶化。因此，在参与该研究的过 程中将密切监测肾功能。如果患者的肾功能发生任何变化，该患者可 能会被移出该研究。
非常少见地，一些人会对造影剂有过敏反应(比如荨麻疹和瘙痒)。 严重的反应(例如，血压下降、呼吸困难或严重的过敏反应和死亡) 非常罕见。
生殖性风险：
该研究使用的药物可能会影响胎儿。当参与本研究时，患者不应 该怀孕，并且不应该给婴儿喂奶。患者如果怀孕应立即告知医生。将 对男性或女性研究参与者提供有关预防怀孕的咨询。
合并用药
除了在排除标准中列出的药物，对合并用药没有限制。但是， VB-111不应该与其它药物混合。从基线直到最后一次施用后1个月的 跟踪回访，所有在研究中给予的合并用药将被记录。将记录常规药物 的产品名称、说明、剂量、单位、频率、起始和停止日期。任何持续 的合并用药将如此记录，不必重复出现，除非在研究结束前记录停止 用药日期。
止吐方案
预计恶心应该是轻微的副作用。建议下列代表性的止吐方案：地 塞米松4-8mgPO，或劳拉西泮(Lorazepam)0.5-1.0mg，或丙氯拉 嗪(Prochlorperazine)10mg PO，或甲氧氯普胺(Metoclopramide) 10-20mg，化疗前30分钟。
阿司匹林
对于具有高风险动脉血栓栓塞性疾病的受试者，可以开始或持续 施用低剂量的阿司匹林(≤325mg/d)。在研究中出现动脉缺血症状或 出血的受试者，应该对停止药物进行评估。
退热治疗
VB-111施用通常与在施用后持续24小时的自限性发热有关，一 些病例中，低级发热可能延长至施用后2－3天。在VB-111施用前1 －2小时应该施用1000mg的醋氨酚，VB-111施用后施用PRN醋氨酚。 在发展了3级发热的患者或者根据研究人员的自行判断，在接下来施 用VB-111之前10分钟，IV施用10mg地塞米松。
其它实验室分析
因为临床重要事件抽取的实验室样品，将记录为未计划的实验室 评估。对于具有临床相关的异常实验室数值时，将跟踪检验，直至该 数值回到正常范围内和/或发现所述异常的充分解释。所有该类实验室 研究都将在该研究地进行，除了分布评估，其将被送到独立中心实验 室(Independent Central Laboratory)。如果任何这些结果需要证实， 如果可能，将在同一医院实验室进行重新检验。必须为每个医院实验 室提供认证证书和正常参考范围。如果从当地实验室抽取安全性实验 室，应该尽力为这些实验室获得实验室认证证书和正常参考范围。
在筛选访问和每6个月或早期撤出的访问中将进行ECG。
研究持续时间
每个患者将每周施用紫杉醇和每第二个周期施用VB-111。患者将 参加该研究直至病情发展，然后只有他们的文件可供CA125和 RECIST详细信息的收集。
患者可以决定在任何时间撤出研究。应该仍然联系撤出的患者并 询问有关不良反应(AE)。所有AE，不管是否与药物或疾病相关， 都将记录在患者的记录和CRF中。基于到目前为止完成的临床前研究 得到的毒性特征，以及转基因表达的特异性，认为一年时间足以确定 治疗后产生的任何长期毒性。应该大约每2个月联系已经撤出的或发 生病情发展的患者，调查存活率。
剂量限制性毒性(只是周期#1,2和3)
在研究计划的第一个周期确定剂量限制性毒性(DLT)，在这些 周期中产生DLT的所有患者将被移出研究计划。在周期1中不允许剂 量降低。DLT被定义为>4天的IV级中性粒细胞减少症(ANC <500/mm3)、发热和中性粒细胞减少症(定义为温度>100.2°F和ANC <500/mm3)、IV级血小板减少症(血小板<25,000/mm3)以及等级≥III 的非血液学毒性，不包括恶心和III级呕吐。
如果他们对对症疗法有反应，在VB-111施用后24小时内发生的 3－4级发热不应被视为DLT。
对于每周的计划，如果80mg/m2的紫杉醇是临床可接受的剂量， 则没有计划升高超过该剂量。
剂量调整–紫杉醇
在本研究剂量升高阶段的第一周期不会进行剂量调整。
在与研究PI讨论之后，可以允许具有神经病变症状的患者有“一 周休息”。预计允许4周中有3周的施用计划，或者如果是交替周期， 8周中有7周的施用计划。如果在这些计划之一中不能保持施用密度， 该患者应被移出研究。如果对紫杉醇的计划进行了剂量调整，则无需 因此对VB-111施用进行调整来遵循紫杉醇的周期。
由于毒性恢复或社会义务而中断施用最长达3周的参与者可允许 保持在研究中。
注意：28天以后，一旦患者剂量降低，则不允许剂量升高，在接 下来的所有周期中该患者应该继续该剂量。
应该根据按照Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE-4)分级显示最大毒性的体系进行剂量调整。
除非特别说明，否则针对血液学毒性的通常剂量调整将基于再处 理时间72小时内获得的血液计数。将基于ANC(表12)、血小板计 数(表13)和神经病(表14)确定紫杉醇的施用剂量。
表12:每周一次给药前的中性粒细胞减少症
表13:每周一次给药前的血小板减少症
表14:感觉神经病剂量降低图表
一旦紫杉醇剂量被降低，其不应该被重新升高。
延长的骨髓抑制的管理
到28天时，如果血小板或中性粒细胞不能恢复，可以允许另外7 天进行血液学恢复。在第35天未完全恢复(ANC<1,000/mm3或血小 板<100,000/mm3)的患者将被移出研究计划。
发热和中性粒细胞减少症的管理
对于发热和中性粒细胞减少症的患者将以通常方式进行管理。患 者需要在重新进行疗法前从发热和活跃的感染问题中恢复。没有用生 长因子的患者将在他们的下一周期中加入Neupogen或Neulasta。使 用Neupogen 5ug/kg/天的患者将在同一计划内将剂量升高至 10ug/kg。
另外的毒性和剂量调整
在本试验中不预见其它毒性，但也有可能出现。发生药物相关的 III或IV级非血液学或非粘膜毒性的患者如果在下一周期的7天内没 有消除或改善到I级，其将被移出研究计划。发生严重III或IV级非 血液学/非粘膜毒性的患者如果在下一周期开始的一周内消除或改善 到I级，患者对治疗有反应并且主要研究人员已经复阅了患者的毒性， 其可继续留在试验中。
对于异常肝功能检验的剂量降低如下：
未发现紫杉醇引起肝毒性；但是，在严重肝功能障碍的患者中其 消除延迟。因此，应该根据表15对肝功能障碍的患者的紫杉醇剂量进 行调整。
表15:基于血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移 酶(ALT)水平的紫杉醇施用剂量
具有>1.5mg/dl的升高胆红素的患者不应接受紫杉醇，直至该异 常实验室数值改善到<1级。在恢复后重新开始治疗对应根据上表将 紫杉醇降低一个剂量水平，如果毒性持续超过2周，患者将被移出研 究。一旦患者的剂量降低，不允许剂量升高，在接下来的所有周期中 患者应该继续该剂量。
具有延长的aPTT的患者不应接受VB-111直到aPTT恢复正常。 在狼疮抗凝物(LAC)和/或抗磷脂抗体(APLA)检验阳性的患者 中，在重复施用VB-111之前需要检验阴性。如果检验保持阳性，不 应进一步施用VB-111。对于一直阳性的LAC或抗磷脂抗体(APLA) 检验，必须在初始阳性检验开始的12周内重复所述的检验。
如果患者形成被认为是继发于其卵巢癌的严重毒性(例如肠梗 阻)，也将被移出研究计划。在可逆的3－4级毒性继发于癌症并且患 者感觉从化疗中获益这种不寻常的情况下，治疗医师应该与研究PI 一起复阅在毒性消除时患者继续进行研究计划的可能性。
只有当所有的非血液学毒性消除至I级或更好才可以进行下一个 治疗周期。
允许最多两次施用延迟，每次一周。如果存在持续的毒性，患者 将被移出研究。
参与者的安全性
将采取很多措施来确保参与试验的患者的安全性。这些措施将通 过排除标准进行，常规监测如下。
列入研究的患者，在该研究前和在其参与研究的过程中以一定的 间隔进行临床评估和标准实验室检验。安全性评估组成如下：医学审 查、记录不良事件、体检、血压和实验室测量值(由当地实验室完成)。 在参加研究的整个过程中，在每次研究访问时，都将评估患者的不良 事件(所有等级)、严重不良事件和需要研究药物中断或停顿的不良 事件。将对因为任何原因停止研究治疗阶段的患者在停止治疗决定后 评估～30天(28–42天)。
如果治疗中的患者需要择期手术，建议在手术操作前停止治疗2 －4周。
重新治疗标准
在周期开始时的剂量调整应该基于当时的非血液学毒性或血液计 数。患者不应开始新的治疗周期，除非中性粒细胞绝对计数>1,000 个细胞/mm3、血小板计数>100,000个细胞/mm3、以及非血液学毒性 改善到1级(轻微)或消除。
患者在开始重新治疗前可延迟多至3周。如果需要多于3周进行 毒性恢复，他们应该被移出研究。
如果毒性：利益权衡是有益于参与者和临床医生，那么在2级疲 劳、腹泻、脱发和恶心的情况下可以继续治疗。
紫杉醇配制、提供、保存和稳定性
紫杉醇(NSC#673089)
在28天一个周期的第1、8、15和22天IV输注紫杉醇40-80 mg/m2，用时超过1小时。将按最大体表面积(BSA)2.0m2确定药物 给药剂量，并根据当天的体重计算BSA。
配制
紫杉醇以6mg/mL非水溶液提供在多种剂量样品瓶中：其中包含 30mg/5mL、100mg/16.7mL或300mg/50mL紫杉醇。除了6mg的紫 杉醇外，每mL的无菌无热源性溶液中含有527mg纯化的 EL(聚氧乙烯蓖麻油)和49.7％(v/v)无水醇，USP。
保存
当于20至25℃(68至77°F)下保存时，未打开的紫杉醇药瓶可以 稳定至包装上指示的日期。避光。
制剂
紫杉醇在输注前稀释。可以将紫杉醇稀释于注射用0.9％的氯化 钠，USP；5％葡萄糖注射液，USP；5％葡萄糖和0.9％氯化钠注 射液，USP；或者5％葡萄糖Ringer’s注射液，至终浓度0.3至 1.2mg/mL。该溶液在室温(大约25℃/77°F)和室内光线条件下保持物 理和化学稳定长达27小时。为了尽量减少患者暴露于增塑剂DEHP(其 可能从PVC输液袋或组件中浸出)，稀释的紫杉醇应该保存于瓶子(玻 璃、聚丙烯)中或塑料(聚丙烯、聚烯烃)中，并通过聚乙烯内衬的 施用组件施用。
施用
将通过具有不大于0.22微米的微孔膜的管路过滤器(inline filter) 施用紫杉醇。过滤器比如或(结合短进口和出口 PVC涂层的管道)的使用不会引起DEHP的明显浸出。
术前治疗
所有患者将在第一次紫杉醇施用之前使用糖皮质激素、苯海拉明 和H2拮抗剂进行术前治疗(premedication)以防止严重的过敏性反 应。对药物发生严重过敏反应的患者可能需要重复术前治疗和用稀溶 液重复刺激以及慢速输注。对于紫杉醇严重过敏性反应无需进行重复 刺激。当对药物很好耐受后或建立了对樟脑的耐受，口服地塞米松可 逐步取消。多西紫杉醇不能被替代。
不良反应：有关最新和完整的信息，查阅包装内说明书。
供应者：可从Bristol-Myers Squibb Oncology以及常规生产商商 售获得。查阅American Hospital Formulary Service Drug Information guide、Facts andComparisons或包装内说明书获得更多信息。
VB-111
说明
研究药物将以每受试者剂量提供在标注的1.8ml冷冻管(聚丙烯) 中。每一冷冻管含有1.1ml(1012vp/ml)的体积。
配制
VB-112被配制为无菌载体溶液。溶液以冷冻形式(低于65℃) 提供在一次性使用的塑料旋口瓶中。每瓶含有病毒滴度为1012vp/ml 的1.1mL载体和媒介物(10％甘油的磷酸缓冲液)。融化载体溶液， 并在稀释和操作过程中，将载体溶液保持在2-8℃。
稳定性和保存
VB-111的稳定性研究仍在进行中，到目前为止认为在65℃以下 保质期为30个月。打开和/或稀释的药瓶不应被重复使用。VB-111 药瓶应在封闭、冷冻(低于65℃)、避光下保存。
制剂
将如表16所示准备VB-111。
表16.VB-111制剂
*配药时可以使用无菌空袋并分别向袋中加入40ml NS+10ml VB-111，或者配药时可以使用50ml的NS袋，去除多出的体积然后 加入VB-111。任一方式都是配药实践中可接受的。
整个药物配制过程应在BSC II型室中室温下进行。融化后，在准 备过程中，药物可在冰水中保持长达3小时。
药物稀释于室温盐水中。
在尽可能短的时间内完成药物的准备和药物注射，不要超过1小 时。
准备药物的药剂师应该验证容器上的信息适宜该研究和受试者： 产品名称、浓度、批号。
在无菌塑料管中放置需要体积的盐水(至室温)。在戴着手套的 手之间摩擦融化VB-111溶液药瓶。立即从每个意欲用于特定受试者 的冷冻药瓶中取出1ml VB-111。每个1ml VB-111都使用新的注射器。 将VB-111加入含有事先准备的盐水溶液的塑料管中。用手涡旋内容 物来混合稀释的药品。根据患者的重量确定将要使用的体积，抽出注 射所需的体积到用于施用的注射器中(参见表16)。准备完成之后 进行核对过程：检查使用的原料药瓶的正确编号，以及管中剩余的体 积大约如预期一致，并完成药物计量日志。药物溶液准备后，根据药 学程序清洁药房中的药物配制区。
输注
1.应该根据下列指示通过注射器泵进行稀释的VB-111单次静 脉内输注施用：
a.剂量水平1-2:应该以1ml/分钟的速率施用3x1012VPs(15或 10.5ml，取决于受试者重量)
b.剂量水平3:1x1013VPs(50或35ml，取决于受试者重量)
i.以下列速率进行输注：
1.在第一个10分钟为1ml/分钟
2.剩余的输注体积为3ml/分钟
完成施用后30分钟可为受试者提供常规的饮食。
受试者中止
满足下列标准的受试者应该中止研究治疗：
1. 3级神经病持续>7天
2. 4级高血压或药物不能控制的3级高血压
3.肾病综合征
4.等级≥2的肺或CNS出血；任何4级出血
5.任何等级的动脉血栓栓塞事件
6. 4级充血性心脏衰竭
7.胃肠道穿孔
8.任何等级的瘘
9.任何等级的肠梗阻
10.需要药物或手术干预的伤口裂开
11.受试者不愿意或不能遵守研究要求
12.研究者确定受试者继续疗法不再安全
13.研究者认为的与研究治疗相关的所有4级事件
禁忌症
在具有已知的先前严重的(NCI CTC 3级/4级)对在 EL(聚氧乙烯蓖麻油)中配制的药物有过敏反应史的患者 中禁忌研究药物治疗。
临床检验和程序
根据表17，在整个研究过程中，以指定的间隔进行一系列的临床 检验和操作。
表17:临床检验和操作
*在VB-111施用日(每两个周期)在施用前、输注结束、施用后 6小时，以及那个周期(奇数周期)的第8天收集样品。
^施用前收集样品
#将在VB-111施用当天在施用前和施用后30分钟、60分钟、4 小时和6小时监测生命指征
a:所有体检、血液检验和尿分析必须在登记前14天内进行。肿 瘤的放射评估应该在登记前4周内进行。
b:在所有接下来的周期的第1、8、15和22天的3天内抽血。CBC 分类：CBC并分类和血小板；综合代谢包括电解质、LFT、BUN/Cr、 钙和镁。在第8、15和22天只要求LFT和CBC分类。
c:预计肿瘤应答将被评估2个周期。
d:如果出现新的或增加的蛋白尿，需要24小时尿液。+2浸尿棒 需要24小时收集，但是+3浸尿棒需要保持研究药物并24小时收集。 因为蛋白尿不是VB-111施用的特征，尿分析将在第1、8、15、22天 获得。
e:可以在每个周期的第一天的三天内抽血检查PT、PTT。在PTT 延长超过ULN的情况下，应该抽血检查狼疮抗凝物(LAC)和抗磷 脂抗体(针对β2－GP－1和抗心磷脂的IgG和IgM)。
f:可根据学院标准进行肿瘤评估，比如肿瘤应答评估：CT，MRI 等。注意：可以计划以规则的间隔进行肿瘤评估(每8周)，这通常 与每2个周期一致，但是以固定的间隔以便比较彻底的评估PFS、原 发终点。
g:在周期1的第1天施用前和周期1的第8、15、22天、周期2 的第1天、周期3的第1天施用前和每2个周期直至病情进展，收集 特异的生物标志物。
h:组织探查不是本研究的必须部分，但是可选的，有预算涵盖非 临床指示的活检或穿刺获得样品。完成其没有特定的时间。参见下面 组织收集部分。
i.研究完成数据应该在研究治疗最后施用起30天的一周内完成。 存活数据可以电话收集。
效力和安全性评估
RECIST标准
使用ECIST1.1标准在基线和之后每两个周期(即周期2、4、6 等之后)进行肿瘤应答评估。如果患者持续使用紫杉醇，将继续正式 的评估。使用TumorMetrics进行独立的成像评估。
肿瘤测量
可测量的疾病：存在至少一种可测量的病灶。如果可测量的疾病 限于单独病灶，应该通过细胞学/组织学证实其肿瘤性。
可测量病灶
至少可以在一个维度准确测量的最大直径>2.0cm的病灶。使用 螺旋CT扫描，病灶必须在至少一个维度上>1.0cm，并且对于淋巴 结，最小直径必须>1.5cm。
不可测量的病灶
所有其它病灶，包括小的病灶(使用常规技术最大直径<2.0cm或 使用螺旋CT扫描<1.0cm)，以及其它不可测量的病灶。其包括：骨 病变；软脑膜疾病；腹水；胸腔/心包积液；炎性乳腺疾病；皮肤淋巴 管炎/肺炎；未证实的、接着进行成像技术的腹部肿块，和囊性病变。
使用尺子或卡尺，以公制表示法记录所有的测量值。在尽可能接 近治疗起始时进行所有基线评估，绝不能超过开始治疗前4周。
在基线和跟踪过程中应该使用相同的评估方法和相同的技术来鉴 定每个确定的和报告的病变。
只有当临床病变位于浅表时(例如皮肤结节、可触知的淋巴结) 才能被认为是可测量的。对于皮肤病变的情况，建议使用包括使用尺 子估计病变大小的彩色摄影术记录。
目标和非目标病变的基线记录
代表每个所涉及的器官最多5个病变的所有可测量病变应该确定 为目标病变，并在基线记录和测量。
应该基于病变的大小(具有较大直径的病变)以及可准确反复测 量的适宜性(通过成像技术或临床上)选择目标病变。
将计算所有目标病变的最大直径(LD)的总和并报告为基线总计 LD。该基线总计LD将被用作参考，进一步鉴定疾病的可测量维度的 目的肿瘤应答。
所有其它病变(或疾病位点)应该被确定为非目标病变，也应该 在基线记录。无需测量值，这些病变应该跟踪为“有”或“无”。
应答标准
目标病变的评估：
完全应答(CR)-所有目标病变消失。
部分应答(PR)-以基线总计LD作为参考，目标病变的总计LD至 少减少30％。
进展(PD)-以从开始治疗或一个或多个新病变出现开始记录的 最小总计LD作为参考，目标病变的总计LD至少增加20％。
稳定病情(SD)-以开始治疗以来最小的总计LD作为参考，既没 有充分的缩减而符合PR，也没有足够的增加而符合PD。
非目标病变的评估：
完全应答(CR)-所有非目标病变消失，并且肿瘤标志物水平正 常。
不完全应答(非-CR)/非进展(非-PD)-一直存在一个或多个非目 标病变或/和维持肿瘤标志物水平在正常限定值之上。
病情发展(PD)-出现一个或多个新的病变。存在的非目标病变 的明确发展。尽管仅有明确的非目标病变的发展属例外，但是在这种 情况下，治疗医生的意见起决定作用，之后复阅小组(或研究的首席/ 主要研究者)应该对该进展状态进行确认。
评估最佳总体应答
最佳总体应答是指从开始治疗直至病情进展/复发以来记录的最 好的应答(对于进展性疾病，以自治疗开始记录的最小的测量值作为 参考)。通常，患者的最好应答评估将取决于测量和证实标准的完成， 如表18所示。
表18:基于目标、非目标和新病变的患者总体应答
目标病变 非目标病变 新病变 总体应答
CR CR 无 CR
CR 非CR/非-PD 无 PR
PR 非-PD 无 PR
SD 非-PD 无 SD
PD 任何 有或无 PD
任何 PD 有或无 PD
任何 任何 有 PD
健康状况全面恶化需要中止治疗、而当时没有病情进展的客观证 据的患者将报告为”临床恶化”。甚至在中止治疗后也要尽一切努力记 录其客观进展。
在一些情况下，区分残留病症和正常组织可能会比较困难。当完 全应答的评估依赖于这种判断时，建议在确认完全应答状态前进行残 留病变检查(微针吸取/活检)。
确认：若指定为部分应答(PR)或完全应答(CR)的状态，肿瘤 测量值的变化必须在首次符合应答标准后经过进行不少于4周的反复 研究来确认。在SD的情形下，在以6－8周的最小间隔进入研究后， 跟踪测量值必须满足SD标准至少一次。
Rustin标准:如果只有CA125是可评估的(升高超过35U/ml)， 应根据GCIG而不是Rustin标准定义应答。
GCIG CA125应答定义：与治疗前样品相比，如果CA125水平 在有至少50％的降低，则产生了CA125应答。该应答必须被确认并 持续至少28天。只有当患者的治疗前样品至少是正常上限的两倍，并 且在开始治疗的2周内，他们才可以根据CA125进行评估。
如果CA125有确认的升高(两次记录)或者之前的正常CA125 升高至≥2x ULN(两次记录)，则发生了基于CA125的进展。
预期的不良事件
在临床前小鼠毒理学研究中，VB-111引起最小的毒性。观察到轻 微贫血、轻度的血小板减少症、轻度的白细胞增多、脾肿大和骨髓增 生。也观察到与临床病理学无关的短暂的肝酶升高。全身性施用腺病 毒载体耐受较好。流感样症状(发热、疲劳、发冷、恶心和/或呕吐) 是最常见的不良事件。在参与I/II期试验的几个患者中观察到无症状 的aPTT延长和阳性LAC。另外，在II期患者中报告了唯一一例严重 腹泻。大部分静脉内注射的腺病毒颗粒集中于肝脏，其因此引起了以 急性转氨酶和血管损伤为特征的炎症反应。抗血管生成剂的主要不良 反应为伤口愈合障碍、出血、血栓栓塞和心血管疾病、高血压和蛋白 尿。
相关研究
分布
根据附录I收集所有患者的血液样品进行分布评估。在最大耐受 剂量组或最高剂量组检查这些样品的腺病毒和进行VB-111转基因水 平定量。在预先确定的施用后时间点分别通过血液的Q-PCR和 Q-RT-PCR测定血液中病毒DNA水平和转基因水平，从而进行分布评估。将在所有预定的时间点收集所有患者的样品。对来自开始于最 高剂量的患者的样品进行检查，并继续较低剂量的检查。对施用后未 发现可检测水平的病毒DNA的样品将不进行转基因水平的检查，并 且不进行之后时间点的评估。
抗体
将收集血清样品用于分析针对腺病毒的抗体水平(总IgG和中和 抗体)。
血管生成的生物标志物
目前没有针对抗血管生成疗法的生物标志物，但是已经确定了几 种候选的生物标志物[Jain 2009]。将在列入本研究的所有患者外周血 液样品中对此进行检查。进行血浆分析以评估循环血管生成性和炎症 性标志物：VEGF、PlGF、sVEGFR1、bFGF、IL-1β、IL-6、IL-8、 和TNF-α(使用Meso-Scale Discovery的多重ELISA平板)以及sVEGFR2和SDF1α(使用R&D Systems试剂盒)，其中使用已经确 定的方法，样品一式两份进行检查[HorowitzClinical Ovarian Cancer 2011付印中]。将使用标准流式细胞术计数新鲜样品中的血液循环细胞。定量分析终点是治疗后血液单个核细胞中循环性 CD34bright CD45dim CPC或VEGFR2+CD45+单核细胞级分发生变 化，如之前所述的[Horowitz Clinical OvarianCancer 2011打印中]。 将对归档组织评价CD31、CD34、VEGFR2和vWF。
组织收集
组织探查不是本研究的必须部分，但是可选的，若有预算支持非 临床指示的活检或穿刺获得样品。完成其没有特定的时间。VB-111 首次施用后的一到两个月被认为是理想的时间。预计20－50％的参与 者可能会有合适的区域用于安全活检或适合腹水穿刺。
统计方法的说明
将使用标准的“3+3”设计确定VB-111的MTD。也就是，起始将 3名患者以特定的剂量水平进行治疗。如果多于一名患者发生DLT， 则停止升高，下一个较低的剂量水平被接受为MTD。如果没有DLT 发生，则开始升高至下一个较高剂量水平。如果发生一例DLT,另外 3名患者将被加入到那个剂量水平。如果这3名患者没人发生DLT，将 升高VB-111至下一个较高的水平，但是如果一名或多名患者发生此 类事件，则将停止升高，并将MTD定义为该下一个较低的剂量水平。 利用这一升高方案，表19给出了对于多种假想的潜在毒性率升高至下一个更高剂量水平的可能性。
表19:基于DLT VB-111剂量升高的可能性
从表19可以看出，如果发生DLT的潜在风险<20％，则存在>71％ 的机率升高该组合，如果潜在风险<10％，则有>91％的机率升高。 相反，如果发生DLT风险>50％，则最高有17％的机率升高，而如 果风险>60％，则有<8％的机率。
客观应答的评估将主要是描述性的。通常来讲，将计算总体应答 率和相应的95％置信区间。
II期方面的设计将评估由RECIST标准或CA125(GCIG，不是 Rustin标准)确定的应答率，以及描述安全性特征并表征不良事件及 毒性。根据报告的复发卵巢癌患者对化疗剂－抗血管生成剂组合的应 答，选择30％作为目标应答，通常在20－25％范围内。
