JPH09510620A - 神経膠細胞神経栄養因子（ｇｄｎｆ）をコードする組み換えアデノウィルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 神経膠細胞−由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする異種ＤＮＡ配列を含む組み換えアデノウィルス、それらの製造、及び変性神経疾患の処置及び／又は予防のためのそれらの利用。

Description

【発明の詳細な説明】 神経膠細胞神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をコードする 組み換えアデノウィルス 本発明は神経膠細胞−由来神経栄養因子をコードするＤＮＡ配列を含む組み換 えアデノウィルスに関する。本発明はこのようなベクターの製造、それらを含む 製薬学的組成物、及び特に神経変性疾患の処置及び／又は予防のための遺伝子療 法におけるそれらの治療的利用にも関する。 西欧諸国における寿命の延びは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンテ ィングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の安定した増加を伴 っている。かくして例えばパーキンソン病は６５才以上の人々の４％を冒し、ア ルツハイマー病は７０才以上の人々の１０％、及び８０才以上の人々の３０％を 冒している。一般にこれらの疾患はすべて中枢神経系における、あるいはパーキ ンソン病の場合のように非常に局在化した構造内における神経細胞の累進的損失 から生ずる。 近年、老化に伴うこの変性の遺伝子療法による処置及び又、その予防のための 手段を開発するという観点で、その機構の理解のための多数の研究計画が展開さ れてきた。 神経変性疾患は神経細胞の累進的死の発現なので、これらの神経細胞の発生に 含まれる成長因子の生産の刺激が実際に、この変性を予防する、又はそれに対抗 する可能なルートであると思われてきた。 本発明の目的は特に、ある種の栄養因子の有効で局所的な方法における発現に より、これらの病気に含まれる神経細胞の残存を直接促進することを可能にする ベクターを提供することである。 栄養因子は軸索成長又は神経細胞の残存を刺激するための性質を有する種類の 分子である。神経栄養性を有する第１の因子、ＮＧＦ（神経成長因子）は約４０ 年前に特性決定された（再調査のためにＬｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ ａｎ ｄ Ａｎｇｅｌｌｅｔｉ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８（１９６８）５３４を 参照されたい）。他の神経栄養因子、特に神経膠細胞−由来神経栄養因子（ＧＤ ＮＦ）（Ｌ．−Ｆ．Ｌｉｎ，Ｄ．Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｊ．Ｌｉｌｅ，Ｓ．Ｂｅｓｋ ｔｅｓｈ，Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，１１３０−１１３２ （１９９３））が同定されたのは最近になって初めてであった。ＧＤＮＦは１６ ｋＤの分子量を有する１３４アミノ酸のタンパク質である。その必須の機能は試 験管内におけるドパミン作用性ニューロンの残存の促進である。 本発明は治療薬の形態でＧＤＮＦを投与するのに特に有利である。 さらに特定的に本発明は、神経系において治療的活性量のＧＤＮＦをコードす る特異的遺伝子を生体内において、及び局所的に送達するための特に有効なベク ターの開発を目的とする。 同時係属中の出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２５１９において、生体内におい て異種遺伝子を神経系中に転移させ、対応するタンパク質を発現させるためのベ クターとしてアデノウィルスを用いることができることが示された。 さらに特定的に本発明は、神経膠細胞−由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を転移 させるために特に適応させられ、有効である新規な構築物に関する。 さらに正確に本発明は、ＧＤＮＦをコードするＤＮＡ配列又はその誘導体を含 む組み換えアデノウィルス、その製造、ならびに神経変性疾患 の処置及び／又は予防のためのその利用に関する。 かくして出願人は、ＧＤＮＦをコードする配列を含む組み換えアデノウィルス を構築し、これらの組み換えアデノウィルスを生体内において投与することが可 能であること、ならびにこの投与が生体内において、特に神経系において、細胞 病理学的影響なく、治療的活性量のＧＤＮＦの安定で局所的発現を可能にするこ とを示した。 かくして本発明の最初の主題は、神経膠細胞−由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ） 又はそれらの誘導体の１つの全体又はその活性部分をコードする少なくとも１つ のＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルスである。 本発明の範囲内で生産される神経膠細胞−由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）はヒ トＧＤＮＦ又は動物のＧＤＮＦであることができる。 ヒトＧＤＮＦ及びラットＧＤＮＦをコードするｃＤＮＡ配列はクローニングさ れ、配列決定されている（Ｌ．−Ｆ．Ｌｉｎ，Ｄ．Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｊ．Ｌｉｌ ｅ，Ｓ．Ｂｅｓｋｔｅｓｈ，Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０，１ １３０−１１３２（１９９３））。 ＧＤＮＦをコードし、本発明の範囲内で用いられるＤＮＡ配列はｃＤＮＡ、ゲ ノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、又は例えば１つ又はそれ以上のイントロンが挿入され ていることができるｃＤＮＡを含むハイブリッド構築物であることができる。配 列は合成又は半合成配列を含むこともできる。本発明の配列は本来のプロ領域に より先行されているＧＤＮＦ（プロＧＤＮＦ）をコードするのが特に有利である 。 ｃＤＮＡ又はｇＤＮＡを用いるのが特に有利である。本発明の好ましい実施態 様に従うと、配列はＧＤＮＦをコードするｇＤＮＡ配列である。 この後者の配列の使用は、ヒト細胞において発現を増加させることを可能にする 。 当然、本発明のアデノウィルスベクターへのその挿入の前に、ＤＮＡ配列は、 例えば特定部位の突然変異誘発により、特に適した制限部位の挿入のために有利 に改変される。かくして先行技術において記載されている配列は実際に本発明で 用いることができるように構築されてはおらず、実質的量の発現を得るためには あらかじめ適応させることが必要であることが証明され得る。 本発明の意味の範囲内でＧＤＮＦの誘導体は、改変により得られ、ＧＤＮＦの 生物学的性質（栄養的及び／又は分化効果）の少なくとも１つを保存している産 物をコードするいずれの配列をも意味すると理解される。改変はいずれの突然変 異、置換、欠失、付加、あるいは遺伝的及び／又は化学的性質の改変をも意味す ると理解されるべきである。これらの改変は当該技術分野における熟練者に既知 の方法により行うことができる（下記の一般的分子生物学法を参照されたい）。 本発明の意味の範囲内における誘導体は、プローブとして本来の配列又はそのフ ラグメントを用いた核酸ライブラリからのハイブリッド形成により得ることもで きる。 これらの誘導体は特に、それらの結合の部位に関するより大きな親和力を有す る分子、生体内における発現を強化させる配列、プロテアーゼに対するより大き な抵抗性を有する分子、ならびにより大きな治療的有効性又はより少ない副作用 、あるいはおそらく新規な生物学的性質を有する分子である。 最も特定的に挙げることができる好ましい誘導体は自然の変異体、１ つ又はそれ以上の残基が置換された分子、考慮されている結合部位との相互作用 に含まれない、又は限られた程度でしか含まれない、あるいは望ましくない活性 を発現する領域の欠失により得られる誘導体、及び本来の配列における残基に付 加的な、例えば分泌シグナル及び／又は結合ペプチドなどの残基を含む誘導体で ある。 本発明の１つの好ましい実施態様に従うと、ＧＤＮＦ又はその誘導体の１つを コードするＤＮＡ配列は、合成されるＧＤＮＦを感染細胞の分泌経路中に方向付 けることを可能にする分泌シグナルも含む。１つの好ましい実施態様に従うと、 ＤＮＡ配列は５’位置に、及びＧＤＮＦをコードする配列を有する読み枠内に分 泌配列を含む。この方法で合成されるＧＤＮＦは有利に細胞外区画に放出され、 この方法でそのレセプターを活性化することができる。分泌シグナルはＧＤＮＦ の本来の分泌シグナルであるのが有利である（下記において「プレ」という用語 で呼ぶ）。しかし分泌配列は異種の、又は人工的分泌シグナルであることさえで きる。ＤＮＡ配列はプレ−ＧＤＮＦ、又はさらに特定的にヒトプレ−ＧＤＮＦを コードするのが有利である。 ＧＤＮＦをコードする配列は神経細胞におけるＧＤＮＦの発現を可能にするシ グナルの調節下に置かれるのが有利である。これらのシグナルは異種発現シグナ ル、すなわちＧＤＮＦの発現を自然に担っているシグナルと異なるシグナルであ るのが好ましい。それらは特に他のタンパク質又は合成配列の発現を担う配列で あることができる。特にそれらは真核又はウィルス遺伝子のプロモーター配列で あることができる。例えばそれらは感染することが望まれている細胞のゲノムか ら誘導されるプロモーター配列であることができる。同様にそれらは、用いられ るアデノ ウィルスを含むウィルスのゲノムから誘導されるプロモーター配列であることが できる。これに関して挙げることができるプロモーターの例はＥ１Ａ、ＭＬＰ、 ＣＭＶ、ＲＳＶ−ＬＴＲなどである。さらにこれらの発現配列は、活性化配列又 は調節配列、あるいは組織−特異的発現を可能にする配列の付加により改変する ことができる。かくして、神経細胞において特異的に、又は主に活性である発現 シグナルを用い、ウィルスが実際に神経細胞に感染した場合のみにＤＮＡ配列が 発現され、その効果を生み出すようにするのが特に興味深い。これに関して挙げ ることができるプロモーターの例はニューロン−特異的エノラーゼのプロモータ ー、ＧＦＡＰのプロモーターなどである。 