设计为两步骤(two－stage)优化设计，其中最初的10名患者在 步骤1被列入。这将包括在I期开始紫杉醇剂量为80mg/m2的参与 者(即剂量水平2和3的参与者)。从本研究I期部分的剂量水平2 和3组列入2到6名患者，在中期效力分析之前另外8到4名参与者 将被列入到II期第一个步骤。如果观察到一个应答或没有应答，那么 该试验将停止招募。否则，如果有两名或多名应答，那么另外19名参 与者将被列入(即可能最多共29名)到II期中(那么对于整个研究 总共将有I期的2－18名与II期的0－29名重叠)。如果有5名或 更少的应答，那么该疗法没有进一步研究的必要。
如果真实RR≤10％，在步骤1结束该试验的机率至少是74％。 如果真实RR≥30％，那么该试验在步骤1停止的机率≤15％。最终分 析的能力是：80％拒绝H0:RR≤10％利于H1:RR≥30％，目标类 型－1，错误率5％。
如在步骤I发现超过2名发生IV级的GI穿孔将中止该试验。在 任何时间如果有3名GI穿孔，那么该试验将被中止。假设真实的GI 穿孔率是4％，那么在步骤I观察到超过2次事件的可能性是6.2％， 从整个试验观察到3次以上事件的可能性是2.7％。
定量的和半定量的数据比如IHC数据将被视为初步试验数据，使 用描述性统计学和非参数分析，试图探讨相关性，承认这些样品的数 量不足以得出明确的结论，但是在多项研究中使用同一组分析的优势， 使我们能够评价对效力和毒性潜在地最有用的预测指标。
生物标志物
将主要使用非参数方法(例如Wilcoxon符号秩或秩和检验)评价 VB-111对CEC的影响、相关性/预见性措施，所有统计学显著性检验 都是双侧的，并且对多重比较不做调整。
显著性水平
计算(双侧)95％的置信水平下的置信区间。
实验室检查
血管生成生物标志物分析(当地)
进行血浆分析以评估循环血管生成性和炎症性生物标志物 VEGF、PlGF、sVEGFR1、bFGF、IL-1β、IL-6、IL-8、和TNF-α(使 用Meso-Scale Discovery的多重ELISA平板)以及sVEGFR2和 SDF1α(使用R&D Systems试剂盒)。使用标准流式细胞术计数新鲜 样品中的血液循环细胞。将对存档组织评价CD31、CD34、VEGFR2 和vWF。肿瘤标志物：CA-125。在室温EDTA管中的每个时间点10cc 总血浆将被分析。
将在下列时间点收集样品：
1.在基线
2.周期1：研究药物施用前第1天，第8、15和22天
3.周期2：研究药物施用前第1天
4.周期3开始后的每2个周期，研究药物施用前，直至病情发 展。
抗体检查
针对Ad-5病毒的抗体(包括IgG和中和抗体)的效价将被收集 用于分析。在下列时间点收集样品：
1.在每一周期：第1、8、15和22天在研究药物施用前；
2.在研究完成回访时。
以下列方式收集并准备血液：
1.将6ml血液收集到没有抗凝剂的管中
2.将样品在室温放置1小时，然后在2-8℃保存过夜以进行血 块凝缩。
3.在第二天离心血液。
4.将提取大约2ml的血清，分装成4管(每管0.5ml，在1.5ml 的Nalgene 100中，总计2ml)，保存于-20℃直至运输去分析。
生物学分布检查
进行下列检查：
1.血液生物学分布：病毒DNA和转基因表达
2.尿液生物学分布：病毒DNA
在下列时间点收集全血样品用于生物学分布检查：
1.在每个奇数周期的第1天和第8天在研究药物施用前。
2.在VB-111施用日：
a.输注前(与第1天样品相同)
b.输注结束时
c.3±0.5小时
d.6±0.5小时
e.在研究完成回访时
以下列方式准备血液样品：
1.收集每一时间点的血液到4个含有EDTA的管中(0.75ml/管)
a.两管用于病毒DNA分析
b.两管用于转基因表达分析
2.管子应该标记受试者号码、名字首字母、日期和样品收集时间， 并保存于-70℃或低于-70℃的冰箱中。
按下列方式收集尿液：
1.从保存的总收集体积中收集两份1－2ml的尿液样品。
2.尿液样品和总收集体积将冷冻保存直至进一步分析。
结果
对6名患者施用VB-111，每名患者在研究开始前都具有持续至少 一年的输卵管或卵巢上皮癌，剂量为每名受试者3x1012VPs与紫杉醇 (40mg或80mg)的组合，如图3所示。患者没有表现任何与VB-111 相关的严重不良事件。没有观察到剂量限制性毒性。
序列表
<110> Breibart, Eyal
Leubitz, Andrea
Feige, Erez
Penson, Richard
<120> 使用腺病毒的治疗方法
<130> 3182.043PC02
<140> PCT/IB13/03015
<141> 2013-10-17
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<223> TNFRSF1A
<400> 1
atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccgctgg tgctcctgga gctgttggtg 60
ggaatatacc cctcaggggt tattggactg gtccctcacc taggggacag ggagaagaga 120
gatagtgtgt gtccccaagg aaaatatatc caccctcaaa ataattcgat ttgctgtacc 180
aagtgccaca aaggaaccta cttgtacaat gactgtccag gcccggggca ggatacggac 240
tgcagggagt gtgagagcgg ctccttcacc gcttcagaaa accacctcag acactgcctc 300
agctgctcca aatgccgaaa ggaaatgggt caggtggaga tctcttcttg cacagtggac 360
cgggacaccg tgtgtggctg caggaagaac cagtaccggc attattggag tgaaaacctt 420
ttccagtgct tcaattgcag cctctgcctc aatgggaccg tgcacctctc ctgccaggag 480
aaacagaaca ccgtgtgcac ctgccatgca ggtttctttc taagagaaaa cgagtgtgtc 540
tcctgtagta actgtaagaa aagcctggag tgcacgaagt tgtgcctacc ccagattgag 600
aatgttaagg gcactgagga ctcaggcacc acagtgctgt tgcccctggt cattttcttt 660
ggtctttgcc ttttatccct cctcttcatt ggtttaatgt atcgctacca acggtggaag 720
tccaagctct actccattgt ttgtgggaaa tcgacacctg aaaaagaggg ggagcttgaa 780
ggaactacta ctaagcccct ggccccaaac ccaagcttca gtcccactcc aggcttcacc 840
cccaccctgg gcttcagtcc cgtgcccagt tccaccttca cctccagctc cacctatacc 900
cccggtgact gtcccaactt tgcggctccc cgcagagagg tggcaccacc ctatcagggg 960
gctgacccca tccttgcgac agccctcgcc tccgacccca tccccaaccc ccttcagaag 1020
tgggaggaca gcgcccacaa gccacagagc ctagacactg atgaccccgc gacgctgtac 1080
gccgtggtgg agaacgtgcc cccgttgcgc tggaaggaat tcgtgcggcg cctagggctg 1140
agcgaccacg agatcgatcg gctggagctg cagaacgggc gctgcctgcg cgaggcgcaa 1200
tacagcatgc tggcgacctg gaggcggcgc acgccgcggc gcgaggccac gctggagctg 1260
ctgggacgcg tgctccgcga catggacctg ctgggctgcc tggaggacat cgaggaggcg 1320
ctttgcggcc ccgccgccct cccgcccgcg cccagtcttc tcaga 1365
<210> 2
<211> 455
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> 野生型TNF 受体 1
<400> 2
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
195 200 205
Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val Ile Phe Phe Gly Leu Cys Leu
210 215 220
Leu Ser Leu Leu Phe Ile Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gln Arg Trp Lys
225 230 235 240
Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu
245 250 255
Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser
260 265 270
Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val
275 280 285
Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys
290 295 300
Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly
305 310 315 320
Ala Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro Ile Pro Asn
325 330 335
Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp
340 345 350
Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro
355 360 365
Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu
370 375 380
Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln
385 390 395 400
Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala
405 410 415
Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly
420 425 430
Cys Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro
435 440 445
Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg
450 455
<210> 3
<211> 591
<212> DNA
<213> 人
<220>
<223> TNFR1的配体结合结构域
<400> 3
atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccgctgg tgctcctgga gctgttggtg 60
ggaatatacc cctcaggggt tattggactg gtccctcacc taggggacag ggagaagaga 120
gatagtgtgt gtccccaagg aaaatatatc caccctcaaa ataattcgat ttgctgtacc 180
aagtgccaca aaggaaccta cttgtacaat gactgtccag gcccggggca ggatacggac 240
tgcagggagt gtgagagcgg ctccttcacc gcttcagaaa accacctcag acactgcctc 300
agctgctcca aatgccgaaa ggaaatgggt caggtggaga tctcttcttg cacagtggac 360
cgggacaccg tgtgtggctg caggaagaac cagtaccggc attattggag tgaaaacctt 420
ttccagtgct tcaattgcag cctctgcctc aatgggaccg tgcacctctc ctgccaggag 480
aaacagaaca ccgtgtgcac ctgccatgca ggtttctttc taagagaaaa cgagtgtgtc 540
tcctgtagta actgtaagaa aagcctggag tgcacgaagt tgtgcctacc a 591
<210> 4
<211> 197
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> TNFR1的配体结合结构域
<400> 4
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro
195
<210> 5
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人
<220>
<223> 全长FAS
<400> 5
atgctgggca tctggaccct cctacctctg gttcttacgt ctgttgctag attatcgtcc 60
aaaagtgtta atgcccaagt gactgacatc aactccaagg gattggaatt gaggaagact 120
gttactacag ttgagactca gaacttggaa ggcctgcatc atgatggcca attctgccat 180
aagccctgtc ctccaggtga aaggaaagct agggactgca cagtcaatgg ggatgaacca 240
gactgcgtgc cctgccaaga agggaaggag tacacagaca aagcccattt ttcttccaaa 300
tgcagaagat gtagattgtg tgatgaagga catggcttag aagtggaaat aaactgcacc 360
cggacccaga ataccaagtg cagatgtaaa ccaaactttt tttgtaactc tactgtatgt 420
gaacactgtg acccttgcac caaatgtgaa catggaatca tcaaggaatg cacactcacc 480
agcaacacca agtgcaaaga ggaaggatcc agatctaact tggggtggct ttgtcttctt 540
cttttgccaa ttccactaat tgtttgggtg aagagaaagg aagtacagaa aacatgcaga 600
aagcacagaa aggaaaacca aggttctcat gaatctccaa ctttaaatcc tgaaacagtg 660
gcaataaatt tatctgatgt tgacttgagt aaatatatca ccactattgc tggagtcatg 720
acactaagtc aagttaaagg ctttgttcga aagaatggtg tcaatgaagc caaaatagat 780
gagatcaaga atgacaatgt ccaagacaca gcagaacaga aagttcaact gcttcgtaat 840
tggcatcaac ttcatggaaa gaaagaagcg tatgacacat tgattaaaga tctcaaaaaa 900
gccaatcttt gtactcttgc agagaaaatt cagactatca tcctcaagga cattactagt 960
gactcagaaa attcaaactt cagaaatgaa atccaaagct tggtctag 1008
<210> 6
<211> 335
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> 全长FAS
<400> 6
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
20 25 30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
35 40 45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
50 55 60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65 70 75 80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
85 90 95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
100 105 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
115 120 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
130 135 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145 150 155 160
Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp
165 170 175
Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp Val Lys Arg
180 185 190
Lys Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys Glu Asn Gln Gly
195 200 205
Ser His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr Val Ala Ile Asn Leu
210 215 220
Ser Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr Ile Thr Thr Ile Ala Gly Val Met
225 230 235 240
Thr Leu Ser Gln Val Lys Gly Phe Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu
245 250 255
Ala Lys Ile Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu
260 265 270
Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys
275 280 285
Glu Ala Tyr Asp Thr Leu Ile Lys Asp Leu Lys Lys Ala Asn Leu Cys
290 295 300
Thr Leu Ala Glu Lys Ile Gln Thr Ile Ile Leu Lys Asp Ile Thr Ser
305 310 315 320
Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val
325 330 335
<210> 7
<211> 505
<212> DNA
<213> 人
<220>
<223> FAS的效应子结构域
<400> 7
aggatccaga tctaacttgg ggtggctttg tcttcttctt ttgccaattc cactaattgt 60
ttgggtgaag agaaaggaag tacagaaaac atgcagaaag cacagaaagg aaaaccaagg 120
ttctcatgaa tctccaacct taaatcctga aacagtggca ataaatttat ctgatgttga 180
cttgagtaaa tatatcacca ctattgctgg agtcatgaca ctaagtcaag ttaaaggctt 240
tgttcgaaag aatggtgtca atgaagccaa aatagatgag atcaagaatg acaatgtcca 300
agacacagca gaacagaaag ttcaactgct tcgtaattgg catcaacttc atggaaagaa 360
agaagcgtat gacacattga ttaaagatct caaaaaagcc aatctttgta ctcttgcaga 420
gaaaattcag actatcatcc tcaaggacat tactagtgac tcagaaaatt caaacttcag 480
aaatgaaatc caaagcttgg tctag 505
<210> 8
<211> 167
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> FAS的效应子结构域
<400> 8
Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile
1 5 10 15
Pro Leu Ile Val Trp Val Lys Arg Lys Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg
20 25 30
Lys His Arg Lys Glu Asn Gln Gly Ser His Glu Ser Pro Thr Leu Asn
35 40 45
Pro Glu Thr Val Ala Ile Asn Leu Ser Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr
50 55 60
Ile Thr Thr Ile Ala Gly Val Met Thr Leu Ser Gln Val Lys Gly Phe
65 70 75 80
Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu Ala Lys Ile Asp Glu Ile Lys Asn
85 90 95
Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn
100 105 110
Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys Glu Ala Tyr Asp Thr Leu Ile Lys
115 120 125
Asp Leu Lys Lys Ala Asn Leu Cys Thr Leu Ala Glu Lys Ile Gln Thr
130 135 140
Ile Ile Leu Lys Asp Ile Thr Ser Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg
145 150 155 160
Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val
165
<210> 9
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人
<220>
<223> FAS-嵌合体
<400> 9
atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccgctgg tgctcctgga gctgttggtg 60
ggaatatacc cctcaggggt tattggactg gtccctcacc taggggacag ggagaagaga 120