第１の特定の実施態様において、本発明はＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの調節 下にヒトプレ−ＧＤＮＦをコードするｃＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウ ィルスに関する。 他の特定の実施態様において、本発明はＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの調節下 にヒトプレ−ＧＤＮＦをコードするｇＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィ ルスに関する。 かくして出願人は、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）のＬＴＲプロモーターが神 経系、特に中枢神経系の細胞においてＧＤＮＦを長期間、及び実質的量で発現す ることを可能にすることを示した。 さらに好ましい実施態様の範囲内において、本発明は神経系において最も多く の発現が起こることを可能にするプロモーターの調節下にヒトＧＤＮＦ又はそれ らの誘導体の全体又は活性部分をコードするＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデ ノウィルスに関する。 本発明の特に好ましい実施態様は、ＩＴＲ配列、包膜を可能にする配 列、神経膠細胞−由来ヒト神経栄養因子（ｈＧＤＮＦ）又はそれらの誘導体を、 神経系において最も多い発現が起こることを可能にするプロモーターの調節下に 含み、Ｅ１遺伝子、ならびにＥ２、Ｅ４及びＬ１〜Ｌ５遺伝子の少なくとも１つ が非−機能性である欠失組み換えアデノウィルスである。 本発明の欠失アデノウィルスは、標的細胞において自律的に複製することがで きないアデノウィルスである。従って一般に本発明の範囲内で用いられる欠失ア デノウィルスのゲノムは、少なくとも感染細胞における該ウィルスの複製に必要 な配列が欠けている。これらの領域は除去されるか（完全に、又は部分的に）、 又は非−機能性とされるか、あるいは種々の配列により、特にＧＤＮＦをコード するＤＮＡにより置換されていることができる。 本発明の欠失ウィルスはウィルス粒子の包膜に必要な配列をそのゲノムに保存 しているのが好ましい。さらに好ましくは、上記の通り、本発明の欠失組み換え アデノウィルスのゲノムはＩＴＲ配列、包膜を可能にする配列、非−機能性Ｅ１ 遺伝子、ならびに非−機能型の遺伝子Ｅ２、Ｅ４及びＬ１〜Ｌ５の少なくとも１ つを含む。 構造及び性質がいくらか異なる種々のアデノウィルスの血清型が存在する。こ れらの血清型の中で、２又は５型ヒトアデノウィルス（Ａｄ２又はＡｄ５）、あ るいは動物起源（出願ＦＲ９３ ０５９５４を参照されたい）のアデノウィルス の利用が本発明の範囲内で好ましい。本発明の範囲内で用いることができ、挙げ ることができる動物起源のアデノウィルスはイヌ、ウシ、ネズミ（例えば：Ｍａ ｖ１，Ｂｅａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１） 、ヒツジ、ブタ、ト リあるいは又、サル（例えば：ＳＡＶ）起源のアデノウィルスである。動物起源 のアデノウィルスはイヌアデノウィルス、さらに特定的にＣＡＶ２アデノウィル スが好ましい［例えばＭａｎｈａｔｔａｎ株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ −８００）］。本発明の範囲内でヒト又はイヌ起源、あるいはこれらの混合物起 源のアデノウィルスを用いるのが好ましい。 本発明の欠失組み換えアデノウィルスは当該技術分野における熟練者に既知の いずれの方法によっても製造することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ． ，Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５，ＥＰ １８５ ５７３；Ｇｒａｈａｍ ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７）。特にそれらはアデノウィルス及び 、中でもＧＤＮＦをコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドの間の相同的組み 換えにより製造することができる。相同的組み換えは適した細胞系中に該アデノ ウィルス及びプラスミドをコトランスフェクションした後に起こる。用いられる 細胞系は好ましくは（ｉ）該要素により形質転換可能でなくてはならず、（ｉｉ ）アデノウィルスゲノムの欠失部分を補足できる配列を、組み換えの危険を避け るために好ましくは組み込まれた形態で含まなければならない。細胞系の例とし てヒト胚腎臓細胞系２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ ｏｌ．３６（１９７７）５９）を挙げることができ、それは特にＡｄ５アデノウ ィルスのゲノムの左部分（１２％）をそのゲノムに組み込んで含む。アデノウィ ルスに由来するベクターの構築のための戦術も出願番号ＦＲ９３ ０５９５４及 びＦＲ９３ ０８５９６に記載されており、それらは引用することにより本明細 書の内容となる。 後に、増殖したアデノウィルスを回収し、実施例に記載の従来の分子生物学法 に従って精製する。 特に有利な本発明のベクターの性質は、特に用いられる構築物（あるウィルス 領域が欠失した欠失アデノウィルス）、ＧＤＮＦをコードする配列の発現のため に用いられるプロモーター（好ましくはウィルス又は組織−特異的プロモーター ）、ならびに該ベクターの投与の方法に由来し、ＧＤＮＦの有効な、及び適した 組織における発現を生ずる。かくして本発明は遺伝子療法において直接用いるこ とができ、特に生体内におけるＧＤＮＦの発現を方向付けるために適しており、 有効であるウィルスベクターを提供する。かくして本発明は神経変性疾患の処置 及び／又は予防のために特に有利な新規な方法を提供する。 本発明は神経変性疾患の処置及び／又は予防を目的とする製薬学的組成物の製 造のための、上記のアデノウィルスの利用にも関する。 さらに特定的に本発明はパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬 化症（ＡＬＳ）、ハンティングトン病、てんかん及び血管性痴呆の処置及び／又 は予防を目的とする製薬学的組成物の製造のためのこれらのアデノウィルスの利 用に関する。 本発明は１種又はそれ以上の前記の欠失組み換えアデノウィルスを含む製薬学 的組成物にも関する。これらの製薬学的組成物は中でも局所的、経口的、非経口 的、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内又は経皮的経路によりそれらを投与する 観点を持って調製することができる。本発明の製薬学的組成物は注入用調剤のた めの、特に患者の神経系に直接注入するための製薬学的に許容され得る賦形剤を 含むのが好ましい。これらの注入用調剤は特に等張無菌溶液、あるいは臨機応変 に無菌水又は生理食 塩水をそれらに添加することにより注入用溶液を構築できる乾燥、特に凍結乾燥 組成物であることができる。患者の神経系中への直接の注入は、冒された組織の レベルに治療効果を集中させることを可能にするので有利である。患者の中枢神 経系中への直接の注入は、定位的注入装置を用いて行うのが有利である。この理 由は、そのような装置の使用が、高い精度で注入部位を狙うことができるように することである。 これに関し、本発明は上記で定義された組み換えアデノウィルスを患者に投与 することを含む、神経変性疾患の処置のための方法にも関する。さらに特定的に 、本発明は上記で定義された組み換えアデノウィルスの定位的投与を含む神経変 性疾患の処置のための方法に関する。 注入のために用いられる欠失組み換えアデノウィルスの投薬量は種々のパラメ ーターに依存して、特に用いられる投与様式、関連する病理学、ならびに求めら れている処置の持続期間に従って調節することができる。一般に本発明の組み換 えアデノウィルスは１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆ ｕ／ｍｌを含む投薬量の形態で調製され、投与される。ｐｆｕ（「プラーク形成 単位」）という用語はウィルス溶液の感染力を示し、適した細胞培養に感染させ 、次いで一般に４８時間後に感染細胞のプラークの数を測定することにより決定 される。ウィルス溶液のｐｆｕ力価の決定のための方法は文献において十分に例 証されている。 本発明は、１種又はそれ以上の上記の欠失組み換えアデノウィルスに感染した 哺乳類細胞にも関する。さらに特定的に本発明は、これらのアデノウィルスに感 染したヒト細胞集団に関する。これらの細胞は特に繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細 胞、表皮細胞、内皮細胞、神経膠細胞などで あることができる。 本発明の細胞は一次培養から誘導することができる。これらの細胞を当該技術 分野における熟練者に既知の方法により取り出し、次いでそれらの増殖を可能に する条件下で培養することができる。さらに特定的に繊維芽細胞に関しては、こ れらの細胞を例えばＨａｍ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１ａ（１ ９８０）２５５］により記載の方法に従って生検から容易に得ることができる。 これらの細胞をアデノウィルスによる感染に直接用いることができ、あるいは後 の使用のためのオートロガスバンクの確立のために例えば凍結により保存するこ とができる。本発明のこれらの細胞は例えばあらかじめ確立されたバンクから得 られる二次培養であることもできる。 次いで培養中の細胞を組み換えアデノウィルスに感染させ、細胞にＧＤＮＦを 生産する能力を与える。感染は当該技術分野における熟練者に既知の方法に従っ て試験管内において行われる。特に用いられる細胞の型及び必要な細胞当たりの ウィルスコピーの数に従い、当該技術分野における熟練者は感染多重度、及び適 宜、行われる感染のサイクルの数を調節することができる。当然これらの段階は 、細胞が生体内投与を予定されているので、適した無菌の条件下で行われなけれ ばならない。細胞の感染のために用いられる組み換えアデノウィルスの投薬量は 、求められている目的に従って当該技術分野における熟練者が調節することがで きる。生体内投与のための上記の条件は、試験管内における感染にも適用され得 る。 本発明は１種又はそれ以上の上記の欠失組み換えアデノウィルスに感染した哺 乳類細胞及び細胞外マトリックスを含む体内埋植物にも関する。 