gatagtgtgt gtccccaagg aaaatatatc caccctcaaa ataattcgat ttgctgtacc 180
aagtgccaca aaggaaccta cttgtacaat gactgtccag gcccggggca ggatacggac 240
tgcagggagt gtgagagcgg ctccttcacc gcttcagaaa accacctcag acactgcctc 300
agctgctcca aatgccgaaa ggaaatgggt caggtggaga tctcttcttg cacagtggac 360
cgggacaccg tgtgtggctg caggaagaac cagtaccggc attattggag tgaaaacctt 420
ttccagtgct tcaattgcag cctctgcctc aatgggaccg tgcacctctc ctgccaggag 480
aaacagaaca ccgtgtgcac ctgccatgca ggtttctttc taagagaaaa cgagtgtgtc 540
tcctgtagta actgtaagaa aagcctggag tgcacgaagt tgtgcctacc aagcttagga 600
tccagatcta acttggggtg gctttgtctt cttcttttgc caattccact aattgtttgg 660
gtgaagagaa aggaagtaca gaaaacatgc agaaagcaca gaaaggaaaa ccaaggttct 720
catgaatctc caaccttaaa tcctgaaaca gtggcaataa atttatctga tgttgacttg 780
agtaaatata tcaccactat tgctggagtc atgacactaa gtcaagttaa aggctttgtt 840
cgaaagaatg gtgtcaatga agccaaaata gatgagatca agaatgacaa tgtccaagac 900
acagcagaac agaaagttca actgcttcgt aattggcatc aacttcatgg aaagaaagaa 960
gcgtatgaca cattgattaa agatctcaaa aaagccaatc tttgtactct tgcagagaaa 1020
attcagacta tcatcctcaa ggacattact agtgactcag aaaattcaaa cttcagaaat 1080
gaaatccaaa gcttggtcta g 1101
<210> 10
<211> 366
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> FAS-嵌合体
<400> 10
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro Ser Leu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp Leu
195 200 205
Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp Val Lys Arg Lys
210 215 220
Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys Glu Asn Gln Gly Ser
225 230 235 240
His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr Val Ala Ile Asn Leu Ser
245 250 255
Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr Ile Thr Thr Ile Ala Gly Val Met Thr
260 265 270
Leu Ser Gln Val Lys Gly Phe Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu Ala
275 280 285
Lys Ile Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu Gln
290 295 300
Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys Glu
305 310 315 320
Ala Tyr Asp Thr Leu Ile Lys Asp Leu Lys Lys Ala Asn Leu Cys Thr
325 330 335
Leu Ala Glu Lys Ile Gln Thr Ile Ile Leu Lys Asp Ile Thr Ser Asp
340 345 350
Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val
355 360 365
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性增强子元件
<400> 11
ctggagggtg actttgcttc tggagccagt acttcatact tttcatt 47
<210> 12
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性增强子
<400> 12
aatgaaaagt atgaagtact ggctccagaa gcaaagtcac cctccag 47
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性增强子
<400> 13
gtacttcata cttttcattc caatggggtg actttgcttc tgga 44
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性增强子元件
<400> 14
tccagaagca aagtcacccc attggaatga aaagtatgaa gtac 44
<210> 15
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性3X 增强子元件
<400> 15
ctccagaagc aaagtcaccc cattggaatg aaaagtatga agtacaatga aaagtatgaa 60
gtactggctc cagaagcaaa gtcaccctcc agaagcaaag tcaccccatt ggaatgaaaa 120
gtatgaagta c 131
<210> 16
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性3X 增强子元件
<400> 16
gtacttcata cttttcattc caatggggtg actttgcttc tggagggtga ctttgcttct 60
ggagccagta cttcatactt ttcattgtac ttcatacttt tcattccaat ggggtgactt 120
tgcttctgga g 131
<210> 17
<211> 850
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性PPE-1 启动子
<400> 17
gtacgtgtac ttctgatcgg cgatactagg gagataagga tgtgcctgac aaaaccacat 60
tgttgttgtt atcattatta tttagttttc cttccttgct aactcctgac ggaatctttc 120
tcacctcaaa tgcgaagtac tttagtttag aaaagacttg gtggaagggg tggtggtgga 180
aaagtagggt gatcttccaa actaatctgg ttccccgccc gccccagtag ctgggattca 240
agagcgaaga gtggggatcg tccccttgtt tgatcagaaa gacataaaag gaaaatcaag 300
tgaacaatga tcagccccac ctccacccca cccccctgcg cgcgcacaat acaatctatt 360
taattgtact tcatactttt cattccaatg gggtgacttt gcttctggag aaactcttga 420
ttcttgaact ctggggctgg cagctagcaa aaggggaagc gggctgctgc tctctgcagg 480
ttctgcagcg gtctctgtct agtgggtgtt ttctttttct tagccctgcc cctggattgt 540
cagacggcgg gcgtctgcct ctgaagttag ccgtgatttc ctctagagcc gggtcttatc 600
tctggctgca cgttgcctgt gggtgactaa tcacacaata acattgttta gggctggaat 660
gaagtcagag ctgtttaccc ccactctata ggggttcaat ataaaaaggc ggcggagaac 720
tgtccgagtc agaagcgttc ctgcaccggc gctgagagcc tgacccggtc tgctccgctg 780
tccttgcgcg ctgcctcccg gctgcccgcg acgctttcgc cccagtggaa gggccacttg 840
ctgcggccgc 850
<210> 18
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性PPE-1 3X 启动子
<400> 18
gtacgtgtac ttctgatcgg cgatactagg gagataagga tgtgcctgac aaaaccacat 60
tgttgttgtt atcattatta tttagttttc cttccttgct aactcctgac ggaatctttc 120
tcacctcaaa tgcgaagtac tttagtttag aaaagacttg gtggaagggg tggtggtgga 180
aaagtagggt gatcttccaa actaatctgg ttccccgccc gccccagtag ctgggattca 240
agagcgaaga gtggggatcg tccccttgtt tgatcagaaa gacataaaag gaaaatcaag 300
tgaacaatga tcagccccac ctccacccca cccccctgcg cgcgcacaat acaatctatt 360
taattgtact tcatactttt cattccaatg gggtgacttt gcttctggag aaactcttga 420
ttcttgaact ctggggctgg cagctagcct ccagaagcaa agtcacccca ttggaatgaa 480
aagtatgaag tacaatgaaa agtatgaagt actggctcca gaagcaaagt caccctccag 540
aagcaaagtc accccattgg aatgaaaagt atgaagtacg ctagcaaaag gggaagcggg 600
ctgctgctct ctgcaggttc tgcagcggtc tctgtctagt gggtgttttc tttttcttag 660
ccctgcccct ggattgtcag acggcgggcg tctgcctctg aagttagccg tgatttcctc 720
tagagccggg tcttatctct ggctgcacgt tgcctgtggg tgactaatca cacaataaca 780
ttgtttaggg ctggaatgaa gtcagagctg tttaccccca ctctataggg gttcaatata 840
aaaaggcggc ggagaactgt ccgagtcaga agcgttcctg caccggcgct gagagcctga 900
cccggtctgc tccgctgtcc ttgcgcgctg cctcccggct gcccgcgacg ctttcgcccc 960
agtggaaggg ccacttgctg cggccgc 987
<210> 19
<211> 35207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VB-111完整构建体
<400> 19
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420
cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagtacgta cgtgtacttc tgatcggcga 480
tactagggag ataaggatgt gcctgacaaa accacattgt tgttgttatc attattattt 540
agttttcctt ccttgctaac tcctgacgga atctttctca cctcaaatgc gaagtacttt 600
agtttagaaa agacttggtg gaaggggtgg tggtggaaaa gtagggtgat cttccaaact 660
aatctggttc cccgcccgcc ccagtagctg ggattcaaga gcgaagagtg gggatcgtcc 720
ccttgtttga tcagaaagac ataaaaggaa aatcaagtga acaatgatca gccccacctc 780
caccccaccc ccctgcgcgc gcacaataca atctatttaa ttgtacttca tacttttcat 840
tccaatgggg tgactttgct tctggagaaa ctcttgattc ttgaactctg gggctggcag 900
ctagcctcca gaagcaaagt caccccattg gaatgaaaag tatgaagtac aatgaaaagt 960
atgaagtact ggctccagaa gcaaagtcac cctccagaag caaagtcacc ccattggaat 1020
gaaaagtatg aagtacgcta gcaaaagggg aagcgggctg ctgctctctg caggttctgc 1080
agcggtctct gtctagtggg tgttttcttt ttcttagccc tgcccctgga ttgtcagacg 1140
gcgggcgtct gcctctgaag ttagccgtga tttcctctag agccgggtct tatctctggc 1200
tgcacgttgc ctgtgggtga ctaatcacac aataacattg tttagggctg gaatgaagtc 1260
agagctgttt acccccactc tataggggtt caatataaaa aggcggcgga gaactgtccg 1320
agtcagaagc gttcctgcac cggcgctgag agcctgaccc ggtctgctcc gctgtccttg 1380
cgcgctgcct cccggctgcc cgcgacgctt tcgccccagt ggaagggcca cttgctgcgg 1440
ccgctaattc tgcagatcgg gatccggcat gggcctctcc accgtgcctg acctgctgct 1500
gccgctggtg ctcctggagc tgttggtggg aatatacccc tcaggggtta ttggactggt 1560
ccctcaccta ggggacaggg agaagagaga tagtgtgtgt ccccaaggaa aatatatcca 1620
ccctcaaaat aattcgattt gctgtaccaa gtgccacaaa ggaacctact tgtacaatga 1680
ctgtccaggc ccggggcagg atacggactg cagggagtgt gagagcggct ccttcaccgc 1740
ttcagaaaac cacctcagac actgcctcag ctgctccaaa tgccgaaagg aaatgggtca 1800
ggtggagatc tcttcttgca cagtggaccg ggacaccgtg tgtggctgca ggaagaacca 1860
gtaccggcat tattggagtg aaaacctttt ccagtgcttc aattgcagcc tctgcctcaa 1920
tgggaccgtg cacctctcct gccaggagaa acagaacacc gtgtgcacct gccatgcagg 1980
tttctttcta agagaaaacg agtgtgtctc ctgtagtaac tgtaagaaaa gcctggagtg 2040
cacgaagttg tgcctaccaa gcttaggatc cagatctaac ttggggtggc tttgtcttct 2100
tcttttgcca attccactaa ttgtttgggt gaagagaaag gaagtacaga aaacatgcag 2160
aaagcacaga aaggaaaacc aaggttctca tgaatctcca accttaaatc ctgaaacagt 2220
ggcaataaat ttatctgatg ttgacttgag taaatatatc accactattg ctggagtcat 2280
gacactaagt caagttaaag gctttgttcg aaagaatggt gtcaatgaag ccaaaataga 2340
tgagatcaag aatgacaatg tccaagacac agcagaacag aaagttcaac tgcttcgtaa 2400
ttggcatcaa cttcatggaa agaaagaagc gtatgacaca ttgattaaag atctcaaaaa 2460
agccaatctt tgtactcttg cagagaaaat tcagactatc atcctcaagg acattactag 2520
tgactcagaa aattcaaact tcagaaatga aatccaaagc ttggtctagc tcgagcatgc 2580
atctaggcgg ccgcatggca gaaattcgcg aattcgctag cgttaacgga tcctctagac 2640
gagatccgaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 2700
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 2760
atgtatctta tcatgtctag atctgtactg aaatgtgtgg gcgtggctta agggtgggaa 2820
agaatatata aggtgggggt cttatgtagt tttgtatctg ttttgcagca gccgccgccg 2880
ccatgagcac caactcgttt gatggaagca ttgtgagctc atatttgaca acgcgcatgc 2940
ccccatgggc cggggtgcgt cagaatgtga tgggctccag cattgatggt cgccccgtcc 3000
tgcccgcaaa ctctactacc ttgacctacg agaccgtgtc tggaacgccg ttggagactg 3060
cagcctccgc cgccgcttca gccgctgcag ccaccgcccg cgggattgtg actgactttg 3120
ctttcctgag cccgcttgca agcagtgcag cttcccgttc atccgcccgc gatgacaagt 3180
tgacggctct tttggcacaa ttggattctt tgacccggga acttaatgtc gtttctcagc 3240
agctgttgga tctgcgccag caggtttctg ccctgaaggc ttcctcccct cccaatgcgg 3300
tttaaaacat aaataaaaaa ccagactctg tttggatttg gatcaagcaa gtgtcttgct 3360
gtctttattt aggggttttg cgcgcgcggt aggcccggga ccagcggtct cggtcgttga 3420
gggtcctgtg tattttttcc aggacgtggt aaaggtgact ctggatgttc agatacatgg 3480
gcataagccc gtctctgggg tggaggtagc accactgcag agcttcatgc tgcggggtgg 3540
tgttgtagat gatccagtcg tagcaggagc gctgggcgtg gtgcctaaaa atgtctttca 3600
gtagcaagct gattgccagg ggcaggccct tggtgtaagt gtttacaaag cggttaagct 3660
gggatgggtg catacgtggg gatatgagat gcatcttgga ctgtattttt aggttggcta 3720
tgttcccagc catatccctc cggggattca tgttgtgcag aaccaccagc acagtgtatc 3780
cggtgcactt gggaaatttg tcatgtagct tagaaggaaa tgcgtggaag aacttggaga 3840
cgcccttgtg acctccaaga ttttccatgc attcgtccat aatgatggca atgggcccac 3900
gggcggcggc ctgggcgaag atatttctgg gatcactaac gtcatagttg tgttccagga 3960
tgagatcgtc ataggccatt tttacaaagc gcgggcggag ggtgccagac tgcggtataa 4020
tggttccatc cggcccaggg gcgtagttac cctcacagat ttgcatttcc cacgctttga 4080
gttcagatgg ggggatcatg tctacctgcg gggcgatgaa gaaaacggtt tccggggtag 4140
gggagatcag ctgggaagaa agcaggttcc tgagcagctg cgacttaccg cagccggtgg 4200
gcccgtaaat cacacctatt accggctgca actggtagtt aagagagctg cagctgccgt 4260
catccctgag caggggggcc acttcgttaa gcatgtccct gactcgcatg ttttccctga 4320
ccaaatccgc cagaaggcgc tcgccgccca gcgatagcag ttcttgcaag gaagcaaagt 4380
ttttcaacgg tttgagaccg tccgccgtag gcatgctttt gagcgtttga ccaagcagtt 4440
ccaggcggtc ccacagctcg gtcacctgct ctacggcatc tcgatccagc atatctcctc 4500
gtttcgcggg ttggggcggc tttcgctgta cggcagtagt cggtgctcgt ccagacgggc 4560
cagggtcatg tctttccacg ggcgcagggt cctcgtcagc gtagtctggg tcacggtgaa 4620