本発明の体内埋植物は１０⁵〜１０¹⁰個の細胞を含むのが好ましい。それらは１ ０⁶〜１０⁸個を含むのがより好ましい。 さらに特定的に、本発明の体内埋植物における細胞外マトリックスはゲル−形 成化合物及び場合により細胞の固定のための担体を含む。 本発明の体内埋植物の製造のために種々の型のゲル−形成剤を用いることがで きる。ゲル−形成剤はゲル構造を有するマトリックスに細胞を閉じ込め、必要が 生じたら、担体上への細胞の固定を容易にするために用いられる。従って種々の 細胞接着剤、特にコラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン類、フィブロネ クチン、レクチン類などをゲル−形成剤として用いることができる。本発明の範 囲内ではコラーゲンを用いるのが好ましい。このコラーゲンはヒト、ウシ又はネ ズミ起源であることができる。さらに好ましくは、Ｉ型コラーゲンが用いられる 。 上記の通り、本発明の組成物は細胞の固定のための担体を含むのが有利である 。固定という用語は、担体上への細胞の接着及び／又は結合を生ずるいずれの形 態の生物学的及び／又は化学的及び／又は物理的相互作用をも示す。さらに細胞 は用いられる担体を覆う、及び／又はこの担体の内部に浸透することができる。 無毒性及び／又は生物適合性固体担体の使用が本発明の範囲内で好ましい。特に ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）繊維又は生物起源の担体を用いること ができる。 本発明の体内埋植物は生物の種々の部位において体内埋植することができる。 特に体内埋植は腹腔のレベルにおいて、皮下組織（恥骨上領域、腸骨窩及び猟径 窩など）において、臓器、筋肉、腫瘍、中枢神経系において、ならびに又、角質 化下（ｕｎｄｅｒ ａ ｃｏｒｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）において行うことができ る。本発明の体内埋植は、それらが生 物内における治療的産物の放出を調節することを可能にするという点で特に有利 である：この放出は最初に感染の多重度により、及び体内埋植細胞の数により決 定される。その後放出は処置を終局的に停止する体内埋植物の収縮により調節さ れるか、あるいは治療的遺伝子の発現を誘導又は抑制することを可能にする調節 可能な発現系の使用により調節されることができる。 かくして本発明は神経変性疾患の処置及び／又は予防のために非常に有効な手 段を提供する。それは非常に特定的にはアルツハイマー病、パーキンソン病、ハ ンティングトン病の処置のために、及びＡＬＳの処置のために適応させられる。 さらに本発明のアデノウィルスベクターは、特に神経細胞の感染における非常に 高いそれらの効率と結び付いた重要な利点を示し、それにより小容積のウィルス 懸濁液を用いて感染を行うことを可能にする。さらに本発明のアデノウィルスに よる感染は注入の部位に高度に局在化しており、それは隣接する脳構造への拡散 の危険を避ける。 さらに、この処置はヒツジ、ウシ、家畜（イヌ、ネコなど）、ウマ、サカナな どのいずれの動物の場合とも同様に、ヒトの場合に容易に用いることができる。 本発明を以下の実施例を用いてさらに詳細に説明するが、それは本発明を例示 しており、制限ではないと考えられるべきである。図の説明 図１：ベクターｐＬＴＲ ＩＸ−ＧＤＮＦの図一般的分子生物学法 分子生物学において用いられる標準的方法、例えばプラスミドＤＮＡ の調製的抽出、塩化セシウム勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心、アガロース 又はアクリルアミドゲル上の電気泳動、電気溶出によるＤＮＡフラグメントの精 製、タンパク質のフェノール又はフェノール／クロロホルムを用いた抽出、食塩 水媒体中のＤＮＡのエタノール又はイソプロパノールを用いた沈降、エシェリキ ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中への形質転換などは当該技術 分野における熟練者に周知であり、文献に広く記載されている［Ｍａｎｉａｔｉ ｓ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａｌＦ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８ ２；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＦ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。 ｐＢＲ３２２及びｐＵＣなどのプラスミド、ならびにＭ１３系列のファージは 商業的に得た（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）。 連結のために、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲルにお ける電気泳動によりそれらの寸法に従って分離し、フェノールを用いて、又はフ ェノール／クロロホルム混合物を用いて抽出し、エタノールにより沈降させ、次 いで供給者の勧告に従ってファージＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の 存在下でインキュベートすることができる。 突出（Ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）５’末端は、供給者の規格に従ってＥ． コリ ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い て充填（ｆｉｌｌｅｄ ｉｎ）することができる。突出３’末端はＴ４ファージ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で、それを製造者の勧告に従っ て用いて破壊される。突出５’末端はＳ１ヌクレアーゼを用いた、注意深い処理 により破壊される。 合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いた試験管内における特定部位の突然変 異誘発は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法に従い、Ａｍｅ ｒｓｈａｍにより販売されるキットを用いて行うことができる。 ＰＣＲ［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ＣｈａｉｎＲｅａｃｔ ｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９ ８５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］と呼ば れる方法によるＤＮＡフラグメントの酵素的増幅は、「ＤＮＡサーマルサイクラ ー」（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ ｓ）を用い、製造者の規格に従って行うことができる。 ヌクレオチド配列はＳａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７］により開発され た方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍにより販売されるキットを用いて確認すること ができる。実施例 実施例１：ベクターｐＬＴＲ ＩＸ−ＧＤＮＦの構築 この実施例はＲＳＶウィルスＬＴＲの調節下においてラットプレ−ＧＤＮＦを コードする配列、ならびに生体内における組み換えを可能にするアデノウィルス 配列を含むベクターｐＬＴＲ ＩＸ−ＧＤＮＦの構築を説明する。 ラットプレ−ＧＤＮＦをコードするｃＤＮＡのクローニング。クローニングは ＰＣＲ法を用いて行い、それはラット神経膠細胞由来のＲＮＡの逆転写により得 られるこれらの細胞のｃＤＮＡを用い、以下のオリゴヌクレオチドを鋳型として 用いる： ５’オリゴヌクレオチド：CCGTCGACCTAGGCCACCATGAAGTTA TGGGATGTC ３’オリゴヌクレオチド：CCGTCGACATGCATGAGCTCAGATACA TCCACACC ＰＣＲ法により得られるフラグメントをゲル精製に供し、制限酵素ＳａＩＩで 切断した後、それらをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスミ ド中に、ＳａＩＩ部位において挿入した。ＳＶ４０に由来するポリアデニル化配 列が同プラスミドのＸｈｏＩ部位中にあらかじめ挿入されていた。このプラスミ ドをＳＫ−ＧＤＮＦ−ＰｏｌｙＡと呼ぶ。 ベクターｐＬＴＲＩＸ−ＧＤＮＦは、ＳＫ−ＧＤＮＦ−ＰｏｌｙＡをＣｌａＩ 及びＫｐｎＩ（Ｋｐｎｌ末端は平滑化される）を用いて切断することにより得ら れる挿入片をプラスミドｐＬＴＲＩＸ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ，Ｐｅｒｒｉｃａｕ ｄｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ；Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）ｐ６２ ６）のＣｌａＩ及びＥｃｏＲＶ部位の間に導入することにより得た。 実施例２．ＧＤＮＦをコードする配列を含む組み換えアデノウィルスの構築 ベクターｐＬＴＲ ＩＸ−ＧＤＮＦを線状化し、欠失アデノウィルスベクター と共に、アデノウィルスＥ１（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）領域によりコードされる機能 をトランス（ｔｒａｎｓ）において与えるヘルパー細胞（系２９３）中にコトラ ンスフェクトした。 さらに特定的に、アデノウィルスＡｄ−ＧＤＮＦを、以下の案に従って突然変 異体アデノウィルスＡｄ−ｄ１１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ ｅｔ ａｌ ．，Ｃｅｌｌ ３１（１９８２）５４３）及びベクターｐＬＴＲ ＩＸ−ＧＤＮ Ｆの間の生体内における相同的組み換えにより得た：酵素ＣｌａＩを用いて線状 化されたプラスミドｐＬＴＲ ＩＸ−ＧＤＮＦ及びアデノウィルスＡｄ−ｄ１１ ３２４をリン酸カルシウムの存在下で系２９３中にコトランスフェクトし、相同 的組み換えを起こさせた。かくして生成された組み換えアデノウィルスをプラー ク精製により選択した。