ggggtgcgct ccgggctgcg cgctggccag ggtgcgcttg aggctggtcc tgctggtgct 4680
gaagcgctgc cggtcttcgc cctgcgcgtc ggccaggtag catttgacca tggtgtcata 4740
gtccagcccc tccgcggcgt ggcccttggc gcgcagcttg cccttggagg aggcgccgca 4800
cgaggggcag tgcagacttt tgagggcgta gagcttgggc gcgagaaata ccgattccgg 4860
ggagtaggca tccgcgccgc aggccccgca gacggtctcg cattccacga gccaggtgag 4920
ctctggccgt tcggggtcaa aaaccaggtt tcccccatgc tttttgatgc gtttcttacc 4980
tctggtttcc atgagccggt gtccacgctc ggtgacgaaa aggctgtccg tgtccccgta 5040
tacagacttg agaggcctgt cctcgagcgg tgttccgcgg tcctcctcgt atagaaactc 5100
ggaccactct gagacaaagg ctcgcgtcca ggccagcacg aaggaggcta agtgggaggg 5160
gtagcggtcg ttgtccacta gggggtccac tcgctccagg gtgtgaagac acatgtcgcc 5220
ctcttcggca tcaaggaagg tgattggttt gtaggtgtag gccacgtgac cgggtgttcc 5280
tgaagggggg ctataaaagg gggtgggggc gcgttcgtcc tcactctctt ccgcatcgct 5340
gtctgcgagg gccagctgtt ggggtgagta ctccctctga aaagcgggca tgacttctgc 5400
gctaagattg tcagtttcca aaaacgagga ggatttgata ttcacctggc ccgcggtgat 5460
gcctttgagg gtggccgcat ccatctggtc agaaaagaca atctttttgt tgtcaagctt 5520
ggtggcaaac gacccgtaga gggcgttgga cagcaacttg gcgatggagc gcagggtttg 5580
gtttttgtcg cgatcggcgc gctccttggc cgcgatgttt agctgcacgt attcgcgcgc 5640
aacgcaccgc cattcgggaa agacggtggt gcgctcgtcg ggcaccaggt gcacgcgcca 5700
accgcggttg tgcagggtga caaggtcaac gctggtggct acctctccgc gtaggcgctc 5760
gttggtccag cagaggcggc cgcccttgcg cgagcagaat ggcggtaggg ggtctagctg 5820
cgtctcgtcc ggggggtctg cgtccacggt aaagaccccg ggcagcaggc gcgcgtcgaa 5880
gtagtctatc ttgcatcctt gcaagtctag cgcctgctgc catgcgcggg cggcaagcgc 5940
gcgctcgtat gggttgagtg ggggacccca tggcatgggg tgggtgagcg cggaggcgta 6000
catgccgcaa atgtcgtaaa cgtagagggg ctctctgagt attccaagat atgtagggta 6060
gcatcttcca ccgcggatgc tggcgcgcac gtaatcgtat agttcgtgcg agggagcgag 6120
gaggtcggga ccgaggttgc tacgggcggg ctgctctgct cggaagacta tctgcctgaa 6180
gatggcatgt gagttggatg atatggttgg acgctggaag acgttgaagc tggcgtctgt 6240
gagacctacc gcgtcacgca cgaaggaggc gtaggagtcg cgcagcttgt tgaccagctc 6300
ggcggtgacc tgcacgtcta gggcgcagta gtccagggtt tccttgatga tgtcatactt 6360
atcctgtccc ttttttttcc acagctcgcg gttgaggaca aactcttcgc ggtctttcca 6420
gtactcttgg atcggaaacc cgtcggcctc cgaacggtaa gagcctagca tgtagaactg 6480
gttgacggcc tggtaggcgc agcatccctt ttctacgggt agcgcgtatg cctgcgcggc 6540
cttccggagc gaggtgtggg tgagcgcaaa ggtgtccctg accatgactt tgaggtactg 6600
gtatttgaag tcagtgtcgt cgcatccgcc ctgctcccag agcaaaaagt ccgtgcgctt 6660
tttggaacgc ggatttggca gggcgaaggt gacatcgttg aagagtatct ttcccgcgcg 6720
aggcataaag ttgcgtgtga tgcggaaggg tcccggcacc tcggaacggt tgttaattac 6780
ctgggcggcg agcacgatct cgtcaaagcc gttgatgttg tggcccacaa tgtaaagttc 6840
caagaagcgc gggatgccct tgatggaagg caatttttta agttcctcgt aggtgagctc 6900
ttcaggggag ctgagcccgt gctctgaaag ggcccagtct gcaagatgag ggttggaagc 6960
gacgaatgag ctccacaggt cacgggccat tagcatttgc aggtggtcgc gaaaggtcct 7020
aaactggcga cctatggcca ttttttctgg ggtgatgcag tagaaggtaa gcgggtcttg 7080
ttcccagcgg tcccatccaa ggttcgcggc taggtctcgc gcggcagtca ctagaggctc 7140
atctccgccg aacttcatga ccagcatgaa gggcacgagc tgcttcccaa aggcccccat 7200
ccaagtatag gtctctacat cgtaggtgac aaagagacgc tcggtgcgag gatgcgagcc 7260
gatcgggaag aactggatct cccgccacca attggaggag tggctattga tgtggtgaaa 7320
gtagaagtcc ctgcgacggg ccgaacactc gtgctggctt ttgtaaaaac gtgcgcagta 7380
ctggcagcgg tgcacgggct gtacatcctg cacgaggttg acctgacgac cgcgcacaag 7440
gaagcagagt gggaatttga gcccctcgcc tggcgggttt ggctggtggt cttctacttc 7500
ggctgcttgt ccttgaccgt ctggctgctc gaggggagtt acggtggatc ggaccaccac 7560
gccgcgcgag cccaaagtcc agatgtccgc gcgcggcggt cggagcttga tgacaacatc 7620
gcgcagatgg gagctgtcca tggtctggag ctcccgcggc gtcaggtcag gcgggagctc 7680
ctgcaggttt acctcgcata gacgggtcag ggcgcgggct agatccaggt gatacctaat 7740
ttccaggggc tggttggtgg cggcgtcgat ggcttgcaag aggccgcatc cccgcggcgc 7800
gactacggta ccgcgcggcg ggcggtgggc cgcgggggtg tccttggatg atgcatctaa 7860
aagcggtgac gcgggcgagc ccccggaggt agggggggct ccggacccgc cgggagaggg 7920
ggcaggggca cgtcggcgcc gcgcgcgggc aggagctggt gctgcgcgcg taggttgctg 7980
gcgaacgcga cgacgcggcg gttgatctcc tgaatctggc gcctctgcgt gaagacgacg 8040
ggcccggtga gcttgaacct gaaagagagt tcgacagaat caatttcggt gtcgttgacg 8100
gcggcctggc gcaaaatctc ctgcacgtct cctgagttgt cttgataggc gatctcggcc 8160
atgaactgct cgatctcttc ctcctggaga tctccgcgtc cggctcgctc cacggtggcg 8220
gcgaggtcgt tggaaatgcg ggccatgagc tgcgagaagg cgttgaggcc tccctcgttc 8280
cagacgcggc tgtagaccac gcccccttcg gcatcgcggg cgcgcatgac cacctgcgcg 8340
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gattcgttga tatcccccaa ggcctcaagg cgctccatgg cctcgtagaa gtccacggcg 8520
aagttgaaaa actgggagtt gcgcgccgac acggttaact cctcctccag aagacggatg 8580
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tggtgtttag tgctccactt aaactcaggc acaaccatcc gcggcagctc ggtgaagttt 21840
tcactccaca ggctgcgcac catcaccaac gcgtttagca ggtcgggcgc cgatatcttg 21900
aagtcgcagt tggggcctcc gccctgcgcg cgcgagttgc gatacacagg gttgcagcac 21960
tggaacacta tcagcgccgg gtggtgcacg ctggccagca cgctcttgtc ggagatcaga 22020
tccgcgtcca ggtcctccgc gttgctcagg gcgaacggag tcaactttgg tagctgcctt 22080
cccaaaaagg gcgcgtgccc aggctttgag ttgcactcgc accgtagtgg catcaaaagg 22140
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accacatttc ggccccaccg gttcttcacg atcttggcct tgctagactg ctccttcagc 22380
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gcgcagcccg tgggctcgtg atgcttgtag gtcacctctg caaacgactg caggtacgcc 22560
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ccgcggtgct cctcgttcag ccaggtcttg catacggccg ccagagcttc cacttggtca 22680
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ttgattagca ccggtgggtt gctgaaaccc accatttgta gcgccacatc ttctctttct 22980
tcctcgctgt ccacgattac ctctggtgat ggcgggcgct cgggcttggg agaagggcgc 23040
ttctttttct tcttgggcgc aatggccaaa tccgccgccg aggtcgatgg ccgcgggctg 23100
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tcagtcgaga agaaggacag cctaaccgcc ccctctgagt tcgccaccac cgcctccacc 23400
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cgccaagaaa acggcacatg cgagcccaac ccgcgcctca acttctaccc cgtatttgcc 23820
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tttctatgct acacctggca gacggccatg ggcgtttggc agcagtgctt ggaggagtgc 24660
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accacagaac atgaaaagct gcttattcgc cacaaaaaca aaattggcaa gtatgctgtt 28200
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tcagccttac cagtaaaaaa gaaaacctat taaaaaaaca ccactcgaca cggcaccagc 34860
tcaatcagtc acagtgtaaa aaagggccaa gtgcagagcg agtatatata ggactaaaaa 34920
atgacgtaac ggttaaagtc cacaaaaaac acccagaaaa ccgcacgcga acctacgccc 34980
agaaacgaaa gccaaaaaac ccacaacttc ctcaaatcgt cacttccgtt ttcccacgtt 35040
acgtcacttc ccattttaag aaaactacaa ttcccaacac atacaagtta ctccgcccta 35100
aaacctacgt cacccgcccc gttcccacgc cccgcgccac gtcacaaact ccaccccctc 35160
attatcatat tggcttcaat ccaaaataag gtatattatt gatgatg 35207
<210> 20
<211> 35203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有两个错配、没有重复的构建体
<400> 20
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420
cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagtacgta cgtgtacttc tgatcggcga 480
tactagggag ataaggatgt acctgacaaa accacattgt tgttgttatc attattattt 540
agttttcctt ccttgctaac tcctgacgga atctttctca cctcaaatgc gaagtacttt 600
agtttagaaa agacttggtg gaaggggtgg tggtggaaaa gtagggtgat cttccaaact 660
aatctggttc cccgcccgcc ccagtagctg ggattcaaga gcgaagagtg gggatcgtcc 720
ccttgtttga tcagaaagac ataaaaggaa aatcaagtga acaatgatca gccccacctc 780
caccccaccc ccctgcgcgc gcacaataca atctatttaa ttgtacttca tacttttcat 840
tccaatgggg tgactttgct tctggagaaa ctcttgattc ttgaactctg gggctggcag 900
ctagcctcca gaagcaaagt caccccattg gaatgaaaag tatgaagtac aatgaaaagt 960
atgaagtact ggctccagaa gcaaagtcac cctccagaag caaagtcacc ccattggaat 1020
gaaaagtatg aagtacgcta gcaaaagggg aagcgggctg ctgctctctg caggttctgc 1080
agcggtctct gtctagtggg tgttttcttt ttcttagccc tgcccctgga ttgtcagacg 1140
gcgggcgtct gcctctgaag ttagccgtga tttcctctag agccgggtct tatctctggc 1200
tgcacgttgc ctgtgggtga ctaatcacac aataacattg tttagggctg gaataaagtc 1260
agagctgttt acccccactc tataggggtt caatataaaa aggcggcgga gaactgtccg 1320
agtcagaagc gttcctgcac cggcgctgag agcctgaccc ggtctgctcc gctgtccttg 1380
cgcgctgcct cccggctgcc cgcgacgctt tcgccccagt ggaagggcca cttgctgcgg 1440
ccgctaattc tgcagatcgg gatccggcat gggcctctcc accgtgcctg acctgctgct 1500
gccgctggtg ctcctggagc tgttggtggg aatatacccc tcaggggtta ttggactggt 1560
ccctcaccta ggggacaggg agaagagaga tagtgtgtgt ccccaaggaa aatatatcca 1620
ccctcaaaat aattcgattt gctgtaccaa gtgccacaaa ggaacctact tgtacaatga 1680
ctgtccaggc ccggggcagg atacggactg cagggagtgt gagagcggct ccttcaccgc 1740
ttcagaaaac cacctcagac actgcctcag ctgctccaaa tgccgaaagg aaatgggtca 1800
ggtggagatc tcttcttgca cagtggaccg ggacaccgtg tgtggctgca ggaagaacca 1860
gtaccggcat tattggagtg aaaacctttt ccagtgcttc aattgcagcc tctgcctcaa 1920
tgggaccgtg cacctctcct gccaggagaa acagaacacc gtgtgcacct gccatgcagg 1980
tttctttcta agagaaaacg agtgtgtctc ctgtagtaac tgtaagaaaa gcctggagtg 2040
cacgaagttg tgcctaccaa gcttaggatc cagatctaac ttggggtggc tttgtcttct 2100
tcttttgcca attccactaa ttgtttgggt gaagagaaag gaagtacaga aaacatgcag 2160
aaagcacaga aaggaaaacc aaggttctca tgaatctcca accttaaatc ctgaaacagt 2220
ggcaataaat ttatctgatg ttgacttgag taaatatatc accactattg ctggagtcat 2280
gacactaagt caagttaaag gctttgttcg aaagaatggt gtcaatgaag ccaaaataga 2340
tgagatcaag aatgacaatg tccaagacac agcagaacag aaagttcaac tgcttcgtaa 2400
ttggcatcaa cttcatggaa agaaagaagc gtatgacaca ttgattaaag atctcaaaaa 2460
agccaatctt tgtactcttg cagagaaaat tcagactatc atcctcaagg acattactag 2520
tgactcagaa aattcaaact tcagaaatga aatccaaagc ttggtctagc tcgagcatgc 2580
atctaggcgg ccgcatggca gaaattcgcg aattcgctag cgttaacgga tcctctagac 2640
gagatccgaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 2700
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 2760
atgtatctta tcatgtctag atctgtactg aaatgtgtgg gcgtggctta agggtgggaa 2820
agaatatata aggtgggggt cttatgtagt tttgtatctg ttttgcagca gccgccgccg 2880
ccatgagcac caactcgttt gatggaagca ttgtgagctc atatttgaca acgcgcatgc 2940
ccccatgggc cggggtgcgt cagaatgtga tgggctccag cattgatggt cgccccgtcc 3000
tgcccgcaaa ctctactacc ttgacctacg agaccgtgtc tggaacgccg ttggagactg 3060
cagcctccgc cgccgcttca gccgctgcag ccaccgcccg cgggattgtg actgactttg 3120
ctttcctgag cccgcttgca agcagtgcag cttcccgttc atccgcccgc gatgacaagt 3180
tgacggctct tttggcacaa ttggattctt tgacccggga acttaatgtc gtttctcagc 3240
agctgttgga tctgcgccag caggtttctg ccctgaaggc ttcctcccct cccaatgcgg 3300
tttaaaacat aaataaaaaa ccagactctg tttggatttg gatcaagcaa gtgtcttgct 3360
gtctttattt aggggttttg cgcgcgcggt aggcccggga ccagcggtct cggtcgttga 3420
gggtcctgtg tattttttcc aggacgtggt aaaggtgact ctggatgttc agatacatgg 3480
gcataagccc gtctctgggg tggaggtagc accactgcag agcttcatgc tgcggggtgg 3540
tgttgtagat gatccagtcg tagcaggagc gctgggcgtg gtgcctaaaa atgtctttca 3600