単離の後、組み換えアデノウィルスＤＮＡを細胞系２９ ３において増幅し、約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する非精製欠失組み換えア デノウィルスを含む培養上澄み液を得た。 続いてウィルス粒子を勾配遠心により精製した。 実施例３：黒質線状体路の外傷を有するラットへの、組み換えアデノウィルスを 用いたＧＤＮＦ遺伝子の生体内転移 この実施例は、本発明のアデノウィルスベクターを用いたＧＤＮＦ遺伝子の生 体内転移を記載する。それは黒質線状体路の外傷の動物モデルを用い、本発明の ベクターが治療的量のＧＤＮＦの生体内における発現の誘導を可能にすることを 示す。 あらかじめ麻酔されたラットの黒質線状体路を、毒素６−ヒドロキシドパミン （６ＯＨ−ＤＡ）の注入により、中脳路（ＭＦＢ）のレベルで傷付けた。注入に より誘導されるこの化学的外傷は、以下の定位座標に従って片側性であった：Ａ Ｐ：０及び−１；ＭＬ：＋１．６；Ｖ：−８．６及び−９（ＡＰ及びＭＬ座標は ブレグマに関して、Ｖ座標は硬膜に関して決定される）。切断の線は＋５ｍｍの レベルに固定する。 外傷が作られた直後に組み換えアデノウィルスＧＤＮＦを、外傷の側において 黒質及び線条中に注入した。さらに特定的に、注入されるアデノウィルスは前に 製造されたＡｄ−ＧＤＮＦアデノウィルスであり、リン酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢ Ｓ）中において精製形態（３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌ）で用いる。 注入はポンプに接続されたカニューラ（外径２８０μｍ）を用いて行われた。 注入の速度は０．５μｌ／分に固定され、その後カニューラを除去する前にその 場所にさらに４分間留める。線条及び黒質中への注入容積はそれぞれ２ｘ３μｌ 及び２μｌである。注入されるアデノウィルス濃度は３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μ ｌである。 黒質中への注入の場合、以下の定位座標を用いる：ＡＰ＝−５．８；ＭＬ＝＋ ２；Ｖ＝−７．５（ＡＰ及びＭＬ座標はブレグマに関して、Ｖ座標は硬膜に関し て決定される）。 線条中への注入の場合、以下の定位座標を用いる：ＡＰ＝＋０．５及び−０． ５；ＭＬ＝３；Ｖ＝−５．５（ＡＰ及びＭＬ座標はブレグマに関して、Ｖ座標は 硬膜に関して決定される）。 本発明のアデノウィルスの投与の治療的効果を３種類の分析：組織学的及び免 疫組織化学的分析、定量的分析、ならびに挙動的分析により示 した。組織学的及び免疫組織化学的分析 黒質線状体路の化学的外傷は黒質におけるニューロン損失、ならびに線条にお けるドパミン作用性脱神経（抗−チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＨ抗体を用いて 免疫組織学において明らかにされる変化）を誘導する。 注入された脳の組織学的分析は、実施例６に記載の条件下でＡｄ−ＧＤＮＦア デノウィルスの脳内注入の３週間後に行う。黒質及び線条から３０μｍの厚さの 冠状系列切片を採取する。１８０μｍの間隔で離れた切片（６切片の中の１切片 ）をクレシルバイオレットで染色し（ニューロン密度を評価するため）、抗−チ ロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体を用いて免疫標識する（黒質におけるドパ ミン作用性ニューロン及び線条におけるそれらの脱神経を検出するため）。定量的分析 黒質におけるドパミン作用性ニューロン（ＴＨ−陽性）の数は、Ａｄ−ＧＤＮ Ｆアデノウィルスの効果の評価のためのパラメーターである。試料（黒質の全長 に関する６切片中の１切片）につき計数を行う。各切片に関し、黒質の両側につ き別々にＴＨ−陽性ニューロンを計数する。すべての切片に関する累積の結果を ：損傷側のＴＨ−陽性ニューロンの数対非損傷側のＴＨ−陽性ニューロンの数の 比率として表す。挙動的分析 Ａｄ−ＧＤＮＦアデノウィルスの注入により発生する黒質線状体路の外傷への 保護機能的効果を評価するために、２つの挙動試験：ドパミン作用性作用薬（ア ポモルフィン、アンフェタミン及びレボドパ）により誘導される回転の試験、及 び捕捉（手−到達）試験の間に動物の感覚運 動性能を分析する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/27 ＡＡＭ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＡＢ 47/48 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 48/00 ＡＡＢ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ０７Ｈ 21/04 9282−4Ｂ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＡＭ 7/00 9051−4Ｃ 37/12 ＡＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ペリコーデ， ミシエル フランス・エフ−28320エクロスヌ・リユ ドシヤルトル31 (72)発明者 レバ， フレデリク フランス・エフ−92160アントニイ・リユ ドシヤトネ49・バテイマンフランドル２ (72)発明者 ビニユ， エマニユエル フランス・エフ−94200イブリ−シユール −セーヌ・リユジヤン−ル−ガルー60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＧＤＮＦ又はその誘導体の１つの全体又は活性部分をコードする少なくと も１つのＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルス。 ２．ＤＮＡ配列が５’位置に、及びＧＤＮＦをコードする配列を有する読み枠 に分泌配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のアデノウィルス。 ３．ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の範囲第１又は２ 項に記載のアデノウィルス。 ４．ＤＮＡ配列がｇＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の範囲第１又は２ 項に記載のアデノウィルス。 ５．ＤＮＡ配列がヒトＧＤＮＦをコードすることを特徴とする請求の範囲第１ 〜４項の１つに記載のアデノウィルス。 ６．ＤＮＡ配列が神経細胞においてそれが発現されることを可能にするシグナ ルの調節下におかれることを特徴とする請求の範囲第１〜５項の１つに記載のア デノウィルス。 ７．発現シグナルがウィルスプロモーターの中から、好ましくはＥ１Ａ、ＭＬ Ｐ、ＣＭＶ及びＲＳＶ ＬＴＲプロモーターの中から選ばれることを特徴とする 請求の範囲第６項に記載のアデノウィルス。 ８．ＲＳＶ ＬＴＲプロモーターの調節下でヒトプレ−ＧＤＮＦをコードする ｃＤＮＡ配列を含む請求の範囲第１項に記載の欠失組み換えアデノウィルス。 ９．ＲＳＶ ＬＴＲプロモーターの調節下でヒトプレ−ＧＤＮＦをコードする ｇＤＮＡ配列を含む請求の範囲第１項に記載の欠失組み換えアデノウィルス。 １０．神経膠細胞−由来ヒト神経栄養因子（ｈＧＤＮＦ）又はそれらの誘導体 の全体又は活性部分をコードするＤＮＡ配列を、神経細胞においてその発現の大 部分が起こることを可能にするプロモーターの調節下に含む請求の範囲第１項に 記載の欠失組み換えアデノウィルス。 １１．プロモーターが神経−特異的エノラーゼのプロモーター及びＧＦＡＰプ ロモーターの中から選ばれることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の欠失 望組み換えアデノウィルス。 １２．標的細胞におけるその複製に必要なそのゲノムの領域が欠けていること を特徴とする請求の範囲第１〜１１項の１つに記載のアデノウィルス。 １３．ＩＴＲ、ならびに包膜を可能にし、Ｅ１遺伝子、ならびに遺伝子Ｅ２、 Ｅ４及びＬ１〜Ｌ５の少なくとも１つが非−機能性である配列を含むことを特徴 とする請求の範囲第１２項に記載のアデノウィルス。 １４．Ａｄ２又はＡｄ５ヒトアデノウィルス又はＣＡＶ−２イヌアデノウィル スであることを特徴とする請求の範囲第１２又は１３項に記載のアデノウィルス 。 １５．神経変性疾患の処置及び／又は予防を目的とする製薬学的組成物の製造 のための請求の範囲第１〜１４項の１つに記載のアデノウィルスの利用。 １６．パーキンソン病、アルツハイマー病又はハンティングトン病、あるいは ＡＬＳの処置及び／又は予防を目的とする製薬学的組成物の製造のための請求の 範囲第１５項に記載の利用。 １７．請求の範囲第１〜１４項の１つに記載の１種又はそれ以上の欠失組み換 えアデノウィルスを含む製薬学的組成物。 １８．注入可能な形態であることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の製 薬学的組成物。 １９．１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの 欠失組み換えアデノウィルスを含むことを特徴とする請求の範囲第１７又は１８ 項に記載の製薬学的組成物。 ２０．請求の範囲第１〜１４項の１つに記載の１種又はそれ以上の欠失組み換 えアデノウィルスに感染した哺乳類細胞。 ２１．ヒト細胞であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の細胞。 ２２．繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、内皮細胞、神経膠細胞又は表皮細胞の 型のヒト細胞であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の細胞。 ２３．請求の範囲第２０〜２２項に記載の感染細胞及び細胞外マトリックスを 含む体内埋植物。 ２４．細胞外マトリックスが、好ましくはコラーゲン、ゼラチン、グルコサミ ノグリカン類、フィブロネクチン及びレクチン類の中から選ばれるゲル−形成化 合物を含むことを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の体内埋植物。 ２５．細胞外マトリックスが感染細胞の固定のための担体も含むことを特徴と する請求の範囲第２３又は２４項に記載の体内埋植物。 ２６．担体が好ましくはポリテトラフルオロエチレン繊維から成ることを特徴 とする請求の範囲第２５項に記載の体内埋植物。