gtagcaagct gattgccagg ggcaggccct tggtgtaagt gtttacaaag cggttaagct 3660
gggatgggtg catacgtggg gatatgagat gcatcttgga ctgtattttt aggttggcta 3720
tgttcccagc catatccctc cggggattca tgttgtgcag aaccaccagc acagtgtatc 3780
cggtgcactt gggaaatttg tcatgtagct tagaaggaaa tgcgtggaag aacttggaga 3840
cgcccttgtg acctccaaga ttttccatgc attcgtccat aatgatggca atgggcccac 3900
gggcggcggc ctgggcgaag atatttctgg gatcactaac gtcatagttg tgttccagga 3960
tgagatcgtc ataggccatt tttacaaagc gcgggcggag ggtgccagac tgcggtataa 4020
tggttccatc cggcccaggg gcgtagttac cctcacagat ttgcatttcc cacgctttga 4080
gttcagatgg ggggatcatg tctacctgcg gggcgatgaa gaaaacggtt tccggggtag 4140
gggagatcag ctgggaagaa agcaggttcc tgagcagctg cgacttaccg cagccggtgg 4200
gcccgtaaat cacacctatt accggctgca actggtagtt aagagagctg cagctgccgt 4260
catccctgag caggggggcc acttcgttaa gcatgtccct gactcgcatg ttttccctga 4320
ccaaatccgc cagaaggcgc tcgccgccca gcgatagcag ttcttgcaag gaagcaaagt 4380
ttttcaacgg tttgagaccg tccgccgtag gcatgctttt gagcgtttga ccaagcagtt 4440
ccaggcggtc ccacagctcg gtcacctgct ctacggcatc tcgatccagc atatctcctc 4500
gtttcgcggg ttggggcggc tttcgctgta cggcagtagt cggtgctcgt ccagacgggc 4560
cagggtcatg tctttccacg ggcgcagggt cctcgtcagc gtagtctggg tcacggtgaa 4620
ggggtgcgct ccgggctgcg cgctggccag ggtgcgcttg aggctggtcc tgctggtgct 4680
gaagcgctgc cggtcttcgc cctgcgcgtc ggccaggtag catttgacca tggtgtcata 4740
gtccagcccc tccgcggcgt ggcccttggc gcgcagcttg cccttggagg aggcgccgca 4800
cgaggggcag tgcagacttt tgagggcgta gagcttgggc gcgagaaata ccgattccgg 4860
ggagtaggca tccgcgccgc aggccccgca gacggtctcg cattccacga gccaggtgag 4920
ctctggccgt tcggggtcaa aaaccaggtt tcccccatgc tttttgatgc gtttcttacc 4980
tctggtttcc atgagccggt gtccacgctc ggtgacgaaa aggctgtccg tgtccccgta 5040
tacagacttg agaggcctgt cctcgagcgg tgttccgcgg tcctcctcgt atagaaactc 5100
ggaccactct gagacaaagg ctcgcgtcca ggccagcacg aaggaggcta agtgggaggg 5160
gtagcggtcg ttgtccacta gggggtccac tcgctccagg gtgtgaagac acatgtcgcc 5220
ctcttcggca tcaaggaagg tgattggttt gtaggtgtag gccacgtgac cgggtgttcc 5280
tgaagggggg ctataaaagg gggtgggggc gcgttcgtcc tcactctctt ccgcatcgct 5340
gtctgcgagg gccagctgtt ggggtgagta ctccctctga aaagcgggca tgacttctgc 5400
gctaagattg tcagtttcca aaaacgagga ggatttgata ttcacctggc ccgcggtgat 5460
gcctttgagg gtggccgcat ccatctggtc agaaaagaca atctttttgt tgtcaagctt 5520
ggtggcaaac gacccgtaga gggcgttgga cagcaacttg gcgatggagc gcagggtttg 5580
gtttttgtcg cgatcggcgc gctccttggc cgcgatgttt agctgcacgt attcgcgcgc 5640
aacgcaccgc cattcgggaa agacggtggt gcgctcgtcg ggcaccaggt gcacgcgcca 5700
accgcggttg tgcagggtga caaggtcaac gctggtggct acctctccgc gtaggcgctc 5760
gttggtccag cagaggcggc cgcccttgcg cgagcagaat ggcggtaggg ggtctagctg 5820
cgtctcgtcc ggggggtctg cgtccacggt aaagaccccg ggcagcaggc gcgcgtcgaa 5880
gtagtctatc ttgcatcctt gcaagtctag cgcctgctgc catgcgcggg cggcaagcgc 5940
gcgctcgtat gggttgagtg ggggacccca tggcatgggg tgggtgagcg cggaggcgta 6000
catgccgcaa atgtcgtaaa cgtagagggg ctctctgagt attccaagat atgtagggta 6060
gcatcttcca ccgcggatgc tggcgcgcac gtaatcgtat agttcgtgcg agggagcgag 6120
gaggtcggga ccgaggttgc tacgggcggg ctgctctgct cggaagacta tctgcctgaa 6180
gatggcatgt gagttggatg atatggttgg acgctggaag acgttgaagc tggcgtctgt 6240
gagacctacc gcgtcacgca cgaaggaggc gtaggagtcg cgcagcttgt tgaccagctc 6300
ggcggtgacc tgcacgtcta gggcgcagta gtccagggtt tccttgatga tgtcatactt 6360
atcctgtccc ttttttttcc acagctcgcg gttgaggaca aactcttcgc ggtctttcca 6420
gtactcttgg atcggaaacc cgtcggcctc cgaacggtaa gagcctagca tgtagaactg 6480
gttgacggcc tggtaggcgc agcatccctt ttctacgggt agcgcgtatg cctgcgcggc 6540
cttccggagc gaggtgtggg tgagcgcaaa ggtgtccctg accatgactt tgaggtactg 6600
gtatttgaag tcagtgtcgt cgcatccgcc ctgctcccag agcaaaaagt ccgtgcgctt 6660
tttggaacgc ggatttggca gggcgaaggt gacatcgttg aagagtatct ttcccgcgcg 6720
aggcataaag ttgcgtgtga tgcggaaggg tcccggcacc tcggaacggt tgttaattac 6780
ctgggcggcg agcacgatct cgtcaaagcc gttgatgttg tggcccacaa tgtaaagttc 6840
caagaagcgc gggatgccct tgatggaagg caatttttta agttcctcgt aggtgagctc 6900
ttcaggggag ctgagcccgt gctctgaaag ggcccagtct gcaagatgag ggttggaagc 6960
gacgaatgag ctccacaggt cacgggccat tagcatttgc aggtggtcgc gaaaggtcct 7020
aaactggcga cctatggcca ttttttctgg ggtgatgcag tagaaggtaa gcgggtcttg 7080
ttcccagcgg tcccatccaa ggttcgcggc taggtctcgc gcggcagtca ctagaggctc 7140
atctccgccg aacttcatga ccagcatgaa gggcacgagc tgcttcccaa aggcccccat 7200
ccaagtatag gtctctacat cgtaggtgac aaagagacgc tcggtgcgag gatgcgagcc 7260
gatcgggaag aactggatct cccgccacca attggaggag tggctattga tgtggtgaaa 7320
gtagaagtcc ctgcgacggg ccgaacactc gtgctggctt ttgtaaaaac gtgcgcagta 7380
ctggcagcgg tgcacgggct gtacatcctg cacgaggttg acctgacgac cgcgcacaag 7440
gaagcagagt gggaatttga gcccctcgcc tggcgggttt ggctggtggt cttctacttc 7500
ggctgcttgt ccttgaccgt ctggctgctc gaggggagtt acggtggatc ggaccaccac 7560
gccgcgcgag cccaaagtcc agatgtccgc gcgcggcggt cggagcttga tgacaacatc 7620
gcgcagatgg gagctgtcca tggtctggag ctcccgcggc gtcaggtcag gcgggagctc 7680
ctgcaggttt acctcgcata gacgggtcag ggcgcgggct agatccaggt gatacctaat 7740
ttccaggggc tggttggtgg cggcgtcgat ggcttgcaag aggccgcatc cccgcggcgc 7800
gactacggta ccgcgcggcg ggcggtgggc cgcgggggtg tccttggatg atgcatctaa 7860
aagcggtgac gcgggcgagc ccccggaggt agggggggct ccggacccgc cgggagaggg 7920
ggcaggggca cgtcggcgcc gcgcgcgggc aggagctggt gctgcgcgcg taggttgctg 7980
gcgaacgcga cgacgcggcg gttgatctcc tgaatctggc gcctctgcgt gaagacgacg 8040
ggcccggtga gcttgaacct gaaagagagt tcgacagaat caatttcggt gtcgttgacg 8100
gcggcctggc gcaaaatctc ctgcacgtct cctgagttgt cttgataggc gatctcggcc 8160
atgaactgct cgatctcttc ctcctggaga tctccgcgtc cggctcgctc cacggtggcg 8220
gcgaggtcgt tggaaatgcg ggccatgagc tgcgagaagg cgttgaggcc tccctcgttc 8280
cagacgcggc tgtagaccac gcccccttcg gcatcgcggg cgcgcatgac cacctgcgcg 8340
agattgagct ccacgtgccg ggcgaagacg gcgtagtttc gcaggcgctg aaagaggtag 8400
ttgagggtgg tggcggtgtg ttctgccacg aagaagtaca taacccagcg tcgcaacgtg 8460
gattcgttga tatcccccaa ggcctcaagg cgctccatgg cctcgtagaa gtccacggcg 8520
aagttgaaaa actgggagtt gcgcgccgac acggttaact cctcctccag aagacggatg 8580
agctcggcga cagtgtcgcg cacctcgcgc tcaaaggcta caggggcctc ttcttcttct 8640
tcaatctcct cttccataag ggcctcccct tcttcttctt ctggcggcgg tgggggaggg 8700
gggacacggc ggcgacgacg gcgcaccggg aggcggtcga caaagcgctc gatcatctcc 8760
ccgcggcgac ggcgcatggt ctcggtgacg gcgcggccgt tctcgcgggg gcgcagttgg 8820
aagacgccgc ccgtcatgtc ccggttatgg gttggcgggg ggctgccatg cggcagggat 8880
acggcgctaa cgatgcatct caacaattgt tgtgtaggta ctccgccgcc gagggacctg 8940
agcgagtccg catcgaccgg atcggaaaac ctctcgagaa aggcgtctaa ccagtcacag 9000
tcgcaaggta ggctgagcac cgtggcgggc ggcagcgggc ggcggtcggg gttgtttctg 9060
gcggaggtgc tgctgatgat gtaattaaag taggcggtct tgagacggcg gatggtcgac 9120
agaagcacca tgtccttggg tccggcctgc tgaatgcgca ggcggtcggc catgccccag 9180
gcttcgtttt gacatcggcg caggtctttg tagtagtctt gcatgagcct ttctaccggc 9240
acttcttctt ctccttcctc ttgtcctgca tctcttgcat ctatcgctgc ggcggcggcg 9300
gagtttggcc gtaggtggcg ccctcttcct cccatgcgtg tgaccccgaa gcccctcatc 9360
ggctgaagca gggctaggtc ggcgacaacg cgctcggcta atatggcctg ctgcacctgc 9420
gtgagggtag actggaagtc atccatgtcc acaaagcggt ggtatgcgcc cgtgttgatg 9480
gtgtaagtgc agttggccat aacggaccag ttaacggtct ggtgacccgg ctgcgagagc 9540
tcggtgtacc tgagacgcga gtaagccctc gagtcaaata cgtagtcgtt gcaagtccgc 9600
accaggtact ggtatcccac caaaaagtgc ggcggcggct ggcggtagag gggccagcgt 9660
agggtggccg gggctccggg ggcgagatct tccaacataa ggcgatgata tccgtagatg 9720
tacctggaca tccaggtgat gccggcggcg gtggtggagg cgcgcggaaa gtcgcggacg 9780
cggttccaga tgttgcgcag cggcaaaaag tgctccatgg tcgggacgct ctggccggtc 9840
aggcgcgcgc aatcgttgac gctctagacc gtgcaaaagg agagcctgta agcgggcact 9900
cttccgtggt ctggtggata aattcgcaag ggtatcatgg cggacgaccg gggttcgagc 9960
cccgtatccg gccgtccgcc gtgatccatg cggttaccgc ccgcgtgtcg aacccaggtg 10020
tgcgacgtca gacaacgggg gagtgctcct tttggcttcc ttccaggcgc ggcggctgct 10080
gcgctagctt ttttggccac tggccgcgcg cagcgtaagc ggttaggctg gaaagcgaaa 10140
gcattaagtg gctcgctccc tgtagccgga gggttatttt ccaagggttg agtcgcggga 10200
cccccggttc gagtctcgga ccggccggac tgcggcgaac gggggtttgc ctccccgtca 10260
tgcaagaccc cgcttgcaaa ttcctccgga aacagggacg agcccctttt ttgcttttcc 10320
cagatgcatc cggtgctgcg gcagatgcgc ccccctcctc agcagcggca agagcaagag 10380
cagcggcaga catgcagggc accctcccct cctcctaccg cgtcaggagg ggcgacatcc 10440
gcggttgacg cggcagcaga tggtgattac gaacccccgc ggcgccgggc ccggcactac 10500
ctggacttgg aggagggcga gggcctggcg cggctaggag cgccctctcc tgagcggcac 10560
ccaagggtgc agctgaagcg tgatacgcgt gaggcgtacg tgccgcggca gaacctgttt 10620
cgcgaccgcg agggagagga gcccgaggag atgcgggatc gaaagttcca cgcagggcgc 10680
gagctgcggc atggcctgaa tcgcgagcgg ttgctgcgcg aggaggactt tgagcccgac 10740
gcgcgaaccg ggattagtcc cgcgcgcgca cacgtggcgg ccgccgacct ggtaaccgca 10800
tacgagcaga cggtgaacca ggagattaac tttcaaaaaa gctttaacaa ccacgtgcgt 10860
acgcttgtgg cgcgcgagga ggtggctata ggactgatgc atctgtggga ctttgtaagc 10920
gcgctggagc aaaacccaaa tagcaagccg ctcatggcgc agctgttcct tatagtgcag 10980
cacagcaggg acaacgaggc attcagggat gcgctgctaa acatagtaga gcccgagggc 11040
cgctggctgc tcgatttgat aaacatcctg cagagcatag tggtgcagga gcgcagcttg 11100
agcctggctg acaaggtggc cgccatcaac tattccatgc ttagcctggg caagttttac 11160
gcccgcaaga tataccatac cccttacgtt cccatagaca aggaggtaaa gatcgagggg 11220
ttctacatgc gcatggcgct gaaggtgctt accttgagcg acgacctggg cgtttatcgc 11280
aacgagcgca tccacaaggc cgtgagcgtg agccggcggc gcgagctcag cgaccgcgag 11340
ctgatgcaca gcctgcaaag ggccctggct ggcacgggca gcggcgatag agaggccgag 11400
tcctactttg acgcgggcgc tgacctgcgc tgggccccaa gccgacgcgc cctggaggca 11460
gctggggccg gacctgggct ggcggtggca cccgcgcgcg ctggcaacgt cggcggcgtg 11520
gaggaatatg acgaggacga tgagtacgag ccagaggacg gcgagtacta agcggtgatg 11580
tttctgatca gatgatgcaa gacgcaacgg acccggcggt gcgggcggcg ctgcagagcc 11640
agccgtccgg ccttaactcc acggacgact ggcgccaggt catggaccgc atcatgtcgc 11700
tgactgcgcg caatcctgac gcgttccggc agcagccgca ggccaaccgg ctctccgcaa 11760
ttctggaagc ggtggtcccg gcgcgcgcaa accccacgca cgagaaggtg ctggcgatcg 11820
taaacgcgct ggccgaaaac agggccatcc ggcccgacga ggccggcctg gtctacgacg 11880
cgctgcttca gcgcgtggct cgttacaaca gcggcaacgt gcagaccaac ctggaccggc 11940
tggtggggga tgtgcgcgag gccgtggcgc agcgtgagcg cgcgcagcag cagggcaacc 12000
tgggctccat ggttgcacta aacgccttcc tgagtacaca gcccgccaac gtgccgcggg 12060
gacaggagga ctacaccaac tttgtgagcg cactgcggct aatggtgact gagacaccgc 12120
aaagtgaggt gtaccagtct gggccagact attttttcca gaccagtaga caaggcctgc 12180
agaccgtaaa cctgagccag gctttcaaaa acttgcaggg gctgtggggg gtgcgggctc 12240
ccacaggcga ccgcgcgacc gtgtctagct tgctgacgcc caactcgcgc ctgttgctgc 12300
tgctaatagc gcccttcacg gacagtggca gcgtgtcccg ggacacatac ctaggtcact 12360
tgctgacact gtaccgcgag gccataggtc aggcgcatgt ggacgagcat actttccagg 12420
agattacaag tgtcagccgc gcgctggggc aggaggacac gggcagcctg gaggcaaccc 12480
taaactacct gctgaccaac cggcggcaga agatcccctc gttgcacagt ttaaacagcg 12540
aggaggagcg cattttgcgc tacgtgcagc agagcgtgag ccttaacctg atgcgcgacg 12600
gggtaacgcc cagcgtggcg ctggacatga ccgcgcgcaa catggaaccg ggcatgtatg 12660
cctcaaaccg gccgtttatc aaccgcctaa tggactactt gcatcgcgcg gccgccgtga 12720
accccgagta tttcaccaat gccatcttga acccgcactg gctaccgccc cctggtttct 12780
acaccggggg attcgaggtg cccgagggta acgatggatt cctctgggac gacatagacg 12840
acagcgtgtt ttccccgcaa ccgcagaccc tgctagagtt gcaacagcgc gagcaggcag 12900
aggcggcgct gcgaaaggaa agcttccgca ggccaagcag cttgtccgat ctaggcgctg 12960
cggccccgcg gtcagatgct agtagcccat ttccaagctt gatagggtct cttaccagca 13020
ctcgcaccac ccgcccgcgc ctgctgggcg aggaggagta cctaaacaac tcgctgctgc 13080
agccgcagcg cgaaaaaaac ctgcctccgg catttcccaa caacgggata gagagcctag 13140
tggacaagat gagtagatgg aagacgtacg cgcaggagca cagggacgtg ccaggcccgc 13200
gcccgcccac ccgtcgtcaa aggcacgacc gtcagcgggg tctggtgtgg gaggacgatg 13260
actcggcaga cgacagcagc gtcctggatt tgggagggag tggcaacccg tttgcgcacc 13320
ttcgccccag gctggggaga atgttttaaa aaaaaaaaaa gcatgatgca aaataaaaaa 13380
ctcaccaagg ccatggcacc gagcgttggt tttcttgtat tccccttagt atgcggcgcg 13440
cggcgatgta tgaggaaggt cctcctccct cctacgagag tgtggtgagc gcggcgccag 13500
tggcggcggc gctgggttct cccttcgatg ctcccctgga cccgccgttt gtgcctccgc 13560
ggtacctgcg gcctaccggg gggagaaaca gcatccgtta ctctgagttg gcacccctat 13620
tcgacaccac ccgtgtgtac ctggtggaca acaagtcaac ggatgtggca tccctgaact 13680
accagaacga ccacagcaac tttctgacca cggtcattca aaacaatgac tacagcccgg 13740
gggaggcaag cacacagacc atcaatcttg acgaccggtc gcactggggc ggcgacctga 13800
aaaccatcct gcataccaac atgccaaatg tgaacgagtt catgtttacc aataagttta 13860
aggcgcgggt gatggtgtcg cgcttgccta ctaaggacaa tcaggtggag ctgaaatacg 13920
agtgggtgga gttcacgctg cccgagggca actactccga gaccatgacc atagacctta 13980
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gtcttgtcat gcctggggta tatacaaacg aagccttcca tccagacatc attttgctgc 14160
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agcacaggcc agatgctgag ggataagttg aaagagcaaa atttccaaca aaaggtggta 17520
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gtgctgagta taataaatac agaaattaaa atatactggg gctcctatcg ccatcctgta 27480
aacgccaccg tcttcacccg cccaagcaaa ccaaggcgaa ccttacctgg tacttttaac 27540
atctctccct ctgtgattta caacagtttc aacccagacg gagtgagtct acgagagaac 27600
ctctccgagc tcagctactc catcagaaaa aacaccaccc tccttacctg ccgggaacgt 27660
acgagtgcgt caccggccgc tgcaccacac ctaccgcctg accgtaaacc agactttttc 27720
cggacagacc tcaataactc tgtttaccag aacaggaggt gagcttagaa aacccttagg 27780
gtattaggcc aaaggcgcag ctactgtggg gtttatgaac aattcaagca actctacggg 27840
ctattctaat tcaggtttct ctagaatcgg ggttggggtt attctctgtc ttgtgattct 27900
ctttattctt atactaacgc ttctctgcct aaggctcgcc gcctgctgtg tgcacatttg 27960
catttattgt cagcttttta aacgctgggg tcgccaccca agatgattag gtacataatc 28020
ctaggtttac tcacccttgc gtcagcccac ggtaccaccc aaaaggtgga ttttaaggag 28080
ccagcctgta atgttacatt cgcagctgaa gctaatgagt gcaccactct tataaaatgc 28140
accacagaac atgaaaagct gcttattcgc cacaaaaaca aaattggcaa gtatgctgtt 28200
tatgctattt ggcagccagg tgacactaca gagtataatg ttacagtttt ccagggtaaa 28260
agtcataaaa cttttatgta tacttttcca ttttatgaaa tgtgcgacat taccatgtac 28320
atgagcaaac agtataagtt gtggccccca caaaattgtg tggaaaacac tggcactttc 28380
tgctgcactg ctatgctaat tacagtgctc gctttggtct gtaccctact ctatattaaa 28440
tacaaaagca gacgcagctt tattgaggaa aagaaaatgc cttaatttac taagttacaa 28500
agctaatgtc accactaact gctttactcg ctgcttgcaa aacaaattca aaaagttagc 28560
attataatta gaataggatt taaacccccc ggtcatttcc tgctcaatac cattcccctg 28620
aacaattgac tctatgtggg atatgctcca gcgctacaac cttgaagtca ggcttcctgg 28680
atgtcagcat ctgactttgg ccagcacctg tcccgcggat ttgttccagt ccaactacag 28740
cgacccaccc taacagagat gaccaacaca accaacgcgg ccgccgctac cggacttaca 28800
tctaccacaa atacacccca agtttctgcc tttgtcaata actgggataa cttgggcatg 28860
tggtggttct ccatagcgct tatgtttgta tgccttatta ttatgtggct catctgctgc 28920
ctaaagcgca aacgcgcccg accacccatc tatagtccca tcattgtgct acacccaaac 28980
aatgatggaa tccatagatt ggacggactg aaacacatgt tcttttctct tacagtatga 29040
ttaaatgaga catgattcct cgagttttta tattactgac ccttgttgcg ctttttttgt 29100
gcgtgctcca cattggctgc ggtttctcac atcgaagtag actgcattcc agccttcaca 29160
gtctatttgc tttacggatt tgtcaccctc acgctcatct gcagcctcat cactgtggtc 29220
atcgccttta tccagtgcat tgactgggtc tgtgtgcgct ttgcatatct cagacaccat 29280
ccccagtaca gggacaggac tatagctgag cttcttagaa ttctttaatt atgaaattta 29340
ctgtgacttt tctgctgatt atttgcaccc tatctgcgtt ttgttccccg acctccaagc 29400
ctcaaagaca tatatcatgc agattcactc gtatatggaa tattccaagt tgctacaatg 29460
aaaaaagcga tctttccgaa gcctggttat atgcaatcat ctctgttatg gtgttctgca 29520
gtaccatctt agccctagct atatatccct accttgacat tggctggaac gcaatagatg 29580
ccatgaacca cccaactttc cccgcgcccg ctatgcttcc actgcaacaa gttgttgccg 29640
gcggctttgt cccagccaat cagcctcgcc caccttctcc cacccccact gaaatcagct 29700
actttaatct aacaggagga gatgactgac accctagatc tagaaatgga cggaattatt 29760
acagagcagc gcctgctaga aagacgcagg gcagcggccg agcaacagcg catgaatcaa 29820
gagctccaag acatggttaa cttgcaccag tgcaaaaggg gtatcttttg tctggtaaag 29880
caggccaaag tcacctacga cagtaatacc accggacacc gccttagcta caagttgcca 29940
accaagcgtc agaaattggt ggtcatggtg ggagaaaagc ccattaccat aactcagcac 30000
tcggtagaaa ccgaaggctg cattcactca ccttgtcaag gacctgagga tctctgcacc 30060
cttattaaga ccctgtgcgg tctcaaagat cttattccct ttaactaata aaaaaaaata 30120
ataaagcatc acttacttaa aatcagttag caaatttctg tccagtttat tcagcagcac 30180
ctccttgccc tcctcccagc tctggtattg cagcttcctc ctggctgcaa actttctcca 30240
caatctaaat ggaatgtcag tttcctcctg ttcctgtcca tccgcaccca ctatcttcat 30300
gttgttgcag atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata 30360
tgacacggaa accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa 30420
tgggtttcaa gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac ctctagttac 30480
ctccaatggc atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg aggccggcaa 30540
ccttacctcc caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca agtcaaacat 30600
aaacctggaa atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg tggctgccgc 30660
cgcacctcta atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc cgctaaccgt 30720
gcacgactcc aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag aaggaaagct 30780
agccctgcaa acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta ctatcactgc 30840
ctcaccccct ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag agcccattta 30900
tacacaaaat ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa cagacgacct 30960
aaacactttg accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt ccttgcaaac 31020
taaagttact ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta atgtagcagg 31080
aggactaagg attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt atccgtttga 31140
tgctcaaaac caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa actcagccca 31200
caacttggat attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa acaattccaa 31260
aaagcttgag gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta cagccatagc 31320
cattaatgca ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca caaatcccct 31380
caaaacaaaa attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg ttcctaaact 31440
aggaactggc cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca aaaataatga 31500
taagctaact ttgtggacca caccagctcc atctcctaac tgtagactaa atgcagagaa 31560
agatgctaaa ctcactttgg tcttaacaaa atgtggcagt caaatacttg ctacagtttc 31620
agttttggct gttaaaggca gtttggctcc aatatctgga acagttcaaa gtgctcatct 31680
tattataaga tttgacgaaa atggagtgct actaaacaat tccttcctgg acccagaata 31740
ttggaacttt agaaatggag atcttactga aggcacagcc tatacaaacg ctgttggatt 31800
tatgcctaac ctatcagctt atccaaaatc tcacggtaaa actgccaaaa gtaacattgt 31860
cagtcaagtt tacttaaacg gagacaaaac taaacctgta acactaacca ttacactaaa 31920
cggtacacag gaaacaggag acacaactcc aagtgcatac tctatgtcat tttcatggga 31980
ctggtctggc cacaactaca ttaatgaaat atttgccaca tcctcttaca ctttttcata 32040
cattgcccaa gaataaagaa tcgtttgtgt tatgtttcaa cgtgtttatt tttcaattgc 32100
agaaaatttc aagtcatttt tcattcagta gtatagcccc accaccacat agcttataca 32160
gatcaccgta ccttaatcaa actcacagaa ccctagtatt caacctgcca cctccctccc 32220
aacacacaga gtacacagtc ctttctcccc ggctggcctt aaaaagcatc atatcatggg 32280
taacagacat attcttaggt gttatattcc acacggtttc ctgtcgagcc aaacgctcat 32340
cagtgatatt aataaactcc ccgggcagct cacttaagtt catgtcgctg tccagctgct 32400
gagccacagg ctgctgtcca acttgcggtt gcttaacggg cggcgaagga gaagtccacg 32460
cctacatggg ggtagagtca taatcgtgca tcaggatagg gcggtggtgc tgcagcagcg 32520
cgcgaataaa ctgctgccgc cgccgctccg tcctgcagga atacaacatg gcagtggtct 32580
cctcagcgat gattcgcacc gcccgcagca taaggcgcct tgtcctccgg gcacagcagc 32640
gcaccctgat ctcacttaaa tcagcacagt aactgcagca cagcaccaca atattgttca 32700
aaatcccaca gtgcaaggcg ctgtatccaa agctcatggc ggggaccaca gaacccacgt 32760
ggccatcata ccacaagcgc aggtagatta agtggcgacc cctcataaac acgctggaca 32820
taaacattac ctcttttggc atgttgtaat tcaccacctc ccggtaccat ataaacctct 32880
gattaaacat ggcgccatcc accaccatcc taaaccagct ggccaaaacc tgcccgccgg 32940
ctatacactg cagggaaccg ggactggaac aatgacagtg gagagcccag gactcgtaac 33000
catggatcat catgctcgtc atgatatcaa tgttggcaca acacaggcac acgtgcatac 33060
acttcctcag gattacaagc tcctcccgcg ttagaaccat atcccaggga acaacccatt 33120
cctgaatcag cgtaaatccc acactgcagg gaagacctcg cacgtaactc acgttgtgca 33180
ttgtcaaagt gttacattcg ggcagcagcg gatgatcctc cagtatggta gcgcgggttt 33240
ctgtctcaaa aggaggtaga cgatccctac tgtacggagt gcgccgagac aaccgagatc 33300
gtgttggtcg tagtgtcatg ccaaatggaa cgccggacgt agtcatattt cctgaagcaa 33360
aaccaggtgc gggcgtgaca aacagatctg cgtctccggt ctcgccgctt agatcgctct 33420
gtgtagtagt tgtagtatat ccactctctc aaagcatcca ggcgccccct ggcttcgggt 33480
tctatgtaaa ctccttcatg cgccgctgcc ctgataacat ccaccaccgc agaataagcc 33540
acacccagcc aacctacaca ttcgttctgc gagtcacaca cgggaggagc gggaagagct 33600
ggaagaacca tgtttttttt tttattccaa aagattatcc aaaacctcaa aatgaagatc 33660
tattaagtga acgcgctccc ctccggtggc gtggtcaaac tctacagcca aagaacagat 33720
aatggcattt gtaagatgtt gcacaatggc ttccaaaagg caaacggccc tcacgtccaa 33780
gtggacgtaa aggctaaacc cttcagggtg aatctcctct ataaacattc cagcaccttc 33840
aaccatgccc aaataattct catctcgcca ccttctcaat atatctctaa gcaaatcccg 33900
aatattaagt ccggccattg taaaaatctg ctccagagcg ccctccacct tcagcctcaa 33960
gcagcgaatc atgattgcaa aaattcaggt tcctcacaga cctgtataag attcaaaagc 34020
ggaacattaa caaaaatacc gcgatcccgt aggtcccttc gcagggccag ctgaacataa 34080
tcgtgcaggt ctgcacggac cagcgcggcc acttccccgc caggaaccat gacaaaagaa 34140
cccacactga ttatgacacg catactcgga gctatgctaa ccagcgtagc cccgatgtaa 34200
gcttgttgca tgggcggcga tataaaatgc aaggtgctgc tcaaaaaatc aggcaaagcc 34260
tcgcgcaaaa aagaaagcac atcgtagtca tgctcatgca gataaaggca ggtaagctcc 34320
ggaaccacca cagaaaaaga caccattttt ctctcaaaca tgtctgcggg tttctgcata 34380
aacacaaaat aaaataacaa aaaaacattt aaacattaga agcctgtctt acaacaggaa 34440
aaacaaccct tataagcata agacggacta cggccatgcc ggcgtgaccg taaaaaaact 34500
ggtcaccgtg attaaaaagc accaccgaca gctcctcggt catgtccgga gtcataatgt 34560
aagactcggt aaacacatca ggttgattca catcggtcag tgctaaaaag cgaccgaaat 34620
agcccggggg aatacatacc cgcaggcgta gagacaacat tacagccccc ataggaggta 34680
taacaaaatt aataggagag aaaaacacat aaacacctga aaaaccctcc tgcctaggca 34740
aaatagcacc ctcccgctcc agaacaacat acagcgcttc cacagcggca gccataacag 34800
tcagccttac cagtaaaaaa gaaaacctat taaaaaaaca ccactcgaca cggcaccagc 34860
tcaatcagtc acagtgtaaa aaagggccaa gtgcagagcg agtatatata ggactaaaaa 34920
atgacgtaac ggttaaagtc cacaaaaaac acccagaaaa ccgcacgcga acctacgccc 34980
agaaacgaaa gccaaaaaac ccacaacttc ctcaaatcgt cacttccgtt ttcccacgtt 35040
acgtcacttc ccattttaag aaaactacaa ttcccaacac atacaagtta ctccgcccta 35100
aaacctacgt cacccgcccc gttcccacgc cccgcgccac gtcacaaact ccaccccctc 35160
attatcatat tggcttcaat ccaaaataag gtatattatt gat 35203
<210> 21
<211> 36460
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有两个错配、并具有重复的构建体
<400> 21
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420
cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagtacgta cgtgtacttc tgatcggcga 480
tactagggag ataaggatgt acctgacaaa accacattgt tgttgttatc attattattt 540
agttttcctt ccttgctaac tcctgacgga atctttctca cctcaaatgc gaagtacttt 600
agtttagaaa agacttggtg gaaggggtgg tggtggaaaa gtagggtgat cttccaaact 660
aatctggttc cccgcccgcc ccagtagctg ggattcaaga gcgaagagtg gggatcgtcc 720
ccttgtttga tcagaaagac ataaaaggaa aatcaagtga acaatgatca gccccacctc 780
caccccaccc ccctgcgcgc gcacaataca atctatttaa ttgtacttca tacttttcat 840
tccaatgggg tgactttgct tctggagaaa ctcttgattc ttgaactctg gggctggcag 900
ctagcctcca gaagcaaagt caccccattg gaatgaaaag tatgaagtac aatgaaaagt 960
atgaagtact ggctccagaa gcaaagtcac cctccagaag caaagtcacc ccattggaat 1020
gaaaagtatg aagtacgcta gcaaaagggg aagcgggctg ctgctctctg caggttctgc 1080
agcggtctct gtctagtggg tgttttcttt ttcttagccc tgcccctgga ttgtcagacg 1140
gcgggcgtct gcctctgaag ttagccgtga tttcctctag agccgggtct tatctctggc 1200
tgcacgttgc ctgtgggtga ctaatcacac aataacattg tttagggctg gaataaagtc 1260
agagctgttt acccccactc tataggggtt caatataaaa aggcggcgga gaactgtccg 1320
agtcagaagc gttcctgcac cggcgctgag agcctgaccc ggtctgctcc gctgtccttg 1380
cgcgctgcct cccggctgcc cgcgacgctt tcgccccagt ggaagggcca cttgctgcgg 1440
ccgctaattc tgcagatcgg gatccggcat gggcctctcc accgtgcctg acctgctgct 1500
gccgctggtg ctcctggagc tgttggtggg aatatacccc tcaggggtta ttggactggt 1560
ccctcaccta ggggacaggg agaagagaga tagtgtgtgt ccccaaggaa aatatatcca 1620
ccctcaaaat aattcgattt gctgtaccaa gtgccacaaa ggaacctact tgtacaatga 1680
ctgtccaggc ccggggcagg atacggactg cagggagtgt gagagcggct ccttcaccgc 1740
ttcagaaaac cacctcagac actgcctcag ctgctccaaa tgccgaaagg aaatgggtca 1800
ggtggagatc tcttcttgca cagtggaccg ggacaccgtg tgtggctgca ggaagaacca 1860
gtaccggcat tattggagtg aaaacctttt ccagtgcttc aattgcagcc tctgcctcaa 1920
tgggaccgtg cacctctcct gccaggagaa acagaacacc gtgtgcacct gccatgcagg 1980
tttctttcta agagaaaacg agtgtgtctc ctgtagtaac tgtaagaaaa gcctggagtg 2040
cacgaagttg tgcctaccaa gcttaggatc cagatctaac ttggggtggc tttgtcttct 2100
tcttttgcca attccactaa ttgtttgggt gaagagaaag gaagtacaga aaacatgcag 2160
aaagcacaga aaggaaaacc aaggttctca tgaatctcca accttaaatc ctgaaacagt 2220
ggcaataaat ttatctgatg ttgacttgag taaatatatc accactattg ctggagtcat 2280
gacactaagt caagttaaag gctttgttcg aaagaatggt gtcaatgaag ccaaaataga 2340
tgagatcaag aatgacaatg tccaagacac agcagaacag aaagttcaac tgcttcgtaa 2400
ttggcatcaa cttcatggaa agaaagaagc gtatgacaca ttgattaaag atctcaaaaa 2460
agccaatctt tgtactcttg cagagaaaat tcagactatc atcctcaagg acattactag 2520
tgactcagaa aattcaaact tcagaaatga aatccaaagc ttggtctagc tcgagcatgc 2580
atctaggcgg ccgcatggca gaaattcgcg aattcgctag cgttaacgga tcctctagac 2640
gagatccgaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 2700
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 2760
atgtatctta tcatgtctag atctgtactg aaatgtgtgg gcgtggctta agggtgggaa 2820
agaatatata aggtgggggt cttatgtagt tttgtatctg ttttgcagca gccgccgccg 2880
ccatgagcac caactcgttt gatggaagca ttgtgagctc atatttgaca acgcgcatgc 2940
ccccatgggc cggggtgcgt cagaatgtga tgggctccag cattgatggt cgccccgtcc 3000
tgcccgcaaa ctctactacc ttgacctacg agaccgtgtc tggaacgccg ttggagactg 3060
cagcctccgc cgccgcttca gccgctgcag ccaccgcccg cgggattgtg actgactttg 3120
ctttcctgag cccgcttgca agcagtgcag cttcccgttc atccgcccgc gatgacaagt 3180
tgacggctct tttggcacaa ttggattctt tgacccggga acttaatgtc gtttctcagc 3240
agctgttgga tctgcgccag caggtttctg ccctgaaggc ttcctcccct cccaatgcgg 3300
tttaaaacat aaataaaaaa ccagactctg tttggatttg gatcaagcaa gtgtcttgct 3360
gtctttattt aggggttttg cgcgcgcggt aggcccggga ccagcggtct cggtcgttga 3420
gggtcctgtg tattttttcc aggacgtggt aaaggtgact ctggatgttc agatacatgg 3480
gcataagccc gtctctgggg tggaggtagc accactgcag agcttcatgc tgcggggtgg 3540
tgttgtagat gatccagtcg tagcaggagc gctgggcgtg gtgcctaaaa atgtctttca 3600
gtagcaagct gattgccagg ggcaggccct tggtgtaagt gtttacaaag cggttaagct 3660
gggatgggtg catacgtggg gatatgagat gcatcttgga ctgtattttt aggttggcta 3720
tgttcccagc catatccctc cggggattca tgttgtgcag aaccaccagc acagtgtatc 3780
cggtgcactt gggaaatttg tcatgtagct tagaaggaaa tgcgtggaag aacttggaga 3840
cgcccttgtg acctccaaga ttttccatgc attcgtccat aatgatggca atgggcccac 3900
gggcggcggc ctgggcgaag atatttctgg gatcactaac gtcatagttg tgttccagga 3960
tgagatcgtc ataggccatt tttacaaagc gcgggcggag ggtgccagac tgcggtataa 4020
tggttccatc cggcccaggg gcgtagttac cctcacagat ttaagggtgg gaaagaatat 4080
ataaggtggg ggtcttatgt agttttgtat ctgttttgca gcagccgccg ccgccatgag 4140
caccaactcg tttgatggaa gcattgtgag ctcatatttg acaacgcgca tgcccccatg 4200
ggccggggtg cgtcagaatg tgatgggctc cagcattgat ggtcgccccg tcctgcccgc 4260
aaactctact accttgacct acgagaccgt gtctggaacg ccgttggaga ctgcagcctc 4320
cgccgccgct tcagccgctg cagccaccgc ccgcgggatt gtgactgact ttgctttcct 4380
gagcccgctt gcaagcagtg cagcttcccg ttcatccgcc cgcgatgaca agttgacggc 4440
tcttttggca caattggatt ctttgacccg ggaacttaat gtcgtttctc agcagctgtt 4500
ggatctgcgc cagcaggttt ctgccctgaa ggcttcctcc cctcccaatg cggtttaaaa 4560
cataaataaa aaaccagact ctgtttggat ttggatcaag caagtgtctt gctgtcttta 4620
tttaggggtt ttgcgcgcgc ggtaggcccg ggaccagcgg tctcggtcgt tgagggtcct 4680
gtgtattttt tccaggacgt ggtaaaggtg actctggatg ttcagataca tgggcataag 4740
cccgtctctg gggtggaggt agcaccactg cagagcttca tgctgcgggg tggtgttgta 4800
gatgatccag tcgtagcagg agcgctgggc gtggtgccta aaaatgtctt tcagtagcaa 4860
gctgattgcc aggggcaggc ccttggtgta agtgtttaca aagcggttaa gctgggatgg 4920
gtgcatacgt ggggatatga gatgcatctt ggactgtatt tttaggttgg ctatgttccc 4980
agccatatcc ctccggggat tcatgttgtg cagaaccacc agcacagtgt atccggtgca 5040
cttgggaaat ttgtcatgta gcttagaagg aaatgcgtgg aagaacttgg agacgccctt 5100
gtgacctcca agattttcca tgcattcgtc cataatgatg gcaatgggcc cacgggcggc 5160
ggcctgggcg aagatatttc tgggatcact aacgtcatag ttgtgttcca ggatgagatc 5220
gtcataggcc atttttacaa agcgcgggcg gagggtgcca gactgcggta taatggttcc 5280
atccggccca ggggcgtagt taccctcaca gatttgcatt tcccacgctt tgagttcaga 5340
tggggggatc atgtctacct gcggggcgat gaagaaaacg gtttccgggg taggggagat 5400
cagctgggaa gaaagcaggt tcctgagcag ctgcgactta ccgcagccgg tgggcccgta 5460
aatcacacct attaccggct gcaactggta gttaagagag ctgcagctgc cgtcatccct 5520
gagcaggggg gccacttcgt taagcatgtc cctgactcgc atgttttccc tgaccaaatc 5580
cgccagaagg cgctcgccgc ccagcgatag cagttcttgc aaggaagcaa agtttttcaa 5640
cggtttgaga ccgtccgccg taggcatgct tttgagcgtt tgaccaagca gttccaggcg 5700
gtcccacagc tcggtcacct gctctacggc atctcgatcc agcatatctc ctcgtttcgc 5760
gggttggggc ggctttcgct gtacggcagt agtcggtgct cgtccagacg ggccagggtc 5820
atgtctttcc acgggcgcag ggtcctcgtc agcgtagtct gggtcacggt gaaggggtgc 5880
gctccgggct gcgcgctggc cagggtgcgc ttgaggctgg tcctgctggt gctgaagcgc 5940
tgccggtctt cgccctgcgc gtcggccagg tagcatttga ccatggtgtc atagtccagc 6000
ccctccgcgg cgtggccctt ggcgcgcagc ttgcccttgg aggaggcgcc gcacgagggg 6060
cagtgcagac ttttgagggc gtagagcttg ggcgcgagaa ataccgattc cggggagtag 6120
gcatccgcgc cgcaggcccc gcagacggtc tcgcattcca cgagccaggt gagctctggc 6180
cgttcggggt caaaaaccag gtttccccca tgctttttga tgcgtttctt acctctggtt 6240
tccatgagcc ggtgtccacg ctcggtgacg aaaaggctgt ccgtgtcccc gtatacagac 6300
ttgagaggcc tgtcctcgag cggtgttccg cggtcctcct cgtatagaaa ctcggaccac 6360
tctgagacaa aggctcgcgt ccaggccagc acgaaggagg ctaagtggga ggggtagcgg 6420
tcgttgtcca ctagggggtc cactcgctcc agggtgtgaa gacacatgtc gccctcttcg 6480
gcatcaagga aggtgattgg tttgtaggtg taggccacgt gaccgggtgt tcctgaaggg 6540
gggctataaa agggggtggg ggcgcgttcg tcctcactct cttccgcatc gctgtctgcg 6600
agggccagct gttggggtga gtactccctc tgaaaagcgg gcatgacttc tgcgctaaga 6660
ttgtcagttt ccaaaaacga ggaggatttg atattcacct ggcccgcggt gatgcctttg 6720
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cgccattcgg gaaagacggt ggtgcgctcg tcgggcacca ggtgcacgcg ccaaccgcgg 6960
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tccggggggt ctgcgtccac ggtaaagacc ccgggcagca ggcgcgcgtc gaagtagtct 7140
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cccttttttt tccacagctc gcggttgagg acaaactctt cgcggtcttt ccagtactct 7680
tggatcggaa acccgtcggc ctccgaacgg taagagccta gcatgtagaa ctggttgacg 7740
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agcgaggtgt gggtgagcgc aaaggtgtcc ctgaccatga ctttgaggta ctggtatttg 7860
aagtcagtgt cgtcgcatcc gccctgctcc cagagcaaaa agtccgtgcg ctttttggaa 7920
cgcggatttg gcagggcgaa ggtgacatcg ttgaagagta tctttcccgc gcgaggcata 7980
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cgcgggatgc ccttgatgga aggcaatttt ttaagttcct cgtaggtgag ctcttcaggg 8160
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cgacctatgg ccattttttc tggggtgatg cagtagaagg taagcgggtc ttgttcccag 8340
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ccgaacttca tgaccagcat gaagggcacg agctgcttcc caaaggcccc catccaagta 8460
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cgacagtgtc gcgcacctcg cgctcaaagg ctacaggggc ctcttcttct tcttcaatct 9900
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gggacaacga ggcattcagg gatgcgctgc taaacatagt agagcccgag ggccgctggc 12300
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ttcaagtcat ttttcattca gtagtatagc cccaccacca catagcttat acagatcacc 33420
gtaccttaat caaactcaca gaaccctagt attcaacctg ccacctccct cccaacacac 33480
agagtacaca gtcctttctc cccggctggc cttaaaaagc atcatatcat gggtaacaga 33540
catattctta ggtgttatat tccacacggt ttcctgtcga gccaaacgct catcagtgat 33600
attaataaac tccccgggca gctcacttaa gttcatgtcg ctgtccagct gctgagccac 33660
aggctgctgt ccaacttgcg gttgcttaac gggcggcgaa ggagaagtcc acgcctacat 33720
gggggtagag tcataatcgt gcatcaggat agggcggtgg tgctgcagca gcgcgcgaat 33780
aaactgctgc cgccgccgct ccgtcctgca ggaatacaac atggcagtgg tctcctcagc 33840
gatgattcgc accgcccgca gcataaggcg ccttgtcctc cgggcacagc agcgcaccct 33900
gatctcactt aaatcagcac agtaactgca gcacagcacc acaatattgt tcaaaatccc 33960
acagtgcaag gcgctgtatc caaagctcat ggcggggacc acagaaccca cgtggccatc 34020
ataccacaag cgcaggtaga ttaagtggcg acccctcata aacacgctgg acataaacat 34080
tacctctttt ggcatgttgt aattcaccac ctcccggtac catataaacc tctgattaaa 34140
catggcgcca tccaccacca tcctaaacca gctggccaaa acctgcccgc cggctataca 34200
ctgcagggaa ccgggactgg aacaatgaca gtggagagcc caggactcgt aaccatggat 34260
catcatgctc gtcatgatat caatgttggc acaacacagg cacacgtgca tacacttcct 34320
caggattaca agctcctccc gcgttagaac catatcccag ggaacaaccc attcctgaat 34380
cagcgtaaat cccacactgc agggaagacc tcgcacgtaa ctcacgttgt gcattgtcaa 34440
agtgttacat tcgggcagca gcggatgatc ctccagtatg gtagcgcggg tttctgtctc 34500
aaaaggaggt agacgatccc tactgtacgg agtgcgccga gacaaccgag atcgtgttgg 34560
tcgtagtgtc atgccaaatg gaacgccgga cgtagtcata tttcctgaag caaaaccagg 34620
tgcgggcgtg acaaacagat ctgcgtctcc ggtctcgccg cttagatcgc tctgtgtagt 34680
agttgtagta tatccactct ctcaaagcat ccaggcgccc cctggcttcg ggttctatgt 34740
aaactccttc atgcgccgct gccctgataa catccaccac cgcagaataa gccacaccca 34800
gccaacctac acattcgttc tgcgagtcac acacgggagg agcgggaaga gctggaagaa 34860
ccatgttttt ttttttattc caaaagatta tccaaaacct caaaatgaag atctattaag 34920
tgaacgcgct cccctccggt ggcgtggtca aactctacag ccaaagaaca gataatggca 34980
tttgtaagat gttgcacaat ggcttccaaa aggcaaacgg ccctcacgtc caagtggacg 35040
taaaggctaa acccttcagg gtgaatctcc tctataaaca ttccagcacc ttcaaccatg 35100
cccaaataat tctcatctcg ccaccttctc aatatatctc taagcaaatc ccgaatatta 35160
agtccggcca ttgtaaaaat ctgctccaga gcgccctcca ccttcagcct caagcagcga 35220
atcatgattg caaaaattca ggttcctcac agacctgtat aagattcaaa agcggaacat 35280
taacaaaaat accgcgatcc cgtaggtccc ttcgcagggc cagctgaaca taatcgtgca 35340
ggtctgcacg gaccagcgcg gccacttccc cgccaggaac catgacaaaa gaacccacac 35400
tgattatgac acgcatactc ggagctatgc taaccagcgt agccccgatg taagcttgtt 35460
gcatgggcgg cgatataaaa tgcaaggtgc tgctcaaaaa atcaggcaaa gcctcgcgca 35520
aaaaagaaag cacatcgtag tcatgctcat gcagataaag gcaggtaagc tccggaacca 35580
ccacagaaaa agacaccatt tttctctcaa acatgtctgc gggtttctgc ataaacacaa 35640
aataaaataa caaaaaaaca tttaaacatt agaagcctgt cttacaacag gaaaaacaac 35700
ccttataagc ataagacgga ctacggccat gccggcgtga ccgtaaaaaa actggtcacc 35760
gtgattaaaa agcaccaccg acagctcctc ggtcatgtcc ggagtcataa tgtaagactc 35820
ggtaaacaca tcaggttgat tcacatcggt cagtgctaaa aagcgaccga aatagcccgg 35880
gggaatacat acccgcaggc gtagagacaa cattacagcc cccataggag gtataacaaa 35940
attaatagga gagaaaaaca cataaacacc tgaaaaaccc tcctgcctag gcaaaatagc 36000
accctcccgc tccagaacaa catacagcgc ttccacagcg gcagccataa cagtcagcct 36060
taccagtaaa aaagaaaacc tattaaaaaa acaccactcg acacggcacc agctcaatca 36120
gtcacagtgt aaaaaagggc caagtgcaga gcgagtatat ataggactaa aaaatgacgt 36180
aacggttaaa gtccacaaaa aacacccaga aaaccgcacg cgaacctacg cccagaaacg 36240
aaagccaaaa aacccacaac ttcctcaaat cgtcacttcc gttttcccac gttacgtcac 36300
ttcccatttt aagaaaacta caattcccaa cacatacaag ttactccgcc ctaaaaccta 36360
cgtcacccgc cccgttccca cgccccgcgc cacgtcacaa actccacccc ctcattatca 36420
tattggcttc aatccaaaat aaggtatatt attgatgatg 36460
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性增强子元件
<400> 22
ggtgactttg cttctggag 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性增强子元件
<400> 23
ctccagaagc aaagtcacc 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性增强子元件
<400> 24
gtacttcata cttttcatt 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 内皮细胞特异性增强子元件
<400> 25
aatgaaaagt atgaagtac 19
<210> 26
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 缺氧反应元件
<400> 26
gcacgt 6
<210> 27
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 27
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
35 40

Claims (10)

1.降低或减小患者中肿瘤大小或消除肿瘤的方法，其包含施用患者有效量的核酸构建体，所述构建体包含可操作性连接到内皮细胞特异性启动子的Fas嵌合基因，其中由所述的核酸构建体编码的Fas嵌合基因产物降低或减小患者中肿瘤大小或消除肿瘤，而且其中所述的肿瘤与女性妇科癌症或其转移相关。
2.抑制、减少或降低肿瘤中新血管生成或血管发生的方法，其包含具有所述肿瘤的患者施用有效量的核酸构建体，所述构建体含有可操作性连接到内皮细胞特异性启动子的Fas嵌合基因，其中由所述的核酸构建体编码的Fas嵌合基因产物抑制、降低或减少肿瘤中新血管生成或血管发生，而且其中所述的肿瘤与女性妇科癌症或其转移相关。
3.治疗或预防患者中肿瘤的方法，所述肿瘤与米勒管癌、卵巢癌、腹膜癌、输卵管癌或子宫乳头状浆液性腺癌相关或衍生自这些癌症，所述方法包含施用有效量的核酸构建体，所述构建体包含可操作性连接到内皮细胞特异性启动子的Fas嵌合基因，其中由所述的核酸构建体编码的Fas嵌合基因产物治疗或预防女性妇科癌症或其转移。
4.权利要求2或3的方法，其中所述肿瘤或其转移在所述施用后大小减少或被消除。
5.权利要求4的方法，其中所述的肿瘤或其转移被减小，从而与施用前的最大直径(LD)相比，所述肿瘤的LD至少被减小了大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
6.权利要求2到5中任一项的方法，其中所述的女性妇科癌症与下列癌症相关或衍生自下列癌症：米勒管癌，卵巢癌，腹膜癌，输卵管癌，子宫乳头状浆液性腺癌或其组合。
7.权利要求1到6中任一项的方法，其中所述的肿瘤与米勒管癌相关或衍生自米勒管癌。
8.权利要求7的方法，其中米勒管癌是妇科恶性混合型米勒管癌或生殖器外恶性混合型米勒管癌。
9.权利要求1到6中任一项的方法，其中卵巢癌是卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞癌或卵巢低恶性潜能癌。
10.权利要求1到6中任一项的方法，其中腹膜癌是腹膜瘤或腹膜间皮瘤。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110621350A (zh) * 2017-01-06 2019-12-27 稳定技术生物制药有限公司 病毒
CN111356480A (zh) * 2017-10-20 2020-06-30 脉管生物生长有限公司 用于抗血管生成剂疗法的诊断方法

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201500048SA (en) 2010-01-05 2015-03-30 Vascular Biogenics Ltd Compositions and methods for treating glioblastoma gbm
JP6196040B2 (ja) 2010-01-05 2017-09-13 バスキュラー バイオジェニックス リミテッド 特異的な抗血管形成アデノウイルス剤の使用法
SG11201502941VA (en) 2012-10-17 2015-05-28 Vascular Biogenics Ltd Treatment methods using adenovirus
EP2951307B1 (en) * 2013-02-04 2019-12-25 Vascular Biogenics Ltd. Methods of inducing responsiveness to anti-angiogenic agent
EP3127545B1 (en) * 2014-04-04 2020-06-03 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-tumor drug containing taxane compound, and anti-tumor effect enhancer
ES2796857T3 (es) 2014-04-17 2020-11-30 Inst Nat Sante Rech Med Polipéptidos y usos de los mismos para reducir la motilidad celular mediada por CD95
FI127460B (en) * 2016-01-15 2018-06-29 Targovax Oy COMBINATION OF ADENOVIRUS AND CHEMOTHERAPY AGENTS FOR CANCER CARE
CA3123853A1 (en) * 2018-12-20 2020-06-25 The University Of Chicago Methods and compositions related to therapeutic peptides for cancer therapy
WO2020183424A1 (en) * 2019-03-13 2020-09-17 Vascular Biogenics Ltd. Methods of anti-tumor therapy
KR20210152504A (ko) * 2019-04-12 2021-12-15 바스큘라 바이오제닉스 리미티드 항종양 요법의 방법
KR102601875B1 (ko) * 2020-03-25 2023-11-14 (주)큐리진 면역 회피성 항종양 아데노바이러스
WO2022056488A1 (en) * 2020-09-14 2022-03-17 Genprex, Inc. Nonviral vectors for increasing fas expression in cancer cells and methods of use thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011083464A2 (en) * 2010-01-05 2011-07-14 Vascular Biogenics Ltd. Methods for use of a specific anti-angiogenic adenoviral agent
WO2011086509A1 (en) * 2010-01-12 2011-07-21 Vascular Biogenics Ltd. Methods of producing adenovirus vectors and viral preparations generated thereby
US20130209450A1 (en) * 2010-01-05 2013-08-15 Yael Cohen Compositions and Methods for Treating Glioblastoma GBM

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3773319A (en) 1971-12-16 1973-11-20 Fabcor Ind Inc Corrugated sheet inverting machine
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US5747469A (en) 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
DE69434594T2 (de) 1993-10-25 2006-09-21 Canji, Inc., San Diego Rekombinante adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
UA70909C2 (uk) 1993-10-25 2004-11-15 Канджи Інк. Рекомбінантний аденовірусний вектор, фармацевтична композиція, що його містить, та набір для зменшення проліферації пухлинних клітин
US7070771B1 (en) * 1996-12-09 2006-07-04 Regents Of The University Of California Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells
AU2003222427B8 (en) 2000-11-17 2010-04-29 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same
US20100282634A1 (en) 2000-11-17 2010-11-11 Dror Harats Promoters Exhibiting Endothelial Cell Specificity and Methods of Using Same for Regulation of Angiogenesis
US8071740B2 (en) 2000-11-17 2011-12-06 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis
US20070286845A1 (en) 2000-11-17 2007-12-13 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis
US8039261B2 (en) 2000-11-17 2011-10-18 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same for regulation of angiogenesis
US7067649B2 (en) 2000-11-17 2006-06-27 Vascular Biogenics Ltd. Promoters exhibiting endothelial cell specificity and methods of using same
WO2003033514A1 (en) * 2001-10-19 2003-04-24 Vascular Biogenics Ltd. Polynucleotide constructs, pharmaceutical compositions and methods for targeted downregulation of angiogenesis and anticancer therapy
CN1294268C (zh) 2001-09-03 2007-01-10 上海三维生物技术有限公司 可在肿瘤细胞内特异性复制并扩散的重组腺病毒载体
KR20070044868A (ko) 2005-10-26 2007-05-02 주식회사 바이오인프라 스트렙토라이신 ｏ 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하는재조합 아데노바이러스 및 이를 유효성분으로 하는 항암용조성물
AU2007280017B2 (en) 2006-07-31 2012-04-12 Vascular Biogenics Ltd. Polypeptides and polynucleotides encoding same and use thereof in the treatment of medical conditions associated with ischemia
US20100034775A1 (en) 2006-12-20 2010-02-11 Shenzhen Well. D Genetic Engineering Co., Ltd. RECOMBINANT ADENOVIRUS COMPRISING RECOMBINANT khp53 GENE AND THE PREPARATION METHOD AND USES THEREOF
CN101348512B (zh) 2007-07-20 2012-08-15 郑州威瑞生物技术有限公司 一种抗肿瘤的腺病毒制剂
JP4896102B2 (ja) 2008-09-12 2012-03-14 富士フイルム株式会社 レンズ装置
KR101248912B1 (ko) 2009-12-31 2013-03-29 한양대학교 산학협력단 항혈관신생 활성을 가지는 재조합 아데노바이러스
KR101253276B1 (ko) 2010-07-27 2013-04-10 윤채옥 복합 유전자 치료용 항종양 조성물
KR101232123B1 (ko) 2010-10-08 2013-02-12 연세대학교 산학협력단 재조합된 유전자발현 조절서열을 가지는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체
CN103261298B (zh) 2010-10-18 2014-07-16 道达尔研究技术弗吕公司 能膨胀的乙烯基芳族聚合物
WO2012052878A1 (en) 2010-10-19 2012-04-26 Vascular Biogenics Ltd. Isolated polynucleotides and nucleic acid constructs for directing expression of a gene-of-interest in cells
SG11201502941VA (en) * 2012-10-17 2015-05-28 Vascular Biogenics Ltd Treatment methods using adenovirus
EP2951307B1 (en) 2013-02-04 2019-12-25 Vascular Biogenics Ltd. Methods of inducing responsiveness to anti-angiogenic agent

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011083464A2 (en) * 2010-01-05 2011-07-14 Vascular Biogenics Ltd. Methods for use of a specific anti-angiogenic adenoviral agent
US20130209450A1 (en) * 2010-01-05 2013-08-15 Yael Cohen Compositions and Methods for Treating Glioblastoma GBM
WO2011086509A1 (en) * 2010-01-12 2011-07-21 Vascular Biogenics Ltd. Methods of producing adenovirus vectors and viral preparations generated thereby

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110621350A (zh) * 2017-01-06 2019-12-27 稳定技术生物制药有限公司 病毒
CN111356480A (zh) * 2017-10-20 2020-06-30 脉管生物生长有限公司 用于抗血管生成剂疗法的诊断方法

Also Published As

Publication number Publication date
HUE042262T2 (hu) 2019-06-28
AU2018271398A1 (en) 2018-12-20
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EP2908865A2 (en) 2015-08-26
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US9200056B2 (en) 2015-12-01
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KR101989171B1 (ko) 2019-06-14
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US11311583B2 (en) 2022-04-26
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